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特表2024-535145改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）による細胞傷害性導入遺伝子発現を下方調節するためのマイクロＲＮＡの利用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-27
(54)【発明の名称】改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）による細胞傷害性導入遺伝子発現を下方調節するためのマイクロＲＮＡの利用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/863 20060101AFI20240919BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240919BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240919BHJP
A61K 39/275 20060101ALI20240919BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240919BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240919BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240919BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240919BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240919BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240919BHJP
【ＦＩ】
C12N15/863 Z ZNA
C12N15/113 Z
C12N7/01
A61K39/275
A61P31/00
A61P35/00
A61P31/12
A61K48/00
A61K35/76
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513977
(86)(22)【出願日】2022-09-02
(85)【翻訳文提出日】2024-03-14
(86)【国際出願番号】 EP2022074510
(87)【国際公開番号】W WO2023031428
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】21194940.9
(32)【優先日】2021-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509296443
【氏名又は名称】バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ
(74)【代理人】
【識別番号】100069556
【弁理士】
【氏名又は名称】江崎 光史
(74)【代理人】
【識別番号】100111486
【弁理士】
【氏名又は名称】鍛冶澤 實
(74)【代理人】
【識別番号】100139527
【弁理士】
【氏名又は名称】上西 克礼
(74)【代理人】
【識別番号】100164781
【弁理士】
【氏名又は名称】虎山 一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100221981
【弁理士】
【氏名又は名称】石田 大成
(72)【発明者】
【氏名】ハウスマン・ユルゲン
(72)【発明者】
【氏名】カッラ・マルクス
(72)【発明者】
【氏名】シュヴェネカー・マルク
(72)【発明者】
【氏名】ハビャン・マティアス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA01
4B065BB40
4B065BC50
4B065CA45
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB321
4C084ZB322
4C084ZB331
4C084ZB332
4C085AA03
4C085BA85
4C085CC08
4C085EE01
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZB32
4C087ZB33
(57)【要約】
本発明は、導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関するものであり、各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応する。本発明はまた、組み換えＭＶＡの医学的用途にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、前記ヌクレオチド配列が、前記導入遺伝子に結合した異種ｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、各ｍｉＲＮＡ標的配列が、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応し、前記ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の前記ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの少なくとも１個が、前記真核生物ＭＶＡ産生細胞内での前記導入遺伝子の発現の下方調節を媒介可能である、前記組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項2】
ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む転写単位であって、前記ヌクレオチド配列が、前記導入遺伝子に結合した異種ｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、各ｍｉＲＮＡ標的配列が、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡ配列に対応し、前記ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の前記ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの少なくとも１個が、前記真核生物ＭＶＡ産生細胞内での前記導入遺伝子の発現の下方調節を媒介可能である、前記転写単位。
【請求項3】
異種ｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列であって、各ｍｉＲＮＡ標的配列が真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応し、前記ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の前記ｍｉＲＮＡ標的配列のうちの少なくとも１個が、前記真核生物ＭＶＡ産生細胞内での前記ｍｉＲｂｌｏｃｋに結合した導入遺伝子の発現の下方調節を媒介可能である、前記ｍｉＲＮＡ標的配列。
【請求項4】
少なくとも１個のｍｉＲＮＡ標的配列が、約８０～１００％、好ましくは約９０～１００％、より好ましくは約９５～１００％、最も好ましくは約１００％のヌクレオチド配列類似性で前記ｍｉＲＮＡの配列に対応する、請求項１に記載の組み換えＭＶＡ、請求項２に記載の転写単位、または請求項３に記載のｍｉＲｂｌｏｃｋ。
【請求項5】
少なくとも１個のｍｉＲＮＡ標的配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択される、請求項１もしくは４に記載の組み換えＭＶＡ、請求項２もしくは４に記載の転写単位、または請求項３もしくは４に記載のｍｉＲｂｌｏｃｋ。
【請求項6】
前記ｍｉＲｂｌｏｃｋが、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる、請求項１、４、及び５のいずれか１項に記載の組み換えＭＶＡ、請求項２、４、及び５のいずれか１項に記載の転写単位、または請求項３～５のいずれか１項に記載のｍｉＲｂｌｏｃｋ。
【請求項7】
前記導入遺伝子が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）由来のタンパク質、またはその抗原性部分、好ましくはＲＳＶ Ｇ（Ａ）、Ｇ（Ｂ）、Ｆ、Ｎ、及びＭ２－１タンパク質、ならびにＮ／Ｍ２－１融合タンパク質からなる群より選択されるタンパク質をコードする、請求項１及び４～６のいずれか１項に記載の組み換えＭＶＡ、請求項２及び４～６のいずれか１項に記載の転写単位、または請求項３～６のいずれか１項に記載のｍｉＲｂｌｏｃｋ。
【請求項8】
前記真核生物ＭＶＡ産生細胞が、鳥類初代細胞、好ましくはニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）、または鳥類永久細胞株、好ましくはＤＦ－１もしくはウズラ細胞である、請求項１及び４～７のいずれか１項に記載の組み換えＭＶＡ、請求項２及び４～７のいずれか１項に記載の転写単位、または請求項３～７のいずれか１項に記載のｍｉＲｂｌｏｃｋ。
【請求項9】
前記プロモーターが、Ｐｒ１３．５ｌｏｎｇ、Ｐｒ１３２８、ＰｒＬＥ１（ｐＨｙｂ）プロモーターからなる群より選択される最初期プロモーターであり、好ましくはＰｒ１３．５ｌｏｎｇプロモーターである、請求項１及び４～８のいずれか１項に記載の組み換えＭＶＡ、または請求項２及び４～８のいずれか１項に記載の転写単位。
【請求項10】
請求項１及び４～９のいずれか１項に記載の組み換えＭＶＡを生成するための方法であって、以下：（１）請求項３～８のいずれか１項に記載のｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列を準備する工程と、
（２）ステップ（１）で準備された前記ｍｉＲｂｌｏｃｋを用いて、請求項２及び４～９のいずれか１項に記載の転写単位を調製する工程と、
（３）ステップ（２）で調製された前記転写単位をＭＶＡに挿入する工程と、
（４）真核生物ＭＶＡ産生細胞に、ステップ（３）で得られた前記ＭＶＡを感染させ、これを増殖させる工程と、
（５）ステップ（４）で増殖された前記組み換えＭＶＡを採取する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項11】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで真核生物ＭＶＡ産生細胞内でのＭＶＡコード導入遺伝子の発現を下方調節するためのｍｉＲＮＡ標的配列の使用であって、前記ｍｉＲＮＡ標的配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択される、前記使用。
【請求項12】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで真核生物ＭＶＡ産生細胞内でのＭＶＡコード導入遺伝子の発現を下方調節するための、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列の使用であって、前記ｍｉＲｂｌｏｃｋが、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、及び配列番号５５に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる、前記使用。
【請求項13】
請求項１及び４～９のいずれか１項に記載の組み換えＭＶＡを含む医薬組成物またはワクチン。
【請求項14】
医薬品またはワクチンとして使用するための、請求項１及び４～９のいずれか１項に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項15】
感染症またはがんの治療または予防に使用するための、好ましくはＲＳＶ感染症の予防に使用するための、請求項１及び４～９のいずれか１項に記載の組み換えＭＶＡ。
【請求項16】
ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む組み換えＭＶＡであって、前記ヌクレオチド配列が、前記導入遺伝子に結合したｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、前記ｍｉＲＮＡ標的配列が、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応し、前記ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の前記ｍｉＲＮＡ標的配列が、前記真核生物ＭＶＡ産生細胞内での前記導入遺伝子の発現の下方調節を媒介可能である、前記組み換えＭＶＡ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウイルスベクターの分野に関し、詳細にはウイルスベクターベースワクチンに関する。より具体的には、本発明は、導入遺伝子に結合したいわゆるｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）標的配列を含む組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）に関するものであり、各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内で発現するｍｉＲＮＡに対応する。本発明はまた、組み換えＭＶＡの医学的用途にも関する。
【背景技術】
【0002】
組み換えウイルスベクターの一般的な問題は、このようなベクターにより発現した導入遺伝子産物がベクター産生細胞の細胞プロセスに及ぼす悪影響である。これは最終的に、所与の組み換えウイルスベクターの収量を損なうことにつながる（１）。細胞傷害性作用は、単一または複数の導入遺伝子の発現の結果であることもあれば、別々に発現させたときには細胞傷害性作用を示さない導入遺伝子産物を組み合わせた結果であることもある。細胞傷害性導入遺伝子産物がウイルスベクターの収量を低減するという問題は、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ科Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ属の原型種であるワクシニアウイルスに由来する組み換えＭＶＡベクターにも関係する問題である。例えば、複製異常がＨＩＶ－ｅｎｖ発現ＭＶＡで観察されている（２）。
【0003】
ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）は、ＭＶＡ（改変ワクシニアウイルスアンカラ）ウイルスストックから単離された十分に特性評価されたウイルスベクターである。ＭＶＡは、複製ワクシニアウイルスである皮膚ワクシニアウイルスアンカラ株（漿尿膜ワクシニアウイルスアンカラ（ＣＶＡ：Ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｓ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ））を起源とする（３）。ＣＶＡを初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦまたはＣＥＦ細胞）で５７０継代超にわたり連続的に増殖させることにより、弱毒化されたＣＶＡ由来ウイルスＭＶＡが得られた。Ｂａｖａｒｉａｎ ＮｏｒｄｉｃがさらにこのＭＶＡを継代し、さらに弱毒化されたＭＶＡ株であるＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）が得られた（４）。ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）は、祖先ＣＶＡウイルスと比較するとゲノムのおよそ１５％が欠如している（３１ｋｂが消失し、その結果６つの主な欠失部位がある）。これらの欠失は、複数の病原性及び宿主域遺伝子ならびにＡ型封入体における遺伝子に影響を及ぼす。ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）は、ヒト細胞内でウイルスコード遺伝子に付着し、侵入し、これを非常に効率的に発現させることができる。ただし、ヒト細胞内では後代ウイルスの構築及び放出は生じない。そのため、ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）は重要で汎用性の高いワクチンベクターであり、これまでに医療ニーズが満たされていない疾患（例えば、エボラウイルス疾患（５））を標的とするワクチン接種アプローチに使用する抗原コード導入遺伝子を、効率的に発現させることができる。ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）及びその誘導体の調製物は、多くのタイプの動物に、そして臨床試験で免疫不全患者を含む１０，５００例超のヒト対象にも、いかなる重篤な有害事象も伴わずに投与されている。
【0004】
細胞傷害性導入遺伝子を発現するいくつかのＭＶＡ組み換え体のウイルス収量の低減は広範囲にわたって変動し得るものであり、その結果、ウイルス収量の顕著な低減から深刻な複製障害に至るまで生じ、さらには特にある特定の導入遺伝子を発現する組み換えＭＶＡを作製できなくなることすら生じる。組み換えＭＶＡ複製の障害は、単一の細胞傷害性の高い導入遺伝子だけで引き起こされることもあるが、複数の導入遺伝子の組み合わせによって引き起こされることもある。これらの導入遺伝子は、ＭＶＡ媒介発現の際に個別には細胞傷害性がないように思われる場合もあるが、これらの最小限の細胞傷害性作用が加算され、あるいは相乗すらしてＭＶＡの収量を著しく減少させるように思われる。ある特定の導入遺伝子を含む組み換えＭＶＡが作製できないのは、有害な導入遺伝子がＭＶＡ組み換え体の複製プロセスに付与する選択的不利益（複製が非効率であるために親ＭＶＡバックグラウンドから首尾よく選択及び単離できない程度の不利益）が寄与する可能性がある。さらに、この導入遺伝子を発現するウイルスベクターのトランスジェニックインサートまたはゲノムの遺伝子的安定性が、ウイルスベクター生産中に有害な導入遺伝子が発現することにより損なわれることがある（１、２）。
【0005】
したがって、ウイルス複製能力を可能な限り損なわずに、細胞傷害性の可能性がある複数の導入遺伝子を発現可能な組み換えＭＶＡが必要とされている。
【0006】
発明者らは、ＭＶＡベクター産生細胞のマイクロＲＮＡ機構が、組み換えＭＶＡ生産中に導入遺伝子の発現を下方調節するために利用できるかどうかを評価することを目的とした。
【0007】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、すべての真核細胞が遺伝子発現の転写後制御のために産生する、典型的には２１～２３ヌクレオチド（ｎｔ）長の小さな非コードＲＮＡである。これらのＲＮＡは、細胞ゲノム内で一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる１００～１０００ヌクレオチドの長い非コードＲＮＡとしてコードされ、核内でＲＮアーゼドローシャにより、前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる約８０ｎｔのヘアピン構造にトリミングされる。これらのヘアピンＲＮＡは細胞質内でＲＮアーゼダイサーによりさらにトリミングされて、成熟した２１～２３ｎｔのｍｉＲＮＡが得られる。成熟ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの作用を媒介するいわゆるＲＩＳＣ多タンパク質複合体にロードされる。ｍｉＲＮＡが細胞内ｍＲＮＡのコード配列または５’もしくは３’－非翻訳領域（ＵＴＲ）内の同族標的配列に結合すると、マッチが不完全な場合は翻訳性低下に至り、マッチが完全な場合はｍＲＮＡ分解にすら至る。後者のプロセスでは、ｍＲＮＡ分解を媒介するｍｉＲＮＡ自体は分解されず、マイクロＲＮＡエフェクター機構により取り込まれる。したがって、これらは、その標的配列を認識することで、新たなサイクルのｍＲＮＡ分解を開始することができる。注目すべきことに、ｍｉＲＮＡによる細胞タンパク質レベルの下方制御は、通常は２倍未満である（６、７）が、これらの効果は、例えば、完全な標的マッチングにより、及び標的配列のタンデム配置により増強することができる（８）。
【0008】
多くのｍｉＲＮＡ遺伝子は動物界全体で非常に高度に保存されているが、その一方で系統特異的、種特異的、さらには組織特異的なｍｉＲＮＡも存在する。特定の組織向性を達成する、または非腫瘍組織内での複製を防ぐという一般的な目的で、ウイルスが細胞ｍｉＲＮＡにより標的化されるように操作された例は複数存在する。複製制限に成功した例としては、２個の別々の単一ｍｉＲＮＡ標的配列の挿入により改変されたポリオウイルス、及び３個の標的配列により改変された水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）がある。これらの研究は、ｉｎ ｖｉｖｏのウイルス複製がｍｉＲＮＡにより制御できることを示すものである（９、１０）。同様にして、種特異的あるいは組織特異的なマイクロＲＮＡの標的配列をウイルスゲノムに挿入することにより、インフルエンザウイルスまたは腫瘍溶解性ピコルナウイルスの減弱が達成された（１１、１２）。また、Ａ型インフルエンザウイルスにおいて、ｍｉＲＮＡ－９３標的配列をインフルエンザＯＲＦに挿入することにより、マウスにおいて種特異的に減弱する（ただしニワトリ卵では減弱しない）ことも証明されている（１３）。
【0009】
ｍｉＲＮＡの標的化による意図的なウイルス複製の減弱に加えて、マイクロＲＮＡ機構は、ウイルス遺伝子治療ベクターの導入遺伝子発現の抑制にも使用されている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターゲノムのベクター粒子へのパッケージングは、導入遺伝子産物が細胞傷害性を有する場合、コードされた導入遺伝子が真核生物プロモーターの制御下で発現することによって深刻に損なわれることがある。細胞傷害性導入遺伝子発現のｍｉＲＮＡ媒介性下方調節により、それぞれのＡＡＶのパッケージング効率及び収量が増加した（１４）。これまで、このアプローチは、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ様スキャフォールド（１４）において人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）を過剰発現させるか、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）（１５）としてＡＡＶの収量を高めることによってのみ効果的であることが示唆されてきた。典型的には、ＡＡＶベクターは、ベクターゲノム及びヘルパー機能をコードするプラスミドのセットをトランスフェクションすることにより生成されるため、ａｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ発現プラスミドを同時トランスフェクションすることは技術的に実現可能であった。しかし、ｍｉＲＮＡトランスフェクションアプローチは、感受性の高い産生細胞の感染により増殖するＭＶＡまたはポックスウイルスベースのベクター全般に対しては実現不可能である。ＣＥＦ適応性ＭＶＡの場合、一般的な産生細胞は初代ＣＥＦ細胞か、またはニワトリ連続線維芽細胞株ＤＦ－１のようないくつかの鳥類細胞株である。初代ＣＥＦは非常に限られたトランスフェクション効率を示すため、概して、トランスフェクション手順は工業的規模の生産プロセスでは理想的ではない。
【0010】
そのため、発明者らは、初代ＣＥＦ内の細胞内在性ｍｉＲＮＡを利用して、ベクター生産中にＭＶＡベクターにより駆動される導入遺伝子の発現を下方調節し、ワクチン接種目的の組み換えＭＶＡの収量向上を達成することを目標とした。
【0011】
ｍｉＲＮＡ機構及びワクシニアウイルス感染の相互作用に関し、公的に入手可能な知識は限られている。ワクシニアウイルスは、ｍｉＲＮＡ分解の誘導（１６、１７）、及びｍｉＲＮＡの生合成に必要とされる細胞内ＲＮアーゼダイサーの下方調節（１７、１８）を含めて、様々なレベルで細胞内のｍｉＲＮＡ機構を下方調節しているようである。このことから、ｍｉＲＮＡは、ワクシニアウイルスに駆動される導入遺伝子発現の制御には適しないことが示唆された。Ｂ５という名称のワクシニアウイルスタンパク質の標的ｍｉＲＮＡ媒介性発現下方調節の一例が存在する。そこでの目標は、Ｂ５依存的なワクシニアウイルスの形態形成の障害、ひいては子孫ウイルス生産の障害であった（１９、２０）。しかし、Ｂ５Ｒ遺伝子の発現を駆動する初期／後期ポックスウイルスＢ５プロモーターは、それほど強力なプロモーターではない（２１、２２）。これに対し、産生細胞内でポックスウイルスによる導入遺伝子の発現を制御する上での問題は、導入遺伝子の発現を駆動するために使用されるポックスウイルスのプロモーターが、免疫原として機能する最大量の組み換えタンパク質の合成を指示するために、意図的に可能な限り強力になるように設計及び選択されている（例えば、広く使用されている合成初期／後期ＰｒＳプロモーター（２３）及び強力な最初期プロモーターＰｒ１３．５ｌｏｎｇ（２４））という事実により、さらに大きな問題となる。
【発明の概要】
【0012】
本発明の目的は、組み換えＭＶＡを高い収量で生成する手段及び方法を提供することである。
【0013】
本発明の根底にある問題は、感受性産生細胞内でＭＶＡが増殖する間に導入遺伝子の発現が下方調節されるように改変された組み換えＭＶＡを提供することにより、解決される。詳細には、本発明は、添付の特許請求の範囲、ならびに以下の態様及びその実施形態により定義される。
【0014】
第１の態様において、本発明は、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を提供し、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応する。
【0015】
第１の態様において、本発明は、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む組み換え改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）を提供し、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応する。
【0016】
さらなる態様において、本発明は、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む転写単位を含む組み換えＭＶＡを提供し、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲＮＡ標的配列、または導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、ｍｉＲＮＡ標的配列またはｍｉＲｂｌｏｃｋ内の各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応する。
【0017】
またさらなる態様において、本発明は、第１及び第２の転写単位、またはそれ以上の転写単位を含む組み換えＭＶＡを提供し、各転写単位は、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲＮＡ標的配列、または導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、ｍｉＲＮＡ標的配列またはｍｉＲｂｌｏｃｋ内の各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応する。
【0018】
別の態様において、本発明は、好ましくは組み換えＭＶＡにおける使用に適した、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む転写単位を提供し、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲＮＡ標的配列、または導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、ｍｉＲＮＡ標的配列またはｍｉＲｂｌｏｃｋ内の各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応する。
【0019】
また別の態様において、本発明は、好ましくは組み換えＭＶＡにおける使用に適した、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列を提供し、各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応する。
【0020】
また別の態様において、本発明は、真核生物産生細胞内で活性であるプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含むプラスミドを提供し、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲＮＡ標的配列、または導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、ｍｉＲＮＡ標的配列またはｍｉＲｂｌｏｃｋ内の各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物産生細胞内のｍｉＲＮＡに対応する。
【0021】
また別の態様において、本発明は、本発明による組み換えＭＶＡを生成するための方法を提供し、この方法は、以下：
（１）本発明によるｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置されたｍｉＲＮＡ標的配列または一連のｍｉＲＮＡ標的配列を準備する工程と、
（２）ステップ（１）で準備されたｍｉＲＮＡ標的配列またはｍｉＲｂｌｏｃｋを用いて、本発明による転写単位を調製する工程と、
（３）ステップ（２）で調製された転写単位をＭＶＡに挿入する工程と、
（４）真核生物ＭＶＡ産生細胞に、ステップ（３）で得られたＭＶＡを感染させ、これを増殖させる工程と、
（５）ステップ（４）で増殖された組み換えＭＶＡを採取する工程とを含む。
（１）本発明によるｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置されたｍｉＲＮＡ標的配列または一連のｍｉＲＮＡ標的配列を準備する工程と、
（２）ステップ（１）で準備されたｍｉＲＮＡ標的配列またはｍｉＲｂｌｏｃｋを用いて、本発明による転写単位を調製する工程と、
（３）ステップ（２）で調製された転写単位をＭＶＡに挿入する工程と、
（４）真核生物ＭＶＡ産生細胞に、ステップ（３）で得られたＭＶＡを感染させ、これを増殖させる工程と、
（５）ステップ（４）で増殖された組み換えＭＶＡを採取する工程とを含む。
【0022】
また別の態様において、本発明は、本発明によるプロセスにより生成された組み換えＭＶＡを提供する。
【0023】
また別の態様において、本発明は、ワクチンの工業的規模の生産のための、本発明による組み換えＭＶＡの使用を提供する。
【0024】
また別の態様において、本発明は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内でのＭＶＡコード導入遺伝子の発現を下方調節するための、詳細にはワクチンの工業的規模生産のための、本発明によるｍｉＲＮＡ標的配列の使用を提供する。
【0025】
また別の態様において、本発明は、真核生物ＭＶＡ産生細胞におけるＭＶＡコード導入遺伝子の発現を下方調節するための、詳細にはワクチンの大規模生産のための、本発明によるｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列の使用を提供する。
【0026】
また別の態様において、本発明は、本発明による組み換えＭＶＡを含み、任意選択で、医薬的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、医薬組成物またはワクチンを提供する。
【0027】
また別の態様において、本発明は、医薬品またはワクチンとして使用するための、好ましくは疾患の治療または予防に使用するための、本発明による組み換えＭＶＡを提供する。
【0028】
また別の態様において、本発明は、感染性疾患またはがんの治療または予防に使用するための、本発明による組み換えＭＶＡを提供する。
【0029】
また別の態様において、本発明は、感染症またはがんの治療または予防に使用するための医薬品またはワクチンの製造のための、本発明による組み換えＭＶＡの使用を提供する。
【0030】
また別の態様において、本発明は、対象における感染性疾患またはがんを治療または予防する方法を提供し、この方法は、本発明による組み換えＭＶＡを対象に投与することを含む。
【0031】
