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特表2024-534991オトフェリンのアイソフォーム５をコードする二重組換えＡＡＶ８ベクター系およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】オトフェリンのアイソフォーム５をコードする二重組換えＡＡＶ８ベクター系およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240918BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240918BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240918BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240918BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
A61K35/76
A61K48/00
A61P27/16
C12N15/12 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515645
(86)(22)【出願日】2022-09-09
(85)【翻訳文提出日】2024-05-02
(86)【国際出願番号】 EP2022075185
(87)【国際公開番号】W WO2023036966
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】21306245.8
(32)【優先日】2021-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】63/303,743
(32)【優先日】2022-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．プルロニック
２．ＴＷＥＥＮ
３．ＭＡＴＬＡＢ
(71)【出願人】
【識別番号】523098278
【氏名又は名称】インスティチュート パスツール
(71)【出願人】
【識別番号】524091722
【氏名又は名称】アシスタンス パブリック－オピトークス ド パリ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】サフィエディン，サーイド
(72)【発明者】
【氏名】プティ，クリスティーン
(72)【発明者】
【氏名】ルコント，マリー－ホセ
(72)【発明者】
【氏名】ジスリーン，ラルー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA34
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA34
(57)【要約】
本発明は、ＡＡＶ８カプシド中にパッケージ化され、およびそれにより送達される２つの発現カセットに分割されているオトフェリンｃＤＮＡのアイソフォーム５をコードする二重ＡＡＶベクター戦略が、オトフェリンｃＤＮＡを効率的に内耳有毛細胞（ＩＨＣ）に送達することができるという観察に基づいている。さらに、発明者らは、２つのＡＡＶ８ベクターの１つにＣＭＶプロモーターを使用することが、これらの特定の細胞におけるオトフェリンの有意な発現をもたらすことを強調した。ＡＡＶ血清型および使用されるプロモーターのタイプは、形質導入効率に対して有意な効果を有する２つの主要な要素であるので、本発明のベクター系の開発は、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者に最適治療効果を与えることになるであろう。この治療効果をさらに改善するために、発明者らは、最後に、いくつかの特定のオトフェリンコード二重ベクター構築物を試験し、ＤＦＮＢ９マウスモデルの成熟蝸牛中の増強されたトランスフェクション率ならびに非常に有効なインビトロおよびインビボでのオトフェリン発現を同定し、それらの聴覚の回復をもたらした。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも２つの異なるＡＡＶ粒子を含むベクター系であって、即ち：ａ）第１のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのＡＡＶ８粒子であって、前記第１のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター配列、その後に続くオトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列を、含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子、ならびに
ｂ）第２のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのＡＡＶ８粒子であって、前記第２のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列を、含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子、
を含み、
前記第１および第２のポリヌクレオチドが、組換え誘導ポリヌクレオチド配列を含み、
前記第１および第２のポリヌクレオチド中の前記コード配列が、組み合わされると、オトフェリンポリペプチドのアイソフォーム５、またはその機能性フラグメントをコードする、
ベクター系。
【請求項2】
前記オトフェリン遺伝子が、配列番号１５の配列またはその相同配列を有する、請求項１に記載のベクター系。
【請求項3】
ａ）第１のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのＡＡＶ８粒子であって、前記第１のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、その後に続くオトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列、およびスプライスドナー部位を、含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子、ならびにｂ）第２のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのＡＡＶ８粒子であって、前記第２のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列を、含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子、
を含み、
前記第１および第２のポリヌクレオチドはまた、前記第１のポリヌクレオチド中のスプライスドナー部位の後かつ前記第２のポリヌクレオチド中の前記スプライスアクセプター部位の前に位置する第２の組換え誘導配列も含有する、請求項１または２に記載のベクター系。
【請求項4】
前記第２の組換え誘導配列が、配列番号６９の外来性配列である、請求項１～３のいずれか１項に記載のベクター系。
【請求項5】
前記ＣＭＶプロモーターが、配列番号９またはその相同配列を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載のベクター系。
【請求項6】
前記ＣＭＶプロモーターは、その後に、好ましくは配列番号１０のイントロン配列が続き、前記配列は、オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分の上流に位置する、請求項１～５のいずれか１項に記載のベクター系。
【請求項7】
前記第２のポリヌクレオチドはまた、配列番号２３のＷＰＲＥ配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載のベクター系。
【請求項8】
オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分が、配列番号１５またはその相同配列のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２４０６、ヌクレオチド１～２５２３、ヌクレオチド１～２６７６、ヌクレオチド１～２９９１またはヌクレオチド１～３１２６にある、請求項１～７のいずれか１項に記載のベクター系。
【請求項9】
ａ）第１のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのＡＡＶ８粒子であって、前記第１のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：配列番号９のＣＭＶプロモーター、必要に応じて配列番号１０のイントロン配列、その後に続く配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２４０６、ヌクレオチド１～２５２３、ヌクレオチド１～２６７６、ヌクレオチド１～２９９１またはヌクレオチド１～３１２６、およびスプライスドナー部位を、含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子、ならびにｂ）第２のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのＡＡＶ８粒子であって、前記第２のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２４０７～５９９１、ヌクレオチド２５２４～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、ヌクレオチド２９９２～５９９１またはヌクレオチド３１２７～５９９１、必要に応じてその後に続くＷＰＲＥ配列および／またはポリアデニル化配列を、含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子、
を含み、
前記第１および第２のポリヌクレオチドはまた、前記第１のポリヌクレオチド中の前記スプライスドナー部位の後かつ前記第２のポリヌクレオチド中の前記スプライスアクセプター部位の前に位置する配列番号６９のＡＰ組換え誘導配列も含有する、
請求項８に記載のベクター系。
【請求項10】
ａ）第１のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのＡＡＶ８粒子であって、前記第１のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：配列番号９のＣＭＶプロモーター、必要に応じて配列番号１０のイントロン配列、その後に続く配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２６７６、またはヌクレオチド１～２９９１、およびスプライスドナー部位を、含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子、ならびにｂ）第２のポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのＡＡＶ８粒子であって、前記第２のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、またはヌクレオチド２９９２～５９９１、必要に応じてその後に続く、ポリアデニル化配列を、含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子、
を含み、
前記第１および第２のポリヌクレオチドはまた、前記第１のポリヌクレオチド中の前記スプライスドナー部位の後かつ前記第２のポリヌクレオチド中の前記スプライスアクセプター部位の前に位置する配列番号６９のＡＰ組換え誘導配列も含有し、
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号２３のＷＰＲＥ配列を含有しない、
請求項８または９のいずれかに記載のベクター系。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか１項に記載のベクター系ならびに薬学的に許容可能なビヒクルを含む、医薬組成物。
【請求項12】
ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者の処置に使用するための、またはＤＦＮＢ９変異を有する患者のＤＦＮＢ９難聴の防止に使用するための、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記患者が、言語習得後に前記ＤＦＮＢ９難聴と診断されているヒト患者である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記患者が、温度感受性変異により誘導されるＤＦＮＢ９難聴に罹患しているティーンエージャーまたはヒト成人である、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項15】
前記温度感受性変異が、ＰＱ９９４ＶｆｓＸ６、Ｐ．Ｉ５１５Ｔ、ｐ．Ｇ５４１Ｓ、ＰＲ１６０７Ｗ、ｐＥ１８０４ｄｅｌ、ｃ．２９７５＿２９７８ｄｅｌＡＧ／ｃ．４８１９Ｃ＞Ｔ、ｃ．４８１９Ｃ＞Ｔ（ｃ．Ｒ１６０７Ｗ）から選択される、請求項１４に記載の組成物。【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【0001】
本発明は、ＡＡＶ８カプシド中にパッケージ化およびそれにより送達される２つの発現カセットに分割されたオトフェリンｃＤＮＡのアイソフォーム５をコードする二重ＡＡＶベクター戦略が、オトフェリンｃＤＮＡを効率的に内耳有毛細胞（ＩＨＣ）に送達できるという観察に基づいている。さらに、発明者らは、２つのＡＡＶ８ベクターの１つにＣＭＶプロモーターを使用することが、これらの特定の細胞中のオトフェリンの有意な発現をもたらすことを強調した。ＡＡＶ血清型および使用されるプロモーターのタイプは、形質導入効率に対し有意な効果を有する２つの主要な要素であるので、本発明のベクター系の開発は、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者に最適な治療利益を与えることになるであろう。この治療効果をさらに改善するために、発明者らは、最後に、いくつかの特定のオトフェリンコード二重ベクター構築物を試験し、ＤＦＮＢ９マウスモデルの成熟蝸牛中の増強されたトランスフェクション率ならびに非常に有効なインビトロおよびインビボでのオトフェリン発現を同定し、それらの聴力の回復をもたらした。
【背景技術】
【0002】
非症候性の重度の先天性難聴に関する症例の半数以上は遺伝的原因を有し、ほとんど（約８０％）が常染色体劣性（ＤＦＮＢ）型である（Ｄｕｍａｎ Ｄ．＆ Ｔｅｋｉｎ Ｍ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ（Ｌａｎｄｍａｒｋ Ｅｄ）１７：２２１３－２２３６（２０１２））。難聴の遺伝子診断は、蝸牛の遺伝子治療に不可欠な情報を提供し、過去数年間で遺伝子検査の正確性および利用しやすさの両方において、急速な進歩がなされている。症候性の難聴遺伝子における変異の特定は、患者に症状が出現する何年も前に行うことができ、疾患管理を計画する時間が与えられる。
【0003】
難聴遺伝子は、蝸牛が機能するのに不可欠な広範囲の分子機能（例えば、感覚器官の発達、有毛細胞の不動毛における音の伝達、蝸牛内電位（ＥＰ）および高濃度の細胞外カリウムの維持、有毛細胞と、らせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）との間のシナプス神経伝達）を有するタンパク質をコードする。難聴遺伝子から作られる主要なタンパク質は、イオンチャネルおよびトランスポーター、ギャップ結合およびタイトジャンクション、細胞骨格および分子モーターのタンパク質サブユニット並びに蝸牛の発達中に一過的に発現される転写因子を含む。変異が蝸牛の初期の発達に影響を及ぼし、有意な細胞変性を引き起こすか否かは、この治療分野において、重大な問題である「処置時間枠」を決定する際の主要な因子である。
【0004】
補綴の人工内耳が現在、リハビリテーションのために使用されているが（Ｋｒａｌ Ａ ＆ Ｏ’Ｄｏｎｏｇｈｕｅ ＧＭ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３（１５）：１４３８－１４５０（２０１０））、聴覚の回復は、特に、騒がしい環境での発話の知覚または音楽の知覚に関して、完全にはほど遠い。これは、チャネル間の電気的干渉により課される周波数分解能の固有の限界のためである。
【0005】
生物学的処置を開発する主な動機は、なんらかの補綴デバイスを移植することなく聴覚を回復し、人工内耳によって現在達成可能なものよりもはるかに優れた音分解能の質および単価を達成することである。特に、局所的アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介遺伝子治療による遺伝子治療が、ヒト型の難聴を処置するために既に提案されている（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．１１，Ａｒｔ．２２１，２０１８）。この手法は、パーキンソン病、視力障害および代謝障害を含むいくつかの遺伝性疾患に対して、種々の前臨床および臨床試験で現在試験されている。
【0006】
このような試験は、ヒトでは聴力損失に対してまだ実施されいないが、比較的隔離された流体充填区画は、播種のリスクの低い局所ウイルス適用のための機会を提供するので、ヒト内耳の解剖学はインビボ遺伝子治療の手法にとって理想的である。
【0007】
最近の１０年間では、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＣＡＧプロモーター）を有するＡＡＶ８血清型は特異的に蝸牛および前庭有毛細胞を標的にする（Ｅｍｐｔｏｚ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１７ Ｓｅｐ ５；１１４（３６）：９６９５－９７００）ことが示されている。このＡＡＶ構成を用いて、マウスＤＦＮＢ５９モデルの聴覚が回復し、アッシャー（Ｕｓｈｅｒ）１ＧおよびＩＩＩＡ症候群のマウスモデルの聴覚およびバランスの両方が改善した（Ｄｅｌｍａｇｈａｎｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｎｏｖ ５；１６３（４）：８９４－９０６；Ｅｍｐｔｏｚ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１７ Ｓｅｐ ５；１１４（３６）：９６９５－９７００；Ｄｕｌｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１８ Ａｕｇ １；１２８（８）：３３８２－３４０１）。 加えて、二重ＡＡＶ遺伝子治療が重度の難聴形態であるマウスＤＦＮＢ９モデルに対し、難聴表現型を逆転させるという最初の原理証明が得られ、ＤＦＮＢ９患者での将来の遺伝子治療試験に対する希望が高まった。注目すべきことには、二重ＡＡＶ治療は、これらの変異マウスが難聴になることを防止するのみならず、聴覚発生後に注入されたマウスで聴覚も回復した。これらの結果は、将来のＤＦＮＢ９の遺伝子治療試験に対する強い希望をもたらす（Ａｋｉｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１９ Ｍａｒ ５；１１６（１０）：４４９６－４５０１）。
【0008】
欠損細胞の特異的感染およびこれらの特定の細胞中での罹患タンパク質の高レベルの発現を確実にするために、増強された標的化特異性を含む最適化特性を有するベクターの開発は、今では、遺伝性内耳障害のための根治遺伝子治療の開発の不可欠なステップであるように見える。
【発明を実施するための形態】
【0009】
この文脈において、本発明者らは、ＤＦＮＢ９前臨床試験で使用できる新規治療的組換えベクターを設計した。これらのベクターは、それらが、必要に応じてその後にイントロン配列が続くＣＭＶプロモーターの制御下に置いた場合にヒトオトフェリンタンパク質のアイソフォーム５を発現し、内耳有毛細胞（ＩＨＣ）を特異的に標的にするＡＡＶ８カプシド中にパッケージ化されるという点で、先行技術のものとは異なる。それらの比較による結果は、適所に、適切なレベルで、適切な時点で、オトフェリンタンパク質のアイソフォーム５を効率的にコードする特定の構築物を特定し、最適な治療効果をもたらした。
【0010】
オトフェリンｃＤＮＡ配列（６ｋｂ）が、ＡＡＶ（５ｋｂ）のパッケージ化能力を越えることは周知である。したがって、以前のマウス試験で使用して成功した方法と同様にして、二重ＡＡＶベクター戦略を採用した（Ａｋｉｌ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１９ Ｍａｒ ５；１１６（１０）：４４９６－４５０１）。ヒトオトフェリンｃＤＮＡの予想される蝸牛アイソフォーム（アイソフォーム５および新規アイソフォーム）を、２つの発現カセットに分割し、両方をＡＡＶ８ベクターにより送達した。二重ＡＡＶ導入の有効性は、オトフェリンｃＤＮＡ内の分割部位により影響される可能性があるので、オトフェリン転写物をコードするエクソンの間のいくつかの切断部位を調べた。ヒトオトフェリンｃＤＮＡの対応する５’および３’部分を、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）を有するシャトルベクター中にクローニングし、ユビキタスＣＭＶプロモーターを５’ヒトオトフェリンｃＤＮＡの上流に挿入し、前記プロモーターの後に、必要に応じてイントロン配列が続いた。次に、ＨＥＫ２９３細胞を、担体としてリポソームを使用してトランスフェクトすることにより、異なる二重プラスミドをインビトロで試験し、免疫細胞化学およびウエスタンブロットを使用して、ＯＴＯＦ発現をトランスフェクションの４８時間後に評価した（図３、５、および７）。種々の二重ＡＡＶ ＯＴＯＦベクターの完全長タンパク質を産生する組換えの有効性をＲＴ－ＰＣＲによりさらに調査した（図７Ａ）。最良のトランスフェクション率および最も有効なインビトロタンパク質発現を示す二重ベクターを、完全長タンパク質を産生した組換え誘導領域の精度を確認することにより、さらに調べた。次に、二重発現カセットをＡＡＶ８カプシドにパッケージ化し、ＤＦＮＢ９マウスモデルの蝸牛にインビボで送達した。免疫共焦点顕微鏡を使用して、蝸牛ＡＡＶの送達後に、オトフェリンタンパク質が正しくＩＨＣに標的化されたかどうかを判定した。ＡＡＶ送達後の種々の段階での聴覚誘発脳幹応答記録によりマウスの聴覚回復を評価した。
【0011】
オトフェリンは、蝸牛の感覚性ＩＨＣにおいて、豊富に発現されている。また、中枢神経系のその他の細胞においても発現されている。オトフェリンは、蝸牛有毛細胞シナプスでの求心性らせん神経節ニューロンとのシナプス小胞融合の最終段階で重要な役割を果たす。より正確には、オトフェリンは、聴覚リボンシナプスにおけるエキソサイトーシスにとって重要である（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １２７（２）：２７７－８９， ２００６）。ヒトにおいて、オトフェリン遺伝子（「ＯＴＯＦ遺伝子」）に影響を与える変異は、出生後、言語の習得前に起こる重度の非症候性の両側性聴力損失をもたらす。それらのいくつかはまた、体温が大きく上昇したときに誘発される温度感受性の非症候性神経性聴覚障害ももたらす（例えば、発熱の場合、Ｍａｒｌｉｎ Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，３９４（２０１０）７３７－７４２；Ｖａｒｇａ Ｒ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ ２００６；４３：５７６－５８１；Ｚｈａｎｇ Ｑ．ｅｔ ａｌ，Ｈｅａｒｉｎｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ ３３５，Ｍａｙ ２０１６，Ｐａｇｅｓ ５３－６３；Ｓｔａｒｒ Ａ．ｅｔ ａｌ，Ｂｒａｉｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １１９，Ｉｓｓｕｅ ３，Ｊｕｎｅ １９９６，Ｐａｇｅｓ ７４１－７５３を参照）。
【0012】
これまで少なくとも７５個の変異が同定されており、そのうちの７個（Ｐ．Ｑ９９４ＶｆｓＸ６、Ｐ．Ｉ５１５Ｔ、ｐ．Ｇ５４１Ｓ、ＰＲ１６０７Ｗ、ｐ．Ｅ１８０４ｄｅｌ、ｃ．２９７５＿２９７８ｄｅｌＡＧ／ｃ．４８１９Ｃ＞Ｔ、ｃ．４８１９Ｃ＞Ｔ（ｃ．Ｒ１６０７Ｗ））は、Ｐａｎｇｒｓｉｃ Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２，ｃｏｌ．３５，Ｎｏ．１１で概説されているように、温度感受性であることが知られている。これらの難聴表現型（構成的および誘導型）は世界中で見出され、「Ｄｅａｆｎｅｓｓ，Ａｕｔｏｓｏｍａｌ Ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ９」または「ＤＦＮＢ９」難聴として知られている。ＤＦＮＢ９難聴は、常染色体劣性非症候性聴力損失の最大１０％を占めており、それにより、依然として治療介入が必要な遺伝性の聴覚障害の上位５位以内に存在する。
【0013】
重要なことに、本発明者らは、ＣＭＶプロモーターの転写制御下で、ヒトオトフェリンｃＤＮＡの５’部分を含有するＡＡＶ８ベクターが、標的細胞中で最適および効率的であることを示している。したがって、本発明者らは、同定されたプロモーターおよびＩＨＣに対するオトフェリン遺伝子の２つの半分の部分を含む二重ＡＡＶベクター系を構成し、そこで、トランススプライシングおよび／または相同組換えを生じさせ、タンパク質完全長の発現をもたらした。
【0014】
特に断らなければ、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の目的に関して、以下の用語を以下に定義する。
【0015】
定義
本明細書で使用される場合、「核酸」および「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配列」という用語は、一本鎖または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、特に限定されない限り、天然起源ヌクレオチドと類似の方法で機能することができる天然のヌクレオチドの既知のアナログを包含する。
本明細書で使用される場合、「核酸」および「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド配列」という用語は、一本鎖または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、特に限定されない限り、天然起源ヌクレオチドと類似の方法で機能することができる天然のヌクレオチドの既知のアナログを包含する。
【0016】
本明細書で使用される場合、「オトフェリン」という用語は、オトフェリンポリペプチドを意味する。本明細書では「ＯＴＯＦ」と略記する。このポリペプチドはまた、「ＡＵＮＢ１」、「ＤＦＮＢ６」、「ＤＦＮＢ９」、「ＮＳＲＤ９」および「ＦＥＲ１Ｌ２」としても知られている。
このポリペプチドは、シナプトタグミンとしてＣ２ドメイン、ＰＫＣおよびＰＬＣを有する、膜貫通タンパク質であるフェリンファミリーのメンバーである（Ｙａｓｕｎａｇａ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０００ Ｓｅｐ；６７（３）：５９１－６００）。この長い形態は、６つのＣ２ドメインを含有する。上記のように、ポリペプチドは、蝸牛有毛細胞と、求心性のらせん神経節ニューロンとの間のシナプス小胞融合に関与している（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １２７（２）：２７７－８９，２００６； Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｌｉｆｅ，２０１７ Ｎｏｖ ７；６ ｅ３１０１３）。
このポリペプチドは、シナプトタグミンとしてＣ２ドメイン、ＰＫＣおよびＰＬＣを有する、膜貫通タンパク質であるフェリンファミリーのメンバーである（Ｙａｓｕｎａｇａ Ｓ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０００ Ｓｅｐ；６７（３）：５９１－６００）。この長い形態は、６つのＣ２ドメインを含有する。上記のように、ポリペプチドは、蝸牛有毛細胞と、求心性のらせん神経節ニューロンとの間のシナプス小胞融合に関与している（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １２７（２）：２７７－８９，２００６； Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｌｉｆｅ，２０１７ Ｎｏｖ ７；６ ｅ３１０１３）。
【0017】
本明細書で使用される場合、「オトフェリンポリペプチド」という用語は、配列番号５（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿００１２７４４１８に対応する）の野性型ヒトオトフェリンポリペプチドのアイソフォーム５（バリアントｅ）および相同配列を示す。オトフェリンポリペプチドは、例えば、ｃＤＮＡ配列ＮＭ＿００１２８７４８９．１（配列番号９１、前記アイソフォームのコード配列は、ヌクレオチド１８６で始まる）および配列番号１５（前記アイソフォームのコード配列に対応する）によりコードされる。
【0018】
本明細書において、そのアミノ酸配列が配列番号５と少なくとも７０％の同一性および／または類似性を共有し、、配列番号５のオトフェリンポリペプチドの少なくとも１つの生物学的機能を保持するその相同なポリペプチドも包含される。例えば、この生物学的機能は、一次聴覚ニューロンを活性化する蝸牛内耳有毛細胞のリボンシナプスにおける小胞融合の調節に関連している（Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｌｉｆｅ，２０１７ Ｎｏｖ ７；６ ｅ３１０１３）。この調節は、古典的なエクスビボでの電気生理学的測定により評価することができる。前記相同配列は、配列番号５と、より好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の同一性および／または類似性を共有する。相同ポリペプチドが配列番号５よりもかなり短い場合、ローカルアラインメントを検討することができる。
【0019】
前記相同ポリペプチドは、例えば、配列番号１（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿９１９２２４．１に対応）に提示されるアミノ酸配列を有し得る。前記配列は、野生型ヒトオトフェリンポリペプチドのアイソフォームａ（バリアント１）を特徴付ける。このバリアントは、配列番号５と比較して、３’コード領域で交互するインフレームエクソンを有する。それは、配列番号５と比較して、別個のＣ末端をさらに含有する（しかし、そのＮ末端部分は同じである）。
【0020】
前記相同ポリペプチドはまた、短いアイソフォームｂおよびｃ（バリアント２および３）にそれぞれ対応する、配列番号２（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿００４７９３．２に対応）に示されるアミノ酸配列または配列番号３（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿９１９３０３．１に対応）に示されるアミノ酸配列を有し得る。より正確には、配列番号２は、アイソフォームｂ（バリアント２、「短縮型１」とも呼ばれる）を表し、配列番号１と比較すると、より短いＮ末端を有し、セグメントを１つ欠いている。一方、配列番号３は、アイソフォームｃ（バリアント３、「短縮型２」とも呼ばれる）を表し、配列番号１と比較すると、より短く、別個のＣ末端を有するため、バリアント１（配列番号１）と比較すると、５’ＵＴＲおよびコード配列が異なる。
