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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】化学修飾を有するプライム編集のためのガイドＲＮＡ
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240918BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240918BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/09 110
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024514728
(86)(22)【出願日】2022-09-12
(85)【翻訳文提出日】2024-05-02
(86)【国際出願番号】 US2022076317
(87)【国際公開番号】W WO2023039586
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】63/243,055
(32)【優先日】2021-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】399117121
【氏名又は名称】アジレント・テクノロジーズ・インク
【氏名又は名称原語表記】ＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100099623
【弁理士】
【氏名又は名称】奥山 尚一
(74)【代理人】
【識別番号】100125380
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 綾子
(74)【代理人】
【識別番号】100142996
【弁理士】
【氏名又は名称】森本 聡二
(74)【代理人】
【識別番号】100166268
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 祐
(74)【代理人】
【識別番号】100180231
【弁理士】
【氏名又は名称】水島 亜希子
(72)【発明者】
【氏名】ライアン，ダニエル・イー．
(72)【発明者】
【氏名】デリンジャー，ダグラス・ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】カイザー，ロバート
(57)【要約】
１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドが組み込まれている修飾プライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を使用して、標的核酸（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡ）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの編集をインビトロまたは細胞内で誘導するための組成物および方法が、本明細書に提供される。本明細書に開示される修飾ｐｅｇＲＮＡは、標的核酸の１つもしくは複数のヌクレオチド変化のＣａｓ媒介組込みおよび／または標的変異誘発を誘導するために使用されることがある。ヌクレオチド変化は、例えば、１つもしくは複数のヌクレオチド変化、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失を含みうる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸の標的領域内の標的配列とハイブリダイズできるガイド配列と；Ｃａｓタンパク質と相互作用するセグメントと；
前記標的領域と結合できるプライマー結合部位セグメントと；
前記標的領域に対する所望の編集を有する配列を含む逆転写酵素鋳型セグメントと
を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）であって、
前記ｐｅｇＲＮＡが、一方がプライム編集末端であり、他方が遠位末端と称される５’末端および３’末端を含み、
前記ｐｅｇＲＮＡが、前記プライム編集末端の５つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、
前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、
（ａ）２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノカルボキシレートおよび／もしくは２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノカルボキシレート、または
（ｂ）２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）
を含み、
前記ｐｅｇＲＮＡが、前記プライム編集末端に伸長テールを含まない、
ｐｅｇＲＮＡ。
【請求項2】
前記プライム編集末端に伸長テールを含まない、請求項１に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項3】
前記３’末端または前記５’末端に伸長テールを含む、請求項１または２に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項4】
前記プライム編集末端の５つのヌクレオチド内に２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチド、２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチド、または２つの連続するＭＳを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項5】
前記プライム編集末端の５つのヌクレオチド内に３つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチド、３つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチド、または３つの連続するＭＳを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項6】
前記２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノカルボキシレートが２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項7】
前記２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノカルボキシレートが２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノアセテート（ＭＳＰ）である、請求項１～６のいずれか１項に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項8】
前記遠位末端の５つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項9】
前記遠位末端の５つのヌクレオチド内の前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、（１）２’－ＭＯＥ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシから選択される２’修飾と；（２）ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、およびチオホスホノカルボキシレートから選択されるヌクレオチド間連結修飾とを含むヌクレオチドを含む、請求項８に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項10】
前記遠位末端の５つのヌクレオチド内の前記１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ＭＳ、ＭＰまたはＭＳＰを含む、請求項９に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項11】
前記プライマー結合部位および／または前記逆転写酵素の鋳型が、２’－デオキシ修飾を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項12】
一本鎖ガイドＲＮＡである、請求項１～１１のいずれか１項に記載のｐｅｇＲＮＡ。
【請求項13】
核酸中に標的配列を含む標的領域を編集する方法であって、前記標的領域を、
前記標的領域の１つの鎖にニックを入れるためのニッカーゼＣａｓタンパク質；
逆転写酵素；および
請求項１～１２のいずれか１項に記載のｐｅｇＲＮＡ
と接触させるステップを含み；
前記接触させるステップが、前記標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
【請求項14】
前記Ｃａｓタンパク質および前記逆転写酵素が、融合タンパク質として、直接的にまたはリンカーを介して共有結合的に連結している、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記逆転写酵素が、ＭＭＬＶ逆転写酵素または変異型ＭＭＬＶ逆転写酵素である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
前記Ｃａｓタンパク質および／または前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓタンパク質および／または前記逆転写酵素をコードするｍＲＮＡとして提供される、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記Ｃａｓタンパク質および前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓタンパク質および前記逆転写酵素を含む融合タンパク質をコードするｍＲＮＡとして提供される、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記Ｃａｓタンパク質および／または前記逆転写酵素が、前記Ｃａｓタンパク質および／または前記逆転写酵素をコードするＤＮＡとして提供される、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記Ｃａｓタンパク質および前記ｐｅｇＲＮＡが、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）として提供され、必要に応じてナノ粒子中に封入されている、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記接触させるステップが、細胞内で行われる、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
前記細胞がエクスビボで存在する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記細胞が初代細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
少なくとも２つの核酸標的領域を編集する方法であって、第１の核酸標的領域および第２の核酸標的領域を、
前記核酸標的領域の一本鎖にニックを入れることができるＣａｓタンパク質；
逆転写酵素；
前記第１の核酸標的領域に特異的なガイド配列を有する請求項１に記載の第１のｐｅｇＲＮＡ；および
前記第２の核酸標的領域に特異的なガイド配列を有する請求項１に記載の第２のｐｅｇＲＮＡ
と接触させるステップを含み；
前記接触させるステップが、前記第１の核酸標的領域および前記第２の核酸標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２１年９月１０日に出願された米国特許仮出願第６３／２４３，０５５号の優先権の利益を主張し、その全内容は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものとする。
本出願は、２０２１年９月１０日に出願された米国特許仮出願第６３／２４３，０５５号の優先権の利益を主張し、その全内容は、その全体が参照により本明細書の一部をなすものとする。
【0002】
［電子的に提出された配列表への参照］
本明細書は、２０２２年９月１２日に作成されたファイル名「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提示された、同時に提出された配列表を参照によりさらに組み込んでいる。本文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
本明細書は、２０２２年９月１２日に作成されたファイル名「ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提示された、同時に提出された配列表を参照によりさらに組み込んでいる。本文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【0003】
本開示は、生物学の分野に関する。特に、本開示は、規則的な配置の短い回文配列リピートのクラスター（ＣＲＩＳＰＲ）技術に関する。
【背景技術】
【0004】
ネイティブな原核生物ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、一定長の介在可変配列を有する短いＤＮＡ配列リピートのアレイ（すなわち、規則的な配置の短い回文配列リピートのクラスター、または「ＣＲＩＳＰＲ」）と、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）タンパク質を発現する１つまたは複数の配列とを含む。転写されたＣＲＩＳＰＲ座位のＲＮＡ（または「ＣＲＩＳＰＲアレイ」）は、Ｃａｓタンパク質および細胞性ＲＮアーゼのサブセットによって低分子ガイドＲＮＡにプロセシングされ、低分子ガイドＲＮＡは、一般的に下記のような２つの構成要素を有する。Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩ型の少なくとも６つの異なる種類のＣＲＩＳＰＲシステムがある。これらの７つのシステムでは、転写されたＲＮＡの成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングに関与する酵素が異なる。ネイティブな原核生物ＩＩ型システムでは、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）およびトランス活性化ＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）と称される２つの低分子ノンコーディングＲＮＡ種を含む。例示的なシステムでは、ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成する。ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）およびプロトスペーサー（後者はｇＲＮＡの一部分と相補的な配列を有する）を有する標的ポリヌクレオチド配列と結合する。ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体による標的ポリヌクレオチドの認識および結合は、標的ポリヌクレオチドの切断を誘導する。ネイティブなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、原核生物において免疫システムとして機能し、そこで、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体は、真核生物におけるＲＮＡｉと類似の様式で外因性遺伝要素を認識およびサイレンシングし、それにより、感染性プラスミドおよびファージなどの外因性遺伝要素に対する抵抗性を付与する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと称される２つの低分子ＲＮＡ種は、様々な長さの低分子ＲＮＡステムループによって接続されて、２つの天然種と同様に機能する一本鎖ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）になりうることが実証されている（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２、３３７、８１６～８２１；Ｈｓｕら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３、８２７～８３２；Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ ２０１３、１５５、１４７９～１４９１）。
【0005】
プライム編集は、ＤＮＡ内の標的とされた配列を編集するためのＣＲＩＳＰＲベースの技術であり、トランスバージョンおよび対変異などの様々な形式の塩基置換を可能にする。これはまた、最大約７００ｂｐ長の大きな欠失を含む正確な挿入および欠失を可能にする。特に、プライム編集は外因性ＤＮＡ修復鋳型を必要としない。プライム編集のための基礎をなす技術は、Ａｎｚａｌｏｎｅら「Ｓｅａｒｃｈ－ａｎｄ－ｒｅｐｌａｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｏｒ ｄｏｎｏｒ ＤＮＡ．」Ｎａｔｕｒｅ ５７６：７７８５（２０１９）１４９～１５７に記載されており、その後の進歩および変形が報告されている（Ａｎｚａｌｏｎｅら Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２０、８８３～８９１；Ｈｓｕら Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２１、１２：１０３４；Ｌｉｕら Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０２１、１２：２１２１；Ｌｉｎら Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２１、９２３～９２７；Ｃｈｏｉら Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２２、２１８～２２６；Ｎｅｌｓｏｎら Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２２、４０２～４１０；Ｃｈｅｎら、Ｃｅｌｌ ２０２１、１８４、１～１８；Ａｎｚａｌｏｎｅら Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２２、７３１～７４０）。これらの研究では、Ｃａｓ９ニッカーゼポリペプチドを逆転写酵素ポリペプチドと融合し、この融合タンパク質には、新規な設計を有するプライム編集ガイドＲＮＡ（または「ｐｅｇＲＮＡ」）を用いた。その結果、（ｉ）ＤＮＡ標的部位（Ｃａｓ９ニッカーゼ部分によって標的とされた）のニック入りの鎖の３’末端上に、融合タンパク質の逆転写酵素部分がコピーするための所望の編集を含む配列であるＲＮＡ鋳型セグメント、および（ｉｉ）ニック入りの３’末端を有する標的配列と相補的な配列であるプライマー結合セグメントの、２つの追加的なｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの３’末端に付加され、それにより、ニック入りの３’末端がプライマー結合配列との配列ハイブリダイゼーションによって捕捉されて、逆転写酵素部分によるニック入りの３’末端のプライマー伸長が可能になる（図１に示す）。最近の進歩の中には、ｐｅｇＲＮＡ対を利用してＤＮＡ標的部位への大きな欠失（最大約１ｋｂ）または挿入（最大約１５０ｂｐ）を含む、小さな編集から大きな編集まで正確に導入する巧みな技術がある（Ａｎｚａｌｏｎｅら ２０２２；Ｌｉｎら ２０２１；およびＣｈｏｉら ２０２２を参照されたい）。それ以来、プライム編集のための融合タンパク質の設計が改善されてきた。例えば、逆転写酵素（「ＲＴ」）部分に様々な点変異を導入することでＲＴ活性を高めることができると報告されている（Ａｎｚａｌｏｎｅら ２０１９；Ａｒｅｚｉ ＆ Ｈｏｇｒｅｆｅ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００９、４７３～４８１を参照されたい）。他の研究は、プライムエディター融合タンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に核移行配列（ＮＬＳ）を付加することが比較的大きなタンパク質の細胞核内への分子輸送を高め、ゲノムＤＮＡの編集を促進することを見出している（Ｌｉｕら ２０２１を参照されたい）。
【0006】
これらの進歩にもかかわらず、特にＣＲＩＳＰＲベースシステムの効率および安定性への、例えばＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集の治療ツールとしての採用を支持するための、ＣＲＩＳＰＲ技術へのさらなる改善の必要性が当技術分野において存在する。一部の態様では、本開示は、この必要性および他の必要性に取り組むものである。例えば、本明細書に記載される方法は、目的の標的配列に対する特異性を高める方法と組み合わせて実行される場合がある。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、標的核酸の配列を編集するための化学修飾ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡ（特にプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ））および関連方法を提供する。
【0008】
第１の一般的態様では、本開示は、核酸の標的ＤＮＡ配列と相補的なガイド配列と；ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質と相互作用できる配列と、ここで、前記Ｃａｓタンパク質が標的配列の相補鎖にニックを入れることができ；核酸の配列への１つまたは複数の編集を含む逆転写酵素の鋳型配列（ＲＴＴ配列）と；標的配列（すなわち、ニックの入った鎖）の相補鎖とハイブリダイズできるプライマー結合部位配列（ＰＢＳ配列）とを含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を提供し、ここで、ｐｅｇＲＮＡは、５’末端および３’末端（その一方はプライム編集末端であり、他方は「遠位末端」と称される）と、プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドとを含み、ここで、各々の修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシから選択される２’修飾、ならびに３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノカルボキシレート、および３’－チオホスホノカルボキシレートから選択されるヌクレオチド間連結修飾を含むヌクレオチドである。
【0009】
第２の一般的態様では、本開示は、核酸の配列を編集する方法であって、ａ）核酸を、核酸の一本鎖にニックを入れることができるＣａｓタンパク質；逆転写酵素；および核酸の標的配列と相補的なガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する配列と、標的配列の相補鎖と結合できるプライマー結合部位配列と、核酸の配列への１つまたは複数の編集を含む逆転写酵素の鋳型配列とを含むｐｅｇＲＮＡと接触させるステップと、ここで、ガイドＲＮＡが、５’末端および３’末端と、プライム編集末端の５つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドとを含み；ならびに、ｂ）１つまたは複数の編集を核酸の配列に組み込むことによって編集された核酸を生成するステップと、ここで、各々の編集が、１つもしくは複数のヌクレオチド置換、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、および／または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失を含む、方法を提供する。
【0010】
第３の一般的態様では、本開示は、少なくとも２つの異なる核酸標的を編集する方法を提供する。方法は、異なる標的配列を認識し、一般的に上記と同じ方法で作動する２つの異なるｐｅｇＲＮＡを利用する。単一のＣａｓタンパク質を使用することができ、またはその代わりに各々がｐｅｇＲＮＡの一方に対するものである２つの異なるＣａｓタンパク質を使用することができる。同様に、３、４、５、６、１０、２０またはそれよりも多いなどの、２つよりも多いｐｅｇＲＮＡとの多重化が、本発明を考慮して考えられる。
【0011】
本明細書に記載される様々な例示的な実施形態の一部の態様では、ｐｅｇＲＮＡの３’および／または５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは：１）０、１、２、３、４、もしくは５つのＭＳヌクレオチド；２）０、１、２、３、４、もしくは５つのＭＰもしくはＭＳＰヌクレオチド；または３）最大５つのＭＳおよびＭＰ／ＭＳＰヌクレオチドの任意の組合せ（例えば、０ｘＭＳ、５ｘＭＰ；１ｘＭＳ、４ｘＭＰ；２ｘＭＳ、３ｘＭＰ；３ｘＭＳ、２ｘＭＰ；４ｘＭＳ、ＩｘＭＰ；もしくは５ｘＭＳ、０ｘＭＰ）を含む。一部の態様では、ｐｅｇＲＮＡの３’または５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、もしくは５つのＭＳヌクレオチド、および／または少なくとも１、２、３、４、もしくは５つのＭＰもしくはＭＳＰヌクレオチドを含む。ｐｅｇＲＮＡの３’または５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、任意の順序で配置されたＭＳおよびＭＰ／ＭＳＰヌクレオチドを含みうる（例えば、ＭＳ、ＭＳ、ＭＰ、ＭＳ、ＭＳ；ＭＰ、ＭＰ、ＭＰ、ＭＳ、ＭＳ；ＭＳ、ＭＳ、ＭＳ；またはＭＰ、ＭＰ）。ｐｅｇＲＮＡの３’または５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、独立して選択されうる（例えば、修飾ヌクレオチドの配列は、ｐｅｇＲＮＡの５’および３’末端上で異なりうる）。一部の態様では、ｐｅｇＲＮＡは、３’末端の５つのヌクレオチド内に（および／または５’末端の５つのヌクレオチド内に）１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、ここで、各々の修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシから選択される２’修飾と、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノカルボキシレート、および３’－チオホスホカルボキシレートから選択されるヌクレオチド間連結とを含むヌクレオチドである。
【0012】
本開示の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図面から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを使用するプライム編集を示す図である。
【図2】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの最初のセットを使用するＫ５６２細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。
【図3】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの最初のセットを使用するＪｕｒｋａｔ細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。
【図4】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの第２のセットを使用するＫ５６２細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。
【図5】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの第２のセットを使用するＪｕｒｋａｔ細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。
【図6】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの最初のセットを使用するＫ５６２細胞におけるＲＵＮＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。
【図7】化学修飾ｐｅｇＲＮＡの最初のセットを使用するＪｕｒｋａｔ細胞におけるＲＵＮＸ１のプライム編集の有効性を示すグラフである。
【図8】本明細書に開示されるｐｅｇＲＮＡに組み込まれうる化学修飾ヌクレオチドの２つの例である２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）および２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）の化学構造を図示する。
【図9】５’および３’末端に３ｘＭＳ（上）、または５’末端に３ｘＭＳおよび３’末端に３ｘＭＰ（下）を組み込んでいる２つの例示的なｇＲＮＡを図示する。
【図10】Ｋ５６２細胞における化学修飾ｇＲＮＡの経時的な相対レベルを評価した実験の結果を示すグラフである。
【図11】例示的な標的配列を使用するＥＭＸ１およびＲＵＮＸ１のプライム編集を図示する。
【図12】Ｋ５６２細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集を判定した実験の結果を示すグラフである。この場合、ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするためにプライム編集を使用した。
【図13】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＥＭＸ１のプライム編集を判定した実験の結果を示すグラフである。この場合、ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするためにプライム編集を使用した。
【図14】Ｋ５６２細胞におけるＲＵＮＸ１のプライム編集を判定した実験の結果を示すグラフである。この場合、ＲＵＮＸ１に３塩基挿入を導入するためにプライム編集を使用した。
【図15】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＲＵＮＸ１のプライム編集を判定した実験の結果を示すグラフである。この場合、ＲＵＮＸ１に３塩基挿入を導入するためにプライム編集を使用した。
【図16】（Ａ）３’末端に編集エレメントを有するＣａｓ９様式のｐｅｇＲＮＡ；（Ｂ）５’末端に編集エレメントを有するＣａｓ９様式のｐｅｇＲＮＡ；（Ｃ）５’末端に編集エレメントを有するＣｐｆ１様式のｐｅｇＲＮＡ；および（Ｄ）３’末端に編集エレメントを有するＣｐｆ１様式のｐｅｇＲＮＡにおける様々な配置での主要構成要素の相対位置を図示する。
【発明を実施するための形態】
【0014】
インビトロ（例えば、培養細胞；一例は、エクスビボ療法に使用するための初代細胞である）またはインビボ（例えば、ヒトなどの対象の臓器もしくは組織内の細胞）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースゲノム編集の方法が、本明細書に提供される。特に、本明細書に提供される方法は、対応する未修飾ｐｅｇＲＮＡと比較してプライム編集のための高い活性を有する、プライム編集のための化学修飾ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（ｐｅｇＲＮＡ）を利用する。一部の態様では、本開示は、プライムエディターと、標的核酸とハイブリダイズする化学修飾ｐｅｇＲＮＡとを導入することによる標的核酸の配列を編集する方法を提供する。プライムエディターは、Ｃａｓタンパク質および逆転写酵素活性を含む。Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓタンパク質、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターとして提供されることがある。一部の態様では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ヌクレアーゼ活性（例えば、ニッカーゼ活性）を有するバリアントでありうる。一部の態様では、Ｃａｓタンパク質は、逆転写酵素活性を組み込んでいる融合タンパク質として提供される。ある特定の他の態様では、本開示は、疾患に関連する遺伝性変異を（例えば、患者のゲノムＤＮＡを編集することによって）修正するのに十分な量の化学修飾ｐｅｇＲＮＡおよびプライムエディターを投与することによって対象における遺伝性疾患を予防または治療する方法を提供する。
【0015】
