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特表2024-535004イオン化可能な脂質その調製および遺伝子送達における使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】イオン化可能な脂質その調製および遺伝子送達における使用
(51)【国際特許分類】
C07D 295/13 20060101AFI20240918BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240918BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20240918BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20240918BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240918BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20240918BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240918BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240918BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20240918BHJP
A61K 47/69 20170101ALI20240918BHJP
A61K 9/38 20060101ALI20240918BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240918BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20240918BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20240918BHJP
【ＦＩ】
C07D295/13 CSP
A61K48/00
A61K47/28
A61K47/22
A61K9/14
A61K47/24
A61K47/34
A61K31/7088
A61K31/7105
A61K31/711
A61K31/713
A61K9/127
A61K47/69
A61K9/38
A61P43/00 111
C12N15/113 Z
C12N15/115 Z
C12N15/88 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515853
(86)(22)【出願日】2022-09-09
(85)【翻訳文提出日】2024-05-10
(86)【国際出願番号】 CN2022118198
(87)【国際公開番号】W WO2023036311
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】202111064429.3
(32)【優先日】2021-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524093380
【氏名又は名称】浙江吉量科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＸＩＲＮＡ （ＺＨＥＪＩＡＮＧ） ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ２． Ｌｏｔ Ｎｏ．Ａ２０１８－１１６ （ｌｏｔ ３， Ｓｉｑｉａｎ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）， Ｃｈａｎｇｌｅ Ｔｏｗｎ， Ｓｈｅｎｇｚｈｏｕ Ｃｉｔｙ， Ｓｈａｏｘｉｎｇ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ， ３１２４６７， Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】524093391
【氏名又は名称】上海吉量医薬工程有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＭＡＸＩＲＮＡ （ＳＨＡＮＧＨＡＩ） ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ １０１， ２０１，３０１． Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １０， Ｎｏ．１． Ｗａｎｇｄｏｎｇ Ｍｉｄｄｌｅ Ｒｏａｄ， Ｓｉｊｉｎｇ Ｔｏｗｎ， Ｓｏｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ， ２０１６０１， Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】520233869
【氏名又は名称】上海細胞治療集団股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＣＥＬＬ ＴＨＥＲＡＰＹ ＧＲＯＵＰ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】田 志丹
(72)【発明者】
【氏名】薛 源
(72)【発明者】
【氏名】劉 韜
(72)【発明者】
【氏名】銭 其軍
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA30
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB11
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE41
4C076FF16
4C076FF43
4C084AA13
4C084MA52
4C084MA55
4C084NA13
4C084ZC021
4C084ZC022
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA38
4C086MA41
4C086MA52
4C086MA55
4C086NA13
4C086ZC02
(57)【要約】
イオン化可能な脂質、その調製および遺伝子送達における使用。具体的には、下式Ｉで示されるイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物は提供され、式中の各基は本文で定義される。さらに、式（Ｉ）で示されるイオン化可能な脂質化合物を含む脂質ナノ粒子も提供される。さらに、組成物および関連する使用も提供される。式（Ｉ）の化合物によれば、核酸系の治療剤または活性剤をインビボおよびインビトロで送達するための脂質ナノ粒子を調製できる。
【化１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下式Ｉで示されるイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物。【化1】
Ａ１とＡ２はそれぞれ独立にＣＨまたはＮである；
Ｂは－Ｌ４－Ｎ（Ｒ９Ｒ１０）またはＲ１２から選ばれる；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はそれぞれ独立に、任意に置換されるアルキレン基、任意に置換される－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－、任意に置換されるアルケニレン基および任意に置換されるアルキニレン基から選ばれる；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０とＲ１２はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、任意に置換されるアルキル基、任意に置換されるアルケニル基、任意に置換されるシクロアルキル基、任意に置換されるヘテロシクリル基、任意に置換されるシクロアルケニル基、任意に置換されるシクロアルキニル基、任意に置換されるアリール基、任意に置換されるヘテロアリール基、任意に置換されるアルコキシ基、任意に置換されるアルコキシカルボニル基、任意に置換されるアシル基、－ＮＲ’Ｒ’’、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基またはアルキルチオニル基である；
Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、任意に置換されるアルキル基、任意に置換されるアルケニル基、任意に置換されるアルキニル基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、－ＮＲ’Ｒ’’およびカルボキシ基から選ばれる；
ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～１０の整数である；および
Ｒ’とＲ’’はそれぞれ独立に、Ｈまたは任意に置換されるアルキル基から選ばれる）
【請求項2】
Ａ１とＡ２は両方ともＮである；および／またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基、－ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ１－４アルコキシ基およびハロゲンから選ばれる１～５個の置換基で任意に置換されるＣ１－４アルキレン基または－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－であり、ただし、Ｒ’とＲ’’はそれぞれ独立に、ＨおよびＣ１－４アルキル基から選ばれる；より好ましくは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はそれぞれ独立に、Ｃ１－４アルキレン基または－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－である；好ましくは、ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～４の整数である；より好ましくは、ｎは２で、ｍは１～４で、ｏは２である；より好ましくは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はいずれもＣ１－４アルキレン基であり、或いはＬ１、Ｌ２とＬ４はそれぞれ独立に－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－であり、好ましくは、Ｌ１、Ｌ２とＬ４は同じ基であり、Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である；および／または
Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはそれぞれ独立に、Ｈおよび、ヒドロキシ基およびハロゲンから選ばれる１～５個の置換基で任意に置換されるＣ１－４アルキル基から選ばれる；好ましくは、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはいずれもＨである
ことを特徴とする、請求項１に記載のイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項3】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基および／またはハロゲンで置換されているＣ１－２４アルキル基であり、好ましくは、それぞれ独立に、ヒドロキシ基および／またはハロゲンで置換されているＣ８－２４アルキル基である；好ましくは、当該アルキル基が前記Ｎ原子と結合する末端から２番目の炭素原子は一つのヒドロキシで置換されている；好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１は非置換のまたはハロゲンで置換されているＣ１－２１アルキル基であり、好ましくは非置換のまたは全フッ素置換のＣ１－２１アルキル基である；好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４は同じ基である；および／またはＲ９、Ｒ１０とＲ１２はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基および／またはハロゲンで任意に置換されるＣ１－２４アルキル基であり、好ましくは、それぞれ独立に、ヒドロキシ基および／またはハロゲンで任意に置換されるＣ８－２４アルキル基である；好ましくは、当該アルキル基が前記Ｎ原子と結合する末端から２番目の炭素原子は一つのヒドロキシで置換されている；好ましくは、Ｒ９とＲ１０はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１は未置換のまたはハロゲンで置換されているＣ１－２１アルキル基であり、好ましくは非置換のまたは全フッ素置換のＣ１－２１アルキル基である；好ましくは、Ｒ９とＲ１０はいずれも前記－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１基である；好ましくは、Ｒ１２は１～５個のヒドロキシ基で任意に置換されるＣ１－１０アルキル基であり、好ましくは、当該アルキル基がＮと結合する末端から２番目の炭素原子は、ヒドロキシ基で置換されている；
より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９とＲ１０は同じ基である
ことを特徴とする、請求項１または２に記載のイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項4】
Ａ１とＡ２は両方ともＮである；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基および／またはハロゲンで任意に置換されるＣ１－２４アルキル基である；好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４は少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されている；好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１はハロゲンで任意に置換されるＣ１－２１アルキル基であり、好ましくは、Ｒ１１は非置換のＣ１－２１アルキル基または全フッ素置換のＣ１－２１アルキル基である；
Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはいずれもＨである；
Ｂは－Ｌ４－Ｎ（Ｒ９Ｒ１０）である；ただし、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はいずれもＣ１－４アルキレン基であり、好ましくは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４は同じアルキレン基である；或いは、Ｌ１、Ｌ２とＬ４はそれぞれ独立に－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－であり、好ましくは、Ｌ１、Ｌ２とＬ４は同じ基であり、Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である；Ｒ９とＲ１０はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基及び／又はハロゲンで任意に置換されるＣ１－２４アルキル基である；好ましくは、Ｒ９とＲ１０は少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されている；好ましくは、Ｒ９とＲ１０はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１はハロゲンで任意に置換されるＣ１－２１アルキル基であり、好ましくは、Ｒ１１は非置換のＣ１－２１アルキル基または全フッ素置換のＣ１－２１アルキル基である；
或いは、ＢはＲ１２である；ただし、Ｒ１２は１～５個のヒドロキシ基で任意に置換され
るＣ１－１０アルキル基であり、好ましくは、当該アルキル基がＮと結合する末端から２番目の炭素原子は、ヒドロキシ基で置換されている；Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－またはＣ１－４アルキレン基であり、好ましくは、Ｌ１とＬ２は同じ基である；Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である；
ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～４の整数である
ことを特徴とする、請求項１に記載のイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項5】
前記式Ｉの化合物は以下の構造を有する：【化2】
【化3】
【化4】
ことを特徴とする、請求項１に記載のイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項6】
前記式Ｉの化合物は、化合物Ａ－Ｃ１２、Ａ－Ｃ１４、Ａ－Ｃ１６、Ａ－Ｃ１８、Ｂ－Ｃ１２、Ｂ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６、Ｂ－Ｃ１８、Ｃ－Ｃ１２、Ｃ－Ｃ１４、Ｃ－Ｃ１６、Ｃ－Ｃ１８、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１４、Ｄ－Ｃ１６、Ｄ－Ｃ１８、Ｅ－Ｃ１２、Ｅ－Ｃ１４、Ｅ－Ｃ１６、Ｅ－Ｃ１８、Ｆ－Ｃ１２、Ｆ－Ｃ１４、Ｆ－Ｃ１６、Ｆ－Ｃ１８、Ｇ－Ｃ１２、Ｇ－Ｃ１４、Ｇ－Ｃ１６、Ｇ－Ｃ１８、Ｈ－Ｃ１２、Ｈ－Ｃ１４、Ｈ－Ｃ１６、Ｈ－Ｃ１８、Ｉ－Ｃ１２、Ｉ－Ｃ１４、Ｉ－Ｃ１６、Ｉ－Ｃ１８、Ｊ－Ｃ１２、Ｊ－Ｃ１４、Ｊ－Ｃ１６、Ｊ－Ｃ１８、Ｋ－Ｃ１２、Ｋ－Ｃ１４、Ｋ－Ｃ１６、Ｋ－Ｃ１８、Ｌ－Ｃ１２、Ｌ－Ｃ１４、Ｌ－Ｃ１６およびＬ－Ｃ１８から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項7】
請求項１～６のいずれかに記載のイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物を含む脂質ナノ粒子であって、好ましくはさらに１種以上のヘルパー脂質分子、１種以上のコレステロールまたはコレステロール誘導体、および／または１種以上のポリマー抱合脂質分子とを含むことを特徴とする、脂質ナノ粒子。
【請求項8】
前記ヘルパー脂質分子は中性脂質分子であり、好ましくは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選ばれ、より好ましくはＤＯＰＥまたはＤＳＰＣである；および／または前記ポリマー抱合脂質分子において、前記ポリマーはポリエチレングリコールである；好ましくは、前記ポリマー抱合脂質分子は、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＰＥ、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、ＰＥＧ－ｃｅｒ、ＤＭＧ－ＰＥＧおよびＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメートから選ばれ、好ましくはＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥまたはＤＭＧ－ＰＥＧ２０００である
ことを特徴とする、請求項７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項9】
前記脂質ナノ粒子において、前記イオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物と、ヘルパー脂質分子、コレステロールまたはコレステロール誘導体、ポリマー抱合脂質分子とのモル比は６０～５：６０～５：５０～５：１０～１、好ましくは４０～１０：３０～１０：５０～２０：８～１であることを特徴とする、請求項７または８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項10】
