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特表2024-534987核酸ポリメラーゼ及び非ＤＮＡヌクレオチドポリマーの生成におけるその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】核酸ポリメラーゼ及び非ＤＮＡヌクレオチドポリマーの生成におけるその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/12 20060101AFI20240918BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240918BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240918BHJP
【ＦＩ】
C12N9/12
C12N1/19 ZNA
C12N1/21
C12N1/15
C12N5/10
C12N15/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515536
(86)(22)【出願日】2022-09-06
(85)【翻訳文提出日】2024-05-02
(86)【国際出願番号】 EP2022074749
(87)【国際公開番号】W WO2023036779
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】2112907.7
(32)【優先日】2021-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2207699.6
(32)【優先日】2022-05-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524089305
【氏名又は名称】ユナイテッド キングダム リサーチ アンド イノベーション
(74)【代理人】
【識別番号】100097456
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 徹
(72)【発明者】
【氏名】ニクラス フレウンド
(72)【発明者】
【氏名】セバスチャン アランガンディー‐フランクリン
(72)【発明者】
【氏名】フィリップ ホリガー
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA27
4B065CA43
4B065CA44
(57)【要約】
ある態様において、本発明は、非DNAポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼに関する。さらに、本発明は、前記ポリメラーゼの使用及び結果として生じる生成物に関する。
【選択図】図1
【選択図】図1
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してT541及び/又はK592で変異している、
前記核酸ポリメラーゼ。
【請求項2】
前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してE664で変異している、請求項1記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項3】
前記アミノ酸配列が、i)T541変異及びK592変異、ii)T541変異及びE664変異、又はiii)T541変異、K592変異、及びE664変異を含む、請求項1又は請求項2記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項4】
前記T541変異が、T541G、T541S、T541A、T541C、T541D、T541P、又はT541Nである、請求項1～3のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項5】
前記T541変異がT541Gである、請求項1～4のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項6】
前記K592変異が、K592G、K592A、K592C、K592M、K592S、K592D、K592P、K592N、K592T、K592E、K592V、K592Q、K592H、K592I、又はK592Lである、請求項1～5のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項7】
前記K592変異が、K592A又はK592Gである、請求項1～6のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項8】
前記E664変異が、E664H、E664K、又はE664Rである、請求項1～7のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項9】
前記アミノ酸配列が、変異T541G及びK592Aを含む、請求項1～8のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項10】
前記アミノ酸配列が、i)配列番号1に対して、以下の変異:V93Q、D141A、E143A、及びA485Lのうちの1以上、又は全て;並びに/又は
ii)配列番号1に対して、以下の変異:Y409、I521、及びF545のうちの1以上、又は全て;並びに/又は
iii)配列番号1に対して、以下の変異:Y409G、I521L又はI521H、及びF545Lのうちの1以上、又は全て
を含む、請求項1～9のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項11】
前記アミノ酸配列が、配列番号1に対してD614変異を含む、請求項1～10のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項12】
前記D614変異がD614Nである、請求項11記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項13】
前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有する、請求項1～12のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項14】
前記アミノ酸配列が、i)配列番号3又は配列番号4のアミノ酸配列、ここで残基93、141、143、409、485、521、541、545、592、及び664は不変である;並びに/又は
ii)配列番号5又は配列番号6のアミノ酸配列、ここで、残基93、141、143、409、485、521、541、545、592、614、及び664は不変である
と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有する、請求項1～13のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項15】
前記アミノ酸配列が、配列番号7又は配列番号8を含む、請求項1～14のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項16】
核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してE664Rで変異している、
前記核酸ポリメラーゼ。
【請求項17】
前記アミノ酸配列が、配列番号1に対して以下の変異:D540、D542、K591、K593、Y663、及びQ665のうちの1以上、又は任意の組み合わせを含む、請求項1～16のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項18】
核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対して、配列番号1に対する位置D540、D542、K591、K593、Y663、及び/もしくはQ665のうちの1つ、全て、又は任意の組み合わせで変異している、
前記核酸ポリメラーゼ。
【請求項19】
(i)D540における変異が、D540A、D540G、D540S、もしくはD540Cであり;かつ/又は(ii)D542における変異が、D542A、D542G、D542S、もしくはD542Cであり;かつ/又は
(iii)K591における変異が、K591G、K591A、K591C、K591M、K591S、K591D、K591P、K591N、K591T、K591E、K591V、K591Q、K591H、K591I、もしくはK591Lであり;かつ/又は
(iv)K593における変異が、K593G、K593A、K593C、K593M、K593S、K593D、K593P、K593N、K593T、K593E、K593V、K593Q、K593H、K593I、もしくはK593Lである、
請求項17又は請求項18記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項20】
(i)E663における変異が、E663K、E663R、もしくはE663Hであり;かつ/又は(ii)E665における変異が、E665K、E665R、もしくはE665Hである、請求項17～19のいずれか一項記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項21】
前記非DNAヌクレオチドポリマーが、2’-O-メチル-RNA及び(2’OMe-RNA)ヌクレオチド及び/又は2’-O-(2-メトキシエチル)-RNA(MOE-RNA)ヌクレオチドを含む、請求項1～20のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項22】
前記アミノ酸配列が、polBファミリーの核酸ポリメラーゼの野生型配列に由来する、請求項1～21のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項23】
前記アミノ酸配列が、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有する、請求項1～22のいずれか記載の核酸ポリメラーゼ。
【請求項24】
非DNAヌクレオチドポリマーを作製する方法であって、重合を助長する条件下で、核酸鋳型と、請求項1～23のいずれか一項記載の核酸ポリメラーゼとを接触させることを含む、前記方法。
【請求項25】
2’OMe-RNAヌクレオチド及び/又はMOE-RNAヌクレオチドが重合中に提供され、結果として生じる非DNAヌクレオチドポリマーが前記ヌクレオチドを含む、請求項24記載の方法。
【請求項26】
非DNAヌクレオチドポリマーの作製のための、請求項1～23のいずれか一項記載の核酸ポリメラーゼの使用。
【請求項27】
前記非DNAヌクレオチドポリマーが、2’OMe-RNAヌクレオシド及び/又はMOE-RNAヌクレオシドを含む、請求項26記載の使用。
【請求項28】
請求項1～23のいずれか記載のポリメラーゼをコードする核酸。
【請求項29】
請求項1～23のいずれか記載のポリメラーゼ又は請求項28記載の核酸を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
(発明の分野)
ある態様において、本発明は、非DNAポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼに関する。さらに、本発明は、前記ポリメラーゼの使用及び結果として生じる生成物に関する。
ある態様において、本発明は、非DNAポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼに関する。さらに、本発明は、前記ポリメラーゼの使用及び結果として生じる生成物に関する。
【背景技術】
【0002】
(発明の背景)
標準(デオキシ)リボ核酸への化学変化は、医薬品化学と核酸ベースの治療薬(RNAワクチンを含む)の重複分野、及び核酸の合成生物学と化学生物学で大きな関心を集めている。これらの修飾には、グリコシド結合の変更、不自然な塩基対相互作用、及び修飾骨格化学を含むがこれらに限定されない幅広い異性体置換、糖変化、糖置換基修飾、核酸塩基修飾が含まれる。これらの中で、リボースの2’-ヒドロキシ基への修飾が特に注目されている。
標準(デオキシ)リボ核酸への化学変化は、医薬品化学と核酸ベースの治療薬(RNAワクチンを含む)の重複分野、及び核酸の合成生物学と化学生物学で大きな関心を集めている。これらの修飾には、グリコシド結合の変更、不自然な塩基対相互作用、及び修飾骨格化学を含むがこれらに限定されない幅広い異性体置換、糖変化、糖置換基修飾、核酸塩基修飾が含まれる。これらの中で、リボースの2’-ヒドロキシ基への修飾が特に注目されている。
【0003】
このような2’修飾は、らせん構造や塩基対の特異性などの核酸機能の主要な物理化学的原理を維持する一方で、修飾された核酸の生物物理学的及び薬理学的特性を高めることが示されており、核酸治療薬への広範な組み込みを促進する。これらの中で、2’-フルオロ(2’F)、2’-O-メチル(2’OMe)、2’-O-(2-メトキシエチル)(MOE)、及び2’,4’-ロック、架橋、又は拘束された(例えば、トリシクロ)核酸が広く研究されている1。
【0004】
2’OMeは、ヒトrRNA、tRNA、核内低分子RNA(snRNA)及びヒトmRNAのキャップとボディの両方に見られる天然のRNA修飾であるため、本質的に生体適合性であり、かつ自然免疫系を誘発する可能性は低い。実際、ウイルスRNAの2’OMe修飾は、インターフェロン媒介性抗ウイルス応答の回避を可能にする自己シグナルとして、一部のウイルスによって利用されているようである。
【0005】
2’OMe及び関連するMOE修飾(図1a、4a)は、様々な好ましい物理化学的、薬理学的及び免疫学的特性を示し、その臨床的有用性は、サイレンシングRNA(siRNA)薬であるパチシラン(Patisiran)及びギボシラン(Givosiran)(2’OMe)及びアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)薬であるヌシネルセン(Nusinersen)(スピンラザ(Spinraza))、イノテルセン(Inotersen)(テグセディ(Tegsedi))及びボラネソルセン(Volanesorsen(ワイリブラ(Waylivra))(全MOE)などの最近承認された核酸医薬で検証されている2。さらに、プリン塩基での2’OMe-RNA修飾は、加齢黄斑変性の治療のためのFDA承認アプタマー薬であるペガプタニブ(Pegaptanib)(マクジェン(Macugen))で有益であることが判明した。
【0006】
しかし、2’OMe修飾及びMOE修飾オリゴヌクレオチドは、現在、主に固相ホスホロアミダイトベースの化学合成によって合成されており、これは短いオリゴマーと比較的少数の特有の配列に限定されており、それらの進化を妨げている。そのため、所望の治療効果についてスクリーニングされる2’OMe修飾オリゴヌクレオチド及びMOE修飾オリゴヌクレオチドの適用可能な配列は、半合理的に設計されなければならない。このアプローチは、メッセンジャーRNAの調節配列に結合するように設計されたASO治療薬には妥当であるように思われるが、これらの重要な化学におけるアプタマー及び核酸酵素治療薬の新規発見と開発を妨げ、バイオテクノロジー用途と医療用途の両方のための核酸ナノテクノロジーオブジェクトとデバイスの開発を遅らせる。
【0007】
これにより、T7 RNAポリメラーゼの突然変異体3、4、5、6又はTaq DNAポリメラーゼのStoffel断片の変異体7を含む、合成及び逆転写のツールとして、様々な操作されたポリメラーゼの開発に拍車がかかり、部分的及び完全に置換された2’OMe-RNAアプタマーが発見できた6、8。より最近では、KOD DNAポリメラーゼの突然変異体が、Mn2+イオンの存在下で1kbの2’OMe-RNA断片を合成できると報告され、トロンビンに対する混合LNA/2’OMe-RNAアプタマーの進化を可能にした9。
【0008】
これらの進歩にもかかわらず、より嵩高いMOE-RNAの酵素合成は報告されていない。さらに、2’OMe-RNAの傑出した重要性と可能性により、より長いか又はより複雑な2’OMe-RNAをより効率的に合成するためのツールが依然として望まれている。
【発明の概要】
【0009】
(発明の概要)
本発明の態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してT541及び/又はK592で変異している、前記核酸ポリメラーゼが提供される。該アミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列に対してE664で変異していてよい。
本発明の態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してT541及び/又はK592で変異している、前記核酸ポリメラーゼが提供される。該アミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列に対してE664で変異していてよい。
【0010】
該アミノ酸配列は、i)T541変異及びK592変異、ii)T541変異及びE664変異、又はiii)T541変異、K592変異、及びE664変異を含み得る。T541変異は、T541G、T541S、T541A、T541C、T541D、T541P、又はT541Nであり得る。特定の実施態様において、T541変異はT541Gである。K592変異は、K592G、K592A、K592C、K592M、K592S、K592D、K592P、K592N、K592T、K592E、K592V、K592Q、K592H、K592I、又はK592Lであり得る。特定の実施態様において、K592変異は、K592A又はK592Gである。E664変異は、E664K又はE664Rであり得る。
【0011】
特定の実施態様において、該アミノ酸配列は、変異T541G及びK592Aを含む。
【0012】
該アミノ酸配列は、配列番号1に対して、以下の変異:V93Q、D141A、E143A、及びA485Lのうちの1以上、又は全てを含み得る。該アミノ酸配列は、配列番号1に対して、以下の変異:Y409、I521、及びF545のうちの1以上、又は全てを含み得る。該アミノ酸配列は、配列番号1に対して、以下の変異:Y409G、I521L又はI521H、及びF545Lのうちの1以上、又は全てを含み得る。
【0013】
該アミノ酸配列は、配列番号1に対してD614変異を含み得る。D614変異はD614Nであり得る。
【0014】
該アミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有し得る。該アミノ酸配列は、配列番号3又は配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有してよく、ここで、残基93、141、143、409、485、521、541、545、592、及び664は不変である。該アミノ酸配列は、配列番号5又は配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有してよく、ここで、残基93、141、143、409、485、521、541、545、592、614、及び664は不変である。
【0015】
該アミノ酸配列は、配列番号7又は配列番号8を含み得る。
【0016】
本発明の別の態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してE664Rで変異している、前記核酸ポリメラーゼが提供される。この核酸ポリメラーゼは、核酸ポリメラーゼに関して本明細書に開示されるような任意の特徴、配列、変異、特性、又は変異のパターンを含み得る。
【0017】
本明細書に開示される核酸ポリメラーゼは、配列番号1に対して以下の変異:D540、D542、K591、K593、Y663、及びQ665のうちの1以上、又は任意の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み得る。
【0018】
本発明の別の態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対して、配列番号1に対する位置D540、D542、K591、K593、Y663、及び/もしくはQ665のうちの1つ、全て、又は任意の組み合わせで変異している、前記核酸ポリメラーゼが提供される。
【0019】
いくつかの実施態様において、D540における変異は、D540A、D540G、D540S、又はD540Cである。特に、変異はD540Aであり得る。いくつかの実施態様において、D542における変異は、D542A、D542G、D542S、又はD542Cである。いくつかの実施態様において、K591における変異は、K591G、K591A、K591C、K591M、K591S、K591D、K591P、K591N、K591T、K591E、K591V、K591Q、K591H、K591I、又はK591Lである。いくつかの実施態様において、K593における変異は、K593G、K593A、K593C、K593M、K593S、K593D、K593P、K593N、K593T、K593E、K593V、K593Q、K593H、K593I、又はK593Lである。いくつかの実施態様において、E663変異は、E663K、E663R、又はE663Hであり得る。いくつかの実施態様において、E665変異は、E665K、E665R、又はE665Hであり得る。
【0020】
本明細書に開示される核酸ポリメラーゼは、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができ、ここで、非DNAヌクレオチドポリマーは、2’-O-メチル-RNA及び(2’OMe-RNA)ヌクレオチド及び/又は2’-O-(2-メトキシエチル)-RNA(MOE-RNA)ヌクレオチドを含む。
【0021】
本明細書に開示される核酸ポリメラーゼは、polBファミリーの核酸ポリメラーゼの野生型配列に由来するアミノ酸配列を有し得る。本明細書に開示される核酸ポリメラーゼは、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【0022】
本発明の別の態様において、非DNAヌクレオチドポリマーを作製する方法であって、重合を助長する条件下で、核酸鋳型と、先行する請求項のいずれか1つの核酸ポリメラーゼとを接触させることを含む、前記方法が提供される。いくつかの実施態様において、2’OMe-RNAヌクレオチド及び/又はMOE-RNAヌクレオチドが重合中に提供され、結果として生じる非DNAヌクレオチドポリマーは、前記ヌクレオチドを含む。
【0023】
本発明の別の態様において、非DNAヌクレオチドポリマーの作製のための本明細書に開示される任意の核酸ポリメラーゼの使用が提供される。いくつかの実施態様において、非DNAヌクレオチドポリマーは、2’OMe-RNAヌクレオシド及び/又はMOE-RNAヌクレオシドを含む。
【0024】
本発明の別の態様において、本明細書に開示される任意のポリメラーゼをコードする核酸が提供される。
【0025】
本発明の別の態様において、本明細書に開示される任意のポリメラーゼ又は本明細書に開示されるポリメラーゼをコードする任意の核酸を含む宿主細胞が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0026】
(図面の簡単な説明)