本開示の態様は、当業者の技能の範囲内である、免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来技術を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９８７））、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照されたい。
【0016】
オリゴヌクレオチドは、例えば、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２２：１８５９～１８６２（１９８１）によって最初に記載された固相ホスホロアミダイトトリエステル法により、Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９～６１６８（１９８４）に記載された自動合成装置を使用して化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、当技術分野において承認されている任意の戦略、例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅａｎｉｅｒ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．２５５：１３７～１４９（１９８３）に記載されたように変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して行われる。
【0017】
［定義および略語］
別段の具体的な指示がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。加えて、本明細書に記載される方法または材料と類似または等価の任意の方法または材料を、本明細書に記載される方法の実施および組成物の調製に使用することができる。本開示のために、以下の用語が定義される。
別段の具体的な指示がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。加えて、本明細書に記載される方法または材料と類似または等価の任意の方法または材料を、本明細書に記載される方法の実施および組成物の調製に使用することができる。本開示のために、以下の用語が定義される。
【0018】
本明細書で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」という用語は、１つのメンバーによる態様を含むだけでなく、１つよりも多いメンバーによる態様も含む。例えば、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への参照は、複数のこのような細胞を含み、「薬剤」への参照は、当業者に公知の１つまたは複数の薬剤への参照を含むなどである。
【0019】
「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」または「Ｃａｓタンパク質」または「Ｃａｓポリペプチド」という用語は、野生型Ｃａｓタンパク質、その断片、またはその変異体もしくはバリアントを指す。「Ｃａｓ変異体」または「Ｃａｓバリアント」という用語は、野生型Ｃａｓタンパク質のタンパク質またはポリペプチド誘導体、例えば、１つもしくは複数の点変異、挿入、欠失、短縮化を有するタンパク質、融合タンパク質、またはそれらの組合せを指す。ある特定の実施形態では、「Ｃａｓ変異体」または「Ｃａｓバリアント」は、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性を実質的に保持する。ある特定の実施形態では、「Ｃａｓ変異体」または「Ｃａｓバリアント」は、一方または両方のヌクレアーゼドメインが不活性であるように変異している（このタンパク質は、それぞれＣａｓニッカーゼまたはデッド型Ｃａｓタンパク質と称されることがある）。ある特定の実施形態では、「Ｃａｓ変異体」または「Ｃａｓバリアント」はヌクレアーゼ活性を有する。ある特定の実施形態では、「Ｃａｓ変異体」または「Ｃａｓバリアント」は、その野生型対応物のヌクレアーゼ活性の一部またはすべてを欠如する。「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」または「Ｃａｓタンパク質」という用語はまた、原核生物の様々な種の、Ｃａｓ１２ａとも称される野生型Ｃｐｆ１タンパク質（ブレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）由来のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート１リボ核タンパク質またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１リボ核タンパク質にちなんで名付けられる）、その断片またはその変異体もしくはバリアントを含む。Ｃａｓタンパク質は、以下に限定されないが、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、およびＶＩ型の６つの異なるＣＲＩＳＰＲシステムのいずれか１つを含む、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質のいずれかを含む。
【0020】
Ｃａｓタンパク質の「ヌクレアーゼドメイン」という用語は、ＤＮＡ切断のための触媒活性を有するタンパク質内のポリペプチド配列またはドメインを指す。Ｃａｓ９は、典型的に、ＰＡＭ配列上流の二本鎖切断を触媒する。ヌクレアーゼドメインがポリペプチド一本鎖に含有されることがあり、また、切断活性は、２つ（またはそれよりも多い）ポリペプチドの会合に起因することがある。単一ヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内のアミノ酸の１つよりも多い単離されたストレッチからなることがある。これらのドメインの例は、ＲｕｖＣ様モチーフ（配列番号１内のアミノ酸７～２２、７５９～７６６および９８２～９８９）およびＨＮＨモチーフ（アミノ酸８３７～８６３）を含む；Ｇａｓｉｕｎａｓら（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ．ＵＳＡ １０９：３９、Ｅ２５７９～Ｅ２５８６およびＷＯ／２０１３１７６７７２を参照されたい。
【0021】
「ｇＲＮＡの機能性」を有する合成ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）は、Ｃａｓタンパク質と会合してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成すること、またはＣａｓタンパク質と会合したガイドＲＮＡによって実行される機能（すなわち、ＲＮＰ複合体の機能）などの天然に存在するガイドＲＮＡの機能のうち１つまたは複数を有するものである。ある特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドと結合することを含む。ある特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質またはｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の標的とすることを含む。ある特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドにニックを入れることを含む。ある特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドを切断することを含む。ある特定の実施形態では、機能性は、Ｃａｓタンパク質と会合または結合することを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質は、１つまたは複数のタンパク質またはその部分、例えば転写因子エンハンサーまたはリプレッサー、デアミナーゼタンパク質、逆転写酵素、ポリメラーゼなどと融合された「デッド型」Ｃａｓタンパク質（ｄＣａ）であるように操作されることがあり、その結果、融合されたタンパク質またはその部分は、標的部位でその機能を発揮することができる。ある特定の実施形態では、機能性は、操作Ｃａｓタンパク質を用いた人工ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む、Ｃａｓタンパク質を用いたＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムにおけるガイドＲＮＡの任意の他の公知の機能である。ある特定の実施形態では、機能性は天然ガイドＲＮＡの任意の他の機能である。合成ガイドＲＮＡは、天然に存在するガイドＲＮＡよりも大きなまたは小さな程度でｇＲＮＡの機能性を有することがある。ある特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、類似の天然に存在するガイドＲＮＡと比較して１つの機能に関して大きな活性を有することがあり、別の機能に関して小さな活性を有することがある。
【0022】
一本鎖「ニッキング」活性を有するＣａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質と比較してｄｓＤＮＡの２つの鎖のうち１つを切断する能力が低減している、Ｃａｓ変異体またはＣａｓバリアントを含むＣａｓタンパク質を指す。例えば、ある特定の実施形態では、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質は、ＲｕｖＣドメイン（またはＨＮＨドメイン）の機能を低減し、結果として標的ＤＮＡの１つの鎖を切断する能力を低減する変異（例えば、アミノ酸置換）を有する。このようなバリアントの例は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｈ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、および／またはＮ８６３Ａ置換を含み、他の種のＣａｓ９酵素における同等部位に同じまたは類似の置換も含む。
【0023】
「結合」活性を有する、または標的ポリヌクレオチドと「結合する」Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと複合体を形成するＣａｓタンパク質を指し、このような複合体では、ガイドＲＮＡはガイドＲＮＡの塩基とその他のポリヌクレオチドとの間の水素結合を介して標的ポリヌクレオチド配列などの別のポリヌクレオチドとハイブリダイズして塩基対を形成する。水素結合は、ワトソン－クリックモデル塩基対形成によって、または任意の他の配列特異的な様式で起こりうる。ハイブリッドは、二重鎖を形成する２つの鎖、多重鎖の三重鎖を形成する３つ以上の鎖、またはこれらの任意の組合せを含むことがある。
【0024】
「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、少なくとも１つのＣａｓタンパク質および少なくとも１つのｇＲＮＡを利用して、以下に限定されないが、遺伝子編集、ＤＮＡ切断、ＤＮＡニッキング、ＤＮＡ結合、遺伝子発現の調節、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、およびＣａｓタンパク質を別のエフェクターに連結することによって達成できる任意の他の機能を含む機能または効果を提供し、それにより、Ｃａｓタンパク質によって認識される標的配列に対してエフェクター機能を果たすシステムである。例えば、ヌクレアーゼを含まないＣａｓタンパク質は、転写因子、デアミナーゼ、メチラーゼ、逆転写酵素などと融合することができる。結果として生じる融合タンパク質を使用して、標的のためのガイドＲＮＡの存在下で、標的を編集する、その転写を調節する、脱アミノする、またはメチル化することができる。プライム編集における別の例として、ｐｅｇＲＮＡの存在下で標的核酸を編集するためにＣａｓタンパク質は逆転写酵素または他のポリメラーゼと共に（必要に応じて融合タンパク質として）使用される。
【0025】
「ガイドＲＮＡ」（または「ｇＲＮＡ」）は、一般的に、Ｃａｓタンパク質と結合し、標的ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）内の特異的位置にＣａｓタンパク質を標的とすることを助けることができるＲＮＡ分子（またはまとめてＲＮＡ分子の群）を指す。したがって、ガイドＲＮＡは、標的配列とハイブリダイズできるガイド配列を含み、ガイドＲＮＡの別の部分（「足場」）は、Ｃａｓタンパク質と結合して、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するように機能する。以下に限定されないが、Ｃａｓ９様式およびＣｐｆ１様式のガイドＲＮＡを含む様々な様式のガイドＲＮＡがある。「Ｃａｓ９様式」のガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含む。本明細書で使用される場合、「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡセグメント」という用語は、ポリヌクレオチド標的化ガイド配列と；Ｃａｓタンパク質との相互作用を助ける足場配列と；必要に応じて５’－オーバーハング配列とを含むＲＮＡ分子またはその部分を指す。本明細書で使用される場合、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント」という用語は、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互作用できるタンパク質結合セグメントを含むＲＮＡ分子またはその部分を指す。Ｃａｓ９に加えて、Ｃａｓ９様式のガイドＲＮＡを利用する他のＣａｓタンパク質があり、「Ｃａｓ９」という語句は、「Ｃａｓ９様式」という用語の中でこの様式を利用する様々なＣａｓタンパク質の代表的なメンバーを単に特定するために使用される。「Ｃｐｆ１様式」は、ガイド配列の５’である足場を含む一分子ガイドＲＮＡである。文献では、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡではなくｃｒＲＮＡだけを有するとしばしば記載されている。用語法にかかわらず、すべてのガイドＲＮＡは、標的と結合するためのガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用できる足場領域とを有することに注目すべきである。
【0026】
「ガイドＲＮＡ」という用語は、一分子中にすべての機能的部分を含有する単一ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）を包含する。例えば、Ｃａｓ９様式のｓｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、同じＲＮＡ分子に位置する。別の例として、Ｃｐｆ１ガイドＲＮＡは、本来、単一ガイドＲＮＡ分子である。「ガイドＲＮＡ」という用語はまた、まとめて２つ以上のＲＮＡ分子の群を包含し；例えばｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、別々のＲＮＡ分子に位置することがある。
【0027】
必要に応じて、「ガイドＲＮＡ」は、ｇＲＮＡと会合したＣａｓタンパク質の機能と一緒に分子機能を実行するコグネートポリペプチドまたは酵素による認識および結合を受けて１つまたは複数の補助機能を果たす、１つまたは複数の追加的なセグメントを含みうる。例えば、プライム編集のためのｇＲＮＡ（一般に「ｐｅｇＲＮＡ」と称される）は、本開示により詳細に記載されるようにプライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型を含むことがある。別の例では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質機能と一緒に補助機能を果たすアプタマー結合ポリペプチド（必要に応じて他のポリペプチドと融合されている）を認識し、それと結合する１つまたは複数のアプタマーを形成する１つまたは複数のポリヌクレオチドセグメントを含みうる。必要に応じて、「ガイドＲＮＡ」は、例えばエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼによって起こりうるような、その分解を妨害することによってｇＲＮＡの安定性を高めることができる追加的なポリヌクレオチドセグメント（３’末端ポリウリジンテールなど）を含むことがある。
【0028】
「ガイド配列」という用語は、標的ポリヌクレオチド中の標的配列と部分的または完全な相補性を有し、Ｃａｓタンパク質によって促進される塩基対形成により標的配列とハイブリダイズできる、ｇＲＮＡ（またはｐｅｇＲＮＡ）におけるヌクレオチドの連続配列を指す。場合によっては、標的配列はＰＡＭ部位（ＰＡＭ配列）と隣接する。場合によっては、標的配列は、ＰＡＭ配列のすぐ上流に位置することがある。ガイド配列とハイブリダイズする標的配列は、ＰＡＭ配列の相補体のすぐ下流にあってもよい。Ｃｐｆ１などの他の例では、ガイド配列とハイブリダイズする標的配列の位置は、ＰＡＭ配列の相補体の上流にあってもよい。
【0029】
ガイド配列は、約１４ヌクレオチドと短いこともあれば、約３０ヌクレオチドと長いこともある。典型的なガイド配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４ヌクレオチド長である。ガイド配列の長さは、上述の２つのクラスおよび６つの型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムによって異なる。Ｃａｓ９のための合成ガイド配列は、通常２０ヌクレオチド長であるが、より長いまたは短いことがある。ガイド配列が２０ヌクレオチドよりも短い場合、これは、典型的には２０ヌクレオチドガイド配列と比較して５’末端からの欠失である。例として、ガイド配列は、標的配列と相補的な２０ヌクレオチドからなることがある。言い換えると、ガイド配列は、ＤＮＡとＲＮＡとの間のＡ／Ｕの差異を除きＰＡＭ配列上流の２０ヌクレオチドと同一である。このガイド配列が、５’末端から３つのヌクレオチドだけ切断された場合、２０ヌクレオチドのガイド配列のヌクレオチド４は今や１７塩基長のヌクレオチド１になり、２０ヌクレオチドガイド配列のヌクレオチド５は今や１７塩基長のヌクレオチド２になるなどである。１７塩基長ガイド配列についての新しい位置は、本来の位置から３を引いたものである。
【0030】
本明細書で使用される場合、「プライム編集ガイドＲＮＡ」（または「ｐｅｇＲＮＡ」）という用語は、核酸の標的配列への１つまたは複数の編集をコードする逆転写酵素の鋳型配列と、標的領域内の配列と結合できるプライマー結合部位（標的部位とも呼ばれる）とを含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を指す。例えば、ｐｅｇＲＮＡは、標的領域内の配列への１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入または欠失を含む逆転写酵素の鋳型配列を含みうる。ｐｅｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、通常は細胞のゲノムにおける標的領域内の標的配列とハイブリダイズして、結果として標的領域内の配列の編集をもたらす機能を有する。理論に縛られるわけではないが、一部の実施形態では、ｐｅｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質とＲＮＰ複合体を形成し、標的領域内の標的配列と結合し、Ｃａｓタンパク質が標的領域の一本鎖にニックを作り、結果としてフラップを生じ、ｐｅｇＲＮＡのプライマー結合部位がフラップとハイブリダイズし、逆転写酵素が、ハイブリダイズしたｐｅｇＲＮＡの逆転写酵素の鋳型上のプライマーとしてフラップを使用し、それがフラップのニック入り末端上で新しいＤＮＡ配列を合成するための鋳型として作用し、そのとき、この新しいＤＮＡ配列は所望の編集を含有し、最終的にこの新しいＤＮＡ配列が標的領域内の本来の配列と置き換わり、結果として標的の編集をもたらす。
【0031】
ｐｅｇＲＮＡは、その５’末端または３’末端近くに逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位を含むことがある。「プライム編集末端」は、ガイド配列よりも逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位に近い、５’または３’のいずれかのｐｅｇＲＮＡの一方の末端である。ｐｅｇＲＮＡの他方の末端は、逆転写酵素の鋳型またはプライマー結合部位よりもガイド配列に近い「遠位末端」である。したがって、これらの構成要素の順序は、５’方向または３’方向に：
プライム編集末端－（プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型）－（ガイド配列および足場）－遠位末端
であり、この場合カッコは、ｐｅｇＲＮＡの様式（例えば、Ｃａｓ９様式またはＣｐｆ１様式）のみならず、プライム編集末端の位置（すなわち、５’末端または３’末端）に応じて、中に記載した２つのセグメントの順序を相互に切り替えできることを示す。ｐｅｇＲＮＡが単一ガイドＲＮＡではなく、１つよりも多いＲＮＡ分子を含むならば、プライム編集末端は、プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型を含有するＲＮＡ分子内でこれらの構成要素により近い末端を指すのに対し、このＲＮＡ分子の反対の末端は遠位末端であることに留意すべきである。ガイド配列は、プライム編集末端および遠位末端を有するＲＮＡ分子とは別個の、ｐｅｇＲＮＡの異なるＲＮＡ分子内にあってもよい。
プライム編集末端－（プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型）－（ガイド配列および足場）－遠位末端
であり、この場合カッコは、ｐｅｇＲＮＡの様式（例えば、Ｃａｓ９様式またはＣｐｆ１様式）のみならず、プライム編集末端の位置（すなわち、５’末端または３’末端）に応じて、中に記載した２つのセグメントの順序を相互に切り替えできることを示す。ｐｅｇＲＮＡが単一ガイドＲＮＡではなく、１つよりも多いＲＮＡ分子を含むならば、プライム編集末端は、プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型を含有するＲＮＡ分子内でこれらの構成要素により近い末端を指すのに対し、このＲＮＡ分子の反対の末端は遠位末端であることに留意すべきである。ガイド配列は、プライム編集末端および遠位末端を有するＲＮＡ分子とは別個の、ｐｅｇＲＮＡの異なるＲＮＡ分子内にあってもよい。
【0032】
ｐｅｇＲＮＡの他の主要構成要素と比べたプライム編集末端の位置を図１６により詳細に示す。図１６Ａおよび１６Ｂに、それぞれ３’末端または５’末端のいずれかにプライム編集末端を有するＣａｓ９様式のｐｅｇＲＮＡの配置を図示する。図１６Ｃおよび１６Ｄに、Ｃｐｆ１様式のｐｅｇＲＮＡについて同じことを図示する。
【0033】
「プライムエディター」は、Ｃａｓタンパク質活性と逆転写酵素活性との両方を有する分子または複数の分子の集合である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はニッカーゼである。一部の実施形態では、プライムエディターは、Ｃａｓタンパク質と逆転写酵素との両方を含む融合タンパク質である。本開示の他の箇所に示すように、プライム編集に逆転写酵素の代わりに他のポリメラーゼを使用することができ、それでプライムエディターは、ＲＴの代わりに逆転写酵素ではないポリメラーゼを含むことがある。種々のバージョンのプライムエディターが開発されており、ＰＥＩ、ＰＥ２、ＰＥ３などと称される。例えば、「ＰＥ２」は、［ＮＬＳ］－［Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）］－［リンカー］－［ＭＭＬＶ＿ＲＴ（Ｄ２００Ｎ）（Ｔ３３０Ｐ）（Ｌ６０３Ｗ）（Ｔ３０６Ｋ）（Ｗ３１３Ｆ）］の構造を有する、Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）ニッカーゼとＭＭＬＶ－ＲＴのバリアントとを含む融合タンパク質（ＰＥ２タンパク質）および所望のｐｅｇＲＮＡを含むＰＥ複合体を指す。「ＰＥ３」は、細胞を標的領域の修復へと刺激するためにＰＥ２タンパク質と複合体を形成し、未編集ＤＮＡ鎖にニックを導入する、第２鎖ニッキングガイドＲＮＡをＰＥ２に加えたものを指し、これは、ゲノムへの編集の組み入れを促進する（Ａｎｚａｌｏｎｅら ２０１９を参照；Ｌｉｕ、Ｗ０２０２０１９１１５３を参照）。
【0034】
「ニッキングガイドＲＮＡ」または「ニッキングｇＲＮＡ」は、必要に応じてプライム編集に追加されて、標的領域内またはその近くで未編集の鎖のニッキングを引き起こすことができるガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡではない）である。このようなニッキングは、関連領域、すなわち標的領域を修復するためにプライム編集が行われる細胞を刺激することを助ける。
【0035】
「融合タンパク質」は、相互に共有結合的に連結している少なくとも２つのペプチド配列（すなわち、アミノ酸配列）を含むタンパク質であり、ここで、当該２つのペプチド配列は自然界で共有結合的に連結していない。２つのペプチド配列は、直接的に（結合が間に入る）または間接的に（リンカーが間に入る、ここでリンカーは、以下に限定されないが第３のペプチド配列を含む任意の化学構造を含むことがある）連結することができる。
【0036】
「伸長テール」は、ｐｅｇＲＮＡなどのガイドＲＮＡの５’末端または３’末端のいずれかに付加することができる１、２、３、４、５、６、７、８、９つ、または１０個のヌクレオチドのヌクレオチドストレッチである。「ポリ（Ｎ）テール」は、同じ核酸塩基、例えばＡ、Ｕ、ＣまたはＴを有する１～１０個のヌクレオチドを含有するホモポリマー伸長テールである。「ポリウリジンテール」または「ポリＵテール」は、１～１０個のウリジンを含有するポリ（Ｎ）テールである。同様に、「ポリＡテール」は１～１０個のアデノシンを含有する。
【0037】
「核酸」、「ヌクレオチド」、または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本、二本、または多重鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）およびそれらのポリマーを指す。この用語は、以下に限定されないが、一本、二本、もしくは多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよび／もしくはピリミジン塩基または他の天然の、化学修飾された、生化学修飾された、非天然の、合成もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの類似体の混合物を含みうる。具体的に限定しない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有する、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドンの置換）、アレル、オーソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、および相補的配列を暗示的に包含するのみならず、明示された配列を包含する。具体的には、縮重コドンの置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基により置換されている配列を生成することによって達成されることがある（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５～２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１～９８（１９９４））。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
【0038】
「ヌクレオチド類似体」または「修飾ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシド（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））の含窒素塩基内／上に、ヌクレオシドの糖部分内／上に（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、六員糖類似体、もしくは開環糖類似体）、またはホスフェートに、１つもしくは複数の化学修飾（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。
【0039】
「遺伝子」または「ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。ＤＮＡセグメントは、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の調節に関与するコード領域に先行および後続する領域（リーダーおよびトレーラー）のみならず、個別のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含むことがある。
【0040】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーのみならず、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用される場合、これらの用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここで、アミノ酸残基は、共有ペプチド結合によって連結されている。
【0041】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはそれらの類似体を指す。本明細書で使用される場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、以下に限定されないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡなどのＤＮＡ分子、およびガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたは合成ＲＮＡなどのＲＮＡ分子を含む。そのうえ、本明細書で使用される場合、これらの用語は、一本鎖および二本鎖形態を含む。
【0042】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズすること」という用語は、完全または部分的に相補性のポリヌクレオチド鎖が適切なハイブリダイゼーション条件で一緒になって、２つの構成鎖が水素結合によってつながった二本鎖構造または領域を形成する過程を指す。本明細書で使用される場合、「部分的ハイブリダイゼーション」という用語は、二本鎖構造または領域が１つまたは複数のバルジまたはミスマッチを含有する場合を含む。水素結合は典型的にアデニンとチミン、またはアデニンとウラシル（それぞれＡおよびＴ、またはＡおよびＵ）またはシトシンとグアニン（ＣおよびＧ）の間で形成するものの、他の非定型の塩基対が形成することがある（例えば、Ａｄａｍｓら、「Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」、第１１版、１９９２を参照されたい）。修飾ヌクレオチドは、非定型的にハイブリダイゼーションを可能にするまたは促進する水素結合を形成しうることが考えられている。
【0043】
「相補性」という用語は、核酸が別の核酸配列と従来のワトソン－クリック型または他の非伝統型のいずれかによって水素結合を形成する能力を指す。相補性パーセントは、第２の核酸配列（例えば、１０個のうちの５、６、７、８、９つ、１０個は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％の相補性である）と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対形成）を形成することができる、核酸分子内の残基のパーセントを示す。「完全に相補性」は、核酸配列のすべての連続残基が第２の核酸配列内の同じ数の連続残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補性」は、本明細書で使用される場合、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、もしくはそれよりも多いヌクレオチドの領域にわたり少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％である相補性の程度を指す、またはストリンジェントな条件でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【0044】
本明細書で使用される場合、配列の「部分」、「セグメント」、「エレメント」、または「断片」という用語は、完全な配列よりも短い、配列の任意の部分（例えば、ヌクレオチド部分配列またはアミノ酸部分配列）を指す。ポリヌクレオチドの部分、セグメント、エレメント、または断片は、１よりも大きな任意の長さ、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００もしくは５００ヌクレオチド長またはそれよりも長いことがある。
