特表 2024-535020 アルツハイマー病バイオマーカーのアスパラギンおよびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-26

(54)【発明の名称】アルツハイマー病バイオマーカーのアスパラギンおよびその使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20240918BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20240918BHJP

   C07C 237/06 20060101ALI20240918BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N27/62 D

C07C237/06

G01N27/62 V

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516428

(86)(22)【出願日】2021-09-29

(85)【翻訳文提出日】2024-03-13

(86)【国際出願番号】 CN2021121754

(87)【国際公開番号】W WO2023039954

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】202111074848.5

(32)【優先日】2021-09-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519002014

【氏名又は名称】中国科学院深▲チェン▼先進技術研究院

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥＳ ＯＦ ＡＤＶＡＮＣＥＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ

【住所又は居所原語表記】１０６８， Ｘｕｅｙｕａｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｏｗｎ， Ｎａｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０５５， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100101454

【弁理士】

【氏名又は名称】山田 卓二

(74)【代理人】

【識別番号】100156144

【弁理士】

【氏名又は名称】落合 康

(74)【代理人】

【識別番号】100103230

【弁理士】

【氏名又は名称】高山 裕貢

(72)【発明者】

【氏名】陳 宇

(72)【発明者】

【氏名】陳 芸菁

(72)【発明者】

【氏名】樊 穎穎

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

4H006

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA12

2G041GA06

2G041GA09

2G045AA25

2G045CA26

2G045DA35

2G045FB06

4H006AA03

4H006AB99

4H006BS10

4H006BU32

4H006BV21

(57)【要約】

【課題】本願は、アルツハイマー病バイオマーカーおよびその使用に関し、該アルツハイマー病バイオマーカーはアスパラギンである。
【解決手段】アルツハイマー病の血液サンプル中のアスパラギンレベルが正常な血液サンプルよりも著しく低いことを初めて検出し、血液中のアスパラギンをアルツハイマー病バイオマーカーとして、血液中のアスパラギンレベルを検出することにより、アルツハイマー病の早期診断を補助することができ、非侵襲的かつ迅速な検出に寄与し、タイムリー、便利、高特異性および高感度という特徴を備える。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アスパラギンである、
アルツハイマー病バイオマーカー。

【請求項2】

請求項１に記載のアルツハイマー病バイオマーカーの、アルツハイマー病の早期診断モデルの構築および／またはアルツハイマー病の早期診断装置の製造における使用。

【請求項3】

アルツハイマー病の早期診断モデルの入力変数は、請求項１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を含む、
アルツハイマー病の早期診断モデル。

【請求項4】

前記アルツハイマー病の早期診断モデルの出力変数は発現差倍率を含み、前記発現差倍率の計算式は式（１）に示すとおりである、

【数1】

請求項３に記載のアルツハイマー病の早期診断モデル。

【請求項5】

アルツハイマー病陽性の判断基準は、前記発現差倍率≦０．６４である、
請求項４に記載のアルツハイマー病の早期診断モデル。

【請求項6】

測定待ちサンプルを、液体クロマトグラフによる分離に使用可能な測定待ちサンプル溶液に調製するサンプル調製ユニットと、
前記液体クロマトグラフで前記測定待ちサンプル溶液を分離し、質量分析計で分離後のサンプルをデータ処理し、サンプル中の請求項１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定する検出ユニットと、
検出されたアスパラギンの質量分析のピーク強度値を請求項３～５のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の早期診断モデルに入力して分析する分析ユニットと、
サンプルに対応する発現差倍率を出力し、アルツハイマー病陽性であるか否かを判断する評価ユニットと、を備える、
アルツハイマー病の早期診断装置。

【請求項7】

前記測定待ちサンプルは、血液サンプルを含む、
請求項６に記載の装置。

【請求項8】

前記データ処理は、
タンデム飛行時間型質量分析計で分離後のサンプルに対して一次スペクトルおよび二次スペクトルの採取を行い、前記一次スペクトルおよび二次スペクトルをｍｚＸＭＬフォーマットに変換した後、ピーク位置合わせ、保持時間補正、ピーク面積の抽出、および構造同定を行い、サンプル中の請求項１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定することを含む、
請求項６または７に記載の装置。

【請求項9】

測定待ちサンプルを、液体クロマトグラフによる分離に使用可能な測定待ちサンプル溶液に調製するサンプル調製ユニットと、
前記液体クロマトグラフで前記測定待ちサンプル溶液を分離し、タンデム飛行時間型質量分析計で分離後のサンプルに対して一次スペクトルおよび二次スペクトルの採取を行い、前記一次スペクトルおよび二次スペクトルをｍｚＸＭＬフォーマットに変換した後、ピーク位置合わせ、保持時間補正、ピーク面積の抽出、および構造同定を行い、サンプル中の請求項１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定する検出ユニットと、
検出されたアスパラギンの質量分析のピーク強度値を請求項３～５のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の早期診断モデルに入力して分析する分析ユニットと、
サンプルに対応する発現差倍率を出力し、アルツハイマー病陽性であるか否かを判断する評価ユニットと、を備える、
請求項６～８のいずれか１項に記載の装置。

