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▶ ソーター・バイオファーマ・プライベイト・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】抗ＡＮＧ２抗体、その調製方法及び使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/22 20060101AFI20240918BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240918BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240918BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240918BHJP
C07K 14/54 20060101ALI20240918BHJP
C07K 14/525 20060101ALI20240918BHJP
C07K 14/57 20060101ALI20240918BHJP
C07K 14/535 20060101ALI20240918BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20240918BHJP
C07K 14/52 20060101ALI20240918BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/28 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/26 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/24 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/23 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/19 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/27 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240918BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240918BHJP
C07K 16/08 20060101ALI20240918BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240918BHJP
C07K 16/12 20060101ALI20240918BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20240918BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240918BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240918BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240918BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240918BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20240918BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240918BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240918BHJP
【ＦＩ】
C07K16/22
C12N15/13 ZNA
C07K19/00
C07K16/46
C07K14/54
C07K14/525
C07K14/57
C07K14/535
C07K14/55
C07K14/52
C07K16/28
C12N15/62 Z
C12N15/28
C12N15/26
C12N15/24
C12N15/23
C12N15/19
C12N15/27
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/08
C07K16/30
C07K16/12
C07K16/24
A61K39/395 N
A61K47/68
A61K39/395 L
A61P27/02
A61P19/02
A61P17/06
A61P35/00
A61K9/08
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515391
(86)(22)【出願日】2021-09-10
(85)【翻訳文提出日】2024-04-17
(86)【国際出願番号】 CN2021117697
(87)【国際公開番号】W WO2023035226
(87)【国際公開日】2023-03-16
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523320526
【氏名又は名称】ソーター・バイオファーマ・プライベイト・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＯＴＥＲ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ ＰＴＥ． ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】石剣
(72)【発明者】
【氏名】方麗娟
(72)【発明者】
【氏名】厳永祥
(72)【発明者】
【氏名】張敬
(72)【発明者】
【氏名】華珊
(72)【発明者】
【氏名】周鵬飛
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA92Y
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA12
4C076AA95
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB24
4C076CC09
4C076CC10
4C076CC18
4C076CC26
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF11
4C076FF68
4C085AA14
4C085AA21
4C085AA25
4C085AA27
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045BA70
4H045BA71
4H045BA72
4H045CA42
4H045DA04
4H045DA12
4H045DA14
4H045DA18
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA24
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、及びその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のいずれか一項に示す重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又はその変異体を含む抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であって、好ましくは、ＩＭＧＴナンバリング体系に従い、以下の各項からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すＨＣＤＲ３であり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示すＨＣＤＲ３であり、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示すＨＣＤＲ３であり、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体、及びそれらの組合せであって、前記変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３と比べてそれぞれ１つ又は複数（好ましくは１つ、２つ又は３つ）の保存アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有し、かつＡＮＧ２との結合親和性を保留したアミノ酸配列であり、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＣＤＲ１における５～８番目及び１０～１１番目のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＣＤＲ２における２～５番目のアミノ酸及び７番目、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＣＤＲ３の１番目のアミノ酸、３～８番目のアミノ酸は、アミノ酸Ｘから選択され、前記アミノ酸Ｘは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選択され、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１の変異体において、１番目のグリシンＧはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、２番目のフェニルアラニンＦはＴｙｒにより、３番目のプロリンＰはＴｒｐ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸により、４番目のＳｅｒはＴｈｒにより、９番目のＳｅｒはＴｈｒにより、１２番目のＧｌｎはＡｓｎにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２の変異体について、１番目のＩｌｅはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸により、６番目のＬｅｕはＩｌｅにより、８番目のＬｙｓはＡｒｇにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体において、２番目のＶａｌはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、９番目のＡｓｐはＧｌｕにより置換されてもよく、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示すＨＣＤＲ３であり、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、および
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示すＨＣＤＲ３である、
抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体。
【請求項2】
前記ＡＮＧ２は、ヒトＡＮＧ２、ウサギＡＮＧ２、又はサルＡＮＧ２から選択される、請求項１に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体。
【請求項3】
重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のいずれか一項に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のいずれか一項に記載の配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有し且つＡＮＧ２結合活性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成される、請求項１又は２に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体を含む組換えプロテインであって、好ましくは、前記組換えプロテインは生物活性物質、例えば酵素活性を有する毒素又はその活性断片（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素）、腫瘍壊死因子又はインターフェロン（例えばＩＦＮ－γ）、生物反応調節物（例えばリンフォカイン、ＩＬ－２、ＩＬ－２、ＩＬ２－６、ＩＬ－１０、粒ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｃ断片（例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のサブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ由来のＦｃ領域、例えばヒト、ウサギ又はサルのＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ由来のＦｃ領域）をさらに含み、好ましくは、前記抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体と前記Ｆｃ断片は、連結ペプチドにより連結され、好ましくは、前記連結ペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎ＝１、２又は３であり、好ましくは、前記Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり、より好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＫ３０３１８５．１に示すＦｃ断片であり、より好ましくは、前記組換えプロテインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０に示す配列を含むか、又は上記配列から構成される、
組換えプロテイン。
【請求項5】
多重特異性抗体であって、好ましくは二重特異性抗体であり、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体を含み、好ましくは前記二重特異性抗体の構造は、軽鎖及び重鎖を含み、そのうち、軽－重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、２つの重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、そのうち、重鎖は、（ＶＨ）－（ＣＨ１）－（ヒンジ領域）－（Ｆｃ）－（連結ペプチド）－（ＶＨＨ）であり、軽鎖は、（ＶＬ）－（軽鎖定常領域）である、
多重特異性抗体。
【請求項6】
ＶＨＨは請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であり、ＶＨ及びＶＬは第２種の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域であり、好ましくは、前記第２種の抗体により向けられる抗原は、免疫細胞表面抗原、腫瘍抗原、ウイルス、細菌、エンドトキシン、サイトカイン、又はそれらの組合せから選択され、より好ましくは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＥＡ、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、Ｂ７－Ｈ３、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３、及び／又はＣＤ１６ａから選択され、好ましくは、第２種の抗体により向けられる抗原は、ＶＥＧＦであり、より好ましくは、第２抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体から選択され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３（好ましくはＩＭＧＴナンバリング体系に従い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示すＨＣＤＲ３を含む）と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（好ましくはＩＭＧＴナンバリング体系に従い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示すＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示すＬＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示すＬＣＤＲ３を含む）と、を含み、より好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成され、前記抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成される、請求項５に記載の多重特異性抗体。
【請求項7】
ＣＨ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に、ヒンジ領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に、Ｆｃ定常領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に、連結ペプチドの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又は４７に、軽鎖定常領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示すとおりである、請求項５又は６に記載の多重特異性抗体。
【請求項8】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、又は請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項9】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項10】
請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項11】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、又は請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、及びカップリング部分を含むカップリング物であって、前記カップリング部分は、精製タグ（例えばＨｉｓタグ）、検出可能な標識、薬品、毒素、サイトカイン、酵素、又はそれらの組合せであり、好ましくは、前記カップリング部分は、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、有色物、化学療法剤、生物毒素、ポリエチレングリコール又は酵素である、カップリング物。
【請求項12】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１１に記載のカップリング物を含むキットであって、好ましくは、前記キットは、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１１に記載のカップリング物を特異的に認識する抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、組換えプロテイン又は多重特異性抗体をさらに含み、任意に、前記抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、組換えプロテイン又は多重特異性抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、有色物又は酵素をさらに含み、好ましくは、前記キットは、ＡＮＧ２のサンプルにおける存在又はそのレベルを検出するために用いられ、又は前記キットは、（１）請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１１に記載のカップリング物、及び（２）他の抗原に対する抗体又はその抗原結合断片、及び／又は細胞毒性剤、及び／又は化学療法薬、及び選択可能な取扱説明書を含む、
キット。
【請求項13】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１１に記載のカップリング物を含む医薬組成物であって、選択的に、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なベクター及び／又は賦形剤をさらに含み、好ましくは、前記医薬組成物は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は病巣内注射による投与に適した形式である、医薬組成物。
【請求項14】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１１に記載のカップリング物の、ＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制すること、血管新生過程による疾病又はそれに関連する疾病、例えば眼底新生血管性疾病、関節リウマチ及び乾癬、及び／又は腫瘍を予防及び／又は治療することにおける使用、又はＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制し、血管新生過程による疾病又はそれに関連する疾病、例えば眼底新生血管性疾病、関節リウマチ及び乾癬及び／又は腫瘍を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬の分野に関し、具体的にはＡＮＧ２（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２、ヒト血管新生２）の抗体、その調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＡＮＧ２に対する抗体は、新生血管の形成と漏出を抑制し、炎症反応の発生を減少することができる。ＡＮＧ／Ｔｉｅ２は、血管新生を調節する重要な信号通路である。ＡＮＧ１は、内皮細胞受容体Ｔｉｅ２のリン酸化を促進し、血管平滑筋細胞、周皮細胞等の血管周囲細胞が内皮細胞を取り囲んで支持するように吸引し、血管リモデリングを促進し、血管の完全性を維持して血管機能を調節し、ＡＮＧ１は血管を病変から保護し、かつ血管形態を維持することができるがが、ＡＮＧ２は血管漏出を促進し、低血圧及び血管構造の異常を引き起こす。企業開発の臨床実験中のＡＮＧ２抗体が数多くあるものの、現時点ではＡＮＧ２に対する抗体薬品はまだ市場に出ていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、ＡＮＧ２に対する特異性モノクローン抗体を提供し、ＡＮＧ２の血管新生促進活性の抑制、および血管新生過程による疾病及び病症又はそれに関連する疾病及び病症、例えば眼底新生血管性疾病、関節リウマチ及び乾癬の治療において作用する。また、血管新生は、腫瘍成長及び維持にとって非常に重要であり、ＡＮＧ２を抑制するモノクローン抗体は、がんの治療過程においても作用することが可能である。また、本発明は、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦに対する二重特異性抗体をさらに提供する。本発明の抗体は、ヒトＡＮＧ２、ウサギＡＮＧ２及びサルＡＮＧ２に結合することができる。
【課題を解決するための手段】
【0004】
具体的には、本発明は、以下の方面に関する。
【0005】
１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のいずれか一項に示す重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又はその変異体を含む抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であって、