【0045】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ヌクレオチドのマルチマーを意味する。例えば、オリゴヌクレオチドは、約２～約２００ヌクレオチド長、最大約５０ヌクレオチド長、最大約１００ヌクレオチド長、最大約５００ヌクレオチド長、または２から５００の間の任意の整数値のヌクレオチド長を有することがある。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３０～３００ヌクレオチド長または３０～４００ヌクレオチド長の範囲でありうる。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー（すなわち、オリゴリボヌクレオチドでありうる）および／またはデオキシリボヌクレオチドモノマーを含有しうる。オリゴヌクレオチドは、１０～２０、２１～３０、３１～４０、４１～５０、５１～６０、６１～７０、７１～８０、８０～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～３５０、または３５０～４００ヌクレオチド長、例えばこれらの範囲の間の任意の整数値でありうる。
【0046】
「組換え発現ベクター」は、宿主細胞において特定のポリヌクレオチド配列の転写を許す一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え的または合成的に生成された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、または核酸断片の一部でありうる。典型的には、発現ベクターは、プロモーターと作動可能に連結された転写すべきポリヌクレオチドを含む。これに関連する「作動可能に連結された」は、コード配列の転写を指示するプロモーターなどのエレメントの適正な生物学的機能が発揮されるような相対位置に置かれた、ポリヌクレオチドコード配列およびプロモーターなどの２つ以上の遺伝エレメントを意味する。「プロモーター」という用語は、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイを指すために本明細書において使用される。本明細書で使用される場合、プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントなどの転写開始部位近くの必要な核酸配列を含む。プロモーターはまた、必要に応じて転写開始部位から数千塩基対ほど離れて位置しうる遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。発現ベクター内に存在しうる他のエレメントには、転写を高めるもの（例えば、エンハンサー）および転写を終止するもの（例えば、ターミネーター）のみならず、発現ベクターから産生された組換えタンパク質に、ある特定の結合親和性または抗原性を付与するものが含まれる。
【0047】
「組換え」は、遺伝的に修飾されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞、組織、または生物を指す。例えば、組換えポリヌクレオチド（または組換えポリヌクレオチドのコピーもしくは相補体）は、周知の方法を使用して操作されたものである。第２のポリヌクレオチド（例えば、コード配列）と作動可能に連結されたプロモーターを含む組換え発現カセットは、ヒトの操作の結果として（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８９）またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１～３巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４～１９９８）に記載された方法により）第２のポリヌクレオチドに対して異種であるプロモーターを含みうる。組換え発現カセット（または発現ベクター）は、典型的には、ポリヌクレオチドを自然界に見出されない組合せで含む。例えば、ヒト操作制限部位またはプラスミドベクター配列は、プロモーターを他の配列と隣接させるまたは他の配列から分離することがある。組換えタンパク質は、組換えポリヌクレオチドから発現されるものであり、組換え細胞、組織、および生物は、組換え配列（ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチド）を含むものである。
【0048】
核酸標的を「編集すること」は、標的のヌクレオチド配列に変化を起こすことを意味する。変化は、単一ヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドそれぞれの挿入、欠失または置換でありうる。複数のヌクレオチドが挿入、欠失または置換される場合、これらのヌクレオチドは、連続的または非連続的でありうる。変化は、上記のいずれかの組合せであってもよい。
【0049】
「一塩基多型」または「ＳＮＰ」という用語は、アレル内を含むポリヌクレオチドに関する単一ヌクレオチドの変化を指す。これは、１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドによる交換のみならず、単一ヌクレオチドの欠失または挿入を含みうる。もっとも典型的には、ＳＮＰはバイアレル型マーカーであるが、トリおよびテトラアレル型マーカーが存在することもある。非限定的な例として、ＳＮＰ Ａ＼Ｃを含む核酸分子は、多型位置にＣまたはＡを含みうる。
【0050】
「初代細胞」という用語は、多細胞生物から直接単離された細胞を指す。初代細胞は、典型的には集団倍加をほとんど経ておらず、したがって、連続（腫瘍または人工的に不死化された）細胞株と比べて、それらが由来する組織の主要機能的構成要素をより大きく代表している。場合によっては、初代細胞は、単離されてから直ちに使用される細胞である。他の場合に、初代細胞は無制限に分裂することができず、したがって、インビトロで長期間培養することができない。
【0051】
細胞培養自体または培養過程を指す場合の「培養する」、「培養すること」、「成長する」、「成長すること」、「維持する」、「維持すること」、「拡大増殖させる」、「拡大増殖させること」などの用語を互換的に使用して、細胞（例えば、初代細胞）がその通常の環境外の制御された条件で、例えば生存に適した条件で維持されることを意味することができる。培養細胞を生存させ、培養することは、細胞の成長、静止、分化または分裂を結果としてもたらすことができる。一部の細胞は自然に死滅または老化しうるので、この用語は培養物中のすべての細胞が生存、成長、または分裂することを意味するわけでない。細胞は、典型的には、培養過程の間に交換することができる培地中で培養される。
【0052】
「対象」、「患者」、および「個体」という用語は、ヒトまたは動物を含むために本明細書において互換的に使用される。例えば、動物対象は、哺乳動物、霊長類の動物（例えば、サル）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、またはヤギ）、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験室試験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、トリ）、獣医学的に意義のある動物、または経済的に意義のある動物でありうる。
【0053】
本明細書で使用される場合、「投与すること」という用語は、対象への経口投与、局所接触、坐剤としての投与、静脈内、腹腔内、筋肉内、病巣内、くも膜下腔内、鼻腔内、または皮下投与を含む。投与は、非経口および経粘膜（例えば、頬間隙、舌下、口蓋、歯肉、経鼻、経腟、直腸、または経皮）を含む任意の経路による。非経口投与は、例えば、静脈内、筋肉内、細動脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内を含む。他の送達様式は、以下に限定されないが、リポソーム製剤の使用、静脈内注入、経皮パッチなどを含む。
【0054】
「処置すること」という用語は、以下に限定されないが、治療的利益および／または予防的利益を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチを指す。治療的利益によって、処置されている１つまたは複数の疾患、状態、または症状に対する任意の治療的に意義のある改善または効果が意味される。予防的利益のために、組成物は、特定の疾患、状態、もしくは症状を発生する危険のある対象に、または疾患の生理学的症状のうちの１つもしくは複数を報告している対象に、たとえ疾患、状態、または症状がまだ出現していないことがあるにしても投与されうる。
【0055】
「有効量」または「十分な量」という用語は、有益なまたは所望の結果を引き起こすのに十分な薬剤（例えば、Ｃａｓタンパク質、修飾ｇＲＮＡ／ｐｅｇＲＮＡなど）の量を指す。治療有効量は、当業者が容易に決定できる、処置されている対象および病状、対象の体重および年齢、病状の重症度、投与方式などのうちの１つまたは複数に応じて変動しうる。特定の量は、選ばれた特定の薬剤、標的細胞の型、対象内の標的細胞の位置、従うべき投薬レジメン、それが他の薬剤と組み合わせて投与されるか、投与のタイミング、およびそれが運搬される物理送達システムのうちの１つまたは複数に応じて変動しうる。
【0056】
本明細書に開示される場合、いくつかの値の範囲が提供される。その範囲の上限と下限との間の各介在値もまた具体的に考えられることが理解されている。述べられた範囲によって包含される各々のより小さな範囲または介在値もまた、具体的に考えられる。「約」という用語は、一般的に、表示された数の±１０％を指す。例えば、「約１０％」は、９％～１１％の範囲を示すことがあり、「約２０」は、１８～２２を意味しうる。丸めることなどの「約」の他の意味は、文脈から明らかなことがあり、それで例えば「約１」は０．５～１．４も意味することがある。
【0057】
いくつかの化学修飾ヌクレオチドが本明細書に記載される。ＭＳ、ＭＰ、およびＭＳＰの各々が、対応する修飾または対応する修飾を含むヌクレオチドを意味できることに留意されたい。以下の略語を関連する文脈で使用するものとする。
【0058】
「ＰＡＣＥ」：ホスホノアセテート
【0059】
「ＭＳ」：２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート
【0060】
「ＭＰ」：２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート
【0061】
「ＭＳＰ」：２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノアセテート
【0062】
「２’－ＭＯＥ」：２’－Ｏ－メトキシエチル
【0063】
用語の他の定義は、本明細書の全体にわたり出現することがある。
【0064】
近年、ＣＲＩＳＰＲベース技術は、潜在的に革新的な治療法として登場した（例えば、遺伝的欠陥を修正するため）。しかし、ＣＲＩＳＰＲシステムの使用は、実用上の問題のせいで限られている。特に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成要素のインビボ送達のためにガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を安定化する方法の必要性がある。以前の研究は、化学修飾ヌクレオチドを有するｇＲＮＡの使用を研究していた。しかし、従来のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の構造は、プライム編集ｇＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）と顕著に異なり、本開示の前にｐｅｇＲＮＡの化学修飾がその活性にどのように影響するかは不明であった。特に、ｐｅｇＲＮＡは、典型的なｇＲＮＡ（すなわち、逆転写酵素の鋳型配列およびプライマー結合部位配列）と比較してそれらのプライム編集末端に追加的な配列を含有し、ｐｅｇＲＮＡのプライム編集末端は、他のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおける典型的なｇＲＮＡの対応する末端と異なる機能を果たす。したがって、ｐｅｇＲＮＡのプライム編集末端でのヌクレオチドの化学修飾は、プライマー結合部位配列（ＤＮＡ標的部位のニック入りの鎖とハイブリダイズし、それにより、逆転写酵素は結果として生じたＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖を、ニック入りの部位でのニック入りの鎖の３’末端からのプライマー伸長のために許容される基質として認識する）または逆転写酵素の鋳型配列（上記のプライマー伸長において鋳型として役立つ）の役割を妨害する潜在性を有する。
【0065】
この理解に基づき、ＲＮＡ：ＤＮＡプライマー二重鎖のＲＮＡセグメントにおけるＭＳ、ＭＳＰおよびＭＰなどの化学修飾がこの二重鎖に対する逆転写酵素の親和性を妨害または低減し、したがって、プライム編集活性を低減または無効にしうることが予期される。そのうえ、修飾ヌクレオチド（例えばＭＳ、ＭＳＰまたはＭＰによる）の位置および／または位置の組合せは、プライム編集における逆転写酵素の機能を妨害し、したがって、プライム編集活性を低減すると予期されうる。ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖と、その逆転写酵素がプライム編集に通常利用されるモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）の近縁である異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス由来逆転写酵素の二重鎖複合体化ポリペプチド断片の部分との複合体の公表された共結晶構造は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖の３’末端と相互作用する逆転写酵素の部分を欠如しており（Ｎｏｗａｋら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３、３８７４～３８８７）、プライム編集においてｐｅｇＲＮＡのプライム編集末端で重要でありうるＲＮＡ－タンパク質接触に関する情報の欠如を当技術分野に残している。
【0066】
本開示は、一部には、ＭＳまたはＭＰ修飾がプライム編集活性を高めることができるという驚くべき発見に基づく。下記にさらに詳細に述べるように、典型的に約１２０～１５０ｎｔ長（それよりも長いときもある）の範囲である化学合成されたｐｅｇＲＮＡの様々な設計（５’－ガイド配列－足場－逆転写酵素の鋳型－プライマー結合部位－３’の配置を有する）を培養ヒト細胞中にプライムエディターｍＲＮＡと共トランスフェクトした。ｐｅｇＲＮＡの３’末端でのホスホリボースにＭＳまたはＭＰ修飾を付加した場合に高いプライム編集活性が観察された。顕著には、ＭＰによるプライム編集の高まりが、ＭＳによるものと異なる別個の傾向に従うことが見出された。一部の態様では、プライマー結合セグメントの３’末端に組み込まれ、ｐｅｇＲＮＡがポリＵテールなどの３’伸長の付加を含有しない場合に、ＭＰ修飾は驚くことにより高いレベルの強化を提供した。対照的に、どちらの末端設計の３’末端でも、すなわちｐｅｇＲＮＡの３’末端のプライマー結合セグメントの３’末端、またはｐｅｇＲＮＡの３’末端のプライマー結合セグメントの下流に付加されたポリＵテールの３’末端でも、ＭＳ修飾は結果として実質的な高まりをもたらした（下記参照）。
【0067】
例示的な合成ｐｅｇＲＮＡを下の表１および２に示す。５’および３’末端修飾は、標的遺伝子も示す各合成ｐｅｇＲＮＡの名前の中に表示される。例えば、「ＥＭＸ１－ｐｅｇ－３ｘＭＳ，３ｘＭＰ」は、ｐｅｇＲＮＡの５’末端に３つのＭＳ修飾および３’末端に３つのＭＰ修飾を有するＥＭＸ１遺伝子についてのｐｅｇＲＮＡを指す。修飾の正確な位置は、表１に示される配列に下線を付けることによって表示される。ｐｅｇＲＮＡの設計のいくつかは、ｐｅｇＲＮＡ名の中の「＋３’ＵＵ」、「＋３’ＵＵＵ」、または「＋３’ＵＵＵＵ」によって示されるように３’末端に付加された短いポリウリジン区域（すなわち、ポリＵテール）を有する。
【0068】
【表1】
【0069】
【表2】
【0070】
図２および３ならびに下記実施例によって実証されるように、ｐｅｇＲＮＡの３’末端での化学修飾の使用は、プライムエディターを有する合成ｐｅｇＲＮＡの有効性を（３’末端が未修飾のｐｅｇＲＮＡと比較して）実質的に改善する。文献に本来報告されたように、ＤＮＡベクターをトランスフェクトされた細胞内でｐｅｇＲＮＡおよびプライムエディターが構成的に発現される場合の持続的編集活性とは対照的に（Ａｎｚａｌｏｎｅら ２０１９参照）、プライム編集のために合成ｐｅｇＲＮＡを使用することは、編集活性の持続時間を限定することを目指す場合に好ましい可能性がある。本開示は、ｐｅｇＲＮＡのプライム編集末端に少なくとも２つのＭＰ修飾を組み込むことなどの、ｐｅｇＲＮＡ配列内のある特定の化学修飾およびある特定のヌクレオチド位置が、特に有利でありうるとさらに実証している。特に、ＭＰは、３’末端にポリＵテールを付加しなくても有意な効果を有する。ｐｅｇＲＮＡなどの長鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは化学合成が容易でなく、任意の１つのヌクレオチドを追加すること（１つの追加的な合成サイクルを意味する）は、完全長ＲＮＡの収率を有意に低減する。したがって、３’末端または任意の他の場所に余分なヌクレオチド（ポリＵテールなど）を必要としない修飾ｐｅｇＲＮＡは、非常に有用である。また、本明細書に記載されるＭＰ、ＭＳまたは様々な他の修飾を有するオリゴヌクレオチドを酵素的転写によって製造することはできない。
【0071】
ＭＰの有意な効果は、ＭＰがガイドＲＮＡの半減期を増大させたという本発明者らの発見と一致する。実施例２およびＲｙａｎら「Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｆｏｒ Ｃａｓ９ Ｅｄｉｔｏｒｓ．」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０２２）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｌｃ００７６８に記載されるように、３’末端により大きな数のＭＰ修飾を有するガイドＲＮＡはより少ないＭＰを有するガイドＲＮＡよりも安定であるのに対し、同じ位置にＭＳ修飾を有するガイドＲＮＡは、ＭＰ含有対応物ほど安定ではない。
【0072】
一部の態様では、本明細書に記載される３’または５’末端修飾は、必要に応じて、ガイド配列または足場における修飾などのガイドＲＮＡにおける他の修飾と組み合わされることがある。例えば、米国特許第１０，７６７，１７５号は、標的特異性を増大させる修飾を教示している。したがって、例として、３’末端のプライマー結合セグメントで終止する（かつ下流のポリＵテールを３’末端に付加せずに）ｐｅｇＲＮＡ鎖上の連続する３’末端ホスホリボースに少なくとも２つのＭＰ修飾を組み込むことは、ｐｅｇＲＮＡのヌクレオチド２０個のガイド配列部分における位置５または１１でのＭＰまたは他の修飾と組み合わせられることがある。
【0073】
化学修飾は、所望の配列についてのアミダイトカップリングの選択サイクルで化学修飾ホスホロアミダイトを使用することによってｇＲＮＡの化学合成の間に組み込まれることがある。合成された後、化学修飾ｇＲＮＡは、遺伝子編集のための未修飾ｇＲＮＡと同じように使用される。一部の態様では、化学修飾合成ｇＲＮＡは、トランスフェクトされた細胞においてプライムエディターを発現するＣａｓ ｍＲＮＡと共トランスフェクトされることがある。本明細書に提供されるデータによって実証されるように、ｐｅｇＲＮＡ、プライムエディターｍＲＮＡ、および／または追加的なｇＲＮＡが電気穿孔、リポフェクションによって、またはそれらをチャージされたナノ粒子への生きた細胞もしくは組織の曝露によって導入された場合、化学修飾は、トランスフェクトされた細胞におけるｐｅｇＲＮＡの活性を高める。
【0074】
Ａ．例示的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
ゲノム修飾のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）またはそのバリアントもしくは断片と、標的ゲノムＤＮＡをＣａｓタンパク質の標的とするガイド配列およびＣａｓタンパク質と相互作用する足場配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含有するＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｇＲＮＡ）と、必要に応じてドナー修復鋳型とを含む。場合によっては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｄ８３９Ａ、およびＨ８６３Ａの変異のうちの１つまたは複数を含有するＣａｓ９変異体などのＣａｓタンパク質のバリアント、またはＣａｓ９ニッカーゼを使用することができる。他の場合には、所望の特性を有する（例えば、一本鎖または二本鎖切断を生成できる）Ｃａｓタンパク質の断片またはそのバリアントを使用することができる。ドナー修復鋳型は、蛍光タンパク質または抗生物質耐性マーカーなどのレポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、標的ＤＮＡと相同で遺伝子修飾部位に隣接する相同アームとを含みうる。または、ドナー修復鋳型は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）でありうる。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムは、プライムエディターとして作用できるＣａｓタンパク質（例えば、逆転写酵素タンパク質またはそのドメインと融合された、ニッカーゼ活性を示すＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質）を含みうる。プライムエディターは、プライム編集と称される過程によって標的核酸の配列を修飾するために、標的核酸の配列への１つまたは複数の編集を含有する逆転写酵素の鋳型を組み入れているｐｅｇＲＮＡと共に使用されることがある。
ゲノム修飾のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）またはそのバリアントもしくは断片と、標的ゲノムＤＮＡをＣａｓタンパク質の標的とするガイド配列およびＣａｓタンパク質と相互作用する足場配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含有するＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｇＲＮＡ）と、必要に応じてドナー修復鋳型とを含む。場合によっては、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｄ８３９Ａ、およびＨ８６３Ａの変異のうちの１つまたは複数を含有するＣａｓ９変異体などのＣａｓタンパク質のバリアント、またはＣａｓ９ニッカーゼを使用することができる。他の場合には、所望の特性を有する（例えば、一本鎖または二本鎖切断を生成できる）Ｃａｓタンパク質の断片またはそのバリアントを使用することができる。ドナー修復鋳型は、蛍光タンパク質または抗生物質耐性マーカーなどのレポーターポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、標的ＤＮＡと相同で遺伝子修飾部位に隣接する相同アームとを含みうる。または、ドナー修復鋳型は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）でありうる。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳシステムは、プライムエディターとして作用できるＣａｓタンパク質（例えば、逆転写酵素タンパク質またはそのドメインと融合された、ニッカーゼ活性を示すＣａｓタンパク質を含む融合タンパク質）を含みうる。プライムエディターは、プライム編集と称される過程によって標的核酸の配列を修飾するために、標的核酸の配列への１つまたは複数の編集を含有する逆転写酵素の鋳型を組み入れているｐｅｇＲＮＡと共に使用されることがある。
【0075】
１．Ｃａｓタンパク質およびそのバリアント
ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼシステムが細菌において発見されたが、ゲノム編集のために真核細胞（例えば哺乳類）において使用されている。これは、多くの細菌微生物および古細菌の適応免疫応答の部分に基づく。ウイルスまたはプラスミドが微生物に侵入した場合、侵入体のＤＮＡのセグメントが微生物ゲノム内のＣＲＩＳＰＲ座位（または「ＣＲＩＳＰＲアレイ」）に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ座位の発現は、ノンコーディングＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を産生する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、次いでｃｒＲＮＡが部分相補性領域を介してｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質を、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡ内のｃｒＲＮＡと相同な領域へと導く。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有されるヌクレオチド２０個のガイド配列によって特定される部位の二本鎖切断に平滑末端を生成する。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質は、部位特異的なＤＮＡ認識および切断のためにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。このシステムは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて一つの分子（一本鎖ガイドＲＮＡまたは「ｓｇＲＮＡ」）にできるように操作されている（例えば、Ｊｉｎｅｋら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７：８１６～８２１；Ｊｉｎｅｋら（２０１３）ｅＬｉｆｅ、２：ｅ００４７１；Ｓｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ、２：ｅ００５６３を参照されたい）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを操作して、細胞ゲノム内の所望の標的に二本鎖切断を生成し、誘導された切断を相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復する細胞内因性メカニズムを利用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ（クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）ヌクレアーゼシステムが細菌において発見されたが、ゲノム編集のために真核細胞（例えば哺乳類）において使用されている。これは、多くの細菌微生物および古細菌の適応免疫応答の部分に基づく。ウイルスまたはプラスミドが微生物に侵入した場合、侵入体のＤＮＡのセグメントが微生物ゲノム内のＣＲＩＳＰＲ座位（または「ＣＲＩＳＰＲアレイ」）に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ座位の発現は、ノンコーディングＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を産生する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、次いでｃｒＲＮＡが部分相補性領域を介してｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる別の種類のＲＮＡと会合して、Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質を、「プロトスペーサー」と呼ばれる標的ＤＮＡ内のｃｒＲＮＡと相同な領域へと導く。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質は、ＤＮＡを切断して、ｃｒＲＮＡ転写物内に含有されるヌクレオチド２０個のガイド配列によって特定される部位の二本鎖切断に平滑末端を生成する。Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）タンパク質は、部位特異的なＤＮＡ認識および切断のためにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方を必要とする。このシステムは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを組み合わせて一つの分子（一本鎖ガイドＲＮＡまたは「ｓｇＲＮＡ」）にできるように操作されている（例えば、Ｊｉｎｅｋら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３７：８１６～８２１；Ｊｉｎｅｋら（２０１３）ｅＬｉｆｅ、２：ｅ００４７１；Ｓｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ、２：ｅ００５６３を参照されたい）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを操作して、細胞ゲノム内の所望の標的に二本鎖切断を生成し、誘導された切断を相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復する細胞内因性メカニズムを利用することができる。
【0076】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＤＮＡ切断活性を有する。Ｃａｓタンパク質は、標的ＤＮＡ配列内の位置に一方または両方の鎖の切断を指示することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、標的ＤＮＡ配列の一本鎖を切断する１つまたは複数の不活性化触媒ドメインを有するニッカーゼでありうる（例えば、プライムエディターＣａｓタンパク質の場合と同様）。
【0077】
Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１１、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、ＣａｓΦ、ＣａｓＸ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｐｆ１、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、それらのホモログ、それらのバリアント、それらの断片、それらの変異体、およびそれらの誘導体が含まれる。少なくとも６つの型のＣａｓタンパク質（Ｉ～ＶＩ型）、および少なくとも３３個の亜型がある（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０２０、１８：２、６７～８３を参照されたい）。ＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃｓｎ２、およびＣａｓ９を含む。Ｃａｓタンパク質は、当業者に公知である。例えば、化膿性連鎖球菌野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ＮＢＣＩ参照配列番号ＮＰ＿２６９２１５に示され、ストレプトコッカス サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ＮＢＣＩ参照配列番号ＷＰ０１１６８１４７０に示される。本開示の態様に有用なＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、例えば、米国特許第９，２６７，１３５号；同第９，７４５，６１０号；および同第１０，２６６，８５０号に開示されている。
【0078】
Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９ポリペプチドは、以下に限定されないが、ベイロネラ アティピカル（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ａｔｙｐｉｃａｌ）、フソバクテリウム ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、フィリファクター アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ ａｌｏｃｉｓ）、ソロバクテリウム モーレイ（Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｏｒｅｉ）、コプロコッカス カタス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｔｕｓ）、トレポネーマ デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ペプトニフィルス デューデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、カテニバクテリウム ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｔｓｕｏｋａｉ）、ストレプトコッカス ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、リステリア イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、スタフィロコッカス シューディンテルメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、アシダミノコッカス インテスティン（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、オルセネラ ウリ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ ｕｌｉ）、オエノコッカス キタハラエ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ ｋｉｔａｈａｒａｅ）、ビフィドバクテリウム ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ラクトバシルス ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバシルス ガゼリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、フィネゴルディア マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、マイコプラズマ モビレ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍｏｂｉｌｅ）、マイコプラズマ ガリセプティカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ オビニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｏｖｉｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ カニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｃａｎｉｓ）、マイコプラズマ シノビエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ）、ユーバクテリウム レクタレ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ）、ストレプトコッカス サーモフィルス、ユーバクテリウム ドリカム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ラクトバシルス コリニフォルミス亜種トルケンス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｔｏｒｑｕｅｎｓ）、イリオバクター ポリトロプス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、ルミノコッカス アルブス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｕｓ）、アッケルマンシア ムチニフィリア（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）、アシドテルムス セルロリティカス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム デンティウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｎｔｉｕｍ）、コリネバクテリウム ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、エルシミクロビウム ミヌタム（Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｍｉｎｕｔｕｍ）、ニトラティフラクター サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、スフェロキエータ グロブス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、フィブロバクター スクシノゲネス亜種スクシノゲネス（Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ ｓｕｂｓｐ．Ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バクテロイデス カプノサイトファーガ オクラセア（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ）、ロドシュードモナス パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、プレボテラ ミカンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｉｃａｎｓ）、プレボテラ ルミニコラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌａ）、フラボバクテリウム コルムナレ（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｌｕｍｎａｒｅ）、アミノモナス ポーシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、ロドスピリルム ルブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、カンジデーテス プニセイスピリルム マリヌム（Ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、ベルミネフロバクター アイゼニエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）、ラルストニア シジギイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ディノロセオバクター シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ニトロバクター ハンブルゲンシス（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ウォリネラ スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター ジェジュニ亜種ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｓｕｂｓｐ．Ｊｅｊｕｎｉ）、ヘリコバクター ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、バシルス セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、アシドボラックス エブレウス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｅｂｒｅｕｓ）、クロストリジウム パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、パルビバキュラム ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ロセブリア インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ナイセリア メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、パスツレラ ムルトシダ亜種ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｓｕｂｓｐ．Ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、スッテレラワズウォルテンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、プロテオバクテリア（ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、パラスッテレラ エクスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ウォリネラ サクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、およびフランシセラ ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）を含む多様な細菌種に由来しうる。
【0079】
「Ｃａｓ９」は、ＲＮＡガイド二本鎖ＤＮＡ結合性ヌクレアーゼタンパク質またはニッカーゼタンパク質を指す。野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、異なるＤＮＡ鎖を切断する２つの機能的ドメイン、例えばＲｕｖＣおよびＨＮＨを有する。Ｃａｓ９は、両方の機能的ドメインが活性の場合にゲノムＤＮＡ（標的ＤＮＡ）に二本鎖切断を導入することができる。Ｃａｓ９酵素は、コリネバクター（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、スッテレラ（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロキエータ（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリルム（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロセブリア（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバキュルム（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ニトラティフラクター（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、およびカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）からなる群に属する細菌に由来するＣａｓ９タンパク質の１つまたは複数の触媒ドメインを含みうる。一部の実施形態では、２つの触媒ドメインは、異なる細菌種に由来する。
【0080】
Ｃａｓ９タンパク質の有用なバリアントは、両方ともニッカーゼであるＲｕｖＣまたはＨＮＨ酵素などの単一の不活性触媒ドメインを含みうる。このようなＣａｓタンパク質は、例えばプライム編集の状況で有用である。Ｃａｓ９ニッカーゼは、１つの機能的ドメインだけを有し、標的ＤＮＡの一本鎖だけを切断し、それにより、一本鎖切断またはニックを生成することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、少なくともＤ１０Ａ変異を有する変異型Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、かつＣａｓ９ニッカーゼである。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、少なくともＨ８４０Ａ変異を有する変異型Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり、かつＣａｓ９ニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼに存在する変異の他の例は、以下に限定されないが、Ｎ８５４ＡおよびＮ８６３Ａを含む。二本鎖切断は、向かい合うＤＮＡ鎖を標的とする少なくとも２つのＤＮＡ標的化ＲＮＡを使用する場合にＣａｓ９ニッカーゼを使用して導入することができる。ずれた二重ニック導入二本鎖切断はＮＨＥＪまたはＨＤＲによって修復することができる（Ｒａｎら、２０１３、Ｃｅｌｌ、１５４：１３８０～１３８９；Ａｎｚａｌｏｎｅら Ｎａｔｕｒｅ ５７６：７７８５、２０１９、１４９～１５）。この遺伝子編集戦略は、ＨＤＲに有利であり、副産物としてのインデル変異の頻度を減少させる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼの非限定的な例は、例えば、米国特許第８，８９５，３０８号；同第８，８８９，４１８号；同第８，８６５，４０６号；同第９，２６７，１３５号；および同第９，７３８，９０８号；ならびに米国特許出願公開第２０１４／０１８６９１９号に記載されている。Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼは、標的細胞または標的生物のためにコドン最適化することができる。
【0081】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ｄＣａｓ９と称される、ＲｕｖＣｌおよびＨＮＨヌクレアーゼドメインの２つのサイレンシング変異（Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ）を含有するＣａｓ９ポリペプチドでありうる（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２、３３７：８１６～８２１；Ｑｉら、Ｃｅｌｌ、１５２（５）：１１７３～１１８３）。一実施形態では、化膿性連鎖球菌由来のｄＣａｓ９ポリペプチドは、位置Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、Ａ９８７またはそれらの任意の組合せに少なくとも１つの変異を含む。このようなｄＣａｓ９ポリペプチドおよびそのバリアントの説明は、例えば、国際特許公報番号ＷＯ２０１３／１７６７７２に提供されている。ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｈ９８３またはＤ９８６での変異のみならず、Ｈ８４０またはＮ８６３での変異を含有しうる。場合によっては、ｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ変異を含有する。また、ｄＣａｓ９酵素は、Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０Ｙ、またはＨ８４０Ｎを含みうる。一部の実施形態では、本開示の態様に使用されるｄＣａｓ９酵素は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｙ；Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ｎ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ；Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ｙ；またはＤ１０ＮおよびＨ８４０Ｎ置換を含む。置換は、Ｃａｓ９ポリペプチドを触媒的に不活性にし、標的ＤＮＡと結合できるようにするための保存的または非保存的置換でありうる。
【0082】
ｄＣａｓ９ポリペプチドは触媒的に不活性であり、ヌクレアーゼ活性を欠如する。場合によっては、ｄＣａｓ９酵素またはそのバリアントもしくは断片は、標的配列の転写を遮断し、場合によってはＲＮＡポリメラーゼを遮断することができる。他の例では、ｄＣａｓ９酵素またはそのバリアントもしくは断片は、標的配列、例えば転写アクティベーターポリペプチドと融合した場合に、標的配列の転写を活性化することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはタンパク質バリアントは、１つまたは複数のＮＬＳ配列を含む。
【0083】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に存在する。場合によっては、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス構築物、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物などである。例えば、ウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルスなどに基づきうる。レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、およびレトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、乳がんウイルスなどに由来するベクターに基づきうる。有用な発現ベクターは、当業者に公知であり、多くが市販されている。真核生物宿主細胞のための例として、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０のベクターが提供される。しかし、宿主細胞と適合するならば任意の他のベクターを使用してもよい。
【0084】
Ｃａｓタンパク質、逆転写酵素、またはＣａｓタンパク質および逆転写酵素を含む融合タンパク質などのポリペプチドに関する実施形態のいずれかは、ポリペプチド内に１つまたは複数の核移行シグナル（ＮＬＳ）配列を含むことがある。
【0085】
使用される標的細胞／発現系に応じて、プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含むいくつかの転写および翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターに使用されることがある。有用なプロモーターは、ウイルス、または任意の生物、例えば、原核生物もしくは真核生物から導出されうる。適切なプロモーターには、以下に限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳がんウイルス長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６核内低分子プロモーター（Ｕ６）、強化（ｅｎｈａｎｃｅｄ）Ｕ６プロモーター、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などが含まれる。
【0086】
Ｃａｓタンパク質およびそのバリアントまたは断片は、Ｃａｓポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片、Ｃａｓポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓポリペプチドまたはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターとして、細胞（例えば、エクスビボ療法のための初代細胞などのインビトロ細胞または患者内などのインビボ細胞）内に導入することができる。
【0087】
２．化学修飾ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）
ゲノム修飾のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに使用するための修飾されたｇＲＮＡは、典型的に、標的核酸配列と相補的なガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場配列とを含む。本開示は、対応する未修飾ｐｅｇＲＮＡと比較して増大した活性、安定性、特異性、および／または減少した毒性（例えば免疫原性）を有する修飾ｐｅｇＲＮＡを提供する。先行技術に勝る修飾ｐｅｇＲＮＡの利点は、以下に限定されないが、初代細胞などの標的細胞への送達がより容易なことのみならず、安定性の増大、活性持続時間の増大、および／または標的細胞における毒性の低減を含みうる。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一部としての修飾ｐｅｇＲＮＡの使用は、他のシステムと比較してより高い頻度のオンターゲット遺伝子編集を提供する。他の例では、修飾ｐｅｇＲＮＡは、それらの未修飾配列等価物と比較して改善された活性および／または特異性を提供する。
ゲノム修飾のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに使用するための修飾されたｇＲＮＡは、典型的に、標的核酸配列と相補的なガイド配列と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する足場配列とを含む。本開示は、対応する未修飾ｐｅｇＲＮＡと比較して増大した活性、安定性、特異性、および／または減少した毒性（例えば免疫原性）を有する修飾ｐｅｇＲＮＡを提供する。先行技術に勝る修飾ｐｅｇＲＮＡの利点は、以下に限定されないが、初代細胞などの標的細胞への送達がより容易なことのみならず、安定性の増大、活性持続時間の増大、および／または標的細胞における毒性の低減を含みうる。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一部としての修飾ｐｅｇＲＮＡの使用は、他のシステムと比較してより高い頻度のオンターゲット遺伝子編集を提供する。他の例では、修飾ｐｅｇＲＮＡは、それらの未修飾配列等価物と比較して改善された活性および／または特異性を提供する。
【0088】
場合によっては、修飾ｐｅｇＲＮＡは、細胞（例えば、エクスビボ療法のための初代細胞などのインビトロ細胞または患者内などのインビボ細胞）内に導入する前にＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片と複合体化されてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）ベースの送達システムを形成する。他の例では、修飾ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡと共に細胞（例えば、エクスビボ療法のための初代細胞などのインビトロ細胞または患者内などのインビボ細胞）内に導入される。さらに他の例では、修飾ｇＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターと共に細胞（例えば、エクスビボ療法のための初代細胞などのインビトロ細胞または患者内などのインビボ細胞）内に導入される。
【0089】
修飾ｐｅｇＲＮＡのガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列との配列特異的結合を指示するのに十分な相補性を標的ポリヌクレオチド配列（例えば、標的ＤＮＡ配列）と有する任意のポリヌクレオチド配列でありうる。一部の実施形態では、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントされた場合、修飾ｐｅｇＲＮＡのガイド配列とその対応する標的配列との相補性の程度は、約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくはそれ以上である、または約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、もしくはそれ以上よりも大きい。最適なアライメントは、配列をアライメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定されることがあり、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えばＢｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒアライナー）、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで利用可能）、およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで利用可能）が含まれる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長、またはそれよりも長い。場合によっては、ガイド配列は約２０ヌクレオチド長である。他の例では、ガイド配列は約１５ヌクレオチド長である。他の例では、ガイド配列は約２５ヌクレオチド長である。ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列との配列特異的結合を指示する能力は、任意の適切なアッセイによって評価されることがある。例えば、被験ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成要素をコードするベクターのトランスフェクションに続く、標的配列内の優先的な切断または編集の評価などにより、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供されることがある。同様に、標的配列と、被験ガイド配列および被験ガイド配列と異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成要素とを提供し、試験ガイド配列反応物と対照ガイド配列反応物の間で標的配列での結合または切断速度を比較することによって、標的ポリヌクレオチド配列の切断が試験管内で評価されることがある。
【0090】
修飾ｐｅｇＲＮＡのヌクレオチド配列は、上記のウェブベースのソフトウェアのいずれかを使用して選択することができる。ＤＮＡ標的化ＲＮＡを選択するための考慮は、使用すべきＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）についてのＰＡＭ配列、およびオフターゲット修飾を最小化するための戦略を含む。ＣＲＩＳＰＲ設計ツールなどのツールは、修飾ｇＲＮＡを調製するため、標的修飾効率を判定するため、および／またはオフターゲット部位での切断を判定するための配列を提供することができる。修飾ｐｅｇＲＮＡの配列を選択するための別の考慮は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減することを含む。二次構造は、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定されることがある。一部のプログラムは、最小Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーを計算することに基づく。適切なアルゴリズムの例には、ｍＦｏｌｄ（ＺｕｋｅｒおよびＳｔｉｅｇｌｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、９（１９８１）、１３３～１４８）、ＵＮＡＦｏｌｄパッケージ（Ｍａｒｋｈａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２００８、４５３：３～３１）およびＶｉｅｎｎａＲＮＡパッケージからのＲＮＡｆｏｌｄが含まれる。
【0091】
修飾ｐｅｇＲＮＡのガイド配列の１つもしくは複数のヌクレオチドおよび／または足場配列の１つもしくは複数のヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドでありうる。例えば、約２０ヌクレオチド長のガイド配列は、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを有することがある。場合によっては、ガイド配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを含む。他の例では、ガイド配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、ガイド配列の任意の核酸位置に位置することがある。言い換えると、修飾ヌクレオチドは、ガイド配列の第１および／もしくは最後のヌクレオチドもしくはその近く、ならびに／またはそれらの間の任意の位置にありうる。例えば、２０ヌクレオチド長であるガイド配列について、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、ガイド配列の核酸位置１、位置２、位置３、位置４、位置５、位置６、位置７、位置８、位置９、位置１０、位置１１、位置１２、位置１３、位置１４、位置１５、位置１６、位置１７、位置１８、位置１９、および／または位置２０に位置しうる。場合によっては、ガイド配列の約１０％～約３０％、例えば、約１０％～約２５％、約１０％～約２０％、約１０％～約１５％、約１５％～約３０％、約２０％～約３０％、または約２５％～約３０％が修飾ヌクレオチドを含むことがある。他の例では、ガイド配列の約１０％～約３０％、例えば、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、または約３０％が修飾ヌクレオチドを含むことがある。
【0092】
一部の実施形態では、修飾ｐｅｇＲＮＡの足場配列は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含有する。例えば、約８０ヌクレオチド長の足場配列は、１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、７６、７７、７８、７９、８０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを有することがある。場合によっては、足場配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを含む。他の例では、足場配列は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１９、２０個、またはそれよりも多い修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、足場配列の任意の核酸位置に位置することがある。例えば、修飾ヌクレオチドは、足場配列の第１および／もしくは最後のヌクレオチドもしくはその近く、ならびに／またはそれらの間の任意の位置にありうる。例えば、約８０ヌクレオチド長である足場配列について、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、配列の核酸位置１、位置２、位置３、位置４、位置５、位置６、位置７、位置８、位置９、位置１０、位置１１、位置１２、位置１３、位置１４、位置１５、位置１６、位置１７、位置１８、位置１９、位置２０、位置２１、位置２２、位置２３、位置２４、位置２５、位置２６、位置２７、位置２８、位置２９、位置３０、位置３１、位置３２、位置３３、位置３４、位置３５、位置３６、位置３７、位置３８、位置３９、位置４０、位置４１、位置４２、位置４３、位置４４、位置４５、位置４６、位置４７、位置４８、位置４９、位置５０、位置５１、位置５２、位置５３、位置５４、位置５５、位置５６、位置５７、位置５８、位置５９、位置６０、位置６１、位置６２、位置６３、位置６４、位置６５、位置６６、位置６７、位置６８、位置６９、位置７０、位置７１、位置７２、位置７３、位置７４、位置７５、位置７６、位置７７、位置７８、位置７９、および／または位置８０に位置しうる。場合によっては、足場配列の約１％～約１０％、例えば、約１％～約８％、約１％～約５％、約５％～約１０％、または約３％～約７％が修飾ヌクレオチドを含むことがある。他の例では、足場配列の約１％～約１０％、例えば、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％が修飾ヌクレオチドを含むことがある。
【0093】
ｐｅｇＲＮＡの修飾ヌクレオチドは、リボース（例えば、糖）基、リン酸基、核酸塩基、またはそれらの任意の組合せに修飾を含むことがある。一部の実施形態では、リボース基における修飾は、リボースの２’位に修飾を含む。
【0094】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、２’フルオロ－アラビノ核酸、トリサイクル（ｔｒｉｃｙｃｌｅ）－ＤＮＡ（ｔｃ－ＤＮＡ）、ペプチド核酸、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ゼノ核酸（ＸＮＡ）、ホスホジアミデートモルホリノ、またはそれらの組合せを含む。
【0095】
修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、糖修飾および／または骨格修飾リボヌクレオチド（すなわち、リン酸－糖骨格への修飾を含む）を含むことがある。例えば、ネイティブまたは天然のＲＮＡのホスホジエステル連結は、窒素または硫黄ヘテロ原子のうちの少なくとも１つを含むように修飾されることがある。いくつかの骨格修飾されたリボヌクレオチドのうち、隣接リボヌクレオチドを接続しているホスホエステル基は、修飾基、例えば、ホスホロチオエート基によって置き換えられることがある。好ましい糖修飾リボヌクレオチドでは、２’部分は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２またはＯＮから選択される基であり、ここで、Ｒは、Ｃ１－Ｃ６アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩである。