【請求項10】

請求項１に記載のアルツハイマー病バイオマーカーの、アルツハイマー病を治療および／または予防する薬剤のスクリーニングにおける使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、バイオテクノロジー分野に属し、アルツハイマー病バイオマーカーのアスパラギンおよびその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ、ＡＤ）は、認知症とも呼ばれ、老年期に発生する進行性発達の中枢神経系の退化的な変性疾患であり、漸進的な記憶障害、認知機能の低下および日常生活能力の喪失を特徴とし、人格変化等の神経精神症状に伴い、社会や生活機能に大きな影響を及ぼし、アルツハイマー病の発症機序はまだ完全に明確にされておらず、そしてその早期症状が比較的に秘匿されているため、アルツハイマー病の患者は見落とされたり誤診されたりしやすい。

【0003】

現在の段階では、ＡＤに対する早期スクリーニング技術は、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）および脳脊髄液Ａβ分子レベル検出等を含み、前者は、被検者に一定用量の放射性物質を注射する必要があり、後者は、操作損傷が大きく、外科感染を引き起こしやすく、且つ、上記診断技術のＡＤ早期診断に対する信頼性も不安定であるため、ＡＤの早期スクリーニングに使用しにくい。

【0004】

従って、ＡＤの早期診断の新たなマーカーに対する開発は、将来のＡＤ診療の重要な方向の１つである。

【0005】

ＣＮ１１２８５８６８４Ａは、神経変性疾患マーカーＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ Ｂおよびその使用を開示し、前記マーカーは、リン酸化Ｃｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ Ｂタンパク質を含み、９つのＣｈｒｏｍｏｇｒａｎｉｎ Ｂタンパク質のペプチド断片がリン酸化されるものを神経変性疾患のマーカーとし、ＡＤ、ＰＤ等の神経変性疾患の症状の判断評価に使用し、構築した試薬キットサンプルの前期処理過程が簡単で、サンプル消耗量が少なく、精度が高く、ＡＤ、ＰＤ関連指標の診断補助に重要な臨床指導意義を持つ。

【0006】

近年、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクスおよびメタボロミクス等のハイスループットオミクス技術の発展に伴い、新型バイオマーカーの研究開発を加速し、特に、メタボロミクスは、磁気共鳴スペクトルおよび質量分析等の技術により、代謝産物グラフの動的変化を監視し、疾患関連バイオマーカーのスクリーニングで大きな優位性を示し、血液中にタンパク質、ポリペプチド、核酸、脂質および他の代謝物が含まれ、且つ、血液標本は入手しやすく、侵入性が小さく、バイオマーカーのスクリーニングで巨大な応用潜在力を有する。

【0007】

以上をまとめ、新たな血液代謝物に基づくＡＤバイオマーカーをスクリーニングすることは、ＡＤの早期診断の判断根拠を拡張することに寄与し、他のマーカー検出と組み合わせ、ＡＤ診断の正確性を向上させることができ、疾患の早期警告、病理分類、および発展段階の予測・評価等に寄与する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本願は、アルツハイマー病バイオマーカーのアスパラギンおよびその使用を提供し、本願は、高分解能非標的メタボロミクス分析技術に基づいてヒト血液中の代謝物を定性定量分析し、初めて血液中のアスパラギンをアルツハイマー病マーカーとし、血液中のアスパラギンレベルを検出することにより、アルツハイマー病の早期診断を補助することができ、タイムリー、便利、高特異性および高感度という特徴を備える。

【課題を解決するための手段】

【0009】

態様１において、
アスパラギン（Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）である、
アルツハイマー病バイオマーカー。

【0010】

アスパラギンはアミノ酸であり、分子式がＣ_２７Ｈ_１８Ｃ_ｌ３Ｎ_３Ｏであり、分子量が５０６．８１０３であり、薬として血圧降下、気管支拡張（抗喘息）、抗消化性潰瘍および胃機能障害等に使用でき、微生物培養、アクリロニトリルの汚水処理等にも使用される。

【0011】

本願は、高分解能非標的メタボロミクス分析技術に基づいて血液の代謝物を定性定量分析し、アルツハイマー病の血液サンプル中のアスパラギンレベルが正常な血液サンプルよりも著しく低いことを検出し、血液中のアスパラギンをアルツハイマー病バイオマーカーとし、血液中のアスパラギンレベルを検出することにより、アルツハイマー病の早期診断を補助することができる。

