特表 2024-535249 合成ヒト化ラマナノボディライブラリーおよびＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２中和抗体を同定するためのその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-30

(54)【発明の名称】合成ヒト化ラマナノボディライブラリーおよびＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２中和抗体を同定するためのその使用

(51)【国際特許分類】

   C40B 40/10 20060101AFI20240920BHJP

   C07K 16/10 20060101ALI20240920BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240920BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240920BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240920BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240920BHJP

   G01N 33/569 20060101ALI20240920BHJP

   G01N 33/577 20060101ALI20240920BHJP

【ＦＩ】

C40B40/10 ZNA

C07K16/10

C07K16/46

C07K19/00

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12P21/08

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 S

A61P31/14

G01N33/569 L

G01N33/577 B

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516630

(86)(22)【出願日】2022-09-09

(85)【翻訳文提出日】2024-05-07

(86)【国際出願番号】 US2022076221

(87)【国際公開番号】W WO2023044272

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】63/245,512

(32)【優先日】2021-09-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514144836

【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】フー， イン

(72)【発明者】

【氏名】フレミング， ブライアン ディー．

(72)【発明者】

【氏名】レン， アレックス

(72)【発明者】

【氏名】ホール， マシュー ディー．

(72)【発明者】

【氏名】シメオノフ， アントン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C085AA14

4C085BA71

4C085BB31

4C085CC23

4C085DD61

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045BA52

4H045BA70

4H045BA71

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA53

4H045FA74

4H045GA21

(57)【要約】

ヒト化ラマナノボディフレームワーク配列を使用して合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーを産生するための方法、当該方法によって入手可能なライブラリー、および当該ライブラリーから選択された抗体が記載されている。特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質に特異的に結合し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を中和する合成シングルドメインモノクローナル抗体が記載されている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の検出、予防および処置のための開示されている抗体の使用が記載されている。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーを作製する方法であって、合成シングルドメインモノクローナル抗体のそれぞれのフレームワーク（ＦＲ）コード領域の間の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をコードする核酸分子の多様性を導入して、同じ合成シングルドメインモノクローナル抗体足場アミノ酸配列を有する合成シングルドメインモノクローナル抗体の多様性をコードする核酸分子を生成するステップを含み、前記合成シングルドメインモノクローナル抗体足場が、配列番号１を含むＦＲ１配列、配列番号２を含むＦＲ２配列、配列番号３を含むＦＲ３配列および配列番号４を含むＦＲ４配列を含む、方法。

【請求項2】

ＣＤＲ１が、５～８残基の長さであり、前記ＣＤＲ１配列のアミノ酸残基が、次の法則：
ＣＤＲ１の１位は、Ｇであり、
ＣＤＲ１の２位は、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＹであり、
ＣＤＲ１の３位は、Ｉであり、
ＣＤＲ１の４位は、ＦまたはＳであり、
ＣＤＲ１の５位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
ＣＤＲ１の６、７および／または８位は、存在する場合、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮおよびＱから個々に選択される、
に従って決定される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＣＤＲ２が、９残基の長さであり、前記ＣＤＲ２配列のアミノ酸残基が、次の法則：
ＣＤＲ２の１位は、Ｉであり、
ＣＤＲ２の２位は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＴであり、
ＣＤＲ２の３位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
ＣＤＲ２の４位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
ＣＤＲ２の５位は、Ｇであり、
ＣＤＲ２の６位は、Ａ、Ｇ、ＳまたはＴであり、
ＣＤＲ２の７位は、Ｉ、Ｎ、ＳまたはＴであり、
ＣＤＲ２の８位は、Ｔであり、
ＣＤＲ２の９位は、ＮまたはＹである、
に従って決定される、請求項１または請求項２に記載の方法。

【請求項4】

ＣＤＲ３が、１４～２０アミノ酸の長さであり、各位置が、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮおよびＱから個々に選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

ＣＤＲ１の５位、存在する場合のＣＤＲ１の６位、存在する場合のＣＤＲ１の７位、存在する場合のＣＤＲ１の８位、ＣＤＲ２の３位、ＣＤＲ２の４位およびＣＤＲ３の各位置のそれぞれのアミノ酸組成が、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

請求項１から５のいずれか一項に記載の方法によって入手可能な合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリー。

【請求項7】

少なくとも１０^１０種の特有の抗体配列を含む、請求項６に記載の合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリー。

【請求項8】

目的の標的に結合する合成シングルドメインモノクローナル抗体を同定するためのスクリーニング方法であって、請求項６または請求項７に記載の合成シングルドメイン抗体ライブラリーの使用を含むスクリーニング方法。

【請求項9】

前記目的の標的が、ウイルス抗原である、請求項８に記載のスクリーニング方法。

【請求項10】

前記ウイルス抗原が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質である、請求項９に記載のスクリーニング方法。

【請求項11】

ファージディスプレイ方法である、請求項８から１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。

【請求項12】

次式：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（式中、
ＦＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１を含み、
ＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２を含み、
ＦＲ３のアミノ酸配列は、配列番号３を含み、
ＦＲ４のアミノ酸配列は、配列番号４を含む）
を有するシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項13】

ＣＤＲ１が、５～８残基の長さであり、前記ＣＤＲ１配列のアミノ酸残基が、次の法則：
ＣＤＲ１の１位は、Ｇであり、
ＣＤＲ１の２位は、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＹであり、
ＣＤＲ１の３位は、Ｉであり、
ＣＤＲ１の４位は、ＦまたはＳであり、
ＣＤＲ１の５位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
ＣＤＲ１の６、７および／または８位は、存在する場合、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱからランダムに選択される、
に従って決定される、請求項１２に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項14】

ＣＤＲ２が、９残基の長さであり、前記ＣＤＲ２配列のアミノ酸残基が、次の法則：
ＣＤＲ２の１位は、Ｉであり、
ＣＤＲ２の２位は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＴであり、
ＣＤＲ２の３位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
ＣＤＲ２の４位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり、
ＣＤＲ２の５位は、Ｇであり、
ＣＤＲ２の６位は、Ａ、Ｇ、ＳまたはＴであり、
ＣＤＲ２の７位は、Ｉ、Ｎ、ＳまたはＴであり、
ＣＤＲ２の８位は、Ｔであり、
ＣＤＲ２の９位は、ＮまたはＹである、
に従って決定される、請求項１２または請求項１３に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項15】

ＣＤＲ３が、１４～２０アミノ酸の長さであり、各位置が、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱからランダムに選択される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項16】

ＣＤＲ１の５位、存在する場合のＣＤＲ１の６位、存在する場合のＣＤＲ１の７位、存在する場合のＣＤＲ１の８位、ＣＤＲ２の３位、ＣＤＲ２の４位およびＣＤＲ３の各位置のそれぞれのアミノ酸が、次のパーセンテージ：１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑで選択される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項17】

請求項１２から１６のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体をコードする核酸分子。

【請求項18】

プロモーターに作動可能に連結された、請求項１７に記載の核酸分子。

【請求項19】

請求項１７または請求項１８に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項20】

請求項１７もしくは請求項１８に記載の核酸分子または請求項１９に記載のベクターを含む、単離された宿主細胞。

【請求項21】

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）スパイクタンパク質に特異的に結合するシングルドメインモノクローナル抗体であって、配列番号５の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含むシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項22】

前記ＣＤＲ配列が、ＫａｂａｔまたはＩＭＧＴ慣例を使用して定義される、請求項２１に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項23】

前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列がそれぞれ、配列番号５の残基２６～３２、５０～５８および９７～１１０を含む、請求項２１または請求項２２に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項24】

アミノ酸配列が、配列番号５と少なくとも９０％同一であり、配列番号５の残基２６～３２、５０～５８および９７～１１０を含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項25】

フレームワーク領域１（ＦＲ１）、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含み、
ＦＲ１のアミノ酸配列が、配列番号１を含む、
ＦＲ２のアミノ酸配列が、配列番号２を含む、
ＦＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３を含む、および／または
ＦＲ４のアミノ酸配列が、配列番号４を含む、
請求項２１から２４のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項26】

前記抗体のアミノ酸配列が、配列番号５を含むかまたはそれからなる、請求項２１から２５のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項27】

ヒト化抗体である、請求項２１から２６のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項28】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する、請求項２１から２７のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項29】

検出可能な標識にコンジュゲートされた、請求項２１から２８のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体。

【請求項30】

請求項２１から２９のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体と、異種タンパク質とを含む融合タンパク質。

【請求項31】

前記異種タンパク質が、ヒトＦｃタンパク質を含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。

【請求項32】

前記ヒトＦｃタンパク質が、前記融合タンパク質の半減期を増加させる修飾を含む、請求項３１に記載の融合タンパク質。

【請求項33】

前記修飾が、新生児Ｆｃ受容体への結合を増加させる、請求項３２に記載の融合タンパク質。

【請求項34】

前記異種タンパク質が、タンパク質タグを含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。

【請求項35】

前記タンパク質タグのアミノ酸配列が、配列番号６を含むかまたはそれからなる、請求項３４に記載の融合タンパク質。

【請求項36】

請求項２１から２９のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体を含む二価抗体。

【請求項37】

請求項２１から２９のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体を含む三価単鎖Ｆｖ。

【請求項38】

請求項２１から２９のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体を含む二重特異性抗体。

【請求項39】

請求項２１から２９のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３６に記載の二価抗体、請求項３７に記載の三価単鎖Ｆｖまたは請求項３８に記載の二重特異性抗体をコードする核酸分子。

【請求項40】

プロモーターに作動可能に連結された、請求項３９に記載の核酸分子。

【請求項41】

請求項３９または請求項４０に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項42】

請求項３９もしくは請求項４０に記載の核酸分子または請求項４１に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項43】

薬学的に許容される担体と、請求項２１から２９のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３６に記載の二価抗体、請求項３７に記載の三価単鎖Ｆｖ、請求項３８に記載の二重特異性抗体、請求項３９もしくは請求項４０に記載の核酸分子または請求項４１に記載のベクターとを含む組成物。

【請求項44】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的に結合するシングルドメインモノクローナル抗体を産生する方法であって、
宿主細胞において請求項２１から２９のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体をコードする核酸分子を発現させるステップと、
前記シングルドメインモノクローナル抗体を精製するステップと
を含む方法。

【請求項45】

対象由来の生体試料におけるコロナウイルスの存在を検出する方法であって、
免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、前記生体試料を、有効量の請求項２１から２９のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体と接触させるステップと、
前記生体試料における前記免疫複合体の存在を検出するステップであって、前記生体試料における前記免疫複合体の存在が、前記試料における前記コロナウイルスの存在を指し示す、ステップと
を含む方法。

【請求項46】

前記生体試料における前記免疫複合体の存在を検出するステップが、前記対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有することを指し示す、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

対象におけるコロナウイルス感染を阻害する方法であって、有効量の請求項２１から２９のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３６に記載の二価抗体、請求項３７に記載の三価単鎖Ｆｖ、請求項３８に記載の二重特異性抗体、請求項３９もしくは請求項４０に記載の核酸分子、請求項４１に記載のベクターまたは請求項４３に記載の組成物を投与するステップを含み、前記対象が、コロナウイルス感染を有するかまたはそのリスクがある、方法。

【請求項48】

前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

対象におけるコロナウイルス感染を阻害するための、または生体試料におけるコロナウイルスの存在を検出するための、請求項２１から２９のいずれか一項に記載のシングルドメインモノクローナル抗体、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項３６に記載の二価抗体、請求項３７に記載の三価単鎖Ｆｖ、請求項３８に記載の二重特異性抗体、請求項３９もしくは請求項４０に記載の核酸分子、請求項４１に記載のベクターまたは請求項４３に記載の組成物の使用。

【請求項50】

前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項４９に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２４５，５１２号に基づく利益を主張している。

【0002】

分野
本開示は、ヒト化ラマナノボディフレームワーク領域およびランダム化された相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーに関する。本開示はさらに、当該ライブラリーから同定されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
重症急性呼吸器症候群－コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）パンデミックは、医療制度に重い負荷を課す世界的な緊急事態を生じ、驚異的な数の死亡をもたらした。科学界は、防御免疫を付与する有効なワクチンを開発しようと前例のない迅速さで応じた。ワクチン接種は、入院者数を低減させるが、エスケープバリアントの出現および進行中のウイルス伝染の可能性がある。よって、依然として、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および他の新興のパンデミック脅威に対する有効な治療薬を同定することができる対費用効果の高い、ハイスループットで、適応可能なパイプラインの必要が継続してある。

【0004】

宿主細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２侵入は、エンベロープ繋留スパイク（Ｓ）糖タンパク質に頼る。この大型の三量体クラスＩタンパク質は、ウイルス表面を密に装飾し、宿主アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を認識し、ウイルス侵入に必要とされる融合機構を含有する。バイオジェネシスの際に、キノコ形の三量体における各Ｓプロトマーは、細胞のフューリンによって、それぞれ標的認識および融合の原因となるＳ１およびＳ２サブユニットへと切断される。各Ｎ末端Ｓ１サブユニットは、宿主細胞におけるＡＣＥ２を標的化する受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有する。ＲＢＤはヒンジに接続され、これにより、それが、ＡＣＥ２に結合することができる「アップ」状態と、受容体との相互作用が隣接ＲＢＤの近接によって邪魔される「ダウン」状態との間を移行することが可能となる。「アップ」位置における受容体結合は、柄を形成する（stalk forming）Ｓ２プロトマーのＴＭＰＲＳＳ２媒介性切断を含む事象のカスケードを誘起して、長軸方向３ヘリックス束の各Ｎ末端側の端における疎水性融合ペプチド（ＦＰ）が露わになる。標的細胞の膜へのＦＰの挿入に続いて大規模な構造再編成が行われ、それとウイルスエンベロープとの並置（apposition）をもたらし、これにより、それらの融合が生じる。この標的化／融合装置における突然変異は、ウイルス感染力の増加への関与が示唆されてきた。ウイルストロピズムのドライバーとして、表面露出Ｓタンパク質のＲＢＤは、中和抗体および免疫原の開発に関する強い関心の焦点である。ＲＢＤ内の鍵となる接触残基の１つであるＮ５０１がＮ５０１Ｙへと突然変異した、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複数のバリアントが独立して生じている。この突然変異は、ヒトＡＣＥ２への結合親和性を増加させる。このようなバリアントは、伝染率の増加および抗体中和の低減に関連付けられてきた、スパイクにおける複数の突然変異を有する。循環するバリアントに対して有効な改善されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体と同様に、抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに結合する仕方に関する構造的な洞察が依然として必要とされる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

要旨
本開示は、ヒト化ラマナノボディフレームワーク配列およびランダム化された多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）配列に由来する合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーの生成について記載する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質への高親和性結合に基づきライブラリーから選択されたシングルドメインモノクローナル抗体についても記載する。

【0006】

合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーを作製する方法が本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、方法は、合成シングルドメインモノクローナル抗体のそれぞれのフレームワーク（ＦＲ）コード領域の間の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をコードする核酸分子の多様性を導入して、同じ合成シングルドメインモノクローナル抗体足場アミノ酸配列を有する合成シングルドメインモノクローナル抗体の多様性をコードする核酸分子を生成するステップを含む。一部の例では、合成シングルドメインモノクローナル抗体足場は、配列番号１を含むＦＲ１配列、配列番号２を含むＦＲ２配列、配列番号３を含むＦＲ３配列および配列番号４を含むＦＲ４配列を含む。開示されている方法によって入手可能な合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーがさらに提供される。

【0007】

目的の標的に結合する合成シングルドメインモノクローナル抗体を同定するためのスクリーニング方法も提供される。一部のインプリメンテーションでは、方法は、本明細書に開示される合成シングルドメイン抗体ライブラリーの使用を含む。

【0008】

次式：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（式中、ＦＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１を含む；ＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２を含む；ＦＲ３のアミノ酸配列は、配列番号３を含む；および／またはＦＲ４のアミノ酸配列は、配列番号４を含む）を有するシングルドメインモノクローナル抗体がさらに本明細書に提供される。シングルドメインモノクローナル抗体をコードする核酸分子およびベクター、ならびに核酸分子またはベクターを含む単離された宿主細胞がさらに提供される。

【0009】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的に結合するシングルドメインモノクローナル抗体も本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、抗体は、抗体ＲＢＤ－１－２ＧのＣＤＲ配列を含む。一部の例では、抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和することができる。

【0010】

検出可能なマーカーにコンジュゲートされたシングルドメインモノクローナル抗体がさらに提供される。

【0011】

本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体と、Ｆｃタンパク質、例えば、ヒトＦｃタンパク質等の異種タンパク質とを含む融合タンパク質も提供される。本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体を含む二価抗体および三価単鎖Ｆｖ抗体がさらに提供される。開示されているシングルドメインモノクローナル抗体と、異なる抗原またはエピトープに特異的な第２の抗体（または抗原結合性断片）とを含む二重特異性モノクローナル抗体も提供される。

【0012】

本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体をコードする核酸分子がさらに提供される。一部のインプリメンテーションでは、核酸分子は、異種プロモーター等のプロモーターに作動可能に連結される。開示されている核酸分子を含むベクター、およびそのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。

【0013】

薬学的に許容される担体と、本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、核酸分子またはベクターとを含む組成物も提供される。

【0014】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的に結合するシングルドメインモノクローナル抗体を産生する方法がさらに提供される。一部のインプリメンテーションでは、方法は、宿主細胞において開示されているシングルドメインモノクローナル抗体をコードする核酸分子を発現させるステップと、シングルドメインモノクローナル抗体を精製するステップとを含む。

【0015】

対象由来の生体試料におけるコロナウイルスの存在を検出する方法も提供される。一部のインプリメンテーションでは、方法は、免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、生体試料を、有効量の本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体と接触させるステップと、生体試料における免疫複合体の存在を検出するステップとを含む。生体試料における免疫複合体の存在は、試料におけるコロナウイルスの存在を指し示す。

【0016】

対象におけるコロナウイルス感染を阻害する方法がさらに提供される。一部のインプリメンテーションでは、方法は、有効量の本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体、組成物、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、核酸分子またはベクターを対象に投与するステップを含む。

【0017】

本開示の前述および他の目的および特色は、添付の図面を参照しつつ進む次の詳細な説明からより明らかとなるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1A】ＡＣＥ２との相互作用を遮断する抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤナノボディの発見。（図１Ａ）合成ヒト化ラマナノボディライブラリーの構築のためのパラメーター。（図１Ｂ）ファージパニングを使用した抗ＲＢＤナノボディの同定のための選択戦略の概略図。（図１Ｃ）ＲＢＤ－ｍＦｃに対するＲＢＤ－１－１Ｅ、ＲＢＤ－２－１ＦおよびＲＢＤ－１－２ＧのＯｃｔｅｔ結合プロファイル（２００ｎＭから１２．５ｎＭへと、１：２希釈）。（図１Ｄ）ＲＢＤ－ｍＦｃおよびＳ１－ｈＦｃへのナノボディ結合の会合（ｋ_ｏｎ）および解離（ｋ_ｏｆｆ）速度定数ならびに平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）。ＲＢＤ－１－１Ｅ、ＲＢＤ－２－１ＦおよびＲＢＤ－１－２Ｇのためのグローバルフィット計算は、２００ｎＭから１２．５ｎＭを使用した；他は全て、２００ｎＭから５０ｎＭを使用した。（図１Ｅ）ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを使用したＡＣＥ２－ＡｖｉへのＲＢＤ－Ｆｃ結合のナノボディ媒介性阻害。

【図1B】同上。

【図1C】同上。

【図1D-E】同上。

【図2A-C】多価性（Multivalency）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで親和性およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の阻害を改善する。（図２Ａ～図２Ｃ）ＲＢＤ－Ｈｉｓに対する（図２Ａ）ＲＢＤ－１－２Ｇ Ｎｂ、（図２Ｂ）ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃおよび（図２Ｃ）ＲＢＤ－１－２Ｇ－三量体のためのＯｃｔｅｔ結合プロファイル（１００ｎＭから６．２５ｎＭへと、１：２希釈）。（図２Ｄ～図２Ｅ）受容体結合を可視化するためのＱＤ_６０８－ＲＢＤおよびＡＣＥ２－ＧＦＰ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用したＱＤエンドサイトーシスアッセイ。（図２Ｄ）ナノボディおよび（図２Ｅ）Ｆｃ構築物によるＲＢＤ内部移行の低減におけるナノボディ有効性が示される。Ｎ＝２回繰り返しウェル、それぞれおよそ２５００個の細胞および１６００個の細胞。（図２Ｆ～図２Ｇ）標的としてＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２細胞を使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化粒子侵入アッセイ。シュードタイプ化粒子侵入の阻害を、ナノボディ（図２Ｆ）およびＦｃ（図２Ｇ）構築物について検査した。２回の独立した実験から得られる代表的なデータ。データは、濃度当たりの平均阻害を表し（ｎ＝３）、全てのエラーバーは、ＳＥＭを表す。（図２Ｈ）様々なフォーマットにおけるＲＢＤ－１－２ＧおよびＲＢＤ－２－１ＦによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の生きているウイルス感染の阻害。ｎ＝２による代表的な生物学的複製。技術的複製は、濃度当たりｎ＝２であり、全てのエラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。

【図2D-E】同上。

【図2F-H】同上。

【図3】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク三量体およびＲＢＤ結合ナノボディのクライオＥＭ。（図３Ａ）ＲＢＤ（アップ状態）と複合体形成したナノボディのクライオＥＭ解析は、２種の別個の結合機序を明らかにした。（図３Ｂ）３分子のＲＢＤ－１－２Ｇと複合体形成したＳ－タンパク質のクライオＥＭマップの上面図および側面図。（図３Ｃ）画像処理の際に緻密化されたスパイク単量体領域を強調するＳ－タンパク質の側面図を示す。横たえた（laid）状態のＲＢＤを含有する密度を原子モデルフィッティング緻密化に使用した。

【図4】ＵＫバリアント（Ｎ５０１Ｙ）に結合するＲＢＤ－１－２Ｇの能力の試験。（図４Ａ）野生型（ＷＴ）および英国（ＵＫ）バリアントＲＢＤに結合するＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃによって会合相において最大応答値に達した。ｐＨの差は、ＰＢＳ（７．４ｐＨ）または１０ｍＭ酢酸塩緩衝剤と１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ４～ｐＨ６．０）を使用して達成され、全ての緩衝剤が、０．１％ＢＳＡおよび０．０２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）を含有した。（図４Ｂ）ＷＴおよびＵＫバリアントＳ１タンパク質に結合するＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃによって会合相において最大応答値に達した。（図４Ｃ～図４Ｄ）標的としてＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２細胞を使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化粒子侵入アッセイ。様々なＲＢＤ－１－２ＧおよびＲＢＤ－２－１Ｆフォーマットで処置されたＷＴ（図４Ｃ）およびＵＫ（図４Ｄ）シュードタイプ化粒子の阻害。ｎ＝２による代表的な生物学的複製。技術的複製は、濃度当たりｎ＝３であり、全てのエラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。

【図5A-B】野生型およびＢ．１．１．７ ＲＢＤバリアントによるＲＢＤ－１－２Ｇの分子動力学。（図５Ａ～図５Ｂ）ＷＴ ＲＢＤ（図５Ａ）およびＢ．１．１．７ ＲＢＤ（図５Ｂ）と複合体形成したＲＢＤ－１－２Ｇのソーセージ（Sausage）プロット表示。最も大きい可動性を示す領域が指し示されている（４７０～４９０および３５５～３７５）。（図５Ｃ）結合の総自由エネルギーに関するＷＴ ＲＢＤおよびＢ．１．１．７（Ｎ５０１Ｙ）ＲＢＤと複合体形成したＲＢＤ－１－２Ｇ残基のエネルギー寄与。最高の寄与は、残基Ｒ７６（ＲＢＤ－１－２Ｇ）およびＥ４８４（ＲＢＤ）について観察される。（図５Ｄ～図５Ｅ）Ｅ４８４（ＲＢＤ）が関与する相互作用の差を強調する、ＲＢＤ－１－２Ｇと複合体形成した（図５Ｄ）ＷＴ ＲＢＤおよび（図５Ｅ）Ｂ．１．１．７ ＲＢＤの原子モデルフィッティングおよび分子動力学（ＭＤ）シミュレーションの後に得られた原子モデル。

【図5C】同上。

【図5D-E】同上。

【図6A-C】ナノボディ精製および品質管理。（図６Ａ）代表的なＩＭＡＣ精製。Ｔ－総タンパク質（ライセート）、Ｌ－カラムロード（清澄化されたライセート）、ＦＴ－カラムフロースルー、Ｗ－カラム洗浄液。（図６Ｂ）サイズ排除カラム精製（ＳＥＣ）後の代表的な調製用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。Ｌ－カラムロード。（図６Ｃ）精製されたナノボディのＳＤＳ－ＰＡＧＥクーマシーブルー染色。図６Ａ～図６Ｃ中のゲルは全て、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／クーマシー染色であり、タンパク質標準の質量はｋＤａ単位で記述されている。実線のバーは、プールされた画分を指し示す。（図６Ｄ）代表的な精製されたナノボディのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）。

【図6D】同上。

【図7A-F】２００ｎＭ、１００ｎＭおよび５０ｎＭの濃度でＲＢＤ－ｍＦＣに結合する固定化されたナノボディに関するＯｃｔｅｔ結合プロファイル。

【図7G-H】同上。

【図8A-F】２００ｎＭ、１００ｎＭおよび５０ｎＭの濃度でＳ１－ｈＦｃに結合する固定化されたナノボディに関するＯｃｔｅｔ結合プロファイル。ＲＢＤ－１－２Ｇ（図８Ｃ）、ＲＢＤ－２－１Ｆ（図８Ｂ）およびＲＢＤ－１－１Ｅ（図８Ａ）は、２５ｎＭおよび１２．５ｎＭの濃度も含んだ。

【図8G-K】同上。

【図9A】ナノボディ処置によるＱＤ ＡＣＥ２－ＧＦＰエンドサイトーシスアッセイ。（図９Ａ）ＱＤエンドサイトーシスのナノボディ阻害に関する代表的な画像。１０μＭの濃度で開始したＲＢＤ－２－１Ｆ、ＲＢＤ－１－２Ｇ、ＲＢＤ－１－１ＥまたはＲＢＤ－２－１Ｅと共に３０分間プレインキュベートされた、ＱＤ_６０８－ＲＢＤで処置されたＡＣＥ２－ＧＦＰ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の代表的な画像モンタージュ。細胞を総計３時間処置した。デジタル位相差（ＤＰＣ）を使用して、細胞体を可視化した。スケールバー、２０μｍ。（図９Ｂ～図９Ｃ）各チャネルにおいてハイコンテンツ画像解析を使用した（図９Ｂ）ＱＤ_６０８－ＲＢＤおよび（図９Ｃ）ＡＣＥ２－ＧＦＰの定量化。データを、Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ処置細胞（１００％）およびＱＤ６０８－ＲＢＤ単独（０％）に対して正規化した。Ｎ＝２回繰り返しウェル由来のおよそ２５００個の細胞、３回の独立した実験の代表。非線形回帰を使用して曲線をフィットさせる。エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を指し示す。