【図1】図1 2残基立体ゲート。a)2’-O-メチル(2’OMe)-RNAの化学構造。2’-メトキシ置換基はシアンで強調表示されている。b)ポリメラーゼTgoの野生型及び操作したポリメラーゼ、並びにTGK(青)、TGLLK(緑)及び2M(赤)のそれぞれの重要な変異を示す配列アライメント。図b)に示す配列は、配列番号10、11、12、及び13である。c)TGK(青)、TGLLK(緑)及び2M(赤)のそれぞれの変異を有するKOD DNAポリメラーゼ(PDB ID 5OMF)の三元構造の空間充填モデル。d)DNA鋳型鎖(オレンジ)、活性部位2’OMe-ATP及び2’OMe-RNA新生鎖(シアン)とKOD DNAポリメラーゼ(PDB ID 5OMF)の活性部位の構造モデルであり、3'末端の2’-メトキシ基と＋1ヌクレオチドが空間充填エンベロープとして示されており、重要な立体ゲート変異(T541G、K592A)はピンク(棒)で表示され、野生型側鎖残基は空間充填エンベロープとして示され、立体容積が低下していることが強調されている。e)立体ゲートの単一変異及び二重変異の2’OMe-RNA合成(DNAプライマーFD、鋳型TempNpure、全長+72nt)の変性PAGE。T541GとK592Aの二重変異の相乗効果に注意されたい。f～h) f)定義された配列鋳型(DNA/2’OMe-RNAプライマーFD、鋳型TempNpure、全長+72nt)、g)ランダムN40鋳型(RNA/2’OMe-RNAプライマーA-試験2、鋳型Tag3.3-N40-試験2、全長+79nt)、N40合成収率のデンシトメトリー:TGLLK 2’OMe-RNA 0%、2M 2’OMe-RNA 90%(SI 図17)、及びh)GFP転写産物(2’OMe-RNAプライマーSynth-out1mm、鋳型sfGFP、全長+752nt)の長い範囲の合成におけるTGK、TGLLK又は2MによるDNA(H)、RNA(OH)及び2’OMe-RNA(OMe)合成の変性PAGE。
【図2】図2 2’OMe-RNAで構成される部位特異的RNAエンドヌクレアーゼ触媒。a) RNA「Sub_KRas_12」 [G12D](c.35G＞A (G12D)変異を保有するヒトKRAS mRNAの残基213～242(配列番号14及び15)」を標的とするように選択された2’OMezyme R15/5-K並びにb)代替RNA「Sub_CTNNB1_33」(c.98C＞A (S33Y)変異を保有するヒトCTNNB1 mRNAの残基85～111)に再ターゲティングされた変異体2’OMezyme R15/5-Cの配列と推定二次構造。2’OMe-RNAヌクレオチドは、シアン又は青で示され(残基がR15/5-KからR15/5-Cに変わる)、RNA基質はオレンジ(KRAS)又は赤(CTNNB1)で示されている。黒矢印はRNA切断部位を示す。丸で囲んだ残基は、再選択中に変化した「R15_1」親2’OMezyme中の塩基を示す(下)(配列番号16及び17)。c、d)(左パネル) 尿素PAGEゲルは、準生理学的条件 (37℃、pH7.4、1mM Mg2+、17.5時間)下でのトランスの二分子反応で基質RNA(1μM) Sub_KRas_12及びSub_CTNNB1_33の対立遺伝子特異的切断を行う2’OMezyme(5μM)を示す。レーン1は、部分的に加水分解されたRNA基質を示す。(右パネル)グラフは、基質RNA(1μM)、2’OMezyme(5μM)及び37℃での示される反応条件での前定常状態のシングルターンオーバー反応を示す。エラーバーは、3つの独立した反復の平均の標準偏差(s.e.m.)を示す。e＆f)準生理学的条件(37℃、pH7.4、1mM Mg2+、65時間)下で、示される変異を保有するe)KRAS(「Sub_KRas_ORF」)及びf)CTNNB1(「Sub_CTNNB1_ORF」)の(5μM)2’OMezymeと(0.5μM)合成RNA転写産物の反応。
【図3】図3 MOE-RNA合成。a)2’-O-(2-メトキシエチル)基が強調されている2’-O-(2-メトキシエチル)-RNA(MOE-RNA)の化学構造。b)リボース糖パッカリングの平衡。2’-O-MOE修飾は、RNAに匹敵するC3’-エンド(N型)立体構造に平衡をシフトさせる。c)2’-O-(2-メトキシエチル)基(強調されている)を有するMOE-RNA二本鎖(PDB ID 468D)のX線構造を側面から見た(左)及び上から見た(右)空間充填表現、並びに2つの酸素原子にそれぞれゴーシュ立体構造を優先的に採用するエチレングリコールモノメチルエーテルのニューマン投影の隣に観察される2’-O-(2-メトキシエチル)立体構造の重ね合わせ(棒状図、中央)。d～f) d)定義された配列鋳型(2’OMe-RNAプライマーFD、鋳型TempNpure、全長+72nt)、e)ランダムN40鋳型(2’OMe-RNAプライマーA-試験2、鋳型Tag3.3-N40-試験2、全長+79nt)、N40合成収率のデンシトメトリー:TGLLK 2’OMe-RNA 1%、TGLLK MOE-RNA 0%、2M 2’OMe-RNA 84%、2M MOE-RNA 65%(SI 図17)、並びにf) GFP転写物(2’OMe-RNAプライマーSynth-out1mm、鋳型sfGFP、全長+752nt)の長い範囲の合成におけるTGLLK又は2Mによる2’OMe-RNA(OMe)及びMOE-RNA(MOE)合成の変性PAGE。
【図4】図4 2’OMe/MOE-RNAアプタマーと結合動態。a～c) a)ARC224 2’OMe-GACU、b)ARC224 2’OMe-GU MOE-AC(MOE置換、緑)及びc)ARC224 2’OMe-U MOE-ACG(SPR結合動態:補足表3)についての抗VEGFアプタマーARC2246の配列と二次構造の表現(上のパネル)、それぞれのSPRセンサーグラムと平均KD(中央)、適合する曲線の残基(下)。配列は配列番号18～20である。
【図5】図5 新生鎖の立体ゲートとポリメラーゼモチーフ。a)モチーフC(T541)とモチーフKxY(K592)の新生鎖立体ゲートの配列状況と保存を示すpolBポリメラーゼファミリー中の保存された配列モチーフ。b)D540と共にH結合ネットワークを伴う立体ゲート及び+1マイナーグルーブへの直接接触と3'末端ヌクレオチドへの間接接触(H2Oを介する)を示す活性部位2’OMe-ATP(KOD DNAポリメラーゼ(PDB ID 5OMF))との構造的状況。c)古細菌polBポリメラーゼ(左)から、細菌polBポリメラーゼ(中央)、真核生物polBポリメラーゼ(右)へのpolB系統発生にわたる新生鎖立体ゲートの構造的保存。
【図6】図6(補足図1)ポリメラーゼスクリーニング。a)操作したポリメラーゼとTGLLK(青と緑)、TGHLK(オレンジ)及び2M(赤)中のそれぞれの重要な変異を示す配列アライメント。配列は配列番号12、21、及び13である。b)材料＆方法に記載のポリメラーゼ活性アッセイ(PAA)を用いてポリメラーゼ構造(KOD DNAポリメラーゼ(PDB ID 5OMF))中のスクリーニングされた残基(D540、T541、K592、D614、E664)の相対位置の表現。c)定義された配列鋳型(DNAプライマーFD、鋳型TempNpure、全長+72nt)上の、スクリーニングで特定された異なるTGLLK(I521L)単一突然変異体による2’OMe-RNA合成の変性PAGE。T541G及びK592A及びE664R変異の正の効果に注意されたい。この状況で、本発明者らはまた、2’OMe-RNA合成を高めるが、最終的にはI521L変異体を支持するTGLLK状況におけるL521Hへの変異を調査した。d)定義された配列鋳型(DNAプライマーFD、鋳型TempNpure、全長+72nt)での異なるTGLLK及びTGHLK突然変異体による2’OMe-RNA合成の変性PAGE。T541GとK592A二重変異の相乗効果に注意されたい。e)ランダムN40鋳型(DNA/2’OMe-RNAプライマーA-試験2、鋳型Tag3.3-N40-試験2、全長+79nt)での2MによるDNA/2’OMe-RNA合成の変性PAGE。
【図7】図7(補足図2) 2’Omezyme R15/5-KのpH及びマグネシウム依存性。(a)示すような緩衝系(1mM Mg2+、37℃、16.5時間)でpHを変えるか、又は(b)MgCl2(pH7.4、37℃、16.5時間)の濃度を変えたSub_Kras_12[G12D] RNA(1μM)における2’Omezyme R15/5-K(5μM)又は類似のDNAzyme「1023_KrasC」(5μM)の正規化した活性。(c)Mg2+の非存在(pH7.4、37℃、5mM EDTA)下での基質RNA Sub_Kras_12[G12D] RNA(1μM)及び2’Omezyme R15/5-Kras(5μM)との前定常状態のシングルターンオーバー反応。エラーバーは、3回の独立した反復の平均の標準誤差(s.e.m.)を示す。(d & e)準生理学的条件(37℃、pH7.4、1mM Mg2+)下で(1μM)RNA基質の(d)Sub_KRas_12[G12D]又は(e)Sub_CTNNB1_33[S33Y]を用いてマルチターンオーバー触媒作用を行った(10nM)2’Omezyme(d)R15/5-K又は(e)R15/5-Cを示す尿素PAGEゲル。
【図8】図8(補足図3)。2’OMezyme R15/5-Kに触媒されるRNA切断生成物の特性評価。(a)RNA Sub_KRas_12[G12D]のR15/5-Kに触媒される切断の5'RNA生成物のMALDI-ToFスペクトル。生成物の予想質量は、3'一リン酸(p)又は環状リン酸(＞p)で示されている(模式図に示されている)(配列番号22)。(b)RNA Sub_KRas_12[G12D]のR15/5-Kに触媒される切断の5'生成物のホスファターゼアッセイ。事前に酸加水分解を行うか又は行わずに、ウシ腸ホスファターゼ(CIP;2'又は3'末端一リン酸を除去するが、2'、3'-環状リン酸は除去しない)、又はT4ポリヌクレオチドキナーゼ(T4 PNK;一リン酸と2'、3'-環状リン酸の両方を除去する)で処理し、PAGE精製した5’生成物RNAを示す尿素PAGEゲル。レーン1は、マーカーとしての部分的に加水分解したRNA基質を示す。
【図9】図9(補足図4)。2’OMezyme R15/5-Kの血清ヌクレアーゼ耐性。(a)37℃での90%ヒト血清中の2’OMezyme R15/5-K及び類似のDNAzyme「1023_KRasC」の安定性を示す尿素PAGEゲルとグラフ。(b)準生理学的条件(pH7.4、1mM Mg2+、37℃、18時間)下でのRNA基質Sub_KRas_12[G12D](1μM)との反応による、90%ヒト血清中で、37℃で120時間インキュベートする前(レーン3)又はインキュベートした後(レーン4)の(5μm)2’OMezyme R15/5-Kの活性を示す尿素PAGEゲル。レーン1は、マーカーとしての部分的に加水分解したRNA基質を示す。
【図10】図10(補足図5)。再ターゲティング2’OMezyme R15/5-CTNNB1における推定不対基質-近位核酸塩基の変異スクリーニング。(a)RNA基質「Sub_CTNNB1_33」(c.98C＞A(S33Y)変異を保有するヒトCTNNB1 mRNAの残基85～111)に結合した再ターゲティング2’OMezyme「R15/5-CTNNB1」の配列と推定二次構造。2’OMe-RNAヌクレオチドは、シアン又は青(R15/5-Kからの配列変化)又はオレンジ(親R15/5_1 2’OMezymeからの変化を示す)で示され、RNAはオレンジで示されている。黒矢印はRNA切断部位を示す。丸で示したように、基質結合アームに隣接する推定不対位置の全ての可能な単一変異(又は1つの二重変異、A39G + U45A)を有する2’OMezymeの変異体を調製した。示される配列は、配列番号16及び23である。(b)準生理学的条件(pH7.4、1mM Mg2+、37℃、24時間)下でのRNA基質Sub_CTNNB1_33[S33Y](1μM)に対するR15/5-CTNNB1(2.5μM)の変異体の活性を示す尿素PAGEゲル。R15/5-CTNNB1: A39G、U45A変異体(*R15/5-Cと呼ばれる)を他の全ての実験に使用した。
【図11】図11(補足図6): 2’-O-(2-メトキシエチル)リボヌクレオシドの三リン酸化の一般的な合成経路。塩基＝アデニン(A、化合物a)、5-メチルウラシル(m5U、化合物b)、グアニン(G、化合物c)、又はシトシン(C、化合物d)。i) POCl3、プロトンスポンジ、(MeO)3PO、-15℃;ii)(Bu4N)3HP2O7、Bu3N、DMF、RT、30分;iii)TEAB緩衝液、RT、3工程にわたって13～28％(ワンポット)。
【図12】図12(補足図7) 2’OMe-RNA及びMOE-RNA合成の経時変化。a)定義された配列鋳型(2’OMe-RNAプライマーFD、鋳型TempNpure、全長+72nt)でのTGLLK及び2Mによる2’OMe-RNA及びMOE-RNA合成の経時変化の変性PAGE。2Mは、それぞれ5分未満(2’OMe-RNA)、20分未満(MOE-RNA)で全長合成(+72nt)に達する。b)ランダムN40配列鋳型(2’OMe-RNAプライマーFD-試験2、鋳型Tag3.3-N40-試験2、全長+79nt)での2MによるDNA、2’OMe-RNA、及びMOE-RNA合成の経時変化の変性PAGE。2Mは、それぞれ1分未満(DNA)、10分未満(2’OMe-RNA)、30分未満(MOE-RNA、SI 図17のデンシトメトリー測定)で全長合成(+79nt)に達する。
【図13】図13(補足図8) 2’OMe-RNA、混合2’OMe/MOE-RNA、及び全MOE-RNAの合成。(左から右へ)定義された配列鋳型(2’OMe-RNAプライマーFD、鋳型TempN、全長+57nt)でのTGLLK及び2Mによる2’OMe-RNA合成、混合2’OMe/MOE-RNA合成(2’OMe-U/G/C MOE-A、2’OMe-G/C MOE-A/m5U、2’OMe-C MOE-A/m5U/G)、及び全MOE-RNA合成の変性PAGE。MOE含量が増加するに連れてゲルシフト(遅延)が増加し、ヘリックスから突き出る2’-O-(2-メトキシエチル)基の流体力学的エンベロープが増加することを示すことに注意されたい。
【図14】図14(補足図9) 2’OMe/MOE-RNAアプタマー。a)、b) a)ARC224 2’OMe-及びARC224 2’OMe m5U並びにb)ARC224 MOEについての抗VEGFアプタマーARC22413の配列と二次構造表現(上のパネル)、それぞれのSPRセンサーグラムと平均KD(中央)、適合する曲線の残基(下)。ARC224(2’OMe-U)と比較したARC224 2’OMe-m5Uの親和性の低下に注意されたい。配列は配列番号24及び25である。
【図15】図15.(補足図10)ポリメラーゼの系統発生とモチーフの保存。a)古細菌(パイロコッカス(Pyrococcales)/テルモコックス(Thermococcales))、細菌(大腸菌、RB69バクテリオファージ)、真核生物(サッカロミセス)、哺乳類(ヒト)、及びウイルス(ワクシニア)ポリメラーゼを含むpolBファミリーポリメラーゼの系統樹。b)異なるpolBポリメラーゼ間の配列アライメントとモチーフC(左)及びKxY(右)の保存。配列は配列番号26～40である。
【図16】図16(補足図11) 2MによるMOE-RNA合成の忠実度。反対側の鋳型Cにいくつかの誤組み込みを示すMOE-GTPを除いて、正しい組み込みについて予想される停止パターンを示す1つのMOE-NTP(左から右へ: MOE-CTP、MOE-GTP、MOE-m5UTP、MOE-ATP)を省いて、TempNpure鋳型(プライミング部位後の3’-CTAG-5’)に対する最初の4つの塩基の鋳型合成を示すMOE-RNA忠実度のドロップアウトアッセイ。全MOE-NTPsによる全長合成(+72nt)も示されている。
【図17】図17(補足図12) 2MによるATP、2’OMe-ATP及びMOE-ATPを用いた2’OMe-RNAプライマー伸長についての定常状態の動態。a) ATP(黒丸)、2’OMe-ATP(赤四角)及びMOE-ATP(シアンの三角形)について2M(n＝3)による鋳型BFL770(補足表1)での2’OMe-RNAプライマーFAM-FDの伸長についてヌクレオチド三リン酸濃度[NTP]に対して718プロットした定常状態の動態パラメーターV0(μmole/分)。b)2Mによる一塩基組み込みの定常状態の動態パラメーターの表。
【図18】図18(補足図13) 他のポリメラーゼに対する2Mの評価。a)各ポリメラーゼに最適な条件下、定義された配列鋳型(DNA又は2’OMe-RNAプライマーFD、鋳型TempNpure、全長+72nt)での2M及び操作したTaq Stoffel断片変異体SFM4-6によるRNA、2’F-DNA、及び2’OMe-RNA合成の変性PAGE。b)RGVG-M6の最適条件下、長い定義された配列鋳型(材料＆方法に記載の通りに作製、901bp)でのT7 RNAポリメラーゼ(WT)及び操作したT7 RNAP変異体RGVG-M6によるRNA及び2’OMe-RNA転写の変性PAGE。c)等モル核酸インプット(プライマー及びdsDNA鋳型の50nM(0.5pmol)インプット)下で、1.5mM Mn2+の存在下及び非存在下、長い定義された配列鋳型(転写反応用: 材料＆方法に記載の通りに作製した鋳型、901bp;プライマー伸長反応用:2’OMe-RNAプライマーSynthout1mm、鋳型sfGFP、全長+752nt)での2M及び操作したT7 RNAP変異体RGVG-M6による2’OMe-RNAプライマー伸長合成及び転写の変性PAGE。
【図19】図19(補足図14)ポリメラーゼの比較。各ポリメラーゼに最適な条件下で、Mn2+イオンの存在下と非存在下の両方で、定義された配列鋳型(2’OMe-RNAプライマーFD、鋳型TempNpure、全長+72nt)での2M、操作したKOD変異体DGLNK14、及びDGLNK変異D614Nを保有する2M(2M D614N)による2’OMe-及びMOE-RNA合成の変性PAGE。記載14されるように、KOD DGLNKは、Mn2+の存在下での2’OMe-RNA合成において最高の性能を発揮するが、MOE-RNAを効率的に合成することはできない。興味深いことに、D614N変異は、2’OMe-RNA合成の状況で2Mに対する活性をわずかに増加させる。
【図20】図20(補足図15) 2M対3Mのポリメラーゼ比較。a)ポリメラーゼTgo野生型と操作したポリメラーゼ、並びにTGK(青)、TGLLK(緑)及び2M(赤)及び3M(茶)内のそれぞれの重要な変異を示す配列アライメント。配列番号は配列番号10、11、12、13、41である。b)定義された配列鋳型(DNA/2’OMe-RNAプライマーFD、鋳型TempNpure、全長+72nt)でのTGK、TGLLK、2M及び3MによるDNA(H)、RNA(OH)、2’F-RNA(F)、及び2’OMe-RNA(OMe)合成の変性PAGE。c)定義された配列鋳型(2’OMe-RNAプライマーFD、鋳型TempNpure、全長+72nt)でのTGLLK、2M及び3Mによる2’OMe-RNA(OMe)及びMOE-RNA(MOE)合成の変性PAGE。
【図21】図21(補足図16)ヘアピンリボザイムの類似体としての2’OMezyme R15/5-C。a)ヒトCTNNB1 mRNA RNA(上)及びヘアピンリボザイム(Hpz)(下)を標的とするように操作した2’OMezyme R15/5-Cの配列と推定二次構造。2’OMe-RNAヌクレオチド(R15/5-C)は、オレンジ又はシアンで示されている(Hpzコンセンサスと同一の変異か又は変異している)。RNAヌクレオチドは、赤又はシアンで示されている(R15/5-Cと同等の場合)。RNA基質は灰色で示されている。黒矢印はRNA切断部位を示す。配列は配列番号42、43、44である。b)Hpzコンセンサスに対して変異を有するR15/5-Cの変異体によるSub_CTNNB1_33基質RNA(1μM)の切断を示す尿素PAGEゲル。(c)2’OMezyme R15/5_1のRNAライゲーション活性を示す尿素PAGEゲル。準生理学的緩衝液(pH7.4、1mM Mg2+)(レーン4、5、9、10、12及び13)又はマグネシウムを含まない緩衝液(pH7.4、5mM EDTA)(レーン2、3、7、8)中で20時間、氷中-7℃(レーン2～5)又は過冷却(レーン7～10)で、又は37℃でR15/5-K(5μM)と再インキュベートしたSub_KRas_12[G12D](各1μM)のR15/5-Kに触媒される切断のPAGE精製済み5’(FITC-標識)及び3’(未標識)RNA切断生成物。レーン1は、マーカーとして部分的に加水分解されたRNA Sub_KRas_12[G12D]基質を示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
(発明の詳細な説明)
本明細書に提供されるのは、2残基の立体制御「ゲート」に変異を含有し得るポリメラーゼである。本明細書に提供されるポリメラーゼは、このゲートの立体的嵩高さを低下させるように操作されており、該ポリメラーゼは、ゼノ核酸(XNA)ポリマーを合成する能力が高まっている。特に、該ポリメラーゼは、2’-O-メチル-RNA及び(2’OMe-RNA)ヌクレオチド及び/又は2’-O-(2-メトキシエチル)-RNA(MOE-RNA)ヌクレオチドをポリマーに組み込むことが可能であり得る。
本明細書に提供されるのは、2残基の立体制御「ゲート」に変異を含有し得るポリメラーゼである。本明細書に提供されるポリメラーゼは、このゲートの立体的嵩高さを低下させるように操作されており、該ポリメラーゼは、ゼノ核酸(XNA)ポリマーを合成する能力が高まっている。特に、該ポリメラーゼは、2’-O-メチル-RNA及び(2’OMe-RNA)ヌクレオチド及び/又は2’-O-(2-メトキシエチル)-RNA(MOE-RNA)ヌクレオチドをポリマーに組み込むことが可能であり得る。
【0028】
そのため、ある態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してT541及び/又はK592で変異している、前記核酸ポリメラーゼが提供される。言い換えると、該ポリメラーゼは、配列番号1のアミノ酸配列に対して、i)T541、ii)K592、又はiii)T541及びK592で変異していてよい。
【0029】
該ポリメラーゼは、配列番号1に対してE664変異を含み得る。
【0030】
いくつかの実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、T541及びK592に変異を含む。いくつかの実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、T541及びE664に変異を含む。いくつかの実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、T541、K592、及びE664に変異を含む。
【0031】
T541及び/又はK592における変異は、それほどかさばらない残基への変異であり得る。そのため、変異は、541位のスレオニン又は592位のリジンよりも立体ブロックが少ない任意の残基への変異であり得る。T541変異は、T541G、T541S、T541A、T541C、T541D、T541P、又はT541N群から選択され得る。特に、T541変異は、T541G又はT541Sであり得る。K592変異は、K592G、K592A、K592C、K592M、K592S、K592D、K592P、K592N、K592T、K592E、K592V、K592Q、K592H、K592I、又はK592Lであり得る。特に、K592変異は、K592G、K592A、K592C、又はK592Mであり得る。
【0032】
E664における変異は、任意の正電荷残基への変異であり得る。E664変異は、E664K、E664R、又はE664Hであり得る。特に、E644変異は、E664K又はE664Rであり得る。
【0033】
実施態様において、T541における変異はT541Gである。実施態様において、K592における変異は、K592A又はK592Gである。実施態様において、E644における変異は、E664K又はE664Rである。該ポリメラーゼは、変異T541G及びK592Aを含み得る。該ポリメラーゼは、変異T541G及びE664Kを含み得る。該ポリメラーゼは、変異T541G及びE664Rを含み得る。該ポリメラーゼは、変異T541G、K592A、及びE664Kを含み得る。該ポリメラーゼは、変異T541G、K592A、及びE664Rを含み得る。