【0012】

本願は、アスパラギンの、バイオマーカーとしてアルツハイマー病の早期診断を補助することにおける使用を提供する。

【0013】

態様２において、本願は、態様１に記載のアルツハイマー病バイオマーカーの、アルツハイマー病の早期診断モデルの構築および／またはアルツハイマー病の早期診断装置の製造における使用を提供する。

【0014】

態様３において、本願は、アルツハイマー病の早期診断モデルであって、
前記アルツハイマー病の早期診断モデルの入力変数は、態様１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を含む、
アルツハイマー病の早期診断モデルを提供する。

【0015】

好ましくは、前記アルツハイマー病の早期診断モデルの出力変数は発現差倍率を含み、前記発現差倍率の計算式は式（１）に示すとおりである。

【数1】

【0016】

好ましくは、アルツハイマー病陽性の判断基準は、前記発現差倍率≦０．６４である。

【0017】

本願において、正常な血液サンプルとＡＤ血液サンプル中のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を十分に比較して分析し、合理的な設計を行うことにより、アルツハイマー病の早期診断モデルを構築し、前記モデルは、アスパラギンの質量分析のピーク強度値を入力変数とし、発現差倍率を出力変数とし、結果を迅速に出力でき、且つ、アスパラギンレベルが異常なサンプルを十分に表し、アルツハイマー病の早期診断を補助する。

【0018】

態様４において、本願は、
測定待ちサンプルを、液体クロマトグラフによる分離に使用可能な測定待ちサンプル溶液に調製するサンプル調製ユニットと、
前記液体クロマトグラフで前記測定待ちサンプル溶液を分離し、質量分析計で分離後のサンプルをデータ処理し、サンプル中の態様１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定する検出ユニットと、
検出されたアスパラギンの質量分析のピーク強度値を態様３に記載のアルツハイマー病の早期診断モデルに入力して分析する分析ユニットと、
サンプルに対応する発現差倍率を出力し、アルツハイマー病陽性であるか否かを判断する評価ユニットと、を備える、
アルツハイマー病の早期診断装置を提供する。

【0019】

本願のアルツハイマー病の早期診断装置において、各ユニット間は効果的に連携し、簡単で効率的であり、サンプルの処理、検出を迅速に完了し、且つ発現差倍率を取得することができるとともに、合理的に設計された判断基準でアルツハイマー病陽性の評価を行い、アルツハイマー病の早期診断に重要な意義を持つ。

【0020】

好ましくは、前記測定待ちサンプルは、血液サンプルを含む。

【0021】

好ましくは、前記測定待ちサンプル溶液の調製方法は、測定待ちサンプルをアセトニトリル水溶液内に入れ、遠心分離して上清を収集し、前記測定待ちサンプル溶液を取得することを含む。

【0022】

好ましくは、前記測定待ちサンプル溶液の調製方法は、
（１）測定待ちサンプルを予冷メタノール／アセトニトリル／水溶液内に入れ、混合して超音波を２５～３５ｍｉｎ（例えば、２６ｍｉｎ、２７ｍｉｎ、２８ｍｉｎ、２９ｍｉｎまたは３２ｍｉｎであってもよい）行い、－２０～－１５℃（例えば、－１９℃、－１８℃、－１６℃または－１７℃であってもよい）で５～１５ｍｉｎ（例えば、６ｍｉｎ、７ｍｉｎ、８ｍｉｎ、９ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１２ｍｉｎまたは１４ｍｉｎであってもよい）静置し、０～４℃（例えば、１℃、２℃または３℃であってもよい）、１２０００～１６０００×ｇ（例えば、１２２００×ｇ、１２４００×ｇ、１２６００×ｇ、１２８００×ｇ、１３２００×ｇ、１２６００×ｇ、１５０００×ｇまたは１５８００×ｇであってもよい）で１５～２５ｍｉｎ（例えば、１６ｍｉｎ、１７ｍｉｎ、１８ｍｉｎ、１９ｍｉｎ、２０ｍｉｎ、２１ｍｉｎ、２２ｍｉｎ、２３ｍｉｎまたは２４ｍｉｎであってもよい）遠心分離し、上清を取って真空乾燥し、前処理サンプルを取得するステップと、
（２）前記前処理サンプルを８０～１２０μＬのアセトニトリル水溶液内に入れて再溶解し、ボルテックスし、０～４℃において１２０００～１６０００×ｇ（例えば、１２２００×ｇ、１２４００×ｇ、１２６００×ｇ、１２８００×ｇ、１３２００×ｇ、１２６００×ｇ、１５０００×ｇまたは１５８００×ｇであってもよい）で１０～２０ｍｉｎ（例えば、１１ｍｉｎ、１２ｍｉｎ、１３ｍｉｎ、１４ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、１６ｍｉｎ、１７ｍｉｎ、１８ｍｉｎまたは１９ｍｉｎであってもよい）遠心分離し、上清を取り、前記測定待ちサンプル溶液を取得するステップと、を含む。