【0021】
前記相同ポリペプチドは、アイソフォームｄ（バリアント４）に対応する配列番号４（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿９１９３０４．１に対応）に示されるアミノ酸配列も有し得る。このバリアントは、バリアント１と比較して、５’ＵＴＲおよびコード領域、ならびに３’コード領域が異なる。得られたアイソフォーム（ｄ）は、配列番号１のアイソフォームと比較して、より短いＮ末端および異なるＣ末端を有する。それは、配列番号１４（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＭ＿１９４３２３．３に対応）によりコードされる。
【0022】
ある実施形態では、本発明のベクター系は、配列番号５のオトフェリンポリペプチドの機能的フラグメントの発現を可能にし得る。本明細書における「機能的フラグメント」という用語は、ヒトオトフェリンポリペプチドの任意のフラグメントまたは上記で定義された相同配列を有するポリペプチドの任意のフラグメントを意味し、前記フラグメントは、本文脈におけるためのオトフェリンポリペプチドの少なくとも１つの生物学的機能を保持している。例えば、この生物学的機能は、一次聴覚ニューロンを活性化する蝸牛内耳有毛細胞のリボンシナプスにおける小胞融合の調節に関係している（Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｌｉｆｅ，２０１７ Ｎｏｖ ７；６ ｅ３１０１３）。この調節は、古典的なエクスビボでの電気生理学的測定により評価することができる。
【0023】
別の実施形態では、本発明のベクター系は、バリアント５の３つの特定の相同タンパク質の発現を可能にし得る（実施例２および関連図６を参照）。これらの３つの代替ＯＴＯＦアイソフォームは、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を有する。それらは、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８のｃＤＮＡ配列によりコードされ得る。したがって、本発明のベクター系では、これらの新規アイソフォームが、ヒトの聴覚を回復する潜在力を有すると考えられるため、それらのいずれかを使用することが好ましい。
【0024】
組換え後、これらの新規アイソフォームは、現在のヒトアイソフォーム５転写物に加えて、ヒトで聴覚を回復する潜在力を有する配列番号６、配列番号７および／または配列番号８のタンパク質をインサイチューでコードし得る。
【0025】
特定の実施形態では、したがって、本発明のベクター系は、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号８の発現、またはこれらの新規アイソフォームおよび／もしくは配列番号５の活性を保持する、それらの機能的相同ポリペプチドの発現を可能にする。これらの機能的ホモログは、そのアミノ酸配列が、配列番号６、配列番号７または配列番号８と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の同一性および／または類似性を共有するホモログである。相同ポリペプチドが、配列番号６、配列番号７または配列番号８よりもかなり短い場合、ローカルアラインメントを検討することができる。
【0026】
本発明は、上記で定義されるこれらの配列に「類似する」相同アミノ酸配列をコードする系を提供する。この場合、それらは、例えば、長いｃＤＮＡ配列ＮＭ＿１９４２４８．３（アイソフォームａまたはバリアント１、配列番号）、より短いｃＤＮＡ配列ＮＭ＿００４８０２．４（アイソフォームｂまたはバリアント２、配列番号１２）、ｃＤＮＡ配列ＮＭ＿１９４３２２．３（アイソフォームｃまたはバリアント３、配列番号１３）、またはｃＤＮＡ配列ＮＭ＿１９４３２３．３（アイソフォームｄまたはバリアント４、配列番号１４）であり得るコード配列を含有する。前記コード配列はまた、以下で説明するＯＴＯＦ遺伝子の新規アイソフォームのｃＤＮＡに対応する配列番号１６、１７または１８の配列を有し得る。
【0027】
好ましい実施形態では、前記コード配列は、転写物バリアント５（そのコード配列はヌクレオチド１８６で始まる）をコードする配列番号９１（ＮＭ＿００１２８７４８９．１）のヒトオトフェリン遺伝子由来である。コード配列は、より好ましくは、配列番号１５で開示されるとおりである。
したがって、本発明のベクター系では、コード配列は、好ましくは配列番号１５である。配列番号１５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する任意のその相同配列を使用することも可能である。
したがって、本発明のベクター系では、コード配列は、好ましくは配列番号１５である。配列番号１５と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する任意のその相同配列を使用することも可能である。
【0028】
本発明の文脈において、２つの相同配列間の同一性パーセンテージは、配列がほぼ同じサイズである場合、配列全体のグローバルアラインメントにより同定されることが好ましい。このアラインメントは、当業者に周知であるアルゴリズム、例えば、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）に開示されているアルゴリズムにより実行できる。したがって、２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の配列比較は、当業者に周知であるいずれかのソフトウェア、例えば、「ギャップオープン」パラメータ１０、「ギャップ伸長」パラメータ０．５および「Ｂｌｏｓｕｍ６２」行列を使用する「ｎｅｅｄｌｅ」ソフトウェアを用いることにより実施できる。
【0029】
配列のローカルアラインメントを検討すべきである場合（例えば、本発明の配列よりも小さいサイズを有する相同体の場合）、前記アラインメントは、従来のアルゴリズム、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．１９８１；１８（１）３８－４６）で開示されているアルゴリズムにより実施することができる。
【0030】
２つの標的化アミノ酸配列の「類似性」は、２つのアミノ酸配列の類似性スコアを計算することにより決定することができる。本明細書で使用される場合、「類似性スコア」は、２つの配列を最適に整列させた場合に、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換行列、ギャップ存在ペナルティ１１およびギャップ伸長ペナルティ１を使用して２つの配列に対して生成されたスコアを意味する。２つの配列は、その最大スコアを達成するには一方または両方の配列にギャップを導入する必要があり得る、その配列対で可能な最大スコアを生成するように整列させた場合に「最適に整列」する。その類似性スコアがある特定の閾値を超える場合、２つのアミノ酸配列は実質的に類似である。閾値は、特定の参照配列（例えば、配列番号１５）に関して、少なくとも１１９０から可能な最高スコアまでの範囲の任意の整数であってもよい。例えば、類似性スコアの閾値は、１１９０、１２００、１２１０、１２２０、１２３０、１２４０、１２５０、１２６０、１２７０、１２８０、１２９０、１３００、１３１０、１３２０、１３３０、１３４０、１３５０、１３６０、１３７０、１３８０、１３９０、１４００、１４１０、１４２０、１４３０、１４４０、１４５０、１４６０、１４７０、１４８０、１４９０、１５００またはそれ超であってもよい。本発明の特定の実施形態で、閾値スコアを、参照配列と比較して、例えば１３００に設定する場合、前記参照配列と最適に整列させて１３００より大きい類似性スコアを生成することができるいずれのアミノ酸配列も、前記参照配列に「類似」である。２つの配列間の類似性を定量化する際のアミノ酸置換行列およびそれらの使用は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８），“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，“Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，” Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３（ｅｄ．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ），ｐｐ．３４５－３５２．Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．ａｎｄ ｉｎ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９に記載されている。最適なアラインメントおよびスコアリングは手作業で実施可能であるが、このプロセスは、コンピュータ実装アラインメントアルゴリズム、例えば、ギャップＢＬＡＳＴ２．０（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載され、米国国立バイオテクノロジー情報センターのウェブサイトで一般に公開されている）の使用により容易となる。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを使用して正確な類似性スコアを生成するには、あらゆるフィルタリング、例えば、低複雑度のフィルタリング（ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）をオフにし、組成に基づく統計学（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）の使用を無効にすることが重要である。また、正しい置換行列およびギャップペナルティが使用されていることを確認すべきである。複数のアラインメントを含む最適アラインメントは、例えば、ＮＣＢＩのインターネットサイトを通じて入手可能であり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２により記載されているＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを使用して調製することができる。
【0031】
下記実施例１に示すように、マウスオトフェリン遺伝子の配列、特に、マウスオトフェリン遺伝子のアイソフォーム１（ＮＭ＿００１１００３９５．１）のＮ末端およびＣ末端部分をコードする配列番号７９および配列番号８０を使用することもまた可能である
【0032】
本発明のベクター系
第１の態様では、本発明は、少なくとも２つの異なるＡＡＶ粒子、即ち、
ａ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター配列、その後に続くオトフェリン遺伝子のＮ末端コードコード部分を含有する部分コード配列を、含む第１のポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子、ならびに
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列の間に５’から３’に向けて：オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列を、含む第２のポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子を含むベクター系であって、
第１および第２のポリヌクレオチドが、組換え誘導ポリヌクレオチド配列を含み、
第１および第２のポリヌクレオチド中のコード配列が、組み合わされると、上記で定義されるオトフェリンポリペプチドのアイソフォーム５、そのホモログまたは機能性フラグメントをコードする、
ベクター系に関する。
第１の態様では、本発明は、少なくとも２つの異なるＡＡＶ粒子、即ち、
ａ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター配列、その後に続くオトフェリン遺伝子のＮ末端コードコード部分を含有する部分コード配列を、含む第１のポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子、ならびに
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列の間に５’から３’に向けて：オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列を、含む第２のポリヌクレオチドを含む、少なくとも１つのＡＡＶ８粒子を含むベクター系であって、
第１および第２のポリヌクレオチドが、組換え誘導ポリヌクレオチド配列を含み、
第１および第２のポリヌクレオチド中のコード配列が、組み合わされると、上記で定義されるオトフェリンポリペプチドのアイソフォーム５、そのホモログまたは機能性フラグメントをコードする、
ベクター系に関する。
【0033】
本発明のベクター系は、ａ）で定義されるポリヌクレオチドを含有する少なくとも１つのＡＡＶ８粒子（即ち、オトフェリンのＮ末端コード部分をコードする）、およびｂ）で定義されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのＡＡＶ８粒子を含有する。言い換えれば、前記ベクター系は、前記第１および第２のポリヌクレオチドを含有し、それぞれのポリヌクレオチドは、好ましくは、個別のＡＡＶ８粒子中に含有される。２つの異なるタイプのＡＡＶ８粒子を、同じ組成物内または異なる組成物内に含有することができ、共にまたは個別に投与してもよい。
【0034】
本明細書では、「第１」および「第２」は、特定の順序または重要性を意味するものではないと理解される。しかしながら、必要なことは、本発明のベクター系は、２つの異なる組換えＡＡＶベクターを含有し、１つは、上記ポリヌクレオチドａ）を含み、残りの１つは、上記ポリヌクレオチドｂ）を含み、それにより、２つのポリヌクレオチドが、標的細胞中に同時に存在し、オトフェリンポリペプチドをインサイチューで生成することができることである。
【0035】
ＡＡＶは、パルボウイルス科の小さい複製欠損アデノウイルス依存性ウイルスである。それらは、直径２０～２５ｎｍの二十面体（icosaedrical）カプシドおよび２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）に挟まれた４．７ｋｂのゲノムを有する。宿主細胞内で脱殻後、組換えＡＡＶゲノムは、高分子量のヘッドトゥーテールの環状コンカテマーを形成することにより、安定したエピソーム状態で存続することができ、長期間の高レベルトランスジーン発現を提供する。本発明の文脈において、好ましいＡＡＶ血清型であるＡＡＶ８は、現在、インビボで試験されている。
【0036】
遺伝子発現の有効性を高め、ウイルスの意図しない拡散を防止するために、ＡＡＶ８の遺伝子改変を行うことができる。これらの遺伝子改変は、Ｅ１領域の欠失、Ｅ２またはＥ４領域のいずれかの欠失と共にＥ１領域の欠失、またはシス作用性の末端逆位配列およびパッケージングシグナルを除くアデノウイルスゲノム全体の欠失を含む。このような改変ベクターは、本発明に有利に包含される。
【0037】
さらに、遺伝子発現を特定の組織タイプ、例えば聴細胞に方向付けるために、変異カプシドタンパク質を有する遺伝子改変ＡＡＶ８を使用することも可能である。この目的では、ウイルスエンベロープ内のチロシン残基がアラニン残基で置換されたＡＡＶ８ベクターを使用することができる。例えば、チロシン７３３をアラニン残基で置換することができる（ＡＡＶ８－Ｙ７３３Ａ）。ＡＡＶ８－Ｙ７３３Ａを使用することにより、トランスフェクションを最大１０，０００倍に増加させ、蝸牛の感覚有毛細胞に感染させるために必要なＡＡＶの量を減少させることが可能である。ウイルスエンベロープ内のいずれかのチロシン残基がアラニン残基で置換されたＡＡＶ８ベクターを使用することも可能である。加えて、ＡＡＶ８血清型の有効性を、Ｍｉｃｈｅｌｆｅｌｄｅｒ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（８）：ｅ２３１０１に開示されるように、ペプチドリガンド挿入を用いてさらに改善することができる。
【0038】
異種ポリヌクレオチドまたは構築物を含むウイルスおよびビリオンを調製する方法は、当技術分野で公知である。ＡＡＶの場合には、ＡＡＶヘルパー機能に適したアデノウイルス遺伝子を含むアデノウイルスまたはポリヌクレオチド構築物を細胞に同時感染させるまたはトランスフェクトすることができる。材料および方法の例は、例えば、米国特許第８，１３７，９６２号および同第６，９６７，０１８号に記載されている。本明細書で提供される情報および共通の知識に基づいて、本発明のベクター系に不可欠なＡＡＶ粒子を生成することは当業者にとって定型業務である。
【0039】
本明細書で使用される場合、「本発明のプロモーター」という用語は、配列番号９、およびオトフェリンポリペプチドにおける配列番号９のプロモーター機能を保持するその相同配列を有するＣＭＶプロモーターを意味する。配列番号９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するいずれかの相同配列を使用することが実際に可能である。
【0040】
特に、ＣＭＶプロモーターの下流にイントロン配列を挿入し、ｍＲＮＡを安定化し、細胞質輸出を改善し、したがって、前記ＣＭＶプロモーターの効率を増強することが可能である。この追加の配列は、例えば、配列番号１０の配列であってもよく、前記配列は、ヒトβグロビン由来のイントロンと、免疫グロブリン重鎖との間のキメラを表す。
【0041】
このプロモーター（必要に応じ、イントロン配列が後に続く）は、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して本発明のベクターに組み込むことができる。プロモーターは、オトフェリン遺伝子の最初のエクソンの上流に位置する必要がある。一実施形態では、プロモーター（および、必要に応じ、イントロン配列）は、その天然の遺伝的環境における転写開始部位からの距離とほぼ同じ転写開始部位からの距離に配置される。しかし、この距離の変動は、プロモーター活性を実質的に低下させることなく許容される。転写開始部位は通常、ベクター中に含まれる。
【0042】
本発明のベクター系に含まれるポリヌクレオチドは、組換えられた場合、上記で定義される配列番号のオトフェリンポリペプチドのアイソフォーム５（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＮＰ＿００１２７４４１８に対応する）またはその機能性フラグメントおよび相同配列をコードするオトフェリン遺伝子のＮ末端またはＣ末端コード部分を含有する。
【0043】
好ましい一実施形態では、本発明のベクター系に含まれるポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ配列ＮＭ＿００１２８７４８９．１（アイソフォーム５またはバリアントｅ、配列番号９１）の一部、より好ましくは、配列番号１５上にその配列が提示されるそのコード部分を含む。
【0044】
別の好ましい実施形態では、本発明のベクター系に含まれるポリヌクレオチドは、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８のｃＤＮＡ配列の一部を含有し、それぞれ、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアイソフォーム５の３つの特定の相同タンパク質の発現を可能にする（実施例２および関連図６を参照）。
【0045】
切断部位
二重ベクター手法は、限られたパッケージ化容量を有するビリオンにより簡単にパッケージ化するために、長いコード配列を２つの部分に分割するために有利である。ＡＡＶカプシドを本明細書で使用する場合、５キロベース以下、好ましくは４．７キロベース以下を含有するＯＴＯＦコード配列を含有するポリヌクレオチドを使用することが好ましい。
二重ベクター手法は、限られたパッケージ化容量を有するビリオンにより簡単にパッケージ化するために、長いコード配列を２つの部分に分割するために有利である。ＡＡＶカプシドを本明細書で使用する場合、５キロベース以下、好ましくは４．７キロベース以下を含有するＯＴＯＦコード配列を含有するポリヌクレオチドを使用することが好ましい。
【0046】
本発明のベクター系は、したがって、上記のオトフェリンポリペプチドをコードするオトフェリン遺伝子のコード配列部分をそれぞれ含む２つの異なるポリヌクレオチドを含有しなければならない。前記コード配列は、例えば、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７もしくは配列番号１８に示される配列、または配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７もしくは配列番号１８と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有するそのいずれかの相同配列である。
【0047】
本明細書で記載のポリヌクレオチドに含有される部分コード配列は、ポリヌクレオチドの送達時に、部分コード配列が、例えば、相同組換えにより、共に結合され、上記で定義されるオトフェリンポリペプチドをコードする完全なコード配列（「オトフェリン遺伝子」とも呼ばれる）を形成するように設計される。
【0048】
好ましい実施形態では、前記コード配列（または「オトフェリン遺伝子」）は、配列番号９１のヌクレオチド１８６～６１７９で示される配列を有するか、またはコード配列は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７もしくは配列番号１８に示される配列、または上記で定義されるその相同配列を有する。
【0049】
ヒトＯＴＯＦ遺伝子のコード配列は、好ましくは、天然のスプライシング部位で切断される。
例えば、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン１８と１９の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～２２１４を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド２２１５～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
あるいは、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン２０と２１の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～２４０６を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド２４０７～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
あるいは、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン２１と２２の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～２５２３を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド２５２４～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
あるいは、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン２２と２３の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～２６７６を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド２６７７～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
同様に、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン２４と２５の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～２９９１を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド２９９２～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
最後に、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン２５と２６の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～３１２６を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド３１２７～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
同じ切断部位を用いて、配列番号１６～１８の新規アイソフォームを２つの部分に分割し、それにより、ＡＡＶ８カプシド中への容易なカプセル化を可能にし、容易なインサイチュー組換えに有利となる。
例えば、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン１８と１９の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～２２１４を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド２２１５～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
あるいは、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン２０と２１の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～２４０６を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド２４０７～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
あるいは、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン２１と２２の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～２５２３を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド２５２４～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
あるいは、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン２２と２３の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～２６７６を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド２６７７～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
同様に、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン２４と２５の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～２９９１を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド２９９２～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
最後に、配列番号１５のヒトＯＴＯＦ遺伝子アイソフォーム５は、エクソン２５と２６の間で、配列番号１５のヌクレオチド１～３１２６を有するＮ末端コード部分と、配列番号１５のヌクレオチド３１２７～５９９１を有するＣ末端コード部分とに分割され得る。
同じ切断部位を用いて、配列番号１６～１８の新規アイソフォームを２つの部分に分割し、それにより、ＡＡＶ８カプシド中への容易なカプセル化を可能にし、容易なインサイチュー組換えに有利となる。
【0050】
本発明のベクター系では、２つのポリヌクレオチドの１つに含有されるオトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分は、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２４０６、ヌクレオチド１～２５２３、ヌクレオチド１～２６７６、ヌクレオチド１～２９９１またはヌクレオチド１～３１２６にあるのが好ましい。および、他のポリヌクレオチドに含有されるオトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分は、したがって、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２４０７～５９９１、ヌクレオチド２５２４～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、ヌクレオチド２９９２～５９９１またはヌクレオチド３１２７～５９９１にあるのが好ましい。
【0051】
本発明のベクター系で第１および第２のポリヌクレオチドとして使用することができる例示的ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号４７＆４８または４７＆４９、５０＆５１または５０＆５２、５３＆５４または５３＆５５、５６＆５７または５６＆５８、５９＆６０または５９＆６１、および６２＆６３または６２＆６４であり、前記対の各配列番号は、配列番号９のＣＭＶプロモーターを含有し、および配列は、それぞれ、ハイブリッドＡＰベクターにおいて、前述のオトフェリンヒトタンパク質のアイソフォーム５のＮ末端＆Ｃ末端部分をコードする。配列番号４８、５１、５４、５７、６０および６３は、配列番号２３のＷＰＲＥ配列を含有するが、配列番号４９、５２、５５、５８、６１および６４は、これを含有しない。
【0052】
配列番号９のＣＭＶプロモーター、配列番号１０のイントロン配列、およびそれぞれ、配列番号１５のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２４０６、ヌクレオチド１～２５２３、ヌクレオチド１～２６７６、ヌクレオチド１～２９９１またはヌクレオチド１～３１２６を含有し、それにより、ヒトオトフェリン（配列番号１５）のアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号７０～７５のヌクレオチドも本発明のベクター系の第１のポリヌクレオチドとして同様に使用可能である。
【0053】
その配列が、配列番号９のＣＭＶプロモーター、配列番号１０のイントロン配列、およびオトフェリンヒトタンパク質のアイソフォーム５のＮ末端部分、より正確には、配列番号１５のヌクレオチド１～２６７６を含有する配列番号７３であるポリヌクレオチドも、本発明のベクター系の第１のポリヌクレオチドとして同様に使用可能である。
【0054】
配列番号９のＣＭＶプロモーター、配列番号１０のイントロン配列、およびオトフェリンヒトタンパク質のアイソフォーム５のＮ末端部分、より正確には、配列番号１５のヌクレオチド１～２６７６を含有する、配列番号９０のＡＡＶカセットを含有するポリヌクレオチドも、本発明のベクター系の第１のポリヌクレオチドとして同様に使用可能である。
