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特表2024-535392ヒト扁桃幹細胞由来の小胞体を有効成分として含む組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-30
(54)【発明の名称】ヒト扁桃幹細胞由来の小胞体を有効成分として含む組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/28 20150101AFI20240920BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240920BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240920BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240920BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20240920BHJP
A61K 8/98 20060101ALI20240920BHJP
【ＦＩ】
A61K35/28
C12N5/071
C07K14/705
A61P17/00
A61Q19/08
A61K8/98
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518676
(86)(22)【出願日】2021-11-30
(85)【翻訳文提出日】2024-04-04
(86)【国際出願番号】 KR2021017840
(87)【国際公開番号】W WO2023048339
(87)【国際公開日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】10-2021-0126659
(32)【優先日】2021-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和３年６月２２日にＡｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ誌で公開された論文
(71)【出願人】
【識別番号】522110430
【氏名又は名称】プルコスキン カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＰＬＣＯＳＫＩＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000394
【氏名又は名称】弁理士法人岡田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ペク，ウーヨル
(72)【発明者】
【氏名】シム，ギュシク
(72)【発明者】
【氏名】キム，ドヒョン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C083
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC20
4B065CA44
4B065CA50
4C083AA071
4C083AA072
4C083BB51
4C083CC02
4C083EE12
4C083FF01
4C087AA01
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4C087CA04
4C087MA55
4C087MA63
4C087NA14
4C087ZA89
4C087ZC52
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA86
4H045EA20
4H045EA60
(57)【要約】
本発明は、ヒト扁桃幹細胞に由来する小胞体を有効成分として含む組成物に関する。前記組成物は、老化が誘導された線維芽細胞の皮膚再生および抗酸化関連遺伝子の発現を促進し、線維芽細胞の老化を抑制する効果を示す。
【選択図】図１Ｂ
【選択図】図１Ｂ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト扁桃幹細胞由来の小胞体を有効成分として含む皮膚再生および老化防止用組成物。
【請求項2】
前記小胞体は、細胞外小胞体、マイクロベシクルおよびナノベシクルの中から選択された１種である、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記ヒト扁桃幹細胞は、ヒト扁桃中間葉幹細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記ヒト扁桃幹細胞は、ＣＤ１４６ポジティブである、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
前記ナノベシクルは、直径が５０ｎｍ～２５０ｎｍである、請求項２に記載の組成物。
【請求項6】
前記小胞体は、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１４６の中から選択された１種以上の免疫抗原を追加的に含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
前記ヒト扁桃幹細胞は、ヒト扁桃腺組織をコラゲナーゼタイプ１およびＤＮａｓｅ１に分解するステップと、
前記分解された生成物を濾過および遠心分離して上澄液を除去して細胞ペレットを得るステップと、
前記細胞ペレットから得た細胞を培養してヒト扁桃幹細胞を得るステップとを含む方法で製造されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記ナノベシクルは、継代培養されたヒト扁桃幹細胞を培養培地に懸濁した後、遠心分離して上澄液を除去するステップと、
前記上澄液を除去した細胞ペレットを再懸濁した後、押出機で２つ以上のポアサイズの異なるフィルタを連続的に通過させるステップとを含む方法で製造されるものである、請求項２に記載の組成物。
【請求項9】
前記２つ以上のポアサイズの異なるフィルタは、ポアサイズの大きいフィルタからポアサイズの小さいフィルタの順に用いられるものである、請求項８に記載の組成物。
【請求項10】
前記２つ以上のポアサイズの異なるフィルタは、ポアサイズが１０μｍ、５μｍおよび０．４μｍのフィルタの順に用いられるものである、請求項８に記載の組成物。
【請求項11】
前記得られたヒト扁桃幹細胞をＦｃＲブロッキング試薬（ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）で処理した後、ＣＤ１４６マイクロビーズ（ＣＤ１４６ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）処理後に反応させるステップと、反応後、磁気活性細胞分離法（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＭＡＣＳ）用緩衝液で処理した後、遠心分離して上澄液を除去するステップと、
ＭＡＣＳセパレータおよびカラムを介してＣＤ１４６ポジティブとネガティブとを分離するステップとをさらに含むものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項12】
前記組成物は、薬学的組成物または化粧料組成物である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒト扁桃幹細胞由来の小胞体を有効成分として含む組成物、特に、皮膚再生および老化防止用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
老化は、有機体の機能および再生特性が時間依存的に損失することを特徴とする。皮膚の老化に関連する要因は細胞を損傷させて、細胞老化として知られた皮膚再生および細胞増殖の遅延をもたらす。細胞老化は、細胞周期の不可逆的停止および局所付着性細胞骨格（ｆｏｃａｌ ａｄｈｅｓｉｖｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｅ）の変更を特徴とする。
【0003】
皮膚組織の細胞老化は、酸化性ストレス、ミトコンドリア機能障害、紫外線照射のような多様な要因によって誘導される。
【0004】
ここ数十年間、多くの研究者がこれを克服するための研究を行ってきた。
【0005】
最近は、細胞老化を克服するために、エキソソームの組織再生の可能性について多くの研究が集中している。
【0006】
細胞内経路（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ ｐａｔｈｗａｙ）によって生成された細胞において原形質膜を横切って分泌するナノサイズの生体模倣体として知られたエキソソームは、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびタンパク質を含む様々な成分を含有している。また、エキソソームは、皮膚の若返りおよび老化防止アプローチ法のために研究された。
【0007】
しかし、治療目的のためのエキソソームの潜在力にもかかわらず、低い効率性、長い手続き時間および高い技術専門性といった、いくつかの不都合がある。
【0008】
