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特表2024-535100コンパニオンアニマルにおけるバイオマーカー検出方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-26

(54)【発明の名称】コンパニオンアニマルにおけるバイオマーカー検出方法

(51)【国際特許分類】

G01N 33/53 20060101AFI20240918BHJP

G01N 33/48 20060101ALI20240918BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 L

G01N33/48 C

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024518808

(86)(22)【出願日】2022-09-15

(85)【翻訳文提出日】2024-04-24

(86)【国際出願番号】 US2022043687

(87)【国際公開番号】W WO2023055577

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】63/249,329

(32)【優先日】2021-09-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524113932

【氏名又は名称】ユニファーマカンパニーリミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋香元

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ユ－シャン

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA13

2G045AA26

2G045BA13

2G045BB10

2G045CA26

2G045CB17

2G045DA39

2G045DA40

2G045FA37

2G045FB01

2G045FB03

2G045FB12

(57)【要約】

血液試料中のフィブリン／フィブリノーゲン分解産物（「ＦＤＰ」）を定量化するための２つの方法。第１の方法は、非ヒト動物から血液試料を得る工程、この血液試料を遠心分離して第１の上澄みを得、かつ第１の上澄みを回収する工程、第１の上澄みを遠心分離して第２の上澄みを得、かつ第２の上澄みを回収する工程、第２の上澄みを希釈する工程、希釈した第２の上澄みをＦＤＰに特異的に結合する抗体を含む試薬と接触させる工程、およびＦＤＰに特異的に結合している抗体の量を検出し、それにより血液試料中のＦＤＰを定量化する工程を特徴とする。第２の方法は、希釈した第２の上澄みを、ＦＤＰを特異的に検出して非ヒト血液試料中のＦＤＰの量を定量化する定量的免疫測定法に供する工程を必要とする。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

血液試料中のフィブリン／フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）を定量化するための方法であって、
非ヒト動物から血液試料を得る工程、
前記血液試料を１０×ｇ～２，０００×ｇで遠心分離して第１の上澄みを得る工程、
前記第１の上澄みを回収する工程、
前記第１の上澄みを１，０００×ｇ～５０，０００×ｇで遠心分離して第２の上澄みを得る工程、
前記第２の上澄みを回収する工程、
前記第２の上澄みを１：５～１：１０，０００で希釈する工程、
前記希釈した第２の上澄みをＦＤＰに特異的に結合する抗体を含む試薬と接触させる工程、
ＦＤＰに結合していない抗体を除去する工程、および
ＦＤＰに特異的に結合している抗体の量を検出し、それにより前記血液試料中のＦＤＰを定量化する工程、
を含む、方法。

【請求項2】

前記血液試料を抗凝固処理する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記非ヒト動物は、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、フェレットまたはブタである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記抗凝固処理した血液試料を３０秒間～３０分間遠心分離する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記第２の上澄みを３０秒間～３０分間遠心分離する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記接触させる工程の前に前記第２の上澄みを１：５０～１：５，０００で希釈する、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記接触させる工程の前に前記第２の上澄みを１：１００～１：１，０００で希釈する、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

血液試料中のフィブリン／フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）を定量化するための方法であって、
非ヒト動物から血液試料を得る工程、
前記血液試料を１０×ｇ～２，０００×ｇで遠心分離して第１の上澄みを得る工程、
前記第１の上澄みを回収する工程、
前記第１の上澄みを１，０００×ｇ～５０，０００×ｇで遠心分離して第２の上澄みを得る工程、
前記第２の上澄みを回収する工程、
前記第２の上澄みを１：５～１：１０，０００で希釈する工程、
前記希釈した第２の上澄みを、ＦＤＰを特異的に検出する定量的免疫測定法に供し、それにより前記血液試料中のＦＤＰの量を定量化する工程、
を含む、方法。

