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特表2024-534976ＭＨＣタンパク質に基づくヘテロ二量体を含む二重特異性抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】ＭＨＣタンパク質に基づくヘテロ二量体を含む二重特異性抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240918BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240918BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240918BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240918BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240918BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240918BHJP
C07K 16/22 20060101ALN20240918BHJP
C07K 16/18 20060101ALN20240918BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240918BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C07K19/00
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C07K16/28
C07K16/22
C07K16/18
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515483
(86)(22)【出願日】2022-09-07
(85)【翻訳文提出日】2024-05-08
(86)【国際出願番号】 RU2022050281
(87)【国際公開番号】W WO2023038548
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】2021126369
(32)【優先日】2021-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】RU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516261966
【氏名又は名称】ジョイント・ストック・カンパニー “バイオキャド”
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100107386
【弁理士】
【氏名又は名称】泉谷 玲子
(72)【発明者】
【氏名】レゴツキー，セルゲイ・アレクサドロビッチ
(72)【発明者】
【氏名】ナザレンコ，オルガ・フィクトロウナ
(72)【発明者】
【氏名】ダニロフ，マクシム・アンドリービッチ
(72)【発明者】
【氏名】バラノウスカイア，マリアンナ・ドミトリエウナ
(72)【発明者】
【氏名】ポリアコフ，ドミトリー・ニコラエビッチ
(72)【発明者】
【氏名】ワリアクメトワ，エルイラ・ライソウナ
(72)【発明者】
【氏名】トポルコワ，クセニーア・アレクサンドロウナ
(72)【発明者】
【氏名】マチウキーナ，ナタリア・ミクハイロウナ
(72)【発明者】
【氏名】クラト，セルゲイ・ミクハイロビッチ
(72)【発明者】
【氏名】グリナ，ナタリア・ニコラエウナ
(72)【発明者】
【氏名】イアコウレフ，パベル・アンドリービッチ
(72)【発明者】
【氏名】モロゾフ，ドミトリー・バレンチノビッチ
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA91X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4H045AA11
4H045BA41
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）またはＭＨＣ様分子（ＣＤ１（分化抗原群１）もしくはＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質））の膜近位ドメインに基づくヘテロ二量体を含む二価二重特異性キメラ抗体、ならびに前記二重特異性抗体を生産するための技術に関する。本発明はさらに、前記二重特異性抗体をコードする核酸、発現ベクター、前記二価キメラ二重特異性抗体を生産するための宿主細胞および前記細胞を生産するための方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二価二重特異性キメラ抗体であって、当該抗体は、ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、前記第１の軽鎖が、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、前記第１の重鎖が、重鎖可変ドメイン、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメイン、を含む；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、前記第２の軽鎖が、軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインを含み、
前記定常ドメインは、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメイン、もしくは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される、
ここにおいて、前記第２の重鎖が、
重鎖可変ドメイン、
ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメイン、もしくは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体
を含む；
ここにおいて、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、ジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をそれらの間で形成し；
ここにおいて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインが、その表面と互いに接触し、二価二重特異性キメラ抗体を形成するように修飾され、重鎖ＣＨ３ドメイン中の前記修飾が、ヘテロ二量体化を容易にする置換である、
を含む、前記二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項2】
ＭＨＣの前記第１の膜近位ドメインが、ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択され得る、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項3】
ＭＨＣの前記第２の膜近位ドメインが、ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択され得る、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項4】
前記ＭＨＣクラスＩＩが、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱまたはＨＬＡ－ＤＲの群から選択される、請求項２または３に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項5】
前記ＭＨＣクラスＩが、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦまたはＨＬＡ－Ｇの群から選択される、請求項２または３に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項6】
ＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインが、ＣＤ１（分化抗原群１）の第１の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第１の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択され得る、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項7】
ＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、ＣＤ１（分化抗原群１）の第２の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第２の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択され得る、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項8】
前記ＣＤ１が、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄまたはＣＤ１ｅの群から選択される、請求項６または７に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項9】
前記第２の軽鎖の可変断片（ＶＬ）が、１～２５アミノ酸長のリンカーによってＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインから分離されている、および／または前記第２の重鎖の可変断片（ＶＨ）が、１～２５アミノ酸長のリンカーによってＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインから分離されている、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項10】
ａ）一方の重鎖のＣＨ３ドメインが、前記二価二重特異性抗体中の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面と接触する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上のホールに適合することができる一方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上でノブの形成をもたらすように修飾されている、および
ｂ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインが、前記二価二重特異性抗体中の第１の重鎖のＣＨ３ドメインの表面と接触する第２の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換されており、前記第１の重鎖のＣＨ３ドメインの境界面上のノブを受容することができる第２の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上でホールの形成をもたらすように修飾されており；
ここにおいて、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を含む群から選択され、
そして、ここにおいて、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）を含む群から選択される、
請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項11】
抗体の前記第１の軽鎖の定常ドメインが、ＣＫまたはＣＬから選択される、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項12】
抗体の前記ＣＨ３ドメインが、ジスルフィド架橋が両方のＣＨ３ドメインの間で形成し得るように、それぞれのＣＨ３ドメインの対応する位置へのアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入によってさらに修飾されている、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項13】
一方の重鎖の前記ＣＨ３ドメインがノブを形成するように修飾されている、および他方の重鎖の前記ＣＨ３ドメインがホールを形成するように修飾されている、またはその逆である、請求項１０に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項14】
一方の重鎖の前記ＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する、および他方の重鎖のＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを有する；あるいは一方の重鎖の前記ＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７を有する、および他方の重鎖の前記ＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する、
請求項１３に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項15】
ＭＨＣの前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、ＭＨＣ ＩＩのα２ドメインおよびＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項16】
ＭＨＣ ＩＩの前記α２ドメインが、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８の群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＭＨＣ ＩＩの前記β２ドメインが、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号３９の群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項17】
ＭＨＣの前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、ＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインおよびＭＨＣ ＩＩのα２ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項18】
ＭＨＣ ＩＩの前記β２ドメインが、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号３９の群から選択されるアミノ酸配列を有し、ＭＨＣ ＩＩの前記α２ドメインが、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８の群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１７に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項19】
ＭＨＣの前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、ＭＨＣ ＩＩのα２ドメインの修飾されたバリアントおよびＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成するか、あるいは、ＭＨＣの前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、ＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインの修飾されたバリアントおよびＭＨＣ ＩＩのα２ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成するか、あるいは、
ＭＨＣの前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、ＭＨＣ Ｉのα３ドメインおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、
請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項20】
ＭＨＣ Ｉの前記α３ドメインが配列番号１～２９の群から選択されるアミノ酸配列を有し、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）が配列番号４６のアミノ酸配列を有する、請求項１９に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項21】
ＭＨＣの前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）およびＭＨＣ Ｉの前記α３ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項22】
前記β２ミクログロブリン（β２Ｍ）が配列番号４６のアミノ酸配列を有し、ＭＨＣ Ｉの前記α３ドメインが配列番号１～２９の群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項23】
ＭＨＣの前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、ＭＨＣ Ｉの前記α３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成するか、あるいは、ＭＨＣの前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの前記第２の膜近位ドメインが、それぞれβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントおよびＭＨＣ Ｉの前記α３ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、
請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項24】
β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の前記修飾されたバリアントが、配列番号４７または配列番号４８から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項25】
ＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、ＣＤ１の前記α３ドメインおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項26】
ＣＤ１の前記α３ドメインが配列番号４０～４４の群から選択されるアミノ酸配列を有し、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）が配列番号４６のアミノ酸配列を有する、請求項２５に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項27】
ＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）およびＣＤ１の前記α３ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項28】
前記β２ミクログロブリン（β２Ｍ）が配列番号４６のアミノ酸配列を有し、ＣＤ１の前記α３ドメインが配列番号４０～４４の群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項29】
ＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、ＣＤ１の前記α３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項30】
ＣＤ１の前記α３ドメインの修飾されたバリアントが配列番号４９～５６の群から選択されるアミノ酸配列を有し、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の前記修飾されたバリアントが配列番号４７または配列番号４８から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項２９に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項31】
ＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントおよびＣＤ１の前記α３ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項32】
β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の前記修飾されたバリアントが配列番号４７または配列番号４８から選択されるアミノ酸配列を有し、ＣＤ１の前記α３ドメインの修飾されたバリアントが配列番号４９～５６または配列番号１０９の群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項33】
ＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、ＨＦＥの前記α３ドメインおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項34】
ＨＦＥの前記α３ドメインが配列番号４５のアミノ酸配列を有し、前記β２ミクログロブリン（β２Ｍ）が配列番号４６のアミノ酸配列を有する、請求項３３に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項35】
ＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）およびＨＦＥの前記α３ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項36】
前記β２ミクログロブリン（β２Ｍ）が配列番号４６のアミノ酸配列を有し、ＨＦＥの前記α３ドメインが配列番号４５のアミノ酸配列を有する、請求項３５に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項37】
ＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、それぞれ、ＨＦＥの前記α３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成するか、あるいは、ＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、それぞれβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントおよびＨＦＥの前記α３ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、
請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項38】
β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の前記修飾されたバリアントが、配列番号４７または配列番号４８から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項３７に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項39】
修飾されたバリアントが、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第１および第２の膜近位ドメインから産生されるヘテロ二量体の鎖の間でジスルフィド架橋を形成するシステイン（Ｃ）への置換を含むバリアントを指すか；あるいは、修飾されたバリアントが、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインの様々な位置に１つまたは複数の置換を含み、それぞれ、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の野生型膜近位ドメインと比較して、熱力学的安定性Ｔｍの１℃より高い増大をもたらすバリアントを指すか；あるいは、
修飾されたバリアントが、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインの様々な位置に１つまたは複数の置換を含み、それぞれ、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の野生型膜近位ドメインと比較して、１０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で５％を超える凝集体の量の減少をもたらすバリアントを指すか；あるいは、
修飾されたバリアントが、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインの様々な位置に１つまたは複数の置換を含み、それぞれ、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の野生型膜近位ドメインと比較して、グリコシル化部位の除去をもたらすバリアントを指す、
請求項２、３、６、７、１９、２３、２９、３１および３７のいずれか一項に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項40】
前記第１の軽鎖の可変ドメインおよび前記第２の軽鎖の可変ドメインが同一である、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項41】
前記Ｆｃ断片がＩｇＧに属する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項42】
前記Ｆｃ断片アイソタイプが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４の群から選択される、請求項４１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項43】
置換が前記Ｆｃ断片単量体中にさらに導入され、二価二重特異性抗体におけるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ特性の非存在をもたらす、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項44】
ＬＡＬＡ置換（Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ）が前記Ｆｃ断片単量体中にさらに導入されている、請求項４３に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項45】
抗体活性の延長をもたらす置換が前記Ｆｃ断片単量体中にさらに導入されている、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項46】
ＹＴＥ置換（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）が前記Ｆｃ断片単量体中にさらに導入されている、請求項４５に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項47】
置換Ｅ３４５Ｒが前記Ｆｃ断片単量体中にさらに導入されている、請求項４３に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項48】
ＣＤ２０およびＣＤ３に特異的に結合する；またはＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する；または
ＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７に特異的に結合する；または
凝固因子９（ＦＩＸ）および凝固因子１０（ＦＸ）に特異的に結合する；または
ＧＤ２およびＣＤ３に特異的に結合する；または
ＡＸＬおよびＣＤ３に特異的に結合する；または
ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦベータに特異的に結合する、
請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項49】
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメイン間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィドシステイン架橋）を形成する第１および／または第２の膜近位ドメイン中の１個の突然変異または複数の突然変異によるジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をその間で形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項50】
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するＣ末端の１つまたは複数（１～１０個）のアミノ酸およびＣ末端の末端ＣｙｓによるＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長によるジスルフィド結合によって安定化される、ヘテロ二量体をその間で形成する、請求項１に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項51】
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインの伸長がＧＳＣである、請求項５０に記載の二価二重特異性キメラ抗体。
【請求項52】
請求項１から５１のいずれか一項に記載の二価二重特異性キメラ抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項53】
前記核酸がＤＮＡである、請求項５２に記載の単離された核酸。
【請求項54】
請求項５２または５３に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項55】
細胞を請求項５４に記載のベクターで形質転換するステップを含む、請求項１から５１のいずれか一項に記載の二価二重特異性キメラ抗体を生産するための宿主細胞を生産する方法。
【請求項56】
請求項５２または５３に記載の核酸を含む、請求項１から５１のいずれか一項に記載の二価二重特異性キメラ抗体を生産するための宿主細胞。
【請求項57】
ａ）前記宿主細胞を、－ 前記二重特異性キメラ抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター、
－ 前記二重特異性キメラ抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター
で形質転換するステップ、
ｂ）前記二価二重特異性キメラ抗体の合成にとって好適な条件下で前記宿主細胞を培養するステップ、ならびに
ｃ）細胞培養物から前記二価二重特異性抗体を単離するステップ
を含む、請求項１から５１のいずれか一項に記載の二価二重特異性キメラ抗体を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーの分野、特に、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）またはＭＨＣ様タンパク質（ＣＤ１（分化抗原群１）もしくはＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質））の膜近位ドメインに基づくヘテロ二量体を含む二価二重特異性キメラ抗体、ならびに前記二重特異性抗体を生産するための技術に関する。本発明はさらに、前記二重特異性抗体をコードする核酸、発現ベクター、前記二価キメラ二重特異性抗体を生産するための宿主細胞および前記細胞を生産するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
キメラ、ヒト化または完全ヒト分子の形態のモノクローナル抗体は、いくつかの障害および疾患を処置するための有効な医薬として有用であることが証明されている。
天然に存在するヒト抗体分子は、それぞれ２個の同一の軽鎖分子と組んでヘテロ二量体を形成する、２個の重鎖ホモ二量体からなる。全分子の形態にある従来のモノクローナル抗体は、重鎖および軽鎖の二価（「２アーム」）ヘテロ二量体からなる。
天然に存在するヒト抗体分子は、それぞれ２個の同一の軽鎖分子と組んでヘテロ二量体を形成する、２個の重鎖ホモ二量体からなる。全分子の形態にある従来のモノクローナル抗体は、重鎖および軽鎖の二価（「２アーム」）ヘテロ二量体からなる。
【0003】
疾患は、いくつかの病理の結果として引き起こされることが多く、多くの合併症を伴う。二重特異性抗体は、抗体分子あたり２つ以上の異なる抗原に結合し、それにより、これを中和することができる。モノクローナル抗体と比較した、医薬品の治療特性（および価値）における有意な改善の可能性は、二重特異性抗体を、活発な研究領域にしてきた。過去２０年にわたって、文献は、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，ＵおよびＲＥ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、２０１７、Ｔｈｅ Ｍａｋｉｎｇ ｏｆ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭＡｂｓ；２０９ Ｆｅｂ／Ｍａｒ；９（２）：１８２～２１２、ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１６．１２６８３０７に記載されたような、二重特異性抗体の操作されたバージョンに関する多くの解決法を記載してきた。
【0004】
上記のように、組み合わせた抗原－結合ドメインを有する、すなわち、互いに異なる抗原結合性ドメインを有する分子を作出するための多くの手法が存在する。しかしながら、これらの方法はそれぞれ、その欠点を有する。
【0005】
ホモ二量体および他の望ましくない副産物を対応する部分から除去するべきであるため、化学的方法による架橋は時間消費的なプロセスである。さらに、化学的修飾のステップは、タンパク質の完全性を変化させ、かくして、その安定性を損なうことがある。かくして、上記方法は、典型的には無効であり、抗体活性の喪失をもたらし得る。
【0006】
細胞融合に基づく方法（例えば、ハイブリドーマの生産）は、２個の重鎖および２個の軽鎖の任意のアセンブリーであり、抗体の１０個の組合せをもたらす。標的ヘテロ多量体抗体は、この様式で生産される抗体の一部分に過ぎない。標的ヘテロ多量体タンパク質の単離は、生成物の収率を有意に低下させ、生産コストを増大させる。
【0007】
組換えＤＮＡ技術は、様々なヘテロ多量体抗体、例えば、Ｆｃ断片を含まない、単鎖Ｆｖ断片、ダイアボディなどを作出するために用いられている。この型の抗体分子の主な欠点は、Ｆｃドメインが存在しないことであり、エフェクター機能（例えば、補体活性化、Ｆｃ受容体への結合など）を誘発することができない抗体をもたらす。かくして、機能的なＦｃドメインを含む二重特異性抗体が必要である。
【0008】
組換えＤＮＡ技術は、ノブイントゥーホール（Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ）技術を使用して二重特異性抗体を設計するためにさらに使用されている。国際出願ＷＯ９６２７０１１およびＷＯ９８５０４３１、ならびにＭｅｒｃｈａｎｔ ＡＭ ＥＴ ＡＬＬ．，Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８ Ｊｕｌ；１６（７）：６７７～８１を参照されたい。上記方法の使用を制限する１つの因子は、単一細胞中で発現された場合、望ましくないおよび／または不活性な分子の誤対合および形成を防止するためには、２つの初期抗体の軽鎖が同一であるべきであるという事実である。
【0009】
二重特異性抗体生成物の純度は、以下のような２つの因子に依存する：
ａ）細胞中で同時発現される２つの異なる重鎖のヘテロ二量体アセンブリー、および
ｂ）２個の異なる軽鎖の、対応する重鎖との正確な対合。
ａ）細胞中で同時発現される２つの異なる重鎖のヘテロ二量体アセンブリー、および
ｂ）２個の異なる軽鎖の、対応する重鎖との正確な対合。
【0010】
二重特異性抗体を設計するための「ノブイントゥーホール技術」技術は、細胞中で同時発現される２個の異なる重鎖の正確なヘテロ二量体アセンブリーの問題を解決する。しかしながら、二重特異性抗体を設計するためのノブイントゥーホール技術の使用は、２個の異なる軽鎖の対応する重鎖との正確な対合の問題が依然として解消されていないため、わずか約２５％の収率の適切にアセンブリーされた二重特異性生成物の達成を可能にするに過ぎない。
【0011】
２個の異なる軽鎖の、対応する重鎖との正確な対合の問題は、様々な様式で解決される：
１．抗体の第１および第２の抗原結合性部分における（同一の）軽鎖の使用（Ｖａｎ Ｂｌａｒｃｏｍ Ｔ ＥＴ ＡＬ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｙｉｅｌｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐａｎｅｌｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍａｂｓ．２０１８ Ｆｅｂ／Ｍａｒ；１０（２）：２５６～２６８．ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１７．１４０６５７０）。
１．抗体の第１および第２の抗原結合性部分における（同一の）軽鎖の使用（Ｖａｎ Ｂｌａｒｃｏｍ Ｔ ＥＴ ＡＬ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｍｍｏｎ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｙｉｅｌｄ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐａｎｅｌｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍａｂｓ．２０１８ Ｆｅｂ／Ｍａｒ；１０（２）：２５６～２６８．ｄｏｉ：１０．１０８０／１９４２０８６２．２０１７．１４０６５７０）。
【0012】
両方の価数にとって好適な軽鎖を選択することは問題が多い場合があるため、上記解決法の欠点は、その非普遍性である。さらに抗原結合性断片の特性を最適化するための軽鎖におけるアミノ酸置換は、両方の価数に影響し得る。さらに、抗体の第２の抗原に対する結合は破壊され得る。
【0013】
２．単鎖形式、すなわち、第１の抗原に特異的な抗原結合性断片の軽鎖および重鎖がいくつかのアミノ酸のリンカーを介して相互接続される形式の使用。
この形式は抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭ）をさらなる結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖもしくはｓｃＦａｂ）に融合させるか、または例えば、ｓｃＦｖ内の軽鎖および重鎖可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）もしくは軽鎖（ＶＬ－ＣＫ（もしくはＣＬ））を、ｓｃＦａｂ内のＶＨ－ＣＨ１に融合させるリンカーを使用するため、技術的な欠点を有する。リンカーは、治療設定において問題を引き起こし得る。事実、これらの外来ペプチドは、リンカー自体またはタンパク質とリンカーとの間の結合領域に対する免疫応答を惹起し得る。さらに、これらのペプチドの可撓性およびその移動性は、それらを、タンパク質分解的切断をより受けやすくし、潜在的には、低い抗体安定性、凝集および免疫原性の増大をもたらす。
この形式は抗体コア（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭ）をさらなる結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖもしくはｓｃＦａｂ）に融合させるか、または例えば、ｓｃＦｖ内の軽鎖および重鎖可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）もしくは軽鎖（ＶＬ－ＣＫ（もしくはＣＬ））を、ｓｃＦａｂ内のＶＨ－ＣＨ１に融合させるリンカーを使用するため、技術的な欠点を有する。リンカーは、治療設定において問題を引き起こし得る。事実、これらの外来ペプチドは、リンカー自体またはタンパク質とリンカーとの間の結合領域に対する免疫応答を惹起し得る。さらに、これらのペプチドの可撓性およびその移動性は、それらを、タンパク質分解的切断をより受けやすくし、潜在的には、低い抗体安定性、凝集および免疫原性の増大をもたらす。
【0014】
３．軽鎖の不正確な会合を排除するための、二重特異性抗体発現技術における相互作用境界面を変更させる二重特異性抗体中のＣＨ１－ＣＫドメインの修飾。例えば、国際出願ＷＯ２０１７０５９５５１は、所望の重鎖と所望の軽鎖との間の好ましい対合を容易にするＣＨ１および／またはＣＫ中の様々なアミノ酸置換を提供する。
【0015】
上記の様々な二重特異性抗体発現技術にも拘わらず、二重特異性抗体生成物の純度の改善、ならびに正確にアセンブリーされた二重特異性抗体を生産するための拡大可能な生産ソリューションが当業界で依然として必要である。
【発明の概要】
【0016】
本発明の著者らによって開発された、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質、例えば、ＣＤ１（分化抗原群１）もしくはＨＦＥ（ヒト恒常性鉄調節タンパク質）の膜近位ドメインに基づくヘテロ二量体を含む新しい形式の二重特異性キメラ抗体、ならびに前記二重特異性キメラ抗体を生産するための技術は驚くべきことに、細胞中で同時発現される２つの異なる重鎖の正確なヘテロ二量体アセンブリーおよび２つの異なる軽鎖と対応する重鎖との間の正確な対合を有する高収率の生成物の生産を可能にする。
【0017】
本発明の著者らによって開発された、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインに基づくヘテロ二量体を含む新しい形式の二重特異性キメラ抗体、ならびに前記二重特異性抗体を生産するための技術は驚くべきことに、高純度で正確にアセンブリーされた二重特異性キメラ抗体生成物の生産を可能にする。
【0018】
結果として、上記結果は、正確にアセンブリーされた二重特異性抗体を生産するための生産コストを低減させ、拡大可能な生産ソリューションをもたらす。