【0096】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオチドは糖修飾を含有する。糖修飾の非限定的な例には、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミンオリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン－５’－三リン酸、２’－メチルウリジン－５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびそれらの異性体（２’－アラシチジン－５’－三リン酸、２’－アラウリジン－５’－三リン酸）、アジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸）、およびそれらの組合せが含まれる。
【0097】
一部の実施形態では、修飾ｐｅｇＲＮＡは、１つまたは複数の２’－フルオロ、２’－アミノおよび／または２’－チオ修飾を含有する。場合によっては、修飾は、２’－フルオロ－シチジン、２’－フルオロ－ウリジン、２’－フルオロ－アデノシン、２’－フルオロ－グアノシン、２’－アミノ－シチジン、２’－アミノ－ウリジン、２’－アミノ－アデノシン、２’－アミノ－グアノシン、２，６－ジアミノプリン、４－チオ－ウリジン、５－アミノ－アリル－ウリジン、５－ブロモ－ウリジン、５－ヨード－ウリジン、５－メチル－シチジン、リボ－チミジン、２－アミノプリン、２’－アミノ－ブチリル－ピレン－ウリジン、５－フルオロ－シチジン、および／または５－フルオロ－ウリジンである。
【0098】
９６個よりも多い天然に存在するヌクレオシド修飾が哺乳動物ＲＮＡに見出される。例えば、Ｌｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２（１２）：２１８３～２１９６（１９９４）を参照されたい。ヌクレオチドならびに修飾ヌクレオチドおよびヌクレオシドの調製は、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、同第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第４，６６８，７７７号、同第４，９７３，６７９号、同第５，０４７，５２４号、同第５，１３２，４１８号、同第５，１５３，３１９号、同第５，２６２，５３０号、および同第５，７００，６４２号に記載されている。本明細書に記載される使用に適した数多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、市販されている。ヌクレオシドは、天然に存在するヌクレオシドの類似体でありうる。場合によっては、類似体は、ジヒドロウリジン、メチルアデノシン、メチルシチジン、メチルウリジン、メチルシュードウリジン、チオウリジン、デオキシシチジン（ｄｅｏｘｙｃｙｔｏｄｉｎｅ）、およびデオキシウリジンである。
【0099】
場合によっては、本明細書に記載される修飾ｐｅｇＲＮＡは、核塩基修飾リボヌクレオチド、すなわち天然に存在する核塩基の代わりに少なくとも１つの天然に存在しない核塩基を含有するリボヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドに組み込むことができる修飾核塩基の非限定的な例には、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）、Ｕｍ（２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１－メチルアデノシン）、ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）、Ａｍ（２－１－Ｏ－メチルアデノシン）、ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）、ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）、ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）、ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）、ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）、ｔ６Ａ（Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）、ｈｎ６Ａ（Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）、Ａｒ（ｐ）（２－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸））、Ｉ（イノシン）、ｍ１Ｉ（１－メチルイノシン）、ｍ’Ｉｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）、ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）、Ｃｍ（２Ｔ－Ｏ－メチルシチジン）、ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）、ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）、ｆ５Ｃ（５－ホルミル（ｆｏｎｎｙｌ）シチジン）、ｍ５Ｃｍ（５，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）、ｋ２Ｃ（リシジン）、ｍ１Ｇ（１－メチルグアノシン）、ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）、ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）、Ｇｍ（２’－Ｏ－メチルグアノシン）、ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）、ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン）、Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸））、ｙＷ（ワイブトシン）、ｏ２ｙＷ（ペルオキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ（ヒドロキシワイブトシン）、ＯＨｙＷ＊（低修飾ヒドロキシワイブトシン）、ｉｍＧ（ワイオシン）、ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）、Ｑ（キューオシン）、ｏＱ（エポキシキューオシン）、ｇａｌＱ（ガラクトシル（ｇａｌｔａｃｔｏｓｙｌ）－キューオシン）、ｍａｎＱ（マンノシル－キューオシン）、ｐｒｅＱｏ（７－シアノ－７－デアザグアノシン）、ｐｒｅＱｉ（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）、Ｇ（アーキオシン）、Ｄ（ジヒドロウリジン）、ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）、ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）、ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）、ｈｏ５Ｕ（５－ヒドロキシウリジン）、ｍｏ５Ｕ（５－メトキシウリジン）、ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）、ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）、ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））、ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）、ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）、ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ－メトキシカルボニルメチル－２－Ｏ－メチルウリジン）、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）、ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）、ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）、ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）、ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）、ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－Ｌ－Ｏメチルウリジン）、ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）、ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）、Ｔｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）、ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）、ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２－Ｏ－ジメチルシチジン）、ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）、ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）、ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）、ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ－Ｏ－ジメチルアデノシン）、ｍ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ－２－トリメチルアデノシン）、ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）、ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）、ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ－Ｏ－ジメチルウリジン）、ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）、ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）、ｍ１Ｇｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）、ｍ’Ａｍ（１，２－Ｏ－ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）、ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ－タウリノメチル－２－チオウリジン））、ｉｍＧ－１４（４－デメチルグアノシン）、ｉｍＧ２（イソグアノシン）、またはａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８－オキソ－アデニン、その７－置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－アミノウラシル、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキルウラシル、５－メチルウラシル、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルケニルウラシル、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルキニルウラシル、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－（Ｃ１－Ｃ６）－アルキルシトシン、５－メチルシトシン、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルケニルシトシン、５－（Ｃ２－Ｃ６）－アルキニルシトシン、５－クロロシトシン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、Ｎ２－ジメチルグアニン、７－デアザグアニン、８－アザグアニン、７－デアザ－７－置換グアニン、７－デアザ－７－（Ｃ２－Ｃ６）アルキニルグアニン、７－デアザ－８－置換グアニン、８－ヒドロキシグアニン、６－チオグアニン、８－オキソグアニン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，４－ジアミノプリン、２，６－ジアミノプリン、８－アザプリン、置換７－デアザプリン、７－デアザ－７－置換プリン、７－デアザ－８－置換プリン、およびそれらの組合せが含まれる。
【0100】
一部の実施形態では、修飾ｐｅｇＲＮＡのリン酸骨格は変更される。修飾ｇＲＮＡは、１つまたは複数のホスホロチオエート、ホスホロアミデート（例えば、Ｎ３’－Ｐ５’－ホスホロアミデート（ＮＰ））、２’－Ｏ－メトキシ－エチル（２’ＭＯＥ）、２’－Ｏ－メチル－エチル（２’ＭＥ）、および／またはメチルホスホネート連結を含むことがある。
【0101】
特定の実施形態では、修飾ｐｅｇＲＮＡのガイド配列の修飾ヌクレオチドのうちの１つもしくは複数および／または足場配列の修飾ヌクレオチドの１つもしくは複数は、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル－３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）ヌクレオチド、またはそれらの組合せを含む。場合によっては、修飾ｐｅｇＲＮＡは、１つまたは複数のＭＳヌクレオチドを含む。他の例では、修飾ｐｅｇＲＮＡは、１つまたは複数のＭＰヌクレオチドを含む。さらに他の例では、修飾ｐｅｇＲＮＡは、１つまたは複数のＭＳヌクレオチドおよび１つまたは複数のＭＰまたはＭＳＰヌクレオチドを含む。場合によっては、修飾ｐｅｇＲＮＡは、１つもしくは複数のＭＳヌクレオチドおよび／または１つもしくは複数のＭＳＰヌクレオチドを含み、１つまたは複数のＭヌクレオチドをさらに含む。ある特定の他の例では、ＭＳヌクレオチドおよび／またはＭＰヌクレオチドだけが、修飾ｐｅｇＲＮＡに存在する修飾ヌクレオチドである。
【0102】
一部の態様では、修飾ｐｅｇＲＮＡの３’および／または５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、１）０、１、２、３、４、もしくは５つのＭＳヌクレオチド；２）０、１、２、３、４、もしくは５つのＭＰもしくはＭＳＰヌクレオチド；または３）最大５つのＭＳおよびＭＰ／ＭＳＰヌクレオチドの任意の組合せ（例えば、０ｘＭＳ、５ｘＭＰ；１ｘＭＳ、４ｘＭＰ；２ｘＭＳ、３ｘＭＰ；３ｘＭＳ、２ｘＭＰ；４ｘＭＳ、１ｘＭＰ；もしくは５ｘＭＳ、０ｘＭＰ）を含む。一部の態様では、修飾ｐｅｇＲＮＡの３’または５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、もしくは５つのＭＳヌクレオチド、および／または少なくとも１、２、３、４、もしくは５つのＭＰ／ＭＳＰヌクレオチドを含む。ｐｅｇＲＮＡの３’または５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、任意の順序に配列されたＭＳおよびＭＰ／ＭＳＰヌクレオチド（例えば、ＭＳ、ＭＳ、ＭＰ、ＭＳ、ＭＳ；ＭＰ、ＭＰ、ＭＰ、ＭＳ、ＭＳ；ＭＳ、ＭＳ、ＭＳ；またはＭＰ、ＭＰ）を含むことがある。ｐｅｇＲＮＡの３’または５’末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドは、独立して選択されることがある（例えば、修飾ヌクレオチドの配列は修飾ｐｅｇＲＮＡの５’および３’末端で異なることがある）。一部の態様では、修飾ｐｅｇＲＮＡは、３’末端の５つのヌクレオチド内（および／または５’末端の５つのヌクレオチド内）の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み、ここで、各々の修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシから選択される２’修飾と、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノカルボキシレート、および３’－チオホスホノカルボキシレートから選択されるヌクレオチド間連結修飾とを含むヌクレオチドである。
【0103】
修飾ｐｅｇＲＮＡのガイド配列および／または足場配列内に、本明細書に記載される修飾のいずれかが組合せおよび組込みされうることに留意すべきである。
【0104】
場合によっては、修飾ｐｅｇＲＮＡはまた、ステムループ、例えば、ＭＳ２ステムループまたはテトラループなどの構造修飾を含む。
【0105】
修飾ｐｅｇＲＮＡは、当業者に公知の任意の方法によって合成することができる。修飾ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－チオノカルバメート保護ヌクレオシドホスホロアミダイトを使用して合成することができる。方法は、例えば、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １３３、１１５４０～１１５５６（２０１１）；Ｔｈｒｅｌｆａｌｌら、Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０、７４６～７５４（２０１２）；およびＤｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２５、９４０～９５０（２００３）に記載されている。
【0106】
３．逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位
逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位は、ｐｅｇＲＮＡの重要な編集構成要素である。プライマー結合部位は、標的領域内のニック入りの標的鎖（ニックはプライム編集の間にＣａｓタンパク質によって生成される）の配列との相補性によってハイブリダイズできる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質－逆転写酵素融合タンパク質または関連システム（例えば、逆転写酵素の代わりにポリメラーゼまたは末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む）は、ｐｅｇＲＮＡのガイド配列により標的領域へと運ばれ、Ｃａｓ９結合標的領域内に一本鎖ニックを生成し、次いでｐｅｇＲＮＡ内のＲＴ鋳型によってコードされる逆転写のためのプライマーとしてニック入りのＤＮＡを使用する。
逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位は、ｐｅｇＲＮＡの重要な編集構成要素である。プライマー結合部位は、標的領域内のニック入りの標的鎖（ニックはプライム編集の間にＣａｓタンパク質によって生成される）の配列との相補性によってハイブリダイズできる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質－逆転写酵素融合タンパク質または関連システム（例えば、逆転写酵素の代わりにポリメラーゼまたは末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む）は、ｐｅｇＲＮＡのガイド配列により標的領域へと運ばれ、Ｃａｓ９結合標的領域内に一本鎖ニックを生成し、次いでｐｅｇＲＮＡ内のＲＴ鋳型によってコードされる逆転写のためのプライマーとしてニック入りのＤＮＡを使用する。
【0107】
したがって、ｐｅｇＲＮＡは、所望の遺伝子変化を含有するＤＮＡの置き換え鎖をコードする逆転写酵素の鋳型に新しい遺伝情報を含有し、これは、標的領域内の対応する内因性ＤＮＡ鎖を置き換えるために使用される。ｐｅｇＲＮＡからの情報を標的ＤＮＡに移行させるために、プライム編集のメカニズムは、ＤＮＡ標的部位の一本鎖にニックを入れて３’－ヒドロキシル基を露出させることを伴う。一部の実施形態では、露出した３’－ヒドロキシル基は、ｐｅｇＲＮＡ中の逆転写鋳型上でＤＮＡの重合をプライミングするために使用される。様々な実施形態では、編集を含有する置き換え鎖の重合のための鋳型は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡヌクレオチドの両方の混合配列でありうる。ｐｅｇＲＮＡの構造およびセグメント（逆転写酵素の鋳型、プライマー結合部位、ガイド配列、足場、必要に応じてリンカーなど）、プライム編集のためのその他の構成要素（Ｃａｓタンパク質、逆転写酵素、Ｃａｓタンパク質と逆転写酵素との融合タンパク質、必要に応じて融合タンパク質中のリンカーなど）、プライム編集のメカニズムおよび操作のみならず、それらの変形に関して、Ｄａｖｉｄ ＬｉｕらによるＰＣＴ公報番号Ｗ０２０２０１９１１５３は、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれている。
【0108】
一部の実施形態では、プライマー結合部位は、ニック部位の次に始まる配列とハイブリダイズし、ニック部位から離れるように伸長する。一部の他の実施形態では、プライマー結合部位は、ニック部位から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド離れて開始する配列とハイブリダイズし、ニック部位から離れるように伸長する。一部の実施形態では、プライマー結合部位は、標的領域と相補的な４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個のヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、プライマー結合部位は、少なくとも３ヌクレオチド長、少なくとも４ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも６ヌクレオチド長、少なくとも７ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも９ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長、少なくとも１１ヌクレオチド長、少なくとも１２ヌクレオチド長、少なくとも１３ヌクレオチド長、少なくとも１４ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチド長、少なくとも１６ヌクレオチド長、少なくとも１７ヌクレオチド長、少なくとも１８ヌクレオチド長、少なくとも１９ヌクレオチド長、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも３０ヌクレオチド長、または少なくとも４０ヌクレオチド長である。
【0109】
逆転写酵素の鋳型は、逆転写酵素の鋳型が少なくとも１つの所望の編集、すなわち、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、挿入または欠失を含むことを除き、標的領域内の配列（目的の配列）と同じ配列（「編集領域」）を含有する。逆転写酵素の鋳型は、目的の配列の隣の標的領域内の別の配列と実質的に同一である相同領域をさらに含むことがある。編集領域および相同領域は、独立して少なくとも３ヌクレオチド長、少なくとも４ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも６ヌクレオチド長、少なくとも７ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも９ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長、少なくとも１１ヌクレオチド長、少なくとも１２ヌクレオチド長、少なくとも１３ヌクレオチド長、少なくとも１４ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチド長、少なくとも１６ヌクレオチド長、少なくとも１７ヌクレオチド長、少なくとも１８ヌクレオチド長、少なくとも１９ヌクレオチド長、少なくとも２０ヌクレオチド長、少なくとも３０ヌクレオチド長、少なくとも４０ヌクレオチド長、少なくとも５０ヌクレオチド長、少なくとも６０ヌクレオチド長、少なくとも７０ヌクレオチド長、少なくとも８０ヌクレオチド長、少なくとも９０ヌクレオチド長、少なくとも１００ヌクレオチド長、少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも３００ヌクレオチド長、少なくとも４００ヌクレオチド長、または少なくとも５００ヌクレオチド長でありうる。一部の実施形態では、編集領域および相同領域は、独立して、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５ヌクレオチド長である。
【0110】
ｐｅｇＲＮＡは、その機能に関して、（１）ガイド配列、（２）足場（Ｃａｓタンパク質相互作用エレメント）、および（３）編集エレメント（プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型）の３つの主要構成要素エレメントを含む。ｐｅｇＲＮＡのこれらの３つの主要エレメントは、２つの主要配置で配列することができる。第１の配置は、編集エレメントをｐｅｇＲＮＡの３’末端に位置させ、Ｃａｓ９様式のｐｅｇＲＮＡについて構成要素は、５’－ガイド配列－足場－逆転写酵素の鋳型－プライマー結合部位－３’の順序である。Ｃｐｆ１様式のｐｅｇＲＮＡについて、順序は、５’－足場－ガイド配列－逆転写酵素の鋳型－プライマー結合部位－３’である。
【0111】
第２の配置は、編集エレメントをｐｅｇＲＮＡの５’末端に位置させる。Ｃａｓ９様式ｐｅｇＲＮＡについて、構成要素は、５’－逆転写酵素の鋳型－プライマー結合部位－ガイド配列－足場－３’の順序である。Ｃｐｆ１様式のｐｅｇＲＮＡについて、順序は、５’－逆転写酵素の鋳型－プライマー結合部位－足場－ガイド配列－３’である。
【0112】
すべての配置で、編集エレメントは、ホスフェートヌクレオチド間連結を介して直接的に、または（以下に限定されないが）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー、スクアラミドリンカー、トリアゾロリンカー、オリゴヌクレオチドリンカーまたは当技術分野において公知の任意の他のリンカーなどの化学リンカーを介して、他の部分（ガイド配列および足場を含む）と連結されることがある。
【0113】
さらに、逆転写酵素の鋳型（相同領域を含む）および／またはプライマー結合部位は、ＤＮＡもしくはＲＮＡのことがあり、またはリボヌクレオチドと２’－デオキシリボヌクレオチドとの混合物を含むことがある。なおさらに、逆転写酵素の鋳型は、２’－ＭＯＥヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体または逆転写を停止／遮断することが知られている他の類似体を含むことがある。
【0114】
４．逆転写酵素（ＲＴ）
本発明のための逆転写酵素は、逆転写酵素活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合活性）を有する任意のタンパク質でありうる。したがって、任意の逆転写酵素、またはその断片およびバリアントは、断片およびバリアントが逆転写酵素活性を有する限り利用することができる。したがって、本発明の「逆転写酵素」には、レトロウイルス、他のウイルスからの逆転写酵素のみならず、逆転写酵素活性を示すＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼなどが含まれる。レトロウイルス由来のＲＴには、以下に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫－白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ－Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ－Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴが含まれる。
本発明のための逆転写酵素は、逆転写酵素活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合活性）を有する任意のタンパク質でありうる。したがって、任意の逆転写酵素、またはその断片およびバリアントは、断片およびバリアントが逆転写酵素活性を有する限り利用することができる。したがって、本発明の「逆転写酵素」には、レトロウイルス、他のウイルスからの逆転写酵素のみならず、逆転写酵素活性を示すＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼなどが含まれる。レトロウイルス由来のＲＴには、以下に限定されないが、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫－白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、トリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ－Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ－Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴが含まれる。
【0115】
トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素は、最初に広く使用されたＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであった（Ｖｅｒｍａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ４７３：１（１９７７））。この酵素は、５’－３’ ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性、５－３’ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ活性、およびＲＮアーゼＨ活性を有する。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドについてＲＮＡ鎖に特異的な連続移動的５’および３’リボヌクレアーゼである（Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８４））。公知のウイルス逆転写酵素はプルーフリーディングに必要な３’－５’エキソヌクレアーゼ活性を欠如するので、転写中のエラーは逆転写酵素によって修正できない（ＳａｕｎｄｅｒｓおよびＳａｕｎｄｅｒｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｏｎｄｏｎ：Ｃｒｏｏｍ Ｈｅｌｍ（１９８７））。ＡＭＶ逆転写酵素の活性およびその関連ＲＮアーゼＨ活性の詳細な研究が、Ｂｅｒｇｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２：２３６５～２３７２（１９８３）によって提示されている。分子生物学に広く使用される別の逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）に由来する逆転写酵素である。例えば、Ｇｅｒａｒｄ，Ｇ．Ｒ．、ＤＮＡ ５：２７１～２７９（１９８６）およびＫｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ ３５：２４９～２５８（１９８５）を参照されたい。ＲＮアーゼＨ活性を実質的に欠如するＭＭＬＶ逆転写酵素も記載されている。例えば、米国特許第５，２４４，７９７号を参照されたい。任意のこのような逆転写酵素、またはそのバリアントもしくは変異体を本発明に使用することができる。
【0116】
