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特表2024-535056新規の相乗的組合せおよびガンを治療するためのその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】新規の相乗的組合せおよびガンを治療するためのその使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 45/06 20060101AFI20240918BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240918BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240918BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/366 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/40 20060101ALI20240918BHJP
A61K 33/24 20190101ALI20240918BHJP
【ＦＩ】
A61K45/06 ZNA
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 111
A61P43/00 121
A61K31/496
A61K31/5377
A61K31/366
A61K31/40
A61K33/24
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024516987
(86)(22)【出願日】2022-09-15
(85)【翻訳文提出日】2024-05-14
(86)【国際出願番号】 EP2022075708
(87)【国際公開番号】W WO2023041674
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】21197506.5
(32)【優先日】2021-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515010235
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ ド ボルドー
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＢＯＲＤＥＡＵＸ
【住所又は居所原語表記】３５， Ｐｌａｃｅ Ｐｅｙ Ｂｅｒｌａｎｄ， Ｆ－３３０００ Ｂｏｒｄｅａｕｘ， Ｆｒａｎｃｅ
(71)【出願人】
【識別番号】591100596
【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル
(74)【代理人】
【識別番号】100103034
【弁理士】
【氏名又は名称】野河 信久
(74)【代理人】
【識別番号】100159385
【弁理士】
【氏名又は名称】甲斐 伸二
(74)【代理人】
【識別番号】100163407
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 裕輔
(74)【代理人】
【識別番号】100166936
【弁理士】
【氏名又は名称】稲本 潔
(74)【代理人】
【識別番号】100189429
【弁理士】
【氏名又は名称】保田 英樹
(74)【代理人】
【識別番号】100213849
【弁理士】
【氏名又は名称】澄川 広司
(72)【発明者】
【氏名】グロセット，クリストフ
(72)【発明者】
【氏名】ハーゲドルン，マルタン
(72)【発明者】
【氏名】ラーハル，ファーラー
(72)【発明者】
【氏名】クバイ，ファトマ ゾーラ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA20
4C084AA24
4C084MA02
4C084MA17
4C084MA60
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC751
4C084ZC752
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA17
4C086BC05
4C086BC50
4C086BC73
4C086GA02
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA12
4C086HA12
4C086HA28
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA60
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC75
(57)【要約】
本発明は、新規の組成物と、組合せと、ＥＺＨ２を阻害する化合物及びその使用に関する方法であって、メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２に関連する腫瘍を治療及び／または予防する方法とに関する。より具体的には、本発明は、メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２に関連する腫瘍を治療及び／または予防する方法で使用する相乗的二剤併用治療用組成物であって、該方法は必要とする対象に治療有効量の前記組成物を投与することを含み、ＥＺＨ２阻害剤と１つのＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤またはスタチンとの組合せを含む組成物に関する。本発明はまた、相乗的三剤併用治療用組成物と、特定のタイプのガン及び腫瘍を治療及び／または予防するためのその使用方法であって、前記二剤併用治療用組成物と組み合わせて有効量の１つ以上の抗ガン剤または化学療法剤をさらに投与することを含む方法とに関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２に関連する腫瘍を治療及び／または予防する方法で使用する組成物であって、該方法は必要とする対象に治療有効量の前記組成物を投与することを含み、ＥＺＨ２阻害剤と１つのスタチンとの組合せを含む組成物。
【請求項2】
前記ＥＺＨ２阻害剤が、ＧＳＫ－１２６、ＵＮＣ１９９９、ＥＰＺ００５６８７、ＥＩ１、ＭＣ３６２９、ＧＳＫ９２６、ＧＳＫ３４３、ＧＳＫ５０３、ＣＰＩ－３６０、ＣＰＩ－１６９、ＣＰＩ－１２０５、タゼメトスタット、ＥＰＺ０１１９８９、ＺＬＤ１０３９、ＥＢＩ－２５１１、ピノメトスタット、リラメトスタット、ＪＱＥＺ５、ＰＲＯＴＡＣ ＭＳ１９４３、ＤＺＮｅｐ、ＭＣ１９４７、ＭＣ１９４８及び／またはＰＦ－０６８２１４９７から選択される、請求項１に記載の方法で使用する組成物。
【請求項3】
メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２に関連する腫瘍が、肝芽腫、びまん性内在性橋神経膠腫（ＤＩＰＧ）、びまん性正中神経膠腫（ＤＭＧ）、膀胱ガン、骨ガン、脳腫瘍、乳ガン、悪性リンパ腫、ラブドイド腫瘍、白血病、肺ガン、胃ガン、前立腺ガン、直腸結腸ガン、食道ガン、卵巣ガン、子宮ガン、肝臓ガン、精巣ガン、膵臓ガン、腎臓ガン、直腸ガン、甲状腺ガン、皮膚ガン、頭頸部ガンから選択される、請求項１または２に記載の方法で使用する組成物。
【請求項4】
前記１つのスタチンが、アトルバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン及びそれらのアナログから選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法で使用する組成物。
【請求項5】
前記ＥＺＨ２阻害剤がＧＳＫ－１２６またはタゼメトスタットである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法で使用する組成物。
【請求項6】
前記ＥＺＨ２阻害剤がＧＳＫ－１２６またはタゼメトスタットであり、前記スタチンがアトルバスタチンまたはシンバスタチンである、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法で使用する組成物。
【請求項7】
前記ＥＺＨ２阻害剤がＧＳＫ－１２６であり、ＧＳＫ－１２６が前記対象に２０～１５００ｍｇまたは５０～１２００ｍｇまたは１００～１０００ｍｇを含む用量で週２回静脈内投与される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法で使用する組成物。
【請求項8】
有効量の抗ガン剤を更に含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法で使用する組成物。
【請求項9】
前記抗ガン剤が、プラチナ化合物、タキサン誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン治療剤、アンドロゲン除去剤、アンドロゲン受容体剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗血管新生剤、免疫療法製剤、抗炎症薬、抗ガン作用を有する生物製剤、天然物質から製造された抗ガン製剤から選択される、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法で使用する組成物。
【請求項10】
前記抗ガン剤がシスプラチン、カルボプラチン及び／またはオキサリプラチンである、請求項９に記載の方法で使用する組成物。
【請求項11】
必要とする患者に静脈内経路、腸管外若しくは非腸管外経路または局所注入により投与される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法で使用する組成物。
【請求項12】
標準的な抗ガン処置、放射線療法または他の第一選択若しくは第二選択のガン治療法の後の再発または難治性患者に投与される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法で使用する組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［００１］本発明は、新規の相乗的組合せと、特定のタイプのガン及び腫瘍、特にヒストンメチルトランスフェラーゼｚｅｓｔｅホモログ２エンハンサー（ＥＺＨ２）に関連するガン及び腫瘍等を治療及び／または予防するためのその使用方法とに関する。本発明はまた、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２関連ガン及び／または腫瘍の治療及び／または予防に使用する前記相乗的組合せを含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、新規のマーカーｚｅｓｔｅホモログ２エンハンサー（ＥＺＨ２）と、高い再発確率または死亡確率の予後因子としてのＥＺＨ２の使用と、特定のタイプのガンに罹患している対象の予後を予測するためのバイオマーカーEZH2を分析する方法とに関する。
【背景技術】
【0002】
［００２］エピジェネティック修飾は、ＤＮＡメチル化及び脱メチル化、ヒストン修飾、クロマチン再構築等を通して、ＤＮＡ配列を変化させることなくクロマチン状態及び遺伝子発現を制御し得る。重要なエピジェネティック制御因子の１つであるポリコームグループタンパク質（ＰｃＧｓ）は、細胞増殖において重要な役割を果たしており、幹細胞の多能性と分化、さらには悪性形質転換における遺伝子発現異常の重要な因子である。ＰｃＧタンパク質は、維持複合体ポリコーム抑制複合体１（ＰＲＣ１）及び開始複合体ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）の２つのコア複合体を含む。ＰＲＣ１は、ＲＩＮＧ１Ａ及びＲＩＮＧ１Ｂユビキチンリガーゼを介して、ヒストンＨ２Ａのリジン１１９をモノユビキチン化することが知られている。ＰＲＣ２は、ヒストンＨ３のリジン２７におけるモノ、ジ、トリメチル化を触媒し、遺伝子転写を制御すると考えられている。
【0003】
［００３］ｚｅｓｔｅホモログ２エンハンサー（ＥＺＨ２）は、多くの生物種で確認されている進化的に保存された遺伝子であり、類似した構造モチーフとドメインを共有している。ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２は、そのＣ末端のＳＥＴドメインによって、ヒストンＨ３のリジン２７のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３）に対するＰＲＣ２の触媒サブユニットとして確認されており、標的遺伝子をサイレンシングし、様々な生物学的機能（たとえば、細胞周期、細胞増殖、細胞分化等）に関与している。ガンの進行におけるＥＺＨ２の役割も検討されている。ＥＺＨ２は、前立腺ガン、乳ガン、卵巣ガン等の様々な悪性腫瘍において異常に過剰発現する。ＥＺＨ２は、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３を媒介し、多くの悪性腫瘍モデルにおいて腫瘍の増殖や転移を促進する重要な因子として機能する。さらに、ＥＺＨ２の機能増強または喪失変異も様々なガンで発見されている。低分子阻害剤や遺伝子ノックダウンによってＥＺＨ２を阻害すると、ガン細胞の増殖や腫瘍形成が抑制されることを示す研究もある。ＰＣＲ２依存的にヒストン修飾因子としての役割を果たすだけでなく、ＥＺＨ２はガンにおいてＰＣＲ２やヒストンに依存しない働きもする。たとえば、ＥＺＨ２は神経膠芽腫では非ヒストンタンパク質ＳＴＡＴ３をメチル化し、去勢抵抗性前立腺ガン（ＣＲＰＣ）ではアンドロゲン受容体関連複合体に共活性因子として関与できる。Ｇａｎ Ｌらによって記載されているように（Biomark Res 6, 10 (2018).doi.org/10.1186/s40364-018-0122-2）、ガンにおけるＥＺＨ２の多様な機能は、異なる状況及び異なるタイプのガンにおけるその遺伝的、転写的、転写後及び翻訳後の制御に由来する。
【0004】
［００４］近年になって、ＥＺＨ２の発ガン性の役割を支持するさらなる知見が得られている。胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の２２％及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）の７％～１２％にＥＺＨ２のＣ末端触媒ＳＥＴドメイン内のチロシン６４１（Ｙ６４１）で反復するヘテロ接合点突然変異が生じることが、研究によって示されている。これによって、Ｈ３Ｋ２７のトリメチル化形態への変換を増大させる酵素活性の機能増強をもたらすことが示された。Ｙ６４１変異体（Ｙ６４１Ｆ、Ｙ６４１Ｎ、Ｙ６４１Ｓ、Ｙ６４１Ｃ及びＹ６４１Ｈ）は、非メチル化Ｈ３Ｋ２７のメチル化活性は低下しているが、Ｈ３ｋ２７のジメチル化形態に対する活性は亢進している。したがって、この変異体は野生型ＥＺＨ２と協働してＨ３Ｋ２７の定常状態をトリメチル化を好むように変え、ポリコーム標的の発現を抑制した。Ａ６７７及びＡ６８７残基のＥＺＨ２点突然変異は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）でも確認されており、同様にＨ３Ｋ２７の過剰トリメチル化につながっている。通常はＥＺＨ２活性に拮抗するその他のクロマチン制御因子のガン関連機能喪失変異の確認からも、ガンにおける変異型ＥＺＨ２の機能増強の役割がさらに裏付けられている。ＵＴＸ（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｔｅｔｒａｔｒｉｃｏｐｅｐｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔ ｇｅｎｅ ｏｎ Ｘ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）はヒストン脱メチル化酵素であり、ジメチル化及びトリメチル化Ｈ３Ｋ２７からメチル基を除去することによってＥＺＨ２活性に拮抗することで一部が機能する。ＵＴＸに影響を及ぼす不活性化変異は、多発性骨髄腫、髄芽腫、食道ガン、膀胱ガン、膵臓ガン、腎臓ガン等、いくつかのタイプのヒトガンで発生する。これらの変異には、ホモ接合体（女性）またはヘミ接合体（男性）の大規模な欠失、ナンセンス変異、小規模なフレームシフト挿入／欠失、未成熟終止コドンにつながるコンセンサススプライス部位変異が含まれる。ほぼすべての変異は、ＵＴＸの脱メチル化酵素活性に必須なＪｍｊＣドメインの欠損をもたらすと予測され、Ｈ３Ｋ２７トリメチル化レベルの上昇を引き起こすことが示されている。したがって、Ｋｉｍ ＫＨら（Targeting EZH2 in cancer. Nat Med. 2016;22(2):128-134.doi:10.1038/nm.4036）に記載されているように、ＵＴＸの機能喪失変異は、ＥＺＨ２の機能獲得変異によって引き起こされるものと類似している可能性がある。
【0005】
［００５］このような理解にもかかわらず、腫瘍及びガンの予防及び／または治療に対するＥＺＨ２阻害剤の有効性については、依然として議論の余地がある。いくつかの候補が臨床試験済または現在臨床試験中であるが、これまでのところ決定的な利用可能データはない。
【0006】
［００６］１つ目のＥＺＨ２阻害剤は、３－デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）であった。Ｓ－アデノシル－Ｌ－ホモシステイン（ＳＡＨ）ヒドロラーゼ阻害剤として知られるＤＺＮｅｐは、ＳＡＨの増加によって間接的にＥＺＨ２を阻害し、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン依存性ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を直接抑制する。ＤＺＮｅｐは、ヒストンのメチル化を全般的に阻害するが、ＥＺＨ２には特異的ではない。
【0007】
［００７］２つ目の候補ＧＳＫ－１２６（ＧＳＫ２８１６１２６としても知られる）は、野生型及びＹ６４１変異型ＥＺＨ２を同程度の力価で阻害すること、ＥＺＨ１（力価は１５０倍増）またはその他の２０のメチルトランスフェラーゼ（ＥＺＨ２に対して１０００倍以上の選択性）と比較して高い選択性を有することが示されている。再発／難治性固形腫瘍及び血液悪性腫瘍患者を対象に、ＧＳＫ－１２６（ＮＣＴ０２０８２９７７）の安全性、最大耐量（ＭＴＤ）、薬物動態、薬力学的効果を評価するための多施設共同第１相臨床試験が２０１９年に開始された。４１人の参加者（固形腫瘍２１人、リンパ腫２０人）に、５０～３０００ｍｇの漸増用量のＧＳＫ２８１６１２６を週２回、静脈注射用溶液として２８日間投与した（３週間投与／１週間休薬）。しかしながら、投与方法及び半減期が比較的短いことから有効な暴露が制限されたと共に、臨床活性のエビデンスが不十分で、臨床研究の継続が妥当ではないとの結果が示されたため、この臨床相は終了された（臨床試験番号ＮＣＴ０２０８２９７７参照）。この臨床相の結果は、Ｙａｐ ＴＡら（Clin Cancer Res. 2019 Dec 15;25(24):7331-7339）によっても報告されており、複数の固形腫瘍及びリンパ腫細胞株に対する感受性を示す前臨床データにもかかわらず、ＧＳＫ２８１６１２６は難治性／再発固形腫瘍及び血液悪性腫瘍患者においてＥＺＨ２を標的とする薬剤としては有効ではないと結論付けられている。この試験では、ＧＳＫ２８１６１２６の最大耐量（ＭＴＤ）が２，４００ｍｇとされたが、当該薬剤がこの量で示した臨床活性は不十分であり、標的外用量制限毒性（ＤＬＴ）によりそれ以上の用量増量は不可能となった。
【0008】
［００８］その他にも、とりわけＧＳＫ３４３、ＧＳＫ９２６、タゼメトスタット（Ｅ７４３８／ＥＰＺ６４３８）等、いくつかのＥＺＨ２のＳ－アデノシル－メチオニン競合阻害剤が開発されている。ＳＫ９２６及びＧＳＫ３４３は、乳ガン細胞及び前立腺ガン細胞において、ヒストンＨ３Ｋ２７ｍｅ３レベルを抑制し、ＥＺＨ２活性を阻害することができ、ＧＳＫ３４３は、ラットの薬物動態試験においてクリアランスが高いことから、生体外でのみ使用できる。
【0009】
［００９］タゼメトスタットは、高い力価と薬物動態学的特性を示し、経口投与が可能である。Ｗｉｅｓｅ Ｍら（Klin Padiatr. 2016 Apr;228(3):113-7）は、ＥＺＨ２及びその他のＰＲＣ２遺伝子（ＥＺＨ１、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ）の発現と小児多形膠芽腫（ＧＢＭ）患者の全生存率との相関、ならびにＨ３．３変異またはＨ３野生型を有する小児神経膠芽腫多型性／びまん性内在性橋神経膠腫／びまん性正中神経膠腫（ＧＢＭ／ＤＩＰＧ／ＤＭＧ）細胞におけるタゼメトスタットによるＥＺＨ２阻害の細胞毒性影響を調査した。しかしながら、Ｗｉｅｓｅらは、このＥＺＨ２阻害剤による治療はこれらの腫瘍において有望なアプローチではないと結論づけた。それでもなお、ＵＳＦＤＡは２０２０年６月、ＦＤＡが承認した検査で腫瘍がＥＺＨ２変異陽性であること認められ、以前に少なくとも２種類の全身療法を受けたことのある再発または難治性（Ｒ／Ｒ）濾胞性リンパ腫（ＦＬ）の成人患者及び満足のいく代替治療の選択肢がないＲ／ＲＦＬの成人患者に対して、ＥＺＨ２阻害剤タゼメトスタット（ＴＡＺＶＥＲＩＫ、Ｅｐｉｚｙｍｅ， Ｉｎｃ．）を早期承認した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
［００１０］このように、現在、メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２活性に関連する多数の悪性腫瘍を治療及び／または予防するための、より高い治療効果を有する新規の方法及び組成物が求められている。本発明は、この要求に対応し、新規の治療法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
［００１１］本発明は、ＥＺＨ２阻害剤と１つのスタチンとの組合せを含む相乗的二剤併用治療用組成物と、特定のタイプのガン及び腫瘍を治療及び／または予防するためのその使用方法であって、必要とする対象に治療有効量の前記組成物を投与することを含む方法とに関する。
【0012】
［００１２］本発明はまた、相乗的三剤併用治療用組成物と、特定のタイプのガン及び腫瘍を治療及び／または予防するためのその使用方法であって、上記二剤併用治療用組成物と組み合わせて有効量の１つ以上の抗ガン剤または化学療法剤をさらに投与することを含む方法とに関する。
【0013】
［００１３］本発明に係る相乗的二剤併用治療用及び三剤併用治療用組成物は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２に関連する特定のタイプのガン及び腫瘍の治療に特に有効である。
【0014】
［００１４］最も重要なことは、本発明に係る相乗的二剤併用治療及び三剤併用治療は、以前の臨床試験と比較して、ＥＺＨ２阻害剤の投与量を少なくとも半分に低減することが可能なため、前記腫瘍に対する治療効率を維持しつつ、はるかに低減された毒性を示すことである。実際、出願人は、ＧＳＫ－１２６等のＥＺＨ２阻害剤を１つと少なくとも１つのスタチン及び／または１つ以上の抗ガン剤若しくは化学療法剤との組合せを投与することにより、ガンまたは腫瘍がＧＳＫ－１２６に対して感作され、それによりＧＳＫ－１２６に対する患者の耐性が改善または低減されることを本明細書に示している。
【0015】
［００１５］本発明はさらに、ガンに罹患している対象、特に肝芽腫またはびまん性内在性橋神経膠腫（ＤＩＰＧ）に罹患している患者の予後不良のバイオマーカーとしてのＥＺＨ２の使用、及び前記対象の単離サンプルにおけるＥＺＨ２レベルを求めることを含む、前記対象の予後不良を予測する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】ＤＭＧ細胞が低用量でＧＳＫ－１２６阻害剤に感受性があること、及びＧＳＫ－１２６がＨ３ｋ２７ｍｅ３トリメチル化を阻害することを示す図である。（Ａ）一連のＤＭＧ生検（ｎ＝３５）において、正常脳（ｎ＝１０）と比較して、ＥＺＨ２転写産物が有意に過剰発現している、ＧＳＥ５００２１から取得したマイクロアレイデータである。破線四角で囲まれた範囲は発現中央値付近で再グループ化したサンプルを示す。ＤＭＧ生検と正常脳とのパラメトリックｔ検定である。（Ｂ）ウェスタンブロット法により検出されたＥＺＨ２タンパク質を発現する患者由来の細胞株を示す。（Ｃ～Ｄ）ＧＳＫ－１２６はＮＥＭ１５７ｉ及びＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ ＤＭＧ細胞の増殖を強く阻害し（Ｃ）、投与５日後に腫瘍細胞死を誘導している（Ｄ）。一元配置分散分析（ｎ＞３， ｐ＜０．０００１）、ボンフェローニの多重比較後検定。（Ｅ）ＧＳＫ－１２６処理ＮＥＭ１５７ｉ及びＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ ＤＭＧ細胞では、Ｈ３ｋ２７ｍｅ３トリメチル化が用量依存的に減少している。３回の独立した実験の代表的なブロット。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図2】ＤＭＧ細胞がＧＳＫ－１２６阻害剤に低用量で感受性があることを示す図である。（Ａ～Ｃ）ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ（Ａ）、ＮＥＭ１５７ｉ（Ｂ）及びＮＥＭ１６３ｉ（Ｃ）ＤＭＧ細胞の細胞生存率を、漸増用量のＧＳＫ－１２６の存在下で７２時間処理した後に測定した（ｎ＝３）。各細胞株について、ＩＣ５０を対応するグラフに示す。
【図3】ＧＳＫ－１２６処理ＤＩＰＧ細胞における脂質及びコレステロール合成に関与する遺伝子の発現の増加を示す図である。グラフは、１．５％ＤＭＳＯまたはＧＳＫ－１２６で処理したＮＥＭ１６３ｉ、ＮＥＭ１５７ｉ及びＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ細胞において、リアルタイム定量ＰＣＲにより測定したＨＭＧＣＳ、ＨＭＧＣＲ、ＬＤＬＲ、ＮＰＣ１及びＳＱＬＥ転写産物の正規化レベルを示す（各細胞株で測定したＩＣ５０、ｎ＝６、マン・ホイットニーの対応のないU検定）。ＧＡＰＤＨ転写産物は正規化のための内部基準として使用した。＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図4】ＧＳＫ－１２６処理ＤＩＰＧ細胞におけるＳＱＬＥ及びＨＭＧＣＲタンパク質の発現の増加を示す図である。１．５％ＤＭＳＯまたはＧＳＫ－１２６で処理したＮＥＭ１６３ｉ及びＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ細胞において、ウエスタン法で測定したＨＭＧＣＲ及びＳＱＬＥタンパク質のレベル（各細胞株で測定したＩＣ５０、ｎ＝４～５、マン・ホイットニーの対応のないU検定）。ＧＡＰＤＨ転写産物は正規化のための内部基準として使用した。２～４回の独立した実験の代表的なブロットを示す。＊：ｐ＜０．０５、 ＊＊：ｐ＜０．０１。
【図5】ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ及びＮＥＭ１５７ｉ ＤＭＧ細胞の生存率にコレステロール生合成経路酵素の阻害剤（用量をＸ軸に示す）の影響がないことを示す図である。（Ａ～Ｃ）コレステロール生合成経路に関与し、ＧＳＫ－１２６によって誘導される異なる酵素の３種類の化学的阻害剤［（Ａ）テルビナフィン：スクアレンエポキシダーゼ－ＳＱＬＥ、（Ｂ）アトルバスタチン：ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）還元酵素－ＨＭＧＳＣ１、（Ｃ）ＡＣＳＳ２阻害剤：アセテート依存性アセチル－ＣｏＡ合成酵素２－ＡＣＣＳ２］は、３０μＭまでＤＭＧ細胞の増殖に影響を及ぼさなかったことから、ＧＳＫ－１２６の非存在下では、これらの阻害剤に対する細胞の感受性が低いことが示唆される。一元配置分散分析（ｎ＝３、ｐ＜０．０００１）、ボンフェローニの多重比較後検定。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図6】ＤＭＧ細胞に対するＧＳＫ－１２６及びコレステロール生合成経路酵素の阻害剤を含む二剤併用治療の相乗効果を示す図である。（Ａ～Ｃ）ＤＭＧ細胞に対して増殖阻害効果を示さない用量として４μＭのＧＳＫ－１２６（開丸）、及び漸増用量のＡＣＳＳ２阻害剤（Ａ）、アトルバスタチン（Ｂ）、またはテルビナフィン（Ｃ）に暴露したＮＥＭ１５７ｉ及びＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ細胞（指定通り）の細胞増殖アッセイ。一元配置分散分析（ｎ＞３， ｐ＜０．０００１）、ボンフェローニの多重比較後検定。二剤併用治療は、単独では効果を示さないスタチンの低マイクロモル用量から有意な増殖抑制を示している（図３参照）。＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図7】新しい初代ＤＭＧ細胞株ＢＸｄｍｇ１の分子的及び表現型的特徴を示す図である。（Ａ）ＢＸｄｍｇ１初代細胞の特性評価。左上パネル：初期パッセージＢＸｄｍｇ１初代細胞の細胞形態を示す明視野顕微鏡画像。バー＝２００μｍ。中央上パネル：核の不規則性を示す細胞を取り込んだサイトブロック（Cytoblock preparation of cells）のＨＥ染色。右上パネル：Ｋｉ－６７染色による増殖状態。左下パネル：ＢＸｄｍｇ１細胞におけるＨ３Ｋ２７Ｍ変異の存在を示す。中央下パネル：ＢＸｄｍｇ１細胞におけるＨ３Ｋ２７ｍｅトリメチル化の状態。右下パネル：ＧＳＫ－１２６暴露後のＨ３Ｋ２７ｍｅの典型的な減少を示すヒストンタンパク単離のウェスタンブロット。（Ｂ、Ｃ）ＢＸｄｍｇ１の増殖はＧＳＫ－１２６によって阻害され、その際ＩＣ５０は１０．３６μＭで、その他のＤＭＧ細胞と同等の感受性を示した（図２参照）。一元配置分散分析（ｎ＝３、ｐ＜０．０００１）、ボンフェローニの多重比較後検定。（Ｄ）ＢＸｄｍｇ１細胞は、コレステロール生合成阻害剤への暴露に感受性がない。（Ｅ）ＧＳＫ－１２６とアトルバスタチン（Ａｔｏｒ）の併用処理は、ＧＳＫ－１２６またはアトルバスタチン単独よりも強い増殖阻害を示す。併用効果は低用量で認められるが、高用量では細胞毒性を示すため、高用量のＧＳＫ－１２６では失われる。一元配置分散分析（ｎ＝３、ｐ＜０．０００１）、ボンフェローニの多重比較後検定。ｎｓ：有意でない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図8】ＤＭＧ細胞遊走に対するＧＳＫ－１２６及びコレステロール生合成経路酵素の阻害剤の相乗効果を示す図である。（Ａ～Ｃ）ＮＥＭ１５７ｉ（Ａ）及びＮＥＭ１６３ｉ細胞（Ｂ）ならびにＢＸｄｍｇ１初代細胞（Ｃ）における創傷スクラッチアッセイによって明らかにされた併用処理における細胞遊走障害。一元配置分散分析（ｎ＝３、ｐ＜０．０００１）、ボンフェローニの多重比較後検定。ｎｓ：有意でない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図9】ＤＭＧスフェロイド形成に対するＧＳＫ－１２６及びコレステロール生合成経路酵素の阻害剤の相乗効果を示す図である。（Ａ、Ｂ、Ｄ）指定の阻害剤に暴露した後の、指定のＤＭＧグリオーマ細胞由来の代表的なスフェロイドの位相差顕微鏡写真。（Ｃ、Ｅ）対応するグラフの上に示すＤＭＧ細胞株由来のスフェロイド形成に対する処理効果の統計解析。表現型の基準は、スフェロイドが形成されるか、形成されないか（分散細胞）とした。フィッシャーの正確検定を用いて関連する処理と組合せ（併用）を比較した。ＧＳＫ－１２６の投与量は、ＮＥＭ１５７ｉについては２０μＭ、その他は１５μＭとした。＊＊＊：ｐ＜０．００１．
