特表 2024-534981 誘導ナチュラルキラー細胞の製造方法及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-26

(54)【発明の名称】誘導ナチュラルキラー細胞の製造方法及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240918BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240918BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/18 20060101ALI20240918BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N15/09 110

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

A61K35/17

A61P31/12

A61P31/04

A61P31/00

A61P31/14

A61P31/20

A61P31/16

A61P31/18

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515518

(86)(22)【出願日】2022-09-08

(85)【翻訳文提出日】2024-05-08

(86)【国際出願番号】 KR2022013561

(87)【国際公開番号】W WO2023038475

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】10-2021-0121118

(32)【優先日】2021-09-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】505448855

【氏名又は名称】コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー

【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】チョ、イ スク

(72)【発明者】

【氏名】キム、ハン－ソプ

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジェ ユン

(72)【発明者】

【氏名】ソル、ビンナ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065BD50

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA17

4C084MA22

4C084MA23

4C084MA31

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA41

4C084MA43

4C084MA44

4C084MA52

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C084ZB321

4C084ZB322

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZB351

4C084ZB352

4C084ZC551

4C084ZC552

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB43

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZB32

4C087ZB33

4C087ZB35

4C087ZC55

(57)【要約】

本発明は、ＢＣＬ１１Ｂ（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ １１Ｂ）遺伝子発現及び／又は機能を抑制する物質及び方法を用いて、誘導ナチュラルキラー（Ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ； ｄｒＮＫ）細胞又はＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子導入ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞を製造する方法に関する。また、本発明は、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子ベースの細胞リプログラミング法により製造されたｄｒＮＫ細胞又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞、それを含む、癌、並びにウイルス、細菌、カビなどによる感染性疾患及び／又は炎症性疾患の予防又は治療用細胞治療剤及び組成物に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）分離された細胞に、ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）及びｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１つを導入し、細胞におけるＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制するステップと、
ｂ）前記ａ）ステップの細胞をサイトカイン及び成長因子含有培地で培養してＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞に細胞転換させるステップとを含む、ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ＮＫ（ｄｒＮＫ）細胞の製造方法。

【請求項2】

前記ａ）ステップの分離された細胞は、ＮＫ細胞を除く体細胞である、請求項１に記載の製造方法。

【請求項3】

前記体細胞は、血液細胞（Ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）及び線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の製造方法。

【請求項4】

前記ｓｈＲＮＡのターゲットセンス配列（Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、配列番号１～７からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項5】

前記ｓｉＲＮＡのターゲットセンス配列（Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、配列番号８～１１からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項6】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂは、ａ）ステップ及びｂ）ステップからなる群から選択される少なくとも１つのステップで処理されるものである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項7】

前記ｇＲＮＡは、配列番号１２～１３からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項8】

前記ｂ）の成長因子は、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ－ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ＡＡ）、ＩＧＦ－１（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １）、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）及びＦＬＴ３Ｌ（ＦＭＳ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｇａｎｄ）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項9】

前記ｂ）のサイトカインは、ＩＬ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、アクチビンＡ（Ａｃｉｖｉｎ Ａ）、ノッチリガンド（Ｎｏｔｃｈ ｌｉｇａｎｄ）、Ｇ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）及びＳＤＦ－１（Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項10】

前記ｂ）の成長因子及びサイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＳＣＦ及びＦＬＴ３Ｌからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の製造方法。

【請求項11】

前記ｂ）の培地は、ＧＳＫ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β）阻害剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＰＤＫ１（３－ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ １）阻害剤及びＡＨＲ（Ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の製造方法。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞。

【請求項13】

前記細胞は、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つを発現するものである、請求項１２に記載の細胞。

【請求項14】

請求項１に記載の方法において、前記ａ）及びｂ）からなる群から選択される少なくとも１つのステップに、ＣＤ１９－ＣＡＲ、ＭＳＬＮ－ＣＡＲ及びＨＥＲ２－ＣＡＲからなる群から選択されるＣＡＲ遺伝子をさらに導入する過程を含む、ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法。

【請求項15】

前記ＣＡＲ遺伝子は、ＢＣＬ１１Ｂノックアウト塩基配列にノックイン（Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）して導入するものである、請求項１４に記載の製造方法。

【請求項16】

前記ＣＡＲ遺伝子は、
ｉ）ＣＤ８リーダー（Ｌｅａｄｅｒ）、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びＦｃ－γ（Ｇａｍｍａ）受容体を含むＣＡＲ遺伝子、
ｉｉ）ＣＤ８リーダー、ＭＳＬＮ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ） ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、ＣＤ３ζ及びＩＲＥＳを含むＣＡＲ遺伝子、並びに
ｉｉｉ）ＣＤ８リーダー、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２） ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、ＣＤ３ζ及びＩＲＥＳを含むＣＡＲ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１４に記載の製造方法。

【請求項17】

請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法により製造されたＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞。

【請求項18】

前記細胞は、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つを発現するものである、請求項１７に記載の細胞。

【請求項19】

請求項１～１１及び１４～１６のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞を有効成分として含む、癌の予防又は治療用細胞治療剤組成物。

【請求項20】

請求項１～１１及び１４～１６のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞を有効成分として含む、癌の予防又は治療用薬学組成物。

【請求項21】

前記癌は、ＣＤ１９、ＭＳＬＮ及びＨＥＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの発現に関連する癌である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項22】

前記ＣＤ１９、ＭＳＬＮ及びＨＥＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの発現に関連する癌は、リンパ腫、白血病、骨髄腫、中皮腫、子宮癌、頭頸部癌、食道癌、滑膜肉腫、腎臓癌、移行上皮癌、甲状腺癌、胚細胞腫、胆道癌／胆管癌、乳頭状漿液性腺癌、大腸癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、膠芽腫、結腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、筋肉腫、甲状腺癌、骨肉腫、絨毛癌、胃癌、神経膠腫、軟組織肉腫、神経内分泌腫瘍、脳下垂体腫瘍、乏突起膠腫、消化管間質腫瘍、胆嚢癌、小腸癌、孤立性線維性腫瘍、胸腺癌及び膀胱癌からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

請求項１～１１及び１４～１６のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞を有効成分として含む、感染性疾患の予防又は治療用細胞治療剤組成物。

【請求項24】

請求項１～１１及び１４～１６のいずれか一項に記載の方法により製造された細胞を有効成分として含む、感染性疾患の予防又は治療用薬学組成物。

【請求項25】

前記感染性疾患は、ウイルス、細菌及びカビからなる群から選択される少なくとも１つにより発生するものである、請求項２３に記載の組成物。

【請求項26】

前記ウイルスは、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

前記ウイルスは、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ（エプスタイン・バール）ウイルス（ＥＢＶ）、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓウイルス、Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ヒト免疫不全）ウイルス（ＨＩＶ）、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（インフルエンザ）ウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａ（パピローマ）ウイルス、ＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（サーズ）ウイルス、ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａ（サーズコロナ）ウイルス及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２５に記載の組成物。

【請求項28】

前記細菌は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２５に記載の組成物。

【請求項29】

前記細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ストレプトコッカス）からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２５に記載の組成物。

【請求項30】

前記カビは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）、Ａｂｓｉｄｉａ（ユミケカビ）、Ｍｕｃｏｒ（ムコール）及びＲｈｉｚｏｐｕｓ（クモノスカビ）属からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２５に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＢＣＬ１１Ｂ（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ １１Ｂ）遺伝子発現及び／又は機能を抑制する物質及び方法を用いて、誘導ナチュラルキラー（Ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ，ｄｒＮＫ）細胞又はＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子導入ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞を製造する方法に関する。また、本発明は、細胞リプログラミング法により製造されたｄｒＮＫ細胞又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞、それを含む、癌疾患、ウイルス、細菌、カビなどによる感染性疾患及び／又は炎症性疾患に対する予防又は治療用細胞治療剤及び／又は組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞は、先天的及び後天的免疫反応に重要な役割を果たすリンパ球系血液細胞の１つであり、特に癌細胞、ウイルス、細菌（バクテリア）、カビ、寄生虫の感染細胞などの異常細胞を認識して直ちに除去する機能を有し、そのような機能を用いた治療剤の開発研究が盛んに行われている。

【0003】

ＮＫ細胞が癌細胞の発生、増殖、転移を抑制すること以外にも、癌幹細胞を効果的に制御することによる癌再発防止機能まで有することが明らかになるにつれ、ＮＫ細胞を用いた抗癌治療剤の開発研究の重要性が増してきている。近年、機能的な面では、抗癌治療の効能を向上させるための革新的な方法として、標的癌細胞に対する特異性と活性化を促進するのに効果的な癌細胞標的キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）の遺伝子を導入するＣＡＲ－ＮＫプラットフォーム技術が盛んに開発されている。よって、ＣＡＲ－ＮＫ細胞は、他の免疫細胞治療剤であるＣＡＲ－Ｔ細胞とは異なり、サイトカイン放出症候群（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＣＲＳ）を引き起こす可能性が低く［非特許文献１］、免疫抑制をほとんど引き起こさず、抗ＰＤ－１免疫療法を向上させるなどの特性が報告されており、従来の細胞治療剤における問題を解決し、臨床的効果を最大化するという治療剤開発の利点が注目されている［非特許文献２］。また、前臨床及び臨床試験において、ＣＡＲ－ＮＫが血液癌だけでなく、治療が困難な固形癌細胞を効果的に除去することが確認されているので［非特許文献３］、多くの癌疾患を対象に、副作用が少なく、機能が改善される効果的な抗癌免疫細胞治療剤として開発される可能性を秘めている。

【0004】

現在、ＣＡＲ－ＮＫの作製のための主な細胞源として、増殖能に優れる不死化ＮＫ－９２細胞、多能性幹細胞［Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＰＳＣ：胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｉＰＳＣ）］などが用いられている。ＮＫ－９２細胞は、不死化細胞株であり、持続的な生産は容易であるが、先天的に非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ－Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）患者由来の癌細胞であるので安全性の問題があり、体内での抗癌効果が低いという欠点が指摘されている。多能性幹細胞に基づくＣＡＲ－ＮＫの生産は、まずＣＡＲ遺伝子が搭載されたＣＡＲ－ＰＳＣを生産し、分離増幅過程を経た後に、さらにＣＡＲ－ＮＫ細胞への段階的分化過程を経なければならない。ＰＳＣを用いたＮＫ細胞の生産は、初期細胞を大量に増殖してバンキング化できるという利点を有するが、ＰＳＣから最終産物であるＣＡＲ－ＮＫを生産するための工程が複雑であり、長い時間と多くのコストを要するという問題が指摘されている。それと共に、残留未分化ＰＳＣは腫瘍形成の可能性を内在しているので、ＰＳＣ由来の分化細胞を治療目的に用いるためには、まず安全性を確保、維持することのできる技術の確保と品質管理が必須である。

【0005】

近年、体細胞リプログラミング技術の発展に伴い、臨床的有用性の高い機能性細胞をｉＰＳＣなどの幹細胞生産工程を経ずに直接生産する技術開発が盛んに行われている。ダイレクトリプログラミング技術により生産された機能性細胞は、エピジェネティクスリモデリング及び腫瘍形成のリスクが低く、細胞の生産工程を単純化できるので、安全性、信頼性、効率性を向上させることが容易であるという技術的利点が大きい。このような特性は、究極的に治療剤の開発に要する時間とコストを画期的に短縮、節減し、実用化への障壁の解消に寄与するものと予想されるので、癌疾患をはじめとする様々な疾患を対象とする細胞治療剤の原材料をダイレクトリプログラミング技術により確保する研究開発のための努力が続けられている。

【0006】

現在まで、ダイレクトリプログラミングにより生産されたＮＫ細胞における、ウイルス、細菌、カビなどによる感染症及び／又は炎症に対する予防、治療及び改善効果については報告されていない。

【0007】

こうした背景の下、本発明者らは、ＰＳＣリプログラミング過程を経てＮＫ細胞を確保する従来の方法とは差別化し、ｉＰＳＣリプログラミング過程及びＰＳＣ分化過程を経ずに、ダイレクトリプログラミングによりＮＫ細胞又はＣＡＲ－ＮＫ細胞を確保する新たなアプローチを開発し、ＮＫベースの治療剤生産における様々な問題を解決すべく鋭意努力した。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｋ．Ｒｅｚｖａｎｉ等，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２５（２０１７），ｐｐ．１７６９－１７８１

【非特許文献2】Ｋ．Ｃ．Ｂａｒｒｙ等，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２４（２０１８），ｐｐ．１１７８－１１９１

【非特許文献3】Ｅ．Ｌ．Ｓｉｅｇｌｅｒ等，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２３（２０１８），ｐｐ．１６０－１６１

【非特許文献4】Ｍｏｒｇａｎ ＲＡ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１２；２３：１０４３－１０５３

【非特許文献5】Ｗｉｌｋｉｅ Ｓ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８０：４９０１－４９０９

【非特許文献6】Ｗｉｌｌｅｍｓｅｎ ＲＡ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００１；８：１６０１－１６０８

【非特許文献7】Ｅｍｔａｇｅ ＰＣ，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００８；１４：８１１２－８１２２

【非特許文献8】Ｋａｋａｒｌａ Ｓ， Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４；２０：１５１－１５５

【非特許文献9】Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）

【非特許文献10】Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３，１９９０

【非特許文献11】ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ

【非特許文献12】Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９

【非特許文献13】Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｉｏｌｏｇｙ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明者らは、ＢＣＬ１１Ｂ（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ １１Ｂ）遺伝子の発現を制御することにより、分離されたヒト体細胞からｄｒＮＫ細胞又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞を体細胞リプログラミング培養で生産できることを確認した。また、上記方法により生産された細胞が癌細胞殺傷能並びに抗ウイルス、抗菌及び抗カビ効果を発揮するので、癌並びに感染性疾患及び／又は炎症性疾患の予防又は治療に適用できることを確認し、本発明を完成するに至った。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、ａ）分離された細胞に、ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）及びｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１つを導入し、細胞におけるＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制するステップと、ｂ）前記ａ）ステップの細胞をサイトカイン及び成長因子含有培地で培養してＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞に細胞転換させるステップとを含む、誘導ナチュラルキラー（Ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ，ｄｒＮＫ）細胞の製造方法を提供することを目的とする。

【0011】

また、本発明は、前記方法により製造されたｄｒＮＫ細胞を提供することを目的とする。

【0012】

さらに、本発明は、前記方法において、前記ａ）及びｂ）からなる群から選択される少なくとも１つのステップに、ＣＤ１９－ＣＡＲ、ＭＳＬＮ－ＣＡＲ及びＨＥＲ２－ＣＡＲからなる群から選択されるＣＡＲ遺伝子をさらに導入する過程を含む、ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法を提供することを目的とする。

【0013】

さらに、本発明は、前記方法により製造されたＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法を提供することを目的とする。

【0014】

さらに、本発明は、前記方法により製造された細胞を有効成分として含む、癌の予防又は治療用細胞治療剤組成物を提供することを目的とする。

【0015】

さらに、本発明は、前記方法により製造された細胞を有効成分として含む、癌の予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。

【0016】

さらに、本発明は、前記方法により製造された細胞を有効成分として含む、感染性疾患の予防又は治療用細胞治療剤組成物を提供することを目的とする。

【0017】

さらに、本発明は、前記方法により製造された細胞を有効成分として含む、感染性疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供することを目的とする。

【発明の効果】

【0018】

本発明により製造されたｄｒＮＫ細胞又はＣＡＲ－ｄｒＮＫは、癌細胞、又はウイルス、細菌及びカビ感染細胞に対する細胞殺傷能に優れるので、癌、又は細菌及びカビによる感染性疾患及び／もしくは炎症性疾患の予防又は治療用細胞治療剤及び組成物として適用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法（Ａ）、及びＣＡＲ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法（Ｂ）の模式図である。

【図2】遺伝子はさみＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法（Ａ）、及びＣＡＲ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法（Ｂ）の模式図である。

【図3】ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクター（Ａ）、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子のｅｘｏｎ１部位をターゲットとする遺伝子はさみプラスミドベクター、及びＣＡＲを発現する挿入遺伝子を含むＡＡＶベクター（Ｂ）の模式図である。

【図4】７種のｓｈＲＮＡ（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃１，ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃２，ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃３，ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃４，ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃５，ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃６，ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃７）及び４種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ａ，ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｂ，ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｃ，ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｄ）の配列及び位置を示す図（Ａ）、ＰＢＭＣからｓｈＢＣＬ１１Ｂ／ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を製造する模式図（Ｂ）、並びにＮＫマーカーを用いたＮＫ細胞生産確認の結果を示す図（Ｃ）である。

【図5】第１培地（Ａ）及び第２培地（Ｂ）の培養構成要素がｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞生産収率に及ぼす影響を示す図である。

【図6】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞のＮＫ特異的マーカーの発現特性を検証した結果を示す図である。

【図7】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の癌細胞殺傷能分析結果を示す図である。

【図8】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞とＮＫ－９２細胞の癌細胞殺傷能比較結果を示す図である。

【図9】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞とＰＢＭＣ－ＮＫ細胞の癌細胞感作に対するＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度（Ａ）及びＩＦＮ－ｇａｍｍａ発現細胞頻度（Ｂ）の結果を示す図である。

【図10】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞とＰＢＭＣ－ＮＫ細胞のマウス前立腺癌モデル（ＰＣ－３）（Ａ）及びマウス卵巣癌モデル（ＳＫ－ＯＶ－３）（Ｂ）における生体内癌細胞殺傷能比較結果を示す図である。

【図11】ＰＢＭＣからのＣＡＲ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法の模式図（Ａ）、及びＮＫマーカーを用いた生産確認結果を示す図（Ｂ）である。

【図12】ＣＡＲ（ＭＳＬＮ－ＣＡＲ）－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞のＮＫ特異的マーカーの発現特性を検証した結果を示す図である。

【図13】ＰＢＭＣからのｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞製造の模式図（Ａ）、及びＮＫマーカーを用いたＮＫ細胞生産確認結果を示す図（Ｂ）である。

【図14】ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞のＮＫ特異的マーカーの発現特性様相検証結果を示す図である。

【図15】ＰＢＭＣからのＣＡＲ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法の模式図（Ａ及びＢ）、ＮＫマーカーを用いたＮＫ細胞生産確認結果を示す図（Ｃ）、及びゲノムに挿入されたＣＡＲ－ＫＩ（Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）を確認した結果を示す図（Ｄ）である。

【図16】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ、ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ、ＣＡＲ（ＭＳＬＮ－ＣＡＲ）－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ及びＣＡＲ（ＭＳＬＮ－ＣＡＲ）－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の癌細胞殺傷能（Ａ）及びＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度（Ｂ）の結果を示す図である。

【図17a】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の抗ウイルス効能分析結果を示す図である。エプスタイン・バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）に感染したＢ－ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｒａｊｉ細胞に対する細胞殺傷能（Ａ）、ＥＢＶに感染したＲａｊｉ細胞におけるＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度（Ｂ）、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ、ＮＫ－９２、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞との共培養時にＥＢＶに感染したＲａｊｉ細胞におけるＬＭＰ－１（Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）発現レベル（Ｃ）を示す図である。

【図17b】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の抗ウイルス効能分析結果を示す図である。ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）、インフルエンザ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルス、パピローマ（Ｐａｐｉｌｌｏｍａ）ウイルス及び肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）ウイルスに対する抗ウイルス効能分析結果（Ｄ）を示す図である。

【図18】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞とＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した細胞の共培養によるアポトーシス分析結果を示す図である。

【図19】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞培養によるグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に対する抗菌効能を分析した結果を示す図である。ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞培養によるグラム陰性細菌である大腸菌のコロニー数（Ａ）、ＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度（Ｂ）の結果、及びｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞培養によるグラム陽性細菌であるレンサ球菌のＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度（Ｃ）の結果を示す図である。

【図20】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞とカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の共培養によるＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度の結果を示す図である。

【図21】ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫのアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対する抗カビ活性分析結果を示す図である。

