特表 2024-535220 調整可能なサイズ選択を使用して細胞試料からゲノムＤＮＡを抽出するためのデバイス、方法、およびシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-30

(54)【発明の名称】調整可能なサイズ選択を使用して細胞試料からゲノムＤＮＡを抽出するためのデバイス、方法、およびシステム

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20240920BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240920BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20240920BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240920BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20240920BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240920BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20240920BHJP

   G01N 1/28 20060101ALI20240920BHJP

   G01N 1/04 20060101ALI20240920BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 15/115 20100101ALN20240920BHJP

   C12N 15/10 20060101ALN20240920BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20240920BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20240920BHJP

   C12M 1/34 20060101ALN20240920BHJP

   C07K 2/00 20060101ALN20240920BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240920BHJP

   C12N 5/04 20060101ALN20240920BHJP

   C12N 1/14 20060101ALN20240920BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20240920BHJP

【ＦＩ】

C12M1/00 A

C12Q1/686 Z

C12Q1/6869 Z

C12N15/09 200

G01N33/48 S

G01N33/53 Y

G01N37/00 101

G01N1/28 J

G01N1/04 M

G01N21/64 F

C12N15/115 Z

C12N15/10 110Z

C12N9/16 Z

C12N9/10

C12M1/34 Z

C07K2/00

C12N5/0783

C12N5/04

C12N1/14 A

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515563

(86)(22)【出願日】2022-09-09

(85)【翻訳文提出日】2024-05-02

(86)【国際出願番号】 US2022043093

(87)【国際公開番号】W WO2023039182

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】63/242,216

(32)【優先日】2021-09-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/320,389

(32)【優先日】2022-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524090194

【氏名又は名称】インソ バイオサイエンシーズ インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ビソーニ， アダム

(72)【発明者】

【氏名】クレイグヘッド， ハロルド

(72)【発明者】

【氏名】ティアン， ハーヴェイ

【テーマコード（参考）】

2G043

2G045

2G052

4B029

4B063

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G043AA03

2G043AA04

2G043BA16

2G043CA04

2G043EA01

2G043FA01

2G043FA02

2G045AA24

2G045BB03

2G045BB35

2G045CA11

2G045CA18

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB01

2G045CB03

2G045CB07

2G045CB30

2G045FA16

2G045FA37

2G045FA40

2G045FB02

2G045FB05

2G045FB06

2G045FB12

2G052AA29

2G052AA33

2G052AB20

2G052AD09

2G052AD29

2G052AD46

2G052AD55

2G052BA03

2G052BA21

2G052GA09

2G052GA28

2G052GA29

2G052HA19

2G052JA07

2G052JA08

2G052JA11

4B029AA07

4B029AA23

4B029BB06

4B029BB11

4B029BB12

4B029BB20

4B029FA12

4B029FA15

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA17

4B063QQ06

4B063QQ07

4B063QQ08

4B063QQ09

4B063QQ42

4B063QR06

4B063QR08

4B063QR10

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS16

4B063QS17

4B063QS25

4B063QS34

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065BD01

4B065BD02

4B065CA23

4B065CA60

4H045AA30

4H045AA40

4H045CA11

4H045CA15

4H045CA20

4H045CA30

4H045CA40

4H045EA50

(57)【要約】

細胞または細胞核から選択されたサイズ範囲のゲノムＤＮＡの断片を抽出するためのマイクロ流体の流れに基づくデバイスを開示する。デバイスは、マイクロ流体チャネルおよび規定の形体でマイクロ流体チャネル内に配置されたマイクロピラーのアレイを含む。かかるデバイスおよび流体制御モジュールを含むシステムも開示する。細胞または細胞核から所望のサイズのメトリックを有するゲノムＤＮＡの断片を抽出するためのパラメーターを選択する方法、および細胞または細胞核から選択されたサイズのメトリックを有するゲノムＤＮＡの断片を単離する方法をさらに開示する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞または細胞核から選択されたサイズ範囲のゲノムＤＮＡの断片を抽出するためのマイクロ流体の流れに基づくデバイスであって、
入口から出口に向かう流れ方向に流すことを可能にする少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を有する少なくとも１つのマイクロ流体チャネル；および
前記マイクロ流体チャネル内に配置されたマイクロピラーの少なくとも１つのアレイ
を含み、ここで、
前記マイクロピラーの直径が、３マイクロメートルと５０マイクロメートルとの間である；
前記マイクロピラーが、２マイクロメートルと１５０マイクロメートルとの間の間隔によって相互に分離されている；
前記アレイが、１平方ミリメートルと１６００平方センチメートルとの間の区域内で境されている；
前記マイクロピラーの高さが、１～２００マイクロメートルの間である；そして
前記マイクロピラーが、規定の形体で前記アレイ内に配置されている、デバイス。

【請求項2】

前記マイクロピラーの形状が、円形、楕円形、正方形、三角形、矩形、十字形、六角形、菱形、多角形、ドーム型、ピラミッド形、または２またはそれを超える前述の任意の組み合わせである、請求項１に記載のデバイス。

【請求項3】

前記チャネルが、
（ａ）ランダム配向；
（ｂ）正方格子；
（ｂ）六方格子；または
（ｃ）２またはそれを超える前述の任意の組み合わせ
のマイクロピラーを含む、請求項１または２に記載のデバイス。

【請求項4】

前記チャネルが、正方格子のマイクロピラー、ランダム配向のマイクロピラー、および六方格子のマイクロピラーの交互領域を含む、請求項３に記載のデバイス。

【請求項5】

前記正方格子および六方格子のマイクロピラーの交互領域が、（ａ）連続しているか、あるいは（ｂ）前記領域が構造領域によって分離されて不連続である、請求項４に記載のデバイス。

【請求項6】

前記マイクロピラーが、可変間隔のグラジエントで配置されている、請求項１～５のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項7】

前記可変間隔のグラジエントが、（ａ）滑らかなグラジエント、（ｂ）段階的なグラジエント、または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせを含む、請求項６に記載のデバイス。

【請求項8】

前記チャネルが、少なくとも１つのより短いマイクロピラーアレイ領域（例えば、図２９）を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項9】

前記チャネルが、少なくとも２つまたは少なくとも３つのより短いマイクロピラーアレイ領域を含み、必要に応じて、前記より短いマイクロピラーアレイ領域が構造領域で分離されている、請求項８に記載のデバイス。

【請求項10】

前記より短いマイクロピラーアレイ領域の長さが、前記チャネルの長さの約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％未満である、請求項８または９に記載のデバイス。

【請求項11】

前記デバイスが、前記マイクロピラーアレイ領域内まで伸長している１またはそれを超えるカナルをさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項12】

前記１またはそれを超えるカナルが前記流れ方向に沿って整列され、必要に応じて、前記１またはそれを超えるカナルが、真っすぐであるか、分岐しているか、湾曲しているか、交差している、請求項１１に記載のデバイス。

【請求項13】

前記デバイスが、異なる長さの少なくとも２つのカナルを含む、請求項１１または１２に記載のデバイス。

【請求項14】

前記直径、前記間隔、前記区域、前記形体、またはそれらの組み合わせが、前記細胞または細胞核のタイプに基づいて選択される、請求項１～１３のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項15】

前記細胞または細胞核が、動物、真菌、原生生物、または植物の細胞または細胞核、必要に応じて、ヒトの細胞または細胞核である、請求項１～１４のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項16】

前記細胞または細胞核が、白血球またはＴ細胞の細胞または細胞核である、請求項１～１５のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項17】

前記デバイスが、（ａ）前記アレイの先端部のシングルセルサイズの開口部、および／または（ｂ）シングルセルからゲノムＤＮＡの断片を抽出可能な前記入口近傍のより狭い形体（例えば、マイクロピラー間隔）を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項18】

「溝状の」分岐チャネルをさらに含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項19】

前記デバイスが、（ａ）前記アレイの先端部のマルチセルサイズの開口部および／または（ｂ）前記入口近傍のより広い形体（例えば、マイクロピラー間隔）を含み、それにより、複数の細胞からゲノムＤＮＡの断片を抽出可能である、請求項１～１６および１８のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項20】

前記細胞または細胞核に結合する薬剤をさらに含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項21】

前記薬剤が、抗体、その抗原結合断片、またはアプタマーである、請求項２０に記載のデバイス。

【請求項22】

前記マイクロ流体チャネルに対する二次チャネルをさらに含む、請求項２０または２１に記載のデバイス。

【請求項23】

前記二次チャネル（例えば、図４）が、前記細胞が前記薬剤に結合した後に、前記細胞を溶解し、前記ゲノムＤＮＡを捕捉することを可能にする、請求項２２に記載のデバイス。

【請求項24】

前記マイクロピラーが、ポリマー、プラスチック、金属、シリコン、ガラス、または２またはそれを超える前述の任意の組み合わせを含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項25】

前記マイクロピラーがポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項26】

前記マイクロピラーが、約２～３０マイクロメートルの範囲の間隔、必要に応じて、５マイクロメートルまたはそれ未満の間隔で相互に分離している、請求項１～２５のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項27】

前記マイクロピラーの高さが５～５０マイクロメートルの間である、請求項１～２６のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項28】

前記デバイスが、マイクロピラーのアレイを含む少なくとも２つのマイクロ流体チャネルを含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項29】

前記デバイスが、少なくとも６、１２、８、１２、２４、４８、９６、３８４、または１５３６のチャネルを含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項30】

（ａ）前記チャネルが、デバイス中でスタガード形体またはサイドバイサイド形体である；そして／または
（ｂ）前記チャネルが、マルチウェルプレート形体と位置合わせされている秩序形体である、請求項２８または２９に記載のデバイス。

【請求項31】

前記少なくとも２つのマイクロ流体チャネルが垂直に積み重なっている、請求項２８～３０のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項32】

細胞および／または細胞核を組織から単離する機器をさらに含む、請求項１～３１のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項33】

前記機器が、ホモジナイザー、超音波処理器、および／または組織グラインダーを含み、必要に応じて、ここで、前記ホモジナイザーが、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）、ダウンス型ホモジナイザー、ヒーター付きｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－４２７）、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９３－２３５）、およびＳｉｎｇｕｌａｔｏｒ１００（Ｓ２ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから選択される、請求項３２に記載のデバイス。

【請求項34】

前記組織が、未処理であるか、凍結されているか、急速凍結されているか、ホルマリン固定パライン包埋（ＦＦＰＥ）されているか、あるいは最適切断温度化合物（ＯＣＴ）中で保存されている、請求項３２または３３に記載のデバイス。

【請求項35】

細胞または細胞核を選別する機器をさらに含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項36】

前記機器が、フローサイトメーター、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）機器、および／または顕微鏡を含む、請求項３５に記載のデバイス。

【請求項37】

細胞または細胞核の溶解を容易にする少なくとも１つの薬剤（例えば、溶解緩衝液 変性剤、および／または洗浄緩衝液）をさらに含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項38】

消化緩衝液、１またはそれを超える酵素、ＤＮＡ標識剤（例えば、ビオチン、蛍光分子、バーコード）、ハイブリッド形成剤（例えば、（例えば、検出可能なマーカー、例えば、蛍光分子、ビオチンで標識された）プライマー）、および／または洗浄緩衝液をさらに含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項39】

前記１またはそれを超える酵素が、ＤＮＡ切断酵素、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＤＮＡ会合タンパク質を修飾する酵素から選択される、請求項３８に記載のデバイス。

【請求項40】

前記１またはそれを超える酵素が、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タンパク質、およびｄｓＤＮＡフラグメンターゼから選択される、請求項３８または３９に記載のデバイス。

【請求項41】

前記１またはそれを超える酵素が、１またはそれを超える制限酵素を含む、請求項３８～４０のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項42】

ＤＮＡ切断および／またはチャネルからのＤＮＡ放出を容易にする少なくとも１つの機器をさらに含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項43】

前記少なくとも１つの機器が、超音波処理器、ネブライザー、光源（例えば、可視光、ＵＶ光、Ｘ線、ガンマ線、または電離放射線を放射する）、または２またはそれを超える前述の任意の組み合わせから選択される、請求項４２に記載のデバイス。

【請求項44】

前記マイクロピラーが、折り畳み可能である、融解可能である、機械的に格納可能である、溶解可能である、機械的に剥離される、機械的に屈曲可能である、そして／または電気的に屈曲可能である、請求項１～４３のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項45】

単離したＤＮＡを分析する少なくとも１つの器具をさらに含む、請求項１～４４のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項46】

前記少なくとも１つの器具が、顕微鏡、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、マイクロアレイ、質量分析計（例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、およびシーケンサー（例えば、ＮＧＳ、第三世代シーケンサー）から選択される、請求項４５に記載のデバイス。

【請求項47】

ロボット試料調製プラットフォームおよび／またはプレートリーダーをさらに含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項48】

前記回収されたゲノムＤＮＡが、少なくとも１つのＤＮＡ結合タンパク質を含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載のデバイス。

【請求項49】

前記少なくとも１つのＤＮＡ結合タンパク質が、ヒストン、転写因子、複製タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）、および／またはヌクレアーゼを含む、請求項４８に記載のデバイス。

【請求項50】

少なくとも１つの入口への接続に適する少なくとも１つの流体制御モジュールをさらに含む、請求項１～４９のいずれか１項に記載の少なくとも１つのデバイスを含むシステム。

【請求項51】

前記流体制御モジュールが、ピペットまたはシリンジを含む、請求項５０に記載のシステム。

【請求項52】

前記流体制御モジュールが、加圧空気源（例えば、圧縮空気）、制御圧力源、制御空気圧源、圧力駆動ポンプ、シリンジポンプ、真空ポンプ、または蠕動ポンプを含む、請求項５０に記載のシステム。

【請求項53】

出口への接続に適する１またはそれを超える収集リザーバをさらに含み、必要に応じて、ここで、前記１またはそれを超える収集リザーバが、試料収集リザーバおよび廃棄物収集リザーバを含む、請求項５０～５２のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項54】

マイクロ流体チャネル内のＤＮＡを電気泳動により駆動するための制御電圧源をさらに含む、請求項５０～５３のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項55】

少なくとも１つの温度制御モジュールをさらに含み、必要に応じて、ここで、（ａ）前記少なくとも１つの温度制御モジュールが、異なる温度で前記デバイスの異なる部分を加熱することができ、そして／または（ｂ）前記少なくとも１つの温度制御モジュールを、時間制御様式で制御することができる（例えば、ある特定の持続時間加熱することができる）、請求項５０～５４のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項56】

前記少なくとも１つの温度制御モジュールが、前記デバイスの温度を約２℃～１００℃の範囲で設定することができる、請求項５５に記載のシステム。

【請求項57】

前記システムが、少なくとも２つのデバイスを含み、必要に応じて、ここで、前記少なくとも２つのデバイスが垂直に積み重なっている、請求項５０～５６のいずれか１項に記載のシステム。

【請求項58】

細胞または細胞核から所望のサイズのメトリックを有するゲノムＤＮＡの断片を抽出するためのパラメーターを選択する方法であって、
少なくとも１つの細胞または細胞核を含む試料を、請求項１～４９のいずれか１項に記載のデバイスまたは請求項５０～５７のいずれか１項に記載のシステムによって、
前記１またはそれを超える酵素の各々の濃度；
前記１またはそれを超える酵素の数；
前記消化緩衝液の緩衝液組成；
消化時間；および
消化温度；
を含むパラメーターを使用して、少なくとも１回処理する工程；
収集された試料の断片サイズのメトリックを決定する工程；ならびに、前記断片サイズのメトリックに基づいて、
前記断片サイズのメトリックが前記所望のサイズのメトリックに対応する場合、使用される前記パラメーターを選択する工程；
前記断片サイズのメトリックが前記所望のサイズのメトリックより小さい場合、前記断片サイズのメトリックが前記所望のサイズのメトリックより小さくなくなるまで、前記濃度を低下させるか、前記数を減少させるか、前記消化時間を減少させるか、酵素の効率を低下させるために前記消化温度を変化させるか、酵素の効率を低下させるために前記緩衝液組成を変化させるか、あるいはこれらの組み合わせを行う工程；および
前記断片サイズのメトリックが前記所望のサイズのメトリックより大きい場合、前記断片サイズのメトリックが前記所望のサイズのメトリックより大きくなくなるまで、前記濃度を増加させるか、前記数を増加させるか、前記消化時間を増加させるか、酵素の効率を増大させるために前記消化温度を変化させるか、酵素の効率を増大させるために前記緩衝液組成を変化させるか、あるいはこれらの組み合わせを行う工程
を含む、方法。

【請求項59】

前記断片サイズのメトリックが、断片サイズの平均または断片サイズの中央値である、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記処理する工程が、前記試料を前記デバイス中にロードすることおよび前記洗浄緩衝液を使用して前記デバイス中で少なくとも１つの細胞または細胞核を洗浄することを含む、請求項５８または５９に記載の方法。

【請求項61】

前記１またはそれを超える酵素を失活させる工程をさらに含む、請求項５８～６０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記失活が熱失活を含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

試料から細胞または細胞核を単離する方法であって、請求項１～４９のいずれか１項に記載のデバイス、または請求項５０～５７のいずれか１項に記載のシステムによって前記試料を流動させる工程；および
前記デバイス中に捉えた前記細胞または細胞核を収集する工程
を含む、方法。

【請求項64】

核膜がインタクトなままで細胞膜または細胞壁を溶解する工程をさらに含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記捉えた細胞または細胞核を洗浄する工程をさらに含む、請求項６３または６４に記載の方法。

【請求項66】

前記細胞または細胞核が、動物、真菌、原生生物、または植物、必要に応じて、植物の細胞または細胞核である、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項67】

前記試料が、血液、血漿、リンパ、唾液、尿、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物、および組織ホモジネートから選択され、必要に応じて、ここで、前記組織ホモジネートが植物組織ホモジネートである、請求項６３～６６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項68】

前記試料が、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、イオン性界面活性剤、別の荷電剤、ＰＥＧ、またはＰＥＯポリマーをさらに含む、請求項６３～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

大きなサイズのゲノムＤＮＡ（例えば、インタクトなｇＤＮＡ、染色体全体、または５００ｋｂを超えるｇＤＮＡの断片）を単離する方法であって、少なくとも１つの細胞または細胞核を含む試料を、請求項１～４９のいずれか１項に記載のデバイスまたは請求項５０～５７のいずれか１項に記載のシステムによって処理する工程を含み、必要に応じて、ここで、前記デバイスが、折り畳み可能である、融解可能である、機械的に格納可能である、溶解可能である、機械的に剥離される、機械的に屈曲可能である、そして／または電気的に屈曲可能であるマイクロピラーを含む、方法。

【請求項70】

少なくとも１つの細胞または細胞核から選択されたサイズのメトリックを有するゲノムＤＮＡの断片を単離する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの細胞または細胞核を含む試料を、請求項１～４９のいずれか１項に記載のデバイス、または請求項５０～５７のいずれか１項に記載のシステムによって処理する工程；および
（ｂ）前記処理によって単離された前記ゲノムＤＮＡの断片を収集する工程
を含む、方法。

