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特表2024-535163ポリペプチド、融合型多量体タンパク質及びそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-30
(54)【発明の名称】ポリペプチド、融合型多量体タンパク質及びそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/31 20060101AFI20240920BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240920BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240920BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240920BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240920BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240920BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240920BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240920BHJP
B01J 20/281 20060101ALI20240920BHJP
B01J 20/285 20060101ALI20240920BHJP
B01J 20/283 20060101ALI20240920BHJP
【ＦＩ】
C07K14/31 ZNA
C07K19/00
C12N15/31
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
B01J20/281 R
B01J20/285 N
B01J20/285 T
B01J20/283
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023566720
(86)(22)【出願日】2022-12-21
(85)【翻訳文提出日】2023-10-27
(86)【国際出願番号】 CN2022140536
(87)【国際公開番号】W WO2024045430
(87)【国際公開日】2024-03-07
(31)【優先権主張番号】202211064221.6
(32)【優先日】2022-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517446393
【氏名又は名称】西安藍暁科技新材料股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＵＮＲＥＳＩＮ ＮＥＷ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＣＯ． ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１３５， Ｊｉｎｙｅ Ｒｄ， Ｘｉ’ａｎ Ｈｉ－ｔｅｃｈ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ， Ｘｉ’ａｎ， Ｓｈａａｎｘｉ， ７１００７５， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001896
【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】李 延軍
(72)【発明者】
【氏名】李 ▲剛▼
(72)【発明者】
【氏名】▲顧▼ 桐年
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 建涛
(72)【発明者】
【氏名】劉 ▲龍▼
(72)【発明者】
【氏名】雷 暁菊
(72)【発明者】
【氏名】劉 瓊
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA41
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、タンパク質の生物学的機能の技術分野に関し、具体的には、（１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に置換突然変異を有し、１６位は、ロイシン又はバリンに置換により突然変異され、２５位は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はトリプトファンに置換により突然変異され、２９位は、アラニン、ロイシン、又はトレオニンに置換により突然変異され、４９位は、アルギニン又はヒスチジンに置換により突然変異され、５８位は、グリシン、イソロイシン、又はアラニンに置換により突然変異されたもの、（２）、（１）のポリペプチドと少なくとも８０％以上の相同性を有し、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位のうちの少なくとも１つの位置における置換突然変異を保持するものから選択される、ポリペプチド、融合型多量体タンパク質及びそれらの使用に関する。ポリペプチドは、高いアルカリ耐性及び高い担持量を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に置換突然変異を有し、前記１６位は、ロイシン又はバリンに置換により突然変異され、
前記２５位は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はトリプトファンに置換により突然変異され、
前記２９位は、アラニン、ロイシン、又はトレオニンに置換により突然変異され、
前記４９位は、アルギニン又はヒスチジンに置換により突然変異され、
前記５８位は、グリシン、イソロイシン、又はアラニンに置換により突然変異されたもの、
（２）、（１）の前記ポリペプチドと少なくとも８０％以上の相同性を有し、前記１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位のうちの少なくとも１つの位置における置換突然変異を保持するものから選択される、ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項2】
前記１６位はロイシンに置換により突然変異され、及び／又は前記２５位はリジンに置換により突然変異され、及び／又は
前記２９位はアラニンに置換により突然変異され、及び／又は
前記４９位はアルギニンに置換により突然変異され、及び／又は
前記５８位はグリシンに置換により突然変異される、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
前記ポリペプチドは、前記５８位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、２９位及び４９位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は前記ポリペプチドは、４９位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、２９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、２９位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、２５位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、１６位に前記置換突然変異を有し、前記２５位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、２９位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位及び２９位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位及び２５位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、４９位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、２５位の位置に置換突然変異を有する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチドが融合して形成された融合型多量体タンパク質を含む、ことを特徴とする融合型多量体タンパク質。
【請求項5】
ポリペプチドＢ及び／又はポリペプチドＺｍｂをさらに含み、前記ポリペプチドＢは、
ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列を有するもの、
ｂ ａのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものから選択され、
前記ポリペプチドＺｍｂは、
ｃ、ａのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸配列ＭＬが挿入されたものであって、前記アミノ酸配列ＭＬのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるもの、
ｄ、ｂの前記アミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸配列ＭＬが挿入されたものから選択され、
任意に、前記ポリペプチドＺｍｂのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される、ことを特徴とする請求項４に記載の融合型多量体タンパク質。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか１項に記載のポリペプチドをポリペプチドＣｍと表記し、前記融合型多量体タンパク質は、少なくとも１つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は少なくとも１つの前記ポリペプチドＺｍｂを含み、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、１～６つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は１～４つの前記ポリペプチドＺｍｂを含み、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、４つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は２つの前記ポリペプチドＺｍｂを含む、ことを特徴とする請求項４又は５に記載の融合型多量体タンパク質。
【請求項7】
Ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるアミノ酸配列を有するもの、Ｂ、ＡのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものから選択される少なくとも１つの機能性ポリペプチドＦＬＤをさらに含み、
