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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-30
(54)【発明の名称】ＴＰＯ模倣融合タンパク質および使用方法
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240920BHJP
A61K 38/17 20060101ALI20240920BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240920BHJP
A61P 7/04 20060101ALI20240920BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240920BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240920BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240920BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20240920BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240920BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240920BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240920BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240920BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240920BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240920BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240920BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240920BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240920BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240920BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
A61K38/17
A61K48/00
A61P7/04
A61P1/16
A61P35/00
A61P37/06
C07K16/24 ZNA
C07K14/47
C07K16/46
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N7/01
C12P21/08
C12P21/02 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518407
(86)(22)【出願日】2022-09-23
(85)【翻訳文提出日】2024-04-18
(86)【国際出願番号】 CN2022120948
(87)【国際公開番号】W WO2023046085
(87)【国際公開日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/120388
(32)【優先日】2021-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522480621
【氏名又は名称】シチュアン クロバー バイオファーマシューティカルズ，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】100091683
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼川 俊雄
(74)【代理人】
【識別番号】100179316
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 寛奈
(72)【発明者】
【氏名】リアン，ペン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA90X
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4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
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4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA31
4C084BA35
4C084BA41
4C084DA25
4C084DA45
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4C084MA52
4C084MA56
4C084MA57
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4C084MA67
4C084NA14
4C084ZA53
4C084ZA75
4C084ZB02
4C084ZB08
4C084ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、いくつかの態様において、ＴＰＯ受容体（ＴＰＯＲ）アゴニストとしてのトロンボポエチン模倣ペプチドのような、トロンボポエチン（ＴＰＯ）活性を有する組換えペプチドおよびタンパク質に関する。いくつかの態様において、前記組換えペプチドまたはタンパク質は、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片を介して連結した組換えヒトｐ７５ ＴＮＦ受容体およびＴＰＯ模倣ペプチドを含む。いくつかの態様において、前記組換えペプチドは、Ｆｃ領域の鎖間ジスルフィド結合を通じてホモ二量体を形成し、Ｃ末端の六つのＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインを含む。いくつかの態様において、本発明によって提供される組換えペプチドまたはタンパク質は、血小板減少症の治療のような、血小板数を増加させるために使用されることができる。本発明は、前記組換えペプチドおよびタンパク質を産生するための方法、製剤および治療方法をさらに提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）結合および／または阻害部分、ならびにトロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ）結合および／または活性化部分を含む、ポリペプチド。
【請求項2】
前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ＴＮＦ－αに結合したＴＮＦＲ部分または抗ＴＮＦ－α抗体またはその抗原結合断片であり、ここで、前記ＴＰＯＲ結合および／または活性化部分は、ＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインを含むことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項3】
前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ヒトＴＮＦＲ２（ｐ７５）もしくはその機能的断片もしくは変異体またはヒトＴＮＦＲ１（ｐ５５）もしくはその機能的断片もしくは変異体を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項4】
前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外部分であることを特徴とする、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項5】
前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、インフリキシマブ（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、ゴリムマブ（例えば、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、アダリムマブ（例えば、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、および／またはセルトリズマブ（例えば、Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片であるか、または含むことを特徴とする、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項6】
前記ＴＰＯＲ結合および／または活性化部分は、一つ、二つ、三つまたはそれ以上のＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインを含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項7】
二つのＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメイン間の一つまたは複数のスペーサーを含むことを特徴とする、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項8】
前記ＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインは、ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）に由来することを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項9】
前記ＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインは、ヒトトロンボポエチン模倣（ＴＰＭ）ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項10】
前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、免疫グロブリンＦｃ部分を介して前記ＴＰＯＲ結合および／または活性化部分に連結されることを特徴とする、請求項１～９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項11】
前記免疫グロブリンＦｃ部分は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡもしくはＩｇＥのＦｃ領域またはその断片または変異体を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項12】
前記免疫グロブリンＦｃ部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＦｃ領域またはその断片または変異体を含むことを特徴とする、請求項１０または１１に記載のポリペプチド。
【請求項13】
前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、前記免疫グロブリンＦｃ部分に融合され、前記免疫グロブリンＦｃ部分は、前記ＴＰＯＲ結合および／または活性化部分にさらに融合されることを特徴とする、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項14】
前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分のＣ末端は、前記免疫グロブリンＦｃ部分のＮ末端に融合され、前記免疫グロブリンＦｃ部分のＣ末端は、前記ＴＰＯＲ結合および／または活性化部分のＮ末端に融合されることを特徴とする、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項15】
以下の分子式の配列を含み、ＴＮＦＲ－Ｆｃ－（Ｓ１）ｍ－ＴＰＯＲＢＤ１－（Ｓ２）ｎ－ＴＰＯＲＢＤ２－（Ｓ３）ｐ－ＴＰＯＲＢＤ３
ここで、
ＴＮＦＲは、腫瘍壊死因子受容体またはその断片または変異体であり、
Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域またはその断片または変異体であり、
ＴＰＯＲＢＤ１、ＴＰＯＲＢＤ２およびＴＰＯＲＢＤ３は、同じまたは異なるＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、同じまたは異なるスペーサーであり、
ｍ、ｎおよびｐは、０以上であり、互いに独立した整数であることを特徴とする、請求項１～１４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項16】
前記ＴＮＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項17】
前記Ｆｃは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項18】
野生型ヒトＦｃと比較して、前記Ｆｃは、少なくとも一つのＮ－グリコシル化部位突然変異を含み、選択可能で、前記Ｎ－グリコシル化部位突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＮ３１７に対応するＫａｂａｔ番号付けＮ３１４（ＥＵ番号付けＮ２９７）に位置することを特徴とする、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項19】
ｍ、ｎおよびｐは、１～１０から独立して選択されることを特徴とする、請求項１４～１８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項20】
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれペプチドリンカーであることを特徴とする、請求項１４～１９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項21】
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ、複数のグリシン、アラニン、セリンおよび／またはロイシン残基を含むことを特徴とする、請求項１４～２０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項22】
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ、少なくとも五つの連続したグリシン残基を含むことを特徴とする、請求項１４～２１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項23】
ＴＰＯＲＢＤ１、ＴＰＯＲＢＤ２およびＴＰＯＲＢＤ３は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１４～２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項24】
（Ｓ１）ｍ－ＴＰＯＲＢＤ１－（Ｓ２）ｎ－ＴＰＯＲＢＤ２－（Ｓ３）ｐ－ＴＰＯＲＢＤ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１４～２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項25】
前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１４～２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項26】
シグナルペプチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１４～２５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項27】
前記シグナルペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項28】
前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、請求項１４～２７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項29】
前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けされたＣ１８－Ｃ３１、Ｃ３２－Ｃ４５、Ｃ３５－Ｃ５３、Ｃ５６－Ｃ７１、Ｃ７８－Ｃ８８、Ｃ７８－Ｃ９６、Ｃ９８－Ｃ１０４、Ｃ１１２－Ｃ１２１、Ｃ１１５－Ｃ１３９、Ｃ１４２－Ｃ１５７、Ｃ１６３－Ｃ１７８、Ｃ２８１－Ｃ３４１およびＣ３８７－Ｃ４４５の少なくとも一つ、少なくとも二つまたはすべてのポリペプチド内ジスルフィド結合対を含むことを特徴とする、請求項１４～２８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項30】
前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けされたＣ２４０、Ｃ２４６および／またはＣ２４９でポリペプチド間ジスルフィド結合を形成することができることを特徴とする、請求項１４～２９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項31】
請求項１～３０のいずれか１項に記載のポリペプチドの二量体を含む錯体。
【請求項32】
二つのポリペプチド分子間の一つまたは複数のポリペプチド間ジスルフィド結合を通じて前記二量体を形成することを特徴とする、請求項３１に記載の錯体。
【請求項33】
前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列を含み、前記錯体は、Ｃ１８－Ｃ３１、Ｃ３２－Ｃ４５、Ｃ３５－Ｃ５３、Ｃ５６－Ｃ７１、Ｃ７８－Ｃ８８、Ｃ７８－Ｃ９６、Ｃ９８－Ｃ１０４、Ｃ１１２－Ｃ１２１、Ｃ１１５－Ｃ１３９、Ｃ１４２－Ｃ１５７、Ｃ１６３－Ｃ１７８、Ｃ２８１－Ｃ３４１およびＣ３８７－Ｃ４４５のうちの一つまたは複数のポリペプチド内ジスルフィド結合を含み、前記錯体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けされたＣ２４０－Ｃ２４０、Ｃ２４６－Ｃ２４６およびＣ２４９－Ｃ２４９のうちの一つまたは複数のポリペプチド間ジスルフィド結合を含むことを特徴とする、請求項３１または３２に記載の錯体。
【請求項34】
請求項１～３０のいずれか１項に記載のポリペプチドおよび／または請求項３１～３３のいずれか１項に記載の錯体、ならびに薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項35】
請求項３４に記載の医薬組成物、および前記医薬組成物を使用して疾患または病症を治療する説明書を含むキット。
【請求項36】
請求項１～３０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする、および／または請求項３１～３３のいずれか１項に記載の錯体を産生するために示される、単離された核酸。
【請求項37】
ＴＮＦ結合および／または阻害部分をコードする第１の核酸配列および免疫グロブリンＦｃ部分をコードする第２の核酸配列は、インフレームに位置し、前記第２の核酸配列およびＴＰＯＲ結合および／または活性化部分をコードする第３の核酸配列は、インフレームに位置することを特徴とする、請求項３６に記載の単離された核酸。
【請求項38】
前記単離された核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結されることを特徴とする、請求項３６または３７に記載の単離された核酸。
【請求項39】
前記単離された核酸は、ＤＮＡ分子であることを特徴とする、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の単離された核酸。
【請求項40】
前記単離された核酸は、ＲＮＡ分子であり、選択可能に、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ、非増幅ｍＲＮＡ、自己増幅ｍＲＮＡまたはトランス増幅ｍＲＮＡのようなｍＲＮＡ分子であることを特徴とする、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の単離された核酸。
【請求項41】
請求項３６～４０のいずれか１項に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項42】
請求項３６～４０のいずれか１項に記載の単離された核酸および／または請求項４１に記載のベクターを含み、選択可能で、前記細胞は、哺乳動物細胞であり、選択可能で、前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である、顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造。
【請求項43】
前記組換え融合タンパク質を産生するのに適した条件下で請求項４２に記載の細胞を培養することを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるポリペプチド配列を含む組換え融合タンパク質を産生するための方法。
【請求項44】
必要とする被験者の疾患または症状の治療に使用される、請求項１～３０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の錯体、請求項３４に記載の医薬組成物、請求項３５に記載のキット、請求項３６～４０のいずれか１項に記載の単離された核酸、請求項４１に記載のベクターおよび／または請求項４２に記載の顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造の用途。
【請求項45】
必要とする被験者の疾患または病症を治療するための薬物の生産における、請求項１～３０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の錯体、請求項３４に記載の医薬組成物、請求項３５に記載のキット、請求項３６～４０のいずれか１項に記載の単離された核酸、請求項４１に記載のベクターおよび／または請求項４２に記載の顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造の用途。
【請求項46】
被験者に有効量の請求項１～３０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の錯体、請求項３４に記載の医薬組成物、請求項３５に記載のキット、請求項３６～４０のいずれか１項に記載の単離された核酸、請求項４１に記載のベクターおよび／または請求項４２に記載の顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造を投与することを含む、必要とする被験者の疾患または病症を治療するための方法。
【請求項47】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む有効量の組換え融合タンパク質を被験者に投与することを含む、必要とする被験者を治療するための方法。
【請求項48】
前記組換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列を有するポリペプチドの二量体を含むことを特徴とする、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記被験者の巨核球および／または血小板のレベルは、投与後に増加されることを特徴とする、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項50】
投与前、参照レベルと比較して、前記被験者は、より低い巨核球および／または血小板のレベルを有するか、有する傾向があるか、または有すると予想されることを特徴とする、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
投与前、前記被験者は、血小板減少症を患っていることを特徴とする、請求項４７～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記血小板減少症は、免疫性疾患、肝臓の炎症および／または損傷、薬物療法、放射線療法および／または手術によって引き起こされ、および／またはそれに関連して生じることを特徴とする、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記血小板減少症は、肝線維症、脂肪肝、肝炎（例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）によって引き起こされ、および／またはそれに関しることを特徴とする、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項54】
前記血小板減少症は、免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、ＩＴＰ）によって引き起こされ、および／またはそれに関し生じ、選択可能で、前記ＩＴＰは、慢性ＩＴＰであることを特徴とする、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項55】
前記血小板減少症は、化学療法、免疫腫瘍学療法または化学療法と免疫腫瘍学療法との組み合わせによって引き起こされ、および／またはそれに関し、選択可能で、前記免疫腫瘍学療法は、免疫チェックポイント阻害剤療法であることを特徴とする、請求項５１～５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項56】
前記血小板減少症は、化学療法誘発性血小板減少症（ＣＩＴ）であることを特徴とする、請求項５１～５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
前記血小板減少症は、カルボプラチン、および／またはニボルマブ、ペンブロリズマブ、ドスタルリマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブまたはセミプリマブまたはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片の薬物の治療によって引き起こされ、および／またはそれに関しることを特徴とする、請求項５１～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
前記組換え融合タンパク質は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、埋め込み、吸入、くも膜下腔内、心室内または鼻腔内経路によって投与されることを特徴とする、請求項４７～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項59】
前記組換え融合タンパク質は、単回投与されるか、または一つまたは複数の間隔で複数回投与されることを特徴とする、請求項４７～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
前記組換え融合タンパク質は、週に１回投与されることを特徴とする、請求項４７～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
前記組換え融合タンパク質は、週に２回投与されることを特徴とする、請求項４７～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
前記組換え融合タンパク質は、２週間ごとに、またはそれ以上の間隔で１回投与されることを特徴とする、請求項４７～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項63】
前記組換え融合タンパク質は、化学療法、免疫腫瘍学療法または化学療法と免疫腫瘍学療法との組み合わせの最初の投与から２４時間以内に投与されることを特徴とする、請求項４７～６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項64】
前記組換え融合タンパク質は、体重に基づいて０．０１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする、請求項４７～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