一側面では、本発明は、二価二重特異性キメラ抗体であって、前記抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、前記第１の軽鎖が、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、前記第１の重鎖が、重鎖可変ドメイン、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメイン、を含む；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
第２の軽鎖が、軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインを含み、
前記定常ドメインは、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメイン、もしくは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される、
ここにおいて、第２の重鎖が、
重鎖可変ドメイン、
ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメイン、もしくは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体
を含む；
ここにおいて、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、ジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をそれらの間で形成し；
ここにおいて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインが、その表面と互いに接触し、二価二重特異性キメラ抗体を形成するように修飾され、重鎖ＣＨ３ドメイン中の前記修飾が、ヘテロ二量体化を容易にする置換である、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体に関する。
一側面では、本発明は、二価二重特異性キメラ抗体であって、前記抗体が、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、前記第１の軽鎖が、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、前記第１の重鎖が、重鎖可変ドメイン、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメイン、を含む；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
第２の軽鎖が、軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインを含み、
前記定常ドメインは、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメイン、もしくは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される、
ここにおいて、第２の重鎖が、
重鎖可変ドメイン、
ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメイン、もしくは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体
を含む；
ここにおいて、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、ジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をそれらの間で形成し；
ここにおいて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインが、その表面と互いに接触し、二価二重特異性キメラ抗体を形成するように修飾され、重鎖ＣＨ３ドメイン中の前記修飾が、ヘテロ二量体化を容易にする置換である、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体に関する。
【0019】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメイン間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィドシステイン架橋）を形成する第１および／または第２の定常ドメイン中の１個の突然変異または複数の突然変異によるジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をその間で形成する、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0020】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するＣ末端の１つまたは複数（１～１０個）のアミノ酸およびＣ末端の末端ＣｙｓによってＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長によるジスルフィド結合によって安定化される、ヘテロ二量体をその間で形成する、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0021】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長であって、３個のアミノ酸ＧＳＣの配列である、伸長を含む。
【0022】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ここにおいて、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメイン間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィドシステイン架橋）を形成する第１および／または第２の定常ドメイン中の１個の突然変異または複数の突然変異によるジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をその間で形成し；
ここにおいて、ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成される。
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ここにおいて、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメイン間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィドシステイン架橋）を形成する第１および／または第２の定常ドメイン中の１個の突然変異または複数の突然変異によるジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をその間で形成し；
ここにおいて、ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成される。
【0023】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ここにおいて、ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成され、
ここにおいて、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するＣ末端の１つまたは複数（１～１０個）のアミノ酸およびＣ末端の末端ＣｙｓによってＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長をさらに含む。
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ここにおいて、ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成され、
ここにおいて、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するＣ末端の１つまたは複数（１～１０個）のアミノ酸およびＣ末端の末端ＣｙｓによってＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長をさらに含む。
【0024】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ここにおいて、ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成され、
ここにおいて、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するアミノ酸配列ＧＳＣによってＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長をさらに含む。
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ここにおいて、ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成され、
ここにおいて、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するアミノ酸配列ＧＳＣによってＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長をさらに含む。
【0025】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインを含む。
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインを含む。
【0026】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0027】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ヒトＭＨＣクラスＩの膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ヒトＭＨＣクラスＩＩの膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ヒトＭＨＣクラスＩＩの膜近位ドメインを含む。
【0028】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱまたはＨＬＡ－ＤＲの群から選択されるＭＨＣクラスＩＩの膜近位ドメインを含む。
【0029】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦまたはＨＬＡ－Ｇの群から選択されるＭＨＣクラスＩの膜近位ドメインを含む。
【0030】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ヒトＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１（分化抗原群１）の第１の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第１の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１（分化抗原群１）の第１の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第１の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む。
【0031】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１（分化抗原群１）の第２の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第２の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
ＣＤ１（分化抗原群１）の第２の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第２の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0032】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄまたはＣＤ１ｅの群から選択されるＣＤ１の膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、１～２５アミノ酸長のリンカーによってＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインから分離されている、第２の軽鎖の可変断片（ＶＬ）、および／または１～２５アミノ酸長のリンカーによってＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインから分離されている、第２の重鎖の可変断片（ＶＨ）を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、１～２５アミノ酸長のリンカーによってＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインから分離されている、第２の軽鎖の可変断片（ＶＬ）、および／または１～２５アミノ酸長のリンカーによってＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインから分離されている、第２の重鎖の可変断片（ＶＨ）を含む。
【0033】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ａ）二価二重特異性抗体中の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面と接触する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上のホールに適合することができる一方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上でノブの形成をもたらすように修飾されている、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン、
および
ｂ）二価二重特異性抗体中の第１の重鎖のＣＨ３ドメインの表面と接触する第２の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換されており、第１の重鎖のＣＨ３ドメインの境界面上のノブを受容することができる第２の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上でホールの形成をもたらすように修飾されている、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン
を含み；
ここにおいて、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を含む群から選択され、
そして、ここにおいて、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）を含む群から選択される。
ａ）二価二重特異性抗体中の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面と接触する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上のホールに適合することができる一方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上でノブの形成をもたらすように修飾されている、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン、
および
ｂ）二価二重特異性抗体中の第１の重鎖のＣＨ３ドメインの表面と接触する第２の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換されており、第１の重鎖のＣＨ３ドメインの境界面上のノブを受容することができる第２の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上でホールの形成をもたらすように修飾されている、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン
を含み；
ここにおいて、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を含む群から選択され、
そして、ここにおいて、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）を含む群から選択される。
【0034】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＣＫまたはＣＬから選択される、抗体の第１の軽鎖の定常ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ジスルフィド架橋がＣＨ３ドメインの間で形成し得るように、それぞれのＣＨ３ドメインの対応する位置へのアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入によってさらに修飾される抗体のＣＨ３ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ジスルフィド架橋がＣＨ３ドメインの間で形成し得るように、それぞれのＣＨ３ドメインの対応する位置へのアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入によってさらに修飾される抗体のＣＨ３ドメインを含む。
【0035】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性抗体は、ノブを形成するように修飾されている、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン、およびホールを形成するように修飾されている、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン、またはその逆を含む。
【0036】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン、およびアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを有する、他方の重鎖のＣＨ３ドメインを含む。
【0037】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７を有する、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン、およびアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する、他方の重鎖のＣＨ３ドメインを含む。
【0038】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣＩのα２ドメインおよびＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0039】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインおよびＭＨＣ ＩＩのα２ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0040】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８の群から選択されるアミノ酸配列を有するＭＨＣ ＩＩのα２ドメイン、および配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号３９の群から選択されるアミノ酸配列を有するＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインを含む。
【0041】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ ＩＩのα２ドメインの修飾されたバリアントおよびＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0042】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインの修飾されたバリアントおよびＭＨＣ ＩＩのα２ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0043】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ Ｉのα３ドメインおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0044】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）およびＭＨＣ Ｉのα３ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0045】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号１～２９を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するＭＨＣ Ｉのα３ドメインおよび配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を含む。
【0046】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ Ｉのα３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0047】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントおよびＭＨＣ ＩＩのα３ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0048】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号４７または配列番号４８から選択されるアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントを含む。
【0049】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＣＤ１のα３ドメインおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0050】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）およびＣＤ１のα３ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0051】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号４０～４４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤ１のα３ドメインおよび配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を含む。
【0052】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＣＤ１のα３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0053】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントおよびＣＤ１のα３ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0054】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号４９～５６および／または配列番号１０９を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤ１のα３ドメインの修飾されたバリアントおよび配列番号４７または配列番号４８から選択されるアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントを含む。
【0055】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＨＦＥのα３ドメインおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0056】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）およびＨＦＥのα３ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0057】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＦＥのα３ドメインおよび配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を含む。
【0058】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＨＦＥのα３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0059】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントおよびＨＦＥのα３ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0060】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号４７または配列番号４８から選択されるアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントを含む。
【0061】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の修飾されたバリアントを含み、ここで、修飾されたバリアントとは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメインから産生されるヘテロ二量体の鎖の間でジスルフィド架橋を形成するシステイン（Ｃ）への置換を含むバリアントを指す。
【0062】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の修飾されたバリアントを含み、ここで、修飾されたバリアントとは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインの様々な位置に１つまたは複数の置換を含み、それぞれ、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の野生型膜近位ドメインと比較して、熱力学的安定性Ｔｍの１℃より高い増大をもたらすバリアントを指す。
【0063】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の修飾されたバリアントを含み、ここで、修飾されたバリアントとは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインの様々な位置に１つまたは複数の置換を含み、それぞれ、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の野生型膜近位ドメインと比較して、１０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で５％を超える凝集体の量の減少をもたらすバリアントを指す。
【0064】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の修飾されたバリアントを含み、ここで、修飾されたバリアントとは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインの様々な位置に１つまたは複数の置換を含み、それぞれ、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の野生型膜近位ドメインと比較して、グリコシル化部位の除去をもたらすバリアントを指す。
【0065】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、同一である、第１の軽鎖の可変ドメインおよび第２の軽鎖の可変ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＩｇＧに属するＦｃ断片を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＩｇＧに属するＦｃ断片を含む。
【0066】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４を含む群から選択されるＦｃ断片を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、二価二重特異性抗体におけるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ特性の非存在をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、二価二重特異性抗体におけるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ特性の非存在をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
【0067】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＬＡＬＡ置換（Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ）がさらに導入されているＦｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、抗体の作用の延長をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、抗体の作用の延長をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
【0068】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＹＴＥ置換（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）がさらに導入されているＦｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、二価二重特異性抗体におけるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ特性の増強をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、二価二重特異性抗体におけるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ特性の増強をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
【0069】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換Ｅ３４５Ｒがさらに導入されているＦｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＣＤ２０およびＣＤ３に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＣＤ２０およびＣＤ３に特異的に結合する。
【0070】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７に特異的に結合する。
【0071】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、凝固因子９（ＦＩＸ）および凝固因子１０（ＦＸ）に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＧＤ２およびＣＤ３に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＧＤ２およびＣＤ３に特異的に結合する。
【0072】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＡＸＬおよびＣＤ３に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦベータに特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦベータに特異的に結合する。
【0073】
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかをコードする単離された核酸に関する。
本発明の一部の態様では、核酸はＤＮＡである。
本発明の一部の態様では、核酸はＤＮＡである。
【0074】
一側面では、本発明は、上記核酸のいずれかを含む発現ベクターに関する。
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかを生産するための宿主細胞を生産する方法に関し、細胞の上記発現ベクターによる形質転換を含む。
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかを生産するための宿主細胞を生産する方法に関し、細胞の上記発現ベクターによる形質転換を含む。
【0075】
一側面では、本発明は、上記核酸のいずれかを含む上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかを生産するための宿主細胞に関する。
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかを生産するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、
－ 二重特異性キメラ抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター、
－ 二重特異性キメラ抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター
で形質転換するステップ、
ｂ）前記二価二重特異性キメラ抗体の合成にとって好適な条件下で宿主細胞を培養するステップ、ならびに
ｃ）細胞培養物から前記二価二重特異性抗体を単離するステップ
を含む方法に関する。
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかを生産するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、
－ 二重特異性キメラ抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター、
－ 二重特異性キメラ抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター
で形質転換するステップ、
ｂ）前記二価二重特異性キメラ抗体の合成にとって好適な条件下で宿主細胞を培養するステップ、ならびに
ｃ）細胞培養物から前記二価二重特異性抗体を単離するステップ
を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0076】
【図1】図１は、二価二重特異性キメラ抗体の形式の略図である。Ａは二量体化ユニットの「フォワード」方向であり、Ｂは二量体化ユニットの「リバース」方向である。ＶＨ１、ＶＬ１は、抗原１への結合を担う、それぞれ重鎖および軽鎖可変ドメインである；ＶＨ２、ＶＬ２は、抗原２への結合を担う可変ドメインである。ＣＨ１、ＣＫは、それぞれ、重鎖および軽鎖定常ドメインである；ｂ２Ｍはβミクログロブリンであり、ＣＤ１ｂはＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインである。ノブ、ホールは、重鎖のヘテロ二量体化を可能にする、抗体のＣＨ３ドメイン中の突然変異である。
【図2】図２は、ＣＨ１およびＣＫドメインがβ２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質の膜近位ドメインα３に置換されたキメラ抗体の重鎖および軽鎖複合体の略図である。Ａは二量体化ユニットのドメインの「直接」方向である；Ｂは二量体化ユニットの「リバース」方向である。ＶＨ、ＶＬは抗体の可変ドメインであり、ｂ２Ｍはβミクログロブリンであり、ＣＤ１ｂはＣＤ１ｂタンパク質の膜近位ドメインα３であり、ヒンジは抗体のヒンジ領域であり、最初の５アミノ酸が明示的に示され、Ｆｃは抗体のＦｃ断片である；ｂ２Ｍ、ＣＤ１ｂのα３ドメインのＣ末端およびヒンジ領域のＮ末端に由来するアミノ酸が明示的に示される；ＳＳ結合は点線として示されている。
【図3】図３は、７．５％ポリアクリルアミドゲル、非還元条件での、重鎖と軽鎖との間に追加のジスルフィド結合を含む、および含まないキメラ抗体の電気泳動図である。レーン：Ｍは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカーであり、対応するレーンの分子量は、ゲルに左側の列にｋＤａとして示されている。１－対照プロルゴリマブ－ＩｇＧ１；２－プロルゴリマブの可変ドメインおよびさらなるジスルフィド架橋を有する、ＣＨ１－ＣＫを置換するＭＨＣ様タンパク質のドメインに基づく単一特異性キメラ抗体；３－プロルゴリマブの可変ドメインおよびさらなるジスルフィド架橋を有する、ＣＨ１－ＣＫを置換するＭＨＣ様タンパク質のドメインに基づく単一特異性キメラ抗体；４－プロルゴリマブの可変ドメインおよびさらなるジスルフィド架橋を有する、「リバース」方向の、ＣＨ１－ＣＫを置換するＭＨＣ様タンパク質のドメインに基づく単一特異性キメラ抗体。
【図4】図４は、重鎖と軽鎖との間の不正確な対合に対する、ＭＨＣ二量体化ユニットの効果を試験するための実験の図である。楕円形は、ＭＨＣ様タンパク質に由来するＣＨ１およびＣＫを置換するドメインを示す。第１群：試料０１－００１～０１－００３は、ＶＨとＶＬとの「正確な」組合せおよび定常ドメインの「不正確な」ペアを有する抗体である。第２群：試料０１－００４～０１－００７は、ＶＨとＶＬとの「不正確な」組合せおよび定常ドメインの「正確な」ペアを有する抗体である。第３群：試料０１－００８～０１－０１０は、ＶＨとＶＬとの「不正確な」組合せおよび定常ドメインの「不正確な」ペアを有する抗体である。第４群：試料０１－０１１および０１－０１２は、定常ドメインが、それぞれ、ＭＨＣ二量体化ユニットおよびＩｇＧ１形式の古典的抗体に置換されているキメラ抗体である対照抗体である。ＶＨとＶＬとの「正確な」組合せとは、単一抗体に由来するＶＨとＶＬとのペアを意味する。ＶＨとＶＬとの「不正確な」組合せとは、異なる抗体に由来するＶＨおよびＶＬを意味する。定常ドメインの「正確な」ペアとは、ＣＨ１－ＣＫのペアまたはＭＨＣ様タンパク質に由来するドメインのペア（この場合、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメイン）を意味する。定常ドメインの「不正確な」ペアとは、ＣＨ１－ＣＤ１ｂまたはβ２ミクログロブリン－ＣＫのペアを意味する。
【図5】図５は、鎖の不正確な対合を含む実験において生産された試料の電気泳動図である。７．５％ポリアクリルアミドゲル、非還元条件である。Ａ－レーン：Ｍは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカーであり、対応するレーンの分子量は、ゲルに左側の列にｋＤａとして示されている。１－０１－００１：２－０１－００２；３－０１－００７；４－０１－００８；５－０１－００９；６－０１－０１２；Ｂ－レーン：Ｍ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカー；１－０１－００３；２－０１－００４；３－０１－００５；４－０１－００６；５－０１－００７；６－０１－０１２；Ｃ－レーン：Ｍ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカー；１－０１－０１０；２－０１－０１１。
【図6】図６は、二重特異性キメラ抗体の電気泳動図である。Ａ－７．５％ポリアクリルアミドゲル、非還元条件であり、Ｂ－１２．５％ポリアクリルアミドゲル、還元条件である。レーン：Ｍは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカーであり、対応するレーンの分子量は、ゲルに左側の列にｋＤａとして示されている。１－０２－００４、２－０２－００５、３－０２－００６、４－０２－００７、５－０２－００８、６－０２－００９。
【図7】図７は、抗体０２－００６および０２－００７と、２つの異なる抗原（ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６ＦおよびｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ）との同時的相互作用を含む実験のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）である。ステージ（実験のステップ）は、画像の上部に番号付けられており、縦線で隔てられている。ステップ８でｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓとの相互作用（シグナルレベルの増大が観察される）およびステップ８でｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓを含まない１ｘＫＢ緩衝液中での参照シグナル（シグナルレベルの増大がない）を示す各抗体に関する２センサーグラムが与えられる。
