特表 2024-535351 乾燥ナノ粒子組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-30

(54)【発明の名称】乾燥ナノ粒子組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20240920BHJP

   A61K 9/00 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 9/19 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20240920BHJP

   A61K 47/06 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 47/14 20170101ALI20240920BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240920BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 31/711 20060101ALI20240920BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240920BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240920BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7088

A61K9/00

A61K9/107

A61K9/19

A61K47/22

A61K47/44

A61K47/06

A61K47/24

A61K47/14

A61K47/02

A61K47/26

A61K31/7105

A61K48/00

A61P37/04

A61K31/711

A61K47/18

C12N15/88 Z ZNA

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024518361

(86)(22)【出願日】2022-01-24

(85)【翻訳文提出日】2024-05-21

(86)【国際出願番号】 US2022013508

(87)【国際公開番号】W WO2023048758

(87)【国際公開日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】63/247,172

(32)【優先日】2021-09-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/297,449

(32)【優先日】2022-01-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522375693

【氏名又は名称】エイチディーティー バイオ コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】リード， スティーブン グレゴリー

(72)【発明者】

【氏名】カーター， ダリック アルバート

(72)【発明者】

【氏名】カンダール， アミット プラフル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065BA05

4C076AA17

4C076AA29

4C076AA99

4C076CC06

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4C076DD26

4C076DD29

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4C076GG05

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4C084AA13

4C084MA11

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4C084NA03

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4C086AA01

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4C086MA22

4C086MA44

4C086NA03

4C086NA13

4C086ZB09

(57)【要約】

核酸の対象への送達における使用のための、乾燥組成物およびそのような組成物を調製するための方法が本明細書に提供される。乾燥組成物は、脂質キャリアであって、脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、脂質キャリア、１つまたは複数の核酸、ならびに少なくとも１つの凍結保護物質を含み得る。これらの処置のための乾燥組成物を使用する方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

乾燥組成物であって、
（ａ）脂質キャリアであって、前記脂質キャリアが、疎水性コア、１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、脂質キャリア；
（ｂ）１つまたは複数の核酸；ならびに
（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質
を含む乾燥組成物。

【請求項2】

凍結乾燥されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

噴霧乾燥されている、請求項１に記載の組成物。

【請求項4】

熱的に安定である、請求項１に記載の組成物。

【請求項5】

摂氏約２５度で熱的に安定である、請求項１に記載の組成物。

【請求項6】

摂氏約４５度で熱的に安定である、請求項１に記載の組成物。

【請求項7】

摂氏約－２０度で熱的に安定である、請求項１に記載の組成物。

【請求項8】

摂氏約２度～摂氏約８度で熱的に安定である、請求項１に記載の組成物。

【請求項9】

少なくとも１週間、少なくとも２週間、および／または少なくとも１か月間、熱的に安定である、請求項１に記載の組成物。

【請求項10】

前記疎水性コアが、油を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項11】

前記油が、α－トコフェロール、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、プロポリス、スクアレン、鉱物油、ブドウ種子油、オリーブ油、パラフィン油、ピーナッツ油、大豆油、ヒマワリ油、大豆レシチン、トリグリセリド、ビタミンＥ、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステル、ジヒドロイソスクアレン（ＤＨＩＳ）、ファルネセン、ならびにスクアランの少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記１つまたは複数の無機ナノ粒子が、金属塩、金属酸化物、金属水酸化物、金属リン酸塩、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

前記１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質、アニオン性脂質、中性脂質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項14】

前記１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質である、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）；１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）；ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；および１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）；１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；Ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ－ジメチルデカン－１－アミニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記脂質キャリアが、必要に応じて、少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項17】

前記少なくとも１つの界面活性剤が、疎水性界面活性剤、親水性界面活性剤、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記疎水性界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、およびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含み；前記親水性界面活性剤が、ポリソルベートを含む、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記脂質キャリアが、約０．１～約０．４の範囲の平均多分散指数で、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲のｚ平均流体力学直径を有する、請求項１に記載の組成物。

【請求項20】

前記１つまたは複数の核酸が、ＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。

【請求項21】

前記ＲＮＡが、自己複製性ＲＮＡである、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記１つまたは複数の核酸が、前記脂質キャリアに組み込まれるか、またはそれと複合体化して、脂質キャリア－核酸複合体を形成する、請求項１に記載の組成物。

【請求項23】

前記脂質キャリア－核酸複合体が、非共有結合性相互作用を介して、または可逆的な共有結合性相互作用を介して形成される、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

窒素のホスフェートに対する（Ｎ：Ｐ）モル比によって特徴付けられる前記脂質キャリアの前記１つまたは複数の核酸に対するモル比が、約１：１～約１５０：１の範囲である、請求項１に記載の組成物。

【請求項25】

前記少なくとも１つの凍結保護物質が、スクロース、マルトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項26】

前記少なくとも１つの凍結保護物質が、スクロースである、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

前記少なくとも１つの凍結保護物質が、約１％ｗ／ｖ～約４０％ｗ／ｖである、請求項１に記載の組成物。

【請求項28】

前記少なくとも１つの凍結保護物質が、約１０％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖである、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

前記少なくとも１つの凍結保護物質が、約１０％ｗ／ｖである、請求項２７に記載の組成物。

【請求項30】

好適な希釈剤中で再構成された請求項１～２９のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。

【請求項31】

前記希釈剤が、水性である、請求項３０に記載の医薬組成物。

【請求項32】

前記希釈剤が、水である、請求項３０に記載の医薬組成物。

【請求項33】

請求項３０に記載の医薬組成物、および対象への投与のための送達システムを含むキット。

【請求項34】

請求項３０に記載の医薬組成物、および必要に応じて１つまたは複数のワクチンアジュバントを含むワクチン送達システム。

【請求項35】

対象における免疫応答を生じさせるための方法であって、治療有効量の請求項３０に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項36】

対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の請求項３０に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項37】

対象における１つまたは複数の核酸の送達をイメージングおよび／または追跡する方法であって、治療有効量の請求項３０に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項38】

凍結乾燥組成物を調製するための方法であって、
（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、前記脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；
（ｂ）１つまたは複数の核酸を前記脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；
（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を前記脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；ならびに
（ｄ）前記製剤を凍結乾燥して、凍結乾燥組成物を形成するステップ
を含む、方法。

【請求項39】

噴霧乾燥組成物を調製するための方法であって、
（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、前記脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；
（ｂ）１つまたは複数の核酸を前記脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；
（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を前記脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；ならびに
（ｄ）前記製剤を噴霧乾燥して、噴霧乾燥組成物を形成するステップ
を含む、方法。

【請求項40】

凍結乾燥組成物を再構成するための方法であって、
（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、前記脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；
（ｂ）１つまたは複数の核酸を前記脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；
（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を前記脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；
（ｄ）前記製剤を凍結乾燥して、凍結乾燥組成物を形成するステップ；ならびに
（ｅ）好適な希釈剤中で前記凍結乾燥組成物を再構成するステップ
を含む、方法。

【請求項41】

噴霧乾燥組成物を再構成するための方法であって、
（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、前記脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；
（ｂ）１つまたは複数の核酸を前記脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；
（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を前記脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；
（ｄ）前記製剤を噴霧乾燥して、噴霧乾燥組成物を形成するステップ；ならびに
（ｅ）好適な希釈剤中で前記噴霧乾燥組成物を再構成するステップ
を含む、方法。

【請求項42】

前記希釈剤が、水性である、請求項４０および４１に記載の方法。

【請求項43】

前記希釈剤が、水である、請求項４０および４１に記載の方法。

【請求項44】

前記凍結乾燥組成物が、熱的に安定である、請求項３８および４０に記載の方法。

【請求項45】

前記凍結乾燥組成物が、摂氏約２５度で熱的に安定である、請求項３８および４０に記載の方法。

【請求項46】

前記凍結乾燥組成物が、摂氏約４５度で熱的に安定である、請求項３８および４０に記載の方法。

【請求項47】

前記凍結乾燥組成物が、摂氏約－２０度で熱的に安定である、請求項３８および４０に記載の方法。

【請求項48】

前記凍結乾燥組成物が、摂氏約２度～摂氏約８度で熱的に安定である、請求項３８および４０に記載の方法。

【請求項49】

前記凍結乾燥組成物が、少なくとも１週間、少なくとも２週間、および／または少なくとも１か月間、熱的に安定である、請求項３８および４０に記載の方法。

【請求項50】

前記疎水性コアが、油を含む、請求項３８～４１に記載の方法。

【請求項51】

前記油が、α－トコフェロール、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、プロポリス、スクアレン、鉱物油、ブドウ種子油、オリーブ油、パラフィン油、ピーナッツ油、大豆油、ヒマワリ油、大豆レシチン、トリグリセリド、ビタミンＥ、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステル、ジヒドロイソスクアレン（ＤＨＩＳ）、ファルネセン、ならびにスクアランの少なくとも１つを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記１つまたは複数の無機ナノ粒子が、金属塩、金属酸化物、金属水酸化物、金属リン酸塩、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３８～４１に記載の方法。

【請求項53】

前記１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質、アニオン性脂質、中性脂質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３８～４１に記載の方法。

【請求項54】

前記１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質である、請求項３８～４１に記載の方法。

【請求項55】

前記カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）；１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）；ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；および１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）；１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；Ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ－ジメチルデカン－１－アミニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記脂質キャリアが、必要に応じて、１つまたは複数の界面活性剤を含む、請求項３８～４１に記載の方法。

【請求項57】

前記１つまたは複数の界面活性剤が、疎水性界面活性剤、親水性界面活性剤、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

前記疎水性界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、およびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含み；前記親水性界面活性剤が、ポリソルベートを含む、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記脂質キャリアが、約０．１～約０．４の範囲の平均多分散指数で、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲のｚ平均流体力学直径を有する、請求項３８～４１に記載の方法。

【請求項60】

前記１つまたは複数の核酸が、ＲＮＡである、請求項３８～４１に記載の方法。

【請求項61】

前記ＲＮＡが、自己複製性ＲＮＡである、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記１つまたは複数の核酸が、前記脂質キャリアに組み込まれるか、またはそれと複合体化して、脂質キャリア－核酸複合体を形成する、請求項３８～４１に記載の方法。

【請求項63】

前記脂質キャリア－核酸複合体が、非共有結合性相互作用を介して、または可逆的な共有結合性相互作用を介して形成される、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記少なくとも１つの凍結保護物質が、スクロース、マルトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３８～４１に記載の方法。

【請求項65】

前記少なくとも１つの凍結保護物質が、スクロースである、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記少なくとも１つの凍結保護物質が、約１％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖである、請求項３８～４１に記載の方法。

【請求項67】

前記少なくとも１つの凍結保護物質が、約１０％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖである、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記少なくとも１つの凍結保護物質が、約１０％ｗ／ｖである、請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

ソルビタン脂肪酸エステル、エトキシ化ソルビタンエステル、カチオン性脂質、免疫刺激物質、およびＲＮＡを含む乾燥組成物。

【請求項70】

前記ソルビタン脂肪酸エステルが、ソルビタンモノステアレートである、請求項６９に記載の組成物。

【請求項71】

前記エトキシ化ソルビタンエステルが、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートである、請求項６９に記載の組成物。

【請求項72】

前記カチオン性脂質が、ＤＯＴＡＰである、請求項６９に記載の組成物。

【請求項73】

前記免疫刺激物質が、スクアレンである、請求項６９に記載の組成物。

【請求項74】

前記エステルの比が、８～１１の親水性－親油性バランスを生じさせる、請求項６９に記載の組成物。

【請求項75】

前記エステルおよび脂質の比が、３０ｎｍ～２００ｎｍの粒子径を生じさせる、請求項６９に記載の組成物。

【請求項76】

前記エステルおよび脂質の比が、４０ｎｍ～７０ｎｍの粒子径を生じさせる、請求項６９に記載の組成物。

【請求項77】

ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ＤＯＴＡＰ、免疫刺激物質、およびＲＮＡを含む乾燥組成物。

【請求項78】

前記免疫刺激物質が、産生されるタンパク質の総量を減少させるが、ワクチンに対する免疫応答を増加させる、請求項６９～７７に記載の組成物。

【請求項79】

ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ＤＯＴＡＰ、およびスクアレンを含み、固体粒子を含まない、請求項７７に記載の組成物。

【請求項80】

前記エステルの比が、８～１１の親水性－親油性バランスを生じさせる、請求項７７に記載の組成物。

【請求項81】

前記粒子径が、３０ｎｍ～２００ｎｍである、請求項７７に記載の組成物。

【請求項82】

Ｎ：Ｐの比が、５～３５である、請求項７７に記載の組成物。

【請求項83】

前記免疫刺激物質が、産生されるタンパク質の総量を増加させるが、ワクチンに対する免疫応答を減少させる、請求項６９および７７に記載の組成物。

【請求項84】

前記免疫刺激物質が、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、または飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステルである、請求項８３に記載の組成物。

【請求項85】

乾燥組成物であって、
ａ）脂質キャリアであって、前記脂質キャリアが、疎水性コア、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、脂質キャリア；
ｂ）必要に応じて１つまたは複数の核酸；ならびに
ｃ）（ｉ）前記乾燥組成物の少なくとも約５０重量％、または（ｉｉ）少なくとも約５０ｍｇの量で存在する少なくとも１つの糖
を含む乾燥組成物。

【請求項86】

凍結乾燥されている、請求項８５に記載の組成物。

【請求項87】

摂氏約２５度で熱的に安定である、請求項８５に記載の組成物。

【請求項88】

摂氏約４５度で熱的に安定である、請求項８５に記載の組成物。

【請求項89】

摂氏約－２０度で熱的に安定である、請求項８５に記載の組成物。

【請求項90】

摂氏約２度～摂氏約８度で熱的に安定である、請求項８５に記載の組成物。

【請求項91】

少なくとも１週間、少なくとも２週間、および／または少なくとも１か月間、熱的に安定である、請求項８５に記載の組成物。

【請求項92】

前記疎水性コアが、油を含む、請求項８５に記載の組成物。

【請求項93】

前記油が、α－トコフェロール、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、プロポリス、スクアレン、鉱物油、ブドウ種子油、オリーブ油、パラフィン油、ピーナッツ油、大豆油、ヒマワリ油、大豆レシチン、トリグリセリド、ビタミンＥ、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステル、ジヒドロイソスクアレン（ＤＨＩＳ）、ファルネセン、ならびにスクアランの少なくとも１つを含む、請求項９２に記載の組成物。

【請求項94】

前記１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質、アニオン性脂質、中性脂質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８５に記載の組成物。

【請求項95】

前記１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質を含む、請求項９４に記載の組成物。

【請求項96】

前記カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）；１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）；ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；および１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）；１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；Ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ－ジメチルデカン－１－アミニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項９４に記載の組成物。

【請求項97】

前記脂質キャリアが、少なくとも１つの界面活性剤を含む、請求項８５に記載の組成物。

【請求項98】

前記少なくとも１つの界面活性剤が、疎水性界面活性剤、親水性界面活性剤、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項９７に記載の組成物。

【請求項99】

前記疎水性界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、およびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含み；前記親水性界面活性剤が、ポリソルベートを含む、請求項９８に記載の組成物。

【請求項100】

前記脂質キャリアが、約０．１～約０．４の範囲の平均多分散指数で、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲のｚ平均流体力学直径を有する、請求項８５に記載の組成物。

【請求項101】

前記１つまたは複数の核酸が、ＤＮＡである、請求項８５に記載の組成物。

【請求項102】

前記１つまたは複数の核酸が、ＲＮＡである、請求項８５に記載の組成物。

【請求項103】

前記ＲＮＡが、自己複製性ＲＮＡである、請求項１０２に記載の組成物。

【請求項104】

前記１つまたは複数の核酸が、前記脂質キャリアに組み込まれるか、またはそれと複合体化して、脂質キャリア－核酸複合体を形成する、請求項８５に記載の組成物。

【請求項105】

前記脂質キャリア－核酸複合体が、非共有結合性相互作用を介して、または可逆的な共有結合性相互作用を介して形成される、請求項１０４に記載の組成物。

【請求項106】

窒素のホスフェートに対する（Ｎ：Ｐ）モル比によって特徴付けられる前記脂質キャリアの前記１つまたは複数の核酸に対するモル比が、約１：１～約１５０：１の範囲である、請求項８５に記載の組成物。

【請求項107】

前記少なくとも１つの糖が、スクロース、マルトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項８５～１０６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項108】

前記少なくとも１つの糖が、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００ｍｇ、またはそれよりも多くの量で存在する、請求項８５～１０７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項109】

前記少なくとも１つの糖が、５０ｍｇ～２５０ｍｇの量で存在する、請求項８５に記載の組成物。

【請求項110】

前記少なくとも１つの糖が、少なくとも約２５０ｍｇの量で存在する、請求項８５に記載の組成物。

【請求項111】

前記糖が、組成物の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５重量％、またはそれよりも多くの量で存在する、請求項８５～１０７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項112】

前記糖が、組成物の８０～９８重量％、必要に応じて９４～９６重量％の量で存在する、請求項８５に記載の組成物。

【請求項113】

前記糖が、組成物の約９５重量％の量で存在する、請求項８５に記載の組成物。

【請求項114】

前記少なくとも１つの糖が、スクロースを含む、請求項８５～１１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項115】

前記疎水性コアが、１つまたは複数の無機ナノ粒子を含む、請求項８５～１１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項116】

前記１つまたは複数の無機ナノ粒子が、金属塩、金属酸化物、金属水酸化物、金属リン酸塩、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１１５に記載の組成物。

【請求項117】

前記１つまたは複数の無機ナノ粒子が、酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、オキシ水酸化アルミニウム、酸化鉄、二酸化チタン、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、ヒドロキシリン酸アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_ｘ（ＰＯ_４）_ｙ）、リン酸カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、カルシウムヒドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）、グルコン酸鉄、または硫酸鉄を含む、請求項１１５に記載の組成物。

【請求項118】

前記１つまたは複数の無機ナノ粒子が、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、マグヘマイト（ｙ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、ウスタイト（ＦｅＯ）、もしくはヘマタイト（アルファ（α）－Ｆｅ_２Ｏ_３）、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１１５に記載の組成物。

【請求項119】

最大で約２００マイクログラム（μｇ）の量で存在する核酸；
最大で約１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するカチオン性脂質；
最大で約０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する酸化鉄；
最大で約１．８８ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するスクアレン；
最大で約１．８６ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するソルビタンモノステアレート；
最大で約１．８６ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するポリソルベート８０；
最大で約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するスクロース；および
必要に応じて最大で約２．１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するクエン酸一水和物
を含む組成物。

【請求項120】

前記核酸が、ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１１９に記載の組成物。

【請求項121】

前記核酸が、ＲＮＡであり、最大で約５０μｇの量で存在する、請求項１１９に記載の組成物。

【請求項122】

好適な希釈剤中で再構成された請求項８５～１１８のいずれか一項に記載の組成物および薬学的に許容される担体、または請求項１１９～１２１のいずれか一項に記載の組成物を含む医薬組成物。

【請求項123】

前記希釈剤が、水性である、請求項１２２に記載の医薬組成物。

【請求項124】

前記希釈剤が、水である、請求項１２３に記載の医薬組成物。

【請求項125】

請求項１２２に記載の医薬組成物、および対象への投与のための送達システムを含むキット。

【請求項126】

対象における免疫応答を生じさせるための方法であって、治療有効量の請求項１２３に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項127】

対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の請求項１２０に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項128】

対象における１つまたは複数の核酸の送達をイメージングおよび／または追跡する方法であって、治療有効量の請求項１２２に記載の医薬組成物を前記対象に投与するステップを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０２１年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６３／２４７，１７２号、および２０２２年１月７日に出願された米国仮特許出願第６３／２９７，４４９号に対する優先権の利益を主張し、それらのそれぞれの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２２年１月１８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９５３－７１２６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３，３９６バイトのサイズである。

【背景技術】

【0002】

背景
ワクチンを含む各種の治療用および予防用製品が、疾患のために利用可能である。そのような製品に対する産業界における課題は、安定性である。そのような製品の多くは、安定性を維持するために、低温で維持されなければならず、高価な冷却ユニットまたは液体窒素を必要とする。そのため、治療用および予防用製品が最小限の冷却の必要性でまたは室温で安定である、溶液の製造、組成物、およびそれらの使用に対する必要性が存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

簡潔な概要
乾燥組成物である組成物が本明細書に提供される。脂質キャリアであって、脂質キャリアが、疎水性コア、１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、脂質キャリア；１つまたは複数の核酸；ならびに少なくとも１つの凍結保護物質を含む、組成物が本明細書に提供される。

【0004】

好適な希釈剤中で再構成された乾燥組成物および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物が本明細書にさらに提供される。

【0005】

本明細書に提供される乾燥組成物を含む医薬組成物；および対象への投与のための送達システムを含む、キットが本明細書にさらに提供される。

【0006】

医薬組成物および必要に応じて１つまたは複数のワクチンアジュバントを含む、ワクチン送達システムが本明細書にさらに提供される。

【0007】

対象における免疫応答を生じさせるための方法であって、治療有効量の本明細書に提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0008】