任意に、前記機能性ポリペプチドＦＬＤは、ポリペプチドＣｍとポリペプチドＺｍｂとの間に位置し、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、４つのポリペプチドＣｍ、１つの機能性ポリペプチドＦＬＤ、及び２つのポリペプチドＺｍｂを含む、ことを特徴とする請求項４～６のいずれか１項に記載の融合型多量体タンパク質。
【請求項8】
１）請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項４～７のいずれか１項に記載の融合型多量体タンパク質をコードする、任意に、ＤＮＡ又はＲＮＡである核酸分子、２）請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項４～７のいずれか１項に記載の融合型多量体タンパク質を発現する発現カセット、組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
３）１）の前記核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
４）２）又は３）の前記発現カセットを含む組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
５）２）又は３）又は４）の前記組換えベクターを含む宿主細胞のうちのいずれか１種を含み、
任意に、前記組換えベクターは、大腸菌発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）から構築されたものであり、任意に、前記宿主細胞は大腸菌であり、任意に、前記大腸菌は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である、ことを特徴とする生物材料。
【請求項9】
抗体検出、単離又は精製における請求項１～３のいずれか１項に記載のポリペプチド又は請求項４～７のいずれか１項に記載の融合型多量体タンパク質の使用。
【請求項10】
請求項４～７のいずれか１項に記載の融合型多量体タンパク質とアフィニティークロマトグラフィー媒体担体とを含み、任意に、前記アフィニティークロマトグラフィー媒体担体は、アガロースゲル、デキストラン、セルロース、水酸基を有する高分子ポリマー又はシリカゲルを含むが、これらに限定されない、ことを特徴とするアフィニティークロマトグラフィー媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願は、２０２２年９月１日に中国特許庁に提出された、出願番号が２０２２１１０６４２２１．６、発明名称が「ポリペプチド、融合型多量体タンパク質及びそれらの使用」である中国特許出願の優先権を主張しており、その全内容は引用によって本明細書に組み込まれている。
【0002】
本願は、タンパク質の生物学的機能の技術分野に関し、具体的には、ポリペプチド、融合型多量体タンパク質及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0003】
２０２２年２月までに、ＦＤＡは、計１０９種類の抗体薬を承認しており、世界の抗体薬市場は８年連続で１０％以上の成長率を維持し、２０２１年に初めて２０００億ドルを突破し、２０２０年よりも１６．５％増となった。抗体の単離は抗体薬の生産において極めて重要であり、プロテインＡアフィニティー精製は抗体の単離精製における重要なステップであり、現在、プロテインＡ充填剤はアルカリ性条件に対して敏感で、溶離条件があまりにも厳しく、抗体精製の市場規模の拡大中、プロテインＡ充填剤の担持量と耐アルカリ性などの性能に対する要求がますます高くなっている。黄色ブドウ球菌プロテインＡ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ、ＳＰＡ）は、プロテインＡと略称し、黄色ブドウ球菌の細胞壁タンパク質の１種である。１９８３年に、ＳＰＡ遺伝子はＤｕｇｇｌｅｂｙらによってクローニングされ、大腸菌で発現した（Duggleby，C.J and Jones ， SA：cloning and expression of the Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichia coli.Nucl Acids Res.11(1983)3065-3076； Lofdahl， S., Guss， B., et al； Gene for Staphylococcal protein A.Proc.Natl.Acid.Sci.USA 80(1983)697-701）。ＳＰＡタンパク質分子は、Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、及びＣの５つの高度に相同なドメインとＸドメインの計６つのドメインからなる。ＳＰＡ上のＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、及びＣの５つの高度に相同なドメインはすべてＩｇＧに結合する能力を持っているとともに、ほとんどの哺乳類のＩｇＧのＦｃ及びＦａｂ領域に結合することができる（Jansson B, Uhlen M, Nygren PA. All individual domains of staphylococcalprotein A show Fab binding. FEMS Immunol Med Microbiol. 1998 Jan;20(1):69-78.）ことから、ＳＰＡは、抗体精製のためのアフィニティーリガンドとして固相担体に結合され、抗体の単離精製に広く応用されている。
【0004】
抗体の生産過程で、検体中に脂質、核酸、タンパク質、多糖類、細胞断片などの不純物が含まれているか、ウイルス細菌によって汚染されているため、このような不純物は抗体の精製過程でプロテインＡアフィニティー充填剤に非特異的に吸着され、充填剤を汚染する可能性があり、また、プロテインＡカラムも定期的にその場洗浄（Ｃｌｅａｎ Ｉｎ Ｐｌａｃｅ、ＣＩＰ）を必要とする。プロテインＡ充填剤の使用寿命を延ばし、充填剤使用中のカラム効果を確保するため、充填剤の洗浄と再生が必要である。現在最も広く使用されている手段は、０．１～１ＭのＮａＯＨを用いたクロマトカラムの原位置洗浄である。しかし、天然のプロテインＡは０．１Ｍより高い濃度のＮａＯＨに耐えることができず（Garshasb, Rigi, Samira, et al. A comprehensive review on staphylococcal protein A (SpA): Its productionand applications.[J]. Biotechnology & Applied Biochemistry, 2019.)、遺伝子工学の発展により、組換えプロテインＡの耐アルカリ性が徐々に向上したが、工業的生産により抗体薬を製造する場合は組換えプロテインＡの消費量が多く、その使用寿命が限られ、生産コストが増加し、このため、より高い担持量、より高い耐アルカリ性を持つプロテインＡ充填剤は、抗体メーカーが追求する必然のトレンドであり、充填剤メーカーの開発の方向でもある。
【0005】
抗体は、一般的に、ＦａｂとＦｃドメインからなり、抗体Ｆａｂ領域とＳＰＡとの相互作用は溶離ｐＨ値に深刻な影響を与え、ＩｇＧの解離と溶離にはより低いｐＨ値が必要となり、ＳＰＡ分子のＢドメインの２９位のグリシンがアラニンに置換されたＢドメイン突然変異体は、Ｆａｂ領域とほとんど相互作用せず、Ｂドメインの２３位のアスパラギンがトレオニンに置換された場合、Ｂドメイン突然変異体の耐アルカリ性が著しく向上する（Amritkar V, Adat S, Tejwani V, et al. Engineering Staphylococcal Protein A for high-throughput affinity purification of monoclonal2antibodies[J]. Biotechnology advances, 2020:107632.）。しかし、改変されたＳＰＡ分子も、現在のＳＰＡ分子の高担持、高耐アルカリ性の要求を満たすことができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、本願が解決しようとする技術的課題は、ポリペプチド、融合型多量体タンパク質及びそれらの使用を提供することにあり、得られる融合型多量体タンパク質は、より高い担持量、より高い耐アルカリ性を有する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
これに鑑み、本願は以下の技術的解決手段を提供する。
本願の一態様によれば、
（１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に置換突然変異を有し、
前記１６位は、ロイシン又はバリンに置換により突然変異され、
前記２５位は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はトリプトファンに置換により突然変異され、
前記２９位は、アラニン、ロイシン、又はトレオニンに置換により突然変異され、
前記４９位は、アルギニン又はヒスチジンに置換により突然変異され、
前記５８位は、グリシン、イソロイシン、又はアラニンに置換により突然変異されたもの、
（２）、（１）の前記ポリペプチドと少なくとも８０％以上の相同性を有し、前記１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位のうちの少なくとも１つの位置における置換突然変異を保持するものから選択されるポリペプチドを提供する。
本願の一態様によれば、
（１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に置換突然変異を有し、
前記１６位は、ロイシン又はバリンに置換により突然変異され、
前記２５位は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はトリプトファンに置換により突然変異され、
前記２９位は、アラニン、ロイシン、又はトレオニンに置換により突然変異され、
前記４９位は、アルギニン又はヒスチジンに置換により突然変異され、
前記５８位は、グリシン、イソロイシン、又はアラニンに置換により突然変異されたもの、
（２）、（１）の前記ポリペプチドと少なくとも８０％以上の相同性を有し、前記１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位のうちの少なくとも１つの位置における置換突然変異を保持するものから選択されるポリペプチドを提供する。
【0008】
任意に、前記１６位はロイシンに置換により突然変異され、及び／又は
前記２５位はリジンに置換により突然変異され、及び／又は
前記第２９はアラニンに置換により突然変異され、及び／又は
前記４９位はアルギニンに置換により突然変異され、及び／又は
前記５８位はグリシンに置換により突然変異される。
前記２５位はリジンに置換により突然変異され、及び／又は
前記第２９はアラニンに置換により突然変異され、及び／又は
前記４９位はアルギニンに置換により突然変異され、及び／又は
前記５８位はグリシンに置換により突然変異される。
【0009】