【0055】
本発明のハイブリッドＡＰベクター系において第１および第２のポリヌクレオチドとして使用することができる他の例示的ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号７９＆８０、ハイブリッドＡＰベクターにおいて、配列番号９のＣＭＶプロモーター、およびオトフェリンマウスタンパク質のアイソフォーム１のＮ末端部分をコードする配列を含有する配列番号７９である。配列番号８０は、ＷＰＲＥ配列を含まない、オトフェリンマウスタンパク質のアイソフォーム１のＣ末端部分をコードする配列を含む。
【0056】
本発明のベクターの他の成分
国際公開第２０１３／０７５００８号で説明されるように、この特定の実施形態で使用される第１および第２のポリヌクレオチドは、標的細胞中のオトフェリンタンパク質の適切な組換えおよび発現を誘導するために特定の遺伝的成分（末端逆位配列、ポリアデニル化配列、組換え誘導領域、など）を含有すべきである。
国際公開第２０１３／０７５００８号で説明されるように、この特定の実施形態で使用される第１および第２のポリヌクレオチドは、標的細胞中のオトフェリンタンパク質の適切な組換えおよび発現を誘導するために特定の遺伝的成分（末端逆位配列、ポリアデニル化配列、組換え誘導領域、など）を含有すべきである。
【0057】
より具体的には、これらの遺伝的成分は以下の通りである：
・ＩＴＲ
本発明のベクター系は、野性型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列を含有することができる。当業者は、どのＩＴＲが二重手法ＡＡＶ系において有利に使用することができるかをよく知っている。
ＡＡＶ８ベクターを使用する場合、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）に由来してもよく、または２種以上の血清型に由来してもよい。本明細書で提供されるポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ８に由来する。ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含有するプラスミドは当技術分野で公知であり、市販されている。
発現構築物の５’末端に隣接する例示的なＡＡＶ８のＩＴＲ配列は、配列番号１９の配列を含む。発現構築物の３’末端に隣接する例示的なＡＡＶ８のＩＴＲ配列は、配列番号２０の配列を含む。
配列番号１９および／または配列番号２０と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するいずれの相同配列の使用も可能である。
・組換え誘導領域
本発明の２つのポリヌクレオチド（第１および第２のポリヌクレオチド）はまた、細胞に送達後、２つのポリヌクレオチド間の相同組換えを含む組換えを促進して組換え誘導領域、トランスフェクトされた内耳有毛細胞においてＯＴＯＦポリペプチドの全コード配列およびその発現を生じることができる、いわゆる「組換え誘導領域」も含み（例えば、Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｊａｎ；２２（ｌ）：７７－８３を参照）。
この組換え誘導領域は、典型的には、第２のポリヌクレオチド中に相同領域を有する第１のポリヌクレオチドの第１の領域中にあるか、またはその逆であり得る。２つの領域は、好ましくは、上記で定義したように、互いに少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する配列同一性の閾値レベルを有する。
この組換え誘導領域は、好ましくは、５０～５００、５０～４００、５０～３００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、２００～５００、２００～４００または２００～３００ヌクレオチドで構成されるサイズを有する。
好ましい実施形態では、２つの領域は同一であり、２００～３００ヌクレオチドで構成されるサイズを有する。
これらの組換え誘導配列はまた、標準的なストリンジェントな条件下および標準的な方法下で互いのハイブリダイゼーションを可能にするように十分に相同である配列も有し得る。
・ＩＴＲ
本発明のベクター系は、野性型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列を含有することができる。当業者は、どのＩＴＲが二重手法ＡＡＶ系において有利に使用することができるかをよく知っている。
ＡＡＶ８ベクターを使用する場合、本明細書に記載されるポリヌクレオチドのＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０）に由来してもよく、または２種以上の血清型に由来してもよい。本明細書で提供されるポリヌクレオチドのいくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ８に由来する。ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含有するプラスミドは当技術分野で公知であり、市販されている。
発現構築物の５’末端に隣接する例示的なＡＡＶ８のＩＴＲ配列は、配列番号１９の配列を含む。発現構築物の３’末端に隣接する例示的なＡＡＶ８のＩＴＲ配列は、配列番号２０の配列を含む。
配列番号１９および／または配列番号２０と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するいずれの相同配列の使用も可能である。
・組換え誘導領域
本発明の２つのポリヌクレオチド（第１および第２のポリヌクレオチド）はまた、細胞に送達後、２つのポリヌクレオチド間の相同組換えを含む組換えを促進して組換え誘導領域、トランスフェクトされた内耳有毛細胞においてＯＴＯＦポリペプチドの全コード配列およびその発現を生じることができる、いわゆる「組換え誘導領域」も含み（例えば、Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ Ｊａｎ；２２（ｌ）：７７－８３を参照）。
この組換え誘導領域は、典型的には、第２のポリヌクレオチド中に相同領域を有する第１のポリヌクレオチドの第１の領域中にあるか、またはその逆であり得る。２つの領域は、好ましくは、上記で定義したように、互いに少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の同一性を有する配列同一性の閾値レベルを有する。
この組換え誘導領域は、好ましくは、５０～５００、５０～４００、５０～３００、１００～５００、１００～４００、１００～３００、２００～５００、２００～４００または２００～３００ヌクレオチドで構成されるサイズを有する。
好ましい実施形態では、２つの領域は同一であり、２００～３００ヌクレオチドで構成されるサイズを有する。
これらの組換え誘導配列はまた、標準的なストリンジェントな条件下および標準的な方法下で互いのハイブリダイゼーションを可能にするように十分に相同である配列も有し得る。
【0058】
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな」条件は、ハイブリダイゼーションが、通常、６ｘＳＳＰＥ、５ｘデンハルト溶液、０．１％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ変性ＤＮＡ中のＤＮＡハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より２０～２５℃低い温度で一晩行われる条件を意味する。融解温度は以下の式：Ｔｍ＝８１．５Ｃ＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）－０．６１（％ホルムアミド）－６００／塩基対中の二重鎖の長さ、により記述される。洗浄は通常、以下のように行われる：（１）１ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間を２回（低ストリンジェンシー洗浄）。（２）０．２ｘＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、Ｔｍ－２０℃で１５分間を１回（中程度のストリンジェンシー洗浄）。
【0059】
好ましい実施形態では、本発明のベクター系の２つのポリヌクレオチド中に存在する組換え誘導配列、特に、オーバーラップ組換え誘導配列は、外来性のフラグメントまたはオトフェリンのフラグメントである。前記組換え誘導配列は、コードもしくは非コード外来性遺伝子のフラグメント、またはポリヌクレオチド中に存在するＩＴＲであり得る。特に、それは、配列番号６９の配列（アルカリフォスファターゼＡＰの遺伝子由来）、または、好ましくは配列番号６９と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有するその相同配列であり得る。
【0060】
ＯＴＯＦフラグメントの輸送戦略
本明細書において、発明者らは、オトフェリンポリヌクレオチドの２つの部分を輸送し、それを標的細胞中で適切に組換えさせるためのいくつかの戦略を提唱する。
・「トランススプライシング戦略」、この場合、スプライスドナー（ＳＤ）シグナルを５’ハーフベクターの３’末端に配置し、スプライスアクセプター（ＳＡ）シグナルを３’ハーフベクターの５’末端に配置する。二重ＡＡＶベクターによる同じ細胞の共感染時に、２つの半分の末端逆位配列（ＩＴＲ）媒介ヘッドトゥーテールコンカテマー化が２つのポリヌクレオチドのトランススプライシングを誘導し、目的の成熟ｍＲＮＡおよび完全サイズタンパク質の産生をもたらす（Ｄｕａｎ Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１，ｖｏｌ．４，Ｎ°４，ｐｐ．３８３－３９１）。
・「オーバーラップ戦略」、この場合、組換え誘導配列は、オトフェリンｃＤＮＡそれ自体の一部である。実際に、この場合、二重ＡＡＶベクターに含有される大きいトランスジーン発現カセットの２つの半分は、相同組換えにより単一の大きな遺伝子の再構成を媒介する相同オーバーラップ配列（５’ハーフベクターの３’末端および３’ハーフベクターの５’末端に、図４の最下段参照）を含む（国際公開第２０１３／０７５００８号参照）。この場合、スプライス部位は必要ない（それでも、組換えプロセスを促進するためにそれらを使用することは可能である）。
・「ハイブリッド戦略」、この場合、場合によっては、外来性の遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ、ＡＰ）から、本開示のトランススプライシングベクターに高度組換え誘導配列が追加される。この第２の組換え誘導配列は、例えば、二重ＡＡＶ間の組換えを増大させるために、５’ハーフベクター中のＳＤシグナルの下流に、および３’ハーフベクター中のＳＡシグナルの上流に配置される（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１．２２：７７－８３参照）。
この後者の戦略では、２つの外来性の組換え誘導配列は、好ましくは、同一であり、より好ましくは、配列番号６９の配列（アルカリフォスファターゼＡＰの遺伝子由来）、または上記で定義されるその相同配列を有する。
トランススプライシングおよびハイブリッド戦略では、本発明の二重ベクター系に含まれるポリヌクレオチドは、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位を含み、それにより、インビボで組み換えられると、外来性の組換え誘導領域を切り出すことができる。好ましい実施形態において、スプライスドナー部位および／またはスプライスアクセプター部位は、スプライスコンセンサス配列を含有する。より好ましい実施形態では、本発明のベクター系に含まれるポリヌクレオチドにより保持されるスプライスドナー部位および／またはスプライスアクセプター部位は、アルカリフォスファターゼ酵素に由来するスプライスコンセンサス配列を含有する（配列番号２１および配列番号２２参照）。
本明細書において、発明者らは、オトフェリンポリヌクレオチドの２つの部分を輸送し、それを標的細胞中で適切に組換えさせるためのいくつかの戦略を提唱する。
・「トランススプライシング戦略」、この場合、スプライスドナー（ＳＤ）シグナルを５’ハーフベクターの３’末端に配置し、スプライスアクセプター（ＳＡ）シグナルを３’ハーフベクターの５’末端に配置する。二重ＡＡＶベクターによる同じ細胞の共感染時に、２つの半分の末端逆位配列（ＩＴＲ）媒介ヘッドトゥーテールコンカテマー化が２つのポリヌクレオチドのトランススプライシングを誘導し、目的の成熟ｍＲＮＡおよび完全サイズタンパク質の産生をもたらす（Ｄｕａｎ Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１，ｖｏｌ．４，Ｎ°４，ｐｐ．３８３－３９１）。
・「オーバーラップ戦略」、この場合、組換え誘導配列は、オトフェリンｃＤＮＡそれ自体の一部である。実際に、この場合、二重ＡＡＶベクターに含有される大きいトランスジーン発現カセットの２つの半分は、相同組換えにより単一の大きな遺伝子の再構成を媒介する相同オーバーラップ配列（５’ハーフベクターの３’末端および３’ハーフベクターの５’末端に、図４の最下段参照）を含む（国際公開第２０１３／０７５００８号参照）。この場合、スプライス部位は必要ない（それでも、組換えプロセスを促進するためにそれらを使用することは可能である）。
・「ハイブリッド戦略」、この場合、場合によっては、外来性の遺伝子（例えば、アルカリフォスファターゼ、ＡＰ）から、本開示のトランススプライシングベクターに高度組換え誘導配列が追加される。この第２の組換え誘導配列は、例えば、二重ＡＡＶ間の組換えを増大させるために、５’ハーフベクター中のＳＤシグナルの下流に、および３’ハーフベクター中のＳＡシグナルの上流に配置される（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１．２２：７７－８３参照）。
この後者の戦略では、２つの外来性の組換え誘導配列は、好ましくは、同一であり、より好ましくは、配列番号６９の配列（アルカリフォスファターゼＡＰの遺伝子由来）、または上記で定義されるその相同配列を有する。
トランススプライシングおよびハイブリッド戦略では、本発明の二重ベクター系に含まれるポリヌクレオチドは、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位を含み、それにより、インビボで組み換えられると、外来性の組換え誘導領域を切り出すことができる。好ましい実施形態において、スプライスドナー部位および／またはスプライスアクセプター部位は、スプライスコンセンサス配列を含有する。より好ましい実施形態では、本発明のベクター系に含まれるポリヌクレオチドにより保持されるスプライスドナー部位および／またはスプライスアクセプター部位は、アルカリフォスファターゼ酵素に由来するスプライスコンセンサス配列を含有する（配列番号２１および配列番号２２参照）。
【0061】
好ましい実施形態では、本発明の二重ベクター系に含まれるポリヌクレオチドは、それぞれスプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位として配列番号２１および／もしくは配列番号２２を含むか、または、配列番号２１および／もしくは配列番号２２と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の配列同一性を有する配列を含むスプライス部位を含む。
【0062】
本発明のポリヌクレオチドは、いくつかの組換え誘導配列、即ち、例えば、スプライスドナー／アクセプター部位、および外来性の組換え誘導配列を含有してもよい。望ましくないヌクレオチドが残留することなくインビボで正確で精密な組換え保証するために、２つの組換え誘導領域の存在は、実際に好ましい。適切ないずれかの組み合わせまたは上記で開示のものとは他の組換え誘導配列の使用は、それが内耳有毛細胞などの標的細胞中の効率的組換えを可能にすると直ちに、考慮され得る。
【0063】
本発明のベクター系に存在するポリヌクレオチド配列は、ベクターが発現され得る内耳有毛細胞中で機能的である他の調節成分を含有してもよい。当業者は、ヒト内耳有毛細胞で使用するために調節エレメントを選択することができる。調節エレメントは、例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写終結配列、翻訳終結配列、エンハンサーおよびポリアデニル化エレメントを含む。
【0064】
本発明のベクター系に存在するポリヌクレオチド配列は、例えば、ｍＲＮＡを安定化し、タンパク質収率を増強することができるＷＨＶ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含有してもよい。前記ＷＰＲＥ配列は、配列番号２３の配列であり得る。それはまた、コザックコンセンサス配列、例えば、本明細書で提案された例示的配列（配列番号４７、５０、５３、５６、５９、６２、配列番号７０～７５、配列番号８１、８２、８５および配列番号８６）において開示されるように、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号８９）の配列を含有してもよい。あるいは、５’－（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧ－３’配列（配列番号９２）を使用することも可能であり、ここで、大文字は、高度に保存された塩基を示し、Ｒはプリン（アデニンまたは文字）がこの位置に常に観察されることを示し（アデニンは、コザックによってより高頻度である）、および小文字は、塩基がそれでもなお変動し得る位置で最も一般的な塩基を示す。括弧（ｇｃｃ）の配列は、臨床的意義不明の配列であることに留意されたい。
【0065】
オトフェリン遺伝子のＣ末端配列を含有するポリヌクレオチドは、好ましくは、構造遺伝子によりコードされるｍＲＮＡのポリアデニル化を方向付けるＤＮＡ配列を含有する。このポリアデニル化ＤＮＡ配列を、本発明のベクターに含めることもできる。例えば、ウシ成長ホルモン（配列番号２４）のポリＡをこの観点で使用することができる。
【0066】
転写終止領域は通常、真核生物またはウイルス遺伝子配列の３’非翻訳領域から得ることができる。転写終結配列は、コード配列の下流に配置されて、効率的な終結を提供することができる。シグナルペプチド配列は、作動可能に連結されたポリペプチドを、特定のオルガネラ区画からタンパク質の作用部位および細胞外環境に至るまで、広範囲の翻訳後の細胞目的地に再配置するのに関与する情報をコードするアミノ末端配列である。エンハンサーは、遺伝子の転写を増加させるシス作用性エレメントであり、本発明のベクターに含めることができる。エンハンサーエレメントは当技術分野で公知であり、ＣａＭＶ３５Ｓエンハンサーエレメント、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターエンハンサーエレメントおよびＳＶ４０エンハンサーエレメントを含むが、これらに限定されない。
【0067】
特定のベクター系
本発明の特定のベクター系を、以降でより詳細に説明する。
本発明の好ましい実施形態では、本発明のベクター系は、少なくとも２つの異なる組換えＡＡＶ８粒子：即ち：
ａ）ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、必要に応じてその後に続く配列番号８９または９２のコザック配列、次に続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列、および組換え誘導配列としてのスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：組換え誘導配列としてのスプライスアクセプター部位、オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含むトランススプライシングベクター系である。
好ましくは、配列番号９であるＣＭＶプロモーターは、必要に応じてその後に配列番号１０のイントロン配列および／または配列番号８９もしくは９２のコザック配列が続く。この場合、オトフェリンをコードする部分コード配列は、この追加のイントロン配列の下流に位置する。
２つの異なるタイプのＡＡＶ８粒子を、同じ組成物内または異なる組成物内に含有することができ、共にまたは個別に投与してもよい。
本発明の特定のベクター系を、以降でより詳細に説明する。
本発明の好ましい実施形態では、本発明のベクター系は、少なくとも２つの異なる組換えＡＡＶ８粒子：即ち：
ａ）ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、必要に応じてその後に続く配列番号８９または９２のコザック配列、次に続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列、および組換え誘導配列としてのスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：組換え誘導配列としてのスプライスアクセプター部位、オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含むトランススプライシングベクター系である。
好ましくは、配列番号９であるＣＭＶプロモーターは、必要に応じてその後に配列番号１０のイントロン配列および／または配列番号８９もしくは９２のコザック配列が続く。この場合、オトフェリンをコードする部分コード配列は、この追加のイントロン配列の下流に位置する。
２つの異なるタイプのＡＡＶ８粒子を、同じ組成物内または異なる組成物内に含有することができ、共にまたは個別に投与してもよい。
【0068】
このベクター系を、上記のトランススプライシング戦略で使用することができる。同封のリストは、それに従って使用することができる好ましいベクター（配列番号８５～配列番号８８）を提供する。配列番号８５および配列番号８６は、それぞれＣＭＶプロモーターまたはＣＭＶとその後に続くイントロン配列の制御下でオトフェリンヒトアイソフォーム５のＮ末端部分（アミノ酸８９２まで）をコードし、一方、配列番号８７および配列番号８８は、それぞれ、ＷＰＲＥ配列を含む、または含まない、オトフェリンヒトアイソフォーム５のＣ末端部分（アミノ酸８９３を基点として）をコードする。
【0069】
別の実施形態では、本発明のベクター系は、少なくとも２つの異なるＡＡＶ８粒子、即ち：
ａ）ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に：ＣＭＶプロモーター、必要に応じてその後に続く配列番号８９または９２のコザック配列、次に続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含むオーバーラップベクター系であって、
オトフェリン遺伝子の前記ＮおよびＣ末端コード部分が、組換え誘導配列として作用し得る相同部分を含有する、オーバーラップベクター系である。
ａ）ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に：ＣＭＶプロモーター、必要に応じてその後に続く配列番号８９または９２のコザック配列、次に続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含むオーバーラップベクター系であって、
オトフェリン遺伝子の前記ＮおよびＣ末端コード部分が、組換え誘導配列として作用し得る相同部分を含有する、オーバーラップベクター系である。
【0070】
好ましくは、配列番号９であるＣＭＶプロモーターは、必要に応じてその後に配列番号１０のイントロン配列および／または配列番号８９もしくは９２のコザック配列が続く。この場合、オトフェリンをコードする部分コード配列は、この追加のイントロン配列の下流に位置する。
【0071】
２つの異なるタイプのＡＡＶ８粒子を、同じ組成物内または異なる組成物内に含有することができ、共にまたは個別に投与してもよい。
そのようなベクター系を、上記のオーバーラップ戦略で使用することができる。同封のリストは、好ましいオーバーラップベクター（配列番号８１～配列番号８４）を提供する。配列番号８１および配列番号８２は、それぞれＣＭＶプロモーターまたはＣＭＶとその後に続くイントロンの制御下でオトフェリンヒトアイソフォーム５のＮ末端部分（アミノ酸８９２まで）をコードし、一方、配列番号８３および配列番号８４は、それぞれ、ＷＰＲＥ配列を含む、またはそれを含まない、オトフェリンヒトアイソフォーム５のＣ末端部分（アミノ酸８９３に関して）をコードする。
そのようなベクター系を、上記のオーバーラップ戦略で使用することができる。同封のリストは、好ましいオーバーラップベクター（配列番号８１～配列番号８４）を提供する。配列番号８１および配列番号８２は、それぞれＣＭＶプロモーターまたはＣＭＶとその後に続くイントロンの制御下でオトフェリンヒトアイソフォーム５のＮ末端部分（アミノ酸８９２まで）をコードし、一方、配列番号８３および配列番号８４は、それぞれ、ＷＰＲＥ配列を含む、またはそれを含まない、オトフェリンヒトアイソフォーム５のＣ末端部分（アミノ酸８９３に関して）をコードする。
【0072】
別の好ましい実施形態では、本発明のベクター系は、少なくとも２つの異なる組換えＡＡＶ８粒子、即ち：
ａ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、その後に続くオトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列、およびスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、ならびに
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含む、ハイブリッドベクター系であって、
前記第１および第２のポリヌクレオチドが、それぞれ、前記第１のポリヌクレオチド中の前記スプライスドナー部位の後かつ前記第２のポリヌクレオチド中のスプライスアクセプター部位の前に位置する第２の組換え誘導配列も含有する、
ハイブリッドベクター系である。
ａ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、その後に続くオトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列、およびスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、ならびに
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含む、ハイブリッドベクター系であって、
前記第１および第２のポリヌクレオチドが、それぞれ、前記第１のポリヌクレオチド中の前記スプライスドナー部位の後かつ前記第２のポリヌクレオチド中のスプライスアクセプター部位の前に位置する第２の組換え誘導配列も含有する、
ハイブリッドベクター系である。
【0073】
好ましくは、配列番号９であるＣＭＶプロモーターは、必要に応じてその後に配列番号１０のイントロン配列および／または配列番号８９もしくは９２のコザック配列が続く。この場合、オトフェリンをコードする部分コード配列は、この追加のイントロン配列の下流に位置する。
２つの異なるタイプのＡＡＶ８粒子を、同じ組成物内または異なる組成物内に含有することができ、共にまたは個別に投与してもよい。
そのようなベクター系を、上記のハイブリッド戦略で使用することができる。同封のリストは、この観点で使用することができるエクソン１８～１９、２０～２１、２１～２２、２２～２３、２４～２５および２６～２７間の切断部位にそれぞれ対応するいくつかの例示的ベクター（配列番号４７＆４８または４７＆４９、５０＆５１または５０＆５２、５３＆５４または５３＆５５、５６＆５７または５６＆５８、５９＆６０または５９＆６１、および６２＆６３または６２＆６４）（ＷＰＲＥ配列を含有するまたは含有しないＣ末端ベクター）を提供する。配列番号９７のＣ末端ベクターを、有利に使用することができる。また、ＣＭＶプロモーターの後にイントロン配列が続く、配列番号７０～７５および９０のＮ末端ベクターも、有利に使用することができる。
いずれかのこれらのベクター系では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５のオトフェリン遺伝子の、ヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２４０６、ヌクレオチド１～２５２３、ヌクレオチド１～２６７６、ヌクレオチド１～２９９１、またはヌクレオチド１～３１２６を含有し得る。および、したがって、第２のポリヌクレオチドは、配列番号１５のオトフェリン遺伝子の、ヌクレオチド２２１５～５９９１、２４０７～５９９１、ヌクレオチド２５２４～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、ヌクレオチド２９９２～５９９１、またはヌクレオチド３１２７～５９９１を含有し得る。
検討される遺伝子における天然のエクソン接合部に対応する任意の同等の切断部位によりオトフェリン遺伝子を２つの部分に分割することも可能である。
２つの異なるタイプのＡＡＶ８粒子を、同じ組成物内または異なる組成物内に含有することができ、共にまたは個別に投与してもよい。
そのようなベクター系を、上記のハイブリッド戦略で使用することができる。同封のリストは、この観点で使用することができるエクソン１８～１９、２０～２１、２１～２２、２２～２３、２４～２５および２６～２７間の切断部位にそれぞれ対応するいくつかの例示的ベクター（配列番号４７＆４８または４７＆４９、５０＆５１または５０＆５２、５３＆５４または５３＆５５、５６＆５７または５６＆５８、５９＆６０または５９＆６１、および６２＆６３または６２＆６４）（ＷＰＲＥ配列を含有するまたは含有しないＣ末端ベクター）を提供する。配列番号９７のＣ末端ベクターを、有利に使用することができる。また、ＣＭＶプロモーターの後にイントロン配列が続く、配列番号７０～７５および９０のＮ末端ベクターも、有利に使用することができる。
いずれかのこれらのベクター系では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１５のオトフェリン遺伝子の、ヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２４０６、ヌクレオチド１～２５２３、ヌクレオチド１～２６７６、ヌクレオチド１～２９９１、またはヌクレオチド１～３１２６を含有し得る。および、したがって、第２のポリヌクレオチドは、配列番号１５のオトフェリン遺伝子の、ヌクレオチド２２１５～５９９１、２４０７～５９９１、ヌクレオチド２５２４～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、ヌクレオチド２９９２～５９９１、またはヌクレオチド３１２７～５９９１を含有し得る。
検討される遺伝子における天然のエクソン接合部に対応する任意の同等の切断部位によりオトフェリン遺伝子を２つの部分に分割することも可能である。
【0074】
本発明の特に好ましいベクター系は：