対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0009】

対象における１つまたは複数の核酸の送達をイメージングおよび／または追跡する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0010】

凍結乾燥組成物を調製するための方法であって、（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；（ｂ）１つまたは複数の核酸を脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；ならびに（ｄ）製剤を凍結乾燥して、凍結乾燥組成物を形成するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0011】

噴霧乾燥組成物を調製するための方法であって、（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；（ｂ）１つまたは複数の核酸を脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；ならびに（ｄ）製剤を噴霧乾燥して、噴霧乾燥組成物を形成するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0012】

凍結乾燥組成物を再構成するための方法であって、（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；（ｂ）１つまたは複数の核酸を前記脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；製剤を凍結乾燥して、凍結乾燥組成物を形成するステップ；ならびに（ｄ）好適な希釈剤中で凍結乾燥組成物を再構成するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0013】

噴霧乾燥組成物を再構成するための方法であって、（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；（ｂ）１つまたは複数の核酸を前記脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；（ｄ）製剤を噴霧乾燥して、噴霧乾燥組成物を形成するステップ；ならびに（ｅ）好適な希釈剤中で噴霧乾燥組成物を再構成するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0014】

ソルビタン脂肪酸エステル、エトキシ化ソルビタンエステル、カチオン性脂質、免疫刺激物質、およびＲＮＡを含む乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。

【0015】

ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ＤＯＴＡＰ、免疫刺激物質、およびＲＮＡを含む乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。

【0016】

（ａ）脂質キャリアであって、脂質キャリアが、疎水性コア、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、脂質キャリア；（ｂ）必要に応じて１つまたは複数の核酸；ならびに（ｃ）（ｉ）乾燥組成物の少なくとも約５０重量％、または（ｉｉ）少なくとも約５０ｍｇの量で存在する少なくとも１つの糖を含む乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。

【0017】

好適な希釈剤中で再構成された本明細書に提供される乾燥組成物；および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物が本明細書にさらに提供される。

【0018】

本明細書に提供される医薬組成物および対象への投与のための送達システムを含む、キットが本明細書にさらに提供される。

【0019】

対象における免疫応答を生じさせるための方法であって、治療有効量の本明細書に提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0020】

対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の本明細書に提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0021】

対象における１つまたは複数の核酸の送達をイメージングおよび／または追跡する方法であって、治療有効量の本明細書に記載される医薬組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1】図１Ａ～１Ｃは、ナノ粒子（ＮＰ）キャリアの概略図を示す。図１Ａは、水中油型エマルジョンを示す。図１Ｂは、ナノ構造脂質キャリア（ＮＬＣ）を示す。図１Ｃは、液状油中に無機ナノ粒子を有するナノ粒子を示す。

【0023】

【図2】図２は、凍結乾燥サイクル＃１後の時間＝０時間での示された糖組成におけるナノ構造脂質キャリア（ＮＬＣ）および脂質キャリア製剤についてのケーキの外観を図示する。

【0024】

【図3】図３は、凍結乾燥サイクル＃１後の摂氏２５度および摂氏４２度で２４時間後の示された糖組成におけるナノ構造脂質キャリア（ＮＬＣ）および脂質キャリア製剤についてのケーキの外観を図示する。

【0025】

【図4】図４は、凍結乾燥サイクル＃１後の摂氏２５度および摂氏４２度で２４時間での示された糖組成におけるナノ構造脂質キャリア（ＮＬＣ）および脂質キャリア製剤の外観を図示する。

【0026】

【図5A】図５Ａ～５Ｂは、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成における摂氏２５度および摂氏４２度で貯蔵後１日後の再構成ケーキの粒子径を図示する。図５Ａは、示された糖組成における時間＝０時間での液体製剤と比べた倍数変化を示す。図５Ｂは、示された糖組成におけるＰＤＩの時間＝０時間での液体製剤と比べた点変化を示す。

【図5B】同上。

【0027】

【図6】図６Ａ～６Ｂは、脂質キャリア＋ＲＮＡおよびＮＬＣ＋ＲＮＡ製剤について、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるアガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ完全性を図示する。図６Ａは、脂質キャリア＋ＲＮＡ製剤について、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるアガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ完全性を示す。図６Ｂは、脂質キャリア＋ＲＮＡおよびＮＬＣ＋ＲＮＡ製剤について、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるアガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ完全性を示す。

【0028】

【図7-1】図７Ａ～７Ｇは、脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡおよびＮＬＣ＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰ製剤について、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるＢＨＫ２１細胞のＳＥＡＰ発現を図示する。図７Ａは、１０％のトレハロースにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｂは、５％のマンニトールにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｃは、１０％のスクロースにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｄは、２０％のスクロースにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｅは、５％のグルコースにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｆは、１０％のマルトースにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｇは、１０％のスクロースにおけるＮＬＣ＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。

【図7-2】同上。

【図7-3】同上。

【図7-4】同上。

【0029】

【図8】図８は、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるさまざまな時点（時間＝０時間、摂氏２５度で６日後および摂氏２５度で１か月後）での脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰケーキの外観を図示する。

【0030】

【図9】図９は、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるさまざまな時点（時間＝０時間、摂氏４２度で２４時間後、摂氏４２度で３日後および摂氏４２度で１か月後）での脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰケーキの外観を図示する。

【0031】

【図10】図１０Ａ～１０Ｂは、凍結乾燥サイクル＃３後の示された糖組成における貯蔵１日後の再構成ケーキの粒子径を図示する。図１０Ａは、示された糖組成における再構成製剤のＰＤＩの点変化を示す。図１０Ｂは、脂質キャリア＋ＲＮＡの新鮮な複合体と比べた粒子径のｌｏｇ_１０倍数変化を示す。

【0032】

【図11】図１１は、凍結乾燥サイクル＃３後の示された糖組成におけるアガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ完全性を図示する。

【0033】

【図12】図１２は、凍結乾燥サイクル＃３後の示された糖組成におけるＢＨＫ２１細胞のＳＥＡＰ発現を図示する。

【0034】

【図13A】図１３Ａ～１３Ｂは、ｍｉｇｌｙｏｌ－脂質キャリア製剤が、マクロファージにおいて増強されたｒｅｐＲＮＡタンパク質産生を誘導することを示す。図１３Ａは、第１の実験におけるＮａｎｏ ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅコードレプリコンＲＮＡを有するさまざまな製剤の吸収スペクトルを示す。図１３Ｂは、第２の実験におけるＮａｎｏ ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅコードレプリコンＲＮＡを有するさまざまな製剤の吸収スペクトルを示す。

【図13B】同上。

【0035】

【図14A】図１４Ａ～１４Ｂは、ｍｉｇｌｙｏｌ製剤によるマクロファージのＴＮＦ－アルファ（α）産生の低減を示す。図１４Ａは、第１の実験におけるさまざまな製剤についてのＴＮＦ－アルファの産生を示す。図１４Ｂは、第２の実験におけるさまざまな製剤についてのＴＮＦ－アルファの産生を示す。

【図14B】同上。

【0036】

【図15】図１５Ａ～１５Ｂは、ｍｉｇｌｙｏｌ製剤によるマクロファージのタンパク質産生の増強と低ＴＮＦ－アルファ産生との間の相関を示す。図１５Ａは、第１の実験におけるさまざまな製剤についてのｓｅｃ－ＮａｎｏＬｕｃとＴＮＦ－アルファとの間の相関を示す。図１５Ｂは、第２の実験におけるさまざまな製剤についてのｓｅｃ－ＮａｎｏＬｕｃとＴＮＦ－アルファとの間の相関を示す。

【0037】

【図16-1】図１６Ａ～１６Ｆは、種々の反復の脂質キャリア－製剤化ＤＮＡ ＳＥＡＰが筋肉内注射されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳＥＡＰレベルを図示する。図１６Ａは、４日目の相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図１６Ｂは、６日目の相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図１６Ｃは、８日目の相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図１６Ｄは、４日目の相対発光単位（ＲＬＵ）のコピーである。図１６Ｅは、６日目の相対発光単位（ＲＬＵ）のコピーである。図１６Ｆは、８日目の相対発光単位（ＲＬＵ）のコピーである。

【図16-2】同上。

【図16-3】同上。

【0038】

【図17】図１７は、条件１～１４についての、Ｙ軸にＺ平均測定および多分散指数（ＰＤＩ）の測定値、ならびにＸ軸に群番号を有する棒グラフである。

【0039】

【図18】図１８Ａ～１８Ｂは、条件１～１４についての抗Ｄ６１４ＧのＩｇＧレベルを示すドットチャートを示す。図１８Ａは、条件１～１４についての、Ｙ軸にＩｇＧ（μｇ／ｍｌ）、およびＸ軸に群番号を有するドットチャートを示す。測定値を、抗Ｄ６１４Ｇ（１：４０希釈）のＩｇＧ応答について、１４日目に記録した。図１８Ｂは、条件１～１４についての、Ｙ軸にＩｇＧ（μｇ／ｍｌ）、およびＸ軸に群番号を有するドットチャートを示す。測定値を、抗Ｄ６１４Ｇ（１：２００希釈）のＩｇＧ応答について、２８日目に記録した。

【0040】

【図19】図１９は、Ｙ軸に抗Ｄ６１４Ｇ（１：２００希釈）のＩｇＧ（μｇ／ｍｌ）測定値、およびＸ軸に貯蔵条件の指示を有する、２８日目のドットチャートを示す。

【発明を実施するための形態】

【0041】

詳細な説明
ここに、さまざまな態様を、本明細書の以下でより完全に記載する。そのような態様は、しかしながら、多くの異なる形態で具現化され得、本明細書に示される実施形態に限定されるとして解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的および完全なものであり、その範囲を当業者に完全に伝えるように、提供される。

【0042】

増強された安全性プロファイルを有する治療的に関連する組成物の作製のための方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、組成物は、必要に応じて核酸と複合体化された、脂質ナノ粒子キャリアを含む。さらなる実施形態では、組成物は、凍結乾燥されている。
定義

【0043】

すべての定義は、本明細書で定義および使用される場合、辞書による定義、参照により組み込まれた文献における定義、および／または定義された用語の通常の意味を制御するものと理解されるべきである。

【0044】

本明細書に開示されるすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用される主題に関して参照によって組み込まれ、一部の事例では、文献の全体を包含することがある。特許文献および非特許文献を含む本明細書に開示されるすべての参考文献は、それぞれが個々に組み込まれたかのように、それらの全体が、これにより参照により本明細書に組み込まれる。しかしながら、明白な定義を含有する特許、特許出願、または刊行物が参照により組み込まれる場合、これらの明白な定義は、それらが見出される組み込まれた特許、特許出願、または刊行物に適用され、本出願の本文、特に、本出願の特許請求の範囲に必ずしも適用されず、その場合には、本明細書に提供される定義が優先されることを意味するものとすると理解されるべきである。

【0045】

不定冠詞の「ａ」および「ａｎ」は、明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、対照的に明確に指示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

【0046】

「および／または」という語句は、明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、そのように結合された要素、すなわち、一部の事例において結合的に存在し、他の事例において分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」を用いて列挙された複数の要素は、同じ方式で、すなわち、そのように結合された要素の「１つまたは複数」と解釈されるべきである。他の要素は、具体的に特定された要素に関連するまたは関連しないかどうかにかかわらず、「および／または」節によって具体的に特定される要素以外に、必要に応じて存在していてもよい。そのため、非限定的な例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンドの語と組み合わせて使用される場合、一実施形態では、Ａのみ（必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみ（必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡおよびＢの両方（必要に応じて、他の要素を含む）などを指すことができる。

【0047】

明細書および特許請求の範囲において本明細書で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、必要に応じて、追加の列挙されていない項目を含むとして解釈されるべきである。「の１つのみ」もしくは「の正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合に「からなる」などの、明確に逆のことが示されている用語のみが、要素の数またはリストの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、「または」という用語は、本明細書で使用される場合、「いずれか」、「の１つ」、「のただ１つ」、または「の正確に１つ」などの排他的な用語が先行する場合に、排他的代替（すなわち、「どちらか一方であるが、両方ではない」）を示すとして単に解釈されるものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。

【0048】

本開示の組成物は、開示される構成要素を含み得るか、それから本質的になり得るか、またはそれからなり得る。

【0049】

本明細書で使用される場合、「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載される状況が生じてもよく、または生じなくてもよいことを意味し、その結果、その記載は、状況が生じる例および状況が生じない例を含む。

【0050】

本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、所与の値の最大で±２０％の範囲を意味する。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載される場合、他に述べられない限り、「約」という用語は、黙示的であり、この文脈では、特定の値についての許容される誤差範囲内を意味する。

【0051】

本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐの比（またはＮ：Ｐ）」という用語は、正に荷電したポリマーアミン（Ｎ＝窒素）基の負に帯電した核酸ホスフェート（Ｐ）基に対する比を指す。ポリマー／核酸複合体のＮ／Ｐの特徴は、その正味の表面電荷、サイズ、および安定性などの多くの他の性質に影響を及ぼし得る。

【0052】

本明細書で使用される場合、「改変ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））中のまたはその上の１つまたは複数の化学改変（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。

【0053】

値の範囲が本明細書に提供される場合、文脈が明確に他を指示しない限り、その範囲の上限および下限と、その述べられた範囲内の任意の他の述べられた値または介在する値との間のそれぞれの介在する値が、下限の単位の１０分の１まで、本開示内に包含されることが理解される。述べられた範囲内の任意の具体的に除外される限定に従って、より小さい範囲に独立して含まれ得るこれらのより小さい範囲の上限および下限も、本開示内に包含される。述べられた範囲が、限定の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限定のいずれかまたは両方を除外する範囲も本開示に含まれる。例えば、本明細書に提供される任意の濃度の範囲、パーセンテージの範囲、比の範囲、または整数の範囲は、他に指示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むことが理解されるべきである。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さなどの任意の物理的特色に関連する本明細書に列挙される任意の数の範囲は、他に指示されない限り、列挙された範囲内の任意の整数を含むことが理解されるべきである。
ナノ粒子キャリアシステム

【0054】

１つのナノ粒子および多数のナノ粒子を含むさまざまな組成物が本明細書に提供される。ナノ粒子はまた、本明細書においてキャリアと称されるか、またはＮＰと略される。本明細書に提供されるナノ粒子は、約１マイクロメートル（μｍ）未満の直径である、有機材料、無機材料、または無機材料および有機材料の組合せであり得る。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、本明細書に提供される生物活性剤のための送達システムとして使用される。

【0055】

一部の実施形態では、脂質キャリアであって、脂質キャリアが、疎水性コア、１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、脂質キャリア；１つまたは複数の核酸；ならびに少なくとも１つの凍結保護物質を含む乾燥組成物が提供される。組成物は、当技術分野において公知の技法を使用して、噴霧乾燥または凍結乾燥することができる。組成物は、熱的に安定である。例えば、組成物は、摂氏約２５度、摂氏約４５度、摂氏約－２０度、および摂氏約２度～摂氏約８度で熱的に安定である。組成物は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、および／または少なくとも１か月間、熱的に安定である。

【0056】

本明細書に記載される組成物を凍結乾燥するための方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、昇華、または一次乾燥は、この点で行われて、未結合水が除去され；次いで、二次乾燥が行われて、結合水が昇華し、材料は、所望の残留水分レベルに低下する。この段階での水が、未結合ではなく標的に結合していることを考慮すると、典型的には、より多くのエネルギーが、このプロセスを駆動するために必要である。噴霧乾燥が使用されてもよく、これは、多くの場合に、より速いプロセスであり、単一ステップで液体製剤の乾燥粉末への変換を含む。溶液は、微細液滴に霧化され、これは、暖かいガスを使用して、大きなチャンバー中で、迅速に、間を置かずに乾燥される。次いで、得られた乾燥粒子は、サイクロンで収集され得る。追加の乾燥技法としては、例えば、噴霧凍結乾燥および超臨界流体乾燥が挙げられる。

【0057】

本開示は、ＲＮＡなどの１つまたは複数の核酸のキャリアとしての脂質キャリアの使用を提供する。特に、緩衝液中の荷電したコーティングを有する脂質マトリックス中の固体無機コアが開示される。これらのナノ粒子の使用は、多数の利点を有する：ＲＮＡは、粒子と無関係に複合体化され得、粒子は、磁気シグナルを有するように設計され得る、例えば、ＭＲＩまたは他のイメージング技法のために使用可能であり得る。ＲＮＡは、粒子によって保護され、それらは、細胞または生体に与えられた場合に、の抗原オフを含む多数の種類のタンパク質の、保護されたＲＮＡからの発現を駆動する。

【0058】

さまざまなナノ粒子およびナノ粒子の製剤（すなわち、ナノエマルジョン）が用いられる。例示的なナノ粒子を図１Ａ～１Ｃに図示する。本明細書に提供されるナノ粒子としては、限定されるものではないが、水中油型エマルジョン、ナノ構造脂質キャリア（ＮＬＣ）、カチオン性ナノエマルジョン（ＣＮＥ）、小胞状リン脂質ゲル（ＶＰＧ）、ポリマーナノ粒子、カチオン性脂質ナノ粒子、リポソーム、金ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子（ＬＮＰまたはＳＬＮ）、混合相コアＮＬＣ、イオン化脂質キャリア、磁気キャリア、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能化キャリア、コレステロール官能化キャリア、ポリ乳酸（ＰＬＡ）官能化キャリア、およびポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）官能化脂質キャリアが挙げられ得る。

【0059】

図１Ａに図示される水中油型エマルジョン（縮尺通りではない）は、水または水相に分散した油滴を含有する安定な不混和流体である。図１Ｂ（縮尺通りではない）は、固体有機脂質（例えば、トリミリスチン）および液状油（例えば、スクアレン）のブレンドを含み得るナノ構造脂質キャリア（ＮＬＣ）を図示する。ＮＬＣ中で、固体脂質は、液状油に分散される。ナノ液滴全体が、水性（水）相に分散される。一部の実施形態では、ナノ粒子は、図１Ｃ（縮尺通りではない）に図示されるように、液状油に分散した固体無機ナノ粒子（例えば、酸化鉄ナノ粒子）として、無機ナノ粒子を含む。次いで、ナノ液滴全体が、水性（水）相中のコロイドとして分散される。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、水溶液に分散される。水溶液の非限定的な例としては、水（例えば、滅菌、蒸留、脱イオン化、超純粋、ＲＮＡｓｅを含まないなど）、生理食塩水（例えば、クレブス、Ａｓｃａｒｉｓ、デンツ、テト食塩水）、または１％（ｗ／ｖ）の水中のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。

【0060】

脂質キャリアを含むさまざまな組成物および方法が本明細書に提供される。脂質キャリアは、疎水性コア、１つまたは複数の無機ナノ粒子および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである。脂質キャリアの疎水性コアは、油を含む。一部の実施形態では、油は、液相中にある。

【0061】

一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、親水性表面を含む。一部の実施形態では、親水性表面は、カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、親水性表面は、イオン化脂質を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子は、膜を含む。一部の実施形態では、膜は、カチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、カチオン性脂質を含む。親水性表面への包含のための例示的なカチオン性脂質としては、限定されないが、１，２－ジオレオイルオキシ－３（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）；１，２－ジミリストイル３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウム、クロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）、および１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシ－ドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、３０６Ｏｉ１０、テトラキス（８－メチルノニル）３，３’，３’’，３’’’－（（（メチルアザンジイル）ビス（プロパン－３，１－ジイル））ビス（アザントリイル））テトラプロピオネート、９Ａ１Ｐ９、デシル（２－（ジオクチルアンモニオ）エチル）ホスフェート；Ａ２－Ｉｓｏ５－２ＤＣ１８、エチル５，５－ジ（（Ｚ）－ヘプタデカ－８－エン－１－イル）－１－（３－（ピロリジン－１－イル）プロピル）－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－イミダゾール－２－カルボキシレート；ＡＬＣ－０３１５、（（４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）；ＡＬＣ－０１５９、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド；β－シトステロール、（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１７－（（２Ｒ，５Ｒ）－５－エチル－６－メチルヘプタン－２－イル）－１０，１３－ジメチル－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－オール；ＢＡＭＥ－Ｏ１６Ｂ、ビス（２－（ドデシルジスルファニル）エチル）３，３’－（（３－メチル－９－オキソ－１０－オキサ－１３，１４－ジチア－３，６－ジアザヘキサコシル）アザンジイル）ジプロピオネート；ＢＨＥＭ－コレステロール、２－（（（（（３Ｓ，８Ｓ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）カルボニル）アミノ）－Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－Ｎ－メチルエタン－１－アミニウムブロミド；ｃＫＫ－Ｅ１２、３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン；ＤＣ－コレステロール、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール；ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート；ＤＯＰＥ、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン；ＤＯＳＰＡ、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート；ＤＳＰＣ、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン；ｅＰＣ、エチルホスファチジルコリン；ＦＴＴ５、ヘキサ（オクタン－３－イル）９，９’，９’’，９’’’，９’’’’，９’’’’’－（（（（ベンゼン－１，３，５－トリカルボニル）イリス（アザンジイル））トリス（プロパン－３，１－ジイル））トリス（アザントリイル））ヘキサノナノエート；リピドＨ（ＳＭ－１０２）、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート；ＯＦ－Ｄｅｇ－Ｌｉｎ、（（（３，６－ジオキソピペラジン－２，５－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザントリイル））テトラキス（エタン－２，１－ジイル）（９Ｚ，９’Ｚ，９’’Ｚ，９’’’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ，１２’’Ｚ，１２’’’Ｚ）－テトラキス（オクタデカ－９，１２－ジエノエート）；ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ、（Ｒ）－２，３－ビス（ミリストイルオキシ）プロピル－１－（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバメート；ＴＴ３、またはＮ１，Ｎ３，Ｎ５－トリス（３－（ジドデシルアミノ）プロピル）ベンゼン－１，３，５－トリカルボキサミドが挙げられる。脂質の好適なクラスについての他の例としては、限定されるものではないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）；および上記の脂質のいずれかのＰＥＧ化バージョンを含むＰＥＧ化脂質（例えば、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、ＤＯＴＡＰを含む。