【請求項71】

前記ｇＤＮＡの断片を、ＤＮＡ切断酵素での消化、超音波処理、噴霧、流動条件の変更、光による方法、機械的方法、またはこれらのうちの２つまたはそれを超える方法の組み合わせによって産生する、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記方法が、請求項５８～６２のいずれか１項に記載の方法によって選択されたパラメーターを使用する工程を含む、請求項７０または７１に記載の方法。

【請求項73】

請求項６３～６８のいずれか１項に記載の細胞または細胞核を単離する方法をさらに含む、請求項７０～７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

（ａ）前記溶解の前に捉えた細胞または細胞核を洗浄する工程；
（ｂ）前記消化の前に前記ゲノムＤＮＡを洗浄する工程；および／または
（ｃ）前記１またはそれを超える酵素を失活させる工程（例えば、熱失活）
をさらに含む、請求項７０～７３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項75】

前記ゲノムＤＮＡの断片が、約１ｋｂ～５００ｋｂの範囲にある、請求項７０～７４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項76】

前記ゲノムＤＮＡの断片が、２００ｋｂ、３０ｋｂ、２５ｋｂ、１４ｋｂ、１０ｋｂ、または８ｋｂの範囲にある、請求項７０～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

前記ゲノムＤＮＡが、シングルセルまたはシングルセルの核に由来する、請求項７０～７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

前記ゲノムＤＮＡの断片を収集する工程が、手作業のピペッティングによるか、管材料を通じて収集リザーバから前記断片を取り出すことを含む、請求項７０～７７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項79】

前記ゲノムＤＮＡの断片を収集する工程が、前記収集リザーバに取り付けられた電気泳動チャネルを介して前記収集リザーバから前記断片を取り出すことを含む、請求項７０～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

前記ゲノムＤＮＡを配列決定し、増幅し、ハイブリッド形成し、末端標識し、そして／またはバーコード化する工程をさらに含む、請求項７０～７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

前記細胞または細胞核が、動物、真菌、原生生物、または植物、必要に応じて、ヒトの細胞または細胞核である、請求項７０～８０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項82】

前記細胞または細胞核が、白血球またはＴ細胞の細胞または細胞核である、請求項７０～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項83】

前記試料が、血液、血漿、リンパ、唾液、尿、精液、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物、および／または組織ホモジネートを含む、請求項７０～８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

前記試料が、部分精製されたか完全精製された細胞または細胞核を含む、請求項７０～８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項85】

ゲノム中の変異を検出する方法であって、
（ａ）請求項６９～８４のいずれか１項に記載の方法にしたがってゲノムＤＮＡまたはその断片を単離する工程；および
（ｂ）回収された前記ＤＮＡを分析し、それにより、前記変異を検出する工程
を含む、方法。

【請求項86】

前記変異が、置換、欠失、挿入、重複、ＤＮＡ融合、および／または染色体融合を含む、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記ＤＮＡを、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイブリッド形成、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、サザンブロッティング、配列決定（例えば、ＮＧＳ、第三世代配列決定）、マイクロアレイ、およびこれらのうちの任意の２つまたはそれを超える手技の組み合わせから選択される１つまたは複数を使用して分析する、請求項８５または８６に記載の方法。

【請求項88】

前記ゲノムＤＮＡが、動物、真菌、原生生物、または植物、必要に応じて、ヒトのゲノムＤＮＡである、請求項８５～８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項89】

前記試料または緩衝液（例えば、溶解緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、消化緩衝液など）が、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、イオン性界面活性剤、別の荷電剤、ＰＥＧ、またはＰＥＯポリマー）を含む、請求項６９～８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

前記少なくとも１つのチャネルが、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、イオン性界面活性剤、別の荷電剤、ＰＥＧ、またはＰＥＯポリマー）を含み、必要に応じて、ここで、前記ブロッキング剤が、前記チャネルの内面および／または前記チャネル内のマイクロピラーをコーティングする、請求項１～４９のいずれか１項に記載のデバイスまたは請求項５０～５７のいずれか１項に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年９月９日出願の米国仮出願第６３／２４２，２１６号；および２０２２年３月１６日出願の米国仮出願第６３／３２０，３８９号（これらの内容全体は、本明細書中で参考として援用される）に基づく利益を主張する。

【0002】

権利の記載
本発明を、米国国立科学財団によって授与された助成金番号１９４０３９５の下で政府支援を受けて実施した。政府は、本発明において一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

背景
細胞を含む試料からのゲノムＤＮＡなどのＤＮＡの抽出は、種々の用途で必要である。例えば、抽出したＤＮＡは、他にも多数の用途があるが、パルスフィールドゲル電気泳動、増幅、および特定の遺伝子座の検出、または配列決定に必要であろう。これらの用途は、同様に、癌、感染症、および他の多くの疾患などの重要な現象の理解に有用であり得る。

【0004】

マイクロ流体デバイスの使用は、細胞からＤＮＡを抽出するための選択肢のうちの１つである。例えば、溶解した細胞由来のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を固定し、次いで、アレイからそのｇＤＮＡを抽出するために、デバイス内にマイクロピラーアレイを使用し得る。多数の利点があるにもかかわらず、これらの方法は、しばしば、種々のサイズのｇＤＮＡ断片の混合物が得られ、しばしば、処理可能な試料の範囲が制限される。

【0005】

したがって、当該分野において細胞試料からｇＤＮＡを抽出する方法をさらに開発する必要がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

要旨
本発明は、いくつかの態様では、細胞または細胞核を含む試料から選択可能な断片サイズのゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出および単離する方法に関する。抽出されたＤＮＡを、断片のサイズによる選別、選択的増幅、または配列決定などの種々の技術によって分析し得る。この能力は、生物学的研究および医学的用途（疾患の診断および治療の指示など）において有用である。特定の配列決定技術に最適なｇＤＮＡ断片サイズを選択することにより、プロセスの効率が改善される。また、開示のアプローチは、試料の調製に必要な工程数を減少させ、小さなサイズの試料に効率的なはずである。

【0007】

選択された断片サイズで選択された細胞または細胞核からｇＤＮＡを抽出するために、しばしば、酵素アプローチを利用してＤＮＡを所望のサイズに剪断し、ピラー様障害物が固定されたマイクロ流体デバイス中のピラー様障害物からより短いＤＮＡ断片を放出させる。次いで、ｇＤＮＡを、デバイスから取り出すか、あるいは、緩衝液の交換またはデバイスの第２段階での濃縮などのさらなる処理に供することができる。ｇＤＮＡは、その後の選択的増幅、検出、または配列決定などの分析プロセスに適合する。

【0008】

マイクロ流体デバイスを作製する方法は、モールディング、型押し、または射出成形を使用してポリジメチルシロキサン、（ＰＤＭＳ）、または他のポリマー中に再現することができる鋳型を作製するための標準的なリソグラフィーおよびエッチングアプローチを使用する。デバイスの作製方法の一例は、Ｂｅｎｉｔｅｚ ｅｔ ａｌ．に記載されている。モールディングされたＰＤＭＳを、ガラスプレートに容易に接着して構造体を完成させることができるか、あるいは、デバイスを、異なるポリマー材料の組み合わせによって構築し得る。

【0009】

あるいは、マイクロ流体デバイスを、他の材料を使用して作製することができる。例えば、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）に加えて、ガラス、プラスチック、金属、シリコン、またはその任意の組み合わせなどの材料を使用することができる。

【0010】

チャネルの寸法、ピラーサイズ、およびピラーアレイの組織化の組み合わせを、所望の試料型または試料体積のために変動させることができる。例えば、より小さな細胞または細胞核を捉えるためにより小さなピラー間隔が使用されるであろうし、一方、試料中により小さな実体を含む混合物からより大きな細胞を選択するためにより大きな間隔が使用されるであろう。

【0011】

いくつかの態様では、細胞または細胞核から選択されたサイズ範囲のゲノムＤＮＡの断片を抽出するためのマイクロ流体の流れに基づくデバイスは、入口から出口に向かう流れ方向で流動させることを可能にするための入口および出口を有するマイクロ流体チャネルを含む。好ましい実施形態では、デバイスは、マイクロ流体チャネル内に配置したマイクロピラーのアレイを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、マイクロピラーの直径は、好ましくは、少なくとも約３マイクロメートルと約１５マイクロメートルとの間であるが、少なくとも約１マイクロメートルから約１００マイクロメートルまでの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、直径は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００マイクロメートル；またはこれらの値の間の任意の範囲である。

【0013】

いくつかの実施形態では、マイクロピラーの好ましい高さは、少なくとも約１５～約２５マイクロメートルであるが、少なくとも約１から約２００マイクロメートルまでの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、高さは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、もしくは２００マイクロメートル；またはこれらの値の間の任意の範囲である。

【0014】

いくつかの実施形態では、マイクロピラーは、好ましくは少なくとも約２マイクロメートルと約１５０マイクロメートルとの間の間隔で相互に分離されているが、０．１マイクロメートルから３００マイクロメートル超までの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、間隔は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、もしくは４００マイクロメートル；またはこれらの値の間の任意の範囲である。

【0015】

いくつかの実施形態では、マイクロピラーの各々のアレイは、２５平方ミクロンまたはそれを超える区域内で境されている。いくつかの実施形態では、マイクロピラーの各々のアレイは、１平方ミリメートルまたはそれを超える区域内で境されている。いくつかの実施形態では、区域は、少なくとも約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、もしくは５００平方ミリメートル；またはこれらの値の間の任意の範囲である。いくつかの実施形態では、マイクロピラーの各々のアレイは、約２００平方ミリメートル未満の区域内で境されている。いくつかの実施形態では、マイクロピラーの各々のアレイは、約１００平方ミリメートル未満の区域内で境されている。好ましい実施形態では、マイクロピラーの各々のアレイは、約１６００平方センチメートル未満の区域内で境されている。

【0016】

いくつかの実施形態では、マイクロピラーは、規定の形体でアレイ内に配置されている（例えば、図９および図１０に示す）。

【0017】

いくつかの実施形態では、マイクロピラーは、ポリマー（例えば、マイクロピラーはポリマーから作製される）、プラスチック、金属、シリコーン、ガラス、または２またはそれを超える前述の任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、マイクロピラーを、リソグラフプロセスを使用して作製する。いくつかの実施形態では、デバイスは、マイクロピラーのアレイの前述の区域内に伸長している１またはそれを超えるカナルをさらに含む。いくつかの実施形態では、１またはそれを超えるカナルは、流れ方向に沿って整列されている。いくつかの実施形態では、前述の直径、前述の間隔、前述の区域、前述の形体、またはその組み合わせを、前述の細胞または細胞核のタイプに基づいて選択する。いくつかの実施形態では、前述の細胞は白血球である。いくつかの実施形態では、前述の細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、前述の細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、前述の核は、植物細胞核（または別の生物由来の細胞核）である。いくつかの実施形態では、前述の形体が入口近傍で狭いことによって、前述の形体はシングルセルからゲノムＤＮＡの断片を抽出可能である。いくつかの実施形態では、前述の形体は、複数の細胞または細胞核からゲノムＤＮＡの断片を抽出可能である。いくつかの実施形態では、デバイスは、細胞または核に結合する薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、薬剤は、抗体、その抗原結合断片、またはアプタマーである。いくつかの実施形態では、デバイスは、マイクロ流体チャネルに対して垂直方向に二次チャネルをさらに含む。あるいは、第１のチャネルと交差している二次チャネルは、任意の角度であり得る。いくつかの実施形態では、二次チャネルは、細胞が薬剤に結合した後に細胞を溶解することを可能にする。いくつかの実施形態では、マイクロピラーは、ポリジメチルシロキサンを含む。

【0018】

いくつかの態様では、これらのデバイスの任意の実施形態を含むシステムは、入口への接続に適した流体制御モジュールをさらに含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、流体制御モジュールは、ピペットまたはシリンジを含む。いくつかの実施形態では、流体制御モジュールは、加圧空気源（例えば、圧縮空気）、制御圧力源、制御空気圧源、圧力駆動ポンプ、シリンジポンプ、真空ポンプ、または蠕動ポンプを含む。いくつかの実施形態では、システムは、出口への接続に適した１またはそれを超える収集リザーバをさらに含む。いくつかの実施形態では、１またはそれを超える収集リザーバは、試料収集リザーバおよび廃棄物収集リザーバを含む。いくつかの実施形態では、システムは、マイクロ流体チャネル内のＤＮＡを電気泳動により駆動するための制御電圧源をさらに含む。いくつかの実施形態では、システムは、複数のマイクロ流体チャネル内に複数のマイクロピラーのアレイを含む。いくつかの実施形態では、アレイは、デバイス中でスタガード形体である。いくつかの実施形態では、アレイは、マルチウェルプレート形体と位置合わせされている秩序形体である。いくつかの実施形態では、前述のマルチウェルプレートは、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルプレート、１５３６ウェル、または他の類似の形式である。いくつかの実施形態では、流体制御モジュールは、細胞、溶解緩衝液、１またはそれを超える酵素を含む消化緩衝液、および洗浄緩衝液をマイクロ流体チャネル中に送達可能である。いくつかの実施形態では、システムは、前述の消化緩衝液をさらに含み、ここで、１またはそれを超える酵素は、１またはそれを超える制限酵素を含む。いくつかの実施形態では、システムは、前述の消化緩衝液をさらに含み、ここで、１またはそれを超える酵素は、１またはそれを超えるヌクレアーゼ（エンドヌクレアーゼなど）を含む。

【0020】

いくつかの態様では、細胞または細胞核から所望のサイズのメトリックを有するゲノムＤＮＡの断片を抽出するためのパラメーターを選択する方法は、少なくとも１つの細胞または細胞核を含む試料を、本開示のシステムによって、前述の１またはそれを超える酵素の各々の濃度；前述の１またはそれを超える酵素の数；前述の消化緩衝液の緩衝液組成；消化時間；および消化温度を含むパラメーターを使用して、少なくとも１回処理する工程；収集された試料の断片サイズのメトリックを決定する工程；ならびに、前述の断片サイズのメトリックに基づいて、前述の断片サイズのメトリックが前述の所望のサイズのメトリックに対応する場合、使用される前述のパラメーターを選択する工程；前述の断片サイズのメトリックが前述の所望のサイズのメトリックより小さい場合、前述の断片サイズのメトリックが前述の所望のサイズのメトリックより小さくなくなるまで、前述の濃度を低下させるか、前述の数を減少させるか、前述の消化時間を減少させるか、酵素の効率を低下させるために前述の消化温度を変化させるか、酵素の効率を低下させるために前述の緩衝液組成を変化させるか、あるいはこれらの組み合わせを行う工程；および前述の断片サイズのメトリックが前述の所望のサイズのメトリックより大きい場合、前述の断片サイズのメトリックが前述の所望のサイズのメトリックより大きくなくなるまで、前述の濃度を増加させるか、前述の数を増加させるか、前述の消化時間を増加させるか、酵素の効率を増大させるために前述の消化温度を変化させるか、酵素の効率を増大させるために前述の緩衝液組成を変化させるか、あるいはこれらの組み合わせを行う工程を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、前述の断片サイズのメトリックは、断片サイズの平均または断片サイズの中央値である。いくつかの実施形態では、前述の処理する工程は、試料をデバイス中にロードすることおよび洗浄緩衝液を使用してデバイス中で少なくとも１つの細胞または細胞核を洗浄することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、１またはそれを超える酵素を失活させる工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、前述の失活は熱失活を含む。

【0022】

いくつかの態様では、細胞または細胞核から選択されたサイズのメトリックを有するゲノムＤＮＡの断片を単離する方法は、少なくとも１つの細胞または細胞核を含む試料を、本明細書中に記載の方法によって選択されたパラメーターを使用して、本開示のシステムによって処理する工程；および前述の処理によって単離されたゲノムＤＮＡの断片を収集する工程を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、方法は、収集された断片を回収する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、前述の回収する工程は、手作業のピペッティングによるか、管材料を通じて収集リザーバから断片を取り出すことを含む。いくつかの実施形態では、前述の回収する工程は、収集リザーバに取り付けられた電気泳動チャネル介して収集リザーバから断片を取り出すことを含む。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】ゲノム分析のための試料調製のための開示のシステムの例示的な実施形態を利用した場合のワークフローの概要。ここでは、４つの重要な工程で、細胞試料調製のための開示のプラットフォームテクノロジーを利用した場合のワークフローの全容を概説する。これらを、一般に、（１）少なくとも１つの細胞を含む生物試料（例えば、全血または細胞試料溶液）を得ること、（２）前述の試料を本開示のデバイスにロードすること（次いで、流体制御およびユーザーインターフェースを担うプラットフォーム機器にロードするであろう）、（３）プラットフォームから処理後／調整済み試料を取り出し、次いで、試料を分析すること、および（４）データを分析し、工程３から結論を導くこととして記載することができる。

【0025】

【図2】図２Ａ～Ｄ。細胞ｇＤＮＡ抽出から収集したｇＤＮＡサイズ断片の記載の調整方法のために使用されるマイクロピラーアレイテクノロジーの例示的なワークフローの概要。ここでは、マイクロピラーアレイテクノロジーによって実施した４工程のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）抽出プロセスは、（Ａ）試料内の細胞を固定すること、（Ｂ）溶解緩衝液（表面活性物質または高塩緩衝液など）で細胞を化学的に溶解すること、（Ｃ）ｇＤＮＡを隣接ピラー内に物理的に絡め取られるようにし、次いで、マイクロピラーアレイに絡め取られたままでｇＤＮＡを処理し、そして／またはイメージングのためにｇＤＮＡを蛍光染色すること、および、最後に、（Ｄ）ピラーアレイから放出させるために、ｇＤＮＡをより小さな断片に切断することから開始する。

【0026】

【図3】マイクロピラーアレイテクノロジーを使用して抽出されたゲノムＤＮＡの顕微鏡写真。ゲノムＤＮＡは、蛍光挿入色素で染色されており、蛍光顕微鏡法によって可視化される予定である。図３は、ピラー間の間隔の「段階的」グラジエントが出口に向かう方向にピラー数が密に増加する（マイクロピラー間隔の減少）ように変化した六方格子（スタガード配向）を含むデバイスを示す。

【0027】

【図4】標的細胞の捕捉およびその後のｇＤＮＡ抽出のワークフローのイラストレーション。非標的細胞（赤色）は、大きい方の構造アレイに妨害されることなく流れることがき、標的細胞（紫色）とともに溶解されない。次いで、大きい方のピラー（交差点にある）の表面上に、その表面結合特性に起因して停止するようになる標的細胞を、垂直方向に溶解して、図２および図３に記載のｇＤＮＡ抽出に供することができる。垂直方向にある二次チャネルを例として示しているが、第１のチャネルと交差している二次チャネルは、第１のチャネルに対して任意の角度であり得る。