ａ）ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：本発明のＣＭＶプロモーター、必要に応じてイントロン配列（典型的には、配列番号１０）、必要に応じて配列番号８９または９２のコザック配列、その後に続く、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２４０６、ヌクレオチド１～２５２３、ヌクレオチド１～２６７６、ヌクレオチド１～２９９１またはヌクレオチド１～３１２６、およびスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチド、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２４０７～５９９１、ヌクレオチド２５２４～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、ヌクレオチド２９９２～５９９１またはヌクレオチド３１２７～５９９１、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含有し、
各ポリヌクレオチドは、アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子由来の配列番号６９の第２の組換え誘導配列を含む。
好ましくは、前記ベクター系の第１のポリヌクレオチドは：配列番号４７、５０、５３、５６、５９、および６２（イントロン配列を含まない）の中から、または配列番号７０、７１、７２、７３、７４、および７５（イントロン配列を含む）の中から選択され、前記ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１５のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２４０６、ヌクレオチド１～２５２３、ヌクレオチド１～２６７６、ヌクレオチド１～２９９１、またはヌクレオチド１～３１２６を含有し、それにより、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする。
好ましくは、前記ベクター系の第２のポリヌクレオチドは：配列番号４８、５１、５４、５７、６０および６３（エンハンサーＷＰＲＥを含まない）の中から、または配列番号４９、５２、５５、５８、６１、および６４（ＷＰＲＥを含まない）の中から選択され、前記ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１５のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２４０７～５９９１、ヌクレオチド２５２４～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、ヌクレオチド２９９２～５９９１、またはヌクレオチド３１２７～５９９１を含有し、それにより、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする。
これらのポリヌクレオチドの構築は、下記実施例１に詳細に記載されている。
ａ）ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：本発明のＣＭＶプロモーター、必要に応じてイントロン配列（典型的には、配列番号１０）、必要に応じて配列番号８９または９２のコザック配列、その後に続く、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２４０６、ヌクレオチド１～２５２３、ヌクレオチド１～２６７６、ヌクレオチド１～２９９１またはヌクレオチド１～３１２６、およびスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチド、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２４０７～５９９１、ヌクレオチド２５２４～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、ヌクレオチド２９９２～５９９１またはヌクレオチド３１２７～５９９１、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含有し、
各ポリヌクレオチドは、アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子由来の配列番号６９の第２の組換え誘導配列を含む。
好ましくは、前記ベクター系の第１のポリヌクレオチドは：配列番号４７、５０、５３、５６、５９、および６２（イントロン配列を含まない）の中から、または配列番号７０、７１、７２、７３、７４、および７５（イントロン配列を含む）の中から選択され、前記ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１５のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２４０６、ヌクレオチド１～２５２３、ヌクレオチド１～２６７６、ヌクレオチド１～２９９１、またはヌクレオチド１～３１２６を含有し、それにより、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする。
好ましくは、前記ベクター系の第２のポリヌクレオチドは：配列番号４８、５１、５４、５７、６０および６３（エンハンサーＷＰＲＥを含まない）の中から、または配列番号４９、５２、５５、５８、６１、および６４（ＷＰＲＥを含まない）の中から選択され、前記ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号１５のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２４０７～５９９１、ヌクレオチド２５２４～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、ヌクレオチド２９９２～５９９１、またはヌクレオチド３１２７～５９９１を含有し、それにより、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする。
これらのポリヌクレオチドの構築は、下記実施例１に詳細に記載されている。
【0075】
特に好ましいベクター系は：
ａ）ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：配列番号９のＣＭＶプロモーター、および必要に応じて配列番号１０のイントロン配列、および／または配列番号８９もしくは９２のコザック配列、その後に続く配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２６７６、またはヌクレオチド１～２９９１、より好ましくは、ヌクレオチド１～２６７６、およびスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、またはヌクレオチド２９９２～５９９１（より好ましくは、ヌクレオチド２６７７～５９９１）、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含むベクター系であって、
前記第１および第２のポリヌクレオチドはまた、前記第１のポリヌクレオチド中のスプライスドナー部位の後かつ前記第２のポリヌクレオチド中のスプライスアクセプター部位の前に位置する配列番号６９のＡＰ組換え誘導配列を含み、
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号２３のＷＰＲＥ配列を含有しない、ベクター系である。
ａ）ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：配列番号９のＣＭＶプロモーター、および必要に応じて配列番号１０のイントロン配列、および／または配列番号８９もしくは９２のコザック配列、その後に続く配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２６７６、またはヌクレオチド１～２９９１、より好ましくは、ヌクレオチド１～２６７６、およびスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、またはヌクレオチド２９９２～５９９１（より好ましくは、ヌクレオチド２６７７～５９９１）、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含むベクター系であって、
前記第１および第２のポリヌクレオチドはまた、前記第１のポリヌクレオチド中のスプライスドナー部位の後かつ前記第２のポリヌクレオチド中のスプライスアクセプター部位の前に位置する配列番号６９のＡＰ組換え誘導配列を含み、
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号２３のＷＰＲＥ配列を含有しない、ベクター系である。
【0076】
別の特に好ましいベクター系は、
ａ）前記ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：配列番号９のＣＭＶプロモーター、および必要に応じて配列番号１０のイントロン配列、および必要に応じて配列番号８９または９２のコザック配列、その後に続く、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２６７６、またはヌクレオチド１～２９９１、より好ましくは、ヌクレオチド１～２６７６、およびスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、またはヌクレオチド２９９２～５９９１（より好ましくは、ヌクレオチド２６７７～５９９１）、必要に応じてこの後に続く、ポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含むベクター系であって、
前記第１および第２のポリヌクレオチドがまた、前記第１のポリヌクレオチド中のスプライスドナー部位の後で、前記第２のポリヌクレオチド中のスプライスアクセプター部位の前に位置する配列番号６９のＡＰ組換え誘導配列を含み、
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号２３のＷＰＲＥ配列を含有しない、ベクター系である。
本発明による本発明の特に好ましいベクター系は、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号５６（イントロン配列を含まない）、およびヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする配列番号５８（エンハンサーＷＰＲＥを含まない）を含有する。
ａ）前記ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：配列番号９のＣＭＶプロモーター、および必要に応じて配列番号１０のイントロン配列、および必要に応じて配列番号８９または９２のコザック配列、その後に続く、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド１～２２１４、ヌクレオチド１～２６７６、またはヌクレオチド１～２９９１、より好ましくは、ヌクレオチド１～２６７６、およびスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、配列番号１５のオトフェリン遺伝子のヌクレオチド２２１５～５９９１、ヌクレオチド２６７７～５９９１、またはヌクレオチド２９９２～５９９１（より好ましくは、ヌクレオチド２６７７～５９９１）、必要に応じてこの後に続く、ポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含むベクター系であって、
前記第１および第２のポリヌクレオチドがまた、前記第１のポリヌクレオチド中のスプライスドナー部位の後で、前記第２のポリヌクレオチド中のスプライスアクセプター部位の前に位置する配列番号６９のＡＰ組換え誘導配列を含み、
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号２３のＷＰＲＥ配列を含有しない、ベクター系である。
本発明による本発明の特に好ましいベクター系は、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号５６（イントロン配列を含まない）、およびヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする配列番号５８（エンハンサーＷＰＲＥを含まない）を含有する。
【0077】
本発明の医薬組成物
別の態様では、本発明は、上記のような本発明のベクター系（すなわち、上述のポリヌクレオチドを含むビリオン）、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を目標とする。
本発明はまた、本発明のウイルスの唯一の集団を含む医薬組成物も目標とし、前記ウイルスは、上記で十分に説明されている「第１」または「第２」のポリヌクレオチドを含む。
前記医薬組成物は通常、上記で開示されるトランススプライシング、ハイブリッドまたはオーバーラップベクターのいずれかを含有する。
別の態様では、本発明は、上記のような本発明のベクター系（すなわち、上述のポリヌクレオチドを含むビリオン）、および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を目標とする。
本発明はまた、本発明のウイルスの唯一の集団を含む医薬組成物も目標とし、前記ウイルスは、上記で十分に説明されている「第１」または「第２」のポリヌクレオチドを含む。
前記医薬組成物は通常、上記で開示されるトランススプライシング、ハイブリッドまたはオーバーラップベクターのいずれかを含有する。
【0078】
特に、および一例として、本発明の組成物は、本発明のハイブリッドベクターを含む粒子、即ち：
－ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、必要に応じ、コザック配列、これに続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列、および組換え誘導配列としてのスプライスドナー部位を、含むポリヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体と、を含むＡＡＶ８粒子、あるいは
－ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：組換え誘導配列としてのスプライスアクセプター部位、オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含むポリヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体と、を含むＡＡＶ８粒子、を含有する。
－ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、必要に応じ、コザック配列、これに続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列、および組換え誘導配列としてのスプライスドナー部位を、含むポリヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体と、を含むＡＡＶ８粒子、あるいは
－ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：組換え誘導配列としてのスプライスアクセプター部位、オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含むポリヌクレオチドと、薬学的に許容可能な担体と、を含むＡＡＶ８粒子、を含有する。
【0079】
別の実施形態では、前記組成物は、
ａ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、必要に応じて、コザック配列、これに続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列、およびスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含み、
前記第１および第２のポリヌクレオチドはまた、前記第１のポリヌクレオチド中のスプライスドナー部位の後かつ前記第２のポリヌクレオチド中のスプライスアクセプター部位の前に位置する第２の組換え誘導配列を含む。
ａ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、必要に応じて、コザック配列、これに続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列、およびスプライスドナー部位を、含む第１のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、および
ｂ）ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含む第２のポリヌクレオチドを含む１つのＡＡＶ８粒子、を含み、
前記第１および第２のポリヌクレオチドはまた、前記第１のポリヌクレオチド中のスプライスドナー部位の後かつ前記第２のポリヌクレオチド中のスプライスアクセプター部位の前に位置する第２の組換え誘導配列を含む。
【0080】
好ましい実施形態では、本発明はまた、ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、その後に続く、オトフェリン遺伝子のＮ末端コード部分を含有する部分コード配列、およびスプライスドナー部位を、含むポリヌクレオチドを含むＡＡＶ８粒子であって、前記ポリヌクレオチドがまた、前記ポリヌクレオチドのスプライスドナー部位の後に位置する第２の組換え誘導配列を含有する、ＡＡＶ８粒子を、薬学的に許容可能な担体とは別に、含む医薬組成物も対象とする。
【0081】
別の好ましい実施形態では、本発明はまた、ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：スプライスアクセプター部位、オトフェリン遺伝子のＣ末端コード部分を含有する部分コード配列、必要に応じてその後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含むポリヌクレオチドを含むＡＡＶ８粒子であって、前記ポリヌクレオチドがまた、前記ポリヌクレオチドのスプライスアクセプター部位の前に位置する第２の組換え誘導配列も含有する、ＡＡＶ８粒子を、薬学的に許容可能な担体とは別に、含む医薬組成物も対象とする。
【0082】
このようなポリヌクレオチドの全ての構成部分（プロモーター配列、翻訳のエンハンサー、組換え誘導配列、部分的コード部分、など）は、上記で詳述されており、ここで繰り返す必要はない。本発明のベクター系のために開示された全ての実施形態（トランススプライシング、ハイブリッドおよびオーバーラップ）は、必要な変更を加えて、ここに当てはまる。
【0083】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、生理学的に適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。薬学的に許容可能な担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうちの１種または複数、ならびにそれらの組み合わせを含む。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい場合がある。薬学的に許容可能な担体は、ベクター系またはそれを含む医薬組成物の貯蔵寿命または有効性を高める少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤をさらに含むことができる。
本発明の医薬組成物は、様々な形態であり得る。これらは、液体、半固体および固体の剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤を含む。使用される形態は、意図される投与様式および治療応用に依存する。典型的な組成物は、注射可能または注入可能な溶液の形態である。
医薬組成物は、通常、製造および保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。本発明の医薬組成物は、好ましくは、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の規則正しい構造として調合される。滅菌注射液は、本発明のベクターを必要な量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の１種または組み合わせとともに組み込み、次いで、濾過滅菌することにより調製され得る。一般に、分散液は、本発明のベクターまたはウイルスを、基本的な分散媒および上に列挙されたもの由来の必要なその他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および噴霧乾燥であり、これにより、その事前に滅菌濾過された溶液からの活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることにより達成可能である。
本発明の医薬組成物は通常、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明のベクターまたはウイルスを含む。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、この場合、許容できない毒性または望ましくない副作用なく聴力損失の予防および処置の両方に対して、必要な投与量および期間で有効である本発明のベクターまたはウイルスの量を意味する。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号５６（イントロン配列を含まない）、およびヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする配列番号５８（エンハンサーＷＰＲＥを含まない）を含む治療有効量のウイルスを含有する。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号５６（イントロン配列を含まない）、およびヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする配列番号５７（エンハンサーＷＰＲＥを含む）を含む治療有効量のウイルスを含有する。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号７５（イントロン配列を含む）、およびヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする配列番号５７（エンハンサーＷＰＲＥを含む）を含む治療有効量のウイルスを含有する。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号７５（イントロン配列を含む）、およびヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする配列番号５８（エンハンサーＷＰＲＥを含まない）を含む治療有効量のウイルスを含有する。
本発明の医薬組成物は、様々な形態であり得る。これらは、液体、半固体および固体の剤形、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、散剤、リポソームおよび坐剤を含む。使用される形態は、意図される投与様式および治療応用に依存する。典型的な組成物は、注射可能または注入可能な溶液の形態である。
医薬組成物は、通常、製造および保管の条件下で無菌かつ安定でなければならない。本発明の医薬組成物は、好ましくは、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高薬物濃度に適したその他の規則正しい構造として調合される。滅菌注射液は、本発明のベクターを必要な量で適切な溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の１種または組み合わせとともに組み込み、次いで、濾過滅菌することにより調製され得る。一般に、分散液は、本発明のベクターまたはウイルスを、基本的な分散媒および上に列挙されたもの由来の必要なその他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および噴霧乾燥であり、これにより、その事前に滅菌濾過された溶液からの活性成分プラス任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。溶液の適切な流動性は、例えば、コーティング、例えば、レシチンの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持され得る。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることにより達成可能である。
本発明の医薬組成物は通常、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明のベクターまたはウイルスを含む。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、この場合、許容できない毒性または望ましくない副作用なく聴力損失の予防および処置の両方に対して、必要な投与量および期間で有効である本発明のベクターまたはウイルスの量を意味する。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号５６（イントロン配列を含まない）、およびヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする配列番号５８（エンハンサーＷＰＲＥを含まない）を含む治療有効量のウイルスを含有する。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号５６（イントロン配列を含まない）、およびヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする配列番号５７（エンハンサーＷＰＲＥを含む）を含む治療有効量のウイルスを含有する。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号７５（イントロン配列を含む）、およびヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする配列番号５７（エンハンサーＷＰＲＥを含む）を含む治療有効量のウイルスを含有する。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＮ末端部分をコードする配列番号７５（イントロン配列を含む）、およびヒトオトフェリンのアイソフォーム５のＣ末端部分をコードする配列番号５８（エンハンサーＷＰＲＥを含まない）を含む治療有効量のウイルスを含有する。
【0084】
特に好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は：
－ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、これに続く配列番号１０のイントロン配列、配列番号８９のコザック配列、ヒトオトフェリン遺伝子（アイソフォーム５、エクソン１～２２）のＮ末端コード部分、スプライスドナー部位および配列番号６９の組換え誘導配列を、含むポリヌクレオチドを、薬学的に許容可能な担体と共に、含むＡＡＶ８粒子であって、前記ポリペプチドが、例えば配列番号７３または配列番号９０を示す配列を有する、ＡＡＶ８粒子、
および／または
－ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：配列番号６９の組換え誘導配列、スプライスアクセプター部位、ヒトオトフェリン遺伝子（アイソフォーム５、エクソン２３を基点として）のＣ末端コード部分、その後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含むポリヌクレオチドを、薬学的に許容可能な担体と共に、含むＡＡＶ８粒子であって、前記ポリペプチドが、例えば配列番号９７で示される配列を有する、ＡＡＶ８粒子、
を含有するウイルスの治療有効量を含む。
－ポリヌクレオチドのそれぞれの末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：ＣＭＶプロモーター、これに続く配列番号１０のイントロン配列、配列番号８９のコザック配列、ヒトオトフェリン遺伝子（アイソフォーム５、エクソン１～２２）のＮ末端コード部分、スプライスドナー部位および配列番号６９の組換え誘導配列を、含むポリヌクレオチドを、薬学的に許容可能な担体と共に、含むＡＡＶ８粒子であって、前記ポリペプチドが、例えば配列番号７３または配列番号９０を示す配列を有する、ＡＡＶ８粒子、
および／または
－ポリヌクレオチドの各末端に末端逆位配列を、および前記末端逆位配列同士の間に５’から３’に向けて：配列番号６９の組換え誘導配列、スプライスアクセプター部位、ヒトオトフェリン遺伝子（アイソフォーム５、エクソン２３を基点として）のＣ末端コード部分、その後に続くポリアデニル化配列（例えば、配列番号２４のウシ成長ホルモンのポリＡ）を、含むポリヌクレオチドを、薬学的に許容可能な担体と共に、含むＡＡＶ８粒子であって、前記ポリペプチドが、例えば配列番号９７で示される配列を有する、ＡＡＶ８粒子、
を含有するウイルスの治療有効量を含む。
【0085】
特に最も好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は：
－配列が配列番号９０で示されるポリヌクレオチドを、薬学的に許容可能な担体と共に含むＡＡＶ８粒子；
および／または
－配列が配列番号９７で示されるポリヌクレオチドを、薬学的に許容可能な担体と共に含むＡＡＶ８粒子、を含むウイルスの治療有効量を含む。
－配列が配列番号９０で示されるポリヌクレオチドを、薬学的に許容可能な担体と共に含むＡＡＶ８粒子；
および／または
－配列が配列番号９７で示されるポリヌクレオチドを、薬学的に許容可能な担体と共に含むＡＡＶ８粒子、を含むウイルスの治療有効量を含む。
【0086】
本発明のベクターまたはウイルスの治療有効量は、対象の病状、年齢、性別および体重、ならびに前記化合物が対象において所望の応答を誘発能力などの要因に応じて変化し得る。治療有効量はまた、特許請求の範囲の化合物の毒性または有害な効果を、処置的に有益な効果が上回る量であり得る。「予防有効量」は、所望の予防結果を達成するために、必要な投与量および期間で有効である本発明のウイルスまたはベクターの量を意味する。典型的には、予防用量は、疾患段階の前の、または疾患の初期段階の対象において使用され得るため、予防有効量は、通常、治療有効量よりも少ない。
【0087】
投与計画を調整して、最適な所望の応答（例えば、治療応答または予防応答）を提供することができる。例えば、単一のボーラスを投与することができ、いくつかの分割用量を経時的に投与することができ、または治療状況の緊急性により示されるように、用量を相対的に減少または増加させることができる。本明細書で使用される場合、投与単位剤形は、処置すべき哺乳動物対象にとって単位投与量として適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体に関連して所望の治療効果または予防効果を生じるように計算された、本発明のベクターまたはウイルスの既定量を含有する。投与単位形態の仕様は、（ａ）ベクターまたはウイルスの固有の特性および達成される特定の治療効果または予防効果、ならびに（ｂ）対象の聴力損失を処置または防止するためのこのようなベクターまたはウイルスを製剤化する技術に固有の制限により左右され、直接依存し得る。
【0088】