【0062】

一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、油を含む。一部の実施形態では、油は、液相中にある。使用され得る油の非限定的な例としては、α－トコフェロール、ココナツ油、ブドウ種子油、ラウロイルポリオキシルグリセリド、鉱物油、モノアシルグリセロール、パーム核油、オリーブ油、パラフィン油、ピーナッツ油、プロポリス、スクアレン、スクアラン、ソラネソール、大豆レシチン、大豆油、ヒマワリ油、トリグリセリド、またはビタミンＥが挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、トリグリセリドを含む。例示的なトリグリセリドとしては、限定されるものではないが、カプリン酸トリグリセリド、カプリル酸トリグリセリド、カプリル酸およびカプリン酸トリグリセリド、トリグリセリドエステル、およびミリスチン酸トリグリセリンが挙げられる。

【0063】

一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、液体有機材料および固体無機材料を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、無機粒子を含む。一部の実施形態では、無機粒子は、固体無機粒子である。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、疎水性コア内の無機粒子を含む。一部の実施形態では、油は、固相中にある。一部の実施形態では、油は、ソラネソールを含む。

【0064】

一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、金属を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、疎水性コア内の金属を含む。金属は、限定されないが、金属塩、金属酸化物、金属水酸化物、または金属リン酸塩であり得る。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、オキシ水酸化アルミニウム、酸化鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４、Ｆｅ_２Ｏ_３、ＦｅＯ、またはそれらの組合せ）、二酸化チタン、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、ヒドロキシリン酸アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_ｘ（ＰＯ_４）_ｙ）、リン酸カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、カルシウムヒドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）、グルコン酸鉄、または硫酸鉄を含む。無機粒子は、１つまたは複数の同じまたは異なる金属（遷移金属を含む任意の金属）から形成されてもよい。一部の実施形態では、無機粒子は、遷移金属酸化物である。一部の実施形態では、遷移金属は、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、マグヘマイト（ｙ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、ウスタイト（ＦｅＯ）、またはヘマタイト（アルファ（α）－Ｆｅ_２Ｏ_３）である。一部の実施形態では、金属は、水酸化アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムであり、ホスフェート末端脂質または界面活性剤、例えば、オレイン酸、オレイルアミン、ＳＤＳ、ＴＯＰＯまたはＤＳＰＡは、液状油と混合されて、疎水性コアが形成される前に、無機固体ナノ粒子をコーティングするために使用される。

【0065】

一部の実施形態では、金属は、常磁性、超常磁性、フェリ磁性または強磁性化合物を含むことができる。一部の実施形態では、金属は、超常磁性酸化鉄（Ｆｅ_３Ｏ_４）である。

【0066】

一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、カチオン性脂質、油、および無機粒子を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、ＤＯＴＡＰ；スクアレンおよび／またはグリセリルトリミリステート－ｄｙｎａｓａｎ；および酸化鉄を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、界面活性剤をさらに含む。そのため、一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、カチオン性脂質、油、無機粒子、および界面活性剤を含む。

【0067】

界面活性剤は、本明細書に提供されるナノ粒子の、２つの液体間、または液体および固体構成要素間の表面張力を低下させる化合物である。界面活性剤は、疎水性、親水性、または両親媒性であり得る。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、疎水性界面活性剤を含む。用いられ得る例示的な疎水性界面活性剤としては、限定されるものではないが、ソルビタンモノラウレート（ＳＰＡＮ（登録商標）２０）、ソルビタンモノパルミテート（ＳＰＡＮ（登録商標）４０）、ソルビタンモノステアレート（ＳＰＡＮ（登録商標）６０）、ソルビタントリステアレート（ＳＰＡＮ（登録商標）６５）、ソルビタンモノオレエート（ＳＰＡＮ（登録商標）８０）、およびソルビタントリオレエート（ＳＰＡＮ（登録商標）８５）が挙げられる。好適な疎水性界面活性剤は、１０もしくはそれ未満、例えば、５もしくはそれ未満、１～５、または４～５の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）値を有するものを含む。例えば、疎水性界面活性剤は、１～５、または４～５のＨＬＢ値を有するソルビタンエステルであり得る。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、乳化剤とも呼ばれる親水性界面活性剤を含む。

【0068】

一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、ポリソルベートを含む。ポリソルベートは、脂肪酸でエステル化されたエトキシ化ソルビタン（ソルビトールの誘導体）に由来する油性液体である。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子または脂質キャリアは、親水性界面活性剤を含む。用いられ得る例示的な親水性界面活性剤としては、限定されるものではないが、ポリソルベート、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ、Ｓｃａｔｔｉｃｓ、Ａｌｋｅｓｔ、またはＣａｎａｒｃｅｌ；ポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリソルベート）；ポリソルベート８０（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）；ポリソルベート６０（ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）６０）；ポリソルベート４０（ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）４０）；およびポリソルベート２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）２０）が挙げられる。一実施形態では、親水性界面活性剤は、ポリソルベート８０である。

【0069】

本明細書に提供されるナノ粒子は、脂質膜（例えば、ＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質）によって囲まれた疎水性コアを含む。一部の実施形態では、疎水性コアは、１つまたは複数の無機粒子；ホスフェート末端脂質；および界面活性剤を含む。

【0070】

本明細書に記載される無機固体ナノ粒子は、液状油と混合する前に、表面改変されていてもよい。例えば、無機固体ナノ粒子の表面が親水性である場合、無機固体ナノ粒子を、疎水性分子（または界面活性剤）でコーティングして、ナノエマルジョン粒子の「油」相中の液状油との無機固体ナノ粒子の混和性を促進し得る。一部の実施形態では、無機粒子は、キャッピングリガンド、ホスフェート末端脂質、および／または界面活性剤でコーティングされる。一部の実施形態では、疎水性コアは、ホスフェート末端脂質を含む。用いられ得る例示的なホスフェート末端脂質としては、限定されるものではないが、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）またはジステアリルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）が挙げられる。一部の実施形態では、疎水性コアは、リン末端界面活性剤、カルボキシレート末端界面活性剤、サルフェート末端界面活性剤、またはアミン末端界面活性剤である界面活性剤を含む。典型的なカルボキシレート末端界面活性剤としては、オレイン酸が挙げられる。典型的なアミン末端界面活性剤としては、オレイルアミンが挙げられる。一部の実施形態では、界面活性剤は、ジステアリルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、オレイン酸、オレイルアミンまたはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。一部の実施形態では、無機固体ナノ粒子は、金属酸化物、例えば、酸化鉄であり、液状油と混合して、疎水性コアが形成される前に、界面活性剤、例えばオレイン酸、オレイルアミン、ＳＤＳ、ＤＳＰＡ、またはＴＯＰＯを使用して、無機固体ナノ粒子がコーティングされる。

【0071】

一部の実施形態では、疎水性コアは、必要に応じてホスフェート末端脂質、リン末端界面活性剤、カルボキシレート末端界面活性剤、サルフェート末端界面活性剤、またはアミン末端界面活性剤でコーティングされた、少なくとも１つの金属水酸化物またはオキシ水酸化物粒子を含有する１つまたは複数の無機粒子；ならびに天然に存在するまたは合成のスクアレンを含有する液状油；ＤＯＴＡＰを含むカチオン性脂質；ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、およびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含む疎水性界面活性剤；ならびにポリソルベートを含む親水性界面活性剤を含む。

【0072】

一部の実施形態では、疎水性コアは、必要に応じてＴＯＰＯでコーティングされた、水酸化アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムナノ粒子を含有する１つまたは複数の無機ナノ粒子、ならびに天然に存在するまたは合成のスクアレンを含有する液状油；カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ；ソルビタンモノステアレートを含む疎水性界面活性剤；およびポリソルベート８０を含む親水性界面活性剤を含む。

【0073】

一部の実施形態では、疎水性コアは、必要に応じてホスフェート末端脂質、リン末端界面活性剤、カルボキシレート末端界面活性剤、サルフェート末端界面活性剤、またはアミン末端界面活性剤でコーティングされた、少なくとも１つの金属水酸化物またはオキシ水酸化物粒子を含有する１つまたは複数の無機粒子；ならびに天然に存在するまたは合成のスクアレンを含有する液状油；ＤＯＴＡＰを含むカチオン性脂質；ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、およびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含む疎水性界面活性剤；ならびにポリソルベートを含む親水性界面活性剤からなる。一部の実施形態では、疎水性コアは、必要に応じてＴＯＰＯでコーティングされた、水酸化アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムナノ粒子を含有する１つまたは複数の無機ナノ粒子、ならびに天然に存在するまたは合成のスクアレンを含有する液状油；カチオン性脂質ＤＯＴＡＰ；ソルビタンモノステアレートを含む疎水性界面活性剤；およびポリソルベート８０を含む親水性界面活性剤からなる。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、約０．２％～約４０％ｗ／ｖのスクアレン、約０．００１％～約１０％ｗ／ｖの酸化鉄ナノ粒子、約０．２％～約１０％ｗ／ｖのＤＯＴＡＰ、約０．２５％～約５％ｗ／ｖのソルビタンモノステアレート、および約０．５％～約１０％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、約２％～約６％ｗ／ｖのスクアレン、約０．０１％～約１％ｗ／ｖの酸化鉄ナノ粒子、約０．２％～約１％ｗ／ｖのＤＯＴＡＰ、約０．２５％～約１％ｗ／ｖのソルビタンモノステアレート、および約０．５％～約５％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、約０．２％～約４０％ｗ／ｖのスクアレン、約０．００１％～約１０％ｗ／ｖの水酸化アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムナノ粒子、約０．２％～約１０％ｗ／ｖのＤＯＴＡＰ、約０．２５％～約５％ｗ／ｖのソルビタンモノステアレート、および約０．５％～約１０％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、約２％～約６％ｗ／ｖのスクアレン、約０．０１％～約１％ｗ／ｖの水酸化アルミニウムまたはオキシ水酸化アルミニウムナノ粒子、約０．２％～約１％ｗ／ｖのＤＯＴＡＰ、約０．２５％～約１％ｗ／ｖのソルビタンモノステアレート、および約０．５％～約５％ｗ／ｖのポリソルベート８０を含み得る。

【0074】

一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、表１に記載される少なくとも１つのナノ粒子製剤を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、ＮＰ－１～ＮＰ－３０のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、ＮＰ－１～ＮＰ－３１のいずれか１つを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、本明細書に提供される核酸と混合される。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、ホモジナイゼーションおよび超音波処理技法によって作製される。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【0075】

一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、ソルビタンモノステアレート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）６０）、ポリソルベート８０（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、ＤＯＴＡＰ、スクアレンを含み、固体粒子を含まない。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、ソルビタンモノステアレート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）６０）、ポリソルベート８０（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、ＤＯＴＡＰ、スクアレン、および酸化鉄粒子を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、免疫刺激物質を含む。一部の実施形態では、免疫刺激物質は、スクアレンである。一部の実施形態では、免疫刺激物質は、中鎖トリグリセリドである。一部の実施形態では、免疫刺激物質は、Ｍｉｇｌｙｏｌ ８１０またはＭｉｇｌｙｏｌ ８１２である。Ｍｉｇｌｙｏｌ ８１０は、飽和カプリルおよびカプリン脂肪酸とグリセロールのトリグリセリドエステルである。Ｍｉｇｌｙｏｌ ８１２は、飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステルである。一部の実施形態では、免疫刺激物質は、産生されるタンパク質の総量を減少させ得るが、本明細書に提供される組成物に対する免疫応答を増加させ得る（例えば、ワクチンとして送達される場合）。一部の実施形態では、免疫刺激物質は、産生されるタンパク質の総量を増加させ得るが、本明細書に提供される組成物に対する免疫応答を減少させ得る。

【0076】

本明細書に提供されるナノ粒子は、さまざまな平均直径のサイズのものであり得る。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、約２０ナノメートル（ｎｍ）～約２００ｎｍの範囲の平均直径（ｚ平均流体力学直径、動的光散乱によって測定される）を有する。一部の実施形態では、ナノ粒子のｚ平均直径は、約２０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、約２０ｎｍ～約８０ｎｍ、約２０ｎｍ～約６０ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ粒子のｚ平均直径は、約４０ｎｍ～約２００ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１００ｎｍ、約４０ｎｍ～約９０ｎｍ、約４０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約４０ｎｍ～約６０ｎｍの範囲である。一実施形態では、ナノ粒子のｚ平均直径は、約４０ｎｍ～約８０ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子のｚ平均直径は、約４０ｎｍ～約６０ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ粒子は、最大で１００ｎｍの直径である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、５０～７０ｎｍの直径である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、４０～８０ｎｍの直径である。一部の実施形態では、ナノ粒子の疎水性コア内の無機粒子（例えば、酸化鉄）は、約３ｎｍ～約５０ｎｍの範囲の平均直径（数加重平均直径）であり得る。例えば、無機粒子は、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、または約５０ｎｍの平均直径を有し得る。

【0077】

本明細書に提供されるナノ粒子は、多分散指数（ＰＤＩ）によって特徴付けられ得、これは、サイズ分布に関するそれらの品質の指標である。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子の平均多分散指数（ＰＤＩ）は、約０．１～約０．５の範囲である。一部の実施形態では、ナノ粒子の平均ＰＤＩは、約０．２～約０．５、約０．１～約０．４、約０．２～約０．４、約０．２～約０．３、または約０．１～約０．３の範囲であり得る。

【0078】

一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、約０．１：１～約２０：１、約０．５：１～約１２：１、約０．５：１～約９：１、約０．５：１～約５：１、約０．５：１～約３：１、または約０．５：１～約１：１の範囲の油の界面活性剤に対するモル比を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、約０．１：１～約２：１、約０．２：１～約１．５：１、約０．３：１～約１：１、約０．５：１～約１：１、または約０．６：１～約１：１の範囲の親水性界面活性剤の脂質に対する比を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、約０．１：１～約５：１、約０．２：１～約３：１、約０．３：１～約２：１、約０．５：１～約２：１、または約１：１～約２：１の範囲の疎水性界面活性剤の脂質に対する比を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、約０．２％～約４０％ｗ／ｖの液状油、約０．００１％～約１０％ｗ／ｖの無機固体ナノ粒子、約０．２％～約１０％ｗ／ｖの脂質、約０．２５％～約５％ｗ／ｖの疎水性界面活性剤、および約０．５％～約１０％ｗ／ｖの親水性界面活性剤を含む。一部の実施形態では、脂質はカチオン性脂質を含み、油はスクアレンを含み、および／または疎水性界面活性剤は、ソルビタンエステルを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供されるナノ粒子は、８～１１の親水性－親油性バランスを生じさせる、エステルの比を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸は、本明細書に提供される脂質キャリアに組み込まれるか、それと会合するか、またはそれと複合体化して、脂質キャリア－核酸複合体を形成する。一部の実施形態では、脂質キャリア－核酸複合体は、非共有結合性相互作用を介して、または可逆的な共有結合性相互作用を介して形成される。
核酸

【0079】

一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、１つまたは複数の核酸を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。自然免疫応答をモジュレートするＲＮＡ、タンパク質または抗原をコードするＲＮＡ、サイレンシングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｔＲＮＡ、自己複製性ＲＮＡなどを含む各種のＲＮＡは、送達のために脂質キャリアと会合し得る。本開示の具体的な態様では、ＲＮＡは、自己複製性ＲＮＡである。

【0080】

ナノ粒子および核酸を含む組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、核酸は、ナノ粒子を有する複合体中にある。一部の実施形態では、核酸は、ナノ粒子の膜を有する複合体中にある。一部の実施形態では、核酸は、ナノ粒子の親水性表面を有する複合体中にある。一部の実施形態では、核酸は、ナノ粒子内にある。一部の実施形態では、核酸は、疎水性コア内にある。

【0081】

一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼをコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸は、自己複製のためのエレメント、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＶＥＥＶポリメラーゼ）をコードする。

【0082】

自己複製性ヌクレオチドは、一般に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼおよび他の非構造ウイルスタンパク質からなる群から選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子を含有し、５’－および３’末端シス活性複製配列、ならびにがん関連タンパク質をコードする抗原配列も含む。異種配列の発現を方向付けるサブゲノムプロモーターは、自己複製性ヌクレオチド配列に含まれ得る。所望により、異種配列は、自己複製性ＲＮＡ中の他のコード領域に、インフレームで融合されていてもよく、および／または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の制御下であってもよい。

【0083】

さまざまな実施形態では、自己複製性ヌクレオチド配列は、自己複製性ＲＮＡ分子である。本開示の自己複製性ＲＮＡ分子は、自己複製性ＲＮＡ分子が、感染性ウイルス粒子の生成を誘導することができないように、設計され得る。これは、例えば、自己複製性ＲＮＡ中のウイルス粒子の生成のために必要である構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を除くことによって達成することができる。例えば、自己複製性ＲＮＡ分子がアルファウイルス、例えば、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、セムリキ森林熱ウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）に基づいている場合、ウイルス構造タンパク質、例えば、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を除くことができる。所望により、本開示の自己複製性ＲＮＡ分子は、弱毒化されているもしくは病原性がある感染性ウイルス粒子の生成を誘導するように、またはその後の感染の単一ラウンドが可能であるウイルス粒子を生成するように、設計することができる。

【0084】

自己複製性ＲＮＡ分子は、任意のタンパク質なしでも脊椎動物細胞に送達される場合に、それ自身からの転写によって（またはそれ自身のアンチセンスコピーから）複数の娘ＲＮＡの生成をもたらし得る。自己複製性ＲＮＡは、細胞への送達後に、直接翻訳され得、この翻訳は、次いで送達されたＲＮＡから転写物を生成するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。このようにして、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの生成をもたらす。これらの転写物は、送達されたＲＮＡに対してアンチセンスであり、それら自身が翻訳されて、コードされるがん関連タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ発現を提供してもよく、または転写されて、コードされるがん関連タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ発現を提供するように翻訳される、送達されたＲＮＡと同じセンスを有するさらなる転写物を提供してもよい。

【0085】

所望により、自己複製性ＲＮＡは、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、改変リボース、改変デオキシリボース、６員糖アナログ、または開環糖アナログ）中にもしくはその上に、またはホスフェートに化学改変を含有し得る。

【0086】

本開示の自己複製性ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含有し、したがって、改善された安定性を有し、ｉｎ ｖｉｖｏでの分解およびクリアランスに対して抵抗性であり、ならびに他の利点を有し得る。任意の特定の理論に縛られることを望まないが、改変ヌクレオチドを含有する自己複製性ＲＮＡ分子は、自己複製性ＲＮＡが細胞に送達される場合に、エンドソームおよび細胞質免疫受容体の刺激を回避または低減すると考えられる。これは、タンパク質の自己複製、増幅および発現が生じるのを可能にする。これはまた、改変ヌクレオチドを含有する自己複製性ＲＮＡが、自然免疫系の活性化およびその後の望ましくない結果（例えば、注射部位の炎症、注射部位の刺激、痛みなど）を低減するので、改変ヌクレオチドを含有しない自己複製性ＲＮＡと比べて安全性の懸念も低減する。自己複製の結果として生成したＲＮＡ分子は、細胞質免疫受容体によって外来核酸として認識されるとも考えられる。そのため、改変ヌクレオチドを含有する自己複製性ＲＮＡ分子は、宿主細胞におけるＲＮＡの効率的な増幅、およびがん関連タンパク質の発現、ならびにアジュバント効果を提供する。