【図9-1】図９は、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮプロテアーゼによるタンパク質分解後の二重特異性キメラ抗体のＳＤＳゲル電気泳動の電気泳動図である。７．５％ポリアクリルアミドゲル、非還元条件である。Ａ－レーン：Ｍは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカーであり、対応するレーンの分子量は、ゲルに左側の列にｋＤａとして示されている。１－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００４、２－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００９、３－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていないオクレリズマブ、４－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０１－０１１、５－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていないプロルゴリマブ、６－１００ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７．２中、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００４；Ｂ－レーン：Ｍ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカー；１－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００４、２－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００９、３－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後のオクレリズマブ、４－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０１－０１１、５－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後のプロルゴリマブ、６－１００ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７．２中、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００４、Ｃ－レーン：Ｍ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカー；１－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００５、２－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００５、３－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００６、４－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００６、５－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００７、６－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００７、Ｄ－レーン：Ｍ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカー；１－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００８、２－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００８、３－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００４、４－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００４。
【図9-2】図９は、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮプロテアーゼによるタンパク質分解後の二重特異性キメラ抗体のＳＤＳゲル電気泳動の電気泳動図である。７．５％ポリアクリルアミドゲル、非還元条件である。Ａ－レーン：Ｍは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカーであり、対応するレーンの分子量は、ゲルに左側の列にｋＤａとして示されている。１－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００４、２－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００９、３－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていないオクレリズマブ、４－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０１－０１１、５－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていないプロルゴリマブ、６－１００ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７．２中、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００４；Ｂ－レーン：Ｍ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカー；１－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００４、２－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００９、３－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後のオクレリズマブ、４－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０１－０１１、５－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後のプロルゴリマブ、６－１００ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液ｐＨ７．２中、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００４、Ｃ－レーン：Ｍ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカー；１－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００５、２－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００５、３－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００６、４－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００６、５－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００７、６－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００７、Ｄ－レーン：Ｍ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカー；１－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００８、２－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００８、３－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによってプロセシングされていない０２－００４、４－ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮによるタンパク質分解後の０２－００４。
【図10】図１０は、ＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインに基づく二量体化ユニット中に導入された修飾を有する試料の電気泳動図である。７．５％ポリアクリルアミドゲル、非還元条件である。Ａ－レーン：Ｍは、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカーであり、対応するレーンの分子量は、ゲルに左側の列にｋＤａとして示されている。１－プロルゴリマブ；２－０１－０１１；３－０３－００３；４－０３－００４；５－０３－００５；６－０３－００６；７－０３－００７；８－０３－００８。Ｂ－レーン：Ｍ－Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（ＢＩＯ－ＲＡＤ）の標準マーカー；１－プロルゴリマブ；２－０１－０１１；３－０３－００１；４－０３－００２。
【発明を実施するための形態】
【0077】
一般的定義および一般的方法
本明細書で別途定義されない限り、本発明に関連して使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で別途定義されない限り、本発明に関連して使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【0078】
さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。典型的には、本発明の分類および細胞培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医化学および薬化学の方法、ならびに本明細書に記載のタンパク質および核酸のハイブリダイゼーションおよび化学は、当業者には周知であり、当業界で広く使用されている。酵素反応および精製方法は、製造業者の指針に従って、当業界で一般的に達成されるように、または本明細書に記載のように実施される。
【0079】
本明細書における用語「ＫＤ」は、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から算出され、モル濃度（Ｍ）として表される親和性定数（または平衡定数）を指す。
「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有相互作用の合計の強度を一般的に指す。別途指摘されない限り、「結合親和性」とは、結合ペア（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の（特徴的な、真の）結合親和性を指す。分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和性は、一般に、親和性定数（ＫＤ）によって表すことができる。好ましいＫｄ値は、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、またはそれ未満である。親和性を、本明細書に記載のものを含む、当業界で公知の一般的方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般に、より速く抗原に結合し、より長く結合したままになる傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当業界で公知であり、それらのいずれかを本発明の目的のために使用することができる。
「結合親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有相互作用の合計の強度を一般的に指す。別途指摘されない限り、「結合親和性」とは、結合ペア（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の（特徴的な、真の）結合親和性を指す。分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和性は、一般に、親和性定数（ＫＤ）によって表すことができる。好ましいＫｄ値は、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、またはそれ未満である。親和性を、本明細書に記載のものを含む、当業界で公知の一般的方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般に、より速く抗原に結合し、より長く結合したままになる傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当業界で公知であり、それらのいずれかを本発明の目的のために使用することができる。
【0080】
用語「Ｋｄ」、「ｋｏｆｆ」または「ｋｄｉｓ」とは、結合分子と抗原との間の特定の相互作用の解離速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）定数を指す。解離速度定数ｋｏｆｆを、バイオレイヤー干渉法を使用して、例えば、Ｏｃｔｅｔ（商標）システムを使用して測定することができる。
【0081】
用語「Ｋａ」、「ｋｏｎ」または「結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）」とは、結合速度定数を指す。
用語「Ｒ２」とは、決定係数を指す。
用語「Ｒ２」とは、決定係数を指す。
【0082】
用語「応答」とは、抗体－抗原結合シグナルを指す。
本明細書および以下の特許請求の範囲において使用される場合、本文によって別途指示しない限り、単語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、述べた整数または整数の群を含めることを意味するが、任意の他の整数または整数の群の除外を意味しないことが理解されるであろう。
本明細書および以下の特許請求の範囲において使用される場合、本文によって別途指示しない限り、単語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのその変形は、述べた整数または整数の群を含めることを意味するが、任意の他の整数または整数の群の除外を意味しないことが理解されるであろう。
【0083】
発明の詳細な説明
二価二重特異性キメラ抗体
本発明は、二価二重特異性キメラ抗体に関する。
二価二重特異性キメラ抗体
本発明は、二価二重特異性キメラ抗体に関する。
【0084】
本発明による抗体は、モノクローナル抗体である。
用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、別々のクローン細胞集団によって合成および単離される抗体を指す。
用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」とは、別々のクローン細胞集団によって合成および単離される抗体を指す。
【0085】
本発明の抗体は、組換え抗体である。
用語「組換え抗体」とは、抗体をコードするヌクレオチド配列であって、天然では細胞と関連しない前記ヌクレオチド配列を含む、細胞または細胞系中で発現される抗体を指す。
用語「組換え抗体」とは、抗体をコードするヌクレオチド配列であって、天然では細胞と関連しない前記ヌクレオチド配列を含む、細胞または細胞系中で発現される抗体を指す。
【0086】
本発明による二価二重特異性キメラ抗体は、単離された抗体である。
本明細書に記載の様々な抗体を記載するために使用される用語「単離された」とは、抗体が発現される、細胞または細胞培養物から同定および分離および／または再生された抗体を指す。天然の環境に由来する不純物（夾雑成分）は、典型的には、ポリペプチドの診断的または治療的使用を妨げる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。単離されたポリペプチドは、典型的には、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
本明細書に記載の様々な抗体を記載するために使用される用語「単離された」とは、抗体が発現される、細胞または細胞培養物から同定および分離および／または再生された抗体を指す。天然の環境に由来する不純物（夾雑成分）は、典型的には、ポリペプチドの診断的または治療的使用を妨げる材料であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。単離されたポリペプチドは、典型的には、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【0087】
一側面では、本発明は、二価二重特異性キメラ抗体であって、前記抗体は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、前記第１の軽鎖が、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、前記第１の重鎖が、重鎖可変ドメイン、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメイン、を含む；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、前記第２の軽鎖が、軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインを含み、
前記定常ドメインは、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメイン、もしくは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される、
ここにおいて、前記第２の重鎖が、
重鎖可変ドメイン、
ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメイン、もしくは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体
を含む；
ここにおいて、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、ジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をそれらの間で形成し；
ここにおいて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインが、その表面と互いに接触し、二価二重特異性キメラ抗体を形成するように修飾され、重鎖ＣＨ３ドメイン中の前記修飾が、ヘテロ二量体化を容易にする置換である、
を含む、前記二価二重特異性キメラ抗体に関する。
ａ）第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、前記第１の軽鎖が、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、前記第１の重鎖が、重鎖可変ドメイン、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメイン、を含む；
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、前記第２の軽鎖が、軽鎖可変ドメインおよび定常ドメインを含み、
前記定常ドメインは、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメイン、もしくは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される、
ここにおいて、前記第２の重鎖が、
重鎖可変ドメイン、
ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメイン、もしくは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体
を含む；
ここにおいて、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の前記第２の膜近位ドメインが、ジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をそれらの間で形成し；
ここにおいて、一方の重鎖のＣＨ３ドメインおよび他方の重鎖のＣＨ３ドメインが、その表面と互いに接触し、二価二重特異性キメラ抗体を形成するように修飾され、重鎖ＣＨ３ドメイン中の前記修飾が、ヘテロ二量体化を容易にする置換である、
を含む、前記二価二重特異性キメラ抗体に関する。
【0088】
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインによって形成され、ジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体とは、
１）ＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメイン間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するための、ＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１および／もしくは第２の膜近位ドメイン中に突然変異もしくは複数の突然変異を含むヘテロ二量体；
あるいは、
２）ＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインと、ヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するための、Ｃ末端の１つもしくは複数（１～１０個）のアミノ酸およびＣ末端の末端ＣｙｓによるＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長
を意味する。
１）ＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメイン間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するための、ＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１および／もしくは第２の膜近位ドメイン中に突然変異もしくは複数の突然変異を含むヘテロ二量体；
あるいは、
２）ＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインと、ヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するための、Ｃ末端の１つもしくは複数（１～１０個）のアミノ酸およびＣ末端の末端ＣｙｓによるＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長
を意味する。
【0089】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメイン間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィドシステイン架橋）を形成する、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および／または第２の膜近位ドメイン中の１個の突然変異または複数の突然変異によるジスルフィド結合によって安定化される、ヘテロ二量体をその間で形成する、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0090】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するＣ末端の１つまたは複数（１～１０個）のアミノ酸およびＣ末端の末端ＣｙｓによるＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長によるジスルフィド結合によって安定化される、ヘテロ二量体をその間で形成する、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0091】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長であって、３個のアミノ酸ＧＳＣの配列である、伸長を含む。
【0092】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメイン間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィドシステイン架橋）を形成するＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および／または第２の膜近位ドメイン中の１個の突然変異または複数の突然変異によるジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をその間で形成し；
ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成される。
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメイン間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィドシステイン架橋）を形成するＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および／または第２の膜近位ドメイン中の１個の突然変異または複数の突然変異によるジスルフィド結合によって安定化されるヘテロ二量体をその間で形成し；
ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成される。
【0093】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成され、
ＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するＣ末端の１つまたは複数（１～１０個）のアミノ酸およびＣ末端の末端ＣｙｓによるＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長をさらに含む。
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成され、
ＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するＣ末端の１つまたは複数（１～１０個）のアミノ酸およびＣ末端の末端ＣｙｓによるＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長をさらに含む。
【0094】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成され、
ＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するＧＳＣによってＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長をさらに含む。
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成され、
ＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインとヒンジとの間でＳ－Ｓ結合（ジスルフィド結合、システイン架橋）を形成するＧＳＣによってＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの伸長をさらに含む。
【0095】
上記の二価二重特異性キメラ抗体において、可変および定常ドメインは、以下の順序で重鎖および軽鎖中に配置される：
第１の軽鎖：
１）軽鎖可変ドメイン、
２）軽鎖定常ドメイン；
抗体の第１の重鎖：
１）重鎖可変ドメイン、
２）第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメイン、
３）第２（ＣＨ２）の重鎖定常ドメインおよび
４）第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメイン；
第２の軽鎖：
１）軽鎖可変ドメイン、
２）ＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン；
抗体の第２の重鎖：
１）重鎖可変ドメイン、
２）ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン、
３）第２（ＣＨ２）の重鎖定常ドメインおよび
４）第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメイン。
第１の軽鎖：
１）軽鎖可変ドメイン、
２）軽鎖定常ドメイン；
抗体の第１の重鎖：
１）重鎖可変ドメイン、
２）第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメイン、
３）第２（ＣＨ２）の重鎖定常ドメインおよび
４）第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメイン；
第２の軽鎖：
１）軽鎖可変ドメイン、
２）ＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン；
抗体の第２の重鎖：
１）重鎖可変ドメイン、
２）ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン、
３）第２（ＣＨ２）の重鎖定常ドメインおよび
４）第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメイン。
【0096】
図１は、上記の二価二重特異性キメラ抗体の形式のいくつかのバリアントを示す。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、全抗体を含む。用語「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２個の重（Ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖、または抗原結合性部分を含む糖タンパク質を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略される）と重鎖定常領域とを含む。ギリシャ文字：α、δ、ε、γおよびμによって示される５つの型の哺乳動物抗体重鎖が公知である（Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによる出版、２００１）。存在する重鎖の型は、抗体のクラスを定義する；これらの鎖は、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ抗体中に見出される（Ｒｈｏａｄｅｓ Ｒ．Ａ．、Ｐｆｌａｎｚｅｒ Ｒ．Ｇ．、Ｈｕｍａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｌｅａｒｎｉｎｇによる出版、２００２）。異なる重鎖は、サイズおよび組成において異なる；αおよびγは約４５０個のアミノ酸を含有するが、μおよびεは約５５０個のアミノ酸を有する。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体においては異なる。重鎖γ、αおよびδは、３個の定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（一列に）から構成される定常領域、ならびに可撓性の付加のためのヒンジ領域を有する（Ｗｏｏｆ Ｊ．、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４、２００４、ｃｃ．８９～９９）；重鎖μおよびεは、４個の定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４から構成される定常領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによる出版、２００１）。哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）によって示されるわずか２つの型の軽鎖が公知である。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖のおよその長さは、２１１～２１７アミノ酸である。好ましくは、軽鎖はカッパ（κ）軽鎖であり、定常ドメインＣＬは好ましくはＣカッパ（κ）である。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、全抗体を含む。用語「抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２個の重（Ｈ）鎖および２個の軽（Ｌ）鎖、または抗原結合性部分を含む糖タンパク質を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略される）と重鎖定常領域とを含む。ギリシャ文字：α、δ、ε、γおよびμによって示される５つの型の哺乳動物抗体重鎖が公知である（Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによる出版、２００１）。存在する重鎖の型は、抗体のクラスを定義する；これらの鎖は、それぞれ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ抗体中に見出される（Ｒｈｏａｄｅｓ Ｒ．Ａ．、Ｐｆｌａｎｚｅｒ Ｒ．Ｇ．、Ｈｕｍａｎ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｌｅａｒｎｉｎｇによる出版、２００２）。異なる重鎖は、サイズおよび組成において異なる；αおよびγは約４５０個のアミノ酸を含有するが、μおよびεは約５５０個のアミノ酸を有する。定常領域は、同じアイソタイプの全ての抗体において同一であるが、異なるアイソタイプの抗体においては異なる。重鎖γ、αおよびδは、３個の定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（一列に）から構成される定常領域、ならびに可撓性の付加のためのヒンジ領域を有する（Ｗｏｏｆ Ｊ．、Ｂｕｒｔｏｎ Ｄ．、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４、２００４、ｃｃ．８９～９９）；重鎖μおよびεは、４個の定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４から構成される定常領域を有する（Ｊａｎｅｗａｙ Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによる出版、２００１）。哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）によって示されるわずか２つの型の軽鎖が公知である。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖のおよその長さは、２１１～２１７アミノ酸である。好ましくは、軽鎖はカッパ（κ）軽鎖であり、定常ドメインＣＬは好ましくはＣカッパ（κ）である。
【0097】
本発明による「抗体」は、任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、好ましくは、ＩｇＧ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２、好ましくは、ＩｇＧ１）のものであってもよい。
【0098】
ＶＬおよびＶＨ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域の間に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、以下の順序で配置された３個のＣＤＲと４個のＦＲとから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【0099】
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合性部分」または「抗原結合性断片」（または単に「抗体部分」もしくは「抗体断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の「抗原結合性部分」という用語に含まれる結合断片の例は、Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインまたはＦａｂ様断片からなる一価断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨドメイン、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインからなる一価断片を含む。
【0100】
好ましくは、抗原結合性部分のＣＤＲ、または本発明の抗体の全抗原結合性部分は、マウス、ラマもしくはヒトドナーライブラリーに由来するか、またはある特定のアミノ酸残基が変更された、例えば、抗体の特定の特性、例えば、ＫＤ、ｋｏｆｆ、ＩＣ５０、ＥＣ５０、ＥＤ５０を最適化するために異なるアミノ酸残基で置換された、実質的にヒト起源のものである。好ましくは、本発明の抗体のフレームワーク領域は、ヒト起源のものであるか、または実質的にヒト起源（少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％のヒト起源）のものである。
【0101】
他の態様では、本発明の抗原結合性部分は、限定されるものではないが、マウス、ラマ、ウサギ、ラットまたはハムスターを含む他の非ヒト種に由来してもよい。あるいは、抗原結合領域は、ヒト種に由来してもよい。
【0102】
用語「可変」とは、可変ドメインのある特定の部分が抗体間で配列において大きく異なるという事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を媒介し、その特定の抗原に対するそれぞれ特定の抗体の特異性を決定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインの１１０個のアミノ酸の広がりにわたって均等に分布しているわけではない。その代わりに、Ｖ領域は、「超可変領域」またはＣＤＲと呼ばれる極端な可変性のより短い領域によって隔てられた１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる不変性断片からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ベータシート構造を接続し、一部の場合、その一部を形成するループを形成する、３個の超可変領域によって接続された、ベータシート構成を採用することが多い、４個のＦＲを含む。それぞれの鎖の中の超可変領域は、ＦＲによってごく近くに一緒に保持されると共に、他の鎖に由来する超可変領域は、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の参加などの様々なエフェクター機能を示す。
【0103】
本明細書に記載の用語「超可変領域」とは、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は典型的には、「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」に由来するアミノ酸残基および／または「超可変ループ」に由来する残基を含む。
【0104】
本出願において使用される場合、「Ｋａｂａｔのナンバリングスキーム」または「Ｋａｂａｔによるナンバリング」とは、抗体の重鎖および軽鎖の可変領域中の他のアミノ酸残基よりも可変性が高い（すなわち、超可変性である）アミノ酸残基のナンバリングのためのシステムを指す（Ｋａｂａｔら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９０：３８２～９３（１９７１）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１））。
【0105】
標的抗原「に結合する」本発明の抗体とは、タンパク質または抗原を発現する細胞もしくは組織を標的とする診断剤および／または治療剤として抗体を使用することができるような十分な親和性で抗原に結合し、他のタンパク質とはわずかに交差反応する抗体を指す。そのような態様では、分析方法：蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、ライジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡによる、非標的タンパク質に対する抗体結合の程度は、特定の標的タンパク質に対する抗体結合の１０％未満である。抗体の標的分子への結合に関して、特定のポリペプチドまたは特定の標的ポリペプチド上のエピトープに対する「特異的結合」または「に特異的に結合する」または「に特異的である」という用語は、非特異的相互作用とは有意に（測定可能に）異なる結合を意味する。
【0106】
特異的結合を、例えば、対照分子の結合と比較した、ある分子の結合を決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合を、標的、例えば、過剰の標識されていない標的と類似する別の分子との競合によって決定することができる。この場合、標識された標的のプローブへの結合が過剰の未標識の標的によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。本明細書で使用される場合、特定のポリペプチドまたは特定の標的ポリペプチド上のエピトープに対する用語「特異的結合」または語句「に特異的に結合する」は、少なくとも約２００ｎＭ、または少なくとも約１５０ｎＭ、または少なくとも約１００ｎＭ、または少なくとも約６０ｎＭ、または少なくとも約５０ｎＭ、または少なくとも約４０ｎＭ、または少なくとも約３０ｎＭ、または少なくとも約２０ｎＭ、または少なくとも約１０ｎＭ、または少なくとも約８ｎＭ、または少なくとも約６ｎＭ、または少なくとも約４ｎＭ、または少なくとも約２ｎＭ、または少なくとも約１ｎＭ、またはそれより高い、標的に対するＫｄを有する分子の例によって記載され得る。一態様では、用語「特異的結合」とは、ある分子が、他の任意のポリペプチドまたはポリペプチド上のエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する結合を指す。
【0107】
用語「二重特異性抗体」とは、単一の生体分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができる、または２つの異なる生体分子上のエピトープに特異的に結合することができる抗原結合性ドメインを有する抗体を指す。二重特異性抗体はまた、本明細書では「デュアル特異性」を有する、または「デュアル特異性」抗体であるとも称される。
【0108】