任意に、前記ポリペプチドは、５８位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、２９位及び４９位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、４９位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、２９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、２９位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、２５位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、１６位に前記置換突然変異を有し、前記２５位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、２９位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位及び２９位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位及び２５位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、４９位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、２５位の位置に置換突然変異を有する。
前記ポリペプチドは、４９位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、２９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、２９位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、２５位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、１６位に前記置換突然変異を有し、前記２５位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、２９位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位及び２９位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位及び２５位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、４９位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、２５位の位置に置換突然変異を有する。
【0010】
本願の別の態様によれば、ポリペプチドが融合して形成された融合型多量体タンパク質を含む、融合型多量体タンパク質を提供する。
【0011】
前記融合型多量体タンパク質は、ポリペプチドＢ及び／又はポリペプチドＺｍｂをさらに含み、
前記ポリペプチドＢは、
ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列を有するもの、
ｂ ａのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものから選択され、
前記ポリペプチドＺｍｂは、
ｃ、ａのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸配列ＭＬが挿入されたものであって、前記アミノ酸配列ＭＬのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるもの、
ｄ、ｂの前記アミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸配列ＭＬが挿入されたものから選択され、
任意に、前記ポリペプチドＺｍｂのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される。
前記ポリペプチドＢは、
ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列を有するもの、
ｂ ａのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものから選択され、
前記ポリペプチドＺｍｂは、
ｃ、ａのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸配列ＭＬが挿入されたものであって、前記アミノ酸配列ＭＬのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるもの、
ｄ、ｂの前記アミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸配列ＭＬが挿入されたものから選択され、
任意に、前記ポリペプチドＺｍｂのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される。
【0012】
前記融合型多量体タンパク質は、前記ポリペプチドをポリペプチドＣｍと表記し、
前記融合型多量体タンパク質は、少なくとも１つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は少なくとも１つの前記ポリペプチドＺｍｂを含み、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、１～６つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は１～４つの前記ポリペプチドＺｍｂを含み、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、４つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は２つの前記ポリペプチドＺｍｂを含む。
前記融合型多量体タンパク質は、少なくとも１つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は少なくとも１つの前記ポリペプチドＺｍｂを含み、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、１～６つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は１～４つの前記ポリペプチドＺｍｂを含み、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、４つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は２つの前記ポリペプチドＺｍｂを含む。
【0013】
前記融合型多量体タンパク質は、
Ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるアミノ酸配列を有するもの、
Ｂ、ＡのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものから選択される少なくとも１つの機能性ポリペプチドＦＬＤをさらに含み、
任意に、前記機能性ポリペプチドＦＬＤは、ポリペプチドＣｍとポリペプチドＺｍｂとの間に位置し、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、４つのポリペプチドＣｍ、１つの機能性ポリペプチドＦＬＤ、及び２つのポリペプチドＺｍｂを含む。
Ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるアミノ酸配列を有するもの、
Ｂ、ＡのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものから選択される少なくとも１つの機能性ポリペプチドＦＬＤをさらに含み、
任意に、前記機能性ポリペプチドＦＬＤは、ポリペプチドＣｍとポリペプチドＺｍｂとの間に位置し、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、４つのポリペプチドＣｍ、１つの機能性ポリペプチドＦＬＤ、及び２つのポリペプチドＺｍｂを含む。
【0014】
本願の又の態様によれば、
１）前記ポリペプチド又は前記融合型多量体タンパク質をコードする、任意に、ＤＮＡ又はＲＮＡである核酸分子、
２）前記ポリペプチド又は前記融合型多量体タンパク質を発現する発現カセット、組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
３）１）の前記核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
４）２）又は３）の前記発現カセットを含む組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
５）２）又は３）又は４）の前記組換えベクターを含む宿主細胞のうちのいずれか１種を含み、任意に、前記組換えベクターは、大腸菌発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）から構築されたものであり、任意に、前記宿主細胞は大腸菌であり、任意に、前記大腸菌は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である、生物材料を提供する。
１）前記ポリペプチド又は前記融合型多量体タンパク質をコードする、任意に、ＤＮＡ又はＲＮＡである核酸分子、
２）前記ポリペプチド又は前記融合型多量体タンパク質を発現する発現カセット、組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
３）１）の前記核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
４）２）又は３）の前記発現カセットを含む組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
５）２）又は３）又は４）の前記組換えベクターを含む宿主細胞のうちのいずれか１種を含み、任意に、前記組換えベクターは、大腸菌発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）から構築されたものであり、任意に、前記宿主細胞は大腸菌であり、任意に、前記大腸菌は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である、生物材料を提供する。
【0015】
抗体検出、単離又は精製における前記ポリペプチド又は前記融合型多量体タンパク質の使用。
【0016】
本願の又の態様によれば、前記融合型多量体タンパク質とアフィニティークロマトグラフィー媒体担体とを含み、任意に、前記アフィニティークロマトグラフィー媒体担体は、アガロースゲル、デキストラン、セルロース、水酸基を有する高分子ポリマー又はシリカゲルを含む、アフィニティークロマトグラフィー媒体を提供する。
【発明の効果】
【0017】
本願の技術的解決手段には、次のような利点がある。
【0018】