【0087】

ＲＮＡ配列は、例えば、ＲＮＡの翻訳効率および半減期を増加させるために、そのコドン使用頻度に関して改変することができる。ポリＡテール（例えば、約３０またはそれよりも多くのアデノシン残基のもの）は、その半減期を増加させるために、ＲＮＡの３’末端に付着されてもよい。ＲＮＡの５’末端は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ構造（キャップ０構造）を有する改変リボヌクレオチドまたはその誘導体でキャップされていてもよく、これは、ＲＮＡ合成の間に組み込まれ得るか、ＲＮＡ転写後に酵素的に操作され得る（例えば、Ｎ７－モノメチル化キャップ０構造の構築を触媒する、ｍＲＮＡトリホスファターゼ、グアニリル－トランスフェラーゼおよびグアニン－７－メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）を使用することによって）。キャップ構造は、ＲＮＡ分子に安定性および翻訳効率を提供し得る。ＲＮＡ分子の５’キャップは、キャップ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’－Ｏ］Ｎ）の生成をもたらす２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼによってさらに改変されてもよく、これは、翻訳効率をさらに増加させ得る。キャップ１構造は、ｉｎ ｖｉｖｏ効力も増加させ得る。

【0088】

本明細書で使用される場合、「改変ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））中のまたはその上の１つまたは複数の化学改変（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。所望により、自己複製性ＲＮＡ分子は、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、改変リボース、改変デオキシリボース、６員糖アナログ、または開環糖アナログ）中にもしくはその上に、またはホスフェートに化学改変を含有し得る。

【0089】

自己複製性ＲＮＡ分子は、好ましくは、５’キャップの一部ではない少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含有し得る（例えば、５’’キャップの一部である改変に加えて）。したがって、自己複製性ＲＮＡ分子は、単一の位置に改変ヌクレオチドを含有することができ、２つもしくは複数の位置に特定の改変ヌクレオチド（例えば、シュードウリジン、Ｎ６－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン）を含有することができ、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くの改変ヌクレオチドを含有することができる（例えば、１つまたは複数の位置のそれぞれに）。好ましくは、自己複製性ＲＮＡ分子は、窒素塩基上またはその中に改変を含有するが、改変糖またはリン酸部分を含有しない、改変ヌクレオチドを含む。

【0090】

一部の例では、自己複製性ＲＮＡ分子中の０．００１％～９９％または１００％のヌクレオチドが、改変ヌクレオチドである。例えば、自己複製性ＲＮＡ分子中の０．００１％～２５％、０．０１％～２５％、０．１％～２５％、または１％～２５％のヌクレオチドが、改変ヌクレオチドである。

【0091】

他の例では、自己複製性ＲＮＡ分子中の０．００１％～９９％または１００％の特定の未改変ヌクレオチドが、改変ヌクレオチドで置き換えられる。例えば、ウリジンを含有する自己複製性ＲＮＡ分子中の約１％のヌクレオチドが、例えば、ウリジンのシュードウリジンでの置き換えによって、改変され得る。他の例では、自己複製性ＲＮＡ分子中の所望の量（パーセンテージ）の２、３、または４つの特定のヌクレオチド（ウリジン、シチジン、グアノシン、またはアデニンを含有するヌクレオチド）が、改変ヌクレオチドである。例えば、自己複製性ＲＮＡ分子中の０．００１％～２５％、０．０１％～２５％、０．１％～２５％、または１％～２５％の特定のヌクレオチドが、改変ヌクレオチドである。他の例では、自己複製性ＲＮＡ分子中の０．００１％～２０％、０．００１％～１５％、０．００１％～１０％、０．０１％～２０％、０．０１％～１５％、０．１％～２５％、０．０１％～１０％、１％～２０％、１％～１５％、１％～１０％、または約５％、約１０％、約１５％、約２０％の特定のヌクレオチドが、改変ヌクレオチドである。

【0092】

自己複製性ＲＮＡ分子中の１００％未満のヌクレオチドが、改変ヌクレオチドであることが好ましい。自己複製性ＲＮＡ分子中の１００％未満の特定のヌクレオチドが、改変ヌクレオチドであることも好ましい。したがって、好ましい自己複製性ＲＮＡ分子は、少なくともいくつかの未改変ヌクレオチドを含む。

【0093】

改変ヌクレオシドおよびヌクレオチドに組み込まれ得、ＲＮＡ分子中に存在し得る改変核酸塩基としては、ｍ５Ｃ（５－メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５－メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６－メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２－チオウリジン）、Ｕｍ（２’－Ｏ－メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１－メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２－メチルアデノシン）；Ａｍ（２－１－Ｏ－メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６－イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１－メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３－メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ－Ｏ－メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２－チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４－アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５－フォニルシチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２－Ｏ－ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（ライシジン）；ｍ１Ｇ（１－メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２－メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７－メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’－Ｏ－メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’－Ｏ－リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ウイブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシウイブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシウイブトシン）；ＯＨｙＷ^＊（未改変ヒドロキシウイブトシン）；ｉｍＧ（ウイオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（キューオシン）；ｏＱ（エポキシキューオシン）；ｇａｌＱ（ガルタクトシル－キューオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル－キューオシン）；ｐｒｅＱｏ（７－シアノ－７－デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７－アミノメチル－７－デアザグアノシン）；Ｇ^＊（アルカエオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４－チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５－メチル－２－チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏＳＵ（５－ヒドロキシウリジン）；ｍｏＳＵ（５－メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５－メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ－メトキシカルボニルメチル－２－Ｏ－メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５－アミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５－メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５－メチルアミノメチル－２－セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５－カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－Ｌ－Ｏメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’－Ｏ－メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４－メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２－Ｏ－ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５－ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３－メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５－カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ－Ｏ－ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ－２－トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７－ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ－Ｏ－ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５－メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（１，２－Ｏ－ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ－タウリノメチル－２－チオウリジン））；ｉｍＧ－１４（４－デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；ａｃ６Ａ（Ｎ６－アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８－オキソ－アデニン、その７－置換誘導体、ジヒドロウラシル、シュードウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－アミノウラシル、５－（Ｃ_１～Ｃ_６）－アルキルウラシル、５－メチルウラシル、５－（Ｃ_２～Ｃ_６）－アルケニルウラシル、５－（Ｃ_２～Ｃ_６）－アルキニルウラシル、５－（ヒドロキシメチル）ウラシル、５－クロロウラシル、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－ヒドロキシシトシン、５－（Ｃ_１～Ｃ_６）－アルキルシトシン、５－メチルシトシン、５－（Ｃ_２～Ｃ_６）－アルケニルシトシン、５－（Ｃ_２～Ｃ_６）－アルキニルシトシン、５－クロロシトシン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、Ｎ^２－ジメチルグアニン、７－デアザグアニン、８－アザグアニン、７－デアザ－７－置換グアニン、７－デアザ－７－（Ｃ２～Ｃ６）アルキニルグアニン、７－デアザ－８－置換グアニン、８－ヒドロキシグアニン、６－チオグアニン、８－オキソグアニン、２－アミノプリン、２－アミノ－６－クロロプリン、２，４－ジアミノプリン、２，６－ジアミノプリン、８－アザプリン、置換７－デアザプリン、７－デアザ－７－置換プリン、７－デアザ－８－置換プリン、水素（脱塩基残基）、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ｗ、または２’－Ｏ－メチル－Ｕが挙げられる。これらの改変核酸塩基のいずれか１つまたは任意の組合せは、本開示の自己複製性ＲＮＡに含まれていてもよい。これらの改変核酸塩基の多くおよびそれらの対応するリボヌクレオシドは、商業的供給業者から入手可能である。

【0094】

一部の実施形態では、ＲＮＡ分子、必要に応じて自己複製性ＲＮＡ分子は、ホスホロアミデート、ホスホロチオエート、および／またはメチルホスホネート連結を含む。

【0095】

少なくとも１つの改変ヌクレオチドを含む自己複製性ＲＮＡ分子は、任意の好適な方法を使用して調製することができる。改変ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を生成するために、いくつかの好適な方法が、当技術分野において公知である。例えば、改変ヌクレオチドを含有する自己複製性ＲＮＡ分子は、好適なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼなど、または改変ヌクレオチドのＲＮＡ分子への効率的な組込みを可能にするこれらのポリメラーゼの突然変異体を使用して、自己複製性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写すること（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写）によって調製することができる。転写反応は、ヌクレオチドおよび改変ヌクレオチド、ならびに選択されたポリメラーゼの活性をサポートする他の構成要素、例えば、好適な緩衝液および好適な塩を含有する。ヌクレオチドアナログの自己複製性ＲＮＡへの組み込みは、例えば、そのようなＲＮＡ分子の安定性を変更する、ＲＮａｓｅに対する抵抗性を増加させる、適切な宿主細胞への導入後に複製を確立する（ＲＮＡの「感染力」）、ならびに／または自然免疫応答および適応免疫応答を誘導もしくは低減するように、操作され得る。

【0096】

自己複製性ＲＮＡ分子中の１つまたは複数の改変ヌクレオチドの存在および／または量は、任意の好適な方法を使用して決定することができる。例えば、自己複製性ＲＮＡを、モノホスフェートに消化（例えば、ヌクレアーゼＰ１を使用する）および脱リン酸化し（例えば、ＣＩＡＰなどの好適なホスファターゼを使用する）、得られたヌクレオシドを、逆相ＨＰＬＣ（例えば、ＹＭＣ Ｐａｃｋ ＯＤＳ－ＡＱカラム（５ミクロン、４．６×２５０ｍｍ）、および３０％のＢ（０～５分）から１００％のＢ（５～１３分）および１００％のＢ（１３～４０）分のグラジエント、流速（０．７ｍｌ／分）、ＵＶ検出（波長：２６０ｎｍ）、カラム温度（３０℃）、緩衝液Ａ（２０ｍＭの酢酸－酢酸アンモニウムｐＨ３．５）、緩衝液Ｂ（２０ｍＭの酢酸－酢酸アンモニウムｐＨ３．５／メタノール［９０／１０］）を使用する溶出を使用する）によって分析することができる。

【0097】

自己複製性ＲＮＡは、送達システムと会合していてもよい。自己複製性ＲＮＡは、アジュバントありまたはなしで投与され得る。

【0098】

１つまたは複数の核酸は、脂質キャリアに組み込まれて／それと会合して／それと複合体化して、脂質キャリア－核酸複合体を形成し得る。脂質キャリア－核酸複合体は、非共有結合性相互作用を介して、または可逆的な共有結合性相互作用を介して形成される。

【0099】

一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、１つまたは複数の核酸を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、２つまたはそれよりも多くの核酸を含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、少なくとも１つのＤＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、少なくとも１つのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、少なくとも１つのＤＮＡおよび少なくとも１つのＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸は、５ｎｇ～約１ｍｇを上回る量で存在する。一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸は、最大で約２５、５０、７５、１００、１５０、１７５ｎｇの量で存在する。一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸は、最大で約１ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸は、約０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、２５μｇ、４０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸は、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．５μｇ、１μｇ、５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、２５μｇ、４０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸は、約５μｇ、約１０μｇ、約２５μｇ、約５０μｇ、または約１００μｇの量で存在する。一部の実施形態では、本明細書に提供される核酸は、最大で約５μｇ、約１０μｇ、約２５μｇ、約５０μｇ、または１００μｇの量で存在する。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも約２００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、核酸は、最大で約７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、または２０，０００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、核酸は、約７５００、１０，０００、１５，０００、または２０，０００ヌクレオチド長である。
凍結保護物質

【0100】

一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物および方法は、少なくとも１つの凍結保護物質を含む。包含のための例示的な凍結保護物質は、限定されるものではないが、スクロース、マルトース、トレハロース、マンニトール、またはグルコース、およびそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、包含のための追加のまたは代替の凍結保護物質は、ソルビトール、リビトール、エリスリトール（erthritol）、トレイトール、エチレングリコール、またはフルクトースである。一部の実施形態では、包含のための追加のまたは代替の凍結保護物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、プロピレングリコール、エチレングリコール、３－Ｏ－メチル－Ｄ－グルコピラノース（３－ＯＭＧ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、１，２－プロパンジオール、アセトアミド、トレハロース、ホルムアミド、糖、タンパク質、および炭水化物である。一部の実施形態では、凍結保護物質は、約１％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖ、好ましくは、約１０％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖ、より好ましくは、約１０％ｗ／ｖで存在する。本開示のある特定の態様では、凍結保護物質は、スクロースである。本開示の一部の態様では、凍結保護物質は、マルトースである。本開示の一部の態様では、凍結保護物質は、トレハロースである。本開示の一部の態様では、凍結保護物質は、マンニトールである。本開示の一部の態様では、凍結保護物質は、グルコースである。一部の実施形態では、凍結保護物質は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００ｍｇまたはそれよりも多くの量で存在する。一部の実施形態では、凍結保護物質は、約５０～約５００ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、凍結保護物質は、約２００～約３００ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、凍結保護物質は、約２５０ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、凍結保護物質は、凍結乾燥組成物の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５またはそれよりも多い重量パーセントの量で存在する。一部の実施形態では、凍結保護物質は、凍結乾燥組成物の約９５重量％の量で存在する。一部の実施形態では、凍結保護物質は、凍結乾燥組成物の８０～９８％、８５～９８％、９０～９８％、または９４～９６重量％の量で存在する。一部の実施形態では、凍結保護物質は、糖である。一部の実施形態では、糖は、スクロース、マルトース、トレハロース、マンニトール、またはグルコースである。一部の実施形態では、糖は、スクロースである。一部の実施形態では、スクロースは、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４５０、５００ｍｇまたはそれよりも多くの量で存在する。一部の実施形態では、スクロースは、約５０～約５００ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、スクロースは、約２００～約３００ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、スクロースは、約２５０ｍｇの量で存在する。一部の実施形態では、スクロースは、凍結乾燥組成物の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５またはそれよりも多い重量パーセントの量で存在する。一部の実施形態では、スクロースは、凍結乾燥組成物の約９５重量％の量で存在する。一部の実施形態では、スクロースは、凍結乾燥組成物の８０～９８％、８５～９８％、９０～９８％、または９４～９６重量％の量で存在する。

【0101】

一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、熱的に安定である。組成物は、組成物が、熱または低温の作用に抵抗し、所与の温度で分解から核酸分子を保護する能力などのその性質を維持する場合に、熱的に安定であると考えられる。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物およびワクチンは、摂氏約２５度または標準的な室温で熱的に安定である。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物およびワクチンは、摂氏約４５度で熱的に安定である。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物およびワクチンは、摂氏約－２０度で熱的に安定である。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物およびワクチンは、摂氏約２度～摂氏約８度で熱的に安定である。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物およびワクチンは、少なくとも摂氏約－８０度、少なくとも摂氏約－２０度、少なくとも摂氏約０度、少なくとも摂氏約２度、少なくとも摂氏約４度、少なくとも摂氏約６度、少なくとも摂氏約８度、少なくとも摂氏約１０度、少なくとも摂氏約２０度、少なくとも摂氏約２５度、少なくとも摂氏約３０度、少なくとも摂氏約３７度、最高で摂氏４５度の温度で熱的に安定である。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物およびワクチンは、少なくとも約５日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約１か月間、最大で３か月間、熱的に安定である。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物およびワクチンは、少なくとも約４℃から最高で摂氏３７度の温度で、少なくとも約５日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約１か月間、最大で３か月間、貯蔵される。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物およびワクチンは、少なくとも摂氏約２０度から最高で摂氏２５度の温度で、少なくとも約５日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約１か月間、最大で３か月間、貯蔵される。
組合せ組成物

【0102】

本明細書に記載される核酸および本明細書に記載される脂質キャリアを含む組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－３を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－４を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－５を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－６を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－７を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－８を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－９を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１０を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１１を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１２を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１３を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１４を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１５を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１６を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１７を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１８を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１８を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１９を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２０を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２１を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２２を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２３を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２４を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２５を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２６を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２７を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２８を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２８を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－２９を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－３０を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－３１を含む。一部の実施形態では、脂質キャリアは、ＮＰ－１～ＮＰ－３１のいずれかおよび凍結保護物質を含む。一部の実施形態では、凍結保護物質は、本明細書に記載される糖である。本明細書に提供される組成物は、窒素のホスフェートに対する（Ｎ：Ｐ）モル比によって特徴付けられ得る。Ｎ：Ｐの比は、窒素を含有するナノ粒子中のカチオン性脂質の量、および負に荷電したホスフェートを含有する組成物中で使用される核酸の量によって決定される。脂質キャリアの核酸に対するモル比は、核酸の送達効率を増加させる、核酸保持ナノエマルジョン組成物が抗原に対する免疫応答を誘発する能力を増加させる、核酸保持ナノエマルジョン組成物が対象において抗原に対する抗体価の生成を誘発する能力を増加させるように選択することができる。一部の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、窒素のホスフェートに対するモル比によって特徴付けられ得る脂質キャリアの核酸に対するモル比を有し、これは、約０．０１：１～約１０００：１、例えば、約０．２：１～約５００：１、約０．５：１～約１５０：１、約１：１～約１５０：１、約１：１～約１２５：１、約１：１～約１００：１、約１：１～約５０：１、約１：１～約５０：１、約５：１～約５０：１、約５：１～約２５：１、または約１０：１～約２０：１の範囲であり得る。一部の実施形態では、窒素のホスフェートに対する（Ｎ：Ｐ）モル比によって特徴付けられる脂質キャリアの核酸に対するモル比は、約１：１～約１５０：１、約５：１～約２５：１、または約１０：１～約２０：１の範囲である。一部の実施形態では、ナノエマルジョン組成物のＮ：Ｐのモル比は、約１５：１である。一部の実施形態では、ナノ粒子は、膜に共有結合的に付着した本明細書に提供される核酸を含む。

【0103】

本明細書に提供される組成物は、油の界面活性剤に対するモル比によって特徴付けられ得る。一部の実施形態では、油の界面活性剤に対する比は、スクアレン：カチオン性脂質、疎水性界面活性剤、および親水性界面活性剤のモル比である。一部の実施形態では、油の界面活性剤に対する比は、スクアレン：ＤＯＴＡＰ、疎水性界面活性剤、および親水性界面活性剤のモル比である。一部の実施形態では、油の界面活性剤に対する比は、スクアレン：ＤＯＴＡＰ、ソルビタンモノステアレート、およびポリソルベート８０のモル比である。一部の実施形態では、油の界面活性剤対するモル比は、約０．１：１～約２０：１、約０．５：１～約１２：１、約０．５：１～約９：１、約０．５：１～約５：１、約０．５：１～約３：１、または約０．５：１～約１：１の範囲である。一部の実施形態では、油の界面活性剤に対数するモル比は、少なくとも約０．１：１、少なくとも約０．２：１、少なくとも約０．３：１、少なくとも約０．４：１、少なくとも約０．５：１、少なくとも約０．６：１、少なくとも約０．７：１である。一部の実施形態では、油の界面活性剤に対するモル比は、少なくとも約０．４：１から最大で１：１である。

【0104】

本明細書に提供される組成物は、親水性界面活性剤のカチオン性脂質に対する比によって特徴付けられ得る。一部の実施形態では、親水性界面活性剤のカチオン性脂質に対する比は、約０．１：１～約２：１、約０．２：１～約１．５：１、約０．３：１～約１：１、約０．５：１～約１：１、または約０．６：１～約１：１の範囲である。本明細書に提供される組成物は、疎水性界面活性剤の脂質（例えば、カチオン性脂質）に対する比によって特徴付けられ得る。一部の実施形態では、疎水性界面活性剤の脂質に対する比は、約０．１：１～約５：１、約０．２：１～約３：１、約０．３：１～約２：１、約０．５：１～約２：１、または約１：１～約２：１の範囲である。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。

【0105】

ソルビタン脂肪酸エステル、エトキシ化ソルビタンエステル、カチオン性脂質、免疫刺激物質、およびＲＮＡを含む乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。ソルビタンモノステアレート（例えば、ＳＰＡＮ（登録商標）６０）、ポリソルベート８０（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、ＤＯＴＡＰ、免疫刺激物質、およびＲＮＡを含む乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。
医薬組成物

【0106】

一態様では、本開示は、脂質キャリア、および必要に応じて、本明細書に記載される核酸を含む医薬組成物を提供する。必要に応じて、医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含むことができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体または賦形剤」という用語は、医薬品投与に適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。

【0107】

医薬組成物は、好適な希釈剤中で再構成された乾燥組成物および薬学的に許容される担体を含む。希釈剤は、水性である。好ましい態様では、希釈剤は、水である。

【0108】

本開示は、医薬組成物および対象への投与のための送達システムを含むキットも提供する。対象は、哺乳動物であり得る。好ましい態様では、対象は、ヒトである。

【0109】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載される医薬組成物、および必要に応じて１つまたは複数のワクチンアジュバントを含む組成物を含むワクチン送達システムを提供する。

【0110】

脂質キャリアと核酸の複合体化によって、組成物は、細胞に送達され得る。細胞は、必要とする対象中のものであり得る。例えば、核酸が、タンパク質抗原であるか、タンパク質抗原をコードする場合、核酸を保持する組成物は、抗原に対する対象における免疫応答を誘発し得る。組成物は、対象において抗原に対する抗体価を誘発することによって、例えば、対象において中和抗体価を誘導することによって、貢献し得る。

【0111】

本開示は、対象における免疫応答を生じさせるための方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法にも関する。