【図10】マウスにおけるＤＭＧ腫瘍発生に対するＧＳＫ－１２６及びコレステロール生合成経路酵素の阻害剤の相乗効果を示す図である。（Ａ）ＮＯＤ／ＬｔＳｚ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγ（ＮＳＧ）マウスの脳幹に移植したＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ－Ｌｕｃ細胞（ルシフェラーゼを発現）の、ＧＳＫ－１２６腹腔内投与後の同所腫瘍増殖阻害。指定の処理後、生物発光ライブイメージング及び統計解析により、すべてのマウスについて腫瘍増殖抑制が示された（溶媒コントロール：ＤＭＳＯ、ＧＳＫ－１２６）。グレイスケールバーは発現レベルを示し、薄いグレーの値は低発現、濃いグレーの値は高発現に相当する。パラメトリック検定としてスチューデントのｔ検定（ＤＭＳＯ：ｎ＝１８、ＧＳＫ－１２６：ｎ＝２３）。（Ｂ）非細胞毒性用量のＧＳＫ－１２６と非細胞毒性用量のアトルバスタチンを組み合わせて同じアプローチを実施した。両薬剤の組合せは有意な増殖抑制効果を示すが、単独処理では効果がない。バーは中央値と範囲を示す。一元配置分散分析（ＤＭＳＯ：ｎ＝１３、アトルバスタチン：ｎ＝１３、ＧＳＫ－１２６：ｎ＝１７、併用：ｎ＝１３、ｐ＜０．０００１）、ボンフェローニの多重比較後検定。（Ｃ）ニワトリＣＡＭ ＤＭＧモデルを用いて同様の腫瘍増殖阻害結果が得られ、併用処理では移植された腫瘍の血管新生表現型があまりみられなかったのに対し、単独処理では抗血管新生効果がまったくみられなかった。両側フィッシャーの正確検定。ｎｓ：有意でない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図11】ＥＺＨ２サイレンシングが生体内で肝芽腫の発生を阻害することを示す図である。（Ａ～Ｂ）Ｈｕｈ６細胞（Ａ）またはＨｅｐＧ２細胞（Ｂ）を、コントロールｓｉＲＮＡ（ＳｉＣＴＲ）またはＥＺＨ２に対するｓｉＲＮＡ（ＳｉＥＺＨ２）でトランスフェクトした。２４時間後、細胞を回収し、胚発生１０日目のニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）に移植した。腫瘍増殖を１１日目から１６日目まで観察した。両細胞株及び指定の条件について、左上パネル：１７日目にＣＡＭ上で増殖した腫瘍（レーン1）と、切除及びパラホルムアルデヒド固定後の腫瘍（レーン２）の代表画像。両細胞株について、右上パネル：ＳｉＣＴＲ腫瘍とＳｉＥＺＨ２腫瘍において、７日目に出血を認めたＣＡＭの数または出血を認めなかったＣＡＭの数を棒グラフで示す。両側フィッシャーの正確検定。両細胞株について、下パネル：ＳｉＥＺＨ２またはＳｉＣＴＲトランスフェクトＨｕｈ６細胞移植後６日目に腫瘍を切除し、重量を測定した。左パネル：指定の条件における摘出した腫瘍の代表画像。右パネル：棒グラフはｍｇ単位の腫瘍重量の平均値±ＳＤを表す。グループごとの解析卵の総数を対応する条件の上に括弧書きで示す。パラメトリック検定としてスチューデントのｔ検定。＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【図12】肝芽腫細胞の生存に対するシスプラチン単独または２種類のＥＺＨ２阻害剤の効果を示す図である。（Ａ～Ｂ）指定の通り、漸増濃度のシスプラチン（Ａ、上パネル）、ＧＳＫ－１２６（Ａ、下パネル）、またはＥＰＺ－６４３８（タゼメトスタット、Ｂ）の存在下でＨｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞を４８時間増殖させた。ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６(R) ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて細胞生存率とＩＣ５０を測定した。対応する条件のＩＣ５０は示す通りである。
【図13】二次元及び三次元培養条件における肝芽腫細胞の生存率に対するシスプラチンとＧＳＫ－１２６の併用効果を示す図である。（Ａ～Ｂ）指定の通り、ＧＳＫ－１２６単独、シスプラチン単独、または両者の組合せの存在下で、従来の二次元培養条件下で、または腫瘍スフェロイドとして、Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞を７２時間増殖させた。薬剤の濃度は、単独で使用した場合に肝芽腫細胞の５０％が死滅するように選択した（図１２の各細胞株と薬剤のＩＣ５０を参照）。（Ａ）ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６(R) ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて細胞の生存率を測定した（ｎ＝５、一元配置分散分析、ｐ＜０．０００１）、シダックの多重比較後検定。（Ｂ）カルセイン－ＡＭ基質（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Calcein-AM）を用いて生細胞を緑色に染色し、エチジウムホモダイマー（EthD-1, https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/12328897）を用いて死細胞を赤色に染色した。データは、ＧＳＫ－１２６及びシスプラチンが生体外で、二次元及び三次元条件下で増殖している肝芽腫細胞に対してさらなる抗腫瘍効果を有することを示している。＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【図14】ＥＺＨ２の除去がシスプラチンに対する肝芽腫細胞の感受性を増加させることを示す図である。（Ａ）Ｈｕｈ６（左）細胞及びＨｅｐＧ２（右）細胞を、コントロール（ＳｉＣＴＲ）または２つの異なるＳｉＥＺＨ２（ＳｉＥＺＨ２－１及びＳｉＥＺＨ２－２）でトランスフェクトし、漸増濃度のシスプラチンの存在下で７２時間増殖させた。ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６(R) ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて細胞生存率を測定した。（ｎ＝４、二元配置分散分析、ｐ＜０．０００１）、シダックの多重比較後検定。薄いグレーのアスタリスク：コントロール細胞とＳｉＥＺＨ２－１トランスフェクト細胞との間の細胞生存率の有意差。黒いアスタリスク：コントロール細胞とＳｉＥＺＨ２－２トランスフェクト細胞との間の細胞生存率の有意差。（Ｂ）コントロール（ＳｉＣＴＲ）またはｓｉＥＺＨ２トランスフェクトＨｅｐＧ２細胞を、１２μＭのシスプラチン（＝ＩＣ５０）存在下で腫瘍スフェロイドとして４８時間増殖させた。カルセイン－ＡＭ基質を用いて生細胞を緑色に染色し、ＥｔｈＤ－１を用いて死細胞を赤色に染色した（図１１Ｂ参照）。１つの代表図に３回の独立した実験を示す。ｎｓ：有意でない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図15】スタチンがＧＳＫ－１２６と相乗作用して肝芽腫細胞を根絶することを示す図である。（Ａ）Ｈｕｈ６細胞（左）及びＨｅｐＧ２細胞（右）を、漸増濃度のシンバスタチンまたはアトルバスタチンの存在下で７２時間処理した（ｎ＝３、一元配置分散分析、ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較後検定、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。（Ｂ）Ｈｕｈ６細胞（左）及びＨｅｐＧ２細胞（右）を、４μＭのシンバスタチンまたは８μＭのアトルバスタチンの非存在下または存在下で、漸増濃度のＧＳＫ－１２６（上パネル）またはシスプラチン（下パネル）の存在下で７２時間処理した。（ｎ＝３、二元配置分散分析、ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較後検定。（Ａ～Ｂ）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６(R) ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて全条件において細胞生存率とＩＣ５０を測定した。薄いグレーのアスタリスク：ＧＳＫ－１２６単独と指定の濃度のアトルバスタチンを組み合わせたＧＳＫ－１２６との間の細胞生存率の有意差。黒いアスタリスク：ＧＳＫ－１２６単独と指定の濃度のシンバスタチンを組み合わせたＧＳＫ－１２６との間の細胞生存率における有意差。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【図16】スタチンがシスプラチンの非存在下または存在下でＧＳＫ－１２６と相乗作用し、生体外で肝芽腫細胞を根絶することを示す図である。（Ａ～Ｂ）Ｈｕｈ６細胞（Ａ）及びＨｅｐＧ２細胞（Ｂ）を、漸増濃度のシンバスタチン（右パネル）またはアトルバスタチン（左パネル）の存在下で、３μＭのシスプラチンと組み合わせて、または組み合わせずに、３μＭのＧＳＫ－１２６で７２時間処理した。ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６(R) ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて各条件で細胞生存率を測定した（ｎ＝３、二元配置分散分析、ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較後検定。§：溶媒コントロール（ＤＭＳＯ）とＧＳＫ－１２６単独または試験対象の濃度のいずれかの指定のスタチンを組み合わせたＧＳＫ－１２６との間の細胞生存率の有意差。＊：溶媒コントロール（ＤＭＳＯ）とＧＳＫ－１２６＋シスプラチンまたは試験対象濃度のいずれかの指定のスタチンと組み合わせたＧＳＫ－１２６＋シスプラチンとの間の細胞生存率の有意差。＃：ＧＳＫ－１２６とＧＳＫ－１２６＋シスプラチンとの間の、指定のスタチンの指定の濃度における細胞生存率の有意差。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、＃＃：ｐ＜０．０１、＃＃＃：ｐ＜０．００１、＃＃＃＃：ｐ＜０．０００１、§§：ｐ＜０．０１、§§§：ｐ＜０．００１、§§§§：ｐ＜０．０００１。
【図17】スタチンがタゼメトスタット（ＥＰＺ－６４３８）に対する肝芽腫細胞の感受性を強く高めることを示す図である。８μＭのアトルバスタチンまたは４μＭのシンバスタチンの非存在下または存在下で、漸増濃度のタゼメトスタット存在下でＨｕｈ６細胞（左）とＨｅｐＧ２細胞（右）を７２時間処理した（各グラフの下の凡例に示す通り）。ＰｒｏｍｅｇａのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６(R) ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて各条件で細胞生存率及びＩＣ５０（各条件の括弧内の値を参照）を測定した（ｎ＝３、二元配置分散分析、ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較後検定。黒いアスタリスク：タゼメトスタット単独とシンバスタチン存在下でのタゼメトスタットとの間の細胞生存率の有意差。薄いグレーのアスタリスク：タゼメトスタット単独とアトルバスタチン存在下でのタゼメトスタットとの間の細胞生存率の有意差。＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【図18】肝芽腫におけるＥＺＨ２の発現の増加を示す図である。特に図１８ａは、我々のデータセット（gse104766, Hooks KB, Audoux J, Fazli H, Lesjean S, Ernault T, Dugot-Senant N, et al. New insights into diagnosis and therapeutic options for proliferative hepatoblastoma. Hepatology 2018;68:89-10）（ウィルコクソンの対応ペア符号付き検定）から、Ｃ１及びＣ２Ｂサブグループならびに非腫瘍性サンプル（本図及び以下ではＮＴ）と比較した増殖性Ｃ２ＡサブグループにおけるＥＺＨ２転写産物の発現の増加を示す図である。図１８ｂは、ＥＺＨ２転写産物の発現とＴＯＰ２Ａ転写産物の発現との間の両側ピアソンＲ相関を示したグラフである（gse104766, Hooks KB, Audoux J, Fazli H, Lesjean S, Ernault T, Dugot-Senant N, et al. New insights into diagnosis and therapeutic options for proliferative hepatoblastoma. Hepatology 2018;68:89-10）。Ｒ及びｐ値は示す通りである。図１８ｃは、Ｉｋｅｄａのデータセット（gse131329, Hiyama E. Gene expression profiling in hepatoblastoma cases of the Japanese Study Group for Pediatric Liver Tumors-2 (JPLT-2) trial): Science Repository OU; 2019 2019-02-12)、Ｃａｒｒｉｌｌｏ－Ｒｅｉｘａｃｈのデータセット(gse133039, Carrillo-Reixach J, Torrens L, Simon-Coma M, Royo L, Domingo-Sabat M, Abril-Fornaguera J, et al. Epigenetic footprint enables molecular risk stratification of hepatoblastoma with clinical implications. J Hepatol 2020;73:328-341）、Ｌｏｐｅｚ－Ｔｅｒｒａｄａのデータセット（gse75271, Sumazin P, Chen Y, Trevino LR, Sarabia SF, Hampton OA, Patel K, et al. Genomic analysis of hepatoblastoma identifies distinct molecular and prognostic subgroups. Hepatology 2017;65:104-121）、Ｋａｒｎｓのデータセット（gse81928, Valanejad L, Cast A, Wright M, Bissig KD, Karns R, Weirauch MT, et al. PARP1 activation increases expression of modified tumor suppressors and pathways underlying development of aggressive hepatoblastoma. Commun Biol 2018;1:67）、Ｂｕｅｎｄｉａのデータセット（Cairo S, Armengol C, De Reynies A, Wei Y, Thomas E, Renard CA, et al. Hepatic stem-like phenotype and interplay of Wnt/beta-catenin and Myc signaling in aggressive childhood liver cancer. Cancer Cell 2008;14:471-484）及びＫａｐｐｌｅｒのデータセット（gse151347, Eichenmuller M, Trippel F, Kreuder M, Beck A, Schwarzmayr T, Haberle B, et al. The genomic landscape of hepatoblastoma and their progenies with HCC-like features. J Hepatol 2014;61:1312-1320）から肝芽腫及び非腫瘍肝組織におけるＥＺＨ２転写産物の発現増加を示す図である。マン・ホイットニーの対応のないＵ検定。＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【図19】肝芽腫データセットにおけるＥＺＨ２及びＴＯＰ２Ａ転写産物のレベル間の正の相関を示す図である。グラフは、Ｉｋｅｄａのデータセット（gse131329, Hiyama E. Gene expression profiling in hepatoblastoma cases of the Japanese Study Group for Pediatric Liver Tumors-2 (JPLT-2) trial:Science Repository OU; 2019 2019-02-12）、Ｃａｒｒｉｌｌｏ－Ｒｅｉｘａｃｈのデータセット（gse133039, Carrillo-Reixach J, Torrens L, Simon-Coma M, Royo L, Domingo-Sabat M, Abril-Fornaguera J, et al. Epigenetic footprint enables molecular risk stratification of hepatoblastoma with clinical implications. J Hepatol 2020;73:328-341）、Ｌｏｐｅｚ－Ｔｅｒｒａｄａのデータセット（gse75271, Sumazin P, Chen Y, Trevino LR, Sarabia SF, Hampton OA, Patel K, et al. Genomic analysis of hepatoblastoma identifies distinct molecular and prognostic subgroups. Hepatology 2017;65:104-121）、Ｋａｒｎｓのデータセット（gse81928, Valanejad L, Cast A, Wright M, Bissig KD, Karns R, Weirauch MT, et al. PARP1 activation increases expression of modified tumor suppressors and pathways underlying development of aggressive hepatoblastoma. Commun Biol 2018;1:67）、Ｂｕｅｎｄｉａのデータセット（Cairo S, Armengol C, De Reynies A, Wei Y, Thomas E, Renard CA, et al. Hepatic stem-like phenotype and interplay of Wnt/beta-catenin and Myc signaling in aggressive childhood liver cancer. Cancer Cell 2008;14:471-484）及びＫａｐｐｌｅｒのデータセット（gse151347, Eichenmuller M, Trippel F, Kreuder M, Beck A, Schwarzmayr T, Haberle B, et al. The genomic landscape of hepatoblastoma and their progenies with HCC-like features. J Hepatol 2014;61:1312-1320）からＨＢサンプルにおけるＥＺＨ２転写産物の発現とＴＯＰ２Ａ転写産物の発現との間の両側ピアソンＲ相関を示している。各データセットについて、Ｒ及びｐ値は対応するグラフに示す通りである。
【図20】ＥＺＨ２発現が腫瘍再発及び患者死亡と相関することを示す図である。ＥＺＨ２転写産物発現と臨床的または組織学的特徴との間の相関分析。図２０ａ：ステージ（gse75271、Sumazin P、Chen Y、Trevino LR、Sarabia SF、Hampton OA、Patel K、et al. Genomic analysis of hepatoblastoma identifies distinct molecular and prognostic subgroups. Hepatology 2017;65:104-121）、図２０ｂ：指定の病理組織学的サブタイプ（gse75271, Sumazin P, Chen Y, Trevino LR, Sarabia SF, Hampton OA, Patel K, et al. Genomic analysis of hepatoblastoma identifies distinct molecular and prognostic subgroups. Hepatology 2017;65:104-121）、図２０ｃ：寛解及び再発（gse133039, Carrillo-Reixach J, Torrens L, Simon-Coma M, Royo L, Domingo-Sabat M, Abril-Fornaguera J, et al. Epigenetic footprint enables molecular risk stratification of hepatoblastoma with clinical implications. J Hepatol 2020;73:328-341、図２０ｄ：ＰＲＥＴＥＸＴ放射線画像病期分類システム（gse131329, Hiyama E. Gene expression profiling in hepatoblastoma cases of the Japanese Study Group for Pediatric Liver Tumors-2 (JPLT-2) trial: Science Repository OU; 2019 2019-02-12）、図２０ｅ：生存患者と死亡患者（MAS5.0 - u133a, Buendia et al dataset (Cairo S, Armengol C, De Reynies A, Wei Y, Thomas E, Renard CA, et al. Hepatic stem-like phenotype and interplay of Wnt/beta-catenin and Myc signaling in aggressive childhood liver cancer. Cancer Cell 2008;14:471-484）。図２０ａ～ｄについて、一元配置分散分析、＊＊：ｐ＜０．０１、シダックの多重比較後検定。図２０ｅについて、マン・ホイットニーの対応のないU検定。ｎｓ：有意でない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１．
【図21】ＥＺＨ２サイレンシングが、細胞老化を誘導することによって肝芽腫細胞の増殖を阻害することを示す図である。図２１ａ：２つの異なるｓｉＲＮＡ（図２１ａ～ｅ以降の図に示すｓｉＥＺＨ２－１またはｓｉＥＺＨ２－２）を用いたコントロール（ｓｉＣＴＲＬ）及びＥＺＨ２除去Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）におけるＥＺＨ２タンパク質のレベル。図２１ａ及びｄ：３回以上の独立した実験の代表的なブロットを切り取った画像で示す（ローディングコントロール：ＧＡＰＤＨ）。図２１ｂ：ＥＺＨ２除去Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）とｓｉＣＴＲＬ細胞の増殖（５６５ｎｍにおける吸光度）（ｎ＝３、二元配置分散分析法、＊＊＊：ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較後検定）。図２１ｃ：ｓｉＣＴＲＬとＥＺＨ２除去Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）で測定した老化。代表的な実験を示し、棒グラフは平均値±標準偏差（ＳＤ）を示す（ｎ＝５、一元配置分散分析、＊＊＊：ｐ＜０．００１、シダックの多重比較後検定）。図２１ｄ：ＥＺＨ２除去Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）とｓｉＣＴＲＬにおける細胞周期阻害タンパク質Ｐ１６及びＰ２１の相対レベル。図２１ｅ：ＥＺＨ２除去Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）とｓｉＣＴＲＬにおけるカスパーゼ３／７活性を示すグラフ（ｎ＝３、一元配置分散分析、有意でない、Ｓｉｄａｋの多重比較後検定）。ｎ＝３、一元配置分散分析、有意でない、シダックの多重比較後検定）。ｎｓ：有意でない、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【図22】：ＥＺＨ２サイレンシングが肝芽腫細胞の遊走及びヒストンＨ３のリジン２７のトリメチル化を減少させることを示す図である。図２２ａ：指定の通りｓｉＥＺＨ２－１またはｓｉＥＺＨ２－２を用いたＥＺＨ２除去Ｈｕｈ６細胞とｓｉＣＴＲＬの遊走。上パネル：４回の独立した実験の代表画像。下パネル：棒グラフは平均値±ＳＤを示す（ｎ＝４、二元配置分散分析法、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較後検定）。図２２ｂ：ｓｉＣＴＲＬとＥＺＨ２除去Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３及び総ヒストンＨ３タンパク質の相対レベル。３回の独立した実験の代表的なブロットを切り取った画像で示す（ローディングコントロール：ヒストンＨ３）。＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【図23】ＥＺＨ２がそのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を介して肝芽腫におけるＥＲＫシグナル伝達を増強することを示す図である。図２３ａ：指定の通りｓｉＥＺＨ２－１またはｓｉＥＺＨ２－２を用いたｓｉＣＴＲＬとＥＺＨ２欠失Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）における総ＥＲＫ及びリン酸化ＥＲＫ（ｐ－ＥＲＫ）タンパク質のレベルを示す。図２３ｂ：空の遺伝子カセット（ＬＶ－ＣＴＲＬ）、野生型ＥＺＨ２タンパク質（ＬＶ－ＥＺＨ２カセット）、またはＥＺＨ２タンパク質のＨ６９８Ａ変異型（ＬＶ－ＥＺＨ２＊カセット）を発現するＨｕｈ６細胞（左）及びＨｅｐＧ２細胞（右）における総ＥＲＫ及びリン酸化ＥＲＫ（ｐ－ＥＲＫ）タンパク質のレベルを示す。図２３ａ～ｂ：３つの実験の代表的なブロットを切り取った画像で示す（ローディングコントロール：総タンパク質）。
【図24】ＥＺＨ２がそのメチルトランスフェラーゼ活性を介して肝芽腫のガン遺伝子として作用することを示す図である。図２４ａ：ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼドメインに対応するコード配列を示す。上パネル：野生型（ＷＴ）配列。下パネル：６８９残基のヒスチジン（Ｈ）の代わりにアラニン（Ａ）をコードする変異配列（Ｈ６９８Ａ変異体：ＥＺＨ２＊と称する）。図２４ｂ：ＬＶ－ＣＴＲＬ（空遺伝子カセット）、ＬＶ－ＥＺＨ２またはＬＶ－ＥＺＨ２＊で形質導入したＨｕｈ６細胞（左）及びＨｅｐＧ２細胞（右）における内因性かつトランスジェニックＥＺＨ２及びＥＺＨ２＊タンパク質のレベルを示す。３回以上の独立した実験の代表的なブロットを切り取った画像で示す（ローディングコントロール：ＧＡＰＤＨ）。図２４ｃ：空のカセット（ＬＶ－ＣＴＲＬ）、野生型（ＬＶ－ＥＺＨ２）、またはＨ６９８Ａ変異ＥＺＨ２タンパク質（ＬＶ－ＥＺＨ２＊）を発現する形質導入Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）の細胞増殖（５６５ｎｍにおける吸光度）を示す（ｎ＝３、二元配置分散分析、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較後検定）。図２４ｄ：ＣＴＲＬカセット、ＥＺＨ２、またはＥＺＨ２＊を発現するＨｕｈ６細胞（上）及びＨｅｐＧ２細胞（下）由来の代表的な９６時間培養スフェロイドの位相差顕微鏡写真を示す。図２４ｅ：空のカセット（ＬＶ－ＣＴＲＬ）、野生型（ＬＶ－ＥＺＨ２）、またはＨ６９８Ａ変異ＥＺＨ２タンパク質（ＬＶ－ＥＺＨ２＊）を発現するＨｕｈ６細胞（左）及びＨｅｐＧ２細胞（右）におけるスフェロイド表面積（ｍｍ２）を示すグラフ（ｎ＝４、一元配置分散分析、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較後検定）．ｎｓ：有意でない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１．
【図25】肝芽腫細胞において、シスプラチン耐性が部分的にＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性によって媒介されることを示す図である。空のカセット（ＬＶ－ＣＴＲＬ）、野生型（ＬＶ－ＥＺＨ２）、またはＨ６９８Ａ変異ＥＺＨ２タンパク質（ＬＶ－ＥＺＨ２＊）を発現するＨｕｈ６細胞（左）及びＨｅｐＧ２細胞（右）のシスプラチンに対する応答。グラフは、漸増用量のシスプラチンで処理した生存Ｈｕｈ６細胞（左）及びＨｅｐＧ２細胞（右）の割合を示す（ｎ＝３、バー＝平均値±ＳＤ、二元配置分散分析、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較後検定）。＊：ｐ＜０．０５、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【図26】ＥＺＨ２の除去が肝芽腫細胞におけるＨＭＧＣＲレベルを低下させることを示す図である。図２６ａ：ｓｉＥＺＨ２－１とｓｉＣＴＲＬ Ｈｕｈ６細胞におけるプロテオーム解析によって測定されたタンパク質レベルの倍数変化（Ｘ軸、ｌｏｇ２）とｑ値（Ｙ軸、ｌｏｇ１０）のボルケーノプロット。ＥＺＨ２除去細胞で有意に下方制御されたタンパク質及び有意に上方制御されたタンパク質をそれぞれ左と右の破線枠内に示す。ＨＭＧＣＲタンパク質を大きな黒点で表し、矢印で示す。図２６ｂ：２つの異なるｓｉＲＮＡ（指定のｓｉＥＺＨ２－１またはｓｉＥＺＨ２－２）を用いたコントロール（ｓｉＣＴＲＬ）及びＥＺＨ２除去Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）におけるＨＭＧＣＲタンパク質のレベル。３回以上の独立した実験の代表的なブロットを画像に示す（ローディングコントロール：ＧＡＰＤＨ）。ＨＭＧＣＲタンパク質を９８ｋＤａの帯形状として示す。
【図27】ＧＳＫ－１２６によるＥＺＨ２ヒストンメチルトランスフェラーゼの不活性化が、肝芽腫細胞においてＨＭＧＣＲレベル及び脂質合成を誘導することを示す図である。図２７ａ：コントロール（ＤＭＳＯ処理）とＧＳＫ－１２６処理Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）におけるＨ３Ｋ２７ｍｅ３及び総Ｈ３タンパク質の相対レベル（ＧＳＫ－１２６はＩＣ５０で使用、Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞に対してそれぞれ６μＭ及び８μＭ）。３回の独立した実験の代表的なブロットを切り取った画像で示す（ローディングコントロール：ヒストンＨ３）。図２７ｂ：コントロール（ＤＭＳＯ）とＧＳＫ－１２６処理Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）におけるＨＭＧＣＲタンパク質のレベル。３回の独立した実験の代表的なブロットを画像で示す（ローディングコントロール：ＧＡＰＤＨ）。図２７ｃ：コントロール（ＤＭＳＯ）とＧＳＫ－１２６処理Ｈｕｈ６細胞（左）またはＨｅｐＧ２細胞（右）における脂質のレベル。脂質顆粒を細胞質内の濃い色の顆粒として示す。３回の独立した実験の代表画像を示す。
【図28】ＧＳＫ－１２６が、アフリカツメガエル胚においてシスプラチンよりも毒性が低いことを示す図である。アフリカツメガエル胚を、各パネルの下部に示すとおり、漸増濃度のシスプラチンまたはＧＳＫ－１２６の存在下で成長させた。３回の独立した実験の代表画像。
