特表 2024-535594 ＤＨＥＡＳアッセイ、そのための試薬、並びにその製造方法及び使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-30

(54)【発明の名称】ＤＨＥＡＳアッセイ、そのための試薬、並びにその製造方法及び使用

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20240920BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522234

(86)(22)【出願日】2022-09-23

(85)【翻訳文提出日】2024-04-12

(86)【国際出願番号】 US2022076904

(87)【国際公開番号】W WO2023064670

(87)【国際公開日】2023-04-20

(31)【優先権主張番号】63/262,472

(32)【優先日】2021-10-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508147326

【氏名又は名称】シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ジジェン・ジャオ

(72)【発明者】

【氏名】イー・フェン・ヂァン

(72)【発明者】

【氏名】アンドリュー・ライビン

(72)【発明者】

【氏名】ジェームズ・フリーマン

(57)【要約】

デヒドロエピアンドロステロンスルファート－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ）抱合体又はデヒドロエピアンドロステロンスルファート－カルボキシメトキシルアミノ－ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＤＭＡＥ）抱合体を含有するイムノアッセイ試薬が開示される。ＤＨＥＡＳ抱合体の１つ又はそれ以上を含有するイムノアッセイキット及びデバイスも開示される。ＤＨＥＡＳ抱合体を製造及び使用する方法がさらに開示される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

デヒドロエピアンドロステロンスルファート－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ）抱合体
を含む、イムノアッセイ試薬。

【請求項2】

ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＦＩＴＣ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－エチルジアミン－フルオレセイン）を含む、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬。

【請求項3】

ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＰＥＧ３－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－（ポリエチレングリコール）_３－フルオレセイン）又はＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＢＳＡ－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－ウシ血清アルブミン－フルオレセイン）を含む、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬。

【請求項4】

フルオレセインはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である、請求項１に記載のイムノアッセイ試薬。

【請求項5】

デヒドロエピアンドロステロンスルファート－カルボキシメトキシルアミノ－ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＤＭＡＥ）抱合体
を含む、イムノアッセイ試薬。

【請求項6】

ＤＨＥＡＳ－ＡＥ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＤＭＡＥ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－エチルジアミン－ジメチルアクリジニウムエステル）又はＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－Ｚ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－Ｚ－Ｎ－スルホプロピル－ジメチルアクリジニウムエステル）を含む、請求項５に記載のイムノアッセイ試薬。

【請求項7】

デヒドロエピアンドロステロンスルファート－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ）抱合体；
抗フルオレセイン常磁性固相粒子；及び
アクリジニウムエステル標識抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体
を含む、イムノアッセイキット。

【請求項8】

ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＦＩＴＣ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－エチルジアミン－フルオレセイン）を含む、請求項７に記載のイムノアッセイキット。

【請求項9】

ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体のフルオレセインはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である、請求項７に記載のイムノアッセイキット。

【請求項10】

ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＰＥＧ３－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－（ポリエチレングリコール）_３－フルオレセイン）又はＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＢＳＡ－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－ウシ血清アルブミン－フルオレセイン）を含む、請求項９に記載のイムノアッセイキット。

【請求項11】

フルオレセイン化された抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体で標識された常磁性固相粒子；及び
デヒドロエピアンドロステロンスルファート－カルボキシメトキシルアミノ－ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＤＭＡＥ）抱合体
を含む、イムノアッセイキット。

【請求項12】

ＤＨＥＡＳ－ＡＥ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＤＭＡＥ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－エチルジアミン－ジメチルアクリジニウムエステル）又はＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－Ｚ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－Ｚ－Ｎ－スルホプロピル－ジメチルアクリジニウムエステル）を含む、請求項１１に記載のイムノアッセイキット。

【請求項13】

生物学的サンプル中のＤＨＥＡＳの濃度を決定する方法であって、該方法は：
（ａ）
（１） ＤＨＥＡＳを含有すると疑われる生物学的サンプル；
（２） デヒドロエピアンドロステロンスルファート－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ）抱合体；
（３） 抗フルオレセイン常磁性固相粒子；及び
（４） アクリジニウムエステル標識抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体
を、同時に又は部分的にもしくは全体的に連続して混合して、混合物を形成する工程；
（ｂ） （ａ）において形成された混合物中で、（２）、（３）、及び（４）の互いに対する結合並びに生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳに対する（４）の結合を可能にする工程；並びに
（ｃ） 混合物において生成された蛍光シグナルを測定する工程；及び
（ｄ） 生物学的サンプルが存在しない場合に観察される蛍光シグナルと比較した場合に、観察される蛍光シグナルの減少量に基づいて、生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳの濃度を決定する工程
を含む、上記方法。

【請求項14】

ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＦＩＴＣ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－エチルジアミン－フルオレセイン）を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体のフルオレセインは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＰＥＧ３－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－（ポリエチレングリコール）_３－フルオレセイン）又はＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＢＳＡ－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－ウシ血清アルブミン－フルオレセイン）を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

工程（ｄ）において、生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳの濃度は、蛍光シグナルを較正曲線と比較することにより決定される、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

生物学的サンプル中のＤＨＥＡＳの濃度を決定する方法であって、該方法は：
（ａ）
（１） ＤＨＥＡＳを含有すると疑われる生物学的サンプル；
（２） フルオレセイン化された抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体で標識された常磁性固相粒子；及び
（３） デヒドロエピアンドロステロンスルファート－カルボキシメトキシルアミノ－ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＤＭＡＥ）抱合体；
を、同時に又は部分的にもしくは全体的に連続して混合して、混合物を形成する工程；
（ｂ） （ａ）において形成された混合物において、（３）の（２）に対する結合又は生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳの（２）に対する結合を可能にする工程；並びに
（ｃ） 混合物において生成された蛍光シグナルを測定する工程；並びに
（ｄ） 生物学的サンプルが存在しない場合に観察される蛍光シグナルと比較した場合に、観察される蛍光シグナルの減少量に基づいて、生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳの濃度を決定する工程
を含む、上記方法。

【請求項19】

ＤＨＥＡＳ－ＡＥ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＤＭＡＥ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－エチルジアミン－ジメチルアクリジニウムエステル）又はＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－Ｚ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－Ｚ－Ｎ－スルホプロピル－ジメチルアクリジニウムエステル）を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

工程（ｄ）において、生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳの濃度は、蛍光シグナルを較正曲線と比較することにより決定される、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

サンプル中のＤＨＥＡＳの濃度を決定するためのマイクロ流体デバイスであって、該マイクロ流体デバイスは：
（ｉ） ＤＨＥＡＳを含有すると疑われるサンプルを収容することができる第１の区画；
（ｉｉ） デヒドロエピアンドロステロンスルファート－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ）抱合体；
（ｉｉｉ） 抗フルオレセイン常磁性固相粒子；及び
（ｉｖ） アクリジニウムエステル標識抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体
を含む、上記マイクロ流体デバイス。

