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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-30
(54)【発明の名称】ＤＫＫ１に対するアプタマー及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/115 20100101AFI20240920BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240920BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240920BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240920BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20240920BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240920BHJP
A61P 19/00 20060101ALI20240920BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240920BHJP
【ＦＩ】
C12N15/115 Z ZNA
A61K31/7088
A61K48/00
A61P35/00
A61P19/10
A61P19/02
A61P19/00
A61P43/00 111
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515626
(86)(22)【出願日】2022-09-26
(85)【翻訳文提出日】2024-05-07
(86)【国際出願番号】 CN2022121254
(87)【国際公開番号】W WO2023046147
(87)【国際公開日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】202111127857.6
(32)【優先日】2021-09-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520303058
【氏名又は名称】アプタキュア セラピューティクス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＰＴＡＣＵＲＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ユー， ユアンユアン
(72)【発明者】
【氏名】ヘー， イーシン
(72)【発明者】
【氏名】チュー， ハンイン
(72)【発明者】
【氏名】チャン， ジー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA96
4C084ZA97
4C084ZB15
4C084ZB26
4C084ZC41
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA96
4C086ZA97
4C086ZB15
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、生物医学の分野に関する。具体的には、本発明は、ＤＫＫ１に対するアプタマー及びその使用に、特にＤＫＫ１関連がん等のＤＫＫ１関連疾患の治療における使用に関する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＤＫＫ１に対するアプタマーであって、ｉ）配列番号１～２０のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか；又は
ｉｉ）配列番号１～２０のいずれか１つの中の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、若しくはそれを上回る数の連続ヌクレオチドを含むか；又は
ｉｉｉ）配列番号４５～６４のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか；又は
ｉｖ）配列番号８７～１０５のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、
ＤＫＫ１に特異的に結合する、アプタマー。
【請求項2】
配列番号１～６４及び８７～１０５のいずれか１つの配列を含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項3】
配列番号５、２０、３５～３８、４９、又は６４に示されるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号３７に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項4】
３５０ｎＭ未満、好ましくは１５０ｎＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、好ましくは３０ｎＭ未満、好ましくは２０ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満、好ましくは５ｎＭ未満、好ましくは１ｎＭ未満の、又はそれを下回る、ＤＫＫ１に対するＫｄを有する、請求項１～３のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項5】
ＤＫＫ１の生物学的活性を阻害することができる、請求項１～４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項6】
細胞ベースのＷｎｔシグナル伝達アッセイにおいてＤＫＫ１の拮抗効果を遮断することができる、請求項１～５のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項7】
ＤＫＫ１の生物学的活性を阻害する、例えばＷｎｔシグナル伝達経路に対するＤＫＫ１の拮抗効果を阻害することに対して、２０００ｎＭ未満、好ましくは１５００ｎＭ未満、好ましくは１０００ｎＭ未満、好ましくは８００ｎＭ未満の、又はそれを下回るＩＣ５０値を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項8】
増強したヌクレアーゼ耐性を前記アプタマーに付与する及び／又は前記アプタマーのインビボ半減期を増強する１種又は複数の修飾を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項9】
２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）修飾及び３’逆位デオキシチミジン（３’ｉｄＴ）修飾を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項10】
それを必要とする対象に、請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＫＫ１に対するアプタマーの治療有効量を投与するステップを含む方法であって、前記対象が例えばヒトである、ＤＫＫ１関連疾患を治療するための方法。
【請求項11】
前記ＤＫＫ１関連疾患が、骨髄腫（例えば、溶骨性病変を有する多発性骨髄腫、肝門部胆管癌を伴う多発性骨髄腫）、乳がん、結腸がん、黒色腫、肝細胞がん、上皮がん、食道がん、胃がん、胃食道がん、肝門部胆管癌、脳腫瘍、肺がん、前立腺がん、又は膵臓がん等の、ＤＫＫ１関連がん並びにその任意の転移である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ＤＫＫ１関連疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、虚血性骨壊死、関節リウマチ、骨折、変形性関節症、及び骨髄腫から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＫＫ１に対する少なくとも１種のアプタマー、及び薬学的に許容できるキャリア又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項14】
ＤＫＫ１関連疾患を治療するための医薬の調製における、請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＫＫ１に対するアプタマー又は請求項１３に記載の医薬組成物の、使用。
【請求項15】
前記ＤＫＫ１関連疾患が、骨髄腫（例えば、溶骨性病変を有する多発性骨髄腫、肝門部胆管癌を伴う多発性骨髄腫）、乳がん、結腸がん、黒色腫、肝細胞がん、上皮がん、食道がん、胃がん、胃食道がん、肝門部胆管癌、脳腫瘍、肺がん、前立腺がん、又は膵臓がん等の、ＤＫＫ１関連がん並びにその任意の転移である、請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
前記ＤＫＫ１関連疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、虚血性骨壊死、関節リウマチ、骨折、変形性関節症、及び骨髄腫から選択される、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［発明の分野］
本発明は、生物医学の分野に関する。具体的には、本発明は、ＤＫＫ１に対するアプタマー及びその使用に、特にＤＫＫ１関連がん等のＤＫＫ１関連疾患の治療における使用に関する。
本発明は、生物医学の分野に関する。具体的には、本発明は、ＤＫＫ１に対するアプタマー及びその使用に、特にＤＫＫ１関連がん等のＤＫＫ１関連疾患の治療における使用に関する。
【0002】
［背景］
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１（ＤＫＫ１）は、ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリーのメンバーであり、Ｗｎｔシグナル伝達の負の調節因子であることが証明されており、ＤＫＫ１は、骨の発達及び形成において中核的役割を果たす。ＬＲＰ５（ＬＲＰ６）及びクレメン（ｋｒｅｍｅｎ）タンパク質に結合することによって、ＤＫＫ１は、ＬＲＰ５又はＬＲＰ６がＷｎｔ経路のメンバーに結合するのを阻止し、それによってＷｎｔ媒介性シグナル伝達を阻止し、骨形成を阻害する。
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１（ＤＫＫ１）は、ｄｉｃｋｋｏｐｆタンパク質ファミリーのメンバーであり、Ｗｎｔシグナル伝達の負の調節因子であることが証明されており、ＤＫＫ１は、骨の発達及び形成において中核的役割を果たす。ＬＲＰ５（ＬＲＰ６）及びクレメン（ｋｒｅｍｅｎ）タンパク質に結合することによって、ＤＫＫ１は、ＬＲＰ５又はＬＲＰ６がＷｎｔ経路のメンバーに結合するのを阻止し、それによってＷｎｔ媒介性シグナル伝達を阻止し、骨形成を阻害する。
【0003】
臨床研究において、Ｗｎｔ拮抗剤ＤＫＫ１のレベルの増加が、一連のがんを有する患者の血清又は腫瘍において検出されており、この増加は、予後不良としばしば関連している。加えて、ＤＫＫ１は、免疫抑制性腫瘍微小環境を促進し、Ｔ細胞を阻害することによって腫瘍が免疫監視を逃れるように誘導する。化学療法との組み合わされた、ＤＫＮ－０１と名付けられたＤＫＫ１に対するヒト化モノクローナル治療用抗体が、食道胃がん及び他のタイプのがんを治療するために、第ＩＩ相試験において使用されている。それゆえ、ＤＫＫ１は、腫瘍免疫療法の有望な標的であることがある。しかしながら、高い免疫原性（Ｐａｄｈｉ、Ｊａｎｇら２０１１、Ｐａｄｈｉ、Ａｌｌｉｓｏｎら２０１４）、産生するのに費用がかかり且つ労力を要する（Ｂａｋｅｒ ２０１５、Ｂｒａｄｂｕｒｙ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ ２０１５、Ｇｒｏｆｆ、Ｂｒｏｗｎら２０１５）、輸送及び保管に連続的なコールドチェーンを要する不安定性（Ｊａｙａｓｅｎａ １９９９）を含めた、治療用抗体に対するいくつかの大きな懸念がある。それゆえ、無の免疫原性、容易な産生、低いコスト、及び高い安定性を有する代替的な抗ＤＫＫ１剤が、骨同化療法に望ましい。
【0004】
アプタマーは、それらアプタマーの高い結合親和性及び特異性、並びに低い免疫原性に起因して、幅広い注目を集めている。アプタマーは、立体構造的相補性を通じてそれらアプタマーの標的に結合する、短い一本鎖オリゴヌクレオチドである（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ及びＳｚｏｓｔａｋ １９９０、Ｔｕｅｒｋ及びＧｏｌｄ １９９０）。治療用抗体と比較して、アプタマーは、同様の親和性及び特異性を所有するが、ある重要な利点を有する。免疫原性に関して、アプタマーは免疫系によって異物として認識されず、小さなサイズが理由で負の免疫応答を刺激しない（Ｋｅｅｆｅ、Ｐａｉら２０１０）。産生及びコストに関して、アプタマーは、様々な選択条件下でインビトロで特定され、化学的方法によって容易に合成され得、そのような産生は、それほど費用がかからず且つリスクが低い（Ｂａｎｅｒｊｅｅ ２０１０）。安定性に関して、アプタマーは、耐熱性であり、冷却のいかなる特別な要件もなしで輸送に耐え得ることから、無期限の貯蔵寿命を有し、連続的なコールドチェーンの必要性を排除する（Ｊａｙａｓｅｎａ １９９９）。加齢黄斑変性症の治療のための、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）に対するアプタマーであるペガプタニブは、クリニックにおける使用に成功している（Ｊｅｌｌｉｎｅｋ、Ｇｒｅｅｎら１９９４、Ｒｕｃｋｍａｎ、Ｇｒｅｅｎら１９９８、Ｎｇ及びＡｄａｍｉｓ ２００６、Ｑｕｅ－Ｇｅｗｉｒｔｈ及びＳｕｌｌｅｎｇｅｒ ２００７）。
【0005】
それゆえ、ＤＫＫ１に対するアプタマーを開発して、ＤＫＫ１関連がんの治療のためのモノクローナル抗体を置き換えることが望ましい。
【0006】
［発明の概要］
１つの態様において、本発明は、ＤＫＫ１に対するアプタマーであって、アプタマーは、
ｉ）配列番号１～２０のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか；又は
ｉｉ）配列番号１～２０のいずれか１つの中の少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、若しくはそれを上回る数の連続ヌクレオチドを含むか；又は
ｉｉｉ）配列番号４５～６４のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか；又は
ｉｖ）配列番号８７～１０５のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、
アプタマーはＤＫＫ１に特異的に結合する、アプタマーを提供する。
１つの態様において、本発明は、ＤＫＫ１に対するアプタマーであって、アプタマーは、
ｉ）配列番号１～２０のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか；又は
ｉｉ）配列番号１～２０のいずれか１つの中の少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、若しくはそれを上回る数の連続ヌクレオチドを含むか；又は
ｉｉｉ）配列番号４５～６４のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか；又は
ｉｖ）配列番号８７～１０５のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、若しくは少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、
アプタマーはＤＫＫ１に特異的に結合する、アプタマーを提供する。
【0007】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１～６４及び８７～１０５のいずれか１つの配列を含む。
【0008】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号５、２０、３５～３８、４９、又は６４に示されるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号３７に示されるヌクレオチド配列を含む。
【0009】
一部の実施形態において、アプタマーは、増強したヌクレアーゼ耐性をアプタマーに付与する及び／又はアプタマーのインビボ半減期を増強する１種又は複数の修飾を含む。
【0010】
一部の実施形態において、アプタマーは、２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）修飾及び３’逆位デオキシチミジン（３’ｉｄＴ）修飾を含む。
【0011】
一部の実施形態において、アプタマーは、３５０ｎＭ未満、好ましくは１５０ｎＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満、好ましくは５０ｎＭ未満、好ましくは３０ｎＭ未満、好ましくは２０ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満、好ましくは５ｎＭ未満、好ましくは１ｎＭ未満の、又はそれを下回る、ＤＫＫ１に対するＫｄを有する。
【0012】
一部の実施形態において、アプタマーは、ＤＫＫ１の生物学的活性を阻害することができる。一部の実施形態において、アプタマーは、細胞ベースのＷｎｔシグナル伝達アッセイにおいてＤＫＫ１の拮抗効果を遮断することができる。一部の実施形態において、アプタマーは、ＤＫＫ１の生物学的活性を阻害する、例えばＷｎｔシグナル伝達経路に対するＤＫＫ１の拮抗効果を阻害することに対して、２０００Ｎｍ未満、好ましくは１５００ｎＭ未満、好ましくは１０００ｎＭ未満、好ましくは８００ｎＭ未満の、又はそれを下回るＩＣ５０値を有する。
【0013】
別の態様において、本発明は、ＤＫＫ１関連疾患を治療するための方法であって、方法は、それを必要とする対象に、本発明のＤＫＫ１に対するアプタマーの治療有効量を投与するステップを含み、対象は例えばヒトである、方法を提供する。
【0014】
一部の実施形態において、ＤＫＫ１関連疾患は、骨髄腫（例えば、溶骨性病変を有する多発性骨髄腫、肝門部胆管癌を伴う多発性骨髄腫）、乳がん、結腸がん、黒色腫、肝細胞がん、上皮がん、食道がん、胃がん、胃食道がん、肝門部胆管癌、脳腫瘍、肺がん、前立腺がん、又は膵臓がん等の、ＤＫＫ１関連がん並びにその任意の転移である。
【0015】
一部の実施形態において、ＤＫＫ１関連疾患は、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、虚血性骨壊死、関節リウマチ、骨折、変形性関節症、及び骨髄腫から選択される。
【0016】
別の態様において、本発明は、本発明のＤＫＫ１に対する少なくとも１種のアプタマー、及び薬学的に許容できるキャリア又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【0017】
別の態様において、本発明は、ＤＫＫ１関連疾患を治療するための医薬の調製における、本発明のＤＫＫ１に対するアプタマー又は本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【0018】
一部の実施形態において、ＤＫＫ１関連疾患は、骨髄腫（例えば、溶骨性病変を有する多発性骨髄腫、肝門部胆管癌を伴う多発性骨髄腫）、乳がん、結腸がん、黒色腫、肝細胞がん、上皮がん、食道がん、胃がん、胃食道がん、肝門部胆管癌、脳腫瘍、肺がん、前立腺がん、又は膵臓がん等の、ＤＫＫ１関連がん並びにその任意の転移である。
【0019】
一部の実施形態において、ＤＫＫ１関連疾患は、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、ＯＩ、虚血性骨壊死、関節リウマチ、骨折、変形性関節症、及び骨髄腫から選択される。
【図面の簡単な説明】
【0020】
【図1】ＤＫＫ１タンパク質へのＮｉ－ＮＴＡ磁気アガロースビーズの試験された結合能を示した図である。２回の実験を実施して、ＤＫＫ１タンパク質へのＮｉ－ＮＴＡ磁気アガロースビーズの結合能を検出した。還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）において、ＤＫＫ１の見かけの分子量は約４０ＫＤａである。この条件（０．６ｎｍｏｌ ＤＫＫ１＋６μｌ ５％ビーズ）が、最も高い結合能を示している。
【図2】ラウンド１～ラウンド２０でスクリーニングされたアプタマープールのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物についてのアガロースゲル（３％）電気泳動分析を示した図である。第１のレーンはＤＮＡラダーである。ＤＮＡバンドは、およそ８０ｂｐに存在する。
【図3】アプタマー候補の系統樹及びアライメントを示した図である。２０種のアプタマー配列は、２つの群に分割される。第１の群は、Ｇリッチな群として知られる、８種のグアニンリッチな配列を含有し；第２の群は、Ｇリッチでない群として知られる、他のヌクレオチドに属する１２種の配列を含む。