【図29】ＧＳＫ－１２６＋スタチンが肝芽腫細胞のクローン原性を完全に阻害することを示す図である。肝芽腫細胞の生存及び増殖を、クローン原性アッセイを用いて評価した。Ｈｕｈ６細胞（上パネル）及びＨｅｐＧ２細胞（下パネル）を、ＤＭＳＯ（コントロール：ＣＴＲＬ）、ＩＣ２５用量（Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞に対してそれぞれ３μＭ及び４μＭ）のＧＳＫ－１２６、スタチン（ＡＴＲ：アトルバスタチン８μＭ、ＳＩＭ：シンバスタチン４μＭ）、またはその両方で処理した。細胞プレーティング（cell plating）の１０日後、コロニーをクリスタルバイオレットで染色し、Ｆｕｓｉｏｎ ＦＸ（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ）を用いてプレートを撮像した。３回の独立した実験の代表画像。
【図30】ＧＳＫ－１２６＋スタチンが肝芽腫細胞の遊走を阻害することを示す図である。Ｈｕｈ６細胞の遊走を、創傷治癒試験によって評価した。Ｈｕｈ６細胞を、ＤＭＳＯ（コントロール：ＣＴＲＬ）、ＩＣ２５用量（Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞に対してそれぞれ３μＭ及び４μＭ）のＧＳＫ－１２６、スタチン（ＡＴＲ：アトルバスタチン８μＭ、ＳＩＭ：シンバスタチン４μＭ）、またはその両方で処理した。細胞プレーティングと創傷誘導の後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅライブセル解析システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて、相対的創傷密度の割合を観察した。上パネル：創傷誘導から２０時間後の遊走Ｈｕｈ６細胞の３回の独立した実験の代表画像。下パネル：指定薬剤で処理したＨｕｈ６細胞遊走の動態解析。棒グラフは平均値±ＳＤを示す（ｎ＝３、２４時間時点の二元配置分散分析、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、シダックの多重比較後検定）。＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図31】ＧＳＫ－１２６－アトルバスタチンの組合せが、肝機能及び腎機能に影響を与えることなく、生体内での肝芽腫発生を阻害することを示す図である。図３１ａ：ビークル（週３回、１％ＤＭＳＯ含有ＰＢＳ）、シスプラチン（週２回、１ｍｇ／ｋｇ）、ＧＳＫ－１２６（週３回、５０ｍｇ／ｋｇ）、アトルバスタチン（ＡＴＲ、週３回、２０ｍｇ／ｋｇ）、またはＧＳＫ－１２６＋アトルバスタチンで処理した異なるマウス群を表す模式図。図３１ｂ：日単位の時間とｍｍ３単位の腫瘍体積との間の相関を示すグラフ。二元配置分散分析（ビークル：ｎ＝８、シスプラチン：ｎ＝７、ＡＴＲ：ｎ＝７、ＧＳＫ－１２６：ｎ＝７、併用：ｎ＝８、ｐ＜０．０００１）、テューキーの多重比較後検定。図３１ｃ：２８日目に安楽死させたマウスから摘出した腫瘍の画像。図３１ｄ：異なるマウス群におけるＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、クレアチニン及び尿素の血中レベル。ｎｓ：有意でない、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0017】
［００４７］しがたって、本発明は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２に関連するガン及び腫瘍を治療及び／または予防する方法で使用する組合せ及び相乗的組成物であって、ＥＺＨ２阻害剤と１つ以上のスタチンとの組合せを含む組成物に関する。本発明はまた、ガンを治療及び／または予防する方法であって、必要とする対象に治療有効量の前記組成物を投与することを含む方法に関する。以下、本明細書において、前記相乗的組成物または組合せを二剤併用治療または組合せ治療と呼ぶ。
【0018】
［００４８］典型的には、ＥＺＨ２阻害剤はＥＺＨ２のＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）競合的阻害剤であり、とりわけＦｉｏｒａｖａｎｔｉ Ｒら（Chem. Rec. 2018, 18, 1818-1832）に記載されるように、２－ピリドン基またはテトラメチルピペリジノベンズアミド基を有する。
【0019】
［００４９］一例として、ＥＺＨ２阻害剤は、中心骨格として二環式芳香族複素環を有する触媒２－ピリドンＥＺＨ２阻害剤を含んでいてもよく、ＧＳＫ－１２６またはＧＳＫ２８１６１２６（１－［（２Ｓ）－ブタン－２－イル］－Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－３－メチル－６－［６－（１－ピペラジニル）－３－ピリジニル］－４－インドールカルボキサミド）、ＵＮＣ１９９９（Ｎ－［（６－メチル－２－オキソ－４－プロピル－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－１－プロパン－２－イル－６－［６－（４－プロパン－２－イルピペラジン－１－イル）ピリジン－３－イル］インダゾール－４－カルボキサミド）、ＥＰＺ００５６８７（１－シクロペンチル－Ｎ－［（４,６－ジメチル－２－オキソ－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－６－［４－（モルホリン－４－イルメチル）フェニル］インダゾール－４－カルボキサミド）及びＥＩ１（６－シアノ－Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－ｌＨ－ピリジン－３－イル）メチル］－ｌ－ペンタン－３－イルインドール－４－カルボキサミド）等が挙げられるが、これに限定されるものではない。また、ＥＰＺ００５６８７及びＧＳＫ－１２６の簡略化されたアナログであり、２－ピリドン基にアミド結合を介して連結されたピラゾール及びピロール系の化合物からなるＭＣ３６２９、ＧＳＫ９２６（Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－６－［６－（４－メチルピペラジン－１－イル）ピリジン－３－イル］－１－プロパン－２－イルインダゾール－４－カルボキサミド）、ＧＳＫ３４３（Ｎ－［（６－メチル－２－オキソ－４－プロピル－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－６－［２－（４－メチルピペラジン－１－イル）ピリジン－４－イル］－１－プロパン－２－イルインダゾール－４－カルボキサミド）、ＧＳＫ５０３（Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－３－メチル－６－［６－（４－メチルピペラジン－１－イル）ピリジン－３－イル］－１－プロパン－２－イルインダゾール－４－カルボキサミド）が挙げられる。さらに、アミド機能を介してインドール核に連結された２－ピリドン基を有するＣＰＩ－３６０、そのアナログＣＰＩ－１６９、及びＣＰＩ－１２０５またはリラメトスタット（Ｎ－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－ｌＨ－ピリジン－３－イル）メチル］－２－メチル－ｌ－［（ｌＲ）－ｌ－［ｌ－（２，２，２－トリフルオロエチル）ピペリジン－４－イル］エチル］インドール－３－カルボキサミド）が挙げられる。
【0020】
［００５０］また、ＥＰＺ－６４３８またはＥ７４３８（Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－３－［エチル（オキサン－４－イル）アミノ］－２－メチル－５－［４－（モルホリン－４－イルメチル）フェニル］ベンズアミドとも称されるタゼメトスタット、ならびに別名１５９８３８３－４０－４と称されるＥＰＺ０１１９８９（Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－３－［エチル－［４－［２－メトキシエチル（メチル）アミノ］シクロヘキシル］アミノ］－２－メチル－５－（３－モルホリン－４－イルプロプ－１－イニル）ベンズアミド）及び別名１８２６８６５－４６－６と称されるＺＬＤ１０３９（３－［エチル（オキサン－４－イル）アミノ］－２－メチル－Ｎ－［（１－メチル－３－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロ－２Ｈ－イソキノリン－４－イル）メチル］－５－［６－（４－メチルピペラジン－１－イル）ピリジン－３－イル］ベンズアミド）の２つの経口入手可能なタゼメトスタットのベンズアミドメチル－２－ピリドンアナログが挙げられる。タゼメトスタットのその他のアナログとしては、ＥＢＩ－２５１１（Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－５－エチル－６－［エチル（オキサン－４－イル）アミノ］－２－（１－プロパン－２－イルピペリジン－４－イル）－１－ベンゾフラン－４－カルボキサミド）、ピノメトスタット（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－２－（６－アミノプリン－９－イル）－５－［［［３－［２－（６－ｔｅｒｔ－ブチル－１Ｈ－ベンズイミダゾール－２－イル）エチル］シクロブチル］－プロパン－２－イルアミノ］メチル］オキソラン－３，４－ジオール）、リラメトスタット（Ｎ－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－２－メチル－１－［（１Ｒ）－１－［１－（２，２，２－トリフルオロエチル）ピペリジン－４－イル］エチル］インドール－３－カルボキサミド）が挙げられる。
【0021】
［００５１］さらに、ＪＱＥ５（１－イソプロピル－Ｎ－（（６－メチル－２－オキソ－４－プロピル－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル）－６－（６－（４－メチルピペラジン－１－イル）ピリジン－３－イル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｂ］ピリジン－４－カルボキサミド）とも呼ばれるＪＱＥＺ５、ＰＲＯＴＡＣ（ＰＲＯｔｅｏｌｙｓｉｓ ＴＡｒｇｅｔｉｎｇ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）ＭＳ１９４３（Feral et al. , Adv. Therap. 2020, 3, 2000148参照）、ＤＺＮｅｐ（（ｌＳ，２Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノイミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－ｌ－イル）－３－（ヒドロキシメチル）シクロペント－３－エン－ｌ，２－ジオール））、ＭＣ１９４７、ＭＣ１９４８が挙げられる。
【0022】
［００５２］さらに、２－ピリドン基に加えて３，４－ジヒドロイソキノリン基を含む触媒ＥＺＨ２阻害剤であるＰＦ－０６８２１４９７化合物が挙げられる。完全な化学名は、５，８－ジクロロ－２－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－１Ｈ－ピリジン－３－イル）メチル］－７－［（Ｒ）－メトキシ（オキセタン－３－イル）メチル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－１－オンである。
【0023】
［００５３］本発明に係る相乗的二剤併用治療及び三剤併用治療用組成物において使用することができるその他の選択的ＥＺＨ２阻害剤としては、以下が挙げられる。
・５．８－ジクロロ－２－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－ピリジン－３－イル）メチル］－７－ ［メトキシ（オキセタン－３－イル）メチル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２／－／）－オン
・５．８－ジクロロ－２－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－ピリジン－３－イル）メチル］－７－［（Ｒ）－メトキシ（オキセタン－３－イル）メチル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン
・５．８－ジクロロ－２－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－ピリジン－３－イル）メチル］－７－［（Ｓ）－メトキシ（オキセタン－３－イル）メチル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２／－／）－オン
・５－ブロモ－８－クロロ－２－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－７－（１ ，４－ジメチル－ｆ／－／－１ ，２，３－トリアゾール－５－イル）－３，４－ジヒドロイソキノリン－１ （２／－／）－オン
・ ５， ８－ジクロロ－７－（３，５－ジメチル－１，２－オキサゾール－４－イル）－２－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－１｛２Ｈ）－オン
・Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－５－［エチル（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）アミノ］－４－メチル－４'－（モルホリン－４－イルメチル）ビフェニル－３－カルボキサミド
・Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－５－［エチル（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）アミノ］－４－メチル－４'－（モルホリン－４－イルメチル）ビフェニル－３－カルボキサミド
・Ｎ－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－２－メチル－１－［（１Ｒ）－１－［１－（２，２，２－トリフルオロエチル）ピペリジン－４－イル］エチル］－１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド
・Ｎ－（４，６－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イルメチル）－１－イソプロピル－３－メチル－６－［６－（４－メチルピペラジン－１－イル）ピリジン－３－イル］－１Ｈ－インドール－４－カルボキサミド
・Ｎ－［（６－メチル－２－オキソ－４－プロピル－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－６－［２－（４－メチルピペラジン－１－イル）ピリジン－４－イル］－１－（プロパン－２－イル）－１Ｈ－インダゾール－４－カルボキサミド
・５．８－ジクロロ－２－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－ピリジン－３－イル）メチル］－７－ ［メトキシ（オキセタン－３－イル）メチル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２／－／）－オン
・５．８－ジクロロ－２－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－ピリジン－３－イル）メチル］－７－［（Ｒ）－メトキシ（オキセタン－３－イル）メチル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２Ｈ）－オン
・５．８－ジクロロ－２－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－ピリジン－３－イル）メチル］－７－［（Ｓ）－メトキシ（オキセタン－３－イル）メチル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－１（２／－／）－オン
・５－ブロモ－８－クロロ－２－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－７－（１ ，４－ジメチル－ｆ／－／－１ ，２，３－トリアゾール－５－イル）－３，４－ジヒドロイソキノリン－１ （２／－／）－オン
・ ５， ８－ジクロロ－７－（３，５－ジメチル－１，２－オキサゾール－４－イル）－２－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－３，４－ジヒドロイソキノリン－１｛２Ｈ）－オン
・Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－５－［エチル（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）アミノ］－４－メチル－４'－（モルホリン－４－イルメチル）ビフェニル－３－カルボキサミド
・Ｎ－［（４，６－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－５－［エチル（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）アミノ］－４－メチル－４'－（モルホリン－４－イルメチル）ビフェニル－３－カルボキサミド
・Ｎ－［（４－メトキシ－６－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－２－メチル－１－［（１Ｒ）－１－［１－（２，２，２－トリフルオロエチル）ピペリジン－４－イル］エチル］－１Ｈ－インドール－３－カルボキサミド
・Ｎ－（４，６－ジメチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリジン－３－イルメチル）－１－イソプロピル－３－メチル－６－［６－（４－メチルピペラジン－１－イル）ピリジン－３－イル］－１Ｈ－インドール－４－カルボキサミド
・Ｎ－［（６－メチル－２－オキソ－４－プロピル－１，２－ジヒドロピリジン－３－イル）メチル］－６－［２－（４－メチルピペラジン－１－イル）ピリジン－４－イル］－１－（プロパン－２－イル）－１Ｈ－インダゾール－４－カルボキサミド
【0024】
［００５４］前記１つのスタチンは、アトルバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、メバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、セリバスタチン及び／またはそれらのアナログからなる群から選択することができる。スタチンは処方があれば入手可能である。臨床研究中のものがさらにいくつかある。ただし、本発明に係る二剤併用治療に使用される前記１つのスタチンはロバスタチンを含まないことが好ましいため、いかなるロバスタチンも含まないものとする。
【0025】
［００５５］スタチンは、脂質低下化合物として機能する３－ヒドロキシ－３－メチル－グルタリル－コエンザイムＡ還元酵素阻害剤（ＨＭＧ－ＣｏＡ阻害剤またはＨＭＧＣＲ阻害剤としても知られる）である化合物群である。ＨＭＧ－ＣｏＡは、メバロン酸経路、すなわちコレステロール及びその他のイソプレノイドを産生する代謝経路の律速酵素である酵素｛すなわち、ＮＡＤＨ依存性（ＥＣ １．１．１．８８）、ＮＡＤＰＨ依存性（ＥＣ １．１．１．３４）｝である。ＨＭＧ－ＣｏＡは通常、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介したＬＤＬの内在化及び分解に由来するコレステロールや、コレステロールの酸化種によって抑制される。スタチンによるＨＭＧ－ＣｏＡの競合的阻害は、最初にコレステロール産生を減少させ、適応反応として、減少した細胞コレステロールレベルは、肝臓及びその他の組織におけるＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）を含む遺伝子発現のステロール調節配列結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）媒介活性化を誘発し、血液循環からのＬＤＬの取り込み増加につながり、それゆえ血中コレステロールレベルを低下させる。
【0026】
［００５６］本発明に係る相乗的組成物または二剤併用治療は、ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２に関連するガン及び腫瘍の治療及び／または予防に有効である。これらは、患者のガンの状態に有益な変化をもたらすことが示されている。この変化は、主観的でも客観的でもあり、ガン細胞の数、ガン細胞の増殖、ガン腫瘍のサイズ、ガン細胞の別のガン治療薬に対する耐性の減少及び／または患者の状態の悪化の防止等の、治療対象のガンの症状または徴候等の特徴に関連し得る。さらに、これらの二剤併用治療は、これまでの臨床試験と比較してＥＺＨ２阻害剤の投与量を減らすことを可能にし、その結果、ガンに対する治療効果を維持しつつ、ＥＺＨ２阻害剤の中毒性副作用による患者の苦痛を減らすことができる。ＧＳＫ－１２６等のＥＺＨ２阻害剤の投与量は、現在臨床試験で使用されている投与量と比較して、少なくとも半分に減らすことができる。したがって、本発明に係る二剤または三剤併用治療におけるＧＳＫ－１２６の投与量は、静脈内投与で週２回、２０～１５００ｍｇ、好ましくは５０～１２００ｍｇ、より好ましくは１００～１０００ｍｇとすることができる。
【0027】
［００５７］実際、出願人は、ＧＳＫ－１２６等の１つのＥＺＨ２阻害剤と少なくとも１つのスタチン及び／または１つ以上の抗ガン剤若しくは化学療法剤との組合せを投与することにより、ガンまたは腫瘍がＧＳＫ－１２６に対して感作され、それによりＧＳＫ－１２６に対する患者の耐性が改善または低減されることを本明細書に示している。
【0028】
［００５８］本明細書で使用される場合、患者及び対象という用語は同じ意味で使用され、ガン治療を必要とする、またはガン／腫瘍を発症する危険性のあるヒトを指す。
【0029】
［００５９］ヒストンメチルトランスフェラーゼＥＺＨ２と関連するガン及び腫瘍は、特に、肝芽腫（ＨＢ）、びまん性内在性橋神経膠腫（ＤＩＰＧ、本疾患の出現に関与するヒストンＨ３遺伝子の変異の頻度から「びまん性正中神経膠腫Ｈ３Ｋ２７Ｍ－変異型」としても知られる。Louis, D.N.ら、The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathol, 2016. 131(6): p. 803-20）、びまん性正中神経膠腫（ＤＭＧ）、膀胱ガン、骨ガン、脳腫瘍、乳ガン、悪性リンパ腫、ラブドイド腫瘍、白血病、肺ガン、胃ガン、前立腺ガン、結腸直腸ガン、食道ガン、卵巣ガン、子宮ガン、肝臓ガン、精巣ガン、膵臓ガン、腎臓ガン、直腸ガン、甲状腺ガン、皮膚ガン、頭頸部ガンから選択できる。前記腫瘍及びガンは、内皮間葉転換に関連する病態と関連しないことが好ましい。
【0030】
［００６０］本発明に係る相乗的二剤併用治療用組成物または併用治療は、これらのガンまたは腫瘍の一部が特定の抗ガン剤に対して耐性である可能性があるため、標準的な抗ガン処置、放射線療法または他の第一選択若しくは第二選択のガン治療法の後の再発または難治性患者に投与することが好ましい。
【0031】
［００６１］実際、以下の実施例において出願人によって実証されたように、前記二剤併用治療は有意な相乗的治療効果を有する：ＧＳＫ－１２６と１つのスタチンが併用または共投与された場合に生じる治療効果及び／または有益な効果は、それらが単独で投与された場合と比較して大きく、個々の化合物の効果の合計によって生じる効果よりも大きい（すなわち、相加効果よりも大きい効果）。特に、細胞遊走及び接着に対して、併用治療または二剤併用治療の予期せぬ有効性が証明されている。相乗効果を確認する方法は、Ｆｏｕｃｑｕｉｅｒ Ｊ．ら（Pharmacology Research & Perspectives (2015) (3)3:e00l49）等の様々な刊行物で検討されている。
【0032】
［００６２］上記二剤併用治療用組成物の相乗効果のため、患者に投与される、または１つのスタチンと組み合わせて共投与されるＥＺＨ２阻害剤の治療上または予防上の有効量は、これまで現在の臨床期に投与されてきた用量よりもはるかに減量することができる。そのようなＧＳＫ－１２６の減量された有効量は、患者の体重基準で１～２０ｍｇ／ｋｇまたは５～１０ｍｇ／ｋｇとすることができる。本発明の二剤併用治療におけるＥＺＨ２阻害剤の投与量のこのような減量は、ガン細胞の遅延または阻害、腫瘍の増殖、腫瘍の血管新生、進行及び／または転移の阻害、腫瘍サイズの縮小、細胞死の誘導、平均生存期間の延長及びガン細胞が耐性を獲得した、または耐性を獲得している抗ガン剤に対するガン細胞の感作を含む効率的な抗ガン作用を維持しつつ、患者に対する薬剤の一般毒性を大幅に減少させるという大きな影響を有する。
【0033】
［００６３］本発明に係るＧＳＫ－１２６とスタチンとの組合せを含む相乗的組成物及び治療方法は、生体外で肝芽腫細胞を根絶し、生体内で肝芽腫の増殖及び血管新生を阻害することが示されている。これらの組成物は、シスプラチン耐性肝芽腫の治療にも有効である。
【0034】
［００６４］特に、出願人は、実施例２及び４において、メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２が肝芽腫における重要なガン遺伝子であり、この小児肝腫瘍の治療に関連する治療標的であることを明確に証明した。出願人は、一方ではＥＺＨ２がヒストンＨ３及び非ヒストン標的に対するそのメチルトランスフェラーゼ活性によって、増殖性肝芽腫における重要なガン遺伝子として作用し、それによってクロマチン凝縮及び腫瘍抑制遺伝子の阻害をもたらすことを実証した。実際、出願人は、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性が細胞遊走、生存、シスプラチン抵抗性、ならびに腫瘍の発生と血管新生に必要であること、したがって、ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ活性がガン化の過程と薬剤抵抗性の中心であることを明確に示した。他方では、ＥＺＨ２は、コレステロールや脂質の合成に関与するＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素や、侵攻性肝芽腫に関与する二重特異性ホスファターゼであるＤＵＳＰ９の過剰発現を誘導する転写補因子として作用することが示されている（Khoubai and Grosset, Int J Mol Sci 2021, https://doi.org/10.3390/ijms222111538参照）。
【0035】
［００６５］二剤及び三剤併用治療の相乗効果について、出願人は、ＧＳＫ－１２６処理肝芽腫細胞においてＨＧＭＣＲタンパク質が誘導され、ＥＺＨ２とヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）遺伝子の間の機能的関連を示唆することを示した。たとえば、アトルバスタチンとシンバスタチンという２つのスタチンが心臓病や脂質異常症の治療に広く使われているが、同じ投与量では、いずれのスタチンにも肝芽腫に対する効果がなかった。しかし、驚くべきことに、これらのスタチンは実際にはＧＳＫ－１２６やＥＰＺ６４３８のようなＥＺＨ２の阻害剤に対する肝芽腫の感受性を高めることがわかった。また、アトルバスタチン及びシンバスタチンに対する肝芽腫の感受性は、ＩＣ５０の５０％の用量で使用されるＧＳＫ－１２６の添加によって増大し、ＩＣ５０の２５％の用量で使用されるシスプラチンを二剤併用治療に添加すると、肝芽腫はさらに急速に死滅した。
【0036】
［００６６］同様に、出願人は、ＧＳＫ１２６処理ＤＩＰＧにおいて、脂質及びコレステロール合成に関与する遺伝子の発現が増加することを示した。特に、ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧＣＳ）、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、 ニーマン・ピックＣ１タンパク質（ＮＰＣ１）及びスクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＬＥ）遺伝子、ならびにＨＭＧＣＲ及びＳＱＬＥタンパク質の発現の誘導によって、ＧＳＫ－１２６がＤＩＰＧにおける脂質及びコレステロール合成経路を活性化することが実証された。
【0037】
［００６７］これは、以下の実施例において証明された、ＥＺＨ２阻害剤と少なくともスタチンとを含む二剤併用治療用組成物の相乗効果を機構論的説明し裏付けるものである。その結果、肝芽腫及びＤＩＰＧは薬効を免れにくくなった。さらに、ＥＺＨ２阻害剤は、単独またはシスプラチンと組み合わせて使用することで肝芽腫の管理を改善することができ、スタチンの添加は、メバロン酸経路を遮断することによってＧＳＫ－１２６の効果を増強した。
【0038】
［００６８］ＥＺＨ２の機能を不活性化する遺伝学的または薬剤ベースの薬理学的アプローチを用いて、出願人は、生体外での肝芽腫細胞の二次元及び三次元の増殖及び生存、ならびにニワトリ胚モデルにおける侵攻性かつ血管新生性腫瘍の発生にＥＺＨ２タンパク質が必要であることを示した。
【0039】
［００６９］出願人はさらに、ＥＺＨ２の除去がシスプラチンに対する肝芽腫細胞の感受性を増大させること及びシスプラチンとＧＳＫ－１２６との併用が生体外での腫瘍細胞の排除に相加的効果を有することを見出した。また、ＧＳＫ－１２６は単独でも５～１０μＭの濃度で生体外で肝芽腫細胞を非常に効率的に死滅させた。上記の通り、これらのデータは、たとえばシスプラチンとＧＳＫ－１２６を含むこのような二剤併用治療が、第一選択治療において効率的であり、化学療法の効率を改善し、シスプラチンに対する獲得耐性を示す再発患者に対する第二選択治療として有用であることを明確に示した。
【0040】
［００７０］さらに、出願人は、ＥＺＨ２阻害剤、スタチン（たとえば、シンバスタチンまたはアトルバスタチン等）及びシスプラチンを含む本発明に係る１つの三剤併用治療を実施し、ＧＳＫ－１２６単独の抗腫瘍力が、シンバスタチンまたはアトルバスタチンの添加によっても増大することを示し、三剤併用治療の治療上の有益性を実証している。
【0041】
［００７１］本発明に係る三剤併用治療用組成物は、本明細書中に上述した二剤併用治療用組成物を含み、さらに、プラチナ化合物またはプラチナ系剤、チロシンキナーゼ阻害剤、タキサン誘導体、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン治療剤、抗アンドロゲン薬、アンドロゲン受容体剤、抗血管新生剤、免疫療法製剤、抗炎症薬、放射線治療剤、抗ガン作用を有する生物製剤、天然物質から製造された抗ガン製剤から選択することができる1つ以上の抗ガン剤を含む。
【0042】
［００７２］本発明の三剤併用治療に使用される好ましい抗ガン剤としては、たとえばシスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、及び／またはリポプラチン等の白金化合物または白金系剤が挙げられる。出願人は、以下の実施例において、有効量のＧＳＫ－１２６、スタチン及び前記白金化合物等のさらなる抗ガン剤を含む三剤併用治療の組合せを投与することにより、優れた治療効果が得られ、その結果、ガン細胞の増殖の実質的な阻害、ガン細胞の転移の阻害、腫瘍サイズの減少、対象の生存期間の延長、より一般的には、ガンの１つ以上の徴候及び／または症状の実質的な改善が得られることを実証した。このような三剤併用治療の組合せは、抗ガン剤に対するガン細胞の耐性を抑制または減少させ、かつ／または抗ガン剤に対してガン細胞を感作する可能性があるが、作用機序は不明である。
【0043】