前記脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現に適用され、ただし、前記タンパク質は、生体の生理学的機能に対して治療効果、予防効果または改善効果を有するタンパク質であり、抗原と抗体を含む；或いは前記脂質ナノ粒子は、特定のｍｉＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤を送達することによって、或いは１種の標的ｍＲＮＡ若しくは多種のｍＲＮＡを調節するｍｉＲＮＡのセットを送達することによって、内因性タンパク質発現をアップレギュレートするために適用される；或いは
前記脂質ナノ粒子は、標的遺伝子のタンパク質レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルをダウンレギュレートするために適用される；或いは
前記脂質ナノ粒子は、導入遺伝子の発現の目的でｍＲＮＡおよびプラスミドを送達するために適用される；或いは
前記脂質ナノ粒子は、タンパク質の発現から生じる薬理学的効果を誘発するために適用される
ことを特徴とする、請求項７～９のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
【請求項11】
前記脂質ナノ粒子はさらに治療剤または活性剤を含有する；好ましくは、前記治療剤または活性剤は核酸系の治療剤または活性剤である；より好ましくは、前記核酸系の治療剤または活性剤は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイムおよびアプタマーから選ばれることを特徴とする、請求項７～１０のいずれかに記載の脂質ナノ粒子。
【請求項12】
請求項１～６のいずれかに記載のイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物を含む組成物であって好ましくは、前記組成物は、請求項１～６のいずれかに記載のイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物と、治療剤または活性剤と、および１種以上のヘルパー脂質分子、１種以上のコレステロールまたはコレステロール誘導体、および／または１種以上のポリマー抱合脂質分子とを含む医薬組成物である、組成物。
【請求項13】
前記ヘルパー脂質分子は中性脂質分子であり、好ましくは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選ばれ、より好ましくはＤＯＰＥである；および／または前記ポリマー抱合脂質分子において、前記ポリマーはポリエチレングリコールである；好ましくは、前記ポリマー抱合脂質分子は、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＰＥ、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、ＰＥＧ－ｃｅｒおよびＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメートから選ばれ、好ましくはＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥである；および／または
前記治療剤または活性剤は核酸系の治療剤または活性剤である；好ましくは、前記核酸系の治療剤または活性剤は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイムおよびアプタマーから選ばれる
ことを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
前記組成物はさらに、アポリポタンパク質を含む；好ましくは、前記アポリポタンパク質は、ＡｐｏＡ－Ｉ、ＡｐｏＡ－ＩＩ、ＡｐｏＡ－ＩＶ、ＡｐｏＡ－ＶとＡｐｏＥ、並びにそれらの活性結晶多形、アイソフォーム、バリアントや変異体およびそれらのフラグメントや短縮型から選ばれ、好ましくはＡｐｏＥ4であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の組成物。
【請求項15】
対象の疾患または病状を治療または予防するための脂質ナノ粒子または医薬組成物の調製における、或いは治療剤または活性剤（例えば核酸）の送達に使用される試薬の調製における、請求項１～６のいずれかに記載のイオン化可能な脂質化合物、その立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグ若しくは溶媒和物の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、イオン化可能な脂質、その調製および遺伝子送達における使用に関する。
【背景技術】
【0002】
低分子医薬品、抗体医薬品に次いで、核酸医薬品は新薬の第三のカテゴリーとなった。他のカテゴリーの薬剤とは異なり、それはヌクレオチド配列で構成されるものであり、現在、治療上で有用な核酸薬剤には、例えばプラスミド、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）などが含まれる。
【0003】
核酸と細胞膜はどちらも同じ電荷、即ち負電荷を持っており、外力がない状態で、裸の核酸が直接に細胞内に入ることは難しい。同時に、核酸は細胞質中の核酸分解酵素によって非常に分解されやすく、遺伝子導入や遺伝子治療の効果が得られない。遺伝子を導入するためには、外力やベクターの支持が必要である。一般的に使用される外力は、エレクトロポレーション、押し出し、注入などを含む物理的方法である。これらの方法の最大の欠点は、インビボでの遺伝子導入ができないことと、インビトロでの遺伝子導入が大量に行えないことである。
【0004】
ベクターは通常、ウイルスベクターと非ウイルスベクターに分けられる。ウイルスベクターは、インビボおよびインビトロでのトランスフェクション効率が非常に高いが、毒性が強い、免疫反応が強い、遺伝子担持量が少ない、ターゲティング性が弱い、調製工程が複雑であるなど、多くの欠点がある。非ウイルスベクターは、調製・輸送・保存が容易で、且つ安全で効果的で、免疫原性がないなどの利点があり、ますます広く注目され、応用されている。
【0005】
脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、ＬＮＰ）技術は、近年開発された非ウイルスベクター技術である。この技術を用いて、Ａｌｎｙｌａｍ社は世界初のＳｉＲＮＡ医薬品であるＯｎｐａｔｔｒｏ(R)を発売した。ファイザーやＭｏｄｅｒｎａ社などはｍＲＮＡ新型コロナウイルスワクチンを開発した。脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、ＬＮＰ）は、カチオン性脂質とヘルパー脂質（リン脂質、コレステロール、ＰＥＧ化脂質）からマイクロ流体制御デバイスによって調製され、ただし、ヘルパー脂質は既に市販されているが、カチオン性脂質は核酸医薬のカプセル化と送達効率を直接決定し、ＬＮＰ技術開発における肝心な要素となっている。
【0006】
Ｔ細胞（Ｔ ｃｅｌｌ、Ｔリンパ球／Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）は、免疫反応において重要な役割を果たすリンパ球の一種である。細胞免疫療法、特にＣＡＲ－Ｔ技術の応用が日々発展するにつれ、Ｔ細胞の遺伝子工学改造はますます重要になってきている。しかし、Ｔ細胞へのトランスフェクションは通常、エレクトロポレーション若しくはウイルスベクターで行われる。リポソームによるＴ細胞へのトランスフェクションに関する研究は非常に限られている。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、従来技術の欠点に対処し、遺伝子を細胞内に送達するために使用できる送達ベクター、およびその調製方法と使用を提供する。
【0008】
本発明の第一の態様は、化学式Ｉで示される化合物、またはその立体異性体、またはその
互変異性体、またはその薬学的に許容される塩、そのプロドラッグ若しくはその溶媒和物であるイオン化可能な脂質化合物を提供する：
式中：
Ａ１とＡ２はそれぞれ独立にＣＨまたはＮである；
Ｂは－Ｌ４－Ｎ（Ｒ９Ｒ１０）またはＲ１２から選ばれる；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はそれぞれ独立に、任意に置換されるアルキレン基、任意に置換される－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－、任意に置換されるアルケニレン基および任意に置換されるアルキニレン基から選ばれる；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０とＲ１２はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、任意に置換されるアルキル基、任意に置換されるアルケニル基、任意に置換されるシクロアルキル基、任意に置換されるヘテロシクリル基、任意に置換されるシクロアルケニル基、任意に置換されるシクロアルキニル基、任意に置換されるアリール基、任意に置換されるヘテロアリール基、任意に置換されるアルコキシ基、任意に置換されるアルコキシカルボニル基、任意に置換されるアシル基、－ＮＲ’Ｒ’’、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基またはアルキルチオニル基である；
Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、任意に置換されるアルキル基、任意に置換されるアルケニル基、任意に置換されるアルキニル基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、－ＮＲ’Ｒ’’およびカルボキシ基から選ばれる；
ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～１０の整数である；および
Ｒ’とＲ’’はそれぞれ独立に、Ｈまたは任意に置換されるアルキル基から選ばれる。
互変異性体、またはその薬学的に許容される塩、そのプロドラッグ若しくはその溶媒和物であるイオン化可能な脂質化合物を提供する：
【化1】
Ａ１とＡ２はそれぞれ独立にＣＨまたはＮである；
Ｂは－Ｌ４－Ｎ（Ｒ９Ｒ１０）またはＲ１２から選ばれる；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はそれぞれ独立に、任意に置換されるアルキレン基、任意に置換される－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－、任意に置換されるアルケニレン基および任意に置換されるアルキニレン基から選ばれる；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０とＲ１２はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、任意に置換されるアルキル基、任意に置換されるアルケニル基、任意に置換されるシクロアルキル基、任意に置換されるヘテロシクリル基、任意に置換されるシクロアルケニル基、任意に置換されるシクロアルキニル基、任意に置換されるアリール基、任意に置換されるヘテロアリール基、任意に置換されるアルコキシ基、任意に置換されるアルコキシカルボニル基、任意に置換されるアシル基、－ＮＲ’Ｒ’’、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基またはアルキルチオニル基である；
Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、任意に置換されるアルキル基、任意に置換されるアルケニル基、任意に置換されるアルキニル基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、－ＮＲ’Ｒ’’およびカルボキシ基から選ばれる；
ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～１０の整数である；および
Ｒ’とＲ’’はそれぞれ独立に、Ｈまたは任意に置換されるアルキル基から選ばれる。
【0009】
本発明の第二の態様は、式Ｉで示されるイオン化可能な脂質化合物を含む脂質ナノ粒子を提供する。
【0010】
本発明の第三の態様は、式Ｉで示されるイオン化可能な脂質化合物を含むか、或いは前記の脂質ナノ粒子を含む組成物を提供する。
【0011】
本発明の第四の態様は、本発明のいずれかの実施形態にかかる医薬組成物を投与することを含む、対象の疾患または病症を治療または予防するための方法を提供する。
【0012】
本発明の第五の態様は、脂質ナノ粒子または医薬組成物の調製における本発明のいずれかの実施形態にかかる式Ｉの化合物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】フローサイトメトリー解析による細胞生存率。
【図2】ＡｏｐＥ４を添加しないまたは添加した条件下で、本発明の一実施形態にかかるＬＮＰ製剤による細胞へのトランスフェクション効率。
【図3】細胞蛍光イメージングで得られた蛍光イメージ。
【図4】脂質ナノ粒子の筋肉内注射（ｉ．ｍ．）および静脈内注射（ｉ．ｖ．）後６時間のマウスの蛍光イメージング画像。
【図5】脂質ナノ粒子の筋肉内注射（ｉ．ｍ．）および静脈内注射（ｉ．ｖ．）後６時間のマウスの組織蛍光イメージング画像。
【図6】脂質ナノ粒子の筋肉内注射（ｉ．ｍ．）および静脈内注射（ｉ．ｖ．）後２４時間のマウスの蛍光イメージング画像。
【図7】脂質ナノ粒子の筋肉内注射（ｉ．ｍ．）および静脈内注射（ｉ．ｖ．）後６時間、２４時間のマウスの蛍光強度。
【図8】インビトロ安定性試験結果。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明の範囲内であれば、本発明の上記した各技術的特徴および以下（例えば実施例）で具体的に開示される各技術的特徴は、互いに組み合わせて、好ましい技術方案を構成してもよいことは理解されるべきである。
【0015】
Ｉ．用語
特に断らない限り、本文で用いられる下記の用語は、下記の意味を有する：
本文で用いられる「含む」および「含有する」などの用語は、開放的且つ包括的な意味で解釈されるべきであり、文脈上で別途断らない限り、本明細書および特許請求の範囲全体にわたり、「含むが、これらに限定されない」ことを意味する。
特に断らない限り、本文で用いられる下記の用語は、下記の意味を有する：
本文で用いられる「含む」および「含有する」などの用語は、開放的且つ包括的な意味で解釈されるべきであり、文脈上で別途断らない限り、本明細書および特許請求の範囲全体にわたり、「含むが、これらに限定されない」ことを意味する。
【0016】
本発明において、「一実施形態」と言及される場合、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が、本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体にわたり、様々な箇所に現れる「一つまたは複数の実施形態において」という表現は、必ずしも同じ実施形態を指すものではない。また、特定の特徴、構造または特性は、一つまたは複数の実施形態において、任意の適切な方式で組み合わせてもよい。
【0017】
別途定義されない限り、本文で用いられる全ての技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書および特許請求の範囲で用いられるように、単数形の「一つ」、「当該」および「前記」は、文脈上で別途断らない限り、複数の参照語も含む。
【0018】
治療用核酸などの活性剤または治療剤の「有効量」または「治療有効量」とは、所望の効果（例えば、核酸の非存在下で検出される正常な発現レベルと比較した標的配列の発現の増加または阻害）をもたらすのに十分な量である。
【0019】
本文に記載の「核酸」とは、少なくとも２つのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む一本鎖または二本鎖の形態のポリマーを指し、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらのハイブリッドを含む。ＤＮＡはアンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ生成物またはベクターの形態であってもよい。ＲＮＡは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、多価ＲＮＡ、ダイサー基質ＲＮＡ、またはウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、およびそれらの組み合わせの形態であってもよい。
【0020】
本文に記載の「遺伝子」とは、ポリペプチドまたは前駆体ポリペプチドを生成するのに必要なコード配列の一部または全長を含む核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。
【0021】
本文に記載の「脂質」とは、一般に水には溶けないが多くの有機溶媒には溶けることを特徴とする有機化合物群を指し、脂肪酸のエステルを含むが、これらに限定されない。それらは通常、少なくとも３つのカテゴリーに分けられる：（１）脂肪や油脂やワックスを含む「単純脂質」；（２）リン脂質や糖脂質を含む「複合脂質」；（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。
【0022】
「ステロイド」とは、以下の炭素骨格を含む化合物である：
ステロイドの非制限的な実例として、コレステロールなどがある。
【化2】
【0023】
「コレステロール誘導体」は、リポソームの調製に使用するために本技術分野で公知のコレステロール誘導体であってもよく、例示的なコレステロール誘導体には、汎用のコレステロール（ＣＡＳ：５７－８８－５）が含まれる。
【0024】
本文に記載の「ポリマー抱合脂質」とは、脂質部分とポリマー部分を含む分子を指す。ポリマー抱合脂質の実例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化脂質である。用語の「ポリエチレングリコール化脂質」とは、脂質部分とポリエチレングリコール部分を含む分子を指す。ポリエチレングリコール化脂質は本分野で既知のものであり、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ＤＡＧ（ジアシルグリセロール）、ＰＥＧ－ＰＥ（ホスファチジルエタノールアミン）、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ（－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）、ＰＥＧ－ｃｅｒ（セラミド）、およびＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメートを含む。本発明の好ましい実施形態において、ポリマー抱合脂質はｍＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥである。
【0025】
本文に記載の「中性脂質」とは、所定のｐＨで非荷電または中性の両性イオンの形態で存在する脂質物質を指す。生理的ｐＨで、このような脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などのホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、セラミドなどを含むが、これらに限定されない。中性脂質は、合成的なものであっても、天然由来のものであってもよい。
【0026】
本文に記載の「脂質ナノ粒子」とは、少なくとも一つのナノスケールサイズ（例えば１～１０００ｎｍ）を有する粒子を指す。脂質ナノ粒子は、活性剤または治療剤（例えば核酸）を標的部位（例えば細胞、組織（例えば腫瘍組織などの疾患組織）、臓器）に送達する
ために、製剤に封入されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明にかかる脂質ナノ粒子は核酸を含む。このような脂質ナノ粒子は通常、１種以上の本発明の式Ｉの化合物と、１種以上のヘルパー脂質分子、１種以上のコレステロールまたはコレステロール誘導体、および／または１種以上のポリマー抱合脂質分子とを含む。前記ヘルパー脂質分子は、１種以上の中性脂質分子であってもよい。活性剤または治療剤は、酵素分解から、或いは宿主の有機体または細胞のメカニズムによって誘発される他の望ましくない作用、例えば有害な免疫応答から保護されるために、脂質ナノ粒子の脂質部分内に、或いは脂質ナノ粒子の脂質部分の一部または全部によって囲まれた水性空間内にカプセル化されてもよい。