【図4】代表的なアプタマー候補の特異性を示した図である。酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡ）を使用して、ＤＫＫ１に対する１μＭの各アプタマー／ＲＳの特異性を判定し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出する。＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を表し；＊＊はＰ＜０．００５を表し；＊はＰ＜０．０５を表す。
【図5】代表的なアプタマー候補の親和性を示した図である。ＤＫＫ－１に対する親和性を、特異的濃度の各アプタマーを用いて検出し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。
【図6】代表的なアプタマー候補の阻害効果を示した図である。対照群と比較して、ａｐｔｄｋｋ－５、１９、及び２０はより高い比を示し、それらアプタマーが、ＤＫＫ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害を軽減することができることを示す。
【図7】代表的なアプタマー候補の阻害効力を示した図である。ａｐｔｄｋｋ－５は、ＩＣ５０＝７５４±２９ｎＭを有して相対的に高い阻害効力を有し、一方でａｐｔｄｋｋ－２０は、ＩＣ５０＝１５０４±３９ｎＭを有して相対的に低い阻害効力を有する。ａｐｔｄｋｋ－１９のデータは、フィッティング曲線に合わない。
【図8】短縮ａｐｔｄｋｋ５の特異性を示した図である。ＤＫＫ－１に対する特異性を、ａ）１００ｎＭ及びｂ）１ｎＭの各短縮ａｐｔｄｋｋ５を用いて検出し、４５０ｎｍにおける吸光度を元のａｐｔｄｋｋ－５の吸光度と比較する。＊はＰ＜０．０５を表し；ＮＳは有意差なしを表す。
【図9】短縮ａｐｔｄｋｋ５の親和性を示した図である。ＤＫＫ１への結合親和性を、勾配濃度の各アプタマーを用いて検出し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出する。
【図10】Ａｐｔｄｋｋ５ｓ変異体の特異性を示した図である。ＤＫＫ－１に対する１μＭの各アプタマーの特異性をＥＬＯＮＡによって検出し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出する。＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を表し；＊＊はＰ＜０．００５を表し；＊はＰ＜０．０５を表す。
【図11】ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動によって測定された、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＤＫＫ１及び欠陥のあるＤＫＫ１の発現レベルを示した図である。Ｓ４、ｐＣＳ２－ＤＫＫ１－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ；Ｓ３、ｐＣＳ２－ＤＫＫ１－ΔＣ－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ；及びＳ２、ｐＣＳ２－ＤＫＫ１－ΔＬ２＆Ｃ－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ。
【図12】全長及び短縮ＤＫＫ１の結合能、並びにＤＫＫ１変異体へのａｐｔｄｋｋ５ｓ結合の蛍光画像を示した図である。Ｓ４、ｐＣＳ２－ＤＫＫ１－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ；Ｓ３、ｐＣＳ２－ＤＫＫ１－ΔＣ－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ；Ｓ２、ｐＣＳ２－ＤＫＫ１－ΔＬ２＆Ｃ－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ；陽性対照、純粋なタンパク質ＤＫＫ１ Ｈｉｓ６；及び陰性対照、ビーズのみ。
【図13】修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの特異性を示した図である。ＤＫＫ－１への１μＭの各アプタマーの特異性をＥＬＯＮＡによって検出し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出する。
【図14】修飾されたａｐｔｄｄｋ５ｓの親和性を示した図である。ＤＫＫ－１へのある特定の濃度の各アプタマーの親和性をＥＬＯＮＡによって検出し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出する。
【図15】修飾されていないａｐｔｄｋｋ５ｓと比較した、修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの血清安定性についての評価を示した図である。すべてのアプタマーを、それぞれ１０％及び１００％胎仔ウシ血清で０～７２時間処理する。
【図16】ａｐｔｄｋｋ５－ＯＭ－ｉｎｄＴの阻害効力を示した図である。３コピーの各群分析がある。
【図17】配列富化傾向曲線を示した図である。各ラウンドにおけるアプタマーのタイプをシーケンシング読み取りの数で割ることによって、各ラウンドにおけるＤＮＡプールの富化の程度を算出する。飽和富化はラウンド２４において生じると思われる。
【図18】ラウンド２１～ラウンド３０で選択されたアプタマープールのＰＣＲ産物についてのアガロースゲル（３％）電気泳動分析を示した図である。前方のレーンはＤＮＡラダーである。ＤＮＡバンドは、およそ８０ｂｐにある。
【図19】ラウンド３０における代表的なアプタマー候補の特異性を示した図である。ＤＫＫ１に対する１μＭの各アプタマー／ＲＳの特異性をＥＬＯＮＡによって検出し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出する。
【図20】代表的なアプタマー候補の結合曲線を示した図である。ＤＫＫ－１に対する親和性を、ある特定の濃度の各アプタマーを用いてバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって検出する。
【0021】
［発明の詳細な説明］
別様に示されない又は定義されない限り、使用されるすべての用語は、当業者に明らかであろう、当技術分野におけるそれら用語の通常の意味を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ ＩＶ」；及びＲｏｉｔｔら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８編）等の標準的手引書への、並びに本明細書において引用される一般的背景技術への参照がなされる。さらに、別様に示されない限り、詳細に具体的に記載されないすべての方法、ステップ、技法、及び操作は、当業者に明らかであろうように、それ自体が公知の様式で実施され得且つ実施されている。例えば、標準的手引書への、上で参照される一般的背景技術への、及び本明細書において引用されるさらなる参考文献への参照が再度なされる。
別様に示されない又は定義されない限り、使用されるすべての用語は、当業者に明らかであろう、当技術分野におけるそれら用語の通常の意味を有する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」；Ｌｅｗｉｎ、「Ｇｅｎｅｓ ＩＶ」；及びＲｏｉｔｔら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８編）等の標準的手引書への、並びに本明細書において引用される一般的背景技術への参照がなされる。さらに、別様に示されない限り、詳細に具体的に記載されないすべての方法、ステップ、技法、及び操作は、当業者に明らかであろうように、それ自体が公知の様式で実施され得且つ実施されている。例えば、標準的手引書への、上で参照される一般的背景技術への、及び本明細書において引用されるさらなる参考文献への参照が再度なされる。
【0022】
定義
本明細書において使用するとき、「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はその修飾形態、並びにその類似体を指す。ヌクレオチドは、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、並びにそれらの誘導体及び類似体）、並びにピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、並びにそれらの誘導体及び類似体）を含む種を含む。
本明細書において使用するとき、「ヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はその修飾形態、並びにその類似体を指す。ヌクレオチドは、プリン（例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン、並びにそれらの誘導体及び類似体）、並びにピリミジン（例えば、シトシン、ウラシル、チミン、並びにそれらの誘導体及び類似体）を含む種を含む。
【0023】
本明細書において使用するとき、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマーを指すために互換可能に使用され、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、並びに、任意の位置におけるヌクレオチド単位への様々な実体又は部分の付着が含まれる、これらの種類の核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドの修飾を含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、及び「核酸」という用語は、二本鎖又は一本鎖分子を含む。核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、アプタマーという用語よりも広い用語であり、ゆえに、核酸、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドという用語は、アプタマーを含むがアプタマーに限定されるわけではない。
【0024】
本明細書において使用するとき、「アプタマー」とは、標的分子に対して望ましい作用を有する、天然に存在しない核酸を指す。望ましい作用は、標的に結合すること、標的を触媒的に変化させること、標的若しくは標的の機能的活性を修飾する若しくは変更する手段で標的と反応すること、標的に共有結合で付着すること、及び標的と別の分子との間の反応を促すことを含むが、それらに限定されるわけではない。１つの実施形態において、作用は、標的分子（ＤＫＫ１等）に対する特異的な結合親和性であり、そのような標的分子は、ワトソン／クリック塩基対合又は三重らせん形成から独立しているメカニズムを通じてアプタマーに結合するポリヌクレオチド以外の３次元化学構造であり、アプタマーは、標的分子によって結合される公知の生理学的機能を有する核酸ではない。この文脈において、アプタマーの標的（ＤＫＫ１等）に対するアプタマーの「特異的結合」とは、アプタマーが、混合物又はサンプルにおける他の非標的の構成要素に結合するよりもはるかに高い程度の親和性を一般的に有して、アプタマーがアプタマーの標的に結合することを意味する。
【0025】
配列「同一性」は周知の意味を有し、２種の核酸又はポリペプチド分子又は領域の間の配列同一性のパーセンテージは、公開された技法を使用して算出され得る。配列同一性は、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドの全長に沿って、又は分子の領域に沿って測定され得る。（例えば、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１を参照されたい）。２種のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の同一性を測定するいくつかの方法が存在するものの、「同一性」という用語は当業者に周知である（Ｃａｒｒｉｌｌｏ，Ｈ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３（１９８８））。配列同一性パーセントを判定するために適切であるアルゴリズムの１つの例は、基本的局所アライメント検索ツール（以降「ＢＬＡＳＴ」）において使用されるアルゴリズムであり、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０、１９９０及びＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１５：３３８９～３４０２、１９９７を参照されたい。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（以降「ＮＣＢＩ」）を通じて公的に使用可能である。ＮＣＢＩから使用可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列に対する）を使用して配列同一性を判定することにおいて使用される初期設定パラメーターは、ＭｃＧｉｎｎｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３２：Ｗ２０～Ｗ２５、２００４に記載される。
【0026】
ＤＫＫ１に対するアプタマー
タンパク質－ＳＥＬＥＸ技術に基づき、本発明者らは、陽性スクリーニングに対して標的タンパク質としてＤＫＫ１を、陰性スクリーニングに対して非関連タンパク質を使用し、高い親和性でＤＫＫ１に特異的に結合するアプタマーを最終的に選択した。本明細書に記載されるＤＫＫ１は、好ましくはヒトＤＫＫ１、例えばアミノ酸配列が配列番号７３に示されるＤＫＫ１である。
タンパク質－ＳＥＬＥＸ技術に基づき、本発明者らは、陽性スクリーニングに対して標的タンパク質としてＤＫＫ１を、陰性スクリーニングに対して非関連タンパク質を使用し、高い親和性でＤＫＫ１に特異的に結合するアプタマーを最終的に選択した。本明細書に記載されるＤＫＫ１は、好ましくはヒトＤＫＫ１、例えばアミノ酸配列が配列番号７３に示されるＤＫＫ１である。
【0027】
例示的なヒトＤＫＫ１アミノ酸配列：
ＭＭＡＬＧＡＡＧＡＴＲＶＦＶＡＭＶＡＡＡＬＧＧＨＰＬＬＧＶＳＡＴＬＮＳＶＬＮＳＮＡＩＫＮＬＰＰＰＬＧＧＡＡＧＨＰＧＳＡＶＳＡＡＰＧＩＬＹＰＧＧＮＫＹＱＴＩＤＮＹＱＰＹＰＣＡＥＤＥＥＣＧＴＤＥＹＣＡＳＰＴＲＧＧＤＡＧＶＱＩＣＬＡＣＲＫＲＲＫＲＣＭＲＨＡＭＣＣＰＧＮＹＣＫＮＧＩＣＶＳＳＤＱＮＨＦＲＧＥＩＥＥＴＩＴＥＳＦＧＮＤＨＳＴＬＤＧＹＳＲＲＴＴＬＳＳＫＭＹＨＴＫＧＱＥＧＳＶＣＬＲＳＳＤＣＡＳＧＬＣＣＡＲＨＦＷＳＫＩＣＫＰＶＬＫＥＧＱＶＣＴＫＨＲＲＫＧＳＨＧＬＥＩＦＱＲＣＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＳＲＬＨＴＣＱＲＨ（配列番号７３）
ＭＭＡＬＧＡＡＧＡＴＲＶＦＶＡＭＶＡＡＡＬＧＧＨＰＬＬＧＶＳＡＴＬＮＳＶＬＮＳＮＡＩＫＮＬＰＰＰＬＧＧＡＡＧＨＰＧＳＡＶＳＡＡＰＧＩＬＹＰＧＧＮＫＹＱＴＩＤＮＹＱＰＹＰＣＡＥＤＥＥＣＧＴＤＥＹＣＡＳＰＴＲＧＧＤＡＧＶＱＩＣＬＡＣＲＫＲＲＫＲＣＭＲＨＡＭＣＣＰＧＮＹＣＫＮＧＩＣＶＳＳＤＱＮＨＦＲＧＥＩＥＥＴＩＴＥＳＦＧＮＤＨＳＴＬＤＧＹＳＲＲＴＴＬＳＳＫＭＹＨＴＫＧＱＥＧＳＶＣＬＲＳＳＤＣＡＳＧＬＣＣＡＲＨＦＷＳＫＩＣＫＰＶＬＫＥＧＱＶＣＴＫＨＲＲＫＧＳＨＧＬＥＩＦＱＲＣＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＳＲＬＨＴＣＱＲＨ（配列番号７３）
【0028】
それゆえ、１つの態様において、本発明は、ＤＫＫ１に対するアプタマーを提供する。一部の実施形態において、アプタマーはＤＫＫ１に特異的に結合する。
【0029】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１～２０のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１～２０のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１～２０のいずれか１つの中の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、又はそれを上回る数の連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１～２０のいずれか１つの中の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、又はそれを上回る数の連続ヌクレオチドからなる。
【0030】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号５と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号５と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号５の中の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、又はそれを上回る数の連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号５の中の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、又はそれを上回る数の連続ヌクレオチドからなる。
【0031】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１９と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１９と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１９の中の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、又はそれを上回る数の連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１９の中の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、又はそれを上回る数の連続ヌクレオチドからなる。
【0032】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号２０と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号２０と少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号２０の中の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、又はそれを上回る数の連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号２０の中の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、又はそれを上回る数の連続ヌクレオチドからなる。
【0033】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号４５～６４のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号４５～６４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、又は配列番号４５～６４のいずれか１つのヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号４９、６３、若しくは６４に示されるヌクレオチド配列を含む、又は配列番号４９、６３、若しくは６４に示されるヌクレオチド配列からなる。
【0034】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号８７～１０５のいずれか１つと少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号８７～１０５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、又は配列番号８７～１０５のいずれか１つのヌクレオチド配列からなる。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号８７～９０、９３～９６、及び９８～１０５のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、又は配列番号８７～９０、９３～９６、及び９８～１０５のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列からなる。
【0035】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１～２０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号１～２０のいずれか１つのヌクレオチド配列からなる。