【0034】
該ポリメラーゼは、変異T541G及びK592位における変異を含み得る。位置K592における変異は、A又はGなどの本明細書に開示される任意のものであり得る。該ポリメラーゼは、変異T541G、K592位における変異、及びE664位における変異を含み得る。
【0035】
該ポリメラーゼは、配列番号1に対して、位置D540、D542、K591、K593、Y663、及び/もしくはQ665のいずれか1つ、全部、又は任意の組み合わせで変異を含み得る。場合によっては、位置D540、D542、K591、及び/又はK593における変異は、任意のそれほどかさばらない残基、すなわち、野生型残基よりも立体ブロックが少ない任意の残基への変異である。場合によっては、Y663位、及び/又はQ665位における変異は、任意の正電荷を帯びた残基への変異である。
【0036】
いくつかの実施態様において、D540における変異は、D540A、D540G、D540S、又はD540Cである。特に、変異はD540Aであり得る。
【0037】
いくつかの実施態様において、D542における変異は、D542A、D542G、D542S、又はD542Cである。
【0038】
いくつかの実施態様において、K591における変異は、K591G、K591A、K591C、K591M、K591S、K591D、K591P、K591N、K591T、K591E、K591V、K591Q、K591H、K591I、又はK591Lである。
【0039】
いくつかの実施態様において、K593における変異は、K593G、K593A、K593C、K593M、K593S、K593D、K593P、K593N、K593T、K593E、K593V、K593Q、K593H、K593I、又はK593Lである。
【0040】
いくつかの実施態様において、E663変異は、E663K、E663R、又はE663Hであり得る。
【0041】
いくつかの実施態様において、E665変異は、E665K、E665R、又はE665Hであり得る。
【0042】
特定の実施態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してT541及びK592で変異している、前記核酸ポリメラーゼが提供される。実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、変異T541G及びK592A/K592Gを含む。ある実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、変異T541G及びK592Aを含む。
【0043】
別の実施態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してT541及びK592で変異しており、例えば、T541G及びK592A/K592Gであり、該アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対して、配列番号1に対する位置D540、D542、K591、K593、Y663、及び/もしくはQ665のうちの1以上、又は任意の組み合わせで変異している、前記核酸ポリメラーゼが提供される。
【0044】
別の実施態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してT541、K592、及びE644で変異している、前記核酸ポリメラーゼが提供される。実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、変異T541G、K592A/K592G、及びE664K/E664Rを含む。ある実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、変異T541G、K592A、及びE664Kを含む。別の実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、変異T541G、K592A、及びE664Rを含む。
【0045】
別の実施態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してT541、K592、及びE644で変異しており、例えば、T541G、K592A/K592G、及びE664K/E664Rであり、該アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対して、配列番号1に対する位置D540、D542、K591、K593、Y663、及び/もしくはQ665のうちの1以上、又は任意の組み合わせで変異している、前記核酸ポリメラーゼが提供される。
【0046】
T541とK592の両方は、古細菌、真核生物、さらにはウイルス起源のpolBポリメラーゼにおいて、配列レベルと構造レベル(図5、SI 図10)の両方で非常に高度に保存されているモチーフ(それぞれモチーフCとKxY)の一部である(Kazlauskasらの文献 BファミリーDNAポリメラーゼの多様性と進化(Diversity and evolution of B-family DNA polymerases) Nucleic Acids Res 2020、48(18): 620 10142-10156)。そのため、本開示の変異は、polBファミリー由来の任意のポリメラーゼのポリメラーゼ配列に適用され得るか、又はpolBファミリー由来の任意のポリメラーゼに由来し得る。特定の実施態様において、骨格は任意のpolBポリメラーゼである。他の実施態様において、骨格は、ウイルスポリメラーゼを除く任意のpolBポリメラーゼである。骨格は、古細菌テルモコックス属及び/又はピロコッカス属のポリメラーゼのものであり得る。
【0047】
該ポリメラーゼは、T.gorgonarius(Tgo)由来のポリメラーゼの変異体であり得る。野生型Tgoの配列を以下に示す:
(配列番号1)。
【化1】
【0048】
本明細書に開示される任意の核酸ポリメラーゼは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。前記アミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有し得る。前記アミノ酸配列は、配列番号1のアミノ酸配列に対してT541及び/又はK592、及び任意にE664で変異していてよい。該ポリメラーゼは、本明細書に開示されるような任意の特異的変異又は変異のパターンを含み得る。
【0049】
本明細書に開示されるポリメラーゼは、配列番号1に対するV93変異を含み得る。該変異はV93Qであり得る。
【0050】
本明細書に開示されるポリメラーゼは、配列番号1に対するD141変異及び/又はE143変異を含み得る。該変異は、D141A及び/又はE143Aであり得る。
【0051】
本明細書に開示されるポリメラーゼは、配列番号1に対するA485変異を含み得る。該変異はA485Lであり得る。
【0052】
該核酸ポリメラーゼのアミノ酸配列は、以下の変異:V93Q、D141A、E143A、及びA485Lのうちの1以上、又は全てをさらに含み得る。
【0053】
V93Qは、ウラシル停止を無効にすることが知られている変異であり、D141A及びE143Aは、3'-5'エキソヌクレアーゼ機能を低下させ、「サーミネーター」変異(A485L)は、不自然な基質の組み込みを高めることが知られている。これらの変異を含むTgoポリメラーゼ(以下TgoTと呼ぶ)の配列を以下に示す:
(配列番号2)。
【化2】
【0054】
変異が配列番号1を含む骨格に適用される本明細書に開示される実施態様のいずれかの変異は、配列番号2を含む骨格に適用されてよく、ここで、残基93、141、143、及び485は不変である。例えば、いくつかの実施態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対してT541及び/又はK592、及び任意にE664で変異しており、ここで、残基93、141、143、及び485は不変である、前記核酸ポリメラーゼが提供される。該アミノ酸配列はまた、位置D540、D542、K591、K593、Y663、及び/又はQ665のいずれか1つ又は任意の組み合わせで変異を含み得る。
【0055】
本明細書に開示されるポリメラーゼは、配列番号1に対してY409変異を含み得る。場合によっては、Y409変異は、Y409N又はY409Gであり得る。
【0056】
【0057】
本明細書に開示されるポリメラーゼは、配列番号1に対してF545変異を含み得る。場合によっては、F545変異はF545Lであり得る。
【0058】
【0059】
該ポリメラーゼは、配列番号1又は配列番号2に対して変異Y409、I521、T541G、F545、K592A/K592G、及びE664を含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1又は配列番号2に対して変異Y409G/Y409N、I521L/I521H、T541、F545L、K592、及びE664K/E664Rを含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1又は配列番号2に対して変異Y409G/Y409N、I521L/I521H、T541G、F545L、K592A/K592G、及びE664K/E664Rを含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1又は配列番号2に対して変異Y409G、I521L、T541G、F545L、K592A、及びE664Kを含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1に対して変異V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、T541G、F545L、K592A、及びE664Kを含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1又は配列番号2に対して変異Y409G、I521L、T541G、F545L、K592A、及びE664Rを含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1に対して変異V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、T541G、F545L、K592A、及びE664Rを含み得る。
【0060】
該ポリメラーゼは、配列番号1又は配列番号2に対して変異Y409、I521、T541G、F545、K592A/K592G、D614N、及びE664を含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1又は配列番号2に対して変異Y409G/Y409N、I521L/I521H、T541、F545L、K592、D614、及びE664K/E664Rを含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1又は配列番号2に対して変異Y409G/Y409N、I521L/I521H、T541G、F545L、K592A/K592G、D614N、及びE664K/E664Rを含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1又は配列番号2に対して変異Y409G、I521L、T541G、F545L、K592A、D614N、及びE664Kを含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1に対して変異V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、T541G、F545L、K592A、D614N、及びE664Kを含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1又は配列番号2に対して変異Y409G、I521L、T541G、F545L、K592A、D614N、及びE664Rを含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1に対して変異V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、T541G、F545L、K592A、D614N、及びE664Rを含み得る。
【0061】
特定の実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、以下のアミノ酸配列を含むか、又は以下のアミノ酸配列のものであり得る:
(配列番号3;2Mポリメラーゼとしても知られる)。
【化3】
【0062】
そのため、態様において、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列のポリメラーゼであって、ここで、残基93、141、143、409、485、521、541、545、592、及び664は不変である(すなわち、変異V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、T541G、F545L、K592A、及びE664Kは維持される)、前記ポリメラーゼが提供される。
【0063】
特定の実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、以下のアミノ酸配列を含むか、又は以下のアミノ酸配列のものであり得る:
(配列番号4;3Mポリメラーゼとしても知られる)。
【化4】
【0064】
そのため、ある態様において、配列番号4のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列のポリメラーゼであって、ここで、残基93、141、143、409、485、521、541、545、592、及び664は不変である(すなわち、変異V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、T541G、F545L、K592A、及びE664Rは維持される)、前記ポリメラーゼが提供される。
【0065】
特定の実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、以下のアミノ酸配列を含むか、又は以下のアミノ酸配列のものであり得る:
(配列番号5; 2M+D614Nポリメラーゼとしても知られる)。
【化5】
【0066】
そのため、態様において、配列番号5のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列のポリメラーゼであって、ここで、残基93、141、143、409、485、521、541、545、592、614、及び664は不変である(すなわち、変異V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、T541G、F545L、K592A、D614N、及びE664Kは維持される)、前記ポリメラーゼが提供される。
【0067】
特定の実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、以下のアミノ酸配列を含むか、又は以下のアミノ酸配列のものであり得る:
(配列番号6; 3M+D614Nポリメラーゼとしても知られる)。
【化6】
【0068】
そのため、態様において、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列のポリメラーゼであって、ここで、残基93、141、143、409、485、521、541、545、592、614、及び664は不変である(すなわち、変異V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、T541G、F545L、K592A、D614N、及びE664Rは維持される)、前記ポリメラーゼが提供される。
【0069】
いくつかの実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、配列:
(配列番号7、ここで、Xは任意のアミノ酸である)を含む。
【化7】
【0070】
他の実施態様において、該核酸ポリメラーゼは、配列:
(配列番号8、ここで、Xは任意のアミノ酸である)を含む。
【化8】
【0071】
配列番号7及び配列番号8は、polBファミリーポリメラーゼのモチーフC及びKxYのアライメント後に得られたコンセンサス配列に由来し(図15(捕捉図10)参照)、「X」アミノ酸は保存されていないため、ある程度の変動を許容し得る。配列番号7は、変異T541G、F454L、及びK592Aを含む。配列番号8は、変異T541G、F454L、及びK592Gを含む。
【0072】
そのため、態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号7又は配列番号8を含む、前記核酸ポリメラーゼが提供される。配列番号7及び配列番号8は、配列番号1の残基536から配列番号1の残基598に位置付けられる。核酸ポリメラーゼはまた、本明細書に開示される任意の変異又は変異のパターンを含み得る。例えば、変異V93Q、D141A、E143A、Y409G/Y409N、A485L、I521L/I521H、任意にD614N、及びE664K/E664R。特定の実施態様において、該ポリメラーゼは、変異V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、任意に、D614N、及びE664K/E664Rを含む。該ポリメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号1の位置D540、D542、K591、及び/又はK593に対応する本明細書に開示される任意の変異も含む配列番号7又は配列番号8を含み得る。これらは、配列番号7及び配列番号8の位置5、7、56、及び58である。
【0073】
別の態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列がE664R変異を含む、前記核酸ポリメラーゼが提供される。
【0074】
該核酸ポリメラーゼは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を含んでよく、ここで、前記アミノ酸配列が、配列番号1に対するE664R変異を含む。該ポリメラーゼは、本明細書に開示されるような任意の他の特異的変異又は変異のパターンを含み得る。例えば、該ポリメラーゼは、以下の変異:配列番号1に対してV93Q、D141A、E143A、及びA485Lのうちの1以上、又は全て;以下の変異:配列番号1に対してY409、I521、及びF545のうちの1以上、又は全て;並びに/又は以下の変異:配列番号1に対してY409G、I521L又はI521H、及びF545Lのうちの1以上、又は全てを含み得る。該ポリメラーゼは、D614Nなどの配列番号1に対してD614を含み得る。
【0075】
別の態様において、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列に少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1に対して位置D540、D542、K591、K593、Y663、及び/もしくはQ665の任意の1つ、全て、又は任意の組み合わせで変異を含む、前記核酸ポリメラーゼが提供される。場合によっては、位置D540、D542、K591、及び/又はK593のいずれかにおける変異は、任意のそれほどかさばらない残基、すなわち、野生型残基よりも立体ブロックが少ない任意の残基への変異である。場合によっては、位置Y663、及び/又はQ665のいずれかにおける変異は、任意の正に帯電した残基への変異である。いくつかの実施態様において、D540における変異は、D540A、D540G、D540S、又はD540Cである。特に、変異はD540Aであり得る。いくつかの実施態様において、D542における変異は、D542A、D542G、D542S、又はD542Cである。いくつかの実施態様において、K591における変異は、K591G、K591A、K591C、K591M、K591S、K591D、K591P、K591N、K591T、K591E、K591V、K591Q、K591H、K591I、又はK591Lである。いくつかの実施態様において、K593における変異は、K593G、K593A、K593C、K593M、K593S、K593D、K593P、K593N、K593T、K593E、K593V、K593Q、K593H、K593I、又はK593Lである。いくつかの実施態様において、E663変異は、E663K、E663R、又はE663Hであり得る。いくつかの実施態様において、E665変異は、E665K、E665R、又はE665Hであり得る。該ポリメラーゼは、本明細書に開示されるような任意の他の特異的変異又は変異のパターンを含み得る。特に、本明細書に開示されるT541、K592、及び/又はE664における任意の変異。該ポリメラーゼはまた、以下の変異:配列番号1に対してV93Q、D141A、E143A、及びA485Lのうちの1以上、又は全て;以下の変異:配列番号1に対してY409、I521、及びF545のうちの1以上、又は全て;並びに/又は以下の変異:配列番号1に対してY409G、I521L又はI521H、及びF545Lのうちの1以上、又は全てを含み得る。該ポリメラーゼは、D614Nなどの配列番号1に対するD614変異を含み得る。
【0076】
本開示のポリメラーゼは、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる。核酸鋳型は、DNAヌクレオチドポリマー鋳型であり得る。非DNAヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド以外のヌクレオチドを意味する。該ポリメラーゼは、2’-O-メチル-RNA及び(2’OMe)ヌクレオチド及び/又は2’-O-(2-メトキシエチル)-RNA(MOE)ヌクレオチドをポリマーに組み込むことが可能であり得る。該ポリメラーゼはまた、ホスホロチオエート2’-O-2-メトキシエチル-RNA(PS-MOE)ヌクレオチド及び/又はロック核酸(LNA)ヌクレオチドをポリマーに組み込むことが可能であり得る。
【0077】
該核酸ポリメラーゼは、DNAプライマーに作用して、2’OMe、MOE、PS-MOE、又はLNAポリマーを合成することが可能であり得る。該核酸ポリメラーゼは、非DNAプライマーに作用して、2’OMe、MOE、PS-MOE、又はLNAポリマーを合成することが可能であり得、例えば、該ポリメラーゼは、2’OMe-RNAプライマーに作用することが可能であり得る。
【0078】
本開示の多数のポリメラーゼが、複数のXNAに対する活性を示し得ることが理解されるであろう。そのため、該ポリメラーゼは、2種類のXNAを含むポリマー又はオリゴマーを合成することが可能であり得る。例えば、2’OMeヌクレオチドとMOEヌクレオチドの両方を含むポリマー。
【0079】
特定の機能を有することができるとみなされるには、該ポリメラーゼは、長さが少なくとも14ヌクレオチド、適切には長さが少なくとも15ヌクレオチド;より適切には長さが40ヌクレオチド、最も適切には長さが少なくとも50ヌクレオチドのポリマーを生成する必要がある。
【0080】
そのため、本開示のポリメラーゼが特定の種類のXNAを組み込むことができると論じられる場合には、該ポリメラーゼは、ポリマー又は少なくとも40ヌクレオチド、適切には少なくとも50ヌクレオチドの長さを一貫して生成できると予想されることを理解されたい。
【0081】