好ましくは、ＩＭＧＴナンバリング体系に従い、以下の各項からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すＨＣＤＲ３であり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示すＨＣＤＲ３であり、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示すＨＣＤＲ３であり、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体、及びそれらの組合せであって、前記変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３と比べてそれぞれ１つ又は複数（好ましくは１つ、２つ又は３つ）の保存アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有し、かつＡＮＧ２との結合親和性を保留したアミノ酸配列であり、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＣＤＲ１における５～８番目及び１０～１１番目のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＣＤＲ２における２～５番目のアミノ酸及び７番目、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＣＤＲ３の１番目のアミノ酸、３～８番目のアミノ酸はアミノ酸Ｘから選択され、前記アミノ酸Ｘは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選択され、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１の変異体において、１番目のグリシンＧはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、２番目のフェニルアラニンＦはＴｙｒにより、３番目のプロリンＰはＴｒｐ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸により、４番目のＳｅｒはＴｈｒにより、９番目のＳｅｒはＴｈｒにより、１２番目のＧｌｎはＡｓｎにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２の変異体について、１番目のＩｌｅはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸により、６番目のＬｅｕはＩｌｅにより、８番目のＬｙｓはＡｒｇにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体において、２番目のＶａｌはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、９番目のＡｓｐはＧｌｕにより置換されてもよく、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示すＨＣＤＲ３であり、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示すＨＣＤＲ３である。
好ましくは、ＩＭＧＴナンバリング体系に従い、以下の各項からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すＨＣＤＲ３であり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示すＨＣＤＲ３であり、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示すＨＣＤＲ３であり、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体、及びそれらの組合せであって、前記変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３と比べてそれぞれ１つ又は複数（好ましくは１つ、２つ又は３つ）の保存アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有し、かつＡＮＧ２との結合親和性を保留したアミノ酸配列であり、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＣＤＲ１における５～８番目及び１０～１１番目のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＣＤＲ２における２～５番目のアミノ酸及び７番目、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＣＤＲ３の１番目のアミノ酸、３～８番目のアミノ酸はアミノ酸Ｘから選択され、前記アミノ酸Ｘは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選択され、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１の変異体において、１番目のグリシンＧはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、２番目のフェニルアラニンＦはＴｙｒにより、３番目のプロリンＰはＴｒｐ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸により、４番目のＳｅｒはＴｈｒにより、９番目のＳｅｒはＴｈｒにより、１２番目のＧｌｎはＡｓｎにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２の変異体について、１番目のＩｌｅはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸により、６番目のＬｅｕはＩｌｅにより、８番目のＬｙｓはＡｒｇにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体において、２番目のＶａｌはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、９番目のＡｓｐはＧｌｕにより置換されてもよく、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示すＨＣＤＲ３であり、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示すＨＣＤＲ３である。
【0006】
２．項１に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であって、そのうち、前記ＡＮＧ２は、ヒトＡＮＧ２、ウサギＡＮＧ２、又はサルＡＮＧ２から選択される。
【0007】
３．項１又は２に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であって、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のいずれか一項に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のいずれか一項に記載の配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有し且つＡＮＧ２結合活性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成される。
【0008】
４．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体を含む組換えプロテインであって、好ましくは、前記組換えプロテインは生物活性物質、例えば酵素活性を有する毒素又はその活性断片（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素）、腫瘍壊死因子又はインターフェロン（例えばＩＦＮ－γ）、生物反応調節物（例えばリンフォカイン、ＩＬ－２、ＩＬ－２、ＩＬ２－６、ＩＬ－１０、粒ＧＭ－ＣＳＦ）、及び／又はＦｃ断片（例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のサブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ由来のＦｃ領域、例えばヒト、ウサギ又はサルのＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ由来のＦｃ領域）をさらに含み、好ましくは、前記抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体と前記Ｆｃ断片は、連結ペプチドにより連結され、好ましくは、前記連結ペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎ＝１、２又は３であり、好ましくは、前記Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり、より好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＫ３０３１８５．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示すＦｃ断片であり、より好ましくは、前記組換えプロテインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０に示す配列を含むか、又は上記配列から構成される。
【0009】
５．多重特異性抗体であって、好ましくは二重特異性抗体であり、項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体を含み、好ましくは前記二重特異性抗体の構造は、軽鎖及び重鎖を含み、そのうち、軽－重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、２つの重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、そのうち、重鎖は、（ＶＨ）－（ＣＨ１）－（ヒンジ領域）－（Ｆｃ）－（連結ペプチド）－（ＶＨＨ）であり、軽鎖は、（ＶＬ）－（軽鎖定常領域）である。
【0010】
６．項５に記載の多重特異性抗体であって、ＶＨＨは項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であり、ＶＨ及びＶＬは第２種の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域であり、好ましくは、前記第２種の抗体により向けられる抗原は、免疫細胞表面抗原、腫瘍抗原、ウイルス、細菌、エンドトキシン、サイトカイン、又はそれらの組合せから選択され、より好ましくは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＥＡ、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、Ｂ７－Ｈ３、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３、及び／又はＣＤ１６ａから選択され、好ましくは、第２種の抗体により向けられる抗原は、ＶＥＧＦであり、より好ましくは、第２抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体から選択され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３（好ましくはＩＭＧＴナンバリング体系に従い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示すＨＣＤＲ３を含む）と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（好ましくはＩＭＧＴナンバリング体系に従い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示すＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示すＬＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示すＬＣＤＲ３を含む）と、を含み、より好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成され、前記抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成される。
【0011】
７．項５又は６に記載の多重特異性抗体であって、ＣＨ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に、ヒンジ領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に、Ｆｃ定常領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に、連結ペプチドの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又は４７に、軽鎖定常領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示し、好ましくは、前記多重特異性抗体は、
（１）重鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、２５、２６、２９、３０及び４を含むか、又は上記配列から構成される重鎖と、軽鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８を含むか、又は上記配列から構成される軽鎖と、を含むか、又は上記配列から構成されるＹ４００Ｃと、
（２）重鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、２５、２６、２９、４７及び４を含むか、又は上記配列から構成される重鎖と、軽鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８を含むか、又は上記配列から構成される軽鎖と、を含むか、又は上記配列から構成されるＹ４００Ｅと、の群から選択される。
（１）重鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、２５、２６、２９、３０及び４を含むか、又は上記配列から構成される重鎖と、軽鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８を含むか、又は上記配列から構成される軽鎖と、を含むか、又は上記配列から構成されるＹ４００Ｃと、
（２）重鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、２５、２６、２９、４７及び４を含むか、又は上記配列から構成される重鎖と、軽鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８を含むか、又は上記配列から構成される軽鎖と、を含むか、又は上記配列から構成されるＹ４００Ｅと、の群から選択される。
【0012】
８．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、又は項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドである。
【0013】
９．項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【0014】
１０．項９に記載のベクターを含む宿主細胞である。
【0015】
１１．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、又は項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、及びカップリング部分を含むカップリング物であって、前記カップリング部分は、精製タグ（例えばＨｉｓタグ）、検出可能な標識、薬品、毒素、サイトカイン、酵素、又はそれらの組合せであり、好ましくは、前記カップリング部分は、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、有色物、化学療法剤、生物毒素、ポリエチレングリコール又は酵素である。
【0016】
１２．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物を含むキットであって、好ましくは、前記キットは、項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物を特異的に認識する抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、組換えプロテイン又は多重特異性抗体をさらに含み、任意に、前記抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、組換えプロテイン又は多重特異性抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、有色物又は酵素をさらに含み、好ましくは、前記キットは、ＡＮＧ２のサンプルにおける存在又はそのレベルを検出するために用いられ、又は
前記キットは、（１）項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物、及び（２）他の抗原に対する抗体又はその抗原結合断片、及び／又は細胞毒性剤、及び／又は化学療法薬、及び選択可能な取扱説明書を含む。
前記キットは、（１）項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物、及び（２）他の抗原に対する抗体又はその抗原結合断片、及び／又は細胞毒性剤、及び／又は化学療法薬、及び選択可能な取扱説明書を含む。
【0017】
１３．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物を含む医薬組成物であって、選択的に、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なベクター及び／又は賦形剤をさらに含み、好ましくは、前記医薬組成物は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は病巣内注射による投与に適した形式である。
【0018】
１４．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物の、ＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制すること、血管新生過程による疾病又はそれに関連する疾病、例えば眼底新生血管性疾病、関節リウマチ及び乾癬、及び／又は腫瘍を予防及び／又は治療することにおける使用、又はＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制し、血管新生過程による疾病又はそれに関連する疾病、例えば眼底新生血管性疾病、関節リウマチ及び乾癬及び／又は腫瘍を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における使用である。
【0019】
本発明の範囲内において、本発明の上記各技術特徴及び後文（例えば実施例）で具体的に記述した各技術特徴の間は、いずれも互いに組み合わせて、新規又は好適な技術態様を構成することができることを理解すべきである。紙面の都合上、ここでは個々に説明しない。
【0020】
本発明に係る用語は、当業者が理解する通常の意味を具備する。当分野内で使用する及び／又は許容可能な場合において、１つ用語が２つ又は２つ以上の定義を有するときに、本稿で使用する用語の定義は、全ての意味を含むために用いられる。
【0021】
当業者として理解できるように、抗体のＣＤＲ領域は、抗原に対する抗体の結合特異性を担当する。抗体重鎖及び軽鎖可変領域の配列が既知である場合、現時点では抗体ＣＤＲ領域を確定する方法がいくつかあり、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＡｂＭナンバリング体系を含む。しかしながら、抗体又はその変異体のＣＤＲに関する各種の定義の応用はいずれも本稿で定義及び使用する用語の範囲内にある。該抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられると、当業者は通常、該配列そのもの以外の如何なる実験データに依存することなく、特定ＣＤＲを確定することができる。
【0022】
本発明において、重鎖単一ドメイン抗体は、ＶＨＨドメインとも呼ばれ、ＶＨＨ抗体断片又はＶＨＨ抗体は、「重鎖抗体」（即ち軽鎖を欠く抗体）と呼ばれる抗原結合免疫グロブリンの可変ドメイン（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ、Ａｔａｒｈｏｕｃｈ Ｔ、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｇ、Ｈａｍｅｒｓ Ｃ、Ｓｏｎｇａ ＥＢ、ＢＥｎｄａｈｍａｎ Ｎ、Ｈａｍｅｒｓ Ｒ．：「Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ ３６３、４４６～４４８、１９９３）である。ＶＨＨドメインは、他の抗原結合ドメインを必要とせずエピトープに特異的に結合する。ＶＨＨドメインは、単一免疫グロブリンドメインからなる小型で安定した高効率的な抗原認識ユニットである。
【0023】
本発明の重鎖単一ドメイン抗体は、必要な生物活性を有する物質に接合して、組換えプロテインを形成することができる。いくつかの実施態様において、前記生物活性物質は、例えば酵素活性を有する毒素又はその活性断片（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素）、腫瘍壊死因子又はインターフェロン（例えばＩＦＮ－γ）、生物反応調節物（例えばリンフォカイン、ＩＬ－２、ＩＬ－２、ＩＬ２－６、ＩＬ－１０、粒ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｃ断片から選択される。本発明の組換えプロテインに含まれるＦｃ断片は、それに二量体を形成させ、同時に前記組換えプロテインの体内半減期を延長することができる。いくつかの実施態様において、本発明に使用可能なＦｃ断片は、異なるサブタイプの免疫グロブリン、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のサブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来してもよい。
【0024】
本発明の抗体は、（ｉ）１つ又は複数の保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド、又は（ｉｉ）１つ又は複数のアミノ酸残基には置換基を有するポリペプチド、又は（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと他の１つの化合物（例えばポリペプチド半減期を延長する化合物、例えばポリエチレングリコール）が融合して形成したポリペプチド、又は（ｉｖ）付加されたアミノ酸配列がこのポリペプチド配列に融合して形成したポリペプチド（例えばリーダー配列又は分泌配列又はこのポリペプチドを精製するための配列又はフィブリノーゲン配列、又は６Ｈｉｓタグと形成した融合プロテイン）であってもよい。本稿の教示によれば、これらの断片、誘導体及び類似物は、当業者周知の範囲に属する。
【0025】
保存的置換え
「保存的アミノ酸置換え」は、その中のアミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられることである。類似側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは既に当分野で定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐の側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基に置き換えられることが好ましい。他のいくつかの実施態様において、アミノ酸の鎖は、構造的に類似するアミノ酸の鎖に置き換えられてもよく、後者は順番及び／又は側鎖ファミリーの構成が異なる。
