▶ ザ・カウンシル・オヴ・ザ・クイーンズランド・インスティテュート・オヴ・メディカル・リサーチの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】免疫原性組成物及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/045 20060101AFI20240918BHJP
C12N 15/38 20060101ALI20240918BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240918BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240918BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20240918BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240918BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240918BHJP
【ＦＩ】
C07K14/045 ZNA
C12N15/38
A61P31/12
A61P35/00
A61P31/20
A61K38/16
A61K39/395 Y
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024516977
(86)(22)【出願日】2022-09-16
(85)【翻訳文提出日】2024-05-10
(86)【国際出願番号】 AU2022051120
(87)【国際公開番号】W WO2023039638
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】2021902988
(32)【優先日】2021-09-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】504200892
【氏名又は名称】ザ・カウンシル・オヴ・ザ・クイーンズランド・インスティテュート・オヴ・メディカル・リサーチ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】カーナ， ラジブ
(72)【発明者】
【氏名】ダサリ， ヴィジャイェンドラ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA01
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084CA01
4C084DA39
4C084MA16
4C084MA17
4C084MA21
4C084MA23
4C084MA28
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA52
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4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB331
4C084ZB332
4C085BA83
4C085BB11
4C085BB31
4C085BB33
4C085BB34
4C085BB35
4C085BB36
4C085BB37
4C085CC22
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG05
4C085GG08
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA01
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、新規組換えポリペプチド、及びヒトヘルペスウイルスに対する保護的又は治療的免疫応答を刺激するための方法を開示する。本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）由来の修飾ｇＢポリペプチドの単離されたホモ三量体を含む組成物に関し、ｇＢポリペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド、フーリン切断部位変異を有する細胞外ドメイン、及び／又はビリオン内ドメインを含むが、膜貫通ドメインを欠く。また、その使用、並びに上記組成物を用いてＣＭＶ関連疾患又はＣＭＶ感染を治療及び予防する方法。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
修飾ｇＢポリペプチドの単離されたホモ三量体を含む、組成物。
【請求項2】
前記修飾ｇＢポリペプチドが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に対応するアミノ酸配列を含み、前記修飾ｇＢポリペプチドが、膜貫通ドメインの少なくとも一部分を欠く、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記膜貫通ドメインが、配列番号１に記載の天然全長ポリペプチド配列のアミノ酸残基７５１～７７１に対応する、請求項２に記載の組成物。
【請求項4】
前記修飾ｇＢポリペプチドが、Ｎ末端シグナルペプチドを更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記シグナルペプチドが、細胞からの前記修飾ｇＢポリペプチドの分泌をもたらす、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記シグナルペプチドが、免疫グロブリンアイソタイプに由来する、請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項7】
前記免疫グロブリンアイソタイプが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのうちのいずれか１つから選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記シグナルペプチドが、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、請求項４～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記修飾ｇＢポリペプチドが、天然ｇＢタンパク質ビリオン表面ドメインの少なくとも一部分に対応する第１の領域と、天然ｇＢタンパク質ビリオン内ドメインの少なくとも一部分に対応する第２の領域と、を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記天然ｇＢタンパク質ビリオン表面ドメインが、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項11】
前記ｇＢタンパク質ビリオン表面ドメインが、疎水性膜近位領域を含まない、請求項９又は１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記ｇＢタンパク質ビリオン内ドメインが、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９～１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記ポリペプチドが、フーリン切断部位モチーフを含まない、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５６位に対応する前記アミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５６位に対応する前記アミノ酸残基が、グルタミン又はスレオニンである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項16】
前記野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５８位に対応する前記アミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
前記野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５８位に対応する前記アミノ酸残基が、スレオニン又はグルタミンである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項18】
前記野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５９位に対応する前記アミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
前記野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５９位に対応する前記アミノ酸残基が、グルタミン又はスレオニンである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
前記アミノ酸配列が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項21】
三量体修飾ｇＢポリペプチド複合体が、二量体を形成する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
前記修飾ｇＢポリペプチドが、天然ｇＢポリペプチドと比較して免疫原性を増強する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項23】
請求項１～２２のいずれか一項に記載の修飾ｇＢポリペプチドをコードする、核酸組成物。
【請求項24】
調節エレメントに作動可能に連結された、請求項２３に記載の核酸をコードする、発現ベクター。
【請求項25】
請求項２４に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項26】
三量体形態の修飾ｇＢポリペプチドの実質的に均質な調製物と、医薬的に許容される、担体、希釈剤、及び／又は賦形剤と、を含む、医薬的組成物。
【請求項27】
前記修飾ｇＢポリペプチドが、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）に対応するアミノ酸配列を含み、前記修飾ｇＢポリペプチドが、膜貫通ドメインの少なくとも一部分を欠く、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
前記膜貫通ドメインが、配列番号１に記載の天然全長ポリペプチド配列のアミノ酸残基７５１～７７１に対応する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項29】
前記修飾ｇＢポリペプチドが、Ｎ末端シグナルペプチドを更に含む、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項30】
前記シグナルペプチドが、細胞からの前記修飾ｇＢポリペプチドの分泌をもたらす、請求項２９に記載の組成物。
【請求項31】
前記シグナルペプチドが、免疫グロブリンアイソタイプに由来する、請求項２９又は３０に記載の組成物。
【請求項32】
前記免疫グロブリンアイソタイプが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのうちのいずれか１つから選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項33】
前記シグナルペプチドが、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項34】
前記修飾ｇＢポリペプチドが、天然ｇＢタンパク質ビリオン表面ドメインの少なくとも一部分に対応する第１の領域と、天然ｇＢタンパク質ビリオン内ドメインの少なくとも一部分に対応する第２の領域と、を含む、請求項２６～３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項35】
前記天然ｇＢタンパク質ビリオン表面ドメインが、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項36】
前記ｇＢタンパク質ビリオン表面ドメインが、疎水性膜近位領域を含まない、請求項３４又は３５に記載の組成物。
【請求項37】
前記ｇＢタンパク質ビリオン内ドメインが、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項38】
前記ポリペプチドが、フーリン切断部位モチーフを含まない、請求項２６～３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項39】
野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５６位に対応する前記アミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸である、請求項２６～３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項40】
前記野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５６位に対応する前記アミノ酸残基が、グルタミン又はスレオニンである、請求項２６～３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項41】
前記野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５８位に対応する前記アミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸である、請求項２６～４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項42】
前記野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５８位に対応する前記アミノ酸残基が、スレオニン又はグルタミンである、請求項２６～４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項43】
前記野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５９位に対応する前記アミノ酸残基が、アルギニン以外のアミノ酸である、請求項２６～４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項44】
前記野生型ＨＣＭＶ ｇＢの４５９位に対応する前記アミノ酸残基が、グルタミン又はスレオニンである、請求項２６～４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項45】
前記アミノ酸配列が、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる、請求項２６～４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項46】
三量体修飾ｇＢポリペプチド複合体が、二量体を形成する、請求項２６～４５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項47】
前記修飾ｇＢポリペプチドが、天然ｇＢポリペプチドと比較して免疫原性を増強する、請求項２６～４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項48】
少なくとも１つのＣＭＶ Ｔ細胞エピトープを更に含む、請求項２６～４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項49】
アジュバントを更に含む、請求項２６～４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項50】
対象におけるＣＭＶ関連疾患を治療又は予防する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１～２２又は２６～４９のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項51】
ＣＭＶ関連疾患の治療又は予防のための薬物の製造における、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項52】
前記ＣＭＶ関連疾患が、がんである、請求項５１に記載の組成物。
【請求項53】
ＣＭＶ感染の治療又は予防のための薬物の製造における、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願 本出願は、２０２１年９月１６日に出願されたオーストラリア仮出願第２０２１／９０２９８８号、表題“Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ Ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ”の優先権を主張し、その内容は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、概して、免疫応答を刺激するための組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、新規組換えポリペプチド、及びヒトヘルペスウイルスに対する保護的又は治療的免疫応答を刺激するための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
健常者における一次ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）は、一般に無症候性であり、時折再活性化し、粘膜表面から放出する、潜伏状態を確立する。場合によって、一次ＨＣＭＶ感染は、エプスタイン・バーウイルスによって引き起こされるものと同様の、単核球症様疾患の臨床症状を伴う。ＨＣＭＶが著しい罹患率及び死亡率を引き起こす重要な臨床状況が２つ存在する。これらには、先天性の一次感染、及び免疫抑制成人におけるウイルスの一次活性化又は再活性化が含まれる。
【0004】
ＨＣＭＶエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）タンパク質は、高度に保存された糖タンパク質であり、ウイルスと宿主細胞の融合による全ての細胞型へのウイルス侵入を媒介する際に重要な役割を果たす。ＨＣＭＶ ｇＢは、ＨＣＭＶ融合及び宿主細胞への侵入プロセス中に、ｇＨ、ｇＬ、ｇＯ及びＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１Ａ等の他のＨＣＭＶエンベロープタンパク質と相互作用する。ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の天然のコンフォメーションは、後にウイルスエンベロープ内で二量体化する三量体として存在する。ｇＢ特異的抗体が全ての自然に感染した個体で検出され得るため、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質は、免疫原性の高い抗原である。したがって、ｇＢタンパク質は、ワクチン開発のための主要な標的抗原であると考えられる。
【0005】
タンパク質分解切断部位の保持が組換えタンパク質産生を妨げたため、様々な第ＩＩ相臨床試験において最も広く試験されているＨＣＭＶワクチン製剤は、フーリン切断部位が除去されるという修飾を含有する（Ｓｐａｅｔｅ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．，１９９１）。そのような産生方法は、ｇＢタンパク質の単量体可溶性形態をもたらした。特に、ＭＦ５９アジュバントを含むこのｇＢタンパク質構築物は、固形臓器移植レシピエントにおけるＨＣＭＶ感染の予防においてわずか５０％の有効性を示したのみであった（Ｐａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｌ．Ｊ Ｍｅｄ．，２００９；及びＰａｓｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ．，２００９）。
【0006】
ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の天然形態は三量体であるため、これは、中和抗体を誘発するための最適な物理構造であると提唱されている（Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１４）。最近の研究では、完全に三量体の組換えＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の産生が記載されており、これは、その単量体対応物と比較して、マウスにおける血清ＨＣＭＶ中和抗体の顕著により高い力価を誘発する（Ｃｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２０１８）。この三量体組換えタンパク質の産生により、１５アミノ酸（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカー配列で置き換えられたフーリン切断部位、及びタンパク質精製をより良く可能にするために３’末端に付加された６ｘ Ｈｉｓ配列が得られた。
【発明の概要】
【0007】
本発明は、天然全長ｇＢタンパク質の膜貫通ドメインの少なくとも一部分を除去することによって、三量体に多量体化する修飾ｇＢポリペプチドが産生されたという本発明者の同定に、少なくとも一部、基づいている。これらの修飾ｇＢポリペプチドは、実質的な免疫応答を誘発するため、ＣＭＶ感染及び／又はＣＭＶ関連疾患の治療及び／又は予防において明確な臨床的有用性を有する。
【0008】
したがって、一態様において、本発明は、修飾ｇＢポリペプチドの単離されたホモ三量体を含む組成物を提供する。好適には、修飾ｇＢポリペプチドは、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＢタンパク質に対応するアミノ酸配列を含み、アミノ酸配列は、膜貫通領域の少なくとも一部分を欠く。
【0009】
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１に記載の天然全長ポリペプチド配列のアミノ酸残基７５１～７７１に対応する。いくつかの好ましい実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドアミノ酸配列は、膜貫通領域を実質的に欠く。
【0010】
いくつかの実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドは、ｇＢタンパク質ビリオン表面ドメインの少なくとも一部分に対応する第１の領域と、ｇＢタンパク質ビリオン内ドメインの少なくとも一部分に対応する第２の領域と、を含む。典型的には、ビリオン表面ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸残基３２～７０５を含む。いくつかの実施形態において、ビリオン内ドメインは、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基７７２～９０６を含む。
【0011】
いくつかの実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、細胞からの修飾ｇＢポリペプチドの分泌を促進する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、免疫グロブリンアイソタイプに由来する。このタイプのいくつかの実施形態において、免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのうちのいずれか１つから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれからなる。
【0012】
いくつかの実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドは、フーリン切断部位モチーフを含まない。このタイプのいくつかの実施形態において、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５６位に対応するアミノ酸残基（すなわち、配列番号１に記載の配列）は、アルギニン以外のアミノ酸である。典型的には、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５６位に対応するアミノ酸残基は、グルタミン又はスレオニンである。同じ実施形態のいくつか及び他のいくつかの実施形態において、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５８位に対応するアミノ酸残基は、アルギニン以外のアミノ酸である。典型的には、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５８位に対応するアミノ酸残基は、スレオニン又はグルタミンである。同じ実施形態のいくつか及びいくつかの他の実施形態において、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５９位に対応するアミノ酸残基は、アルギニン以外のアミノ酸である。典型的には、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５９位に対応するアミノ酸残基は、グルタミン又はスレオニンである。
【0013】
いくつかの実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドホモ三量体は、六量体を形成するように二量体化する。
【0014】
いくつかの実施形態において、修飾ｇＢポリペプチド複合体は、融合前確認で存在する。
【0015】
別の態様において、本発明は、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＢタンパク質に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる修飾ｇＢポリペプチドをコードする核酸分子を提供し、アミノ酸配列は、膜貫通領域の少なくとも一部分を欠く。
【0016】
更に別の態様において、本発明は、調節エレメントに作動可能に接続された、上記及び／又は本明細書の他所に記載される核酸分子を含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、調節エレメントはプロモーターである。
【0017】
なおも更に別の態様において、本発明は、上記及び／又は本明細書の他所に記載される発現ベクターを含む細胞を提供する。
【0018】
別の態様において、本発明は、ＨＣＭＶエンベロープｇＢタンパク質に対応するアミノ酸配列であって、膜貫通領域の少なくとも一部分を欠く、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる調製物と、医薬的に許容される担体、賦形剤、及び／又は希釈剤と、を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、アジュバントを更に含んでもよい。
【0019】
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号１に記載の天然全長ポリペプチド配列のアミノ酸残基７５１～７７１に対応する。
【0020】
いくつかの実施形態において、修飾ポリペプチドは、Ｎ末端シグナルペプチドを更に含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、細胞からのポリペプチドの分泌を促進する。
【0021】
いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、免疫グロブリンアイソタイプに由来する。このタイプのいくつかの実施形態において、免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのうちのいずれか１つから選択される。いくつかの好ましい実施形態において、シグナルペプチドは、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれからなる。
【0022】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ｇＢビリオン表面ドメインの少なくとも一部分に対応する第１の領域と、ｇＢビリオン内ドメインの少なくとも一部分に対応する第２の領域と、を含む。典型的には、ｇＢビリオン表面ドメインは、配列番号１に記載のアミノ酸残基３２～７０５を含む。いくつかの実施形態において、ｇＢビリオン内ドメインは、配列番号１に記載の配列のアミノ酸残基７７２～９０６を含む。
【0023】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、フーリン切断部位モチーフを含まない。このタイプのいくつかの実施形態において、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５６位に対応するアミノ酸残基（すなわち、配列番号１に記載の配列）は、アルギニン以外のアミノ酸である。典型的には、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５６位に対応するアミノ酸残基は、グルタミンである。
【0024】
同じ実施形態及び他の実施形態のいくつかにおいて、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５８位に対応するアミノ酸残基は、アルギニン以外のアミノ酸である。典型的には、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５８位に対応するアミノ酸残基は、スレオニンである。
【0025】
同じ実施形態及び他の実施形態のいくつかにおいて、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５９位に対応するアミノ酸残基は、アルギニン以外のアミノ酸である。典型的には、野生型ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の４５９位に対応するアミノ酸残基は、グルタミンである。
【0026】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる修飾ポリペプチドを含む。
【0027】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、多量体を形成するように複合体を形成する。
【0028】