これらの態様及びその実施形態について、本発明の説明とともにさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】ＥＧＦＰを発現し、ＥＧＦＰ ３’－ＵＴＲのヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置されたｍｉＲＮＡ標的配列を含むプラスミド挿入物の設計を示している。ｍｉＲＮＡ標的配列なし（「ｍｉＲｂなしＥＧＦＰ」）（Ａ）、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１あり（Ｂ）及び－２あり（Ｃ）、ならびに４個のスクランブルｍｉＲＮＡ標的配列を含む対照ｍｉＲｂｌｏｃｋあり（「ＥＧＦＰ－ｓｃｒｂｌ２」）（Ｄ）のＥＧＦＰプラスミド。ｐＣＭＶ＝ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーター／エンハンサー；ＥＧＦＰ＝高感度緑色蛍光タンパク質：ＳＶ４０ポリＡ＝シミアンウイルス－４０由来のポリアデニル化シグナル；ｎｔ＝ヌクレオチド；ＯＲＦ＝オープンリーディングフレーム。
【図2】ｍｉＲｂｌｏｃｋが初代ＣＥＦ細胞内のプラスミド駆動ＥＧＦＰ発現に及ぼす効果の比較を示している。ＶＰ－ＳＦＭ培地中のＣＥＦ細胞を、０日目に３７℃で９６ウェルプレートに播種した（４×１０４細胞／ウェル）。細胞に対し、１日目に三重反復で、ＥＧＦＰ及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）をコードするプラスミドを同時トランスフェクションした。ＥＧＦＰ遺伝子の３’－ＵＴＲ内に１０の異なるヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋを有するＥＧＦＰコードプラスミドをｍｉＲｂ－１～ｍｉＲｂ－１０と命名した（ｍｉＲＮＡ標的配列については表４を参照）。ｍｉＲｂｌｏｃｋを含まないＥＧＦＰをコードするプラスミドによるトランスフェクションをＥＧＦＰ発現の基準（「ｍｉＲｂなし」）とした。細胞に対し、２日目にフローサイトメトリーによりＥＧＦＰとＢＦＰの発現を解析した。ＢＦＰ陽性細胞のＥＧＦＰ（上）及びＢＦＰ（下）の幾何平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）を示す（幾何平均（ＧＭ）及び幾何標準偏差（ｇｅｏＳＤ）を示すエラーバー）。パーセンテージは、ｍｉＲｂｌｏｃｋを含まないＥＧＦＰ発現基準のＥＧＦＰ発現レベルに対する％を示す。
【図3】ＣＥＦ及びＤＦ－１細胞におけるプラスミドトランスフェクション後にｍｉＲｂｌｏｃｋが３０℃及び３７℃においてＥＧＦＰ発現に及ぼす効果についての解析を示している。ＶＰ－ＳＦＭ培地中のＣＥＦ細胞（左）及びＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中のＤＦ－１細胞（右）を、０日目に９６ウェルプレートに播種した（４×１０４細胞／ウェル）。細胞に対し、１日目に三重反復で、ＥＧＦＰ（「ｍｉＲｂ－１」、「ｍｉＲｂ－２」、ｍｉＲｂｌｏｃｋ対照「ｓｃｒｂｌ」）及びＢＦＰをコードするプラスミドを同時トランスフェクションした。ｍｉＲｂｌｏｃｋを含まないＥＧＦＰをコードするプラスミドによるトランスフェクションをＥＧＦＰ発現基準とした（「ｍｉＲｂなし」）。細胞を３０℃または３７℃でインキュベートし、トランスフェクションから２３時間後にフローサイトメトリーによりＥＧＦＰ及びＢＦＰの発現を解析した。ＢＦＰ陽性細胞のＥＧＦＰ（上）及びＢＦＰ（下）のＧＭＦＩを示している（ＧＭ及びｇｅｏＳＤ）。ＥＧＦＰ発現基準に対するＥＧＦＰ発現レベル％。
【図4】ＥＧＦＰをコードし、ＥＧＦＰ ３’－ＵＴＲのヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置されたｍｉＲＮＡ標的配列を含む組み換えＭＶＡインサートの設計を示している。ｍｉＲＮＡ標的配列なし（「ＥＧＦＰ」）、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２あり（「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－１」、「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－２」）、ならびに対照ｍｉＲｂｌｏｃｋあり（「ＥＧＦＰ－ｓｃｒｂｌ２」）のＥＧＦＰをコードする組み換えＭＶＡ。ＰｒＳ＝合成ポックスウイルス初期／後期プロモーター；ＲＦＰ＝赤色蛍光タンパク質；ｇｐｔ＝グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ；ｎｔ＝ヌクレオチド；ＴＴＳ＝初期転写終結シグナル；ＩＧＲ＝ＭＶＡゲノム内の遺伝子間領域。
【図5】組み換えＭＶＡによるｍｉＲｂｌｏｃｋがＥＧＦＰ発現レベルに及ぼす効果の解析を示している。ＶＰ－ＳＦＭ培地中のＣＥＦ細胞（左）及びＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中のＤＦ－１細胞（右）を、０日目に９６ウェルプレートに播種した（４×１０４細胞／ウェル）。１日目に三重反復で、細胞にｍｉＲｂｌｏｃｋなし（「ｍｉＲｂなし」、ＥＧＦＰ発現基準）か、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１もしくは－２（「ｍｉＲｂ－１」、「ｍｉＲｂ－２」）、またはｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２対照（「ｓｃｒｂｌ２」）を含むＥＧＦＰ及びＲＦＰ発現ＭＶＡ－ＢＮ組み換え体を感染多重度（ＭＯＩ）＝５で感染させた。感染中、細胞を３０℃または３７℃でインキュベートした。感染から１９時間後に、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＰＢＳ－ＦＡＣＳ－ＦＯＲＭ（１％ ＦＣＳ、０．１％ ＮａＮ３、１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ））に再懸濁した。ＥＧＦＰ及びＲＦＰの発現をフローサイトメトリーにより解析した。ＲＦＰ陽性細胞のＥＧＦＰ（上）及びＲＦＰ（下）のＧＭＦＩを示している（ＧＭ及びｇｅｏＳＤ）。ＥＧＦＰ発現基準に対するＥＧＦＰ発現レベル％。
【図6】組み換えＭＶＡを異なるＭＯＩで感染させた後にｍｉＲｂｌｏｃｋがＥＧＦＰ発現に及ぼす効果の解析を示している。ＶＰ－ＳＦＭ培地（左）中のＣＥＦ細胞（左）及びＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ（右）中のＤＦ－１細胞（右）を、０日目に三重反復で９６ウェルプレート（４×１０４細胞／ウェル）に播種した。１日目に、細胞にｍｉＲｂｌｏｃｋなし（「ｍｉＲｂなし」、ＥＧＦＰ発現基準）か、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１もしくは－２（「ｍｉＲｂ－１」、「ｍｉＲｂ－２」）、またはｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２対照（「ｓｃｒｂｌ２」）を含むＥＧＦＰ及びＲＦＰ発現ＭＶＡ－ＢＮ組み換え体を、示されるように感染多重度（ＭＯＩ）＝５、１、または０．２で感染させた。感染から６時間後に、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＰＢＳ－ＦＡＣＳ－ＦＯＲＭ（１％ ＦＣＳ、０．１％ＮａＮ３、１％ ＰＦＡ）に再懸濁した。ＥＧＦＰの発現をフローサイトメトリーにより解析した。ＥＧＦＰのＧＭＦＩ（上；ＧＭ及びｇｅｏＳＤ）及びＥＧＦＰ発現基準に対するＥＧＦＰ発現レベルのＧＭＦＩ％（下；平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ））を示している。ＲＦＰの発現は記録されなかった。
【図7】組み換えＭＶＡを低ＭＯＩで感染させた後にｍｉＲｂｌｏｃｋがＥＧＦＰ発現に及ぼす経時的な効果（複数サイクル複製）の解析を示している。ＶＰ－ＳＦＭ培地中のＣＥＦ細胞を、０日目に三重反復で９６ウェルプレートに播種した（４×１０４細胞／ウェル）。１日目に、細胞にｍｉＲｂｌｏｃｋなし（「ｍｉＲｂなし」）か、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１もしくは－２（「ｍｉＲｂ－１」、「ｍｉＲｂ－２」）、またはｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２（「ｓｃｒｂｌ２」、対照）を含むＥＧＦＰ及びＲＦＰ発現ＭＶＡ－ＢＮ組み換え体をＭＯＩ＝０．１で感染させた。指示された感染後時間に、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＰＢＳ－ＦＡＣＳ－ＦＯＲＭ（１％ ＦＣＳ、０．１％ ＮａＮ３、１％ ＰＦＡ）に再懸濁した。ＥＧＦＰ及びＲＦＰの発現をフローサイトメトリーにより解析した。ＲＦＰ陽性細胞のＥＧＦＰ（左上）及びＲＦＰ（右上）のＳＧＭＦＩ（ＧＭ及びｇｅｏＳＤ）、ならびにＥＧＦＰ発現基準に対するＧＭＦＩ ＥＧＦＰ％及びＧＭＦＩ ＲＦＰ％を示している（下；平均及びＳＥＭ）。
【図8】ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置されたｍｉＲＮＡ標的配列を含み、異なるプロモーター下でＥＧＦＰを発現する組み換えＭＶＡインサートの設計を示している。ＰｒＳ＝合成ポックスウイルス初期／後期プロモーター；Ｐｒ１３．５ｌｏｎｇ＝最初期プロモーター。
【図9】異なるポックスウイルスプロモーター下においてｍｉＲｂｌｏｃｋがＥＧＦＰ発現に及ぼす効果の比較を示している。ＶＰ－ＳＦＭ培地中のＣＥＦ細胞（左）及びＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中のＤＦ－１細胞（右）を、０日目に９６ウェルプレートに播種した（４×１０４または３×１０４細胞／ウェル）。１日目に三重反復で、細胞に、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２（「ｍｉＲｂ－２」）またはｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２（「ｓｃｒｂｌ２」、対照）と、ＰｒＳプロモーターまたはＰｒ１３．５ｌｏｎｇプロモーターのいずれかの制御下にあるｍｉＲＮＡ標的ＥＧＦＰ遺伝子とを含むＥＧＦＰ及びＲＦＰ発現ＭＶＡ－ＢＮ組み換え体を感染させた（ＭＯＩ＝１０）。感染から６時間後及び１８時間後に、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＰＢＳ－ＦＡＣＳ－ＦＯＲＭ（１％ ＦＣＳ、０．１％ ＮａＮ３、１％ ＰＦＡ）に再懸濁した。ＥＧＦＰ及びＲＦＰの発現をフローサイトメトリーにより解析した。「ｓｃｒｂｌ２」対照により感染させたＲＦＰ陽性細胞内のＥＧＦＰ発現レベルに対するＥＧＦＰのＧＭＦＩ％を示している（平均及びＳＥＭ）。ＰｒＳまたはＰｒ１３．５ｌｏｎｇプロモーター及び感染時間は示されている通り。「ｓｃｒｂｌ２」対照に対するＥＧＦＰ発現レベルの％。
【図10】ヘテロ及び関連ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋについて、プラスミド駆動ＥＧＦＰ発現に及ぼす効果に関する比較を示している。０日目に、ＶＰ－ＳＦＭ培地中のＣＥＦ細胞（４×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。細胞に対し、１日目に三重反復で、ＥＧＦＰ及びＢＦＰコードプラスミドを同時トランスフェクションした。ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１もしくは－２（「ｍｉＲｂ－１」、「ｍｉＲｂ－２」）またはホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３～－２０を含むプラスミドによるＥＧＦＰ発現を解析した。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３～－１６は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１に含まれるｍｉＲＮＡ標的配列の３回リピートを含み、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７～－２０は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２に含まれるｍｉＲＮＡ標的配列の４回リピートを含んだ。ｍｉＲｂｌｏｃｋを含まないプラスミド（「ｍｉＲｂなし」）をＥＧＦＰ発現基準とし、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２（「ｓｃｒｂｌ２」）を含むプラスミドを対照とした。トランスフェクション後１日目にフローサイトメトリーにより定量したＢＦＰ陽性細胞のＥＧＦＰ（上）及びＢＦＰ（下）のＧＭＦＩ（ＧＭ及びｇｅｏＳＤ）を示している。ＥＧＦＰ発現基準に対するＥＧＦＰ発現％。ｍｉＲｂｌｏｃｋを含むプラスミドのセットを２つの別々の実験で解析した。
【図11】ＥＧＦＰを発現しホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された選択したｍｉＲｂｌｏｃｋ－２由来ｍｉＲＮＡ標的配列を含む、組み換えＭＶＡインサートの設計を示している。ｍｉＲＮＡ標的配列なし（「ＥＧＦＰ」）、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－２あり（「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－２」）、ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７または－１８あり（「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－１７」、「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－１８」）、及び対照ｍｉＲｂｌｏｃｋあり（「ＥＧＦＰ－ｓｃｒｂｌ２」）の組み換えＭＶＡ。
【図12】ヘテロ及び関連ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋについて、組み換えＭＶＡによるＥＧＦＰ発現に及ぼす効果に関する比較を示している。ＶＰ－ＳＦＭ中のＣＥＦ細胞を、０日目に９６ウェルプレートに播種した（４×１０４細胞／ウェル）。１日目に、細胞にヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－２（「ｍｉＲｂ－２」）またはホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７もしくは－１８（「ｍｉＲｂ－１７」、「ｍｉＲｂ－１８」）を含むＭＶＡ－ＢＮ組み換え体（ＭＯＩ＝５）を感染させた。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７及び－１８は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２に含まれるｍｉＲＮＡ標的配列の４回リピートを含んだ。感染から１８時間後に、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＰＢＳ－ＦＡＣＳ－ＦＯＲＭ（１％ ＦＣＳ、０．１％ ＮａＮ３、１％ ＰＦＡ）に再懸濁した。ＥＧＦＰ及びＲＦＰの発現をフローサイトメトリーにより解析した。ＲＦＰ陽性細胞のＥＧＦＰ（左）及びＲＦＰ（右）発現のＧＭＦＩを示している（ＧＭ及びｇｅｏＳＤ）。ＥＧＦＰ発現基準（「ｍｉＲｂなし」）に対するＥＧＦＰ発現レベル％。
【図13】選択したｍｉＲＮＡに基づき設計されたホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋにより制御されたプラスミド駆動ＥＧＦＰ発現の比較を示している。０日目に、ＶＰ－ＳＦＭ培地中のＣＥＦ細胞（４×１０４細胞／ウェル）（左）及びＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中のＤＦ－１細胞（３×１０４細胞／ウェル）（右）を９６ウェルプレートに播種した。細胞に対し、１日目に三重反復で、ＥＧＦＰ及びＢＦＰ発現プラスミドをトランスフェクションした。ｍｉＲＮＡ標的配列の４回リピートから構成されたホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－２５～－３６を含むプラスミドによるＥＧＦＰ発現を解析した。ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１または－２を含むプラスミドを比較のために含めた。ｍｉＲｂｌｏｃｋを含まないプラスミド（「ｍｉＲｂなし」）をＥＧＦＰ発現基準とし、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２（「ｓｃｒｂｌ２」）を含むプラスミドを対照とした。トランスフェクション後１日目にフローサイトメトリーにより定量したＢＦＰ陽性細胞のＥＧＦＰ（上）及びＢＦＰ（下）のＧＭＦＩ（ＧＭ及びｇｅｏＳＤ）を示している。ＥＧＦＰ発現基準（「ｍｉＲｂなし」）に対するＥＧＦＰ発現％。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２５及び２６のデータを含むデータセットは、独立した実験由来のものである。
【図14】最も効果的なｍｉＲＮＡ標的配列から構成されたヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋを含む組み換えＭＶＡを感染させた細胞におけるＥＧＦＰ下方調節の解析を示している。０日目に、ＶＰ－ＳＦＭ培地中のＣＥＦ細胞（４×１０４細胞／ウェル）（左）及びＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中のＤＦ－１細胞（３×１０４細胞／ウェル）（右）を９６ウェルプレートに播種した。細胞に対し、１日目に三重反復で、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋを含むプラスミドを発現するＥＧＦＰ及びＢＦＰをトランスフェクションした。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７～－４７は、ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３、－１７－、－１８、－２０（参照：図１０）及びｍｉＲｂｌｏｃｋ－２５、－２６、－３１～－３３（参照：図１３）由来のｍｉＲＮＡ標的配列から構成された。ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－２を含むプラスミドを比較のために含めた。ｍｉＲｂｌｏｃｋを含まないプラスミド（「ｍｉＲｂなし」）をＥＧＦＰ発現基準とし、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２（「ｓｃｒｂｌ２」）を含むプラスミドを対照とした。トランスフェクション後２４時間時に、フローサイトメトリーにより細胞のＥＧＦＰ及びＢＦＰの発現を解析した。ＢＦＰ陽性細胞のＥＧＦＰ（上）及びＢＦＰ（下）のＧＭＦＩ（ＧＭ及びｇｅｏＳＤ）を示している。ＥＧＦＰ発現基準（「ｍｉＲｂなし」）に対するＥＧＦＰ発現％。
【図15】組み換えＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ及びＲＳＶ由来導入遺伝子の３’－ＵＴＲ内にｍｉＲｂｌｏｃｋを含むその改変バージョンの設計を示している。異なるプロモーターの制御下でＲＳＶ由来導入遺伝子をコードするＭＶＡ－ＢＮ組み換え体（「ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ」、「ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２」、「ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１」）を示されているように図示している。ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶでは、コードされたＲＳＶ由来導入遺伝子はｍｉＲｂｌｏｃｋに結合していない。ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２及びＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１では、それぞれ３つまたは４つすべての導入遺伝子がヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋに結合している。Ｇ（Ａ）、Ｇ（Ｂ）＝ＲＳＶ Ｇタンパク質のＡ及びＢ血清型におけるＯＲＦ；Ｎ＝ＲＳＶ核タンパク質ＯＲＦ；２Ａ＝ピコルナウイルス由来自己切断２Ａペプチド；Ｍ２－１＝ＲＳＶ Ｍ２遺伝子のＭ２－１ ＯＲＦ；Ｆ（Ａ－ｌｏｎｇ ＢＮ）＝ＲＳＶ－Ｆタンパク質の改変Ａ－ｌｏｎｇ血清型におけるＯＲＦ；示されているポックスウイルスプロモーター。
【図16】ＭＶＡコードＲＳＶ Ｇ、Ｆ、及びＮ／Ｍ２－１導入遺伝子のｍｉＲＮＡ媒介性下方調節の解析を示している。０日目に、１×１０６個のＣＥＦ細胞をＶＰ－ＳＦＭに播種した。翌日、細胞にＭＯＩ＝１で、モック感染を行うか、あるいはＭＶＡ－ＢＮ、または組み換え体ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２、もしくはＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１を感染させた。細胞ライセート（「ＣＬ」）を感染から１２時間後（左）及び１８時間後（右）調製し、タンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによりサイズに従って分離し、抗ＲＳＶ Ｇ抗体、抗ＲＳＶ Ｆ抗体、もしくは抗ＲＳＶ Ｎ抗体、または抗Ｄ８ ＶＡＣＶ抗体（ＭＶＡベクター対照）を用いたイムノブロッティングにより解析した。
【図17】ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２及びＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１の複製能力をＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶと比較して示している。感染の１日前に、ＣＥＦ細胞を６ウェルプレートに入ったＶＰ－ＳＦＭ培地に播種した。コンフルエントな単層に三重反復で、ＭＯＩ＝０．１（左）または０．０１（右）で１ｍｌ ＶＰ－ＳＦＭ中のＭＶＡ組み換え体：ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２、またはＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１を感染させた。ＭＶＡ－ＢＮ野生型（すなわち非組み換え）を比較のために含めた。感染細胞を３０℃で培養し、感染後３日目及び４日目に直接凍結して、次に行うＴＣＩＤ５０滴定に用いた。ウイルス収量は、ＴＣＩＤ５０／２ｍｌの幾何平均及びＳＤとして示している。表内に、図（上）に示すデータから算出したウイルス力価の倍数差を示している。
【図18】Ｄｅｘｔｒａｍｅｒ染色により解析した、マウスの末梢血細胞におけるＲＳＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の解析を示している。１０頭の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、０日目及び２１日目に、マウス当たり１×１０８ＴＣＩＤ５０のＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２、またはＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１で筋肉内免疫した。ＴＢＳ処置マウス（ｎ＝５）を対照として含めた。プライミング後７日目、２８日目（＝ブースト後７日目）、及び３４日目（＝ブースト後１３日目）にＰＢＭＣを収集し、ＲＳＶ Ｍ２－１及びＭＶＡ Ｅ３タンパク質（ベクター対照）内の免疫優性エピトープ、ならびに表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ４４の発現に特異的なＭＨＣクラスＩ ｄｅｘｔｒａｍｅｒで染色した。活性化され（ＣＤ４４＋）、ＲＳＶ Ｍ２－１（左）またはＭＶＡ由来Ｅ３（右）に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを示している（平均及びＳＥＭ）。
【図19】細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）及びＥＬＩＳｐｏｔにより解析したマウスの脾細胞におけるＲＳＶ特異的Ｔ細胞応答の解析を示している。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを図１８に記載のように処置した。ブースト後１３日目に、単細胞脾細胞懸濁液を調製してＴ細胞のＩＣＣＳ及びＥＬＩＳｐｏｔ解析に用いた。（Ａ）ＩＣＣＳのために、脾細胞を、示されたＲＳＶタンパク質由来の免疫優性ペプチドまたはＭＶＡ Ｅ３由来の免疫優性ＭＶＡエピトープ（ベクター対照）で６時間再刺激した。ペプチド刺激後のＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４４＋ＩＦＮ－γ＋細胞の頻度を示している（平均及びＳＥＭ）。（Ｂ）ＥＬＩＳｐｏｔ解析のために、脾細胞を免疫優性ＲＳＶ Ｇ、Ｆ、及びＭ２－１由来ペプチドまたは免疫優性ＭＶＡ－Ｅ３ペプチドで再刺激した。１×１０６個の脾細胞当たりのＩＦＮ－γ＋スポット形成コロニー（ＳＦＣ）を示している（平均及びＳＥＭ）。
【図20】マウス血清中のＲＳＶ特異的ＩｇＧ抗体力価及びＲＳＶプラーク減少中和力価の解析を示している。雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを図１８に記載のように処置した。血清を、免疫の１日前（－１日目）、プライミング後２０日目、及び３４日目（＝ブースト後１３日目）に収集した。（Ａ）ＲＳＶ及びＭＶＡ特異的ＩｇＧ抗体（それぞれ左及び右）をＥＬＩＳＡにより検出し、結果を幾何平均力価（ＧＭＴ）及びｇｅｏＳＤとして示している。（Ｂ）血清試料中のＲＳＶ Ａ２株特異的中和抗体力価をプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）により定量した（ＧＭＴ及びｇｅｏＳＤ）。血清転換のパーセンテージ（初期血清陰性マウスにおけるプラーク減少中和力価≧１５の出現として定義）を表中に示している。
【0033】
配列の簡単な説明
【表1】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表3-1】
【表3-2】
【表4】
【発明を実施するための形態】
【0034】
目的は、組み換えＭＶＡのその産生細胞での成長を改善して、とりわけ大規模なワクチン生産において、ウイルス収量を増加させることであった。
【0035】
問題は、増殖中に組み換えＭＶＡによる細胞傷害性導入遺伝子発現を減少させつつ、ワクチンレシピエントにおいて組み換えＭＶＡが導入遺伝子特異的免疫応答を誘導する潜在能力を保持することであった。
【0036】
この問題を解決するため、組み換えＭＶＡによる導入遺伝子発現を下方調節するために、鳥類ＭＶＡ産生細胞内で内在的に発現するｍｉＲＮＡを利用した。この目的において、ｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ標的配列を導入遺伝子の３’－ＵＴＲ領域に挿入した。
【0037】
発明者らは、最初に、トランスフェクションしたモデル遺伝子（ＥＧＦＰ）を用いて、組み換えＭＶＡによる導入遺伝子発現の下方調節が最も効率的なｍｉＲＮＡをスクリーニングし、次いで選択したｍｉＲＮＡ標的配列を評価して、組み換えＭＶＡでのそれらの使用を最適化するという戦略に従った。
【0038】
ここでは、ｍｉＲＮＡ標的配列を、組み換えＭＶＡが発現する導入遺伝子に結合するという概念は、ＭＶＡ産生細胞における導入遺伝子発現の下方調節に対し実施可能であることが示された。ワクシニアウイルスが細胞のマイクロＲＮＡ機構の障害を媒介することが想定されているという理由のみをとっても、そして大量の導入遺伝子産生物を実現するためにポックスウイルスプロモーターの大規模な活性化が使用されるという理由からも、このような知見は予想できなかった。
【0039】
２個の一連の異種ｍｉＲＮＡ標的配列であって、各々がいわゆるｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置されている配列、すなわちｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９及び－４２を、改変ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶの調製に選択した。ｍｉＲｂｌｏｃｋ選択の基準は、（ｉ）ＭＶＡ産生細胞における導入遺伝子発現の下方調節を媒介する活性が高いこと、（ｉｉ）ｍｉＲｂｌｏｃｋ内のｍｉＲＮＡ標的配列間の配列類似性が低いこと、ならびに（ｉｉｉ）ワクチン接種の標的組織、すなわち血液及び骨格筋における関連ｍｉＲＮＡの発現が低いこと、とした。
【0040】
最後に、ｍｉＲＮＡ標的配列（例えば、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９及び－４２）の挿入によって改変されたＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体が、ＭＶＡ産生細胞での増殖中に、非改変ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体よりも高いウイルス収量をもたらすことが示された。さらに、マウス免疫実験において、組み換えＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ内の導入遺伝子に結合したｍｉＲＮＡ標的配列が、ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＳＶ由来抗原の免疫原性を損なわないことも示された。
【0041】
定義
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で別段の明確な指示がない限り、複数の言及物が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「核酸配列（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ））」には、１つ以上の核酸配列が含まれる。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で別段の明確な指示がない限り、複数の言及物が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「核酸配列（ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ））」には、１つ以上の核酸配列が含まれる。
【0042】
本明細書で使用される場合、複数の記述されている要素の間の「及び／または」という接続語は、個々の選択肢と組み合わせの選択肢の両方を包含すると理解される。例えば、２つの要素が「及び／または」により結ばれている場合、第１の選択肢は、第１の要素が第２の要素なしで適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第２の要素が第１の要素なしで適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢の任意の１つがこの意味に含まれ、よって本明細書で使用される「及び／または」という用語の要件を満たすものと理解される。選択肢のうちの２つ以上を同時に適用可能であることも、その意味の範囲内に入り、したがって、「及び／または」という用語の要件を満たすと理解される。
【0043】
本明細書及び添付の特許請求の範囲の全体を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、記述されている、整数もしくは工程または整数群もしくは工程群の包含であって、他の任意の整数もしくは工程または整数群もしくは工程群の除外ではないことを示唆していることが理解される。本発明の説明中の態様または実施形態との関連において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は修正可能であり、したがって、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語で置き換えられるかまたは本明細書で使用される場合は「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語で置き換えられ得る。同様に、前述の用語（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、有する（ｈａｖｉｎｇ））はいずれも、本発明の説明における態様または実施形態の文脈で使用される場合は常に、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を含み、これらは各々管轄に応じた特定の法的意味を示す。