【0028】

【図5】図５Ａ～Ｃ。例示的なシングルセルワークフローのイラストレーション。ここに示す一般的な工程は、図２中の工程と同一であるが、主な相違点はチャネル構造である。隙間のない壁構造がマイクロピラーアレイを取り囲んでおり、一方で、アレイの先端部のシングルセル専用サイズの開口部はシングルセルのみを各々のマイクロピラーアレイ領域中にロードするのが可能であり、一方で、さらなる細胞は、必要とされる用途に応じて、側面の「溝状の」チャネルを介してさらなる下流のピラーアレイ中に漏斗状にロードされるか破棄される。右側の２つのパネルは、マイクロピラーアレイの先端部にロードされたヒト癌シングルセル、ならびに溶解および染色後に画像化されたシングルセルのｇＤＮＡを示す顕微鏡写真である。

【0029】

【図6】マイクロ流体チップのアレイ部分内のマイクロピラーの種々のピラーの直径。（寸法をミクロンで示す）。ここでは、約４μｍから約６．４μｍまでの範囲のピラー直径サイズの４つの別々の例を示す。

【0030】

【図7】マイクロ流体チップのピラーアレイ部分内の種々のピラー間の間隔。（寸法をミクロンで示す）。ここでは、２．８μｍ～１０５μｍのピラー間の間隔を示す。これらを、特定の適用のための細胞サイズに応じて、必要に応じて自由に調整することができる。

【0031】

【図8】マイクロ流体チップ内の種々のマイクロピラー領域のサイズ。（測定値をミクロンで示す）。マイクロピラーアレイ領域の長さおよび幅を、シングルセルの適用から試料あたり数十万個の細胞を必要とする適用までの範囲の種々の細胞投入サイズが受け入れられるように変動させることができる。

【0032】

【図9】種々のチップ形体、マイクロチャネルの分布、およびマイクロ流体チャネルの全体レイアウト。各々のチャネルの配向およびサイズは自由に調整可能であり、別個のチャネルを、同一のシリコンウェーハマスター上の他のチャネルとは別に作製することができる。

【0033】

【図10】９６ウェル「マイクロプレート」形体およびマイクロ流体チャネルのレイアウト。投入ポートおよび排出ポートが９６ウェルマイクロプレート中の別個のウェルの間隔と一致するようにチャネルの間隔を開けると、マイクロプレートあたり合計４８のチャネルを有する形体が可能である。これにより、開示のマイクロピラーテクノロジーの機能性を保持しながら、標準化されたマイクロプレート／９６ウェル形式で開示のテクノロジーを操作可能である。４８チャネルの各々は、単一のマイクロピラーアレイチャネルまたはセットを含むと考えられ、次いで、４８チャネルの全てを同時に制御することができるか、あるいは各々のチャネルに個別に対処することができる流体系で操作することができる。操作の自由度および柔軟性は、適用に依存し得る。

【0034】

【図11】入口に管材料を装着した典型的なマイクロ流体チップデバイスの写真。

【0035】

【図12】圧力駆動フローシステムの概要図。加圧空気源は、管材料を通じてデバイスに接続され、チップを通じて溶液を収集用の排出ポートに押し出す。

【0036】

【図13】流体を導入してマイクロ流体チップから回収するための流体制御システムの概要図。

【0037】

【図14】異なるタイプのポンプおよび弁の形体を使用することができることを示す、交互配置の流体制御を用いた流体制御の概要図。

【0038】

【図15】流体を駆動するための従来のポンプと組み合わせた、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの荷電分子を駆動するために電位を印加する流体制御システムの概要図。

【0039】

【図16】異なる流体排出成分を異なる収集体積に向けることができる流体制御システムの概要図。

【0040】

【図17】選択されたサイズのＤＮＡ断片を得るための方法を示すフローチャート。開示の方法を使用して、ＤＮＡ断片サイズを、開示のデバイスに対して条件を変化させることによって調整することができる。

【0041】

【図18】Ｆｅｍｔｏ Ｐｕｌｓｅシステムを使用したパルスフィールドキャピラリー電気泳動分析により、開示のテクノロジーを使用して哺乳動物細胞から生成した断片化ｇＤＮＡのサイズ分布が明らかとなる。この試料で使用した特定の条件で得られたサイズ範囲は狭く、主ピークは８ｋｂである。

【0042】

【図19】Ｆｅｍｔｏ Ｐｕｌｓｅシステムを使用したパルスフィールドキャピラリー電気泳動分析により、開示のテクノロジーを使用して哺乳動物細胞から生成した断片化ｇＤＮＡのサイズ分布が明らかとなる。この試料で使用した特定の条件で得られたサイズ範囲は狭く、主ピークは１０ｋｂである。

【0043】

【図20】Ｆｅｍｔｏ Ｐｕｌｓｅシステムを使用したパルスフィールドキャピラリー電気泳動分析により、開示のテクノロジーを使用して哺乳動物細胞から生成した断片化ｇＤＮＡのサイズ分布が明らかとなる。この試料で使用した特定の条件で得られたサイズ範囲は狭く、主ピークは１４ｋｂである。

【0044】

【図21】Ｆｅｍｔｏ Ｐｕｌｓｅシステムを使用したパルスフィールドキャピラリー電気泳動分析により、開示のテクノロジーを使用して哺乳動物細胞から生成した断片化ｇＤＮＡのサイズ分布が明らかとなる。この試料で使用した特定の条件で得られたサイズ範囲は狭く、主ピークは２５ｋｂである。

【0045】

【図22】Ｆｅｍｔｏ Ｐｕｌｓｅシステムを使用したパルスフィールドキャピラリー電気泳動分析により、開示のテクノロジーを使用して哺乳動物細胞から生成した断片化ｇＤＮＡのサイズ分布が明らかとなる。この試料で使用した特定の条件で得られたサイズ範囲は広く、主ピークは２００ｋｂである。

【0046】

【図23】図２３Ａ～Ｂ。マイクロピラーアレイ領域中への細胞のさらなる／より深いローディングを容易にするための一体型の「カナル」構造。（Ａ）流れ方向にカナルをさらに下って進行するほど間隔が密集するようになるようにマイクロピラーがカラム中に等間隔で配置されている、通常のマイクロピラーアレイ領域を示す。このシナリオでは、ロードされた細胞は、ピラーアレイ中の類似の領域内に局在する可能性があり、それ故に、流れがせき止められるか目詰まりし得る。（Ｂ）では、最後の細胞ローディングが広がるようにするためにピラーアレイの最初の部分を直通できるようにカナルをピラーアレイ領域中に構築する。これにより、抽出されたｇＤＮＡがより濃い「ロープ状」に束ねられることを防止することによって細胞溶解と最終的なＤＮＡ処理の両方が容易になる。

【0047】

【図24】マイクロ流体デバイス中のスタガードマイクロピラーアレイ領域。この画像は、デバイス内のマイクロピラーアレイの可能なかかる形体の１つを示しており、ここで、細胞が全て小さな区域内に拘束されて局在化するようになるよりもむしろ、細胞をロードするが細胞がより大きな区域に広がるように改善するために複数のピラーアレイが交互に配列されている。

【0048】

【図25】図２５Ａ～Ｂ。例示的なマイクロ流体デバイス。（Ａ）このデバイスデザインについては合計で８つのチャネルのうちの２つの並列したマイクロ流体チャネルを切り取り画像として示しており、流れ方向は上下である。（Ｂ）は、本明細書中で「正方」格子と命名された配置でマイクロピラーが配置されていることを示し、それにより、ピラーは、相互に指定の距離で離れた明確な横列および縦列を有するような方法で配置されている。したがって、正方格子構成の種々の間隔のピラーの「滑らかな」グラジエントが、マイクロピラーアレイ領域を規定する。マイクロピラーチャネルは相互に同一であり、８つのチャネルが並行しているのは、１つの巨大なチャネルを作製することの代替としての機能を果たすことも意味する。

【0049】

【図26】図２６Ａ～Ｃ。例示的なマイクロ流体デバイス。（Ａ）図２５と同様に、このデバイスデザインについては合計で８つのチャネルのうちの２つの並列したマイクロ流体チャネルを切り取り画像として示しており、流れ方向は上下である。（Ｂ）および（Ｃ）は、正方格子マイクロピラーアレイが異なる間隔を有することを示しており、この間隔は意図的にデザインされているので、任意の他の所望の間隔または寸法に変更可能であり得る。図２５と異なり、このデバイスは、チャネル中で「滑らかな」グラジエントであるよりもむしろ「段階的な」グラジエントであり、間隔の移行がマイクロピラーアレイの上部から下部への滑らかなものであるよりもむしろ、間隔がある周期に均一に保持された後に間隔が次の周期に変化する。また、マイクロピラーチャネルは相互に同一であり、８つのチャネルが並行しているのは、１つの巨大なチャネルを作製することの代替としての機能を果たすことも意味する。

【0050】

【図27】図２７Ａ～Ｃ。例示的なマイクロ流体デバイス。（Ａ）図２５および図２６と同様に、このデバイスデザインについては合計で８つのチャネルのうちの２つの並列したマイクロ流体チャネルを切り取り画像として示しており、流れ方向は上下である。（Ｂ）および（Ｃ）は、「六方」格子のマイクロピラーアレイが異なる間隔を有することを示しており、この間隔は意図的にデザインされているので、任意の他の所望の間隔または寸法に変更可能であり得る。図２５および図２６と同様に、ピラー間隔のグラジエントは、滑らかまたは段階的のいずれかであり得る。さらに同様に、２つのマイクロピラーチャネルは、合計８つの並行チャネルのうちの他の６つと比較して相互に同一であり、１つの巨大なチャネルを作製することの代替としての機能も果たす。

【0051】

【図28】図２８Ａ～Ｆ。例示的なマイクロ流体デバイス。（Ａ）流れ方向は上下であり、８つ全ての並行マイクロ流体チャネルをズームアウトで示す。（Ｂ）また、パネル（Ａ）から２つのチャネルをズームインしている。（Ｃ）は、このデザインが正方格子のみまたは六方格子のみのマイクロピラーアレイよりも試料（細胞または核）のローディングを改善するかどうかを判定するために、チャネル内で、このデザインが、正方格子領域と六方格子領域とが混交していることを示す。（Ｄ）、（Ｅ）、および（Ｆ）は、交互に並ぶ正方格子領域と六方格子領域が間近に見えるようなさらに一層ズームインした切り取り画像を示す。

【0052】

【図29】図２９Ａ～Ｂ。例示的なマイクロ流体デバイス。（Ａ）流れ方向は上下であり、８つ全ての並行マイクロ流体チャネルをズームアウトで示す。（Ｂ）このデザインは、マイクロピラーアレイ領域全体を切り詰める／短くすることを目的としており、マイクロピラーアレイが本明細書中に示した他のデザイン（例えば、図２５または図２６）の長さより短く、チャネル（幅、高さ）またはマイクロピラー（高さ、直径、形状、間隔など）の任意の他の寸法を必要に応じて自由に調整することができる方法と同様に、全体の長さを任意に望ましく調整することができる。マイクロピラーアレイ領域の下流のより大きく広がったピラー（出口近傍；パネル（Ｂ）の下半分）は、単純に構造を保つために存在する支持ピラーであるが、しかしながら、必要に応じて他のフィーチャデザインに変更することもできる。

【0053】

【図30】図３０Ａ～Ｄ。例示的なマイクロ流体デバイス。（Ａ）流れ方向は上下であり、８つ全ての並行マイクロ流体チャネルをズームアウトで示す。（Ｂ）このデザインは、支持構造中にある距離で分離されたマイクロピラーアレイ領域を反復することを目的としており、ここで、マイクロピラーアレイは、正方格子、六方格子、またはその組み合わせのいずれかが可能であり、滑らかまたは段階的な間隔の任意のグラジエントが可能であり、反復マイクロピラー領域は、同一であることが可能であるが、完全に異なることも可能である。（Ｃ）マイクロピラーと空白／支持構造領域が交互に存在する単一チャネルのズームイン。（Ｄ）空白／支持構造領域で分離された２つのマイクロピラーアレイ領域のさらにズームインして拡大された例。このデザインでは、本明細書中に示した全てのマイクロ流体チャネルの全ての他のデザインと同様に、支持構造は、間隔、サイズ、形状、および周期性を変動させることができる。

【0054】

【図31】図３１Ａ～Ｃ。（Ａ）流れ方向は上下であり、８つ全ての並行マイクロ流体チャネルをズームアウトで示す。この図では、図３０にあるように、マイクロピラーアレイの反復領域をデザインしているが、ここでは、マイクロピラーアレイ領域が２つよりもむしろ３つ存在する。また、各々のマイクロピラーアレイ領域は、空白／支持構造領域の間隔によって分離されている。（Ｂ）および（Ｃ）は、異なる領域をより良好に示すためのＣＡＤ描画のさらなるズームインしたスクリーンショットである。（Ｂ）中の３つのマイクロピラー領域のための間隔が同一であることまたは異なることが可能である（例えば、マイクロピラー密度の増加／ピラー間の距離の減少、または任意の他の所望の変動もしくは代替の間隔）に留意することが重要である。

【発明を実施するための形態】

【0055】

詳細な説明
本開示は、調整可能なサイズ選択を用いて細胞試料からゲノムＤＮＡを抽出するためのシステム、方法、およびデバイスに関する。以下の特許および刊行物の各々は、その全体が本明細書中で参考として援用される：米国特許第１０，９４７，５２８号，Ｃｒａｉｇｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ，ｉｓｏｌａｔｉｎｇ，ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ；米国特許第９，９２６，５５２号，Ｃｒａｉｇｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ，ｉｓｏｌａｔｉｎｇ，ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌｓ；米国特許第９，８５６，５１３号，Ｃｅｒｆ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｂｅｎｉｔｅｚ，Ｊ．Ｊ．，Ｔｏｐｏｌａｎｃｉｋ，Ｊ．，Ｔｉａｎ，Ｈ．Ｃ．，Ｗａｌｌｉｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｌａｔｕｌｉｐｐｅ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｚｅｔｏ，Ｋ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｃｉｐｒｉａｎｙ，Ｂ．Ｒ．，Ｌｅｖｙ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｏｌｏｗａｙ，Ｐ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｅｔｃｈｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ．Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ ７２，４８４８；Ｔｉａｎ，Ｈ．Ｃ．，Ｂｅｎｉｔｅｚ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｃｒａｉｇｈｅａｄ，Ｈ．Ｇ．（２０１８）．Ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ｏｎ－ｃｈｉｐ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｖｉａ ｍｉｃｒｏｐｉｌｌａｒ ａｒｒａｙｓ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｉａｓ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ １３，ｅ０１９１５２０；Ｒｅｉｎｈｏｌｔ，Ｓ．＆Ｃｒａｉｇｈｅａｄ，Ｈ．Ｇ．（２０１８）Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ａｐｔａｍｅｒ－Ｂａｓｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．９０ ２６０１－２６０８．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．７ｂ０４１２０；およびＨ．Ｗ．Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ ２０１１，２（３），３１９－３４３；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｍｉ２０３０３１９。

【0056】

定義
冠詞「ａ」および「ａｎ」を、本明細書中で、冠詞の文法上の目的語が１つまたは１つを超えること（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用する。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの要素または１つを超える要素を意味する。

【0057】

特記していないか、文脈から明らかでない限り、本明細書中で使用される場合、用語「約」は、当該分野における通常の許容範囲内であると理解される（例えば、平均の２標準偏差以内）。約は、記載の値の５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解され得る。そうでないことが文脈から明らかでない限り、本明細書中に提供した全ての数値は、約という用語で修飾される。

【0058】

本明細書中に提供された全ての数値範囲は、範囲内の全ての小数値および分数値の省略表現であると理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群由来の任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲、ならびに前述の整数の間の全ての介在する小数値（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、および１．９など）および前述の整数の間の全ての介在する分数値（例えば、１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／８、および１／９など）、および前述の値の全ての倍数を含むと理解される。部分範囲に関して、前述の範囲のいずれかの端点からの「入れ子になった部分範囲」が具体的に意図される。例えば、１～５０の例示的範囲の入れ子になった部分範囲は、一方の方向での１～１０、１～２０、１～３０、および１～４０、または他方の方向での５０～４０、５０～３０、５０～２０、および５０～１０を含み得る。

【0059】

本明細書中で使用される場合、用語「試料」は、より複雑な混合物の成分として単離または検出されたか、前駆体種から合成された任意の流体、溶液、または混合物を包含すると理解されるであろう。用語「試料」は、任意の生物学的に誘導された試料または生物試料（血液、血漿、血清、リンパ、唾液、涙、脳脊髄液、尿、汗、植物または食用植物の抽出物、精液、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物、組織ホモジネート（例えば、動物組織ホモジネート、植物組織ホモジネートなど）、解離した細胞または細胞核を含む溶液、および腹水が挙げられるが、これらに限定されない）を包含する。試料は、ネイティブであってもなくてもよい。例えば、試料は、無細胞種（例えば、破壊された細胞、核）を含み得る。さらに、試料は、固定されているか、他の方法で処理されていてよい。いくつかの実施形態では、試料または生物試料は、少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの細胞核、および／またはｇＤＮＡの少なくとも一部（部分的に単離されているか、完全に単離されている）を含む。

【0060】

本開示のデバイスは、サイズが変動し得る。ｇＤＮＡまたはその断片の単離テクノロジーは、デバイスのサイズに制限されない。したがって、本明細書中に提供した寸法は、実用のみを目的とし、デバイスの寸法は、表示より大きいまたは小さい寸法が可能である。

【0061】

いくつかの実施形態では、デバイスの長さまたは幅は、約４５０ミリメートルまたはそれ未満であり得る。

【0062】

いくつかの実施形態では、デバイスの高さまたはデバイス内の内部チャネルの高さは、１μｍ～２００μｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、前述の高さは、少なくとも約１、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００μｍであり得る。いくつかの実施形態では、前述の高さは、１５μｍ～３５μｍの範囲であり得る。

【0063】

本発明は、細胞を含む試料からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出および単離する方法に基づく。図１は、開示のシステムの例示的なワークフローを示す。

【0064】

図２に示すように、例示的な方法は、１またはそれを超えるマイクロ流体チャネルを含むマイクロ流体デバイス中への試料（例えば、全血、または細胞懸濁液）の導入から開始する。これを、ピペッティングまたはシリンジポンプ、蠕動ポンプなどを利用する任意の他の手段、または流体を制御可能に駆動する他の手段によって手作業で行うことができる。

【0065】

試料をマイクロ流体チャネル中に導入するとき、流体に印加した軽度の圧力により、細胞溶液がチャネルを介して排出リザーバへ押し出される。この過程中に、細胞溶液が、マイクロピラーのアレイを含むチャネル領域を通過し、チャネル中の流体の流れを変化させる。

【0066】

これらのマイクロピラーは、任意の形状または形を有することができる。例えば、マイクロピラーのヘッドおよび／またはマイクロピラーの先端部は、円形（それにより、円筒状のマイクロピラーを形成する）、楕円形、正方形、三角形、矩形、十字形、六角形、菱形、多角形、ドーム型（三次元）、ピラミッド形、またはこれらの任意の組み合わせ（複数可）の形状を含むことができる。