【図22】ＭＳＬＮ－ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを示す図である。

【図23】ＭＳＬＮ－ＣＡＲを発現するＣＡＲプラスミドを示す図である。

【図24】ＭＳＬＮ－ＣＡＲを発現するＡＡＶプラスミドを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0020】

以下、これらを具体的に説明する。なお、本発明で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本発明で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。

【0021】

本発明の一態様は、ａ）分離された細胞に、ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）及びｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１つを導入し、細胞におけるＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制するステップと、ｂ）前記ａ）ステップの細胞をサイトカイン及び成長因子含有培地で培養してＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞に細胞転換させるステップとを含む、誘導ナチュラルキラー（Ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ，ｄｒＮＫ）細胞の製造方法を提供する。

【0022】

本発明における「ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞」とは、ウイルス、細菌（バクテリア）、カビ及び寄生虫の感染と非自己細胞（特に、癌細胞）を直ちに認識して除去する中核的な先天免疫細胞を意味する。抗原特異的な受容体を発現して標的細胞を認識するＴ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は、抗原に対する特異性を持たず、ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）マッチングを行うことなく、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（Ｋｉｌｌｅｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＫＩＲ）、ナチュラル細胞毒性受容体（Ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＮＣＲ）、ＤＮＡＭ－１（ＤＮＡＸ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１）、ＮＫＧ２Ｄ（ＮＫ ｇｒｏｕｐ ２ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ）などの抑制受容体又は活性化受容体のバランス、表面ＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）クラス（Ｃｌａｓｓ）Ｉ抗原の消失などの標的細胞（特に、癌細胞及び感染した細胞）の異常な変化を認識し、様々な機序により接触依存性（Ｃｏｎｔａｃｔ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）細胞毒性を示す。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が一致しない非自己（ｎｏｎ－ｓｅｌｆ）同種細胞において移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，ＧＶＨＤ）を引き起こすＴ細胞とは異なり、同種ＮＫ細胞は、移植片対宿主病の副作用がほとんどなく、むしろ抗癌効果が強く現れることが確認されている。

【0023】

近年、ＮＫ細胞の疾患標的細胞に対する特異性と活性化を向上させる方法として、標的細胞抗原に特異的なキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）を発現するＮＫ（ＣＡＲ－ＮＫ）細胞を作製し、それにより標的細胞殺害活性を向上させ、その治療効用を解明する研究が盛んに行われている。前記ＣＡＲ－ＮＫ細胞を作製する方法として、増殖が比較的容易な単一ＮＫ細胞株（ＮＫ－９２、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞など）にＣＡＲ遺伝子を導入する方法が主に用いられているが、依然として低い生産効率、複雑な工程、安全性の問題（腫瘍形成の可能性など）、低い治療効能などは克服しなければならない問題である。

【0024】

本発明における「ダイレクトリプログラミング（Ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）」とは、特定細胞が有する全遺伝子発現パターン（Ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ）などを調節し、全く異なる特性の目的とする細胞に系統を転換する方法を意味する。前記ダイレクトリプログラミングは、細胞のリプログラミング（Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）、分化（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、直接分化、脱分化（Ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、直接脱分化、転換（Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）、直接転換、トランス分化（Ｔｒａｎｓ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、直接トランス分化が含まれる概念であるが、これに限定されるものではない。

【0025】

前記「ダイレクトリプログラミング」は、外来遺伝子又はＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）もしくはベクターを細胞に導入することにより「細胞転換」を行うものであってもよく、細胞を異なる状態に変えるものであってもよい。前記「分化」とは、細胞が分裂して生じた娘細胞が元の母細胞とは異なる機能を有する現象を意味する。本発明において、前記「ダイレクトリプログラミング」は、「直接細胞転換誘導」、「直接細胞転換」、「細胞転換」と混用される。

【0026】

本発明における「分化した細胞」とは、構造や機能が特殊化した細胞、すなわち生物の細胞、組織などがそれぞれに与えられた役割を果たすのに適した形態及び機能に変化した状態を意味する。例えば、広義には胚性幹細胞などの多能性幹細胞由来の外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞が分化した細胞であり、狭義には造血母細胞由来の赤血球、白血球、血小板などが分化した細胞である。

【0027】

本発明における「系統が転換された細胞」とは、細胞が有する固有の系統特性が発生学的に又は人為的な方法（例えば、直接細胞転換誘導、リプログラミングなど）により変化し、異なる系統特性を有する細胞タイプに転換された細胞を意味し、転換される前の細胞タイプの特性とは全く異なる細胞タイプの特性を有する。本発明において、前記系統が転換された細胞は、標的細胞であってもよい。例えば、末梢血液単核細胞が直接細胞転換誘導により末梢血液単核細胞とは異なる系統であるリンパ系幹細胞、具体的にはＮＫ細胞に転換されたものであるが、これに限定されるものではない。

【0028】

前述したように、ＮＫ細胞は、免疫細胞治療剤などとして用いるために、ヒト由来のＮＫ細胞の一次分離及び培養、幹細胞からの分化、体細胞リプログラミング法などにより生産されている。特に、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）リプログラミング技術によりＮＫ細胞を作製するには、まず、１）分離された体細胞から人工多能性幹細胞を作製し、その後２）人工多能性幹細胞から分化中間体である造血幹（前駆）細胞を分化し、さらに、３）ＮＫ細胞分化を誘導する過程を経なければならない。このように、従来のリプログラミング技術ベースのｉＰＳＣ－ＮＫ生産技術は、複雑な培養及び分化過程を順次経なければならないので、製造効率が低く、時間、コストの消費が大きいという欠点がある。また、全分化能を有する人工多能性幹細胞を経て製造するので、未分化細胞の残留の有無が腫瘍形成の可能性と密接に関連し、安全性確保の検証が重要な争点となっている。

【0029】

それに対して、本発明は、ｉＰＳＣを経ずにダイレクトリプログラミング誘導により分離された体細胞からＮＫ細胞を直接製造するので、製造時間が短く、コストが低減されるという利点を有すると共に、安全性が確保され、従来技術と差別化されており、従来のＮＫ細胞源の問題を解決する代案となり得る。

【0030】

具体的には、本発明は、複数の全分化能転写因子の遺伝子組み合わせの過剰発現を用いる従来の細胞リプログラミング法とは差別化された、単一ＢＣＬ１１Ｂ（Ｂ－ｃｅｌｌ Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１Ｂ）遺伝子の発現及び／又は機能を抑制する物質及び方法を用いて、「誘導ナチュラルキラー（Ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ，ｄｒＮＫ）」細胞又はそれにＣＡＲ遺伝子がさらに導入されてＣＡＲを発現する「ＣＡＲ－ｄｒＮＫ」細胞を作製することにより、遺伝的安全性が改善されたＮＫ細胞を製造できることを確認した。特に、本発明は、遺伝子はさみ技術と組み合わせて、ＢＣＬ１１Ｂ発現制御のための遺伝子配列編集を制限することにより、従来のリプログラミング法のランダム遺伝子挿入の問題を解決する画期的な代案を提示するものである。

【0031】

本発明において、前記ｄｒＮＫ細胞の製造方法は、ａ）分離された細胞にダイレクトリプログラミング因子を導入し、細胞におけるＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制するステップを含むものであってもよい。

【0032】

例えば、リプログラミング因子は、ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であってもよく、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）であってもよく、ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂであってもよい。

【0033】

本発明における「分離された細胞」は、特に限定されるものではなく、例えば生殖細胞、体細胞（Ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ）、前駆細胞（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）などの既に系統（Ｌｉｎｅａｇｅ）が特定されている細胞である。前記「体細胞」とは、生殖細胞を除く、動・植物を構成する、分化が完了した全ての細胞を意味し、前記「前駆細胞」とは、子孫に相当する細胞が特定の分化形質を発現する場合に、分化形質を発現しないが、その分化運命を有する母細胞を意味する。例えば、血液細胞においては、造血幹細胞が前駆細胞に相当し、間葉細胞においては、間葉系幹細胞が前駆細胞に相当する。

【0034】

前記分離された細胞は、ヒト由来の細胞であるが、これに限定されるものではなく、様々な個体に由来する細胞が本発明に含まれる。また、本発明の分離された細胞には、生体内又は生体外の細胞が全て含まれる。

【0035】

一例として、前記分離された細胞は体細胞であり、他の例として、ＮＫ細胞を除く体細胞であり、さらに他の例として、血液細胞（Ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）及び線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これらに限定されるものではない。例えば、前記血液細胞は末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）であるが、これに限定されるものではない。

【0036】

本発明における「ダイレクトリプログラミング誘導因子」とは、細胞に導入されて細胞転換を誘導する遺伝子（もしくは、ポリヌクレオチド）、又はそれによりコードされるタンパク質を意味する。前記ダイレクトリプログラミング誘導因子は、リプログラミングにより得ようとする標的細胞に応じて、また、細胞転換される前の細胞の種類に応じて変化する。本発明の目的上、分離された体細胞をＮＫ細胞に誘導するために前記分離された体細胞に導入されるダイレクトリプログラミング誘導因子は、ＢＣＬ１１Ｂ（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ／Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１Ｂ）遺伝子発現を抑制する物質であり、具体的にはＢＣＬ１１Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ｓｈＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂであるが、これらに限定されるものではなく、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制する物質又は方法であれば、当該技術分野で公知のいかなる物質又は方法であってもよい。前記ダイレクトリプログラミング誘導因子を用いた細胞転換は、細胞の有する全遺伝子発現パターンを調節して標的細胞への転換を誘導するものであり、前記ダイレクトリプログラミング誘導因子を細胞に導入して細胞を所定期間培養することにより、目的とする種類の細胞の遺伝子発現パターンを有する標的細胞への細胞転換を誘導することができる。本発明において、前記「ダイレクトリプログラミング誘導因子」は、「直接細胞転換誘導因子」、「細胞転換誘導因子」、「リプログラミング因子」と混用される。

【0037】

本発明における「ダイレクトリプログラミング誘導因子の導入」は、ダイレクトリプログラミング誘導因子を細胞の培養液に投与する方法、ダイレクトリプログラミング誘導因子を細胞に直接注入する方法、細胞内に存在するダイレクトリプログラミング誘導因子の発現レベルを増加又は減少させる方法、ダイレクトリプログラミング誘導因子をコードする遺伝子を含む発現ベクターを細胞に形質転換する方法、ダイレクトリプログラミング誘導因子をコードする遺伝子の発現が増加又は減少するように遺伝子配列を改変する方法、ダイレクトリプログラミング誘導因子をコードする外来発現遺伝子を導入する方法、ダイレクトリプログラミング誘導因子の発現誘導又は発現抑制効果を有する物質で処理する方法、及びそれらを組み合わせて、細胞内のダイレクトリプログラミング誘導因子の発現レベルを増加又は減少させる方法により行われるが、ダイレクトリプログラミング誘導因子の発現レベルを増加又は減少させるものであれば、上記例に限定されるものではない。特に、ダイレクトリプログラミング誘導因子の導入は、所望の時間及び条件下で、ダイレクトリプログラミング誘導因子の発現を誘導するものであってもよい。具体的には、前記ダイレクトリプログラミング誘導因子を細胞に導入する方法は、ダイレクトリプログラミング誘導因子を細胞の培養液に投与する方法、ダイレクトリプログラミング誘導因子をコードする遺伝子を含む発現ベクターを細胞に形質転換する方法であるが、これらに限定されるものではない。

【0038】

例えば、前記ダイレクトリプログラミング誘導因子を細胞に直接注入する方法は、当該技術分野で公知の任意の方法を選択して用いることができ、これらに限定されるものではないが、微量注入法（Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、粒子衝突（Ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、直接筋肉内注射、インスレーター（Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）及びトランスポゾン（Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）を用いる方法から適宜選択して適用することができる。

【0039】

本発明において、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制するダイレクトリプログラミング誘導因子は、ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｉＲＮＡ及びｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。

【0040】

本発明における「ｓｈＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）」とは、タイトなヘアピンカーブを有する人工ＲＮＡ分子を意味し、主にＲＮＡ干渉により標的遺伝子発現を抑制するために用いられる。本発明の目的上、本発明のｓｈＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制するものであってもよい。

【0041】

具体的には、本発明のｓｈＲＮＡ（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃１、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃２、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃３、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃４、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃５、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃６及びｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃７）のターゲットセンス配列（Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、それぞれ配列番号１～７からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これに限定されるものではない。

【0042】

本発明における「ｓｉＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）」とは、ＲＮＡ阻害又は遺伝子サイレンシングを媒介する核酸分子を意味する。本発明の目的上、本発明のｓｉＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制するものであってもよい。

【0043】

具体的には、本発明のｓｉＲＮＡ（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－Ａ、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－Ｂ、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－Ｃ及びｓｈＢＣＬ１１Ｂ－Ｄ）のターゲットセンス配列（Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｎｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、それぞれ配列番号８～１１からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これに限定されるものではない。

【0044】

本発明における「ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ９」とは、遺伝子編集技術の一種であって、ＣＲＩＳＰＲタンパク質と、Ｃａｓ９タンパク質と、ｇＲＮＡ（Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）とから構成され、ｇＲＮＡにより特定されるＤＮＡ配列を正確に切断することのできるシステムを意味する。前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、Ｚｉｎｃ ＦｉｎｇｅｒやＴＡＬＥＮ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ）に比べて、編集の正確性が高く、適用可能範囲が非常に広いという利点がある。本発明の目的上、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９は、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制するものであるが、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制する遺伝子はさみ技術であればいかなるものでもよい。

【0045】

具体的には、本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムには、ＢＣＬ１１Ｂを含むゲノム配列（ＮＣ＿００００１４．９）由来のＥｘｏｎ１（ＢＣＬ１１Ｂ－ｅｘ１）をターゲットとするｓｇＲＮＡ＃１（配列番号１２）及びｓｇＲＮＡ＃２（配列番号１３）が含まれるが、ＢＣＬ１１Ｂを含むゲノム配列をターゲットとするｇＲＮＡであればいかなるものでもよい。

【0046】

特に、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムなどの遺伝子はさみ技術と組み合わせて、ＢＣＬ１１Ｂの特定遺伝子配列を制限することにより、従来のリプログラミング法のランダム遺伝子挿入の問題を解決したことに意義がある。

【0047】

本発明の方法において、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂは、ａ）ステップ及びｂ）ステップからなる群から選択される少なくとも１つのステップで処理されるものであるが、これに限定されるものではない。

【0048】

本発明のＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現を抑制するダイレクトリプログラミング誘導因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミドベクター又はウイルスベクター、マイクロＲＮＡ（ＭｉｃｒｏＲＮＡ）により、ダイレクトリプログラミング誘導対象細胞（母細胞）に導入されるものであってもよい。

【0049】

本発明における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的タンパク質又はポリペプチドを発現させることができるように、好適な調節配列と、前記標的タンパク質又はポリペプチドの塩基配列とを有するＤＮＡ産物を意味する。前記調節配列には、プロモーター、オペレーター、開始コドン、終止コドン、ポリアデニル化シグナル、エンハンサーが含まれる。本発明のベクターは、調節配列以外にも、膜標的化又は分泌のためのシグナル配列又はリーダー配列を含むものであってもよく、目的に応じて様々な形態に作製することができる。ベクターのプロモーターは、構成的であってもよく、誘導性であってもよい。また、ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能なベクターであれば、複製起源を含む。前記ベクターは、好適な宿主細胞に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製又は機能することができ、ゲノムそれ自体に組み込まれる。

【0050】

本発明に用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のウイルスベクター（Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、エピソーマルベクター（Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、プラスミドベクター（Ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ）、コスミドベクター（Ｃｏｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などが挙げられる。

【0051】

具体的には、前記ウイルスベクターには、センダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ）、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉ ｖｉｒｕｓ）、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）、ＭＬＶ（Ｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）、ＡＳＬＶ（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／Ｌｅｕｋｏｓｉｓ）、ＳＮＶ（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）、ＭＭＴＶ（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）などのレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）などに由来するベクターが含まれ、より具体的にはＲＮＡベースのウイルスベクターであるが、これらに限定されるものではない。

【0052】

前記エピソーマルベクターは、非ウイルス性非挿入性ベクターであり、染色体に挿入されることなく、ベクターに含まれる遺伝子を発現させることができるという特性を有することが知られている。よって、前記エピソーマルベクターを含む細胞は、エピソーマルベクターがゲノムに挿入されたものであってもよく、エピソーマルベクターがゲノムに挿入されていない状態で細胞内に存在するものであってもよい。

【0053】

本発明における「作動可能に連結された（Ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一般的機能が行えるように、核酸発現調節配列と目的とするタンパク質をコードする核酸配列が機能的に連結（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋａｇｅ）されていることを意味する。組換えベクターとの作動的連結は当該技術分野で周知の遺伝子組換え技術を用いて行うことができ、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は当該技術分野において一般に知られた酵素などを用いる。

【0054】

本発明において、前記ｄｒＮＫ細胞の製造方法は、ｂ）前記ａ）ステップの細胞をサイトカイン及び成長因子含有培地で培養してＮＫ細胞に細胞転換させるステップを含むものであってもよい。

【0055】

本発明における「培養」とは、細胞を調節した環境条件で生育させることを意味する。本発明の培養過程は、当該技術分野で公知の培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される細胞に応じて容易に調整して用いることができる。本発明の目的上、前記培養は、ダイレクトリプログラミング又は細胞転換誘導因子を導入した細胞を他の系統の標的細胞に転換する過程であるので、前記ダイレクトリプログラミング誘導因子を導入した細胞を培養する第１培地又は第２培地の組成は、標的細胞に転換するのに適した組成、例えば成長因子やサイトカインなどを含むものであってもよい。よって、ＧＳＫ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β）阻害剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＰＤＫ１（３－ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ １）阻害剤、ＡＨＲ（Ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）阻害剤などをさらに含むものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0056】

本発明において、前記ｂ）の培地は、サイトカイン及び成長因子を含むものであってもよい。

【0057】

本発明における「サイトカイン」とは、細胞で産生されて細胞シグナル伝達に用いられる比較的小さなサイズの様々なタンパク質を意味し、それを含む他の細胞に影響を及ぼす。一般に、炎症又は感染に対する免疫反応に関連があることが知られている。前記サイトカインとしては、例えばＩＬ（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）－２、ＩＬ－３、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＢＭＰ４（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）、アクチビンＡ（Ａｃｉｖｉｎ Ａ）、ノッチリガンド（Ｎｏｔｃｈ ｌｉｇａｎｄ）、Ｇ－ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、ＳＤＦ－１（Ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｆａｃｔｏｒ－１）などが挙げられ、具体的にはＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つであるが、上記例に限定されるものではない。

【0058】

本発明における「成長因子」とは、様々な細胞の分裂、成長及び分化を促進するポリペプチドを意味する。前記成長因子としては、例えばＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ－ＡＡ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－ＡＡ）、ＩＧＦ－１（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １）、ＴＧＦ－β（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ－β）、ＦＧＦ（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ）、ＦＬＴ３Ｌ（ＦＭＳ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｇａｎｄ）などが挙げられ、具体的にはＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つであるが、上記例に限定されるものではない。

【0059】

本発明の目的上、前記サイトカイン及び成長因子は、分離された細胞を標的細胞に直接細胞転換誘導する培地に含まれ、成長因子及びサイトカインの種類は、直接細胞転換誘導に用いられるものであればいかなるものでもよい。

【0060】

本発明において、前記ｂ）の培地は、ＧＳＫ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β）阻害剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、ＰＤＫ１（３－ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ １）阻害剤及びＡＨＲ（Ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含むものであってもよい。