【0112】

一実施形態では、脂質キャリアを含有する組成物は、有効量で対象に投与された場合に、核酸が脂質キャリアなしで対象に投与された場合に誘発される免疫応答と同等またはそれよりも高い抗原に対する免疫応答を誘発することができる。

【0113】

理論によって縛られないが、ナノエマルジョン組成物中の疎水性界面活性剤は、核酸を細胞に送達するナノエマルジョン組成物の能力を増加させる、または抗原に対する対象における免疫応答を誘発する核酸を保持するナノエマルジョン組成物の能力を増加させるのに寄与し得る（核酸が、タンパク質抗原であるか、またはタンパク質抗原をコードする場合）。例えば、ナノエマルジョン組成物中の疎水性界面活性剤は、核酸を保持するナノエマルジョン組成物の能力を増加させるのに寄与し得る。

【0114】

本開示の別の態様は、対象における感染症または疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法に関する。

【0115】

上記で論じられたように、無機固体ナノ粒子は、イメージング法を介して検出可能なレポーターエレメントを含有する場合に、得られたナノエマルジョン粒子を、ナノエマルジョン粒子が身体に投与された後に、イメージングおよび追跡することができる。例えば、無機固体ナノ粒子は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を介して検出可能なレポーターエレメント、例えば、常磁性、超常磁性、フェリ磁性または強磁性化合物を含有していてもよい。

【0116】

したがって、本開示の一態様は、対象における核酸送達をイメージングおよび／または追跡する方法であって、治療有効量の医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法にも関する。

【0117】

本開示は、凍結乾燥組成物および噴霧乾燥組成物を調製および再構成するための方法も提供する。

【0118】

本開示の一部の態様では、組成物および方法は、各種の疾患および開示を処置するのに有用である。

【0119】

感染症の非限定的な例としては、ウイルスおよび非ウイルス感染症が挙げられ得る。ウイルス感染症の例としては、限定されるものではないが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、インフルエンザウイルス、インフルエンザウイルスのタイプおよびサブタイプ、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、ジカウイルス、西ナイルウイルス、チクングニアウイルス、デング熱、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、およびそのバリアントが挙げられる。

【0120】

疾患の例としては、黒色腫関連抗原Ａ遺伝子、例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、およびチロシナーゼ関連タンパク質（ＴＹＲＰ）遺伝子、例えば、ＴＹＲＰ－１に関連するがんが挙げられる。

【0121】

本開示の一部の態様では、組成物および方法は、抗原をコードする１つまたは複数の核酸を含み、抗原は、細菌感染症、細菌疾患、ウイルス感染症、ウイルス疾患、原虫感染症、原虫疾患、非伝染性疾患、１つもしくは複数のがん、または自己免疫疾患に由来する。

【0122】

一部の態様では、抗原は、ウイルスに由来する。ウイルスは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、インフルエンザウイルス、インフルエンザウイルスのタイプおよびサブタイプ、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、ジカウイルス、西ナイルウイルス、チクングニアウイルス、デング熱、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、およびそのバリアントからなる群から選択される。
投与および投薬量

【0123】

ある態様では、本開示の乾燥組成物は、核酸（例えば、ＲＮＡ、必要に応じて自己複製性ＲＮＡ）を細胞または対象、例えば、限定されるものではないが、ヒト、イヌ、ネコ、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ）、ウマなどを含む哺乳動物に送達するために使用され得る。本明細書に記載される組成物における組み込みのための総核酸の例示的な量は、約１、２、２．５、５、７．５、１０、１２．５、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０マイクログラム（μｇ）またはそれよりも多くを含む。

【0124】

一部の実施形態では、本明細書に記載される製剤は、投与のために単一の容器中で調製される。一部の実施形態では、本明細書に記載される製剤は、投与のために２つの容器中で調製され、ナノ粒子キャリアから製剤を分離する。

【0125】

本明細書で使用される場合、「容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）」としては、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、バイアル、アンプル、管、カップ、ボックス、ボトル、フラスコ、ジャー、ディッシュ、単一ウェルもしくは複数ウェルの器具のウェル、リザーバー、タンクなど、または本明細書に開示される組成物が、入れられ、貯蔵され、および／もしくは輸送され得、ならびに内容物を取り出すためにアクセスされ得る他のデバイスが挙げられる。そのような容器の例としては、針および注射器を使用する内容物の抜き取りに適合するゴム栓または他のシール手段を有するものを含む、ガラスおよび／もしくはプラスチックのシールされたまたは再シール可能な管およびアンプルが挙げられる。一部の実行では、容器は、ＲＮａｓｅを含まない。

【0126】

好ましい実施形態では、乾燥組成物は、凍結乾燥されている。一部の実施形態では、乾燥組成物は、噴霧乾燥されている。

【0127】

一部の実施形態では、凍結乾燥組成物は、本明細書に記載される方法によって再構成される。他の実施形態では、噴霧乾燥組成物は、本明細書に記載される方法によって再構成される。

【0128】

一部の実施形態では、本明細書に提供される医薬組成物は、組成物を対象に投与することを可能にする形態である。一部の実施形態では、医薬組成物は、固体、半固体、液体または気体（エアロゾル）の形態である。

【0129】

核酸を細胞または対象に送達するために、任意の好適な投与経路が用いられ得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、腫瘍内、皮下、皮内、筋肉内、吸入／鼻腔内、静脈内、腹腔内、頭蓋内、もしくはくも膜下腔内経路を介した投与のためおよび／またはそれを介した投与における使用のために製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与される。一部の実施形態では、医薬組成物は、経皮的投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、筋肉内投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮内投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、経皮投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、皮下投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、鼻腔内、例えば、鼻噴霧器を介して投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、経口、例えば、ドロップを介して投与される。

【0130】

ある態様では、任意の好適な剤形が、本明細書に記載される医薬組成物の送達のために使用され得る。一部の実施形態では、医薬組成物は、注射可能な剤形、例えば、溶液または懸濁液で提供される。

【0131】

他の実施形態では、組成物は、吸入器を介して送達され得る剤形、例えば、溶液、懸濁液、または粉末で提供され、剤形は、計量式吸入器、ソフトミスト吸入器、ネブライザー、または乾燥粉末吸入器などの吸入器を介した送達のために製剤化される。

【0132】

他の実施形態では、組成物は、経鼻送達され得る剤形、例えば、溶液、懸濁液、または粉末で提供され、剤形は、アトマイザーもしくは鼻ポンプボトル、または経鼻投与される医薬組成物の送達のための他の好適なデバイスを介した経鼻送達のために製剤化される。

【0133】

ある態様では、薬学的に許容される担体、保存剤、および／または他の賦形剤が、本開示の組成物の送達のための本明細書に記載される剤形で使用され得る。

【0134】

本開示は、１つまたは複数の無機ナノ粒子を含有しない乾燥組成物も提供する。乾燥組成物は、ソルビタン脂肪酸エステル、エトキシ化ソルビタンエステル、カチオン性脂質、免疫刺激物質およびＲＮＡを含む。具体的な態様では、乾燥組成物は、ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ＤＯＴＡＰ、免疫刺激物質、およびＲＮＡを含む。

【0135】

一部の態様では、免疫刺激物質は、産生されるタンパク質の総量を減少させ得るが、ワクチンに対する免疫応答を増加させ得る。一部の態様では、免疫刺激物質は、産生されるタンパク質の総量を増加させ得るが、ワクチンに対する免疫応答を減少させ得る。一部の態様では、免疫刺激物質は、スクアレンである。一部の態様では、免疫刺激物質は、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド（ＭＩＧＬＹＯＬ（登録商標）８１０）、または飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステル（ＭＩＧＬＹＯＬ（登録商標）８１２Ｎ）である。
例示的な実施形態

【0136】

（ａ）脂質キャリアであって、脂質キャリアが、疎水性コア、１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、脂質キャリア；（ｂ）１つまたは複数の核酸；ならびに（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を含む乾燥組成物が本明細書に提供される。組成物が、凍結乾燥されている、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。組成物が、噴霧乾燥されている、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。熱的に安定である、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。摂氏約２５度で熱的に安定である、乾燥組成物が本明細書に提供される。摂氏約４５度で熱的に安定である、乾燥組成物が本明細書に提供される。摂氏約－２０度で熱的に安定である、乾燥組成物が本明細書に提供される。摂氏約２度～摂氏約８度で熱的に安定である、乾燥組成物が本明細書に提供される。少なくとも１週間、少なくとも２週間、および／または少なくとも１か月間、熱的に安定である、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。組成物の疎水性コアが、油を含む、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。油が、α－トコフェロール、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、プロポリス、スクアレン、鉱物油、ブドウ種子油、オリーブ油、パラフィン油、ピーナッツ油、大豆油、ヒマワリ油、大豆レシチン、トリグリセリド、ビタミンＥ、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステル、ジヒドロイソスクアレン（ＤＨＩＳ）、ファルネセン、ならびにスクアランの少なくとも１つを含む、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、金属塩、金属酸化物、金属水酸化物、金属リン酸塩、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質、アニオン性脂質、中性脂質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質である、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）；１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）；ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；および１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；Ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ－ジメチルデカン－１－アミニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。脂質キャリアが、必要に応じて、少なくとも１つの界面活性剤を含む、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの界面活性剤が、疎水性界面活性剤、親水性界面活性剤、および任意の組合せからなる群から選択される、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。疎水性界面活性剤が、ソルビタンエステルを含む、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。ソルビタンエステルが、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、およびソルビタントリオレエートからなる群から選択され；親水性界面活性剤が、ポリソルベートを含む、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。脂質キャリアが、約０．１～０．４の範囲の平均多分散指数で、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲のｚ平均流体力学直径を有する、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の核酸が、ＲＮＡである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。ＲＮＡが、自己複製性ＲＮＡである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の核酸が、脂質キャリアに組み込まれるか、またはそれと複合体化して、脂質キャリア－核酸複合体を形成する、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。脂質キャリア－核酸複合体が、非共有結合性相互作用を介して、または可逆的な共有結合性相互作用を介して形成される、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。窒素のホスフェートに対する（Ｎ：Ｐ）モル比によって特徴付けられる脂質キャリアの１つまたは複数の核酸に対するモル比が、約１：１～約１５０：１の範囲である、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、スクロース、マルトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、スクロースである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、約１％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、約１％ｗ／ｖ～約４０％ｗ／ｖである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、約１０％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、約１０％ｗ／ｖである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、オキシ水酸化アルミニウム、酸化鉄、二酸化チタン、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、ヒドロキシリン酸アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_ｘ（ＰＯ_４）_ｙ）、リン酸カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、カルシウムヒドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）、グルコン酸鉄、または硫酸鉄を含む、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、マグヘマイト（ｙ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、ウスタイト（ＦｅＯ）、もしくはヘマタイト（アルファ（α）－Ｆｅ_２Ｏ_３）、またはそれらの任意の組合せを含む、組成物が本明細書にさらに提供される。

【0137】

好適な希釈剤中で再構成された本明細書に提供される乾燥組成物；および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物が本明細書にさらに提供される。好適な希釈剤が、水性である、医薬組成物が本明細書にさらに提供される。好適な希釈剤が、水である、医薬組成物が本明細書にさらに提供される。

【0138】

本明細書に提供される医薬組成物または本明細書に提供される乾燥組成物；および対象への投与のための送達システムを含む、キットが本明細書にさらに提供される。

【0139】

本明細書に提供される医薬組成物および必要に応じて１つまたは複数のワクチンアジュバントを含む、ワクチン送達システムが本明細書にさらに提供される。

【0140】

対象における免疫応答を生じさせるための方法であって、治療有効量の本明細書に提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0141】

対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の本明細書に提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0142】

対象における１つまたは複数の核酸の送達をイメージングおよび／または追跡する方法であって、治療有効量の本明細書に提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0143】

凍結乾燥組成物を調製するための方法であって、（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；（ｂ）１つまたは複数の核酸を脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；ならびに（ｄ）製剤を凍結乾燥して、凍結乾燥組成物を形成するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0144】

噴霧乾燥組成物を調製するための方法であって、（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；（ｂ）１つまたは複数の核酸を脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；ならびに（ｄ）製剤を噴霧乾燥して、噴霧乾燥組成物を形成するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0145】

凍結乾燥組成物を再構成するための方法であって、（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；（ｂ）１つまたは複数の核酸を前記脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；製剤を凍結乾燥して、凍結乾燥組成物を形成するステップ；ならびに（ｄ）好適な希釈剤中で凍結乾燥組成物を再構成するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。好適な希釈剤が、水性である、方法が本明細書にさらに提供される。好適な希釈剤が、水である、方法が本明細書にさらに提供される。凍結乾燥組成物が、熱的に安定である、方法が本明細書にさらに提供される。凍結乾燥組成物が、少なくとも１週間、少なくとも２週間、および／または少なくとも１か月間、熱的に安定である、方法が本明細書にさらに提供される。凍結乾燥組成物が、摂氏約２５度で熱的に安定である、方法が本明細書にさらに提供される。凍結乾燥組成物が、摂氏約４５度で熱的に安定である、方法が本明細書にさらに提供される。凍結乾燥組成物が、摂氏約－２０度で熱的に安定である、方法が本明細書に提供される。凍結乾燥組成物が、摂氏約２度～摂氏約８度で熱的に安定である、方法が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、オキシ水酸化アルミニウム、酸化鉄、二酸化チタン、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、ヒドロキシリン酸アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_ｘ（ＰＯ_４）_ｙ）、リン酸カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、カルシウムヒドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）、グルコン酸鉄、または硫酸鉄を含む、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、マグヘマイト（ｙ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、ウスタイト（ＦｅＯ）、もしくはヘマタイト（アルファ（α）－Ｆｅ_２Ｏ_３）、またはそれらの任意の組合せを含む、組成物が本明細書にさらに提供される。

【0146】

噴霧乾燥組成物を再構成するための方法であって、（ａ）脂質キャリアを得るステップであって、脂質キャリアが、疎水性コア、必要に応じて１つまたは複数の無機ナノ粒子、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、ステップ；（ｂ）１つまたは複数の核酸を前記脂質キャリアに組み込んで、脂質キャリア－核酸複合体を形成するステップ；（ｃ）少なくとも１つの凍結保護物質を脂質キャリア－核酸複合体に添加して、製剤を形成するステップ；（ｄ）製剤を噴霧乾燥して、噴霧乾燥組成物を形成するステップ；ならびに（ｅ）好適な希釈剤中で噴霧乾燥組成物を再構成するステップを含む方法が本明細書にさらに提供される。希釈剤が、水性である、方法が本明細書にさらに提供される。希釈剤が、水である、方法が本明細書にさらに提供される。凍結乾燥組成物が、熱的に安定である、方法が本明細書にさらに提供される。凍結乾燥組成物が、摂氏約２５度で熱的に安定である、方法が本明細書にさらに提供される。凍結乾燥組成物が、摂氏約４５度で熱的に安定である、方法が本明細書にさらに提供される。凍結乾燥組成物が、摂氏約－２０度で熱的に安定である、方法が本明細書に提供される。凍結乾燥組成物が、摂氏約２度～摂氏約８度で熱的に安定である、方法が本明細書にさらに提供される。疎水性コアが、油を含む、方法が本明細書にさらに提供される。油が、α－トコフェロール、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、プロポリス、スクアレン、鉱物油、ブドウ種子油、オリーブ油、パラフィン油、ピーナッツ油、大豆油、ヒマワリ油、大豆レシチン、トリグリセリド、ビタミンＥ、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステル、ジヒドロイソスクアレン（ＤＨＩＳ）、ファルネセン、ならびにスクアランの少なくとも１つを含む、方法が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質、アニオン性脂質、中性脂質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、方法が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質を含む、方法が本明細書にさらに提供される。カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）；１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）；ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；および１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；Ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ－ジメチルデカン－１－アミニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、方法が本明細書にさらに提供される。脂質キャリアが、必要に応じて、１つまたは複数の界面活性剤を含む、方法が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の界面活性剤が、疎水性界面活性剤、親水性界面活性剤、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、方法が本明細書にさらに提供される。疎水性界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、およびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含み；親水性界面活性剤が、ポリソルベートを含む、方法が本明細書にさらに提供される。脂質キャリアが、約０．１～約０．４の範囲の平均多分散指数で、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲のｚ平均流体力学直径を有する、方法が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の核酸が、ＲＮＡである、方法が本明細書にさらに提供される。ＲＮＡが、自己複製性ＲＮＡである、方法が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の核酸が、脂質キャリアに組み込まれるか、またはそれと複合体化して、脂質キャリア－核酸複合体を形成する、方法が本明細書にさらに提供される。脂質キャリア－核酸複合体が、非共有結合性相互作用を介して、または可逆的な共有結合性相互作用を介して形成される、方法が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、スクロース、マルトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、方法が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、スクロースである、方法が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、約１％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖである、方法が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、約１０％ｗ／ｖ～約２０％ｗ／ｖである、方法が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの凍結保護物質が、約１０％ｗ／ｖである、方法が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、オキシ水酸化アルミニウム、酸化鉄、二酸化チタン、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、ヒドロキシリン酸アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_ｘ（ＰＯ_４）_ｙ）、リン酸カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、カルシウムヒドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）、グルコン酸鉄、または硫酸鉄を含む、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、マグヘマイト（ｙ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、ウスタイト（ＦｅＯ）、もしくはヘマタイト（アルファ（α）－Ｆｅ_２Ｏ_３）、またはそれらの組合せを含む、組成物が本明細書にさらに提供される。

【0147】

ソルビタン脂肪酸エステル、エトキシ化ソルビタンエステル、カチオン性脂質、免疫刺激物質、およびＲＮＡを含む乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。ソルビタン脂肪酸エステルが、ソルビタンモノステアレートである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。エトキシ化ソルビタンエステルが、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。カチオン性脂質が、ＤＯＴＡＰである、乾燥組成物が本明細書に提供される。免疫刺激物質が、スクアレンである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。エステルの比が、８～１１の親水性－親油性バランスを生じさせる、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。エステルおよび脂質の比が、３０ｎｍ～２００ｎｍの粒子径を生じさせる、乾燥組成物が本明細書に提供される。エステルおよび脂質の比が、４０ｎｍ～７０ｎｍの粒子径を生じさせる、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、オキシ水酸化アルミニウム、酸化鉄、二酸化チタン、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、ヒドロキシリン酸アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_ｘ（ＰＯ_４）_ｙ）、リン酸カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、カルシウムヒドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）、グルコン酸鉄、または硫酸鉄を含む、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、マグヘマイト（ｙ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、ウスタイト（ＦｅＯ）、もしくはヘマタイト（アルファ（α）－Ｆｅ_２Ｏ_３）、またはそれらの任意の組合せを含む、組成物が本明細書にさらに提供される。

【0148】

ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ＤＯＴＡＰ、免疫刺激物質、およびＲＮＡを含む乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。免疫刺激物質が、産生されるタンパク質の総量を減少させるが、ワクチンに対する免疫応答を増加させる、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート、ＤＯＴＡＰ、およびスクアレンを含み、固体粒子を含まない、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。エステルの比が、８～１１の親水性－親油性バランスを生じさせる、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。粒子径が、３０ｎｍ～２００ｎｍである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。Ｎ：Ｐの比が、５～３５である、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。免疫刺激物質が、産生されるタンパク質の総量を増加させるが、ワクチンに対する免疫応答を減少させる、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。免疫刺激物質が、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、または飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステルの少なくとも１つである、乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、オキシ水酸化アルミニウム、酸化鉄、二酸化チタン、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、ヒドロキシリン酸アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_ｘ（ＰＯ_４）_ｙ）、リン酸カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、カルシウムヒドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）、グルコン酸鉄、または硫酸鉄を含む、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、マグヘマイト（ｙ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、ウスタイト（ＦｅＯ）、もしくはヘマタイト（アルファ（α）－Ｆｅ_２Ｏ_３）、またはそれらの任意の組合せを含む、組成物が本明細書にさらに提供される。