【図9B】同上。

【図9C】同上。

【図10A】Ｆｃ処置によるＱＤ ＡＣＥ２－ＧＦＰエンドサイトーシスアッセイ。（図１０Ａ）ＱＤエンドサイトーシスのＦｃ阻害に関する代表的な画像。５μＭまたは１０μＭの濃度で開始したＲＢＤ－２－１Ｆ－Ｆｃ、ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃ、ＲＢＤ－１－１Ｅ－ＦｃまたはＲＢＤ－２－１Ｅ－Ｆｃと共に３０分間プレインキュベートされた、ＱＤ_６０８－ＲＢＤで処置されたＡＣＥ２－ＧＦＰ ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の代表的な画像モンタージュ。細胞を総計３時間処置した。デジタル位相差（ＤＰＣ）を使用して、細胞体を可視化した。スケールバー、２０μｍ。（図１０Ｂ～図１０Ｃ）各チャネルにおいてハイコンテンツ画像解析を使用した（図１０Ｂ）ＱＤ_６０８－ＲＢＤおよび（図１０Ｃ）ＡＣＥ２－ＧＦＰの定量化。データを、Ｏｐｔｉｍｅｍ Ｉ処置細胞（１００％）およびＱＤ６０８－ＲＢＤ単独（０％）に対して正規化した。Ｎ＝２回繰り返しウェル由来のおよそ１６００個の細胞、３回の独立した実験の代表。非線形回帰を使用して曲線をフィットさせる。エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を指し示す。

【図10B】同上。

【図10C】同上。

【図11】ＲＢＤ－ｍＦｃに結合する１－２Ｇ－Ｆｃおよび２－１Ｆ－Ｆｃのグローバルフィット曲線。（図１１Ａ～図１１Ｂ）ロードタンパク質としてＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃ（図１１Ａ）またはＲＢＤ－２－１Ｆ－Ｆｃ（図１１Ｂ）のいずれかを使用したＯｃｔｅｔ結合プロファイル。２００ｎＭから６．２５ｎＭ（１：２系列希釈）の範囲に及ぶＲＢＤ－ｍＦｃの会合をグローバル曲線フィッティングのために使用した。（図１１Ｃ～図１１Ｄ）ＯｃｔｅｔバイオセンサーにＲＢＤ－ｍＦｃをロードし、次いで様々な濃度のＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃ（図１１Ｃ）またはＲＢＤ－２－１Ｆ－Ｆｃ（図１１Ｄ）（２００ｎＭから６．２５ｎＭへと、１：２系列希釈）に曝露した。（図１１Ｅ）図１１Ａ～図１１Ｄに関するグローバルフィットモデル化由来の計算。

【図12】非ブロッカーに関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化粒子アッセイ。ナノボディ（図１２Ａ）およびＦｃ（図１２Ｂ）フォーマットに関するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化粒子侵入アッセイ。

【図13】ＲＢＤ／ＡＣＥ２／ナノボディ相互作用の原子フィットモデル。（図１３Ａ）ＲＢＤ－１－２Ｇ結合のモデルは、ＡＣＥ２結合部位と重複するが、ＲＢＤ－１－１Ｇは、結合を阻害することができない。（図１３Ｂ）同様のエピトープを示唆するＲＢＤ－２－１ＦおよびＲＢＤ－１－２Ｇの重複は、「グループ１」結合剤によって標的化される。

【図14】ＲＢＤ領域配列重複。

【図15】クライオＥＭワークフローチャートおよび緻密化戦略。

【図16】ＲＢＤ－１－２Ｇナノボディにおける凍結乾燥の効果。ＲＢＤ－１－２Ｇ ｖｓ 凍結乾燥され復元された試料を、生きているウイルスの感染を阻害するそれらの能力について検査した。上位濃度は、無処置ＲＢＤ－１－２Ｇでは１５．２μＭ、復元された凍結乾燥ＲＢＤ－１－２Ｇ試料では１５．８μＭであり、これは次いで、ｄＰＢＳにおける１：２希釈を使用して希釈された。技術的複製は、濃度当たりｎ＝３であり、全てのエラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。（図１６Ｂ）生きているウイルスアッセイからのパーセントＣＰＥレスキューの棒グラフ。

【図17】（図１７Ａ）ＷＴ ＲＢＤおよび（図１７Ｂ）Ｂ．１．１．７ ＲＢＤと複合体形成したＲＢＤ－１－２Ｇに関するカラム当たりのＭＤ３回繰り返しの平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）は、系が安定していることを示した。

【図18】変形形態の同じパターンを示す（図１８Ａ）ＷＴ ＲＢＤ残基および（図１８Ｂ）Ｂ．１．１．７ ＲＢＤ残基に関する二乗平均平方根変動（Root mean square fluctuation）（ＲＭＳＦ）。両方のグラフが、残基３５５～３７５および４７０～４９０に対応する２個の主要ピークを示す。（図１８Ｃ～図１８Ｄ）（図１８Ｃ）ＷＴ ＲＢＤおよび（図１８Ｄ）Ｂ．１．１．７ ＲＢＤと複合体形成したＲＢＤ－１－２Ｇの残基の変動。

【図19A】ＲＢＤ－１－２Ｇと（図１９Ａ）ＷＴ ＲＢＤおよび（図１９Ｂ）Ｂ．１．１．７ ＲＢＤを含有する系（カラム当たり）に関する、３回繰り返したＭＤシミュレーションの時間当たりの水素結合および塩橋相互作用。

【図19B】同上。

【図20】交差反応性スクリーニングにおいて同定されたヒト膜プロテオームアレイ（ＭＰＡ）結果（図２０Ａ）。ＲＢＤ－１－２Ｇに対するＭＩＥＦ１タンパク質の反応性を決定するための追跡検証スクリーニング（図２０Ｂ）。

【図21】ＷＴおよびＢ．１．１．７バリアントにおけるＲＢＤ－１－２Ｇ ｖｓ ＲＢＤにおける残基のヒートマップ。

【発明を実施するための形態】

【0019】

配列表
配列表は、４２３９－１０７０２１－０２．ｘｍｌと命名され、２０２２年９月１日に作成され、８，４６９バイトのサイズを有し、参照により本明細書に組み込まれる、ＳＴ．２６ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ ＸＭＬファイルとして提出される。添付の配列表中：
配列番号１は、フレームワーク１（ＦＲ１）のアミノ酸配列である：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ
配列番号２は、フレームワーク２（ＦＲ２）のアミノ酸配列である：
ＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＬＶＡＡ
配列番号３は、フレームワーク３（ＦＲ３）のアミノ酸配列である：
ＹＰＤＳＶＥＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＲＭＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡ
配列番号４は、フレームワーク４（ＦＲ４）のアミノ酸配列である：
ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
配列番号５は、シングルドメイン抗体ＲＢＤ－１－２Ｇのアミノ酸配列である：

【化1】

配列番号６は、タンパク質タグのアミノ酸配列である：
ＧＱＡＧＱＨＨＨＨＨＨＧＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳ（配列中、残基１～５、１２～１３および２３は、スペーサー残基であり、残基６～１１は、Ｈｉｓタグであり、残基１４～２２は、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タグである）。
配列番号７は、ランダム化されたＣＤＲ１のアミノ酸コンセンサス配列である：ＧＸ_１ＩＸ_２Ｘ_３（配列中、Ｘ_１は、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＹであり；Ｘ_２は、ＦまたはＳであり；Ｘ_３は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮおよびＱから個々に選択される１～４個のアミノ酸残基である）（図１Ａを参照）。
配列番号８は、ランダム化されたＣＤＲ２のアミノ酸コンセンサス配列である：ＩＸ_１Ｘ_２Ｘ_２ＧＸ_３Ｘ_４ＴＸ_５（配列中、Ｘ_１は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＴであり；Ｘ_２は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮおよびＱから選択されるいずれかのアミノ酸であり；Ｘ_３は、Ａ、Ｇ、ＳまたはＴであり；Ｘ_４は、Ｉ、Ｎ、ＳまたはＴであり；Ｘ_５は、ＮまたはＹである）（図１Ａを参照）。
配列番号９は、ペプチドリンカーのアミノ酸配列である（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）。
配列番号１０は、突然変異したフューリン部位のアミノ酸配列である（ＧＳＡＳ）。

【0020】

詳細な説明
Ｉ．略語
ＡＣＥ２ アンジオテンシン変換酵素２
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＦＵ コロニー形成単位
ＣｏＶ コロナウイルス
ＣＰＥ 細胞変性効果
ＣＶ カラム体積
ＥＢ 平衡化緩衝剤
ＦＰ 融合ペプチド
ＧＦＰ 緑色蛍光タンパク質
ＩＭＡＣ 固定化金属親和性クロマトグラフィー
ＭＤ 分子動力学
ＭＬＶ マウス白血病ウイルス
ＭＰＡ 膜プロテオームアレイ
Ｎｂ ナノボディ
ＰＰ シュードタイプ化粒子
ＱＤ 量子ドット
ＲＢＤ 受容体結合ドメイン
ＲＢＭ 受容体結合モチーフ
ＲＭＳＤ 平均二乗偏差
ＲＭＳＦ 二乗平均平方根変動
ＲＴ 室温
Ｓ スパイク
ＳＡＲＳ 重症急性呼吸器症候群
ＳＥＣ サイズ排除クロマトグラフィー
ＵＫ 英国
ＷＴ 野生型

【0021】

ＩＩ．用語の概要
他に記述がなければ、技術用語は、慣例的な用法に従って使用される。分子生物学における多くの共通用語の定義は、Krebs et al. (eds.), Lewin's genes XII, published by Jones & Bartlett Learning, 2017に見出すことができる。本明細書で使用される場合、単数形「ある（a）」、「ある（an）」および「その（the）」は、文脈がそれ以外のことを明らかに指し示さない限り、単数と複数の両方を指す。例えば、用語「ある抗原（an antigen）」は、単数または複数の抗原を含み、語句「少なくとも１つの抗原」と均等であると考慮することができる。本明細書で使用される場合、用語「を含む（comprises）」は、「を含む（includes）」を意味する。他に指示がなければ、ありとあらゆる塩基サイズまたはアミノ酸サイズや、あらゆる分子量または分子質量値は、核酸またはポリペプチドに付けられる場合、近似であり、説明目的で提供されることをさらに理解されたい。本明細書に記載されているものと同様のまたは均等な多くの方法および材料を使用することができるが、特定の適した方法および材料が本明細書に記載されている。矛盾がある場合、用語の説明を含む本明細書が優先されるものとする。加えて、材料、方法および実施例は、単なる説明であり、限定を意図するものではない。

【0022】

様々なインプリメンテーションの概説を容易にするために、次の用語説明が提供される：

【0023】

約：文脈が、それ以外のことを指し示していない限り、「約」は、参照値のプラスマイナス５％を指す。例えば、「約」１００は、９５～１０５を指す。

【0024】

投与：選ばれた経路による対象への開示されている抗体等の薬剤の導入。投与は、局所性または全身性であり得る。例えば、選ばれた経路が血管内である場合、薬剤（抗体等）は、対象の血管内に組成物を導入することにより投与される。例示的な投与経路は、経口、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内および静脈内等）、舌下、直腸、経皮（例えば、外用）、鼻腔内、腟および吸入経路を含むがこれらに限定されない。

【0025】

アミノ酸置換：ポリペプチドにおけるある１個のアミノ酸の、異なるアミノ酸による置換え。

【0026】

抗体：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のスパイクタンパク質等のコロナウイルススパイクタンパク質等の分析物（抗原）に特異的に結合および認識する免疫グロブリン、その抗原結合性断片または誘導体。用語「抗体」は、最も広い意味で本明細書において使用されており、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、シングルドメイン抗体および抗原結合性断片を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を、それらが所望の抗原結合活性を示す限りにおいて包含する。

【0027】

抗体の非限定的な例は、例えば、抗原に対する結合親和性を保持するインタクトな免疫グロブリンならびにそのバリアントおよび断片を含む。抗原結合性断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ（diabody）；線形抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含むがこれらに限定されない。抗体断片は、完全抗体の修飾によって産生された抗原結合性断片か、または組換えＤＮＡ方法論を使用してｄｅ ｎｏｖｏ合成された抗原結合性断片を含む（例えば、Kontermann and Dubel (Eds.), Antibody Engineering, Vols. 1-2, 2^nd ed., Springer-Verlag, 2010を参照）。

【0028】

抗体は、キメラ抗体（ヒト化マウス抗体等）およびヘテロコンジュゲート抗体（二重特異性抗体等）等、遺伝子操作された形態も含む。

【0029】

抗体は、１個または複数の結合部位を有することができる。２個以上の結合部位が存在する場合、結合部位は、互いに同一であっても、異なっていてもよい。例えば、天然に存在する免疫グロブリンは、２個の同一の結合部位を有し、単鎖抗体またはＦａｂ断片は、１個の結合部位を有するが、二重特異性または二機能性抗体は、２個の異なる結合部位を有する。

【0030】

典型的には、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。哺乳動物免疫グロブリン遺伝子は、カッパー、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに多種多様な免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含む。２つの型の軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパー（κ）が存在する。哺乳動物抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。哺乳動物において見出されない抗体アイソタイプは、ＩｇＸ、ＩｇＹ、ＩｇＷおよびＩｇＮＡＲを含む。ＩｇＹは、鳥類および爬虫類によって産生される主な抗体であり、哺乳動物ＩｇＧおよびＩｇＥと同様のいくつかの機能性を有する。ＩｇＷおよびＩｇＮＡＲ抗体は、軟骨魚類によって産生され、一方、ＩｇＸ抗体は、両生類において見出される。

【0031】

各重および軽鎖は、定常領域（または定常ドメイン）および可変領域（または可変ドメイン）を含有する。組み合わさって、重および軽鎖可変領域は、抗原に特異的に結合する。

【0032】

「Ｖ_Ｈ」または「ＶＨ」の参照は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂ等の抗原結合性断片のものを含む、抗体重鎖の可変領域を指す。「Ｖ_Ｌ」または「ＶＬ」の参照は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂのものを含む、抗体軽鎖の可変ドメインを指す。

【0033】

Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの高頻度可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有する（例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th ed., NIH Publication No. 91-3242, Public Health Service, National Institutes of Health, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照）。異なる軽または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で相対的に保存されている。構成物軽および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、三次元空間においてＣＤＲの位置を定め整列させる役立つ。

【0034】

ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合の原因となる。所与のＣＤＲのアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら（Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th ed., NIH Publication No. 91-3242, Public Health Service, National Institutes of Health, U.S. Department of Health and Human Services, 1991；「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら（"Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins," J. Mol. Bio., 273(4):927-948, 1997；「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）およびＬｅｆｒａｎｃら（"IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev. Comp. Immunol., 27(1):55-77, 2003；「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）によって記載されているもの含む、多数の周知スキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。各鎖のＣＤＲは典型的に、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（Ｎ末端からＣ末端へと）と称され、また、典型的に、特定のＣＤＲが配置された鎖によって同定される。よって、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ３は、それが見出される抗体のＶ_Ｈ由来のＣＤＲ３である一方で、Ｖ_Ｌ ＣＤＲ１は、それが見出される抗体のＶ_Ｌ由来のＣＤＲ１である。軽鎖ＣＤＲは時に、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称される。重鎖ＣＤＲは時に、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称される。

【0035】

一部のインプリメンテーションでは、開示されている抗体は、異種定常ドメインを含む。例えば、抗体は、半減期を増加させる１個または複数の修飾（「ＬＳ」突然変異等）を含む定常ドメイン等、ネイティブ定常ドメインとは異なる定常ドメインを含む。

【0036】

「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体である、すなわち、例えば、天然に存在する突然変異を含有するかまたはモノクローナル抗体調製物の産生の際に生じる可能なバリアント抗体を除いて、集団を構成する個々の抗体は、同一でありおよび／または同じエピトープに結合し、そのようなバリアントは一般に、少量存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して作製された異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定基に対して作製されている。よって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるものとしての抗体の特徴を指し示し、いずれか特定の方法による抗体の産生を要求するものとして解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用した方法を含むがこれらに限定されない、種々の技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。一部の例では、シングルドメイン抗体は、ファージディスプレイライブラリーから単離される。モノクローナル抗体は、抗原結合においても他の免疫グロブリン機能においても実質的にいかなる効果もない保存的アミノ酸置換を有することができる（例えば、Greenfield (Ed.), Antibodies: A Laboratory Manual, 2^nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014を参照）。

【0037】

「シングルドメイン抗体」は、追加の抗体ドメインの非存在下で、抗原または抗原のエピトープに特異的に結合することができるシングルドメイン（可変ドメイン）を有する抗体を指す。シングルドメイン抗体は、例えば、ラクダ類Ｖ_ＨＨ抗体、Ｖ_ＮＡＲ抗体、Ｖ_Ｈドメイン抗体およびＶ_Ｌドメイン抗体を含む。Ｖ_ＮＡＲ抗体は、コモリザメ（nurse shark）、テンジクザメ（wobbegong shark）、アブラツノザメ（spiny dogfish）およびバンブーシャーク（bamboo shark）等の軟骨魚類によって産生される。ラクダ類Ｖ_ＨＨ抗体は、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコを含むいくつかの種によって産生される。

【0038】

本開示の文脈では、「二価抗体」は、２個のシングルドメインモノクローナル抗体（「ナノボディ」）単量体を含む分子である。一部のインプリメンテーションでは、単量体は、Ｉｇ Ｆｃ領域に融合される（図２Ｂにおける概略図を参照）。

【0039】

本開示の文脈では、「三価単鎖Ｆｖ」は、３個のシングルドメイン抗体（「ナノボディ」）単量体を含む分子である。一部のインプリメンテーションでは、単量体は、可動性ペプチドリンカーによって接続される（図２Ｃにおける概略図を参照）。

【0040】

「ヒト化」抗体または抗原結合性断片は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（マウス、ラットまたは合成等）抗体または抗原結合性断片由来の１個または複数のＣＤＲとを含む。ＣＤＲを提供する非ヒト抗体または抗原結合性断片は、「ドナー」と名付けられ、フレームワークを提供するヒト抗体または抗原結合性断片は、「アクセプター」と名付けられる。１つのインプリメンテーションでは、ＣＤＲは全て、ヒト化免疫グロブリンにおけるドナー免疫グロブリン由来である。定常領域は、存在する必要はないが、存在する場合、少なくとも約８５～９０％、例えば、約９５％またはそれよりも多く同一等、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一であり得る。したがって、おそらくＣＤＲを除いた、ヒト化抗体または抗原結合性断片の全ての部分が、天然ヒト抗体配列の対応する部分と実質的に同一である。

【0041】

「キメラ抗体」は、典型的には異なる種のものである２種の異なる抗体に由来する配列を含む抗体である。一部の例では、キメラ抗体は、ある１種のヒト抗体由来の１個または複数のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域、ならびに別のヒト抗体由来のＣＤＲおよび／またはフレームワーク領域を含む。

【0042】

「完全にヒト抗体」または「ヒト抗体」は、ヒトゲノム由来の（またはそれに由来する）配列を含み、別の種由来の配列を含まない抗体である。一部のインプリメンテーションでは、ヒト抗体は、ヒトゲノム由来の（またはそれに由来する）ＣＤＲ、フレームワーク領域および（存在するのであれば）Ｆｃ領域を含む。ヒト抗体は、例えば、ファージディスプレイまたはトランスジェニック動物の使用により、ヒトゲノムに由来する配列に基づき抗体を創出するための技術を使用して同定および単離することができる（例えば、Barbas et al. Phage display: A Laboratory Manuel. 1^st Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2004. Print.；Lonberg, Nat. Biotech., 23: 1117-1125, 2005；Lonenberg, Curr. Opin. Immunol., 20:450-459, 2008を参照）。

【0043】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する抗体：感染を阻害する、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連する生物学的機能を阻害するような仕方で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原（スパイクタンパク質等）に特異的に結合するシングルドメインモノクローナル抗体等の抗体。抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の活性を中和することができる。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する抗体は、それに直接的に結合し、細胞への侵入を限定することによりウイルスに干渉することができる。その代わりに、抗体は、例えば、受容体を使用したウイルス侵入に干渉することにより、受容体と病原体との１種または複数の取付け後（post-attachment）相互作用に干渉することができる。一部の例では、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的な抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染力価を中和する。

【0044】

一部のインプリメンテーションでは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的に結合し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を中和する抗体は、細胞の感染を、例えば、対照抗体または抗原結合性断片と比較して少なくとも５０％阻害する。

【0045】

「広く中和する抗体」は、抗原の抗原表面と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一性を共有する抗原等の関連抗原に結合し、その機能を阻害する抗体である。ウイルス等の病原体由来の抗原に関して、抗体は、病原体の２つ以上のクラスおよび／またはサブクラス由来の抗原に結合し、その機能を阻害することができる。例えば、コロナウイルスに関して、抗体は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むコロナウイルス由来のスパイクタンパク質等の抗原に結合し、その機能を阻害することができる。

【0046】

抗原：動物に注射または吸収される組成物を含む、動物における抗体またはＴ細胞応答の産生を刺激することができる化合物、組成物または物質。抗原は、異種免疫原によって誘導されるものを含む、特異的な液性または細胞性免疫の産物と反応する。本明細書における一部のインプリメンテーションでは、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質等のウイルス抗原である。

【0047】

結合親和性：抗原に対する抗体の親和性。一実施形態では、親和性は、Frankel et al., Mol. Immunol., 16:101-106, 1979によって記載されているスキャッチャード法の修正によって計算される。別の実施形態では、結合親和性は、抗原／抗体解離速度によって測定される。別の実施形態では、高い結合親和性は、競合ラジオイムノアッセイによって測定される。別の実施形態では、結合親和性は、ＥＬＩＳＡによって測定される。一部の実施形態では、結合親和性は、バイオレイヤーインターフェロメトリー（bio-layer interferometry）（ＢＬＩ）技術に基づくＯｃｔｅｔ系（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して測定される。他の実施形態では、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥＳ－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥＳ－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。他の実施形態では、抗体親和性は、フローサイトメトリーまたは表面プラズモン共鳴によって測定される。抗原（コロナウイルススパイクタンパク質等）に「特異的に結合する」抗体は、高い親和性で抗原に結合し、他の無関係な抗原には有意に結合しない抗体である。

【0048】

生体試料：対象から得られる試料。生体試料は、細胞、組織ならびに体液、例えば、血液、血液の派生物および画分（血清等）、脳脊髄液、ならびに生検または外科的に除去された組織、例えば、固定されていない、凍結された、またはホルマリンもしくはパラフィン中で固定された組織を含むがこれらに限定されない、対象における疾患または感染の検出に有用なあらゆる臨床試料を含む。特定の例では、生体試料は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有するかまたはそれを有することが疑われる対象から得られる。

【0049】

二重特異性抗体：２個の異なる抗原エピトープに結果的に結合する２個の異なる抗原結合性ドメインで構成される組換え分子。二重特異性抗体は、２個の抗原結合性ドメインの化学的にまたは遺伝学的に連結された分子を含む。抗原結合性ドメインは、リンカーを使用して連結することができる。抗原結合性ドメインは、モノクローナル抗体、抗原結合性断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）またはそれらの組合せであり得る。二重特異性抗体は、１個または複数の定常ドメインを含むことができるが、必ずしも定常ドメインを含まない。

【0050】

免疫複合体を形成するのに十分な条件：抗体が、実質的に全ての他のエピトープへの結合よりも検出可能に大きい程度まで、および／またはその実質的な排除まで、その同族エピトープに結合することを可能にする条件。免疫複合体を形成するのに十分な条件は、結合反応のフォーマットに依存し、典型的に、イムノアッセイプロトコールにおいて利用される条件またはｉｎ ｖｉｖｏで遭遇される条件である。イムノアッセイフォーマットおよび条件の説明については、Greenfield (Ed.), Antibodies: A Laboratory Manual, 2^nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014を参照されたい。方法において用いられる条件は、生きている哺乳動物または哺乳動物細胞の典型的な内側にある条件（例えば、温度、容積オスモル濃度、ｐＨ）の参照を含む「生理的条件」である。いくつかの臓器は、極端な条件に曝されることが認識されるが、生物内（intra-organismal）および細胞内の環境は通常、ｐＨ７前後（例えば、ｐＨ６．０～ｐＨ８．０、より典型的にはｐＨ６．５～７．５）に位置し、主な溶媒として水を含有し、０℃を上回りかつ５０℃を下回る温度で存在する。容積オスモル濃度は、細胞生存率および増殖を支持する範囲内である。

【0051】

免疫複合体の形成は、従来方法、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫沈降（ＩＰ）、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（例えば、ウエスタンブロット）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、Ｘ線検査および親和性クロマトグラフィーにより検出することができる。

【0052】

コンジュゲート：一体に連結された、例えば、共有結合によって一体に連結された２個の分子の複合体。一実施形態では、抗体は、エフェクター分子に連結される；例えば、検出可能な標識等のエフェクター分子に共有結合により連結された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的に結合する抗体。連結は、化学的または組換え手段によって為すことができる。一実施形態では、連結は、化学的であり、抗体部分およびエフェクター分子の間の反応は、２個の分子の間に形成される共有結合を産生して１個の分子を形成した。抗体およびエフェクター分子の間にペプチドリンカー（短いペプチド配列）が必要に応じて含まれてよい。コンジュゲートは、抗体およびエフェクター分子等、別々の機能性を有する２個の分子から調製され得るため、時に、「キメラ分子」と称されることもある。

【0053】

保存的バリアント：「保存的」アミノ酸置換は、標的タンパク質と相互作用するタンパク質の能力等、タンパク質の機能に実質的に影響を与えることも減少させることもない置換である。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－特異的抗体は、参照抗体配列と比較して、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または最大１０個の保存的置換を含むことができ、スパイクタンパク質結合のための特異的結合活性および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和活性を保持することができる。保存的変形形態という用語は、置換されていない親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸の使用も含む。

【0054】

コードされた配列における単一のアミノ酸または僅かなパーセンテージのアミノ酸（例えば、５％未満、一部の実施形態では、１％未満）を変更、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加は、変更があるアミノ酸の化学的に同様のアミノ酸による置換をもたらす、保存的変形形態である。

【0055】

次の６つの群は、互いに保存的置換であると考慮されるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

【0056】

非保存的置換は、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する能力等、抗体の活性または機能を低減させる置換である。例えば、あるアミノ酸残基が、タンパク質の機能に必須である場合、他の点では保存的な置換であっても、当該活性を破壊し得る。よって、保存的置換は、目的のタンパク質の基本的な機能を変更させない。

【0057】

接触：直接的に物理的に会合した設置；ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで行われ得る固体および液体形態の両方を含む。接触は、ある１つの分子および別の分子の間の接触を含み、例えば、抗体等の別のポリペプチドに接触する、抗原等のある１つのポリペプチドの表面におけるアミノ酸が挙げられる。接触は、例えば、細胞と直接的に物理的に会合させて抗体を設置することによる、細胞の接触を含むこともできる。

【0058】

対照：参照標準。一部の実施形態では、対照は、陰性対照、例えば、コロナウイルスに感染していない健康な患者から得られる試料である。他の実施形態では、対照は、陽性対照、例えば、コロナウイルス感染と診断された患者から得られる組織試料である。さらに他の実施形態では、対照は、歴史的対照または標準参照値または値の範囲（以前に検査された対照試料、例えば、既知の予後もしくはアウトカムを有する患者の群、またはベースラインもしくは正常値を表す試料の群等）である。

【0059】

被験試料および対照の間の差は、増加または逆に減少であり得る。差は、定性的な差または定量的な差、例えば、統計的に有意な差であり得る。一部の例では、差は、対照と比べた、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％または少なくとも約５００％の増加または減少である。

【0060】

コロナウイルス：重症呼吸器疾病を引き起こすことが公知である、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスの科。アルファコロナウイルスおよびベータコロナウイルス属由来の、ヒトに感染することが現在公知であるコロナウイルス科由来のウイルス。その上、ガンマコロナウイルスおよびデルタコロナウイルス属が、将来的にヒトに感染し得ると考えられる。

