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特表2024-535178ＣＡＲＳスペクトルを取得するための方法およびシステム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-30
(54)【発明の名称】ＣＡＲＳスペクトルを取得するための方法およびシステム
(51)【国際特許分類】
G01N 21/65 20060101AFI20240920BHJP
【ＦＩ】
G01N21/65
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024504883
(86)(22)【出願日】2022-10-06
(85)【翻訳文提出日】2024-01-25
(86)【国際出願番号】 JP2022037421
(87)【国際公開番号】W WO2023058710
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】63/252,775
(32)【優先日】2021-10-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509339821
【氏名又は名称】アトナープ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100102934
【弁理士】
【氏名又は名称】今井 彰
(72)【発明者】
【氏名】ブルックナー ルーカス
【テーマコード（参考）】
2G043
【Ｆターム（参考）】
2G043AA03
2G043BA16
2G043CA04
2G043EA04
2G043FA02
2G043FA06
2G043HA01
2G043HA02
2G043HA07
2G043HA09
2G043JA03
2G043JA05
2G043KA01
2G043KA08
2G043KA09
2G043LA03
2G043NA01
(57)【要約】
システム（１）は、ストークス光パルス（１１）と、ポンプ光パルス（１２）と、第１のプローブ光パルス（１３ａ）および第２の光パルス（１３ｂ）を含むハイブリッドプローブ光パルス（１３）とをターゲット（５）の一部（５ａ）に照射するように構成された光路（２０）を有し、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスは時間的に部分的に重なり、第１および第２のプローブ光パルスはストークスパルスおよびポンプパルスと部分的に重なり、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスの少なくとも一方が位相を変化させる。システムは、さらに、ストークス光パルスと、ポンプ光パルスと、ハイブリッドプローブ光パルスとによって生成されたＣＡＲＳスペクトル（１５ｘ）および（１５ｙ）を検出し、ハイブリッドプローブ光パルスの位相に関連してＣＡＲＳスペクトル（１５）のセットを取得するように構成された検出器（５０）を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ストークス光パルスと、ポンプ光パルスと、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスを含むハイブリッドプローブ光パルスとをターゲットの一部に照射することによりＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することであって、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスは時間的に部分的に重複し、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスは前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと部分的に重複しており、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスの少なくとも一方の位相を変化させて前記ＣＡＲＳスペクトのセットを取得することと、取得された前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することにより、共鳴成分を抽出することと、を有する、方法。
【請求項2】
請求項１において、前記第２のプローブ光パルスは、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスとともに局部発振（ＬＯ）信号を発生するように選択され、前記第１のプローブ光パルスは、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスとともに共鳴成分を含む信号を発生するように選択されている、方法。
【請求項3】
請求項１において、前記第１および第２のプローブ光パルスのパルス幅は、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスのパルス幅よりも大きく、
前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、前記第１のプローブ光パルスが、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスに対し、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと前記第１のプローブ光パルスの前記パルス幅の範囲内で部分的に重なる第１の相対的な時間的関係を備え、前記第２のプローブ光パルスが、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと前記第２のプローブ光パルスの前記パルス幅の範囲内で部分的に重なる第２の相対的な時間的関係であって、前記第１の相対的な時間的関係に対して負の遅延を含む第２の相対的な時間的関係を備えている、前記ハイブリッドプローブ光パルスを出射することを含む、方法。
【請求項4】
請求項１において、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、前記第２のプローブ光パルスが前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスよりも早く出射されるように、前記ハイブリッドプローブ光パルスを出射することを含む、方法。
【請求項5】
請求項１において、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、前記ストークス光パルス、前記ポンプ光パルスおよび前記第１のプローブ光パルスが実質的に同時に出射され、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスが実質的に前記第２のプローブ光パルスのパルス幅の端になるように、前記ハイブリッドプローブ光パルスを出射することを含む、方法。
【請求項6】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、前記ストークス光パルス、前記ポンプ光パルスおよび前記ハイブリッドプローブ光パルスを用いて前記ターゲットをスキャンし、各画素におけるＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することをさらに有する、方法。
【請求項7】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、前記ストークス光パルス、前記ポンプ光パルスおよび前記ハイブリッドプローブ光パルスで前記ターゲットをスキャンし、各ボクセルのＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することをさらに有する、方法。
【請求項8】
請求項１ないし７のいずれかにおいて、前記ストークス光パルスは第１の波長範囲を備え、前記ポンプ光パルスは前記第１の波長範囲よりも短い第２の波長範囲を備え、前記ハイブリッドプローブ光パルスは前記第２の波長範囲よりも短い第３の波長範囲を備えている、方法。
【請求項9】
請求項１ないし８のいずれかにおいて、前記ストークス光パルスはブロードバンドストークスビームを含む、方法。
【請求項10】
請求項１ないし９のいずれかにおいて、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、
波長板を用いて入力プローブ光パルスの偏光を変換することと、
ＰＢＳを用いて前記入力プローブ光パルスから前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを分離することと、
前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスをそれぞれ第１のプローブ経路および第２のプローブ経路であって、それぞれが、波長板、光パルスを前記ＰＢＳに反射させるためのミラーを含み、前記第１のプローブ経路および前記第２のプローブ経路の少なくとも一方は、別の経路との時間差を含む経路、および変調のために前記ミラーを移動するアクチュエータを含む、前記第１のプローブ経路および前記第２のプローブ経路により調整することと、
前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを前記ＰＢＳにより重ねられるようにガイドすることと、を含む、方法。
【請求項11】
請求項１ないし９のいずれかにおいて、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、
波長板を用いて入力プローブ光パルスの偏光を変換することと、
少なくとも１つの複屈折結晶体を用いて、前記入力プローブ光パルスから前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを分離し、前記第１のプローブ光パルスと前記第２のプローブ光パルスとの間に時間差を設けることと、
ＥＯＭ（電気光学変調器）を用いて、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスの少なくとも一方を変調することと、
偏光素子によってオーバーラップされた前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスをガイドすることと、を含む、方法。
【請求項12】
ストークス光パルスと、ポンプ光パルスと、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスを含むハイブリッドプローブ光パルスとを、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスが時間的に部分的に重なり、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスが前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと部分的に重なり、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスの少なくとも一方の位相を変化させた状態で、ターゲットの一部に照射するように構成された光路と、前記ストークス光パルス、前記ポンプ光パルスおよび前記ハイブリッドプローブ光パルスにより発生されたＣＡＲＳスペクトルを検出して、前記ハイブリッドプローブ光パルスの位相に関連するＣＡＲＳスペクトルのセットを取得するように構成された検出器と、を有する、システム。
【請求項13】
請求項１２において、前記第１のプローブ光パルスと、前記第１のプローブ光パルスに対して負の遅延を含む前記第２のプローブ光パルスとを含む前記ハイブリッドプローブ光パルスを生成するように構成されたプローブパルスジェネレータをさらに有する、システム。
【請求項14】
請求項１２において、さらに、プローブパルスジェネレータを有し、
前記プローブパルスジェネレータは、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスのパルス幅よりも大きいパルス幅を含む前記第１のプローブ光パルスであって、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと前記第１のプローブ光パルスの前記パルス幅内で部分的に重なる第１の相対的な時間的関係を備えた前記第１のプローブ光パルスを生成するように構成された第１のプローブパルスコンディショナと、
前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスのパルス幅よりも大きいパルス幅を含む前記第２のプローブ光パルスであって、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと前記第２のプローブパルスの前記パルス幅内で部分的に重なり、前記第１の相対的な時間的関係に対して負の遅延を含む第２の相対的な時間的関係を備えた前記第２のプローブパルスを生成するように構成された第２のプローブパルスコンディショナと、を含む、システム。