１．本願は、（１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に置換突然変異を有し、前記１６位は、ロイシン又はバリンに置換により突然変異され、前記２５位は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はトリプトファンに置換により突然変異され、前記２９位は、アラニン、ロイシン、又はトレオニンに置換により突然変異され、前記４９位は、アルギニン又はヒスチジンに置換により突然変異され、前記５８位は、グリシン、イソロイシン、又はアラニンに置換により突然変異されたもの、（２）、（１）の前記ポリペプチドと少なくとも８０％以上の相同性を有し、前記１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位のうちの少なくとも１つの位置における置換突然変異を保持するものから選択される、ポリペプチドを提供し、ポリペプチドが、高い耐アルカリ性及び高い担持量を有することによって、このポリペプチドを用いて製造された融合型多量体タンパク質は、より高い担持量、及びより高い耐アルカリ性を有するようになる。
２．本願による融合型多量体タンパク質は、前記ポリペプチドが融合して形成された融合型多量体タンパク質を含み、より高い担持量及びより高い耐アルカリ性を有する。
３．本願による融合型多量体タンパク質は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるポリペプチドＺｍｂをさらに含み、実験結果より、前記ポリペプチドＺｍｂドメインで充填剤を製造して抗体精製に用いる場合、溶離緩衝液のｐＨ値が３．３から４．３に上昇することが示された。
４．本願による融合型多量体タンパク質は、少なくとも１つの機能性ポリペプチドＦＬＤをさらに含み、前記ＦＬＤの挿入により、融合型多量体タンパク質の三次元構造の立体障害効果が低減し、それによって、融合型多量体タンパク質がＩｇＧと再結合することが可能になり、融合型多量体タンパク質全体の担持量が増加する。
５．本願によるアフィニティークロマトグラフィー媒体は、前記融合型多量体タンパク質とアフィニティークロマトグラフィー媒体担体とを含み、前記融合型多量体タンパク質は、クロマトグラフィー媒体担体に結合されて、抗体の検出、単離又は精製のためのアフィニティークロマトグラフィー媒体となれる。
２．本願による融合型多量体タンパク質は、前記ポリペプチドが融合して形成された融合型多量体タンパク質を含み、より高い担持量及びより高い耐アルカリ性を有する。
３．本願による融合型多量体タンパク質は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示されるポリペプチドＺｍｂをさらに含み、実験結果より、前記ポリペプチドＺｍｂドメインで充填剤を製造して抗体精製に用いる場合、溶離緩衝液のｐＨ値が３．３から４．３に上昇することが示された。
４．本願による融合型多量体タンパク質は、少なくとも１つの機能性ポリペプチドＦＬＤをさらに含み、前記ＦＬＤの挿入により、融合型多量体タンパク質の三次元構造の立体障害効果が低減し、それによって、融合型多量体タンパク質がＩｇＧと再結合することが可能になり、融合型多量体タンパク質全体の担持量が増加する。
５．本願によるアフィニティークロマトグラフィー媒体は、前記融合型多量体タンパク質とアフィニティークロマトグラフィー媒体担体とを含み、前記融合型多量体タンパク質は、クロマトグラフィー媒体担体に結合されて、抗体の検出、単離又は精製のためのアフィニティークロマトグラフィー媒体となれる。
【0019】
本発明の具体的な実施形態又は従来技術における技術的解決手段をより明確に説明するために、以下、具体的な実施形態又は従来技術の記述のために使用した図面を簡単に説明するが、明らかに、以下に記述した図面は本発明のいくつかの実施形態であり、当業者にとって、創造的な労力をせずに、これらの図面に基づいて他の図面を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】本願の実施例５におけるＢＬ２１－ｐＥＴ３０ａ－ＣｍＺｍｂ菌液のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果であり、レーン１は乳糖誘導前、レーン２は乳糖誘導後、レーン３は溶解液上清１、レーン４は溶解液上清２、レーン５は溶解液上清３、レーン６は溶離液１、レーン７は溶離液２、レーン８はタンパク質ｍａｒｋｅｒ（陝西普羅安蔕生物科技発展有限公司より提供され、品番：１０２２５－１）である。
【図2】本願の実施例５におけるＢＬ２１－ｐＥＴ３０ａ－ＣｍＺｍｂ菌液の精製タンパク質の結果であり、レーン１は溶解液上清２、レーン２はフロースルー、レーン３は溶出液、レーン４は４％Ｂ液による不純物溶離、レーン５は８％Ｂ液による不純物溶離、レーン６は４０％Ｂ液による目的タンパク質溶離、レーン７は１００％Ｂ液による目的タンパク質溶離である。
【図3】本願の実験例１における融合型多量体タンパク質の担持量の動的試験結果である。
【図4】本願の実験例２における融合型多量体タンパク質の耐アルカリ性の動的試験結果である。
【発明を実施するための形態】
【0021】
本願をより良く理解するために以下の実施例が提供されるが、以下の実施例が提供されるが、本願は前記最良な実施形態に限定されるものではなく、これらの実施例は本願の内容及び保護範囲を制限するものではなく、誰かが本願から示唆された、又は本願と他の先行技術の特徴とを組み合わせた結果として、本願と同一又は類似する製品のいずれかが本願の特許範囲に含まれる。
【0022】
具体的な実験ステップ又は条件が実施例に記載されていない場合、当該分野の文献に記載されている従来の実験ステップの動作又は条件に従って実施することができる。使用した試薬又は器具は製造メーカーが明記されていない場合、いずれも市場で購入することができる通常の試薬製品である。
【0023】
下記の実施例におけるポリペプチド、融合型多量体タンパク質のコード遺伝子は、南京金瑞生物科技有限公司により合成された。
【0024】
本願において、アミノ酸残基は、リジン（Ｋ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）の略字であってもよい。
【0025】
実施例１ ポリペプチドＣｍ
１．ポリペプチドＣｍの耐アルカリ性のスキームを探索するために、本実施例では、具体的には、以下のような一連のポリペプチドＣｍを設計した。
ポリペプチドＣ（天然）：アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、５８位のリジン（Ｋ）がグリシン（Ｇ）に置換により突然変異されただけである。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ４９Ｒ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、４９位のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換により突然変異されただけである。
ポリペプチドＣｍ（Ｇ２９Ａ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、２９位のグリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）に置換により突然変異されただけである。
ポリペプチドＣｍ（Ｅ２５Ｋ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、２５位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換により突然変異されただけである。
ポリペプチドＣｍ（Ｉ１６Ｌ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、１６位のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換により突然変異されただけである。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
５８位のリジン（Ｋ）がグリシン（Ｇ）に置換により突然変異され、
４９位のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換により突然変異され、
２９位のグリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）に置換により突然変異され、
２５位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換により突然変異され、
１６位のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換により突然変異された。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
５８位のリジン（Ｋ）がグリシン（Ｇ）に置換により突然変異され、
４９位のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換により突然変異され、
２５位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換により突然変異され、
１６位のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換により突然変異された。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
５８位のリジン（Ｋ）がグリシン（Ｇ）に置換により突然変異され、
４９位のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換により突然変異された。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
５８位のリジン（Ｋ）がグリシン（Ｇ）に置換により突然変異され、
４９位のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換により突然変異され、
２９位のグリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）に置換により突然変異された。
ポリペプチドＣｍ（Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
２９位のグリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）に置換により突然変異され、
２５位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換により突然変異され、
１６位のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換により突然変異された。
ポリペプチドＣｍ（Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
２５位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換により突然変異され、
１６位のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換により突然変異された。
さらに、上記ポリペプチドＣｍに係る１６位の置換突然変異は、バリンに関するものでもよい。