このような不都合を克服するために、多くの研究者が体細胞からエキソソーム模倣ナノベシクルを直接生産するのに集中してきた。このような生体模倣ナノベシクルは、超音波処理および／または押出により所望の細胞から直接分離することができ、エキソソームと類似の特性を共有することが報告された。類似の特性を勘案する時、細胞由来の生体模倣ナノベシクルは、薬物伝達、組織再生、および癌標的化に活用できる。特に、ヒト扁桃由来の中間葉幹細胞（ｔｏｎｓｉｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＴＭＳＣ）に由来するナノベシクルは、肝線維化症および炎症を弱化させると報告された。また、ヒト扁桃幹細胞に由来するナノ小胞体を含む抗癌用薬学的組成物が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】大韓民国公開特許第１０－２０２０－０１４１８６８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本発明が解決しようとする技術的課題は、ヒト扁桃幹細胞由来の小胞体を含む皮膚再生および皮膚老化防止用組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明の一態様によれば、ヒト扁桃幹細胞由来の小胞体を有効成分として含む皮膚再生および皮膚老化防止用組成物が提供される。
【発明の効果】
【0012】
本発明の一実施形態による組成物は、皮膚再生および皮膚老化防止効果を有し、効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図2A】図２Ａは、ヒト扁桃中間葉幹細胞から製造したナノベシクル（ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｆｒｏｍ ｔｏｎｓｉｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＴＭＳＣ－ＮＶ）のタンパク質発現およびＳＥＭイメージを示す図である。
【図3A】図３は、継代関連老化モデルにおけるＴＭＳＣ－ＮＶ処理による増殖および老化の調節に関するものであって、図３Ａは、ヒト皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）における形態学的変化を示す図である（スケールバー＝２００μｍ）。
【図4A】図４は、継代関連老化モデルにおいてＴＭＳＣ－ＮＶで処理した細胞外マトリックスおよびＨＤＦにおける抗酸化遺伝子の調節に関する図であって、図４Ａは、継代関連老化ＨＤＦにおけるＣＯＬ１、ＥＬＡＳＴＩＮ、ＳＯＤ２、およびＨＭＯＸ１のｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図6A】図６は、ＵＶ誘導老化モデルにおけるＴＭＳＣ－ＮＶ処理による細胞外マトリックスおよび抗酸化遺伝子の制御に関する図であって、図６Ａは、ＵＶ誘導老化ＨＤＦにおけるＣＯＬ１、ＥＬＡＳＴＩＮ、ＳＯＤ２、およびＨＭＯＸ１のｍ－ＲＮＡ発現を示す図である。
【図7A】図７は、継代関連老化モデルにおけるＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶ処理による増殖および老化の調節に関するものであって、図７Ａは、老化ＨＤＦにおけるＣＯＬ１およびＨＭＯＸ１のｍ－ＲＮＡ発現を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0015】
本発明の一態様による皮膚再生および皮膚老化防止用組成物は、ヒト扁桃幹細胞由来の小胞体を有効成分として含む。
【0016】
本明細書において、「幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、未分化細胞であって、自己複製能力を有しかつ、２つ以上の互いに異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞をいう。
【0017】
本明細書において、「有効成分」は、単独で目的とする活性を示すか、またはそれ自体は活性のない担体などと共に目的とする活性を示すことができる成分を意味する。
【0018】
本明細書において、「ナノベシクル」は、成体幹細胞から得たナノサイズのベシクルを意味するものであって、細胞外小嚢であるエキソソームと類似のナノサイズを有するベシクルを意味する。
【0019】
また、ナノベシクルは、生体膜の基本構造であるリン脂質を用いて外部と区分された脂質膜形態をなす。ナノベシクルは、内部に水溶性分子（ＤＮＡを含む）または薬物を担持できるだけでなく、脂溶性薬物を付けるか、または正電荷および負電荷物質を結合させることができる。リン脂質は、両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ）物質であって、陰イオン性または両性イオンの極性分子団と炭化水素１６個前後の多様な不飽和度を有する２つの非極性脂溶性鎖を有する分子構造であるため、リン脂質が水に分散して自発的にベシクルを形成する。
【0020】
応用科学分野において、ナノベシクルは、化粧品産業、薬物伝達、および生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で培養中の細胞に遺伝物質を伝達するモデルとして用いており、現在はナノベシクル内に水溶性および脂溶性物質をすべて捕獲することができ、特定の組織に標的が容易であり、大きさおよび変形が容易であり、リン脂質の使用で毒性の問題点がほとんどなく、捕獲させる薬物を他の薬物運搬体よりも多く捕獲することができる。
【0021】
本明細書において、小胞体とは、主に細胞外小胞体を意味するもので、細胞外小胞体は、すべての細胞が外部環境に分泌する脂質二重層に取り囲まれた小胞体を意味することができる。
【0022】
細胞外小胞体は、起源と分泌機序、大きさなどを基準として、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅｓ）、マイクロベシクル（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅｓ）、マイクロパーティクル（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、膜小胞体（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）、ナノベシクル（ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅｓ）、外膜小胞体（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）などの多様な名称で呼ばれる。
【0023】
前記小胞体は、細胞外小胞体、マイクロベシクルおよびナノベシクルの中から選択された１種であってもよい。特に、ナノベシクルであってもよい。
【0024】
本発明の一実施形態によれば、ヒト扁桃幹細胞由来のナノベシクルは、エキソソームで特異的に発現する細胞の表面マーカーを発現する。
【0025】
本発明の一実施形態によれば、前記ヒト扁桃幹細胞は、ヒト扁桃中間葉幹細胞であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0026】
本発明の他の実施形態によれば、前記ヒト扁桃幹細胞は、ＣＤ１４６ポジティブであってもよい。
【0027】
前記ナノベシクルは、直径が５０ｎｍ～２５０ｎｍ、３０ｎｍ～２００ｎｍであってもよい。
【0028】
さらに具体的には、前記ナノベシクルは、３０ｎｍ以上、３２ｎｍ以上、３４ｎｍ以上、３６ｎｍ以上、３８ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、４２ｎｍ以上、４４ｎｍ以上、４６ｎｍ以上、４８ｎｍ以上または５０ｎｍ以上でかつ、２００ｎｍ以下、１９０ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、１７０ｎｍ以下、１６０ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１４０ｎｍ以下、１３０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下、１１０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９５ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８５ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７５ｎｍ以下または７０ｎｍ以下の直径を有するものであってもよい。例えば、前記ナノベシクルは、３０～１００ｎｍ、４０～８０ｎｍ、５０～１００ｎｍ、または５０～８０ｎｍの直径を有するものであってもよい。
【0029】
一実施形態によれば、前記ナノベシクルは、４０～５５ｎｍの直径を有するものであってもよい。さらに具体的には、前記ナノベシクルは、４０ｎｍ以上、４２ｎｍ以上、４４ｎｍ以上、４６ｎｍ以上、４８ｎｍ以上または５０ｎｍ以上でかつ、５５ｎｍ以下、５４ｎｍ以下、５３ｎｍ以下、５２ｎｍ以下、５１ｎｍ以下または５０ｎｍ以下の平均直径を有するものであってもよい。例えば、前記ナノベシクルは、４２～５３ｎｍ、４６～５２ｎｍ、４８～５２ｎｍ、または５０ｎｍの平均直径を有するものであってもよい。
【0030】