ために、製剤に封入されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明にかかる脂質ナノ粒子は核酸を含む。このような脂質ナノ粒子は通常、１種以上の本発明の式Ｉの化合物と、１種以上のヘルパー脂質分子、１種以上のコレステロールまたはコレステロール誘導体、および／または１種以上のポリマー抱合脂質分子とを含む。前記ヘルパー脂質分子は、１種以上の中性脂質分子であってもよい。活性剤または治療剤は、酵素分解から、或いは宿主の有機体または細胞のメカニズムによって誘発される他の望ましくない作用、例えば有害な免疫応答から保護されるために、脂質ナノ粒子の脂質部分内に、或いは脂質ナノ粒子の脂質部分の一部または全部によって囲まれた水性空間内にカプセル化されてもよい。
【0027】
本分野で周知されるように、脂質ナノ粒子の平均直径は、約３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、或約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍまたは約１５０ｎｍであってもよく、且つ脂質ナノ粒子は実質的に無毒である。ある実施形態において、核酸は、脂質ナノ粒子中に存在する場合、水性溶液中のヌクレアーゼによる分解に対して耐性を持つ。核酸を含む脂質ナノ粒子およびその調製方法は従来技術で既知のものであり、例えば、ＣＮ１０２７１２９３５Ａまたは関連特許などを参照することができ、それらの開示内容全体は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0028】
本発明の脂質ナノ粒子の形態は特に限定されないが、例えば本発明にかかるイオン化可能な脂質が水性溶媒に分散した形態として、単層リポソーム、多層リポソーム、または不特定の層状構造体などが挙げられる。
【0029】
本文において、「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を指す。
「ヒドロキシ基」とは、－ＯＨ基を指す。
「カルボニル基」とは、－Ｃ（＝Ｏ）－基を指す。
「カルボキシ基」とは、－ＣＯＯＨを指す。
「ニトロ基」とは、－ＮＯ２を指す。
「シアノ基」とは、－ＣＮを指す。
「アミノ基」とは、－ＮＨ２を指す。
「ヒドロキシ基」とは、－ＯＨ基を指す。
「カルボニル基」とは、－Ｃ（＝Ｏ）－基を指す。
「カルボキシ基」とは、－ＣＯＯＨを指す。
「ニトロ基」とは、－ＮＯ２を指す。
「シアノ基」とは、－ＣＮを指す。
「アミノ基」とは、－ＮＨ２を指す。
【0030】
「アルキル基」とは、１個から２４個の炭素原子を含有する直鎖または分岐鎖の飽和脂肪族炭化水素基を指し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、トリデシル基、ヘネイコシル基、トリコシル基、メチルペンタデシル基、ヘキシルノニル基などが挙げられ、且つアルキル基は単結合を介して分子の残りの部分と結合している。いくつかの実施形態において、本文に記載のアルキル基は、１０～２４個の炭素原子を有するか、或いは１２～２０個の炭素原子を有する。
【0031】
「アルキレン基」は、１～２０個の炭素原子を有し、親アルカンの同一または異なる２個の炭素原子から２個の水素原子を除去することによって得られる２個の一価基中心を有する飽和、分岐鎖または直鎖の炭化水素基であり、例えば、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－および－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－が挙げられる。いくつかの実施形態において、本文に記載のアルキレン基は、1～１０個の炭素原子を有するか、或いは例えば１～４個の炭素原子を有する。
【0032】
「アルコキシ基」とは、アルキル－Ｏ－、即ち、１～２４個の炭素原子を含有するアルキル基の末端に酸素原子が結合された基を指し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、イソプロポキシなどが挙げられる。アルキレンオキシ基とは、その一つの末端に酸素原子が結合されたアルキレン基を指し、例えば－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－が挙げられる。
【0033】
「アルコキシカルボニル基」とは、アルコキシ基の酸素にカルボニル基が結合された基を指し、例えば、ＣＨ３ＯＣ（＝Ｏ）－、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣ（＝Ｏ）－などが挙げられる。
【0034】
「アルキルチオニル基」とは、アルキル－Ｓ（＝Ｏ）－基を指す。
【0035】
「アルケニル基」とは、２～２４この炭素原子を含有し、一つ以上の不飽和炭素－炭素二重結合を含む直鎖または分岐鎖の脂肪族炭化水素基を指し、例えば、ビニル基、プロペニル基、トリデセニル基、テトラデカジエニル基、オクタデカトリエニル基などが挙げられ、且つそれが単結合を介して分子の残りの部分と結合している。
【0036】
「アルケニレン基」とは、炭素原子数が一般的に２～２４個で、一つ以上の不飽和炭素－炭素二重結合を含む二価の直鎖または分岐鎖のアルケニル基を指し、且つそれが２つの単結合を介して分子の残りの部分と結合している。例示的なアルケニレン基は、－ＣＨＣＨ＝ＣＨＣＨ－であってもよい。
【0037】
「シクロアルケニル基」とは、３～１０個の環炭素原子を含有する不飽和環状アルケニル基を指す。
【0038】
「アルキニル基」とは、２～２４個の炭素原子を含有し、一つ以上の不飽和炭素－炭素三重結合を含む直鎖または分岐鎖の脂肪族炭化水素基を指し、例えば、エチニル基、プロピニル基などが挙げられ、且つそれが単結合を介して分子の残りの部分と結合している。
【0039】
「シクロアルキニル基」とは、３～１０個の環炭素原子を含有する不飽和環状アルキニル基を指す。
【0040】
「アルキニレン基」とは、炭素原子数が一般的に３～２４個で、一つ以上の不飽和炭素－炭素三重結合を含む二価の直鎖または分岐鎖のアルキニル基を指し、且つそれが２つの単結合を介して分子の残りの部分と結合している。例示的なアルキニレン基は、－ＣＨＣ≡ＣＣＨ－であってもよい。
【0041】
「アシル基」とは、アルキル－Ｃ（Ｏ）－基を指し、例えば、アセチル基、プロピオニル基などが挙げられる。
【0042】
「アリール基」とは、水素、６～１８個の炭素原子（好ましくは６～１４個の炭素原子）および少なくとも一つの芳香族環を含む炭素環系基を指す。アリール基は、単環式、二環式、三環式または四環式の環系であってもよく、縮合環系または架橋環系を含む。アリール基は、アセアントリレン、アセナフテン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、フルオランテン、フルオレン、ａｓ‐インダセン、ｓ‐インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、フェナレン、フェナントレン、プレイアデン、ピレンおよびトリフェニレンから由来するアリール基を含むが、これらに限定されない。
【0043】
「アリーロキシ基」とは、－ＯＲを指し、Ｒはアリール基である。
【0044】
「炭素環式基」とは、炭素原子と水素原子のみからなる安定な飽和または不飽和非芳香族
単環式または多環式炭化水素基を指し、その環炭素原子数は３～１８個であってもよい。炭素環式基は、３～１８個の炭素原子を有する縮合環系または架橋環系を含んでもよく、飽和で、単結合を介して分子の残りの部分と結合している。いくつかの実施形態において、炭素環式基はシクロアルキル基であり、代表的なシクロアルキル基は、３～１５個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ１５シクロアルキル基）、３～１０個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ１０シクロアルキル基）、３～８個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル基）、３～６個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル基）、３～５個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ５シクロアルキル基）または３～４個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ４シクロアルキル基）を有するシクロアルキル基を含むが、これらに限定されない。単環式シクロアルキル基は、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基およびシクロオクチル基を含むが、これらに限定されない。多環式シクロアルキル基は、例えば、アダマンチル基、ノルボルニル基、デカヒドロナフチル基、ビシクロ［３．３．０］オクチル、ビシクロ［４．３．０］ノニル、シス－デカヒドロナフチル、トランス－デカヒドロナフチル、ビシクロ［２．１．１］ヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．２．２］ノニルおよびビシクロ［３．３．２］デシル、並びに７，７－ジメチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプチル基を含む。好ましい実施形態において、シクロアルキル基は、３～８員のシクロアルキル基であり、例えば、シクロプロピル基、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基などが挙げられる。
単環式または多環式炭化水素基を指し、その環炭素原子数は３～１８個であってもよい。炭素環式基は、３～１８個の炭素原子を有する縮合環系または架橋環系を含んでもよく、飽和で、単結合を介して分子の残りの部分と結合している。いくつかの実施形態において、炭素環式基はシクロアルキル基であり、代表的なシクロアルキル基は、３～１５個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ１５シクロアルキル基）、３～１０個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ１０シクロアルキル基）、３～８個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ８シクロアルキル基）、３～６個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ６シクロアルキル基）、３～５個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ５シクロアルキル基）または３～４個の炭素原子（Ｃ３－Ｃ４シクロアルキル基）を有するシクロアルキル基を含むが、これらに限定されない。単環式シクロアルキル基は、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基およびシクロオクチル基を含むが、これらに限定されない。多環式シクロアルキル基は、例えば、アダマンチル基、ノルボルニル基、デカヒドロナフチル基、ビシクロ［３．３．０］オクチル、ビシクロ［４．３．０］ノニル、シス－デカヒドロナフチル、トランス－デカヒドロナフチル、ビシクロ［２．１．１］ヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、ビシクロ［２．２．２］オクチル、ビシクロ［３．２．２］ノニルおよびビシクロ［３．３．２］デシル、並びに７，７－ジメチル－ビシクロ［２．２．１］ヘプチル基を含む。好ましい実施形態において、シクロアルキル基は、３～８員のシクロアルキル基であり、例えば、シクロプロピル基、シクロペンチル基およびシクロヘキシル基などが挙げられる。
【0045】
「ヘテロシクリル基」とは、２～１４個の炭素原子と、窒素、リン、酸素および硫黄から選らばれる１～６個のヘテロ原子とからなる安定な３～２０員の非芳香族環式基を指す。ヘテロシクリル基は、単環式、二環式、三環式またはそれ以上の環式の環系であってもよく、縮合環系、架橋環系またはスピロ環系を含んでもよい。ヘテロシクリル基は、部分的に飽和しても完全に飽和してもよい。ヘテロシクリル基は、炭素原子またはヘテロ原子を経由し、単結合を介して化合物の残りの部分と結合することができる。ヘテロシクリル基としては、窒素、酸素および硫黄から選ばれる１～３個のヘテロ原子を含む安定な４員～１１員の非芳香族単環式基、二環式基、架橋環式基またはスピロ環式基が好ましく、窒素、酸素および硫黄から選ばれる１～３個のヘテロ原子を含む安定な４員～８員の非芳香族単環式基、二環式基、架橋環式基またはスピロ環式基がより好ましい。ヘテロシクリル基の実例は、ピロリジニル基、モルホリニル基、ピペラジニル基、ホモピペラジニル基、ピペリジニル基、チオモルホリニル基、２，７－ジアザスピロ［３．５］ノナン－７－イル基、２－オキサ－６－アザスピロ［３．３］ヘプタン－６－イル基、２，５－ジアザ－ビシクロ［２．２．１］ヘプタン－２－イル基、アゼチジニル基、ピラニル基、テトラヒドロピラニル基、チオピラニル基、テトラヒドロフラニル基、オキサジニル基、ジオキソラニル基、テトラヒドロイソキノリニル基、デカヒドロイソキノリニル基、イミダゾリニル基、イミダゾリジニル基、キノリジニル基、チアゾリジニル基、イソチアゾリジニル基、イソオキサゾリジニル基、ジヒドロインドリル基、オクタヒドロインドリル基、オクタヒドロイソインドリル基、ピロリジニル基、ピラゾリジニル基、フタルイミド基などを含むが、これらに限定されない。
【0046】
「ヘテロアリール基」とは、１～１５個の炭素原子（好ましくは１～１０個の炭素原子）と、窒素、酸素および硫黄から選らばれる１～６個のヘテロ原子とを環内に有する５～１６員の共役環系基を指す。ヘテロアリール基は、単環式、二環式、三環式またはそれ以上の環式の環系であってもよい。ヘテロアリール基としては、窒素、酸素および硫黄から選らばれる１～５個のヘテロ原子を含む安定な５～１２員の芳香族基が好ましく、窒素、酸素および硫黄から選らばれる１～４個のヘテロ原子を含む安定な５～１０員の芳香族基、または窒素、酸素および硫黄から選らばれる１～３個のヘテロ原子を含む５～６員の芳香族基がより好ましい。ヘテロアリール基の実例は、チエニル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、オキサジアゾリル基、イソオキサゾリル基、ピリジニル基、ピリミジニル基、ピラジニル基、ピリダジニル基、ベンズイミダゾリル基、
ベンズピラゾリル基、インドリル基、フラニル基、ピロリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、トリアジニル基、インドリジニル基、イソインドリル基、インダゾリル基、イソインダゾリル基、プリニル基、キノリル基、イソキノリル基、ナフチリジニル基、ナフチリジル基、キノキサリニル基、プテリジル基、カルバゾリル基、カルボリニル基、フェナントリジニル基、フェナントロリニル基、アクリジニル基、フェナジニル基、イソチアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾチエニル基、オキサトリアゾリル基、シンノリニル基、キナゾリニル基、フェニルチオ基、インドリジニル基、ｏ－フェナントロリニル基、イソオキサゾリル基、フェノキサジニル基、フェノチアジニル基、４，５，６，７－テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエニル基、ナフトピリジニル基、［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｂ］ピリダジニル、［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジニル、［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｃ］ピリミジニル、［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピリジニル、イミダゾロ［１，２－ａ］ピリジニル、イミダゾロ［１，２－ｂ］ピリダジニル、イミダゾロ［１，２－ａ］ピラジニルなどを含むが、これらに限定されない。
ベンズピラゾリル基、インドリル基、フラニル基、ピロリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、トリアジニル基、インドリジニル基、イソインドリル基、インダゾリル基、イソインダゾリル基、プリニル基、キノリル基、イソキノリル基、ナフチリジニル基、ナフチリジル基、キノキサリニル基、プテリジル基、カルバゾリル基、カルボリニル基、フェナントリジニル基、フェナントロリニル基、アクリジニル基、フェナジニル基、イソチアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、ベンゾチエニル基、オキサトリアゾリル基、シンノリニル基、キナゾリニル基、フェニルチオ基、インドリジニル基、ｏ－フェナントロリニル基、イソオキサゾリル基、フェノキサジニル基、フェノチアジニル基、４，５，６，７－テトラヒドロベンゾ［ｂ］チエニル基、ナフトピリジニル基、［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｂ］ピリダジニル、［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピラジニル、［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ｃ］ピリミジニル、［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］ピリジニル、イミダゾロ［１，２－ａ］ピリジニル、イミダゾロ［１，２－ｂ］ピリダジニル、イミダゾロ［１，２－ａ］ピラジニルなどを含むが、これらに限定されない。
【0047】
本文において、ある基が「任意に置換される」場合、１～５個の置換基で任意に置換されてもよく、前記置換基は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン、ハロアルキル基、ハロアルケニル基、ハロアルキニル基、シアノ基、ニトロ基、任意に置換されるアリール基、任意に置換されるヘテロアリール基、任意に置換されるシクロアルキル基、任意に置換されるヘテロシクリル基から選らばれてもよい。置換基としてのこれらのアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基およびヘテロシクリル基はそれぞれ、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ハロゲン、ハロアルキル基、ハロアルケニル基、ハロアルキニル基、シアノ基、ニトロ基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基およびヘテロシクリル基などの基で任意に置換されてもよい。置換基の数は化合物の分子構造に影響されることを理解すべきである。例えば、置換基がアリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基またはヘテロシクリル基の場合、置換基の数は通常１個であり、置換基がハロゲンの場合、ハロゲン原子の数は、置換される基の鎖長または環炭素原子数に応じて、２～５個であってもよい。
【0048】
本文において、「イオン化可能な脂質化合物」とは、特定のｐＨまたはｐＨ範囲において、荷電の形態で存在する脂質化合物を指し、正荷電または負荷電、好ましくは正荷電した脂質化合物（即ち、カチオン性脂質化合物）を含む。特定のｐＨまたはｐＨ範囲とは、脂質化合物が保存または使用されようとする環境のｐＨまたはｐＨ範囲を指し、生理的ｐＨを含むが、これに限定されない。
【0049】
本文において、「薬学的に許容される塩」は酸付加塩と塩基付加塩を含む。