適切には、本明細書に開示されるポリメラーゼによって生成されるポリマーは、それらの情報含量の点で従来のDNAポリマーと同じ4つの塩基を反映し、鋳型の相補的な塩基に対応する。
【0082】
本明細書に開示されるポリメラーゼは、2Mポリメラーゼを含め、以下の表の化学物質に作用することが可能であり得る。
【表1】
【0083】
該核酸ポリメラーゼは、一本鎖核酸鋳型と相補的な2’OMe、MOE、PS-MOE、又はLNAポリマーなどのXNA分子を合成するためにDNAプライマーに作用することができるポリメラーゼであり得る。このようなポリメラーゼには、polBファミリー由来の任意のポリメラーゼの骨格にY409G、I521L、T541G、F545L、K592A、及びE664K(配列番号1に対して記載)に対応する変異を含むポリメラーゼが含まれる。特定の実施態様において、骨格は、ウイルスポリメラーゼを除く任意のpolBポリメラーゼである。骨格は、古細菌テルモコックス属及び/又はピロコッカス属由来のポリメラーゼのものであり得る。該ポリメラーゼは、T.gorgonarius(Tgo)由来のポリメラーゼの変異体であり得る(配列番号1)。該ポリメラーゼは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列のものであり得、ここで、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対して変異Y409G、I521L、T541G、F545L、K592A、及びE664Kを含む。特定の実施態様において、2’OMe、MOE、PS-MOE、又はLNAポリマーを合成するためにDNAプライマーに作用することができる核酸ポリメラーゼは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列のものであり得、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対して変異V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、T541G、F545L、K592A、及びE664Kを含む。
【0084】
ポリメラーゼ
原則として、本開示のポリメラーゼは、本明細書に記載の特異的変異を、開始ポリメラーゼの対応する部位又は操作者の選択する「ポリメラーゼ骨格」に導入することによって作製され得る。このようにして、その出発ポリメラーゼの活性は、本明細書に記載されるような活性を提供するように改変され得る。
原則として、本開示のポリメラーゼは、本明細書に記載の特異的変異を、開始ポリメラーゼの対応する部位又は操作者の選択する「ポリメラーゼ骨格」に導入することによって作製され得る。このようにして、その出発ポリメラーゼの活性は、本明細書に記載されるような活性を提供するように改変され得る。
【0085】
該ポリメラーゼ骨格は、周知のpolB酵素ファミリー(配列番号1の例示的配列とわずか36%の同一性を示すpolデルタ変異体を含む)の任意のメンバーであり得る。場合によっては、該ポリメラーゼ骨格は、ウイルスポリメラーゼを除く周知のpolB酵素ファミリーの任意のメンバーであり得る。該ポリメラーゼ骨格は、配列番号1と少なくとも36%;少なくとも50%;少なくとも60%;少なくとも70%;又は少なくとも80%の同一性を有する周知のpolB酵素ファミリーの任意のメンバーであり得る。80%の同一性レベルでは、古細菌テルモコックス属及び/又はピロコッカス属のpolB酵素が包含される。特定の実施態様において、該ポリメラーゼ骨格は、配列番号1と少なくとも90%の同一性を有する。
【0086】
そのため、一例では、核酸鋳型から非DNAヌクレオチドポリマーを生成することができる核酸ポリメラーゼであって、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号1のアミノ酸配列に対して、本明細書に開示される任意の変異又は変異のパターンを含むpolBファミリー由来のポリメラーゼである、前記核酸ポリメラーゼが提供される。特定の実施態様において、配列は、特定された変異とは別に野生型である。
【0087】
他のポリメラーゼ骨格を使用する場合、当技術分野において周知のとおり、変異は同等の位置に移動される。例えば、例示的なポリメラーゼ6G12を参照して、以下の表は、代替骨格への変異の移動がどのように実施され得るかを示す。この表は、Pol6G12変異と、他のPolBにおける構造的等価位置を示している。Pol6G12に見られる変異は、野生型Tgoの基底配列に対して示されている。他のよく研究されたBファミリーポリメラーゼの構造的に同等の残基が与えられる。同等の位置にマッピングされなかった残基は、N.D.として示される。
【表2】
【0088】
該ポリメラーゼは、ポリメラーゼ機能を保持するポリメラーゼの断片であり得る。
【0089】
参照配列
ポリメラーゼの特定のアミノ酸残基を、数値アドレスを用いて参照する場合、付番は、配列番号1の真の野生型アミノ酸配列(又はそれをコードする核酸配列)を基準にして行われる。
ポリメラーゼの特定のアミノ酸残基を、数値アドレスを用いて参照する場合、付番は、配列番号1の真の野生型アミノ酸配列(又はそれをコードする核酸配列)を基準にして行われる。
【0090】
これは、当技術分野においてよく理解されているように、目的の残基を位置づけるために用いられるべきである。これは必ずしも厳密なカウント作業ではなく、状況に注意を払う必要がある。例えば、目的のタンパク質がわずかに異なる長さである場合、(例えば)E664に対応するその配列における正しい残基の位置は、単に目的の配列の664番目の残基を取るのではなく、配列を整列させ、同等又は対応する残基を選別する必要があり得る。これは十分に当業者の範囲内にある。
【0091】
「変異」は、言及される残基、モチーフ又はドメインの置換又はトランケーション又は欠失を指し得る。特定の実施態様において、変異は、1種類のアミノ酸残基の別の種類のアミノ酸残基との置換である。
【0092】
変異は、例えば、変異配列を有するポリペプチドの合成によってポリペプチドレベルでもたらされるか、又は、例えば、変異配列をコードする核酸を作製することによってヌクレオチドレベルでもたらされてよく、その核酸は、その後、変異ポリペプチドを生成するために翻訳され得る。所与の変異部位の置換アミノ酸としてアミノ酸が指定されていない場合には、デフォルトとして、アラニン(A)を使用してよい。適切には、特定の部位(複数可)で使用される変異は、本明細書に記載される通りである。
【0093】
断片は、適切には、目的のポリメラーゼポリペプチドの長さが少なくとも10個のアミノ酸、適切には少なくとも25個のアミノ酸、適切には少なくとも50個のアミノ酸、適切には少なくとも100個のアミノ酸、又は適切には大部分、すなわち、Tgo又はTgoT polB配列の387個以上のアミノ酸、適切には少なくとも500個のアミノ酸、適切には少なくとも600個のアミノ酸、適切には少なくとも700個のアミノ酸、適切には全773個のアミノ酸である。
【0094】
配列のバリエーション
本開示のポリメラーゼは、本明細書でより詳細に記載される重要な変異に加えて、野生型配列に対する配列の変化を含み得る。具体的には、本開示のポリメラーゼは、本明細書に記載のポリメラーゼの機能又は作用を著しく損なわない部位における配列の変化を含み得る。
本開示のポリメラーゼは、本明細書でより詳細に記載される重要な変異に加えて、野生型配列に対する配列の変化を含み得る。具体的には、本開示のポリメラーゼは、本明細書に記載のポリメラーゼの機能又は作用を著しく損なわない部位における配列の変化を含み得る。
【0095】
ポリメラーゼの機能は、機能が損なわれていないか、又は著しく変わっていないことを確認するために、実施例の節などに記載されるようにポリメラーゼを操作することによって容易に試験することができる。
【0096】
そのため、該ポリメラーゼが、本明細書に定めるように容易に試験され得る機能を保持しているという条件で、野生型参照配列に対して配列の変更がポリメラーゼ分子内で行われてよい。
【0097】
保存的置換は、例えば、以下の表に従って行うことができる。第2列の同一ブロック中のアミノ酸、及び好ましくは、第3列の同一ライン中のアミノ酸が互いに置換され得る:
【表3】
【0098】
野生型配列に対してどの変異、置換、又は他のそのような変化が起こり得るかを検討する際には、ポリメラーゼの機能の保持が最も重要である。典型的には、保存的アミノ酸置換は、機能に悪影響を及ぼす可能性が低くなるであろう。適切には、本開示のポリメラーゼは、論じられるような場合を除いて、保存的アミノ酸置換によることのみが野生型配列と異なる。
【0099】
配列の類似性/同一性
配列比較は、容易に入手できる配列比較プログラムの助けを借りて実施することができる。これらの公的及び商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、2以上の配列間の配列同一性を計算することができる。
配列比較は、容易に入手できる配列比較プログラムの助けを借りて実施することができる。これらの公的及び商業的に入手可能なコンピュータプログラムは、2以上の配列間の配列同一性を計算することができる。
【0100】
当業者は、2つの核酸配列間の同一性の割合を計算する方法を理解しているだろう。2つの核酸配列間の同一性の割合を計算するためには、まず2つの配列のアライメントを準備し、続いて、配列同一性の値を計算する必要がある。2つの配列の同一性の割合は、(i)配列を整列させるために使用される方法、例えば、Needleman-Wunschアルゴリズム(例えば、Needle(EMBOSS)又はStretcher(EMBOSS)によって適用される)、Smith-Watermanアルゴリズム(例えば、Water(EMBOSS)によって適用される)、又はLALIGNアプリケーション(例えば、Matcher(EMBOSS)によって適用される);並びに(ii)アライメント法によって使用されるパラメーター、例えば、ローカルアライメント対グローバルアライメント、使用するマトリックス、及びギャップに適用されるパラメーターに依存して異なる値になる可能性がある。
【0101】
アライメントを行った後、2つの配列間の同一性の割合を計算する多くの異なる方法がある。例えば、同一の数を、(i)最短の配列の長さ;(ii)アライメントの長さ;(iii)配列の平均長;(iv)ギャップのない位置の数;又は(iv)オーバーハングを除いた等価位置の数で割ってよい。さらに、同一性の割合は長さにも強く依存することが理解されよう。したがって、配列のペアが短いほど、偶然に発生すると予想され得る配列の同一性が高くなる。
【0102】
次いで、2つの核酸配列間の同一性の割合の計算は、(N/T)*100としてそのようなアライメントから計算することができ、ここで、Nは、配列が同一の残基を共有する位置の数、Tはギャップを含むがオーバーハングを除いた比較される位置の総数である。
【0103】
配列アライメントは、ペアワイズ配列アライメントであり得る。適切なサービスには、Needle(EMBOSS)、Stretcher(EMBOSS)、Water(EMBOSS)、Matcher(EMBOSS)、LALIGN、又はGeneWiseが含まれる。一例では、2つのアミノ酸配列間の同一性は、デフォルトパラメーター、例えば、マトリックス(BLOSUM62)、ギャップオープン(10)、ギャップ伸長(0.5)、エンドギャップペナルティ(偽)、エンドギャップオープン(10)、及びエンドギャップ伸長(0.5)に設定されたサービスNeedle(EMBOSS)を用いて計算することができる。別の例では、2つのアミノ酸配列間の同一性は、デフォルトパラメーター、例えば、マトリックス(BLOSUM62)、ギャップオープン(14)、ギャップ伸長(4)、代替マッチ(1)に設定されたサービスMatcher (EMBOSS)を用いて計算することができる。一例では、2つの核酸配列間の同一性は、デフォルトパラメーター、例えば、マトリックス(DNAfull)、ギャップオープン(10)、ギャップ伸長(0.5)、エンドギャップペナルティ(偽)、エンドギャップオープン(10)、及びエンドギャップ伸長(0.5)に設定されたサービスNeedle(EMBOSS)を用いて計算することができる。別の例では、2つの核酸配列間の同一性は、デフォルトパラメーター、例えば、マトリックス(DNAfull)、ギャップオープン(16)、ギャップ伸長(4)、代替マッチ(1)に設定されたサービスMatcher(EMBOSS)を用いて計算することができる。
【0104】
適切には、同一性又は類似性は、本明細書に開示される関連するポリペプチド配列(複数可)(配列番号1～6のいずれか1つなど)と少なくとも400又は500、好ましくは600、700、又は773アミノ酸にわたってアミノ酸レベルで評価される。
【0105】
類似性又は同一性は、切断型核酸ポリメラーゼのアミノ酸配列の全長を、参照配列(配列番号1～6のいずれか1つなど)の関連部分と比較することによって計算することができる。特定の実施態様において、類似性又は同一性は、参照配列の全長(例えば、配列番号1～6のいずれか1つの全773残基)を考慮して計算される。ある実施態様において、本開示の核酸の配列同一性は、配列番号1～6のいずれか1つの全773残基に対する同一性の割合として計算される。
【0106】
適切には、類似性又は同一性は、非必須の隣接配列ではなく、タンパク質機能に必須であることが知られている配列のそれらの1以上の領域に関して考慮されるべきである。これは、遠縁の生物由来の相同配列を検討する場合に特に重要である。
【0107】
保存された領域を考慮する場合、適切には、配列番号1とpolB酵素ファミリーのpolデルタメンバーの両方に共通する残基の36%は、別段の記載がない限り、本開示のポリペプチドにおいて適切に変異しない潜在的に重要な残基であると見なされるべきである。そのため、適切には、本開示のポリペプチドは、配列番号1と少なくとも36%の同一性を有し、適切には、前記少なくとも36%の同一性を構成するアミノ酸残基は、配列番号1とpolB酵素ファミリーのpolデルタメンバーとの間で同一であるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む。適切には、本開示のポリペプチドは、配列番号1と少なくとも36%の同一性を有し、polB酵素ファミリーのpolデルタメンバーと少なくとも36%の同一性を有する。
【0108】
比較のために、ヒトDNAポリメラーゼデルタ触媒サブユニットの配列は、以下の配列:
(配列番号9)で提供される。
【化9】
【0109】
そのため、該ポリメラーゼは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有し、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、もしくは100%の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。該ポリメラーゼは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、又は100%の同一性を有し、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも36%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0110】
同じ考慮事項が、核酸ヌクレオチド配列に当てはまる。
【0111】
トランケーション
本開示の全長ポリメラーゼ酵素全体のトランケーションは、所望であれば行ってもよい。適切には、全長ポリメラーゼポリペプチドは、配列番号1～6のいずれか1つに示されるような全長Tgoポリメラーゼ1～773などの骨格ポリペプチドとして使用される。トランケーションを使用する場合は、活性について注意深くチェックする必要がある。これは、本明細書に記載の酵素(複数可)をアッセイすることによって容易に行うことができる。
本開示の全長ポリメラーゼ酵素全体のトランケーションは、所望であれば行ってもよい。適切には、全長ポリメラーゼポリペプチドは、配列番号1～6のいずれか1つに示されるような全長Tgoポリメラーゼ1～773などの骨格ポリペプチドとして使用される。トランケーションを使用する場合は、活性について注意深くチェックする必要がある。これは、本明細書に記載の酵素(複数可)をアッセイすることによって容易に行うことができる。
【0112】
精製
本開示のポリメラーゼは、都合の良いことに熱安定性である。これらのポリメラーゼを従来の(熱安定性ではない)宿主株で発現させることにより、都合の良いことに精製が簡略化される。例えば、本開示のポリメラーゼを従来の熱安定性ではない宿主細胞で発現させる場合、宿主細胞を99℃に加熱し、続いて細胞破片を遠心分離で除去するだけで、約90%の純度を得ることができる。例えば、宿主細胞の熱処理した可溶性画分をイオン交換及び/又はヘパリンカラム精製に供することにより、より高い純度レベルを得ることができる。
本開示のポリメラーゼは、都合の良いことに熱安定性である。これらのポリメラーゼを従来の(熱安定性ではない)宿主株で発現させることにより、都合の良いことに精製が簡略化される。例えば、本開示のポリメラーゼを従来の熱安定性ではない宿主細胞で発現させる場合、宿主細胞を99℃に加熱し、続いて細胞破片を遠心分離で除去するだけで、約90%の純度を得ることができる。例えば、宿主細胞の熱処理した可溶性画分をイオン交換及び/又はヘパリンカラム精製に供することにより、より高い純度レベルを得ることができる。
【0113】
適切には、本開示のポリメラーゼは、他のいかなるポリペプチドにも融合しない。適切には、本開示のポリメラーゼは、任意のさらなるポリペプチド又は融合体で標識されていない。
【0114】
忠実度
核酸ポリマーの正確な生成(又は再生)のために十分な忠実性が維持されることが明らかに重要である。適切には、本開示のポリメラーゼは、少なくとも95%の忠実度を保持する。忠実度(エラー閾値)は、導入されたエラーの数を重合したヌクレオチドの数で割ったものとして得ることができる。言い換えると、1%のエラー率は、重合した100ヌクレオチドごとに1エラーの導入に相当する。実際、本開示のポリメラーゼは、これよりもはるかに優れた忠実度を達成する。5%以下のエラー率は、本開示のポリメラーゼに対する最小の有用な忠実度レベルとして考慮される。適切には、本開示のポリメラーゼは、4%以下;適切には3%以下;適切には2%以下;適切には1%以下のエラー率を有する。
核酸ポリマーの正確な生成(又は再生)のために十分な忠実性が維持されることが明らかに重要である。適切には、本開示のポリメラーゼは、少なくとも95%の忠実度を保持する。忠実度(エラー閾値)は、導入されたエラーの数を重合したヌクレオチドの数で割ったものとして得ることができる。言い換えると、1%のエラー率は、重合した100ヌクレオチドごとに1エラーの導入に相当する。実際、本開示のポリメラーゼは、これよりもはるかに優れた忠実度を達成する。5%以下のエラー率は、本開示のポリメラーゼに対する最小の有用な忠実度レベルとして考慮される。適切には、本開示のポリメラーゼは、4%以下;適切には3%以下;適切には2%以下;適切には1%以下のエラー率を有する。
【0115】
忠実度は、そのため、2つの変換イベント(DNA-XNA及びXNA-DNA)を包含する集合的な忠実度(例えば、DNA-XNA-DNA)として評価され得る。数値はそれに応じて調整又は解釈されるべきである。
【0116】
方法と用途
本明細書に開示されるポリメラーゼは、XNAポリマーを生成するために使用され得る。そのため、態様において、非DNAヌクレオチドポリマーを作製する方法であって、重合を助長する条件下で、核酸鋳型と本明細書に開示される任意の核酸ポリメラーゼとを接触させることを含む、前記方法が提供される。
本明細書に開示されるポリメラーゼは、XNAポリマーを生成するために使用され得る。そのため、態様において、非DNAヌクレオチドポリマーを作製する方法であって、重合を助長する条件下で、核酸鋳型と本明細書に開示される任意の核酸ポリメラーゼとを接触させることを含む、前記方法が提供される。
【0117】
非DNAヌクレオチドポリマーは、2’OMe-RNAヌクレオチド及び/又はMOE-RNAヌクレオチドを含むか又はそれらからなり得る。そのようなものとして、2’OMe-RNAヌクレオチド及び/又はMOE-RNAヌクレオチドが重合中に提供され得る。実施態様において、得られるポリマーは、全て2’OMe-RNAポリマーである。別の実施態様において、得られるポリマーは、全てMOE-RNAポリマーである。追加の実施態様において、得られるポリマーは、2’OMe-RNAとMOE-RNAの両方を含む。該ポリマーは、2’OMe-RNA及びMOE-RNAのみを含み得る。該ポリマーはオリゴヌクレオチドであり得る。
【0118】
非DNAヌクレオチドポリマーは、ホスホロチオエート2’-O-2-メトキシエチル-RNA(PS-MOE)ヌクレオチド又はロック核酸(LNA)ヌクレオチドを含み得る。そのようなものとして、PS-MOEヌクレオチド及び/又はLNAヌクレオチドは、重合中に提供され得る。
【0119】
実施態様において、本方法は、2’OMe-RNAヌクレオチド、MOE-RNAヌクレオチド、PS-MOEヌクレオチド、LNAヌクレオチド、又は前記ヌクレオチドの任意の組み合わせを重合反応に提供することを含む。
【0120】
本方法は、プライマー、例えば、DNA又は非DNAプライマーの提供を含み得る。該プライマーは、2’OMe-RNAプライマーであり得る。
【0121】
本方法は、長さが少なくとも14、15、20、25、40、50、又は70ヌクレオチドのポリマーを生成するために使用され得る。
【0122】
別の態様において、非DNAヌクレオチドポリマーの生成のための、本明細書に開示される任意の核酸ポリメラーゼの使用が提供される。使用は、オリゴヌクレオチドの生成のためであり得る。該ポリマーは、2’OMe-RNAヌクレオチド、MOE-RNAヌクレオチド、PS-MOEヌクレオチド、LNAヌクレオチド、又は任意の組み合わせを含み得る。該ポリマーは、2’OMe-RNAヌクレオチドを含み得る。該ポリマーは、MOE-RNAヌクレオチドを含み得る。該ポリマーは、2’OMe-RNAヌクレオチド及びMOE-RNAヌクレオチドを含み得る。該ポリマーは、全2’OMe-RNAポリマーであり得る。該ポリマーは、全MOE-RNAポリマーであり得る。該ポリマーは、2’OMe-RNA及びMOE-RNAのみを含み得る。
【0123】
場合によっては、得られるポリマーは、触媒として作用することができる。該ポリマーはエンドヌクレアーゼであり得る。該触媒ポリマーは、2’OMe-RNA及び/又はMOE-RNAを含み得る。該触媒ポリマーは、2’OMe-RNAヌクレオチドのみを含み得る。該ポリマーは、2’OMe-RNAヌクレオチドのみを含み、エンドヌクレアーゼ活性(2’OMezyme)を有する。
【0124】
場合によっては、得られるポリマーはアプタマーである。アプタマーは、2’OMe-RNA及び/又はMOE-RNAを含み得る。アプタマーは、2’OMe-RNAのみ、MOE-RNAのみ、又は2’OMe-RNA及びMOE-RNAのみを含み得る。
【0125】
別の態様において、一本鎖核酸鋳型に相補的である非DNA核酸分子を合成するために、基質上に固定化されたDNAプライマーを伸長させるために、本明細書に開示される核酸ポリメラーゼの使用が提供される。
【0126】
生成物
ある態様において、触媒オリゴヌクレオチドが提供され、ここで、該ヌクレオチドは、2’OMe-RNAヌクレオチドのみを含む。該触媒オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ活性を有し得る。該オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される2’OMezymeの配列を有し得る。