【0067】

マイクロピラーを、目的の標的細胞のサイズに応じて変動可能な間隔の寸法で配置することができる。ほとんどの動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）の直径は、１０μｍから１００μｍの間である。ＨｅＬａ細胞は、培養条件に応じて、通常、直径１０～４０μｍである。赤血球（最小のヒト細胞の１つ）の直径は、約８μｍ未満である。一方で、筋繊維細胞およびニューロンは、極度に長い場合がある。哺乳動物細胞核（例えば、ヒト細胞核）の直径は、約１０μｍであり得る。植物細胞は動物細胞よりも大きい傾向があるが、直径は依然として１０μｍ～１００μｍであり得る。真菌細胞の直径は、２μｍ～１０μｍの間であり得る。原生生物の直径または長さは、１μｍ～３ミリメートルの間であり得る。出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの直径は、約４μｍである。球菌の平均直径は、０．５μｍ～２．０μｍである。桿菌または糸状性細菌の場合、長さは１μｍ～１０μｍであり、直径は０．２５μｍ～１μｍである。細胞のサイズおよび核のサイズは、当該分野で周知である。細胞または細胞核は、任意の生物（動物（マウス、イヌ、猫、ヒト、ウシなど）、真菌、原生生物、細菌、または植物が挙げられる）に由来し得る。

【0068】

プロセス中の次の工程は、緩衝液から任意の望ましくない物質を除去するように作用し、チャネル中に詰まり得る任意のばらばらの粒子の洗い流しに役立つ好適な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）を用いた短時間の洗浄工程を行うことである。次に、捉えられた細胞のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、デバイス中またはデバイスを通じて溶解緩衝液を流すことによって放出させる。細胞溶解の際に、ゲノムＤＮＡが核から放出され、相対的に長いｇＤＮＡ分子が捕らえられるようになってマイクロピラー状に保持され、一方で、全ての他の細胞成分が排出リザーバへ流され、それにより、全ての他の細胞成分からｇＤＮＡが単離される。次いで、チャネルから溶解緩衝液を除去するための別の洗浄工程を行う。これを図３に示す。

【0069】

細胞がアレイを横切るときに、標的細胞は、ピラー間隔の拘束に起因してアレイ中に捉えられるようになり、一方で、制限ピラー間隔よりも小さいサイズの溶液中の全ての粒子は、排出リザーバに向かって制限なく通過するであろう。例えば、全血試料では、白血球などのより大きい方の細胞は、制限マイクロピラー間隔に起因してマイクロピラー間に捉えられるようになると考えられ、一方、小さい方の細胞（例えば、赤血球、血小板、細菌）および他の無細胞物質（例えば、ウイルス粒子、タンパク質、脂質、ＲＮＡ）は、制限なくマイクロピラーアレイを通過して排出リザーバに到達する。

【0070】

あるいは、親和性選択アプローチを採用する場合、１つの抗体または複数の抗体（またはアプタマーなどの特異的な親和性を付与する他の分子）を用いてチャネルを機能化するようにチャネルを前処理することができ、異なる表面マーカーを発現する類似のサイズの細胞から選択することができるように、ピラー間隔による制限を緩和する（例えば、細胞を捉えるのに必要とされるよりも大きくする）ことができる。このアプローチを使用して、ある特定のマーカーまたはマーカーセットを発現する細胞のみがピラーアレイ中に捉えられ、一方で、他の細胞はアレイを通過するであろう。また、サイズ選択と親和性選択の組み合わせを使用することができる。かかる組み合わせは、任意の配列または形体であり得る。いくつかの実施形態では、親和性捕捉のためのマイクロピラーのアレイを、サイズ選択のためのマイクロピラーのアレイと比較して、入口のより近くか遠くに配置することができる。他の実施形態では、親和性捕捉のためのマイクロピラーとサイズ選択のためのマイクロピラーとの混合物を、チャネル中の同一の区域内に配置することができる。さらなる他の実施形態では、マイクロピラー（例えば、親和性捕捉用対サイズ選択用）の異なるアレイを、異なるチャネル中に配置することができる（例えば、以下の直交チャネルまたは分岐チャネル、例えば、図４を参照のこと）。

【0071】

このチャネル表面機能化ストラテジーを利用して、混合された生物学的成分の試料内から目的の細胞を捕捉することができる。図４に示されるように、適用例としては、直交した２つのマイクロ流体チャネルの交点にあるより大きな構造でのチャネル機能化を利用することであろう。図４中の例として直交した二次チャネルを示しているが、第１のチャネルと交差している二次チャネルは、第１のチャネルに対して任意の角度であり得る。より大きな構造を、抗体、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマー、または特定の細胞型を選択的に標的にして拘束する能力を付与する一方で、全ての他の細胞が妨害されることなく通過することを可能にする任意の他の分子で機能化することができる。次いで、捕捉された標的細胞を、直交するチャネル中のピラーアレイ領域に向かって溶解することができる。これにより、目的の細胞由来のＤＮＡを選択的に捕捉および抽出し、次いで、標的細胞の遺伝子材料を収集および分析することが可能であり、一方で、他の細胞またはデブリをこの回収物から分離することができる。

【0072】

ｇＤＮＡを回収するために、以下のシステムでは、絡み合ったＤＮＡを、二本鎖ＤＮＡを切断する酵素を使用することによってより小さな断片に切断する。ＤＮＡのより小さな断片は、ピラーからより容易に抜け出し、排出リザーバに向かって流れる。次いで、ｇＤＮＡを、下流処理のためにデバイスから取り出すか、デバイスの第２段階での酵素の熱失活、緩衝液の交換、試料の濃縮、または配列決定プラットフォームのためのライブラリー調製などのさらなる処理に供することができる。ｇＤＮＡは、その後の増幅、遺伝子の同定、または配列決定などの任意の分析プロセスに適合する。本開示は、絡み合ったＤＮＡをより小さな断片に切断するための種々の手段（例えば、エンドヌクレアーゼ消化（例えば、制限酵素）、超音波処理、高輝度の光、流動条件の変更、当該分野で公知のｇＤＮＡをより小さな断片に切断する任意の他の方法、またはこれらの任意の組み合わせを包含する（さらなる考察については以下を参照のこと）。

【0073】

デバイスの拡張性を、マイクロピラーアレイテクノロジーの機能性および性能を保持しながらシングルセルの処理に落とし込むことができる。図５は、シングルセルのワークフローを示し、これは図２に記載のマルチセルワークフローと非常に類似している。ここでは、マイクロピラーアレイ領域を取り囲む一体型の壁により、マイクロピラーアレイの先端部でシングルセルのみを捕捉可能である。細胞が捕らえられた時点で、さらなる細胞のマイクロピラーアレイへのアクセスが妨げられ、チャネルに入ってくる任意のさらなる細胞が「溝状の」分岐チャネルを介して下流の廃棄物チャネルに再度仕向けられるか、さらなるシングルセルチャネルに接続される。細胞溶解の際に、シングルセルｇＤＮＡのみが各々のマイクロピラーアレイ中に収集され、ＤＮＡが切断されて収集された時点でシングルセルをさらに分析することを可能にする。

【0074】

図２から図５は、リソグラフプロセスによってＰＤＭＳ中に作製されたピラーのアレイからなるマイクロ流体デバイスを示す。ＰＤＭＳ構造は、ガラスプレートで蓋がされており、それにより、選択された細胞を捕捉し、その後に選択された断片の長さのＤＮＡを捕捉および選択するためのミクロ構造が組み込まれた流体チャネルを形成する。マイクロピラーアレイを、必要に応じて全ての寸法で構成することができ、これを、小さな試料または大きな試料に特異的に合わせることができる。図６から図１１は、種々のデバイスのデザインを示す。

【0075】

マイクロ流体システムの機能性を、広範なチャネルの形体および寸法で保持することができる。マイクロチャネル内で、このコンフィギュアビリティとしては、細胞の捕捉ならびに細胞溶解中のゲノムＤＮＡの抽出および保持を担うミクロ構造のサイズ、形状、密度、および間隔が挙げられる。チップ全体の寸法について、チャネルの高さ、幅、および長さを変更すると同時に、システムの機能性を保持することができる。これには、チップの全サイズおよび容量の拡大縮小だけでなく、シングルセル処理に好適な形式、大量の細胞の処理に好適な形式、およびマイクロウェルプレート形体内で操作する他の試料の調製および／または分析システムへさらなるレベルで統合することができる９６ウェルまたはマイクロウェルプレート形式などの種々の形式へのチップの設定が挙げられる。これらの代替マイクロウェルプレートシステムとしては、他のロボット試料調製プラットフォーム、フローサイトメータープラットフォーム、プレートリーダーなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0076】

本開示は、ここに、選択された細胞から規定のサイズのＤＮＡの断片を調製および収集するためのいくつかのシステム、デバイス、および方法を実証し、意図する。これらにより、配列決定および他の分析のためのＤＮＡ調製が改善される。

【0077】

システム
図１１に示すように、開示のシステムは、細胞およびＤＮＡを処理するためのマイクロ流体「チップ」デバイスおよび試料をマイクロ流体チップデバイスに送達させ、マイクロ流体チップを通過する異なる試薬の一連の流れを制御するシステムを含む。

【0078】

よく利用されている流体システムの１つは、約１０マイクロリットル～約５０ｍＬの体積の流体の試料および試薬を入口にピペットで入れる簡便なものである。いくつかの実施形態では、体積は、少なくとも約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８、０．３、０．３２、０．３４、０．３６、０．３８、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ｍＬ；またはこれらの値の間の任意の範囲であり、流体チップのＰＤＭＳ部分に組み込まれる。図６は、入口および排出ポートを装着した典型的なマイクロ流体デバイスの画像を示す。圧縮空気由来の数ＰＳＩの空気圧の印加によって流体が駆動されてマイクロ流体チップデバイスを通過する。制御圧力源に接続したチューブをデバイスの入口に挿入することによって、所望量の流体を駆動するのに必要な期間にわたって気圧を印加する。流れが起きた後にチューブを除去して、プロセスに必要な次の液体または試薬を入口中にピペッティングし、その後に別の圧力駆動工程を実施する。

【0079】

本開示は、必要な流体を駆動するために圧力を印加するためのチューブの着脱を必要としない他のシステムを包含する。図８は、必要とされる工程段階に必要な流体を選出するための選択弁を有する任意のポンプタイプ（加圧空気源（例えば、圧縮空気）、制御圧力源、制御空気圧源、圧力駆動ポンプ、シリンジポンプ、真空ポンプ、または蠕動ポンプなど）によって流体を駆動することができるシステムの略図を示す。流速および流量を、標準的なプロセスによって測定し、制御することができる。

【0080】

方法
サイズ選択されたＤＮＡ断片の抽出方法は、特定の断片長のｇＤＮＡ断片を産生するためにＤＮＡ切断酵素のカクテル、印加させる流れ圧力、インキュベーション時間、および時間の特定の組み合わせを使用する工程を含む。

【0081】

任意の試料または溶液（消化緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、溶解緩衝液などが挙げられるが、これらに限定されない）を、加圧力（例えば、正のｐｓｉまたは流速で測定される）または真空圧（例えば、負のｐｓｉまたは流速で測定される）を使用してマイクロ流体デバイス中にロードすることができる。

【0082】

いくつかの実施形態では、加圧力または真空圧は、少なくとも約０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、もしくは２００ｐｓｉ；またはこれらの値の間の任意の範囲であり得る。ここでは、加圧力に関するｐｓｉは正のｐｓｉを示し、それに対して、真空圧に関するｐｓｉは負のｐｓｉを示す。

【0083】

いくつかの実施形態では、流速は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、または１０００μｌ／分であり得る。いくつかの実施形態では、流速は、０．１μｌ／分から１０００μｌ／分までの範囲である。いくつかの実施形態では、流速は、約０．１μｌ／分から約５００μｌ／分までの範囲である。

【0084】

マイクロ流体デバイス中への細胞を含む試料のローディング
少なくとも約１０マイクロリットルから約５０ｍＬまでの範囲の体積（例えば、少なくとも約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８、０．３、０．３２、０．３４、０．３６、０．３８、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ｍＬ；またはこれらの値の間の任意の範囲）の懸濁液中に細胞を含む試料（例えば、解離した動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、全血）を、１またはそれを超えるチャネルを含むマイクロ流体デバイス中にロードする。各々のチャネルは、入口、マイクロピラーのアレイ、排出リザーバ、ならびに試料の加熱、緩衝液の交換、試料の濃縮、およびライブラリーの調製を含むさらなる処理のための第２段階からなる。

【0085】

デバイス上への試料のローディングを、試料体積を保持することができるマイクロ流体チャネルとインターフェイスしている器具中に溶液を手作業でピペッティングするか、加圧空気源（例えば、圧縮空気）、制御圧力源、制御空気圧源、圧力駆動ポンプ、シリンジポンプ、真空ポンプ、もしくは蠕動ポンプ、または類似のデバイスのいずれかによって行う。次いで、細胞を含む試料を、器具への加圧力（０．００１～５０ｐｓｉ）を使用するか、規定の速度のポンプシステムを介して駆動してチャネルを通過させる。

【0086】

次いで、所望の体積が駆動されてデバイスを通過するまで（１秒間から数時間まで）、試料をデバイス中に流す。この間に、試料は、マイクロピラーのアレイを通過する。ピラーのサイズ、間隔、およびアレイの長さを、ピラーの間に特定の間隔（ある特定の実施形態では、最小で１マイクロメートル）を有する、特定の細胞型に合わせたピラーアレイを作製するようにカスタマイズすることができる。細胞がアレイに遭遇したときに、ピラー間隔より大きい任意の細胞が物理的に捉えられるようになり、アレイおよびチャネルを通過し続けることができないであろう。ピラー間隔より小さい任意の細胞または他の粒子は、排出リザーバに向かってチャネルを制限なく流れることができる。

【0087】

例えば、全血を含む試料の場合、ピラー間隔のグラジエントが１００から８マイクロメートルまでの範囲のアレイは、アレイ中の白血球または循環腫瘍細胞を捉える一方で、全血の全ての他の成分（例えば、エリスロサイト、栓球、アルブミン、細菌、ウイルスなど）を、これらのサイズがより小さいので、ピラーを制限なく通過させるであろう。これらのより小さな成分は、チャネルおよび排出リザーバ中のプールに流れ続け、プールにおいて、成分を廃棄物として除去することができるか、さらなるオフデバイス分析のために使用することができる。

【0088】

親和性選択が望ましい場合、チャネルおよびピラーを、特異的抗体（またはアプタマーもしくは任意の親和性を付与するタンパク質、溶液、分子、もしくは核酸）で機能化することができる。例えば、成熟Ｔ細胞を全血から単離することを所望する場合、チャネルおよびアレイを、抗ＣＤ３（成熟Ｔ細胞の特異的マーカー）で機能化するように処置することができ、ピラーを、全ての白血球がピラーを物理的に横切るように規定することができる。したがって、ＣＤ３－細胞は通過するであろうし、一方で、ＣＤ３＋は親和性によって捕捉されるであろう。種々の細胞表面マーカーに結合する抗体は、市販されている。例えば、ＣＤ３に結合する抗体を、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（代表的なカタログ番号ＭＡＢ１００、ＭＡＢ１００Ｒ、ＦＡＢ１００Ａなど）、Ａｂｅａｍ（代表的なカタログ番号ａｂｌｌ０８９、ａｂ５６９０、ａｂ５２９５９など）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（代表的なカタログ番号１４－００３７－８２、１６－００３７－８１、４８－００３７－４２、１６－００３８－８１、１３－００３７－８２など）、およびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（代表的なカタログ番号３１７３１９、３１７３０１、３４４８０１など）などの販売者から購入することができる。また、標識された抗体（例えば、ビオチン標識抗体）が販売者から入手可能であり、その後に、ストレプトアビジンでコーティングされたマイクロピラーに容易に付着させることができる。最後に、（例えば、抗体またはアプタマーを用いて）機能化したマイクロピラーを含むチャネルを、少なくとも１つの細胞または細胞核を含む溶液に、（約０．００１～約５０ｐｓｉ；または少なくとも約０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ｐｓｉ；またはこれらの値の間の任意の範囲）の加圧力または規定の流速で、１分間から数時間または数日間まで曝露することができる。いくつかの実施形態では、デバイス中に流れる溶液の総体積は、少なくとも約１０μｌから約１００ｍｌまでの範囲（またはこれらの値の間の範囲）であり得る。いくつかの実施形態では、流れを停止させて、結合を最大にするために、機能化したマイクロピラーと細胞をインキュベートすることが可能であり得る。細胞結合と同様に、捉えた／結合した細胞を、上記表示と同一の圧力、流速、または緩衝液の量を使用して、溶液を洗浄緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７～７．９）と交換することによって洗浄することができる。

【0089】

捕捉細胞の溶解およびｇＤＮＡのトラッピング
ピラー間に捉えられた細胞からｇＤＮＡの内容物を放出させるために、細胞の核膜の溶解に好適な溶解緩衝液（例えば、ＰＢＳ中の１％ＳＤＳ（ｐＨ７～８）、または４Ｍグアニジウムイソチオシアナート）をデバイスに添加し、加圧力（約０．００１～約５０ｐｓｉ、例えば、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ｐｓｉ）を用いて約０．００１～約１２０分間にわたって細胞上に流した。溶解緩衝液の組成を、溶解の際に未変性のヒストン複合体が保持されるように変更し得る。したがって、回収されたゲノムＤＮＡへのタンパク質の結合量を、溶解緩衝液および／または洗浄緩衝液のタイプ（例えば、より厳しいかより穏やかな変性剤などを含む）によって制御および調整することができる。溶解中に、全ての細胞の内容物が１つの細胞または複数の細胞から放出されるが、ゲノムＤＮＡがマイクロピラー上に絡まって捉えられるようになる一方で、全ての他の内容物（脂質、タンパク質、ＲＮＡなど）は、ピラーを通過して排出リザーバに向かって流れ、ここで、前述の他の内容物を、廃棄物としてかさらなる分析のためにデバイスから除去することができる。ピラーは、１つの細胞または複数の細胞中に含まれると予想されるゲノムＤＮＡのほぼ１００％を保持する。次いで、リン酸緩衝生理食塩水をデバイスに添加して、約０．００１～約５０ｐｓｉの圧力下で約０．１秒間～約１２０分間にわたって溶解緩衝液を洗い流す。いくつかの実施形態では、圧力は、少なくとも約０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ｐｓｉである。これらの条件下で、捉えられたｇＤＮＡは、ピラー上に数日間保持される。