本発明の一実施形態によれば、前記小胞体は、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１４６の中から選択された１種以上の免疫抗原を追加的に含むことができる。
【0031】
本発明の一実施形態によれば、前記ヒト扁桃幹細胞は、ヒト扁桃腺組織をコラゲナーゼタイプ１およびＤＮａｓｅ１に分解するステップと、前記分解された生成物を濾過および遠心分離して上澄液を除去して細胞ペレットを得るステップと、前記細胞ペレットから得た細胞を培養してヒト扁桃幹細胞を得るステップとを含む方法で製造できる。一実施形態において、前記ヒト扁桃腺組織をコラゲナーゼタイプ１およびＤＮａｓｅ１に分解するステップは、低ブドウ糖のダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）で行われる。前記細胞ペレットから得た細胞を培養するステップは、１０％ウシ胎児血清、抗生剤および抗真菌剤を含むＤＥＭＥで培養することができる。
【0032】
前記ナノベシクルは、継代培養されたヒト扁桃中間葉幹細胞を培養培地に懸濁した後、遠心分離して上澄液を除去するステップと、前記上澄液を除去した細胞ペレットを再懸濁した後、押出機で２つ以上のポアサイズの異なるフィルタを連続的に通過させるステップとを含む方法で製造できる。
【0033】
前記２つ以上のポアサイズの異なるフィルタは、ポアサイズの大きいフィルタからポアサイズの小さいフィルタの順に用いられるものであってもよい。例えば、前記２つ以上のポアサイズの異なるフィルタは、８～１２μｍのポアサイズを有するフィルタ、３～７μｍのポアサイズを有するフィルタ、および０．２～０．６μｍのポアサイズを有するフィルタで構成されてもよい。例えば、前記２つ以上のポアサイズの異なるフィルタは、ポアサイズが１０μｍ、５μｍおよび０．４μｍのフィルタの順に用いられるものであってもよい。
【0034】
一方、ＣＤ１４６ポジティブの小胞体を得る方法は、前記得られたヒト扁桃幹細胞をＦｃＲブロッキング試薬（ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ）で処理した後、ＣＤ１４６マイクロビーズ処理後に反応させるステップと、反応後、磁気活性細胞分離法（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ、ＭＡＣＳ）用緩衝液で処理した後、遠心分離して上澄液を除去するステップと、ＭＡＣＳセパレータおよびカラム、例えば、ＬＳカラムを介してＣＤ１４６ポジティブとネガティブとを分離するステップとをさらに含むことができる。一実施形態によれば、前記ＣＤ２４６マイクロビーズ処理後に反応させるステップは、光遮断状態で行われる。
【0035】
あるいは、前記ＣＤ１４６ポジティブの小胞体を得る方法は、前記得られたヒト扁桃幹細胞を抗ＣＤ１４６抗体または蛍光物質が連結された抗ＣＤ１４６抗体で処理して反応させるステップと、反応後、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いてＣＤ１４６ポジティブとネガティブとを分離するステップとをさらに含むことができる。また、あるいは、抗ＣＤ１４６抗体が導入された表面に細胞を捕捉して分離するステップをさらに含むことができる。前記抗ＣＤ１４６抗体が導入された表面は、抗体が付けられる表面であれば、いかなる表面でも可能であり、具体的には、プラスチック板、金属板、金属合金板、高分子ナノ粒子、金属ナノ粒子などがある。
【0036】
また、ヒト扁桃幹細胞由来のＣＤ１４６ポジティブナノベシクルは、ＣＤ１４６細胞表面マーカーとして選別された細胞からＣＤ１４６ポジティブヒト扁桃幹細胞由来のナノベシクルを生産するステップを含む方法で製造できるが、ナノベシクルを生産するステップは、前記ヒト扁桃幹細胞からナノベシクルを製造する方法と同様の方法で製造することができる。
【0037】
一実施形態によれば、前記皮膚再生および老化防止用組成物は、薬学的組成物または化粧料組成物であってもよい。
【0038】
一実施形態によれば、前記組成物は、薬学組成物であってもよい。
【0039】
前記薬学組成物は、小胞体のほか、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩および／または緩衝剤などの薬剤学的補助剤およびその他治療的に有用な物質を追加的に含むことができ、通常の方法により多様な経口投与剤または非経口投与剤の形態に剤形化することができる。
【0040】
前記経口投与剤は、例えば、錠剤、丸剤、硬質および軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、粉剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、ペレット剤などがあり、これらの剤形は、有効成分のほか、界面活性剤、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよびグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムまたはカルシウム塩およびポリエチレングリコール）を含むことができる。錠剤はまた、マグネシウムアルミニウムシリケート、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ソジウムカルボキシメチルセルロースおよびポリビニルピロリジンのような結合剤を含むことができ、場合によっては、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのソジウム塩のような崩壊剤、吸収剤、着色剤、香味剤、および甘味剤などの薬剤学的添加剤を含むことができる。前記錠剤は、通常の混合、顆粒化またはコーティング方法により製造できる。
【0041】
また、前記非経口投与形態としては、経皮投与型剤形であってもよいし、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチなどの剤形であってもよいが、これに制限されるわけではない。
【0042】
本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法により、薬剤学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか、または多用量容器内に入れて製造される。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤形態であってもよいし、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【0043】
本発明の薬学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分のほか、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加的に含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．、１９９５）に詳しく記載されている。
【0044】
本発明の薬学的組成物は、経口および非経口投与可能であり、例えば、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与、硬膜内投与、眼球投与、皮膚投与および経皮投与などで投与してもよい。
【0045】
本発明の薬学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因によって多様であり、通常熟練した医師は所望の治療または予防に効果的な投与量を容易に決定および処方可能である。
【0046】
前記有効成分の投与量の決定は、通常の技術者の水準内にあり、薬物の１日投与用量は、投与しようとする対象の進行程度、発病時期、年齢、健康状態、合併症などの多様な要因によって異なるが、成人を基準として、一態様において、前記組成物１μｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、他の態様において、５０μｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇを１日１～３回分割して投与することができ、前記投与量はいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【0047】
本発明の一実施形態によれば、前記組成物は、化粧料組成物であってもよい。例えば、前記化粧料組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション、リーブオン（ｌｅａｖｅ－ｏｎ）型、ミストおよびスプレーなどに剤形化できるが、これに限定されるものではない。より詳しくは、シャンプー、リンス、ボディクレンザーなどの洗浄剤、ヘアトニック、ジェルまたはムースなどの整髪剤、毛髪栄養化粧水、ヘアエッセンス、ヘアセラムスカルプトリートメント、ヘアトリートメント、ヘアコンディショナー、ヘアシャンプー、ヘアローション、養毛剤または染毛剤などの毛髪用化粧料組成物、水中油（Ｏ／Ｗ）型、油中水（Ｏ／Ｗ）型などの基礎化粧料に剤形化可能である。
【0048】
また、前記組成物は、それぞれの剤形において、前記必須成分のほか、他の成分はその他の外用剤の種類または使用目的などによって当業者が困難なく好適に選定して配合可能である。例えば、紫外線遮断剤、ヘアコンディショニング剤、香料などをさらに含むことができる。