【0044】
本明細書で使用される場合、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、請求項の要素内で特定されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書で使用される場合、「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、請求項の基本的な及び新規の特徴に実質的な影響を及ぼさない材料またはステップを除外しない。
【0045】
本明細書に記載されている「組み換えＭＶＡ」という用語は、野生型ウイルスには天然に存在しない、ゲノム内に挿入された外来核酸配列を含むＭＶＡを指す。したがって、組み換えＭＶＡとは、自然界には存在しない、または自然界には見られない配置で別の核酸に結合した、合成または半合成起源の核酸配列の２つ以上のセグメントを人工的に組み合わせることにより作製されたＭＶＡを指す。人工的組み合わせは、最も一般的には、確立された遺伝子操作技術を用いて、単離された核酸セグメントを人工的に操作することにより達成される。概して、本明細書に記載されている「組み換えＭＶＡ」とは、標準的な遺伝子操作法により生成されたＭＶＡを指し、したがって、例えば組み換えＭＶＡは、遺伝子操作または遺伝子改変ＭＶＡである。したがって、「組み換えＭＶＡ」という用語は、少なくとも１つの組み換え核酸を、好ましくは転写単位の形態でそのゲノムに組み込んだＭＶＡ（例えば、ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標））を含む。組み換えＭＶＡは、調節エレメント（例えば、プロモーター）の誘導により、異種抗原決定基、ポリペプチド、またはタンパク質（抗原）を発現することがある。
【0046】
本明細書で使用される場合、「異種」という用語は、ＭＶＡにとって本来ネイティブでない（または外来である）が、組み換え技術を用いて人工的にＭＶＡに挿入された遺伝子または導入遺伝子またはＤＮＡ配列を指す。同様に、「異種ｍｉＲｂｌｏｃｋ」という表現は、それを含むＭＶＡに対し異種であるｍｉＲｂｌｏｃｋを指す。
【0047】
「ｍｉＲＮＡ」（「マイクロＲＮＡ」の省略形）という用語は、典型的には２１～２３ヌクレオチド（ｎｔ）長の小さな一本鎖非コードＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡに結合することにより、ＲＮＡサイレンシング及び遺伝子発現の転写後調節において機能する。
【0048】
ｍｉＲＮＡの名称は主に、特定されたｍｉＲＮＡの単純な連番に基づき、この連番の前に当該ｍｉＲＮＡが特定された生物の略称が付される。本明細書で言及されるすべてのｍｉＲＮＡは、ＣＥＦ細胞またはニワトリ組織で特定されているため、それぞれのｍｉＲＮＡ名の前にｇｇａ（ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ）を表す）を付ける必要があり、例えば、（本明細書で使用する）「ｍｉＲ－１７－５ｐ」の正式名称はｇｇａ－ｍｉＲ－１７－５ｐとなる。本明細書で提示する試験ではニワトリｍｉＲＮＡのみを試験したため、読みやすさのため、すべてのｍｉＲＮＡ名前でｇｇａを省略した。
【0049】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ配列」という用語は、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列を指す。
【0050】
「シード配列」という用語は、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列内にある、ｍｉＲＮＡとｍＲＮＡとの間の結合に不可欠なセクションを指す。このセクションは７～８ヌクレオチド長であり、ｍＲＮＡ配列内の関連セクションに対し完全に相補的である。
【0051】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的配列」とは、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列に対応する核酸配列を意味する。ｍｉＲＮＡの配列とその対応標的配列との間のマッチング（すなわちヌクレオチド相補性）は１００％適合またはそれ以下であり得る。
【0052】
本明細書で使用される場合、「対応する」または「～に対応する」という用語は、関連するヌクレオチド配列（例えば、ｍｉＲＮＡの）に対する、ヌクレオチド配列（例えば、ｍｉＲＮＡ標的配列の）に関するものである。より正確には、あるｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ標的配列は、当該ｍｉＲＮＡ配列の対応物または相補配列を表す。
【0053】
「相補的」という用語は、ヌクレオチドが二本鎖構造を形成するように互いにマッチする２個のヌクレオチド配列を指す。
【0054】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲｂｌｏｃｋ」という用語は、一連のｍｉＲＮＡ標的配列を指す。この文脈における「一連」とは、２つ、３つ、またはそれ以上の連続したまたは連鎖状のｍｉＲＮＡ標的配列を意味する。
【0055】
「ホモオリゴマー」ｍｉＲｂｌｏｃｋは、一連の同一のｍｉＲＮＡ標的配列から構成される。
【0056】
ヘテロオリゴマー「ｍｉＲｂｌｏｃｋ」は、ヌクレオチド配列が異なる一連のｍｉＲＮＡ標的配列から構成される。通常は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内のすべてのｍｉＲＮＡ標的配列は互いに異なる。代替的に、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列は互いに異なり、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の他の配列は同一である。
【0057】
導入遺伝子発現の文脈における「下方調節」または「下方制御」という用語は、導入遺伝子産物の量の低減または減少に関するものである。この低減または減少は、導入遺伝子ｍＲＮＡの量の低減、または導入遺伝子ｍＲＮＡの翻訳の低減から生じる。
【0058】
本明細書で使用される場合、「転写単位」は、導入遺伝子及びそれに作用可能に結合したプロモーター、ターミネーター、及び任意選択で一連のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。
【0059】
本明細書で使用される場合、「作用可能に結合した」という用語は、第１の核酸配列（例えば、導入遺伝子）が第２の核酸配列（例えば、プロモーター）と機能的関係にあることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写を指示できる位置にある場合、プロモーターは導入遺伝子のコード配列に作用可能に結合している。
【0060】
略語
ＢＦＰ：青色蛍光タンパク質
ｂｐ：塩基対（複数可）
ＣＥＦ：ニワトリ胚線維芽細胞
ＣＭＶ：サイトメガロウイルス
ＤＦ－１：ニワトリ連続線維芽細胞株の名称
ＥＧＦＰ：高感度緑色蛍光タンパク質
ｍｉＲｂ：ｍｉＲｂｌｏｃｋ、すなわち一連のｍｉＲＮＡ標的配列
ｍｉＲＮＡ：マイクロＲＮＡ
ＭＯＩ：感染多重度
ＭＶＡ：改変ワクシニアウイルスアンカラ
ＭＶＡ－ＢＮ：ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）（Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ）
ｎｔ：ヌクレオチド
ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム
ｐ．ｉ．：感染後
ＲＦＰ：赤色蛍光タンパク質
ＲＳＶ：呼吸器合胞体ウイルス
ＴＣＩＤ５０：５０％組織培養感染量
ＴＴＳ：転写終結シグナル
ＢＦＰ：青色蛍光タンパク質
ｂｐ：塩基対（複数可）
ＣＥＦ：ニワトリ胚線維芽細胞
ＣＭＶ：サイトメガロウイルス
ＤＦ－１：ニワトリ連続線維芽細胞株の名称
ＥＧＦＰ：高感度緑色蛍光タンパク質
ｍｉＲｂ：ｍｉＲｂｌｏｃｋ、すなわち一連のｍｉＲＮＡ標的配列
ｍｉＲＮＡ：マイクロＲＮＡ
ＭＯＩ：感染多重度
ＭＶＡ：改変ワクシニアウイルスアンカラ
ＭＶＡ－ＢＮ：ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）（Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ）
ｎｔ：ヌクレオチド
ＯＲＦ：オープンリーディングフレーム
ｐ．ｉ．：感染後
ＲＦＰ：赤色蛍光タンパク質
ＲＳＶ：呼吸器合胞体ウイルス
ＴＣＩＤ５０：５０％組織培養感染量
ＴＴＳ：転写終結シグナル
【0061】
実施形態
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内のｍｉＲＮＡ標的配列のうちの少なくとも１個は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内での導入遺伝子の発現レベルの下方調節を媒介可能である。
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内のｍｉＲＮＡ標的配列のうちの少なくとも１個は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内での導入遺伝子の発現レベルの下方調節を媒介可能である。
【0062】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内のｍｉＲＮＡ標的配列のうちの少なくとも１個は、ｍｉＲＮＡ標的配列が対応するｍｉＲＮＡに結合すると、真核生物ＭＶＡ産生細胞内での導入遺伝子の発現レベルの下方調節を媒介する。
【0063】
１つの実施形態において、導入遺伝子の発現レベルの下方調節は、ｍｉＲＮＡ標的配列に結合していない導入遺伝子と比較して、（例えば、細胞当たりの）導入遺伝子産物の量が少ないことを意味する。
【0064】
１つの実施形態において、導入遺伝子の発現レベルの下方調節とは、導入遺伝子のｍＲＮＡのレベルの低減または導入遺伝子のｍＲＮＡの翻訳の低減を意味する。
【0065】
１つの実施形態において、いかなるｍｉＲＮＡ標的配列にも結合していない導入遺伝子の発現レベルと比較した導入遺伝子の発現レベルの低減または減少は、約２０、４０、６０、８０、９０、または９９％である。
【0066】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の一連のｍｉＲＮＡ標的配列は、２、３、４、５、６、７、８個、またはそれ以上の一連のｍｉＲＮＡ標的配列、好ましくは３、４、５、６、または７個の一連のｍｉＲＮＡ標的配列、より好ましくは３または４個の一連の標的配列、最も好ましくは４個の一連の標的配列である。
【0067】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の一連のｍｉＲＮＡ標的配列は、２～１０個、好ましくは２～８個の一連のｍｉＲＮＡ標的配列、より好ましくは３～７個の一連のｍｉＲＮＡ標的配列、さらに好ましくは２～５個の一連のｍｉＲＮＡ標的配列、最も好ましくは３～５個の一連のｍｉＲＮＡ標的配列である。
【0068】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、導入遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’－ＵＴＲ領域に挿入される。
【0069】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、５’側の最初のｍｉＲＮＡ標的配列の５’側の最初のヌクレオチドが、約１～５００ヌクレオチド、または約２～１００ヌクレオチド、または約３～５０ヌクレオチド、好ましくは５～２５ヌクレオチド、より好ましくは約１０～２０ヌクレオチド、さらに好ましくは約１３～１７ヌクレオチド、最も好ましくは１５ヌクレオチドのスペーサーヌクレオチド配列を介し導入遺伝子ＯＲＦの終止コドンと連結するように、導入遺伝子に結合する。代替的に、好ましさは劣るが、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、５’側の最初のｍｉＲＮＡ標的配列の５’側の最初のヌクレオチドが、導入遺伝子ＯＲＦの終止コドンに直接、すなわちスペーサーヌクレオチド配列なしで連結するように、導入遺伝子に結合する。
【0070】
１つの実施形態において、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子は、導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋと一緒に、組み換えＭＶＡの遺伝子間領域（ＩＧＲ）、好ましくは、ＩＧＲ４４／４５、６４／６５、８８／８９、及び１４８／１４９からなる群より選択されるＩＧＲに挿入される。
【0071】
１つの実施形態において、転写単位は組み換えＭＶＡの遺伝子間領域（ＩＧＲ）、好ましくは、ＩＧＲ４４／４５、６４／６５、８８／８９、及び１４８／１４９からなる群より選択されるＩＧＲに挿入される。
【0072】
ｍｉＲＮＡ標的配列に関する実施形態
１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡ標的配列はｍｉＲＮＡに対応し、その結果、ｍｉＲＮＡ標的配列はｍｉＲＮＡとの結合または部分的結合が可能である。
１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡ標的配列はｍｉＲＮＡに対応し、その結果、ｍｉＲＮＡ標的配列はｍｉＲＮＡとの結合または部分的結合が可能である。
【0073】
１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡに対応するｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列に対し部分的または完全に相補的である。
【0074】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の少なくとも１個のｍｉＲＮＡ標的配列は、約８０～１００％、好ましくは約９０～１００％、より好ましくは約９５～１００％、最も好ましくは約１００％の配列類似性でｍｉＲＮＡ配列に対応する。最も好ましいのは、１００％の配列同一性である。
【0075】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の少なくとも１個のｍｉＲＮＡ標的配列は、約８０～１００％、好ましくは約９０～１００％、より好ましくは約９５～１００％、最も好ましくは約１００％の配列類似性でｍｉＲＮＡ配列に対応するシード配列外のヌクレオチド配列を含む。最も好ましいのは、１００％の配列同一性である。
【0076】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の少なくとも１個のｍｉＲＮＡ標的配列は、ｍｉＲＮＡ配列に相補的であり、好ましくは約１００％の配列類似性で相補的である。最も好ましいのは、１００％の配列同一性である。
【0077】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の少なくとも１個のｍｉＲＮＡ標的配列は、配列番号１（ｍｉＲ－１７－５ｐに対応）、配列番号２（ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ）、配列番号３（ｍｉＲ－２１－５ｐ）、配列番号４（ｍｉＲ－２２１ａ－３ｐ）、配列番号５（ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ）、配列番号６（ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ）、配列番号７（ｍｉＲ－１９９－３ｐ）、配列番号８（ｍｉＲ－３３－５ｐ）、配列番号９（ｍｉＲ－２１８ｂ－５ｐ）に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択される。
【0078】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の少なくとも１個のｍｉＲＮＡ標的配列は、配列番号１（ｍｉＲ－１７－５ｐに対応）、配列番号２（ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ）、配列番号３（ｍｉＲ－２１－５ｐ）、配列番号４（ｍｉＲ－２２１ａ－３ｐ）、配列番号６（ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ）、及び配列番号７（ｍｉＲ－１９９－３ｐ）に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択される。
【0079】
ｍｉＲｂｌｏｃｋに関する実施形態
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の一連のｍｉＲＮＡ標的配列は、約２００ｂｐ未満、好ましくは約１５０ｂｐ未満、より好ましくは約９０～１００ｂｐを含む、またはそれからなる。
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の一連のｍｉＲＮＡ標的配列は、約２００ｂｐ未満、好ましくは約１５０ｂｐ未満、より好ましくは約９０～１００ｂｐを含む、またはそれからなる。
【0080】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内のｍｉＲＮＡ標的配列は、ヘテロまたはホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ、好ましくはヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置されている。
【0081】
１つの実施形態において、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内のすべてのｍｉＲＮＡ標的配列は互いに異なる。別の実施形態において、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内の少なくとも２つまたはほとんどのｍｉＲＮＡ標的配列は互いに異なる。詳細には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、そのヌクレオチド配列が異なる。
【0082】
１つの実施形態において、３または４個、好ましくは４個のｍｉＲＮＡ標的配列がヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置されている。好ましくは、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内の３または４個、好ましくは４個のｍｉＲＮＡ標的配列はすべて互いに異なる。詳細には、ｍｉＲＮＡ標的配列は、そのヌクレオチド配列が異なる。
【0083】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内の各ｍｉＲＮＡ標的配列からの２個のｍｉＲＮＡ標的配列は、約１～１０ヌクレオチド、好ましくは約２～８ヌクレオチド、より好ましくは約３～６ヌクレオチド、最も好ましくは４ヌクレオチドのスペーサーヌクレオチド配列によって区切られている。代替的に、好ましさは劣るが、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内のｍｉＲＮＡ標的配列は、スペーサーヌクレオチド配列によって区切られていない。
【0084】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋの後にはポックスウイルス転写終結シグナル（ＴＴＳ）が続く。
【0085】
１つの実施形態において、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内のｍｉＲＮＡ標的配列は、配列番号１（ｍｉＲ－１７－５ｐに対応）、配列番号２（ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ）、配列番号３（ｍｉＲ－２１－５ｐ）、配列番号４（ｍｉＲ－２２１ａ－３ｐ）、配列番号５（ｍｉＲ－１８ａ－５ｐ）、配列番号６（ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ）、配列番号７（ｍｉＲ－１９９－３ｐ）、配列番号８（ｍｉＲ－３３－５ｐ）、配列番号９（ｍｉＲ－２１８ｂ－５ｐ）に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択される。
【0086】
１つの実施形態において、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内のｍｉＲＮＡ標的配列は、配列番号１（ｍｉＲ－１７－５ｐに対応）、配列番号２（ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ）、配列番号３（ｍｉＲ－２１－５ｐ）、配列番号４（ｍｉＲ－２２１ａ－３ｐ）、配列番号６（ｍｉＲ－１９ａ－３ｐ）、及び配列番号７（ｍｉＲ－１９９－３ｐ）に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択される。
【0087】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号１（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１のｍｉＲ－１７－５ｐに対応）に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0088】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号２（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２のｍｉＲ－２０ａ－５ｐに対応）、配列番号３（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２のｍｉＲ－２１－５ｐ）、及び配列番号４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２のｍｉＲ－２２１ａ－３ｐ）に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0089】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号１（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７のｍｉＲ－１７－５ｐに対応）、配列番号２（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７のｍｉＲ－２０ａ－５ｐ）、配列番号３（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７のｍｉＲ－２１－５ｐ）、及び配列番号６（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７のｍｉＲ－１９ａ－３ｐ）に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0090】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号１（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３８のｍｉＲ－１７－５ｐに対応）、配列番号３（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３８のｍｉＲ－２１－５ｐ）、配列番号５（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３８のｍｉＲ－１８ａ－５ｐ）、及び配列番号６（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３８のｍｉＲ－１９ａ－３ｐ）に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0091】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号１（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９のｍｉＲ－１７－５ｐに対応）、配列番号５（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９のｍｉＲ－１８ａ－５ｐ）、配列番号６（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９のｍｉＲ－１９ａ－３ｐ）、及び配列番号７（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９のｍｉＲ－１９９－３ｐ）に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0092】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号１（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１のｍｉＲ－１７－５ｐに対応）、配列番号４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１のｍｉＲ－２２１ａ－５ｐ）、配列番号８（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１のｍｉＲ－３３－５ｐ）、及び配列番号９（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１のｍｉＲ－２１８ｂ－５ｐ）に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0093】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号４８（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１に対応）、配列番号４９（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２）、配列番号５５（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ－２）、配列番号５１（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７）、配列番号５２（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３８）、配列番号５３（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９）、及び配列番号５４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１）に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【0094】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号４８（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１に対応）、配列番号４９（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２）、配列番号５３（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９）、及び配列番号５４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１）に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【0095】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５３（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９に対応）、及び配列番号５４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１）に示されるヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【0096】
１つの実施形態において、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１に対応）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【0097】
プロモーターに関する実施形態
１つの実施形態において、プロモーターは、初期／後期プロモーターまたは初期プロモーターであり、好ましくは最初期プロモーターである。
１つの実施形態において、プロモーターは、初期／後期プロモーターまたは初期プロモーターであり、好ましくは最初期プロモーターである。
【0098】
１つの実施形態において、初期／後期プロモーターは、ＰｒＳ、Ｐｒ７．５、及びＰｒＨ５ｍプロモーターからなる群より選択される。
【0099】
１つの実施形態において、最初期プロモーターは、Ｐｒ１３．５ｌｏｎｇ、Ｐｒ１３２８、ＰｒＬＥ１（ｐＨｙｂ）プロモーターからなる群より選択される。
【0100】
好ましい実施形態において、プロモーターはＰｒ１３．５ｌｏｎｇプロモーターである。
【0101】
導入遺伝子に関する実施形態
１つの実施形態において、導入遺伝子は、タンパク質またはペプチド、好ましくは１つ以上の抗原決定基を含むタンパク質またはペプチド、より好ましくはタンパク質性またはペプチド性抗原をコードする。
１つの実施形態において、導入遺伝子は、タンパク質またはペプチド、好ましくは１つ以上の抗原決定基を含むタンパク質またはペプチド、より好ましくはタンパク質性またはペプチド性抗原をコードする。
【0102】
１つの実施形態において、導入遺伝子は、ウイルス、細菌、真菌、植物、寄生虫、非ヒト動物、及びヒト抗原からなる群より選択される抗原、またはその抗原部分をコードする。
【0103】
１つの実施形態において、導入遺伝子は、ウイルス抗原またはその一部をコードする。
【0104】
１つの実施形態において、ウイルス抗原は、アルファウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、デングウイルス、エボラウイルス、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、東部、西部、またはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＥＥＶ）、グアナリートウイルス、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ－２）、ヒトヘルペスウイルス８型（ＨＨＶ－８）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、マチュポウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ムンプスウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ライノウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビアウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、西ナイルウイルス、及び黄熱ウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来する。
【0105】
１つの実施形態において、ウイルス抗原はＲＳＶに由来する。
【0106】
１つの実施形態において、導入遺伝子は、ＲＳＶに由来するタンパク質、またはその抗原部分、好ましくは、ＲＳＶ Ｇ（Ａ）、Ｇ（Ｂ）、Ｆ、Ｎ、及びＭ２－１タンパク質、ならびにＮ／Ｍ２－１融合タンパク質からなる群より選択されるものをコードする。
【0107】
１つの実施形態において、ウイルス抗原は、東部、西部、またはベネズエラＥＥＶに由来する。
【0108】
１つの実施形態において、導入遺伝子は、東部、西部、もしくはベネズエラＥＥＶ、またはその抗原部分に由来するタンパク質、好ましくは、エンベロープポリタンパク質Ｅ３、Ｅ２、６ｋ、及びＥ１からなる群より選択されるタンパク質をコードする。
【0109】
１つの実施形態において、ウイルス抗原はエプスタイン－バーウイルスに由来する。