「保存的アミノ酸置換え」は、その中のアミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられることである。類似側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは既に当分野で定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐の側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基に置き換えられることが好ましい。他のいくつかの実施態様において、アミノ酸の鎖は、構造的に類似するアミノ酸の鎖に置き換えられてもよく、後者は順番及び／又は側鎖ファミリーの構成が異なる。
【0026】
下表では、保存的アミノ酸の置換えの非制限的実例が提供され、そのうち、類似性スコアが０になる又はより高くなるとは、この２つのアミノ酸の間に保存的置換えがあることを表す。
【0027】
【表1】
【0028】
いくつかの実施態様において、前記保存的置換えは、下記群（ａ）～（ｅ）の１つアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸残基に置き換えられる置換えであることが好ましく、前記群は（ａ）小さい脂肪族、非極性又は弱極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙと、（ｂ）極性、負電荷を持つ残基及びその（無電荷の）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎと、（ｃ）極性、正電荷を持つ残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓと、（ｄ）大きい脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓと、（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐである。
【0029】
特に好ましい保存的置換えは、以下の通りである。ＡｌａをＧｌｙに置き換え又はＳｅｒに置き換え、ＡｒｇをＬｙｓに置き換え、ＡｓｎをＧｌｎに置き換え又はＨｉｓに置き換え、ＡｓｐをＧｌｕに置き換え、ＣｙｓをＳｅｒに置き換え、ＧｌｎをＡｓｎに置き換え、ＧｌｕをＡｓｐに置き換え、ＧｌｙをＡｌａに置き換え又はＰｒｏに置き換え、ＨｉｓをＡｓｎに置き換え又はＧｌｎに置き換え、ＩｌｅをＬｅｕに置き換え又はＶａｌに置き換え、ＬｅｕをＩｌｅに置き換え又はＶａｌに置き換え、ＬｙｓをＡｒｇに置き換え、Ｇｌｎに置き換え又はＧｌｕに置き換え、ＭｅｔをＬｅｕに置き換え、Ｔｙｒに置き換え又はＩｌｅに置き換え、ＰｈｅをＭｅｔに置き換え、Ｌｅｕに置き換え又はＴｙｒに置き換え、ＳｅｒをＴｈｒに置き換え、ＴｈｒをＳｅｒに置き換え、ＴｒｐをＴｙｒに置き換え、ＴｙｒをＴｒｐに置き換え、及び／又はＰｈｅをＶａｌに置き換え、Ｉｌｅに置き換え又はＬｅｕに置き換える。
【0030】
いくつかの実施態様において、以下のアミノ酸は類似する構造特徴及び性能を有する。
【0031】
例えばグリシンＧ、アラニンＡ、バリンＶ、ロイシンＬ及びイソロイシンＩはいずれも１つのアミノ基、１つのカルボキシル基を含む中性アミノ酸に属し、
セリンＳ及びスレオニンＴはいずれもヒドロキシアミノ酸に属し、
システインＣ及びメチオニンＭはいずれも含硫アミノ酸に属し、
アスパラギンＮ及びグルタミンＱはいずれもアミド基含有アミノ酸に属し、
アスパラギン酸Ｄ及びグルタミン酸Ｅはいずれも酸性アミノ酸に属し、
リジンＫ及びアルギニンＲはいずれも塩基性アミノ酸に属し、
フェニルアラニンＦ及びチロシンＹはいずれも芳香族アミノ酸に属し、
トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ及びプロリンＰはいずれも複素環アミノ酸に属する。そのため、類似する構造特徴及び性能は、互いに保存的置換を行うことができる。
セリンＳ及びスレオニンＴはいずれもヒドロキシアミノ酸に属し、
システインＣ及びメチオニンＭはいずれも含硫アミノ酸に属し、
アスパラギンＮ及びグルタミンＱはいずれもアミド基含有アミノ酸に属し、
アスパラギン酸Ｄ及びグルタミン酸Ｅはいずれも酸性アミノ酸に属し、
リジンＫ及びアルギニンＲはいずれも塩基性アミノ酸に属し、
フェニルアラニンＦ及びチロシンＹはいずれも芳香族アミノ酸に属し、
トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ及びプロリンＰはいずれも複素環アミノ酸に属する。そのため、類似する構造特徴及び性能は、互いに保存的置換を行うことができる。
【発明の効果】
【0032】
いくつかの実施態様において、本発明に記載の抗体は、治療剤（例えば化学療法薬、例えばシスプラチン、カルボプラチン）、薬品前駆体、ペプチド、プロテイン、酵素、ウイルス、脂質、生物反応調節剤、薬剤又はＰＥＧに結合することができる。本発明の抗体は、治療剤に連結又は融合することができ、該治療剤は、検出可能な標識物、例えば放射性標識物、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤又は診断剤、細胞毒性剤を含むことができ、薬品又は毒素、超音波増強剤、非放射性標識物、それらの組合せ及び他の当分野既知のこのような成分であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの、ヒトＡＮＧ２に結合する生物学的活性である。
【図2】抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの、サルＡＮＧ２に結合する生物学的活性である。
【図3】抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの、ヒトＡＮＧ２とその受容体ｈＴＩＥ２との結合を抑制する生物学的活性である。
【図4】抗体によるヒトＡＮＧ２とＨＵＶＥＣとの結合への抑制の生物学的活性である。
【図5】抗体によるヒトＡＮＧ１とＨＵＶＥＣとの結合への抑制の生物学的活性である。
【図6】抗体によるヒトＡＮＧ２依存のＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化への抑制である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0034】
以下、実施例により本発明を詳しく記述する。当業者として理解できるように、下記実施例は、単に例を挙げて説明する目的のために用いられるものである。本発明の精神及び範囲は、請求項により限定される。下記実施例に用いられる方法は別途説明しない限り、いずれも通常の方法であり、用いられる試薬は別途説明しない限り、いずれも市販可能な試薬である。
【0035】
実施例１：ＡＮＧ２に対する重鎖単一ドメイン抗体のスクリーニング
ヒトＡＮＧ２のＬｙｓ２７５－Ｐｈｅ４９６位のアミノ酸に対応する組換えヒトＡＮＧ２プロテインは、以下でｈＡＮＧ２と略称され、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示し、サルＡＮＧ２プロテインは、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示し、以下でｃｙｎｏＡＮＧ２と略称される。具体的なＡＮＧ２ ＥＣＤ分子のアミノ酸配列情報は表１に示す。
ヒトＡＮＧ２のＬｙｓ２７５－Ｐｈｅ４９６位のアミノ酸に対応する組換えヒトＡＮＧ２プロテインは、以下でｈＡＮＧ２と略称され、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示し、サルＡＮＧ２プロテインは、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示し、以下でｃｙｎｏＡＮＧ２と略称される。具体的なＡＮＧ２ ＥＣＤ分子のアミノ酸配列情報は表１に示す。
【0036】
【表2】
【0037】
１．１重鎖単一ドメイン抗体ファージライブラリーの構築
２頭のアルパカ（Ａｌｐａｃａ）を選出して抗原免疫を行い、ヒトＡＮＧ２プロテインで４回の免疫を行った後、アルパカの末梢血１００ｍｌのリンパ球を抽出し、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ試薬（ＴＡＫＡＲＡ、９１０９）を用いて総ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩキット（ＴＡＫＡＲＡ、６２１０Ａ）を使用して抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ増幅の方法で、まず７５０ｂｐ長さの重鎖抗体可変領域及び定常領域ＣＨ２の核酸断片を増幅し、次いで、前のステップで回収された７５０ｂｐ長さの核酸断片を鋳型として目的断片、即ち重鎖抗体可変領域断片を増幅した。ベクターｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ（ＮＢｂｉｏｌａｂ、ＮＰＬ－００１、）と目的断片をそれぞれＳｆｉＩで酵素切断し、５０℃で一晩経過して酵素切断して、目的断片を回収し、連結モル比率であるベクター：断片＝１：３の比率に従い連結した。連結生成物を大腸菌コンピテント細胞ＴＧ１に電気変換し、各頭のアルパカの連結生成物に対して１０回の電撃変換を行った。勾配希釈によりプレーティングし、ライブラリサイズの大きさを計算し、２頭のアルパカのファージライブラリーの大きさはそれぞれ１．２１×１０９と１×１０９であった。力価測定プレートからランダムに９６個のクローンを選び取り同定した結果、挿入率が１００％であることが分った。
２頭のアルパカ（Ａｌｐａｃａ）を選出して抗原免疫を行い、ヒトＡＮＧ２プロテインで４回の免疫を行った後、アルパカの末梢血１００ｍｌのリンパ球を抽出し、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ試薬（ＴＡＫＡＲＡ、９１０９）を用いて総ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩキット（ＴＡＫＡＲＡ、６２１０Ａ）を使用して抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ増幅の方法で、まず７５０ｂｐ長さの重鎖抗体可変領域及び定常領域ＣＨ２の核酸断片を増幅し、次いで、前のステップで回収された７５０ｂｐ長さの核酸断片を鋳型として目的断片、即ち重鎖抗体可変領域断片を増幅した。ベクターｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ（ＮＢｂｉｏｌａｂ、ＮＰＬ－００１、）と目的断片をそれぞれＳｆｉＩで酵素切断し、５０℃で一晩経過して酵素切断して、目的断片を回収し、連結モル比率であるベクター：断片＝１：３の比率に従い連結した。連結生成物を大腸菌コンピテント細胞ＴＧ１に電気変換し、各頭のアルパカの連結生成物に対して１０回の電撃変換を行った。勾配希釈によりプレーティングし、ライブラリサイズの大きさを計算し、２頭のアルパカのファージライブラリーの大きさはそれぞれ１．２１×１０９と１×１０９であった。力価測定プレートからランダムに９６個のクローンを選び取り同定した結果、挿入率が１００％であることが分った。
【0038】
１．２ ＡＮＧ２に対する重鎖単一ドメイン抗体のパンニング
ｈＡＮＧ２プロテインにより１０μｇ／ウェルでプレートを被覆し、４℃で一晩経過した。翌日、１％ＢＳＡを用いて室温で２時間ブロッキングした後、１００μｌのファージ（２×１０９ｐｆｕ／ウェルであり、１．１で構築した重鎖単一ドメイン抗体ファージライブラリーに由来した）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳには０．０５％のツイーン２０が含まれている）で５回洗うことで結合していないファージを洗い流した。最後に、グリシン－塩酸（２００ｍＭ）を用いてｈＡＮＧ２に特異的に結合したファージを溶出しており、対数期成長にある大腸菌ＴＧ１に感染させ、ファージを生成して精製し、次のラウンドのスクリーニングに用いられる。同じスクリーニング過程を２ラウンド繰り返した後に、獲得したファージを大腸菌ＴＧ１に感染させてプレーティングし、プレートからモノクローンを選び取り、シーケンシングした。配列アライメント結果に応じて個々のクローンのプロテイン配列を分析し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列が異なるクローンを異なる抗体株と見なし、最終的に合計で１０株の異なる抗体を取得した。
ｈＡＮＧ２プロテインにより１０μｇ／ウェルでプレートを被覆し、４℃で一晩経過した。翌日、１％ＢＳＡを用いて室温で２時間ブロッキングした後、１００μｌのファージ（２×１０９ｐｆｕ／ウェルであり、１．１で構築した重鎖単一ドメイン抗体ファージライブラリーに由来した）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳには０．０５％のツイーン２０が含まれている）で５回洗うことで結合していないファージを洗い流した。最後に、グリシン－塩酸（２００ｍＭ）を用いてｈＡＮＧ２に特異的に結合したファージを溶出しており、対数期成長にある大腸菌ＴＧ１に感染させ、ファージを生成して精製し、次のラウンドのスクリーニングに用いられる。同じスクリーニング過程を２ラウンド繰り返した後に、獲得したファージを大腸菌ＴＧ１に感染させてプレーティングし、プレートからモノクローンを選び取り、シーケンシングした。配列アライメント結果に応じて個々のクローンのプロテイン配列を分析し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列が異なるクローンを異なる抗体株と見なし、最終的に合計で１０株の異なる抗体を取得した。
【0039】
【表3】
【0040】
実施例２：ＡＮＧ２に対する重鎖単一ドメイン抗体の初歩評価同定
１．重鎖単一ドメイン抗体の宿主菌大腸菌での発現
取得した１０株の重鎖単一ドメイン抗体のＴＧ１宿主菌に対して単一コロニーを選んで接種し、一晩経過して培養し、翌日、一晩経過した菌種を転移接種して増幅し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、３７℃で一晩経過してシェーカー培養した。翌日、遠心分離して上清を収集して検出する。
１．重鎖単一ドメイン抗体の宿主菌大腸菌での発現
取得した１０株の重鎖単一ドメイン抗体のＴＧ１宿主菌に対して単一コロニーを選んで接種し、一晩経過して培養し、翌日、一晩経過した菌種を転移接種して増幅し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、３７℃で一晩経過してシェーカー培養した。翌日、遠心分離して上清を収集して検出する。
【0041】
２．ＥＬＩＳＡによる１０個の重鎖単一ドメイン抗体の親和性検出
ｈＡＮＧ２プロテイン溶液及びＢＳＡをそれぞれ２μｌ／ウェルで酵素標識プレートを被覆し、４度で一晩経過し、上清を捨て、各ウェルに３００μｌのブロッキング液（３％のＢＳＡを含むＰＢＳ）を加え、３７度で２時間ブロッキングし、遠心分離して収集した上清を各ウェル２００μｌで酵素標識プレートウェルに加え、室温で静置して２時間インキュベートし、上清を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＰＢＳには０．１％のＴｗｅｅｎ２０が含まれている）で３回洗浄し、希釈済みのＨＲＰ標識の抗ＶＨＨ二次抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ａ０１８６１）を加え、二次抗体は１：１００００で希釈後に使用され、希釈液は１％ＢＳＡのＰＢＳであり、体積は１００μｌ／ウェルであり、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢＤ、５５２１４）を１００μｌ／ウェルで加え、３７度で８分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌ停止液を１００μｌ／ウェルで加え、停止液を加えた後、３０分間内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍに読取りを行った。結果は下表３の通りである。
ｈＡＮＧ２プロテイン溶液及びＢＳＡをそれぞれ２μｌ／ウェルで酵素標識プレートを被覆し、４度で一晩経過し、上清を捨て、各ウェルに３００μｌのブロッキング液（３％のＢＳＡを含むＰＢＳ）を加え、３７度で２時間ブロッキングし、遠心分離して収集した上清を各ウェル２００μｌで酵素標識プレートウェルに加え、室温で静置して２時間インキュベートし、上清を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＰＢＳには０．１％のＴｗｅｅｎ２０が含まれている）で３回洗浄し、希釈済みのＨＲＰ標識の抗ＶＨＨ二次抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ａ０１８６１）を加え、二次抗体は１：１００００で希釈後に使用され、希釈液は１％ＢＳＡのＰＢＳであり、体積は１００μｌ／ウェルであり、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢＤ、５５２１４）を１００μｌ／ウェルで加え、３７度で８分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌ停止液を１００μｌ／ウェルで加え、停止液を加えた後、３０分間内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍに読取りを行った。結果は下表３の通りである。
【0042】
【表4】
【0043】
実施例３：抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃのプラスミドの調製
ＰＣＲクローンのモノクローン抗体重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０）に対応するコードＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＫ３０３１８５．１）に対応するコードＤＮＡに連結させて、重鎖抗体を構築することにより、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの発現プラスミドを取得し、ベクターは、一般的にｐｃＤＮＡ３．１（－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）又はその他の真核発現ベクターを用いる。上記した重鎖抗体プロテイン配列の可変領域と定常領域との間は、連結ペプチドで繋がり、前記連結ペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎ＝１、２又は３である。
ＰＣＲクローンのモノクローン抗体重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０）に対応するコードＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＫ３０３１８５．１）に対応するコードＤＮＡに連結させて、重鎖抗体を構築することにより、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの発現プラスミドを取得し、ベクターは、一般的にｐｃＤＮＡ３．１（－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）又はその他の真核発現ベクターを用いる。上記した重鎖抗体プロテイン配列の可変領域と定常領域との間は、連結ペプチドで繋がり、前記連結ペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ｎ＝１、２又は３である。
【0044】
【表5】
【0045】
実施例４．抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの発現と精製
エンドトキシンフリー大量抽出プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ、商品番号１２３９１）を利用してプラスミド抽出を行い、具体的な操作は、メーカーにより提供された明細書に従い行った。ＣＨＯ－Ｓ細胞培養は、メーカーにより提供された説明書に応じて、ＣＤ ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ、商品番号１０７４３－０２９）において、３７℃で、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置かれて培養し、細胞の準備ができた後、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ配列を含有するプラスミドをともにＣＨＯ－Ｓ細胞に共トランスフェクトすることで、抗体－Ｆｃを発現させる。トランスフェクト後の翌日に、培養温度を３２℃に下げ、毎日３．５％の２×ＥＦＣ＋（Ｇｉｂｃｏ、商品番号Ａ２５０３１０５）を補充し、１４日間培養した後、８００×ｇで遠心分離して発現上清を収穫した。そして０．２２μｍのろ過膜でろ過した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製して培養上清液中の抗体－Ｆｃを得た。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度及び各種のプロテインに対応する消光係数により精製した抗体－Ｆｃの濃度を測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥ－ＨＰＬＣにより抗体－Ｆｃの純度及び均質性を評価した。又はイオン交換及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００のＳＥＣを使用して二次精製を行い、高純度抗体－Ｆｃサンプルを調製して使用に備える。
エンドトキシンフリー大量抽出プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ、商品番号１２３９１）を利用してプラスミド抽出を行い、具体的な操作は、メーカーにより提供された明細書に従い行った。ＣＨＯ－Ｓ細胞培養は、メーカーにより提供された説明書に応じて、ＣＤ ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ、商品番号１０７４３－０２９）において、３７℃で、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置かれて培養し、細胞の準備ができた後、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ配列を含有するプラスミドをともにＣＨＯ－Ｓ細胞に共トランスフェクトすることで、抗体－Ｆｃを発現させる。トランスフェクト後の翌日に、培養温度を３２℃に下げ、毎日３．５％の２×ＥＦＣ＋（Ｇｉｂｃｏ、商品番号Ａ２５０３１０５）を補充し、１４日間培養した後、８００×ｇで遠心分離して発現上清を収穫した。そして０．２２μｍのろ過膜でろ過した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製して培養上清液中の抗体－Ｆｃを得た。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度及び各種のプロテインに対応する消光係数により精製した抗体－Ｆｃの濃度を測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥ－ＨＰＬＣにより抗体－Ｆｃの純度及び均質性を評価した。又はイオン交換及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００のＳＥＣを使用して二次精製を行い、高純度抗体－Ｆｃサンプルを調製して使用に備える。