２５位に係る置換突然変異は、アルギニン、ヒスチジン、又はトリプトファンに関するものでもよい。
２９位に係る置換突然変異は、ロイシン又はトレオニンに関するものでもよい。
４９位に係る置換突然変異は、ヒスチジンに関するものでもよい。
５８位に係る置換突然変異は、イソロイシン又はアラニンに関するものでもよい。
１．ポリペプチドＣｍの耐アルカリ性のスキームを探索するために、本実施例では、具体的には、以下のような一連のポリペプチドＣｍを設計した。
ポリペプチドＣ（天然）：アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示される。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、５８位のリジン（Ｋ）がグリシン（Ｇ）に置換により突然変異されただけである。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ４９Ｒ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、４９位のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換により突然変異されただけである。
ポリペプチドＣｍ（Ｇ２９Ａ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、２９位のグリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）に置換により突然変異されただけである。
ポリペプチドＣｍ（Ｅ２５Ｋ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、２５位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換により突然変異されただけである。
ポリペプチドＣｍ（Ｉ１６Ｌ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、１６位のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換により突然変異されただけである。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
５８位のリジン（Ｋ）がグリシン（Ｇ）に置換により突然変異され、
４９位のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換により突然変異され、
２９位のグリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）に置換により突然変異され、
２５位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換により突然変異され、
１６位のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換により突然変異された。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
５８位のリジン（Ｋ）がグリシン（Ｇ）に置換により突然変異され、
４９位のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換により突然変異され、
２５位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換により突然変異され、
１６位のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換により突然変異された。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
５８位のリジン（Ｋ）がグリシン（Ｇ）に置換により突然変異され、
４９位のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換により突然変異された。
ポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
５８位のリジン（Ｋ）がグリシン（Ｇ）に置換により突然変異され、
４９位のリジン（Ｋ）がアルギニン（Ｒ）に置換により突然変異され、
２９位のグリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）に置換により突然変異された。
ポリペプチドＣｍ（Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
２９位のグリシン（Ｇ）がアラニン（Ａ）に置換により突然変異され、
２５位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換により突然変異され、
１６位のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換により突然変異された。
ポリペプチドＣｍ（Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、
２５位のグルタミン酸（Ｅ）がリジン（Ｋ）に置換により突然変異され、
１６位のイソロイシン（Ｉ）がロイシン（Ｌ）に置換により突然変異された。
さらに、上記ポリペプチドＣｍに係る１６位の置換突然変異は、バリンに関するものでもよい。
２５位に係る置換突然変異は、アルギニン、ヒスチジン、又はトリプトファンに関するものでもよい。
２９位に係る置換突然変異は、ロイシン又はトレオニンに関するものでもよい。
４９位に係る置換突然変異は、ヒスチジンに関するものでもよい。
５８位に係る置換突然変異は、イソロイシン又はアラニンに関するものでもよい。
【0026】
実施例２
本実施例は、以下のようなポリペプチドＺｍｂを設計した。
ポリペプチドＢ：アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される。
ポリペプチドＺｍｂ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の２０位と２１位のアミノ酸の間に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるアミノ酸配列ＭＬが挿入されており、すなわち、ポリペプチドＺｍｂのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される。
本実施例は、以下のようなポリペプチドＺｍｂを設計した。
ポリペプチドＢ：アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示される。
ポリペプチドＺｍｂ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の２０位と２１位のアミノ酸の間に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるアミノ酸配列ＭＬが挿入されており、すなわち、ポリペプチドＺｍｂのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される。
【0027】
実施例３
本実施例では、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示される機能性ポリペプチドＦＬＤを設計した。
本実施例では、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示される機能性ポリペプチドＦＬＤを設計した。
【0028】
実施例４ 融合型多量体タンパク質
本実施例では、実施例１～３のポリペプチドを用いて、以下のような一連の融合型多量体タンパク質を設計した。
ＣＣ：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣ（天然）が融合したアミノ酸配列であり、配列はＣ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｃである。
ＣｍＣｍ（Ｋ５８Ｇ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｋ４９Ｒ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ４９Ｒ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｇ２９Ａ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｇ２９Ａ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｅ２５Ｋ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｅ２５Ｋ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｉ１６Ｌ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｉ１６Ｌ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣＤＢ：Ｎ末端からＣ末端に４つのポリペプチドＣ（天然）、１つの機能性ポリペプチドＦＬＤ、２つのポリペプチドＢが融合したアミノ酸配列であり、配列はＣ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－ＦＬＤ－Ｂ－Ｂである。
ＣＢ：Ｎ末端からＣ末端に向かって４つのポリペプチドＣ（天然）、２つのポリペプチドＢが融合したアミノ酸配列であり、配列はＣ－Ｃ－Ｃ－Ｂ－Ｂである。
ＣｍＺｍｂ：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に４つのポリペプチドＣｍ、１つの機能性ポリペプチドＦＬＤ、２つのポリペプチドＺｍｂが融合したアミノ酸配列であり、配列はＣｍ－Ｃｍ－Ｃｍ－Ｃｍ－ＦＬＤ－Ｚｍｂ－Ｚｍｂであり、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、その遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示される。
さらに、上記融合型多量体タンパク質中のポリペプチドＣｍが関与する
１６位の置換突然変異は、バリンに関するものであってもよい。
２５位の置換突然変異は、アルギニン、ヒスチジン又はトリプトファンに関するものであってもよい。
２９位の置換突然変異は、ロイシン又はトレオニンに関するものであってもよい。
４９位の置換突然変異は、ヒスチジンに関するものであってもよい。
５８位の置換突然変異は、イソロイシン又はアラニンに関するものであってもよい。
本実施例では、実施例１～３のポリペプチドを用いて、以下のような一連の融合型多量体タンパク質を設計した。
ＣＣ：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣ（天然）が融合したアミノ酸配列であり、配列はＣ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－Ｃである。