「薬学的に許容される酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的効力と特性が保持され、無機酸または有機酸と形成した塩を指す。前記無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸やリン酸などを含む。前記有機酸は、酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４－アセトアミド安息香酸、樟脳酸、樟脳－１０－スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２－オキソグルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフタレンカルボン酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシア
ン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸やウンデシレン酸などを含む。
「薬学的に許容される酸付加塩」とは、遊離塩基の生物学的効力と特性が保持され、無機酸または有機酸と形成した塩を指す。前記無機酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸やリン酸などを含む。前記有機酸は、酢酸、２，２－ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、４－アセトアミド安息香酸、樟脳酸、樟脳－１０－スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、桂皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン－１，２－ジスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、ガラクタル酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、２－オキソグルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン－１，５－ジスルホン酸、ナフタレン－２－スルホン酸、１－ヒドロキシ－２－ナフタレンカルボン酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、４－アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシア
ン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸やウンデシレン酸などを含む。
【0050】
「薬学的に許容される塩基付加塩」とは、遊離酸の生物学的効力と特性が保持された塩を指す。これらの塩は、遊離酸に無機または有機塩基を加えることによって調製される。無機塩基から誘導された塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩などを含むが、これらに限定されない。好ましい無機塩は、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩である。有機塩基から誘導された塩は、例えば、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、２－ジメチルアミノエタノール、２－ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベナミン、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルコサミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ－エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などの、第一級、第二級、第三級アミン、天然に存在するものを含む置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂との塩を含むが、これらに限定されない。特に好ましい有機塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンおよびカフェインである。
【0051】
本文において、「医薬組成物」とは、本発明の式Ｉの化合物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む製剤を指す。医薬組成物は通常、治療有効量の式Ｉの化合物および／または治療剤若しくは活性剤を含有する。「治療有効量」とは、哺乳動物、好ましくはヒトに投与した場合、哺乳動物において治療効果を得るのに十分な量を指す。「治療有効量」を構成する本発明の式Ｉの化合物および／または治療剤若しくは活性剤の量は、使用される化合物または治療剤若しくは活性剤、病状およびその重症度、投与形態、並びに治療しようとする哺乳動物の年齢によって異なるが、当業者であれば、自身の知識および本開示の内容に基づいて普通に決定することができる。
【0052】
本文に記載の「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、ヒトまたは家畜での使用が許容されるものとしてＦＤＡまたはＣＦＤＡにより承認されたあらゆるアジュバント、担体、賦形剤、流動化剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料／着色剤、増味剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、等張化剤、溶媒または乳化剤を含むが、これらに限定されない。
【0053】
本文に記載の「治療」は、標的疾患または病状に罹患している哺乳動物、好ましくはヒトにおける標的疾患または病状に対する治療を含み、且つ以下のものを含む：
（１）特に哺乳動物が当該病状に罹患しやすいが、罹患していると診断されていない場合に、当該疾患または病状がその哺乳動物に発現するのを予防すること；
（２）当該疾患または病状を抑制する、即ちその進行を阻止すること；
（３）当該疾患または病状を緩和する、即ち当該疾患または病状の解消を引き起こすこと；或いは
（４）当該疾患または病状による症状を緩和させる、即ち潜在的な疾患または病状を解決することなく痛みを緩和すること。
（１）特に哺乳動物が当該病状に罹患しやすいが、罹患していると診断されていない場合に、当該疾患または病状がその哺乳動物に発現するのを予防すること；
（２）当該疾患または病状を抑制する、即ちその進行を阻止すること；
（３）当該疾患または病状を緩和する、即ち当該疾患または病状の解消を引き起こすこと；或いは
（４）当該疾患または病状による症状を緩和させる、即ち潜在的な疾患または病状を解決することなく痛みを緩和すること。
【0054】
本文において、「疾患」と「病態」は互換的に用いても、使い分けられてもよく、それは、特定の疾患または病状は、病原体が知られていない（発症の原因がまだ明らかにされていない）せいで、まだ疾患として認識されておらず、むしろ望ましくない状態や症候群（ただし、臨床医によって多かれ少なかれ特定の症状群が特定された）として認識されている場合があるからである。
【0055】
本文において、「哺乳動物」は、ヒトのほか、実験動物や家庭用ペットなどの家畜化された動物（例えばネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ）、および家畜化されていない動物（例えば野生動物など）も含む。
【0056】
式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩は、１つ以上の不斉中心を含んでもよく、これによって、エナンチオマー、ジアステレオマー、および絶対立体化学により（Ｒ）－または（Ｓ）－、或いは（Ｄ）－または（Ｌ）－（アミノ酸の場合）として定義され得る他の立体異性体の形態を生じ得る。本発明は、そのような可能な異性体の全て、並びにそれらのラセミ体および光学的に純粋な形態を含む。光学活性的な（＋）と（－）、（Ｒ）－と（Ｓ）－、または（Ｄ）－と（Ｌ）－の異性体は、キラルシントンやキラル試薬を用いて調製してもよく、或いはクロマトグラフィーや段階的結晶化などの従来の技術を用いて分割してもよい。個々のエナンチオマーの調製／分離に使用される従来の技術は、適切な光学的に純粋な前駆体からのキラル合成、或いは例えばキラル高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるラセミ体（または塩若しくは誘導体のラセミ体）の分割を含む。本文に記載の化合物がエチレン性二重結合または他の幾何不斉中心を有する場合、特に断らない限り、該化合物がＥとＺ幾何異性体を含むことを意味する。同様に、全ての互変異性体形態を含むことも意味する。
【0057】
ＩＩ．イオン化可能な脂質化合物
本文に記載のイオン化可能な脂質化合物は、下式Ｉで示される構造式を有する：
式中、Ａ１とＡ２はそれぞれ独立にＣＨまたはＮである；Ｂは－Ｌ４－Ｎ（Ｒ９Ｒ１０）またはＲ１２から選ばれる；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はそれぞれ独立に、任意に置換されるアルキレン基、任意に置換される－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－、任意に置換されるアルケニレン基および任意に置換されるアルキニレン基から選ばれる；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、Ｒ１０とＲ１２はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、任意に置換されるアルキル基、任意に置換されるアルケニル基、任意に置換されるシクロアルキル基、任意に置換されるヘテロシクリル基、任意に置換されるシクロアルケニル基、任意に置換されるシクロアルキニル基、任意に置換されるアリール基、任意に置換されるヘテロアリール基、任意に置換されるアルコキシ基、任意に置換されるアルコキシカルボニル基、任意に置換されるアシル基、－ＮＲ’Ｒ’’、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基またはアルキルチオニル基である；Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはそれぞれ独立に、Ｈ、任意に置換されるアルキル基、任意に置換されるアルケニル基、任意に置換されるアルキニル基、ハロゲン、ニトロ基、シアノ基、－ＮＲ’Ｒ’’およびカルボキシ基から選ばれる；ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～１０の整数である；
およびＲ’とＲ’’はそれぞれ独立に、Ｈまたは任意に置換されるアルキル基から選ばれる。
本文に記載のイオン化可能な脂質化合物は、下式Ｉで示される構造式を有する：
【化3】
およびＲ’とＲ’’はそれぞれ独立に、Ｈまたは任意に置換されるアルキル基から選ばれる。
【0058】
本文は、化学式Ｉで示される化合物の立体異性体、互変異性体、薬学的に許容される塩、プロドラッグおよび溶媒和物も含む。
【0059】
式Ｉにおいて、ある基が「任意に置換される」場合、置換基は、ヒドロキシ基、アルコキシ基、ハロゲン、アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシ置換アルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、ヒドロキシ置換アルケニル基、－ＮＲ’とＲ’’、任意に置換されるシクロアルキル基、任意に置換されるアリール基、任意に置換されるヘテロアリール基、または任意に置換されるヘテロシクリル基から選ばれてもよい。置換基の数は１、２、３、４、５または６個であってもよい。前記Ｒ’とＲ’’はそれぞれ独立に、ＨおよびＣ１－４アルキル基から選ばれる。前記アルキル基、アルコキシ基、ハロアルキル基およびヒドロキシ置換アルキル基におけるアルキル基は、Ｃ１－６アルキル基またはＣ１－４アルキル基であってもよい；前記アルケニル基、ハロアルケニル基およびヒドロキシ置換アルケニル基におけるアルケニル基は、Ｃ２－６アルケニル基またはＣ２－４アルケニル基であってもよい；前記シクロアルキル基は、ハロゲン、Ｃ１－４アルキル基、ヒドロキシ基および－ＮＲ’Ｒ’’から選ばれる１～４個の置換基で任意に置換されるＣ３－８シクロアルキル基であってもよい；前記アリール基は、６～１４員のアリール基、例えばフェニル基およびナフチル基であってもよく、前記アリール基は、ハロゲン、Ｃ１－４アルキル基、ヒドロキシ基および－ＮＲ’Ｒ’’から選ばれる１～４個の置換基で任意に置換されてもよい；前記ヘテロアリール基は、５～１０員のヘテロアリール基、例えば５～１０員の窒素および／または酸素含有ヘテロアリール基、例えばピリジニル基、ピラゾリル基およびイミダゾリル基などであってもよく、前記ヘテロアリール基は、ハロゲン、Ｃ１－４アルキル基、ヒドロキシ基および－ＮＲ’Ｒ’’から選ばれる１～４個の置換基で任意に置換されてもよい；前記ヘテロシクリル基は、４～１０員のヘテロシクリル基、好ましくは４～１０員の窒素および／または酸素含有ヘテロシクリル基、例えばモルホリニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、ピロリジニル基などであってもよく、前記ヘテロシクリル基は、ハロゲン、Ｃ１－４アルキル基、ヒドロキシ基および－ＮＲ’Ｒ’’から選ばれる１～４個の置換基で任意に置換されてもよい。
【0060】
好ましい実施形態において、式Ｉにおいて、Ａ１とＡ２は両方ともＮである。
【0061】
好ましい実施形態において、式Ｉにおいて、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はそれぞれ独立に、任意に置換されるアルキレン基または任意に置換される－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－である。好ましくは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はそれぞれ、ヒドロキシ基、－ＮＲ’Ｒ’’、Ｃ１－４アルコキシ基およびハロゲンから選ばれる１～５個の置換基で任意に置換され、ただし、Ｒ’とＲ’’はそれぞれ独立に、ＨおよびＣ１－４アルキル基から選ばれる。好ましくは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はそれぞれ独立に、Ｃ１－４アルキレン基または－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－である。
【0062】
好ましい実施形態において、式Ｉにおいて、ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～４の整数である。
【0063】
いくつかの好ましい実施形態において、ｎは２で、ｍは１～４で、ｏは２である。
【0064】
いくつかの実施形態において、式Ｉにおいて、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はいずれもＣ１－４アルキレン基である。いくつかの実施形態において、Ｌ１、Ｌ２とＬ４はそれぞれ独立に－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－であり、好ましくは、Ｌ１、Ｌ２とＬ４は同じ基である；Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である。好ましくは、これらの実施形態におい
て、ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～４の整数である；より好ましくは、ｎは２で、ｍは１～４で、ｏは２である。
て、ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～４の整数である；より好ましくは、ｎは２で、ｍは１～４で、ｏは２である。
【0065】
好ましい実施形態において、式Ｉにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基および／またはハロゲンで任意に置換されるアルキル基である。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４は少なくともヒドロキシ基で置換されており、好ましくは少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されている。ヒドロキシ基である置換基の数は、好ましくは１、２、３、４または５個であり、より好ましくは１個である。好ましくは、少なくとも一つのヒドロキシ基は、当該アルキル基が前記Ｎ原子と結合する末端から２番目の炭素原子に位置する。好ましくは、前記アルキル基の炭素鎖長は、１～２４個の炭素原子、好ましくは８～２４個の炭素原子、より好ましくは１０～２０個の炭素原子である。いくつかの実施形態において、前記アルキル基の炭素鎖長は１２～１８個の炭素原子であり、好ましくは、当該アルキル基では、当該アルキル基が前記Ｎ原子と結合する末端から２番目の炭素原子に一つのヒドロキシ置換基がある。いくつかの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１はハロゲンで任意に置換されるＣ１－２１アルキル基であり、好ましくは、Ｒ１１はＣ８－１５アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は非置換のＣ１－２１アルキル基または全フッ素置換のＣ１－２１アルキル基である。好ましい実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４は同じ基である。
【0066】
好ましい実施形態において、式Ｉにおいて、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはそれぞれ独立に、Ｈおよび任意に置換されるＣ１－４アルキル基から選ばれる。前記Ｃ１－４アルキル基は、ヒドロキシ基およびハロゲンから選ばれる１～５個の置換基で任意に置換される。より好ましくは、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはいずれもＨである。
【0067】
好ましい実施形態において、Ｒ９、Ｒ１０とＲ１２はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基および／またはハロゲンで任意に置換されるアルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ９、Ｒ１０とＲ１２はそれぞれ、少なくともヒドロキシ基で置換されており、好ましくは少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されている。ヒドロキシ基である置換基の数は、好ましくは１～５個であり、より好ましくは１個である。好ましくは、少なくとも一つのヒドロキシ基は、当該アルキル基が前記Ｎ原子と結合する末端から２番目の炭素原子に位置する。好ましくは、前記アルキル基の炭素鎖長は、１～２４個の炭素原子、好ましくは８～２４個の炭素原子、より好ましくは１０～２０個の炭素原子である。いくつかの実施形態において、前記アルキル基の炭素鎖長は１２～１８個の炭素原子であり、好ましくは、当該アルキル基では、当該アルキル基が前記Ｎ原子と結合する末端から２番目の炭素原子に一つのヒドロキシ置換基がある。いくつかの実施形態において、Ｒ９、Ｒ１０とＲ１２はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１はハロゲンで任意に置換されるＣ１－２１アルキル基であり、好ましくは、Ｒ１１はＣ８－１５アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ１１は非置換のＣ１－２１アルキル基または全フッ素置換のＣ１－２１アルキル基である。好ましい実施形態において、Ｒ９とＲ１０は同じ基である。
【0068】
いくつかの好ましい実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９とＲ１０はいずれも前記－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１基であり、好ましくはいずれも同じ基である。
【0069】
いくつかの実施形態において、ＢはＲ１２であり、Ｒ１２は１、２、３、４または５個のヒドロキシ基で任意に置換されるＣ１－１０アルキル基である。好ましくは、当該アルキル基では、Ｎと結合する末端から２番目の炭素原子がヒドロキシ基で置換されている。好ましくは、Ｒ１２は非置換のＣ１－４アルキル基または１若しくは２個のヒドロキシ基で