【0036】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号２１～４４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号２１～４４のいずれか１つのヌクレオチド配列からなる。
【0037】
一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号７４～８６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、アプタマーは、配列番号７４～８６のいずれか１つのヌクレオチド配列からなる。
【0038】
一部の好ましい実施形態において、アプタマーは、配列番号１～４４のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、アプタマーは、配列番号５、１９、又は２０～４４のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、より好ましくは、アプタマーは、配列番号５、２０、又は３５～３８のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。一部の好ましい実施形態において、アプタマーは、配列番号１～４４のいずれか１つのヌクレオチド配列からなり、より好ましくは、アプタマーは、配列番号５、１９、又は２０～４４のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列からなり、より好ましくは、アプタマーは、配列番号５、２０、又は３５～３８のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列からなる。一部の好ましい実施形態において、アプタマーは、配列番号３７に示されるヌクレオチド配列を含む、又は配列番号３７に示されるヌクレオチド配列からなる。
【0039】
一部の実施形態において、本発明のアプタマーは、約３５０ｎＭ未満、好ましくは約１５０ｎＭ未満、好ましくは約１００ｎＭ未満、好ましくは約５０ｎＭ未満、好ましくは約３０ｎＭ未満、好ましくは約２０ｎＭ未満、好ましくは約１０ｎＭ未満、好ましくは約５ｎＭ未満、好ましくは約１ｎＭ未満の、又はそれより小さい、ＤＫＫ１に対するＫｄ（解離定数）を有する。一部の実施形態において、本発明のアプタマーは、約０．０１ｎＭ～約３５０ｎＭ、好ましくは約０．０１ｎＭ～約１５０ｎＭ、好ましくは約０．０１ｎＭ～約１００ｎＭ、好ましくは約０．０１ｎＭ～約５０ｎＭ、好ましくは約０．０１ｎＭ～約３０ｎＭ、好ましくは約０．０１ｎＭ～約２０ｎＭ、好ましくは約０．０１ｎＭ～約１０ｎＭ、好ましくは約０．０１ｎＭ～約５ｎＭ、好ましくは約０．０１ｎＭ～約１ｎＭの、ＤＫＫ１に対するＫｄ（解離定数）を有する。Ｋｄは、例えば酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡ）又はバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって判定される。
【0040】
一部の実施形態において、本発明のアプタマーは、ＤＫＫ１の生物学的活性を阻害する。「阻害」とは、アプタマーの非存在と比較して、アプタマーの存在下でＤＫＫ１の生物学的活性が低下する、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、及びさらに少なくとも約９０％低下することを意味する。
【0041】
本記事において使用するとき、「生物学的活性」という用語は、生理学的又は病態生理学的過程に影響を及ぼすことがある１種又は複数の細胞又は細胞外の過程に対する影響を指す。ＤＫＫ１の生物学的活性は、Ｗｎｔシグナル伝達経路に拮抗することを含むが、それに限定されるわけではない。一部の実施形態において、本発明のアプタマーは、Ｗｎｔシグナル伝達経路に対するＤＫＫ１の拮抗効果を阻害することができる。例えば、本発明のアプタマーは、細胞ベースのＷｎｔシグナル伝達アッセイにおいてＤＫＫ１の拮抗効果を遮断することができる。
【0042】
一部の実施形態において、本発明のアプタマーは、約２０００ｎＭ未満、好ましくは約１５００ｎＭ未満、好ましくは約１０００ｎＭ未満、好ましくは約８００ｎＭ未満、好ましくは約４００ｎＭ未満、好ましくは約２００ｎＭ未満の、又はそれを下回るＩＣ５０値で、Ｗｎｔシグナル伝達経路に対するＤＫＫ１の拮抗効果を阻害する等、ＤＫＫ１の生物学的活性を阻害する。一部の実施形態において、本発明のアプタマーは、約２００ｎＭ～約２０００ｎＭ、好ましくは約２００ｎＭ～約１５００ｎＭ、好ましくは約２００ｎＭ～約１０００ｎＭ、好ましくは約２００ｎＭ～約８００ｎＭ、又は好ましくは約２００ｎＭ～約４００ｎＭのＩＣ５０値で、Ｗｎｔシグナル伝達経路に対するＤＫＫ１の拮抗効果を阻害する等、ＤＫＫ１の生物学的活性を阻害する。一部の実施形態において、ＩＣ５０値は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＣＦ－Ｗｎｔ誘導性ルシフェラーゼ活性アッセイによってインビトロで判定される。
【0043】
一部の実施形態において、本発明のアプタマーは、１種又は複数の修飾をさらに含有してもよい。例えば、修飾は、増強したヌクレアーゼ耐性をアプタマーに付与する及び／又はアプタマーのインビボ半減期を増強する修飾である。
【0044】
修飾は、例えば３’及び５’キャッピング等の３’及び５’修飾を含む。一部の実施形態において、アプタマーは、３’末端で逆位デオキシチミジンでキャッピングされる、すなわち３’逆位デオキシチミジン（３’ｉｄＴ）修飾。
【0045】
修飾は、修飾ヌクレオチドでの、１つ又は複数の天然に存在するヌクレオチドの置換をさらに含んでもよい。例えば、修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ、２’－メトキシエチル、２’－メトキシ、及び／又は２’アリルオキシ修飾ヌクレオチド（すなわち、リボースの２’位ヒドロキシル基が、フッ素、メトキシエチル、メトキシ、又はアリルオキシ等によって置換されている）を含むが、それらに限定されるわけではない。修飾ヌクレオチドは、Ｃ－５修飾ピリミジンも含んでもよい。「Ｃ－５修飾ピリミジン」という用語は、Ｃ－５位における修飾を有するピリミジンを指す。Ｃ－５修飾ピリミジンは、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強し得、当技術分野において公知である。例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２０１１／１３０１９５号及びその中で引用される参考文献への参照がなされ得る。一部の好ましい実施形態において、修飾は２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）修飾である。一部の実施形態において、２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）修飾等の修飾は、アプタマーの５’及び／又は３’末端における１つ又は複数のヌクレオチド、例えば４個のヌクレオチドに対して行われる。
【0046】
修飾は、非荷電結合（メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミンエステル、カルバメート等）を有するそうしたヌクレオチド間修飾、及び荷電結合（ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するそうしたヌクレオチド間修飾、挿入剤（アクリジン、ソラーレン等）を有するヌクレオチド間修飾、キレート剤（金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属等）を含有するヌクレオチド間修飾、アルキル化剤を含有するヌクレオチド間修飾、並びに修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸等）を有するヌクレオチド間修飾等、ヌクレオチド間修飾をさらに含む。
【0047】
修飾は、ペグ化修飾（ＰＥＧ修飾）も含んでもよい。ＰＥＧとのコンジュゲーションは、インビボ半減期等、アプタマーの半減期を延長させ得る。一部の実施形態において、ＰＥＧの分子量は、約１ｋＤａ～約１００ｋＤａ、例えば約１０ｋＤａ～約８０ｋＤａ、約２０ｋＤａ～約６０ｋＤａ、約３０ｋＤａ～約５０ｋＤａ、約４０ｋＤａである。一部の実施形態において、ＰＥＧは、アプタマーの５’末端にコンジュゲートされてもよい。一部の実施形態において、ＰＥＧは、アプタマーの３’末端にコンジュゲートされてもよい。
【0048】
修飾は、脂肪酸修飾及び／又はクマリン修飾をさらに含んでもよい。例えば、アプタマーは、脂肪酸及び／又はクマリン誘導体とコンジュゲートされてもよい（例えば、アプタマー分子の５’末端にコンジュゲートされる）。適切な脂肪酸は、ドデカン二酸、パルミチン酸（ＰＡ）、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ステアリン酸（ＳＡ）、オクタデカン二酸、ラウリン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、及びアラキドン酸（ＡＲＡ）を含むが、それらに限定されるわけではない。適切なクマリン誘導体は、４－ヒドロキシクマリン、３－アセチル－６－カルボキシクマリン、ワルファリン、（２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）酢酸、［８－アセチル－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）酸素］酢酸、クマリン－３－カルボン酸、Ｎ－（４－メチル－７－クマリン）オキサルアミド、７－（カルボキシメチル）－４－メチルクマリン、７－メトキシクマリン－３－カルボン酸、及び６－メトキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸を含むが、それらに限定されるわけではない。
【0049】
一部の実施形態において、アプタマーは、上で記載される様々な修飾の組み合わせを含んでもよい。例えば、アプタマーは、２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）修飾及び３’逆位デオキシチミジン（３’ｉｄＴ）修飾を含んでもよい。
【0050】
一部の実施形態において、本発明の修飾されたアプタマーのインビボ半減期は、対応する修飾されていないアプタマーのインビボ半減期の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、又はそれを上回る倍である。
【0051】
疾患の治療
別の態様において、本発明は、本発明のＤＫＫ１に対するアプタマーによって疾患を治療するための方法であって、方法は、それを必要とする対象に、本発明のＤＫＫ１に対するアプタマーの治療有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。
別の態様において、本発明は、本発明のＤＫＫ１に対するアプタマーによって疾患を治療するための方法であって、方法は、それを必要とする対象に、本発明のＤＫＫ１に対するアプタマーの治療有効量を投与するステップを含む、方法を提供する。
【0052】
本発明のＤＫＫ１に対するアプタマーによって治療される疾患は、例えば、ＤＫＫ１媒介性疾患等のＤＫＫ１関連疾患である。一実施形態において、ＤＫＫ１関連疾患は、ＤＫＫ１の過剰発現等、ＤＫＫ１の異常な発現を有する疾患によって特徴付けられる。
【0053】
本明細書において使用するとき、「ＤＫＫ１関連疾患」は、ＤＫＫ１関連がんを含む。一実施形態において、「ＤＫＫ１関連がん」は、ＤＫＫ１の過剰発現等、ＤＫＫ１の異常な発現を有するがんによって特徴付けられる。一実施形態において、ＤＫＫ１関連がんは、例えば骨髄腫（例えば、溶骨性病変を有する多発性骨髄腫、肝門部胆管癌多発性骨髄腫）、乳がん、結腸がん、黒色腫、肝細胞がん、上皮がん、食道がん、胃がん、胃食道がん、肝門部胆管癌、脳腫瘍、肺がん、前立腺がん、又は膵臓がん、並びにその任意の転移から選択される。
【0054】
本明細書において使用するとき、「ＤＫＫ１関連疾患」は、異常な骨芽細胞又は破骨細胞活性に関連した骨関連疾患等の骨関連疾患を含む。異常な骨芽細胞又は破骨細胞活性によって特徴付けられる疾患は、原発性及び続発性骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、無血管性壊死（骨壊死）、骨折及びインプラント治癒（歯科インプラント及び股関節インプラント）、他の疾患に起因した骨喪失（例えば、ＨＩＶ感染症、がん、又は関節炎と関連した）を含むが、それらに限定されるわけではない。他の「ＤＫＫ１関連疾患」は、関節リウマチ、変形性関節症、関節炎、及び溶骨性病変を含むが、それらに限定されるわけではない。
【0055】
対象は、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、及びウシを含むがそれらに限定されない任意の動物（飼い慣らされた、家畜の、又は野生の）であり得、ヒト対象が好ましい。本明細書において使用するとき、患者、個体、及び対象という用語は、互換可能に使用され得る。一部の実施形態において、対象は、雄性又は雌性であり得る。
【0056】
本明細書において使用するとき、疾患に罹患している個体を「治療すること」とは、個体の症状が、治療後に部分的に若しくは完全に緩和する、又は変化しないままであることを意味する。ゆえに、治療は、阻止、治療、及び／又は回復を含む。阻止とは、潜在的疾患の阻止、及び／又は症状の悪化若しくは疾患進行の阻止を指す。
【0057】
本明細書において使用するとき、「治療有効量」又は「治療有効用量」とは、対象への投与後に治療効果をもたらすのに少なくとも十分である、物質、化合物、材料、又は化合物を含む組成物の量を指す。ゆえに、該用語は、疾患又は病状の症状を阻止するか、治すか、改善するか、食い止めるか又は部分的に食い止めるのに必要な量である。本明細書において使用するとき、「治療効果」とは、疾患若しくは病態の症状を変更するか、おおむね改善するか、若しくは緩和する、又は疾患若しくは病態を治す、個体の治療により生じる効果を意味する。
【0058】
ＤＫＫ１に対するアプタマーの投薬量レジメンは、例えば、患者のタイプ、種、年齢、重量、性別、及び医学的病状；治療されるべき病状の重症度；投与の経路；患者の腎機能及び肝機能；並びに使用されるＤＫＫ１に対する特異的アプタマー又はその塩を含めた、多様な因子に従って選択される。通常の技能を有する医師であれば、病状の進行を阻止するか、対抗するか、又は阻害するのに要される組成物の有効量を容易に判定し得且つ指定し得る。
【0059】
典型的に、ＤＫＫ１に対するアプタマーの投薬量レジメンは、日あたり約１μｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【0060】
例示的な治療レジームは、１日１回、２日ごとに１回、週あたり１回、週あたり２回、２週間ごとに１回、３週間ごとに１回、４週間ごとに１回、月１回、３カ月ごとに１回、若しくは３～６カ月ごとに１回の投与、又は当初は短い投与間隔（週あたり１回から３週間ごとに１回等）及び次いでその後長い間隔（月１回から３～６カ月ごとに１回等）を有する投与を伴う。投与の頻度及び間隔は、アプタマーの薬物動態学的パラメーターに従って、当業者によって判定され得る。
【0061】
医薬組成物
別の態様において、本発明は、本発明のＤＫＫ１に対する少なくとも１種のアプタマー、及び薬学的に許容できるキャリア又は賦形剤を含む医薬組成物も提供する。前記医薬組成物は、例えばＤＫＫ１関連疾患を治療するために使用される。
別の態様において、本発明は、本発明のＤＫＫ１に対する少なくとも１種のアプタマー、及び薬学的に許容できるキャリア又は賦形剤を含む医薬組成物も提供する。前記医薬組成物は、例えばＤＫＫ１関連疾患を治療するために使用される。
【0062】
本明細書に記載されるアプタマーは、注射可能な剤形、液体分散体、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム、凍結乾燥製剤、乾燥粉末、錠剤、カプセル、制御放出製剤、急速に溶ける製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、混合型即時放出及び制御放出製剤等を含むがそれらに限定されない、任意の薬学的に許容できる剤形において利用され得る。具体的には、本明細書に記載されるアプタマーは、（ａ）経口、肺、静脈内、動脈内、髄腔内、関節内、直腸、眼科的、結腸、非経口、大槽内、膣内、腹腔内、局所、頬、鼻腔、及び局部投与のうちのいずれかから選択される投与のために；（ｂ）液体分散体、ゲル、エアロゾル、軟膏、クリーム、錠剤、小袋、及びカプセルのうちのいずれかから選択される剤形に；（ｃ）凍結乾燥製剤、乾燥粉末、急速に溶ける製剤、制御放出製剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、並びに混合型即時放出及び制御放出製剤のうちのいずれかから選択される剤形に；又は（ｄ）その任意の組み合わせ、に製剤化され得る。
【0063】
非経口、皮内、又は皮下適用に使用される溶液又は懸濁液は、以下の構成要素：（１）注射用水、生理食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒等の無菌の希釈剤；（２）ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗細菌剤；（３）アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウム等の抗酸化物質；（４）エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；（５）酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩等の緩衝液；及び（６）塩化ナトリウム又はデキストロース等の張度の調整のための作用物質、のうちの１種又は複数を含み得る。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基で調整され得る。非経口調製物は、ガラス又はプラスチックで作製されたアンプル、使い捨て注射器、又は複数用量バイアルに封入され得る。
【0064】
注射可能な使用に適切な医薬組成物は、無菌の水溶液（水溶性である場合）又は分散体、及び無菌の注射可能な溶液若しくは分散体の即席調製のための無菌の粉末を含んでもよい。静脈内投与に関して、適切なキャリアは、生理学的食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合において、組成物は無菌であるべきであり、易注射器能（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流体であるべきである。医薬組成物は、製造及び保管の条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌等の微小生物の汚染作用から守られるべきである。本明細書において使用される「安定な」という用語は、患者への投与に適切である状態又は条件にとどまることを意味する。
【0065】
キャリアは、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びその適切な混合物を含めた、溶媒又は分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散体の場合には要される粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微小生物の作用の阻止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール又はソルビトール等の多価アルコール、及び塩化ナトリウム等の無機塩を組成物に含めることが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期吸入は、吸入を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。
【0066】
無菌の注射可能な溶液は、必要に応じて、上で列挙される成分の１種又は組み合わせとともに、適当な溶媒に要される量の活性試薬（例えば、ＤＫＫ１に対するアプタマー）を組み入れ、その後に濾過滅菌が続くことによって調製され得る。一般的に、分散体は、基本的分散媒及び任意の他の要される成分を含有する無菌のビヒクルに、ＤＫＫ１に対する少なくとも１種のアプタマーを組み入れることによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、例示的な調製方法は、真空乾燥及びフリーズドライを含み、その両方とも、ＤＫＫ１に対するアプタマーと、以前に滅菌濾過されたその溶液からの任意の付加的な所望の成分との粉末を産出するであろう。
【0067】
経口組成物は、不活性希釈剤又は食用キャリアを一般的に含む。経口組成物は、例えばゼラチンカプセルに封入され得る、又は錠剤に圧縮され得る。経口の治療的投与の目的上、ＤＫＫ１に対するアプタマーは、賦形剤とともに組み入れられ得、錠剤、トローチ、又はカプセルの形態で使用され得る。薬学的に適合する結合剤及び／又はアジュバント材料が、組成物の一部として含まれ得る。