なおも更に別の態様において、本発明は、対象におけるＣＭＶ感染及び／又はＣＭＶ関連疾患若しくは状態を治療又は予防するための方法を提供し、該方法は、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質に対応するアミノ酸配列を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる修飾ポリペプチドを含む組成物を対象に投与することを含み、アミノ酸配列は、膜貫通領域の少なくとも一部分を欠く。このタイプのいくつかの実施形態において、方法は、１つ以上の補助剤を対象に投与することを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【0029】
以下の図は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様を更に実証するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と合わせて、これらの図のうちの１つ以上を参照することによってより良く理解され得る。
【0030】
【図1】ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の発現及び精製プロセスのフロー図を提供する。
【0031】
【図2】修飾ｇＢポリペプチドの発現及び精製のグラフ表示を提供する。ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質コード配列を、哺乳動物発現のためにコドン最適化し、次いで、哺乳動物発現ベクターにクローニングした。（Ａ）１５Ｌ発酵槽で発現される修飾ｇＢポリペプチドの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（Ｂ）アニオン交換クロマトグラフィーの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（Ｃ）ＣＨＴタイプＩＩクロマトグラフィーの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。（Ｄ）カチオン交換クロマトグラフィーの非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析、及び多量体形態の精製された修飾ｇＢポリペプチド。Ｍ：分子量マーカー；Ｒ：参照標準；ＣＰ：清澄化及び濃縮タンパク質；Ｌ：充填；ＦＴ：フロースルー；Ｗ：洗浄；Ｅ：溶出；及びＳ：カラムストリップ画分。
【0032】
【図3】修飾ポリペプチドの精製及び特徴付けのグラフ表示を提供する。（Ａ）修飾ｇＢポリペプチドのサイズ排除クロマトグラフィー。精製された修飾ｇＢポリペプチドを２０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、次いで０．５ｍＬのタンパク質をＳＵＰＥＲＤＥＸ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムに充填した。次いで、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）緩衝液でタンパク質を溶出した。（Ｂ）ＳＵＰＥＲＤＥＸカラムで精製された修飾ｇＢポリペプチドを、８％天然ＰＡＧＥ－ＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で分析した。タンパク質試料をＤＤＴなしで充填し、試料を沸騰させなかった。レーン１：分子量マーカー；レーン２：２５ｍＭグリシン、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ４．０）中の修飾ｇＢポリペプチド、ＳＵＰＥＲＤＥＸに充填；及びレーン３～９：修飾ｇＢポリペプチドのＳＵＰＥＲＤＥＸ精製画分Ｅ５～Ｅ１１。
【0033】
【図4】ヒトＨＬＡ Ａ２４トランスジェニックマウスにおけるＨＣＭＶ ｇＢタンパク質特異的抗体応答のグラフ表示を提供する。（Ａ）２つの群のヒトＨＬＡ Ａ２４トランスジェニックマウスを、第１群：修飾ｇＢポリペプチド（５μｇ）、ＣＭＶポリ（３０μｇ）及びＣｐＧ１０１８（５０μｇ）を用いて製剤化したＣＭＶワクチン（ｎ＝６）、又は第２群：対照製剤（ｎ＝４）ＣｐＧ１０１８（５０μｇ）で３回（０日目、２１日目及び４２日目）皮下免疫した。４９日目にマウスを屠殺し、血清試料を採取してＨＣＭＶ ｇＢ特異的抗体応答を分析した。（Ｂ）折れ線グラフは、ｇＢポリペプチドの３つのアイソフォームを用いたマウスの免疫後に誘導されたＨＣＭＶ ｇＢ特異的免疫グロブリン力価の合計を表す。ＶＭ１～ＶＭ６は、ワクチン群マウスを表し、ＣＭ１～ＣＭ４は、対照群マウスを表す。（Ｃ）非還元条件下でＣＭＶワクチンを用いて免疫した後に得られた２つの異なる濃度（１：１０００及び１：３０００）のマウス血清を使用した、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドのウェスタンブロット分析。
【0034】
【図5】ＨＣＭＶ ｇＢ特異的抗体応答の特徴付けを提供する。２つの群のヒトＨＬＡ Ａ２４トランスジェニックマウスを、ｇＢポリペプチド（５μｇ）、ＣＭＶポリ（３０μｇ）及びＣｐＧ１０１８（５０μｇ）を用いて製剤化したＣＭＶワクチン（ｎ＝６）、又は対照製剤（ｎ＝４）ＣｐＧ１０１８（５０μｇ）で３回皮下免疫した。４９日目にマウスを屠殺し、血清試料を採取してＨＣＭＶ ｇＢ特異的抗体応答を分析した。（Ａ）折れ線グラフは、ＣＭＶワクチンによる免疫後に誘導されたＨＣＭＶ ｇＢ特異的免疫グロブリンアイソタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３を表す。（Ｂ）棒グラフは、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９株に感染したＭｒｃ－５細胞及びＨＣＭＶ ＴＢ４０ｅ株に感染したＡＲＰＥ－１９細胞に対する５０％中和抗体価を表す。（Ｃ及びＤ）Ｍｒｃ－５細胞をＡＤ１６９株に一晩感染させた。ＣｐＧ１０１８単独又はＣＭＶワクチンをワクチン接種したマウスから得られた血清を希釈し（１：５１２及び１：１０２４）、次いでＨＣＭＶ ＡＤ１６９株に感染したＭｒｃ－５細胞に添加した。細胞をＦＩＴＣに結合した抗マウスＩｇ抗体で染色した。フローサイトメトリー分析によって決定される、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９株に感染したＭｒｃ－５細胞に結合するマウス抗体の頻度。（Ｃ）棒グラフは、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９株に感染したＭｒｃ－５細胞に結合するＨＣＭＶ ｇＢ特異的抗体の頻度を表す。（Ｄ）代表的なＦＡＣＳプロット。
【0035】
【図6】ＨＣＭＶ ｇＢ特異的Ｂ細胞応答の特徴付けを提供する。２つの群のヒトＨＬＡ Ａ２４トランスジェニックマウスを、修飾ｇＢポリペプチド（５μｇ）、ＣＭＶポリ（３０μｇ）及びＣｐＧ１０１８（５０μｇ）を用いて製剤化したＣＭＶワクチン（ｎ＝６）、又は対照製剤（ｎ＝４）ＣｐＧ１０１８（５０μｇ）で３回（０日目、２１日目及び４２日目）皮下免疫した。４９日目にマウスを屠殺して脾臓を採取し、単一細胞懸濁液を作製して、ＴＦＨ細胞、ＧＣ Ｂ細胞、及びｇＢ特異的抗体分泌Ｂ細胞を分析した。（Ａ）棒グラフは、ＣｘＣｒ５＋ＰＤ１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＴＦＨ細胞）の頻度を表す。（Ｂ）棒グラフは、Ｂ２２０＋ＧＬ７＋ＦＡＳ＋Ｂ細胞（ＧＣ Ｂ細胞）の頻度を表す。（Ｃ及びＤ）棒グラフ及びＥＬＩＳｐｏｔウェルの写真は、ｇＢ特異的抗体を分泌する形質及びメモリーＢ細胞の頻度を表す。エラーバーは、平均±ＳＥＭ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１を表す（スチューデントｔ検定によって決定される）。
【0036】
【図7】ＨＣＭＶ ｇＢ特異的Ｔ細胞応答の特徴付けを提供する。２つの群のヒトＨＬＡ Ａ２４トランスジェニックマウスを、修飾ｇＢポリペプチド（５μｇ）、ＣＭＶポリ（３０μｇ）及びＣｐＧ１０１８（５０μｇ）を用いて製剤化したＣＭＶワクチン（ｎ＝６）、又は対照製剤（ｎ＝４）ＣｐＧ１０１８（５０μｇ）で３回（０日目、２１日目及び４２日目）皮下免疫した。４９日目にマウスを屠殺して脾臓を採取し、単一細胞懸濁液を作製して、ＨＣＭＶ ｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を分析した。ＨＣＭＶ ｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を測定するために、脾細胞をｇＢ ｐｅｐｍｉｘで刺激し、次いで、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を使用して、複数のサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ及びＩＬ－２）を分泌する能力を測定した。ＨＣＭＶ ｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を更に増殖させるために、対照群及びＣＭＶワクチン群からの脾細胞をｇＢ ｐｅｐｍｉｘを用いてインビトロで刺激し、次いで１０日間培養した。インビトロで増殖したｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＣＳを使用して複数のサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ及びＩＬ－２）を分泌する能力について評価した。（Ａ）エクスビボでＩＦＮ－γを産生するＨＣＭＶ ｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の平均頻度を表す。（Ｂ）円グラフは、エクスビボで異なる組み合わせのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、及びＩＬ－２を分泌するｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。（Ｃ）インビトロ増殖後にＩＦＮ－γを産生するＨＣＭＶ ｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の平均頻度を表す。（Ｄ）円グラフは、インビトロ増殖後に異なる組み合わせのＩＦＮ－γ、ＴＮＦ及びＩＬ－２を分泌するｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す。エラーバーは、平均±ＳＥＭ＊、ｐ＜０．０５を表す（スチューデントｔ検定によって決定される）。
【0037】
【図8】極低温電子顕微鏡法によって得られた、修飾ｇＢポリペプチドホモ三量体の写真による表示を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0038】
【表1】
１．定義 別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が記載される。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
【0039】
本明細書で使用される場合、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、単数又は複数の要素又は特徴を指す又は包含するために本明細書で使用され、「１つの」又は「単一の」要素又は特徴を意味又は定義するものと解釈されるべきではない。例えば、「ａ」タンパク質は、１つのタンパク質、１つ以上のタンパク質、又は複数のタンパク質を含む。
【0040】
「同時に投与」又は「同時に投与する」又は「同時投与」等の用語は、２つ以上の活性剤を含有する単一の組成物の投与、又は別個の組成物としての各活性剤の投与、及び／又は、効果的な結果が、そのような活性剤が全て単一組成物として投与された場合に得られるものと同等である十分に短い期間内に、同時期に、又は同時に、又は連続的に、別々の経路によって送達されることを指す。「同時に」は、活性薬剤が実質的に同時に、望ましくは同じ製剤中で一緒に投与されることを意味する。「同時期に」は、活性薬剤が、別の薬剤の前又は後に、時間的に近接して投与される（例えば、１つの薬剤が、約１分以内～約１時間以内に投与される）ことを意味する。いずれの同時期の時間も有用である。しかしながら、多くの場合、同時に投与されない場合、薬剤は、約１分以内～約８時間以内、好ましくは約１時間未満～約４時間以内に投与される。同時に投与される場合、薬剤は、対象の同じ部位に好適に投与される。用語「同じ部位」は、正確な位置を含むが、約０．５ｃｍ～約１５ｃｍ以内、好ましくは約０．５ｃｍ～約５ｃｍ以内であり得る。本明細書で使用される「別個に」という用語は、薬剤が、ある間隔で、例えば、約１日から数週間又は数ヶ月の間隔で投与されることを意味する。活性薬剤は、いずれの順序で投与されてもよい。本明細書で使用される「連続的に」という用語は、薬剤が、例えば、分、時間、日又は週の間隔又は複数の間隔で、順次投与されることを意味する。必要に応じて、活性薬剤は、定期的な反復サイクルで投与されてもよい。
【0041】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、関連する列挙された項目のうちの１つ以上のあらゆる可能な組み合わせ、及び代替（又は）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、包含する。
【0042】
「コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物又は遺伝子の最終ｍＲＮＡ産物（例えば、スプライシング後の遺伝子のｍＲＮＡ産物）のコードに寄与する任意の核酸配列を意味する。対照的に、「非コード配列」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物又は遺伝子の最終ｍＲＮＡ産物のコードに寄与しない任意の核酸配列を指す。
【0043】
文脈が別途必要とする場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語、又は同様の用語は、非排他的な包含を意味することが意図され、そのため、要素又は特徴の列挙されたリストは、記載又は列挙された要素のみを含むのではなく、列挙又は記載されていない他の要素又は特徴を含み得る。
【0044】
単離されたタンパク質等のアミノ酸配列との関連で「～から本質的になる」は、Ｎ末端又はＣ末端に追加の１つ、２つ又は３つのアミノ酸と一緒に記載されたアミノ酸配列を意味する。
【0045】
用語「構築物」及び「合成構築物」は、互いに作動可能に連結された異種核酸配列を指すために本明細書で互換的に使用され、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現を提供する配列、及び任意選択的に、構築物の維持を提供する場合により配列を含み得る。
【0046】
「～に対応する」又は「～に対応している」は、標的抗原中のアミノ酸配列に対して実質的な配列同一性又は類似性を示すアミノ酸配列をコードする抗原を意味する。一般に、抗原は、標的抗原の少なくとも一部分に対して、少なくとも約３０、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性又は類似性を示す。
【0047】
「有効量」は、免疫応答を刺激するか、又は疾患若しくは状態を治療若しくは予防するという文脈において、その量の組成物を、その調節、治療若しくは予防に有効な単回用量又は一連の用量の一部として、それを必要とする個体に投与することを意味する。有効量は、治療される個体の健康及び身体状態、治療される個体の分類群、組成物の配合、医学的状況の評価、並びに他の関連する要因に応じて変化する。量は、ルーチン試験を通じて決定することができる比較的広い範囲に属すると予想される。
【0048】
「発現ベクター」は、ベクターによってコードされるタンパク質の合成を指示することができる任意の自律的な遺伝的要素を意味する。そのような発現ベクターは、当業者によって知られている。
【0049】
「ｇＢ」及び「ｇＢタンパク質」等の用語は、本明細書で使用される場合、ｇＢ遺伝子（例えば、ＨＣＭＶ ｇＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号３０７７４２４によって識別される））の産物である、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０６４７３による配列を有するポリペプチドであって、ｇＢのバリアント、アイソフォーム及びウイルス相同体の全てを含む、「糖タンパク質Ｂ」を意味する。
【0050】
用語「遺伝子」は、その最も広範な文脈で使用され、遺伝子に対応するゲノムＤＮＡ領域、及びエクソンに対応するｃＤＮＡ配列、又は生成物の機能的形態をコードするように操作された組換え分子の両方を含む。
【0051】
免疫応答を増強すること（「免疫増強」）は、当該技術分野で周知であるように、外来又は疾患特異的抗原（例えば、ウイルス抗原）に応答する動物の能力を増強することを意味し、すなわち、そのような抗原を攻撃するようにプライミングされた細胞は、それらの抗原を検出及び破壊するように数、活性、及び能力が増加する。免疫応答の強度は、当該技術分野に既知の手段による末梢血リンパ球の直接測定、ナチュラルキラー細胞細胞傷害性アッセイ（例えば、Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５５：１９－２４を参照）、細胞増殖アッセイ（例えば、Ｖｏｌｌｅｎｗｅｉｄｅｒ，Ｉ．ａｎｄ Ｇｒｏｓｅｕｒｔｈ，Ｐ．Ｊ．（１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１４９：１３３－１３５を参照）、免疫細胞及びサブセットのイムノアッセイ（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｃｙｔｏｍ．１３：１６９－１７４）、Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９９２，Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３４：２４１－２５１）を参照）、又は細胞媒介性免疫の皮膚試験（例えば、Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９３，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：１０４３－１０５０を参照）を含む標準的な試験によって測定される。上記の試験によって測定される免疫応答の強度の統計的に有意な増加は、本明細書で使用される「増強された免疫応答」、「免疫増強」又は「免疫強化」とみなされる。増強された免疫応答はまた、発熱及び炎症、並びに全身及び局所感染の治癒、並びに疾患における症状の軽減、すなわち、ウイルス負荷の減少、ＣＭＶ関連疾患又は状態を含むがこれらに限定されない、疾患又は状態の症状の緩和によっても示される。そのような身体的な症状はまた、本明細書で使用される「増強された免疫応答」「免疫増強」又は「免疫強化」を定義する。
【0052】
「単離された」は、その天然状態で通常それに付随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。
【0053】
組成物は、ａ）ナイーブ個体における抗原（例えば、ウイルス抗原）に対して免疫応答を生成すること、又はｂ）化合物若しくは組成物が投与されなかった場合に生じるであろう免疫応答を超えて、個体における免疫応答を再構築、増強、若しくは維持すること、のいずれかが可能である場合、「免疫賦活性」である。組成物は、単回用量又は複数回用量で投与されたときにこれらの基準のいずれかを達成することができる場合、免疫原性である。
【0054】
本明細書で使用される場合、「予防すること」（又は「予防する」又は「予防する」）は、ＣＭＶ感染、又はＣＭＶ関連疾患、障害若しくは状態の症状、態様、又は特徴を予防又は軽減するために、症状、態様、又は特徴の発症前に開始される一連の行為（本発明の医薬組成物を投与する等）を指す。そのような予防は、対象に有益であるために絶対的である必要はないことが理解されるべきである。「予防的」治療は、ＣＭＶ感染、又はＣＭＶ関連疾患、障害若しくは状態の症状、態様、又は特徴を発症するリスクを低減する目的で、ＣＭＶ感染、又はＣＭＶ関連疾患、障害若しくは状態の兆候を示していない対象、あるいは初期兆候のみを示す対象に投与される治療である。「刺激する」は、標的分子のレベル及び／又は機能活性を直接的又は間接的に増加させることを意味する。例えば、薬剤は、標的分子以外の分子と相互作用することによって、上記レベル／活性を間接的に刺激し得る。この点において、標的ポリペプチドをコードする遺伝子の間接的な刺激は、その範囲内に第１の核酸分子の発現の刺激を含み、第１の核酸分子の発現産物が、標的ポリペプチドをコードする核酸分子の発現を刺激する。ある特定の実施形態において、「刺激」又は「刺激すること」は、所望の／選択された応答が、抗原が単独で使用されていた場合と比べて、より効率的である（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％以上）、より迅速である（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％以上）、より大規模である（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％以上）、及び／又はより容易に誘導される（例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％以上）ことを意味する。
【0055】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、ホスホジエステル結合（又はその関連する構造バリアント若しくは合成類似体）を介して連結された複数のヌクレオチド単位（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はその関連する構バリアント若しくは合成類似体）で構成されるポリマーを指す。したがって、「オリゴヌクレオチド」という用語は、典型的には、ヌクレオチド及びそれらの間の結合が天然に存在するヌクレオチドポリマーを指す一方で、この用語は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミダート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、２－Ｏ－メチルリボ核酸等を含むがこれらに限定されない様々な類似体もその範囲内に含むことを理解されたい。分子の正確なサイズは、特定の用途に応じて変動し得る。オリゴヌクレオチドは、典型的には、長さがかなり短く、一般的には約１０～３０ヌクレオチドであるが、この用語は、任意の長さの分子を指すことができるものの、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、典型的には、大きなオリゴヌクレオチドについて使用される。
【0056】
「プライマー」は、通常、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、好ましくは１５～５０個の連続したヌクレオチドを有し、これは、相補的核酸の「鋳型」にアニーリングし、Ｔａｑポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、又はＳｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）等のＤＮＡポリメラーゼの作用によって鋳型依存的様式で伸長されることができる。「プローブ」は、例えば、ノーザンブロット法又はサザンブロット法において相補的配列を検出する目的で好適に標識された、一本鎖又は二本鎖オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドであり得る。
【0057】
「５’非コード領域」という用語は、遺伝子のポリペプチド産物を含むアミノ酸残基をコードする配列以外の、発現可能な遺伝子の上流領域に由来する全てのヌクレオチド配列を含むように、本明細書においてその最も広い文脈で使用され、５’非コード領域は、遺伝子の発現を、少なくとも一部、付与する、活性化する、又は別様に促進する。
【0058】
「配列同一性」という用語は、本明細書で使用される場合、配列が比較ウィンドウにわたってヌクレオチドごとに、又はアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）が両方の配列で生じる位置の数を決定して、一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。本発明の目的のために、「配列同一性」は、適切な方法によって算出された「一致率」を意味すると理解されたい。例えば、配列同一性分析は、ＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（Ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン２．５；Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡから入手可能）を使用して、ソフトウェアに添付された参照マニュアルで使用される標準的なデフォルトを用いて実行され得る。
【0059】
「類似性」は、同一であるか、又は表２に定義されるような保存的置換を構成するアミノ酸のパーセンテージ数を指す。
【表2】
【0060】
類似性は、ＧＡＰ等の配列比較プログラムを使用して決定することができる（Ｄｅｖｅｒａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，３８７－３９５）。このようにして、本明細書に挙げられるものと同様の長さ又は実質的に異なる長さの配列を、ギャップをアライメントに挿入することによって比較することができ、そのようなギャップは、例えば、ＧＡＰによって使用される比較アルゴリズムによって決定されている。
【0061】
２つ以上のポリペプチド又はポリヌクレオチドの間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、及び「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチド及びアミノ酸残基を含めた、少なくとも１２個であるが、頻繁に１５～１８個、しばしば少なくとも２５個の単量体単位の長さである。２つのポリヌクレオチドは各々、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分のみ）、及び（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列を含み得るため、２つ（又はそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定及び比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、少なくとも６個、一般的には約５０～約１００個、より一般的には約１００～約１５０の連続した位置からなる概念上のセグメントを指し、そこで２つの配列を最適に整列させた後、配列を、同じ数の連続する位置の参照配列と比較する。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアライメントの参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して約２０％以下の付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための最適な配列のアライメントは、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ処理による実装によって、又はインスペクションによって、及び選択された様々な方法のいずれかによって生成された最良のアライメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高いパーセンテージ相同性をもたらす）によって実施することができる。また、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されるようなＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを参照してもよい。配列解析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ，１９９４－１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ １５のＵｎｉｔ １９．３に見出すことができる。
【0062】
本明細書で定義される場合、「シグナルペプチド」という用語（リーダーペプチド、標的化シグナル、シグナル配列、輸送ペプチド又は局在化シグナルとも称される）は、小胞体膜を通過して移行するタンパク質を標的とする配列モチーフである。シグナルペプチドは、新生タンパク質のアミノ末端に見出され、細胞内の輸送機構を促してタンパク質を細胞内の特定の目的地に、又はタンパク質が分泌される場合は細胞外に運ぶことによって機能する。細胞外環境で分泌される場合、シグナルペプチドは分泌型シグナルペプチドであることが特定され得る。
【0063】
本明細書で使用される場合、「治療すること」（又は「治療する」又は「治療」）は、ＣＭＶ関連疾患、障害又は状態を含むＣＭＶ感染の兆候又は症状が発症した後に、それを改善する治療的介入を指す。「改善する」という用語は、ＣＭＶ関連疾患、障害又は状態に関して、治療の任意の観察可能な有益な効果を指す。治療は、対象に有益であるために絶対的である必要はない。有益な効果は、当業者に既知の任意の方法又は標準を使用して決定することができる。
【0064】
本発明の関連において、「ＣＭＶ関連疾患、障害又は病態」は、前述のもの等のサイトメガロウイルスによるそのような感染から生じる任意の臨床病理を含む任意のＣＭＶ感染を意味する。
【0065】
「投与すること」又は「投与」は、特定の選択された経路によって、本明細書に開示される組成物を対象に導入することを意味する。上記のような任意の安全な投与経路及び剤形が、本発明の組成物を患者に提供するために用いられ得る。
【0066】
本明細書で一般的に使用される場合、「患者」、「個体」、及び「対象」という用語は、本明細書に開示される治療又は組成物の任意の哺乳動物レシピエントの文脈で使用される。したがって、本明細書に開示される方法及び組成物は、医学的及び／又は獣医学的用途を有し得る。好ましい形態において、対象はヒトである。
【0067】