前記組換え融合タンパク質は、体重に基づいて０．１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されることを特徴とする、請求項４７～５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項66】
前記被験者は、癌、腫瘍および／または自己免疫性疾患を患っていることを特徴とする、請求項４４～６４のいずれか１項に記載の用途または方法。
【請求項67】
前記被験者の血小板産生は、刺激され、前記被験者体内において、巨核球を攻撃する細胞の増殖および／または活性は、下方制御されることを特徴とする、請求項４４～６６のいずれか１項に記載の用途または方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
ＡＳＣＩＩテキストファイルとしての配列表の提出
【0002】
ＡＳＣＩＩテキストファイル提出の内容は、その全体が参照により組み込まれ、本発明の一部となる：配列表のコンピューター可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：１６５７６２００１２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年９月２４日、大きさ：２３ＫＢ）。
【0003】
本開示は、いくつかの態様において、トロンボポエチン（ＴＰＯ）活性（例えば、トロンボポエチン受容体アゴニストおよび／またはトロンボポエチン模倣ペプチド）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）受容体活性を有する融合ペプチドおよびタンパク質、ならびにそのような組換えペプチドおよびタンパク質を使用して血小板および／またはその前駆体の産生を増加させるための、血小板減少症を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【0004】
血小板減少症には、自己免疫性疾患（例えば、慢性免疫性（特発性）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ））、化学療法（例えば、化学療法誘発性血小板減少症（ＣＩＴ））、免疫腫瘍学療法および肝臓の炎症または損傷を含む様々な病因がある。血小板輸血で重度の血小板減少症を改善することができる。しかしながら、血小板輸血を繰り返すと重篤な副作用が生じ、さらに血小板減少症が悪化する可能性がある。さらに、血小板の供給には限界がある。さらに、現在血小板減少症に使用できる薬物は、安全性のリスクによって制限されるか、または非常に頻繁な投与を必要とする。従って、血小板減少症の治療に対するニーズは、依然として満たされていない。腫瘍患者は、治療体験および生活の質を向上させるために、より安全、より効率的、より経済的、より便利な血小板減少症の治療法を必要とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
いくつかの実施例において、本発明は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）結合および／または阻害部分、ならびにトロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ）結合および／または活性化部分を含むポリペプチドを開示する。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ＴＮＦ－αに結合したＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）部分または抗ＴＮＦ－α抗体またはその抗原結合断片であり、ここで、前記ＴＰＯＲ結合および／または活性化部分可は、ＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインを含む。
【0006】
本発明の任意の実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ヒトＴＮＦＲ２（ｐ７５）もしくはその機能的断片もしくは変異体またはヒトＴＮＦＲ１（ｐ５５）もしくはその機能的断片もしくは変異体を含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分（例えば、ＴＮＦＲ部分）は、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外部分であり得る。本発明の任意の実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、インフリキシマブ（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、ゴリムマブ（例えば、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、アダリムマブ（例えば、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、セルトリズマブ（例えば、Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片を含む。
【0007】
本発明の任意の実施例において、前記ＴＰＯＲ結合および／または活性化部分は、一つ、二つ、三つまたはそれ以上のＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインを含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記ポリペプチドは、二つのＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメイン間の一つまたは複数のスペーサーを含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記ＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインは、ヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）に由来することができる。本発明の任意の実施例において、前記ＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインは、ヒトトロンボポエチン模倣（ＴＰＭ）ペプチドを含むことができる。
【0008】
本発明の任意の実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分および前記ＴＰＯＲ結合および／または活性化部分は、免疫グロブリンＦｃ部分を介して連結されることができる。本発明の任意の実施例において、前記免疫グロブリンＦｃ部分は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡもしくはＩｇＥのＦｃ領域またはその断片または変異体を含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記免疫グロブリンＦｃ部分は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＦｃ領域またはその断片または変異体を含むことができる。
【0009】
本発明の任意の実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、前記免疫グロブリンＦｃ部分に融合されることができ、前記免疫グロブリンＦｃ部分は、前記ＴＰＯＲ結合および／または活性化部分にさらに融合されることができる。本発明の任意の実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分のＣ末端は、前記免疫グロブリンＦｃ部分のＮ末端に融合されることができ、并且前記免疫グロブリンＦｃ部分のＣ末端は、前記ＴＰＯＲ結合および／または活性化部分のＮ末端に融合されることができる。
【0010】
いくつかの実施例において、本発明は、以下の分子式の配列を含むポリペプチドを開示し、ＴＮＦＲ－Ｆｃ－（Ｓ１）ｍ－ＴＰＯＲＢＤ１－（Ｓ２）ｎ－ＴＰＯＲＢＤ２－（Ｓ３）ｐ－ＴＰＯＲＢＤ３、ここで、ＴＮＦＲは、腫瘍壊死因子受容体またはその断片または変異体であり、Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域またはその断片または変異体であり、ＴＰＯＲＢＤ１、ＴＰＯＲＢＤ２およびＴＰＯＲＢＤ３は、同じまたは異なるトロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ）結合ドメインおよび／または活性化ドメインであり、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、同じまたは異なるスペーサーであり、ｍ、ｎおよびｐは、０以上であり、互いに独立した整数である。
【0011】
本発明の任意の実施例において、前記ＴＮＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
【0012】
本発明の任意の実施例において、前記Ｆｃは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。本発明の任意の実施例において、野生型ヒトＦｃと比較して、前記Ｆｃは、少なくとも一つのＮ－グリコシル化部位突然変異を含むことができ、選択可能で、前記Ｎ－グリコシル化部位突然変異は、Ｋａｂａｔ番号付けＮ３１４（ＥＵ番号付けＮ２９７）に位置する。
【0013】
本発明の任意の実施例において、ｍ、ｎおよびｐは、１～１０から独立して選択されることができる。本発明の任意の実施例において、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ、ペプチドリンカーを含むことができる。本発明の任意の実施例において、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ、複数のグリシン、アラニン、セリンおよび／またはロイシン残基を含むことができる。本発明の任意の実施例において、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ、約五つ～約八つの連続したグリシン残基を含むことができる。本発明の任意の実施例において、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３の一つまたは複数は、少なくとも五つの連続したグリシン残基を含むことができる。本発明の任意の実施例において、ＴＰＯＲＢＤ１、ＴＰＯＲＢＤ２およびＴＰＯＲＢＤ３は、それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。本発明の任意の実施例において、（Ｓ１）ｍ－ＴＰＯＲＢＤ１－（Ｓ２）ｎ－ＴＰＯＲＢＤ２－（Ｓ３）ｐ－ＴＰＯＲＢＤ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
【0014】
本発明の任意の実施例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記ポリペプチドは、シグナルペプチドを含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記シグナルペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含むことができる。
【0015】
本発明の任意の実施例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けされたＣ１８－Ｃ３１、Ｃ３２－Ｃ４５、Ｃ３５－Ｃ５３、Ｃ５６－Ｃ７１、Ｃ７８－Ｃ８８、Ｃ７８－Ｃ９６、Ｃ９８－Ｃ１０４、Ｃ１１２－Ｃ１２１、Ｃ１１５－Ｃ１３９、Ｃ１４２－Ｃ１５７、Ｃ１６３－Ｃ１７８、Ｃ２８１－Ｃ３４１およびＣ３８７－Ｃ４４５の少なくとも一つ、少なくとも二つまたはすべてのポリペプチド内ジスルフィド結合対を含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けされたＣ２４０、Ｃ２４６および／またはＣ２４９でポリペプチド間ジスルフィド結合を形成することができる。
【0016】
いくつかの実施例において、本発明は、本開示の任意の実施例に記載のポリペプチドの二量体を含む錯体を開示する。いくつかの実施例において、二つのポリペプチド分子間の一つまたは複数のポリペプチド間ジスルフィド結合を通じて前記二量体を形成する。本発明の任意の実施例において、前記錯体内のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列を含むことができ、前記錯体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けされたＣ１８－Ｃ３１、Ｃ３２－Ｃ４５、Ｃ３５－Ｃ５３、Ｃ５６－Ｃ７１、Ｃ７８－Ｃ８８、Ｃ７８－Ｃ９６、Ｃ９８－Ｃ１０４、Ｃ１１２－Ｃ１２１、Ｃ１１５－Ｃ１３９、Ｃ１４２－Ｃ１５７、Ｃ１６３－Ｃ１７８、Ｃ２８１－Ｃ３４１およびＣ３８７－Ｃ４４５のうちの一つまたは複数のポリペプチド内ジスルフィド結合を含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記錯体内のポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列を含むことができ、前記錯体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けされたＣ１８－Ｃ３１、Ｃ３２－Ｃ４５、Ｃ３５－Ｃ５３、Ｃ５６－Ｃ７１、Ｃ７８－Ｃ８８、Ｃ７８－Ｃ９６、Ｃ９８－Ｃ１１５、Ｃ１０４－Ｃ１１２、Ｃ１２１－Ｃ１３９、Ｃ１４２－Ｃ１５７、Ｃ１６３－Ｃ１７８、Ｃ２８１－Ｃ３４１およびＣ３８７－Ｃ４４５のうちの一つまたは複数のポリペプチド内ジスルフィド結合を含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記錯体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けされたＣ２４０－Ｃ２４０、Ｃ２４６－Ｃ２４６およびＣ２４９－Ｃ２４９のうちの一つまたは複数のポリペプチド間ジスルフィド結合を含むことができる。本発明の任意の実施例において、前記錯体は、組換え融合タンパク質を含むことができる。
【0017】
いくつかの実施例において、本発明は、本開示の任意の実施例に記載のポリペプチドおよび／または錯体、ならびに薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物を開示する。
【0018】
いくつかの実施例において、本発明は、本開示の任意の実施例に記載の医薬組成物、および前記医薬組成物を使用して疾患または病症を治療する説明書を含む、キットを開示する。
【0019】
いくつかの実施例において、本発明は、本開示の任意の実施例に記載のポリペプチドをコードする、および／または本開示の任意の実施例に記載の錯体を産生するために使用される、ポリヌクレオチドまたは単離された核酸を開示する。前記ポリヌクレオチドまたは単離された核酸のいくつかの実施例において、ＴＮＦ結合および／または阻害部分（例えば、ＴＮＦＲ部分）をコードする第１の核酸配列および免疫グロブリンＦｃ部分をコードする第２の核酸配列は、インフレームに位置することができ、前記第２の核酸配列およびＴＰＯＲ結合および／または活性化部分をコードする第３の核酸配列は、インフレームに位置することができる。本発明の任意の実施例において、前記単離された核酸は、プロモーター配列に作動可能に連結されることができる。本発明の任意の実施例において、前記単離された核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。本発明の任意の実施例において、前記単離された核酸は、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ、非増幅ｍＲＮＡ、自己増幅ｍＲＮＡまたはトランス増幅ｍＲＮＡのようなｍＲＮＡ分子を含むことができる。
【0020】
いくつかの実施例において、本発明は、本開示の任意の実施例に記載の単離された核酸を含む、ベクターを開示する。いくつかの実施例において、本発明は、前記単離された核酸および／またはベクターを含む、顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造を開示する。本発明の任意の実施例において、前記細胞は、哺乳動物細胞であり得、前記哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞であり得る。
【0021】
いくつかの実施例において、本発明は、前記組換え融合タンパク質を産生するのに適した条件下で細胞を培養することを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるポリペプチド配列を含む組換え融合タンパク質を産生するための方法を開示する。
【0022】
いくつかの実施例において、本発明は、必要とする被験者の疾患または病症の治療に使用される、および／または前記疾患または病症を治療するための薬物を調製する、前記ポリペプチド、錯体、医薬組成物、キット、単離された核酸、ベクターおよび／または顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造を開示する。
【0023】
いくつかの実施例において、本発明は、必要とする被験者の疾患または病症の治療に使用される、前記ポリペプチド、錯体、医薬組成物、キット、単離された核酸、ベクターおよび／または顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造の用途を開示する。
【0024】
いくつかの実施例において、本発明は、必要とする被験者の疾患または病症を治療するための薬物の生産における、前記ポリペプチド、錯体、医薬組成物、キット、単離された核酸、ベクターおよび／または顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造の用途を開示する。
【0025】
いくつかの実施例において、本発明は、被験者に有効量の前記ポリペプチド、錯体、医薬組成物、キット、単離された核酸、ベクターおよび／または顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造を投与することを含む、必要とする被験者の疾患または病症を治療するための方法を開示する。
【0026】
いくつかの実施例において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の配列同一性を有する配列を含む有効量の組換え融合タンパク質を被験者に投与することを含む、必要とする被験者を治療するための方法を開示する。
【0027】
本発明の任意の実施例において、前記組換え融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列を有するポリペプチドの二量体を含む。
【0028】
本発明の任意の実施例において、前記被験者の巨核球および／または血小板のレベルは、前記ポリペプチド、錯体（例えば、組換え融合タンパク質）、医薬組成物、キット、単離された核酸、ベクターおよび／または顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造の投与後に増加される。
【0029】
本発明の任意の実施例において、投与前、参照レベルと比較して、前記被験者は、より低い巨核球および／または血小板のレベルを有するか、有する傾向があるか、または有すると予想されることができる。本発明の任意の実施例において、投与前、前記被験者は、血小板減少症を患っている可能性がある。いくつかの実施例において、前記血小板減少症は、免疫性疾患、肝臓の炎症および／または損傷、薬物療法、放射線療法および／または手術によって引き起こされ、および／またはそれに関連する。
【0030】
本発明の任意の実施例において、前記血小板減少症は、肝線維症、脂肪肝、肝炎（例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）によって引き起こされ、および／またはそれに関する可能性がある。本発明の任意の実施例において、前記血小板減少症は、免疫性血小板減少症（特発性血小板減少性紫斑病、ＩＴＰ）によって引き起こされ、および／またはそれに関しる可能性がある。いくつかの実施例において、前記ＩＴＰは、慢性ＩＴＰである。本発明の任意の実施例において、前記血小板減少症は、化学療法、免疫腫瘍学療法または化学療法と免疫腫瘍学療法との組み合わせによって引き起こされ、および／またはそれに関しる可能性があり、選択可能で、前記免疫腫瘍学療法は、免疫チェックポイント阻害剤療法である。本発明の任意の実施例において、前記血小板減少症は、化学療法誘発性血小板減少症（ＣＩＴ）であり得る。本発明の任意の実施例において、前記血小板減少症は、カルボプラチン、および／またはニボルマブ、ペンブロリズマブ、ドスタルリマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブまたはセミプリマブまたはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片の薬物の治療によって引き起こされ、および／またはそれに関しる可能性がある。
【0031】
本発明の任意の実施例において、前記ポリペプチド、錯体（例えば、組換え融合タンパク質）、医薬組成物、単離された核酸、ベクターおよび／または顆粒、ウイルス、ウイルス様構造、細胞または細胞様構造は、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、埋め込み、吸入、くも膜下腔内、心室内または鼻腔内経路によって投与されることができる。本発明の任意の実施例において、前記組換え融合タンパク質は、単回投与されるか、または一つまたは複数の間隔で複数回投与されることができる。本発明の任意の実施例において、前記組換え融合タンパク質は、週に１回投与されることができる。本発明の任意の実施例において、前記組換え融合タンパク質は、週に２回投与されることができる。本発明の任意の実施例において、前記組換え融合タンパク質は、２週間ごとに、またはそれ以上の間隔で１回投与される。本発明の任意の実施例において、前記組換え融合タンパク質は、化学療法、免疫腫瘍学療法または化学療法と免疫腫瘍学療法との組み合わせの最初の投与から２４時間以内に投与されることができる。本発明の任意の実施例において、前記組換え融合タンパク質は、体重に基づいて０．０１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与されることができる。本発明の任意の実施例において、前記組換え融合タンパク質は、体重に基づいて０．１μｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与されることができる。本発明の任意の実施例において、前記被験者は、癌、腫瘍および／または自己免疫性疾患を患う可能性がある。本発明の任意の実施例において、前記被験者の血小板産生を刺激することができ、前記被験者体内において巨核球を攻撃する細胞の増殖および／または活性は、下方制御されることができる。本発明の任意の実施例において、前記被験者体内における制御性Ｔ細胞の増殖および／または活性は、下方制御されることができる。本発明の任意の実施例において、前記被験者体内における巨核球を攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および／または活性は、下方制御されることができる。
【0032】
本発明の任意の実施例において、前記ポリペプチドのＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ＴＮＦ－αに結合したＴＮＦＲ部分（例えば、ＴＮＦＲ２部分、例えば、ヒトＴＮＦＲ２の細胞外部分）および／またはその抗体または抗原結合断片を含むことができ、ここで、前記ポリペプチドのトロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ）結合および／または活性化部分は、一つ、二つ、三つまたはそれ以上のＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメイン、例えば、二つ、三つまたはそれ以上のヒトトロンボポエチン模倣（ＴＰＭ）ペプチド配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される配列）を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）部分およびトロンボポエチン受容体（ＴＰＯ受容体またはＴＰＯＲ）結合部分を含む例示的な融合ポリペプチドの概略図を示す。Ｎ末端からＣ末端まで、前記融合ポリペプチドｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭは、組換えヒトＴＮＦＲ２部分、Ｆｃ部分、トロンボポエチン受容体結合ドメインと中間スペーサーとを含むＴＰＯ模倣（ＴＰＭ）部分を含む。
【図2】ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ（ストック溶液または精製生成物）またはＮｐｌａｔｅ（登録商標）の存在下でのＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞成長曲線を示す。ｙ軸は、ＣＣＫ－８検出方法によって分析された細胞成長を表わし、ｘ軸は、様々な化合物の濃度を表わす。
【図3】０．５ｍｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ、０．５ｍｇ／ｍｌのＮｐｌａｔｅ（登録商標）または陰性対照品で処理したＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞におけるＴＰＯＲおよびＳＴＡＴ３リン酸化の分析を示す。
【図4】皮下注射（「ｓ．ｃ」）または静脈内注射（「ｉｖ」）を介して、５、１０、５０、１００または２００μｇ／ｋｇのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で治療された健康なＢａｌｂ／ｃマウスにおける体重変化を示す。５０μｇ／ｋｇのＮｐｌａｔｅ（登録商標）を陽性対照品として使用し、ＰＢＳ溶液を陰性対照品（「対照」）として使用する。
【図5A】ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で治療された健康なＢａｌｂ／ｃマウスおよびＳＤラットにおける血小板数の変化を示す。皮下注射（「ｓ．ｃ」）または静脈内注射（「ｉｖ」）を介して、５、１０、５０、１００または２００μｇ／ｋｇのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で治療された健康なＢａｌｂ／ｃマウスにおける血小板数の変化を示す。５０μｇ／ｋｇのＮｐｌａｔｅ（登録商標）を陽性対照品として使用し、ＰＢＳ溶液を陰性対照品（「対照」）として使用する。
【図5B】ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で治療された健康なＢａｌｂ／ｃマウスおよびＳＤラットにおける血小板数の変化を示す。Ｎｐｌａｔｅ（登録商標）または溶媒対照品と比較して、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で治療された健康なＳＤラットにおける血小板数の変化を示す。
【図6】皮下注射を介して１００、２００または４００μｇ／ｋｇのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で治療されたカルボプラチン誘発性ＣＩＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおける体重変化を示す。１００μｇ／ｋｇのＮｐｌａｔｅ（登録商標）を陽性対照品として使用し、０．９％ ＮａＣｌを陰性対照品として使用する。
【図7A】ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で治療された健康なＢａｌｂ／ｃマウスおよびＳＤラットにおける血小板数の変化を示す。皮下注射を介して１００、２００または４００μｇ／ｋｇのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で治療されたカルボプラチン誘発性ＣＩＴ Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおける血小板数の変化を示す。１００μｇ／ｋｇのＮｐｌａｔｅ（登録商標）を陽性対照品として使用し、０．９％ ＮａＣｌを陰性対照品として使用する。