ある態様において、触媒オリゴヌクレオチドが提供され、ここで、該ヌクレオチドは、2’OMe-RNAヌクレオチドのみを含む。該触媒オリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼ活性を有し得る。該オリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される2’OMezymeの配列を有し得る。
【0127】
別の態様において、本明細書に開示されるような任意のアプタマーが提供される。
【0128】
備考
本明細書に記載の特徴の全て(添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む)、並びに/又はそのように開示される任意の方法もしくはプロセスの工程の全ては、そのような特徴及び/又は工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
本明細書に記載の特徴の全て(添付の特許請求の範囲、要約及び図面を含む)、並びに/又はそのように開示される任意の方法もしくはプロセスの工程の全ては、そのような特徴及び/又は工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
【0129】
本発明をより良く理解するために、かつその実施態様がどのように実施され得るかを示すために、これから実施例に言及するが、それは決して本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【0130】
(実施例)
立体排除は、ポリメラーゼを含む酵素基質特異性の重要な要素である。本明細書で本発明者らは、古細菌DNAポリメラーゼにおける2残基の新生鎖立体制御「ゲート」の発見について述べる。先に記載されたRNAポリメラーゼ活性の状況で立体バルクを低下させるようにゲートを操作すると、2'修飾RNAオリゴマーの合成、特に、750ntまでの定義されたランダム配列の2’-O-メチル-RNA(2’OMe-RNA)及び2’-O-(2-メトキシエチル)-RNA(MOE-RNA)オリゴマーの効率的な合成が可能になることが示されている。
立体排除は、ポリメラーゼを含む酵素基質特異性の重要な要素である。本明細書で本発明者らは、古細菌DNAポリメラーゼにおける2残基の新生鎖立体制御「ゲート」の発見について述べる。先に記載されたRNAポリメラーゼ活性の状況で立体バルクを低下させるようにゲートを操作すると、2'修飾RNAオリゴマーの合成、特に、750ntまでの定義されたランダム配列の2’-O-メチル-RNA(2’OMe-RNA)及び2’-O-(2-メトキシエチル)-RNA(MOE-RNA)オリゴマーの効率的な合成が可能になることが示されている。
【0131】
これにより、発癌性KRAS(G12D)及びβ-カテニンCTNNB1(S33Y)mRNAの対立遺伝子特異的切断のための、2’OMe-RNA(「2’OMezyme」)で完全に構成されるRNAエンドヌクレアーゼ触媒の発見と、血管内皮増殖因子(VEGF)に対する高い親和性を有する混合2’OMe-/MOE-RNAアプタマーの精緻化が可能になった。本発明者らの研究成果は、いくつかの承認された核酸医薬に使用されているこれらの化学物質を、酵素合成並びに指向性進化及びナノテクノロジーのより広範な探求に利用できる。
【0132】
(実施例1 - 2残基の新生鎖立体ゲートは2’-O-メチル及び2’-O-(2-メトキシエチル)-RNAの1合成を制御する)
以下で論じる実験において、本発明者らは、超好熱性古細菌テルモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)由来の複製DNAポリメラーゼであるTgo中の2残基立体ゲートの存在を開示する。Tgo中の以前に操作されたプライマー依存性RNAポリメラーゼ活性10,11の状況で、この立体ゲートを変異させると、2’OMe-RNA、そして初めて、MOE-RNAの非常に効率的な合成が可能になった。これにより、2つの発癌性mRNA標的の変異特異的切断用の最初の全2’OMe-RNA触媒(「2’OMezyme」)のインビトロ進化と、血管内皮増殖因子(VEGF)に対して高い親和性を有する混合2’OMe/MOE-RNAアプタマーの精緻化も可能になった。
以下で論じる実験において、本発明者らは、超好熱性古細菌テルモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)由来の複製DNAポリメラーゼであるTgo中の2残基立体ゲートの存在を開示する。Tgo中の以前に操作されたプライマー依存性RNAポリメラーゼ活性10,11の状況で、この立体ゲートを変異させると、2’OMe-RNA、そして初めて、MOE-RNAの非常に効率的な合成が可能になった。これにより、2つの発癌性mRNA標的の変異特異的切断用の最初の全2’OMe-RNA触媒(「2’OMezyme」)のインビトロ進化と、血管内皮増殖因子(VEGF)に対して高い親和性を有する混合2’OMe/MOE-RNAアプタマーの精緻化も可能になった。
【0133】
(結果)
本発明者らは、以前に、Tgo、具体的にはTGK及びTGLLK(Tgo:V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、F545L、E664K)の操作したバージョン10、11(図1b)が、RNA、2’F-DNA、及び程度は低いが2’OMe-RNAの合成能を有することを観察した。しかし、TGLLKによる2’OMe-RNA合成は、特にインビトロ選択実験で使用される場合が多い、より困難なN40ランダム配列鋳型では比較的非効率的であった。本発明者らは、T.kodakarensis KOD1(PDB ID 5OMF)由来の相同性DNAポリメラーゼの三元構造12、及び71°のC1’-C2’-O2’-Cメチル二面角に調整された2’-O-メチル基14,15により増強されたRNA-DNA二本鎖の構造13(ゴーシュ立体構造)を含む2’OMe-RNA合成の単純な静的モデルを用いて、2’OMe-RNA新生鎖の嵩高い2'-メトキシ置換基とポリメラーゼとの間の好ましくない立体接触の系統的排除に基づく準合理的な設計により2’OMe-RNA合成を改善しようとした。
本発明者らは、以前に、Tgo、具体的にはTGK及びTGLLK(Tgo:V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、F545L、E664K)の操作したバージョン10、11(図1b)が、RNA、2’F-DNA、及び程度は低いが2’OMe-RNAの合成能を有することを観察した。しかし、TGLLKによる2’OMe-RNA合成は、特にインビトロ選択実験で使用される場合が多い、より困難なN40ランダム配列鋳型では比較的非効率的であった。本発明者らは、T.kodakarensis KOD1(PDB ID 5OMF)由来の相同性DNAポリメラーゼの三元構造12、及び71°のC1’-C2’-O2’-Cメチル二面角に調整された2’-O-メチル基14,15により増強されたRNA-DNA二本鎖の構造13(ゴーシュ立体構造)を含む2’OMe-RNA合成の単純な静的モデルを用いて、2’OMe-RNA新生鎖の嵩高い2'-メトキシ置換基とポリメラーゼとの間の好ましくない立体接触の系統的排除に基づく準合理的な設計により2’OMe-RNA合成を改善しようとした。
【0134】
このアプローチにより、2'OMe-RNA新生鎖の2'-メトキシ基と近位にあり、立体的に衝突する可能性があるTgo残基D540、T541、K592、D614、及びE664の側鎖が特定された。これらの残基を、TGLLKフレームワークの部位飽和突然変異誘発の標的とし、2’OMe-RNA合成活性についてスクリーニングした(SI 図1)。これらのうち、T541は、新生(プライマー)鎖の3'末端ヌクレオチドと直接接触し、その位置決めは触媒作用、すなわち、入ってくるヌクレオシド三リン酸基質のα-リン酸上の新生鎖末端3’-OHの求核攻撃に重要であるため、特に興味深いものであった。実際、スクリーニングにより、2’OMe-RNA合成活性を増加させる変異としてT541Gが特定され、活性がわずかに増加した変異K592A及びK664Rも特定された。変異を組み合わせることで、以前のTGLLK変異に照らして、2’OMe-RNA合成に対してT541G変異とK592A変異の顕著な相乗効果が明らかになった(SI 図1、図1e)。
【0135】
ポリメラーゼTGLLK:T541G、K592A(以下2Mと命名)(図1)は、全ての可能なジヌクレオチドの組み合わせを含むモデルDNA鋳型(TempN)16(図1f)及びランダム配列N40鋳型(図1g)で2'OMe-RNA合成活性の著しい増加を示した。さらに、2Mは長い範囲750ntの2’OMe-RNA合成を可能にした(図1h)である。このことは、残基T541とK592が一緒になって2’OMe-RNA合成を強力に阻止し、それはかさばらない側鎖への変異(T541G、K592A)によって緩和されることを示唆している(図1d)。また、2M変異は、DNA合成とさらに大きな程度での2’OMe-RNA合成の両方が、2’OMe-RNAプライマーと比較して、DNAプライマーからでは不利になる程度にポリメラーゼプライマー結合界面を再構築するように思われる(SI 図1)。それにもかかわらず、忠実度測定から、2’OMe-RNAを合成する2Mのエラー率が、2’OMe-RNAとRNAをそれぞれ合成する親ポリメラーゼのTGLLKとTGKと同じ範囲にあることが示唆されるため、これらの変異は核酸塩基の識別を妨げないようである(SI 表4)。
【0136】
ランダム鋳型からのXNA合成及び逆転写の効率が低いと、合成バイアスと配列空間のアンダーサンプリングが発生する可能性があり、それに伴いライブラリーの多様性が失われ、レパートリー選択実験で最適ではない結果につながる。本発明者らは、2Mによる(最近記載されたより効率的な2’OMe-RNA逆転写酵素C817と共に)2’OMe-RNA合成の効率を向上させると、これまで難解だったインビトロ進化実験を成功させる可能性があると推論した。この目的を達成するために、本発明者らの知る限りではこれまで報告されていなかった完全2’OMe-RNA触媒(以下、2’OMezymeと呼ぶ)の新規選択を追求した。シスで切断するためにRNA基質が共有結合しているランダム配列の完全2’OMe-RNA(N40)レパートリー18から直接開始して、KRAS癌遺伝子mRNAを標的とするエンドヌクレアーゼ2’OMezymeの発見を目指した。15ラウンド後、選択プールをディープシーケンシングし、RNAエンドヌクレアーゼ活性についてスクリーニングし、最も豊富な活性配列をドープ配列ライブラリー(70%の正しい塩基、各10%の代替塩基)からさらに5ラウンドの触媒「成熟」選択に供した。最も濃縮された2’OMezyme配列R15/5-KRAS(以下、R15/5-Kと呼ぶ)(図2a)を、さらなる特性評価のために固相合成によって調製した。
【0137】
R15/5-Kは、二分子反応においてその同族基質であるKRAS G12D(cG35A)RNAの切断を触媒する非常に配列特異的なRNAエンドヌクレアーゼであり(25mM Mg2+中でkcat = 0.24時-1±0.05、pH8.5、37℃)(図2c)、複数のターンオーバー触媒作用が可能である(SI 図2)。
【0138】
切断はG12D(c.35G＞A)変異特異的であり、基本的に「野生型」(wt) KRAS RNAを切断せず、1ヌクレオチド(G35)のみが異なる(図2c)。さらに、同じKRAS配列モチーフを標的とする標準的な10～23 DNAzymeの同等の変異体とは異なり、R15/5-Kは、短いモデルRNA基質だけでなく、G12D変異(c.35G＞A)に対する特異性を保持しながら、長い構造の2.1kbのKRAS転写産物に入り込んで、切断することができ(図2e)、wt KRAS転写産物又は類似の近傍の発癌性変異(G13D(c.38G＞A))を有する転写産物をほとんど切断しなかった。
【0139】
RNAエンドヌクレアーゼDNAzyme及びXNAzyme(及び一部のリボザイム)で以前に観察されたように、切断生成物のMALDI-ToF質量分析及び電気泳動移動度シフト(EMSA)分析によって示されるエステル転移反応と2’,3’-環状リン酸(＞p)中間体を経て切断は進行する(SI 図3)。しかし、RNAエンドヌクレアーゼDNAzyme及びXNAzymeは、フォールディングと触媒作用の両方について2価の陽イオン(典型的にはMg2+)の存在に依存する必須の金属酵素であり、したがって、生理学的条件下で触媒活性が大幅に低下するため、R15/5-K 2’OMezymeは、広いpH範囲にわたって準生理学的な低Mg2+レジーム(0.5～1mM Mg2+)下で70～80%の活性(図2c)を保持した(SI 図2)。実際、最適条件と比較して、シングルターンオーバー率は約50%しか低下しなかった(1mM Mg2+中でkcat = 0.11時-1±0.01、pH7.4、37℃)(図2c)。さらに、10～23 DNAzymeとは異なり、R15/5-KのRNA切断活性は、たとえ非常に低い割合であっても、Mg2+の非存在下でも観察できた(5mM EDTA中でkcat = 0.001時-1±0.0002、pH7.4、37℃)(SI 図2)。最後に、全て2’OMe-RNA構造であるため予想通り、R15/5-Kは、ヒト血清中で、37℃、120時間インキュベートした後に、顕著な分解(又は活性の低下)がなく、生物学的安定性が高いことが証明された(SI 図4)。
【0140】
モジュール化の可能性、すなわち結合アームを介したRNA標的特異性のプログラム可能性は、10～23 DNAzymeのような一部の核酸触媒の魅力的な特徴であるが、全てに共有されてはいない。次に、R15/5-K 2’OMezymeを代替mRNA基質に再ターゲティングできるかどうかを検討した。R15/5-Kの推定二次構造(図2a)に基づいて、中央のヘアピンモチーフに隣接するヌクレオチド1～7、39～40、45～51を再プログラムし、β-カテニン(CTNNB1)癌原遺伝子mRNA(c.85-111)とペアにした。得られた2'OMezyme R15/5-CTNNB1は活性が弱かったが、改良された変異体(R15/5-CTNNB1:A39G、U45A、以後R15/5-Cと呼ぶ)(図2b)は、認識エレメント(位置9、39、42 & 45)に隣接する残基の変異をスクリーニングすることによって容易に発見された(SI 図5)。改良された2’OMezyme R15/5-Cは、特異性が高く、発癌性S33Y CTNNB1(c.G99A)RNA基質のみを切断することができた(図2d)。それは、マルチターンオーバー触媒作用(SI 図2)及び長い(4kb)構造の完全β-カテニン転写産物の侵入の能力を保持しながら、特異性を保持していた(図2f)。R15/5-Cのターンオーバー率は、最適な条件(25mM Mg2+中でkcat = 0.14時-1±0.02、pH8.5、37℃)下で親のR15/5-Kと比較して約40%低かったが、再ターゲティングは準生理学的な低Mg2+条件(1mM Mg2+中でkcat = 0.10時-1±0.01、pH7.4、37℃)下で割合に影響を与えなかった(図2d)。
【0141】
次に、本発明者らは、2Mポリメラーゼがより困難な2'修飾RNA基質にも対処できるのではないかと考えた。これらのうち、2’-O-(2-メトキシエチル)(MOE)修飾(図3a)が、MOE修飾核酸の優れた生物物理学的かつ薬理学的特性のために特に興味がある。2’OMe-RNAとMOE-RNAの両方で、2’-置換基は、リボフラノース環のC3’-エンド糖立体構造を好む(RNA(A型)のリボース糖パッカリングに類似)(図3b)。MOEエチレングリコールモノメチルエーテル修飾は、O2-C-C-Oに沿った追加のゴーシュ配向で好まれ(図3c)、O4-C1-C2-O2からのゴーシュ効果を拡張し、それにより、回転平衡をC3’-エンドに促進する(図3b)19。この構造的な事前組織化(及びMOE-RNA構造の剛性)は、標的RNAとの塩基対形成及びスタッキング相互作用を高め、RNAに対する2’OMe-RNA及びMOE-RNAの高いアンチセンス結合親和性をもたらす。実際、DNAオリゴのあらゆるMOE修飾により、相補的RNAに結合したオリゴのTmが0.9～1.2℃増加する19。
【0142】
さらに、ゴーシュ配向MOE部分は、水素結合ネットワークの形成に有利なマイナーグルーブに追加の水素結合アクセプターを配置する。これにより、MOE修飾は、MOE部分とホスホジエステル骨格の間に閉じ込められた最大3つの水分子を安定にする20。この水和「スパイン」は、マイナーグルーブの2’-O-(2-メトキシエチル)基によって導入される立体障害と共に、5’-3’ホスホジエステル結合の遮蔽をもたらし、MOE-RNAの優れた生物学的安定性とインビボ半減期をもたらし1、過剰な水和は、非修飾オリゴと比較して、MOE修飾オリゴヌクレオチドの傍細胞吸収及び腸内取り込み率を増加させる21。
【0143】
しかし、溶液状態NMR22及びX線結晶20構造は、MOE-RNAヘリックスが嵩高いメトキシエチル基での酵素合成に、前述のゴーシュ立体構造を採用し、らせん状エンベロープから突出する、困難な立体エンベロープであることを示す(図3c)。それにもかかわらず、本発明者らは、MOE-NTPsの化学合成に着手し、酵素によるMOE-RNA合成を探求した。
【0144】
MOEヌクレオシドの合成23及びそれらのホスホロアミダイト24が確立され、MOEオリゴヌクレオチドの商業的合成が可能であるが、2’-O-(2-メトキシエチル)ヌクレオシド三リン酸(MOE-NTPs)は商業的には入手できず、それらの合成も確立されていなかった。したがって、本発明者らはまず、市販の2’-O-(2-メトキシエチル)リボヌクレオシドから始めて、確立されたラディック(Ludwig)25、26に基づく三リン酸化により、4種のMOE-NTPsへの合成経路を開発した(SI 図6、SI 材料＆方法)。
【0145】
全4種のMOE-NTPs(MOE-ATP、MOE-GTP、MOE-CTP、MOE-m5UTP)を合成してから、新たに操作したポリメラーゼ2MのMOE-RNAオリゴマーを合成する能力の試験に進んだ。前型のTGLLKと異なり、2M(SI 図7)は、モデルDNA鋳型(+72nt)とランダムN40ライブラリー鋳型の両方でMOE-RNAを効率よく合成することができ、750ntオリゴマーの長い範囲のMOE-RNA合成が可能になった(図3def、SI 図7)。より嵩高いメトキシエチル置換基を完全置換で組み込むと、同じ長さと配列のDNA又は2’OMe-RNAオリゴマーと比較して、MOEオリゴマーの電気泳動移動度がかなりシフトした(SI 図8)。
【0146】
MOEは、薬理学的特性を調節し、かつ /又は効力を高めるためのRNA、2’F-DNA又は2’OMe-RNAアプタマーの魅力的な創薬化学修飾である。実際、MOE-RNAと2’OMe-RNAは、類似の立体構造及びらせんの選好性、並びに類似の塩基対形成強度を有する22、27。一方、2’-O-(2-メトキシエチル)基は、立体エンベロープが著しく大きく(図3c)、密に折りたたまれた構造で他の基と立体衝突が生じる可能性がある。それにもかかわらず、機能的な混合2’OMe/MOE-RNAアプタマーは、以前に記載された全ての2'OMe-RNAリードから精緻化できると思われた。これを試験するために、血管内皮増殖因子(VEGF)にして十分に特徴づけられた全2'OMe-RNAアプタマー6の全MOE-RNA又は混合2’OMe/MOE-RNAアプタマーへの変換を検討し、表面プラズモン共鳴(SPR)によりそれぞれの結合活性を試験した。SPRから、4種の2’OMeヌクレオチドのうち2種をMOEヌクレオチドで置換したアプタマーは、全2’OMe-RNAアプタマーと比較してVEGFと事実上同一の親和性を示すのに対し、2’OMeヌクレオチドのうち3つをMOEヌクレオチドに置き換えたアプタマーは、親和性は低下したものの、なおもVEGFに結合していることが明らかになった(図4、SI 表3)。
【0147】
全MOEアプタマーは、おそらく部分的にMOE-m5UTPの使用により、結合活性をほぼ全て失ったと思われる(SI 図9)一方で、元のVEGFアプタマーは2’OMe-Uを使用して進化した。実際、元のアプタマー中の2’OMe-Uを2’OMe-m5Uに置き換えると、その結合親和性は低下した(SI 図9)。本明細書に記載の2’OMe/MOE-RNAアプタマーは、このような骨格で開発された初めての混合化学アプタマーであり、MOE修飾核酸がタンパク質標的に対して高い親和性でタイトな三次元構造に折り畳まれ得ることを示唆する。
【0148】
(考察)
立体排除は、酵素及び特にポリメラーゼ特異性の一般的な決定要因である。これには、ゲノムへのRNAの組み込みを制限するために、ポリメラーゼ活性部位からリボヌクレオシド三リン酸(細胞内にはるかに高濃度で存在する)を排除するように進化したと考えられているほとんどのDNAポリメラーゼの活性部位に見られる「立体ゲート」残基が含まれる。Koolらは、これが、複製ポリメラーゼの忠実性機構の重要な構成要素としての、活性部位中の核酸塩基対寸法の立体制御の一般的な機構であり得ることを示した28。立体的要因は、新生鎖ポリメラーゼ界面との直接衝突を経るか、又は新生二本鎖の立体構造平衡の変更による、ミスマッチ29又は非同族ヌクレオチドの組み込み時の新生鎖伸長の合成後阻害30にも関与している可能性がある。最後に、立体制御の緩和はポリメラーゼ操作の巧みな戦略であり、例えば、9°N DNAポリメラーゼ変異体はIllumina次世代シーケンシングにおける嵩高い3'-置換基の組み込み用に操作されており31又はRNA合成もしくは逆転写のためにDNAポリメラーゼが操作される11、17。
立体排除は、酵素及び特にポリメラーゼ特異性の一般的な決定要因である。これには、ゲノムへのRNAの組み込みを制限するために、ポリメラーゼ活性部位からリボヌクレオシド三リン酸(細胞内にはるかに高濃度で存在する)を排除するように進化したと考えられているほとんどのDNAポリメラーゼの活性部位に見られる「立体ゲート」残基が含まれる。Koolらは、これが、複製ポリメラーゼの忠実性機構の重要な構成要素としての、活性部位中の核酸塩基対寸法の立体制御の一般的な機構であり得ることを示した28。立体的要因は、新生鎖ポリメラーゼ界面との直接衝突を経るか、又は新生二本鎖の立体構造平衡の変更による、ミスマッチ29又は非同族ヌクレオチドの組み込み時の新生鎖伸長の合成後阻害30にも関与している可能性がある。最後に、立体制御の緩和はポリメラーゼ操作の巧みな戦略であり、例えば、9°N DNAポリメラーゼ変異体はIllumina次世代シーケンシングにおける嵩高い3'-置換基の組み込み用に操作されており31又はRNA合成もしくは逆転写のためにDNAポリメラーゼが操作される11、17。
【0149】
本発明者らは、以前に、T.gorgonarius由来のpolBファミリーポリメラーゼにおいて、立体ゲート変異(Y409G)に加えて、効率的なRNA合成(E664K)11及び非同族2'-5'結合の組み込み(I521L、F545L)10を可能にする重要な変異を発見した。後者のポリメラーゼ変異体(TGLLKと名付けられた)は、2’OMe-RNA合成能力は高まっているが、依然として非効率的であることが示され、ポリメラーゼ構造の態様が2’OMe-RNA合成にまだ十分に適合していないことが示唆された。RNAと2’OMe-RNAは立体構造の選好性が非常に似ているので、本発明者らは立体的要因を疑った。実際、ポリメラーゼと新生鎖の2'-メトキシ基との潜在的な立体衝突の系統的評価により、2残基の立体ゲートが特定され、かさばらない側鎖へのそれらの変異(T541G、K592A)により、MOE-RNAの2’-O-(2-メトキシエチル)基の立体エンベロープがかなり大きいにもかかわらず、2’OMe-RNA合成効率の劇的な向上をもたらし(図1)、初めて効率的なMOE-RNA合成を可能にし(図3)、全長の定義された配列又はランダムな配列(N40)の生成物は30分未満で合成された(2’OMe-RNA、10分未満)(SI 図7)。T541GとK592AをTGLLKに組み込むと、デンシトメトリーで測定した場合、N40合成収率が1%～90%(2’OMe-RNA)及び0%～65%(MOE-RNA、図1g及び3e、SI 図17)に増加した。