【0149】

（ａ）脂質キャリアであって、脂質キャリアが、疎水性コア、および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、脂質キャリア；（ｂ）必要に応じて１つまたは複数の核酸；ならびに（ｃ）（ｉ）乾燥組成物の少なくとも約５０重量％、または（ｉｉ）少なくとも約５０ｍｇの量で存在する少なくとも１つの糖を含む乾燥組成物が本明細書にさらに提供される。凍結乾燥されている組成物が本明細書にさらに提供される。摂氏約２５度で熱的に安定である組成物が本明細書にさらに提供される。摂氏約４５度で熱的に安定である組成物が本明細書にさらに提供される。摂氏約－２０度で熱的に安定である組成物が本明細書にさらに提供される。摂氏約２度～摂氏約８度で熱的に安定である組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１週間、少なくとも２週間、および／または少なくとも１か月間、熱的に安定である組成物が本明細書にさらに提供される。疎水性コアが、油を含む、組成物が本明細書にさらに提供される。油が、α－トコフェロール、ラウロイルポリオキシルグリセリド、モノアシルグリセロール、プロポリス、スクアレン、鉱物油、ブドウ種子油、オリーブ油、パラフィン油、ピーナッツ油、大豆油、ヒマワリ油、大豆レシチン、トリグリセリド、ビタミンＥ、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステル、ジヒドロイソスクアレン（ＤＨＩＳ）、ファルネセン、ならびにスクアランの少なくとも１つを含む、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質、アニオン性脂質、中性脂質、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の脂質が、カチオン性脂質を含む、組成物が本明細書にさらに提供される。カチオン性脂質が、１，２－ジオレオイルオキシ－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）；３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）；１，２－ジミリストイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）；ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）；Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ－ジオレオイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；および１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）；１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；Ｎ－デシル－Ｎ，Ｎ－ジメチルデカン－１－アミニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；エチルホスファチジルコリン（ｅＰＣ）；およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、組成物が本明細書にさらに提供される。脂質キャリアが、少なくとも１つの界面活性剤を含む、組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの界面活性剤が、疎水性界面活性剤、親水性界面活性剤、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、組成物が本明細書にさらに提供される。疎水性界面活性剤が、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、およびソルビタントリオレエートからなる群から選択されるソルビタンエステルを含み；親水性界面活性剤が、ポリソルベートを含む、組成物が本明細書にさらに提供される。脂質キャリアが、約０．１～約０．４の範囲の平均多分散指数で、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲のｚ平均流体力学直径を有する、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の核酸が、ＤＮＡである、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の核酸が、ＲＮＡである、組成物が本明細書にさらに提供される。ＲＮＡが、自己複製性ＲＮＡである、組成物が本明細書にさらに提供される。疎水性コアが、１つまたは複数の無機ナノ粒子を含む、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、金属塩、金属酸化物、金属水酸化物、金属リン酸塩、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の核酸が、脂質キャリアに組み込まれるか、またはそれと複合体化して、脂質キャリア－核酸複合体を形成する、組成物が本明細書にさらに提供される。脂質キャリア－核酸複合体が、非共有結合性相互作用を介して、または可逆的な共有結合性相互作用を介して形成される、組成物が本明細書にさらに提供される。窒素のホスフェートに対する（Ｎ：Ｐ）モル比によって特徴付けられる脂質キャリアの１つまたは複数の核酸に対するモル比が、約１：１～約１５０：１の範囲である、組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの糖が、スクロース、マルトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの糖が、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００ｍｇ、またはそれよりも多くの量で存在する、組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの糖が、５０ｍｇ～２５０ｍｇの量で存在する、組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの糖が、少なくとも約２５０ｍｇの量で存在する、組成物が本明細書にさらに提供される。糖が、組成物の少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５重量％、またはそれよりも多くの量で存在する、組成物が本明細書にさらに提供される。糖が、組成物の８０～９８％、必要に応じて９４～９６重量％の量で存在する、組成物が本明細書にさらに提供される。糖が、組成物の約９５重量％の量で存在する、組成物が本明細書にさらに提供される。少なくとも１つの糖が、スクロースを含む、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、酸化アルミニウム（Ａｌ_２Ｏ_３）、オキシ水酸化アルミニウム、酸化鉄、二酸化チタン、二酸化ケイ素（ＳｉＯ_２）、ヒドロキシリン酸アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_ｘ（ＰＯ_４）_ｙ）、リン酸カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２）、カルシウムヒドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２）、グルコン酸鉄、または硫酸鉄を含む、組成物が本明細書にさらに提供される。１つまたは複数の無機ナノ粒子が、マグネタイト（Ｆｅ_３Ｏ_４）、マグヘマイト（ｙ－Ｆｅ_２Ｏ_３）、ウスタイト（ＦｅＯ）、もしくはヘマタイト（アルファ（α）－Ｆｅ_２Ｏ_３）、またはそれらの任意の組合せを含む、組成物が本明細書にさらに提供される。

【0150】

最大で約２００マイクログラム（μｇ）の量で存在する核酸；最大で約１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するカチオン性脂質；最大で約０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する酸化鉄；最大で約１．８８ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するスクアレン；最大で約１．８６ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するソルビタンモノステアレート；最大で約１．８６ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するポリソルベート８０；最大で約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するスクロース；および必要に応じて最大で約２．１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するクエン酸一水和物を含む組成物が本明細書にさらに提供される。核酸が、ＲＮＡまたはＤＮＡである、組成物が本明細書にさらに提供される。核酸が、ＲＮＡであり、最大で約５０μｇの量で存在する、組成物が本明細書にさらに提供される。

【0151】

本明細書に提供される医薬組成物および対象への投与のための送達システムを含む、キットが本明細書にさらに提供される。それぞれ、脂質キャリアおよび核酸を含む、２つまたはそれよりも多くの別々のユニットを含む、キットが本明細書にさらに提供される。脂質キャリアおよび核酸を含むユニットを含む、キットが本明細書にさらに提供される。乾燥組成物の水和のための試薬を含むユニットをさらに含む、キットが本明細書にさらに提供される。水和のための試薬が、水を含む、キットが本明細書にさらに提供される。

【0152】

対象における免疫応答を生じさせるための方法であって、治療有効量の本明細書に提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0153】

対象における疾患を処置または防止する方法であって、治療有効量の本明細書に提供される医薬組成物を対象に投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0154】

対象における１つまたは複数の核酸の送達をイメージングおよび／または追跡する方法であって、治療有効量の本明細書に記載される医薬組成物を投与するステップを含む、方法が本明細書にさらに提供される。

【0155】

以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態の原理およびプラクティスを当業者により明確に説明するために示され、任意の特許請求の範囲に記載の実施形態の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。他に述べられない限り、すべての部およびパーセンテージは、重量基準である。

【実施例】

【0156】

（実施例１）
一般的な生成技法および用いた材料
以下の材料を、脂質キャリアが、疎水性コア、１つまたは複数の無機ナノ粒子および１つまたは複数の脂質を含むナノエマルジョンである、脂質キャリアの製造において使用した。

【0157】

剤は、スクアレン、ソルビタンモノステアレート（ＳＰＡＮ（登録商標）６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）、ＤＯＴＡＰクロリド、酸化鉄ナノ粒子およびクエン酸ナトリウム二水和物を含む。一般に、５ｎｍの数－重量平均直径を有する酸化鉄ナノ粒子に、クロロホルムを添加した。クロロホルムを、ドラフト中で蒸発させ、酸化鉄ナノ粒子の乾燥コーティングが残った。酸化鉄ナノ粒子に、ＳＰＡＮ（登録商標）６０、スクアレン、およびＤＯＴＡＰクロリドを添加して、「油」相を調製した。油相を、６０℃に事前に加熱した水浴中で３０分間超音波処理した。別々に、１リットルのガラスボトル中で、「水」相を、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水を用いて調製されたクエン酸ナトリウム二水和物溶液に添加することによって調製した。水相を３０分間撹拌して、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を完全に溶解させた。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０の完全な溶解後、水相を、ビーカーに移し、６０℃に事前に加熱した水浴中でインキュベートした。加熱した油相に、事前に加熱された水相を添加した。混合物を、乳様の外観を有する均質なコロイドが生成するまで、ＶＷＲ ２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、直ぐに乳化した。コロイドを、その後、２０，０００ｐｓｉで、ＬＭ１０マイクロフルイダイザーのＹ型相互作用チャンバーに流体を通過させることによって、処理した。流体を、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学直径が、０．２の多分散指数で、５９ｎｍになるまで、通過させた。マイクロフルイダイズされた脂質キャリア試料を、最後に、２００ｎｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）注射器フィルターで濾過した。
（実施例２）
脂質キャリア＋ＲＮＡ－分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）複合体の調製。

【0158】

脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰ複合体を調製し、凍結乾燥のために三反復で等分した。本明細書のどこかに記載されるＦｅ－脂質キャリアは、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン（ＳＥＰＰＩＣ）、３７ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、３７ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）、０．２ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの１２ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含む。脂質試料は、比較のために省いた。試料を収集し、再構成のために選択した。次いで、凍結乾燥ケーキの外観を記録した。次いで、すべての凍結乾燥ケーキを、０．７ｍｌのｍｉｌｌｉＱ水中で再構成した。次いで、（ｉ）粒子径、（ｉｉ）サイズ分布、（ｉｉｉ）ＲＮＡ完全性、（ｉｖ）ＤＯＴＡＰおよびスクアレン含有量、ならびに（ｖ）ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質発現の測定を含む、再構成された材料の物理化学的性質を測定した。結果を下記に示す。表２は、脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰ複合体の調製において使用される材料を開示する。

【表2】

【0159】

凍結乾燥のための条件を、表３～５に下記の通り示す。

【表3】

【表4】

【表5】

【0160】

希釈剤の調製：糖およびクエン酸塩を含む希釈剤を、表６に概説されるようにして調製した。それぞれの糖を、５０ｍｌのＲＮａｓｅを含まないコニカル管に量りとった。約３５～４０ｍｌのヌクレアーゼを含まない水を添加して、糖を溶解し、必要により、わずかに加熱し、超音波処理を使用した。０．５ｍｌの１Ｍのクエン酸Ｎａ、ｐＨ＝６の溶液をピペットで入れる。すべての糖が溶解し、溶液が透明になった後、コニカル管において、５０ｍｌのマークまで、ヌクレアーゼを含まない水で、Ｑ．Ｓ．にした。希釈剤を０．２２μｍのＳＴＥＲＩＦＬＩＰ（登録商標）で濾過し、無菌を維持するために、無菌でキャップをしめた。

【表6】

【0161】

プレ複合体製剤の調製：脂質キャリア「ＤＳ」は、３０ｍｇのＤＯＴＡＰ／ｍｌのバルク溶液であり、Ｆｅ－脂質キャリア製剤を指し、その調製は、実施例８に記載する。

【0162】

５倍の５０％のスクロース組成の脂質キャリアを希釈して、２×６ｍｇのＤＯＴＡＰ／ｍｌの脂質キャリア「ＤＰ」を作製したのを除いて、１０倍の脂質キャリア「ＤＳ」（３０ｍｇのＤＯＴＡＰ／ｍｌ）を、それぞれの希釈剤に希釈して、３ｍｇのＤＯＴＡＰ／ｍｌの脂質キャリア「ＤＰ」を作製した。液体製剤中の標的ＲＮＡ濃度は、５０ｎｇ／μｌであり、１５のＮ：Ｐで、脂質キャリアと複合体化した。これは、バイアルあたり２５μｇのＲＮＡ用量をシミュレートする。表７は、プレ複合体の脂質キャリア複合体の調製を開示する。未使用の脂質キャリアを、摂氏２～８度で貯蔵した。

【表7】

【0163】

表８は、プレ複合体のナノ構造脂質キャリア（ＮＬＣ）複合体の調製を開示する。ＮＬＣを対照として使用した。未使用のＮＬＣを、新鮮な複合体対照のために、摂氏２～８度で貯蔵した。

【表8】

【0164】

ＲＮＡプレ複合体の調製を表９に開示する。ＲＮＡストックを調製した。アリコートあたり５０％のスクロースのために約７．５ｍｌまたは０．６３ｍｌに分け、摂氏－８０度で貯蔵した。

【表9】

【0165】

脂質キャリア－ＲＮＡ複合体の調製を表９に開示する。ＲＮＡストックを調製した。凍結乾燥（ｌｙｏ）サイクルごとの複合体化ごとに、希釈されたＲＮＡの体積は、（＋５％）であり、希釈された脂質キャリアは、（＋５％）であった。

【0166】

脂質キャリア＋ＲＮＡまたはＮＬＣ＋ＲＮＡの複合体を、１：１の体積で、上記に記載の表８および表９に列挙されたそれぞれの希釈製剤を、表１０に開示されたＲＮＡを希釈した対応する「組成物ＩＤ」と混合することによって、調製した。複合体を、凍結乾燥サイクルまたは長期貯蔵条件に付す前に、室温で３０分間平衡化した。

【表10】

（実施例３）
粒子径測定。

【0167】

製剤を、使い捨てサイジングキュベットＤＴＳ００１２において、９００μｌのｍｉｌｌｉＱ水を１０μｌのＧＬＢ５１－Ｆ０４－２０－０２に添加することによって、１００倍希釈した。ボルテックスし、泡を、キュベットを軽くタッピングすることによって除去した。粒子径を、ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＵＬＴＲＡにおいて、ＭＡＬＤＳ法によって測定した。最低で５つの測定値を収集した。平均ｚ平均直径、および平均ＰＤＩを、後方散乱（１７３°）測定から記録した。
（実施例４）
アガロースゲル電気エイドによるＲＮＡ完全性。

【0168】

試料を、５０ｎｇ／μｌの複合体を、１０ｎｇ／μｌのヌクレアーゼを含まない水：１２μｌの複合体＋４８μｌの水で、５倍希釈することによって調製した。６０μｌのフェノール：クロロホルムを添加し、１０～１５回反転させて、ＲＮＡを抽出した。１５分間遠心分離して、１０μｌの上清を除去し、１０μｌのグリオキサールロード色素と混ぜ、それに続いて、摂氏５０度に３０分間加熱することによって、ＲＮＡを変性させた。レーンあたり１０μｌをロードした。
（実施例５）
ＢＨＫ２１細胞のＳＥＡＰ発現。

【0169】

細胞トランスフェクション：９６ウェルプレートに、トランスフェクションの１日前に、１．５×１０^５個細胞／ｍＬで事前に播種した。トランスフェクションの日に、増殖培地を、ピペッティングによってプレートから除去した。５０μＬのＲＮＡ：脂質キャリア混合物および５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ ＵＳＡ）を、ＢＨＫ２１（ベビーハムスター腎臓線維芽細胞）細胞に添加した。細胞を４時間インキュベートした。ＲＮＡ：脂質キャリアおよびＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地を、ピペッティングによって除去し、ＤＭＥＭ増殖培地で置き換えた。細胞を終夜インキュベートした。

【0170】

上清におけるＳＥＡＰ発現の評価：ＳＥＡＰレポーターアッセイキット（商標）（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ＮＰＢ２－２５２８５）のキットを使用して、上清におけるＳＥＡＰレベルを測定した。上清を、製造業者の推奨プロトコールに従って、未希釈で分析した。
（実施例６）
サイクル＃１後の特徴付けデータ

【0171】

すべての凍結乾燥ケーキは、サイクル＃１後に時間＝０時間で良好な完全性を示した。５％のグルコースにおける脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰの完全性は、摂氏２５度で２４時間後に、部分的に損なわれた。すべての他の製剤の完全性は保存された。本明細書のどこかに記載されるＦｅ－脂質キャリアは、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン（ＳＥＰＰＩＣ）、３７ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、３７ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）、０．２ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの１２ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含む。１０％のスクロースにおけるＮＬＣ＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰおよび５％のグルコースにおける脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰの製剤からのケーキは、摂氏４２度で２４時間後に著しく縮んだ。すべての他の製剤の完全性は保存された。図２～４は、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成における凍結乾燥ケーキの外観を図示する。図２は、時間＝０時間での示された糖組成におけるＮＬＣおよび脂質キャリアケーキの外観を図示する。図３は、ｔ＝摂氏２５度および摂氏４２度で２４時間後の示された糖組成におけるＮＬＣおよび脂質キャリアケーキの外観を図示する。図４は、ｔ＝摂氏２５度および摂氏４２度で２４時間での示された糖組成におけるＮＬＣおよび脂質キャリアケーキの外観を図示する。

【0172】

凍結乾燥サイクル＃１後の摂氏２５度および摂氏４２度で示された糖組成における貯蔵１日後の再構成ケーキの粒子径を、図４Ａ～４Ｂにおけるようにして測定した。図５Ａは、示された糖組成における時間＝０時間での液体製剤と比べた粒子径の倍数変化を示す。図５Ｂは、示された糖組成におけるそれらの対応する液体製剤と比べた再構成凍結乾燥製剤のＰＤＩの点変化を示す。平均サイズおよびサイズ分布の値を表１１に示す。すべての再構成された凍結乾燥製剤は、再構成後に、脂質キャリア＋ＲＮＡ複合体のサイズの増加をもたらした。凍結保護物質としてスクロースを含有するすべての再構成された製剤は、摂氏２５度で時間＝０時間および２４時間で最小限のＰＤＩ変化をもたらした。

【0173】

表１１に記載される凍結乾燥（ｔ＝０）は、凍結乾燥サイクルの完了と同じ日に再構成された凍結乾燥製剤を指す。表１１に記載される液体は、凍結乾燥製剤の同等の液体（非凍結乾燥）製剤を指す。

【表11】

凍結乾燥サイクル＃１後のアガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ完全性：

【0174】

脂質キャリア＋ＲＮＡおよびＮＬＣ＋ＲＮＡ製剤について、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるアガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ完全性を、図６Ａ～６Ｂに図示する。図６Ａは、脂質キャリア＋ＲＮＡ製剤について、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるアガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ完全性を示す。図６Ｂは、脂質キャリア＋ＲＮＡおよびＮＬＣ＋ＲＮＡ製剤について、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるアガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ完全性を示す。

【0175】

摂氏２５度および摂氏４２度の凍結乾燥ケーキを、再構成の前に２４時間貯蔵した。再構成、および脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰからのＲＮＡ－ＳＥＡＰのフェノール：クロロホルム抽出後のすべての凍結乾燥試料は、図６Ａ～６Ｂに示されるように、ネイキッドＲＮＡ－ＳＥＡＰ陽性対照と関係がある規定のＲＮＡバンドを示した。図６Ａは、摂氏４２度で２４時間貯蔵された１０％のスクロースにおける脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰ複合体の液体製剤が、液体として貯蔵された場合に、分解の加速を示唆するＲＮＡバンド強度の有意な減少をもたらしたが、乾燥凍結乾燥形態で貯蔵されていない場合には、分解の加速を示唆するＲＮＡバンド強度の有意な減少をもたらさなかったことを示す。

【0176】

凍結乾燥は、摂氏４２度での貯蔵で、液体脂質キャリア＋ＲＮＡ製剤におけるＲＮＡ完全性を保存した。
凍結乾燥サイクル＃１後のＢＨＫ２１細胞のＳＥＡＰ発現：

【0177】

脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡおよびＮＬＣ＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰ製剤について、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるＢＨＫ２１細胞のＳＥＡＰ発現を、図７Ａ～７Ｇに図示する。図７Ａは、１０％のトレハロースにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｂは、５％のマンニトールにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｃは、１０％のスクロースにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｄは、２０％のスクロースにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｅは、５％のグルコースにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｆは、１０％のマルトースにおける脂質キャリア＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図７Ｇは、１０％のスクロースにおけるＮＬＣ＋ｒｅｐＲＮＡ－ＳＥＡＰについての相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。

【0178】

比較のために、細胞に、示された糖組成において、新たに調製された脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰをトランスフェクトした。追加の安定性の比較として、細胞に、摂氏２５度で２４時間または摂氏４２度で２４時間貯蔵された１０％のスクロースにおける脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰの液体製剤をトランスフェクトした。後者の条件は、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質発現における分解されたＲＮＡの効果を測定するための対照としての役割を果たした。図７Ａ～７Ｇは、時間＝０時間または摂氏２５度で２４時間後の再構成されたすべての凍結乾燥製剤が、対応する新たに調製された脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰ複合体と比べて、ＲＮＡ用量依存性の発現プロファイルの変化をもたらさなかったことを図示する。液体製剤において摂氏４２度で２４時間貯蔵された１０％のスクロースにおける脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰ（図７Ｃ）は、凍結乾燥製剤と比較して、有意に減少したＳＥＡＰ発現をもたらした。１０％のトレハロース（図７Ａ）、２０％のスクロース（図７Ｄ）および１０％のマルトース（図７Ｆ）も、摂氏４２度で２４時間貯蔵後に、ＳＥＡＰ発現によって測定されるように、ＲＮＡ－ＳＥＡＰの効力を保存した。最後に、摂氏４２度で、５％のマンニトール（図７Ｂ）または５％のグルコース（図７Ｅ）を含有する凍結乾燥された脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰは、それらの対応する新たに調製された液体製剤と比べて、ＳＥＡＰの用量依存性の発現プロファイルの著しい減少をもたらした。比較のために、ＮＬＣを、１０％のスクロースにおいてＲＮＡ－ＳＥＡＰを用いて調製した（図７Ｇ）。
凍結乾燥サイクル＃１後の脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰケーキの外観：

【0179】

図８および図９は、サイクル＃１後のさまざまな時点での示された糖組成における脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰケーキの外観を示す。すべての凍結乾燥ケーキは、サイクル＃１後に時間＝０時間で良好な完全性を示した。図８は、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるさまざまな時点（時間＝０時間、摂氏２５度で６日後および摂氏２５度で１か月後）での脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰケーキの外観を図示する。図８は、５％のグルコースにおける脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰの完全性が、摂氏２５度で６日後および摂氏２５度で１か月後に有意に損なわれたことを示す。１０％のスクロースにおけるＮＬＣ＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰの完全性は、摂氏２５度で６日後に部分的に損なわれ、摂氏２５度で１か月後に有意に損なわれた。すべての他の製剤の完全性は、摂氏２５度で１か月後に保存された。