置換されるＣ１－４アルキル基である。
いくつかの実施形態において、ＢはＲ１２であり、Ｒ１２は１～５個のヒドロキシ基で任意に置換されるＣ１－１０アルキル基であり、好ましくは、当該アルキル基がＮと結合する末端から２番目の炭素原子は、ヒドロキシ基で置換されている；Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－またはＣ１－４アルキレン基であり、好ましくは、Ｌ１とＬ２は同じ基である；Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である。
置換されるＣ１－４アルキル基である。
いくつかの実施形態において、ＢはＲ１２であり、Ｒ１２は１～５個のヒドロキシ基で任意に置換されるＣ１－１０アルキル基であり、好ましくは、当該アルキル基がＮと結合する末端から２番目の炭素原子は、ヒドロキシ基で置換されている；Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－またはＣ１－４アルキレン基であり、好ましくは、Ｌ１とＬ２は同じ基である；Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である。
【0070】
好ましい実施形態において、式Ｉにおいて：
Ａ１とＡ２は両方ともＮである；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基で任意に置換されるＣ１－２４アルキル基である；好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４は少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されている；好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１はハロゲンで任意に置換されるＣ１－２１アルキル基であり、好ましくは、Ｒ１１は非置換のＣ１－２１アルキル基である；Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはいずれもＨである；
Ｂは－Ｌ４－Ｎ（Ｒ９Ｒ１０）である；ただし、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はいずれもＣ１－４アルキレン基であり、好ましくは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４は同じアルキレン基である；或いは、Ｌ１、Ｌ２とＬ４はそれぞれ独立に－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－であり、好ましくは、Ｌ１、Ｌ２とＬ４は同じ基であり、Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である；Ｒ９とＲ１０はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基および／またはハロゲンで任意に置換されるＣ１－２４アルキル基である；好ましくは、Ｒ９とＲ１０は少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されている；好ましくは、Ｒ９とＲ１０はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１はハロゲンで任意に置換されるＣ１－２１アルキル基であり、好ましくは、Ｒ１１は非置換のＣ１－２１アルキル基である；或いは、ＢはＲ１２である；ただし、Ｒ１２は１～５個のヒドロキシ基で任意に置換されるＣ１－１０アルキル基であり、好ましくは、当該アルキル基がＮと結合する末端から２番目の炭素原子は、ヒドロキシ基で置換されている；Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－またはＣ１－４アルキレン基であり、好ましくは、Ｌ１とＬ２は同じ基である；Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である；
ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～４の整数である。
Ａ１とＡ２は両方ともＮである；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基で任意に置換されるＣ１－２４アルキル基である；好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４は少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されている；好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１はハロゲンで任意に置換されるＣ１－２１アルキル基であり、好ましくは、Ｒ１１は非置換のＣ１－２１アルキル基である；Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはいずれもＨである；
Ｂは－Ｌ４－Ｎ（Ｒ９Ｒ１０）である；ただし、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４はいずれもＣ１－４アルキレン基であり、好ましくは、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３とＬ４は同じアルキレン基である；或いは、Ｌ１、Ｌ２とＬ４はそれぞれ独立に－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－であり、好ましくは、Ｌ１、Ｌ２とＬ４は同じ基であり、Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である；Ｒ９とＲ１０はそれぞれ独立に、ヒドロキシ基および／またはハロゲンで任意に置換されるＣ１－２４アルキル基である；好ましくは、Ｒ９とＲ１０は少なくとも一つのヒドロキシ基で置換されている；好ましくは、Ｒ９とＲ１０はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１はハロゲンで任意に置換されるＣ１－２１アルキル基であり、好ましくは、Ｒ１１は非置換のＣ１－２１アルキル基である；或いは、ＢはＲ１２である；ただし、Ｒ１２は１～５個のヒドロキシ基で任意に置換されるＣ１－１０アルキル基であり、好ましくは、当該アルキル基がＮと結合する末端から２番目の炭素原子は、ヒドロキシ基で置換されている；Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－またはＣ１－４アルキレン基であり、好ましくは、Ｌ１とＬ２は同じ基である；Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である；
ｎ、ｍとｏはそれぞれ独立に１～４の整数である。
【0071】
好ましい実施形態において、式Ｉにおいて、Ａ１とＡ２は両方ともＮである；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１は未置換のＣ５－１８アルキル基である；Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはいずれもＨである；ＢはＲ１２である；Ｒ１２は１、２、３、４または５個のヒドロキシ基で任意に置換されるＣ１－１０アルキル基であり、好ましくはＣ１－４アルキル基であり、好ましくは、当該アルキル基がＮと結合する末端から２番目の炭素原子は、ヒドロキシ基で置換されている；Ｌ１とＬ２はそれぞれ独立に、－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－またはＣ１－４アルキレン基であり、好ましくは、Ｌ１とＬ２は同じ基である；Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である；ｎは２で、ｍは１～４で、ｏは２である。
【0072】
好ましい実施形態において、式Ｉにおいて、Ａ１とＡ２は両方ともＮである；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３とＲ４はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１は未置換のＣ５－１８アルキル基である；Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ、Ｒ８ａとＲ８ｂはいずれもＨである；Ｂは－Ｌ４－Ｎ（Ｒ９Ｒ１０）である；Ｌ１、Ｌ２とＬ４はそれぞれ独立に－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－である；Ｌ３はＣ１－４アルキレン基である；Ｒ９とＲ１０はそれぞれ独立に－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｒ１１であり、ただし、前記Ｒ１１は未置換のＣ５－１８アルキル基である；ｎ
は２で、ｍは１～４で、ｏは２である。
は２で、ｍは１～４で、ｏは２である。
【0073】
好ましい実施形態において、前記化合物Ｉは以下の構造を有する：
各式中、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅとｆはそれぞれ独立に、０～２０の整数、好ましくは８～１６の整数、より好ましくは９～１５の整数である。いくつかの実施形態において、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅとｆはいずれも０～２０の同じ整数、好ましくは８～１６の同じ整数、より好ましくは９～１５の同じ整数である。
【化4】
【化5】
【化6】
【0074】
好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は：
である。
【化7】
【0075】
好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は：
である。
【化8】
【0076】
好ましい実施形態において、式Ｉの化合物は：
である。
【化9】
【0077】
ＩＩＩ．脂質ナノ粒子
本発明にかかる式Ｉの化合物によれば、核酸系の治療剤または活性剤をインビボおよびインビトロで送達するための脂質ナノ粒子を調製できる。
本発明にかかる式Ｉの化合物によれば、核酸系の治療剤または活性剤をインビボおよびインビトロで送達するための脂質ナノ粒子を調製できる。
【0078】
本発明にかかる式Ｉの化合物のほか、本発明にかかる脂質ナノ粒子はさらに、１種以上のヘルパー脂質分子、１種以上のコレステロールまたはコレステロール誘導体、および／または１種以上のポリマー抱合脂質分子を含んでもよい。
【0079】
好ましくは、前記ヘルパー脂質分子は中性脂質分子であり、好ましくは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選ばれる。好ましい実施形態において、前記脂質ナノ粒子はＤＯＰＥを含有する。いくつかの実施形態において、前記脂質ナノ粒子はＤＳＰＣを含有する。
【0080】
好ましくは、前記コレステロール誘導体はコレステロール（略称ｃｈｏｌ，ＣＡＳ：５７－８８－５）である。
【0081】
好ましくは、前記ポリマー抱合脂質分子において、前記ポリマーはポリエチレングリコールである。好ましい実施形態において、前記ポリマー抱合脂質分子は、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＰＥ、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、ＰＥＧ－ｃｅｒ、ＤＭＧ－ＰＥＧおよびＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメートから選ばれる。好ましくは、前記脂質ナノ粒子はＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを含有する。いくつかの実施形態において、前記脂質ナノ粒子はＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含有する。
【0082】
好ましい実施形態において、前記脂質ナノ粒子において、式Iの化合物、その立体異性体、ラセミ体または薬学的に許容される塩と、ヘルパー脂質分子、コレステロールまたはコレステロール誘導体、ポリマー抱合脂質分子とは、含有される場合、モル比で６０～５：６０～５：５０～５：１０～１、好ましくは４０～１０：３０～１０：５０～２０：８～１である。いくつかの実施形態において、当該モル比は４０～３０：２０～１０：５０～４０：４～１である。
【0083】
本発明にかかる脂質ナノ粒子の平均粒子径は通常、３０ｎｍ～１５０ｎｍであり、好まし
くは４０ｎｍ～１５０ｎｍである。
くは４０ｎｍ～１５０ｎｍである。
【0084】
好ましい実施形態において、本発明にかかる脂質ナノ粒子は治療剤または活性剤を含有し、好ましくは、前記治療剤または活性剤は核酸系の治療剤または活性剤である。より好ましくは、前記核酸系の治療剤または活性剤は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイムおよびアプタマーから選ばれる。いくつかの実施形態において、本発明にかかる脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現に適用できる。前記タンパク質は、例えば、生体の生理学的機能に対して治療効果、予防効果または改善効果を有するタンパク質であってもよく、抗原、抗体、および本技術分野で知られている生物学的機能を有するタンパク質を含むが、これらに限定されない。他の実施形態において、本発明にかかる脂質ナノ粒子は、特定のｍｉＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤を送達することによって、或いは１種の標的ｍＲＮＡ若しくは多種のｍＲＮＡを調節するｍｉＲＮＡのセットを送達することによって、内因性タンパク質発現をアップレギュレートするために適用できる。他の実施形態において、本発明にかかる脂質ナノ粒子組成物は、標的遺伝子のタンパク質レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルをダウンレギュレート（例えばサイレンシング）するために適用できる。他のいくつかの実施形態において、本発明にかかる脂質ナノ粒子は、導入遺伝子の発現の目的でｍＲＮＡおよびプラスミドを送達するためにも適用できる。他の実施形態において、本発明にかかる脂質ナノ粒子は、例えば、適切なエリスロポエチンｍＲＮＡの送達による赤血球産生の増加や、興味のある抗原または抗体をコードするｍＲＮＡの送達による感染からの防御など、タンパク質の発現から生じる薬理学的効果を誘発するために適用できる。本発明にかかる脂質ナノ粒子は治療剤または活性剤を含有する場合、リポソーム自身と治療剤または活性剤（例えばｍＲＮＡ）との質量比は、例えば５～２０：１の範囲内にあってもよい。
【0085】
本発明の脂質ナノ粒子は、本技術分野で慣用の調製方法を用いて調製してもよい。一例を挙げると、化合物Ｉを、ヘルパー脂質分子、コレステロールおよびポリマー抱合脂質分子と所定のモル比で混合し、エタノールに溶解してエタノール脂質溶液を得る。ｍＲＮＡをクエン酸緩衝液に溶解してｍＲＮＡ水溶液を得る。エタノール脂質溶液とｍＲＮＡ水溶液を、マイクロ流体制御デバイスを用いて所定の体積比で混合する。限外濾過で液を交換することでエタノールを除去し、ＤＰＢＳを用いて定容する。最後に、脂質ナノ粒子を０．２μｍの滅菌フィルターで濾過し、イオン化可能な脂質を用いたＬＮＰ製剤を得る。
【0086】
ＩＶ．組成物
本発明はさらに、本発明にかかる式Ｉで示される化合物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本発明にかかる式Ｉで示される化合物と、治療剤または活性剤と、および１種以上のヘルパー脂質分子、１種以上のコレステロールまたはコレステロール誘導体、および／または１種以上のポリマー抱合脂質分子とを含む医薬組成物である。
本発明はさらに、本発明にかかる式Ｉで示される化合物を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、前記組成物は、本発明にかかる式Ｉで示される化合物と、治療剤または活性剤と、および１種以上のヘルパー脂質分子、１種以上のコレステロールまたはコレステロール誘導体、および／または１種以上のポリマー抱合脂質分子とを含む医薬組成物である。
【0087】
好ましくは、前記ヘルパー脂質分子は中性脂質分子であり、好ましくは、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭから選ばれる。好ましい実施形態において、前記脂質ナノ粒子はＤＯＰＥを含有する。いくつかの実施形態において、前記脂質ナノ粒子はＤＳＰＣを含有する。
【0088】
好ましくは、前記コレステロール誘導体はコレステロールである。
【0089】
好ましくは、前記ポリマー抱合脂質分子において、前記ポリマーはポリエチレングリコールである。好ましい実施形態において、前記ポリマー抱合脂質分子は、ＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＰＥ、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＤＳＰＥ、ＰＥＧ－ｃｅｒ、ＤＭＧ－ＰＥ
ＧおよびＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメートから選ばれる。好ましくは、前記脂質ナノ粒子はＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを含有する。いくつかの実施形態において、前記脂質ナノ粒子はＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含有する。
ＧおよびＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメートから選ばれる。好ましくは、前記脂質ナノ粒子はＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを含有する。いくつかの実施形態において、前記脂質ナノ粒子はＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を含有する。
【0090】
好ましくは、前記治療剤または活性剤は、核酸系の治療剤または活性剤である。より好ましくは、前記核酸系の治療剤または活性剤は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイムおよびアプタマーから選ばれる。
【0091】
好ましくは、前記組成物において、前記式Ｉで示される化合物と、１種以上のヘルパー脂質分子、１種以上のコレステロールまたはコレステロール誘導体、および／または１種以上のポリマー抱合脂質分子から、本願のいずれかの実施形態に記載の脂質ナノ粒子が形成され、ただし、当該脂質ナノ粒子には前記治療剤または活性剤が封入されている。好ましくは、前記組成物において、脂質ナノ粒子自身と治療剤または活性剤（例えばｍＲＮＡ）との質量比は、例えば５～２０：１の範囲内にあってもよい。
【0092】
好ましくは、前記医薬組成物は、治療または予防有効量の本発明のいずれかの実施形態に記載の脂質ナノ粒子と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含有する。具体的には、本発明にかかる式Ｉの化合物は、脂質ナノ粒子を効率的に形成し且つ例えば特定の標的疾患または病状を治療するために治療または予防有効量の治療剤または活性剤を送達する量で、組成物に存在する。適切な濃度や投与量は、当業者なら容易に決定できる。
【0093】
いくつかの実施形態において、本発明にかかる組成物はさらに、アポリポタンパク質（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）を含む。本文に用いられるように、用語の「アポリポタンパク質」または「リポタンパク質」とは、当業者に公知のアポリポタンパク質およびそのバリアントやフラグメント、並びに下記のアポリポタンパク質アゴニストまたはその類似体やフラグメントを指す。適切なアポリポタンパク質は、ＡｐｏＡ－Ｉ、ＡｐｏＡ－ＩＩ、ＡｐｏＡ－ＩＶ、ＡｐｏＡ－ＶとＡｐｏＥ、並びにそれらの活性結晶多形、アイソフォーム、バリアントや変異体およびそれらのフラグメントや短縮型を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、前記アポリポタンパク質はＡｐｏＥ４である。