【0061】

本発明における「ＧＳＫ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ－３β）阻害剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」とは、ＧＳＫ３βのタンパク質に直接／間接的に結合して活性を阻害又は抑制する物質を意味する。前記ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば１－Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、２－Ｄ０８、３Ｆ８、５－Ｂｒｏｍｏｉｎｄｏｌｅ、６－Ｂｉｏ、Ａ １０７０７２２、Ａｌｏｉｓｉｎｅ Ａ、ＡＲ－Ａ０１４４１８、Ａｌｓｔｅｒｐａｕｌｌｏｎｅ、ＡＺＤ－１０８０、ＡＺＤ２８５８、Ｂｉｋｉｎｉｎ、ＢＩＯ、ＢＩＯ－ａｃｅｔｏｘｉｍｅ、Ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ｉ、Ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ｉ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＣＡＳ ５５６８１３－３９－９、Ｃａｚｐａｕｌｌｏｎｅ、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９８０２３、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＴ９９０２１）、ＣＰ２１Ｒ７、Ｄｉｂｒｏｍｏｃａｎｔｈｅｒｅｌｌｉｎｅ、ＧＳＫ－３β ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉ、ＶＩ、ＶＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＶ、ＧＳＫ－３ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＸ、ＸＶＩ、Ｈｙｍｅｎｉｄｉｎ、Ｈｙｍｅｎｉａｌｄｉｓｉｎｅ、ＨＭＫ－３２、Ｉ３Ｍ（Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３－ｍｏｎｏｘｉｍｅ）、Ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ、Ｉｎｄｏｌｅ－３－ａｃｅｔａｍｉｄｅ、ＩＭ－１２、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ、Ｌ８０３－ｍｔｓ、Ｌｅｕｃｅｔｔｉｎｅ Ｌ４１、Ｌｉｔｈｉｕｍ、Ｌｉｔｈｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ、ＬＹ－２０９０３１４、Ｍａｎｚａｍｉｎｅ Ａ ＭｅＢＩＯ、Ｍｅｒｉｄｉａｎｉｎｅ Ａ、ＮＰ００１１１、ＮＰ０３１１１５、ＮＰ０３１１１１、ＮＳＣ ６９３８６８、Ｐａｌｉｎｕｒｉｎ、Ｒｏ ３１－８２２０ Ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ、ＳＢ－２１６７６３、ＳＢ－４１５２８６、ＴＣ－Ｇ ２４、ＴＣＳ ２００２、ＴＣＳ ２１３１１、Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ、Ｔｒｉｃａｎｔｉｎ、Ｔｒｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｔｕｎｇｓｔａｔｅ、ＴＷＳ－１１９、ＴＺＤＺ－８、Ｚｉｎｃなどが挙げられ、一例としてＣＨＩＲ９９０２１（ＣＴ９９０２１）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0062】

本発明における「ＰＤＫ１（３－ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ １）阻害剤」とは、ＰＤＫ１のタンパク質に直接／間接的に結合して活性を阻害又は抑制する物質を意味する。前記ＰＤＫ１阻害剤は、ＢＸ－７９５、ＢＸ－９１２、ＰＨＴ－４２７、ＧＳＫ２３３４４７０、ＯＳＵ－０３０１２などであり、例えばＢＸ－７９５であるが、これらに限定されるものではない。

【0063】

本発明における「ＡＨＲ（Ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）阻害剤」とは、ＴＣＤＤ（Ｄｉｏｘｉｎ（２，３，７，８－ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏｄｉｂｅｎｚｏ－ｐ－ｄｉｏｘｉｎ））により活性化するリガンド活性化転写因子（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）であるＡＨＲの活性を下方調節又は減少させる物質を意味する。前記ＡＨＲ阻害剤としては、例えばステムレゲニンＩ［ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ Ｉ，ＳＲＩ；４－（２－（２－（ベンゾ［ｂ］チオフェン－３－イル）－９－イソプロピル－９Ｈ－プリン－６－イルアミノ）エチル）フェノールヒドロクロリド，４－（２－（（２－Ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｐｈｅｎ－３－ｙｌ）－９－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－９Ｈ－ｐｕｒｉｎ－６－ｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ］、ＣＨ－２２３１９１（１－メチル－Ｎ－［２－メチル－４－［２－（２－メチルフェニル）ジアゼニル］フェニル－１Ｈ－ピラゾール－５－カルボキサミド，１－Ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ－［２－ｍｅｔｈｙｌ－４－［２－（２－ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｄｉａｚｅｎｙｌ］ｐｈｅｎｙｌ－１Ｈ－ｐｙｒａｚｏｌｅ－５－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）などが挙げられ、一例としてステムレゲニンＩが挙げられる。

【0064】

しかし、前記阻害剤は、ダイレクトリプログラミングの効率を高める役割を果たすものであれば、前述したものに限定されるものではない。

【0065】

本発明において、ｂ）の培地は、第１培地と、第２培地に分けられる。

【0066】

本発明の第１培地は、例えば成長因子、サイトカイン、ＧＳＫ３β阻害剤、ＰＤＫ１阻害剤及び／又はＡＨＲ阻害剤を含むものであってもよい。

【0067】

前記第１培地は、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＣＴ９９０２１及び／又はＢＸ７９５を含むものであるが、これに限定されるものではない。

【0068】

前記第１培地は、ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、抗生剤及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含むものであるが、これに限定されるものではない。

【0069】

前記抗生剤は、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）であるが、これに限定されるものではない。

【0070】

具体的には、前記ａ）の第１培地は、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＣＴ９９０２１及び／又はＢＸ７９５を含むものであるが、これに限定されるものではない。

【0071】

より具体的には、前記ａ）の第１培地は、８～１２％のＦＢＳ、０．１～２％のペニシリン／ストレプトマイシン、１０～３０ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦ、１０～３０ｎｇ／ｍｌのヒトＦＬＴ３Ｌ、１５０～２５０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２、１０～３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７、１０～３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１５、２～４ｕＭのＣＴ９９０２１、及び２～１０ｕＭのＢＸ７９５を含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩであり、より具体的には、９～１１％のＦＢＳ、０．５～１．５％のペニシリン／ストレプトマイシン、１５～２５ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦ、１５～２５ｎｇ／ｍｌのヒトＦＬＴ３Ｌ、１８０～２２０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２、１５～２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７、１５～２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１５、２．５～３．５ｕＭのＣＴ９９０２１、及び／又は４～８ｕＭのＢＸ７９５を含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩであるが、これらに限定されるものではない。

【0072】

本発明の第２培地は、例えば成長因子、サイトカイン及びステムレゲニンＩを含むものであってもよい。

【0073】

前記第２培地は、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びステムレゲニンＩを含むものであるが、これに限定されるものではない。

【0074】

前記第２培地は、ＦＢＳ、抗生剤及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つをさらに含むものであるが、これに限定されるものではない。

【0075】

前記抗生剤は、ペニシリン／ストレプトマイシンであるが、これに限定されるものではない。

【0076】

具体的には、ａ）ステップの第２培地は、ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１及びステムレゲニンＩを含むものであるが、これに限定されるものではない。

【0077】

より具体的には、ａ）ステップの第２培地は、８～１２％のＦＢＳ、０．１～２％のペニシリン／ストレプトマイシン、１０～３０ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦ、１０～３０ｎｇ／ｍｌのヒトＦＬＴ３Ｌ、１５０～２５０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２、１０～３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７、１０～３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１５、１０～３０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－２１、及び２～４ｕＭのステムレゲニンＩを含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩであり、さらに具体的には、９～１１％のＦＢＳ、０．５～１．５％のペニシリン／ストレプトマイシン、１５～２５ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦ、１２～２５ｎｇ／ｍｌのヒトＦＬＴ３Ｌ、１８０～２２０ＩＵ／ｍｌのヒトＩＬ－２、１５～２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－７、１５～２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－１５、１５～２５ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ－２１、及び／又は１．５～２．５ｕＭのステムレゲニンＩを含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩであるが、これらに限定されるものではない。

【0078】

本発明の第１培地及び第２培地は、ＢＣＬ１１Ｂ遺伝子発現の抑制によるｄｒＮＫ細胞製造において、ＮＫ細胞製造効率を最大化することができる。

【0079】

本発明の一実施例において、第１培地及び第２培地の培地構成要素がｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ製造収率に及ぼす影響を確認するために、ＰＢＭＣにｓｈＢＣＬ１１Ｂを形質転換し、その後それを第１培地（陽性対照群）、第１培地を構成する要素からヒトＩＬ－２、ヒトＩＬ－１５又はＣＨＩＲ９９０２１を１つずつ欠乏させた培地、又はＢＸ７９５を追加した培地で培養し、次いで第２培地でさらに培養してＮＫ生産効率を分析した結果、第１培地で培養した陽性対照群（１００％）を基準に、ＩＬ－２を欠乏させた培地で培養した細胞群は４３％、ＩＬ－１５を欠乏させた培地で培養した細胞群は７５％、ＣＨＩＲ９９０２１を欠乏させた培地で培養した細胞群は９２％、ＢＸ７９５を追加した培地で培養した細胞群は１１３％の効率で製造されたことが確認された（図５のＡ）。

【0080】

本発明の他の実施例において、ＰＢＭＣにｓｈＢＣＬ１１Ｂを形質転換し、その後第１培地で培養し、第２培地（陽性対照群）、又は第２培地を構成する要素から２００ＩＵ／ｍｌヒトＩＬ－２、２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－７、２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１５、２０ｎｇ／ｍｌヒトＦＬＴ３Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦもしくは２ｕＭ ＳＲ１を１つずつ欠乏させた培地でさらに培養してＮＫ生産効率を分析した結果、第２培地で培養した陽性対照群（１００％）を基準に、ＩＬ－２を欠乏させた培地で培養した細胞群は５６％、ＩＬ－１５を欠乏させた培地で培養した細胞群は６９％、ＩＬ－７を欠乏させた培地で培養した細胞群は８２％、ＳＣＦを欠乏させた培地で培養した細胞群は８１％、ＦＬＴ３Ｌを欠乏させた培地で培養した細胞群は３８％、ＳＲ１を欠乏させた培地で培養した細胞群は５７％の効率で製造されたことが確認された（図５のＢ）。

【0081】

よって、本発明の第１培地及び第２培地を用いると、ＮＫ細胞製造効率が向上することが分かる。

【0082】

前記方法において、直接細胞転換因子を導入した分離された細胞は、前記ａ）の第１培地で４～８日間培養し、その後前記ｂ）の第２培地で１０～１４日間培養するものであるが、これに限定されるものではない。

【0083】

本発明の一実施例において、末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ，ＰＢＭＣ）細胞に細胞転換を誘導するリプログラミング因子としてＢＣＬ１１Ｂに対するｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを導入するために、ＰＢＭＣにＢＣＬ１１Ｂ特異的ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルス処理又はｓｉＲＮＡ導入を行って形質転換し、７日目までは第１培地で培養し、次いで１８日目までは第２培地で培養して直接細胞転換誘導ｄｒＮＫ細胞（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）を製造した（図１のＡ及び図４のＢ）。

【0084】

本発明の他の実施例において、ＰＢＭＣ細胞に細胞転換誘導因子としてＢＣＬ１１ＢをターゲットとするｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを発現するレンチウイルス処理を行って形質転換し、７日目までは第１培地で培養し、次いで１８日目までは第２培地で培養して直接細胞転換誘導ｄｒＮＫ細胞（ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）を製造した（図２のＡ及び図１３のＡ）。

【0085】

本発明の他の態様は、ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法を提供する。

【0086】

ここで用いる用語については前述した通りである。

【0087】

前記ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の製造方法は、本発明のｄｒＮＫ細胞の製造方法において、ａ）及びｂ）からなる群から選択される少なくとも１つのステップに、ＣＤ１９－ＣＡＲ、ＭＳＬＮ－ＣＡＲ及びＨＥＲ２－ＣＡＲからなる群から選択されるＣＡＲ遺伝子をさらに導入する過程を含んでもよい。具体的には、前記ＣＡＲ遺伝子は、ＢＣＬ１１Ｂノックアウト（Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ，ＫＯ）塩基配列にノックイン（Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ，ＫＩ）して導入するものであってもよい。

【0088】

本発明における「ＣＡＲ遺伝子」とは、抗体ドメイン（ｓｃＦｖ）をはじめとする細胞外ドメイン、細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインをコードする遺伝子であって、前記細胞外ドメイン、細胞膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインで構成されるキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）をコードする遺伝子を意味する。本発明の目的上、本発明のＣＡＲ遺伝子は、ＣＤ１９ ｓｃＦｖを含むＣＤ１９－ＣＡＲ遺伝子、ＭＳＬＮ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ） ｓｃＦｖを含むＭＳＬＮ－ＣＡＲ遺伝子、及びＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２） ｓｃＦｖを含むＨＥＲ２－ＣＡＲ遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これに限定されるものではない。

【0089】

固形腫瘍に対するＣＡＲ標的因子として、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（非特許文献４）、ＭＵＣ－１（非特許文献５）、ＭＡＧＥ（非特許文献６）、ＣＥＡ（非特許文献７）、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＡ１２５、Ｈｅｒ２及びＭＳＬＮ、ＦＡＰ、ＶＥＧＦＲ（非特許文献８）などが用いられることが知られている。

【0090】

また、前記ＣＤ１９とは、分化抗原群（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ＣＤ）であって、免疫表現型により細胞表面分子を識別する番号１９を割り当てたものを意味し、前記ＣＤ１９は、Ｂリンパ球のマーカーである。前記ＣＤ１９は、ほとんどのＢ－細胞悪性腫瘍、癌細胞において発現し、それらの癌腫に対する理想的な標的となることが知られている。

【0091】

例えば、前記ＣＡＲ遺伝子は、ｉ）ＣＤ８リーダー（Ｌｅａｄｅｒ）、ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ（Ｈｉｎｇｅ）、ＣＤ８膜貫通ドメイン（ＴＭ）及びＦｃ－γ（Ｇａｍｍａ）受容体を含むＣＡＲ遺伝子（ＣＤ１９－ＣＡＲ遺伝子）、ｉｉ）ＣＤ８リーダー、ＭＳＬＮ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ） ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、ＣＤ３ζ（ｚｅｔｔａ）及びＩＲＥＳを含むＣＡＲ遺伝子（ＭＳＬＮ－ＣＡＲ遺伝子）、並びにｉｉｉ）ＣＤ８リーダー、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２） ｓｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン、ＣＤ３ζ及びＩＲＥＳを含むＣＡＲ遺伝子（ＨＥＲ２－ＣＡＲ遺伝子）からなる群から選択される少なくとも１つであるが、これに限定されるものではない。

【0092】

前記ＣＤ８リーダーは配列番号１４、ＣＤ１９ ｓｃＦｖは配列番号１５、ＭＳＬＮ ｓｃＦｖは配列番号１６、ＨＥＲ２ ｓｃＦｖは配列番号１７、ＣＤ８ヒンジは配列番号１８、ＣＤ８膜貫通ドメインは配列番号１９、Ｆｃ－γ受容体は配列番号２０、ＣＤ２８細胞内ドメインは配列番号２１、ＣＤ３ζは配列番号２２、バイシストロンを構成するベクターに前記ＣＡＲ遺伝子をクローニングするために挿入するＩＲＥＳは配列番号２３の塩基配列を含むものであるが、これに限定されるものではない。

【0093】

前記ＣＡＲ遺伝子は、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）をさらに含むものであるが、これに限定されるものではない。

【0094】

前記ＧＦＰは、配列番号２４の塩基配列を含むものであるが、これに限定されるものではない。

【0095】

配列番号１４～配列番号２４の塩基配列は、公知のデータベースであるＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋにおいてその配列を確認することができる。

【0096】

本発明において、配列番号１４～配列番号２４の塩基配列には、配列番号１４～配列番号２４と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する塩基配列が含まれる。また、そのような相同性又は同一性を有し、配列番号１４～配列番号２４の塩基配列に相当する機能を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加された塩基配列を有する配列も本発明に含まれることは言うまでもない。

【0097】

本発明における「相同性（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」及び「同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が関連する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。

【0098】

保存されている（Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）又は同じ（Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下において、一般に配列全体又は全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドがコドンの代わりに縮退コドンを有するようにするものであってもよい。

【0099】

前記ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の相同性又は同一性は、例えば文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：非特許文献９］やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献１０）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸというプログラムが開発されている（参照：非特許文献１１）。また、任意のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される適切なハイブリダイゼーション条件は、当該技術の範囲内であり、当業者に周知である（例えば、非特許文献１２、１３）。

【0100】

本発明において、前記ＣＡＲ遺伝子は、前述した直接細胞転換因子の導入方法と同様の方法で細胞に導入することができ、直接細胞転換因子とＣＡＲ遺伝子は、所望の時間及び条件下で同時に又は順次導入することができる。

【0101】

本発明の一実施例において、ＰＢＭＣ細胞に細胞転換を誘導するリプログラミング因子としてＢＣＬ１１Ｂに対するｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡを導入するために、ＰＢＭＣにＢＣＬ１１Ｂ特異的ｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルス処理又はｓｉＲＮＡ導入を行って形質転換し、ＭＳＬＮ－ＣＡＲ遺伝子を発現するレンチウイルスで形質転換した。ここで、細胞培養は、第１培地で培養し、その後第２培地でさらに培養することにより、ＣＡＲ（ＭＳＬＮ－ＣＡＲ）遺伝子を発現する直接細胞転換誘導ｄｒＮＫ細胞（ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）を製造した（図１のＢ及び図１１のＡ）。

【0102】

本発明の他の実施例において、ＢＭＣ細胞にＣＡＲをコードする配列がＢＣＬ１１Ｂ Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ（ＫＯ）と同時に切断部位に挿入されてＫｎｏｃｋ－ｉｎ（ＫＩ）されるｄｏｎｏｒプラスミドとしてＣＡＲ－ＡＡＶを導入して形質転換し、細胞転換誘導因子としてＢＣＬ１１ＢをターゲットとするｓｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを発現するレンチウイルス処理を行って形質転換した。ここで、細胞培養は、第１培地で培養し、その後第２培地でさらに培養することにより、ＣＡＲ（ＭＳＬＮ－ＣＡＲ）遺伝子を発現する直接細胞転換誘導ｄｒＮＫ細胞（ＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）を製造した（図２のＢ及び図１５）。

【0103】

本発明のさらに他の態様は、本発明の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞を提供する。

【0104】

本発明のさらに他の態様は、本発明の方法により製造されたＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞を提供する。

【0105】

ここで用いる用語については前述した通りである。

【0106】

本発明の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つを発現するものであるが、これに限定されるものではない。

【0107】

前記「ＣＤ５６^＋」及び「ＣＤ３^－」は、ＮＫ細胞の表面にある指標であり、本発明においては、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－及びそれらの組み合わせの発現をフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）により分析し、ＮＫ細胞が製造されたことを確認した。

【0108】

本発明の一実施例において、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を生産するか否か、及び収率を確認するために、ＣＤ５６抗体、ＣＤ３抗体で前記細胞を染色し、その後フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いてＮＫ細胞群（ＣＤ５６^＋及びＣＤ３^－）を分析した結果、対照群においてＣＤ５６^＋ＣＤ３^－（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）細胞がそれぞれ２％（Ｎｏ－ｔｒｅａｔｅｄ）、０％（ｓｈ－Ｃｏｎｔｒｏｌ）であったのに対して、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃１、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃２、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃３、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃４、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃５、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃６及びｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃７処理群においては７３％～９２％の効率で製造され、ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ａ、ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｂ、ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｃ及びｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｄ処理群においては３８％～５７％の効率で製造されたことが確認された（図４のＣ）。

【0109】

本発明の他の実施例において、ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を生産するか否か、及び収率を確認するために、ＣＤ５６抗体、ＣＤ３抗体で前記細胞を染色し、その後フローサイトメトリーを用いてＮＫ細胞群（ＣＤ５６^＋及びＣＤ３^－）を分析した結果、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－（ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）細胞は、非処理群が６．０％であったのに対して、ｓｇＲＮＡ－Ａ、ｓｇＲＮＡ－Ｂ又はｓｇＲＮＡ－Ｃを含むＣａｓ９－ｓｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂ処理群において、それぞれ８３．９％、７２．２％、７２．０％の効率で製造されたことが確認された（図１３のＢ）。