【0110】
１つの実施形態において、導入遺伝子は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）もしくは腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、またはその抗原部分をコードする。
【0111】
ｍｉＲＮＡに関する実施形態
１つの実施形態において、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡは、真核生物ＭＶＡ産生細胞内に存在する、検出可能である、または発現している。
１つの実施形態において、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡは、真核生物ＭＶＡ産生細胞内に存在する、検出可能である、または発現している。
【0112】
１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、真核生物ＭＶＡ産生細胞に対し内在性である。
【0113】
１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、トランスジェニック細胞株において異種ヌクレオチド配列によりコードされ、好ましくは発現する。
【0114】
好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡは、骨格筋細胞及び血液細胞（例えば、白血球）内で発現しない、または低い程度もしくは中程度にしか発現しない。
【0115】
真核生物ＭＶＡ産生細胞に関する実施形態
１つの実施形態において、真核生物ＭＶＡ産生細胞は鳥類（例えば、ニワトリ）細胞であり、好ましくは、鳥類初代細胞または鳥類永久細胞株の細胞である。
１つの実施形態において、真核生物ＭＶＡ産生細胞は鳥類（例えば、ニワトリ）細胞であり、好ましくは、鳥類初代細胞または鳥類永久細胞株の細胞である。
【0116】
１つの実施形態において、真核生物ＭＶＡ産生細胞、好ましくは鳥類初代細胞はニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）である。
【0117】
１つの実施形態において、真核生物ＭＶＡ産生細胞、好ましくは鳥類永久細胞株の細胞はＤＦ－１またはウズラ細胞である。
【0118】
ＭＶＡに関する実施形態
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ） においてｉｎ ｖｉｔｒｏで生殖的複製能力を有し、ただしヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ヒト胚腎細胞株２９３、及びヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａにおいて生殖的複製能力を有しない、ＭＶＡまたはＭＶＡ誘導体に由来する。
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ） においてｉｎ ｖｉｔｒｏで生殖的複製能力を有し、ただしヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ヒト胚腎細胞株２９３、及びヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａにおいて生殖的複製能力を有しない、ＭＶＡまたはＭＶＡ誘導体に由来する。
【0119】
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、２０００年８月３０日にＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）にアクセッション番号Ｖ０００８３００８として寄託されたＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）に由来する。
【0120】
いくつかの導入遺伝子を有する組み換えＭＶＡに関する実施形態
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは複数の、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはさらにそれ以上の導入遺伝子または転写単位を含む。
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは複数の、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、またはさらにそれ以上の導入遺伝子または転写単位を含む。
【0121】
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、第１、第２、及び第３の、または第１～第４の、または第１～第５の、または第１～第６の、またはそれ以上の転写単位を含む。
【0122】
好ましい実施形態において、組み換えＭＶＡは４つまたは第１～第４の転写単位を含む。
【0123】
２つ超の導入遺伝子を含む組み換えＭＶＡの１つの実施形態において、各導入遺伝子は異なり、好ましくは、各転写単位は異なる導入遺伝子を含む。
【0124】
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、ｍｉＲＮＡ標的配列を含まない１つ以上の転写単位をさらに含み、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含み、導入遺伝子に結合したｍｉＲＮＡ標的配列を含まない、１つ以上の転写単位を含む。
【0125】
ＲＳＶ由来タンパク質をコードする導入遺伝子を有する組み換えＭＶＡに関する実施形態
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む転写単位を含み、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内で発現するｍｉＲＮＡに対応するか、またはそれに相補的であり、
（ａ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードし、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターはＰｒ７．５プロモーターであり、
（ｂ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードし、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＳプロモーターであり、
（ｃ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｆタンパク質をコードし、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＨ５ｍプロモーターであり、及び／または
（ｄ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１融合タンパク質をコードし、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＬＥ１プロモーターである。
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む転写単位を含み、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内で発現するｍｉＲＮＡに対応するか、またはそれに相補的であり、
（ａ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードし、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターはＰｒ７．５プロモーターであり、
（ｂ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードし、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＳプロモーターであり、
（ｃ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｆタンパク質をコードし、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＨ５ｍプロモーターであり、及び／または
（ｄ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１融合タンパク質をコードし、好ましくは、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＬＥ１プロモーターである。
【0126】
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む転写単位を含み、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内で発現するｍｉＲＮＡに対応するか、またはそれに相補的であり、導入遺伝子はＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１融合タンパク質をコードし、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＬＥ１プロモーターである。
【0127】
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、第１～第３の転写単位内にＲＳＶ由来タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、各転写単位は、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡ配列に対応するか、またはそれに相補的であり、
（ａａ）第１の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードし、
（ｂｂ）第２の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードし、
（ｃｃ）第３の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする。
（ａａ）第１の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードし、
（ｂｂ）第２の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードし、
（ｃｃ）第３の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする。
【0128】
組み換えＭＶＡが第１～第３の転写単位内にＲＳＶ由来タンパク質をコードする導入遺伝子を含む１つの実施形態において、
（ａａ’）ＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号４９（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２に対応）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、
（ｂｂ’）ＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号４８（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、
（ｃｃ’）ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号４８（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
（ａａ’）ＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号４９（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２に対応）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、
（ｂｂ’）ＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号４８（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、
（ｃｃ’）ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号４８（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【0129】
好ましい実施形態である１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、第１～第４の転写単位内にＲＳＶ由来タンパク質をコードする導入遺伝子を含み、各転写単位は、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡ配列に対応するか、またはそれに相補的であり、
（ａａａ）第１の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードし、
（ｂｂｂ）第２の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードし、
（ｃｃｃ）第３の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｆタンパク質をコードし、
（ｄｄｄ）第４の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ－Ｎ／Ｍ２－１タンパク質をコードする。
（ａａａ）第１の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードし、
（ｂｂｂ）第２の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードし、
（ｃｃｃ）第３の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ Ｆタンパク質をコードし、
（ｄｄｄ）第４の転写単位内の導入遺伝子はＲＳＶ－Ｎ／Ｍ２－１タンパク質をコードする。
【0130】
組み換えＭＶＡが第１～第４の転写単位内にＲＳＶ由来タンパク質をコードする導入遺伝子を含む１つの実施形態において、
（ａａａ’）ＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１に対応）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、
（ｂｂｂ’）ＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５３（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、
（ｃｃｃ’）ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５３（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、
（ｄｄｄ’）ＲＳＶ－Ｎ／Ｍ２－１タンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
（ａａａ’）ＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１に対応）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、
（ｂｂｂ’）ＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５３（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、
（ｃｃｃ’）ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５３（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなり、
（ｄｄｄ’）ＲＳＶ－Ｎ／Ｍ２－１タンパク質をコードする導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【0131】
１つの実施形態において、
（ｗ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードし、ポックスウイルスプロモーターはＰｒ７．５プロモーターであり、
（ｘ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードし、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＳプロモーターであり、
（ｙ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｆタンパク質をコードし、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＨ５ｍプロモーターであり、及び／または
（ｚ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１融合タンパク質をコードし、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＬＥ１プロモーターである。
（ｗ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ａ）タンパク質をコードし、ポックスウイルスプロモーターはＰｒ７．５プロモーターであり、
（ｘ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｇ（Ｂ）タンパク質をコードし、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＳプロモーターであり、
（ｙ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｆタンパク質をコードし、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＨ５ｍプロモーターであり、及び／または
（ｚ）導入遺伝子はＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１融合タンパク質をコードし、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＬＥ１プロモーターである。
【0132】
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合した導入遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む転写単位を含み、このヌクレオチド配列は、導入遺伝子に結合したｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置された一連のｍｉＲＮＡ標的配列をさらに含み、各ｍｉＲＮＡ標的配列は、真核生物ＭＶＡ産生細胞内のｍｉＲＮＡ配列に対応するか、またはそれに相補的であり、導入遺伝子はＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１融合タンパク質をコードし、ポックスウイルスプロモーターはＰｒＬＥ１プロモーターであり、ｍｉＲｂｌｏｃｋは、配列番号５４（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４１）に示されるヌクレオチド配列を含む、またはそれからなる。
【0133】
医療使用または治療に関する実施形態
１つの実施形態において、医薬品またはワクチンとして使用するための、好ましくは疾患の治療または予防に使用するための、より好ましくは感染性疾患またはがんの治療または予防に使用するための組み換えＭＶＡは、対象に使用するためのものである。
１つの実施形態において、医薬品またはワクチンとして使用するための、好ましくは疾患の治療または予防に使用するための、より好ましくは感染性疾患またはがんの治療または予防に使用するための組み換えＭＶＡは、対象に使用するためのものである。
【0134】
１つの実施形態において、対象は鳥類ではなく、好ましくはヒトまたは非ヒト哺乳類である。
【0135】
１つの実施形態において、感染性疾患は、ＲＳＶ感染症、または東部、西部、もしくはベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＥＥＶ）の感染症、またはエプスタイン－バーウイルスの感染症であり、好ましくはＲＳＶ感染症である。
【0136】
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは筋肉内または皮下投与され、好ましくは筋肉内投与される。
【0137】
さらなる実施形態
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、約３０℃～３７℃の温度、好ましくは約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、及び３７℃からなる群より選択される温度、最も好ましくは約３０℃または３７℃の温度で、真核生物産生細胞において増殖される。
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、約３０℃～３７℃の温度、好ましくは約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、及び３７℃からなる群より選択される温度、最も好ましくは約３０℃または３７℃の温度で、真核生物産生細胞において増殖される。
【0138】
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、ＤＦ－１細胞内で約３０℃または３７℃の温度で、真核生物産生細胞内で増殖される。
【0139】
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、感染多重度（ＭＯＩ）＝０．００１～５、好ましくはＭＯＩ＝０．００１、０．０５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、１、２、または５で組み換えＭＶＡを感染させた後、真核生物産生細胞培養物中で増殖される。
【0140】
１つの実施形態において、組み換えＭＶＡは、多サイクル複製設定において真核生物産生細胞培養物中で増殖される。
【0141】
さらなる詳細
改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）
過去において、ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞で、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）を５１６代連続継代することによって作製された（概説については、Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．１９７５）。このウイルスは、その実質的に変化した特性を考慮して、継代５７０代目でＣＶＡからＭＶＡに改名された。ＭＶＡは５７０代目までさらなる継代を受けた。これらの長期継代の結果、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、その約３１キロベースのゲノム配列が欠失しており、そのため、トリ細胞での複製に関して、宿主細胞が非常に限られているものとして説明された（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９１）。この得られたＭＶＡが、完全に複製能のある出発材料と比較して大いに非病原性であることが様々な動物モデルにおいて示された（Ｍａｙｒ ａｎｄ Ｄａｎｎｅｒ １９７８）。
改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）
過去において、ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞で、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）を５１６代連続継代することによって作製された（概説については、Ｍａｙｒ ｅｔ ａｌ．１９７５）。このウイルスは、その実質的に変化した特性を考慮して、継代５７０代目でＣＶＡからＭＶＡに改名された。ＭＶＡは５７０代目までさらなる継代を受けた。これらの長期継代の結果、得られたＭＶＡウイルスのゲノムは、その約３１キロベースのゲノム配列が欠失しており、そのため、トリ細胞での複製に関して、宿主細胞が非常に限られているものとして説明された（Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９１）。この得られたＭＶＡが、完全に複製能のある出発材料と比較して大いに非病原性であることが様々な動物モデルにおいて示された（Ｍａｙｒ ａｎｄ Ｄａｎｎｅｒ １９７８）。
【0142】
本発明の実施において有用なＭＶＡとしては、ＭＶＡ－５７２（１９９４年１月２７日にＥＣＡＣＣ Ｖ９４０１２７０７として寄託）、ＭＶＡ－５７５（２０００年１２月７日にＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７として寄託）、ＭＶＡ－Ｉ７２１（Ｓｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００９に参照されている）、ＮＩＨクローン１（２００３年３月２７日にＡＴＣＣ（登録商標）ＰＴＡ－５０９５として寄託）、及びＭＶＡ－ＢＮ（２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８として寄託）が挙げられる。
【0143】
より好ましくは、本発明に従って使用されるＭＶＡとしては、ＭＶＡ－ＢＮ及びＭＶＡ－ＢＮ誘導体が挙げられる。ＭＶＡ－ＢＮは、ＷＯ０２／０４２４８０に記載されている。「ＭＶＡ－ＢＮ誘導体」とは、本明細書に記載のようなＭＶＡ－ＢＮと本質的に同じ複製特性を示すが、それらのゲノムの１つ以上の部分に差異を示す任意のウイルスを指す。
【0144】
ＭＶＡ－ＢＮ及びＭＶＡ－ＢＮ誘導体は複製不能であり、すなわちｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで生殖的に複製することができない。より具体的には、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮ誘導体は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）では生殖的複製が可能であると説明されているが、ヒトケラチノサイト細胞株ＨａＣａＴ（Ｂｏｕｋａｍｐ ｅｔ ａｌ １９８８）、ヒト骨骨肉腫細胞株１４３Ｂ（ＥＣＡＣＣ寄託番号９１１１２５０２）、ヒト胚腎細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ寄託番号８５１２０６０２）、及びヒト子宮頸部腺癌細胞株ＨｅＬａ（ＡＴＡＣＣ寄託番号ＣＣＬ－２）では生殖複製が不可能であると説明されている。さらに、ＭＶＡ－ＢＮまたはＭＶＡ－ＢＮ誘導体は、Ｈｅｌａ細胞及びＨａＣａＴ細胞株においてＭＶＡ－５７５よりも少なくとも２倍、より好ましくは３倍低いウイルス増幅比率を有する。ＭＶＡ－ＢＮ及びＭＶＡ－ＢＮ誘導体のこれらの特性に関する試験及びアッセイは、ＷＯ０２／４２４８０及びＷＯ０３／０４８１８４に記載されている。
【0145】
上記のようにｉｎ ｖｉｔｒｏのヒト細胞株における「生殖的複製が不可能」という用語は、例えばＷＯ０２／４２４８０で説明されており、当該文献はまた、上記のような所望の特性を有するＭＶＡを得る方法についても教示している。この用語は、ＷＯ０２／４２４８０またはＵＳ６，７６１，８９３に記載されているアッセイを用いて感染から４日後にｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルス増幅率が１未満であるウイルスに適用される。
【0146】
組み換えＭＶＡウイルスの例示的作製
本明細書で開示されている組み換えＭＶＡの作製には、異なる方法を適用してよい。ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列は、ポックスウイルスのＤＮＡのセクションに相同なＤＮＡが挿入されているＥ．ｃｏｌｉプラスミドコンストラクトに配置することができる。別途、挿入するＤＮＡ配列をプロモーターにライゲーションしてもよい。プロモーター－遺伝子結合は、非必須座位を含むポックスウイルスＤＮＡの領域に隣接するＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列が両端に隣接するように、プラスミドコンストラクト内に配置することができる。得られたプラスミドコンストラクトは、Ｅ．ｃｏｌｉ菌内での増殖により増幅させ、単離することができる。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含む単離プラスミドは、細胞培養物、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養物にトランスフェクションすることができ、同時に培養物をＭＶＡに感染させる。プラスミド及びウイルスゲノムのそれぞれにおいて相同なＭＶＡウイルスＤＮＡ間の組み換えを行うことで、外来（異種）ＤＮＡ配列の存在により改変されたＭＶＡを作製することができる。
本明細書で開示されている組み換えＭＶＡの作製には、異なる方法を適用してよい。ウイルスに挿入されるＤＮＡ配列は、ポックスウイルスのＤＮＡのセクションに相同なＤＮＡが挿入されているＥ．ｃｏｌｉプラスミドコンストラクトに配置することができる。別途、挿入するＤＮＡ配列をプロモーターにライゲーションしてもよい。プロモーター－遺伝子結合は、非必須座位を含むポックスウイルスＤＮＡの領域に隣接するＤＮＡ配列と相同なＤＮＡ配列が両端に隣接するように、プラスミドコンストラクト内に配置することができる。得られたプラスミドコンストラクトは、Ｅ．ｃｏｌｉ菌内での増殖により増幅させ、単離することができる。挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含む単離プラスミドは、細胞培養物、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の細胞培養物にトランスフェクションすることができ、同時に培養物をＭＶＡに感染させる。プラスミド及びウイルスゲノムのそれぞれにおいて相同なＭＶＡウイルスＤＮＡ間の組み換えを行うことで、外来（異種）ＤＮＡ配列の存在により改変されたＭＶＡを作製することができる。
【0147】
例えばＣＥＦ細胞のような好適な細胞培養物の細胞に、ＭＶＡウイルスを感染させることができる。続いて感染細胞に、外来または異種遺伝子（単数または複数）（例えば、本明細書で提供される核酸のうちの１つ以上）を含む第１のプラスミドベクターを、好ましくはポックスウイルス発現制御エレメントの転写制御下で、トランスフェクションすることができる。上記で説明されているように、プラスミドベクターは、ＭＶＡウイルスゲノムの選択された部分への外来配列の挿入を誘導する能力がある配列も含む。任意選択で、プラスミドベクターは、ポックスウイルスプロモーターに作用可能に結合したマーカー遺伝子及び／または選択遺伝子を含むカセットも含む。選択カセットまたはマーカーカセットの使用により、作製された組み換えＭＶＡの特定及び単離が簡略になる。ただし、組み換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても同定することができる。その後、さらなる細胞に、上記のようにして得られた組み換えＭＶＡを感染させ、それに第２の外来または異種の遺伝子（複数可）を含む第２のベクターをトランスフェクションすることができる。念のため、この遺伝子は、ポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入されるべきであり、第２のベクターにおいても、ポックスウイルスのゲノムへの第２の外来遺伝子（複数可）の組み込みを誘導する、ポックスウイルスと相同な配列が異なる。相同組み換えが発生した後に、２つ以上の外来または異種遺伝子を含む組み換えウイルスを単離することができる。追加の外来遺伝子を組み換えウイルスに導入する場合、前の感染工程で単離された組み換えウイルスを用いることによって、かつトランスフェクション用のさらなる外来遺伝子（複数可）を含むさらなるベクターを用いることによって、感染及びトランスフェクションの工程を繰り返すことができる。組み換えＭＶＡを作製するために知られている他の技術が多数ある。
【0148】