免疫グロブリンの断片結晶化可能領域（「Ｆｃ領域、Ｆｃ」）は、細胞表面Ｆｃ受容体、ならびに補体系の一部のタンパク質と相互作用する免疫グロブリン分子の「尾部」領域である。この特性は、抗体が免疫系を活性化することを可能にする。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプでは、Ｆｃ領域は、それぞれ、２個の重鎖の第２および第３の定常ドメインに由来する２個の同一のタンパク質断片から構成される；ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプでは、Ｆｃは、それぞれのポリペプチド鎖中に３個の重鎖定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン）を含有する。
【0109】
「Ｆｃ断片単量体」は、２個の重鎖のいずれか一方の第２および第３の定常ドメインに由来するＦｃ領域（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤアイソタイプについて）を意味すると理解される；ＩｇＭおよびＩｇＥアイソタイプについては、Ｆｃ単量体は、２個の重鎖のうちの一方の３個の定常ドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン）を含む。
【0110】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成され、
ＭＨＣの第２の膜近位ドメインおよび／またはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインと、ヒンジとの間に、さらなるペプチドリンカーが挿入されている。
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）および軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖；
軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）およびＭＨＣの第１の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む第２の軽鎖；
重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインまたはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む第２の重鎖
を含み、
ＣＨ３ドメイン中の第１のＦｃバリアントと第２のＦｃバリアントとの間で、ノブイントゥーホール構造が形成され、
ＭＨＣの第２の膜近位ドメインおよび／またはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインと、ヒンジとの間に、さらなるペプチドリンカーが挿入されている。
【0111】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチドリンカー」は、互いに結合するドメインに応じた長さを有するドメインを組み合わせる能力を有し、任意のアミノ酸配列を含む任意のペプチドを意味することが意図される。好ましくは、ペプチドリンカーは、４アミノ酸以上の長さを有し、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｔ、Ｄ、Ｋから選択されるアミノ酸の任意のセットからなる。
【0112】
ＭＨＣ（主要組織適合複合体）とは、全ての有核細胞の表面上に存在する脊椎動物の免疫系の中心成分である主要組織適合複合体分子を指す。２つの主な形態のＭＨＣ、特に、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩが存在する。
【0113】
ＭＨＣ様タンパク質とは、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞外部分との構造的類似性を有するタンパク質を指す。特に、ＭＨＣ様タンパク質は、例えば、ＣＤ１（分化抗原群１）タンパク質またはＨＦＥタンパク質（遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質）を意味する。
【0114】
ＭＨＣ Ｉ、ＩＩ、ＣＤ１およびＨＦＥ分子間の一般的な構造類似性は明らかである。この分子は、全分子の空間的構成の均一性、ドメインの数（４個）、ＭＨＣおよびＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインの構造類似性、ならびに抗原結合部位、類似する分子量を含む。
【0115】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインを含む。
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインを含む。
【0116】
ヒトにおいては、古典的なＭＨＣ Ｉ遺伝子は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦまたはＨＬＡ－Ｇと称される。クラスＩ分子は、２個のポリペプチド鎖：多型性のα鎖（重鎖と称されることもある）および一般的には多型性ではない、β２ミクログロブリンと呼ばれるより小さい鎖（軽鎖としても知られる）からなる。これらの２個の鎖は、細胞表面上で非共有的ヘテロ二量体を形成する。α鎖は、３つのドメイン（α１、α２、およびα３）を含有する。α鎖遺伝子のエクソン１はリーダー配列をコードし、エクソン２および３はα１およびα２ドメインをコードし、エクソン４はα３ドメインをコードし、エクソン５は膜貫通ドメインをコードし、エクソン６および７は細胞質尾部をコードする。α鎖は、α１およびα２ドメインを含むペプチド結合領域を形成する。
【0117】
α２ドメインに次いで、α３ドメインがＭＨＣ Ｉのα鎖の細胞外部分のＣ末端に位置し、β２ミクログロブリンと一緒になってヘテロ二量体非共有複合体を形成する。ＭＨＣ Ｉのα３ドメインおよびβ２ミクログロブリンから構成される前記ヘテロ二量体非共有複合体は、本発明の明細書では、ＭＨＣ Ｉの膜近位ドメインに基づくヘテロ二量体と称される。
【0118】
ＭＨＣクラスＩ分子は、腫瘍細胞を含む全ての有核細胞上で発現される。それらは特に、ＴおよびＢリンパ球、マクロファージ、樹状細胞ならびに好中球上で特異的に発現され、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の表面上にペプチド断片（典型的には、８～１０アミノ酸長）を提示するように機能する。
【0119】
ヒトにおいては、古典的なＭＨＣ ＩＩ遺伝子は、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱまたはＨＬＡ－ＤＲと称される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、非共有的に連結されたアルファおよびベータ鎖から構成されるヘテロ二量体である。それぞれの鎖の細胞外部分は、２個のドメイン（それぞれ、α１（アルファ１）、α２（アルファ２）およびβ１（ベータ１）、β２（ベータ２））からなり、膜貫通セグメントを有する短いペプチド（約３０アミノ酸残基の長さ）によって接続される。膜貫通セグメントに次いで、約１０～１５残基を含有する細胞質ドメインが存在する。
【0120】
ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原結合領域は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原結合溝が単一のアルファ鎖の２個のドメインではなく、異なる鎖の２個のドメイン、α１およびβ１ドメインによって形成されることを除いて、クラスＩ分子と同様に相互作用する鎖のアルファヘリックスセクションによって形成される。
【0121】
α１ドメインに次いで、β２ドメインとのヘテロ二量体非共有複合体を形成するα２ドメインが存在する。ＭＨＣ ＩＩのα２ドメインおよびＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインから構成される前記ヘテロ二量体非共有複合体は、本発明の明細書では、ＭＨＣ ＩＩの膜近位ドメインに基づくヘテロ二量体と称される。
【0122】
ＭＨＣクラスＩＩ分子の構造において、抗原結合溝は、ＭＨＣクラスＩ分子のものよりも開いており、かくして、より長いペプチドを受け入れる。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0123】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ヒトＭＨＣクラスＩの膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ヒトＭＨＣクラスＩＩの膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ヒトＭＨＣクラスＩＩの膜近位ドメインを含む。
【0124】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
ならびに、
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
ならびに、
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメイン、
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0125】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメインであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメインであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメインであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメインであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0126】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメインであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメインであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメインであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメインであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0127】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0128】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0129】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメインであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第１の膜近位ドメインであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0130】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメインであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＭＨＣクラスＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩ（主要組織適合複合体クラスＩ）の第２の膜近位ドメインであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0131】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメインであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第１の膜近位ドメインであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩＩの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0132】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメインであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＭＨＣクラスＩＩの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントであるＭＨＣの第１の膜近位ドメイン、
および
ＭＨＣクラスＩＩ（主要組織適合複合体クラスＩＩ）の第２の膜近位ドメインであるＭＨＣの第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0133】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱまたはＨＬＡ－ＤＲの群から選択されるＭＨＣクラスＩＩの膜近位ドメインを含む。
【0134】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－ＦまたはＨＬＡ－Ｇの群から選択されるＭＨＣクラスＩの膜近位ドメインを含む。
【0135】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ヒトＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１（分化抗原群１）の第１の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第１の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１（分化抗原群１）の第１の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第１の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインを含む。
【0136】
ＣＤ１（分化抗原群１）とは、樹状細胞、マクロファージおよび他の細胞などの、様々な抗原提示細胞の表面上に位置する免疫系の成分である分化抗原群１分子を指す。ＭＨＣクラスＩ、ＩＩと同じ様式で、ＣＤ１はＴ細胞受容体との相互作用を介したＴ細胞による認識のために抗原を提示する。ＭＨＣクラスＩ、ＩＩと違って、ＣＤ１タンパク質は、ペプチドよりもむしろ、脂質およびその誘導体を提示する。
【0137】
ヒトにおいて見出される複数のＣＤ１バリアントは、５群に分割される：抗原結合性断片の構造、結果として、異なる構造の脂質に対する特異性において異なる、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ。ＣＤ１ｅ群のタンパク質は、他の群のタンパク質と違って、細胞表面上に発現されないが、可溶性であり、脂質輸送を担う（Ｋａｃｚｍａｒｅｋ，Ｒ．、Ｐａｓｃｉａｋ，Ｍ．、Ｓｚｙｍｃｚａｋ－Ｋｕｌｕｓ，Ｋ．、＆ Ｃｚｅｒｗｉｎｓｋｉ，Ｍ．（２０１７）、ＣＤ１：Ａ Ｓｉｎｇｅｄ Ｃａｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｒｅｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ．Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ Ｔｈｅｒａｐｉａｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ、６５（３）、２０１～２１４）。
【0138】
ＣＤ１分子は、ＭＨＣクラスＩと構造において類似している。同様の様式で、１個のＣＤ１分子は、２個のポリペプチド鎖：多型性のα鎖（重鎖と称されることもある）および一般的には多型性ではない、β２ミクログロブリンと呼ばれるより小さい鎖（軽鎖としても知られる）からなる非共有複合体である。
【0139】
α鎖は、α１およびα２ドメインを含む抗原結合領域を形成する。α２ドメインに次いで、α３ドメインがＣＤ１のα鎖の細胞外部分のＣ末端に位置し、β２ミクログロブリンと一緒になってヘテロ二量体非共有複合体を形成する。ＣＤ１のα３ドメインおよびβ２ミクログロブリンから構成される前記ヘテロ二量体非共有複合体は、本発明の明細書では、ＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインに基づくヘテロ二量体と称される。
【0140】
ＨＦＥ（遺伝性ヘモクロマトーシスタンパク質）とは、ヘモクロマトーシスタンパク質分子を指す。ヒトＨＦＥ遺伝子座は、第６染色体上に位置し、５個のエクソンおよび４個のイントロンからなる。ヘモクロマトーシスタンパク質は、β２ミクログロブリンと関連する膜タンパク質であり、トランスフェリン－トランスフェリン受容体相互作用の調節によって鉄吸収の調節を担う。ＨＦＥ遺伝子中の突然変異は、様々な臓器における鉄蓄積と関連する鉄代謝関連潜性病理であるヘモクロマトーシスをもたらす。ＨＦＥ分子は、ＭＨＣ Ｉと構造において同一である。１個のＨＦＥ分子は、２個のポリペプチド鎖：多型性のα鎖（重鎖と称されることもある）および一般的には多型性ではない、β２ミクログロブリンと呼ばれるより小さい鎖（軽鎖としても知られる）からなる非共有複合体である。
【0141】
α鎖は、α１、α２およびα３ドメインを含む。α３ドメインに次いで、α２ドメインが存在し、ＨＦＥのα鎖の細胞外部分のＣ末端に位置し、β２ミクログロブリンと共にヘテロ二量体非共有複合体を形成する。ＨＦＥのα３ドメインおよびβ２ミクログロブリンから構成される前記ヘテロ二量体非共有複合体は、本発明の明細書では、ＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインに基づくヘテロ二量体と称される。
【0142】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１（分化抗原群１）の第２の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第２の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
ＣＤ１（分化抗原群１）の第２の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第２の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0143】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１（分化抗原群１）の第１の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第１の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
ならびに
ＣＤ１（分化抗原群１）の第２の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第２の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
ＣＤ１（分化抗原群１）の第１の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第１の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
ならびに
ＣＤ１（分化抗原群１）の第２の膜近位ドメイン、
ＨＦＥ（ヘモクロマトーシスタンパク質）の第２の膜近位ドメイン、
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント、または
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアント
を含む群から選択することができる、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0144】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0145】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0146】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0147】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0148】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0149】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＣＤ１の第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＣＤ１の第２の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0150】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0151】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインである。ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
ＨＦＥの第１の膜近位ドメインの修飾されたバリアントである、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメイン、
および
ＨＦＥの第２の膜近位ドメインである。ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン
を含む。
【0152】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄまたはＣＤ１ｅの群から選択されるＣＤ１の膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、１～２５アミノ酸長のリンカーによってＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインから分離されている、第２の軽鎖の可変断片（ＶＬ）、および／または１～２５アミノ酸長のリンカーによってＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインから分離されている、第２の重鎖の可変断片（ＶＨ）を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、１～２５アミノ酸長のリンカーによってＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインから分離されている、第２の軽鎖の可変断片（ＶＬ）、および／または１～２５アミノ酸長のリンカーによってＭＨＣもしくはＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインから分離されている、第２の重鎖の可変断片（ＶＨ）を含む。
【0153】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、
ａ）二価二重特異性抗体中の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面と接触する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上のホールに適合することができる一方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上でノブの形成をもたらすように修飾されている、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン、
および
ｂ）二価二重特異性抗体中の第１の重鎖のＣＨ３ドメインの表面と接触する第２の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換されており、第１の重鎖のＣＨ３ドメインの境界面上のノブを受容することができる第２の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上でホールの形成をもたらすように修飾されている、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン
を含み；
ここにおいて、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を含む群から選択され、
そして、ここにおいて、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）を含む群から選択される。
ａ）二価二重特異性抗体中の他方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面と接触する一方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上で、アミノ酸残基が、より大きい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換されており、他方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上のホールに適合することができる一方の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上でノブの形成をもたらすように修飾されている、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン、
および
ｂ）二価二重特異性抗体中の第１の重鎖のＣＨ３ドメインの表面と接触する第２の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上で、アミノ酸残基が、より小さい側鎖体積を有するアミノ酸残基に置換されており、第１の重鎖のＣＨ３ドメインの境界面上のノブを受容することができる第２の重鎖のＣＨ３ドメインの表面上でホールの形成をもたらすように修飾されている、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン
を含み；
ここにおいて、より大きい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）を含む群から選択され、
そして、ここにおいて、より小さい側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）を含む群から選択される。
【0154】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＣＫまたはＣＬから選択される、抗体の第１の軽鎖の定常ドメインを含む。
哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）によって示されるわずか２つの型の軽鎖が公知である。ラムダ軽鎖の定常ドメインはＣＬと指定され、カッパ軽鎖のそれはＣＫと指定されている。
哺乳動物では、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）によって示されるわずか２つの型の軽鎖が公知である。ラムダ軽鎖の定常ドメインはＣＬと指定され、カッパ軽鎖のそれはＣＫと指定されている。
【0155】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ジスルフィド架橋が両方のＣＨ３ドメインの間で形成し得るように、それぞれのＣＨ３ドメインの対応する位置へのアミノ酸としてのシステイン（Ｃ）の導入によってさらに修飾される抗体のＣＨ３ドメインを含む。
【0156】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性抗体は、ノブを形成するように修飾されている、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン、およびホールを形成するように修飾されている、他方の重鎖のＣＨ３ドメイン、またはその逆を含む。
【0157】
「ノブイントゥーホール」（「ノブイントゥーホール」型の相互作用）は、誤対合の副生成物と関連する問題を回避することができる手法である。この手法は、接触境界面を修飾するためにＣＨ３ドメイン中に突然変異を導入することによって２つの異なる抗体重鎖を強制的に対合させることを目的とするものである。一方の鎖上で、嵩高いアミノ酸を、短い側鎖を有するアミノ酸で置き換えて、「ホール」を作出した。逆に、大きい側鎖を有するアミノ酸を他方のＣＨ３ドメイン中に導入して、「ノブ」を作出した。これらの２つの重鎖の同時発現は、ホモ二量体形成（「ホール・ホール」または「ノブ・ノブ」）と比較して、高収率のヘテロ二量体形成（「ノブ・ホール」）をもたらした（ＷＯ９６２７０１１およびＷＯ９８５０４３１、ならびにＭｅｒｃｈａｎｔ ＡＭ ＥＴ ＡＬＬ．，Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８ Ｊｕｌ；１６（７）：６７７～８１）。
【0158】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン、およびアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを有する、他方の重鎖のＣＨ３ドメインを含む。
【0159】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７を有する、一方の重鎖のＣＨ３ドメイン、およびアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗを有する、他方の重鎖のＣＨ３ドメインを含む。
【0160】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ Ｉのα２ドメインおよびＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0161】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインおよびＭＨＣ ＩＩのα２ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0162】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６または配列番号３８の群から選択されるアミノ酸配列を有するＭＨＣ ＩＩのα２ドメイン、および配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７または配列番号３９の群から選択されるアミノ酸配列を有するＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインを含む。
【0163】
配列番号３０は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＭのα２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＭＡ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号３１は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＭのβ２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＭＢ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号３１は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＭのβ２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＭＢ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0164】
配列番号３２は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＯのα２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＯＡ＊０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＯのβ２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＯＢ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＯのβ２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＯＢ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0165】
配列番号３４は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＰのα２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＰＡ１＊０１：０３：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＰのβ２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＰのβ２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＰＢ１＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0166】
配列番号３６は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＱのα２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＱＡ１＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＱのβ２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＱのβ２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０５：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0167】
配列番号３８は、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲのα２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、ＭＨＣクラスＨＬＡ－ＤＲのβ２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号３９は、ＭＨＣクラスＨＬＡ－ＤＲのβ２膜近位ドメイン（ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0168】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ ＩＩのα２ドメインの修飾されたバリアントおよびＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0169】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ ＩＩのβ２ドメインの修飾されたバリアントおよびＭＨＣ ＩＩのα２ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0170】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ Ｉのα３ドメインおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0171】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）およびＭＨＣ Ｉのα３ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0172】
β２ミクログロブリンは、１２ｋＤａの非グリコシル化タンパク質である；その機能の１つは、ＭＨＣクラスＩのα鎖、ならびにＣＤ１およびＨＦＥタンパク質を安定化することである。上記タンパク質内のヒトβ２ミクログロブリンは実質的に同一の構造を有し、したがって、本発明の明細書では、ヒトβ２ミクログロブリンは、そのタンパク質がその一部であることを示すことなく記載される。
【0173】
α鎖と違って、β２ミクログロブリンは膜を通過しない。ヒトβ２ミクログロブリンの遺伝子座は、第１５染色体上に位置する。β２ミクログロブリン遺伝子は、４個のエクソンおよび３個のイントロンからなる。
【0174】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号１～２９を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するＭＨＣ Ｉのα３ドメインおよび配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を含む。
【0175】
配列番号１は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａのα３膜近位ドメイン（アレルＡ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａのα３膜近位ドメイン（Ａ＊０２：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａのα３膜近位ドメイン（Ａ＊０２：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0176】
配列番号３は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａのα３膜近位ドメイン（Ａ＊０３：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号４は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａのα３膜近位ドメイン（Ａ＊１１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号４は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａのα３膜近位ドメイン（Ａ＊１１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0177】
配列番号５は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ａのα３膜近位ドメイン（Ａ＊２３：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｂのα３膜近位ドメイン（Ｂ＊０７：０２：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号６は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｂのα３膜近位ドメイン（Ｂ＊０７：０２：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0178】
配列番号７は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｂのα３膜近位ドメイン（Ｂ＊０８：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号８は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｂのα３膜近位ドメイン（Ｂ＊１３：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号８は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｂのα３膜近位ドメイン（Ｂ＊１３：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0179】
配列番号９は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｂのα３膜近位ドメイン（Ｂ＊１４：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｂのα３膜近位ドメイン（Ｂ＊１５：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｂのα３膜近位ドメイン（Ｂ＊１５：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0180】
配列番号１１は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｃのα３膜近位ドメイン（Ｃ＊０１：０２：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｃのα３膜近位ドメイン（Ｃ＊０３：０２：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号１２は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｃのα３膜近位ドメイン（Ｃ＊０３：０２：０１）のアミノ酸配列である。
【0181】
配列番号１３は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｃのα３膜近位ドメイン（Ｃ＊０４：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｃのα３膜近位ドメイン（Ｃ＊０５：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号１４は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｃのα３膜近位ドメイン（Ｃ＊０５：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0182】