【0110】

本発明の方法により製造されたＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞は、ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つを発現するものであるが、これに限定されるものではない。

【0111】

本発明の一実施例において、ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を生産するか否か、及び収率を確認するために、ＣＤ５６抗体、ＭＳＬＮ－ＣＡＲ抗原で前記細胞を染色し、その後フローサイトメトリーを用いてＮＫ細胞群（ＣＤ５６^＋及びＭＳＬＮ－ＣＡＲ^＋）を分析した結果、ＣＤ５６^＋ＭＳＬＮ^＋（ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）細胞は４．９％～１３．１％の効率で製造されたことが確認された（図１１のＢ）。

【0112】

本発明の他の実施例において、ＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を生産するか否か、及び収率を確認するために、ＣＤ５６抗体、ＣＤ３抗体及びＭＳＬＮ－ＣＡＲ抗原で前記細胞を染色し、その後フローサイトメトリーを用いてｄｒＮＫ細胞群（ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－及びＭＳＬＮ－ＣＡＲ^＋）を分析した結果、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－細胞群が２２．８％であったのに対して、ＣＤ５６^＋ＭＳＬＮ^＋細胞群は１７．３％の効率で製造されたことが確認された（図１５のＣ）。

【0113】

また、本発明のさらに他の実施例において、ＮＫ特異的マーカーの発現特性を検証した結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞及びｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は、ＣＤ１６、ＣＤ６９、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１などの活性化受容体がＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ１などの抑制受容体に比べて高い頻度で発現し、類似した様相を呈することが確認された（図６、図１２及び図１４）。

【0114】

よって、ＢＣＬ１１Ｂに対するｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又はＣａｓ９／ｓｇＲＮＡによる直接細胞転換により、ヒト血液細胞からＮＫ細胞への転換が可能であることが確認された。

【0115】

本発明のさらに他の態様は、本発明の方法により製造された細胞を有効成分として含む、癌の予防又は治療用細胞治療剤組成物を提供する。

【0116】

ここで用いる用語については前述した通りである。

【0117】

本発明において、前記癌は、ＣＤ１９、ＭＳＬＮ及びＨＥＲ２からなる群から選択される少なくとも１つの発現に関連する癌であってもよく、具体的にはｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の免疫反応などにより予防又は治療結果が得られる癌であってもよい。前記癌としては、例えば肝癌、甲状腺癌、甲状腺悪性腫瘍、甲状腺乳頭癌、甲状腺髄様癌、偽粘液腫、肝内胆管癌、肝芽腫、気管支原性癌、基底細胞癌、睾丸癌、骨髄癌、骨髄腫、骨髄異形成症、骨肉腫、骨原性肉腫、結腸癌、膠芽腫、口腔癌、口唇癌、菌状息肉腫、卵巣癌、卵巣胚細胞腫瘍、男性乳癌、嚢胞腺癌、内皮肉腫、脳癌、髄膜腫、下垂体腺腫、胆管癌、大腸癌、頭頸部癌、頭蓋咽頭腫、胆道癌、胆嚢癌、多発性骨髄腫、リンパ管内皮肉腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、リンパ管肉腫、粘膜癌、網膜芽細胞腫、脈絡膜黒色腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、前白血病、急性骨髄性白血病、急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞性急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、急性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｔ細胞性急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、ファーター膨大部癌、非黒色腫皮膚癌、腹膜癌、副甲状腺癌、副腎癌、鼻副鼻腔癌、扁平上皮細胞癌、非小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、上皮癌、上衣腫、胚細胞癌、腎臓癌、腎臓細胞癌、神経膠腫、神経芽腫、腎盂癌、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、十二指腸癌、舌癌、線維肉腫、腺癌、星細胞腫、松果体細胞腫、小児脳腫瘍、小児リンパ腫、小腸癌、髄膜腫、髄芽腫、腎細胞癌、食道癌、眼球癌、悪性軟部組織腫瘍、悪性骨腫瘍、悪性リンパ腫、悪性中皮腫、悪性黒色腫、眼腫瘍、外陰部癌、ユーイング肉腫、尿管癌、尿道癌、原発部位不明癌、肉腫、悪性乳房腫瘍、乳癌、絨毛癌、胃癌、胃リンパ腫、胃カルチノイド、消化管間質腫瘍、ウィルムス腫瘍、陰茎癌、咽頭癌、妊娠性絨毛疾患、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、前立腺癌、粘液肉腫、精上皮腫、脂肪肉腫、中皮腫、直腸癌、膣癌、転移性骨腫瘍、転移性脳腫瘍、縦隔癌、脊髄癌、脊索腫、聴神経腫瘍、聴神経鞘腫、唾液腺癌、膵胆管癌、膵臓癌、歯肉癌、カポジ肉腫、パジェット病、扁桃腺癌、皮脂腺癌、乏突起膠腫系腫瘍、平滑筋肉腫、扁平細胞癌、肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮細胞癌、皮膚癌、肛門癌、喉頭癌、胸膜癌、胸腺癌、血管芽細胞腫、血液癌、血管肉腫、滑膜肉腫、横紋筋肉腫、黒色腫、希少癌、胎生期癌、汗腺癌及びそれらの組み合わせが挙げられ、具体的には血液癌、大腸癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、脳癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、筋肉腫、腎臓癌、甲状腺癌、骨肉腫、子宮癌、胃癌、膀胱癌などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0118】

一例として、前記癌は、ＭＳＬＮの発現に関連する癌であってもよい。他の例として、リンパ腫、白血病、骨髄腫、中皮腫、子宮癌、頭頸部癌、食道癌、滑膜肉腫、腎臓癌、移行上皮癌、甲状腺癌、胚細胞腫、胆道癌／胆管癌、乳頭状漿液性腺癌、大腸癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、膠芽腫、結腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、筋肉腫、甲状腺癌、骨肉腫、絨毛癌、胃癌、神経膠腫、軟組織肉腫、神経内分泌腫瘍、脳下垂体腫瘍、乏突起膠腫、消化管間質腫瘍、胆嚢癌、小腸癌、孤立性線維性腫瘍、胸腺癌、膀胱癌などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0119】

本発明における「予防」とは、前記組成物の投与により癌の発症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味する。

【0120】

本発明における「治療」とは、前記組成物の投与により癌による症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。

【0121】

本発明における「細胞治療剤」とは、個体から分離、培養及び特殊操作により作製した細胞及び組織であって、治療、診断及び予防の目的で用いられる医薬品（米国ＦＤＡ規定）を意味し、細胞又は組織の機能を復元させるために、生きた自己、同種又は異種細胞を体外で増殖、選択したり、他の方法で細胞の生物学的特性を変化させたりする一連の行為により、治療、診断及び予防の目的で用いられる医薬品を意味する。

【0122】

前記細胞治療剤組成物は、本発明の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞を含むことにより、癌の予防又は治療効能を発揮するものであってもよい。

【0123】

前記細胞治療剤組成物は、組成物の総重量に対して前記ｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞を１．０×１０～１．０×１０^１０個細胞／ｍｌ、具体的には１．０×１０^６～１．０×１０^９個細胞／ｍｌで含むが、これらに限定されるものではない。

【0124】

前記細胞治療剤組成物は、薬学分野における通常の方法による患者の体内投与に適した単位投与型の薬学的製剤に剤形化して投与することができ、前記製剤は１回又は数回に分けて投与することにより効果的な投与量で投与することができる。上記目的に適した剤形としては、非経口投与製剤である、注射用アンプルなどの注射剤、注入バッグなどの注入剤、エアゾール製剤などの噴霧剤などが好ましい。前記注射用アンプルは使用直前に注射液と混合調製することができ、注射液としては、生理食塩水、グルコース、マンニトール、リンガー溶液などを用いることができる。また、注入バッグとしては、塩化ポリビニル又はポリエチレン製のものを用いることができ、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、メドセップ（Ｍｅｄｃｅｐ）、ナショナルホスピタルプロダクツ（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）又はテルモ（Ｔｅｒｕｍｏ）社の注入バッグが挙げられる。

【0125】

前記薬学的製剤は、上記有効成分以外にも、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される通常の不活性担体、例えば注射剤の場合は、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、安定化剤などをさらに含んでもよく、局所投与用製剤の場合は、基剤（ｂａｓｅ）、賦形剤、滑沢剤、保存剤などをさらに含んでもよい。

【0126】

このように作製した本発明の細胞治療剤組成物又はその薬学的製剤は、当該技術分野で通常用いる投与方法を用いて、癌治療に用いる他の細胞と共に又は混合物の形態で投与してもよく、具体的には治療を必要とする患者の疾患部位に直接生着又は移植するか、腹腔に直接移植又は注入してもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記投与には、カテーテルを用いた非外科的投与、及び疾患部位切開後の注入、移植などの外科的投与法の全てが可能である。さらに、通常の方法による非経口的投与、例えば病変への直接投与以外にも、血管内注入による移植も可能である。

【0127】

前記細胞治療剤組成物は、１日０．０００１～１，０００ｍｇ／ｋｇ、具体的には０．０１～１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与してもよく、前記投与は、１日１回又は数回に分けて行ってもよい。しかし、有効成分の実際の投与量は、治療する疾患、疾患の重症度、投与経路、患者の体重、年齢、性別などの様々な関連因子を考慮して決定しなければならないことを理解すべきである。よって、前記投与量は、いかなる場合でも本発明を限定するものではない。

【0128】

本発明の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞は、様々な癌細胞に対する殺傷能が優れるものであってもよい。

【0129】

本発明の一実施例において、作製されたｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の癌細胞殺傷能を確認した結果、様々な種類（リンパ腫、大腸癌、肝癌、肺癌、膵臓癌、膠芽腫、結腸癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、黒色腫、筋肉腫、甲状腺癌、骨肉腫、絨毛癌、胃癌及び膀胱癌）の癌細胞殺傷能を有することが確認され、各ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の低いＥ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＮＫ ｃｅｌｌ）：Ｔ（Ｔａｒｇｅｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ）比（０．２５：１～２．５：１）においても高い癌細胞殺傷能を示すことが確認された（図７）。また、従来のヒトナチュラルキラー細胞であるＮＫ－９２細胞に比べて、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は、約５．２～５．５倍以上優れた癌細胞殺傷能を示すことが確認された（図８）。

【0130】

本発明の他の実施例において、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞（ヒト末梢血液細胞由来のＮＫ）を癌細胞と共培養した後に、発現した、癌細胞溶解能を有するＣＤ１０７ａ^＋細胞を定量分析した結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞と癌細胞を共培養したもの、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞と癌細胞を共培養したもの、及び共培養していない対照群（Ｎｏ ｔａｒｇｅｔ）に比べて、ＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度（％）が増加することが確認された（図９のＡ）。また、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞又はＰＢＭＣ－ＮＫ細胞を癌細胞と共培養した後に、癌細胞溶解ＩＦＮ－γサイトカインが発現するＩＦＮ－γ^＋細胞を定量分析した結果、共培養していない対照群（Ｎｏ ｔａｒｇｅｔ）に比べて、ＩＦＮ－γ^＋細胞の頻度（％）が増加することが確認され、癌細胞の種類によって異なる頻度を示すことが確認された（図９のＢ）。

【0131】

本発明のさらに他の実施例において、ＰＣ－３を移植したマウス前立腺癌モデルにＰＢＭＣ－ＮＫ細胞、ＯＳＫＭ－ｄｒＮＫ細胞、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞又はＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を注入した２１日後から、対照群の腫瘍サイズに比べて、ＰＢＭＣ－ＮＫ及びｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ投与群において腫瘍サイズが大幅に減少したので、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫがＰＢＭＣ－ＮＫに比べて優れた抗癌効果を発揮することが確認された（図１０のＡ）。また、ＳＫ－ＯＶ－３を移植したマウス卵巣癌モデルにＰＢＭＣ－ＮＫ細胞、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞又はＰＢＳを注入した２１日後から、対照群の腫瘍サイズに比べて、ＰＢＭＣ－ＮＫ、ＯＳＫＭ－ｄｒＮＫ及びｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ投与群で腫瘍サイズが大幅に減少したので、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫがＰＢＭＣ－ＮＫに比べて優れた抗癌効果を発揮することが確認された（図１０のＢ）。

【0132】

本発明のさらに他の実施例において、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞及びＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞をＭＳＬＮが発現しないＫ５６２、ＭＳＬＮが発現するＰＣ－３及びＭｉａ－ｐａｃａ－２と共培養した後に、癌細胞殺傷能を確認した結果、ＭＳＬＮが発現しないＫ５６２に対して、４種のＮＫ細胞が同程度の癌細胞殺傷能を示し、ＭＳＬＮが発現する癌細胞群ＰＣ－３及びＭｉａ－ｐａｃａ－２に対して、ｎｏｎ－ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ，ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）に比べて、ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞（ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ，ＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）における低いＥ：Ｔ比（０．２５：１～２．５：１）においても高い癌細胞殺傷能を示すことが確認された（図１６のＡ）。

【0133】

また、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞及びＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を癌細胞と共培養した後に、発現したＣＤ１０７ａ^＋細胞を定量分析した結果、ＭＳＬＮが発現するＰＣ－３及びＭｉａ－ｐａｃａ－２に対して、ｎｏｎ－ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ，ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）に比べて、ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞（ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ，ＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）細胞において、ＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度（％）が増加することが確認された（図１６のＢ）。

【0134】

よって、本発明の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞は、癌細胞殺傷能、癌細胞と共培養した後のＣＤ１０７ａ^＋細胞及びＩＦＮ－γ^＋細胞の頻度及び抗腫瘍効果に優れるので、抗癌効果を有することが分かる。

【0135】

本発明のさらに他の態様は、本発明の方法により製造された細胞を有効成分として含む、癌の治療又は予防用薬学組成物を提供する。

【0136】

ここで用いる用語については前述した通りである。

【0137】

前記薬学組成物は、本発明の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞を含むことにより、癌の予防又は治療効能を発揮するものであってもよい。

【0138】

本発明の薬学組成物は、組成物の総重量に対して前記ｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞を１．０×１０^４～１．０×１０^１０個細胞／ｍｌ、具体的には１．０×１０^６～１．０×１０^９個細胞／ｍｌで含むが、これらに限定されるものではない。

【0139】

前記薬学組成物は、薬学組成物の製造に通常用いられる薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよく、前記担体は、非天然担体（Ｎｏｎ－ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｃａｒｒｉｅｒ）であってもよい。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油が挙げられる。

【0140】

また、前記薬学組成物は、それぞれ通常の方法で錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥製剤、経皮吸収剤、ゲル剤、ローション剤、軟膏剤、クリーム剤、貼付剤、パップ剤、ペースト剤、スプレー剤、皮膚乳剤、皮膚懸濁液剤、経皮パッチ剤、薬物含有包帯剤又は坐剤の形態に剤形化して用いることができる。

【0141】

具体的には、剤形化する場合は、通常用いる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製される。経口用固形製剤としては、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの固形製剤は、少なくとも１つの賦形剤、例えばデンプン、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混合して調製される。また、通常の賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤なども用いられる。経口用液状物、流動パラフィン以外にも種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などを添加して調製してもよい。非経口投与製剤としては、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が挙げられる。非水性溶剤及び懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物性オイル、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイーン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが用いられる。

【0142】

本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。前記「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用できる合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する感受性、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、同時に用いられる薬物が含まれる要素、並びにその他医学分野で公知の要素により決定される。例えば、前記薬学組成物は、１日０．０００１～１，０００ｍｇ／ｋｇ、具体的には０．０１～１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与してもよく、前記投与は、１日１回又は数回に分けて行ってもよい。

【0143】

前記薬学組成物は、単独で又は他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤と順次又は同時に投与してもよい。また、単一又は多重投与してもよい。上記要素を全て考慮して副作用なく最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者により容易に決定される。

【0144】

前記「投与」とは、任意の適切な方法で個体に本発明の組成物を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、標的組織に送達できるものであれば、一般的なあらゆる経路で投与することができる。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0145】

前記「個体」とは、癌を発症したか、発症するリスクのある、ヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットが含まれるあらゆる動物を意味する。本発明の薬学組成物を個体に投与することにより、前記疾患を効果的に予防又は治療できるものであれば、個体の種類はいかなるものでもよい。