一部の実施形態では、通常はランダム変異誘発のためのエラー率の高い（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ）逆転写酵素が使用される。これらの酵素は、エラー率の高い逆転写酵素、または重合の間にヌクレオチドの忠実度の高い組込みを支援しない逆転写酵素と称されることがある。ｐｅｇＲＮＡにおけるＲＴ鋳型に基づくプライマー伸長の間、エラー率の高い逆転写酵素は、ＲＴ鋳型配列とマッチしない１つまたは複数のヌクレオチドを導入することによって、誤った重合を介してヌクレオチド配列に変化を導入する可能性がある。次いで、合成の間に導入されたこれらの誤りは、対応する内因性標的鎖とのハイブリダイゼーション、外された内因鎖の除去、ライゲーションを介して、次いでもう１ラウンドの内因性ＤＮＡ修復および／または複製を介して二本鎖分子に組み込まれるようになる。本発明の他の実施形態では、より高い忠実度を有するエラー率の低い逆転写酵素が使用される。このようなエラー率がより低い酵素により、ＲＴ鋳型における編集が、標的により高い忠実度で導入される。
【0117】
本開示全体にわたり逆転写酵素について述べるものの、プライム編集のために他のポリメラーゼを使用することが可能である。例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌ Ｉ、Ｐｏｌ ＩＩ、もしくはＰｏｌ ＩＩＩを含む原核生物ポリメラーゼ、またはＰｏｌ ａ、Ｐｏｌ ｂ、Ｐｏｌ ｇ、Ｐｏｌ ｄ、Ｐｏｌ ｅ、もしくはＰｏｌ ｚを含む真核生物ポリメラーゼ）が逆転写酵素の代わりに使用されることがある。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが利用される場合、ｐｅｇＲＮＡのプライマー伸長鋳型構成要素（この場合、逆転写酵素の鋳型よりもむしろポリメラーゼの鋳型と呼ぶべきである）は、好ましくはＤＮＡであり、または部分的にＤＮＡである。修飾ヌクレオチドの位置および型、ｐｅｇＲＮＡの配置、ならびにプライム編集を実施する方式を含む本発明の他の態様は、実質的に同じままである。プライム編集のための、本発明による化学修飾ｐｅｇＲＮＡを調製し、逆転写酵素よりもむしろＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してプライム編集を実施する方法は、当業者に明らかである。
【0118】
５．標的ＤＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、標的ＤＮＡ配列の直後に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列がありうる。標的ＤＮＡ部位は、使用されるＣａｓタンパク質Ｃａｓ９の細菌種に特異的なＰＡＭ配列の５’に直接位置することがある。例えば、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＧＧであり；ナイセリア メニンギティディス由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴであり；ストレプトコッカス サーモフィルス由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＡＧＡＡであり；トレポネーマ デンティコラ由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＡＡＡＡＣである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＧ（Ｎは任意のヌクレオチドである）；５’－ＮＲＧ（Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）；または５’－ＮＮＧＲＲ（Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）でありうる。化膿性連鎖球菌システムについて、選択された標的ＤＮＡ配列は、５’ＮＧＧ ＰＡＭの直前（例えば５’に位置する）にあるべきであり（Ｎは任意のヌクレオチドである）、それにより、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｇＲＮＡ）のガイド配列は、反対鎖と塩基対を形成して、ＰＡＭ配列の約３塩基対上流で切断を媒介する。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて、標的ＤＮＡ配列の直後に、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列がありうる。標的ＤＮＡ部位は、使用されるＣａｓタンパク質Ｃａｓ９の細菌種に特異的なＰＡＭ配列の５’に直接位置することがある。例えば、化膿性連鎖球菌由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＧＧであり；ナイセリア メニンギティディス由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＮＮＧＡＴＴであり；ストレプトコッカス サーモフィルス由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＮＡＧＡＡであり；トレポネーマ デンティコラ由来Ｃａｓ９のＰＡＭ配列はＮＡＡＡＡＣである。一部の実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＧＧ（Ｎは任意のヌクレオチドである）；５’－ＮＲＧ（Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）；または５’－ＮＮＧＲＲ（Ｎは任意のヌクレオチドであり、Ｒはプリンである）でありうる。化膿性連鎖球菌システムについて、選択された標的ＤＮＡ配列は、５’ＮＧＧ ＰＡＭの直前（例えば５’に位置する）にあるべきであり（Ｎは任意のヌクレオチドである）、それにより、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｇＲＮＡ）のガイド配列は、反対鎖と塩基対を形成して、ＰＡＭ配列の約３塩基対上流で切断を媒介する。
【0119】
一部の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｐｅｇＲＮＡ）のガイド配列とその対応する標的ＤＮＡ配列との相補性の程度は、適切なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントされた場合、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上、または約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれ以上よりも大きい。最適なアライメントは、配列をアライメントするために適した任意のアルゴリズムを使用して決定されることがあり、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒアライナー）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅｌａｎｇｏｒ、Ｍａｌａｙｓｉａ）、およびＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。
【0120】
標的ＤＮＡ部位は、ＺｉＦｉＴ Ｔａｒｇｅｔｅｒソフトウェア（Ｓａｎｄｅｒら、２００７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３５：５９９～６０５；Ｓａｎｄｅｒら、２０１０、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３８：４６２～４６８）、Ｅ－ＣＲＩＳＰ（Ｈｅｉｇｗｅｒら、２０１４、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１１：１２２～１２３）、ＲＧＥＮ Ｔｏｏｌｓ（Ｂａｅら、２０１４、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３０（１０）：１４７３～１４７５）、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ（Ａａｃｈら、２０１４、ｂｉｏＲｘｉｖ）、ＤＮＡ２．０ ｇＮＲＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＣＲＩＳＰｉｃｋ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）などのウェブベースソフトウェアを使用して前定義されたゲノム配列（遺伝子）内から選択することができる。このようなツールは、ゲノム配列（例えば、目的の遺伝子または座位）を解析し、遺伝子編集に適した標的部位を特定する。各々のＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、修飾ｇＲＮＡ）のためのオフターゲット遺伝子修飾を判定するために、オフターゲット部位のコンピュータ予測は、塩基対形成ミスマッチの同一性、位置および分布の量的特異性解析に基づき行われる。
【0121】
Ｂ．初代細胞
本開示の組成物および方法を使用して、目的の任意の初代細胞内の標的核酸を編集することができる。初代細胞は、任意の多細胞生物から単離された細胞、例えば、植物細胞（例えば、イネ細胞、コムギ細胞、トマト細胞、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）細胞、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）細胞など）、多細胞原生生物からの細胞、多細胞性真菌からの細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）からの細胞または脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）からの細胞、ヒトからの細胞、健康なヒトからの細胞、ヒト患者からの細胞、がん患者からの細胞などでありうる。場合によっては、編集された遺伝子を有する初代細胞を対象（例えば、患者）に移植することができる。例えば、初代細胞は、処置すべき対象（例えば、患者）に由来することがある。
本開示の組成物および方法を使用して、目的の任意の初代細胞内の標的核酸を編集することができる。初代細胞は、任意の多細胞生物から単離された細胞、例えば、植物細胞（例えば、イネ細胞、コムギ細胞、トマト細胞、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）細胞、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）細胞など）、多細胞原生生物からの細胞、多細胞性真菌からの細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）からの細胞または脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）からの細胞、ヒトからの細胞、健康なヒトからの細胞、ヒト患者からの細胞、がん患者からの細胞などでありうる。場合によっては、編集された遺伝子を有する初代細胞を対象（例えば、患者）に移植することができる。例えば、初代細胞は、処置すべき対象（例えば、患者）に由来することがある。
【0122】
任意の型の初代細胞、例えば、幹細胞、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、成体幹細胞（例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、造血幹細胞、臓器幹細胞）、前駆細胞、体細胞（例えば、線維芽細胞、肝実質細胞、心臓細胞、肝細胞、膵臓細胞、筋細胞、皮膚細胞、血液細胞、神経細胞、免疫細胞）、および身体、例えばヒト身体の任意の他の細胞が、目的の細胞でありうる。初代細胞は、典型的には対象、例えば、動物対象またはヒト対象に由来し、限られた継代数の間、インビトロで成長させられる。一部の実施形態では、細胞は疾患細胞である、または疾患を有する対象に由来する。例えば、細胞はがん細胞または腫瘍細胞でありうる。
【0123】
初代細胞は、任意の標準的な方法によって対象から回収することができる。例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織からの細胞を、組織生検または細針吸引によって回収することができる。血液細胞および／または免疫細胞は、全血、血漿または血清から単離することができる。場合によっては、適切な初代細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および他の血液細胞サブセット、例えば以下に限定されないが、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーＴ細胞、単球前駆細胞、造血幹および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えばＣＤ３４＋ ＨＳＰＣ、または非多能性幹細胞が含まれる。場合によっては、細胞は、以下に限定されないが、任意のＴ細胞、例えば腫瘍浸潤細胞（ＴＩＬ）、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、または任意の他の型のＴ細胞を含む任意の免疫細胞でありうる。Ｔ細胞はまた、メモリーＴ細胞、メモリー幹Ｔ細胞、またはエフェクターＴ細胞を含みうる。Ｔ細胞はまた、特定の集団および表現型に偏ることがある。例えば、表現型が偏ることがあるＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ－７Ｒａ（＋）を含む。ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）および／またはＩＬ－７Ｒａ（＋）を含むリストから選択される１つまたは複数のマーカーを含む適切な細胞を選択することができる。人工多能性幹細胞は、例えば、米国特許第７，６８２，８２８号、同第８，０５８，０６５号、同第８，５３０，２３８号、同第８，８７１，５０４号、同第８，９００，８７１号および同第８，７９１，２４８号に記載された標準的なプロトコールにより分化細胞から生成しうる。
【0124】
Ｃ．エクスビボ療法
本明細書に記載される方法は、エクスビボ療法に使用することができる。エクスビボ療法は、生物外で生成または改変された組成物（例えば、細胞）を対象（例えば、患者）に投与することを含むことがある。一部の実施形態では、組成物（例えば、細胞）は、本明細書に開示される方法によって生成または改変することができる。例えば、エクスビボ療法は、生物外で生成または改変された初代細胞を対象（例えば、患者）に投与することを含むことがあり、ここで、初代細胞は、培養され、初代細胞内の標的核酸を、本明細書に記載される１つまたは複数の修飾ｐｅｇＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターと接触させることを含む本開示の方法によりインビトロで編集されている。
本明細書に記載される方法は、エクスビボ療法に使用することができる。エクスビボ療法は、生物外で生成または改変された組成物（例えば、細胞）を対象（例えば、患者）に投与することを含むことがある。一部の実施形態では、組成物（例えば、細胞）は、本明細書に開示される方法によって生成または改変することができる。例えば、エクスビボ療法は、生物外で生成または改変された初代細胞を対象（例えば、患者）に投与することを含むことがあり、ここで、初代細胞は、培養され、初代細胞内の標的核酸を、本明細書に記載される１つまたは複数の修飾ｐｅｇＲＮＡ、およびＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくは断片をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ポリペプチド）またはそのバリアントもしくはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターと接触させることを含む本開示の方法によりインビトロで編集されている。
【0125】
一部の実施形態では、組成物（例えば、細胞）は、エクスビボ療法により処置すべき対象（例えば、患者）に由来しうる。一部の実施形態では、エクスビボ療法は、養子免疫療法などの細胞ベースの療法を含みうる。
【0126】
一部の実施形態では、エクスビボ療法に使用される組成物は細胞でありうる。細胞は、以下に限定されないが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）、および他の血液細胞サブセットを含む初代細胞でありうる。初代細胞は、免疫細胞でありうる。初代細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞、単球、ナチュラルキラーＴ細胞、単球前駆細胞、造血幹細胞もしくは非多能性幹細胞、幹細胞、または前駆細胞でありうる。初代細胞は、造血幹または前駆細胞（ＨＳＰＣ）、例えばＣＤ３４＋ ＨＳＰＣでありうる。初代細胞はヒト細胞でありうる。初代細胞は、単離、選択、および／または培養することができる。初代細胞は、エクスビボで拡大増殖させることができる。初代細胞は、インビボで拡大増殖させることができる。初代細胞は、ＣＤ４５ＲＯ（－）、ＣＣＲ７（＋）、ＣＤ４５ＲＡ（＋）、ＣＤ６２Ｌ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ２８（＋）、および／またはＩＬ－７Ｒａ（＋）でありうる。初代細胞は、それを必要とする対象に対して自己でありうる。初代細胞は、それを必要とする対象に対して非自己でありうる。初代細胞は、医薬品および医薬部外品の製造管理および品質管理規則（ＧＭＰ）に適合する試薬でありうる。初代細胞は、それを必要とする対象におけるがん、感染症、自己免疫障害、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を含む疾患を処置するための併用療法の一部でありうる。
【0127】
エクスビボ療法の非限定的な例として、初代細胞は、初代細胞内の標的核酸をプライムエディターおよび修飾ｐｅｇＲＮＡと接触させる前に、多細胞生物（例えば、植物、多細胞原生生物、多細胞真菌、無脊椎動物、脊椎動物など）から単離することができる。標的核酸をプライムエディターおよび修飾ｐｅｇＲＮＡと接触させた後、編集された初代細胞またはその後代（例えば、初代細胞に由来する細胞）を多細胞生物に戻すことができる。
【0128】
Ｄ．核酸および／またはポリペプチドを標的細胞に導入する方法
ポリペプチドおよび核酸を標的細胞（宿主細胞）に導入する方法は、当技術分野において公知であり、任意の公知の方法を使用して、プライム編集のためのポリペプチド構成要素（例えば、Ｃａｓタンパク質、逆転写酵素またはポリメラーゼ、Ｃａｓタンパク質と逆転写酵素との融合タンパク質など）、プライム編集のための核酸構成要素（例えば、上記のポリペプチド構成要素をコードするｐｅｇＲＮＡまたはポリヌクレオチド）、またはプライム編集のための（例えば、Ｃａｓタンパク質およびｐｅｇＲＮＡの）ＲＮＰ構成要素を細胞に、例えば、幹細胞、前駆細胞、または分化細胞などの初代細胞に導入することができる。適切な方法の非限定的な例には、電気穿孔、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子媒介送達、例えば脂質ナノ粒子媒介送達、ポリマーナノ粒子媒介送達、ハイブリッド脂質－ポリマーナノ粒子媒介送達などが含まれる。
ポリペプチドおよび核酸を標的細胞（宿主細胞）に導入する方法は、当技術分野において公知であり、任意の公知の方法を使用して、プライム編集のためのポリペプチド構成要素（例えば、Ｃａｓタンパク質、逆転写酵素またはポリメラーゼ、Ｃａｓタンパク質と逆転写酵素との融合タンパク質など）、プライム編集のための核酸構成要素（例えば、上記のポリペプチド構成要素をコードするｐｅｇＲＮＡまたはポリヌクレオチド）、またはプライム編集のための（例えば、Ｃａｓタンパク質およびｐｅｇＲＮＡの）ＲＮＰ構成要素を細胞に、例えば、幹細胞、前駆細胞、または分化細胞などの初代細胞に導入することができる。適切な方法の非限定的な例には、電気穿孔、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、ナノ粒子媒介送達、例えば脂質ナノ粒子媒介送達、ポリマーナノ粒子媒介送達、ハイブリッド脂質－ポリマーナノ粒子媒介送達などが含まれる。
【0129】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、送達システムを使用して細胞内に導入することができる。場合によっては、送達システムは、ナノ粒子、マイクロ粒子（例えば、ポリマーマイクロポリマー）、リポソーム、ミセル、ビロソーム、ウイルス粒子、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、核酸複合体、トランスフェクション剤、電気穿孔剤（例えば、ＮＥＯＮトランスフェクションシステムを使用する）、ヌクレオフェクション剤、リポフェクション剤、ならびに／またはプライム編集のためのポリペプチド、核酸、および／もしくはＲＮＰ構成要素を含む緩衝剤システムを含む。例えば、構成要素は、陽イオン性サブミクロン水中油型エマルジョンに封入またはパッケージングされるようにリポフェクション剤と混合することができる。または、構成要素は、送達システムなしに、例えば水溶液として送達することができる。
【0130】
リポソームを調製し、ポリペプチドおよび核酸をリポソームに封入する方法は、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第１巻：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、（Ｗｅｉｓｓｉｇ編）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００９およびＨｅｙｅｓら（２００５）Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６～８７に記載されている。マイクロ粒子を調製し、ポリペプチドおよび核酸を封入する方法は、例えば、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ 第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ ＆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）、（ＡｒｓｈａｄｙおよびＧｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ Ｂｏｏｋｓ、２００２およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、（ＣｏｈｅｎおよびＢｅｒｎｓｔｅｉｎ編）．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９６に記載されている。脂質、ポリマーまたはハイブリッド脂質－ポリマーナノ粒子などのナノ粒子の調製に関する総説についてはＡｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０２１、第１６８巻を参照されたい。
【0131】
Ｅ．ゲノム編集効率の判定方法
正しいゲノム編集修飾の存在を機能的に試験するために、標的ＤＮＡを当業者に公知の標準的な方法によって分析することができる。例えば、インデル変異は、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（登録商標）変異検出キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）またはＧｕｉｄｅ－ｉｔ（商標）インデル同定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）を使用する配列決定によって同定することができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）またはプライム編集媒介編集をＰＣＲベースの方法によって、および配列決定またはＲＦＬＰ解析と組み合わせて検出することができる。ＰＣＲベースのキットの非限定的な例には、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ変異検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ゲノム切断検出キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。特に多数の試料または潜在的標的／オフターゲット部位についてディープシーケンシングも使用することができる。
正しいゲノム編集修飾の存在を機能的に試験するために、標的ＤＮＡを当業者に公知の標準的な方法によって分析することができる。例えば、インデル変異は、ＳＵＲＶＥＹＯＲ（登録商標）変異検出キット（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、Ｉｏｗａ）またはＧｕｉｄｅ－ｉｔ（商標）インデル同定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）を使用する配列決定によって同定することができる。相同組換え修復（ＨＤＲ）またはプライム編集媒介編集をＰＣＲベースの方法によって、および配列決定またはＲＦＬＰ解析と組み合わせて検出することができる。ＰＣＲベースのキットの非限定的な例には、Ｇｕｉｄｅ－ｉｔ変異検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）ゲノム切断検出キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。特に多数の試料または潜在的標的／オフターゲット部位についてディープシーケンシングも使用することができる。
【0132】
ある特定の実施形態では、ゲノム編集の効率（例えば、特異性）は、オンターゲットおよびオフターゲット事象を含むすべてのゲノム編集事象の数またはパーセントに対するオンターゲットゲノム編集事象の数またはパーセントに対応する。
【0133】
一部の実施形態では、本明細書に記載される修飾ｐｅｇＲＮＡは、対応する未修飾ｐｅｇＲＮＡと比べて初代細胞などの細胞において標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を強化することができる。ゲノム編集は、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入および／または欠失を含みうる。
【0134】
ある特定の実施形態では、細胞における標的ＤＮＡ配列のヌクレアーゼ媒介ゲノム編集効率は、対応する未修飾ｐｅｇＲＮＡ配列と比較して、本明細書に記載される修飾ｐｅｇＲＮＡの存在下で少なくとも約０．５倍、０．６倍、０．７倍、０．８倍、０．９倍、１倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、５．５倍、６倍、６．５倍、７倍、７．５倍、８倍、８．５倍、９倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、またはそれよりも大きく高まる。
【0135】
Ｆ．対象における遺伝性疾患を予防または処置する方法
修飾ｐｅｇＲＮＡは、遺伝性疾患の標的化ゲノム編集治療学に適用することができる。初代患者細胞のゲノム内の遺伝子変異を正確に修正するための現在のアプローチは、非常に非効率的であった（細胞の１％未満を正確に編集できるときがある）。本明細書に記載される修飾ｐｅｇＲＮＡは、ゲノム編集の活性を高め、ゲノム編集ベース療法の有効性を増大させることができる。特定の実施形態では、修飾ｐｅｇＲＮＡは、遺伝性疾患を有する対象における遺伝子のインビボ遺伝子編集のために使用されることがある。修飾ｐｅｇＲＮＡは、任意の適切な投与経路を介して、ゲノム編集療法の効果を高める（例えば、ゲノム編集効率を改善する）のに十分な用量または量で対象に投与することができる。
修飾ｐｅｇＲＮＡは、遺伝性疾患の標的化ゲノム編集治療学に適用することができる。初代患者細胞のゲノム内の遺伝子変異を正確に修正するための現在のアプローチは、非常に非効率的であった（細胞の１％未満を正確に編集できるときがある）。本明細書に記載される修飾ｐｅｇＲＮＡは、ゲノム編集の活性を高め、ゲノム編集ベース療法の有効性を増大させることができる。特定の実施形態では、修飾ｐｅｇＲＮＡは、遺伝性疾患を有する対象における遺伝子のインビボ遺伝子編集のために使用されることがある。修飾ｐｅｇＲＮＡは、任意の適切な投与経路を介して、ゲノム編集療法の効果を高める（例えば、ゲノム編集効率を改善する）のに十分な用量または量で対象に投与することができる。
【0136】
遺伝性疾患に関連する遺伝子変異を修正することによって、それを必要とする対象における当該疾患を予防または処置する方法が、本明細書に提供される。方法は、変異を修正するのに十分な量の本明細書に記載される修飾ｐｅｇＲＮＡおよびプライムエディターを対象に投与することを含む。遺伝性疾患に関連する遺伝子変異を修正することによって、それを必要とする対象における当該疾患を予防または処置するための医薬の製造への、本明細書に記載される修飾ｐｅｇＲＮＡの使用も、本明細書に提供される。修飾ｐｅｇＲＮＡは、プライム編集のためのＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターも含む組成物中に含有されうる。同様に、修飾ｐｅｇＲＮＡは、ニッキングｇＲＮＡ、逆転写酵素、またはＣａｓタンパク質と逆転写酵素との融合タンパク質などの、プライム編集のための他の構成要素と共に組成物中に含有されうる。プライム編集のためのポリペプチドおよび核酸構成要素は、上に記載されており、修飾ｐｅｇＲＮＡとの任意の組合せが本明細書に企図される。場合によっては、修飾ｐｅｇＲＮＡは、上記の送達システムに含まれる。
【0137】
本方法によって修正されることがある遺伝性疾患には、以下に限定されないが、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病、新形成、がん、加齢黄斑変性、統合失調症、トリヌクレオチド反復障害、脆弱Ｘ症候群、プリオン関連障害、筋萎縮性側索硬化症、薬物嗜癖、自閉症、アルツハイマー病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、血液および凝固疾患または障害、炎症、免疫関連疾患または障害、代謝性疾患、肝疾患および障害、腎疾患および障害、筋／骨格疾患および障害（例えば、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー）、神経および神経細胞疾患および障害、心血管疾患および障害、肺疾患および障害、眼疾患および障害、ウイルス感染（例えば、ＨＩＶ感染）などが含まれる。
【実施例】
【0138】
本教示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができるが、これらの実施例は、本教示の範囲を何らかの点で限定するものと理解すべきではない。
【0139】
［実施例１：化学合成されたｐｅｇＲＮＡの３’末端での２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）修飾の使用の評価］
＜方法＞
ＥＭＸ１を標的遺伝子として使用して化学修飾ｐｅｇＲＮＡの有効性を試験するための実験を計画した。プライムエディター（この場合、Ｃａｓ９ニッカーゼとＭＭＬＶ由来逆転写酵素とを含む融合タンパク質）をコードするｍＲＮＡを、ＥＭＸ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡと共にＫ５６２またはＪｕｒｋａｔ細胞に導入した。別々に培養した３つ組の細胞試料で各トランスフェクションを行った。ゲノムＤＮＡを回収し、ＥＭＸ１に特異的なプライマーを使用してＥＭＸ１標的配列を増幅してアンプリコンを産生し、アンプリコンを配列決定し、配列決定の結果からプライム編集度（「％編集」）を決定した。配列決定の結果から、ＥＭＸ１標的配列内のニッカーゼ部位での望まれないインデル形成度（「％インデル」）も決定した。このようなインデルは、プライム編集の公知の副産物であり、一般的に望ましくないと見なされる（Ａｎｚａｌｏｎｅら ２０１９参照）。ｐｅｇＲＮＡあたりのプライム編集の収率およびインデル副産物の収率を図２～７に棒グラフとしてプロットする。これらのアッセイに使用される配列を、表１に示される配列から選択した。ＥＭＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡの第１のバッチ合成を使用して図２～３のデータを得たのに対して、ＥＭＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡの第２のバッチ合成を使用して図４～５のデータを得た。同じ配列のいくつかを第２のバッチ合成で再度合成したことに留意されたい。逆に、ＲＵＮＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡを使用して（すなわち、表２に記載される配列を使用して）図６～７のデータを得た。
＜方法＞