本明細書で使用される「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、ｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）、及びゲノムＤＮＡを含む、一本鎖又は二本鎖のｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、及びＤＮＡを示す。
【0068】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマー、並びにそのバリアント及び合成類似体を指すために本明細書で互換的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、生成物の最小の長さに限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体等が、この定義に含まれる。全長タンパク質及びその部分の両方が、この定義に包含される。「生物学的に活性な部分」又は「断片」という用語は、ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドの免疫原性部分を記載するために、本明細書において互換的に使用される。これらの部分は、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９以上のアミノ酸残基長のポリペプチドであり得る。その断片、バリアント、及び誘導体を含む、本明細書に記載の単離されたタンパク質は、化学合成、組換えＤＮＡ技術、及びペプチド断片を産生するためのタンパク質分解切断を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の手段によって生成され得る。
【0069】
組換えタンパク質は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）、特にセクション１６及び１７；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ ＵＳＡ １９９５－２００８）、特に第１０章及び第１６章；並びにＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｅｄｓ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ ＵＳＡ １９９５－２００８）、特に第１章、第５章及び第６章に記載されるような標準プロトコルを使用して、当業者によって好都合に調製され得る。典型的には、組換えタンパク質の調製は、好適な宿主細胞におけるタンパク質をコードする核酸の発現を含む。
【0070】
「ベクター」は、核酸分子、好ましくは、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又は植物ウイルスに由来するＤＮＡ分子を意味し、その中に核酸配列を挿入又はクローニングすることができる。ベクターは、好ましくは、１つ以上の独自の制限部位を含有し、標的細胞若しくは組織、又はその前駆細胞若しくは組織を含む定義された宿主細胞において自律複製が可能であってもよく、又はクローニングされた配列が再現可能であるように、定義された宿主のゲノムに組み込み可能であってもよい。したがって、ベクターは、その複製が染色体の複製とは無関係である自律複製型ベクター（すなわち、染色体外実体として存在するベクター）（例えば直線状又は閉鎖状の環状プラスミド）、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有してもよい。代替的に、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体と一緒に複製されたベクターであってもよい。ベクター系は、単一のベクター若しくはプラスミド、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含有する２つ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンを含み得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターはまた、好適な形質転換体の選択に使用することができる抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを含んでもよい。そのような耐性遺伝子の例は、当該技術分野の当業者に周知である。
【0071】
「野生型」という用語は、生物、ポリペプチド、又は核酸配列に関して、天然に存在するか、又は、人によって変更されていない、変異されていない、若しくは別様に操作されていない、少なくとも１つの天然に存在する生物において利用可能である、生物、ポリペプチド、又は核酸配列を指す。
【0072】
本発明が容易に理解され、実用化され得るように、ここで、特定の好ましい実施形態を、以下の非限定的な実験例によって説明する。
【0073】
２．組成物 本発明は、膜貫通ドメインの少なくとも一部分を欠く組換え産生された修飾ｇＢポリペプチドが、組換え産生された天然ｇＢタンパク質と比較して、ＣＭＶに対する増強された免疫応答を刺激又は誘発することができるという決定に、少なくとも一部、基づいている。本発明者らは、この修飾ｇＢポリペプチドがＣＭＶ感染に対する予防的及び／又は治療的治療として有効であろうと判断した。そうすることで、ポリペプチドを含む組成物は、ＣＭＶ関連疾患、障害若しくは状態を予防するか、又は予防的に若しくは治療的に治療するのにも有効である。したがって、本発明は、対象におけるＣＭＶ感染、又はＣＭＶ関連疾患、障害若しくは状態を治療又は予防するための組成物及び方法において、天然ＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドに対応するが、膜貫通ドメインの少なくとも一部分を欠くアミノ酸配列を有する修飾ｇＢポリペプチドを提供する。
【0074】
２．１修飾ｇＢポリペプチド
ＨＣＭＶの細胞侵入には、フソゲンとして機能し、シグナル伝達受容体に結合することが報告されている、保存されたｇＢタンパク質が必要である。ｇＢタンパク質は、ヒトにおいて強い免疫応答を誘発し、中和抗体の産生を誘導するが、ほとんどの抗ｇＢタンパク質抗体は非中和性である。ウイルスのフソゲンは、いくつかのウイルス融合体についてマッピングされた融合前形態から融合後形態への一連のコンフォメーション変化を受けることによって、ウイルス侵入及び細胞拡散中のウイルスエンベロープと宿主膜の融合を媒介する。
ＨＣＭＶの細胞侵入には、フソゲンとして機能し、シグナル伝達受容体に結合することが報告されている、保存されたｇＢタンパク質が必要である。ｇＢタンパク質は、ヒトにおいて強い免疫応答を誘発し、中和抗体の産生を誘導するが、ほとんどの抗ｇＢタンパク質抗体は非中和性である。ウイルスのフソゲンは、いくつかのウイルス融合体についてマッピングされた融合前形態から融合後形態への一連のコンフォメーション変化を受けることによって、ウイルス侵入及び細胞拡散中のウイルスエンベロープと宿主膜の融合を媒介する。
【0075】
ｇＢタンパク質は、ＵＬ５５遺伝子によってコードされる。ＵＬ５５遺伝子の配列変異は、４つの主要なｇＢ遺伝子型（ｇＢ１、ｇＢ２、ｇＢ３、ｇＢ４）があることを示す。加えて、３つの非プロトタイプ遺伝子型（ｇＢ５、ｇＢ６、及びｇＢ７）も同定されている。全長天然ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質は、９０６アミノ酸長であり、シグナル配列、疎水性膜近位領域を含むビリオンドメイン（すなわち、エクトドメイン）、膜貫通ドメイン、及びウイルス内（又は細胞質）ドメイン（サイトドメイン）を含有する。
【0076】
全長天然ｇＢタンパク質アミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０６４７３で保管）を以下に示す。
ＭＥＳＲＩＷＣＬＶＶＣＶＮＬＣＩＶＣＬＧＡＡＶＳＳＳＳＴＳＨＡＴＳＳＴＨＮＧＳＨＴＳＲＴＴＳＡＱＴＲＳＶＹＳＱＨＶＴＳＳＥＡＶＳＨＲＡＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮＴＴＫＹＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＩＣＴＳＭＫＰＩＮＥＤＬＤＥＧＩＭＶＶＹＫＲＮＩＶＡＨＴＦＫＶＲＶＹＱＫＶＬＴＦＲＲＳＹＡＹＩＹＴＴＹＬＬＧＳＮＴＥＹＶＡＰＰＭＷＥＩＨＨＩＮＫＦＡＱＣＹＳＳＹＳＲＶＩＧＧＴＶＦＶＡＹＨＲＤＳＹＥＮＫＴＭＱＬＩＰＤＤＹＳＮＴＨＳＴＲＹＶＴＶＫＤＱＷＨＳＲＧＳＴＷＬＹＲＥＴＣＮＬＮＣＭＬＴＩＴＴＡＲＳＫＹＰＹＨＦＦＡＴＳＴＧＤＶＶＹＩＳＰＦＹＮＧＴＮＲＮＡＳＹＦＧＥＮＡＤＫＦＦＩＦＰＮＹＴＩＶＳＤＦＧＲＰＮＡＡＰＥＴＨＲＬＶＡＦＬＥＲＡＤＳＶＩＳＷＤＩＱＤＥＫＮＶＴＣＱＬＴＦＷＥＡＳＥＲＴＩＲＳＥＡＥＤＳＹＨＦＳＳＡＫＭＴＡＴＦＬＳＫＫＱＥＶＮＭＳＤＳＡＬＤＣＶＲＤＥＡＩＮＫＬＱＱＩＦＮＴＳＹＮＱＴＹＥＫＹＧＮＶＳＶＦＥＴＳＧＧＬＶＶＦＷＱＧＩＫＱＫＳＬＶＥＬＥＲＬＡＮＲＳＳＬＮＩＴＨＲＴＲＲＳＴＳＤＮＮＴＴＨＬＳＳＭＥＳＶＨＮＬＶＹＡＱＬＱＦＴＹＤＴＬＲＧＹＩＮＲＡＬＡＱＩＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＮＳＳＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＬＳＳＩＳＴＶＤＳＭＩＡＬＤＩＤＰＬＥＮＴＤＦＲＶＬＥＬＹＳＱＫＥＬＲＳＳＮＶＦＤＬＥＥＩＭＲＥＦＮＳＹＫＱＲＶＫＹＶＥＤＫＶＶＤＰＬＰＰＹＬＫＧＬＤＤＬＭＳＧＬＧＡＡＧＫＡＶＧＶＡＩＧＡＶＧＧＡＶＡＳＶＶＥＧＶＡＴＦＬＫＮＰＦＧＡＦＴＩＩＬＶＡＩＡＶＶＩＩＴＹＬＩＹＴＲＱＲＲＬＣＴＱＰＬＱＮＬＦＰＹＬＶＳＡＤＧＴＴＶＴＳＧＳＴＫＤＴＳＬＱＡＰＰＳＹＥＥＳＶＹＮＳＧＲＫＧＰＧＰＰＳＳＤＡＳＴＡＡＰＰＹＴＮＥＱＡＹＱＭＬＬＡＬＡＲＬＤＡＥＱＲＡＱＱＮＧＴＤＳＬＤＧＱＴＧＴＱＤＫＧＱＫＰＮＬＬＤＲＬＲＨＲＫＮＧＹＲＨＬＫＤＳＤＥＥＥＮＶ［配列番号１］。
ＭＥＳＲＩＷＣＬＶＶＣＶＮＬＣＩＶＣＬＧＡＡＶＳＳＳＳＴＳＨＡＴＳＳＴＨＮＧＳＨＴＳＲＴＴＳＡＱＴＲＳＶＹＳＱＨＶＴＳＳＥＡＶＳＨＲＡＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮＴＴＫＹＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＩＣＴＳＭＫＰＩＮＥＤＬＤＥＧＩＭＶＶＹＫＲＮＩＶＡＨＴＦＫＶＲＶＹＱＫＶＬＴＦＲＲＳＹＡＹＩＹＴＴＹＬＬＧＳＮＴＥＹＶＡＰＰＭＷＥＩＨＨＩＮＫＦＡＱＣＹＳＳＹＳＲＶＩＧＧＴＶＦＶＡＹＨＲＤＳＹＥＮＫＴＭＱＬＩＰＤＤＹＳＮＴＨＳＴＲＹＶＴＶＫＤＱＷＨＳＲＧＳＴＷＬＹＲＥＴＣＮＬＮＣＭＬＴＩＴＴＡＲＳＫＹＰＹＨＦＦＡＴＳＴＧＤＶＶＹＩＳＰＦＹＮＧＴＮＲＮＡＳＹＦＧＥＮＡＤＫＦＦＩＦＰＮＹＴＩＶＳＤＦＧＲＰＮＡＡＰＥＴＨＲＬＶＡＦＬＥＲＡＤＳＶＩＳＷＤＩＱＤＥＫＮＶＴＣＱＬＴＦＷＥＡＳＥＲＴＩＲＳＥＡＥＤＳＹＨＦＳＳＡＫＭＴＡＴＦＬＳＫＫＱＥＶＮＭＳＤＳＡＬＤＣＶＲＤＥＡＩＮＫＬＱＱＩＦＮＴＳＹＮＱＴＹＥＫＹＧＮＶＳＶＦＥＴＳＧＧＬＶＶＦＷＱＧＩＫＱＫＳＬＶＥＬＥＲＬＡＮＲＳＳＬＮＩＴＨＲＴＲＲＳＴＳＤＮＮＴＴＨＬＳＳＭＥＳＶＨＮＬＶＹＡＱＬＱＦＴＹＤＴＬＲＧＹＩＮＲＡＬＡＱＩＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＮＳＳＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＬＳＳＩＳＴＶＤＳＭＩＡＬＤＩＤＰＬＥＮＴＤＦＲＶＬＥＬＹＳＱＫＥＬＲＳＳＮＶＦＤＬＥＥＩＭＲＥＦＮＳＹＫＱＲＶＫＹＶＥＤＫＶＶＤＰＬＰＰＹＬＫＧＬＤＤＬＭＳＧＬＧＡＡＧＫＡＶＧＶＡＩＧＡＶＧＧＡＶＡＳＶＶＥＧＶＡＴＦＬＫＮＰＦＧＡＦＴＩＩＬＶＡＩＡＶＶＩＩＴＹＬＩＹＴＲＱＲＲＬＣＴＱＰＬＱＮＬＦＰＹＬＶＳＡＤＧＴＴＶＴＳＧＳＴＫＤＴＳＬＱＡＰＰＳＹＥＥＳＶＹＮＳＧＲＫＧＰＧＰＰＳＳＤＡＳＴＡＡＰＰＹＴＮＥＱＡＹＱＭＬＬＡＬＡＲＬＤＡＥＱＲＡＱＱＮＧＴＤＳＬＤＧＱＴＧＴＱＤＫＧＱＫＰＮＬＬＤＲＬＲＨＲＫＮＧＹＲＨＬＫＤＳＤＥＥＥＮＶ［配列番号１］。
【0077】
ビリオン表面ドメインは、Ｎ結合型糖鎖で装飾された大きな外部ドメインであり、配列番号１に記載の天然全長ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のアミノ酸残基３２～７５０に対応する。ビリオン表面ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２として本明細書に提供される。このドメインのＣ末端は、配列番号１に記載の天然全長ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のアミノ酸６９６～７５０を含む疎水性膜近位領域である。いくつかの好ましい実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドは、全長天然ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質に存在する疎水性膜近位領域の少なくとも一部を含まない。いくつかの好ましい実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドは、全長天然ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質に存在する疎水性膜近位領域を欠く。
【0078】
ビリオン内ドメインは、内部ウイルス成分との相互作用に関与する小さな内部ドメインである。ビリオン内ドメインは、配列番号１に記載の全長天然ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のアミノ酸残基７７２～９０６に対応する。ビリオン内ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３として本明細書に提供される。
【0079】
ビリオン表面ドメインとビリオン内ドメインは、単一の膜スパニングドメイン（すなわち、膜貫通ドメイン）によって連結され、これにより、ｇＢタンパク質が脂質二重層を通して挿入されることが可能になる。膜貫通ドメインは、配列番号１に記載の全長天然ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質のアミノ酸残基７５１～７７１に対応する。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、修飾ｇＢポリペプチド配列は、全長天然ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の膜貫通ドメインの少なくとも一部分を欠く。例えば、修飾ｇＢポリペプチドは、膜貫通ドメインの実質的に全てを欠いていてもよい。
【0080】
このタイプのいくつかの実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドはまた、全長天然ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の疎水性膜近位領域の少なくとも一部分を欠く。例えば、いくつかの実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドは、全長天然ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の疎水性膜近位領域の実質的に全てを欠いていてもよい。
【0081】
全長天然ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質は、配列番号１によって識別される配列のアミノ酸４５７～４６０に対応する位置にフーリン切断部位モチーフを含有する。フーリンプロテアーゼは、ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質を、ジスルフィド結合によって共有結合されたｇｐ９０及びｇｐ５８サブユニットに切断し、成熟したグリコシル化ｇＢタンパク質は、三量体形態を得る。フーリン切断部位モチーフは、プロタンパク質転換酵素であるフーリンによって認識されて切断され、タンパク質前駆体を機能性タンパク質に変換する、アミノ酸の配列パターンである。一般に、天然切断部位モチーフは、４つのアミノ酸パターンＲ４－Ｘ３－［Ｋ／Ｒ］２－Ｒ１＊として記載され、式中、＊は、ペプチドが切断される場所を表す。位置１（Ｒ１）は、正に荷電したアルギニン（Ｒ）残基を必要とする。この位置でのアルギニンの変異は、検出可能なフーリン切断を減少させる。
【0082】
例示的な例として、好適な修飾ｇＢポリペプチドは、上記及び／又は本明細書の他所に記載される天然ヒトｇＢタンパク質に対応する配列を含む。より具体的には、修飾ｇＢポリペプチドは、天然膜貫通ドメインの少なくとも一部分を欠く（例えば、配列番号１に記載の野生型ヒトｇＢポリペプチドのアミノ酸残基７５１～７７１の少なくとも一部分を欠く）。したがって、いくつかの実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドは、（配列番号２に記載されるような）野生型ｇＢビリオン表面ドメインの少なくとも一部分に対応するアミノ酸配列、及び（配列番号３に記載されるような）野生型ｇＢビリオン内ドメインの少なくとも一部分に対応するアミノ酸配列を含む。このタイプのいくつかの実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドは、ビリオン表面ドメインの疎水性膜近位領域の少なくとも一部分（すなわち、配列番号１に記載の全長天然ｇＢタンパク質配列のアミノ酸残基６９６～７５０に対応する）を欠く。好ましくは、修飾ｇＢポリペプチドは、膜貫通ドメイン及び疎水性膜近位領域を欠く。
【0083】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３及び４に記載の配列の一方若しくは両方、又はそのようなポリペプチドの断片と、少なくとも７０％（及び少なくとも７１％～少なくとも９９％、及びその間の全ての整数パーセンテージ）の配列類似性又は配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み得る。より具体的な実施形態において、ポリペプチドは、配列番号３及び４に記載の配列の一方若しくは両方、又はそのようなポリペプチドの断片と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列類似性又は配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み得る。
【0084】
いくつかの実施形態において、天然ビリオン表面ドメインの一部分は、全長天然ビリオン表面ドメインのアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端切断を含む。いくつかの好ましい実施形態において、切断は、天然ビリオン表面ドメインのＣ末端で生じる。例示的な例として、修飾ｇＢポリペプチドは、全長天然ビリオン表面ドメインのアミノ酸残基１～６６９に対応するアミノ酸配列（すなわち、配列番号３に記載のアミノ酸配列）を含み得る。ビリオン表面ドメインの好適な部分の例示的な配列は、配列番号５に同定され、以下に記載される。
ＴＳＳＴＨＮＧＳＨＴＳＲＴＴＳＡＱＴＲＳＶＹＳＱＨＶＴＳＳＥＡＶＳＨＲＡＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮＴＴＫＹＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＩＣＴＳＭＫＰＩＮＥＤＬＤＥＧＩＭＶＶＹＫＲＮＩＶＡＨＴＦＫＶＲＶＹＱＫＶＬＴＦＲＲＳＹＡＹＩＹＴＴＹＬＬＧＳＮＴＥＹＶＡＰＰＭＷＥＩＨＨＩＮＫＦＡＱＣＹＳＳＹＳＲＶＩＧＧＴＶＦＶＡＹＨＲＤＳＹＥＮＫＴＭＱＬＩＰＤＤＹＳＮＴＨＳＴＲＹＶＴＶＫＤＱＷＨＳＲＧＳＴＷＬＹＲＥＴＣＮＬＮＣＭＬＴＩＴＴＡＲＳＫＹＰＹＨＦＦＡＴＳＴＧＤＶＶＹＩＳＰＦＹＮＧＴＮＲＮＡＳＹＦＧＥＮＡＤＫＦＦＩＦＰＮＹＴＩＶＳＤＦＧＲＰＮＡＡＰＥＴＨＲＬＶＡＦＬＥＲＡＤＳＶＩＳＷＤＩＱＤＥＫＮＶＴＣＱＬＴＦＷＥＡＳＥＲＴＩＲＳＥＡＥＤＳＹＨＦＳＳＡＫＭＴＡＴＦＬＳＫＫＱＥＶＮＭＳＤＳＡＬＤＣＶＲＤＥＡＩＮＫＬＱＱＩＦＮＴＳＹＮＱＴＹＥＫＹＧＮＶＳＶＦＥＴＳＧＧＬＶＶＦＷＱＧＩＫＱＫＳＬＶＥＬＥＲＬＡＮＲＳＳＬＮＩＴＨＱＴＴＱＳＴＳＤＮＮＴＴＨＬＳＳＭＥＳＶＨＮＬＶＹＡＱＬＱＦＴＹＤＴＬＲＧＹＩＮＲＡＬＡＱＩＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＮＳＳＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＬＳＳＩＳＴＶＤＳＭＩＡＬＤＩＤＰＬＥＮＴＤＦＲＶＬＥＬＹＳＱＫＥＬＲＳＳＮＶＦＤＬＥＥＩＭＲＥＦＮＳＹＫＱＲＶＫＹＶＥＤＫＶ［配列番号５］。
ＴＳＳＴＨＮＧＳＨＴＳＲＴＴＳＡＱＴＲＳＶＹＳＱＨＶＴＳＳＥＡＶＳＨＲＡＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮＴＴＫＹＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＩＣＴＳＭＫＰＩＮＥＤＬＤＥＧＩＭＶＶＹＫＲＮＩＶＡＨＴＦＫＶＲＶＹＱＫＶＬＴＦＲＲＳＹＡＹＩＹＴＴＹＬＬＧＳＮＴＥＹＶＡＰＰＭＷＥＩＨＨＩＮＫＦＡＱＣＹＳＳＹＳＲＶＩＧＧＴＶＦＶＡＹＨＲＤＳＹＥＮＫＴＭＱＬＩＰＤＤＹＳＮＴＨＳＴＲＹＶＴＶＫＤＱＷＨＳＲＧＳＴＷＬＹＲＥＴＣＮＬＮＣＭＬＴＩＴＴＡＲＳＫＹＰＹＨＦＦＡＴＳＴＧＤＶＶＹＩＳＰＦＹＮＧＴＮＲＮＡＳＹＦＧＥＮＡＤＫＦＦＩＦＰＮＹＴＩＶＳＤＦＧＲＰＮＡＡＰＥＴＨＲＬＶＡＦＬＥＲＡＤＳＶＩＳＷＤＩＱＤＥＫＮＶＴＣＱＬＴＦＷＥＡＳＥＲＴＩＲＳＥＡＥＤＳＹＨＦＳＳＡＫＭＴＡＴＦＬＳＫＫＱＥＶＮＭＳＤＳＡＬＤＣＶＲＤＥＡＩＮＫＬＱＱＩＦＮＴＳＹＮＱＴＹＥＫＹＧＮＶＳＶＦＥＴＳＧＧＬＶＶＦＷＱＧＩＫＱＫＳＬＶＥＬＥＲＬＡＮＲＳＳＬＮＩＴＨＱＴＴＱＳＴＳＤＮＮＴＴＨＬＳＳＭＥＳＶＨＮＬＶＹＡＱＬＱＦＴＹＤＴＬＲＧＹＩＮＲＡＬＡＱＩＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＮＳＳＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＬＳＳＩＳＴＶＤＳＭＩＡＬＤＩＤＰＬＥＮＴＤＦＲＶＬＥＬＹＳＱＫＥＬＲＳＳＮＶＦＤＬＥＥＩＭＲＥＦＮＳＹＫＱＲＶＫＹＶＥＤＫＶ［配列番号５］。
【0085】
同じ実施形態のいくつか及びいくつかの他の実施形態において、天然ビリオン内ドメインの一部分は、全長天然ビリオン内ドメインのアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端切断を含む。いくつかの好ましい実施形態において、切断は、天然ビリオン内ドメインのアミノ酸配列のＮ末端にある。例示的な例として、修飾ｇＢポリペプチドは、全長天然ビリオン内ドメインのアミノ酸残基６～１３０に対応するアミノ酸配列（すなわち、配列番号４に記載のアミノ酸配列）を含み得る。ビリオン内ドメインの好適な部分の例示的な配列は、配列番号６に同定され、以下に記載される。
ＬＣＴＱＰＬＱＮＬＦＰＹＬＶＳＡＤＧＴＴＶＴＳＧＳＴＫＤＴＳＬＱＡＰＰＳＹＥＥＳＶＹＮＳＧＲＫＧＰＧＰＰＳＳＤＡＳＴＡＡＰＰＹＴＮＥＱＡＹＱＭＬＬＡＬＡＲＬＤＡＥＱＲＡＱＱＮＧＴＤＳＬＤＧＱＴＧＴＱＤＫＧＱＫＰＮＬＬＤＲＬＲＨＲＫＮＧＹＲＨＬＫＤＳＤＥＥＥＮＶ［配列番号６］。
ＬＣＴＱＰＬＱＮＬＦＰＹＬＶＳＡＤＧＴＴＶＴＳＧＳＴＫＤＴＳＬＱＡＰＰＳＹＥＥＳＶＹＮＳＧＲＫＧＰＧＰＰＳＳＤＡＳＴＡＡＰＰＹＴＮＥＱＡＹＱＭＬＬＡＬＡＲＬＤＡＥＱＲＡＱＱＮＧＴＤＳＬＤＧＱＴＧＴＱＤＫＧＱＫＰＮＬＬＤＲＬＲＨＲＫＮＧＹＲＨＬＫＤＳＤＥＥＥＮＶ［配列番号６］。
【0086】
例示的な例として、好適な修飾ｇＢポリペプチドアミノ酸配列は、配列番号４に同定され、以下に記載される。
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＳＳＳＴＳＨＡＴＳＳＴＨＮＧＳＨＴＳＲＴＴＳＡＱＴＲＳＶＹＳＱＨＶＴＳＳＥＡＶＳＨＲＡＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮＴＴＫＹＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＩＣＴＳＭＫＰＩＮＥＤＬＤＥＧＩＭＶＶＹＫＲＮＩＶＡＨＴＦＫＶＲＶＹＱＫＶＬＴＦＲＲＳＹＡＹＩＹＴＴＹＬＬＧＳＮＴＥＹＶＡＰＰＭＷＥＩＨＨＩＮＫＦＡＱＣＹＳＳＹＳＲＶＩＧＧＴＶＦＶＡＹＨＲＤＳＹＥＮＫＴＭＱＬＩＰＤＤＹＳＮＴＨＳＴＲＹＶＴＶＫＤＱＷＨＳＲＧＳＴＷＬＹＲＥＴＣＮＬＮＣＭＬＴＩＴＴＡＲＳＫＹＰＹＨＦＦＡＴＳＴＧＤＶＶＹＩＳＰＦＹＮＧＴＮＲＮＡＳＹＦＧＥＮＡＤＫＦＦＩＦＰＮＹＴＩＶＳＤＦＧＲＰＮＡＡＰＥＴＨＲＬＶＡＦＬＥＲＡＤＳＶＩＳＷＤＩＱＤＥＫＮＶＴＣＱＬＴＦＷＥＡＳＥＲＴＩＲＳＥＡＥＤＳＹＨＦＳＳＡＫＭＴＡＴＦＬＳＫＫＱＥＶＮＭＳＤＳＡＬＤＣＶＲＤＥＡＩＮＫＬＱＱＩＦＮＴＳＹＮＱＴＹＥＫＹＧＮＶＳＶＦＥＴＳＧＧＬＶＶＦＷＱＧＩＫＱＫＳＬＶＥＬＥＲＬＡＮＲＳＳＬＮＩＴＨＱＴＴＱＳＴＳＤＮＮＴＴＨＬＳＳＭＥＳＶＨＮＬＶＹＡＱＬＱＦＴＹＤＴＬＲＧＹＩＮＲＡＬＡＱＩＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＮＳＳＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＬＳＳＩＳＴＶＤＳＭＩＡＬＤＩＤＰＬＥＮＴＤＦＲＶＬＥＬＹＳＱＫＥＬＲＳＳＮＶＦＤＬＥＥＩＭＲＥＦＮＳＹＫＱＲＶＫＹＶＥＤＫＶＬＣＴＱＰＬＱＮＬＦＰＹＬＶＳＡＤＧＴＴＶＴＳＧＳＴＫＤＴＳＬＱＡＰＰＳＹＥＥＳＶＹＮＳＧＲＫＧＰＧＰＰＳＳＤＡＳＴＡＡＰＰＹＴＮＥＱＡＹＱＭＬＬＡＬＡＲＬＤＡＥＱＲＡＱＱＮＧＴＤＳＬＤＧＱＴＧＴＱＤＫＧＱＫＰＮＬＬＤＲＬＲＨＲＫＮＧＹＲＨＬＫＤＳＤＥＥＥＮＶ［配列番号４］。
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＳＳＳＴＳＨＡＴＳＳＴＨＮＧＳＨＴＳＲＴＴＳＡＱＴＲＳＶＹＳＱＨＶＴＳＳＥＡＶＳＨＲＡＮＥＴＩＹＮＴＴＬＫＹＧＤＶＶＧＶＮＴＴＫＹＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＩＣＴＳＭＫＰＩＮＥＤＬＤＥＧＩＭＶＶＹＫＲＮＩＶＡＨＴＦＫＶＲＶＹＱＫＶＬＴＦＲＲＳＹＡＹＩＹＴＴＹＬＬＧＳＮＴＥＹＶＡＰＰＭＷＥＩＨＨＩＮＫＦＡＱＣＹＳＳＹＳＲＶＩＧＧＴＶＦＶＡＹＨＲＤＳＹＥＮＫＴＭＱＬＩＰＤＤＹＳＮＴＨＳＴＲＹＶＴＶＫＤＱＷＨＳＲＧＳＴＷＬＹＲＥＴＣＮＬＮＣＭＬＴＩＴＴＡＲＳＫＹＰＹＨＦＦＡＴＳＴＧＤＶＶＹＩＳＰＦＹＮＧＴＮＲＮＡＳＹＦＧＥＮＡＤＫＦＦＩＦＰＮＹＴＩＶＳＤＦＧＲＰＮＡＡＰＥＴＨＲＬＶＡＦＬＥＲＡＤＳＶＩＳＷＤＩＱＤＥＫＮＶＴＣＱＬＴＦＷＥＡＳＥＲＴＩＲＳＥＡＥＤＳＹＨＦＳＳＡＫＭＴＡＴＦＬＳＫＫＱＥＶＮＭＳＤＳＡＬＤＣＶＲＤＥＡＩＮＫＬＱＱＩＦＮＴＳＹＮＱＴＹＥＫＹＧＮＶＳＶＦＥＴＳＧＧＬＶＶＦＷＱＧＩＫＱＫＳＬＶＥＬＥＲＬＡＮＲＳＳＬＮＩＴＨＱＴＴＱＳＴＳＤＮＮＴＴＨＬＳＳＭＥＳＶＨＮＬＶＹＡＱＬＱＦＴＹＤＴＬＲＧＹＩＮＲＡＬＡＱＩＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＮＳＳＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＬＳＳＩＳＴＶＤＳＭＩＡＬＤＩＤＰＬＥＮＴＤＦＲＶＬＥＬＹＳＱＫＥＬＲＳＳＮＶＦＤＬＥＥＩＭＲＥＦＮＳＹＫＱＲＶＫＹＶＥＤＫＶＬＣＴＱＰＬＱＮＬＦＰＹＬＶＳＡＤＧＴＴＶＴＳＧＳＴＫＤＴＳＬＱＡＰＰＳＹＥＥＳＶＹＮＳＧＲＫＧＰＧＰＰＳＳＤＡＳＴＡＡＰＰＹＴＮＥＱＡＹＱＭＬＬＡＬＡＲＬＤＡＥＱＲＡＱＱＮＧＴＤＳＬＤＧＱＴＧＴＱＤＫＧＱＫＰＮＬＬＤＲＬＲＨＲＫＮＧＹＲＨＬＫＤＳＤＥＥＥＮＶ［配列番号４］。
【0087】
本発明に包含されるバリアントタンパク質は、生物学的に活性であり、すなわち、それらは、天然タンパク質の所望の生物学的活性を有し続ける（例えば、ＣＭＶに対する免疫応答を誘発する）。そのようなバリアントは、例えば、遺伝的多型又はヒトの操作に起因し得る。
【0088】
ｇＢポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む様々な方法で変更され得る。そのような操作のための方法は、当該技術分野で一般に既知である。例えば、ｇＢペプチド又はポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡの変異によって調製することができる。変異誘発及びヌクレオチド配列改変のための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８－４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７－３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ”，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）及びそれらの中で引用される参考文献を参照されたい。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。点変異又は切断によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための方法、及び選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための方法は、当該技術分野で既知である。そのような方法は、ｇＢペプチド又はポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって生成される遺伝子ライブラリーの高速スクリーニングに適応可能である。ライブラリー内の機能的変異体の頻度を高める技術である再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）は、ｇＢバリアントを同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる（Ａｒｋｉｎ ａｎｄ Ｙｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７８１１－７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，６：３２７－３３１）を参照されたい）。あるアミノ酸を、類似の特性を有する別のアミノ酸と交換する等の保存的置換が、以下でより詳細に考察されるように、望ましい場合がある。
【0089】