【0146】

本発明のさらに他の態様は、前記細胞治療剤組成物又は薬学組成物をヒト以外の個体に投与するステップを含む、癌の治療方法を提供する。

【0147】

ここで用いる用語については前述した通りである。

【0148】

本発明のさらに他の態様は、本発明の方法により製造された細胞を有効成分として含む、感染性疾患及び／又は炎症性疾患の予防又は治療用細胞治療剤組成物を提供する。

【0149】

ここで用いる用語については前述した通りである。

【0150】

本発明において、感染性疾患は、ウイルス、細菌及びカビからなる群から選択される少なくとも１つにより発生又は発症するものであるが、これに限定されるものではない。

【0151】

前記感染性疾患を引き起こすウイルスは、ＲＮＡウイルス及び／又はＤＮＡウイルスであるが、当該技術分野で公知のウイルスであればいかなるものでもよい。

【0152】

例えば、前記ウイルスとしては、Ａｖｉａｄｅｎｏ（アビアデノ）ウイルス、Ａｌｐｈａｔｏｒｑｕｅ（アルファトルク）ウイルス、Ａｒｅｎａ（アレナ）ウイルス、Ａｌｐｈａｐａｐｉｌｌｏｍａ（アルファパピローマ）ウイルス、Ａｄｅｎｏ（アデノ）ウイルス（Ａｄ５）、Ａｓｔｒｏ（アストロ）ウイルス、Ａｉｃｈｉ（アイチ）ウイルス、Ａｍａｐａｒｉ（アマパリ）ウイルス、Ａｒａｖａｎ（アラバン）ウイルス、Ａｕｒａ（アウラ）ウイルス、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｂａｔ ｌｙｓｓａ（オーストラリアコウモリリッサ）ウイルス、Ｂａｎｎａ（バンナ）ウイルス、Ｂａｒｍａｈ ｆｏｒｅｓｔ（バーマフォレスト）ウイルス、Ｂａｔｋｅｎ（バトケン）ウイルス、Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ（ブニヤムウェラ）ウイルス、Ｂｕｎｇａ（ブンガ）ウイルス、Ｂｕｎｙａ（ブニヤ）ウイルスＬａ ｃｒｏｓｓｅ、ＢＫ（ビーケイ）ウイルス、ＢＫ ｐｏｌｙｏｍａ（ビーケイポリオーマ）ウイルス、Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓ（オナガザルヘルペス）ウイルス、Ｃａｒｄｉｏ（カーディオ）ウイルス、Ｃｒｉｍｅａｎ－ｃｏｎｇｏ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ（クリミア・コンゴ出血熱）ウイルス、Ｃｈａｐａｒｅ（チャパレ）ウイルス、Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ（チャンディプラ）ウイルス、Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ ｖｅｓｉｃｕｌｏ（チャンディプラベシクロ）ウイルス、Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ（チクングニア）ウイルス、Ｃｏｓａ（コサ）ウイルス、Ｃｏｗｐｏｘ（牛痘）ウイルス、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ（コクサッキー）ウイルス、Ｃｏｒｏｎａ（コロナ）ウイルス、Ｃｏｒｏｎａ（コロナ）ウイルスアルファ（ベータ，ガンマ，デルタ）、Ｃｏｌｔｉ（コルティ）ウイルス、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ（サイトメガロ）ウイルス、Ｄｅｎｓｏ（デンソ）ウイルス、Ｄｅｐｅｎｄｏ（デペンド）ウイルス、Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏ（デペンドパルボ）ウイルス、Ｄｅｎｇｕｅ（デング）ウイルス、Ｄｅｌｔａｒｅｔｒｏ（デルタレトロ）ウイルス、Ｄｈｏｒｉ（ドーリ）ウイルス、Ｄｕｇｂｅ（ダグベ）ウイルス、Ｄｕｖｅｎｈａｇｅ（ドゥベンヘイジ）ウイルス、Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（東部ウマ脳炎）ウイルス、Ｅｂｏｌａ（エボラ）ウイルス、Ｅｃｈｏ（エコー）ウイルス、Ｅｃｔｒｏｍｅｌｉａ（エクトロメリア）ウイルス、Ｅｌ Ｂｏ（エルボー）ウイルス、Ｅｒｂｏ（エルボ）ウイルス、Ｅｎｔｅｒｏ（エンテロ）ウイルス、Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ（脳心筋炎）ウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ（エプスタイン・バール）ウイルス（ＥＢＶ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｂａｔ ｌｙｓｓａ（ヨーロッパコウモリリッサ）ウイルス、Ｅｒｙｔｈｒｏ（エリスロ）ウイルス、Ｆｌａｖｉ（フラビ）ウイルス、Ｆｌｅｘａｌ（フレキサル）ウイルス、Ｆｏｗｌ ｐｌａｇｕｅ（家禽ペスト）ウイルス、ＧＢウイルスＣ／Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ（肝炎）Ｇウイルス、Ｇｕａｎａｒｉｔｏ（グアナリト）ウイルス、Ｈａｎｔａａｎ（ハンターン）／Ｈａｎｔａｎｎ ｒｉｖｅｒウイルス、Ｈａｎｔａ（ハンタ）ウイルス、Ｈｅｎｄｒａ（ヘンドラ）ウイルス、Ｈｅｐａｔｏ／Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ（肝炎）ウイルス、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ（肝炎）ウイルス（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）、Ｈｏｒｓｅｐｏｘ（馬痘）ウイルス、Ｈｕｍａｎ ｈｅｒｐｅｓ（ヘルペス）ウイルス（ＨＨＶ－６，ＨＨＶ－７）、Ｈｅｎｉｐａ（ヘニパ）ウイルス、Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ（単純ヘルペス）ウイルス（１，２）、Ｈｅｐａｃｉ（ヘパシ）ウイルス、Ｈｅｐｅ（へペ）ウイルス、Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ヒト免疫不全）ウイルス（ＨＩＶ－１）、Ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ（サイトメガロ）ウイルス、Ｉｐｐｙ（イッピー）ウイルス、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（インフルエンザ）ウイルス（Ａ，Ｂ，Ｃ）、Ｉｓｆａｈａｎ（イスファハン）ウイルス、Ｊｏｈｎ ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ（ＪＣ）ウイルス、ＪＣ ｐｏｌｙｏｍａウイルス、Ｊａｐａｎｅｓｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（日本脳炎）ウイルス、Ｊｕｎｉｎ（フニン）ウイルス、Ｊｕｎｉｎ ａｒｅｎａ（フニンアレナ）ウイルス、Ｋａｐｏｓｉ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓ（カポジ肉腫関連ヘルペス）ウイルス（ＫＳＨＶ）、ＫＩ ｐｏｌｙｏｍａウイルス、Ｋｏｂｕ（コブ）ウイルス、Ｋｕｎｊｉｎ（クンジン）ウイルス、Ｌｅｎｔｉ（レンチ）ウイルス、Ｌａｔｉｎｏ（ラティーノ）ウイルス、Ｌａｓｓａ（ラッサ）ウイルス、Ｌａｇｏｓ Ｂａｔ（ラゴスコウモリ）ウイルス、Ｌａｋｅ ｖｉｃｔｏｒｉａ Ｍａｒｂｕｒｇ（マールブルグ）ウイルス、Ｌｙｓｓａ（リッサ）ウイルス、Ｌａｎｇａｔ（ランガット）ウイルス、Ｌｏｒｄｓｄａｌｅ（ローズデール）ウイルス、Ｌｏｕｐｉｎｇ ｉｌｌ（跳躍病）ウイルス、Ｌｕｇｏ（ルゴ）ウイルス、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｃｈｏｒｉｏｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ（リンパ球性脈絡髄膜炎）ウイルス、Ｌｙｍｐｈｏｃｒｙｐｔｏ（リンホクリプト）ウイルス、Ｍａｃｈｕｐｏ（マチュポ）ウイルス、Ｍａｓｔａｄｅｎｏ（マストアデノ）ウイルス、Ｍａｍａｓｔｒｏ（マムアストロ）ウイルス、Ｍａｙａｒｏ（マヤロ）ウイルス、ＭＥＲＳ ｃｏｒｏｎａ（マーズコロナ）ウイルス、Ｍｅａｓｌｅｓ（麻疹）ウイルス、Ｍａｒｂｕｒｇ（マールブルグ）ウイルス、Ｍｕｍｐｓ（ムンプス）ウイルス、Ｍｅｎｇｏ（メンゴ）ウイルス、Ｍｅｒｋｅｌ ｃｅｌｌ ｐｏｌｙｏｍａ（メルケル細胞ポリオーマ）ウイルス、Ｍｏｋｏｌａ（モコラ）ウイルス、Ｍｏｌｌｕｓｃｕｍ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ（伝染性軟属腫）ウイルス、Ｍｏｐｅｉａ（モペイア）ウイルス、Ｍｏｎｋｅｙｐｏｘ（サル痘）ウイルス、Ｍｏｂａｌａ（モバラ）ウイルス、Ｍｏｒｂｉｌｉ（モルビリ）ウイルス、Ｍｕｐａｐｉｌｌｏｍａ（ミューパピローマ）ウイルス、Ｍｏｌｌｕｓｃｉｐｏｘ（モルシポックス）ウイルス、Ｍｕｒｒａｙ ｖａｌｌｅｙ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（マレー渓谷脳炎）ウイルス、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ニューヨーク）ウイルス、Ｎａｉｒｏ（ナイロ）ウイルス、Ｎｉｐａｈ（ニパ）ウイルス、Ｎｏｒｏ（ノロ）ウイルス、Ｎｏｒｗａｌｋ（ノーウォーク）ウイルス、Ｏｌｉｖｅｒｏｓ（オリベロス）ウイルス、Ｏ’ｎｙｏｎｇ－ｎｙｏｎｇ（オニョンニョン）ウイルス、Ｏｒｂｉ（オルビ）ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｏｘ（オルソポックス）ウイルス、Ｏｒｔｈｏｂｕｎｙａ（オルソブニヤ）ウイルス、Ｏｒｔｈｏｈｅｐａｄｎａ（オルソヘパドナ）ウイルス、Ｏｒｆ（オーフ）ウイルス、Ｏｒｏｐｏｕｃｈｅ（オロプーシェ）ウイルス、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ（オルソミクソ）ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｏｘ（オルソポックス）ウイルス、Ｏｒｔｈｏｐｎｅｕｍｏ（オルソニューモ）ウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａ（パピローマ）ウイルス、Ｐａｐｏｖａ（パポバ）ウイルス、Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ（パラインフルエンザ）ウイルス、Ｐａｒｅｃｈｏ（パレコ）ウイルス、Ｐｅｇｉ（ペギ）ウイルス、Ｐａｒａｎａ（パラナ）ウイルス、Ｐｉｃｈｉｎｄｅ（ピチンデ）ウイルス、Ｐｉｒｉｔａｌ（ピリタル）ウイルス、Ｐａｒｖｏ（パルボ）ウイルス、Ｐｏｌｉｏ（ポリオ）ウイルス、Ｐｏｌｙｏｍａ（ポリオーマ）ウイルス、Ｐｏｘ（ポックス）ウイルス、Ｐｕｎｔａ ｔｏｒｏ ｐｈｌｅｂｏ（プンタトロフレボ）ウイルス、Ｐｕｕｍａｌａ（プーマラ）ウイルス、Ｐｈｌｅｂｏ（フレボ）ウイルス、Ｒｏｓｅｏｌｏ（ロゼオロ）ウイルス、Ｒａｂｉｅｓ（狂犬病）ウイルス、Ｒｈｉｎｏ（ライノ）ウイルス、Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ（呼吸器合胞体）ウイルス、Ｒｉｆｔ ｖａｌｌｅｙ ｆｅｖｅｒ（リフトバレー熱）ウイルス、Ｒｈａｄｉｎｏ（ラディノ）ウイルス、Ｒｏｓａ（ロサ）ウイルス、Ｒｕｂｉ（ルビ）ウイルス、Ｒｏｓｓ ｒｉｖｅｒ（ロスリバー）ウイルス、Ｒｏｔａ（ロタ）ウイルス、Ｒｕｂｅｌｌａ（風疹）ウイルス、Ｒｕｂｕｌａ（ルブラ）ウイルス、Ｒｅｓｐｉｒｏ（レスピロ）ウイルス、Ｓａｂｉａ（サビア）ウイルス、Ｓａｐｏ（サポ）ウイルス、Ｓａｇｉｙａｍａ（サギヤマ）ウイルス、Ｓａｌｉ（サリ）ウイルス、Ｓａｎｄｆｌｙ ｆｅｖｅｒ Ｓｉｃｉｌｉａｎ（シチリア型サシチョウバエ熱）ウイルス、Ｓｎｏｗｓｈｏｅ ｈａｒｅ（カンジキウサギ）ウイルス、Ｓｉｃｉｌｉａｎ ｐｈｌｅｂｏ（シチリアフレボ）ウイルス、Ｓｐｕｍａｒｅｔｒｏ（スプマレトロ）ウイルス、Ｓａｐｐｏｒｏ（サッポロ）ウイルス、ＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（サーズ）ウイルス、ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａ（サーズコロナ）ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス、Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ（セムリキ森林）ウイルス、Ｓｅｏｕｌ（ソウル）ウイルス、Ｓｉｍｉａｎ ｆｏａｍｙ（シミアンフォーミー）ウイルス、Ｓｅａｄｏｒｎａ（‘Ｓｏｕｔｈ ｅａｓｔｅｒｎ Ａｓｉａ ｄｏｄｅｃａ ＲＮＡ）ウイルス、Ｓｉｍｉａｎ（シミアン）ウイルス、Ｓｉｎｄｂｉｓ（シンドビス）ウイルス、Ｓｐｕｍａ（スプマ）ウイルス、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（サザンプトン）ウイルス、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（セントルイス脳炎）ウイルス、Ｔａｃａｒｉｂｅ（タカリベ）ウイルス、Ｔａｍｉａｍｉ（タミアミ）ウイルス、Ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ Ｐｏｗａｓｓａｎ（ダニ媒介ポワッサン）ウイルス、Ｔｉｃｋ－ｂｏｒｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ダニ媒介脳炎）ウイルス、Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ（Ｔリンパ好性）ウイルス、Ｔｏｒｏ（トロ）ウイルス、Ｔｏｒｑｕｅ ｔｅｎｏ（トルクテノ）ウイルス、Ｔｈｏｇｏｔｏ（トゴト）ウイルス、Ｔｏｓｃａｎａ（トスカーナ）ウイルス、Ｕｕｋｕｎｉｅｍｉ（ウークニエミ）ウイルス、Ｖａｃｃｉｎｉａ（ワクシニア）ウイルス、Ｖａｒｉｃｅｌｌａ－ｚｏｓｔｅｒ（水痘・帯状疱疹）ウイルス、Ｖａｒｉｏｌａ（天然痘）ウイルス、Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（ベネズエラウマ脳炎）ウイルス、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ（水疱性口内炎）ウイルス、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ（西部ウマ脳炎）ウイルス、Ｗｅｓｔ ｎｉｌｅ（ウエストナイル）ウイルス、Ｗｈｉｔｅｗａｔｅｒ Ａｒｒｏｙｏ（ホワイトウォーター・アロヨ）ウイルス、ＷＵ ｐｏｌｙｏｍａ（ポリオーマ）ウイルス、Ｙａｂａ ｍｏｎｋｅｙ ｔｕｍｏｒ（ヤバサル腫瘍）ウイルス、Ｙａｂａ－ｌｉｋｅ ｄｉｓｅａｓｅ（ヤバ様疾患）ウイルス、Ｙｅｌｌｏｗ ｆｅｖｅｒ（黄熱）ウイルス、Ｖｅｓｉｃｕｌｏ（ベシクロ）ウイルス、Ｖａｒｉｃｅｌｌｏ（バリセロ）ウイルス及びＺｉｋａ（ジカ）ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0153】

具体的には、前記ウイルスとしては、Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ（エプスタイン・バール）ウイルス（ＥＢＶ）、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓウイルス、Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ヒト免疫不全）ウイルス（ＨＩＶ）、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（インフルエンザ）ウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａ（パピローマ）ウイルス、ＳＡＲＳ（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（サーズ）ウイルス、ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａ（サーズコロナ）ウイルス、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0154】

前記感染性疾患を引き起こす細菌は、グラム陰性細菌及び／又はグラム陽性細菌であるが、当該技術分野で公知の細菌であればいかなるものでもよい。

【0155】

例えば、前記細菌としては、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ（アクロモバクター）ｓｐｅｃｉｅｓ（ＳＰＰ）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ（アシネトバクター）ｓｐｐ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ（アクチノマイセス）ｓｐｐ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ（エロモナス）ｓｐｐ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ（アルテルナリア）ｓｐｐ、Ａｎｔｈｒａｘ（炭疽菌）ｓｐｐ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）ｓｐｐ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチルス）ｓｐｐ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（バクテロイデス）ｓｐｐ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ（バルトネラ）ｓｐｐ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ（ブルセラ）ｓｐｐ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ（ボレリア）ｓｐｐ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（ボルデテラ）ｓｐｐ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ（バークホルデリア）ｓｐｐ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（カンピロバクター）ｓｐｐ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ（カプノサイトファーガ）ｓｐｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ（クラミドフィラ）ｓｐｐ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ（クラミジア）ｓｐｐ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ（シトロバクター）ｓｐｐ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（クロストリジウム）ｓｐｐ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（コリネバクテリウム）ｓｐｐ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ（コクシエラ）ｓｐｐ、Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ（ジフテリア）ｓｐｐ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ（エールリキア）ｓｐｐ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）ｓｐｐ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（エンテロバクター）ｓｐｐ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（エンテロコッカス）ｓｐｐ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ（エリジペロスリックス）ｓｐｐ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ（エイケネラ）ｓｐｐ、Ｅｒｗｉｎｉａ（エルウィニア）ｓｐｐ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ（フランシセラ）ｓｐｐ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（フソバクテリウム）ｓｐｐ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ（ガードネレラ）ｓｐｐ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（ヘモフィルス）ｓｐｐ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ（ヘリコバクター）ｓｐｐ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ（クレブシエラ）ｓｐｐ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ（ラクトバチルス）ｓｐｐ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ（レジオネラ）ｓｐｐ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ（リステリア）ｓｐｐ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ（レプトスピラ）ｓｐｐ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ（ミクロコッカス）ｓｐｐ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ（モラクセラ）ｓｐｐ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ（モルガネラ）ｓｐｐ、Ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ（モニリフォルミス）ｓｐｐ、Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ（メニンゴコッカス）ｓｐｐ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（マイコバクテリウム）ｓｐｐ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（マイコプラズマ）ｓｐｐ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ（ナイセリア）ｓｐｐ、Ｎｏｃａｒｄｉａ（ノカルディア）ｓｐｐ、Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（パーツシス）ｓｐｐ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ（肺炎球菌）ｓｐｐ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）ｓｐｐ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ（パスツレラ）ｓｐｐ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ペプトストレプトコッカス）ｓｐｐ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ（フォトラブダス）ｓｐｐ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ（ポルフィロモナス）ｓｐｐ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（プロピオニバクテリウム）ｓｐｐ、Ｐｒｏｔｅｕｓ（プロテウス）ｓｐｐ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ（プロビデンシア）ｓｐｐ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（サルモネラ）ｓｐｐ、Ｓｅｒｒａｔｉａ（セラチア）ｓｐｐ、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ（スピロプラズマ）ｓｐｐ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（赤痢菌）ｓｐｐ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（ブドウ球菌）ｓｐｐ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ（ステノトロホモナス）ｓｐｐ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ストレプトコッカス）ｓｐｐ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ（トレポネーマ）ｓｐｐ、Ｖｉｂｒｉｏ（ビブリオ）ｓｐｐ、Ｗｏｌｂａｃｈｉａ（ボルバキア）ｓｐｐ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ（ゼノラブダス）ｓｐｐ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ（エルシニア）ｓｐｐなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0156】

例えば、前記細菌としては、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｊｕｎｉｌ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｊｏｈｎｓｏｎｉｌ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｖｅｒｏｎｏｌ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃｕｓ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｃｈｏｍｅｌｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｃａｎｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ａｆｚｅｌｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｇａｒｉｎｉｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ（ボルデテラ） ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍｉｍｏｓａｒｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｉｄｉｓｏｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｉｄｉｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂａｒｔｌｅｔｔｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｏｂｉｏｐａｒｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｉｔｒｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｌａｒｉｆｌａｖｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｏｃｌｅａｔｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｒａｎｏｎｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｉｒｒｅｇｕｌａｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒｅｔｕｒｎ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｄｉｇｅｎｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｐｐｅｎｄｉｃｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ａｌｂｅｒｔｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｉｎｏｐｉｎａｔａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｂｒａｎｔａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｂｒｕｎｅｎｓｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｄｒａｎｃｏｕｒｔｉｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｄｒｏｚａｎｓｋｉｌ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｉｍｐｌｅｔｉｓｏｌｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｌｅｘａｎｄｅｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｍｅｙｅｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｗｏｌｂａｃｈｉｌ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｂｓｃｅｓｓｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｕｒｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｕｍａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｏｒｉｏｋａｅｎｓｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｌｌｅｎｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｓｃｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｎｏｖａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｅｓｃｈｌｉｍａｎｎｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｓｉａｔｉｃａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｍｏｎｔａｎｅｎｓｉｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒａｏｕｌｔｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｐｏｕｌｓｏｎｉｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ ｇｒｏｕｐ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ｇｒｏｕｐｓ Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｇ，Ｆ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ａｚｏｔｏｎｕｔｒｉｃｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｂｅｒｌｉｎｅｎｓｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｒｉｍｉｔｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ、Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0157】

具体的には、前記細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ストレプトコッカス）属などに属する細菌であり、より具体的には、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなどであるが、これらに限定されるものではない。前記Ｅ．ｃｏｌｉには、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ．Ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｉｎｖａｓｉｖｅ Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ．Ｃｏｌｉなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0158】