【0150】
T541とK592の両方は、古細菌、真核生物、さらにはウイルス起源のpolBポリメラーゼにおいて配列レベルと構造レベルの両方で非常に高度に保存されているモチーフの一部である(それぞれ、モチーフC32及びKxY33)(図5、SI 図10)34。これらのモチーフは、ミスマッチセンシングに関与するマイナーグルーブ相互作用モチーフの一部であると考えられており35、嵩高い疎水性側鎖への以前の変異は、ミスマッチ識別を高めることが示された36。それにもかかわらず、2’OMe-RNA合成の忠実度は、これらの変異を欠く親ポリメラーゼTGK及びTGLLKと比較して、本質的に影響を受けないことが判明している(SI 表4)10,11。MOE合成の忠実度は、現在、利用可能なMOE-RNA RTの効率が低い17ため測定が困難であるが、ドロップアウトアッセイは、正しいMOE-NTPの特異的プロセシングを示唆している(SI 図11)。
【0151】
密接に関連するKODポリメラーゼの三元複合体構造12によると、T541とK592の両方が、新生鎖の3'末端(T541、水による)及び+1(K592)核酸塩基とのH結合相互作用に関与し、2'修飾の移行を妨げる(図5b)。2つの変異の正のエピスタシスは、構造的考察と一致している。立体ブロックを緩和するには両方の変異が必要であり、触媒部位に近いこの重要な領域に大きな自由体積をもたらし、かつ2’OMe-RNAの2’-O-メチル基(図1)とMOERNAの嵩高い2’-O-(2-メトキシエチル)基(図3)を収容するのに十分に大きい新生鎖ももたらす。
【0152】
この構造モデルの予測では、T541及びK592のこの2残基の立体ゲートが、ポリメラーゼ触媒サイクルのヌクレオチド組み込み工程よりむしろ、プライマー3'末端伸長の効率を主に高める。実際、ATP(2’OMe-RNAプライマーから)についての2Mの一塩基組み込みの定常状態動態パラメーター(SI 図12)は、親ポリメラーゼTGK(RNAプライマーから)のそれとほぼ一致している。一方、ATP、2’OMe-ATP及びMOE-ATPの組み込みのVmax/kcat値は本質的に同一であり、2Mは、ATP(SI 図12)及び親ポリメラーゼTGK(ATPについてKM = 13.3μM)と比較して、2’OMe-ATPとMOE-ATPの両方のKM値を約5倍改善させた。これは、立体ゲートが、ポリメラーゼ活性部位への2'修飾ヌクレオチド三リン酸の適合性と位置決めを改善するが、触媒工程を加速しないことを示し得る。
【0153】
ポリメラーゼによる酵素的MOE-RNA合成はこれまで報告されていないが、密接に関連するpolBファミリーKODポリメラーゼ(KOD:N210D/Y409G/A485L/D614N/E664K)の変異体を含む、2’OMe-RNA合成に対する多くの代替操作アプローチが検討されている9。2Mによる2’OMe-RNA合成は、より効率的(SI 図14)で、より高い忠実度(SI 表4)である(Mn2+イオンなどの強制条件を必要としない)ことが判明したが、DGLNK変異はXNA-RNA合成を高めるための興味深い代替の非立体的戦略である。2M(Y409G活性部位立体ゲート、E664Kサムサブドメイン変異及びA485L「サーミネーター」変異37、並びに3’-5’エキソヌクレアーゼドメインを不活性化する変異(N210D)を含む)と同じ(又は非常に類似した)変異背景から始めて、DGLNKは、新生鎖のホスホジエステル骨格に近接する負電荷を除去するサムサブドメイン中の重要なD614N変異も含む。これは、正電荷を帯びたポリメラーゼ相互作用面を拡大し、プライマー-鋳型二本鎖に対する親和性を高めることで、効率的なRNA合成を可能にすることが判明した前述のTgo:E664K変異に非常によく似ている。DGLNKでは実証されていないが、ポリメラーゼ-新生鎖界面における負電荷電位をさらに低下させるD614N変異は、プライマー-鋳型二本鎖に対するポリメラーゼの親和性も高める可能性がある。同時に、本発明者らの元のモデルでは、新生鎖メトキシ基と立体衝突する可能性があるとしてD614を特定したが、本発明者らのスクリーニングでは、2’OMe-RNA合成に対する強い正の効果を単離変異として特定しなかった。それにもかかわらず、2Mの状況でD614N変異(2MN;2M:D614N)を再び調べると、2MNによる2’OMe-RNAのわずかな増強と、MOE-RNA合成の程度の低さが判明した(SI 図14)。
【0154】
また、以前に発表された他の2つのポリメラーゼであるT7 RNAポリメラーゼ変異体RGVG-M6(T7:P266L、S430P、N433T、E593G、S633P、Y639V、V685A、H784G、F849I、F880Y)及び2’OMe-RNA合成活性を有すると報告されているTaqポリメラーゼStoffel断片変異体SFM4-6(Taq SF:I614E、E615G、D655N、L657M、E681K、E742N、M747R)も評価した。しかし、2Mと比較すると、2’OMe-RNA合成活性はいずれの場合も中程度であり、高濃度のMn2+イオンの存在などの強制条件に依存しているようであった(SI 図13)。
【0155】
最後に、最初のスクリーニングでは、TGLLK: T541G、K664R(SI 図1)も単一突然変異体T541Gと比較して、2’OMe-RNA合成効率の(より小さい)増加を示したため、K664Rを2Mポリメラーゼに導入し、TGLLK:T541G、K592A、K664R(以下、3Mと命名)を生成した。しかし、ポリメラーゼ2Mと3Mは、実質的に同一の合成活性、全長収率、及び失速パターンを示した(SI 図15)。
【0156】
より効率的な2’OMe-RNA RTの発見17とともに、2Mは、最初の2’OMezymeの発見を含む、より意欲的なインビトロ進化実験への扉を開いた。2’OMe-RNAアプタマーとは異なり、2’OMezymeはこれまで報告されていなかったが、これはおそらく、触媒が一般的に核酸配列空間によりまばらに分布しているように思われるという事実38によるためである。本明細書で特徴付けられるRNAエンドヌクレアーゼ2’OMezyme R15/5-K及び2’OMezyme R15/5-Cは、報告される他のRNAエンドヌクレアーゼのDNAzyme及びXNAzymeとは興味深い点で異なる。特異性は高いものの、最大触媒ターンオーバーは中程度で、これはおそらく2’OMe-RNAによるRNA基質の結合が過度に強固であり、生成物阻害及び/又は触媒作用によらずに立体構造に閉じ込められた2’OMezymeの割合が高いためである。しかし、例えば、標準的な10～23 DNAzyme、又は一部のXNAzymeとは異なり、2’OMezymeは、生理学的に関連する低Mg2+濃度で触媒活性のほとんどを保持する。これは、上記とは異なり、2’OMezymeが金属酵素を必須とする可能性は低いが、代わりに古典的なヘアピンリボザイム(Hpz)に似た酸塩基触媒作用に依存し得る。興味深いことに、2’OMezymeは、配列相同性を欠いているにもかかわらず、ヘアピンリボザイムと、いくつかの顕著な二次構造及び配列セグメントの類似性を共有している39(但し、ヘアピンと切断部位が逆になっている)(SI 図16)。Hpzと同様に、2’OMezymeも低温でRNAライゲーションを触媒する能力を有し(SI 図16)、Mg2+非存在下で活性を示す(SI 図2)。これと一致して、HPzとの配列同一性を増加させる突然変異は、ほとんどが無害である(SI 図16)。
【0157】
2Mポリメラーゼは、その珍しい構造的及び薬理学的特性と並外れた生物学的安定性により、核酸治療薬で関心の高い核酸修飾であるMOE-RNAの鋳型に基づく酵素的合成を初めて可能にし、FDAに承認されたASO薬での適用が推進されている2。これにより、MOEは既存の2’OMe-RNAアプタマーの望ましい創薬化学修飾がなされる。抗VEGF 2’OMe-RNAアプタマー6の場合、2’OMeヌクレオチドのうち2つ又は3つがMOEヌクレオチドに置換されたキメラバージョンは、容易に精緻化することができ、VEGFに対する結合親和性をそれぞれ同一又はわずかに低下させた(図4)が、2’OMe-RNAをMOE RNAに完全置換すると、このアプタマーの結合活性が消失した(SI 図9)。
【0158】
結論として、本発明者らの研究は、ポリメラーゼ基質特異性における立体制御の重要性を強調する。新しい2残基の新生鎖立体ゲートの発見は、2'修飾核酸を新生鎖への組み込みから排除することで、古典的な活性部位の立体ゲートを補完し、嵩高い2'-置換基を有する核酸オリゴマーの酵素合成を可能にする。これにより、2’OMezymeの効率的な合成と進化並びにMOE-RNA合成及び混合2’OMe-/MOE-RNAアプタマーの精緻化が可能になった。ホスホロチオエート(αPS)-MOE-RNAオリゴマーの立体特異的合成、及び変異型アプタマーの迅速な反復及び効力の強化に向けたASOの配列と化学を含む様々な適用が期待されている。
【0159】
(材料＆方法)
(ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド)
2’OMe-RNA(2’OMe-NTPs;2’OMe-ATP、2’OMe-CTP、2’OMe-GTP、2’OMe-UTP)の三リン酸は、Jena Biosciences(Germany)から、DNA(Illustra dNTPs)はGE Life Sciences(USA)から入手した。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies(Belgium)又はMerck/MilliporeSigma(Germany)によって合成された。SFM4-6をコードするgBlockをIntegrated DNA Technologies(Belgium)で合成し、pET28a(+)-His6-RGVG-M6の遺伝子合成はGenScript Biotech(UK)によって行われた。
(ヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド)
2’OMe-RNA(2’OMe-NTPs;2’OMe-ATP、2’OMe-CTP、2’OMe-GTP、2’OMe-UTP)の三リン酸は、Jena Biosciences(Germany)から、DNA(Illustra dNTPs)はGE Life Sciences(USA)から入手した。オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies(Belgium)又はMerck/MilliporeSigma(Germany)によって合成された。SFM4-6をコードするgBlockをIntegrated DNA Technologies(Belgium)で合成し、pET28a(+)-His6-RGVG-M6の遺伝子合成はGenScript Biotech(UK)によって行われた。
【0160】
(2’-O-MOE-NTPsの合成)
(1. 2’-O-MOE-NTP合成の一般的な合成情報)
全ての試薬及び溶媒は、商用供給元から購入し、取得した状態で使用した。湿気に敏感な反応は、窒素雰囲気下で真空乾燥させたガラス器具内で行った。1H、13C、及び31P NMRスペクトルは、Bruker Avance 300、500、又は600 MHz分光計で、テトラメチルシランを内部標準として使用するか、又は残留溶媒シグナル[D2O(d=4.79ppm 1H NMR)]を参照して記録した。結合定数をヘルツ(Hz)で報告し、スペクトルから直接取得した。NMR分裂パターンを、s(一重線)、d(二重線)、t(三重線)、q(四重線)、及びm(多重線)と指定する。高分解能質量スペクトル(HRMS)は、四重極直交加速飛行時間質量分析計(Synapt G2 HDMS、Waters、Milford、MA)で取得した。試料を3μL/分で注入し、ロイシンエンケファリンをロックマスとして使用して、分解能15000 FWHMのネガティブイオン化モードでスペクトルを取得した。プレコーティングしたアルミニウムシート(254nm)を薄層クロマトグラフィー(TLC)に使用した。生成物を、分取HPLCイオン交換クロマトグラフィー(SOURCE 15Q)により0.1M/1M TEAB緩衝液を溶離液として使用して精製した後、溶出系として1:1(v/v)のアセトニトリル/水中0.1M TEAB緩衝液/0.05M TEABを使用して、分取イオン対逆相HPLC(Phenomenex Gemini 110A、C18、10μm、21.2mm×250mm)により精製した。
(1. 2’-O-MOE-NTP合成の一般的な合成情報)
全ての試薬及び溶媒は、商用供給元から購入し、取得した状態で使用した。湿気に敏感な反応は、窒素雰囲気下で真空乾燥させたガラス器具内で行った。1H、13C、及び31P NMRスペクトルは、Bruker Avance 300、500、又は600 MHz分光計で、テトラメチルシランを内部標準として使用するか、又は残留溶媒シグナル[D2O(d=4.79ppm 1H NMR)]を参照して記録した。結合定数をヘルツ(Hz)で報告し、スペクトルから直接取得した。NMR分裂パターンを、s(一重線)、d(二重線)、t(三重線)、q(四重線)、及びm(多重線)と指定する。高分解能質量スペクトル(HRMS)は、四重極直交加速飛行時間質量分析計(Synapt G2 HDMS、Waters、Milford、MA)で取得した。試料を3μL/分で注入し、ロイシンエンケファリンをロックマスとして使用して、分解能15000 FWHMのネガティブイオン化モードでスペクトルを取得した。プレコーティングしたアルミニウムシート(254nm)を薄層クロマトグラフィー(TLC)に使用した。生成物を、分取HPLCイオン交換クロマトグラフィー(SOURCE 15Q)により0.1M/1M TEAB緩衝液を溶離液として使用して精製した後、溶出系として1:1(v/v)のアセトニトリル/水中0.1M TEAB緩衝液/0.05M TEABを使用して、分取イオン対逆相HPLC(Phenomenex Gemini 110A、C18、10μm、21.2mm×250mm)により精製した。
【0161】
(2.トリエチルアンモニウム塩をナトリウム塩に変換するための一般的な手順)
トリエチルアンモニウムヌクレオシド三リン酸(4～7mg)をプラスチックチューブ内で凍結乾燥させた。化合物をメタノール(500μL)に溶解し、NaClO4(アセトン中0.1M、3mL)を素早く添加した。これにより、ヌクレオシド三リン酸ナトリウム塩が沈殿した。チューブを遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットをアセトンで2回洗浄し、次いで真空下で乾燥させた。
トリエチルアンモニウムヌクレオシド三リン酸(4～7mg)をプラスチックチューブ内で凍結乾燥させた。化合物をメタノール(500μL)に溶解し、NaClO4(アセトン中0.1M、3mL)を素早く添加した。これにより、ヌクレオシド三リン酸ナトリウム塩が沈殿した。チューブを遠心分離し、上清を廃棄した。ペレットをアセトンで2回洗浄し、次いで真空下で乾燥させた。
【0162】
(3. 2’-O-MOE-ATP、Na+塩(2a))
全ての固体試薬を秤量し、デシケーター内で、真空下、反応フラスコ内で一晩乾燥させた。窒素雰囲気下で、2’-O-(2-メトキシエチル)アデノシン(50mg、0.15mmol、1.0当量)及びプロトンスポンジ(66mg、0.30mmol、2.0当量)をリン酸トリメチル(4mL)に溶解した。-15℃で、オキシ塩化ホスホリル(phosphoryl oxychloride)(22μL、0.24mmol、1.5当量)を添加し、反応混合物を-15℃で2時間撹拌した。分析用陰イオン交換HPLCによる反応モニタリング後、反応混合物を室温まで加温した。ピロリン酸水素トリス(テトラブチルアンモニウム)(554mg、0.62mmol、4.0当量)及びトリブチルアミン(370μL、1.60mmol、10.0当量)をDMF(1mL)に溶解し、この溶液を反応混合物に添加した。混合物を室温で30分間撹拌した。重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)緩衝液(1M、20mL)を添加して反応をクエンチし、反応混合物をジイソプロピルエーテル(20mL)で抽出した。水相を凍結乾燥させた。反応混合物を0.1M TEAB～1M TEAB勾配で分取陰イオン交換HPLCにより精製し、続いて、1:1(v/v)のアセトニトリル/水中0.1M TEAB～0.05M TEAB勾配でイオン対逆相HPLCにより精製した。生成物を、白色粉末としてトリエチルアンモニウム塩(31.0mg、20.8%)として取得した。分析目的で、トリエチルアンモニウム塩をナトリウム塩に変換した。
ESI-MS 計算された[M-H]-: m/z = 564.03032;実測[M-H]-: m/z = 564.0279 (10 %)。
【化10】
【化11】
【0163】
(4. 2’-O-MOE-m5UTP、Na+塩(2b))
全ての固体試薬を秤量し、デシケーター内で、真空下、反応フラスコ内で一晩乾燥させた。窒素雰囲気下で、2’-O-(2-メトキシエチル)-5-メチルウリジン(50mg、0.16mmol、1.0当量)及びプロトンスポンジ(68mg、0.32mmol、2.0当量)をリン酸トリメチル(4mL)に溶解した。-15℃で、オキシ塩化ホスホリル(22μL、0.24mmol、1.5当量)を添加し、反応混合物を-15℃で2時間撹拌した。分析用陰イオン交換HPLCによる反応モニタリング後、反応混合物を室温まで加温した。ピロリン酸水素トリス(テトラブチルアンモニウム)(571mg、0.63mmol、4.0当量)及びトリブチルアミン(376μL、1.58mmol、10.0当量)をDMF(1mL)に溶解し、この溶液を反応混合物に添加した。混合物を室温で30分間撹拌した。重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)緩衝液(1M、20mL)を添加して反応をクエンチし、反応混合物をジイソプロピルエーテル(20mL)で抽出した。水相を凍結乾燥させた。反応混合物を0.1M TEAB～1M TEAB勾配で分取陰イオン交換HPLCにより精製し、続いて、1:1(v/v)のアセトニトリル/水中0.1M TEAB～0.05M TEAB勾配でイオン対逆相HPLCにより精製した。生成物を、白色粉末としてトリエチルアンモニウム塩(42.5mg、28.0%)として取得した。分析目的で、トリエチルアンモニウム塩をナトリウム塩に変換した。
ESI-MS 計算された[M-H]-: m/z = 555.01875;実測[M-H]-: m/z = 555.0176 (10 %)。
【化12】
【化13】
【0164】
(5. 2’-O-MOE-GTP、Na+塩(2c))
全ての固体試薬を秤量し、デシケーター内で、真空下、反応フラスコ内で一晩乾燥させた。窒素雰囲気下で、2’-O-(2-メトキシエチル)グアノシン(50mg、0.15mmol、1.0当量)及びプロトンスポンジ(63mg、0.29mmol、2.0当量)をリン酸トリメチル(4mL)に溶解した。-15℃で、オキシ塩化ホスホリル(21μL、0.22mmol、1.5当量)を添加し、反応混合物を-15℃で2時間撹拌した。分析用陰イオン交換HPLCによる反応モニタリング後、さらにオキシ塩化ホスホリル(21μL、0.22mmol、1.5当量)を添加し、反応混合物を-15℃でさらに2時間撹拌した。これを、3回目のオキシ塩化ホスホリル(21μL、0.22mmol、1.5当量)を添加してもう1回繰り返した。分析用陰イオン交換HPLCによる反応モニタリング後、反応混合物を室温まで加温した。ピロリン酸水素トリス(テトラブチルアンモニウム)(1058mg、1.18mmol、8.0当量)及びトリブチルアミン(696μL、2.92mmol、20.0当量)をDMF(2mL)に溶解し、この溶液を反応混合物に添加した。混合物を室温で30分間撹拌した。重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)緩衝液(1M、20mL)を添加して反応をクエンチし、反応混合物をジイソプロピルエーテル(20mL)で抽出した。水相を凍結乾燥させた。反応混合物を0.1M TEAB～1M TEAB勾配で分取陰イオン交換HPLCにより精製し、続いて、1:1(v/v)のアセトニトリル/水中0.1M TEAB～0.05M TEAB勾配でイオン対逆相HPLCにより精製した。生成物を、白色粉末としてトリエチルアンモニウム塩(24.5mg、17.0%)として取得した。分析目的で、トリエチルアンモニウム塩をナトリウム塩に変換した。
ESI-MS 計算された[M-H]-: m/z = 580.02523;実測[M-H]-: m/z = 580.0270 (11 %)。
【化14】
【化15】
【0165】
(6. 2’-O-MOE-CTP、Na+塩(2d))
全ての固体試薬を秤量し、デシケーター内で、真空下、反応フラスコ内で一晩乾燥させた。窒素雰囲気下で、2’-O-(2-メトキシエチル)シチジン(50mg、0.17mmol、1.0当量)及びプロトンスポンジ(71mg、0.33mmol、2.0当量)をリン酸トリメチル(4mL)に溶解した。-15℃で、オキシ塩化ホスホリル(23μL、0.25mmol、1.5当量)を添加し、反応混合物を-15℃で2時間撹拌した。分析用陰イオン交換HPLCによる反応モニタリング後、さらにオキシ塩化ホスホリル(23μL、0.25mmol、1.5当量)を添加し、反応混合物を-15℃でさらに2時間撹拌した。分析用陰イオン交換HPLCによる反応モニタリング後、反応混合物を室温まで加温した。ピロリン酸水素トリス(テトラブチルアンモニウム)(1198mg、1.32mmol、8.0当量)及びトリブチルアミン(788μL、3.32mmol、20.0当量)をDMF(2mL)に溶解し、この溶液を反応混合物に添加した。混合物を室温で30分間撹拌した。重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)緩衝液(1M、20mL)を添加して反応をクエンチし、反応混合物をジイソプロピルエーテル(20mL)で抽出した。水相を凍結乾燥させた。反応混合物を0.1M TEAB～1M TEAB勾配で分取陰イオン交換HPLCにより精製し、続いて、1:1(v/v)のアセトニトリル/水中0.1M TEAB～0.05M TEAB勾配でイオン対逆相HPLCにより精製した。生成物を、白色粉末としてトリエチルアンモニウム塩(20.0mg、12.7%)として取得した。分析目的で、トリエチルアンモニウム塩をナトリウム塩に変換した。
ESI-MS 計算された[M-H]-: m/z = 540.01908;実測[M-H]-: m/z = 540.0197 (65 %)(TEA塩として記録)。
【化16】
【化17】
【0166】
(ポリメラーゼモデルと変異誘発部位の合理的な選択)
特異的ポリメラーゼ残基に単一突然変異型を導入するミニライブラリーの構築には、本研究で用いたテルモコックス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)ポリメラーゼ突然変異体の近縁Bファミリー相同体の閉鎖型テルモコックス・カドカレンシス(Thermococcus kodakarensis) KOD1 DNAポリメラーゼと複合体を形成するDNAプライマー-鋳型二本鎖と、活性部位(PDB ID 5OMF)1に入ってくるdATPの三元結晶構造を用いた。結晶構造をPymolにロードし、プライマーヌクレオチドの適切な2'-水素原子を、Pymolの「ビルド」機能を用いて酸素原子に手動で置き換えた。次いで、新たに導入した2'-ヒドロキシル部分の水素原子を、同様にメチル基で置き換えた。加わった二面角を手動で71°(ゴーシュ立体構造)に調整した2,3。このモデルは、ポリメラーゼ残基から導入されたプライマーの2’-O-メチル炭素原子までの距離を計算し、立体衝突の部位を特定するための構造ガイドとして機能した。これらは、立体障害を緩和し、2’OMe-RNAでのポリメラーゼ処理能力を高めるために、部位飽和突然変異誘発を標的とした。