【0023】

好ましくは、前記メタノール／アセトニトリル／水溶液内のメタノールとアセトニトリルと水との体積比は（１～２）：（１～２）：１であり、１．２：２：１、１．２：１：１、２：２：１、１．４：１．５：１、１．６：１．２：１、１．８：２：１、１．９：１．８：１または１．１：１．４：１を含むが、これらに限定されない。

【0024】

好ましくは、前記アセトニトリル水溶液内のアセトニトリルと水との体積比は（１～２）：１であり、１．１：１、１．２：１、１．３：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１または１．９：１を含むが、これらに限定されない。

【0025】

好ましくは、前記液体クロマトグラフは、超高速液体クロマトグラフを含む。

【0026】

好ましくは、前記超高速液体クロマトグラフは、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ超高速液体クロマトグラフを含む。

【0027】

好ましくは、前記質量分析計は、タンデム飛行時間型質量分析計を含む。

【0028】

好ましくは、前記タンデム飛行時間型質量分析計は、ＡＢ Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ６６００質量分析計を含む。

【0029】

好ましくは、前記データ処理は、
タンデム飛行時間型質量分析計で分離後のサンプルに対して一次スペクトルおよび二次スペクトルの採取を行い、前記一次スペクトルおよび二次スペクトルをｍｚＸＭＬフォーマットに変換した後、ピーク位置合わせ、保持時間補正、ピーク面積の抽出、および構造同定を行い、サンプル中の態様１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定することを含む。

【0030】

好ましい技術案として、前記アルツハイマー病の早期診断装置は、
測定待ちサンプルを、液体クロマトグラフによる分離に使用可能な測定待ちサンプル溶液に調製するサンプル調製ユニットと、
前記液体クロマトグラフで前記測定待ちサンプル溶液を分離し、タンデム飛行時間型質量分析計で分離後のサンプルに対して一次スペクトルおよび二次スペクトルの採取を行い、前記一次スペクトルおよび二次スペクトルをｍｚＸＭＬフォーマットに変換した後、ピーク位置合わせ、保持時間補正、ピーク面積の抽出、および構造同定を行い、サンプル中の態様１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定する検出ユニットと、
検出されたアスパラギンの質量分析のピーク強度値を態様３に記載のアルツハイマー病の早期診断モデルに入力して分析する分析ユニットと、
サンプルに対応する発現差倍率を出力し、アルツハイマー病陽性であるか否かを判断する評価ユニットと、を備える。

【0031】

本願において、血液サンプル中のアスパラギンレベルを検出し、診断根拠として他の検出結果と組み合わせ、アルツハイマー病の早期診断を補助することができ、アルツハイマー病診断の正確性を向上させることができることが期待されるが、単独でアルツハイマー病を１００％診断できる診断指標とすることができない。

【0032】

本願において、ＫＥＧＧ経路分析により、Ｌ－Ａｓｐａｒａｇｉｎｅがアミノ酸の生合成経路（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｐａｔｈｗａｙ）に属することを発見する。

【0033】

態様５において、本願は、態様１に記載のアルツハイマー病バイオマーカーの、アルツハイマー病を治療および／または予防する薬剤のスクリーニングにおける使用を提供する。

【0034】

即ち、態様１に係るアルツハイマー病バイオマーカーを標的点としてアルツハイマー病を治療および／または予防する薬剤をスクリーニングする。

【発明の効果】

【0035】

従来技術と比べ、本願は、以下の有益な効果を有する。

【0036】

本願は、アルツハイマー病の血液サンプル中のアスパラギンレベルが正常な血液サンプルよりも著しく低いことを初めて検出し、血液中のアスパラギンをアルツハイマー病バイオマーカーとし、血液中のアスパラギンレベルを検出することにより、アルツハイマー病の早期診断を補助することができ、非侵襲的かつ迅速な検出に寄与し、タイムリー、便利、高特異性および高感度という特徴を備える。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】ＡＤモデルマウスと野生型マウスの血液サンプル中のアスパラギンレベルの図である。