前記感染性疾患を引き起こすカビの例としては、Ａｂｓｉｄｉａ（ユミケカビ）ｓｐｐ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ（アルタナリア）ｓｐｐ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）ｓｐｐ、Ａｓｃｏｓｐｈａｅｒａ（アスコスフェラ）ｓｐｐ、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ（アジェロミセス）ｓｐｐ、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ（バシディオボルス）ｓｐｐ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ（担子菌）ｓｐｐ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ（ビポラリス）ｓｐｐ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ（ブラストミセス）ｓｐｐ、Ｂａｔｒａｃｈｏｃｈｙｔｒｉｕｍ（カエルツボカビ）ｓｐｐ、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ（ボーベリア）ｓｐｐ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ（ヤケイロタケ）ｓｐｐ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ（ボトリチス）ｓｐｐ、Ｂｌｕｍｅｒｉａ（ブルメリア）ｓｐｐ、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）ｓｐｐ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ（ササクレヒトヨタケ）ｓｐｐ、Ｃｈｒｏｍｏｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ（クロモブラストミコーシス）ｓｐｐ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ（クラドスポリウム）ｓｐｐ、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ（クラドフィアロフォラ）ｓｐｐ、Ｃｈａｅｏｔｏｍｉｕｍ（ケトミウム）ｓｐｐ、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ（コニディオボラス）ｓｐｐ．Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ（コクシジオイデス）ｓｐｐ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ（コレトトリカム）ｓｐｐ、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ（ノムシタケ）ｓｐｐ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（クリプトコッカス）ｓｐｐ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ（クスダマカビ）ｓｐｐ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ（カーブラリア）ｓｐｐ、Ｄａｃｔｙｌａｒｉａ（ダクティラリア）ｓｐｐ、Ｄａｃｒｙｍｙｃｅｓ（アカキクラゲ）ｓｐｐ、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ（エピデルモフィトン）ｓｐｐ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ（エクソフィアラ）ｓｐｐ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（フザリウム）ｓｐｐ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ（ゲオトリクム）ｓｐｐ、Ｇｅｏｍｙｃｅｓ（ジオミセス）ｓｐｐ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ（ヒストプラズマ）ｓｐｐ、Ｌａｃａｚｉａ（ラカジア）ｓｐｐ、Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ（ラシオジプロジア）ｓｐｐ、Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ（レプトスフェリア）ｓｐｐ、Ｌｏｍｅｎｔｏｓｐｏｒａ（ロメントスポラ）ｓｐｐ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ（マラセチア）ｓｐｐ、Ｍａｄｕｒｅｌｌａ（マズレラ）ｓｐｐ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ（マグナポルテ）ｓｐｐ、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ（メタリジウム）ｓｐｐ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ（ミクロスポルム）ｓｐｐ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ（ミコスフェレラ）ｓｐｐ、Ｍｅｍｎｏｎｉｅｌｌａ（メムノニエラ）ｓｐｐ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ（メランプソラ）ｓｐｐ、Ｍｕｃｏｒ（ムコール）ｓｐｐ、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（ムコラレス）ｓｐｐ、Ｍｕｃｏｒｍｙｃｅｔｅｓ（ムコルマイセテス，Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）ｓｐｐ、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ（ミロテシウム）ｓｐｐ、Ｎｅｃｔｒｉａ（アカツブタケ）ｓｐｐ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ（パラコクシジオイデス）ｓｐｐ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ（アオカビ）ｓｐｐ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ（ニューモシスチス）ｓｐｐ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ（プクシニア）ｓｐｐ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ（シュードアレシェリア）ｓｐｐ、Ｐｙｔｈｉｕｍ（ピシウム）ｓｐｐ、Ｒａｍｉｃｈｌｏｒｉｄｉｕｍ（ラミクロリジウム）ｓｐｐ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ（クモノスカビ）ｓｐｐ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ（リゾクトニア）ｓｐｐ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（サッカロマイセス）ｓｐｐ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ（スケドスポリウム）ｓｐｐ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ（ソドスポリウム）ｓｐｐ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ（スエヒロタケ）ｓｐｐ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ（キンカクキン）ｓｐｐ、Ｓｃｏｐｕｌａｒｉｏｐｓｉｓ（スコプラリオプシス）ｓｐｐ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ（シタリジウム）ｓｐｐ、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ（スタキボトリス）ｓｐｐ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｘ（スポロトリックス）ｓｐｐ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ（セプトリア）ｓｐｐ、Ｓｙｎｃｅｐｈａｌａｓｔｒｕｍ（ハリサシカビモドキ）ｓｐｐ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ（タラロマイセス）ｓｐｐ、Ｔｒｅｍｅｌｌａ（シロキクラゲ）ｓｐｐ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ（トリコフィトン）ｓｐｐ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ（トリコスポロン）ｓｐｐ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（トリコデルマ）ｓｐｐ、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ（ウロクラジウム）ｓｐｐ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ（ウスチラゴ）ｓｐｐ、Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ（ジモセプトリア）ｓｐｐなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0159】

例えば、前記カビとしては、Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｌｔｅｒｎａｔｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｒａｎａｒｕｍ、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｐｉｃｉｆｅｒａ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｇｉｌｃｈｒｉｓｔｉｉ、Ｂａｔｒａｃｈｏｃｈｙｔｒｉｕｍ ｄｅｎｄｒｏｂａｔｉｄｉｓ、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ ｂａｓｓｉａｎａ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｂｌｕｍｅｒｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｕｒｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｉｌｖａｔｉｖａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｈｅｒｂａｒｕｍ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｐｈｏｒａ ｂａｎｔｉａｎｕｍ、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｃｏｒｏｎａｔｕｓ、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｉｎｃｏｎｇｒｕｕｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｐｏｓａｄａｓｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｔｔｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａｅ、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｌｕｎａｔａ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｊｅａｎｓｅｌｍｅｉ、Ｅｘｏｐｈｉａｌａ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、Ｄａｃｔｙｌａｒｉａ ｇａｌｌｏｐａｖａ、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ、Ｇｅｏｍｙｃｅｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｌａｃａｚｉａ ｌｏｂｏｉ、Ｌｏｍｅｎｔｏｓｐｏｒａ ｐｒｏｌｉｆｉｃａｎｓ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｏｒｙｚａｅ、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ、Ｍｅｌａｍｐｓｏｒａ ｌｉｎｉ、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ、Ｍｕｃｏｒ ｍｕｃｅｄｏ、Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｌｕｔｚｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｒｙｌｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｅｘｐａｎｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｅｌｌｕｔａｎｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｉｎｕｌｏｓｕｍ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｍｕｒｉｎａ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ ｂｏｙｄｉｉ、Ｐｙｔｈｉｕｍ ｄｅｂａｒｙａｎｕｍ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｎａｍｏｒｐｈｓ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｍｕｍ、Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｉｃａｎｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ Ａｍｅｒｉｃａｎａ、Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ ｃｈａｒｔａｒｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｉｎｔｅｒｄｉｇｉｔａｌｅ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ａｓａｈｉｉ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｉｇｎｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｚｙｍｏｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0160】

具体的には、前記カビは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）、Ｃａｎｄｉｄａ（カンジダ）、Ａｂｓｉｄｉａ（ユミケカビ）、Ｍｕｃｏｒ（ムコール）、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ（クモノスカビ）属などに属するカビであり、より具体的には、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アブシジア・コリムビフェラ（Ａｂｓｉｄｉａ ｃｏｒｙｍｂｉｆｅｒａ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコール・ムセド（Ｍｕｃｏｒ ｍｕｃｅｄｏ）、ムコール・プシラス（Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）などであるが、これらに限定されるものではない。

【0161】

本発明の組成物は、本発明の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞を含むことにより、感染性疾患及び／又は前記感染性疾患から起こる炎症性疾患に対する予防又は治療効能を発揮するものであってもよい。

【0162】

本発明の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞は、様々なウイルスに対して抗ウイルス効果を発揮する。

【0163】

本発明の一実施例において、ＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫの抗ウイルス効果を確認するために、ウイルスに感染していないＢ－ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｒａｍｏｓ及びＥＢＶに感染したＢ－ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｒａｊｉ細胞に対する細胞殺傷能及びＣＤ１０７ａ^＋細胞を測定した結果、対照群細胞ＮＫ－９２及びＰＢＭＣ－ＮＫに比べて、ＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫにおいてＲａｍｏｓよりＥＢＶに感染したＲａｊｉ細胞に対する殺傷毒性が高いことが確認された（図１７ａのＡ及び図１７ａのＢ）。

【0164】

また、ＥＢＶを含むＲａｊｉ細胞を、レンチウイルスによりＧＦＰを発現するように形質転換してＧＦＰ－Ｒａｊｉ細胞を確保し、その後ＧＦＰ－ＲａｊｉとＮＫ細胞の共培養後に残存するＥＢＶ特異遺伝子であるＬＭＰ－１（Ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）の発現量を測定した結果、共培養していない対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、ＮＫ細胞とＧＦＰ－Ｒａｊｉ細胞を共培養すると、ＧＦＰに比べてＬＭＰ－１の発現の程度が減少することが確認され、ＬＭＰ－１発現減少の程度は、対照群ＮＫ－９２及びＰＢＭＣに比べて、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞において高いことが確認された（図１７ａのＣ）。

【0165】

本発明の他の実施例において、ｄｒＮＫ細胞は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａウイルス、Ｈｅｐａｔｉｔｉｓウイルスに感染した各ＣＥＭ Ｔ細胞、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、ＨＫ２近位尿細管細胞、ＳＮＵ４４９肝細胞に対して、対照群細胞ＮＫ－９２と比較して、低いＥ：Ｔ比においても高い殺傷能（図１７ｂのＤ）と高いＣＤ１０７ａ^＋発現細胞頻度を示すことが確認された（図１７ｂのＥ）。

【0166】

本発明のさらに他の実施例において、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞との共培養は、陽性対照群（ＰＭＢＣ－ＮＫ細胞）に比べて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した細胞の死滅を増加させることが確認された（図１８）。

【0167】

よって、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞に比べて、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスに対して顕著な抗菌効能を示すことが確認された。

【0168】

本発明の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞は、様々な細菌に対して抗菌効果を発揮する。

【0169】

本発明の一実施例において、ｄｒＮＫ細胞のグラム陰性細菌である大腸菌に対する殺傷効果を共培養後のＥ．ｃｏｌｉのコロニー数（図１９のＡ）とＣＤ１０７ａ^＋発現細胞頻度（図１９のＢ）により確認した結果、ｄｒＮＫは、ＮＫ－９２、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞に比べて、抗菌効能が高いことが確認された。

【0170】

本発明の他の実施例において、ｄｒＮＫ細胞のグラム陽性細菌であるレンサ球菌に対する抗菌効果を共培養後のＣＤ１０７ａ^＋発現細胞頻度により確認した結果、ｄｒＮＫは、ＮＫ－９２細胞に比べて、抗菌効能が高いことが確認された（図１９のＣ）。

【0171】

よって、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞に比べて、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に対して顕著な抗菌効能を示すことが確認された。

【0172】

本発明の方法により製造されたｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞は、様々なカビに対して抗カビ効果を発揮する。

【0173】

本発明の一実施例において、ｄｒＮＫ細胞のカンジダカビの一種であるカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ Ａｌｂｉｃａｎｓ）に対する抗カビ効果を共培養後のＣＤ１０７ａ^＋発現細胞頻度（図２０）により確認した結果、ｄｒＮＫは、ＮＫ－９２及びＰＢＭＣ－ＮＫ細胞に比べて、抗カビ効能が高いことが確認された。

【0174】

本発明の他の実施例において、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞と陽性対照群（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞）の全てがアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対して抗カビ活性を示し、特にｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は抗カビ活性に最も優れることが確認された（図２１）。

【0175】

前記細胞治療剤組成物、前記組成物中のｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の含有量、細胞治療剤組成物の投与量などについては前述した通りである。

【0176】

本発明のさらに他の態様は、本発明の方法により製造された細胞を有効成分として含む、感染性疾患及び／又は炎症性疾患の予防又は治療用薬学組成物を提供する。

【0177】

ここで用いる用語については前述した通りである。

【0178】

前記薬学組成物、前記組成物中のｄｒＮＫ細胞及び／又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の含有量、細胞治療剤組成物の投与量などについては前述した通りである。

【0179】

本発明のさらに他の態様は、前記細胞治療剤組成物又は薬学組成物をヒト以外の個体に投与するステップを含む、感染性疾患及び／又は炎症性疾患の治療方法を提供する。

【0180】

ここで用いる用語については前述した通りである。

【0181】

本発明のさらに他の態様は、ａ）ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｉＲＮＡ、又はｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂを入れた第１容器と、ｂ）本発明の第１培地を入れた第２容器と、ｃ）本発明の第２培地を入れた第３容器とを含む、ｄｒＮＫ細胞又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞製造用の直接細胞転換誘導培地キットを提供する。

【0182】

ここで用いる用語については前述した通りである。

【0183】

本発明のキットとは、前記ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｉＲＮＡ、又はｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂを入れた第１容器と、本発明の第１培地を入れた第２容器と、本発明の第２培地を入れた第３容器とを含み、ｄｒＮＫ細胞又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞製造用のダイレクトリプログラミング培地として用いられるツールを意味する。前記キットは、特にその種類が限定されるものではなく、当該技術分野で通常用いられる形態のキットが用いられる。

【0184】

本発明の前記キットは、前記ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｉＲＮＡ、又はｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂと、第１培地と、第２培地とがそれぞれ個別容器に入った形態であってもよく、１つ以上の区画に分けられた１つの容器に入った形態で包装されていてもよく、また、前記ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ、又はｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂと、第１培地と、第２培地は、それぞれ１回投与用の単位用量の形態で包装されていてもよい。

【0185】

前記キット中の前記ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｉＲＮＡ、又はｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂと、第１培地と、第２培地は、当業者の実験計画に基づいて適切な時期に順次投与する。

【0186】

本発明の前記キットは、前記ｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｈＲＮＡ、ｉｉ）ＢＣＬ１１Ｂ ｓｉＲＮＡ、又はｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ－ＢＣＬ１１Ｂと、第１培地と、第２培地の各添加量、添加方法、添加頻度などを記載した使用説明書をさらに含んでもよい。
［実施例］

【0187】

以下、実施例を挙げて本発明の構成及び効果をより詳細に説明する。これらの実施例はあくまで本発明を例示するものにすぎず、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］

【0188】

ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫの製造及びＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ）細胞特異的マーカーの発現の検証
１－１．ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫの製造
細胞におけるＢＣＬ１１Ｂ（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ １１Ｂ）遺伝子発現抑制による直接細胞転換を誘導するために、体細胞に細胞転換を誘導するリプログラミング因子としてＢＣＬ１１Ｂに対するｓｈＲＮＡ（Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ）又はｓｉＲＮＡを導入した。

【0189】

具体的には、体細胞としての末梢血液単核細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ：ＰＢＭＣ）を、リプログラミング因子として７種のｓｈＢＣＬ１１Ｂ（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃１、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃２、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃３、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃４、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃５、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃６及びｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃７）をそれぞれ発現するレンチウイルス、又は４種のｓｉＲＮＡ（ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ａ、ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｂ、ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｃ及びｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｄ）で処理し、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ又はｓｉＲＮＡ（図４のＡ）を導入することにより、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を製造した。

【0190】

ｓｈＢＣＬ１１Ｂを発現するレンチウイルス７種をＰＢＭＣ細胞に導入するために、４８ウェルプレートに２×１０^５個のＰＢＭＣ細胞を接種し、前記レンチウイルス３ＭＯＩと、４μｇ／ｍｌのポリブレン又は６μＭのＢｘ７９５で処理し、次いでＲＰＭＩ培地で１６時間培養し、その後新鮮な培地に交換し、ＰＢＭＣ細胞を形質転換した。

【0191】

ｓｉＲＮＡ ４種をＰＢＭＣ細胞に導入するために、４８ウェルプレートに２×１０^５個のＰＢＭＣ細胞を入れ、製造業者の指針に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いて、１００ｎＭ ｓｉＲＮＡで処理し、ＰＢＭＣ細胞を形質転換した。

【0192】

翌日、前述したように形質転換した細胞２×１０^５個を４８ウェルプレートに接種し、ＧＳＫ３β（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ ３β）阻害剤（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含む第１培地（３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＴ９９０２１）、１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌヒトＦＬＴ３Ｌ（ＦＭＳ－ｌｉｋｅ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｇａｎｄ）、２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－７、２００ＩＵ／ｍｌヒトＩＬ－２及び２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１５を含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩ）で６日間培養し、その後ＡＨＲ（Ａｒｙｌ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）阻害剤を含む第２培地（１０％ＦＢＳ，１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌヒトＦＬＴ３Ｌ、２００ＩＵ／ｍｌヒトＩＬ－２、２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－７、２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１５、２ｕＭステムレゲニンＩ（ＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ Ｉ、ＳＲ１）を含むＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩ）で１１日間培養した。

【0193】

前述したようなｓｈＢＣＬ１１Ｂ導入及び体細胞直接細胞転換によるｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ製造方法の模式図を図１のＡ及び図４のＢに示す。

【0194】

１－２．ＮＫ細胞製造収率の確認
実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞が生産されたか否か、及び収率を確認するために、ＣＤ５６抗体及びＣＤ３抗体で前記細胞を染色し、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて、ＮＫ細胞群（ＣＤ５６^＋及びＣＤ３^－）の比率を分析した。

【0195】

その結果、ＮＫ細胞（ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－）は、対照群において、それぞれ２．１％（Ｎｏ－ｔｒｅａｔｅｄ）、０．２％（ｓｈ－Ｃｏｎｔｒｏｌ）の割合で存在するのに対して、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃１、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃２、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃３、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃４、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃５、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃６、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃７、ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ａ、ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｂ、ｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｃ又はｓｉＢＣＬ１１Ｂ－Ｄを導入又は形質転換して製造したｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞においては、それぞれ７６．１％、９０．４％、８５．１％、７２．６％、９１．７％、７７．９％、９０．３％、５７．１％、４８．７％、３８．２％又は４２．３％の割合で存在し、細胞にｓｈＢＣＬ１１Ｂ又はｓｉＲＮＡを導入すると、高い効率でＮＫ細胞が製造されることが確認された（図４のＣ）。

【0196】

１－３．ＮＫ特異的マーカーの発現特性の検証
実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞のＮＫ特異的マーカーの発現特性を検証するために、ＮＫ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いたＭＡＣＳ（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）法によりＮＫ細胞のみを回収し、フローサイトメトリーを用いて、ＮＫ細胞に関連する活性化受容体（ＣＤ１６、ＣＤ６９、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＤＮＡＭ－１）又は抑制受容体（ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２及びＫＩＲ３ＤＬ１）の発現パターンを分析した。

【0197】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞において、ＣＤ１６、ＣＤ６９、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１などの活性化受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ１などの抑制受容体に比べて、高い頻度で発現することが確認された（図６）。

【0198】

よって、ｓｈＢＣＬ１１Ｂを用いた体細胞直接細胞転換により体細胞がＮＫ細胞（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）に転換されたことが確認された。
［実施例２］

【0199】

ＣＡＲ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫの製造及びＮＫ特異的マーカーの発現特性の検証
２－１．ＣＡＲ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫの製造
細胞にｓｈＢＣＬ１１Ｂ及びＣＡＲ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子を同時に導入し、ＣＡＲ遺伝子を発現するＣＡＲ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を作製した。

【0200】

具体的には、ＭＳＬＮ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）に特異的なＭＳＬＮ－ＣＡＲをコードするバイシストロン性レンチウイルスベクター遺伝子を作製した（図２２）。ＭＳＬＮ－ＣＡＲ遺伝子は、ＣＤ８リーダー（Ｌｅａｄｅｒ）（配列番号１４）と、ＭＳＬＮ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ） ｓｃＦｖ（配列番号１６）と、ＣＤ８ヒンジ（配列番号１８）と、ＣＤ８膜貫通ドメイン（配列番号１９）と、ＣＤ２８細胞内ドメイン（配列番号２１）と、ＣＤ３ζ（配列番号２２）と、ＩＲＥＳ（配列番号２３）と、ＧＦＰ（配列番号２４）とを含む（図３のＡ）。

【0201】

ＰＢＭＣ細胞を、Ｄａｙ０にｓｈＢＣＬ１１Ｂ＃２を発現するレンチウイルスで形質転換し、Ｄａｙ０、Ｄａｙ６、Ｄａｙ１２及びＤａｙ１８にＭＳＬＮ－ＣＡＲ遺伝子を発現するレンチウイルスで形質転換した。ここで、Ｄａｙ０からＤａｙ１８までの細胞培養は、実施例１－１と同様に、Ｄａｙ０からＤａｙ７までは第１培地、その後は第２培地で培養し、ＭＳＬＮ－ＣＡＲ遺伝子を発現するｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）を製造した（図１１のＡ）。

【0202】

前述したようなｓｈＢＣＬ１１Ｂ及びＣＡＲ遺伝子導入並びに体細胞直接細胞転換によるＣＡＲ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ製造方法の模式図を図１のＢ及び図１１のＡに示す。

【0203】

２－２．ＮＫ細胞製造収率の確認
実施例２－１のＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞が生産されたか否か、及び収率を確認するために、ＣＤ５６抗体及びＭＳＬＮ－ＣＡＲ抗原で前記細胞を染色し、その後フローサイトメトリーを用いて、ＮＫ細胞群（ＣＤ５６^＋及びＭＳＬＮ－ＣＡＲ^＋）の比率を分析した。