第１および第２のＡＡＶポリヌクレオチド／粒子が使用されるいくつかの実施形態では、第１および第２のＡＡＶポリヌクレオチド／粒子は、同じ組成物内または異なる組成物内に含有されてもよく、共にまたは個別に投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、１０６～１０１４粒子／ｍＬもしくは１０１０～１０１５個の粒子／ｍＬ、またはいずれか範囲の間の任意の値、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４個の粒子／ｍＬを含有する。一実施形態では、本発明の組成物は、１０１３個のＡＡＶ粒子／ｍＬ超を含有する。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ粒子および第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶ粒子を投与する場合、投与される量は、両方の粒子について同じである。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、１０６～１０１４粒子／ｍＬもしくは１０１０～１０１５個の粒子／ｍＬ、またはいずれか範囲の間の任意の値、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３または１０１４個の粒子／ｍＬを含有する。一実施形態では、本発明の組成物は、１０１３個のＡＡＶ粒子／ｍＬ超を含有する。
いくつかの実施形態では、第１のポリヌクレオチドを含む第１のＡＡＶ粒子および第２のポリヌクレオチドを含む第２のＡＡＶ粒子を投与する場合、投与される量は、両方の粒子について同じである。
【0089】
治療的使用および処置方法
別の態様では、本発明はまた、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者の処置またはＤＦＮＢ９変異を有する患者のＤＦＮＢ９難聴の防止に使用するための、本発明のウイルスもしくはベクター系、または上記で定義される医薬組成物にも関する。
本発明はまた、本発明のウイルスもしくはベクター系、またはそれを含む医薬組成物をそれぞれ、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者、またはＤＦＮＢ９変異を有する患者に投与することを伴う、処置するまたは防止する方法にも関する。
別の態様では、本発明はまた、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者の処置またはＤＦＮＢ９変異を有する患者のＤＦＮＢ９難聴の防止に使用するための、本発明のウイルスもしくはベクター系、または上記で定義される医薬組成物にも関する。
本発明はまた、本発明のウイルスもしくはベクター系、またはそれを含む医薬組成物をそれぞれ、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者、またはＤＦＮＢ９変異を有する患者に投与することを伴う、処置するまたは防止する方法にも関する。
【0090】
より一般的には、本発明のこれらのウイルスもしくはベクター系または医薬組成物は、改変ＤＦＮＢ５９遺伝子発現または欠損による先天性聴力損失に罹患しているヒト対象に投与することができる。前記欠損は、例えば、オトフェリンが正常レベルで発現されているが機能していない場合に観察され得る。
言い換えれば、本発明は、変更されたＤＦＮＢ９遺伝子発現または欠損に関連する障害に罹患している患者を防止および／または処置することが意図される医薬組成物を製造するための、上記の本発明のウイルスまたはベクター系の使用に関する。
言い換えれば、本発明は、変更されたＤＦＮＢ９遺伝子発現または欠損に関連する障害に罹患している患者を防止および／または処置することが意図される医薬組成物を製造するための、上記の本発明のウイルスまたはベクター系の使用に関する。
【0091】
本明細書で使用される場合、「処置する」という用語は、患者の聴覚を部分的または完全に回復させるために、本発明のウイルスまたはベクター系の治療有効量をＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者に投与することを意味することを意図している。上記の回復は、電気生理学的デバイスにより聴性脳幹反応（ＡＢＲ）を試験することにより評価することができる。「ＤＦＮＢ９難聴の処置」は、特に、関与する細胞機序に関係なく、聴覚機能の完全な回復を示すことを意図している。
温度感受性変異を有する患者の場合、本発明のウイルスまたはベクター系または組成物を投与して、体温調節により誘導される聴力損失を防止することもできる。本発明の文脈において、「防止する」という用語は、可聴周波数範囲内の聴力損失を弱めるかまたは遅らせることを意味する。
これらおよびその他のＤＦＮＢ９患者において、本発明のウイルスまたはベクター系または組成物は、聴力損失が発生する前に防止するため、および聴力損失が既に発生している場合に聴能を少なくとも部分的に回復させるための両方の場合に投与することができる。
本発明のこの態様では、本発明のウイルスまたはベクター系または組成物は、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者に投与される。「ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者」は、本明細書では、構成的オトフェリン遺伝子に変異を有すると考えられる（または有すると診断されている）患者、特にヒト患者を意味し、前記変異は、オトフェリンタンパク質の異常な発現、機能またはその両方を誘発する。特定の実施形態において、上記変異は温度感受性であり得る。
温度感受性変異を有する患者の場合、本発明のウイルスまたはベクター系または組成物を投与して、体温調節により誘導される聴力損失を防止することもできる。本発明の文脈において、「防止する」という用語は、可聴周波数範囲内の聴力損失を弱めるかまたは遅らせることを意味する。
これらおよびその他のＤＦＮＢ９患者において、本発明のウイルスまたはベクター系または組成物は、聴力損失が発生する前に防止するため、および聴力損失が既に発生している場合に聴能を少なくとも部分的に回復させるための両方の場合に投与することができる。
本発明のこの態様では、本発明のウイルスまたはベクター系または組成物は、ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者に投与される。「ＤＦＮＢ９難聴に罹患している患者」は、本明細書では、構成的オトフェリン遺伝子に変異を有すると考えられる（または有すると診断されている）患者、特にヒト患者を意味し、前記変異は、オトフェリンタンパク質の異常な発現、機能またはその両方を誘発する。特定の実施形態において、上記変異は温度感受性であり得る。
【0092】
現在までに、オトフェリンにおいて７５個を超える病原性変異が報告されている。これらの中には、発熱によって条件付けられた突発性難聴に罹患している患者において同定された、少なくとも７個の温度感受性変異がある（ＰＱ９９４ＶｆｓＸ６、Ｐ．Ｉ５１５Ｔ、ｐ．Ｇ５４１Ｓ、ＰＲ１６０７Ｗ、ｐＥ１８０４ｄｅｌ、ｃ．２９７５＿２９７８ｄｅｌＡＧ／ｃ．４８１９Ｃ＞Ｔ、ｃ．４８１９Ｃ＞Ｔ（ｃ．Ｒ１６０７Ｗ））。
これらの患者は、例えば、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）の電気生理学的試験および／またはＯＴＯＦ遺伝子の変異を同定するための遺伝子検査の組み合わせを使用して、熟練した医師により特定され得る。いくつかの実施形態では、患者は、ＯＴＯＦ遺伝子に以下のナンセンスまたはミスセンス変異：ＴＹＲ７３０ＴＥＲ、ＧＬＮ８２９ＴＥＲ、ＰＲ０１８２５ＡＬＡ、ＰＲＯ５０ＡＲＧ、ＬＥＵ１０１１ＰＲＯ、ＩＬＥ５１５ＴＨＲ、ＡＲＧ１９３９ＧＬＮまたはＧＬＹ５４１ＳＥＲの内の１つまたは複数を有する。いくつかの実施形態において、患者は、イントロン８／エクソン９接合部におけるＡからＧへのトランジション（ＩＶＳ８－２Ａ－Ｇ）、またはエクソン５のスプライスドナー部位における第一のイントロンヌクレオチドである位置＋１におけるＧからＡへのトランジション、またはイントロン３９のドナースプライス部位におけるＧからＣへのトランスバージョンを有する。いくつかの実施形態において、患者は、終止コドンをもたらすエクソン１６での１塩基対の欠失（１７７８Ｇ）およびエクソン４８でのＡＲＧからＧＬＮへの置換をもたらす６１４１Ｇ－Ａ変化を有する。
これらの患者は、例えば、聴性脳幹反応（ＡＢＲ）の電気生理学的試験および／またはＯＴＯＦ遺伝子の変異を同定するための遺伝子検査の組み合わせを使用して、熟練した医師により特定され得る。いくつかの実施形態では、患者は、ＯＴＯＦ遺伝子に以下のナンセンスまたはミスセンス変異：ＴＹＲ７３０ＴＥＲ、ＧＬＮ８２９ＴＥＲ、ＰＲ０１８２５ＡＬＡ、ＰＲＯ５０ＡＲＧ、ＬＥＵ１０１１ＰＲＯ、ＩＬＥ５１５ＴＨＲ、ＡＲＧ１９３９ＧＬＮまたはＧＬＹ５４１ＳＥＲの内の１つまたは複数を有する。いくつかの実施形態において、患者は、イントロン８／エクソン９接合部におけるＡからＧへのトランジション（ＩＶＳ８－２Ａ－Ｇ）、またはエクソン５のスプライスドナー部位における第一のイントロンヌクレオチドである位置＋１におけるＧからＡへのトランジション、またはイントロン３９のドナースプライス部位におけるＧからＣへのトランスバージョンを有する。いくつかの実施形態において、患者は、終止コドンをもたらすエクソン１６での１塩基対の欠失（１７７８Ｇ）およびエクソン４８でのＡＲＧからＧＬＮへの置換をもたらす６１４１Ｇ－Ａ変化を有する。
【0093】
本発明のウイルス、ウイルス系または組成物の投与の時間は、本教示の利益を有する当業者の理解の範囲内にあるであろう。本発明の組成物を１２歳までまたはそれ以降に投与可能であるが、疾患または変異が検出されると直ちに、例えば、子宮内の胚もしくは胎児に、または出生後直ちに、例えば、出生後３か月以内に、好ましくは出生後１か月以内に、実施することもできる。
【0094】
本発明のウイルスまたはベクター系または組成物が投与される患者は、好ましくは、聴覚系、特に蝸牛が既に発達して成熟している患者、特にヒト患者である。この場合、これらの患者、特にヒト患者は、したがって、ヒトの胚または胎児ではない。したがって、本発明の目標となる患者は、ＤＦＮＢ９難聴がその若さで診断される場合、好ましくはヒト新生児であり、典型的には生後６か月未満、あるいは生後３か月未満でさえある。これらのヒトの乳幼児は、より好ましくは生後３か月～１年である。
【0095】
注目すべきことに、ヒトの蝸牛は全体として、妊娠１７～１９週で成体のサイズに達し、３０～３６週（マウスにおける生後１２日に相当）で完全に形態学的に成熟する。内耳有毛細胞のリボンシナプスの機能的成熟は、ＡＢＲ測定のＩ波をモニターすることによって、評価することができ、これは、ヒトでは妊娠２８週目頃に記録され得る。ＡＢＲのＩ波（一次聴覚ニューロンとの内耳有毛細胞シナプスの機能を反映）の記録および分析は、出生時（マウスの出生後２０日に相当）のヒトの乳幼児の完全な機能的成熟を示す。これは当技術分野で周知である（例えば、Ｐｕｊｏｌ ｅｔ Ｌａｖｉｇｎｅ－Ｒｅｂｉｌｌａｒｄ，Ａｃｔａ ｏｔｏ－ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｉｃａ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｕｍ・Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９１を参照されたい）。
【0096】
本発明者らは、以前に、オトフェリンによる遺伝子治療が、成熟聴覚系に達した場合でも、有効であることを示した（Ａｋｉｌ ｅｌ ａｌ ２０１９，ＰＮＡＳ；Ｈａｒｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｍeｄｅｃｉｎｅ／ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１９；３５：１２１３－２５）。
したがって、本発明のベクター系を、より年上のヒト患者、例えば、幼児（２～６歳）、小児（６～１２歳）、ティーンエージャー（１２～１８歳）または成人（１８歳以上）に投与することも可能である。
本発明の患者は、特に、言語習得後にＤＦＮＢ９難聴に罹患していると診断されたヒトの乳児であり得る。
したがって、本発明のベクター系を、より年上のヒト患者、例えば、幼児（２～６歳）、小児（６～１２歳）、ティーンエージャー（１２～１８歳）または成人（１８歳以上）に投与することも可能である。
本発明の患者は、特に、言語習得後にＤＦＮＢ９難聴に罹患していると診断されたヒトの乳児であり得る。
【0097】
別の特定の実施形態では、本発明の患者は、６歳以上のヒトであり、即ち、処置の投与は、それらの中枢神経系が完全に成熟しているときに行われる。
特定の実施形態では、本発明のウイルスまたはベクター系または組成物は、好ましくは、ＰＱ９９４ＶｆｓＸ６、Ｐ．Ｉ５１５Ｔ、ｐ．Ｇ５４１Ｓ、ＰＲ１６０７Ｗ、ｐＥ１８０４ｄｅｌ、ｃ．２９７５＿２９７８ｄｅｌＡＧ／ｃ．４８１９Ｃ＞Ｔ、ｃ．４８１９Ｃ＞Ｔ、（ｃ．Ｒ１６０７Ｗ）から選択される温度感受性変異により誘導されるＤＦＮＢ９難聴に罹患しているヒト患者、より好ましくは、前述のオトフェリン温度感受性変異の少なくとも１つを有するティーンエージャーまたはヒト成人に投与される。
特定の実施形態では、本発明のウイルスまたはベクター系または組成物は、好ましくは、ＰＱ９９４ＶｆｓＸ６、Ｐ．Ｉ５１５Ｔ、ｐ．Ｇ５４１Ｓ、ＰＲ１６０７Ｗ、ｐＥ１８０４ｄｅｌ、ｃ．２９７５＿２９７８ｄｅｌＡＧ／ｃ．４８１９Ｃ＞Ｔ、ｃ．４８１９Ｃ＞Ｔ、（ｃ．Ｒ１６０７Ｗ）から選択される温度感受性変異により誘導されるＤＦＮＢ９難聴に罹患しているヒト患者、より好ましくは、前述のオトフェリン温度感受性変異の少なくとも１つを有するティーンエージャーまたはヒト成人に投与される。
【0098】
本発明の文脈において、本発明の医薬組成物の典型的な投与方法は、鼓室内（中耳内）、蝸牛内または非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、髄腔内）である。一例では、本発明の医薬組成物は、静脈内注入または注射により投与される。別の例では、本発明の医薬組成物は、定位送達を使用して、特に、鼓膜または中耳の乳様突起を介して、特定の場所に送達される。
より正確には、本発明のウイルス、ベクター系または医薬組成物は、レーザースタペドトミー（ｌａｓｅｒ ｓｔａｐｅｄｏｔｏｍｙ）（アブミ骨経由）を用いて卵円窓を介して、または経乳突／経正円窓を介して実施されるマイクロカテーテルを使用して投与され得る（Ｄａｉ Ｃ．ｅｔ ａｌ，ＪＡＲＯ，１８：６０１－６１７，２０１７）。
より正確には、本発明のウイルス、ベクター系または医薬組成物は、レーザースタペドトミー（ｌａｓｅｒ ｓｔａｐｅｄｏｔｏｍｙ）（アブミ骨経由）を用いて卵円窓を介して、または経乳突／経正円窓を介して実施されるマイクロカテーテルを使用して投与され得る（Ｄａｉ Ｃ．ｅｔ ａｌ，ＪＡＲＯ，１８：６０１－６１７，２０１７）。
【0099】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のウイルス、ベクター系または医薬組成物は、蝸牛内投与を介して、より正確には、前庭系中の内リンパ腔を標的にすることにより、または前述の半規管アプローチにより、ヒトの耳に投与される。
複数の内耳への送達経路が探索されている。これらは、正円窓膜（ＲＷＭ）および卵円窓を介した外リンパ腔への注射、ならびに蝸牛切開による鼓室階または前庭階への注射を含む。外リンパ腔全体への分布が、これらすべての送達経路に関して実証されている。さらに、蝸牛および前庭器官の中の移流が、注射部位から内耳のより離れた領域への治療薬の分布を容易にし得ることが実証されている。内リンパ腔への送達もまた、中央階への内耳開窓述、管切開術（ｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）および内リンパ嚢への注射を通して探索されているこれらのアプローチもまた、幅広い分布をもたらしたが、高カリウムの内リンパと外リンパとの間のバリアに穴を開けるという追加の課題に直面している。バリアの破壊は、２つの潜在的な問題を引き起こす。第一に、有毛細胞およびニューロンの外底面を浸す外リンパ腔への高カリウムの漏出は、これらの細胞を慢性的に脱分極させ、細胞死をもたらし得る。第二に、内リンパと外リンパとの間のタイトジャンクションの破れは、通常＋８０～＋１２０ｍＶの範囲である蝸牛内電位の減弱をもたらし得る。蝸牛内電位の減弱は、有毛細胞における感覚伝達の駆動力を低下させ、したがって、蝸牛感度の低減および聴覚閾値の上昇をもたらす。これらの合併症を回避することは、成人の蝸牛では特に困難である。しかし、蝸牛内直流電位を有しないが、蝸牛の内リンパ腔と連続している前庭系の内リンパ腔を標的にすることにより、蝸牛内に十分な分布を依然として提供しながら、これらの交絡問題を最小限に抑えることができる（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ，ＪＡＲＯ １８：６４９－６７０（２０１７））。
複数の内耳への送達経路が探索されている。これらは、正円窓膜（ＲＷＭ）および卵円窓を介した外リンパ腔への注射、ならびに蝸牛切開による鼓室階または前庭階への注射を含む。外リンパ腔全体への分布が、これらすべての送達経路に関して実証されている。さらに、蝸牛および前庭器官の中の移流が、注射部位から内耳のより離れた領域への治療薬の分布を容易にし得ることが実証されている。内リンパ腔への送達もまた、中央階への内耳開窓述、管切開術（ｃａｎａｌｏｓｔｏｍｙ）および内リンパ嚢への注射を通して探索されているこれらのアプローチもまた、幅広い分布をもたらしたが、高カリウムの内リンパと外リンパとの間のバリアに穴を開けるという追加の課題に直面している。バリアの破壊は、２つの潜在的な問題を引き起こす。第一に、有毛細胞およびニューロンの外底面を浸す外リンパ腔への高カリウムの漏出は、これらの細胞を慢性的に脱分極させ、細胞死をもたらし得る。第二に、内リンパと外リンパとの間のタイトジャンクションの破れは、通常＋８０～＋１２０ｍＶの範囲である蝸牛内電位の減弱をもたらし得る。蝸牛内電位の減弱は、有毛細胞における感覚伝達の駆動力を低下させ、したがって、蝸牛感度の低減および聴覚閾値の上昇をもたらす。これらの合併症を回避することは、成人の蝸牛では特に困難である。しかし、蝸牛内直流電位を有しないが、蝸牛の内リンパ腔と連続している前庭系の内リンパ腔を標的にすることにより、蝸牛内に十分な分布を依然として提供しながら、これらの交絡問題を最小限に抑えることができる（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ，ＪＡＲＯ １８：６４９－６７０（２０１７））。
【0100】
蝸牛は高度に区画化されており、血液蝸牛関門（ＢＣＢ）によって、身体の残りの部分から分離されている。これにより、治療注入量および身体の全身循環系への漏出が最小限に抑えられ、蝸牛の免疫特権が保護され、全身性の有害な免疫応答の機会が低減する。蝸牛の有毛細胞および支持細胞は通常は、分裂しないため、蝸牛の細胞は安定したままであり、したがって、持続的な導入遺伝子発現のために非組み込みウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）を使用することが可能である。
後半規管もまた、ヒトにおいてもアクセス可能であると考えられることから、半規管アプローチは、ヒトの試験における将来の蝸牛遺伝子治療のための有望な注入経路として提案されている（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７：４５５２４（２０１７）；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．８：２９８０（２０１８））。
後半規管もまた、ヒトにおいてもアクセス可能であると考えられることから、半規管アプローチは、ヒトの試験における将来の蝸牛遺伝子治療のための有望な注入経路として提案されている（Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．７：４５５２４（２０１７）；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．８：２９８０（２０１８））。
【0101】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のウイルス、ベクター系または組成物は、臨床の耳外科診療において、日常的に使用される２つの一般的でよく確立された技術のうちの１つを介してヒトの耳に投与される。より正確には、これらの手法は、外リンパ腔を標的とするために採用される。この目的のために、マイクロカテーテルを使用した注射は、レーザースタペドトミー（アブミ経由）を使って卵円窓を通して、または経乳突／経正円窓により実施される（Ｄａｉ Ｃ．ｅｔ ａｌ，ＪＡＲＯ，１８：６０１－６１７，２０１７）。静脈内注射または注入による全身投与も可能である。
当業者は、本発明のウイルス、ベクターまたは組成物の投与前に、標的細胞に応じて、国際公開第２０１１／０７５８３８号で提案されているように正円窓膜の透過性を増強することが必要か否かを容易に決定するであろう。
当業者は、本発明のウイルス、ベクターまたは組成物の投与前に、標的細胞に応じて、国際公開第２０１１／０７５８３８号で提案されているように正円窓膜の透過性を増強することが必要か否かを容易に決定するであろう。
【0102】
本発明の新規アイソフォーム
別の態様では、本発明は、本発明者らにより特定された、バリアント５の３つの特定の相同タンパク質に関する（下記の実施例２を参照）。
これらの３つの代替ＯＴＯＦアイソフォームは、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を有する。それらは、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８のｃＤＮＡ配列によりコードされ得る。
それらのそれぞれは、ヒトの聴覚を回復する潜在力を有し得る。したがって、それらは、当該技術分野で開示されている通常のＯＴＯＦアイソフォームタンパク質１～５の代わりに遺伝子治療で使用することができる。
本発明はまた、そのアミノ酸配列が、配列番号６、配列番号７または配列番号８と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、およびさらにより好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の同一性および／または類似性を共有する、その相同ポリペプチドにも関する。相同ポリペプチドが、配列番号６、配列番号７または配列番号８よりもかなり短い場合、ローカルアラインメントを検討することができる。
本発明はまた、配列番号６、配列番号７または配列番号８、または上記で定義されるその相同ポリペプチドをコードするいずれかのベクターまたはベクター系に関する。
特に、本発明は、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のｃＤＮＡ配列を含むいずれかのベクターに関する。
これらのベクターは好ましくは、遺伝子治療に有用である。それらは、限定されないが、ＤＮＡプラスミドベクターならびにＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクターを含む。本発明では、このようなベクターを使用して、蝸牛有毛細胞などの聴覚経路の細胞においてＯＴＯＦの新規アイソフォームを発現させることができる。これらのベクターは、当該技術分野で周知である。ベクターは、例えば、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターである。
別の態様では、本発明は、本発明者らにより特定された、バリアント５の３つの特定の相同タンパク質に関する（下記の実施例２を参照）。
これらの３つの代替ＯＴＯＦアイソフォームは、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列を有する。それらは、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８のｃＤＮＡ配列によりコードされ得る。
それらのそれぞれは、ヒトの聴覚を回復する潜在力を有し得る。したがって、それらは、当該技術分野で開示されている通常のＯＴＯＦアイソフォームタンパク質１～５の代わりに遺伝子治療で使用することができる。
本発明はまた、そのアミノ酸配列が、配列番号６、配列番号７または配列番号８と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、およびさらにより好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％の同一性および／または類似性を共有する、その相同ポリペプチドにも関する。相同ポリペプチドが、配列番号６、配列番号７または配列番号８よりもかなり短い場合、ローカルアラインメントを検討することができる。
本発明はまた、配列番号６、配列番号７または配列番号８、または上記で定義されるその相同ポリペプチドをコードするいずれかのベクターまたはベクター系に関する。
特に、本発明は、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８のｃＤＮＡ配列を含むいずれかのベクターに関する。
これらのベクターは好ましくは、遺伝子治療に有用である。それらは、限定されないが、ＤＮＡプラスミドベクターならびにＤＮＡおよびＲＮＡウイルスベクターを含む。本発明では、このようなベクターを使用して、蝸牛有毛細胞などの聴覚経路の細胞においてＯＴＯＦの新規アイソフォームを発現させることができる。これらのベクターは、当該技術分野で周知である。ベクターは、例えば、レンチウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのウイルスベクターである。
【図面の簡単な説明】
【0103】
【図1-1】図１：ＡおよびＢ。Ｐ１２の野性型マウスへの蝸牛送達後のＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰの形質導入プロファイル。Ａ．ＲＷＭ注射後のＧＦＰに関して免疫標識したＰ３０コルチ器官の低倍率および高倍率顕微鏡写真。ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰが全てのＩＨＣを形質導入したことに留意されたい。Ｂ．ＡＡＶ８－ＧＦＰ、Ａｎｃ８０－ＧＦＰ、およびＡＡＶ２－ＧＦｐをＰ２０でＲＷＭを通して注入した中央部－心尖部野性型蝸牛の共焦点画像。スケールバー：１００μｍ；挿入図は１０μｍ。
【図1-2】図１：ＣおよびＤ。ＮＨＰにおける蝸牛細胞のＡＡＶ８およびＡＡＶ２ベクターによるインビボ形質導入。卵円窓開窓送達手法と組み合わせてＲＷＭを通してＡＡＶ８－（Ｃ）またはＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（Ｄ）の注入を受けた蝸牛の代表的な共焦点画像。ＧＦＰ発現細胞（緑）は、蝸牛の長さに沿っている。細胞核を、ＤＡＰＩ（青）により染色した。赤は、ファロイジン染色したアクチンである。スケールバー：１００μｍ；挿入図は１０μｍ。
【図2-1】図２：二重－ＡＡＶ８ ＣＭＶプロモーターは、Ｏｔｏｆ－／－マウス蝸牛におけるマウスオトフェリン発現を駆動する。（Ａ）Ｐ１０で注入され、オトフェリンに関して免疫染色したＯｔｏｆ－／－マウスのコルチのＰ６４器官の共焦点ｚ断面の最大強度投影像。ほとんどすべてのＩＨＣが、マウスオトフェリンを発現した。（Ｂ）８、１０、１５、および２０ｋＨｚのトーンバーストに応答した、Ｏｔｏｆ－／－非注入マウス（黒色点線））、野性型非注入マウス（灰色点線）およびマウスオトフェリンをコードする本発明の二重ＡＡＶをｐ１０で注入したＯｔｏｆ－／－マウス（実線）の４２日目のＡＢＲ記録。Ｏｔｏｆ－／－ＡＡＶオトフェリン処置マウスの聴覚は、ほぼ正常閾値まで回復する。（Ｃ）ｐ１０齢のＯｔｏｆ－／－処置マウスの１５ｋＨｚ周波数に対する聴覚寿命（この周波数で、最良の聴覚閾値が観察された）は、マウスオトフェリンをコードする本発明の二重ベクターの注入後、少なくとも４７週間記録された。非注入Ｏｔｏｆ－／－マウス（一点鎖線）およびｐ１０で処置したＯｔｏｆ－／－マウスにおける１５ｋＨｚでのトーンバーストに応答した個々のＡＢＲの経時的記録を示す（ｎ＝６）。（Ｄ）５、１０、１５、２０、３２、および４０ｋＨｚのトーンバーストに応答した１０日齢Ｏｔｏｆ－／－マウス（ｎ＝８、実線、平均±ＳＥＭ）、非注入野性型マウス（点線、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）および非注入Ｏｔｏｆ－／－マウス（一点鎖線、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）におけるマウスオトフェリンをコードする本発明の二重オトフェリンベクターの蝸牛内注入後２８～３１９日の間のＡＢＲ記録。（Ｅ）ＰＢＳを注入した２１／２２日齢Ｏｔｏｆ－／－マウス（一点鎖線、平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）、ＰＢＳ注入野性型２１／２２日齢マウス（破線、平均±ＳＥＭ、ｎ＝６）、非注入野性型マウス（濃色破線、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）、ｐ２１／ｐ２２にマウスオトフェリンをコードする本発明の二重ＡＡＶベクターを注入したマウス（点線、平均±ＳＥＭ、ｎ＝９）、およびｐ２１／ｐ２２にマウスオトフェリンをコードする本発明の二重ベクターを注入したＯｔｏｆ－／－マウス＃８（実線、ｎ＝１）における処置後１８週でのＡＢＲ記録。前記マウスは、５、１０、１５、２０、３２、および４０ｋＨｚのトーンバーストへの応答で、最良の回復を示す。（Ｆ）ＰＢＳを注入した１８～２５日齢Ｏｔｏｆ－／－マウス（一点鎖線、平均±ＳＥＭ、ｎ＝５）、ＰＢＳ注入野性型１８～２５日齢マウス（破線、平均±ＳＥＭ、ｎ＝７）、非注入野性型１８～２５日齢マウス（濃色破線、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）、およびヒトオトフェリンをコードする本発明の二重ＡＡＶベクターをｐ１８～ｐ２５で注入したＯｔｏｆ－／－マウス（点線、平均±ＳＥＭ、ｎ＝４）における注入後１８週のＡＢＲ記録。これらの内で、ｐ１８～ｐ２５で本発明の二重ベクターを注入したＯｔｏｆ－／－マウス＃３（実線、ｎ＝１）における注入後１８週のＡＢＲ記録。前記マウスは、５、１０、１５、２０、３２、および４０ｋＨｚのトーンバーストに応答して、最良の回復を示す。（Ｇ）二重ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｍｕＯＴＯＦ（ｎ＝８）またはＡＡＶ８－ｓｍＣＢＡｍｕＯＴＯＦ（ｎ＝１５）で処置したマウスにおける１５ｋＨｚでの聴覚回復の寿命。１５ｋＨｚでの平均±ＳＥＭを示す。ｄＢ＝デシベル；ＳＰＬ＝音圧レベル；ｋＨｚ＝キロヘルツ。（Ｈ）最良のレスポンダーマウス１匹（＃８）からのマウスオトフェリン（青）に関して免疫染色した注入した左蝸牛の心尖部、ＭＴ、および基底回転の共焦点ｚ断面の最大強度投影像。ＩＨＣおよびそれらの核はＲｉｂｅｙｅ（緑）により染色されている。スケールバー：１０μｍ。（Ｉ）最良のレスポンダーマウス１匹（＃３）からのヒトオトフェリン（青）に関して免疫染色した注入した左蝸牛の心尖部、ＭＴ、および基底回転の共焦点ｚ断面の最大強度投影像。ＩＨＣおよびそれらの核はＲｉｂｅｙｅ（緑）により染色されている。スケールバー：１０μｍ。
【図2-2】同上。
【図2-3】同上。
【図2-4】同上。
【図2-5】同上。
【図2-6】同上。
【図2-7】同上。
【図3】図３：形質導入細胞における完全長ヒトタンパク質オトフェリンを産生する組換え、転写、スプライシングおよび翻訳プロセスの概略図。ｐＡ＝ポリアデニル化部位、ＳＤ＝スプライスドナーエレメント、ＳＡ＝スプライスアクセプターエレメント、ＡＰ＝アルカリフォスファターゼ組換え誘導領域、ＩＴＲ＝末端逆位配列。