【0061】

ベータコロナウイルスの非限定的な例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＫＵ１－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＯＣ４３－ＣｏＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ－ＣｏＶ）、コウモリＳＡＲＳ様コロナウイルスＷＩＶ１（ＷＩＶ１－ＣｏＶ）およびヒトコロナウイルスＨＫＵ９（ＨＫＵ９－ＣｏＶ）を含む。アルファコロナウイルスの非限定的な例は、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（２２９Ｅ－ＣｏＶ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＮＬ６３－ＣｏＶ）、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）および伝染性胃腸炎コロナウイルス（ＴＧＥＶ）を含む。デルタコロナウイルスの非限定的な例は、ブタデルタコロナウイルス（ＳＤＣＶ）である。

【0062】

ウイルスゲノムは、キャッピングされ、ポリアデニル化され、ヌクレオカプシドタンパク質でカバーされている。コロナウイルスビリオンは、スパイク（Ｓ）タンパク質と称されるＩ型融合糖タンパク質を含有するウイルスエンベロープを含む。大部分のコロナウイルスは、レプリカーゼ遺伝子による共通ゲノム組織化を有する。

【0063】

ＣＯＶＩＤ－１９：コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患。

【0064】

縮重バリアント：本開示の文脈では、「縮重バリアント」は、遺伝暗号の結果としての縮重である配列を含む、ポリペプチド（抗体重または軽鎖等）をコードするポリヌクレオチドを指す。２０種の天然アミノ酸が存在し、その大部分は、２種以上のコドンによって指定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるペプチドのアミノ酸配列が変化しない限りにおいて、ペプチドをコードする全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。

【0065】

検出可能な標識：第２の分子の検出を容易にするために抗体等の第２の分子に直接的にまたは間接的にコンジュゲートされる、検出可能な分子（検出可能なマーカーとしても公知）。例えば、検出可能な標識は、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡または診断イメージング技法（ＣＴスキャン、ＭＲＩ、超音波、光ファイバー試験および腹腔鏡試験等）による検出が可能であり得る。検出可能なマーカーの具体的で非限定的な例は、フルオロフォア、化学発光剤、酵素による連結、放射性同位元素および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）を含む。検出可能なマーカーを使用するための方法、および様々な目的に適切な検出可能なマーカーの選択に関するガイダンスは、例えば、Green and Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)およびAusubel et al. (Eds.) (Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons、２０１７年の補足を含む）に記述されている。

【0066】

検出：あるものの実存、存在または実態を同定すること。

【0067】

有効量：当該物質が投与される対象において所望の効果を達成するのに十分な、特異的物質の含量。例えば、これは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染等のコロナウイルス感染を阻害するのに、またはそのような感染の表面的な症状を測定可能に変更するのに必要な量であり得る。

【0068】

一例では、所望の応答は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を阻害または低減または防止することである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染は、方法が有効となるために、完全に排除または低減または防止される必要はない。

【0069】

一部の実施形態では、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する開示されている抗体（またはその組成物もしくはコンジュゲート）の有効量の投与は、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２感染を、適した対照と比較して、所望の量、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％またはさらには少なくとも１００％（検出可能な感染の排除または防止）低減または阻害することができる（例えば、細胞の感染によって、またはコロナウイルスに感染した対象の数もしくはパーセンテージによって、または感染した対象の生存時間の増加によって、または感染に関連する症状の低減によって測定される通り）。

【0070】

感染を阻害するために対象に投与される、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する抗体の有効量は、当該対象に関連する多数の因子、例えば、対象の全体的な健康および／または体重に応じて変動するであろう。有効量は、投薬量を変動させ、例えば、病原体力価の低減等、その結果生じる応答を測定することにより決定することができる。有効量は、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイにより決定することもできる。

【0071】

有効量は、以前のまたは後続の投与と組み合わせて、有効な応答の達成に寄与する部分用量を包含する。例えば、薬剤の有効量は、単一の用量において、またはいくつかの用量において、例えば、毎日において、数日間もしくは数週間持続する処置の経過において、投与することができる。しかし、有効量は、処置されている対象、処置されている状態の重症度および型、ならびに投与の様式に依存することができる。薬剤の単位剤形は、ある量で、または有効量の倍数で、例えば、無菌の構成成分を有するバイアル（例えば、貫通できる蓋を備えた）またはシリンジにおいて、パッケージングすることができる。

【0072】

エフェクター分子：所望の効果；例えば、エフェクター分子が標的化される細胞における所望の効果を有するもしくは生じることが意図される分子、または検出可能なマーカー。エフェクター分子は、例えば、ポリペプチドおよび小分子を含むことができる。一部のエフェクター分子は、２種以上の所望の効果を有するまたは生じることができる。

【0073】

エピトープ：抗原決定基。これは、特異的免疫応答を誘発するような、抗原性である分子上の特定の化学基またはペプチド配列であり、例えば、エピトープは、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原の領域である。抗体は、コロナウイルススパイクタンパク質におけるエピトープ等、特定の抗原エピトープに結合することができる。

【0074】

発現：核酸配列の転写または翻訳。例えば、そのＤＮＡがＲＮＡまたはＲＮＡ断片へと転写され、一部の例では、それがプロセシングされてｍＲＮＡになるときに、コード核酸配列（遺伝子等）は発現され得る。そのｍＲＮＡがタンパク質またはタンパク質断片等のアミノ酸配列へと翻訳されるときにも、コード核酸配列（遺伝子等）は発現され得る。特定の例では、それがＲＮＡへと転写されるときに、異種遺伝子は発現される。別の例では、そのＲＮＡがアミノ酸配列へと翻訳されるときに、異種遺伝子は発現される。発現の調節は、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡ等の中間分子の分解に関する制御、または産生後の特異的タンパク質分子の活性化、不活性化、区画化もしくは分解による制御を含むことができる。

【0075】

発現制御配列：それが稼働可能に連結した異種核酸配列の発現を調節する核酸配列。発現制御配列が、核酸配列の転写および適宜、翻訳を制御および調節する場合、発現制御配列は、核酸配列に稼働可能に連結される。よって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の直前にある開始コドン（ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライスシグナル、ｍＲＮＡの適正な翻訳を可能にするための当該遺伝子の正しい読み枠の維持、および停止コドンを含むことができる。用語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現に影響し得る構成成分を含むことを意図し、その存在が有利となる追加の構成成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含むこともできる。発現制御配列は、プロモーターを含むことができる。

【0076】

発現ベクター：発現されるべきヌクレオチド配列に稼働可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクター。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞によってまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給され得る。発現ベクターの非限定的な例は、組換えポリヌクレオチドを取り込む、コスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドのまたはリポソームに含有された）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む。

【0077】

ポリヌクレオチドは、宿主の挿入された遺伝的配列の効率的な転写を容易にするプロモーター配列を含有する発現ベクターに挿入され得る。発現ベクターは典型的に、複製開始点、プロモーターと共に、形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特異的核酸配列を含有する。

【0078】

Ｆｃ領域：最初の重鎖定常ドメインを除外した抗体の定常領域。Ｆｃ領域は一般に、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２個の重鎖定常ドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３個の重鎖定常ドメインを指す。Ｆｃ領域は、これらのドメインのＮ末端にある可動性ヒンジの一部または全てを含むこともできる。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃ領域は、尾部を含んでも含まなくてもよく、Ｊ鎖が結合していても結合していなくてもよい。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は典型的に、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３、ならびに必要に応じてＣγ１およびＣγ２の間のヒンジの下部を含むと理解される。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｆｃカルボキシル末端までのＣ２２６またはＰ２３０に続く残基を含むと定義され、この番号付けはＫａｂａｔに従う。ＩｇＡについて、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣα２およびＣα３、ならびに必要に応じてＣα１およびＣα２の間のヒンジの下部を含む。

【0079】

融合タンパク質：２個の異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部分を含むタンパク質。

【0080】

異種：異なる遺伝的供給源に起源をもつこと。それが発現される細胞以外の遺伝的供給源に起源をもつ、細胞にとって異種である核酸分子。具体的で非限定的な一例では、ｓｃＦｖ等のタンパク質をコードする異種核酸分子は、哺乳動物細胞等の細胞において発現される。細胞または生物において異種核酸分子を導入するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、電気穿孔、リポフェクション、パーティクルガン加速および相同組換えを含む、核酸による形質転換が挙げられる。

【0081】

宿主細胞：その中でベクターを増やし、そのＤＮＡを発現させることができる細胞。細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。この用語は、対象宿主細胞のいずれかの後代も含む。複製の際に発生する突然変異が存在し得るため、全ての後代が、親細胞と同一でなくてもよいことが理解される。しかし、用語「宿主細胞」が使用されるときに、そのような後代が含まれる。

【0082】

免疫複合体：可溶性抗原への抗体（本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体等）の結合は、免疫複合体を形成する。免疫複合体の形成は、従来方法、例えば、免疫組織化学、免疫沈降、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティング（例えば、ウエスタンブロット）、磁気共鳴画像法、ＣＴスキャン、Ｘ線検査および親和性クロマトグラフィーにより検出することができる。

【0083】

疾患の阻害または処置：例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染等の疾患のリスクがある対象における、疾患または状態の完全発症の阻害。「処置」は、発症し始めた後に、疾患または病理学的状態の徴候または症状を軽快させる治療介入を指す。疾患または病理学的状態を参照した用語「軽快」は、処置のいずれかの観察可能な有益な効果を指す。疾患の阻害は、ウイルス感染のリスクの防止または低減等、疾患のリスクの防止または低減を含むことができる。有益な効果は、例えば、易罹患性対象における疾患の臨床症状の開始遅延、疾患の一部もしくは全ての臨床症状の重症度の低減、より遅い疾患進行、ウイルス負荷量の低減、対象の全体的な健康もしくは福祉の改善、または特定の疾患に特異的な他のパラメーターによって証明することができる。「予防的」処置は、病理の発症リスクを減少させる目的で、疾患の徴候を示さないかまたは初期徴候のみを示す対象に投与される処置である。

【0084】

用語「低減させる」は、参照薬剤と比較して、薬剤の投与後に疾患もしくは状態が定量的に縮小される場合、または薬剤の投与後に縮小される場合、薬剤が、疾患または状態を低減させるような、相対的な用語である。同様に、用語「防止する」は、疾患または状態の少なくとも１種の特徴が排除される限りにおいて、薬剤が、疾患または状態を完全に排除することを必ずしも意味しない。よって、感染が、例えば、薬剤の非存在下での感染の、または参照薬剤と比較して、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約７０％または約８０％またはさらには約９０％だけ、測定可能に縮小される限りにおいて、感染を低減または防止する組成物は、感染を排除することができるが、必ずしも完全でなくてもよい。

【0085】

単離された：当該構成成分が天然に存在する生物の細胞における他の生物学的構成成分、すなわち、他の染色体および染色体外ＤＮＡならびにＲＮＡ、ならびにタンパク質から実質的に分離された、それから離れた状態で産生された、またはそれと離れるように精製された、生物学的構成成分（核酸、ペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体、例えば、抗体等）。よって、単離された核酸、ペプチドおよびタンパク質は、標準精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸、ペプチドおよびタンパク質、ならびに化学合成された核酸も包括する。単離された核酸、ペプチドまたはタンパク質、例えば、抗体は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％純粋であり得る。

【0086】

リンカー：２個の分子を１個の近接分子へと連結するために、例えば、検出可能なマーカーを抗体に連結するために使用することができる二機能性分子。ペプチドリンカーの非限定的な例は、グリシン－セリンリンカーを含む。

【0087】

用語「コンジュゲート」、「連接」、「結合」または「連結」は、２個の分子を１個の近接分子にすること；例えば、２個のポリペプチドを１個の近接ポリペプチドへと連結すること、またはエフェクター分子もしくは検出可能なマーカー放射性核種もしくは他の分子をｓｃＦｖ等のポリペプチドに共有結合により取り付けることを指すことができる。連結は、化学的または組換え手段のいずれかによるものであり得る。「化学的手段」は、１個の分子を形成するように２個の分子の間に形成された共有結合が存在するような、抗体部分およびエフェクター分子の間の反応を指す。

【0088】

核酸（分子または配列）：ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成（化学合成等）ＤＮＡまたはＲＮＡを限定することなく含む、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドポリマーまたはそれらの組合せ。核酸は、二本鎖（ｄｓ）または一本鎖（ｓｓ）であり得る。一本鎖の場合、核酸は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。核酸は、天然ヌクレオチド（Ａ、Ｔ／Ｕ、ＣおよびＧ等）を含むことができ、天然ヌクレオチドのアナログ、例えば、標識されたヌクレオチドを含むことができる。

【0089】

「ｃＤＮＡ」は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかにおいて、ｍＲＮＡと相補的または同一であるＤＮＡを指す。

【0090】

「コードする」は、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）またはアミノ酸の定義された配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ等、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特異的配列の固有の特性、およびそれに起因する生物学的特性を指す。よって、遺伝子は、当該遺伝子によって産生されたｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物システムにおいてタンパク質を産生する場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提示される、コード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、当該遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称され得る。他に指定がなければ、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含むことができる。

【0091】

作動可能に連結された：第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係性で設置されている場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を与える場合、ＣＭＶプロモーター等のプロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は近接しており、２個のタンパク質コード領域を連接することが必要な場合、同じ読み枠内にある。

【0092】

薬学的に許容される担体：役立つ薬学的に許容される担体は、従来のものである。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd ed., London, UK: Pharmaceutical Press, 2013は、開示されている薬剤の医薬品送達に適した組成物および製剤について記載する。

【0093】

一般に、担体の性質は、用いられている特定の投与機序に依存するであろう。例えば、非経口製剤は通常、媒体として、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水、グリセロールその他等、薬学的におよび生理学的に許容される流体を含む注射可能流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸薬、錠剤またはカプセル形態）について、従来の無毒性固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与されるべき医薬組成物は、少量の無毒性補助的物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、添加される保存料（非天然保存料等）およびｐＨ緩衝剤その他、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。特定の例では、薬学的に許容される担体は、無菌であり、例えば、注射による対象への非経口投与に適している。一部の実施形態では、活性薬剤および薬学的に許容される担体は、丸薬等の単位剤形で、またはバイアルにおいて選択された含量で提供される。単位剤形は、１つの投薬量または複数の投薬量を含むことができる（例えば、計量された投薬量の薬剤を選択的に分注することができるバイアルにおいて）。

【0094】

ポリペプチド：アミド結合により一体に連接された、単量体がアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がアルファ－アミノ酸である場合、Ｌ－光学異性体またはＤ－光学異性体のいずれかを使用することができ、Ｌ－異性体が好まれる。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、本明細書で使用される場合、いずれかのアミノ酸配列を包含し、糖タンパク質等の修飾された配列を含むことを意図する。ポリペプチドは、天然に存在するタンパク質と、組換えまたは合成により産生されたものの両方を含む。ポリペプチドは、アミノ末端（Ｎ末端）側の端およびカルボキシ末端側の端を有する。一部の実施形態では、ポリペプチドは、開示されている抗体またはその断片である。

【0095】

精製された：精製されたという用語は、絶対的な純度を要求しない；むしろこれは、相対的な用語として意図される。よって、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質（抗体等）が、細胞内等、その天然の環境にあるペプチドまたはタンパク質よりも富化された調製物である。一実施形態では、タンパク質またはペプチドが、調製物の総ペプチドまたはタンパク質含有量の少なくとも５０％を表すように、調製物は精製される。

【0096】

組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するか、または２個の組合せを行わなければ分離された状態の配列セグメントの人為的な組合せによって作製された配列を有する核酸である。この人為的な組合せは、化学合成によって、またはより一般的には、単離された核酸セグメントの人為的なマニピュレーションによって、例えば、遺伝子操作技法によって達成することができる。組換えタンパク質は、天然に存在しない配列を有するか、または２個の組合せを行わなければ分離された状態の配列セグメントの人為的な組合せによって作製された配列を有するタンパク質である。いくつかのインプリメンテーションでは、組換えタンパク質は、細菌または真核細胞等の宿主細胞に導入された異種（例えば、組換え）核酸によってコードされる。核酸は、例えば、導入された核酸によってコードされるタンパク質を発現することができるシグナルを有する発現ベクターにおいて導入され得る、または核酸は、宿主細胞染色体に組み込まれ得る。

【0097】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２：２０１９年にヒトに最初に出現したベータコロナウイルス属のコロナウイルス。このウイルスは、武漢（Wuhan）コロナウイルス、２０１９－ｎＣｏＶまたは２０１９新型コロナウイルスとしても公知である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、重症急性呼吸器感染症の致死的原因として出現したポジティブセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルスゲノムは、キャッピングされ、ポリアデニル化され、ヌクレオカプシドタンパク質でカバーされている。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオンは、大型のスパイク糖タンパク質を有するウイルスエンベロープを含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、大部分のコロナウイルスと同様に、ゲノムの５’側の３分の２に含まれたレプリカーゼ遺伝子およびゲノムの３’側の３分の１に含まれた構造遺伝子による共通ゲノム組織化を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムは、５’－スパイク（Ｓ） － エンベロープ（Ｅ） － 膜（Ｍ）およびヌクレオカプシド（Ｎ）－３’の順序で構造タンパク質遺伝子の正準セットをコードする。

【0098】

用語「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」は、アルファ（Ｂ．１．１．７およびＱ系列）；ベータ（Ｂ．１．３５１および派生系列）；デルタ（Ｂ．１．６１７．２およびＡＹ系列）；ガンマ（Ｐ．１および派生系列）；イプシロン（Ｂ．１．４２７およびＢ．１．４２９）；エータ（Ｂ．１．５２５）；イオタ（Ｂ．１．５２６）；カッパー（Ｂ．１．６１７．１）；１．６１７．３；ミュー（Ｂ．１．６２１、Ｂ．１．６２１．１）、ゼータ（Ｐ．２）およびオミクロン（Ｂ．１．１．５２９）等が挙げられるがこれらに限定されない、そのバリアントを含む。

【0099】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の症状は、発熱ならびに乾性咳嗽および息切れ等の呼吸器疾病を含む。重症感染の症例は、重症肺炎、多臓器不全および死亡へと進行し得る。曝露から症状開始までの時間は、およそ２～１４日間である。

【0100】

患者症状および背景の査定ならびに遺伝子検査、例えば、逆転写－ポリメラーゼ連鎖反応（ｒＲＴ－ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない、ウイルス感染を検出するための標準方法を使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を検出することができる。検査は、呼吸器または血液試料等の患者試料において行うことができる。

【0101】

ＳＡＲＳスパイク（Ｓ）タンパク質：ＳＡＲＳ－ＣｏＶではおよそ１２５６アミノ酸のサイズ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２では１２７３アミノ酸のサイズの前駆体タンパク質として最初に合成されるクラスＩ融合糖タンパク質。個々の前駆体Ｓポリペプチドは、ホモ三量体を形成し、ゴルジ体内でグリコシル化を受けると共に、シグナルペプチドを除去するようにプロセシングされ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶではおよそ６７９／６８０位、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２では６８５／６８６位の間で細胞プロテアーゼにより切断されて、別々のＳ１およびＳ２ポリペプチド鎖を生成し、これは、ホモ三量体内のＳ１／Ｓ２プロトマーとして会合を維持し、したがって、ヘテロ二量体の三量体となる。Ｓ１サブユニットは、ウイルス膜に対して遠位にあり、Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）と、その宿主受容体へのウイルス取付けを媒介することが考えられる受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）とを含有する。Ｓ２サブユニットは、融合ペプチド等の融合タンパク質機構、融合糖タンパク質に典型的な２個の７アミノ酸繰り返し配列（ＨＲ１およびＨＲ２）および中心ヘリックス、膜貫通ドメイン、ならびにサイトゾルテイルドメインを含有すると考えられる。

【0102】

足場：本明細書に開示される合成シングルドメインモノクローナル抗体等、モノクローナル抗体の４個のフレームワーク領域。一部のインプリメンテーションでは、シングルドメインモノクローナル抗体の足場は、それぞれ配列番号１、２、３および４として示されるＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列を含む。足場は、配列番号１、２、３および／または４に対して１、２、３、４または５個の保存的アミノ酸置換等の１～５個の保存的アミノ酸置換を有するバリアント等、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のバリアントを含むこともできる。

【0103】

配列同一性：２種もしくはそれよりも多い核酸配列または２種もしくはそれよりも多いアミノ酸配列の間の同一性は、配列間のパーセンテージ同一性単位で表現される。配列同一性は、パーセンテージ同一性単位で測定することができる；パーセンテージが高いほど、配列はより同一となる。標的抗原に特異的に結合する抗体のＶ_ＬまたはＶ_Ｈのホモログおよびバリアントは典型的に、目的のアミノ酸配列との全長整列にわたり計数される少なくとも約７５％配列同一性、例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性の保有によって特徴付けされる。

【0104】

いずれか適した方法を使用して、比較のために配列を整列することができる。プログラムおよび整列アルゴリズムの非限定的な例は、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2(4):482-489, 1981；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48(3):443-453, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85(8):2444-2448, 1988；Higgins and Sharp, Gene, 73(1):237-244, 1988；Higgins and Sharp, Bioinformatics, 5(2):151-3, 1989；Corpet, Nucleic Acids Res. 16(22):10881-10890, 1988；Huang et al. Bioinformatics, 8(2):155-165, 1992；およびPearson, Methods Mol. Biol. 24:307-331, 1994に記載されている。Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990は、配列整列方法および相同性計算についての詳細な考察を発表する。ＮＣＢＩ基本的局所整列検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool）（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215(3):403-410, 1990）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと接続した使用のために、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎおよびインターネット上を含むいくつかの供給源から利用することができる。Ｂｌａｓｔｎは核酸配列の比較に使用され、一方、ｂｌａｓｔｐはアミノ酸配列の比較に使用される。追加の情報は、ＮＣＢＩウェブサイトに見出すことができる。

【0105】

一般に、２種の配列を整列したら、両方の配列に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在する位置の数を計数することにより、マッチの数を決定する。マッチの数を、同定された配列に示される配列の長さまたは繋がれた長さ（同定された配列に示される配列由来の１００個の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基等）のいずれかで割り、続いて、その結果生じる値に１００を掛けることにより、２種の配列の間のパーセント配列同一性を決定する。

【0106】

特異的に結合する：抗体を参照する場合、タンパク質および他の生物製剤の不均一集団の存在下での標的タンパク質の存在を決定する結合反応を指す。よって、指名された条件下で、抗体は、特定の標的タンパク質、ペプチドまたは多糖（病原体の表面に存在する抗原、例えば、コロナウイルススパイクタンパク質等）に優先的に結合し、有意な量では、試料または対象に存在する他のタンパク質に結合しない。スパイクタンパク質に関して、抗体が、両方の型のウイルスにおけるスパイクタンパク質に結合するが、他のタンパク質には結合しないように、エピトープは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に存在することができる。特異的結合は、標準方法によって決定することができる。特異的免疫反応性の決定に使用することができるイムノアッセイフォーマットおよび条件の説明については、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Publications, New York (2013)を参照されたい。

【0107】

抗体－抗原複合体を参照すると、抗原および抗体の特異的結合は、約１０^－７モル濃度未満、例えば、約１０^－８モル濃度、１０^－９未満またはさらには約１０^－１０モル濃度未満のＫ_Ｄを有する。Ｋ_Ｄは、所与の相互作用、例えば、ポリペプチドリガンド相互作用または抗体抗原相互作用の解離定数を指す。例えば、抗体または抗原結合性断片および抗原の二分子相互作用について、それは、複合体の濃度で割った二分子相互作用の個々の構成成分の濃度である。

【0108】

コロナウイルススパイクタンパク質におけるエピトープに特異的に結合する抗体は、ウイルス、スパイクタンパク質が取り付けられた基材または生物学的検体中のタンパク質を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のスパイクタンパク質のＮＴＤまたはＲＢＤ等のコロナウイルススパイクタンパク質に実質的に結合する抗体である。当然ながら、ある程度の非特異的相互作用が、抗体および非標的の間に発生し得ることが認識される。典型的には、特異的結合は、抗体およびスパイクタンパク質の間に、抗体および他の異なるコロナウイルスタンパク質（ＭＥＲＳ等）または非コロナウイルスタンパク質の間よりもはるかに強い会合をもたらす。特異的結合は典型的に、エピトープを含むタンパク質または標的エピトープを発現する細胞もしくは組織に結合した抗体の量（単位時間当たり）の、このエピトープを欠如するタンパク質または細胞または組織と比較して、２倍を超える、例えば、５倍を超える、１０倍を超えるまたは１００倍を超える増加をもたらす。そのような条件下でのタンパク質への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択される抗体を要求する。種々のイムノアッセイフォーマットは、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体または他のリガンドの選択に適切である。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するためにルーチンに使用される。

【0109】

対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ブタ、ラクダ、コウモリ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、齧歯類その他を含むカテゴリーである、生きている多細胞脊椎動物の生物。ある例では、対象は、ヒトである。特定の例では、対象は、ヒトである。追加の例では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の阻害を必要とする対象が選択される。例えば、対象は、感染しておらず、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクがあるか、または感染しており、処置の必要がある。

【0110】

合成：研究室において人為的手段によって産生されることであり、例えば、合成核酸またはタンパク質（例えば、抗体）は、研究室において化学合成することができる。

【0111】

合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリー：本開示の文脈では、用語「合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリー」は、ＣＤＲ配列の間に高い程度の多様性を有する合成シングルドメイン抗体コード配列、および必要に応じてクローニングベクターまたは発現ベクターを含む核酸ライブラリーを包含する。合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーは、核酸ライブラリーで形質転換された細菌、酵母もしくは糸状菌もしくは哺乳動物細胞等、核酸ライブラリーを含有するいずれかの形質転換された宿主細胞もしくは生物、または核酸ライブラリーを含有するバクテリオファージもしくはウイルスをさらに含むことができる。この用語は、核酸ライブラリーによってコードされる多様な抗体の対応する混合物をさらに含むことができる。

【0112】

形質転換された：形質転換された細胞は、分子生物学技法によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書で使用される場合、形質転換されたという用語や、その他（例えば、形質転換、トランスフェクション、形質導入等）は、ウイルスベクターによる形質導入、プラスミドベクターによる形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクションおよびパーティクルガン加速によるＤＮＡの導入を含む、そのような細胞に核酸分子を導入することができるあらゆる技法を包含する。

【0113】

ベクター：目的のタンパク質のコード配列に操作可能に連結されており、コード配列を発現することができる、プロモーター（複数可）を有する核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ分子等）を含有する実体。非限定的な例は、ネイキッドのもしくはパッケージングされた（脂質および／またはタンパク質）ＤＮＡ、ネイキッドのもしくはパッケージングされたＲＮＡ、複製能力がなくてよいウイルスもしくは細菌もしくは他の微生物、または複製能力があってよいウイルスもしくは細菌もしくは他の微生物の部分構成成分を含む。ベクターは時に、構築物と称される。組換えＤＮＡベクターは、組換えＤＮＡを有するベクターである。ベクターは、複製開始点等、それが宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列を含むことができる。ベクターは、１個または複数の選択可能なマーカー遺伝子および他の遺伝的エレメントを含むこともできる。ウイルスベクターは、１種または複数のウイルスに由来する少なくとも一部の核酸配列を有する組換え核酸ベクターである。一部のインプリメンテーションでは、ウイルスベクターは、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合し、コロナウイルスを中和する、開示されている抗体または抗原結合性断片をコードする核酸分子を含む。一部のインプリメンテーションでは、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。