本発明の実施では、特に明記しない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、及び組み換え技術の従来技術が用いられ、それらはいずれも当業者の技量の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）シリーズ、ＰＣＲ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ ＭＪ，Ｈａｍｓ ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ ＧＲ，ｅｄｓ，１９９５、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ，１９８８を参照のこと。
【実施例】
【0149】
以下の実施例は、本開示をさらに説明する役割を果たす。実施例を本発明を限定するものとして理解してはならない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定められる。
【0150】
実施例１：材料及び方法
１．１ 細胞及びウイルス
ニワトリ線維芽細胞株ＤＦ－１をＡＴＣＣから入手した。１１日齢のニワトリ発育卵から初代ＣＥＦ細胞を調製した。ＣＥＦ細胞を、トランスフェクション及びウイルスストック生産用にはＶＰ－ＳＦＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１％ゲンタマイシン及び４ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加）中で、複製解析及びウイルス滴定用にはＤＭＥＭ（１０％ ＦＣＳを追加）中で培養した。この試験で使用したＭＶＡは、ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）（Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ；本明細書では「ＭＶＡ－ＢＮ」と称する）から構築したバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）クローンに由来し、過去に説明されているものである（３５）（ＷＯ０２／４２４８０）。ＭＶＡ－ＢＮ野生型及びＭＶＡ－ＢＮ組み換え体をＣＥＦまたはＤＦ－１細胞内で増殖させ、ＴＣＩＤ５０法を用いてＣＥＦ細胞において滴定した。ＭＶＡ－ＢＡＣ再活性化用のショープ線維腫ウイルスをＡＴＣＣ（ＶＲ－３６４）から入手し、ウサギ角膜ＳＩＲＣ細胞において増殖させ滴定した。
１．１ 細胞及びウイルス
ニワトリ線維芽細胞株ＤＦ－１をＡＴＣＣから入手した。１１日齢のニワトリ発育卵から初代ＣＥＦ細胞を調製した。ＣＥＦ細胞を、トランスフェクション及びウイルスストック生産用にはＶＰ－ＳＦＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１％ゲンタマイシン及び４ｍＭ Ｌ－グルタミンを追加）中で、複製解析及びウイルス滴定用にはＤＭＥＭ（１０％ ＦＣＳを追加）中で培養した。この試験で使用したＭＶＡは、ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）（Ｂａｖａｒｉａｎ Ｎｏｒｄｉｃ；本明細書では「ＭＶＡ－ＢＮ」と称する）から構築したバクテリア人工染色体（ＢＡＣ）クローンに由来し、過去に説明されているものである（３５）（ＷＯ０２／４２４８０）。ＭＶＡ－ＢＮ野生型及びＭＶＡ－ＢＮ組み換え体をＣＥＦまたはＤＦ－１細胞内で増殖させ、ＴＣＩＤ５０法を用いてＣＥＦ細胞において滴定した。ＭＶＡ－ＢＡＣ再活性化用のショープ線維腫ウイルスをＡＴＣＣ（ＶＲ－３６４）から入手し、ウサギ角膜ＳＩＲＣ細胞において増殖させ滴定した。
【0151】
１．２ ＢＡＣ組み換え操作及び感染性組み換えＭＶＡの再活性化
ＭＶＡ－ＢＡＣの構築については、過去に説明されている（３５）。簡潔に説明すると、挿入されるＢＡＣカセットは、Ｅ．ｃｏｌｉ内で維持するためのプラスミドｐＭＢＯ１３１（３６）に由来するｍｉｎｉＦプラスミド配列を含む。ＢＡＣカセットを、ＶＡＣＶ－Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ遺伝子Ｉ３Ｌ及びＩ４ＬのＭＶＡオルソログ（ＭＶＡ０６４Ｌ／ＭＶＡ０６５Ｌ）間に挿入した。元来含まれているネオマイシン－ホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ）ＩＩ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰマーカーカセットを細菌テトラサイクリン発現カセットに置き換えて、ＢＡＣバックボーンから高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を除去し、ｍｉＲＮＡ標的配列に結合したＥＧＦＰ導入遺伝子の挿入及び解析ができるようにした。ＭＶＡ－ＢＡＣを、説明されている通りに、対抗選択可能ｒｐｓＬ／ｎｅｏカセットを用いたアレル交換変異誘発により改変した（３５）。ＥＧＦＰ遺伝子をＰｒＳ－ｇｐｔ－ＲＦＰカセット（図４を参照）と一緒に、合成ポックスウイルス初期／後期プロモーターＰｒＳの制御下で、ＶＡＣＶ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ命名法における遺伝子ＭＶＡ０４４Ｌ／ＭＶＡ０４５Ｌ（Ｆ１４Ｌ及びＦ１５Ｌ）間の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入した（２３）。それぞれのｍｉＲＮＡにおける標的配列（表１及び表２に収載）、またはｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２のスクランブルバージョンを有する対照ｍｉＲｂｌｏｃｋ）（表３を参照）を、ＥＧＦＰ遺伝子の３’－ＵＴＲの終止コドンに続いて直接挿入した。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３（ｍｉＲｂｌｏｃｋについては表５及び表６を参照）から開始して、ＥＧＦＰ ＯＲＦの終止コドンと５’近位ｍｉＲＮＡ標的配列の最初のヌクレオチドとの間に１５ヌクレオチドのスペーサーを挿入した。初期遺伝子のポックスウイルス転写終結配列を、ｍｉＲＮＡ標的配列の下流に挿入した。ｍｉＲｂｌｏｃｋを含まない基準組み換えＭＶＡ－ＥＧＦＰのＥＧＦＰ遺伝子の３’－ＵＴＲには、初期の転写終結配列（ＴＴＳ）のみを挿入した（「ＥＧＦＰ発現基準」）。ＭＶＡ－ＢＡＣからの感染性ウイルスを再活性化するため、１０６個のＢＨＫ－２１細胞に、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３μｇのＢＡＣ ＤＮＡをトランスフェクションし、６０分後にショープ線維腫ウイルスを感染させて必要なヘルパー機能を提供した。再活性化したウイルスをＣＥＦ細胞内でさらに継代培養することにより単離し、ヘルパーウイルスを過去に説明されている通りに除去した（３５）。
ＭＶＡ－ＢＡＣの構築については、過去に説明されている（３５）。簡潔に説明すると、挿入されるＢＡＣカセットは、Ｅ．ｃｏｌｉ内で維持するためのプラスミドｐＭＢＯ１３１（３６）に由来するｍｉｎｉＦプラスミド配列を含む。ＢＡＣカセットを、ＶＡＣＶ－Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ遺伝子Ｉ３Ｌ及びＩ４ＬのＭＶＡオルソログ（ＭＶＡ０６４Ｌ／ＭＶＡ０６５Ｌ）間に挿入した。元来含まれているネオマイシン－ホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔ）ＩＩ－ＩＲＥＳ－ＥＧＦＰマーカーカセットを細菌テトラサイクリン発現カセットに置き換えて、ＢＡＣバックボーンから高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を除去し、ｍｉＲＮＡ標的配列に結合したＥＧＦＰ導入遺伝子の挿入及び解析ができるようにした。ＭＶＡ－ＢＡＣを、説明されている通りに、対抗選択可能ｒｐｓＬ／ｎｅｏカセットを用いたアレル交換変異誘発により改変した（３５）。ＥＧＦＰ遺伝子をＰｒＳ－ｇｐｔ－ＲＦＰカセット（図４を参照）と一緒に、合成ポックスウイルス初期／後期プロモーターＰｒＳの制御下で、ＶＡＣＶ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ命名法における遺伝子ＭＶＡ０４４Ｌ／ＭＶＡ０４５Ｌ（Ｆ１４Ｌ及びＦ１５Ｌ）間の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入した（２３）。それぞれのｍｉＲＮＡにおける標的配列（表１及び表２に収載）、またはｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２のスクランブルバージョンを有する対照ｍｉＲｂｌｏｃｋ）（表３を参照）を、ＥＧＦＰ遺伝子の３’－ＵＴＲの終止コドンに続いて直接挿入した。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３（ｍｉＲｂｌｏｃｋについては表５及び表６を参照）から開始して、ＥＧＦＰ ＯＲＦの終止コドンと５’近位ｍｉＲＮＡ標的配列の最初のヌクレオチドとの間に１５ヌクレオチドのスペーサーを挿入した。初期遺伝子のポックスウイルス転写終結配列を、ｍｉＲＮＡ標的配列の下流に挿入した。ｍｉＲｂｌｏｃｋを含まない基準組み換えＭＶＡ－ＥＧＦＰのＥＧＦＰ遺伝子の３’－ＵＴＲには、初期の転写終結配列（ＴＴＳ）のみを挿入した（「ＥＧＦＰ発現基準」）。ＭＶＡ－ＢＡＣからの感染性ウイルスを再活性化するため、１０６個のＢＨＫ－２１細胞に、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて３μｇのＢＡＣ ＤＮＡをトランスフェクションし、６０分後にショープ線維腫ウイルスを感染させて必要なヘルパー機能を提供した。再活性化したウイルスをＣＥＦ細胞内でさらに継代培養することにより単離し、ヘルパーウイルスを過去に説明されている通りに除去した（３５）。
【0152】
（ＰｒＳプロモーターの制御下の）ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７及び－１８を含む組み換えＭＶＡ、ならびにＰｒ１３．５ｌｏｎｇ最初期プロモーターの制御下のＥＧＦＰ－ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２及びＥＧＦＰ－ｓｃｒｂｌ２を発現する組み換え体を、ＣＥＦ細胞内での標準的な相同組み換えにより、ＩＧＲ ＭＶＡ０４４Ｌ／ＭＶＡ０４５Ｌへの導入遺伝子を標的とする隣接相同性領域を有するトランスファープラスミドを用いて、上述のＢＡＣ由来組み換えＭＶＡと同様に作製した。得られた組み換え体を、ＣＥＦ細胞でプラーク精製を３ラウンド行うことにより精製した。
【0153】
すべての組み換えＭＶＡウイルスストックをＤＦ－１細胞において生成し、説明されている通りにＴＣＩＤ５０法を用いてＣＥＦ細胞において滴定した（３）。マウス実験用の組み換えＭＶＡをＣＥＦ細胞上で増殖させ、スクロースクッション遠心分離を２回連続行って精製し、ＴＣＩＤ５０滴定法を用いてＣＥＦ細胞上で滴定した。
【0154】
１．３ ｍｉＲＮＡ標的ＥＧＦＰ発現解析のためのプラスミド設計及びクローニング
ＥＧＦＰの３’－ＵＴＲに挿入する様々なｍｉＲＮＡ標的配列またはｍｉＲｂｌｏｃｋは、フォワードプライマーと一緒にＥＧＦＰ遺伝子の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーとして機能するオリゴヌクレオチドプライマーとして配列した。ＯＲＦの３’末端にｍｉＲＮＡ標的配列を含み、両端にクローニング用の制限部位を含む完全なＥＧＦＰ ＯＲＦを有するＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、哺乳類発現ベクターｐＥＧＦＰ－Ｃ１にクローニングした。このベクターから、鳥類細胞と同様にすべての哺乳類細胞内で活性のヒトＣＭＶプロモーターの制御下で様々なＥＧＦＰ遺伝子を発現させた。様々なｍｉＲｂｌｏｃｋで試験したｍｉＲＮＡ標的配列を表１及び２に収載する。
ＥＧＦＰの３’－ＵＴＲに挿入する様々なｍｉＲＮＡ標的配列またはｍｉＲｂｌｏｃｋは、フォワードプライマーと一緒にＥＧＦＰ遺伝子の増幅のためのリバースＰＣＲプライマーとして機能するオリゴヌクレオチドプライマーとして配列した。ＯＲＦの３’末端にｍｉＲＮＡ標的配列を含み、両端にクローニング用の制限部位を含む完全なＥＧＦＰ ＯＲＦを有するＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、哺乳類発現ベクターｐＥＧＦＰ－Ｃ１にクローニングした。このベクターから、鳥類細胞と同様にすべての哺乳類細胞内で活性のヒトＣＭＶプロモーターの制御下で様々なＥＧＦＰ遺伝子を発現させた。様々なｍｉＲｂｌｏｃｋで試験したｍｉＲＮＡ標的配列を表１及び２に収載する。
【0155】
１．４ トランスフェクションアッセイ
０日目に、新たに調製したＶＰ－ＳＦＭ培地中のＣＥＦ細胞（４×１０４細胞／ウェル）及びＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中のＤＦ－１細胞（３×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。細胞に対し、１日目に三重反復で、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をメーカーの指示に従って用いたトランスフェクションを、９６ウェル当たり０．３μｌのトランスフェクション試薬及び０．１μｇのプラスミドＤＮＡ（ヒトＣＭＶプロモーターにより駆動するＥＧＦＰまたはＢＦＰを発現するプラスミドを１：２の比率で含む）を含む５μｌのトランスフェクションミックスを用いて行った。ｍｉＲｂｌｏｃｋを含まないＥＧＦＰをコードするプラスミドによるトランスフェクションをＥＧＦＰ発現基準とし、スクランブルｍｉＲｂｌｏｃｋ－２を含むＥＧＦＰをコードするプラスミドを対照とした。続いて、細胞を３７℃で、示された時間期間の間インキュベートした。トランスフェクション後１日目に、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＰＢＳ－ＦＡＣＳ－ＦＯＲＭ（１％ ＦＣＳ、０．１％ ＮａＮ３、１％ ＰＦＡ）に再懸濁し、次いでフローサイトメトリーによりＥＧＦＰ及びＢＦＰの発現を解析した。
０日目に、新たに調製したＶＰ－ＳＦＭ培地中のＣＥＦ細胞（４×１０４細胞／ウェル）及びＤＭＥＭ／１０％ ＦＣＳ中のＤＦ－１細胞（３×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。細胞に対し、１日目に三重反復で、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をメーカーの指示に従って用いたトランスフェクションを、９６ウェル当たり０．３μｌのトランスフェクション試薬及び０．１μｇのプラスミドＤＮＡ（ヒトＣＭＶプロモーターにより駆動するＥＧＦＰまたはＢＦＰを発現するプラスミドを１：２の比率で含む）を含む５μｌのトランスフェクションミックスを用いて行った。ｍｉＲｂｌｏｃｋを含まないＥＧＦＰをコードするプラスミドによるトランスフェクションをＥＧＦＰ発現基準とし、スクランブルｍｉＲｂｌｏｃｋ－２を含むＥＧＦＰをコードするプラスミドを対照とした。続いて、細胞を３７℃で、示された時間期間の間インキュベートした。トランスフェクション後１日目に、細胞をトリプシン処理し、洗浄し、ＰＢＳ－ＦＡＣＳ－ＦＯＲＭ（１％ ＦＣＳ、０．１％ ＮａＮ３、１％ ＰＦＡ）に再懸濁し、次いでフローサイトメトリーによりＥＧＦＰ及びＢＦＰの発現を解析した。
【0156】
１．５ 蛍光マーカー発現解析のためのフローサイトメトリー
細胞培養単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により細胞を採取して、単一細胞懸濁液を調製した。ＥＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）の発現解析を行うため、細胞をＰＢＳ－ＦＡＣＳ（２％ ＦＣＳ、０．１％ＮａＮ３）に再懸濁し、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いたフローサイトメトリーにより直接解析した。
細胞培養単層をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理により細胞を採取して、単一細胞懸濁液を調製した。ＥＧＦＰ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）の発現解析を行うため、細胞をＰＢＳ－ＦＡＣＳ（２％ ＦＣＳ、０．１％ＮａＮ３）に再懸濁し、ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いたフローサイトメトリーにより直接解析した。
【0157】
１．６ ウイルス複製解析
多サイクルウイルス複製の解析を行うため、６ウェル細胞培養プレートのコンフルエントな単層を、５００μｌのＦＣＳなしのＤＭＥＭ中の示された感染多重度（ＭＯＩ）における超音波処理ウイルス希釈液により感染させた。３７℃及び５％ ＣＯ２で６０分間吸着させた後、接種物を吸引し、細胞をＤＭＥＭで１回洗浄し、ＤＭＥＭ／２％ ＦＣＳ中、３７℃及び５％ ＣＯ２でさらにインキュベートした。細胞及び上清を示された時点で採取し、３回凍結融解し、超音波処理してから滴定した。ＣＥＦ細胞におけるＭＶＡの収量を、説明されている通りにＴＣＩＤ５０滴定法を用いて測定した（３）。
多サイクルウイルス複製の解析を行うため、６ウェル細胞培養プレートのコンフルエントな単層を、５００μｌのＦＣＳなしのＤＭＥＭ中の示された感染多重度（ＭＯＩ）における超音波処理ウイルス希釈液により感染させた。３７℃及び５％ ＣＯ２で６０分間吸着させた後、接種物を吸引し、細胞をＤＭＥＭで１回洗浄し、ＤＭＥＭ／２％ ＦＣＳ中、３７℃及び５％ ＣＯ２でさらにインキュベートした。細胞及び上清を示された時点で採取し、３回凍結融解し、超音波処理してから滴定した。ＣＥＦ細胞におけるＭＶＡの収量を、説明されている通りにＴＣＩＤ５０滴定法を用いて測定した（３）。
【0158】
１．７ 組み換えＭＶＡによるＲＳＶタンパク質発現のイムノブロット解析
細胞を、感染の前日に１２ウェル組織培養プレートに播種した。過去に説明されている通り（３７）に感染を実施した。感染後の示された時間に、細胞を低温リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２００μｌの１Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファー（６５ｍＭトリス－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％グリセロール、２％ ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、ベータ－メルカプトエタノール［３５μｌ／ｍｌ］）中で室温で５分間溶解し、次に３分間超音波処理を行い、続いて９５℃で５分間加熱した。ライセートを１８，０００ｘｇで１分間遠心分離して、細胞デブリを除去した。細胞ライセート中の可溶性タンパク質をプレキャストＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ ＴＧＸ、１０％；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で分離し、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及びＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐａｃｋ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移した。０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＮａＮ３を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）中で５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）を用いて膜をブロックし、以下に挙げる初代抗体（ブロッキングバッファーで希釈）とともに、４℃で一晩振とうしながらインキュベートした。膜を工程間で０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＴＢＳで４回（合計２０～４０分）洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合しマウスまたはウサギＩｇＧに向けられた二次抗体とともに、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。二次抗体を５％スキムミルク粉末を含むＴＢＳ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に希釈した。バンドを増強化学発光（ＥＣＬ）により、２つの異なる基質試薬、標準試薬としてのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び高感度検出のためのＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１：１０希釈）を用いて可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ及びＩｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてシグナルを記録して、画像解析及び定量化に用いた。
細胞を、感染の前日に１２ウェル組織培養プレートに播種した。過去に説明されている通り（３７）に感染を実施した。感染後の示された時間に、細胞を低温リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、２００μｌの１Ｘ Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファー（６５ｍＭトリス－ＨＣｌ［ｐＨ６．８］、１０％グリセロール、２％ ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、ベータ－メルカプトエタノール［３５μｌ／ｍｌ］）中で室温で５分間溶解し、次に３分間超音波処理を行い、続いて９５℃で５分間加熱した。ライセートを１８，０００ｘｇで１分間遠心分離して、細胞デブリを除去した。細胞ライセート中の可溶性タンパク質をプレキャストＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル（ＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ ＴＧＸ、１０％；Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で分離し、Ｔｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）及びＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐａｃｋ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に移した。０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０及び０．１％ ＮａＮ３を含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５）中で５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）を用いて膜をブロックし、以下に挙げる初代抗体（ブロッキングバッファーで希釈）とともに、４℃で一晩振とうしながらインキュベートした。膜を工程間で０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＴＢＳで４回（合計２０～４０分）洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合しマウスまたはウサギＩｇＧに向けられた二次抗体とともに、振とうしながら室温で１時間インキュベートした。二次抗体を５％スキムミルク粉末を含むＴＢＳ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に希釈した。バンドを増強化学発光（ＥＣＬ）により、２つの異なる基質試薬、標準試薬としてのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び高感度検出のためのＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｓｅｌｅｃｔ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１：１０希釈）を用いて可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ Ｔｏｕｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ及びＩｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いてシグナルを記録して、画像解析及び定量化に用いた。
【0159】
以下の初代抗体をイムノブロット解析に使用した：抗ＲＳＶ Ｇ（ａｃｒｉｓ ＢＭ１２６８）、抗ＲＳＦ Ｆ（ａｂｃａｍ ａｂ４３８１２）、ＲＳＶ Ｎ（ａｂｃａｍ ａｂ９４８０６）、または抗Ｄ８ ＶＡＣＶ（ｃｌｏｎｅ ＡＢ１２ＩＴ－０１２－００１Ｍ１）（すべてマウス、１：１０００）。
【0160】
１．８ マウス免疫
１０頭の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ ＳＡＳ，Ｓａｉｎｔ－Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）の群を、０日目（プライミング）及び２１日目（ブースト）に、の１０８ＴＣＩＤ５０のそれぞれのＭＶＡ組み換え体を含む合計１００μｌの接種物（各後肢に５０μｌ）を筋肉内（ｉ．ｍ．）経路により免疫した。ＴＢＳ処置マウス（ｎ＝５）を対照として含めた。解析を行うため、指示時点で尾静脈から血液を収集して２％ ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム、及び２．５Ｕ／ｍｌヘパリンを含むＰＢＳに入れ、以下に記載のように処理した。免疫後の３４日目にマウスを安楽死させ、Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）用に脾細胞を準備した。すべての動物実験はＵｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａ政府（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｏｂｅｒｂａｙｅｒｎ）の承認を受けている。
１０頭の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ ＳＡＳ，Ｓａｉｎｔ－Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）の群を、０日目（プライミング）及び２１日目（ブースト）に、の１０８ＴＣＩＤ５０のそれぞれのＭＶＡ組み換え体を含む合計１００μｌの接種物（各後肢に５０μｌ）を筋肉内（ｉ．ｍ．）経路により免疫した。ＴＢＳ処置マウス（ｎ＝５）を対照として含めた。解析を行うため、指示時点で尾静脈から血液を収集して２％ ＦＣＳ、０．１％アジ化ナトリウム、及び２．５Ｕ／ｍｌヘパリンを含むＰＢＳに入れ、以下に記載のように処理した。免疫後の３４日目にマウスを安楽死させ、Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）用に脾細胞を準備した。すべての動物実験はＵｐｐｅｒ Ｂａｖａｒｉａ政府（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ ｖｏｎ Ｏｂｅｒｂａｙｅｒｎ）の承認を受けている。
【0161】
１．９ Ｔ細胞アッセイ：ＲＳＶ－Ｍ２－１及びＭＶＡ－Ｅ３特異的ＣＤ８ Ｔ細胞に対するＤｅｘｔｒａｍｅｒ染色
ＲＳＶ及びＭＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の解析を行うため、７日目、２８日目、及び３４日目にマウスから血液を収集し、赤血球溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をメーカーの指示に従って用いて赤血球を溶解することにより、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製した。ＰＢＭＣを、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドにおけるＲＳＶ Ｍ２－１またはＭＶＡ Ｅ３（対照）の免疫優性エピトープ、ならびに表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ４４の発現に特異的なＭＨＣクラスＩ ｄｅｘｔｒａｍｅｒ（Ｉｍｍｕｄｅｘ）で染色した。
ＲＳＶ及びＭＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の解析を行うため、７日目、２８日目、及び３４日目にマウスから血液を収集し、赤血球溶解バッファー（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をメーカーの指示に従って用いて赤血球を溶解することにより、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製した。ＰＢＭＣを、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドにおけるＲＳＶ Ｍ２－１またはＭＶＡ Ｅ３（対照）の免疫優性エピトープ、ならびに表面マーカーＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ４４の発現に特異的なＭＨＣクラスＩ ｄｅｘｔｒａｍｅｒ（Ｉｍｍｕｄｅｘ）で染色した。
【0162】
１．１０ 細胞内サイトカイン染色及びＥＬＩＳｐｏｔ解析
ブースト後１３日目（３４日目）にマウスを屠殺し、脾臓を収集して、７０μｍのセルストレーナーにより組織を機械的に破壊しながらコラゲナーゼ／ＤＮａｓｅ消化を行い、次に赤血球溶解（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を行うことにより、単細胞懸濁液を調製した。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）のために、脾細胞を示されているペプチドまたは対照で６時間再刺激し、その後ＩＣ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ＆ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定し、細胞表面マーカー及び細胞内サイトカインＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２の発現について染色した。ＥＬＩＳｐｏｔ解析を行うため、５×１０５個の脾細胞／ウェルを、Ｈ－２ｄハプロタイプにおける指示されたＲＳＶタンパク質及びＭＶＡ Ｅ３に対する免疫優性ペプチドで二重反復で再刺激し、メーカーのプロトコル（ＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴ）に従って応答をアッセイした。
ブースト後１３日目（３４日目）にマウスを屠殺し、脾臓を収集して、７０μｍのセルストレーナーにより組織を機械的に破壊しながらコラゲナーゼ／ＤＮａｓｅ消化を行い、次に赤血球溶解（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を行うことにより、単細胞懸濁液を調製した。細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）のために、脾細胞を示されているペプチドまたは対照で６時間再刺激し、その後ＩＣ Ｆｉｘａｔｉｏｎ ＆ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定し、細胞表面マーカー及び細胞内サイトカインＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－２の発現について染色した。ＥＬＩＳｐｏｔ解析を行うため、５×１０５個の脾細胞／ウェルを、Ｈ－２ｄハプロタイプにおける指示されたＲＳＶタンパク質及びＭＶＡ Ｅ３に対する免疫優性ペプチドで二重反復で再刺激し、メーカーのプロトコル（ＢＤ（商標）ＥＬＩＳＰＯＴ）に従って応答をアッセイした。
【0163】
１．１１ ＲＳＶ及びＭＶＡ特異的抗体に対するＥＬＩＳＡ