【請求項22】

（ｉｉ）～（ｉｖ）の少なくとも１つは第１の区画に配置される、請求項２１に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項23】

第１の区画と流体連通することが可能な第２の区画を少なくとも含むとさらに定義され、ここで（ｉｉ）～（ｉｖ）の少なくとも１つは第２の区画に配置される、請求項２１に記載のマイクロ流体デバイス。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

関連出願の相互参照／参照による援用の記載
該当なし。

【0002】

連邦政府資金による研究開発の記載
該当なし。

【0003】

背景
デヒドロエピアンドロステロンスルファート（Ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ Ｓｕｌｐｈａｔｅ）（ＤＨＥＡＳ）は、図１に示される化学構造を有する副腎ステロイドであり、そして異常なレベルのＤＨＥＡＳは、多くの様々な障害及び状態と関連することが当該分野で知られている。例えば、（限定としてではないが）、ＤＨＥＡＳの循環レベルの測定は、異常発毛（多毛症）及び女性における禿頭症（脱毛症）の調査において重要である。また、ＤＨＥＡＳの血漿レベルは７歳ごろから次第に増加し、その後３０代から徐々に減少するので、ＤＨＥＡＳレベルの測定は、副腎皮質性思春期徴候及び思春期遅発症の評価において有用である。さらに、ＤＨＥＡＳはしばしば、多毛症におけるアンドロゲン過剰症についての初期スクリーニングとして遊離テストステロンと結合してアッセイされ、そして高いＤＨＥＡＳレベルは、多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）においてよく見られる。さらに、女性において７００～８００μｇ／ｄＬより高いＤＨＥＡＳのレベルは、ホルモン分泌副腎腫瘍を示唆する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

ＤＨＥＡＳの測定のための方法は、ヒト患者におけるＤＨＥＡＳレベルの評価のための機構を提供するために望ましい。しかし、ＤＨＥＡＳの検出のためのイムノアッセイは、アッセイ感度、周囲温度効果（ＡＴＥ）、及びビオチン干渉に対する感受性の問題に直面してきた。

【0005】

従って、新しくかつ改善されたＤＨＥＡＳアッセイ試薬及びアッセイ、さらには生物学的サンプル中のＤＨＥＡＳレベルを検出するためにそれらを製造し使用する方法の必要も当該分野に存在する。

【図面の簡単な説明】

【0006】

【図1】図１は、デヒドロエピアンドロステロンスルファート（ＤＨＥＡＳ）の化学構造を示す。

【図2】図２は、本開示に従って構築されたＤＨＥＡＳアッセイフォーマットの１つの非限定的な実施形態を示す。

【図3】図３は、本開示に従って構築されたＤＨＥＡＳアッセイフォーマットの別の非限定的な実施形態を示す。

【図4】図４は、本開示に従って利用され得るアッセイ試薬の１つの非限定的な実施形態、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－フルオレセインの合成のためのスキームを提供する。

【図5】図５は、本開示に従って利用され得るアッセイ試薬の別の非限定的な実施形態、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＰＥＧ３－フルオレセインの合成のためのスキームを提供する。

【図6】図６は、本開示に従って利用され得るアッセイ試薬の別の非限定的な実施形態、ＤＨＥＡＳ－ＢＳＡ－フルオレセインの合成のためのスキームを提供する。

【図7】図７は、本開示に従って利用され得るアッセイ試薬のさらに別の非限定的な実施形態、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＤＭＡＥ抱合体の合成のためのスキームを提供する。

【図8】図８は、本開示に従って利用され得るアッセイ試薬のさらに別の非限定的な実施形態、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－Ｚ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥ抱合体の合成のためのスキームを提供する。

【図9】図９は、市販のアッセイ（ＤＨＥＡＳを使用する）と対比してアッセイ試薬ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－フルオレセインを使用する図２のＤＨＥＡＳアッセイフォーマットのための結合曲線の試験定義最適化をグラフで示す。試験定義８１１－８３３は、ＤＨＥＡＳＩＩフォーマットを使用した試薬添加の様々な順序及びタイミングを取り上げるが、全て市販のＤＨＥＡＳアッセイと比較して改善された結合プロフィールを示す。

【図10】図１０は、市販アッセイ（ＤＨＥＡＳを使用する）と対比してＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＤＭＡＥ抱合体を使用する図３のＤＨＥＡＳアッセイフォーマットのための結合曲線をグラフで示す。

【発明を実施するための形態】

【0007】

詳細な説明
例となる用語及び結果によって本開示の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、当然のことながら、本開示は、その出願において、以下の記載において示される成分の構築及び配置の詳細に限定されない。本開示は他の実施形態であることが可能であり、又は本開示を様々なやり方で実施もしくは実行することができる。したがって、本明細書において使用される用語は、最も広い可能な範囲及び意味を与えられることを意図され；そして実施形態は例示的であり、包括的ではないことを意図される。また、当然のことながら、本明細書において使用される表現及び用語は、説明の目的のためのものであり、限定とみなされるべきではない。

【0008】

本明細書において別の定義がなければ、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段必要がなければ、単数の語は複数を含むものとし、かつ複数の語は単数を含むものとする。上述の技術及び手順は、概して、当該分野で周知の従来の方法に従って、及び本明細書全体を通して引用されそして考察される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されるように行われる。本明細書において記載される分析化学、合成有機化学、及び医薬品化学及び製薬化学に関連して利用される命名法、並びにそれらの検査法及び技術は、当該分野で周知でありかつ一般的に使用されるものである。

【0009】

明細書において言及される全ての特許、公開特許出願、及び非特許刊行物は、本開示が属する分野の当業者の技能のレベルを示す。本出願のいずれかの部分において参照される全ての特許、公開特許出願、及び非特許刊行物は、各個々の特許又は刊行物が参照により加入されると具体的かつ個別に示される場合と同じ程度まで、それら全体として参照により本明細書に明示的に加入される。

【0010】

本明細書において開示される組成物／デバイス、キット、及び／又は方法は全て、本開示を考慮すれば過度の実験なしに製造しかつ実行することが可能である。組成物／デバイス、キット、及び／又は方法は特定の実施形態に関して記載されてきたが、本開示の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される組成物／デバイス、キット、及び／又は方法並びに方法の工程または工程の順序に、変形が適用され得るということは当業者に明らかである。当業者に明らかである全てのこのような類似した置換及び改変は、添付の特許請求の範囲により定義されるとおりの本開示の精神、範囲、及び概念内であるとみなされる。

【0011】

本開示に従って利用されるように、以下の用語は、別段の指示がなければ、以下の意味を有すると理解されるものとする：
特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と関連して使用される場合の用語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「１つ」を意味し得るが、「１つ又はそれ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は１つより多く」の意味とも一致する。従って、用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしていなければ、複数の指示を含む。従って、例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、１つもしくはそれ以上の化合物、２つもしくはそれ以上の化合物、３つもしくはそれ以上の化合物、４つもしくはそれ以上の化合物、又はより大きな数の化合物を指す。