【0046】
実施例５．抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－ＦｃのＡＮＧ２への結合親和性
本実施例は、ＥＬＩＳＡ検出方法を使用して１０個の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの親和性を評価した。
本実施例は、ＥＬＩＳＡ検出方法を使用して１０個の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの親和性を評価した。
【0047】
ＡＮＧ２プロテイン溶液をそれぞれ２μｌ／ウェルで酵素標識プレートを被覆し、４度で一晩経過し、上清を捨て、各ウェルに３００μｌのブロッキング液（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を加え、３７度で２時間ブロッキングし、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃを勾配希釈し、希釈液は、１％ＢＳＡのＰＢＳであった。例えば、希釈の初期濃度は、５００ｎＭであり、１０倍希釈し、８つの濃度勾配に希釈した。希釈済みの抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃを各ウェル２００μｌで酵素標識プレートウェルに加え、室温で静置して２時間インキュベートし、上清を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＰＢＳには０．１％のＴｗｅｅｎ２０が含まれている）で３回洗浄し、希釈済みのＨＲＰ標識の抗ヒトＦｃ二次抗体（ＳＩＧＭＡ、Ａ８６６７）を加え、二次抗体は、１：２００００で希釈した後に使用し、希釈液は、１％ＢＳＡのＰＢＳであり、体積は、１００μｌ／ウェルであり、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢＤ、５５２１４）を１００μｌ／ウェルで加え、３７度で８分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌ停止液を１００μｌ／ウェルで加え、停止液を加えた後、３０分間内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍに読取りを行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェアでデータを分析し、親和性のフィッティングを行い、ＥＣ５０値を取得し、結果は図１、図２及び表５に示す。Ｂ２－Ｅ２－Ｆｃは、ヒトＡＮＧ２及びサルＡＮＧ２プロテインに対して親和性が最も高かった。
【0048】
【表6】
【0049】
実施例６．抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－ＦｃによるｈＡＮＧ２とその受容体ｈＴＩＥ２との結合への抑制
２μｇ／ｍＬ、ＰＢＳの中で調製したｈＴＩＥ２－Ｆｃ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＷ９８）１００μＬを用いて９６ウェルプレートを処理し、４℃でインキュベートして一晩経過した。次いで、プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有したＰＢＳ洗浄緩衝液で３回洗浄し、続いて、１％ＢＳＡを含有したＰＢＳを３００μＬ加えて２時間ブロッキングした。検出対象となる抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃを希釈した後に最終濃度が１０μｇ／ｍＬであるｈＡＮＧ２と混合させ、３７℃で１時間インキュベートした後、抗原抗体混合物を９６ウェルプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有したＰＢＳ洗浄緩衝液で洗浄した後に、希釈済みのＨＲＰ標識の抗Ｈｉｓ二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、６６００５－１－Ｉｇ）を加え、二次抗体は、１：２０００で希釈した後に使用し、希釈液は、１％ＢＳＡのＰＢＳであり、体積は、１００μｌ／ウェルであり、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢＤ、５５２１４）を１００μｌ／ウェルで加え、３７度で８分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌ停止液を１００μｌ／ウェルで加え、停止液を加えた後、３０分間内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍに読取りを行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェアでデータを分析し、親和性のフィッティングを行い、ＥＣ５０値を取得し、結果は図３に示し、Ｂ２Ｅ２－Ｆｃは、ヒトＡＮＧ２とその受容体ＴＩＥ２との結合に顕著な抑制作用があった。
２μｇ／ｍＬ、ＰＢＳの中で調製したｈＴＩＥ２－Ｆｃ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＷ９８）１００μＬを用いて９６ウェルプレートを処理し、４℃でインキュベートして一晩経過した。次いで、プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有したＰＢＳ洗浄緩衝液で３回洗浄し、続いて、１％ＢＳＡを含有したＰＢＳを３００μＬ加えて２時間ブロッキングした。検出対象となる抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃを希釈した後に最終濃度が１０μｇ／ｍＬであるｈＡＮＧ２と混合させ、３７℃で１時間インキュベートした後、抗原抗体混合物を９６ウェルプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有したＰＢＳ洗浄緩衝液で洗浄した後に、希釈済みのＨＲＰ標識の抗Ｈｉｓ二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、６６００５－１－Ｉｇ）を加え、二次抗体は、１：２０００で希釈した後に使用し、希釈液は、１％ＢＳＡのＰＢＳであり、体積は、１００μｌ／ウェルであり、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢＤ、５５２１４）を１００μｌ／ウェルで加え、３７度で８分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌ停止液を１００μｌ／ウェルで加え、停止液を加えた後、３０分間内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍに読取りを行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェアでデータを分析し、親和性のフィッティングを行い、ＥＣ５０値を取得し、結果は図３に示し、Ｂ２Ｅ２－Ｆｃは、ヒトＡＮＧ２とその受容体ＴＩＥ２との結合に顕著な抑制作用があった。
【0050】
実施例７：抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの酸安定性及び熱安定性の評価
以下の酸安定性及び熱安定性の評価方法に従いＢ２－Ｅ２－Ｆｃを評価した。抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ分子のｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの時に、酸溶出ステップにおいて（ｐＨ３．５のクエン酸緩衝液を使用）、溶出された抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ溶液は中和せず、該緩衝液で一定時間保持した後に、３０ｍｉｎにサンプリングし、１／１０体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて中和し、該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行った。抗体分子は、ｐＨ３．５で３０ｍｉｎ処理した後、凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことにより、酸性環境で安定性を維持できることが分かった。同時に、４０℃のインキュベーターで１４日間インキュベートした後に該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行い、凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことにより、４０℃の環境で安定性を維持できることが分かった。表６及び表７の結果に示すように、Ｂ２－Ｅ２－Ｆｃは、良好な酸安定性及び熱安定性があった。
以下の酸安定性及び熱安定性の評価方法に従いＢ２－Ｅ２－Ｆｃを評価した。抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ分子のｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの時に、酸溶出ステップにおいて（ｐＨ３．５のクエン酸緩衝液を使用）、溶出された抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ溶液は中和せず、該緩衝液で一定時間保持した後に、３０ｍｉｎにサンプリングし、１／１０体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて中和し、該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行った。抗体分子は、ｐＨ３．５で３０ｍｉｎ処理した後、凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことにより、酸性環境で安定性を維持できることが分かった。同時に、４０℃のインキュベーターで１４日間インキュベートした後に該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行い、凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことにより、４０℃の環境で安定性を維持できることが分かった。表６及び表７の結果に示すように、Ｂ２－Ｅ２－Ｆｃは、良好な酸安定性及び熱安定性があった。
【0051】
【表7】
【表8】
（１）二重特異性抗体の構築
表８に示す二重特異性抗体アミノ酸配列に従い、ＤＮＡコードの逆翻訳及びＤＮＡ断片の合成を行い、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に構築し、２９３又はＣＨＯ細胞に一時トランスフェクトして発現させた。上清を収穫してプロテイン精製を行い、純度が９５％以上の二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅを取得した。具体的なベクター構築、一時トランスフェクト及びプロテイン精製方法は前述した各実施例を参照した。前記二重特異性抗体の構造は、軽鎖及び重鎖を含み、そのうち、軽－重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、２つの重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、そのうち、重鎖が（ＶＨ）－（ＣＨ１）－（ヒンジ領域）－（Ｆｃ）－（連結ペプチド）－（ＶＨＨ）であり、軽鎖が（ＶＬ）－（軽鎖定常領域）であり、ＶＨ及びＶＬが抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域であり、ＶＨＨが抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体の可変領域であった。
【0052】
【表9】
【0053】
（２）二重特異性抗体の熱安定性の考察
二重特異性抗体を４０度のインキュベーターに置いて１４日間又は２８日間処理した後に該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行った。結果は、本発明の抗体分子は４０℃で２８日間処理した後に凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことを見出し、４０℃の環境で安定性を維持できることが分かって、表９に示すとおりである。
二重特異性抗体を４０度のインキュベーターに置いて１４日間又は２８日間処理した後に該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行った。結果は、本発明の抗体分子は４０℃で２８日間処理した後に凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことを見出し、４０℃の環境で安定性を維持できることが分かって、表９に示すとおりである。
【0054】
【表10】
【0055】
結果から分かるように、二重抗体分子Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅはいずれも良好な熱安定性があった。
【0056】
（３）二重特異性抗体とｈＡＮＧ２との結合
Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡチップ（ＧＥ、商品番号：２８９９５０５６）を用いて供試抗体を捕獲し、抗原ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）は、分析物として供試品に結合する動力学及び親和性データが検出される。抗原と供試品との結合の検出開始濃度は、１０ｎＭであり、これをもとに、２倍勾配希釈し、即ち抗原希釈の濃度はそれぞれ１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６２５ｎＭであり、抗原は低濃度から高濃度まで順次に注入が開始し、１つの陰性対照（即ち１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ）及び１つの繰返し濃度（一般的には最低濃度が繰り返す）を設定し、注入前にシステムのバランスを取るためにＳｔａｒｔ ｕｐ（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ）のすすぎ工程を少なくとも３回行い、抗原と供試品との結合及び解離傾向を検出し、解離完了後に、再生試薬を注入し、チップに対して再生を行い、チップの再生完了後に、次の濃度の検出を行った。検出完了後に、データ分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇフィッティング方式によりデータフィッティングを行い、試験結果は表１０に示す。
Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡチップ（ＧＥ、商品番号：２８９９５０５６）を用いて供試抗体を捕獲し、抗原ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）は、分析物として供試品に結合する動力学及び親和性データが検出される。抗原と供試品との結合の検出開始濃度は、１０ｎＭであり、これをもとに、２倍勾配希釈し、即ち抗原希釈の濃度はそれぞれ１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６２５ｎＭであり、抗原は低濃度から高濃度まで順次に注入が開始し、１つの陰性対照（即ち１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ）及び１つの繰返し濃度（一般的には最低濃度が繰り返す）を設定し、注入前にシステムのバランスを取るためにＳｔａｒｔ ｕｐ（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ）のすすぎ工程を少なくとも３回行い、抗原と供試品との結合及び解離傾向を検出し、解離完了後に、再生試薬を注入し、チップに対して再生を行い、チップの再生完了後に、次の濃度の検出を行った。検出完了後に、データ分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇフィッティング方式によりデータフィッティングを行い、試験結果は表１０に示す。
【0057】
【表11】
【0058】
ヒトＡＮＧ２との親和性の検出結果から分かるように、二重特異性抗体は、ヒトＡＮＧ２に対して強い親和性があった。
【0059】
（４）二重特異性抗体によるｈＡＮＧ２とＨＵＶＥＣ細胞との結合への抑制
成長状態が良好なＨＵＶＥＣ細胞（Ｈ－００３、Ａｌｌｃｅｌｌｓ）を単一細胞懸濁液に調製した。細胞の計数後に、１０５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）の最終濃度を１０μｇ／ｍｌに固定し、各ウェルには、実験設計に従いそれぞれ検出対象となる抗体を加え、抗体最高濃度は、１０００ｎＭであり、順次に５倍希釈し、合計で７つの濃度勾配を設定し、同時にブランク対照及び陽性対照ＲＧ７７１６（ＡＴＡＤ００５３４、Ａｔａｇｅｎｉｘ）を設定し、細胞を室温に置いて３０ｍｉｎインキュベートした後、各ウェルの細胞を３回洗い、再懸濁した後、蛍光標識二次抗体ＰＥ ａｎｔｉ－Ｈｉｓ（３６２６０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、室温で遮光して３０ｍｉｎインキュベートし、各ウェルの細胞を３回洗浄し、再懸濁した後にフローサイトメトリー機器に乗せて検出した。図４に示すように、二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅは、ＡＮＧ２及びＨＵＶＥＣ細胞に対する遮断活性が対照陽性抗体よりも優れている。
成長状態が良好なＨＵＶＥＣ細胞（Ｈ－００３、Ａｌｌｃｅｌｌｓ）を単一細胞懸濁液に調製した。細胞の計数後に、１０５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）の最終濃度を１０μｇ／ｍｌに固定し、各ウェルには、実験設計に従いそれぞれ検出対象となる抗体を加え、抗体最高濃度は、１０００ｎＭであり、順次に５倍希釈し、合計で７つの濃度勾配を設定し、同時にブランク対照及び陽性対照ＲＧ７７１６（ＡＴＡＤ００５３４、Ａｔａｇｅｎｉｘ）を設定し、細胞を室温に置いて３０ｍｉｎインキュベートした後、各ウェルの細胞を３回洗い、再懸濁した後、蛍光標識二次抗体ＰＥ ａｎｔｉ－Ｈｉｓ（３６２６０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、室温で遮光して３０ｍｉｎインキュベートし、各ウェルの細胞を３回洗浄し、再懸濁した後にフローサイトメトリー機器に乗せて検出した。図４に示すように、二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅは、ＡＮＧ２及びＨＵＶＥＣ細胞に対する遮断活性が対照陽性抗体よりも優れている。
【0060】
【表12】
【0061】
（５）二重特異性抗体はｈＡＮＧ１とＨＵＶＥＣ細胞との結合を抑制しない
ＡＮＧ１／ＡＮＧ２－ＴＩＥ２という信号通路に関連する生物学機能において、ＡＮＧ１活性を保存することは、何らかの抗血管新生の治療に有益である。そのため、本発明における抗体は、ＡＮＧ２に特異的に結合するがＡＮＧ１に結合せず、同時にＡＮＧ２とその受容体ＴＩＥ２との結合のみを抑制するがＡＮＧ１とその受容体ＴＩＥ２との結合を抑制しない。本発明の抗体は、ＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制すること、血管新生過程による疾病及び病症又はそれに関連する疾病及び病症を治療することにおいて特に有用である。
ＡＮＧ１／ＡＮＧ２－ＴＩＥ２という信号通路に関連する生物学機能において、ＡＮＧ１活性を保存することは、何らかの抗血管新生の治療に有益である。そのため、本発明における抗体は、ＡＮＧ２に特異的に結合するがＡＮＧ１に結合せず、同時にＡＮＧ２とその受容体ＴＩＥ２との結合のみを抑制するがＡＮＧ１とその受容体ＴＩＥ２との結合を抑制しない。本発明の抗体は、ＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制すること、血管新生過程による疾病及び病症又はそれに関連する疾病及び病症を治療することにおいて特に有用である。
【0062】
成長状態が良好なＨＵＶＥＣ細胞（Ｈ－００３、Ａｌｌｃｅｌｌｓ）を単一細胞懸濁液に調製した。細胞計数後に、１０５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、ヒトＡＮＧ１プロテイン（６２３－ＡＮ／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）の最終濃度を１０μｇ／ｍｌに固定し、各ウェルには、実験設計に従いそれぞれ検出対象となる抗体を加え、抗体最高濃度は、１０００ｎＭであり、順次に５倍希釈し、合計で７つの濃度勾配を設定し、同時にブランク対照及び陽性対照ｈＴＩＥ２－Ｆｃ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＷ９８）を設定し、細胞を室温に置いて３０ｍｉｎインキュベートした後、各ウェルの細胞を３回洗い、再懸濁した後、蛍光標識二次抗体ＰＥ ａｎｔｉ－Ｈｉｓ（３６２６０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、室温で遮光して３０ｍｉｎインキュベートし、各ウェルの細胞を３回洗浄し、再懸濁した後にフローサイトメトリー機器に乗せて検出した。図５に示すように、二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅは、ＡＮＧ１とＨＵＶＥＣ細胞に対して結合遮断活性がなかった。
【0063】
（６）二重特異性抗体によるｈＡＮＧ２依存のＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化への抑制
ＨＵＶＥＣ細胞表面には、ＡＮＧ２プロテインの受容体が自然に発現され、ＡＮＧ２が細胞表面の受容体に結合すると、ＡＫＴのリン酸化反応が活性化される。Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＫＴ分析キット（６４ＡＫＳＰＥ１－１、Ｃｉｓｂｉｏ）は、ドナー蛍光団付きと、受容体付きの２種の標識抗体を含んだ。第１抗体は、タンパク質上のリン酸化モチーフとの特異的な結合の理由から選択され、第２抗体は、タンパク質を認識する能力がそのリン酸化状態から独立している理由から選択された。タンパク質のリン酸化により、免疫複合体の形成に標識の抗体が関わるし、ドナーの蛍光団が受容体に密接に近接して、信号を生じる。本実験において、ＨＵＶＥＣ細胞は、連続的に希釈したサンプルと固定濃度のＡＮＧ２とともに共インキュベートした。ＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化程度により、ＡＮＧ２機能活性及びサンプルによるＡＮＧ２機能活性への抑制作用を評価した。成長状態が良好なＨＵＶＥＣ細胞（７００１３５０２、ＡＴＣＣ）を単一細胞懸濁液に調製した。細胞計数後に、１０５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）の最終濃度を１０μｇ／ｍｌに固定し、各ウェルには、実験設計に従いそれぞれ検出対象となる抗体を加え、抗体最高濃度は、１０００ｎＭであり、順次に５倍希釈し、合計で８つの濃度勾配を設定し、同時にブランク対照及び陽性対照ＲＧ７７１６（ＡＴＡＤ００５３４、Ａｔａｇｅｎｉｘ）を設定し、細胞を３７度で１０ｍｉｎインキュベートした後、ウェル内の上清を除去し、溶解液を加えた後、室温で振とうして３０ｍｉｎインキュベートし、細胞溶解液を３８４ウェルプレートに吸い取り、検出試薬を加え遮光して４時間インキュベートし、ＰＨＥＲＡｓｔａｒを使用して検出を行った。図６に示すように、二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅは、ｈＡＮＧ２依存のＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化への抑制活性が対照陽性抗体よりも優れている。