【0049】
前記化粧料組成物は、化粧品学的に許容可能な媒質または基剤を含むことができる。これは局所適用に適したすべての剤形で、例えば、溶液、ゲル、固体または練り無水生成物、水相に油相を分散させて得られたエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球またはイオン型（リポソーム）および／または非イオン型の小嚢分散剤の形態で、またはクリーム、スキン、ローション、パウダー、軟膏、スプレーまたはコンシールスティックの形態で提供される。これらの組成物は、当該分野の通常の方法により製造可能である。
【0050】
本発明の剤形が溶液または乳濁液の場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤または乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルがある。
【0051】
本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラカントなどが用いられる。
【0052】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルの場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが用いられる。
【0053】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーの場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが用いられ、特に、スプレーの場合には、追加的にクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進体を含むことができる。
【0054】
本発明の一実施形態において、前記化粧料組成物に追加的に増粘剤を含むことができる。前記化粧料組成物に含まれる増粘剤は、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルヒドロキシグアニン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリクオタニウム、セテアリルアルコール、ステアリン酸、カラギーナンなどを使用することができ、好ましくは、カルボキシメチルセルロース、カルボキシビニルポリマー、ポリクオタニウムのうちの１種以上を使用することができ、最も好ましくは、カルボキシビニルポリマーになってもよい。
【0055】
本発明の一実施形態において、前記化粧料組成物は、必要に応じて適切な各種の基剤と添加剤を含むことができ、これら成分の種類と量は発明者によって容易に選定可能である。必要に応じて許容可能な添加剤を含むことができ、例えば、当業界における通常の防腐剤、色素、添加剤などの成分を追加的に含むことができる。
【0056】
前記防腐剤は、具体的には、フェノキシエタノール（Ｐｈｅｎｏｘｙｅｔｈａｎｏｌ）または１，２－ヘキサンジオール（１，２－Ｈｅｘａｎｅｄｉｏｌ）などになってもよく、香料は、人工香料などになってもよい。
【0057】
そして、本発明の一実施形態において、化粧料組成物は、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖、スフィンゴ脂質および海草エキスからなる群より選択された組成物を含むことができる。その他添加しても良い配合成分としては、乳脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機および無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水などが挙げられる。
【0058】
また、その他添加しても良い配合成分はこれに限定されるものではなく、また、前記いずれの成分も本発明の目的および効果を損なわない範囲内で配合可能である。
【0059】
以下、本発明の理解のために実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。ただし、下記の実施例は本発明の内容を例示するものに過ぎず、本発明の範囲が下記の実施例に限定されるものではない。本発明の実施例は当業界における平均的な知識を有する者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【0060】
製造例１：ヒト扁桃中間葉幹細胞（ＴＭＳＣ）の抽出および培養
扁桃腺切除術で得られたヒト扁桃腺組織から扁桃中間葉幹細胞（ＴＭＳＣ）を次のような方法で分離した。
扁桃腺切除術で得られたヒト扁桃腺組織から扁桃中間葉幹細胞（ＴＭＳＣ）を次のような方法で分離した。
【0061】
まず、ヒト扁桃腺組織を２％抗生剤－抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含むリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ；ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ、Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｓｅｏｕｌ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）で洗浄した。その後、組織を細かく切り、低ブドウ糖のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）で２１０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼタイプ１（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）および４ＫＵ／ｍＬのＤＮａｓｅ１（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を用いて３７℃で１時間３０分間分解させた。分解した生成物を低ブドウ糖のダルベッコ培地（ＤＭＥＭ／ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ）で１０％ウシ胎児血清および１％抗生剤が添加された幹細胞培養液で処理した後、４０μｍのストレーナー（ｓｔｒａｉｎｅｒ）を通して濾過し、３分間１，３００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
【0062】
得られたペレットを新しいＤＭＥＭで２回洗浄した。洗浄後に得た細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）と１％抗生剤および抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭで３７℃および５％ＣＯ2の環境で培養した。培地を２日ごとに取り替えた。すべての中間葉幹細胞は、５－６日間隔でＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）により継代培養された。
【0063】
図１Ａは、前記製造例１で製造したヒト扁桃幹細胞の光学顕微鏡（スケールバー＝２００μｍ．ＬＳＭ７００、ＺＥＩＳＳ）分析による細胞形態を示す図である。
【0064】
図１Ａに示すように、ＴＭＳＣは、従来知られた中間葉幹細胞と類似して線維芽細胞形態を有していた。
【0065】
一方、抗－ＣＤ９０、抗－ＣＤ１０５および抗－ＣＤ７３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ ＩＩ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＴＭＳＣを特性化した。
【0066】
図１Ｂは、製造例１で製造したヒト扁桃中間葉幹細胞の表面マーカーの発現を示す図である。図１Ｂに示すように、フローサイトメトリーデータは、ＴＭＳＣがＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ７３を含む一般的なＴＭＳＣの表面マーカーに対して陽性（＞９０％）であることを示した。
【0067】
製造例２：ヒト扁桃中間葉幹細胞内ＣＤ１４６発現する細胞（ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ）の選別
ヒトＣＤ１４６マイクロビーズキット（ｈｕｍａｎ ＣＤ１４６ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ；１３０－０９３－５９６、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＵＳＡ）を用いて、ヒト扁桃中間葉幹細胞からＣＤ１４６－ポジティブ扁桃中間葉幹細胞を選別した。
ヒトＣＤ１４６マイクロビーズキット（ｈｕｍａｎ ＣＤ１４６ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ Ｋｉｔ；１３０－０９３－５９６、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＵＳＡ）を用いて、ヒト扁桃中間葉幹細胞からＣＤ１４６－ポジティブ扁桃中間葉幹細胞を選別した。
【0068】
