特表 2024-535057 組換えＡ型ボツリヌス神経毒及びその調製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-26

(54)【発明の名称】組換えＡ型ボツリヌス神経毒及びその調製方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20240918BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240918BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240918BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 38/48 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 25/08 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 25/06 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 8/66 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 8/65 20060101ALI20240918BHJP

【ＦＩ】

C12N15/31 ZNA

C12N15/63 Z

C07K14/195

C12N1/21

C12P21/02 Z

A61K38/48

A61P21/02

A61P25/08

A61P25/02

A61P25/06

A61P13/10

A61P17/00

A61K8/66

A61K8/65

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024517004

(86)(22)【出願日】2023-05-18

(85)【翻訳文提出日】2024-03-15

(86)【国際出願番号】 CN2023095060

(87)【国際公開番号】W WO2023226873

(87)【国際公開日】2023-11-30

(31)【優先権主張番号】202210572145.3

(32)【優先日】2022-05-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202211112222.3

(32)【優先日】2022-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523085164

【氏名又は名称】ジェイ・エイチ・エム バイオファーマシューティカル（ハンチョウ）カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＪＨＭ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ（ＨＡＮＧＺＨＯＵ）ＣＯ．，ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍｓ ５０１，５０２，５０３ ａｎｄ ５０４，Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ９，Ｈｅｘｉａｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｑｉａｎｔａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１００１８，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110000523

【氏名又は名称】アクシス国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ユイパオ・シェン

(72)【発明者】

【氏名】クオチン・パオ

(72)【発明者】

【氏名】リーミン・クオ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C083

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG30

4B064BJ12

4B064CA02

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01Y

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AB10

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C083AD471

4C083AD472

4C083BB51

4C083CC02

4C083EE13

4C083FF06

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084BA26

4C084BA41

4C084BA44

4C084CA04

4C084DC02

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA06

4C084ZA08

4C084ZA23

4C084ZA30

4C084ZA33

4C084ZA84

4C084ZA89

4C084ZA94

4H045AA10

4H045AA20

4H045BA32

4H045BA72

4H045CA11

4H045DA83

4H045EA15

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、組換えＡ型ボツリヌス神経毒及びその調製方法に関する。前記組換えＡ型ボツリヌス神経毒はＡ型ボツリヌス神経毒変異体であり、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体は、第１のペプチドセグメントと第２のペプチドセグメントを含み、前記第１のペプチドセグメントは前記第２のペプチドセグメントに鎖間ジスルフィド結合で結合され、前記第１のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、１３４位及び／又は１６５位の変異を有し、及び／又は前記第２のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、７９１位、９６７位及び１０６０位の変異部位の少なくとも１つを有する。前記方法は、第１のペプチドセグメントを第１の変性処理し、第１の変性産物を得るステップと、第２のペプチドセグメントを第２の変性処理し、第２の変性産物を得るステップと、前記第１の変性産物と第２の変性産物を再生及び組立処理し、前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体を得るステップと、を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ａ型ボツリヌス神経毒変異体であって、
第１のペプチドセグメントと第２のペプチドセグメントを含み、前記第１のペプチドセグメントは前記第２のペプチドセグメントに鎖間ジスルフィド結合で結合され、
前記第１のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、１３４位及び／又は１６５位の変異を有し、及び／又は
前記第２のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、７９１位、９６７位及び１０６０位の変異部位の少なくとも１つを有する、ことを特徴とするＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項2】

前記鎖間ジスルフィド結合は前記第１のペプチドセグメント中の４３０位のシステインと前記第２のペプチドセグメント中の４５４位のシステインにより形成される、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項3】

前記第１のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、１３４位と１６５位の変異を有し、及び／又は
前記第２のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、７９１位、９６７位及び１０６０位の変異を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項4】

前記１３４位、１６５位、７９１位、９６７位または１０６０位のシステイン変異は、
Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｅ及びＰのアミノ酸の中の１つである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項5】

前記第１のペプチドセグメントの１３４位のＣ変異はＧ、ＡまたはＳである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項6】

前記第１のペプチドセグメントの１６５位のＣ変異はＧ、Ａ、ＰまたはＳである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項7】

前記第２のペプチドセグメントの７９１位のＣ変異はＧ、ＡまたはＳである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項8】

前記第２のペプチドセグメントの９６７位のＣ変異はＧ、ＡまたはＳである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項9】

前記第２のペプチドセグメントの１０６０位のＣ変異はＧ、Ａ、ＥまたはＳである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項10】

前記第１のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、Ｃ１３４ＧとＣ１６５Ｐの変異を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項11】

前記第２のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、Ｃ７９１Ａ、Ｃ９６７Ａ及びＣ１０６０Ｅの変異を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項12】

前記第１のペプチドセグメントはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３または５に示すアミノ酸配列を有し、または
前記第２のペプチドセグメントはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または６に示すアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項13】

前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列を有する第１のペプチドセグメントとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を有する第２のペプチドセグメントを含み、または
前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列を有する第１のペプチドセグメントとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を有する第２のペプチドセグメントを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項14】

核酸分子であって、前記核酸分子は、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体中の第１のペプチドセグメント及び／又は第２のペプチドセグメントをコードする、ことを特徴とする核酸分子。

【請求項15】

前記核酸分子はＤＮＡである、ことを特徴とする請求項１４に記載の核酸分子。

【請求項16】

請求項１４または１５に記載の核酸分子を担持する、ことを特徴とする発現ベクター。

【請求項17】

前記発現ベクターは、プラスミド発現ベクターである、ことを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。

【請求項18】

遺伝子工学菌であって、
請求項１４～１５のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項１６～１７のいずれか１項に記載の発現ベクターを担持し、または、
請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体を発現する、ことを特徴とする遺伝子工学菌。

【請求項19】

前記遺伝子工学菌は請求項１６～１７のいずれか１項に記載の発現ベクターを宿主菌に形質転換することによって得られる、ことを特徴とする請求項１８に記載の遺伝子工学菌。

【請求項20】

前記宿主菌は大腸菌である、ことを特徴とする請求項１９に記載の遺伝子工学菌。

【請求項21】

遺伝子組換えによるＡ型ボツリヌス神経毒の調製方法であって、
軽鎖タンパク質を第１の変性処理し、第１の変性産物を得るステップと、
重鎖タンパク質を第２の変性処理し、第２の変性産物を得るステップと、
前記第１の変性産物と前記第２の変性産物を再生及び組立処理し、前記Ａ型ボツリヌス神経毒を得るステップと、を含む、ことを特徴とする遺伝子組換えによるＡ型ボツリヌス神経毒の調製方法。

【請求項22】

前記軽鎖タンパク質は、請求項１～１３のいずれか１項に記載の第１のペプチドセグメントまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は
前記重鎖タンパク質は、請求項１～１３のいずれか１項に記載の第２のペプチドセグメントまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項２１に記載の調製方法。

【請求項23】

前記軽鎖タンパク質または重鎖タンパク質は、
前記軽鎖タンパク質または重鎖タンパク質をコードする遺伝子を担持するプラスミドを大腸菌に形質転換することと、
前記プラスミドにより形質転換された大腸菌にタンパク質の発現に適する条件下で培養、誘導、遠心分離菌体採取、菌体破砕、遠心分離産物破砕を行い、前記軽鎖タンパク質または重鎖タンパク質を取得することとにより得られる、ことを特徴とする請求項２２に記載の調製方法。

【請求項24】

前記第１の変性処理と前記第２の変性処理は変性緩衝液中で行い、前記変性緩衝液は、
５～１０Ｍの尿素、５～１５ｍＭのジチオスレイトール及び１０～３０ｍＭのＴｒｉｓまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌを含み、
任意選択に、前記変性緩衝液のｐＨ値は９．５～１０．５である、ことを特徴とする請求項２３に記載の調製方法。

【請求項25】

前記再生及び組立処理を行う前に、予め前記第１の変性産物と前記第２の変性産物を混合処理して、変性混合液を得る、ことを特徴とする請求項２１～２４のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項26】

前記混合処理では前記第１の変性産物と前記第２の変性産物の体積比は１：（１～１０）である、ことを特徴とする請求項２５に記載の調製方法。

【請求項27】

前記変性混合液と再生及び組立緩衝液との体積比は１：（１～１０）である、ことを特徴とする請求項２５に記載の調製方法。

【請求項28】

前記再生及び組立処理は再生及び組立緩衝液中で行われ、前記再生及び組立緩衝液は、
５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１～１．０ｍＭのＺｎＣｌ₂、０．１～１．０ｍＭのＣａＣｌ₂、１．０～１０．０ｍＭの還元型グルタチオン、１．０～１０．０ｍＭの酸化性グルタチオン、４０～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び０．４～０．６％のトウェイン２０を含む、ことを特徴とする請求項２１～２４のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項29】

前記再生及び組立緩衝液のｐＨ値は９．５～１０．５である、ことを特徴とする請求項２８に記載の調製方法。

【請求項30】

前記再生及び組立処理の処理時間は１２～１６ｈである、ことを特徴とする請求項２８に記載の調製方法。

【請求項31】

前記再生及び組立処理の撹拌回転数は５０～２００ｒｐｍである、ことを特徴とする請求項２８に記載の調製方法。

【請求項32】

前記再生及び組立処理で得られた組立液に順次疎水クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム塩析、透析、アニオンクロマトグラフィー及びモレキュラーシーブスクロマトグラフィー処理を行い、前記Ａ型ボツリヌス神経毒を得るステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項２１～２４のいずれか１項に記載の調製方法。

【請求項33】

前記疎水クロマトグラフィー処理の移動相Ａ１は、１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２～８ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ及び１～３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含み、移動相Ｂ１は、１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌと２～８ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含み、前記移動相Ａ１と移動相Ｂ１のｐＨ値はいずれも８．０～９．０である、ことを特徴とする請求項３２に記載の調製方法。

【請求項34】

前記硫酸アンモニウム塩析処理は、
硫酸アンモニウムと前記疎水クロマトグラフィー処理で得られた溶離液を２～８℃条件下で１２～２４ｈ混合してから、混合産物を２～８℃、１００００～１５０００ｒｐｍの条件下で２０～４０ｍｉｎ遠心分離処理し、沈殿物を得ることを含む、ことを特徴とする請求項３２に記載の調製方法。

【請求項35】

前記透析処理は、
前記沈殿物を第１の緩衝液に溶解し、透析対象液を得ることと、
前記透析対象液と第１の透析液を第１の透析処理することと、
得られた第１の透析処理産物と第２の透析液を第２の透析処理することとを含み、
第１の緩衝液は、４０～６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液から選ばれ、第１の透析液は、４０～６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ塩含有透析液から選ばれ、第２の透析液は４０～６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ透析液から選ばれる、ことを特徴とする請求項３４に記載の調製方法。

【請求項36】

前記沈殿物の重量ｇと前記第１の緩衝液との体積ｍｌ比は１：（５～１５）である、ことを特徴とする請求項３５に記載の調製方法。

【請求項37】

前記第１の透析処理の透析時間は２～５ｈであり、前記第２の透析処理の透析時間は１２～２４ｈである、ことを特徴とする請求項３５に記載の調製方法。

【請求項38】

前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ塩含有透析液は２００～３００ｍＭのＮａＣｌをさらに含む、ことを特徴とする請求項３５に記載の調製方法。

【請求項39】

前記第１の透析処理と前記第２の透析処理の透析バッグのカットオフ分子量は８０～１２０ｋＤａである、ことを特徴とする請求項３５に記載の調製方法。

【請求項40】

前記アニオンクロマトグラフィー処理はＤＥＡＥセルロースアニオンクロマトグラフィーから選ばれる、ことを特徴とする請求項３２に記載の調製方法。

【請求項41】

前記ＤＥＡＥセルロースアニオンクロマトグラフィーの移動相Ａ２は１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓを含み、移動相Ｂ２は１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓと０．５～１．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含み、前記移動相Ａ２と移動相Ｂ２のｐＨ値は８．０～９．０である、ことを特徴とする請求項３２に記載の調製方法。

【請求項42】

前記モレキュラーシーブスクロマトグラフィー処理にはＧ－２５Ｍモレキュラーシーブスクロマトグラフィーを採用する、ことを特徴とする請求項３２に記載の調製方法。

【請求項43】

請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体または請求項２１～４２のいずれか１項に記載の方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒を含む、ことを特徴とする医薬組成物。

【請求項44】

薬学的に許容できる補助剤をさらに含む、ことを特徴とする請求項４３に記載の医薬組成物。

【請求項45】

前記薬学的に許容できる補助剤は、緩衝液、保護剤、活性剤及び賦形剤の中から選ばれる少なくとも１つを含む、ことを特徴とする請求項４４に記載の医薬組成物。

【請求項46】

請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体、請求項２１～４２のいずれか１項に記載の方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または請求項４３～４５のいずれか１項に記載の医薬組成物の、薬物の調製における使用であって、
前記薬物は医療美容に用いられ、または
前記薬物は、斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つの治療または改善に用いられる、使用。

【請求項47】

請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体、請求項２１～４２のいずれか１項に記載の調製方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または請求項４３～４５のいずれか１項に記載の医薬組成物の、医療美容または疾患の治療または改善における使用であって、
前記疾患は、斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つを含む、使用。

【請求項48】

医療美容に用いられ、または
斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つを含む疾患の治療または改善に用いられる、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体、依据請求項２１～４２のいずれか１項に記載の調製方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または請求項４３～４５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項49】

前記医療美容は、
眉間のしわ、目じりの小じわ及び額のしわを含む症状の少なくとも１つの改善及び／又は治療を含む、ことを特徴とする請求項４６～４７のいずれか１項に記載の使用。

【請求項50】

疾患の改善及び／又は治療の方法であって、
被験者に、薬学的に許容できる量の請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体、請求項２１～４２のいずれか１項に記載の調製方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または請求項４３～４５のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、
前記疾患は、斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つを含む、ことを特徴とする疾患の改善及び／又は治療の方法。

【請求項51】

前記投与は皮下注射または筋肉注射を含む、ことを特徴とする請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

医療美容の方法であって、
被験者に、薬学的に許容できる量の請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体、請求項２１～４２のいずれか１項に記載の調製方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または請求項４３～４５のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、ことを特徴とする医療美容の方法。

【請求項53】

前記医療美容はしわの除去及び／又は顔痩せを含む、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記医療美容は、眉間のしわ、目じりの小じわ及び額のしわの症状の少なくとも１つの改善及び／又は治療を含む、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記投与は、皮下注射または筋肉注射を含む、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はバイオ医薬品技術の分野に関し、具体的に、本発明は組換えＡ型ボツリヌス神経毒及びその調製方法に関し、具体的に、本発明は、Ａ型ボツリヌス神経毒、その変異体及び調製方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ボツリヌス神経毒（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ、ＢｏＮＴ）は、嫌気性ボツリヌス菌（「ボツリヌス菌」と略称）が生成する神経毒であり、世界で毒性が最も強い物質の一つであり、ボツリヌス神経毒は７種類の血清型（Ａ型－Ｇ型）に分け、最も一般的なのはＡ型であり、Ａ型ボツリヌス神経毒（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ ｔｙｐｅ Ａ、ＢｏＮＴ／Ａ）と呼ばれる。

【0003】

ＢｏＮＴ／Ａの構造は、軽鎖（ＬＣ、５０ｋＤ）と重鎖（ＨＣ、１００ｋＤ）の二つの部分に分けられ、軽鎖と重鎖の間は一対の鎖間ジスルフィド結合（Ｃ４３０－Ｃ４５４）、非アミド結合で結合される。軽鎖は活性ドメインであり、亜鉛依存性金属エンドペプチダーゼ活性を有し、ボツリヌス神経毒の毒性部分である。重鎖は、結合ドメインと転位ドメインの２つのドメインを含み、結合ドメインは神経細胞膜上の対応する受容体との結合を担当し、内体膜上にイオンチャンネルを形成し、転位ドメインは軽鎖の転位を担当し、軽鎖を細胞内に移送し、軽鎖は、ＳＮＡＰ－２５（シナプス小胞関連タンパク質）上のＱ１９７－Ｒ１９８部位を認識し、それを特異的に切断する。

【0004】

多くの研究によると、ＢｏＮＴ／Ａは多くの応用シーンがあり、医療美容だけでなく、多くの疾患の治療にも広範な応用見通しがあり、様々な筋張力障害、手足多汗症、疼痛、その他多くの難病などの分野での臨床応用に伴い、その疾患治療範囲は拡大しつつある。ＢｏＮＴ／Ａの治療メカニズムは、神経筋接合部では、ＢｏＮＴ／Ａが神経細胞表面の対応する受容体に結合し、その重鎖Ｎ末端を介して、膜を貫通して軽鎖を細胞内に移送し、ＳＮＡＰ－２５を切断することでアセチルコリンの放出を遮断し、筋肉の継続的な弛緩性麻痺を引き起こすことである。

【0005】

天然構造の活性ＢｏＮＴ／Ａタンパク質は、重鎖内に一対のジスルフィド結合（Ｃ１２３５－Ｃ１２８０）を有し、軽鎖、重鎖の間に一対のジスルフィド結合（Ｃ４３０－Ｃ４５４）を有する。鎖内及び鎖間のジスルフィド結合を形成する４個のシステイン以外、Ａ型ボツリヌス神経毒分子構造に遊離システイン（非対形成ジスルフィド結合、以下で同様）がまだ５個存在し、組換えＡ型ボツリヌス神経毒の調製過程で、ジスルフィド結合のミスマッチが起こりやすく、不正確な構造を持つＡ型ボツリヌス神経毒タンパク質を形成し、Ａ型ボツリヌス神経毒活性が低下し、ひいては人体に適用した後に免疫反応を起こすこともある。