ＨＵＶＥＣ細胞表面には、ＡＮＧ２プロテインの受容体が自然に発現され、ＡＮＧ２が細胞表面の受容体に結合すると、ＡＫＴのリン酸化反応が活性化される。Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＫＴ分析キット（６４ＡＫＳＰＥ１－１、Ｃｉｓｂｉｏ）は、ドナー蛍光団付きと、受容体付きの２種の標識抗体を含んだ。第１抗体は、タンパク質上のリン酸化モチーフとの特異的な結合の理由から選択され、第２抗体は、タンパク質を認識する能力がそのリン酸化状態から独立している理由から選択された。タンパク質のリン酸化により、免疫複合体の形成に標識の抗体が関わるし、ドナーの蛍光団が受容体に密接に近接して、信号を生じる。本実験において、ＨＵＶＥＣ細胞は、連続的に希釈したサンプルと固定濃度のＡＮＧ２とともに共インキュベートした。ＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化程度により、ＡＮＧ２機能活性及びサンプルによるＡＮＧ２機能活性への抑制作用を評価した。成長状態が良好なＨＵＶＥＣ細胞（７００１３５０２、ＡＴＣＣ）を単一細胞懸濁液に調製した。細胞計数後に、１０５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）の最終濃度を１０μｇ／ｍｌに固定し、各ウェルには、実験設計に従いそれぞれ検出対象となる抗体を加え、抗体最高濃度は、１０００ｎＭであり、順次に５倍希釈し、合計で８つの濃度勾配を設定し、同時にブランク対照及び陽性対照ＲＧ７７１６（ＡＴＡＤ００５３４、Ａｔａｇｅｎｉｘ）を設定し、細胞を３７度で１０ｍｉｎインキュベートした後、ウェル内の上清を除去し、溶解液を加えた後、室温で振とうして３０ｍｉｎインキュベートし、細胞溶解液を３８４ウェルプレートに吸い取り、検出試薬を加え遮光して４時間インキュベートし、ＰＨＥＲＡｓｔａｒを使用して検出を行った。図６に示すように、二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅは、ｈＡＮＧ２依存のＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化への抑制活性が対照陽性抗体よりも優れている。
【0064】
【表13】
【0065】
本発明で言及される全ての文献は、各文献が参照として単独に引用されるように、いずれも本願で参照として引用されるものである。また、本発明の上記教示内容を閲読した後、当業者は本発明に対して各種の変更又は修正を行うことができ、これらの等価形式は同様に本願の特許請求の範囲に限定される範囲に収まることを理解すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬の分野に関し、具体的にはＡＮＧ２（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ－２、ヒト血管新生２）の抗体、その調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ＡＮＧ２に対する抗体は、新生血管の形成と漏出を抑制し、炎症反応の発生を減少することができる。ＡＮＧ／Ｔｉｅ２は、血管新生を調節する重要な信号通路である。ＡＮＧ１は、内皮細胞受容体Ｔｉｅ２のリン酸化を促進し、血管平滑筋細胞、周皮細胞等の血管周囲細胞が内皮細胞を取り囲んで支持するように吸引し、血管リモデリングを促進し、血管の完全性を維持して血管機能を調節し、ＡＮＧ１は血管を病変から保護し、かつ血管形態を維持することができるがが、ＡＮＧ２は血管漏出を促進し、低血圧及び血管構造の異常を引き起こす。企業開発の臨床実験中のＡＮＧ２抗体が数多くあるものの、現時点ではＡＮＧ２に対する抗体薬品はまだ市場に出ていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、ＡＮＧ２に対する特異性モノクローン抗体を提供し、ＡＮＧ２の血管新生促進活性の抑制、および血管新生過程による疾病及び病症又はそれに関連する疾病及び病症、例えば眼底新生血管性疾病、関節リウマチ及び乾癬の治療において作用する。また、血管新生は、腫瘍成長及び維持にとって非常に重要であり、ＡＮＧ２を抑制するモノクローン抗体は、がんの治療過程においても作用することが可能である。また、本発明は、ＡＮＧ２及びＶＥＧＦに対する二重特異性抗体をさらに提供する。本発明の抗体は、ヒトＡＮＧ２、ウサギＡＮＧ２及びサルＡＮＧ２に結合することができる。
【課題を解決するための手段】
【0004】
具体的には、本発明は、以下の方面に関する。
【0005】
１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のいずれか一項に示す重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又はその変異体を含む抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であって、
好ましくは、ＩＭＧＴナンバリング体系に従い、以下の各項からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すＨＣＤＲ３であり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示すＨＣＤＲ３であり、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示すＨＣＤＲ３であり、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体、及びそれらの組合せであって、前記変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３と比べてそれぞれ１つ又は複数（好ましくは１つ、２つ又は３つ）の保存アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有し、かつＡＮＧ２との結合親和性を保留したアミノ酸配列であり、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＣＤＲ１における５～８番目及び１０～１１番目のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＣＤＲ２における２～５番目のアミノ酸及び７番目、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＣＤＲ３の１番目のアミノ酸、３～８番目のアミノ酸はアミノ酸Ｘから選択され、前記アミノ酸Ｘは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選択され、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１の変異体において、１番目のグリシンＧはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、２番目のフェニルアラニンＦはＴｙｒにより、３番目のプロリンＰはＴｒｐ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸により、４番目のＳｅｒはＴｈｒにより、９番目のＳｅｒはＴｈｒにより、１２番目のＧｌｎはＡｓｎにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２の変異体について、１番目のＩｌｅはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸により、６番目のＬｅｕはＩｌｅにより、８番目のＬｙｓはＡｒｇにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体において、２番目のＶａｌはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、９番目のＡｓｐはＧｌｕにより置換されてもよく、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示すＨＣＤＲ３であり、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示すＨＣＤＲ３である。
好ましくは、ＩＭＧＴナンバリング体系に従い、以下の各項からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すＨＣＤＲ３であり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６に示すＨＣＤＲ３であり、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９に示すＨＣＤＲ３であり、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体、及びそれらの組合せであって、前記変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３と比べてそれぞれ１つ又は複数（好ましくは１つ、２つ又は３つ）の保存アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有し、かつＡＮＧ２との結合親和性を保留したアミノ酸配列であり、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＣＤＲ１における５～８番目及び１０～１１番目のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＣＤＲ２における２～５番目のアミノ酸及び７番目、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＣＤＲ３の１番目のアミノ酸、３～８番目のアミノ酸はアミノ酸Ｘから選択され、前記アミノ酸Ｘは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選択され、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１の変異体において、１番目のグリシンＧはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、２番目のフェニルアラニンＦはＴｙｒにより、３番目のプロリンＰはＴｒｐ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸により、４番目のＳｅｒはＴｈｒにより、９番目のＳｅｒはＴｈｒにより、１２番目のＧｌｎはＡｓｎにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２の変異体について、１番目のＩｌｅはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸により、６番目のＬｅｕはＩｌｅにより、８番目のＬｙｓはＡｒｇにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体において、２番目のＶａｌはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、９番目のＡｓｐはＧｌｕにより置換されてもよく、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５に示すＨＣＤＲ３であり、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（７）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（８）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８に示すＨＣＤＲ３であり、
（９）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７に示すＨＣＤＲ３である。
【0006】
２．項１に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であって、そのうち、前記ＡＮＧ２は、ヒトＡＮＧ２、ウサギＡＮＧ２、又はサルＡＮＧ２から選択される。
【0007】
３．項１又は２に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であって、重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のいずれか一項に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のいずれか一項に記載の配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有し且つＡＮＧ２結合活性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成される。
【0008】
４．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体を含む組換えプロテインであって、好ましくは、前記組換えプロテインは生物活性物質、例えば酵素活性を有する毒素又はその活性断片（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素）、腫瘍壊死因子又はインターフェロン（例えばＩＦＮ－γ）、生物反応調節物（例えばリンフォカイン、ＩＬ－２、ＩＬ－２、ＩＬ２－６、ＩＬ－１０、粒ＧＭ－ＣＳＦ）、及び／又はＦｃ断片（例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のサブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ由来のＦｃ領域、例えばヒト、ウサギ又はサルのＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ由来のＦｃ領域）をさらに含み、好ましくは、前記抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体と前記Ｆｃ断片は、連結ペプチドにより連結され、好ましくは、前記連結ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）であり、好ましくは、前記Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり、より好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＫ３０３１８５．１又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示すＦｃ断片であり、より好ましくは、前記組換えプロテインはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０に示す配列を含むか、又は上記配列から構成される。
【0009】
５．多重特異性抗体であって、好ましくは二重特異性抗体であり、項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体を含み、好ましくは前記二重特異性抗体の構造は、軽鎖及び重鎖を含み、そのうち、軽－重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、２つの重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、そのうち、重鎖は、（ＶＨ）－（ＣＨ１）－（ヒンジ領域）－（Ｆｃ）－（連結ペプチド）－（ＶＨＨ）であり、軽鎖は、（ＶＬ）－（軽鎖定常領域）である。
【0010】
６．項５に記載の多重特異性抗体であって、ＶＨＨは項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であり、ＶＨ及びＶＬは第２種の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域であり、好ましくは、前記第２種の抗体により向けられる抗原は、免疫細胞表面抗原、腫瘍抗原、ウイルス、細菌、エンドトキシン、サイトカイン、又はそれらの組合せから選択され、より好ましくは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＥＡ、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、Ｂ７－Ｈ３、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３、及び／又はＣＤ１６ａから選択され、好ましくは、第２種の抗体により向けられる抗原は、ＶＥＧＦであり、より好ましくは、第２抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体から選択され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３（好ましくはＩＭＧＴナンバリング体系に従い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示すＨＣＤＲ３を含む）と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（好ましくはＩＭＧＴナンバリング体系に従い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示すＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示すＬＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示すＬＣＤＲ３を含む）と、を含み、より好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成され、前記抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成される。
【0011】
７．項５又は６に記載の多重特異性抗体であって、ＣＨ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に、ヒンジ領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に、Ｆｃ定常領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に、連結ペプチドの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又は４７に、軽鎖定常領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示し、好ましくは、前記多重特異性抗体は、
（１）重鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、２５、２６、２９、３０及び４を含むか、又は上記配列から構成される重鎖と、軽鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８を含むか、又は上記配列から構成される軽鎖と、を含むか、又は上記配列から構成されるＹ４００Ｃと、
（２）重鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、２５、２６、２９、４７及び４を含むか、又は上記配列から構成される重鎖と、軽鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８を含むか、又は上記配列から構成される軽鎖と、を含むか、又は上記配列から構成されるＹ４００Ｅと、の群から選択される。
（１）重鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、２５、２６、２９、３０及び４を含むか、又は上記配列から構成される重鎖と、軽鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８を含むか、又は上記配列から構成される軽鎖と、を含むか、又は上記配列から構成されるＹ４００Ｃと、
（２）重鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４、２５、２６、２９、４７及び４を含むか、又は上記配列から構成される重鎖と、軽鎖の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７及び２８を含むか、又は上記配列から構成される軽鎖と、を含むか、又は上記配列から構成されるＹ４００Ｅと、の群から選択される。
【0012】
８．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、又は項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドである。
【0013】
９．項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクターである。
【0014】
１０．項９に記載のベクターを含む宿主細胞である。
【0015】
１１．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、又は項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体、及びカップリング部分を含むカップリング物であって、前記カップリング部分は、精製タグ（例えばＨｉｓタグ）、検出可能な標識、薬品、毒素、サイトカイン、酵素、又はそれらの組合せであり、好ましくは、前記カップリング部分は、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、有色物、化学療法剤、生物毒素、ポリエチレングリコール又は酵素である。
【0016】
１２．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物を含むキットであって、好ましくは、前記キットは、項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物を特異的に認識する抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、組換えプロテイン又は多重特異性抗体をさらに含み、任意に、前記抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、組換えプロテイン又は多重特異性抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、有色物又は酵素をさらに含み、好ましくは、前記キットは、ＡＮＧ２のサンプルにおける存在又はそのレベルを検出するために用いられ、又は
前記キットは、（１）項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物、及び（２）他の抗原に対する抗体又はその抗原結合断片、及び／又は細胞毒性剤、及び／又は化学療法薬、及び選択可能な取扱説明書を含む。
前記キットは、（１）項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物、及び（２）他の抗原に対する抗体又はその抗原結合断片、及び／又は細胞毒性剤、及び／又は化学療法薬、及び選択可能な取扱説明書を含む。
【0017】