【請求項15】
請求項１３または１４において、前記プローブパルスジェネレータは、前記第２のプローブ光パルスが前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスよりも早く出射されるように、前記ハイブリッドプローブ光パルスを生成するように構成されている、システム。
【請求項16】
請求項１３ないし１５のいずれかにおいて、前記プローブパルスジェネレータは、前記第１のプローブ光パルスが前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと実質的に同時に出射され、前記第２のプローブ光パルスが前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスが前記第２のプローブ光パルスの前記パルス幅の実質的な端部で出射されるように、前記ハイブリッドプローブ光パルスを生成するように構成されている、システム。
【請求項17】
請求項１２において、さらに、プローブパルスジェネレータを有し、
前記プローブパルスジェネレータは、
入力プローブ光パルスの偏光を変換するための波長板と、
前記入力プローブ光パルスから前記第１のプローブ光パルスと前記第２のプローブ光パルスとを分離するためのＰＢＳと、
前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスをそれぞれ調整するための第１のプローブ経路および第２のプローブ経路とを含み、前記第１のプローブ経路および前記第２のプローブ経路はそれぞれ、波長板、および光パルスを前記ＰＢＳに反射させるためのミラーを含み、前記第１のプローブ経路および前記第２のプローブ経路の少なくとも一方は、他の経路との間に時間差を設けるための経路、および変調のために前記ミラーを移動させるアクチュエータを含み、
前記プローブパルスジェネレータは、さらに、前記ＰＢＳによって重ねられた前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを導くための出力経路を含む、システム。
【請求項18】
請求項１２において、さらに、プローブパルスジェネレータを有し、
前記プローブパルスジェネレータは、
入力プローブ光パルスの偏光を変換するための波長板と、
前記入力プローブ光パルスから前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを分離し、前記第１のプローブ光パルスと前記第２のプローブ光パルスとの間に時間差を設けるための少なくとも１つの複屈折結晶体と、
前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスの少なくとも一方を変調するためのＥＯＭと、
偏光素子によって重ねられた前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを導く出力経路と、を含む、システム。
【請求項19】
請求項１２ないし１７のいずれかにおいて、前記光路は、第１の波長範囲の前記ストークス光パルスを供給するように構成された第１の光路と、
前記第１の波長範囲よりも短い第２の波長範囲の前記ポンプ光パルスを供給するように構成された第２の光路と、
前記第２の波長範囲よりも短い第３の波長範囲の前記ハイブリッドプローブ光パルスを供給するように構成された第３の光路と、を含む、システム。
【請求項20】
請求項１９において、前記第１の光路は、ブロードバンドポンプ光パルスからブロードバンドストークスビームを生成するための第１の光学素子を含む、システム。
【請求項21】
請求項１２ないし２０のいずれかにおいて、前記ストークス光パルス、前記ブロードバンドポンプ光パルスおよび前記ハイブリッドプローブ光パルスを用いて前記ターゲットを走査し、各画素におけるＣＡＲＳスペクトルのセットを取得するように構成されたスキャナーをさらに有する、システム。
【請求項22】
請求項１２ないし２０のいずれかにおいて、前記ストークス光パルス、前記ブロードバンドポンプ光パルスおよび前記ハイブリッドプローブ光パルスを用いて前記ターゲットを走査し、各ボクセルのＣＡＲＳスペクトルのセットを取得するように構成されたスキャナーをさらに有する、システム。
【請求項23】
請求項１２ないし２２のいずれかにおいて、取得されたＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することにより共鳴成分を抽出するように構成された分析装置をさらに有する、システム。
【請求項24】
コンピュータを請求項１２ないし２３のいずれかに記載のシステムとして動作させるためのコンピュータプログラムであって、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得し、取得されたＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することによって共鳴成分を抽出するように前記システムを制御するための命令を含む、コンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般に、ＣＡＲＳ（コヒーレント反ストークスラマン散乱（分光））スペクトルおよび／または複数のスペクトルを取得するためのシステムおよび方法に関するものである。
【背景技術】
【0002】
米国特許第７，３８８，６６８号は、試料体積内に誘導された非線形コヒーレント場を検出するためのシステムを開示している。このシステムは、第１の周波数で第１の電磁場を発生するための第１のソースと、第２の周波数で第２の電磁場を発生するための第２のソースと、第１および第２の電磁場を試料体積に向けるための第１の光学系と、第１および第２の電磁場を局部発振器体積に向けるための第２の光学系と、干渉計とを含む。干渉計は、試料体積における第１および第２の電磁場の相互作用によって生成される第１の散乱場と、局所発振器体積における第１および第２の電磁場の相互作用によって生成される第２の散乱場とを干渉させるためのものである。
【0003】
コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）のスペクトルまたは散乱光を検出することを含む方法およびシステムは、例えば、生体対象の関心対象の生化学的および構造特性評価の分野、特に生体対象の関心対象の生化学組成物の侵襲的および非侵襲的評価およびそれらのアプリケーションを含む広い分野で応用されている。
【発明の概要】
【0004】
しかしながら、ＣＡＲＳスペクトル（スペクトラ）は共鳴成分と非共鳴成分とを含む。局部発振（ＬＯ）を用いたヘテロダイン検出は、ＣＡＲＳスペクトル（スペクトラ、複数のスペクトル）から共鳴成分を取得するための解決策の１つであった。この方法は、（ａ）信号と一定の位相関係を持つコヒーレントで位相安定なＬＯと信号をオーバーラップさせるステップと、（ｂ）ＬＯと信号の位相差をスキャンするステップとを含む。位相差は、ディレイステージ、シングルムービングミラー、対象物全体の移動（エピ、後方散乱）、パルスシェーパー、２つのガラスウェッジなどによって制御することができる。局部発振源としては、米国特許第７，３８８，６６８号に開示されているような、非共鳴試料の第２の焦点からＬＯ信号を発生させる発振器、外部レーザー、コヒーレントプロセスで発生するレーザー（ＮＯＰＡ／ＯＰＡ）、ブロードバンドレーザーのブルーウィング（ＳＢ－ＣＡＲＳ）などが考えられる。しかしながら、このような外部、すなわちターゲット以外からＬＯを取得する方法では、異なる光学系を使用することによる不安定性に加え、ＬＯの取得や切り替えに時間がかかるという問題がある。
【0005】
本発明の一態様は、（ｉ）ストークス光パルスと、ポンプ光パルスと、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスを含むハイブリッドプローブ光パルスとを、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスの少なくとも一方の位相を変化させながら、ターゲットの一部に照射してＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することと、（ｉｉ）取得したＣＡＲＳスペクトルのセットを比較して共鳴成分を抽出することとを含む方法である。ハイブリッドプローブ光パルスの第１のプローブ光パルスと第２のプローブ光パルスとは時間的に部分的に重なり、第１のプローブ光パルスと第２のプローブ光パルスとはストークス光パルスとポンプ光パルスと部分的に重なる。
【0006】
本発明者のシミュレーションの結果によれば、負の遅延のプローブ光パルスを使用することにより、共鳴成分はスペクトルから消去されるか、ほぼ消去されるので、そのスペクトルをＬＯ信号（局部発振信号）または信号として使用することができる。この方法では、ハイブリッドプローブ光パルスのうち、負の遅延を持つ一方のパルス（第２のプローブ光パルス）を、ターゲットから照射することで、ハイブリッドプローブ光パルスのうち、他方のパルス（第１のプローブ光パルス）で発生された共鳴成分を含む信号と同時にＬＯ信号を得ることができる。したがって、この方法では、第２のプローブ光パルスは、ストークス光パルスとポンプ光パルスとにより局部発振（ＬＯ）信号を発生するように選択することができ、第１のプローブ光パルスは、ストークス光パルスとポンプ光とにより共鳴成分を含む信号を発生するように選択することができる。このため、この方法では、本質的に干渉を安定化でき、リファレンス測定が不要で、光学系の切り替えが不要であり、スキャン速度を向上できる。ＬＯと共鳴成分を持つ信号とを得るために試料を切り替える場合、レーザーのドリフトなどの不安定要因が発生する可能性がある。しかしながら、この方法では、ターゲットからＬＯと共鳴成分を持つ信号とを同じ光学系で同時に取得することができるため、ＬＯの測定と共鳴成分を持つ信号の測定との間で、上記のような変化やドリフトが発生することはない。
【0007】
第１および第２のプローブ光パルスのパルス幅は、ストークス光パルスおよびポンプ光パルスのパルス幅よりも大きく（広く）てもよい。ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、第１のプローブ光パルスが、ストークス光パルスおよびポンプ光パルスと第１のプローブ光パルスのパルス幅内で部分的に重なるように、ストークス光パルスおよびポンプ光パルスに対して第１の相対的な時間的関係を有し、第２のプローブ光パルスが、ストークス光パルスおよびポンプ光パルスと第２のプローブ光パルスのパルス幅内で部分的に重なり、第１の相対的な時間的関係に対して負の遅延を含む第２の相対的な時間的関係を有するように、ハイブリッドプローブ光パルスを出射することを含んでもよい。この方法のＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、第２のプローブ光パルスがストークス光およびポンプ光のパルスよりも早く出射（放出）されるように、ハイブリッドプローブ光パルスを出射（放出）することを含んでもよい。この方法のＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、ストークス光パルス、ポンプ光パルスおよび第１のプローブ光パルスが実質的に同時に出射され、ストークス光パルスおよびポンプ光パルスが第２のプローブ光パルスのパルス幅の実質的な端部（終了部分）に出射されるように、ハイブリッドプローブ光パルスを出射することを含んでもよい。
【0008】
この方法は、２Ｄ（二次元）ＣＡＲＳ顕微鏡イメージングの処理を行うために、複数のストークス光パルス、複数のポンプ光パルス、および複数のハイブリッドプローブ光パルスでターゲットを走査し、各画素でＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することをさらに含んでもよい。この方法は、３Ｄ（三次元）ＣＡＲＳ顕微鏡イメージングの処理を行うために、複数のストークス光パルス、複数のポンプ光パルス、および複数のハイブリッドプローブ光パルスでターゲットを走査し、各ボクセルでＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することをさらに含んでもよい。
【0009】
本発明の他の態様の１つは、（ｉ）ストークス光パルス、ポンプ光パルスおよびハイブリッドプローブ光パルスをターゲットの一部に照射するように構成された光路であって、ハイブリッドプローブ光パルス中の第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスが時間的に部分的に重なり、さらに、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスがストークスパルスおよびポンプパルスと部分的に重なり、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスの少なくとも一方の位相を変化させながら照射する光路と、（ｉｉ）ストークス光パルス、ポンプ光パルスおよびハイブリッドプローブ光パルスによって生成されたＣＡＲＳスペクトルを検出して、ハイブリッドプローブ光パルスの位相に関連するＣＡＲＳスペクトルのセットを取得するように構成された検出器とを有するシステムである。