【0006】

このため、空間構造が正確で、生物活性の高いＡ型ボツリヌス神経毒を開発することが急務となる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、関連技術における技術的問題の一つを少なくとも一定の程度解決する。このため、本発明は、ジスルフィド結合のミスマッチ率が低く、生物活性（毒性）が高いなどの利点を有するＡ型ボツリヌス神経毒変異体を提供する。

【0008】

本発明は発明者らの以下の発見に基づいて完了される。

【0009】

天然構造の活性ＢｏＮＴ／Ａ分子は１２９６個のアミノ酸からなり、軽鎖と重鎖に分けられ、軽鎖は４４８個のアミノ酸（１－４４８）を含み、重鎖は８４８個のアミノ酸（４４９－１２９６）を含み、重鎖内に一対のジスルフィド結合（Ｃ１２３５－Ｃ１２８０）を形成し、重鎖アミノ酸配列のＣ末端付近領域に位置し、軽鎖と重鎖の間に一対のジスルフィド結合（Ｃ４３０－Ｃ４５４）を形成し、該ジスルフィド結合を構成するシステインはそれぞれ軽鎖アミノ酸配列のＣ末端付近及び重鎖アミノ酸配列のＮ末端付近に位置し、該ジスルフィド結合により、軽、重鎖の間に完全なＢｏＮＴ／Ａ分子の正しいアーキテクチャが形成され、ＢｏＮＴ／Ａ分子が受容体と結合し、膜を貫通して転送し、毒性を発揮するなどの生物学的作用を持つ。

【0010】

重鎖内のジスルフィド結合（Ｃ１２３５－Ｃ１２８０）と軽鎖と重鎖間のジスルフィド結合（Ｃ４３０－Ｃ４５４）を構成する４個のシステイン以外、軽鎖と重鎖の一次構造組成には他の遊離システインがまだ存在し、ペアリングされていない状態である。自然界のボツリヌス菌がＡ型ボツリヌス神経毒を生成するのは、遅い過程であり、天然構造を形成するボツリヌス神経毒の分子作用力は、自然界のＡ型ボツリヌス神経毒に正しい高次配座を形成する傾向があり、ボツリヌス菌を人工培養したり、他の発現方式（例えば大腸菌による発現）を採用してＢｏＮＴ／Ａを調製する過程において、人為的にボツリヌス菌の自然成長規則または他の宿主菌内ＢｏＮＴ／Ａの形成速度に関与したため、一部の細胞内ＢｏＮＴ／Ａは自然状態下と一致する正しい高次配座を形成できず、ＢｏＮＴ／Ａの毒性に影響を及ぼす。その原因は、分子間力（例えば水素結合、ファンデルワールス力、疎水、イオン間力など）の作用以外、遊離システイン間の空間的なミスマッチが間違ったジスルフィド結合を形成することで、ＢｏＮＴ／Ａの空間構造配座をある程度変化し、それにより、完全なＢｏＮＴ／Ａ分子の重鎖Ｃ末端受容体結合領域、または重鎖Ｎ末端転位領域、または軽鎖酵素活性領域は天然のＢｏＮＴ／Ａ分子のサブユニット構造の高次空間配座を有さなくなり、ＢｏＮＴ／Ａ分子の体内生物学的効果を減少または弱め、ひいては完全な分子またはサブユニット高次構造または空間配座の変化により、人体に使用された後にこれらの非天然高次構造または空間配座に対する抗タンパク質抗体（ａｎｔｉ－ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＡＰＡと略称）を生成する。

【0011】

分子構造内作用力の形成は、ＢｏＮＴ／Ａ分子形成過程における転写速度、翻訳効率及び宿主細胞内の酸化還元環境状況に密接に関係し、速すぎたり、不一致であったりする転写速度、翻訳効率及び不適切な宿主細胞内環境は、ＢｏＮＴ／Ａ分子の構造の不正確を招きやすい。分子の体内再生及び組立過程で、遊離システインの存在により、システイン分子間のジスルフィド結合のミスマッチを引き起こしやすく、これは、天然構造位に遊離したシステイン同士、または天然構造位に遊離したシステインと天然構造位に対部位を有するシステインとの間、または天然構造位上に異なる対部位を有するシステイン同士のいずれかで発生し、何れの場合でも、ＢｏＮＴ／Ａ分子の高次配座を一定程度変化し、ＢｏＮＴ／Ａ分子の体内生物学的効果に影響を与え、人体に使用された後にこれら「非天然」構造に対するＡＰＡを増加し、薬効を低下させる。

【課題を解決するための手段】

【0012】

これに基づいて、本発明の一態様では、本発明は、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体を提供する。本発明の実施例によれば、前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体は、第１のペプチドセグメントと第２のペプチドセグメントを含み、前記第１のペプチドセグメントは前記第２のペプチドセグメントに鎖間ジスルフィド結合で連結され、前記第１のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、１３４位及び／又は１６５位の変異を有し、及び／又は前記第２のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、７９１位、９６７位及び１０６０位の変異部位の少なくとも１つを有する。発明者らは、天然のＢｏＮＴ／Ａの分子構造を分析し、大量の実験を経て、Ａ型ボツリヌス神経毒の上記アミノ酸を変異することによって、ジスルフィド結合のミスマッチを減少し、その生物活性を向上させることができることが分かる。

【0013】

本発明の他の態様では、本発明は、核酸分子を提供する。本発明の実施例によれば、前記核酸分子は前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体の中の第１のペプチドセグメント及び／又は第２のペプチドセグメントをコードする。本発明の実施例による核酸分子は前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体をコードすることができる。

【0014】

本発明のさらに他の態様では、本発明は発現ベクターを提供する。本発明の実施例によれば、前記発現ベクターは前記核酸分子を担持する。発明者らは、実験により、上記発現ベクターを適切な宿主菌に形質転換した後、調節系の媒介下で、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体の発現を効果的に実現し、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体を大量に得ることができることを発見した。

【0015】

本発明のさらに他の態様では、本発明は遺伝子工学菌を提供する。本発明の実施例によれば、前記遺伝子工学菌は、前記核酸分子または前記発現ベクターを担持し、または、前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体を発現する。発明者らは、実験により、上記遺伝子工学菌を適切な条件下で培養することにより、上記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体を効率よく発現することができることを発見した。

【0016】

本発明のさらに他の態様では、本発明は遺伝子組換えによってＡ型ボツリヌス神経毒を調製する方法を提供する。本発明の実施例によれば、前記方法は、軽鎖タンパク質を第１の変性処理し、第１の変性産物を得るステップと、重鎖タンパク質を第２の変性処理して、第２の変性産物を得るステップと、前記第１の変性産物と第２の変性産物を再生及び組立処理し、前記Ａ型ボツリヌス神経毒を得るステップと、を含む。

【0017】

本発明の調製方法によって、正しい配座を有する配列ヘテロ体を含まない単亜型、単成分のＢｏＮＴ／Ａタンパク質を調製することができ、該ＢｏＮＴ／Ａにはボツリヌス菌抽出物に含まれるＨＡ、ＮＴＮＨ、及び完全なＢｏＮＴ／Ａタンパク質を発現してプロテアーゼでボツリヌス神経毒毒性を活性化する際に生じる酵素残留などの非ＢｏＮＴ／Ａ成分が含まれなく、ロット間の品質が安定するなどの利点を有し、商業化規模での生産に適する。また、該調製方法はプロセスが簡便で、効率が良く、調製フローが短く、わずか８つのステップ、４－５日の時間で全プロセスの調製を完成することができる。

【0018】

本発明のさらに他の態様では、本発明は医薬組成物を提供する。本発明の実施例によれば、前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体を含む。本発明の医薬組成物は高い生物活性（毒性）を有し、医療美容だけでなく、筋張力障害、手足多汗症または疼痛などの病症の治療または改善に利用できる。

【0019】

本発明のさらに他の態様では、本発明は、前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体、前記方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または前記医薬組成物の薬物調製における使用を提供し、前記薬物は、医療美容に用いられるか、または斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つの治療または改善に用いられる。

【0020】

本発明のさらに他の態様では、本発明は、前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体、前記方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または前記医薬組成物の、医療美容または疾患の治療または改善における使用を提供し、前記疾患は、斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つを含む。

【0021】

本発明のさらに他の態様では、本発明は、医療美容または疾患の治療または改善に用いられる前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体、前記方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または前記医薬組成物を提供し、前記疾患は、斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つを含む。

【0022】

本発明のさらに他の態様では、本発明は、疾患の改善及び／又は治療方法を提供する。本発明の実施例によれば、被験者に薬学的に許容できる量の前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体、前記方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または前記医薬組成物を投与するステップを含み、前記疾患は斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つを含む。

【0023】

本発明のさらに他の態様では、本発明は医療美容の方法を提供する。本発明の実施例によれば、被験者に薬学的に許容できる量の前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体、前記方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または前記医薬組成物を投与するステップを含む。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】本発明の実施例２におけるＢｏＮＴ／Ａ－ＬＣ、ＢｏＮＴ／Ａ－ＨＣ発現及び封入体のＳＤＳ－ＰＡＧＥ図である。

【図2】本発明の実施例２における再生及び組立後のサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥ図である。

【図3】本発明の実施例２におけるＢｏＮＴ／Ａタンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥ図である。

【図4】本発明の実施例２におけるＢｏＮＴ／Ａタンパク質のＳＥＣクロマトグラフィー純度である。

【図5】本発明の実施例３の構造同定における完全な分子量データ分析図である。

【図6】本発明の実施例３の構造同定における還元分子量データ分析図である。

【図7】本発明の実施例３の構造同定におけるジスルフィド結合位置分析図である。

【図8】本発明の実施例６における軽鎖変異体プラスミド二本酵素切断アガロースゲル電気泳動と重鎖変異体プラスミド二本酵素切断アガロースゲル電気泳動である。

【図9】本発明の実施例７における野生型Ａ型ボツリヌス神経毒中のシステインの位置及びジスルフィド結合の連結位置である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

以下、本発明の実施例を詳細に説明する。以下で説明される実施例は例示的なものであり、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明を制限するものとして理解されるべきではない。実施例に具体的な技術または条件が示されていない場合、当該分野の文献に記載されている技術または条件に従うか、製品の仕様書に従って実行する。使用される試薬または器具はメーカーが示されていない場合、すべて市場から入手できる従来の製品である。

【0026】

なお、「第１の」、「第２の」といった用語は目的を説明するためのものにすぎず、相対的に重要性を示す若しくは暗に示す、または技術的特徴を明示する数を暗に示すとみなすことはできない。したがって、「第１の」、「第２の」と限定している特徴は１つまたは複数の該特徴を含むことを明示するまたは暗に示すことができ、本発明の説明において、特に別途の説明がない限り、「複数」の概念は２つまたは２つ以上である。

【0027】

本文で開示される範囲の端点といかなる値はこの正確な範囲または値に限定されず、これらの範囲または値は、これらの範囲または値に近い値を含むものとして理解されるべきである。数値範囲について、各範囲の端点値間、各範囲の端点値と個々の点値間、及び個々の点値間を互いに組み合わせて１つまたは複数の新しい数値範囲が得られ、これらの数値範囲は本文に具体的に開示されるものと見なされるべきである。

【0028】

本発明の理解を容易にするために、以下、具体的にいくつかの技術と科学用語を具体的に定義する。本明細書において明示的に定義されている場合を除き、本明細書で使用される他のすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。

【0029】

ここで、「含有」または「含む」という用語は、非限定的表現であり、即ち本発明が示す内容を含むが、その他の態様の内容を排除するものではない。

【0030】

本明細書において、「任意選択に」、「任意選択的」または「任意選択」という用語は、通常、後述するイベントまたは状況が発生してもよいが、必ずしも発生していないことを意味し、この説明には、該イベントまたは状況が発生した場合と、そのイベントまたは状況が発生していない場合が含まれる。

【0031】

本明細書において、前記Ａ型ボツリヌス神経毒のアミノ酸番号はＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされ、例えば、１３４位とは、ＥＵ番号付けシステムに従って１３４位を番号付けるものであり、前記「Ｃ１３４Ｇ」とは、ＥＵ番号付けシステムに従って１３４位と番号付けられるシステインがグリシンで取り替えられることを意味し、「Ｃ７９１Ａ」とは、ＥＵ番号付けシステムに従って７９１位を番号付けるシステインがアラニンで取り替えられることを意味する。

【0032】

本明細書において、「発現ベクター」という用語は、通常、適切な宿主に挿入または挿入して自己複製できる核酸分子のベクターを指し、挿入した核酸分子を宿主菌内及び／又は宿主菌の間に移送することができる。前記発現ベクターは主にＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に挿入するためのベクター、主にＤＮＡまたはＲＮＡを複製するためのベクター、及び主にＤＮＡまたはＲＮＡの転写及び／又は翻訳の発現に用いられるベクターを含んでもよく、好ましくはＤＮＡである。前記発現ベクターは、上記のような複数の機能を有するベクターも含み、発現ベクターの種類として、プラスミド、直鎖状ＤＮＡ断片、ウイルス、細菌ファージ、プロウイルス、ファージ、トランスポゾン及び人工染色体等を含むが、これらに制限されない。前記発現ベクターは標的遺伝子断片を含み、発現ベクターは適切な宿主生物体に形質転換される際に、該標的遺伝子断片はポリペプチドを構成するアミノ酸に転写及び翻訳することができる。通常、前記発現ベクターを含む適切な宿主菌を培養することにより、前記発現ベクターは所望の発現産物を生成することができる。

【0033】

本明細書において、「遺伝子工学菌」という用語は、通常、目的遺伝子を宿主菌に形質転換し、必要なタンパク質を発現して生成する細菌を指す。ここで、用語「宿主菌」とは、組換え発現ベクターが形質転換可能な細菌または細胞、例えば大腸菌を指す。

【0034】

本明細書において、「医薬組成物」という用語は、通常、単位投与量の形態を指し、製薬分野でよく知られている方法のいずれかで調製することができる。すべての方法は、活性成分と１つまたは複数の付属成分を構成するベクターを結合するステップを含む。通常、活性化合物と液体ベクター、微細固体ベクターまたはその両方を均一で十分に結合することによって、組成物を調製する。

【0035】

本明細書において、「薬学的に許容できる補助剤」という用語は、いかなる溶媒、固体賦形剤、希釈剤またはその他の液体賦形剤などを含むことができ、特有の目的剤形に適する。任意の従来の補助剤が本発明の化合物と相溶しない範囲、例えば生じる任意の不良な生物学的効果または薬学的に許容される組成物の任意の他の成分と有害な方式で生じる相互作用以外、それらの使用も本発明によって考慮される範囲である。

【0036】

本明細書において、「治療」という用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得るために使用されることを意味する。前記効果は、疾患またはその症状を完全または部分的に治療または改善することについて治療的であってもよく、及び／又は疾患及び／又は疾患による不良作用を部分的または完全に治癒することについて治療性的であってもよい。本文で使用される「治療」は、哺乳動物、特に人の疾患をカバーし、（ａ）病気にかかりやすいが、まだ病気と診断されていない個体で病気または病気の発生を予防し、（ｂ）疾患の進行を遅らせるなどの疾患を抑制し、または（ｃ）例えば疾患に関連する症状を軽減するなど疾患を緩和する。本文で使用される「治療」は、薬物または化合物を個体に投与して個体の疾患を治療、治癒、緩和、改善、軽減または抑制する任意の薬物をカバーし、本文に記載の化合物の薬物を必要な個体に投与することを含むが、これらに限定されない。

【0037】

本明細書において、「ＢｏＮＴ／Ａ」、「ＢｏＮＴ／Ａタンパク質」、「ＢｏＮＴ／Ａ成分」、「ＢｏＮＴ／Ａ分子」及び「Ａ型ボツリヌス神経毒タンパク質」という用語は、いずれもＡ型ボツリヌス神経毒を指す。

【0038】

本明細書において、「ＬＣ」、「ＢｏＮＴ／Ａ－ＬＣ」、「ＢｏＮＴ／Ａ－ＬＣタンパク質」、「軽鎖タンパク質」及び「軽鎖」という用語は意味が同じである。「ＨＣ」、「ＢｏＮＴ／Ａ－ＨＣ」、「ＢｏＮＴ／Ａ－ＨＣタンパク質」、「重鎖タンパク質」及び「重鎖」という用語は意味が同じである。「軽鎖タンパク質」及び「軽鎖」という用語は意味が同じである。「重鎖タンパク質」及び「重鎖」という用語は意味が同じである。「軽鎖変異体タンパク質」及び「軽鎖変異体」という用語は意味が同じであり、「重鎖変異体タンパク質」と「重鎖変異体」という用語は意味が同じである。

【0039】

本発明はＡ型ボツリヌス神経毒変異体、核酸分子、発現ベクター、遺伝子工学菌、遺伝子組換えによるＡ型ボツリヌス神経毒の調製方法、医薬組成物及びその使用を提供し、以下、それらをそれぞれ詳細に説明する。

【0040】

Ａ型ボツリヌス神経毒変異体

【0041】

本発明の一態様では、本発明は、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体を提供する。本発明の実施例によれば、前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体は、第１のペプチドセグメントと第２のペプチドセグメントを含み、前記第１のペプチドセグメントは前記第２のペプチドセグメントに鎖間ジスルフィド結合で連結され、前記第１のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、１３４位及び／又は１６５位の変異を有し、及び／又は前記第２のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、７９１位、９６７位及び１０６０位の変異部位の少なくとも１つを有する。発明者らは、天然のＢｏＮＴ／Ａの分子構造を分析し、大量の実験を経て、Ａ型ボツリヌス神経毒の上記アミノ酸を変異することによって、ジスルフィド結合のミスマッチを減少し、且つ該Ａ型ボツリヌス神経毒変異体は高い生物活性（毒性）を有することを発見した。