【0180】

図９は、凍結乾燥サイクル＃１後の示された糖組成におけるさまざまな時点（時間＝０時間、摂氏４２度で２４時間後、および摂氏４２度で３日後、および摂氏４２度で１か月後）での脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰケーキの外観を図示する。図８は、すべてのスクロースおよびグルコースを含有する製剤が、摂氏４２度での貯蔵の２４時間後、３日後、および１か月後に次第に縮んだことを示す。すべての他の製剤の完全性は、摂氏４２度で１か月後に保存された。
（実施例７）
サイクル＃３後の特徴付けデータ
凍結乾燥サイクル＃３後の粒子径：

【0181】

凍結乾燥サイクル＃３後の示された糖組成における摂氏２５度および摂氏４２度での貯蔵１日後の再構成ケーキの粒子径を、図１０Ａ～１０Ｂにおけるようにして測定した。図１０Ａ～１０Ｂは、凍結乾燥サイクル＃３後の示された糖組成における貯蔵１日後の再構成ケーキの粒子径を図示する。図１０Ａは、示された糖組成における再構成製剤のＰＤＩの点変化を示す。図１０Ｂは、脂質キャリア＋ＲＮＡの新鮮な複合体と比べた粒子径のｌｏｇ１０倍数変化を示す。

【0182】

平均サイズおよびサイズ分布の値を表１２に示す。摂氏２５度または摂氏４２度で１か月間貯蔵されたすべての凍結乾燥製剤は、再構成後に複合体のサイズの増加をもたらした。２０％のスクロースにおいて調製された脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰは、図１０Ａ～１０Ｂに示されるように、摂氏５度で１か月間貯蔵された液体製剤と比べて、粒子径の最も小さい倍数変化および最低限のＰＤＩの変化をもたらした。

【表12】

凍結乾燥サイクル＃３後のアガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ完全性：

【0183】

凍結乾燥サイクル＃３後の示された糖組成におけるアガロースゲル電気泳動によるＲＮＡ完全性を図１１に図示する。液体製剤および凍結乾燥製剤の両方を、摂氏２５度および摂氏４２度で１か月間貯蔵した。図１１は、バンドの光学密度（ＯＤ）％が、１０％のスクロースにおける新たに調製された脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰから抽出されたＲＮＡ－ＳＥＡＰに対して正規化されたことを示す。摂氏４２度で１か月間貯蔵された、液体または凍結乾燥のすべての試料は、ＲＮＡ－ＳＥＡＰの完全な分解を示す検出可能なＲＮＡバンドを示さなかった。１０％のスクロースにおけるＮＬＣ＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰおよび５％のマンニトールにおける脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰを除いて、すべての凍結乾燥された脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰ製剤は、摂氏５度で１か月間液体形態で貯蔵された脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰよりも、摂氏２５度で１か月間、ＲＮＡ－ＳＥＡＰをより良好に保護した。摂氏２５度で１か月間液体として貯蔵された１０％のスクロースにおける脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰは、完全であった。比較において、凍結乾燥形態で摂氏２５度で貯蔵された場合に、ＲＮＡ－ＳＥＡＰは、新鮮な複合体と比べて５０％のＯＤであり、液体形態で摂氏５度で貯蔵された場合、２３％のＯＤであった。２０％のスクロースまたは１０％のマルトースにおいて製剤化された脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰは、摂氏２５度で１か月貯蔵後に、ＲＮＡ－ＳＥＡＰを有意に保存した。
凍結乾燥サイクル＃３後のＢＨＫ２１細胞のＳＥＡＰ発現：

【0184】

凍結乾燥サイクル＃３後の示された糖組成におけるＢＨＫ２１細胞のＳＥＡＰ発現を図１２に図示する。平均ＳＥＡＰ発現レベルを、１２．５ｎｇ／ウェルの単一ＲＮＡトランスフェクション用量について示した。比較のために、細胞に、図１２に示されるように、１０％のスクロースにおける新たに調製された脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰをトランスフェクトした（上側の点線）。摂氏４２度で１か月間貯蔵された１０％のスクロースにおける脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰの液体製剤をトランスフェクトした細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質発現に対する分解したＲＮＡの効果を測定するための比較としての役割を果たした（下側の点線）。摂氏４２度で１か月間貯蔵されたすべての凍結乾燥試料からの発現は、摂氏４２度で１か月間液体形態で貯蔵された１０％のスクロースにおける脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰの発現レベルであったか、またはそれを下回った。摂氏２５度で１か月間貯蔵された１０％のスクロース、２０％のスクロース、１０％のトレハロースおよび１０％のマルトースにおける凍結乾燥された脂質キャリア＋ＲＮＡ－ＳＥＡＰ複合体は、摂氏５度で液体形態で１か月間貯蔵された同じ組成物よりも高いＳＥＡＰ発現をもたらした。
（実施例８）
マクロファージの免疫応答。

【0185】

脂質キャリアおよびｒｅｐＲＮＡのさまざまな製剤を調製し、分析して、マクロファージにおける脂質キャリアの自然免疫応答をアッセイした。ＴＨＰ－１マクロファージにおけるタンパク質発現およびＴＮＦ産生の刺激を研究した。

【0186】

最初に、ＴＨＰ－１単球を、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）を使用して、マクロファージに分化させた。次いで、細胞に、Ｎａｎｏ ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅコードレプリコンＲＮＡ（配列番号２）を有するさまざまな製剤をトランスフェクトした。次いで、細胞培養培地を、ＮａｎｏＬｕｃおよびＴＮＦ発現について評価した。

【0187】

このアッセイにおいて使用された、製剤、ならびに粒子径およびＰＤＩなどのそれらの特徴を表１３に記載する。ｒｅｐＲＮＡコードＮａｎｏＬｕｃの濃度は、９０９ｎｇ／μｌであり、摂氏－８０度で維持した。飽和ココナツ油／パーム核油由来カプリルおよびカプリン脂肪酸と植物由来グリセロールのトリグリセリドエステルであるＭＩＧＬＹＯＬ（登録商標）８１２ Ｎを、このアッセイにおいて使用した。

【表13】

【0188】

Ｆｅ－脂質キャリア製剤（１００ｍｌスケールで調製）：Ｆｅ－脂質キャリア製剤は、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン（ＳＥＰＰＩＣ）、３７ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、３７ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）、０．２ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの１２ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含む。１ｍｌのクロロホルム（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ロット番号９５－１２７）中の２０ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの直径１２ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子を、４：１のアセトン：クロロホルム（ｖ／ｖ）溶媒混合物中で磁気分離することによって、３回洗浄した。３回目の洗浄後、揮発性溶媒（アセトンおよびクロロホルム）を、ドラフト中で完全に蒸発させて、乾燥オレイン酸酸化鉄ナノ粒子のコーティングが残った。この酸化鉄コーティングに、３．７５グラムのスクアレン、３．７グラムのＳＰＡＮ（登録商標）６０、および３グラムのＤＯＴＡＰを添加して、油相を生成した。油相を、摂氏６５度の水浴中で４５分間超音波処理した。別々に、水相を、ヌクレアーゼを含まない水中で調製された５００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液に１９．５グラムのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を溶解することによって調製した。９２ｍｌの水相を、別々のガラスボトルに移し、摂氏６５度に３０分間加熱した。油相を、温かい油相を温かい水相に添加することによって、９２ｍｌの水相と混合した。混合物を、ＶＷＲ ２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して乳化し、得られた粗エマルジョンを、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学直径が、０．１～０．２５の多分散指数（ＰＤＩ）で、４０～８０ｎｍに達するまで、３０，０００ｐｓｉで、Ｆ１２Ｙ ７５μｍのダイヤモンド相互作用チャンバーおよび補助的なＨ３０Ｚ－２００μｍのセラミック相互作用チャンバーを備えたＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させることによって処理した。マイクロフルイダイズされた製剤を、最後に、２００ｎｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過し、摂氏２～８度で貯蔵した。鉄濃度を、ＩＣＰ－ＯＥＳによって決定した。ＤＯＴＡＰおよびスクアレン濃度を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。

【0189】

高Ｆｅ－脂質キャリア製剤（１００ｍｌスケールで調製）：高Ｆｅ－脂質キャリア製剤は、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン（ＳＥＰＰＩＣ）、３７ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、３７ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）、１ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの１５ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含む。５ｍｌのクロロホルム（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ロット番号９５－１３３）中の２０ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの直径１５ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子を、４：１のアセトン：クロロホルム（ｖ／ｖ）溶媒混合物中で磁気分離することによって、３回洗浄した。３回目の洗浄後、揮発性溶媒（アセトンおよびクロロホルム）を、ドラフト中で完全に蒸発させて、乾燥オレイン酸酸化鉄ナノ粒子のコーティングが残った。この酸化鉄コーティングに、３．７５グラムのスクアレン、３．７グラムのＳＰＡＮ（登録商標）６０、および３グラムのＤＯＴＡＰを添加して、油相を生成した。油相を、摂氏６５度の水浴中で４５分間超音波処理した。別々に、水相を、ヌクレアーゼを含まない水中で調製された５００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液に１９．５グラムのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を溶解することによって調製した。９２ｍｌの水相を、別々のガラスボトルに移し、摂氏６５度に３０分間加熱した。油相を、温かい油相を温かい水相に添加することによって、９２ｍｌの水相と混合した。混合物を、ＶＷＲ ２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して乳化し、得られた粗エマルジョンを、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学直径が、０．１～０．３の多分散指数（ＰＤＩ）で、４０～８０ｎｍに達するまで、３０，０００ｐｓｉで、Ｆ１２Ｙ ７５μｍのダイヤモンド相互作用チャンバーおよび補助的なＨ３０Ｚ－２００μｍのセラミック相互作用チャンバーを備えたＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させることによって処理した。マイクロフルイダイズされた製剤を、最後に、２００ｎｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過し、摂氏２～８度で貯蔵した。鉄濃度を、ＩＣＰ－ＯＥＳによって決定した。ＤＯＴＡＰおよびスクアレン濃度を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。

【0190】

Ｆｅ－脂質キャリアｍｉｇｌｙｏｌ製剤（１００ｍｌスケールで調製）：Ｆｅ－脂質キャリアｍｉｇｌｙｏｌ製剤は、３７．５ｍｇ／ｍｌのＭＩＧＬＹＯＬ（登録商標）８１２ Ｎ（ＩＯＩ Ｏｌｅｏ ＧｍｂＨ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、３７ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、３７ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）、０．２ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの１５ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含む。１ｍｌのクロロホルム（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ロット番号９５－１２７）中の２０ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの直径１５ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子を、４：１のアセトン：クロロホルム（ｖ／ｖ）溶媒混合物中で磁気分離することによって、３回洗浄した。３回目の洗浄後、揮発性溶媒（アセトンおよびクロロホルム）を、ドラフト中で完全に蒸発させて、乾燥オレイン酸酸化鉄ナノ粒子のコーティングが残った。この酸化鉄コーティングに、３．７５グラムのスクアレン、３．７グラムのＳＰＡＮ（登録商標）６０、および３グラムのＤＯＴＡＰを添加して、油相を生成した。油相を、摂氏６５度の水浴中で４５分間超音波処理した。別々に、水相を、ヌクレアーゼを含まない水中で調製された５００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液に１９．５グラムのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を溶解することによって調製した。９２ｍｌの水相を、別々のガラスボトルに移し、摂氏６５度に３０分間加熱した。油相を、温かい油相を温かい水相に添加することによって、９２ｍｌの水相と混合した。混合物を、ＶＷＲ ２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して乳化し、得られた粗エマルジョンを、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学直径が、０．１～０．３の多分散指数（ＰＤＩ）で、４０～８０ｎｍに達するまで、３０，０００ｐｓｉで、Ｆ１２Ｙ ７５μｍのダイヤモンド相互作用チャンバーおよび補助的なＨ３０Ｚ－２００μｍのセラミック相互作用チャンバーを備えたＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させることによって処理した。マイクロフルイダイズされた製剤を、最後に、２００ｎｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過し、摂氏２～８度で貯蔵した。鉄濃度を、ＩＣＰ－ＯＥＳによって決定した。ＤＯＴＡＰ濃度を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。

【0191】

高Ｆｅ－脂質キャリアｍｉｇｌｙｏｌ製剤（１００ｍｌスケールで調製）：高Ｆｅ－脂質キャリアｍｉｇｌｙｏｌ製剤は、３７．５ｍｇ／ｍｌのＭＩＧＬＹＯＬ（登録商標）８１２ Ｎ（ＩＯＩ Ｏｌｅｏ ＧｍｂＨ）、３７ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、３７ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）、１ｍｇ／ｍｌの１５ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム二水和物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含む。５ｍｌのクロロホルム（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ロット番号９５－１２７）中の２０ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの直径１５ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子を、４：１のアセトン：クロロホルム（ｖ／ｖ）溶媒混合物中で磁気分離することによって、３回洗浄した。３回目の洗浄後、揮発性溶媒（アセトンおよびクロロホルム）を、ドラフト中で完全に蒸発させて、乾燥オレイン酸酸化鉄ナノ粒子のコーティングが残った。この酸化鉄コーティングに、３．７５グラムのスクアレン、３．７グラムのＳＰＡＮ（登録商標）６０、および３グラムのＤＯＴＡＰを添加して、油相を生成した。油相を、摂氏６５度の水浴中で４５分間超音波処理した。別々に、水相を、ヌクレアーゼを含まない水中で調製された５００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液に１９．５グラムのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を溶解することによって調製した。９２ｍｌの水相を、別々のガラスボトルに移し、摂氏６５度に３０分間加熱した。油相を、温かい油相を温かい水相に添加することによって、９２ｍｌの水相と混合した。混合物を、ＶＷＲ ２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して乳化し、得られた粗エマルジョンを、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学直径が、０．１～０．３の多分散指数（ＰＤＩ）で、４０～８０ｎｍに達するまで、３０，０００ｐｓｉで、Ｆ１２Ｙ ７５μｍのダイヤモンド相互作用チャンバーおよび補助的なＨ３０Ｚ－２００μｍのセラミック相互作用チャンバーを備えたＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させることによって処理した。マイクロフルイダイズされた製剤を、最後に、２００ｎｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過し、摂氏２～８度で貯蔵した。鉄濃度を、ＩＣＰ－ＯＥＳによって決定した。ＤＯＴＡＰ濃度を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。

【0192】

ミョウバン－脂質キャリア製剤（１００ｍｌスケールで調製）：ミョウバン－脂質キャリア製剤は、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン（ＳＥＰＰＩＣ）、３７ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、３７ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）、１ｍｇ Ａｌ／ｍｌのＴＯＰＯコーティングＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）（オキシ水酸化アルミニウム）粒子（Ｃｒｏｄａ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。１０ｍｌのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを、１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、メタノール中で３回洗浄した。３回目の洗浄後、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを１０ｍｌのメタノールに分散させ、この分散液に、１ｍｌの２５０ｍｇ／ｍｌのトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）を添加し、オービタルシェーカーで、摂氏３７度で終夜インキュベートした。過剰のＴＯＰＯを、追加のメタノール洗浄によって除去し、次いで、１１ｍｌのメタノールに分散させた。メタノールを、ドラフト中で終夜蒸発させて、ＴＯＰＯ－Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌの乾燥層が残った。この乾燥ＴＯＰＯ－Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ層に、３．７５グラムのスクアレン、３．７グラムのＳＰＡＮ（登録商標）６０、および３グラムのＤＯＴＡＰを添加して、油相を生成した。油相を、摂氏６５度の水浴中で４５分間超音波処理した。別々に、水相を、ヌクレアーゼを含まない水中で調製された５００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液に１９．５グラムのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を溶解することによって調製した。９２ｍｌの水相を、別々のガラスボトルに移し、摂氏６５度に３０分間加熱した。油相を、温かい油相を温かい水相に添加することによって、９２ｍｌの水相と混合した。混合物を、ＶＷＲ ２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して乳化し、得られた粗エマルジョンを、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学直径が、０．１～０．３の多分散指数（ＰＤＩ）で、４０～８０ｎｍに達するまで、３０，０００ｐｓｉで、Ｆ１２Ｙ ７５μｍのダイヤモンド相互作用チャンバーおよび補助的なＨ３０Ｚ－２００μｍのセラミック相互作用チャンバーを備えたＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させることによって処理した。マイクロフルイダイズされた製剤を、最後に、２００ｎｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過し、摂氏２～８度で貯蔵した。アルミニウム濃度を、ＩＣＰ－ＯＥＳによって決定した。ＤＯＴＡＰおよびスクアレン濃度を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。

【0193】

Ｆｅ－脂質キャリアソラネソール製剤（１００ｍｌスケールで調製）：Ｆｅ－脂質キャリアソラネソール製剤は、３７．５ｍｇ／ｍｌのソラネソール（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、３７ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、３７ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）、０．２ｍｇ Ｆｅ／ｍｌのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。１ｍｌのクロロホルム（Ｉｍａｇｉｏｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ロット番号９５－１３３）中の２０ｍｇ Ｆｅ／ｍｌの直径１５ｎｍのオレイン酸コーティング酸化鉄ナノ粒子を、４：１のアセトン：クロロホルム（ｖ／ｖ）溶媒混合物中で磁気分離することによって、３回洗浄した。３回目の洗浄後、揮発性溶媒（アセトンおよびクロロホルム）を、ドラフト中で完全に蒸発させて、乾燥オレイン酸酸化鉄ナノ粒子のコーティングが残った。この酸化鉄コーティングに、３．７５グラムのソラネソール、３．７グラムのＳＰＡＮ（登録商標）６０、および３グラムのＤＯＴＡＰを添加して、油相を生成した。油相を、摂氏６５度の水浴中で４５分間超音波処理した。別々に、水相を、ヌクレアーゼを含まない水中で調製された５００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液に１９．５グラムのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を溶解することによって調製した。９２ｍｌの水相を、別々のガラスボトルに移し、摂氏６５度に３０分間加熱した。油相を、温かい油相を温かい水相に添加することによって、９２ｍｌの水相と混合した。混合物を、ＶＷＲ ２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して乳化し、得られた粗エマルジョンを、３０，０００ｐｓｉで、Ｆ１２Ｙ ７５μｍのダイヤモンド相互作用チャンバーおよび補助的なＨ３０Ｚ－２００μｍのセラミック相互作用チャンバーを備えたＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させることによって処理した。マイクロフルイダイズされた製剤を、最後に、２００ｎｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過し、摂氏２～８度で貯蔵した。鉄濃度を、ＩＣＰ－ＯＥＳによって決定した。ＤＯＴＡＰおよびソラネソール濃度を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。

【0194】

ＮＬＣ製剤（１００ｍｌスケールで調製）：ＮＬＣ製剤は、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン（ＳＥＰＰＩＣ）、３７ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、３７ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）、２．４ｍｇ／ｍｌのＤｙｎａｓａｎ １１４（ＩＯＩ Ｏｌｅｏ ＧｍｂＨ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。２００ｍｌのビーカーに、３．７５グラムのスクアレン、３．７グラムのＳＰＡＮ（登録商標）６０、０．２４グラムのＤｙｎａｓａｎ １１４および３グラムのＤＯＴＡＰを添加して、油相を生成した。油相を、摂氏６５度の水浴中で４５分間超音波処理した。別々に、水相を、ヌクレアーゼを含まない水中で調製された５００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液に１９．５グラムのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を溶解することによって調製した。９２ｍｌの水相を、別々のガラスボトルに移し、摂氏６５度に３０分間加熱した。油相を、温かい油相を温かい水相に添加することによって、９２ｍｌの水相と混合した。混合物を、ＶＷＲ ２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して乳化し、得られた粗エマルジョンを、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学直径が、０．１～０．３の多分散指数（ＰＤＩ）で、４０～８０ｎｍに達するまで、３０，０００ｐｓｉで、Ｆ１２Ｙ ７５μｍのダイヤモンド相互作用チャンバーおよび補助的なＨ３０Ｚ－２００μｍのセラミック相互作用チャンバーを備えたＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させることによって処理した。マイクロフルイダイズされた製剤を、最後に、２００ｎｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過し、摂氏２～８度で貯蔵した。ＤＯＴＡＰおよびスクアレン濃度を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。

【0195】

ＣＮＥ製剤（１００ｍｌスケールで調製）：ＣＮＥ製剤は、４３ｍｇ／ｍｌのスクアレン（ＳＥＰＰＩＣ）、５ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）８５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、５ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、４ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。２００ｍｌのビーカーに、４．３グラムのスクアレン、０．５グラムのＳＰＡＮ（登録商標）８５、および０．４グラムのＤＯＴＡＰを添加して、油相を生成した。油相を、摂氏６５度の水浴中で４５分間超音波処理した。別々に、水相を、ヌクレアーゼを含まない水中で調製された５００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液に２．６グラムのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を溶解することによって調製した。９５ｍｌの水相を、別々のガラスボトルに移し、摂氏６５度に３０分間加熱した。油相を、温かい油相を温かい水相に添加することによって、９５ｍｌの水相と混合した。混合物を、ＶＷＲ ２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して乳化し、得られた粗エマルジョンを、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学直径が、０．０５～０．１の多分散指数（ＰＤＩ）で、１００±１０ｎｍに達するまで、３０，０００ｐｓｉで、Ｆ１２Ｙ ７５μｍのダイヤモンド相互作用チャンバーおよび補助的なＨ３０Ｚ－２００μｍのセラミック相互作用チャンバーを備えたＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させることによって処理した。マイクロフルイダイズされた製剤を、最後に、２００ｎｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過し、摂氏２～８度で貯蔵した。ＤＯＴＡＰおよびスクアレン濃度を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。