ＣｍＣｍ（Ｋ５８Ｇ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｋ４９Ｒ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ４９Ｒ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｇ２９Ａ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｇ２９Ａ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｅ２５Ｋ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｅ２５Ｋ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｉ１６Ｌ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｉ１６Ｌ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｋ５８Ｇ、Ｋ４９Ｒ、Ｇ２９Ａ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｇ２９Ａ、Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣｍＣｍ（Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に６つのポリペプチドＣｍ（Ｅ２５Ｋ、Ｉ１６Ｌ）が融合したアミノ酸配列である。
ＣＤＢ：Ｎ末端からＣ末端に４つのポリペプチドＣ（天然）、１つの機能性ポリペプチドＦＬＤ、２つのポリペプチドＢが融合したアミノ酸配列であり、配列はＣ－Ｃ－Ｃ－Ｃ－ＦＬＤ－Ｂ－Ｂである。
ＣＢ：Ｎ末端からＣ末端に向かって４つのポリペプチドＣ（天然）、２つのポリペプチドＢが融合したアミノ酸配列であり、配列はＣ－Ｃ－Ｃ－Ｂ－Ｂである。
ＣｍＺｍｂ：Ｎ末端からＣ末端に向かって順に４つのポリペプチドＣｍ、１つの機能性ポリペプチドＦＬＤ、２つのポリペプチドＺｍｂが融合したアミノ酸配列であり、配列はＣｍ－Ｃｍ－Ｃｍ－Ｃｍ－ＦＬＤ－Ｚｍｂ－Ｚｍｂであり、そのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に、その遺伝子配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示される。
さらに、上記融合型多量体タンパク質中のポリペプチドＣｍが関与する
１６位の置換突然変異は、バリンに関するものであってもよい。
２５位の置換突然変異は、アルギニン、ヒスチジン又はトリプトファンに関するものであってもよい。
２９位の置換突然変異は、ロイシン又はトレオニンに関するものであってもよい。
４９位の置換突然変異は、ヒスチジンに関するものであってもよい。
５８位の置換突然変異は、イソロイシン又はアラニンに関するものであってもよい。
【0029】
実施例５ 融合型多量体タンパク質の製造
本実施例では、実施例４で設計した融合型多量体タンパク質を以下のプロセスに従って製造した。
本実施例では、実施例４で設計した融合型多量体タンパク質を以下のプロセスに従って製造した。
【0030】
（１）組換えベクターの構築
融合型多量体タンパク質のコード遺伝子と発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）をＮｄｅＩ（生工生物工程（上海）有限公司より購入、Ｂ６００１２０）とＨｉｎｄＩＩＩ（生工生物工程（上海）有限公司より購入、Ｂ６００１８４）の二重酵素で切断し、対応する断片を回収した後にライゲーションし（ＤＮＡゲル回収キット、上海碧雲天生物技術有限公司より購入、Ｄ００５６）、ライゲーション産物と大腸菌ＴＯＰ１０コンピテント細胞を均一に混合し、氷上に３０ｍｉｎ放置し、水浴鍋にて４２℃で９０ｓヒートショックし、氷上に３ｍｉｎ放置し、形質転換を行い、室温ＬＢ液体培地を１００μｌ加え、シェーカーにおいて３７℃、２２０回転数で振盪培養を６０分間行い、菌液を均一に混合してカナマイシン（生工生物工程（上海）有限公司より購入、Ａ５０６６３６）抵抗性プレートに塗布して、このプレートを逆様にして、３７℃で一晩培養し、カナマイシン抵抗性を有する形質転換体をスクリーニングして、融合型多量体タンパク質を発現させた組換えベクターをスクリーニングした。例えば、スクリーニングした融合型多量体タンパク質ＣｍＺｍｂを発現させた組換えベクターをｐＥＴ－３０ａ－ＣｍＺｍｂと命名し、このことから類推して、他の融合型多量体タンパク質の組換えベクターを命名した。
融合型多量体タンパク質のコード遺伝子と発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）をＮｄｅＩ（生工生物工程（上海）有限公司より購入、Ｂ６００１２０）とＨｉｎｄＩＩＩ（生工生物工程（上海）有限公司より購入、Ｂ６００１８４）の二重酵素で切断し、対応する断片を回収した後にライゲーションし（ＤＮＡゲル回収キット、上海碧雲天生物技術有限公司より購入、Ｄ００５６）、ライゲーション産物と大腸菌ＴＯＰ１０コンピテント細胞を均一に混合し、氷上に３０ｍｉｎ放置し、水浴鍋にて４２℃で９０ｓヒートショックし、氷上に３ｍｉｎ放置し、形質転換を行い、室温ＬＢ液体培地を１００μｌ加え、シェーカーにおいて３７℃、２２０回転数で振盪培養を６０分間行い、菌液を均一に混合してカナマイシン（生工生物工程（上海）有限公司より購入、Ａ５０６６３６）抵抗性プレートに塗布して、このプレートを逆様にして、３７℃で一晩培養し、カナマイシン抵抗性を有する形質転換体をスクリーニングして、融合型多量体タンパク質を発現させた組換えベクターをスクリーニングした。例えば、スクリーニングした融合型多量体タンパク質ＣｍＺｍｂを発現させた組換えベクターをｐＥＴ－３０ａ－ＣｍＺｍｂと命名し、このことから類推して、他の融合型多量体タンパク質の組換えベクターを命名した。
【0031】
（２）組換え菌の構築
新鮮なＢＬ２１（ＤＥ３）菌液を３０ｍｉｎ氷浴処理し、４℃、１０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2－ＣａＣｌ2（８０ｍｍｏｌ ＭｇＣｌ2と８０ｍｍｏｌ ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2とＣａＣｌ2は国薬集団化学試薬有限公司より購入、分析純粋、残りの化学試薬は純度が同じ）で再懸濁させ、４℃、１０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、その後、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2溶液で重懸濁させ、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を製造し、ステップ（１）でスクリーニングした組換えベクター（例えばｐＥＴ－３０ａ－ＣｍＺｍｂ）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、カナマイシン含有プレートにおいて形質転換体をスクリーニングし、配列決定の結果、正しい組換え形質転換体と確認し、ＢＬ２１－ｐＥＴ３０ａ－ＣｍＺｍｂと命名し、このことから類推して、他の融合型多量体タンパク質の組換え形質転換体を命名した。
新鮮なＢＬ２１（ＤＥ３）菌液を３０ｍｉｎ氷浴処理し、４℃、１０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を０．１ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ2－ＣａＣｌ2（８０ｍｍｏｌ ＭｇＣｌ2と８０ｍｍｏｌ ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2とＣａＣｌ2は国薬集団化学試薬有限公司より購入、分析純粋、残りの化学試薬は純度が同じ）で再懸濁させ、４℃、１０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、その後、０．１ｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ2溶液で重懸濁させ、ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞を製造し、ステップ（１）でスクリーニングした組換えベクター（例えばｐＥＴ－３０ａ－ＣｍＺｍｂ）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、カナマイシン含有プレートにおいて形質転換体をスクリーニングし、配列決定の結果、正しい組換え形質転換体と確認し、ＢＬ２１－ｐＥＴ３０ａ－ＣｍＺｍｂと命名し、このことから類推して、他の融合型多量体タンパク質の組換え形質転換体を命名した。
【0032】
（３）組換え菌の発酵
配列決定の結果、正しい組換え形質転換体（例えばＢＬ２１－ｐＥＴ３０ａ－ＣｍＺｍｂ）をＬＢ培地に接種量０．５％（体積％）で接種し、ＯＤ600が０．８となるように３７℃で一晩培養し、最終濃度が１０ｇ／Ｌの乳糖を加えて誘導し、３～５時間後に遠心分離して、菌液を収集した。
配列決定の結果、正しい組換え形質転換体（例えばＢＬ２１－ｐＥＴ３０ａ－ＣｍＺｍｂ）をＬＢ培地に接種量０．５％（体積％）で接種し、ＯＤ600が０．８となるように３７℃で一晩培養し、最終濃度が１０ｇ／Ｌの乳糖を加えて誘導し、３～５時間後に遠心分離して、菌液を収集した。
【0033】
菌液（それぞれ乳糖誘導前の菌液、乳糖誘導後の菌液）４０μｌに５×注入緩衝液（陝西普羅安蔕生物科技発展有限公司より提供、品番：１０１３７－１）１０μｌを加え、沸騰水で５ｍｉｎ煮て、２０μｌ注入してＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動を行った結果、図１に示すように、乳糖誘導ＢＬ２１－ｐＥＴ３０ａ－ＣｍＺｍｂ菌液では、４４ｋＤの位置に１本の新しいタンパク質バンドが現れ（図１のレーン２を参照）、乳糖誘導していないＢＬ２１－ｐＥＴ３０ａ－ＣｍＺｍｂ菌液では、このようなバンドが現れない或いはこのバンドの色が薄い（図１のレーン１を参照）。このことから、融合型多量体タンパク質ＣｍＺｍｂがＢＬ２１－ｐＥＴ３０ａ－ＣｍＺｍｂで発現を誘導されたことが示された。同様に、実施例４の他の融合型多量体タンパク質でも、発現が誘導されることに成功した。
【0034】
（４）精製
２０ｍＭ ＰＢ（リン酸水素二ナトリウム十二水和物水溶液５．８０１８ｇ／Ｌ及びリン酸水素二ナトリウム二水和物水溶液０．５９２８ｇ／Ｌを用いて調製し、緩衝液の調製方式はいずれも通常の方法）を含む溶液に、分析用塩化ナトリウムを１１．６８８ｇ／Ｌの濃度に添加し、酸アルカリ水溶液でｐＨをｐＨ７．４に調整して、緩衝液Ａ液を得た。上記ステップ（３）で収集した菌液を緩衝液Ａ液により重量比１：１０で懸濁させ、分解時間をそれぞれ２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４０ｍｉｎとし、超音波破砕し、室温で遠心分離した後、上清を収集し、分解液上清１、２、３を得た。同時に、溶解液上清２をニッケルカラムアフィニティー精製にかけた（下記の溶解液上清２（溶解時間３０ｍｉｎ）のように、４０％Ｂ液が溶離するまでニッケルカラムアフィニティー精製を行い、溶離液を収集し、得られた溶離液を２つに分け、溶離液１と溶離液２とした）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出の結果、図１のレーン３～７に（３種類の分解時間を用いたサンプルの結果に差がなく、図１のレーン３～５のように、レーン３の分解液上清１は分解時間２０ｍｉｎに対応し、レーン４の分解液上清２は分解時間３０ｍｉｎに対応し、レーン５の分解液上清３は分解時間４０ｍｉｎに対応する。図１のレーン６～７のように、溶離液１と溶離液２の結果に明らかな差がなかった）に示すように、融合型多量体タンパク質の大部分は大腸菌ペリプラズムに発現し、沈殿中の発現量は比較的に少なかった。