［００７３］このような三剤併用治療に使用することができるその他の化学療法剤としては、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（ダウノマイシン、ルビドマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルビシン）等のアントラセンジオン（アントラキノン）；４－ヒドロキシタモキシフェン（アフィモキシフェン）及びＮ－デスメチル－４－ヒドロキシタモキシフェン（エンドキシフェン）等のタモキシフェン及びその代謝物；パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル、カバジタキセル、ホンドウシャンＡ、ホンドウシャンＢ、ホンドウシャンＣ、バッカチンＩ、バッカチンＩＩ等のタキサン；アルキル化剤（たとえばメクロレタミン（ＨＮ２）等のナイトロジェンマスタード、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ－サルコリシン）、クロラムブシル）；エチレンイミン及びメチルメラミン（たとえば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、ブスルファン等のアルキルスルホン酸塩、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＬＪ）、セムスチン（メチル－ＣＣＮ－Ｕ）、ストレプトゾエイン（ストレプトゾトシン）等のニトロソウレア、デカルバジン（ＤＴＩＣ、ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド）等のトリアゼン）；代謝拮抗物質（たとえば、メトトレキサート（アメトプテリン）等の葉酸アナログ、フルオロウラシル（５－フルオロウラシル、５－ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン、 ＦＵｄＲ）、シタラビン（シトシンアラビノシド）等のピリミジンアナログ、メルカプトプリン（６－メルカプトプリン、６－ＭＰ）、チオグアニン（６－チオグアニン、６－ＴＧ）、ペントスタチンまたは２'－デオキシコフォニーシン）等のプリンアナログ及び関連阻害剤；天然物、たとえば、ビンブラスチン（ＶＬＢ）やビンクリスチン等のビンカアルカロイド、エトポシドやテニポシド等のエピポドフィロトキシン；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシン（マイトマイシンＱ）等の抗生物質；Ｌ－アスパラギナーゼ等の酵素；ヒドロキシウレア等の置換尿素；プロカルバジン（Ｎ－メチルヒドラジン、ＭＩＨ）等のメチルヒドラジン誘導体；及び／またはマイトタン、アミノグルテチミド等の副腎皮質抑制剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0044】
［００７４］抗アンドロゲン薬とは、アンドロゲン受容体を遮断したり、細胞表面の結合部位を競合したり、アンドロゲン産生に影響を与えたり、媒介したりすることにより、アンドロゲン経路を変化させる薬剤である。抗アンドロゲン薬としては、エンザルタミド、アビラテロン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、アパルタミド、フィナステリド、デュタステリド、アルファトラジオール、及びこれらの組合せが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【0045】
［００７５］放射線治療剤は当該技術分野でよく知られており、外部放射線療法及び／または内部放射線療法を含む。外部放射線療法は、高エネルギーＸ線及び／またはガンマ線の放射性ビームを患者の腫瘍に照射するものであり、内部放射線療法は、放射性原子を患者の腫瘍に照射するものである。外部放射線療法及び内部放射線療法の両方は、標的部位に十分な量の放射能を照射することにより、腫瘍の増殖を抑制するか、またはガン細胞を死滅させるために使用される。いくつかの実施形態では、放射線治療剤は放射性原子を含み、標的部位への照射を増加させるために生物学的または合成薬剤と複合体化されている。したがって、放射線治療剤は、ガン細胞への放射線治療剤の局在を改善するために、抗体等の標的化部位と結合させてもよい。
【0046】
［００７６］前記三剤併用治療用組成物は、ＲＯＲｙ（レチノイン酸受容体関連オーファン受容体ｙ）の阻害剤を含まず、スニチニブ等の抗ＶＥＧＦ剤を含まず、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、ダサチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、ボルテゾミブ、サリノマイシン等の薬剤を含まず、ＶＥＦＧ／ＶＥＧＦＲ阻害剤を含まず、ＢＣＬ２阻害剤、ＬＳＤ１阻害剤を含まないのが好ましい。
【0047】
［００７７］したがって、本発明はまた、必要とする対象に治療上有効な上記の二剤併用治療または三剤併用治療を行うことを含む、メチルトランスフェラーゼＥＺＨ２に関連する腫瘍を治療及び／または予防する方法で使用する組成物であって、前記二剤併用治療または三剤併用治療を、標準的な抗ガン処置、放射線療法または他の第一選択若しくは第二選択ガン治療法の後の再発または難治性患者に行う組成物を提供する。
【0048】
［００７８］別の態様によれば、本発明は、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む、とりわけＥＺＨ２及び／またはトポイソメラーゼ２α（ＴＯＰ２Ａ）の上方制御を特徴とする、Ｃ２Ａサブグループの肝芽腫を治療及び／または予防する方法で使用する組成物を提供する。
【0049】
［００７９］さらに、本発明は、治療有効量のＥＺＨ２阻害剤をそれを必要とする対象に投与することを含む、とりわけＥＺＨ２及び／またはＴＯＰ２Ａの上方制御を特徴とする、ＤＩＰＧを治療及び／または予防する方法で使用する組成物を提供する。
【0050】
［００８０］すべての年齢の対象が治療対象であるが、その大部分は１～５歳である。
【0051】
［００８１］発明の本態様によれば、ＧＳＫ－１２６は、肝芽腫の第一選択治療における金字塔的な薬剤としてこれまで使用されてきたが、毒性が高く重篤な二次病態を引き起こすものとして知られていたシスプラチンよりも２０倍毒性が低いため、ＥＺＨ２阻害剤として好ましい。したがって、本態様によれば、ＧＳＫ－１２６は、増殖性で侵攻性の肝芽腫における新たな治療選択肢として、または再発患者若しくはシスプラチンに対して化学耐性を示す患者の第二選択治療として用いられている。
【0052】
［００８２］実際、出願人は、実施例３において、ＥＺＨ２の上方制御が、特に侵攻性の肝芽腫（ＨＢ）の存在と関連し、新規の好ましくない予後因子を構成し、再発または死亡のリスクが高い等の患者の転帰が予測できることを実証した。このような上方制御は、Ｃ２Ａ及びＣ２Ｂと名付けられた、ＨＢ腫瘍の３つのサブグループの１つであって、予後が最も悪く、腫瘍の病期が進行し、全生存率が最も悪い、Ｃ２Ａサブグループとして指定されるＨＢ腫瘍の１つのサブグループにおいて証明されている。転写産物プロファイリングにより、ＨＢをＣ１、Ｃ２Ａ、Ｃ２Ｂと名付けられた３つの異なるサブグループに分けているが、これらは以下の簡潔な４遺伝子シグネチャーによって識別可能である。すなわち、ヒドロキシステロイド１７－βデヒドロゲナーゼ６、インテグリンα６、トポイソメラーゼ２α及びビメンチンであり、中でもトポイソメラーゼ２α（ＴＯＰ２Ａ）は増殖性Ｃ２Ａ腫瘍に特徴的であった（Hooks KB et al、 Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10.1002/hep.29672参照）。出願人はさらに、高増殖性腫瘍Ｃ２Ａサブタイプは、トポイソメラーゼ２α遺伝子の上方制御を特徴とするだけでなく、ＴＯＰ２Ａの上方制御と正の強い相関があることが示されたＥＺＨ２の上方制御も特徴とすることを実証した。ＥＺＨ２及び／またはＴＯＰ２Ａの上方制御は、腫瘍の特に侵攻的な性質及びガン細胞の高い増殖率の指標であり、再発または死亡等、患者の転帰は悪い。
【0053】
［００８３］ＥＺＨ２は、ＨＢにおいて上方制御され、その発現は、ＴＯＰ２Ａを発現する細胞を含む好ましくない分子的かつ臨床的バイオマーカーを有する腫瘍及び再発または死亡患者において有意に増加していることが示された。したがって、ＥＺＨ２は、ＨＢまたはＤＩＰＧにおける患者の再発または死亡の独立した予後因子として使用することができる。あるいは、ＥＺＨ２及びＴＯＰ２Ａ、またはＥＺＨ２及びＤＵＳＰ９（二重特異性ホスファターゼ９）、またはＥＺＨ２、ＴＯＰ２Ａ及びＤＵＰＳ９の組合せは、したがって、ＨＢまたはＤＩＰＧにおける患者の再発または死亡の予後因子として使用することができる。
【0054】
［００８４］したがって、この態様によれば、本発明は、ＨＢまたはＤＩＰＧに罹患している患者の再発、さらには死亡の可能性がより高い予後不良のバイオマーカーとしてのＥＺＨ２の使用、及び前記対象の単離サンプルにおけるＥＺＨ２レベルを生体外で求めることを含む、ＨＢまたはＤＩＰＧから選択されるガンに罹患している患者の予後を評価及び／または予測する方法を提供する。ＥＺＨ２レベルが参照対照値以上である場合、ＨＢまたはＤＩＰＧの予後不良と判定される。典型的には、参照対照値は、ＨＢまたはＤＩＰＧに罹患している対象のコホートのＥＺＨ２レベルの中央値から得られるＥＺＨ２の血清レベルである。たとえば、上記ＥＺＨ２レベルは、参照対照値以上である。
【0055】
［００８５］本態様によれば、ＨＢまたはＤＩＰＧに罹患している対象の予後を予測する方法は、（ｉ）前記対象からの単離サンプルにおいて、あるタンパク質レベルまたはＲＮＡレベルでＥＺＨ２のレベル及び濃度を検出することと、（ｉｉ）検出結果を、対照サンプルの対応するバイオマーカーのもの、または基準値のものと比較することとを含み、対照または基準値と比較して、前記対象における少なくともバイオマーカーＥＺＨ２の濃度の増加、レベルの増加は、対象の悪化を示す。バイオマーカーＥＺＨ２を評価することに加えて、本方法は、たとえばＴＯＰ２Ａ及び／またはＤＵＳＰ９バイオマーカーを評価することを含む、前記患者の臨床的な悪化の追加のバイオマーカーを評価することをさらに含んでいてもよい。
【0056】
［００８６］同じ態様において、本発明は、上記タンパク質レベルまたはＲＮＡレベルで少なくともＥＺＨ２のレベル、濃度及び／または存在を検出するのに適した薬剤を含む生体外キットを提供する。このようなキットは、上記タンパク質レベルまたはＲＮＡレベルにおけるＴＯＰ２Ａ及び／またはＤＵＳＰ９のレベル、濃度及び／または存在を評価することを可能にする薬剤をさらに含んでいてもよい。これらの薬剤は当該技術分野でよく知られている。一例として、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫拡散アッセイ、免疫電気泳動、免疫染色、免疫沈降、質量分析及びタンパク質マイクロアレイ等の、タンパク質の検出及び定量のためのアッセイを実施するために使用されるものが挙げられる。また、上記ＲＮＡレベルにおける、単独またはＴＯＰ２Ａ及び／またはＤＵＳＰ９と組み合わせたバイオマーカーＥＺＨ２の過剰発現の検出に適しているものも挙げられる。
【0057】
［００８７］本発明はまた、単独またはＴＯＰ２Ａ及び／またはＤＵＳＰ９と組み合わせた１つのバイオマーカーＥＺＨ２の過剰発現を検出するための患者の事前スクリーニング工程を含み、それによってこれらの患者の特定の治療プロトコル及び特定のフォローアップを計画することを可能にする、ガン治療法を提供する。
【0058】
［００８８］本発明はさらに、上記のような二剤併用治療または三剤併用治療用の組合せと、薬学的に許容される賦形剤及び／または担体及び／または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。この医薬組成物はまた、任意に１つ以上の抗ガン剤を含んでいてもよい。本組成物の製剤化及び所望の投与に適した任意の薬学的に許容される担体及び／または賦形剤及び／または希釈剤が、本明細書において企図される。
【0059】
［００８９］典型的には、このような薬学的に許容される賦形剤は、塩または希釈剤を含んでいてもよく、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、グルタミン酸ナトリウム、ＰＶＰ、ＨＰｐＣＤ、ＣＤ、グリセロール、マルトース、マンニトール、及びサッカロース等の製薬用凍結保護剤をさらに含んでいてもよい。
【0060】
［００９０］本発明の医薬組成物には、局所投与、腸管外投与、経肺投与、鼻腔投与、直腸投与、または経口投与に適した製剤が含まれる。どのような場合でも、最も適した投与経路は、部分的にはガンの状態の性質及び重篤度によって決められ、任意にガンの病期によっても決められる。好ましくは、医薬組成物は腸管外投与用に製剤され、最も好ましくは、静脈内投与用に製剤される。即時放出製剤及び持続放出製剤の両方が本発明の範囲に含まれる。
【0061】
［００９１］本発明の医薬組成物は、薬学の技術分野において周知の方法のいずれかによって調製することができる。本発明と共に使用するのに適した薬学的に許容される担体には、リン酸緩衝生理食塩水、水、及びエマルション（油／水または水／油エマルション等）を含む標準的な医薬担体、緩衝剤、及び賦形剤のいずれか、ならびに様々な種類の湿潤剤及び／またはアジュバントが含まれる。適切な医薬担体及びその製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Mack Publishing Co., Easton, l9th ed. 1995）に記載されている。好ましい医薬担体は、活性薬剤の意図される投与方法によって決められる。
【0062】
［００９２］したがって、医薬組成物は、注入による腸管外投与、たとえばボーラス注入または持続注入用に製剤されるのが好ましい。注入用製剤は、たとえば、アンプルまたは複数回投与用容器に、保存剤を添加した単位投与形態で提供することができる。注入可能組成物は、好ましくは水溶性等張液または懸濁液である。製剤は滅菌されていてもよく、かつ／またはアジュバント、たとえば保存剤、安定化剤、湿潤剤、または乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩、及び／または緩衝剤を含有していてもよい。
【0063】
［００９３］本発明によれば、ＥＺＨ２阻害剤は、有利には、スタチン及び任意に抗ガン剤と共投与され、ガン及び腫瘍の治療及び／または予防に相乗効果を発揮する。ＥＺＨ２阻害剤、スタチン、及び抗ガン剤は、同時投与（共投与）しても連続投与してもよい。
【0064】
［００９４］三剤併用治療の場合、ＥＺＨ２阻害剤及びスタチンは、経口または腸管外（たとえば、静脈内）の同一または異なる投与経路を介して、抗ガン剤と組み合わせて患者に投与してもよい。たとえば、ＥＺＨ２阻害剤及びサチンが腸管外（たとえば、静脈内）投与され、抗ガン剤が経口投与されてもよく、またはその逆であってもよい。
【0065】
［００９５］このようにして、患者は、治療有効量のＧＳＫ－１２６化合物及び１つのスタチンの投与を受けることができる。このような投与は、所定の期間、たとえば、約１～２４時間、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１日、若しくはそれ以上の間、または所定の順序、たとえば、ＧＳＫ－１２６及びスタチンの投与に続いて１つ若しくは複数の抗ガン剤の投与、またはその逆の順序で有効量を提供することを含むものであってもよい。治療プロトコルは、２つ以上の構造的に異なる化合物の連続投与または同時投与を含むものであってもよい。たとえば、２つ以上の構造的に異なる薬学的に活性な化合物を、２つ以上の構造的に異なる活性な薬学的に活性な化合物を含む経口投与に適合した医薬組成物を投与することによって共投与してもよい。別の例として、２つ以上の構造的に異なる化合物を、一方の化合物を投与した後に他方の化合物を投与することによって共投与することができる。ある例では、共投与化合物は同じ経路で投与される。他の例では、共投与化合物は異なる経路で投与される。たとえば、一方の化合物を経口投与し、他方の化合物を静脈内注射または腹腔内注射により、たとえば、連続または同時に投与することができる。
【0066】
［００９６］したがって、医薬組成物は、ＥＺＨ２阻害剤及び１つのスタチン（たとえば、アトルバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、セリバスタチン、プラバスタチン、及び／またはピタバスタチン）、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤または希釈剤、ならびに任意で１つまたは複数の抗ガン剤を混和することによって作製される個々の投薬単位からなる単一の医薬品または別個の医薬品として調製することができる。
【0067】
［００９７］医薬組成物または医薬品は、ＥＺＨ２阻害に応答するガンを予防、治療、感作、または制御するために、治療有効量で対象に投与することができる。医薬組成物または医薬品は、対象において有効な治療応答を引き出すのに十分な量で対象に投与されている。有効な治療的応答には、ガンの症状または合併症を少なくとも部分的に停止させるか、または遅らせる応答が含まれている。これを達成するのに十分な量を「治療有効量」と定義している。
【0068】
［００９８］投与される活性薬剤の量は、対象の体重、年齢、個々の状態、治療される部位の表面積または体積、及び投与形態によって決められる。投与量の大きさもまた、特定の対象における特定の製剤の投与に伴うあらゆる副作用の存在、性質、及び程度によって決定するものとする。典型的には、本発明の活性化合物の投与量は、所望の効果を達成するのに十分な量とする。最適な投与スケジュールは、対象の体内における活性剤の蓄積の測定値から算出することができる。一般に、投与は、１日、１週間、または１か月に１回以上行うことができる。当業者であれば、最適な投与量、投与方法、及び反復率を容易に決定することができるであろう。本発明の組成物の最適な投与量、毒性、及び治療効力は、投与された組成物の相対的な効力に応じて変化し得、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定することによって、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す薬剤が好ましい。毒性副作用を示す薬剤を使用することもできるが、正常細胞への潜在的な損傷を最小にし、それによって副作用を低減するために、そのような薬剤を罹患組織の部位に標的化する送達系を設計するように注意すべきである。
【0069】
［００９９］一般に、組成物の効果のある量、すなわち有効量は、まず低用量または少量の組成物を投与し、次いで、投与する量、すなわち投与量を漸増させ、必要に応じて第２または第３の薬剤を追加し、最小限の毒性副作用または無毒性副作用で治療対象に所望の効果が見られるまで投与することによって決定される。
【0070】
［００１００］組成物の単回または複数回の投与は、患者が必要とし、かつ許容する投与量及び頻度に応じて行われる。いずれの場合も、本発明の組成物は、患者を効果的に治療するのに効率的な量を提供すべきである。一般に、用量は、患者に許容できない毒性を生じることなく、疾患の症状または徴候を治療または改善するのに十分なものである。
【0071】
［００１０１］本出願を通して種々の参考文献が参照されるが、本発明が関連する先行技術をより完全に記載するために、これらの刊行物の開示内容全体を参照により本明細書に援用する。
【実施例】
【0072】
実施例１：びまん性正中神経膠腫（ＤＭＧ）の治療及び／または予防における二剤併用治療の効果
実施例１．１：方法
マイクロアレイ解析
ＧＳＥ５００２１発現プロファイル（ＤＭＧ３５サンプル、正常脳１０サンプル）をＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓデータベースから抽出した。生のリードを分位正規化し、ｌｏｇ２変換した。ＥＺＨ２用ＩＬＭＮ＿１６５２９１３プローブで確認された発現値を抽出し、グラフパッドプリズム（GraphPad Prism）を用いて解析した。
実施例１．１：方法
マイクロアレイ解析
ＧＳＥ５００２１発現プロファイル（ＤＭＧ３５サンプル、正常脳１０サンプル）をＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓデータベースから抽出した。生のリードを分位正規化し、ｌｏｇ２変換した。ＥＺＨ２用ＩＬＭＮ＿１６５２９１３プローブで確認された発現値を抽出し、グラフパッドプリズム（GraphPad Prism）を用いて解析した。
【0073】
ＤＭＧ細胞株及び初代ＢＸｄｍｇ１細胞
本試験で使用したＤＭＧ細胞株は、ＮＥＭ１５７ｉ、ＮＥＭ１５７ｉ－ＶＥＧＦ、ＮＥＭ１６３ｉ、ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ、ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ－Ｌｕｃ、及び初代細胞ＢＸｄｍｇ１である。起源及びレンチウイルスの改変手順（不死化を含む）ならびに培養条件については、本明細書の以下に記述している。
本試験で使用したＤＭＧ細胞株は、ＮＥＭ１５７ｉ、ＮＥＭ１５７ｉ－ＶＥＧＦ、ＮＥＭ１６３ｉ、ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ、ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ－Ｌｕｃ、及び初代細胞ＢＸｄｍｇ１である。起源及びレンチウイルスの改変手順（不死化を含む）ならびに培養条件については、本明細書の以下に記述している。
【0074】
化学阻害剤
ＥＺＨ２阻害剤ＧＳＫ－１２６、アトルバスタチン、ＡＣＳＳ２阻害剤、及びテルビナフィンを使用した（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 Ｈｏｕｓｔｏｎ、 ＵＳＡ）。
ＥＺＨ２阻害剤ＧＳＫ－１２６、アトルバスタチン、ＡＣＳＳ２阻害剤、及びテルビナフィンを使用した（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍｉｃａｌｓ、 Ｈｏｕｓｔｏｎ、 ＵＳＡ）。
【0075】
ウェスタンブロット
ブロットは標準的な手法で行った（下記参照）。
ブロットは標準的な手法で行った（下記参照）。
【0076】
ヒストン抽出
ヒストン抽出は、製造業者の使用説明書に従って行った（Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ － ａｂ１１３４７６、 Ａｂｃａｍ、 Ｐａｒｉｓ、フランス）。
ヒストン抽出は、製造業者の使用説明書に従って行った（Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ － ａｂ１１３４７６、 Ａｂｃａｍ、 Ｐａｒｉｓ、フランス）。
【0077】
増殖アッセイ
細胞増殖は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ、 Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、 Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）を用い、製造業者の使用説明書に従って測定した。細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり２０００個の密度で３回繰り返してプレーティングした。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ （ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、 Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ－ｓｕｒ－Ｍａｒｎｅ、フランス）を用い、指定の時点に５６５ｎｍで吸光度を測定した。
細胞増殖は、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ、 Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、 Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）を用い、製造業者の使用説明書に従って測定した。細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり２０００個の密度で３回繰り返してプレーティングした。ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ ｍｕｌｔｉｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ （ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、 Ｃｈａｍｐｉｇｎｙ－ｓｕｒ－Ｍａｒｎｅ、フランス）を用い、指定の時点に５６５ｎｍで吸光度を測定した。
【0078】
アポトーシスアッセイ
指定の濃度及び時間で薬剤に暴露した後、細胞をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、 Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、 フランス）及び７－ＡｍｉｎｏＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ（７－ＡＡＤ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識し、［４］に記載の通りフローサイトメトリーを用いて解析した。
指定の濃度及び時間で薬剤に暴露した後、細胞をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、 Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、 フランス）及び７－ＡｍｉｎｏＡｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ（７－ＡＡＤ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で標識し、［４］に記載の通りフローサイトメトリーを用いて解析した。
【0079】
遊走アッセイ
96ウェルプレートに１ウェル当たり２×１０４細胞を配置し、２４時間培養した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｗｏｕｎｄ Ｍａｋｅｒ（９６ピン創傷作成ツール）を用いて傷を作成した。
96ウェルプレートに１ウェル当たり２×１０４細胞を配置し、２４時間培養した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｗｏｕｎｄ Ｍａｋｅｒ（９６ピン創傷作成ツール）を用いて傷を作成した。
【0080】
スフェロイド培養
ＤＭＧ細胞株及び肝芽腫細胞株ともに、スフェロイド培養の標準的な培養法を用いた。
ＤＭＧ細胞株及び肝芽腫細胞株ともに、スフェロイド培養の標準的な培養法を用いた。
【0081】
ＤＭＧ生体内モデル
欧州（指令２０１０／６３／ＵＥ）及びフランス（政令２０１３－１１８）のガイドラインに従って動物実験手順が実施された。マウス実験が現地の倫理委員会により承認され、フランス高等教育・研究・革新大臣により確認されている（ＡＰＡＦＩＳ ＃１３４６６－２０１９０３２１１２２１１２８１、承認番号Ｂ３３０６３９１６）。
ＤＭＧ ＮＥＭ１５７ｉ／ＮＥＭ１５７ｉ－ＶＥＧＦ ＣＡＭモデルが以前に記載されているCapdevielle V et al. Neuro Oncol 2019; 10.1093/neuonc/noz215）。
Ｍｏｈａｍｍｅｄらの研究（Nat Med 2017;23(4):483-492）に基づいてマウス同所モデル（SU-DIPG-IVi-Luc in NOD/LtSz-scid IL2R gamma mice）が開発された。
欧州（指令２０１０／６３／ＵＥ）及びフランス（政令２０１３－１１８）のガイドラインに従って動物実験手順が実施された。マウス実験が現地の倫理委員会により承認され、フランス高等教育・研究・革新大臣により確認されている（ＡＰＡＦＩＳ ＃１３４６６－２０１９０３２１１２２１１２８１、承認番号Ｂ３３０６３９１６）。
ＤＭＧ ＮＥＭ１５７ｉ／ＮＥＭ１５７ｉ－ＶＥＧＦ ＣＡＭモデルが以前に記載されているCapdevielle V et al. Neuro Oncol 2019; 10.1093/neuonc/noz215）。
Ｍｏｈａｍｍｅｄらの研究（Nat Med 2017;23(4):483-492）に基づいてマウス同所モデル（SU-DIPG-IVi-Luc in NOD/LtSz-scid IL2R gamma mice）が開発された。
【0082】
化学阻害剤
ＧＳＫ－１２６は、ＩＣ５０が９．９ｎＭの高選択的ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ阻害剤である（その他の２０のヒトメチルトランスフェラーゼよりもＥＺＨ２に対して１０００倍以上の選択性）。ＧＳＫ－１２６（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で溶解し、－２０℃で保存した。ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素の阻害剤であるアトルバスタチン、酢酸依存性アセチル－ＣｏＡ合成酵素２（ＡＣＳＳ２）を標的とするＡＣＳＳ２阻害剤、及びテルビナフィン（スクアレンエポキシダーゼ阻害剤）の、３つのコレステロール合成経路の阻害剤を使用した。すべての阻害剤はＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、米国）で購入した。すべての阻害剤はＤＭＳＯに分注し、－２０℃で保存した。
ＧＳＫ－１２６は、ＩＣ５０が９．９ｎＭの高選択的ＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ阻害剤である（その他の２０のヒトメチルトランスフェラーゼよりもＥＺＨ２に対して１０００倍以上の選択性）。ＧＳＫ－１２６（ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ）をＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で溶解し、－２０℃で保存した。ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素の阻害剤であるアトルバスタチン、酢酸依存性アセチル－ＣｏＡ合成酵素２（ＡＣＳＳ２）を標的とするＡＣＳＳ２阻害剤、及びテルビナフィン（スクアレンエポキシダーゼ阻害剤）の、３つのコレステロール合成経路の阻害剤を使用した。すべての阻害剤はＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、米国）で購入した。すべての阻害剤はＤＭＳＯに分注し、－２０℃で保存した。
【0083】
初代細胞の単離、培養、特性評価
すべての細胞株が、マイコプラズマの存在について定期的に検査され、２０２１年４月に認証のためのＳＴＲプロファイリングに成功している（ＬＧＣ、 Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、 フランス）。ボルドーの大学病院での治療のために登録された患者（またはその保護者）が、フランスの国家ガイドラインに従って、匿名化された方法で生物学的プローブが研究目的に使用されることに書面で同意した。