【0042】

野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １：
ＭＰＦＶＮＫＱＦＮＹＫＤＰＶＮＧＶＤＩＡＹＩＫＩＰＮＡＧＱＭＱＰＶＫＡＦＫＩＨＮＫＩＷＶＩＰＥＲＤＴＦＴＮＰＥＥＧＤＬＮＰＰＰＥＡＫＱＶＰＶＳＹＹＤＳＴＹＬＳＴＤＮＥＫＤＮＹＬＫＧＶＴＫＬＦＥＲＩＹＳＴＤＬＧＲＭＬＬＴＳＩＶＲＧＩＰＦＷＧＧＳＴＩＤＴＥＬＫＶＩＤＴＮＣＩＮＶＩＱＰＤＧＳＹＲＳＥＥＬＮＬＶＩＩＧＰＳＡＤＩＩＱＦＥＣＫＳＦＧＨＥＶＬＮＬＴＲＮＧＹＧＳＴＱＹＩＲＦＳＰＤＦＴＦＧＦＥＥＳＬＥＶＤＴＮＰＬＬＧＡＧＫＦＡＴＤＰＡＶＴＬＡＨＥＬＩＨＡＧＨＲＬＹＧＩＡＩＮＰＮＲＶＦＫＶＮＴＮＡＹＹＥＭＳＧＬＥＶＳＦＥＥＬＲＴＦＧＧＨＤＡＫＦＩＤＳＬＱＥＮＥＦＲＬＹＹＹＮＫＦＫＤＩＡＳＴＬＮＫＡＫＳＩＶＧＴＴＡＳＬＱＹＭＫＮＶＦＫＥＫＹＬＬＳＥＤＴＳＧＫＦＳＶＤＫＬＫＦＤＫＬＹＫＭＬＴＥＩＹＴＥＤＮＦＶＫＦＦＫＶＬＮＲＫＴＹＬＮＦＤＫＡＶＦＫＩＮＩＶＰＫＶＮＹＴＩＹＤＧＦＮＬＲＮＴＮＬＡＡＮＦＮＧＱＮＴＥＩＮＮＭＮＦＴＫＬＫＮＦＴＧＬＦＥＦＹＫＬＬＣＶＲＧＩＩＴＳＫＴＫＳＬＤＫＧＹＮＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）であり、
野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２：
ＡＬＮＤＬＣＩＫＶＮＮＷＤＬＦＦＳＰＳＥＤＮＦＴＮＤＬＮＫＧＥＥＩＴＳＤＴＮＩＥＡＡＥＥＮＩＳＬＤＬＩＱＱＹＹＬＴＦＮＦＤＮＥＰＥＮＩＳＩＥＮＬＳＳＤＩＩＧＱＬＥＬＭＰＮＩＥＲＦＰＮＧＫＫＹＥＬＤＫＹＴＭＦＨＹＬＲＡＱＥＦＥＨＧＫＳＲＩＡＬＴＮＳＶＮＥＡＬＬＮＰＳＲＶＹＴＦＦＳＳＤＹＶＫＫＶＮＫＡＴＥＡＡＭＦＬＧＷＶＥＱＬＶＹＤＦＴＤＥＴＳＥＶＳＴＴＤＫＩＡＤＩＴＩＩＩＰＹＩＧＰＡＬＮＩＧＮＭＬＹＫＤＤＦＶＧＡＬＩＦＳＧＡＶＩＬＬＥＦＩＰＥＩＡＩＰＶＬＧＴＦＡＬＶＳＹＩＡＮＫＶＬＴＶＱＴＩＤＮＡＬＳＫＲＮＥＫＷＤＥＶＹＫＹＩＶＴＮＷＬＡＫＶＮＴＱＩＤＬＩＲＫＫＭＫＥＡＬＥＮＱＡＥＡＴＫＡＩＩＮＹＱＹＮＱＹＴＥＥＥＫＮＮＩＮＦＮＩＤＤＬＳＳＫＬＮＥＳＩＮＫＡＭＩＮＩＮＫＦＬＮＱＣＳＶＳＹＬＭＮＳＭＩＰＹＧＶＫＲＬＥＤＦＤＡＳＬＫＤＡＬＬＫＹＩＹＤＮＲＧＴＬＩＧＱＶＤＲＬＫＤＫＶＮＮＴＬＳＴＤＩＰＦＱＬＳＫＹＶＤＮＱＲＬＬＳＴＦＴＥＹＩＫＮＩＩＮＴＳＩＬＮＬＲＹＥＳＮＨＬＩＤＬＳＲＹＡＳＫＩＮＩＧＳＫＶＮＦＤＰＩＤＫＮＱＩＱＬＦＮＬＥＳＳＫＩＥＶＩＬＫＮＡＩＶＹＮＳＭＹＥＮＦＳＴＳＦＷＩＲＩＰＫＹＦＮＳＩＳＬＮＮＥＹＴＩＩＮＣＭＥＮＮＳＧＷＫＶＳＬＮＹＧＥＩＩＷＴＬＱＤＴＱＥＩＫＱＲＶＶＦＫＹＳＱＭＩＮＩＳＤＹＩＮＲＷＩＦＶＴＩＴＮＮＲＬＮＮＳＫＩＹＩＮＧＲＬＩＤＱＫＰＩＳＮＬＧＮＩＨＡＳＮＮＩＭＦＫＬＤＧＣＲＤＴＨＲＹＩＷＩＫＹＦＮＬＦＤＫＥＬＮＥＫＥＩＫＤＬＹＤＮＱＳＮＳＧＩＬＫＤＦＷＧＤＹＬＱＹＤＫＰＹＹＭＬＮＬＹＤＰＮＫＹＶＤＶＮＮＶＧＩＲＧＹＭＹＬＫＧＰＲＧＳＶＭＴＴＮＩＹＬＮＳＳＬＹＲＧＴＫＦＩＩＫＫＹＡＳＧＮＫＤＮＩＶＲＮＮＤＲＶＹＩＮＶＶＶＫＮＫＥＹＲＬＡＴＮＡＳＱＡＧＶＥＫＩＬＳＡＬＥＩＰＤＶＧＮＬＳＱＶＶＶＭＫＳＫＮＤＱＧＩＴＮＫＣＫＭＮＬＱＤＮＮＧＮＤＩＧＦＩＧＦＨＱＦＮＮＩＡＫＬＶＡＳＮＷＹＮＲＱＩＥＲＳＳＲＴＬＧＣＳＷＥＦＩＰＶＤＤＧＷＧＥＲＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）である。

【0043】

野生型Ａ型ボツリヌス神経毒軽鎖をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７：
ＡＴＧＣＣＧＴＴＴＧＴＧＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＴＧＣＧＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＧＡＡＣＧＣＧＧＧＴＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣＧＧＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴＴＣＣＧＧＡＡＣＧＣＧＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＡＣＣＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＧＴＧＣＧＣＧＧＣＡＴＴＣＣＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＡＡＣＧＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＧＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧＣＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＣＧＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧＴＡＴＡＴＴＣＧＣＴＴＴＡＧＣＣＣＧＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡＡＡＴＴＴＧＣＧＡＣＣＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＡＣＣＧＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＧＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＴＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧＣＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＡＴＴＴＡＧＣＧＴＧＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＡＴＴＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＡＣＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＴＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡＴＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＴＡＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＣＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＴＣＧＣＧＧＣＡＴＣＡＴＴＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）であり、
野生型Ａ型ボツリヌス神経毒重鎖をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８：
ＡＴＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＡＡＴＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＣＣＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＣＧＡＧＣＧＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＡＧＴＡＴＴＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＡＣＡＴＴＧＡＡＣＧＣＴＴＴＣＣＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＡＴＴＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＡＧＣＧＧＣＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＴＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＣＧＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＴＴＧＣＧＧＡＴＡＴＴＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＴＴＣＣＧＴＡＴＡＴＴＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＣＣＧＧＡＡＡＴＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＴＧＣＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＧＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＣＧＣＡＧＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＴＴＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＡＴＡＡＴＣＡＧＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＡＴＴＣＣＧＴＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＡＣＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＡＴＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＧＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＣＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＴＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＡＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＡＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＴＴＣＣＧＡＡＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＧＡＡＴＡＴＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＡＣＴＧＣＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＧＧＣＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＡＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＣＡＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＣＣＧＣＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＧＡＴＡＣＧＣＡＴＣＧＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＴＡＴＧＡＴＡＡＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＧＡＴＴＡＴＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＡＣＣＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＧＧＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＴＴＡＴＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＴＣＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴＴＧＴＧＣＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＴＴＡＡＣＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＧＧＣＧＡＣＣＡＡＣＧＣＧＡＧＣＣＡＡＧＣＧＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＴＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＡＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）である。

【0044】

本発明の実施例によれば、前記鎖間ジスルフィド結合は前記第１のペプチドセグメント中の４３０位のシステインと前記第２のペプチドセグメントの中の４５４位のシステインにより形成される。

【0045】

本発明の実施例によれば、前記第１のペプチドセグメントは野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、１３４位と１６５位の変異を有し、及び／又は前記第２のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、７９１位、９６７位及び１０６０位の変異を有する。これにより、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体中のジスルフィド結合のミスマッチ率を減少し、その生物活性を向上させることができる。

【0046】

本発明の実施例によれば、前記１３４位、１６５位、７９１位、９６７位または１０６０位のシステイン変異は、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｅ及びＰのアミノ酸の中の１つである。これにより、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体中のジスルフィド結合のミスマッチ率をさらに減少し、その生物活性を向上させることができる。

【0047】

本発明の実施例によれば、前記第１のペプチドセグメントの１３４位のＣ変異はＧ、ＡまたはＳである。

【0048】

本発明の一好ましい実施例において、前記第１のペプチドセグメントの１３４位のＣ変異はＧである。

【0049】

本発明の一好ましい実施例において、前記第１のペプチドセグメントの１３４位のＣ変異はＡである。

【0050】

本発明の一好ましい実施例において、前記第１のペプチドセグメントの１３４位のＣ変異はＳである。

【0051】

本発明の実施例によれば、前記第１のペプチドセグメントの１６５位のＣ変異はＧ、Ａ、ＰまたはＳである。

【0052】

本発明の一好ましい実施例において、前記第１のペプチドセグメントの１６５位のＣ変異はＧである。

【0053】

本発明の一好ましい実施例において、前記第１のペプチドセグメントの１６５位のＣ変異はＡである。

【0054】

本発明の一好ましい実施例において、前記第１のペプチドセグメントの１６５位のＣ変異はＰである。

【0055】

本発明の一好ましい実施例において、前記第１のペプチドセグメントの１６５位のＣ変異はＳである。

【0056】

本発明の実施例によれば、前記第２のペプチドセグメントの７９１位のＣ変異はＧ、ＡまたはＳである。

【0057】

本発明の一好ましい実施例において、前記第２のペプチドセグメントの７９１位のＣ変異はＧである。

【0058】

本発明の一好ましい実施例において、前記第２のペプチドセグメントの７９１位のＣ変異はＡである。

【0059】

本発明の一好ましい実施例において、前記第２のペプチドセグメントの７９１位のＣ変異はＳである。

【0060】

本発明の実施例によれば、前記第２のペプチドセグメントの９６７位のＣ変異はＧ、ＡまたはＳである。

【0061】

本発明の一好ましい実施例において、前記第２のペプチドセグメントの９６７位のＣ変異はＧである。

【0062】

本発明の一好ましい実施例において、前記第２のペプチドセグメントの９６７位のＣ変異はＡである。

【0063】

本発明の一好ましい実施例において、前記第２のペプチドセグメントの９６７位のＣ変異はＳである。

【0064】

本発明の実施例によれば、前記第２のペプチドセグメントの１０６０位のＣ変異はＧ、Ａ、ＥまたはＳである。

【0065】

本発明の一好ましい実施例において、前記第２のペプチドセグメントの１０６０位のＣ変異はＧである。

【0066】

本発明の一好ましい実施例において、前記第２のペプチドセグメントの１０６０位のＣ変異はＡである。

【0067】

本発明の一好ましい実施例において、前記第２のペプチドセグメントの１０６０位のＣ変異はＥである。

【0068】

本発明の一好ましい実施例において、前記第２のペプチドセグメントの１０６０位のＣ変異はＳである。

【0069】

本発明の実施例によれば、前記第１のペプチドセグメントの１６５位のＣ変異はＰであり、または前記第２のペプチドセグメントの１０６０位のＣ変異はＥである。

【0070】

発明者らは大量の試験により、第１のペプチドセグメントと第２のペプチドセグメントの上記部位を変異する過程で、上記変異部位をいずれもアミノ酸ＧまたはＡまたはＳに変異することによって得られたＡ型ボツリヌス神経毒変異体は、表１２、表１４のＡ型ボツリヌス神経毒変異体２のように、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒と比べてジスルフィド結合のミスマッチを減少し、生物活性（毒性）を向上させることを発見した。また、発明者らは、意外に、上記の変異方式で、変異部位の付近のペプチド鎖の組成、例えばアミノ酸のサイズ、疎水性、可能な水素結合形成及び帯電状況などを十分に考慮すると、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒にジスルフィド結合のミスマッチが発生する確率の高いシステイン（Ｃ１６５、Ｃ１０６０）をＰまたはＥに変異することによって、表１１、表１４のＡ型ボツリヌス神経毒変異体１のように、ジスルフィド結合のミスマッチをより大幅に解消し、ひいてはジスルフィド結合のミスマッチを完全に解消し、且つその生物活性も顕著に向上し、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒活性よりも１倍以上向上させることを発見した。

【0071】

本発明の実施例によれば、前記第１のペプチドセグメントは野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、Ｃ１３４ＧとＣ１６５Ｐの変異を有する。これにより、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体中のジスルフィド結合のミスマッチ率をさらに減少し、その生物活性を向上させることができる。

【0072】

本発明の実施例によれば、前記第２のペプチドセグメントは野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、Ｃ７９１Ａ、Ｃ９６７Ａ及びＣ１０６０Ｅの変異を有する。これにより、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体中のジスルフィド結合のミスマッチ率をさらに減少し、その生物活性を向上させることができる。

【0073】

本発明の実施例によれば、前記第１のペプチドセグメントは野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、Ｃ１３４ＧとＣ１６５Ｐの変異を有し、及び前記第２のペプチドセグメントは野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、Ｃ７９１Ａ、Ｃ９６７Ａ及びＣ１０６０Ｅの変異を有する。上記のＡ型ボツリヌス神経毒変異体は、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒と比較して、高い毒性を有する。