２０ｍＭ ＰＢ（リン酸水素二ナトリウム十二水和物水溶液５．８０１８ｇ／Ｌ及びリン酸水素二ナトリウム二水和物水溶液０．５９２８ｇ／Ｌを用いて調製し、緩衝液の調製方式はいずれも通常の方法）を含む溶液に、分析用塩化ナトリウムを１１．６８８ｇ／Ｌの濃度に添加し、酸アルカリ水溶液でｐＨをｐＨ７．４に調整して、緩衝液Ａ液を得た。上記ステップ（３）で収集した菌液を緩衝液Ａ液により重量比１：１０で懸濁させ、分解時間をそれぞれ２０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、４０ｍｉｎとし、超音波破砕し、室温で遠心分離した後、上清を収集し、分解液上清１、２、３を得た。同時に、溶解液上清２をニッケルカラムアフィニティー精製にかけた（下記の溶解液上清２（溶解時間３０ｍｉｎ）のように、４０％Ｂ液が溶離するまでニッケルカラムアフィニティー精製を行い、溶離液を収集し、得られた溶離液を２つに分け、溶離液１と溶離液２とした）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出の結果、図１のレーン３～７に（３種類の分解時間を用いたサンプルの結果に差がなく、図１のレーン３～５のように、レーン３の分解液上清１は分解時間２０ｍｉｎに対応し、レーン４の分解液上清２は分解時間３０ｍｉｎに対応し、レーン５の分解液上清３は分解時間４０ｍｉｎに対応する。図１のレーン６～７のように、溶離液１と溶離液２の結果に明らかな差がなかった）に示すように、融合型多量体タンパク質の大部分は大腸菌ペリプラズムに発現し、沈殿中の発現量は比較的に少なかった。
【0035】
溶解液上清２（溶解時間３０ｍｉｎ）をニッケルカラムアフィニティー精製にかけ、具体的な精製ステップを以下に示す。精製装置（ＡＫＴＡ、Ｐｕｒｉｆｉｅｒ）の流速を３ｍｌ／ｍｉｎに調整し、緩衝液Ａ液を用いてカラムを平衡化し、Ａ２８０ｎｍ（検出波長）、Ａ２３１ｎｍ（検出波長）、及びＡ２１５ｎｍ（検出波長）のベースラインを約１０ＣＶだけ安定化させ、ベースラインをゼロにした。Ａポンプでサンプル（溶解液上清６０～１２０ｍｌ）を注入した。ベースラインを約１０ＣＶだけ安定化させるまで、緩衝液Ａ液でカラムをリンスした。ベースラインを約１０ＣＶだけ安定化させるまで、８％（体積％）Ｂ液（Ｂ液は緩衝液Ａ液に最終濃度が１７．０２ｇ／Ｌのイミダゾールを加えたもの、イミダゾールは国薬集団化学試薬有限公司より購入）で不純物を洗浄した。ベースラインを約１０ＣＶ安定化させるまで、４０％（体積％）のＢ液で目的のタンパク質を溶離した。Ｂ液（１００％（体積％））で約３ＣＶ溶離し、ベースラインを安定化させた（このタンパク質は、Ａ２８０ｎｍの吸収が小さく、Ａ２１５ｎｍの吸収が高いが、イミダゾールはＡ２１５ｎｍへの影響が大きく、タンパク質を収集する際には収集範囲を繰り返し確認する必要があるが、濃度が低い場合、Ａ２１５ｎｍ又はＡ２３１ｎｍのピーク開始時に収集を開始し、濃度が高い場合、Ａ２８０ｎｍのピーク開始時に収集する）。ベースラインを約１０ＣＶ安定化させるまで、緩衝液Ａ液を用いてカラムとクロマトグラフィーシステムを洗浄した。特徴的なピークが精製された組換えタンパク質を収集し、例えば、融合型多量体タンパク質ＣｍＺｍｂの純度が８０％以上になった（結果は図２のレーンを参照）。同様に他の融合型多量体タンパク質の純度も８０％以上になった。
【0036】
実施例６ アフィニティークロマトグラフィー媒体の製造
本実施例では、以下のようにアフィニティークロマトグラフィー媒体を製造した。
本実施例では、以下のようにアフィニティークロマトグラフィー媒体を製造した。
【0037】
実施例５で得られた融合型多量体タンパク質を用いて、アフィニティークロマトグラフィー媒体をそれぞれ製造した。具体的なステップは以下に示される。アガロースゲル４ＦＦ（西安藍暁科技新材料股▲ふん▼有限公司）１００ｇに、臭化シアンを２～３０ｍＬ（本実施例では１５ｍｌ）加え、－１０℃～１０℃（本実施例では０℃）で１５～３０ｍｉｎ（本実施例では２２ｍｉｎ）反応させ、２～５０ｍＬ（本実施例では２５ｍｌ）のトリエチルアミンを加え、－１０℃～１０℃（本実施例では０℃）で１５～６０ｍｉｎ（本実施例では３５ｍｉｎ）反応させ、アセトンで洗浄した。融合型多量体タンパク質を純水で０．２～２ｇ（本実施例では１ｇ）溶解し、上記アガロースゲル４ＦＦに加えてｐＨ＝７～１１（本実施例ではｐＨ＝８）に調整し、０～２０℃（本実施例では１０℃）で一晩反応させた後、ｐＨ＝７～１１のエタノールアミン溶液を０．１～１０％（体積％、本実施例では５％）加え、０～４０℃（本実施例では２０℃）で一晩反応させて、アフィニティークロマトグラフィー媒体を得た。製造されたアフィニティークロマトグラフィー媒体は、２０％（体積％）のエタノール溶液中に保存された。
【0038】
実験例１ 融合型多量体タンパク質充填剤の動的担持量試験
ＡＫＴＡ ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステムを用いてプログラミングして実験を行い、カラム媒体を実施例６で製造されたアフィニティークロマトグラフィー媒体とし、１．１ｍｌのアフィニティークロマトグラフィー媒体を用いて２０％（体積％）のエタノール水溶液２ｍｌで均一に混合し、定流ポンプ（上海青浦濾西儀器場により購入）を用いて８ｒｐｍ／ｍｉｎの流速でカラムに入れ、検出波長を２８０ｎｍに設定し、カラム前圧を０．３ＭＰａに設定し、カラムをシステムに接続し、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎに設定し、移動相Ｂ１で１０ＣＶ溶離し、移動相Ａ１で１５ＣＶ平衡化した。サンプル（２ｍｇ／ｍｌＩｇＧ、北京索莱宝科技有限公司により購入、ＳＰ０３１）を流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで注入し、２８０ｎｍまで注入したところの吸収値は９０ｍＡｕであった。一定溶離移動相１００％（体積％）として移動相Ｂ１を設定し、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎにし、ベースラインが安定するまで溶離し、溶離液を収集した。最後に、移動相Ａ１を用いて１０ｍｌ再生し、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。吸収値はプログラムの起動から終了まで動的に検出されていた。
ＡＫＴＡ ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステムを用いてプログラミングして実験を行い、カラム媒体を実施例６で製造されたアフィニティークロマトグラフィー媒体とし、１．１ｍｌのアフィニティークロマトグラフィー媒体を用いて２０％（体積％）のエタノール水溶液２ｍｌで均一に混合し、定流ポンプ（上海青浦濾西儀器場により購入）を用いて８ｒｐｍ／ｍｉｎの流速でカラムに入れ、検出波長を２８０ｎｍに設定し、カラム前圧を０．３ＭＰａに設定し、カラムをシステムに接続し、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎに設定し、移動相Ｂ１で１０ＣＶ溶離し、移動相Ａ１で１５ＣＶ平衡化した。サンプル（２ｍｇ／ｍｌＩｇＧ、北京索莱宝科技有限公司により購入、ＳＰ０３１）を流速０．２ｍｌ／ｍｉｎで注入し、２８０ｎｍまで注入したところの吸収値は９０ｍＡｕであった。一定溶離移動相１００％（体積％）として移動相Ｂ１を設定し、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎにし、ベースラインが安定するまで溶離し、溶離液を収集した。最後に、移動相Ａ１を用いて１０ｍｌ再生し、流速を１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。吸収値はプログラムの起動から終了まで動的に検出されていた。
【0039】
移動相Ａ１：２０ｍｍ ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む混合液、ｐＨ７．４
移動相Ｂ１：０．１Ｍクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．３
動的担持量＝（ＶA×Ｃ0）／ＶC（ｍｇ／ｍｌ ｇｅｌ）
Ｃ0はサンプル中の目的タンパク質の濃度であり、ＶAは突破曲線中の目的サンプルの濃度が５％Ｃ0に達する時の注入総体積であり、ＶCは総カラムベッド体積である（劉瑩、曾建筑、于▲びょう▼ら。アフィニティークロマトグラフィー充填剤の動的担持量の測定方法：中国特許出願公開第１１４２８０２０８号明細書参照）。
ＣｍＺｍｂ、ＣＣ、ＣＤＢ、及びＣＢ（ＣＣ、ＣＤＢ、及びＣＢ中のポリペプチドＣはいずれもポリペプチドＣ（天然））で製造された充填剤について上記の方法に従って動的担持量を検出した結果、図３に示すように、ＣｍＺｍｂで製造された充填剤の動的担持量は、ＣＣ、ＣＤＢ、及びＣＢで製造された充填剤よりも高かった。
移動相Ｂ１：０．１Ｍクエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．３
動的担持量＝（ＶA×Ｃ0）／ＶC（ｍｇ／ｍｌ ｇｅｌ）
Ｃ0はサンプル中の目的タンパク質の濃度であり、ＶAは突破曲線中の目的サンプルの濃度が５％Ｃ0に達する時の注入総体積であり、ＶCは総カラムベッド体積である（劉瑩、曾建筑、于▲びょう▼ら。アフィニティークロマトグラフィー充填剤の動的担持量の測定方法：中国特許出願公開第１１４２８０２０８号明細書参照）。
ＣｍＺｍｂ、ＣＣ、ＣＤＢ、及びＣＢ（ＣＣ、ＣＤＢ、及びＣＢ中のポリペプチドＣはいずれもポリペプチドＣ（天然））で製造された充填剤について上記の方法に従って動的担持量を検出した結果、図３に示すように、ＣｍＺｍｂで製造された充填剤の動的担持量は、ＣＣ、ＣＤＢ、及びＣＢで製造された充填剤よりも高かった。
【0040】
以上の方法により実施した結果、溶離緩衝液ｐＨ４．３（すなわち移動相Ｂ１はｐＨ４．３）の場合、ＣｍＺｍｂ、ＣＣ、ＣＤＢ及びＣＢの溶離効率はそれぞれ８６．６％、５６．８％、８７．９％及び６２．３％であり、ＣｍＺｍｂで製造されたアフィニティークロマトグラフィー媒体は、ｐＨ４．３緩衝液で目的タンパク質を溶離するときの効率が他のアフィニティークロマトグラフィー媒体と比較して高かった。
【0041】
実験例２ 融合型多量体タンパク質充填剤の耐アルカリ性試験