【0090】

ｇＤＮＡの調整可能な剪断および放出
マイクロピラーからｇＤＮＡを放出させて回収するために、以下の例示的な方法を使用し得る：
１．酵素的切断
２．流動条件の変更
３．超音波処理
４．光による方法（例えば、高輝度の光）
５．噴霧
６．機械的方法／ピラーの融解または崩壊
７．１～５の任意の組み合わせ
当業者は、上記方法に加えて、当該分野で公知のｇＤＮＡの任意の切断／剪断方法を、本開示のデバイス、システム、および／または方法と組み合わせることができる。

【0091】

酵素的方法
異なる酵素的プロセスおよび条件を使用して、回収されたｇＤＮＡ断片のサイズを、所望の下流分析用途のための至適条件を満たすように特定のサイズ範囲に調整することができる。二本鎖ＤＮＡをヌクレアーゼ切断することができる任意の酵素を使用してこれを行うことができる。

【0092】

かかる例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：制限酵素（例えば、Ｉ型制限酵素（酵素の認識配列から離れたＤＮＡを切断する制限および修飾酵素）、ＩＩ型制限酵素（平滑末端またはオーバーハング末端のカッター）、ＩＩＩ型制限酵素（その認識配列の外側を切断し、切断には同一のＤＮＡ分子内に逆向きの２つのかかる配列を必要とする）、ＩＶ型制限酵素（修飾された（例えば、メチル化された）ＤＮＡ）を認識／切断する酵素）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タンパク質、またはｄｓＤＮＡを切断する他の市販の酵素（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓのｄｓＤＮＡフラグメンターゼ（代表的なカタログ番号：Ｍ０３４８Ｓ、Ｍ０３４８Ｌ））。デバイスから回収されたｇＤＮＡのサイズを、以下などのいくつかの条件に基づいて選択的に調整することができる：使用される酵素のタイプおよび数、１つの酵素または複数の酵素の濃度、緩衝液組成、インキュベーション温度、インキュベーション時間、および流動条件（ｐｓｉおよび特定のｐｓｉでの時間）。

【0093】

制限エンドヌクレアーゼを使用した酵素的方法の概要
特定の断片サイズ範囲内のｇＤＮＡ断片を回収するために、以下を含む反応混合物を調製する：
〇１またはそれを超えるＩＩ型制限酵素および／またはホーミングエンドヌクレアーゼ（最終的に１×１０^－４～５Ｕ／マイクロリットル）
〇緩衝液中に以下を含む：
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（０～５００ｍＭ）
ＮａＣｌ（０～５００ｍＭ）
ＭｇＣｌ２（０～１００ｍＭ）
酢酸カリウム（０～５００ｍＭ）
Ｔｒｉｓ酢酸（０～５００ｍＭ）
ＤＴＴ（０～１０ｍＭ）

【0094】

器具（ピペッティングまたはシリンジポンプによる）によって緩衝液をマイクロ流体チャネルに導入する。デバイスを、制御反応温度（１０～７０℃）に設定する。０．０１～５０ｐｓｉの流れ圧力下で、好ましくは１～６０分間、次いで、０．５～５０ｐｓｉで１～３０分間反応を進行させる。特に、ある特定の状況では、（酵素インキュベーション中に使用した流速と比較して）ＤＮＡ放出中の流速がより高いほど、ｇＤＮＡ断片の回収率が高い。いくつかの実施形態では、少なくとも約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ｐｓｉの圧力を使用して、ＤＮＡ放出中により高い流速（「ブラスト」）を適用し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも約０．１μｌ／分～約１０００μｌ／分の範囲（またはこれらの値の間の任意の範囲）の流速のブラストを適用し得る。いくつかの実施形態では、ブラストを、およそ数分の１秒の持続時間（例えば、ミリ秒範囲）にわたって適用し得る。いくつかの実施形態では、ブラストを、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、または５９秒間の持続時間にわたって適用し得る。いくつかの実施形態では、ブラストを、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０分間の持続時間にわたって適用し得る。好ましい実施形態では、ブラストを、少なくとも約０．１秒～１０分間の範囲の持続時間にわたって適用する。

【0095】

一般に、ユーザーは、以下の原理により、回収された断片サイズを調整することを可能にする。変更を別個または様々に組み合わせて、異なる断片サイズを得ることができる。
１．断片サイズが大きい場合
１．総酵素濃度の低下
２．異なる酵素の数の減少
３．酵素の効率を低下させるための緩衝液の交換
４．消化時間の減少
５．消化温度の低下
６．流動条件の変更
２．断片サイズが小さい場合
１．総酵素濃度の増加
２．異なる酵素の数の増加
３．酵素の効率を増加させるための緩衝液の交換
４．消化時間の増加
５．消化温度の上昇
６．流動条件の変更

【0096】

ＤＮＡ断片化のための他の酵素的および非酵素的アプローチ
また、以下の他の酵素的アプローチを使用して、規定のサイズにｇＤＮＡを剪断し、ピラーから放出させ得る。
・ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９
・トランスポザーゼ
・フラグメンターゼ
・細菌トランスポザーゼＴｎ５などのタグメンテーションアプローチ（ＤＮＡの断片化に加えて、ＤＮＡを変化させたままにするアプローチ（下流の方法で使用されるヌクレオチドまたは他のアダプターを用いた断片化されたＤＮＡの末端のバーコード化など）が挙げられる）
・二本鎖ＤＮＡを断片化する市販の酵素

【0097】

酵素的切断の代替法としてＤＮＡを断片化するために、物理的な力を使用することもできる。例えば、液体の流速を増加させると、固定されたｇＤＮＡに対して流体力学的な力が生じ、それによりＤＮＡが断片化するであろう。流体の超音波による撹拌（例えば、超音波処理）もＤＮＡを切断することが知られており、固定化されたｇＤＮＡを断片にするために適用され得る。紫外光を単独でまたは前述の他のプロセスと組み合わせてデバイスに照射して、ｇＤＮＡの断片化／放出が可能である。

【0098】

したがって、本開示のデバイス、システム、および／または方法は、（ａ）ｇＤＮＡの断片への切断および／または（ｂ）ｇＤＮＡ断片または前述の断片に会合しているタンパク質の修飾を容易にする少なくとも１つの薬剤および／または少なくとも１つの機器をさらに含み得る。

【0099】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの薬剤は、少なくとも１つの酵素を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの酵素は、ＤＮＡ切断酵素、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ断片を標識することができるターミナルトランスフェラーゼ、増幅のためにＤＮＡ断片にＰＣＲプライマーをライゲーションすることができるＴ４ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＰＣＲ増幅用；例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼなど）、ならびに／またはＤＮＡ会合タンパク質（例えば、ヒストン、転写因子など）を修飾する酵素（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、デメチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ユビキチンリガーゼ、脱ユビキチン化酵素、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ（ＯＧＴ）、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃａｓｅ（ＯＧＡ）、Ｅ３ ＳＵＭＯリガーゼ、ＳＵＭＯ特異的プロテアーゼ、プロテアーゼ、Ｐｏｌｙ－ＡＤＰリボースポリメラーゼ、（Ａｄｐ－リボシル）ヒドロラーゼＡＲＨ１およびＡＲＨ３、タンパク質アルギニンデイミナーゼ４（ＰＡＤ４）、Ｆｐｒ４（プロリン異性化））を含み得る。

【0100】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機器は、超音波液体処理器（例えば、超音波処理器）を含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機器は、ｇＤＮＡを断片化する高輝度の光のための光源を含む。いくつかの実施形態では、高輝度の光のための光源は、ＵＶ光、Ｘ線、ガンマ線、および／または電離放射線を放射／生成する。好ましい実施形態では、光源はＵＶ光を放射する。

【0102】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機器は、ネブライザーを含む。噴霧によってＤＮＡが断片化されることが当該分野で認識されている（例えば、Ｌｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｓｃｉ ３６：９７３－９９０；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００６）ＣＳＨ Ｐｒｏｔｏｃ ｐｄｂ．ｐｒｏｔ４５３６（その各々が、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。

【0103】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの機器は、ｇＤＮＡを断片化することができる流体力学的な力を生成する機器（例えば、Ｐｏｉｎｔ－ｓｉｎｋ Ｓｈｅａｒｅｒ（ＰｔＳ）、再循環式ポイントシンクフローシステム、バブリングシステム、および／または例えば、Ｙｅｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｓｏｎ（１９６８）；Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ８：８４８－８５５；Ｓｈｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｒｓｃ Ａｄｖ ３：１３１１５－１３１１８；Ｏｅｆｎｅｒ ｃ／ ａ／．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２４：３８７９－３８８６；Ｎｅｓｔｅｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １２：１０４４－１０４７；Ｊｏｎｅｊａ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ（２００９）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４６：５５３－５５６；Ｓｈｕｉ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：４９４０１３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：４０７４５（その各々が、本明細書中で参考として援用される）に記載の任意の機器）を含む。

【0104】

光による方法
ある特定の態様では、非酵素的アプローチ／方法を使用して、ｇＤＮＡを切断し、マイクロピラーから放出させる。かかる方法は、ｇＤＮＡが捕捉／抽出されるチップカートリッジ（デバイス）の領域上に直接または集中させて方向づけた光（高輝度であり得る）の使用を含み得る。このアプローチでは、１またはそれを超える光源を、座標で定義された角度または一連の角度でチャネルの上部または下部に直接適用する（または領域全体をスキャンする）ことができる。光は、単独または化学物質（ＤＮＡ結合剤または蛍光色素が挙げられるが、これらに限定されない）と併せて二本鎖分解物を生じる；あるいは、集合的なｇＤＮＡの物理的／機械的性質を脆弱にし、次いで、ｇＤＮＡをマイクロピラーアレイ中の係留ピラーからより容易に放出または開放可能な複数の一本鎖ＤＮＡ分解物を作出するのに最低限十分に強力な輝度であるべきである。これを、補助として流体の流れの増加もしくはチャネルの内圧の変化による剪断力の増加、または酵素的切断、または記載の任意の他の切断方法と組み合わせることができる。

【0105】

また、光による方法で利用した原理と同一の原理は、ヒトの眼の可視スペクトルを超える波長（Ｘ線、紫外線が挙げられる）、または他の波長（放射性波長などであるが、これに限定されない）にまで拡大することができる。

【0106】

超音波処理法
ある特定の態様では、ｇＤＮＡを切断してマイクロピラーから放出させる非酵素的アプローチは、抽出されたｇＤＮＡを剪断し、それにより、ｇＤＮＡをマイクロピラーから放出することができる超音波処理の使用を含み、超音波処理は、マイクロ流体チャネルを通過する流体の一定または間欠的な流れを用いても用いなくても実施することができる。この用途では、１またはそれを超える超音波処理源を、チャネルに直接埋め込むか、パネルの上方または下方に直接シールし得るか、あるいは、チップ全体を、超音波処理室または超音波処理溶液／超音波処理浴中に収容または配置し得る。超音波処理力を間欠的または一定で適用する場合、ｇＤＮＡは剪断されるであろう。流体の流れがその後または同時にマイクロ流体チャネルに適用される場合、剪断／超音波処理されたＤＮＡは、抽出／細胞または核の溶解中に最初はｇＤＮＡを係留していた物理的／機械的な絡み合う力から開放されると考えられ、したがって、その後に流す／回収する／取り出す／収集することができる。

【0107】

流れを変化させる方法
流速を、ピラーからｇＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片を放出させるために使用した力および方法に影響を及ぼすいくつかの方法で操作することができる。例えば、ｇＤＮＡを切断するために酵素を使用しながら、流速を低下させて酵素のＤＮＡとの相互作用およびプロセスをより頻繁にまたはより速くし、それにより、より多くのＤＮＡを切断することができる。逆に、流速を加速させて酵素－ＤＮＡ相互作用事象を最小にすることができる。別の用途では、酵素的切断によってＤＮＡとマイクロピラーとの間の物理的／機械的な絡み合う力を弱めた後に、流速を増大させるとＤＮＡ分子に対してより高い剪断力を誘導することができ、この速度の増大はマイクロピラー由来のＤＮＡをさらに解すか剪断し、それにより、チャネルを「一掃する／洗い流す」ように作用し、チップカートリッジ（複数可）中に投入された元の細胞試料または核試料から収集されたＤＮＡの回収率／収率の改善／最大化に役立つであろう。

【0108】

機械的方法／融解または崩壊用のピラー
いかなる生化学的／酵素的処理を使用することなくマイクロピラー内で物理的に絡まった抽出ｇＤＮＡの放出および回収率／収率を向上させるために、いくつかの方法は、機械的に曲げるか（もはやチャネル面に対して垂直ではない）、（チップカートリッジ／マイクロ流体チャネルの１つの壁またはキャップ層中に）機械的に格納するか、マイクロピラーに付着した層の剥離によって機械的に除去されるか、あるいは全体または一部を化学的に溶解して、ｇＤＮＡを流体の流れの中でマイクロピラーから滑り落とすか流下させ、断片化されなかったか断片化が最小限のものを排出ポート中に収集することができるマイクロピラーの使用を含み得る。マイクロピラーは、常磁性粒子を含む軟質ポリマー（ＰＤＭＳなど）から構成することが可能であり、次いで、チャネル上部に位置している単一の磁性体を使用して、マイクロピラーを一方向に傾くように操作または動作させることができる。同様に、収集のためにマイクロピラーを溶解することによりｇＤＮＡを放出させるために、溶液をチャネルに流し、チャネル内のｇＤＮＡに対して不活性であるかダメージが最小限でありながらマイクロピラー材料の一部または全部を溶解することができる。

【0109】

ｇＤＮＡ断片のサイズ
本開示のデバイス、システム、および方法は、インタクトなゲノムＤＮＡ（染色体全体が挙げられる）を回収することができる。あるいは、本開示のデバイス、システム、および方法は、種々のサイズのｇＤＮＡ断片を生成することもできる。例えば、ｇＤＮＡ断片のサイズは、少なくとも約１ｋｂ～５００ｋｂの間；またはこれらの値の間の任意の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ断片のサイズは、少なくとも約１ｋｂ～５００ｋｂの間；またはこれらの値の間の任意の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ断片のサイズは、少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、もしくは５００ｋｂ；またはこれらの値の間の任意の範囲であり得る。

【0110】

用語「ｇＤＮＡ断片のサイズ」は、全ての断片が同一のサイズ（例えば、長さ、分子量）を有することを意味しない。むしろ、回収された溶液中のｇＤＮＡ断片の代表的または平均的なサイズを指す。例えば、いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ断片のサイズが少なくとも約５ｋｂである場合、回収した溶液中のｇＤＮＡ断片の少なくとも約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の平均サイズが少なくとも約５ｋｂである。

【0111】

いくつかの実施形態では、ｇＤＮＡ断片のサイズは、回収した溶液中のｇＤＮＡ断片の少なくとも約５０％の平均サイズを表す。

【0112】

いくつかの実施形態では、細胞／核溶解後のチャネル内の総ゲノムＤＮＡの少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％が、所望の断片サイズ＋／－１０ｋｂを含む。

【0113】

いくつかの実施形態では、細胞／核溶解後のチャネル内の総ゲノムＤＮＡの少なくとも約５０％が、所望の断片サイズ＋／－１０ｋｂを含む。

【0114】

デバイスからの試料の回収率
ｇＤＮＡが剪断反応中に切断されるとき、ｇＤＮＡは、ピラーから放出され、排出リザーバに向かって流れるであろう。反応完了時に、次いで、ｇＤＮＡを２つの方法のうちの１つで処理し得る。

【0115】

（１）第１の方法は、手作業のピペッティングによるか、管材料を通じて排出リザーバから剪断されたｇＤＮＡを取り出す工程を含み、それにより試料がデバイス外の収集チューブ中にポンピングされる。サイズ選択されたｇＤＮＡを含む総排出体積は、少なくとも約０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．１８、０．２、０．２２、０．２４、０．２６、０．２８、０．３、０．３２、０．３４、０．３６、０．３８、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０ｍＬ；またはこれらの値の間の任意の範囲であり得る。好ましい実施形態では、サイズ選択されたｇＤＮＡを含む総排出体積は、１マイクロリットルから５ｍＬまでの範囲；またはこれらの値の間の任意の範囲であり得る。酵素を使用した場合、試料を、使用した特定の酵素について示した特定の温度にて特定の時間（例：８０℃で１５分間）インキュベートして、試料中に存在する酵素を失活させる。

【0116】

（２）第２のアプローチは、第２のチャネルの連続段階を含む。剪断反応の完了時に、排出リザーバの下流の弁を開き、電気泳動チャネルに試料を曝露する。

【0117】

酵素的失活後、ｇＤＮＡ試料を、パルスフィールドゲル電気泳動、特定の遺伝子座の増幅および検出、または配列決定などの下流の適用のために準備する。

【0118】

いくつかの実施形態では、任意の試料または緩衝液（例えば、溶解緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液）は、回収されたｇＤＮＡ断片の収率またはインタクトな染色体もしくはｇＤＮＡの回収率を最大にするためのブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、イオン性界面活性剤、または別の荷電剤）および／または潤滑剤（例えば、ポリマー）をさらに含み得る。かかるブロッキング剤および／または潤滑剤は、マイクロピラーまたはチャネル表面へのｇＤＮＡの絡みつきを軽減し、物理的牽引によるインタクトなまたは大型のｇＤＮＡの剪断を回避し得る。さらなる考察については以下を参照のこと。

【0119】

機械的および電気的なマイクロピラーの摂動（ｐｅｒｔｕｂａｔｉｏｎ）
マイクロピラーに対する機械的摂動を、マイクロピラーアレイ内のマイクロピラーのうちの１つまたは複数に対して種々の方法にて、同時に、連続的に、または他の間隔のいずれかで行うことができる。摂動（ｐｅｒｔｕｂａｔｉｏｎ）としては、マイクロピラーの機械的傾斜または崩壊、マイクロピラーの機械的または物理的格納、またはマイクロピラーが付着されているチャネルの層／壁の剥離によるマイクロピラー全体の除去を挙げることができる。また、これらのマイクロピラーに粒子を埋め込むことができ、この粒子は、ＤＮＡの切断または断片化を必要とせずに抽出されたゲノムＤＮＡを放出できることを目的として、形状または他の機械的もしくは物理的性質を変化させるために機械的または電気的に作用することができる。電気的摂動は、マイクロピラー内の受電構成要素（ワイヤ、金属製のアンカーなど）がマイクロピラー全体の形状を強制的に変化させるか、変化を誘導ための電荷または電場の印加を含むことができる。

【0120】

化学的なマイクロピラーの摂動（ｐｅｒｔｕｂａｔｉｏｎ）
化学的摂動は、マイクロ流体チャネル中に流された溶液を介したマイクロピラー構造材料の部分的または完全な溶解または分解を含むことができる。また、化学的摂動は、チャネル内に固定または付着された部分からのマイクロピラーの放出を可能にするような様式で、マイクロピラーの特定の部分にダメージを与えるか分解することを含むことができる。また、この摂動を、チップカートリッジ上／チャネル内の任意の数のマイクロピラーアレイ内のマイクロピラーの特定のサブセットを摂動の標的にすることによって行うことができ、ＤＮＡ抽出およびその後の摂動のために作製されたマイクロピラー（かかる構造に制限されない）の材料を選択することによって選択することができ、構想的には支持構造、壁、またはチャネル内の他のデザインされた構造に適用することができる。