【0074】

本発明の実施例によれば、前記第１のペプチドセグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３または５に示すアミノ酸配列を有する。
ＭＰＦＶＮＫＱＦＮＹＫＤＰＶＮＧＶＤＩＡＹＩＫＩＰＮＡＧＱＭＱＰＶＫＡＦＫＩＨＮＫＩＷＶＩＰＥＲＤＴＦＴＮＰＥＥＧＤＬＮＰＰＰＥＡＫＱＶＰＶＳＹＹＤＳＴＹＬＳＴＤＮＥＫＤＮＹＬＫＧＶＴＫＬＦＥＲＩＹＳＴＤＬＧＲＭＬＬＴＳＩＶＲＧＩＰＦＷＧＧＳＴＩＤＴＥＬＫＶＩＤＴＮＧＩＮＶＩＱＰＤＧＳＹＲＳＥＥＬＮＬＶＩＩＧＰＳＡＤＩＩＱＦＥＰＫＳＦＧＨＥＶＬＮＬＴＲＮＧＹＧＳＴＱＹＩＲＦＳＰＤＦＴＦＧＦＥＥＳＬＥＶＤＴＮＰＬＬＧＡＧＫＦＡＴＤＰＡＶＴＬＡＨＥＬＩＨＡＧＨＲＬＹＧＩＡＩＮＰＮＲＶＦＫＶＮＴＮＡＹＹＥＭＳＧＬＥＶＳＦＥＥＬＲＴＦＧＧＨＤＡＫＦＩＤＳＬＱＥＮＥＦＲＬＹＹＹＮＫＦＫＤＩＡＳＴＬＮＫＡＫＳＩＶＧＴＴＡＳＬＱＹＭＫＮＶＦＫＥＫＹＬＬＳＥＤＴＳＧＫＦＳＶＤＫＬＫＦＤＫＬＹＫＭＬＴＥＩＹＴＥＤＮＦＶＫＦＦＫＶＬＮＲＫＴＹＬＮＦＤＫＡＶＦＫＩＮＩＶＰＫＶＮＹＴＩＹＤＧＦＮＬＲＮＴＮＬＡＡＮＦＮＧＱＮＴＥＩＮＮＭＮＦＴＫＬＫＮＦＴＧＬＦＥＦＹＫＬＬＣＶＲＧＩＩＴＳＫＴＫＳＬＤＫＧＹＮＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）、
ＭＰＦＶＮＫＱＦＮＹＫＤＰＶＮＧＶＤＩＡＹＩＫＩＰＮＡＧＱＭＱＰＶＫＡＦＫＩＨＮＫＩＷＶＩＰＥＲＤＴＦＴＮＰＥＥＧＤＬＮＰＰＰＥＡＫＱＶＰＶＳＹＹＤＳＴＹＬＳＴＤＮＥＫＤＮＹＬＫＧＶＴＫＬＦＥＲＩＹＳＴＤＬＧＲＭＬＬＴＳＩＶＲＧＩＰＦＷＧＧＳＴＩＤＴＥＬＫＶＩＤＴＮＧＩＮＶＩＱＰＤＧＳＹＲＳＥＥＬＮＬＶＩＩＧＰＳＡＤＩＩＱＦＥＧＫＳＦＧＨＥＶＬＮＬＴＲＮＧＹＧＳＴＱＹＩＲＦＳＰＤＦＴＦＧＦＥＥＳＬＥＶＤＴＮＰＬＬＧＡＧＫＦＡＴＤＰＡＶＴＬＡＨＥＬＩＨＡＧＨＲＬＹＧＩＡＩＮＰＮＲＶＦＫＶＮＴＮＡＹＹＥＭＳＧＬＥＶＳＦＥＥＬＲＴＦＧＧＨＤＡＫＦＩＤＳＬＱＥＮＥＦＲＬＹＹＹＮＫＦＫＤＩＡＳＴＬＮＫＡＫＳＩＶＧＴＴＡＳＬＱＹＭＫＮＶＦＫＥＫＹＬＬＳＥＤＴＳＧＫＦＳＶＤＫＬＫＦＤＫＬＹＫＭＬＴＥＩＹＴＥＤＮＦＶＫＦＦＫＶＬＮＲＫＴＹＬＮＦＤＫＡＶＦＫＩＮＩＶＰＫＶＮＹＴＩＹＤＧＦＮＬＲＮＴＮＬＡＡＮＦＮＧＱＮＴＥＩＮＮＭＮＦＴＫＬＫＮＦＴＧＬＦＥＦＹＫＬＬＣＶＲＧＩＩＴＳＫＴＫＳＬＤＫＧＹＮＫ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）。

【0075】

本発明の実施例によれば、前記第２のペプチドセグメントはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または６に示すアミノ酸配列を有する。
ＡＬＮＤＬＣＩＫＶＮＮＷＤＬＦＦＳＰＳＥＤＮＦＴＮＤＬＮＫＧＥＥＩＴＳＤＴＮＩＥＡＡＥＥＮＩＳＬＤＬＩＱＱＹＹＬＴＦＮＦＤＮＥＰＥＮＩＳＩＥＮＬＳＳＤＩＩＧＱＬＥＬＭＰＮＩＥＲＦＰＮＧＫＫＹＥＬＤＫＹＴＭＦＨＹＬＲＡＱＥＦＥＨＧＫＳＲＩＡＬＴＮＳＶＮＥＡＬＬＮＰＳＲＶＹＴＦＦＳＳＤＹＶＫＫＶＮＫＡＴＥＡＡＭＦＬＧＷＶＥＱＬＶＹＤＦＴＤＥＴＳＥＶＳＴＴＤＫＩＡＤＩＴＩＩＩＰＹＩＧＰＡＬＮＩＧＮＭＬＹＫＤＤＦＶＧＡＬＩＦＳＧＡＶＩＬＬＥＦＩＰＥＩＡＩＰＶＬＧＴＦＡＬＶＳＹＩＡＮＫＶＬＴＶＱＴＩＤＮＡＬＳＫＲＮＥＫＷＤＥＶＹＫＹＩＶＴＮＷＬＡＫＶＮＴＱＩＤＬＩＲＫＫＭＫＥＡＬＥＮＱＡＥＡＴＫＡＩＩＮＹＱＹＮＱＹＴＥＥＥＫＮＮＩＮＦＮＩＤＤＬＳＳＫＬＮＥＳＩＮＫＡＭＩＮＩＮＫＦＬＮＱＡＳＶＳＹＬＭＮＳＭＩＰＹＧＶＫＲＬＥＤＦＤＡＳＬＫＤＡＬＬＫＹＩＹＤＮＲＧＴＬＩＧＱＶＤＲＬＫＤＫＶＮＮＴＬＳＴＤＩＰＦＱＬＳＫＹＶＤＮＱＲＬＬＳＴＦＴＥＹＩＫＮＩＩＮＴＳＩＬＮＬＲＹＥＳＮＨＬＩＤＬＳＲＹＡＳＫＩＮＩＧＳＫＶＮＦＤＰＩＤＫＮＱＩＱＬＦＮＬＥＳＳＫＩＥＶＩＬＫＮＡＩＶＹＮＳＭＹＥＮＦＳＴＳＦＷＩＲＩＰＫＹＦＮＳＩＳＬＮＮＥＹＴＩＩＮＡＭＥＮＮＳＧＷＫＶＳＬＮＹＧＥＩＩＷＴＬＱＤＴＱＥＩＫＱＲＶＶＦＫＹＳＱＭＩＮＩＳＤＹＩＮＲＷＩＦＶＴＩＴＮＮＲＬＮＮＳＫＩＹＩＮＧＲＬＩＤＱＫＰＩＳＮＬＧＮＩＨＡＳＮＮＩＭＦＫＬＤＧＥＲＤＴＨＲＹＩＷＩＫＹＦＮＬＦＤＫＥＬＮＥＫＥＩＫＤＬＹＤＮＱＳＮＳＧＩＬＫＤＦＷＧＤＹＬＱＹＤＫＰＹＹＭＬＮＬＹＤＰＮＫＹＶＤＶＮＮＶＧＩＲＧＹＭＹＬＫＧＰＲＧＳＶＭＴＴＮＩＹＬＮＳＳＬＹＲＧＴＫＦＩＩＫＫＹＡＳＧＮＫＤＮＩＶＲＮＮＤＲＶＹＩＮＶＶＶＫＮＫＥＹＲＬＡＴＮＡＳＱＡＧＶＥＫＩＬＳＡＬＥＩＰＤＶＧＮＬＳＱＶＶＶＭＫＳＫＮＤＱＧＩＴＮＫＣＫＭＮＬＱＤＮＮＧＮＤＩＧＦＩＧＦＨＱＦＮＮＩＡＫＬＶＡＳＮＷＹＮＲＱＩＥＲＳＳＲＴＬＧＣＳＷＥＦＩＰＶＤＤＧＷＧＥＲＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）；
ＡＬＮＤＬＣＩＫＶＮＮＷＤＬＦＦＳＰＳＥＤＮＦＴＮＤＬＮＫＧＥＥＩＴＳＤＴＮＩＥＡＡＥＥＮＩＳＬＤＬＩＱＱＹＹＬＴＦＮＦＤＮＥＰＥＮＩＳＩＥＮＬＳＳＤＩＩＧＱＬＥＬＭＰＮＩＥＲＦＰＮＧＫＫＹＥＬＤＫＹＴＭＦＨＹＬＲＡＱＥＦＥＨＧＫＳＲＩＡＬＴＮＳＶＮＥＡＬＬＮＰＳＲＶＹＴＦＦＳＳＤＹＶＫＫＶＮＫＡＴＥＡＡＭＦＬＧＷＶＥＱＬＶＹＤＦＴＤＥＴＳＥＶＳＴＴＤＫＩＡＤＩＴＩＩＩＰＹＩＧＰＡＬＮＩＧＮＭＬＹＫＤＤＦＶＧＡＬＩＦＳＧＡＶＩＬＬＥＦＩＰＥＩＡＩＰＶＬＧＴＦＡＬＶＳＹＩＡＮＫＶＬＴＶＱＴＩＤＮＡＬＳＫＲＮＥＫＷＤＥＶＹＫＹＩＶＴＮＷＬＡＫＶＮＴＱＩＤＬＩＲＫＫＭＫＥＡＬＥＮＱＡＥＡＴＫＡＩＩＮＹＱＹＮＱＹＴＥＥＥＫＮＮＩＮＦＮＩＤＤＬＳＳＫＬＮＥＳＩＮＫＡＭＩＮＩＮＫＦＬＮＱＡＳＶＳＹＬＭＮＳＭＩＰＹＧＶＫＲＬＥＤＦＤＡＳＬＫＤＡＬＬＫＹＩＹＤＮＲＧＴＬＩＧＱＶＤＲＬＫＤＫＶＮＮＴＬＳＴＤＩＰＦＱＬＳＫＹＶＤＮＱＲＬＬＳＴＦＴＥＹＩＫＮＩＩＮＴＳＩＬＮＬＲＹＥＳＮＨＬＩＤＬＳＲＹＡＳＫＩＮＩＧＳＫＶＮＦＤＰＩＤＫＮＱＩＱＬＦＮＬＥＳＳＫＩＥＶＩＬＫＮＡＩＶＹＮＳＭＹＥＮＦＳＴＳＦＷＩＲＩＰＫＹＦＮＳＩＳＬＮＮＥＹＴＩＩＮＡＭＥＮＮＳＧＷＫＶＳＬＮＹＧＥＩＩＷＴＬＱＤＴＱＥＩＫＱＲＶＶＦＫＹＳＱＭＩＮＩＳＤＹＩＮＲＷＩＦＶＴＩＴＮＮＲＬＮＮＳＫＩＹＩＮＧＲＬＩＤＱＫＰＩＳＮＬＧＮＩＨＡＳＮＮＩＭＦＫＬＤＧＧＲＤＴＨＲＹＩＷＩＫＹＦＮＬＦＤＫＥＬＮＥＫＥＩＫＤＬＹＤＮＱＳＮＳＧＩＬＫＤＦＷＧＤＹＬＱＹＤＫＰＹＹＭＬＮＬＹＤＰＮＫＹＶＤＶＮＮＶＧＩＲＧＹＭＹＬＫＧＰＲＧＳＶＭＴＴＮＩＹＬＮＳＳＬＹＲＧＴＫＦＩＩＫＫＹＡＳＧＮＫＤＮＩＶＲＮＮＤＲＶＹＩＮＶＶＶＫＮＫＥＹＲＬＡＴＮＡＳＱＡＧＶＥＫＩＬＳＡＬＥＩＰＤＶＧＮＬＳＱＶＶＶＭＫＳＫＮＤＱＧＩＴＮＫＣＫＭＮＬＱＤＮＮＧＮＤＩＧＦＩＧＦＨＱＦＮＮＩＡＫＬＶＡＳＮＷＹＮＲＱＩＥＲＳＳＲＴＬＧＣＳＷＥＦＩＰＶＤＤＧＷＧＥＲＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）。

【0076】

本発明のいくつかの選択的な実施例において、前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列を有する第１のペプチドセグメントとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を有する第２のペプチドセグメントを含み、または前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列を有する第１のペプチドセグメントとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を有する第２のペプチドセグメントを含む。

【0077】

核酸分子、発現ベクター及び遺伝子工学菌

【0078】

本発明の第二態様では、本発明は核酸分子を提供する。本発明の実施例によれば、前記核酸分子は第一態様に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体の中の第１のペプチドセグメント及び／又は第２のペプチドセグメントをコードする。本発明の核酸分子は前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体をコードすることができる。

【0079】

本発明の実施例によれば、前記核酸分子はＤＮＡである。

【0080】

本発明の第三態様では、本発明は発現ベクターを提供する。本発明の実施例によれば、前記発現ベクターは第二態様に記載の核酸分子を担持する。本発明の発現ベクターは適切な宿主菌に形質転換された後、調節系の媒介下で、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体の発現を効果的に実現し、第一態様のＡ型ボツリヌス神経毒変異体を大量に得ることができる。

【0081】

本発明の実施例によれば、前記発現ベクターはプラスミド発現ベクターである。

【0082】

本発明の第四態様では、本発明は遺伝子工学菌を提供する。本発明の実施例によれば、前記遺伝子工学菌は、第二態様に記載の核酸分子または第三態様に記載の発現ベクターを担持し、または、第一態様に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体を発現する。本発明の遺伝子工学菌は適切な条件で第一態様のＡ型ボツリヌス神経毒変異体を効率よく発現することができる。

【0083】

本発明の実施例によれば、前記遺伝子工学菌は、第三態様に記載の発現ベクターを宿主菌内に形質転換することによって得られる。

【0084】

本発明の実施例によれば、前記宿主菌は大腸菌である。

【0085】

遺伝子組換えによるＡ型ボツリヌス神経毒の調製方法

【0086】

本発明の第五態様では、本発明は遺伝子組換えによるＡ型ボツリヌス神経毒の調製方法を提供する。本発明の実施例によれば、前記方法は、軽鎖タンパク質を第１の変性処理し、第１の変性産物を得るステップと、重鎖タンパク質を第２の変性処理し、第２の変性産物を得るステップと、前記第１の変性産物と第２の変性産物を再生及び組立処理し、前記Ａ型ボツリヌス神経毒を得るステップと、を含む。

【0087】

発明者らは、ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の高次構造、タンパク質の特性を研究及び分析し、大量の実験を経て、軽鎖タンパク質と重鎖タンパク質を変性処理してから、体外で再生及び組立処理し、最終的に完全な活性があるＡ型ボツリヌス神経毒を形成することを発見した。該方法は、プロテアーゼを追加的に使用して毒性活性化を行う必要がなく、外来ツール酵素の残留を避けることができ、また切断の不完全または非特異的な切断による不活性異性化不純物体を避けることができ、同時に、完全なＢｏＮＴ／Ａタンパク質分子を単独で発現させる必要がなく、タンパク質分子が大きすぎて誤った高次構造を形成する傾向とリスクを回避した。従って、該方法は、単亜型、単成分のＢｏＮＴ／Ａを調製することができ、該ＢｏＮＴ／Ａにはボツリヌス菌抽出物に含まれるＨＡ、ＮＴＮＨ、及び完全なＢｏＮＴ／Ａタンパク質を発現してプロテアーゼでボツリヌス神経毒毒性を活性化する際に生じる酵素残留などの非ＢｏＮＴ／Ａ成分が含まれなく、ロット間の品質が安定するなどの利点を有する。

【0088】

本発明の実施例によれば、前記軽鎖タンパク質は第一態様に記載の第１のペプチドセグメントを含み、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は、前記重鎖タンパク質は第一態様に記載の第２のペプチドセグメントを含み、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を有する。

【0089】

なお、本文における「Ａ型ボツリヌス神経毒」は野生型のＡ型ボツリヌス神経毒を含んでもよいし、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体を含んでもよい。

【0090】

本発明の実施例によれば、前記軽鎖タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列を有し、及び前記重鎖タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を有する。

【0091】

本発明の実施例によれば、前記軽鎖タンパク質または重鎖タンパク質は、前記軽鎖タンパク質または重鎖タンパク質をコードする遺伝子を担持するプラスミドを大腸菌に形質転換するステップと、前記プラスミドで形質転換された大腸菌をタンパク質の発現に適する条件で培養処理し、誘導、菌体採取、菌体破砕、遠心分離などの過程を経て、前記軽鎖タンパク質または重鎖タンパク質を取得するステップとによって得られる。これにより、ＢｏＮＴ／Ａタンパク質分子を構成する軽鎖タンパク質または重鎖タンパク質を取得することができる。

【0092】

本発明の実施例によれば、前記第１の変性処理または前記第２の変性処理は変性緩衝液中で行われ、前記変性緩衝液は、５～１０Ｍの尿素、５～１５ｍＭのジチオスレイトール及び１０～３０ ｍＭのＴｒｉｓまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌを含む。発明者らは、大量の実験により、上記の好ましい配合割合を取得し、これにより、軽鎖タンパク質のアミノ酸鎖と重鎖タンパク質のアミノ酸鎖を完全に伸ばした状態にする。

【0093】

本発明の実施例によれば、前記変性緩衝液のｐＨ値は９．５～１０．５である。これにより、軽鎖タンパク質と重鎖タンパク質のアミノ酸鎖の伸ばしにより有利である。

【0094】

本発明の実施例によれば、前記再生及び組立処理を行う前に、予め前記第１の変性産物と前記第２の変性産物を混合処理し、変性混合液を得る。発明者らは、大量の実験により、第１の変性産物と第２の変性産物を混合してから同時に再生することによって、一本鎖再生と重鎖と軽鎖の間の組立を同時に行うことができることを発見した。

【0095】

本発明の実施例によれば、前記混合処理における前記第１の変性産物と前記第２の変性産物の体積比は１：（１～１０）である。

【0096】

本発明の実施例によれば、前記再生及び組立処理は再生及び組立緩衝液中で行われ、前記再生及び組立緩衝液は、５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１～１．０ｍＭのＺｎＣｌ₂、０．１～１．０ｍＭのＣａＣｌ₂、１．０～１０．０ｍＭの還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、１．０～１０．０ｍＭの酸化性グルタチオン（ＧＳＳＧ）、４０～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び０．４～０．６％（ｗ／ｖ）トウェイン２０（Ｔｗｅｅｎ－２０）を含む。発明者らは、大量のスクリーニング実験を経て、上記好ましい配合割合を得て、該再生及び組立緩衝液による、変性の、伸ばし状態にある軽鎖タンパク質と重鎖タンパク質を折りたたんで、組み立て、折りたたみ、組み立て過程に軽鎖または重鎖タンパク質内及び軽鎖タンパク質と重鎖タンパク質間のジスルフィド結合のミスマッチ率を減らすことができ、高い一本鎖（軽鎖、重鎖）の正しい再生率と二本鎖間の組立効率を有し、組立液中の高い目的タンパク質（ＢｏＮＴ／Ａ）含有量を取得し、後続で調製された正しい鎖内ジスルフィド結合及び鎖間ジスルフィド結合を有するＢｏＮＴ／Ａタンパク質の純度がより高く、活性（毒性）がより良い。