【図2】ＡＤモデルマウスと野生型マウスの大脳皮質サンプル中のヒスチジンレベルの図である。

【図3】ＡＤモデルマウスと野生型マウスの大脳皮質サンプル中のグリシンレベルの図である。

【図4】ＡＤモデルマウスと野生型マウスの大脳皮質サンプル中のジヒドロキシアセトンリン酸レベルの図である。

【図5】ＡＤモデルマウスと野生型マウスの大脳皮質サンプル中のＤ－エリトロース－４－リン酸レベルの図である。

【図6】ＡＤモデルマウスと野生型マウスの大脳皮質サンプル中のホスホエノールピルビン酸レベルの図である。

【図7】ＡＤモデルマウスと野生型マウスの大脳皮質サンプル中の３－ホスホグリセリン酸レベルの図。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本願に使用される技術手段およびその効果を更に記述するために、以下、実施例および図面を参照しながら本願について更に説明する。ここで説明する具体的な実施形態は、本願を解釈するためのものに過ぎず、本願を限定するものではないことが理解できる。

【0039】

実施例で具体的な技術または条件が明記されていない場合、本分野内の文献で説明された技術または条件に従い、あるいは製品の説明書に従って行う。使用される試薬または機器のうちのメーカーが明記されていないものは、いずれも正規のルートから購入された通常の製品である。

【実施例】

【0040】

実施例１
本実施例は、９ヶ月齢のＡＤモデルマウス（ＡＰＰ／ＰＳ１トランスジェニックマウス、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｏｄｅｌ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒにより提供された）および野生型（ＷＴ）マウスの血液サンプルに対して代謝物の定性定量分析を行った。

【0041】

同じ条件で培養した１０匹のＡＤモデルマウスおよび１０匹の野生型マウスの血液をそれぞれ採取し、野生型マウスサンプルにＳＷＴ－１－１～ＳＷＴ－１－１０の番号を順に付け、ＡＤモデルマウスサンプルにＳＴＧ－１－１～ＳＴＧ－１－１０の番号を順に付け、超高速液体クロマトグラフ－タンデム飛行時間質量分析を採用してサンプル中のアスパラギンレベルを検出し、具体的な方法は、以下のステップを含んだ。

【0042】

ステップ（１）血液サンプルを予冷メタノール／アセトニトリル／水溶液（体積比２：２：１）に入れ、ボルテックスして混合し、低温超音波で３０ｍｉｎ処理し、－２０℃で１０ｍｉｎ静置し、４℃、１４０００×ｇで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を取って真空乾燥し、前処理サンプルを取得した。

【0043】

ステップ（２）前記前処理サンプルを１００μＬのアセトニトリル水溶液（体積比は、アセトニトリル：水＝１：１であった）に入れて再溶解し、ボルテックスし、４℃、１４０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を取ってサンプル注入して分析し、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ超高速液体クロマトグラフシステム（ＵＨＰＬＣ）ＨＩＬＩＣカラムにより分離し、カラム温度が２５℃で、流速が０．５ｍＬ／ｍｉｎで、サンプル注入量が２μＬであり、移動相組成は、酢酸アンモニウムとアンモニア水とを混合した水溶液（酢酸アンモニウムとアンモニア水との終濃度はいずれも２５ｍＭであった）であるＡ相と、アセトニトリルであるＢ相とを含み、グラジエント溶出プログラムは、次のとおりであった。０～０．５ｍｉｎにおいて、９５％のＢ相であり、０．５～７ｍｉｎにおいて、Ｂ相は９５％から６５％に線形に変化し、７～８ｍｉｎにおいて、Ｂ相は６５％から４０％に線形に変化し、８～９ｍｉｎにおいて、Ｂ相は４０％に維持し、９～９．１ｍｉｎにおいて、Ｂ相は、４０％から９５％に線形に変化し、９．１～１２ｍｉｎにおいて、Ｂ相は９５％に維持し、分析全過程において、サンプルは４℃のオートサンプラ内に置かれた。