【請求項9】

前記血液試料を抗凝固処理する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記定量的免疫測定法は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫組織化学染色、免疫蛍光染色法、フローサイトメトリー法またはマイクロ流体免疫測定法である、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記定量的免疫測定法は、ＦＤＰに特異的に結合する抗体を含むポリクローナルウサギ血清を用いるＥＬＩＳＡである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記定量的免疫測定法は、ＦＤＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡである、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記非ヒト動物は、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、フェレットまたはブタである、請求項９に記載の方法。

【請求項14】

前記抗凝固処理した血液試料を３０秒間～３０分間遠心分離する、請求項９に記載の方法。

【請求項15】

前記第２の上澄みを３０秒間～３０分間遠心分離する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記供する工程の前に前記第２の上澄みを１：５０～１：５０００で希釈する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記供する工程の前に前記第２の上澄みを１：１００～１：１０００で希釈する、請求項１６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

コンパニオンアニマルはヒトのように、医学における進歩ならびに予防ケアおよび栄養の向上により長生きしている。より長い寿命を有するペットは加齢に伴う疾患、特に癌を発症する可能性が高い。推定６００万匹のイヌおよび約６００万匹のネコが毎年癌と診断されている。

【0002】

約１００種類の動物の癌が存在する。ペットの癌は皮膚、骨、乳房、頭頸部、リンパ系、腹部および精巣において見つけることができる。白血病はネコにおいて最も一般的な種類の癌であり、リンパ腫および乳腺癌はイヌにおいて最も一般的な種類の癌である。

【0003】

イヌは他のコンパニオンアニマルと比較してより多くの形態の癌に罹患する。米国獣医癌学会によれば、癌はイヌ、特に１０歳を超えるイヌの４７％における主な死因である。

【0004】

ヒトの血清中に存在する多くのバイオマーカーは癌、例えば癌胎児抗原およびフィブリン／フィブリノーゲン分解産物に関連していることが知られている。特定のバイオマーカーがヒトの癌の進行を予測するものであることが決定されている。しかし非ヒト動物の癌に関する研究は散発的なままである。

【0005】

癌のより早期の段階で適切な治療を与え、それにより生存を高めることができるように、動物の癌に関連するバイオマーカーを検出するための方法を開発することが必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

この必要性を満たすために、血液試料中のフィブリン／フィブリノーゲン分解産物（「ＦＤＰ」）を定量化するための方法が提供される。本方法は、非ヒト動物から血液試料を得る工程、この血液試料を遠心分離して第１の上澄みを得、かつその上澄みを回収する工程、第１の上澄みを遠心分離して第２の上澄みを得、かつ第２の上澄みを回収する工程、第２の上澄みを希釈する工程、希釈した第２の上澄みをＦＤＰに特異的に結合する抗体を含む試薬と接触させる工程、ＦＤＰに結合していない抗体を除去する工程、およびＦＤＰに特異的に結合している抗体の量を検出し、それにより血液試料中のＦＤＰを定量化する工程により行う。

【0007】

血液試料中のＦＤＰを定量化するための第２の方法も提供される。この方法は、非ヒト動物から血液試料を得る工程、この血液試料を遠心分離して第１の上澄みを得、かつその上澄みを回収する工程、第１の上澄みを遠心分離して第２の上澄みを得、かつ第２の上澄みを回収する工程、第２の上澄みを希釈する工程、および希釈した第２の上澄みを、ＦＤＰを特異的に検出して血液試料中のＦＤＰの量を定量化する定量的免疫測定法に供する工程により達成する。

【0008】

本発明のいくつかの実施形態の詳細は以下の「発明を実施するための形態」に記載されている。本発明の他の特徴、目的および利点は「発明を実施するための形態」および図面から明らかになり、特許請求の範囲からも明らかになるであろう。

【0009】

以下の「発明を実施するための形態」では添付の図面を参照する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1A】図１Ａは、対照のイヌおよび腫瘍を有するイヌにおけるＤＲ－７０抗原の発現レベルのプロットを示す。