配列番号１５は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｃのα３膜近位ドメイン（Ｃ＊０６：０２：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｅのα３膜近位ドメイン（Ｅ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号１６は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｅのα３膜近位ドメイン（Ｅ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0183】
配列番号１７は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｅのα３膜近位ドメイン（Ｅ＊０１：０３：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号１８は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｅのα３膜近位ドメイン（Ｅ＊０１：０５）のアミノ酸配列である。
配列番号１８は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｅのα３膜近位ドメイン（Ｅ＊０１：０５）のアミノ酸配列である。
【0184】
配列番号１９は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｅのα３膜近位ドメイン（Ｅ＊０１：０６）のアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｅのα３膜近位ドメイン（Ｅ＊０１：０９）のアミノ酸配列である。
配列番号２０は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｅのα３膜近位ドメイン（Ｅ＊０１：０９）のアミノ酸配列である。
【0185】
配列番号２１は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｆのα３膜近位ドメイン（Ｆ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｆのα３膜近位ドメイン（Ｆ＊０１：０２）のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｆのα３膜近位ドメイン（Ｆ＊０１：０２）のアミノ酸配列である。
【0186】
配列番号２３は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｆのα３膜近位ドメイン（Ｆ＊０１：０３：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｆのα３膜近位ドメイン（Ｆ＊０１：０４：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｆのα３膜近位ドメイン（Ｆ＊０１：０４：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0187】
配列番号２５は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｆのα３膜近位ドメイン（Ｆ＊０１：０５）のアミノ酸配列である。
配列番号２６は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｇのα３膜近位ドメイン（Ｇ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号２６は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｇのα３膜近位ドメイン（Ｇ＊０１：０１：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0188】
配列番号２７は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｇのα３膜近位ドメイン（Ｇ＊０１：０３：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｇのα３膜近位ドメイン（Ｇ＊０１：０４：０１：０１）のアミノ酸配列である。
配列番号２８は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｇのα３膜近位ドメイン（Ｇ＊０１：０４：０１：０１）のアミノ酸配列である。
【0189】
配列番号２９は、ＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ－Ｇのα３膜近位ドメイン（Ｇ＊０１：０６）のアミノ酸配列である。
配列番号４６は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣ様タンパク質（ＣＤ１、ＨＦＥ）のユニバーサルβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）のアミノ酸配列である。
配列番号４６は、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣ様タンパク質（ＣＤ１、ＨＦＥ）のユニバーサルβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）のアミノ酸配列である。
【0190】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＭＨＣ Ｉのα３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0191】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントおよびＭＨＣ Ｉのα３ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣの第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣの第２の膜近位ドメインを含む。
【0192】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号４７または配列番号４８から選択されるアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントを含む。
【0193】
配列番号４７は、突然変異Ｒ１２Ｃを有するＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣ様タンパク質（ＣＤ１、ＨＦＥ）のユニバーサルβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）（ＳＳ架橋がユニット内にある）のアミノ酸配列である。
【0194】
配列番号４８は、突然変異Ｒ１２Ｃを有するＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣ様タンパク質（ＣＤ１、ＨＦＥ）のユニバーサルβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）（ＳＳ架橋がユニット内にある）＋突然変異Ｃ２２０Ａを有するヒンジ（ＳＳ架橋がユニットのＣ末端から除去されており、ユニット内に移動している）のアミノ酸配列である。
【0195】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＣＤ１のα３ドメインおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0196】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）およびＣＤ１のα３ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0197】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号４０～４４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤ１のα３ドメインおよび配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を含む。
【0198】
配列番号４０は、ＣＤ１ａのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４１は、ＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４２は、ＣＤ１ｃのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４１は、ＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４２は、ＣＤ１ｃのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
【0199】
配列番号４３は、ＣＤ１ｄのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４４は、ＣＤ１ｅのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＣＤ１のα３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
配列番号４４は、ＣＤ１ｅのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＣＤ１のα３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0200】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントおよびＣＤ１のα３ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0201】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号４９～５６または配列番号１０９を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤ１のα３ドメインの修飾されたバリアント、および配列番号４７または配列番号４８から選択されるアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントを含む。
【0202】
配列番号４９は、突然変異Ｎ５７Ｃ（追加のＳＳ架橋がユニット内にある）およびＣ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
【0203】
配列番号５０は、突然変異Ｎ５７Ｃ（ＳＳ架橋がユニット内にある）およびＣ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長（ＳＳ架橋がユニットのＣ末端から除去されており、ユニット内に移動している）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
【0204】
配列番号５１は、突然変異Ｎ５９Ａ（予測されたＮグリコシル化部位での置換）およびＣ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
【0205】
配列番号５２は、突然変異Ｎ５９Ｄ（予測されたＮグリコシル化部位での置換）およびＣ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
【0206】
配列番号５３は、突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９ＡおよびＣ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメイン（追加のＳＳ架橋がユニット内にある＋予測されたＮグリコシル化部位が除去されている）のアミノ酸配列である。
【0207】
配列番号５４は、突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９ＤおよびＣ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメイン（追加のＳＳ架橋がユニット内にある＋予測されたＮグリコシル化部位が除去されている）のアミノ酸配列である。
【0208】
配列番号５５は、突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９ＡおよびＣ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメイン（ＳＳ架橋がユニット内に移動している＋予測されたＮグリコシル化部位が除去されている）のアミノ酸配列である。
【0209】
配列番号５６は、突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９ＤおよびＣ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメイン（ＳＳ架橋がユニット内に移動している＋予測されたＮグリコシル化部位が除去されている）のアミノ酸配列である。
【0210】
配列番号１０９は、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＨＦＥのα３ドメインおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＨＦＥのα３ドメインおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）であり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0211】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）およびＨＦＥのα３ドメインであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0212】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号４５のアミノ酸配列を有するＨＦＥのα３ドメインおよび配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を含む。
【0213】
配列番号４５は、ＨＦＥのα３膜近位ドメインのアミノ酸配列である。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＨＦＥのα３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、ＨＦＥのα３ドメインの修飾されたバリアントおよびβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0214】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、それぞれ、β２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントおよびＨＦＥのα３ドメインの修飾されたバリアントであり、それらの間でヘテロ二量体を形成する、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインおよびＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメインを含む。
【0215】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、配列番号４７または配列番号４８から選択されるアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）の修飾されたバリアントを含む。
【0216】
ＭＨＣ、ＣＤ１およびＨＦＥの１，０００を超える特徴付けられた構造が公知である。上記構造はいずれも、本発明による二重特異性抗体において使用することができる。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の修飾されたバリアントを含み、ここで、修飾されたバリアントとは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメインから産生されるヘテロ二量体の鎖の間でジスルフィド架橋を形成するシステイン（Ｃ）への置換を含むバリアントを指す。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の修飾されたバリアントを含み、ここで、修飾されたバリアントとは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の第１および第２の膜近位ドメインから産生されるヘテロ二量体の鎖の間でジスルフィド架橋を形成するシステイン（Ｃ）への置換を含むバリアントを指す。
【0217】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の修飾されたバリアントを含み、ここで、修飾されたバリアントとは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインの様々な位置に１つまたは複数の置換を含み、それぞれ、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の野生型膜近位ドメインと比較して、熱力学的安定性Ｔｍの１℃より高い増大をもたらすバリアントを指す。
【0218】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の修飾されたバリアントを含み、ここで、修飾されたバリアントとは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインの様々な位置に１つまたは複数の置換を含み、それぞれ、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の野生型膜近位ドメインと比較して、１０ｍｇ／ｍｌより高い濃度で５％を超える凝集体の量の減少をもたらすバリアントを指す。
【0219】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の修飾されたバリアントを含み、ここで、修飾されたバリアントとは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインの様々な位置に１つまたは複数の置換を含み、それぞれ、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の野生型膜近位ドメインと比較して、グリコシル化部位の除去をもたらすバリアントを指す。
【0220】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、同一である、第１の軽鎖の可変ドメインおよび第２の軽鎖の可変ドメインを含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＩｇＧに属するＦｃ断片を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＩｇＧに属するＦｃ断片を含む。
【0221】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４を含む群から選択されるＦｃ断片を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、二価二重特異性抗体におけるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ特性の非存在をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、二価二重特異性抗体におけるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ特性の非存在をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
【0222】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＬＡＬＡ置換（Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ）がさらに導入されているＦｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、抗体の作用の延長をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、抗体の作用の延長をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
【0223】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＹＴＥ置換（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ）がさらに導入されているＦｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、二価二重特異性抗体におけるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ特性の増強をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換がさらに導入されており、二価二重特異性抗体におけるＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ特性の増強をもたらす、Ｆｃ断片単量体を含む。
【0224】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、置換Ｅ３４５Ｒがさらに導入されているＦｃ断片単量体を含む。
Ｆｃ断片における上記突然変異は、抗体のアミノ酸鎖に関するＥＵナンバリングに従って番号付けられる（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１９６９）、７８～８５頁；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。
Ｆｃ断片における上記突然変異は、抗体のアミノ酸鎖に関するＥＵナンバリングに従って番号付けられる（Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１９６９）、７８～８５頁；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。
【0225】
Ｆｃ断片における突然変異は、本出願に記載された抗体のアミノ酸配列の修飾を意味すると理解される。抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化を抗体核酸中に導入すること、またはペプチド合成によって調製される。そのような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失および／または挿入および／または置換が挙げられる。最終構築物が所望の特徴を有するという条件で、最終構築物に到達するために、任意の組合せの欠失、挿入、および置換が作製される。
【0226】
アミノ酸置換を使用する抗体のアミノ酸配列の修飾物のバリアントは、抗体分子中の少なくとも１個のアミノ酸残基の、別の残基による置換である。
保存的置換は、「好ましい置換」の下で表Ａに示される。
保存的置換は、「好ましい置換」の下で表Ａに示される。
【0227】
【表1】
【0228】
抗体「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域（天然Ｆｃ領域配列またはＦｃ領域アミノ酸バリアント）に起因する生物活性を指し、抗体アイソタイプと共に変化する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方調節；およびＢ細胞活性化が挙げられる。
【0229】
「抗体依存性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、次いで、標的細胞の溶解または食作用を引き起こす、細胞媒介性の応答を指す。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７～９２（１９９１）の４６４頁の表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されたものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを実施することができる。そのようなアッセイにとって有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２～６５６（１９９８）に開示されたものなどの動物モデルにおいて、評価することができる。
【0230】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞を、本明細書に記載のようにその天然の供給源、例えば、血液またはＰＢＭＣから単離することができる。
【0231】
「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を指す。補体活性化経路は、同族抗原と複合体を形成した分子（例えば、抗体）への補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２：１６３（１９９６）に記載されたような、ＣＤＣアッセイを行うことができる。
【0232】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＣＤ２０およびＣＤ３に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する。
【0233】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＣＤ４７に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、凝固因子９（ＦＩＸ）および凝固因子１０（ＦＸ）に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、凝固因子９（ＦＩＸ）および凝固因子１０（ＦＸ）に特異的に結合する。
【0234】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＧＤ２およびＣＤ３に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＡＸＬおよびＣＤ３に特異的に結合する。
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＡＸＬおよびＣＤ３に特異的に結合する。
【0235】
本発明の一部の態様では、二価二重特異性キメラ抗体は、ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦベータに特異的に結合する。
本出願の材料は、以下の抗体および抗体様分子を提供する：０１－００１、０１－００２、０１－００３、０１－００４、０１－００５、０１－００６、０１－００７、０１－００８、０１－００９、０１－０１０、０１－０１１、０１－０１２、０２－００４、０２－００５、０２－００６、０２－００７、０２－００８、０２－００９、０３－００１、０３－００２、０３－００３、０３－００４、０３－００５、０３－００６、０３－００７、０３－００８。
本出願の材料は、以下の抗体および抗体様分子を提供する：０１－００１、０１－００２、０１－００３、０１－００４、０１－００５、０１－００６、０１－００７、０１－００８、０１－００９、０１－０１０、０１－０１１、０１－０１２、０２－００４、０２－００５、０２－００６、０２－００７、０２－００８、０２－００９、０３－００１、０３－００２、０３－００３、０３－００４、０３－００５、０３－００６、０３－００７、０３－００８。
【0236】
０１－００１は、ＶＨおよびＣＨ１に基づく重鎖、ならびにＶＬおよびＣＤ１ｂに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ＶＬが配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）のアミノ酸配列であり、ＣＤ１ｂが配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３ドメインである、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0237】
０１－００２は、ＶＨおよびｂ２Ｍに基づく重鎖ならびにＶＬおよびＣＫに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ｂ２Ｍが配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンであり、ＶＬが配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）のアミノ酸配列である、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0238】
０１－００３は、ＶＨおよびＣＨ１に基づく重鎖ならびにＶＬおよびＣＤ１ｂに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ＶＬが配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ＣＤ１ｂが配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３ドメインである、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0239】
０１－００４は、ＶＨおよびＣＨ１に基づく重鎖ならびにＶＬおよびＣＫに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ＶＬが配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）のアミノ酸配列である、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0240】
０１－００５は、ＶＨおよびＣＨ１に基づく重鎖ならびにＶＬおよびｂ２Ｍに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ｂ２Ｍが配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンであり、ＶＬが配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）のアミノ酸配列であり、ＣＤ１ｂが配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３ドメインである、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0241】
０１－００６は、ＶＨおよびＣＨ１に基づく重鎖ならびにＶＬおよびＣＫに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ＶＬが配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）のアミノ酸配列である、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0242】
０１－００７は、ＶＨおよびＣＨ１に基づく重鎖ならびにＶＬおよびｂ２Ｍに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ｂ２Ｍが配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンであり、ＶＬが配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）のアミノ酸配列であり、ＣＤ１ｂが配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３ドメインである、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0243】
０１－００８は、ＶＨおよびＣＨ１に基づく重鎖ならびにＶＬおよびＣＤ１ｂに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ＶＬが配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ＣＤ１ｂが配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３ドメインである、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0244】
０１－００９は、ＶＨおよびｂ２Ｍに基づく重鎖ならびにＶＬおよびＣＫに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ｂ２Ｍが配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンであり、ＶＬが配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）のアミノ酸配列である、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0245】
０１－０１０は、ＶＨおよびＣＨ１に基づく重鎖ならびにＶＬおよびＣＤ１ｂに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ＶＬが配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）のアミノ酸配列であり、ＣＤ１ｂが配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３ドメインである、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0246】
０１－０１１は、ＶＨおよびＣＨ１に基づく重鎖ならびにＶＬおよびｂ２Ｍに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ｂ２Ｍが配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンであり、ＶＬが配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）のアミノ酸配列であり、ＣＤ１ｂが配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３ドメインである、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0247】
０１－０１２は、ＶＨおよびＣＨ１に基づく重鎖ならびにＶＬおよびＣＫに基づく軽鎖を含むモデル単一特異性抗体様分子であって、ＶＨが配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）のアミノ酸配列であり、ＶＬが配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）のアミノ酸配列である、モデル単一特異性抗体様分子である。
【0248】
０２－００４は、ＰＤ１およびＣＤ２０に特異的に結合し、
ａ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）および軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、ならびに、および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体、を含む抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）および配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）および軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、ならびに、および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体、を含む抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）および配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0249】
０２－００４は、ＰＤ１およびＣＤ２０に特異的に結合し、
ａ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号５８（プロルゴリマブ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第１の重鎖が配列番号５７（プロルゴリマブ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６０（オクレリズマブ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号５９（オクレリズマブ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号５８（プロルゴリマブ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第１の重鎖が配列番号５７（プロルゴリマブ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６０（オクレリズマブ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号５９（オクレリズマブ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0250】
０２－００５は、ＰＤ１およびＣＤ２０に特異的に結合し、
ａ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）および軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）、ならびに、および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）および配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）および軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）、ならびに、および第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）および配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0251】
０２－００５は、ＰＤ１およびＣＤ２０に特異的に結合し、
ａ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号６２（オクレリズマブ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第１の重鎖が配列番号６１（オクレリズマブ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６４（プロルゴリマブ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号６３（プロルゴリマブ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号６２（オクレリズマブ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第１の重鎖が配列番号６１（オクレリズマブ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６４（プロルゴリマブ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号６３（プロルゴリマブ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0252】
０２－００６は、ＰＤ１およびＣＳＦ１Ｒに特異的に結合し、
ａ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）および軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、ならびに、び第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体、を含む抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０８を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０７を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の重鎖可変ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）および軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、ならびに、び第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体、を含む抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０８を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０７を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の重鎖可変ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0253】
０２－００６は、ＰＤ１およびＣＳＦ１Ｒに特異的に結合し、
ａ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号５８（プロルゴリマブ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
第１の重鎖が配列番号５７（プロルゴリマブ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６６（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号６５（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号５８（プロルゴリマブ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