【0044】

ステップ（３）ＡＢ Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ６６００質量分析計を採用し、ステップ（２）の超高速液体クロマトグラフシステムで分離した後のサンプルに対してサンプルの一次、二次スペクトルの採取を行い、ＥＳＩ源の条件は、Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｇａｓ１（Ｇａｓ１）：６０、Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ Ｇａｓ２（Ｇａｓ２）：６０、Ｃｕｒｔａｉｎ ｇａｓ（ＣＵＲ）：３０、ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：６００℃、ＩｏｎＳａｐａｒｙ Ｖｏｌｔａｇｅ Ｆｌｏａｔｉｎｇ（ＩＳＶＦ）±５５００Ｖ（正負という２つのモード）、ＴＯＦ ＭＳ ｓｃａｎ ｍ／ｚ ｒａｎｇｅ：６０～１０００Ｄａ、ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ ｓｃａｎ ｍ／ｚ ｒａｎｇｅ：２５～１０００Ｄａ、ＴＯＦ ＭＳ ｓｃａｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ０．２０ ｓ／ｓｐｅｃｔｒａ、ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｏｎ ｓｃａｎ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ０．０５ ｓ／ｓｐｅｃｔｒａであり、二次質量分析はｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ（ＩＤＡ）で取得し、且つ、ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙモード、Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ（ＤＰ）：±６０ Ｖ（正負という２つのモード）、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ Ｅｎｅｒｇｙ：３５±１５ｅＶを採用し、ＩＤＡ設定は、Ｅｘｃｌｕｄｅ ｉｓｏｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ４Ｄａ、Ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｉｏｎｓ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｐｅｒ ｃｙｃｌｅ：１０であり、採取したＷｉｆｆフォーマットの生データをＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄによりｍｚＸＭＬフォーマットに変換した後、ＸＣＭＳソフトウェアで、ピーク位置合わせ、保持時間補正、およびピーク面積の抽出を行い、ＸＣＭＳで抽出されたデータに対して代謝物の構造同定を行い、サンプル中のアスパラギンレベルを分析し、Ｒ言語ツール（Ｒ ｐａｃｋａｇｅ（ｒｏｐｌｓ））を用いて変異倍数分析（Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ、ＦＣ Ａｎａｌｙｓｉｓ）、主成分分析（ＰＣＡ）、直交部分最小二乗法判別分析（ＯＰＬＳ－ＤＡ）、およびＴテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔ）を行い、結果は図１および表１に示すように、ＡＤモデルマウスの血液サンプル中のアスパラギンレベルは、野生型マウスよりも著しく低く、血液中のアスパラギンをアルツハイマー病バイオマーカーとすることができ、血液中のアスパラギンレベルを検出することにより、アルツハイマー病の早期診断を補助することができることを表す。

【0045】

【表1】

【0046】

また、更にＫＥＧＧ経路の注釈および分析により、アスパラギンがアミノ酸の生合成経路（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｐａｔｈｗａｙ）に属することを発見し、アスパラギンは、２０種の最もよく見られるアミノ酸の１つであり、アミド基を有するアミノ酸であり、アスパラギン酸がアミノ基転移により産生され、また、アスパラギナーゼの触媒作用下でアスパラギン酸に変換でき、脳機能の発展に関連し、体のアンモニアサイクルで重要な役割を果たし、生体の代謝を調節し、人体の免疫力を向上させる作用を有する。

【0047】

実施例２
本実施例は、９ヶ月齢のＡＤモデルマウスと野生型（ＷＴ）マウスの大脳皮質サンプルに対して代謝物の定性定量分析を行った。

【0048】

同じ条件で培養した１０匹のＡＤモデルマウスおよび１０匹の野生型マウスの大脳皮質サンプルをそれぞれ採取し、野生型大脳皮質サンプルにＣＷＴ－１－１～ＣＷＴ－１－１０の番号を順に付け、ＡＤモデルマウス大脳皮質サンプルにＣＴＧ－１－１～ＣＴＧ－１－１０の番号を順に付け、超高速液体クロマトグラフ－タンデム飛行時間型質量分析計を採用して代謝物の定性定量分析を行い、具体的な方法は、以下のステップを含んだ。

【0049】

ステップ（１）マウスの首を切って殺した後、ハサミで脳殻を切断し、脳を露出させ、脳を真ん中の分け目に沿って２つの部分に切り、小脳、脳幹、視床、皮質下部および海馬をそれぞれ除去し、大脳皮質を残し、左右両側の完全な大脳皮質を収集してサンプルとし、予冷メタノール／アセトニトリル／水溶液（体積比２：２：１）に入れ、ボルテックスして混合し、低温超音波で３０ｍｉｎ処理し、－２０℃で１０ｍｉｎ静置し、４℃、１４０００×ｇで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を取って真空乾燥し、前処理サンプルを取得した。

【0050】

ステップ（２）前記前処理サンプルを１００μＬのアセトニトリル水溶液（体積比は、アセトニトリル：水＝１：１であった）に入れて再溶解し、ボルテックスし、４℃、１４０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を取ってサンプル注入して分析し、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＬＣ超高速液体クロマトグラフシステム（ＵＨＰＬＣ）ＨＩＬＩＣカラムにより分離し、条件は実施例１と同じであった。