【0097】

本発明の実施例によれば、前記再生及び組立緩衝液のｐＨ値は９．５～１０．５である。これにより、重鎖内及び軽、重鎖間ジスルフィド結合の正確なペアリング率を向上させ、組立液中の目的タンパク質の含有量を高めることができる。

【0098】

本発明の実施例によれば、前記変性混合液と前記再生及び組立緩衝液との体積比は１：（１～１０）である。発明者らは、大量の実験により、上記の好ましい配合比を得て、これにより、再生及び組立処理過程における重鎖内及び軽、重鎖間ジスルフィド結合の正確なペアリング率を向上させ、組立液中の目的タンパク質の含有量を高めることができる。

【0099】

本発明の実施例によれば、前記再生及び組立処理の処理時間は１２～１６ｈである。発明者らは、大量の実験により、上記の好ましい再生及び組立処理条件を得て、これにより、重鎖タンパク質内または軽鎖タンパク質と重鎖タンパク質との間のジスルフィド結合の正確な接続に有利であり、組み立て正確な高次構造を有するＡ型ボツリヌス神経毒を形成する。

【0100】

本発明の実施例によれば、前記再生及び組立処理の撹拌回転数は５０～２００ｒｐｍである。発明者らは、大量の実験により、上記好ましい再生及び組立処理条件を得て、これにより、重鎖タンパク質内または軽鎖タンパク質と重鎖タンパク質との間のジスルフィド結合の正確な接続に有利であり、組み立て正確な高次構造を有するＡ型ボツリヌス神経毒を形成する。

【0101】

本発明の実施例によれば、前記方法は、前記再生及び組立処理で得られる組立液に順次疎水クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム塩析、透析、アニオンクロマトグラフィー及びモレキュラーシーブスクロマトグラフィーの処理を行い、前記Ａ型ボツリヌス神経毒を得ることをさらに含む。発明者らは、大量の実験により、上記精製ステップを得て、発明者らは、上記精製ステップと精製系の下で、組立液中の不純物を除去するのに有利であり、得られたＡ型ボツリヌス神経毒の純度は９８．０％以上に達することができることを発見した。また、発明者らは、上記５種類の精製処理の順序を変えるか、またはその中の１つまたは複数の精製処理を除去することにより、最終的に得られたＡ型ボツリヌス神経毒の純度を顕著に下げることができることをさらに発見した。

【0102】

本発明の実施例によれば、前記疎水クロマトグラフィー処理の移動相Ａ１は１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２～８ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ及び１～３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含み、移動相Ｂ１は１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓと２～８ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含み、前記移動相Ａ１と移動相Ｂ１のｐＨ値はいずれも８．０～９．０である。発明者らは、大量の実験により、上記好ましい精製条件を得て、これにより、Ａ型ボツリヌス神経毒を含む組立液の精製効果が良好である。

【0103】

本発明の実施例によれば、前記硫酸アンモニウム塩析処理は、硫酸アンモニウムを前記疎水クロマトグラフィーで処理して得られた溶離液に、硫酸アンモニウム飽和濃度８０％までゆっくりと添加し、２～８℃条件下で１２～２４ｈ撹拌して塩析液を得た後、塩析液を２～８℃、１００００～１５０００ｒｐｍの条件下で２０～４０ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを捨て、沈殿を得ることを含む。発明者らは、大量の実験により、上記好ましい精製条件を得て、これにより、Ａ型ボツリヌス神経毒の純度を更に高めることができる。

【0104】

本発明の実施例によれば、前記透析処理は、前記沈殿物を第１の緩衝液に溶解し、透析対象液を得ることと、前記透析対象液と第１の透析液を第１の透析処理することと、得られた第１の透析処理産物と第２の透析液を第２の透析処理することと、を含み、第１の緩衝液は４０～６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液から選ばれ、第１の透析液は４０～６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ塩含有透析液から選ばれ、第２の透析液は４０～６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ透析液から選ばれる。発明者らは、大量の実験により、上記好ましい精製条件を得て、これにより、得られたＡ型ボツリヌス神経毒の純度が高い。また、発明者らは、大量の実験により、第１の透析処理過程で、塩の存在は、溶解したタンパク質の持続的な溶解性を確保すると同時に、目的タンパク質の表面への不純物の非特異的な吸着を避けることができるため、第１の透析液には塩含有透析液が選択され、透析処理で得られたＡ型ボツリヌス神経毒の純度をさらに高めることができることを更に発見する。

【0105】

なお、「４０～６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ塩含有透析液」とは、塩を含有するＴｒｉｓ－ＨＣｌ透析液を指し、該透析液中のＴｒｉｓ－ＨＣｌの濃度は４０～６０ｍＭである。

【0106】

本発明の実施例によれば、前記沈殿物の重量ｇと前記第１の緩衝液の体積ｍｌ比は１：（５～１５）である。発明者らは、大量の実験により、上記好ましい配合比を得て、これにより、Ａ型ボツリヌス神経毒の純度を更に高めることができる。

【0107】

本発明の実施例によれば、前記第１の透析処理の透析時間は２～５ｈであり、前記第２の透析処理の透析時間は１２～２４ｈである。これにより、透析処理の効果が良い。

【0108】

本発明の実施例によれば、前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ塩含有透析液は２００～３００ｍＭのＮａＣｌをさらに含む。

【0109】

本発明の実施例によれば、前記第１の透析処理と前記第２の透析処理の透析バッグのカットオフ分子量は８０～１２０ｋＤａである。

【0110】

本発明の実施例によれば、前記アニオンクロマトグラフィー処理はＤＥＡＥセルロースアニオンクロマトグラフィーから選ばれる。

【0111】

本発明の実施例によれば、前記ＤＥＡＥセルロースアニオンクロマトグラフィーの移動相Ａ２は１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含み、移動相Ｂ２は１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌと０．５～１．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含み、前記移動相Ａ２と移動相Ｂ２のｐＨ値は８．５である。発明者らは、大量の実験により、上記好ましい精製条件を得て、これにより、Ａ型ボツリヌス神経毒の純度を更に高めることができる。

【0112】

本発明の実施例によれば、前記モレキュラーシーブスクロマトグラフィー処理にはＧ－２５Ｍモレキュラーシーブスクロマトグラフィーを採用する。

【0113】

本発明の実施例によれば、前記Ｇ－２５Ｍモレキュラーシーブスクロマトグラフィーの移動相Ｃは１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌを含み、前記移動相ＣのｐＨ値は８．０～９．０である。発明者らは、大量の実験により、上記好ましい精製条件を得て、これにより、Ａ型ボツリヌス神経毒の純度を更に高めることができる。

【0114】

本発明の実施例によれば、前記Ｇ－２５Ｍモレキュラーシーブスクロマトグラフィーの担持量≦３０％カラム体積／ｃｙｃｌｅであり、線形流速が２５０～３５０ｃｍ／ｈである。

【0115】

本発明の第六態様では、本発明はＡ型ボツリヌス神経毒またはＡ型ボツリヌス神経毒変異体を提供する。本発明の実施例によれば、前記Ａ型ボツリヌス神経毒は第五態様に記載の方法によって調製されるものである。発明者らは、実験により、第五態様に記載の方法を採用して正しい配座を有する単亜型、単成分ＢｏＮＴ／Ａを調製することができ、該ＢｏＮＴ／ＡにＨＡ、ＮＴＮＨ、酵素残留等の非ＢｏＮＴ／Ａ成分が含まれなく、ロット間の品質の安定性などの利点を有することを発見した。

【0116】

本発明の第七態様では、本発明はＡ型ボツリヌス神経毒を提供する。本発明の実施例によれば、前記Ａ型ボツリヌス神経毒のＬＤ₅₀は１－２０ｐｇ／匹であり、前記Ａ型ボツリヌス神経毒の純度は９８％以上である。

【0117】

本発明の実施例によれば、前記Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列を有する。

【0118】

本発明の実施例によれば、前記Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を有する。

【0119】

医薬組成物

【0120】

本発明の第八態様では、本発明は医薬組成物を提供する。本発明の実施例によれば、第一態様に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体または第五態様に記載の方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒を含む。本発明の医薬組成物は高い生物活性（毒性）を有し、医療美容だけでなく、斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つの治療または改善に用いられる。

【0121】

本発明の実施例によれば、前記医療美容は、眉間のしわ、目じりの小じわ及び額のしわの症状の少なくとも１つを改善及び／又は治療することを含む。

【0122】

本発明の実施例によれば、薬学的に許容できる補助剤をさらに含む。

【0123】

本発明の実施例によれば、前記薬学的に許容できる補助剤は、緩衝液、保護剤、活性剤及び賦形剤から選ばれる少なくとも１つを含む。

【0124】

なお、緩衝液とは、通常、緩衝の役割を果たすことができる液体溶液のことであり、ここで広義に理解すべきである。例示的に、生理的に相溶可能な緩衝系及び／又は緩衝系組成物であってもよく、酢酸、コハク酸、クエン酸、ヒスチジン、グルタミン酸、クエン酸塩／酢酸塩、クエン酸塩／ヒスチジン、コハク酸塩／ヒスチジン、リン酸塩、トリメチロールアミノメタン緩衝系等を含むが、これらに制限されない。

【0125】

なお、保護剤は、通常、医薬組成物に対して保護作用を発揮する試薬であり、ここで広義に理解すべきである。例示的に、非還元性糖トレハロース、スクロース、ヒト血中アルブミンなどを含むが、これらに制限されない。

【0126】

本発明の実施例によれば、前記活性剤は非イオン型表面活性剤である。

【0127】

本発明の実施例によれば、前記非イオン型表面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０から選ばれる少なくとも１つを含む。

【0128】

本発明の実施例によれば、前記医薬組成物は液体組成物であり、前記保護剤は、非還元性糖トレハロース及び／又はスクロースから選ばれるものを含み、前記非イオン型表面活性剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０和ポリソルベート８０から選ばれる少なくとも１つを含む。

【0129】

本発明の実施例によれば、前記医薬組成物は凍結乾燥組成物であり、前記保護剤は非還元性糖トレハロース、スクロース及びヒト血中アルブミンから選ばれる少なくとも１つを含み、前記賦形剤は多価アルコール系賦形剤である。

【0130】

使用

【0131】

本発明の第九態様では、本発明は第一態様に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体、第五態様に記載の方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または第八態様に記載の医薬組成物の薬物調製における使用を提供し、前記薬物は、医療美容に用いられるか、または斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つの治療または改善に用いられる。

【0132】

本発明の実施例によれば、前記医療美容はしわの除去及び／又は顔痩せを含む。

【0133】

本発明の実施例によれば、前記医療美容は、眉間のしわ、目じりの小じわ及び額のしわの症状の少なくとも１つの改善及び／治療を含む。

【0134】

本発明の第十態様では、本発明は前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体、前記方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または前記医薬組成物の医療美容または疾患における治療または改善の使用を提供し、前記疾患は、斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つを含む。

【0135】

本発明の実施例によれば、前記医療美容はしわの除去及び／又は顔痩せを含む。

【0136】

本発明の実施例によれば、前記医療美容は、眉間のしわ、目じりの小じわ及び額のしわの症状の少なくとも１つの改善及び／又は治療を含む。

【0137】

本発明の第十一態様では、本発明は前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体、前記方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または前記医薬組成物を提供し、医療美容または疾患の治療または改善に用いられ、前記疾患は、斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つを含む。

【0138】

本発明の実施例によれば、前記医療美容はしわの除去及び／又は顔痩せを含む。

【0139】

本発明の実施例によれば、前記医療美容は、眉間のしわ、目じりの小じわ及び額のしわの症状の少なくとも１つの改善及び／又は治療を含む。

【0140】

方法

【0141】

本発明の第十二態様では、本発明は医療美容の方法を提供する。本発明の実施例によれば、前記方法は、被験者に薬学的に許容できる量の第一態様に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体、第五態様に記載の方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または第八態様に記載の医薬組成物を投与するステップを含む。本発明の実施例による方法は効果的に医療美容に用いられることができる。

【0142】

本発明の実施例によれば、前記医療美容はしわの除去及び／又は顔痩せを含む。

【0143】

本発明の実施例によれば、前記医療美容は、眉間のしわ、目じりの小じわ及び額のしわの症状の少なくとも１つの改善及び／又は治療を含む。

【0144】

本発明の実施例によれば、前記投与は皮下注射または筋肉注射を含む。

【0145】

本発明の第十三態様では、本発明は疾患の改善及び／又は治療方法を提供する。本発明の実施例によれば、前記方法は、被験者に薬学的に許容できる量の第一態様に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体、第五態様に記載の方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒または第八態様に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、前記疾患は、斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中から選ばれる少なくとも１つを含む。

【0146】

なお、本明細書において、「薬学的に許容できる量」は、投与様式と治療対象の疾患の重症度などに応じて変化することができ、好ましくは有効量である。薬学的に許容できる量の選択は、当業者によって様々な要素に応じて決定することができる（例えば臨床試験）。前記要素は、バイオアベイラビリティ、代謝、半減期などの前記活性成分の薬物動態パラメータ、患者が治療する疾患の重症度、患者の体重、患者の免疫状況、投与経路などを含むが、これらに限定されない。例えば、治療状況の切実な要求により、１日に何回かに分けて投与したり、投与量を比例的に減少させたりすることができる。

【0147】

本発明の実施例によれば、前記投与は皮下注射または筋肉注射を含む。

【0148】

以下、本発明の実施例を詳細に説明する。以下で説明される実施例は例示的なものであり、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明を制限するものとして理解されるべきではない。実施例に具体的な技術または条件が示されていない場合、当該分野の文献に記載されている技術または条件に従うか、製品の仕様書に従って実行する。使用される試薬または器具はメーカーが示されていない場合、すべて市場から入手できる従来の製品である。

【0149】

実施例１：野生型Ａ型ボツリヌス神経毒軽鎖タンパク質（ＢｏＮＴ／Ａ－ＬＣ）、重鎖タンパク質（ＢｏＮＴ／Ａ－ＨＣ）発現プラスミドの設計及び構築

【0150】

１、目的遺伝子の設計と合成
目的タンパク質アミノ酸配列に基づいて、目的遺伝子ヌクレオチド配列を設計し、大腸菌の嗜好コドンに基づいて最適化し、軽鎖タンパク質、重鎖タンパク質のヌクレオチド配列を決定する。設計されたヌクレオチド配列は、宝生物工程（大連）有限公司に合成を依頼し、軽鎖タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１であり、重鎖タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２であり、軽鎖タンパク質をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７であり、重鎖タンパク質をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８である。

【0151】

２、発現プラスミドの構築、目的遺伝子工学菌の取得
軽鎖、重鎖目的遺伝子の両端にそれぞれＸｂａＩとＢａｍＨＩ酵素切断部位を有し、それぞれＸｂａＩとＢａｍＨＩ二本酵素で軽鎖、重鎖目的遺伝子配列及びｐＥＴ－２８ａ（＋）ベクターを切断し、ガムを切って回収し、酵素切断後の目的遺伝子断片は酵素切断後のｐＥＴ－２８ａ（＋）の長い断片と連結し、形質転換とスクリーニングを経て、それぞれ軽鎖及び重鎖の目的タンパク質を発現する遺伝子工学菌を得る。

【0152】

実施例２：野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の調製

【0153】

１、軽鎖タンパク質、重鎖タンパク質の発現
それぞれ軽鎖、重鎖遺伝子を担持した遺伝子工学菌をＬＢ培地を入れた振とうフラスコに入れて培養し、ＯＤ₆₀₀が１．６～２．０となると、５Ｌ発酵槽に移して培養し、初期培養体積を２．５Ｌ、培養温度を３７℃、撹拌回転数を８００ｒｐｍとし、ＯＤ₆₀₀が３０に上げると誘導し始め、誘導剤をイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）とし、濃度が０．５ｍＭで、誘導時間が４～８ｈである。

【0154】

発酵液中の遺伝子工学菌体の成長を顕微鏡検査し、発現状況を観察し、タンパク質の発現が観察され、且つ誘導時間が４～８ｈ後、発酵液を集め、４℃で、１００００ｒｐｍ条件下で３０分間遠心分離し、遺伝子工学菌を集める。

【0155】

集めた遺伝子工学菌を高圧均質化破砕し、破砕圧力を７００－８００Ｂａｒ、少なくとも２サイクルとし、顕微鏡検査で完全な細胞がなくなるまで、遠心分離して封入体を集め、封入体をそれぞれ１：２０（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）超清浄水で２回洗浄し、軽鎖タンパク質（ＢｏＮＴ／Ａ－ＬＣ）、重鎖タンパク質（ＢｏＮＴ／Ａ－ＨＣ）の発現及び封入体ＳＤＳ－ＰＡＧＥ図を図１に示す。

【0156】

２、ＢｏＮＴ／Ａ－ＬＣタンパク質、ＢｏＮＴ／Ａ－ＨＣタンパク質の変性
室温で、重量比１：４でＢｏＮＴ／Ａ－ＬＣ封入体とＢｏＮＴ／Ａ－ＨＣ封入体をそれぞれ秤量し、１：２０（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）比で変性緩衝液にそれぞれ溶解し、回転数が２００ｒｐｍ条件下で撹拌し、すべて溶解するまで、６０ｍｉｎ撹拌し続ける。ここで、変性緩衝液の組成：８Ｍの尿素、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）及び２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌであり、ｐＨ値が１０．０である。