【0094】
本発明にかかる医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液、懸濁剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、微小球剤、エアゾール剤などの固体状、半固体状、液体状または気体状の製剤に製剤化してもよい。このような医薬組成物の投与経路は、経口、局所、経皮、吸入、腹腔内、舌下、経頬、経直腸、経膣および鼻内を含むが、これらに限定されない。本文に用いられる用語の「腹腔内」は、皮下注射、静脈内、筋肉内、皮内、胸骨内注射、または注入技術を含む。
【0095】
具体的な剤形および投与経路に基づいて、適切な薬学的に許容される担体および賦形剤を選択してもよい。例えば、経口投与のための固体組成物として、医薬組成物は、粉末剤、顆粒剤、打錠剤、丸剤、カプセル剤、チューインガム、フレークなどの形態で製剤化してもよい。このような固形組成物は通常、１種以上の不活性希釈剤または食用担体を含む。さらに、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、トラガカント、ゼラチンなどの結合剤；デンプン、乳糖、デキストリンなどの賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、コーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステロテックスなどの滑沢剤；コロイダルシリカなどの流動化剤；スクロース、サッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料などの香料；および着色剤から選らばれる１種以上が存在してもよい。
【0096】
医薬組成物がゼラチンカプセルのようなカプセルの形態である場合、上記の材料の種類に
加えて、ポリエチレングリコールや油などの液体担体を含んでもよい。
加えて、ポリエチレングリコールや油などの液体担体を含んでもよい。
【0097】
本発明にかかる医薬組成物は、製薬分野で周知の方法により調製してもよい。例えば、注射による投与を意図した医薬組成物は、本発明にかかる脂質ナノ粒子を滅菌蒸留水または他の担体と組み合わせて溶液を形成することにより調製してもよい。
【0098】
本発明にかかる医薬組成物は、治療有効量で投与され、前記量は、使用される具体的な治療剤の活性；治療剤の代謝安定性および作用時間；患者の年齢、体重、一般的健康状態、性別、および食事；投与の形態および時間；排泄速度；薬物の組み合わせ；特定の疾患または病状の重症度；および治療を受けている対象を含む種々の要因に応じて変化する。
【0099】
Ｖ．治療方法および使用
本発明にかかる脂質ナノ粒子および医薬組成物は、対象の疾患または病状を治療または予防するために、治療剤または活性剤（例えば核酸）をインビボおよびインビトロで送達するために使用することができる。
本発明にかかる脂質ナノ粒子および医薬組成物は、対象の疾患または病状を治療または予防するために、治療剤または活性剤（例えば核酸）をインビボおよびインビトロで送達するために使用することができる。
【0100】
従って、本発明は、対象の疾患または病状を治療または予防するための脂質ナノ粒子または医薬組成物の調製における本発明にかかる式Ｉの化合物の使用、並びに対象の疾患または病状を治療または予防するための本発明にかかる式Ｉの化合物、脂質ナノ粒子または医薬組成物を提供する。
【0101】
本文に記載の疾患および病状は、核酸による治療および予防が適用できる本技術分野で既知の様々な疾患および病状であってよく、脂質ナノ粒子によって送達される核酸の具体的な生物学的機能に依存する。いくつかの実施形態において、医薬組成物はワクチンであり、前記方法は、個体を免疫化して、相応の疾患または病状に対する免疫を当該個体に付与することを含み、前記疾患または病状は、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、新規コロナウイルスによる感染症などを含むが、これらに限定されない。前記疾患または病状は、例えば、固形腫瘍および血液腫瘍を含む腫瘍、種々の炎症なども含む。
【0102】
投与経路および方法は、本技術分野で周知のものであり、且つ前に記載したとおりであり、例えば、経口、局所、経皮、吸入、腹腔内、舌下、頬、直腸、膣および鼻内を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記腹腔内投与は、皮下注射、静脈内、筋肉内、皮内、胸骨内注射、または注入技術を含む。
【0103】
本発明はさらに、治療剤または活性剤（例えば核酸）の送達における、或いは治療剤または活性剤（例えば核酸）の送達に使用される試薬の調製における、本発明にかかる式Ｉの化合物の使用も含む。本発明はさらに、治療剤または活性剤（例えば核酸）をインビボまたはインビトロで送達する方法を提供し、前記方法は、式Ｉの化合物を用いて作製された脂質ナノ粒子内に前記治療剤または活性剤を封入し、前記脂質ナノ粒子または当該脂質ナノ粒子を含む組成物を介して前記治療剤または活性剤を送達することを含む。前記核酸は、本文のいずれかの実施形態に記載のものであってもよい。いくつかの実施形態において、前記脂質ナノ粒子または当該脂質ナノ粒子を含む組成物を介して、前記治療剤または活性剤（例えば核酸）を標的部位（例えば細胞、組織（例えば腫瘍組織などの疾患組織）、臓器）に送達する。いくつかの実施形態において、前記細胞は免疫細胞であり、Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ細胞）、または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などを含むが、これらに限定されない。
【0104】
ＶＩ．式Iの化合物の製造方法
本発明にかかる式Ｉの化合物は、以下の汎用合成スキームＩとＩＩで調製してもよい：
本発明にかかる式Ｉの化合物は、以下の汎用合成スキームＩとＩＩで調製してもよい：
【化10】
【化11】
【0105】
上記の汎用合成スキームＩとＩＩにおいて、各Ｒ１はそれぞれ独立に、Ｈ、ハロゲン、任意に置換されるアルキル基、任意に置換されるアルケニル基、任意に置換されるシクロアルキル基、任意に置換されるヘテロシクリル基、任意に置換されるシクロアルケニル基、任意に置換されるシクロアルキニル基、任意に置換されるアリール基、任意に置換されるヘテロアリール基、任意に置換されるアルコキシ基、任意に置換されるアルコキシカルボニル基、任意に置換されるアシル基、－ＮＲ’Ｒ’’、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基またはアルキルチオニル基である；ただし、Ｒ’とＲ’’はそれぞれ独立に、Ｈまたは任意に置換されるアルキル基から選ばれる。各Ｇはそれぞれ独立に、任意に置換されるアルキレン基、任意に置換される－［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍ－（ＣＨ２）ｏ－、任意に置換されるアルケニレン基および任意に置換されるアルキニレン基から選ばれる。式Ｉの他の化合物を合成する場合、反応物として相応の基を有する化合物で、上記の合成スキームＩとＩＩにおける相応の反応物を置き換えてもよい。
【0106】
以下、具体的な実施例により本発明をさらに説明する。それらの実施例は説明のためのものだけであり、本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。特に断らない限り、実施例で用いられた方法と試薬は本分野の通常の方法と試薬である。
【実施例】
【0107】
実施例一：標的化合物の合成
１、Ａ－Ｃ１２、Ａ－Ｃ１４、Ａ－Ｃ１６、Ａ－Ｃ１８の合成
１、Ａ－Ｃ１２、Ａ－Ｃ１４、Ａ－Ｃ１６、Ａ－Ｃ１８の合成
【化12】
【0108】
合成スキーム
【化13】
【0109】
ステップ１：化合物３（（２－（４－（２－（２－（（（ベンジルオキシカルボニル）アミノ）エチル）アミノエチル）ピペラジニルエチル）カルバメート）の合成
２－（ピペラジン－１－イル）エタン－１－アミン（１ｇ，７．７５ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）、ベンジル（２－ブロモエチル）カルバメート（７．９ｇ，３１．０ｍｍｏｌ，４．
０ｅｑ）、Ｋ２ＣＯ３（６．４ｇ，４６．５ｍｍｏｌ，６．０ｅｑ）混合物を無水アセトニトリル（５０ｍｌ）で、８０℃に加熱して一晩攪拌した。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１／１０）により、出発物質であるアミンが完全になくなった。減圧濾過で不溶性の塩とその他の不純物を取り除き、フィルターケーキをＤＣＭで洗浄した。有機相を合わせ、ロータリーエバポレーションで濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をｃｏｍｂｉＦｌａｓｈで精製した（シリカゲルカラム４０ｇ，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％アンモニア水含有）＝１００／１－１００／７，体積比）。精製生成物画分を蒸発させ、無色オイルとして化合物３を得た（４ｇ，収率７８．２％）。ESI: [M+1]:661.1。
２－（ピペラジン－１－イル）エタン－１－アミン（１ｇ，７．７５ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）、ベンジル（２－ブロモエチル）カルバメート（７．９ｇ，３１．０ｍｍｏｌ，４．
０ｅｑ）、Ｋ２ＣＯ３（６．４ｇ，４６．５ｍｍｏｌ，６．０ｅｑ）混合物を無水アセトニトリル（５０ｍｌ）で、８０℃に加熱して一晩攪拌した。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１／１０）により、出発物質であるアミンが完全になくなった。減圧濾過で不溶性の塩とその他の不純物を取り除き、フィルターケーキをＤＣＭで洗浄した。有機相を合わせ、ロータリーエバポレーションで濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をｃｏｍｂｉＦｌａｓｈで精製した（シリカゲルカラム４０ｇ，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％アンモニア水含有）＝１００／１－１００／７，体積比）。精製生成物画分を蒸発させ、無色オイルとして化合物３を得た（４ｇ，収率７８．２％）。ESI: [M+1]:661.1。
【0110】
ステップ２：化合物４（Ｎ１－（２－アミノエチル）－ｎ１－（２－（４－（２－アミノエチル）ピペラジン－１－イル）エチル）エチレンジアミン）の合成
（２－（４－（２－（２－（（（ベンジルオキシカルボニル）アミノ）エチル）アミノエチル）ピペラジニルエチル）カルバメート（４．０ｇ，６．０ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）を４０ｍｌの無水メタノールに溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１０％，４００ｍｇ）を加え、水素雰囲気で一晩反応させた。反応終了後、減圧濾過し、フィルターケーキを少量のメタノールで洗浄し、濾液を減圧濃縮して化合物４（１．２ｇ，収率７６．９％）を得た。ESI: [M+1]:259.1。
（２－（４－（２－（２－（（（ベンジルオキシカルボニル）アミノ）エチル）アミノエチル）ピペラジニルエチル）カルバメート（４．０ｇ，６．０ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）を４０ｍｌの無水メタノールに溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１０％，４００ｍｇ）を加え、水素雰囲気で一晩反応させた。反応終了後、減圧濾過し、フィルターケーキを少量のメタノールで洗浄し、濾液を減圧濃縮して化合物４（１．２ｇ，収率７６．９％）を得た。ESI: [M+1]:259.1。
【0111】
ステップ３：１，１’，１”，１”－（（２－（４－（２－（２－（２－（２－（２－（２－ヒドロキシドデシル）アミノエチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アゾジメチル）ビス（２，１－ジイル）ビス（アゾトリイル）テトラス（ドデカン－２－オール）の合成
化合物４（１００ｍｇ，０．３８７ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）、１，２－エポキシドデカン（７１２ｍｇ，３．８７ｍｍｏｌ，１０．０ｅｑ）、ＥｔＯＨ（１ｍｌ）を均一に混合した。加熱還流し、４８時間攪拌した。反応液をロータリーエバポレーションで濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をｃｏｍｂｉＦｌａｓｈで精製した（シリカゲルカラム２０ｇ，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％アンモニア水含有）＝１００／１－１００／７，体積比）。精製生成物画分を蒸発させ、無色オイルとして標的生成物Ａ－Ｃ１２を得た（２００ｍｇ，収率３７．８％）。
化合物４（１００ｍｇ，０．３８７ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）、１，２－エポキシドデカン（７１２ｍｇ，３．８７ｍｍｏｌ，１０．０ｅｑ）、ＥｔＯＨ（１ｍｌ）を均一に混合した。加熱還流し、４８時間攪拌した。反応液をロータリーエバポレーションで濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をｃｏｍｂｉＦｌａｓｈで精製した（シリカゲルカラム２０ｇ，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％アンモニア水含有）＝１００／１－１００／７，体積比）。精製生成物画分を蒸発させ、無色オイルとして標的生成物Ａ－Ｃ１２を得た（２００ｍｇ，収率３７．８％）。
【0112】
それぞれ１，２－エポキシテトラデカン、１，２－エポキシヘキサデカン、１，２－エポキシオクタデカンで、上記ステップ３における１，２－エポキシドデカンを置き換えて、標的生成物Ａ－Ｃ１４、Ａ－Ｃ１６、Ａ－Ｃ１８を合成した。
【0113】
２、Ｂ－Ｃ１２、Ｂ－Ｃ１４、Ｂ－Ｃ１６、Ｂ－Ｃ１８の合成
【化14】
【化15】
【0114】
合成スキーム：
【化16】
【0115】
ステップ１：化合物２（（２－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）エチル－４－メチルベンゼンスルホネート）の合成
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エチル）カルバメート（２０ｇ，９７．５６ｍｍｏｌ，１ｅｑ）、ＤＭＡＰ（１２ｇ，９７．５０ｍｍｏｌ，１ｅｑ）、ＤＩＥＡ（２５ｇ，１９３ｍｍｏｌ，２ｅｑ）をＤＣＭ（３００ｍｌ）で混合し、室温で全ての物質が溶解したまで攪拌した。室温で、ＴｓＣｌ（２２ｇ，１１５．７９，１．２ｅｑ）をＤＣＭ溶液にゆっくりとバッチで添加し、淡黄色溶液を得た。室温で一晩攪拌し、ＴＬＣにより、出発アルコールが完全になくなった。反応液をＤＣＭ（２００ｍｌ）で希釈し、それぞれ水（１００ｍｌ＊３）、希塩酸１Ｎ（１００ｍｌ＊３）、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍｌ＊３）、食塩水（４０ｍｌ＊２）で洗浄した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相をロータリーエバポレーションで濃縮し、淡黄色オイル状液体を３３ｇ得た。さらに精製しないままで、次の反応に適用した。ESI: [M+1]:360.1。
ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エチル）カルバメート（２０ｇ，９７．５６ｍｍｏｌ，１ｅｑ）、ＤＭＡＰ（１２ｇ，９７．５０ｍｍｏｌ，１ｅｑ）、ＤＩＥＡ（２５ｇ，１９３ｍｍｏｌ，２ｅｑ）をＤＣＭ（３００ｍｌ）で混合し、室温で全ての物質が溶解したまで攪拌した。室温で、ＴｓＣｌ（２２ｇ，１１５．７９，１．２ｅｑ）をＤＣＭ溶液にゆっくりとバッチで添加し、淡黄色溶液を得た。室温で一晩攪拌し、ＴＬＣにより、出発アルコールが完全になくなった。反応液をＤＣＭ（２００ｍｌ）で希釈し、それぞれ水（１００ｍｌ＊３）、希塩酸１Ｎ（１００ｍｌ＊３）、飽和ＮａＨＣＯ３（１００ｍｌ＊３）、食塩水（４０ｍｌ＊２）で洗浄した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相をロータリーエバポレーションで濃縮し、淡黄色オイル状液体を３３ｇ得た。さらに精製しないままで、次の反応に適用した。ESI: [M+1]:360.1。
【0116】
ステップ２：化合物４（ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（４－（１１－（２－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）エチル）－２，２－ジメチル－４－オキソ－３，８－ジオキサン－５，１１－ジアザトリデカン－１３－イル）ピペラジン－１－イル）エトキシ）エチル）カルバメート）の合成
２－（ピペラジン－１－イル）エタン－１－アミン（１ｇ，７．７５ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）、２－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）エチル４－メチルベンゼンスルホネート（１１．１ｇ，３１．０ｍｍｏｌ，４．０ｅｑ）、Ｋ２ＣＯ３（６．４ｇ，４６．５ｍｍｏｌ，６．０ｅｑ）混合物を無水アセトニトリル（５０ｍｌ）で、８０℃に加熱して一晩攪拌した。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１／１０）により、出発物質であるアミンが完全になくなった。減圧濾過で不溶性の塩とその他の不純物を取り除き、フィルターケーキをＤＣＭで洗浄した。有機相を合わせ、ロータリーエバポレーションで濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をｃｏｍｂｉＦｌａｓｈで精製した（シリカゲルカラム４０ｇ，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％アンモニア水含有）＝１００／１－１００／７，体積比）。精製生成物画分を蒸発させ、無色オイルとして化合物４を得た（２．６ｇ，収率４９％）。ESI: [M+1]:692.0。
２－（ピペラジン－１－イル）エタン－１－アミン（１ｇ，７．７５ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）、２－（２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）エトキシ）エチル４－メチルベンゼンスルホネート（１１．１ｇ，３１．０ｍｍｏｌ，４．０ｅｑ）、Ｋ２ＣＯ３（６．４ｇ，４６．５ｍｍｏｌ，６．０ｅｑ）混合物を無水アセトニトリル（５０ｍｌ）で、８０℃に加熱して一晩攪拌した。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ＝１／１０）により、出発物質であるアミンが完全になくなった。減圧濾過で不溶性の塩とその他の不純物を取り除き、フィルターケーキをＤＣＭで洗浄した。有機相を合わせ、ロータリーエバポレーションで濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をｃｏｍｂｉＦｌａｓｈで精製した（シリカゲルカラム４０ｇ，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％アンモニア水含有）＝１００／１－１００／７，体積比）。精製生成物画分を蒸発させ、無色オイルとして化合物４を得た（２．６ｇ，収率４９％）。ESI: [M+1]:692.0。
【0117】