ＤＭＧ生検が研究室で行われ、ＭＡＣＳＢｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐａｒｉｓ、フランス）及び標準的なＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ脳組織分離プログラムを用いて、２４時間以内にＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ細胞分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐａｒｉｓ、フランス）を用いて解離した。得られた細胞を、Ａｍｎｉｏｍａｘ Ｃ１００ＳＵＰ ｐｌｕｓ Ａｍｎｉｏｍａｘ Ｃ１００基礎培地（Ｇｉｂｃｏ、 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、 Ｉｌｌｋｉｒｃｈ Ｃｅｄｅｘ、フランス）で培養した。生検の分子及び細胞解析を図７に詳述した（Rahal, F., C. Capdevielle, B. Rousseau, J. Izotte, J. W. Dupuy, D. Cappellen, G. Chotard, M. Menard, J. Charpentier, V. Jecko, C. Caumont, E. Gimbert, C. F. Grosset and M. Hagedorn (2022). "An EZH2 blocker sensitizes histone mutated diffuse midline glioma to cholesterol metabolism inhibitors through an off-target effect." Neurooncol Adv 4(1): vdac018参照）。
生検由来細胞（ＢＸｄｍｇ１）の特性評価には免疫組織化学を用いた。細胞を採取し、切片作製と染色の前にサイトブロック（ＣｙｔｏＢｌｏｃｋｓ）に取り込んだ（図７Ａ）。クエン酸緩衝液中での熱抗原回収、Ｆｌｅｘ増幅処理、及び以下の抗体とのインキュベーションの後、Ｏｍｎｉｓ Ｄａｋｏ(R) 染色装置で自動染色を行った：Ｋｉ－６７（Ｄａｋｏ、クローンＭＩＢ１、１／１００）、Ｈ３－Ｋ２７Ｍ（Ｄｉａｇｏｍｉｃｓ、クローンＲＭ１９２、１／５０００）、Ｈ３－Ｋ２７ｍｅ３（ＡＢｃａｍ、クローン８２９０、１／１００）。ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ）を用いて可視化（revelation）を行った。細胞は定期的に継代され、均質な形態学的表現型を示し、ＢＸｄｍｇ１と命名された。
すべての細胞株が、マイコプラズマの存在について定期的に検査され、２０２１年４月に認証のためのＳＴＲプロファイリングに成功している（ＬＧＣ、 Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、 フランス）。ボルドーの大学病院での治療のために登録された患者（またはその保護者）が、フランスの国家ガイドラインに従って、匿名化された方法で生物学的プローブが研究目的に使用されることに書面で同意した。
ＤＭＧ生検が研究室で行われ、ＭＡＣＳＢｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐａｒｉｓ、フランス）及び標準的なＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ脳組織分離プログラムを用いて、２４時間以内にＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ細胞分離器（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐａｒｉｓ、フランス）を用いて解離した。得られた細胞を、Ａｍｎｉｏｍａｘ Ｃ１００ＳＵＰ ｐｌｕｓ Ａｍｎｉｏｍａｘ Ｃ１００基礎培地（Ｇｉｂｃｏ、 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、 Ｉｌｌｋｉｒｃｈ Ｃｅｄｅｘ、フランス）で培養した。生検の分子及び細胞解析を図７に詳述した（Rahal, F., C. Capdevielle, B. Rousseau, J. Izotte, J. W. Dupuy, D. Cappellen, G. Chotard, M. Menard, J. Charpentier, V. Jecko, C. Caumont, E. Gimbert, C. F. Grosset and M. Hagedorn (2022). "An EZH2 blocker sensitizes histone mutated diffuse midline glioma to cholesterol metabolism inhibitors through an off-target effect." Neurooncol Adv 4(1): vdac018参照）。
生検由来細胞（ＢＸｄｍｇ１）の特性評価には免疫組織化学を用いた。細胞を採取し、切片作製と染色の前にサイトブロック（ＣｙｔｏＢｌｏｃｋｓ）に取り込んだ（図７Ａ）。クエン酸緩衝液中での熱抗原回収、Ｆｌｅｘ増幅処理、及び以下の抗体とのインキュベーションの後、Ｏｍｎｉｓ Ｄａｋｏ(R) 染色装置で自動染色を行った：Ｋｉ－６７（Ｄａｋｏ、クローンＭＩＢ１、１／１００）、Ｈ３－Ｋ２７Ｍ（Ｄｉａｇｏｍｉｃｓ、クローンＲＭ１９２、１／５０００）、Ｈ３－Ｋ２７ｍｅ３（ＡＢｃａｍ、クローン８２９０、１／１００）。ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ）を用いて可視化（revelation）を行った。細胞は定期的に継代され、均質な形態学的表現型を示し、ＢＸｄｍｇ１と命名された。
【0084】
ウェスタンブロット
ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）とプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて細胞をスクレ―ピングして細胞溶解液を調製し、１３０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙｓ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてタンパク質濃度を測定し、等量の細胞抽出物を４～１５％の事前に作製されたポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でウェスタンブロット分析用にロードした。タンパク質をニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ(R) Ｔｕｒｂｏ ｍｉｄｉ－ｓｉｚｅ、Ｂｉｏ Ｒａｄ）にブロットし、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳｃｉｅｎｃｅＴｅｃ、Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ、フランス）または０．１％のＴｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）を加えたトリス緩衝生理食塩水で希釈したＢＳＡでブロッキングし、一次抗体で４℃で一晩プローブした。一次抗体としては、ブロッキングバッファーまたは５％ＢＳＡで希釈した、ウサギポリクローナル抗ＥＺＨ２（１：１０００希釈、＃５２４６Ｓ、Ｏｚｙｍｅ／Ｃｅｌｌｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｓａｉｎｔ Ｃｙｒ ｌ'Ｅｃｏｌｅ、フランス）、ウサギ抗ＧＡＰＤＨ（１：１５０００、ＢＬＥ６４９２０３、Ｏｚｙｍｅ／Ｃｅｌｌｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナルＨ３Ｋ２７ｍｅ３（１：１０００、９７３３Ｓ、Ｏｚｙｍｅ／Ｃｅｌｌｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウスモノクローナルヒストンＨ３（１：５００、ｓｃ－５１７５７６、Ｓａｎｔａ－Ｃｒｕｚ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、マウスモノクローナルアクチン（Ｃ－２）（１：５００、ｓｃ－８４３２、Ｓａｎｔａ－Ｃｒｕｚ）、マウスモノクローナル抗ＨＭＧＣＲ（１：１０００、ＣＬ０２５９、Ａｔｌａｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｂｒｏｍｍａ、スウェーデン）、ウサギポリクローナル抗ＳＱＬＥ（１：１０００、１２５４４－１－ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）を使用した。ＴＢＳＴで洗浄後、これらの膜を対応するヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰコンジュゲート（１：３０００、１７０－６５１６、Ｂｉｏｒａｄ、Ｍａｒｎｅｓ－ｌａ－Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、フランス）または抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（１：３０００、Ａ０５４５、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）と培養した。ＴＢＳＴで洗浄後（２回、１０分間）、膜をＦｕｓｉｏｎ ＦＸ（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ）で可視化した。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を用いて定量を行った。
ＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）とプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて細胞をスクレ―ピングして細胞溶解液を調製し、１３０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。ＰｉｅｒｃｅＴＭ ＢＣＡＴＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙｓ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてタンパク質濃度を測定し、等量の細胞抽出物を４～１５％の事前に作製されたポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でウェスタンブロット分析用にロードした。タンパク質をニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ(R) Ｔｕｒｂｏ ｍｉｄｉ－ｓｉｚｅ、Ｂｉｏ Ｒａｄ）にブロットし、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳｃｉｅｎｃｅＴｅｃ、Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ、フランス）または０．１％のＴｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）を加えたトリス緩衝生理食塩水で希釈したＢＳＡでブロッキングし、一次抗体で４℃で一晩プローブした。一次抗体としては、ブロッキングバッファーまたは５％ＢＳＡで希釈した、ウサギポリクローナル抗ＥＺＨ２（１：１０００希釈、＃５２４６Ｓ、Ｏｚｙｍｅ／Ｃｅｌｌｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｓａｉｎｔ Ｃｙｒ ｌ'Ｅｃｏｌｅ、フランス）、ウサギ抗ＧＡＰＤＨ（１：１５０００、ＢＬＥ６４９２０３、Ｏｚｙｍｅ／Ｃｅｌｌｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ウサギモノクローナルＨ３Ｋ２７ｍｅ３（１：１０００、９７３３Ｓ、Ｏｚｙｍｅ／Ｃｅｌｌｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、マウスモノクローナルヒストンＨ３（１：５００、ｓｃ－５１７５７６、Ｓａｎｔａ－Ｃｒｕｚ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、マウスモノクローナルアクチン（Ｃ－２）（１：５００、ｓｃ－８４３２、Ｓａｎｔａ－Ｃｒｕｚ）、マウスモノクローナル抗ＨＭＧＣＲ（１：１０００、ＣＬ０２５９、Ａｔｌａｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｂｒｏｍｍａ、スウェーデン）、ウサギポリクローナル抗ＳＱＬＥ（１：１０００、１２５４４－１－ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）を使用した。ＴＢＳＴで洗浄後、これらの膜を対応するヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰコンジュゲート（１：３０００、１７０－６５１６、Ｂｉｏｒａｄ、Ｍａｒｎｅｓ－ｌａ－Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、フランス）または抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（１：３０００、Ａ０５４５、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、フランス）と培養した。ＴＢＳＴで洗浄後（２回、１０分間）、膜をＦｕｓｉｏｎ ＦＸ（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ）で可視化した。ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を用いて定量を行った。
【0085】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ｓｉＲＮＡを1倍のｓｉＭＡＸ希釈バッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝７．３（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、 Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、 ドイツ））で希釈した。細胞をそれぞれのＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）で別々にトランスフェクションした。簡単に説明すると、１０ｎＭのｓｉＲＮＡをＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者のリバース及びフォワードトランスフェクションの使用説明書に従ってトランスフェクションを行った。トランスフェクションの前に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）をトランスフェクション培地（ＯｐｔｉＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）で１／1００希釈した。
ｓｉＲＮＡを1倍のｓｉＭＡＸ希釈バッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ＝７．３（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、 Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、 ドイツ））で希釈した。細胞をそれぞれのＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡまたはコントロールｓｉＲＮＡ（ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）で別々にトランスフェクションした。簡単に説明すると、１０ｎＭのｓｉＲＮＡをＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造業者のリバース及びフォワードトランスフェクションの使用説明書に従ってトランスフェクションを行った。トランスフェクションの前に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）をトランスフェクション培地（ＯｐｔｉＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ Ｃｅｄｅｘ、Ｆｒａｎｃｅ）で１／1００希釈した。
【0086】
細胞遊走アッセイ及びスフェロイド培養
ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３ ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ， Ｌｔｄ、 Ｒｏｙｓｔｏｎ Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、 英国）を用いて遊走を観察した。統計解析にはオリジナルの未修正Ｉｎｃｕｃｙｔｅ画像を用いたが、効果を示すためにＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ４ （Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、米国）を用いて画像を変換した。細胞の視認性を最適化するために、グレースケールモード機能、バイクロームモード機能、ネガティブ機能、コントラスト/輝度機能、露出/ガンマ機能、ネガティブ機能を使用した。
スフェロイド形成アッセイには、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１０４個の細胞を用いた。１ウェル当たりのメチルセルロース／培地／細胞及び阻害剤（１０、１５または２０μＭ）混合物の量は１００μＬとし、メチルセルロースの最終濃度は０．５％とした。迅速かつ穏やかに均質化した後、混合物を丸底細胞培養マイクロプレート（Ｕ字型）に置き、細胞接着を制限した。その後、スフェロイドを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養した。ＩｎＣｅｌｌｉｓセルイメージャー（Ｂｅｒｔｉｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 Ｍｏｎｔｉｇｎｙ－ｌｅ－Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ、フランス）によってスフェロイドの写真とフィルムを撮影した。試験した用量では用量依存的な効果は観察されなかったため、統計解析には全用量を統合（pool）した。
ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３ ｌｉｖｅ－ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ， Ｌｔｄ、 Ｒｏｙｓｔｏｎ Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、 英国）を用いて遊走を観察した。統計解析にはオリジナルの未修正Ｉｎｃｕｃｙｔｅ画像を用いたが、効果を示すためにＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ４ （Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、米国）を用いて画像を変換した。細胞の視認性を最適化するために、グレースケールモード機能、バイクロームモード機能、ネガティブ機能、コントラスト/輝度機能、露出/ガンマ機能、ネガティブ機能を使用した。
スフェロイド形成アッセイには、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１０４個の細胞を用いた。１ウェル当たりのメチルセルロース／培地／細胞及び阻害剤（１０、１５または２０μＭ）混合物の量は１００μＬとし、メチルセルロースの最終濃度は０．５％とした。迅速かつ穏やかに均質化した後、混合物を丸底細胞培養マイクロプレート（Ｕ字型）に置き、細胞接着を制限した。その後、スフェロイドを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２４時間培養した。ＩｎＣｅｌｌｉｓセルイメージャー（Ｂｅｒｔｉｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、 Ｍｏｎｔｉｇｎｙ－ｌｅ－Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ、フランス）によってスフェロイドの写真とフィルムを撮影した。試験した用量では用量依存的な効果は観察されなかったため、統計解析には全用量を統合（pool）した。
【0087】
ＲＮＡ精製及びリアルタイム定量ＰＣＲ分析
ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、製造業者の使用説明書に従って細胞株から全ＲＮＡを単離した。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現の定量のため、Ｍａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて全ＲＮＡを再転写した。ＲＴ－ｑＰＣＲ増幅は、１Ｘ ＳＹＢＲ(R) Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑTM（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を含む１２μＬのマルチプレックスＰＣＲ反応で行った。フォワードプライマー及びリバースプライマーは表１に記載する通りである。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡは標準化のための内部基準とした。
ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、製造業者の使用説明書に従って細胞株から全ＲＮＡを単離した。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現の定量のため、Ｍａｘｉｍａ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて全ＲＮＡを再転写した。ＲＴ－ｑＰＣＲ増幅は、１Ｘ ＳＹＢＲ(R) Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑTM（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｅｕｒｏｐｅ）を含む１２μＬのマルチプレックスＰＣＲ反応で行った。フォワードプライマー及びリバースプライマーは表１に記載する通りである。ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡは標準化のための内部基準とした。
【0088】
【表1】
【0089】
ニワトリモデル及びマウスモデル
ニワトリＣＡＭアッセイＤＭＧモデルでは、１×１０６個のＮＥＭ１５７ｉ／ＮＥＭ１５７ｉ－ＶＥＧＦ（５０：５０）細胞を指定の濃度の阻害剤を含むマトリゲルと混合し、４０μｌをＣＡＭ上に直接置いた。実体顕微鏡（ＤＳ－Ｆｉ２、Ｎｉｋｏｎ／ＳＭＺ７４５Ｔ）を用いて腫瘍の増殖を２～３日ごとに観察した。腫瘍を４％ＰＦＡで固定し、写真に記録した。同様の方法を肝芽腫Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞にも用いた。
マウスモデルには、不死化ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶ株を用いた。ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉにルシフェラーゼベクター（Ｌｕｃ）をＭＯＩ １０で形質導入した。生後２日後、２μｌのＮｅｕｒｏＳｙｒｉｎｇｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｅｕｒｏｓ、 Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、 Ｂｒｕｘｅｌｌｅｓ、 ベルギー）を用いて、２％のイソフルラン及び５０％の酸素濃縮による麻酔下で、２μｌのＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ－Ｌｕｃ細胞１０５個を頸部から脳幹に３ｍｍの深さまで直接注入した。処理は８日後に開始し、週３回、溶媒コントロール（ＤＭＳＯ）またはＧＳＫ－１２６（６または１０ｍｇ／ｋｇ）、アトルバスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ）または併用（スタチンとＧＳＫ－１２６の併用）で行った。腫瘍の増殖を、各処理の１～２日後に麻酔したマウスを用いてＢｉｏｓｐａｃｅ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ、 Ｎｅｓｌｅｓ ｌａ Ｖａｌｌeｅ、 フランス）で非侵襲的に評価した。
処理の前に、マウスにマイクロタトゥーを施した（Ａｒａｍｉｓ ｋｉｔ、 ＢｉｏｓｅｂＬａｂ、フランス）。動物の体重を測定後、ＩＡＣＵＣの勧告に従って右下腹部に腹腔内注射を行った。注射量を３０ｇのマウスに対して２００μｌとし（３ｍｇ／ｍｌ）、毎週実際の体重に調節して１ｍｌのツベルクリン注射器及び２６ゲージの注射針を使用した。処理は８日目に開始し、週３回行った。Ｂｉｏｓｐａｃｅ ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ、 Ｎｅｓｌｅｓ ｌａ Ｖａｌｌeｅ、フランス）で腫瘍の増殖を非侵襲的に評価した。全処置を３７℃のヒーティングマット上で実施した。動物は剃毛し、イメージング専用ボックス内で無菌状態で麻酔した（ＰＳＭ－２下）。動物は、イメージングに先立ち、それぞれの体重に応じて、ＰＢＳ（５０～１００μｌ）で希釈した１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－Ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６４Ｘ）の腹腔内注射を受けた。その後、５０％酸素と共に２％イソフルランが維持されたフォトイメージャー内で、３７℃のヒーティングマット上にボックスを置いた。イメージングは週に２回行った。動かないことだけが求められ、動物の覚醒はほぼ瞬間的であるため麻酔時間は約１５分とした。動物は２１日目に頸椎脱臼により殺処分した。
ニワトリＣＡＭアッセイＤＭＧモデルでは、１×１０６個のＮＥＭ１５７ｉ／ＮＥＭ１５７ｉ－ＶＥＧＦ（５０：５０）細胞を指定の濃度の阻害剤を含むマトリゲルと混合し、４０μｌをＣＡＭ上に直接置いた。実体顕微鏡（ＤＳ－Ｆｉ２、Ｎｉｋｏｎ／ＳＭＺ７４５Ｔ）を用いて腫瘍の増殖を２～３日ごとに観察した。腫瘍を４％ＰＦＡで固定し、写真に記録した。同様の方法を肝芽腫Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞にも用いた。
マウスモデルには、不死化ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶ株を用いた。ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉにルシフェラーゼベクター（Ｌｕｃ）をＭＯＩ １０で形質導入した。生後２日後、２μｌのＮｅｕｒｏＳｙｒｉｎｇｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｅｕｒｏｓ、 Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、 Ｂｒｕｘｅｌｌｅｓ、 ベルギー）を用いて、２％のイソフルラン及び５０％の酸素濃縮による麻酔下で、２μｌのＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ－Ｌｕｃ細胞１０５個を頸部から脳幹に３ｍｍの深さまで直接注入した。処理は８日後に開始し、週３回、溶媒コントロール（ＤＭＳＯ）またはＧＳＫ－１２６（６または１０ｍｇ／ｋｇ）、アトルバスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ）または併用（スタチンとＧＳＫ－１２６の併用）で行った。腫瘍の増殖を、各処理の１～２日後に麻酔したマウスを用いてＢｉｏｓｐａｃｅ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ、 Ｎｅｓｌｅｓ ｌａ Ｖａｌｌeｅ、 フランス）で非侵襲的に評価した。
処理の前に、マウスにマイクロタトゥーを施した（Ａｒａｍｉｓ ｋｉｔ、 ＢｉｏｓｅｂＬａｂ、フランス）。動物の体重を測定後、ＩＡＣＵＣの勧告に従って右下腹部に腹腔内注射を行った。注射量を３０ｇのマウスに対して２００μｌとし（３ｍｇ／ｍｌ）、毎週実際の体重に調節して１ｍｌのツベルクリン注射器及び２６ゲージの注射針を使用した。処理は８日目に開始し、週３回行った。Ｂｉｏｓｐａｃｅ ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｓｐａｃｅ Ｌａｂ、 Ｎｅｓｌｅｓ ｌａ Ｖａｌｌeｅ、フランス）で腫瘍の増殖を非侵襲的に評価した。全処置を３７℃のヒーティングマット上で実施した。動物は剃毛し、イメージング専用ボックス内で無菌状態で麻酔した（ＰＳＭ－２下）。動物は、イメージングに先立ち、それぞれの体重に応じて、ＰＢＳ（５０～１００μｌ）で希釈した１５０ｍｇ／ｋｇのＤ－Ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ２６４Ｘ）の腹腔内注射を受けた。その後、５０％酸素と共に２％イソフルランが維持されたフォトイメージャー内で、３７℃のヒーティングマット上にボックスを置いた。イメージングは週に２回行った。動かないことだけが求められ、動物の覚醒はほぼ瞬間的であるため麻酔時間は約１５分とした。動物は２１日目に頸椎脱臼により殺処分した。
【0090】
統計方法
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）を用いて統計分析を行った。２つ以上のサンプルの定量的比較には、一元配置分散分析検定を用い、続いてボンフェローニの後検定を行った。データ分布が正規分布でない場合は、適切な条件を選択したダンの後検定に従いクラスカル・ワリス検定を用いた。独立した２つの小さなサンプルの比較には、対応のないｔ－検定を用いた。半定量的アプローチによる表現型評価で解析した実験については、フィッシャーの直接確率検定を用いた。すべての実験（生体内の実験を除く）は、独立して少なくとも３回実施した。ｎ＝独立した実験。ｐ値＜０．０５の場合に統計的に有意とみなした。図中のすべてのデータについて、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、または正確なｐ値（示される場合）とする。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、米国）を用いて統計分析を行った。２つ以上のサンプルの定量的比較には、一元配置分散分析検定を用い、続いてボンフェローニの後検定を行った。データ分布が正規分布でない場合は、適切な条件を選択したダンの後検定に従いクラスカル・ワリス検定を用いた。独立した２つの小さなサンプルの比較には、対応のないｔ－検定を用いた。半定量的アプローチによる表現型評価で解析した実験については、フィッシャーの直接確率検定を用いた。すべての実験（生体内の実験を除く）は、独立して少なくとも３回実施した。ｎ＝独立した実験。ｐ値＜０．０５の場合に統計的に有意とみなした。図中のすべてのデータについて、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、または正確なｐ値（示される場合）とする。