【図1B】図１Ｂは、図１Ａに示されているデータから計算され、かつ様々なカットオフ値から構築された受信者動作特性曲線を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

上に要約されているように、血液試料中のＦＤＰを定量化するための第１の方法を開示する。本方法は、非ヒト血液試料を遠心分離して第１の上澄みを得る工程を特徴とする。

【0012】

好ましくは、非ヒト血液試料は哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、フェレットまたはブタからのものである。血液は当該技術分野で知られている任意の方法により得ることができる。

【0013】

特定の第１の方法では、抗凝固処理した血液を使用することができる。例えば新鮮血は、エチレンジアミン四酢酸またはクエン酸ナトリウムで処理して凝固を防止することができる。凝固した全血も使用することができるため、非ヒト血液試料の抗凝固は請求項に係る発明を実施するために必要ではない。

【0014】

第１の上澄みが得られるように、非ヒト血液試料を遠心分離して血液細胞を除去する。遠心分離は、１０×ｇ～２，０００×ｇ（例えば、１０×ｇ、５０×ｇ、１００×ｇ、２５０×ｇ、５００×ｇ、１０００×ｇ、１２５０×ｇ、１５００×ｇおよび２０００×ｇ）で３０秒間～３０分間（例えば、３０秒間、１分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間および３０分間）行うことができる。

【0015】

例えば、第１の上澄みを血液細胞ペレットの頂上からピペットで移すことによりそれを回収した後に、第１の上澄みを再度遠心分離して第２の上澄みを得る。この第２の遠心分離工程は、１，０００×ｇ～５０，０００×ｇ（例えば、１，０００×ｇ、２，５００×ｇ、５，０００×ｇ、１０，０００×ｇ、１１，０００×ｇ、１２，０００×ｇ、１３，０００×ｇ、１４，０００×ｇ、１５，０００×ｇ、１６，０００×ｇ、１７，０００×ｇ、１８，０００×ｇ、１９，０００×ｇ、２０，０００×ｇ、２５，０００×ｇ、３０，０００×ｇ、３５，０００×ｇ、４０，０００×ｇ、４５，０００×ｇおよび５０，０００×ｇ）で３０秒間～３０分間（例えば、３０秒間、１分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間および３０分間）行う。

【0016】

第２の上澄みを回収した後に、それを適当な希釈液で希釈することにより免疫検出のために調製する。例えば、リン酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）を使用して第２の上澄みを希釈することができる。

【0017】

第２の上澄みは、１：５～１：１０，０００、好ましくは１：５０～１：５，０００、より好ましくは１：１００～１：１，０００で希釈することができる。許容される希釈は、例えば１：５、１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：７５０、１：１，０００、１：１，５００、１：２，０００、１：２，５００、１：３，０００、１：３，５００、１：４，０００、１：４，５００、１：５，０００、１：７，５００および１：１０，０００であってもよい。

【0018】

次いで、希釈した第２の上澄みをＦＤＰに特異的に結合する抗体を含む試薬と接触させた状態で置く。

【0019】

ＦＤＰに特異的に結合する抗体を開発することは、当業者の技量の範囲内である。例えば目的の動物、例えばイヌから単離されたＦＤＰを使用してウサギに接種して、ＦＤＰに特異的に結合する抗体を含むポリクローナル血清を得ることができる。陽性反応している動物から単離されたＦＤＰおよび脾細胞をマウスに接種して、ＦＤＰに対するモノクローナル抗体を得ることができる。特定の例では、ヒトのＦＤＰに結合する特定の抗体は他の生物種からのＦＤＰと交差反応する。従って、抗ヒトＦＤＰポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を試薬として使用することができる。

【0020】

上記方法は、希釈した第２の上澄みを試薬と接触させた状態で置くことを要件とする。これは、例えば希釈した第２の上澄みをプレート表面に吸着させ、かつそのプレート表面を抗ＦＤＰ抗体を含む試薬に曝露することにより達成することができる。別の例では、希釈した第２の上澄みを試薬を含む管の中で混合する。