【0068】
吸入による投与に関して、化合物は、適切な推進剤、例えば二酸化炭素等の気体を含有する加圧容器若しくはディスペンサーからのエアロゾルスプレー、適切なデバイスからの噴霧液体又は乾燥粉末の形態で送達される。経粘膜又は経皮投与に関して、透過されるべきバリアに適当な浸透剤が製剤において使用される。そのような浸透剤は、当技術分野において一般的に公知であり、例えば経粘膜投与に関しては、洗浄剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレー又は座薬の使用により遂行され得る。経皮投与に関して、活性試薬は、当技術分野において一般的に公知であるように、軟膏、軟膏薬、ゲル、又はクリームに製剤化される。試薬は、直腸送達のための座薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリド等、従来の座薬基剤を有する）又は停留浣腸の形態でも調製され得る。
【0069】
１つの実施形態において、ＤＫＫ１に対するアプタマーは、局部投与のために製剤化される。本明細書において使用するとき、「局部投与」とは、動物の皮膚（表皮）のすべて又は一部分に、ＤＫＫ１に対するアプタマーを含む製剤を直接的に又は別様に接触させることによる、動物へのＤＫＫ１に対するアプタマーの送達を指す。該用語は、局部及び経皮を含むがそれらに限定されない、いくつかの投与の経路を包含する。これらの投与の様態に対する共通の要件は、標的組織又は層への効率的な送達である。１つの態様において、局部投与は、表皮及び真皮に浸透し、ＤＫＫ１に対するアプタマーの全身送達を究極的には達成するための手段として使用される。別の態様において、局部投与は、動物の表皮若しくは真皮に又はその特異的な層に、ＤＫＫ１に対するアプタマーを選択的に送達するための手段として使用される。
【0070】
局部投与に関して、ＤＫＫ１に対するアプタマーは、薬学的に許容できる軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼薬、点耳薬、含浸包帯、及びエアロゾル、薬用粉末、薬用接着剤、泡に製剤化されてもよく、例えば防腐剤又は薬物浸透を支援する溶媒、並びに軟膏、ゲル、及びクリームにおける皮膚軟化剤を含めた、適当な従来の添加物又は賦形剤を含有してもよい。そのような局部製剤は、適合する従来のキャリア、例えばローションのためのエタノール又はオレイルアルコールも含有してもよい。そのようなキャリアは、製剤の約１重量％～約９８重量％を構成してもよく；より通常では、そのようなキャリアは、製剤の最高約８０重量％を構成するであろう。アプタマーの局部送達のための具体的な製剤は、当技術分野において記載される。
【0071】
１つの実施形態において、ＤＫＫ１に対するアプタマーは、身体からの迅速な排除を防ぐであろうキャリアとともに調製される。例えば、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含めた、制御放出製剤が使用され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等、生分解性生体適合性ポリマーが使用され得る。そのような製剤の調製のための方法は、当業者に明白であろう。
【0072】
感染細胞を標的にするウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有するリポソームを含めたリポソーム懸濁液も、薬学的に許容できるキャリアとして使用され得る。これらリポソーム懸濁液は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【0073】
付加的に、ＤＫＫ１に対するアプタマーの懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド、若しくはリポソーム等の合成脂肪酸エステルを含む。非脂質性ポリカチオン性アミノポリマーも送達に使用されてもよい。任意選択で、懸濁液は、化合物の溶解度を増加させ且つ高度に濃縮された溶液の調製を可能にするための、適切な安定剤又は作用物質も含んでもよい。
【0074】
ある場合には、投与のし易さ及び投薬量の均一性のために、経口又は非経口組成物を単位剤形に製剤化することがとりわけ有利であることがある。本明細書において使用される単位剤形とは、治療されるべき対象に対する単一の投薬量として適した物理的に別々の単位を指し；各単位は、要される薬学的キャリアと併せて所望の治療効果をもたらすように算出された、ＤＫＫ１に対するアプタマーの所定の分量を含有する。本明細書に記載されるＤＫＫ１に対するアプタマーの単位剤形に関する仕様は、ＤＫＫ１に対する特定のアプタマーの特有の特徴、及び達成されるべき特定の治療効果、及び個体の治療のためのそのような活性剤を配合することについての当技術分野において固有の制限によって決定付けられ且つそれらに直接依存する。
【0075】
ＤＫＫ１に対する少なくとも１種のアプタマーを含む医薬組成物は、１種又は複数の薬学的賦形剤を含み得る。そのような賦形剤の例は、結合剤、充填剤、滑沢剤、懸濁化剤、甘味料、香味剤、防腐剤、緩衝剤、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤、及び他の賦形剤を含むが、それらに限定されるわけではない。そのような賦形剤は当技術分野において公知である。例示的な賦形剤は、（１）様々なセルロース及び架橋ポリビニルピロリドン、アビセル（Ａｖｉｃｅｌ）ＰＨ１０１及びアビセルＰＨ１０２等の微結晶セルロース（ｍｉｃｒｏｃｒｙｓｔａｌｈｎｅ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ケイ化微結晶セルロース（プロソルブ（ＰｒｏＳｏｌｖ）ＳＭＣＣ（商標））、トラガカントゴム、並びにゼラチンを含む結合剤；（２）様々なデンプン、ラクトース、ラクトース一水和物、及び無水ラクトース等の充填剤；（３）アルギン酸、プリモゲル、コーンスターチ、軽度架橋ポリビニルピロリドン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、及び加工デンプン、クロスカルメロースナトリウム、クロス－ポビドン（ｃｒｏｓｓ－ｐｏｖｉｄｏｎｅ）、デンプングリコール酸ナトリウム、並びにその混合物等の崩壊剤；（４）圧縮される対象となる粉末の流動性に作用し、ステアリン酸マグネシウム、アエロジル（Ａｅｒｏｓｉｌ）２００等のコロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、及びシリカゲルを含む作用物質を含めた滑沢剤；（５）コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；（６）ソルビン酸カリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸及びその塩、ブチルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸の他のエステル、エチル若しくはベンジルアルコール等のアルコール、フェノール等のフェノール化合物、又は塩化ベンザルコニウム等の第４級化合物等の防腐剤；（７）微結晶セルロース、ラクトース、リン酸カルシウム二塩基性、サッカリド等の薬学的に許容できる不活性充填剤等の希釈剤、並びに／或いは前述のもののいずれかの混合物を含み；希釈剤の例は、アビセルＰＨ１０１及びアビセルＰＨ１０２等の微結晶セルロース；ラクトース一水和物、無水ラクトース、及びファーマトース（Ｐｈａｒｍａｔｏｓｅ）ＤＣＬ２１等のラクトース；エムコンプレス（Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ）等のリン酸カルシウム二塩基性；マンニトール；デンプン；ソルビトール；スクロース；及びグルコース；（８）スクロース、サッカリンスクロース、キシリトール、サッカリンナトリウム、チクロ、アスパルテーム、及びアセスルファム等、任意の天然又は人工甘味料を含めた甘味剤；（９）ペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香味料、マグナスイート（Ｍａｇｎａｓｗｅｅｔ）（ＭＡＦＣＯの商標）、バブルガム香味料、果実香味料等の香味剤；並びに（１０）有機酸とカーボネート又はバイカーボネート等の発泡性カップルを含めた発泡剤を含む。
【0076】
［実施例］
本発明は、以下の実施例によってさらに記載されるが、本発明の範囲は、記載される実施例に限定されるわけではない。
本発明は、以下の実施例によってさらに記載されるが、本発明の範囲は、記載される実施例に限定されるわけではない。
【0077】
材料及び方法
タンパク質－ＳＥＬＥＸ：ＤＫＫ１に対するアプタマーを、Ｎｉ－ＮＴＡビーズに基づくＳＥＬＥＸ法によってスクリーニングした。要するに、Ｈｉｓ６タグ付ＤＫＫ－１をＮｉ－ＮＴＡビーズとともにまずインキュベートして、タンパク質結合Ｎｉ－ＮＴＡ磁気ビーズを形成した。次いで、そのような複合体をｓｓＤＮＡランダムライブラリーとともに室温でインキュベートして、ｓｓＤＮＡ－タンパク質結合Ｎｉ－ＮＴＡ磁気ビーズ複合体を形成した。洗浄した後、ｓｓＤＮＡ－タンパク質結合Ｎｉ－ＮＴＡ磁気ビーズ複合体を、フォワードプライマー及びビオチン化リバースプライマーを用いたＰＣＲを実施するための鋳型として使用する。メーカーのプロトコールに従い、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズによって、ｓｓＤＮＡを再生させた。ｓｓＤＮＡプールを、次のラウンドのＳＥＬＥＸに使用した。第４ラウンドから、進化したｓｓＤＮＡプールを、逆選択のためにＮｉ－ＮＴＡビーズ又は非標的タンパク質とともにインキュベートした。次いで、結合していないｓｓＤＮＡを逆選択及び陰性選択から回収し、ＤＫＫ１結合Ｎｉ－ＮＴＡ磁気ビーズに適用した。ラウンド１０、１６、１８、及び２０からのｓｓＤＮＡ産物を使用して、初回ランダムライブラリーと比較した、選択過程における富化の程度を判定した。最も高い結合親和性を有するｓｓＤＮＡライブラリーをクローニングし、シーケンシングした。
タンパク質－ＳＥＬＥＸ：ＤＫＫ１に対するアプタマーを、Ｎｉ－ＮＴＡビーズに基づくＳＥＬＥＸ法によってスクリーニングした。要するに、Ｈｉｓ６タグ付ＤＫＫ－１をＮｉ－ＮＴＡビーズとともにまずインキュベートして、タンパク質結合Ｎｉ－ＮＴＡ磁気ビーズを形成した。次いで、そのような複合体をｓｓＤＮＡランダムライブラリーとともに室温でインキュベートして、ｓｓＤＮＡ－タンパク質結合Ｎｉ－ＮＴＡ磁気ビーズ複合体を形成した。洗浄した後、ｓｓＤＮＡ－タンパク質結合Ｎｉ－ＮＴＡ磁気ビーズ複合体を、フォワードプライマー及びビオチン化リバースプライマーを用いたＰＣＲを実施するための鋳型として使用する。メーカーのプロトコールに従い、ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズによって、ｓｓＤＮＡを再生させた。ｓｓＤＮＡプールを、次のラウンドのＳＥＬＥＸに使用した。第４ラウンドから、進化したｓｓＤＮＡプールを、逆選択のためにＮｉ－ＮＴＡビーズ又は非標的タンパク質とともにインキュベートした。次いで、結合していないｓｓＤＮＡを逆選択及び陰性選択から回収し、ＤＫＫ１結合Ｎｉ－ＮＴＡ磁気ビーズに適用した。ラウンド１０、１６、１８、及び２０からのｓｓＤＮＡ産物を使用して、初回ランダムライブラリーと比較した、選択過程における富化の程度を判定した。最も高い結合親和性を有するｓｓＤＮＡライブラリーをクローニングし、シーケンシングした。
【0078】
酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ（ＥＬＯＮＡ）：ウェルあたり１６０ｎｇ ＤＫＫ１、及び陰性標的を、疎水性相互作用により、４℃で一晩インキュベートすることによって、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてコートした。ウェルにおける非結合部位を、雄牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で室温にて１時間ブロッキングし、次いでＤＮＡ結合緩衝液で各５分間４回洗浄した。適当な濃度を有するビオチン化アプタマー候補／ＲＳを各ウェルに添加し、連続的に穏やかに振とうしながら室温で４５分間インキュベートした。結合後、プレートを洗浄緩衝液で各５分間４回洗浄して、非特異的な及び弱く結合している配列を除去した。１００μｌストレプトアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（ＰＢＳＴ＋０．１％ＢＳＡに１：１００００希釈）を各ウェルに添加し、３０分間インキュベートし、結合緩衝液で４回洗浄した。ＨＲＰ基質としての５０μｌ ３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに添加し、２０分間インキュベートした。５０μｌ ２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して反応を終結させた。４５０ｎｍにおける吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ ｉ３ｘ）で測定した。データをＯｒｉｇｉｎソフトウェアで分析した。結合曲線を作成し、非線形曲線フィッティングモデルロジスティックを用いてＫＤを算出した。
【0079】
ＴＣＦ－ｗｎｔ誘導性ルシフェラーゼ活性アッセイ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＴＯＰＦｌａｓｈ、ＦＯＰＦｌａｓｈ、Ｗｎｔ３ａ、及びＤＫＫ１構築物を含めた対応するプラスミドを共トランスフェクトした。等量のキャリアをトランスフェクションのたびに使用した。トランスフェクションの２４時間後に、培養培地を置き換えた。細胞を、１μＭの対応するアプタマー候補を含有する順化培養培地で処理した。阻害効果を判定するために、細胞を、勾配濃度を有するアプタマー候補で処理する。処理の２４時間後、細胞を１００μｌの溶解緩衝液で溶解し、２０μｌを分析のために採取した。阻害効果をプロトコール（デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って算出した。
【0080】
結合能アッセイ：トランスフェクションの４８時間後、培養培地を１５ｍｌ遠心分離チューブに回収し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。２ｍｌの上清を、３０μｌ ＮＴＡ磁気ビーズとともに室温で１時間インキュベートした（Ｓａｉｙｅｄ、Ｔｅｌａｎｇら、２００３）。ビーズをＰＢＳで２回洗浄することによって、結合していないタンパク質を除去することができる。その後、ビーズ－ＤＫＫ１複合体を、２０μｌの総容積で２５０ｎＭ ＦＡＭタグ付ａｐｔｄｋｋ５ｓとともに室温で４５分間インキュベートした。インキュベーションの後、ビーズ複合体をＰＢＳで２回洗浄して、結合していないＤＮＡを除去した。次いで、蛍光シグナルを倒立蛍光顕微鏡の下で検出した。
【0081】
ＤＮＡ検出：すべてのアプタマーサンプルのバンド密度を、モレキュラーイメージャー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって測定した（Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ、Ｎｏｌｔｅら１９９６、Ｓｉｌｌｅｒ－Ｍａｔｕｌａ、Ｍｅｒｈｉら２０１２）。
【0082】
実施例１：ＮＴＡ磁気ビーズに固定された組み換えＨｉｓ６－ＤＫＫ１
Ｎｉ－ＮＴＡ磁気アガロースビーズを５％（ｖ／ｖ）懸濁液で提供し、６×Ｈｉｓタグ付タンパク質へのＮｉ－ＮＴＡ磁気アガロースビーズの結合能は、懸濁液のミリリットルあたり３００μｇタンパク質（約２４ｋＤａ）であった。後続の第１ラウンドのＳＥＬＥＸにおいて磁気ビーズに０．２ｎｍｏｌのＤＫＫ１を固定するために、組み換えＨｉｓ６－ＤＫＫ１及びＮＴＡ磁気ビーズの量及び比を最適化した。０．８ｎｍｏｌタンパク質＋１０μｌ磁気ビーズ、０．６ｎｍｏｌタンパク質＋１０μｌ磁気ビーズ、０．４ｎｍｏｌタンパク質＋１０μｌ磁気ビーズ、０．８ｎｍｏｌタンパク質＋６μｌ磁気ビーズ、０．６ｎｍｏｌタンパク質＋６μｌ磁気ビーズ、及び０．４ｎｍｏｌタンパク質＋６μｌ磁気ビーズを４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、タンパク質－ビーズ複合体をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。結果によれば、最適な条件は、０．６ｎｍｏｌ Ｈｉｓ６－ＤＫＫ１及び６μＬ ＮＴＡアガロース磁気ビーズであった（図１）。それゆえ、そのような条件を以下の調査に使用した。
Ｎｉ－ＮＴＡ磁気アガロースビーズを５％（ｖ／ｖ）懸濁液で提供し、６×Ｈｉｓタグ付タンパク質へのＮｉ－ＮＴＡ磁気アガロースビーズの結合能は、懸濁液のミリリットルあたり３００μｇタンパク質（約２４ｋＤａ）であった。後続の第１ラウンドのＳＥＬＥＸにおいて磁気ビーズに０．２ｎｍｏｌのＤＫＫ１を固定するために、組み換えＨｉｓ６－ＤＫＫ１及びＮＴＡ磁気ビーズの量及び比を最適化した。０．８ｎｍｏｌタンパク質＋１０μｌ磁気ビーズ、０．６ｎｍｏｌタンパク質＋１０μｌ磁気ビーズ、０．４ｎｍｏｌタンパク質＋１０μｌ磁気ビーズ、０．８ｎｍｏｌタンパク質＋６μｌ磁気ビーズ、０．６ｎｍｏｌタンパク質＋６μｌ磁気ビーズ、及び０．４ｎｍｏｌタンパク質＋６μｌ磁気ビーズを４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、タンパク質－ビーズ複合体をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。結果によれば、最適な条件は、０．６ｎｍｏｌ Ｈｉｓ６－ＤＫＫ１及び６μＬ ＮＴＡアガロース磁気ビーズであった（図１）。それゆえ、そのような条件を以下の調査に使用した。
【0083】
実施例２：全長ＤＫＫ１を標的にするアプタマーのＳＥＬＥＸ
Ｈｉｓ６タグを有する組み換えヒトＤＫＫ－１をＮｉ－ＮＴＡ磁気ビーズに固定し、フォワード選択標的として使用した。ブランクＮｉ－ＮＴＡビーズ、及びＨｉｓ６タグを有する他のタンパク質を、陰性選択標的として使用した。フォワード選択の各ラウンド後に回収されたｓｓＤＮＡプールをＰＣＲによって増幅し、ｓｓＤＮＡ再生の前にアガロースゲル電気泳動によって検出した（図２）。ＰＣＲサイクルをモニターして、ＰＣＲにおける非特異的副産物を回避した。２０ラウンドのＳＥＬＥＸを実施した。
Ｈｉｓ６タグを有する組み換えヒトＤＫＫ－１をＮｉ－ＮＴＡ磁気ビーズに固定し、フォワード選択標的として使用した。ブランクＮｉ－ＮＴＡビーズ、及びＨｉｓ６タグを有する他のタンパク質を、陰性選択標的として使用した。フォワード選択の各ラウンド後に回収されたｓｓＤＮＡプールをＰＣＲによって増幅し、ｓｓＤＮＡ再生の前にアガロースゲル電気泳動によって検出した（図２）。ＰＣＲサイクルをモニターして、ＰＣＲにおける非特異的副産物を回避した。２０ラウンドのＳＥＬＥＸを実施した。
【0084】
実施例３：シーケンシングデータの分析
第１０ラウンド及び最終ラウンドのｓｓＤＮＡプールを次世代シーケンシングによってシーケンシングした。第１０ラウンドにおいて富化された配列はなく、一方で最終ラウンドには富化された配列が現れた（表１）。それゆえ、最も高い発生率を有する２０種の潜在的配列を、最終的に富化されたｓｓＤＮＡプールにおいて特定し、Ａｐｔｄｋｋ－１～２０と名付けた（表２）。クラスターオメガ（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｏｍｅｇａ）を使用した多重配列アライメント結果に従い、これらの配列を２つの群に分割することができた（図３）。第１の群は、明らかにグアニンに富み（赤色のボックスに示される）、一方で第２の群は、Ｇリッチでない配列であった（青色のボックスに示される）。
第１０ラウンド及び最終ラウンドのｓｓＤＮＡプールを次世代シーケンシングによってシーケンシングした。第１０ラウンドにおいて富化された配列はなく、一方で最終ラウンドには富化された配列が現れた（表１）。それゆえ、最も高い発生率を有する２０種の潜在的配列を、最終的に富化されたｓｓＤＮＡプールにおいて特定し、Ａｐｔｄｋｋ－１～２０と名付けた（表２）。クラスターオメガ（Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｏｍｅｇａ）を使用した多重配列アライメント結果に従い、これらの配列を２つの群に分割することができた（図３）。第１の群は、明らかにグアニンに富み（赤色のボックスに示される）、一方で第２の群は、Ｇリッチでない配列であった（青色のボックスに示される）。
【0085】
【表1】
【0086】
【表2】
【0087】
実施例４：Ｇ－群様態の予測