【0012】

用語「少なくとも１つ」の使用は、１つ、さらには１つより多くの任意の量を含むと理解され、これらとしては、限定されないが、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００などが挙げられる。用語「少なくとも１つ」は、それが付随する用語に依存して、１００又は１０００又はそれ以上に及び得る；さらに、より高い上限も満足な結果を生じ得るので、量１００／１０００は限定とみなされるべきではない。さらに、用語「Ｘ、Ｙ、及びＺの少なくとも１つ」の使用は、Ｘのみ、Ｙのみ、及びＺのみ、さらにＸ、Ｙ、及びＺの任意の組み合わせを含むと理解される。

【0013】

序数の用語（すなわち、「第１」、「第２」、「第３」、「第４」など）の使用は、単に２つ又はそれ以上の項目を区別する目的のためであり、そして別段の規定が明確に述べられていなければ、別の項目に対する１つの項目のいずれの順序も順位も重要度も、例えば添加のいずれの順序も示すことは意図されない。

【0014】

特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、選択肢のみを指すと明示的に示されていなければ、又は選択肢が相互排他的でなければ、包括的な「及び／又は」を意味するために使用される。例えば、条件「Ａ又はＢ」は、以下のいずれによっても満たされる：Ａが真であり（又は存在し）かつＢが偽である（又は存在しない）、Ａが偽であり（又は存在せず）かつＢが真である（又は存在する）、及びＡ及びＢの両方が真である（又は存在する）。

【0015】

本明細書において使用される場合、「一実施形態」、「実施形態」、「いくつかの実施形態」、「一実施例」、「例えば」、又は「実施例」への任意の言及は、その実施形態に関連して記載される特定の要素、特徴、構造、又は特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれるということを意味する。明細書中の様々な箇所における句「いくつかの実施形態において」又は「一実施例」の出現は、例えば、必ずしも全て同じ実施形態を指すわけではない。さらに、１つ又はそれ以上の実施形態又は実施例への全ての言及は、特許請求の範囲に対して非限定的であると解釈されるべきである。

【0016】

本出願全体を通して、用語「約」は、値が、組成物／装置／デバイス、その値を決定するために使用される方法についての誤差の固有の変動、又は試験対象間に存在する変動を含むということを示すために使用される。例えば、限定としてではないが、用語「約」が利用される場合、以下のような変動は開示される方法を実行するために妥当であるので、そして当業者により理解されるように、指定された値は、特定の値からプラス又はマイナス２０パーセント、又は１５パーセント、又は１２パーセント、又は１１パーセント、又は１０パーセント、又は９パーセント、又は８パーセント、又は７パーセント、又は６パーセント、又は５パーセント、又は４パーセント、又は３パーセント、又は２パーセント、又は１パーセント変動し得る。

【0017】

本明細書及び特許請求の範囲において使用されるように、語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」のような含むことの任意の形態）、「有すること」（並びに「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」のような有することの任意の形態）、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」のような含むことの任意の形態）、又は「含有すること」（並びに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」のような含有することの任意の形態）は、包括的又はオープンエンドであり、かつ追加の記載されていない要素又は方法工程を排除しない。例えば、要素のリストを含むプロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではないが、明示的にリストに記載されていないか又は本来その中に存在する他の要素を含んでいてもよい。

【0018】

本明細書において使用されるように用語「又はそれらの組み合わせ」は、その用語の前のリストに記載された項目の全ての並び替え及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組み合わせ」は：Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣ、及び順序が特定の状況で重要な場合には、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢの少なくとも１つを含むことを意図される。この例を用いて続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどのような１つ又はそれ以上の項目の繰り返しを含有する組み合わせも明示的に含まれる。当業者には当然のことながら、文脈上別段明らかでなければ、典型的に、任意の組み合わせ中の項目の数に制限はない。

【0019】

本明細書において使用されるように、用語「実質的に」は、その後に記載される事象又は状況が完全に発生すること又はその後に記載される事象又は状況が大部分又はかなりの程度まで発生することを意味する。例えば、特定の事象又は状況に関連する場合、用語「実質的に」は、その後に記載される事象又は状況が、少なくとも８０％の確率で、又は少なくとも８５％の確率で、又は少なくとも９０％の確率で、又は９５％の確率で発生することを意味する。用語「実質的に隣接する」は、２つの項目が互いに１００％隣接していること、又は２つの項目が互いにごく近くにあるが互いに１００％隣接してはいないこと、又は２つの項目の一方の一部が他方の項目に１００％隣接してはいないが、他方の項目のすぐ近くにあることを意味し得る。

【0020】

本明細書において使用されるように、句「と会合した」は、２つの部分の互いとの直接的な会合及び２つの部分の互いとの間接的な会合の両方を含む。会合の非限定的な例としては、直接結合によるか又はスペーサー基を介した１つの部分の別の部分への共有結合、直接的又は部分に結合された特異的結合対メンバーを用いた１つの部分の別の部分への非共有結合、例えば１つの部分を別の部分中に溶解することにより又は合成により１つの部分を別の部分中に組み込むこと、及び１つの部分を別の部分上にコーティングすることが挙げられる。

【0021】

本明細書において使用されるように用語「液体試験サンプル」は、本開示に従って利用され得る任意の種類の生物学的流体サンプルを含むと理解される。利用され得る生物学的サンプルの例としては、限定されないが、全血又はその任意の部分（すなわち、血漿又は血清）、唾液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、腸液、腹腔内液、嚢胞液、汗、間質液、涙、粘液、尿、膀胱洗浄液、精液、それらの組み合わせなどが挙げられる。本開示に従って利用される液体試験サンプルの体積は、（例えば、しかし限定としてではなく）約０．１μｌから約１００μｌであり得る。

【0022】

本明細書において使用されるように、本開示に従って利用される液体試験サンプルに関連する用語「体積」は、約０．１μｌ～約１００μｌ、又は約１μｌ～約７５μｌ、又は約２μｌ～約６０μｌ、又は約５０μｌに等しいかもしくは約５０μｌ未満を意味する。

【0023】

用語「患者」はヒト及び獣医学対象を含む。特定の実施形態において、患者は哺乳動物である。特定の他の実施形態において、患者はヒトである。診断／処置の目的のための「哺乳動物」は哺乳動物として分類される任意の動物を指し、これらとしてはヒト、家畜及び産業動物、非ヒト霊長類、及びイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどのような動物園、スポーツ又はペットの動物が挙げられる。

【0024】

ここで本発明概念の特定の非限定的な実施形態に戻ると、本開示は、生物学的サンプル中のＤＨＥＡＳの濃度を決定する方法において利用することができるイムノアッセイ試薬（さらにそれを含有するキット及びデバイス）に関する。本開示のイムノアッセイ試薬は新規なＤＨＥＡＳ抱合体を含み、そしてこれらの新規なＤＨＥＡＳ抱合体を利用するイムノアッセイは、現在利用可能なＤＨＥＡＳイムノアッセイにおいて観察されるアッセイ感度、周囲温度効果（ＡＴＥ）、及びビオチン干渉に対する感受性の問題を克服する。