バリアントｇＢポリペプチドは、親（例えば、天然に存在する又は参照）ｇＢタンパク質アミノ酸配列と比較して、それらの配列に沿った様々な位置に保存的アミノ酸置換を含有し得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、一般に以下のように下位分類することができる：
【0090】
酸性：残基は、生理的ｐＨではＨイオンの損失により負電荷を有し、ペプチドが生理的ｐＨの水性媒体中にある場合、残基は、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおいて表面位置を求めるように水溶液に引き付けられる。酸性側鎖を有するアミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられる。
【0091】
塩基性：残基は、生理的ｐＨでは、又はその１若しくは２ｐＨ単位以内（例えば、ヒスチジン）では、Ｈイオンとの会合により正電荷を有し、ペプチドが生理的ｐＨの水性媒体中にある場合、残基は、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおいて表面位置を求めるように水溶液に引き付けられる。塩基性側鎖を有するアミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。
【0092】
荷電：残基は、生理的ｐＨで荷電し、したがって、酸性又は塩基性側鎖を有するアミノ酸（すなわち、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、及びヒスチジン）を含む。
【0093】
疎水性：残基は、生理的ｐＨでは荷電せず、ペプチドが水性媒体中にある場合、残基は、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおいて内部位置を求めるように、水溶液から反発される。疎水性側鎖を有するアミノ酸としては、チロシン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンが挙げられる。
【0094】
中性／極性：残基は、生理的ｐＨでは荷電しないが、ペプチドが水性媒体中にある場合、残基は、それが含有されるペプチドのコンフォメーションにおいて内部位置を求めるように、水溶液からあまり反発されない。中性／極性側鎖を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、システイン、ヒスチジン、セリン及びスレオニンが挙げられる。
【0095】
本明細書はまた、たとえ極性基を欠いていても、それらの側鎖が疎水性を付与するのに十分に大きくないため、ある特定のアミノ酸を「小さい」と特徴付ける。プロリンを除いて、「小さい」アミノ酸は、少なくとも１つの極性基が側鎖上にある場合は４個以下の炭素を有するアミノ酸であり、そうでない場合は３個以下の炭素を有するアミノ酸である。小さい側鎖を有するアミノ酸としては、グリシン、セリン、アラニン、及びスレオニンが挙げられる。遺伝子にコードされた二級アミノ酸プロリンは、ペプチド鎖の二次コンフォメーションに対するその既知の効果のために特別な例である。プロリンの構造は、その側鎖がα－アミノ基の窒素だけでなくα－炭素にも結合しているという点で、他の全ての天然アミノ酸とは異なる。しかしながら、いくつかのアミノ酸類似性マトリックス（例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，（１９７８），Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ Ｉｎ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ，（ｅｄ．）、Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．３４５－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ；及びＧｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（５０６２）：１４４３０－１４４５によって開示される、ＰＡＭ１２０マトリックス及びＰＡＭ２５０マトリックス）は、グリシン、セリン、アラニン及びスレオニンと同じ群にプロリンを含む。したがって、本発明の目的のために、プロリンは「小さい」アミノ酸として分類される。
【0096】
極性又は非極性としての分類に必要な引力又は反発力の程度は任意であり、したがって、本発明によって具体的に企図されるアミノ酸は、どちらか一方として分類されている。具体的に命名されていないほとんどのアミノ酸は、既知の挙動に基づいて分類することができる。
【0097】
アミノ酸残基は、残基の側鎖置換基に関して一目瞭然の分類である、環状又は非環状、及び芳香族又は非芳香族として、並びに小さい又は大きいとして、更に下位分類することができる。残基は、追加の極性置換基が存在する場合には、カルボキシル炭素を含めて合計４個以下の炭素原子、追加の極性置換基が存在しない場合には、３個以下の炭素原子を含有する場合に、小さいとみなされる。小さい残基は、当然ながら、常に非芳香族である。それらの構造特性に依存して、アミノ酸残基は、２つ以上のクラスに属し得る。天然に存在するタンパク質アミノ酸について、このスキームによる下位分類を表３に提示する。
【表3】
【0098】
保存的アミノ酸置換はまた、側鎖に基づくグループ分けも含む。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。例えば、イソロイシン若しくはバリンによるロイシンの置き換え、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置き換え、セリンによるスレオニンの置き換え、又は構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置き換えは、結果として得られるバリアントポリペプチドの特性に大きな影響を及ぼさないと予想するのが妥当である。アミノ酸の変化が機能的ｇＢポリペプチドをもたらすかどうかは、その活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。保存的置換は、表４において、例示的置換及び好ましい置換という見出しの下に示される。本発明の範囲内に属するアミノ酸置換は、一般に、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさ高さ、を維持することに対するそれらの影響に有意な差がない置換を選択することによって達成される。置換が導入された後、バリアントは、生物活性についてスクリーニングされる。
【表4】
【0099】
代替的に、保存的置換を行うための類似のアミノ酸は、側鎖の同一性に基づいて３つのカテゴリーに分類することができる。Ｚｕｂａｙ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｍ：Ｃ．Ｂｒｏｗｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９３）に記載されているように、第１の群は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジンを含み、これらは全て荷電した側鎖を有し；第２の群は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、グルタミン、アスパラギンを含み、第３の群は、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンを含む。
【0100】
したがって、ｇＢポリペプチド内の予測される非必須アミノ酸残基は、典型的には、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えられる。代替的に、変異は、飽和変異誘発等によってｇＢタンパク質遺伝子コード配列の全部又は一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた変異体は、例えば本明細書に記載されるように、親ポリペプチドの活性についてスクリーニングして、その活性を保持する変異体を同定することができる。コード配列の変異誘発後、コードされたポリペプチドを組換え的に発現させ、その活性を決定することができる。「非必須」アミノ酸残基は、その活性のうちの１つ以上を消失又は実質的に変化させることなく、実施形態のペプチド又はポリペプチドの野生型配列から変化させることができる残基である。好適には、変化は、これらの活性のうちの１つを実質的に変化させず、例えば、活性は、野生型の少なくとも２０％、４０％、６０％、７０％、又は８０％である。対照的に、「必須」アミノ酸残基は、参照ｇＢポリペプチドの野生型配列から変化させたときに、野生型活性の２０％未満が存在するように親分子の活性の消失をもたらす残基である。例えば、そのような必須アミノ酸残基は、異なる種にわたってｇＢタンパク質内で保存されているものを含む。
【0101】
したがって、本発明はまた、天然に存在するｇＢポリペプチド配列のバリアント又はそれらの生物学的に活性な断片も、ｇＢポリペプチドとして企図し、バリアントは、１つ以上のアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって天然に存在する配列と区別される。一般に、バリアントは、デフォルトパラメータを使用して本明細書の他所に記載される配列アライメントプログラムによって決定した場合、例えば、配列番号１～３のいずれか１つに記載される、親又は参照ｇＢタンパク質配列に対して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を示すであろう。望ましくは、バリアントは、デフォルトパラメータを使用して本明細書の他所に記載される配列アライメントプログラムによって決定した場合、例えば、配列番号１～３のいずれか１つに記載される、親ｇＢタンパク質配列に対して、少なくとも４０％、４５％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するであろう。バリアントポリペプチドの範囲内に属する野生型ｇＢタンパク質のバリアントは、一般的に、１５、１４、１３、１２、若しくは１１個のアミノ酸残基分だけ、又は好適には、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１個のアミノ酸残基分だけ、野生型分子と異なり得る。いくつかの実施形態において、バリアントポリペプチドは、少なくとも１個、但し、１５．１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個以下のアミノ酸残基分だけ、配列番号１～３のいずれか１つの対応する配列と異なる。他の実施形態において、それは、配列番号１のいずれか１つの対応する配列と、残基の少なくとも１％、但し、残基の２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％又は２％以下だけ異なる。配列比較がアライメントを必要とする場合、配列を、典型的には、最大の類似性又は同一性となるように整列させる。欠失若しくは挿入、又はミスマッチからの「ループ」アウト配列は、一般に差異であるとみなされる。差異は、好適には、以下でより詳細に考察されるように、非必須残基又は保存的置換における差異又は変化である。
【0102】
本発明の修飾ｇＢポリペプチドはまた、修飾側鎖を有するアミノ酸を含むｇＢポリペプチド；ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質合成中の非天然アミノ酸残基及び／又はそれらの誘導体の組み込み；並びに本発明のペプチド、部分及びバリアントにコンフォメーション制約を課す架橋剤及び他の方法の使用も包含する。側鎖修飾の例としては、無水酢酸によるアシル化、無水コハク酸及び無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化、メチルアセトイミデートによるアミド化、シアン酸塩によるアミノ基のカルバモイル化、ピリドキサール－５－リン酸塩によるリジンのピリドキシル化とそれに続くＮａＢＲｔによる還元、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化とそれに続くＮａＢＨ４による還元、及び２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基のトリニトロベンジル化等のアミノ基の修飾が挙げられる。
【0103】
カルボキシル基は、Ｏ－アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミド活性化と、それに続く、例えば、対応するアミドへの、後続の誘導体化によって修飾され得る。
【0104】
アルギニン残基のグアニジン基は、２，３－ブタンジオン、フェニルグリオキサール及びグリオキサール等の試薬との複素環縮合生成物の形成によって修飾され得る。
【0105】
スルフヒドリル基は、システイン酸への過ギ酸酸化；４－クロロメルクリフェニルスルホン酸、４－クロロメルクリ安息香酸、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノール、塩化フェニル水銀、及び他の水銀を使用した水銀誘導体の形成；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸又は他の置換マレイミドとの反応；ヨード酢酸又はヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；並びにアルカリｐＨでのシアン酸によるカルバモイル化等の方法によって修飾され得る。
【0106】
トリプトファン残基は、例えば、２－ヒドロキシ－５－ニトロベンジルブロミド若しくはハロゲン化スルホニルによるインドール環のアルキル化によって、又はＮ－ブロモスクシンイミドによる酸化によって修飾され得る。
【0107】
チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化によって修飾され、３－ニトロチロシン誘導体を形成し得る。
【0108】
ヒスチジン残基のイミダゾール環は、ジエチルピロカーボネートによるＮ－カルボエトキシル化、又はヨード酢酸誘導体によるアルキル化によって修飾され得る。
【0109】
ペプチド合成中に非天然アミノ酸及び誘導体を組み込む例としては、限定されないが、４－アミノ酪酸、６－アミノヘキサン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－５－フェニルペンタン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、ｔ－ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２－チエニルアラニン、及び／又はアミノ酸のＤ－異性体の使用が挙げられる。本発明によって企図される非天然アミノ酸のリストを表５に示す。
【表5】
【0110】
本発明に包含されるバリアントタンパク質は、生物学的に（例えば、免疫学的に）活性であり、すなわち、天然タンパク質の所望の生物活性を有し続ける。そのようなバリアントは、例えば、遺伝的多型又はヒトの操作に起因し得る。
【0111】
２．３異種シグナル配列 本発明の修飾ｇＢポリペプチドは、典型的には、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）で発現したときに分泌される。そのため、いくつかの好ましい実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドは、Ｎ末端に異種シグナルペプチドを含む。宿主細胞からの作動可能に連結されたペプチドの分泌を促進する多くのシグナルペプチドが当該技術分野で既知であり、任意のそのようなシグナル配列は、本発明とともに使用するのに好適であり得る。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、作動可能に連結された免疫原性修飾ｇＢポリペプチドの、小胞体、細胞膜、プロテアソーム、リソソームへの移行を指示するか、又はｇＢの免疫原性部分を特定の細胞型若しくは細胞サブセットに誘導する。
【0112】
いくつかの実施形態において、異種シグナルは、免疫グロブリンシグナル配列、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）シグナル配列、エリスロポエチン（ＥＰＯ）シグナル配列、ＶＰ２２ ＨＳＶ１シグナル配列、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）Ｎ末端ＥＲシグナル、カルレティキュリン（ＣＲＴ）、アデノウイルスＥ３シグナル配列、又は構造タンパク質（例えば、キャプシド（Ｃ）、エンベロープ（Ｅ）、若しくはプレメンブレン（ｐｒＭ）タンパク質）を含むフラビウイルスシグナル配列からなる群から選択される。
【0113】
いくつかの実施形態において、シグナル配列は、コードされた生成物を所望の細胞型又は細胞サブセットに標的化し、修飾ｇＢポリペプチドの作動可能に連結された部分の分泌又は局在化を促進し得る標的配列を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態において、標的配列は、修飾ｇＢポリペプチドの作動可能に連結された部分を免疫細胞に標的化する。いくつかの実施形態において、標的配列は、修飾ｇＢポリペプチドの作動可能に連結された部分を抗原提示細胞に標的化する。いくつかの実施形態において、標的配列は、コードされた生成物を宿主細胞のプロテアソームに標的化する。いくつかの実施形態において、標的配列は、修飾ｇＢポリペプチドの作動可能に連結された部分を宿主細胞のエンドソーム又はリソソームに標的化する。
【0114】
いくつかの実施形態において、異種シグナルペプチドは免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチドである。多くのＩｇシグナルペプチド配列は当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのうちのいずれか１つから選択される免疫グロブリンアイソタイプに由来する。一例では、本明細書に記載の異種シグナルペプチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個のアミノ酸を含み得る。例示的な例として、好ましいシグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７に記載され、以下に記載される１８アミノ酸ＩｇＧ重鎖シグナルペプチドである：
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ［配列番号７］。
ＭＥＦＧＬＳＷＬＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣ［配列番号７］。
【0115】
別の例では、好ましいシグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号８に同定され、以下に記載される１９アミノ酸ＩｇＧ重鎖シグナルペプチドである。
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ［配列番号８］。
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＬＦＲＧＶＱＣ［配列番号８］。
【0116】
いくつかの実施形態において、Ｎ末端シグナルペプチドは、配列番号７に記載の配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【0117】
好適には、組成物は、８０％を超える修飾ｇＢポリペプチドのホモ三量体、８５％を超える修飾ｇＢポリペプチドのホモ三量体、９０％を超える修飾ｇＢポリペプチドのホモ三量体、９５％を超える修飾ｇＢポリペプチドのホモ三量体、９７％を超える修飾ｇＢポリペプチドのホモ三量体、又は９８％を超える修飾ｇＢポリペプチドのホモ三量体を含む。いくつかの実施形態において、調製物は９９％を超える修飾ｇＢポリペプチドのホモ三量体を含む。
【0118】
このタイプのいくつかの実施形態において、組成物は、修飾ｇＢポリペプチドの単量体、及び／又は修飾ｇＢポリペプチドの二量体を実質的に含まない。
【0119】
同じ実施形態のいくつか及びいくつかの他の実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドのホモ三量体は、六量体複合体を形成するように二量体化する。
【0120】
いくつかの好ましい実施形態において、ｇＢポリペプチド複合体は、融合前のアイソフォームである。
【0121】
２．４核酸組成物
本発明はまた、上記及び／又は本明細書の他所に記載される修飾ｇＢタンパク質をコードする核酸組成物も提供する。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号９に記載のヌクレオチド配列、又はその断片、バリアント若しくは誘導体を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
本発明はまた、上記及び／又は本明細書の他所に記載される修飾ｇＢタンパク質をコードする核酸組成物も提供する。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、配列番号９に記載のヌクレオチド配列、又はその断片、バリアント若しくは誘導体を含むか、それからなるか、又はそれから本質的になる。
【0122】
また、単離された核酸の断片及びバリアントも企図される。
【0123】
本発明はまた、単離された核酸のバリアント及び／又は断片も提供する。バリアントは、本発明の単離されたタンパク質をコードする任意のヌクレオチド配列（例えば、配列番号９）と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のヌクレオチド配列同一性を含み得る。
【0124】
断片は、本明細書に開示される任意のヌクレオチド配列に存在する連続したヌクレオチドの最大５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５～９９％を含み得るか、又はそれからなり得る。
【0125】
断片は、本明細書に開示される任意のヌクレオチド配列に存在する最大２０個、５０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個又は６６０個の連続したヌクレオチドを含み得るか、又はそれからなり得る。
【0126】
本発明はまた、例えば、コドン配列の冗長性を利用することによって修飾されている核酸も企図する。より具体的な例では、コドンの使用は、特定の生物又は細胞型における核酸の発現を最適化するように修飾され得る。
【0127】
本発明は、本発明の単離された核酸における修飾プリン（例えば、イノシン、メチルイノシン、及びメチルアデノシン）及び修飾ピリミジン（例えば、チオウリジン及びメチルシトシン）の使用を更に提供する。
【0128】
当業者は、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ ＮＹ，１９９５－２００８）の第２章及び第３章に記載されるもの等の標準プロトコルを使用して、本発明の単離された核酸を好都合に調製することができることを、十分に理解するであろう。
【0129】
更に別の実施形態において、相補的核酸は、高いストリンジェンシー条件下で本発明の核酸にハイブリダイズする。
【0130】
「ハイブリダイズ」及び「ハイブリダイゼーション」は、ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＲＮＡ－ＲＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを産生するための少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列の対形成を示すために本明細書で使用される。相補的ヌクレオチド配列を含むハイブリッド配列は、塩基対形成によって生じる。
【0131】
本明細書で使用される「ストリンジェンシー」は、ハイブリダイゼーション中の温度及びイオン強度条件、並びに特定の有機溶媒及び／又は洗浄剤の存在又は不在を指す。ストリンジェンシーが高いほど、ハイブリダイゼーションするヌクレオチド配列間に必要とされる相補性レベルは高くなる。
【0132】
「ストリンジェント条件」は、相補的塩基の頻度が高い核酸のみがハイブリダイズする条件を示す。
【0133】
ストリンジェントな条件は、参照により本明細書に組み込まれるＡｕｓｕｂｅｌら（上記）の第２．９章及び第２．１０章に記載されているように、当該技術分野で周知である。当業者は、様々な因子がハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために操作され得ることも認識するであろう。最終洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度なハイブリダイゼーションを確実にするのに役立ち得る。
【0134】
相補的ヌクレオチド配列は、ヌクレオチドがマトリックス（好ましくはニトロセルロース等の合成膜）上に固定化されるステップ、ハイブリダイゼーションステップ、及び、典型的には標識されたプローブ又は他の相補的な核酸を使用する検出ステップ、を含むブロッティング技術によって同定され得る。サザンブロット法は、相補的ＤＮＡ配列を同定するために使用され、ノーザンブロット法は、相補的ＲＮＡ配列を同定するために使用される。ドットブロット法及びスロットブロット法を使用して、相補的なＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチド配列を同定することができる。そのような技術は、当業者に周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）の２．９．１～２．９．２０ページに記載されている。そのような方法によれば、サザンブロット法は、ゲル電気泳動によってサイズに応じてＤＮＡ分子を分離し、サイズ分離されたＤＮＡを合成膜に移し、膜結合ＤＮＡを相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることを伴う。代替的なブロッティングステップは、プラーク又はコロニーハイブリダイゼーションのプロセス等を介して、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリー中の相補的核酸を同定するときに使用される。この手順の他の典型的な例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）の第８章～第１２章に記載されている。
【0135】
固定化された核酸にハイブリダイズされた標識核酸を検出するための方法は、当業者に周知である。そのような方法は、オートラジオグラフィー、化学発光、蛍光及び比色検出を含む。
【0136】
核酸はまた、核酸配列増幅技術を使用して、単離され得る、検出され得る、かつ／又は組換えＤＮＡ技術に供され得る。
【0137】
熱的方法及び等温方法の両方を網羅する好適な核酸増幅技術は、当業者に周知であり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ローリングサークル複製（ＲＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｑβレプリカーゼ増幅、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、及びヘリカーゼ依存性増幅を含むが、これらに限定されない。
【0138】
本明細書で使用される場合、「増幅産物」は、核酸増幅によって生成された核酸産物を指す。
【0139】
核酸増幅技術は、当該技術分野で周知であるような、ｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ及び競合ＰＣＲ等の特定の定量的及び半定量的技術を含み得る。
【0140】
なおも更なる態様において、本発明は、前の態様の単離された核酸を含む遺伝子構築物を提供する。
【0141】
特定の実施形態において、遺伝子構築物は、１つ以上の他の遺伝子成分に作動可能に連結又は接続された単離された核酸を含む。遺伝子構築物は、単離された核酸の治療的送達、又は宿主細胞における本発明の単離されたタンパク質の組換え産生に好適であり得る。
【0142】
広義には、遺伝子構築物は、当該技術分野でよく理解されるようなプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、酵母若しくは細菌人工染色体の形態であり得るか、又はそれらの遺伝子成分を含み得る。遺伝子構築物は、本発明の核酸若しくはコードタンパク質の組換えＤＮＡ技術による操作、及び／又は発現のための、細菌又は他の宿主細胞における単離された核酸の維持及び増殖に好適であり得る。
【0143】
宿主細胞発現の目的のために、遺伝子構築物は発現構築物である。好適には、発現構築物は、発現ベクター内の１つ以上の追加の配列に作動可能に連結された本発明の核酸を含む。「発現ベクター」は、プラスミド等の自己複製染色体外ベクター、又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであってもよい。
【0144】
本明細書で使用される「作動可能に接続された」又は「作動可能に連結された」という用語は、遺伝子の転写及び任意選択的に翻訳を制御するプロモーター等の調節ポリヌクレオチドの調節制御下に構造遺伝子を置くことを意味する。例えば、異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築において、遺伝子配列又はプロモーターを、その遺伝子配列又はプロモーターと、遺伝子配列又はプロモーターがその天然の環境において制御する遺伝子（すなわち、遺伝子配列又はプロモーターが由来する遺伝子）との間の距離とほぼ同じである、遺伝子転写開始部位からの距離に配置することが一般的に好ましい。当該技術分野で既知であるように、この距離のいくつかの変動は、機能を失うことなく調整することができる。同様に、その制御下に置かれる異種遺伝子に対する調節配列エレメントの好ましい配置は、該エレメントをその天然の環境（すなわち、それが由来する遺伝子）に配置することによって定義される。
【0145】
調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現に使用される宿主細胞に適しているであろう。様々な宿主細胞について、多数のタイプの適切な発現ベクター及び好適な調節配列が当該技術分野で既知である。
【0146】
典型的には、上記１つ以上の調節ヌクレオチド配列は、限定されないが、プロモーター配列、リーダー配列又はシグナル配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー配列又はアクチベーター配列を含み得る。