【0010】
この発明のさらに他の態様の１つは、コンピュータを上述したシステムとして動作させるための非一過性媒体に格納されたコンピュータプログラムまたはコンピュータプログラム製品である。コンピュータプログラム（プログラム製品）は、ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得し、取得されたＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することによって共鳴成分を抽出するようにシステムを制御するための命令を含む。
【図面の簡単な説明】
【0011】
本明細書の実施形態は、図面を参照した以下の詳細な説明からより良く理解されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本明細書における実施形態ならびにその様々な特徴および有利な詳細は、添付図面に図示され、以下の説明において詳述される非限定的な実施形態を参照して、より十分に説明される。周知の構成要素および処理技術の説明は、本明細書における実施形態を不必要に不明瞭にしないように省略する。本明細書で使用される例は、単に、本明細書の実施形態が実施され得る方法の理解を容易にし、当業者が本明細書の実施形態を実施することをさらに可能にすることを意図している。したがって、実施例は、本明細書における実施形態の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0013】
図１は、この発明の一実施形態によるシステム１を示す。このシステム１は、ターゲット５の一部５ａにＣＡＲＳ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ－Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（コヒーレント反ストークスラマン散乱）またはＣｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ－Ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（コヒーレント反ストークスラマン分光））信号（ＣＡＲＳスペクトル、ＣＡＲＳ光）１５を発生（生成）するために、ターゲット５の一部５ａに照射するようにストークス光パルス１１、ポンプ光パルス１２およびハイブリッドプローブ光パルス１３を供給（出射）するように構成された光学モジュール１０を備えている。このシステム１は、用途に応じて、測定装置、分析装置、監視装置、モニタ等として使用することができる。光学系１０は、ＣＡＲＳを用いて、キュベット内の試料や人体などのターゲット５の表面および内部の状態や成分を示すデータを取得する。
【0014】
システム１は、さらに、ストークス光パルス１１、ポンプ光パルス１２、およびプローブパルス１３によりターゲット５を走査（スキャン）し、レンズ２８および他の光学要素を通してターゲット５からＣＡＲＳ光１５を取得するように構成されたスキャナー（走査インターフェース）６０と、ハイブリッドプローブ光パルス１３を生成（発生）し、その位相を制御するように構成されたプローブパルスジェネレータ（プローブパルス発生器）７０と、分析するためにＣＡＲＳ光１５を検出するように構成された検出器（ディテクター）５０と、システム１およびスキャナー６０、プローブパルスジェネレータ７０、およびレーザー光源３０などのモジュールを制御するように構成されたコントローラー５５とをさらに備えている。スキャニングモジュール６０は、キュベットをスキャニングするように構成されてもよく、非侵襲的サンプラー、侵襲的サンプラー、流路、または指先（フィンガーチップ）スキャニングインターフェースモジュールのようなウェアラブルスキャニングインターフェースとして機能してもよい。コントローラー５５は、レーザー光源３０を制御するレーザーコントローラー５８と、ＣＡＲＳ（ＣＡＲＳスペクトル）によって内部組成（成分）を分析する分析器（アナライザー）５６とを含む。分析器５６は、ＣＡＲＳ光１５が生成されるターゲット５の一部（部位）５ａを確認するための複数のモジュールを含んでいてもよい。コントローラー５５のメモリに格納されたプログラム（プログラム製品、ソフトウェア、アプリケーション）５９は、メモリ、ＣＰＵ等のコンピュータ資源を備えたコントローラー５５上の処理を実行するために提供される。プログラム（ソフトウェア）５９は、プロセッサまたはコンピュータによって読み取り可能な他の記憶媒体（非一時的媒体）に格納されていてもよい。プログラムは、システム１を制御して本明細書に記載の処理を実行するための命令を含んでもよい。
【0015】
光学システム１０は、複数のストークス光パルス（ストークスビームパルス）１１および複数のポンプ光パルス（ポンプビームパルス）１２のための第１の波長１０４０ｎｍの複数の第１のレーザーパルス３０ａを生成するためのレーザー光源３０を含む。好ましいレーザー光源３０の１つは、ファイバーレーザーである。複数の第１のレーザーパルス３０ａのそれぞれは、数１０～数１００ｍＷの１～数１００ｆｓ（フェムト秒）オーダーのパルス幅を有し、フェムト秒オーダーのパルス幅を有するストークス光１１およびポンプ光１２のパルスを生成（発生）する。ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスのパルス幅ＰＷ１は、１～数１００ｆｓ、例えば、１～９００ｆｓであってもよく、１０～６００ｆｓであってもよく、５０～４００ｆｓであってもよい。光学系１０は、レーザー光パルスの分離および結合用の光路を配置するためのレンズ、フィルタ、ミラー、ダイクロイックミラーおよびプリズムなどの複数の光学素子２９を含む。
【0016】
光学系１０は、複数のストークス光パルス１１、複数のポンプ光パルス１２および複数のハイブリッドプローブ光パルス１３をターゲット５の一部５ａに照射するように構成された光路２０を含む。光路２０は、ＰＣＦ（Ｐｈｏｔｏｎｉｃ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｆｉｂｅｒ、フォトニッククリスタルファイバ、ファイバ）２１ａを介して、ポンプ光パルス１２と共通の第１のレーザーパルス３０ａから波長１０８０～１３００ｎｍの第１の範囲Ｒ１を有するブロードバンド（広帯域）の複数のストークス光パルス１１を供給するように構成されたストークス光路（第１の光路、ストークスユニット）２１を含む。光路２０は、ストークス光パルス１１と共通の第１のレーザーパルス３０ａからの第１の波長範囲（第１の範囲）Ｒ１よりも短い波長１０７０ｎｍの第２の波長範囲Ｒ２を有する複数のポンプ光パルス（第２の光パルス）１２に供給するように構成されたポンプ光路（第２の光路、ポンプユニット）２２を含む。光路２０は、経路２１により供給されるストークス光パルス１１と、経路２２により供給されるポンプ光パルス１２とを、ハイブリッドプローブ光パルス１３とともに光入出力部（レンズ系）２８に供給する共通光路を含む。光路には、フィルタ、ファイバ、ダイクロイックミラー、プリズムなど、各光路を構成するために必要な光学素子が含まれる。以下に説明する光路についても同様である。
【0017】
レーザー光源３０は、複数のストークス光パルス１１および複数のポンプ光パルス１２用の第１の波長１０４０ｎｍの複数の第１のレーザーパルス３０ａに加えて、複数のプローブ光パルス（プローブビームパルス）１３用の第２の波長７８０ｎｍの複数の第２のレーザーパルス３０ｂを発生する。第２のレーザーパルス３０ｂは、ピコ秒オーダーのパルス幅を有するプローブ光１３のパルスを生成するために、数１０～数１００ｍＷの１～数１０ｐｓ（ピコ秒）オーダーのパルスを含むことができる。プローブ光１３のパルスのパルス幅ＰＷ２は、１～数１０ｐｓ、例えば、１～９０ｐｓであってもよく、１～５０ｐｓであってもよく、２～１０ｐｓであってもよい。波長７８０ｎｍの第２のレーザーパルス３０ｂは、波長１５６０ｎｍの光源発振器から発生させてもよい。光路２０は、ストークス光路２１およびポンプ光路２２に加えて、第２の波長範囲Ｒ２よりも短い波長７８０ｎｍの第３の波長範囲Ｒ３を有する複数のプローブ光パルス（プローブビームパルス）１３を供給するように構成されたプローブ光路（第３の光路）２３を含む。
【0018】
光路２０は、複数のストークス光パルス１１、複数のポンプ光パルス１２および複数のプローブ光パルス１３をターゲット５に同軸的に出力し、共通の光路を介してターゲット５からＣＡＲＳ光１５を取得するように構成された光Ｉ／Ｏユニット（光学ユニット）２８をさらに含む。典型的な光入出力ユニット２８は、ターゲット５に対向し、後方に散乱したＣＡＲＳ光パルス（バックワードＣＡＲＳ光パルス、Ｅｐｉ－ＣＡＲＳ）１５を取得する対物レンズまたはレンズ系である。光学系１０は、前方に散乱したＣＡＲＳ光（フォワードＣＡＲＳ光）を得るように構成された光路を含んでもよい。このシステム１では、波長範囲Ｒ３よりも短い６８０～７６０ｎｍの波長範囲の複数のＣＡＲＳ光パルス１５がプローブ光パルス１３によって発生（生成）され、検出器５０によって検出されるように取得される。
【0019】
プローブ光路２３は、第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとによるハイブリッドプローブ光パルス（ペアプローブ光パルス、複合プローブ光パルス）１３を生成するように構成されたプローブパルスジェネレータ（プローブパルス生成装置、プローブパルス発生装置、プローブパルスコンディショナ）７０を含む。第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂは、時間的に一部重複しており、第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂは、それぞれ、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２と一部重複している。さらに、プローブパルスジェネレータ７０は、第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂの少なくとも一方の位相を変化させるように構成されている。プローブパルスジェネレータ７０は、プローブ光パルス１３ａおよび１３ｂのパルス幅ＰＷ２内において、プローブ光１３ａおよび１３ｂの各パルスと、ストークス光１１およびポンプ光１２の各パルスとの間の相対的な時間的関係を制御するように構成されている。典型的には、プローブパルスジェネレータ７０は、プローブ光パルス１３ａおよび１３ｂの出射（放出）と、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２の出射（放出）との間の時間差Δｔを制御（変化、設定、または変調）する。プローブパルスジェネレータ７０は、後述するように、プローブ光パルス１３ａ、１３ｂの各光路（光路の長さ）を変調することができるコリメータとモータやピエゾなどのアクチュエータとを有する時間遅延ステージ（時間遅延ユニット）を含むことができる。プローブパルスジェネレータ７０は、コリメータ間の距離を制御するＬＣ－ＳＬＭ（Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｐａｔｉａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ、液晶空間光変調器）、ＡＷＧ（Ａｒｒａｙｅｄ Ｗａｖｅ－ｇｕｉｄｅ Ｇｒａｔｉｎｇ、アレイ導波路解析格子）等を含むことができる。
【0020】
このシステム１では、ハイブリッドプローブ光パルス１３の対をなすうちの１つである負の遅延（逆時間遅延）Δｔｎを有する第２のプローブ光パルス１３ｂがストークス光パルス１１とポンプ光パルス１２とで局部発振（ＬＯ）信号を生成するために選択される。したがって、プローブパルスジェネレータ７０は、第１のプローブ光パルス１３ａと、第１のプローブ光パルス１３ａに対して負の遅延Δｔｎの第２のプローブ光パルス１３ｂとでハイブリッドプローブ光パルス１３を生成するように構成されている。
【0021】