ＡＫＴＡ ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステムを用いてプログラミングして実験を行い、カラム媒体を実施例６で製造されたアフィニティークロマトグラフィー媒体とし、１．１ｍｌのアフィニティークロマトグラフィー媒体を用いて２０％（体積％）エタノール水溶液２ｍｌで均一に混合し、定流ポンプ（上海青浦濾西儀器場により購入）を用いて８ｒｐｍ／ｍｉｎの流速でカラムに入れ、検出波長を２８０に設定し、カラム前圧を０．３ＭＰａに設定し、カラムをシステムに接続し、緩衝液Ａ２を用いて１ｍＬ／ｍｉｎの流速で１０ｍｉｎ平衡化し、カラム中のエタノールを洗い流し、０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて０．２ｍＬ／ｍｉｎの流速でカラムを１５ｍｉｎ洗浄した後、緩衝液Ａ２を用いて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速でカラムを１０ｍｉｎ洗浄し、このことを１００サイクル繰り返し、１０サイクルごとに動的担持量を測定した（動的担持量の計算方法は実験例１参照）。緩衝液Ａ２：２０ｍＭＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む混合液、ｐＨ７．４。
ＡＫＴＡ ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステムを用いてプログラミングして実験を行い、カラム媒体を実施例６で製造されたアフィニティークロマトグラフィー媒体とし、１．１ｍｌのアフィニティークロマトグラフィー媒体を用いて２０％（体積％）エタノール水溶液２ｍｌで均一に混合し、定流ポンプ（上海青浦濾西儀器場により購入）を用いて８ｒｐｍ／ｍｉｎの流速でカラムに入れ、検出波長を２８０に設定し、カラム前圧を０．３ＭＰａに設定し、カラムをシステムに接続し、緩衝液Ａ２を用いて１ｍＬ／ｍｉｎの流速で１０ｍｉｎ平衡化し、カラム中のエタノールを洗い流し、０．５Ｍ ＮａＯＨを用いて０．２ｍＬ／ｍｉｎの流速でカラムを１５ｍｉｎ洗浄した後、緩衝液Ａ２を用いて０．５ｍＬ／ｍｉｎの流速でカラムを１０ｍｉｎ洗浄し、このことを１００サイクル繰り返し、１０サイクルごとに動的担持量を測定した（動的担持量の計算方法は実験例１参照）。緩衝液Ａ２：２０ｍＭＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む混合液、ｐＨ７．４。
【0042】
ポリペプチドＣ（天然）又はポリペプチドＣｍのみで融合型多量体タンパク質を製造した場合の耐アルカリ性試験の結果の一部について、図４を参照する。
【0043】
【表1】
【0044】
２．ＣｍＺｍｂ、ＣＣ、ＣＤＢ及びＣＢで製造された充填剤の耐アルカリ性試験の結果は図４に示され、この図からみると、ＣｍＺｍｂで製造された充填剤の耐アルカリ性試験における動的担持量百分率はＣＣ、ＣＤＢ、及びＣＢより高かった。
【0045】
明らかなように、上記実施例は明瞭に説明するための例に過ぎず、実施形態を限定するものではない。当業者にとって、上記説明に基づき様々な形態の変更や修正を行うことができる。ここで、あらゆる実施形態を網羅する必要がなく、網羅することもできない。これから派生する明らかな変更や修正は依然として本発明創造の保護範囲内にある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるプロテインＡの天然Ｃドメインと比較して、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に置換突然変異を有し、前記１６位は、ロイシン又はバリンに置換により突然変異され、
前記２５位は、リジン、アルギニン、ヒスチジン、又はトリプトファンに置換により突然変異され、
前記２９位は、アラニン、ロイシン、又はトレオニンに置換により突然変異され、
前記４９位は、アルギニン又はヒスチジンに置換により突然変異され、
前記５８位は、グリシン、イソロイシン、又はアラニンに置換により突然変異されたもの、
（２）、（１）の前記ポリペプチドと少なくとも８０％以上の相同性を有し、前記１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位のうちの少なくとも１つの位置における置換突然変異を保持するものから選択される、ことを特徴とするポリペプチド。
【請求項2】
前記１６位はロイシンに置換により突然変異され、及び／又は前記２５位はリジンに置換により突然変異され、及び／又は
前記２９位はアラニンに置換により突然変異され、及び／又は
前記４９位はアルギニンに置換により突然変異され、及び／又は
前記５８位はグリシンに置換により突然変異される、ことを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
前記ポリペプチドは、前記５８位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、２９位及び４９位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は前記ポリペプチドは、４９位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、２９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、２９位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２５位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、２５位に前記置換突然変異を有し、前記１６位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、又は
前記ポリペプチドは、１６位に前記置換突然変異を有し、前記２５位、２９位、４９位及び５８位から選択される少なくとも１つの位置に前記置換突然変異を有し、
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位、２９位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、２９位、４９位及び５８位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位、２５位及び２９位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、１６位及び２５位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、４９位の位置に置換突然変異を有し、又は
任意に、前記ポリペプチドは、２５位の位置に置換突然変異を有する、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
請求項１又は２に記載のポリペプチドが融合して形成された融合型多量体タンパク質を含む、ことを特徴とする融合型多量体タンパク質。
【請求項5】
ポリペプチドＢ及び／又はポリペプチドＺｍｂをさらに含み、前記ポリペプチドＢは、
ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列を有するもの、
ｂ ａのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものから選択され、
前記ポリペプチドＺｍｂは、
ｃ、ａのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸配列ＭＬが挿入されたものであって、前記アミノ酸配列ＭＬのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３に示されるもの、
ｄ、ｂの前記アミノ酸配列の少なくとも１つの位置にアミノ酸配列ＭＬが挿入されたものから選択され、
任意に、前記ポリペプチドＺｍｂのアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示される、ことを特徴とする請求項４に記載の融合型多量体タンパク質。
【請求項6】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをポリペプチドＣｍと表記し、前記融合型多量体タンパク質は、少なくとも１つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は少なくとも１つの前記ポリペプチドＺｍｂを含み、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、１～６つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は１～４つの前記ポリペプチドＺｍｂを含み、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、４つの前記ポリペプチドＣｍ及び／又は２つの前記ポリペプチドＺｍｂを含む、ことを特徴とする請求項４に記載の融合型多量体タンパク質。
【請求項7】
Ａ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるアミノ酸配列を有するもの、Ｂ、ＡのＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するものから選択される少なくとも１つの機能性ポリペプチドＦＬＤをさらに含み、
任意に、前記機能性ポリペプチドＦＬＤは、ポリペプチドＣｍとポリペプチドＺｍｂとの間に位置し、
任意に、前記融合型多量体タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、４つのポリペプチドＣｍ、１つの機能性ポリペプチドＦＬＤ、及び２つのポリペプチドＺｍｂを含む、ことを特徴とする請求項４に記載の融合型多量体タンパク質。
【請求項8】
１）請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする、任意に、ＤＮＡ又はＲＮＡである核酸分子、２）請求項１又は２に記載のポリペプチドを発現する発現カセット、組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
３）１）の前記核酸分子を含む発現カセット、組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
４）２）又は３）の前記発現カセットを含む組換えベクター、組換え微生物又はトランスジェニック細胞株、
５）２）又は３）又は４）の前記組換えベクターを含む宿主細胞のうちのいずれか１種を含み、
任意に、前記組換えベクターは、大腸菌発現ベクターｐＥＴ－３０ａ（＋）から構築されたものであり、任意に、前記宿主細胞は大腸菌であり、任意に、前記大腸菌は大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である、ことを特徴とする生物材料。
【請求項9】
抗体検出、単離又は精製における請求項１又は２に記載のポリペプチドの使用。
【請求項10】
請求項４に記載の融合型多量体タンパク質とアフィニティークロマトグラフィー媒体担体とを含み、任意に、前記アフィニティークロマトグラフィー媒体担体は、アガロースゲル、デキストラン、セルロース、水酸基を有する高分子ポリマー又はシリカゲルを含むが、これらに限定されない、ことを特徴とするアフィニティークロマトグラフィー媒体。
【国際調査報告】