【0204】

その結果、ＣＤ５６^＋ＭＳＬＮ^＋（ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）細胞は、Ｄａｙ０（４．９％）、Ｄａｙ６（１３．１％）、Ｄａｙ１２（９．９％）及びＤａｙ１８（８．８％）に形質転換された細胞のうち、Ｄａｙ６に形質転換された細胞群において、最も高い効率で製造されたことが確認された（図１１のＢ）。

【0205】

２－３．ＮＫ特異的マーカーの発現特性の検証
実施例２－１のＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞のＮＫ特異的マーカーの発現特性を検証するために、実施例１－３と同様に、ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の様々なナチュラルキラー細胞に関連する活性化及び抑制受容体の発現パターンをフローサイトメトリーにより分析した。

【0206】

その結果、製造したＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫにおいて、ＣＤ１６、ＣＤ６９、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１などの活性化受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ１などの抑制受容体に比べて、高い頻度で発現し（図１２）、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫに類似した様相を呈することが確認された。
［実施例３］

【0207】

ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ９を用いたｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫの製造及びＮＫ特異的マーカーの発現特性の検証
３－１．ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫの製造
細胞におけるＢＣＬ１１Ｂ（Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ／Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１Ｂ）遺伝子発現抑制による直接細胞転換を誘導するために、細胞転換誘導因子として遺伝子はさみＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ）を導入した市販のレンチウイルスベクター（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ，ＣＡＴ＃：Ｋ００１３１０５）を用いた。

【0208】

本実施例のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて、ｓｇＲＮＡには、前記市販のレンチウイルスベクターセットにおけるｓｇＲＮＡ－Ａ、ｓｇＲＮＡ－Ｂ又はｓｇＲＮＡ－Ｃが含まれる。

【0209】

具体的には、ＰＢＭＣ細胞をリプログラミング因子により形質転換するために、ｓｇＲＮＡ－Ａ、ｓｇＲＮＡ－Ｂ又はｓｇＲＮＡ－Ｃを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ベクターを発現するレンチウイルス３ＭＯＩ、ＰＢＭＣ細胞及びポリブレン（４μｇ／ｍｌ）を共に１６時間培養し、その後新鮮な培地に交換し、ＰＢＭＣ細胞を形質転換した。その後、Ｄａｙ０からＤａｙ１８までの細胞培養は、実施例１－１と同様に、Ｄａｙ０からＤａｙ７までは第１培地、その後は第２培地で培養し、直接細胞転換誘導ｄｒＮＫ細胞（ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）を製造した（図１３のＡ）。

【0210】

遺伝子はさみＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９導入及び体細胞ダイレクトリプログラミングによるｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ製造方法の模式図を図２のＡ及び図１３のＡに示す。

【0211】

３－２．ＮＫ細胞製造収率の確認
実施例３－１のｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞が生産されか否か、及び収率を確認するために、ＣＤ５６抗体及びＣＤ３抗体で前記細胞を染色し、その後フローサイトメトリーを用いて、ＮＫ細胞群（ＣＤ５６^＋及びＣＤ３^－）の比率を分析した。

【0212】

その結果、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－（ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）細胞は、非処理群が６．０％であったのに対して、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ処理群において、それぞれ８３．９％（ｓｇＲＮＡ－Ａ）、７２．２％（ｓｇＲＮＡ－Ｂ）、７２．０％（ｓｇＲＮＡ－Ｃ）の効率で製造されたことが確認された（図１３のＢ）。

【0213】

３－３．ＮＫ特異的マーカーの発現特性の検証
実施例３－１のｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞のＮＫ特異的マーカーの発現特性を検証するために、実施例１－３と同様に、ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の様々なナチュラルキラー細胞に関連する活性化及び抑制受容体の発現パターンをフローサイトメトリーにより分析した。

【0214】

その結果、製造したｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞において、ＣＤ１６、ＣＤ６９、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１などの活性化受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ１などの抑制受容体に比べて、高い頻度で発現し（図１４）、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫに類似した様相を呈することが確認された。

【0215】

よって、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡを導入すると、ｓｈＢＣＬ１１Ｂと同様のｄｒＮＫが製造されることが確認された。
［実施例４］

【0216】

ＣＡＲ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫの製造及びＮＫ特異的マーカーの発現特性の検証
４－１．ＣＡＲ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫの製造
細胞にＣａｓ９、ｓｇＲＮＡ及びＣＡＲ遺伝子を同時に導入し、ＣＡＲ遺伝子を発現するＣＡＲ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を作製した。

【0217】

本実施例のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにおいて、ｓｇＲＮＡには、ＢＣＬ１１Ｂを含むゲノム配列（ＮＣ＿００００１４．９）由来のＥｘｏｎ１（ＢＣＬ１１Ｂ－ｅｘ１）をターゲットとする表１のｓｇＲＮＡ＃１（ｆｏｒｗａｒｄ）及びｓｇＲＮＡ＃２（ｒｅｖｅｒｓｅ）が含まれる。

【0218】

【表1】

【0219】

具体的には、ＣＡＲをコードする配列がＢＣＬ１１Ｂ Ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ（ＫＯ）と同時に切断部位に挿入されてＫｎｏｃｋ－ｉｎ（ＫＩ）されるｄｏｎｏｒプラスミドを作製するために、ＢＣＬ１１Ｂ－ｅｘｏｎ１を中心として、イントロン部分にそれぞれ右ホモロジーアーム（Ｒｉｇｈｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ，ＲＨＡ）６００ｂｐ（ＮＣ＿００００１４．９における９９２７０５６１－９９２７１１６０塩基配列）（配列番号２５）と左ホモロジーアーム（Ｌｅｆｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ，ＬＨＡ）６００ｂｐ（ＮＣ＿００００１４．９における９９２７１２１９－９９２７１８１８塩基配列）（配列番号２６）を選定し、ＬＨＡとＲＨＡ間にＳＥＦＶプロモーター（配列番号２７）及びｐｏｌｙＡシグナル（配列番号２８）を含むＣＡＲプラスミドを作製した（図２３）。その後、ｐＪＥＰ３００－ｐＡＡＶ－ＣＭＶ－ＭＣＳ２－ｐＡにおいて、１５０－７８７ｂｐ部位を除去した部位にＭＳＬＮ－ＣＡＲプラスミドの２７０７－５７４０ｂｐ部位を挿入し、ＣＡＲ－ＡＡＶを作製した（図３のＢ，図２４）。

【0220】

ＰＢＭＣ細胞をＲＰＭＩ培地で１日間培養し、その後実験開始１日前（Ｄａｙ－１）に、ＭＳＬＮ－ＣＡＲをコードするＣＡＲ－ＡＡＶ（１ＭＯＩ）で処理し、形質転換した。２４時間後となるＤａｙ０に、ＡＡＶで処理したＰＢＭＣ １×１０^６個にｓｇＲＮＡ＃１及びｓｇＲＮＡ＃２を含むプラスミドベクターをエレクトロポレーション（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）し、さらに形質転換した。形質転換した細胞をＲＰＭＩ培地で１日間培養し、次いで５×１０^５個の細胞を、実施例１－１と同様に、Ｄａｙ６までは第１培地、その後は第２培地で培養し、ＣＡＲ（ＭＳＬＮ－ＣＡＲ）遺伝子を発現する直接細胞転換誘導ｄｒＮＫ細胞（ＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）を製造した（図１５のＡ及び図１５のＢ）。

【0221】

Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ及びＣＡＲ遺伝子導入及び体細胞ダイレクトリプログラミングによるＣＡＲ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ製造方法の模式図を図２のＢ及び図１５のＡに示す。

【0222】

４－２．ＮＫ細胞製造収率の確認
実施例４－１のＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞が生産されたか否か、及び収率を確認するために、ＣＤ５６抗体、ＣＤ３抗体及びＭＳＬＮ－ＣＡＲ抗原で前記細胞を染色し、その後フローサイトメトリーを用いて、ＮＫ細胞群（ＣＤ５６^＋、ＣＤ３^－及びＭＳＬＮ－ＣＡＲ^＋）の比率を分析した。

【0223】

その結果、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－細胞群が２２．８％であったのに対して、ＣＤ５６^＋ＭＳＬＮ^＋細胞群は１７．３％の効率で製造されたことが確認された（図１５のＣ）。

【0224】

次に、ＣＡＲ遺伝子がｄｒＮＫ細胞ゲノムに挿入されたか否かをＰＣＲ分析により確認した。

【0225】

具体的には、ゲノムＤＮＡをＬＨＡより前の配列に対するプライマー（配列番号２９）及びＳＦＦＶプロモーターに対するプライマー（配列番号３０）によりＰＣＲを行った。各細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出するために、ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ，ｃａｔ．ｎｏ．６９５０４）を用いて、製造業者のプロトコルに従って全ＤＮＡを抽出し、その後各サンプル当たりｇＤＮＡ ２００ｎｇ、２ｘ Ｐｒｅｍｉｘ（ＥｍｅｒａｌｄＡｍｐ ＧＴ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ，ＴＡＫＡＲＡ，ｃａｔ．ｎｏ．ＲＲ３１０Ａ）及びターゲットプライマーを混合して全２０ｕｌの反応溶液を作製した。これに対して、９５℃で１０分間の変性後、９５℃で３０秒間、５７℃で４０秒間、７２℃で１分間を４０サイクル行い、７２℃で５分間伸長し、ＰＣＲを行った。反応したＰＣＲ生産物を１％アガローズゲルで電気泳動した。

【0226】

ここで用いたプライマー配列を表２に示す。

【0227】

【表2】

【0228】

その結果、ＣＡＲ遺伝子がｄｒＮＫ細胞ゲノムに挿入（ＣＡＲ Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ，ＣＡＲ－ＫＩ）されたことが確認された（図１５のＤ）。

【0229】

よって、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ及びＣＡＲ遺伝子を同時に導入してＣＡＲ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を作製すると、ＣＡＲ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫに比べて、ｄｒＮＫ細胞の製造収率は低いが、ＢＣＬ１１Ｂが位置するゲノムにのみ特異的にＣＡＲ遺伝子を挿入することができるので、レンチウイルスによる遺伝子変化の可能性を最小限に抑えることができることが確認された。
［実施例５］

【0230】

培地構成要素がｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ製造収率に及ぼす影響
５－１．第１培地の構成によるｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ製造収率
実施例１－１と同様に、ＰＢＭＣにＢＣＬ１１Ｂに対するｓｈＲＮＡ♯２を導入し、その後それを、第１培地（陽性対照群）、又は第１培地を構成する要素において２００ＩＵ／ｍｌヒトＩＬ－２、２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１５及び３ｕＭ ＣＨＩＲ９９０２１からなる群から選択されるいずれか１つを欠乏させた培地、もしくは６μＭ ＢＸ７９５を追加した培地で６日間培養し、次いで第２培地で１２日間培養した。

【0231】

前記培養によりＮＫ細胞が製造されたか否かを確認するために、ＣＤ５６抗体及びＣＤ３抗体で前記細胞を染色し、その後フローサイトメトリーを用いて、ｄｒＮＫ細胞群（ＣＤ５６^＋及びＣＤ３^－）の比率を分析した。

【0232】

その結果、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）細胞は、第１培地で培養した陽性対照群（１００％）を基準として、ＩＬ－２を欠乏させた培地で培養した細胞群は４３％、ＩＬ－１５を欠乏させた培地で培養した細胞群は７５％、ＣＨＩＲ９９０２１を欠乏させた培地で培養した細胞群は９２％、ＢＸ７９５を追加した培地で培養した細胞群は１１３％の効率で製造されたことが確認された（図５のＡ）。

【0233】

５－２．第２培地の構成によるｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ製造収率
実施例１－１と同様に、ＰＢＭＣにＢＣＬ１１Ｂに対するｓｈＲＮＡ＃２を導入し、その後それを第１培地で６日間培養し、次いで第２培地（陽性対照群）、又は第２培地を構成する要素において２００ＩＵ／ｍｌヒトＩＬ－２、２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－７、２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１５、２０ｎｇ／ｍｌヒトＦＬＴ３Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌヒトＳＣＦ及び２ｕＭ ＳＲ１からなる群から選択されるいずれか１つを欠乏させた培地で１２日間培養した。

【0234】

前記培養によりＮＫ細胞が製造されたか否かを確認するために、ＣＤ５６抗体及びＣＤ３抗体で前記細胞を染色し、その後フローサイトメトリーを用いて、ｄｒＮＫ細胞群（ＣＤ５６^＋及びＣＤ３^－）の比率を分析した。

【0235】

その結果、ＣＤ５６^＋ＣＤ３^－（ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）細胞は、第２培地で培養した陽性対照群（１００％）を基準として、ＩＬ－２を欠乏させた培地で培養した細胞群は５６％、ＩＬ－１５を欠乏させた培地で培養した細胞群は６９％、ＩＬ－７を欠乏させた培地で培養した細胞群は８２％、ＳＣＦを欠乏させた培地で培養した細胞群は８１％、ＦＬＴ３Ｌを欠乏させた培地で培養した細胞群は３８％、ＳＲ１を欠乏させた培地で培養した細胞群は５７％の効率で製造されたことが確認された（図５のＢ）。
［実施例６］

【0236】

ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の効能の検証
６－１．ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の癌細胞殺傷能の測定
実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ｓｈＲＮＡ＃２）細胞の癌細胞殺傷能を測定するために、カルセイン－ＡＭ（Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ）を用いた癌細胞殺傷能測定法を行った。

【0237】

具体的には、癌細胞としてのＲａｊｉ（Ｈｕｍａｎ Ｂ－ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ＨＣＴ１１６（ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、ＳＮＵ－８１７（Ｂ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、ＨｅｐＧ２（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、ＮＣＩＨ４６０（Ｈｕｍａｎ Ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、Ｍｉａ－ｐａｃａ－２（ｈｙｐｏｔｒｉｐｌｏｉｄ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、Ｕ３７３ＭＧ（Ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、ＳＷ６２０（ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、ＳＫ－ＯＶ－３（ｈｕｍａｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、ＭＣＦ７（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、ＰＣ－３（ｈｕｍａｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、ＳＫ－ＭＥＬ－３（ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）、Ａ－６７３（ｈｕｍａｎ ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ）、Ｃａｋｉ－１（ｈｕｍａｎ ｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＳＮＵ－７９０（ｈｕｍａｎ ｔｈｙｒｏｉｄ ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、ＭＧ－６３（ｈｕｍａｎ ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）、ＢｅＷｏ（ｈｕｍａｎ ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＫＡＴＯ ＩＩＩ（Ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）及び２５３ｊ（ｈｕｍａｎ ｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地でそれぞれ１×１０^５個細胞／ｍｌになるように希釈し、その後カルセイン－ＡＭを最終濃度が２５μＭになるように添加し、３７℃で１時間培養し、その後ＤＭＥＭ培地で洗浄してカルセイン標識標的癌細胞を作製した。

【0238】

実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ｓｈＲＮＡ＃２）細胞の培養液を用いて、それぞれ０．２５×１０^５個細胞／ｍｌ、１×１０^５個細胞／ｍｌ及び２．５×１０^５個細胞／ｍｌの密度に希釈して準備しておき、９６ウェルプレートに１００ｍｌずつ分注した。前述したように９６ウェルプレートに作製したカルセイン標識標的癌細胞（１×１０^５個細胞／ｍｌ）を１００ｕｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、その後４００ｇで１分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ_２の培養器で４時間共培養した。各ウェルから上清１００ｕｌを採取し、蛍光プレートリーダー（４８５ｎｍ／５３５ｎｍ）で測定した。癌細胞殺傷能（％）は、次の数式により算出した。

【0239】

【数1】

【0240】

上記式において、最小値はカルセイン標識標的癌細胞のみ存在するウェルの測定値であり、最大値はカルセイン標識標的癌細胞に１．０％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を添加して細胞を完全溶解したウェルの測定値である。

【0241】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は、各種癌細胞に対して殺傷能を有することが確認され、癌細胞数よりｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の数が多いほど、癌細胞殺傷能が高くなることが確認された（図７）。

【0242】

６－２．ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞と従来のヒトナチュラルキラー（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ，ＮＫ）細胞の癌細胞殺傷能の比較
実施例６－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞と従来のヒトナチュラルキラー細胞であるＮＫ－９２細胞（ＡＴＣＣ）（陽性対照群）のＫ５６２（ｈｕｍａｎ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）に対する癌細胞殺傷能を実施例６－１と同様に比較した。

【0243】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の癌細胞殺傷能は、対照群であるＮＫ－９２に比べて、約５．２～５．５倍以上優れることが確認された（図８）。

【0244】

６－３．ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞とヒト末梢血液細胞由来のナチュラルキラー細胞の癌細胞感作に対するＣＤ１０７ａ^＋細胞及びインターフェロンγ（ＩＦＮ－ｇａｍｍａ）発現細胞頻度の比較
ＮＫ細胞を癌細胞と共培養すると、癌細胞溶解能を有するＣＤ１０７ａ^＋細胞が発現するので、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を癌細胞と共培養した際にＣＤ１０７ａ^＋細胞が発現するか否かを確認した。

【0245】

実施例６－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞又はヒト末梢血液細胞由来のナチュラルキラー細胞であるＰＢＭＣ－ＮＫ細胞（陽性対照群）を癌細胞（ＨＣＴ１１６、ＨｅｐＧ２及びＭｉａ－ｐａｃａ－２）と３７℃、５％ＣＯ_２の培養器で４時間共培養し、発現する、癌細胞溶解能を有するＣＤ１０７ａ^＋細胞を定量分析した。

【0246】

ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞は、ＮＫ ｉｓｏｌａｔａｉｏｎ ｋｉｔを用いてＰＢＭＣ細胞から分離した。前記ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞は、ＰＢＭＣ細胞から分離した後に、ＮＫ培地（１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２００ＩＵ／ｍｌヒトＩＬ－２及び２０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ－１５を含むＲＰＭＩ１６４０）で２日間培養してから用いた。

【0247】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞又はＰＢＭＣ－ＮＫ細胞を癌細胞と共培養すると、共培養していない対照群（Ｎｏ ｔａｒｇｅｔ）に比べて、ＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度（％）が全て増加した（図９のＡ）。ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞と癌細胞を共培養すると、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞と癌細胞を共培養したものに比べて、ＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度がさらに増加した。

【0248】

次に、実施例６－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞又はＰＢＭＣ－ＮＫ細胞（陽性対照群）を上記と同様に癌細胞（ＨＣＴ１１６、ＨｅｐＧ２及びＭｉａ－ｐａｃａ－２）と共培養し、その後発現するＩＦＮ－γ^＋細胞を定量分析した。

【0249】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞又はＰＢＭＣ－ＮＫ細胞を癌細胞と共培養すると、共培養していない対照群（Ｎｏ ｔａｒｇｅｔ）に比べて、ＩＦＮ－γ^＋細胞の頻度（％）が全て増加することが確認された（図９のＢ）。ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞とＨｅｐＧ２を共培養すると、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞とＨｅｐＧ２を共培養したものに比べて、ＩＦＮ－γ^＋細胞の頻度が大幅に増加した。

【0250】

６－４．ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞とヒト末梢血液細胞由来のナチュラルキラー細胞の生体内癌細胞殺傷能の比較
８週齢のヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ－ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ，平均重量２０～２５ｇ）の背中に、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を発現する癌細胞（ＰＣ－３又はＳＫ－ＯＶ－３）をそれぞれ１×１０^７個細胞／ｍｌ ２００ｕｌで皮下注入（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、マウス前立腺癌モデル又はマウス卵巣癌モデルを作製した。

【0251】

翌日、陰性対照群としてのＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）２００ｕｌ、陽性対照群としてのＰＢＭＣ－ＮＫ細胞、又は実施例６－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を同一容量（１×１０^７個細胞／１５０ｕｌ）で尾静脈に注入し、その後７日間隔で２１日後までの腫瘍サイズを測定した。前記ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞は、ＰＢＭＣ細胞から分離した後に、ＮＫ培地で２日間培養してから用いた。