より詳しくは、製造例１で培養されたヒト扁桃中間葉幹細胞をリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で１回洗浄した後、ＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓで３分間処理して細胞を分離した。分離された細胞に１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）と１％抗生剤および抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭを添加し、１，３００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上澄液を除去し、ＰＢＳに再懸濁して、同一の条件で遠心分離した。上澄液を除去した後、０．５％ウシ胎児血清および２ｍＭ ＥＤＴＡが添加されたＰＢＳを６０μＬ／１０7細胞数だけ処理して細胞ペレットを解離した。前記細胞ペレットから得た細胞を培養して得られたヒト扁桃幹細胞を２０μＬ／１０7細胞数のＦｃＲブロッキング試薬（ＦｃＲ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）で処理し、２０μＬ／１０7細胞数のＣＤ１４６マイクロビーズで処理した後、光を遮断し、４℃で１５分間反応させた。反応後、１ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液で処理し、１，３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上澄液を除去した。以後、ＭＡＣＳセパレータおよびＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を介してＣＤ１４６－ポジティブ扁桃中間葉幹細胞（ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ）とＣＤ１４６－ネガティブ扁桃中間葉幹細胞（ＣＤ１４６－ＴＭＳＣ）とを分離した。
【0069】
製造例３：ＴＭＳＣに由来するナノベシクル（ＴＭＳＣ－ＮＶ）の製造
ＴＭＳＣ由来のナノベシクルの製造のために、前記製造例１で得られたＴＭＳＣをＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）で３７℃で３分間処理して分離した。分離された細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）と１％抗生剤および抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭに懸濁し、１３００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄液を除去し、得られた細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、１０℃でＰＢＳ中に１×１０6細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。
ＴＭＳＣ由来のナノベシクルの製造のために、前記製造例１で得られたＴＭＳＣをＴｒｙｐＬＥ ｅｘｐｒｅｓｓ溶液（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）で３７℃で３分間処理して分離した。分離された細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）と１％抗生剤および抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭに懸濁し、１３００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上澄液を除去し、得られた細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、１０℃でＰＢＳ中に１×１０6細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。
【0070】
再懸濁された細胞を、ミニ押出機（Ａｖａｎｔｉ○Ｒ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｍｉｎｉ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ、Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、ＵＳＡ）を用いて、（リテーナおよび押出機の間に挟んだ）１０μｍ、５μｍおよび０．４μｍのポアサイズを有する（多孔性ポリカーボネート）濾紙に順次に各３回ずつ通過させてナノベシクルを製造した。
【0071】
製造例４：ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣに由来するナノベシクル（ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶ）の製造
前記製造例１で製造したＴＭＳＣの代わりに、前記製造例２で製造したＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣを用いることを除けば、前記製造例３と同様の方法でナノベシクルを製造した。
前記製造例１で製造したＴＭＳＣの代わりに、前記製造例２で製造したＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣを用いることを除けば、前記製造例３と同様の方法でナノベシクルを製造した。
【0072】
前記製造例３および製造例４で得られたナノベシクルの大きさと形状は、それぞれ動的光散乱（ＤＬＳ）および透過電子顕微鏡分析（ＴＥＭ）によって決定した。
１）透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＴＥＭ）
グロー放電炭素コーティング銅グリッド（ｇｌｏｗ－ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ ｃａｒｂｏｎ－ｃｏａｔｅｄ ｃｏｐｐｅｒ ｇｒｉｄｓ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）に精製されたナノベシクルを加えた。ナノベシクルを１時間グリッド上に吸収されるようにした後、グリッドを４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定させ、脱イオン水の水滴で洗浄した後、２％ウラニルアセテート（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）で陰性染色（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎ）した。電子顕微鏡写真は１００ｋＶの加速電圧でＪＥＭ １０１１ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で記録した。
２）動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）
ナノベシクルの大きさ分布をＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌｔｄ．、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｕ．Ｋ．）で測定した。
１）透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＴＥＭ）
グロー放電炭素コーティング銅グリッド（ｇｌｏｗ－ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ ｃａｒｂｏｎ－ｃｏａｔｅｄ ｃｏｐｐｅｒ ｇｒｉｄｓ）（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）に精製されたナノベシクルを加えた。ナノベシクルを１時間グリッド上に吸収されるようにした後、グリッドを４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定させ、脱イオン水の水滴で洗浄した後、２％ウラニルアセテート（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）で陰性染色（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｔａｉｎ）した。電子顕微鏡写真は１００ｋＶの加速電圧でＪＥＭ １０１１ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で記録した。
２）動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）
ナノベシクルの大きさ分布をＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌｔｄ．、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｕ．Ｋ．）で測定した。
【0073】