本システム１において、プローブパルスジェネレータ７０は、第１のプローブパルスコンディショナ（第１のプローブパルスユニット、第１のプローブパルスジェネレータ）７１と、第２のプローブパルスコンディショナ（第２のプローブパルスユニット、第２のプローブパルスジェネレータ）７２と、入力インターフェース７３と、出力インターフェース７４と、ＴＤプローブパルスコンディショナ（ＴＤプローブパルスユニット、ＴＤプローブパルスジェネレータ）７５とを含む。第１のプローブパルスユニット７１は、パルス幅ＰＷ２がストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２のパルス幅ＰＷ１よりも大きい第１のプローブ光パルス１３ａであって、第１のプローブ光パルス１３ａのパルス幅ＰＷ２内でストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２と部分的に重なる第１の相対的な時間的関係（相対時間関係、相対的時間的関係）Δｔ１を有する複数の第１のプローブ光パルス１３ａを生成するように構成されている。第２のプローブパルスユニット７２は、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２のパルス幅ＰＷ１よりも大きなパルス幅ＰＷ２の第２のプローブ光パルス１３ｂであって、第１の相対的な時間的関係Δｔ１に対して負の遅延時間Δｔｎを有し、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２と第２のプローブパルス１３ｂのパルス幅ＰＷ２内で部分的に重なる第２の相対的な時間的関係Δｔ２を有する複数の第２のプローブ光パルス１３ｂを生成するように構成されている。ＴＤプローブパルスユニット７５は、ＴＤ－ＣＡＲＳスペクトルを生成するために、正の遅延Δｔｄを有する複数のＴＤプローブ光パルス１３ｃを生成するように構成されている。
【0022】
このシステム１では、プローブパルスジェネレータ７０は、負の遅延Δｔｎを有する第２のプローブ光パルス１３ｂがストークス光１１およびポンプ光１２のパルスよりも早く放出されるように、ハイブリッドプローブ光パルス１３を生成（発生）するように構成されている。典型的には、プローブパルスジェネレータ７０は、第１のプローブ光パルス１３ａがストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２と実質的に同時に（第１の相対的な時間的関係Δｔ１＝０）出射され、ストークス光パルス１１とポンプ光パルス１２とが第２のプローブ光パルス１３ｂのパルス幅ＰＷ２の実質的な端部（終端、第２の相対的な時間的関係Δｔ２および負の遅延時間ΔｔｎがＰＷ２にほぼ一致または等しい）で出射されるように、第２のプローブ光パルス１３ｂを出射させる。負の時間遅延は、ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスによる励起に対して数１０００ｆｓ（数ピコ秒）またはそれ以上であってもよい。
【0023】
第１のプローブユニット７１および／または第２のプローブユニット７２は、第１のプローブ光パルス１３ａの位相φ１と第２のプローブ光パルスの位相φ２との間の位相差Δφをプラス・マイナスＰｉ／２（（＋／－）π／２）付近で変化させる機能を含んでもよい。このシステム１では、第２のプローブパルスユニット７２が第２のプローブ光パルス１３ｂを変調して、ハイブリッドプローブ光パルス１３にプラス・マイナスＰｉ／２（（＋／－）π／２）付近の位相差Δφを含むように位相φ２を変化させる。プローブパルスジェネレータ７０によって提供される相対的な位相差Δφは、コントローラー５５内の位相コントローラー（タイミングコントローラー、変調コントローラー）５６ｔの制御下で変化または設定されてもよい。ジェネレータ７０を用いて、プローブ光路２３は、第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとの位相差Δφがプラス・マイナスＰｉ／２（（＋／－）π／２）の異なる２種類（２タイプ）のハイブリッドプローブ光パルス１３ｘおよび１３ｙを供給し、光入出力部２８を介してターゲット５の点５ａにハイブリッドプローブ光パルス１３として照射し、ストークス光１１、ポンプ光１２およびハイブリッドプローブ光１３のパルスにより発生された、ＬＯ信号に位相が異なる共鳴成分（共振成分）を含む２種類（２タイプ）のＣＡＲＳパルス１５ｘおよび１５ｙを得ることができる。
【0024】
コントローラー５５は、ＣＡＲＳスペクトル取得モジュール（ＣＡＲＳ取得モジュール、ＣＡＲＳ取得装置）５６ａをさらに含む。ＣＡＲＳ取得モジュール５６ａは、位相制御器５６ｔを介してプローブパルスジェネレータ７０を制御して、複数のストークス光パルス１１、ポンプ光パルス１２およびハイブリッドプローブ光パルス１３をターゲット５の一部５ａに、ハイブリッドプローブ光パルス１３の位相を変化させながら同期して照射することにより、ハイブリッドプローブ光パルス１３の位相と関連付けられたＣＡＲＳスペクトル１５ｘおよび１５ｙを含むＣＡＲＳスペクトル１５のセット（複数のセット）を取得する。コントローラー５５は、位相コントローラー５６ｔを介してプローブパルスジェネレータ７０を制御し、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２に対して正の遅延Δｔｄを有するＴＤ（時間遅延）プローブ光パルス１３ｃを用いてＴＤ－ＣＡＲＳスペクトルを取得する、ＴＤ－ＣＡＲＳ取得モジュール５６ｂをさらに含んでもよい。
【0025】
検出器５０は、ストークス光１１と、ポンプ光１２と、ハイブリッドプローブ光１３ｘおよび１３ｙとのパルスによって生成されたＣＡＲＳスペクトル１５ｘおよび１５ｙを検出して、ハイブリッドプローブ光１３ｘおよび１３ｙの位相差に関連するスペクトル１５ｘおよび１５ｙを含むＣＡＲＳスペクトル１５のセットを取得するように構成される。
【0026】
コントローラー５５は、分析器５５の機能の１つとして、ターゲット５の部分５ａの特徴または組成を分析するために取得されたＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することによって、ＣＡＲＳスペクトル１５のセットから共鳴成分（共鳴特徴）Ｒｆを抽出するように構成された抽出モジュール（抽出器）５６ｄをさらに含んでもよい。抽出モジュール５６ｄは、スキャナー６０を使用してターゲット５を走査する機能を含んでもよい。スキャナー６０は、複数のストークス光パルス１１、複数のポンプ光パルス１２、および複数のハイブリッドプローブ光パルス１３ｘおよび１３ｙを用いてターゲット５を走査し、各画素におけるＣＡＲＳスペクトル１５のセットを取得するように構成される。分析器５６は、共鳴特徴Ｒｆを有する複数の画素によるターゲット５の画像（２次元画像）を生成する画像生成モジュール（画像生成器）５６ｅを含んでもよい。したがって、システム１は、ＣＡＲＳ分光およびＣＡＲＳ顕微鏡としての機能を有していてもよい。
【0027】
ＣＡＲＳ分光法では、ストークス光１１、ポンプ光１２およびプローブ光１３の焦点またはスポットを移動させることにより、システム１はターゲット５の深さプロファイルを生成することができる。したがって、スキャナー６０は、複数のストークス光パルス１１、複数のポンプ光パルス１２、および複数のハイブリッドプローブ光パルス１３ｘおよび１３ｙでターゲット５を３次元的に走査し、各ボクセルにおけるＣＡＲＳスペクトル１５のセットを取得するように構成されてもよい。分析器５６は、共鳴成分Ｒｆを有するボクセルによるターゲット５の３Ｄ画像を生成する３Ｄ画像生成モジュール（３Ｄ画像ジェネレータ）５６ｆを含んでもよい。したがって、システム１は、ＣＡＲＳ３Ｄ顕微鏡の機能を有してもよい。
【0028】
ブロードバンド（広帯域）ストークスパルス（ストークスビーム）１１を用いることにより、一度に多くの共鳴を励起し、ワンショットでフルスペクトルを記録することができる。したがって、ターゲット（試料）５を走査することにより、各ショットで各ピクセルまたはボクセルにおいて、フルＣＡＲＳスペクトル（全域のＣＡＲＳスペクトル）１５ｘおよび１５ｙを取得することができ、短時間で２Ｄ（二次元）または３Ｄ（三次元）のＣＡＲＳイメージングを行うことができる。また、本システム１を用いることで、組織（細胞）等を含むターゲット（被検体）５内の実際の測定場所から、ＬＯ信号と共鳴特徴量の両方を含むＣＡＲＳスペクトル１５ｘおよび１５ｙを各画素またはボクセルにおいて一度に得ることができる。ＬＯ信号と共鳴特徴との間では、発生環境、光路、散乱、試料の不均一性、その他のアーチファクトの違いが打ち消される（キャンセルされる）ため、システム１によって感度が向上したＣＡＲＳスペクトル（ｓｐｅｃｔｒａ）が生成される。
【0029】
図２は、典型的なＣＡＲＳプロセスと信号との関係を示す。図２（ａ）は、ストークス光パルス１１、ポンプ光パルス１２、プローブ光パルス１３、および生成されたＣＡＲＳ信号１６のエネルギーマップを示す。図２（ｂ）はこれらの信号を周波数領域（周波数ドメイン）で示し、図２（ｃ）はこれらの信号を時間領域（時間ドメイン）で示す。それぞれの領域だけでは、信号の時間的な重なりの関係、および周波数により発生（生成）される信号の関係に基づいて、本発明における信号の挙動を説明するには不十分である。本発明の説明では、より良く理解するために時間－周波数（時間周波数）マップを用いる。図２（ｄ）は、ストークス光パルス１１、ポンプ光パルス１２、プローブ光パルス１３、生成されたＣＡＲＳ信号１６を時間－周波数マップを用いて説明した例である。
【0030】
図３は、ストークス光１１、ポンプ光１２、および時間遅延Δｔ１（０ｆｓ）のプローブ光（第１のプローブ光パルス）１３ａのパルス（図３（ａ））によって生成される、ブロードな非共鳴バックグラウンド（ＮＲＢ）と共鳴成分（Ｒｆ）とを含む典型的なＣＡＲＳスペクトル（光、信号、スペクトル、分光）（図３（ｂ））を示しており、この場合、ストークスパルス１１、ポンプパルス１２、プローブパルス１３ａが同時に出射され、ＣＡＲＳ信号１６ａの時間遅延特徴（組成、成分）がプローブ光パルス１３ａのパルス幅ＰＷ２内において取得される。ストークスパルス１１とポンプパルス１１とは時間的に重なっており、プローブ光パルス１３ａのポジションを制御することができる。ストークス光１１およびポンプ光１２のパルスとプローブパルス１３ａとの時間差（時間的関係、時間遅れ）Δｔは任意に選択される。図３（ａ）では、時間遅れΔｔをΔｔ１（ｔ＝０）とし、すなわち、ストークスパルス１１とポンプパルス１２はプローブパルス１３ａの開始（最初に到達、先に到来する部分）１３ｓと重なり、その後、プローブパルス１３ａの残りが最終（最後に到達、後で到来する部分）１３ｅを含めて遅れて到達する。
【0031】
図４は、プローブ光１３ａ、１３ｂ、１３ｃの遅延（時間的関係）Δｔを変化させた場合のシミュレーション結果としてのＣＡＲＳ光（信号、スペクトル、分光）１６の例を示す。図４（ｃ）は、ストークスパルス１１、ポンプパルス１２、および第１のプローブパルス１３ａを同時に出射させた場合（時間遅延ΔｔをΔｔ１（Δｔ＝０）とした場合）に発生するＣＡＲＳスペクトル１６ａの一例を示す。図４（ａ）および図４（ｂ）は、ストークスパルス１１、ポンプパルス１２、および負の遅延Δｔ２（Δｔｎ）を有する第２のプローブパルス１３ｂによって生成されるインターナルリファレンス（内部参照用の信号、ＬＯ信号）１６ｂの例を示す。すなわち、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２は、第２のプローブパルス１３ｂの放出よりも遅れて、しかしながら、第２のプローブパルス１３ｂと重なるように放出される。典型的なインターナルリファレンス（ＬＯ信号）１６ｂは、図４（ａ）に示すように、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２が第２のプローブパルス１３ｂの終端と重なるように放射されたときに取得される。
【0032】
図４（ｄ）および図４（ｅ）は、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２と、正の遅延Δｔ３（Δｔｄ）を有するプローブパルス１３ｃとによって生成されるＴＤ－ＣＡＲＳスペクトル１６ｃの例を示す。すなわち、プローブパルス１３ｃは、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２の放出よりも遅れて、さらに、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２と重ならないように放出される。典型的なＴＤ－ＣＡＲＳ１６ｃは、図４（ｅ）に示すように、ほとんど共鳴成分（共振成分、共鳴特徴）Ｒｆのみで形成されているが、ターゲットのＣＡＲＳスペクトル１６ａおよびインターナルリファレンス１６ｂと比較して強度が非常に小さいものが取得される。
【0033】