【0121】

ＤＮＡを滑らせるためのマイクロピラーのコーティング
マイクロピラーアレイまたはさらにはチャネル全体内の１またはそれを超えるマイクロピラーに、マイクロピラーアレイ内に抽出されて絡みついたＤＮＡをマイクロピラーから滑り落とし、それ故に、断片化を必要とせずに回収可能にする／収集されると考えられる化学物質または材料でコーティングすることができる。チャネル内のインキュベーション時間だけでなく、分子（ＰＥＧもしくはＰＥＯポリマー、またはさらにはＢＳＡもしくは他の生体分子など）を調整することができ、これらは、チャネルもしくはマイクロピラーの総内部表面の被覆率と相関し、そして／またはかかる構造の表面自体のコーティングの厚さと相関するであろう。

【0122】

開示のマイクロ流体チャネルのための他のデバイスの形体のバリエーション
ピラーの形状、ピラーの寸法、およびピラー間の間隔についてバリエーションが存在する基本的なマイクロピラーアレイのレイアウトに加えて、細胞のローディング中の機能性を改善するための三次構造をマイクロピラーアレイ内にデザインすることもできる。例示的なバリエーションを、以下に記載する。

【0123】

マイクロピラーアレイ中の追加のカナル
例えば、「カナル」（図２３および図２４中に示す）を、アレイ中に細胞をさらにロードすることを可能にすると考えられる様式でピラーの一片を除去することによって、マイクロピラーアレイ内に生成することができる。これにより、局所的な領域の周囲に全てが停滞するよりもむしろアレイ領域の至る所に細胞をより広げることが可能であろう。これにより、ピラーアレイ領域内での目詰まりまたは流動障害の可能性が軽減されるだけでなく、これにより、高密度にロードされた細胞を有する局在化領域中でＤＮＡがロープ状に束ねられるのを防止するのにも役立つであろう。同様に、これにより、細胞からのＤＮＡ抽出が容易になるだけでなく、酵素消化中の抽出ＤＮＡの取り出しおよびオフチップでの収集も容易になる。

【0124】

したがって、本発明者らのマイクロピラーアレイ内にかかるカナル構造を構築すると、細胞ローディングが容易になり、デバイス内の細胞容量を増加でき、局在化された細胞クラスターの目詰まりの防止に役立ち、オンチップでのＤＮＡ抽出容量が改善されるであろう。

【0125】

複数のチャネル
ある特定の態様では、本開示のデバイスまたはシステムは、少なくとも１つのチャネルを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のデバイスまたはシステムは、複数のチャネル（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれを超えるチャネル）を含み得る。いくつかの実施形態では、かかるチャネルを、水平に配置し得る。いくつかの実施形態では、複数のチャネルを、相互に平行に配置し得る。他の実施形態では、複数のチャネルを、スタガード形体に配置し得る（例えば、図２４）。

【0126】

スタック型デバイス（２またはそれを超えるデバイスを、接着または無接着のいずれかで重ね合わせたもの）
マイクロピラーアレイ領域自体を、細胞ローディング工程中に細胞試料のさらにより良好な広がりを容易にするために、積み重ね様式で戦略的に配置することができる。

【0127】

例えば、本開示のデバイスおよびシステムは、相互の上部に（垂直面に）垂直に積み重ねられた別個のまたは接続／接着されたチャネルまたはチップカートリッジの配置を含み得る。これらの積み重ねられたチップカートリッジまたはチャネルは、マクロスケールおよびマイクロ流体チャネル自体の両方で同一のデザインまたは異なるデザインであり得る。これにより、チャネルの水平方向のフットプリントを拡大することを必要とせずにチャネル体積／マイクロピラー区域をより高度に処理することができる可能性があり、本発明者らは、このことが、ｇＤＮＡの総回収量の増大もしくは増加、チップカートリッジフットプリント全体の水平方向の広がりの減少、および／または生物（細胞または核）試料の処理中のチップカートリッジのスループットの改善に有用であると予想する。

【0128】

他のバリエーション
他のバリエーションとしては、図２５～図３１に示したバリエーションが挙げられる。また、かかるデザインを、以下の実施例の部に記載する。

【0129】

図２９～図３１は、より短い／短縮されたマイクロピラーアレイ領域を含む。いくつかの実施形態では、より短い／短縮されたマイクロピラーアレイ領域の長さ（流体の流れの方向で測定）は、チャネルの長さの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％またはそれ未満である。

【0130】

いくつかの実施形態では、より短い／短縮されたマイクロピラーアレイ領域の長さは、チャネルの長さの少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％である。

【0131】

他の実施形態では、より短い／短縮されたマイクロピラーアレイ領域の長さは、チャネルの長さの約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％未満である。

【0132】

いくつかの実施形態では、より短い／短縮されたマイクロピラーアレイ領域の長さは、５μｍから４５０μｍまでの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、長さは、２０μｍ～５０μｍの間である。いくつかの実施形態では、長さは、５０ミリメートル未満である。

【0133】

いくつかの実施形態では、より短い／短縮されたマイクロピラーアレイ領域の長さは、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、または４５０μｍであり得る。

【0134】

追加の機器
本開示のデバイス、システム、または方法は、（ａ）組織をシングルセルに解離すること、（ｂ）マイクロ流体デバイスに侵入する細胞を分析すること、（ｃ）回収されたｇＤＮＡもしくはｇＤＮＡ断片を分析すること、または（ｄ）その任意の組み合わせを行う機器、薬剤、および／または方法をさらに含み得る。

【0135】

いくつかの実施形態では、機器、薬剤、および／または方法は、組織をシングルセルに解離し得る。多数の機器および薬剤は、市販されている。例えば、超音波処理器、ホモジナイザー（例えば、例えば、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）、ダウンス型ホモジナイザー、ヒーター付きｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－４２７）、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９３－２３５）、Ｓｉｎｇｕｌａｔｏｒ１００（Ｓ２ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）が挙げられる）、および／または組織グラインダーを使用して、組織をシングルセルに破壊することができる。さらに、機器および方法としては、ＷＯ２０２１／２３６６６６Ａ１号、ＷＯ２０１８／１０２４７１Ａ１号、およびＷＯ２０１９／２３２５０４Ａ２号（その各々が、本明細書中で参考として援用される）に記載のものが挙げられる。

【0136】

いくつかの実施形態では、機器、薬剤、および／または方法は、マイクロ流体デバイスに侵入する細胞を分析し得る。例えば、細胞または細胞核を、サイズ、形態学、剛性、細胞の機械的性質、またはある特定の細胞表面マーカーの存在によって選別することができる。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のデバイス、システム、または方法は、細胞分画装置、フローサイトメーター、蛍光標識単一細胞分取（ＦＡＣＳ）、顕微鏡（光学顕微鏡、蛍光顕微鏡など）、またはこれらの組み合わせをさらに含み得る。

【0137】

いくつかの実施形態では、機器、薬剤、および／または方法は、回収されたｇＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片を分析し得る。いくつかの実施形態では、回収されたｇＤＮＡまたはｇＤＮＡ断片を、パルスフィールドゲル電気泳動、ハイブリッド形成、マイクロアレイ、増幅、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ）、サザンブロッティング、配列決定、またはこれらの組み合わせによって分析し得る。したがって、本開示のデバイス、システム、または方法は、前述の分析（例えば、ゲル電気泳動、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、質量分析計（例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、シーケンサー（例えば、次世代配列決定、第三世代配列決定）、マイクロアレイ、またはこれらの組み合わせ）を実施することができる機器をさらに含み得る。

【0138】

配列決定
当該分野で公知の種々の配列決定反応のうちのいずれかを使用して、回収されたｇＤＮＡ断片を直接配列決定することができる。配列決定反応の例としては、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｔ．ＵＳＡ ７４：５６０またはＳａｎｇｅｒ（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｅｔ．ＵＳＡ ７４：５４６３によって開発された技術に基づいたものが挙げられる。種々の自動化配列決定手順（Ｎａｅｖｅ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９：４４８－５３）のうちのいずれかを利用することができることも意図される（質量分析法による配列決定（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１号；Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７－１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７－１５９を参照のこと）が挙げられる）。特に、質量分析法（例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して、ＤＮＡを配列決定し得る（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ａｎｄ Ｇｕｅｎｇｅｒｉｃｈ（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍ ７：Ｕｎｉｔ－７．１６１１を参照のこと）。

【0139】

ある特定の実施形態では、ｇＤＮＡ断片の検出を、シーケンシングバイハイブリダイゼーション（ＳＢＨ）、シーケンシングバイライゲーション（ＳＢＬ）、定量的漸増蛍光ヌクレオチド付加配列決定（ＱＩＦＮＡＳ）、パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ配列決定（ＦＩＳＳＥＱ）、ＦＩＳＳＥＱビーズ（米国特許第７，４２５，４３１号）、ゆらぎ配列決定（ＰＣＴ／ＵＳ０５／２７６９５）、マルチプレックスシーケンシング（２００８年２月６日出願の米国特許出願第１２／０２７，０３９号；Ｐｏｒｒｅｃａ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：９３１）、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）配列決定（米国特許第６，４３２，３６０号、同第６，４８５，９４４号、および同第６，５１１，８０３号、ならびにＰＣＴ／ＵＳ０５／０６４２５）；およびナノグリッドローリングサークル配列決定（ＲＯＬＯＮＹ）（２００８年５月１４日出願の米国特許出願第１２／１２０，５４１号）などが挙げられるが、これらに限定されない方法を使用して行うことができる。また、ハイスループット配列決定法（例えば、プラットフォーム（Ｒｏｃｈｅ ４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＳｏｌｅｘａまたはＭｉＳｅｑまたはＨｉＳｅｑ、ＡＢ－ＳＯＬｉＤ、Ｈｅｌｉｃｏｓ、およびＰｏｌｏｎａｔｏｒプラットフォームなど）を使用したサイクリックアレイ配列決定などによる）を利用することができる。ハイスループット配列決定法は、２００９年３月２４出願の米国特許出願第６１／１６２，９１３号に記載されている。種々の光ベースの配列決定テクノロジーが当該分野で公知である（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．８：７６９－７６；Ｋｗｏｋ（２０００）Ｐｈａｒｍｏｃｏｇｅｎｏｍ．１：９５－１００；およびＳｈｉ（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１６４－１７２）（例えば、米国特許出願第２０１３／０２７４１１７号、同第２０１３／０１３７５８７号、および同第２０１１／００３９３０４号を参照のこと）。

【0140】

次世代配列決定（ＮＧＳ）は、疾患または他の生物学的現象に関連する遺伝的変異を研究するためにＤＮＡ配列を決定するためのテクノロジーである。２００５年に商業利用のために導入されたとき、この方法は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）による伝統的なサンガー配列決定などの一度に１つのＤＮＡ鎖の代わりに、多数のＤＮＡ鎖を同時に配列決定することができるので、最初に「超並列シーケンシング」と呼ばれていた。

【0141】

ＮＧＳの速度、スループット、および精度のために、ＮＧＳは、複数の試料中の何十万ものｇＤＮＡ断片を一度に調査可能であり、単一の配列決定ランにおいて異なるタイプのゲノムの特徴（一塩基変異（ＳＮＶ）からコピー数および構造バリアント、さらにはＤＮＡ融合まで）も発見および分析可能である。ＮＧＳは、ランあたり理想的なスループットを提供し、迅速かつ費用効率よく研究を行うことができる。ＮＧＳのさらなる利点としては、サンガー配列決定より低い試料投入要件、高い精度、およびより低い対立遺伝子頻度でのバリアントの検出能が挙げられる。

【0142】

次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用した全ゲノムの分析により、全てのゲノムの変化（一塩基変異（ＳＮＶ）、挿入欠失、コピー数の変化、ならびに構造バリエーションが挙げられる）が塩基ごとに表示される。ペアードエンド全ゲノム配列決定は、ＤＮＡ断片の両端の配列決定を含み、それにより、基準とアラインメントされる可能性が上がり、ゲノムの配置、反復配列、および遺伝子融合の検出が容易になる。

【0143】

いくつかの実施形態では、長いおよび短いペアエンドの組み合わせを使用するＩｌｌｕｍｉｎａ「フェーズドシーケンシング」プラットフォームを使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｉｌｌｕｍｎａ「ロングリードアッセイ」は、約１０ｋｂ長のＤＮＡ断片の連続するリードを得ることができる。他の実施形態では、第三世代単一分子配列決定テクノロジー（例えば、ＯＮＴ）は、ＤＮＡ配列のはるかにより長いリードを得ることができる。

【0144】

いくつかの実施形態では、「ディープシーケンシング」またはＩｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳの高回収バージョンを使用することができる。ディープシーケンシングは、１つの試料の複数回、時折、数百回、またはさらには数千回の配列決定を指す。ディープシーケンシングは、元の試料の１％ほどしか含まれないｍｉＲＮＡ、稀なクローン型、細胞、または微生物の検出が可能である。ＩｌｌｕｍｉｎａのＮｏｖａＳｅｑは、かかる全ゲノム配列決定を効率よくかつ高い費用効果を実施し、その拡張性のある出力により、簡潔で合理化された自動化ワークフローを用いたデュアルフローセルモードで最大６Ｔｂおよび２００億のリードを生成する。

【0145】

マイクロアレイ
ある特定の実施形態では、マイクロアレイを使用してｇＤＮＡ断片を分析することができる。ハイスループットマイクロアレイは、種々の試料（例えば、組織型および細胞型）中のある特定の遺伝子座またはＤＮＡの異常（例えば、変異）（例えば、置換、欠失、挿入、重複、ＤＮＡ融合、染色体融合など）の存在を同定および検出するために開発されている。

【0146】

いくつかの実施形態では、フルオロフォアの共有結合を使用して、マイクロアレイ分析で用いるためのｇＤＮＡ分子を、例えばＤＮＡを標識する市販のキットを使用して直接標識することができる。

【0147】

ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、転写因子）を含む未変性形態の回収ｇＤＮＡ（例えば、クロマチン）を、クロマチン免疫沈降と組み合わせたマイクロアレイ（「ＣｈＩＰチップ」とも呼ばれる）中で使用することができる。

【0148】

例示的な実施形態
１．細胞または細胞核から選択されたサイズ範囲のゲノムＤＮＡの断片を抽出するためのマイクロ流体の流れに基づくデバイスであって、
入口から出口に向かう流れ方向に流すことを可能にする少なくとも１つの入口および少なくとも１つの出口を有する少なくとも１つのマイクロ流体チャネル；および
前述のマイクロ流体チャネル内に配置されたマイクロピラーの少なくとも１つのアレイ
を含み、ここで、
前述のマイクロピラーの直径が、３マイクロメートルと５０マイクロメートルとの間である；
前述のマイクロピラーが、２マイクロメートルと１５０マイクロメートルとの間の間隔によって相互に分離されている；
前述のアレイが、１平方ミリメートルと１６００平方センチメートルとの間の区域内で境されている；
前述のマイクロピラーの高さが、１～２００マイクロメートルの間である；そして
前述のマイクロピラーが、規定の形体で前述のアレイ内に配置されている、デバイス。

【0149】

２．前述のマイクロピラーの形状が、円形、楕円形、正方形、三角形、矩形、十字形、六角形、菱形、多角形、ドーム型、ピラミッド形、または２またはそれを超える前述の任意の組み合わせである、１に記載のデバイス。

【0150】

３．前述のチャネルが、
（ａ）ランダム配向；
（ｂ）正方格子；
（ｂ）六方格子；または
（ｃ）２またはそれを超える前述の任意の組み合わせ
のマイクロピラーを含む、１または２に記載のデバイス。

【0151】

４．前述のチャネルが、正方格子のマイクロピラー、ランダム配向のマイクロピラー、および六方格子のマイクロピラーの交互領域を含む、３に記載のデバイス。

【0152】

５．前述の正方格子および六方格子のマイクロピラーの交互領域が、（ａ）連続しているか、あるいは（ｂ）前述の領域が構造領域によって分離されて不連続である、４に記載のデバイス。

【0153】

６．前述のマイクロピラーが、可変間隔のグラジエントで配置されている、１～５のいずれか１つに記載のデバイス。

【0154】

７．前述の可変間隔のグラジエントが、（ａ）滑らかなグラジエント、（ｂ）段階的なグラジエント、または（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組み合わせを含む、６に記載のデバイス。

【0155】

８．前述のチャネルが、少なくとも１つのより短いマイクロピラーアレイ領域（例えば、図２９）を含む、１～７のいずれか１つに記載のデバイス。

【0156】

９．前述のチャネルが、少なくとも２つまたは少なくとも３つのより短いマイクロピラーアレイ領域を含み、必要に応じて、前述のより短いマイクロピラーアレイ領域が構造領域で分離されている、８に記載のデバイス。

【0157】

１０．前述のより短いマイクロピラーアレイ領域の長さが、前述のチャネルの長さの約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％未満である、８または９に記載のデバイス。

【0158】

１１．前述のデバイスが、前述のマイクロピラーアレイ領域内まで伸長している１またはそれを超えるカナルをさらに含む、１～１０のいずれか１つに記載のデバイス。

【0159】

１２．前述の１またはそれを超えるカナルが前述の流れ方向に沿って整列され、必要に応じて、前述の１またはそれを超えるカナルが、真っすぐであるか、分岐しているか、湾曲しているか、交差している、１１に記載のデバイス。

【0160】

１３．前述のデバイスが、異なる長さの少なくとも２つのカナルを含む、１１または１２に記載のデバイス。

【0161】

１４．前述の直径、前述の間隔、前述の区域、前述の形体、またはその組み合わせが、前述の細胞または細胞核のタイプに基づいて選択される、１～１３のいずれか１つに記載のデバイス。

【0162】

１５．前述の細胞または細胞核が、動物、真菌、原生生物、または植物の細胞または細胞核、必要に応じて、ヒトの細胞または細胞核である、１～１４のいずれか１つに記載のデバイス。

【0163】

１６．前述の細胞または細胞核が、白血球またはＴ細胞の細胞または細胞核である、１～１５のいずれか１つに記載のデバイス。

【0164】

１７．前述のデバイスが、（ａ）前述のアレイの先端部のシングルセルサイズの開口部、および／または（ｂ）シングルセルからゲノムＤＮＡの断片を抽出可能な前述の入口近傍のより狭い形体（例えば、マイクロピラー間隔）を含む、１～１６のいずれか１つに記載のデバイス。

【0165】

１８．「溝状の」分岐チャネルをさらに含む、１～１７のいずれか１つに記載のデバイス。

【0166】

１９．前述のデバイスが、（ａ）前述のアレイの先端部のマルチセルサイズの開口部および／または（ｂ）前述の入口近傍のより広い形体（例えば、マイクロピラー間隔）を含み、それにより、複数の細胞からゲノムＤＮＡの断片を抽出可能である、１～１６および１８のいずれか１つに記載のデバイス。