【図7B】ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で治療された健康なＢａｌｂ／ｃマウスおよびＳＤラットにおける血小板数の変化を示す。Ｎｐｌａｔｅ（登録商標）または溶媒対照品と比較して、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で治療されたＣＩＴマウスモデルにおける血小板数の変化を示す。
【図8A】０．０２ｍｇ／ｋｇ（低用量）、０．０６ｍｇ／ｋｇ（中用量）または０．２ｍｇ／ｋｇ（高用量）で皮下投与されるか、または０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与されたｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量後のＳＤラット体内におけるｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの血清濃度を示す。ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量投与後のＳＤラット体内におけるｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの血清濃度を示す。
【図8B】０．０２ｍｇ／ｋｇ（低用量）、０．０６ｍｇ／ｋｇ（中用量）または０．２ｍｇ／ｋｇ（高用量）で皮下投与されるか、または０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与されたｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量後のカニクイザル体内におけるｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの血清濃度を示す。ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量投与後のカニクイザル体内におけるｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの血清濃度を示す。
【図9】０．０２ｍｇ／ｋｇ（低用量）、０．０６ｍｇ／ｋｇ（中用量）または０．２ｍｇ／ｋｇ（高用量）で皮下投与されるか、または０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与されたｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量後のカニクイザルにおける血小板数の変化を示す。
【図10】単回用量投与後の１２５Ｉ標識ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの組織分布および排泄を示す。
【図11A】患者１および患者２にｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを単回用量で投与した後の薬力学曲線を示す。
【図11B】患者１および患者２にｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを単回用量で投与した後の薬力学曲線を示す。
【図12】それぞれ患者１および患者２にｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを単回用量で投与した後の薬物動態曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本発明は、融合ペプチドまたはタンパク質組成物、方法、並びに血小板減少症の治療、例えば、化学療法誘発性血小板減少症（ＣＩＴ）、慢性免疫性（特発性）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、免疫腫瘍学療法による血小板減少症および肝臓の炎症または損傷に随伴する血小板減少症の治療に使用される、融合ペプチドまたはタンパク質の用途を提供する。いくつかの実施例において、本発明は、共有結合した二量体形態でＣＨＯ細胞から発現される融合タンパク質の組成物および使用方法を開示する。いくつかの実施例において、得られた融合タンパク質は、より安定した構造を有するジスルフィド結合ホモ二量体として分泌されるため、血小板減少症の治療においてＴＰＯと比較してより長い半減期（例えば、血清半減期）を有する可能性がある。
【0035】
ロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））は、慢性ＩＴＰの治療に適したＴＰＯ受容体（ＴＰＯＲ）アゴニストである。血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）は、自己免疫性疾患に属し、通常、ステロイドタイプのホルモンで治療して、過剰に活性な免疫系を阻害する。研究では、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））等の抗ＴＮＦ生物学的製剤がＩＴＰを効果的に治療できることを示す（ＭｃＭｉｎｎ ＪＲ Ｊｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｆｒｏｍ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ ｐｕｒｐｕｒａ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ． Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ． ２００３ Ｊｕｎ；７３（２）：１３５－４０）。いくつかの態様において、本発明は、一つまたは複数のＴＮＦ結合および／またはアンタゴニスト機能ドメイン（過剰に活性な免疫系を阻害できる）と一つまたは複数のＴＰＯＲ結合および／またはアゴニストドメイン（ヒトＴＰＯ受容体に結合し、且つ活性化することにより、血小板数を増加させることができる）とを組み合わせた二重特異性組成物を提供する。
【0036】
免疫腫瘍学（ＩＯ）薬物（例えば、キイトルーダ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ）（登録商標）、オプジーボ（Ｏｐｄｉｖｏ）（登録商標）等の抗ＰＤ－１抗体療法、抗ＰＤ－Ｌ１抗体療法、抗ＣＴＬＡ－４抗体療法、および／または抗ＣＤ４７抗体療法）も、血小板数の減少を引き起こす可能性がある。例えば、チェックポイント阻害剤療法の治療を受けた患者では、１０％以上の患者で血小板数が減少し、１％の患者で重症度がグレード３～４に達する（Ｓｈｉｕａｎ Ｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｌａｎｏｍａ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ． ２０１７ Ｆｅｂ ２１；５：８； ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０２１／１２５５１４ｓ０９６ｌｂｌ．ｐｄｆ； ａｎｄ Ｃａｌｖｏ Ｒ． Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｉｄｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： Ｔｈｅ Ｅｘａｍｐｌｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ． Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２０１９；１０：４５４）。さらに、研究では、ＣＤ４７がＩＴＰにおいて調節不全であることを示す（Ｃａｔａｎｉ Ｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ＣＤ４７ ｐａｔｈｗａｙ ｉｓ ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ． Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ． ２０１１ Ａｐｒ；３９（４）：４８６－９４）。癌患者が化学療法、免疫療法または化学療法と免疫療法との組み合わせで治療されることができるため、本発明に開示される二重特異性組成物は、血小板数を増加させ、ＣＩＴおよび／またはＩＴＰを治療するのに特に有用である。
【0037】
血小板数の減少は、肝硬変、肝線維症、脂肪肝、肝炎（例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）等肝臓の炎症および／または損傷によって引き起こされ、および／またはそれに関しる可能性がある（Ｒａｍａｄｏｒｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ， ｆｒｏｍ ｂｅｎｃｈ ｔｏ ｂｅｄｓｉｄｅ． ＪＨＥＰ Ｒｅｐ． ２０１９ Ｏｃｔ ２５；１（６）：４４８－４５９）。本発明は、ＴＮＦ結合機能ドメインとトロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体結合ドメインとを組み合わせる融合ペプチドまたはタンパク質組成物を提供し、前記融合ペプチドまたはタンパク質組成物は、血小板数を増加させ、肝臓の炎症および／または損傷の症状を治療するために使用されることができる。
【0038】
いくつかの態様において、本発明は、組換えＤＮＡ技術を通じてＣＨＯ細胞によって産生される融合タンパク質を提供する。いくつかの実施例において、前記融合タンパク質は、ヒト腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）結合部分とヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片のＮ末端とを融合してから、Ｆｃ断片のＣ末端と、三つのトロンボポエチン（ＴＰＯ）受容体結合ドメインを含む模倣ペプチドとを融合することによって産生されたホモ二量体糖タンパク質である。いくつかの実施例において、前記Ｎ末端のＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ＴＮＦ－αに結合することにより、自己免疫性疾患による血小板減少症を阻害する。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ＴＮＦ－αに結合および／または阻害できる化学的化合物である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、レナリドマイドまたはポマリドマイド等のサリドマイドまたはその誘導体である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ペントキシフィリンまたはブプロピオン等のキサンチンまたはその誘導体である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、（Ｒ）－ＤＯＩ、ＴＣＢ－２、ＬＳＤまたはＬＡ－ＳＳ－Ａｚ等の５－ＨＴ２Ａアゴニスト幻覚剤である。
【0039】
いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ＴＮＦ－αに結合した抗ＴＮＦ－α抗体（例えば、インフリキシマブ（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、ゴリムマブ（例えば、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、アダリムマブ（例えば、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、および／またはセルトリズマブ（例えば、Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片）またはその抗原結合断片である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ＴＮＦ－αに結合したＴＮＦ－α受容体部分である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ－α受容体部分は、ＴＮＦＲ２部分である（図１）。
【0040】
いくつかの実施例において、前記Ｃ末端の模倣ペプチドは、ＴＰＯ受容体に結合し、内因性ＴＰＯの生物学的効果を誘導することができ、例えば、前駆体細胞の増幅および倍数体巨核球の発育および成熟を含む巨核球発育の様々な段階を刺激することにより、血小板数を増加する。いくつかの実施例において、本発明に開示される融合タンパク質は、二機能性トロンボポエチンとして機能する。一態様において、本発明に開示される融合タンパク質は、巨核球上のＴＰＯ受容体に結合することによって、血小板産生を直接刺激することができる。別の態様において、本発明に開示される融合タンパク質は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖および／または活性を誘導すること、および／または巨核球を攻撃する細胞傷害性Ｔ細胞の増殖および／または活性を下方制御することによって、血小板産生を間接的に刺激することができる。さらに別の態様において、本発明に開示される融合タンパク質は、遅いクリアランス、長い半減期および／または限られた組織分布等の方式を提供することによって、融合タンパク質の薬物動態および／または薬力学を改善するＦｃ領域を含む。いくつかの態様において、例えば、小分子と比較して、前記長い半減期は、患者への投与頻度がより低いという利点を有する。改善された薬物動態および／または薬力学は、ＴＰＯ受容体アゴニストとしての本発明に開示される融合タンパク質の効力をさらに増加する可能性がある。従って、本発明に開示される融合タンパク質は、二重のメカニズムを通じて血小板数を効果的に増加させるだけでなく、患者の都合の良い投与解決策にも寄与する。
【0041】
いくつかの態様において、本発明は、ＣＨＯ細胞から発現および分泌されたトロンボポエチン模倣タンパク質の革新的な解決策を提供する。いくつかの実施例において、本発明によって提供される解決策は、大腸菌による不溶性タンパク質の産生を防ぎ、その後の後続の複雑で、非効率的なタンパク質変性プロセス、複雑な再構成プロセスおよび時代遅れのＣＭＣ精製プロセスを回避し、それにより生成物の純度および生成物の品質の安定性を大幅に向上させる。
【0042】
いくつかの態様において、本発明は、二機能性特徴を有するトロンボポエチン模倣融合タンパク質を提供する。いくつかの実施例において、本発明によって提供されるトロンボポエチン模倣融合タンパク質は、そのＣ末端に効率的なトロンボポエチン機能を有し、さらに、そのＮ末端ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、炎症因子ＴＮＦ－αに結合し、且つＴＮＦ－αの生物学的機能をブロッキングすることができる。
【0043】
いくつかの実施例において、本発明によって提供されるトロンボポエチン模倣融合タンパク質は、内因性ＴＰＯと配列相同性を共有しないため、例えば、ＴＰＩＡＯ（登録商標）（組換えヒトトロンボポエチン、ｒＨｕＴＰＯ）と比較して、自己免疫応答または中和抗体の産生を誘発するりすくは、低くなる。いくつかの実施例において、前記トロンボポエチン模倣融合タンパク質は、長期投与に適している。いくつかの実施例において、前記トロンボポエチン模倣融合タンパク質は、ＴＰＯよりも長い半減期を有し、週に１回投与されることができる。いくつかの実施例において、毎日の投与を必要とするＴＰＩＡＯ（登録商標）と比較して、本発明によって提供されるトロンボポエチン模倣融合タンパク質は、週に１回投与されるため、患者の治療時の痛みを軽減し、治療費を削減することができる。
【0044】
いくつかの態様において、本発明は、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片を介して連結した二重作用単位のホモ二量体を含む、トロンボポエチン模倣融合タンパク質を提供する。いくつかの実施例において、前記トロンボポエチン模倣融合タンパク質のＣ末端は、三つの同一の単鎖ユニットを含むＴＰＯ模倣ペプチドに連結される。いくつかの実施例において、前記トロンボポエチン模倣融合タンパク質のＮ末端は、組換えヒトｐ７５ ＴＮＦ受容体の細胞外部分に連結される。いくつかの実施例において、前記Ｃ末端のＴＰＯ模倣ペプチドは、合成六つのトロンボポエチン受容体（ＴＰＯ受容体、ｃ－ＭＰＬとも呼ばれる）結合ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を含む。
【0045】
いくつかの態様において、本発明は、ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）に結合する化合物、ならびにヒトトロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ）を提供し、ここで、前記化合物は、ＴＮＦＲ－Ｆｃ－（Ｓ１）ｍ－ＴＰＯＲＢＤ１－（Ｓ２）ｎ－ＴＰＯＲＢＤ２－（Ｓ３）ｐ－ＴＰＯＲＢＤ３の構造を含み、ここで、ＴＮＦＲは、ヒト腫瘍壊死因子受容体またはその断片または変異体であり、Ｆｃは、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域またはその断片または変異体であり、ＴＰＯＲＢＤ１、ＴＰＯＲＢＤ２およびＴＰＯＲＢＤ３は、同じまたは異なるトロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ）結合ドメインおよび／または活性化ドメインであり、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、スペーサーである。本発明の任意の実施例において、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３等の前記スペーサーの長さ（例えば、アミノ酸配列の長さ）は、互いに独立していてもよい。本発明の任意の実施例において、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３等の前記スペーサーの長さは、０～４０個のアミノ酸残基、例えば、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸残基から選択されることができる。
【0046】
いくつかの実施例において、前記ＴＮＦＲは、組換えヒトｐ７５ ＴＮＦ受容体またはその断片または変異体であり得る。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦＲは、組換えヒトｐ７５ ＴＮＦ受容体またはその断片または変異体の細胞外部分であり得る。いくつかの実施例において、前記ＮＦＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列を含むことができる。いくつかの実施例において、前記ＴＰＯＲＢＤは、ヒトトロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ）に結合することができる。
【0047】
いくつかの実施例において、前記ＴＰＯＲＢＤ１、ＴＰＯＲＢＤ２およびＴＰＯＲＢＤ３は、それぞれ、ＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインまたはその断片を含むことができる。いくつかの実施例において、前記ＴＰＯＲＢＤ１、ＴＰＯＲＢＤ２およびＴＰＯＲＢＤ３は、異なる配列を含むことができる。いくつかの実施例において、前記ＴＰＯＲＢＤ１、ＴＰＯＲＢＤ２およびＴＰＯＲＢＤ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される同じ配列を含むことができる。
【0048】
いくつかの実施例において、前記Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域またはその断片または変異体であり得る。いくつかの実施例において、前記Ｆｃは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列を含むことができる。いくつかの実施例において、前記Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、異なる配列を含むことができる。いくつかの実施例において、前記Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、一つまたは複数のグリシン残基を含むことができる。
【0049】
いくつかの実施例において、前記化合物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列を含むことができる。いくつかの実施例において、前記化合物は、Ｃ１８－Ｃ３１、Ｃ３２－Ｃ４５、Ｃ３５－Ｃ５３、Ｃ５６－Ｃ７１、Ｃ７８－Ｃ８８、Ｃ７８－Ｃ９６、Ｃ９８－Ｃ１０４、Ｃ１１２－Ｃ１２１、Ｃ１１５－Ｃ１３９、Ｃ１４２－Ｃ１５７、Ｃ１６３－Ｃ１７８、Ｃ２８１－Ｃ３４１およびＣ３８７－Ｃ４４５の少なくとも一つのポリペプチド内ジスルフィド結合対を含むことができる。
【0050】
いくつかの態様において、本発明は、組換えポリペプチドの二量体を含む錯体を提供し、ここで、前記ポリペプチドは、ＴＮＦＲ－Ｆｃ－（Ｓ１）ｍ－ＴＰＯＲＢＤ１－（Ｓ２）ｎ－ＴＰＯＲＢＤ２－（Ｓ３）ｐ－ＴＰＯＲＢＤ３の構造を含み、ここで、ＴＮＦＲは、腫瘍壊死因子受容体またはその断片または変異体であり、Ｆｃは、免疫グロブリンＦｃ領域またはその断片または変異体であり、ＴＰＯＲＢＤ１、ＴＰＯＲＢＤ２およびＴＰＯＲＢＤ３は、同じまたは異なるトロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ）結合ドメインおよび／または活性化ドメインであり、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、同じまたは異なるスペーサーであり、ｍ、ｎおよびｐは、０以上であり、且つそれぞれ独立した整数であり、ここで、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して、前記組換えポリペプチドを二量体化することにより、二量体を形成する。
【0051】
いくつかの実施例において、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を含むか、またはそれらから構成されることができる。いくつかの実施例において、Ｃ１８－Ｃ３１、Ｃ３２－Ｃ４５、Ｃ３５－Ｃ５３、Ｃ５６－Ｃ７１、Ｃ７８－Ｃ８８、Ｃ７８－Ｃ９６、Ｃ９８－Ｃ１０４、Ｃ１１２－Ｃ１２１、Ｃ１１５－Ｃ１３９、Ｃ１４２－Ｃ１５７、Ｃ１６３－Ｃ１７８、Ｃ２８１－Ｃ３４１およびＣ３８７－Ｃ４４５等のポリペプチド内ジスルフィド結合の少なくとも一つを介して、前記組換えポリペプチドを二量体化する。
【0052】
いくつかの態様において、本発明は、トロンボポエチン模倣融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0053】
いくつかの実施例において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を含むトロンボポエチン模倣融合タンパク質の有効量を患者に投与することを含む、必要とする患者体内において巨核球または血小板を増加するための方法を提供する。いくつかの実施例において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を含むトロンボポエチン模倣融合タンパク質の有効量を患者に投与することを含む、必要とする患者の血小板減少症を治療するための方法を提供する。
【0054】
いくつかの実施例において、前記血小板減少症は、自己免疫性疾患、肝臓の炎症および／または損傷によって引き起こされるか、または薬物療法、放射線療法または手術によって引き起こされる。いくつかの実施例において、前記自己免疫性疾患によって誘発される血小板減少症は、慢性免疫性（特発性）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）であり得る。いくつかの実施例において、前記ＣＤ４７経路は、ＩＴＰにおいて調節不全である。いくつかの実施例において、前記肝臓の炎症および／または損傷は、肝硬変、肝線維症、脂肪肝、肝炎（例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であり得る。いくつかの実施例において、前記薬物療法は、化学療法であり得る。いくつかの実施例において、前記化学療法は、カルボプラチンであり得、ここで、前記血小板減少症は、カルボプラチンによって誘発される可能性がある。いくつかの実施例において、前記薬物療法によって誘発される血小板減少症は、化学療法誘発性血小板減少症（ＣＩＴ）であり得る。いくつかの実施例において、前記薬物療法は、免疫腫瘍学療法であり得る。いくつかの実施例において、前記免疫腫瘍学療法は、免疫チェックポイント阻害剤療法であり得る。いくつかの実施例において、前記免疫チェックポイント阻害剤療法は、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ドスタルリマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブまたはセミプリマブまたはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片）を阻害することができる。いくつかの実施例において、前記免疫チェックポイント阻害剤療法は、化学療法および／または放射線療法と組み合わせることができる。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、皮下注射によって投与されることができる。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、静脈内注射によって投与されることができる。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、単回投与されるか、または週に１回もしくは週に２回の間隔に分割されて複数回投与されることができる。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の投与量は、０．１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の投与量は、１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、週に１回投与されることができる。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、週に２回投与されることができる。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の最初の投与は、化学療法の最初の投与から２４時間以内に実行されることができる。
【0055】
いくつかの態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７および９のいずれかの配列に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７および９のいずれかの配列に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【0056】
いくつかの態様において、本発明は、ベクターを含む宿主細胞を提供し、前記ベクターは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７および９のいずれかの配列に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施例において、前記宿主細胞は、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物または哺乳動物細胞から選択されることができる。いくつかの実施例において、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。いくつかの実施例において、前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞であり得る。
【0057】
いくつかの実施例において、本発明は、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を産生するのに適した条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７および９のいずれかの配列に示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することを含む、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を調製するための方法を提供する。
【0058】
本発明は、前記タンパク質を含むトロンボポエチン活性を有する組成物、前記融合タンパク質を産生する方法、前記融合タンパク質および組成物を使用して被験者を治療する方法およびキットをさらに提供する。