図４（ａ）ないし（ｅ）に示すように、共鳴成分（Ｒｆ）に相当する減衰時間の長い分子振動変化などの現象は、ビルドアップに長時間を要し、ＮＲＢに相当する減衰時間の短い分子振動変化などの現象は、ビルドアップに短時間を要する。つまり、ＮＲＢは瞬時の電子応答である。共鳴成分（Ｒｆ）はビルドアップに時間を要し、ＴＤ－ＣＡＲＳのシミュレーション結果でも同様の傾向を示している。また、減衰時間が長い場合はビルドアップも長くなり（線幅が狭くなる）、減衰時間が短い場合は応答のビルドアップに要する時間が短くなる（線幅が広くなる）。したがって、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２と同時に第１のプローブパルス１３ａを出射することにより、ＮＲＢとの大きな共鳴成分を含むＣＡＲＳスペクトル１６ａを取得し、第２のプローブパルス１３ｂのパルス幅ＰＷ２の終端に合わせてストークスパルス１１およびポンプパルス１２を出射することにより、ほぼＮＲＢ（本明細書において、ほぼＮＲＢとなるスペクトルまたは全てがＮＲＢとなるスペクトルとは、ＮＲＢとして取り扱い可能な（参照できる、基準となる）、十分な程度に共鳴成分を含まないスペクトルを示す）のＣＡＲＳスペクトルであるインターナルリファレンス（内部基準信号、内部参照信号）１６ｂを取得する。
【0034】
図５ないし図７は、この発明の基本概念（ヘテロダインインターナルリファレンス、インターナルヘテロダイン化、インターナルヘテロダイン法）を示す。図５に示すように、ストークスパルス１１およびポンプパルス１２に対するプローブパルス１３ａおよび１３ｂの時間的関係Δｔを変化させることにより、全く同じ実験条件（焦点、散乱、吸収、光路等）において、試料（サンプル）および容器（キュベット）を変えることなく、ＮＲＢと共鳴特徴とを有するＣＡＲＳスペクトル１６ａ（図５（ｂ））と、ＮＲＢのみのＣＡＲＳスペクトル（インターナルリファレンス、内部参照、ＩＮＲ）１６ｂ（図５（ａ））とを取得することができる。したがって、ＩＮＲ１６ｂを局部発振（ＬＯ）として使用することにより、ヘテロダイン法で共鳴成分を抽出することができる。すなわち、ＩＮＲ１６ｂと共鳴成分を有するＣＡＲＳ信号１６ａとを同じ位置で同時に発生させることにより、ＩＮＲ１６ｂを検出器５０上で局部発振（ＬＯ）としてのＣＡＲＳ信号１６ａと干渉させることができる。さらに、干渉信号はＬＯ１６ｂと共鳴成分（ｒｅｓ）と非共鳴成分（ＮＲ）を含むＣＡＲＳ信号１６ａとの位相差Δφに依存する。
【0035】
図６（ａ）に示すように、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２と同時に、２つの時間遅延プローブパルス１３ａおよび１３ｂを含むハイブリッドプローブ光パルス１３を試料５に送ると（図６（ｂ）に示す）、集光された点５ａにおいて、図７に示す干渉信号（ターゲットＣＡＲＳ信号）１５ｘおよび１５ｙがそれぞれ同時に発生する。ハイブリッドプローブ光パルス１３において、第１のプローブ光パルス１３ａは、第２のプローブ光パルス１３ｂとの間に時間差を含み、第２のプローブ光パルス１３ｂと部分的に時間的に重なる。また、第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂの重なり部分１３ｍが、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２と重なるように、ストークス光パルス１１、ポンプ光パルス１２およびハイブリッドプローブ光パルス１３が出射される。ハイブリッドプローブ光パルス１３のプローブパルス１３ａおよび１３ｂは、それぞれ散乱信号（ＣＡＲＳ）１６ａおよびＬＯ（局部発振（内部参照、インターナルリファレンス））１６ｂを発生させる。生成された２つの信号１６ａおよび１６ｂは、検出器５０上で干渉され、干渉または合成（結合）された信号１５ｘおよび１５ｙとなり、それらがＣＡＲＳスペクトル（ターゲットＣＡＲＳスペクトル）１５のセット（集合）となる。
【0036】
このシステム１では、ＬＯのための第２のプローブ光パルス１３ｂの位相φ２をプラス・マイナスＰｉ／２（（＋／－）π／２）に変化させる（変更する）ことにより、２つのタイプ１３ｘおよび１３ｙを含む複数のハイブリッドプローブ光パルス１３が提供される。２つのタイプのうちの一方は、位相差ΔφがマイナスＰｉ／２の第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとを含むハイブリッドプローブ光パルス１３ｘである。２つのタイプの他方は、位相差ΔφがプラスＰｉ／２の第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとを含むハイブリッドプローブ光パルス１３ｙである。ハイブリッドプローブ光パルス１３の位相差Δφを変化させることにより、ターゲットＣＡＲＳスペクトル１５の干渉および信号形状を制御することができる。したがって、ハイブリッドプローブ光パルス１３を用いて位相差Δφを変化させることにより、ＬＯ１６ｂからＣＡＲＳ１６ａを差し引いた形状のターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ｘと、ＬＯ１６ｂにＣＡＲＳ１６ａを加えた形状のターゲットＣＡＲＳスペクトル１５ｙとが含まれる、ターゲットＣＡＲＳスペクトル１５のセットを生成し取得できる。そのため、位相差Δφを用いて、ＣＡＲＳスペクトル１５のセットから共鳴成分１７を算出または抽出することができる。
【0037】
共鳴寄与成分と非共鳴寄与成分は、異なる位相（および偏光）特性を示す。したがって、共鳴電界と非共鳴電界は異なる位相を持つが、位相情報は検出時に失われる。干渉法による検出のためにコヒーレントな参照ビーム（局部発振、ＬＯ）とターゲットの信号とをオーバーラップさせるヘテロダイン検出を用いることにより、異なる位相関係を利用して、信号の振幅と位相を測定したり、χ（３）の実部と虚部を分離したりすることができる。ヘテロダイン検出には、信号と、その信号と一定の位相関係を示すコヒーレントで位相安定なＬＯとをオーバーラップさせるステップと、ＬＯと信号との位相差をスキャンするステップとが含まれる。
【0038】
図６に示すように、ハイブリッドプローブパルス１３によって、ＮＲＢと共鳴特性とを含むＣＡＲＳ１６ａと、ＮＲＢのみのＬＯ１６ｂとの両方が、同じスポット５ａから同じ光路を用いて同時に取得される。したがって、両信号１６ａおよび１６ｂは、吸収、信号経路およびその他の実験条件が同じである。さらに、この内部ヘテロダイン（インターナルヘテロダイン）法は、前方散乱ＣＡＲＳおよび後方散乱ＣＡＲＳに適用可能である。
【0039】
局部発振源は、第２の焦点（非共鳴サンプル）、外部レーザー、コヒーレントプロセス（ＮＯＰＡ／ＯＰＡ）によって生成されたレーザー、またはブロードバンドレーザーのブルーウィング（ＳＢ－ＣＡＲＳ）から生成することができる。しかしながら、ＬＯ信号を得るためには、そのためのリファレンスを測定する必要があり、ＬＯ光源とサンプル（ターゲット）の測定切り替えに時間がかかる。また、光学系の切り替えによる揺らぎ、例えば、レーザードラフトなどにより、非共鳴成分と共鳴成分で測定条件が異なり、正確な測定が困難となる場合がある。したがって、局部発振用の対象物（体積）を用いるのではなく、被測定試料（ターゲット）のみを用いて局部発振（ＬＯ）を得ることが望ましい。
【0040】
インターヘテロダイン法を用いた本システム１では、次のような利点が挙げられる。（ｉ）外部ＬＯが不要であり、ＬＯは同じ位置で同じパルスから同時に生成されるため、本質的に安定で位相ロックされる（非常に長い平均化が可能になる）。（ｉｉ）リファレンスとなる水の測定は不要となり、非共鳴サンプルのための切替は不要であり、ＬＯを含めて全ての信号を測定対象（サンプル）から得ることができる。（ｉｉｉ）エタロンを用いることにより、ディテクタの干渉を排除し、差異を打ち消すことができる。（ｉｖ）ＭＥＭ（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｅｎｔｒｏｐｙ Ｍｅｔｈｏｄ、最大エントロピー法）を使用することなく、χ（３）の虚部を抽出することができる。（ｖ）システム１は、組織（細胞）のような散乱試料でも動作可能である。つまり、ＬＯは全く同じ光路を介して、同時に生成されるため、試料による位相変化は問題にならない。
【0041】
図８は、時間－周波数マップ（時間周波数マップ）を用いてＣＡＲＳ信号を生成する幾つかの例を示している。図８（ａ）は、プローブ遅延のない第１のプローブ光パルス１３ａを用いた通常の測定例を示している。第１のプローブ光パルス１３ａは、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２の励起と重なり、共鳴およびＮＲを有するＣＡＲＳ信号１６ａが生成される。生成されたＣＡＲＳ信号１６ａは、共鳴電界と非共鳴電界との干渉（ｒ－ｎｒ位相シフトロック）による典型的な分散型ＣＡＲＳのライン形状を有する。
【0042】
図８（ｂ）は、時間遅延（正の遅延）のあるＴＤプローブ光パルス１３ｃを用いた測定例を示している。ストークス光パルス１１とポンプ光パルスが先に到来し、ＴＤプローブ光パルス１３ｃが遅れて到来する。ＮＲ信号は振動共鳴信号よりも減衰が早いため、ｒ／ｎｒ比は増加するが信号強度は減少する。図８（ｃ）は、インターナルリファレンス用のプローブパルス（負の遅延を持つ第２のプローブ光パルス）１３ｂを用いた測定例を示している。負のプローブ遅延を持つプローブ光パルス１３ｂが先に到来する。電子的にＮＲ信号が即座に発生するため、コヒーレンスな振動がビルドアップされる時間はなく、共鳴信号は発生しない。生成された信号１６ｂは、ほぼＮＲ成分（インターナルリファレンス（ＩＮＲ））のみを含む。
【0043】
図９は、プローブパルスジェネレータ（プローブパルス生成装置）７０の一実施形態を示す。図１０は、時間－周波数マップを用いた内部ヘテロダイン法における複数の信号を示す。プローブパルスジェネレータ（プローブパルスコンディショナ）７０は、第１のプローブパルスコンディショナ（第１のプローブパルスユニット）７１、第２のプローブパルスコンディショナ（第２のプローブパルスユニット）７２、入力インターフェース７３、および出力インターフェース７４を含む。入力インターフェース７３は、入力プローブパルス３０ｂの偏光を変換するための波長板７６と、入力プローブパルス３０ｂから第１のプローブパルス（例えばＰ偏光光）１３ａと第２のプローブパルス（例えばＳ偏光光）１３ｂとを分離するためのＰＢＳ（偏光ビームスプリッタ）７５とを含む。第１のプローブパルスユニット７１は、第１のプローブパルス１３ａを調整するための第１のプローブ経路７７を含み、この第１のプローブ経路７７は、波長板７１ａと、第１のプローブパルス１３ａをＰＢＳ７５に反射させるためのミラー７１ｂと、第２のプローブパルスユニット７２内の第２の光路７８との間の距離Δｓの差（時間差Δｔおよび位相差Δφに影響を与える）を制御するためのアクチュエータ、例えばピエゾアクチュエータ７１ｃとを含む。第２のプローブパルスユニット７２は、第２のプローブパルス１３ｂを調整するための第２のプローブ光路７８を含み、この第２のプローブ光路７８は、波長板７２ａ、第２のプローブパルス１３ｂをＰＢＳ７５に反射させるためのミラー７２ｂ、および距離Δｓの差を制御するためのアクチュエータ、例えばピエゾアクチュエータ７２ｃを含む。出力インターフェース７４は、ＰＢＳ７５によってオーバーラップされた第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂをハイブリッド（ペアまたは複合）プローブパルス１３として導くための、ミラー７４ａ、７４ｂおよび他の光学素子を含む出力経路７９を含む。
【0044】
第１のプローブ経路７７および／または第２のプローブ経路７８は、別の経路に対する距離の差Δｓを制御する経路を含み、位相コントローラー５６ｔの制御下でアクチュエータ７１ｃおよび／または７２ｃを用いてミラー７１ｂおよび／または７２ｂを制御して、第１のプローブパルス１３ａに対する（ストークスパルス１１およびポンプパルス１２に対する）時間差（遅延時間）Δｔを設定し、第１のプローブパルス１３ａと第２のプローブパルス１３ｂとの間の位相差Δφを変化させる。ジェネレータ７０は、偏光光学系を使用することにより、高速で再現性のある変調を行うことができる。このジェネレータ７０は、偏光によって選択される調整可能な相対的遅延を設けるための２つの経路７７および７８を含む。波長板７６は、高速（＞ｋＨｚ）変調のための回転ステージまたは電気光学変調器（ＥＯＭ）であってもよい。高速で変調することにより、ノイズの低減、パワー、アライメント、電位エタロニング等のドリフトの除去、およびＣＡＲＳ画像を生成するための走査速度を向上することができる。
【0045】