第１の重鎖が配列番号５７（プロルゴリマブ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６６（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号６５（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0254】
０２－００７は、ＰＤ１およびＣＳＦ１Ｒに特異的に結合し、
ａ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０８を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０７を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の重鎖可変ドメイン、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）および配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０８を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０７を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の重鎖可変ドメイン、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む、抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）および配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0255】
０２－００７は、ＰＤ１およびＣＳＦ１Ｒに特異的に結合し、
ａ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号６８（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第１の重鎖が配列番号６７（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６４（プロルゴリマブ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号６３（プロルゴリマブ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号６８（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第１の重鎖が配列番号６７（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＰＤ１に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６４（プロルゴリマブ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号６３（プロルゴリマブ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0256】
０２－００８は、ＣＤ２０およびＣＳＦ１Ｒに特異的に結合し、
ａ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）および軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０８を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０７を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の重鎖可変ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）および軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０８を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の軽鎖可変ドメインおよび配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０７を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の重鎖可変ドメイン、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0257】
０２－００８は、ＣＤ２０およびＣＳＦ１Ｒに特異的に結合し、
ａ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号６２（オクレリズマブ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第１の重鎖が配列番号６１（オクレリズマブ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６６（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号６５（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号６２（オクレリズマブ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第１の重鎖が配列番号６１（オクレリズマブ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６６（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号６５（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0258】
０２－００９は、ＣＤ２０およびＣＳＦ１Ｒに特異的に結合し、
ａ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０８を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０７を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の重鎖可変ドメイン、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）および配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が、配列番号１０８を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含み、
ここにおいて、第１の重鎖が、配列番号１０７を有するＣＳＦ１Ｒに対する抗体の重鎖可変ドメイン、ならびに、第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含み、ＣＨ３がホールを形成するアミノ酸置換を含む；
ｂ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が、配列番号１０６を有する抗体オクレリズマブの軽鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＬ）および配列番号１０９のアミノ酸配列を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含み、
ここにおいて、第２の重鎖が、配列番号１０５を有する抗体オクレリズマブの重鎖可変ドメイン（オクレリズマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含み、ＣＨ３がノブを形成するアミノ酸置換を含む、
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0259】
０２－００９は、ＣＤ２０およびＣＳＦ１Ｒに特異的に結合し、
ａ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号６８（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第１の重鎖が配列番号６７（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６０（オクレリズマブ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号５９（オクレリズマブ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
ａ）ＣＳＦ１Ｒに特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖；
ここにおいて、第１の軽鎖が配列番号６８（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第１の重鎖が配列番号６７（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列を含む；
ｂ）ＣＤ２０に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖；
ここにおいて、第２の軽鎖が配列番号６０（オクレリズマブ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列を含み、
ここにおいて、第２の重鎖が配列番号５９（オクレリズマブ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列を含む
を含む、二価二重特異性キメラ抗体である。
【0260】
０３－００１は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ（追加のＳＳ架橋がユニット内にある）および配列番号４９のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４７のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ（追加のＳＳ架橋がユニット内にある）および配列番号４９のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４７のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0261】
０３－００１は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号７２のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0262】
０３－００２は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ（追加のＳＳ架橋がユニット内にある）および配列番号５０のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長（ＳＳ架橋がユニットのＣ末端から除去されており、ユニット内に移動している）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメインおよび配列番号４８のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｃ２２０Ａを有するヒンジならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ（追加のＳＳ架橋がユニット内にある）および配列番号５０のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長（ＳＳ架橋がユニットのＣ末端から除去されており、ユニット内に移動している）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメインおよび配列番号４８のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｃ２２０Ａを有するヒンジならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0263】
０３－００２は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号７３のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0264】
０３－００３は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５９Ａ（軽鎖上の予測Ｎグリコシル化部位における置換）および配列番号５１のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５９Ａ（軽鎖上の予測Ｎグリコシル化部位における置換）および配列番号５１のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0265】
０３－００３は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号７４のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0266】
０３－００４は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５９Ｄ（軽鎖上の予測Ｎグリコシル化部位における置換）および配列番号５２のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５９Ｄ（軽鎖上の予測Ｎグリコシル化部位における置換）および配列番号５２のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４６のアミノ酸配列を有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0267】
０３－００４は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号７５のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号７５のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号７０のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0268】
０３－００５は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９Ａおよび配列番号５３のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長（さらなるＳＳ架橋がユニット内にある＋予測Ｎグリコシル化部位が除去されている）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４７のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９Ａおよび配列番号５３のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長（さらなるＳＳ架橋がユニット内にある＋予測Ｎグリコシル化部位が除去されている）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４７のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0269】
０３－００５は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0270】
０３－００６は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９Ｄおよび配列番号５４のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長（さらなるＳＳ架橋がユニット内にある＋予測Ｎグリコシル化部位が除去されている）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４７のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９Ｄおよび配列番号５４のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長（さらなるＳＳ架橋がユニット内にある＋予測Ｎグリコシル化部位が除去されている）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、配列番号４７のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメイン、ならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0271】
０３－００６は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号７７のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号６９のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0272】
０３－００７は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９Ａおよび配列番号５５のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長（ＳＳ架橋がユニット内に移動している＋予測Ｎグリコシル化部位が除去されている）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメインおよび配列番号４８のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｃ２２０Ａを有するヒンジならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９Ａおよび配列番号５５のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長（ＳＳ架橋がユニット内に移動している＋予測Ｎグリコシル化部位が除去されている）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメインおよび配列番号４８のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｃ２２０Ａを有するヒンジならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0273】
０３－００７は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号７８のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0274】
０３－００８は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９Ｄおよび配列番号５６のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長（ＳＳ架橋がユニット内に移動している＋予測Ｎグリコシル化部位が除去されている）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメインおよび配列番号４８のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｃ２２０Ａを有するヒンジならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号１０４を有する抗体プロルゴリマブの軽鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＬ）ならびに突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９Ｄおよび配列番号５６のアミノ酸配列を有する、Ｃ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長（ＳＳ架橋がユニット内に移動している＋予測Ｎグリコシル化部位が除去されている）を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む軽鎖；
配列番号１０３を有する抗体プロルゴリマブの重鎖可変ドメイン（プロルゴリマブ＿ＶＨ）、突然変異Ｒ１２Ｃを有するβ２ミクログロブリンの膜近位ドメインおよび配列番号４８のアミノ酸配列を有する、突然変異Ｃ２２０Ａを有するヒンジならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0275】
０３－００８は、ＰＤ１に特異的に結合し、
配列番号７９のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
配列番号７９のアミノ酸配列を含む軽鎖、および
配列番号７１のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、二価単一特異性キメラ抗体である。
【0276】
これらの抗体は、本発明による二価二重特異性キメラ抗体の操作性を確認する、ならびにその驚くべき特性を確認するための例示目的で与えられるものである。これらの抗体は、本発明による二価二重特異性キメラ抗体を何らかの形で制限すると解釈されるべきではない。
【0277】
２つの異なる重鎖の正確なヘテロ二量体アセンブリーおよび２つの異なる軽鎖と対応する重鎖との間の正確な対合を示す生成物の収率パラメーターは、二重特異性キメラ抗体の重鎖および軽鎖可変断片ならびに抗原に対するその特異性に依存しない。
【0278】
本発明による二価二重特異性キメラ抗体を使用して、様々な疾患、特に、腫瘍疾患、自己免疫疾患または血液凝固（凝固）障害と関連する疾患を処置することができる。
核酸
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかまたはその断片をコードする単離された核酸に関する。
核酸
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかまたはその断片をコードする単離された核酸に関する。
【0279】
本明細書において互換的に使用される、用語「核酸」、「核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」は、非天然ヌクレオチドを含有する、または含有しない、二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または前記ＤＮＡの転写産物のいずれかである、核酸の断片または領域を決定する、修飾された、または修飾されていない、ヌクレオチドの正確な配列を意味する。
【0280】
また、本発明がその天然の染色体環境、すなわち、天然状態にあるヌクレオチド配列に関するものではないことも、本明細書に含まれるべきである。本発明の配列は、単離および／または精製されている、すなわち、それらは、例えば、少なくとも部分的に修飾されているその環境をコピーすることによって、直接的または間接的に試料化された。かくして、例えば、宿主細胞を用いた組換え遺伝学によって得られた、または化学合成によって得られた単離された核酸も、本明細書に記載されるべきである。
【0281】
ヌクレオチド配列に対する参照は、別途特定しない限り、その相補体を包含する。かくして、特定の配列を有する核酸に対する参照は、その相補配列を有するその相補鎖を包含するものと理解されるべきである。
【0282】
上記態様のいずれかにおいて、核酸分子は単離されていてもよい。
「単離された」核酸分子は、少なくとも１つの核酸分子－不純物から同定および分離されているものであり、前者は抗体核酸の天然の供給源に結合している。単離された核酸分子は、それが天然条件下で見出される形態またはセットとは異なる。かくして、単離された核酸分子は、天然条件下で細胞中に存在する核酸分子とは異なる。
「単離された」核酸分子は、少なくとも１つの核酸分子－不純物から同定および分離されているものであり、前者は抗体核酸の天然の供給源に結合している。単離された核酸分子は、それが天然条件下で見出される形態またはセットとは異なる。かくして、単離された核酸分子は、天然条件下で細胞中に存在する核酸分子とは異なる。
【0283】
一側面では、本発明は、配列番号１～７９または配列番号１０９から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。核酸分子はまた、前記ヌクレオチド配列の任意の組合せを含んでもよい。
【0284】
一部の態様では、核酸は、ＤＮＡである。
１つのバリアントでは、本発明は、本発明による上記二重特異性抗体の軽鎖または重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関し、前記アミノ酸配列は、
軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメインおよび第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖アミノ酸配列；
軽鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメインを含む、第２の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体の群から選択される定常ドメインを含む第２の重鎖アミノ酸配列、
から選択される。
１つのバリアントでは、本発明は、本発明による上記二重特異性抗体の軽鎖または重鎖アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関し、前記アミノ酸配列は、
軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメインおよび第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖アミノ酸配列；
軽鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメインを含む、第２の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体の群から選択される定常ドメインを含む第２の重鎖アミノ酸配列、
から選択される。
【0285】
核酸分子はまた、上記ヌクレオチド配列の任意の組合せを含んでもよい。
当業者であれば、
軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメインおよび第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖アミノ酸配列；
軽鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメインを含む、第２の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体の群から選択される定常ドメインを含む第２の重鎖アミノ酸配列、
から選択される、本発明による上記二重特異性抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列を含むペプチドが、遺伝子コードの縮重性に起因して、様々な異なるＤＮＡ配列によってコードされ得ることを理解するであろう。同じアミノ酸配列をコードするこれらの代替的なＤＮＡ配列を作出することは、当業界で訓練された当業者の技術の範囲内にある。そのようなバリアントＤＮＡ配列は、本発明の範囲内にある。
当業者であれば、
軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメインおよび第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖アミノ酸配列；
軽鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメインを含む、第２の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体の群から選択される定常ドメインを含む第２の重鎖アミノ酸配列、
から選択される、本発明による上記二重特異性抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列を含むペプチドが、遺伝子コードの縮重性に起因して、様々な異なるＤＮＡ配列によってコードされ得ることを理解するであろう。同じアミノ酸配列をコードするこれらの代替的なＤＮＡ配列を作出することは、当業界で訓練された当業者の技術の範囲内にある。そのようなバリアントＤＮＡ配列は、本発明の範囲内にある。
【0286】
本発明による核酸分子は、本発明による二重特異性抗体を産生する任意の供給源から単離され得る。本発明のある特定の態様では、本発明の核酸分子は、単離されるよりもむしろ合成され得る。
【0287】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００４および０２－００６の第１の重鎖（プロルゴリマブ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列をコードし、配列番号８０を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0288】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００４および０２－００６の第１の軽鎖（プロルゴリマブ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列をコードし、配列番号８１を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0289】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００４および０２－００９の第２の重鎖（オクレリズマブ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列をコードし、配列番号８２を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0290】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００４および０２－００９の第２の軽鎖（オクレリズマブ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列をコードし、配列番号８３を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0291】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００５および０２－００８の第１の重鎖（オクレリズマブ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列をコードし、配列番号８４を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0292】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００５および０２－００８の第１の軽鎖（オクレリズマブ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列をコードし、配列番号８５を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0293】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００５および０２－００７の第２の重鎖（プロルゴリマブ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列をコードし、配列番号８６を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0294】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００５および０２－００７の第２の軽鎖（プロルゴリマブ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列をコードし、配列番号８７を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0295】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００６および０２－００８の第２の重鎖（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＨ＿ｂ２ｍ＿Ｆｃ＿ノブ）のアミノ酸配列をコードし、配列番号８８を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0296】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００６および０２－００８の第２の軽鎖（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＬ＿ＣＤ１ｂ）のアミノ酸配列をコードし、配列番号８９を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0297】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００７および０２－００９の第１の重鎖（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＨ＿ＨＣ＿ホール）のアミノ酸配列をコードし、配列番号９０を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0298】
本発明の一部の態様では、核酸は、候補０２－００７および０２－００９の第１の軽鎖（抗ＣＳＦ１Ｒ＿ＶＬ＿ＣＫ）のアミノ酸配列をコードし、配列番号９１を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0299】
本発明の一部の態様では、核酸は、突然変異Ｒ１２Ｃを有するユニバーサルβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を含む、候補０３－００１および０３－００５の重鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号９２を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0300】
本発明の一部の態様では、核酸は、ユニバーサルβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）を含む、候補０３－００３および０３－００４の重鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号９３を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0301】
本発明の一部の態様では、核酸は、突然変異Ｒ１２Ｃを有するユニバーサルβ２ミクログロブリン（β２Ｍ）および突然変異Ｃ２２０Ａを有するヒンジを含む、候補０３－００２、０３－００７および０３－００８の重鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号９４を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0302】
本発明の一部の態様では、核酸は、突然変異Ｎ５７ＣおよびＣ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む、候補０３－００１の軽鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号９５を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0303】
本発明の一部の態様では、核酸は、突然変異Ｎ５７ＣおよびＣ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む、候補０３－００２の軽鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号９６を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0304】
本発明の一部の態様では、核酸は、突然変異Ｎ５９ＡおよびＣ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む、候補０３－００３の軽鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号９７を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0305】
本発明の一部の態様では、核酸は、突然変異Ｎ５９ＤおよびＣ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む、候補０３－００４の軽鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号９８を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0306】
本発明の一部の態様では、核酸は、突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９ＡおよびＣ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む、候補０３－００５の軽鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号９９を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0307】
本発明の一部の態様では、核酸は、突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９ＤおよびＣ末端の３個のアミノ酸ＧＳＣによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む、候補０３－００６の軽鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号１００を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0308】
本発明の一部の態様では、核酸は、突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９ＡおよびＣ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む、候補０３－００７の軽鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号１０１を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0309】
本発明の一部の態様では、核酸は、突然変異Ｎ５７Ｃ、Ｎ５９ＤおよびＣ末端の２個のアミノ酸ＧＳによる伸長を有するＣＤ１ｂのα３膜近位ドメインを含む、候補０３－００８の軽鎖のアミノ酸配列をコードし、配列番号１０２を有するヌクレオチド配列を含む核酸である。
【0310】
核酸分子を使用して、本発明による二価二重特異性キメラ抗体を発現させることができる。
発現ベクター
一側面では、本発明は、上記の単離された核酸を含む発現ベクターに関する。本発明は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかの発現にとって好適なベクターに関する。
発現ベクター
一側面では、本発明は、上記の単離された核酸を含む発現ベクターに関する。本発明は、本明細書に記載のヌクレオチド配列のいずれかの発現にとって好適なベクターに関する。
【0311】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を意味する。本発明の一部の態様では、ベクターは、プラスミド、すなわち、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされていてもよいＤＮＡの環状二本鎖片である。本発明の一部の態様では、ベクターは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされていてもよい、ウイルスベクターである。本発明の一部の態様では、ベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製することができる（例えば、複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。本発明のさらなる態様では、ベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主遺伝子と一緒に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に、「発現ベクター」）と称される。
【0312】
本発明は、本明細書に記載されるような、
軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメインおよび第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖アミノ酸配列；
軽鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメインを含む、第２の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体の群から選択される定常ドメインを含む第２の重鎖アミノ酸配列、
から選択される、上記二価二重特異性抗体のいずれかまたはその構造部分をコードする上記核酸分子を含むベクターに関する。
軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメインおよび第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖アミノ酸配列；
軽鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメインを含む、第２の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体の群から選択される定常ドメインを含む第２の重鎖アミノ酸配列、