ＲＳＶ及びＭＶＡ特異的ＩｇＧ抗体力価の解析を行うため、免疫の１日前（－１日目）、プライミング接種後２０日目、及び３４日目（＝ブースト接種後１３日目）に血清を収集した。血清中のＲＳＶ及びＭＶＡ特異的ＩｇＧレベルを直接ＥＬＩＳＡにより測定した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＲＳＶ抗原（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）またはＭＶＡ－ＢＮ感染細胞由来粗抽出物で一晩コーティングした。試料を、血清に対し１：１００で開始する段階希釈を用いて滴定した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）を検出抗体として使用した。抗体力価を４パラメーターフィット（Ｍａｇｅｌｌａｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により算出し、光学密度＝０．２４をもたらす血清希釈度として規定した。Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ ３６５）を用いて、幾何平均力価（ＧＭＴ）及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を算出した。アッセイのカットオフ値（ＯＤ＜０．２４）未満の抗体力価には、計算の目的で恣意的値「１」を付与した。
ＲＳＶ及びＭＶＡ特異的ＩｇＧ抗体力価の解析を行うため、免疫の１日前（－１日目）、プライミング接種後２０日目、及び３４日目（＝ブースト接種後１３日目）に血清を収集した。血清中のＲＳＶ及びＭＶＡ特異的ＩｇＧレベルを直接ＥＬＩＳＡにより測定した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ＲＳＶ抗原（Ｍｅｒｉｄｉａｎ）またはＭＶＡ－ＢＮ感染細胞由来粗抽出物で一晩コーティングした。試料を、血清に対し１：１００で開始する段階希釈を用いて滴定した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）またはヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）を検出抗体として使用した。抗体力価を４パラメーターフィット（Ｍａｇｅｌｌａｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）により算出し、光学密度＝０．２４をもたらす血清希釈度として規定した。Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｏｆｆｉｃｅ ３６５）を用いて、幾何平均力価（ＧＭＴ）及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を算出した。アッセイのカットオフ値（ＯＤ＜０．２４）未満の抗体力価には、計算の目的で恣意的値「１」を付与した。
【0164】
１．１２ ＲＳＶ中和抗体のＰＲＮＴ
ＲＳＶプラーク減少中和力価の解析を行うため、免疫の１日前（－１日目）、プライミング接種後２０日目、及び３４日目（＝ブースト接種後１３日目）に血清を収集した。ＲＳＶ特異的中和力価を、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）により測定した。血清試料の２倍連続希釈液を規定数のＲＳＶ－Ａ２プラーク形成単位（ｐｆｕ）とともに３０分間インキュベートして、ウイルス中和を行った。次いで混合物をＶｅｒｏ細胞に７０分間吸着させた。オーバーレイ培地を加え、プレートを５日間インキュベートした。Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔで染色した後、ニューラルネットワークプラークカウントパッケージを用いてプラークカウントに基づいてＰＲＮＴ力価を定量及び算出した。中和力価は、成熟ウイルスの５０％を中和できる血清希釈度として示される。
ＲＳＶプラーク減少中和力価の解析を行うため、免疫の１日前（－１日目）、プライミング接種後２０日目、及び３４日目（＝ブースト接種後１３日目）に血清を収集した。ＲＳＶ特異的中和力価を、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）により測定した。血清試料の２倍連続希釈液を規定数のＲＳＶ－Ａ２プラーク形成単位（ｐｆｕ）とともに３０分間インキュベートして、ウイルス中和を行った。次いで混合物をＶｅｒｏ細胞に７０分間吸着させた。オーバーレイ培地を加え、プレートを５日間インキュベートした。Ｃｒｙｓｔａｌ Ｖｉｏｌｅｔで染色した後、ニューラルネットワークプラークカウントパッケージを用いてプラークカウントに基づいてＰＲＮＴ力価を定量及び算出した。中和力価は、成熟ウイルスの５０％を中和できる血清希釈度として示される。
【0165】
実施例２：ｍｉＲＮＡ標的配列及びｍｉＲｂｌｏｃｋの設計
最初に、科学文献（２８～３４）からＣＥＦ細胞内に最も多く存在することが報告されているｍｉＲＮＡを抽出した。さらに、非感染ＣＥＦ細胞及び非組み換え型ＭＶＡに感染したＣＥＦ細胞内のｍｉＲＮＡをＲＮＡシークエンシングにより定量した。
最初に、科学文献（２８～３４）からＣＥＦ細胞内に最も多く存在することが報告されているｍｉＲＮＡを抽出した。さらに、非感染ＣＥＦ細胞及び非組み換え型ＭＶＡに感染したＣＥＦ細胞内のｍｉＲＮＡをＲＮＡシークエンシングにより定量した。
【0166】
ｍｉＲＮＡの標的配列には、それぞれのｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列と完全にマッチするヌクレオチド配列を使用した。通常、４個のｍｉＲＮＡ標的配列は、いわゆる「ｍｉＲｂｌｏｃｋ」（本明細書では「ｍｉＲｂ」と略することがある）内に連続して配置されている。場合によっては、４個ではなく３個（１つの例外的事例では８個）のｍｉＲＮＡ標的配列をｍｉＲｂｌｏｃｋ内で組み合わせた。個々のｍｉＲＮＡ標的配列に関するｍｉＲｂｌｏｃｋの組成は、ヘテロまたはホモオリゴマーであった。
【0167】
選択したｍｉＲＮＡ、それらの対応する標的配列、及びそれぞれ構築したｍｉＲｂｌｏｃｋを以下の表５及び６に収載する。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３～－２０は、文献（２５～３１）にあるニワトリｍｉＲＮＡ存在量及び特異性のデータに基づき、ｍｉＲＮＡ標的配列から構築した。少数の事例（「ｍｉＲ－９９９９」、「ｍｉＲ－１００００」）では、ｍｉＲｖｉｅｗｅｒデータベースからｍｉＲＮＡを選択した。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２５～３６は、独自のｍｉＲＮＡシーケンスデータに基づいて特定されたｍｉＲＮＡ標的配列から構築し、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７～－４７は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３～－３６で過去に使用したｍｉＲＮＡ標的配列から構成された。
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表6】
【0168】
実施例３：プラスミド内のｍｉＲＮＡ標的配列
３．１ ｍｉＲＮＡ標的配列を含むプラスミドの構築
ニワトリ細胞内での導入遺伝子発現の下方調節を媒介するｍｉＲＮＡ標的配列の潜在可能性を評価する目的で、プラスミドを構築した。このようなプラスミドコンストラクトのインサートを図１に示す。
３．１ ｍｉＲＮＡ標的配列を含むプラスミドの構築
ニワトリ細胞内での導入遺伝子発現の下方調節を媒介するｍｉＲＮＡ標的配列の潜在可能性を評価する目的で、プラスミドを構築した。このようなプラスミドコンストラクトのインサートを図１に示す。
【0169】
モデル導入遺伝子として、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子を使用した。ＥＧＦＰレポーター遺伝子の発現を、標準的なサイトメガロウイルスＩＥプロモーター（ｐＣＭＶ）により駆動した（図１）。
【0170】
ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２内のｍｉＲＮＡ標的配列（それぞれ図１Ｂ及び図１Ｃの「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－１」、「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－２」；表３も参照）は、ＣＥＦ細胞内で最も豊富に存在するｍｉＲＮＡに対応するため選択した（２５、２７、３０）。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び２内の４個のｍｉＲＮＡ標的配列を、４ヌクレオチド（ｎｔ）のスペーサーにより互いに区切った（それぞれ図１Ｂ及び１Ｃ）。ｍｉＲｂｌｏｃｋの５’末端にあるｍｉＲＮＡ標的配列の最初のヌクレオチドを、ＥＧＦＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の終止コドンに直接連結した。この概念をｍｉＲｂｌｏｃｋ－３～－１０にも適用した。他のすべての事例では、ＥＧＦＰの終止コドンと最初のｍｉＲＮＡ標的配列の間に１５－ｎｔのスペーサーを挿入した。
【0171】
対照として、３’－ＵＴＲ内にいかなる追加の挿入配列も含まないＥＧＦＰ ＯＲＦを含むＥＧＦＰ発現プラスミド（「ＥＧＦＰ発現基準」）を使用した（図１Ａの「ｍｉＲｂなしＥＧＦＰ」）。３’－ＵＴＲ内に「スクランブル－２（またはｓｃｒｂｌ２）」と称されるｍｉＲｂｌｏｃｋを有するＥＧＦＰ ＯＲＦを含むプラスミドをさらなる対照とした（図１Ｄの「ｓｃｒｂｌ２」）。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２の４個のｍｉＲＮＡ標的配列のそれぞれのヌクレオチドをスクランブルし、４－ｎｔスペーサーを用いてスクランブルｍｉＲＮＡ標的配列を再び連結することにより設計した（表３）。スクランブルには、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）が提供するツールを使用した。
【0172】
３．２ ＥＧＦＰ発現の下方調節
ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１～－１０のＥＧＦＰ下方調節活性を試験した。
ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１～－１０のＥＧＦＰ下方調節活性を試験した。
【0173】
この目的において、ＣＥＦ細胞に、それぞれのｍｉＲｂｌｏｃｋを含むプラスミドと、ＣＭＶプロモーター下で青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を発現する第２のプラスミドとを同時トランスフェクションした。このＢＦＰ発現プラスミドは、３’－ＵＴＲコード領域内のいかなる追加挿入配列も含まず、ＢＦＰ陽性細胞内でのＥＧＦＰ発現レベルを定量するためのトランスフェクション対照及び内部基準として機能した。
【0174】
図２（上）に示すように、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１は、対照（「ｍｉＲｂなし」）の約２５％までＥＧＦＰ発現の下方調節を媒介し、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２はさらに、対照の約９％までＥＧＦＰ下方調節を媒介した。このような効果は、同時トランスフェクション対照プラスミドによるＢＦＰ発現では観察されなかった（図２下）。
【0175】
ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２と比較して、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３は中程度のＥＧＦＰ下方調節を媒介し、一方ｍｉＲｂｌｏｃｋ－５～－１０はＥＧＦＰ発現に有意な影響を示さなかった（図２上）。
【0176】
３．３ 温度がＥＧＦＰ下方調節に及ぼす効果
実施例３．２に記載の結果に基づき、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２をさらなる特性評価に選択した。
実施例３．２に記載の結果に基づき、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２をさらなる特性評価に選択した。
【0177】
ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２により媒介されるＥＧＦＰ発現の下方調節を３０℃または３７℃で試験した。ＣＥＦ細胞におけるＥＧＦＰ下方調節を、同じコンストラクト及び温度を用いたニワトリ線維芽細胞株ＤＦ－１における下方調節とも比較した。
【0178】
図３（上）に示すように、ＥＧＦＰ発現基準（「ｍｉＲｂなし」）及びｍｉＲｂｌｏｃｋ対照（「ｓｃｒｂｌ２」）からは、（トランスフェクションから２４時間後）いずれの細胞タイプにおいても所与の温度で同レベルのＥＧＦＰ発現が得られた。この発見は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ（すなわち、およそ９０～１００ヌクレオチドの配列の連なり）をＥＧＦＰの３’－ＵＴＲコード領域に挿入しても導入遺伝子の発現レベルはそのように変化しないこと、そしてｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２が好適な対照であることを示した。
【0179】
さらに示しているように、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２は、ＣＥＦ及びＤＦ－１細胞内でのＥＧＦＰ発現の下方調節を媒介した（図３上）。両方の細胞タイプ及び両方の温度で、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２がもたらす効果は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１がもたらす効果よりも著明であった。
【0180】
さらに、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２はいずれも、３０℃よりも３７℃で効果的にＥＧＦＰ発現の下方調節を媒介した。この温度効果は、ＤＦ－１細胞の方が著明であった（図３上）。
【0181】
同時感染させた対照プラスミドによるＢＦＰ発現は、この場合もＥＧＦＰの下方調節に非依存的であった（図３下）。
【0182】
実施例４：組み換えＭＶＡ内のｍｉＲＮＡ標的配列
４．１ ｍｉＲＮＡ標的配列を含む組み換えＭＶＡの構築
次に、ｍｉＲＮＡ標的配列を用いて、ＥＧＦＰ下方調節がＭＶＡ感染の文脈でも達成できるかどうかについて調べた。
４．１ ｍｉＲＮＡ標的配列を含む組み換えＭＶＡの構築
次に、ｍｉＲＮＡ標的配列を用いて、ＥＧＦＰ下方調節がＭＶＡ感染の文脈でも達成できるかどうかについて調べた。
【0183】
この目的において、遺伝子間領域（ＩＧＲ）４４／４５にｍｉＲｂｌｏｃｋ－１またはｍｉＲｂｌｏｃｋ－２に結合したＥＧＦＰ遺伝子を挿入した２つのＭＶＡ組み換え体を構築した（図４の「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－１」、「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－２」）。各ｍｉＲｂｌｏｃｋの後にポックスウイルス初期転写終結シグナル（ＴＴＳ）が続き、初期転写産物の長さを約５０ヌクレオチドに制限するように機能する。ＴＴＳは、ポックスウイルスベクターにおける遺伝子発現カセット内の標準的要素である。単量体赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を、すべてのＭＶＡ組み換え体により同時発現させた（図４）。ＲＦＰ遺伝子は、ｍｉＲＮＡ標的配列の挿入によって改変されていないため、感染細胞のｍｉＲＮＡ機構による調節を受けないはずである。これを挿入して、異なるＭＶＡコンストラクトによりもたらされる感染レベルをモニター及び比較するためのマーカーとした。ＥＧＦＰ及びＲＦＰはいずれも、組み換えＭＶＡコンストラクト内で初期／後期ＰｒＳプロモーターの制御下にあった（図４）。
【0184】
対照として、ｍｉＲＮＡ標的配列なしのＥＧＦＰ ＯＲＦを含む組み換えＭＶＡ（図４の「ＥＧＦＰ」）、すなわちＥＧＦＰ発現基準と、ＥＧＦＰの３’－ＵＴＲ内にｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２を有する組み換えＭＶＡ（図４の「ＥＧＦＰ－ｓｃｒｂｌ２」）とを構築した。
【0185】
４．２ ＥＧＦＰ発現の下方調節及び温度の効果
今度は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２のＥＧＦＰ下方調節媒介活性を、それぞれのＭＶＡ組み換え体を感染させ３０℃または３７℃で培養した細胞において解析した。
今度は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２のＥＧＦＰ下方調節媒介活性を、それぞれのＭＶＡ組み換え体を感染させ３０℃または３７℃で培養した細胞において解析した。
【0186】
図５（上）に示すように、組み換えＭＶＡによるＥＧＦＰ発現は、ＣＥＦ及びＤＦ－１細胞のいずれにおいてもｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２により下方調節された。プラスミドにおける観察結果と同様に、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２は、特にＤＦ－１細胞でより効果的であった。
【0187】
さらに、ＥＧＦＰ下方調節は両方の温度で検出可能であったが、両方の細胞タイプにおいて３０℃よりも３７℃の方が著明であり、この温度効果はＤＦ－１細胞の方が著明であった（図５上）。
【0188】
ＲＦＰの同時発現は、ＥＧＦＰ下方調節に非依存的であった（図５下）。これにより、ＭＶＡ導入遺伝子（ここではＥＧＦＰ遺伝子）の発現は、同じ組み換えＭＶＡ内に存在する他の導入遺伝子（ここではＲＦＰ遺伝子）に同時に影響を及ぼすことなく、ｍｉＲＮＡ標的配列により選択的に制御できることが示された。
【0189】
４．３ ＭＯＩがＥＧＦＰ下方調節に及ぼす効果
感染多重度（ＭＯＩ）がｍｉＲｂｌｏｃｋ－１または－２によるＥＧＦＰ下方調節に影響を及ぼすかどうかを試験するため、細胞にそれぞれのＭＶＡ組み換え体をＭＯＩ＝５、１、または０．２で感染させた。
感染多重度（ＭＯＩ）がｍｉＲｂｌｏｃｋ－１または－２によるＥＧＦＰ下方調節に影響を及ぼすかどうかを試験するため、細胞にそれぞれのＭＶＡ組み換え体をＭＯＩ＝５、１、または０．２で感染させた。
【0190】
図６（上）に示すように、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２によるＥＧＦＰ発現の下方調節は、試験した全ＭＯＩにおいて、感染後６時間に検出可能であった。注目すべきことに、ＥＧＦＰ発現を対照（すなわち、ＥＧＦＰ発現基準である「ｍｉＲｂなし」）に対する％として示すと（図６下）、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２の下方調節効果が、使用するＭＯＩに依存しないことが明らかになる。したがって、ＭＯＩが高いために感染細胞培養物におけるＥＧＦＰ発現レベルが高くなっても、ＥＧＦＰ発現の下方調節には影響を及ぼさなかった。
【0191】
４．４ 多サイクルＭＶＡ複製がＥＧＦＰ下方調節に及ぼす効果
導入遺伝子の下方調節について、ウイルスストックまたはワクチンロットを生産するためのウイルス増殖中に通常適用されるのと同様の設定で、さらに検討した。この目的において、ＣＥＦ細胞にｍｉＲｂｌｏｃｋ－１または－２を含む組み換えＭＶＡを低ＭＯＩ（０．１）で感染させ、３日間の持続的インキュベート期間にわたり培養した。
導入遺伝子の下方調節について、ウイルスストックまたはワクチンロットを生産するためのウイルス増殖中に通常適用されるのと同様の設定で、さらに検討した。この目的において、ＣＥＦ細胞にｍｉＲｂｌｏｃｋ－１または－２を含む組み換えＭＶＡを低ＭＯＩ（０．１）で感染させ、３日間の持続的インキュベート期間にわたり培養した。
【0192】
図７（上、左）に示すように、ＥＧＦＰ発現レベルは経時的に（少なくとも感染後６～４８時間は）増加した。しかし、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１または－２を含む組み換えＭＶＡを感染させた後のＥＧＦＰ発現の増加は、ＥＧＦＰ発現基準（「ｍｉＲｂなし」）及びｍｉＲｂｌｏｃｋ対照（「ｓｃｒｂｌ２」）で観察されたものに比べて有意に低減された。
【0193】
ＥＧＦＰ発現を対照（「ｍｉＲｂなし」）に対する％として示すと（図７左下）、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２によるＥＧＦＰの下方調節は、感染後７２時間の全観察期間にわたってほぼ一定に保たれることが判明した。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２はｍｉＲｂｌｏｃｋ－１よりも効果的にＥＧＦＰ発現の下方調節を媒介した。Ａｇａｉｎ，
組み換えＭＶＡにより同時発現したＲＦＰのレベルも経時的に（感染後７２時間まで）増加したが（図７左上）、ＥＧＦＰで観察されるような下方調節は伴わなかった（図７の右上及び右下）。これにより、細胞培養物全体で感染効率及びウイルス拡散が同様であることが示された。
組み換えＭＶＡにより同時発現したＲＦＰのレベルも経時的に（感染後７２時間まで）増加したが（図７左上）、ＥＧＦＰで観察されるような下方調節は伴わなかった（図７の右上及び右下）。これにより、細胞培養物全体で感染効率及びウイルス拡散が同様であることが示された。
【0194】
したがって、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２により媒介されるＥＧＦＰ下方調節の効率は、多サイクルＭＶＡ複製の過程にわたって安定が保たれた。
【0195】
４．５ ポックスウイルスプロモーターの効果
導入遺伝子発現を駆動するために使用されるポックスウイルスプロモーターは、多くの場合、ウイルス感染の初期及び後期に発現を開始する複合プロモーターのクラスから選択されている。強力な導入遺伝子発現を誘導するように設計された合成ＰｒＳプロモーター（２３）がその古典的例であり、広く使用されている。
導入遺伝子発現を駆動するために使用されるポックスウイルスプロモーターは、多くの場合、ウイルス感染の初期及び後期に発現を開始する複合プロモーターのクラスから選択されている。強力な導入遺伝子発現を誘導するように設計された合成ＰｒＳプロモーター（２３）がその古典的例であり、広く使用されている。
【0196】
ＰｒＳプロモーター内に最適化された初期プロモーターモチーフが存在するにもかかわらず、このプロモーターの制御下での導入遺伝子発現は主に後期に生じる。しかし、導入遺伝子産物に対するＴ細胞応答を可能な限り最良に誘導するには、初期、さらには最初期の導入遺伝子発現が好ましい。
【0197】
そのため、これまで使用されたＰｒＳプロモーター（例えば、図４を参照）を最初期Ｐｒ１３．５ｌｏｎｇプロモーター（２４）（ＷＯ２０１４／０６３８３２）に置き換えた実験を実施した。ＥＧＦＰの３’－ＵＴＲコード領域内にｍｉＲｂｌｏｃｋ－２を含む組み換えＭＶＡにおいて、ＰｒＳまたはＰｒ１３．５ｌｏｎｇプロモーターの制御下でのＥＧＦＰ発現を比較した（図８）。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－ｓｃｒｂｌ２とＰｒＳまたはＰｒ１３．５ｌｏｎｇプロモーターとを有する組み換えＭＶＡを対照として使用した（図８）。
【0198】
図９に示すように、ＰｒＳ及びＰｒ１３．５プロモーターの両方により指示されたＥＧＦＰ発現は、ＣＥＦ及びＤＦ－１細胞内のｍｉＲｂｌｏｃｋ－２により、感染後６時間及び１８時間時に下方調節された。しかし、注目すべきことに、Ｐｒ１３．５ｌｏｎｇ駆動ＥＧＦＰ発現の下方調節は、いずれの細胞タイプでも、またいずれの時点でもＰｒＳ駆動ＥＧＦＰ発現よりも有意に効果的であった（図９）。
【0199】
実施例５：ホモ及びヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋを用いたｍｉＲＮＡ標的配列の評価
５．１ プラスミド内の個々のｍｉＲＮＡ標的配列によるＥＧＦＰ下方調節
ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋにより媒介されるＥＧＦＰ下方調節に対する個々のｍｉＲＮＡ標的配列の寄与を定量するため、事前にヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置した個々のｍｉＲＮＡ標的配列のホモオリゴマーリピートを有するプラスミド発現コンストラクトを作製した。
５．１ プラスミド内の個々のｍｉＲＮＡ標的配列によるＥＧＦＰ下方調節
ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋにより媒介されるＥＧＦＰ下方調節に対する個々のｍｉＲＮＡ標的配列の寄与を定量するため、事前にヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置した個々のｍｉＲＮＡ標的配列のホモオリゴマーリピートを有するプラスミド発現コンストラクトを作製した。
【0200】
最初に、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２の８個の異なる標的配列を調べた。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１に含まれる各ｍｉＲＮＡ標的配列を、ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に３つの同一コピー（３回リピート）で配置した（表６のｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３～－１６を参照）。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２に含まれる各ｍｉＲＮＡ標的配列を４つのコピー（４回リピート）で配置した（表６のｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７～－２０を参照）。ｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐにおける標的配列（ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１に含まれる）を例として用いると、ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に配置した３つまたは４つのコピーでは、ＥＧＦＰ下方調節に有意差は見られないことが観察された。ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内の個々のｍｉＲＮＡ標的配列を、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋについて上述したように４－ｎｔスペーサーによって区切った（実施例３．１を参照）。
【0201】
図１０（上）に示すように、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３、－１７、及び－１８（それぞれｍｉＲ－１７－５ｐ、ｍｉＲ－２０ａ－５ｐ、及びｍｉＲ－２１－５ｐにおける標的配列から構成される）が、ＥＧＦＰ発現の下方調節において、ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３～－２０の中で最も効率的であった。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３、－１７、及び－１８により媒介されるＥＧＦＰ下方調節の程度は、対照（「ｍｉＲｂなし」）に対する％において、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２に媒介される効果の範囲内であった（図１０上）。
【0202】
ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１５、－１６、及び－２０（それぞれｍｉＲ－１２５ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２２２ａ、及びｍｉＲ－２２１－３ｐにおける標的配列）は中レベルでＥＧＦＰの下方調節を媒介し、一方ｍＲｂｌｏｃｋ－１４及び－１９（それぞれｍｉＲＮＡ１０３－３ｐと１４８ａ－３ｐにおける標的配列）の効果はわずかにとどまった（図１０上）。
【0203】
すべてのトランスフェクションＣＥＦ培養物においてＢＦＰ発現が非常に類似しており、これにより、プラスミドコンストラクトのトランスフェクション効率が類似することが裏付けられた（図１０下）。
【0204】
ｍｉＲ－２２２ａ及びｍｉＲ－２２１ａ－３ｐ（それぞれｍｉＲｂｌｏｃｋ－１６及び－２０）はＣＥＦ細胞内に最も豊富に存在するｍｉＲＮＡとして記載されている（２８）ため、得られた結果は興味深いものであった。ただし、発明者らの実験において、それらの対応する標的配列が媒介したＥＧＦＰ発現の下方調節は、中程度に過ぎなかった（図１０上）。一方、ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｍｉＲ－２０ａ－５ｐ（それぞれｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３及び－１７）の存在量は、ｍｉＲ－２２２ａとｍｉＲ－２２１－３ｐの存在量のおよそ１０％に過ぎないと報告されている（２８）が、発明者らの実験では、それらの対応する標的配列が、さらにより効果的であることが判明した（図１０上）。
【0205】
５．２ 組み換えＭＶＡにおける選択されたｍｉＲＮＡ標的配列によるＥＧＦＰ下方調節
実施例５．１で上述し、図１０に示しているように、ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３、－１７、及び－１８は、特に効果的にプラスミドトランスフェクションによるＥＧＦＰ発現の下方調節を媒介した。
実施例５．１で上述し、図１０に示しているように、ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－１３、－１７、及び－１８は、特に効果的にプラスミドトランスフェクションによるＥＧＦＰ発現の下方調節を媒介した。
【0206】
次に、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７及び－１８によるＥＧＦＰ下方調節の効率をＭＶＡ感染の文脈で定量した。ＰｒＳプロモーター下でＥＧＦＰを発現し、ＥＧＦＰの３’－ＵＴＲコード領域にｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７またはｍｉＲｂｌｏｃｋ－１８のいずれかを含む２つの組み換えＭＶＡ（それぞれ図１１の「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－１７」及び「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－１８」）を構築した。比較のために、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２を含む組み換えＭＶＡを使用した（図１１の「ＥＧＦＰ－ｍｉＲｂ－２」）。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７及び－１８を構成するｍｉＲＮＡ標的配列は、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ－２にも含まれた。
【0207】
図１２（左）に示すように、ＣＥＦ細胞内のＥＧＦＰ発現は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２により対照（「ｍｉＲｂなし」）の約２９％に下方調節された。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７または－１８を含むＭＶＡ組み換え体の場合、ＥＧＦＰ発現はそれぞれ約６２％及び６６％への減少にとどまった（図１２左）。
【0208】
異なるＭＶＡ組み換え体によるＲＦＰの発現は非常に類似しており（図１２右）、これにより、ＭＶＡ感染のレベルが同様であることが示された。
【0209】
注目すべきなのは、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７及び－１８が達成したＥＧＦＰ発現の下方調節の程度が、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２がもたらした下方調節の約半分にとどまったことである（図１２左）。この結果は、プラスミドで得られた結果と異なるものであった。上記で示したように（実施例５．１、図１０も参照）、プラスミドから発現させた場合のｍｉＲｂｌｏｃｋ－１７及び－１８によるＥＧＦＰの下方調節は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２がもたらした下方調節とかなり類似していた。したがって、ヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内のｍｉＲＮＡ標的配列の配置は、ＭＶＡ組み換え体に適用したときに特に有利な可能性がある。