このプローブパルスジェネレータ７０において、入力プローブ光パルス３０ｂの偏光を制御するための波長板７６は、第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとの比を制御するユニットの機能を備えていてもよい。すなわち、波長板７６は０から９０°の間のいずれかで設定されてもよい。これにより、第１のプローブパルス１３ａ用の経路７７における強度と、第２のプローブパルス１３ｂ用の経路７８における強度とを制御することができる（したがって、ＬＯ信号（ｎｒ信号）およびＣＡＲＳ信号の強度を制御することができる）。プローブパルスジェネレータ（コンディショナ）７０では、偏光子がＳ偏光のみを伝えるように設定され、このセットアップを出た後のパルスがＳ偏光（ポンプおよびストークスと同じ）となり、整った偏光を持つようにしている。本実施形態では、ストークス光パルス１１とポンプ光パルス１２の偏光を同じにするために、入力プローブパルス３０ｂをＰ偏光とし、第１および第２のプローブパルス１３ａおよび１３ｂの出力をＳ偏光としている。しかしながら、このような構成は本発明の実施例の一つである。例えば、波長板７６は（例えば）２２．５°に設定してもよい。ＰＢＳ７５の前の偏光が４５°で直線的である場合、パルスの５０％は一方の経路（アーム）７７を通り、残りの５０％は他方の経路（アーム）７８を通る。ＰＢＳ７５の後では、５０％のＳ偏光とＰ偏光が残っている。同じ偏光になるように同時に回転して戻す方法がないため、偏光子は有効でない部分をカットしてしまってもよい。２２．５°波長板（ＷＰ）設定の例では、Ｓ偏波は＋４５°直線偏波、Ｐ偏波は－４５°偏波となる。そこで、偏光板はＰ偏光成分をすべてカットし、整ったＳ偏光パルスを２つ生成してもよい。波長板（ＷＰ）７６の設定により、カットオフされる割合やカットオフされる量を調整できる。
【0046】
図１０に示すように、第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとが部分的に重なったハイブリッドプローブ光パルス１３により、共鳴成分とＮＲとを有するＣＡＲＳ信号（通常のＣＡＲＳ信号）１６ａと、ＮＲと非共鳴成分とのみを有するＬＯ信号（ＩＮＲ信号）１６ｂとが同期して生成される。したがって、本システム１では、通常のＣＡＲＳ信号１６ａとＬＯ信号１６ｂとの干渉により生成されたターゲットＣＡＲＳスペクトル１５を得ることができる。
【0047】
図１１は、プローブパルスジェネレータ７０において第１のプローブ光パルス１３ａが生成される過程を示す。図１２は、時間－周波数マップを用いて第１のプローブ光パルス１３ａによりＣＡＲＳを発生させるための複数の信号を示す。図１３は、プローブパルスジェネレータ７０において第２のプローブ光パルス１３ｂが生成される過程を示す図である。図１４は、時間－周波数マップを用いて第２のプローブ光パルス１３ｂによりＣＡＲＳを発生させるための複数の信号を示している。レーザー光源３０から供給されたオリジナル（元）のプローブ光パルス３０ｂは、偏光方向に応じて２つの光路７７および７８のいずれかを選択するように供給される。光路７７および７８の光路長の差は、プローブ遅延Δｔおよび位相差Δφを変化させるように制御される。
【0048】
１つの実施形態では、第１のプローブパルス１３ａと第２のプローブパルス１３ｂとの間の位相Δφを（－π／２）および（＋π／２）だけシフトするように、第１のプローブパルス１３ａの位相を変調してもよい。本システム１における信号検出（ヘテロダイン信号検出）においては、位相差Δφを周期的に変化させることが最も重要である。したがって、プローブパルスジェネレータ７０は、第１のプローブパルス１３ａまたは第２のプローブパルス１３ｂのいずれか一方、あるいは両方の位相を変化させてもよい。後で説明する式で示すように、いずれの位相を変化させても関係ないが、ＬＯ（ｎｒ）を発生させるための負の遅延時間Δｔｎを持つ第２のプローブ光パルス１３ｂの方が、共鳴（共振）がないため、時間遅延を変えても信号の変化が少ないので、位相を変更する一方として適していると言える。なお、位相の変更は小さな時間遅延を利用して行うので、上記のいずれを選択しても問題ない程度に小さいはずである。原理的には、より良い制御と簡素化のために、経路７７または経路７８の一方で位相変化を加え、他の経路を固定してもよい。
【0049】
一般に、変調する頻度（変調周波数）はできるだけ高くする必要がある。しかし、変調周波数は以下の条件を考慮して選択することができる。プローブパルスジェネレータ７０の変調はピエゾを使用して実施することができるので（高速位相変調を達成する他の、またはより良い方法であってもよい）、ピエゾアクチュエータは反応と移動にある程度、例えば、ミリ秒のオーダーの時間を必要とする。２つの定位置を切り替える場合、ピエゾが定位置に達するまで待つ必要がある。そのため、使用可能な最大周波数はおよそ１００Ｈｚ程度に制限される。しかしながら、改善することは可能である。
【0050】
もう一つのポイントは、信号強度である。システム１を非常に低い濃度でも動作させるためには、検出器のノイズを低く抑える必要がある。そのためには、検出器５０が８０％程度まで十分に満たされるように積分時間を調整する必要がある（その場合、読み出しノイズなどではなく、ほとんどショットノイズへの対策が重要である）。すなわち、信号強度により積分時間は調整可能であり、例えば、このシステムの一実施形態では５０μｓである。可能な限り速いスイッチング周波数が選択されてもよく、そのような高速変調が可能であれば、１つの位相につき１つのスペクトルしか取得されなくてもよい。別の検出器を使うことも可能であるが、その場合も位相変調の速さによって周波数が制限される。まとめると、例えば電気光学変調器を用いて、より高速に位相を変調する方法があり、ＣＣＤカメラの代わりにいくつかの高速の高感度光検出器を用いることにより、原理的には変調周波数はＭＨｚであってもよい。変調周波数が１Ｈｚ－１ｋＨｚの間であっても、この検出方法の利点は達成できることに留意すべきである。
【0051】
図１５は、ハイブリッドプローブ光パルス１３ｘおよび１３ｙによりそれぞれ生成された２種類のＣＡＲＳスペクトル１５ｘおよび１５ｙを含むＣＡＲＳスペクトル１５のセットから共鳴成分１７が抽出されるプロセスを示す。図１６は、２種類のＣＡＲＳペクトル１５ｘおよび１５ｙの波形例と、シミュレーションにより得られた共鳴成分１７を示す。図１５（ａ）に示すように、第２のプローブ光路７８のピエゾアクチュエータ７２ｃの電圧を制御して第２のプローブ光パルス１３ｂの位相をφ１およびφ２に変化させることにより、プラス・マイナスＰｉ／２（（＋／－）π／２）のような位相差Δφの異なるハイブリッドプローブ光パルス１３ｘおよび１３ｙの複数のセットが生成され、供給される。図１５（ｂ）に示すように、これらのハイブリッドプローブ光パルス１３ｘおよび１３ｙのセットにより、ＣＡＲＳスペクトル１５ｘ（フェーズ１（第１の位相）、ＬＯ１６ｂと通常のＣＡＲＳ信号１６ａとの和）と、ＣＡＲＳスペクトル１５ｙ（フェーズ２（第２の位相）、ＬＯ１６ｂから通常のＣＡＲＳ信号１６ａを引いたもの）とを含むＣＡＲＳスペクトルのセット１５が生成される。図１５（ｃ）に示すように、これらのＣＡＲＳスペクトルのセット１５における差を、位相差Δφを参照して計算することにより、共鳴成分（共鳴特徴）１７が抽出される。
【0052】
第２のプローブ光路７８のピエゾアクチュエータ７２ｃの代わりに、あるいはピエゾアクチュエータ７２ｃとともに、第１のプローブ光路７７のピエゾアクチュエータ７１ｃを制御してもよい。ピエゾアクチュエータ７１の電圧を走査することにより、経路７７の経路長が変更され、第１のプローブ光パルス１３ａの位相が変更される。これにより、ＬＯ１３ｂの位相との間の位相差Δφが変化し、最終的に検出された干渉信号１５を得ることができる。ピエゾ変調は、電圧変化とカメラまたは検出器によるＣＡＲＳスペクトル１５ｘおよび１５ｙの取得とを同期させてもよい。
【0053】
図１７は、このインターヘテロダイン法の理論的背景を示す。図１７（ａ）に示すように、共鳴寄与成分と非共鳴寄与成分とは異なる位相（および偏光）特性を示す。したがって、共鳴電界と非共鳴電界とは異なる位相を持つが、この位相情報は検出時に失われる。干渉法による検出の際に、コヒーレントな参照ビーム（基準ビーム、局部発振、ＬＯ）と信号とをオーバーラップさせるヘテロダイン検出を使用することにより、異なる位相関係を利用して信号の振幅と位相を測定したり、χ（３）の実部と虚部とを分離したりすることができる。検出器の信号におけるヘテロダイン項ＳＨｅｔ（ω）では、図１７（ｂ）に示すように、プラス・マイナスＰｉ／２の位相差Δφで測定し、差し引きすることで、定数項と余弦項を除去し、χ（３）の虚部を抽出することができる。
【0054】
図１８は、スキャンプローブの位相Δφ（図１８（ａ））と、異なる位相Δφを有するハイブリッドプローブパルス１３を用いて得られたＣＡＲＳスペクトル１５ｘおよび１５ｙのセットの強度（図１８（ｂ）～（ｆ））との関係を示す。図１８（ｂ）から（ｆ）に示された信号の強度によれば、予想されたように、位相差±Ｐｉ／２のスペクトルを差し引きすることにより、強度が最大の信号を抽出できる（図１８（ｄ））。
【0055】
図１９は、プローブパルスジェネレータ（プローブパルス生成装置、プローブパルス発生装置）７０の別の実施形態を示す。ジェネレータ７０は、入力プローブ光パルス３０ｂの偏光を変換するための波長板６５と、入力プローブ光パルス３０ｂから第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂを分離し、第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとの間の時間差Δφを設けるための少なくとも１つの複屈折結晶６６と、第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとの間の位相差Δφを制御するために、第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光１３ｂの少なくとも一方を変調するＥＯＭ（電気光学変調器）６７と、波長板、偏光板６８またはＰＢＳなどの偏光素子により第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂをオーバーラップ（重複）させた後に導く出力経路７９とを備える。このジェネレータ７０では、単一の入力パルス３０ｂが複屈折結晶６６の各軸上の２つのパルス１３ａおよび１３ｂに変換され、それらの間に約２．５～３ｐｓの遅延が設けられる。この遅延は、複屈折ウェッジ対を追加することにより調整可能である。複屈折ウェッジ対は、遅延を微調整するのに適している。２つのパルス１３ａおよび１３ｂ間の位相変調Δφは、ＥＯＭ（電気光学変調器）６７により電気的に制御される。
【0056】
図２０は、インターヘテロダイン検出法のプロセスの概要を示すフローチャートである。この方法は、ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することと（ステップ８１）、取得したＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することによって共鳴成分（共振成分、共鳴特徴）を抽出することと（ステップ８２）を含む。ステップ８１では、複数のストークス光パルス１１、複数のポンプ光パルス１２、および複数のハイブリッドプローブ光パルス１３を、ハイブリッドプローブ光パルス１３の位相を変化させながらターゲット５の一部５ａに照射することにより、ＣＡＲＳスペクトル１５の複数のセットを取得する。これらのハイブリッドプローブ光パルス１３は、複数の第１のプローブ光パルス１３ａと複数の第２のプローブ光パルス１３ｂとを含む。複数の第１のプローブ光パルス１３ａおよび複数の第２のプローブ光パルス１３ｂはそれぞれ時間的に部分的に重なり、第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂの少なくとも一方の位相を変化させながら、第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂは部分的にストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２と重なる。
【0057】
ステップ８１において、第２のプローブ光パルス１３ｂは、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２とともに局部発振（ＬＯ）信号１６ｂを発生するように選択され、第１のプローブ光パルス１３ａは、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２とともに共鳴成分を含む信号１６ａを発生するように選択される。第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂのパルス幅ＰＷ２は、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２のパルス幅ＰＷ１よりも大きくてもよく、ステップ８１において、ハイブリッドプローブ光パルス１３は、第１のプローブ光パルス１３ａがストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２に対して第１の相対的な時間的関係Δｔ１を有し、第１のプローブ光パルス１３ａのパルス幅ＰＷ２内で部分的に重なり、第２のプローブ光パルス１３ｂが第２の相対的な時間的関係Δｔ２であって、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２に対して、第１の相対的な時間的関係Δｔ１に対して負の遅延Δｔｎの第２の相対的な時間的関係Δｔ２を有し、第２のプローブパルス１３ｂのパルス幅ＰＷ２内で部分的に重なるように出射されてもよい。