【0091】
実施例１．２：結果
ＤＭＧサンプル及び細胞株におけるＥＺＨ２遺伝子及びタンパク質の発現
ＥＺＨ２の転写産物は、正常脳と比較してＤＭＧサンプルで有意に過剰発現した（図１Ａ）。同様の結果が、前立腺ガンから、肺ガン、肝細胞ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、膵ガンに渡るその他の固形悪性腫瘍でも認められている。平均ＥＺＨ２過剰発現は、２つのグループ間で発現のばらつきが大きいため、コントロールと比較してあまり上昇しなかったが、ＥＺＨ２発現の中央値付近で再グループ化されたサンプルのコアセットとその差は依然として有意であった（図１Ａ、左プロット、四角の枠）。本研究で使用した細胞株は、ウェスタンブロットによって明らかになったように、すべてＥＺＨ２タンパク質の発現を示した（図１Ｂ）。
ＤＭＧサンプル及び細胞株におけるＥＺＨ２遺伝子及びタンパク質の発現
ＥＺＨ２の転写産物は、正常脳と比較してＤＭＧサンプルで有意に過剰発現した（図１Ａ）。同様の結果が、前立腺ガンから、肺ガン、肝細胞ガン、結腸直腸ガン、乳ガン、膵ガンに渡るその他の固形悪性腫瘍でも認められている。平均ＥＺＨ２過剰発現は、２つのグループ間で発現のばらつきが大きいため、コントロールと比較してあまり上昇しなかったが、ＥＺＨ２発現の中央値付近で再グループ化されたサンプルのコアセットとその差は依然として有意であった（図１Ａ、左プロット、四角の枠）。本研究で使用した細胞株は、ウェスタンブロットによって明らかになったように、すべてＥＺＨ２タンパク質の発現を示した（図１Ｂ）。
【0092】
ＤＭＧ細胞はＧＳＫ－１２６阻害剤に感受性がある
有意なＧＳＫ－１２６の増殖阻害は、６μＭ以上の用量で見られ、２５μＭ以上の高用量では完全だった（図１Ｃ）。増殖阻害は、細胞増殖が強く抑制されたときと同程度の用量で、腫瘍細胞のアポトーシスの増加を伴った（図１Ｄ）。さらに、ＧＳＫ－１２６はＤＭＧ細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅ３トリメチル化を効率的に阻害した（図１Ｅ）。最後に、３つのＤＭＧ細胞株でＧＳＫ－１２６の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を測定したところ、７．６～１０．３μＭの範囲であった（図２）。
有意なＧＳＫ－１２６の増殖阻害は、６μＭ以上の用量で見られ、２５μＭ以上の高用量では完全だった（図１Ｃ）。増殖阻害は、細胞増殖が強く抑制されたときと同程度の用量で、腫瘍細胞のアポトーシスの増加を伴った（図１Ｄ）。さらに、ＧＳＫ－１２６はＤＭＧ細胞のＨ３Ｋ２７ｍｅ３トリメチル化を効率的に阻害した（図１Ｅ）。最後に、３つのＤＭＧ細胞株でＧＳＫ－１２６の半最大阻害濃度（ＩＣ５０）を測定したところ、７．６～１０．３μＭの範囲であった（図２）。
【0093】
ＧＳＫ－１２６処理ＤＩＰＧ細胞における脂質及びコレステロール合成に関与する遺伝子の発現の増加
ＤＩＰＧ細胞のＧＳＫ－１２６による処理によって、ＨＭＧＣＳ、ＨＭＧＣＲ、ＬＤＬＲ、ＮＰＣ１、及びＳＱＬＥ遺伝子、ならびにＨＭＧＣＲ及びＳＱＬＥタンパク質の発現が誘導されている（図３及び４）。これらの結果は、我々のプロテオミクスデータを裏付けるものであり（Rahal, F., C. Capdevielle, B. Rousseau, J. Izotte, J. W. Dupuy, D. Cappellen, G. Chotard, M. Menard, J. Charpentier, V. Jecko, C. Caumont, E. Gimbert, C. F. Grosset and M. Hagedorn (2022). "An EZH2 blocker sensitizes histone mutated diffuse midline glioma to cholesterol metabolism inhibitors through an off-target effect." Neurooncol Adv 4(1): vdac018参照）、さらにＧＳＫ－１２６がＤＩＰＧ細胞の脂質及びコレステロール合成経路を活性化することを証明するものである。
ＤＩＰＧ細胞のＧＳＫ－１２６による処理によって、ＨＭＧＣＳ、ＨＭＧＣＲ、ＬＤＬＲ、ＮＰＣ１、及びＳＱＬＥ遺伝子、ならびにＨＭＧＣＲ及びＳＱＬＥタンパク質の発現が誘導されている（図３及び４）。これらの結果は、我々のプロテオミクスデータを裏付けるものであり（Rahal, F., C. Capdevielle, B. Rousseau, J. Izotte, J. W. Dupuy, D. Cappellen, G. Chotard, M. Menard, J. Charpentier, V. Jecko, C. Caumont, E. Gimbert, C. F. Grosset and M. Hagedorn (2022). "An EZH2 blocker sensitizes histone mutated diffuse midline glioma to cholesterol metabolism inhibitors through an off-target effect." Neurooncol Adv 4(1): vdac018参照）、さらにＧＳＫ－１２６がＤＩＰＧ細胞の脂質及びコレステロール合成経路を活性化することを証明するものである。
【0094】
ＤＭＧ細胞に対するＡＣＳＳ２阻害剤、アトルバスタチン、及びテルビナフィンの単独またはＧＳＫ－１２６との併用による効果
我々は、これらの変化を解釈するために、コレステロールの生合成に関与するいくつかの重要な酵素［スクアレンエポキシダーゼ、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムA（ＨＭＧ－ＣｏＡ）還元酵素、アセチルコアアセテート依存性アセチル－ＣｏＡ合成酵素２］が、ＧＳＫ－１２６処理ＤＭＧ細胞にとって重要になったという仮説を立てた。これらの酵素は、脂質代謝関連疾患に関与するものとして長い間知られてきた。試験した各コレステロール生合成阻害剤について、２つの異なる腫瘍細胞株に対して単独では効果が見られなかった（図５）。
しかしながら、ＤＭＧ細胞の増殖に影響を与えない低用量のＧＳＫ－１２６（４μＭ）と共処理した場合（図１Ｃ、図７Ｄ）、１～５μＭの用量で３つの阻害剤すべてに有意な増殖阻害が生じた（図６、Ａ～Ｃ）。
我々は、これらの変化を解釈するために、コレステロールの生合成に関与するいくつかの重要な酵素［スクアレンエポキシダーゼ、ヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムA（ＨＭＧ－ＣｏＡ）還元酵素、アセチルコアアセテート依存性アセチル－ＣｏＡ合成酵素２］が、ＧＳＫ－１２６処理ＤＭＧ細胞にとって重要になったという仮説を立てた。これらの酵素は、脂質代謝関連疾患に関与するものとして長い間知られてきた。試験した各コレステロール生合成阻害剤について、２つの異なる腫瘍細胞株に対して単独では効果が見られなかった（図５）。
しかしながら、ＤＭＧ細胞の増殖に影響を与えない低用量のＧＳＫ－１２６（４μＭ）と共処理した場合（図１Ｃ、図７Ｄ）、１～５μＭの用量で３つの阻害剤すべてに有意な増殖阻害が生じた（図６、Ａ～Ｃ）。
【0095】
単離直後のＤＭＧ細胞に対するＤＭＧ細胞株データの検証
不死化または一定期間培養された細胞株は、元の細胞とは異なる挙動を示すことがある。そこで、我々はＤＭＧ生検から細胞を単離し、機能解析を行った。明視野顕微鏡で観察すると、均質な紡錘形の細胞集団がみられた（図７Ａ、及び挿入図）。ＢＸｄｍｇ１細胞のＨＥ染色によって、非常に高い有糸分裂活性を有する不規則な異核細胞核を持つ異型の好酸性細胞が認められ、ほぼすべての腫瘍細胞がＫｉ－６７抗原を発現することがわかった（図７Ａ）。腫瘍細胞はまた、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異に対して強い陽性であり、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３トリメチル化に対しては陰性であった（図７Ａ）。ＢＸｄｍｇ１細胞の起源である生検の細胞的、分子的、遺伝学的特性評価により、ＢＸｄｍｇ１細胞で保存されているドライバー発ガンにつながるヒストンＨ３Ｆ３Ａのｃ８３Ａ＞Ｔ；ｐＫ２８Ｍ変異が特に確認された。
ＧＳＫ－１２６処理によって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３トリメチル化が用量依存的に減少することが、ヒストン精製タンパク質抽出物のウェスタンブロットによって明らかになった（図７Ａ、右下パネル）。ＢＸｄｍｇ１細胞はＧＳＫ－１２６による増殖阻害に対して感受性が高く（図７Ｂ）、ＩＣ５０はその他のＤＭＧ株と同程度の約１０μＭであった（図７Ｃ）。ＢＸｄｍｇ１細胞の増殖は、１０μＭまでは３つのコレステロール生合成阻害剤の影響を受けなかった（図７Ｄ）。ＧＳＫ－１２６とアトルバスタチンを併用した場合、各阻害剤について３μＭと５μＭの低用量で有意な増殖阻害を示したが、ＧＳＫ－１２６単独のすでに確立された細胞毒性のため、この効果は予想通り高用量ではみられなかった（図７Ｅ）。
不死化または一定期間培養された細胞株は、元の細胞とは異なる挙動を示すことがある。そこで、我々はＤＭＧ生検から細胞を単離し、機能解析を行った。明視野顕微鏡で観察すると、均質な紡錘形の細胞集団がみられた（図７Ａ、及び挿入図）。ＢＸｄｍｇ１細胞のＨＥ染色によって、非常に高い有糸分裂活性を有する不規則な異核細胞核を持つ異型の好酸性細胞が認められ、ほぼすべての腫瘍細胞がＫｉ－６７抗原を発現することがわかった（図７Ａ）。腫瘍細胞はまた、Ｈ３Ｋ２７Ｍ変異に対して強い陽性であり、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３トリメチル化に対しては陰性であった（図７Ａ）。ＢＸｄｍｇ１細胞の起源である生検の細胞的、分子的、遺伝学的特性評価により、ＢＸｄｍｇ１細胞で保存されているドライバー発ガンにつながるヒストンＨ３Ｆ３Ａのｃ８３Ａ＞Ｔ；ｐＫ２８Ｍ変異が特に確認された。
ＧＳＫ－１２６処理によって、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３トリメチル化が用量依存的に減少することが、ヒストン精製タンパク質抽出物のウェスタンブロットによって明らかになった（図７Ａ、右下パネル）。ＢＸｄｍｇ１細胞はＧＳＫ－１２６による増殖阻害に対して感受性が高く（図７Ｂ）、ＩＣ５０はその他のＤＭＧ株と同程度の約１０μＭであった（図７Ｃ）。ＢＸｄｍｇ１細胞の増殖は、１０μＭまでは３つのコレステロール生合成阻害剤の影響を受けなかった（図７Ｄ）。ＧＳＫ－１２６とアトルバスタチンを併用した場合、各阻害剤について３μＭと５μＭの低用量で有意な増殖阻害を示したが、ＧＳＫ－１２６単独のすでに確立された細胞毒性のため、この効果は予想通り高用量ではみられなかった（図７Ｅ）。
【0096】
細胞遊走に対するアトルバスタチン、ＧＳＫ－１２６、及び組合せの効果
我々はまた、Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ ＩｎｃｕＣｙｔｅ(R) Ｓ３ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を備える自動細胞スクラッチャーを用いて、ＤＭＧ細胞遊走に対する薬剤の影響を調べた。細胞の集合及び創傷開始後２４時間から４８時間まで細胞運動を測定した。初期露出領域は非常にきれいで、説明のためすべての条件において同じ大きさの枠で示す（図８Ａ～Ｃ）。２４時間後、遊走するＤＭＧ細胞ＮＥＭ１５７ｉ、ＮＥＭ１６３ｉ、及び初代ＢＸｄｍｇ１細胞によって覆われた露出領域の割合がＩｎｃｕｃｙｔｅソフトウェアによって報告され、右のグラフに条件ごとに表示されている（図８Ａ～Ｃ）。試験したすべての細胞で、単独処理または溶媒コントロールと比較して、併用処理で遊走活性の有意な阻害（約２倍）がみられた（ｐ＜０．００１）。ＮＥＭ１６３ｉ及びＢＸｄｍｇ１細胞では、ＤＭＳＯと比較してアトルバスタチンによっても遊走は遅くなったが（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１）、併用処理に供した細胞は、アトルバスタチン単独と比較して遊走細胞で覆われた領域がさらに少なかった（ｐ＜０．００１）。
我々はまた、Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ ＩｎｃｕＣｙｔｅ(R) Ｓ３ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を備える自動細胞スクラッチャーを用いて、ＤＭＧ細胞遊走に対する薬剤の影響を調べた。細胞の集合及び創傷開始後２４時間から４８時間まで細胞運動を測定した。初期露出領域は非常にきれいで、説明のためすべての条件において同じ大きさの枠で示す（図８Ａ～Ｃ）。２４時間後、遊走するＤＭＧ細胞ＮＥＭ１５７ｉ、ＮＥＭ１６３ｉ、及び初代ＢＸｄｍｇ１細胞によって覆われた露出領域の割合がＩｎｃｕｃｙｔｅソフトウェアによって報告され、右のグラフに条件ごとに表示されている（図８Ａ～Ｃ）。試験したすべての細胞で、単独処理または溶媒コントロールと比較して、併用処理で遊走活性の有意な阻害（約２倍）がみられた（ｐ＜０．００１）。ＮＥＭ１６３ｉ及びＢＸｄｍｇ１細胞では、ＤＭＳＯと比較してアトルバスタチンによっても遊走は遅くなったが（ｐ＜０．０５及びｐ＜０．００１）、併用処理に供した細胞は、アトルバスタチン単独と比較して遊走細胞で覆われた領域がさらに少なかった（ｐ＜０．００１）。
【0097】
アトルバスタチン／ＧＳＫ－１２６併用による腫瘍細胞スフェロイド形成の阻害
我々の細胞における細胞運動及び接着現象をさらに調べるために、ＤＭＧ細胞のスフェロイド形成を可能にするプロトコルを用い、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍによって細胞運動及び凝集を解析した。腫瘍スフェロイドは、従来の二次元モデルよりも現実的な培養系と考えられ、より生体内の増殖条件に近い三次元の複雑さが加わる。我々の初代ＢＸｄｍｇ１細胞を含む３つの異なるＤＭＧ細胞株を用いたところ、すべての細胞株で腫瘍神経球を確実に形成することができた（図９Ａ、９Ｂ、９Ｄ）。大きさはわずかに異なり、境界の形状が異なることもあったが（境界が明瞭なものと不規則なもの）、丸い形状の球体が２４時間以内に急速に形成された。しかしながら、ＧＳＫ－１２６の単独処理と比較して、併用処理に供した細胞はほとんどスフェロイドを形成しなかった（ｐ＜０．００１、すべての細胞について、図９Ｃ及び９Ｅ）。いくつかのＧＳＫ－１２６処理培養では、特に初代細胞でスフェロイド形成に影響がみられた（図９Ｄ、９Ｅ）。
我々の細胞における細胞運動及び接着現象をさらに調べるために、ＤＭＧ細胞のスフェロイド形成を可能にするプロトコルを用い、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍによって細胞運動及び凝集を解析した。腫瘍スフェロイドは、従来の二次元モデルよりも現実的な培養系と考えられ、より生体内の増殖条件に近い三次元の複雑さが加わる。我々の初代ＢＸｄｍｇ１細胞を含む３つの異なるＤＭＧ細胞株を用いたところ、すべての細胞株で腫瘍神経球を確実に形成することができた（図９Ａ、９Ｂ、９Ｄ）。大きさはわずかに異なり、境界の形状が異なることもあったが（境界が明瞭なものと不規則なもの）、丸い形状の球体が２４時間以内に急速に形成された。しかしながら、ＧＳＫ－１２６の単独処理と比較して、併用処理に供した細胞はほとんどスフェロイドを形成しなかった（ｐ＜０．００１、すべての細胞について、図９Ｃ及び９Ｅ）。いくつかのＧＳＫ－１２６処理培養では、特に初代細胞でスフェロイド形成に影響がみられた（図９Ｄ、９Ｅ）。
【0098】
ＮＯＤ／ＬｔＳｚ－ｓｃｉｄＩＬ２Ｒγ（ＮＳＧ）マウスにおける同所ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ－Ｌｕｃ移植腫瘍細胞に対するＧＳＫ－１２６の効果
我々は、新生児免疫不全マウスにおける同所性脳幹グリオーマモデルを開発した。ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ－Ｌｕｃ細胞はレンチウイルストランスフェクション手法を用いて作製した。第１の実験では、このモデルでＧＳＫ－１２６処理の有効性を試験したところ、溶媒コントロール（ｎ＝１８、図１０Ａ）と比較して、１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与量において、処理を行ったマウス（ｎ＝２３）で生物発光（ｐ＝０．００９）によって証明される有意な増殖抑制がみられた。アトルバスタチン／ＧＳＫ－１２６併用処理実験については、増殖阻害を避けるためにＧＳＫ－１２６の投与量を６ｍｇ／ｋｇに減らした。４回の処理後、アトルバスタチン（ｎ＝１３）、ＧＳＫ－１２６（ｎ＝１７）（ｐ＜０．０５）、及びＤＭＳＯコントロール（ｐ＜０．０１、ｎ＝１３、図１０Ｂ）と比較して、併用によって有意に上回る腫瘍増殖阻害が生じた（ｎ＝１３）。コントロールと単独処理の間に有意差は認められなかった。本試験で用いた動物のすべての生物発光画像を示す（図１０Ａ、Ｂ）。アトルバスタチン／ＧＳＫ－１２６併用処理は、我々が最近開発したニワトリＣＡＭ ＤＭＧモデルにおいてもより優れた抗腫瘍効果を示す。この短期モデルでは、以前に確立された成人神経膠腫ＣＡＭモデルに基づき、薬剤を腫瘍に直接適用し、増殖を生体顕微鏡で観察することができる。薬物作用の表現型の特性評価は、腫瘍の血管新生の程度を高または低／中に分類することによって実施できる（図１０Ｃ、右パネル）。血管新生の程度は、腫瘍細胞が宿主組織と相互作用する能力として解釈されるもので、腫瘍細胞の侵攻性を示す間接的な指標となる。併用処理を行った実験腫瘍は、アトルバスタチン（ｐ＝０．０３６）、ＧＳＫ－１２６（ｐ＝０．０２４８）、及びＤＭＳＯコントロール（ｐ＝０．０３、図１０Ｃ、左グラフ）と比較して、血管新生の減少を示した。
我々は、新生児免疫不全マウスにおける同所性脳幹グリオーマモデルを開発した。ＳＵ－ＤＩＰＧ－ＩＶｉ－Ｌｕｃ細胞はレンチウイルストランスフェクション手法を用いて作製した。第１の実験では、このモデルでＧＳＫ－１２６処理の有効性を試験したところ、溶媒コントロール（ｎ＝１８、図１０Ａ）と比較して、１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内投与量において、処理を行ったマウス（ｎ＝２３）で生物発光（ｐ＝０．００９）によって証明される有意な増殖抑制がみられた。アトルバスタチン／ＧＳＫ－１２６併用処理実験については、増殖阻害を避けるためにＧＳＫ－１２６の投与量を６ｍｇ／ｋｇに減らした。４回の処理後、アトルバスタチン（ｎ＝１３）、ＧＳＫ－１２６（ｎ＝１７）（ｐ＜０．０５）、及びＤＭＳＯコントロール（ｐ＜０．０１、ｎ＝１３、図１０Ｂ）と比較して、併用によって有意に上回る腫瘍増殖阻害が生じた（ｎ＝１３）。コントロールと単独処理の間に有意差は認められなかった。本試験で用いた動物のすべての生物発光画像を示す（図１０Ａ、Ｂ）。アトルバスタチン／ＧＳＫ－１２６併用処理は、我々が最近開発したニワトリＣＡＭ ＤＭＧモデルにおいてもより優れた抗腫瘍効果を示す。この短期モデルでは、以前に確立された成人神経膠腫ＣＡＭモデルに基づき、薬剤を腫瘍に直接適用し、増殖を生体顕微鏡で観察することができる。薬物作用の表現型の特性評価は、腫瘍の血管新生の程度を高または低／中に分類することによって実施できる（図１０Ｃ、右パネル）。血管新生の程度は、腫瘍細胞が宿主組織と相互作用する能力として解釈されるもので、腫瘍細胞の侵攻性を示す間接的な指標となる。併用処理を行った実験腫瘍は、アトルバスタチン（ｐ＝０．０３６）、ＧＳＫ－１２６（ｐ＝０．０２４８）、及びＤＭＳＯコントロール（ｐ＝０．０３、図１０Ｃ、左グラフ）と比較して、血管新生の減少を示した。
【0099】
実施例２：肝芽腫を治療及び／または予防するための三剤併用治療の有効性
ＥＺＨ２は増殖性肝芽腫における中心的なガン遺伝子である
我々は、従来の二次元培養及び三次元スフェロイドモデルを用いて、ＲＮＡ干渉によるＥＺＨ２の除去が、老化を活性化することによって生体外でＨＢ由来細胞株Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２の増殖を阻害することを見出した（以下の実施例４及び図２１を参照）。生体内では、ＥＺＨ２の除去は、絨毛尿膜アッセイ（CAM、Indersie et al, Oncotarget, 2017, PMID:29662633）を用いて肝芽腫の発生を完全に阻害し、腫瘍血管新生を低下させることによって腫瘍細胞の侵攻性を低下させた（図１１）。したがって、ＥＺＨ２は肝芽腫の治療の適切な治療標的である。
次に、我々は２つのＥＺＨ２阻害剤、ＧＳＫ－１２６及びタゼメトスタット（ＥＰＺ－６４３８としても知られる－https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/66558664参照）の肝芽腫細胞の増殖に対する効果を測定した。タゼメトスタットは２０μＭ以上の濃度で有効であったが（図１２）、ＧＳＫ－１２６のＩＣ５０（半最大有効濃度）は６～８μＭ程度であり、シスプラチンよりも２倍低い濃度であった（図１２）。
そこで、我々は従来の２次元培養条件及び３次元腫瘍スフェロイドを用いて、肝芽腫細胞を排除するためにシスプラチンとＧＳＫ－１２６（図１２Ａの各細胞株で薬剤ごとに測定したＩＣ５０を参照）を併用する効果を試験した。図１３に示す通り、ＧＳＫ－１２６及びシスプラチンは、両方の培養モデルにおいて肝芽腫細胞を排除する相加的効果を示した。
ＥＺＨ２は増殖性肝芽腫における中心的なガン遺伝子である
我々は、従来の二次元培養及び三次元スフェロイドモデルを用いて、ＲＮＡ干渉によるＥＺＨ２の除去が、老化を活性化することによって生体外でＨＢ由来細胞株Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２の増殖を阻害することを見出した（以下の実施例４及び図２１を参照）。生体内では、ＥＺＨ２の除去は、絨毛尿膜アッセイ（CAM、Indersie et al, Oncotarget, 2017, PMID:29662633）を用いて肝芽腫の発生を完全に阻害し、腫瘍血管新生を低下させることによって腫瘍細胞の侵攻性を低下させた（図１１）。したがって、ＥＺＨ２は肝芽腫の治療の適切な治療標的である。
次に、我々は２つのＥＺＨ２阻害剤、ＧＳＫ－１２６及びタゼメトスタット（ＥＰＺ－６４３８としても知られる－https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/66558664参照）の肝芽腫細胞の増殖に対する効果を測定した。タゼメトスタットは２０μＭ以上の濃度で有効であったが（図１２）、ＧＳＫ－１２６のＩＣ５０（半最大有効濃度）は６～８μＭ程度であり、シスプラチンよりも２倍低い濃度であった（図１２）。
そこで、我々は従来の２次元培養条件及び３次元腫瘍スフェロイドを用いて、肝芽腫細胞を排除するためにシスプラチンとＧＳＫ－１２６（図１２Ａの各細胞株で薬剤ごとに測定したＩＣ５０を参照）を併用する効果を試験した。図１３に示す通り、ＧＳＫ－１２６及びシスプラチンは、両方の培養モデルにおいて肝芽腫細胞を排除する相加的効果を示した。
【0100】
続いて、我々は、ＥＺＨ２がシスプラチンに対する肝芽腫細胞の抵抗性に関与しているという仮説を検証した。これは、シスプラチンを用いた治療を受けた再発患者によくみられる状況である。図１４Ａに示す通り、ＥＺＨ２タンパク質の非存在下では、Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞のシスプラチンに対する感受性は３５～４８％上昇し、シスプラチン耐性にＥＺＨ２が関与していることを示した。シスプラチンはまた、ＥＺＨ２を発現していない場合、三次元スフェロイドとして培養した肝芽腫細胞をより強力に排除した（図１４Ｂ）。
ＥＺＨ２阻害剤ＧＳＫ－１２６が効率的に肝芽腫細胞を排除し、ＤＭＧ細胞におけるコレステロール代謝を調節することから（実施例１．２参照）、我々はスタチンがＧＳＫ－１２６及び／またはシスプラチンと相乗作用して生体外でこれらの腫瘍性肝細胞を排除するかどうかを試験した。図１５Ａに示す通り、シンバスタチンまたはアトルバスタチン単独は、それぞれ２０μＭ及び５０μＭ以上の濃度で、Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞に対して抗腫瘍効果を示した。予想の通り、ＧＳＫ－１２６に対する（シスプラチンに対してではなく）Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞の感受性が、シンバスタチンまたはアトルバスタチンの存在下で有意に（２倍以上）増加し（図１５Ｂ）、スタチンがＧＳＫ－１２６と（シスプラチンとではなく）相乗作用して肝芽腫細胞を排除することを示した。
ＥＺＨ２阻害剤ＧＳＫ－１２６が効率的に肝芽腫細胞を排除し、ＤＭＧ細胞におけるコレステロール代謝を調節することから（実施例１．２参照）、我々はスタチンがＧＳＫ－１２６及び／またはシスプラチンと相乗作用して生体外でこれらの腫瘍性肝細胞を排除するかどうかを試験した。図１５Ａに示す通り、シンバスタチンまたはアトルバスタチン単独は、それぞれ２０μＭ及び５０μＭ以上の濃度で、Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞に対して抗腫瘍効果を示した。予想の通り、ＧＳＫ－１２６に対する（シスプラチンに対してではなく）Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞の感受性が、シンバスタチンまたはアトルバスタチンの存在下で有意に（２倍以上）増加し（図１５Ｂ）、スタチンがＧＳＫ－１２６と（シスプラチンとではなく）相乗作用して肝芽腫細胞を排除することを示した。
【0101】
次に、我々はＧＳＫ－１２６、シスプラチン、及びスタチンを組み合わせた三剤併用治療を試験した。図１６Ａ～Ｂに示す通り、ＧＳＫ－１２６＋シスプラチン（各３μＭ）の組合せに対するＨｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞の感受性は、シンバスタチンまたはアトルバスタチンの存在下で有意に増加した。ＧＳＫ－１２６＋シスプラチン＋スタチンの三剤併用治療は、ＧＳＫ－１２６＋スタチンの併用よりも肝芽腫細胞を死滅させる効率が有意に高かった（図１６Ａ～Ｂ）。ここでも、シンバスタチンはアトルバスタチンよりわずかに効率よく、ＧＳＫ－１２６単独またはシスプラチンとの併用による抗腫瘍効果を増強した。
【0102】
最後に、我々はＧＳＫ－１２６とスタチンの相乗効果がその他のＥＺＨ２メチルトランスフェラーゼ阻害剤まで拡張できるという仮説を検証した。驚くべきことに、図１７のデータは、シンバスタチンまたはアトルバスタチンがＥＺＨ２阻害剤タゼメトスタット（Ｅ７４３８／ＥＰＺ６４３８）に対する肝芽腫細胞の感受性を有意に増強することを示しており、スタチンがすべてのＥＺＨ２阻害剤と相乗作用する可能性が高いという我々の知見を裏付けている。
【0103】
以上、ＤＭＧ及び肝芽腫細胞の生体外及び生体内データによって、ＥＺＨ２阻害剤（ＧＳＫ－１２６、タゼメトスタット．．．）によるＥＺＨ２酵素活性の阻害は、コレステロールの生合成を活性化し、腫瘍細胞がＥＺＨ２阻害剤によってもたらされる有害な作用に抵抗して生存することを可能にする適応代謝プロセスであることが明確に示された。スタチンとＥＺＨ２阻害剤を組み合わせることにより、腫瘍細胞はＥＺＨ２の不活性化によってコレステロールを合成できなくなり、アポトーシス過程によって死滅するようにプログラムされる。
【0104】
実施例３：ＥＺＨ２上方制御は増殖性肝芽腫及び予後不良指標と関連する
実施例３．１：材料及び方法
細胞培養
ヒトＨＢ細胞株Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２を、それぞれ１ｇ／ＬのＤＭＥＭ及び４．５ｇ／ＬのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、 Ｇｉｂｃｏ）で単層培養した。培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（１，０００単位／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）で補充した。使用したすべての細胞は、短縦列反復（ＳＴＲ）プロファイリングを用いて定期的に認証され、月に２回マイコプラズマ感染の検査を受けた。
三次元培養では、低接着性の９６ウェルプレートに１ウェル当たり１０，０００個の細胞でスフェロイドを形成した。各ウェルで、細胞を１００μｌの培地及び最終濃度０．５％のメチルセルロース１００μｌと混合した。スフェロイドを入れたプレートを培養に供し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ(R) Ｓ３ ライブセル解析システム（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて定期的にスキャンした。
実施例３．１：材料及び方法
細胞培養
ヒトＨＢ細胞株Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２を、それぞれ１ｇ／ＬのＤＭＥＭ及び４．５ｇ／ＬのＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、 Ｇｉｂｃｏ）で単層培養した。培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（１，０００単位／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）で補充した。使用したすべての細胞は、短縦列反復（ＳＴＲ）プロファイリングを用いて定期的に認証され、月に２回マイコプラズマ感染の検査を受けた。
三次元培養では、低接着性の９６ウェルプレートに１ウェル当たり１０，０００個の細胞でスフェロイドを形成した。各ウェルで、細胞を１００μｌの培地及び最終濃度０．５％のメチルセルロース１００μｌと混合した。スフェロイドを入れたプレートを培養に供し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ(R) Ｓ３ ライブセル解析システム（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて定期的にスキャンした。
【0105】
ｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＥＺＨ２ ｍＲＮＡを標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡ［配列番号１１に記載のｓｉＥＺＨ２－１：ＧＡＧ ＧＧＡ ＡＡＧ ＵＧＵ ＡＵＧ ＡＵＡ Ａ（ＴＴ）、配列番号１２に記載のｓｉＥＺＨ２－２：ＵＵＵ ＧＧＣ ＵＵＣ ＡＵＣ ＵＵＵ ＡＵＵ Ｇ（ＴＴ）］、またはコントロールＲＮＡ（ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ、Ｑｉａｇｅｎ）で細胞のトランスフェクションを行った。トランスフェクションは、1ウェル当たり２５０，０００個の細胞を添加した6ウェルマイクロプレートで行った。ｓｉＲＮＡを1倍のｓｉＭＡＸ希釈バッファー（６ｍＭ ＨＥＰＥＳ、 ２０ｍＭ ＫＣｌ、 ０，２ｍＭ ＭｇＣｌ２、 ｐＨ＝７．３；Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、 Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）で希釈した。ｓｉＲＮＡをトランスフェクション培地（ＯｐｔｉＭＥＭ、 Ｇｉｂｃｏ）で１／１００に希釈したリポフェクタミン（ＲＮＡｉＭａｘ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と接触させた。各ｓｉＲＮＡの最終濃度は２０ｎＭとした。混合物を室温で２０分間培養してリポソームを形成させた後、抗生物質を含まない培地で６時間培養した細胞に加えた。トランスフェクション後、培地を抗生物質を含む新しい培地に交換した。