【0157】

３、ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の再生及び体外組立
等体積でステップ２で得られた溶解後の軽鎖変性産物と重鎖変性産物を混合し、変性混合液を得て、変性混合液と再生及び組立緩衝液を体積比１：１０の比で混合し、回転数が２００ｒｐｍ条件下で撹拌し続け、再生及び組立を一晩でさせ、組立液を得る。

【0158】

再生及び組立緩衝液の組成は、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＺｎＣｌ₂、０．５ｍＭのＣａＣｌ₂、５ｍＭのＧＳＨ、５ｍＭのＧＳＳＧ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０であり、ｐＨ値が１０．０である。

【0159】

少量の組立液を取ってＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、再生及び組立状況を観察し、結果を図２に示す。

【0160】

同時に、ゲル電気泳動撮像装置（ＢＩＯ－ＲＡＤ、型番：ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳ＋）Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアで目的タンパク質の含有量を走査して分析し、分析結果から、該系で得られた目的タンパク質（即ち表１中の番号４に対応するＢｏＮＴ／Ａタンパク質）の含有量は３０．２％であることが分かる。実験過程で、該再生及び組立緩衝液系の組成を最適化するために、金属イオン、酸化－還元対、系のｐＨなど、大量の成分組成及び成分濃度の探索実験を行っており、且つ、毎回の実験過程では、同じ量、同じ比のＢｏＮＴ／Ａ－ＬＣタンパク質とＢｏＮＴ／Ａ－ＨＣタンパク質を制御し、実験変数での実験結果の信頼性を確保する。実験結果を表１に示す。

【0161】

【表1-1】

【表1-2】

【0162】

４、ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の精製
ステップ３で得られた組立液（番号４の組立液）に順次疎水クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム塩析、透析、ＤＥＡＥアニオンクロマトグラフィー及びモレキュラーシーブスクロマトグラフィーの処理を行う。具体的な処理過程は以下の通りである。

【0163】

疎水クロマトグラフィー：ステップ３で得られた組立液にＮａＣｌが組立液中の最終濃度が２ｍｏｌ／Ｌになるまで４ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを添加し、ローディング原液とする。クロマトグラフィー条件：移動相Ａ１の組成が２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ＋５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ＋２．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌであり、ｐＨ値が８．５であり、移動相Ｂ１の組成が２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ＋５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡであり、ｐＨ値が８．５である。クロマトグラフィーステップ：移動相Ａ１は３つのカラム体積（ＣＶ）を平衡させ、担持量までローディングし、移動相Ａ１で６ＣＶを洗い流し、０％－１００％の移動相Ｂ１で１０ＣＶを勾配溶出し、２００ｍＡＵ以上のサンプルを集めて吸収し、疎水クロマトグラフィー溶離液を得る。
硫酸アンモニウム塩析：硫酸アンモニウムを前記疎水クロマトグラフィー溶離液に硫酸アンモニウムの飽和濃度が８０％になるまでゆっくりと添加し、４℃条件下で２０ｈ撹拌し、塩析液を得て、塩析液を４℃、１２０００ｒｐｍの条件下で遠心分離し、遠心分離時間が３０ｍｉｎであり、上澄みを捨て、沈殿を得る。
透析：沈殿、緩衝液１：１０（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）比で５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ値８．５）を取り、沈殿を溶解し、透析対象液を得る。得られた透析対象液を透析バッグ（カットオフ分子量：１００ｋＤａ）に移り、４℃条件下で、体積が透析対象液の２０倍の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ値が８．５である）と撹拌（１００ｒｐｍ）して３ｈ透析する。体積が透析対象液の２０倍の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ値８．５）と撹拌（１００ ｒｐｍ）して２４ｈ透析する。
ＤＥＡＥアニオンクロマトグラフィー：上記透析処理で得られた透析液を直接ローディングしてクロマトグラフィーを行う。移動相Ａ２の組成：２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、ｐＨ値が８．５であり、移動相Ｂ２の組成：２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ＋１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ値が８．５である。クロマトグラフィーステップ：移動相Ａ２で３ＣＶを平衡させ、担持量までローディングし、移動相Ａ２で３ＣＶを洗い流し、０％－５０％移動相Ｂ１で２０ＣＶを勾配溶出し、溶離液を得る。
Ｇ－２５Ｍモレキュラーシーブスクロマトグラフィー：ＤＥＡＥアニオンクロマトグラフィー処理で得られた溶離液を直接ローディングしてモレキュラーシーブスクロマトグラフィーを行う。移動相Ｃ：２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ、ｐＨ値が８．５であり、担持量≦３０％カラム体積／ｃｙｃｌｅであり、線形流速が３００ｃｍ／ｈである。各溶出ピークを集め、サンプルを合わせてＳＤＳ－ＰＡＧＥで純度検出を行い、ＢｏＮＴ／Ａサンプルを得て、サンプルＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動結果を図３に示し、目的タンパク質（即ち表２中の番号６に対応して調製されるＢｏＮＴ／Ａタンパク質）ＳＥＣクロマトグラフィー純度は９８．８％（図４）である。

【0164】

上記最適化された精製プロセスを取得するために、発明者らは、大量の影響要素の実験を行い、精製過程を最適化し、高純度ＢｏＮＴ／Ａサンプルを得て、精製ユニットの操作組成、精製ユニットの操作順序に重点を置いて行い、ここで、毎回実験過程では、各ユニット操作がほぼ同じ実験条件を行い、ローディング緩衝液の組成、溶出条件、ｐＨ値、充填剤担持量、ローディング流速、カラム高、カラム直径、カラム体積等を含むが、これらに限定されず、実験結果を表２に示す。

【0165】

【表2】

【0166】

実施例３：ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の構造同定

【0167】

１．完全な分子量検出
１．１ サンプル処理：１ｍｌの実施例２で調製されたＢｏＮＴ／Ａタンパク質サンプルを取り、５倍濃縮した後、均一に混合してローディングする。
１．２ ＵＰＬＣ条件：
クロマトグラフ用カラム：ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ ２．７ μｍ、２．１ｍｍ×１００ ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ ０１０９３８０９９１６８１９；カラム温：５０ ℃；検出波長：２８０ｎｍ；流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ；ローディング量：１０μｌ。
移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡ・Ｈ₂Ｏ（トリフルオロ酢酸水溶液）；移動相Ｂ：０．０５％ＴＦＡ・ＡＣＮ（トリフルオロ酢酸・アセトニトリル）。

１．３ ＭＳ条件：
イオン化方式：ＥＳＩ ｐｏｓｉｔｉｖｅ；品質走査範囲：３００～４０００ Ｄａ；キャピラリー電圧：３．０ ＫＶ；ソース温度：１００℃；テーパ孔電圧：１５０ ＫＶ；脱溶媒ガス温度：４５０℃；テーパ孔逆ブロー流速：５０ Ｌ／Ｈ；脱溶媒ガス流速：８００Ｌ／Ｈ。
１．４ データの採集と処理：Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．１ソフトウェアでデータを採集し、ＵＮＩＦＩソフトウェアでデータを分析し、分析結果を表３と図５に示す。

【0168】

【表3】

【0169】

２．還元分子量検出
２．１ サンプル処理：１５０μｌの実施例２で調製されたＢｏＮＴ／Ａタンパク質サンプルを取り、１５０μｌの７ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジンを添加し、０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ（ｐＨ値が８．０）と３μｌの１ｍｏｌ／ＬＤＴＴ、７０℃で３０ｍｉｎ恒温インキュベートし、均一に混合する。
２．２ ＵＰＬＣ条件はステップ１．２と同じである。
２．３ ＭＳ条件はステップ１．３と同じであり、その違いは、テーパ孔電圧が４０ＫＶである。
２．４ データの採集と処理：Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．１ソフトウェアでデータを採集し、ＵＮＩＦＩソフトウェアでデータを分析し、分析結果を表４と図６に示す。

【0170】

【表4】

【0171】

３．ジスルフィド結合分析
３．１ サンプル処理：１ｍｌの実施例２で調製されたＢｏＮＴ／Ａタンパク質サンプルを取り、次に、５倍の濃縮を行い、各濃縮管に３５０μｌの０．０５ ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素アンモニウムを加えて均一に混合し、１００μｌまで濃縮し、各濃縮管に４μｌの１ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液（ＩＡＭ）と３５０μｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素アンモニウムを添加して均一に混合し、１００μｌまで濃縮し、濃縮したサンプルを１８０μｌ取り、２０μｌの１％ＲａｐｉＧｅｓｔ ＳＦ表面活性剤を加え、６０℃で３０ｍｉｎ恒温インキュベートし、８μｇのトリプシンを添加し、３７ ℃で一晩恒温インキュベートし、取り出した後１μｌのギ酸を加え、３７℃で４５ｍｉｎ恒温インキュベートし、取り出した後に１３０００ ｒｐｍ条件で１０ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを取り、均一に混合して試料化する。
３．２ ＵＰＬＣ条件：
クロマトグラフ用カラム：ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ ０１４４３８０４３１８３２１；カラム温：６０℃；検出波長：２１５ｎｍ；流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ；ローディング量：１０μｌ。
移動相Ａ：０．０５％ＴＦＡ・Ｈ₂Ｏ；移動相Ｂ：０．０５％ＴＦＡ・ＡＣＮ。

３．３ ＭＳ条件：
イオン化方式：ＥＳＩ ｐｏｓｉｔｉｖｅ；品質走査範囲：１００～２０００ Ｄａ；キャピラリー電圧：３．０ＫＶ；ソース温度：１００℃；テーパ孔電圧：４０ＫＶ；脱溶媒ガス温度：４５０℃；テーパ孔逆ブロー流速：５０Ｌ／Ｈ；脱溶媒ガス流速：８００Ｌ／Ｈ。
３．４ データ採集及び処理：Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．１ソフトウェアでデータを採集し、ＵＮＩＦＩソフトウェアでデータを分析し、分析結果を表５と図７に示す。

【0172】

【表5】

【0173】

４．データ分析結果：
表３～５の分析データから分かるように、ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の完全な分子量、還元分子量及びジスルフィド結合連結は理論値と一致に保持し、精製後のＢｏＮＴ／Ａタンパク質配列が正確であり、正しい高次配座を有することを説明する。

【0174】

実施例４：ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の体内活性（毒性）の最初の測定
実験動物：ＩＣＲマウス、４～５週齢、１７～２２ｇ。
実施例２の方法で調製された異なるロットのＢｏＮＴ／Ａサンプルを試験試料として選択し、それぞれ１＃、２＃、３＃及び４＃番号付け、各試験試料の体積が０．５ｍｌであり、次に、４．５ｍｌの生理塩水を添加して１０倍の勾配で希釈し、３～４回振って均一に混合し、氷水混合物に入れる。腹腔接種方式を採用してそれぞれ４つの試験試料を４組のマウス体内に接種し、各組は５匹のマウスであり、それぞれ０．１ｍｌを接種し、３日間連続的に観察し、毎日動物の死亡状況を記録し、分析結果を表６に示す。

【0175】

【表6】

【0176】

実験結果から分かるように
所定の試験試料濃度で、各ロット試験試料（１＃、２＃、３＃、４＃）はいずれも良好な体内活性（毒性）を示し、２＃、３＃、４＃試験試料は相対的により良い体内活性（毒性）を示す。

【0177】

実施例５：ＢｏＮＴ／Ａタンパク質の毒性測定
６０匹のＩＣＲマウス（３０♂３０♀）を取り、重量を量り、体重でランダムに１０グループに分け、各グループに６匹（３♂３♀）である。実施例２の方法で調製されたＢｏＮＴ／Ａタンパク質を試験試料とし、３００ｐｇ／匹の投与量を開始量として、２倍の勾配で１０個の投与量勾配：３００、１５０、７５、３７．５、１８．７５、９．３７５、４．６８７５、２．３４３７５、１．１７１８７５及び０．５８５９３７５ｐｇ／匹を設け、投与する。各匹のマウスはグループ別にそれぞれ対応する濃度の試験試料を投与し、各匹のマウスに０．１ｍｌの実施例２の方法で調製されたＢｏＮＴ／Ａタンパク質を腹腔注射し、毎日各グループの死亡数を観察して記録し、４日間連続的に観察する。ｇｒａｐｈｐａｄ２６で、変換後の投与量対数と死亡率でｌｏｇｓｔｉｃ回帰フィッティングし、ＬＤ₅₀値を計算する。結果から示すように、試験試料のＬＤ₅₀は４．０２３ｐｇ／匹であり、換算したサンプル毒性は１．０６×１０⁸ＬＤ₅₀／ｍｇであり、分析結果を表７に参照する。

【0178】

【表7】

【0179】

実施例６：発現Ａ型ボツリヌス神経毒変異体１の軽鎖変異体、重鎖変異体の遺伝子工学菌の構築
Ａ型ボツリヌス神経毒変異体１の軽鎖変異体をコードするヌクレオチド配列（アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３であり、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９である）と重鎖変異体をコードするヌクレオチド配列（アミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４であり、ヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０である）の両端にＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ酵素切断部位をそれぞれ添加し、配列を宝生物工程（大連）有限公司に合成を依頼し、それぞれ軽鎖変異体と重鎖変異体の目的遺伝子ヌクレオチド配列を取得する。

【0180】

軽鎖変異体と重鎖変異体の目的遺伝子ヌクレオチド配列をそれぞれＸｂａＩとＢａｍＨＩで二本酵素切断し、ベクターｐＥＴ－５ａ（＋）を同様にそれぞれＸｂａＩとＢａｍＨＩで二本酵素切断し、目的遺伝子及びベクターを二本酵素切断した後に得られた目的断片を糊切りして回収する。それぞれ軽鎖変異体と重鎖変異体の二本酵素切断片とベクターの二本酵素切断片を連結し、連結系は、形質転換、目的タンパク質のスクリーニングクローニング及びプラスミド酵素の切断検証を経て、最終的にそれぞれＡ型ボツリヌス神経毒軽鎖変異体タンパク質及び重鎖変異体タンパク質を発現する遺伝子工学菌を得る。ここで、軽鎖変異体タンパク質と重鎖変異体タンパク質の遺伝子工学菌プラスミド検証は、図８に示すように、左図は軽鎖変異体プラスミド二本酵素切断アガロースゲル電気泳動であり、右図は重鎖変異体プラスミド二本酵素切断アガロースゲル電気泳動である。

【0181】

ここで、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体１軽鎖変異体をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９：
ＡＴＧＣＣＧＴＴＴＧＴＧＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＴＧＣＧＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＧＡＡＣＧＣＧＧＧＴＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣＧＧＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴＴＣＣＧＧＡＡＣＧＣＧＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＡＣＣＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＧＴＧＣＧＣＧＧＣＡＴＴＣＣＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＧＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＧＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧＣＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＣＣＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＣＧＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧＴＡＴＡＴＴＣＧＣＴＴＴＡＧＣＣＣＧＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡＡＡＴＴＴＧＣＧＡＣＣＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＡＣＣＧＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＧＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＴＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧＣＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＡＴＴＴＡＧＣＧＴＧＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＡＴＴＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＡＣＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＴＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡＴＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＴＡＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＣＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＴＣＧＣＧＧＣＡＴＣＡＴＴＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）であり、
Ａ型ボツリヌス神経毒変異体１重鎖変異体をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０：
ＡＴＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＡＡＴＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＣＣＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＣＧＡＧＣＧＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＡＧＴＡＴＴＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＡＣＡＴＴＧＡＡＣＧＣＴＴＴＣＣＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＡＴＴＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＡＧＣＧＧＣＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＴＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＣＧＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＴＴＧＣＧＧＡＴＡＴＴＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＴＴＣＣＧＴＡＴＡＴＴＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＣＣＧＧＡＡＡＴＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＴＧＣＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＧＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＣＧＣＡＧＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＴＴＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＡＴＡＡＴＣＡＧＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＡＧＧＣＡＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＡＴＴＣＣＧＴＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＡＣＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＡＴＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＧＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＣＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＴＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＡＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＡＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＴＴＣＣＧＡＡＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＧＡＡＴＡＴＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＧＧＣＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＡＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＣＡＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＣＣＧＣＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＴＡＣＧＣＡＴＣＧＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＴＡＴＧＡＴＡＡＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＧＡＴＴＡＴＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＡＣＣＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＧＧＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＴＴＡＴＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＴＣＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴＴＧＴＧＣＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＴＴＡＡＣＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＧＧＣＧＡＣＣＡＡＣＧＣＧＡＧＣＣＡＡＧＣＧＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＴＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＡＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）である。

【0182】

実施例７：Ａ型ボツリヌス神経毒変異体１の調製
それぞれ実施例６で調製される発現軽鎖変異体タンパク質の遺伝子工学菌を培養し、発酵発現、再生、体外組立及び精製によりＡ型ボツリヌス神経毒変異体１（本実施例においてＡ型ボツリヌス神経毒変異体タンパク質１、または変異体１とも呼ばれる）を取得し、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒と比較して、変異体１の変異部位はＣ１３４Ｇ、Ｃ１６５Ｐ、Ｃ７９１Ａ、Ｃ９６７Ａ及びＣ１０６０Ｅであり、具体的なステップは以下の通りである。