Ｇリッチな配列は、安定ならせん形状を有し、１本、２本、又は４本の鎖によって形成されることができるグアニンテトラッドを含有する、特別なＧ－４重鎖構造を典型的に形成した。次いで、Ｇリッチな配列を、潜在的Ｇ群のＱＧＲＳ、及び単分子４重鎖を形成するそれら配列の傾向についてのＧスコアによって分析した。通常、Ｇスコアを算出する場合、予測ＱＧＲＳにおけるギャップのサイズ及び分布を考慮した。より高いスコアを有する配列ほど、Ｇ－４重鎖のより優れた候補になることができた。分析結果によれば、これらすべての配列は、２本のＧ鎖を形成することができる２つのＧテトラッドを有した（表３）。Ｇスコアはすべて１９～２０前後であった。加えて、ギャップの分布は、同様のパターンで示された。安定なＧ－４重鎖を形成するそれら配列の能力は非常に同様であることが示された。
Ｇリッチな配列は、安定ならせん形状を有し、１本、２本、又は４本の鎖によって形成されることができるグアニンテトラッドを含有する、特別なＧ－４重鎖構造を典型的に形成した。次いで、Ｇリッチな配列を、潜在的Ｇ群のＱＧＲＳ、及び単分子４重鎖を形成するそれら配列の傾向についてのＧスコアによって分析した。通常、Ｇスコアを算出する場合、予測ＱＧＲＳにおけるギャップのサイズ及び分布を考慮した。より高いスコアを有する配列ほど、Ｇ－４重鎖のより優れた候補になることができた。分析結果によれば、これらすべての配列は、２本のＧ鎖を形成することができる２つのＧテトラッドを有した（表３）。Ｇスコアはすべて１９～２０前後であった。加えて、ギャップの分布は、同様のパターンで示された。安定なＧ－４重鎖を形成するそれら配列の能力は非常に同様であることが示された。
【0088】
【表3】
【0089】
実施例５：代表的なアプタマー候補の特異性
ＤＫＫ－１に対する１μＭの各アプタマー／ＲＳの特異性を、最も高い発生率を有する２０種の潜在的配列（表４）に関してＥＬＯＮＡによって判定し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出した。ブランク対照と比較して、候補３を除くアプタマー候補のほとんどは、有意により高い吸光度を示した（図４）。
ＤＫＫ－１に対する１μＭの各アプタマー／ＲＳの特異性を、最も高い発生率を有する２０種の潜在的配列（表４）に関してＥＬＯＮＡによって判定し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出した。ブランク対照と比較して、候補３を除くアプタマー候補のほとんどは、有意により高い吸光度を示した（図４）。
【0090】
【表4】
【0091】
実施例６：代表的なアプタマー候補の親和性
有意な特異性を有するアプタマー候補、及び陰性対照としての候補３を使用して、ＤＫＫ１に対する結合親和性を判定した。候補１、２、４、及び１４は、（０、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２０００ｎＭ、及び４０００ｎＭ）の濃度を有し、候補７、１０、１５、及び１６は、（０、２３．４４ｎＭ、４６．８６ｎＭ、９３．７５ｎＭ、１８７．５ｎＭ、３７５ｎＭ、７５０ｎＭ、及び１５００ｎＭ）の濃度を有し、他の候補は、（０、０．１８ｎＭ、０．７４ｎＭ、２．９６ｎＭ、１１．８４ｎＭ、４７．３５ｎＭ、１８９．３９ｎＭ、及び７５７．５８ｎＭ）の濃度を有した。各候補の結合曲線を、図５及び表５に示した。１１種のアプタマー候補は、ＤＫＫ１に対する高い親和性（低いＫｄ値）を示した。６種の候補（ａｐｔｄｋｋ－５、１３、２０、１９、６、及び１）はＧに富んでいた。他の５種の配列（ａｐｔｄｋｋ－９、１８、１２、１７、及び８）はＧに富んでいなかった。
有意な特異性を有するアプタマー候補、及び陰性対照としての候補３を使用して、ＤＫＫ１に対する結合親和性を判定した。候補１、２、４、及び１４は、（０、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ、２０００ｎＭ、及び４０００ｎＭ）の濃度を有し、候補７、１０、１５、及び１６は、（０、２３．４４ｎＭ、４６．８６ｎＭ、９３．７５ｎＭ、１８７．５ｎＭ、３７５ｎＭ、７５０ｎＭ、及び１５００ｎＭ）の濃度を有し、他の候補は、（０、０．１８ｎＭ、０．７４ｎＭ、２．９６ｎＭ、１１．８４ｎＭ、４７．３５ｎＭ、１８９．３９ｎＭ、及び７５７．５８ｎＭ）の濃度を有した。各候補の結合曲線を、図５及び表５に示した。１１種のアプタマー候補は、ＤＫＫ１に対する高い親和性（低いＫｄ値）を示した。６種の候補（ａｐｔｄｋｋ－５、１３、２０、１９、６、及び１）はＧに富んでいた。他の５種の配列（ａｐｔｄｋｋ－９、１８、１２、１７、及び８）はＧに富んでいなかった。
【0092】
【表5】
【0093】
実施例７：代表的なアプタマー候補の阻害効果
未処理群と比較して、ａｐｔｄｋｋ－５、１９、及び２０で処理された細胞は、より高いルシフェラーゼシグナルを示し、それらアプタマー候補が、ＤＫＫ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害を解放することができることを示した（図６）。しかしながら、他のアプタマー候補で処理された細胞は、未処理群と同様のルシフェラーゼシグナルを示した。それゆえ、ａｐｔｄｋｋ－５、１９、及び２０は、Ｗｎｔシグナル伝達に対するＤＫＫ１の拮抗効果を阻害することができた。
未処理群と比較して、ａｐｔｄｋｋ－５、１９、及び２０で処理された細胞は、より高いルシフェラーゼシグナルを示し、それらアプタマー候補が、ＤＫＫ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害を解放することができることを示した（図６）。しかしながら、他のアプタマー候補で処理された細胞は、未処理群と同様のルシフェラーゼシグナルを示した。それゆえ、ａｐｔｄｋｋ－５、１９、及び２０は、Ｗｎｔシグナル伝達に対するＤＫＫ１の拮抗効果を阻害することができた。
【0094】
実施例８：代表的なアプタマー候補の阻害効力
算出によれば、ａｐｔｄｋｋ－５の阻害効力はＩＣ５０＝７５４±２９ｎＭであり、ａｐｔｄｋｋ－２０の阻害効力はＩＣ５０＝１５０４±３９ｎＭであった。候補１９のデータは、試験された濃度のフィッティング曲線にフィットせず、より高いＩＣ５０を示した（図７）。この結果は、ａｐｔｄｋｋ－５及びａｐｔｄｋｋ－２０が両方とも、ＤＫＫ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害に対する阻害効果を示し、一方でａｐｔｄｋｋ－１９の効果が相対的に弱いことを示した。
算出によれば、ａｐｔｄｋｋ－５の阻害効力はＩＣ５０＝７５４±２９ｎＭであり、ａｐｔｄｋｋ－２０の阻害効力はＩＣ５０＝１５０４±３９ｎＭであった。候補１９のデータは、試験された濃度のフィッティング曲線にフィットせず、より高いＩＣ５０を示した（図７）。この結果は、ａｐｔｄｋｋ－５及びａｐｔｄｋｋ－２０が両方とも、ＤＫＫ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害に対する阻害効果を示し、一方でａｐｔｄｋｋ－１９の効果が相対的に弱いことを示した。
【0095】
実施例９：短縮ａｐｔｄｋｋ－５の特異性
ＤＫＫ－１に対する１００ｎＭ／１ｎＭの各アプタマー／ＲＳの特異性を、ａｐｔｄｋｋ５の２４種の短縮配列及び元のａｐｔｄｋｋ５（表６）に関してＥＬＯＮＡによって判定し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出した。濃度が１００ｎＭである場合、ａｐｔ５－１－３８、ａｐｔ５－１－３５、ａｐｔ５－１－６２、又はａｐｔ５－１－５９と元のａｐｔｄｋｋ５との間に、吸光度の有意な差又はわずかな差はなかった（図８ａ）。濃度が１ｎＭである場合、ａｐｔ５－１－５０、ａｐｔ５－１－４７、ａｐｔ５－１－４４、ａｐｔ５－１－４１、ａｐｔ５－１－３８、ａｐｔ５－１－３５、ａｐｔ５－１－６５、ａｐｔ５－１－６２、ａｐｔ５－１－５９、又はａｐｔ５－１－５３と元のａｐｔｄｋｋ５との間に、吸光度の有意な差又はわずかな差はなかった（図８ｂ）。これらアプタマーの特異性及び長さを考慮した後、ａｐｔ５－１－４４、ａｐｔ５－１－４１、ａｐｔ５－１－３８、及びａｐｔ５－１－３５を選択して、ＤＫＫ１に対する結合親和性を判定した。
ＤＫＫ－１に対する１００ｎＭ／１ｎＭの各アプタマー／ＲＳの特異性を、ａｐｔｄｋｋ５の２４種の短縮配列及び元のａｐｔｄｋｋ５（表６）に関してＥＬＯＮＡによって判定し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出した。濃度が１００ｎＭである場合、ａｐｔ５－１－３８、ａｐｔ５－１－３５、ａｐｔ５－１－６２、又はａｐｔ５－１－５９と元のａｐｔｄｋｋ５との間に、吸光度の有意な差又はわずかな差はなかった（図８ａ）。濃度が１ｎＭである場合、ａｐｔ５－１－５０、ａｐｔ５－１－４７、ａｐｔ５－１－４４、ａｐｔ５－１－４１、ａｐｔ５－１－３８、ａｐｔ５－１－３５、ａｐｔ５－１－６５、ａｐｔ５－１－６２、ａｐｔ５－１－５９、又はａｐｔ５－１－５３と元のａｐｔｄｋｋ５との間に、吸光度の有意な差又はわずかな差はなかった（図８ｂ）。これらアプタマーの特異性及び長さを考慮した後、ａｐｔ５－１－４４、ａｐｔ５－１－４１、ａｐｔ５－１－３８、及びａｐｔ５－１－３５を選択して、ＤＫＫ１に対する結合親和性を判定した。
【0096】
【表6】
【0097】
実施例１０：短縮ａｐｔｄｋｋ－５の親和性
有意な特異性を有するアプタマー候補（ａｐｔ５－１－４４、ａｐｔ５－１－４１、ａｐｔ５－１－３８、及びａｐｔ５－１－３５）、及び陽性対照としての元のａｐｔｄｋｋ５を使用して、ＤＫＫ１に対する結合親和性を判定した。元のａｐｔｄｋｋ５及びａｐｔ５－１－４４は、（０．１５６２５ｎＭ、０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、及び１００ｎＭ）の濃度を有し、ａｐｔ５－１－４１、ａｐｔ５－１－３８、及びａｐｔ５－１－３５は、（０、１．５６２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、及び５０ｎＭ）の濃度を有した。各候補の結合曲線を、図９に示した。１１種のアプタマー候補は、ＤＫＫ１に対する高い親和性（低いＫｄ値）を示した。これら４種の候補の中で、ａｐｔ５－１－３８は、ＤＫＫ１に対する最も高い親和性を示し、そのため、ａｐｔ５－１－３８をさらなる調査のための最適アプタマーとして選択した。
有意な特異性を有するアプタマー候補（ａｐｔ５－１－４４、ａｐｔ５－１－４１、ａｐｔ５－１－３８、及びａｐｔ５－１－３５）、及び陽性対照としての元のａｐｔｄｋｋ５を使用して、ＤＫＫ１に対する結合親和性を判定した。元のａｐｔｄｋｋ５及びａｐｔ５－１－４４は、（０．１５６２５ｎＭ、０．６２５ｎＭ、１．２５ｎＭ、２．５ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、及び１００ｎＭ）の濃度を有し、ａｐｔ５－１－４１、ａｐｔ５－１－３８、及びａｐｔ５－１－３５は、（０、１．５６２５ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、及び５０ｎＭ）の濃度を有した。各候補の結合曲線を、図９に示した。１１種のアプタマー候補は、ＤＫＫ１に対する高い親和性（低いＫｄ値）を示した。これら４種の候補の中で、ａｐｔ５－１－３８は、ＤＫＫ１に対する最も高い親和性を示し、そのため、ａｐｔ５－１－３８をさらなる調査のための最適アプタマーとして選択した。
【0098】
実施例１１：ＤＫＫ１との短縮Ａｐｔｄｋｋ５（Ａｐｔｄｋｋ５ｓ）の結合部位に関する調査
ＤＫＫ－１に対する特異性を、ａｐｔｄｋｋ５ｓの１３種の変異配列及び元のａｐｔｄｋｋ５ｓ（実施例１０におけるａｐｔ５－１－３８）（表７）に関して、１μＭの各アプタマー／ＲＳを用いてＥＬＯＮＡによって判定し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出した。ブランク対照と比較して、候補アプタマーのほとんど、とりわけａｐｔｄｋｋ５ｓ－３、ａｐｔｄｋｋ５ｓ－９、及びａｐｔｄｋｋ５ｓ－１１は、有意により低い吸光度を示し（図１０）、これらアプタマーの配列が、ＤＫＫ１とのａｐｔｄｋｋ５ｓの結合部位であることがあることを示した。ａｐｔｄｋｋ５ｓへのＤＫＫ１結合のドメインを特定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞トランスフェクションのための野生型ＤＫＫ１プラスミド又は３種の短縮ＤＫＫ１（配列番号７３の残基１～９１、１～１４２、及び１～１７８）プラスミドを、Ｈｉｓタグを有するベクターｐＣＳ２において構築することに成功した。タンパク質－ビーズ複合体をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動に適用し、ｐＣＳ２－ＤＫＫ１－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ（Ｓ４）、ｐＣＳ２－ＤＫＫ１－ΔＣ－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ（Ｓ３）、及びｐＣＳ２－ＤＫＫ１－ΔＣ＆Ｌ２－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ（Ｓ２）の発現を検証した（図１１）。蛍光画像結果によれば、ａｐｔｄｋｋ５ｓは全長ＤＫＫ１に有意に結合し、一方で大部分は他の短縮ＤＫＫ１に結合しなかったことがわかり、ＤＫＫ１のＣドメイン（１７８～２６６ａａ）が、ａｐｔｄｋｋ５ｓとのＤＫＫ１の結合ドメインであることがあることを示した（図１２）。
ＤＫＫ－１に対する特異性を、ａｐｔｄｋｋ５ｓの１３種の変異配列及び元のａｐｔｄｋｋ５ｓ（実施例１０におけるａｐｔ５－１－３８）（表７）に関して、１μＭの各アプタマー／ＲＳを用いてＥＬＯＮＡによって判定し、４５０ｎｍにおける吸光度を検出した。ブランク対照と比較して、候補アプタマーのほとんど、とりわけａｐｔｄｋｋ５ｓ－３、ａｐｔｄｋｋ５ｓ－９、及びａｐｔｄｋｋ５ｓ－１１は、有意により低い吸光度を示し（図１０）、これらアプタマーの配列が、ＤＫＫ１とのａｐｔｄｋｋ５ｓの結合部位であることがあることを示した。ａｐｔｄｋｋ５ｓへのＤＫＫ１結合のドメインを特定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞トランスフェクションのための野生型ＤＫＫ１プラスミド又は３種の短縮ＤＫＫ１（配列番号７３の残基１～９１、１～１４２、及び１～１７８）プラスミドを、Ｈｉｓタグを有するベクターｐＣＳ２において構築することに成功した。タンパク質－ビーズ複合体をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動に適用し、ｐＣＳ２－ＤＫＫ１－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ（Ｓ４）、ｐＣＳ２－ＤＫＫ１－ΔＣ－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ（Ｓ３）、及びｐＣＳ２－ＤＫＫ１－ΔＣ＆Ｌ２－Ｈｉｓ－ｆｌａｇ（Ｓ２）の発現を検証した（図１１）。蛍光画像結果によれば、ａｐｔｄｋｋ５ｓは全長ＤＫＫ１に有意に結合し、一方で大部分は他の短縮ＤＫＫ１に結合しなかったことがわかり、ＤＫＫ１のＣドメイン（１７８～２６６ａａ）が、ａｐｔｄｋｋ５ｓとのＤＫＫ１の結合ドメインであることがあることを示した（図１２）。
【0099】
【表7】
【0100】
実施例１２：化学修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの特異性及び親和性
ｄｋｋ５ｓ－２Ｇ－ｉｎｄＴ及びｄｋｋ５ｓ－ＯＭ－ｉｎｄＴを含めた、ａｐｔｄｋｋ５ｓのＩＤＴ修飾を以下の特徴付けに適用した。修飾された及び元のａｐｔｄｋｋ５ｓの両方とも、有意に高い吸光度を示し（＞２）、一方ですべての修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの吸光度は、元のａｐｔｄｋｋ５ｓのものよりもわずかに低く（図１３）、修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの特異性が非常に高いことを示した。その後、修飾されたアプタマー及び陽性対照としての元のａｐｔｄｋｋ５ｓを使用して、種々の濃度（０、１５．６２５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、及び１０００ｎＭ）を有するＤＫＫ１に対する結合親和性をＥＬＯＮＡによって判定した。修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓ（ｄｋｋ５ｓ－２Ｇ－ｉｎｄＴ及びｄｋｋ５ｓ－ＯＭ－ｉｎｄＴ）の両方とも、ＤＫＫ１に対する高い親和性を示したが、元のａｐｔｄｋｋ５ｓよりもわずかに低かった（より高いＫｄ値）（図１４）。
ｄｋｋ５ｓ－２Ｇ－ｉｎｄＴ及びｄｋｋ５ｓ－ＯＭ－ｉｎｄＴを含めた、ａｐｔｄｋｋ５ｓのＩＤＴ修飾を以下の特徴付けに適用した。修飾された及び元のａｐｔｄｋｋ５ｓの両方とも、有意に高い吸光度を示し（＞２）、一方ですべての修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの吸光度は、元のａｐｔｄｋｋ５ｓのものよりもわずかに低く（図１３）、修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの特異性が非常に高いことを示した。その後、修飾されたアプタマー及び陽性対照としての元のａｐｔｄｋｋ５ｓを使用して、種々の濃度（０、１５．６２５ｎＭ、３１．２５ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、及び１０００ｎＭ）を有するＤＫＫ１に対する結合親和性をＥＬＯＮＡによって判定した。修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓ（ｄｋｋ５ｓ－２Ｇ－ｉｎｄＴ及びｄｋｋ５ｓ－ＯＭ－ｉｎｄＴ）の両方とも、ＤＫＫ１に対する高い親和性を示したが、元のａｐｔｄｋｋ５ｓよりもわずかに低かった（より高いＫｄ値）（図１４）。
【0101】
実施例１３：化学修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの血清安定性
修飾された及び修飾されていないアプタマーの血清代謝安定性をＦＢＳにおいて評価した。アプタマーを、１０％及び１００％ＦＢＳで０～７２時間処理した（図１５）。元のａｐｔｄｋｋ５ｓは、１０％ＦＢＳにおいて１６時間インキュベートされた後に分解し始め、１００％ＦＢＳにおいて２時間から分解し始めた。Ｄｋｋ５ｓ－２Ｇ－ｉｎｄＴは、１０％ＦＢＳにおいて７２時間インキュベートされた後に分解し始め、１００％ＦＢＳにおいて８時間から分解し始めた。Ｄｋｋ５ｓ－ＯＭ－ｉｎｄＴは、１０％ＦＢＳにおいて４８時間インキュベートされた後に分解し始め、１００％ＦＢＳにおいて８時間から分解し始めた。要するに、修飾されていないａｐｔｄｋｋ５ｓと比較して、修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの血清安定性は有意に向上した。言い換えれば、ＩＤＴの３’逆位デオキシチミジン及びＯ－メチル修飾は両方とも、血清代謝安定性を増強した。
修飾された及び修飾されていないアプタマーの血清代謝安定性をＦＢＳにおいて評価した。アプタマーを、１０％及び１００％ＦＢＳで０～７２時間処理した（図１５）。元のａｐｔｄｋｋ５ｓは、１０％ＦＢＳにおいて１６時間インキュベートされた後に分解し始め、１００％ＦＢＳにおいて２時間から分解し始めた。Ｄｋｋ５ｓ－２Ｇ－ｉｎｄＴは、１０％ＦＢＳにおいて７２時間インキュベートされた後に分解し始め、１００％ＦＢＳにおいて８時間から分解し始めた。Ｄｋｋ５ｓ－ＯＭ－ｉｎｄＴは、１０％ＦＢＳにおいて４８時間インキュベートされた後に分解し始め、１００％ＦＢＳにおいて８時間から分解し始めた。要するに、修飾されていないａｐｔｄｋｋ５ｓと比較して、修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの血清安定性は有意に向上した。言い換えれば、ＩＤＴの３’逆位デオキシチミジン及びＯ－メチル修飾は両方とも、血清代謝安定性を増強した。
【0102】
実施例１４：化学修飾されたａｐｔｄｋｋ５ｓの阻害効力
細胞アッセイ結果によれば、上で記載される、修飾されたａｐｔｄｋｋ－５（ａｐｔｄｋｋ５－ＯＭ－ｉｎｄＴ）の阻害効力はＩＣ５０＝３８３±６４ｎＭであり、一方で元のａｐｔｄｋｋ－５の阻害効力はＩＣ５０＝７５４±２９ｎＭであった（図１６）。結果は、修飾されたａｐｔｄｋｋ－５が、ＤＫＫ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害に対するより高い阻害効果を有することを示した。
細胞アッセイ結果によれば、上で記載される、修飾されたａｐｔｄｋｋ－５（ａｐｔｄｋｋ５－ＯＭ－ｉｎｄＴ）の阻害効力はＩＣ５０＝３８３±６４ｎＭであり、一方で元のａｐｔｄｋｋ－５の阻害効力はＩＣ５０＝７５４±２９ｎＭであった（図１６）。結果は、修飾されたａｐｔｄｋｋ－５が、ＤＫＫ１によるＷｎｔシグナル伝達の阻害に対するより高い阻害効果を有することを示した。
【0103】
実施例１５：全長ＤＫＫ１に対するアプタマーのさらなるＳＥＬＥＸ
ＤＫＫ１に対する最後の２０ラウンドのＳＥＬＥＸについてのデータ分析によれば、２０ラウンドのＳＥＬＥＸの配列富化は不十分であった。それゆえ、ＤＫＫ１に対する付加的な１０ラウンドのＳＥＬＥＸを、よりストリンジェントな条件下で実施して、より優れた富化を有するｓｓＤＮＡプールを獲得した（図１７及び１８）。その後、１９種の潜在的配列を、第３０ラウンドにおいて富化されたｓｓＤＮＡライブラリーにおいて特定し、Ｄ３０－１～Ｄ３０－１９と名付けた（表８）。