【0025】

本開示の特定の非限定的な実施形態は、デヒドロエピアンドロステロンスルファート－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ）抱合体を含むイムノアッセイ試薬を含む。本明細書において開示されるか又はその他の企図されるいずれのＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体も、本開示に従って構築されるイムノアッセイ試薬に含まれ得る。特定の非限定的な実施形態において、ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＦＩＴＣ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－エチルジアミン－フルオレセイン）、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＰＥＧ３－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－（ポリエチレングリコール）３－フルオレセイン）、又はＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＢＳＡ－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－ウシ血清アルブミン－フルオレセイン）を含む。

【0026】

ＤＨＥＡＳ抱合体の文脈において使用されるように用語「フルオレセイン」は、フルオレセイン単独、さらにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のような（これに限定されないが）フルオレセイン誘導体も指すと理解される。

【0027】

本開示の特定の非限定的実施形態は、デヒドロエピアンドロステロンスルファート－カルボキシメトキシルアミノ－ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＤＭＡＥ）抱合体を含むイムノアッセイ試薬に関する。本明細書において開示されるか又はその他の企図されるいずれのＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＤＭＡＥ抱合体も、本開示に従って構築されるイムノアッセイ試薬に含まれ得る。特定の非限定的な実施形態において、ＤＨＥＡＳ－ＡＥ抱合体は、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＤＭＡＥ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－エチルジアミン－ジメチルアクリジニウムエステル）又はＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－Ｚ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥ（ＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－Ｚ－Ｎ－スルホプロピル－ジメチルアクリジニウムエステル）を含む。

【0028】

本開示の特定の非限定的な実施形態は、ＤＨＥＡＳの濃度の決定のためのイムノアッセイを都合よく実行するために有用なキットに関する。これらのキットは、本明細書において上で開示されるか又はその他の企図されるＤＨＥＡＳ抱合体のいずれかを、単独で又は本明細書において開示されるかもしくはその他の企図される他のアッセイ試薬と組み合わせて含む。さらに、キットは、本明細書において記載されるか又はその他の企図される特定のアッセイのいずれかを実行するための他の成分及び／又は試薬をさらに含有していてもよい。これらのさらなる試薬の性質は、特定のアッセイフォーマットに依存し、そしてそれらの同定は、当業者の技能の十分範囲内である。

【0029】

本開示の特定の非限定的実施形態において、イムノアッセイキットは、本明細書において開示されるか又はその他の企図されるＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体のいずれかを、単独で、又は抗フルオレセイン常磁性固相粒子及び／もしくはアクリジニウムエステル標識抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体と組み合わせて含む。

【0030】

当該分野で公知であるか又はその他の本明細書において企図される任意の常磁性固相粒子（ＰＭＰ）が、本開示に従って利用され得る。用語「常磁性」は、わずかな磁性が導入されて、いずれかの磁極への弱い引力、磁場から取り除く際に失われる状態を生じ得る物質を指す。常磁性物質は、典型的には不対「ｄ」電子を有する。常磁性物質としては、限定されないが、例えば、金属酸化物、及び金属ハロゲン化物のような金属塩；並びに例えば金属元素が挙げられる。限定ではなく例として、金属は、例えば、鉄、クロム、リチウム、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、マンガン、ストロンチウム、ジルコニウム、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、スズ、サマリウム、ユーロピウム、タングステン、白金、及びそれらの組み合わせであり得る。

【0031】

特定の非限定的な実施形態において、常磁性粒子は、一般的に例えば、約０．０２～約１００ミクロン、又は約０．０５～約１００ミクロン、又は約０．１～約１００ミクロン、又は約０．５～約１００ミクロン、又は約０．０２～約５０ミクロン、又は約０．０５～約５０ミクロン、又は約０．１～約５０ミクロン、又は約０．５～約５０ミクロン、又は約０．０２～約２０ミクロン、又は約０．０５～約２０ミクロン、又は約０．１～約２０ミクロン、又は約０．５～約２０ミクロンの平均直径を有する。いくつかの実施形態において、粒子は、例えば、約０．０５ミクロン～約２０ミクロン又は約０．３ミクロン～約１０ミクロン、又は約０．３ミクロン～約５ミクロンの平均直径を有する。いくつかの実施形態において、限定ではなく例示として、常磁性粒子は、例えば、酸化鉄（ＩＩ）粒子、酸化鉄（ＩＩＩ）粒子、酸化鉄（ＩＩ）粒子と酸化鉄（ＩＩＩ）粒子との混合物、酸化クロム粒子、及びリチウム、ナトリウム、マグネシウム、アルミニウム、マンガン、ストロンチウム、ジルコニウム、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、スズ、サマリウム、ユーロピウム、タングステン、又は白金の酸化物から形成される粒子、並びに上記の２つ又はそれ以上の混合物である。

【0032】

常磁性固相粒子は、コーティングされていてもコーティングされていなくてもよく；コーティングが存在する場合、コーティングは（限定としてではないが、例えば）、アルデヒドコーティング、ポリマーコーティング、コポリマーコーティングなどであり得る。

【0033】

抗フルオレセイン抗体は、当該分野で周知であり、広く市販されており、そして大いに研究されてきた。例えば（限定としてではないが）、抗フルオレセイン抗体のいくつかの商業的供給源としては、Ａｂｂｅｘａ Ｌｔｄ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）；Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）；Ｂｉｏｒｂｙｔ Ｌｔｄ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）；Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）；Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＬＬＣ（Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、ＣＯ）；ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ Ｌｉｆｅ（Ｐｅａｃｈｔｒｅｅ Ｃｏｒｎｅｒｓ、ＧＡ）；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｂａｓｅｌ、ＣＨ）；Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．（Ｐｏｔｔｓｔｏｗｎ、ＰＡ）；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；及びＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から入手可能なものが挙げられる。しかし、このリストは包括的ではなく、かつ本開示に従って利用することができる抗フルオレセイン抗体の多くのさらなる商業的供給源がある。従って、当業者は、本開示に従って利用することができる様々な抗フルオレセイン抗体を、明らかにかつ明確に同定し、そして選択することができ、従って、抗ヒトＩｇ抗体又はその特徴のさらなる説明は必要ないとみなされる。

【0034】

さらに、抗体を常磁性固相粒子に結合する方法は、当該分野で広く知られており、かつ当該分野の通常の技術の十分範囲内である。従って、そのさらなる説明は必要ないとみなされる。

【0035】

抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体は当該分野で周知であり、広く市販されており、かつ大いに研究されてきた。例えば（限定としてではないが）、抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体のいくつかの商業的供給源としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ、Ｉｎｃ．（Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、ＰＡ）；Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）；Ｌｉｆｅｓｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）；及びＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から入手可能なものが挙げられる。しかし、このリストは包括的ではなく、かつ本開示に従って利用することができる抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体の多くのさらなる商業的供給源がある。従って、当業者は、本開示に従って利用することができる様々な抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体を、明らかにかつ明確に同定し、そして選択することができ、従って、抗ヒトＩｇ抗体又はその特徴のさらなる説明は必要ないとみなされる。