【0147】
当該技術分野で既知の構成的、抑制可能又は誘導可能なプロモーターが、本発明によって企図される。
【0148】
発現構築物はまた、組換えタンパク質が融合タンパク質として発現されるように、（典型的には発現ベクターによって提供される）融合パートナーをコードする追加のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【0149】
発現構築物はまた、ａｍｐＲ、ｎｅｏＲ又はｋａｎＲ等の選択マーカーをコードする追加のヌクレオチド配列を含み得るが、これらに限定されない。
【0150】
特定の実施形態において、発現構築物は、プラスミドＤＮＡの形態であってもよく、好適には、動物細胞内で作動可能なプロモーター（例えば、ＣＭＶ、Ａ－クリスタリン又はＳＶ４０プロモーター）を含む。他の実施形態において、核酸は、アデノウイルス、ワクシニア、レンチウイルス又はアデノ随伴ウイルスベクター等のウイルス構築物の形態であってもよい。
【0151】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の核酸分子又は遺伝子構築物で形質転換された宿主細胞に関する。
【0152】
発現に好適な宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。例えば、好適な宿主細胞は、限定されないが、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、Ｃｏｓ、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｊｕｒｋａｔ細胞）、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バキュロウイルス発現系の有無にかかわらず利用される昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａｎｉ）、植物細胞（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）又はＥ．ｃｏｌｉ等の細菌細胞を含み得る。宿主細胞（原核又は真核）への遺伝子構築物の導入は、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ Ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９５－２０１５）、特に第９章及び第１６章に記載されているように、当該技術分野で周知である。
【0153】
本発明の関連する態様は、（ｉ）前の態様の宿主細胞を培養するステップと、（ｉｉ）ステップ（ｉ）で培養した上記宿主細胞から上記単離されたタンパク質を単離するステップと、を含む、本明細書に記載の単離されたタンパク質を生成する方法を提供する。
【0154】
この点において、組換えタンパク質は、本明細書において上記に提供したもの等の標準プロトコルを使用して、当業者によって好都合に調製され得る。
【0155】
３．医薬組成物 本発明の修飾ｇＢポリペプチドは、ＣＭＶ感染の治療的治療及び／又は予防のための活性成分として使用することができる。これらの治療薬及び／又は予防薬は、単独で、又は医薬的に許容される担体、希釈剤、及び／若しくはアジュバントと混合された組成物として、対象に投与することができる。
【0156】
治療及び／又は予防のための組成物は、治療されている特定の状態に応じて、全身的又は局所的に製剤化及び投与され得る。製剤化及び投与のための技術は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．の最新版に見出すことができる。好適な経路としては、例えば、皮内注射が挙げられ得る。注射のために、本発明の治療薬は、水溶液中に、好ましくは、Ｆｌａｎｋｓ溶液、リンゲル溶液、又は生理学的生理食塩水緩衝液等の生理学的に適合する緩衝液中に製剤化され得る。経粘膜投与のために、浸透させるバリアに適切な浸透剤を製剤に使用する。そのような浸透剤は、当該技術分野で一般に既知である。筋肉内及び皮下注射は、例えば、免疫原性組成物、ワクチン、及びＤＮＡワクチンの投与に適切である。いくつかの特定の実施形態において、医薬組成物は、皮内投与のために製剤化される。
【0157】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知の医薬的に許容される担体を使用して、投与に好適な投与量で容易に製剤化することができる。そのような担体は、治療される対象への投与のために、本発明の化合物を錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等の剤形に製剤化することを可能にする。例えば、経口摂取のために製剤化された医薬組成物は、例えば、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸緩衝溶液、乳化剤、等張生理食塩水、及びパイロジェン不含水から選択される好適な担体を含有する。
【0158】
本発明で使用するのに好適な医薬組成物は、活性成分がその意図される目的を達成するための有効量で含有される組成物を含む。患者に投与される薬剤の用量は、経時的に患者において有益な応答、例えば、その状態に関連する症状の軽減を誘発するのに十分であるべきである。投与される治療薬／予防薬の量は、年齢、性別、体重、及び一般的な健康状態を含む、治療される対象に依存し得る。この点において、投与のための治療薬／予防薬の正確な量は、医師の判断に依存する。状態の治療又は予防において投与される薬剤の有効量を決定する際に、医師は、ポリペプチド抗原の組織レベル、及び疾患又は状態の進行を評価する場合がある。いずれの場合でも、当業者は、本発明の治療薬及び／又は予防薬の好適な投与量を容易に決定することができる。
【0159】
非経口投与のための医薬製剤としては、水溶性形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。加えて、活性化合物の懸濁液を、適切な油性注入懸濁液として調製してもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランを含有し得る。任意選択的に、懸濁液はまた、高濃縮溶液の調製を可能にするように化合物の溶解度を増加させる、好適な安定剤又は薬剤を含有してもよい。
【0160】
経口使用のための医薬品は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせ、任意選択的に得られた混合物を粉砕し、所望に応じて好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理して、錠剤又は糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖等の充填剤；例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等のセルロース調製物である。所望に応じて、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）等の崩壊剤を添加してもよい。そのような組成物は、薬学の方法のいずれかによって調製され得るが、全ての方法は、上記のような１つ以上の治療薬を、１つ以上の必要な成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、本発明の医薬組成物は、それ自体が既知である様式で、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、捕捉又は凍結乾燥プロセスによって製造され得る。
【0161】
本発明の治療薬の剤形はまた、この目的のために特別に設計された制御放出デバイス、又はこの様式で更に作用するように改変された他の形態のインプラントを、注入するか又は埋め込むことを含み得る。本発明の薬剤の制御放出は、例えば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸及びポリグリコール酸、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース等の特定のセルロース誘導体を含む疎水性ポリマーでコーティングすることによって達成され得る。加えて、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソーム、及び／又は微粒子を使用することによって達成され得る。
【0162】
本発明の治療薬は、医薬的に適合する対イオンを有する塩として提供されてもよい。医薬的に適合する塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含むがこれらに限定されない多くの酸と形成され得る。塩は、対応する遊離塩基形態である水性又は他のプロトン性溶媒中でより可溶性である傾向がある。
【0163】
上記から、本発明の薬剤は、治療的又は予防的な免疫刺激組成物及び／又はワクチンとして使用され得ることを理解されたい。したがって、本発明は、本発明の治療薬／予防薬のうちの１つ以上を活性化合物として含有する免疫刺激組成物の生成に及ぶ。そのようなワクチンを生成するための任意の好適な手順が企図される。例示的な手順としては、例えば、ＮＥＷ ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ（１９９７，Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）が挙げられる。
【0164】
好適には、本発明の修飾ｇＢポリペプチドとエクスビボで接触させた抗原提示細胞、並びにこれらの抗原提示細胞で生成された抗原特異的Ｔリンパ球を、予防的又は治療的用途のための免疫刺激組成物中の活性化合物として使用することができる。プライミングされた細胞は、好ましくは成熟樹状細胞であり、免疫応答を同系対象（すなわち、ヒト）に誘発する任意の方法によって、修飾ポリペプチドとともに注入することができる。好ましくは、抗原提示細胞は、起源となった組織／細胞が得られたのと同じ対象に注射して戻される。注射部位は、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、又は静脈内であり得る。治療を必要とする対象に注射して戻される抗原でプライミングされた抗原提示細胞の数は、とりわけ、個体の抗原及びサイズに応じて変化し得る。この数は、例えば、約１０４～１０８の範囲であり得、より好ましくは、約１０６～１０７の抗原でプライミングされた抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の範囲であり得る。抗原提示細胞は、細胞及び個体に無毒性である医薬的に許容される担体中で投与されるべきである。そのような担体は、抗原提示細胞を増殖させた増殖培地、又はリン酸緩衝食塩水等の任意の好適な緩衝培地であってもよい。
【0165】
一実施形態において、抗原でプライミングされた本発明の抗原提示細胞はまた、正常な免疫応答を発現することができない免疫抑制個体への養子移入のために、多数のＣＤ４＋ＣＴＬを生成するために使用することもできる。例えば、抗原特異的ＣＤ４＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、ＣＭＶ感染症に罹患している対象において、治療目的で養子移入され得る。
【0166】
免疫の有効性は、任意の好適な技術を使用して評価することができる。例えば、５１Ｃｒ標識標的細胞を使用した、ペプチドコーティングされた細胞又は組換えウイルス感染細胞上で刺激された脾細胞又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用するＣＴＬ溶解アッセイが用いられ得る。そのようなアッセイは、例えば、任意の哺乳動物細胞を使用して行うことができる（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（９）：４９６８－４９７８；ａｌｓｏ Ｗｏｏｄｂｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．（下記））。代替的に、免疫の有効性は、新鮮であり、かつ刺激されたＰＢＭＣのＨＬＡクラスＩ四量体染色（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照）、増殖アッセイ（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（上記参））、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ及び細胞内サイトカイン染色（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（上記））、線形Ｂ細胞応答を検出するためのＥＬＩＳＡアッセイ、並びに合成ポリヌクレオチドを発現する細胞試料のウェスタンブロットを含むがこれらに限定されない、１つ以上の技術を使用して監視され得る。特に関連するのは、抗原によって活性化されるＴ細胞のサイトカインプロファイルであり、より具体的には、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、及びＴＮＦの産生及び分泌である。
【0167】
本発明の組成物は、好適には医薬組成物である。医薬組成物は、しばしば１つ以上の「医薬的に許容される担体」を含む。これらは、それ自体が、組成物を受け取る個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体を含む。好適な担体は、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び脂質凝集体（油滴又はリポソーム等）等の、大きい、ゆっくりと代謝される巨大分子である。そのような担体は、当業者に周知である。組成物は、水、食塩水、グリセロール等の希釈剤を含有してもよい。加えて、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質等の補助物質が存在し得る。医薬的に許容される成分の徹底的な考察は、Ｇｅｎｎａｒｏ （２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ ｅｄ、、ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２において入手可能である。
【0168】
医薬組成物は、例えば、２００２年２月１４日に公開された米国特許出願公開第２００２／００１９３５８号に開示されている様々な塩、賦形剤、送達ビヒクル、及び／又は補助剤を含み得る。
【0169】
本発明による免疫刺激組成物は、水、リン酸緩衝食塩水及び生理食塩水等の生理学的に許容される希釈剤又は賦形剤を含有することができる。それらはまた、当該技術分野で周知であるようなアジュバントを含んでもよい。好適なアジュバントとしては、限定されないが、オリゴヌクレオチドアジュバント、表面活性物質、例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ－ジコクタデシル－Ｎ’，Ｎ’ビス（２－ヒドロキシエチル－プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、及びＰｌｕｒｏｎｉｃポリオール；ポリアミン、例えば、ピラン、デキストラン硫酸、ポリＩＣ Ｃａｒｂｏｐｏｌ；ペプチド、例えば、ムラミルジペプチド及び誘導体、ジメチルグリシン、タフトシン；油エマルション；並びに鉱物ゲル、例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム又はミョウバン；リンホカイン、ＱｕｉｌＡ及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）が挙げられる。
【0170】
組成物中のアジュバントは、１つ以上のＴＬＲアゴニストを好適に含む。
【0171】
本明細書で使用される「ＴＬＲアゴニスト」という用語は、直接的にリガンドとして、又は内因性若しくは外因性リガンドの生成によって間接的に、ＴＬＲシグナル伝達経路を介してシグナル伝達応答を引き起こすことができる分子を指す。ＴＬＲ受容体のアゴニストリガンドは、ＴＬＲ受容体の天然リガンドであり得るか、又はＴＬＲ受容体に結合して、その中で共刺激シグナルを誘導する能力を保持する、その機能的に等価なバリアントであり得る。ＴＬＲアゴニストはまた、ＴＬＲ受容体に対するアゴニスト抗体であり得るか、又はＴＬＲ受容体、より具体的には、上記受容体の細胞外ドメインに特異的に結合し、この受容体及び関連するタンパク質によって制御される免疫シグナルのうちのいくつかを誘導することができる、その機能的に等価なバリアントであり得る。結合の特異性は、ヒトＴＬＲ受容体について、又は異なる種のヒト相同ＴＬＲ受容体についてであり得る。
【0172】
特定の実施形態において、１つ以上のＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ４アゴニスト及び／又はＴＬＲ９アゴニストを含む。より具体的には、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ９アゴニストであるか、又はＴＬＲ９アゴニストを含む。
【0173】
例示的なＴＬＲ４アゴニストは、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）又はＬＰＳの誘導体若しくは成分である。これらには、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｍｉｎｎｅｓｏｔａに由来するモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（登録商標））、並びにアミノアルキルグルコサミニドリン酸塩（ＡＧＰ）及びリン酸化ヘキサアシル二糖（ＰＨＡＤ）とその誘導体（例えば、３Ｄ－ＰＨＡＤ、３Ｄ（６－アシル）－ＰＨＡＤ）等の合成ＴＬＲ４アゴニストが挙げられる。好ましいＴＬＲ４アゴニストは、ＭＰＬである。
【0174】
ＴＬＲ９は、微生物ＤＮＡを哺乳動物ＤＮＡから区別する特異的非メチル化ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）配列を認識する。ＣｐＧ ＯＤＮオリゴヌクレオチドは、特定の配列文脈（ＣｐＧモチーフ）に非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含有する。これらのＣｐＧモチーフは、哺乳動物ＤＮＡと比較して、細菌ＤＮＡにおいて２０倍高い頻度で存在する。Ａ型、Ｂ型、Ｃ型の３タイプの刺激性ＯＤＮが記載されている。
【0175】
ＴＬＲ９アゴニストの非限定的な例としては、ＣｐＧ ＯＤＮ１０１８、ＣｐＧ ＯＤＮ２００６、ＣｐＧ ＯＤＮ２２１６、ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６及びＣｐＧ ＯＤＮ２３３６が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧ ＯＤＮ１０１８及び／又はＣｐＧ ＯＤＮ２００６であるか、又はそれを含む。１つの好ましい実施形態において、ＴＬＲ９アゴニストは、ＣｐＧ ＯＤＮ１０１８である。また、両親媒性ワクチンアジュバント、例えば、両親媒性ＣｐＧアジュバント（例えば、両親媒性ＣｐＧ１０１８）も想定される。
【0176】
特定の実施形態において、ＴＬＲアゴニストは、ＭＰＬ、ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６、ＣｐＧ ＯＤＮ２００６、ＣｐＧ ＯＤＮ２２１６及び／又はＣｐＧ ＯＤＮ２３３６ではない。
【0177】
好適には、医薬組成物は、医薬的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を更に含む。
【0178】
本発明の特定の組成物は、ポリヌクレオチドの前、後、又はそれと同時に１つ以上のアジュバントを更に含むことができる。「アジュバント」という用語は、（１）特定の抗原に対する免疫応答を変化若しくは増加させる能力、又は（２）薬物の効果を増加若しくは補助する能力を有する任意の材料を指す。ポリヌクレオチドワクチンに関して、「アジュバント」は、トランスフェクション促進物質であり得ることに留意されたい。同様に、上記の特定の「トランスフェクション促進物質」は、「アジュバント」でもあり得る。アジュバントは、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物とともに使用することができる。プライムブーストレジメンにおいて、本明細書に記載されるように、アジュバントは、プライミング免疫、ブースター免疫のいずれか、又はその両方とともに使用することができる。好適なアジュバントとしては、限定されないが、サイトカイン及び成長因子；細菌成分（例えば、特定のスーパー抗原中の内毒素、外毒素、及び細胞壁成分）；アルミニウムベースの塩；カルシウムベースの塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質、ウイルス及びウイルス由来物質、毒素、毒、イミダゾキニリン化合物、ポロキサマー、並びに陽イオン性脂質が挙げられる。
【0179】
多種多様な物質が、多様な機序を通じてアジュバント活性を有することが示されている。ポリペプチドの発現、抗原性又は免疫原性を増加させ得る任意の化合物は、潜在的なアジュバントである。本発明は、潜在的なアジュバントに対する改善された免疫応答をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明に従って免疫応答を増強する能力についてスクリーニングされ得る潜在的なアジュバントとしては、限定されないが、以下が挙げられる：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、不活性担体、例えば、ミョウバン、ベントナイト、ラテックス、及びアクリル粒子；ＰＬＵＲＯＮＩＣブロックポリマー、例えば、ＴＩＴＥＲＭＡＸ（ブロックコポリマーＣＲＬ－８９４１、スクアレン（代謝性油）、及び微粒子シリカ安定剤）；デポー型、例えばフロイントアジュバント、界面活性物質、例えば、サポニン、リゾレシチン、レチナール、Ｑｕｉｌ Ａ、リポソーム、及びＰＬＵＲＯＮＩＣポリマー製剤；マクロファージ刺激剤、例えば細菌性リポ多糖類；代替経路補体活性化因子、例えば、インシュリン、ザイモサン、内毒素、及びレバミゾール；並びに非イオン性界面活性剤、例えば、ポロキサマー、ポリ（オキシエチレン）－ポリ（オキシプロピレン）トリ－ブロックコポリマー。上記のようなトランスフェクション促進物質も、アジュバントとして含まれる。
【0180】
Ｍｏｎｔａｎｉｄｅアジュバントは、精製スクアレン及びスクアレンに基づいており、高度に精製されたモノオレイン酸マンニドで乳化されている。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅには、ＩＳＡ ５０Ｖ、５１、２０６、及び７２０を含むいくつかのタイプがある。ＩＳＡ ５０Ｖ、５１及び７２０は、油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルションであり、ＩＳＡ ２０６は、水中Ｗ／Ｏエマルションである。ＭｏｎｔａｎｉｄｅＩＳＡ ＩＳＡ５１及び７２０のエマルションは、モノオレイン酸マンニド乳化剤とともに代謝可能なスクアレン系油から構成される。
【0181】
本発明に従って免疫応答を増強する能力についてスクリーニングされ得るポロキサマーとしては、限定されないが、酸化プロピレンと酸化エチレンのブロックコポリマーであり、酸化プロピレンブロックが２つの酸化エチレンブロックに挟まれた、ＰＬＵＲＯＮＩＣ界面活性剤等の市販のポロキサマーが挙げられる。ＰＬＵＲＯＮＩＣ界面活性剤の例としては、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ１２１ポロキサマー（平均分子量：４４００、疎水性物質の概算分子量：３６００、親水性物質の概算重量％：１０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ１０１ポロキサマー（平均分子量：３８００、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：１０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ８１ポロキサマー（平均分子量：２７５０、疎水性物質の概算分子量：２４００、親水性物質の概算重量％：１０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ６１ポロキサマー（平均分子量：２０００；疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：１０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ３１ポロキサマー（平均分子量：１１００；疎水性物質の概算分子量：９００、親水性物質の概算重量％：１０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ１２２ポロキサマー（平均分子量：５０００；疎水性物質の概算分子量：３６００、親水性物質の概算重量％：２０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ９２ポロキサマー（平均分子量：３６５０、疎水性物質の概算分子量：２７００、親水性物質の概算重量％：２０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ７２ポロキサマー（平均分子量：２７５０、疎水性物質の概算分子量：２１００、親水性物質の概算重量％：２０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ６２ポロキサマー（平均分子量：２５００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：２０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ４２ポロキサマー（平均分子量：１６３０、疎水性物質の概算分子量：１２００、親水性物質の概算重量％：２０％）、
【0182】
ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ６３ポロキサマー（平均分子量：２６５０、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：３０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ４３ポロキサマー（平均分子量：１８５０、疎水性物質の概算分子量：１２００、親水性物質の概算重量％：３０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ６４ポロキサマー（平均分子量：２９００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：４０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ４４ポロキサマー（平均分子量：２２００、疎水性物質の概算分子量：１２００、親水性物質の概算重量％：４０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｌ３５ポロキサマー（平均分子量：１９００、疎水性物質の概算分子量：９００、親水性物質の概算重量％：５０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１２３ポロキサマー（平均分子量：５７５０、疎水性物質の概算分子量：３６００、親水性物質の概算重量％：３０％、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０３ポロキサマー（平均分子量：４９５０、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：３０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０４ポロキサマー（平均分子量：５９００、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：４０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ８４ポロキサマー（平均分子量：４２００、疎水性物質の概算分子量：２４００、親水性物質の概算重量％：４０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ１０５ポロキサマー（平均分子量：６５００、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：５０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ８５ポロキサマー（平均分子量：４６００、疎水性物質の概算分子量：２４００、親水性物質の概算重量％：５０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ７５ポロキサマー（平均分子量：４１５０、疎水性物質の概算分子量：２１００、親水性物質の概算重量％：５０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｐ６５ポロキサマー（平均分子量：３４００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：５０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ１２７ポロキサマー（平均分子量：１２６００、疎水性物質の概算分子量：３６００、親水性物質の概算重量％：７０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ９８ポロキサマー（平均分子量：１３０００、疎水性物質の概算分子量：２７００、親水性物質の概算重量％：８０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ８７ポロキサマー（平均分子量：７７００、疎水性物質の概算分子量：２４００、親水性物質の概算重量％：７０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ７７ポロキサマー（平均分子量：６６００、疎水性物質の概算分子量：２１００、親水性物質の概算重量％：７０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ１０８ポロキサマー（平均分子量：１４６００、疎水性物質の概算分子量：３０００、親水性物質の概算重量％：８０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ９８ポロキサマー（平均分子量：１３０００、疎水性物質の概算分子量：２７００、親水性物質の概算重量％：８０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ８８ポロキサマー（平均分子量：１１４００、疎水性物質の概算分子量：２４００、親水性物質の概算重量％：８０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ６８ポロキサマー（平均分子量：８４００、疎水性物質の概算分子量：１８００、親水性物質の概算重量％：８０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｆ３８ポロキサマー（平均分子量：４７００、疎水性物質の概算分子量：９００、親水性物質の概算重量％：８０％）が挙げられる。