１３．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物を含む医薬組成物であって、選択的に、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なベクター及び／又は賦形剤をさらに含み、好ましくは、前記医薬組成物は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は病巣内注射による投与に適した形式である。
【0018】
１４．項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、項４に記載の組換えプロテイン、項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は項１１に記載のカップリング物の、ＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制すること、血管新生過程による疾病又はそれに関連する疾病、例えば眼底新生血管性疾病、関節リウマチ及び乾癬、及び／又は腫瘍を予防及び／又は治療することにおける使用、又はＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制し、血管新生過程による疾病又はそれに関連する疾病、例えば眼底新生血管性疾病、関節リウマチ及び乾癬及び／又は腫瘍を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における使用である。
【0019】
本発明の範囲内において、本発明の上記各技術特徴及び後文（例えば実施例）で具体的に記述した各技術特徴の間は、いずれも互いに組み合わせて、新規又は好適な技術態様を構成することができることを理解すべきである。紙面の都合上、ここでは個々に説明しない。
【0020】
本発明に係る用語は、当業者が理解する通常の意味を具備する。当分野内で使用する及び／又は許容可能な場合において、１つ用語が２つ又は２つ以上の定義を有するときに、本稿で使用する用語の定義は、全ての意味を含むために用いられる。
【0021】
当業者として理解できるように、抗体のＣＤＲ領域は、抗原に対する抗体の結合特異性を担当する。抗体重鎖及び軽鎖可変領域の配列が既知である場合、現時点では抗体ＣＤＲ領域を確定する方法がいくつかあり、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ及びＡｂＭナンバリング体系を含む。しかしながら、抗体又はその変異体のＣＤＲに関する各種の定義の応用はいずれも本稿で定義及び使用する用語の範囲内にある。該抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられると、当業者は通常、該配列そのもの以外の如何なる実験データに依存することなく、特定ＣＤＲを確定することができる。
【0022】
本発明において、重鎖単一ドメイン抗体は、ＶＨＨドメインとも呼ばれ、ＶＨＨ抗体断片又はＶＨＨ抗体は、「重鎖抗体」（即ち軽鎖を欠く抗体）と呼ばれる抗原結合免疫グロブリンの可変ドメイン（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ、Ａｔａｒｈｏｕｃｈ Ｔ、Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｇ、Ｈａｍｅｒｓ Ｃ、Ｓｏｎｇａ ＥＢ、ＢＥｎｄａｈｍａｎ Ｎ、Ｈａｍｅｒｓ Ｒ．：「Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ」、Ｎａｔｕｒｅ ３６３、４４６～４４８、１９９３）である。ＶＨＨドメインは、他の抗原結合ドメインを必要とせずエピトープに特異的に結合する。ＶＨＨドメインは、単一免疫グロブリンドメインからなる小型で安定した高効率的な抗原認識ユニットである。
【0023】
本発明の重鎖単一ドメイン抗体は、必要な生物活性を有する物質に接合して、組換えプロテインを形成することができる。いくつかの実施態様において、前記生物活性物質は、例えば酵素活性を有する毒素又はその活性断片（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素）、腫瘍壊死因子又はインターフェロン（例えばＩＦＮ－γ）、生物反応調節物（例えばリンフォカイン、ＩＬ－２、ＩＬ－２、ＩＬ２－６、ＩＬ－１０、粒ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｃ断片から選択される。本発明の組換えプロテインに含まれるＦｃ断片は、それに二量体を形成させ、同時に前記組換えプロテインの体内半減期を延長することができる。いくつかの実施態様において、本発明に使用可能なＦｃ断片は、異なるサブタイプの免疫グロブリン、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のサブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来してもよい。
【0024】
本発明の抗体は、（ｉ）１つ又は複数の保存的又は非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド、又は（ｉｉ）１つ又は複数のアミノ酸残基には置換基を有するポリペプチド、又は（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと他の１つの化合物（例えばポリペプチド半減期を延長する化合物、例えばポリエチレングリコール）が融合して形成したポリペプチド、又は（ｉｖ）付加されたアミノ酸配列がこのポリペプチド配列に融合して形成したポリペプチド（例えばリーダー配列又は分泌配列又はこのポリペプチドを精製するための配列又はフィブリノーゲン配列、又は６Ｈｉｓタグと形成した融合プロテイン）であってもよい。本稿の教示によれば、これらの断片、誘導体及び類似物は、当業者周知の範囲に属する。
【0025】
保存的置換え
「保存的アミノ酸置換え」は、その中のアミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられることである。類似側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは既に当分野で定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐の側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基に置き換えられることが好ましい。他のいくつかの実施態様において、アミノ酸の鎖は、構造的に類似するアミノ酸の鎖に置き換えられてもよく、後者は順番及び／又は側鎖ファミリーの構成が異なる。
「保存的アミノ酸置換え」は、その中のアミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられることである。類似側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは既に当分野で定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分岐の側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。したがって、免疫グロブリンポリペプチドの非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基に置き換えられることが好ましい。他のいくつかの実施態様において、アミノ酸の鎖は、構造的に類似するアミノ酸の鎖に置き換えられてもよく、後者は順番及び／又は側鎖ファミリーの構成が異なる。
【0026】
下表では、保存的アミノ酸の置換えの非制限的実例が提供され、そのうち、類似性スコアが０になる又はより高くなるとは、この２つのアミノ酸の間に保存的置換えがあることを表す。
【0027】
【表1】
【0028】
いくつかの実施態様において、前記保存的置換えは、下記群（ａ）～（ｅ）の１つアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸残基に置き換えられる置換えであることが好ましく、前記群は（ａ）小さい脂肪族、非極性又は弱極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙと、（ｂ）極性、負電荷を持つ残基及びその（無電荷の）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎと、（ｃ）極性、正電荷を持つ残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓと、（ｄ）大きい脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓと、（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐである。
【0029】
特に好ましい保存的置換えは、以下の通りである。ＡｌａをＧｌｙに置き換え又はＳｅｒに置き換え、ＡｒｇをＬｙｓに置き換え、ＡｓｎをＧｌｎに置き換え又はＨｉｓに置き換え、ＡｓｐをＧｌｕに置き換え、ＣｙｓをＳｅｒに置き換え、ＧｌｎをＡｓｎに置き換え、ＧｌｕをＡｓｐに置き換え、ＧｌｙをＡｌａに置き換え又はＰｒｏに置き換え、ＨｉｓをＡｓｎに置き換え又はＧｌｎに置き換え、ＩｌｅをＬｅｕに置き換え又はＶａｌに置き換え、ＬｅｕをＩｌｅに置き換え又はＶａｌに置き換え、ＬｙｓをＡｒｇに置き換え、Ｇｌｎに置き換え又はＧｌｕに置き換え、ＭｅｔをＬｅｕに置き換え、Ｔｙｒに置き換え又はＩｌｅに置き換え、ＰｈｅをＭｅｔに置き換え、Ｌｅｕに置き換え又はＴｙｒに置き換え、ＳｅｒをＴｈｒに置き換え、ＴｈｒをＳｅｒに置き換え、ＴｒｐをＴｙｒに置き換え、ＴｙｒをＴｒｐに置き換え、及び／又はＰｈｅをＶａｌに置き換え、Ｉｌｅに置き換え又はＬｅｕに置き換える。
【0030】
いくつかの実施態様において、以下のアミノ酸は類似する構造特徴及び性能を有する。
【0031】
例えばグリシンＧ、アラニンＡ、バリンＶ、ロイシンＬ及びイソロイシンＩはいずれも１つのアミノ基、１つのカルボキシル基を含む中性アミノ酸に属し、
セリンＳ及びスレオニンＴはいずれもヒドロキシアミノ酸に属し、
システインＣ及びメチオニンＭはいずれも含硫アミノ酸に属し、
アスパラギンＮ及びグルタミンＱはいずれもアミド基含有アミノ酸に属し、
アスパラギン酸Ｄ及びグルタミン酸Ｅはいずれも酸性アミノ酸に属し、
リジンＫ及びアルギニンＲはいずれも塩基性アミノ酸に属し、
フェニルアラニンＦ及びチロシンＹはいずれも芳香族アミノ酸に属し、
トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ及びプロリンＰはいずれも複素環アミノ酸に属する。そのため、類似する構造特徴及び性能は、互いに保存的置換を行うことができる。
セリンＳ及びスレオニンＴはいずれもヒドロキシアミノ酸に属し、
システインＣ及びメチオニンＭはいずれも含硫アミノ酸に属し、
アスパラギンＮ及びグルタミンＱはいずれもアミド基含有アミノ酸に属し、
アスパラギン酸Ｄ及びグルタミン酸Ｅはいずれも酸性アミノ酸に属し、
リジンＫ及びアルギニンＲはいずれも塩基性アミノ酸に属し、
フェニルアラニンＦ及びチロシンＹはいずれも芳香族アミノ酸に属し、
トリプトファンＷ、ヒスチジンＨ及びプロリンＰはいずれも複素環アミノ酸に属する。そのため、類似する構造特徴及び性能は、互いに保存的置換を行うことができる。
【発明の効果】
【0032】
いくつかの実施態様において、本発明に記載の抗体は、治療剤（例えば化学療法薬、例えばシスプラチン、カルボプラチン）、薬品前駆体、ペプチド、プロテイン、酵素、ウイルス、脂質、生物反応調節剤、薬剤又はＰＥＧに結合することができる。本発明の抗体は、治療剤に連結又は融合することができ、該治療剤は、検出可能な標識物、例えば放射性標識物、免疫調節剤、ホルモン、酵素、オリゴヌクレオチド、光活性治療剤又は診断剤、細胞毒性剤を含むことができ、薬品又は毒素、超音波増強剤、非放射性標識物、それらの組合せ及び他の当分野既知のこのような成分であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの、ヒトＡＮＧ２に結合する生物学的活性である。
【図2】抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの、サルＡＮＧ２に結合する生物学的活性である。
【図3】抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの、ヒトＡＮＧ２とその受容体ｈＴＩＥ２との結合を抑制する生物学的活性である。
【図4】抗体によるヒトＡＮＧ２とＨＵＶＥＣとの結合への抑制の生物学的活性である。
【図5】抗体によるヒトＡＮＧ１とＨＵＶＥＣとの結合への抑制の生物学的活性である。
【図6】抗体によるヒトＡＮＧ２依存のＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化への抑制である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0034】
以下、実施例により本発明を詳しく記述する。当業者として理解できるように、下記実施例は、単に例を挙げて説明する目的のために用いられるものである。本発明の精神及び範囲は、請求項により限定される。下記実施例に用いられる方法は別途説明しない限り、いずれも通常の方法であり、用いられる試薬は別途説明しない限り、いずれも市販可能な試薬である。
【0035】
実施例１：ＡＮＧ２に対する重鎖単一ドメイン抗体のスクリーニング
ヒトＡＮＧ２のＬｙｓ２７５－Ｐｈｅ４９６位のアミノ酸に対応する組換えヒトＡＮＧ２プロテインは、以下でｈＡＮＧ２と略称され、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示し、サルＡＮＧ２プロテインは、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示し、以下でｃｙｎｏＡＮＧ２と略称される。具体的なＡＮＧ２ ＥＣＤ分子のアミノ酸配列情報は表１に示す。
ヒトＡＮＧ２のＬｙｓ２７５－Ｐｈｅ４９６位のアミノ酸に対応する組換えヒトＡＮＧ２プロテインは、以下でｈＡＮＧ２と略称され、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示し、サルＡＮＧ２プロテインは、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示し、以下でｃｙｎｏＡＮＧ２と略称される。具体的なＡＮＧ２ ＥＣＤ分子のアミノ酸配列情報は表１に示す。
【0036】
【表2】
【0037】
１．１重鎖単一ドメイン抗体ファージライブラリーの構築
２頭のアルパカ（Ａｌｐａｃａ）を選出して抗原免疫を行い、ヒトＡＮＧ２プロテインで４回の免疫を行った後、アルパカの末梢血１００ｍｌのリンパ球を抽出し、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ試薬（ＴＡＫＡＲＡ、９１０９）を用いて総ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩキット（ＴＡＫＡＲＡ、６２１０Ａ）を使用して抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ増幅の方法で、まず７５０ｂｐ長さの重鎖抗体可変領域及び定常領域ＣＨ２の核酸断片を増幅し、次いで、前のステップで回収された７５０ｂｐ長さの核酸断片を鋳型として目的断片、即ち重鎖抗体可変領域断片を増幅した。ベクターｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ（ＮＢｂｉｏｌａｂ、ＮＰＬ－００１、）と目的断片をそれぞれＳｆｉＩで酵素切断し、５０℃で一晩経過して酵素切断して、目的断片を回収し、連結モル比率であるベクター：断片＝１：３の比率に従い連結した。連結生成物を大腸菌コンピテント細胞ＴＧ１に電気変換し、各頭のアルパカの連結生成物に対して１０回の電撃変換を行った。勾配希釈によりプレーティングし、ライブラリサイズの大きさを計算し、２頭のアルパカのファージライブラリーの大きさはそれぞれ１．２１×１０９と１×１０９であった。力価測定プレートからランダムに９６個のクローンを選び取り同定した結果、挿入率が１００％であることが分った。
２頭のアルパカ（Ａｌｐａｃａ）を選出して抗原免疫を行い、ヒトＡＮＧ２プロテインで４回の免疫を行った後、アルパカの末梢血１００ｍｌのリンパ球を抽出し、ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ試薬（ＴＡＫＡＲＡ、９１０９）を用いて総ＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩキット（ＴＡＫＡＲＡ、６２１０Ａ）を使用して抽出されたＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ増幅の方法で、まず７５０ｂｐ長さの重鎖抗体可変領域及び定常領域ＣＨ２の核酸断片を増幅し、次いで、前のステップで回収された７５０ｂｐ長さの核酸断片を鋳型として目的断片、即ち重鎖抗体可変領域断片を増幅した。ベクターｐＣｏｍｂ３ＸＳＳ（ＮＢｂｉｏｌａｂ、ＮＰＬ－００１、）と目的断片をそれぞれＳｆｉＩで酵素切断し、５０℃で一晩経過して酵素切断して、目的断片を回収し、連結モル比率であるベクター：断片＝１：３の比率に従い連結した。連結生成物を大腸菌コンピテント細胞ＴＧ１に電気変換し、各頭のアルパカの連結生成物に対して１０回の電撃変換を行った。勾配希釈によりプレーティングし、ライブラリサイズの大きさを計算し、２頭のアルパカのファージライブラリーの大きさはそれぞれ１．２１×１０９と１×１０９であった。力価測定プレートからランダムに９６個のクローンを選び取り同定した結果、挿入率が１００％であることが分った。
【0038】
１．２ ＡＮＧ２に対する重鎖単一ドメイン抗体のパンニング
ｈＡＮＧ２プロテインにより１０μｇ／ウェルでプレートを被覆し、４℃で一晩経過した。翌日、１％ＢＳＡを用いて室温で２時間ブロッキングした後、１００μｌのファージ（２×１０９ｐｆｕ／ウェルであり、１．１で構築した重鎖単一ドメイン抗体ファージライブラリーに由来した）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳには０．０５％のツイーン２０が含まれている）で５回洗うことで結合していないファージを洗い流した。最後に、グリシン－塩酸（２００ｍＭ）を用いてｈＡＮＧ２に特異的に結合したファージを溶出しており、対数期成長にある大腸菌ＴＧ１に感染させ、ファージを生成して精製し、次のラウンドのスクリーニングに用いられる。同じスクリーニング過程を２ラウンド繰り返した後に、獲得したファージを大腸菌ＴＧ１に感染させてプレーティングし、プレートからモノクローンを選び取り、シーケンシングした。配列アライメント結果に応じて個々のクローンのプロテイン配列を分析し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列が異なるクローンを異なる抗体株と見なし、最終的に合計で１０株の異なる抗体を取得した。
ｈＡＮＧ２プロテインにより１０μｇ／ウェルでプレートを被覆し、４℃で一晩経過した。翌日、１％ＢＳＡを用いて室温で２時間ブロッキングした後、１００μｌのファージ（２×１０９ｐｆｕ／ウェルであり、１．１で構築した重鎖単一ドメイン抗体ファージライブラリーに由来した）を加え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳＴ（ＰＢＳには０．０５％のツイーン２０が含まれている）で５回洗うことで結合していないファージを洗い流した。最後に、グリシン－塩酸（２００ｍＭ）を用いてｈＡＮＧ２に特異的に結合したファージを溶出しており、対数期成長にある大腸菌ＴＧ１に感染させ、ファージを生成して精製し、次のラウンドのスクリーニングに用いられる。同じスクリーニング過程を２ラウンド繰り返した後に、獲得したファージを大腸菌ＴＧ１に感染させてプレーティングし、プレートからモノクローンを選び取り、シーケンシングした。配列アライメント結果に応じて個々のクローンのプロテイン配列を分析し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の配列が異なるクローンを異なる抗体株と見なし、最終的に合計で１０株の異なる抗体を取得した。
【0039】
【表3】
【0040】
実施例２：ＡＮＧ２に対する重鎖単一ドメイン抗体の初歩評価同定
１．重鎖単一ドメイン抗体の宿主菌大腸菌での発現
取得した１０株の重鎖単一ドメイン抗体のＴＧ１宿主菌に対して単一コロニーを選んで接種し、一晩経過して培養し、翌日、一晩経過した菌種を転移接種して増幅し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、３７℃で一晩経過してシェーカー培養した。翌日、遠心分離して上清を収集して検出する。
１．重鎖単一ドメイン抗体の宿主菌大腸菌での発現
取得した１０株の重鎖単一ドメイン抗体のＴＧ１宿主菌に対して単一コロニーを選んで接種し、一晩経過して培養し、翌日、一晩経過した菌種を転移接種して増幅し、０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、３７℃で一晩経過してシェーカー培養した。翌日、遠心分離して上清を収集して検出する。
【0041】
２．ＥＬＩＳＡによる１０個の重鎖単一ドメイン抗体の親和性検出
ｈＡＮＧ２プロテイン溶液及びＢＳＡをそれぞれ２μｌ／ウェルで酵素標識プレートを被覆し、４度で一晩経過し、上清を捨て、各ウェルに３００μｌのブロッキング液（３％のＢＳＡを含むＰＢＳ）を加え、３７度で２時間ブロッキングし、遠心分離して収集した上清を各ウェル２００μｌで酵素標識プレートウェルに加え、室温で静置して２時間インキュベートし、上清を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＰＢＳには０．１％のＴｗｅｅｎ２０が含まれている）で３回洗浄し、希釈済みのＨＲＰ標識の抗ＶＨＨ二次抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ａ０１８６１）を加え、二次抗体は１：１００００で希釈後に使用され、希釈液は１％ＢＳＡのＰＢＳであり、体積は１００μｌ／ウェルであり、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢＤ、５５２１４）を１００μｌ／ウェルで加え、３７度で８分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌ停止液を１００μｌ／ウェルで加え、停止液を加えた後、３０分間内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍに読取りを行った。結果は下表３の通りである。
ｈＡＮＧ２プロテイン溶液及びＢＳＡをそれぞれ２μｌ／ウェルで酵素標識プレートを被覆し、４度で一晩経過し、上清を捨て、各ウェルに３００μｌのブロッキング液（３％のＢＳＡを含むＰＢＳ）を加え、３７度で２時間ブロッキングし、遠心分離して収集した上清を各ウェル２００μｌで酵素標識プレートウェルに加え、室温で静置して２時間インキュベートし、上清を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＰＢＳには０．１％のＴｗｅｅｎ２０が含まれている）で３回洗浄し、希釈済みのＨＲＰ標識の抗ＶＨＨ二次抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ａ０１８６１）を加え、二次抗体は１：１００００で希釈後に使用され、希釈液は１％ＢＳＡのＰＢＳであり、体積は１００μｌ／ウェルであり、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢＤ、５５２１４）を１００μｌ／ウェルで加え、３７度で８分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌ停止液を１００μｌ／ウェルで加え、停止液を加えた後、３０分間内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍに読取りを行った。結果は下表３の通りである。