ＤＫＫ１に対する最後の２０ラウンドのＳＥＬＥＸについてのデータ分析によれば、２０ラウンドのＳＥＬＥＸの配列富化は不十分であった。それゆえ、ＤＫＫ１に対する付加的な１０ラウンドのＳＥＬＥＸを、よりストリンジェントな条件下で実施して、より優れた富化を有するｓｓＤＮＡプールを獲得した（図１７及び１８）。その後、１９種の潜在的配列を、第３０ラウンドにおいて富化されたｓｓＤＮＡライブラリーにおいて特定し、Ｄ３０－１～Ｄ３０－１９と名付けた（表８）。
【0104】
【表8】
【0105】
実施例１６：第３０ラウンドにおける代表的なアプタマー候補の特異性及び親和性
ＤＫＫ－１に対する特異性を、第３０ラウンドにおいて最も高い発生率を有する１９種の潜在的配列に関して、１μＭの各アプタマー／ＲＳを用いてＥＬＯＮＡによって判定した。結果は、アプタマーのほとんどが、キャリアと比較して有意により高い吸光度を示し、一方で候補３、７、８、及び１２は、以前に特定されたアプタマーａｐｔｄｄｋ５ｓと比較してより高い吸光度を有することを示した（図１９）。次に、ＤＫＫ１に対する結合親和性を、候補アプタマーに関してＢＬＩによって判定した。ＤＫＫ１タンパク質を、０ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２００ｎＭの勾配濃度で適用した。候補５、６、及び１１を除いて（表９及び図２０）、高い親和性を有する１６種の候補が検出され、Ｋｄ値は１．６７ｎＭ～２３ｎＭであった。
ＤＫＫ－１に対する特異性を、第３０ラウンドにおいて最も高い発生率を有する１９種の潜在的配列に関して、１μＭの各アプタマー／ＲＳを用いてＥＬＯＮＡによって判定した。結果は、アプタマーのほとんどが、キャリアと比較して有意により高い吸光度を示し、一方で候補３、７、８、及び１２は、以前に特定されたアプタマーａｐｔｄｄｋ５ｓと比較してより高い吸光度を有することを示した（図１９）。次に、ＤＫＫ１に対する結合親和性を、候補アプタマーに関してＢＬＩによって判定した。ＤＫＫ１タンパク質を、０ｎＭ、３．１２５ｎＭ、６．２５ｎＭ、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、及び２００ｎＭの勾配濃度で適用した。候補５、６、及び１１を除いて（表９及び図２０）、高い親和性を有する１６種の候補が検出され、Ｋｄ値は１．６７ｎＭ～２３ｎＭであった。
【0106】
【表9】
【0107】
参考文献：
１． Ｈ Ｋａｇｅｙ Ｍ， Ｘｉ Ｈ． Ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１ ｆｏｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ （２０１７） １７４：４６３７－４６５０． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｐｈ．１３８９４
２． Ｄ’Ａｍｉｃｏ Ｌ， Ｍａｈａｊａｎ Ｓ， Ｃａｐｉｅｔｔｏ ＡＨ， Ｙａｎｇ Ｚ， Ｚａｍａｎｉ Ａ， Ｒｉｃｃｉ Ｂ， Ｂｕｍｐａｓｓ ＤＢ， Ｍｅｙｅｒ Ｍ， Ｓｕ Ｘ， Ｗａｎｇ－Ｇｉｌｌａｍ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （Ｄｋｋ１） ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ （２０１６） ２１３：８２７－８４０． ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１５０９５０
３． Ｍａｌｌａｄｉ Ｓ， ＭａｃＡｌｉｎａｏ ＤＧ， Ｊｉｎ Ｘ， Ｈｅ Ｌ， Ｂａｓｎｅｔ Ｈ， Ｚｏｕ Ｙ， Ｄｅ Ｓｔａｎｃｈｉｎａ Ｅ， Ｍａｓｓａｇｕｅ Ｊ． Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｌａｔｅｎｃｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｖａｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＷＮＴ． Ｃｅｌｌ （２０１６） １６５：４５－６０． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０２．０２５
４． Ａｒｅｎｄ Ｒ， Ｃａｓｔｒｏ Ｃ， Ｍａｔｕｌｏｎｉｓ Ｕ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｅ， Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ Ｃ， ＬｙＢａｒｇｅｒ Ｋ， Ｇｏｏｄｍａｎ Ｈ， Ｄｕｓｋａ Ｌ， Ｍａｈｄｉ Ｈ， ＥｌＮａｇｇａｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． ７６ Ｐａｔｉｅｎｔｓ （ＰＴＳ） ｗｉｔｈ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｗｈｏｓｅ ｔｕｍｏｒｓ ｈａｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｗｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｐｏｎｄ ｂｅｔｔｅｒ ｔｏ ＤＫＮ－０１， ａ ＤＩＣＫＫＯＰＦ－１ （ＤＫＫ１） ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ （２０１９） ２９：Ａ４０． ｄｏｉ：１０．１１３６／ｉｊｇｃ－２０１９－ｉｇｃｓ．７６
５． Ａｒｅｎｄ ＲＣ， Ｃａｓｔｒｏ ＣＭ， Ｍａｔｕｌｏｎｉｓ ＵＡ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｅ， Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ＣＣ， Ｌｙｂａｒｇｅｒ ＫＳＳ， Ｋａｇｅｙ Ｍ， Ｓｉｒａｒｄ Ｃ， Ｂｉｒｒｅｒ ＭＪ． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ＤＫＫ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （ＤＫＮ－０１） ａｓ ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｗｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ． Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ （２０１９） １５４：３４． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｇｙｎｏ．２０１９．０４．０８０
６． Ｊａｙａｓｅｎａ ＳＤ． Ａｐｔａｍｅｒｓ： Ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｒｉｖａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ （１９９９） ４５：１６２８－１６５０． ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃｌｉｎｃｈｅｍ／４５．９．１６２８
７． Ｂｏｙｌａｎ ＭＯ， Ａｔｈａｎａｓｓｉｏｕ Ｍ， Ｈｏｕｌｅ Ｂ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｚａｒｂｌ Ｈ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｎｏｎｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｒｅｖｅｒｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨｅＬａ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ （１９９６）
８． Ｌａｒｇｙ Ｅ， Ｍｅｒｇｎｙ Ｊ－Ｌ， Ｇａｂｅｌｉｃａ Ｖ． “Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｌｋａｌｉ Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎｓ ｉｎ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，” ｉｎ ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－３－３１９－２１７５６－７＿７
９． Ｒｏｕｔｈ ＥＤ， Ｃｒｅａｃｙ ＳＤ， Ｂｅｅｒｂｏｗｅｒ ＰＥ， Ａｋｍａｎ ＳＡ， Ｖａｕｇｈｎ ＪＰ， Ｓｍａｌｄｉｎｏ ＰＪ． Ａ Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ ＤＮＡ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｇ４ ｒｅｓｏｌｖａｓｅ１． Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ （２０１７） ｄｏｉ：１０．３７９１／５５４９６
１０． Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ ＷＩ， Ｋｌｕｇ Ａ． Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ＤＮＡ ｄｉｍｅｒｉｚｅｓ ｂｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕａｎｉｎｅ ｔｅｔｒａｄｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈａｉｒｐｉｎ ｌｏｏｐｓ． Ｎａｔｕｒｅ （１９８９） ｄｏｉ：１０．１０３８／３４２８２５ａ０
１． Ｈ Ｋａｇｅｙ Ｍ， Ｘｉ Ｈ． Ｒａｔｉｏｎａｌｅ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－１ ｆｏｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ． Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ （２０１７） １７４：４６３７－４６５０． ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｐｈ．１３８９４
２． Ｄ’Ａｍｉｃｏ Ｌ， Ｍａｈａｊａｎ Ｓ， Ｃａｐｉｅｔｔｏ ＡＨ， Ｙａｎｇ Ｚ， Ｚａｍａｎｉ Ａ， Ｒｉｃｃｉ Ｂ， Ｂｕｍｐａｓｓ ＤＢ， Ｍｅｙｅｒ Ｍ， Ｓｕ Ｘ， Ｗａｎｇ－Ｇｉｌｌａｍ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｃｋｋｏｐｆ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １ （Ｄｋｋ１） ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ （２０１６） ２１３：８２７－８４０． ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１５０９５０
３． Ｍａｌｌａｄｉ Ｓ， ＭａｃＡｌｉｎａｏ ＤＧ， Ｊｉｎ Ｘ， Ｈｅ Ｌ， Ｂａｓｎｅｔ Ｈ， Ｚｏｕ Ｙ， Ｄｅ Ｓｔａｎｃｈｉｎａ Ｅ， Ｍａｓｓａｇｕｅ Ｊ． Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｌａｔｅｎｃｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｖａｓｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＷＮＴ． Ｃｅｌｌ （２０１６） １６５：４５－６０． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１６．０２．０２５
４． Ａｒｅｎｄ Ｒ， Ｃａｓｔｒｏ Ｃ， Ｍａｔｕｌｏｎｉｓ Ｕ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｅ， Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ Ｃ， ＬｙＢａｒｇｅｒ Ｋ， Ｇｏｏｄｍａｎ Ｈ， Ｄｕｓｋａ Ｌ， Ｍａｈｄｉ Ｈ， ＥｌＮａｇｇａｒ Ａ， ｅｔ ａｌ． ７６ Ｐａｔｉｅｎｔｓ （ＰＴＳ） ｗｉｔｈ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｗｈｏｓｅ ｔｕｍｏｒｓ ｈａｖｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｗｎｔ ｐａｔｈｗａｙ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｒｅｓｐｏｎｄ ｂｅｔｔｅｒ ｔｏ ＤＫＮ－０１， ａ ＤＩＣＫＫＯＰＦ－１ （ＤＫＫ１） ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｉｎｔ Ｊ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｃａｎｃｅｒ （２０１９） ２９：Ａ４０． ｄｏｉ：１０．１１３６／ｉｊｇｃ－２０１９－ｉｇｃｓ．７６
５． Ａｒｅｎｄ ＲＣ， Ｃａｓｔｒｏ ＣＭ， Ｍａｔｕｌｏｎｉｓ ＵＡ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｅ， Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ ＣＣ， Ｌｙｂａｒｇｅｒ ＫＳＳ， Ｋａｇｅｙ Ｍ， Ｓｉｒａｒｄ Ｃ， Ｂｉｒｒｅｒ ＭＪ． Ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ ＤＫＫ１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ （ＤＫＮ－０１） ａｓ ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｗｎｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ． Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ （２０１９） １５４：３４． ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｇｙｎｏ．２０１９．０４．０８０
６． Ｊａｙａｓｅｎａ ＳＤ． Ａｐｔａｍｅｒｓ： Ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｒｉｖａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ （１９９９） ４５：１６２８－１６５０． ｄｏｉ：１０．１０９３／ｃｌｉｎｃｈｅｍ／４５．９．１６２８
７． Ｂｏｙｌａｎ ＭＯ， Ａｔｈａｎａｓｓｉｏｕ Ｍ， Ｈｏｕｌｅ Ｂ， Ｗａｎｇ Ｙ， Ｚａｒｂｌ Ｈ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｎｏｎｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｒｅｖｅｒｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＨｅＬａ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ （１９９６）
８． Ｌａｒｇｙ Ｅ， Ｍｅｒｇｎｙ Ｊ－Ｌ， Ｇａｂｅｌｉｃａ Ｖ． “Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｌｋａｌｉ Ｍｅｔａｌ Ｉｏｎｓ ｉｎ Ｇ－Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，” ｉｎ ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－３－３１９－２１７５６－７＿７
９． Ｒｏｕｔｈ ＥＤ， Ｃｒｅａｃｙ ＳＤ， Ｂｅｅｒｂｏｗｅｒ ＰＥ， Ａｋｍａｎ ＳＡ， Ｖａｕｇｈｎ ＪＰ， Ｓｍａｌｄｉｎｏ ＰＪ． Ａ Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ ＤＮＡ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ Ｇ４ ｒｅｓｏｌｖａｓｅ１． Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ （２０１７） ｄｏｉ：１０．３７９１／５５４９６
１０． Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ ＷＩ， Ｋｌｕｇ Ａ． Ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ＤＮＡ ｄｉｍｅｒｉｚｅｓ ｂｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕａｎｉｎｅ ｔｅｔｒａｄｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈａｉｒｐｉｎ ｌｏｏｐｓ． Ｎａｔｕｒｅ （１９８９） ｄｏｉ：１０．１０３８／３４２８２５ａ０
【0108】
配列表
配列番号１
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＴＴＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＣＴＴＡＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号２
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号３
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＡＡＣＴＧＴＣＣＧＡＣＧＣＧＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号４
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号５
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号６
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＴＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号７
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号８
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号９
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１０
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１１
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＣＣＣＴＣＴＧＴＡＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１２
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＣＣＣＣＴＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１３
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＧＴＡＴＣＧＴＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１４
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＣＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１５
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＣＧＴＴＣＡＧＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１６