【0059】
いろんな態様において、特許文献、科学論文およびデータベースを含む、本出願に言及されるすべての出版物は、その全体が参照により組み込まれ、各個別の出版物が参照により個別に組み込まれるのと同じ範囲で参照により組み込まれる。本発明に記載の定義が参照により本発明に組み込まれる特許、出願、公開出願および他の出版物に記載の定義に反するか、または矛盾する場合、本発明に記載の定義は、参照により組み込まれる定義より優先する。本発明で使用されるセクションの見出しは、整理のみを目的としており、説明されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0060】
Ｉ．ＴＮＦ－α結合ドメイン
本発明によって提供されるタンパク質は、炎症因子である腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）に結合し、且つＴＮＦ－αの生物学的機能をブロッキングするＮ末端ドメインを含むことができる。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ－α結合部分は、化学的化合物である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ－α結合部分は、ＴＮＦ－αに結合した抗ＴＮＦ－α抗体（例えば、インフリキシマブ（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、ゴリムマブ（例えば、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、アダリムマブ（例えば、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、および／またはセルトリズマブ（例えば、Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片）またはその抗原結合断片である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ＴＮＦ－αに結合したＴＮＦ－α受容体部分である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ－α受容体部分は、ＴＮＦＲ２部分である。いくつかの実施例において、ＴＮＦ－αの生物学的機能をブロッキングすることによって、慢性免疫性（特発性）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を治療または軽減することができる。
本発明によって提供されるタンパク質は、炎症因子である腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）に結合し、且つＴＮＦ－αの生物学的機能をブロッキングするＮ末端ドメインを含むことができる。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ－α結合部分は、化学的化合物である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ－α結合部分は、ＴＮＦ－αに結合した抗ＴＮＦ－α抗体（例えば、インフリキシマブ（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、ゴリムマブ（例えば、Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、アダリムマブ（例えば、Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片、および／またはセルトリズマブ（例えば、Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））またはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片）またはその抗原結合断片である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分は、ＴＮＦ－αに結合したＴＮＦ－α受容体部分である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦ－α受容体部分は、ＴＮＦＲ２部分である。いくつかの実施例において、ＴＮＦ－αの生物学的機能をブロッキングすることによって、慢性免疫性（特発性）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を治療または軽減することができる。
【0061】
ＴＮＦ－αは、急性炎症中にマクロファージ／単球によって産生される炎症性サイトカインであり、壊死またはアポトーシスを引き起こす様々な細胞内シグナル伝達イベントに関与する。タンパク質は、感染および癌に抵抗するのにも重要である。ＴＮＦ－αは、ＴＮＦＲ１（５５ｋＤａ細胞膜受容体）またはＴＮＦＲ２（７５ｋＤａ細胞膜受容体）に三量体として結合することにより、様々な効果を発揮する。
【0062】
ＩＴＰは、自己免疫オプソニン作用および血小板の早期破壊による血液疾患である。Ｔｈ１応答後に炎症誘発性サイトカインＩＬ－２、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γを分泌し、慢性ＩＴＰ患者体内で増加する。ＴＮＦ－αは、食細胞の活性を上方制御することができ、ＩＴＰを引き起こす可能性がある（Ｗａｊａｎｔ Ｈ ａｎｄ Ｓｉｅｇｍｕｎｄ Ｄ （２０１９） ＴＮＦＲ１ ａｎｄ ＴＮＦＲ２ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｆｅ ａｎｄ Ｄｅａｔｈ Ｂａｌａｎｃｅ ｏｆ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ． Ｆｒｏｎｔ． Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． ７：９１）。従って、アポトーシス経路およびＴＮＦ－α受容体を識別して正常化することは、ＩＴＰの潜在的な治療法である。
【0063】
最近の臨床研究の結果では、ＴＮＦ－αを阻害することによって、血小板の増加を促進できる可能性があり、耐性も良好であることを示す。従って、化学療法誘発性血小板減少症（ＣＩＴ）の場合、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭのデュアルターゲット設計は、治療法開発において大きな期待を持っている。
【0064】
いくつかの場合によっては、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＮ末端ドメインは、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）またはその一部である。いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＮ末端ドメインは、ＴＮＦＲ２またはその一部である。いくつかの実施例において、ヒト天然ＴＮＦＲ２と比較して、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＮ末端ドメインは、Ｎ末端切断を含む。
【0065】
いくつかの場合によっては、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＮ末端ドメインは、ヒトＴＮＦＲ２を含むＴＮＦＲ２ドメインまたはその断片または変異体である。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦＲ２ドメインは、天然のヒトＴＮＦＲ２のシグナルペプチドを含まない。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦＲ２ドメインは、天然のヒトＴＮＦＲ２の膜貫通ドメインを含まない。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦＲ２ドメインは、天然のヒトＴＮＦＲ２の細胞質ドメインを含まない。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦＲ２ドメインは、組換えヒトＴＮＦＲ２受容体の細胞外部分である。
【0066】
いくつかの場合によっては、天然のヒトＴＮＦＲ配列と比較して、前記融合タンパク質のＴＮＦＲ２ドメインは、一つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む。いくつかの実施例において、天然のヒトＴＮＦＲ配列と比較して、前記融合タンパク質のＴＮＦＲ２ドメインは、一つまたは複数のアミノ酸位置の置換を含む。いくつかの実施例において、前記アミノ酸の置換、欠失または挿入により、ペプチドまたはタンパク質の発現、精製または安定性プロフィールが改善される。いくつかの実施例において、前記アミノ酸の置換、欠失または挿入により、ペプチドまたはタンパク質の結合親和性および特異性プロフィールが改善されることができる。
【0067】
いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＴＮＦＲ２ドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示される配列を含む。いくつかの実施例において、前記ＴＮＦＲペプチドは、以下に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に対して少なくとももしくは約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0068】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４：ＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣＲＬＲＥＹＹＤＱＴＡＱＭＣＣＳＫＣＳＰＧＱＨＡＫＶＦＣＴＫＴＳＤＴＶＣＤＳＣＥＤＳＴＹＴＱＬＷＮＷＶＰＥＣＬＳＣＧＳＲＣＳＳＤＱＶＥＴＱＡＣＴＲＥＱＮＲＩＣＴＣＲＰＧＷＹＣＡＬＳＫＱＥＧＣＲＬＣＡＰＬＲＫＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰＧＴＥＴＳＤＶＶＣＫＰＣＡＰＧＴＦＳＮＴＴＳＳＴＤＩＣＲＰＨＱＩＣＮＶＶＡＩＰＧＮＡＳＭＤＡＶＣＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ
【0069】
いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＴＮＦＲ２ドメインは、ＣＲＲＰＧＦＧＶＡＲＰとは異なる配列を含む。いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＴＮＦＲ２ドメインは、ＣＲＰＧＦＧＶＡＲＰの代わりにＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬを含む。
【0070】
いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＴＮＦＲ２ドメインは、Ｃ１８－Ｃ３１、Ｃ３２－Ｃ４５、Ｃ３５－Ｃ５３、Ｃ５６－Ｃ７１、Ｃ７８－Ｃ８８、Ｃ７８－Ｃ９６、Ｃ９８－Ｃ１０４、Ｃ１１２－Ｃ１２１、Ｃ１１５－Ｃ１３９、Ｃ１４２－Ｃ１５７およびＣ１６３－Ｃ１７８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に従って番号付けられる）のうちの一つまたは複数のポリペプチド内ジスルフィド結合を含む。
【0071】
ＩＩ．ＴＰＯ模倣ドメイン
幹細胞、巨核球および巨核球前駆体の表面にトロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ、Ｃ－ＭＰＬとも呼ばれる）を発現する。ＴＰＯＲを刺激することによって、Ｊａｎｕｓ活性化キナーゼ２／シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子５（ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５）シグナル伝達経路を活性化し、且つ遺伝子発現レベルを変化し、従って、幹細胞の巨核球経路への分化を促進し、ヒト骨髄前駆細胞の増幅および分化を促進し、成熟巨核球レベルを増加させ、最終的に血小板の形成および末梢循環への放出を促進することができる。
幹細胞、巨核球および巨核球前駆体の表面にトロンボポエチン受容体（ＴＰＯＲ、Ｃ－ＭＰＬとも呼ばれる）を発現する。ＴＰＯＲを刺激することによって、Ｊａｎｕｓ活性化キナーゼ２／シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子５（ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５）シグナル伝達経路を活性化し、且つ遺伝子発現レベルを変化し、従って、幹細胞の巨核球経路への分化を促進し、ヒト骨髄前駆細胞の増幅および分化を促進し、成熟巨核球レベルを増加させ、最終的に血小板の形成および末梢循環への放出を促進することができる。
【0072】
いくつかの場合によっては、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＣ末端ドメインは、トロンボポエチン模倣（ＴＰＭ）ドメインを含む。いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＣ末端ドメインは、二つまたはそれ以上のＴＰＭドメインを含む。いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＣ末端ドメインは、三つのＴＰＭドメインを含む。いくつかの実施例において、前記二つまたはそれ以上のＴＰＭドメインは、異なるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施例において、前記二つまたはそれ以上のＴＰＭドメインは、同じアミノ酸配列を有する。いくつかの実施例において、前記ＴＰＭドメインは、天然のヒトＴＰＯに対して配列相同性を有さない。
【0073】
いくつかの実施例において、前記ＴＰＭドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示される配列を含む。いくつかの実施例において、前記ＴＰＭドメインは、以下に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとももしくは約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0074】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７：ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ
【0075】
いくつかの場合によっては、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＴＰＭドメインは、複数のＴＰＭドメインおよび中間スペーサーを含む。いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＴＰＭドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示される配列を含む。いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＴＰＭドメインは、以下に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に対して少なくとももしくは約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0076】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６：ＧＧＧＧＧＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡＧＧＧＧＧＧＧＧＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡＧＧＧＧＧＧＧＧＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ
【0077】
いくつかの場合によっては、二つまたはそれ以上のＴＰＭドメインは、スペーサー配列によって単離される。いくつかの実施例において、前記スペーサー配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施例において、前記スペーサー配列は、少なくとも一つのグリシン残基を含む。いくつかの実施例において、前記スペーサー配列は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個のグリシン残基を含む。いくつかの実施例において、前記それぞれのＴＰＭドメイン間のスペーサーの長さは、異なる。いくつかの実施例において、前記それぞれのＴＰＭドメイン間のスペーサーの長さは、同じである。いくつかの実施例において、前記それぞれのＴＰＭドメイン間のスペーサーのアミノ酸配列は、異なる。いくつかの実施例において、前記それぞれのＴＰＭドメイン間のスペーサーのアミノ酸配列は、同じである。
【0078】
「スペーサー」という用語は、二つの要素（例えば、ペプチドまたはタンパク質ドメイン）の間に存在し、且つ前記二つの要素間に空間および／または柔軟性を提供する部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー）またはアミノ酸配列（例えば、１～２００個のアミノ酸からなる配列）を指す。アミノ酸スペーサーは、ポリペプチドの一次配列の一部である（例えば、ポリペプチド主鎖を介して間隔ペプチドに融合する）。例えば、Ｆｃドメインを形成する二つのヒンジ領域間のジスルフィド結合の形成は、リンカーに属さない。
【0079】
いくつかの実施例において、前記アミノ酸スペーサーは、ＧＧ、ＧＧＧ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＡ、ＧＧＧＧ、ＧＧＧＡＧ、ＧＧＧＡＧＧ、ＧＧＧＡＧＧＧ、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＡ、ＧＧＧＧＳ、ＧＧＡＧ、ＧＧＳＧ、ＡＧＧＧ、ＳＧＧＧ、ＧＡＧＡ、ＧＳＧＳ、ＧＡＧＡＧＡ、ＧＳＧＳＧＳ、ＧＡＧＡＧＡＧＡ、ＧＳＧＳＧＳＧＳ、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ、ＧＧＡＧＧＡ、ＧＧＳＧＧＳ、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ、ＧＧＡＧＧＧＡＧ、ＧＧＳＧＧＧＳＧ、ＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧ、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＡＡＡＬ、ＡＡＡＫ、ＡＡＡＲ、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ、ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ、ＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ、ＳＡＣＹＣＥＬＳ、ＲＳＩＡＴ、ＲＰＡＣＫＩＰＮＤＬＫＱＫＶＭＮＨ、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ、ＡＡＡＮＳＳＩＤＬＩＳＶＰＶＤＳＲ、ＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ、ＥＡＡＡＫおよびＰＡＰＡＰから独立して選択される。
【0080】
ＩＩＩ．Ｆｃドメイン
いくつかの実施例において、本発明に記載のポリペプチドは、ポリペプチドの血清半減期を延長するために、免疫グロブリンのＦｃドメイン単量体またはＦｃドメインの断片を含むことができる。本発明に記載のポリペプチドは、二つのＦｃドメイン単量体間の相互作用を通じて二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成することができ、前記Ｆｃドメイン単量体は、二量体でＦｃドメインを形成する。当技術分野で一般に知られているように、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンのＣ末端にみられるタンパク質構造である。Ｆｃドメインは、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用を通じて二量体化する二つのＦｃドメイン単量体を含む。野生型Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃγＲＩＶ等のＦｃ受容体に結合する最小構造を形成する。いくつかの実施例において、「死亡」Ｆｃドメインを代表とするＦｃドメインは、突然変異後にエフェクター機能を欠く可能性がある。例えば、Ｆｃドメインは、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用を最小限に抑えることが知られている特定的アミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施例において、前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１抗体に由来し、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａを含む。いくつかの実施例において、前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１抗体に由来し、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｋ３２２ＡおよびＮ４３４Ａを含む。Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））に従って前述のアミノ酸の位置を定義する。特定の抗体について、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列と相同性のある抗体配列の領域と比較することによって、アミノ酸残基のＫａｂａｔ番号付けを決定することができる。さらに、いくつかの実施例において、前記Ｆｃドメインは、いかなる免疫系関連応答を誘導しない。例えば、前記ポリペプチド二量体におけるＦｃドメインは、修飾によりＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用または結合を減少することができる。
いくつかの実施例において、本発明に記載のポリペプチドは、ポリペプチドの血清半減期を延長するために、免疫グロブリンのＦｃドメイン単量体またはＦｃドメインの断片を含むことができる。本発明に記載のポリペプチドは、二つのＦｃドメイン単量体間の相互作用を通じて二量体（例えば、ホモ二量体またはヘテロ二量体）を形成することができ、前記Ｆｃドメイン単量体は、二量体でＦｃドメインを形成する。当技術分野で一般に知られているように、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンのＣ末端にみられるタンパク質構造である。Ｆｃドメインは、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用を通じて二量体化する二つのＦｃドメイン単量体を含む。野生型Ｆｃドメインは、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、ＦｃγＲＩＶ等のＦｃ受容体に結合する最小構造を形成する。いくつかの実施例において、「死亡」Ｆｃドメインを代表とするＦｃドメインは、突然変異後にエフェクター機能を欠く可能性がある。例えば、Ｆｃドメインは、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用を最小限に抑えることが知られている特定的アミノ酸置換を含むことができる。いくつかの実施例において、前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１抗体に由来し、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＧ２３７Ａを含む。いくつかの実施例において、前記Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１抗体に由来し、アミノ酸置換Ｄ２６５Ａ、Ｋ３２２ＡおよびＮ４３４Ａを含む。Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））に従って前述のアミノ酸の位置を定義する。特定の抗体について、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列と相同性のある抗体配列の領域と比較することによって、アミノ酸残基のＫａｂａｔ番号付けを決定することができる。さらに、いくつかの実施例において、前記Ｆｃドメインは、いかなる免疫系関連応答を誘導しない。例えば、前記ポリペプチド二量体におけるＦｃドメインは、修飾によりＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用または結合を減少することができる。
【0081】
いくつかの場合によっては、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＴＮＦ－α結合ドメインおよびＴＰＯ模倣ドメインは、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域またはその断片または変異体を含むＦｃドメインによって連結される。いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＦｃドメインは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインまたはその断片または変異体である。いくつかの実施例において、天然のヒト免疫グロブリンＦｃ領域と比較して、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＦｃドメインは、Ｎ末端切断を有する。いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＦｃドメインは、天然のヒト免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ１ドメインを含まない。
【0082】
いくつかの場合によっては、天然のヒトＩｇＧ１配列と比較して、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＦｃドメインは、一つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を含む。いくつかの実施例において、前記融合タンパク質のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメインにおける一つまたは複数のアミノ酸位置の置換を含む。いくつかの実施例において、前記融合タンパク質のＦｃドメインは、ＤＥターンにおける一つまたは複数のアミノ酸位置の置換を含む。いくつかの実施例において、前記融合タンパク質のＦｃドメインは、２９７位置の天然のアミノ酸置換を含み、ここで、前記置換により、２９７位置のグリコシル化を検出可能に減少および／または除去する。特定の実施例において、前記融合タンパク質のＦｃドメインは、抗体重鎖の２９７位置のアスパラギンに対するシステインの置換を含む。他の実施例において、前記融合タンパク質のＦｃドメインは、２９７位置のグリコシル化を欠く。いくつかの実施例において、前記融合タンパク質のＦｃドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のＮ３１７に対応するＮ２９７Ｑ置換を含む。上記の各実施例において、定常領域の番号付けシステムは、Ｋａｂａｔに記載のＥＵインデックスの番号付けシステムである。
【0083】
いくつかの実施例において、前記アミノ酸の置換、欠失または挿入は、融合ペプチドまたはタンパク質の発現、精製または安定性プロフィールを改善する可能性がある。いくつかの実施例において、前記アミノ酸の置換、欠失または挿入は、融合ペプチドまたはタンパク質の結合親和性および特異性プロフィールを改選する可能性がある。
【0084】
いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＦｃドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示される配列を含む。いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＦｃドメインは、以下に示されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に対して少なくとももしくは約８０％、８５％、９０％、９２％、９５％または９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0085】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５：ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＱＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【0086】
いくつかの場合によっては、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＦｃドメインは、一つまたは複数のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施例において、前記融合ペプチドまたはタンパク質のＦｃドメインは、以下の鎖内ジスルフィド結合：Ｃ２８１～Ｃ３４１およびＣ３８７～Ｃ４４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）のうちの一つまたは複数を含む。いくつかの実施例において、二つの前記融合ペプチドは、以下の鎖間ジスルフィド結合：Ｃ２４０～Ｃ２４０、Ｃ２４６～Ｃ２４６およびＣ２４９～Ｃ２４９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）のうちの一つまたは複数を含む二量体を形成する。
【0087】
ＩＶ．融合ペプチドおよびタンパク質
本発明において、「融合」という用語は、化学的共役、組換えおよび化学結合（例えば、アミド結合）等の方式を介した、二つまたはそれ以上の要素、成分またはタンパク質ドメイン（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）の組み合わせまたは連結を表わすために使用される。例えば、二つの直列単一ペプチドは、化学的共役、化学結合、ペプチドリンカーまたは任意の他の共有結合方式によって融合されて、ポリペプチドのうちの一つの連続タンパク質構造を形成することができる。本発明に記載のポリペプチドのいくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分（例えば、ＴＮＦ－αに結合できる化学的化合物、抗ＴＮＦ－α抗体またはその抗原結合断片または細胞外ＴＮＦＲ２配列）は、リンカーまたは化学結合（例えば、ペプチド結合）介して部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメインまたはアミノ酸置換含有Ｆｃドメイン）のＮ末端に融合されることができる。本発明に記載のポリペプチドのいくつかの実施例において、前記部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメインまたはアミノ酸置換含有Ｆｃドメイン）は、リンカーまたは化学結合（例えば、ペプチド結合）を介してＴＰＯ模倣ペプチドのＮ末端に融合される。
本発明において、「融合」という用語は、化学的共役、組換えおよび化学結合（例えば、アミド結合）等の方式を介した、二つまたはそれ以上の要素、成分またはタンパク質ドメイン（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）の組み合わせまたは連結を表わすために使用される。例えば、二つの直列単一ペプチドは、化学的共役、化学結合、ペプチドリンカーまたは任意の他の共有結合方式によって融合されて、ポリペプチドのうちの一つの連続タンパク質構造を形成することができる。本発明に記載のポリペプチドのいくつかの実施例において、前記ＴＮＦ結合および／または阻害部分（例えば、ＴＮＦ－αに結合できる化学的化合物、抗ＴＮＦ－α抗体またはその抗原結合断片または細胞外ＴＮＦＲ２配列）は、リンカーまたは化学結合（例えば、ペプチド結合）介して部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメインまたはアミノ酸置換含有Ｆｃドメイン）のＮ末端に融合されることができる。本発明に記載のポリペプチドのいくつかの実施例において、前記部分（例えば、Ｆｃドメイン単量体、野生型Ｆｃドメインまたはアミノ酸置換含有Ｆｃドメイン）は、リンカーまたは化学結合（例えば、ペプチド結合）を介してＴＰＯ模倣ペプチドのＮ末端に融合される。
【0088】
いくつかの実施例において、本発明は、アミノ基末端からカルボキシ基末端まで、ａ）ヒトＴＮＦＲ２受容体またはその断片または変異体をふくむ第１の領域、ｂ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域またはその断片または変異体を含む第２の領域、ｃ）ＴＰＯ模倣ペプチドを含む、融合ペプチドを提供する。いくつかの実施例において、前記ＴＰＯ模倣ペプチドは、一つ以上のＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインを含む。いくつかの実施例において、前記複数のＴＰＯＲ結合ドメインおよび／または活性化ドメインは、一つまたは複数のペプチドリンカーを介して相互に連結され、且つＦｃ領域に連結される。いくつかの実施例において、前記ペプチドリンカーは、五つのアミノ酸からなるグリシンペプチドリンカー等のグリシンリンカーである。
【0089】
いくつかの実施例において、前記組換えポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施例において、前記組換えポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して少なくとももしくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらを含む。
【0090】
いくつかの実施例において、上記の融合ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で提供されるＮ末端シグナルペプチドを含むことができる。いくつかの実施例において、前記組換えポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施例において、前記組換えポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して少なくとももしくは約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列であるか、またはそれらを含む。
【0091】
いくつかの実施例において、前記融合ポリペプチドのＮ末端ＴＮＦＲ２ドメインは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施例において、前記融合ポリペプチドのＦｃドメインは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施例において、前記ポリペプチド内のジスルフィド結合は、任意の適切な組み合わせでＣ１８～Ｃ３１、Ｃ３２～Ｃ４５、Ｃ３５～Ｃ５３、Ｃ５６～Ｃ７１、Ｃ７８～Ｃ８８、Ｃ７８～Ｃ９６、Ｃ９８～Ｃ１０４、Ｃ１１２～Ｃ１２１、Ｃ１１５～Ｃ１３９、Ｃ１４２～Ｃ１５７、Ｃ１６３～Ｃ１７８、Ｃ２８１～Ｃ３４１およびＣ３８７～Ｃ４４５の一つまたは複数またはすべてを含むことができる。
【0092】
いくつかの実施例において、本発明は、二つの融合ポリペプチドを含む融合二量体タンパク質を提供し、各融合ポリペプチドは、アミノ基末端からカルボキシ基末端まで、ａ）ヒトＴＮＦＲ２受容体またはその断片または変異体を含む第１の領域、ｂ）ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域またはその断片または変異体を含む第２の領域、ｃ）ＴＰＯ模倣ペプチドを含み、ここで、前記融合ポリペプチドのＦｃは、ポリペプチド間ジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施例において、前記ポリペプチド間ジスルフィド結合は、任意の適切な組み合わせでＣ２４０～Ｃ２４０、Ｃ２４６～Ｃ２４６およびＣ２４９～２４９の一つまたは複数またはすべてを含むことができる。
【0093】
いくつかの実施例において、例えば、Ｎ１４９およびＮ１７１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）の一つまたは二つの位置において、前記二量体の融合ポリペプチドは、一つまたは複数のグリコシル化部位（例えば、Ｎ－グリコシル化）を含むことができる。Ｎ－結合グリコシル化は、オリゴ糖（グリカンと呼ばれることもある）と窒素原子（例えば、タンパク質アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）残基のアミド窒素）との連結である。いくつかの実施例において、ヒトＩｇＧ Ｆｃ媒介ＡＤＣＣにおけるＮ３１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）でのＮ－結合グリコシル化の任意の可能性を回避するために、Ｎ３１７を例えばグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）に突然変異させることができる。いくつかの実施例において、グリカンを含まない宿主細胞（例えば、大腸菌）において本発明に記載の融合ポリペプチドを産生することができる。いくつかの実施例において、例えば、Ｑ８２、Ｑ１０９、Ｎ３０６、Ｑ３１７およびＱ５２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）の一つまたは複数の位置において、前記二量体の融合ポリペプチドは、任意の適切な組み合わせで一つまたは複数の脱アミノ修飾部位を含むことができる。いくつかの実施例において、例えば、Ｍ３０およびＭ２７２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）の一つまたは二つの位置において、前記二量体の融合ポリペプチドは、一つまたは複数の酸化修飾部位を含むことができる。いくつかの実施例において、例えば、Ｄ３００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）において、前記二量体の融合ポリペプチドは、アスパラギン酸異性化修飾部位を含むことができる。いくつかの実施例において、本発明に記載の融合ポリペプチドは、任意の適切な組み合わせで本発明に開示される任意のアミノ酸残基を含むことができる。
【0094】
Ｖ．ポリヌクレオチド、ベクター、ならびに組換えペプチドおよびタンパク質を調製する方法
本発明は、本発明に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（核酸分子）、このような融合ポリペプチドを発現する遺伝子操作された細胞ベクター、およびポリヌクレオチドまたはこのような融合ポリペプチドを発現する遺伝子操作された細胞ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
本発明は、本発明に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（核酸分子）、このような融合ポリペプチドを発現する遺伝子操作された細胞ベクター、およびポリヌクレオチドまたはこのような融合ポリペプチドを発現する遺伝子操作された細胞ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。
【0095】
いくつかの実施例において、本発明は、本発明に記載の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、前記ポリヌクレオチドは、融合ポリペプチドをコードする核酸配列等の単一の核酸配列を含む。いくつかの実施例において、前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、融合ポリペプチドの発現を制御するために、作動可能に連結された少なくとも一つのプロモーターを含む。
【0096】
一態様において、本開示は、本開示に記載の融合ペプチドアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＴＮＦＲ２ドメイン、Ｆｃドメイン、ＴＰＭドメイン、全長融合ペプチド等の本発明に記載の融合タンパク質の任意の部分であってもよく、またはＮ末端シグナルペプチドを有する全長融合ペプチドであってもよい。本開示に記載の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどであり得、且つイントロン配列を含んでいても含んでいなくてもよい。通常、前記核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【0097】
他の実施例において、前記核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～７および９のいずれか１項に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。
【0098】
本開示は、本開示に記載の核酸分子を含む、ベクターをさらに提供する。核酸分子は、ＴＮＦＲ２ドメイン、Ｆｃドメイン、ＴＰＭドメイン、全長融合ペプチド等の本発明に記載の融合タンパク質の任意の部分をコードしてもよく、またはＮ末端シグナルペプチドを有する全長融合ペプチドであってもよい。
【0099】
本開示に記載の融合タンパク質を発現させるために、融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入して、ＤＮＡ分子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結される。この場合、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列がＤＮＡ分子の転写および翻訳を調節するという意図された機能を実行できるように、融合ペプチドをコードするＤＮＡ分子をベクターに連結されることを指す。使用される発現宿主細胞と互換性のある発現ベクターおよび発現制御配列を選択する。任意の適切な方法（例えば、融合ペプチドおよびベクターをコードするＤＮＡ分子上の相補的制限部位の連結、または相同組換えに基づくＤＮＡ連結）によって、融合ペプチドをコードするＤＮＡ分子を、発現ベクターに挿入する。さらにまたは代わりに、前記組換え発現ベクターは、宿主細胞における融合ペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングして、シグナルペプチドと融合ペプチドをコードするＤＮＡ分子のアミノ基末端とをインフレームで連結されることができる。いくつかの実施例において、前記シグナルペプチドをコードする核酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0100】
融合ペプチドをコードする核酸配列に加えて、本開示に記載の発現ベクターは、通常、宿主細胞における融合ペプチドをコードする核酸配列の発現を制御する調節配列を保有する。「調節配列」という用語は、融合ペプチドをコードする核酸配列の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを指す。例えば、このような調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌに記載されたとおりである（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （１９９０））。当業者は、調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル等の要因に依存することができることを理解するであろう。哺乳動物宿主細胞発現に使用される調節配列の例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマウイルス由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー等の哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素を含む。代わりに、ユビキチンプロモーターまたはβ－グロビンプロモーター等の非ウイルス調節配列を使用することができる。さらに、調節要素は、様々なソースからの配列で構成され、例えば、ＳＲプロモーターシステムは、ＳＶ４０初期プロモーターに由来する配列およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列を含む（Ｔａｋｅｂｅ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：４６６－４７２）。
【0101】
融合ペプチドをコードする核酸配列および調節配列に加えて、前記発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子等のさらなる配列をさらに保有することができる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択に有益である（ｓｅｅ， ｅ．ｇ．， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏｓ． ４，３９９，２１６， ４，６３４，６６５ ａｎｄ ５，１７９，０１７， ａｌｌ ｂｙ Ａｘｅｌ ｅｔ ａｌ．）。例えば、選択マーカー遺伝子は、ベクターに導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート等の薬物に対する耐性を与えることがよくある。選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ宿主細胞およびメトトレキサートの選択／増幅に使用される）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８の選択に使用される）を含む。
【0102】
融合ペプチドを発現させるために、任意の適切な技術によって、融合ペプチドをコードする発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクションする。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション等の外因性ＤＮＡを原核生物または真核生物の宿主細胞に導入するために一般的に使用される様々な技術を網羅することを意図している。原核生物または真核生物の宿主細胞で本開示に記載の融合ペプチドを発現させることができるが、最も典型的には真核細胞で、通常、哺乳動物の宿主細胞で抗体を発現する。
【0103】
本開示は、本開示に記載の核酸分子を含む、宿主細胞をさらに提供する。前記宿主細胞は、発現ベクターが使用できる、ほとんどすべての細胞であり得る。例えば、それは、高等真核宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）および下等真核宿主細胞（例えば、酵母細胞）、または原核細胞（例えば、細菌細胞）であり得る。リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはファージ感染によって、組換え核酸構築体を宿主細胞に導入することができる。
【0104】
形質転換に使用される適切な原核宿主としては、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、ならびにシュードモナス属、ストレプトミセス属およびブドウ球菌属内の様々な種を含む。
【0105】
本開示に記載の融合ペプチドを発現するために使用される哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｄｈｆｒ－ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ， ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｉｎ Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０ （１９８０））、ＤＨＦＲ選択マーカーと組み合わせて使用され（例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５９：６０１－６２１ （１９８２）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳｐ２細胞を参照する）等を含む。具体的には、ＮＳ０骨髄腫またはＣＨＯ細胞と組み合わせて使用される場合、別の発現システムは、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６およびＥＰ３３８８４１に開示されたＧＳ（グルタミンシンテターゼ）遺伝子発現システムである。融合ペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを哺乳動物の宿主細胞に導入する場合、宿主細胞を一定期間培養することによって、融合ペプチドを産生し、前記時間は、宿主細胞での融合ペプチドの発現、または宿主細胞成長培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な時間である。任意の適切なタンパク質精製方法を使用して、培地から融合ペプチドを回収することができる。
【0106】
ＶＩ．トロンボポエチン活性を有する組成物および製剤
いくつかの実施例において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列を有するｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合ペプチドの二量体を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施例において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列を有するｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合ペプチドの二量体を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施例において、前記医薬組成物は、本発明によって提供される二量体化融合ポリペプチドを含み、選択可能に、薬学的に許容される担体を含む。
いくつかの実施例において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される配列を有するｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合ペプチドの二量体を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施例において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示される配列を有するｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合ペプチドの二量体を含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施例において、前記医薬組成物は、本発明によって提供される二量体化融合ポリペプチドを含み、選択可能に、薬学的に許容される担体を含む。
【0107】
「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、製剤中の結合分子を送達する際の使用に適した任意の不活性物質を指す。ベクターは、固着防止剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、充填剤または希釈剤、防腐剤（例えば、抗酸化剤、抗菌剤または抗真菌剤）、甘味剤、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液等であり得る。適切な薬学的に許容される担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、ポリソルベート２０、デキストロース、植物油（例えば、オリーブ油）、生理食塩水、緩衝液、緩衝食塩水および等張剤（例えば、糖、ポリオール、ソルビトールおよび塩化ナトリウム）。
【0108】
前記組成物は、液体、半固体および固体の剤形等の任意の適切な形態であり得る。液体剤形の例としては、溶液（例えば、注射用および注入用溶液）、マイクロエマルション、リポソーム、分散体または懸濁液を含む。固体剤形の例としては、錠剤、丸剤、カプセル、マイクロカプセルおよび粉末を含む。結合分子の送達に適した組成物の具体的な形態は、溶液、懸濁液または分散体などの注射用または注入用滅菌液体である。所望の量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を適切なベクターにドーピングし、滅菌し、精密ろかして、滅菌溶液を調製することができる。通常、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を基本的な分散媒体および他のベクターを含む滅菌溶媒にドーピングして、分散体を調製する。滅菌粉末を滅菌液体の調製に使用する場合、調製方法は、活性成分ならびに事前に滅菌ろ過した溶液から任意のさらなる必要とする成分の粉末を調製するための、真空乾燥および凍結乾燥（凍結乾燥）を含む。当技術分野で知られている従来の技術によって、組成物の様々な剤形を調製することができる。
【0109】
組成物中に含まれるｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の相対量は、使用されるベクター、剤形、ならびに所望の放出および薬力学特徴等の様々な要因に応じて変化する。単一剤形ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の量は、通常、治療効果を生み出す量であるが、より少ない量であってもよい。通常、剤形の総重量に対して、前記量の範囲は、約０．０１％～約９９％、約０．１％～約７０％または約１％～約３０％である。
【0110】
いくつかの実施例において、前記トロンボポエチン活性を有する組成物は、溶媒、充填剤、緩衝剤、張性調節剤および防腐剤等を含む薬学的に許容される担体を含む（Ｐｒａｍａｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａ Ｔｉｍｅｓ， ４５：６５－７７， ２０１３）。幾つかの実施例において、前記トロンボポエチン活性を有する組成物は、溶媒、充填剤、緩衝剤および張性調節剤のうちの一種または複数種としてのベクターを含むことができる（例えば、塩化ナトリウム生理食塩水を水性溶媒および張性調節剤として使用できる）。
【0111】
いくつかの実施例において、前記トロンボポエチン活性を有する組成物は、溶媒としての水性溶媒を含む。適切な溶媒は、滅菌水、生理食塩水、リン酸塩緩衝食塩水およびリンゲル液等を含む。いくつかの実施例において、前記組成物は、等張性である。
【0112】
前記トロンボポエチン活性を有する組成物は、緩衝剤を含むことができる。緩衝剤は、ｐＨを制御し、それにより加工中および保存中、選択可能に再構成中で活性剤の分解を阻害する。適切な緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩または硫酸塩等を含む塩等を含む。他の適切な緩衝液は、アルギニン、グリシン、ヒスチジンおよびリジン等のアミノ酸等、またはその薬学的に許容される塩を含む。前記緩衝剤は、塩酸または水酸化ナトリウムをさらに含むことができる。いくつかの実施例において、前記緩衝剤は、組成物のｐＨを５～８の範囲内に維持する。いくつかの実施例において、前記ｐＨは、５または６（下限）より大きい。いくつかの実施例において、前記ｐＨは、８または７（上限）より小さい。即ち、前記ｐＨの範囲は、約５～８であり、ここで、下限は、上限よりも小さい。
【0113】
前記トロンボポエチン活性を有する組成物は、張性調節剤を含むことができる。適切な張性調節剤は、デキストロース、スクロース、グリセロール、塩化ナトリウム、グリセリンおよびマンニトール等を含む。
【0114】
前記トロンボポエチン活性を有する組成物は、充填剤を含むことができる。充填剤は、医薬組成物を投与前に凍結乾燥した場合に特に有用である。いくつかの実施例において、前記充填剤は、凍結乾燥または噴霧乾燥および／または保存中において活性剤の安定化を助け、且つその分解を防止する保護剤である。適切な充填剤は、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、グルコースおよびラフィノース等の糖（単糖、二糖および多糖）である。