【0042】
【表4】
【0043】
実施例３：抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃのプラスミドの調製
ＰＣＲクローンのモノクローン抗体重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０）に対応するコードＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＫ３０３１８５．１）に対応するコードＤＮＡに連結させて、重鎖抗体を構築することにより、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの発現プラスミドを取得し、ベクターは、一般的にｐｃＤＮＡ３．１（－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）又はその他の真核発現ベクターを用いる。上記した重鎖抗体プロテイン配列の可変領域と定常領域との間は、連結ペプチドで繋がり、前記連結ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）である。
ＰＣＲクローンのモノクローン抗体重鎖可変領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０）に対応するコードＤＮＡ配列をヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＫ３０３１８５．１）に対応するコードＤＮＡに連結させて、重鎖抗体を構築することにより、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの発現プラスミドを取得し、ベクターは、一般的にｐｃＤＮＡ３．１（－）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）又はその他の真核発現ベクターを用いる。上記した重鎖抗体プロテイン配列の可変領域と定常領域との間は、連結ペプチドで繋がり、前記連結ペプチドは、ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）である。
【0044】
【表5】
【0045】
実施例４．抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの発現と精製
エンドトキシンフリー大量抽出プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ、商品番号１２３９１）を利用してプラスミド抽出を行い、具体的な操作は、メーカーにより提供された明細書に従い行った。ＣＨＯ－Ｓ細胞培養は、メーカーにより提供された説明書に応じて、ＣＤ ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ、商品番号１０７４３－０２９）において、３７℃で、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置かれて培養し、細胞の準備ができた後、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ配列を含有するプラスミドをともにＣＨＯ－Ｓ細胞に共トランスフェクトすることで、抗体－Ｆｃを発現させる。トランスフェクト後の翌日に、培養温度を３２℃に下げ、毎日３．５％の２×ＥＦＣ＋（Ｇｉｂｃｏ、商品番号Ａ２５０３１０５）を補充し、１４日間培養した後、８００×ｇで遠心分離して発現上清を収穫した。そして０．２２μｍのろ過膜でろ過した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製して培養上清液中の抗体－Ｆｃを得た。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度及び各種のプロテインに対応する消光係数により精製した抗体－Ｆｃの濃度を測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥ－ＨＰＬＣにより抗体－Ｆｃの純度及び均質性を評価した。又はイオン交換及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００のＳＥＣを使用して二次精製を行い、高純度抗体－Ｆｃサンプルを調製して使用に備える。
エンドトキシンフリー大量抽出プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ、商品番号１２３９１）を利用してプラスミド抽出を行い、具体的な操作は、メーカーにより提供された明細書に従い行った。ＣＨＯ－Ｓ細胞培養は、メーカーにより提供された説明書に応じて、ＣＤ ＣＨＯ培地（Ｇｉｂｃｏ、商品番号１０７４３－０２９）において、３７℃で、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置かれて培養し、細胞の準備ができた後、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ配列を含有するプラスミドをともにＣＨＯ－Ｓ細胞に共トランスフェクトすることで、抗体－Ｆｃを発現させる。トランスフェクト後の翌日に、培養温度を３２℃に下げ、毎日３．５％の２×ＥＦＣ＋（Ｇｉｂｃｏ、商品番号Ａ２５０３１０５）を補充し、１４日間培養した後、８００×ｇで遠心分離して発現上清を収穫した。そして０．２２μｍのろ過膜でろ過した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及び陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製して培養上清液中の抗体－Ｆｃを得た。２８０ｎｍでのＵＶ吸光度及び各種のプロテインに対応する消光係数により精製した抗体－Ｆｃの濃度を測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥ－ＨＰＬＣにより抗体－Ｆｃの純度及び均質性を評価した。又はイオン交換及びＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００のＳＥＣを使用して二次精製を行い、高純度抗体－Ｆｃサンプルを調製して使用に備える。
【0046】
実施例５．抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－ＦｃのＡＮＧ２への結合親和性
本実施例は、ＥＬＩＳＡ検出方法を使用して１０個の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの親和性を評価した。
本実施例は、ＥＬＩＳＡ検出方法を使用して１０個の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの親和性を評価した。
【0047】
ＡＮＧ２プロテイン溶液をそれぞれ２μｌ／ウェルで酵素標識プレートを被覆し、４度で一晩経過し、上清を捨て、各ウェルに３００μｌのブロッキング液（３％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を加え、３７度で２時間ブロッキングし、抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃを勾配希釈し、希釈液は、１％ＢＳＡのＰＢＳであった。例えば、希釈の初期濃度は、５００ｎＭであり、１０倍希釈し、８つの濃度勾配に希釈した。希釈済みの抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃを各ウェル２００μｌで酵素標識プレートウェルに加え、室温で静置して２時間インキュベートし、上清を捨て、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＰＢＳには０．１％のＴｗｅｅｎ２０が含まれている）で３回洗浄し、希釈済みのＨＲＰ標識の抗ヒトＦｃ二次抗体（ＳＩＧＭＡ、Ａ８６６７）を加え、二次抗体は、１：２００００で希釈した後に使用し、希釈液は、１％ＢＳＡのＰＢＳであり、体積は、１００μｌ／ウェルであり、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢＤ、５５２１４）を１００μｌ／ウェルで加え、３７度で８分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌ停止液を１００μｌ／ウェルで加え、停止液を加えた後、３０分間内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍに読取りを行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェアでデータを分析し、親和性のフィッティングを行い、ＥＣ５０値を取得し、結果は図１、図２及び表５に示す。Ｂ２－Ｅ２－Ｆｃは、ヒトＡＮＧ２及びサルＡＮＧ２プロテインに対して親和性が最も高かった。
【0048】
【表6】
【0049】
実施例６．抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－ＦｃによるｈＡＮＧ２とその受容体ｈＴＩＥ２との結合への抑制
２μｇ／ｍＬ、ＰＢＳの中で調製したｈＴＩＥ２－Ｆｃ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＷ９８）１００μＬを用いて９６ウェルプレートを処理し、４℃でインキュベートして一晩経過した。次いで、プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有したＰＢＳ洗浄緩衝液で３回洗浄し、続いて、１％ＢＳＡを含有したＰＢＳを３００μＬ加えて２時間ブロッキングした。検出対象となる抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃを希釈した後に最終濃度が１０μｇ／ｍＬであるｈＡＮＧ２と混合させ、３７℃で１時間インキュベートした後、抗原抗体混合物を９６ウェルプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有したＰＢＳ洗浄緩衝液で洗浄した後に、希釈済みのＨＲＰ標識の抗Ｈｉｓ二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、６６００５－１－Ｉｇ）を加え、二次抗体は、１：２０００で希釈した後に使用し、希釈液は、１％ＢＳＡのＰＢＳであり、体積は、１００μｌ／ウェルであり、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢＤ、５５２１４）を１００μｌ／ウェルで加え、３７度で８分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌ停止液を１００μｌ／ウェルで加え、停止液を加えた後、３０分間内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍに読取りを行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェアでデータを分析し、親和性のフィッティングを行い、ＥＣ５０値を取得し、結果は図３に示し、Ｂ２Ｅ２－Ｆｃは、ヒトＡＮＧ２とその受容体ＴＩＥ２との結合に顕著な抑制作用があった。
２μｇ／ｍＬ、ＰＢＳの中で調製したｈＴＩＥ２－Ｆｃ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＷ９８）１００μＬを用いて９６ウェルプレートを処理し、４℃でインキュベートして一晩経過した。次いで、プレートを、０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有したＰＢＳ洗浄緩衝液で３回洗浄し、続いて、１％ＢＳＡを含有したＰＢＳを３００μＬ加えて２時間ブロッキングした。検出対象となる抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃを希釈した後に最終濃度が１０μｇ／ｍＬであるｈＡＮＧ２と混合させ、３７℃で１時間インキュベートした後、抗原抗体混合物を９６ウェルプレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。０．１％のＴｗｅｅｎ－２０を含有したＰＢＳ洗浄緩衝液で洗浄した後に、希釈済みのＨＲＰ標識の抗Ｈｉｓ二次抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、６６００５－１－Ｉｇ）を加え、二次抗体は、１：２０００で希釈した後に使用し、希釈液は、１％ＢＳＡのＰＢＳであり、体積は、１００μｌ／ウェルであり、室温で１時間インキュベートし、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで５回洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢＤ、５５２１４）を１００μｌ／ウェルで加え、３７度で８分間発色させた。２Ｍ ＨＣｌ停止液を１００μｌ／ウェルで加え、停止液を加えた後、３０分間内にマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍに読取りを行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウェアでデータを分析し、親和性のフィッティングを行い、ＥＣ５０値を取得し、結果は図３に示し、Ｂ２Ｅ２－Ｆｃは、ヒトＡＮＧ２とその受容体ＴＩＥ２との結合に顕著な抑制作用があった。
【0050】
実施例７：抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃの酸安定性及び熱安定性の評価
以下の酸安定性及び熱安定性の評価方法に従いＢ２－Ｅ２－Ｆｃを評価した。抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ分子のｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの時に、酸溶出ステップにおいて（ｐＨ３．５のクエン酸緩衝液を使用）、溶出された抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ溶液は中和せず、該緩衝液で一定時間保持した後に、３０ｍｉｎにサンプリングし、１／１０体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて中和し、該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行った。抗体分子は、ｐＨ３．５で３０ｍｉｎ処理した後、凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことにより、酸性環境で安定性を維持できることが分かった。同時に、４０℃のインキュベーターで１４日間インキュベートした後に該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行い、凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことにより、４０℃の環境で安定性を維持できることが分かった。表６及び表７の結果に示すように、Ｂ２－Ｅ２－Ｆｃは、良好な酸安定性及び熱安定性があった。
以下の酸安定性及び熱安定性の評価方法に従いＢ２－Ｅ２－Ｆｃを評価した。抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ分子のｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーの時に、酸溶出ステップにおいて（ｐＨ３．５のクエン酸緩衝液を使用）、溶出された抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体－Ｆｃ溶液は中和せず、該緩衝液で一定時間保持した後に、３０ｍｉｎにサンプリングし、１／１０体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加えて中和し、該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行った。抗体分子は、ｐＨ３．５で３０ｍｉｎ処理した後、凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことにより、酸性環境で安定性を維持できることが分かった。同時に、４０℃のインキュベーターで１４日間インキュベートした後に該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行い、凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことにより、４０℃の環境で安定性を維持できることが分かった。表６及び表７の結果に示すように、Ｂ２－Ｅ２－Ｆｃは、良好な酸安定性及び熱安定性があった。
【0051】
【表7】
【表8】
（１）二重特異性抗体の構築
表８に示す二重特異性抗体アミノ酸配列に従い、ＤＮＡコードの逆翻訳及びＤＮＡ断片の合成を行い、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に構築し、２９３又はＣＨＯ細胞に一時トランスフェクトして発現させた。上清を収穫してプロテイン精製を行い、純度が９５％以上の二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅを取得した。具体的なベクター構築、一時トランスフェクト及びプロテイン精製方法は前述した各実施例を参照した。前記二重特異性抗体の構造は、軽鎖及び重鎖を含み、そのうち、軽－重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、２つの重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、そのうち、重鎖が（ＶＨ）－（ＣＨ１）－（ヒンジ領域）－（Ｆｃ）－（連結ペプチド）－（ＶＨＨ）であり、軽鎖が（ＶＬ）－（軽鎖定常領域）であり、ＶＨ及びＶＬが抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖及び軽鎖可変領域であり、ＶＨＨが抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体の可変領域であった。
【0052】
【表9】
【0053】
（２）二重特異性抗体の熱安定性の考察
二重特異性抗体を４０度のインキュベーターに置いて１４日間又は２８日間処理した後に該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行った。結果は、本発明の抗体分子は４０℃で２８日間処理した後に凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことを見出し、４０℃の環境で安定性を維持できることが分かって、表９に示すとおりである。
二重特異性抗体を４０度のインキュベーターに置いて１４日間又は２８日間処理した後に該サンプルのＨＰＬＣ－ＳＥＣ検出を行った。結果は、本発明の抗体分子は４０℃で２８日間処理した後に凝集又は分解現象が見られず、純度変化が４％よりも小さいことを見出し、４０℃の環境で安定性を維持できることが分かって、表９に示すとおりである。
【0054】
【表10】
【0055】
結果から分かるように、二重抗体分子Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅはいずれも良好な熱安定性があった。
【0056】
（３）二重特異性抗体とｈＡＮＧ２との結合
Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡチップ（ＧＥ、商品番号：２８９９５０５６）を用いて供試抗体を捕獲し、抗原ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）は、分析物として供試品に結合する動力学及び親和性データが検出される。抗原と供試品との結合の検出開始濃度は、１０ｎＭであり、これをもとに、２倍勾配希釈し、即ち抗原希釈の濃度はそれぞれ１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６２５ｎＭであり、抗原は低濃度から高濃度まで順次に注入が開始し、１つの陰性対照（即ち１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ）及び１つの繰返し濃度（一般的には最低濃度が繰り返す）を設定し、注入前にシステムのバランスを取るためにＳｔａｒｔ ｕｐ（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ）のすすぎ工程を少なくとも３回行い、抗原と供試品との結合及び解離傾向を検出し、解離完了後に、再生試薬を注入し、チップに対して再生を行い、チップの再生完了後に、次の濃度の検出を行った。検出完了後に、データ分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇフィッティング方式によりデータフィッティングを行い、試験結果は表１０に示す。
Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡチップ（ＧＥ、商品番号：２８９９５０５６）を用いて供試抗体を捕獲し、抗原ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）は、分析物として供試品に結合する動力学及び親和性データが検出される。抗原と供試品との結合の検出開始濃度は、１０ｎＭであり、これをもとに、２倍勾配希釈し、即ち抗原希釈の濃度はそれぞれ１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭ、１．２５ｎＭ、０．６２５ｎＭであり、抗原は低濃度から高濃度まで順次に注入が開始し、１つの陰性対照（即ち１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ）及び１つの繰返し濃度（一般的には最低濃度が繰り返す）を設定し、注入前にシステムのバランスを取るためにＳｔａｒｔ ｕｐ（１×ＨＢＳ－ＥＰ＋ｂｕｆｆｅｒ）のすすぎ工程を少なくとも３回行い、抗原と供試品との結合及び解離傾向を検出し、解離完了後に、再生試薬を注入し、チップに対して再生を行い、チップの再生完了後に、次の濃度の検出を行った。検出完了後に、データ分析ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における１：１ Ｂｉｎｄｉｎｇフィッティング方式によりデータフィッティングを行い、試験結果は表１０に示す。
【0057】
【表11】
【0058】
ヒトＡＮＧ２との親和性の検出結果から分かるように、二重特異性抗体は、ヒトＡＮＧ２に対して強い親和性があった。
【0059】
（４）二重特異性抗体によるｈＡＮＧ２とＨＵＶＥＣ細胞との結合への抑制
成長状態が良好なＨＵＶＥＣ細胞（Ｈ－００３、Ａｌｌｃｅｌｌｓ）を単一細胞懸濁液に調製した。細胞の計数後に、１０５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）の最終濃度を１０μｇ／ｍｌに固定し、各ウェルには、実験設計に従いそれぞれ検出対象となる抗体を加え、抗体最高濃度は、１０００ｎＭであり、順次に５倍希釈し、合計で７つの濃度勾配を設定し、同時にブランク対照及び陽性対照ＲＧ７７１６（ＡＴＡＤ００５３４、Ａｔａｇｅｎｉｘ）を設定し、細胞を室温に置いて３０ｍｉｎインキュベートした後、各ウェルの細胞を３回洗い、再懸濁した後、蛍光標識二次抗体ＰＥ ａｎｔｉ－Ｈｉｓ（３６２６０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、室温で遮光して３０ｍｉｎインキュベートし、各ウェルの細胞を３回洗浄し、再懸濁した後にフローサイトメトリー機器に乗せて検出した。図４に示すように、二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅは、ＡＮＧ２及びＨＵＶＥＣ細胞に対する遮断活性が対照陽性抗体よりも優れている。