ＥＺＨ２ ｍＲＮＡを標的とする２つの異なるｓｉＲＮＡ［配列番号１１に記載のｓｉＥＺＨ２－１：ＧＡＧ ＧＧＡ ＡＡＧ ＵＧＵ ＡＵＧ ＡＵＡ Ａ（ＴＴ）、配列番号１２に記載のｓｉＥＺＨ２－２：ＵＵＵ ＧＧＣ ＵＵＣ ＡＵＣ ＵＵＵ ＡＵＵ Ｇ（ＴＴ）］、またはコントロールＲＮＡ（ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ、Ｑｉａｇｅｎ）で細胞のトランスフェクションを行った。トランスフェクションは、1ウェル当たり２５０，０００個の細胞を添加した6ウェルマイクロプレートで行った。ｓｉＲＮＡを1倍のｓｉＭＡＸ希釈バッファー（６ｍＭ ＨＥＰＥＳ、 ２０ｍＭ ＫＣｌ、 ０，２ｍＭ ＭｇＣｌ２、 ｐＨ＝７．３；Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、 Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）で希釈した。ｓｉＲＮＡをトランスフェクション培地（ＯｐｔｉＭＥＭ、 Ｇｉｂｃｏ）で１／１００に希釈したリポフェクタミン（ＲＮＡｉＭａｘ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と接触させた。各ｓｉＲＮＡの最終濃度は２０ｎＭとした。混合物を室温で２０分間培養してリポソームを形成させた後、抗生物質を含まない培地で６時間培養した細胞に加えた。トランスフェクション後、培地を抗生物質を含む新しい培地に交換した。
【0106】
突然変異誘発及びプラスミド構築
クローニングを行うために、レンチウイルスプラスミドｐＳＩＮ－ＥＦ１αＬ－ｅＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏを使用した。野生型ＥＺＨ２及び変異型ＥＺＨ２（ＥＺＨ２＊）に対応する２つのインサートをクローニングした。簡単に説明すると、野生型ＥＺＨ２のオープンリーディングフレームを、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手したｃＤＮＡをマトリックスとし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した：フォワード：配列番号１３に記載の５’－ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＡＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＣＡ ＧＡＣ ＴＧＧ ＧＡＡ－３’、 リバース：配列番号１３に記載の５’－ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＡＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＣＡ ＧＡＣ ＴＧＧ ＧＡＡ－３’。ＥＺＨ２＊と称するＨ６８９Ａ変異体を、以下のプライマーを用いてＪｕｎｇ Ｋｉｍら（Polycomb- and Methylation-Independent Roles of EZH2 as a Transcription Activator. Cell Rep, 2018. 25(10): p. 2808-2820 e4）に記載の通り突然変異誘発によって得た：フォワード：配列番号１５に記載の５’－ＧＴＴＴＧＧＡＴＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＡＡＡＣＧＡＡＴＴＴＴＧＴＴＡＣＣＣＴＴＧＣＧ－３’及びリバース：配列番号１６に記載の５’－ＣＧＣＡＡＧＧＧＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＣＧＴＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＧＧＴＡＡＡＴＣＣＡＡＡＣ－３’。ＰＣＲ産物をｐＳＩＮ－ＥＦ１αＬ－ｅＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＰｕｒｏベクターのＮｈｅＩ／ＭｌｕＩ部位にクローニングし、レンチウイルス産生のためにＶｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙコア施設に送る前に完全に配列決定した。
クローニングを行うために、レンチウイルスプラスミドｐＳＩＮ－ＥＦ１αＬ－ｅＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏを使用した。野生型ＥＺＨ２及び変異型ＥＺＨ２（ＥＺＨ２＊）に対応する２つのインサートをクローニングした。簡単に説明すると、野生型ＥＺＨ２のオープンリーディングフレームを、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌから入手したｃＤＮＡをマトリックスとし、以下のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した：フォワード：配列番号１３に記載の５’－ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＡＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＣＡ ＧＡＣ ＴＧＧ ＧＡＡ－３’、 リバース：配列番号１３に記載の５’－ＧＣＧ ＣＧＣ ＴＡＧ ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＧ ＣＣＡ ＧＡＣ ＴＧＧ ＧＡＡ－３’。ＥＺＨ２＊と称するＨ６８９Ａ変異体を、以下のプライマーを用いてＪｕｎｇ Ｋｉｍら（Polycomb- and Methylation-Independent Roles of EZH2 as a Transcription Activator. Cell Rep, 2018. 25(10): p. 2808-2820 e4）に記載の通り突然変異誘発によって得た：フォワード：配列番号１５に記載の５’－ＧＴＴＴＧＧＡＴＴＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＡＡＡＡＣＧＡＡＴＴＴＴＧＴＴＡＣＣＣＴＴＧＣＧ－３’及びリバース：配列番号１６に記載の５’－ＣＧＣＡＡＧＧＧＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＣＧＴＴＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＧＧＴＡＡＡＴＣＣＡＡＡＣ－３’。ＰＣＲ産物をｐＳＩＮ－ＥＦ１αＬ－ｅＧＦＰ－ＩＲＥＳ－ＰｕｒｏベクターのＮｈｅＩ／ＭｌｕＩ部位にクローニングし、レンチウイルス産生のためにＶｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙコア施設に送る前に完全に配列決定した。
【0107】
レンチウイルスの産生、滴定、及び細胞導入
感染性レンチウイルス粒子の産生と滴定を、ＶｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙプラットフォームＶＥＣＴ’ＵＢによって行った。手順及び指針は、Ｍａｕｒｅｌ Ｍら（A functional screening identifies five microRNAs controlling glypican-3: role of miR-1271 down-regulation in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2013. 57(1): p. 195-204）及びＬａｌｏｏ Ｂら（Analysis of post-transcriptional regulations by a functional, integrated, quantitative method. Mol Cell Proteomics, 2009. 8(8): p. 1777-88）によって以前に記載されている。レンチウイルス粒子を細胞に加え、２４時間培養した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、数日間培養してから実験に使用した。各実験において、タンパク質の異所性発現が確認された。
感染性レンチウイルス粒子の産生と滴定を、ＶｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙプラットフォームＶＥＣＴ’ＵＢによって行った。手順及び指針は、Ｍａｕｒｅｌ Ｍら（A functional screening identifies five microRNAs controlling glypican-3: role of miR-1271 down-regulation in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2013. 57(1): p. 195-204）及びＬａｌｏｏ Ｂら（Analysis of post-transcriptional regulations by a functional, integrated, quantitative method. Mol Cell Proteomics, 2009. 8(8): p. 1777-88）によって以前に記載されている。レンチウイルス粒子を細胞に加え、２４時間培養した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、数日間培養してから実験に使用した。各実験において、タンパク質の異所性発現が確認された。
【0108】
薬剤処理
シスプラチン（Ｓ１１６６）、ＥＰＺ６４３８（タゼメトスタットとしても知られる、Ｓ７１２８）、ＧＳＫ－１２６（Ｓ７０６１）、アトロバスタチン（Ｓ５７１５）、及びシンバスタチン（Ｓ１７９２）をＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍから購入した。シスプラチンは０．９％のＮａＣｌで溶解した。ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ－１２６、アトロバスタチン、及びシンバスタチンはＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で溶解した。シンバスタチンについては、細胞アッセイに使用する前に、ＥｔＯＨ処理でＮａＯＨにより薬剤を活性化した。すべての薬剤は－２０℃で保存した。
シスプラチン（Ｓ１１６６）、ＥＰＺ６４３８（タゼメトスタットとしても知られる、Ｓ７１２８）、ＧＳＫ－１２６（Ｓ７０６１）、アトロバスタチン（Ｓ５７１５）、及びシンバスタチン（Ｓ１７９２）をＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍから購入した。シスプラチンは０．９％のＮａＣｌで溶解した。ＥＰＺ６４３８、ＧＳＫ－１２６、アトロバスタチン、及びシンバスタチンはＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）で溶解した。シンバスタチンについては、細胞アッセイに使用する前に、ＥｔＯＨ処理でＮａＯＨにより薬剤を活性化した。すべての薬剤は－２０℃で保存した。
【0109】
細胞増殖及び生存率アッセイ
２次元培養では、合計で１ウェル当たり２，０００個のＨｕｈ６細胞及び1ウェル当たり３，０００個のＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＴＳ ａｓｓａｙ ＫｉｔまたはＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ （ＳＲＢ、５６５ｎｍの吸光度）ａｓｓａｙ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、遺伝子操作の２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間後、及び薬剤処理の４８時間または７２時間後に、製造業者の使用説明書に従って細胞増殖を測定した。３次元培養では、上記のようにスフェロイドを形成し、マイクロプレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ(R) Ｓ３ライブセル解析システムで培養に供し、８時間ごとにスキャンした。遺伝子操作については、レンチウイルス導入または遺伝子除去をプレーティング前に行った。薬剤処理については、実験及び薬剤に応じて、スフェロイドを４日目または５日目に４８時間または７２時間処理した。スフェロイドの細胞生存率アッセイは、１μＭのカルセインＡＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び２μＭのエチジウムホモダイマー１（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃で３０分間行った。ＩｎｃｕＣｙｔｅ(R) Ｓ３ライブセル解析システムを用いてスフェロイドを撮像した。すべての細胞生存率アッセイにおいて、薬剤は半最大阻害濃度（ＩＣ５０）で使用した。
２次元培養では、合計で１ウェル当たり２，０００個のＨｕｈ６細胞及び1ウェル当たり３，０００個のＨｅｐＧ２細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートに播種した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＭＴＳ ａｓｓａｙ ＫｉｔまたはＳｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ （ＳＲＢ、５６５ｎｍの吸光度）ａｓｓａｙ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、遺伝子操作の２４時間、４８時間、７２時間、または９６時間後、及び薬剤処理の４８時間または７２時間後に、製造業者の使用説明書に従って細胞増殖を測定した。３次元培養では、上記のようにスフェロイドを形成し、マイクロプレートをＩｎｃｕＣｙｔｅ(R) Ｓ３ライブセル解析システムで培養に供し、８時間ごとにスキャンした。遺伝子操作については、レンチウイルス導入または遺伝子除去をプレーティング前に行った。薬剤処理については、実験及び薬剤に応じて、スフェロイドを４日目または５日目に４８時間または７２時間処理した。スフェロイドの細胞生存率アッセイは、１μＭのカルセインＡＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び２μＭのエチジウムホモダイマー１（Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃で３０分間行った。ＩｎｃｕＣｙｔｅ(R) Ｓ３ライブセル解析システムを用いてスフェロイドを撮像した。すべての細胞生存率アッセイにおいて、薬剤は半最大阻害濃度（ＩＣ５０）で使用した。
【0110】
細胞老化
ＥＺＨ２サイレンシング細胞またはコントロール細胞を２４ウェルプレートに播種した。３日後、細胞を固定し、老化アッセイによりβガラクトシダーゼ活性をβガラクトシダーゼ染色キット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、 Ｄａｎｖｅｒｓ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、 米国）を用い、製造業者の使用説明書に従って測定した。ＩｎＣｅｌｌｉｓ顕微鏡（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）を用いて細胞を観察し、撮像した。老化細胞の数をＩｍａｇｅＪを用いてカウントした。
ＥＺＨ２サイレンシング細胞またはコントロール細胞を２４ウェルプレートに播種した。３日後、細胞を固定し、老化アッセイによりβガラクトシダーゼ活性をβガラクトシダーゼ染色キット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、 Ｄａｎｖｅｒｓ、 Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、 米国）を用い、製造業者の使用説明書に従って測定した。ＩｎＣｅｌｌｉｓ顕微鏡（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）を用いて細胞を観察し、撮像した。老化細胞の数をＩｍａｇｅＪを用いてカウントした。
【0111】
アポトーシス
遺伝子操作または薬剤処理後に９６ウェルプレートに播種したＥＺＨ２サイレンシング細胞またはコントロール細胞において、カスパーゼ３／７活性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、 Ｍａｄｉｓｏｎ、 ＷＩ、米国）を用いてアポトーシスを測定した。
遺伝子操作または薬剤処理後に９６ウェルプレートに播種したＥＺＨ２サイレンシング細胞またはコントロール細胞において、カスパーゼ３／７活性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、 Ｍａｄｉｓｏｎ、 ＷＩ、米国）を用いてアポトーシスを測定した。
【0112】
細胞遊走
ＥＺＨ２サイレンシング細胞またはコントロール細胞を、２ウェル細胞培養インサート（Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ、フランス）に、１ウェル当たり３５，０００個の密度でプレーティングした。１８時間後、ＩｎＣｅｌｌｉｓ顕微鏡（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）を用いて、０時間、８時間、及び２４時間時点の細胞遊走を撮像した。定量化はＩｍａｇｅ Ｊを用いて行った。
細胞遊走に対する薬剤効果を調べるため、細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり５０，０００個の密度でプレーティングし、接着するまで培養した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（９６ピン創傷作成ツール）を用いて傷を作成した。その後、細胞をＩＣ２５の薬剤で処理し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ(R) Ｓ３ライブセル解析システムを用いて２４時間、１時間ごとに各ウェルをスキャンして細胞遊走を観察した。
ＥＺＨ２サイレンシング細胞またはコントロール細胞を、２ウェル細胞培養インサート（Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ、フランス）に、１ウェル当たり３５，０００個の密度でプレーティングした。１８時間後、ＩｎＣｅｌｌｉｓ顕微鏡（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）を用いて、０時間、８時間、及び２４時間時点の細胞遊走を撮像した。定量化はＩｍａｇｅ Ｊを用いて行った。
細胞遊走に対する薬剤効果を調べるため、細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり５０，０００個の密度でプレーティングし、接着するまで培養した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（９６ピン創傷作成ツール）を用いて傷を作成した。その後、細胞をＩＣ２５の薬剤で処理し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ(R) Ｓ３ライブセル解析システムを用いて２４時間、１時間ごとに各ウェルをスキャンして細胞遊走を観察した。
【0113】
脂質滴アッセイ
細胞を６ウェルプレートに１ウェル当たり２５０，０００個の密度でプレーティングした。２４時間後、細胞を先に決定したＩＣ５０の薬剤で処理するか、未処理とした。処理の４８時間後、細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定し、赤色油を用いて室温で１５分間染色した。最後に細胞を数回洗浄し、ＩｎＣｅｌｌｉｓ顕微鏡（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）を用いてスキャンした。
細胞を６ウェルプレートに１ウェル当たり２５０，０００個の密度でプレーティングした。２４時間後、細胞を先に決定したＩＣ５０の薬剤で処理するか、未処理とした。処理の４８時間後、細胞を４％ＰＦＡで１５分間固定し、赤色油を用いて室温で１５分間染色した。最後に細胞を数回洗浄し、ＩｎＣｅｌｌｉｓ顕微鏡（Ｂｅｒｔｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）を用いてスキャンした。
【0114】
ウェスタンブロット
細胞を溶解し、ＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ）、プロテアーゼ阻害剤、及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）の混合物を用いて、処理の４８時間後または遺伝子操作の７２時間後に総タンパク質を抽出した。
ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙｓ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でタンパク質を定量した後、４０ｕｇの全タンパク質を４～１５％プレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にロードして遊走させた。その後、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ(R) Ｔｕｒｂｏ ｍｉｄｉ－ｓｉｚｅ、Ｂｉｏ Ｒａｄ）に転写した。膜を５％ＢＳＡまたはＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロッキングし、対応する抗体を用いて検出した（表２）。Ｆｕｓｉｏｎ ＦＸ （Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ）を用いて化学発光によって可視化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を用いて定量を行った。
細胞を溶解し、ＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ）、プロテアーゼ阻害剤、及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）の混合物を用いて、処理の４８時間後または遺伝子操作の７２時間後に総タンパク質を抽出した。
ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙｓ （ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でタンパク質を定量した後、４０ｕｇの全タンパク質を４～１５％プレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）にロードして遊走させた。その後、タンパク質をニトロセルロース膜（Ｔｒａｎｓｂｌｏｔ(R) Ｔｕｒｂｏ ｍｉｄｉ－ｓｉｚｅ、Ｂｉｏ Ｒａｄ）に転写した。膜を５％ＢＳＡまたはＯｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファー（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロッキングし、対応する抗体を用いて検出した（表２）。Ｆｕｓｉｏｎ ＦＸ （Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ）を用いて化学発光によって可視化し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、 Ｂｅｔｈｅｓｄａ、 Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）を用いて定量を行った。
【0115】
【表2】
【0116】
プロテオミクス
ボルドー大学のプロテオミクスコア施設（https://proteome.cgfb.u-bordeaux.fr/en）により、ＥＺＨ２除去Ｈｕｈ６細胞株またはコントロールのプロテオーム解析を行った。すべての工程をＧｈｏｕｓｅｉｎら（miR-4510 block hepatocellular carcinoma development through RAF1 targeting and RAS/RAF/MEK/ERK signalling inactivation. Liver Int, 2020. 40(1): p. 240-251）に記載される通りに実施した。
ボルドー大学のプロテオミクスコア施設（https://proteome.cgfb.u-bordeaux.fr/en）により、ＥＺＨ２除去Ｈｕｈ６細胞株またはコントロールのプロテオーム解析を行った。すべての工程をＧｈｏｕｓｅｉｎら（miR-4510 block hepatocellular carcinoma development through RAF1 targeting and RAS/RAF/MEK/ERK signalling inactivation. Liver Int, 2020. 40(1): p. 240-251）に記載される通りに実施した。
【0117】
ニワトリＣＡＭアッセイ
動物処置は、欧州（指令２０１０／６３／ＵＥ）及びフランス（政令２０１３－１１８）のガイドラインに準拠して、先に記載される通りに実施した（Indersie, E., et al., Tracking cellular and molecular changes in a species-specific manner during experimental tumor progression in vivo. Oncotarget, 2018. 9(22): p. 16149-16162）（Indersie, E., et al., MicroRNA therapy inhibits hepatoblastoma growth in vivo by targeting beta-catenin and Wnt signaling. Hepatol Commun, 2017. 1(2): p. 168-183）。簡単に説明すると、受精胚を分割の段階で受け取った。その後、３７．４℃、湿度７０％で培養した。発育３日目に卵の殻を上部に開け、医療用デュラポアテープで開口部を密封した。胚発生１０日目に、１００万個のＨｕｈ６またはＨｅｐＧ２細胞をマトリゲル(R)（増殖因子低減、Ｃｏｒｎｉｎｇ）液滴（４０μＬ）に包埋し、ＣＡＭ上に沈着させた。腫瘍の増殖及び血管新生を実体顕微鏡（ＳＭＺ７４５Ｔ）で観察し、１日目、３日目、７日目にカメラ（ＤＳ－Ｆｉ２）で写真を撮影した。７日目にすべての腫瘍をＰＦＡ４％で固定し、摘出した。その後、精密天秤を用いて重量を測定した。
動物処置は、欧州（指令２０１０／６３／ＵＥ）及びフランス（政令２０１３－１１８）のガイドラインに準拠して、先に記載される通りに実施した（Indersie, E., et al., Tracking cellular and molecular changes in a species-specific manner during experimental tumor progression in vivo. Oncotarget, 2018. 9(22): p. 16149-16162）（Indersie, E., et al., MicroRNA therapy inhibits hepatoblastoma growth in vivo by targeting beta-catenin and Wnt signaling. Hepatol Commun, 2017. 1(2): p. 168-183）。簡単に説明すると、受精胚を分割の段階で受け取った。その後、３７．４℃、湿度７０％で培養した。発育３日目に卵の殻を上部に開け、医療用デュラポアテープで開口部を密封した。胚発生１０日目に、１００万個のＨｕｈ６またはＨｅｐＧ２細胞をマトリゲル(R)（増殖因子低減、Ｃｏｒｎｉｎｇ）液滴（４０μＬ）に包埋し、ＣＡＭ上に沈着させた。腫瘍の増殖及び血管新生を実体顕微鏡（ＳＭＺ７４５Ｔ）で観察し、１日目、３日目、７日目にカメラ（ＤＳ－Ｆｉ２）で写真を撮影した。７日目にすべての腫瘍をＰＦＡ４％で固定し、摘出した。その後、精密天秤を用いて重量を測定した。
【0118】
クローン原性アッセイ（Clonogenicity assay）
Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞をそれぞれ１ウェル当たり５００個及び１０００個、１２ウェルプレートに播種した。接着後、細胞を薬剤で処理した。Ｈｕｈ６については、アトルバスタチン（８ｕＭ）、シンバスタチン（４ｕＭ）、及び／またはＧＳＫ－１２６（３ｕＭ）、ＨｅｐＧ２については、アトルバスタチン（８ｕＭ）、シンバスタチン（４ｕＭ）、及び／またはＧＳＫ－１２６（４ｕＭ）。
３７℃で１０日間培養した後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、０．０５％クリスタルバイオレットで染色した。Ｆｕｓｉｏｎ ＦＸ （Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ）で読み取った。
Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞をそれぞれ１ウェル当たり５００個及び１０００個、１２ウェルプレートに播種した。接着後、細胞を薬剤で処理した。Ｈｕｈ６については、アトルバスタチン（８ｕＭ）、シンバスタチン（４ｕＭ）、及び／またはＧＳＫ－１２６（３ｕＭ）、ＨｅｐＧ２については、アトルバスタチン（８ｕＭ）、シンバスタチン（４ｕＭ）、及び／またはＧＳＫ－１２６（４ｕＭ）。
３７℃で１０日間培養した後、細胞を４％ＰＦＡで固定し、０．０５％クリスタルバイオレットで染色した。Ｆｕｓｉｏｎ ＦＸ （Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ）で読み取った。
【0119】
アフリカツメガエル胚における毒性アッセイ
胃胚期（gastrula stage）胚のバッチ（１バッチ１０杯）を２４ウェルプレート中で、指定の濃度のシスプラチンまたはＧＳＫ－１２６の存在下で培養した。未処理のコントロール胚がステージ４１に達するまで胚を溶液中に放置した。コントロールまたはシスプラチン処理胚は０．１倍Ｍａｒｃ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ中で培養した。ＧＳＫ－１２６処理胚は、０．１％ＤＭＳＯを添加した０．１倍Ｍａｒｃ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ中で培養した。
胃胚期（gastrula stage）胚のバッチ（１バッチ１０杯）を２４ウェルプレート中で、指定の濃度のシスプラチンまたはＧＳＫ－１２６の存在下で培養した。未処理のコントロール胚がステージ４１に達するまで胚を溶液中に放置した。コントロールまたはシスプラチン処理胚は０．１倍Ｍａｒｃ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ中で培養した。ＧＳＫ－１２６処理胚は、０．１％ＤＭＳＯを添加した０．１倍Ｍａｒｃ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｒｉｎｇｅｒ中で培養した。
【0120】
腫瘍異種移植
ＮＯＤ／ＬｔＳｚ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγヌル（ＮＳＧ）マウスを規制機関（フランス政府）に準拠した標準的な条件で飼育した。滅菌した餌と水を不断給餌した。５０％マトリゲル中のＨｕｈ６細胞１００万個を、８～９週齢のメスマウス（２６～３２ｇ；APAFIS #32917-2021121316283534 v2, Agreement #B33063916, Ministere de l’Enseignement Superieur, de la Recherche et de l’Innovation）の右脇腹に合計１００μｌ皮下注射した。
腫瘍が平均体積２５０ｍｍ３に達するまで腫瘍の増殖をキャリパー測定によって観察した（１２日目、矢印参照）。このようにして、マウスを無作為に５つのグループに分け、各薬剤を腹腔内投与した。シスプラチンは、１ｍｇ／ｋｇの投与量で週２回注射した。ＧＳＫ－１２６及びアトルバスタチン（ＡＴＲ）は、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇの投与量で週３回注射した。ビークル（５％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ）を週３回注射した。腫瘍コントロールが２０００ｍｍ３の大きさに達するまで、さらに１６日間腫瘍の増殖を観察した。このようにして、すべてのマウスを安楽死させた。安楽死させたすべてのマウスから血液を採取し、循環ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、クレアチニン、及び尿素を測定して肝臓及び腎臓に対する各処理の毒性を評価した。
ＮＯＤ／ＬｔＳｚ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγヌル（ＮＳＧ）マウスを規制機関（フランス政府）に準拠した標準的な条件で飼育した。滅菌した餌と水を不断給餌した。５０％マトリゲル中のＨｕｈ６細胞１００万個を、８～９週齢のメスマウス（２６～３２ｇ；APAFIS #32917-2021121316283534 v2, Agreement #B33063916, Ministere de l’Enseignement Superieur, de la Recherche et de l’Innovation）の右脇腹に合計１００μｌ皮下注射した。
腫瘍が平均体積２５０ｍｍ３に達するまで腫瘍の増殖をキャリパー測定によって観察した（１２日目、矢印参照）。このようにして、マウスを無作為に５つのグループに分け、各薬剤を腹腔内投与した。シスプラチンは、１ｍｇ／ｋｇの投与量で週２回注射した。ＧＳＫ－１２６及びアトルバスタチン（ＡＴＲ）は、それぞれ５０ｍｇ／ｋｇ及び２０ｍｇ／ｋｇの投与量で週３回注射した。ビークル（５％ＤＭＳＯを含むＰＢＳ）を週３回注射した。腫瘍コントロールが２０００ｍｍ３の大きさに達するまで、さらに１６日間腫瘍の増殖を観察した。このようにして、すべてのマウスを安楽死させた。安楽死させたすべてのマウスから血液を採取し、循環ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、クレアチニン、及び尿素を測定して肝臓及び腎臓に対する各処理の毒性を評価した。
【0121】
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０または７．０ソフトウェアを用いて統計解析を行った。すべてのデータが少なくとも３回の独立した実験の平均値として表示されており、エラーバーは平均値の標準偏差（ＳＤ）を示す。実験に２つのマッチしない値群が含まれる場合、平均値の比較にはノンパラメトリックのマン・ホイットニーの検定を用いた。実験に２つのマッチした値群が含まれる場合、データがガウス分布に従うとみなされるか否かに応じて、パラメトリックｔ検定またはノンパラメトリックのウィルコクソンの対応ペア符号付き検定を用いた。実験に３つ以上の値群が含まれる場合は、通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。実験に３つ以上の値群と２つの実験要因が含まれる場合、複数の平均値と条件の比較に二元配置分散分析を用いた。一元及び二元配置分散分析の検定は，シダックの多重比較後検定に従った。実験に２つのカテゴリー変数の群が含まれる場合は、両側カイ２乗検定を用いた。結果は、ｐ＜０．０５の場合に有意とみなした。図中のすべてのデータについて、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、または正確なｐ値（示される場合）とする。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６．０または７．０ソフトウェアを用いて統計解析を行った。すべてのデータが少なくとも３回の独立した実験の平均値として表示されており、エラーバーは平均値の標準偏差（ＳＤ）を示す。実験に２つのマッチしない値群が含まれる場合、平均値の比較にはノンパラメトリックのマン・ホイットニーの検定を用いた。実験に２つのマッチした値群が含まれる場合、データがガウス分布に従うとみなされるか否かに応じて、パラメトリックｔ検定またはノンパラメトリックのウィルコクソンの対応ペア符号付き検定を用いた。実験に３つ以上の値群が含まれる場合は、通常の一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いた。実験に３つ以上の値群と２つの実験要因が含まれる場合、複数の平均値と条件の比較に二元配置分散分析を用いた。一元及び二元配置分散分析の検定は，シダックの多重比較後検定に従った。実験に２つのカテゴリー変数の群が含まれる場合は、両側カイ２乗検定を用いた。結果は、ｐ＜０．０５の場合に有意とみなした。図中のすべてのデータについて、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１、＊＊＊：ｐ＜０．００１、＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１、または正確なｐ値（示される場合）とする。
【0122】
トランスクリプトームデータ
トランスクリプトームデータ及びデータセット（表３）は、過去の論文（Hiyama, E., Gene expression profiling in hepatoblastoma cases of the Japanese Study Group for Pediatric Liver Tumors-2 (JPLT-2) trial.2019, Science Repository OU; Carrillo-Reixach, J., et al., Epigenetic footprint enables molecular risk stratification of hepatoblastoma with clinical implications. J Hepatol, 2020. 73(2): p. 328-341; Sumazin, P., et al., Genomic analysis of hepatoblastoma identifies distinct molecular and prognostic subgroups. Hepatology, 2017. 65(1): p. 104-121; Valanejad, L., et al., PARP1 activation increases expression of modified tumor suppressors and pathways underlying development of aggressive hepatoblastoma. Commun Biol, 2018. 1: p. 67; Cairo, S., et al., Hepatic stem-like phenotype and interplay of Wnt/beta-catenin and Myc signaling in aggressive childhood liver cancer. Cancer Cell, 2008. 14(6): p. 471-84; ichenmuller, M., et al., The genomic landscape of hepatoblastoma and their progenies with HCC-like features. J Hepatol, 2014. 61(6): p. 1312-20; Hooks, K. B., et al., New insights into diagnosis and therapeutic options for proliferative hepatoblastoma. Hepatology, 2018. 68(1): p. 89-102）に記載される通り、またはＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（
1715561160074_0
, see the accession number and reference in the corresponding graph and/or Figure legend) (Edgar, R., M. Domrachev, and A.E. Lash, Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Res, 2002. 30(1): p. 207-10）若しくはＲ２：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ （1715561160074_1.nl）からアップロードした。
トランスクリプトームデータ及びデータセット（表３）は、過去の論文（Hiyama, E., Gene expression profiling in hepatoblastoma cases of the Japanese Study Group for Pediatric Liver Tumors-2 (JPLT-2) trial.2019, Science Repository OU; Carrillo-Reixach, J., et al., Epigenetic footprint enables molecular risk stratification of hepatoblastoma with clinical implications. J Hepatol, 2020. 73(2): p. 328-341; Sumazin, P., et al., Genomic analysis of hepatoblastoma identifies distinct molecular and prognostic subgroups. Hepatology, 2017. 65(1): p. 104-121; Valanejad, L., et al., PARP1 activation increases expression of modified tumor suppressors and pathways underlying development of aggressive hepatoblastoma. Commun Biol, 2018. 1: p. 67; Cairo, S., et al., Hepatic stem-like phenotype and interplay of Wnt/beta-catenin and Myc signaling in aggressive childhood liver cancer. Cancer Cell, 2008. 14(6): p. 471-84; ichenmuller, M., et al., The genomic landscape of hepatoblastoma and their progenies with HCC-like features. J Hepatol, 2014. 61(6): p. 1312-20; Hooks, K. B., et al., New insights into diagnosis and therapeutic options for proliferative hepatoblastoma. Hepatology, 2018. 68(1): p. 89-102）に記載される通り、またはＮＣＢＩのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（
1715561160074_0
, see the accession number and reference in the corresponding graph and/or Figure legend) (Edgar, R., M. Domrachev, and A.E. Lash, Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Res, 2002. 30(1): p. 207-10）若しくはＲ２：Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ （1715561160074_1.nl）からアップロードした。
【0123】
【表3】
【0124】
例３．２：ＥＺＨ２が予後不良指標である証拠
肝芽腫におけるＥＺＨ２の役割はあまり知られていないため、まず、我々のＣ１、Ｃ２Ａ、及びＣ２Ｂ腫瘍分類を考慮して、我々の公表データセットにおけるＥＺＨ２転写産物の発現を分析した（Hooks KB et al., Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10. 1002/hep. 29672）。図１８ａに示す通り、ＥＺＨ２ ｍＲＮＡは、非腫瘍性（ＮＴ）サンプルと比較して肝芽腫で増加し、この発現は、増殖性のトポイソメラーゼ２α（ＴＯＰ２Ａ）タンパク質陽性Ｃ２Ａ群と特異的に関連していた（Hooks KB et al., Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10. 1002/hep. 29672）。この結果と一致して、我々のコホートの肝芽腫サンプルにおいて、ＥＺＨ２とＴＯＰ２Ａ ｍＲＮＡの間に強い正の相関が認められた（図１８ｂ）。これらのデータを確認するために、我々はさらに６つの公開トランスクリプトームデータセットでＥＺＨ２ ｍＲＮＡレベルを解析した。すべてのケースにおいて、ＥＺＨ２ ｍＲＮＡ発現が肝芽腫で有意に増加し（図１８ｃ）、その発現はＴＯＰ２Ａ ｍＲＮＡ発現と強く相関していた（図１９）。これらのデータは、ＥＺＨ２発現が増殖性かつ侵攻性の肝芽腫のサブタイプと関連している可能性を示唆している。この傾向を確認するため、臨床データ及び組織学的データを用いて比較解析を行った。ＥＺＨ２ ｍＲＮＡは、すべてのＰＲＥＴＥＸＴ群において、Ｓｕｍａｚｉｎら（Hepatology 2017 Jan; 35(1): 104-121. doi: 10. 1002/hep. 28888）によって定義される腫瘍発生のすべての段階で上方制御された。ＥＺＨ２ ｍＲＮＡ発現は、予後不良の胚性、混合、小細胞の組織学的サブタイプで予後良好の胎児型サブタイプより高く、再発腫瘍及び死亡患者で有意に増加していた（図２０）。これらのデータは、ＥＺＨ２が肝芽腫における独立した予後因子となる可能性を示唆している。
肝芽腫におけるＥＺＨ２の役割はあまり知られていないため、まず、我々のＣ１、Ｃ２Ａ、及びＣ２Ｂ腫瘍分類を考慮して、我々の公表データセットにおけるＥＺＨ２転写産物の発現を分析した（Hooks KB et al., Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10. 1002/hep. 29672）。図１８ａに示す通り、ＥＺＨ２ ｍＲＮＡは、非腫瘍性（ＮＴ）サンプルと比較して肝芽腫で増加し、この発現は、増殖性のトポイソメラーゼ２α（ＴＯＰ２Ａ）タンパク質陽性Ｃ２Ａ群と特異的に関連していた（Hooks KB et al., Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10. 1002/hep. 29672）。この結果と一致して、我々のコホートの肝芽腫サンプルにおいて、ＥＺＨ２とＴＯＰ２Ａ ｍＲＮＡの間に強い正の相関が認められた（図１８ｂ）。これらのデータを確認するために、我々はさらに６つの公開トランスクリプトームデータセットでＥＺＨ２ ｍＲＮＡレベルを解析した。すべてのケースにおいて、ＥＺＨ２ ｍＲＮＡ発現が肝芽腫で有意に増加し（図１８ｃ）、その発現はＴＯＰ２Ａ ｍＲＮＡ発現と強く相関していた（図１９）。これらのデータは、ＥＺＨ２発現が増殖性かつ侵攻性の肝芽腫のサブタイプと関連している可能性を示唆している。この傾向を確認するため、臨床データ及び組織学的データを用いて比較解析を行った。ＥＺＨ２ ｍＲＮＡは、すべてのＰＲＥＴＥＸＴ群において、Ｓｕｍａｚｉｎら（Hepatology 2017 Jan; 35(1): 104-121. doi: 10. 1002/hep. 28888）によって定義される腫瘍発生のすべての段階で上方制御された。ＥＺＨ２ ｍＲＮＡ発現は、予後不良の胚性、混合、小細胞の組織学的サブタイプで予後良好の胎児型サブタイプより高く、再発腫瘍及び死亡患者で有意に増加していた（図２０）。これらのデータは、ＥＺＨ２が肝芽腫における独立した予後因子となる可能性を示唆している。
【0125】
実施例４：ＥＺＨ２タンパク質はそのヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を通して肝芽腫の重要なガン遺伝子として作用する
増殖性肝芽腫におけるＥＺＨ２の役割を解読するために、我々はまず、ＲＮＡ干渉技術とＣ２Ａ由来の肝芽腫細胞株Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２の使用を組み合わせた（Hooks KB et al., Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10. 1002/hep. 29672）。図２１ａに示す通り、ＥＺＨ２－１またはＥＺＨ２－２ ｓｉＲＮＡは、トランスフェクションの３日後に、両方の細胞株においてＥＺＨ２タンパク質レベルを効率的にサイレンシングした。ＥＺＨ２除去の９６時間後、肝芽腫細胞の増殖は半分に減少し（図２１ｂ）、細胞はＰ１６及びＰ２１の増加、β－ガラクトシダーゼ陽性染色、及びカスパーゼ－３／７活性化の欠如によって示されるように、アポトーシスの徴候のない老化に入った（図２１ｃ～ｅ）。Ｈｕｈ６細胞遊走もＥＺＨ２タンパク質の欠損によって阻害された（図２２ａ）。ＨｅｐＧ２細胞は我々の培養条件では遊走しない。分子レベルでは、ＥＺＨ２のサイレンシングによってヒストンＨ３リジン２７のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７、図２２ｂ）及び細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ、図２３ａ）のリン酸化が有意に減少した。これらのデータは、ＥＺＨ２サイレンシング肝芽腫細胞における凝縮クロマチンの緩和、腫瘍抑制因子の強力な発現、及び増殖性肝芽腫において重要な役割を果たすＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナルの不活性化を示唆している（Mosca et al. Liver Cancer 2022; 11:126-140）。
増殖性肝芽腫におけるＥＺＨ２の役割を解読するために、我々はまず、ＲＮＡ干渉技術とＣ２Ａ由来の肝芽腫細胞株Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２の使用を組み合わせた（Hooks KB et al., Hepatology, 2018 Jul;68(1):89-102. doi: 10. 1002/hep. 29672）。図２１ａに示す通り、ＥＺＨ２－１またはＥＺＨ２－２ ｓｉＲＮＡは、トランスフェクションの３日後に、両方の細胞株においてＥＺＨ２タンパク質レベルを効率的にサイレンシングした。ＥＺＨ２除去の９６時間後、肝芽腫細胞の増殖は半分に減少し（図２１ｂ）、細胞はＰ１６及びＰ２１の増加、β－ガラクトシダーゼ陽性染色、及びカスパーゼ－３／７活性化の欠如によって示されるように、アポトーシスの徴候のない老化に入った（図２１ｃ～ｅ）。Ｈｕｈ６細胞遊走もＥＺＨ２タンパク質の欠損によって阻害された（図２２ａ）。ＨｅｐＧ２細胞は我々の培養条件では遊走しない。分子レベルでは、ＥＺＨ２のサイレンシングによってヒストンＨ３リジン２７のトリメチル化（Ｈ３Ｋ２７、図２２ｂ）及び細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ、図２３ａ）のリン酸化が有意に減少した。これらのデータは、ＥＺＨ２サイレンシング肝芽腫細胞における凝縮クロマチンの緩和、腫瘍抑制因子の強力な発現、及び増殖性肝芽腫において重要な役割を果たすＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナルの不活性化を示唆している（Mosca et al. Liver Cancer 2022; 11:126-140）。
【0126】
ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性がＥＺＨ２タンパク質の発ガン活性に必須かどうかを調べるために、我々は、野生型ＥＺＨ２導入遺伝子またはＥＺＨ２触媒欠損変異体Ｈ６８９Ａ（図２４ａ、図２３ｂ、２４ａ～ｅ、及び２５ではＥＺＨ２＊と呼ぶ）を異所的に発現するトランスジェニック細胞株を開発した。この変異体は、ＥＺＨ２のメチルトランスフェラーゼ活性が欠損している（図２４ａ）（Kim et al. , Cell Rep 2018; 25:2808-2820 e2804）。これら２つの形態のＥＺＨ２タンパク質のそれぞれの異所性発現を、まずＨｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞におけるウェスタンブロッティングによって検証した（図２２ｂ）。次に、それらの特異的効果を生体外で調べた。図２３ｂ、２４ｃ～ｅ、及び２５に示す通り、野生型ＥＺＨ２タンパク質は、ＥＲＫのリン酸化、肝芽腫細胞の増殖、より大きなスフェロイドの形成、及びシスプラチンに対する抵抗性を増強したが、変異型ＥＺＨ２＊タンパク質は何ら影響を及ぼさなかった。これらのデータを総合すると、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性が、肝芽腫細胞におけるＥＺＨ２の発ガン機能、増殖能、シスプラチンをベースとした化学療法に対する抵抗性の原因となっていることが明確に証明された。
【0127】
実施例５：ＥＺＨ２ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性は脂質合成と関連している
肝芽腫におけるＥＺＨ２の発ガン作用の根底にある分子機構をさらに探索するために、ＥＺＨ２サイレンシング及びコントロールＨｕｈ６細胞で比較プロテオーム解析を行った（図２６ａ）。カットオフ倍数変化を１．８、カットオフｐ値を０．０５として、５４個と８７個の遺伝子がＥＺＨ２サイレンシング細胞とコントロール細胞でそれぞれ有意に上方制御及び下方制御された（図２６ａ）。Ｐ１６とβカテニンタンパク質の上方制御、及びＣＴＳＶとＤＵＳＰ９タンパク質の下方制御を、Ｈｕｈ６細胞においてウェスタンブロットによって評価した結果、我々のプロテオミクスデータが正確であることが確認された（図２１ｄ及び図示しないデータ）。下方制御されたタンパク質のうち、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）は、ＥＺＨ２サイレンシングＨｕｈ６細胞及びＨｅｐＧ２細胞の両方で減少した（図２６ａ～ｂ）。予想の通り、ＥＺＨ２ヒストンメチルトランスフェラーゼの特異的阻害剤であるＧＳＫ－１２６でこれらの細胞を処理することによって、ヒストンＨ３リジン２７のトリメチル化が減少したが（図２７ａ）、ＨＭＧＣＲの発現と脂質の合成が誘発された（図２７ｂ～ｃ）。これらのデータは、代償機構として、肝芽腫細胞はＧＳＫ－１２６に応答して脂質の合成を増強することを示唆している。
肝芽腫におけるＥＺＨ２の発ガン作用の根底にある分子機構をさらに探索するために、ＥＺＨ２サイレンシング及びコントロールＨｕｈ６細胞で比較プロテオーム解析を行った（図２６ａ）。カットオフ倍数変化を１．８、カットオフｐ値を０．０５として、５４個と８７個の遺伝子がＥＺＨ２サイレンシング細胞とコントロール細胞でそれぞれ有意に上方制御及び下方制御された（図２６ａ）。Ｐ１６とβカテニンタンパク質の上方制御、及びＣＴＳＶとＤＵＳＰ９タンパク質の下方制御を、Ｈｕｈ６細胞においてウェスタンブロットによって評価した結果、我々のプロテオミクスデータが正確であることが確認された（図２１ｄ及び図示しないデータ）。下方制御されたタンパク質のうち、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧＣＲ）は、ＥＺＨ２サイレンシングＨｕｈ６細胞及びＨｅｐＧ２細胞の両方で減少した（図２６ａ～ｂ）。予想の通り、ＥＺＨ２ヒストンメチルトランスフェラーゼの特異的阻害剤であるＧＳＫ－１２６でこれらの細胞を処理することによって、ヒストンＨ３リジン２７のトリメチル化が減少したが（図２７ａ）、ＨＭＧＣＲの発現と脂質の合成が誘発された（図２７ｂ～ｃ）。これらのデータは、代償機構として、肝芽腫細胞はＧＳＫ－１２６に応答して脂質の合成を増強することを示唆している。
【0128】
ＧＳＫ－１２６は、ガンタンパク質ＥＺＨ２の活性を効率的に阻害するため、肝芽腫の新しい治療選択肢として考えられる。そこで我々は、その毒性とシスプラチンの毒性をアフリカツメガエル胚で比較した。シスプラチンは、肝芽腫の第一選択治療における金字塔的な薬剤として３０年間使用されている。胃胚期において、胚を漸増濃度のシスプラチンまたはＧＳＫ－１２６で処理した（図２８）。その結果、シスプラチンは５０μＭの低用量で毒性を示すが、ＧＳＫ－１２６は１ｍＭの高用量で毒性を示すことがわかった。したがって、ＧＳＫ－１２６はシスプラチンよりも毒性が低く、増殖性かつ侵攻性の肝芽腫における新しい治療選択肢として、または再発患者若しくはシスプラチンに対して化学耐性を示す患者の第二選択治療として検討することができる。
【0129】
実施例６：ＧＳＫ－１２６とスタチンの組合せは生体外及び生体内で肝芽腫細胞を効率的に根絶する
ＧＳＫ－１２６はＨＭＧＣＲタンパク質レベル及び脂質合成を誘導するため（図２７ｂ及びｃ）、我々は、ＧＳＫ－１２６とＨＭＧＣＲ酵素の２つの特異的阻害剤、アトルバスタチン（ＡＴＲ）またはシンバスタチン（ＳＩＭ）との併用効果を試験した。図２９に示すとおり、最適量以下のＧＳＫ－１２６（Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞についてそれぞれ３μＭ及び４μＭ）、ＡＴＲ（８μＭ）、またはＳＩＭ（４μＭ）単独では、クローン原性細胞アッセイによって明らかになったように、肝芽腫細胞の増殖と生存にほとんど影響を及ぼさなかった（図２９）。しかしながら、ＧＳＫ－１２６とＡＴＲまたはＳＩＭとの組合せは、同じ濃度で相乗効果を示し、生体外で両方の細胞株から肝芽腫細胞を完全に消失させた（図２９）。さらに、ＧＳＫ－１２６＋ＡＴＲまたはＧＳＫ－１２６＋ＳＩＭの組合せはＨｕｈ６細胞遊走を有意に阻害したが、各薬剤単独では効果は限定的であった（図３０）。最後に、我々は、免疫不全ＮＳＧマウスにおけるＨｕｈ６細胞の異種移植モデルを用いて、これらの薬剤の効果を生体内で試験した（図３１ａ）（Hooks KB, Audoux J, Fazli H, Lesjean S, Ernault T, Dugot-Senant N, et al.New insights into diagnosis and therapeutic options for proliferative hepatoblastoma.Hepatology 2018;68:89-10）。図３１ｂに示す通り、ＧＳＫ－１２６＋ＡＴＲの組合せ（ＧＳＫ－１２６、５０ｍｇ／ｋｇ；ＡＴＲ、２０ｍｇ／ｋｇ）は、マウスにおける肝芽腫の発生を効率的に阻害したが、ＧＳＫ－１２６及びＡＴＲの単独は、同じ用量では効果を示さなかった。１ｍｇ／ｋｇの投与量では、シスプラチンも腫瘍の増殖を阻害したが、上記組合せよりも効率は低かった（図１１及び３１ｂ）。腫瘍摘出後、シスプラチンまたは各薬剤を単独で使用した場合と比較すると、腫瘍増殖及び血管新生を抑えるには、上記併用が明らかに最も強力であった（図３１ｃ）。一方、各薬剤もその組合せも、血中ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、クレアチニン、及び尿素レベルには影響を及ぼさず、肝毒性及び腎毒性がないことが示された（図３１ｄ）。以上、我々のデータは、生体外では肝芽腫細胞を根絶し、生体内では腫瘍の増殖及び血管新生を阻害する、ＧＳＫ－１２６とスタチンを組み合わせることの有益性を証明している。
ＧＳＫ－１２６はＨＭＧＣＲタンパク質レベル及び脂質合成を誘導するため（図２７ｂ及びｃ）、我々は、ＧＳＫ－１２６とＨＭＧＣＲ酵素の２つの特異的阻害剤、アトルバスタチン（ＡＴＲ）またはシンバスタチン（ＳＩＭ）との併用効果を試験した。図２９に示すとおり、最適量以下のＧＳＫ－１２６（Ｈｕｈ６及びＨｅｐＧ２細胞についてそれぞれ３μＭ及び４μＭ）、ＡＴＲ（８μＭ）、またはＳＩＭ（４μＭ）単独では、クローン原性細胞アッセイによって明らかになったように、肝芽腫細胞の増殖と生存にほとんど影響を及ぼさなかった（図２９）。しかしながら、ＧＳＫ－１２６とＡＴＲまたはＳＩＭとの組合せは、同じ濃度で相乗効果を示し、生体外で両方の細胞株から肝芽腫細胞を完全に消失させた（図２９）。さらに、ＧＳＫ－１２６＋ＡＴＲまたはＧＳＫ－１２６＋ＳＩＭの組合せはＨｕｈ６細胞遊走を有意に阻害したが、各薬剤単独では効果は限定的であった（図３０）。最後に、我々は、免疫不全ＮＳＧマウスにおけるＨｕｈ６細胞の異種移植モデルを用いて、これらの薬剤の効果を生体内で試験した（図３１ａ）（Hooks KB, Audoux J, Fazli H, Lesjean S, Ernault T, Dugot-Senant N, et al.New insights into diagnosis and therapeutic options for proliferative hepatoblastoma.Hepatology 2018;68:89-10）。図３１ｂに示す通り、ＧＳＫ－１２６＋ＡＴＲの組合せ（ＧＳＫ－１２６、５０ｍｇ／ｋｇ；ＡＴＲ、２０ｍｇ／ｋｇ）は、マウスにおける肝芽腫の発生を効率的に阻害したが、ＧＳＫ－１２６及びＡＴＲの単独は、同じ用量では効果を示さなかった。１ｍｇ／ｋｇの投与量では、シスプラチンも腫瘍の増殖を阻害したが、上記組合せよりも効率は低かった（図１１及び３１ｂ）。腫瘍摘出後、シスプラチンまたは各薬剤を単独で使用した場合と比較すると、腫瘍増殖及び血管新生を抑えるには、上記併用が明らかに最も強力であった（図３１ｃ）。一方、各薬剤もその組合せも、血中ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ、クレアチニン、及び尿素レベルには影響を及ぼさず、肝毒性及び腎毒性がないことが示された（図３１ｄ）。以上、我々のデータは、生体外では肝芽腫細胞を根絶し、生体内では腫瘍の増殖及び血管新生を阻害する、ＧＳＫ－１２６とスタチンを組み合わせることの有益性を証明している。
【図1】
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【図4】
【図5】
【図6】
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【図8】
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【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】
【国際調査報告】