ステップ３：化合物５（２－（２－アミノエトキシ）－Ｎ－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）－Ｎ－（２－（４－（２－（２－アミノエトキシ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）エタン－１－アミン）の合成
化合物４（ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（４－（１１－（２－（２－（（ｔｅｒｔ－ブ
トキシカルボニル）アミノ）エトキシ）エチル）－２，２－ジメチル－４－オキソ－３，８－ジオキサン－５，１１－ジアザトリデカン－１３－イル）ピペラジン－１－イル）エトキシ）エチル）カルバメート）（２．６ｇ，３．７７ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）を１０ｍｌの１，４－ジオキサンに溶解し、６ｍｌの濃塩酸を加え、室温で一晩攪拌した。反応液をロータリーエバポレーションで乾燥状態まで濃縮し、１０ｍｌの水に溶解し、Ｎａ２ＣＯ３を加えてｐＨをアルカリ性に調整し、２時間撹拌した。反応液を完全に乾燥になるまで濃縮し、１００ｍｌのＴＨＦと１０ｇの無水硫酸ナトリウムを加え、３時間撹拌した。減圧濾過で不溶性の塩を取り除き、フィルターケーキをＴＨＦ（５０ｍｌ＊３）で洗浄した。有機相を合わせ、ロータリーエバポレーションで濃縮し、淡黄色オイルとして化合物５を得た（１．２ｇ，収率８２％）。ESI: [M+1]:391.1。
化合物４（ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（４－（１１－（２－（２－（（ｔｅｒｔ－ブ
トキシカルボニル）アミノ）エトキシ）エチル）－２，２－ジメチル－４－オキソ－３，８－ジオキサン－５，１１－ジアザトリデカン－１３－イル）ピペラジン－１－イル）エトキシ）エチル）カルバメート）（２．６ｇ，３．７７ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）を１０ｍｌの１，４－ジオキサンに溶解し、６ｍｌの濃塩酸を加え、室温で一晩攪拌した。反応液をロータリーエバポレーションで乾燥状態まで濃縮し、１０ｍｌの水に溶解し、Ｎａ２ＣＯ３を加えてｐＨをアルカリ性に調整し、２時間撹拌した。反応液を完全に乾燥になるまで濃縮し、１００ｍｌのＴＨＦと１０ｇの無水硫酸ナトリウムを加え、３時間撹拌した。減圧濾過で不溶性の塩を取り除き、フィルターケーキをＴＨＦ（５０ｍｌ＊３）で洗浄した。有機相を合わせ、ロータリーエバポレーションで濃縮し、淡黄色オイルとして化合物５を得た（１．２ｇ，収率８２％）。ESI: [M+1]:391.1。
【0118】
ステップ４：Ｂ－Ｃ１２（１９－（２－（４－（２－（２－（ジ（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エトキシ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）－１３，１５－ジ（２－ヒドロキシドデシル）－１６，２２－ジオキサン－１３，１９，２５－トリアザヘプタトリアコンタン－１１，２７－ジオール）的合成
化合物５（１００ｍｇ，０．２５６ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）、１，２－エポキシドデカン（４７０ｍｇ，２．５６ｍｍｏｌ，１０．０ｅｑ）、ＥｔＯＨ（１ｍｌ）を均一に混合した。加熱還流し、４８時間攪拌した。ＴＬＣにより、化合物５がなくなった。反応液をロータリーエバポレーションで濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をｃｏｍｂｉＦｌａｓｈで精製した（シリカゲルカラム２０ｇ，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％アンモニア水含有）＝１００／１－１００／７，体積比）。精製生成物画分を蒸発させ、無色油状の生成物Ｂ－Ｃ１２を得た（Ｔａｒｇｅｔ－２，２００ｍｇ，収率５２．２％）。
化合物５（１００ｍｇ，０．２５６ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ）、１，２－エポキシドデカン（４７０ｍｇ，２．５６ｍｍｏｌ，１０．０ｅｑ）、ＥｔＯＨ（１ｍｌ）を均一に混合した。加熱還流し、４８時間攪拌した。ＴＬＣにより、化合物５がなくなった。反応液をロータリーエバポレーションで濃縮し、粗生成物を得た。粗生成物をｃｏｍｂｉＦｌａｓｈで精製した（シリカゲルカラム２０ｇ，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％アンモニア水含有）＝１００／１－１００／７，体積比）。精製生成物画分を蒸発させ、無色油状の生成物Ｂ－Ｃ１２を得た（Ｔａｒｇｅｔ－２，２００ｍｇ，収率５２．２％）。
【0119】
それぞれ１，２－エポキシテトラデカン、１，２－エポキシヘキサデカン、１，２－エポキシオクタデカンで、上記ステップ３における１，２－エポキシドデカンを置き換えて、標的生成物Ｂ－Ｃ１４（Ｔａｒｇｅｔ－１）、Ｂ－Ｃ１６、Ｂ－Ｃ１８を合成した。
【0120】
３、Ｃ－Ｃ１２、Ｃ－Ｃ１４、Ｃ－Ｃ１６、Ｃ－Ｃ１８の合成
【化17】
【0121】
合成スキームは以下に示す。
【化18】
【0122】
Ｃ－Ｃ１２は、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エチル）カルバメートでｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エチル）カルバメートを置き換えたこと以外に、化合物Ｂ－Ｃ１２の合成法を用いて合成した。それぞれ１，２－エポキシテトラデカン、１，２－エポキシヘキサデカン、１，２－エポキシオクタデカンで１，２－エポキシドデカンを置き換えて、Ｃ－Ｃ１４、Ｃ－Ｃ１６、Ｃ－Ｃ１８を調製した。
【0123】
４、Ｄ－Ｃ１２、Ｄ－Ｃ１４、Ｄ－Ｃ１６、Ｄ－Ｃ１８の合成
【化19】
【0124】
合成スキームは以下の通りであった。
【化20】
【0125】
Ｄ－Ｃ１２は、ｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）エチル）カルバメートでｔｅｒｔ－ブチル（２－（２－ヒドロキシエトキシ）エチル）カルバメートを置き換えたこと以外に、化合物Ｂ－Ｃ１２の合成法を用いて合成した。それぞれ１，２－エポキシテトラデカン、１，２－エポキシヘキサデカン、１，２－エポキシオクタデカンで１，２－エポキシドデカンを置き換えて、Ｄ－Ｃ１４、Ｄ－Ｃ１６、Ｄ－Ｃ１８を合成した。
【0126】
５、Ｅ－Ｃ１２、Ｅ－Ｃ１４、Ｅ－Ｃ１６、Ｅ－Ｃ１８の合成
【化21】
【0127】
合成スキーム：
【化22】
【0128】
Ｅ－Ｃ１２は、４－メチル－１－ピペラジニルエチルアミンで２－（ピペラジン－１－イル）エタン－１－アミンを置き換えたこと以外に、Ａ－Ｃ１２の合成法を用いて合成した。それぞれ１，２－エポキシテトラデカン、１，２－エポキシヘキサデカン、１，２－エポキシオクタデカンで１，２－エポキシドデカンを置き換えて、Ｅ－Ｃ１４、Ｅ－Ｃ１６、Ｅ－Ｃ１８を合成した。
【0129】
６、Ｆ－Ｃ１２、Ｆ－Ｃ１４、Ｆ－Ｃ１６、Ｆ－Ｃ１８の合成
【化23】
【0130】
合成スキーム：
【化24】
【0131】
Ｆ－Ｃ１２は、４－メチル－１－ピペラジニルエチルアミンで２－（ピペラジン－１－イ
ル）エタン－１－アミンを置き換えたこと以外に、Ｂ－Ｃ１２の合成法を用いて合成した。それぞれ１，２－エポキシテトラデカン、１，２－エポキシヘキサデカン、１，２－エポキシオクタデカンで１，２－エポキシドデカンを置き換えて、Ｆ－Ｃ１４、Ｆ－Ｃ１６、Ｆ－Ｃ１８を合成した。
ル）エタン－１－アミンを置き換えたこと以外に、Ｂ－Ｃ１２の合成法を用いて合成した。それぞれ１，２－エポキシテトラデカン、１，２－エポキシヘキサデカン、１，２－エポキシオクタデカンで１，２－エポキシドデカンを置き換えて、Ｆ－Ｃ１４、Ｆ－Ｃ１６、Ｆ－Ｃ１８を合成した。
【0132】
７、Ｇ－Ｃ１２、Ｇ－Ｃ１４、Ｇ－Ｃ１６、Ｇ－Ｃ１８の合成
【化25】
【0133】
合成スキーム：
【化26】
【0134】
Ｇ－Ｃ１２は、４－メチル－１－ピペラジニルエチルアミンで２－（ピペラジン－１－イル）エタン－１－アミンを置き換えたこと以外に、Ｃ－Ｃ１２の合成法を用いて合成した。それぞれ１，２－エポキシテトラデカン、１，２－エポキシヘキサデカン、１，２－エポキシオクタデカンで１，２－エポキシドデカンを置き換えて、Ｇ－Ｃ１４、Ｇ－Ｃ１６、Ｇ－Ｃ１８を合成した。
【0135】
８、Ｈ－Ｃ１２、Ｈ－Ｃ１４、Ｈ－Ｃ１６、Ｈ－Ｃ１８の合成
【化27】
【0136】
合成スキーム：
【化28】
【0137】
Ｈ－Ｃ１２は、４－メチル－１－ピペラジニルエチルアミンで２－（ピペラジン－１－イル）エタン－１－アミンを置き換えたこと以外に、Ｄ－Ｃ１２の合成法を用いて合成した。それぞれ１，２－エポキシテトラデカン、１，２－エポキシヘキサデカン、１，２－エポキシオクタデカンで１，２－エポキシドデカンを置き換えて、Ｈ－Ｃ１４、Ｈ－Ｃ１６、Ｈ－Ｃ１８を合成した。
【0138】
９、Ｉ－Ｃ１２、Ｉ－Ｃ１４、Ｉ－Ｃ１６、Ｉ－Ｃ１８、Ｊ－Ｃ１２、Ｊ－Ｃ１４、Ｊ－Ｃ１６、Ｊ－Ｃ１８、Ｋ－Ｃ１２、Ｋ－Ｃ１４、Ｋ－Ｃ１６、Ｋ－Ｃ１８、Ｌ－Ｃ１２、Ｌ－Ｃ１４、Ｌ－Ｃ１６、Ｌ－Ｃ１８の合成
【化29】
【化30】
【化31】
【化32】
【化33】
【0139】
中間体化合物４は、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌを合成するために共用される原料であり、その合成スキームは以下に示す。
【化34】
【0140】
化合物３の合成
Ｎ－（２－ブロモエチル）フタルイミド（８．７８ｇ，３４．５６ｍｍｏｌ，０．９ｅｑ）、無水炭酸カリウム（１２．５３ｇ）を５００ｍｌナスフラスコに入れ、窒素で保護した。化合物１（５ｇ，３８．４１ｍｍｏｌ，１ｅｑ）を別途秤量し、窒素保護下で無水アセトニトリル（１０ｘ ｍ／ｖ）５０ｍＬに溶解し、注射器でナスフラスコに入れ、撹拌した。８０℃に加熱して一晩攪拌した。反応をＴＬＣ（ＴＬＣ条件：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）でモニターし、ｕｖが反応終了を示したら、反応液を砂中子漏斗で濾過した。フィルターケーキを５０ｍＬのアセトニトリルで３回洗浄し、全ての濾液を回収した。濾液に１０ｇのシリカゲルを加え、シリカゲルが乾燥になるまでロータリーエバポレーションで乾燥した。粗生成物をｃｏｍｂｉＦｌａｓｈで精製した（シリカゲルカラム４０ｇ，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％アンモニア水含有）＝１００／１－１００／７，体積比）。標的生成物である化合物３を得た（８．２２ｇ，収率７０．５６％）。ESI: [M+1]:304.2
Ｎ－（２－ブロモエチル）フタルイミド（８．７８ｇ，３４．５６ｍｍｏｌ，０．９ｅｑ）、無水炭酸カリウム（１２．５３ｇ）を５００ｍｌナスフラスコに入れ、窒素で保護した。化合物１（５ｇ，３８．４１ｍｍｏｌ，１ｅｑ）を別途秤量し、窒素保護下で無水アセトニトリル（１０ｘ ｍ／ｖ）５０ｍＬに溶解し、注射器でナスフラスコに入れ、撹拌した。８０℃に加熱して一晩攪拌した。反応をＴＬＣ（ＴＬＣ条件：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０：１）でモニターし、ｕｖが反応終了を示したら、反応液を砂中子漏斗で濾過した。フィルターケーキを５０ｍＬのアセトニトリルで３回洗浄し、全ての濾液を回収した。濾液に１０ｇのシリカゲルを加え、シリカゲルが乾燥になるまでロータリーエバポレーションで乾燥した。粗生成物をｃｏｍｂｉＦｌａｓｈで精製した（シリカゲルカラム４０ｇ，ＤＣＭ／ＭｅＯＨ（１０％アンモニア水含有）＝１００／１－１００／７，体積比）。標的生成物である化合物３を得た（８．２２ｇ，収率７０．５６％）。ESI: [M+1]:304.2
【0141】
化合物４の合成
化合物３（８．２ｇ，２７．０３ｍｍｏｌ，１ｅｑ）を、１６０ｍＬのエタノールが入れたナスフラスコに加えて攪拌してから、２６．０５ｍＬの３５％濃アンモニア水を加え、９０℃で一晩還流した。翌日、白色の懸濁液を得た。 ＴＬＣモニタリング（ＴＬＣ条件：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（ＮＨ３）＝１０：１，ｕｖおよびニンヒドリン発色比較）により、
原料がなくなったことを確認したら、室温まで冷却した。砂中子漏斗に珪藻土を１０ｇ投入し、反応液を濾過して濾液を回収した。濾液にアセトニトリルを２００ｍＬ加え、白色沈殿を大量に得た。白色沈殿を珪藻土で濾過し、濾液を回収した。濾液を濃縮して乾燥し、無色オイルとして標的生成物である化合物４（４．３ｇ，収率９２％）を得た。ESI: [M+1]:174.1。
化合物３（８．２ｇ，２７．０３ｍｍｏｌ，１ｅｑ）を、１６０ｍＬのエタノールが入れたナスフラスコに加えて攪拌してから、２６．０５ｍＬの３５％濃アンモニア水を加え、９０℃で一晩還流した。翌日、白色の懸濁液を得た。 ＴＬＣモニタリング（ＴＬＣ条件：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（ＮＨ３）＝１０：１，ｕｖおよびニンヒドリン発色比較）により、
原料がなくなったことを確認したら、室温まで冷却した。砂中子漏斗に珪藻土を１０ｇ投入し、反応液を濾過して濾液を回収した。濾液にアセトニトリルを２００ｍＬ加え、白色沈殿を大量に得た。白色沈殿を珪藻土で濾過し、濾液を回収した。濾液を濃縮して乾燥し、無色オイルとして標的生成物である化合物４（４．３ｇ，収率９２％）を得た。ESI: [M+1]:174.1。
【0142】
シリーズＩ、Ｊ、ＫおよびＬの化合物は、それぞれシリーズＡ、Ｂ、ＣおよびＤの化合物に従って合成されたが、具体的な合成方法については省略する。
【0143】
上記のように合成した化合物のＭＳとＨＮＭＲは下表に示す。
【0144】
実施例二：脂質ナノ粒子（ＬＮＰ製剤）の調製と測定
実施例一のイオン化可能な脂質化合物をそれぞれ、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（いずれも艾偉拓（上海）医薬科技有限会社から購入する）と３５：１６：４６．５：２．５のモル比でエタノールに溶解してエタノール脂質溶液を調製したと共に、２０ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ＝６．１）で改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ｍＲＮＡ（上海吉量医薬工学有限会社，ＪＮ－４２０１）を希釈し、ｍＲＮＡ水溶液を得た。エタノール脂質溶液とｍＲＮＡ水溶液を、マイクロ流体制御デバイス（邁安納（上海）機械科技有限会社，型番：ＩＮａｎｏTM Ｌ）を用いて、１：３の体積比で混合し、全脂質とｍＲＮＡの重量比が約１０：１になるようにリポソームを調製した。限外濾過で液を交換することでエタノールを除去し、ＤＰＢＳを用いて定容する。最後に、脂質ナノ粒子を０．２μｍ滅菌フィルターで濾過し、イオン化可能な脂質／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（３５／１６／４６．５／２．５ｍｏｌ％）でｅＧＦＰ ｍＲＮＡをカプセル化したＬＮＰ製剤を得、ｍＲＮＡの含有量は０．００２ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬであった。
実施例一のイオン化可能な脂質化合物をそれぞれ、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（いずれも艾偉拓（上海）医薬科技有限会社から購入する）と３５：１６：４６．５：２．５のモル比でエタノールに溶解してエタノール脂質溶液を調製したと共に、２０ｍＭのクエン酸塩緩衝液（ｐＨ＝６．１）で改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ｍＲＮＡ（上海吉量医薬工学有限会社，ＪＮ－４２０１）を希釈し、ｍＲＮＡ水溶液を得た。エタノール脂質溶液とｍＲＮＡ水溶液を、マイクロ流体制御デバイス（邁安納（上海）機械科技有限会社，型番：ＩＮａｎｏTM Ｌ）を用いて、１：３の体積比で混合し、全脂質とｍＲＮＡの重量比が約１０：１になるようにリポソームを調製した。限外濾過で液を交換することでエタノールを除去し、ＤＰＢＳを用いて定容する。最後に、脂質ナノ粒子を０．２μｍ滅菌フィルターで濾過し、イオン化可能な脂質／ＤＯＰＥ／コレステロール／ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（３５／１６／４６．５／２．５ｍｏｌ％）でｅＧＦＰ ｍＲＮＡをカプセル化したＬＮＰ製剤を得、ｍＲＮＡの含有量は０．００２ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬであった。
【0145】
Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ ＵＫ）を用いて、１７３°後方散乱検出モードで動的光散乱法により脂質ナノ粒子のサイズと多分散指数ＰＤＩを測定し、測定結果は表１に示した。
【0146】
実施例三：脂質ナノ粒子（ＬＮＰ製剤）によるインビトロ細胞トランスフェクション試験本発明では、末梢血単核球ＰＢＭＣ（上海澳能生物技術有限会社）、ヒト末梢血白血病Ｔ細胞Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ）、腫瘍浸潤リンパ球ＴＩＬ（肝癌患者の切除腫瘍組織から単離したもの、調製法についてはＣＮ１１４７６３５３０Ａを参照）、マウス骨髄由来樹状細胞ＤＣ２．４（中国科学院細胞バンク）、中国ハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（ＡＴＣＣ）をリポソームによるトランスフェクション試験の検証細胞株として使用した。ＰＢＭＣ、Ｊｕｒｋａｔ、ＴＩＬ細胞は浮遊で増殖させ、ＤＣ２．４とＣＨＯ細胞は付着で増殖させた。細胞培養の全操作手順は、所定のプロトコルを厳守し、無菌クリーンベンチで無菌試薬を使用して無菌条件で実施されなければならない。主な操作手順は以下の通りであった：
【0147】
１）細胞蘇生：保存した細胞凍結保存液を－８０℃の冷蔵庫から取り出し、直ちに３７℃の水浴に入れ、急速で且つ継続的に振とうし、１分間以内に完全に融解させた。新鮮な培地を予め１５ｍＬの遠心チューブに入れ、バイオセーフティキャビネット内で細胞液を遠心チューブに加えた。同じ質量の遠心チューブ１本を取り、遠心分離機に対称に入れ、１２００ｒｐｍで５分間低速遠心した。遠心終了後、上層の澄んだ液体を取り除き、チューブの壁に沿って適量の培地をゆっくりと加え、細胞を軽くフリックして均一に分散してから、当該細胞懸濁液を吸引し、予め用意した培養フラスコに入れた。蘇生初期の細胞の状態と分布プロファイルを顕微鏡で観察した。培養フラスコを５％ＣＯ２インキュベーターに置き、３７℃でインキュベートし、蘇生時間を記録した。
【0148】
２）細胞継代：顕微鏡下で、視野内の細胞密度が８０％～９０％に達したら、細胞を継代培養した。付着細胞はトリプシンで消化する必要があり、培地中の残留血清がトリプシンの活性を低下させることを避けるために、元の培養液を取り除いた後、ＤＰＢＳ溶液を加えて一度洗浄し、ＤＰＢＳ溶液を吸引した後、トリプシンを加えて細胞間接着箇所のタンパク質を分解させたことにより、細胞を分離させてさらなる培養を容易にした。軽くて均一に振とうしてから、インキュベーターに置いて２分間消化した。消化終了直後、元のシャーレに適量の培地を加えて消化を終了させた。最後に、ピペットを用いて慎重に細胞を吹き下ろし、均一に分散するまでフリックした後、試験の需要に応じて所定の割合で接種して継代培養した。浮遊細胞には、トリプシンによる消化が必要ない。
【0149】
各細胞株に用いられた培地と具体的な試験手順は以下の通りであった：
ＰＢＭＣ細胞へのトランスフェクション
１）抗体コーティング：６ウエルプレートをプレコートし、ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体を－２０℃冷蔵庫から取り出し、融解して使用に備えた。上記２種類の抗体を５μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳ溶液に添加し、均一に混合した後、６ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルずつ添加し、３７℃インキュベーターに置き、４時間後に使用に備えた。