【0210】
５．３ プラスミドにおけるさらなる有力なｍｉＲＮＡ標的配列のスクリーニング
ＣＥＦ細胞に含まれるｓｍａｌｌ ＲＮＡの独自のＲＮＡシークエンシング解析を行った。この解析から得られたｍｉＲＮＡによるＥＧＦＰ下方調節を試験した。
ＣＥＦ細胞に含まれるｓｍａｌｌ ＲＮＡの独自のＲＮＡシークエンシング解析を行った。この解析から得られたｍｉＲＮＡによるＥＧＦＰ下方調節を試験した。
【0211】
選択したｍｉＲＮＡにおける標的配列を、ホモオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ内に４－ｎｔスペーサーで区切った４回リピートで配置した（表６のｍｉＲｂｌｏｃｋ－２５～－３６を参照）。ｍｉＲｂｌｏｃｋをＥＧＦＰ ＯＲＦの配列ストレッチ内に配置し、プラスミドトランスフェクションによりＥＧＦＰを発現させた。
【0212】
図１３（上）に示すように、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２６及び－３１（それぞれｍｉＲ－１９ａ－３ｐ及びｍｉＲ－１９９－３ｐにおける標的配列）は、ＣＥＦ及びＤＦ－１細胞内でのＥＧＦＰ発現の下方調節において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２５～－３６の中で最も効率的であった。
【0213】
ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２５及び－３２（それぞれｍｉＲ－１８ａ－５ｐ及びｍｉＲ－３３－５ｐにおける標的配列）は、ＥＧＦＰ下方調節を中レベルで媒介した。同様のことが、少なくともＣＥＦ細胞において、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３３（ｍｉＲ－２１８ｂ－５ｐにおける標的配列）にも該当した。これに対し、残りのｍｉＲｂｌｏｃｋ－２７～－３０及びｍｉＲｂｌｏｃｋ－３３～－３６は、ほとんどまたは全く下方調節活性を示さず、あるいはＥＧＦＰ発現の増強効果すら観察された（図１３上）。
【0214】
ＣＥＦ及びＤＦ－１細胞内でＲＦＰ発現レベルが同様であることにより、トランスフェクション効率が等しいことが裏付けられた（図１３下）。
【0215】
５．４ 組み換えＭＶＡによるＥＧＦＰ発現下方調節に最も適したｍｉＲＮＡの定義
異なるｍｉＲＮＡ標的配列のＥＧＦＰ下方調節活性について得た知見（実施例５．１、５．２、５．３を参照）は、組み換えＭＶＡに使用するヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋの設計を最適化するための基礎としての役割を果たした。この効果に対し選択したｍｉＲＮＡを以下の表７に収載する。
異なるｍｉＲＮＡ標的配列のＥＧＦＰ下方調節活性について得た知見（実施例５．１、５．２、５．３を参照）は、組み換えＭＶＡに使用するヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋの設計を最適化するための基礎としての役割を果たした。この効果に対し選択したｍｉＲＮＡを以下の表７に収載する。
【表7】
【0216】
概して、ヌクレオチド配列のリピートは、ＭＶＡ複製中に相同組み換えのリスクを有する。したがって、ｍｉＲｂｌｏｃｋ内のｍｉＲＮＡ標的配列の一部または全部のホモオリゴマーリピートは、新たに作製した組み換えＭＶＡゲノムにおいて、望ましくない欠失または再構成をもたらす可能性がある。このような事象の確率は、同一の配列または類似性が高い配列ストレッチがタンデム配置され、そのため互いに密接または直接隣接する場合に最も高くなることが想定される。
【0217】
そのため、発明者らは、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列が最大限に異なるヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋの設計を目指した。その結果、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７～－４７のヘテロオリゴマーを作製した（表５）。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－４３及び－４４は、それぞれｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９及び－４１と同じｍｉＲＮＡ標的配列を、ただし異なる順序で含んだ。
【0218】
ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７～－４７のうちの１つを含むプラスミドにおいて、既に上述したようにＥＧＦＰをコードする配列と連結し、ＥＧＦＰ下方調節を解析した。
【0219】
図１４（左上）に示すように、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７、－３８、－３９は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７～－４７の中で最も効果的にＣＥＦ細胞内でＥＧＦＰ下方調節を媒介した。ＥＧＦＰ発現の下方調節の程度（対照「ｍｉＲｂなし」に対する％）は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２によりもたらされた程度よりもさらに良好であった。ＤＦ－１細胞（図１４右上）では、少なくともｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７及び－３８によるＥＧＦＰ下方調節は、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２により誘導される範囲内であった。残りのｍｉＲｂｌｏｃｋ－４０～－４７は、これらに比べてＥＧＦＰ発現の下方調節の媒介が効果的ではなかった（図１４上）。
【0220】
異なるＭＶＡ組み換え体によるＲＦＰの発現は、この場合も非常に類似していた（図１４下）。
【0221】
８個の異なるｍｉＲＮＡ標的配列を有するヘテロオリゴマーｍｉＲｂｌｏｃｋ（表４のｍｉＲｂｌｏｃｋ－４５）を含む組み換えＭＶＡも試験したが、ＥＧＦＰ下方調節においてほんのわずかな活性を示すにとどまった。
【0222】
最良のＥＧＦＰ下方調節活性を示すｍｉＲｂｌｏｃｋから、リード候補ｍｉＲｂｌｏｃｋを以下の検討事項に基づき選択した：第一に、ヒトの血液、白血球、または骨格筋内で発現が高いまたは非常に高いｍｉＲＮＡ標的配列を回避した。背景にある理由は、筋肉内または皮下適用をワクチン接種の最も一般的な経路として検討したためである。ヒトの血液、白血球、及び骨格筋内でのｍｉＲＮＡ発現についてのデータをｍｉＲｇｅｎｅＤＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ／）から取得した。ｍｉＲＮＡ－２１－５ｐはヒト白血球内で高発現するため、対応する標的配列を含むｍｉＲｂｌｏｃｋ、すなわちｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７及び－３８はさらなる検討から除外した。第二に、ｍｉＲ－１７－５ｐ及びｍｉＲ－２０ａ－５ｐの両方における標的配列を含むｍｉＲｂｌｏｃｋ、すなわちｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７、－４６、及び－４７は、これらの２個の標的配列の配列類似性が高いため、さらなる検討を行わなかった。
【0223】
最終的に、ｍｉＲＮＡ標的配列の除外基準を満たし、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３７及び－３８に最も近いＥＧＦＰ下方調節活性を有するｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９及び－４１を、組み換えＭＶＡにおける適用に最も適しているものと特定した。
【0224】
実施例６：組み換えＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ内のｍｉＲＮＡ標的配列
６．１ ｍｉＲＮＡ標的配列により改変されたＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶの構築
ｍｉＲＮＡ標的配列が、ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）－ＲＳＶ（「ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ」と称される）（ＷＯ２０１４／０１９７１８）内に存在する導入遺伝子の発現に及ぼす影響について調べた。
６．１ ｍｉＲＮＡ標的配列により改変されたＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶの構築
ｍｉＲＮＡ標的配列が、ＭＶＡ－ＢＮ（登録商標）－ＲＳＶ（「ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ」と称される）（ＷＯ２０１４／０１９７１８）内に存在する導入遺伝子の発現に及ぼす影響について調べた。
【0225】
ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶは、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の５つのタンパク質をコードする（図１５）。両方の循環ＲＳＶ抗原サブタイプＡ及びＢからの糖タンパク質（Ｇ）の２つのＯＲＦは、それぞれ初期／後期プロモーターＰｒ７．５（Ｇ（Ａ））及びＰｒＳ（Ｇ（Ｂ））の制御下で発現する。融合糖タンパク質（Ｆ）遺伝子は、ＰｒＨ５ｍ初期／後期プロモーターの制御下で発現する。核タンパク質（Ｎ）及びＭ２－１タンパク質は、主に抗ウイルスＣＤ８ Ｔ細胞応答の標的として機能し、融合タンパク質Ｎ／Ｍ２－１としてコードされ、それぞれのＯＲＦは、最初期プロモーターＰｒＬＥ１の制御下で発現する（図１５）（（３５）、当該文献においてＰｒＬＥ１はｐＨｙｂと称されている）。
【0226】
ＲＳＶ糖タンパク質Ｇ（Ａ）、Ｇ（Ｂ）、及びＦの発現を下方調節することを目的として、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２を含む第１のバージョンの改変ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ（図１５の「ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２」）を作製した。ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１をＧ（Ｂ）遺伝子及びＦ遺伝子の３’－ＵＴＲに挿入し、一方ｍｉＲｂｌｏｃｋ－２をＧ（Ａ）遺伝子の３’－ＵＴＲに挿入した（図１５）。
【0227】
第２のバージョンの改変ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ（図１５の「ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１」）では、すべてのＲＳＶ由来導入遺伝子をｍｉＲＮＡ標的配列に結合した。ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１は、組み換えＭＶＡ内での導入遺伝子下方調節に最も好適であると特定されたｍｉＲｂｌｏｃｋ、すなわちｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９及び－４１を用いて設計及び作製した（実施例５．４を参照）。
【0228】
６．２ 改変ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶにおける導入遺伝子の下方調節
ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２またはＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１を感染させたＣＥＦ細胞内でのＲＳＶ Ｇ、Ｆ、及びＮ／Ｍ２－１タンパク質の発現を免疫ブロットにより解析し、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ内でのそれぞれのタンパク質発現と比較した。
ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２またはＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１を感染させたＣＥＦ細胞内でのＲＳＶ Ｇ、Ｆ、及びＮ／Ｍ２－１タンパク質の発現を免疫ブロットにより解析し、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ内でのそれぞれのタンパク質発現と比較した。
【0229】
ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２、またはＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１を１２時間または１８時間感染させたＣＥＦ細胞のライセート中で、およそ９０ｋＤａの分子量を有する完全グリコシル化成熟形態のＲＳＶ Ｇが主に検出された（図１６）。この点において、ＲＳＶ Ｇ検出に使用した抗体が、ＲＳＶ Ｇタンパク質の２つの抗原サブタイプＡ及びＢを識別しなかったことに留意されたい。したがって、図１６のイムノブロットに見られるＲＳＶ Ｇ特異的シグナルは、ＲＳＶ Ｇ（Ａ）及びＧ（Ｂ）の重なったシグナルから構成されていると考えられる。ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ対照を感染させた細胞と比較して、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２またはＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１を感染させた細胞では成熟ＲＳＶ Ｇ及び未成熟ＲＳＶ Ｇの発現レベルがともに低かった（図１６）。したがって、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－１及び－２（ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２内のそれぞれＲＳＶ Ｇ（Ｂ）及び（Ｇ）Ａに結合）ならびにｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９及び－４１（ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１内のそれぞれＲＳＶ Ｇ（Ｂ）及びＧ（Ａ）に結合）は、ＲＳＶ Ｇ（Ａ）／（Ｂ）タンパク質発現の下方調節を媒介した。
【0230】
ＲＳＶ Ｆタンパク質は、前駆体タンパク質Ｆ０及び大型Ｆ１サブユニット（細胞フリンプロテアーゼによるＦ０のタンパク質分解切断により生成される）として検出可能であった（図１６）。ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２によるＲＳＶ Ｆ０／Ｆ１の発現は、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ対照と比較して中程度の低減にとどまったが、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１の場合には明らかに低減された（図１６）。したがって、ｍｉＲｂｌｏｃｋ－３９はｍｉＲｂｌｏｃｋ－１よりも効果的にＲＳＶ Ｆ０／Ｆ１の発現を下方調節した。
【0231】
ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１感染細胞におけるＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１融合タンパク質（およそ６２ｋＤａ）の発現は、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ対照またはＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２を感染させた細胞と比較して明らかに低減された（図１６）。この点において、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２が、いかなるｍｉＲＮＡ標的配列もＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１ ＯＲＦ内に含まなかったことに留意されたい（図１５を参照）。
【0232】
内在性発現対照として使用したワクシニアウイルスＤ８タンパク質の発現は、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２またはＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１を感染させた細胞において同等であった（図１６）。興味深いことに、Ｄ８シグナルは、３つの組み換え体と比較して、野生型、すなわち非組み換え体ＭＶＡ－ＢＮを感染させた細胞からのライセート中ではわずかに協力であった（図１６）。この結果は、いかなるｍｉＲＮＡ媒介性下方調節も伴わない同時発現したＲＳＶ由来導入遺伝子の細胞傷害性作用が、Ｄ８などの自発性ＭＶＡ遺伝子の発現に影響を及ぼしたことを示す可能性がある。一方、ＲＳＶ導入遺伝子のｍｉＲＮＡ標的化では、正常なＤ８発現は完全には回復しなかった。
【0233】
まとめると、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２及びＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１内でＲＳＶ Ｇ（Ａ）／（Ｂ）及びＲＳＶ Ｆ０／Ｆ１の発現は下方調節される。しかし、ＲＳＶ Ｆ０／Ｆ１発現の下方調節は、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１の場合の方が著明であった。Ｎ／Ｍ２－１の発現は、その発現が初期プロモーターにより駆動されるため、予想されたように、特に良好に下方調節される。
【0234】
６．３ 改変ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体の収量
ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２、及びＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１を感染させたＣＥＦ細胞からの組み換えＭＶＡの収量を、２つの異なるＭＯＩ、すなわち０．１及び０．０１において、感染後の３日目及び４日目に定量した。
ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２、及びＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１を感染させたＣＥＦ細胞からの組み換えＭＶＡの収量を、２つの異なるＭＯＩ、すなわち０．１及び０．０１において、感染後の３日目及び４日目に定量した。
【0235】
図１７に示すように、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶは、感染後３日目及び４日目に、ＭＯＩ＝０．１及び０．０１のいずれにおいても野生型ＭＶＡ－ＢＮと比較して収量が有意に減少した（約４．２倍～２１．５倍の減少；図１７の表の「ＭＶＡ－ＢＮ ｖｓ．－ＲＳＶ」を参照）。しかし、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶと比較すると、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２の収量は約１．２倍～４．２倍増加した（「ＭＶＡ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２ ｖｓ．ＭＶＡ－ＲＳＶ」）。ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１の収量は、（少なくとも３日目及び４日目のＭＯＩ＝０．１、４日目のＭＯＩ＝０．０１において）ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２よりもさらに増加し、１．２倍～２．６倍となった（「ＭＶＡ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１ ｖｓ．－ｍｉＲｂ１／２」）。ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶに対する最大の増加は、感染後３日目及び４日目のＭＯＩ＝０．１におけるＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１で観察された（それぞれ約３．２倍及び６．８倍）（「ＭＶＡ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１ ｖｓ．ＭＶＡ－ＲＳＶ」）。
【0236】
それにもかかわらず、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１は、ＭＶＡ－ＢＮの複製挙動を完全には回復せず（図１７の表の「ＭＶＡ－ＢＮ ｖｓ．ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１」を参照）、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１の収量は依然として、ＭＶＡ－ＢＮと比較して約３．２倍（ＭＯＩ＝０．１）及び２．６倍（ＭＯＩ＝０．０１）低減された。
【0237】
結論として、ｍｉＲＮＡ標的配列が生産収量についてもたらす最高の効果は、ＭＯＩ＝０．１及び感染後４日目におけるＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１で得られた。
【0238】
６．４ 改変ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ由来のＲＳＶタンパク質の免疫原性
６．４．１ Ｔ細胞アッセイ
ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１及びＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２からのＲＳＶ導入産物の免疫原性を調べるため、マウス免疫実験を行った。
６．４．１ Ｔ細胞アッセイ
ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１及びＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２からのＲＳＶ導入産物の免疫原性を調べるため、マウス免疫実験を行った。
【0239】
ＢＡＬＢ／ｃ系統のマウス内で生成された場合、Ｍ２－１タンパク質は強力な免疫優性ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープを有する。したがって、このエピトープの解析からは、ＲＳＶ Ｍ２－１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞応答を定量するための広いダイナミックレンジを有する高感度アッセイがもたらされた。
【0240】
ＲＳＶ Ｍ２－１またはＭＶＡ Ｅ３（ベクター対照として使用）に特異的なＢＡＬＢ／マウスのＣＤ８ Ｔ細胞応答をＤｅｘｔｒａｍｅｒ染色により解析した。マウスＰＢＭＣをプライミング後７日目、ならびに２１日目のブースト後７日目及び１３日目（すなわち、初回免疫後２８日目及び３４日目）に収集し、染色した。
【0241】
図１８（左パネル）に示すように、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２、及びＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１は、ＲＳＶ Ｍ２－１に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を、解析したすべての時間において同様の頻度で誘導した。したがって、ＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１の免疫原性は、改変ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体内に存在するｍｉＲＮＡ標的配列によってｉｎ ｖｉｖｏで影響を受けることはなかった。
【0242】
さらに、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２、及びＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１は、Ｅ３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を同様の頻度で誘導した（図１８右パネル）。これにより、ＭＶＡベクターバックボーンに対するＴ細胞応答は同等であり、異なる組み換え体による免疫も概して同様に効果的であることが示された。さらに、ある特定の細胞表面マーカー（ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ２９、ＣＸ３ＣＲ１）の発現パターンに基づくメモリーＴ細胞表現型サブセットの頻度を解析したところ、３つのＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体の間で差は示されなかった。
【0243】
６．４．２ 細胞内サイトカイン染色及びＥＬＩＳｐｏｔ解析
サイトカイン生成という観点からＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的応答をさらに評価し、ＲＳＶ Ｆ及びＧタンパク質に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を定量的に比較するため、ブースト後１３日目にマウス脾細胞を収集し、直ちにＲＳＶ Ｇ、Ｆ、もしくはＭ２－１に由来するペプチド、またはＭＶＡ Ｅ３（ベクター対照）に由来するペプチドで刺激した。応答を、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）及びＥＬＩＳｐｏｔ解析により解析した。
サイトカイン生成という観点からＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的応答をさらに評価し、ＲＳＶ Ｆ及びＧタンパク質に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を定量的に比較するため、ブースト後１３日目にマウス脾細胞を収集し、直ちにＲＳＶ Ｇ、Ｆ、もしくはＭ２－１に由来するペプチド、またはＭＶＡ Ｅ３（ベクター対照）に由来するペプチドで刺激した。応答を、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣＳ）及びＥＬＩＳｐｏｔ解析により解析した。
【0244】
ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ、ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ１／２、またはＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ－ｍｉＲｂ３９／４１で免疫したマウスにおいて、ＲＳＶ Ｇ、Ｆ、及びＮ／Ｍ２－１タンパク質またはＭＶＡ Ｅ３の各々に特異的なＣＤ４４＋ＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の全体的な頻度が、３つのＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体のうちの１つで免疫したマウスの群間で非常に類似していた（図１９Ａ）。ＲＳＶ Ｆ由来ペプチドで刺激した後、ＩＦＮ－γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の全体的頻度は、試験した抗原の中で最も低かった（＜２％）ものの、ＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１由来ペプチドで得られた頻度は最も高かった（図１９Ａ）。それに加え、表面マーカーＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、及びＣＸ３ＣＲ１のパターンはすべてのマウス群の間で非常に類似していた。
【0245】
免疫マウスにおけるＴ細胞応答についても、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞の解析を包含するＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて解析した。結果を図１９Ｂに示す。
【0246】
脾細胞をＲＳＶ Ｍ２－１由来ペプチドで刺激した後のＥＬＩＳｐｏｔ解析の結果、ＩＦＮ－γ＋スポット形成コロニーが多すぎて数えられなかった（そのため、図１９Ｂには示していない）。この結果からは、ＲＳＶ Ｎ／Ｍ２－１タンパク質が強力なＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘導することが裏付けられ、これは、Ｈ－２ｄマウスにおいてＲＳＶ Ｍ２－１が免疫優性エピトープを含むという他の報告（３６、３７）と一致するものであった。
【0247】
ＲＳＶ Ｇ及びＦ、ならびにＭＶＡ Ｅ３に由来するペプチドで刺激した後の脾細胞のＥＬＩＳｐｏｔ解析からは、ＲＳＶ Ｇペプチドに対する応答がＲＳＶ Ｆペプチドに対する応答よりも強力であることが確認された（図１９Ｂ）。ＩＣＣＳ（図１９Ａ及び上述）と同様に、３つのＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体のうちの１つで免疫したマウスの群間で、ＲＳＶ Ｇ及びＦタンパク質ならびにＭＶＡ Ｅ３の各々に特異的なＴ細胞の頻度において差は観察されなかった（図１９Ｂ）。
【0248】
６．４．３ ＥＬＩＳＡ及びＰＲＮＴ解析
コードされたＲＳＶタンパク質に対する液性応答を、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体が抗原として全ＲＳＶに結合するＥＬＩＳＡ法により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで感染性ＲＳＶを中和する抗体力価を定量することにより、解析した。ＲＳＶ及びＭＶＡ特異的ＩｇＧ力価を、プライミングの１日前（－１日目）、プライミング後２０日目、及びプライミング後３４日目（すなわちブースト後１３日目）に解析した。
コードされたＲＳＶタンパク質に対する液性応答を、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体が抗原として全ＲＳＶに結合するＥＬＩＳＡ法により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで感染性ＲＳＶを中和する抗体力価を定量することにより、解析した。ＲＳＶ及びＭＶＡ特異的ＩｇＧ力価を、プライミングの１日前（－１日目）、プライミング後２０日目、及びプライミング後３４日目（すなわちブースト後１３日目）に解析した。
【0249】
プライミングまたはブースト後、３つのＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体のうちの１つで免疫したマウスの血清において、総ＲＳＶ特異的ＩｇＧ力価の差は観察されなかった（図２０Ａ左）。ＭＶＡ特異的ＩｇＧ力価についても同様の結果が観察された（図２０Ａ右）。
【0250】
プライミング後３４日目（すなわちブースト後１３日目）に免疫したマウスの血清中のＲＳＶ特異的中和抗体力価を、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）により定量した。
【0251】
３つの異なるＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体のうちの１つでマウスを免疫した後に誘導された中和抗体の量における差は検出不可能であった（図２０Ｂ）。ＲＳＶ中和抗体に対する血清転換率は、免疫マウスの全群において１００％であった（図２０Ｂの表を参照）。
【0252】
６．４．４ 免疫原性試験からの結論