成長状態が良好なＨＵＶＥＣ細胞（Ｈ－００３、Ａｌｌｃｅｌｌｓ）を単一細胞懸濁液に調製した。細胞の計数後に、１０５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）の最終濃度を１０μｇ／ｍｌに固定し、各ウェルには、実験設計に従いそれぞれ検出対象となる抗体を加え、抗体最高濃度は、１０００ｎＭであり、順次に５倍希釈し、合計で７つの濃度勾配を設定し、同時にブランク対照及び陽性対照ＲＧ７７１６（ＡＴＡＤ００５３４、Ａｔａｇｅｎｉｘ）を設定し、細胞を室温に置いて３０ｍｉｎインキュベートした後、各ウェルの細胞を３回洗い、再懸濁した後、蛍光標識二次抗体ＰＥ ａｎｔｉ－Ｈｉｓ（３６２６０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、室温で遮光して３０ｍｉｎインキュベートし、各ウェルの細胞を３回洗浄し、再懸濁した後にフローサイトメトリー機器に乗せて検出した。図４に示すように、二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅは、ＡＮＧ２及びＨＵＶＥＣ細胞に対する遮断活性が対照陽性抗体よりも優れている。
【0060】
【表12】
【0061】
（５）二重特異性抗体はｈＡＮＧ１とＨＵＶＥＣ細胞との結合を抑制しない
ＡＮＧ１／ＡＮＧ２－ＴＩＥ２という信号通路に関連する生物学機能において、ＡＮＧ１活性を保存することは、何らかの抗血管新生の治療に有益である。そのため、本発明における抗体は、ＡＮＧ２に特異的に結合するがＡＮＧ１に結合せず、同時にＡＮＧ２とその受容体ＴＩＥ２との結合のみを抑制するがＡＮＧ１とその受容体ＴＩＥ２との結合を抑制しない。本発明の抗体は、ＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制すること、血管新生過程による疾病及び病症又はそれに関連する疾病及び病症を治療することにおいて特に有用である。
ＡＮＧ１／ＡＮＧ２－ＴＩＥ２という信号通路に関連する生物学機能において、ＡＮＧ１活性を保存することは、何らかの抗血管新生の治療に有益である。そのため、本発明における抗体は、ＡＮＧ２に特異的に結合するがＡＮＧ１に結合せず、同時にＡＮＧ２とその受容体ＴＩＥ２との結合のみを抑制するがＡＮＧ１とその受容体ＴＩＥ２との結合を抑制しない。本発明の抗体は、ＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制すること、血管新生過程による疾病及び病症又はそれに関連する疾病及び病症を治療することにおいて特に有用である。
【0062】
成長状態が良好なＨＵＶＥＣ細胞（Ｈ－００３、Ａｌｌｃｅｌｌｓ）を単一細胞懸濁液に調製した。細胞計数後に、１０５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、ヒトＡＮＧ１プロテイン（６２３－ＡＮ／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）の最終濃度を１０μｇ／ｍｌに固定し、各ウェルには、実験設計に従いそれぞれ検出対象となる抗体を加え、抗体最高濃度は、１０００ｎＭであり、順次に５倍希釈し、合計で７つの濃度勾配を設定し、同時にブランク対照及び陽性対照ｈＴＩＥ２－Ｆｃ（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＷ９８）を設定し、細胞を室温に置いて３０ｍｉｎインキュベートした後、各ウェルの細胞を３回洗い、再懸濁した後、蛍光標識二次抗体ＰＥ ａｎｔｉ－Ｈｉｓ（３６２６０３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、室温で遮光して３０ｍｉｎインキュベートし、各ウェルの細胞を３回洗浄し、再懸濁した後にフローサイトメトリー機器に乗せて検出した。図５に示すように、二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅは、ＡＮＧ１とＨＵＶＥＣ細胞に対して結合遮断活性がなかった。
【0063】
（６）二重特異性抗体によるｈＡＮＧ２依存のＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化への抑制
ＨＵＶＥＣ細胞表面には、ＡＮＧ２プロテインの受容体が自然に発現され、ＡＮＧ２が細胞表面の受容体に結合すると、ＡＫＴのリン酸化反応が活性化される。Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＫＴ分析キット（６４ＡＫＳＰＥ１－１、Ｃｉｓｂｉｏ）は、ドナー蛍光団付きと、受容体付きの２種の標識抗体を含んだ。第１抗体は、タンパク質上のリン酸化モチーフとの特異的な結合の理由から選択され、第２抗体は、タンパク質を認識する能力がそのリン酸化状態から独立している理由から選択された。タンパク質のリン酸化により、免疫複合体の形成に標識の抗体が関わるし、ドナーの蛍光団が受容体に密接に近接して、信号を生じる。本実験において、ＨＵＶＥＣ細胞は、連続的に希釈したサンプルと固定濃度のＡＮＧ２とともに共インキュベートした。ＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化程度により、ＡＮＧ２機能活性及びサンプルによるＡＮＧ２機能活性への抑制作用を評価した。成長状態が良好なＨＵＶＥＣ細胞（７００１３５０２、ＡＴＣＣ）を単一細胞懸濁液に調製した。細胞計数後に、１０５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）の最終濃度を１０μｇ／ｍｌに固定し、各ウェルには、実験設計に従いそれぞれ検出対象となる抗体を加え、抗体最高濃度は、１０００ｎＭであり、順次に５倍希釈し、合計で８つの濃度勾配を設定し、同時にブランク対照及び陽性対照ＲＧ７７１６（ＡＴＡＤ００５３４、Ａｔａｇｅｎｉｘ）を設定し、細胞を３７度で１０ｍｉｎインキュベートした後、ウェル内の上清を除去し、溶解液を加えた後、室温で振とうして３０ｍｉｎインキュベートし、細胞溶解液を３８４ウェルプレートに吸い取り、検出試薬を加え遮光して４時間インキュベートし、ＰＨＥＲＡｓｔａｒを使用して検出を行った。図６に示すように、二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅは、ｈＡＮＧ２依存のＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化への抑制活性が対照陽性抗体よりも優れている。
ＨＵＶＥＣ細胞表面には、ＡＮＧ２プロテインの受容体が自然に発現され、ＡＮＧ２が細胞表面の受容体に結合すると、ＡＫＴのリン酸化反応が活性化される。Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＫＴ分析キット（６４ＡＫＳＰＥ１－１、Ｃｉｓｂｉｏ）は、ドナー蛍光団付きと、受容体付きの２種の標識抗体を含んだ。第１抗体は、タンパク質上のリン酸化モチーフとの特異的な結合の理由から選択され、第２抗体は、タンパク質を認識する能力がそのリン酸化状態から独立している理由から選択された。タンパク質のリン酸化により、免疫複合体の形成に標識の抗体が関わるし、ドナーの蛍光団が受容体に密接に近接して、信号を生じる。本実験において、ＨＵＶＥＣ細胞は、連続的に希釈したサンプルと固定濃度のＡＮＧ２とともに共インキュベートした。ＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化程度により、ＡＮＧ２機能活性及びサンプルによるＡＮＧ２機能活性への抑制作用を評価した。成長状態が良好なＨＵＶＥＣ細胞（７００１３５０２、ＡＴＣＣ）を単一細胞懸濁液に調製した。細胞計数後に、１０５個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播き、ヒトＡＮＧ２プロテイン（６２３－ＡＮ－０２５／ＣＦ、Ｒ＆Ｄ）の最終濃度を１０μｇ／ｍｌに固定し、各ウェルには、実験設計に従いそれぞれ検出対象となる抗体を加え、抗体最高濃度は、１０００ｎＭであり、順次に５倍希釈し、合計で８つの濃度勾配を設定し、同時にブランク対照及び陽性対照ＲＧ７７１６（ＡＴＡＤ００５３４、Ａｔａｇｅｎｉｘ）を設定し、細胞を３７度で１０ｍｉｎインキュベートした後、ウェル内の上清を除去し、溶解液を加えた後、室温で振とうして３０ｍｉｎインキュベートし、細胞溶解液を３８４ウェルプレートに吸い取り、検出試薬を加え遮光して４時間インキュベートし、ＰＨＥＲＡｓｔａｒを使用して検出を行った。図６に示すように、二重特異性抗体Ｙ４００Ｃ及びＹ４００Ｅは、ｈＡＮＧ２依存のＨＵＶＥＣ細胞のＡＫＴリン酸化への抑制活性が対照陽性抗体よりも優れている。
【0064】
【表13】
【0065】
本発明で言及される全ての文献は、各文献が参照として単独に引用されるように、いずれも本願で参照として引用されるものである。また、本発明の上記教示内容を閲読した後、当業者は本発明に対して各種の変更又は修正を行うことができ、これらの等価形式は同様に本願の特許請求の範囲に限定される範囲に収まることを理解すべきである。
【手続補正2】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、又はその変異体を含む抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であって、好ましくは、ＩＭＧＴナンバリング体系に従い、以下の各項からなる群から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体、及びそれらの組合せであって、前記変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３と比べてそれぞれ１つ又は複数（好ましくは１つ、２つ又は３つ）の保存アミノ酸変異（好ましくは置換、挿入又は欠失）を有し、かつＡＮＧ２との結合親和性を保留したアミノ酸配列であり、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＣＤＲ１における５～８番目及び１０～１１番目のアミノ酸、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＣＤＲ２における２～５番目のアミノ酸及び７番目、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＣＤＲ３の１番目のアミノ酸、３～８番目のアミノ酸は、アミノ酸Ｘから選択され、前記アミノ酸Ｘは、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選択され、
好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０に示すＨＣＤＲ１の変異体において、１番目のグリシンＧはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、２番目のフェニルアラニンＦはＴｙｒにより、３番目のプロリンＰはＴｒｐ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸により、４番目のＳｅｒはＴｈｒにより、９番目のＳｅｒはＴｈｒにより、１２番目のＧｌｎはＡｓｎにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１に示すＨＣＤＲ２の変異体について、１番目のＩｌｅはＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸により、６番目のＬｅｕはＩｌｅにより、８番目のＬｙｓはＡｒｇにより置換されてもよく、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２に示すＨＣＤＲ３の変異体において、２番目のＶａｌはＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸により、９番目のＡｓｐはＧｌｕにより置換されてもよい、
抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体。
【請求項2】
前記ＡＮＧ２は、ヒトＡＮＧ２、ウサギＡＮＧ２、又はサルＡＮＧ２から選択される、請求項１に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体。
【請求項3】
重鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載の配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有し且つＡＮＧ２結合活性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成される、請求項１に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体。
【請求項4】
請求項１に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体を含む組換えプロテインであって、好ましくは、前記組換えプロテインは生物活性物質、例えば酵素活性を有する毒素又はその活性断片（例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素又はジフテリア毒素）、腫瘍壊死因子又はインターフェロン（例えばＩＦＮ－γ）、生物反応調節物（例えばリンフォカイン、ＩＬ－２、ＩＬ－２、ＩＬ２－６、ＩＬ－１０、粒ＧＭ－ＣＳＦ）、Ｆｃ断片（例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のサブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ由来のＦｃ領域、例えばヒト、ウサギ又はサルのＩｇＧ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭ由来のＦｃ領域）をさらに含み、好ましくは、前記抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体と前記Ｆｃ断片は、連結ペプチドにより連結され、好ましくは、前記連結ペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）であり、好ましくは、前記Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり、より好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．ＡＫ３０３１８５．１に示すＦｃ断片であり、より好ましくは、前記組換えプロテインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示す配列を含むか、又は上記配列から構成される、
組換えプロテイン。
【請求項5】
多重特異性抗体であって、好ましくは二重特異性抗体であり、請求項１に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体を含み、好ましくは前記二重特異性抗体の構造は、軽鎖及び重鎖を含み、そのうち、軽－重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、２つの重鎖が対合して鎖間ジスルフィド結合を形成し、そのうち、重鎖は、（ＶＨ）－（ＣＨ１）－（ヒンジ領域）－（Ｆｃ）－（連結ペプチド）－（ＶＨＨ）であり、軽鎖は、（ＶＬ）－（軽鎖定常領域）である、
多重特異性抗体。
【請求項6】
ＶＨＨは前記の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体であり、ＶＨ及びＶＬは第２種の抗体の重鎖及び軽鎖可変領域であり、好ましくは、前記第２種の抗体により向けられる抗原は、免疫細胞表面抗原、腫瘍抗原、ウイルス、細菌、エンドトキシン、サイトカイン、又はそれらの組合せから選択され、より好ましくは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０Ｒ、ＢＣＭＡ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－β、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＧＩＴ、ＣＥＡ、ＣＤ３８、ＳＬＡＭＦ７、Ｂ７－Ｈ３、Ｈｅｒ２、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１３３、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ＲＡＮＫＬ、ＣＤ３、及び／又はＣＤ１６ａから選択され、好ましくは、第２種の抗体により向けられる抗原は、ＶＥＧＦであり、より好ましくは、第２抗体は、抗ＶＥＧＦ抗体から選択され、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す重鎖可変領域に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３（好ましくはＩＭＧＴナンバリング体系に従い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示すＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１に示すＨＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３に示すＨＣＤＲ３を含む）と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す軽鎖可変領域に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３（好ましくはＩＭＧＴナンバリング体系に従い、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４に示すＬＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８に示すＬＣＤＲ２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９に示すＬＣＤＲ３を含む）と、を含み、より好ましくは、前記抗ＶＥＧＦ抗体の重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成され、前記抗ＶＥＧＦ抗体の軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す配列又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示す配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する配列を含むか、又は上記配列から構成される、請求項５に記載の多重特異性抗体。
【請求項7】
ＣＨ１の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に、ヒンジ領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に、Ｆｃ定常領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に、連結ペプチドの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０又は４７に、軽鎖定常領域の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示すとおりである、請求項５に記載の多重特異性抗体。
【請求項8】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、又は請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項9】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項10】
請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項11】
請求項１に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、組換えプロテイン、又は多重特異性抗体、及びカップリング部分を含むカップリング物であって、前記カップリング部分は、精製タグ（例えばＨｉｓタグ）、検出可能な標識、薬品、毒素、サイトカイン、酵素、又はそれらの組合せであり、好ましくは、前記カップリング部分は、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、有色物、化学療法剤、生物毒素、ポリエチレングリコール又は酵素であり、そのうち、前記組換えプロテインは請求項１に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体を含み、前記多重特異性抗体は、二重特異性抗体が好ましく、請求項１に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体を含む、
カップリング物。
【請求項12】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１１に記載のカップリング物を含むキットであって、好ましくは、前記キットは、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１１に記載のカップリング物を特異的に認識する抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、組換えプロテイン又は多重特異性抗体をさらに含み、任意に、前記抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、組換えプロテイン又は多重特異性抗体は、検出可能な標識、例えば放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、有色物又は酵素をさらに含み、好ましくは、前記キットは、ＡＮＧ２のサンプルにおける存在又はそのレベルを検出するために用いられ、又は前記キットは、（１）請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１１に記載のカップリング物、及び（２）他の抗原に対する抗体又はその抗原結合断片、及び／又は細胞毒性剤、及び／又は化学療法薬、及び選択可能な取扱説明書を含む、
キット。
【請求項13】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１１に記載のカップリング物を含む医薬組成物であって、選択的に、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なベクター及び／又は賦形剤をさらに含み、好ましくは、前記医薬組成物は、皮下注射、皮内注射、静脈内注射、筋肉内注射又は病巣内注射による投与に適した形式である、医薬組成物。
【請求項14】
請求項１～３のいずれか一項に記載の抗ＡＮＧ２重鎖単一ドメイン抗体、請求項４に記載の組換えプロテイン、請求項５～７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体又は請求項１１に記載のカップリング物の、ＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制すること、血管新生過程による疾病又はそれに関連する疾病、例えば眼底新生血管性疾病、関節リウマチ及び乾癬、及び／又は腫瘍を予防及び／又は治療することにおける使用、又はＡＮＧ２の血管新生促進活性を抑制し、血管新生過程による疾病又はそれに関連する疾病、例えば眼底新生血管性疾病、関節リウマチ及び乾癬及び／又は腫瘍を予防及び／又は治療するための医薬品の調製における使用。
【国際調査報告】