【0021】

試薬中の抗ＦＤＰ抗体が希釈した第２の上澄み中のＦＤＰに結合するのに十分な時間をかけた後に、未結合抗体を除去する。例えば希釈した第２の上澄みをプレートに吸着させる場合、適当な界面活性剤溶液、例えばＰＢＳ／ポリソルベート２０で洗浄することにより未結合抗ＦＤＰ抗体を除去することができる。さらに、希釈した第２の上澄みを試薬を含む管の中で混合する場合、ＦＤＰにも結合する第２の抗体を添加し、かつ第２の抗体を捕捉することにより未結合抗体を結合している抗体から分離および除去することができる。

【0022】

上述のとおり、本方法は接触させる工程の後に、ＦＤＰに特異的に結合している抗体の量を検出する工程を含む。試薬中の抗ＦＤＰ抗体は蛍光または酵素で標識することができ、ＦＤＰに結合している抗ＦＤＰ抗体の量は、例えば蛍光で標識した抗体を使用する場合には蛍光強度により、酵素で標識した抗体を使用する場合には比色手段により測定することができる。特異的に結合している抗ＦＤＰ抗体を検出するための当該技術分野で知られている任意の方法を使用することができる。

【0023】

第２の上澄み中のＦＤＰの量は多くの方法で定量化することできる。特定の例では、異なる希釈の精製されたＦＤＰの標準に結合している抗ＦＤＰ抗体の量を第２の上澄み中で検出された量と比較する。

【0024】

上記方法は、比較のために同じ生物種の何匹かの動物からの血液試料に対して行うことができる。例えば本方法を使用して、癌を有しないイヌからの血液試料中のＦＤＰレベルを決定してベースライン値を確立することができる。同じ方法を使用して癌を有するイヌからの血液試料中のＦＤＰレベルを決定して、これらのレベルが癌を有しない動物のものとは異なるか否かを知ることができる。

【0025】

血液試料中のＦＤＰを定量化するための第２の方法が「発明の概要」の箇所で述べられている。第２の方法は、上に詳細に記載されている第１の方法と特定の工程を共有する。第２の方法は第１の方法のように、（ｉ）非ヒト動物から血液試料を得る工程、（ｉｉ）血液試料を遠心分離して第１の上澄みを得る工程、（ｉｉｉ）第１の上澄みを回収する工程、（ｉｖ）第１の上澄みを遠心分離して第２の上澄みを得る工程、（ｖ）第２の上澄みを回収する工程、および（ｖｉ）第２の上澄みを希釈する工程を必要とする。第２の方法は、希釈した第２の上澄みを、血液試料中のＦＤＰの量を定量化するためにＦＤＰを特異的に検出する定量的免疫測定法に供する工程を特徴とする。

【0026】

第２の方法は上記第１の方法のように、非ヒト血液試料の抗凝固を必要としない。凝固した全血を使用することができる。

【0027】

第２の方法における遠心分離する工程および希釈は第１の方法と同じように行う。繰り返しておくが、非ヒト血液試料を１０×ｇ～２，０００×ｇで３０秒間～３０分間遠心分離して第１の上澄みを得、第１の上澄みを１，０００×ｇ～５０，０００×ｇで３０秒間～３０分間遠心分離して第２の上澄みを得、第２の上澄みを定量的免疫測定法に使用するために１：５～１：１０，０００に希釈する。

【0028】

定量的免疫測定法は限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」）、酵素増幅免疫測定法、定量的免疫組織染色法、放射性免疫測定法、免疫蛍光染色法、フローサイトメトリー法、タンパク質マイクロアレイ測定法、電気化学発光法、マイクロビーズ法、マイクロ流体免疫測定法または表面プラズモン共鳴法による免疫測定法であってもよい。