【0036】

さらに、モノクローナル抗体をアクリジニウムエステルで標識する方法は、当該分野で広く知られており、かつ十分に当業者の技術範囲内である。従って、そのさらなる説明は必要ないとみなされる。

【0037】

別の非限定的な実施形態において、イムノアッセイキットは、本明細書において開示されるか又はその他の企図されるＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＤＭＡＥ抱合体のいずれかを、単独で、又はフルオレセイン化（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅｄ）抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体で標識された常磁性固相粒子と組み合わせて含み得る。

【0038】

常磁性固相粒子及び抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体は、本明細書において開示されるか又はその他の企図されるいずれかのものであり得る。さらに、モノクローナル抗体をフルオレセインで標識する方法は、当該分野で周知であり、かつ十分に当業者の技術範囲内である。従って、そのさらなる説明は必要ないとみなされる。

【0039】

さらに、本開示のキットは、本開示に従って生物学的サンプル収集及び／又は診断適用を行うための１つ又はそれ以上の他の成分又は試薬をさらに含有し得る。例えば（限定としてではないが）、キットは、１つ又はそれ以上の生物学的サンプル収集デバイス、１つ又はそれ以上のアッセイ試薬、１つ又はそれ以上の較正試薬、１つ又はそれ以上の品質管理試薬、１つ又はそれ以上の洗浄試薬などを含み得る。これらのさらなる成分／試薬の性質は、（限定されないが）生物学的サンプルの種類及び診断アッセイフォーマットのような様々な因子に依存し、そしてその同定は十分当業者の技術範囲内である；従って、そのさらなる説明は必要ないとみなされる。

【0040】

また、キット中に存在する様々な成分／試薬は、成分／試薬の交差反応性及び安定性に依存して、それぞれ別々の容器／区画にあってもよく、又は様々な成分／試薬は１つ又はそれ以上の容器／区画で混合してもよい。キットはさらに、アッセイを実行するための他の別々に包装された試薬を含み得る。さらに、キットは、成分／試薬が適用されるマイクロ流体デバイスを含み得る。

【0041】

キット中に存在する様々な成分／試薬の相対的な量は、アッセイ方法の間に起こる必要がある反応を実質的に最適化する成分／試薬の濃度を提供するため、そしてさらにアッセイの感度を実質的に最適化するために、広く変動し得る。適切な状況下で、キット中の成分／試薬の１つ又はそれ以上は、凍結乾燥粉末のような乾燥粉末として提供され得、そしてキットは、乾燥された試薬の溶解のための賦形剤をさらに含んでいてもよい；このやり方では、本開示に従う方法又はアッセイを行うために適した濃度を有する試薬溶液を、これらの成分から得ることができる。ポジティブコントロール及び／又はネガティブコントロールは、キットに含まれ得る。キットは、キットの使い方を説明する一組の書面での指示をさらに含み得る。この性質のキットは、本明細書において記載されるかまたはその他の企図される方法のいずれかにおいて使用することができる。

【0042】

組成物／キット／方法の試薬は、ここで開示されそして特許請求される本発明の概念に従ってそれらが機能することを可能にする任意の形態で提供され得る。例えば、限定としてではないが、試薬は、単一のアリコートの凍結乾燥された試薬の形態で提供され得る。マイクロ流体デバイスにおいて乾燥された試薬の使用は、米国特許第９，２４４，０８５号（その内容全体が参照により本明細書に明示的に加入される）において詳細に記載される。

【0043】

本開示の特定の非限定的な実施形態は、生物学的サンプル中のＤＨＥＡＳの濃度を決定する方法に関する。該方法は：（ａ）（１）ＤＨＥＡＳを含有すると疑われる生物学的サンプル；（２）本明細書において開示されるか又はその他の企図されるデヒドロエピアンドロステロンスルファート－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ）抱合体のいずれか；（３）本明細書において開示されるかまたはその他の企図される抗フルオレセイン常磁性固相粒子のいずれか；及び（４）本明細書において開示されるかまたはその他の企図されるいずれかのアクリジニウムエステル標識抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体を、同時に又は部分的にもしくは全体的に連続して混合して、混合物を形成する工程；並びに（ｂ）（ａ）において形成された混合物中で、（２）、（３）、及び（４）の互いに対する結合及び生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳに対する（４）の結合を可能にする工程を含む。該方法は、（ｃ）該混合物において生成された蛍光シグナルを測定する工程；及び／又は（ｄ）生物学的サンプルが存在しない場合に観察される蛍光シグナルと比較した場合に、観察される蛍光シグナルの減少量に基づいて、生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳの濃度を決定する工程をさらに含み得る。すなわち、該方法は、蛍光の量がサンプル中に存在するＤＨＥＡＳの量に反比例する競合フォーマットを利用する。

【0044】

特定の（しかし非限定的）実施形態において、上記方法の工程（ｄ）において、生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳの濃度は、蛍光シグナルを較正曲線と比較することにより決定される。

【0045】

本開示の特定の非限定的な実施形態は、生物学的サンプル中のＤＨＥＡＳの濃度を決定する方法に関する。該方法は：（ａ）（１）ＤＨＥＡＳを含有すると疑われる生物学的サンプル；（２）本明細書において開示されるかまたはその他の企図されるフルオレセイン化された抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体で標識された常磁性固相粒子のいずれか；及び（３）本明細書において開示されるかまたはその他の企図されるデヒドロエピアンドロステロンスルファート－カルボキシメトキシルアミノ－ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＤＭＡＥ）抱合体のいずれかを、同時に又は部分的にもしくは全体的に連続して混合して、混合物を形成する工程；（ｂ）（ａ）において形成された混合物において、（３）の（２）に対する結合又は生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳの（２）に対する結合を可能にする工程を含む。該方法は、（ｃ）混合物において生成された蛍光シグナルを測定する工程；及び／又は（ｄ）生物学的サンプルが存在しない場合に観察される蛍光シグナルと比較した場合に、観察される蛍光シグナルの減少量に基づいて、生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳの濃度を決定する工程をさらに含み得る。換言すると、該方法は、蛍光の量がサンプル中に存在するＤＨＥＡＳの量に反比例する競合フォーマットを利用する。

【0046】

特定の（しかし非限定的な）実施形態において、該方法の工程（ｄ）において、生物学的サンプル中に存在するＤＨＥＡＳの濃度は、蛍光シグナルを較正曲線と比較することにより決定される。