【0115】
前記トロンボポエチン活性を有する組成物は、防腐剤を含むことができる。適切な防腐剤は、抗酸化剤および抗微生物剤等を含む。しかし、好ましい実施例において、前記トロンボポエチン活性を有する組成物は、滅菌条件下で調製され、且つ使い捨て容器に保存されるため、防腐剤を含む必要はない。
【0116】
いくつかの実施例において、前記組成物は、滅菌組成物として提供されてもよい。前記医薬組成物は、通常、有効量の開示された融合タンパク質を含み、従来技術によって調製されることができる。通常、免疫原性組成物の用量当たりの融合タンパク質の量は、重大な有害な副作用なしに血小板数の増加を誘導するように選択される。いくつかの実施例において、前記組成物は、被験者の血小板数の増加を誘導するための単位剤形で提供されることができる。単位剤形は、被験者に投与するための適切な単一の予め選択された用量、または標識または測定された適切な倍数、即ち、二つまたはそれ以上の予め選択された用量、および／または単位用量またはその倍数を投与するための計量メカニズムを含む。
【0117】
ＶＩＩ．血小板減少症を治療する方法
いくつかの実施例において、本発明は、患者にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含む有効量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を投与することを含む、血小板減少症を治療する方法を提供する。いくつかの実施例において、本発明は、患者にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を含む有効量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を投与することを含む、血小板減少症を治療する方法を提供する。
いくつかの実施例において、本発明は、患者にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含む有効量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を投与することを含む、血小板減少症を治療する方法を提供する。いくつかの実施例において、本発明は、患者にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を含む有効量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を投与することを含む、血小板減少症を治療する方法を提供する。
【0118】
いくつかの実施例において、前記血小板減少症は、自己免疫性疾患、肝臓の炎症および／または損傷によって引き起こされるか、または薬物療法、放射線療法または手術によって誘導される可能性がある。いくつかの実施例において、前記自己免疫性疾患によって誘発される血小板減少症は、慢性免疫性（特発性）血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）であり得る。いくつかの実施例において、前記ＣＤ４７経路は、ＩＴＰにおいて調節不全である。いくつかの実施例において、前記肝臓の炎症および／または損傷は、肝硬変、肝線維症、脂肪肝、肝炎（例えば、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎）または非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）であり得る。いくつかの実施例において、前記薬物療法は、化学療法であり得る。いくつかの実施例において、前記化学療法は、カルボプラチンであり得、ここで、前記血小板減少症は、カルボプラチンによって誘発される可能性がある。いくつかの実施例において、前記薬物療法によって誘発される血小板減少症は、化学療法誘発性血小板減少症（ＣＩＴ）であり得る。いくつかの実施例において、前記薬物療法は、免疫腫瘍学療法であり得る。いくつかの実施例において、前記免疫腫瘍学療法は、免疫チェックポイント阻害剤療法であり得る。いくつかの実施例において、前記免疫チェックポイント阻害剤療法は、ＣＤ４７、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１および／またはＰＤ－Ｌ１（例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ドスタルリマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブまたはセミプリマブまたはそのバイオシミラー、生物学的同等薬または生物学的改良薬、またはその抗原結合断片）を阻害することができる。いくつかの実施例において、前記免疫チェックポイント阻害剤療法は、化学療法および／または放射線療法と組み合わせることができる。
【0119】
いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、皮下注射によって投与される。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、静脈内注射によって投与される。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、単回投与されるか、または週に１回、週に２回、２週間に１回、１週間半に１回の間隔またはそれ以上の間隔で複数回投与される。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、週に１回投与される。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、週に２回投与される。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、２週間に１回または１週間半に１回投与されるか、またはそれ以上の間隔で投与される。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、１週間半に１回、２週間に１回、２週間半に１回、または３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０または１０．５週間に１回投与される。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、２週間に１回投与される。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、３週間に１回投与される。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、４週間に１回投与される。
【0120】
いくつかの態様において、前記融合ペプチドまたはタンパク質の投与は、被験者が受けている可能性のある化学療法または免疫腫瘍学療法のサイクルと調整される。いくつかの実施例において、化学療法または免疫腫瘍学療法の最初の投与から２４時間以内に前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の最初の投与を実行する。いくつかの実施例において、化学療法または免疫腫瘍学療法の最初の投与から４８時間以内に前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の最初の投与を実行する。いくつかの実施例において、化学療法または免疫腫瘍学療法サイクル中に血小板最小値が観察される１２日前に前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の最初の投与を実行する。いくつかの実施例において、最初の投与後毎週に前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の追加投与を１回実行する。いくつかの実施例において、最初の投与後に前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の追加投与を週に２回実行する。いくつかの実施例において、最初の投与後に前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の追加投与を２週間に１回またはそれ以上の間隔で実行する。いくつかの実施例において、前記週に１回、週に２回、２週間に１回、３週間に１回または４週間に１回もしくは複数回投与される用量は、同じである。いくつかの実施例において、前記週に１回、週に２回、２週間に１回、３週間に１回または４週間に１回もしくは複数回投与される用量は、異なる。いくつかの実施例において、前記薬物は、最初の化学療法サイクル中に最初に投与される。いくつかの実施例において、前記薬物は、２回目の化学療法サイクル中における化学療法または免疫腫瘍学療法の投与後２４または４８時間以内に最初に投与される。いくつかの実施例において、前記薬物は、３回目の化学療法サイクルにおける化学療法または免疫腫瘍学療法の投与後２４または４８時間以内に最初に投与される。
【0121】
いくつかの態様において、被験者の血小板数または他の症状の観察に関する標準的な研究を通じて、融合ペプチドまたはタンパク質を投与するかどうかを決定する。いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、患者の血小板数が４００×１０９、３００×１０９、２００×１０９、１００×１０９、５０×１０９、４０×１０９、３０×１０９、２０×１０９または１０×１０９／Ｌ未満の場合に投与される。
【0122】
いくつかの実施例において、他の治療方法に反応しなかった患者に前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を投与する。いくつかの実施例において、前記患者は、ＴＰＩＡＯ（登録商標）（組換えヒトトロンボポエチン、ｒＨｕＴＰＯ）に対して無反応である。いくつかの実施例において、前記患者は、コルチコステロイド、免疫グロブリンに対して反応性がないか、または脾臓摘出術に対して不十分な反応を示す。いくつかの実施例において、前記患者は、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）またはエタネルセプトに対して反応性がない。いくつかの実施例において、前記患者は、Ｎｐｌａｔｅ（登録商標）またはロミプロスチムに対して反応性がない。
【0123】
患者体内の巨核球または血小板を効果的に増加させる量で本発明に記載のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を被験者に提供する。開示されたｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の実際の用量は、疾患の適応症および被験者の具体的な状態（例えば、被験者の年齢、体型、健康な状況、症状の重症度、感受性要因等）、投与の時間および経路、同時に投与される他の薬物または治療、ならびに被験者体内において所望の活性または生物学的反応を誘発するために使用される組成物の特定の薬理学等の要因に応じて変化する。投与計画を調整して、最適な治療反応を提供することができる。
【0124】
いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の投与量は、０．１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約１μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１μｇ／ｋｇ、約２μｇ／ｋｇ、約３μｇ／ｋｇ、約６μｇ／ｋｇ、約８μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約１３μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約２０μｇ／ｋｇ、約２５μｇ／ｋｇ、約３０μｇ／ｋｇ、約４０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約６００μｇ／ｋｇ、約８００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．２ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇまたは約５０ｍｇ／ｋｇである。
【0125】
被験者集団（例えば、乳児または高齢者）に基づいて、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の量を決定する。被験者における血清濃度、血小板数および他の反応の観察に関する標準的にな研究を通じて、特定の組成の最適量を決定することができる。被験者の血清濃度、血小板数および他の反応の観察、ならびに被験者が受ける他の治療（例えば、化学療法または免疫腫瘍学療法）に基づいて、本発明に記載のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の治療有効量を調整することを理解されたい。
【0126】
いくつかの実施例において、少なくとも部分的には血小板数に基づいて、個体に投与される治療 の量を変更するかどうかを決定することができる。血小板数は、血小板数を含む全血球数（ＣＢＣ）に基づくことができる。各投与前、毎週または毎月に全血球数を実行することができる。全血球数および／または血小板数の結果に基づいて、投与されるｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質の量を調整することができる。
【0127】
方法が効果的であると見なされるには、血小板数が健康な個体の正常な血小板数に達する必要ない。例えば、本発明に記載のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を投与して血小板生成を誘導することによって、血小板数を所望のレベル、例えば１０×１０９、２０×１０９、３０×１０９、４０×１０９、５０×１０９、１００×１０９、２００×１０９、３００×１０９または４００×１０９／Ｌを超えるレベルまで増加させることができる。いくつかの実施例において、本発明に記載のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、臨床的に重要な出血を回避するのに十分なレベルまで血小板数を増加させることができる。
【0128】
いくつかの実施例において、癌患者に前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を投与することができる。いくつかの実施例において、前記癌は、血液がんまたはリンパ造血系悪性腫瘍等の液体がんであり得る。いくつかの実施例において、前記癌は、固形がんである。いくつかの実施例において、前記癌は、固形腫瘍、血液がん、膀胱がん、脳がん、乳がん、結腸がん、胃がん、神経膠腫、頭部がん、白血病、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、骨髄腫、頸部がん、卵巣がん、黒色腫、膵臓がん、腎臓がん、唾液腺がん、胃がん、胸腺上皮がんおよび甲状腺がんから選択されることができる。いくつかの実施例において、前記癌は、アジュバント治療環境にある。いくつかの実施例において、前記癌は、ネオアジュバント治療環境にあり得る。いくつかの実施例において、前記癌は、進行がんであり得る。いくつかの実施例において、前記癌は、転移性がんであり得る。
【0129】
いくつかの実施例において、前記癌のタイプは、固形がんのタイプまたは血液悪性がんのタイプであり得る。いくつかの実施例において、前記癌のタイプは、再発性または難治性の癌のタイプである。いくつかの実施例において、前記癌のタイプは、急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬまたはＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、副腎皮質がん（ＡＣＣ）、膀胱尿路上皮がん（ＢＬＣＡ）、脳幹神経膠腫、脳低悪性度神経膠腫（ＬＧＧ）、 腫瘍、乳がん（ＢＲＣＡ）、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発部位不明の癌、カルチノイド腫瘍、原発部位不明の癌、中枢神経系の非定型奇形種／ラブドイド腫瘍、中枢神経系の胎児性腫瘍、子宮頸部扁平上皮がん、子宮頸部内膜腺がん（ＣＥＳＣ）、小児がん、胆管がん（ＣＨＯＬ）、脊索腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸（腺がん）がん（ＣＯＡＤ）、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣芽腫、上衣腫、食道がん（ＥＳＣＡ）、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛腫瘍、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、有毛細胞白血病、頭頚部がん（ＨＮＳＤ）、心臓がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、口唇がん、肝臓がん、リンパ系腫瘍、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、悪性線維性組織球腫、骨がん、髄芽腫、髄上皮腫、黒色腫、メルケル細胞がん、メルケル細胞皮膚がん、中皮腫（ＭＥＳＯ）、潜在的原発転移性扁平上皮がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚がん、非小細胞肺がん、中咽頭がん、骨肉腫、他の脳および脊髄腫瘍、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、悪性度の低い卵巣腫瘍、膵臓がん、乳頭腫症、副鼻腔がん、副甲状腺がん、骨盤がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫および傍神経節腫（ＰＣＰＧ）、中分化型松果体実質腫瘍、松果芽腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性肝細胞がん、前立腺がん（ＰＲＡＤ）等の前立腺がん、直腸がん、腎細胞（腎臓）がん、腎細胞がん、呼吸器がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫（ＳＡＲＣ）、セザリー症候群、皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）、小細胞肺がん、小腸がん、軟部肉腫、扁平上皮がん、子宮頸部扁平上皮がん、胃がん、テント上原始神経外胚葉腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣がん、精巣胚細胞腫瘍（ＴＧＣＴ）、喉頭がん、胸腺がん、胸腺腫（ＴＨＹＭ）、甲状腺がん（ＴＨＣＡ）、移行上皮がん、腎盂および尿管移行上皮がん、トロホブラスティック腫瘍、尿管がん、尿道がん、子宮がん、ブドウ膜黒色腫（ＵＶＭ）、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症または腎芽腫を含むことができる。いくつかの実施例において、前記癌のタイプは、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、膀胱がん、乳がん、脳がん、 頸部がん、胆管がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、消化器がん、神経膠腫、神経膠芽腫、頭頚部がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、リンパ系腫瘍、黒色腫、骨髓腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、褐色細胞腫および傍神経節腫、前立腺がん、直腸がん、扁平上皮がん、精巣がん、胃がんまたは甲状腺がんを含むことができる。
【0130】
いくつかの実施例において、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質は、任意の適切な経腸経路または非経腸経路を介して投与されることができる。「経腸経路」投与という用語は、胃腸管の任意の部分を通る投与を指す。経腸経路の例としては、経口、舌下、粘膜、頬側および直腸経路または胃内経路を含む。「非経腸経路」投与とは、経腸経路以外の投与経路を指す。非経口投与経路の例としては、静脈内、筋肉内、皮内、経皮、腹腔内、腫瘍内、膀胱内、動脈内、くも膜下腔内、 内、眼窩内、骨内、腎臓内、経粘膜、経気管、経気管、硝子体内、関節内、関節周囲、網膜下、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内、皮下または局所投与を含む。
【0131】
いくつかの実施例において、任意の適切な方法、例えば、経口投与、経鼻胃チューブ、胃瘻造設チューブ、注射、注入、埋め込み型注入ポンプおよび浸透圧ポンプを通じて、前記ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質を投与することができる。適切な投与経路および方法は、使用される特定の抗体、所望の吸収速度、使用される特定の製剤または剤形、治療される疾患のタイプまたは重症度、特定の作用部位、ならびに患者の状况等の様々な要因に応じて変化することができ、当業者であれば容易に選択されることができる。いくつかの実施例において、本開示に記載のＴＰＯ模倣融合タンパク質および組成物は、皮下注射によって投与される。いくつかの実施例において、本開示に記載のＴＰＯ模倣融合タンパク質および組成物は、静脈内注射によって投与される。
【0132】
ＶＩＩＩ．製品
本発明は、前記組換えポリペプチドおよびタンパク質組成物を含む製品またはキットをさらに提供する。前記製品は、容器と、その上のまたはそれに付随するラベルまたは薬品説明書とを含むことができる。適切な容器は、ボトル、バイアル、注射器、試験管、ＩＶ溶液バッグ等を含む。前記容器は、ガラスまたはパラスチック等の様々な材料で作られることができる。いくつかの実施例において、前記容器は、滅菌アクセスポートを有する。例示的な容器は、注射針で突き刺すことができるストッパーを有する容器を含む、静脈内溶液バッグおよびバイアルを含む。前記製品またはキットは、組成物が本発明に記載の病症（例えば、ＣＩＴまたはＩＴＰ）等の特定の病症を治療するために使用できる薬品説明書をさらに含むことができる。代わりにまたはさらに、前記製品またはキットは、薬学的に許容される緩衝液を含む、異なるまたは同じ容器をさらに含むことができる。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針および／または注射器等の他の材料をさらに含むことができる。
本発明は、前記組換えポリペプチドおよびタンパク質組成物を含む製品またはキットをさらに提供する。前記製品は、容器と、その上のまたはそれに付随するラベルまたは薬品説明書とを含むことができる。適切な容器は、ボトル、バイアル、注射器、試験管、ＩＶ溶液バッグ等を含む。前記容器は、ガラスまたはパラスチック等の様々な材料で作られることができる。いくつかの実施例において、前記容器は、滅菌アクセスポートを有する。例示的な容器は、注射針で突き刺すことができるストッパーを有する容器を含む、静脈内溶液バッグおよびバイアルを含む。前記製品またはキットは、組成物が本発明に記載の病症（例えば、ＣＩＴまたはＩＴＰ）等の特定の病症を治療するために使用できる薬品説明書をさらに含むことができる。代わりにまたはさらに、前記製品またはキットは、薬学的に許容される緩衝液を含む、異なるまたは同じ容器をさらに含むことができる。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針および／または注射器等の他の材料をさらに含むことができる。
【0133】
前記ラベルまたは薬品説明書には、組成物が個体のＣＩＴの治療に使用されることが記載されている可能性がある。前記ラベルまたは薬品説明書には、組成物が個体のＩＴＰの治療に使用されることが記載されている可能性がある。容器の上の、またはそれに付随するラベルまたは薬品説明書には、製剤の再構成および／または使用に関する指示が記載されている可能性がある。前記ラベルまたは薬品説明書には、さらに、製剤が皮下、静脈内または他の投与方式による個体のＣＩＴまたはＩＴＰの治療に使用されることが記載されている可能性がある。
【0134】
いくつかの実施例における前記容器は、組成物を保持し、前記組成物は、単独で、または別の組成物と一緒になって、病症を共同に効果的に治療、予防および／または診断する。前記製品またはキットは、（ａ）融合ペプチドまたはそのタンパク質を含む組成物（第１の薬物）を保持する第１の容器と、（ｂ）別の治療剤等のさらなる薬剤を含む組成物（第２の薬物）を保持する第２の容器とを含むことができ、前記製品またはキットは、被験者を治療するために有効量の第２の薬物を使用するためのラベルまたは薬品説明書をさらに含む。
【0135】
ー用語ー
特に定義しない限り、本発明で使用されるすべての技術用語、記号および他の技術的および科学的用語または専門用語は、保護主題が属する当業者に知られているのと同じ意味を有する。いくつかの場合によっては、明確化および／または参照の容易化のために、本発明は、一般に理解される意味を有する用語を定義し、本発明にそのような定義が含まれることは、これらの定義が当該技術分野で一般に理解される定義と大きく異なることを必ずしも意味するものではないことを理解されたい。
特に定義しない限り、本発明で使用されるすべての技術用語、記号および他の技術的および科学的用語または専門用語は、保護主題が属する当業者に知られているのと同じ意味を有する。いくつかの場合によっては、明確化および／または参照の容易化のために、本発明は、一般に理解される意味を有する用語を定義し、本発明にそのような定義が含まれることは、これらの定義が当該技術分野で一般に理解される定義と大きく異なることを必ずしも意味するものではないことを理解されたい。
【0136】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小の長さに限定されない。ポリペプチド（提供される受容体、および例えばリンカーまたはペプチド等の他のポリペプチドを含む）は、アミノ酸残基（天然および／または非天然のアミノ酸残基を含む）を含むことができる。当該用語は、グリコシル化、シアル化、アセチル化およびリン酸化等のポリペプチドの発現後修飾をさらに含む。いくつかの態様において、天然または自然の配列と比較して、前記ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性保持している限り、修飾を含むことができる。これらの修飾は、部位特異的突然変異形成等の意図的な修飾である場合もあれば、またはタンパク質を産生する宿主における突然変異またはＰＣＲ増幅によってエラーを引き起こした後の形成等の非意図的な修飾である場合もある。
【0137】
本発明で使用される「Ｆｃ領域」とは、抗体の重鎖定常領域（第１の定常領域免疫グロブリンドメインを含まない）を含むポリペプチドを指す。ＩｇＧの場合、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３、ならびにＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジを含むことができる。Ｆｃドメインは、少なくともＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むヒトＦｃドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または１００％の配列同一性）を有することができる。Ｆｃドメイン単量体は、第２および第３の抗体定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）を含む。いくつかの実施例において、前記Ｆｃドメイン単量体は、ヒンジドメインをさらに含む。Ｆｃドメインは、可変ドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）等の抗原識別領域として機能できる免疫グロブリンの任意の部分を含まない。野生型Ｆｃドメインにおいて、二つのＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用、および二つの二量体化Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン間で形成された一つまたは複数のジスルフィド結合を通じて、二つのＦｃドメイン単量体は、二量体化される。いくつかの実施例において、「死亡」Ｆｃドメインで表されるＦｃドメインは、突然変異後にエフェクター機能を欠く可能性がある。特定の実施例において、前記Ｆｃドメインにおける各Ｆｃドメイン単量体は、ＦｃドメインとＦｃγ受容体との間の相互作用または結合を減少させるＣＨ２ドメイン中のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施例において、前記Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン二量体化を減少または阻害しない一つまたは複数のアミノ酸置換を含む。Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤを含む、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプであり得る。さらに、Ｆｃドメインは、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）であり得る。Ｆｃドメインは、組換えＦｃドメイン等の非天然Ｆｃドメインであることもできる。