【0252】

その結果、ＰＣ－３腫瘍を有するマウスに各細胞又はＰＢＳを注入して２１日後に、対照群の腫瘍サイズ（４．６６×１０^１０放射輝度（Ｒａｄｉａｎｃｅ））に比べて、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞投与群（７．３１×１０^９放射輝度）及びｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞投与群（６．０７×１０^９放射輝度）の腫瘍サイズが大幅に減少したので、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞に比べて優れた抗癌効果を発揮することが確認された（図１０のＡ）。

【0253】

また、ＳＫ－ＯＶ－３腫瘍を有するマウスに各細胞又はＰＢＳを注入して２１日後に、対照群の腫瘍サイズ（３．１２×１０^１０放射輝度）に比べて、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞投与群（１．１４×１０^１０放射輝度）及びｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞投与群（５．９２×１０^９放射輝度）の腫瘍サイズが大幅に減少したので、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞に比べて優れた抗癌効果を発揮することが確認された（図１０のＢ）。
［実施例７］

【0254】

ｄｒＮＫ細胞又はＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の抗癌効能の検証
実施例１－１で製造したｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ｓｈＲＮＡ＃２）細胞、実施例２－１で製造したＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ｓｈＲＮＡ＃２）細胞、実施例３－１で製造したｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ｓｇＲＮＡ－Ａ）細胞、及び実施例４－１で製造したＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ｓｇＲＮＡ＃１及びｓｇＲＮＡ＃２）細胞の癌細胞殺傷能を検証するために、実施例６－１と同様に、癌細胞としてＭＳＬＮが発現しないＫ５６２、ＭＳＬＮが発現するＰＣ－３及びＭｉａ－ｐａｃａ－２と共培養し、癌細胞殺傷能を分析した。

【0255】

その結果、ＭＳＬＮが発現しないＫ５６２においては、４種のｄｒＮＫ細胞が同程度の癌細胞殺傷能を示した（図１６のＡ）。

【0256】

しかし、ＭＳＬＮが発現するＭｉａ－ｐａｃａ－２においては、癌細胞数に対するｄｒＮＫ細胞数が１：１であると、ｎｏｎ－ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞であるｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞（３．９％）及びｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞（４．８％）に比べて、ＣＡＲ（ＭＳＬＮ）－ｄｒＮＫ細胞であるＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞（２１．９％）及びＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞（２０．８％）が高い癌細胞殺傷能を示し、癌細胞数よりＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の数が多いほど、癌細胞殺傷能が高くなることが確認された（図１６のＡ）。

【0257】

また、ＭＳＬＮが発現するＰＣ－３においては、癌細胞数に対するｄｒＮＫ細胞数が１：１であると、ｎｏｎ－ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞であるｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（２５．１％）及びｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞（１５．０％）に比べて、ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞であるＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞（４１．４％）及びＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞（４４．７％）が高い癌細胞殺傷能を示し、癌細胞数よりＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞の数が多いほど、癌細胞殺傷能が高くなることが確認された（図１６のＡ）。

【0258】

次に、前記ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞及びＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の癌細胞殺傷可能性を検証するために、実施例６－３と同様に共培養し、発現するＣＤ１０７ａ^＋細胞を定量分析した。

【0259】

その結果、ＭＳＬＮが発現しないＫ５６２においては、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ及びｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫに比べて、ＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ及びＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度（％）が減少したのに対して、ＭＳＬＮが発現するＰＣ－３においては、ｎｏｎ－ＣＡＲ－ｄｒＮＫ細胞であるｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（１７．６％）及びｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（１９．４％）に比べて、ＣＡＲ（ＭＳＬＮ）－ｄｒＮＫ細胞であるＭＳＬＮ－ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（３２．０％）及びＭＳＬＮ－ｇＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（３７．２％）細胞のＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度（％）が増加することが確認された（図１６のＢ）。また、ＭＳＬＮが発現するＭｉａ－ｐａｃａ－２においても、ＰＣ－３と同程度のＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度が確認された。
［実施例８］

【0260】

ｄｒＮＫ細胞の抗ウイルス効能の検証
実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ｓｈＲＮＡ＃２）細胞の抗ウイルス効果を確認するために、ウイルスに感染していないＲａｍｏｓ（Ｈｕｍａｎ Ｂ－ｌｙｍｐｈｏｍａ）、及びエプスタイン・バールウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）に感染したＲａｊｉに対する細胞殺傷能を実施例６－１と同様に測定した。陽性対照群としてＰＢＭＣ－ＮＫ細胞又はＮＫ－９２細胞を用いた。

【0261】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞（ＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）及び陽性対照群（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞）の全てにおいて、非感染ＲａｍｏｓよりＥＢＶ感染Ｒａｊｉに対して高い細胞殺傷能を示し、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞においては、陽性対照群（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞）に比べて、非感染ＲａｍｏｓとＥＢＶ感染Ｒａｊｉの両方に対して高い細胞殺傷能を示した（図１７ａのＡ）。

【0262】

次に、ＥＢＶ感染Ｒａｊｉ及び非感染ＲａｍｏｓをｄｒＮＫ細胞と共培養し、ＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度を確認した。

【0263】

具体的には、ＥＢＶ感染Ｒａｊｉ及び非感染Ｒａｍｏｓそれぞれ１×１０^６個細胞／ｍｌと、前記ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、陽性対照群としてのＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞それぞれ１×１０^６個細胞／ｍｌを６ウェルプレートに１ｍｌずつ分注し、その後４００ｇで１分間遠心分離し、それを３７℃、５％ＣＯ_２の培養器で４時間共培養し、次いで前記細胞を遠心分離機で洗浄及び回収し、ＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ）分析により感染細胞に反応するＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度を確認した。

【0264】

ＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度を確認するために、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、陽性対照群としてのＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞それぞれ１×１０^６個細胞／ｍｌを、蛍光が付着したＣＤ５６及びＣＤ１０７ａに対する抗体を添加したＦＡＣＳ緩衝液に投入し、常温で２０分間反応させ、その後前記細胞を遠心分離機で洗浄及び回収し、ＦＡＣＳ分析を行った。

【0265】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞（ＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ）及び陽性対照群（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞）の全てにおいて、ＲａｍｏｓよりＥＢＶ感染したＲａｊｉと共培養するとＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度（％）が増加し、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞においては、陽性対照群（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞）に比べて、ＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度が大幅に増加した（図１７ａのＢ）。

【0266】

次に、ＥＢＶ感染Ｒａｊｉ及び非感染ＲａｍｏｓをｄｒＮＫ細胞と共培養し、ＥＢＶ特異遺伝子であるＬＭＰ－１（Ｌａｔｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ １）の発現の程度を確認した。

【0267】

具体的には、ＧＦＰ発現レンチウイルスベクター（ＣＴＩＰ２ （ＢＣＬ１１Ｂ） Ｈｕｍａｎ ｓｈＲＮＡ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ （Ｌｏｃｕｓ ＩＤ ６４９１９）中のｃｏｎｔｒｏｌ ｖｅｃｔｏｒ，ＯＲＩＧＥＮＥ，ＣＡＴ＃：ＴＬ３０６４２４）から得たレンチウイルス５ＭＯＩ及び８μｇ／ｍｌポリブレンで処理し、次いでＲＰＭＩ培地で１６時間培養し、その後新鮮な培地に交換し、ＲａｊｉをＧＦＰ－Ｒａｊｉに形質転換した。

【0268】

製造したＧＦＰ－Ｒａｊｉ １×１０^６個細胞／ｍｌとｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞１×１０^６個細胞／ｍｌを６ウェルプレートにそれぞれ１ｍｌずつ分注、ピペッティングし、３７℃、５％ＣＯ_２の培養器で２４時間共培養し、その後反応物を遠心分離して回収した。陽性対照群としてＰＢＭＣ－ＮＫ細胞又はＮＫ－９２細胞を用いた。細胞反応物からＴｏｔａｌ ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出し、製造業者の指針に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯＴＭ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を用いて逆転写した。ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎによりｑＲＴ－ＰＣＲを行い、７５００ Ｆａｓｔ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＬＭＰ－１の発現レベルを分析した。

【0269】

ここで用いたプライマー配列を表３に示す。

【0270】

【表3】

【0271】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞及び陽性対照群（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞）の全てにおいて、ＧＦＰ－Ｒａｊｉ細胞と共培養すると、共培養していない対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて、ＧＦＰに対するＬＭＰ－１の発現の程度が減少し、特にｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞において、ＬＭＰ－１発現減少の程度がＰＢＭＣ－ＮＫ、ＮＫ－９２に比べて顕著であることが確認された（図１７ａのＣ）。

【0272】

次に、前記ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞のヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）に感染したＣＥＭ Ｔ細胞、インフルエンザ（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ウイルスに感染したＨＥＫ－２９３Ｔ細胞、パピローマ（Ｐａｐｉｌｌｏｍａ）ウイルスに感染したＨＫ２近位尿細管細胞、及び肝炎（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）ウイルスに感染したＳＮＵ４４９肝細胞に対する細胞殺傷能、並びに共培養により発現したＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度を上記と同様に測定し、ＮＫ－９２細胞と比較した。

【0273】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は、陽性対照群であるＮＫ－９２細胞に比べて、全てのウイルス感染細胞に対して、低いＥ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ ＮＫ ｃｅｌｌ）：Ｔ（Ｔａｒｇｅｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ）比においても、高い細胞殺傷能（図１７ｂのＤ）と高いＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度を示すことが確認された（図１７ｂのＥ）。

【0274】

次に、前記ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞のコロナウイルスに対する抗ウイルス効果を確認するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＣａｌｕ－１細胞（ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）とウイルスに感染していないＣａｌｕ－１細胞におけるアポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を測定した。

【0275】

具体的には、非感染Ｃａｌｕ－１細胞又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染Ｃａｌｕ－１細胞とｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞それぞれ１０×１０^４個を９６ウェルプレートに分注し、３７℃、５％ＣＯ_２の培養器で４時間共培養した。陽性対照群としてＰＢＭＣ－ＮＫ細胞を用いた。

【0276】

アポトーシスは、ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）を含むＡＰＣアネキシンＶ（Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ）アポトーシス検出キットを用いて、製造業者（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ＃：６４０９３２）の指針に従って測定した。共培養した細胞をＥチューブ（ｅ－ｔｕｂｅ）に移し、細胞染色溶液と遠心分離機を用いて２回洗浄し、アネキシンＶ結合バッファで懸濁した。各チューブにＡＰＣアネキシンＶ ５ｕｌとＰＩ １０ｕｌを入れ、光を遮断して常温で１５分間反応させた。アネキシンＶ結合バッファをさらに添加し、その後フローサイトメトリーを用いて測定した。

【0277】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞との共培養は、陽性対照群（ＰＭＢＣ－ＮＫ細胞）に比べて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに感染した細胞のアポトーシスを増加させた（図１８）。

【0278】

よって、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞が優れた抗ウイルス効果を発揮することが確認された。
［実施例９］

【0279】

ｄｒＮＫ細胞の抗菌効能
実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ｓｈＲＮＡ＃２）細胞のグラム陰性細菌に対する抗菌効果を確認するために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する細胞殺傷能、及び共培養により発現したＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度を測定した。

【0280】

具体的には、ＬＢ寒天プレートからＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａコロニーを１つ採取し、ＬＢ培地にて３７℃で１６～１７時間培養し、その後５０００×ｇで５分間遠心分離し、次いで１０％ＦＢＳを含み、抗生剤を含まないＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄した。実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、陽性対照群であるＰＢＭＣ－ＮＫ細胞又はＮＫ－９２細胞を培養液でそれぞれ１×１０^４個細胞／１００μｌ、３×１０^４個細胞／１００μｌ及び９×１０^４個細胞／１００μｌの密度に希釈して準備しておき、９６ウェルプレートに分注した。前記９６ウェルプレートに３×１０^４個細胞／１００μｌのＥ．ｃｏｌｉを添加し、その後３７℃でそれぞれ０及び２時間培養した。前述したように連続希釈した培養液をＬＢ寒天プレートに接種し、３７℃で２０時間培養し、次いでＬＢ寒天プレートのＥ．ｃｏｌｉコロニー数を計算した。

【0281】

ＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度は、３×１０^４個細胞／１００μｌのｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞と３×１０^４個細胞／１００μｌのＥ．ｃｏｌｉ（Ｅ：Ｔ比＝１：１）の反応２時間後に測定した。培養が完了したｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、陽性対照群であるＰＢＭＣ－ＮＫ細胞又はＮＫ－９２細胞を、蛍光が付着したＣＤ５６及びＣＤ１０７ａに対する抗体を添加したＦＡＣＳ緩衝液に投入し、常温で２０分間反応させ、その後細胞を遠心分離機で洗浄及び回収し、ＦＡＣＳ分析により測定した。

【0282】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞及び陽性対照群（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞）の全てにおいて、Ｅ．ｃｏｌｉコロニー数（図１９のＡ）が少なく、Ｅ．ｃｏｌｉに対して毒性が高いことが確認された（ＰＢＭＣ－ＮＫ：０ｈ（０：１）；平均２０，０００個，２ｈ（０：１）；平均２８，０００個，２ｈ（０．３：１）；平均３，６４０個，２ｈ（１：１）；平均８６０個，２ｈ（３：１）；平均８５個，ＮＫ－９２：０ｈ（０：１）；平均１９，８２５個，２ｈ（０：１）；平均２８，０００個，２ｈ（０．３：１）；平均５，２００個，２ｈ（１：１）；平均３，２００個，２ｈ（３：１）；平均８８．５個，ＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ：０ｈ（０：１）；平均１９，８２５個，２ｈ（０：１）；平均２８，０００個，２ｈ（０．３：１）；平均３，５４０個，２ｈ（１：１）；平均３９７．５個，２ｈ（３：１）；平均８０個）。

【0283】

また、陽性対照群に比べて顕著に少ないＥ．ｃｏｌｉコロニー数を示すＥ：Ｔ比（１：１）において、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は、陽性対照群（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞）に比べて、高いＣＤ１０７ａ^＋細胞頻度を示すことが確認された（図１９のＢ）。

【0284】

次に、実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ｓｈＲＮＡ＃２）細胞のグラム陽性細菌に対する抗菌効果を確認するために、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｓｅｕｄｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）との共培養により発現したＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度を測定した。

【0285】

具体的には、ＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）にレンサ球菌を懸濁し、１０％ＦＢＳを含み、抗生剤を含まないＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄した。実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、又は陽性対照群であるＮＫ－９２細胞を培養液でそれぞれ１５×１０^４個細胞／１００μｌの密度に希釈して準備しておき、９６ウェルプレートに分注した。前記９６ウェルプレートに１５×１０^４個細胞／１００μｌのレンサ球菌を添加し、その後３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２時間培養し、次いでフローサイトメトリーによりＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度を確認した。

【0286】

ＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度は、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞又はＮＫ－９２細胞を、蛍光が付着したＣＤ５６及びＣＤ１０７ａに対する抗体を添加したＦＡＣＳ緩衝液に投入し、常温で２０分間反応させ、その後細胞を遠心分離機で洗浄及び回収し、ＦＡＣＳ分析を行った。

【0287】

その結果、陽性対照群であるＮＫ－９２細胞に比べて、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞を共培養した試験群において、レンサ球菌に対して顕著な抗菌効果を発揮することが確認された（図１９のＣ）。

【0288】

よって、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞は、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞に比べて、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に対して顕著な抗菌効能を示すことが確認された。
［実施例１０］

【0289】

ｄｒＮＫ細胞の抗カビ効能
実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ（ｓｈＲＮＡ＃２）細胞の抗カビ効果を確認するために、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）との共培養により発現したＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度を測定した。

【0290】

具体的には、ＹＰＤ寒天プレート（１％酵母抽出物、２％ペプトン、２％Ｄ－グルコース及び１％アガーを含む）からカンジダ・アルビカンスのコロニーを１つ採取し、ＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％ペプトン及び２％Ｄ－グルコースを含む）にて３７℃で２時間培養し、その後１０００×ｇで５分間遠心分離し、次いで１０％ＦＢＳを含み、抗生剤を含まないＲＰＭＩ １６４０培地で洗浄した。実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、陽性対照群であるＰＢＭＣ－ＮＫ細胞又はＮＫ－９２細胞を培養液でそれぞれ２×１０^５個細胞／１００μｌの密度に希釈して準備しておき、９６ウェルプレートに分注した。前記９６ウェルプレートに２×１０^５個細胞／１００μｌのカンジダ菌を添加し、その後（Ｅ：Ｔ比＝１：１）３７℃で６時間共培養し、次いでＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度を測定した。

【0291】

ＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度は、培養が完了したｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、陽性対照群であるＰＢＭＣ－ＮＫ細胞又はＮＫ－９２細胞を、蛍光が付着したＣＤ５６－ＰＥ及びＣＤ１０７ａ－ＡＰＣ抗体を添加したＦＡＣＳ緩衝液に投入し、常温で２０分間反応させ、その後細胞を遠心分離機で洗浄及び回収し、ＦＡＣＳ分析により測定した。

【0292】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞とカンジダ菌の共培養においてＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度が最も高く（２０．４％）、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞とカンジダ菌の共培養（１０．０％）、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の単独培養（８．５％）、ＮＫ－９２細胞とカンジダ菌の共培養（６．３％）、ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞の単独培養（５．６％）、ＮＫ－９２細胞の単独培養（２．９％）の順にＣＤ１０７ａ^＋細胞の頻度が高かった（図２０）。

【0293】

次に、前記ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞のアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に対する抗カビ効果を確認した。

【0294】

具体的には、アスペルギルス・フミガーツスのコロニーを採取し、ポテトデキストロース寒天培地（Ｐｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ａｇａｒ，ＰＤＡ）プレートにて２５℃で５日間培養し、その後０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ １２ｍｌを添加し、火炎滅菌したスライドグラス（Ｓｌｉｄｅ ｇｌａｓｓ）に掻き出して菌体懸濁液を得た。４０μｍセルストレーナー（Ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎｅｒ）に菌体懸濁液を濾過し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その後上清を除去し、分生子（Ｃｏｎｉｄｉａ）を回収した。回収した分生子をＰＢＳで懸濁し、遠心分離し、上清を除去する過程を２回繰り返して洗浄し、ＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した。５×１０^３個の分生子を９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２の培養器で４時間培養し、実施例１－１のｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞、陽性対照群であるＰＢＭＣ－ＮＫ細胞又はＮＫ－９２細胞とＥ：Ｔ比＝１：１で６時間共培養した。９６ウェルプレートから上清を除去し、滅菌蒸留水で細胞溶解（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ）及び洗浄し、その後Ｃｏｅｎｚｙｍｅ Ｑ０（２，３－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－５－ｍｅｔｈｙｌ－ｐ－ｂｅｎｚｏｑｕｉｎｏｎｅ）を含むＸＴＴ（２，３－Ｂｉｓ－（２－Ｍｅｔｈｏｘｙ－４－Ｎｉｔｒｏ－５－Ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ－５－Ｃａｒｂｏｘａｎｉｌｉｄｅ）溶液１５０ｕｌを添加した。３７℃、５％ＣＯ_２の培養器で１時間培養し、その後上清１００ｕｌを新たな９６ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ、６９０ｎｍで吸光度を測定した。

【0295】

その結果、ｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞及び陽性対照群（ＰＢＭＣ－ＮＫ細胞及びＮＫ－９２細胞）の全てが抗カビ活性を示し、特にｓｈＢＣＬ１１Ｂ－ｄｒＮＫ細胞の抗カビ活性が最も優れることが確認された（図２１）。

【0296】

上記実施例の結果から、本発明により製造されたｄｒＮＫ細胞又はＣＡＲ－ｄｒＮＫは、癌細胞、又はウイルス、細菌及びカビ感染細胞に対する細胞殺傷能に優れるので、癌、又は細菌及びカビによる感染性疾患及び／もしくは炎症性疾患の予防又は治療用細胞治療剤及び組成物として適用することができる。

【0297】

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれる変更又は変形された形態が全て含まれるものと解釈すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17a】

【図17b】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

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【国際調査報告】