【0167】

２０．前述の細胞または細胞核に結合する薬剤をさらに含む、１～１９のいずれか１つに記載のデバイス。

【0168】

２１．前述の薬剤が、抗体、その抗原結合断片、またはアプタマーである、２０に記載のデバイス。

【0169】

２２．前述のマイクロ流体チャネルに対する二次チャネルをさらに含む、２０または２１に記載のデバイス。

【0170】

２３．前述の二次チャネル（例えば、図４）が、前述の細胞が前述の薬剤に結合した後に、前述の細胞を溶解し、前述のゲノムＤＮＡを捕捉することを可能にする、２２に記載のデバイス。

【0171】

２４．前述のマイクロピラーが、ポリマー、プラスチック、金属、シリコン、ガラス、または２またはそれを超える前述の任意の組み合わせを含む、１～２３のいずれか１つに記載のデバイス。

【0172】

２５．前述のマイクロピラーがポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含む、１～２４のいずれか１つに記載のデバイス。

【0173】

２６．前述のマイクロピラーが、約２～３０マイクロメートルの範囲の間隔、必要に応じて、５マイクロメートルまたはそれ未満の間隔で相互に分離している、１～２５のいずれか１つに記載のデバイス。

【0174】

２７．前述のマイクロピラーの高さが５～５０マイクロメートルの間である、１～２６のいずれか１つに記載のデバイス。

【0175】

２８．前述のデバイスが、マイクロピラーのアレイを含む少なくとも２つのマイクロ流体チャネルを含む、１～２７のいずれか１つに記載のデバイス。

【0176】

２９．前述のデバイスが、少なくとも６、１２、８、１２、２４、４８、９６、３８４、または１５３６のチャネルを含む、１～２８のいずれか１つに記載のデバイス。

【0177】

３０．（ａ）前述のチャネルが、デバイス中でスタガード形体またはサイドバイサイド形体である；そして／または
（ｂ）前述のチャネルが、マルチウェルプレート形体と位置合わせされている秩序形体である、２８または２９に記載のデバイス。

【0178】

３１．前述の少なくとも２つのマイクロ流体チャネルが垂直に積み重なっている、２８～３０のいずれか１つに記載のデバイス。

【0179】

３２．細胞および／または細胞核を組織から単離する機器をさらに含む、１～３１のいずれか１つに記載のデバイス。

【0180】

３３．前述の機器が、ホモジナイザー、超音波処理器、および／または組織グラインダーを含み、必要に応じて、ここで、前述のホモジナイザーが、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）、ダウンス型ホモジナイザー、ヒーター付きｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９６－４２７）、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、カタログ番号１３０－０９３－２３５）、およびＳｉｎｇｕｌａｔｏｒ１００（Ｓ２ Ｇｅｎｏｍｉｃｓから選択される、３２に記載のデバイス。

【0181】

３４．前述の組織が、未処理であるか、凍結されているか、急速凍結されているか、ホルマリン固定パライン包埋（ＦＦＰＥ）されているか、あるいは最適切断温度化合物（ＯＣＴ）中で保存されている、３２または３３に記載のデバイス。

【0182】

３５．細胞または細胞核を選別する機器をさらに含む、１～３４のいずれか１つに記載のデバイス。

【0183】

３６．前述の機器が、フローサイトメーター、蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）機器、および／または顕微鏡を含む、３５に記載のデバイス。

【0184】

３７．細胞または細胞核の溶解を容易にする少なくとも１つの薬剤（例えば、溶解緩衝液 変性剤、および／または洗浄緩衝液）をさらに含む、１～３６のいずれか１つに記載のデバイス。

【0185】

３８．消化緩衝液、１またはそれを超える酵素、ＤＮＡ標識剤（例えば、ビオチン、蛍光分子、バーコード）、ハイブリッド形成剤（例えば、（例えば、検出可能なマーカー、例えば、蛍光分子、ビオチンで標識された）プライマー）、および／または洗浄緩衝液をさらに含む、１～３７のいずれか１つに記載のデバイス。

【0186】

３９．前述の１またはそれを超える酵素が、ＤＮＡ切断酵素、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ）、およびＤＮＡ会合タンパク質を修飾する酵素から選択される、３８に記載のデバイス。

【0187】

４０．前述の１またはそれを超える酵素が、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９タンパク質、およびｄｓＤＮＡフラグメンターゼから選択される、３８または３９に記載のデバイス。

【0188】

４１．前述の１またはそれを超える酵素が、１またはそれを超える制限酵素を含む、３８～４０のいずれか１つに記載のデバイス。

【0189】

４２．ＤＮＡ切断および／またはチャネルからのＤＮＡ放出を容易にする少なくとも１つの機器をさらに含む、１～４１のいずれか１つに記載のデバイス。

【0190】

４３．前述の少なくとも１つの機器が、超音波処理器、ネブライザー、光源（例えば、可視光、ＵＶ光、Ｘ線、ガンマ線、または電離放射線を放射する）、または２またはそれを超える前述の任意の組み合わせから選択される、４２に記載のデバイス。

【0191】

４４．前述のマイクロピラーが、折り畳み可能である、融解可能である、機械的に格納可能である、溶解可能である、機械的に剥離される、機械的に屈曲可能である、そして／または電気的に屈曲可能である、１～４３のいずれか１つに記載のデバイス。

【0192】

４５．単離したＤＮＡを分析する少なくとも１つの器具をさらに含む、１～４４のいずれか１つに記載のデバイス。

【0193】

４６．前述の少なくとも１つの器具が、顕微鏡、蛍光顕微鏡、光学顕微鏡、マイクロアレイ、質量分析計（例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動、およびシーケンサー（例えば、ＮＧＳ、第三世代シーケンサー）から選択される、４５に記載のデバイス。

【0194】

４７．ロボット試料調製プラットフォームおよび／またはプレートリーダーをさらに含む、１～４６のいずれか１つに記載のデバイス。

【0195】

４８．前述の回収されたゲノムＤＮＡが、少なくとも１つのＤＮＡ結合タンパク質を含む、１～４７のいずれか１つに記載のデバイス。

【0196】

４９．前述の少なくとも１つのＤＮＡ結合タンパク質が、ヒストン、転写因子、複製タンパク質、ＤＮＡ修復タンパク質、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ）、および／またはヌクレアーゼを含む、４８に記載のデバイス。

【0197】

５０．少なくとも１つの入口への接続に適する少なくとも１つの流体制御モジュールをさらに含む、１～４９のいずれか１つに記載の少なくとも１つのデバイスを含むシステム。

【0198】

５１．前述の流体制御モジュールが、ピペットまたはシリンジを含む、５０に記載のシステム。

【0199】

５２．前述の流体制御モジュールが、加圧空気源（例えば、圧縮空気）、制御圧力源、制御空気圧源、圧力駆動ポンプ、シリンジポンプ、真空ポンプ、または蠕動ポンプを含む、５０に記載のシステム。

【0200】

５３．出口への接続に適する１またはそれを超える収集リザーバをさらに含み、必要に応じて、ここで、前述の１またはそれを超える収集リザーバが、試料収集リザーバおよび廃棄物収集リザーバを含む、５０～５２のいずれか１つに記載のシステム。

【0201】

５４．マイクロ流体チャネル内のＤＮＡを電気泳動により駆動するための制御電圧源をさらに含む、５０～５３のいずれか１つに記載のシステム。

【0202】

５５．少なくとも１つの温度制御モジュールをさらに含み、必要に応じて、ここで、（ａ）前述の少なくとも１つの温度制御モジュールが、異なる温度で前述のデバイスの異なる部分を加熱することができ、そして／または（ｂ）前述の少なくとも１つの温度制御モジュールを、時間制御様式で制御することができる（例えば、ある特定の持続時間加熱することができる）、５０～５４のいずれか１つに記載のシステム。

【0203】

５６．前述の少なくとも１つの温度制御モジュールが、前述のデバイスの温度を約２℃～１００℃の範囲で設定することができる、５５に記載のシステム。

【0204】

５７．前述のシステムが、少なくとも２つのデバイスを含み、必要に応じて、ここで、前述の少なくとも２つのデバイスが垂直に積み重なっている、５０～５６のいずれか１つに記載のシステム。

【0205】

５８．細胞または細胞核から所望のサイズのメトリックを有するゲノムＤＮＡの断片を抽出するためのパラメーターを選択する方法であって、
少なくとも１つの細胞または細胞核を含む試料を、１～４９のいずれか１つに記載のデバイスまたは５０～５７のいずれか１つに記載のシステムによって、
前述の１またはそれを超える酵素の各々の濃度；
前述の１またはそれを超える酵素の数；
前述の消化緩衝液の緩衝液組成；
消化時間；および
消化温度；
を含むパラメーターを使用して、少なくとも１回処理する工程；
収集された試料の断片サイズのメトリックを決定する工程；ならびに、前述の断片サイズのメトリックに基づいて、
前述の断片サイズのメトリックが前述の所望のサイズのメトリックに対応する場合、使用される前述のパラメーターを選択する工程；
前述の断片サイズのメトリックが前述の所望のサイズのメトリックより小さい場合、前述の断片サイズのメトリックが前述の所望のサイズのメトリックより小さくなくなるまで、前述の濃度を低下させるか、前述の数を減少させるか、前述の消化時間を減少させるか、酵素の効率を低下させるために前述の消化温度を変化させるか、酵素の効率を低下させるために前述の緩衝液組成を変化させるか、あるいはこれらの組み合わせを行う工程；および
前述の断片サイズのメトリックが前述の所望のサイズのメトリックより大きい場合、前述の断片サイズのメトリックが前述の所望のサイズのメトリックより大きくなくなるまで、前述の濃度を増加させるか、前述の数を増加させるか、前述の消化時間を増加させるか、酵素の効率を増大させるために前述の消化温度を変化させるか、酵素の効率を増大させるために前述の緩衝液組成を変化させるか、あるいはこれらの組み合わせを行う工程
を含む、方法。

【0206】

５９．前述の断片サイズのメトリックが、断片サイズの平均または断片サイズの中央値である、５８に記載の方法。

【0207】

６０．前述の処理する工程が、前述の試料を前述のデバイス中にロードすることおよび前述の洗浄緩衝液を使用して前述のデバイス中で少なくとも１つの細胞または細胞核を洗浄することを含む、５８または５９に記載の方法。

【0208】

６１．前述の１またはそれを超える酵素を失活させる工程をさらに含む、５８～６０のいずれか１つに記載の方法。

【0209】

６２．前述の失活が熱失活を含む、６１に記載の方法。

【0210】

６３．試料から細胞または細胞核を単離する方法であって、１～４９のいずれか１つに記載のデバイス、または５０～５７のいずれか１つに記載のシステムによって前述の試料を流動させる工程；および
前述のデバイス中に捉えた前述の細胞または細胞核を収集する工程
を含む、方法。

【0211】

６４．核膜がインタクトなままで細胞膜または細胞壁を溶解する工程をさらに含む、６３に記載の方法。

【0212】

６５．前述の捉えた細胞または細胞核を洗浄する工程をさらに含む、６３または６４に記載の方法。

【0213】

６６．前述の細胞または細胞核が、動物、真菌、原生生物、または植物、必要に応じて、植物の細胞または細胞核である、６３～６５のいずれか１つに記載の方法。

【0214】

６７．前述の試料が、血液、血漿、リンパ、唾液、尿、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物、および組織ホモジネートから選択され、必要に応じて、ここで、前述の組織ホモジネートが植物組織ホモジネートである、６３～６６のいずれか１つに記載の方法。

【0215】

６８．前述の試料が、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、イオン性界面活性剤、別の荷電剤、ＰＥＧ、またはＰＥＯポリマーをさらに含む、６３～６７のいずれか１つに記載の方法。

【0216】

６９．大きなサイズのゲノムＤＮＡ（例えば、インタクトなｇＤＮＡ、染色体全体、または５００ｋｂを超えるｇＤＮＡの断片）を単離する方法であって、少なくとも１つの細胞または細胞核を含む試料を、１～４９のいずれか１つに記載のデバイスまたは５０～５７のいずれか１つに記載のシステムによって処理する工程を含み、必要に応じて、ここで、前述のデバイスが、折り畳み可能である、融解可能である、機械的に格納可能である、溶解可能である、機械的に剥離される、機械的に屈曲可能である、そして／または電気的に屈曲可能であるマイクロピラーを含む、方法。

【0217】

７０．少なくとも１つの細胞または細胞核から選択されたサイズのメトリックを有するゲノムＤＮＡの断片を単離する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの細胞または細胞核を含む試料を、１～４９のいずれか１つに記載のデバイス、または５０～５７のいずれか１つに記載のシステムによって処理する工程；および
（ｂ）前述の処理によって単離された前述のゲノムＤＮＡの断片を収集する工程
を含む、方法。

【0218】

７１．前述のｇＤＮＡの断片を、ＤＮＡ切断酵素での消化、超音波処理、噴霧、流動条件の変更、光による方法、機械的方法、またはこれらのうちの２つまたはそれを超える方法の組み合わせによって産生する、７０に記載の方法。

【0219】

７２．前述の方法が、５８～６２のいずれか１つに記載の方法によって選択されたパラメーターを使用する工程を含む、７０または７１に記載の方法。

【0220】

７３．６３～６８のいずれか１つに記載の細胞または細胞核を単離する方法をさらに含む、７０～７２のいずれか１つに記載の方法。

【0221】

７４．（ａ）前述の溶解の前に捉えた細胞または細胞核を洗浄する工程；
（ｂ）前述の消化の前に前述のゲノムＤＮＡを洗浄する工程；および／または
（ｃ）前述の１またはそれを超える酵素を失活させる工程（例えば、熱失活）
をさらに含む、７０～７３のいずれか１つに記載の方法。

【0222】

７５．前述のゲノムＤＮＡの断片が、約１ｋｂ～５００ｋｂの範囲にある、７０～７４のいずれか１つに記載の方法。

【0223】

７６．前述のゲノムＤＮＡの断片が、２００ｋｂ、３０ｋｂ、２５ｋｂ、１４ｋｂ、１０ｋｂ、または８ｋｂの範囲にある、請求項７０～７５のいずれか１項に記載の方法。

【0224】

７７．前述のゲノムＤＮＡが、シングルセルまたはシングルセルの核に由来する、７０～７６のいずれか１つに記載の方法。

【0225】

７８．前述のゲノムＤＮＡの断片を収集する工程が、手作業のピペッティングによるか、管材料を通じて収集リザーバから前述の断片を取り出す工程を含む、７０～７７のいずれか１つに記載の方法。

【0226】

７９．前述のゲノムＤＮＡの断片を収集する工程が、前述の収集リザーバに取り付けられた電気泳動チャネルを介して前述の収集リザーバから前述の断片を取り出すことを含む、７０～７８のいずれか１つに記載の方法。

【0227】

８０．前述のゲノムＤＮＡを配列決定し、増幅し、ハイブリッド形成し、末端標識し、そして／またはバーコード化する工程をさらに含む、７０～７９のいずれか１つに記載の方法。

【0228】

８１．前述の細胞または細胞核が、動物、真菌、原生生物、または植物、必要に応じて、ヒトの細胞または細胞核である、７０～８０のいずれか１つに記載の方法。

【0229】

８２．前述の細胞または細胞核が、白血球またはＴ細胞の細胞または細胞核である、７０～８１のいずれか１つに記載の方法。

【0230】

８３．前述の試料が、血液、血漿、リンパ、唾液、尿、精液、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物、および／または組織ホモジネートを含む、７０～８２のいずれか１つに記載の方法。

【0231】

８４．前述の試料が、部分精製されたか完全精製された細胞または細胞核を含む、７０～８３のいずれか１つに記載の方法。

【0232】

８５．ゲノム中の変異を検出する方法であって、
（ａ）６９～８４のいずれか１つに記載の方法にしたがってゲノムＤＮＡまたはその断片を単離する工程；および
（ｂ）回収された前述のＤＮＡを分析し、それにより、前述の変異を検出する工程
を含む、方法。

【0233】

８６．前述の変異が、置換、欠失、挿入、重複、ＤＮＡ融合、および／または染色体融合を含む、８５に記載の方法。

【0234】

８７．前述のＤＮＡを、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイブリッド形成、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、サザンブロッティング、配列決定（例えば、ＮＧＳ、第三世代配列決定）、マイクロアレイ、およびこれらのうちの任意の２つまたはそれを超える手技の組み合わせから選択される１つまたは複数を使用して分析する、８５または８６に記載の方法。

【0235】

８８．前述のゲノムＤＮＡが、動物、真菌、原生生物、または植物、必要に応じて、ヒトのゲノムＤＮＡである、８５～８７のいずれか１つに記載の方法。

【0236】

８９．前述の試料または緩衝液（例えば、溶解緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、消化緩衝液など）が、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、イオン性界面活性剤、別の荷電剤、ＰＥＧ、またはＰＥＯポリマー）を含む、６９～８８のいずれか１つに記載の方法。

【0237】

９０．前述の少なくとも１つのチャネルが、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ、イオン性界面活性剤、別の荷電剤、ＰＥＧ、またはＰＥＯポリマー）を含み、必要に応じて、ここで、前述のブロッキング剤が、前述のチャネルの内面および／または前述のチャネル内のマイクロピラーをコーティングする、１～４９のいずれか１つに記載のデバイスまたは５０～５７のいずれか１つに記載のシステム。

【実施例】

【0238】

本開示を、以下の具体的な実施例を参照してさらに例証するであろう。これらの実施例は、例証のために記載しており、以下の開示やクレームを制限することを意味しない。

【0239】

実施例１：マイクロ流体デバイスの作製
主型を作製するために、Ｍｉｃｒｏｐｏｓｉｔ Ｓ１８１３フォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ；Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）を、シリコン・オン・インシュレーター（ＳＯＩ）ウェハー（Ｕｌｔｒａｓｉｌ；Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）上にスピンし、ＵＶコンタクトリソグラフィー（ＥＶＧ６２０、ＥＶＧ Ｇｒｏｕｐ；Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ）によって曝露する。曝露された樹脂レジストを７２６ＭＩＦ現像液（Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で現像し、パターンをＵｎａｘｉｓ ＳＬＲ ７７０ディーブリアクティブイオンエッチングシステム（Ｕｎａｘｉｓ ＵＳＡ Ｉｎｃ．；Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬ）におけるＢｏｓｃｈプロセスによって厚さ２０μｍのトップシリコン層にパターンを移す。（１Ｈ、１Ｈ、２Ｈ、２Ｈペルフルオロオクチル）トリクロロシランの単層を、ＭＶＤ１００分子ウェハー蒸着システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ；Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中でエッチングしたウェハー上に蒸着して、ＰＤＭＳの鋳型への粘着を防止する。Ｓｙｌｇａｒｄ １８４（Ｄｏｗ Ｃｏｍｉｎｇ；Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）ＰＤＭＳベースレジンを、硬化剤と１０：１の比で混合し、室温にて真空下で脱気し、主型に注ぎ、１５０℃で４５分間硬化させる。次いで、鋳込んだエラストマーを鋳型から剥離し、マイクロチャネルの投入口および排出口へのアクセスホールを、１．５ｍｍ生検パンチ（Ｓｋｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）を使用して作出する。チャネル作製を完了するために、パターン形成したＰＤＭＳを、酸素プラズマで１分間処理し、厚さ１７０μｍの石英ガラスウェハー（Ｍａｒｋ Ｏｐｔｉｃｓ；Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）に接合する。