【0058】
ステップ８１において、ハイブリッドプローブ光パルス１３は、第２のプローブ光パルス１３ｂがストークス光１１およびポンプ光１２のパルスよりも早く出射されるようにしてもよい。ステップ８１において、ハイブリッドプローブ光パルス１３は、ストークス光パルス１１、ポンプ光パルス１２および第１のプローブ光パルス１３が実質的に同時に、ストークス光パルス１１およびポンプ光パルス１２が実質的に第２のプローブ光パルス１３ｂのパルス幅ＰＷ２の終端部になるように出射されてもよい。
【0059】
図９に示すプローブパルスジェネレータ７０を使用する場合、ステップ８１は、（ｉ）波長板７６を用いて入力プローブ光パルス３０ｂの偏光を変換することと、（ｉｉ）ＰＢＳ７５を用いて入力プローブ光パルス３０ｂから第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂを分離することと、（ｉｉｉ）第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂをそれぞれ第１のプローブ経路７７および第２のプローブ経路７８によってコンディショニング（調整）することと、（ｉｖ）ＰＢＳ７５により重ねられた第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂをハイブリッドプローブパルス１３として導くこととを含んでもよい。第１のプローブ経路７７および第２のプローブ経路７８の少なくとも一方は、他の経路との時間差を含むための経路と、変調のためにミラーを動かす（移動させる）ためのアクチュエータとを含んでもよい。
【0060】
図１９に示すプローブパルスジェネレータ７０を使用する場合、ステップ８１は（ｉ）波長板６５を用いて入力プローブ光パルス３０ｂの偏光を変換することと、（ｉｉ）少なくとも１つの複屈折結晶６６を用いて、入力プローブ光パルス３０ｂから第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとを分離し、第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとの間に時間差を含めることと、（ｉｉｉ）ＥＯＭ６７を用いて、第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂの少なくとも一方を変調することと、（ｉｖ）偏光素子６８により重複（オーバーラップ）された第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂを、ハイブリッドプローブ光パルス１３として導光することとを含んでいてもよい。
【0061】
この方法は、ターゲット５を走査（スキャン）するステップ（ステップ８３）をさらに含んでいてもよい。ステップ８３では、複数のストークス光パルス１１、複数のポンプ光パルス１２、および複数のハイブリッドプローブ光パルス１３を用いてターゲット５を走査し、各画素におけるＣＡＲＳスペクトル１５のセットを取得してターゲット５の画像を生成する。ステップ８３は、各ボクセルでＣＡＲＳスペクトル１５のセットを取得してターゲット５の３Ｄ画像を生成する、３Ｄスキャンであってもよい。ステップ８４では、全てのピクセルまたはボクセル情報が得られるまで、上記のステップを繰り返してもよい。
【0062】
サンプル、例えばキュベット内の溶液にレーザー光を集光することにより、ＣＡＲＳスペクトルが生成され、それを分析して異なる分子を同定したり、溶質の濃度を定量的に求めることも可能である。蛍光やラマン分光のような他の方法とは対照的に、ＣＡＲＳや他の非線形な手法では、信号は焦点位置でのみ生成される。集光度を高めることにより、本質的な空間分解能が得られ、１μｍ３オーダーの微小体積からのみで発生する信号を得ることが可能である。キュベット内の溶液を測定する代わりに、組織のような構造化された物質にＣＡＲＳを直接適用することも可能である。システム１は、ビーム１１、１２、および１３によってサンプル上をスキャンし、異なる位置ごとにスペクトルを提供することができるため、画像を生成することが可能である。システム１は、ＣＡＲＳ分光法としてだけでなく、画像を形成するために各ピクセルでスペクトルをスキャンして取得するＣＡＲＳ顕微鏡としても適用できる。薄い試料（ターゲット）５に対しては、試料を通過する前方散乱方向で信号を記録することができ、厚い試料に対しては後方散乱方向で信号を記録することができる。例えば、脂肪細胞中の脂質のような局所的に高い濃度のものに対してイメージングが要望される。局所的に濃度が高いものにおいては、小さな体積に焦点を合わせることで、バックグラウンドからピークを際立たせることができる。
【0063】
上記で説明したように、ヘテロダイン検出を用いるための方法とシステムとが提供される。開示されたヘテロダイン検出（インターヘテロダイン法、ヘテロダイン内部参照法、ヘテロダインインターナルリファレンス手法）は、前方散乱ＣＡＲＳおよび後方散乱ＣＡＲＳを含むあらゆる種類のＣＡＲＳ測定に適用可能である。開示されたヘテロダイン検出は、複数のビームを用いたシステムを使用することにより、共鳴成分１７を取得する同じ試料（ターゲット）５からＬＯ信号を取得することができる。
【0064】
本明細書に記載の方法およびシステムは、生体の関心対象の生化学的および構造的特性評価、特に生体の関心対象の生化学的組成の侵襲的および非侵襲的な評価ならびにそのアプリケーションに適用できる。本明細書に記載された方法およびシステムは、あらゆる種類の試料に適用可能であり、生化学とは無関係な溶液のような単純な試料にも適用可能である。
【0065】
本明細書では、ＣＡＲＳ信号を検出するシステム１を開示している。このシステムは、（ｉ）共鳴成分（共振成分）を含む散乱光を発生させるために、少なくとも１種類の第１の光パルスをターゲットに供給するように構成された第１の光路と、（ｉｉ）散乱光（ＣＡＲＳ信号）を発生させるために、第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂをターゲット５に供給するように構成されたプローブパルスコンディショナ（プローブパルスジェネレータ）と、（ｉｉｉ）共鳴成分を抽出するために、変調に同期して取得された散乱光の差分を生成する取得ユニット（アナライザー）５６と、を含む。第１のプローブ光パルス１３ａは、第２のプローブ光パルス１３ｂとの間に時間差を含み、時間的に部分的に重なる。第１のプローブ光パルス１３ａおよび第２のプローブ光パルス１３ｂの少なくとも一方は、変調された後、光学的にオーバーラップされて、ハイブリッドプローブパルス（ペアプローブ光パルスまたは複合プローブ光パルス）１３として出射される。ストーク光パルス１１とポンプ光パルス１２とを含む第１の光（ビーム）パルスを、第１のプローブ光パルス１３ａと第２のプローブ光パルス１３ｂとに時間的に部分的に重なるように出射することにより、非共鳴成分と、変調された共鳴成分とを含む散乱光を発生させる（生成される）。したがって、取得された散乱光の差分を変調に同期して生成することにより、共鳴成分を抽出することができる。
【0066】
上記で開示された別の態様は、ＣＡＲＳ信号を検出するための方法である。この方法は、共鳴成分を含む散乱光を発生させるために、少なくとも１つの種類の第１の光パルスをターゲットに供給することと、第１のプローブ光パルスと第２のプローブ光パルスとをターゲットに供給し、散乱光を発生させることと、変調に同期して取得した散乱光の差分を生成することとを含む。第１のプローブ光パルスは、第２のプローブ光パルスとの間に時間差を含み、時間的に部分的に重なる。第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスの少なくとも一方は変調され、その後、光学的にオーバーラップされる。そして、第１の光パルスは、第１のプローブ光パルスと第２のプローブ光パルスとが時間的に部分的に重なるように出射される。
【0067】
この方法は、第１の光パルス、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスをターゲットに出射し、ターゲットから散乱光を取得することを更に含んでもよい。この方法は、第１の光パルス、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスを用いてターゲットの少なくとも一部を走査し、ターゲットからの散乱光を取得することをさらに含んでもよい。第１の光パルスを供給するステップは、第１の波長範囲のストークス光パルスを供給するステップと、第１の波長範囲より短い第２の波長範囲のポンプ光パルスをストークス光パルスと時間的に重なるように供給するステップと、第２の波長範囲よりも短い第３の波長範囲の第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスを供給するステップとを含んでもよい。この方法は、ターゲットからＣＡＲＳ信号を取得することをさらに含んでもよい。この方法は、ターゲットからのＣＡＲＳ信号の共鳴成分の時間的な減衰を取得することをさらに含んでもよい。
【0068】
本発明のさらに別の態様は、装置を操作するコンピュータのためのコンピュータプログラム（コンピュータプログラム製品）である。対象の装置は、共鳴成分を含む散乱光を発生させるために、少なくとも１つの種類の第１の光パルスをターゲットに供給するように構成された第１の光路と、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスをターゲットに供給して散乱光を発生するように構成されたプローブパルスコンディショナと、ターゲットからの散乱光を取得する取得ユニットとを備える。コンピュータプログラムは、第１のプローブ光パルスと第２のプローブ光パルスとが時間的に部分的に重なる時間差を含むように第１のプローブ光パルスと第２のプローブ光パルスとを供給し、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスの少なくとも一方を変調した後に光学的にオーバーラップさせるステップと、変調に同期して取得された散乱光の差分を生成して共鳴成分を抽出するステップとを実行するための実行可能コードを含む。
【0069】
具体的な実施形態に関する前述の説明は、本明細書における実施形態の一般的な性質を十分に明らかにするので、他者は、現在の知識を適用することによって、一般的な概念から逸脱することなく、そのような具体的な実施形態を様々な用途のために容易に修正および／または適合させることができる。したがって、そのような適合および修正は、開示された実施形態の意味および等価物の範囲内で理解されるべきであり、理解されることが意図される。本明細書の表現または用語は、説明のためのものであり、限定するためのものではないことを理解されたい。従って、本明細書における実施形態は、好ましい実施形態の観点から説明されているが、当業者であれば、本明細書における実施形態は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内で変更を加えて実施することができることを認識するであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ストークス光パルスと、ポンプ光パルスと、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスを含むハイブリッドプローブ光パルスとをターゲットの一部に照射することによりＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することであって、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスは時間的に部分的に重複し、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスは前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと部分的に重複しており、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスの少なくとも一方の位相を変化させて前記ＣＡＲＳスペクトのセットを取得することと、取得された前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することにより、共鳴成分を抽出することと、を有する、方法。
【請求項2】
請求項１において、前記第２のプローブ光パルスは、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスとともに局部発振（ＬＯ）信号を発生するように選択され、前記第１のプローブ光パルスは、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスとともに共鳴成分を含む信号を発生するように選択されている、方法。