から選択される、上記二価二重特異性抗体のいずれかまたはその構造部分をコードする上記核酸分子を含むベクターに関する。
【0313】
発現ベクターとしては、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソームなどが挙げられる。ベクター内の転写および翻訳制御配列がＤＮＡの転写および翻訳を調節するというそれらの意図された機能を果たすように、ＤＮＡ分子をベクター中にライゲーションすることができる。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞に適合するように選択され得る。第１および第２の結合ドメインの配列を部分的または完全にコードするＤＮＡ分子（例えば、結合ドメインが重鎖および軽鎖配列を含む場合の重鎖および軽鎖配列）を、個々のベクター中に導入することができる。一態様では、前記ＤＮＡ分子の任意の組合せが、同じ発現ベクター中に導入される。標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上での相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合、平滑末端ライゲーション）によって、ＤＮＡ分子を発現ベクター中に挿入することができる。
【0314】
本発明の一部の態様では、好適なベクターは、上記のように、任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に挿入し、発現させることができるような制限部位を含むものである。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体部位で起こってもよい。組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードしてもよい。シグナルペプチドが免疫グロブリン鎖のアミノ末端にインフレームに連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクター中にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であってもよい。
【0315】
本発明の一部の態様では、抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換えベクター発現は、宿主細胞中での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持してもよい。当業者であれば、調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることを理解するであろう。哺乳動物における発現宿主細胞のための好ましい制御配列としては、例えば、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を確保するウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーならびに天然の免疫グロブリンプロモーターおよびアクチンプロモーターなどの強力な哺乳動物プロモーターが挙げられる。ポリペプチドを細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞において発現させる方法も、当業界で周知である。
【0316】
本発明の一部の態様では、抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子などの追加の配列を担持してもよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする。
【0317】
本発明の一部の態様では、ベクターは発現制御配列を含んでもよい。本明細書で使用される場合、用語「発現制御配列」とは、それらがライゲーションされるコード配列の発現およびプロセシングを行うのに必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列としては、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに必要に応じて、タンパク質分泌を増強する配列が挙げられる。そのような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる；原核生物では、そのような制御配列は一般に、リボソーム結合部位のプロモーター、および転写終結配列を含む；真核生物では、典型的には、そのような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現およびプロセシングにとって必須である少なくとも全部の成分を含み、また、その存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含んでもよい。
【0318】
宿主細胞およびその生産のための方法
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかを生産するための宿主細胞を生産する方法に関し、細胞の上記発現ベクターによる形質転換を含む。
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかを生産するための宿主細胞を生産する方法に関し、細胞の上記発現ベクターによる形質転換を含む。
【0319】
一側面では、本発明は、上記核酸のいずれかを含む上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかを生産するための宿主細胞に関する。
本明細書で使用される場合、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。本発明は、例えば、上記の本発明によるベクターを含んでもよい、宿主細胞に関する。
本明細書で使用される場合、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。本発明は、例えば、上記の本発明によるベクターを含んでもよい、宿主細胞に関する。
【0320】
本発明はさらに、例えば、本発明による二価二重特異性キメラ抗体の第１の重鎖をコードするヌクレオチド配列、本発明による二価二重特異性キメラ抗体の第１の軽鎖をコードするヌクレオチド配列、本発明による二価二重特異性キメラ抗体の第２の重鎖をコードするヌクレオチド配列、または本発明による二価二重特異性キメラ抗体の第２の軽鎖をコードするヌクレオチド配列または上記４つの配列の全部を含む宿主細胞に関する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象の細胞だけでなく、同様にそのような細胞の子孫も指すことが理解されるべきである。修飾は突然変異または環境的影響に起因して後の世代で生じ得るため、そのような子孫は、事実、親細胞と同一でなくてもよいが、そのような細胞は、本明細書で使用される場合の用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
【0321】
軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む第１の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメインおよび第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖アミノ酸配列；
軽鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメインを含む、第２の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体の群から選択される定常ドメインを含む第２の重鎖アミノ酸配列、
から選択される、上記の二重特異性抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含むベクターを、好適な哺乳動物またはその細胞、植物またはその細胞、細菌または酵母宿主細胞をトランスフェクトするために使用することができる。形質転換を、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための任意の公知の技術によって実行することができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞中に導入するための方法は、当業界で周知であり、デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー－核酸複合体トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子を、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞中に導入することができる。
重鎖可変ドメインおよび第１（ＣＨ１）の重鎖定常ドメインならびに第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体を含む抗体の重鎖定常ドメインを含む、第１の重鎖アミノ酸配列；
軽鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第１の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第１の膜近位ドメインの群から選択される定常ドメインを含む、第２の軽鎖アミノ酸配列；
重鎖可変ドメイン、ならびに、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）の第２の膜近位ドメインまたは、ＭＨＣ様タンパク質の第２の膜近位ドメイン、
ならびに、第２（ＣＨ２）および第３（ＣＨ３）の重鎖定常ドメインを含むＦｃ断片単量体の群から選択される定常ドメインを含む第２の重鎖アミノ酸配列、
から選択される、上記の二重特異性抗体の軽鎖または重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含むベクターを、好適な哺乳動物またはその細胞、植物またはその細胞、細菌または酵母宿主細胞をトランスフェクトするために使用することができる。形質転換を、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための任意の公知の技術によって実行することができる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞中に導入するための方法は、当業界で周知であり、デキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー－核酸複合体トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソームへのポリヌクレオチドの封入、および核へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが挙げられる。さらに、核酸分子を、ウイルスベクターによって哺乳動物細胞中に導入することができる。
【0322】
形質転換のための宿主として使用される哺乳動物細胞系は当業界で周知であり、利用可能な複数の不死化細胞系を含む。これらのものとしては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ－３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、ＨｅｐＧ２）、Ａ５４９細胞、およびいくつかの他の細胞系が挙げられる。細胞系は、細胞系が高い発現レベルを有し、産生されるタンパク質の必要な特徴を提供することを決定することによって選択される。使用することができる他の細胞系は、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞などの昆虫細胞系である。上記の二重特異性抗体またはその一部をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞中に導入される場合、上記の二重特異性抗体は、宿主細胞中で本発明による上記の二重特異性抗体またはその一部を発現させる、または、より好ましくは、上記の二重特異性抗体を、宿主細胞が培養される培養培地中に分泌させるのに十分な期間にわたって、宿主細胞を培養することによって生産される。上記の二重特異性抗体を、標準的なタンパク質精製技術を使用して培養培地から単離することができる。植物宿主細胞としては、例えば、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどが挙げられる。細菌宿主細胞としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種が挙げられる。酵母宿主細胞としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。
【0323】
さらに、産生細胞系からの本発明の二重特異性抗体の産生レベルを、いくつかの公知の技術を使用して増強させることができる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、ある特定の条件下で発現を増強するための一般的手法である。ＧＳ系は、欧州特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号、第０３２３９９７号および第０３３８８４１号と関連して全体的または部分的に考察されている。
【0324】
異なる細胞系または宿主細胞中の本発明の二重特異性キメラ抗体は互いに異なるグリコシル化パターンを有する可能性が高い。しかしながら、本明細書に開示される二重特異性抗体は、結合分子のグリコシル化の状態に関係なく、また、一般的には、翻訳後修飾の存在または非存在に関係なく、本発明の一部である。
【0325】
上記宿主細胞は、ヒト胚を使用して生産された宿主細胞を指さない。
上記宿主細胞は、ヒト生殖系列細胞の遺伝的完全性を修飾することによって生産された宿主細胞を指さない。
上記宿主細胞は、ヒト生殖系列細胞の遺伝的完全性を修飾することによって生産された宿主細胞を指さない。
【0326】
抗体を生産する方法
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかを生産するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、
－ 本発明による二価二重特異性キメラ抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター、
－ 本発明による二価二重特異性キメラ抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター
で形質転換するステップ、
ｂ）前記二価二重特異性抗体の合成にとって好適な条件下で宿主細胞を培養するステップ、ならびに
ｃ）細胞培養物から前記二価二重特異性抗体を単離するステップ
を含む方法に関する。
一側面では、本発明は、上記の二価二重特異性キメラ抗体のいずれかを生産するための方法であって、
ａ）宿主細胞を、
－ 本発明による二価二重特異性キメラ抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター、
－ 本発明による二価二重特異性キメラ抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター
で形質転換するステップ、
ｂ）前記二価二重特異性抗体の合成にとって好適な条件下で宿主細胞を培養するステップ、ならびに
ｃ）細胞培養物から前記二価二重特異性抗体を単離するステップ
を含む方法に関する。
【0327】
本発明は、本発明による二価二重特異性キメラ抗体を生産するための方法に関する。本発明の一態様は、本明細書で定義される二価二重特異性キメラ抗体を生産するための方法であって、二価二重特異性キメラ抗体を発現することができる組換え宿主細胞を生産するステップ、二価二重特異性キメラ抗体の発現にとって好適な条件下で前記宿主細胞を培養するステップ、および得られる二価二重特異性キメラ抗体を単離するステップを含む方法に関する。そのような組換え宿主細胞中でのそのような発現によって産生される二価二重特異性キメラ抗体は、本明細書では「二価二重特異性キメラ抗体」と称される。
【実施例】
【0328】
以下の実施例は、本発明のより良い理解のために提供される。これらの実施例は、例示に過ぎず、いかなる様式でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前記発明は明確な理解のための実例および例としていくらか詳細に説明されてきたが、添付の態様の精神または範囲から逸脱することなく、ある特定の変化および修飾を、それに対して行うことができることが、本発明の教示に照らせば、当業者には容易に明らかとなるであろう。
本明細書で引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前記発明は明確な理解のための実例および例としていくらか詳細に説明されてきたが、添付の態様の精神または範囲から逸脱することなく、ある特定の変化および修飾を、それに対して行うことができることが、本発明の教示に照らせば、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【0329】
材料および一般的方法
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載されたような標準的な方法を使用して、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造業者のプロトコールに従って使用した。
組換えＤＮＡ技術
Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９に記載されたような標準的な方法を使用して、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造業者のプロトコールに従って使用した。
【0330】
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから調製した。単一の制限部位によって挟まれた、３００～４，０００ｂｐの長さの遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによってアセンブリーさせた後、特殊な制限部位を介してクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから調製した。単一の制限部位によって挟まれた、３００～４，０００ｂｐの長さの遺伝子セグメントを、ＰＣＲ増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによってアセンブリーさせた後、特殊な制限部位を介してクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【0331】
ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって決定した。
ＤＮＡおよびタンパク質の配列分析および配列データの管理
Ｙｌａｂ２（Ｂｉｏｃａｄ）ソフトウェアパッケージを、配列作出、マッピング、分析、注釈および実例のために使用した。
ＤＮＡ配列を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定によって決定した。
ＤＮＡおよびタンパク質の配列分析および配列データの管理
Ｙｌａｂ２（Ｂｉｏｃａｄ）ソフトウェアパッケージを、配列作出、マッピング、分析、注釈および実例のために使用した。
【0332】
発現ベクター
発現プラスミドバリアントを、真核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中での対象抗体、抗体様タンパク質および抗原の一過的発現に適用した。標的タンパク質のための発現カセットの他に、（プラスミド）ベクターは、大腸菌中での前記プラスミドの複製を可能にする複製起点、様々な抗生物質（例えば、アンピシリンおよびカナマイシン）に対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での耐性を付与する遺伝子を含有していた。
発現プラスミドバリアントを、真核細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中での対象抗体、抗体様タンパク質および抗原の一過的発現に適用した。標的タンパク質のための発現カセットの他に、（プラスミド）ベクターは、大腸菌中での前記プラスミドの複製を可能にする複製起点、様々な抗生物質（例えば、アンピシリンおよびカナマイシン）に対する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での耐性を付与する遺伝子を含有していた。
【0333】
上記の抗体鎖を含む融合遺伝子を、ＰＣＲおよび／または遺伝子合成によって生成し、例えば、対応するベクター中のユニークな制限部位を使用する、対応する核酸セグメントの接続による公知の方法および技術を用いてアセンブリーさせた。サブクローニングされた核酸配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。一過的トランスフェクションのためのプラスミドの必要量を、大腸菌細胞培養物中で生成し、公知の技術を使用して単離した。
【0334】
哺乳動物細胞の懸濁培養中での組換え抗原の生成および精製
組換えタンパク質を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ系）から得られた確立された細胞系の細胞中で産生させた。８ｍＭのＬ－グルタミンおよび１ｇ／ｌのプルロニック（登録商標）６８を添加した無血清培地を使用して、オービタルインキュベーター振とう器上のフラスコ中で懸濁培養を行った。一過的発現のために、細胞（２～２．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌ）を、直鎖状ポリエチレンイミンを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの９日後、０．５／０．２２μｍの深層フィルターを介する濾過によって培養液を細胞から分離した。
組換えタンパク質を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ系）から得られた確立された細胞系の細胞中で産生させた。８ｍＭのＬ－グルタミンおよび１ｇ／ｌのプルロニック（登録商標）６８を添加した無血清培地を使用して、オービタルインキュベーター振とう器上のフラスコ中で懸濁培養を行った。一過的発現のために、細胞（２～２．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌ）を、直鎖状ポリエチレンイミンを使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの９日後、０．５／０．２２μｍの深層フィルターを介する濾過によって培養液を細胞から分離した。
【0335】
ヒスチジンタグ付きタンパク質を、金属キレートクロマトグラフィーによって精製した。精製されたタンパク質を、０．２２μｍを介して濾過し、－７０℃で保存した。
得られたタンパク質溶液の純度を、ＳＤＳゲル電気泳動を使用して評価し、電気泳動を、メルカプトエタノールを添加した変性１２％ポリアクリルアミドゲルおよび天然８％ポリアクリルアミドゲル中で実施した。
得られたタンパク質溶液の純度を、ＳＤＳゲル電気泳動を使用して評価し、電気泳動を、メルカプトエタノールを添加した変性１２％ポリアクリルアミドゲルおよび天然８％ポリアクリルアミドゲル中で実施した。
【0336】
哺乳動物細胞の懸濁培養中での抗体および抗体様タンパク質の生産
対照抗体、本発明による二重特異性キメラ抗体および抗体様タンパク質を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ系）から得られた永続細胞系の細胞中で産生させた。８ｍＭのＬ－グルタミンおよび１ｇ／ｌのプルロニック（登録商標）６８を添加した無血清培地を使用して、オービタルインキュベーター振とう器上のフラスコ中で懸濁培養を行った。一過的発現のために、細胞（２～２．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌ）を、直鎖状ポリエチレンイミンを使用してトランスフェクトした。ＤＮＡ／ＰＥＩ比は、１：３／１：１０であった。トランスフェクションの９日後、０．５／０．２２μｍの深層フィルターを介する濾過によって細胞から培養液を分離した後、標準的な方法を使用してＦｏｒｔｅＢｉｏ上でタンパク質力価を測定した。明澄化された培養液を、吸着剤１ｍｌあたり１０～２０ｍｇのプロテインＡ親和性吸着剤カラムに通過させ、カラムをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化させた。次いで、カラムを、５倍カラム体積のＰＢＳで洗浄して、非特異的に結合する成分を除去した。結合したタンパク質を、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３）を使用して溶出させた。主たるタンパク質溶出ピークを収集し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）を使用してｐＨ６．８～７．０にした。全ての段階を、１１０ｃｍ／ｈの流量で行った。次いで、タンパク質を透析によってＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で透析し、濾過（０．２２μｍ）し、チューブに移し、－７０℃で保存した。
対照抗体、本発明による二重特異性キメラ抗体および抗体様タンパク質を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ系）から得られた永続細胞系の細胞中で産生させた。８ｍＭのＬ－グルタミンおよび１ｇ／ｌのプルロニック（登録商標）６８を添加した無血清培地を使用して、オービタルインキュベーター振とう器上のフラスコ中で懸濁培養を行った。一過的発現のために、細胞（２～２．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌ）を、直鎖状ポリエチレンイミンを使用してトランスフェクトした。ＤＮＡ／ＰＥＩ比は、１：３／１：１０であった。トランスフェクションの９日後、０．５／０．２２μｍの深層フィルターを介する濾過によって細胞から培養液を分離した後、標準的な方法を使用してＦｏｒｔｅＢｉｏ上でタンパク質力価を測定した。明澄化された培養液を、吸着剤１ｍｌあたり１０～２０ｍｇのプロテインＡ親和性吸着剤カラムに通過させ、カラムをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化させた。次いで、カラムを、５倍カラム体積のＰＢＳで洗浄して、非特異的に結合する成分を除去した。結合したタンパク質を、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３）を使用して溶出させた。主たるタンパク質溶出ピークを収集し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８）を使用してｐＨ６．８～７．０にした。全ての段階を、１１０ｃｍ／ｈの流量で行った。次いで、タンパク質を透析によってＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で透析し、濾過（０．２２μｍ）し、チューブに移し、－７０℃で保存した。
【0337】
得られたタンパク質溶液の純度を、還元および非還元条件下でＳＤＳゲル電気泳動を使用して、ならびにサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ ＨＰＬＣ）を使用して評価した。
【0338】
ＳＥ ＨＰＬＣを、ＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム、７．８ｘ３００ｍｍ、粒径：５μｍ、孔径：２５０Å、およびＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇｕａｒｄ ＳＷｘｌプレカラム上で実施した。
【0339】
実施例１
二重特異性抗体中のＣＨ１／ＣＫドメイン置換の選択
二重特異性抗体中の重鎖および軽鎖の正確なヘテロ二量体化のために、ＣＨ１／ＣＫドメインの２つのペアのうちの一方を、他のタンパク質に由来する構造的に同一のドメインに置換した（図１）。好適な置換ドメインを、３つのステップで選択した：
１）ＣＨ１／ＣＫドメインの三次元モデルの予備生成；
２）抗体およびＴ細胞受容体を除く、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）の全ての対象物との、ＣＨ１／ＣＫドメインの三次元モデルの構造アラインメント；
３）ＲＭＳＤ測定基準および同一の二次構造エレメントを形成するアミノ酸の数に基づく構造アラインメントの結果に従う好適な置換の選択。
二重特異性抗体中のＣＨ１／ＣＫドメイン置換の選択
二重特異性抗体中の重鎖および軽鎖の正確なヘテロ二量体化のために、ＣＨ１／ＣＫドメインの２つのペアのうちの一方を、他のタンパク質に由来する構造的に同一のドメインに置換した（図１）。好適な置換ドメインを、３つのステップで選択した：
１）ＣＨ１／ＣＫドメインの三次元モデルの予備生成；
２）抗体およびＴ細胞受容体を除く、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）の全ての対象物との、ＣＨ１／ＣＫドメインの三次元モデルの構造アラインメント；
３）ＲＭＳＤ測定基準および同一の二次構造エレメントを形成するアミノ酸の数に基づく構造アラインメントの結果に従う好適な置換の選択。
【0340】
第１のステップ、ＣＨ１／ＣＫドメインの三次元モデルの予備生成は、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＳｕｉｔｅからのＰｒｅｐｗｉｚａｒｄユーティリティを使用した、ＰＤＢｉｄ ４ｎｙｌ構造からのＣＨ１／ＣＫドメイン中の欠けている原子の付加である。第２のステップで、得られたモデルを、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ ＳｕｉｔｅからのＰｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔユーティリティを使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋからの全ての構造（抗体およびＴ細胞受容体を除く）に対して交互に整列させた。任意の構造とＣＨ１／ＣＫドメインモデルとの間の類似性の程度を、以下のような２つの測定基準を使用して評価した：１）一方の構造と他方の構造との間の原子に関する二乗平均平方根偏差を反映するＲＭＳＤ（ポリペプチド鎖骨格原子を計算のために使用した）、２）アラインメントの結果に従って同一の二次タンパク質構造エレメントを形成するアミノ酸の数。表１は、ＲＭＳＤ測定基準を使用したアラインメントの最良の結果を示す。
【0341】
【表2-1】
【0342】
【表2-2】
【0343】
ＲＭＳＤ測定基準によるＣＨ１／ＣＫドメインとの最大の構造類似性を有する構造は、主要組織適合複合体クラスＩおよびＩＩ（ＭＨＣ）タンパク質、ならびにその構造アナログ、ＣＤ１およびＨＦＥに属する。構造類似性の程度の比較可能な値に基づいて（ＲＭＳＤおよび同一の二次構造に由来するアミノ酸の数）、上記タンパク質のいずれかを置換のために選択することができる。ＣＨ１／ＣＫドメイン置換を含むさらなる研究および例示目的のために、本発明者らは、ＣＤ１ｂ、特に、その膜近位ドメインを選択した。
【0344】
実施例２
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインへの、ＣＨ１／ＣＫの置換を有する抗体分子中の重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合の位置の選択
ヒトＩｇＧアイソタイプ抗体分子は、２個の軽鎖および２個の重鎖からなる。抗体の２個の軽鎖はそれぞれ、システイン残基中の硫黄原子間の共有結合であるＳＳ架橋を介して重鎖に接続されている。この結合は、軽鎖のＣ末端システイン残基および重鎖のヒンジ領域Ｎ末端近位システイン残基によって形成される（ＩｇＧ１アイソタイプの場合）。
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインへの、ＣＨ１／ＣＫの置換を有する抗体分子中の重鎖と軽鎖との間のジスルフィド結合の位置の選択
ヒトＩｇＧアイソタイプ抗体分子は、２個の軽鎖および２個の重鎖からなる。抗体の２個の軽鎖はそれぞれ、システイン残基中の硫黄原子間の共有結合であるＳＳ架橋を介して重鎖に接続されている。この結合は、軽鎖のＣ末端システイン残基および重鎖のヒンジ領域Ｎ末端近位システイン残基によって形成される（ＩｇＧ１アイソタイプの場合）。
【0345】
ＭＨＣおよびＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインは、非共有結合によってのみ接続され、それらの間でＳＳ架橋を形成しない；したがって、ＣＨ１／ＣＫドメインの、ＭＨＣの膜近位ドメインへの置換は、抗体分子の熱安定性および生成中の標的生成物の収率を潜在的に低下させ得る。これを回避するためには、キメラ抗体分子の軽鎖中の、ヒンジ領域のＮ末端に近いシステイン残基とのＳＳ架橋の形成にとって好適な位置に、点システイン置換が必要であった。
【0346】
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインへのシステイン残基の導入のための位置を、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質と、完全長抗体分子との構造アラインメントに基づいて選択した。アラインメントの結果として、システイン残基を、抗体の初期ＣＬ（ＣＫ）ドメインの部位、天然のＩｇＧ１アイソタイプ抗体分子中の軽鎖とＳＳ架橋を形成するヒンジ領域システイン残基に近い位置に位置するＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質膜近位ドメイン中に導入した。天然抗体の軽鎖から類推して、導入されるシステイン残基は末端である。システイン残基間の距離がジスルフィド結合を確立するのに十分なものとするために、軽鎖を２個のアミノ酸ＧＳによって伸長させた。図２は、ＭＨＣ様タンパク質ＣＤ１ｂの膜近位ドメインに置換されたＣＨ１－ＣＫドメインを有するキメラ抗体中の重鎖と軽鎖との間のＳＳ架橋の位置を図示する。
【0347】
実施例３
二価二重特異性キメラ抗体を生成するための遺伝子構築物の生産
第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖の配列をコードする構築物を生産するために、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインの遺伝子を含むＰＣＲ産物を、制限部位を含むプライマーを使用して生成した。重鎖可変ドメインを、ＳａｌＩ／ＸｂａＩ制限部位を使用してベクターｐＳＸｎ－ＨＣｈｏｌｅ－ＮＲ＿ＶＨ１中にクローニングした。軽鎖可変ドメインを、ＳａｌＩ／ＸｂａＩ制限部位を使用してベクターｐＳＸｎ－ＣＬ－ＢＲ＿ＶＬ１中にクローニングした。
二価二重特異性キメラ抗体を生成するための遺伝子構築物の生産
第１の抗原に特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖の配列をコードする構築物を生産するために、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインの遺伝子を含むＰＣＲ産物を、制限部位を含むプライマーを使用して生成した。重鎖可変ドメインを、ＳａｌＩ／ＸｂａＩ制限部位を使用してベクターｐＳＸｎ－ＨＣｈｏｌｅ－ＮＲ＿ＶＨ１中にクローニングした。軽鎖可変ドメインを、ＳａｌＩ／ＸｂａＩ制限部位を使用してベクターｐＳＸｎ－ＣＬ－ＢＲ＿ＶＬ１中にクローニングした。
【0348】
第２の抗原に特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖の配列をコードする構築物を生産するために、本発明者らは、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインならびに様々な修飾を含む、または含まないヒトＣＤ１配列の膜近位ドメイン（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／５ｗｌ１）の遺伝子を含む構築物を合成した。
【0349】
制限部位を含むプライマーを使用するＰＣＲによってオリゴヌクレオチドから配列を合成した。修飾を含む、または含まないヒトＣＤ１配列の第１の膜近位ドメインを有する重鎖可変ドメインを、ＳａｌＩ／ＸｂａＩ制限部位を使用してベクターｐＳＸ－ＦＣｋｎｏｂ－ＰＲ中にクローニングした。修飾を含む、または含まないヒトＣＤ１配列の第２の膜近位ドメインを有する軽鎖可変ドメインを、ＳａｌＩ／ＸｂａＩ制限部位を使用してベクターｐＳＸ－ＨＲ中にクローニングした。
【0350】
上記の４つのベクターをトランスフェクションステップで組み合わせて、本発明による二価二重特異性キメラ抗体を生産した。
全ての上記プラスミドの必要量を、大腸菌細胞中で生成し、Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｑｉａｇｅｎキットを使用して精製した。
全ての上記プラスミドの必要量を、大腸菌細胞中で生成し、Ｍａｘｉｐｒｅｐ Ｑｉａｇｅｎキットを使用して精製した。
【0351】
実施例４
完全長キメラ抗体のアセンブリーに対する導入されたジスルフィド結合の効果
導入されたジスルフィド結合の操作性を試験するために、本発明者らは、モデル単一特異性キメラ抗体を生成した。この形式は、重鎖ＣＨ１および軽鎖ＣＫドメインが、それぞれ、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインに置換された、２個の重鎖および２個の軽鎖からなる抗体である。
完全長キメラ抗体のアセンブリーに対する導入されたジスルフィド結合の効果
導入されたジスルフィド結合の操作性を試験するために、本発明者らは、モデル単一特異性キメラ抗体を生成した。この形式は、重鎖ＣＨ１および軽鎖ＣＫドメインが、それぞれ、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインに置換された、２個の重鎖および２個の軽鎖からなる抗体である。
【0352】
ＶＨ（配列番号１０３）およびＶＬ（配列番号１０４）可変ドメインの配列を、抗体プロルゴリマブ（ＣＪＳＣ Ｂｉｏｃａｄ）から得た。試料の第１のバリアント中の重鎖と軽鎖との間にジスルフィド結合は存在しなかった。第２のバリアント中では、軽鎖Ｃ末端にシステインを付加した（実施例２に記載のように）；システインは、上側ヒンジ領域のシステインとジスルフィド結合を形成し、それによって、重鎖および軽鎖ヘテロ二量体を安定化すると考えられる。
【0353】
図３は、生成された試料の非還元的ＳＤＳゲル電気泳動の結果を示す。プロルゴリマブ試料（古典的ＩｇＧ１）を、対照としてレーン３に印加した。結果は、完全長分子は、さらなるジスルフィド結合の存在下でのみアセンブリーした（レーン２）が、その非存在下では、本発明者らは移動度が重鎖二量体に一致する断片のみを観察した（レーン３）ことを示す。
【0354】
本発明者らはまた、重鎖および軽鎖と比較して逆向きの二量体化ユニットを有するキメラ抗体も生成した（重鎖ＣＨ１ドメインおよび軽鎖ＣＫドメインを、それぞれ、ＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインおよびβ２ミクログロブリンに置換した。図１Ｂを参照されたい）。図３（レーン４）は、非還元条件下での試料のＳＤＳゲル電気泳動の結果を示す；この結果は、この向きもキメラ抗体をアセンブリーさせることができることを確認する。
【0355】
実施例５
重鎖と軽鎖との正確な対合に対するＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質に基づく二量体化ユニットの効果の検証
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質に基づく二量体化ユニットの機能を証明するために、特に、軽鎖と、不適切な重鎖との不正確な対合を防止するために、本発明者らは単一特異性分子を含む以下の実験を行った。本発明者らは、以下のような４つの群の分子を生成した：
１．ＶＨとＶＬとの「正確な」組合せおよび定常ドメインの「不正確な」ペアを有する分子。
２．ＶＨとＶＬとの「不正確な」組合せおよび定常ドメインの「正確な」ペアを有する分子。
３．ＶＨとＶＬとの「不正確な」組合せおよび定常ドメインの「不正確な」ペアを有する分子。
４．古典的ＩｇＧ１形式抗体および定常ドメインがＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメイン（この場合、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメイン）に置換されたキメラ抗体を含む対照分子。
重鎖と軽鎖との正確な対合に対するＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質に基づく二量体化ユニットの効果の検証
ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質に基づく二量体化ユニットの機能を証明するために、特に、軽鎖と、不適切な重鎖との不正確な対合を防止するために、本発明者らは単一特異性分子を含む以下の実験を行った。本発明者らは、以下のような４つの群の分子を生成した：
１．ＶＨとＶＬとの「正確な」組合せおよび定常ドメインの「不正確な」ペアを有する分子。
２．ＶＨとＶＬとの「不正確な」組合せおよび定常ドメインの「正確な」ペアを有する分子。
３．ＶＨとＶＬとの「不正確な」組合せおよび定常ドメインの「不正確な」ペアを有する分子。
４．古典的ＩｇＧ１形式抗体および定常ドメインがＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメイン（この場合、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメイン）に置換されたキメラ抗体を含む対照分子。
【0356】
ＶＨとＶＬとの「正確な」組合せとは、単一抗体から得られるＶＨとＶＬとのペアを意味する。ＶＨとＶＬとの「不正確な」組合せとは、異なる抗体から得られるＶＨおよびＶＬを意味する。
【0357】
定常ドメインの「正確な」ペアとは、ＣＨ１－ＣＫのペアまたはＭＨＣ様タンパク質に由来する相互作用ドメインのペア（この場合、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメイン）を意味する。定常ドメインの「不正確な」ペアとは、ＣＨ１－ＣＤ１ｂまたはβ２ミクログロブリン－ＣＫのペアを意味する。