また、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡTM Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、ナノベシクルの濃度を測定した。
【0074】
一方、ナノベシクルのタンパク質発現を測定するために、ウェスタンブロッティング方法を使用した。
３）ウェスタンブロッティング
ＴＭＳＣおよびＴＭＳＣ－ＮＶをＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（ＲＩＰＡ）緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で収獲および溶解した。細胞破片の除去のために、２０分間１３，０００ｒｐｍで溶解物を遠心分離した。上澄液に入っているタンパク質の量は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡTM Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定した。２０μｇの量の総タンパク質をローディングし、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離した。ローディング後に分離されたタンパク質を３０分間５％ＢＳＡ溶液でブロッキングされたメンブレンに移した。免疫ブロッティングの場合、ウサギ抗－ＣＤ９（１：２０００）、抗－ＣＤ６３（１：２０００）および抗ベータアクチン（１：５０００）一次抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を４℃で一晩適用した。
３）ウェスタンブロッティング
ＴＭＳＣおよびＴＭＳＣ－ＮＶをＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（ＲＩＰＡ）緩衝液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で収獲および溶解した。細胞破片の除去のために、２０分間１３，０００ｒｐｍで溶解物を遠心分離した。上澄液に入っているタンパク質の量は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡTM Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定した。２０μｇの量の総タンパク質をローディングし、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離した。ローディング後に分離されたタンパク質を３０分間５％ＢＳＡ溶液でブロッキングされたメンブレンに移した。免疫ブロッティングの場合、ウサギ抗－ＣＤ９（１：２０００）、抗－ＣＤ６３（１：２０００）および抗ベータアクチン（１：５０００）一次抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を４℃で一晩適用した。
【0075】
タンパク質の化学発光検出のためのｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗－ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（１：５，０００）二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を室温で２時間適用し、ＡｍｅｒｓｈａｍＴＭ ＥＣＬ ＳｅｌｅｃｔＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を検出に用いた。
【0076】
図２Ａは、ＴＭＳＣ－ＮＶのタンパク質発現およびＴＥＭ（ＪＥＭ １０１１ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（ＪＥＯＬ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）イメージを示す図である。タンパク質レベルはβ－アクチンによって正規化された。
【0077】
図２Ｂは、ＴＭＳＣ－ＮＶの動的光散乱分析の結果を示す図である。
【0078】
図２ＡからＴＭＳＣ－ＮＶはＣＤ９およびＣＤ６３のようなエキソソームマーカーを発現することを確認した。一方、ＴＭＳＣ－ＮＶは球形状を有し、図２ＢからＴＭＳＣ－ＮＶの直径は２つのピーク（８８．５および２２８．３ｎｍ）で表示された。このような結果は、ＴＭＳＣ－ＮＶがエキソソームと類似の特性を有することを示す。
【0079】
製造例５：脂肪幹細胞に由来するナノベシクルの製造
前記製造例１で製造したＴＭＳＣの代わりに、脂肪幹細胞を用いることを除けば、前記製造例３と同様の方法でナノベシクルを製造した。
前記製造例１で製造したＴＭＳＣの代わりに、脂肪幹細胞を用いることを除けば、前記製造例３と同様の方法でナノベシクルを製造した。
【0080】
製造例６：骨髄幹細胞に由来するナノベシクルの製造
前記製造例１で製造したＴＭＳＣの代わりに、骨髄幹細胞を用いることを除けば、前記製造例３と同様の方法でナノベシクルを製造した。
前記製造例１で製造したＴＭＳＣの代わりに、骨髄幹細胞を用いることを除けば、前記製造例３と同様の方法でナノベシクルを製造した。
【0081】
実験例
細胞の培養
ヒト皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）から購入した。この細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）と１％抗生剤－抗真菌剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭで３７℃および５％ＣＯ2雰囲気で培養した。培地は２日ごとに取り替えた。固有の複製老化細胞は繰り返し継代によって生成された。継代３と継代１５の細胞はそれぞれ「幼若」状態と「老化」状態として識別した。外因性老化細胞は２００ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ照射によって処理した。
細胞の培養
ヒト皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ、ＨＤＦ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）から購入した。この細胞を１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）と１％抗生剤－抗真菌剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭで３７℃および５％ＣＯ2雰囲気で培養した。培地は２日ごとに取り替えた。固有の複製老化細胞は繰り返し継代によって生成された。継代３と継代１５の細胞はそれぞれ「幼若」状態と「老化」状態として識別した。外因性老化細胞は２００ｍＪ／ｃｍ2のＵＶ照射によって処理した。
【0082】
実験例１：細胞増殖能の比較
細胞増殖はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８ ａｓｓａｙ（ＣＣＫ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｊａｐａｎ）で確認し、ＡＴＣＣから購入したＨＤＦを１２ウェルプレートに５，０００細胞数／ｃｍ2で分注し、幹細胞培養液（１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）と１％抗生剤および抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ）で培養した。ＨＤＦを分注し、２４時間後に、前記製造例３および製造例４のナノベシクルをそれぞれタンパク質濃度基準５０μｇ／ｍＬでＨＤＦに１回処理した後、６日間培養した。細胞増殖を比較するために、幹細胞培養液をＣＣＫ－８と１：１０の比率で混合して各ウェルに処理した。１時間３０分間３７℃で反応させた後、４５０ｎｍの波長における吸光度を測定して細胞増殖程度を比較した。
細胞増殖はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８ ａｓｓａｙ（ＣＣＫ－８、Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｊａｐａｎ）で確認し、ＡＴＣＣから購入したＨＤＦを１２ウェルプレートに５，０００細胞数／ｃｍ2で分注し、幹細胞培養液（１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）と１％抗生剤および抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含むＤＭＥＭ）で培養した。ＨＤＦを分注し、２４時間後に、前記製造例３および製造例４のナノベシクルをそれぞれタンパク質濃度基準５０μｇ／ｍＬでＨＤＦに１回処理した後、６日間培養した。細胞増殖を比較するために、幹細胞培養液をＣＣＫ－８と１：１０の比率で混合して各ウェルに処理した。１時間３０分間３７℃で反応させた後、４５０ｎｍの波長における吸光度を測定して細胞増殖程度を比較した。
【0083】
実験例２：免疫染色分析