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＣＧＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＣＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１７
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１８
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１９
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号２０
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＣＧＴＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号２１ Ａｐｔ５－４－７１
ＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２２ Ａｐｔ５－７－７１
ＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２３ Ａｐｔ５－１０－７１
ＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２４ Ａｐｔ５－１３－７１
ＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２５ Ａｐｔ５－１６－７１
ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２６ Ａｐｔ５－１９－７１
ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２７ Ａｐｔ５－１９－５３
ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧ
配列番号２８ Ａｐｔ５－２２－７１
ＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２９ Ａｐｔ５－２５－７１
ＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号３０ Ａｐｔ５－２８－７１
ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号３１ Ａｐｔ５－３１－７１
ＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号３２ Ａｐｔ５－３４－７１
ＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号３３ Ａｐｔ５－１－５０
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧ
配列番号３４ Ａｐｔ５－１－４７
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧ
配列番号３５ Ａｐｔ５－１－４４
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴ
配列番号３６ Ａｐｔ５－１－４１
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴ
配列番号３７ Ａｐｔ５－１－３８
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号３８ Ａｐｔ５－１－３５
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴ
配列番号３９ Ａｐｔ５－１－６８
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴ
配列番号４０ Ａｐｔ５－１－６５
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣ
配列番号４１ Ａｐｔ５－１－６２
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣ
配列番号４２ Ａｐｔ５－１－５９
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧ
配列番号４３ Ａｐｔ５－１－５６
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴ
配列番号４４ Ａｐｔ５－１－５３
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧ
配列番号４５
ＴＧＴＧＧＴＴＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＣＴＴＡＣＧＧＡ
配列番号４６
ＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧＴ
配列番号４７
ＴＡＡＣＴＧＴＣＣＧＡＣＧＣＧＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧ
配列番号４８
ＴＧＣＡＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
配列番号４９
ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧ
配列番号５０
ＣＣＧＧＴＴＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧ
配列番号５１
ＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＡ
配列番号５２
ＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＧＣＧ
配列番号５３
ＴＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＧ
配列番号５４
ＡＣＴＣＴＣＣＡＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＣ
配列番号５５
ＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＣＣＣＴＣＴＧＴＡＣＣＣＴＣＣＴＧ
配列番号５６
ＴＣＣＣＣＴＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣ
配列番号５７
ＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＧＴＡＴＣＧＴＴＴＧＡ
配列番号５８
ＣＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡ
配列番号５９
ＡＣＧＴＴＣＡＧＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＣＧ
配列番号６０
ＴＡＣＡＣＧＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＣＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧ
配列番号６１
ＴＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＣＡ
配列番号６２
ＴＣＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧ
配列番号６３
ＡＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＧ
配列番号６４
ＣＧＴＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧ
配列番号６５ ＱＧＲＳ－６
ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧ
配列番号６６ ＱＧＲＳ－２０
ＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ
配列番号６７ ＱＧＲＳ－１９
ＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧ
配列番号６８ ＱＧＲＳ－１４
ＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧ
配列番号６９ ＱＧＲＳ－１３
ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧ
配列番号７０ ＱＧＲＳ－５
ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧ
配列番号７１ ＱＧＲＳ－１
ＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ
配列番号７２ ＱＧＲＳ－２
ＧＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧ
配列番号７３ ヒトＤＫＫ１アミノ酸配列
ＭＭＡＬＧＡＡＧＡＴＲＶＦＶＡＭＶＡＡＡＬＧＧＨＰＬＬＧＶＳＡＴＬＮＳＶＬＮＳＮＡＩＫＮＬＰＰＰＬＧＧＡＡＧＨＰＧＳＡＶＳＡＡＰＧＩＬＹＰＧＧＮＫＹＱＴＩＤＮＹＱＰＹＰＣＡＥＤＥＥＣＧＴＤＥＹＣＡＳＰＴＲＧＧＤＡＧＶＱＩＣＬＡＣＲＫＲＲＫＲＣＭＲＨＡＭＣＣＰＧＮＹＣＫＮＧＩＣＶＳＳＤＱＮＨＦＲＧＥＩＥＥＴＩＴＥＳＦＧＮＤＨＳＴＬＤＧＹＳＲＲＴＴＬＳＳＫＭＹＨＴＫＧＱＥＧＳＶＣＬＲＳＳＤＣＡＳＧＬＣＣＡＲＨＦＷＳＫＩＣＫＰＶＬＫＥＧＱＶＣＴＫＨＲＲＫＧＳＨＧＬＥＩＦＱＲＣＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＳＲＬＨＴＣＱＲＨ
配列番号７４ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－１
ＡＡＡＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号７５ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－２
ＣＧＴＡＡＡＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号７６ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－３
ＣＧＴＡＣＧＡＡＡＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号７７ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－４
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＡＡＡＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号７８ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－５
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号７９ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－６
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号８０ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－７
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号８１ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－８
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号８２ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－９
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号８３ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－１０
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号８４ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－１１
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴ
配列番号８５ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－１２
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴ
配列番号８６ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－１３
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡ
配列番号８７ Ｄ３０－１
ＡＴＧＴＣＣＡＴＴＴＧＣＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＧＴＧＡ
配列番号８８ Ｄ３０－２
ＣＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＣＴＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号８９ Ｄ３０－３
ＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号９０ Ｄ３０－４
ＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＡＧＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
配列番号９１ Ｄ３０－５
ＡＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＧ
配列番号９２ Ｄ３０－６
ＴＣＡＧＴＧＴＣＧＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＴＡＣＧＣＧＣ
配列番号９３ Ｄ３０－７
ＴＧＴＡＧＡＴＡＧＡＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＣＣ
配列番号９４ Ｄ３０－８
ＴＧＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＣＴＡＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＣＧ
配列番号９５ Ｄ３０－９
ＣＴＧＴＴＣＴＡＡＣＧＴＧＧＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＧＡＣ
配列番号９６ Ｄ３０－１０
ＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＡＧＧＴＴＧＧＴＴＡＧＧＴＴＧＧＴＧＣ
配列番号９７ Ｄ３０－１１
ＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＧＴＡＴＣＧＴＴＴＧＡ
配列番号９８ Ｄ３０－１２
ＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＴＴＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧ
配列番号９９ Ｄ３０－１３
ＴＡＴＧＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号１００ Ｄ３０－１４
ＡＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＴＡＣＣＣＣＴＴＴＧＡ
配列番号１０１ Ｄ３０－１５
ＡＡＴＴＴＣＧＡＴＡＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号１０２ Ｄ３０－１６
ＡＴＧＴＡＡＡＴＣＧＡＴＴＣＣＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＧＣＴＴＴＡ
配列番号１０３ Ｄ３０－１７
ＣＡＧＴＣＴＴＡＧＴＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号１０４ Ｄ３０－１８
ＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＣＧＴＡＣＴＡＧＧＴＴＧＧＴＴＡＧＧＴＴＧＧＴＧＴ
配列番号１０５ Ｄ３０－１９
ＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号１
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＴＧＧＴＴＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＣＴＴＡＣＧＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号２
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号３
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＡＡＣＴＧＴＣＣＧＡＣＧＣＧＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号４
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号５
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号６
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＣＣＧＧＴＴＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号７
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号８
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号９
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１０
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１１
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＣＣＣＴＣＴＧＴＡＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１２
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＣＣＣＣＴＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１３
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＧＴＡＴＣＧＴＴＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１４
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＣＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１５
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＣＧＴＴＣＡＧＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１６
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＣＧＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＣＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１７
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１８
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号１９
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号２０
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＣＧＴＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＣＧＴＧ
配列番号２１ Ａｐｔ５－４－７１
ＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２２ Ａｐｔ５－７－７１
ＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２３ Ａｐｔ５－１０－７１
ＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２４ Ａｐｔ５－１３－７１
ＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２５ Ａｐｔ５－１６－７１
ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２６ Ａｐｔ５－１９－７１
ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２７ Ａｐｔ５－１９－５３
ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧ
配列番号２８ Ａｐｔ５－２２－７１
ＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号２９ Ａｐｔ５－２５－７１
ＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号３０ Ａｐｔ５－２８－７１
ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号３１ Ａｐｔ５－３１－７１
ＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号３２ Ａｐｔ５－３４－７１
ＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＣＧ
配列番号３３ Ａｐｔ５－１－５０
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧ
配列番号３４ Ａｐｔ５－１－４７
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧ
配列番号３５ Ａｐｔ５－１－４４
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴ
配列番号３６ Ａｐｔ５－１－４１
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴ
配列番号３７ Ａｐｔ５－１－３８
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号３８ Ａｐｔ５－１－３５
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴ
配列番号３９ Ａｐｔ５－１－６８
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴ
配列番号４０ Ａｐｔ５－１－６５
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣ
配列番号４１ Ａｐｔ５－１－６２
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧＧＴＣ
配列番号４２ Ａｐｔ５－１－５９
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴＡＣＧ
配列番号４３ Ａｐｔ５－１－５６
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧＣＧＴ
配列番号４４ Ａｐｔ５－１－５３
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧ
配列番号４５
ＴＧＴＧＧＴＴＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴＣＴＴＡＣＧＧＡ
配列番号４６
ＴＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴＴＧＧＣＧＧＴ
配列番号４７
ＴＡＡＣＴＧＴＣＣＧＡＣＧＣＧＴＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＴＣＣＣＧＣＣＧ
配列番号４８
ＴＧＣＡＣＧＣＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＣＧＴＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
配列番号４９
ＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＧ
配列番号５０
ＣＣＧＧＴＴＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＴＧ
配列番号５１
ＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＧＣＡ
配列番号５２
ＴＧＣＣＡＣＣＣＣＴＧＴＴＴＴＣＣＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＧＡＣＣＧＣＧ
配列番号５３
ＴＡＣＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＴＴＣＴＡＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＴＧＣＧ
配列番号５４
ＡＣＴＣＴＣＣＡＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴＴＧＣ
配列番号５５
ＣＡＴＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＴＴＡＴＴＣＣＣＴＣＴＧＴＡＣＣＣＴＣＣＴＧ
配列番号５６
ＴＣＣＣＣＴＣＡＴＡＡＴＣＣＧＡＣＴＴＴＴＴＣＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣ
配列番号５７
ＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＧＴＡＴＣＧＴＴＴＧＡ
配列番号５８
ＣＴＧＴＧＣＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＴＴＡＴＧＧＴＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡ
配列番号５９
ＡＣＧＴＴＣＡＧＡＴＡＣＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＴＴＧＴＴＣＴＧＣＣＧ
配列番号６０
ＴＡＣＡＣＧＣＣＡＴＣＧＧＴＧＣＣＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧ
配列番号６１
ＴＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＣＡ
配列番号６２
ＴＣＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＧＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧ
配列番号６３
ＡＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＧ
配列番号６４
ＣＧＴＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧ
配列番号６５ ＱＧＲＳ－６
ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＧＧ
配列番号６６ ＱＧＲＳ－２０
ＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ
配列番号６７ ＱＧＲＳ－１９
ＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧ
配列番号６８ ＱＧＲＳ－１４
ＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧ
配列番号６９ ＱＧＲＳ－１３
ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧ
配列番号７０ ＱＧＲＳ－５
ＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧ
配列番号７１ ＱＧＲＳ－１
ＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧ
配列番号７２ ＱＧＲＳ－２
ＧＧＴＧＧＧＴＴＧＧＴＧＧＧ
配列番号７３ ヒトＤＫＫ１アミノ酸配列
ＭＭＡＬＧＡＡＧＡＴＲＶＦＶＡＭＶＡＡＡＬＧＧＨＰＬＬＧＶＳＡＴＬＮＳＶＬＮＳＮＡＩＫＮＬＰＰＰＬＧＧＡＡＧＨＰＧＳＡＶＳＡＡＰＧＩＬＹＰＧＧＮＫＹＱＴＩＤＮＹＱＰＹＰＣＡＥＤＥＥＣＧＴＤＥＹＣＡＳＰＴＲＧＧＤＡＧＶＱＩＣＬＡＣＲＫＲＲＫＲＣＭＲＨＡＭＣＣＰＧＮＹＣＫＮＧＩＣＶＳＳＤＱＮＨＦＲＧＥＩＥＥＴＩＴＥＳＦＧＮＤＨＳＴＬＤＧＹＳＲＲＴＴＬＳＳＫＭＹＨＴＫＧＱＥＧＳＶＣＬＲＳＳＤＣＡＳＧＬＣＣＡＲＨＦＷＳＫＩＣＫＰＶＬＫＥＧＱＶＣＴＫＨＲＲＫＧＳＨＧＬＥＩＦＱＲＣＹＣＧＥＧＬＳＣＲＩＱＫＤＨＨＱＡＳＮＳＳＲＬＨＴＣＱＲＨ
配列番号７４ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－１
ＡＡＡＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号７５ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－２
ＣＧＴＡＡＡＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号７６ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－３
ＣＧＴＡＣＧＡＡＡＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号７７ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－４
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＡＡＡＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号７８ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－５
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号７９ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－６
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＡＡＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号８０ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－７
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＡＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号８１ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－８
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号８２ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－９
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号８３ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－１０
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＡＡＴＧＧＧＴＧＧＴ
配列番号８４ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－１１
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＴ
配列番号８５ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－１２
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＡＡＧＴ
配列番号８６ Ａｐｔｄｋｋ５ｓ－１３
ＣＧＴＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＡＡ
配列番号８７ Ｄ３０－１
ＡＴＧＴＣＣＡＴＴＴＧＣＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＴＧＡＧＧＴＧＡ
配列番号８８ Ｄ３０－２
ＣＡＴＴＧＴＣＴＣＡＧＣＧＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＣＴＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号８９ Ｄ３０－３
ＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＣＴＣＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号９０ Ｄ３０－４
ＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＴＡＣＧＴＧＡＴＴＣＴＡＧＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＣＧ
配列番号９１ Ｄ３０－５
ＡＴＡＧＧＴＴＧＧＧＴＡＧＧＴＴＧＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＧＴＣＧＣＧ
配列番号９２ Ｄ３０－６
ＴＣＡＧＴＧＴＣＧＴＡＡＡＧＴＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＣＴＴＴＡＣＧＣＧＣ
配列番号９３ Ｄ３０－７
ＴＧＴＡＧＡＴＡＧＡＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧＣＧＣＴＡＴＣＣ
配列番号９４ Ｄ３０－８
ＴＧＣＡＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＧＡＴＴＣＴＡＴＧＣＴＣＧＧＣＣＧＣＧ
配列番号９５ Ｄ３０－９
ＣＴＧＴＴＣＴＡＡＣＧＴＧＧＴＴＧＡＣＣＣＣＣＣＴＴＴＧＣＴＴＴＧＡＣ
配列番号９６ Ｄ３０－１０
ＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＧＧＣＴＡＧＧＴＴＧＧＴＴＡＧＧＴＴＧＧＴＧＣ
配列番号９７ Ｄ３０－１１
ＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＴＴＧＴＡＴＣＧＴＴＴＧＡ
配列番号９８ Ｄ３０－１２
ＴＣＧＴＧＣＴＴＧＡＴＴＣＣＡＴＧＣＴＴＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＴＣＧＴＧ
配列番号９９ Ｄ３０－１３
ＴＡＴＧＧＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号１００ Ｄ３０－１４
ＡＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＴＡＣＣＣＣＴＴＴＧＡ
配列番号１０１ Ｄ３０－１５
ＡＡＴＴＴＣＧＡＴＡＧＴＣＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号１０２ Ｄ３０－１６
ＡＴＧＴＡＡＡＴＣＧＡＴＴＣＣＴＣＴＧＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＧＣＴＴＴＡ
配列番号１０３ Ｄ３０－１７
ＣＡＧＴＣＴＴＡＧＴＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＴＴＧＴＧＴＧＴ
配列番号１０４ Ｄ３０－１８
ＴＣＴＧＣＴＴＴＣＡＣＧＴＡＣＴＡＧＧＴＴＧＧＴＴＡＧＧＴＴＧＧＴＧＴ
配列番号１０５ Ｄ３０－１９
ＴＡＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＧＴＧＴＴＧＴＧＴＧＴ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＤＫＫ１に対するアプタマーであって、ｉ）配列番号１～２０のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか；又は
ｉｉ）配列番号１～２０のいずれか１つの中の少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、若しくはそれを上回る数の連続ヌクレオチドを含むか；又は
ｉｉｉ）配列番号４５～６４のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むか；又は
ｉｖ）配列番号８７～１０５のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、
ＤＫＫ１に特異的に結合する、アプタマー。
【請求項2】
配列番号１～６４及び８７～１０５のいずれか１つの配列を含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項3】
配列番号５、２０、３５～３８、４９、又は６４に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項4】
３５０ｎＭ未満の、ＤＫＫ１に対するＫｄを有する、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項5】
ＤＫＫ１の生物学的活性を阻害することができる、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項6】
細胞ベースのＷｎｔシグナル伝達アッセイにおいてＤＫＫ１の拮抗効果を遮断することができる、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項7】
ＤＫＫ１の生物学的活性を阻害することに対して、２０００ｎＭ未満のＩＣ５０値を有する、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項8】
増強したヌクレアーゼ耐性を前記アプタマーに付与する及び／又は前記アプタマーのインビボ半減期を増強する１種又は複数の修飾を含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項9】
２’－メトキシ（２’－ＯＭｅ）修飾及び３’逆位デオキシチミジン（３’ｉｄＴ）修飾を含む、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＫＫ１に対するアプタマーの治療有効量を含む、ＤＫＫ１関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項11】
前記ＤＫＫ１関連疾患が、ＤＫＫ１関連がん並びにその任意の転移である、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記ＤＫＫ１関連疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、虚血性骨壊死、関節リウマチ、骨折、変形性関節症、及び骨髄腫から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項13】
請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＫＫ１に対する少なくとも１種のアプタマー、及び薬学的に許容できるキャリア又は賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項14】
ＤＫＫ１関連疾患を治療するための医薬の調製における、請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＫＫ１に対するアプタマーの、使用。
【請求項15】
前記ＤＫＫ１関連疾患が、ＤＫＫ１関連がん並びにその任意の転移である、請求項１４に記載の使用。
【請求項16】
前記ＤＫＫ１関連疾患が、骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症（ＯＩ）、虚血性骨壊死、関節リウマチ、骨折、変形性関節症、及び骨髄腫から選択される、請求項１４に記載の使用。
【国際調査報告】