【0114】

～に十分な条件下で：所望の活性を可能にするいずれかの環境を表すために使用される語句。

【0115】

ＩＩＩ．序論
「ナノボディ」としても公知のシングルドメインモノクローナル抗体は、Ｃａｍｅｌｉｄａｅ（Ｖ_ＨＨ）および一部のサメ種に存在する重鎖のみの抗体の特有のクラスである。Ｖ_ＨＨおよびサメ可変新抗原受容体（Ｖ_ＮＡＲ）抗体は、それらの全長ＩｇＧ対応物よりも１桁小さい。抗ウイルス生物製剤としてこれらの型のシングルドメインモノクローナル抗体を使用することの利点は、原核生物系における数キログラムスケールでの簡便なバルク産生、長い有効期間、および組織におけるより優れた透過性を含む（Dumoulin et al., Protein Sci 11, 500-515, 2002；Hussack et al., PLoS One 6, e28218, 2011）。シングルドメインモノクローナル抗体は、経口で（例えば、ＧＩＴ活性のためのＶ５６５）または吸入により（例えば、ＡＬＸ－０１７１）投与することができ、これらの経路は両者共に、ＣＯＶＩＤ－１９の処置に有益である（Arezumand et al., Front Immunol 8, 1746, 2017；Nambulli et al., Science Advances 7, eabh0319, 2021）。

【0116】

ファージディスプレイにより、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質等の目的の標的に対して作製された中和シングルドメインモノクローナル抗体の同定のための迅速かつ効率的な方法が本明細書に開示される。ヒト化シングルドメインモノクローナル抗体フレームワークを、ランダム化された相補性決定領域（ＣＤＲ）と組み合わせて、抗原認識を多様化することにより、合成ライブラリーを構築した。１０種の富化されたＲＢＤ結合剤のうち、ＲＢＤ－１－２Ｇが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化粒子に対する４９０ｎＭのＩＣ_５０により最も強力であった。ＲＢＤ－１－２Ｇ抗体の二価または三価フォーマットの構築は、シュードタイプ化粒子および真正のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する改善された親和性および中和効力をもたらした。さらに、安定化されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質外部ドメイン（Wrapp et al., Science 367, 1260-1263, 2020）と複合体形成した４種のシングルドメインモノクローナル抗体のクライオ電子顕微鏡（クライオＥＭ）構造は、２種の別個の結合機序を明らかにした。「グループ１」シングルドメインモノクローナル抗体に対するエピトープは、ＲＢＤの遠位端における受容体結合モチーフ（ＲＢＭ）と重複する。「グループ２」結合剤は、隣接する単量体のＮ末端ドメインに対して近位にある平坦な区域におけるエピトープを標的化する。この結合部位は、ＲＢＭと重複しないことが見出され、ＡＣＥ結合を阻害することができなかった。さらに、クライオＥＭは、３コピーのＲＢＤ－１－２Ｇが、同じスパイク三量体に結合することができたことを示した。ＲＢＤ－１－２Ｇ抗体は、Ｎ５０１Ｙ突然変異を含有するシュードタイプ化粒子を中和することができた。分子動力学シミュレーションは、スパイク－ＡＣＥ２界面に排他的に集中したシングルドメインモノクローナル抗体の基盤を提供し、ＣＤＲ３が、ＷＴ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＢ．１．１．７アルファバリアント（Ｎ５０１Ｙ）の中和に関与する最も重要な領域であることを指し示す。

【0117】

本明細書に開示される研究は、合成ヒト化シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーのパニングが、強い治療および予防潜在力を有し得る強力な中和抗体を同定するための効率的でファスト・トラックな方法であることを実証した。本アプローチは、ＣＯＶＩＤ－１９等、流行中および新興の感染性疾患の介入を大いに支援することができる。

【0118】

ＩＶ．合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリー
本開示は、合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーを作製する方法を提供する。一部のインプリメンテーションでは、方法は、合成シングルドメインモノクローナル抗体のそれぞれのフレームワーク（ＦＲ）コード領域の間の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列をコードする核酸分子の多様性を導入して、同じ合成シングルドメインモノクローナル抗体足場アミノ酸配列を有する合成シングルドメインモノクローナル抗体の多様性をコードする核酸分子を生成するステップを含む。一部のインプリメンテーションでは、合成シングルドメインモノクローナル抗体足場は、配列番号１を含むＦＲ１配列、配列番号２を含むＦＲ２配列、配列番号３を含むＦＲ３配列および配列番号４を含むＦＲ４配列を含む。

【0119】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ１は、５～８残基（５、６、７または８残基）の長さであり、ＣＤＲ１配列のアミノ酸残基は、次の法則に従って決定される：ＣＤＲ１の１位は、グリシン（Ｇ）であり；ＣＤＲ１の２位は、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）またはチロシン（Ｙ）であり；ＣＤＲ１の３位は、イソロイシン（Ｉ）であり；ＣＤＲ１の４位は、フェニルアラニン（Ｆ）またはＳであり；ＣＤＲ１の５位は、Ｙ、Ｇ、アスパラギン酸（Ｄ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、Ｓ、バリン（Ｖ）、Ｆ、ロイシン（Ｌ）、Ｔ、グルタミン酸（Ｅ）、プロリン（Ｐ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、Ｉ、メチオニン（Ｍ）、Ｎまたはグルタミン（Ｑ）であり；ＣＤＲ１の６、７および／または８位は、存在する場合、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮおよびＱから個々に選択される。一部の例では、５位、存在する場合の６位、存在する場合の７位および／または存在する場合の８位のそれぞれのアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む。

【0120】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ２は、９残基の長さであり、ＣＤＲ２配列のアミノ酸残基は、次の法則に従って決定される：ＣＤＲ２の１位は、Ｉであり；ＣＤＲ２の２位は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の３位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ２の４位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ２の５位は、Ｇであり；ＣＤＲ２の６位は、Ａ、Ｇ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の７位は、Ｉ、Ｎ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の８位は、Ｔであり；ＣＤＲ２の９位は、ＮまたはＹである。一部の例では、３位および４位のそれぞれのアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む。

【0121】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ３は、１４～２０アミノ酸の長さ（１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４アミノ酸の長さ）であり、各位置は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮおよびＱから個々に選択される。一部の例では、ＣＤＲ３の各位置のアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む。

【0122】

本明細書に開示される方法によって入手可能な合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーも本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーは、少なくとも１０^８、１０^９、１０^１０または１０^１１種の特有の抗体配列を含む。一部の例では、合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーは、少なくとも１０^１０種の特有の抗体配列を含む。

【0123】

目的の標的に結合する合成シングルドメインモノクローナル抗体を同定するためのスクリーニング方法がさらに本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、スクリーニング方法は、本明細書に開示される合成シングルドメイン抗体ライブラリーの使用を含む。一部の例では、目的の標的は、微生物抗原、例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または寄生生物抗原である。具体例では、ウイルス抗原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原、例えば、スパイクタンパク質である。他の例では、目的の標的は、腫瘍抗原である。一部のインプリメンテーションでは、スクリーニング方法は、ファージディスプレイ方法である。

【0124】

次式を有するシングルドメインモノクローナル抗体：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（式中、ＦＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１を含み、ＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２を含み、ＦＲ３のアミノ酸配列は、配列番号３を含み、ＦＲ４のアミノ酸配列は、配列番号４を含む）も本明細書に提供される。

【0125】

シングルドメインモノクローナル抗体の一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ１は、５～８（５、６、７または８）残基の長さであり、ＣＤＲ１配列のアミノ酸残基は、次の法則に従って決定される：ＣＤＲ１の１位は、Ｇであり；ＣＤＲ１の２位は、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＹであり；ＣＤＲ１の３位は、Ｉであり；ＣＤＲ１の４位は、ＦまたはＳであり；ＣＤＲ１の５位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ１の６、７および／または８位は、存在する場合、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱからランダムに選択される。一部の例では、５位、存在する場合の６位、存在する場合の７位および／または存在する場合の８位のそれぞれのアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む。

【0126】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ２は、９残基の長さであり、ＣＤＲ２配列のアミノ酸残基は、次の法則に従って決定される：ＣＤＲ２の１位は、Ｉであり；ＣＤＲ２の２位は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の３位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ２の４位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ２の５位は、Ｇであり；ＣＤＲ２の６位は、Ａ、Ｇ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の７位は、Ｉ、Ｎ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の８位は、Ｔであり；ＣＤＲ２の９位は、ＮまたはＹである。一部の例では、３位および４位のそれぞれのアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む。

【0127】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ３は、１４～２０アミノ酸の長さ（１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４アミノ酸の長さ）であり、各位置は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮおよびＱから個々に選択される。一部の例では、ＣＤＲ３の各位置のアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む。

【0128】

本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体をコードする核酸分子がさらに提供される。一部のインプリメンテーションでは、核酸分子は、異種プロモーター等のプロモーターに作動可能に連結される。開示されている核酸分子を含むベクター、および開示されている核酸分子またはベクターを含む単離された宿主細胞も提供される。

【0129】

Ａ．シングルドメイン抗体足場におけるＣＤＲ多様性の導入
ＣＤＲコード配列のランダムなまたは方向性のある合成および対応するフレームワーク配列へのクローニング等による、抗体ライブラリーのためにＣＤＲ多様性を生成するための方法が記載されている（例えば、ＵＳ２０１６／０２３７１４２；およびLindner et al., Molecules 16:1625-1641, 2011）。同様に、本明細書に開示される合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーは、高いＣＤＲ多様性を選択される足場配列に導入することにより生成された（米国特許第１０，９１９，９８０号）。

【0130】

一部のインプリメンテーションでは、合成ＣＤＲ１および合成ＣＤＲ２の各アミノ酸配列の位置は、ヒトレパートリーにおいて見出されるＣＤＲの天然の多様性を模倣するように合理的に設計される。一部の例では、細胞内発現および機能性に干渉し得るそのチオール基が原因で、システインは回避される。

【0131】

ＣＤＲ３配列の長さは、異なるエピトープ形状への抗体の結合潜在力、特に、タンパク質の空洞内のエピトープへの結合に影響し得る。したがって、開示されているシングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーは、ＣＤＲ３配列の長さが変動する。一部の例では、ＣＤＲ３は、１４～２０アミノ酸の長さ、例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０アミノ酸の長さである。

【0132】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ１は、５～８アミノ酸の長さ、例えば、５、６、７または８アミノ酸の長さである。一部の例では、ＣＤＲ１のアミノ酸残基は、次の法則に従って選択される：ＣＤＲ１の１位は、Ｇであり；ＣＤＲ１の２位は、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＹであり；ＣＤＲ１の３位は、Ｉであり；ＣＤＲ１の４位は、ＦまたはＳであり；ＣＤＲ１の５位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ１の６、７および／または８位は、存在する場合、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱからランダムに選択される。一部の例では、５位、存在する場合の６位、存在する場合の７位および／または存在する場合の８位のそれぞれのアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む（図１Ａを参照）。

【0133】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ２は、９残基の長さであり、ＣＤＲ２配列のアミノ酸残基は、次の法則に従って決定される：ＣＤＲ２の１位は、Ｉであり；ＣＤＲ２の２位は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の３位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ２の４位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ２の５位は、Ｇであり；ＣＤＲ２の６位は、Ａ、Ｇ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の７位は、Ｉ、Ｎ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の８位は、Ｔであり；ＣＤＲ２の９位は、ＮまたはＹである。一部の例では、３位および４位のそれぞれのアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む。

【0134】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ３は、１４～２０アミノ酸の長さ（１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４アミノ酸の長さ）であり、各位置は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮおよびＱから個々に選択される。一部の例では、ＣＤＲ３の各位置のアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む。

【0135】

上述の法則は、本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーを生成するためのガイドとして使用される。しかし、本明細書に開示される合成シングルドメインモノクローナル抗体足場（配列番号１～４またはそれらのバリアント）を含有する限りにおいて、異なるアミノ酸多様性法則による他のライブラリーも考慮される。

【0136】

特定のインプリメンテーションでは、ライブラリーの相当な比率のクローンのみが、ＣＤＲ組成についての上述の法則に厳密に従う。例えば、統計的には、ライブラリーのクローンの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％が、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３位置におけるアミノ酸残基の組成の上述の法則に従う。

【0137】

一部のインプリメンテーションでは、アミノ酸位置についての上に挙げた法則に従い、インフレーム停止コドンもしくはシステイン残基の出現を回避するために、またはフレームシフトの出現を低減させるために、先端的遺伝子合成アプローチが使用される。そのような方法は、二本鎖ＤＮＡトリプルブロック（例えば、Van den Brulle et al., Biotechniques 45(3): 340-343, 2008を参照）、トリヌクレオチド合成、または他のコドン制御された、より一般には、位置制御された縮重合成アプローチを含むがこれらに限定されない。

【0138】

一部のインプリメンテーションでは、コドンバイアスは、例えば、周知方法を使用して、宿主細胞種、例えば、哺乳動物宿主細胞発現のために最適化される。一部の例では、コード配列は、望まれない制限部位、例えば、適切なクローニングまたは発現ベクターへのコード配列のクローニングに使用される制限部位を含有しないように設計される。

【0139】

その結果生じる多様なコード配列は、抗体ライブラリーのための適した発現またはクローニングベクターに導入される。特定のインプリメンテーションでは、発現ベクターは、プラスミドである。他の特定のインプリメンテーションでは、発現ベクターは、ファージディスプレイライブラリーの生成に適する。２つの異なる型のベクターを、ファージディスプレイライブラリーの生成に使用することができる：ファージミドベクターおよびファージベクター。

【0140】

ファージミドは、プラスミドの複製起点を含有する糸状ファージ（Ｆｆ－ファージ由来）ベクターに由来する。ファージミドの基本的構成成分は、プラスミドの複製起点、選択的マーカー、遺伝子間領域（ＩＧ領域、これは通常、パッキング配列、ならびにマイナスおよびプラス鎖の複製起点を含有する）、ファージコートタンパク質の遺伝子、制限酵素認識部位、プロモーター、およびシグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントを主に含む。その上、ファージミドに基づくライブラリーのスクリーニングを容易にするための分子タグが含まれていてよい。ファージミドは、Ｒ４０８、Ｍ１３ＫＯ７およびＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）等のヘルパーファージとの同時感染によりＦｆファージと同じ形態を有する糸状ファージ粒子へと変換され得る。ファージベクターの一例は、ｆｄ－ファージゲノムおよびファージゲノム複製開始点の付近に挿入されたＴｎ１０のセグメントからなるｆｄ－ｔｅｔ（Zacher et al., Gene 9:127-140, 1980）である。ファージミドベクターにおける使用のためのプロモーターの例は、ＰｌａｃＺおよびＰＴ７を含むがこれらに限定されず、シグナルペプチドの例は、ｐｅｌＢリーダー、ｇＩＩＩ、ＣＡＴリーダー、ＳＲＰおよびＯｍｐＡシグナルペプチドを含むがこれらに限定されない。

【0141】

他のファージディスプレイ方法は、Ｔ４またはＴ７等の溶解性ファージを使用する方法を含む。細菌細胞ディスプレイ（Daugherty et al., Protein Eng 12(7):613-621, 1999；Georgiou et al., Nat Biotechnol 15(1):29-34, 1997）、酵母細胞ディスプレイ（Boder and Wittrup, Nat Biotechnol 15(6):553-557, 1997）、リボソームディスプレイ（Zahnd et al., Nat Methods 4(3):269-279, 2007）、ＤＮＡディスプレイ（Eldridge et al., Protein Eng Des Sel 22(11):691-698, 2009）および哺乳動物細胞における表面ディスプレイ（Rode et al., Biotechniques 21(4):650, 652-3, 655-6, 658, 1996）のためのベクターを含む、ディスプレイライブラリーを生成するためのファージ以外のベクターを使用することもできる。酵母ツーハイブリッド等の非ディスプレイ方法を使用して、ライブラリーから関連する結合剤を選択することもできる（Visintin et al., Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728, 1999）。

【0142】

一部のインプリメンテーションでは、空ベクターの生成を回避するために、自殺遺伝子を有するクローニングベクターにおける組換えコード配列の陽性選択が使用される（例えば、Bernard, BioTechniques 21(2)320-323, 1996を参照）。

【0143】

一部の例では、抗体ライブラリーを生成するために設計されたＣＤＲアミノ酸残基のあらゆる可能な組合せによって計算される多様性は、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０、少なくとも１０^１１または少なくとも１０^１２種の特有の配列である。

【0144】

Ｂ．合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーおよびその使用
本明細書に開示される方法によって産生された合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーも本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーは、少なくとも１０^８、少なくとも１０^９、少なくとも１０^１０または少なくとも１０^１１種の特有の抗体配列を含む。一部の例では、合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーは、少なくとも１０^１０種の特有の抗体配列を含む。

【0145】

一部のインプリメンテーションでは、合成シングルドメインモノクローナル抗体は、目的の標的に特異的に結合するシングルドメインモノクローナル抗体を同定するため等、スクリーニング方法において使用される。本明細書に開示される合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーを用いて、目的の標的に対して特異的な親和性を有する結合剤を同定するためのいずれか公知のスクリーニング方法を使用することができる。そのような方法は、ファージディスプレイ技術、細菌細胞ディスプレイ、酵母細胞ディスプレイ、哺乳動物細胞ディスプレイまたはリボソームディスプレイを含むがこれらに限定されない。特定の例では、スクリーニング方法は、ファージディスプレイである。

【0146】

一部のインプリメンテーションでは、目的の標的は、治療用標的であり、合成シングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーは、治療用標的への特異的結合を有する合成シングルドメイン抗体を同定するために使用される。特異的なインプリメンテーションでは、目的の標的は、抗原であるか、または少なくとも１つの抗原決定基を含む。例えば、標的は、糖類もしくは多糖、タンパク質もしくは糖タンパク質、または脂質であり得る。１つの特異的なインプリメンテーションでは、目的の標的は、植物、酵母、真菌、昆虫、哺乳動物または他の真核生物の細胞起源のものである。別の特異的なインプリメンテーションでは、目的の標的は、細菌、原生動物またはウイルス起源のものである。特定の例では、標的は、ウイルス、細菌、真菌または原生動物抗原等、抗原である。具体的で非限定的な例では、標的は、スパイクタンパク質等、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗原である。

【0147】

Ｃ．ライブラリーから得られたシングルドメインモノクローナル抗体
本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーから選択されたシングルドメインモノクローナル抗体がさらに提供される。開示されるライブラリーの合成シングルドメインモノクローナル抗体の高い多様性を考慮すると、当業者は、ファージディスプレイ／パニング等の従来のスクリーニング方法によって、目的の標的（抗原、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質等）に対して高い親和性および高い特異性を有する合成シングルドメイン抗体を得ることができる。

【0148】

選択されたシングルドメインモノクローナル抗体は、適切な抗原結合特性を生成するために、必要に応じてさらに修飾され得る。特に、ＣＤＲ残基は、例えば、当技術分野で公知の技術（例えば、突然変異誘発、親和性成熟）を使用して、目的の標的に対する抗体親和性を増加させるため、そのフォールディングもしくはその産生を改善するため、またはその粘性を低減するために修飾され得る。

【0149】

一部のインプリメンテーションでは、次式を有するシングルドメインモノクローナル抗体：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（式中、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、ヒト化ラマフレームワーク配列である）が本明細書に提供される。特定の例では、それぞれフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４のアミノ酸配列は、配列番号１、２、３および４を含む。他の例では、フレームワーク配列は、目的の標的への特異的結合を保持しつつ、配列番号１、２、３および４に対して１、２、３、４または５個以下の保存的アミノ酸置換を有する配列番号１、２、３および４の機能的なバリアントである。さらに他の例では、フレームワーク配列は、目的の標的への特異的結合を保持しつつ、それぞれ配列番号１、２、３および４に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％配列同一性を有する配列番号１、２、３および４の機能的なバリアントである。典型的には、フレームワーク領域内の１個または複数のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリー由来の他のアミノ酸残基に置き換えることができ、新しいバリアントは、結合および／または機能アッセイにおいて検査することができる。

【0150】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ１は、５～８アミノ酸の長さ、例えば、５、６、７または８アミノ酸の長さである。一部の例では、ＣＤＲ１のアミノ酸残基は、次の法則に従って選択される：ＣＤＲ１の１位は、Ｇであり；ＣＤＲ１の２位は、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＹであり；ＣＤＲ１の３位は、Ｉであり；ＣＤＲ１の４位は、ＦまたはＳであり；ＣＤＲ１の５位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ１の６、７および／または８位は、存在する場合、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱからランダムに選択される。一部の例では、５位、存在する場合の６位、存在する場合の７位および／または存在する場合の８位のそれぞれのアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む（図１Ａを参照）。

【0151】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ２は、９残基の長さであり、ＣＤＲ２配列のアミノ酸残基は、次の法則に従って決定される：ＣＤＲ２の１位は、Ｉであり；ＣＤＲ２の２位は、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の３位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ２の４位は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮまたはＱであり；ＣＤＲ２の５位は、Ｇであり；ＣＤＲ２の６位は、Ａ、Ｇ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の７位は、Ｉ、Ｎ、ＳまたはＴであり；ＣＤＲ２の８位は、Ｔであり；ＣＤＲ２の９位は、ＮまたはＹである。一部の例では、３位および４位のそれぞれのアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む（図１Ａを参照）。

【0152】

一部のインプリメンテーションでは、ＣＤＲ３は、１４～２０アミノ酸の長さ（１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４アミノ酸の長さ）であり、各位置は、Ｙ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｖ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｗ、Ｈ、Ｋ、Ｉ、Ｍ、ＮおよびＱから個々に選択される。一部の例では、ＣＤＲ３の各位置のアミノ酸組成は、１３％Ｙ、１２％Ｇ、１０％Ｄ、１０％Ａ、８％Ｒ、８％Ｓ、５％Ｖ、５％Ｆ、４％Ｌ、４％Ｔ、３％Ｅ、３％Ｐ、３％Ｗ、２％Ｈ、２％Ｋ、２％Ｉ、２％Ｍ、２％Ｎおよび２％Ｑを含む（図１Ａを参照）。

【0153】

Ｄ．核酸分子
本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体ライブラリーから選択されたシングルドメインモノクローナル抗体をコードする核酸分子も本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、核酸分子は、異種プロモーター等のプロモーターに作動可能に連結される。核酸は、細胞全体、細胞ライセート中に存在し得る、または部分的に精製されたもしくは実質的に純粋な形態の核酸であり得る。一部の例では、核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり、イントロン配列を含有しても含有しなくてもよい。

【0154】

一部のインプリメンテーションでは、核酸は、ＤＮＡ分子である。核酸は、ファージディスプレイベクター等のベクター中に、または組換えプラスミドベクター中に存在し得る。一部の例では、配列番号１～４のフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４をコードする、または前記配列番号１～４に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％配列同一性を有する対応するバリアント配列をコードする少なくとも１個または複数の核酸配列を含む単離された核酸分子またはベクターが提供される。

【0155】

シングルドメインモノクローナル抗体をコードする核酸分子は、標準組換えＤＮＡ技法によって、例えば、発現系における適切な分泌のためのシグナル配列、さらなる精製ステップのための精製タグおよび／または切断可能タグを含むようにさらにマニピュレートすることができる。これらのマニピュレーションにおいて、核酸分子（ＤＮＡ分子等）は、別のＤＮＡ分子に、または別のタンパク質をコードする断片に、例えば、精製／分泌タグまたは可動性リンカーに稼働可能に連結される。用語「稼働可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、２個のＤＮＡ分子が、機能的な様式で、例えば、２個のＤＮＡ分子によってコードされるアミノ酸配列がインフレームを維持するように、またはタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように連接されることを意味することを意図する。

【0156】

シングルドメインモノクローナル抗体の産生に適した単離された宿主細胞がさらに提供される。一部のインプリメンテーションでは、宿主細胞は、哺乳動物細胞系である。シングルドメインモノクローナル抗体の産生のための適切な条件下で宿主細胞を培養するステップと、シングルドメインモノクローナル抗体を単離するステップとを含む、シングルドメインモノクローナル抗体の産生のためのプロセスも提供される。

【0157】

本開示のシングルドメインモノクローナル抗体を分泌させるための哺乳動物宿主細胞は、ＣＨＯ、例えば、ＤＨＦＲ選択可能マーカー（例えば、Kaufman and Sharp, 1982 Mol. Biol. 159:601-621に記載）と共に使用されるＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220に記載）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＩｎｖｉｖｏｇｅｎのｐＦｕｓｅ発現系（Moutel et al., BMC Biotechnol 9:14, 2009に記載）、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞、またはＰＥＲ－Ｃ６細胞系、ＣｒｕｃｅｌｌもしくはＨＥＫ２９３細胞を含むヒト細胞系（Durocher et al., 2002, Nucleic Acids Res 30(2): 9）を含む。シングルドメインモノクローナル抗体をコードする核酸分子が、哺乳動物宿主細胞に導入される場合、宿主細胞における組換えポリペプチドの発現または宿主細胞が育成される培養培地への組換えポリペプチドの分泌および適正なリフォールディングを可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養して、シングルドメインモノクローナル抗体を産生することにより、抗体が産生される。次に、標準タンパク質精製方法を使用して、培養培地からシングルドメインモノクローナル抗体を回収することができる。

【0158】

Ｖ．コロナウイルススパイクタンパク質に特異的なモノクローナル抗体
高い親和性でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的に結合する合成シングルドメインモノクローナル抗体が本明細書に記載されている。シングルドメインモノクローナル抗体ＲＢＤ－１－２Ｇは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対する強力な中和活性を示す。この抗体は、合成シングルドメインモノクローナル抗体ファージディスプレイライブラリーから選択された。

【0159】

ＲＢＤ－１－２Ｇのアミノ酸配列を下に提示する。ＩＭＧＴの方法を使用して決定されたＣＤＲ配列は、太字下線によって指し示されている。当業者は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム等の代替番号付けスキームを使用してＣＤＲ境界を容易に決定することができる。

【化2】

【表A】

【0160】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に結合する（例えば、特異的に結合する）シングルドメインモノクローナル抗体が本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、シングルドメインモノクローナル抗体は、配列番号５として本明細書に示されるアミノ酸配列の少なくとも部分、例えば、いずれかの番号付けの慣例（ＩＭＧＴ、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａ等）によって決定されるＲＢＤ－１－２Ｇの１個または複数（全３個等）のＣＤＲ配列を含む。特定の例では、ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴを使用して決定される。

【0161】

一部のインプリメンテーションでは、シングルドメインモノクローナル抗体は、配列番号５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。特異的なインプリメンテーションでは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ、配列番号５の残基２６～３２、５０～５８および９７～１１０を含む。一部の例では、シングルドメインモノクローナル抗体のアミノ酸配列は、配列番号５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である。一部の例では、シングルドメインモノクローナル抗体は、フレームワーク領域１（ＦＲ１）、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を含み、ＦＲ１のアミノ酸配列は、配列番号１を含む；ＦＲ２のアミノ酸配列は、配列番号２を含む；ＦＲ３のアミノ酸配列は、配列番号３を含む；および／またはＦＲ４のアミノ酸配列は、配列番号４を含む。特定の例では、シングルドメインモノクローナル抗体のアミノ酸配列は、配列番号５を含むかまたはそれからなる。

【0162】

一部のインプリメンテーションでは、シングルドメインモノクローナル抗体は、ヒト化抗体である。

【0163】

一部のインプリメンテーションでは、モノクローナル抗体または抗原結合性断片は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および／またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１を中和する。

【0164】

一部のインプリメンテーションでは、シングルドメインモノクローナル抗体は、検出可能な標識、例えば、フルオロフォア、酵素または放射性同位元素にコンジュゲートされる。

【0165】

本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体と、異種タンパク質とを含む融合タンパク質も本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、異種タンパク質は、Ｆｃタンパク質、例えば、ヒトＦｃタンパク質またはマウスＦｃタンパク質を含む。一部の例では、Ｆｃタンパク質は、融合タンパク質の半減期を増加させる修飾を含むヒトＦｃタンパク質である。一部の例では、修飾は、新生児Ｆｃ受容体への結合を増加させる。他のインプリメンテーションでは、異種タンパク質は、タンパク質タグを含む。一部の例では、タンパク質タグは、Ｈｉｓタグおよび／またはヒトインフルエンザ赤血球凝集素タグを含む。特定の例では、タンパク質タグのアミノ酸配列は、配列番号６を含むかまたはそれからなる。