【0240】

実施例２：１０ｋｂのＤＮＡの抽出のための例示的なプロトコール
１．細胞試料の調製。デバイス上に有効にロードするために、いかなる試料、も溶液でなければならない。２つの試料型の調製を以下に詳述する。
血液：ランセットを使用してヒトの指に突き刺して、１～２滴の血液（約１００ｕＬ）を得る。次いで、血液を、５００ｕＬの５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１×ＰＢＳを有するチューブに移し、穏やかに混合する。次いで、細胞溶液を、デバイス上にロードするまで氷上で貯蔵する。
動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）：培養物中で増殖している不死化されているか初代の動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）を、標準的な方法を使用して調製することができる。簡潔に述べれば、細胞が成長しているプレートから培地を吸引し、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄する。次いで、細胞をトリプシン＋ＥＤＴＡで処理して、細胞をプレートから放出させる。次いで、細胞を培地で洗浄し、２，０００ＲＰＭで２分間スピンダウンさせる。上清を除去し、細胞を培地中に再懸濁する。次いで、再懸濁した細胞を、４０マイクロメートルのセルストレーナーを使用して濾過し、デバイス上にロードする準備が整うまで氷上で貯蔵する。
植物細胞：粗核植物調製物からの植物化合物または二次代謝産物の除去
植物ＤＮＡを配列決定する場合、最初に植物組織から核を調製しなければならない。細胞壁からおおよその核を放出させる植物の核の放出方法がしばしば使用されるが、この方法は、望ましくない植物化合物（デンプンおよびポリフェノールなどの二次代謝産物が挙げられる）も含む。これらの粒子は除去が困難であり、配列決定反応を妨げるので望ましくない。
粗試料をマイクロピラーを有するマイクロ流体デバイス中にロードし、ここで、マイクロピラーは、核を捕らえるが、遥かに小さな植物化合物または二次代謝産物（デンプンまたはポリフェノールなど）はアレイを回避可能である。これらの化合物の粒径が小さいので、最終的には約５マイクロメートルのマイクロピラー間隔サイズを有効な分離のために使用する。したがって、植物の核を、アレイ内に単離し／捉え、望ましくない植物化合物から精製する。
２．マイクロ流体デバイスの調製。マイクロ流体デバイス（ＰＤＭＳ製）を、細胞ローディング前に最初に準備する。デバイスを１～３分間手短にプラズマ洗浄し、次いで、１００％エタノールをバックローディングしてチャネル全体に充填する。次に、投入ポートを、圧力および溶液の送達機構と接続する。この場合、器具をデバイスに直接差し込み、デバイスは、溶液の体積を保持する空間を含み、圧力弁、調整器、およびタンクに接続したホースで塞がれている。
３．細胞のローディング。オーバーローディングすることなく所望のｇＤＮＡ収量を得るのに十分な細胞でマイクロピラーアレイを満たしたときに最適なローディングが達成される。細胞を、細胞濃度に応じて０．１～０．５ｐｓｉで数秒間から数分間ロードする。ローディングの完了後、１×ＰＢＳを数分間ピペッティングするか、０．１～０．５ｐｓｉで流すことによって器具由来の溶液と交換する。この時点で、細胞のみがデバイス中に捕捉される－培地の全ての他の成分またはアレイ中に捕らえられなかった任意の他の粒子は、排出ポートに洗い流される。
４．細胞の溶解。細胞を溶解するために、器具の溶液を、好適な溶解緩衝液（この場合、１×ＰＢＳ中の１％ＳＤＳ（任意の他の化学的溶解緩衝液も作用するであろう））と０．１～０．５ｐｓｉの圧力下で５分間交換する。即時に溶解するが、確実に完全に溶解させるために数分間溶解を継続する。次に、器具中の緩衝液を洗い流し、１×ＰＢＳと交換し、次いで、デバイスをこの溶液にて０．１～０．５ｐｓｉで５分間洗浄する。
５．ｇＤＮＡの断片化および放出。１０ｋｂの断片長でマイクロピラー上に捉えられたｇＤＮＡを放出させるために、以下の緩衝液を使用する：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２（１ｍＭ ＤＴＴを含む）。２００ｕＬのこの緩衝液に、以下の酵素を添加する：０．２Ｕ ＥｃｏＲＶ、０．２Ｕ ＥｃｏＲＩ、０．２Ｕ ＨｉｎｄＩＩＩ、および０．２Ｕ ＳｅａＩ。緩衝液を器具中で交換し、０．３～０．４ｐｓｉにて２７℃で１５分間流す。１５分後、全ての溶液がデバイスを通過するまで、圧力を１．６ｐｓｉに５～１０分間上昇させる。次いで、ｇＤＮＡをチップから収集し、８０℃で１５分間加熱して酵素を失活させ、次いで、氷上で冷却し、４℃で貯蔵する。
６．ｇＤＮＡの分析。試料を最初にＱｕｂｉｔを使用して定量して、収量および濃度を決定する。必要に応じて、次いで、試料を、Ｆｅｍｔｏ Ｐｕｌｓｅパルスフィールドキャピラリー電気泳動システムを使用した断片サイズ分析のために４００ｎｇ／ｕＬに希釈して、断片化の品質およびサイズを確認する。
異なる組み合わせにおいて上記変数を変化させて種々のサイズのｇＤＮＡ断片を産生することができる方法を実証する具体例を、以下に概説する。
以下の全てのデータを、培養ＨｅＬａ細胞ならびに以下のパラメーターおよび寸法を有するデバイスを使用して作成した：
・各々のデバイスについて１つの投入口および４つの排出口
・各々のデバイス中の各々のチャネルについて幅４ｍｍ×長さ３．６ｍｍのアレイ領域
・アレイ内のマイクロピラー間（中心間）の間隔：３３．３マイクロメートルから１８マイクロメートルまでの連続勾配
・マイクロピラーの直径：６．３マイクロメートル
・マイクロピラーの高さ：１８～２０マイクロメートル

【0241】

実施例３（図１８）：ＩＩ型制限酵素を用いた断片サイズの調整：８ｋｂの範囲。
８ｋｂ近傍のメインピークを有するｇＤＮＡを回収するために、以下を含む反応混合物を調製した：
〇４つのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（最終０．８～１．２Ｕ／ｕＬ）
〇緩衝液中に以下を含む：
－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１０ｍＭ）
－ＮａＣｌ（５０ｍＭ）
－ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）
－ＤＴＴ（１ｍＭ）
緩衝液を、ピペッティングまたはシリンジポンプによって器具を通じてマイクロ流体チャネルに導入した。デバイスを、制御された反応温度（２７℃）に設定した。０．３ｐｓｉの流れ圧力下にて１５～２０分間、次いで、１．３～１．８ｐｓｉで５～１５分間反応を進行させた。

【0242】

実施例４（図１９）：ＩＩ型制限酵素を用いた断片サイズの調整：１０ｋｂの範囲
１０ｋｂ近傍のメインピークを有するｇＤＮＡを回収するために、以下を含む反応混合物を調製した：
〇４つのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（最終０．７～０．９Ｕ／ｕＬ）
〇緩衝液中に以下を含む：
－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１０ｍＭ）
－ＮａＣｌ（５０ｍＭ）
－ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）
－ＤＴＴ（１ｍＭ）
緩衝液を、ピペッティングまたはシリンジポンプによって器具を通じてマイクロ流体チャネルに導入した。デバイスを、制御された反応温度（２７℃）に設定した。０．３ｐｓｉの流れ圧力下にて１５～２０分間、次いで、１．３～１．８ｐｓｉで５～１５分間反応を進行させた。

【0243】

実施例５（図２０）：ＩＩ型制限酵素を用いた断片サイズの調整：１４ｋｂの範囲
１４ｋｂ近傍のメインピークを有するｇＤＮＡを回収するために、以下を含む反応混合物を調製した：
〇４つのＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（最終０．６～０．７Ｕ／ｕＬ）
〇緩衝液中に以下を含む：
－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１０ｍＭ）
－ＮａＣｌ（５０ｍＭ）
－ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）
－ＤＴＴ（１ｍＭ）
緩衝液を、ピペッティングまたはシリンジポンプによって器具を通じてマイクロ流体チャネルに導入した。デバイスを、制御された反応温度（２７℃）に設定した。０．３ｐｓｉの流れ圧力下にて１５～２０分間、次いで、１．３～１．８ｐｓｉで５～１５分間反応を進行させた。

【0244】

実施例６（図２１）：ＩＩ型制限酵素を用いた断片サイズの調整：３０ｋｂの範囲
２５～３０ｋｂ近傍のメインピークを有する１～１６５ｋｂの範囲のｇＤＮＡ断片を回収するために、以下を含む反応混合物を調製した：
〇１つのＩＩ型制限酵素（最終０．８Ｕ／ｕＬ）
〇緩衝液中に以下を含む：
－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１０ｍＭ）
－ＮａＣｌ（５０ｍＭ）
－ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）
－ＤＴＴ（１ｍＭ）
緩衝液を、ピペッティングまたはシリンジポンプによって器具を通じてマイクロ流体チャネルに導入した。デバイスを、制御された反応温度（２７℃）に設定した。
０．３５～０．４ｐｓｉの流れ圧力下にて１５分間、次いで、１．６ｐｓｉで５分間反応を進行させた。

【0245】

実施例７（図２２）：ＩＩ型制限酵素を用いた断片サイズの調整：２００ｋｂの範囲
２００ｋｂ近傍のメインピークを有するｇＤＮＡ断片を回収するために、以下を含む反応混合物を調製した：
〇１つのＩＩ型制限酵素（最終０．２Ｕ／ｕＬ）
〇緩衝液中に以下を含む：
－Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１０ｍＭ）
－ＮａＣｌ（５０ｍＭ）
－ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）
－ＤＴＴ（１ｍＭ）
緩衝液を、ピペッティングまたはシリンジポンプによって器具を通じてマイクロ流体チャネルに導入した。デバイスを、制御された反応温度（２７℃）に設定した。０．２ｐｓｉの流れ圧力下にて１５分間、次いで、０．３ｐｓｉで５分間、次いで、１．６ｐｓｉで１５分間反応を進行させた。
数１００塩基対から数Ｍｂ塩基対までの範囲の多数のより起こり得る断片サイズを、上記パラメーターを調整することによって調整することができる。

【0246】

実施例８：回収されたＤＮＡの分析（リアルタイムＰＣＲ）
代表的なプロトコールは、以下を含む：回収されたｇＤＮＡを１：２０に希釈し、２ｐｌを、ある特定の遺伝子座にハイブリッド形成する順方向および逆方向のＰＣＲプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲで使用する。ｇＤＮＡ断片を、１０ｕｌの２×ＰｏｗｅｒＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、１ｕｌの１０ｕＭプライマーミックス、および７ｕｌの水を含むマスターミックスに添加する。反応物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００リアルタイムＰＣＲシステム中にて９５℃で１０分間、その後に、９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、および７２℃で３２秒間の４５サイクルでインキュベートする。その後に、解離段階／融解曲線分析を行う。
分析したときに、本開示のデバイス、システム、および／または方法を使用して回収したｇＤＮＡ断片は、同一のリアルタイムＰＣＲ反応において伝統的に調製した（例えば、ＣｓＣｌ精製した）ｇＤＮＡ断片よりも驚異的に優れていた。

【0247】

実施例９：ｇＤＮＡの増幅
本発明者らは、首尾の良いオンチップおよびオフチップのＤＮＡ増幅を実証した。
オンチップの場合、本発明者らは、多重置換増幅（ＭＤＡ）を使用して等温増幅を実証していた（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＰＬＯＳ ＯＮＥ １３（２）：ｅ０１９１５２０（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。次いで、本発明者らは、増幅されたＤＮＡを首尾よく収集し、方法の対象範囲の実証としてＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーで全エクソーム配列決定を行い、管内ＭＤＡと比較して増幅バイアスが小さいことも示した（実施例１０も参照のこと）。
オフチップの場合、本発明者らは、抽出およびＤＮＡ断片化／切断後にチップデバイスから精製されたＤＮＡを首尾よく収集した。本発明者らは、ＤＮＡ試料を採取し、次いで、ＰＣＲおよびｑＰＣＲでＤＮＡを増幅し、次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンサーで試料を首尾よく配列決定できることを実証した。
オンチップ増幅（ＰＣＲまたは等温のいずれか）とオフチップ増幅（ＰＣＲまたは等温のいずれか）の組み合わせも可能である。

【0248】

実施例１０：回収したＤＮＡの分析（次世代配列決定）
回収したｇＤＮＡ断片を、製造者の説明書（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従って次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用して配列決定した。結果は、伝統的に調製された（例えば、ＣｓＣｌ精製された）ｇＤＮＡ断片を使用して行った配列決定よりも驚異的かつ予想外に優れていた。

【0249】

実施例１１：例示的なデバイス
作製した例示的なデバイスを、本明細書中に示した図面中に示す（例えば、図３、図５、図２３（ＡおよびＢ）、図２４、および図２５～図３１）。選択したデザインについてのさらなる説明を以下に提供する。
種々のデザインの１つの態様／目的は、試料（少なくとも１つの細胞または細胞核を含む試料）のローディングを改善することである。試料ローディングの改善としては、より良好に広げることができることを含み、それができれば、チャネルにロードされる細胞または核が相互に十分に離れてマイクロピラーアレイ内で拘束されて／捉えられて、流体の流れを詰まらせる影響が低下する／最小になるであろう。より良好な試料ローディングのために以下のデバイスをデザインする。
マイクロピラーのうちのいずれの格子（ランダム格子が含まれる）でもｇＤＮＡまたはその断片の抽出で機能するであろうが、正方格子および六方格子では、特により良好に試料がローディングされる。
下記のグラジエント（滑らかなグラジエントおよび段階的なグラジエントの両方）に関して、種々のグラジエント数を試験した。特に、２段階しかない段階的なグラジエント（合計で２段階であり、これは隣接マイクロピラーアレイ領域を除き、各々に異なる間隔が設定されている）、および３０段階ものグラジエントを試験した。
図２５は、正方格子のマイクロピラーを有する少なくとも１つのチャネルを有するデバイスを示し、ここで、前述のピラーを、相互に指定の距離で離れた明確な横列および縦列を有するような方法で配置した。正方格子は、均一な間隔であることを意味するマイクロピラーアレイ領域の場合、（ピラー間の）各間隙が次の隣接間隙に対して真っすぐに配置されているマイクロピラー（ｍｉｃｒｐｉｌｌａｒ）の格子を指す。換言すれば、各々のピラーは、次のピラーと真っすぐに並んでいる。このデバイスには、正方格子の構成で種々のピラー間隔の滑らかなグラジエントを組み込んだ。また、このデバイスには、グラジエントとしてより小さな範囲のピラー間隔を組み込んだ。意図するゲノムＤＮＡの分子量がより高い場合、出口近傍のマイクロピラー間隔が減少したグラジエントが望ましい場合があり、これは、かかるグラジエントが、試料内の細胞および試料中の他のより小さな粒子から離れた細胞をより良好に広げることが可能であるからである。
図２６は、マイクロピラー間隔中に段階的なグラジエントを含む正方格子のマイクロピラーアレイを有するデバイスを示す。ここでは、間隔の移行がマイクロピラーアレイの上部から下部への滑らかなものであるよりもむしろ、間隔がある周期に均一に保持された後に間隔が次の周期に変化した。
図２７は、六方格子マイクロピラーアレイを有するデバイスを示す。六方格子は、各々の間隙が、ピラーが交差するように並んでいるマイクロピラーの格子を指す。換言すれば、ピラーおよび間隙は、マイクロピラーアレイを流れる任意の粒子が物体（例えば、隣接および／または下流の次のマイクロピラー）に遭遇する可能性または確率が最大になるように交互に配置される。ピラー間隔のグラジエントは、滑らかまたは段階的のいずれかであり得る。
図２８は、混交した正方格子領域と六方格子領域が組み込まれたデバイスを示す。
図２９は、図２５～図２８のデバイスと比較して短いマイクロピラーのアレイが組み込まれたデバイスを示す。マイクロピラーアレイの長さがより短いと、マイクロ流体チップカートリッジから回収されるＤＮＡの収率／ＤＮＡの量を改善する場合があり、より短いマイクロピラーアレイに占有されていないチャネル内の区域は、チップカートリッジの崩壊を防止するためのある特定の構造を含んでよく、この構造は、ＰＤＭＳなどの柔軟な材料を用いて作製されたデバイスに必要であり得る。しかしながら、（例えば、プラスチックまたは金属を用いて作製された）特定のデバイスにおいて構造の完全性を考慮しない場合、かかる区域は空でよい（すなわち、構造またはマイクロピラーを欠く）。本明細書中で使用される場合、より短いマイクロピラーアレイに占有されていない区域を、この区域が空であり、かついかなる構造物も欠く場合でさえ、「構造領域」と称する。
図３０は、非マイクロピラー／空白／支持構造領域を有する混在マイクロピラー領域が組み込まれたデバイスを示す。ここでは、２つのマイクロピラーアレイ領域を、ある距離の支持構造によって分離した。２つのマイクロピラーアレイが引き離されていると、より小さな細胞または核にさらなる間隔が開いて相互に離れ、それにより、試料の溶解およびＤＮＡ抽出工程中の重度に集合した／ロープ状になったＤＮＡに由来する流体の流れの抑制が低減される／最小になることによって試料のローディングが改善され得る。
図３１は、支持構造によって分離された３つマイクロピラーアレイ領域を示す。３つが混在しているマイクロピラーアレイ領域は、図３０の２つが混在しているマイクロピラーアレイ領域よりも性能が良い場合がある。さらに、反復マイクロピラーアレイ領域が多いほど、ＤＮＡ切断後にチップカートリッジから収集される最終のＤＮＡ収量についての結果が良くなる場合がある。

【0250】

種々の実施形態が本明細書中に詳細に描写および記載されているが、開示の意図を逸脱することなく種々の修正、追加、および置換などが可能であり、したがって、これらは以下のクレーム中に定義した開示の範囲内にあると見なされることが関連分野の当業者に明らかであろう。

【0251】

参照による援用
本明細書中で言及した全ての米国特許、ならびに米国およびＰＣＴの特許出願公開は、各々の特許または特許出願公開が参考として援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が本明細書中で参考として援用される。矛盾する場合、本明細書中の任意の定義を含む本出願を優先するものとする。

【0252】

均等物
当業者は、日常的な実験しか使用せずに、本明細書中に記載の本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識するか、確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることを意図する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【国際調査報告】