特異的ポリメラーゼ残基に単一突然変異型を導入するミニライブラリーの構築には、本研究で用いたテルモコックス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)ポリメラーゼ突然変異体の近縁Bファミリー相同体の閉鎖型テルモコックス・カドカレンシス(Thermococcus kodakarensis) KOD1 DNAポリメラーゼと複合体を形成するDNAプライマー-鋳型二本鎖と、活性部位(PDB ID 5OMF)1に入ってくるdATPの三元結晶構造を用いた。結晶構造をPymolにロードし、プライマーヌクレオチドの適切な2'-水素原子を、Pymolの「ビルド」機能を用いて酸素原子に手動で置き換えた。次いで、新たに導入した2'-ヒドロキシル部分の水素原子を、同様にメチル基で置き換えた。加わった二面角を手動で71°(ゴーシュ立体構造)に調整した2,3。このモデルは、ポリメラーゼ残基から導入されたプライマーの2’-O-メチル炭素原子までの距離を計算し、立体衝突の部位を特定するための構造ガイドとして機能した。これらは、立体障害を緩和し、2’OMe-RNAでのポリメラーゼ処理能力を高めるために、部位飽和突然変異誘発を標的とした。
【0167】
(発現コンストラクトのクローニングと部位飽和突然変異誘発)
親プラスミドとしてテルモコックス・ゴルゴナリウス(Tgo)ポリメラーゼ突然変異体TGLLK(Tgo:V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、F545L、E664K)5をコードするpASK75プラスミド4にBsaI制限部位(補足表1を参照)を導入するために、オーバーラップしているフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてインバースPCR(iPCR)を実施した。部位飽和突然変異誘発用のクローニングプライマーは、単一残基上に全20種のアミノ酸をコードする32コドンのミニライブラリーを導入するための縮重NNSコドン(全ての塩基についてはN、G及びCについてはS)を含んでいた(補足表1を参照)。
親プラスミドとしてテルモコックス・ゴルゴナリウス(Tgo)ポリメラーゼ突然変異体TGLLK(Tgo:V93Q、D141A、E143A、Y409G、A485L、I521L、F545L、E664K)5をコードするpASK75プラスミド4にBsaI制限部位(補足表1を参照)を導入するために、オーバーラップしているフォワードプライマーとリバースプライマーを用いてインバースPCR(iPCR)を実施した。部位飽和突然変異誘発用のクローニングプライマーは、単一残基上に全20種のアミノ酸をコードする32コドンのミニライブラリーを導入するための縮重NNSコドン(全ての塩基についてはN、G及びCについてはS)を含んでいた(補足表1を参照)。
【0168】
iPCR反応を20ngのDNA鋳型にて、ポリメラーゼQ5(New England Biolabs、NEB)及びフォワードプライマーとリバースプライマー(各0.5μM)及びdNTP(各200μM)を用いて行った。iPCR反応は、サーモサイクラー内で次のプログラム:98℃、30秒;(98℃、10秒;50～72℃、30秒;72℃、3分)の30サイクル;72℃、3分でインキュベートした。PCR精製キット(Qiagen)を使用してiPCR生成物を精製した。生成物をBsaI及びDpnI(NEB)によって制限切断し、必要に応じてアガロースゲルで精製した。生成物を、T4 DNAリガーゼでライゲーションし、別のクリーンアップキット(Bioline)によって精製した。クローニングしたコンストラクトを、化学的又は電気的にコンピテントな大腸菌10-β細胞(NEB)又は大腸菌BL21 CodonPlus-RIL細胞(Agilent)に形質転換し、適切な抗生物質を添加したTYE寒天プレートに播種した。
【0169】
(プライマー伸長反応)
分析用プライマー伸長反応を、MgSO4(4mM)を添加した1xThermopol緩衝液(NEB)中で行った。10μLの反応容量中適切なヌクレオシド三リン酸(各125～250μM)を用いて、鋳型(200nM)にて精製ポリメラーゼ(10～100μg/mL)によりプライマー(100nM)を伸長させた。反応を65℃で行った。プライマー伸長生成物を尿素PAGEにより分析した。定義した配列鋳型TempNpure上でのMOE-NTPを用いた全ての伸長には、10倍過剰のアンチセンス鋳型による合成後の鋳型捕捉、Turbo DNase(Invitrogen)処理、その後のプロテイナーゼK(NEB)処理、及び10倍過剰のアンチセンス鋳型と共に尿素PAGEゲルへのロードが必要であった。鋳型sfGFPでのMOE-NTPsによるプライマー伸長には、500μg/mLのポリメラーゼ濃度が必要であった。
分析用プライマー伸長反応を、MgSO4(4mM)を添加した1xThermopol緩衝液(NEB)中で行った。10μLの反応容量中適切なヌクレオシド三リン酸(各125～250μM)を用いて、鋳型(200nM)にて精製ポリメラーゼ(10～100μg/mL)によりプライマー(100nM)を伸長させた。反応を65℃で行った。プライマー伸長生成物を尿素PAGEにより分析した。定義した配列鋳型TempNpure上でのMOE-NTPを用いた全ての伸長には、10倍過剰のアンチセンス鋳型による合成後の鋳型捕捉、Turbo DNase(Invitrogen)処理、その後のプロテイナーゼK(NEB)処理、及び10倍過剰のアンチセンス鋳型と共に尿素PAGEゲルへのロードが必要であった。鋳型sfGFPでのMOE-NTPsによるプライマー伸長には、500μg/mLのポリメラーゼ濃度が必要であった。
【0170】
(酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ(ELONA)ポリメラーゼ活性アッセイ(PAA))
部位飽和変異誘発ポリメラーゼミニライブラリーを大腸菌10-β細胞に形質転換し、アンピシリンを添加したTYE寒天プレートに播種した。全ての単一変異体ミニライブラリーについて、寒天プレートから2x94クローンを手で選択し、親ポリメラーゼTGLLKを有するプレートあたり2つの対照ウェルとともに、96ディープウェルプレート(Nunc)中のアンピシリン(100μg/mL)添加2xTY 1mLの2x94液体開始培養物を接種するために使用した。培養物を37℃で一晩増殖させた。翌日、各培養物100μLを使用して、新しいプレートに新しい1mLの培養物を接種し、培養物が中期に達するまで37℃で増殖させた。次いで、タンパク質発現を200μg/Lのアンヒドロテトラサイクリンで誘導し、37℃で2時間実施した。培養物を4℃で一晩保存した。細胞を遠心分離により回収し、100μLのThermopol緩衝液に再懸濁した。細胞を200μLの96ウェルプレートに移し、75℃で30分間溶解した。溶解した細胞を氷水浴で冷却し、可溶化液を4℃で遠心分離により清澄化した。清澄化した可溶化液を新しい200μLの96ウェルプレートに移し、4℃で保存した。
部位飽和変異誘発ポリメラーゼミニライブラリーを大腸菌10-β細胞に形質転換し、アンピシリンを添加したTYE寒天プレートに播種した。全ての単一変異体ミニライブラリーについて、寒天プレートから2x94クローンを手で選択し、親ポリメラーゼTGLLKを有するプレートあたり2つの対照ウェルとともに、96ディープウェルプレート(Nunc)中のアンピシリン(100μg/mL)添加2xTY 1mLの2x94液体開始培養物を接種するために使用した。培養物を37℃で一晩増殖させた。翌日、各培養物100μLを使用して、新しいプレートに新しい1mLの培養物を接種し、培養物が中期に達するまで37℃で増殖させた。次いで、タンパク質発現を200μg/Lのアンヒドロテトラサイクリンで誘導し、37℃で2時間実施した。培養物を4℃で一晩保存した。細胞を遠心分離により回収し、100μLのThermopol緩衝液に再懸濁した。細胞を200μLの96ウェルプレートに移し、75℃で30分間溶解した。溶解した細胞を氷水浴で冷却し、可溶化液を4℃で遠心分離により清澄化した。清澄化した可溶化液を新しい200μLの96ウェルプレートに移し、4℃で保存した。
【0171】
プライマー伸長反応を、MgSO4(4mM)を添加した1xThermopol緩衝液(NEB)中で行った。ビオチン化プライマーFD(100nM)を、10μLの反応容量で全細胞可溶化液中のポリメラーゼ突然変異体により、2’-O-メチルリボヌクレオシド三リン酸(各125μM)を用いて鋳型TempNpure(200nM)にて伸長させた。反応を65℃で行った。
【0172】
ビオチン化プライマー伸長生成物を、0.1%(v/v)のTween20(PBST)を添加したPBSで希釈し、ストレプトアビジンコーティングプレート(Roche)上で、室温で1時間結合させた。全のインキュベーション工程の後、それぞれの上清を廃棄した。次いで、ハイブリダイズした鋳型を、0.1MのNaOHによる1分間の変性工程2回によって除去した。PBSTによる中和工程の後、ジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドプローブ(DIGN25、PBST中60nM)を1時間アプライすると、効率的に伸長したプライマーのみにハイブリダイズして、伸長生成物が長くなるほど親和性が増加した。
【0173】
PBSTでの3回の洗浄工程後、西洋ワサビペルオキシダーゼ(PBSTで1:3,000希釈、Roche)に結合した抗ジゴキシゲニン抗体断片をプレート上で1時間結合させた。4回のPBST洗浄後、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB、1-Step Ultra TMB-ELISA、Thermo)を添加し、青色の形成が完了するまでインキュベートすることによってアッセイを発色させた(TGLLK対照ウェルによって判断)。酵素反応を、1MのH2SO4の添加によって停止させ、黄色に色を変化させた。吸光度をプレートリーダーにて450nmで読み取った。
【0174】
スクリーニングヒットをミニ調製して、配列を決定し、上記の蛍光標識プライマーFDの伸長反応でポリメラーゼ活性を検証し、可溶化液の添加量を、SDS-PAGE分析及びポリメラーゼのバンド強度に基づく正規化によって調整した。プライマー伸長生成物を尿素PAGEにより分析した。
【0175】
(ポリメラーゼの発現と精製)
ポリメラーゼの発現及び精製を、基本的に前述6のように行った。簡単に説明すると、大腸菌BL21 CodonPlus-RIL細胞(Agilent)の開始培養物を単一コロニーから接種し、アンピシリン(100μg/mL)及びクロラムフェニコール(25μg/mL)を添加した2xTY培地で、37℃で一晩増殖させた。これを使用して、翌日に同じ培地を30mL(小規模)又は1L(大規模)接種した。培養物を対数期中期まで増殖させ、200μg/Lのアンヒドロテトラサイクリンで、37℃で4時間誘導した。4℃で一晩保存した後、回収した細胞を75℃で30分間溶解し、可溶化液を遠心分離により清澄化した。Hisタグ付きポリメラーゼを、Ni-NTAアガロース樹脂(Qiagen)の重力流によりベンチトップ精製し、Hisタグが付いていないポリメラーゼは、DEAEセファロース高速流動陰イオン交換樹脂(GE Healthcare)の重力流によりベンチトップ精製した。次いで、溶出画分を16/10 Hi-PrepヘパリンFFカラム(Cytiva Life Sciences)にロードし、0.5～0.8MのNaClで溶出した。適切な画分を2xポリメラーゼ保存緩衝液(1M KCl、2mM 290 EDTA、20mM Tris pH7.4)に濾過透析(Amicon Ultra Centrifugal Filters、Millipore)して、50%グリセロール中、-20℃で保存した。
ポリメラーゼの発現及び精製を、基本的に前述6のように行った。簡単に説明すると、大腸菌BL21 CodonPlus-RIL細胞(Agilent)の開始培養物を単一コロニーから接種し、アンピシリン(100μg/mL)及びクロラムフェニコール(25μg/mL)を添加した2xTY培地で、37℃で一晩増殖させた。これを使用して、翌日に同じ培地を30mL(小規模)又は1L(大規模)接種した。培養物を対数期中期まで増殖させ、200μg/Lのアンヒドロテトラサイクリンで、37℃で4時間誘導した。4℃で一晩保存した後、回収した細胞を75℃で30分間溶解し、可溶化液を遠心分離により清澄化した。Hisタグ付きポリメラーゼを、Ni-NTAアガロース樹脂(Qiagen)の重力流によりベンチトップ精製し、Hisタグが付いていないポリメラーゼは、DEAEセファロース高速流動陰イオン交換樹脂(GE Healthcare)の重力流によりベンチトップ精製した。次いで、溶出画分を16/10 Hi-PrepヘパリンFFカラム(Cytiva Life Sciences)にロードし、0.5～0.8MのNaClで溶出した。適切な画分を2xポリメラーゼ保存緩衝液(1M KCl、2mM 290 EDTA、20mM Tris pH7.4)に濾過透析(Amicon Ultra Centrifugal Filters、Millipore)して、50%グリセロール中、-20℃で保存した。
【0176】
(長鎖フルオロフォア標識RNAの合成)
それぞれプラスミドpCMV6-XL6(SP6プロモーター)(カタログ番号SC109374)及びpCMV6-XL5(T7プロモーター)(カタログ番号SC107921)中のKRASのヒトcDNAクローン(転写産物変異体b、受託番号NM_004985)及びCTNNB1(転写産物変異体1、受託番号NM_001904)のヒトcDNAクローンを、OriGene、USAから入手した。部位特異的突然変異誘発を、QuikChange IIキット(Agilent Technologies、USA)を使用して、製造元のプロトコルに従って実施した。KRAS変異G12D(c.35G＞A)及びG13D(c.38G＞G)、並びにCTNNB1変異S33Y(c.98C＞A)を、補足表2に示すプライマーセット(「Quik_KRAS_G12D_Fw/Rev」、「Quik_KRAS_G13D_Fw/Rev」又は「Quik_CTNNB_G12D_Fw/Rev」)を用いて導入し、得られたプラスミドをクローニングし、サンガーシーケンシング(Source Biosciences、UK)によって検証した。5’フルオレセインを有する完全なKRAS及びCTNNB1 mRNA転写物と同等の長鎖RNA基質(それぞれ、「Sub_KRas_ORF」及び「Sub_CTNNB1_ORF」)を、HiScribe T7及びSP6 RNA合成キット(NEB、USA)を用いて、製造元のプロトコルに従い、5'-フルオレセインApGジヌクレオチド(IBA Life Sciences、Germany)とGTPの比率を4:1で用い、XmaI(NEB、USA)を用いて直鎖状にした鋳型プラスミドを用いて調製した。その後、反応物をTURBO DNase(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific、USA)で処理し、RNeasyミニキット(Qiagen、Germany)を使用してRNA転写産物を精製した。
それぞれプラスミドpCMV6-XL6(SP6プロモーター)(カタログ番号SC109374)及びpCMV6-XL5(T7プロモーター)(カタログ番号SC107921)中のKRASのヒトcDNAクローン(転写産物変異体b、受託番号NM_004985)及びCTNNB1(転写産物変異体1、受託番号NM_001904)のヒトcDNAクローンを、OriGene、USAから入手した。部位特異的突然変異誘発を、QuikChange IIキット(Agilent Technologies、USA)を使用して、製造元のプロトコルに従って実施した。KRAS変異G12D(c.35G＞A)及びG13D(c.38G＞G)、並びにCTNNB1変異S33Y(c.98C＞A)を、補足表2に示すプライマーセット(「Quik_KRAS_G12D_Fw/Rev」、「Quik_KRAS_G13D_Fw/Rev」又は「Quik_CTNNB_G12D_Fw/Rev」)を用いて導入し、得られたプラスミドをクローニングし、サンガーシーケンシング(Source Biosciences、UK)によって検証した。5’フルオレセインを有する完全なKRAS及びCTNNB1 mRNA転写物と同等の長鎖RNA基質(それぞれ、「Sub_KRas_ORF」及び「Sub_CTNNB1_ORF」)を、HiScribe T7及びSP6 RNA合成キット(NEB、USA)を用いて、製造元のプロトコルに従い、5'-フルオレセインApGジヌクレオチド(IBA Life Sciences、Germany)とGTPの比率を4:1で用い、XmaI(NEB、USA)を用いて直鎖状にした鋳型プラスミドを用いて調製した。その後、反応物をTURBO DNase(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific、USA)で処理し、RNeasyミニキット(Qiagen、Germany)を使用してRNA転写産物を精製した。
【0177】
(2’OMezyme選択)
大まかに説明すると、キメラRNA-2’OMe-RNAランダム配列ライブラリーを、以前のXNAzymes7,8と同様の戦略を使用して調製及び選択した。最初のライブラリー合成反応を、Thermopol緩衝液(NEB、USA)中1μMのRNAプライマー「P1_KRas12[G12D]」、2μMのDNA鋳型「N40libtemp_KRas12」、1.3μMの2Mポリメラーゼ及び0.125mM(各々)の2’OMe-ATP、2’OMe-CTP、2’OMe-GTPと2’OMe-UTPを用いて、50℃で1時間、65℃で2時間行った。MyOneストレプトアビジンC1ダイナビーズ(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific、USA)を使用して、(5'ビオチン化)一本鎖キメラRNA-2’OMe-RNAライブラリーを捕捉し、前述7のように0.1NのNaOHを使用して(非ビオチン化)DNA鋳型を変性させ、除去した。その後、ライブラリーを尿素PAGEによって精製した。ヌクレアーゼを含まない水(Qiagen、Germany)中でライブラリーを80℃で60秒間、RTで5分間アニーリングし、次いで、2’OMezyme選択緩衝液(30mM EPPS pH7.4、150mM KCl、1mM MgCl2)中で、37℃でインキュベートすることにより選択反応を行った。反応時間は次のように:ラウンド1～11;一晩(約16時間)、ラウンド11＆12;1時間、ラウンド13～15;30分に変更した。
大まかに説明すると、キメラRNA-2’OMe-RNAランダム配列ライブラリーを、以前のXNAzymes7,8と同様の戦略を使用して調製及び選択した。最初のライブラリー合成反応を、Thermopol緩衝液(NEB、USA)中1μMのRNAプライマー「P1_KRas12[G12D]」、2μMのDNA鋳型「N40libtemp_KRas12」、1.3μMの2Mポリメラーゼ及び0.125mM(各々)の2’OMe-ATP、2’OMe-CTP、2’OMe-GTPと2’OMe-UTPを用いて、50℃で1時間、65℃で2時間行った。MyOneストレプトアビジンC1ダイナビーズ(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific、USA)を使用して、(5'ビオチン化)一本鎖キメラRNA-2’OMe-RNAライブラリーを捕捉し、前述7のように0.1NのNaOHを使用して(非ビオチン化)DNA鋳型を変性させ、除去した。その後、ライブラリーを尿素PAGEによって精製した。ヌクレアーゼを含まない水(Qiagen、Germany)中でライブラリーを80℃で60秒間、RTで5分間アニーリングし、次いで、2’OMezyme選択緩衝液(30mM EPPS pH7.4、150mM KCl、1mM MgCl2)中で、37℃でインキュベートすることにより選択反応を行った。反応時間は次のように:ラウンド1～11;一晩(約16時間)、ラウンド11＆12;1時間、ラウンド13～15;30分に変更した。
【0178】
2’OMe-RNA逆転写を、追加の2mMのMgCl2、200μMの各dNTPを有するThermopol緩衝液(NEB、USA)中0.2μMの5’ビオチン化プライマー「RT_Ebo」と共に1μMのポリメラーゼC89を用いて65℃で17時間行った。ファーストストランドcDNAを、ストレプトアビジン磁気ビーズ(C1 MyOne、Thermo Fisher Scientific、USA)を使用して単離し、ヌクレアーゼを含まない水中で、80℃で2分間インキュベートして溶出し、次いで、OneTaqホットスタートマスターミックス(NEB、USA)を使用して2工程のネスティッドPCR戦略により増幅させた。最初の「アウトネスティッド」PCRに0.5μMのフォワードプライマー「dP2_KRas12」及び0.5μMのリバースプライマー「RT_Ebo_out」を使用し、サイクル条件は、94℃で1分、[94℃で30秒、52℃で30秒、72℃で30秒]を20～35回、72℃で2分であった。最初のPCRに続いて、プライマーをExoSAP(Ambion/Life Technologies、USA)を用いて消化し、次いで、製造元の説明書に従って熱不活化した。第2工程(「インネスト」)PCRでは、0.5μMのフォワードプライマー「dP2_KRas12」及び0.5μMのリバースプライマー「RT_Ebo_in」を用いて、50μLの反応中1μLの未精製アウトネストPCR生成物を鋳型として、上記のサイクル条件を使用した。反応を、GelStar染色(Lonza、Switzerland)を含む4% NGQT-1000アガロース(Thistle Scientific、UK)ゲルで電気泳動によって分析した。適切なサイズのバンドを、ゲル抽出キット(Qiagen、Germany)を用いて、製造元の説明書に従って精製した。精製したDNAを、XNA合成用のDNA鋳型生成のためのシーケンシングライブラリーPCR(下記参照)又は分取PCR(最大500μlにスケールアップした「インネスト」PCR)のいずれか用のポリクローナル鋳型として使用した。一本鎖DNA鋳型を、ストレプトアビジンビーズを用いて単離し、さらに使用する前にエタノール沈殿した。
【0179】
その後、ラウンド15で最も存在量の多いクローンの配列(3,942,063のディープシーケンシング読み取り情報のうち84,674を含む;約2%)を基礎として、DNA鋳型「R15_1libtemp_KRas12」を用いて上記のように合成したスパイクライブラリーを用いて、5ラウンド(2’OMezyme反応緩衝液中で、37℃で30分の反応)で「成熟」選択を行った。2’OMezyme「R15/5-K」は、成熟選択のラウンド5で最も存在量の多いクローン(5,507,023のディープシーケンシング読み取り情報のうち1,291を含む;0.02%)であった。
【0180】
(ディープシーケンシング)
ディープシーケンシングを、前述7のように、MiSeqプラットフォーム(Illumina、USA)を使用して行った。必要なプライミング部位を付加するために、2’OMezyme選択プールを、プライマー「P5_P2_KRas12」及び「P3_RT_Ebo_in」を使用するPCRによりシーケンシングライブラリーに変換した。
ディープシーケンシングを、前述7のように、MiSeqプラットフォーム(Illumina、USA)を使用して行った。必要なプライミング部位を付加するために、2’OMezyme選択プールを、プライマー「P5_P2_KRas12」及び「P3_RT_Ebo_in」を使用するPCRによりシーケンシングライブラリーに変換した。