【0047】

本開示の特定の非限定的な実施形態は、サンプル中のＤＨＥＡＳの濃度を決定するためのマイクロ流体デバイスに関する。マイクロ流体デバイスは、ＤＨＥＡＳを含有すると疑われるサンプルを収容することができる区画、及び本明細書において記載されるかまたはその他の企図されるアッセイ試薬の組み合わせの１つ又はそれ以上を含む。限定としてではないが、例えば、マイクロ流体デバイスは、（ｉ）ＤＨＥＡＳを含有すると疑われるサンプルを収容することができる第１の区画と；以下：（ｉｉ）本明細書において開示されるかまたはその他の企図されるデヒドロエピアンドロステロンスルファート－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ）抱合体のいずれか；（ｉｉｉ）本明細書において開示されるかまたはその他の企図される抗フルオレセイン常磁性固相粒子のいずれか；及び（ｉｖ）本明細書において開示されるかまたはその他の企図されるアクリジニウムエステル標識抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体のいずれかの１つ又はそれ以上とを含み得る。別の非限定的な例において、マイクロ流体デバイスは、（ｉ）ＤＨＥＡＳ含有すると疑われるサンプルを収容することができる第１の区画と；以下：（ｉｉ）フルオレセイン化抗ＤＨＥＡＳモノクローナル抗体で標識された常磁性固相粒子；及び（ｉｉｉ）デヒドロエピアンドロステロンスルファート－カルボキシメトキシルアミノ－ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＤＭＡＥ）抱合体の一方又は両方とを含み得る。

【0048】

試薬（ｉｉ）～（ｉｖ）のいずれかはデバイスが本開示に従って機能することを可能にするマイクロ流体デバイスの任意の部分に配置され得る。例えば（しかし限定としてではなく）、（ｉｉ）～（ｉｖ）の少なくとも１つは、第１の区画に配置され得る。あるいは（かつ／又はそれらに加えて）、マイクロ流体デバイスは、第１の区画と流体連通することが可能な第２の区画を少なくとも含み得、そして（ｉｉ）～（ｉｖ）の１つ又はそれ以上は第２の区画に配置され得る。さらに、マイクロ流体デバイスは、他の追加の区画を含んでいてもよく、そして試薬（ｉｉ）～（ｉｖ）は、所望の場合、３つの異なる区画間で分けられ得る。

【0049】

本開示のマイクロ流体デバイスは、サンプルがアプライされ得るサンプル適用チャンバーと、それらと流体連通しており、本明細書の上に記載される試薬の１つ又はそれ以上を収容する１つ又はそれ以上の区画とも流体連通している入口チャネルとを含み得る。デバイスは、そのデバイスが本開示に従って機能する事ができる限り、任意の数の区画、区画の任意の配置、及びそれらの間の成分の任意の分布を備え得る。

【0050】

マイクロ流体デバイスの区画はいずれも、それらの中にアプライされた試薬を実質的に気密性の環境にその使用まで維持するために密閉され得る；例えば、凍結乾燥された試薬を収容する区画は、試薬の任意の意図されない再構成を防止するために密閉され得る。入口チャネル及び区画、さらに２つの区画は、互いに「流体連通することが可能である」と記載され得る；この句は、区画がなお密閉され得るが、区画に又は区画の間に形成された封に穴を開けると２つの区画はその間で流体流動を有することが可能であるということを示す。

【0051】

本開示のマイクロ流体デバイスは、当該分野で公知であるか又はその他の本明細書において企図される任意の他の所望の特徴を備え得る。例えば、限定としてではないが、マイクロ流体デバイスは、読み取りチャンバーをさらに含み得る；読み取りチャンバーは、常磁性固相粒子を収容する区画であり得、又は読み取りチャンバーは、上記区画と流体連通し得る。マイクロ流体デバイスは、限定されないが、洗浄液、希釈溶液、賦形剤、干渉溶液、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、品質管理などのような他の溶液を収容する１つ又はそれ以上の区画をさらに含み得る。例えば、マイクロ流体デバイスは、洗浄液を収容する１つ又はそれ以上の区画を含み得、そしてこれらの区画は、デバイスの任意の他の区画と流体連通することが可能であり得る。別の例において、マイクロ流体デバイスは、１つ又はそれ以上の乾燥試薬の溶解のための少なくとも１つの賦形剤を収容する１つ又はそれ以上の区画をさらに含み得、そして区画はデバイスの任意の他の区画と流体連通することが可能であり得る。さらに、マイクロ流体デバイスは、希釈溶液を収容する１つ又はそれ以上の区画をさらに含み得、そして区画はデバイスの任意の他の区画と流体連通することが可能であり得る。

【0052】

さらに、キット／マイクロ流体デバイス又は本明細書において企図されるのその他のもののいずれかは、単一のキット／デバイスにおいて多重化された多重アッセイを含み得る。

【実施例】

【0053】

実施例が本明細書以下に提供される。しかし、本開示は、その適用において、本明細書以後に開示される特定の実験、結果、及び検査手順に限定されないと理解されるべきである。むしろ、実施例は、単に様々な実施形態の１つとして提供され、かつ包括的ではなく例示的であると意図される。

【0054】

ＤＨＥＡＳ（図１）は副腎ステロイドであり、そしてＤＨＥＡＳの異常なレベルは、上の背景の項で概説されるように、多くの様々な障害及び状態と関連があることが当該分野で知られている。ＤＨＥＡＳの測定のための方法は、ヒト患者におけるＤＨＥＡＳレベルの評価のための機序を提供するために望まれる。しかし、ＤＨＥＡＳの検出のためのイムノアッセイは、アッセイ感度、周囲温度効果（ＡＴＥ）、及びビオチン干渉に対する感受性に伴う問題に直面した。

【0055】

現在利用可能なＤＨＥＡＳアッセイの不利な点及び欠陥に応じて、一連の新規なＤＨＥＡＳ誘導体及び抱合体が、アクリジニウムエステル（ＡＥ）技術に基づくイムノアッセイプラットフォームにおける使用のために設計され、そして合成された（Ｎａｔｒａｊａｎら（２０１０年）；Ｎａｔｒａｊａｎら（２０１１年）；及びＮａｔｒａｊａｎら（２０１２年））。これらの新規なＤＨＥＡＳ誘導体及び抱合体は、デヒドロエピアンドロステロンスルファート－フルオレセイン（ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ）及びデヒドロエピアンドロステロンスルファート－アクリジニウムエステル（ＤＨＥＡＳ－ＡＥ）抱合体を含んでいた。これらのＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ及びＤＨＥＡＳ－ＡＥ抱合体は、Ａｔｅｌｌｉｃａ／ＡＤＶＩＡ Ｃｅｎｔａｕｒ免疫測定器（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）で競合アッセイフォーマットを使用して評価された。ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＦＩＴＣ（８）化合物（抗ＦＩＴＣ標識常磁性固相粒子（抗ＦＩＴＣ－ＰＭＰ）と対になったＤＨＥＡＳ－カルボキシメトキシルアミノ－エチルジアミン－フルオレセイン）は、アッセイ要件と比べて優れたアッセイ性能を示し、そしてＤＨＥＡＳ ＩＩイムノアッセイのための有力候補の試薬の１つとして選択されてきた。