【0358】
図４は、実験の一般的スキームを示す。抗体プロルゴリマブの可変ドメイン配列を可変ドメインＶＨ１およびＶＬ１として使用し、抗体オクレリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の対応する可変ドメイン配列をＶＨ２およびＶＬ２可変ドメインとして使用した。
【0359】
表２は、タンパク質生産性データを示す。結果は、その重鎖中にＣＨ１定常ドメインおよびその軽鎖中にＣＤ１ｂタンパク質の膜近位ドメインを有する候補が低い生産性を示したことを示す（抗体０１－００１、０１－００３、０１－００８、０１－０１０）。これは、小胞体（ＥＲ）からの正確なフォールディングおよび輸送がＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの相互作用を必要とするという公知の事実と一致している（Ｆｅｉｇｅ ＭＪ、Ｇｒｏｓｃｕｒｔｈ Ｓ、Ｍａｒｃｉｎｏｗｓｋｉ Ｍ、Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ、Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｈ、Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ ＬＭ、Ｂｕｃｈｎｅｒ Ｊ．Ａｎ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ＣＨ１ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ＩｇＧ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊｕｎ １２：３４（５）：５６９～７９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｃｅｌ．２００９．０４．０２８．ＰＭＩＤ：１９５２４５３７；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２９０８９９０）。抗体０１－００２および０１－００９は、ＥＲにおけるそのような品質対照を通過せず、２００ｍｇ／ｌを超える生産性を示した；しかしながら、高い生産性レベルにも拘わらず、ＰＡＧＥ中のその移動度は、完全長分子のものと一致しなかった（図５Ａ、レーン２、５）。
【0360】
【表3】
【0361】
図５は、非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動の結果を示す。その結果によれば、第１群（図５Ａのレーン１、２、図５Ｂのレーン１）および第３群（図５Ａのレーン４、５、図５Ｂのレーン１）に由来する抗体の電気泳動移動度は、完全長分子のもの（図５Ｂのレーン２）よりも高く、その分子がアセンブリーできなかったことを示している。ＶＨおよびＶＬ配列が異なる抗体から得られたにも拘わらず、第２群（図５Ｂのレーン２、３、４、５（図５Ａのレーン３と同じ））に由来する抗体の電気泳動移動度は、完全長分子の移動度（図５Ｂのレーン２）と一致する。予想通り、対照群に由来する抗体はアセンブリーした（図５Ｂのレーン２、図５Ａのレーン６（図５Ｂのレーン６と同じ））。
【0362】
得られたデータは、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインに基づく二量体化ユニットが、鎖が異なる性質の定常ドメインを含む場合、重鎖と軽鎖との間の不正確なペアの形成を防止することを示している。
【0363】
実施例６
ＭＨＣ様二量体化ユニットを含む二価二重特異性キメラ抗体の生成
抗原結合性断片（本明細書では以後、軽鎖および重鎖可変断片）の任意のペアを使用して二重特異性分子をアセンブリーさせるためのプラットフォームソリューションとしての対象の手法の普遍性を検証するために、本発明者らは、公知の抗体に由来する軽鎖および重鎖可変断片の３つの無作為のペア（表３を参照されたい）を選択し、それらを使用して、６つの二重特異性キメラ抗体を生成した。表３は、生産されたタンパク質の生産性の結果を示す。図６は、非還元的および還元的条件下での生成された試料のＳＤＳゲル電気泳動の結果を示す。６つ全部の試料について、完全長分子に対応する、約１５０ｋＤａに主要なバンドが存在する。表３はまた、ＳＥ ＨＰＬＣによる試料純度の結果を示す。
ＭＨＣ様二量体化ユニットを含む二価二重特異性キメラ抗体の生成
抗原結合性断片（本明細書では以後、軽鎖および重鎖可変断片）の任意のペアを使用して二重特異性分子をアセンブリーさせるためのプラットフォームソリューションとしての対象の手法の普遍性を検証するために、本発明者らは、公知の抗体に由来する軽鎖および重鎖可変断片の３つの無作為のペア（表３を参照されたい）を選択し、それらを使用して、６つの二重特異性キメラ抗体を生成した。表３は、生産されたタンパク質の生産性の結果を示す。図６は、非還元的および還元的条件下での生成された試料のＳＤＳゲル電気泳動の結果を示す。６つ全部の試料について、完全長分子に対応する、約１５０ｋＤａに主要なバンドが存在する。表３はまた、ＳＥ ＨＰＬＣによる試料純度の結果を示す。
【0364】
【表4】
【0365】
実施例７
Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｒｔ ＲＥＤ ３８４上での完全長二重特異性キメラ抗体の親和性の決定
生成された二重特異性キメラ抗体がその抗原結合能力を喪失していないことを検証するために、本発明者らは、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｒｔ ＲＥＤ ３８４上で親和性分析を行った。抗体０２－００４および０２－００５について、本発明者らは、ヒトＰＤ－１タンパク質の細胞外ドメイン（ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６Ｆ）およびアミノ酸配列中にヒトＣＤ２０配列の断片を含むビオチン化されたペプチド［ＮＨ２］ＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳＩＱＳ［ＣＨ２ＣＨ２］ビオチンに対する親和性を測定した；抗体０２－００６および０２－００７について、本発明者らは、ヒトＰＤ－１タンパク質の細胞外ドメイン（ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６Ｆ）およびヒトＣＳＦ１Ｒタンパク質の細胞外ドメイン（ｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ）に対する親和性を測定した；抗体０２－００８および０２－００９については、本発明者らは、ヒトＣＳＦ１Ｒタンパク質の細胞外ドメイン（ｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ）およびＣＤ２０ペプチドに対する親和性を測定した。
Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｒｔ ＲＥＤ ３８４上での完全長二重特異性キメラ抗体の親和性の決定
生成された二重特異性キメラ抗体がその抗原結合能力を喪失していないことを検証するために、本発明者らは、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｒｔ ＲＥＤ ３８４上で親和性分析を行った。抗体０２－００４および０２－００５について、本発明者らは、ヒトＰＤ－１タンパク質の細胞外ドメイン（ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６Ｆ）およびアミノ酸配列中にヒトＣＤ２０配列の断片を含むビオチン化されたペプチド［ＮＨ２］ＣＥＰＡＮＰＳＥＫＮＳＰＳＴＱＹＣＹＳＩＱＳ［ＣＨ２ＣＨ２］ビオチンに対する親和性を測定した；抗体０２－００６および０２－００７について、本発明者らは、ヒトＰＤ－１タンパク質の細胞外ドメイン（ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６Ｆ）およびヒトＣＳＦ１Ｒタンパク質の細胞外ドメイン（ｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ）に対する親和性を測定した；抗体０２－００８および０２－００９については、本発明者らは、ヒトＣＳＦ１Ｒタンパク質の細胞外ドメイン（ｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ）およびＣＤ２０ペプチドに対する親和性を測定した。
【0366】
Ｃ末端ＨｉｓおよびＦＬＡＧタグを有するヒトＣＳＦ１Ｒタンパク質のアミノ酸２０～５１２の配列、分子量５７．４ｋＤａを、ｈＣＳＦ１Ｒ抗原として使用した。Ｃ末端ＨｉｓおよびＦＬＡＧタグを有するヒトＰＤ－１タンパク質のアミノ酸２１～１７０の配列、分子量２０．６ｋＤａを、ｈＰＤ－１ｅｘ－Ｈ６Ｆ抗原として使用した（表６を参照されたい）。
【0367】
一般的実施例に記載されたように、抗原をコードする遺伝子配列をｄｅ ｎｏｖｏで合成し、発現ベクター中にクローニングし、ＣＨＯ細胞中で生成させ、親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。
【0368】
以下の処方：４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；１３６．９ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４；２．７ｍＭ ＫＣｌ；添加されたＴｗｅｅｎ ２０の体積画分は０．１％であった；添加されたＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の質量画分は０．１％であった；ｐＨ７．４を有する動的緩衝溶液（本明細書では以後、１ｘＫＢと称する）を使用して、実験を実行した。測定の前に、ＰｒｏＡセンサーを、５０ｍＭグリシンおよび塩酸、ｐＨ１．８の溶液を用いて再生させた（再生溶液中で５秒、１ｘＫＢ中で５秒、３回反復）。
【0369】
ｈＰＤ－１ｅｘ－Ｈ６ＦおよびｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ抗原の場合、プロテインＡ（ＰｒｏＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗体を含む溶液中に６０秒間浸して、それを固定した。１ｘＫＢ中で６０秒間、ベースラインを記録した。次いで、抗体をロードしたセンサーを、動的緩衝液中の標的抗原（分析物）の溶液を含有するウェル中に９０秒間浸した。２．５０μｇ／ｍｌ（１２１．４ｎＭ）、１．２５μｇ／ｍｌ（６０．７ｎＭ）、０．６２５μｇ／ｍｌ（３０．３５ｎＭ）の濃度のｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６Ｆ分析物を含む溶液について、測定を実施した。２．５０μｇ／ｍｌ（４３．６ｎＭ）、１．２５μｇ／ｍｌ（２１．８ｎＭ）、０．６２５μｇ／ｍｌ（１０．９ｎＭ）の濃度のｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ分析物を含む溶液について、測定を実施した。次いで、本発明者らは、ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６Ｆについては２１０ｓ、ｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓについては３００ｓにわたって、１ｘＫＢ中で複合体の解離を検出した。
【0370】
会合ステップを除いて、分析物のセンサーグラムを記録するために使用したセンサーが通過するのと同じように参照センサーも全てのステップを通過した－会合ステップでは、センサーを、分析物を含まない１ｘＫＢ溶液中に浸した（参照センサーのシグナルを、主要センサーグラムの記録と同時に測定した）。参照シグナルを、センサーグラムのプロセシング中に分析物と相互作用するセンサー上で受け取ったシグナルから差し引いた。
【0371】
分析物とセンサーとの非特異的相互作用をチェックするために、本発明者らは、抗体を含まないセンサーを使用した（ローディングステップで、センサーを１ｘＫＢ溶液中に浸した；他の全てのステップは、抗体をロードしたセンサーについて使用したものと同一である）。
【0372】
ビオチン化されたＣＤ２０ペプチドの場合、５μｇ／ｍｌの濃度のペプチドを、１２０秒間にわたってＳＡＸセンサー（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＳＡＸ）バイオセンサー、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の表面上に固定した。１ｘＫＢ溶液中で１２０秒間、ベースラインを記録した。ロードされたペプチドを含有するセンサーを、１ｘＫＢ中の抗体溶液（分析物）を含有するウェルに１５秒間浸した。１５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、３７．５μｇ／ｍｌの濃度の分析物（ＣＤ２０ペプチドの場合の抗体）を含む溶液について、測定を実行した。１ｘＫＢ中で１２０秒間、複合体の解離を記録した。
【0373】
全ての測定を３０℃で実行し、オービタル混合速度は毎分１，０００回の回転であった。
速度定数（ｋｏｎはオン／結合速度定数であり、ｋｄｉｓは解離速度定数であり、ＫＤは平衡解離定数または親和性定数である）の数値を得るために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ９．０ソフトウェアのＧｌｏｂａｌ Ｆｉｔを使用する１：１相互作用モデル（異なる濃度のいくつかのセンサーグラムを分析するための１セットのｋｏｎ、ｋｄｉｓ、ＫＤ定数の選択）に従って、得られたセンサーグラムをプロセシングした。その結果を、表４に示す。
速度定数（ｋｏｎはオン／結合速度定数であり、ｋｄｉｓは解離速度定数であり、ＫＤは平衡解離定数または親和性定数である）の数値を得るために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ９．０ソフトウェアのＧｌｏｂａｌ Ｆｉｔを使用する１：１相互作用モデル（異なる濃度のいくつかのセンサーグラムを分析するための１セットのｋｏｎ、ｋｄｉｓ、ＫＤ定数の選択）に従って、得られたセンサーグラムをプロセシングした。その結果を、表４に示す。
【0374】
【表5】
【0375】
表５は、分析物とロードされていないセンサーとの非特異的相互作用に関する検証結果を示す。表５は、分析物とロードされていないセンサーとの間には非特異的相互作用はなかった。
【0376】
【表6】
【0377】
結果によると、全ての二重特異性キメラ抗体０２－００４～０２－００９が、標的抗原への特異的結合を示し、ＫＤの数値は、対応する抗原結合性断片の位置（Ｆａｂ断片内またはＣＫおよびＣＨ１ドメインを置換する、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインを含むＦａｂ様断片内）に関係なく、同じ１桁分を有する。
【0378】
実施例８
非標的抗原への二重特異性キメラ抗体の非特異的結合の分析
非標的抗原への二重特異性キメラ抗体の非特異的結合の実験研究を、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｒｔ ＲＥＤ ３８４上で実施した。
非標的抗原への二重特異性キメラ抗体の非特異的結合の分析
非標的抗原への二重特異性キメラ抗体の非特異的結合の実験研究を、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｒｔ ＲＥＤ ３８４上で実施した。
【0379】
プロテインＡ（ＰｒｏＡ）バイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を、１０μｇ／ｍｌの濃度の抗体を含有する溶液中に１５０秒間浸して、それを固定した。１ｘＫＢ溶液中で３０秒間、ベースラインを記録した。次いで、抗体をロードしたセンサーを、３０μｇ／ｍｌの濃度の非標的抗原を含油するウェル中に１５０秒間浸した。次いで、複合体の解離を３０秒間記録した。
【0380】
会合ステップを除いて、分析物のセンサーグラムを記録するために使用したセンサーが通過するのと同じように参照センサーも全てのステップを通過した－会合ステップでは、センサーを、分析物を含まない動的緩衝溶液中に浸した（参照センサーのシグナルを、主要センサーグラムの記録と同時に測定した）。参照シグナルを、センサーグラムのプロセシング中に分析物と相互作用するセンサー上で受け取ったシグナルから差し引いた。
【0381】
抗原パネルは、ｈＡｎｇ２＿Ｈ６Ｆ、ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６Ｆ、ｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ、ＩＬ５Ｒ－Ｈｉｓ、ｈＩＬ４Ｒ－Ｈｉｓ、ｈＣＤ３８－Ａｖｉ、Ｃ－Ａｖｉ－Ｈｉｓ－ＴＥＶｓ－ＨＳＡ＿ｈＢＣＭＡ、Ｈｅｒ３－Ｈ６Ｆ、ｈｉｓＯＸ４０、Ｍａｃａｃａ ＣＳＦ１Ｒ＿Ｃ－Ｈｉｓを含んでいた（表６を参照されたい）。抗原パネル中のそれぞれの試験された抗体は、特異的（標的）抗原を有し、標的抗原との相互作用の結果は陽性対照として与えられる。
【0382】
センサーグラムを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓｎ ９．０ソフトウェアを使用してプロセシングした。非特異的相互作用がないことを報告するために、記録されたシグナルレベルを、会合ステップの終わりにチェックした（応答パラメーター）。表７は、二重特異性キメラ抗体の結合の検証の結果を示す。実験は、抗体０２－００４～０２－００９と、非標的抗原との間に相互作用がないことを示した。
【0383】
【表7】
【0384】
【表8-1】
【0385】
【表8-2】
【0386】
【表8-3】
【0387】
実施例９
２つの抗原への本発明による二重特異性キメラ抗体の同時的結合の分析
抗体０２－００６および０２－００７を、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４上で２つの異なる標的抗原（ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６ＦおよびｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ）への同時的結合について分析した。実験を、ＡＲ２Ｇセンサー（Ａｍｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｅｃｏｎｄ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ）バイオセンサー、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上で実行した。実験のステップを、表８に示す。
２つの抗原への本発明による二重特異性キメラ抗体の同時的結合の分析
抗体０２－００６および０２－００７を、Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ３８４上で２つの異なる標的抗原（ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６ＦおよびｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ）への同時的結合について分析した。実験を、ＡＲ２Ｇセンサー（Ａｍｉｎｅ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｅｃｏｎｄ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ＡＲ２Ｇ）バイオセンサー、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）上で実行した。実験のステップを、表８に示す。
【0388】
【表9】
【0389】
センサーを、２０ｍＭ ＥＤＣ（１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩）および１０ｍＭ ｓＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド）を含有する水性溶液中で３００ｓにわたって活性化した。抗原（ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６Ｆ）を、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中のバイオセンサーの表面上に３００ｓにわたってロードした。ロードされたタンパク質の濃度は１５μｇ／ｍｌであった。センサー表面上の未反応の活性中心を、ｐＨ８．５のエタノールアミンの１Ｍ水性溶液中で３００ｓにわたってクエンチした。以下の処方：４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；１３６．９ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４；２．７ｍＭ ＫＣｌ；添加されたＴｗｅｅｎ ２０の体積画分は０．１％であった；添加されたＢＳＡの質量画分は０．１％であった；ｐＨ７．４を有する動的緩衝溶液（１ｘＫＢ）中で、実験の第５のステップおよびその後の全てのステップでのベースラインを実行した。ベースライン（ステップ５）を記録した後、抗体をセンサー上にロードした；ロードされた抗体の濃度は３０μｇ／ｍｌであった（ステップ６）。次いで、第３のベースラインを記録した（ステップ７）。このステップは、速いシグナル減衰の非存在を示し、ロードされた抗体と、センサー上に予め固定されたｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６Ｆとの特異的相互作用を示している。会合の次のステップ（ステップ８）で、固定されたｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６Ｆおよび結合した抗体を含有するセンサーを、１００μｇ／ｍｌの濃度のｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ抗原溶液中に浸した。このステップでのシグナル増幅は、センサー上にロードされた抗体、ｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ抗原に対するＦＡＢ断片の存在に起因するものである。
【0390】
センサーグラムを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓｎ ９．０ソフトウェアを使用して分析した。主な結論を表９に示す。実験のステップ（ステージ）を示すセンサーグラムを、図７に示す。結果によると、試料０２－００６および０２－００７は、ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６ＦおよびｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ抗原への同時的結合を示す。
【0391】
【表10】
【0392】
結果によると、抗体０２－００６および０２－００７は、ｈＰＤ１ｅｘ－Ｈ６ＦおよびｈＣＳＦ１Ｒ＿Ｈｉｓ抗原への同時的結合を示す。
実施例１０
質量分析検出と共に逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＨＰＬＣ）を使用した本発明による二重特異性キメラ抗体の分子量の分析
分子の正確なアセンブリーを確認するために、本発明者らは、本発明による完全長二重特異性キメラ抗体の分子量の分析を実行した。この方法は、４つの異なる鎖からなる本発明による完全長二重特異性キメラ抗体の同定および別のセットの鎖から形成される副生成物からのその識別を可能にする。これらのデータは、実施例５で得られたデータと共に、定常ＣＨ１－ＣＫドメインのペアを、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質に由来する膜近位ドメインのペアに置換することを含む技術的解決策が、本発明による二重特異性キメラ抗体の正確なアセンブリーを提供することを示唆する。
実施例１０
質量分析検出と共に逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＨＰＬＣ）を使用した本発明による二重特異性キメラ抗体の分子量の分析
分子の正確なアセンブリーを確認するために、本発明者らは、本発明による完全長二重特異性キメラ抗体の分子量の分析を実行した。この方法は、４つの異なる鎖からなる本発明による完全長二重特異性キメラ抗体の同定および別のセットの鎖から形成される副生成物からのその識別を可能にする。これらのデータは、実施例５で得られたデータと共に、定常ＣＨ１－ＣＫドメインのペアを、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質に由来する膜近位ドメインのペアに置換することを含む技術的解決策が、本発明による二重特異性キメラ抗体の正確なアセンブリーを提供することを示唆する。
【0393】
分析は、ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌ ＲＰカラム（２．１ｘ５０ｍｍ、粒径２．７μｍ；ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌ ＲＰプレカラム、２．１ｘ５ｍｍ、粒径２．７μｍも使用した）上のＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＰＬＣ－Ａｇｉｌｅｎｔ ６５３０ Ｑ－Ｔｏｆクロマトグラフィー－質量分析複合装置を使用して実行した。分析の前に、全ての分子をＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）酵素で処理して、Ｎ－グリカンを除去した。このために、酵素を、１μｌ中の１ユニットの活性の濃度に水で希釈した。１２０μｇのタンパク質含量を有する試料を緩衝溶液（１００ｍＭ重炭酸アンモニウムｐＨ７．２）と混合し、ＰＮＧａｓｅ Ｆの溶液を、１ユニット：５０μｇの酵素：タンパク質比で添加し、混合物を（３７．０±０．１）℃で１８時間、サーモスタット中でインキュベートした。
【0394】
分析のために、１０μｇの試験溶液を、測定されたタンパク質濃度に従って選択し、移動相Ａを用いて濃度を０．２ｍｇ／ｍｌに調整した。試料入力体積は７μｌであった。
分析の前に、クロマトグラフィーシステムを、安定な圧力が達成されるまで少なくとも３０ｍｉｎにわたって、移動相Ａ：９５％、Ｂ：５％の初期比の移動相（相Ａは水中の０．１％ギ酸溶液、０．０２％トリフルオロ酢酸溶液を含有し、相Ｂはイソプロピルアルコール中の０．１％ギ酸溶液、３０％アセトニトリルを含有する）と平衡化させた。質量分析装置を、製造業者の指針に従って較正基準を使用して較正した。
分析の前に、クロマトグラフィーシステムを、安定な圧力が達成されるまで少なくとも３０ｍｉｎにわたって、移動相Ａ：９５％、Ｂ：５％の初期比の移動相（相Ａは水中の０．１％ギ酸溶液、０．０２％トリフルオロ酢酸溶液を含有し、相Ｂはイソプロピルアルコール中の０．１％ギ酸溶液、３０％アセトニトリルを含有する）と平衡化させた。質量分析装置を、製造業者の指針に従って較正基準を使用して較正した。
【0395】
試料を、移動相Ｂの濃度勾配（試料導入後５～６分まで５％～２７％、その後、６～３０分まで２７％～３７％）中、（６０±１）℃のカラム温度で０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で分離し、２８０ｎｍの波長でクロマトグラムを得た。
【0396】
データを、ＰＭｉ Ｉｎｔａｃｔソフトウェア中でプロセシングした。
二重特異性キメラ抗体に含まれる鎖の名称を、表１０に示す。
二重特異性キメラ抗体に含まれる鎖の名称を、表１０に示す。
【0397】
【表11】
【0398】
抗体０２－００４、０２－００６、０２－００９（最も代表的なものとして）に関する質量分析の結果を、表１１に示す。また、図８は、抗体０２－００４に関する全イオン電流クロマトグラムのピーク４～６の解析された質量スペクトルの画像を示し、残りの抗体に関するピークは同様に見えた。
【0399】
それぞれの抗体について、表は、対応するクロマトグラムピークでの物質の質量を示す；ピークにさらに注釈を付け、ある特定の質量の断片に含まれる鎖の同定を得た。質量分布は全ての試料において類似していた：メジャーピークは１４６ｋＤａにあり、マイナー質量ピークは約２３ｋＤａ（単一の軽鎖の質量に対応する）および約７４ｋＤａ（重鎖および軽鎖のヘテロ二量体に対応する）にあった。メジャーピークに、平均質量の理論値に基づいて注釈を付けた。
【0400】
設定が、全てのＮ末端グルタミンがピロ型であるという前提を含んでいたため（したがって、ピログルタミンの質量がグルタミンのものよりも１８Ｄａ小さかった）、抗体０２－００４のピーク４はソフトウェアによって注釈が付かなかった。かくして、ピーク４で得られた質量は、Ｎ末端グルタミンの１つが非ピロ型である、ピーク５において注釈を付けられた分子の質量に対応する。
【0401】
０２－００４抗体のピーク５および６は、完全長分子および２個のリシンを含まない形態の完全長分子（１個のＣ末端システインおよび２個のＣ末端リシンを失っている）に対応する３つの質量を有する。抗体０２－００６および０２－００９では、質量分布は類似する様式であった。
【0402】
【表12-1】
【0403】
【表12-2】
【0404】
【表12-3】
【0405】
【表12-4】
【0406】
今までのところをまとめると、これらの結果は、完全長二重特異性キメラ抗体の質量が４個の異なる鎖からなる分子のものと一致することを示している。また、調製物は低分子量断片を含むが、それらは少量である。
【0407】
実施例１１
得られた断片のタンパク質分解および質量分析を使用した本発明による二重特異性キメラ抗体の正確なアセンブリーの確認
軽鎖と重鎖との正確な対合を直接検証するために、本発明による二重特異性キメラ抗体を、認識部位が抗体ヒンジ領域中に位置する（．．．ＫＳＣＤＫ／ＴＨＴＣＰＰＣＰ．．．）、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮプロテアーゼ（Ｇｅｎｏｖｉｓ）によって切断した。そのようなタンパク質分解は、完全長抗体の、Ｆｃ断片、Ｆａｂ断片、ならびにβ２－ミクログロブリンならびにＣＫおよびＣＨ１ドメインを置換するＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインを含むＦａｂ様断片への破壊をもたらす。二重特異性分子の断片を、非還元条件下での縦型電気泳動を使用してタンパク質分解後に分析した；また、得られた断片を質量分析にかけた。
得られた断片のタンパク質分解および質量分析を使用した本発明による二重特異性キメラ抗体の正確なアセンブリーの確認
軽鎖と重鎖との正確な対合を直接検証するために、本発明による二重特異性キメラ抗体を、認識部位が抗体ヒンジ領域中に位置する（．．．ＫＳＣＤＫ／ＴＨＴＣＰＰＣＰ．．．）、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮプロテアーゼ（Ｇｅｎｏｖｉｓ）によって切断した。そのようなタンパク質分解は、完全長抗体の、Ｆｃ断片、Ｆａｂ断片、ならびにβ２－ミクログロブリンならびにＣＫおよびＣＨ１ドメインを置換するＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインを含むＦａｂ様断片への破壊をもたらす。二重特異性分子の断片を、非還元条件下での縦型電気泳動を使用してタンパク質分解後に分析した；また、得られた断片を質量分析にかけた。
【0408】
タンパク質分解反応混合物は、６０μｌの体積中の１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭシステインから構成される緩衝液中に４０μｇの二重特異性抗体および４０ユニットのＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮ酵素（１酵素ユニット：１μｇタンパク質の比）を含有していた。反応を、（３７．０±０．１）℃のサーモスタット中で１時間実行し、ヨードアセトアミドを１０ｍＭの濃度に添加することによって停止させた。電気泳動のために、ＳＤＳを含有する緩衝液（１％ＳＤＳの濃度まで）を、得られた試料に添加し、ＳＤＳゲル電気泳動を非還元条件下で実施した。
【0409】
図９は、ＳＤＳゲル電気泳動の結果を示す。ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮプロテアーゼを用いた二重特異性キメラ抗体（０２－００４～０２－００９）の処理後、３つの大きな断片が形成され、電気泳動図中、４０～５０ｋＤａの領域で観察され、ポリアクリルアミドゲル中で異なる移動度を示した。ＭＨＣ様タンパク質ＣＤ１ｂ（プロルゴリマブ、オクレリズマブ）の膜近位ドメインに基づく二量体化ユニットを含有する（０１－０１１）および含有しない単一特異性分子も、ＧｉｎｇｉｓＫＨＡＮプロテアーゼで処理した（図９Ｂ、レーン３、４、５）。断片のタンパク質分解の結果として形成された電気泳動移動度を比較する結果として、最も低い移動度レベルを示す断片はＦｃ断片に対応し、中程度の移動度はＦａｂ断片に対応し、最も高い移動度レベルを示す断片はβ２ミクログロブリンならびにＣＫおよびＣＨ１ドメインを置換するＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインを含むＦａｂ様断片に対応すると結論付けられた。抗体０２－００６～０２－００９の場合、電気泳動図は、抗ＣＳＦ１Ｒ断片の可変ドメインの非特異的切断の結果として形成されたさらなる断片を示した。タンパク質分解の結果として形成された断片の正確な質量を決定するために、本発明者らは質量分析を行った。
【0410】
質量分析の前に、ヨードアセトアミドを添加した直後に、試料を、製造業者の指針に従って、Ｚｅｂａ（ＭＷＣＯ ７ｋＤａ）カラム上、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ（７．６±０．２）に移した；その後、１酵素ユニット：５０μｇタンパク質の比のＰＮＧａｓｅ Ｆを試料に添加し、試料をサーモスタット中、（３７．０±０．１）℃で１８時間インキュベートした。
【0411】
得られた断片の質量分析を、実施例１０に記載された方法に従って実行した。
質量分析検出と共にＲＰ ＵＨＰＬＣの結果を表１２に示す。
抗体０２－００６および０２－００８は、β２ミクログロブリンならびにＣＫおよびＣＨ１ドメインを置換するＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインを含むＦａｂ様断片ならびにＣＳＦ１Ｒに対する軽鎖および重鎖の可変断片の質量に対応する合計４８，４５９Ｄａ中、１１，４２４Ｄａおよび３７，０３５Ｄａの断片を示した。抗体０２－００７および０２－００９は、ＣＳＦ１Ｒに対する軽鎖および重鎖の可変断片を含むＦａｂ断片の質量に対応する合計４７，４８６Ｄａ中、１１，４２４Ｄａおよび３６，０６２Ｄａの断片を示したが、これは、これらの試料のＳＤＳゲル電気泳動後に得られたデータと一致し、ＣＳＦ１Ｒに対する可変ドメイン中の推定されるさらなるタンパク質分解の存在を確認する（図９）。
質量分析検出と共にＲＰ ＵＨＰＬＣの結果を表１２に示す。
抗体０２－００６および０２－００８は、β２ミクログロブリンならびにＣＫおよびＣＨ１ドメインを置換するＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインを含むＦａｂ様断片ならびにＣＳＦ１Ｒに対する軽鎖および重鎖の可変断片の質量に対応する合計４８，４５９Ｄａ中、１１，４２４Ｄａおよび３７，０３５Ｄａの断片を示した。抗体０２－００７および０２－００９は、ＣＳＦ１Ｒに対する軽鎖および重鎖の可変断片を含むＦａｂ断片の質量に対応する合計４７，４８６Ｄａ中、１１，４２４Ｄａおよび３６，０６２Ｄａの断片を示したが、これは、これらの試料のＳＤＳゲル電気泳動後に得られたデータと一致し、ＣＳＦ１Ｒに対する可変ドメイン中の推定されるさらなるタンパク質分解の存在を確認する（図９）。
【0412】
【表13-1】
【0413】
【表13-2】
【0414】
【表13-3】
【0415】
【表13-4】
【0416】
【表13-5】
【0417】
【表13-6】
【0418】
試料０２－００９の場合の９７８１１．８Ｄａおよび９７６９３Ｄａの質量は、１つのトランケートされたＦａｂ様断片を有する分子に対応する。
これらの結果は、本発明による全ての二重特異性キメラ抗体が、Ｆｃ断片、Ｆａｂ断片ならびにβ２ミクログロブリンならびにＣＫおよびＣＨ１ドメインを置換するＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインを含むＦａｂ様断片に質量において対応する断片へのタンパク質分解後に破壊されたことを示し、ＣＨ１－ＣＫの定常ドメインのペアの、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質に由来する膜近位ドメインのペアへの置換に基づく技術的解決法が、本発明による二重特異性キメラ抗体の正確なアセンブリーを提供することを示している。
これらの結果は、本発明による全ての二重特異性キメラ抗体が、Ｆｃ断片、Ｆａｂ断片ならびにβ２ミクログロブリンならびにＣＫおよびＣＨ１ドメインを置換するＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインを含むＦａｂ様断片に質量において対応する断片へのタンパク質分解後に破壊されたことを示し、ＣＨ１－ＣＫの定常ドメインのペアの、ＭＨＣまたはＭＨＣ様タンパク質に由来する膜近位ドメインのペアへの置換に基づく技術的解決法が、本発明による二重特異性キメラ抗体の正確なアセンブリーを提供することを示している。
【0419】
実施例１２
キメラ抗体の熱安定性に対する、ＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインに基づく二量体化ユニット中のアミノ酸置換の効果の検証
本発明者らは、二量体化ユニット中の様々な置換ならびに得られるキメラ抗体の純度および安定性に対するその効果をさらに試験した。重鎖ＣＨ１および軽鎖ＣＫドメインが、それぞれ、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインに置換された、２個の重鎖および２個の軽鎖からなる抗体である、単一特異性形式について、試験を行った（二量体化ユニットのフォワード方向）。ＶＨおよびＶＬ可変ドメインの配列を、抗体プロルゴリマブ（ＣＪＳＣ Ｂｉｏｃａｄ）から得た。表１３に示される突然変異を、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインの配列中に導入した。ＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインの配列は、表１３に示されるＣ末端伸長をさらに含む。表１３は、二量体化ユニットの開始部から突然変異が導入された位置の番号を示し、抗体鎖アミノ酸のＥＵナンバリングに従って番号付けられた位置の一致性を示す（Ｅｄｅｌｍａｎ Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１９６９）、７８～８５頁；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。以下に示されるのは、二量体化ユニットの開始部から、置換が導入された位置のナンバリングである；ヒンジ領域中の置換の位置は、ＥＵナンバリングに従う。
キメラ抗体の熱安定性に対する、ＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインに基づく二量体化ユニット中のアミノ酸置換の効果の検証
本発明者らは、二量体化ユニット中の様々な置換ならびに得られるキメラ抗体の純度および安定性に対するその効果をさらに試験した。重鎖ＣＨ１および軽鎖ＣＫドメインが、それぞれ、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインに置換された、２個の重鎖および２個の軽鎖からなる抗体である、単一特異性形式について、試験を行った（二量体化ユニットのフォワード方向）。ＶＨおよびＶＬ可変ドメインの配列を、抗体プロルゴリマブ（ＣＪＳＣ Ｂｉｏｃａｄ）から得た。表１３に示される突然変異を、β２ミクログロブリンおよびＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインの配列中に導入した。ＣＤ１ｂタンパク質のα３ドメインの配列は、表１３に示されるＣ末端伸長をさらに含む。表１３は、二量体化ユニットの開始部から突然変異が導入された位置の番号を示し、抗体鎖アミノ酸のＥＵナンバリングに従って番号付けられた位置の一致性を示す（Ｅｄｅｌｍａｎ Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１９６９）、７８～８５頁；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１））。以下に示されるのは、二量体化ユニットの開始部から、置換が導入された位置のナンバリングである；ヒンジ領域中の置換の位置は、ＥＵナンバリングに従う。
【0420】
【表14-1】
【0421】
【表14-2】
【0422】
図１０は、生成された抗体の非還元的ＳＤＳゲル電気泳動の結果を示す。プロルゴリマブ（古典的ＩｇＧ１）および０１－０１１（ＭＨＣ様タンパク質の膜近位ドメインに基づく初期二量体化ユニットを有する試料、実施例５を参照されたい）の試料を、それぞれ、レーン１および２上に対照として適用した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。結果は、全ての修飾された試料の大きな断片の移動度が、完全長分子に対応することを示し（図１０Ａのレーン３～８、図１０Ｂのレーン３～４を参照されたい）、かくして、導入された修飾が完全長分子のアセンブリーをもたらさないことを示している。ＳＥ ＨＰＬＣ（表１４）は、一部の修飾が単量体含量の減少および低分子断片数の増加（抗体０３－００１、０３－００３、０３－００５、０３－００６、０３－００７）をもたらすことを示す；しかしながら、それらの一部は、単量体パーセンテージの増加を示した（０３－００２、０３－００４、０３－００８）。さらに、本発明者らは、得られる抗体の動的光散乱によって凝集温度を分析した；その結果も表１４に示される。
【0423】
【表15】
【0424】
結果は、ＳＥ ＨＰＬＣによって相対単量体含量の増加を示した抗体バリアントが、ＭＨＣ様タンパク質に基づく二量体化ユニットの非修飾バリアントと比較して、凝集温度の増大をさらに示したことを示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】