【0183】

（１）軽鎖変異体タンパク質、重鎖変異体タンパク質の発酵発現
実施例６で調製された軽鎖変異体タンパク質と重鎖変異体タンパク質を発現する遺伝子工学菌を、それぞれＬＢ培地を入れた振とうフラスコに接種して培養し、ＯＤ₆₀₀が１．６－２．０になると、５Ｌ発酵槽に移して培養し、開始培養体積が２．５Ｌであり、培養温度が３７℃であり、撹拌回転数が８００ｒｐｍであり、ＯＤ₆₀₀が３０になると、誘導し始め、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を誘導剤として選択して誘導し、濃度が０．５ｍＭであり、誘導時間が４～８ｈである。

【0184】

発酵液中の遺伝子工学菌体の成長を顕微鏡検査し、発現状況を観察し、タンパク質の発現が観察され、且つ誘導時間が４～８ｈ後、発酵培養を終了し、発酵液を集め、回転数１００００ｒｐｍ、４℃の条件下で遠心分離し、菌体を集める。光学顕微鏡で採集した菌体を観察し、菌体形態が典型的な大腸菌形態であるかどうか、及び他の微生物の汚染がないかどうかを決定する。

【0185】

集めた菌体を高圧均質化破砕し、破砕圧力を７００－８００Ｂａｒ、少なくとも２サイクルとし、顕微鏡検査で完全な細胞がなくなるまで、遠心分離して封入体を集め、封入体をそれぞれ１：２０（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）超清浄水で２回洗浄し、軽鎖変異体封入体タンパク質（軽鎖変異体封入体と略称）、重鎖変異体封入体タンパク質（重鎖変異体封入体と略称）を得る。

【0186】

（２）軽鎖変異体タンパク質、重鎖変異体タンパク質の変性
室温で、軽鎖変異体封入体と重鎖変異体封入体の重量比を１：４（ｇ／ｇ）の比で、それぞれ秤量し、次に、軽鎖変異体封入体または重鎖変異体封入体と変性緩衝液の重量体積比が１：２０（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）の比で、それぞれ軽鎖変異体封入体または重鎖変異体封入体をそれぞれｐＨ値が１０．０の変性緩衝液（８Ｍ尿素と１０ｍＭ ＤＴＴの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ）に溶解し、全部溶解するまで、回転数が２００ｒｐｍで撹拌して、変性液（即ち軽鎖変異体変性産物または重鎖変異体変性産物である）を得る。

【0187】

（３）軽鎖変異体タンパク質、重鎖変異体タンパク質の再生と体外組立
等体積でステップ（２）で得られた溶解後の軽鎖変異体変性産物と重鎖変異体変性産物を混合して、変性混合液を得て、変性混合液と再生及び組立緩衝液を体積比１：１０の比で混合し、続いて、回転数が２００ｒｐｍ条件下で撹拌し、一晩で再生及び組立を行い、組立液を得る。
再生及び組立緩衝液の組成は、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＺｎＣｌ₂、０．５ｍＭのＣａＣｌ₂、５ｍＭのＧＳＨ、５ｍＭのＧＳＳＧ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び０．５％Ｔｗｅｅｎ－２０であり、ｐＨ値が１０．０である。

【0188】

少量の組立液を体積倍比５：１（ｍｌ／ｍｌ）で濃縮し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で組立状況を観察し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動が単一の１５０ＫＤの目的バンドを呈するようになったら、組立を停止し、下流に進んで精製する。

【0189】

（４）Ａ型ボツリヌス神経毒変異体タンパク質の精製
順次疎水クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム塩析、透析、ＤＥＡＥアニオンクロマトグラフィー、モレキュラーシーブスクロマトグラフィーを行い、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体１を得る。
疎水クロマトグラフィー：ＮａＣｌの最終濃度が２ｍｏｌ／Ｌになるまで、上記体外組立液に４ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを添加し、ローディング原液となる。移動相Ａで３ＣＶを平衡させ、担持量までローディングし、移動相Ａで６ＣＶを洗い流し、０％Ｂ－１００％Ｂの１０ＣＶ勾配で溶出し、
移動相Ａ：２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ＋５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ＋２．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌであり、ｐＨ値が８．５であり、
移動相Ｂ：２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ＋５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡであり、ｐＨ８．５である。
硫酸アンモニウム塩析：硫酸アンモニウム飽和濃度８０％で適量な硫酸アンモニウムを秤量して疎水クロマトグラフィー溶離液に添加し、硫酸アンモニウムが全部溶解するまで撹拌し、冷蔵庫に２－８℃で放置し、２４ｈ持続的に撹拌し、回転数が１００ｒｐｍで撹拌する。４℃、１２０００ｒｐｍ条件下で３０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を分離する。
透析：沈殿、緩衝液の１：１０比（ｗ／ｖ、ｇ／ｍｌ）で、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ値が８．５である）で沈殿を溶解した後、透析バッグ（カットオフ分子量：１００ｋＤａ）に移り、４℃で、透析対象液の２０倍体積の５０ｍＭのｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（２５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ値が８．５である）と撹拌（１００ｒｐｍ）して３時間透析する。さらに透析対象液の２０倍体積の５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ値が８．５である）と撹拌（１００ ｒｐｍ）して２４時間透析する。
ＤＥＡＥアニオンクロマトグラフィー：上記透析液にローディングクロマトグラフィーを直接行い、
移動相Ａ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓであり、ｐＨ値が８．５であり、
移動相Ｂ：２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ＋１．０ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌであり、ｐＨ値が８．５であり、
クロマトグラフィーステップ：Ａで３ＣＶを平衡させ、担持量までローディングし、Ａで３ＣＶを洗い流し、０％Ｂ－５０％Ｂの２０ＣＶを勾配で溶出する。
Ｇ－２５Ｍモレキュラーシーブスクロマトグラフィー：ＤＥＡＥアニオンクロマトグラフィー溶離液を直接ローディングしてモレキュラーシーブスクロマトグラフィーを行い、
移動相：２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓであり、ｐＨ値が８．５であり、担持量≦３０％カラム体積／ｃｙｃｌｅ、線形流速３００ｃｍ／ｈとし、
各溶出ピークを集め、サンプルを合わせてＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動を行い、純度検出を行い、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体１を得る。

【0190】

実施例８：Ａ型ボツリヌス神経毒変異体１の構造同定
１、完全な分子量検出
サンプル処理：１ｍｌの実施例７で調製されたＡ型ボツリヌス神経毒変異体１サンプルを取り、５倍濃縮した後、均一に混合してローディングする。
ＵＰＬＣ条件：
クロマトグラフ用カラム：ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ ２．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ ０１０９３８０９９１６８１９；カラム温：５０℃；検出波長：２８０ｎｍ；流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ；ローディング量：１０μｌ。

ＭＳ条件：
イオン化方式：ＥＳＩ ｐｏｓｉｔｉｖｅ；品質走査範囲：３００～４０００Ｄａ；キャピラリー電圧：３．０ＫＶ；ソース温度：１００℃；テーパ孔電圧：１５０ＫＶ；脱溶媒ガス温度：４５０℃；テーパ孔逆ブロー流速：５０Ｌ／Ｈ；脱溶媒ガス流速：８００Ｌ／Ｈ；
データ採集と処理：Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．１ソフトウェアでデータを採集し、ＵＮＩＦＩソフトウェアでデータを分析する。完全な分子量データ分析を表８に示す。

【0191】

【表8】

【0192】

２、還元分子量の検出
サンプル処理：１５０μｌの実施例７で調製されたＡ型ボツリヌス神経毒変異体１サンプルを取り、１５０μｌの７ｍｏｌ／Ｌ塩酸グアニジン／０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ（ｐＨ値が８．０である）と３μｌの１ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴを添加し、７０℃で３０ｍｉｎ恒温インキュベートし、均一に混合する。
ＵＰＬＣ条件：
クロマトグラフ用カラム：ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ ２．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ ０１０９３８０９９１６８１９；カラム温：５０℃；検出波長：２８０ｎｍ；流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ；ローディング量：１０μｌ；

ＭＳ条件：
イオン化方式：ＥＳＩ ｐｏｓｉｔｉｖｅ；品質走査範囲：３００～４０００Ｄａ；キャピラリー電圧：３．０ＫＶ；ソース温度：１００℃；テーパ孔電圧：４０ＫＶ；脱溶媒ガス温度：４５０℃；テーパ孔逆ブロー流速：５０Ｌ／Ｈ；脱溶媒ガス流速：８００Ｌ／Ｈ；
データ採集と処理：Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．１ソフトウェアでデータを採集し、ＵＮＩＦＩソフトウェアでデータを分析する。還元分子量データ分析を表９に示す。

【0193】

【表9】

【0194】

３、ジスルフィド結合分析
サンプル処理：１ｍｌの実施例７で調製されたＡ型ボツリヌス神経毒変異体１サンプルを取って５倍濃縮を行い、各濃縮管内に３５０μｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素アンモニウムを添加して均一に混合し、１００μｌまで濃縮し、各濃縮管に４μｌの１ｍｏｌ／Ｌヨードアセトアミド溶液（ＩＡＭ）と３５０μｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌ炭酸水素アンモニウムを添加して均一に混合し、１００μｌまで濃縮し、濃縮後のサンプルを１８０μｌ取り、２０μｌの１％ＲａｐｉＧｅｓｔ ＳＦを添加し、６０℃で３０ｍｉｎ恒温インキュベートし、さらに８μｇのトリプシンを添加し、３７℃で一晩で恒温インキュベートし、取り出し、１μｌのギ酸を添加し、３７℃で４５ｍｉｎ恒温インキュベートし、取り出し、１３０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを取って均一に混合し試料化する。
ＵＰＬＣ条件：
クロマトグラフ用カラム：ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ ０１４４３８０４３１８３２１；カラム温：６０℃；検出波長：２１５ｎｍ；流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ；ローディング量：１０μｌ；

ＭＳ条件：
イオン化方式：ＥＳＩ ｐｏｓｉｔｉｖｅ；品質走査範囲：１００～２０００Ｄａ；キャピラリー電圧：３．０ＫＶ；ソース温度：１００℃；テーパ孔電圧：４０ＫＶ；脱溶媒ガス温度：４５０℃；テーパ孔逆ブロー流速：５０Ｌ／Ｈ；脱溶媒ガス流速：８００Ｌ／Ｈ；
野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の構造同定：構造同定の内容及び方法は本実施例３（野生型Ａ型ボツリヌス神経毒サンプルの調製、具体的な調製方法は実施例１と実施例２を参照する）と同様である。
データ採集と処理：Ｍａｓｓｌｙｎｘ Ｖ４．１ソフトウェアでデータを採集し、ＵＮＩＦＩソフトウェアでデータを分析する。具体的な結果を表１０と表１１に示し、表１０は野生型Ａ型ボツリヌス神経毒サンプルの検出結果であり、表１１は実施例７で調製されたＡ型ボツリヌス神経毒変異体１サンプルの検出結果であり、Ｃ₁－Ｃ₉の位置は具体的に図９を参照し、Ｃ_nは野生型Ａ型ボツリヌス神経毒配列中のＮ末端からＣ末端までの第ｎ個のシステインを示し、Ｃ₁は第１個のシステインであり、Ｃ₂は第２個のシステイン……であり、Ｃ₉は第９個のシステインである。

【0195】

【表10】

【0196】

【表11】

【0197】

以上から分かるように、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体１ジスルフィド結合連結の正確率は１００．００％であり、ジスルフィド結合のミスマッチがない。野生型Ａ型ボツリヌス神経毒ジスルフィド結合の連結正確率は９４．８０％であり、５．２０％のミスマッチがあり、Ｃ₃＝Ｃ₈のミスマッチ率は０．６７％であり、Ｃ₃＝Ｃ₉のミスマッチ率は０．２３％である。このため、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒と比べて、本発明のＡ型ボツリヌス神経毒変異体１ジスルフィド結合のミスマッチ率は大幅に低下し、且つＣ₃＝Ｃ₈とＣ₃＝Ｃ₉のミスマッチがない。

【0198】

実施例９：Ａ型ボツリヌス神経毒変異体２の調製及びジスルフィド結合の構造同定
Ａ型ボツリヌス神経毒変異体２（変異体２と略称）の調製について、具体的な調製方法は、実施例６と実施例７を参照し、構造同定内容及び方法について、実施例８を参照し、その違いは、変異体２のアミノ酸配列が異なる（野生型Ａ型ボツリヌス神経毒と比較して、変異体２の変異部位はＣ１３４Ｇ、Ｃ１６５Ｇ、Ｃ７９１Ａ、Ｃ９６７Ａ及びＣ１０６０Ｇである）ことであり、それに対応して、変異体２の軽鎖変異体のアミノ酸配列とヌクレオチド配列（アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５で、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１である）及び重鎖変異体のアミノ酸配列とヌクレオチド配列（アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２である）である。Ａ型ボツリヌス神経毒変異体２ジスルフィド結合を検出して、具体的な検出方法について、実施例８を参照し、検出データを表１２に示す。

【0199】

【表12】

ここで、Ａ型ボツリヌス神経毒変異体２軽鎖変異体をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１：
ＡＴＧＣＣＧＴＴＴＧＴＧＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴＴＡＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＣＣＧＧＴＧＡＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＴＡＴＴＧＣＧＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＴＴＣＣＧＡＡＣＧＣＧＧＧＴＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣＧＧＴＧＡＡＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＡＡＡＡＴＴＴＧＧＧＴＧＡＴＴＣＣＧＧＡＡＣＧＣＧＡＴＡＣＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＣＴＧＡＡＣＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣＧＧＴＧＡＧＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＣＧＴＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＴＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴＴＡＴＡＧＣＡＣＣＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＴＧＴＧＣＧＣＧＧＣＡＴＴＣＣＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＴＧＡＴＡＣＣＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＴＧＡＴＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＧＧＴＡＴＴＡＡＣＧＴＧＡＴＴＣＡＧＣＣＧＧＡＴＧＧＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＴＧＧＣＣＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＧＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧＣＣＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＣＣＧＣＡＡＣＧＧＣＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＧＣＡＧＴＡＴＡＴＴＣＧＣＴＴＴＡＧＣＣＣＧＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＡＣＣＡＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＧＣＧＧＧＣＡＡＡＴＴＴＧＣＧＡＣＣＧＡＴＣＣＧＧＣＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＧＣＡＴＧＡＡＣＴＧＡＴＴＣＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＴＴＧＣＧＡＴＴＡＡＣＣＣＧＡＡＣＣＧＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＣＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＧＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＴＡＧＣＣＴＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧＣＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＧＣＧＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＣＧＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＡＴＴＴＡＧＣＧＴＧＧＡＴＡＡＡＣＴＧＡＡＡＴＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＡＡＴＴＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＡＣＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＴＡＴＣＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＧＣＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡＴＴＧＴＧＣＣＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＴＡＴＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＴＡＡＣＣＴＧＣＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＣＧＧＴＣＡＧＡＡＣＡＣＣＧＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＧＣＣＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴＴＴＡＴＡＡＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＧＴＴＣＧＣＧＧＣＡＴＣＡＴＴＡＣＧＡＧＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＡＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＣＡＡＡＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）であり、
Ａ型ボツリヌス神経毒変異体２重鎖変異体をコードするヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２：
ＡＴＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＴＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＡＡＴＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＣＣＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＧＡＴＣＴＧＡＡＣＡＡＡＧＧＣＧＡＡＧＡＡＡＴＴＡＣＧＡＧＣＧＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＴＴＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＴＡＴＣＴＧＡＣＣＴＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＧＡＡＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＴＴＡＧＴＡＴＴＧＡＡＡＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＡＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＧＣＣＧＡＡＣＡＴＴＧＡＡＣＧＣＴＴＴＣＣＧＡＡＣＧＧＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＴＧＣＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡＡＡＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＴＧＡＡＣＧＡＡＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＣＣＣＧＡＧＣＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＡＧＣＡＧＣＧＡＴＴＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＣＣＧＡＡＧＣＧＧＣＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧＧＣＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＴＡＴＧＡＴＴＴＴＡＣＣＧＡＴＧＡＧＡＣＧＡＧＣＧＡＡＧＴＧＡＧＴＡＣＣＡＣＣＧＡＴＡＡＡＡＴＴＧＣＧＧＡＴＡＴＴＡＣＣＡＴＴＡＴＣＡＴＴＣＣＧＴＡＴＡＴＴＧＧＣＣＣＧＧＣＧＣＴＧＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＴＡＴＡＡＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＴＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＡＴＴＴＴＴＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＴＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＣＣＧＧＡＡＡＴＣＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＴＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＡＴＡＴＴＧＣＧＡＡＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＡＧＡＣＣＡＴＴＧＡＴＡＡＣＧＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＧＡＡＧＴＧＴＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴＧＴＧＡＣＣＡＡＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＡＡＡＧＴＧＡＡＣＡＣＧＣＡＧＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡＴＴＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＡＡＧＧＣＧＡＴＴＡＴＴＡＡＣＴＡＴＣＡＧＴＡＴＡＡＴＣＡＧＴＡＴＡＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＴＴＡＡＣＡＡＡＧＣＧＡＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴＴＡＡＣＡＡＧＴＴＴＣＴＧＡＡＴＣＡＧＧＣＡＡＧＣＧＴＧＡＧＣＴＡＴＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＴＧＡＴＴＣＣＧＴＡＴＧＧＣＧＴＧＡＡＡＣＧＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＧＡＴＡＡＣＣＧＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＴＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＧＡＴＣＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＴＡＡＡＧＴＴＡＡＴＡＡＣＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＴＡＴＴＣＣＧＴＴＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＡＡＴＣＡＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣＴＴＴＡＣＣＧＡＡＴＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＡＣＡＣＧＡＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＣＴＡＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＴＣＴＧＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＡＡＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＡＡＧＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＴＣＣＧＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＡＣＧＣＧＡＴＴＧＴＧＴＡＴＡＡＣＡＧＣＡＴＧＴＡＴＧＡＡＡＡＣＴＴＴＡＧＣＡＣＧＡＧＣＴＴＴＴＧＧＡＴＴＣＧＣＡＴＴＣＣＧＡＡＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＡＣＧＡＡＴＡＴＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＧＧＣＧＡＡＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＣＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＡＧＣＧＣＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＡＡＴＡＴＡＧＴＣＡＧＡＴＧＡＴＴＡＡＣＡＴＴＡＧＣＧＡＴＴＡＴＡＴＴＡＡＣＣＧＣＴＧＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＣＣＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＴＣＴＧＡＡＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＡＴＴＧＡＴＣＡＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＴＣＡＴＧＣＧＡＧＣＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＴＧＴＴＴＡＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧＣＧＧＴＣＧＣＧＡＴＡＣＧＣＡＴＣＧＣＴＡＴＡＴＣＴＧＧＡＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴＧＴＡＴＧＡＴＡＡＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＴＴＧＧＧＧＣＧＡＴＴＡＴＣＴＧＣＡＧＴＡＴＧＡＴＡＡＡＣＣＧＴＡＴＴＡＴＡＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＴＡＴＧＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＧＣＧＧＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＣＴＧＡＡＡＧＧＣＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＴＴＡＴＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＴＡＴＣＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＡＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＡＡＡＧＡＴＡＡＣＡＴＴＧＴＧＣＧＣＡＡＣＡＡＣＧＡＴＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＴＴＡＡＣＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＧＧＣＧＡＣＣＡＡＣＧＣＧＡＧＣＣＡＡＧＣＧＧＧＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＧＣＧＣＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＡＡＧＴＧＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＴＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＡＣＡＡＣＧＧＣＡＡＣＧＡＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＡＡＣＡＡＣＡＴＴＧＣＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＧＣＧＡＧＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＡＡＣＣＧＴＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＡＴＴＴＡＴＴＣＣＧＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧＡＡＣＧＣＣＣＧＣＴＧＴＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）である。