【0196】

処置群を調製した。８つのこれらの群は、ＮａｎｏＬｕｃ ｒｅｐＲＮＡ群であり、ウェルあたり６００ｎｇ用量を、Ｆｅ－脂質キャリア、高Ｆｅ－脂質キャリア、Ｆｅ－脂質キャリアｍｉｇｌｙｏｌ、高Ｆｅ－脂質キャリアｍｉｇｌｙｏｌ、ミョウバン－脂質キャリア、Ｆｅ－脂質キャリアソラネソール（ＳＬＮ）、ＮＬＣ、およびＣＮＥ製剤を使用して調製した。未処置群は、ＮａｎｏＬｕｃを有していなかった。

【0197】

さまざまな製剤を、ＮａｎｏＬｕｃ ｒｅｐＲＮＡを２．２ｍＬのＲＮＡｓｅを含まない水に８ｎｇ／μＬに希釈することによって調製した。脂質キャリア製剤およびＲＮＡマスターミックスを、２５０μＬのそれぞれの希釈された製剤と２５０μＬの希釈されたＲＮＡを添加することによって複合体化し、上下にピペッティングすることによって混合した。

【0198】

細胞トランスフェクションを、２４ウェルプレートにおいて、ウェルあたり７×１０^５個のＴＨＰ－１ｓを播種することによって行った。ウェルあたり８０μＭのＰＭＡを添加し、摂氏３７度でインキュベートした。翌日、トランスフェクションの１時間前に、ＰＭＡ含有培地を除去し、ｃＲＰＭＩで置き換えた。次いで、試料を、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）に連続希釈して、０．４５ｎｇ／μＬで開始する１０点の１．５倍の希釈系列を作製した。次いで、培養培地を、ピペッティングによってプレートから除去した。４５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）および１５０μＬの複合体化製剤を、二反復で、プレートに添加した。空のウェルには、４５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）のみを入れた。４時間後、試料を、ピペッティングによってプレートから除去し、５００μＬの増殖培地で置き換えた。次いで、プレートを、摂氏３７度で終夜インキュベートした。増殖培地を翌日回収し、摂氏－８０度で貯蔵した。下流のアッセイを実施した。

【0199】

ルシフェラーゼアッセイを、最初にＮａｎｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬を緩衝液に１：５０で希釈することによって行った。２５μＬの上清を除去し、９６ウェルプレートにおいて、２５μＬのＮａｎｏ－Ｇｌｏ試薬と混合した。これを、室温で３分間インキュベートした。発光を読み取った。

【0200】

Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ製のヒトＴＮＦ－アルファ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡを使用して、製造業者のプロトコールに従って、ＥＬＩＳＡアッセイを行って、培地におけるＴＮＦ－アルファタンパク質レベルを評価した。９６ウェルマイクロプレートを、抗ＴＮＦ捕捉抗体でコーティングした。プレートをブロッキングし、次いで、培地試料を、希釈なしで直接添加した。ビオチン化検出抗体ＳＡ－ＨＲＰおよび基質の添加後、吸光度を、ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）ｉ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＬＬＣ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ、ＵＳＡ）プレートリーダーにおいて、４５０ｎｍで読み取った。

【0201】

この実施例におけるすべての研究は、二反復で行った。二反復からの結果を、それぞれ、第１の実験および第２の実験として表す。

【0202】

アッセイは、脂質キャリアおよびＭｉｇｌｙｏｌから構成される液体製剤が、図１３Ａにおける第１のアッセイおよび図１３Ｂにおける第２のアッセイに示されるように、レプリコンからのより高いタンパク質産生を誘導したことを実証する。ＴＮＦ－アルファ分泌によって測定されるように、自然免疫応答の低減が検出され、図１４Ａにおける第１のアッセイおよび図１４Ｂにおける第２のアッセイに示した。

【0203】

タンパク質産生の増強と低ＴＮＦ－アルファ刺激との間の相関が、図１５Ａにおける第１のアッセイおよび図１５Ｂにおける第２のアッセイに示されるように、Ｍｉｇｌｙｏｌ脂質キャリア製剤で観察された。ソラネソールは、図１５Ａにおける第１のアッセイおよび図１５Ｂにおける第２のアッセイに示されるように、わずかに低いタンパク質産生を誘導したが、潜在的に高いＴＮＦ産生を誘導した。

【0204】

図１６Ａ～１６Ｆは、種々の反復の脂質キャリア－製剤化ＤＮＡ ＳＥＡＰが筋肉内注射されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳＥＡＰレベルを図示する。図１６Ａは、４日目の相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図１６Ｂは、６日目の相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図１６Ｃは、８日目の相対発光単位（ＲＬＵ）を示す。図１６Ｄは、４日目の相対発光単位（ＲＬＵ）のコピーである。図１６Ｅは、６日目の相対発光単位（ＲＬＵ）のコピーである。図１６Ｆは、８日目の相対発光単位（ＲＬＵ）のコピーである。

【0205】

図１７は、Ｙ軸にＺ平均測定および多分散指数（ＰＤＩ）の測定値、ならびに条件１～１４についてＸ軸に群番号を有する棒グラフである。

【0206】

図１８Ａ～１８Ｂは、Ｙ軸にＩｇＧ（μｇ／ｍｌ）、条件１～１４についてＸ軸に群番号を有するドットチャートであり、記録は、それぞれ、１４日目の抗Ｄ６１４Ｇ（１：４０希釈）および２８日目の抗Ｄ６１４Ｇ（１：２００希釈）での測定について示す。

【0207】

図１９は、Ｙ軸に抗Ｄ６１４Ｇ（１：２００希釈）のＩｇＧ（μｇ／ｍｌ）測定値、およびＸ軸に貯蔵条件の指示を有する、２８日目のドットチャートを示す。

【0208】

製剤間の他の主な相違は観察されなかった。これは、脂質キャリアおよびｍｉｇｌｙｏｌから構成される製剤（Ｆｅ－脂質キャリアｍｉｇｌｙｏｌ）が、限定されるものではないが、抗ウイルス療法およびがん療法などの治療的適用における見込みがある製剤であることを示唆する。そのような治療的適用では、限定されるものではないが、治療用タンパク質または抗体のｉｎ ｖｉｖｏ産生などの高いタンパク質産生および低い免疫刺激が望ましい。
（実施例９）
マウスにおけるＤＮＡ（ＳＥＡＰ）生物活性。

【0209】

この実施例は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける脂質キャリアおよびＤＮＡ（ＳＥＡＰ）の生物活性に対する注射された用量の影響を研究する。動態、持続期間および大きさを研究した。材料：摂氏－２０度のＳＥＡＰをコードするＤＮＡ（供給業者：Ａｌｄｅｖｒｏｎ；カタログ番号：ｇＷｉｚ－ＳＥＡＰ、ロット番号：３８６１１）、５ｍｇ／ｍＬ、摂氏－８０度のＳＥＡＰをコードするｒｅｐＲＮＡ（配列番号１）、２２１７μｇ／ｍＬ、および摂氏４度の脂質キャリア製剤（３０ｍｇ ＤＯＴＡＰ／ｍｌ）をこの実施例で使用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、表１４にリストされる処置群で、記載の通り接種し、その後、ＳＥＡＰレベルを血清中で測定した。

【表14】

【0210】

７つの異なる製剤を調製し、７つの処置群（群１～７）にわたって筋肉内投与した。ＤＮＡ－ＳＥＡＰまたはＲＮＡ－ＳＥＡＰを、表１５に示される体積セットに従って希釈して、群１～７のための製剤を調製した。

【表15】

【0211】

脂質キャリアと複合体化する前の希釈されたＤＮＡまたはＲＮＡの濃度は、以下の通りであった（ＮａｎｏＤｒｏｐ ｓｐｅｃによって測定）：群１、４および５は約８２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含有し；群２および３は約４８０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含有し；群６および７は約４３μｇ／ｍｌのＲＮＡを含有した。群１～６についての製剤を、下記の表１６に示されるように、１００ｍＭのクエン酸塩で希釈した。

【表16】

【0212】

上記の製剤を、２５０μｌの希釈された脂質キャリアを２５０μｌの希釈されたＤＮＡまたはＲＮＡに添加することによって複合体化した。得られた複合体化製剤を、氷上で少なくとも３０分間インキュベートした。表１７は、このアッセイのためのスケジュールを示す。

【表17】

【0213】

マウスを定期的な間隔で採血し、血清を直ぐに調製し、ＳＥＡＰ活性のための分析まで、摂氏－８０度で貯蔵した。

【0214】

血清におけるＳＥＡＰレベルを評価するために、すべての血清試料を同じ時に解凍し、ＳＥＡＰ検出を実施した。図１６Ａ～１６Ｆは、種々の反復の脂質キャリア－製剤化ＤＮＡ ＳＥＡＰが筋肉内注射されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＳＥＡＰレベルを図示する。マウスを定期的な間隔で採血し、血清を調製し、ＳＥＡＰアッセイによる分析まで貯蔵した。データは、平均およびＳＥで示す（群あたりｎ＝５）。

【0215】

図１６Ａ～１６Ｆから分かるように、脂質キャリア製剤は、特に注射後６日目後に、ＤＮＡ単独の送達よりも標的タンパク質産生を支援する。加えて、この実施例は、ｍｉｇｌｙｏｌの包含が、ｍｉｇｌｙｏｌを欠く脂質キャリア製剤よりもＲＮＡレプリコンからのタンパク質産生を増強することを示す。
（実施例１０）
無機コアなしの脂質キャリアの製剤。

【0216】

無機コアなしの脂質キャリアの製剤を１００ｍｌスケールで調製した。無機コアなしの脂質キャリアは、３７．５ｍｇ／ｍｌのスクアレン（ＳＥＰＰＩＣ）、３７ｍｇ／ｍｌのＳＰＡＮ（登録商標）６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、３７ｍｇ／ｍｌのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、３０ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰクロリド（ＬＩＰＯＩＤ）および１０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む。２００ｍｌのビーカーに、３．７５グラムのスクアレン、３．７グラムのＳＰＡＮ（登録商標）６０、および３．０グラムのＤＯＴＡＰを添加して、油相を生成した。油相を、摂氏６５度の水浴中で４５分間超音波処理した。別々に、水相を、ヌクレアーゼを含まない水中で調製された５００ｍｌの１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液に１９．５グラムのＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を溶解することによって調製した。９６ｍｌの水相を、別々のガラスボトルに移し、摂氏６５度に３０分間加熱した。油相を、温かい油相を温かい水相に添加することによって、９６ｍｌの水相と混合した。混合物を、ＶＷＲ ２００ホモジナイザー（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して乳化し、得られた粗エマルジョンを、動的光散乱（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓ）によって測定されるｚ平均流体力学直径が、０．１～０．３の多分散指数（ＰＤＩ）で、４０～８０ｎｍに達するまで、３０，０００ｐｓｉで、Ｆ１２Ｙ ７５μｍのダイヤモンド相互作用チャンバーおよび補助的なＨ３０Ｚ－２００μｍのセラミック相互作用チャンバーを備えたＭ１１０Ｐマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を通過させることによって処理した。無機コアなし製剤のマイクロフルイダイズされた製剤を、最後に、２００ｎｍの細孔サイズのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターで濾過し、摂氏２～８度で貯蔵した。ＤＯＴＡＰおよびスクアレン濃度を、ＲＰ－ＨＰＬＣによって測定した。
（実施例１１）
追加のナノ粒子製剤

【0217】

追加のナノ粒子製剤を、以下の表（表１８および表１９）に従って生成する。

【表18】

【表19】

（実施例１６）
マウスにおける凍結乾燥ＣＯＶＩＤワクチンの評価

【0218】

以下を行って、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク抗原配列をコードするレプリコンＲＮＡを有する凍結乾燥ＮＰ－１の活性、再構成されたワクチンの物理化学的性質、効力、および免疫原性をアッセイした。簡潔には、表２０における材料を使用した。

【表20】

【0219】

製剤複合体の調製。脂質ナノ粒子／ＲＮＡ複合体の組成物を、下記の表２１に示されるように、このアッセイにおいて調製した。ＮＰ－１またはＮＰ－７およびｒｅｐＲＮＡを、１５のＮのＰに対する比で複合体化し、それぞれ、５０ｍｇ／ｍｌまたは１００ｍｇ／ｍｌ（「２×」材料）の最終ｒｅｐＲＮＡ濃度、および１０％または２０％ｗ／ｖのスクロース含有量を得るために複合体化した。１０％のスクロースを有する複合体化材料（５０ｍｇ／ｍｌのｒｅｐＲＮＡ）は、５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含有したが、２０％のスクロースを有する複合体化材料（１００ｍｇ／ｍｌのｒｅｐＲＮＡ）は、１０ｍＭのクエン酸塩を含有した。複合体を、２ｍｌの無菌の脱パイロジェン化した焼成バイアルに充填した。１０％のスクロースを有する複合体をバイアルあたり０．７ｍｌで、２０％のスクロースを有する複合体をバイアルあたり０．３５ｍｌで充填した。次いで、バイアルを凍結乾燥し貯蔵したか、または液体形態のままで貯蔵した。貯蔵温度は、摂氏２５度または摂氏４２度で１週間であった。組成物ごとの凍結乾燥バイアルおよび液体バイアルの量を表２１に要約する。

【表21】

【0220】

凍結乾燥サイクル。ＳＰ ＶｉｒＴｉｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｐｒｏトレイおよび不活性ガスで満たされたバッチ凍結乾燥機およびストッパー能力を使用した。凍結乾燥サイクルの概要を下記の表２２に示す。サイクルの終了後、バイアルを４８ｔｏｒｒの窒素で充填し、栓をした後、室内圧力に平衡化した。

【表22】

【0221】

条件群。このアッセイで分析された１４群の概要を下記の表２３に提供する。群１および４は、貯蔵の欄に示されるように、ワクチン調製のための標準的なプロトコールとの比較のための陽性対照としての役割を果たすように、新たに調製した。

【表23】

【0222】

免疫原性アッセイ。抗スパイクＩｇＧ応答の誘導を、６～８週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて評価した。５頭のマウスの群のサイズを使用した。スケジュールを表２４に示す。

【表24】

【0223】

摂氏２５度または摂氏４２度の安定性チャンバーにおける１週間の貯蔵後。凍結乾燥ナノ粒子／ＲＮＡ複合体を、０．７ｍｌの無菌ｍｉｌｌｉＱ水で再構成し、粒子が肉眼で見えなくなるまで穏やかに回転させた。複合体の粒子径（ｚ平均）およびサイズ分布（ＰＤＩ）を測定し、図１７に要約し、群の指定を表２５に示した。新たに調製されたＮＰ－１／ＷＴ－Ｓ複合体（群１）の粒子径およびＰＤＩは、それぞれ、７６．８ｎｍおよび０．２２３であった。再構成後、凍結乾燥試料（群７～１４）は、平均で４５％（＋／－１１％）成長した。群１と比べたｚ平均の変化％の概要を表２５に含めた。

【表25】

【0224】

フェノール－クロロホルム抽出ｒｅｐＲＮＡのアガロースゲル電気泳動。１０％のスクロースまたは２０％のスクロースにおけるＮＰ－１／ｒｅｐＲＮＡおよびＮＰ－７＋ｒｅｐＲＮＡの液体製剤を、ＮＰ－１／ｒｅｐＲＮＡおよびＮＰ－７＋ｒｅｐＲＮＡで１週間貯蔵し、それぞれ、ｒｅｐＲＮＡ産物の部分的または完全な分解をもたらした（データは示さない）。１０％のスクロースまたは２０％のスクロースにおけるＮＰ－１／ｒｅｐＲＮＡおよびＮＰ－７＋ｒｅｐＲＮＡの凍結乾燥は、ＮＰ－１／ｒｅｐＲＮＡおよびＮＰ－７＋ｒｅｐＲＮＡで１週間の貯蔵後にｒｅｐＲＮＡ完全性を保存した（データは示さない）。

【0225】

効力アッセイ。摂氏２５度で１週間貯蔵された１０％のスクロースにおける凍結乾燥ＮＰ－１／ＷＴ－Ｓは、トランスフェクトＢＨＫ細胞において、スパイクタンパク質の用量依存性の発現を生じた。発現プロファイルは、新たに複合体化されたＮＰ－１／ＷＴ－Ｓと類似していた。１０％のスクロースにおける凍結乾燥ＮＰ－１／ＷＴ－Ｓの摂氏４２度での１週間の貯蔵は、ｉｎ ｖｉｔｒｏタンパク質発現を有意に低減した。摂氏２５度または摂氏４２度で１週間貯蔵された１０％のスクロースにおける液体ＮＰ－１／ＷＴ－Ｓは、ＢＨＫ細胞においてスパイクタンパク質を産生しなかった（データは示さない）。

【0226】

ＥＬＩＳＡによる抗Ｄ６１４ＧスパイクＩｇＧ応答。血清抗Ｄ６１４ＧスパイクＩｇＧレベルを、それぞれ、図１８Ａおよび１８Ｂで下記に示す、プライム後１４日目および２８日目に評価した。マウス血清を、１：４０（１４日目）または１：２００（２８日目）希釈で、抗Ｄ６１４ＧスパイクＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。血清ＩｇＧレベル（μｇ／ｍｌ）を、既知濃度のマウスＩｇＧ標準によって作製された４ＰＬ標準曲線から内挿した。

【0227】

プライム後２８日目の抗Ｄ６１４Ｇ ＩｇＧ応答。摂氏２５度で１週間後、１０％のスクロースにおける液体ＮＰ－１／ＷＴ－Ｓは、新たに調製されたＮＰ－１／ＷＴ－Ｓ陽性対照と比較して、抗スパイクＩｇＧの統計学的に有意な低減をもたらした。摂氏２５度で１週間貯蔵された１０％のスクロースにおける新たに調製されたＮＰ－１／ＷＴ－Ｓおよび凍結乾燥ＮＰ－１／ＷＴ－Ｓの間の平均ＩｇＧレベルに有意差はなかった。

【0228】

摂氏４２度で１週間後、１０％のスクロースにおける凍結乾燥ＮＰ－１／ＷＴ－Ｓは、１００％の抗体陽転を誘導したが、平均ＩｇＧレベルは、新たに調製されたＮＰ－１／ＷＴ－Ｓと比較して、有意に低減された。新たに調製されたＮＰ－１／ＷＴ－Ｓ陽性対照に対して比較する通常の一元配置分散分析によって決定されたｐ値を含む、免疫化後２８日目からの平均＋／－標準偏差ＩｇＧ濃度データの要約を表２６に示した。Ｐ＜０．０５は、考慮される統計学的有意差である。

【表26】

【0229】

新鮮な製剤対凍結乾燥製剤の比較。プライム後２８日目の血清における抗Ｄ６１４ＧスパイクＩｇＧ濃度を図１９に示す。平均ＩｇＧ値間の統計学的な差を、ダネットの多重比較検定を伴う通常の一元配置分散分析によって決定した。すべての群を、１０％のスクロースにおける新たに調製されたＮＰ－１／ＲＮＡと比較した。有意差は、摂氏２５度で７日間貯蔵された１０％のスクロースにおける新たに調製されたＮＰ－１／ＲＮＡおよび凍結乾燥ＮＰ－１／ＲＮＡの間で示されなかった。摂氏４２度で、１０％または２０％のスクロースにおける凍結乾燥ＮＰ－１／ＲＮＡは、新たに調製されたＮＰ－１／ＲＮＡと比較して、有意に低い抗スパイクＩｇＧを誘導した。摂氏２５度または４２度で貯蔵された２０％のスクロースにおける凍結乾燥ＮＰ－１／ＲＮＡは、新たに調製されたＮＰ－１／ＷＴ－Ｓよりも有意に低いＩｇＧを誘導した。摂氏２５度で貯蔵された１０％または２０％のスクロースにおける凍結乾燥ＮＰ－１／Ｄｅｌｔａ－Ｓは、新たに調製されたＮＰ－１／ＷＴ－Ｓと類似の平均ＩｇＧ（統計学的に有意ではない）を誘導した。

【0230】

特許文献および非特許文献を含む本明細書に開示されるすべての参考文献は、それぞれが個々に組み込まれたかのように、それらの全体が、これにより参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で使用される専門用語が、単に具体的な実施形態を記載する目的のものであり、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用される専門用語が、関連する技術分野において公知のその従来の意味を与えるべきであることがさらに理解されるべきである。

【化1】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

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【国際調査報告】