【0056】

試薬設計：Ａｔｅｌｌｉｃａ／ＡＤＶＩＡ Ｃｅｎｔａｕｒ ＤＨＥＡＳ試薬は、固相、補助試薬、及びライト試薬を含んでいた。現在の市販のアッセイは、ビオチン化マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ、補助試薬）と対になったＤＨＥＡＳ－ＮＳＰ－ＡＥ（ライト試薬）及びストレプトアビジン被覆固相を使用する。本開示のアッセイにおいて、ビオチン干渉を防ぐために、ストレプトアビジン被覆粒子の代わりに抗ＦＩＴＣ－ＰＭＰ粒子が固相に選択された。２つのアッセイフォーマットをこのイムノアッセイのために調査した（図２～３）。フォーマット１（図２）において、固相試薬は、フルオレセイン化ＤＨＥＡＳで標識された磁気粒子を含有し、そしてライト試薬はｍＡｂ－ＡＥ抱合体を含有する。ライト試薬抗体は、固相上のＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣと結合する。内在性ＤＨＥＡＳは、ライト試薬中のｍＡｂ－ＡＥに対してＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ結合固相と競合し、較正曲線に対して測定された場合、ＲＬＵシグナル強度と内在性分析物濃度との間に反比例関係を生じる。

【0057】

アッセイフォーマット１（図２）を支持するために、ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ及びｍＡｂ－ＡＥ試薬の両方を新しく開発し、そして評価する必要があった。ＡＥ標識モノクローナル抗体を、当該分野で公知であり特徴づけされている方法により製造した；しかし、ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体及びその合成方法は、本開示の前には知られておらず、従って、ＤＨＥＡＳ ＩＩイムノアッセイにおけるそれらの性能は本開示前には検討されていなかった。

【0058】

第２のＤＨＥＡＳ ＩＩフォーマットも調べた ‐ このアッセイフォーマットはフォーマット２と呼ばれ、図３に示される。フォーマット２において、固相試薬は、フルオレセイン化ｍＡｂで標識された磁気粒子を含有する。ライト試薬はＤＨＥＡＳ－ＡＥトレーサーを含有する。フォーマット２は、フォーマット１と同じ競合的主要部を使用して動作する。患者サンプル由来の内因性ＤＨＥＡＳを反応に加えることで、ＤＨＥＡＳ－ＡＥトレーサーの固相への結合を妨害し、シグナル生成の減少を生じる。フォーマット２において、ビオチン干渉を排除しながらアッセイ性能を改善する目的で、フルオレセイン化ｍＡｂ被覆ＰＭＰ固相と対になった様々なＤＨＥＡＳ－ＡＥトレーサーの合成に設計開発の重点を置いた。

【0059】

フォーマット１（図２）のために、初期アッセイ研究のための（図４）ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－フルオレセイン（５）を設計し、そしてＤＨＥＡＳ－ＣＭＯをＥＤＡ－フルオレセインと反応させることにより合成した（図４）。早期のデータは、この化合物が有望な機能的データを生じたことを示し、現在利用可能な市販のアッセイと比較して周囲温度効果（ＡＴＥ）を有意に減少させた。代替の親水性リンカー構造がアッセイ性能にさらなる利益を与えるかどうかを評価するためにＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＰＥＧ３－フルオレセイン（８）も製造した（図５）。さらに、ＤＨＥＡＳとＢＳＡ上のフルオレセイン部分との多重化学量論を提供し得るタンパク質リンカーとしてＢＳＡを利用して、ＤＨＥＡＳ－ＢＳＡ－フルオレセイン抱合体を製造した（図６）。これらの３つの試薬の詳細なアッセイ性能を以下で考察する。

【0060】

アッセイフォーマット２（図３）のために、初期特徴づけ研究のためのＤＭＡＥアクリジニウムエステルへの結合のためにＤＨＥＡＳ－ＣＭＯを選択した。早期のデータは、この抱合体を使用して、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＤＭＡＥ（１５）が有望な標準曲線形状を生じ、そして周囲温度バイアスを有意に減少させたことを実証した。この初期性能を考慮すると、異なるＡＥ構造がいずれかのさらなるＡＴＥ利益をアッセイに与えるかどうかを決定するために、同じ連結位置でのＺ－ＮＳＰ－ＤＭＡＥとの抱合体も製造した。両方のＤＨＥＡＳ－ＡＥ（１５、１８）の性能を以下で考察する。両方のＤＨＥＡＳ－ＡＥの合成をそれぞれ図７～８におけるスキームで示す。

【0061】

ＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体及びＤＨＥＡＳ－ＡＥ抱合体の両方の評価を、Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹでのイムノアッセイ分析機のＡＤＶＩＡ Ｃｅｎｔａｕｒファミリーを使用して行った。

【0062】

フルオレセイン化抱合体ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＦＩＴＣ、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＰＥＧ３－ＦＩＴＣ、及びＤＨＥＡＳ－ＢＳＡ－ＦＩＴＣ（それぞれ（５）、（８）、（１３））の機能的性能（結合曲線形状、精度推定、及び周囲温度バイアス（ＡＴＥ））を、ＤＨＥＡＳ ＩＩイムノアッセイフォーマット１で評価した。抱合体ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＰＥＧ３－ＦＩＴＣ及びＤＨＥＡＳ－ＢＳＡ－ＦＩＴＣは、現在利用可能な市販のアッセイと比較して最小の改善を示した（データは示していない）。ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－ＦＩＴＣ抱合体（５）は、現在利用可能な市販のアッセイと比較して同等の又はより良好な感度で改善された結合プロフィール（図９）を示した。より重要なことには、表１～２に示されるように、抱合体（５）を用いるアッセイフォーマット１は、ＡＴＥを≦１０％まで最小化し、市販のアッセイ（％ＡＴＥ約２９％）と比較してアッセイ性能を大きく改善した。

【0063】

２つのＤＨＥＡＳ－ＡＥ抱合体（１５、１８）を、プロトタイプＡＤＶＩＡ Ｃｅｎｔａｕｒ ＤＨＥＡＳ ＩＩイムノアッセイを使用してアッセイフォーマット２でも評価した。２つのＡＥ抱合体は、市販のアッセイと比較して有望なアッセイ性能を示した（図１０）。両方のＡＥについてのＡＴＥ推定は、市販のアッセイより良好であった（表３）。