【0138】
本発明において、二つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、配列間の同一アミノ酸のパーセンテージを表わす。通常、Ｂｅｓｔｆｉｔ、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴ等の既知のコンピュータプログラムプログラムを使用して、ポリペプチドのアミノ酸配列同一性を決定することができる（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８３：６３－９８ （１９９０）； Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １３２：１８５－２１９ （２０００）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０ （１９９０）； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２ （１９９７）を参照する）。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アライメントプログラムを使用して特定の配列が参照アミノ酸配列に対して９５％の同一性を有するかどうかを決定する場合、参照アミノ酸配列の全長にわたって同一性パーセンテージを計算し、相同性が参照配列のアミノ酸残基の総数の５％を占めるように、パラメーターを設定する。前述のポリペプチド間の同一性パーセンテージを決定する方法は、本発明に開示されるすべてのタンパク質、断片またはその変異体に適用されることができる。
【0139】
「宿主細胞」という用語は、目的タンパク質、タンパク質断片またはペプチドを産生するように操作された細胞株を指す。宿主細胞としては、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０等のげっ歯類動物（ラット、マウス、モルモットまたはハムスター）に由来する哺乳動物培養細胞等の培養細胞、またはヒト組織もしくはハイブリドーマ細胞、酵母細胞および昆虫細胞、ならびにトランスジェニック動物または培養組織に含まれる細胞を含むが、これらに限定されない。当該用語は、特定の被験者細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も含む。突然変異または環境の影響により子孫に特定の修飾が生じる可能性があるため、そのような子孫は、親細胞と統一ではない可能性があるが、依然として「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。
【0140】
「単離された核酸」という用語は、天然の核酸源の他の核酸分子から単離されたゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成起源またはその組み合わせの核酸分子を指す。例えば、ゲノムＤＮＡの場合、「単離」という用語は、ゲノムＤＮＡに天然に結合している染色体的に単離された核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸の両端に天然に位置する配列（標的核酸５´末端および３´末端に位置する配列）を有さない。
【0141】
本発明で使用される「被験者」という用語は、ヒトまたは他の動物、通常はヒト等の哺乳動物である。いくつかの実施例において、前記一種または複数種の薬剤、細胞、細胞集団または組成物が投与された被験者（例えば、患者）は、哺乳動物、通常はヒト等の霊長類動物である。いくつかの実施例において、前記霊長類動物は、サルまたは類人猿である。前記被験者は、男性でも女性でもよく、幼児、青少年、青年、成人、および老人の被験者を含む任意の適切な年齢であり得る。いくつかの実施例において、前記被験者は、げっ歯類動物等の非霊長類哺乳動物である。
【0142】
本発明で使用される「治療」（およびその文法的変形）とは、疾患、病症、障害、症状、副作用または結果またはその関連用言型の完全にまたは部分的に改善または軽減を指す。治療の望ましい効果は、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的影響の減少、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善または軽減、ならびに疾患状態の緩和または予後の改善を含むが、これらに限定されない。当該用語は、疾患の完全な治癒や任意の症状の完全な除去、またはすべての症状や結果に対する影響を意味するものではない。
【0143】
薬剤（例えば、薬物製剤、細胞または組成物）の「有効量」とは、必要な期間内で一定の用量／量で所望の結果（例えば、治療または予防の結果）を達成するための有効な量を指す。
【0144】
試薬（例えば、薬物製剤または細胞）の「治療有効量」とは、必要な期間内で一定の用量で所望の治療結果（例えば、疾患、病症または障害を治療するために使用される）を達成するための、および／または薬物動態学的もしくは薬力学的治療効果を達成するための有効な量を指す。治療有効量は、被験者の疾患状態、年齢、性別、体重、および投与される細胞集団等の要因に応じて変化する可能性がある。いくつかの実施例において、提供される方法は、細胞および／または組成物を有効量（例えば、治療有効量）で投与することに関する。
【0145】
本発明で使用される「血清半減期」という用語は、被験者に治療性タンパク質を投与する場合に、被験者体内におけるタンパク質の血漿濃度が半分に減少するのに必要な時間を指す。タンパク質を再分配するか、または血流から除去したり、タンパク質加水分解等の方法によってタンパク質を分解したりすることができる。
【0146】
特に明記しない限り、融合タンパク質は、少なくとも二つの無関係なタンパク質のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質であり、前記無関係なタンパク質は、ペプチド結合によって連結されて、単一のタンパク質を形成する。無関係なアミノ酸配列は、直接互いに連結されるか、またはリンカー配列を介して連結されることができる。本発明において、タンパク質のアミノ酸配列が自然環境（例えば、細胞内）でペプチド結合によって通常連結しない場合、タンパク質は、無関係である。例えば、ウイルス抗原のアミノ酸配列およびコラーゲンまたはプロコラーゲンのアミノ酸配列は、通常、ペプチド結合によって連結されない。
【0147】
配列間の同一性または類似性とは、二つまたはそれ以上の核酸配列または二つまたはそれ以上のアミノ酸配列間の配列の同一性または類似性を意味する。パーセンテージ同一性を使用して配列同一性を測することができ、パーセンテージが高いほど、配列同一性が高くなる。以下に説明する配列比較アルゴリズムの一つを使用するか、または手動アラインメントおよび目視検査によって比較ウィンドウまたは測定された指定領域内で最大の一致を求めで比較およびアラインメントする場合、二つの配列が指定のパーセンテージの同一アミノ酸残基またはヌクレオチドを有する場合（例えば、指定領域で、または指定されていない場合は配列全体で、６０％の同一性を有し、選択可能で、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する）、二つの配列は、「実質的に同一」である。選択可能で、同一性は、少なくとも約５０個のヌクレオチド（または１０個のアミノ酸）の長さの領域、より好ましくは、１００個～５００個または１０００個またはそれ以上のポリヌクレオチド（または２０個、５０個、２００個またはそれ以上のアミノ酸）の長さの領域に存在する。
【0148】
本発明で使用される「約」という用語は、当業者には容易に知られる各個値の一般的な誤差範囲を指す。本発明において特定の値またはパラメーターに「約」が言及される場合、当該値またはパラメーター自体を対象とする実施例を含む（および説明する）。
【0149】
本発明において、文脈上特に明記しない限り、単数形「１個（ａ）」、「１個（ａｎ）」および「前記」は、複数の指示対象も含む。例えば、「１個」とは、「少なくとも一つ」または「一つまたは複数」を表わす。
【0150】
本開示全体は、範囲形式で特許請求される主題の様々な態様が提示される。範囲形式での説明は、便宜および簡潔さのためにのみ提供され、特許請求される主題の範囲に対する厳密な制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲、および当該範囲内の各値を具体的に開示するものと見なされるべきである。例えば、値の範囲が提供される場合、特許請求される主題は、当該範囲の上限と下限との間の各中間値、および当該指定範囲内の任意の他の指定値または中間値をカバーすることを理解されたい。これらの小さな範囲の上限および下限は、独立して小さな範囲に含まれる同時に特許請求される主題の範囲内に含まれるが、指定範囲内で明示的に除外される任意の制限値に制限される。指定範囲に一つまたは二つの制限値が含まれる場合、特許請求される主題には、含まれる制限値のいずれか一つまたは二つを除く範囲も含まれる。上記の説明は、範囲の広さに関係なくすべて適用される。
【0151】
本発明で使用される「組成物」とは、２種またはそれ以上の生成物、物質または化合物（細胞を含む）の任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水相、非水相またはその任意の組み合わせであり得る。
【0152】
本発明で使用される「ベクター」という用語は、それが結合している別の核酸を伝達できる核酸分子を指す。当該用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、および導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結される核酸の発現を指示することができる。本発明において、このようなベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。
【実施例】
【0153】
以下の実施例は、説明のみを目的としており、本開示の範囲を制限することを意図するものではない。
【0154】
実施例１：ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの構築、発現、精製および調製
ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ真核生物発現ベクターの構築
ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ発現ベクターは、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質およびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現をそれぞれ促進するＣＭＶおよびＳＶ４０プロモーターを含む。ＤＨＦＲは、メトトレキサート（ＭＴＸ）選択によって高発現細胞株を選択するための発現ベクターの選択標識として使用される。
発現ベクターのコード領域は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＴＮＦＲ２領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｆｃ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）および機能ペプチド断片反復配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を含む、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に翻訳されることができる。
ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ真核生物発現ベクターの構築
ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ発現ベクターは、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ融合タンパク質およびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の発現をそれぞれ促進するＣＭＶおよびＳＶ４０プロモーターを含む。ＤＨＦＲは、メトトレキサート（ＭＴＸ）選択によって高発現細胞株を選択するための発現ベクターの選択標識として使用される。
発現ベクターのコード領域は、Ｎ末端からＣ末端まで、シグナルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、ＴＮＦＲ２領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｆｃ領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）および機能ペプチド断片反復配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を含む、ペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に翻訳されることができる。
【0155】
遺伝子操作されたｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ細胞株の構築
ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ発現ベクターは、ＧＨ－ＣＨＯ（ｄｈｆｒ－／－）細胞に安定にトランスフェクションされる。ＭＴＸ選択下で、モノクローナルスクリーニングによって、二つの高発現リードクローン１Ｆ２Ｂ１１および１Ｆ２Ｅ５を選択する。
ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ発現ベクターは、ＧＨ－ＣＨＯ（ｄｈｆｒ－／－）細胞に安定にトランスフェクションされる。ＭＴＸ選択下で、モノクローナルスクリーニングによって、二つの高発現リードクローン１Ｆ２Ｂ１１および１Ｆ２Ｅ５を選択する。
【0156】
発現および調製
タンパク質ＩＥＦ、加速試験および高温試験のデータに基づいて配合を決定する。最終生成物は、１．００ｇ／ＬのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭタンパク質、２．６０ｇ／Ｌのリン酸水素ナトリウム一水和物、１．１３ｇ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム二水和物、５．８０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１０．００ｇ／Ｌのスクロース、５．３０ｇ／ＬのＬ－アルギニン塩酸塩、０．０４２ｇ／Ｌのポリソルベート２０を含む、ｐＨ６．３０±０．３０の滅菌溶液に調製される。
タンパク質ＩＥＦ、加速試験および高温試験のデータに基づいて配合を決定する。最終生成物は、１．００ｇ／ＬのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭタンパク質、２．６０ｇ／Ｌのリン酸水素ナトリウム一水和物、１．１３ｇ／Ｌのリン酸水素二ナトリウム二水和物、５．８０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１０．００ｇ／Ｌのスクロース、５．３０ｇ／ＬのＬ－アルギニン塩酸塩、０．０４２ｇ／Ｌのポリソルベート２０を含む、ｐＨ６．３０±０．３０の滅菌溶液に調製される。
【0157】
ジスルフィド結合の分布：
ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭは、１６対のジスルフィド結合を有する二量体糖タンパク質である。３対のジスルフィド結合は、Ｃ２４０－Ｃ２４０、Ｃ２４６－Ｃ２４６、Ｃ２４９－２４９のポリペプチド鎖間ジスルフィド結合であり、１３対のジスルフィド結合は、Ｃ１８－Ｃ３１、Ｃ３２－Ｃ４５、Ｃ３５－Ｃ５３、Ｃ５６－Ｃ７１、Ｃ７８－Ｃ８８、Ｃ７８－Ｃ９６、Ｃ９８－Ｃ１０４、Ｃ１１２－Ｃ１２１、Ｃ１１５－Ｃ１３９、Ｃ１４２－Ｃ１５７、Ｃ１６３－Ｃ１７８、Ｃ２８１－Ｃ３４１およびＣ３８７－Ｃ４４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）のポリペプチド内ジスルフィド結合である。
ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭは、１６対のジスルフィド結合を有する二量体糖タンパク質である。３対のジスルフィド結合は、Ｃ２４０－Ｃ２４０、Ｃ２４６－Ｃ２４６、Ｃ２４９－２４９のポリペプチド鎖間ジスルフィド結合であり、１３対のジスルフィド結合は、Ｃ１８－Ｃ３１、Ｃ３２－Ｃ４５、Ｃ３５－Ｃ５３、Ｃ５６－Ｃ７１、Ｃ７８－Ｃ８８、Ｃ７８－Ｃ９６、Ｃ９８－Ｃ１０４、Ｃ１１２－Ｃ１２１、Ｃ１１５－Ｃ１３９、Ｃ１４２－Ｃ１５７、Ｃ１６３－Ｃ１７８、Ｃ２８１－Ｃ３４１およびＣ３８７－Ｃ４４５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）のポリペプチド内ジスルフィド結合である。
【0158】
Ｎ－グリコシル化修飾：
酵素消化およびクロマトグラフィー分析によって、二つのＮ－グリコシル化修飾部位、即ちＮ１４９およびＮ１７１がｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）で検出され、これは、理論上の修飾部位と一致する。
酵素消化およびクロマトグラフィー分析によって、二つのＮ－グリコシル化修飾部位、即ちＮ１４９およびＮ１７１がｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）で検出され、これは、理論上の修飾部位と一致する。
【0159】
翻訳後修飾：
酵素消化およびクロマトグラフィー分析によって、Ｍ３０およびＭ２７２の酸化修飾部位を含む二つのペプチドが検出され、Ｑ８２、Ｑ１０９、Ｎ３０６、Ｑ３１７およびＱ５２４の脱アミノ修飾部位を含む五つのペプチドが検出され、Ｄ３００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）のアスパラギン酸異性化修飾部位を含むペプチドが検出される。
酵素消化およびクロマトグラフィー分析によって、Ｍ３０およびＭ２７２の酸化修飾部位を含む二つのペプチドが検出され、Ｑ８２、Ｑ１０９、Ｎ３０６、Ｑ３１７およびＱ５２４の脱アミノ修飾部位を含む五つのペプチドが検出され、Ｄ３００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に従って番号付けられる）のアスパラギン酸異性化修飾部位を含むペプチドが検出される。
【0160】
実施例２：ロミプロスチムとの比較
ＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞は、ヒトＴＰＯＲを発現する修飾マウスＢ細胞株である。その受容体は、ヒトＴＰＯ、およびＴＰＯ活性を有する関連物質に結合し、ｃ－Ｍｐｌ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナルのチロシンリン酸化を誘導し、細胞ｃ－Ｍｐｌ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴのシグナル伝達経路を活性化し、細胞増殖を刺激することができる。従って、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ、ロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））またはＴＰＯの存在下且つＩＬ－３の非存在下で、ＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞は、増殖できる。
ＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞は、ヒトＴＰＯＲを発現する修飾マウスＢ細胞株である。その受容体は、ヒトＴＰＯ、およびＴＰＯ活性を有する関連物質に結合し、ｃ－Ｍｐｌ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナルのチロシンリン酸化を誘導し、細胞ｃ－Ｍｐｌ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴのシグナル伝達経路を活性化し、細胞増殖を刺激することができる。従って、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ、ロミプロスチム（Ｎｐｌａｔｅ（登録商標））またはＴＰＯの存在下且つＩＬ－３の非存在下で、ＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞は、増殖できる。
【0161】
様々な濃度のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭストック溶液、調製ＣＢ－２１９ＭまたはＮｐｌａｔｅ（登録商標）でＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞を処理する。ＣＣＫ－８検出方法によってＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞の成長を分析する。表１に示されるように、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭのＥＣ５０は、より低い。さらに、Ｎｐｌａｔｅ（登録商標）で処理したＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞と比較して、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭで処理したＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞の濃度曲線は、より優れた均一性および勾配（図２）を有し、これは、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭがＮｐｌａｔｅ（登録商標）より優れた構造、受容体結合機能および質量均一性を有することを示す。
【0162】
【表1】
【0163】
実施例３：インビトロ治療効果研究
ＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞におけるｃ－Ｍｐｌ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路に対するｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの影響を研究する
０．５ｍｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭまたは０．５ｍｇ／ｍｌのＮｐｌａｔｅ（登録商標）でＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞を処理する。処理後、遠心分離によって細胞を収集し、且つ超音波処理によって細胞を溶解する。リン特異的抗体を使用して、ウェスタン免疫ブロッティングによってサンプルを分析する。
ＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞におけるｃ－Ｍｐｌ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路に対するｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの影響を研究する
０．５ｍｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭまたは０．５ｍｇ／ｍｌのＮｐｌａｔｅ（登録商標）でＢａＦ３／ｃ－Ｍｐｌ細胞を処理する。処理後、遠心分離によって細胞を収集し、且つ超音波処理によって細胞を溶解する。リン特異的抗体を使用して、ウェスタン免疫ブロッティングによってサンプルを分析する。
【0164】
図３に示されるように、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭで処理した細胞およびＮｐｌａｔｅ（登録商標）で処理した細胞でリン酸化ＴＰＯＲおよびリン酸化ＳＴＡＴ３が検出され、これは、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭおよびＮｐｌａｔｅ（登録商標）がすべてＴＰＯＲ－ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３シグナル伝達経路を活性化できることを証明する。上記の結果は、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭおよびＮｐｌａｔｅ（登録商標）の作用メカニズムが同じであることを示す。
【0165】
実施例４：インビトロ治療効果研究
健康なＢａｌｂ／ｃマウス血小板生成に対するｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの影響を研究する
異なる投与経路を介して、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で６～８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを治療する。Ｎｐｌａｔｅ（登録商標）を陽性対照品として使用し、ＰＢＳ溶液を陰性対照品として使用する。研究デザインの詳細な情報は、表２に示されたとおりである。
健康なＢａｌｂ／ｃマウス血小板生成に対するｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの影響を研究する
異なる投与経路を介して、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で６～８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを治療する。Ｎｐｌａｔｅ（登録商標）を陽性対照品として使用し、ＰＢＳ溶液を陰性対照品として使用する。研究デザインの詳細な情報は、表２に示されたとおりである。
【0166】
【表2】
【0167】
－１、３、４、５、６、７、９および１１日目に、各グループのマウスの体重を測定し、眼窩静脈叢から血液サンプルを採取する。２因子ＡＮＯＶＡ分析方法を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアによって体重および血小板数を分析する。
【0168】
図４に示されるように、各グループのマウスの体重に有意な変化はなく、０および１１日目に、すべての治療群の体重に有意な差はない（ｐ＞０．０５）。図５Ａに示されるように、すべての三つの用量レベル（５０、１００および２００μｇ／ｋｇ）におけるｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭによる治療は、雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの血小板数を増加させ、投与経路間に有意差はない。血小板数の増加量は、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの用量と正の相関があり、低用量と比較して、高用量かで血小板数のピーク値が遅延され、投与９～１１日後に、各治療群の血小板数は、正常レベルに戻る（図５Ａ）。ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭで治療した健康なＳＤラットにおいても、同様の結果が観察されない（図５Ｂ）。
【0169】
カルボプラチン誘発性ＣＩＴマウスモデルに対するｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの影響を研究する
投与前、マウスに１２５ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンを腹腔内注射することによって、ＣＩＴマウスモデルを確立する。研究デザインの詳細な情報は、表３に示されたとおりである。