【0166】

本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体を含む二価抗体も本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、二価抗体は、Ｆｃタンパク質、例えば、ヒトＦｃタンパク質に融合されたシングルドメインモノクローナル抗体の２個の単量体を含む。一部の例では、Ｆｃタンパク質は、融合タンパク質の半減期を増加させる修飾を含むヒトＦｃタンパク質である。一部の例では、修飾は、新生児Ｆｃ受容体への結合を増加させる。

【0167】

本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体の３個の単量体を含む三価単鎖Ｆｖ抗体がさらに提供される。一部のインプリメンテーションでは、三量体の各単量体は、可動性リンカー、例えば、（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号９）によって分離される。

【0168】

本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体と、異なる抗原またはスパイクタンパク質の異なるエピトープに特異的に結合する第２の抗体とを含む、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体も本明細書に提供される。

【0169】

本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体をコードする核酸分子がさらに本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、核酸分子は、シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体をコードするｃＤＮＡ配列である。一部のインプリメンテーションでは、核酸分子は、異種プロモーター等のプロモーターに作動可能に連結される。

【0170】

本明細書に開示される核酸分子を含むベクターも提供される。一部のインプリメンテーションでは、ベクターは、発現ベクターである。他のインプリメンテーションでは、ベクターは、ウイルスベクターである。開示されている核酸分子またはベクターを含む宿主細胞がさらに提供される。

【0171】

薬学的に許容される担体と、本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、核酸分子またはベクターとを含む組成物がさらに提供される。

【0172】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に特異的に結合するシングルドメインモノクローナル抗体を産生する方法も本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、方法は、宿主細胞において本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体をコードする１種または複数の核酸分子を発現させるステップと、シングルドメインモノクローナル抗体を精製するステップとを含む。

【0173】

対象由来の生体試料におけるコロナウイルスの存在を検出する方法がさらに提供される。一部のインプリメンテーションでは、方法は、免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、生体試料を、有効量の本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体と接触させるステップと、生体試料における免疫複合体の存在を検出するステップとを含む。生体試料における免疫複合体の存在は、試料におけるコロナウイルスの存在を指し示す。一部の例では、生体試料における免疫複合体の存在は、対象が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有することを指し示す。

【0174】

コロナウイルス感染を有するかまたはそのリスクがある対象におけるコロナウイルス感染を阻害する方法も提供される。一部のインプリメンテーションでは、方法は、有効量の開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、核酸分子、ベクターまたは組成物を対象に投与するステップを含む。一部の例では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。他の例では、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１である。

【0175】

対象におけるコロナウイルス感染を阻害するため、または生体試料におけるコロナウイルスの存在を検出するための開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、核酸分子、ベクターまたは組成物の使用も提供される。一部のインプリメンテーションでは、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。他のインプリメンテーションでは、コロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１である。

【0176】

ＶＩ．多重特異性抗体
多重特異性抗体は、２種もしくはそれよりも多いモノクローナル抗体（シングルドメイン抗体等）または２種もしくはそれよりも多い異なるモノクローナル抗体の抗原結合性断片で構成された組換えタンパク質である。例えば、二重特異性抗体は、２種の異なるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片で構成されている。よって、二重特異性抗体は、２種の異なる抗原（または２種の異なるエピトープ）に結合し、三重特異性抗体は、３種の異なる抗原（または３種の異なるエピトープ）に結合する。多重特異性抗体は、例えば、コロナウイルスＳタンパク質（Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）、またはＳ１もしくはＳ２サブユニット全体を含む）および炭水化物（Ｎ－グリカンを含む）、エンベロープタンパク質または赤血球凝集素－エステラーゼ二量体（ＨＥ）を同時に標的化することにより、コロナウイルス感染を処置するために使用することができる。一部の例では、多重特異性抗体は、コロナウイルスＳタンパク質のある部分（ＮＴＤ、ＲＢＤ、Ｓ１サブユニットまたはＳ２サブユニット等）を標的化する第１の結合ドメインと、同じコロナウイルスＳタンパク質の異なる部分（ＮＴＤ、ＲＢＤ、Ｓ１サブユニットまたはＳ２サブユニット等）を標的化する第２の結合ドメインとを含む。

【0177】

Ｓタンパク質特異的シングルドメインモノクローナル抗体を含む、多重特異性、例えば、三重特異性または二重特異性モノクローナル抗体が本明細書に提供される。一部のインプリメンテーションでは、多重特異性モノクローナル抗体は、Ｓタンパク質ＲＢＤ、ＮＴＤ、Ｓ１サブユニットもしくはＳ２サブユニット、または炭水化物（Ｎ－グリカン等）、または他のウイルスタンパク質（エンベロープまたはＨＥ等）に特異的に結合するモノクローナル抗体をさらに含む。多重特異性抗体をコードする単離された核酸分子およびベクター、ならびにこの核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供される。スパイクタンパク質特異的抗体を含む多重特異性抗体は、コロナウイルス感染の処置のために使用することができる。よって、治療有効量のスパイクタンパク質標的化多重特異性抗体を対象に投与することにより、コロナウイルス感染を有する対象を処置する方法が本明細書に提供される。

【0178】

同じ型または異なる型の２個またはそれよりも多い抗体、抗原結合性断片（ｓｃＦｖ等）の架橋等、いずれか適した方法を使用して、多重特異性抗体を設計および産生することができる。多重特異性抗体を作製する例示的な方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／１６３４２７に記載されている方法を含む。適した架橋剤の非限定的な例は、適切なスペーサーによって分離された２個の別個の反応基を有するヘテロ二機能性（ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシサクシニミドエステル等）またはホモ二機能性（スベリン酸ジサクシンイミジル等）である架橋剤を含む。

【0179】

多重特異性抗体は、本明細書に提供されるシングルドメインモノクローナル抗体によるコロナウイルススパイクタンパク質への結合を可能にする、いずれか適したフォーマットを有することができる。二重特異性単鎖抗体は、単一の核酸分子によってコードされ得る。二重特異性単鎖抗体と、そのような抗体を構築する方法の非限定的な例は、米国特許第８，０７６，４５９号、同第８，０１７，７４８号、同第８，００７，７９６号、同第７，９１９，０８９号、同第７，８２０，１６６号、同第７，６３５，４７２号、同第７，５７５，９２３号、同第７，４３５，５４９号、同第７，３３２，１６８号、同第７，３２３，４４０号、同第７，２３５，６４１号、同第７，２２９，７６０号、同第７，１１２，３２４号、同第６，７２３，５３８号に提供される。二重特異性単鎖抗体の追加の例は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９９／５４４４０；Mack et al., J. Immunol., 158(8):3965-3970, 1997；Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92(15):7021-7025, 1995；Kufer et al., Cancer Immunol. Immunother., 45(3-4):193-197, 1997；Loffler et al., Blood, 95(6):2098-2103, 2000；およびBruhl et al., J. Immunol., 166(4):2420-2426, 2001に見出すことができる。二重特異性Ｆａｂ－ｓｃＦｖ（「バイボディ（bibody）」）分子の産生は、例えば、Schoonjans et al. (J. Immunol., 165(12):7050-7057, 2000)およびWillems et al. (J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed Life Sci. 786(1-2):161-176, 2003)に記載されている。バイボディについて、ｓｃＦｖ分子を、ＶＬ－ＣＬ（Ｌ）またはＶＨ－ＣＨ１鎖の１つに融合して、例えば、１つのｓｃＦｖがＦａｂ鎖のＣ末端に融合されたバイボディを産生することができる。

【0180】

ＶＩＩ．コンジュゲート
本明細書に開示される、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合するシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖおよび二重特異性抗体は、薬剤、例えば、エフェクター分子または検出可能なマーカーにコンジュゲートすることができる。共有結合および非共有結合による取付け手段の両方を使用することができる。毒素ならびに放射性薬剤、例えば、^１２５Ｉ、^３２Ｐ、^１４Ｃ、^３Ｈおよび^３５Ｓならびに他の標識、標的部分、酵素およびリガンド等を含む（がこれらに限定されない）、様々なエフェクター分子および検出可能なマーカーを使用することができる。特定のエフェクター分子または検出可能なマーカーの選択は、特定の標的分子または細胞、および所望の生物学的効果に依存する。

【0181】

検出可能なマーカーを抗体に取り付けるための手順は、エフェクターの化学構造に従って変動する。ポリペプチドは典型的に、エフェクター分子または検出可能なマーカーの結合をもたらすためのポリペプチドにおける適した官能基との反応に利用できる種々の官能基、例えば、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）、遊離アミン（－ＮＨ_２）またはスルフヒドリル（－ＳＨ）基を含有する。あるいは、抗体は、追加の反応性官能基を露出するかまたはそれを取り付けるように誘導体化される。誘導体化には、いずれか適したリンカー分子の取付けが関与し得る。リンカーは、抗体およびエフェクター分子または検出可能なマーカーの両方と共有結合を形成することができる。適したリンカーは、直鎖もしくは分枝鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカーまたはペプチドリンカーを含むがこれらに限定されない。抗体およびエフェクター分子または検出可能なマーカーがポリペプチドである場合、リンカーは、それらの側鎖（システインへのジスルフィド連結を介する等）もしくはアルファ炭素を介して、または末端アミノ酸のアミノおよび／もしくはカルボキシル基を介して構成物アミノ酸に連接され得る。

【0182】

種々の放射線診断化合物、放射線療法化合物、標識（酵素または蛍光分子等）、毒素および他の薬剤を抗体に取り付けるための報告された多数の方法を考慮して、所与の薬剤をシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体に取り付けるための適した方法を決定することができる。

【0183】

シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、検出可能なマーカー；例えば、ＥＬＩＳＡ、分光光度法、フローサイトメトリー、顕微鏡または診断イメージング技法（ＣＴ、コンピュータ体軸断層撮影（computed axial tomography）（ＣＡＴ）、ＭＲＩ、磁気共鳴断層撮影（ＭＴＲ）、超音波、光ファイバー試験および腹腔鏡試験等）による検出が可能な検出可能なマーカーとコンジュゲートすることができる。検出可能なマーカーの具体的で非限定的な例は、フルオロフォア、化学発光剤、酵素による連結、放射性同位元素および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）を含む。例えば、有用で検出可能なマーカーは、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５－ジメチルアミン－１－ナフタレンスルホニルクロライド、フィコエリトリン、ランタニドリン光体その他を含む蛍光化合物を含む。ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）等、生物発光マーカーも役立つ。シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼその他等、検出に有用な酵素とコンジュゲートすることもできる。抗体は、検出可能な酵素とコンジュゲートされる場合、識別され得る反応産物の産生のために酵素が使用する追加の試薬を添加することにより検出することができる。例えば、薬剤西洋わさびペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加は、視覚的に検出可能な発色反応産物を生じる。シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体をビオチンとコンジュゲートし、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定により検出することもできる。アビジンそれ自体を、酵素または蛍光標識とコンジュゲートすることができることに留意されたい。

【0184】

シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、常磁性薬剤、例えば、ガドリニウムとコンジュゲートすることができる。常磁性薬剤、例えば、超常磁性酸化鉄もまた、標識として役立つ。抗体は、ランタニド（ユーロピウムおよびジスプロシウム等）およびマンガンとコンジュゲートすることもできる。シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープで標識することもできる（ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ等）。

【0185】

シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、例えば、診断目的で、放射標識されたアミノ酸とコンジュゲートすることもできる。例えば、放射標識を使用して、Ｘ線検査、発光スペクトルまたは他の診断技法によってコロナウイルスを検出することができる。ポリペプチドのための標識の例は、次の放射性同位元素：^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉを含むがこれらに限定されない。放射標識は、例えば、写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して検出することができ、蛍光マーカーは、放射された照明を検出するための光検出器を使用して検出することができる。酵素標識は典型的に、酵素に基質を与え、基質における酵素の作用によって産生された反応産物を検出することにより検出され、比色標識は、発色した標識を単純に可視化することにより検出される。

【0186】

コンジュゲート中の抗体当たりの検出可能なマーカー部分の平均数は、例えば、抗体当たり１～２０個の部分の範囲に及び得る。一部のインプリメンテーションでは、コンジュゲート中の抗体当たりのエフェクター分子または検出可能なマーカー部分の平均数は、約１～約２、約１～約３、約１～約８；約２～約６；約３～約５；または約３～約４の範囲に及ぶ。コンジュゲートのロード（例えば、抗体当たりのエフェクター分子の比）は、例えば、（ｉ）抗体と比べてモル過剰のエフェクター分子－リンカー中間体またはリンカー試薬を限定すること、（ｉｉ）コンジュゲーション反応時間または温度を限定すること、（ｉｉｉ）システインチオール修飾のために還元条件を部分的に限定すること、ならびに（ｉｖ）システイン残基の数および位置が、リンカー－エフェクター分子取付けの数または位置の制御のために修飾されるように、抗体のアミノ酸配列を組換え技法により操作することにより、異なる仕方で制御することができる。

【0187】

ＶＩＩＩ．抗体バリアント
一部のインプリメンテーションでは、本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体のアミノ酸配列バリアントが提供される。例えば、抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましいことがある。シングルドメインモノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、またはペプチド合成により、抗体のアミノ酸配列バリアントを調製することができる。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換を含む。最終構築物が、所望の特徴、例えば、抗原結合を保有することを条件として、欠失、挿入および置換のいずれかの組合せを為して、最終構築物に到達することができる。

【0188】

一部のインプリメンテーションでは、１個または複数のアミノ酸置換を有するバリアントが提供される。置換突然変異誘発のための目的の部位は、ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含む。アミノ酸置換を目的の抗体に導入することができ、産物を所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングすることができる。

【0189】

バリアントは典型的に、分子の低いｐＩおよび低い毒性を保存するために、正しいフォールディングに必要なアミノ酸残基を保持し、残基の電荷特徴を保持するであろう。抗体においてアミノ酸置換を為して、収量を増加させることができる。

【0190】

一部のインプリメンテーションでは、シングルドメインモノクローナル抗体は、配列番号５として示されるアミノ酸配列と比較して、最大１０（最大１、最大２、最大３、最大４、最大５、最大６、最大７、最大８または最大９等）個のアミノ酸置換（保存的アミノ酸置換等）を含む。

【0191】

一部のインプリメンテーションでは、置換、挿入または欠失は、そのような変更が、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低減させない限りにおいて、１個または複数のＣＤＲ内に発生し得る。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的変更（例えば、本明細書に提供される保存的置換）をＣＤＲにおいて為すことができる。上に提供されるバリアント抗体配列の一部のインプリメンテーションでは、各ＣＤＲは、変更されないか、または１、２もしくは３個以下のアミノ酸置換を含有する。上に提供されるバリアント抗体配列の一部のインプリメンテーションでは、フレームワーク残基のみが修飾されるため、ＣＤＲは変化されない。

【0192】

シングルドメインモノクローナル抗体の結合親和性を増加させるために、天然免疫応答の際の抗体の親和性成熟の原因となるｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異プロセスに類似したプロセスにおいて、ＣＤＲ３内等、抗体をランダムに突然変異させることができる。よって、ＣＤＲ３に相補的なＰＣＲプライマーを使用してシングルドメインモノクローナル抗体を増幅することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟を達成することができる。このプロセスにおいて、結果として生じるＰＣＲ産物が、ＣＤＲ３にランダムな突然変異が導入されたシングルドメイン抗体をコードするように、プライマーは、ある特定の位置に４種のヌクレオチド塩基のランダムな混合物を「スパイク」された。これらのランダムシングルドメイン抗体を検査して、スパイクタンパク質に対する結合親和性を決定することができる。

【0193】

一部のインプリメンテーションでは、抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更される。グリコシル化部位の付加または欠失は、１個または複数のグリコシル化部位が創出または除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより、簡便に達成することができる。

【0194】

抗体（または融合タンパク質）がＦｃ領域を含む場合、そこに取り付けられた炭水化物を変更することができる。哺乳動物細胞によって産生されたネイティブ抗体は典型的に、Ｆｃ領域のＣＨ_２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ－連結によって一般に取り付けられる分枝状二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. Trends Biotechnol. 15(1):26-32, 1997を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトースおよびシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「ステム（stem）」におけるＧｌｃＮＡｃに取り付けられたフコースを含むことができる。一部のインプリメンテーションでは、ある特定の改善された特性を有する抗体バリアントを創出するために、抗体におけるオリゴ糖の修飾を為すことができる。

【0195】

１つのインプリメンテーションでは、Ｆｃ領域に取り付けられた（直接的にまたは間接的に）フコースを欠如する炭水化物構造を有するバリアントが提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％または２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されている通り、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に取り付けられた全ての糖構造（glycostructure）（例えば、複合体、ハイブリッドおよび高マンノース構造）の和と比べて、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位に配置されたアスパラギン残基を指す；しかし、Ａｓｎ２９７は、抗体における僅かな配列変形形態により、２９７位の約±３アミノ酸上流または下流に、すなわち、２９４位～３００位の間に配置される場合もある。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許公開番号ＵＳ２００３／０１５７１０８（Ｐｒｅｓｔａ、Ｌ．）；ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化（defucosylated）」または「フコース欠損」抗体バリアントに関する刊行物の例は、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Okazaki et al., J. Mol. Biol., 336(5):1239-1249, 2004；Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol. Bioeng. 87(5):614-622, 2004を含む。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞系の例は、タンパク質フコシル化が欠損したＬｅｃ １３ ＣＨＯ細胞（Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249(2):533-545, 1986；米国特許出願番号ＵＳ２００３／０１５７１０８およびＷＯ２００４／０５６３１２、特に、実施例１１）、およびノックアウト細胞系、例えば、アルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al., Biotechnol. Bioeng., 87(5): 614-622, 2004；Kanda et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688, 2006；およびＷＯ２００３／０８５１０７を参照）を含む。

【0196】

例えば、抗体のＦｃ領域に取り付けられた二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分された、二分されたオリゴ糖を有する抗体バリアントがさらに提供される。そのような抗体バリアントは、低減されたフコシル化および／または改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。そのような抗体バリアントの例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Jean-Mairet et al.）；米国特許第６，６０２，６８４号（Umana et al.）；およびＵＳ２００５／０１２３５４６（Umana et al.）に記載されている。Ｆｃ領域に取り付けられたオリゴ糖に少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。そのような抗体バリアントは、改善されたＣＤＣ機能を有することができる。そのような抗体バリアントは、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７；ＷＯ１９９８／５８９６４；およびＷＯ１９９９／２２７６４に記載されている。

【0197】

シングルドメインモノクローナル抗体がＦｃタンパク質に融合された、いくつかのインプリメンテーションでは、Ｆｃ領域は、抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を最適化するための１個または複数のアミノ酸置換を含む。ＩｇＧ Ａｂの血清半減期は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）によって調節される。よって、いくつかのインプリメンテーションでは、Ｆｃ領域は、ＦｃＲｎへの結合を増加させるアミノ酸置換を含む。そのような置換の非限定的な例は、ＩｇＧ定常領域Ｔ２５０ＱおよびＭ４２８Ｌ（例えば、Hinton et al., J Immunol., 176(1):346-356, 2006を参照）；Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」突然変異、例えば、Zalevsky, et al., Nature Biotechnol., 28(2):157-159, 2010を参照されたい）；Ｎ４３４Ａ（例えば、Petkova et al., Int. Immunol., 18(12):1759-1769, 2006を参照）；Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ（例えば、Petkova et al., Int. Immunol., 18(12):1759-1769, 2006を参照）；ならびにＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅ（例えば、Dall'Acqua et al., J. Biol. Chem., 281(33):23514-23524, 2006を参照）における置換を含む。開示されるシングルドメイン抗体は、上に挙げる置換のいずれかを含むＦｃポリペプチドに連結され得るまたはそれを含むことができ、例えば、Ｆｃポリペプチドは、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓ（「ＬＳ」）置換を含むことができる。

【0198】

一部のインプリメンテーションでは、本明細書に提供されるシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾され得る。抗体の誘導体化に適した部分は、水溶性ポリマーを含むがこれらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコール（propropylene glycol）ホモポリマー、酸化プロリプロピレン（prolypropylene oxide）／酸化エチレンコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物を含むがこれらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中安定性により、製造上の利点を有することができる。ポリマーは、いかなる分子量のものであってもよく、分枝状であっても非分枝状であってもよい。抗体に取り付けられたポリマーの数は変動することができ、２個以上のポリマーが取り付けられる場合、これらは同じまたは異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／または型は、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、定義された条件下での適用において抗体誘導体が使用されることになるか否か等を含むがこれらに限定されない考察に基づき決定することができる。

【0199】

ＩＸ．結合親和性
いくつかのインプリメンテーションでは、シングルドメインモノクローナル抗体（そのバリアントおよびコンジュゲートを含む）は、１．０×１０^－８Ｍ以下、５．０×１０^－８Ｍ以下、１．０×１０^－９Ｍ以下、５．０×１０^－９Ｍ以下、１．０×１０^－１０Ｍ以下、５．０×１０^－１０Ｍ以下または１．０×１０^－１１Ｍ以下の親和性（例えば、Ｋ_Ｄによって測定される）でコロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する。Ｋ_Ｄは、例えば、目的の抗体およびその抗原を用いて行われる放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定することができる。

【0200】

１つのアッセイにおいて、Ｋ_Ｄは、バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定することができる。他のインプリメンテーションでは、Ｋ_Ｄは、ほぼ１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して測定することができる。手短に説明すると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標），Ｉｎｃ．）は、サプライヤーの説明書に従ってＮ－エチル－Ｎ’－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ－ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）を用いて活性化される。抗原は、カップルされたタンパク質のおよそ１０応答単位（ＲＵ）を達成するために、流速５ｌ／分の注射前に１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（ほぼ０．２μＭ）に希釈される。抗原の注射後に、１Ｍエタノールアミンを注射して、未反応の基を遮断する。動態測定のため、２５℃で流速およそ２５ｌ／分にて０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ－２０（商標））界面活性剤入りのＰＢＳ（ＰＢＳＴ）において、抗体の２倍系列希釈（０．７８ｎＭ～５００ｎＭ）が注射される。会合速度（ｋ_ｏｎ）および解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、会合および解離センサグラム（sensorgram）を同時にフィッティングさせることにより、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して計算される。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、比ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎとして計算される。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照されたい。オンレート（on-rate）が、上述の表面プラズモン共鳴アッセイによって１０^６Ｍ^－１秒^－１を超える場合、オンレートは、撹拌キュベットを備えるストップフロー搭載分光光度計（Ａｖｉｖ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または８０００－シリーズＳＬＭ－ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）等の分光計で測定される増加濃度の抗原の存在下、２５℃で、ＰＢＳ、ｐＨ７．２における２０ｎＭ抗抗原抗体の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）の増加または減少を測定する蛍光クエンチング技法を使用することにより決定することができる。親和性は、Ｃａｒｔｅｒｒａ ＬＳＡ、競合ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーまたはＯｃｔｅｔ系（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用したハイスループットＳＰＲによって測定することもでき、これは、バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）技術に基づく。

【0201】

Ｘ．核酸分子
コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する開示されている抗体、融合タンパク質およびコンジュゲートのアミノ酸配列をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ分子）が提供される。これらの分子をコードする核酸分子は、本明細書に提供されるアミノ酸配列、当技術分野で利用できる配列（フレームワークまたは定常領域配列等）および遺伝暗号を使用して容易に産生することができる。一部のインプリメンテーションでは、核酸分子は、宿主細胞（哺乳動物細胞または細菌細胞等）において発現させて、開示されている抗体（例えば、シングルドメイン抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体）、融合タンパク質または抗体コンジュゲートを産生することができる。

【0202】

遺伝暗号を使用して、その配列が異なるが、同じ抗体配列をコードする、またはシングルドメイン抗体配列を含むコンジュゲートもしくは融合タンパク質をコードする核酸等、種々の機能的に等価な核酸配列を構築することができる。

【0203】

コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する抗体、融合タンパク質およびコンジュゲートをコードする核酸分子は、例えば、適切な配列のクローニングまたは標準方法による直接的な化学合成によるものを含むいずれか適した方法によって調製することができる。化学合成は、一本鎖オリゴヌクレオチドを産生する。相補配列とのハイブリダイゼーションにより、または鋳型として一本鎖を使用したＤＮＡポリメラーゼによる重合により、これを二本鎖ＤＮＡに変換することができる。

【0204】

例示的な核酸は、クローニング技法によって調製することができる。適切なクローニングおよび配列決定技法の例は、例えば、Green and Sambrook（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012）およびAusubel et al. (Eds.)（Current Protocols in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons、補足を含む）に見出すことができる。

【0205】

核酸は、増幅方法によって調製することもできる。増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）および自家持続配列複製系（３ＳＲ）を含む。

【0206】

核酸分子は、組換えにより操作された細胞、例えば、細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞において発現させることができる。抗体およびコンジュゲートは、シングルドメインモノクローナル抗体（必要であればエフェクター分子または検出可能なマーカーに連結）を含む個々のタンパク質として発現させることができる、または融合タンパク質として発現させることができる。抗体を発現および精製するいずれか適した方法を使用することができる；非限定的な例は、Al-Rubeai (Ed.), Antibody Expression and Production, Dordrecht; New York: Springer, 2011）に提供される。

【0207】

シングルドメインモノクローナル抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体および融合タンパク質をコードする１種または複数のＤＮＡ配列は、適した宿主細胞へのＤＮＡ移入によってｉｎ ｖｉｔｒｏで発現させることができる。細胞は、原核または真核細胞であり得る。Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母ならびに様々な高等真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞系を含む、タンパク質の発現に利用できる多数の発現系を使用して、開示されている抗体および抗原結合性断片を発現させることができる。外来性ＤＮＡが宿主において継続的に維持されることを意味する安定移入の方法を使用することができる。

【0208】

本明細書に記載されているシングルドメインモノクローナル抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体および融合タンパク質をコードする核酸の発現は、ＤＮＡまたはｃＤＮＡをプロモーター（構成的または誘導性のいずれかである）に作動可能に連結し、続いて発現カセットに取り込むことにより達成することができる。プロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーターを含む、いずれかの目的のプロモーターであり得る。必要に応じて、エンハンサー、例えば、サイトメガロウイルスエンハンサーが、構築物に含まれる。カセットは、原核生物または真核生物のいずれかにおける複製および組込みに適することができる。典型的な発現カセットは、タンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節に有用な特異的な配列を含有する。例えば、発現カセットは、適切なプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、タンパク質コード遺伝子の直前にある開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適正な翻訳を可能にするための当該遺伝子の正しい読み枠の維持のための配列、ならびに停止コドンを含むことができる。ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、薬物抵抗性（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン抵抗性）をコードするマーカーをコードすることができる。

【0209】

クローニングされた遺伝子の高レベル発現を得るために、例えば、転写を方向付けるための強いプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（例えば、内部リボソーム結合配列）および転写／翻訳ターミネーターを含有する発現カセットを構築することが望ましい。Ｅ．ｃｏｌｉのため、これは、プロモーター、例えば、Ｔ７、ｔｒｐ、ｌａｃまたはラムダプロモーター、リボソーム結合部位および転写終結シグナルを含むことができる。真核細胞のため、制御配列は、例えば、免疫グロブリン遺伝子、ＨＴＬＶ、ＳＶ４０またはサイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびにポリアデニル化配列を含むことができ、スプライスドナーおよび／またはアクセプター配列（例えば、ＣＭＶおよび／またはＨＴＬＶスプライスアクセプターおよびドナー配列）をさらに含むことができる。カセットは、Ｅ．ｃｏｌｉのための形質転換または電気穿孔、および哺乳動物細胞のためのリン酸カルシウム処置、電気穿孔またはリポフェクション等のいずれか適した方法によって、選ばれた宿主細胞に移入することができる。カセットによって形質転換された細胞は、ａｍｐ、ｇｐｔ、ｎｅｏおよびｈｙｇ遺伝子等、カセットに含有される遺伝子によって付与された抗生物質に対する抵抗性によって選択することができる。