【図4】図４：二重ＡＡＶ ＯＴＯＦベクター戦略の概略図。ｐＡ＝ポリアデニル化部位、ＳＤ＝スプライスドナーエレメント、ＳＡ＝スプライスアクセプターエレメント、ＡＰ＝アルカリフォスファターゼ組換え誘導領域、ＩＴＲ＝末端逆位配列。
【図5-1】図５：Ａ．リポフェクタミンに基づくトランスフェクションを用いて二重ベクター送達後のヒトオトフェリンタンパク質のインビトロユビキタスＣＭＶプロモーター駆動発現のスキーム。Ｂ．二重プラスミド構成での３つのヒトオトフェリン切断部位の有効性評価。ＨＥＫ２９３細胞にＤｕａｌ ＯＴＯＦ Ｎｔｅｒ－Ｃｔｅｒ ７３８～７３９（黒色）、８９２－８９３（濃い灰色）、および９９７～９９８（薄灰色）プラスミドおよびそれらのそれぞれの対照（ＮｔｅｒまたはＣｔｅｒ単独）をトランスフェクトした。条件毎に、少なくとも２つの独立したウェルを用いて実験を３回実施した。各条件に対し、ウェル当り２００～３００ＤＡＰＩ陽性細胞の少なくとも３つの領域でオトフェリンに関して陽性（Ｎｔｅｒ＋Ｃｔｅｒ）の細胞の定量化を実施した。
【図5-2】同上。
【図6】図６：マウス蝸牛に存在するエクソンをまとめた図であり、マウス転写物（Ａ１－Ｂ２－Ｃ２）上に存在するエクソンおよびヒトアイソフォーム５転写物（Ａ２－Ｂ１－Ｃ２）上に存在するエクソンを強調している。
【図7-1】図７：Ａ．組換えプラスミド対と共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞における再構成完全長ヒトｃＤＮＡにより産生されたオトフェリン転写物のＲＴ－ＰＣＲ分析。ＲＮＡ抽出物を逆転写して、Ｏｔｏｆ Ｎｔｅｒと、Ｏｔｏｆ Ｃｔｅｒ ｃＤＮＡとの間の接合部を包含するオトフェリンｃＤＮＡの８９８または９４６ｂｐフラグメントを増幅するように設計されたプライマーを用いるＰＣＲ増幅に供した。陰性（非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞）および陽性（ＣＭＶプロモーターの制御下でＨｕＯＴＯＦ ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３）対照を示す。Ｍ：ＤＮＡ分子量マーカー。ＤＮＡラダーの０．５、および１．５ｋｂ分子量マーカーの位置を、電気泳動ゲルの左側上に示す。 Ｂ．ＨＥＫ２９３細胞の二重ｏｔｏｆプラスミドトランスフェクション後の完全長オトフェリンの発現。Ｍ：二重プラスミドのそれぞれに対し、対応するＮｔｅｒおよびＣｔｅｒまたはＮｔｅｒまたはＣｔｅｒ部分のみをトランスフェクションのために使用した。オトフェリン特異的抗体を使用して、完全長オトフェリンタンパク質を同定した。ＨｕＯＴＯＦ（Ｈｕ ｃＤＮＡ）プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を陽性対照として使用した。Ｍ：事前染色したタンパク質マーカー。ＴＯＴ：投入量（可溶性タンパク質抽出物）。ＩＰ：ＦＰ２オトフェリン抗体による免疫沈降に供したＨＥＫ２９３細胞からの抽出物。ＮＴ：非トランスフェクト細胞からの細胞溶解物。ＡＣＴＢ：抗ヒトβアクチンモノクローナル抗体を、異なるレーン間の内部負荷対照として使用した。タンパク質ラダーの異なる分子量マーカーの位置を、電気泳動ゲルの左側上に示す。星印は、非特異的抗体検出を示した（バンドは、非トランスフェクト細胞でも観察された）。
【図7-2】同上。
【図7-3】同上。
【実施例】
【0104】
実施例１：本発明のＡＡＶ８ベクターの活性
１．材料および方法
ＡＡＶベクターペプチドの生成
全てのＡＡＶオトフェリン組換えベクター組換えベクターを合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。
二重オトフェリンベクター構築物を生成するために、ヒトオトフェリンコード配列（ＯＴＯＦ転写物バリアント５；ＮＭ＿００１２８７４８９．２）を異なる天然のエクソン－エクソン接合部：エクソン１８－１９（ｎｔ １～２２１４／２２１５～５９９１、ａａ ７３８－７３９）、エクソン２０－２１（ｎｔ １～２４０６／２４０７～５９９１）、エクソン２１－２２（ｎｔ １～２５２３／２５２４～５９９１、ａａ ８４１－８４２）、エクソン２２－２３（ｎｔ １～２６７６／２６７７～５９９１、ａａ ８９２－８９３）、エクソン２４－２５（ｎｔ １～２９９１／２９９２～５９９１、ａａ ９９７－９９８）、およびエクソン２５－２６（ｎｔ １－３１２６／３１２７～５９９１、ａａ １０４２－１０４３）で分割した。
１．材料および方法
ＡＡＶベクターペプチドの生成
全てのＡＡＶオトフェリン組換えベクター組換えベクターを合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。
二重オトフェリンベクター構築物を生成するために、ヒトオトフェリンコード配列（ＯＴＯＦ転写物バリアント５；ＮＭ＿００１２８７４８９．２）を異なる天然のエクソン－エクソン接合部：エクソン１８－１９（ｎｔ １～２２１４／２２１５～５９９１、ａａ ７３８－７３９）、エクソン２０－２１（ｎｔ １～２４０６／２４０７～５９９１）、エクソン２１－２２（ｎｔ １～２５２３／２５２４～５９９１、ａａ ８４１－８４２）、エクソン２２－２３（ｎｔ １～２６７６／２６７７～５９９１、ａａ ８９２－８９３）、エクソン２４－２５（ｎｔ １～２９９１／２９９２～５９９１、ａａ ９９７－９９８）、およびエクソン２５－２６（ｎｔ １－３１２６／３１２７～５９９１、ａａ １０４２－１０４３）で分割した。
【0105】
５’ベクターｐ０１０１－ＣＭＶ－ＮｔｅｒｈｕＯＴＯＦ８９２（配列番号５６）を生成するために、合成フラグメントを合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ｐ０１０１＿ＣＭＶ＿ｅＧＦＰプラスミド（配列番号７７）にクローニングした。ｐ０１０１－ＣＭＶ－ＮｔｅｒｈｕＯＴＯＦ１０４２を生成するために、４５０ｐｂインサート（ヌクレオチド３６１７～４０６６）を合成し、ｐ０１０１－ＣＭＶ－ＮｔｅｒｈｕＯＴＯＦ８９２－ＡＰ中にクローニングした。次に、プラスミドＰ０１０１＿ＣＭＶ－ｈｕＯＴＯＦ７３８、８４１および９９７を、ｐ０１０１－ＣＭＶ－ＮｔｅｒｈｕＯＴＯＦ１０４２（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）から変異誘発により生成した。
【0106】
５’ベクターｐ０１０１－ＣＭＶ－イントロン－ＮｔｅｒｈｕＯＴＯＦ７３８、８０２、８４１、８９２、９９７、および１０４２を、上述のｐ０１０１－ＣＭＶ－ＮｔｅｒｈｕＯＴＯＦ７３８、８０２，８４１、８９２、９９７、および１０４２構築物（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）から変異誘発により生成した。
３’ベクター（ヒトＯＴＯＦ転写物バリアント５；ＮＭ＿００１２８７４８９．２）を生成するために、合成フラグメントを合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ｐ０１０１＿ＣＭＶ＿ｅＧＦＰプラスミド（配列番号７７）にクローニングし、これを、ＮｈｅＩ［２０５］－ＨｉｎｄＩＩＩ［１７０２］（４００７ｂｐのフラグメント）またはＮｈｅＩ［２０５］－ＢｇｌＩＩ［２２５６］（３４５３ｂｐのフラグメント）により消化した。
３’ベクター（ヒトＯＴＯＦ転写物バリアント５；ＮＭ＿００１２８７４８９．２）を生成するために、合成フラグメントを合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ｐ０１０１＿ＣＭＶ＿ｅＧＦＰプラスミド（配列番号７７）にクローニングし、これを、ＮｈｅＩ［２０５］－ＨｉｎｄＩＩＩ［１７０２］（４００７ｂｐのフラグメント）またはＮｈｅＩ［２０５］－ＢｇｌＩＩ［２２５６］（３４５３ｂｐのフラグメント）により消化した。
【0107】
マウスオトフェリンｃＤＮＡ配列の完全長コード配列（Ｏｔｏｆ１アイソフォーム１；ＮＭ＿００１１００３９５．１）を、５’フラグメント（ヌクレオチド１～２４４８）および３’フラグメント（ヌクレオチド２４４９～５９７９）に分割し、これらのフラグメントを合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。５’および３’フラグメントをｐ０１０１＿ＣＭＶ＿ｅＧＦＰプラスミド（配列番号７７）にクローニングした。５’ベクターｐ０１０１－ＣＭＶ－ＮｔｅｒマウスＯＴＯＦ８１６＿ＡＰ（配列番号７９）および３’ベクターＣｔｅｒ ＯＴＯＦマウス８１７＿ＡＰ（配列番号８０）を生成した（Ａｋｉｌ ｅｔ ａｌ．２０１９参照）。
５’フラグメントも同様にｐ０１０１＿ｓｍＣＢＡ＿ｅＧＦＰプラスミド（配列番号９６）にクローニングした。５’ベクターｐ０１０１－ｓｍＣＢＡ－ＮｔｅｒマウスＯＴＯＦ８１６＿ＡＰ（配列番号９５）を生成した（Ａｋｉｌ ｅｔ ａｌ．２０１９参照）。
５’フラグメントも同様にｐ０１０１＿ｓｍＣＢＡ＿ｅＧＦＰプラスミド（配列番号９６）にクローニングした。５’ベクターｐ０１０１－ｓｍＣＢＡ－ＮｔｅｒマウスＯＴＯＦ８１６＿ＡＰ（配列番号９５）を生成した（Ａｋｉｌ ｅｔ ａｌ．２０１９参照）。
【0108】
ＡＡＶ産生
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ（ＵＰｅｎｎ）またはＥＴＨ（Ｚｕｒｉｃｈ）Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ施設のいずれかにより、ＡＡＶベクターを産生した。ＡＡＶ力価は、ｄｄＰＣＲベース法（ＵＰｅｎｎ）または蛍光分析（ＥＴＨ）により測定して、ｍｌ当りのウイルスゲノム（ｖｇ／ｍｌ）で与えられた。最終濃縮ＡＡＶベクターストックをプルロニック－Ｆ６８（０．００１％）を含むＰＢＳ中（ＵＰｅｎｎ）、またはＭｇＣｌ２（１ｍＭ）およびＫＣｌ（２．５ｍＭ）を含むＰＢＳ中（ＥＴＨ）で保存した。
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ（ＵＰｅｎｎ）またはＥＴＨ（Ｚｕｒｉｃｈ）Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ施設のいずれかにより、ＡＡＶベクターを産生した。ＡＡＶ力価は、ｄｄＰＣＲベース法（ＵＰｅｎｎ）または蛍光分析（ＥＴＨ）により測定して、ｍｌ当りのウイルスゲノム（ｖｇ／ｍｌ）で与えられた。最終濃縮ＡＡＶベクターストックをプルロニック－Ｆ６８（０．００１％）を含むＰＢＳ中（ＵＰｅｎｎ）、またはＭｇＣｌ２（１ｍＭ）およびＫＣｌ（２．５ｍＭ）を含むＰＢＳ中（ＥＴＨ）で保存した。
【0109】
トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞におけるトランスジーンの発現
ＨＥＫ２９３細胞を５％ＣＯ２含有加湿チャンバー中、３７℃で培養した。ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレートにおいて１ｘ非必須アミノ酸、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中のポリリジンコートカバーガラス上で成長させた。免疫細胞化学分析のために、細胞をポリリシンコートカバーガラス上で成長させた。翌日、細胞に、リポフェクタミン３０００（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を７０～８０％のコンフルエンシーでトランスフェクトした。手短に説明すると、リポフェクタミン（登録商標）３０００試薬をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ．Ｍｉｘ中で希釈した。ＤＮＡ（０．２５～１０μｇ）をＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ中で希釈することにより、ＤＮＡのマスターミックスを調製した後、Ｐ３０００（商標）試薬を加えた。希釈ＤＮＡを希釈リポフェクタミン（登録商標）３０００試薬の各チューブに加えた（１：１比）。室温で５分間のインキュベーション後、ＤＮＡ－脂質複合体を細胞に加えた。トランスフェクションの翌日、培地を置換した。トランスフェクション後２４～４８時間の間に、免疫細胞化学およびＲＴ－ＰＣＲ分析のために細胞を収集した。
ＨＥＫ２９３細胞を５％ＣＯ２含有加湿チャンバー中、３７℃で培養した。ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルプレートにおいて１ｘ非必須アミノ酸、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中のポリリジンコートカバーガラス上で成長させた。免疫細胞化学分析のために、細胞をポリリシンコートカバーガラス上で成長させた。翌日、細胞に、リポフェクタミン３０００（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を７０～８０％のコンフルエンシーでトランスフェクトした。手短に説明すると、リポフェクタミン（登録商標）３０００試薬をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ．Ｍｉｘ中で希釈した。ＤＮＡ（０．２５～１０μｇ）をＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）Ｍｅｄｉｕｍ中で希釈することにより、ＤＮＡのマスターミックスを調製した後、Ｐ３０００（商標）試薬を加えた。希釈ＤＮＡを希釈リポフェクタミン（登録商標）３０００試薬の各チューブに加えた（１：１比）。室温で５分間のインキュベーション後、ＤＮＡ－脂質複合体を細胞に加えた。トランスフェクションの翌日、培地を置換した。トランスフェクション後２４～４８時間の間に、免疫細胞化学およびＲＴ－ＰＣＲ分析のために細胞を収集した。
【0110】
ＲＴ－ＰＣＲによるＯＴＯＦ発現
トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞をかき取り、全ＲＮＡをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ，７４０９５５）を用いて抽出した。その後、Ｎａｎｏｖｕｅ Ｐｌｕｓ分光光度計を用いて、ＲＮＡ投与量を評価した。特異的接合部断片を増幅するように設計された異なるプライマー対（エクソン１８－１９接合部に対し、順方向 ４Ｆ ＴＧＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＴＧＡＴＣＧＡＣ、配列番号４５および逆方向 ４Ｒ ＡＧＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣ、配列番号４６、およびエクソン２２－２３および２４－２５接合部に対し、順方向 ５Ｆ ＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧ、配列番号９３および逆方向 ５Ｒ ＡＧＴＡＣＧＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＴＣ、配列番号９４）を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１２５７４０１８）で、抽出したＲＮＡについてオトフェリン遺伝子の逆転写ＰＣＲを実施した。各ＲＴ－ＰＣＲ反応に関して、１μｇのＲＮＡ抽出物をテンプレートとして使用した。次に、ＰＣＲ産物を、臭化エチジウムを含む０．８％アガロースゲルで泳動させた。ＰＣＲ産物のサンガー塩基配列決定法をＴｒａｎｓｎｅｔｙｘ自動化塩基配列決定サービスにより実施した。
トランスフェクションＨＥＫ２９３細胞をかき取り、全ＲＮＡをＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ，７４０９５５）を用いて抽出した。その後、Ｎａｎｏｖｕｅ Ｐｌｕｓ分光光度計を用いて、ＲＮＡ投与量を評価した。特異的接合部断片を増幅するように設計された異なるプライマー対（エクソン１８－１９接合部に対し、順方向 ４Ｆ ＴＧＧＡＧＧＣＣＴＣＡＡＴＧＡＴＣＧＡＣ、配列番号４５および逆方向 ４Ｒ ＡＧＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＡＣ、配列番号４６、およびエクソン２２－２３および２４－２５接合部に対し、順方向 ５Ｆ ＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧ、配列番号９３および逆方向 ５Ｒ ＡＧＴＡＣＧＣＣＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＴＣ、配列番号９４）を用いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１２５７４０１８）で、抽出したＲＮＡについてオトフェリン遺伝子の逆転写ＰＣＲを実施した。各ＲＴ－ＰＣＲ反応に関して、１μｇのＲＮＡ抽出物をテンプレートとして使用した。次に、ＰＣＲ産物を、臭化エチジウムを含む０．８％アガロースゲルで泳動させた。ＰＣＲ産物のサンガー塩基配列決定法をＴｒａｎｓｎｅｔｙｘ自動化塩基配列決定サービスにより実施した。
【0111】
イムノブロットによるＯＴＯＦ発現分析タンパク質を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充したＲＩＰＡ緩衝液中での機械的なホモジナイゼーションにより抽出した。ボルテックス振盪により試料を氷中で３０分間インキュベートした後、４℃、１２，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。上清を収集して液体窒素中で凍結し、－８０℃で保持した。各溶解物のタンパク質濃度を、比色分析ＢＣＡプロテインアッセイ（市販キット）を用いて評価した。プロテインＡアガロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共にプレインキュベートした１４ＣＣ抗体を用いて、免疫沈降（ＩＰ）を実施した。免疫沈降物を１：１比率のＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料用緩衝液（４Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＮｕＰａｇｅ試料還元剤（１０Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の５０μｌ中に再懸濁した後、７０℃で１０分間インキュベートした。試料を１：１比率のＮｕＰＡＧＥ（商標）ＬＤＳ試料用緩衝液（４Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＮｕＰａｇｅ試料還元剤（１０Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した後、７０℃で１０分間インキュベートした。これらの変性タンパク質を３～８％ＮｕＰＡＧＥ（商標）トリス酢酸Ｎｏｖｅｘ Ｍｉｎｉ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ウェル当り１５μＬ）にロードし、ＮｕＰＡＧＥ（商標）トリス酢酸ＳＤＳランニング緩衝液（１Ｘ）中、１５０Ｖで１時間泳動させた。タンパク質を、Ｐｏｗｅｒ Ｂｌｏｔｔｅｒ－Ｓｅｍｉ Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、市販プロトコルに従って１５分間にわたりニトロセルロース膜に転写した。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．１％）およびミルク溶液（１％））中で１時間インキュベートした後、膜を、ブロッキング緩衝液中に加えた一次抗体（オトフェリンタンパク質のＮ－ｔｅｒ部分に対するウサギポリクローナル抗体ＦＰ２、１：１００希釈）によって４℃で一晩プロービングした。ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．１％）で数回の洗浄後、膜をブロッキング緩衝液中で二次ＨＲＰ抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ、１：５０００希釈）によりプロービングした。化学発光をＣｌａｒｉｔｙ（商標）Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ）により室温で５分間顕色させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｉｏｒａｄ）で検出した。トランスフェクトされたオトフェリンは、約２３０ｋＤａと予測された。次に、膜をストリッピング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でインキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（０．１％）で洗浄し、ブロッキング緩衝液中で１時間ブロックした。ハウスキーピングタンパク質評価を、βアクチンに対するモノクローナル抗体でブロットすることにより実施した。膜をブロッキング緩衝液中で一次抗体（マウスβアクチン抗体、１：５０００希釈、Ｓｉｇｍａ）で１時間にわたりプロービングした後、同じブロッキング緩衝液中、抗マウスＨＲＰ－抗体（１：５０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でプロービングした。化学発光をＥＣＬ基質により室温で５分間顕色させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｉｏｒａｄ）で検出した。
【0112】
マウスの蝸牛へのベクター送達
全ての外科手術およびウイルス注入をバイオセーフティレベル２実験室で実施した。異なる生後段階（Ｐ１０～Ｐ２５）のＣ５７ＢＬ／６野性型またはＯｔｏｆ－／－マウスをイソフルラン（誘導用に４％、維持用に２％）で麻酔した。疼痛を減らすために、マウスに、手術の初めに、鎮痛薬、メロキシカム（Ｍｅｔａｃａｍ（登録商標）、０．２ｍｇ／ｋｇ／日）の皮下注射、および耳介後方領域に局所麻酔（Ｌａｏｃａｉｎｅ（登録商標）、５ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を行った。麻酔した動物を、手術全体を通してマウスが完全に覚醒するまで、サーモパッド上に置いた。Ａｋｉｌら（２０１９）に記載されるように、蝸牛内注入を実施した。耳介後方切開により左耳にアプローチした。頸部筋肉の切開後、聴胞器を露出させ、２５Ｇ針で穿刺した。開口を必要に応じて鉗子で広げてアブミ骨動脈および正円窓膜（ＲＷＭ）を可視化した。ＲＷＭの中央部をガラスピペットで軽く穿刺した後、固定体積（２マイクロリットル）の、配列番号７７のＡＡＶ８－ＣＭＶ＿ＧＦＰ（５．６ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）、または配列番号７７のＡｎｃ８０Ｌ６５－ＣＭＶ－ＧＦＰ（５．５ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ）、または配列番号７７のＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（１．２ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）または配列番号７９のＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＮｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１６＿ＡＰ（１．３ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号８０のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１７＿ＡＰ（１．５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）ベクター対、または配列番号９５のＡＡＶ８－ｓｍＣＢＡ ＮｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１６＿ＡＰ（１．５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号８０のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１７＿ＡＰ（１．５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）ベクター対、または配列番号５６のＡＡＶ８－ＣＭＶＮｔｅｒＯＴＯＦｈｕ８９２＿ＡＰ（１．１ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号５８のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｈｕ８９３＿ＡＰ（０．８５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）ベクター対のいずれかを含有するＰＢＳまたはウイルス溶液を、ＲＷＭを介して、ガラスマイクロピペットに結合したポンプシステムを使用して注入した。ピペットを引き抜いた後にＲＷ小窩を、筋肉上に配置した小液滴の生物学的粘着性物質（Ｖｅｔｂｏｎｄ（登録商標）３Ｍ）で固定した筋肉の小さい栓で素早く密閉し、正円窓からの漏出を回避し、脂肪の小さい栓で気泡の開口部を閉じた。蝸牛中のＧＦＰまたはＯＴＯＦ発現を免疫蛍光法により評価した。
全ての外科手術およびウイルス注入をバイオセーフティレベル２実験室で実施した。異なる生後段階（Ｐ１０～Ｐ２５）のＣ５７ＢＬ／６野性型またはＯｔｏｆ－／－マウスをイソフルラン（誘導用に４％、維持用に２％）で麻酔した。疼痛を減らすために、マウスに、手術の初めに、鎮痛薬、メロキシカム（Ｍｅｔａｃａｍ（登録商標）、０．２ｍｇ／ｋｇ／日）の皮下注射、および耳介後方領域に局所麻酔（Ｌａｏｃａｉｎｅ（登録商標）、５ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を行った。麻酔した動物を、手術全体を通してマウスが完全に覚醒するまで、サーモパッド上に置いた。Ａｋｉｌら（２０１９）に記載されるように、蝸牛内注入を実施した。耳介後方切開により左耳にアプローチした。頸部筋肉の切開後、聴胞器を露出させ、２５Ｇ針で穿刺した。開口を必要に応じて鉗子で広げてアブミ骨動脈および正円窓膜（ＲＷＭ）を可視化した。ＲＷＭの中央部をガラスピペットで軽く穿刺した後、固定体積（２マイクロリットル）の、配列番号７７のＡＡＶ８－ＣＭＶ＿ＧＦＰ（５．６ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）、または配列番号７７のＡｎｃ８０Ｌ６５－ＣＭＶ－ＧＦＰ（５．５ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ）、または配列番号７７のＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（１．２ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）または配列番号７９のＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＮｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１６＿ＡＰ（１．３ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号８０のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１７＿ＡＰ（１．５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）ベクター対、または配列番号９５のＡＡＶ８－ｓｍＣＢＡ ＮｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１６＿ＡＰ（１．５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号８０のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１７＿ＡＰ（１．５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）ベクター対、または配列番号５６のＡＡＶ８－ＣＭＶＮｔｅｒＯＴＯＦｈｕ８９２＿ＡＰ（１．１ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号５８のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｈｕ８９３＿ＡＰ（０．８５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）ベクター対のいずれかを含有するＰＢＳまたはウイルス溶液を、ＲＷＭを介して、ガラスマイクロピペットに結合したポンプシステムを使用して注入した。ピペットを引き抜いた後にＲＷ小窩を、筋肉上に配置した小液滴の生物学的粘着性物質（Ｖｅｔｂｏｎｄ（登録商標）３Ｍ）で固定した筋肉の小さい栓で素早く密閉し、正円窓からの漏出を回避し、脂肪の小さい栓で気泡の開口部を閉じた。蝸牛中のＧＦＰまたはＯＴＯＦ発現を免疫蛍光法により評価した。
【0113】
非ヒト霊長類の蝸牛へのベクター送達
一晩絶食後、動物をケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびプロポフォール（５～１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋肉注射により麻酔し、気管挿管し、手術中、酸素およびイソフルランで維持した。動物に、抗生物質（Ｄｕｐｈａｍｏｘ １５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）および抗炎症薬（トルフェジン ４ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）の予防注射を行った。経外耳道アプローチを用いて、左または右耳の正円窓小窩（ＲＷ）を露出させた。外耳道へのアクセスは、耳前切開により達成された。外耳道および鼓膜の皮膚を、持ち上げた。外耳道の後部および前部に穴を開けて、中耳にアクセスし、ＲＷ小窩およびアブミ骨を露出させることにより、管形成術を実施した。正円窓小窩に穴をあけ、それを開口させることなく、その膜を露出させた、その後、ダイオードレーザーおよび３００マイクロメートル外径ファイバーを用いて、プラチノトミー（ｐｌａｔｉｎｏｔｏｍｙ）を実施した。プラチナの開口部を、穿孔器を用いて、卵円窓からの外リンパ漏出の可視化によりチェックした。ＲＷ膜を、蝸牛へのアクセスを得るために手術用双眼顕微鏡下で２５標準規格注射針の先端部によって切開し、１ｍｍ長さの薄いカテーテル（Ｍｅｄｅｌ ｃａｔｈｅｔｅｒ）をＲＷの中に挿入した。１つの耳介の手術の総時間は、平均１時間であった。注入後、小さい筋肉移植片を用いて卵円窓および正円窓開口部の密閉を実施した。ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰを発現しているウイルス調製物（ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰ ２．８ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ、ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ １．４ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）（３０μＬ）の注入を、従量式シリンジポンプを用いて実施した。内耳内の過剰圧効果を回避するために、注入速度および体積を１μｌ／５ｓに設定した。動物を、以降の８時間にわたり、姿勢不安定、眼振および他の前庭機能不全の徴候に関して観察した。注意深いモニタリングのために動物を個別の区画に収容した手術後の３～４日の間を除いて、動物を少なくとも二匹一組で収容した。加えて、ストレスを制限するために適合させた強化プログラムを行い、グループモニタリングを実施して社会集団で生じ得る対立を特定し、管理する。動物を、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ；ＩＭ）の注入により麻酔して深い麻酔に入り、静脈カテーテルの留置後、プロポフォール（１ｍｌ／ｋｇ；ＩＶ）で維持した、深い麻酔下（覚醒なし）で、胸郭を開いた後、動物に、深い麻酔下の間に、心臓内の灌流を最初のＰＢＳ（２００ｍＬ）に続けて、４％のパラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）（５００ｍＬ）を投与した。