【0051】

ステップ（３）ＡＢ Ｔｒｉｐｌｅ ＴＯＦ ６６００質量分析計を採用し、ステップ（２）の超高速液体クロマトグラフシステムで分離した後のサンプルに対してサンプルの一次、二次スペクトルの採取を行い、条件は実施例１と同じであり、採取したＷｉｆｆフォーマットの生データをＰｒｏｔｅｏＷｉｚａｒｄによりｍｚＸＭＬフォーマットに変換した後、ＸＣＭＳソフトウェアで、ピーク位置合わせ、保持時間補正、およびピーク面積の抽出を行い、ＸＣＭＳ抽出で得られたデータに対して代謝物の構造同定を行い、その後、一変数統計分析、多次元統計分析、差異代謝物スクリーニング、差異代謝物相関性分析、およびＫＥＧＧ経路分析を行い、ここで、ＯＰＬＳ－ＤＡモデルにより得られた変数の重み値（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ、ＶＩＰ）は、各代謝物の発現モードによる各グループのサンプル分類判別に与える影響の強さよび解釈能力を判定し、生物学的意義を有する差異分子を掘り出すために使用でき、本実施例は、ＶＩＰ値とｐ－ｖａｌｕｅを総合的に考えて顕著な差異代謝物をスクリーニングし、結果は図２～図７および表２に示すように、ＡＤモデルマウス大脳皮質組織中のヒスチジン（Ｌ－Ｈｉｓｔｉｄｉｎｏｌ）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ジヒドロキシアセトンリン酸（Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、およびＤ－エリトロース－４－リン酸（Ｄ－Ｅｒｙｔｈｒｏｓｅ ４－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）のレベルは野生型マウスよりも著しく高い一方、ホスホエノールピルビン酸（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒｕｖａｔｅ）および３－ホスホグリセリン酸（３－Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｄ－ｇｌｙｃｅｒａｔｅ）のレベルは野生型マウスよりも著しく低く、且つ、上記代謝物はいずれもアミノ酸の生合成経路（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｐａｔｈｗａｙ）に属し、アミノ酸の生合成経路（Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｐａｔｈｗａｙ）がアルツハイマー病と関連性があることを意味し、アスパラギンもアミノ酸の生合成経路に属し、他の方面から血液代謝物中のアスパラギンレベルの変化がＡＤ脳内の関連代謝経路の異常を反映する可能性があることを表し、臨床早期診断に重要な意義を持つ。

【0052】

【表2】

【0053】

以上をまとめ、本願は、アルツハイマー病の血液サンプル中のアスパラギンレベルが正常な血液サンプルよりも著しく低いことを初めて検出し、血液中のアスパラギンをアルツハイマー病バイオマーカーとし、血液中のアスパラギンレベルを検出することにより、アルツハイマー病の早期診断を補助することができ、非侵襲的かつ迅速な検出に寄与し、タイムリー、便利、高特異性および高感度という特徴を備える。

【0054】

本願は、上記実施例により本願の詳細方法を説明したが、本願は上記詳細方法に限定するものではなく、すなわち、本願は上記詳細方法に依存して実施しなければならないことを意味するものではないことを、出願人より声明する。当業者であれば、本願に対するいかなる改良、本願の製品の各原料に対する等価的な置換および補助成分の追加、具体的な形態の選択等は、全て本願の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【手続補正書】

【提出日】2024-03-13

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アスパラギンである、
アルツハイマー病バイオマーカー。

【請求項2】

請求項１に記載のアルツハイマー病バイオマーカーの、アルツハイマー病の早期診断モデルの構築および／またはアルツハイマー病の早期診断装置の製造における使用。

【請求項3】

アルツハイマー病の早期診断モデルの入力変数は、請求項１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を含む、
アルツハイマー病の早期診断モデル。

【請求項4】

前記アルツハイマー病の早期診断モデルの出力変数は発現差倍率を含み、前記発現差倍率の計算式は式（１）に示すとおりである、

【数1】

請求項３に記載のアルツハイマー病の早期診断モデル。

【請求項5】

アルツハイマー病陽性の判断基準は、前記発現差倍率≦０．６４である、
請求項４に記載のアルツハイマー病の早期診断モデル。

【請求項6】

測定待ちサンプルを、液体クロマトグラフによる分離に使用可能な測定待ちサンプル溶液に調製するサンプル調製ユニットと、
前記液体クロマトグラフで前記測定待ちサンプル溶液を分離し、質量分析計で分離後のサンプルをデータ処理し、サンプル中の請求項１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定する検出ユニットと、
検出されたアスパラギンの質量分析のピーク強度値を請求項３～５のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の早期診断モデルに入力して分析する分析ユニットと、
サンプルに対応する発現差倍率を出力し、アルツハイマー病陽性であるか否かを判断する評価ユニットと、を備える、
アルツハイマー病の早期診断装置。

【請求項7】

前記測定待ちサンプルは、血液サンプルを含む、
請求項６に記載の装置。

【請求項8】

前記データ処理は、
タンデム飛行時間型質量分析計で分離後のサンプルに対して一次スペクトルおよび二次スペクトルの採取を行い、前記一次スペクトルおよび二次スペクトルをｍｚＸＭＬフォーマットに変換した後、ピーク位置合わせ、保持時間補正、ピーク面積の抽出、および構造同定を行い、サンプル中の前記のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定することを含む、
請求項６に記載の装置。