【0210】

その生物活性を縮小することなく、本明細書に記載されている抗体をコードする核酸に対して修飾を為すことができる。抗体のクローニング、発現または融合タンパク質への取込みを容易にするために、いくつかの修飾を為すことができる。そのような修飾は、例えば、終結コドン、簡便に配置された制限部位を創出するための配列、および開始部位を提供するためにアミノ末端にメチオニンを付加するための配列、または精製ステップに役立つ追加のアミノ酸（ポリＨｉｓ等）を含む。

【0211】

発現されると、シングルドメインモノクローナル抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体および融合タンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィーその他を含む、当技術分野における標準手順に従って精製することができる（一般に、Simpson et al. (Eds.), Basic methods in Protein Purification and Analysis: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009を参照）。シングルドメインモノクローナル抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体および融合タンパク質は、１００％純粋である必要はない。予防的に使用される場合、所望に応じて部分的にまたは均一になるまで精製されると、抗体は、エンドトキシンを実質的に含まない。

【0212】

哺乳動物細胞および細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉからの抗体の発現および／または適切な活性形態へのリフォールディングのための方法は、記載されており、本明細書に開示される抗体に適用可能である。例えば、Greenfield (Ed.), Antibodies: A Laboratory Manual, 2^nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014、Simpson et al. (Eds.), Basic methods in Protein Purification and Analysis: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2009およびWard et al., Nature 341(6242):544-546, 1989を参照されたい。

【0213】

ＸＩ．抗体組成物および使用方法
本明細書に開示されるシングルドメインモノクローナル抗体、三価単鎖Ｆｖ、多重特異性（二重特異性等）抗体、融合タンパク質、組成物、核酸分子およびベクターは、例えば、コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等）感染の検出／診断のための方法において、ならびにコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等）感染の予防および処置において使用することができる。

【0214】

Ａ．検出および診断の方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにおけるコロナウイルススパイクタンパク質の存在の検出のための方法が提供される。一例では、コロナウイルススパイクタンパク質の存在は、対象由来の生体試料において検出され、感染を有する対象の同定に使用され得る。試料は、生検、検死解剖および病理検体由来の組織を含むがこれらに限定されない、いずれかの試料であり得る。生体試料は、組織の切片、例えば、組織学的目的で採取された凍結切片も含む。生体試料は、生体液、例えば、血液、血清、血漿、痰、脊髄液または尿をさらに含む。検出の方法は、免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、細胞または試料を、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合するシングルドメインドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのコンジュゲート（例えば、検出可能なマーカーを含むコンジュゲート）と接触させるステップと、免疫複合体を検出するステップ（例えば、抗体または抗原結合性断片にコンジュゲートされた検出可能なマーカーを検出することにより）とを含むことができる。

【0215】

一部の例では、コロナウイルススパイクタンパク質の存在は、対象由来の生体試料において検出され、コロナウイルス感染を有する対象の同定に使用され得る。試料は、痰、唾液、粘液、鼻洗浄、鼻咽頭試料、中咽頭試料、末梢血、組織、細胞、尿、組織生検、細針吸引、外科的検体、糞便、脳脊髄液（ＣＳＦ）および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液を含むがこれらに限定されない、いずれかの試料であり得る。生体試料は、組織の切片、例えば、組織学的目的で採取された凍結切片も含む。検出の方法は、免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、細胞または試料を、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する抗体または抗体コンジュゲート（例えば、検出可能なマーカーを含むコンジュゲート）と接触させるステップと、免疫複合体を検出するステップ（例えば、抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーを検出することにより）とを含むことができる。

【0216】

１つのインプリメンテーションでは、抗体は、検出可能なマーカーで直接的に標識される。別のインプリメンテーションでは、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する抗体（一次抗体）は、非標識であり、一次抗体に結合することができる二次抗体または他の分子が、検出に利用される。選ばれた二次抗体は、第１の抗体の特異的な種およびクラスに特異的に結合することができる。例えば、第１の抗体が、ヒトＩｇＧである場合、二次抗体は、抗ヒト－ＩｇＧであり得る。抗体に結合することができる他の分子は、プロテインＡおよびプロテインＧを限定することなく含み、これらは両者共に市販されている。

【0217】

抗体または二次抗体のための適した標識は、様々な酵素、接合団、蛍光材料、冷光材料、磁性薬剤および放射性材料を含む。適した酵素の非限定的な例は、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含む。適した接合団複合体の非限定的な例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む。適した蛍光材料の非限定的な例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含む。非限定的な例示的な冷光材料は、ルミノールであり；非限定的な例示的な磁性薬剤は、ガドリニウムであり、非限定的な例示的な放射性標識は、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓまたは^３Ｈを含む。

【0218】

代替インプリメンテーションでは、スパイクタンパク質は、検出可能な物質で標識されたスパイクタンパク質標準およびスパイクタンパク質に特異的に結合する非標識抗体を利用した競合イムノアッセイによって、生体試料においてアッセイすることができる。このアッセイにおいて、生体試料、標識されたスパイクタンパク質標準およびスパイクタンパク質に特異的に結合する抗体が組み合わされ、非標識抗体に結合した標識されたスパイクタンパク質標準の量が決定される。生体試料中のスパイクタンパク質の量は、スパイクタンパク質に特異的に結合する抗体に結合した標識されたスパイクタンパク質標準の量に反比例する。

【0219】

本明細書に開示されるイムノアッセイおよび方法は、多数の目的のために使用することができる。１つのインプリメンテーションでは、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する抗体を使用して、細胞培養物における細胞におけるスパイクタンパク質の産生を検出することができる。別のインプリメンテーションでは、抗体を使用して、コロナウイルス感染を有するかまたはそれを有することが疑われる対象から得られる試料等の生体試料におけるスパイクタンパク質の量を検出することができる。

【0220】

１つのインプリメンテーションでは、鼻咽頭、中咽頭、痰、唾液または血液試料等の生体試料におけるコロナウイルススパイクタンパク質を検出するためのキットが提供される。コロナウイルス感染を検出するためのキットは典型的に、本明細書に開示される抗体またはコンジュゲートのいずれか等、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合するシングルドメインモノクローナル抗体を含むであろう。さらなるインプリメンテーションでは、抗体は、標識されている（例えば、蛍光、放射性または酵素標識で）。

【0221】

１つのインプリメンテーションでは、キットは、コロナウイルススパイクタンパク質に結合する抗体の使用の手段を開示する指導用材料を含む。指導用材料は、電子形式（コンピュータディスケットまたはコンパクトディスク等）における文書であり得る、または視覚的（ビデオファイル等）であり得る。キットは、キットが設計された特定の適用を容易にするための追加の構成成分を含むこともできる。よって、例えばキットはその上、標識を検出する手段を含有することができる（酵素標識のための酵素基質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、二次抗体等の適切な二次標識その他等）。キットはその上、特定の方法の実施のためにルーチンに使用される緩衝剤および他の試薬を含むことができる。そのようなキットおよび適切な内容物は、当業者にとって周知である。

【0222】

１つのインプリメンテーションでは、診断キットは、イムノアッセイを含む。イムノアッセイの詳細は、用いられている特定のフォーマットと共に変動し得るが、生体試料におけるスパイクタンパク質を検出する方法は一般に、生体試料を、免疫学的に反応性の条件下でコロナウイルススパイクタンパク質と特異的に反応する抗体と接触させるステップを含む。抗体に、免疫学的に反応性の条件下で特異的に結合させて免疫複合体を形成させ、免疫複合体（結合した抗体）の存在は、直接的にまたは間接的に検出される。

【0223】

本明細書に開示される抗体は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、側方流動アッセイ（ＬＦＡ）または免疫組織化学的アッセイ等が挙げられるがこれらに限定されない、イムノアッセイにおいて利用することもできる。抗体は、ウイルス感染細胞を同定／検出するため等、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）に使用することもできる。ＦＡＣＳは、複数の色チャネル、低角度および鈍角光散乱検出チャネルならびにインピーダンスチャネルを、いくつものより精巧なレベルの検出の中でもとりわけ用いて、細胞を分離または選別する（米国特許第５，０６１，６２０号を参照）。本明細書に開示される、スパイクタンパク質に結合するモノクローナル抗体または抗原結合性断片のいずれかをこれらのアッセイにおいて使用することができる。よって、抗体は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＬＦＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウエスタンブロットまたは免疫沈降を限定することなく含む、従来のイムノアッセイにおいて使用することができる。開示されている抗体は、コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２等）またはコロナウイルスを含有するエクソソームの捕捉に使用することができるマイクロ流体イムノアッセイ等のナノテクノロジー方法において使用することもできる。マイクロ流体イムノアッセイまたは他のナノテクノロジー方法による使用のための適した試料は、唾液、血液および糞便試料を含むがこれらに限定されない。マイクロ流体イムノアッセイは、米国特許出願第２０１７／０３７０９２１号、同第２０１８／００３６７２７号、同第２０１８／０１４９６４７号、同第２０１８／００３１５４９号、同第２０１５／０１５８０２６号および同第２０１５／０１９８５９３号；ならびにLin et al., JALA June 2010, pages 254-274；Lin et al., Anal Chem 92: 9454-9458, 2020；およびHerr et al., Proc Natl Acad Sci USA 104(13): 5268-5273, 2007に記載されており、これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる。

【0224】

一部のインプリメンテーションでは、開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、ワクチンの検査に使用される。例えば、コロナウイルススパイクタンパク質またはその断片を含むワクチン組成物が、開示されている抗体のエピトープを含む高次構造を取るか否かについて検査するために。よって、ワクチンを検査するための方法であって、免疫複合体の形成に十分な条件下、コロナウイルススパイクタンパク質免疫原等のワクチンを含有する試料を、開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体と接触させるステップと、免疫複合体を検出して、試料中に目的のエピトープを含むワクチンを検出するステップとを含む方法が本明細書に提供される。一例では、試料中の免疫複合体の検出は、免疫原等のワクチン構成成分が、抗体または抗原結合性断片に結合することができる高次構造を取ることを指し示す。

【0225】

Ｂ．コロナウイルス感染を処置または阻害する方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染等、対象におけるコロナウイルス感染を処置または阻害するための方法が本明細書に開示される。方法は、コロナウイルス感染のリスクがあるかまたはコロナウイルス感染を有する対象に、有効量（対象における感染を阻害するのに有効な量等）の開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、核酸分子、ベクターまたは組成物を対象に投与するステップを含む。方法は、曝露前または曝露後に使用することができる。

【0226】

方法が有効となるために、感染が完全に排除または阻害される必要はない。例えば、方法は、処置の非存在下でのコロナウイルス感染と比較して、感染を所望の量だけ、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％またはさらには少なくとも１００％（検出可能なコロナウイルス感染の排除または防止）減少させることができる。一部のインプリメンテーションでは、対象は、有効量の追加の薬剤、例えば、抗ウイルス剤で処置することもできる。

【0227】

一部のインプリメンテーションでは、有効量の開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、核酸分子、ベクターまたは組成物の投与は、対象における感染の確立および／またはその後の疾患進行を阻害し、これは、対象におけるコロナウイルス感染の活性（例えば、ウイルス複製）または症状（発熱または咳等）のいずれかの統計的に有意な低減を包含することができる。

【0228】

対象におけるコロナウイルス複製の阻害のための方法が本明細書に開示される。方法は、コロナウイルス感染のリスクがあるかまたはコロナウイルス感染を有する対象に、有効量（すなわち、対象における複製を阻害するのに有効な量）の開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、核酸分子、ベクターまたは組成物を対象に投与するステップを含む。方法は、曝露前または曝露後に使用することができる。

【0229】

対象におけるコロナウイルス感染を処置するための方法が開示される。対象におけるコロナウイルス感染を防止するための方法も開示される。これらの方法は、開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖ、二重特異性抗体、核酸分子、ベクターまたは組成物のうち１種または複数を投与するステップを含む。

【0230】

抗体および融合タンパク質は、例えば、静脈内注入によって投与することができる。シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体の用量は変動するが、一般に、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇまたは約５０ｍｇ／ｋｇの用量等、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの間の範囲に及ぶ。一部のインプリメンテーションでは、シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体の用量は、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇまたは約５ｍｇ／ｋｇの用量等、約０．５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇであり得る。シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、医師によって決定された投薬スケジュールに従って投与される。一部の例では、シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、毎週、２週間毎、３週間毎または４週間毎に投与される。

【0231】

一部のインプリメンテーションでは、対象における感染を阻害する方法は、対象への１種または複数の追加の薬剤の投与をさらに含む。目的の追加の薬剤は、抗ウイルス剤、例えば、ヒドロキシクロロキン、アルビドール、レムデシビル、ファビピラビル、バリシチニブ、ロピナビル／リトナビル、亜鉛イオンおよびインターフェロンベータ－１ｂ、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。

【0232】

一部のインプリメンテーションでは、方法は、本明細書に開示されるコロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する第１の抗体、およびコロナウイルスタンパク質の異なるエピトープ等のコロナウイルスタンパク質に同様に特異的に結合する第２の抗体の投与を含む。

【0233】

一部のインプリメンテーションでは、対象に、開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡを投与して、例えば、対象の細胞機構を使用したｉｎ ｖｉｖｏ抗体産生を提供する。核酸投与のいずれか適した方法を使用することができる；非限定的な例は、米国特許第５，６４３，５７８号、米国特許第５，５９３，９７２号および米国特許第５，８１７，６３７号に提供されている。米国特許第５，８８０，１０３号は、生物へのタンパク質をコードする核酸の送達のいくつかの方法について記載する。核酸の投与に対する１つのアプローチは、哺乳動物発現プラスミド等のプラスミドＤＮＡによる直接的投与である。開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列は、発現を増加させるためのプロモーターの制御下に設置することができる。方法は、核酸のリポソーム送達を含む。そのような方法は、シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体の産生に適用することができる。一部のインプリメンテーションでは、開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、ｐＶＲＣ８４００ベクター（参照により本明細書に組み込まれるBarouch et al., J. Virol., 79(14), 8828-8834, 2005に記載）を使用して、対象において発現される。

【0234】

いくつかのインプリメンテーションでは、対象（コロナウイルス感染のリスクがあるかまたはコロナウイルス感染を有するヒト対象等）に、開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体をコードする１種または複数の核酸分子を含む有効量のウイルスベクターを投与することができる。ウイルスベクターは、開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体をコードする核酸分子の発現のために設計され、対象への有効量のウイルスベクターの投与は、対象における有効量のシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体の発現を生じる。対象における開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体の発現に使用することができるウイルスベクターの非限定的な例は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれるJohnson et al., Nat. Med., 15(8):901-906, 2009およびGardner et al., Nature, 519(7541):87-91, 2015に提供されるものを含む。

【0235】

１つのインプリメンテーションでは、開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体をコードする核酸は、組織に直接的に導入される。例えば、核酸を、標準方法によって金マイクロスフェア上にロードし、Ｂｉｏ－ＲａｄのＨＥＬＩＯＳ（商標）遺伝子銃等のデバイスによって皮膚内に導入することができる。核酸は、強いプロモーターの制御下のプラスミドからなる「ネイキッド」であり得る。

【0236】

典型的には、ＤＮＡは、筋肉内に注射されるが、他の部位内に直接的に注射されてもよい。注射のための投薬量は通常、０．５μｇ／ｋｇ前後～約５０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇである（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号を参照）。

【0237】

開示されているシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸分子を含む組成物の単一のまたは複数の投与は、患者によって要求されかつ耐容性を示す投薬量および頻度に応じて投与することができる。投薬量は、１回投与することができるが、所望の結果が達成されるまで、または副作用が治療法の中断を是認するまで、定期的に適用することができる。一般に、用量は、患者に許容できない毒性を生じることなく、コロナウイルス感染を阻害するのに十分である。

【0238】

細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを使用して、ヒトにおける使用のためにある範囲の投薬量を処方することができる。投薬量は通常、毒性がほとんどないかまたは最小の、ＥＤ_５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。有効用量は、細胞培養アッセイおよび動物研究から決定することができる。

【0239】

コロナウイルススパイクタンパク質特異的シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸分子、またはそのような分子を含む組成物は、例えば、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内またはくも膜下腔内注射による等、局所性および全身性投与を含む様々な仕方で、対象に投与することができる。あるインプリメンテーションでは、シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸分子、またはそのような分子を含む組成物は、１日１回、単一の皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内またはくも膜下腔内注射によって投与される。シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸分子、またはそのような分子を含む組成物は、疾患部位におけるまたはその付近における直接的な注射によって投与することもできる。さらに別の投与方法は、所定の期間にわたる、シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸分子、またはそのような分子を含む組成物の制御された、継続的なおよび／または緩徐な放出送達を可能にする、浸透圧ポンプ（例えば、Ａｌｚｅｔポンプ）またはミニポンプ（例えば、Ａｌｚｅｔミニ浸透圧ポンプ）による。浸透圧ポンプまたはミニポンプは、皮下に、または標的部位の付近に植え込むことができる。

【0240】

Ｃ．組成物
本明細書に開示されるコロナウイルススパイクタンパク質特異的シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸分子のうち１種または複数を、薬学的に許容される担体中に含む組成物が提供される。一部のインプリメンテーションでは、組成物は、本明細書に開示されるＲＢＤ－１－２Ｇ抗体、またはそのコンジュゲートを含む。一部のインプリメンテーションでは、組成物は、コロナウイルススパイクタンパク質に特異的に結合する２、３、４種またはそれよりも多い抗体（ＲＢＤ－１－２Ｇを含む）を含む。組成物は、例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染等のコロナウイルス感染の阻害または検出に有用である。

【0241】

組成物は、対象への投与のために、キット等において単位剤形で調製することができる。投与の量およびタイミングは、所望の目的を達成するように投与担当の医師の裁量において為される。シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸分子は、全身性または局所性投与のために製剤化することができる。一例では、シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸分子は、静脈内投与等の非経口投与のために製剤化される。

【0242】

一部のインプリメンテーションでは、組成物中のシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体は、少なくとも７０％（少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％等）純粋である。一部のインプリメンテーションでは、組成物は、１０％未満（５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満またはさらに少ない等）の巨大分子夾雑物、例えば、他の哺乳動物（例えば、ヒト）タンパク質を含有する。

【0243】

投与のための組成物は、水性担体等の薬学的に許容される担体に溶解されたシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸分子の溶液を含むことができる。種々の水性担体、例えば、緩衝食塩水その他を使用することができる。そのような溶液は、無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。そのような組成物は、いずれか適した技法によって滅菌することができる。組成物は、ｐＨ調整および緩衝剤、毒性調整剤その他、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムその他等、生理的条件を近似するのに要求される薬学的に許容される補助的物質を含有することができる。そのような製剤中の抗体の濃度は、広く変動し得、選択される特定の投与機序および対象の必要に従って、流体体積、粘性、体重その他に基づき主に選択されるであろう。

【0244】

静脈内投与のための典型的な組成物は、１日当たり対象当たり約０．０１～約３０ｍｇ／ｋｇのシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体（または抗体を含むコンジュゲートの対応する用量）を含む。投与可能な）組成物を調製するためにいずれか適した方法を使用することができる；非限定的な例は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22^nd ed., London, UK: Pharmaceutical Press, 2013等の刊行物に提供されている。一部のインプリメンテーションでは、組成物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌまたは約０．５ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌまたは約１ｍｇ／ｍｌ～約２０ｍｇ／ｍｌまたは約０．１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌまたは約０．５ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌまたは約１ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で１種または複数のシングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖまたは二重特異性抗体を含む液体製剤であり得る。

【0245】

シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸は、凍結乾燥形態で提供することができ、投与前に滅菌水により水を加えて元に戻すことができるが、公知濃度の滅菌溶液中に提供することもできる。次に、シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸を含む溶液を、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加することができ、０．５～１５ｍｇ／ｋｇ（体重）の投薬量で典型的に投与することができる。１９９７年のリツキシマブの承認以降米国で販売されている抗体薬の投与の技術分野における相当な経験を利用できる。シングルドメインモノクローナル抗体、融合タンパク質、二価抗体、三価単鎖Ｆｖもしくは二重特異性抗体、またはそのような分子をコードする核酸は、静脈内プッシュまたはボーラスよりもむしろ、緩徐注入によって投与することができる。一例では、より高い負荷用量が投与され、後続の維持用量は、より低いレベルで投与される。例えば、４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量は、およそ９０分間の期間にわたり注入することができ、続いて、以前の用量が良好な耐容性を示した場合、２ｍｇ／ｋｇの４～８週間の毎週維持用量は、３０分間の期間にわたり注入される。

【0246】

制御放出非経口製剤は、インプラント、油性注射または粒状系として作製することができる。タンパク質送達系の幅広い概観については、Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Lancaster, PA: Technomic Publishing Company, Inc., 1995を参照されたい。粒状系は、マイクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェアおよびナノ粒子を含む。マイクロカプセルは、中心コアとして、細胞毒または薬物等の活性タンパク質剤を含有する。マイクロスフェアにおいて、活性タンパク質剤は、粒子全体にわたり分散されている。約１μｍよりも小さい粒子、マイクロスフェアおよびマイクロカプセルは一般に、それぞれナノ粒子、ナノスフェアおよびナノカプセルと称される。毛細血管は、およそ５μｍの直径を有するため、ナノ粒子のみが静脈内投与される。マイクロ粒子は典型的に、１００μｍ前後の直径であり、皮下または筋肉内投与される。例えば、Kreuter, Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter (Ed.), New York, NY: Marcel Dekker, Inc., pp. 219-342, 1994；およびTice and Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery: Fundamentals, Optimization, Applications, A. Kydonieus (Ed.), New York, NY: Marcel Dekker, Inc., pp. 315-339, 1992を参照されたい。

【0247】

本明細書に開示される組成物のイオン制御放出のためにポリマーを使用することができる。制御された薬物送達における使用に設計された分解性または非分解性ポリマーマトリックス等、いずれか適したポリマーを使用することができる。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御放出のためのマイクロ担体として使用された。さらに別の態様では、脂質カプセル化薬物の薬物標的化と共に制御放出のためにリポソームが使用される。

【0248】

ある特定の特色および／またはインプリメンテーションを説明するために、次の実施例が提供される。これらの実施例は、本開示を記載されている特定の特色またはインプリメンテーションに限定すると解釈されるべきではない。

【実施例】

【0249】

後述する実施例は、ヒト化ファージライブラリーからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和シングルドメイン抗体の単離および特徴付けについて記載する。このようなナノボディは、１桁台のｎＭ～μＭの親和性でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤに結合し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の哺乳動物細胞モデルにおいてＳ－タンパク質シュードタイプ化および真正のウイルスを中和することができる。ナノボディＲＢＤ－１－２Ｇは、二価および三価モダリティに取り込まれた場合、最良の全体的な効力および改善されたウイルス中和を示した。ＲＢＤ－１－２Ｇは、ＡＣＥ２の結合部位と重複するＲＢＤの上部におけるエピトープに結合する（図１３Ａ）。ＲＢＤ－１－２Ｇに観察された高い活性は、その高い親和性に帰するのみならず、「アップ」から「ダウン」状態の広い範囲の高次構造でＲＢＤに結合するこのナノボディの能力が原因でもある。クライオＥＭ研究は、Ｓ三量体の、以下の２種の優勢な状態を明らかにした：高次構造的免疫回避作用機構を指し示すことができる「ダウン」高次構造における３個のＲＢＤドメイン（Walls et al., Cell 181, 281-292 e286, 2020）、またはＡＣＥ２到達可能状態に対応する「アップ」高次構造における１個のみのＲＢＤ（Walls et al., Cell 181, 281-292 e286, 2020；Wrapp et al., Cell 181, 1004-1015, 2020）。一部のナノボディは、複数のＲＢＤ高次構造において画像化することができず、これは、保護された３ＲＢＤダウン高次構造への高次構造スイッチングが、結合を立体的に制限し得ることを示唆するであろう。「アップ」および「半分ダウン」状態の両方において結合するＲＢＤ－１－２Ｇの能力は、３個のナノボディが、ＲＢＤ高次構造状態に関係なく単一のスパイク三量体に結合することを可能にする。

【0250】

（実施例１）
方法
本実施例は、実施例２～７に記載されている研究のための材料および実験手順について記載する。

【0251】

細胞系
ＡＴＣＣから細胞系を得た（ＨＥＫ２９３細胞）。Ｃｏｄｅｘ ＢｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓからＡＣＥ２－ＧＦＰ ＨＥＫ２９３Ｔ（ＣＢ－９７１００－２０３）細胞を購入した。ヒトＡＣＥ２の安定発現を有するＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２）は、Ｃｏｄｅｘ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によってカスタム生産された（Huang et al., Nat Biotechnol 39, 747-753, 2021）。全ての細胞系がマイコプラズマについてルーチンに検査され、マイコプラズマ不含であることが見出された。

【0252】

抗体ライブラリー構築
３ステップ重複伸長ＰＣＲ（ＯＥ－ＰＣＲ）によってナノボディのＤＮＡライブラリーを構築した。ナノボディおよび２０１９年以降のＰＤＢ由来のＣＤＲ３における８９２種の最適なヒト重鎖のアミノ酸またはＩＤＴ三量体１９ミックスの解析に基づき、ＣＤＲ突然変異誘発戦略を設計した（McMahon et al., Nat Struct Mol Biol 25, 289-296, 2018）。図１Ａに示すコドンのバランスを保つライブラリーは、Ｇｌｅｎ ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＫｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって合成された。プライマーを使用して、カプラシズマブ（米国特許第１０，９１９，９８０号）のヒト化ナノボディ骨格の骨格を増幅して、ベクターｐＣｏｍｂ３ＸＬａｍｂｄａ（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃６３８９２）を使用して、ナノボディのライブラリーを生成した。ライゲーション後に、ＤＮＡライブラリーを、増幅前にライブラリー当たりおよそ１０^１０ＣＦＵの効率で、ＴＧ１エレクトロコンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）へと形質転換した。ライブラリーを増幅するために、ファージミドライブラリーを１Ｌ ２ＴＹＡＧ培地（２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に添加し、３０℃で一晩振盪した。ライブラリーファージミドの一晩培養物を、３，５００ｒｐｍで４５分間の遠心分離により収集し、１０ｍｌ ５０％２ＴＹ／５０％グリセロール（ｖ／ｖ）に再懸濁して、ファージライブラリーを作製するためにアリコートを凍結した。１．５ｍｌファージミドグリセロールストックの各アリコートは、ライブラリーサイズのおよそ５×細胞数を含有した。１個のアリコートを、１Ｌの２ＴＹＡＧ培地においてＯＤ６００が０．９～１．０に達するまで３７℃、２５０ｒｐｍで振盪し、次いで２５０μｌのＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（５×１０^１２／ｍｌ）を、５×１０^９の最終濃度のために各１Ｌ培養溶液に添加し、３７℃で６０分間、細胞の感染に使用した。培養物を３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを１Ｌ ２ＴＹＫＡ（５０μｇ／ｍｌカナマイシン、１００μｇ／ｍｌアンピシリン）に再懸濁した。培養物を一晩３０℃で振盪して、ファージ粒子を産生した。ファージライブラリーを含有する上清を、一晩冷蔵下で３０％体積のＰＥＧ／ＮａＣｌにおいて沈殿させ、ＰＢＳ／グリセロールストック中１０^１４／ｍｌの濃度に達するように総計１２ｍｌ ＰＢＳに溶解した（ＵＶ－Ｖｉｓ）。ナノボディＶ_ＨＨドメインおよびヒト抗体重鎖において観察される異なる長さのＣＤＲを繰り返すために、異なる長さのＣＤＲを含有する異なるライブラリーを個々に作製した。