要約すると、Ｔ細胞応答は、ＲＳＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及び機能性、ならびにＲＳＶ特異的ＩｇＧ及び中和抗体の誘導を含めて、３つの異なるＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体のうちの１つで免疫したマウス群間で非常に類似していた。したがって、導入遺伝子の３’－ＵＴＲ内にｍｉＲＮＡ標的配列を加えても、マウスにおけるそれぞれの導入遺伝子産物の免疫原性には、非改変ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶコンストラクトからの導入遺伝子産物との比較で悪影響は及ばなかった。いずれの結果も、ｍｉＲＮＡ標的配列により媒介される細胞傷害性導入遺伝子発現の下方調節は、ｉｎ ｖｉｖｏのそれぞれの導入遺伝子産物の免疫原性に検出可能な影響を及ぼすことなく、ＣＥＦ細胞からのＭＶＡ収量に好影響を及ぼすことを示した。
要約すると、Ｔ細胞応答は、ＲＳＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度及び機能性、ならびにＲＳＶ特異的ＩｇＧ及び中和抗体の誘導を含めて、３つの異なるＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶ組み換え体のうちの１つで免疫したマウス群間で非常に類似していた。したがって、導入遺伝子の３’－ＵＴＲ内にｍｉＲＮＡ標的配列を加えても、マウスにおけるそれぞれの導入遺伝子産物の免疫原性には、非改変ＭＶＡ－ＢＮ－ＲＳＶコンストラクトからの導入遺伝子産物との比較で悪影響は及ばなかった。いずれの結果も、ｍｉＲＮＡ標的配列により媒介される細胞傷害性導入遺伝子発現の下方調節は、ｉｎ ｖｉｖｏのそれぞれの導入遺伝子産物の免疫原性に検出可能な影響を及ぼすことなく、ＣＥＦ細胞からのＭＶＡ収量に好影響を及ぼすことを示した。
【0253】
終わりに：本明細書の本文全体でいくつかの文書を引用している。本明細書で引用した文書の各々（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、指示書等を含む）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾する、または整合しない場合、本明細書がこのようないかなる資料にも優先される。本明細書のいかなる部分も、先行発明によって本発明がこのような開示内容に先行する権利がないことを認めるとは解釈しないものとする。
【0254】
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２９．Ｍｅｕｎｉｅｒ Ｊ，Ｌｅｍｏｉｎｅ Ｆ，Ｓｏｕｍｉｌｌｏｎ Ｍ，Ｌｉｅｃｈｔｉ Ａ，Ｗｅｉｅｒ Ｍ，Ｇｕｓｃｈａｎｓｋｉ Ｋ，Ｈｕ Ｈ，Ｋｈａｉｔｏｖｉｃｈ Ｐ，Ｋａｅｓｓｍａｎｎ Ｈ．２０１３．Ｂｉｒｔｈ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２３：３４－４５．
３０．Ｐｅｎｇ Ｘ，Ｇａｏ ＱＳ，Ｚｈｏｕ Ｌ，Ｃｈｅｎ ＺＨ，Ｌｕ Ｓ，Ｈｕａｎｇ ＨＪ，Ｚｈａｎ ＣＹ，Ｘｉａｎｇ Ｍ．２０１５．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ｈ９Ｎ２－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｎｏｎ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｒｅｓ １４：９０８１－９０９１．
３１．Ｗｕ Ｎ，Ｚｈｕ Ｑ，Ｃｈｅｎ Ｂ，Ｇａｏ Ｊ，Ｘｕ Ｚ，Ｌｉ Ｄ．２０１７．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｎｄ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｇｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １８：２５５．
３２．Ｂａｕｒ Ｋ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｋ，Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒ Ｍ，Ｐａｔｚｏｌｄ Ｊ，Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ－Ｈｅｎｓｃｈｅｌ Ｃ，Ｈｅｒｍａｎｎ Ｊ，Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄ Ｒ，Ｃｈａｐｌｉｎ Ｐ，Ｓｕｔｅｒ Ｍ，Ｈａｕｓｍａｎｎ Ｊ．２０１０．Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ａｎｋａｒａ ｂｒｅａｋｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｏｎｇ ｖｅｃｔｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂ８Ｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４：８７４３－８７５２．
３３．Ｊｅｓｓｅｎ Ｂ，Ｆａｌｌｅｒ Ｓ，Ｋｒｅｍｐｌ ＣＤ，Ｅｈｌ Ｓ．２０１１．Ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｖｉｄｉｔｙ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｓｔｒａｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５：１０１３５－４３．
３４．Ｏｐｅｎｓｈａｗ ＰＪ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｋ，Ｗｅｒｔｚ ＧＷ，Ａｓｋｏｎａｓ ＢＡ．１９９０．Ｔｈｅ ２２，０００－ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｋｄ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｐｒｉｍｅｄ ｂｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６４：１６８３－９．
３５．Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ－Ｈｅｎｓｃｈｅｌ Ｃ，Ｓｐａｔｈ Ｍ，Ｌｕｋａｓｓｅｎ Ｓ，Ｗｏｌｆｅｒｓｔａｔｔｅｒ Ｍ，Ｋａｃｈｅｌｒｉｅｓｓ Ｈ，Ｂａｕｒ Ｋ，Ｄｉｒｍｅｉｅｒ Ｕ，Ｗａｇｎｅｒ Ｍ，Ｃｈａｐｌｉｎ Ｐ，Ｓｕｔｅｒ Ｍ，Ｈａｕｓｍａｎｎ Ｊ．２０１０．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｘ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ （ＭＶＡ） ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔａｌ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ｎｏｔ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅ ａｎ ＭＶＡ－ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４：９９０７－９９１９．
３６．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｍ，Ｐｅｉｆｅｒ Ｍ，Ｂｅｎｄｅｒ Ｗ．１９８９．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３０７－１３１２．
３７．Ｗｏｌｆｅｒｓｔａｔｔｅｒ Ｍ，Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒ Ｍ，Ｓｐａｔｈ Ｍ，Ｌｕｋａｓｓｅｎ Ｓ，Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ Ｍ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｋ，Ｗｉｅｌｅｒｔ Ｕ，Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ Ｈ，Ｈｏｃｈｒｅｉｎ Ｈ，Ｃｈａｐｌｉｎ Ｐ，Ｓｕｔｅｒ Ｍ，Ｈａｕｓｍａｎｎ Ｊ．２０１４．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ａｎｋａｒａ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｅｘｃｅｓｓ ｅａｒｌｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｒ ａｎｄ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：１４３９６－１４４１１．
１．Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ ＭＧ，Ｃａｒｒｏｌｌ Ｆ，Ｍｏｒｒｉｓ ＳＪ，Ｔｕｒｎｅｒ ＡＶ，Ｖａｕｇｈａｎ ＡＭ，Ｋａｐｕｌｕ ＭＣ，Ｃｏｌｌｏｃａ Ｓ，Ｓｉａｎｉ Ｌ，Ｇｉｌｂｅｒｔ ＳＣ，Ｈｉｌｌ ＡＶ．２０１２．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ ｏｆ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ １０９：７１９－２８．
２．Ｗｙａｔｔ ＬＳ，Ｂｅｌｙａｋｏｖ ＩＭ，Ｅａｒｌ ＰＬ，Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ＪＡ，Ｍｏｓｓ Ｂ．２００８．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ａ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＩＶ Ｅｎｖ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭＶＡ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３７２：２６０－２７２．
３．Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ－Ｈｅｎｓｃｈｅｌ Ｃ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ，Ｌｕｋａｓｓｅｎ Ｓ，Ｌｉｎｋｅ Ｂ，Ｋｒａｕｓｅ Ｌ，Ｋｏｎｉｅｔｚｎｙ Ｓ，Ｇｏｅｓｍａｎｎ Ａ，Ｈｏｗｌｅｙ Ｐ，Ｃｈａｐｌｉｎ Ｐ，Ｓｕｔｅｒ Ｍ，Ｈａｕｓｍａｎｎ Ｊ．２００７．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｓ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ，ｔｈｅ ａｎｃｅｓｔｏｒ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８８：３２４９－３２５９．
４．Ｓｕｔｅｒ Ｍ，Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ－Ｈｅｎｓｃｈｅｌ Ｃ，Ｔｚａｔｚａｒｉｓ Ｍ，Ｈｕｌｓｅｍａｎｎ Ｖ，Ｌｕｋａｓｓｅｎ Ｓ，Ｗｕｌｆｆ ＮＨ，Ｈａｕｓｍａｎｎ Ｊ，Ｈｏｗｌｅｙ Ｐ，Ｃｈａｐｌｉｎ Ｐ．２００９．Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｃｔｕａｌｌｙ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｔｈａｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｓｔｒａｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ ２７：７４４２－７４５０．
５．Ｐｏｌｌａｒｄ ＡＪ，Ｌａｕｎａｙ Ｏ，Ｌｅｌｉｅｖｒｅ ＪＤ，Ｌａｃａｂａｒａｔｚ Ｃ，Ｇｒａｎｄｅ Ｓ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｎ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｃ，Ｇａｄｄａｈ Ａ，Ｂｏｃｋｓｔａｌ Ｖ，Ｗｉｅｄｅｍａｎｎ Ａ，Ｌｅｙｓｓｅｎ Ｍ，Ｌｕｈｎ Ｋ，Ｒｉｃｈｅｒｔ Ｌ，Ｂｅｔａｒｄ Ｃ，Ｇｉｂａｎｉ ＭＭ，Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ ＥＡ，Ｓｎａｐｅ ＭＤ，Ｌｅｖｙ Ｙ，Ｄｏｕｏｇｕｉｈ Ｍ，Ｔｈｉｅｂａｕｔ Ｒ，ｇｒｏｕｐ ＥＥｓ．２０２１．Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｔｗｏ－ｄｏｓｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ Ａｄ２６．ＺＥＢＯＶ ａｎｄ ＭＶＡ－ＢＮ－Ｆｉｌｏ Ｅｂｏｌａ ｖａｃｃｉｎｅ ｒｅｇｉｍｅｎ ｉｎ ａｄｕｌｔｓ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅ（ＥＢＯＶＡＣ２）：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｏｂｓｅｒｖｅｒ－ｂｌｉｎｄ，ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ－ｂｌｉｎｄ，ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｐｈａｓｅ ２ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２１：４９３－５０６．
６．Ｂａｅｋ Ｄ，Ｖｉｌｌｅｎ Ｊ，Ｓｈｉｎ Ｃ，Ｃａｍａｒｇｏ ＦＤ，Ｇｙｇｉ ＳＰ，Ｂａｒｔｅｌ ＤＰ．２００８．Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｕｔｐｕｔ．Ｎａｔｕｒｅ ４５５：６４－７１．
７．Ｓｅｌｂａｃｈ Ｍ，Ｓｃｈｗａｎｈａｕｓｓｅｒ Ｂ，Ｔｈｉｅｒｆｅｌｄｅｒ Ｎ，Ｆａｎｇ Ｚ，Ｋｈａｎｉｎ Ｒ，Ｒａｊｅｗｓｋｙ Ｎ．２００８．Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ ４５５：５８－６３．
８．Ｇｅｉｓｌｅｒ Ａ，Ｆｅｃｈｎｅｒ Ｈ．２０１６．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ６：３７－５４．
９．Ｂａｒｎｅｓ Ｄ，Ｋｕｎｉｔｏｍｉ Ｍ，Ｖｉｇｎｕｚｚｉ Ｍ，Ｓａｋｓｅｌａ Ｋ，Ａｎｄｉｎｏ Ｒ．２００８．Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｉＲＮＡｓ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｖｉｒｕｓ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒｏｐｉｓｍ ａｓ ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ ４：２３９－２４８．
１０．Ｅｄｇｅ ＲＥ，Ｆａｌｌｓ ＴＪ，Ｂｒｏｗｎ ＣＷ，Ｌｉｃｈｔｙ ＢＤ，Ａｔｋｉｎｓ Ｈ，Ｂｅｌｌ ＪＣ．２００８．Ａ ｌｅｔ－７ ＭｉｃｒｏＲＮＡ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １６：１４３７－１４４３．
１１．Ｋｅｌｌｙ ＥＪ，Ｈａｄａｃ ＥＭ，Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｓ，Ｒｕｓｓｅｌｌ ＳＪ．２００８．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｎａｔ Ｍｅｄ １４：１２７８－１２８３．
１２．Ｌａｎｇｌｏｉｓ ＲＡ，Ｖａｒｂｌｅ Ａ，Ｃｈｕａ ＭＡ，Ｇａｒｃｉａ－Ｓａｓｔｒｅ Ａ，ｔｅｎＯｅｖｅｒ ＢＲ．２０１２．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９：１２１１７－１２１２２．
１３．Ｐｅｒｅｚ ＪＴ，Ｐｈａｍ ＡＭ，Ｌｏｒｉｎｉ ＭＨ，Ｃｈｕａ ＭＡ，Ｓｔｅｅｌ Ｊ，ｔｅｎＯｅｖｅｒ ＢＲ．２００９．ＭｉｃｒｏＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ ｖｉｒｕｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２７：５７２－５７６．
１４．Ｒｅｉｄ ＣＡ，Ｂｏｙｅ ＳＬ，Ｈａｕｓｗｉｒｔｈ ＷＷ，Ｌｉｐｉｎｓｋｉ ＤＭ．２０１７．ｍｉＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｙｉｅｌｄ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２４：４６２－４６９．
１５．Ｇｕｉｍａｒｏ ＭＣ，Ａｆｉｏｎｅ ＳＡ，Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ＪＡ．２０２０．Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｓｈＲＮＡ Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ３１：１０６８－１０７３．
１６．Ｂａｃｋｅｓ Ｓ，Ｓｈａｐｉｒｏ ＪＳ，Ｓａｂｉｎ ＬＲ，Ｐｈａｍ ＡＭ，Ｒｅｙｅｓ Ｉ，Ｍｏｓｓ Ｂ，Ｃｈｅｒｒｙ Ｓ，ｔｅｎＯｅｖｅｒ ＢＲ．２０１２．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｂｙ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｐｏｌｙ（Ａ） ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｅｒｍｉｎａｌ ＲＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ １２：２００－２１０．
１７．Ｇｒｉｎｂｅｒｇ Ｍ，Ｇｉｌａｄ Ｓ，Ｍｅｉｒｉ Ｅ，Ｌｅｖｙ Ａ，Ｉｓａｋｏｖ Ｏ，Ｒｏｎｅｎ Ｒ，Ｓｈｏｍｒｏｎ Ｎ，Ｂｅｎｔｗｉｃｈ Ｚ，Ｓｈｅｍｅｒ－Ａｖｎｉ Ｙ．２０１２．Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ．Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １５７：１７１９－１７２７．
１８．Ｃｈｅｎ ＪＳ，Ｌｉ ＨＣ，Ｌｉｎ ＳＩ，Ｙａｎｇ ＣＨ，Ｃｈｉｅｎ ＷＹ，Ｓｙｕ ＣＬ，Ｌｏ ＳＹ．２０１５．Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ Ｄｉｃｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｉ７ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｄｕｒｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０：ｅ０１２０３９０．
１９．Ｆｕｔａｍｉ Ｍ，Ｓａｔｏ Ｋ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ，Ｔｏｊｏ Ａ．２０１７．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｄｏｕｂｌｙ－Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ ａ Ｍｏｕｓｅ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ ６：５７－６８．
２０．Ｈｉｋｉｃｈｉ Ｍ，Ｋｉｄｏｋｏｒｏ Ｍ，Ｈａｒａｇｕｃｈｉ Ｔ，Ｉｂａ Ｈ，Ｓｈｉｄａ Ｈ，Ｔａｈａｒａ Ｈ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ．２０１１．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ５Ｒ ｉｎ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｄｕｃｅｓ ｖｉｒａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｍｐａｉｒｉｎｇ ｉｔｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９：１１０７－１１１５．
２１．Ａｓｓａｒｓｓｏｎ Ｅ，Ｇｒｅｅｎｂａｕｍ ＪＡ，Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ Ｍ，Ｓｃｈａｆｆｅｒ Ｌ，Ｈａｍｍｏｎｄ ＪＡ，Ｐａｓｑｕｅｔｔｏ Ｖ，Ｏｓｅｒｏｆｆ Ｃ，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ ＲＣ，Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ ＥＪ，Ｔｓｃｈａｒｋｅ ＤＣ，Ｓｉｄｎｅｙ Ｊ，Ｇｒｅｙ ＨＭ，Ｈｅａｄ ＳＲ，Ｐｅｔｅｒｓ Ｂ，Ｓｅｔｔｅ Ａ．２００８．Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｏｘｖｉｒｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｒｅｖｅａｌｓ ａｎ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０５：２１４０－２１４５．
２２．Ｅｎｇｅｌｓｔａｄ Ｍ，Ｓｍｉｔｈ ＧＬ．１９９３．Ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ４２－ｋＤａ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｅｇｒｅｓｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４：６２７－６３７．
２３．Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ Ｓ，Ｓｉｓｌｅｒ ＪＲ，Ｍｏｓｓ Ｂ．１９９７．Ｃｏｍｐａｃｔ，ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ，ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｅａｒｌｙ／ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０９４－１０９７．
２４．Ｗｅｎｎｉｅｒ ＳＴ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｋ，Ｓｔｅｉｎｈａｕｓｅｒ Ｃ，Ｍａｙｌａｎｄｅｒ Ｎ，Ｍｎｉｃｈ Ｃ，Ｗｉｅｌｅｒｔ Ｕ，Ｄｉｒｍｅｉｅｒ Ｕ，Ｈａｕｓｍａｎｎ Ｊ，Ｃｈａｐｌｉｎ Ｐ，Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄ Ｒ．２０１３．Ａ ｎｏｖｅｌ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ ｄｒｉｖｅｓ ｖｅｒｙ ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８：ｅ７３５１１．
２５．Ｂｕｒｎｓｉｄｅ Ｊ，Ｏｕｙａｎｇ Ｍ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ａ，Ｂｅｒｎｂｅｒｇ Ｅ，Ｌｕ Ｃ，Ｍｅｙｅｒｓ ＢＣ，Ｇｒｅｅｎ ＰＪ，Ｍａｒｋｉｓ Ｍ，Ｉｓａａｃｓ Ｇ，Ｈｕａｎｇ Ｅ，Ｍｏｒｇａｎ ＲＷ．２００８．Ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｃｈｉｃｋｅｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９：１８５．
２６．Ｇｌａｚｏｖ ＥＡ，Ｃｏｔｔｅｅ ＰＡ，Ｂａｒｒｉｓ ＷＣ，Ｍｏｏｒｅ ＲＪ，Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ ＢＰ，Ｔｉｚａｒｄ ＭＬ．２００８．Ａ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ａ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １８：９５７－９６４．
２７．Ｈｉｃｋｓ ＪＡ，Ｔｅｍｂｈｕｒｎｅ Ｐ，Ｌｉｕ ＨＣ．２００８．ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏｓ．Ｐｏｕｌｔ Ｓｃｉ ８７：２３３５－２３４３．
２８．Ｌｉｍ Ｗ，Ｓｏｎｇ Ｇ．２０１４．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ａｖｉａｎ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｔｒａｃｔｓ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９：ｅ９６１７５．
２９．Ｍｅｕｎｉｅｒ Ｊ，Ｌｅｍｏｉｎｅ Ｆ，Ｓｏｕｍｉｌｌｏｎ Ｍ，Ｌｉｅｃｈｔｉ Ａ，Ｗｅｉｅｒ Ｍ，Ｇｕｓｃｈａｎｓｋｉ Ｋ，Ｈｕ Ｈ，Ｋｈａｉｔｏｖｉｃｈ Ｐ，Ｋａｅｓｓｍａｎｎ Ｈ．２０１３．Ｂｉｒｔｈ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｇｅｎｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２３：３４－４５．
３０．Ｐｅｎｇ Ｘ，Ｇａｏ ＱＳ，Ｚｈｏｕ Ｌ，Ｃｈｅｎ ＺＨ，Ｌｕ Ｓ，Ｈｕａｎｇ ＨＪ，Ｚｈａｎ ＣＹ，Ｘｉａｎｇ Ｍ．２０１５．ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ ｉｎ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ Ｈ９Ｎ２－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｎｏｎ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｈｉｃｋｅｎ ｅｍｂｒｙｏ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｇｅｎｅｔ Ｍｏｌ Ｒｅｓ １４：９０８１－９０９１．
３１．Ｗｕ Ｎ，Ｚｈｕ Ｑ，Ｃｈｅｎ Ｂ，Ｇａｏ Ｊ，Ｘｕ Ｚ，Ｌｉ Ｄ．２０１７．Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｎｄ ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｇｇ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １８：２５５．
３２．Ｂａｕｒ Ｋ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｋ，Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒ Ｍ，Ｐａｔｚｏｌｄ Ｊ，Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ－Ｈｅｎｓｃｈｅｌ Ｃ，Ｈｅｒｍａｎｎ Ｊ，Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄ Ｒ，Ｃｈａｐｌｉｎ Ｐ，Ｓｕｔｅｒ Ｍ，Ｈａｕｓｍａｎｎ Ｊ．２０１０．Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ－ｅａｒｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ａｎｋａｒａ ｂｒｅａｋｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒｏｎｇ ｖｅｃｔｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂ８Ｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４：８７４３－８７５２．
３３．Ｊｅｓｓｅｎ Ｂ，Ｆａｌｌｅｒ Ｓ，Ｋｒｅｍｐｌ ＣＤ，Ｅｈｌ Ｓ．２０１１．Ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｖｉｄｉｔｙ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｓｔｒａｉｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ａｆｔｅｒ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８５：１０１３５－４３．
３４．Ｏｐｅｎｓｈａｗ ＰＪ，Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｋ，Ｗｅｒｔｚ ＧＷ，Ａｓｋｏｎａｓ ＢＡ．１９９０．Ｔｈｅ ２２，０００－ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ａ ｍａｊｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｋｄ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｍｉｃｅ ｐｒｉｍｅｄ ｂｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６４：１６８３－９．
３５．Ｍｅｉｓｉｎｇｅｒ－Ｈｅｎｓｃｈｅｌ Ｃ，Ｓｐａｔｈ Ｍ，Ｌｕｋａｓｓｅｎ Ｓ，Ｗｏｌｆｅｒｓｔａｔｔｅｒ Ｍ，Ｋａｃｈｅｌｒｉｅｓｓ Ｈ，Ｂａｕｒ Ｋ，Ｄｉｒｍｅｉｅｒ Ｕ，Ｗａｇｎｅｒ Ｍ，Ｃｈａｐｌｉｎ Ｐ，Ｓｕｔｅｒ Ｍ，Ｈａｕｓｍａｎｎ Ｊ．２０１０．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｘ ｍａｊｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ （ＭＶＡ） ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐａｒｅｎｔａｌ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｓ ｎｏｔ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｏ ｒｅｐｒｏｄｕｃｅ ａｎ ＭＶＡ－ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８４：９９０７－９９１９．
３６．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｍ，Ｐｅｉｆｅｒ Ｍ，Ｂｅｎｄｅｒ Ｗ．１９８９．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１３０７－１３１２．
３７．Ｗｏｌｆｅｒｓｔａｔｔｅｒ Ｍ，Ｓｃｈｗｅｎｅｋｅｒ Ｍ，Ｓｐａｔｈ Ｍ，Ｌｕｋａｓｓｅｎ Ｓ，Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ Ｍ，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｋ，Ｗｉｅｌｅｒｔ Ｕ，Ｌａｕｔｅｒｂａｃｈ Ｈ，Ｈｏｃｈｒｅｉｎ Ｈ，Ｃｈａｐｌｉｎ Ｐ，Ｓｕｔｅｒ Ｍ，Ｈａｕｓｍａｎｎ Ｊ．２０１４．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ａｎｋａｒａ ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｅｘｃｅｓｓ ｅａｒｌｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｒ ａｎｄ ｔｒｉｇｇｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８８：１４３９６－１４４１１．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】