【0183】
本発明に従って免疫応答を増強する能力についてスクリーニングされ得る逆ポロキサマーとしては、限定されないがＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ ３１ Ｒ１リバースポロキサマー（平均分子量：３２５０、疎水性物質の概算分子量：３１００、親水性物質の概算重量％：１０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ２５Ｒ１リバースポロキサマー（平均分子量：２７００、疎水性物質の概算分子量：２５００、親水性物質の概算重量％：１０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ １７Ｒ１リバースポロキサマー（平均分子量：１９００、疎水性物質の概算分子量：１７００、親水性物質の概算重量％：１０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ ３１ Ｒ２リバースポロキサマー（平均分子量：３３００、疎水性物質の概算分子量：３１００、親水性物質の概算重量％：２０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ ２５Ｒ２リバースポロキサマー（平均分子量：３１００、疎水性物質の概算分子量：２５００、親水性物質の概算重量％：２０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ １７Ｒ２リバースポロキサマー（平均分子量：２１５０、疎水性物質の概算分子量：１７００、親水性物質の概算重量％：２０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ １２Ｒ３リバースポロキサマー（平均分子量：１８００、疎水性物質の概算分子量：１２００、親水性物質の概算重量％：３０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ ３１ Ｒ４リバースポロキサマー（平均分子量：４１５０、疎水性物質の概算分子量：３１００、親水性物質の概算重量％：４０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ ２５Ｒ４リバースポロキサマー（平均分子量：３６００、疎水性物質の概算分子量：２５００、親水性物質の概算重量％：４０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ ２２Ｒ４リバースポロキサマー（平均分子量：３３５０、疎水性物質の概算分子量：２２００、親水性物質の概算重量％：４０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ１７Ｒ４リバースポロキサマー（平均分子量：３６５０、疎水性物質の概算分子量：１７００、親水性物質の概算重量％：４０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ ２５Ｒ５リバースポロキサマー（平均分子量：４３２０、疎水性物質の概算分子量：２５００、親水性物質の概算重量％：５０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ１０Ｒ５リバースポロキサマー（平均分子量：１９５０、疎水性物質の概算分子量：１０００、親水性物質の概算重量％：５０％、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ ２５Ｒ８リバースポロキサマー（平均分子量：８５５０、疎水性物質の概算分子量：２５００、親水性物質の概算重量％：８０％）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ １７Ｒ８リバースポロキサマー（平均分子量：７０００、疎水性物質の概算分子量：１７００、親水性物質の概算重量％：８０％）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣ Ｒ １０Ｒ８リバースポロキサマー（平均分子量：４５５０、疎水性物質の概算分子量：１０００、親水性物質の概算重量％：８０％）が挙げられる。
【0184】
本発明に従って免疫応答を増強する能力についてスクリーニングされ得る他の市販のポロキサマーとしては、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ Ｌ１２１（平均分子量：４４００）、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ Ｌ１２２（平均分子量：５０００）、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ Ｐ１０４（平均分子量：５８５０）、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ Ｐ１０５（平均分子量：６５００）、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ Ｐ１２３（平均分子量：５７５０）、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ Ｐ８５（平均分子量：４６００）及びＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ Ｐ９４（平均分子量：４６００）等のポリエチレン及びポリプロピレングリコールのブロックコポリマーである化合物が挙げられ、式中、Ｌは、界面活性剤が液体であることを示し、Ｐは、それらがペーストであることを示し、最初の桁は、界面活性剤のポリプロピレン部分の分子量の尺度であり、数の最後の桁に１０を乗じると界面活性剤の酸化エチレン含有率が得られる。化合物は、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ ＮＰ１０（ノニルフェノールエトキシ化界面活性剤－１０％溶液）、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ ＮＰ３０（３０モルの酸化エチレンを含む１モルのノニルフェノールの縮合物）、及びＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ ＮＰ５（５．５モルの酸化ナフタレンを含む１モルのノニルフェノールの縮合物）等のノニルフェニルポリエチレングリコールである。
【0185】
本発明に従って免疫応答を増強する能力についてスクリーニングされ得る他のポロキサマーは以下を含む：（ａ）Ａ型セグメント及びＢ型セグメントを含むポリエーテルブロックコポリマー。Ａ型セグメントは、比較的親水性の特徴の線形ポリマーセグメントを含み、その繰り返し単位は、約－０．４以下の平均Ｈａｎｓｃｈ－Ｌｅｏ断片定数に寄与し、約３０～約５００の分子量寄与を有する。Ｂ型セグメントは、比較的疎水性の特徴の線形ポリマーセグメントを含み、その繰り返し単位は、約－０．４以上の平均Ｈａｎｓｃｈ－Ｌｅｏ断片定数に寄与し、約３０～約５００の分子量寄与を有する。ポリマーセグメントの各々についての繰り返し単位を連結している結合の少なくとも約８０％がエーテル結合を含む。（ｂ）ポリエーテルセグメント及びポリカチオンセグメントを有するブロックコポリマー。ポリエーテルセグメントは少なくともＡ型ブロックを含み、ポリカチオンセグメントは複数のカチオン性繰り返し単位を含む。（ｃ）ポリマー、ポリエーテルセグメント、及び式－ＮＨ－Ｒ０の複数のカチオン性繰り返し単位を含むポリカチオン性セグメントを含むポリエーテル－ポリカチオンコポリマー。Ｒ０は、置換され得る２～６個の炭素原子の直鎖脂肪族基であり、上記ポリエーテルセグメントは、Ａ型又はＢ型セグメントのうちの少なくとも１つを含む。米国特許第５，６５６，６１１号を参照のこと。対象となる他のポロキサマーとしては、ＣＲＬ１００５（１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）、ＣＲＬ８３００（１１ｋＤａ、５％ＰＯＥ）、ＣＲＬ２６９０（１２ｋＤａ、１０％ＰＯＥ）、ＣＲＬ４５０５（１５ｋＤａ、５％ＰＯＥ）、及びＣＲＬ１４１５（９ｋＤａ、１０％ＰＯＥ）が挙げられる。
【0186】
本発明に従って免疫応答を増強する能力についてスクリーニングされ得る他の補助剤としては、限定されないが、以下が挙げられる：アカシア（アラビアゴム）；ポロキシエチレンエーテルＲ－Ｏ－（Ｃ２Ｈ４０）ｘ－Ｈ（ＢＲＩＪ）、例えば、ポリエチレングリコールドデシルエーテル（ＢＲＩＪ ３５、ｘ＝２３）、ポリエチレングリコールドデシルエーテル（ＢＲＩＪ ３０、ｘ＝４）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ＢＲＩＪ ５２ｘ＝２）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ＢＲＩＪ ５６、ｘ＝１０）、ポリエチレングリコールヘキサデシルエーテル（ＢＲＩＪ ５８Ｐ、ｘ＝２０）、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル（ＢＲＩＪ ７２、ｘ＝２）、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル（ＢＲＩＪ ７６、ｘ＝１０）、ポリエチレングリコールオクタデシルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標）７８Ｐ、ｘ＝２０）、ポリエチレングリコールオレイルエーテル（ＢＲＩＪ ９２Ｖ、ｘ＝２）、及びポリオキシル１０オレイルエーテル（ＢＲＩＪ ９７、ｘ＝１０）；ポリ－Ｄ－グルコサミン（キトサン）；クロロブタノール；コレステロール；ジエタノールアミン；ジギトニン；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；モノステアリン酸グリセリル；ラノリンアルコール；モノグリセリド及びジグリセリド；モノエタノールアミン；ノニルフェノールポリオキシエチレンエーテル（ＮＰ－４０）；オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ａｍｒｅｓｃｏ製ＮＯＮＩＤＥＴ ＮＰ－４０）；エチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ，ｎ＝ｌ１（Ｒｏｃｈｅ製ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ４０）；約９個の酸化エチレン単位を有するオクチルフェノール酸化エチレン縮合物（ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ４０）；ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ ６３０（（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール；ＮＯＮＩＤＥＴ ＮＰ－４０と構造的に同じ）；オレイン酸；オレイルアルコール；ポリエチレングリコール８０００；ポリオキシル２０セトステアリルエーテル；ポリオキシル３５ヒマシ油；ポリオキシル４０水素化ヒマシ油；ステアリン酸ポリオキシル４０；モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート２０、又はＴＷＥＥＮ－２０；モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（ポリソルベート８０、又はＴＷＥＥＮ－８０）；プロピレングリコールジアセテート；プロピレングリコールモノステアレート；硫酸プロタミン；タンパク質分解酵素；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；モノラウリン酸ナトリウム；ステアリン酸ナトリウム；ソルビタン誘導体（ＳＰＡＮ）、例えばモノパルミチン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ ４０）、モノステアリン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ ６０）、トリステアリン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ ６５）、モノオレイン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ ８０）、及びトリオレイン酸ソルビタン（ＳＰＡＮ ８５）；２，６，１０，１５，１９，２３－ヘキサメチル－２，６，１０，１４，１８，２２－テトラコサ－ヘキサエン（スクアレン）；スタキオース；ステアリン酸；スクロース；サーファクチン（枯草菌由来のリポペプチド抗生物質）；ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）９（ＴＨＥＳＩＴ）ＭＷ ５８２．９；約９～１０個の酸化エチレン単位を有するオクチルフェノール酸化エチレン縮合物（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００）；約７～８個の酸化エチレン単位を有するオクチルフェノール酸化エチレン縮合物（ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１ １４）；Ｔｒｉｓ（２）－ヒドロキシエチル）アミン（トロラミン）、及び乳化ワックス。
【0187】
ある特定のアジュバント組成物において、アジュバントはサイトカインである。本発明の組成物は、１つ以上のサイトカイン、ケモカイン、若しくはサイトカイン及びケモカインの産生を誘導する化合物、又は１つ以上のサイトカイン、ケモカイン、若しくはサイトカイン及びケモカインの産生を誘導する化合物をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。例としては、限定されないが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン４（ＩＬ－４）、インターロイキン５（ＩＬ－５）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、インターロイキン８（ＩＬ－８）、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン１８（ＩＬ－１８）、インターフェロンα（ＩＦＮ－α）、インターフェロンβ（ＩＦＮ－β）、インターフェロンγ（ＩＦＮ－ｙ）、インターフェロンω（ＩＦＮω）、インターフェロンτ（ＩＦＮ－Ｔ）、インターフェロンγ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化されると調節され、正常なＴ細胞を発現し、分泌されると推定される）、マクロファージ炎症性タンパク質（例えば、ＭＩＰ－１α及びＭＩＰ－１β）、リーシュマニア伸長開始因子（ＬＥＩＦ）、及びＦｌｔ－３リガンドが挙げられる。
【0188】
本発明の特定の組成物において、ポリヌクレオチド構築物は、（±）－Ｎ－（３－アミノプロピル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ビス（シン－９－テトラデセニルオキシ）－１－プロパナミニウムブロミド（ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ）を含むアジュバント組成物と複合体化され得る。組成物はまた、１つ以上の共脂質、例えば、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）、及び／又は１，２－ジミリストイル－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）も含み得る。１：１のモル比でＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ及びＤＰｙＰＥを含むアジュバント組成物は、本明細書において、ＶＡＸＦＥＣＴＩＮアジュバントと称される。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／５７９１７号を参照されたい。
【0189】
他の実施形態において、ポリヌクレオチド自体は、本発明のポリヌクレオチドの全体又は一部が、細菌ＤＮＡに由来する場合のように、アジュバントとして機能し得る。非メチル化ＣｐＧ－ジヌクレオチド（ＣｐＧ－ＤＮＡ）のモチーフを含有する細菌ＤＮＡは、パターン認識受容体（ＴＬＲ９等のｔｏｌｌ受容体を含む）を介して脊椎動物における自然免疫細胞を誘発し、したがって、マクロファージ、樹状細胞、及びＢリンパ球に対して強力な免疫刺激効果を有する。例えば、Ｗａｇｎｅｒ，Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：６２－６９（２００２）；Ｊｕｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：２３６８－７３（２００２）を参照されたい。また、Ｋｌｉｎｍａｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：２８７９－８３（１９９６）も参照されたい。非メチル化ＣｐＧ－ジヌクレオチドをアジュバントとして使用する方法は、例えば、米国特許第６，２０７，６４６号、同第６，４０６，７０５号、及び同第６，４２９，１９９号に記載されている。
【0190】
他の好適な免疫刺激分子及びアジュバントとしては、限定されないが、更なるＴＬＲアゴニスト、リポ多糖及びその誘導体、例えば、ＭＰＬ、フロイントの完全若しくは不完全アジュバント、スクワラン及びスクワレン（又は植物若しくは動物由来の他の油）；ブロックコポリマー；洗浄剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０；Ｑｕｉｌ（登録商標）Ａ、例えば、Ｄｒａｋｅｏｌ若しくはＭａｒｃｏｌ等の鉱油、ピーナッツ油等の植物油；コリネバクテリウム由来のアジュバント、例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ等のコリネバクテリウム由来のアジュバント；Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅ等のプロピオニバクテリウム由来のアジュバント；Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ（Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ及びＧｕｅｒｉｎ若しくはＢＣＧ）；百日咳菌抗原；破傷性毒素；ジフテリアトキソイド；ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リゾールシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ－ジコクタデシル－Ｎ’，Ｎビス（２－’ヒドロキシエチル－プロパンジアミン）、メトキシヘキサデシルグリセロール、及びＰｌｕｒｏｎｉｃポリオール等の表面活性物質；ピラン、デキストラン硫酸、ポリＩＣ Ｃａｒｂｏｐｏｌ等のポリアミン；ムラミルジペプチド及び誘導体、ジメチルグリシン、タフトシン等のペプチド；油エマルション；並びにリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム若しくはミョウバン等の鉱物ゲル；インターロイキン２及びインターロイキン１２等のインターロイキン；インターロイキン１等のモノカイン；腫瘍壊死因子；γインターフェロン等のインターフェロン；サポニン－アルミニウムヒドロキシド若しくはＱｕｉｌ－Ａアルミニウムヒドロキシド等の組み合わせ；リポソーム；ＩＳＣＯＭ（登録商標）及びＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ムラミルジペプチド若しくは他の誘導体等の合成グリコペプチド；アブリジン；脂質Ａ誘導体；デキストラン硫酸；ＤＥＡＥ－デキストラン単独若しくはリン酸アルミニウムを含む；Ｃａｒｂｏｐｏｌ’ＥＭＡ等のカルボキシポリメチレン；Ｎｅｏｃｒｙｌ Ａ６４０等のアクリルコポリマーエマルション（例えば、米国特許第５，０４７，２３８号）；Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０等の油中水型乳化剤；ポリオウイルス、ワクシニア若しくは動物ポックスウイルスタンパク質；又はそれらの混合物。
【0191】
サブユニットワクチンに関して、そのようなワクチンの例は、国際公開第９７／４５４４４号に記載されているように、ＩＳＣＯＭを用いて製剤化され得る。
【0192】
油中水製剤の形態のワクチンの例としては、国際公開第９７／４５４４４号に記載されているようなＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０が挙げられる。
【0193】
ワクチン組成物を生成するための任意の好適な手順が企図される。例示的な手順としては、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１９９７，Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｅｌ，Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ）に記載されているものが挙げられる。
【0194】
抗原に対する免疫応答を増加させるアジュバントの能力は、典型的には、免疫によって媒介される保護の著しい増加によって現れる。例えば、体液性免疫の増加は、典型的には、抗原に対して産生される抗体の力価の著しい増加によって現れ、Ｔ細胞活性の増加は、典型的には、細胞増殖、又は細胞傷害性、又はサイトカイン分泌の増加に現れる。アジュバントはまた、例えば、主に体液性又はＴｈ２応答を、主に細胞性又はＴｈ１応答に変化させることによって、免疫応答を変化させることもできる。
【0195】
本発明の核酸分子及び／又はポリヌクレオチド、例えば、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、直鎖ＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドは、様々な緩衝液のいずれかに可溶化することができる。好適な緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液、及びリン酸ナトリウム（例えば、１５０ｍＭのリン酸ナトリウム）が挙げられる。不溶性ポリヌクレオチドは、弱酸又は弱塩基に可溶化した後、緩衝液で所望の体積に希釈することができる。緩衝液のｐＨは、必要に応じて調節され得る。加えて、医薬的に許容される添加剤を使用して、適切なモル浸透圧濃度を提供することができる。そのような添加剤は、当業者の知識の範囲内である。インビボで使用される水性組成物については、滅菌したパイロジェン不含水を使用することができる。そのような製剤は、対象（例えば、ヒト）への投与に好適な医薬的に許容される組成物を調製するために、有効量のポリヌクレオチドを、好適な量の水溶液とともに含有する。
【0196】
本発明の組成物は、既知の方法に従って製剤化することができる。好適な調製方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｏｓｏｌ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９８０）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９５）に記載されている。組成物は、水溶液として投与され得るが、エマルション、ゲル、溶液、懸濁液、凍結乾燥形態、又は当該技術分野で既知の任意の他の形態として製剤化することもできる。加えて、組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、及び防腐剤を含む、医薬的に許容される添加剤を含有し得る。
【0197】
４．投与量 本発明は、一般に、治療用及び予防用組成物に関する。組成物は、「有効量」の本明細書に定義される組成物を含み、そうすることで一定量の抗原がインビボで産生され得、それが投与される個体に免疫応答が生じる。必要な正確な量は、数ある要因の中でも、治療されている対象、治療される対象の年齢及び全身状態、抗体を合成する対象の免疫系の能力、所望される保護の程度、治療されている状態の重症度、選択された特定の抗原及びその投与様式に応じて変化するであろう。適切な有効量は、当該技術分野の当業者によって容易に決定され得る。したがって、「有効量」は、ルーチン試験を通じて決定することができる比較的広い範囲に属する。
【0198】
投与量及び間隔を個別に調整して、標的抗原低減効果又は疾患若しくは状態を改善する効果を維持するのに十分である活性化合物の血漿レベルを提供することができる。全身投与のための通常の患者投与量は、約１μｇ～５００μｇ、一般的には約２０μｇ～２００μｇ、典型的には約２５μｇ～１５０μｇの範囲である。
【0199】
代替的に、薬剤は、例えば、多くの場合デポー製剤又は徐放性製剤で、化合物を組織に直接注射することによって、全身的様式ではなく局所的に投与することができる。更に、標的薬物送達システムで、例えば、組織特異的抗体でコーティングされたリポソームで、薬剤を投与することができる。リポソームは、組織を標的とし、組織によって選択的に取り込まれる。
【0200】
本発明の方法で使用される任意の化合物について、有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、動物モデルにおいて用量を処方して、細胞培養で決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲（例えば、標的抗原の半減期を達成する試験剤の濃度）を達成することができる。そのような情報を使用して、哺乳動物における有用な用量をより正確に決定することができる。
【0201】
本発明の化合物の毒性及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養又は実験動物における標準的な医薬的手順によって、決定することができる。毒性作用と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、対象に使用するための投与量の範囲を処方する際に使用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんど又はまったくないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。正確な製剤、投与経路、及び投与量は、対象の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。（例えば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５，ｉｎ“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１ ｐ１を参照されたい）。
【0202】
本発明の組成物は、注射用に好適に製剤化することができる。組成物は、アンプル中に単位剤形で、又は多用量容器内に調製され得る。ポリヌクレオチドは、油性、又は好ましくは水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液、又はエマルションのような形態で存在してもよい。代替的に、ポリヌクレオチド塩は、送達時に、無菌パイロジェン不含水等の好適なビヒクルを用いて再構成するための凍結乾燥形態であってもよい。液体、及び再構成される凍結乾燥形態の両方は、注入された溶液のｐＨを好適に調整するために必要な量の薬剤、好ましくは緩衝液を含む。いずれの非経口使用についても、特に製剤を静脈内に投与する場合、溶質の総濃度は、調製物を等張性、低張性、又は弱高張性にするように制御されるべきである。糖類等の非イオン性材料は、張力を調整するために好ましく、スクロースは特に好ましい。これらの形態はいずれも、デンプン又は糖、グリセロール又は生理食塩水等の好適な処方剤を更に含み得る。単位投与量当たりの組成物は、液体であれ固体であれ、０．１％～９９％のポリヌクレオチド材料を含有し得る。
【0203】
ポリヌクレオチドが使用前に包装されている単位投与量アンプル又は多用量容器は、その医薬的に有効な用量、又は複数の有効用量に好適な量のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含有する溶液を封入する密閉容器を含んでもよい。ポリヌクレオチドは無菌製剤として包装され、密閉容器は使用まで製剤の無菌性を維持するように設計される。
【0204】
投与される投与量は、治療されている対象の状態及びサイズ、並びに治療の頻度及び投与経路に大きく依存する。用量及び頻度を含む治療継続のためのレジメンは、初期応答及び臨床判断によって導かれ得る。組織の間質空への非経口注射経路が好ましいが、特定の投与、例えば、鼻、喉、気管支組織又は肺の粘膜への投与では、エアロゾル製剤の吸入等の他の非経口経路が、必要とされる場合がある。
【0205】
５．使用方法 また、本発明によって包含されるのは、ＣＭＶ感染の治療及び／又は予防のための方法であり、そのような治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に、上記及び本明細書の他所に広く記載される有効量の組成物を投与することを含む。
【0206】
一実施形態において、本発明の修飾ｇＢポリペプチドはまた、多数のＣＤ４＋ＣＴＬを生成するために使用することもできる。例えば、抗原特異的ＣＤ４＋ＣＴＬは、ＣＭＶ感染に罹患した対象（例えば、ヒト）において、治療目的のために養子移入することができる。
【0207】
本発明によれば、上記及び／又は本明細書の他所に記載される修飾ｇＢポリペプチドを含む組成物は、ＣＭＶ感染の治療又は予防において有用性を見出すことが提案される。本発明の組成物は、ＣＭＶ感染が診断された後に治療的に使用され得る。