免疫染色分析を行うために、前記製造例３および製造例４の細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。その後、固定された細胞を０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で１５分間透過化（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ）した。
免疫染色分析を行うために、前記製造例３および製造例４の細胞を４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。その後、固定された細胞を０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で１５分間透過化（ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚａｔｉｏｎ）した。
【0084】
透過化後、細胞を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で室温で３０分間遮断した後、抗－ビンキュリン（ａｎｔｉ－ｖｉｎｃｕｌｉｎｅ）（１：２００）で室温で１時間培養した。ＰＢＳで洗浄後、ヤギ抗－ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８二次抗体（１：２００）およびテトラメチルローダミンコンジュゲーテッドファロイジン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）（１：２００）を暗中で１時間適用した。ＥＣＭの生産を確認するために、細胞を固定、遮断および抗－コラーゲン１一次抗体（１：２００）で１時間培養し、ヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｈ＆Ｌ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８（１：２００）で培養した。免疫細胞化学分析に使用されるすべての抗体はＡｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。免疫細胞化学分析は、ＤＡＰＩ核染色で対照染色し、ＺＥＩＳＳ ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で検査した。
【0085】
実験例３：定量的リアルタイム重合酵素連鎖反応（ｑＰＣＲ）
定量的リアルタイム重合酵素連鎖反応（ｑＰＣＲ）のために、製造例３および製造例４のナノベシクルを老化線維芽細胞に６日間処理し、この細胞を６ウェルプレートに培養した。
定量的リアルタイム重合酵素連鎖反応（ｑＰＣＲ）のために、製造例３および製造例４のナノベシクルを老化線維芽細胞に６日間処理し、この細胞を６ウェルプレートに培養した。
【0086】
各ウェルを１ｍＬのＰＢＳで洗浄して、Ｔｒｉｚｏｌ試薬５００μＬを処理した後、１．７５ｍＬのチューブに得た。
【0087】
試薬をクロロホルム２００μＬと共に処理し、氷上で１０分間置いた。混合物を１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、水性上澄液を注意深く収集し、同量のイソプロパノールを混合して、氷上で１０分間インキュベーションした。
【0088】
ＲＮＡサンプルを１３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄液を除去し、ＲＮＡペレットを得た。ＲＮＡペレットを７５％ＥｔＯＨで洗浄し、乾燥させた。
【0089】
透明なＲＮＡペレットをヌクレアーゼフリーウォーター（ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）で希釈し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ２０００でＲＮＡ濃度を確認し、１μｇのＲＮＡでｃＤＮＡを合成した。
【0090】
ｃＤＮＡはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ、Ｊａｐａｎ）を用いて合成し、ΔΔＣＴ値をＳｔｅｐ－Ｏｎｅ ｐｌｕｓ ｑＰＣＲ ｍａｃｈｉｎｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）で確認した。
【0091】
実験例４：老化関連ベータ－ガラクトシダーゼ分析（ＳＡ－β－ガラクトシダーゼ分析）
老化関連ベータ－ガラクトシダーゼは、ガラクトシドの単糖類への加水分解に触媒作用をする酵素である。老化細胞と組織では、ｐＨ４．０ではないｐＨ６．０でのみ検出可能である。細胞老化のバイオマーカーとして、不溶性青色化合物に転換される５－ブロモ－４－クロロ－３－インドイル－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－ｇａｌ）を使用する発色分析を用いてそれの活性を検出することができる。
老化関連ベータ－ガラクトシダーゼは、ガラクトシドの単糖類への加水分解に触媒作用をする酵素である。老化細胞と組織では、ｐＨ４．０ではないｐＨ６．０でのみ検出可能である。細胞老化のバイオマーカーとして、不溶性青色化合物に転換される５－ブロモ－４－クロロ－３－インドイル－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－ｇａｌ）を使用する発色分析を用いてそれの活性を検出することができる。
【0092】
ここで、ＳＡ－β－ガラクトシダーゼ分析は、細胞老化染色キット（ｃｅｌｌ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【0093】
細胞の老化程度を比較するために、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＣＢＡ－２３０、Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）により細胞のＳＡ－β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅの活性度を測定した。
【0094】
より詳しくは、ＨＤＦに製造例３～製造例６のナノベシクルをそれぞれ処理した後、６日後にＨＤＦをＰＢＳで１回洗浄した後、１０％グリセロールで常温で５分間処理して細胞を固定した。上澄液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔにより３７℃で１４時間染色させた。反応後、上澄液を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、顕微鏡により写真撮影および定量分析した。定量的データは老化細胞の着色比率の記録によって測定した。
【0095】
実験例５：Ｅｘ ｖｉｖｏ組織再生能力の確認（免疫染色法）
供与された人体皮膚組織の脂肪を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１ｃｍ×１ｃｍに切断して準備した。皮膚組織をｓｅｍｉ－ａｇａｒｏｓｅ ＤＭＥＭ培地環境で３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養した。培養中の人体皮膚組織に３００ｍＪ／ｃｍ2に相当する紫外線Ｂ（ｕｌｔｒａｖｉｌｏｌｅｔ Ｂ；ＵＶＢ）を照射した後、ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶをそれぞれ５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの濃度で各２０μＬ塗布し、２４時間後、同一の条件でＵＶＢ照射とＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶ塗布を繰り返した。繰り返し処理後、人体皮膚組織を新しいｓｅｍｉ－ａｇａｒｏｓｅ ＤＭＥＭ培地に移し、３回目のＵＶＢ照射およびＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶ塗布後、２４時間培養した後、組織を固定して免疫染色を進行させた。
供与された人体皮膚組織の脂肪を除去し、ＰＢＳで３回洗浄した後、１ｃｍ×１ｃｍに切断して準備した。皮膚組織をｓｅｍｉ－ａｇａｒｏｓｅ ＤＭＥＭ培地環境で３７℃、５％ＣＯ2の条件で培養した。培養中の人体皮膚組織に３００ｍＪ／ｃｍ2に相当する紫外線Ｂ（ｕｌｔｒａｖｉｌｏｌｅｔ Ｂ；ＵＶＢ）を照射した後、ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶをそれぞれ５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの濃度で各２０μＬ塗布し、２４時間後、同一の条件でＵＶＢ照射とＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶ塗布を繰り返した。繰り返し処理後、人体皮膚組織を新しいｓｅｍｉ－ａｇａｒｏｓｅ ＤＭＥＭ培地に移し、３回目のＵＶＢ照射およびＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶ塗布後、２４時間培養した後、組織を固定して免疫染色を進行させた。
【0096】