【0200】

実施例１０：Ａ型ボツリヌス神経毒変異体タンパク質の活性測定
試験試料：
実施例７で調製されたＡ型ボツリヌス神経毒変異体１、実施例９で調製されたＡ型ボツリヌス神経毒変異体２及び実施例２の番号６で調製された野生型Ａ型ボツリヌス神経毒。

【0201】

実験設計及びグループ分け投与
１６２匹のマウスは適応飼育が終わった後、それぞれ５４匹を３つの測定対象の試験試料のテストに用い、投与後にマウスの毒性反応と各グループの動物の死亡状況をよく観察し、４日間連続した。

【0202】

実験前に、実験マウスの体重を称量し、体重に応じて平均に各グループに分配し、各グループの動物の体重の平均値に統計学的な差がないことを保証した。各実験は９グループに分け、各グループは６匹で、雌雄は半々である。腹腔注射で試験試料を投与し、１人は試験試料溶液を抽出し、もう１人は照合し、１人は動物を保定し、もう１人は動物の投与操作を完了した後、各グループの注射が完了した後に投与時間を記録する。試験試料であるＡ型ボツリヌス神経毒変異体１のグループ別、投与量情報を表１３に示す。

【0203】

【表13】

【0204】

上記表１３に示すように、５０％の累積死亡率は４５．４５４５５％－８３．３３３３３％の間に位置する。
本実験条件下で、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法に従って計算して試験試料であるＡ型ボツリヌス神経毒変異体１のＬＤ₅₀は１．７６３８１ｐｇ／匹であり、換算したサンプル毒性は５．６７×１０⁸ ＬＤ₅₀／ｍｇである。

【0205】

同じ実験条件下で、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法に従って計算して試験試料であるＡ型ボツリヌス神経毒変異体２のＬＤ₅₀は３．０７７０ｐｇ／匹であり、換算したサンプル毒性は３．２５×１０⁸ ＬＤ₅₀／ｍｇである。

【0206】

同じ実験条件下で、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法に従って計算して試験試料である野生型Ａ型ボツリヌス神経毒のＬＤ₅₀は４．５６６２ｐｇ／匹であり、換算したサンプル毒性は２．１９×１０⁸ ＬＤ₅₀／ｍｇである。
３つの異なる試験試料の毒性の比較を表１４に示す。

【0207】

【表14】

【0208】

上表１４から分かるように、本発明のＡ型ボツリヌス神経毒変異体１は、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒と比較して、より高い生物学活性（毒性）を有し、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒毒性の２．６倍である。

【0209】

本発明の実施例を提示し記述したが、上記実施例は例示的なものであり、本発明を制限するためのものとして理解することができなく、当業者であれば、本発明の範囲で上記実施例について様々な変化、修正、置換および変形が可能であることが理解できる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

2024535057000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-03-15

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ａ型ボツリヌス神経毒変異体であって、
第１のペプチドセグメントと第２のペプチドセグメントを含み、前記第１のペプチドセグメントは前記第２のペプチドセグメントに鎖間ジスルフィド結合で結合され、
前記第１のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、１３４位及び／又は１６５位の変異を有し、及び／又は
前記第２のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、７９１位、９６７位及び１０６０位の変異部位の少なくとも１つを有する、ことを特徴とするＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項2】

前記鎖間ジスルフィド結合は前記第１のペプチドセグメント中の４３０位のシステインと前記第２のペプチドセグメント中の４５４位のシステインにより形成される、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項3】

前記第１のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、１３４位と１６５位の変異を有し、及び／又は
前記第２のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、７９１位、９６７位及び１０６０位の変異を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項4】

前記１３４位、１６５位、７９１位、９６７位または１０６０位のシステイン変異は、
Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｅ及びＰのアミノ酸の中の１つである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項5】

前記第１のペプチドセグメントの１３４位のＣ変異はＧ、ＡまたはＳである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項6】

前記第１のペプチドセグメントの１６５位のＣ変異はＧ、Ａ、ＰまたはＳである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項7】

前記第２のペプチドセグメントの７９１位のＣ変異はＧ、ＡまたはＳである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項8】

前記第２のペプチドセグメントの９６７位のＣ変異はＧ、ＡまたはＳである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項9】

前記第２のペプチドセグメントの１０６０位のＣ変異はＧ、Ａ、ＥまたはＳである、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項10】

前記第１のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の軽鎖と比較して、Ｃ１３４ＧとＣ１６５Ｐの変異を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項11】

前記第２のペプチドセグメントは、野生型Ａ型ボツリヌス神経毒の重鎖と比較して、Ｃ７９１Ａ、Ｃ９６７Ａ及びＣ１０６０Ｅの変異を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項12】

前記第１のペプチドセグメントはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３または５に示すアミノ酸配列を有し、または
前記第２のペプチドセグメントはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４または６に示すアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項13】

前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列を有する第１のペプチドセグメントとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列を有する第２のペプチドセグメントを含み、または
前記Ａ型ボツリヌス神経毒変異体はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列を有する第１のペプチドセグメントとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列を有する第２のペプチドセグメントを含む、ことを特徴とする請求項１に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体。

【請求項14】

核酸分子であって、前記核酸分子は、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体中の第１のペプチドセグメント及び／又は第２のペプチドセグメントをコードする、ことを特徴とする核酸分子。

【請求項15】

前記核酸分子はＤＮＡである、ことを特徴とする請求項１４に記載の核酸分子。

【請求項16】

請求項１４に記載の核酸分子を担持する、ことを特徴とする発現ベクター。

【請求項17】

前記発現ベクターは、プラスミド発現ベクターである、ことを特徴とする請求項１６に記載の発現ベクター。

【請求項18】

遺伝子工学菌であって、
請求項１６に記載の発現ベクターを担持する、ことを特徴とする遺伝子工学菌。

【請求項19】

前記遺伝子工学菌は請求項１６に記載の発現ベクターを宿主菌に形質転換することによって得られる、ことを特徴とする請求項１８に記載の遺伝子工学菌。

【請求項20】

前記宿主菌は大腸菌である、ことを特徴とする請求項１９に記載の遺伝子工学菌。

【請求項21】

遺伝子組換えによるＡ型ボツリヌス神経毒の調製方法であって、
軽鎖タンパク質を第１の変性処理し、第１の変性産物を得るステップと、
重鎖タンパク質を第２の変性処理し、第２の変性産物を得るステップと、
前記第１の変性産物と前記第２の変性産物を再生及び組立処理し、前記Ａ型ボツリヌス神経毒を得るステップと、を含む、ことを特徴とする遺伝子組換えによるＡ型ボツリヌス神経毒の調製方法。

【請求項22】

前記軽鎖タンパク質は、請求項１～１３のいずれか１項に記載の第１のペプチドセグメントまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列を有し、及び／又は
前記重鎖タンパク質は、請求項１～１３のいずれか１項に記載の第２のペプチドセグメントまたはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項２１に記載の調製方法。

【請求項23】

前記軽鎖タンパク質または重鎖タンパク質は、
前記軽鎖タンパク質または重鎖タンパク質をコードする遺伝子を担持するプラスミドを大腸菌に形質転換することと、
前記プラスミドにより形質転換された大腸菌にタンパク質の発現に適する条件下で培養、誘導、遠心分離菌体採取、菌体破砕、遠心分離産物破砕を行い、前記軽鎖タンパク質または重鎖タンパク質を取得することとにより得られる、ことを特徴とする請求項２２に記載の調製方法。

【請求項24】

前記第１の変性処理と前記第２の変性処理は変性緩衝液中で行い、前記変性緩衝液は、
５～１０Ｍの尿素、５～１５ｍＭのジチオスレイトール及び１０～３０ｍＭのＴｒｉｓまたはＴｒｉｓ－ＨＣｌを含み、
任意選択に、前記変性緩衝液のｐＨ値は９．５～１０．５である、ことを特徴とする請求項２３に記載の調製方法。

【請求項25】

前記再生及び組立処理を行う前に、予め前記第１の変性産物と前記第２の変性産物を混合処理して、変性混合液を得る、ことを特徴とする請求項２１に記載の調製方法。

【請求項26】

前記混合処理では前記第１の変性産物と前記第２の変性産物の体積比は１：（１～１０）である、ことを特徴とする請求項２５に記載の調製方法。

【請求項27】

前記変性混合液と再生及び組立緩衝液との体積比は１：（１～１０）である、ことを特徴とする請求項２５に記載の調製方法。

【請求項28】

前記再生及び組立処理は再生及び組立緩衝液中で行われ、前記再生及び組立緩衝液は、
５０～１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１～１．０ｍＭのＺｎＣｌ₂、０．１～１．０ｍＭのＣａＣｌ₂、１．０～１０．０ｍＭの還元型グルタチオン、１．０～１０．０ｍＭの酸化性グルタチオン、４０～５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ及び０．４～０．６％のトウェイン２０を含む、ことを特徴とする請求項２１に記載の調製方法。

【請求項29】

前記再生及び組立緩衝液のｐＨ値は９．５～１０．５である、ことを特徴とする請求項２８に記載の調製方法。

【請求項30】

前記再生及び組立処理の処理時間は１２～１６ｈである、ことを特徴とする請求項２８に記載の調製方法。

【請求項31】

前記再生及び組立処理の撹拌回転数は５０～２００ｒｐｍである、ことを特徴とする請求項２８に記載の調製方法。

【請求項32】

前記再生及び組立処理で得られた組立液に順次疎水クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム塩析、透析、アニオンクロマトグラフィー及びモレキュラーシーブスクロマトグラフィー処理を行い、前記Ａ型ボツリヌス神経毒を得るステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項２１に記載の調製方法。

【請求項33】

前記疎水クロマトグラフィー処理の移動相Ａ１は、１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２～８ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ及び１～３ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含み、移動相Ｂ１は、１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌと２～８ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡを含み、前記移動相Ａ１と移動相Ｂ１のｐＨ値はいずれも８．０～９．０である、ことを特徴とする請求項３２に記載の調製方法。

【請求項34】

前記硫酸アンモニウム塩析処理は、
硫酸アンモニウムと前記疎水クロマトグラフィー処理で得られた溶離液を２～８℃条件下で１２～２４ｈ混合してから、混合産物を２～８℃、１００００～１５０００ｒｐｍの条件下で２０～４０ｍｉｎ遠心分離処理し、沈殿物を得ることを含む、ことを特徴とする請求項３２に記載の調製方法。

【請求項35】

前記透析処理は、
前記沈殿物を第１の緩衝液に溶解し、透析対象液を得ることと、
前記透析対象液と第１の透析液を第１の透析処理することと、
得られた第１の透析処理産物と第２の透析液を第２の透析処理することとを含み、
第１の緩衝液は、４０～６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液から選ばれ、第１の透析液は、４０～６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ塩含有透析液から選ばれ、第２の透析液は４０～６０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ透析液から選ばれる、ことを特徴とする請求項３４に記載の調製方法。

【請求項36】

前記沈殿物の重量ｇと前記第１の緩衝液との体積ｍｌ比は１：（５～１５）である、ことを特徴とする請求項３５に記載の調製方法。

【請求項37】

前記第１の透析処理の透析時間は２～５ｈであり、前記第２の透析処理の透析時間は１２～２４ｈである、ことを特徴とする請求項３５に記載の調製方法。

【請求項38】

前記Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ塩含有透析液は２００～３００ｍＭのＮａＣｌをさらに含む、ことを特徴とする請求項３５に記載の調製方法。

【請求項39】

前記第１の透析処理と前記第２の透析処理の透析バッグのカットオフ分子量は８０～１２０ｋＤａである、ことを特徴とする請求項３５に記載の調製方法。

【請求項40】

前記アニオンクロマトグラフィー処理はＤＥＡＥセルロースアニオンクロマトグラフィーから選ばれる、ことを特徴とする請求項３２に記載の調製方法。

【請求項41】

前記ＤＥＡＥセルロースアニオンクロマトグラフィーの移動相Ａ２は１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓを含み、移動相Ｂ２は１０～３０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓと０．５～１．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含み、前記移動相Ａ２と移動相Ｂ２のｐＨ値は８．０～９．０である、ことを特徴とする請求項３２に記載の調製方法。

【請求項42】

前記モレキュラーシーブスクロマトグラフィー処理にはＧ－２５Ｍモレキュラーシーブスクロマトグラフィーを採用する、ことを特徴とする請求項３２に記載の調製方法。

【請求項43】

請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体または請求項２１、２５～４２のいずれか１項に記載の方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒を含む、ことを特徴とする医薬組成物。

【請求項44】

薬学的に許容できる補助剤をさらに含む、ことを特徴とする請求項４３に記載の医薬組成物。

【請求項45】

前記薬学的に許容できる補助剤は、緩衝液、保護剤、活性剤及び賦形剤の中から選ばれる少なくとも１つを含む、ことを特徴とする請求項４４に記載の医薬組成物。

【請求項46】

請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体、または請求項２１、２５～４２のいずれか１項に記載の調製方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒を含む、医療美容または疾患の治療または改善に用いられる治療薬であって、
前記疾患は、斜視、頸部ジストニア、喉頭筋ジストニア、上肢局在性ジストニア、原発性手振戦、流涎症、眼瞼痙攣、側顔面痙攣、脳卒中による上／下肢痙攣、脳性麻痺による上／下肢痙攣、腋窩多汗症、手のひら多汗症、逼排尿筋括約筋協同失調、慢性偏頭痛及び神経源性と特発性膀胱過活動症の中の少なくとも１つを含む、治療薬。

【請求項47】

前記医療美容は、
眉間のしわ、目じりの小じわ及び額のしわを含む症状の少なくとも１つの改善及び／又は治療を含む、ことを特徴とする請求項４６に記載の治療薬。

【請求項48】

医療美容の方法であって、
被験者に、薬学的に許容できる量の請求項１～１３のいずれか１項に記載のＡ型ボツリヌス神経毒変異体、または請求項２１、２５～４２のいずれか１項に記載の調製方法によって調製されるＡ型ボツリヌス神経毒を投与するステップを含む、ことを特徴とする医療美容の方法。

【請求項49】

前記医療美容はしわの除去及び／又は顔痩せを含む、ことを特徴とする請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記医療美容は、眉間のしわ、目じりの小じわ及び額のしわの症状の少なくとも１つの改善及び／又は治療を含む、ことを特徴とする請求項４８に記載の方法。

【請求項51】

前記投与は、皮下注射または筋肉注射を含む、ことを特徴とする請求項４８に記載の方法。

【国際調査報告】