【0208】
上記及び本明細書の他所に記載される組成物がＣＭＶ感染に対する予防的方法に使用される場合、そのような方法は、ｇＢポリペプチドに対する長期にわたる体液性、細胞媒介性、及び粘膜性免疫応答を誘導するｇＢ特異的抗体に対する好適なプライムブーストワクチン接種である。
【0209】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、ｇＢポリペプチドに対する長寿命の強力な免疫を誘導する目的で、プライムブーストレジメンにおいて複数回用量で投与される。そのような戦略は、組成物の第２の用量を使用して、プライミング用量によって誘発された免疫を強化する。
【0210】
本発明のいくつかの実施形態は、ｇＢポリペプチドに対する治療的及び保護的免疫を誘発するための最適な戦略が、ＣＭＶウイルスに対する細胞性免疫応答及び体液性免疫応答の両方の生成を伴うという認識に基づいている。したがって、本発明は、本発明の組成物の第１の用量が第１の免疫応答を誘発又は誘導することによって免疫系をプライミングし、本発明の組成物の第２の用量が第２の免疫応答を増強又は誘発するために使用される多成分投与戦略を提供し、第１の用量で投与される組成物は、投与される第２の用量と同じである。このタイプの例示的な例において、第１の用量は、主として標的抗原に対する細胞性免疫応答を誘導するために投与されるのに対し、第２の用量は、主として標的抗原に対する体液性免疫応答を誘発するために投与される。本戦略の投与ステップが完了すると、細胞性免疫応答及び体液性免疫応答の両方が標的抗原に発現する。したがって、２つの応答は一緒になって、ＣＭＶ感染、あるいはＣＭＶによって伝達される、又は別様にＣＭＶと関連する疾患及び／若しくは状態に対する効果的又は強化された保護を提供する。
【0211】
関連するｇＢポリペプチドを標的とするそれらのＣＤ４＋ＣＴＬの直接刺激及び活性化を最大化するために、プライム投与及びブースト投与に使用される組成物は、好ましくは同じである。
【0212】
６．製造方法 修飾ｇＢポリペプチドは、典型的には、組換え発現法によって製造される。そのような方法は、当該技術分野で周知であり、特に、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＨＯ）における組換えタンパク質発現の方法である。異種シグナルペプチドに照らして、組換え産生された修飾ｇＢポリペプチドは、概して、宿主発現細胞から培養上清中に分泌される。
【0213】
上清が回収されると（典型的には遠心分離によって）、可溶性画分は、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、ＣＨＴタイプＩＩクロマトグラフィー、及びＨＩＣクロマトグラフィーのうちの１つ以上によって精製される。いくつかの好ましい実施形態において、精製されたホモ三量体組成物を生成する方法は、アニオン交換クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、及びＣＨＴタイプＩＩクロマトグラフィーの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、三量体組成物の精製は、サイズ排除クロマトグラフィーを更に含む。
【0214】
好ましい実施形態において、修飾ｇＢポリペプチドはＨｉｓタグを含まないため、精製方法は金属親和性クロマトグラフィーを含まない。
【0215】
７．キット 本発明はまた、上記及び本明細書の他所に広く記載されるような免疫刺激組成物を含むキットも提供する。そのようなキットは、本発明の免疫刺激組成物と同時に使用するための代替の免疫原性剤を追加で含んでもよい。
【0216】
いくつかの実施形態において、本発明の免疫刺激組成物に加えて、キットは、上述のプライムブーストレジメンを実施するための好適な構成要素を含み得る。例えば、キットは、少なくとも１つのポリペプチド抗原の別個に収容されたプライミング用量及びブースト用量を含んでもよい。
【0217】
キットは、例えば、投与デバイス、緩衝液、及び／又は希釈剤等の本発明の方法の実施を補助する追加の構成要素を含んでもよい。キットはまた、様々な構成要素を収容するための容器、及び本発明の方法におけるキット構成要素を使用するための説明書を含み得る。
【0218】
本発明が容易に理解され、実用化され得るために、ここで、特定の好ましい実施形態を、以下の非限定的な例によって説明する。
【実施例】
【0219】
ＣＭＶワクチンを開発するために、（配列番号１に記載されるような）天然ＨＣＭＶ ＡＤ１６９株ｇＢタンパク質に基づいて、修飾ｇＢポリペプチド配列を設計した。修飾ポリペプチドは、（配列番号５に記載されるような）ビリオン表面ドメイン、及び（配列番号６に記載されるような）ビリオン内ドメインを有するように設計された。このアミノ酸配列は、膜貫通領域及び疎水性膜近位領域の少なくとも一部分を欠いており、天然のフーリン切断部位をアミノ酸変異によって除去した。
【0220】
天然ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の膜貫通領域の一部分を欠失させて、細胞培養培地へのタンパク質分泌を促進した。フーリンプロテアーゼは、ｇＢを、ジスルフィド結合によって共有結合されたｇｐ９０及びｇｐ５８サブユニットに切断し、成熟したグリコシル化ｇＢが三量体形態を得る。その後、ウイルスエンベロープ内でタンパク質がその最終的な天然の物理的形状をとると、三量体が二量体化する。しかしながら、フーリン切断部位を有するＨＣＭＶ ｇＢの発現は、ｇＢタンパク質のより低い濃度の単量体形態をもたらすことが示されている。したがって、本発明者らは、フーリン切断部位を非機能的にすることがタンパク質産生を増強するであろうと仮定した。
【0221】
ヌクレオチド配列をコードする修飾ｇＢポリペプチドを、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現を増強するようにコドン最適化した（配列番号９）。修飾ｇＢポリペプチドを発現させるために、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、ｇＢヌクレオチド配列をコードする哺乳動物発現プラスミドでトランスフェクトした。タンパク質発現レベルを小規模な振盪フラスコ培養で確認し、ブラストサイジン及びＺｅｏｃｉｎを使用して迅速で安定なプールを選択した。
【0222】
修飾ｇＢポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号９に同定される。
【0223】
高レベルのタンパク質発現を発現するＣＨＯ－Ｋ１修飾ｇＢポリペプチドクローンをスケールアップし、次いで１０Ｌ発酵槽培養の出発物質として使用した（図１）。１２日目の後に発酵プロセスを停止し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、上清中に分泌された修飾ｇＢポリペプチドの量を推定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により、高濃度のｇＢポリペプチドが細胞上清中に分泌されたことが明らかになった（図２）。しかしながら、参照標準と一致して、発現されたタンパク質は、３つの異なる分子サイズで遊走した。これにより、分泌されたｇＢポリペプチドが多量体形態を形成することが示された。単量体ｇＢ形態、二量体ｇＢ形態、及び三量体ｇＢ形態は、それぞれ、１５０ｋＤａ、２５０ｋＤａ及び３５０ｋＤａの概算分子量を有していた。
【0224】
分泌されたｇＢポリペプチドを精製するために、アニオン交換、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト・タイプＩＩ、及びカチオン交換クロマトグラフィーカラム等の３つの異なるクロマトグラフィー技術を使用した（図２Ａ～図２Ｄ）。最終的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ｇＢポリペプチドの多量体が最終精製試料中に存在し、それらが分子量に従って遊走することを示す。修飾ｇＢタンパク質の多量体プロファイルを考慮した場合、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、ｇＢ三量体に対応する概算分子量（すなわち、約３５０ｋＤａ）でのｇＢタンパク質染色の強度が、ｇＢ二量体（すなわち、２５０ｋＤａ）及び単量体（すなわち、１５０ｋＤａ）に対応する分子量での染色と比較して有意により高いことを示している。総合すると、これらの結果は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞のフーリン切断部位に変異を有するｇＢポリペプチド細胞外ドメイン及び細胞内ドメインの発現が、高濃度のｇＢ三量体、並びにわずかに低い濃度の二量体及び単量体をもたらし得ることを示唆している。
【0225】
ＣＨＯ細胞で発現したｇＢポリペプチドを特徴付けるために、サイズ排除クロマトグラフィーによって更に分析した（図３Ａ）。サイズ排除の溶出プロファイルは、ｇＢポリペプチドが主に単一の鋭利なピークとして溶出したことを示し、ｇＢが融合前三量体形態を呈する可能性が高いことが示唆される。更に、天然ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上のサイズ排除クロマトグラフィーからの溶出画分の分析も、最終精製試料中に存在するｇＢポリペプチドの９０％が三量体形態であり、ｇＢポリペプチドのわずか１０％が単量体であると考えられることを示唆している（図３Ｂ）。ｇＢの多量体プロファイルを考慮した場合、天然ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は、より高い分子量のｇＢ三量体の強度が、２５０ｋＤａの二量体及び１５０ｋＤａの単量体と比較して有意により高いことを示している。総合すると、これらの結果は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞のフーリン切断部位に変異を有するｇＢポリペプチド細胞外ドメイン及び細胞内ドメインの発現が、高濃度のｇＢ三量体、並びにわずかに低い濃度の二量体及び単量体をもたらし得ることを示唆している。
【0226】
第ＩＩ相臨床試験で使用されるＭＦ５９アジュバントを含む組換えＨＣＭＶ ｇＢワクチンは、ＨＣＭＶセロネガティブの思春期及び産後女性の集団でのＨＣＭＶ感染の予防において５０％のタンパク質保護を達成した。これらの以前の臨床試験で使用した組換えｇＢポリペプチドは、単量体形態であったが、自然にＨＣＭＶに感染した個体では、ｇＢは、その天然の融合前三量体コンフォメーションをとる。したがって、ｇＢ特異的抗体応答の最適な誘導にはｇＢポリペプチドのどの成分が必要であるかを明確に示すことが重要である。
【0227】
ｇＢポリペプチドの３つの多量体形態の免疫原性を決定するために、ヒトＨＬＡ Ａ２４トランスジェニックマウスを、０日目、２１日目及び４２日目に、ＣＭＶ ｇＢ、ＣＭＶポリ及びＣｐＧ１０１８アジュバントを用いて製剤化したＣＭＶワクチンで、又は対照製剤としてＣｐｇ１０１８単独で免疫した（図４Ａ）。マウス血清試料を、３回目のワクチン投与の７日後に収集し、次いで、ＥＬＩＳＡを使用して抗ｇＢ抗体応答について分析した。ＣＭＶワクチンで免疫したマウスから得られた血清は、ｇＢポリペプチドへのより強い結合を示した（図４Ｂ）。
【0228】
ｇＢ抗体応答の特異性を、非還元条件下でウェスタンブロット分析を使用して更に特徴付け、ｇＢポリペプチドの天然の融合前コンフォメーションを保存した。ウェスタンブロット分析から得られたデータは、ＣＭＶワクチンでワクチン接種したマウスからの血清が、ｇＢ三量体に強く反応し、ｇＢ二量体にはそれよりは反応が低かったが、ｇＢ単量体に対しては可視的な結合反応が観察されなかったことを示した（図４Ｃ）。総合すると、これらのデータは、ｇＢに対する強力な抗体応答を誘導するには、その天然の三量体確認で製剤化する必要があることを示唆している。
【0229】
血清試料中の抗ｇＢ抗体のアイソタイプも評価した。ＣＭＶワクチンは、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１（Ｔｈ２様Ｉｇアイソタイプ）、及びＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３（Ｔｈ１様Ｉｇアイソタイプ）を含む複数のアイソタイプを含むロバストなｇＢ特異的抗体応答を誘導し（図５Ａ）、機能的マイクロ中和アッセイにおいて、ｇＢ特異的抗体は、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９及びＴＢ４０ｅ株のＭｒｃ－５及びＡＲＰＥ－１９感染に対する強力な中和能力を示した（図５Ｂ）。新たな証拠は、細胞会合ｇＢへの血清ＨＣＭＶ ｇＢ特異的ＩｇＧの結合が、ワクチンの有効性と相関することを示唆している。その後の実験で、ＣＭＶ ＡＤ１６９感染線維芽細胞に結合するマウス血清抗体の能力を決定した。天然ｇＢ三量体を用いて製剤化されたＣＭＶワクチンで免疫したマウスからの血清抗体は、対照マウスから得られた血清と比較して、ＣＭＶ ＡＤ１６９株に感染した線維芽細胞で細胞会合ｇＢへの強い結合を示したことが分かった（図５Ｃ及び図５Ｄ）。
【0230】
濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の特殊なサブセットであり、胚中心（ＧＣ）の形成において重要な役割を果たす。ＧＣは、進行中の免疫応答の間に二次リンパ器官のＢ細胞領域内で形成する別個の構造である。ＧＣ内のＢ細胞は、急速な増殖及び抗体多様化を受け、抗原標的に対する親和性がより高い、異なるタイプの抗体アイソタイプの産生を引き起こす。ＧＣはまた、Ｂ細胞が、抗体分泌形質細胞及びメモリーＢ細胞に分化することができる部位であり、これにより長期にわたる抗体産生が可能となる。したがって、ワクチン接種したマウスにおいてＴＦＨ及びＧＣのＢ細胞応答を評価することが重要である。脾臓におけるＴＦＨ細胞応答の評価は、天然ｇＢ三量体を含むＣＭＶワクチンが、ＣｐＧ１０１８単独対照と比較して有意により多くのＴＦＨ細胞を誘導することを示す（図６Ａ）。ＧＣ Ｂ細胞の更なる評価は、三量体形態の天然ｇＢが、ＣｐＧ１０１８単独で免疫したマウスと比較して、４９日目に有意により高い割合のＧＣ Ｂ細胞（Ｂ２２０＋ＧＬ７＋Ｆａｓ＋）を誘導したことを示した（図６Ｂ）。最後に、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによるＣＭＶ ｇＢ特異的ＩｇＧを分泌する形質及びメモリーＢ細胞の分析は、天然三量体ｇＢを含むＣＭＶワクチン製剤が、ＣｐＧ１０１８単独免疫と比較して有意により高い形質細胞の応答及びロバストなメモリーＢ細胞の応答を誘導したことを示した（図６Ｃ及び図６Ｄ）。
【0231】
進化する証拠は、ＨＣＭＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、抗ウイルス免疫及び潜在的に感染した細胞の潜在的な維持において重要な役割を果たすことを示唆している。ＨＣＭＶに一次感染している成人において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、症候性疾患の回復に不可欠である。一方、幼児においては、ＨＣＭＶの尿及び唾液中への持続的な排出は、ＨＣＭＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の欠如と関連付けられる。免疫抑制された固形臓器移植レシピエントでは、損なわれたＨＣＭＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、長期のウイルス血症及びより重篤な臨床疾患と関連付けられる。造血幹細胞移植レシピエントでは、ＨＣＭＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がその抗ウイルス効果を発揮するために必要であることが示されている。加えて、移植患者における養子Ｔ細胞免疫療法で、ＨＣＭＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在が、ＨＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の維持に必要であることが明らかになっている。これらの観察は、ＨＣＭＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＣＭＶ感染及び疾患を制御する上で非常に重要な役割を果たすことを示唆している。
【0232】
その後の実験において、本発明者らは、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導するために天然ｇＢ三量体タンパク質を用いて製剤化されたＣＭＶワクチンの能力を明確に示した。興味深いことに、天然ｇＢ三量体を含むＣＭＶワクチン製剤は、エクスビボ試験後に、ＩＦＮ－γを産生する三量体ｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答をより高い頻度で誘導し、これらの細胞の大部分は、３つのサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ）又は２つのサイトカイン（ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ）を同時に誘導することができた（図７Ａ及び図７Ｂ）。加えて、ｇＢ ｐｅｐｍｉｘによる三量体ｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔのインビトロ刺激は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の急速な増殖を引き起こし、高い割合のＣＭＶ ｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔが、３つのサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ、ＩＬ－２）又は２つのサイトカインの組み合わせ（ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ又はＴＮＦ及びＩＬ－２）を同時に分泌する能力も示した（図７Ｃ及び図７Ｄを参照）。これは、天然ｇＢ三量体が、強力なメモリー免疫応答を誘導し得ることを示唆している。
【0233】
総合すると、これらの結果は、いずれの変異又は（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３等のリンカーを含めることなく、新規の修飾ｇＢポリペプチド三量体を産生することができることを示している。本発明は、天然全長ＨＣＭＶ ｇＢタンパク質の膜貫通ドメイン及びビリオン表面ドメインの少なくとも一部分を除去することによる、修飾ｇＢポリペプチド三量体の開発のための新規アプローチを開示する。修飾ｇＢポリペプチド三量体は、アニオン交換、ＣＨＴタイプＩＩ、カチオン交換、及びサイズ排除クロマトグラフィー技術を使用して均質に精製することができる。天然ｇＢ三量体を用いて製剤化されたＣＭＶワクチンは、複数のＨＣＭＶ株に対する強力な抗体及び中和抗体応答を誘導する。しかしながら、ＣＭＶワクチン後に誘導される抗体は、主に修飾ｇＢポリペプチド三量体に反応すること、及びこれらの抗体が、ＨＣＭＶ ＡＤ１６９株に感染した線維芽細胞上で発現するｇＢタンパク質に結合することも可能であることが初めて示される。更に、以前の研究はｇＢ特異的中和抗体応答を評価することに限定されているが、本発明者らは、修飾された融合前ｇＢポリペプチド三量体を含む新規ＣＭＶワクチン製剤（ｃｒｙｏ－ＥＭによって確認、データは示さず）が、ロバストなＴＦＨ細胞、ＧＣ、Ｂ細胞、抗体分泌形質細胞、メモリーＢ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞の応答を誘導する実質的な能力を示すことを明らかにした。
【0234】
材料及び方法
修飾ｇＢポリペプチドの発現及び精製。
ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９由来のＨＣＭＶ ｇＢのコード配列を、哺乳動物発現のためにコドン最適化してタンパク質発現を増強させ、哺乳動物発現ベクターにクローニングした。天然Ｎ末端シグナル配列（すなわち、配列番号１に記載の配列のアミノ酸１～３１）を異種ＩｇＧ重鎖シグナルペプチドで置き換え、発現したポリペプチドを細胞培養上清中に分泌させた。修飾ｇＢポリペプチドＤＮＡ配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする。フーリン切断部位のコードされた配列を、Ａｒｇ４５６からＧｌｎ、Ａｒｇ４５８からＴｈｒ、及びＡｒｇ４５９からＧｌｎに変異させた（配列番号１に記載の残基番号に対応）。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ１細胞を、修飾ｇＢポリペプチドプラスミドでトランスフェクトし、修飾ｇＢポリペプチドを発現する安定な細胞を、９μｇ／ｍＬのブラストサイジン及び４００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎで選択した。修飾ｇＢポリペプチドを、流加バッチモードの１０Ｌバイオリアクター中で発現させた。１２日目に、細胞培養物を採取し、遠心分離して細胞デブリから上清を分離した。上清を２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に緩衝液交換し、次いでＰｏｒｏｓ ５０ＨＱ樹脂に充填した（アニオン交換クロマトグラフィー）。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、７０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で洗浄した後、タンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１８０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で溶出した。溶出したポリペプチドを５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で緩衝液交換し、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）タイプＩＩを通過させて宿主細胞タンパク質混入物を除去した。純度を更に向上させるために、修飾ｇＢポリペプチドを５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（ｐＨ５．０）緩衝液に緩衝液交換し、次いでＰＯＲＯＳ ＸＳ（カチオン交換クロマトグラフィー）カラムに充填した。ＰＯＲＯＳ ＸＳカラムに結合した修飾ｇＢポリペプチドを、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．０）緩衝液で溶出し、次いで２５ｍＭグリシン（ｐＨ４．０）緩衝液に対して緩衝液交換した。最終精製ポリペプチドの濃度を、消光係数１．２０９を使用してＵＶ２８０により決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分析し、－７０℃で保管した。
修飾ｇＢポリペプチドの発現及び精製。
ＨＣＭＶ株ＡＤ１６９由来のＨＣＭＶ ｇＢのコード配列を、哺乳動物発現のためにコドン最適化してタンパク質発現を増強させ、哺乳動物発現ベクターにクローニングした。天然Ｎ末端シグナル配列（すなわち、配列番号１に記載の配列のアミノ酸１～３１）を異種ＩｇＧ重鎖シグナルペプチドで置き換え、発現したポリペプチドを細胞培養上清中に分泌させた。修飾ｇＢポリペプチドＤＮＡ配列は、配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードする。フーリン切断部位のコードされた配列を、Ａｒｇ４５６からＧｌｎ、Ａｒｇ４５８からＴｈｒ、及びＡｒｇ４５９からＧｌｎに変異させた（配列番号１に記載の残基番号に対応）。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ１細胞を、修飾ｇＢポリペプチドプラスミドでトランスフェクトし、修飾ｇＢポリペプチドを発現する安定な細胞を、９μｇ／ｍＬのブラストサイジン及び４００μｇ／ｍＬのＺｅｏｃｉｎで選択した。修飾ｇＢポリペプチドを、流加バッチモードの１０Ｌバイオリアクター中で発現させた。１２日目に、細胞培養物を採取し、遠心分離して細胞デブリから上清を分離した。上清を２００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に緩衝液交換し、次いでＰｏｒｏｓ ５０ＨＱ樹脂に充填した（アニオン交換クロマトグラフィー）。カラムを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、７０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で洗浄した後、タンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、１８０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液で溶出した。溶出したポリペプチドを５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で緩衝液交換し、セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）タイプＩＩを通過させて宿主細胞タンパク質混入物を除去した。純度を更に向上させるために、修飾ｇＢポリペプチドを５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（ｐＨ５．０）緩衝液に緩衝液交換し、次いでＰＯＲＯＳ ＸＳ（カチオン交換クロマトグラフィー）カラムに充填した。ＰＯＲＯＳ ＸＳカラムに結合した修飾ｇＢポリペプチドを、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、５００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ５．０）緩衝液で溶出し、次いで２５ｍＭグリシン（ｐＨ４．０）緩衝液に対して緩衝液交換した。最終精製ポリペプチドの濃度を、消光係数１．２０９を使用してＵＶ２８０により決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分析し、－７０℃で保管した。
【0235】
マウスの免疫
ヒトＨＬＡトランスジェニックマウス（ＨＬＡ Ａ２４）を、ＣｐＧ１０１８アジュバント（５０μｇ）を用いて製剤化した修飾ｇＢポリペプチド（５μｇ）及びＣＭＶポリ２０ＰＬＮＨ（３０μｇ）で０日目に免疫した。対照群のマウスには、ＣｐＧ１０１８（５０μｇ）を単独で注入した。２１日目及び４２日目に、マウスを尾部出血させ、同一のワクチン又は対照製剤でブーストした。４９日目に、マウスを安楽死させ、血清を採取して、ＨＣＭＶ ｇＢ特異的抗体応答を評価した。
ヒトＨＬＡトランスジェニックマウス（ＨＬＡ Ａ２４）を、ＣｐＧ１０１８アジュバント（５０μｇ）を用いて製剤化した修飾ｇＢポリペプチド（５μｇ）及びＣＭＶポリ２０ＰＬＮＨ（３０μｇ）で０日目に免疫した。対照群のマウスには、ＣｐＧ１０１８（５０μｇ）を単独で注入した。２１日目及び４２日目に、マウスを尾部出血させ、同一のワクチン又は対照製剤でブーストした。４９日目に、マウスを安楽死させ、血清を採取して、ＨＣＭＶ ｇＢ特異的抗体応答を評価した。
【0236】
酵素結合免疫吸着アッセイ。
抗ｇＢ抗体価を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。ポリスチレン製９６ウェルハーフエリアプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈した５μｇ／ｍＬのＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドで一晩コーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。非結合の修飾ｇＢポリペプチドを洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でプレートをブロックした。ＰＢＳ ５％脱脂粉乳中の血清試料の６倍連続希釈を行った。連続希釈した血清試料をプレートに加え、室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、室温で１時間、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ二次抗体で処理した。プレートを洗浄し、発色のために３，３’５，５’－テトラメチルベンジジン基質を添加した。１Ｎ ＨＣｌを添加することによって発色反応をクエンチし、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎＭでの吸光度を決定した。
抗ｇＢ抗体価を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。ポリスチレン製９６ウェルハーフエリアプレートを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈した５μｇ／ｍＬのＨＣＭＶ ｇＢポリペプチドで一晩コーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。非結合の修飾ｇＢポリペプチドを洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の５％脱脂粉乳でプレートをブロックした。ＰＢＳ ５％脱脂粉乳中の血清試料の６倍連続希釈を行った。連続希釈した血清試料をプレートに加え、室温でインキュベートした。プレートを洗浄し、室温で１時間、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ二次抗体で処理した。プレートを洗浄し、発色のために３，３’５，５’－テトラメチルベンジジン基質を添加した。１Ｎ ＨＣｌを添加することによって発色反応をクエンチし、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して４５０ｎＭでの吸光度を決定した。
【0237】
ウェスタンブロット分析。