【0181】
(特性評価のための2’OMezymeの合成)
2’OMezyme活性の最初のスクリーニング及び点変異の評価のために、2’Omezymeを、上記のポリメラーゼ2Mを用いて、補足表2に示すようにRNAプライマー「P2_Ebo」及び3'ビオチン化DNA鋳型を用いて合成し、前述7のように、MyOneストレプトアビジンC1ダイナビーズ(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific、USA)を用いて単離した。0.1 NaOHを用いたDNA鋳型鎖の変性及び除去に続いて、2’OMezymeを0.8NのNaOH中で、65℃で1時間インキュベートし、プライマーRNAを完全に加水分解した。
2’OMezyme活性の最初のスクリーニング及び点変異の評価のために、2’Omezymeを、上記のポリメラーゼ2Mを用いて、補足表2に示すようにRNAプライマー「P2_Ebo」及び3'ビオチン化DNA鋳型を用いて合成し、前述7のように、MyOneストレプトアビジンC1ダイナビーズ(Invitrogen/Thermo Fisher Scientific、USA)を用いて単離した。0.1 NaOHを用いたDNA鋳型鎖の変性及び除去に続いて、2’OMezymeを0.8NのNaOH中で、65℃で1時間インキュベートし、プライマーRNAを完全に加水分解した。
【0182】
他の全ての特性評価実験用の2’OMezymeは、Merck/MilliporeSigma(Germany)による固相ホスホロアミダイトケミストリーによって合成した。
【0183】
(2’OMezymeの反応)
RNA切断アッセイを、PAGE精製した2’OMezyme及びRNA基質を用いてトランスで行い、上記のようにアニーリングし、RNasinリボヌクレアーゼ阻害剤(Promega、USA)を添加した2’OMezyme選択緩衝液(30mM EPPS pH7.4、150mM KCl、1mM MgCl2)、又は30mM EPP pH8.5、150mM KCl、25mM MgCl2中で、37℃でインキュベートした。Mg2+滴定実験では、2’OMezyme選択緩衝液にさらに塩化マグネシウム(MgCl2)を添加し、pH滴定実験では、150mM KCl、1mM MgCl2と、以下のような50mM緩衝液:HEPES(pH5.0～6.0)、EPPS(pH6.5～8.75)、CHES(pH9.0～12.0)を使用した。マグネシウムを含まない反応では、30mM EPPS pH7.4、150mM KCl、5mM EDTAを使用した。
RNA切断アッセイを、PAGE精製した2’OMezyme及びRNA基質を用いてトランスで行い、上記のようにアニーリングし、RNasinリボヌクレアーゼ阻害剤(Promega、USA)を添加した2’OMezyme選択緩衝液(30mM EPPS pH7.4、150mM KCl、1mM MgCl2)、又は30mM EPP pH8.5、150mM KCl、25mM MgCl2中で、37℃でインキュベートした。Mg2+滴定実験では、2’OMezyme選択緩衝液にさらに塩化マグネシウム(MgCl2)を添加し、pH滴定実験では、150mM KCl、1mM MgCl2と、以下のような50mM緩衝液:HEPES(pH5.0～6.0)、EPPS(pH6.5～8.75)、CHES(pH9.0～12.0)を使用した。マグネシウムを含まない反応では、30mM EPPS pH7.4、150mM KCl、5mM EDTAを使用した。
【0184】
1回ターンオーバー前定常状態(Km/kcat)条件下での擬似一次反応速度(kob)を、前述8のように、5μMの触媒と1μMの基質との(別々にアニーリングした)3つの独立した反応から、Prism9(GraphPad Software、USA)を使用して適合させて決定した。マルチターンオーバー反応については、1μMの基質を2’OMezyme選択緩衝液中で、37℃で10nMの2’OMezymeと反応させた。
【0185】
逆RNAライゲーション反応については、2’OMezyme「R15/5-K」によって触媒される大規模「Sub_KRas_12[G12D]」RNA切断反応の生成物を、尿素PAGEによって精製し、基質として使用した。5μMの2’OMezyme「R15/5-K」並びに(各々)1μMの5'及び3'RNA切断生成物を上記のように水中でアニーリングし、次いで、塩化マグネシウムを含む場合と含まない場合で、2’OMezyme選択緩衝液に希釈し、ドライアイス上で急速凍結させ、次いで、-7℃又は37℃で20時間反応させてインキュベートした。「過冷却」試料を、ドライアイスで事前に凍結させずに-7℃で直接インキュベートした。
【0186】
(2’OMezyme触媒RNA切断生成物の分析)
基質RNA「Sub_KRas_12[G12D]」を、選択条件下で2’OMezyme「R15/5-K」と反応させ、5'RNA切断生成物を尿素PAGEによって精製した。切断生成物を、前述8のように陽イオンモードでUltraflex III TOF-TOF装置(Bruker Daltonik、Bremen、Germany)を使用して、MALDI-ToF質量分析法によって分析した。
基質RNA「Sub_KRas_12[G12D]」を、選択条件下で2’OMezyme「R15/5-K」と反応させ、5'RNA切断生成物を尿素PAGEによって精製した。切断生成物を、前述8のように陽イオンモードでUltraflex III TOF-TOF装置(Bruker Daltonik、Bremen、Germany)を使用して、MALDI-ToF質量分析法によって分析した。
【0187】
3'末端リン酸の酵素除去を、製造元の緩衝液中のウシ腸ホスファターゼ(CIP)(NEB、USA)又はT4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)(NEB、USA)中で、37℃で30分間インキュベートした後に、尿素PAGEゲルシフトによってアッセイした。環状リン酸塩の加水分解を、10mMのグリシンpH2.5中で、室温で30分間インキュベートすることにより達成した。
【0188】
(2’OMezyme血清安定性の分析)
PAGE精製した2’OMezyme「R15/5-K」及びDNAzyme「1023_KRasC」を、上記のように水中でアニーリングし、次いで、95%ヒト血清(MilliporeSigma、Germany)中で、37℃で(5μMで)インキュベートした。SYBR Gold(ThermoFisher Scientific、USA)で染色した尿素PAGEゲル上で、残存する全長触媒を定量した。
PAGE精製した2’OMezyme「R15/5-K」及びDNAzyme「1023_KRasC」を、上記のように水中でアニーリングし、次いで、95%ヒト血清(MilliporeSigma、Germany)中で、37℃で(5μMで)インキュベートした。SYBR Gold(ThermoFisher Scientific、USA)で染色した尿素PAGEゲル上で、残存する全長触媒を定量した。
【0189】
(表面プラズモン共鳴(SPR)によるアプタマー結合の解析)
2’OMe/MOE-NTPを用いる「特性評価のための2’OMezymeの合成」の節に記載されるように、2’OMe/MOE-RNAアプタマーを、RNAプライマーPrim1と3'-ビオチン化DNA鋳型Temp_ARC224(補足表1)から合成した。2’OMe/MOE-RNAアプタマーを、ヌクレアーゼを含まない水中で、1～10μMで、95℃に5分間加熱し、RTで10分間平衡化することによりアニーリングした。次いで、それらを希釈し、PBS+0.1%(v/v)Tween20(PBS-Tw)中で分析した。表面プラズモン共鳴(SPR)測定を、BIAcore 2000装置(GE Life Sciences、UK)を使用して、20℃で、流速20μL/分で行った。CM4センサーチップ(GE Life Sciences、UK)の表面を、アミンカップリングキット(GE Life Sciences、UK)を用いてニュートラビジン(Pierce 31000、ThermoFisher Scientific、USA)表面(フローセルあたり約8000 RU)でコーティングし、5mMのNaOAc(酢酸ナトリウム)pH5.5で流した。チップをPBS Twで平衡化し、シグナルドリフトが落ち着くまで一晩流したままにした。約2000 RUビオチン化ヒトVEGF165(Bio-Techne、USA)を捕捉し(基準細胞を除く)、過剰な遊離ビオチンでブロッキングした。一連の濃度(500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.3nM、15.6nM、7.8nM、3.9nM)の50μLアプタマー試料を150秒間注入し、解離をPBS-Tw中で600秒間記録した。濃度系列外のアプタマーの1回注入をPBS-Tw中100nM(50μL)で行った。各注入後、10mMのNaOH＋生理食塩水(137mM NaCl、2.7mM KCl)の5μLを2回注入してセンサー表面を再生した。
2’OMe/MOE-NTPを用いる「特性評価のための2’OMezymeの合成」の節に記載されるように、2’OMe/MOE-RNAアプタマーを、RNAプライマーPrim1と3'-ビオチン化DNA鋳型Temp_ARC224(補足表1)から合成した。2’OMe/MOE-RNAアプタマーを、ヌクレアーゼを含まない水中で、1～10μMで、95℃に5分間加熱し、RTで10分間平衡化することによりアニーリングした。次いで、それらを希釈し、PBS+0.1%(v/v)Tween20(PBS-Tw)中で分析した。表面プラズモン共鳴(SPR)測定を、BIAcore 2000装置(GE Life Sciences、UK)を使用して、20℃で、流速20μL/分で行った。CM4センサーチップ(GE Life Sciences、UK)の表面を、アミンカップリングキット(GE Life Sciences、UK)を用いてニュートラビジン(Pierce 31000、ThermoFisher Scientific、USA)表面(フローセルあたり約8000 RU)でコーティングし、5mMのNaOAc(酢酸ナトリウム)pH5.5で流した。チップをPBS Twで平衡化し、シグナルドリフトが落ち着くまで一晩流したままにした。約2000 RUビオチン化ヒトVEGF165(Bio-Techne、USA)を捕捉し(基準細胞を除く)、過剰な遊離ビオチンでブロッキングした。一連の濃度(500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.3nM、15.6nM、7.8nM、3.9nM)の50μLアプタマー試料を150秒間注入し、解離をPBS-Tw中で600秒間記録した。濃度系列外のアプタマーの1回注入をPBS-Tw中100nM(50μL)で行った。各注入後、10mMのNaOH＋生理食塩水(137mM NaCl、2.7mM KCl)の5μLを2回注入してセンサー表面を再生した。
【0190】
最適な適合を得るには、SPRデータを二重指数不均一解離/会合モデルに当てはめ、オンライン基準減算を使用してアプタマーあたり2つの独立したデータセットから動態パラメーターを決定しなければならなかった。ARC224 MOE-AGCアプタマーについては、結合シグナルが不十分なため、最も低い2つの濃度点は分析に含めず、外れ値として捨てた。核酸-タンパク質相互作用については、ホモ1:1結合モデルからの逸脱を確立し、DNAアプタマー結合VEGFの2つの立体構造的に異なる集団を説明する不均一モデルについては記載されている10。
【0191】
解離と会合の速度定数を、以下の2つの式を使用して、観測された応答シグナルRを適合することによって得た。
【0192】
不均一解離:
ここで、R0は解離開始時(t0)の応答であり、R1は成分1(フローティングパラメータ)からのR0への寄与であり、したがって、(R0 - R1)は、成分2からのR0への寄与である。Kdiは、成分i(フローティングパラメーター)の解離速度定数である。
【数1】
【0193】
不均一会合:
ここで、Reqiは、成分i(フローティングパラメーター)の定常状態の応答レベルであり、kaiは、成分i(フローティングパラメーター)の会合速度定数であり、kdiは成分iの解離速度定数であり、Cは分析物のモル濃度であり、t0は会合の開始時間である。
【数2】
【0194】
(2’OMe合成及びRT忠実度解析のためのNGS)
2’OMe-RNA合成のために、EcoR1を用いたpASK_TGOプラスミドの直鎖化と、それに続くエビアルカリホスファターゼ処理とBamHIを用いた制限処理により、ssDNA鋳型を作製した。369 ntd dsDNA断片をゲル溶出し、ラムダエキソヌクレアーゼ(NEB)で処理して、RNA/2’OMe-RNA合成用の一本鎖鋳型を作製する。2’OMe-RNA合成を、20μLの反応容量で行い、modFD-N25-TGO682Fプライマー及び前述のように作製したssDNA鋳型を、200μMのrNTP又は200μMの2’OMe-NTPを含む1xThermopol緩衝液中で、95℃で2分間、続いて、55℃で5分間アニーリングした。RNA及び2’OMe-RNA合成を、それぞれTGKポリメラーゼ(RNA)及びTGLLK又は2M又は3M(2’OMe-RNA)合成を用いて行った。
2’OMe-RNA合成のために、EcoR1を用いたpASK_TGOプラスミドの直鎖化と、それに続くエビアルカリホスファターゼ処理とBamHIを用いた制限処理により、ssDNA鋳型を作製した。369 ntd dsDNA断片をゲル溶出し、ラムダエキソヌクレアーゼ(NEB)で処理して、RNA/2’OMe-RNA合成用の一本鎖鋳型を作製する。2’OMe-RNA合成を、20μLの反応容量で行い、modFD-N25-TGO682Fプライマー及び前述のように作製したssDNA鋳型を、200μMのrNTP又は200μMの2’OMe-NTPを含む1xThermopol緩衝液中で、95℃で2分間、続いて、55℃で5分間アニーリングした。RNA及び2’OMe-RNA合成を、それぞれTGKポリメラーゼ(RNA)及びTGLLK又は2M又は3M(2’OMe-RNA)合成を用いて行った。
【0195】
5'ビオチン修飾を含む合成転写産物をダイナビーズ(Dynabeads)(商標)M-280ストレプトアビジンビーズ(Invitrogen)に結合させ、0.2NのNaOHを使用して鋳型を剥離させることによって精製した。RNA又は2’OMe-RNAで固定化した磁気ビーズを、SSIII酵素(ThermoFisherScientific)を用いた逆転写に使用した。ビーズ上で、PCRとシーケンシングのエラー修正用のN25内部バーコードを有するRT_プライマーTagR1-N25-TGO642Rを用いてRT反応を行った。RT反応を、SSIIIに関するベンダーのガイドラインに従って行った。ビーズ上のRNA又は2’OMe-RNAに結合したcDNAを、1X BWBSを用いて2回洗浄し、0.2N NaOHを用いて剥がし、Tris緩衝液を用いて中和してから、シーケンシングライブラリーの作製に用いた。RTをさらに3回繰り返し、溶出させたcDNAをディープシーケンシング用のライブラリー調製に使用した。
【0196】
cDNA(25μL)を、フォワードプライマーのプライマーHiSeq_ModFD及び特有のバーコード識別子プライマーのHiSeq_TagR1xx(補足表5)と共に50μLのPCR反応物に添加し、試料を逆多重化し、Q5ポリメラーゼ(NEB)を使用してIlluminaシーケンシング用のアダプターを導入した。
【0197】
バーコード化した忠実度ライブラリーをプールし、150サイクルのPE読み取り用にIllumina MiSeqで配列を決定した。忠実度解析を、Burrows-Wheeler Aligner(BWA)11を用いて行い、次のことを行うSamtools12及びカスタムスクリプトを、GitHub: https://github.com/holliger-lab/fidelity-analysisで見つけることができた。配列決定した106塩基あたりのRNA及び2’OMe-RNAについて、平均エラー率(補足表4)及び塩基置換を計算した(補足表6及び7)9。
【0198】
(定常状態の動態)
2MによるNTP組み込みについての定常状態の動態パラメーターを、ATP、2’OMe-ATP、又はMOE-ATPのいずれかの単一組み込みの初速度測定を行うことによって決定した。2’OMe-RNA/DNA基質を作製するために、20merの2’OMe-RNAプライマーFDを5′6-カルボキシフルオレセインで末端標識し、52merのDNA鋳型BFL770(補足表1)に1:1.2モル比でアニーリングした。反応を、1XThermopol緩衝液、6mM Mg2+、100nMの2’OMe-RNA/DNAを含む混合物中、0.5～250μMの範囲のNTP濃度で、50℃で行った。酵素濃度と反応時間を、初速度条件を維持するように選択した。25μLの反応を、100mM EDTA、80%脱イオン化ホルムアミド、0.25mg/mlのブロモフェノールブルー及び0.25mg/mlのキシレンシアノールを含むクエンチング溶液を添加して停止した。さらに、必要に応じて、プライマーの20%未満を定常状態条件用に伸長した。
2MによるNTP組み込みについての定常状態の動態パラメーターを、ATP、2’OMe-ATP、又はMOE-ATPのいずれかの単一組み込みの初速度測定を行うことによって決定した。2’OMe-RNA/DNA基質を作製するために、20merの2’OMe-RNAプライマーFDを5′6-カルボキシフルオレセインで末端標識し、52merのDNA鋳型BFL770(補足表1)に1:1.2モル比でアニーリングした。反応を、1XThermopol緩衝液、6mM Mg2+、100nMの2’OMe-RNA/DNAを含む混合物中、0.5～250μMの範囲のNTP濃度で、50℃で行った。酵素濃度と反応時間を、初速度条件を維持するように選択した。25μLの反応を、100mM EDTA、80%脱イオン化ホルムアミド、0.25mg/mlのブロモフェノールブルー及び0.25mg/mlのキシレンシアノールを含むクエンチング溶液を添加して停止した。さらに、必要に応じて、プライマーの20%未満を定常状態条件用に伸長した。
【0199】
生成物と基質を22%変性(8M尿素)ポリアクリルアミドゲル上で分離した。取得したバンドを、蛍光モードでCytiva Typhoon RGBイメージャーを使用して定量化した。データをMichaelis-Menten式に当てはめることによって、定常状態の動態パラメーター(KM、kcat)を決定した。データは、3つの独立した実験からの平均と標準誤差である。
【0200】
(RGVG-M6による転写反応)
転写反応用のDNA鋳型を、T7プロモーター下でsfGFPをコードするプラスミド上の901-bp領域をPCRで増幅することによって作製した。PCRには、0.5μMのフォワードプライマー「5T7.for」と0.5μMのリバースプライマー「pCUN_Do.rev」を使用し、サイクル条件は、95℃で30秒、30×[95℃で10秒、69℃で30秒、72℃で30秒]、72℃で2分であった。
転写反応用のDNA鋳型を、T7プロモーター下でsfGFPをコードするプラスミド上の901-bp領域をPCRで増幅することによって作製した。PCRには、0.5μMのフォワードプライマー「5T7.for」と0.5μMのリバースプライマー「pCUN_Do.rev」を使用し、サイクル条件は、95℃で30秒、30×[95℃で10秒、69℃で30秒、72℃で30秒]、72℃で2分であった。
【0201】
非常に寛容な条件については、反応に、125nMのDNA鋳型、200nMのT7 RNAP WT又はその変異体RGVG-M613、1.5mMのMnCl2、7.5mMの各NTP又は1mMの各2’OMe-NTP、0.1Uの酵母無機ピロホスファターゼを含めた。2M及びRGVG-M6による2’OMe-RNA合成の収率を比較するために、0.5pmolのプライマー(2M)及び0.5pmolのDNA鋳型(50nM、RGVG-M6)、及び50nMのRGVG-M6ポリメラーゼの等モル核酸インプット下で、1:1のポリメラーゼ:鋳型比で13に記載されているように反応を実行した。反応物をターボDNaseとプロテイナーゼKで処理し、その後、変性PAGEを行った。
【0202】
【0203】
補足表1に、配列番号45～87を順に記載する。
補足表2に、配列番号88～127を順に記載する。
補足表5に、配列番号128～142を順に記載する。
補足表2に、配列番号88～127を順に記載する。
補足表5に、配列番号128～142を順に記載する。
【0204】
(補足表)
補足表1:全てのポリメラーゼ研究、突然変異誘発、2'OMe-RNA及びMOE-RNA合成、並びにARC224アプタマー変異体合成用のプライマーと鋳型。
突然変異誘発用にターゲティングしたコドンを太字で強調表示している。異なる化学物質を、次のように、黒＝DNA、赤＝RNA、紫＝2'OMe-RNAで強調表示している。
補足表1:全てのポリメラーゼ研究、突然変異誘発、2'OMe-RNA及びMOE-RNA合成、並びにARC224アプタマー変異体合成用のプライマーと鋳型。
突然変異誘発用にターゲティングしたコドンを太字で強調表示している。異なる化学物質を、次のように、黒＝DNA、赤＝RNA、紫＝2'OMe-RNAで強調表示している。
【表6】
【0205】
(補足表2: 2'OMezyme用のプライマー及び鋳型配列)
異なる化学物質を、次のように、黒＝DNA、赤＝RNA、紫＝2'OMe-RNAで強調表示している(NB-ここで示す2'OMe-RNAオリゴを、ポリメラーゼではなく固相合成によって調製した)。
異なる化学物質を、次のように、黒＝DNA、赤＝RNA、紫＝2'OMe-RNAで強調表示している(NB-ここで示す2'OMe-RNAオリゴを、ポリメラーゼではなく固相合成によって調製した)。
【表7】
【0206】
(補足表3:SPR曲線の適合を経て取得した動態データ)
適合させたパラメーターの各行は、1つの濃度系列(2倍希釈系列の8回の個別注入;MOE-AGC:6回の個別注入;材料＆方法に記載されているとおり)。平均の標準誤差(s.e.m.)が示されている。
適合させたパラメーターの各行は、1つの濃度系列(2倍希釈系列の8回の個別注入;MOE-AGC:6回の個別注入;材料＆方法に記載されているとおり)。平均の標準誤差(s.e.m.)が示されている。
【表8】
【0207】
補足表4:バーコード化次世代シーケンシング(NGS)9で測定した2'OMe-RNA合成(TGK用のRNA合成)の忠実度
a RNA合成についてTGKの忠実度は、1.03×10-3(平均エラー率)と公表されている15。
【表9】
【0208】
補足表5:RNA及び2'OMe-RNA忠実度用のプライマー及び鋳型配列
注釈:シーケンシングライブラリー用のリバースプライマーは、分析用の試料を逆多重化するために、NNNの上流に6文字バーコードを担持する。
注釈:シーケンシングライブラリー用のリバースプライマーは、分析用の試料を逆多重化するために、NNNの上流に6文字バーコードを担持する。
【表10】
【0209】
【表11】
【0210】
【表12】
【図1-01】
【図1-02】
【図2-01】
【図2-02】
【図3-01】
【図3-02】
【図4-01】
【図4-02】
【図5-01】
【図5-02】
【図6-01】
【図6-02】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12-01】
【図12-02】
【図13】
【図14-01】
【図14-02】
【図15-01】
【図15-02】
【図16】
【図17】
【図18-01】
【図18-02】
【図19】
【図20】
【図21-01】
【図21-02】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】