一晩絶食後、動物をケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびプロポフォール（５～１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物の筋肉注射により麻酔し、気管挿管し、手術中、酸素およびイソフルランで維持した。動物に、抗生物質（Ｄｕｐｈａｍｏｘ １５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）および抗炎症薬（トルフェジン ４ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）の予防注射を行った。経外耳道アプローチを用いて、左または右耳の正円窓小窩（ＲＷ）を露出させた。外耳道へのアクセスは、耳前切開により達成された。外耳道および鼓膜の皮膚を、持ち上げた。外耳道の後部および前部に穴を開けて、中耳にアクセスし、ＲＷ小窩およびアブミ骨を露出させることにより、管形成術を実施した。正円窓小窩に穴をあけ、それを開口させることなく、その膜を露出させた、その後、ダイオードレーザーおよび３００マイクロメートル外径ファイバーを用いて、プラチノトミー（ｐｌａｔｉｎｏｔｏｍｙ）を実施した。プラチナの開口部を、穿孔器を用いて、卵円窓からの外リンパ漏出の可視化によりチェックした。ＲＷ膜を、蝸牛へのアクセスを得るために手術用双眼顕微鏡下で２５標準規格注射針の先端部によって切開し、１ｍｍ長さの薄いカテーテル（Ｍｅｄｅｌ ｃａｔｈｅｔｅｒ）をＲＷの中に挿入した。１つの耳介の手術の総時間は、平均１時間であった。注入後、小さい筋肉移植片を用いて卵円窓および正円窓開口部の密閉を実施した。ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰを発現しているウイルス調製物（ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰ ２．８ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ、ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ １．４ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）（３０μＬ）の注入を、従量式シリンジポンプを用いて実施した。内耳内の過剰圧効果を回避するために、注入速度および体積を１μｌ／５ｓに設定した。動物を、以降の８時間にわたり、姿勢不安定、眼振および他の前庭機能不全の徴候に関して観察した。注意深いモニタリングのために動物を個別の区画に収容した手術後の３～４日の間を除いて、動物を少なくとも二匹一組で収容した。加えて、ストレスを制限するために適合させた強化プログラムを行い、グループモニタリングを実施して社会集団で生じ得る対立を特定し、管理する。動物を、ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ；ＩＭ）の注入により麻酔して深い麻酔に入り、静脈カテーテルの留置後、プロポフォール（１ｍｌ／ｋｇ；ＩＶ）で維持した、深い麻酔下（覚醒なし）で、胸郭を開いた後、動物に、深い麻酔下の間に、心臓内の灌流を最初のＰＢＳ（２００ｍＬ）に続けて、４％のパラホルムアルデヒド（ｐＨ７．４）（５００ｍＬ）を投与した。
【0114】
解剖した蝸牛を同じ固定液で潅流した後、１０日間の脱石灰のためにＥＤＴＡ溶液に移した（Ｋｏｓマイクロ波）。ＥＤＴＡを２回新しくし、脱灰骨を交換毎にトリミングした。蝸牛感覚上皮（コルチ器官）を顕微解剖した後、ＧＦＰ免疫検出のために処理した。
コルチ器官を、２０％のウマ血清、０．３％のＴｒｉｔｏｎＴｒｉｔｏｎＸ－１００、および０．３％のＰＢＳ中サポニンを含むＰＢＳ中、室温で１時間プレインキュベートし、その後、一次抗体（ニワトリ抗ＧＦＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、希釈ブロッキング緩衝液（希釈１：２０）中、室温で一晩インキュベートした。試料をＰＢＳにより３回すすぎ、適切な二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、ＰＢＳ中、室温で１時間インキュベートした。次に、試料をファロイジン－Ａｔｔｏ５６５（Ｓｉｇｍａ）および４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）により染色して細胞核を可視化し、１滴のＦｌｕｏｒｓａｖｅ溶媒でスライドガラス上にマウントし、Ｚｅｉｓｓ共焦点免疫蛍光顕微鏡で観察した。
コルチ器官を、２０％のウマ血清、０．３％のＴｒｉｔｏｎＴｒｉｔｏｎＸ－１００、および０．３％のＰＢＳ中サポニンを含むＰＢＳ中、室温で１時間プレインキュベートし、その後、一次抗体（ニワトリ抗ＧＦＰ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、希釈ブロッキング緩衝液（希釈１：２０）中、室温で一晩インキュベートした。試料をＰＢＳにより３回すすぎ、適切な二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、ＰＢＳ中、室温で１時間インキュベートした。次に、試料をファロイジン－Ａｔｔｏ５６５（Ｓｉｇｍａ）および４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）により染色して細胞核を可視化し、１滴のＦｌｕｏｒｓａｖｅ溶媒でスライドガラス上にマウントし、Ｚｅｉｓｓ共焦点免疫蛍光顕微鏡で観察した。
【0115】
聴覚試験
麻酔したＯｔｏｆ＋／＋マウス、Ｏｔｏｆ－／－マウス、および救出されたＯｔｏｆ－／－マウスにおいて、以前に記載のように、防音室内において種々の時点で聴覚検査を実施した（Ａｋｉｌ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
純音刺激を５、１０、１５、２０、３２、および４０ｋＨｚの周波数で使用した。目視検査時にＩ～Ｖ波のＡＢＲピークが明確に定義され、繰り返し存在する最低刺激レベルとして、聴覚閾値を定義した。ＡＢＲをＭａｔｌａｂソフトウェアで分析した。
麻酔したＯｔｏｆ＋／＋マウス、Ｏｔｏｆ－／－マウス、および救出されたＯｔｏｆ－／－マウスにおいて、以前に記載のように、防音室内において種々の時点で聴覚検査を実施した（Ａｋｉｌ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
純音刺激を５、１０、１５、２０、３２、および４０ｋＨｚの周波数で使用した。目視検査時にＩ～Ｖ波のＡＢＲピークが明確に定義され、繰り返し存在する最低刺激レベルとして、聴覚閾値を定義した。ＡＢＲをＭａｔｌａｂソフトウェアで分析した。
【0116】
蛍光顕微鏡法
インビトロ試験
トランスフェクトした細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中の４％パラホルムアルデヒドを用いて、室温で２０分間固定し、ＰＢＳにより３回すすぎすすぎ、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００と共に室温で１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回すすぎ、ＰＢＳ中のウマ血清（２０％）を用いて室温で１時間ブロックした。その後、細胞を、オトフェリンのＣ末端部分に対するウサギポリクローナル抗体ＦＰ２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、希釈１：２００）と、オトフェリンのＮ末端部分に対するマウスモノクローナル抗体（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、希釈１：１００）との混合物と共に室温で１時間インキュベートした。試料をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒヤギ抗ウサギ４８８、ヤギ抗マウス５５５、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、希釈１：５００）と共に、室温で１時間インキュベートした。次に、試料をＰＢＳで２回すすぎ、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色して細胞核を可視化し、１滴のＦｌｕｏｒｓａｖｅ溶媒（ＥＭＢ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でスライドガラス上にマウントし、Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いて観察した。
インビトロ試験
トランスフェクトした細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中の４％パラホルムアルデヒドを用いて、室温で２０分間固定し、ＰＢＳにより３回すすぎすすぎ、０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００と共に室温で１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回すすぎ、ＰＢＳ中のウマ血清（２０％）を用いて室温で１時間ブロックした。その後、細胞を、オトフェリンのＣ末端部分に対するウサギポリクローナル抗体ＦＰ２（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、希釈１：２００）と、オトフェリンのＮ末端部分に対するマウスモノクローナル抗体（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、希釈１：１００）との混合物と共に室温で１時間インキュベートした。試料をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒヤギ抗ウサギ４８８、ヤギ抗マウス５５５、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、希釈１：５００）と共に、室温で１時間インキュベートした。次に、試料をＰＢＳで２回すすぎ、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色して細胞核を可視化し、１滴のＦｌｕｏｒｓａｖｅ溶媒（ＥＭＢ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でスライドガラス上にマウントし、Ｏｌｙｍｐｕｓ共焦点免疫蛍光顕微鏡を用いて観察した。
【0117】
インビボ試験
マウス蝸牛を４％パラホルムアルデヒドの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中溶液で灌流し、同じ固定液中、４℃で４５分間ＲＴでインキュベートした。蝸牛をＰＢＳで３回すすぎ、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に４℃で一晩インキュベートすることにより脱灰した。数回（ＰＢＳで３回）すすいだ後、蝸牛感覚上皮（コルチ器官）を表層標本に顕微解剖し、０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００およびＰＢＳ中の２０％のウマ血清（ブロッキング緩衝液）中、室温で１時間プレインキュベートし、および一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。以下の抗体を使用した：ニワトリポリクローナルＧＦＰ（１：４００希釈、Ａｂｃａｍ）、またはウサギ抗オトフェリン（１：１００希釈、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）、マウス（ＩｇＧ１）抗ＣｔＢＰ２（１：２００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および抗グルタミン酸受容体サブユニットＡ２（１：２０００希釈；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。試料をＰＢＳで３回すすぎ、適切な二次抗体：Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗ニワトリｌｇＹ（１：５００希釈；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＡｔｔｏ Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ウサギＩｇＧ（１：２００希釈；Ｓｉｇｍａ）、Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ１およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８標識抗マウスｌｇＧ２ａ（１：５００希釈；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にインキュベートした。試料をＰＢＳで３回すすぎ、適切な二次抗体と共にインキュベートした：試料をＰＢＳで３回洗浄し、細胞核を染色するためにＤＡＰＩ（１：７５００希釈）を用いて、１滴のＦｌｕｏｒｓａｖｅでスライドガラス上に取り付けた。高解像度の対物レンズ（６３ｘ 油浸対物レンズ）を備えたＬＳＭ７００共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、コルチ器官の蛍光共焦点ｚスタックを取得した。次に、ＦＩＪＩソフトウェアを使用して画像を分析した。
マウス蝸牛を４％パラホルムアルデヒドの０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中溶液で灌流し、同じ固定液中、４℃で４５分間ＲＴでインキュベートした。蝸牛をＰＢＳで３回すすぎ、０．５Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と共に４℃で一晩インキュベートすることにより脱灰した。数回（ＰＢＳで３回）すすいだ後、蝸牛感覚上皮（コルチ器官）を表層標本に顕微解剖し、０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００およびＰＢＳ中の２０％のウマ血清（ブロッキング緩衝液）中、室温で１時間プレインキュベートし、および一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。以下の抗体を使用した：ニワトリポリクローナルＧＦＰ（１：４００希釈、Ａｂｃａｍ）、またはウサギ抗オトフェリン（１：１００希釈、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）、マウス（ＩｇＧ１）抗ＣｔＢＰ２（１：２００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および抗グルタミン酸受容体サブユニットＡ２（１：２０００希釈；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。試料をＰＢＳで３回すすぎ、適切な二次抗体：Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗ニワトリｌｇＹ（１：５００希釈；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＡｔｔｏ Ｆｌｕｏｒ６４７標識抗ウサギＩｇＧ（１：２００希釈；Ｓｉｇｍａ）、Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ１およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８標識抗マウスｌｇＧ２ａ（１：５００希釈；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にインキュベートした。試料をＰＢＳで３回すすぎ、適切な二次抗体と共にインキュベートした：試料をＰＢＳで３回洗浄し、細胞核を染色するためにＤＡＰＩ（１：７５００希釈）を用いて、１滴のＦｌｕｏｒｓａｖｅでスライドガラス上に取り付けた。高解像度の対物レンズ（６３ｘ 油浸対物レンズ）を備えたＬＳＭ７００共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、コルチ器官の蛍光共焦点ｚスタックを取得した。次に、ＦＩＪＩソフトウェアを使用して画像を分析した。
【0118】
トランスフェクション率
オトフェリンタンパク質発現細胞の比率を以下のように計算した：検出可能な緑色蛍光シグナルを有する細胞の数／細胞の総数（ＤＡＰＩ染色細胞核）。この計数をＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔ ３．１イメージングソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）により全カバーガラスまたはスライド上で実施した。
オトフェリンタンパク質発現細胞の比率を以下のように計算した：検出可能な緑色蛍光シグナルを有する細胞の数／細胞の総数（ＤＡＰＩ染色細胞核）。この計数をＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔ ３．１イメージングソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）により全カバーガラスまたはスライド上で実施した。
【0119】
２．結果
２．１．ＣＭＶプロモーターによるＡＡＶ８ベクターの指向性のインビボ試験（ＷＴ動物）
２．１．１．最初に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける単回蝸牛内注入後の成熟段階（Ｐ１２）でＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰが内耳細胞に形質導入する能力を分析した。ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰは、オトフェリンが発現されるＩＨＣを主に標的とし、および形質導入率は、基底部および心尖部でそれぞれ、８９および１００％であることが見出された（図１Ａ）。これらの結果は、治療遺伝子をＩＨＣへ送達するための、このＡＡＶカプシド／プロモーターの組み合わせが適切であることを示す。
２．１．ＣＭＶプロモーターによるＡＡＶ８ベクターの指向性のインビボ試験（ＷＴ動物）
２．１．１．最初に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける単回蝸牛内注入後の成熟段階（Ｐ１２）でＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰが内耳細胞に形質導入する能力を分析した。ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰは、オトフェリンが発現されるＩＨＣを主に標的とし、および形質導入率は、基底部および心尖部でそれぞれ、８９および１００％であることが見出された（図１Ａ）。これらの結果は、治療遺伝子をＩＨＣへ送達するための、このＡＡＶカプシド／プロモーターの組み合わせが適切であることを示す。
【0120】
２．１．２．マウスにおけるいくつかのＡＡＶ血清型の内耳指向性
いくつかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型（ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、およびＡｎｃ８０）が成熟マウス有毛細胞に形質導入する能力を評価した。ＣＭＶプロモーターがレポーター遺伝子としてのＧＦＰの発現を促進する、各組換えベクターの単回のウイルス蝸牛内注入後に達成されたＩＨＣ形質導入率を調べた。
成熟段階（Ｐ２０）のＣ５７ＢＬ／６野性型マウスに、ＡＡＶ組換えベクターを、ＲＷＭを介して注入した（２マイクロリットル）。より正確には、以前に記載されたように（Ａｋｉｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１９））、左耳に背側切開を介してアプローチし、ウイルスを蝸牛に送達した。麻酔したＣ５７ＢＬ／６野性型またはＯｔｏｆ－／－マウスに、蝸牛の正円窓を介して、２マイクロリットルの配列番号７７含有ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰ（５．６ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）、配列番号７７含有Ａｎｃ８０Ｌ６５－ＣＭＶ－ＧＦＰ（５．５ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ）、または配列番号７７含有ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（１．２ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）を含有するウイルス溶液を投与した。蝸牛中のＧＦＰ発現を免疫蛍光法により評価した（図１Ｂ））。
いくつかのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型（ＡＡＶ２、ＡＡＶ８、およびＡｎｃ８０）が成熟マウス有毛細胞に形質導入する能力を評価した。ＣＭＶプロモーターがレポーター遺伝子としてのＧＦＰの発現を促進する、各組換えベクターの単回のウイルス蝸牛内注入後に達成されたＩＨＣ形質導入率を調べた。
成熟段階（Ｐ２０）のＣ５７ＢＬ／６野性型マウスに、ＡＡＶ組換えベクターを、ＲＷＭを介して注入した（２マイクロリットル）。より正確には、以前に記載されたように（Ａｋｉｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１９））、左耳に背側切開を介してアプローチし、ウイルスを蝸牛に送達した。麻酔したＣ５７ＢＬ／６野性型またはＯｔｏｆ－／－マウスに、蝸牛の正円窓を介して、２マイクロリットルの配列番号７７含有ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰ（５．６ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）、配列番号７７含有Ａｎｃ８０Ｌ６５－ＣＭＶ－ＧＦＰ（５．５ｘ１０１２ｖｇ／ｍｌ）、または配列番号７７含有ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰ（１．２ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）を含有するウイルス溶液を投与した。蝸牛中のＧＦＰ発現を免疫蛍光法により評価した（図１Ｂ））。
【0121】
分析は、ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰが主に、全蝸牛らせんを通してＩＨＣを標的とし（ＩＨＣ形質導入９４％）、外有毛細胞（ＯＨＣ）を標的としなかった（＜１％）ことを示している。Ａｎｃ８０Ｌ６５は、蝸牛らせん全体を通して、主にＩＨＣに（９７％）、より少ない程度にＯＨＣに（１３％）形質導入した。ＡＡＶ２は、ＩＨＣのみでなく（９５％）、ＯＨＣにも（６０～８０％）形質導入した（図１Ｂの例示的画像を参照）。
したがって、ユビキタスＣＭＶプロモーターと組み合わせたＡＡＶ８は、成熟ＩＨＣをインビボで標的化するための高度に効率的な組換えベクターである。
したがって、ユビキタスＣＭＶプロモーターと組み合わせたＡＡＶ８は、成熟ＩＨＣをインビボで標的化するための高度に効率的な組換えベクターである。
【0122】
２．１．３．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の内耳のＡＡＶＳ指向性
マウスで試験したいくつかのＡＡＶＳの指向性を非ヒト霊長類でさらに調べた。ウイルス調製物を、卵円窓での小さい窓形成と組み合わせて、正円窓を介して（経外耳道下鼓室切開術アプローチ）非ヒト霊長類の蝸牛に注入した（注入体積：３０マイクロリットル）。全ての注入した蝸牛をトランスジーン送達の３週後に固定し、ＧＦＰレポーター遺伝子に関して免疫標識するために処理した。
重要なことに、結果（例示的画像として、図１Ｃおよび１Ｄを参照）は、ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰの形質導入率およびパターンプロファイルがマウスで得られたものと類似であることを示しており：ＡＡＶ８ベクターは、効率的かつ特異的にＩＨＣに（最大９５％）および程度は少ないものの注入した蝸牛の支持細胞に形質導入した。いずれのＯＨＣも、ＡＡＶ８ベクターの形質導入を受けなかった。これに対して、ＡＡＶ２は、マウスで観察されたように、ＯＨＣに（４０％）、ならびにＩＨＣ（７９％）に形質導入することができた（２．１．１．参照）。この非特異的感染性は、ＯＨＣの同程度の標的化により、これらの細胞はＤＦＮＢ９難聴の場合には欠陥ではないにもかかわらず、処置遺伝子の非特異的発現のリスクを増大させ得る。
マウスで試験したいくつかのＡＡＶＳの指向性を非ヒト霊長類でさらに調べた。ウイルス調製物を、卵円窓での小さい窓形成と組み合わせて、正円窓を介して（経外耳道下鼓室切開術アプローチ）非ヒト霊長類の蝸牛に注入した（注入体積：３０マイクロリットル）。全ての注入した蝸牛をトランスジーン送達の３週後に固定し、ＧＦＰレポーター遺伝子に関して免疫標識するために処理した。
重要なことに、結果（例示的画像として、図１Ｃおよび１Ｄを参照）は、ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＧＦＰの形質導入率およびパターンプロファイルがマウスで得られたものと類似であることを示しており：ＡＡＶ８ベクターは、効率的かつ特異的にＩＨＣに（最大９５％）および程度は少ないものの注入した蝸牛の支持細胞に形質導入した。いずれのＯＨＣも、ＡＡＶ８ベクターの形質導入を受けなかった。これに対して、ＡＡＶ２は、マウスで観察されたように、ＯＨＣに（４０％）、ならびにＩＨＣ（７９％）に形質導入することができた（２．１．１．参照）。この非特異的感染性は、ＯＨＣの同程度の標的化により、これらの細胞はＤＦＮＢ９難聴の場合には欠陥ではないにもかかわらず、処置遺伝子の非特異的発現のリスクを増大させ得る。
【0123】
したがって、これらの結果は、ＮＨＰ蝸牛に送達された本発明のＡＡＶ８カプシド／ＣＭＶプロモーターの組み合わせが、非常に効率的かつ特異的にＩＨＣに形質導入するが、ＯＨＣには形質導入しない（ＡＡＶ２－ＣＭＶ－ＧＦＰとは逆に）ことを実証する。
【0124】
２．２．二重ベクター構成における異なるヒトオトフェリン切断部位の有効性評価
発明者らは、二重マウスオトフェリンＣＭＶベクターおよびヒトオトフェリンタンパク質を発現している改変二重ＡＡＶベクターに使用した同じ戦略を採用した（図３）。二重ＡＡＶの有効性は、ｃＤＮＡ内の分割部位により影響され得ることから、種々の切断部位を用いていくつかのヒトオトフェリンフラグメントを生成し、それらが組み換えて完全長オトフェリンタンパク質を再構成する能力をインビトロで比較した。
二重ヒトオトフェリンベクター構築物を生成するために、ヒトオトフェリンｃＤＮＡの蝸牛アイソフォーム（転写物バリアント５、および新規転写物バリアント）の完全長コード配列を異なる５’フラグメント（ｎｔ １～２２１４、ｎｔ １～２４０６、ｎｔ １～２５２３、ｎｔ １～２６７６、ｎｔ １～２９９１、およびｎｔ １～３１２６）および３’フラグメント（ｎｔ ２２１５～５９９１、ｎｔ ２４０７～５９９１、ｎｔ ２５２４～５９９１、ｎｔ ２６７７～５９９１、ｎｔ ２９９２～５９９１、およびｎｔ ３１２７～５９９１）に分割した。５’構築物は、ＣＭＶプロモーターの制御下のｈＯＴＯＦ ｃＤＮＡ（アミノ酸（ａａ）１～７３８、ａａ １～８０２、ａａ １～８４１、ａａ １～８９２、ａａ １～９９７およびａａ １～１０４２をコードする）の５’フラグメント、必要に応じてその後に続くイントロン配列、および／またはコザック配列コザック配列、その後に続く、スプライスドナー部位（ＳＤ）を含み、３’構築物は、ｈＯＴＯＦ ｃＤＮＡ（ａａ ７３９～１９９７、ａａ ８０３～１９９７、ａａ ８４２～１９９７、ａａ ８９３～１９９７、ａａ ９９８～１９９７、およびａａ １０４３～１９９７をコードする）の３’部分、およびスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含んだ（図３）。アルカリフォスファターゼ組換え架橋配列（ＡＰ）を含有する全てのフラグメントを、ｐ０１０１－ＣＭＶ－Ｎｔｅｒ ｈｕＯＴＯＦ（７３８、８０２、８４１、８９２、９９７および１０４２）およびｐ０１０１－ｈＯＴＯＦ Ｃｔｅｒ ｈｕＯＴＯＦ（７３９、８０３、８４２、８９３、９９８および１０４３）構築物と呼ばれる、ＡＡＶ－ｐ０１０１プラスミドに挿入した。
発明者らは、二重マウスオトフェリンＣＭＶベクターおよびヒトオトフェリンタンパク質を発現している改変二重ＡＡＶベクターに使用した同じ戦略を採用した（図３）。二重ＡＡＶの有効性は、ｃＤＮＡ内の分割部位により影響され得ることから、種々の切断部位を用いていくつかのヒトオトフェリンフラグメントを生成し、それらが組み換えて完全長オトフェリンタンパク質を再構成する能力をインビトロで比較した。
二重ヒトオトフェリンベクター構築物を生成するために、ヒトオトフェリンｃＤＮＡの蝸牛アイソフォーム（転写物バリアント５、および新規転写物バリアント）の完全長コード配列を異なる５’フラグメント（ｎｔ １～２２１４、ｎｔ １～２４０６、ｎｔ １～２５２３、ｎｔ １～２６７６、ｎｔ １～２９９１、およびｎｔ １～３１２６）および３’フラグメント（ｎｔ ２２１５～５９９１、ｎｔ ２４０７～５９９１、ｎｔ ２５２４～５９９１、ｎｔ ２６７７～５９９１、ｎｔ ２９９２～５９９１、およびｎｔ ３１２７～５９９１）に分割した。５’構築物は、ＣＭＶプロモーターの制御下のｈＯＴＯＦ ｃＤＮＡ（アミノ酸（ａａ）１～７３８、ａａ １～８０２、ａａ １～８４１、ａａ １～８９２、ａａ １～９９７およびａａ １～１０４２をコードする）の５’フラグメント、必要に応じてその後に続くイントロン配列、および／またはコザック配列コザック配列、その後に続く、スプライスドナー部位（ＳＤ）を含み、３’構築物は、ｈＯＴＯＦ ｃＤＮＡ（ａａ ７３９～１９９７、ａａ ８０３～１９９７、ａａ ８４２～１９９７、ａａ ８９３～１９９７、ａａ ９９８～１９９７、およびａａ １０４３～１９９７をコードする）の３’部分、およびスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含んだ（図３）。アルカリフォスファターゼ組換え架橋配列（ＡＰ）を含有する全てのフラグメントを、ｐ０１０１－ＣＭＶ－Ｎｔｅｒ ｈｕＯＴＯＦ（７３８、８０２、８４１、８９２、９９７および１０４２）およびｐ０１０１－ｈＯＴＯＦ Ｃｔｅｒ ｈｕＯＴＯＦ（７３９、８０３、８４２、８９３、９９８および１０４３）構築物と呼ばれる、ＡＡＶ－ｐ０１０１プラスミドに挿入した。