修飾ｇＢポリペプチドの最も免疫原性の高い形態を決定するために、ウェスタンブロット分析を行った。修飾ｇＢ精製ポリペプチドの多量体形態を、非還元条件下で８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離した。２つの異なる８％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、５つの異なるｇＢポリペプチド濃度（２～０．２５μｇの範囲）で同時に実行した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のポリペプチド分解後、ポリペプチドをＨｙｂｏｎｄ－Ｃニトロセルロース膜に転写した。転写後、膜を洗浄し、ブロックし、２つの異なる濃度（１：１０００及び１：３０００）のマウス血清でプローブした。膜を洗浄し、次いでＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体とインキュベートした後、洗浄し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＥＣＬ ＵｌｔｒａウェスタンＨＲＰ基質とインキュベートした。シグナルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＬ１５００ Ｃｈｅｍｉ Ｇｅｌ Ｄｏｃ Ｓｙｓｔｅｍを使用して得た。
修飾ｇＢポリペプチドの最も免疫原性の高い形態を決定するために、ウェスタンブロット分析を行った。修飾ｇＢ精製ポリペプチドの多量体形態を、非還元条件下で８％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離した。２つの異なる８％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを、５つの異なるｇＢポリペプチド濃度（２～０．２５μｇの範囲）で同時に実行した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上のポリペプチド分解後、ポリペプチドをＨｙｂｏｎｄ－Ｃニトロセルロース膜に転写した。転写後、膜を洗浄し、ブロックし、２つの異なる濃度（１：１０００及び１：３０００）のマウス血清でプローブした。膜を洗浄し、次いでＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ抗体とインキュベートした後、洗浄し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＥＣＬ ＵｌｔｒａウェスタンＨＲＰ基質とインキュベートした。シグナルは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＣＬ１５００ Ｃｈｅｍｉ Ｇｅｌ Ｄｏｃ Ｓｙｓｔｅｍを使用して得た。
【0238】
マウスＩｇＧ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ。
エクスビボでｇＢ特異的抗体分泌細胞を測定するために、ＰＶＤＦ ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を７０％エタノールで処理した。プレートを蒸留水で５回洗浄し、陽性対照として１００μＬ／ウェルのＨＣＭＶ ｇＢタンパク質（２５μｇ／ｍＬ）又は抗ＩｇＧ抗体（１５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。１０％血清を含有するＤＭＥＭでプレートをブロックし、各マウスからの３００，０００細胞／ウェルを３連で添加し、次いで５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベータ内で１８時間インキュベートした。細胞を除去し、プレートを洗浄した。ＨＲＰ（ＭＡＢＴＥＣＨ）に結合した検出抗体抗ＩｇＧを添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン－ＡＬＰを添加し、室温で１時間インキュベートした後、発色が顕著になるまで、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する基質溶液でプレートを洗浄及び処理した。水でプレートを洗浄することにより発色を停止させ、プレートを一晩乾燥させた。メモリーＢ細胞応答を測定するために、脾臓細胞（５×１０５）を、２４ウェルプレート中で５日間、Ｒ４８４及び組換えマウスＩＬ－２の混合物で活性化し、次いでＥＬＩＳｐｏｔを上記のように行った。ＥＬＩＳｐｏｔリーダーでスポット数をカウントした。
エクスビボでｇＢ特異的抗体分泌細胞を測定するために、ＰＶＤＦ ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を７０％エタノールで処理した。プレートを蒸留水で５回洗浄し、陽性対照として１００μＬ／ウェルのＨＣＭＶ ｇＢタンパク質（２５μｇ／ｍＬ）又は抗ＩｇＧ抗体（１５μｇ／ｍＬ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。１０％血清を含有するＤＭＥＭでプレートをブロックし、各マウスからの３００，０００細胞／ウェルを３連で添加し、次いで５％ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベータ内で１８時間インキュベートした。細胞を除去し、プレートを洗浄した。ＨＲＰ（ＭＡＢＴＥＣＨ）に結合した検出抗体抗ＩｇＧを添加し、室温で２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン－ＡＬＰを添加し、室温で１時間インキュベートした後、発色が顕著になるまで、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する基質溶液でプレートを洗浄及び処理した。水でプレートを洗浄することにより発色を停止させ、プレートを一晩乾燥させた。メモリーＢ細胞応答を測定するために、脾臓細胞（５×１０５）を、２４ウェルプレート中で５日間、Ｒ４８４及び組換えマウスＩＬ－２の混合物で活性化し、次いでＥＬＩＳｐｏｔを上記のように行った。ＥＬＩＳｐｏｔリーダーでスポット数をカウントした。
【0239】
マイクロ中和アッセイ。
ＨＣＭＶのＡＤ１６９及びＴＢ４０／Ｅ株に対する中和活性を決定した。ヒト線維芽細胞Ｍｒｃ－５又は成人網膜色素上皮（ＡＲＰＥ－１９）細胞を９６ウェル平底プレートに播種した。翌日、ＣＭＶワクチン又は対照製剤をワクチン接種したマウスから４９日目に採取した血清試料を、連続希釈し、９６ウェルＵ底プレート中のＤ０（血清を含まないＤＭＥＭ）に希釈した標準数のウイルス粒子（ウェル当たり１０００ｐ．ｆ．ｕ．）に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。陽性対照として、血清を含まないウイルス及びウイルスを含まない陰性対照血清も試験に含めた。次いで、血清／ＣＭＶ混合物をＭｒｃ－５又はＡＲＰＥ－１９細胞に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を廃棄し、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ（Ｄ１０）で細胞を穏やかに５回洗浄し、最終体積２００ｍＬのＲ１０を各ウェルに添加した後、３７℃及び５％ＣＯ２で１６～１８時間インキュベーションした。１００ｍＬの冷メタノールで細胞を固定し、ペルオキシダーゼブロック（Ｄａｋｏ）、続いてマウス抗ＣＭＶ ＩＥ－１／ＩＥ２ｍＡｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で、室温で３時間インキュベートした。次いで、細胞を、ウェル当たり５０ｍＬのＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ（ＰＢＳ中で１：２００に希釈）とともに、室温で３時間インキュベートした。細胞を、室温で１０分間、ウェル当たり２０μＬのジアミノベンジジン＋基質（Ｄａｋｏ）で染色し、暗褐色に染色された陽性核をカウントした。中和力価は、ＩＥ－１／ＩＥ－２発現核の５０％阻害をもたらした血清希釈の逆数として算出した。
ＨＣＭＶのＡＤ１６９及びＴＢ４０／Ｅ株に対する中和活性を決定した。ヒト線維芽細胞Ｍｒｃ－５又は成人網膜色素上皮（ＡＲＰＥ－１９）細胞を９６ウェル平底プレートに播種した。翌日、ＣＭＶワクチン又は対照製剤をワクチン接種したマウスから４９日目に採取した血清試料を、連続希釈し、９６ウェルＵ底プレート中のＤ０（血清を含まないＤＭＥＭ）に希釈した標準数のウイルス粒子（ウェル当たり１０００ｐ．ｆ．ｕ．）に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。陽性対照として、血清を含まないウイルス及びウイルスを含まない陰性対照血清も試験に含めた。次いで、血清／ＣＭＶ混合物をＭｒｃ－５又はＡＲＰＥ－１９細胞に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を廃棄し、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ（Ｄ１０）で細胞を穏やかに５回洗浄し、最終体積２００ｍＬのＲ１０を各ウェルに添加した後、３７℃及び５％ＣＯ２で１６～１８時間インキュベーションした。１００ｍＬの冷メタノールで細胞を固定し、ペルオキシダーゼブロック（Ｄａｋｏ）、続いてマウス抗ＣＭＶ ＩＥ－１／ＩＥ２ｍＡｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）で、室温で３時間インキュベートした。次いで、細胞を、ウェル当たり５０ｍＬのＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇ（ＰＢＳ中で１：２００に希釈）とともに、室温で３時間インキュベートした。細胞を、室温で１０分間、ウェル当たり２０μＬのジアミノベンジジン＋基質（Ｄａｋｏ）で染色し、暗褐色に染色された陽性核をカウントした。中和力価は、ＩＥ－１／ＩＥ－２発現核の５０％阻害をもたらした血清希釈の逆数として算出した。
【0240】
ＣＭＶ感染線維芽細胞アッセイで、細胞会合ｇＢに結合するＣＭＶ ｇＢ特異的抗体。
ヒト線維芽細胞株であるＭｒｃ－５細胞を、Ｔ７５フラスコ中で５０％コンフルエンシーまで増殖させた。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２で２時間、感染多重度（ＭＯＩ）２．０のＣＭＶ ＡＤ１６９株で感染させた。感染後、細胞を洗浄し、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで４８時間インキュベートして細胞間にウイルスを伝播させた。感染細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでトリプシン－ＥＤＴＡで細胞を除去した。細胞を洗浄し、カウントし、次いで、１０６生細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を細胞トレースバイオレットで染色し、室温で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで室温で１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を２回洗浄し、９６ウェルＶ底プレートに２０，０００／ウェルで播種し、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を廃棄した。４９日目のＣＭＶワクチン又は場所による免疫後にＨＬＡ Ａ２４ヒトトランスジェニックマウスから得られたマウス血清試料をポーリング処理し、次いで１：５１２又は１：１０２４に希釈した。希釈した血清試料をＭｒｃ－５細胞に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで４℃で３０分間、抗マウスＡＦ４８８ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で染色した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ上で細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータを解析した。ＣＭＶ感染線維芽細胞に結合するＣＭＶ ｇＢ特異的抗体のパーセンテージは、生存するＡＦ４８８陽性細胞のパーセンテージから算出した。
ヒト線維芽細胞株であるＭｒｃ－５細胞を、Ｔ７５フラスコ中で５０％コンフルエンシーまで増殖させた。細胞を、３７℃及び５％ＣＯ２で２時間、感染多重度（ＭＯＩ）２．０のＣＭＶ ＡＤ１６９株で感染させた。感染後、細胞を洗浄し、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭで４８時間インキュベートして細胞間にウイルスを伝播させた。感染細胞をＰＢＳで洗浄し、次いでトリプシン－ＥＤＴＡで細胞を除去した。細胞を洗浄し、カウントし、次いで、１０６生細胞／ｍＬで再懸濁した。細胞を細胞トレースバイオレットで染色し、室温で２０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで室温で１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。細胞を２回洗浄し、９６ウェルＶ底プレートに２０，０００／ウェルで播種し、細胞を遠心分離によってペレット化し、上清を廃棄した。４９日目のＣＭＶワクチン又は場所による免疫後にＨＬＡ Ａ２４ヒトトランスジェニックマウスから得られたマウス血清試料をポーリング処理し、次いで１：５１２又は１：１０２４に希釈した。希釈した血清試料をＭｒｃ－５細胞に添加し、３７℃及び５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。細胞を洗浄し、次いで４℃で３０分間、抗マウスＡＦ４８８ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で染色した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ上で細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータを解析した。ＣＭＶ感染線維芽細胞に結合するＣＭＶ ｇＢ特異的抗体のパーセンテージは、生存するＡＦ４８８陽性細胞のパーセンテージから算出した。
【0241】
ＩＦＮ－γ、複数のサイトカイン、胚中心Ｂ細胞、又は濾胞性ヘルパーＴ細胞の応答を評価するための細胞内サイトカイン染色。
ワクチン接種後のＨＣＭＶ ｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を検出するために、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（登録商標）（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の存在下で、０．２μｇ／ｍＬのｇＢ ｐｅｐｍｉｘ（ｇＢ重複ペプチド－１５ｍｅｒ、１１アミノ酸重複）で脾細胞を６時間刺激し、細胞を２回洗浄し、次いでＡＰＣ結合抗ＣＤ３、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４、及びＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ８でインキュベートした。細胞を固定し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを使用して透過化した後、ＰＥ結合抗ＩＦＮ－γとインキュベートした。複数のサイトカインの発現を評価するために、細胞を、ＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ８及びＢＶ７８６抗ＣＤ４表面マーカーで染色し、次いで、ＰＥ結合抗ＩＦＮ－γ、ＰＥ－Ｃｙ７結合抗ＴＮＦ、ＦＩＴＣ結合ＣＤ０１７ａ、及びＡＰＣ結合抗ＩＬ－２で細胞内を染色した。胚中心Ｂ細胞応答を評価するために、ワクチン接種マウス由来のリンパ節からの脾細胞又は細胞を、ＰＥ結合抗Ｂ２２０、ＦＩＴＣ結合抗ＧＬ７、及びＡＰＣ結合抗ＣＤ９５で染色した。ワクチン接種マウスからの濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）の細胞応答を評価するために、ＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ８、ＢＶ７８６抗ＣＤ４、ＣｘＣＲ５、及びＰＤ－１表面マーカーで染色した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩで細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータを解析した。
ワクチン接種後のＨＣＭＶ ｇＢ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を検出するために、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（登録商標）（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の存在下で、０．２μｇ／ｍＬのｇＢ ｐｅｐｍｉｘ（ｇＢ重複ペプチド－１５ｍｅｒ、１１アミノ酸重複）で脾細胞を６時間刺激し、細胞を２回洗浄し、次いでＡＰＣ結合抗ＣＤ３、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４、及びＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ８でインキュベートした。細胞を固定し、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを使用して透過化した後、ＰＥ結合抗ＩＦＮ－γとインキュベートした。複数のサイトカインの発現を評価するために、細胞を、ＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ８及びＢＶ７８６抗ＣＤ４表面マーカーで染色し、次いで、ＰＥ結合抗ＩＦＮ－γ、ＰＥ－Ｃｙ７結合抗ＴＮＦ、ＦＩＴＣ結合ＣＤ０１７ａ、及びＡＰＣ結合抗ＩＬ－２で細胞内を染色した。胚中心Ｂ細胞応答を評価するために、ワクチン接種マウス由来のリンパ節からの脾細胞又は細胞を、ＰＥ結合抗Ｂ２２０、ＦＩＴＣ結合抗ＧＬ７、及びＡＰＣ結合抗ＣＤ９５で染色した。ワクチン接種マウスからの濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）の細胞応答を評価するために、ＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ８、ＢＶ７８６抗ＣＤ４、ＣｘＣＲ５、及びＰＤ－１表面マーカーで染色した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩで細胞を取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用してデータを解析した。
【0242】
ワクチン接種後のＣＭＶ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロ増殖。
ワクチン接種後、免疫したマウスから５×１０６脾細胞を単離し、０．２μｇ／ｍＬのＨＣＭＶ ｇＢ ｐｅｐｍｉｘ（ｇＢ重複ペプチド－１５ｍｅｒ、１１アミノ酸重複）で刺激し、２４ウェルプレート中、３７℃、１０％のＣＯ２で１０日間細胞を培養した。３日目及び６日目並びに１０日目に、組換えＩＬ－２を細胞に補充し、ＩＣＳアッセイを使用してＴ細胞特異性を評価した。
ワクチン接種後、免疫したマウスから５×１０６脾細胞を単離し、０．２μｇ／ｍＬのＨＣＭＶ ｇＢ ｐｅｐｍｉｘ（ｇＢ重複ペプチド－１５ｍｅｒ、１１アミノ酸重複）で刺激し、２４ウェルプレート中、３７℃、１０％のＣＯ２で１０日間細胞を培養した。３日目及び６日目並びに１０日目に、組換えＩＬ－２を細胞に補充し、ＩＣＳアッセイを使用してＴ細胞特異性を評価した。
【0243】
実施例２
陰性染色法及びｇＢホモ三量体の観察
陰性染色電子顕微鏡法によりＨＣＭＶのｇＢを観察するために、ゲル濾過緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ又は２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．１、５００ｍＭ ＮａＣｌ）中のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｃｙｔｉｖａ Ｓ２００ １０／３００）によってタンパク質を精製し、１．８又は３ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質を１０００倍に希釈し、グロー放電した、炭素でコーティングされたＦｏｒｍｖａｒグリッドに適用し、２％（ｗ／ｖ）の酢酸ウラニルで２分間染色した後、ブロットし、１０分間空気乾燥させた。試料は、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｆ３０ Ｇ２ ＴＥＭ又はＪＥＯＬ ＪＥＭ １０１１ ＴＥＭを使用して画像化した。
陰性染色法及びｇＢホモ三量体の観察
陰性染色電子顕微鏡法によりＨＣＭＶのｇＢを観察するために、ゲル濾過緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ又は２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．１、５００ｍＭ ＮａＣｌ）中のサイズ排除クロマトグラフィー（Ｃｙｔｉｖａ Ｓ２００ １０／３００）によってタンパク質を精製し、１．８又は３ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質を１０００倍に希釈し、グロー放電した、炭素でコーティングされたＦｏｒｍｖａｒグリッドに適用し、２％（ｗ／ｖ）の酢酸ウラニルで２分間染色した後、ブロットし、１０分間空気乾燥させた。試料は、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｆ３０ Ｇ２ ＴＥＭ又はＪＥＯＬ ＪＥＭ １０１１ ＴＥＭを使用して画像化した。
【0244】
収集された予備データから、タンパク質は純粋であり、透明なホモ三量体の複合体を形成すると考えられる（図８）。これらの画像は、三量体複合体の異なる面（側面、上面、及び底面）を示す。タンパク質は非常に安定であり、この分析に基づいて、陰性染色に関する多くの最適化を回避することができ、ｃｒｙｏ－ＥＭを使用して分析を行って２Ｄ及び３Ｄクラス平均を生成し、恐らくは原子分解能、又は近原子分解能を達成することができる。
【0245】
本明細書に引用されるあらゆる特許、特許出願、及び刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0246】
本明細書における任意の参考文献の引用は、そのような参考文献が本出願の「先行技術」として利用可能であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
【0247】
本明細書全体を通して、目的は、本発明をいずれか１つの実施形態又は特定の特徴の集合に限定することなく、本発明の好ましい実施形態を説明することである。したがって、当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態に様々な修正及び変更を加えることができることを理解するであろう。そのような全ての修正及び変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
【0248】
参考文献
Ｃｕｉ Ｂ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｆａｎｇ Ｙ，Ｚｈｏｕ Ｐ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｙ．Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ ａｓ ａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｄｊｕｖａｎｔ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ．２０１８ Ａｐｒ；１７（４）：３３５－３４９．ｄｏｉ：１０．１０８０／１４７６０５８４．２０１８．１４５７４４３．Ｅｐｕｂ ２０１８ Ｍａｒ ３０．ＰＭＩＤ：２９５８０１０６．
Ｆｕ ＬＹ，Ｂｏｎｈｏｍｍｅ ＬＡ，Ｃｏｏｐｅｒ ＳＣ，Ｊｏｓｅｐｈ ＪＧ，Ｚｉｍｅｔ ＧＤ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ＨＰＶ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１４ Ａｐｒ ７；３２（１７）：１９０１－２０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１４．０１．０９１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４．ＰＭＩＤ：２４５３０４０１；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４２８５４３３．
Ｐａｓｓ ＲＦ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＣＭＶ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｔｈ ＭＦ５９ ａｄｊｕｖａｎｔ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ．２００９ Ｄｅｃ；４６ Ｓｕｐｐｌ ４（Ｓｕｐｐｌ ４）：Ｓ７３－６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｖ．２００９．０７．００２．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｌ ３１．ＰＭＩＤ：１９６４７４８０；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２８０５１９５．
Ｐａｓｓ ＲＦ，Ｚｈａｎｇ Ｃ，Ｅｖａｎｓ Ａ，Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｔ，Ａｎｄｒｅｗｓ Ｗ，Ｈｕａｎｇ ＭＬ，Ｃｏｒｅｙ Ｌ，Ｈｉｌｌ Ｊ，Ｄａｖｉｓ Ｅ，Ｆｌａｎｉｇａｎ Ｃ，Ｃｌｏｕｄ Ｇ．Ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｅｒｎａｌ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９ Ｍａｒ １９；３６０（１２）：１１９１－９．ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０８０４７４９．ＰＭＩＤ：１９２９７５７２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２７５３４２５．
Ｓｐａｅｔｅ ＲＲ．Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ＨＣＭＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．１９９１ Ｊｕｎ；２３（３ Ｓｕｐｐｌ ３）：９０－６．ＰＭＩＤ：１６４８８４３．
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Ｆｕ ＬＹ，Ｂｏｎｈｏｍｍｅ ＬＡ，Ｃｏｏｐｅｒ ＳＣ，Ｊｏｓｅｐｈ ＪＧ，Ｚｉｍｅｔ ＧＤ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅ ＨＰＶ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ：ａ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１４ Ａｐｒ ７；３２（１７）：１９０１－２０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１４．０１．０９１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４．ＰＭＩＤ：２４５３０４０１；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４２８５４３３．
Ｐａｓｓ ＲＦ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＣＭＶ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｖａｃｃｉｎｅ ｗｉｔｈ ＭＦ５９ ａｄｊｕｖａｎｔ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ．２００９ Ｄｅｃ；４６ Ｓｕｐｐｌ ４（Ｓｕｐｐｌ ４）：Ｓ７３－６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｃｖ．２００９．０７．００２．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｊｕｌ ３１．ＰＭＩＤ：１９６４７４８０；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２８０５１９５．
Ｐａｓｓ ＲＦ，Ｚｈａｎｇ Ｃ，Ｅｖａｎｓ Ａ，Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｔ，Ａｎｄｒｅｗｓ Ｗ，Ｈｕａｎｇ ＭＬ，Ｃｏｒｅｙ Ｌ，Ｈｉｌｌ Ｊ，Ｄａｖｉｓ Ｅ，Ｆｌａｎｉｇａｎ Ｃ，Ｃｌｏｕｄ Ｇ．Ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｔｅｒｎａｌ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００９ Ｍａｒ １９；３６０（１２）：１１９１－９．ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０８０４７４９．ＰＭＩＤ：１９２９７５７２；ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２７５３４２５．
Ｓｐａｅｔｅ ＲＲ．Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ＨＣＭＶ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．１９９１ Ｊｕｎ；２３（３ Ｓｕｐｐｌ ３）：９０－６．ＰＭＩＤ：１６４８８４３．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】