ＥＭＸ１を標的遺伝子として使用して化学修飾ｐｅｇＲＮＡの有効性を試験するための実験を計画した。プライムエディター（この場合、Ｃａｓ９ニッカーゼとＭＭＬＶ由来逆転写酵素とを含む融合タンパク質）をコードするｍＲＮＡを、ＥＭＸ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡと共にＫ５６２またはＪｕｒｋａｔ細胞に導入した。別々に培養した３つ組の細胞試料で各トランスフェクションを行った。ゲノムＤＮＡを回収し、ＥＭＸ１に特異的なプライマーを使用してＥＭＸ１標的配列を増幅してアンプリコンを産生し、アンプリコンを配列決定し、配列決定の結果からプライム編集度（「％編集」）を決定した。配列決定の結果から、ＥＭＸ１標的配列内のニッカーゼ部位での望まれないインデル形成度（「％インデル」）も決定した。このようなインデルは、プライム編集の公知の副産物であり、一般的に望ましくないと見なされる（Ａｎｚａｌｏｎｅら ２０１９参照）。ｐｅｇＲＮＡあたりのプライム編集の収率およびインデル副産物の収率を図２～７に棒グラフとしてプロットする。これらのアッセイに使用される配列を、表１に示される配列から選択した。ＥＭＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡの第１のバッチ合成を使用して図２～３のデータを得たのに対して、ＥＭＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡの第２のバッチ合成を使用して図４～５のデータを得た。同じ配列のいくつかを第２のバッチ合成で再度合成したことに留意されたい。逆に、ＲＵＮＸ１を標的とするｐｅｇＲＮＡを使用して（すなわち、表２に記載される配列を使用して）図６～７のデータを得た。
【0140】
＜結果＞
図２～７に示される結果によって説明されるように、ｐｅｇＲＮＡの３’および／または５’末端での化学修飾としてのＭＳおよび／またはＭＰヌクレオチドの包含は、プライム編集活性を増大させる。ｐｅｇＲＮＡのプライム編集末端（ここでは３’末端）が追加的な機能性部位（例えば、プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型配列）を含有するという事実を仮定すると、ｐｅｇＲＮＡの３’末端に修飾ヌクレオチドを有する構築物の高い活性は、特に驚くべきことである。上述のように、本開示の前は、この部位での化学修飾ヌクレオチド（例えば、ＭＳおよび／またはＭＰ）の包含が、ｐｅｇＲＮＡのこれらの追加的な構成要素によって提供される機能性を妨害する可能性があろうと予期されていた。
図２～７に示される結果によって説明されるように、ｐｅｇＲＮＡの３’および／または５’末端での化学修飾としてのＭＳおよび／またはＭＰヌクレオチドの包含は、プライム編集活性を増大させる。ｐｅｇＲＮＡのプライム編集末端（ここでは３’末端）が追加的な機能性部位（例えば、プライマー結合部位および逆転写酵素の鋳型配列）を含有するという事実を仮定すると、ｐｅｇＲＮＡの３’末端に修飾ヌクレオチドを有する構築物の高い活性は、特に驚くべきことである。上述のように、本開示の前は、この部位での化学修飾ヌクレオチド（例えば、ＭＳおよび／またはＭＰ）の包含が、ｐｅｇＲＮＡのこれらの追加的な構成要素によって提供される機能性を妨害する可能性があろうと予期されていた。
【0141】
［実施例２：化学合成されたｇＲＮＡの３’末端でのＭＰおよびＭＳ修飾によるｇＲＮＡ安定性への効果］
３’末端に異なる数の連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ、または「ＭＰ」）修飾を含有するｇＲＮＡのレベルを、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（または「ＭＳ」）修飾を有するガイドＲＮＡと比較して細胞内へのトランスフェクション後の様々な期間の後に評価した。この研究の結果は、Ｒｙａｎら「Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｆｏｒ Ｃａｓ９ Ｅｄｉｔｏｒｓ．」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０２２）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｌｃ００７６８にさらに記載されている。
３’末端に異なる数の連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ、または「ＭＰ」）修飾を含有するｇＲＮＡのレベルを、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（または「ＭＳ」）修飾を有するガイドＲＮＡと比較して細胞内へのトランスフェクション後の様々な期間の後に評価した。この研究の結果は、Ｒｙａｎら「Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ Ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｙｉｅｌｄｓ ｏｆ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ ｆｏｒ Ｃａｓ９ Ｅｄｉｔｏｒｓ．」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０２２）ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｌｃ００７６８にさらに記載されている。
【0142】
＜方法＞
ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製。以前に記載された手順により、Ｄｒ．Ｏｌｉｇｏ ４８および９６合成装置（Ｂｉｏｌｙｔｉｃ Ｌａｂ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｉｎｃ．）を用いて、２’－Ｏ－チオノカルバメート保護ヌクレオシドホスホロアミダイト（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈおよびＨｏｎｇｅｎｅ）を使用して制御孔ガラス（ＬＧＣ）上にＲＮＡオリゴマーを合成した。ＭＰ修飾されたＲＮＡを合成するために使用した２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－（ジイソプロピルアミノ）－ホスフィノ酢酸－１，１－ジメチルシアノエチルエステル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルヌクレオシドをＧｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＨｏｎｇｅｎｅから購入した。ホスホロチオエート含有オリゴマーについて、カップリング反応後のヨウ素酸化ステップを、３－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンのピリジン－アセトニトリル（３：２）混液中０．０５Ｍ溶液を使用する６分間の硫化ステップによって置き換えた。特に述べない限り、固相ＲＮＡ合成のための試薬をＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌから購入した。以前の刊行物から適合させたプロトコールを使用して、上記の市販の保護ヌクレオシドホスフィノアミダイトモノマーを使用することによって、ＭＰ修飾されたｇＲＮＡに組み込まれたホスホノアセテート修飾を合成した。Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら「Ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２５．４（２００３）：９４０～９５０；Ｔｈｒｅｌｆａｌｌら「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔａｔｅ－ａｎｄ ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔａｔｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．」Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０．４（２０１２）：７４６～７５４を参照されたい。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用してすべてのオリゴヌクレオチドを精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４５ Ｑ－ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析機と結合されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズＬＣシステムを使用する液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。すべての場合で、精製ｇＲＮＡの質量スペクトルにおいて複数の荷電状態を含む一連のピークの逆畳み込みによって決定された質量は、較正された機器の誤差の範囲内で予想質量とマッチし（このアッセイに使用される品質保証のための規格は、精製ｇＲＮＡの観測質量が計算質量の０．０１％内であることである）、したがって、各合成ｇＲＮＡの組成が確認された。
ｇＲＮＡおよびｍＲＮＡの調製。以前に記載された手順により、Ｄｒ．Ｏｌｉｇｏ ４８および９６合成装置（Ｂｉｏｌｙｔｉｃ Ｌａｂ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｉｎｃ．）を用いて、２’－Ｏ－チオノカルバメート保護ヌクレオシドホスホロアミダイト（Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈおよびＨｏｎｇｅｎｅ）を使用して制御孔ガラス（ＬＧＣ）上にＲＮＡオリゴマーを合成した。ＭＰ修飾されたＲＮＡを合成するために使用した２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－（ジイソプロピルアミノ）－ホスフィノ酢酸－１，１－ジメチルシアノエチルエステル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルヌクレオシドをＧｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＨｏｎｇｅｎｅから購入した。ホスホロチオエート含有オリゴマーについて、カップリング反応後のヨウ素酸化ステップを、３－（（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－５－チオンのピリジン－アセトニトリル（３：２）混液中０．０５Ｍ溶液を使用する６分間の硫化ステップによって置き換えた。特に述べない限り、固相ＲＮＡ合成のための試薬をＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌから購入した。以前の刊行物から適合させたプロトコールを使用して、上記の市販の保護ヌクレオシドホスフィノアミダイトモノマーを使用することによって、ＭＰ修飾されたｇＲＮＡに組み込まれたホスホノアセテート修飾を合成した。Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒら「Ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２５．４（２００３）：９４０～９５０；Ｔｈｒｅｌｆａｌｌら「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔａｔｅ－ａｎｄ ｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈｏｎｏａｃｅｔａｔｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．」Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０．４（２０１２）：７４６～７５４を参照されたい。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）を使用してすべてのオリゴヌクレオチドを精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５４５ Ｑ－ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析機と結合されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズＬＣシステムを使用する液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。すべての場合で、精製ｇＲＮＡの質量スペクトルにおいて複数の荷電状態を含む一連のピークの逆畳み込みによって決定された質量は、較正された機器の誤差の範囲内で予想質量とマッチし（このアッセイに使用される品質保証のための規格は、精製ｇＲＮＡの観測質量が計算質量の０．０１％内であることである）、したがって、各合成ｇＲＮＡの組成が確認された。
【0143】
ＰＥ２タンパク質をコードするＰＥ２ ｍＲＮＡを、コード配列を提供することによってＴｒｉＬｉｎｋから特別注文として購入し、コード配列にＴｒｉＬｉｎｋはそれら独自の５’および３’ＵＴＲを付加した。注文のｍＲＮＡは、５－メチルシチジンおよびシュードウリジンで完全に置換されており、ＣｌｅａｎＣａｐ ＡＧのキャップおよびポリＡテールを有した。
【0144】
細胞培養およびヌクレオフェクション。ヒトＫ５６２細胞をＡＴＣＣから得て、１０％ウシ胎仔血清（ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭａｘ培地（ｇｉｂｃｏ）中で培養した。プライム編集のためにＰＢＳ緩衝剤中１００ｐｍｏｌのニッキングｇＲＮＡおよび１．３５ｐｍｏｌのＰＥ２ ｍＲＮＡを有する１２５ｐｍｏｌのｐｅｇＲＮＡ ８μＬと組み合わせたＳＦ緩衝液２０μＬ中でトランスフェクションあたり２０万個の細胞を用いてＬｏｎｚａ ＳＦ細胞株キット（Ｖ４ＳＣ－２９６０）を利用するＬｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（９６ウェルシャトルデバイス、プログラムＦＦ－１２０）を製造業者の使用説明書に従って使用して、Ｋ５６２細胞（継代数４～１４以内）にヌクレオフェクションを行った。環境酸素および５％二酸化炭素中、３７℃で細胞を培養し、トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収した。
【0145】
ヒトＪｕｒｋａｔクローンＥ６－１細胞をＡＴＣＣから得て、１０％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭａｘ培地中で培養した。ＰＢＳ緩衝剤中１２５ｐｍｏｌのｐｅｇＲＮＡ、１００ｐｍｏｌのニッキングｇＲＮＡおよび１．３５ｐｍｏｌのＰＥ２ ｍＲＮＡ ８μＬと組み合わせたＳＥ緩衝液２０μＬ中で２０万個の細胞を用いてＬｏｎｚａ ＳＥ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅキット（Ｖ４ＳＣ－１９６０）を利用してＪｕｒｋａｔ細胞（継代数７～２０以内）にヌクレオフェクションを行った（プログラムＣＬ－１２０）。トランスフェクションの７２時間後に培養細胞を回収した。
【0146】
ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイ。ヒトＫ５６２細胞を上記のように培養し、反復１つあたり２０万個の細胞に、記載のような１２５ｐｍｏｌのｇＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡもタンパク質も有しない）をヌクレオフェクションした。各時点で、１．７ｍＬのエッペンドルフチューブに細胞を収集し、ＰＢＳですすぎ、次いで７５０μＬのＱｉａｚｏｌ中に再懸濁し、－２０℃のフリーザーに移す前に室温に５分間保った。ｍｉＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＱｉａＣｕｂｅ ＨＴ上でＱｉａｚｏｌ＋クロロホルム抽出物からＰＢＳ中に総ＲＮＡを単離し、その直後、Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ ＩＩ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＮＥＢ）を使用してそれを逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ装置で、一方がＦＡＭで標識されたｇＲＮＡに対し、他方がΔＣｔとして計算される単離された総ＲＮＡ量に対する規準化のためのＶＩＣで標識されたＵ６ ｓｎＲＮＡに対する、２つのＴａｑＭａｎ ＭＧＢプローブを用いるＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してｑＲＴ－ＰＣＲを行った。３つ組試料についてのΔＣｔ値を平均し、最低観測平均ΔＣｔ値に対して規準化して、ΔΔＣｔ値を計算した。相対ｇＲＮＡレベルを２－ΔΔＣｔとして計算した。
【0147】
＜結果＞
図１０によって示すように、３’末端がＭＰ修飾されたｇＲＮＡのいずれか（２、３、または４つの連続するＭＰ）についての減少と比較して、トランスフェクションの１、６、および２４時間後に検出された３ｘＭＳ，３ｘＭＳ ｇＲＮＡの相対レベルにずっと急激な減少が観察された。具体的には、トランスフェクションの１時間後では、トランスフェクトされたｇＲＮＡの相対量は、３’末端保護の全部で４つの変形の間でエラーバーが大きく重複してわずかに２．６倍だけ異なったのに対し、トランスフェクションの６時間後では、はるかに大きな差が観察され、そのとき３ｘＭＳ，３ｘＭＳ保護ｇＲＮＡの残量は、３ｘＭＳ，３ｘＭＰ保護ｇＲＮＡおよび３ｘＭＳ，４ｘＭＰ保護ｇＲＮＡ（０．３４１～０．３５１）の約１／１０の相対レベル（０．０３９）に低下した。差異は、２４時間の時点でいっそう大きくなり、そのとき、それらは３’末端保護レベルに応じて、２ｘＭＰ、３ｘＭＰ、４ｘＭＰへと論理的に進行し、約２５０倍に及ぶ残留ｇＲＮＡレベルを結果として生じ、これは、３’末端保護のレベルと一致した。したがって、複合体を形成していないｇＲＮＡの３’末端にＭＰ修飾を組み込むことは、ＭＳ修飾よりもトランスフェクトされた細胞におけるそれらの安定性を有意に、具体的にはＭＳのみで修飾されたｇＲＮＡと平行して試験された３つの異なるＭＰ修飾ｇＲＮＡについて１～２桁、高めることができることが見い出された。３’末端に３または４つの連続するＭＰを有する設計は、いっそう長期の時点（トランスフェクションの７２および９６時間後）にわたり遊離ｇＲＮＡの寿命を延長することができる。
図１０によって示すように、３’末端がＭＰ修飾されたｇＲＮＡのいずれか（２、３、または４つの連続するＭＰ）についての減少と比較して、トランスフェクションの１、６、および２４時間後に検出された３ｘＭＳ，３ｘＭＳ ｇＲＮＡの相対レベルにずっと急激な減少が観察された。具体的には、トランスフェクションの１時間後では、トランスフェクトされたｇＲＮＡの相対量は、３’末端保護の全部で４つの変形の間でエラーバーが大きく重複してわずかに２．６倍だけ異なったのに対し、トランスフェクションの６時間後では、はるかに大きな差が観察され、そのとき３ｘＭＳ，３ｘＭＳ保護ｇＲＮＡの残量は、３ｘＭＳ，３ｘＭＰ保護ｇＲＮＡおよび３ｘＭＳ，４ｘＭＰ保護ｇＲＮＡ（０．３４１～０．３５１）の約１／１０の相対レベル（０．０３９）に低下した。差異は、２４時間の時点でいっそう大きくなり、そのとき、それらは３’末端保護レベルに応じて、２ｘＭＰ、３ｘＭＰ、４ｘＭＰへと論理的に進行し、約２５０倍に及ぶ残留ｇＲＮＡレベルを結果として生じ、これは、３’末端保護のレベルと一致した。したがって、複合体を形成していないｇＲＮＡの３’末端にＭＰ修飾を組み込むことは、ＭＳ修飾よりもトランスフェクトされた細胞におけるそれらの安定性を有意に、具体的にはＭＳのみで修飾されたｇＲＮＡと平行して試験された３つの異なるＭＰ修飾ｇＲＮＡについて１～２桁、高めることができることが見い出された。３’末端に３または４つの連続するＭＰを有する設計は、いっそう長期の時点（トランスフェクションの７２および９６時間後）にわたり遊離ｇＲＮＡの寿命を延長することができる。
【0148】
［実施例３：化学合成されたｐｅｇＲＮＡ３’末端でのＭＰまたはＭＳ修飾の組込みの評価］
ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするまたはＲＵＮＸ１に３塩基の挿入を導入する、文献から採用されたプライム編集の２つのアプローチを探求するための実験を行った。両アプローチ共に、１５個のヌクレオチドを含むプライマー結合プライマー結合配列を有するｐｅｇＲＮＡを利用する。本実験で評価した特定の配列編集を図１１に示す。
ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするまたはＲＵＮＸ１に３塩基の挿入を導入する、文献から採用されたプライム編集の２つのアプローチを探求するための実験を行った。両アプローチ共に、１５個のヌクレオチドを含むプライマー結合プライマー結合配列を有するｐｅｇＲＮＡを利用する。本実験で評価した特定の配列編集を図１１に示す。
【0149】
＜方法＞
方法は、実施例２に記載されるものと基本的に同じである。手短に言えば、プライム編集アプローチを、ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするためまたはＲＵＮＸ１に３塩基挿入を導入するために採用した。ＥＭＸ１またはＲＵＮＸ１の編集のために、Ｋ５６２細胞に、プライムエディターｍＲＮＡ（この場合、Ｃａｓ９ニッカーゼおよびＭＭＬＶ由来逆転写酵素を含む融合タンパク質）と、５’末端での３ｘＭＳおよび３’末端での様々な修飾スキーム（表示通り）によって修飾された合成ｐｅｇＲＮＡとを共トランスフェクトした。ＥＭＸ１またはＲＵＮＸ１の編集のために、同じｐｅｇＲＮＡを使用してＪｕｒｋａｔ細胞に同様にトランスフェクトした。所望の編集（％編集）および任意の夾雑インデル副産物（％Ｂｙ－インデル）の両方について、標的座位のＰＣＲアンプリコンのディープシーケンシングによって編集効率を測定した。添付の図面中の棒線は、標準偏差付きの平均を表す（ｎ＝３）。
方法は、実施例２に記載されるものと基本的に同じである。手短に言えば、プライム編集アプローチを、ＥＭＸ１におけるＰＡＭをノックアウトするためまたはＲＵＮＸ１に３塩基挿入を導入するために採用した。ＥＭＸ１またはＲＵＮＸ１の編集のために、Ｋ５６２細胞に、プライムエディターｍＲＮＡ（この場合、Ｃａｓ９ニッカーゼおよびＭＭＬＶ由来逆転写酵素を含む融合タンパク質）と、５’末端での３ｘＭＳおよび３’末端での様々な修飾スキーム（表示通り）によって修飾された合成ｐｅｇＲＮＡとを共トランスフェクトした。ＥＭＸ１またはＲＵＮＸ１の編集のために、同じｐｅｇＲＮＡを使用してＪｕｒｋａｔ細胞に同様にトランスフェクトした。所望の編集（％編集）および任意の夾雑インデル副産物（％Ｂｙ－インデル）の両方について、標的座位のＰＣＲアンプリコンのディープシーケンシングによって編集効率を測定した。添付の図面中の棒線は、標準偏差付きの平均を表す（ｎ＝３）。
【0150】
ＰＣＲ標的化ディープシーケンシングおよび標的化ゲノム修飾の定量。ゲノムＤＮＡの精製およびＰＣＲ標的化ディープシーケンシングライブラリーの構築を前記のように行った。Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＢＲアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してライブラリーの濃度を決定した。ペアードエンドの２×２２０ｂｐのリードを、０．８ｎｇ／μＬのＰＣＲ増幅されたライブラリーで、２０．５％ ＰｈｉＸと共にＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列決定した。
ＦＬＡＳＨバージョン１．２．１１ソフトウェアを使用してペアードエンドリードを併合し、次いでデフォルトのパラメーターに設定したＢＷＡ－ＭＥＭソフトウェア（ｂｗａ－０．７．１０）を使用してヒトゲノムに対してマッピングした。挿入または欠失がＣａｓ９切断部位の１０ｂｐ以内に見い出されたかにより、インデルを有するかまたは有しないとリードをスコア化した。プライム編集分析について、所望の編集がリード内から同定されたならば、編集を有するとリードをスコア化した。シチジン塩基編集分析について、シチジンがＰＡＭ部位の１０～２０ｂｐ上流のウインドウ内で編集されたならば、塩基が編集されたとしてリードをスコア化した。各実験での各反復について、マッピングしたアンプリコン座位に応じてマッピングリードを分離し、インデルまたは編集の存在または非存在によってビン分けした。ビンあたりのリードの集計を使用して、各座位で産生された％インデルまたは％編集を計算した。プロットのためにインデルまたは編集収率および標準偏差を、正規分布に近似するためにｌｎ（ｒ／（１－ｒ））として変換された％インデルまたは％編集のロジット変換によって計算した（式中、ｒは、特定の座位あたりの％インデルまたは％編集である）。３つ組モックトランスフェクションは平均モック対照（または陰性対照）を与えたが、対応する陰性対照よりも有意に高い（ｔ検定でｐ＜０．０５）平均インデル収率または平均編集収率を示す３つ組試料を、バックグラウンドよりも高いと見なした。
ＦＬＡＳＨバージョン１．２．１１ソフトウェアを使用してペアードエンドリードを併合し、次いでデフォルトのパラメーターに設定したＢＷＡ－ＭＥＭソフトウェア（ｂｗａ－０．７．１０）を使用してヒトゲノムに対してマッピングした。挿入または欠失がＣａｓ９切断部位の１０ｂｐ以内に見い出されたかにより、インデルを有するかまたは有しないとリードをスコア化した。プライム編集分析について、所望の編集がリード内から同定されたならば、編集を有するとリードをスコア化した。シチジン塩基編集分析について、シチジンがＰＡＭ部位の１０～２０ｂｐ上流のウインドウ内で編集されたならば、塩基が編集されたとしてリードをスコア化した。各実験での各反復について、マッピングしたアンプリコン座位に応じてマッピングリードを分離し、インデルまたは編集の存在または非存在によってビン分けした。ビンあたりのリードの集計を使用して、各座位で産生された％インデルまたは％編集を計算した。プロットのためにインデルまたは編集収率および標準偏差を、正規分布に近似するためにｌｎ（ｒ／（１－ｒ））として変換された％インデルまたは％編集のロジット変換によって計算した（式中、ｒは、特定の座位あたりの％インデルまたは％編集である）。３つ組モックトランスフェクションは平均モック対照（または陰性対照）を与えたが、対応する陰性対照よりも有意に高い（ｔ検定でｐ＜０．０５）平均インデル収率または平均編集収率を示す３つ組試料を、バックグラウンドよりも高いと見なした。
【0151】
＜結果＞
図１２～１５によって示すように、本実験は、両方の標的について３’末端に３ｘＭＳを有するｐｅｇＲＮＡを、３’末端に１、２または３つの連続するＭＰを有する代替的な設計と比較した。Ｋ５６２またはＪｕｒｋａｔ細胞において各ｐｅｇＲＮＡをＰＥ２のｍＲＮＡと共トランスフェクトした、結果は、３’末端にＭＰ修飾を有するｐｅｇＲＮＡが良好な性能を示し、３ｘＭＳと類似の、または場合によっては幾分高い編集収率を達成できることを示している。ここで試験した２つのｐｅｇＲＮＡ配列について、３’末端に２×ＭＰおよび／または３ｘＭＰを有する設計は、３’末端に１ｘＭＰを有する設計よりも一貫して良好な性能を示した（具体的には１．２～１．４倍良好）。
［例示的な実施形態］
＜製品の実施形態（Ｐ実施形態）＞
Ｐ１． 核酸の標的領域内の標的配列と相補的なガイド配列と；
ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質と相互作用できる配列と；
前記核酸の配列への１つまたは複数の編集を含む逆転写酵素の鋳型と；
前記標的領域とハイブリダイズできるプライマー結合部位と
を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）であって、
前記ｐｅｇＲＮＡが、（ａ）一方がプライム編集末端であり、他方が遠位末端である５’末端および３’末端と；（ｂ）プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドとを含み、各修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、および２’－デオキシから選択される２’修飾を含むヌクレオチドであり、ヌクレオチド間連結修飾が、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノカルボキシレート、および３’－チオホスホノカルボキシレートから選択される、ｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２． 前記核酸の配列への１つまたは複数の編集が、前記核酸の配列への１つまたは複数のヌクレオチド変化の組込みおよび／または標的変異誘発を含む、実施形態Ｐ１に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３． 前記核酸の配列への１つまたは複数の編集が、１つもしくは複数の単一ヌクレオチド変化、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、および／または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失を含む、実施形態Ｐ１またはＰ２に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４． 前記ｐｅｇＲＮＡが一本鎖ガイドＲＮＡである、実施形態Ｐ１～Ｐ３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ５． ３’－ホスホノカルボキシレートが３’－ホスホノアセテートである、実施形態Ｐ１～Ｐ４のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ６． ３’－チオホスホノカルボキシレートが３’－チオホスホノアセテートである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ７． 前記プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノアセテート（「ＭＳＰ」）を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ６のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ８． 前記ｐｅｇＲＮＡの３’末端が、プライマー結合部位配列の一部である、実施形態Ｐ１～Ｐ７のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ９． 遠位末端の５つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ８のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１０． 遠位末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’－ＭＯＥ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシから選択される２’修飾を含むヌクレオチドと、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノカルボキシレート、および３’－チオホスホノカルボキシレートから選択されるヌクレオチド間連結修飾とを含む、実施形態Ｐ９に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１１． ３’－ホスホノカルボキシレートが３’－ホスホノアセテートである、実施形態Ｐ１０に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１２． ３’－チオホスホノカルボキシレートが３’－チオホスホノアセテートである、実施形態Ｐ１０またはＰ１１に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１３． プライム編集末端および遠位末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、両方ともＭＳ、ＭＰおよび／またはＭＳＰを含む、実施形態Ｐ１０～Ｐ１２のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１４． ｐｅｇＲＮＡの３’末端が伸長テールを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１５． 前記伸長テールが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つ、または１０個のウリジン塩基を含む、実施形態Ｐ１４に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１６． プライム編集末端に伸長テールを含まない、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１７． プライム編集末端にポリ（Ｎ）テールを含まない、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１８． プライム編集末端にポリウリジンテールを含まない、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１９． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドがＭＳを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１８のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２０． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、３’－ホスホノカルボキシレートヌクレオチド間連結を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１９のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２１． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドがＭＰを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２０のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２２． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが３’－チオホスホノカルボキシレートヌクレオチド間連結を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２１のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２３． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドがＭＳＰを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２２のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２４． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内に２つの連続するＭＳ、２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチドまたは２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２２のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２５． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内に３つの連続するＭＳ、３つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチドまたは３つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２６． ３’－ホスホノカルボキシレートが３’－ホスホノアセテートであり、３’－チオホスホノカルボキシレートが３’－チオホスホノアセテートである、実施形態Ｐ２４またはＰ２５に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２７． プライム編集末端での１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ＭＳも、ＭＰも、ＭＳＰも含まないが、（１）２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシから選択される２’－修飾と、（２）ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、およびチオホスホノカルボキシレートから選択されるヌクレオチド間連結修飾とを含むヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれかに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２８． 遠位末端での１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ＭＳも、ＭＰも、ＭＳＰも含まないが、（１）２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシから選択される２’－修飾と、（２）ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、およびチオホスホノカルボキシレートから選択されるヌクレオチド間連結修飾とを含むヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２９． プライム編集末端または遠位末端の５つのヌクレオチド内ではない少なくとも１つの修飾ヌクレオチドをさらに含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３０． プライマー結合部位が２’－デオキシ修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３１． プライマー結合部位内のどのヌクレオチドも２’－デオキシ修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３２． 逆転写酵素の鋳型内のどのヌクレオチドも２’－デオキシ修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３３． ｐｅｇＲＮＡの３’末端での第１のヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３４． Ｃａｓ９様式のガイドＲＮＡである、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３５． Ｃｐｆ１様式のガイドＲＮＡである、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３６． プライム編集末端が３’末端である、実施形態Ｐ１～Ｐ３５のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３７． プライム編集末端が５’末端である、実施形態Ｐ１～Ｐ３５のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３８． ５’末端から３’末端にかけて、ガイド配列、Ｃａｓ９の足場、逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３９． ５’末端から３’末端にかけて、逆転写酵素の鋳型、プライマー結合部位、ガイド配列および足場を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４０． ５’末端から３’末端にかけて、逆転写酵素の鋳型、プライマー結合部位、足場およびガイド配列を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４１． ５’末端から３’末端にかけて、足場、ガイド配列、逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４２． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内にＭＳを含む場合に、プライム編集末端に伸長テールを含まないことを条件とする、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４３． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾がＭＳを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４４． 前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）。
Ｐ４５． Ｃａｓタンパク質が、逆転写酵素も含む融合タンパク質中にある、実施形態Ｐ４４に記載のＲＮＰ。
Ｐ４６． 前記実施形態のいずれか１つと独立した１つまたは複数のｐｅｇＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素（またはＣａｓタンパク質および／もしくは逆転写酵素をコードする核酸）と、必要に応じて１つまたは複数の緩衝剤とを含むキット。
Ｐ４７． Ｃａｓタンパク質と逆転写酵素とを含む融合タンパク質、または融合タンパク質をコードする核酸を含む、実施形態Ｐ４６に記載のキット。
＜方法の実施形態（Ｍ実施形態）＞
Ｍ１． 核酸を、
核酸の一本鎖にニックを入れることができるＣａｓタンパク質；
逆転写酵素；および
Ｐ実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ
と接触させることを含む、核酸における標的領域を編集する方法であって、
前記接触させることが、標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
Ｍ２． Ｃａｓタンパク質と逆転写酵素とが、融合タンパク質として、直接的にまたは間接的に共有結合的に連結している、実施形態Ｍ１に記載の方法。
Ｍ３． 逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素であり、ＭＭＬＶ逆転写酵素が、逆転写酵素活性を含む野生型または変異型バージョンである、実施形態Ｍ１またはＭ２に記載の方法。
Ｍ４． Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素が、Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素をコードするｍＲＮＡとして提供される、実施形態Ｍ１～Ｍ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ５． Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素が、Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素をコードするＤＮＡとして提供される、実施形態Ｍ１～Ｍ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ６． Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素とｐｅｇＲＮＡとが、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）として提供される、実施形態Ｍ１～Ｍ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ７． 接触させることが、細胞において行われる、実施形態Ｍ１～Ｍ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ８． 細胞がエクスビボに存在する、実施形態Ｍ７に記載の方法。
Ｍ９． 細胞がインビボに存在する、実施形態Ｍ８に記載の方法。
Ｍ１０． 細胞が初代細胞である、実施形態Ｍ８に記載の方法。
Ｍ１１． 細胞がＴ細胞である、実施形態Ｍ７～Ｍ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ１２． 第１の核酸標的領域および第２の核酸標的領域を、
核酸標的領域の一本鎖にニックを入れることができるＣａｓタンパク質；
逆転写酵素；
第１の核酸標的領域に特異的なガイド配列を有するＰ実施形態のいずれか１つに記載の第１のｐｅｇＲＮＡ；および
第２の核酸標的領域に特異的なガイド配列を有するＰ実施形態のいずれか１つに記載の第２のｐｅｇＲＮＡ
と接触させることを含む、少なくとも２つの核酸標的領域を編集する方法であって、
前記接触させることが、第１および第２の核酸標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
Ｍ１３． ２つの標的領域が同じ遺伝子に位置する、実施形態Ｍ１２に記載の方法。
Ｍ１４． ２つの標的領域が異なる遺伝子に位置する、実施形態Ｍ１２に記載の方法。
Ｍ１５． 実施形態Ｍ２～Ｍ１１に記載されるエレメント、限定またはステップのいずれかをさらに含む、実施形態Ｍ１２～Ｍ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ１６． 前記Ｍ実施形態のいずれか１つに記載の方法によって編集された細胞。
図１２～１５によって示すように、本実験は、両方の標的について３’末端に３ｘＭＳを有するｐｅｇＲＮＡを、３’末端に１、２または３つの連続するＭＰを有する代替的な設計と比較した。Ｋ５６２またはＪｕｒｋａｔ細胞において各ｐｅｇＲＮＡをＰＥ２のｍＲＮＡと共トランスフェクトした、結果は、３’末端にＭＰ修飾を有するｐｅｇＲＮＡが良好な性能を示し、３ｘＭＳと類似の、または場合によっては幾分高い編集収率を達成できることを示している。ここで試験した２つのｐｅｇＲＮＡ配列について、３’末端に２×ＭＰおよび／または３ｘＭＰを有する設計は、３’末端に１ｘＭＰを有する設計よりも一貫して良好な性能を示した（具体的には１．２～１．４倍良好）。
［例示的な実施形態］
＜製品の実施形態（Ｐ実施形態）＞
Ｐ１． 核酸の標的領域内の標的配列と相補的なガイド配列と；
ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質と相互作用できる配列と；
前記核酸の配列への１つまたは複数の編集を含む逆転写酵素の鋳型と；
前記標的領域とハイブリダイズできるプライマー結合部位と
を含むプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）であって、
前記ｐｅｇＲＮＡが、（ａ）一方がプライム編集末端であり、他方が遠位末端である５’末端および３’末端と；（ｂ）プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドとを含み、各修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、および２’－デオキシから選択される２’修飾を含むヌクレオチドであり、ヌクレオチド間連結修飾が、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノカルボキシレート、および３’－チオホスホノカルボキシレートから選択される、ｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２． 前記核酸の配列への１つまたは複数の編集が、前記核酸の配列への１つまたは複数のヌクレオチド変化の組込みおよび／または標的変異誘発を含む、実施形態Ｐ１に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３． 前記核酸の配列への１つまたは複数の編集が、１つもしくは複数の単一ヌクレオチド変化、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、および／または１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失を含む、実施形態Ｐ１またはＰ２に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４． 前記ｐｅｇＲＮＡが一本鎖ガイドＲＮＡである、実施形態Ｐ１～Ｐ３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ５． ３’－ホスホノカルボキシレートが３’－ホスホノアセテートである、実施形態Ｐ１～Ｐ４のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ６． ３’－チオホスホノカルボキシレートが３’－チオホスホノアセテートである、実施形態Ｐ１～Ｐ５のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ７． 前記プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノアセテート（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノアセテート（「ＭＳＰ」）を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ６のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ８． 前記ｐｅｇＲＮＡの３’末端が、プライマー結合部位配列の一部である、実施形態Ｐ１～Ｐ７のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ９． 遠位末端の５つのヌクレオチド内に１つまたは複数の修飾ヌクレオチドをさらに含む、実施形態Ｐ１～Ｐ８のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１０． 遠位末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、２’－ＭＯＥ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシから選択される２’修飾を含むヌクレオチドと、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノカルボキシレート、および３’－チオホスホノカルボキシレートから選択されるヌクレオチド間連結修飾とを含む、実施形態Ｐ９に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１１． ３’－ホスホノカルボキシレートが３’－ホスホノアセテートである、実施形態Ｐ１０に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１２． ３’－チオホスホノカルボキシレートが３’－チオホスホノアセテートである、実施形態Ｐ１０またはＰ１１に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１３． プライム編集末端および遠位末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、両方ともＭＳ、ＭＰおよび／またはＭＳＰを含む、実施形態Ｐ１０～Ｐ１２のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１４． ｐｅｇＲＮＡの３’末端が伸長テールを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１５． 前記伸長テールが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つ、または１０個のウリジン塩基を含む、実施形態Ｐ１４に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１６． プライム編集末端に伸長テールを含まない、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１７． プライム編集末端にポリ（Ｎ）テールを含まない、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１８． プライム編集末端にポリウリジンテールを含まない、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ１９． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドがＭＳを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１８のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２０． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、３’－ホスホノカルボキシレートヌクレオチド間連結を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ１９のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２１． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドがＭＰを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２０のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２２． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが３’－チオホスホノカルボキシレートヌクレオチド間連結を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２１のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２３． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾ヌクレオチドがＭＳＰを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２２のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２４． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内に２つの連続するＭＳ、２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチドまたは２つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２２のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２５． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内に３つの連続するＭＳ、３つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチドまたは３つの連続する２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノカルボキシレート修飾ヌクレオチドを含む、実施形態Ｐ１～Ｐ２３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２６． ３’－ホスホノカルボキシレートが３’－ホスホノアセテートであり、３’－チオホスホノカルボキシレートが３’－チオホスホノアセテートである、実施形態Ｐ２４またはＰ２５に記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２７． プライム編集末端での１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ＭＳも、ＭＰも、ＭＳＰも含まないが、（１）２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシから選択される２’－修飾と、（２）ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、およびチオホスホノカルボキシレートから選択されるヌクレオチド間連結修飾とを含むヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれかに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２８． 遠位末端での１つまたは複数の修飾ヌクレオチドが、ＭＳも、ＭＰも、ＭＳＰも含まないが、（１）２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシから選択される２’－修飾と、（２）ホスホロチオエート、ホスホノカルボキシレート、およびチオホスホノカルボキシレートから選択されるヌクレオチド間連結修飾とを含むヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ２９． プライム編集末端または遠位末端の５つのヌクレオチド内ではない少なくとも１つの修飾ヌクレオチドをさらに含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３０． プライマー結合部位が２’－デオキシ修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３１． プライマー結合部位内のどのヌクレオチドも２’－デオキシ修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３２． 逆転写酵素の鋳型内のどのヌクレオチドも２’－デオキシ修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３３． ｐｅｇＲＮＡの３’末端での第１のヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３４． Ｃａｓ９様式のガイドＲＮＡである、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３５． Ｃｐｆ１様式のガイドＲＮＡである、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３６． プライム編集末端が３’末端である、実施形態Ｐ１～Ｐ３５のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３７． プライム編集末端が５’末端である、実施形態Ｐ１～Ｐ３５のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３８． ５’末端から３’末端にかけて、ガイド配列、Ｃａｓ９の足場、逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ３９． ５’末端から３’末端にかけて、逆転写酵素の鋳型、プライマー結合部位、ガイド配列および足場を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４０． ５’末端から３’末端にかけて、逆転写酵素の鋳型、プライマー結合部位、足場およびガイド配列を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４１． ５’末端から３’末端にかけて、足場、ガイド配列、逆転写酵素の鋳型およびプライマー結合部位を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ３３のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４２． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内にＭＳを含む場合に、プライム編集末端に伸長テールを含まないことを条件とする、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４３． プライム編集末端の５つのヌクレオチド内の１つまたは複数の修飾がＭＳを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ。
Ｐ４４． 前記実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）。
Ｐ４５． Ｃａｓタンパク質が、逆転写酵素も含む融合タンパク質中にある、実施形態Ｐ４４に記載のＲＮＰ。
Ｐ４６． 前記実施形態のいずれか１つと独立した１つまたは複数のｐｅｇＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素（またはＣａｓタンパク質および／もしくは逆転写酵素をコードする核酸）と、必要に応じて１つまたは複数の緩衝剤とを含むキット。
Ｐ４７． Ｃａｓタンパク質と逆転写酵素とを含む融合タンパク質、または融合タンパク質をコードする核酸を含む、実施形態Ｐ４６に記載のキット。
＜方法の実施形態（Ｍ実施形態）＞
Ｍ１． 核酸を、
核酸の一本鎖にニックを入れることができるＣａｓタンパク質；
逆転写酵素；および
Ｐ実施形態のいずれか１つに記載のｐｅｇＲＮＡ
と接触させることを含む、核酸における標的領域を編集する方法であって、
前記接触させることが、標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
Ｍ２． Ｃａｓタンパク質と逆転写酵素とが、融合タンパク質として、直接的にまたは間接的に共有結合的に連結している、実施形態Ｍ１に記載の方法。
Ｍ３． 逆転写酵素がＭＭＬＶ逆転写酵素であり、ＭＭＬＶ逆転写酵素が、逆転写酵素活性を含む野生型または変異型バージョンである、実施形態Ｍ１またはＭ２に記載の方法。
Ｍ４． Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素が、Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素をコードするｍＲＮＡとして提供される、実施形態Ｍ１～Ｍ３のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ５． Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素が、Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素をコードするＤＮＡとして提供される、実施形態Ｍ１～Ｍ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ６． Ｃａｓタンパク質および／または逆転写酵素とｐｅｇＲＮＡとが、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）として提供される、実施形態Ｍ１～Ｍ４のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ７． 接触させることが、細胞において行われる、実施形態Ｍ１～Ｍ６のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ８． 細胞がエクスビボに存在する、実施形態Ｍ７に記載の方法。
Ｍ９． 細胞がインビボに存在する、実施形態Ｍ８に記載の方法。
Ｍ１０． 細胞が初代細胞である、実施形態Ｍ８に記載の方法。
Ｍ１１． 細胞がＴ細胞である、実施形態Ｍ７～Ｍ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ１２． 第１の核酸標的領域および第２の核酸標的領域を、
核酸標的領域の一本鎖にニックを入れることができるＣａｓタンパク質；
逆転写酵素；
第１の核酸標的領域に特異的なガイド配列を有するＰ実施形態のいずれか１つに記載の第１のｐｅｇＲＮＡ；および
第２の核酸標的領域に特異的なガイド配列を有するＰ実施形態のいずれか１つに記載の第２のｐｅｇＲＮＡ
と接触させることを含む、少なくとも２つの核酸標的領域を編集する方法であって、
前記接触させることが、第１および第２の核酸標的領域の編集を結果としてもたらす、方法。
Ｍ１３． ２つの標的領域が同じ遺伝子に位置する、実施形態Ｍ１２に記載の方法。
Ｍ１４． ２つの標的領域が異なる遺伝子に位置する、実施形態Ｍ１２に記載の方法。
Ｍ１５． 実施形態Ｍ２～Ｍ１１に記載されるエレメント、限定またはステップのいずれかをさらに含む、実施形態Ｍ１２～Ｍ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｍ１６． 前記Ｍ実施形態のいずれか１つに記載の方法によって編集された細胞。
【0152】
例示的なまたは好ましい実施形態の前述の説明は、特許請求の範囲によって定義される場合の本開示を限定するのではなく、例示するものと見なすべきである。容易に認識されるように、上に示される特徴の多数の変形形態および組合せは、特許請求の範囲に示される本開示から逸脱せずに利用することができる。このような変形形態は、本開示の範囲からの逸脱と見なされず、すべてのこのような変形形態は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。本明細書に引用されるすべての参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれている。
【0153】
本明細書に言及するすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれていると具体的かつ個別に示された場合と同程度に参照により本明細書の一部をなすものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【配列表】
【国際調査報告】