投与前、マウスに１２５ｍｇ／ｋｇのカルボプラチンを腹腔内注射することによって、ＣＩＴマウスモデルを確立する。研究デザインの詳細な情報は、表３に示されたとおりである。
【0170】
【表3】
【0171】
－１、３、５、８、１１、１４、１６、１９および２２日目に、各グループのマウスの体重を測定し、眼窩静脈叢から血液サンプルを採取する。２因子ＡＮＯＶＡ分析方法を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアによって体重および血小板数を分析する。
【0172】
図６に示されるように、各治療群では体重異常が観察されず、各治療群の平均体重に有意差はない（ｐ＞０．０５）。図７Ａに示されるように、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭは、すべての三つの用量レベル（１００、２００および４００μｇ／ｋｇ）で、マウスのカルボプラチン誘発ＣＩＴに対して良好な治療効果を有する。血小板数の増加量は、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの用量と正の相関がある（図７Ａ）。ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭで治療したカルボプラチン誘発性ＣＩＴ ＳＤラットでは、同様の結果が観察されない（図７Ｂ）。
【0173】
効果的なインビボ研究では、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回用量で皮下注射してマウスの血小板数の増加を誘導できることを示し、有効用量は、＞１０μｇ／ｋｇである。ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭは、カルボプラチン誘発性ＣＩＴモデルにおいて良好な治療効果を有し、血小板数の増加量は、用量と正の相関がある。ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの耐性が良好であり、その有効性は、投与経路間で優位はない。
【0174】
実施例５：インビボ薬力学研究
ＳＤラットに、単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを０．０２ｍｇ／ｋｇ（低用量）、０．０６ｍｇ／ｋｇ（中用量）または０．２ｍｇ／ｋｇ（高用量）で皮下投与するか、または０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与する。皮下投与の場合、投与前および投与後２、８、１２、１４、２４時間、２、３、４、５、７日目に血液サンプルを採取し、静脈内投与の場合、３分間、２、８、１２、１４、２４時間、２、３、４、５、７日目に血液サンプルを採取する。カニクイザルに、単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを０．０２ｍｇ／ｋｇ（低用量）、０．０６ｍｇ／ｋｇ（中用量）または０．２ｍｇ／ｋｇ（高用量）で皮下投与するか、または０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与する。皮下投与の場合、投与前および投与後２、８、１２、２４時間、２、３、６、８、１１、１５日目に血液サンプルを採取し、静脈内投与の場合、５分間、２、８、１２、２４時間、２、３、６、８、１１、１５日目に血液サンプルを採取する。ＥＬＩＳＡ法によって血清中のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの濃度を分析し、ノンコンパートメントモデルを使用してＷｉｎＮｏｎｌｉｎ８．０によって薬力学を分析する。
ＳＤラットに、単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを０．０２ｍｇ／ｋｇ（低用量）、０．０６ｍｇ／ｋｇ（中用量）または０．２ｍｇ／ｋｇ（高用量）で皮下投与するか、または０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与する。皮下投与の場合、投与前および投与後２、８、１２、１４、２４時間、２、３、４、５、７日目に血液サンプルを採取し、静脈内投与の場合、３分間、２、８、１２、１４、２４時間、２、３、４、５、７日目に血液サンプルを採取する。カニクイザルに、単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを０．０２ｍｇ／ｋｇ（低用量）、０．０６ｍｇ／ｋｇ（中用量）または０．２ｍｇ／ｋｇ（高用量）で皮下投与するか、または０．２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与する。皮下投与の場合、投与前および投与後２、８、１２、２４時間、２、３、６、８、１１、１５日目に血液サンプルを採取し、静脈内投与の場合、５分間、２、８、１２、２４時間、２、３、６、８、１１、１５日目に血液サンプルを採取する。ＥＬＩＳＡ法によって血清中のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの濃度を分析し、ノンコンパートメントモデルを使用してＷｉｎＮｏｎｌｉｎ８．０によって薬力学を分析する。
【0175】
図８Ａ～８Ｂに示されるように、血清薬物濃度は、投与量と正の相関がある。被験された雄動物および雌動物の血清薬物濃度の変化の経口は、同じである（データは示されない）。ＳＤラットの半減期は、２２．２～３２．７時間であり（図８Ａ）、カニクイザルの半減期は、２６．９～２９．５時間であり（図８Ｂ）、ＳＤラットまたはカニクイザルの薬物の血清半減期は、投与量とは関係ない（図８Ａ～８Ｂ）。薬力学分析により、ＳＤラットおよびカニクイザルにおけるＡＵＣおよびＣｍａｘは、すべて薬物用量の増加とともに増加することを示す（表４および表５）。
【0176】
【表4A】
【0177】
【表4B】
【0178】
【表4C】
【0179】
【表5A】
【0180】
【表5B】
【0181】
図９に示されるように、すべての用量レベルおよび投与経路は、カニクイザルの血小板数の有意な増加を誘導し、増加レベルは、投与量と正の相関がある。
単回用量の１２５Ｉ標識ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの研究では、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭが血清中で最も多く分布され、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭが主に尿液を通じて排泄される（図１０）ことを示す。投与後１２日目に９４．９１±１．５３％の１２５Ｉ標識が尿液および糞便によって排泄され、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭは、体内で蓄積されることが観察されない（データは示されない）。
単回用量の１２５Ｉ標識ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの研究では、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭが血清中で最も多く分布され、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭが主に尿液を通じて排泄される（図１０）ことを示す。投与後１２日目に９４．９１±１．５３％の１２５Ｉ標識が尿液および糞便によって排泄され、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭは、体内で蓄積されることが観察されない（データは示されない）。
【0182】
実施例６：インビボでの安全性および毒理学の研究
安全性研究
５０、２００または１０００μｇ／ｋｇで単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを皮下投与したＳＤラットは、中枢神経系機能に有意な変化を示さなかった。カニクイザルに、３００、１０００、３０００μｇ／ｋｇでｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを週に２回、４週間投与し、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ投与に関連するＥＣＧパラメーターおよび波形、呼吸頻度および１回換気量または血圧における有意な変化は観察されない（ｐ＞０．０５）。
安全性研究
５０、２００または１０００μｇ／ｋｇで単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを皮下投与したＳＤラットは、中枢神経系機能に有意な変化を示さなかった。カニクイザルに、３００、１０００、３０００μｇ／ｋｇでｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを週に２回、４週間投与し、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ投与に関連するＥＣＧパラメーターおよび波形、呼吸頻度および１回換気量または血圧における有意な変化は観察されない（ｐ＞０．０５）。
【0183】
急性毒理学研究
ＳＤラットに、１００、３００または１０００μｇ／ｋｇで単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを皮下投与し、カニクイザルに、５００、１５００または５０００μ
ｇ／ｋｇで単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを皮下投与する。ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの投与後、動物を２週間観察する。体重、体温、ＥＣＧまたは臨床病理学（血液学、血液生化学、凝固および尿検査）に有意な変化はない。ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ投与１５日後に動物を屠殺し、解剖する。有意な異常な病理学的変化は観察されない。
ＳＤラットに、１００、３００または１０００μｇ／ｋｇで単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを皮下投与し、カニクイザルに、５００、１５００または５０００μ
ｇ／ｋｇで単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを皮下投与する。ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの投与後、動物を２週間観察する。体重、体温、ＥＣＧまたは臨床病理学（血液学、血液生化学、凝固および尿検査）に有意な変化はない。ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ投与１５日後に動物を屠殺し、解剖する。有意な異常な病理学的変化は観察されない。
【0184】
長期にわたる毒理学研究
ＳＤラットにおいて２０、６０、２００μｇ／ｋｇで、カニクイザルにおいて３００、１０００、３０００μｇ／ｋｇで週に２回、連続４週間ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを投与し、その後４週間回復させる。
ＳＤラットにおいて２０、６０、２００μｇ／ｋｇで、カニクイザルにおいて３００、１０００、３０００μｇ／ｋｇで週に２回、連続４週間ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを投与し、その後４週間回復させる。
【0185】
治療期間中に、２０μｇ／ｋｇ以上のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭで治療したＳＤラットにおける血小板、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αが増加し、ヘモグロビンが減少する。さらに、６０μｇ／ｋｇ以上のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭで治療したＳＤラットにおける白血球、好中球、リンパ球、単球および好塩基球が増加する。これらの変化は、回復中に復元される。臨床観察、体重、摂食、体温、眼科検査、尿検査、凝固機能、血液生化学、Ｔリンパ球サブセット、肉眼的解剖学または組織病理学において、投与に関連する異常は観察されない。ＳＤラットにおける副作用のない用量（ＮＯＡＥＬ）は、２００μｇ／ｋｇである。
【0186】
治療期間中に、３００、１０００および３０００μｇ／ｋｇのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭで治療したカニクイザルでは、わずかから軽度の皮膚および／または皮下炎症性細胞浸 が発生し、血小板およびＫ＋レベルが増加し、赤血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリットおよび平均赤血球ヘモグロビン濃度が減少する。さらに、１０００および３０００μｇ／ｋｇのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭで治療したカニクイザルにおける網赤血球数が増加する。これらの変化は、回復中に復元される。臨床観察、体重、摂食、体温、眼科検査、尿検査、凝固機能、リンパ球サブセット、肉眼的解剖学または組織病理学において、投与に関連する異常は観察されない。カニクイザルにおけるＮＯＡＥＬは、３０００μｇ／ｋｇである。
【0187】
ＳＤラットおよびカニクイザルのＡＵＣおよびＣｍａｘは、すべて投与量と正の相関があり、ＳＤラットまたはカニクイザルにおいて、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの蓄積が観察されない。
【0188】
インビトロ溶血研究
２％赤血球生理食塩水懸濁液を０．１～０．５ｍｌビ配合ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ（２．００ｍｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを含む）と３７℃で３時間インキュベートする。赤血球の溶血または凝固は観察されない。
２％赤血球生理食塩水懸濁液を０．１～０．５ｍｌビ配合ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ（２．００ｍｇ／ｍｌのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを含む）と３７℃で３時間インキュベートする。赤血球の溶血または凝固は観察されない。
【0189】
実施例７：第Ｉ相臨床研究
第Ｉ相臨床研究は、用量漸増段階および用量拡大段階の二つの相を含む。用量漸増段階を研究する場合、各患者に単回投与し、用量拡大段階を研究する場合、各患者に複数回投与する。
第Ｉ相臨床研究は、用量漸増段階および用量拡大段階の二つの相を含む。用量漸増段階を研究する場合、各患者に単回投与し、用量拡大段階を研究する場合、各患者に複数回投与する。
【0190】
用量漸増段階
用量漸増段階を研究する主な目的は、皮下投与時のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回漸増用量（ＳＡＤ）の安全性、耐性および免疫原性を評価し、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの最大耐量（ＭＴＤ）および生物学的有効量（ＢＥＤ）を調べることである。
用量漸増段階を研究する第２の目的は、単回投与後の血清中のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの薬力学（ＰＫ）特徴を評価し、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回投与後の化学療法サイクル中の血小板数の変化を評価することである。
Ｂａｌｂ／ｃマウス、ＳＤラットおよびカニクイザルにおける治療効果、薬力学、安全性および毒理学研究に基づいて、用量漸増段階の開始用量は、２μｇ／ｋｇであり、最大用量は、１５μｇ／ｋｇである。選択された患者は、２、６、１０および１５μｇ／ｋｇの四つのグループに分けられる。各患者は、最初の化学療法サイクルの初回投与６～２４時間後に、所在するグループの用量でｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの腹部の皮下注射を１回受ける。
用量漸増段階を研究する主な目的は、皮下投与時のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回漸増用量（ＳＡＤ）の安全性、耐性および免疫原性を評価し、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの最大耐量（ＭＴＤ）および生物学的有効量（ＢＥＤ）を調べることである。
用量漸増段階を研究する第２の目的は、単回投与後の血清中のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの薬力学（ＰＫ）特徴を評価し、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの単回投与後の化学療法サイクル中の血小板数の変化を評価することである。
Ｂａｌｂ／ｃマウス、ＳＤラットおよびカニクイザルにおける治療効果、薬力学、安全性および毒理学研究に基づいて、用量漸増段階の開始用量は、２μｇ／ｋｇであり、最大用量は、１５μｇ／ｋｇである。選択された患者は、２、６、１０および１５μｇ／ｋｇの四つのグループに分けられる。各患者は、最初の化学療法サイクルの初回投与６～２４時間後に、所在するグループの用量でｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの腹部の皮下注射を１回受ける。
【0191】
用量拡大段階
用量拡大段階を研究する主な目的は、週に１回皮下投与時のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ ＭＴＤまたはＢＥＤの用量の安全性、耐性および免疫原性を評価することである。
用量拡大段階を研究する第２の目的は、週に１回皮下投与時の血清中のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの薬力学（ＰＫ）特徴を評価し、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの皮下投与を週に２回と週に１回との安全性および予備的治療効果を比較し、グレード３または４のＣＩＴ管理において、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの投与を週に２回と週に１回との予備的治療効果を比較し、最後のサイクルの血小板の最小値に基づいて、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを使用してグレード３または４の血小板減少症を予防する予備的治療効果を評価することである。
用量拡大段階を研究する主な目的は、週に１回皮下投与時のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ ＭＴＤまたはＢＥＤの用量の安全性、耐性および免疫原性を評価することである。
用量拡大段階を研究する第２の目的は、週に１回皮下投与時の血清中のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの薬力学（ＰＫ）特徴を評価し、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの皮下投与を週に２回と週に１回との安全性および予備的治療効果を比較し、グレード３または４のＣＩＴ管理において、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの投与を週に２回と週に１回との予備的治療効果を比較し、最後のサイクルの血小板の最小値に基づいて、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを使用してグレード３または４の血小板減少症を予防する予備的治療効果を評価することである。
【0192】
選択された患者は、三つのグループに分けられる。
【0193】
グループＡ：
最初のサイクル（Ｃ１）において、最初の化学療法サイクルの初日（Ｃ１Ｄ１）から６～２４時間後に、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを腹部皮下注射によって投与される。開始用量は、用量漸増段階によって決定されたＢＥＤであり、その後、週に１回投与し（血小板数に基づいて後続の用量を調整する）、当該サイクル内の後続の投与日は、Ｃ１Ｄ８およびＤ１５を含む。
最初のサイクル（Ｃ１）において、最初の化学療法サイクルの初日（Ｃ１Ｄ１）から６～２４時間後に、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを腹部皮下注射によって投与される。開始用量は、用量漸増段階によって決定されたＢＥＤであり、その後、週に１回投与し（血小板数に基づいて後続の用量を調整する）、当該サイクル内の後続の投与日は、Ｃ１Ｄ８およびＤ１５を含む。
【0194】
第２サイクル（Ｃ２）では投与しない。当該サイクルの血小板の最小値を評価し、Ｃ２で血小板の最小値が得られた日付をＤｍｉｎ（例えば、Ｄ１４）として記録する。
【0195】
第３サイクル（Ｃ３）において、Ｄｍｉｎ≦Ｄ１２の場合、Ｄ１化学療法後に投与され、Ｄｍｉｎ＞１２の場合、Ｄｍｉｎ－１２で投与し（Ｄｍｉｎが１８である場合、Ｃ３Ｄ６で投与する（適用される場合、化学療法後に投与する））、Ｃ３の最初の投与時間をＤｘ日目として記録し、その後、当該サイクルが完了するまで（Ｃ３Ｄ２１を含まない）、７日ごとに（Ｄｘ＋７）１回投与する。
【0196】
グループＢ：
最初のサイクル（Ｃ１）では投与されない。
最初のサイクル（Ｃ１）では投与されない。
【0197】
第２サイクル（Ｃ２）において、第２化学療法サイクルの初日（Ｃ２Ｄ１）から６～２４時間後に、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを腹部皮下注射によって投与する。開始用量は、用量漸増段階によって決定されたＢＥＤであり、その後週に１回投与し（血小板数に基づいて後続の用量を調整する）、当該サイクル中の後続の投与日は、Ｃ２Ｄ８およびＤ１５を含む。
【0198】
第３サイクルでは、グループＡの第３サイクルと同じ投与スケジュールを使用する。
【0199】
グループＣ：
最初のサイクル（Ｃ１）において、最初の化学療法サイクルの初日（Ｃ１Ｄ１）から６～２４時間後に、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを腹部皮下注射によって投与する。開始用量は、用量漸増段階によって決定されたＢＥＤであり、その後週に２回投与し（ＰＬＴ数に基づいて後続の用量を調整する）、当該サイクル中の後続の投与日は、Ｃ１Ｄ４／Ｄ８／Ｄ１１／Ｄ１５／Ｄ１８を含む。
最初のサイクル（Ｃ１）において、最初の化学療法サイクルの初日（Ｃ１Ｄ１）から６～２４時間後に、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを腹部皮下注射によって投与する。開始用量は、用量漸増段階によって決定されたＢＥＤであり、その後週に２回投与し（ＰＬＴ数に基づいて後続の用量を調整する）、当該サイクル中の後続の投与日は、Ｃ１Ｄ４／Ｄ８／Ｄ１１／Ｄ１５／Ｄ１８を含む。
【0200】
第２サイクル（Ｃ２）では投与されない。
【0201】
第３サイクル（Ｃ３）において、ＤｘでＣ３の最初の投与を実行し（グループＡのＣ３におけるＤｘの測定を参照する）、その後、当該サイクルが完了するまで（Ｃ３Ｄ２１を含まない）３日ごとに（Ｄｘ＋３）１回投与する。
【0202】
実施例８：第Ｉ相臨床研究における薬力学研究
図１１Ａおよび図１１Ｂは、単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ投与後の、化学療法によるＣＩＴを患う患者１および患者２の血清中のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの薬力学的曲線を示す。腹部皮下注射により、患者１に２μｇ／ＫｇのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを投与し、患者２に６μｇ／ＫｇのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを投与する。
図１１Ａおよび図１１Ｂは、単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ投与後の、化学療法によるＣＩＴを患う患者１および患者２の血清中のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの薬力学的曲線を示す。腹部皮下注射により、患者１に２μｇ／ＫｇのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを投与し、患者２に６μｇ／ＫｇのｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを投与する。
【0203】
図１１Ａおよび図１１Ｂでは、二つの患者のＰＬＴ数が、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭ投与前の化学療法サイクル中にＣＩＴ臨界線以下（ＰＬＴ＝７５）に低下したことが観察される。患者に投与されたｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭが後続の二つの化学療法サイクル中のＰＬＴ数を増加することができることも観察される。
発熱、悪寒、全身倦怠感、疲労、膝痛、頭痛、めまいおよび血圧等の副作用に関して、候補薬物投与後のＤ１～Ｄ２１に用量限制毒性（ＤＬＴ）を評価し、低用量および中用量では、すべて良好な安全性を有する。
発熱、悪寒、全身倦怠感、疲労、膝痛、頭痛、めまいおよび血圧等の副作用に関して、候補薬物投与後のＤ１～Ｄ２１に用量限制毒性（ＤＬＴ）を評価し、低用量および中用量では、すべて良好な安全性を有する。
【0204】
実施例９：第Ｉ相臨床研究における薬物動態研究
図１２は、それぞれ患者１および患者２に単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを投与した後の血清中のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの薬物動態曲線を示す。
図１２は、それぞれ患者１および患者２に単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを投与した後の血清中のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭの薬物動態曲線を示す。
【0205】
血漿濃度（Ｃｍａｘ）は、投与量に比例し、半減期（ｔ１／２）は、約２週間であり、これは、実施例８で論じた薬力学的研究と一致する。患者１に２μｇ／Ｋｇを投与し、得られたＣｍａｘは、１３９０ｐｇ／ｍＬであり、ｔ１／２は、３６８時間（１５．３日）であるが、患者２に６μｇ／Ｋｇを投与し、得られたＣｍａｘは、２５３０ｐｇ／ｍＬであり、ｔ１／２は、約３００時間（１２．５日）である。従って、単回用量のｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭを受けた最初の二つのＣＩＴ患者は、後続の２サイクルまたはそれ以上の化学療法中で、血小板のレベルが維持され、血漿濃度（Ｃｍａｘ）は、投与量に比例して明らかな傾向を示し、これは、２週間に１回またはそれ以上の間隔（例えば、２．５、３、３．５、４、４．５週間ごとに１回）の投与頻度に基礎を提供する。このように、連続１４日間毎日来院する必要があるＴＰＩＡＯ（登録商標）（ｒＨｕＴＰＯ）等の既存のＣＩＴ治療薬物と比較して、ｒｈＴＮＦＲ２－Ｆｃ－ＴＰＭは、来院の必要性が大幅に減少し、患者の治療および経済的負担において明らかな利点があり、患者の痛みおよび経済的コストを軽減することができる。
【0206】
具体的に開示された実施例は、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、単に本開示の様々な態様を説明することを目的とするものである。本発明の説明および教示に従って、前記組成物および方法に対して様々な修正を容易に行うことができる。本開示の実際の範囲および精神から逸脱することなく、このような変更を行うことができ、これらの変更は、本開示の範囲内にある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】