【0253】

ファージライブラリーからのＲＢＤ結合剤の単離
１日目に：５ｍｌイムノチューブ（immunotube）（ＮＵＮＣ、４４４２０２）において５００μｌの１０μｇ／ｍｌ ＲＢＤ－ｍＦｃを一晩４℃でコーティングした。２日目：一連の１０種のライブラリーを混合し、ファージパニングに使用した（ＥＰチューブにおける２５０μＬ）。ライブラリーおよびコーティングされたイムノチューブ（ＰＢＳで３回予洗）を、１０％（ｗ／ｖ）スキムミルクで１．５時間室温（ＲＴ）にてブロッキングした。イムノチューブをＰＢＳで３回リンスし、次いで０．５ｍｌプレブロッキングファージ溶液を添加し、その後、ＲＴ（３００ｒｐｍ）で１．５時間振盪した。イムノチューブをＰＢＳＴで１０回、次いでＰＢＳで１０回リンスして、結合していないファージを除去した。最後に、０．５ｍｌの新鮮に作製された１００ｍＭトリエチルアミンと共にＲＴで１５分間インキュベートすることにより、ＲＢＤ結合ファージを溶出させた。溶出されたファージを２５０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ緩衝剤（ｐＨ７．４）によってさらに中和した。中和されたファージ（３７５μＬ）を３ｍＬ ＴＧ１（ＯＤ＝０．６～０．８）に添加して、６０分間振盪しつつ３７℃で感染させた。感染されたＴＧ１細胞を３５００ｒｐｍで１０分間収集し、通気式ＱＴｒａｙバイオアッセイトレーにおいて延展し、２％グルコース、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２ＸＹＴ寒天プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ、Ｙ４２９５およびＹ４２０４）において滴定物をプレーティングし、一晩３０℃でインキュベートした。３日目に：５ｍｌ ２ＴＹ培地を用いて全てのコロニーをプレートから掻き取って、２００μＬを除去し、０．５～０．８のＯＤ６００に達するまで２５ｍＬ ２ＴＹＡＧにおいて育成した。この時点で、ヘルパーファージ（１ｍｌ当たり５×１０^９の最終濃度）を添加し、３７℃で６０分間振盪しつつインキュベートし、その後、一晩振盪しつつ３０℃におけるファージ産生のために培地を２ＴＹＫＡに交換した。

【0254】

抗体およびスパイクタンパク質発現および精製
ナノボディ－Ｆｃフォーマットは、ＨＥＫ２９３一過的発現系（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を使用してＣＲＯ企業により産生された。以前に発表された方法（Esposito et al., Protein Expres Purif 174, 105686, 2020）を使用して、スパイクタンパク質を発現および精製した。Ｖｉｂｒｉｏに関して僅かに修飾したTaylor et al. (Methods Mol Biol 1586, 65-82, 2017)に要約される通り、自己誘導培地（ＺＹＭ－２００５２）中のＶｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓにおいてナノボディを発現させた。具体的には、１．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌまたはＩｎｓｔａｎｔ Ｏｃｅａｎ（Ａｑｕａｒｉｕｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ）により培地を修正し、ラクトースを添加せず、４～５のＯＤ_６００でＩＰＴＧ誘導を始め、誘導温度は３０℃であり、誘導のほぼ６～８時間後に細胞を採集し、－８０℃で凍結した。凍結した細胞ペレットを解凍し、１０００光学密度（ＯＤ_６００）単位当たり１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。９，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザー（microfluidizer）に３回通すことにより、ホモジナイズした細胞を溶解した。７，９００×ｇで３０分間、４℃の遠心分離によってライセートを清澄化した。清澄化されたライセートを０．４５μＭ Ｗｈａｔｍａｎ ＰＥＳシリンジフィルターに通して濾過した。ＮＧＣ中圧クロマトグラフィー系（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ．）を使用してナノボディを精製した。清澄化されたライセートを解凍し、３５ｍＭイミダゾールに調整し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、３５ｍＭイミダゾールおよび１：１０００プロテアーゼ阻害剤カクテルのＩＭＡＣ平衡化緩衝剤（ＥＢ）において平衡化したＨｉＴｒａｐ ＨＰ ＩＭＡＣカラムに３ｍｌ／分でロードした。ＥＢでベースラインとなるようカラムを洗浄し、ＥＢ中３５ｍＭ～５００ｍＭイミダゾールの２０カラム体積（ＣＶ）勾配でタンパク質を溶出した。溶出画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって解析した。陽性画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５樹脂を充填し、ＰＢＳで平衡化した適切なサイズのカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によるＳＥＣ由来の画分の解析後に、適切な画分をプールし、１０Ｋ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離ユニットにおいて濃縮し、液体窒素中で瞬間凍結した（Taylor et al., Methods Mol Biol 1586, 65-82, 2017）。

【0255】

ナノボディ三量体発現および精製
昆虫細胞における三量体ナノボディの産生のためのタンパク質発現構築物を、最適化されたＤＮＡ鋳型の合成によって生成した（ＡＴＵＭ，Ｉｎｃ．）。三量体ナノボディタンパク質には、分泌のためのミツバチメリチン（ＨＢＭ）リーダー配列が先行し、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグが続いた。ＤＮＡは、ａｔｔＢ１およびａｔｔＢ２ Ｇａｔｅｗａｙ組換えクローニング部位で挟まれ、ＡＴＵＭのアルゴリズムを使用して昆虫細胞発現のために最適化された。Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ組換え（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して鋳型を組換えて、エントリークローンを生成し、組換えタンパク質を生成するためにポリヘドリンプロモーターを利用するｐＤｅｓｔ－８、ｐＦａｓｔｂａｃスタイルバキュロウイルス発現ベクターにサブクローニングした。Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のための標準説明書を使用してバクミドＤＮＡを産生し、Ｓｆ９細胞のトランスフェクトに使用して、バキュロウイルス上清を生成した。７×１０^５細胞／ｍｌのＴｎｉ－ＦＮＬ細胞において発現を行い、感染に先立ち２７℃で２４時間振盪するように設定した。２４時間後に、細胞を計数し、３のＭＯＩで目的のナノボディを発現するバキュロウイルスに感染させ、培養物を２７℃で７２時間振盪した。７２時間後に、細胞を１７００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を収集した。次に、上清を１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４に対して一晩４℃で透析して、ニッケルカラムを剥ぎ取る可能性のあるいかなる添加物も除去した。透析された上清を２Ｍイミダゾールで修正して、２５ｍＭイミダゾールの最終濃度にし、次いで１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、２５ｍＭイミダゾールのＩＭＡＣ ＥＢにおいて平衡化したＨｉＴｒａｐ ＨＰ ＩＭＡＣカラムに５ｍｌ／分でロードした。ＥＢでベースラインとなるようカラムを洗浄し、ＥＢ中２５ｍＭ～５００ｍＭイミダゾールの２０ＣＶ勾配でタンパク質を溶出した。溶出画分を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によって解析した。陽性画分をプールし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ－７５樹脂を充填し、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した適切なサイズのカラムを使用したＳＥＣによってさらに精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびクーマシー染色によるＳＥＣ由来の画分の解析後に、適切な画分をプールし、１０Ｋ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離ユニットにおいて濃縮し、液体窒素中で瞬間凍結した。精製プロセスは全て、ＢｉｏＲａｄ ＮＧＣ Ｑｕｅｓｔ ＦＰＬＣ系を使用して実行した。

【0256】

Ｏｃｔｅｔ（ＢＬＩ、バイオレイヤーインターフェロメトリー）を使用した親和性決定
分析物としてＲＢＤ－ｍＦｃまたはＳ１－ｈＦｃ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、それぞれ４０５９２－Ｖ０５Ｈおよび４０５９１－Ｖ０２Ｈ）を使用して、ＶＨＨの親和性決定を実行した。動態緩衝剤（０．１％プロテアーゼ不含ＢＳＡ入りＰＢＳおよびＰＢＳ中０．０２％Ｔｗｅｅｎ－２０）中１０μｇ／ｍｌでＶＨＨをＮｉ－ＮＴＡバイオセンサー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）にロードした。水において１０分間バイオセンサーを水分補給し、次いでプレートを１０分間３０℃でプレインキュベートし、その後、実験を開始した。実験パラメーターは、ベースライン＝１分間、ロード＝５分間、ベースライン２＝３分間、会合＝５分間、解離＝１０分間であった。全条件について２００、１００、５０および０ｎＭでＲＢＤ－ｍＦｃまたはＳ１－ｈＦｃの会合を行い、ＲＢＤ－１－２Ｇ、ＲＢＤ－２－１ＦおよびＲＢＤ－１－１Ｅナノボディについて２５および１２．５ｎＭも含まれた。データ解析のため、０ｎＭ分析物とナノボディのロードを、対応するナノボディロードセンサーから減算した。ベースライン２の最後の５秒間に対する曲線の整列、解離に対して整列されたステップ間補正およびＳｔａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを使用した。データを処理し、次いでグローバルフィットによる１：２二価分析物モデルを親和性計算に使用した（データ解析ＨＴ １１．１）。

【0257】

親和性決定ＲＢＤ－１－２Ｇ多量体モダリティ
ＦｏｒｔｅＢｉｏアミン反応性第二世代（ＡＲ２Ｇ）バイオセンサーを使用して、ＲＢＤ－Ｈｉｓ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２－Ｖ０８Ｈ）に対するＲＢＤ－１－２Ｇの二価および三価モダリティの親和性を決定した。使用前にＵｌｔｒａＰｕｒｅ ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０９７７０１５）においてバイオセンサーを１０分間３０℃で予め水分補給した。６０秒間の水におけるベースラインに続いて、２０ｍＭの１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）および１０ｍＭのＮ－ヒドロキシスルホサクシニミド（ｓ－ＮＨＳ）の混合物における３分間の活性化を行った。次に、バイオセンサー先端を動態緩衝剤（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０および０．１％ＢＳＡ入りＰＢＳ）中２．５μｇ／ｍｌのＲＢＤ－Ｈｉｓに１５０秒間、またはほぼ１．５ｎｍの平均結合に達するまで曝した。１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．５）を使用してセンサーを１５０秒間クエンチした。１５０秒間の会合相に続く前に、動態緩衝剤における１８０秒間の別のベースラインを行った。動態緩衝剤において１００ｎＭで分析物ＲＢＤ－１－２Ｇ、ＲＢＤ－１－２Ｇ－ＦｃおよびＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｔｒｉを調製し、次いで６．１２５ｎＭ濃度に達するまで１：２希釈した。動態緩衝剤において３００秒間、脱会合を測定した。データ解析の際に０ｎＭ対照ウェルを減算した。データ処理（データ解析ＨＴ １１．１）は、ベースライン２（最後の５秒間）に対する曲線の整列、解離に対して整列されたステップ間補正、およびＳｔａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを含んだ。１：１結合モデルを使用してデータを解析し、グローバル曲線フィッティングを使用して、見かけ上の親和性を計算した。

【0258】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２突然変異体Ｓ１結合
Ｓ１突然変異体バリアントに結合するＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃ能力の決定を、抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサーに突然変異体タンパク質をロードし、次いでそれを２００ｎＭの様々なＳ１モダリティに曝露することにより決定した。ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃは、動態緩衝剤（ＰＢＳ ｐＨ７．４＋０．０２％ｔｗｅｅｎおよび０．１％プロテアーゼ不含ＢＳＡ）において１０μｇ／ｍｌで調製された。野生型Ｓ１（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９１－Ｖ０８Ｈ）およびＢ．１．１．７バリアント（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９１－Ｖ０８Ｈ１２）は、動態緩衝剤（ＰＢＳ ｐＨ７．４＋０．０２％ｔｗｅｅｎおよび０．１％プロテアーゼ不含ＢＳＡ）または１５０ｍＭ ＮａＣｌ入り１０ｍＭ酢酸塩緩衝剤（ｐＨ４～ｐＨ６．０）において２００ｎＭで調製された。水において１０分間バイオセンサーに水分補給し、プレートを１０分間３０℃でプレインキュベートし、その後、実験を開始した。実験パラメーターは、ベースライン１分間、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）における条件づけ２０秒間、中和２０秒間（条件づけおよび中和をそれぞれ３回行った）、ロード２分間、ベースライン１分間、会合１．５分間、解離３分間であった。データ解析のため、対応するロードセンサーから０ｎＭ分析物とＳ１タンパク質のロードを減算した。ベースライン２の最後の５秒間に対する曲線の整列、解離に対して整列されたステップ間補正およびＳｔａｖｉｔｚｋｙ－Ｇｏｌａｙフィルタリングを使用した。検査された様々なｐＨ条件に関する会合相中に達成された最大応答としてデータを提示した。

【0259】

ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ
ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ（Hanson et al., Acs Pharmacol Transl 3, 1352-1360, 2020）を使用して、ＡＣＥ２への組換えスパイクタンパク質ＲＢＤ結合を破壊するナノボディの能力を査定した。用量応答において（１μＭ～６ｐＭ）、ナノボディを、０．０５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを補充したＰＢＳにおいて４ｎＭのＦｃタグに融合されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質受容体結合ドメイン（ＲＢＤ－Ｆｃ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質残基３１９～５４１）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｗａｙｎｅ、ＰＡ）と共に２５℃で３０分間プレインキュベートした。インキュベーション後に、Ｃ末端ＨｉｓおよびＡｖｉＴａｇを有するＡＣＥ２（ＡＣＥ２－Ａｖｉ、ヒトＡＣＥ２残基１８～７４０）（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）を４ｎＭの最終濃度となるように添加し、その結果生じる混合物を２５℃で３０分間インキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナルを産生するために、ＡＣＥ２－Ａｖｉを認識するストレプトアビジンドナービーズおよびＲＢＤ－Ｆｃを認識するプロテインＡアクセプタービーズを、それぞれ１０μｇ／ｍｌの最終濃度となるように添加し、その結果生じる混合物を暗所にて２５℃で４０分間インキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ光モジュールを搭載した３８４ウェルフォーマット焦点レンズ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を備えるＰｈｅｒａＳＴＡＲ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）プレートリーダーを使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ冷光シグナルを測定した。全実験を３回繰り返して行った。

【0260】

ＱＤ_６０８－ＲＢＤ中和アッセイ
以前に記載された通りに（Gorshkov et al., Acs Nano 14, 12234-12247, 2020）ＱＤ_６０８－ＲＢＤを合成した。ＰＤＬコーティング９６ウェルプレートにおいてＡＣＥ２－ＧＦＰ細胞（２５，０００個）を播種し、一晩インキュベートした。ナノボディまたはナノボディ－Ｆｃ構築物を１０ｎＭ ＱＤ_６０８－ＲＢＤと共に３０分間プレインキュベートした。細胞をＯｐｔｉｍｅｍ Ｉ血清低減培地で１×洗浄し、その後、ナノボディと共にプレインキュベートした１０ｎＭ ＱＤ_６０８－ＲＢＤで３時間処置した。４０×水浸対物レンズを使用してＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｏｐｅｒａにおいて細胞を画像化した。単一のプレートにおいて２回繰り返しウェルからウェル当たり８～１０個の視野を捕捉した。条件当たりおよそ１６００～２５００個の細胞を画像化した。

【0261】

シュードタイプ化粒子（ＰＰ）中和アッセイ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化粒子（ＰＰｓ）をＣｏｄｅｘ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入し、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）シュードタイプ化系を使用して産生した（Chen et al., Acs Pharmacol Transl 3, 1165-1175, 2020）。全てのＳＡＲＳ－ＣｏＶ２－Ｓ構築物は、１９アミノ酸をＣ末端トランケートして、シュードタイプ化のためにＥＲ保持を低減させた。ＷＴ Ｓ配列は、武漢－Ｈｕ－１配列（ＢＥＩ＃ＮＲ－５２４２０）であった。バリアントＢ１．１．７（アルファ）は、突然変異ｄｅｌ６９－７０、ｄｅｌ１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈを含有する。

【0262】

以前に記載された通りに（２４）ＰＰ中和アッセイを行った。ＷＴ ＰＰアッセイのため、ＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２細胞を、２μＬ／ウェル培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１×Ｌ－グルタミン、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１μｇ／ｍｌピューロマイシン）中２０００細胞／ウェルで白色ソリッドボトム１５３６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ）に播種し、３７℃で５％ＣＯ_２にて一晩（ほぼ１６時間）インキュベートした。被験物をＰＢＳにおいて１：２滴定し、２００ｎＬ／ウェルでアッセイプレートに音響的に分注した。細胞を被験物と共に３時間３７℃で５％ＣＯ_２にてインキュベートし、その後、２μＬ／ウェルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－Ｓ ＰＰを添加した。次に、１５００ｒｐｍ（４５３×ｇ）で４５分間の遠心分離によってプレートをスピンし、次いで３７℃で４８時間、３７℃、５％ＣＯ_２にてインキュベートして、ＰＰの細胞侵入およびルシフェラーゼレポーターの発現を可能にした。インキュベーション後に、Ｂｌｕｅ Ｗａｓｈｅｒ（ＢｌｕｅＣａｔ Ｂｉｏ）を使用して穏やかな遠心分離により上清を除去した。次に、４μＬ／ウェルのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をアッセイプレートに添加し、５分間室温でインキュベートした。ＰＨＥＲＡＳｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して冷光シグナルを測定した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントＰＰ中和アッセイのため、ＨＥＫ２９３－ＡＣＥ２細胞を、１５μＬ／ウェル培地中６０００細胞／ウェルで白色ソリッドボトム３８４ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＢｉｏＯｎｅ）に播種した。細胞を３７℃で５％ＣＯ_２にて一晩（ほぼ１６時間）インキュベートした。ナノボディをＰＢＳにおいて１：２滴定し、１μｌ／ウェルで細胞に添加した。細胞を１時間３７℃、５％ＣＯ_２にてナノボディと共にインキュベートし、その後、１５μＬ／ウェルのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＰＰを添加した。次に、１５００ｒｐｍ（４５３×ｇ）で４５分間の遠心分離によってプレートをスピノキュレーションし、３７℃で４８時間、３７℃、５％ＣＯ_２にてインキュベートして、ＰＰの細胞侵入およびルシフェラーゼレポーターの発現を可能にした。インキュベーション後に、Ｂｌｕｅ Ｗａｓｈｅｒ（ＢｌｕｅＣａｔ Ｂｉｏ）を使用して穏やかな遠心分離により上清を除去した。次に、２０μＬ／ウェルのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をアッセイプレートに添加し、５分間室温でインキュベートした。ＰＨＥＲＡＳｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して冷光シグナルを測定した。１００％としてのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＰＰを含有するウェルおよび０％としての空ＰＰを含有するウェルを用いて、データを正規化した。ＰＰを省略し、代わりに培地を添加することにより、ＡＴＰ含有量細胞毒性アッセイを行った。１００％としての細胞を含有するウェルおよび０％としての培地のみを含有するウェルを用いて、データを正規化した。

【0263】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイ
以前に記載された通りに（Chen et al., Front Pharmacol 11, 592737, 2021）、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）のＢＳＬ－３施設においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイを行った。手短に説明すると、ＰＢＳにおいてナノボディを滴定し、３μＬ／ウェルで３８４ウェルアッセイプレートに添加して、アッセイの準備ができたプレート（ＡＲＰ）を作製し、これを次いで凍結し、検査施設に輸送した。細胞培養培地（ＭＥＭ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ／ＧｌｕｔａＭａｘ、１％ＨＥＰＥＳ、２％ＨＩ ＦＢＳ）を５μＬ／ウェルでＡＲＰに分注し、室温でインキュベートして、化合物を溶解させた。Ｖｅｒｏ Ｅ６アフリカミドリザル腎臓上皮細胞（高いＡＣＥ２発現のため選択）に、培地において０．００２の感染多重度（ＭＯＩ）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＵＳＡ＿ＷＡ１／２０２０）を接種し、２５μＬ／ウェルとしてアッセイプレートに素早く分注した。最終細胞密度は、４０００細胞／ウェルであった。アッセイプレートを７２時間、３７℃、５％ＣＯ_２および９０％湿度でインキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（３０μＬ／ウェル、Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｇ７５７３）をアッセイプレートに分注した。プレートを１０分間室温でインキュベートした。冷光シグナルをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎｖｉｓｉｏｎまたはＢＭＧ ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒプレートリーダーにおいて測定した。０％ＣＰＥレスキューとしての緩衝剤のみのウェルおよび１００％ＣＰＥレスキューとしてのウイルスなしの対照ウェルを用いて、データを正規化した。ＣＰＥアッセイと同じプロトコールをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの添加なしで使用して、ＡＴＰ含有量細胞毒性カウンターアッセイを行った。１００％生存率としての緩衝剤のみのウェルおよび０％生存率としてのハイアミン（塩化ベンゼトニウム）対照化合物で処置された細胞を用いて、データを正規化した。

【0264】

膜タンパク質アレイアッセイ
Ｉｎｔｅｇｒａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）において膜プロテオームアレイ（ＭＰＡ）スクリーニングを行った。ＭＰＡは、発現プラスミドから生細胞においてそれぞれ過剰発現される６，０００個のヒト膜タンパク質クローンで構成されたタンパク質ライブラリーである。各クローンを、３８４ウェルプレートの別々のウェルにおいて個々にトランスフェクトし、続いて３６時間インキュベーションした（Tucker et al., Proc Natl Acad Sci USA 115, E4990-E4999, 2018）。それぞれ個々のＭＰＡタンパク質クローンを発現する細胞を、ハイスループットスクリーニングのためのマトリックスフォーマットにおいて２回繰り返してアレイ化した。ＭＰＡにおけるスクリーニング前に、陽性（膜係留プロテインＡ）および陰性（偽トランスフェクト）結合対照を発現する細胞において、スクリーニングのための被験抗体（ＲＢＤ－１－２Ｇ）濃度を決定し、続いて、蛍光標識された二次抗体を使用したフローサイトメトリーによって検出した。各被験抗体を所定の濃度でＭＰＡに添加し、タンパク質ライブラリーにわたる結合を、蛍光標識された二次抗体を使用してＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ｉＱｕｅにおいて測定した。各アレイプレートは、プレート間の再現性を確実にするために陽性（Ｆｃ結合）および陰性（空ベクター）対照の両方を含有する。ＭＰＡスクリーニングによって同定されたいずれかのオフターゲットとの被験抗体相互作用を、被験抗体の系列希釈を使用した第２のフローサイトメトリー実験において確認し、配列決定によって標的同一性を再検証した。

【0265】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２融合前Ｓ－タンパク質外部ドメイン
構築物ＶＲＣ ７４７１（Ｄａｌｅ ａｎｄ Ｂｅｔｔｙ Ｂｕｍｐｅｒｓ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ＮＩＡＩＤ）は、残基９８６および９８７におけるプロリン置換を有するｎＣｏＶ Ｓ－２Ｐ－ｄＦｕ－Ｆ－３Ｃ－Ｈ－２Ｓ，Ｓ外部ドメイン、ＧＳＡＳに突然変異したフューリン部位（配列番号１０）、Ｔ４フィブリチン三量体化モチーフ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ切断部位、ならびに８×ＨｉｓおよびＳｔｒｅｐタグをコードする。これは、初期に発表された構造（Wrapp et al., Science 367, 1260-1263, 2020）に使用される構築物に基づく。発現は、製造業者のプロトコールに従ってＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において実行した。手短に説明すると、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、１Ｌ Ｅｘｐｉ２９３細胞を一過的にトランスフェクトし、３７℃で１８時間インキュベートした。この時点で、エンハンサーを添加し、温度を９６時間３２℃にシフトさせた。分泌されたタンパク質を採集するために、４００ｇで１５分間の遠心分離によって細胞をペレットにし、０．４５μｍフィルターを通して上清を濾過した。総計５ｍｌのＴａｌｏｎ金属親和性樹脂（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ）を上清に添加し、一晩４℃で混合した。上清／樹脂混合物をカラムに重力ロードし、１００ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０／１５０ｍＭ ＮａＣｌで、続いて１００ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０／５００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／２００ｍＭイミダゾールでスパイク三量体をバッチ溶出した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって査定された、スパイク三量体を含有する画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ４遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｎｃ）を使用して、ほぼ１ｍｇ／ｍｌとなるように緩衝液交換／濃縮した。濃縮されたタンパク質を小さいアリコートに分け、液体窒素中で瞬間的に凍結し、－８０℃で貯蔵した。

【0266】

三量体スパイクタンパク質に結合したナノボディのクライオＥＭ構造決定
検体調製
親水性を増加させるために、２５ｗにおける浸漬モードを使用して、アルゴン雰囲気下でＴｅｒｇｅｏ ＥＭプラズマ洗浄装置（ＰＩＥ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）においてグリッドを１分間前処置した。各ナノボディ（Ｎｂ）と混合した、Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０ ５０ｍＭおよび１６０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝剤における２．７３μＭ ＳＡＲＳ ＣｏＶ－２ Ｓの３μＬアリコートを、クリーンなＵｌｔｒＡｕｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３ ３００メッシュグリッド上に塗布した。Ｌｅｉｃａ ＥＭ ＧＰ ２（Ｌｅｉｃａ）ガラス化ロボット（自動吸い取り圧、２５℃および９５％ＲＨにおけるチャンバー）における液体エタン（－１８２℃）中に差し込む前に、Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．＃１で吸い取ることにより過剰な溶液を除去した。ＲＢＤ－１－１Ｇ（１．５ｍｇ／ｍｌ）、ＲＢＤ－１－２Ｇ（１．３ｍｇ／ｍｌ）、ＲＢＤ－２－１Ｆ（１．８ｍｇ／ｍｌ）、ＲＢＤ－１－３Ｈ（１．２ｍｇ／ｍｌ）、ＲＢＤ－２－１Ｂ（１．７ｍｇ／ｍｌ）およびＲＢＤ－２－３Ａ（４．２ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に調製した。

【0267】

データ収集
それぞれ３００および２００ＫｅＶで操作されるＴｉｔａｎ ＫｒｉｏｓまたはＴａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ透過型電子顕微鏡（ＴＦＳ）のいずれかにおいて、データを収集した。前者は、ポストカラムエネルギーフィルター（Ｇａｔａｎ）を搭載しており、２０ｅＶスリットサイズで操作される。直接的電子検出器（Ｇａｔａｎ Ｋ２）においてマルチフレーム画像を収集した。データセット毎の詳細を表１に記載する。

【表1】

【0268】

画像処理
画像処理は全て、ＲＥＬＩＯＮ－３．１．０の文脈において実行した。ビニングなしで内部インプリメンテーションおよび標準パラメーターを使用して運動補正を行った。３．０～３０Åの分解能範囲、５０００～３５０００Åのデフォーカス範囲および５００ÅのデフォーカスステップサイズにおいてＣＴＦＦＩＮＤ４を使用してＣＴＦを推定した。１５０および１８０Åの最小および最大直径によるラプラシアンオブガウシアン（Laplacian-of-Gaussian）検出を使用して、粒子を選定した。これらを、３００ピクセルのボックスサイズを使用して抽出し、１００ピクセル（最終サイズ３．５６２Ａ／ピクセル）へとフーリエダウンサンプリングした。２または３ラウンドの２Ｄ分類をランして、コンタミネーションおよび外れ値を最初に除去した。「クリーンな」粒子を使用して、確率的勾配降下アルゴリズムを使用した初期３Ｄマップを作成した。３Ｄ分類を使用して、外れ値のさらなる排除を達成した。クリーンなデータセットのそれぞれからコンセンサスＣ３対称マップを緻密化し、フルデフォーカス緻密化に使用した（異方性、デフォーカスおよび高次異常）。スパイクの非対称部分の分解能を改善するために、このステップの後に分類に対する種々のアプローチ（整列、対称性拡大あり／なし等）を採用した。