【0029】

具体例では定量的免疫測定法は、ＦＤＰに特異的に結合する抗体を含むポリクローナルウサギ血清を用いるＥＬＩＳＡである。別の例では定量的免疫測定法は、ＦＤＰに特異的に結合するモノクローナル抗体を用いるＥＬＩＳＡである。ＥＬＩＳＡは、感度を高めるために第２の抗ＦＤＰ抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡであってもよい。

【0030】

最後に第２の方法では、非ヒト血液試料は哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、フェレットまたはブタからのものである。

【0031】

さらなる詳細がなくとも、当業者であれば本明細書中の開示に基づいて本開示を最大限まで利用することができると考えられる。従って以下の具体例は、単に説明的なものであり、あらゆる点で決して本開示の残りを限定するものではないものと解釈されるべきである。

【実施例】

【0032】

実施例１：血液試料の調製
細胞診および／または組織病理診断によって確認された癌を有する２６２匹のイヌから血液試料を得た。５４匹の健康な動物からも血液試料を得た。全ての場合に、研究のために臨床データを使用するためのインフォームドコンセントをペット所有者から得た。

【0033】

抗凝固処理、すなわちエチレンジアミン四酢酸処理した管に全血を回収した。この管を回収直後に１５００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、次いで上澄みを除去し、１６，０００×ｇで１０分間遠心分離した。得られた上澄みを免疫検出法に使用するために、ＰＢＳ中で１：２００に希釈した。

【0034】

実施例２：酵素結合免疫吸着測定法（「ＥＬＩＳＡ」）
ＤＲ－７０抗原、すなわちフィブリンおよびＦＤＰの組み合わせである抗原に対するウサギポリクローナル血清を産生させた。以下に記載するように、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて抗ＤＲ－７０抗原抗体を用いて血液試料中のＦＤＰを定量的に測定した。

【0035】

アフィニティー精製した抗ＤＲ－７０ウサギ血清を９６ウェルプレートのウェルにコーティングし、次いで１００μＬの希釈した血液試料と共に室温で３０分間インキュベートした。ウェルを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（「ＨＲＰ」）結合抗ＤＲ７０抗体を各ウェルに添加し、３０分間インキュベートし、洗浄した。テトラメチルベンジジン基質を添加し、かつ十分な色が発生した後に０．１ＮのＨＣｌにより反応を停止させることにより、結合しているＨＲＰ結合抗ＤＲ７０抗体の検出を達成した。４５０ｎｍでマイクロプレートリーダーにより色の強度を測定した。精製したＤＲ－７０から得られた標準曲線との比較により、ＤＲ－７０濃度を計算した。その結果が図１Ａに示されている。

【0036】

健康な動物からの血液試料中のＤＲ－７０濃度の中央値は、１．１６３μｇ／ｍＬ（０．１０１０～１．７７５μｇ／ｍｌ；ｎ＝５４）であった。癌に罹患しているイヌからの血液試料中のＤＲ－７０濃度の中央値は、２．１３２μｇ／ｍＬ（０．３４９５～４．３５５μｇ／ｍｌ；ｎ＝２６２）であり、値は健康な動物からのものよりも有意に高かった（ｐ＜０．０００１；クラスカル・ワリス検定）。

【0037】

実施例３：診断の有用性
イヌにおいて癌を診断するためのＤＲ－７０レベルの使用の有用性を、受信者動作特性曲線を準備し、かつ曲線下面積（「ＡＵＣ」）を計算することにより試験した。その結果が図１Ｂに示されている。ＤＲ－７０のＡＵＣは０．９１８５（９５％信頼区間：０．８８７６～０．９４９４；ｐ＜０．０００１）であり、これはＤＲ－７０レベルを使用して、癌を有するイヌと健康な動物とを容易に識別することができることを示している。

【0038】

異なるカットオフ値における感度および特異性を計算することにより、ＤＲ－７０血中濃度の最適なカットオフ値を決定した。このデータが以下の表１に示されている。

【表1】