【請求項9】

測定待ちサンプルを、液体クロマトグラフによる分離に使用可能な測定待ちサンプル溶液に調製するサンプル調製ユニットと、
前記液体クロマトグラフで前記測定待ちサンプル溶液を分離し、タンデム飛行時間型質量分析計で分離後のサンプルに対して一次スペクトルおよび二次スペクトルの採取を行い、前記一次スペクトルおよび二次スペクトルをｍｚＸＭＬフォーマットに変換した後、ピーク位置合わせ、保持時間補正、ピーク面積の抽出、および構造同定を行い、サンプル中の前記のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定する検出ユニットと、
検出されたアスパラギンの質量分析のピーク強度値を前記のアルツハイマー病の早期診断モデルに入力して分析する分析ユニットと、
サンプルに対応する発現差倍率を出力し、アルツハイマー病陽性であるか否かを判断する評価ユニットと、を備える、
請求項６に記載の装置。

【請求項10】

請求項１に記載のアルツハイマー病バイオマーカーの、アルツハイマー病を治療および／または予防する薬剤のスクリーニングにおける使用。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0054】

本願は、上記実施例により本願の詳細方法を説明したが、本願は上記詳細方法に限定するものではなく、すなわち、本願は上記詳細方法に依存して実施しなければならないことを意味するものではないことを、出願人より声明する。当業者であれば、本願に対するいかなる改良、本願の製品の各原料に対する等価的な置換および補助成分の追加、具体的な形態の選択等は、全て本願の保護範囲および開示範囲内に含まれることを理解すべきである。
さらに、本願発明は次の態様を含む。
［態様１］
アスパラギンである、
アルツハイマー病バイオマーカー。
［態様２］
態様１に記載のアルツハイマー病バイオマーカーの、アルツハイマー病の早期診断モデルの構築および／またはアルツハイマー病の早期診断装置の製造における使用。
［態様３］
アルツハイマー病の早期診断モデルの入力変数は、態様１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を含む、
アルツハイマー病の早期診断モデル。
［態様４］
前記アルツハイマー病の早期診断モデルの出力変数は発現差倍率を含み、前記発現差倍率の計算式は式（１）に示すとおりである、

【数2】

態様３に記載のアルツハイマー病の早期診断モデル。
［態様５］
アルツハイマー病陽性の判断基準は、前記発現差倍率≦０．６４である、
態様４に記載のアルツハイマー病の早期診断モデル。
［態様６］
測定待ちサンプルを、液体クロマトグラフによる分離に使用可能な測定待ちサンプル溶液に調製するサンプル調製ユニットと、
前記液体クロマトグラフで前記測定待ちサンプル溶液を分離し、質量分析計で分離後のサンプルをデータ処理し、サンプル中の態様１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定する検出ユニットと、
検出されたアスパラギンの質量分析のピーク強度値を態様３～５のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の早期診断モデルに入力して分析する分析ユニットと、
サンプルに対応する発現差倍率を出力し、アルツハイマー病陽性であるか否かを判断する評価ユニットと、を備える、
アルツハイマー病の早期診断装置。
［態様７］
前記測定待ちサンプルは、血液サンプルを含む、
態様６に記載の装置。
［態様８］
前記データ処理は、
タンデム飛行時間型質量分析計で分離後のサンプルに対して一次スペクトルおよび二次スペクトルの採取を行い、前記一次スペクトルおよび二次スペクトルをｍｚＸＭＬフォーマットに変換した後、ピーク位置合わせ、保持時間補正、ピーク面積の抽出、および構造同定を行い、サンプル中の態様１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定することを含む、
態様６または７に記載の装置。
［態様９］
測定待ちサンプルを、液体クロマトグラフによる分離に使用可能な測定待ちサンプル溶液に調製するサンプル調製ユニットと、
前記液体クロマトグラフで前記測定待ちサンプル溶液を分離し、タンデム飛行時間型質量分析計で分離後のサンプルに対して一次スペクトルおよび二次スペクトルの採取を行い、前記一次スペクトルおよび二次スペクトルをｍｚＸＭＬフォーマットに変換した後、ピーク位置合わせ、保持時間補正、ピーク面積の抽出、および構造同定を行い、サンプル中の態様１に記載のアスパラギンの質量分析のピーク強度値を測定する検出ユニットと、
検出されたアスパラギンの質量分析のピーク強度値を態様３～５のいずれか１項に記載のアルツハイマー病の早期診断モデルに入力して分析する分析ユニットと、
サンプルに対応する発現差倍率を出力し、アルツハイマー病陽性であるか否かを判断する評価ユニットと、を備える、
態様６～８のいずれか１項に記載の装置。
［態様１０］
態様１に記載のアルツハイマー病バイオマーカーの、アルツハイマー病を治療および／または予防する薬剤のスクリーニングにおける使用。

【国際調査報告】