【0269】

クライオＥＭモデル建設および解析
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（ｐｄｂ：６ｚｐ０）のＣ３対称閉鎖構造のための原子モデルを、クライオＥＭマップにおけるフィッティングのための出発点として使用した。「ワンアップ（one-up）」モデルを作成するために、６ｚｐ０におけるＲＢＤの１個（残基３３６～５２０）を、参照としてｐｄｂ：６ｖｙｂを使用して開放状態に手作業で整列させた。スパイクタンパク質の原子モデルを、Ｃｈｉｍｅｒａにおけるマップツールにおいてフィットを使用して、各マップ中に、剛体として位置を定めた。この後に、原子モデルを、Ｐｈｅｎｉｘ １．１８．２におけるデフォルト実空間緻密化戦略（ローカルグリッド検索、グローバル最小化、モーフィングおよび原子移動パラメーター緻密化）を使用してマップに可動的にフィットさせた。二次制約もＮＣＳオペレーターの緻密化も用いずに、ラマチャンドラン（Ramachandran）制約を適用しつつ、この緻密化を行った。反復の最大数を１５０に増加させた。原子モデルシミュレートマップおよびクライオＥＭマップの間のラマチャンドランプロットおよびフーリエシェル（Fourier Shell）相関プロットを使用して、フィッティングを検証した。各ナノボディとＲＢＤの間の適正な結合機序を得るために、分子ドッキング計算を、次の通りにクライオＥＭマップへの可動性フィッティングと組み合わせた。Ｉ－ＴＡＳＳＥＲプログラム（Roy et al., Nat Protoc 5, 725-738, 2010）を使用して、ナノボディの３Ｄ構造モデルを作成した。スレッディングプログラムによって使用される抗体の上位１０種の鋳型構造は、ナノボディと６０～７０％の配列同一性を共有する。作成されたモデルは全て、全般に良好な品質を示した（Ｃ－スコア＞０およびＺ－スコア＞１）。Ａｍｂｅｒ２０プログラム（Case et al., University of California, San Francisco, 2020）を使用したエネルギー最小化および分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを用いて、最良の構造モデルをさらに緻密化した。スパイク原子モデルを各密度マップにフィッティングした後に、原子モデルからＲＢＤのＮｂ結合高次構造を抽出した。次に、ナノボディＲＢＤ－１－３Ｈ、ＲＢＤ－２－１Ｆ、ＲＢＤ－１－１ＧおよびＲＢＤ－１－２Ｇと、対応するフィットしたＲＢＤの間の結合機序を、ＺＤＯＣＫサーバーを使用して予測した。ＺＤＯＣＫによって報告されるＮｂ－ＲＢＤ複合体毎の１０種の結合機序を全て、剛体として、ＵＣＳＦ Ｃｈｉｍｅｒａにおいて対応するＲＢＤ密度マップにフィットさせた。次に、ＰｈｅｎｉｘにおけるＣｒｙｏ＿ｆｉｔルーチン（バージョン１．１８－３８５５のためのデフォルトパラメーター）を使用して、マップと最も良く相関するモデルを緻密化した。

【0270】

分子動力学
ＲＢＤ－１－２ＧとＲＢＭ領域との相互作用をより深く理解するために、原子モデルフィッティングを行って、鍵となる結合残基を同定した。マップにおけるＲＢＤ領域の分解能は、原子モデルを直接的に導き出すには十分に高くなかったため、低分解能マップへのＲＢＤおよびＲＢＤ－１－２Ｇの原子モデルのフィッティングが次善の解決策であった。しかし、低分解能におけるＶＨＨの見かけ上の対称性は、複合体の文脈におけるその配向性の曖昧な割当てを生じる。スパイク（６ｚｐ０）のモデルをマップにフィットさせ、ＲＢＤ座標に対応する部分を抽出した（残基３２８～５３１）。ナノボディの座標を変動させつつＲＢＤ座標が硬直を維持した分子ドッキング計算を、ＺＤＯＣＫプラットフォームを使用して行った。要請される１０種の高次構造のうち、ＲＢＭに面するＣＤＲを示したペアを、スパイクモデルの「半分ダウン」状態におけるＲＢＤに対して、マップにおいて位置を定めた。２種の複合体のシミュレートされた密度をマップと比較し、最高の相関係数（ＣＣ）を示す結果をさらなる緻密化のために選択した。最良の予測される結合機序を選ぶためのフィルターとしてクライオＥＭマップを使用して、分子ドッキングと組み合わせたこの原子モデルフィッティング戦略を、ナノボディＲＢＤ－１－２Ｇ、ＲＢＤ－２－１Ｆ、ＲＢＤ－１－１ＧおよびＲＢＤ－１－３Ｈに対して検査したところ、全ての場合において予測の成功を示した。

【0271】

ＲＢＤ－１－２ＧとＷＴ ＲＢＤと共に、ＲＢＤ－１－２ＧとＲＢＤ複合体のアルファバリアントにおいて分子動力学シミュレーションを行って、相互作用界面に配置された様々な残基のエネルギー論および関与をさらに特徴付けた。クライオＥＭ密度マッチ分子ドッキングから出発タンパク質構造を得た。タンパク質原子を表すｆｆ１４ＳＢ力場により、Ａｍｂｅｒ．１８（Wang et al., Nature 593, 130-135, 2021）を使用して全てのＭＤシミュレーションを行った。Ａｍｂｅｒ．１８のＧＰＵ増強ＰＭＥＭＤモジュールにより、初期最小化、平衡化および全ての産生ランを実行した。タンパク質複合体を溶媒和する長方形のＴＩＰ３Ｐ水ボックスの選択により、Ｌｅａｐモジュールを使用して、初期座標およびトポロジーファイルを作成した。ボックス境界を溶質から少なくとも２０Å拡張した。両方の系が、５７個のＮａ^＋イオンおよび６１個のＣｌ^－イオンを含有し、これらは、電荷中和および１００ｍＭ塩濃度を提供した。ＷＴ系は、９７，９９８個の原子で構成され、突然変異体系は、９８，００６個を有した。各タンパク質系による水およびイオンの初期平衡化が、１００ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Å^２力定数による位置的制限に供された後に、最小化は、タンパク質原子における同じ力定数に従った。１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ／Å^２に力定数を維持しつつ、各系を、２ｎ秒間低温（Ｔ＝１００Ｋ）定圧シミュレーションに供して、現実的な値に調整された系密度を得た。１ｎ秒間以内に３００Ｋへと段階的に徐々に加熱した後に、各系を、タンパク質原子における位置制約により最大１０ｎ秒間にわたりさらに平衡化した。次の１０ｎ秒間以内に、位置定数を段階的に除去し、各系をさらなる１０ｎ秒間の平衡化に供した。各系において３回の独立した平衡化を行った（２回目および３回目のランのための出発高次構造は、１回目のＭＤランの１０番目および２０番目のｎ秒間構成から選択される）。全ての系に対して２ｆ秒時間ステップで、５００ｎ秒間にわたり定圧産生ランを行った。９Åの短い範囲のカットオフにより長い範囲の静電気の処置において粒子メッシュＥｗａｌｄ方法を使用した。０．１５Ｍ塩濃度およびＡｍｂｅｒモジュール内のデフォルトパラメーター（ＩＧＢ＝５）の選択により、自由エネルギー推定においてＡｍｂｅｒ．１８のＭＭＧＢＳＡモジュールを遂行した。各トラジェクトリーの各ナノ秒間において選択された５００種の構成をこの計算において使用した。Ａｍｂｅｒ．１８のＣＰＰＴＲＡＪモジュールを使用して、全ての他の解析を行った。

【0272】

（実施例２）
合成ヒト化ナノボディライブラリーからのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和ＶＨＨの同定
迅速なｉｎ ｖｉｔｒｏナノボディ発見のためのプラットフォームを開発するために、最初に承認されたヒト化ナノボディ薬カプラシズマブ（米国特許第１０，９１９，９８０号）に由来する骨格から開始して、多数の合成ファージディスプレイナノボディライブラリーを設計した（図１Ａ）。ヒトにおける使用のために最適化されたカプラシズマブフレームワークにライブラリーを基礎付けることにより、ファージパニングにより同定された強力結合剤を、治験用新薬（ＩＮＤ）研究および治験のために迅速に前進させることができると仮定された。カプラシズマブフレームワーク領域を、合成された相補性決定ループ（ＣＤＲ）と組み合わせて、ナノボディの高度に可変な抗原結合界面を多様化させた（McMahon et al., Nat Struct Mol Biol 25, 289-296, 2018）。これにより、理論上、ヒト治験へと迅速に橋渡しされ得る＞１０^１０種の形質転換体のライブラリー多様性がもたらされた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質に対する１ラウンドと、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＲＢＤに対する２回の追加のパニングラウンドのために、ファージパニングを行った（図１Ｂ）。パニングプロセスにおいて総計１３種のナノボディを同定し、そのうち１０種が、配列富化を示した。

【0273】

ナノボディをＶｉｂｒｉｏ ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓにおいて産生し、Ｎｉ－ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して精製した。ナノボディのサイズおよびＭＷをＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび高分解能ＭＳによって確認した（図６Ａ～図６Ｄ）。Ｏｃｔｅｔ解析を使用して、様々なナノボディに対するＲＢＤ－ｍＦｃおよびＳ１－ｈＦｃのリアルタイムの会合および解離を可視化した。グローバルフィットモデル化は、ＲＢＤ－ｍＦｃに対する０．９ｎＭ（ＲＢＤ－１－１Ｅ）、４．９ｎＭ（ＲＢＤ－２－１Ｆ）および９．４ｎＭ（ＲＢＤ－１－２Ｇ）の結合親和性を明らかにした（図１Ｃ～図１Ｄ、図７Ａ～図７Ｈ）。分析物としてＳ１－ｈＦｃが使用された場合、ＲＢＤ－１－２Ｇは、６．９ｎＭの親和性を示し、これは、ＲＢＤ－ｍＦｃ分析物よりも２６．６％の改善であった（６．９ｎＭ ｖｓ ９．４ｎＭ）。Ｓ１フォーマットにスイッチした場合、ＲＢＤ－２－１Ｆ（２４．６ｎＭ ｖｓ ４．９ｎＭ）およびＲＢＤ－１－１Ｅ（３．８ｎＭから０．９ｎＭ）の両方について低減された結合親和性が観察された（図１Ｄ、図８Ａ～図８Ｋ）。親和性に関する観察された差はおそらく、二量体化Ｓ１の文脈において到達可能性が低いＲＢＤにおけるいくつかのエピトープが原因であろう。これらのナノボディが、ＲＢＤ－ＡＣＥ２複合体形成を阻害するか否か評価するために、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを開発した（Hanson et al., Acs Pharmacol Transl 3, 1352-1360, 2020）。ＡＣＥ２－ＡｖｉおよびＲＢＤ－Ｆｃ会合を増加する濃度のナノボディの存在下で決定して、それらの受容体遮断能力を評価した（図１Ｅ）。ＲＢＤ－１－２Ｇは、Ｓ１－ｈＦｃに対して２番目に高い親和性を有するにもかかわらず、ＲＢＤ－１－１Ｅよりも低いＩＣ_５０を生じた（２８．３ｎＭ ｖｓ．１２６ｎＭ）（図１Ｅ）。これらの結果は、治療薬開発のための潜在的な候補としてＲＢＤ－１－２Ｇを支持する。

【0274】

（実施例３）
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの中和を改善するためのＲＢＤ－１－２Ｇの多量体化
ＲＢＤ－１－２Ｇをさらに評価するために、また、改善されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和性能のために、二価および三価モダリティを構築した。二価フォーマット、ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃは、１４．３ｎＭを有する一価フォーマットと比較して、１．９ｎＭの改善された結合親和性を有した（図２Ａ、図２Ｂ）。３個の一価フォーマットを（ＧＧＧＧＳ）_３（配列番号９）可動性リンカーで連結することにより、三価フォーマット（ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｔｒｉ）を構築した。これは、ＲＢＤ結合のために０．１ｎＭに見かけ上の親和性をさらに改善した（図２Ｃ）。

【0275】

この改善された親和性が、改善された治療潜在力へと置き換わるか検査するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ量子ドット（ＱＤ_６０８－ＲＢＤ）を使用してエンドサイトーシスアッセイを行った（図９Ａ～図９Ｃ、図１０Ａ～図１０Ｃ）（Gorshkov et al., Acs Nano 14, 12234-12247, 2020）。ＲＢＤ－１－２Ｇは、３９０ｎＭのＩＣ_５０により最高の効力を示した（図２Ｄ）。ＦｃフォーマットへのＲＢＤ－１－２Ｇの変換は、ＩＣ_５０を１４ｎＭに低減させた（図２Ｅ）。ＲＢＤ－１－１Ｅ－Ｆｃについて同様の傾向が観察されたが（３７２８ｎＭから３２ｎＭ）、ＲＢＤ－２－１Ｆ－Ｆｃには観察されなかった（９４７ｎＭから３８８３ｎＭ）（図２Ｄ、図２Ｅ）。ＲＢＤ－２－１Ｆは、ＲＢＤ－１－２Ｇよりも優れた親和性を有するにもかかわらず（４．９ｎＭ ｖｓ ９．４ｎＭ、図１Ｄ）、ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃは、ＲＢＤ－２－１Ｆ－Ｆｃよりも高い親和性を示した（図１１Ａ～図１１Ｅ）。ＲＢＤへのＲＢＤ－２－１Ｆの結合は、Ｆｃドメインの存在によって阻害され得る。

【0276】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ－タンパク質シュードタイプ化マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベクター粒子を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイを用いて、抗ウイルス活性をさらに特徴付けた（Chen et al., Acs Pharmacol Transl 3, 1165-1175, 2020）。ＲＢＤ－１－２Ｇは、４９０ｎＭのＩＣ_５０でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードタイプ化ウイルスを中和することが見出された（図２Ｆ）。８８ｎＭ（ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃ）における阻害を示すＦｃおよび三量体モダリティにより、有意な改善が見られた（図２Ｇ）。ＱＤ内部移行アッセイと一致して、ＲＢＤ－２－１Ｆ－Ｆｃは、ＲＢＤ－２－１Ｆよりも改善を示したが、ＲＢＤ－１－２Ｇモダリティよりも良く中和することができなかった（図２Ｆ）。検査された他のナノボディおよびＦｃモダリティは、ほとんど活性を示さなかった（図１２Ａ～図１２Ｂ）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２生きているウイルススクリーニングを行って、ナノボディの中和効果を査定した。ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｔｒｉは、１８２ｎＭのＩＣ_５０を生じ、そのすぐ後に、２５５ｎＭのＩＣ_５０を有するＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃが続く（図２Ｈ）。ＲＢＤ－１－２Ｇの三量体およびＦｃモダリティは、ＲＢＤ－１－２Ｇ（ＩＣ_５０＝１２１１ｎＭ）およびＲＢＤ－２－１Ｆ－Ｆｃ（ＩＣ_５０＝３５７４ｎＭ）よりも強力であることが見出された。これらのデータは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２治療薬としてのさらなる開発のためにＲＢＤ－１－２Ｇおよびその多量体モダリティを支持する。

【0277】

（実施例４）
クライオＥＭは、中和ナノボディについて２種の別個の結合機序を明らかにした
選択されたナノボディが結合する領域を解明するために、単一粒子クライオＥＭを使用して、４種のナノボディと複合体形成したＳ－タンパク質外部ドメインの可溶性形態の電子散乱密度マップを得た（図１３Ａ、図１３Ｂ、図１４および図１５）。ＲＢＤ－１－２Ｇ、ＲＢＤ－２－１Ｆ、ＲＢＤ－１－１ＧおよびＲＢＤ－１－３Ｈとの複合体のマップは、ＲＢＤ領域における追加的な密度を特色付けた（図３Ａ）。２種の追加のナノボディ（ＲＢＤ－２－３ＡおよびＲＢＤ－２－１Ｂ）を検査したが、観察された電子密度は、リガンド未結合のスパイクと同様であることが見出された。Ｏｃｔｅｔによって、これらのナノボディがＳ１－ｈＦｃに結合したときに低い親和性も観察され（図１Ｄ）、これらのエピトープが、三量体スパイクの文脈において到達不能であることを示唆する。

【0278】

到達可能なエピトープは、２つのグループに分類することができる。「グループ１」は、ＲＢＭと重複する区域における「アップ」ＲＢＤの遠位端に配置されたＲＢＤ－１－２ＧおよびＲＢＤ－２－１Ｆのための結合区域を含む。ナノボディＲＢＤ－１－１ＧおよびＲＢＤ－１－３Ｈは、ＲＢＭと重複しない区域における直立したＲＢＤの外表面に露出された、「グループ２」におけるエピトープに結合する（図３Ａ）。スパイク（ＰＤＢＩＤ：６ｚｐ０）の原子モデルフィッティングは、「グループ１」結合剤が、ＡＣＥ２結合部位と重複するが、「グループ２」結合剤が、ＡＣＥ２結合を防止しないことを示唆する（図１３Ａ～図１３Ｂ）。ダウン高次構造において、ＲＢＤにおける「グループ２」のエピトープは、隣接する単量体のＮＴＤによって立体的に閉塞され、よって、このグループのナノボディは、「アップ」高次構造におけるＲＢＤに結合した場合でのみ検出された。対照的に、ＲＢＤ－１－２Ｇに対応する密度は、ＲＢＤの「アップ」および「半分ダウン」高次構造において検出することができる。「アップ」および「ダウン」状態の間のこの特有の中間体は、立体障害なしで３分子のＲＢＤ－１－２Ｇの収容を可能にし（図３Ｂ）、ＲＢＤ－１－２Ｇの高い活性を説明する可能性がある。結合区域の分解能を改善するために、スパイク単量体による対称性拡大およびシグナル減算を使用して、「ＲＢＤダウン」スパイク単量体（図３Ｃにえび茶色（maroon）で示す）の独立した緻密化を実行した。

【0279】

（実施例５）
ＲＢＤ－１－２Ｇは、様々な生理的ｐＨでＷＴおよびＢ．１．１．７バリアント（アルファ）に結合する
感染力増加および中和抗体活性低減に関連付けられてきた、Ｎ５０１Ｙ突然変異を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の異なる系統を同定した（Dejnirattisai et al., Cell 184, 2939-2954, 2021；Wang et al., Nature 593, 130-135, 2021）。Ｏｃｔｅｔバイオセンサー固定化ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃを、野生型およびＢ．１．１．７突然変異体（Ｎ５０１Ｙ）Ｓ１－Ｈｉｓの両方に曝露した。会合相におけるＷＴまたはＢ．１．１．７ ＲＢＤ－Ｈｉｓに対する最大の結合応答を、ｐＨ条件の範囲（７．４～４．０）にわたりグラフ化した（図４Ａ）。ＷＴおよびＢ．１．１．７について同様の結合プロファイルが観察されたが、より強いシグナルが突然変異体により観察された。ｐＨ５．０～６．０の間で最も強い結合が観察された。結合は、４．５のｐＨに至るまで検出可能であった。Ｓ１－Ｈｉｓの代わりにＲＢＤ－Ｈｉｓが使用された場合、同様のパターンが観察された（図４Ｂ）。ｐＨ６．０と、ｐＨが４．０まで低減されるときの漸進的な低減の間で最良の結合が観察された。これらのデータは、ＲＢＤ－１－２Ｇが、エンドソーム中に（ｐＨ＝６．５～４．５）内部移行後にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＷＴおよびＢ．１．１．７バリアント（アルファ）に結合したままでいることを示唆する。

【0280】

ウイルス粒子中和におけるＢ．１．１．７スパイク突然変異体の効果を査定した。ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｔｒｉは、野生型粒子よりも良くＢ．１．１．７シュードタイプ化粒子を阻害することが見出された（０．３ｎＭ ｖｓ ４．５ｎＭ）（図４Ｃ、図４Ｄ）。ＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｆｃ（１７．５ｎＭ ｖｓ １０．２ｎＭ）およびＲＢＤ－１－２Ｇ（７４６．５ｎＭ ｖｓ ５１１．６ｎＭ）は、Ｂ．１．１．７バリアントに対して同様のＩＣ_５０を示した（図４Ｃ、図４Ｄ）。その上、ＲＢＤ－２－１Ｆ－Ｆｃは、ＷＴシュードタイプ化粒子を阻害することができたが、Ｂ．１．１．７（アルファ）突然変異体バージョンを阻害することができなかった（図４Ｃ、図４Ｄ）。

【0281】

（実施例６）
ＲＢＤ－１－２Ｇは、低いオフターゲット結合を表す
ヒト膜プロテオームアレイ（ＭＰＡ、およそ６，０００種のヒト膜タンパク質 ＋ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）を使用して、ＲＢＤ－１－２Ｇの潜在的な多反応性および非特異性をスクリーニングおよび評価した。ＭＰＡスクリーニングは、外因的ヒト膜タンパク質への最小の結合による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクへのＲＢＤ－１－２Ｇの高い特異性の結合を確認した（図２０Ａ）。細胞内で発現されるタンパク質であるミトコンドリア伸長因子１（ＭＩＥＦ１）への結合が、初期スクリーニングにおいて検出された。この標的の検証は、ＲＢＤ－１－２Ｇが、ベクタートランスフェクト細胞と同様の様式でＭＩＥＦ１トランスフェクト細胞に結合したことを明らかにした（図２０Ｂ）。その上、ＭＩＥＦ１は、ミトコンドリアタンパク質であるため、ＲＢＤ－１－２Ｇの血液注入または噴霧投与に干渉する可能性が低いであろう。これらのアッセイは、ＲＢＤ－１－２Ｇの最小の潜在的なオフターゲット効果を指し示す。

【0282】

その上、ＲＢＤ－１－２Ｇナノボディを凍結乾燥し、復元されたナノボディを同様の生きているウイルスの研究において検査した。凍結乾燥プロセスは、生きているウイルスのスクリーニングにおいて全体的な活性にほとんど影響がなく（図１６Ａ～図１６Ｂ）、ＩＣ_５０は、凍結乾燥試料で５．９μＭを、無処置試料において１４．８μＭを測定する（図１６Ａ～図１６Ｂ）。凍結乾燥後に活性を保持するＲＢＤ－１－２Ｇの能力は、ナノボディに基づく治療薬の製造および形成において有用となり得るプラスの特色である。

【0283】

（実施例７）
ＲＢＤ－１－２ＧナノボディＲＢＭ領域相互作用の原子モデル化
ＲＢＤ－１－２Ｇと、ＷＴおよびＢ．１．１．７（アルファ）バリアントのＲＢＤ領域との結合に関与する残基を解明するために、ＲＢＤ－Ｎｂ複合体の分子ドッキングを用い、その後スパイクの文脈でそれをフィッティングした。最良の結合機序は、ドッキング結果をクライオＥＭマップと重ね合わせることにより選択された。次に、溶媒和ＲＢＤ－１－２Ｇ－ＷＴ ＲＢＤおよびＲＢＤ－１－２Ｇ－Ｂ．１．１．７ ＲＢＤ複合体を、溶液における１μ秒間にわたる分子動力学（ＭＤ）シミュレーションに供した。

【0284】

全シミュレーションにおける複合体の平均二乗偏差は、系が安定していたことを示した（図１７Ａ～図１７Ｂ）。主に１個のジャンプを示す曲線の一貫したパターンは、両方の系における少なくとも２つの可能な分布を指し示す（図１７Ａ、セット２およびセット３）。相互作用の高度に保存されたパターンは、ＷＴおよびＢ．１．１．７（アルファ）バリアントに対するＲＢＤ－１－２Ｇの非常に同様の結合機序に寄与する。ＭＤ結果は、ＲＢＤ－１－２Ｇが、ＷＴおよびＢ．１．１．７（アルファ）バリアントの両方に同様の角度で結合することを示した（図５Ａおよび図５Ｂ）。各複合体における残基当たりの位置変動を比較すると、二乗平均平方根変動（ＲＭＳＦ）における同様のパターン（図１８Ａ～図１８Ｄ）と、ＲＢＤ残基３５５～３７５および４７０～４９０の周囲の２個の別個の領域におけるより大きい変形形態（図５Ａおよび図５Ｂ）が観察された。相互作用の解析から、Ｅ４８４（ＲＢＤ）およびＲ７６（ＲＢＤ－１－２Ｇの定常領域における）の間の塩橋が、ＷＴ ＲＢＤを含有する複合体における最も優勢な相互作用であることが見出された（図５Ｃおよび図２１）。ＷＴ複合体におけるＲＢＤ－１－２Ｇに採用された高次構造は、Ｅ４８４およびＲ７６の間の塩橋が、Ｅ４８４とＳ２５（図５Ｄ）または一部の例ではＳ２８、Ｓ２９およびＧ２６との相互作用によってさらに安定化されることを示す。この塩橋は、突然変異体ＲＢＤ複合体における最も優勢な相互作用の１つとして残るが、Ｅ４８４は、この相互作用に排他的に専念するものではない。ＲＢＤ－１－２Ｇにおける残基Ｓ２８、Ｓ２９およびＮ７３はまた、Ｅ４８４との相互作用に関与する（図５Ｄおよび図５Ｅ）。ＷＴ複合体と比較して、突然変異体ＲＢＤとの複合体において、水素イオンのペアまたは塩橋の数の増加が観察された（図１９）。ＣＤＲ１およびＣＤＲ３、ならびに定常領域における数個の残基（Ｒ７６およびＮ７３）が、複合体の安定化の原因であった。Ｎ末端定常領域（Ｅ１、Ｖ２、Ｑ３）およびＣＤＲ２（Ａ５２およびＳ５３）における数個の残基は、ＷＴおよび突然変異体形態の両方においてＲＢＤと相互作用する一方で、ＣＤＲ２領域におけるＳ５３のみが、Ｎ４８７およびＹ４８９によるいくつかの水素結合の生成に関与すると思われる。

【0285】

ＭＭ／ＧＢＳＡ方法を使用して、ナノボディ－ＲＢＤ複合体系の結合自由エネルギー（ΔＧ結合）を推定した。ＭＤシミュレーショントラジェクトリーを通して２０～３０ｎ秒間の時間間隔で千枚のスナップショットを撮って、ＭＭ／ＧＢＳＡ自由エネルギー差をコンピュータ処理した。図５Ｃに示す通り、ＲＢＤ－１－２Ｇ／ＷＴ ＲＢＤの平均結合エネルギーは、－３６．１ｋｃａｌ／ｍｏｌであったが、ＲＢＤ－１－２Ｇ／Ｂ．１．１．７ ＲＢＤについては、－３８．９－ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。よって、ＲＢＤ－１－２Ｇは、ＷＴおよびＢ．１．１．７バリアントの両方と安定な複合体を形成することができ、バリアントが僅かに有利である。各残基によって提供される予測される相互作用エネルギーは、Ｅ４８４およびＲ７６の間の塩橋が、両方のシミュレーションにおいて結合の自由エネルギーに対して最も有意な寄与を有することを示した（図５Ｃおよび図２１）。この残基ペアは、両方の複合体の安定化において重要な役割を果たし、これは、ＷＴおよびＢ．１．１．７バリアントに対するこれらのナノボディの同様の結合機序および活性の観察と一致する。

【0286】

開示されている主題の原理が適用され得る多くの可能なインプリメンテーションを考慮すると、説明されているインプリメンテーションが、本開示の単なる例であり、本開示の範囲の限定として解釈するべきではないことを認識するべきである。むしろ、本開示の範囲は、次の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本出願人らは、そのような特許請求の範囲の範囲および精神の内に収まる全てのものを請求する。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D-E】

【図2A-C】

【図2D-E】

【図2F-H】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D-E】

【図6A-C】

【図6D】

【図7A-F】

【図7G-H】

【図8A-F】

【図8G-K】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20】

【図21】

【配列表】

2024535249000001.xml

【国際調査報告】