【請求項3】
請求項１において、前記第１および第２のプローブ光パルスのパルス幅は、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスのパルス幅よりも大きく、
前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、前記第１のプローブ光パルスが、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスに対し、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと前記第１のプローブ光パルスの前記パルス幅の範囲内で部分的に重なる第１の相対的な時間的関係を備え、前記第２のプローブ光パルスが、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと前記第２のプローブ光パルスの前記パルス幅の範囲内で部分的に重なる第２の相対的な時間的関係であって、前記第１の相対的な時間的関係に対して負の遅延を含む第２の相対的な時間的関係を備えている、前記ハイブリッドプローブ光パルスを出射することを含む、方法。
【請求項4】
請求項１において、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、前記第２のプローブ光パルスが前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスよりも早く出射されるように、前記ハイブリッドプローブ光パルスを出射することを含む、方法。
【請求項5】
請求項１において、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、前記ストークス光パルス、前記ポンプ光パルスおよび前記第１のプローブ光パルスが実質的に同時に出射され、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスが実質的に前記第２のプローブ光パルスのパルス幅の端になるように、前記ハイブリッドプローブ光パルスを出射することを含む、方法。
【請求項6】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、前記ストークス光パルス、前記ポンプ光パルスおよび前記ハイブリッドプローブ光パルスを用いて前記ターゲットをスキャンし、各画素におけるＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することをさらに有する、方法。
【請求項7】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、前記ストークス光パルス、前記ポンプ光パルスおよび前記ハイブリッドプローブ光パルスで前記ターゲットをスキャンし、各ボクセルのＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することをさらに有する、方法。
【請求項8】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、前記ストークス光パルスは第１の波長範囲を備え、前記ポンプ光パルスは前記第１の波長範囲よりも短い第２の波長範囲を備え、前記ハイブリッドプローブ光パルスは前記第２の波長範囲よりも短い第３の波長範囲を備えている、方法。
【請求項9】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、前記ストークス光パルスはブロードバンドストークスビームを含む、方法。
【請求項10】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、
波長板を用いて入力プローブ光パルスの偏光を変換することと、
ＰＢＳを用いて前記入力プローブ光パルスから前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを分離することと、
前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスをそれぞれ第１のプローブ経路および第２のプローブ経路であって、それぞれが、波長板、光パルスを前記ＰＢＳに反射させるためのミラーを含み、前記第１のプローブ経路および前記第２のプローブ経路の少なくとも一方は、別の経路との時間差を含む経路、および変調のために前記ミラーを移動するアクチュエータを含む、前記第１のプローブ経路および前記第２のプローブ経路により調整することと、
前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを前記ＰＢＳにより重ねられるようにガイドすることと、を含む、方法。
【請求項11】
請求項１ないし５のいずれかにおいて、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得することは、
波長板を用いて入力プローブ光パルスの偏光を変換することと、
少なくとも１つの複屈折結晶体を用いて、前記入力プローブ光パルスから前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを分離し、前記第１のプローブ光パルスと前記第２のプローブ光パルスとの間に時間差を設けることと、
ＥＯＭ（電気光学変調器）を用いて、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスの少なくとも一方を変調することと、
偏光素子によってオーバーラップされた前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスをガイドすることと、を含む、方法。
【請求項12】
ストークス光パルスと、ポンプ光パルスと、第１のプローブ光パルスおよび第２のプローブ光パルスを含むハイブリッドプローブ光パルスとを、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスが時間的に部分的に重なり、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスが前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと部分的に重なり、前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスの少なくとも一方の位相を変化させた状態で、ターゲットの一部に照射するように構成された光路と、前記ストークス光パルス、前記ポンプ光パルスおよび前記ハイブリッドプローブ光パルスにより発生されたＣＡＲＳスペクトルを検出して、前記ハイブリッドプローブ光パルスの位相に関連するＣＡＲＳスペクトルのセットを取得するように構成された検出器と、を有する、システム。
【請求項13】
請求項１２において、前記第１のプローブ光パルスと、前記第１のプローブ光パルスに対して負の遅延を含む前記第２のプローブ光パルスとを含む前記ハイブリッドプローブ光パルスを生成するように構成されたプローブパルスジェネレータをさらに有する、システム。
【請求項14】
請求項１２において、さらに、プローブパルスジェネレータを有し、
前記プローブパルスジェネレータは、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスのパルス幅よりも大きいパルス幅を含む前記第１のプローブ光パルスであって、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと前記第１のプローブ光パルスの前記パルス幅内で部分的に重なる第１の相対的な時間的関係を備えた前記第１のプローブ光パルスを生成するように構成された第１のプローブパルスコンディショナと、
前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスのパルス幅よりも大きいパルス幅を含む前記第２のプローブ光パルスであって、前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと前記第２のプローブパルスの前記パルス幅内で部分的に重なり、前記第１の相対的な時間的関係に対して負の遅延を含む第２の相対的な時間的関係を備えた前記第２のプローブパルスを生成するように構成された第２のプローブパルスコンディショナと、を含む、システム。
【請求項15】
請求項１３または１４において、前記プローブパルスジェネレータは、前記第２のプローブ光パルスが前記ストークス光および前記ポンプ光のパルスよりも早く出射されるように、前記ハイブリッドプローブ光パルスを生成するように構成されている、システム。
【請求項16】
請求項１３または１４において、前記プローブパルスジェネレータは、前記第１のプローブ光パルスが前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスと実質的に同時に出射され、前記第２のプローブ光パルスが前記ストークス光パルスおよび前記ポンプ光パルスが前記第２のプローブ光パルスの前記パルス幅の実質的な端部で出射されるように、前記ハイブリッドプローブ光パルスを生成するように構成されている、システム。
【請求項17】
請求項１２において、さらに、プローブパルスジェネレータを有し、
前記プローブパルスジェネレータは、
入力プローブ光パルスの偏光を変換するための波長板と、
前記入力プローブ光パルスから前記第１のプローブ光パルスと前記第２のプローブ光パルスとを分離するためのＰＢＳと、
前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスをそれぞれ調整するための第１のプローブ経路および第２のプローブ経路とを含み、前記第１のプローブ経路および前記第２のプローブ経路はそれぞれ、波長板、および光パルスを前記ＰＢＳに反射させるためのミラーを含み、前記第１のプローブ経路および前記第２のプローブ経路の少なくとも一方は、他の経路との間に時間差を設けるための経路、および変調のために前記ミラーを移動させるアクチュエータを含み、
前記プローブパルスジェネレータは、さらに、前記ＰＢＳによって重ねられた前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを導くための出力経路を含む、システム。
【請求項18】
請求項１２において、さらに、プローブパルスジェネレータを有し、
前記プローブパルスジェネレータは、
入力プローブ光パルスの偏光を変換するための波長板と、
前記入力プローブ光パルスから前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを分離し、前記第１のプローブ光パルスと前記第２のプローブ光パルスとの間に時間差を設けるための少なくとも１つの複屈折結晶体と、
前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスの少なくとも一方を変調するためのＥＯＭと、
偏光素子によって重ねられた前記第１のプローブ光パルスおよび前記第２のプローブ光パルスを導く出力経路と、を含む、システム。
【請求項19】
請求項１２または１３において、前記光路は、第１の波長範囲の前記ストークス光パルスを供給するように構成された第１の光路と、
前記第１の波長範囲よりも短い第２の波長範囲の前記ポンプ光パルスを供給するように構成された第２の光路と、
前記第２の波長範囲よりも短い第３の波長範囲の前記ハイブリッドプローブ光パルスを供給するように構成された第３の光路と、を含む、システム。
【請求項20】
請求項１９において、前記第１の光路は、前記ポンプ光パルスからブロードバンドストークスビームを生成するための第１の光学素子を含む、システム。
【請求項21】
請求項１２または１３において、前記ストークス光パルス、前記ポンプ光パルスおよび前記ハイブリッドプローブ光パルスを用いて前記ターゲットを走査し、各画素におけるＣＡＲＳスペクトルのセットを取得するように構成されたスキャナーをさらに有する、システム。
【請求項22】
請求項１２または１３において、前記ストークス光パルス、前記ポンプ光パルスおよび前記ハイブリッドプローブ光パルスを用いて前記ターゲットを走査し、各ボクセルのＣＡＲＳスペクトルのセットを取得するように構成されたスキャナーをさらに有する、システム。
【請求項23】
請求項１２または１３において、取得されたＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することにより共鳴成分を抽出するように構成された分析装置をさらに有する、システム。
【請求項24】
コンピュータを請求項１２または１３に記載のシステムとして動作させるためのコンピュータプログラムであって、前記ＣＡＲＳスペクトルのセットを取得し、取得されたＣＡＲＳスペクトルのセットを比較することによって共鳴成分を抽出するように前記システムを制御するための命令を含む、コンピュータプログラム。
【国際調査報告】