免疫染色法により人体皮膚組織を構成するタンパク質であるコラーゲンタイプ１、コラーゲンタイプ３、インボルクリン（ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）およびフィラグリン（ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）を染色した。
【0097】
図３は、継代関連老化モデルにおけるＴＭＳＣ－ＮＶ処理による増殖および老化の調節に関するものであって、図３Ａは、ＨＤＦにおける形態学的変化を示す図であり（スケールバー＝２００μｍ）、図３Ｂは、ＴＭＳＣ－ＮＶ処理後の継代関連老化ＨＤＦの増殖を示す図であり、図３Ｃは、老化関連ＳＡ－β－ガラクトシダーゼ分析の結果を示す図であり（スケールバー＝２００μｍ）、図３Ｄは、ＳＡ－β－ガラクトシダーゼ分析の定量的解析を示す図であり、図３Ｅは、ＨＤＦの局所付着におけるビンキュリンの発現を示す図であり、図３Ｆは、局所付着におけるビンキュリン発現の定量的データを示す図である（グループ間の有意な差は一方向ＡＮＯＶＡで測定した（ｎｓ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0098】
図３Ａおよび３Ｂに示すように、ＴＭＳＣ－ＮＶ処理は、老化ＨＤＦ細胞の増殖を増加させた。ＳＡ－β－ガラクトシダーゼ分析を行って、ＴＭＳＣ－ＮＶの老化防止の役割を確認した。図３Ｃに示すように、ＴＭＳＣ－ＮＶで処理したものが老化ＨＤＦのβ－ガラクトシダーゼの活性を減少させたことを示した。図３ＤのＳＡ－β－ガラクトシダーゼ分析の定量的データは、ＴＭＳＣ－ＮＶ処理によって老化細胞の比率が減少することを示しており、これはＴＭＳＣ－ＮＶ処理がＨＤＦの老化水準を減少させることを裏付けた。
【0099】
また、ＴＭＳＣ－ＮＶで処理した後の局所付着におけるビンキュリンのタンパク質発現とアクチン細胞骨格における形態学的変化を調べた。免疫蛍光分析の結果、図３Ｅおよび図３Ｆに示すように、老化ＨＤＦの局所接着力においてビンキュリンの献身度の増加を示し、これはＴＭＳＣＮＶ処理によって減少した。
【0100】
このような結果は、ＴＭＳＣ－ＮＶがＨＤＦの増殖を増加させ、継代によって誘発される老化を減少させることを示す。
【0101】
分子生物学の面でＴＭＳＣ－ＮＶの老化防止特性を確認するために、ＴＭＳＣ－ＮＶ処理後に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の生産および老化関連抗酸化遺伝子の遺伝子発現を調べた。
【0102】
図４は、継代関連老化モデルにおいてＴＭＳＣ－ＮＶで処理した細胞外マトリックスおよびＨＤＦにおける抗酸化遺伝子の調節に関する図であって、図４Ａは、継代関連老化ＨＤＦにおけるＣＯＬ１、ＥＬＡＳＴＩＮ、ＳＯＤ２、およびＨＭＯＸ１のｍ－ＲＮＡ発現を示す図であり、図４Ｂは、継代関連老化ＨＤＦのコラーゲンタイプ１の免疫蛍光分析の結果を示す図であり、図４Ｃは、免疫蛍光分析の定量的データを示す図である。グループ間の有意な差はｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡで測定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0103】
図４Ａに示すように、コラーゲンタイプ１（ＣＯＬ１）とＥＬＡＳＴＩＮのｍＲＮＡレベルは、幼若ＨＤＦに比べて老化ＨＤＦで減少するが、ＴＭＳＣ－ＮＶで処理すれば、ＥＣＭの生産が上方調節されることが明らかになった。
【0104】
類似して、抗酸化遺伝子であるＳＯＤ２およびＨＭＯＸ１のｍＲＮＡ発現は、老化ＨＤＦにおいてＴＭＳＣ－ＮＶで処理すれば増加した。また、ＣＯＬ１のタンパク質発現は、免疫蛍光法で調べた結果、図４Ｂおよび図４Ｃに示すように、ＴＭＳＣ－ＮＶで処理すれば、継代関連老化ＨＤＦで著しく増加したＥＣＭの生成を示した。このような結果によれば、ＴＭＳＣ－ＮＶで処理すれば、老化細胞でＥＣＭの生産および老化減少可能抗酸化遺伝子の回復をもたらすことが分かる。
【0105】
図５は、ＵＶ誘導老化モデルにおけるＴＭＳＣ－ＮＶ処理による増殖および老化の調節に関するものであって、図５Ａは、ＨＤＦにおける形態学的変化を示す図であり（スケールバー＝２００μｍ）、図５Ｂは、ＴＭＳＣ－ＮＶ処理後の継代関連老化ＨＤＦの増殖を示す図であり、図５Ｃは、老化関連ＳＡ－β－ガラクトシダーゼ分析の結果を示す図であり（スケールバー＝２００μｍ）、図５Ｄは、ＳＡ－β－ガラクトシダーゼ分析の定量的解析を示す図であり、図５Ｅは、ＨＤＦの局所付着におけるビンキュリンの発現を示す図であり、図５Ｆは、局所付着におけるビンキュリン発現の定量的データを示す図である（グループ間の有意な差は一方向ＡＮＯＶＡで測定した（ｎｓ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【0106】
図５Ａおよび５Ｂに示すように、ＴＭＳＣ－ＮＶ処理は、ＵＶ誘導老化ＨＤＦ細胞の増殖を増加させた。ＳＡ－β－ガラクトシダーゼ分析を行って、ＴＭＳＣ－ＮＶの老化防止の役割を確認した。図５Ｃに示すように、ＴＭＳＣ－ＮＶで処理したものがＵＶ誘導老化ＨＤＦのβ－ガラクトシダーゼの活性を減少させたことを示した。図５ＤのＳＡ－β－ガラクトシダーゼ分析の定量的データは、ＴＭＳＣ－ＮＶ処理によって老化細胞の比率が減少することを示し、これはＴＭＳＣ－ＮＶ処理がＨＤＦの老化水準を減少させることを裏付けた。
【0107】
また、ＴＭＳＣ－ＮＶで処理した後の局所付着におけるビンキュリンのタンパク質発現とアクチン細胞骨格における形態学的変化を調べた。免疫蛍光分析の結果、図５Ｅおよび図５Ｆに示すように、ＵＶ誘導老化ＨＤＦの局所接着力においてビンキュリンの献身度の増加を示し、これはＴＭＳＣ－ＮＶ処理によって減少した。
【0108】
このような結果は、ＴＭＳＣ－ＮＶがＨＤＦの増殖を増加させ、継代によって誘発される老化を減少させることを示す。
【0109】
分子生物学的観点から、ＵＶ誘導老化モデルにおけるＴＭＳＣ－ＮＶの老化防止特性確認のために、老化関連ＥＣＭの生産および抗酸化遺伝子のｍＲＮＡ発現をｑＰＣＲによって調べた。
【0110】
図６は、ＵＶ誘導老化モデルにおけるＴＭＳＣ－ＮＶ処理による細胞外マトリックスおよび抗酸化遺伝子の制御に関する図であって、図６Ａは、ＵＶ誘導老化ＨＤＦにおけるＣＯＬ１、ＥＬＡＳＴＩＮ、ＳＯＤ２、およびＨＭＯＸ１のｍ－ＲＮＡ発現を示す図であり、図６Ｂは、ＵＶ誘導老化ＨＤＦコラーゲンタイプ１の免疫蛍光分析の結果を示す図であり、図６Ｃは、免疫蛍光分析の定量的データを示す図である。
【0111】
図６Ａに示すように、ｑＰＣＲの結果は、ＣＯＬ１およびＥＬＡＳＴＩＮはＵＶ照射後に減少し、ＴＭＳＣ－ＮＶ処理の結果著しく増加したＣＯＬ１を示した。しかし、ＥＬＡＳＴＩＮは増加しなかった。抗酸化遺伝子であるＳＯＤ２およびＨＭＯＸ１はＵＶ照射によって減少し、ＴＭＳＣ－ＮＶ処理によって増加した。また、図６Ｂおよび図６Ｃに示すように、免疫蛍光分析の結果、ＵＶ－誘導老化ＨＤＦにおけるコラーゲンタイプ１の発現減少を示し、これはＴＭＳＣ－ＮＶで処理すれば増加した。この結果は、ＴＭＳＣ－ＮＶＨがＥＣＭの生産および老化減少抗酸化遺伝子を増加させることを示す。
【0112】
分子生物学の面でＣＤ１６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶの老化防止特性を確認するために、ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶ処理後に細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の生産および老化関連抗酸化遺伝子の遺伝子発現を調べた。
【0113】
【0114】
図７Ａを参照すれば、ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶを６日間処理した時、脂肪幹細胞ナノベシクル（ＡＳＣ－ＮＶ）、骨髄幹細胞ナノベシクル（ＢＭＭＳＣ－ＮＶ）で処理した時より、皮膚再生関連マーカーであるコラーゲンタイプ１のｍＲＮＡ発現量が上昇し、抗酸化関連マーカーであるＨＭＯＸ１の発現量が最も高く上昇することを確認した。
【0115】
【0116】
図７Ｂおよび図７Ｃに示すように、ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶで処理した老化線維芽細胞およびＴＭＳＣ－ＮＶで処理した老化線維芽細胞が比較的低い継代数の線維芽細胞とほぼ類似の程度に染色されることを確認した。
【0117】
前記結果に基づき、ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶは、抗老化効能および皮膚再生効能が高いことが確認された。
【0118】
図８Ａおよび図８Ｂは、人体皮膚組織に紫外線Ｂ（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｂ、ＵＶＢ）を照射して皮膚老化モデルを作製し、ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶを処理した後、人体皮膚組織を構成するコラーゲンタイプ１、コラーゲンタイプ３、インボルクリンおよびフィラグリンを免疫染色法により確認した結果である。
【0119】
前記結果に基づき、ＣＤ１４６＋ ＴＭＳＣ－ＮＶを処理した時、紫外線による人体皮膚組織の損傷が回復することを確認した。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【国際調査報告】