ＰＢＭＣ細胞へのトランスフェクション
１）抗体コーティング：６ウエルプレートをプレコートし、ＣＤ３抗体およびＣＤ２８抗体を－２０℃冷蔵庫から取り出し、融解して使用に備えた。上記２種類の抗体を５μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳ溶液に添加し、均一に混合した後、６ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルずつ添加し、３７℃インキュベーターに置き、４時間後に使用に備えた。
【0150】
２）ＰＢＭＣ蘇生：凍結保存したＰＢＭＣ細胞を－８０℃冷蔵庫から取り出し、直ちに３７℃の水浴に入れて細胞を急速解凍し、融解した細胞を予熱された培地に入れ、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、５００Ｕ／ｍｌのＩＬ－２を含む適量のＡＩＭ－Ｖ培地を加えてＰＢＭＣを再懸濁させた。
【0151】
３）抗体でコーティングされたＤＰＢＳをピペットで吸引し、細胞懸濁液を抗体で予めコーティングされた６ウェルプレートに４ｍＬ／ウェルずつ移し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで３～５日間活性化培養した後、後続の試験を行った。
【0152】
４）試験の需要に応じて、ＰＢＭＣ細胞を同日の３０分間前もって２４ウェルプレートにプレーティングし、細胞トランスフェクションを行った。細胞カウントにより細胞数と細胞生存率を記録し、１ウェルあたり５×１０５個細胞の量で細胞懸濁液を取り、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。添加される無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地の体積を１ウェルあたり３００μＬとして計算し、軽くて均一にフリックしてから、２４ウェルプレートにプレーティングし、後続のトランスフェクション試験を行った。試験の需要に応じて、ＡｐｏＥ４を０．５ｕｇ／ウェルで添加してもよい。
【0153】
５）実施例二で調製したＬＮＰ製剤をＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地でｍＲＮＡ濃度が１ｕｇ／ｍｌになるように希釈した。
【0154】
６）各ウェルの上部から希釈した混合液２００ｕｌを、１ウェルあたりに２００ｎｇのｍＲＮＡが含有されるように均一に滴下した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで活性化培養した。
【0155】
７）細胞生存率、ＥＧＦＰ陽性率、平均蛍光強度のデータは、２４時間後と４８時間後に、細胞蛍光イメージングおよびフローサイトメトリーによって得られた。
【0156】
Ｊｕｒｋａｔ細胞へのトランスフェクション
１）Ｊｕｒｋａｔ細胞蘇生：凍結保存したＪｕｒｋａｔ細胞を－８０℃冷蔵庫から取り出し、直ちに３７℃の水浴に入れて細胞を急速解凍し、融解した細胞を予熱された培地に入れ、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、１０％ＦＢＳを含む適量のＲＰＭＩ－１６４０培地を加えて蘇生したＪｕｒｋａｔを再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで活性化培養した。
１）Ｊｕｒｋａｔ細胞蘇生：凍結保存したＪｕｒｋａｔ細胞を－８０℃冷蔵庫から取り出し、直ちに３７℃の水浴に入れて細胞を急速解凍し、融解した細胞を予熱された培地に入れ、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、１０％ＦＢＳを含む適量のＲＰＭＩ－１６４０培地を加えて蘇生したＪｕｒｋａｔを再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで活性化培養した。
【0157】
２）試験の需要に応じて、Ｊｕｒｋａｔ細胞を同日の３０分間前もって２４ウェルプレートにプレーティングし、細胞トランスフェクションを行った。細胞カウントにより細胞数と細胞生存率を記録し、１ウェルあたり５×１０５個細胞の量で細胞懸濁液を取り、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。添加される無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地の体積を１ウェルあたり３００μＬとして計算し、軽くて均一にフリックしてから、２４ウェルプレートにプレーティングし、後続のトランスフェクション試験を行った。試験の需要に応じて、ＡｐｏＥ４を０．５ｕｇ／ウェルで添加してもよい。
【0158】
後続の手順はＰＢＭＣ細胞へのトランスフェクションプロトコルと同じようにした。
【0159】
ＴＩＬ細胞へのトランスフェクション
１）ＴＩＬ細胞蘇生：凍結保存したＴＩＬ細胞を－８０℃冷蔵庫から取り出し、直ちに３７℃の水浴に入れて細胞を急速解凍し、融解した細胞を予熱された培地に入れ、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、適量の培地を加えて蘇生したＴＩＬを再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで活性化培養した。
１）ＴＩＬ細胞蘇生：凍結保存したＴＩＬ細胞を－８０℃冷蔵庫から取り出し、直ちに３７℃の水浴に入れて細胞を急速解凍し、融解した細胞を予熱された培地に入れ、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、適量の培地を加えて蘇生したＴＩＬを再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで活性化培養した。
【0160】
２）試験の需要に応じて、ＴＩＬ細胞を同日の３０分間前もって２４ウェルプレートにプレーティングし、細胞トランスフェクションを行った。細胞カウントにより細胞数と細胞生存率を記録し、１ウェルあたり５×１０５個細胞の量で細胞懸濁液を取り、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨てた。添加される無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地の体積を１ウェルあたり３００μＬとして計算し、軽くて均一にフリックしてから、２４ウェルプレートにプレーティングし、後続のトランスフェクション試験を行った。試験の需要に応じて、ＡｐｏＥ４を０．５ｕｇ／ウェルで添加してもよい。
【0161】
後続の手順はＰＢＭＣ細胞へのトランスフェクションプロトコルと同じようにした。
【0162】
ＤＣ２．４細胞へのトランスフェクション
１）ＤＣ２．４細胞蘇生：凍結保存したＤＣ２．４細胞を－８０℃冷蔵庫から取り出し、直ちに３７℃の水浴に入れて細胞を急速解凍し、融解した細胞を予熱された培地に入れ、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、１０％ＦＢＳを含む適量のＤＭＥＭ培地を加えて蘇生したＤＣ２．４を再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで活性化培養した。
１）ＤＣ２．４細胞蘇生：凍結保存したＤＣ２．４細胞を－８０℃冷蔵庫から取り出し、直ちに３７℃の水浴に入れて細胞を急速解凍し、融解した細胞を予熱された培地に入れ、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、１０％ＦＢＳを含む適量のＤＭＥＭ培地を加えて蘇生したＤＣ２．４を再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで活性化培養した。
【0163】
２）試験の需要に応じて、ＤＣ２．４細胞を一日前もって２４ウェルプレートにプレーティングし、細胞トランスフェクションを行った。細胞カウントにより細胞数と細胞生存率を記録し、１ウェルあたり２×１０５個細胞の量で細胞懸濁液を取り、さらに所定の体積で１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を補充添加し、均一に混合し、１ウェル当たりに１ｍＬを加え、後続のトランスフェクション試験を行った。
【0164】
３）２４時間後、３０分間前もって培地をピペットで軽く吸引し、１ウェルあたりに１ｍＬのＤＰＢＳを加えて洗浄・吸引し、次に１ウェルあたりに３００μＬの無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地を加え、後続のトランスフェクション試験を行った。
【0165】
後続の手順はＰＢＭＣ細胞へのトランスフェクションプロトコルと同じようにした。
【0166】
ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション
１）ＣＨＯ細胞蘇生：凍結保存したＣＨＯ細胞を－８０℃冷蔵庫から取り出し、直ちに３７℃の水浴に入れて細胞を急速解凍し、融解した細胞を予熱された培地に入れ、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、適量の培地を加えて蘇生したＣＨＯ細胞を再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで活性化培養した。
１）ＣＨＯ細胞蘇生：凍結保存したＣＨＯ細胞を－８０℃冷蔵庫から取り出し、直ちに３７℃の水浴に入れて細胞を急速解凍し、融解した細胞を予熱された培地に入れ、１２００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を捨て、適量の培地を加えて蘇生したＣＨＯ細胞を再懸濁させ、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで活性化培養した。
【0167】
２）試験の需要に応じて、ＣＨＯ細胞を一日前もって２４ウェルプレートにプレーティングし、細胞トランスフェクションを行った。細胞カウントにより細胞数と細胞生存率を記録し、１ウェルあたり２×１０５個細胞の量で細胞懸濁液を取り、さらに所定の体積で培地を補充添加し、均一に混合し、１ウェル当たりに１ｍＬを加え、後続のトランスフェクション試験を行った。
【0168】
３）２４時間後、３０分間前もって培地をピペットで軽く吸引し、１ウェルあたりに１ｍＬのＤＰＢＳを加えて洗浄・吸引し、次に１ウェルあたりに３００μＬの無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地を加え、後続のトランスフェクション試験を行った。
後続の手順はＰＢＭＣ細胞へのトランスフェクションプロトコルと同じようにした。
後続の手順はＰＢＭＣ細胞へのトランスフェクションプロトコルと同じようにした。
【0169】
試験結果
フローサイトメトリー解析により、細胞生存率とＥＧＦＰ陽性率を得た。実施例二で調製した脂質ナノ粒子の特性、およびＤＣ２．４におけるＥＧＦＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、蛍光強度が最も高いサンプルに基づいて正規化したものとして、表１に示す。
フローサイトメトリー解析により、細胞生存率とＥＧＦＰ陽性率を得た。実施例二で調製した脂質ナノ粒子の特性、およびＤＣ２．４におけるＥＧＦＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、蛍光強度が最も高いサンプルに基づいて正規化したものとして、表１に示す。
【0170】
【表1】
【0171】
図１は、Ｂ－Ｃ１４を用いて調製したＬＮＰ製剤をインビトロで細胞にトランスフェクションした後、フローサイトメトリー解析によって得られた細胞生存率を示す。図１から分かるように、ＰＢＭＣ、ＴＩＬ、Ｊｕｒｋａｔ、ＤＣ２．４およびＣＨＯ細胞は高い生存率を示し、これで、当該製剤が細胞毒性を有さないことが示された。トランスフェクション中にＡｐｏＥ４を添加することは、細胞の生存率に影響しなかった。
【0172】
実施例二で調製したＬＮＰ製剤にＡｐｏＥ４を添加してＰＢＭＣにトランスフェクション
した後、ＰＢＭＣにおけるＥＧＦＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、蛍光強度が最も高いサンプルに基づいて正規化したものとして、表２に示す。
した後、ＰＢＭＣにおけるＥＧＦＰ ｍＲＮＡの発現レベルは、蛍光強度が最も高いサンプルに基づいて正規化したものとして、表２に示す。
【0173】
【表2】
【0174】
図２および図３は、ＡｏｐＥ４を添加しないまたは添加した条件下で、Ｂ－Ｃ１４を用いて調製したＬＮＰ製剤による細胞へのトランスフェクション効率を示す。ＡｏｐＥ４を添加しない条件下で、当該ＬＮＰ製剤はＪｕｒｋａｔ、ＤＣ２．４およびＣＨＯ細胞への高いトランスフェクション効率を示したが、ＰＢＭＣとＴＩＬという２種のＴ細胞へのトランスフェクション効率が低かった（図２）。ＡｏｐＥ４を添加した後、ＰＢＭＣとＴＩＬ細胞へのトランスフェクション効率はいずれも向上し、そのうち、ＰＢＭＣへのトランスフェクション効率は７５％以上にも達した（図３）。
【0175】
実施例四：脂質ナノ粒子（ＬＮＰ製剤）のインビトロ安定性試験
実施例二における製剤を４℃～８℃で保存した。１週間おきにサンプリングし、サンプルのＤＣ２．４へのトランスフェクション性能、ナノ粒子のサイズ、および多分散指数ＰＤＩについてテストした。全過程は１６週間であった。Ｂ－Ｃ１４を用いて調製したＬＮＰの結果は図８に示すが、それから分かるように、粒子径、ＰＤＩ、細胞トランスフェクション効率は、４～８℃の条件下で１６週間保存しても初期状態のままであった。他のLNP製剤についても、粒子径、PDI、細胞トランスフェクション効率は、4～8℃の条件下で16週間保存しても初期状態のままであった。
実施例二における製剤を４℃～８℃で保存した。１週間おきにサンプリングし、サンプルのＤＣ２．４へのトランスフェクション性能、ナノ粒子のサイズ、および多分散指数ＰＤＩについてテストした。全過程は１６週間であった。Ｂ－Ｃ１４を用いて調製したＬＮＰの結果は図８に示すが、それから分かるように、粒子径、ＰＤＩ、細胞トランスフェクション効率は、４～８℃の条件下で１６週間保存しても初期状態のままであった。他のLNP製剤についても、粒子径、PDI、細胞トランスフェクション効率は、4～8℃の条件下で16週間保存しても初期状態のままであった。
【0176】
実施例五：脂質ナノ粒子（ＬＮＰ製剤）のインビボトランスフェクション試験
実施例二の方法に従って、Ｆｌｕｃ－ｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ(R)ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ （５ｍｏＵ） Ｌ－７２０２ ０．１／１／５ ｍｇ）、ＭＣ３（ＣＡＳ番号：１２２４６０６－０６－７、厦門賽諾邦格生物科技株式会社）、Ｃ１２－２００（ＣＡＳ番号：１２２０８９０－２５－４、文献ＰＮＡＳ， ２０１０， Ｖｏｌ（１０７）， ５，
１８６４－１８６９に従って合成したもの）のＬＮＰ脂質ナノ粒子をそれぞれ調製した。具体的なパラメータは表３に示す。ＤＳＰＣは艾偉拓（上海）医薬科技有限会社から購入した。ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００は艾偉拓（上海）医薬科技有限会社から購入した。６匹のマウス（菲諾克生物科技（上海）有限会社）を無作為に選び、当該脂質ナノ粒子を０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内注射および筋肉内注射した（１群につき３匹のマウス）。ＤＰＢＳとＦｌｕｃ－ｍＲＮＡをコントロールとした。６時間後、各マウスの生体内にそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌのＤ－フルオレセインカリウム塩を２００ｕｌ尾静脈から注射し、１０分間後、マウスを生体イメージングシステムに置き、各マウスの全蛍光強度を観察し、写真に撮って記録した。解剖して分離した組織（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、膵臓、筋肉）を平皿に入れ、発光写真を撮影した。２４時間後、もう一度マウスを生体イメージングシステムに置き、各マウスの全蛍光強度を観察し、写真に撮って記録した。
実施例二の方法に従って、Ｆｌｕｃ－ｍＲＮＡ（ＣｌｅａｎＣａｐ(R)ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ （５ｍｏＵ） Ｌ－７２０２ ０．１／１／５ ｍｇ）、ＭＣ３（ＣＡＳ番号：１２２４６０６－０６－７、厦門賽諾邦格生物科技株式会社）、Ｃ１２－２００（ＣＡＳ番号：１２２０８９０－２５－４、文献ＰＮＡＳ， ２０１０， Ｖｏｌ（１０７）， ５，
１８６４－１８６９に従って合成したもの）のＬＮＰ脂質ナノ粒子をそれぞれ調製した。具体的なパラメータは表３に示す。ＤＳＰＣは艾偉拓（上海）医薬科技有限会社から購入した。ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００は艾偉拓（上海）医薬科技有限会社から購入した。６匹のマウス（菲諾克生物科技（上海）有限会社）を無作為に選び、当該脂質ナノ粒子を０．５ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内注射および筋肉内注射した（１群につき３匹のマウス）。ＤＰＢＳとＦｌｕｃ－ｍＲＮＡをコントロールとした。６時間後、各マウスの生体内にそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌのＤ－フルオレセインカリウム塩を２００ｕｌ尾静脈から注射し、１０分間後、マウスを生体イメージングシステムに置き、各マウスの全蛍光強度を観察し、写真に撮って記録した。解剖して分離した組織（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳、膵臓、筋肉）を平皿に入れ、発光写真を撮影した。２４時間後、もう一度マウスを生体イメージングシステムに置き、各マウスの全蛍光強度を観察し、写真に撮って記録した。
【0177】
【表3】
【0178】
筋肉内注射の場合、脂質ナノ粒子は部分的に注射部位に留まり、残りは主に肝臓に留まっ
た。静脈内注射の場合、脂質ナノ粒子は全て胸部と腹部に移行し、主に肝臓に留まり、その次は脾臓に留まった。図４～７に示すように、ＭＣ３とＣ１２－２００に比べて、ＣＸ－Ａサンプルの蛍光強度はより高かった。特にＣＸ－Ａは２４時間後も高い蛍光強度を維持し、他の群よりも遥かに高かった。他のＬＮＰ製剤も高い蛍光強度を維持した。
た。静脈内注射の場合、脂質ナノ粒子は全て胸部と腹部に移行し、主に肝臓に留まり、その次は脾臓に留まった。図４～７に示すように、ＭＣ３とＣ１２－２００に比べて、ＣＸ－Ａサンプルの蛍光強度はより高かった。特にＣＸ－Ａは２４時間後も高い蛍光強度を維持し、他の群よりも遥かに高かった。他のＬＮＰ製剤も高い蛍光強度を維持した。
【0179】
実施例六：イオン化可能な脂質化合物の安全性試験
イオン化可能な脂質化合物の遺伝毒性は、「ＳＦＤＡ（国家食品薬品監督管理局）ガイドライン」における「医薬品遺伝毒性研究技術指針」に従ってテストした。実施例二で調製したＬＮＰ製剤は、細菌復帰突然変異試験、哺乳類赤血球小核試験、インビトロ哺乳類細胞染色体異常試験において、結果はいずれも陰性であった。
イオン化可能な脂質化合物の遺伝毒性は、「ＳＦＤＡ（国家食品薬品監督管理局）ガイドライン」における「医薬品遺伝毒性研究技術指針」に従ってテストした。実施例二で調製したＬＮＰ製剤は、細菌復帰突然変異試験、哺乳類赤血球小核試験、インビトロ哺乳類細胞染色体異常試験において、結果はいずれも陰性であった。
【0180】
ブランクＬＮＰの毒性は、「医薬品単回投与毒性研究技術ガイドライン」に従ってテストした。その結果、実施例二で調製したＬＮＰ製剤はいずれも急性毒性反応を引き起こさなかった。
【0181】
ブランクＬＮＰの溶血は、「中華人民共和国薬局方」（四部）２０２０年版、一般的な生物学的検査方法、１１４８溶血・凝固チェック法に従ってテストした。その結果、実施例二で調製したＬＮＰ製剤はいずれも溶血・凝固を引き起こさなかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【国際調査報告】