【0125】
これらの構築物の配列は、同封のリストの、ヒトＯＴＯＦのアイソフォーム５のＮ末端またはＣ末端部分をコードする配列番号４７～６４および配列番号７０～７５で与えられる。
【0126】
【表1】
【0127】
ＨＥＫ２９３細胞に、リポフェクタミンを用いて、ｐ０１０１ ＣＭＶ－ＮＴｅｒｈｕＯＴＯＦ単独（７３８、８０２、８４１、８９２、９９７および１０４２、Ｌｅｆｔ ｐａｎｅｌ）、ｐ０１０１ ＣＴｅｒｈｕＯＴＯＦ単独（７３９、８０３、８４２、８９３、９９８および１０４３、Ｒｉｇｈｔ ｐａｎｅｌ）、またはｐ０１０１ ＣＭＶ－ＮＴｅｒｈｕＯＴＯＦおよびｐ０１０１ ＣＴｅｒｈｕＯＴＯＦ（７３８－７３９、８０２－８０３、８９２－８９３、９９７－９９８および１０４２－１０４３）の両方のいずれかをトランスフェクトした。
【0128】
細胞をオトフェリン発現のために、ヒトオトフェリンのＮ末端およびＣ末端部分に対して、以前に特徴付けたマウスモノクローナル抗体１０Ｈ９（赤）およびウサギポリクローナル抗体ＦＰ２（緑）で、それぞれ、トランスフェクションの４８時間後に染色した（希釈１：２００）。ＡＣＴＩＮフィラメントをファロイジン（オレンジ）で標識し、細胞核をＤＡＰＩ（青）で標識した（図示せず）。３つの切断部位の結果のみを示す。
【0129】
結果は、接合部７３８－７３９、８９２－８９３、および９９７－９９８を含む全ての試験した二重プラスミド構成が、オトフェリンタンパク質を再構成することが可能であることを示した。所与の接合部位では、オトフェリンを発現している細胞の比率は変動を示したにも関わらず、統計学的検定は、これらの比率は有意差がなかったことを示し、３つの切断部位を伴う組換えの有効性が、極めて類似であることを意味する（図５Ｂ）。
これらの結果は、二重ＯＴＯＦプラスミドの同時トランスフェクションが、使用される接合部位に関係なく、完全長カセットの組換えをもたらし、ヒトオトフェリンタンパク質発現をもたらすことを示した。
本発明者らは、切断部位がＡＡＶＳのパッケージ化能力の限界内に留まるＤＮＡフラグメントを与える限り、オトフェリン完全長ｃＤＮＡの再構成が起こると結論付ける。
これらの結果は、二重ＯＴＯＦプラスミドの同時トランスフェクションが、使用される接合部位に関係なく、完全長カセットの組換えをもたらし、ヒトオトフェリンタンパク質発現をもたらすことを示した。
本発明者らは、切断部位がＡＡＶＳのパッケージ化能力の限界内に留まるＤＮＡフラグメントを与える限り、オトフェリン完全長ｃＤＮＡの再構成が起こると結論付ける。
【0130】
２．３．異なる二重ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｈｕＯＴＯＦ構築物の組換え有効性のインビトロ評価
種々の二重ＡＡＶ ＯＴＯＦベクター対（これらの例は、ＣＭＶプロモーターを含む二重ヒトＯＴＯＦ Ｎｔｅｒ－Ｃｔｅｒ ７３８－７３９、８９２－８９３、および９９７－９９８ベクターと共に与えられる）の組換え有効性を評価するために、トランスフェクトした細胞を回収し、ＲＮＡ転写物発現をスプライシング接合部を包含する特異的プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲにより評価した。
ＲＮＡ抽出物を逆転写し、Ｏｔｏｆ Ｎｔｅｒと、Ｏｔｏｆ Ｃｔｅｒ ｃＤＮＡとの間の接合部を包含するオトフェリンｃＤＮＡの８９８または９４６ｂｐフラグメントを増幅するように設計されたプライマーによるＰＣＲ増幅に供した。陰性（非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞）および陽性（ＣＭＶプロモーターの制御下でＨｕＯＴＯＦ ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３）対照を示す。Ｍ：ＤＮＡ分子量マーカー。ＤＮＡラダーの０．５、および１．５ｋｂ分子量マーカーの位置を、電気泳動ゲルの左側に示す（図７Ａ）。
種々の二重ＡＡＶ ＯＴＯＦベクター対（これらの例は、ＣＭＶプロモーターを含む二重ヒトＯＴＯＦ Ｎｔｅｒ－Ｃｔｅｒ ７３８－７３９、８９２－８９３、および９９７－９９８ベクターと共に与えられる）の組換え有効性を評価するために、トランスフェクトした細胞を回収し、ＲＮＡ転写物発現をスプライシング接合部を包含する特異的プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲにより評価した。
ＲＮＡ抽出物を逆転写し、Ｏｔｏｆ Ｎｔｅｒと、Ｏｔｏｆ Ｃｔｅｒ ｃＤＮＡとの間の接合部を包含するオトフェリンｃＤＮＡの８９８または９４６ｂｐフラグメントを増幅するように設計されたプライマーによるＰＣＲ増幅に供した。陰性（非トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞）および陽性（ＣＭＶプロモーターの制御下でＨｕＯＴＯＦ ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３）対照を示す。Ｍ：ＤＮＡ分子量マーカー。ＤＮＡラダーの０．５、および１．５ｋｂ分子量マーカーの位置を、電気泳動ゲルの左側に示す（図７Ａ）。
【0131】
ＲＴ－ＰＣＲは、予測サイズのフラグメントフラグメントを増幅し、これは、ｈｕＯＴＯＦ ｃＤＮＡ対照から増幅したフラグメントに類似の９４６ｂｐ（Ｎｔｅｒ－ＣＴｅｒ ７３８－７３９）または８９８ｐｂ（Ｎｔｅｒ－Ｃｔｅｒ ８９２－８９３およびＮＴｅｒ－Ｃｔｅｒ ９９７－９９８）のサイズであった（図７Ａ）。ｈｕＯＴＯＦの５’または３’部分のみをテンプレートとして使用する場合には、アンプリコンは得られなかった。特異的アンプリコンの精製後のサンガー塩基配列決定法により、７３８－７３９、８９２－８９３、または９９７－９９８接合部分と、ｈｕＯＴＯＦの天然のｃＤＮＡ配列との完全な配列アラインメントが示され、ベクター対が組み換えられたことを確認した（図示せず）。より正確には、トランスフェクト細胞における二重ＡＡＶ ＯＴＯＦベクター対の組換え事象は、５’および３’ベクター配列に本来含有されていたスプライスドナー（ＳＤ）、スプライスアクセプター（ＳＡ）およびＩＴＲ配列の切除を正確に可能にする。ＲＴ－ＰＣＲにより増幅された転写物のサンガー塩基配列決定法により、アンプリコンと、オトフェリンエクソン配列との完全な相同性が示される。これらの結果は、正確な相同組換えおよびｍＲＮＡスプライシングが、二重ＯＴＯＦベクター対をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で起こったことを示した。
【0132】
完全長ｈｕＯＴＯＦタンパク質の組換えも、ウエスタンブロットで評価した。二重７３８－７３９、８９２－８９３、および９９７－９９８プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。細胞を４８時間収集し、効率的なタンパク質抽出および溶解の後に抗オトフェリン抗体を使用するウエスタンイムノブロッティングに供した（図７Ｂ）。二重プラスミドのそれぞれに関して、対応するＮｔｅｒおよびＣｔｅｒまたはＮｔｅｒまたはＣｔｅｒ部分のみをトランスフェクションに使用した。オトフェリン特異的抗体を使用して、完全長オトフェリンタンパク質を特定した。ＨｕＯＴＯＦ（Ｈｕ ｃＤＮＡ）プラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を陽性対照として使用した。
【0133】
図７Ｂに示した結果は、全ての二重プラスミド構成が、約２３０ｋＤａの見かけの分子量を有するタンパク質の発現をもたらしたことを示し、これは、ヒトオトフェリンタンパク質の分子量に同等であった。予測されるように、ＮｔｅｒまたはＣｔｅｒ二重プラスミドのみをトランスフェクションに使用した場合には、予測サイズのバンドは観察されなかった。
結論として、本明細書で試験した種々の二重ＯＴＯＦプラスミド構成は、２つのオトフェリンｃＤＮＡフラグメントのアセンブリ、および完全長ヒトＯＴＯＦタンパク質のインビトロ発現をもたらした。
結論として、本明細書で試験した種々の二重ＯＴＯＦプラスミド構成は、２つのオトフェリンｃＤＮＡフラグメントのアセンブリ、および完全長ヒトＯＴＯＦタンパク質のインビトロ発現をもたらした。
【0134】
２．４．二重ＡＡＶ８ ｈｕＯＴＯＦベクターのインビボ検証
次のステップは、ＣＭＶプロモーターを含む二重ＡＡＶ８ベクターを用いた遺伝子療治療が、聴覚発生（Ｐ１０での）前に投与されると、ヒトまたはマウスオトフェリンタンパク質の発現を駆動して聴覚を救出し、成熟段階（即ち、聴覚発生の十分後のＰ１８～Ｐ２５）のＤＦＮＢ９マウスの蝸牛に投与されると、難聴表現型を逆転する有効性を調べることを目標にした。
この目的では、マウスオトフェリンタンパク質またはヒトオトフェリンタンパク質をコードする本発明による二重ベクターを、材料および方法で開示されるように操作した。
次のステップは、ＣＭＶプロモーターを含む二重ＡＡＶ８ベクターを用いた遺伝子療治療が、聴覚発生（Ｐ１０での）前に投与されると、ヒトまたはマウスオトフェリンタンパク質の発現を駆動して聴覚を救出し、成熟段階（即ち、聴覚発生の十分後のＰ１８～Ｐ２５）のＤＦＮＢ９マウスの蝸牛に投与されると、難聴表現型を逆転する有効性を調べることを目標にした。
この目的では、マウスオトフェリンタンパク質またはヒトオトフェリンタンパク質をコードする本発明による二重ベクターを、材料および方法で開示されるように操作した。
【0135】
２．４．１．ＣＭＶプロモーターを用いてＯｔｏｆ－／－マウス蝸牛中のマウスＯｔｏｆの二重ＡＡＶ８発現
ＡＡＶ８二重マウスＣＭＶベクター（配列番号７９のＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＮｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１６＿ＡＰ（１．３ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号８０のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１７＿ＡＰ（１．５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ））の単回の片側性注入を、Ｐ１０のＯｔｏｆ－／－マウスに行った。組換えベクター対の注入の５４日後、処置した蝸牛の感覚上皮を顕微解剖し、オトフェリンに関して免疫標識して、ＩＨＣの形質導入率を推定した。マウスタンパク質はＩＨＣのほとんど全部で検出された（図２Ａ）。この結果は、二重ＡＡＶ８カプシド／ＣＭＶプロモーターの組み合わせを用いて、オトフェリンｃＤＮＡの２つの半分がインビボで共送達されると、マウスオトフェリンｃＤＮＡが蝸牛感覚細胞中で効率的に再構成され得るという証拠を提供する。
ＡＡＶ８二重マウスＣＭＶベクター（配列番号７９のＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＮｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１６＿ＡＰ（１．３ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号８０のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１７＿ＡＰ（１．５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ））の単回の片側性注入を、Ｐ１０のＯｔｏｆ－／－マウスに行った。組換えベクター対の注入の５４日後、処置した蝸牛の感覚上皮を顕微解剖し、オトフェリンに関して免疫標識して、ＩＨＣの形質導入率を推定した。マウスタンパク質はＩＨＣのほとんど全部で検出された（図２Ａ）。この結果は、二重ＡＡＶ８カプシド／ＣＭＶプロモーターの組み合わせを用いて、オトフェリンｃＤＮＡの２つの半分がインビボで共送達されると、マウスオトフェリンｃＤＮＡが蝸牛感覚細胞中で効率的に再構成され得るという証拠を提供する。
【0136】
Ｐ１０注入の５２日後のＡＢＲ記録は、処置マウス（ｎ＝６）では、トーンバースト刺激（５、１０、１５、および２０ｋＨｚ）に応答して聴覚閾値（最大４０ｄＢ）の実質的な回復を示したが、非注入Ｏｔｏｆ－／－マウスでは回復しなかったことを実証した（図２Ｂ）。遺伝子治療の長期有効性を、４～４７週の間の時点で１５ｋＨｚのトーンバーストに応答したＡＢＲ記録を実施することにより評価した（図２Ｃ）。注入後の４週目～４７週目の１５ｋＨｚ周波数に対する聴覚寿命は、応答する処置マウス（８匹の内の６匹）と、非注入ＷＴマウスとの間で同等であった。処置マウスにおける遺伝子療法の長期有効性を、注入後の４週～４７週の間の種々の時点で他の周波数（５、１０、１５、２０、３２および４０ｋＨｚ）でのトーンバースト刺激に応答したＡＢＲ記録を用いて同様に評価した（図２Ｄ）。ＡＢＲ分析は、回復された聴覚閾値が、全ての応答マウスで経時的に維持され（８匹の内の６匹）、高周波数（３２および４０ｋＨｚ）を除いて、ほぼ野性型のレベルであったことを示した。
【0137】
聴覚回復の寿命もまた、Ｐ１０のＯｔｏｆ－／－マウス中への二重ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｍｕＯＴＯＦ対ＡＡＶ８－ｓｍＣＢＡ－ｍｕＯＴＯＦベクターの蝸牛内注入後に、１５ｋＨｚの音響周波数で試験した
Ｐ１０のＯＴＯＦ－／－マウスに正円窓膜を通して、２μＬのＡＡＶ８－ｓｍＣＢＡ－ｍｕＯＴＯＦ（配列番号９５および配列番号８０）（ｎ＝１５；円）またはＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｍｕＯＴＯＦ（配列番号７９および配列番号８０）（ｎ＝８；四角）を、それぞれ、３．０Ｅ＋１０および２．８Ｅ＋１０合計ｖｇ（１：１比）で注入した。聴性脳幹反応（ＡＢＲ）閾値を１年間にわたり異なる周波数で定期的に測定した。
注入後の４週目（ＡＢＲ１）～４０週目（ＡＢＲ１４）では、１５ｋＨｚ周波数のＡＢＲ閾値は、ＡＡＶ８－ｓｍＣＢＡ－ｍｕＯＴＯＦベクターで処置したマウスが、二重ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｍｕＯＴＯＦベクターを注入したマウスより高い（図２Ｇ）。
Ｐ１０のＯＴＯＦ－／－マウスに正円窓膜を通して、２μＬのＡＡＶ８－ｓｍＣＢＡ－ｍｕＯＴＯＦ（配列番号９５および配列番号８０）（ｎ＝１５；円）またはＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｍｕＯＴＯＦ（配列番号７９および配列番号８０）（ｎ＝８；四角）を、それぞれ、３．０Ｅ＋１０および２．８Ｅ＋１０合計ｖｇ（１：１比）で注入した。聴性脳幹反応（ＡＢＲ）閾値を１年間にわたり異なる周波数で定期的に測定した。
注入後の４週目（ＡＢＲ１）～４０週目（ＡＢＲ１４）では、１５ｋＨｚ周波数のＡＢＲ閾値は、ＡＡＶ８－ｓｍＣＢＡ－ｍｕＯＴＯＦベクターで処置したマウスが、二重ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｍｕＯＴＯＦベクターを注入したマウスより高い（図２Ｇ）。
【0138】
マウスオトフェリンタンパク質をコードする配列番号７９のＡＡＶ８－ＣＭＶ－ＮｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１６＿ＡＰ（１．３ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号８０のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｍｕ８１７＿ＡＰ（１．５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）からなるベクター対をまた、聴覚発生後（ｐ２１～ｐ２２）、２０匹のＯｔｏｆ－／－マウス処置するために使用した。より正確には、これらの二重ベクターは、「物質および方法」の節で記載したように、Ｐ２１～Ｐ２２日齢Ｏｔｏｆ－／－マウス（ｎ＝２０）の聴覚発生後にＤＦＮＢ９マウスの蝸牛に送達された。
注入後１８週で、ＡＢＲ分析から、強い聴覚回復が示され、これは、全ての応答処置マウス（２０匹の内の９匹）で経時的に平均７０ｄＢの閾値に維持された（図２Ｅ）。マウス＃８の聴覚は、注入後１８週の野性型レベルまで著しく救出された
次に、二重ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｍｕＯＴＯＦベクターで注入処置した成熟段階のマウスにおいて、ＩＨＣ形質導入率およびオトフェリン発現を調べた。マウスを安楽死させ、それらの蝸牛を顕微解剖し、オトフェリンを免疫標識し、およびシナプスマーカーであるがＩＨＣ核も染色するｒｉｂｅｙｅで免疫標識した。すべてのレスポンダーマウスの注入蝸牛は、変動するＩＨＣ形質導入率を示した。最良のレスポンダーマウス（平均ＡＢＲ閾値４０ｄＢ、１５ｋＨｚ周波数）の蝸牛では、６０～８１％のＩＨＣが蝸牛らせん全体を通して（心尖部から基底部まで、図２Ｈ）形質導入された。レスポンダーマウスのいずれのＯＨＣもオトフェリンを発現せず、我々の処置ベクターの特異性を確証した。
注入後１８週で、ＡＢＲ分析から、強い聴覚回復が示され、これは、全ての応答処置マウス（２０匹の内の９匹）で経時的に平均７０ｄＢの閾値に維持された（図２Ｅ）。マウス＃８の聴覚は、注入後１８週の野性型レベルまで著しく救出された
次に、二重ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｍｕＯＴＯＦベクターで注入処置した成熟段階のマウスにおいて、ＩＨＣ形質導入率およびオトフェリン発現を調べた。マウスを安楽死させ、それらの蝸牛を顕微解剖し、オトフェリンを免疫標識し、およびシナプスマーカーであるがＩＨＣ核も染色するｒｉｂｅｙｅで免疫標識した。すべてのレスポンダーマウスの注入蝸牛は、変動するＩＨＣ形質導入率を示した。最良のレスポンダーマウス（平均ＡＢＲ閾値４０ｄＢ、１５ｋＨｚ周波数）の蝸牛では、６０～８１％のＩＨＣが蝸牛らせん全体を通して（心尖部から基底部まで、図２Ｈ）形質導入された。レスポンダーマウスのいずれのＯＨＣもオトフェリンを発現せず、我々の処置ベクターの特異性を確証した。
【0139】
これらの結果は、聴覚発生の前または後での二重ＡＡＶ８ベクターおよびＣＭＶプロモーターを使用したフラグメント化マウスオトフェリンｃＤＮＡのＯｔｏｆ－／－マウスの蝸牛への送達が、完全長タンパク質（これは、ＩＨＣに限定される）の産生をもたらすことを示す。形質導入率の変動にも関わらず、ＡＡＶ遺伝子治療は、他の方法では重度の難聴のまま残されるはずの、Ｏｔｏｆ－／－マウスの聴覚を回復回復した。重要なことに、聴覚回復は少なくともほぼ１年間持続した。
【0140】
２．４．２．ＣＭＶプロモーターを使用したＯｔｏｆ－／－マウス蝸牛中のヒトＯｔｏｆの二重ＡＡＶ８発現
次に、成熟段階（聴覚発生の十分後の）でＤＦＮＢ９マウスの蝸牛中に投与される場合、ヒトオトフェリンの発現を促進して難聴表現型を逆転させるＣＭＶプロモーターを含む二重ＡＡＶ８ベクターを用いて遺伝子療法の有効性を試験した。
完全長ヒトオトフェリンタンパク質のインビトロ再構築に基づく、最高性能の二重プラスミドの１つ（二重ＯＴＯＦ Ｎｔｅｒ ８９２－８９３）も試験した。完全長ヒトオトフェリンタンパク質をコードする、配列番号の５６のＡＡＶ８－ＣＭＶＮｔｅｒＯＴＯＦｈｕ８９２＿ＡＰ（１．１ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号５７のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｈｕ８９３＿ＡＰ（０．８５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）からなるベクターを、聴覚発生後に（Ｐ１８～Ｐ２５）１７匹のＯｔｏｆ－／－マウスに投与した。
より正確には、これらの二重ベクターを、「物質および方法」の節で記載されるように、Ｐ１８～Ｐ２５日齢Ｏｔｏｆ－／－マウスの聴覚発生後にＤＦＮＢ９マウスの蝸牛に送達した。
注入後１８週で、ＡＢＲ分析は、応答処置マウス（１４匹の内の４匹）で聴覚救出が、平均９０ｄＢの閾値に維持されたことを示した（図２Ｆ）。しかし、処置マウスのＡＢＲ閾値は、ＷＴレベルに達しなかった。マウス（＃３）は、注入後１８週の野性型レベルまで顕著に救出された（図２Ｆ）。
二重ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｈｕＯＴＯＦベクターで処置した成熟段階のマウスにおいて、ＩＨＣ形質導入率およびオトフェリン発現を調べた。マウスを安楽死させ、それらの蝸牛を顕微解剖し、オトフェリンに関して免疫標識し、およびシナプスマーカーであるがＩＨＣ核も染色するｒｉｂｅｙｅで免疫標識した。全てのレスポンダーマウスの注入蝸牛は、変動する形質導入率を有する形質導入ＩＨＣを示した。最良のレスポンダーマウス（＃３、平均６０ｄＢ、１５ｋＨｚ周波数）の蝸牛では、６０～８０％のＩＨＣが蝸牛らせん全体を通して（心尖部から基底部まで、図２Ｉ）形質導入された。
重要なことに、レスポンダーマウスのいずれのＯＨＣもヒトオトフェリンを発現せず、本発明の治療ベクターのさらなる効率（ＩＨＣで極めて高いトランスフェクション率＞６０％を達成）および特異性を確証したことである。
結論として、ヒトオトフェリン治療的トランスジーンをコードする二重ＡＡＶ８ベクターの成熟Ｏｔｏｆ－／－蝸牛への送達は、成体Ｏｔｏｆ－／－マウスにおける顕著な聴覚回復をもたらす。これらの結果は、マウスオトフェリンとまさに同様に、ヒトオトフェリンを駆動する二重ＡＡＶ８／ＣＭＶプロモーターは、ＤＦＮＢ９マウスモデルにおいて聴覚を回復し、治療遺伝子を成熟段階のＩＨＣに送達する場合のこの組み合わせの適合性を確証する。
次に、成熟段階（聴覚発生の十分後の）でＤＦＮＢ９マウスの蝸牛中に投与される場合、ヒトオトフェリンの発現を促進して難聴表現型を逆転させるＣＭＶプロモーターを含む二重ＡＡＶ８ベクターを用いて遺伝子療法の有効性を試験した。
完全長ヒトオトフェリンタンパク質のインビトロ再構築に基づく、最高性能の二重プラスミドの１つ（二重ＯＴＯＦ Ｎｔｅｒ ８９２－８９３）も試験した。完全長ヒトオトフェリンタンパク質をコードする、配列番号の５６のＡＡＶ８－ＣＭＶＮｔｅｒＯＴＯＦｈｕ８９２＿ＡＰ（１．１ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）および配列番号５７のＡＡＶ８－ＣｔｅｒＯＴＯＦｈｕ８９３＿ＡＰ（０．８５ｘ１０１３ｖｇ／ｍｌ）からなるベクターを、聴覚発生後に（Ｐ１８～Ｐ２５）１７匹のＯｔｏｆ－／－マウスに投与した。
より正確には、これらの二重ベクターを、「物質および方法」の節で記載されるように、Ｐ１８～Ｐ２５日齢Ｏｔｏｆ－／－マウスの聴覚発生後にＤＦＮＢ９マウスの蝸牛に送達した。
注入後１８週で、ＡＢＲ分析は、応答処置マウス（１４匹の内の４匹）で聴覚救出が、平均９０ｄＢの閾値に維持されたことを示した（図２Ｆ）。しかし、処置マウスのＡＢＲ閾値は、ＷＴレベルに達しなかった。マウス（＃３）は、注入後１８週の野性型レベルまで顕著に救出された（図２Ｆ）。
二重ＡＡＶ８－ＣＭＶ－ｈｕＯＴＯＦベクターで処置した成熟段階のマウスにおいて、ＩＨＣ形質導入率およびオトフェリン発現を調べた。マウスを安楽死させ、それらの蝸牛を顕微解剖し、オトフェリンに関して免疫標識し、およびシナプスマーカーであるがＩＨＣ核も染色するｒｉｂｅｙｅで免疫標識した。全てのレスポンダーマウスの注入蝸牛は、変動する形質導入率を有する形質導入ＩＨＣを示した。最良のレスポンダーマウス（＃３、平均６０ｄＢ、１５ｋＨｚ周波数）の蝸牛では、６０～８０％のＩＨＣが蝸牛らせん全体を通して（心尖部から基底部まで、図２Ｉ）形質導入された。
重要なことに、レスポンダーマウスのいずれのＯＨＣもヒトオトフェリンを発現せず、本発明の治療ベクターのさらなる効率（ＩＨＣで極めて高いトランスフェクション率＞６０％を達成）および特異性を確証したことである。
結論として、ヒトオトフェリン治療的トランスジーンをコードする二重ＡＡＶ８ベクターの成熟Ｏｔｏｆ－／－蝸牛への送達は、成体Ｏｔｏｆ－／－マウスにおける顕著な聴覚回復をもたらす。これらの結果は、マウスオトフェリンとまさに同様に、ヒトオトフェリンを駆動する二重ＡＡＶ８／ＣＭＶプロモーターは、ＤＦＮＢ９マウスモデルにおいて聴覚を回復し、治療遺伝子を成熟段階のＩＨＣに送達する場合のこの組み合わせの適合性を確証する。
【0141】
実施例２：ヒトにおけるＯＴＯＦの新規アイソフォームの特定
聴覚回復がＰＮＡＳ刊行物（ＡＫｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１９）で実証されたマウス転写物は、ヒトアイソフォーム５転写物と次の２つの点で異なる：
・マウス転写物は、追加のエクソン（マウス配列中のエクソン６）を有する、および
・マウス転写物中のエクソン３１は、ヒトアイソフォーム５転写物中では同等であるヒトエクソン３０より短い（ナンバリングは、ヒトで報告されたエクソン６の非存在に関連する）。
したがって、エクソン６の類似の配列をヒトイントロン５配列において検索した。ほぼ同一の領域がヒト配列において同定された。
次に、その新規に発見された配列に隣接するスプライスドナーおよびアクセプター部位を調べ、それらが存在した。最後に、同定された配列の翻訳で得られたアミノ酸配列を比較し、配列がヒトとマウスの間で高度に保存されていることが見出された。
ｍｏｕｓｅ＿Ｏｔｏｆ－２０２＿ｅｘｏｎ６＿ｇｅｎｏｍｉｃ＿ｓｅｑ＝配列番号６５
ＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＧＣＡＣＡＡ ４５
ｈｕｍａｎ＿ＯＴＯＦ－２０５＿ｐｕｔａｔｉｖｅ＿ｅｘｏｎ６＿ｇｅｎｏｍｉｃ＿ｓｅｑ＝配列番号６６
ＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＣＧＡＧＣＡＣＡＡ ４５
全てのヌクレオチドは、下線を付したものを除いて、同じである。
ｍｏｕｓｅ＿Ｏｔｏｆ－２０２＿ｅｘｏｎ６＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｓｅｑ＝配列番号６７
ＫＧＲＥＫＴＫＧＧＲＤＧＥＨ １４
ｈｕｍａｎ＿ＯＴＯＦ－２０５＿ｐｕｔａｔｉｖｅ＿ｅｘｏｎ６＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｓｅｑ＝配列番号６８
ＫＧＲＥＫＴＫＧＧＲＤＤＥＨ １４
全てのアミノ酸は、下線を付したものを除いて、同じである。
これらのエレメントは、ヒトのＯＴＯＦ遺伝子中でもエクソン６の存在を支持する非常に強力なエビデンスを共に構成する。
聴覚回復がＰＮＡＳ刊行物（ＡＫｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ２０１９）で実証されたマウス転写物は、ヒトアイソフォーム５転写物と次の２つの点で異なる：
・マウス転写物は、追加のエクソン（マウス配列中のエクソン６）を有する、および
・マウス転写物中のエクソン３１は、ヒトアイソフォーム５転写物中では同等であるヒトエクソン３０より短い（ナンバリングは、ヒトで報告されたエクソン６の非存在に関連する）。
したがって、エクソン６の類似の配列をヒトイントロン５配列において検索した。ほぼ同一の領域がヒト配列において同定された。
次に、その新規に発見された配列に隣接するスプライスドナーおよびアクセプター部位を調べ、それらが存在した。最後に、同定された配列の翻訳で得られたアミノ酸配列を比較し、配列がヒトとマウスの間で高度に保存されていることが見出された。
ｍｏｕｓｅ＿Ｏｔｏｆ－２０２＿ｅｘｏｎ６＿ｇｅｎｏｍｉｃ＿ｓｅｑ＝配列番号６５
ＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧＡＧＣＡＣＡＡ ４５
ｈｕｍａｎ＿ＯＴＯＦ－２０５＿ｐｕｔａｔｉｖｅ＿ｅｘｏｎ６＿ｇｅｎｏｍｉｃ＿ｓｅｑ＝配列番号６６
ＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＡＣＧＡＧＣＡＣＡＡ ４５
全てのヌクレオチドは、下線を付したものを除いて、同じである。
ｍｏｕｓｅ＿Ｏｔｏｆ－２０２＿ｅｘｏｎ６＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｓｅｑ＝配列番号６７
ＫＧＲＥＫＴＫＧＧＲＤＧＥＨ １４
ｈｕｍａｎ＿ＯＴＯＦ－２０５＿ｐｕｔａｔｉｖｅ＿ｅｘｏｎ６＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｓｅｑ＝配列番号６８
ＫＧＲＥＫＴＫＧＧＲＤＤＥＨ １４
全てのアミノ酸は、下線を付したものを除いて、同じである。
これらのエレメントは、ヒトのＯＴＯＦ遺伝子中でもエクソン６の存在を支持する非常に強力なエビデンスを共に構成する。
【0142】
加えて、短縮型のエクソン３０の存在は、データベースで報告されたＯＴＯＦの他のヒトアイソフォーム（例えば、アイソフォーム２および３）中で観察されている。したがって、ヒト治療ｃＤＮＡは、短縮型のエクソン３０（補充エクソンを考慮に入れると、将来のエクソン３１）も含有する可能性がある。
【0143】
以前の刊行物（Ｙａｓｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ２０００）によると、代替のエクソン配置がマウス蝸牛および関連する３つのエクソン（配置は、図６に記載されている）において観察されている。Ｃ２は、蝸牛は蝸牛に特有であり、Ａ１およびＡ２は、Ｂ１およびＢ２と同様に蝸牛中に存在する。
ヒト機能的ＯＴＯＦは、実際に、下記を含むｃＤＮＡ配列によりコードされている可能性がある：
－Ａ１－Ｂ２－Ｃ２（マウス転写物と同一）：エクソン６およびより短いエクソン３０（配列番号１６）を含み、配列番号６のタンパク質をコードする；
－Ａ１－Ｂ１－Ｃ２：エクソン６および正常サイズのエクソン３０（配列番号１７）を含み、配列番号７のタンパク質をコードする；
－Ａ２－Ｂ２－Ｃ２：エクソン６を含まないが、より短いエクソン３０（配列番号１８）を含み、配列番号８のタンパク質をコードする。
これらの新規アイソフォームは、現在のヒトアイソフォーム５転写物に加えて、ヒトで聴覚を回復する潜在力を有する配列番号６、配列番号７および／または配列番号８のタンパク質をコードし得る。
ヒト機能的ＯＴＯＦは、実際に、下記を含むｃＤＮＡ配列によりコードされている可能性がある：
－Ａ１－Ｂ２－Ｃ２（マウス転写物と同一）：エクソン６およびより短いエクソン３０（配列番号１６）を含み、配列番号６のタンパク質をコードする；
－Ａ１－Ｂ１－Ｃ２：エクソン６および正常サイズのエクソン３０（配列番号１７）を含み、配列番号７のタンパク質をコードする；
－Ａ２－Ｂ２－Ｃ２：エクソン６を含まないが、より短いエクソン３０（配列番号１８）を含み、配列番号８のタンパク質をコードする。
これらの新規アイソフォームは、現在のヒトアイソフォーム５転写物に加えて、ヒトで聴覚を回復する潜在力を有する配列番号６、配列番号７および／または配列番号８のタンパク質をコードし得る。
【0144】
参考文献
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【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図2-4】
【図2-5】
【図2-6】
【図2-7】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】