【0064】

予備的アッセイ性能全体に基づいて、抱合体（５）は試験した試薬の中で最も良いＡＴＥ及びアッセイ感度を有する。

【0065】

【表1】

【0066】

【表2】

【0067】

【表3】

【0068】

要約すれば、一連のＤＨＥＡＳ－ＦＩＴＣ抱合体及びＤＨＥＡＳ－ＡＥ抱合体は、首尾よく設計され、合成され、そして、ＤＨＥＡＳ ＩＩイムノアッセイ（フォーマット１～２、それぞれ図２～３）における使用について評価された。アッセイ性能全体に基づいて、ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－フルオレセイン（５）（図４）から誘導されたＳＰ相試薬（フォーマット１）は、有望な低いアッセイ感度を有し、そして現在の市販のアッセイと比較してアッセイでの最も良好な周囲温度効果（ＡＴＥ）を有する。フォーマット１は、ビオチン干渉の危険性を最小にする２Ｈ１－抗ＦＩＴＣ ＰＭＰ固相を使用する。ＤＨＥＡＳ－ＣＭＯ－ＥＤＡ－フルオレセインは、予備アッセイの要件を満たす優れた候補として選択された（表２及び３）。この抱合体は、市販のＡＴＥＬＬＩＣＡ／ＡＤＶＩＡ Ｃｅｎｔａｕｒ ＤＨＥＡＳ ＩＩイムノアッセイの開発に重要な成分である。

【0069】

従って、本開示に従って、本明細書の上で示された目的及び利点を完全に満足する、組成物、デバイス、及びキット、さらにはそれらを製造及び使用する方法が提供された。本開示は、本明細書の上に示される特定の図面、実験、結果、及び言語と合わせて記載されてきたが、多くの代替、改変、及び変形が、当業者に明らかであることは明白である。従って、本開示の精神及び広範な範囲内にある全てのこのような代替、改変、及び変形を包含することが意図される。

【0070】

参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示されるものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する程度まで、参照により具体的に本明細書に加入される。さらに、以下は情報開示陳述書であることを意図するのではなく；３７ＣＦＲ§１．９７の規定に従う情報開示陳述書は別に提出されるだろう。

【0071】

１．Ｈａｎｉｎｇ ＲＶ．「Ｕｓｉｎｇ ＤＨＥＡＳ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．」 Ｃｏｎｔｅｍｐ Ｏｂ／Ｇｙｎ．１９８１；１８（９）：１１７-１３２．
２．Ｋａｓｉｃｋ ＪＭ、Ｂｅｒｇｆｅｌｄ ＷＦ、Ｓｔｅｃｋ ＷＤ、Ｇｕｐｔａ ＭＫ．「Ａｄｒｅｎａｌ ａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｆｅｍａｌｅ－ｐａｔｔｅｒｎ ａｌｏｐｅｃｉａ： ｓｅｘ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｌｄｉｎｇ ｗｏｍａｎ．」 Ｃｌｅｖｅ Ｃｌｉｎ Ｑ．１９８３；５０（２）：１１１-１２２．
３．Ｃｏｈｅｎ ＨＮ、Ｗａｌｌａｃｅ ＡＭ、Ｂｅａｓｔａｌｌ ＧＨ、Ｆｏｇｅｌｍａｎ Ｉ、Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ．「Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａｄｒｅｎａｌ ａｎｄｒｏｇｅｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｄｅｌａｙｅｄ ｐｕｂｅｒｔｙ．」 Ｌａｎｃｅｔ．１９８１；１（８２２２）：６８９-６９２．
４．Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎ ＧＤ．「Ｃｏｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｈｉｒｓｕｔｉｓｍ - ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．」 Ｃｏｎｔｅｍｐ Ｏｂ／Ｇｙｎ．１９８１；１７（５）：１８９-１９３．
５．ｄｅ Ｐｅｒｅｔｔｉ Ｅ、Ｆｏｒｅｓｔ ＭＧ．「Ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｆｒｏｍ ｂｉｒｔｈ ｔｏ ａｄｕｌｔｈｏｏｄ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．」 Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．１９７８；４７（３）：５７２-５７７．
６．Ｚａｐｐｕｌｌａ Ｆ、Ｖｅｎｔｕｒａ Ｄ、Ｃａｐｅｌｌｉ Ｍら．「Ｇｏｎａｄａｌ ａｎｄ ａｄｒｅｎａｌ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ ｉｎ ｐｒｅｐｕｂｅｒｔａｌ ａｎｄ ｐｕｂｅｒｔａｌ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．」 Ｊ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｉｎｖｅｓｔ．１９８１；４（２）：１９７-２０２．
７．Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ Ａ．「Ａｎｄｒｏｇｅｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ａｄｒｅｎａｌｓ ａｎｄ ｇｏｎａｄｓ．」 Ｍａｈｅｓｈ Ｖ、Ｇｒｅｅｎｂｌａｔｔ ＲＢ、ｅｄｓ．Ｈｉｒｓｕｔｉｓｍ ａｎｄ Ｖｉｒｉｌｉｓｍ．Ｂｏｓｔｏｎ： Ｊｏｈｎ Ｗｒｉｇｈｔ-ＰＳＧ；１９８３：１７-３４．
８．Ｓｃｉａｒｒａ Ｆ．「Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｖｉｒｉｌｉｚｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ： ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．」 Ｍｏｌｉｎａｔｔｉ Ｇら編．Ａｎｄｒｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｗｏｍｅｎ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ；１９８３：８５-１１３．
９．Ｈａｎｉｎｇ ＲＶ Ｊｒ、Ｃａｒｌｓｏｎ ＩＨ、Ｓｈａｐｉｒｏ ＳＳ、Ｎｏｌｔｅｎ ＷＥ．「Ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ ｆｒｅｅ ｉｎｄｅｘ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｂｅｓｔ ｗｉｔｈ ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ ｓｕｌｆａｔｅ．」 Ｆｅｒｔｉｌ Ｓｔｅｒｉｌ．１９８１；３６（６）：７５７-７６５．
１０．Ｌｏｂｏ ＲＡ、Ｐａｕｌ ＷＬ、Ｇｏｅｂｅｌｓｍａｎｎ Ｕ．「Ｓｅｒｕｍ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＤＨＥＡＳ ｉｎ ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ ａｎｄ ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．」 Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．１９８１；５７（５）：６０７-６１２．
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１２．Ｎａｔｒａｊａｎ、Ａ．；Ｓｈａｒｐｅ、Ｄ．；Ｃｏｓｔｅｌｌｏ、Ｊ．；Ｊｉａｎｇ、Ｑ．Ｐ．「Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｅｓｔｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｏｕｔｐｕｔ」 Ａｎｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０１０、ｖｏｌ．４０６、２０４．
１３．Ｎａｔｒａｊａｎ、Ａ．；Ｓｈａｒｐｅ、Ｄ．；Ｗｅｎ、Ｄ．「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ Ｏｎ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｏｆ Ａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ Ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ Ｅｓｔｅｒ Ｌａｂｅｌｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」 Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１１、ｖｏｌ．９、５０９２．
１４．Ｎａｔｒａｊａｎ、Ａ．；Ｓｈａｒｐｅ、Ｄ．；Ｗｅｎ、Ｄ．「Ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｌａｂｅｌｉｎｇ、Ｃｒｏｓｓ－Ｌｉｎｋｉｎｇ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」 Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１２、ｖｏｌ．１０、１８８。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】