特表 2024-535621 新規な糖転移酵素及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-30

(54)【発明の名称】新規な糖転移酵素及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/10 20060101AFI20240920BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240920BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240920BHJP

   C12P 19/44 20060101ALI20240920BHJP

【ＦＩ】

C12N9/10 ZNA

C12N15/54

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12P19/44

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024522653

(86)(22)【出願日】2022-06-14

(85)【翻訳文提出日】2024-04-16

(86)【国際出願番号】 KR2022008392

(87)【国際公開番号】W WO2023068472

(87)【国際公開日】2023-04-27

(31)【優先権主張番号】10-2021-0139474

(32)【優先日】2021-10-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514199250

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(74)【代理人】

【識別番号】100152489

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 美樹

(72)【発明者】

【氏名】パク、ソンヒ

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジョンウン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AF41

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA29

4B065CA41

4B065CA46

(57)【要約】

本出願は、新規な糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）又は前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む微生物、並びに前記微生物を用いたレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭの製造方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）。

【請求項2】

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチド。

【請求項3】

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項4】

配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、又は前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む、微生物。

【請求項5】

グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下でレバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含み、
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＤの製造方法。

【請求項6】

前記グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸は、スクロースとヌクレオチド二リン酸をスクロースシンターゼの存在下で反応させて作製したものである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記レバウジオシドＡは、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でステビオシドと反応させて作製したものである、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記スクロースシンターゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項７に記載の方法。

【請求項10】

前記製造方法は、同一反応系で連続的に行われるものである、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下でレバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップと、
前記レバウジオシドＤを糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でグルコースが結合したヌクレオチド二リン酸と反応させてレバウジオシドＭを作製するステップと、を含み、
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＭの製造方法。

【請求項12】

前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸は、スクロースとヌクレオチド二リン酸をスクロースシンターゼの存在下で反応させて作製したものである、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記レバウジオシドＡは、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でステビオシドと反応させて作製したものである、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記スクロースシンターゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記製造方法は、同一反応系で連続的に行われるものである、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、スクロースシンターゼ及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含み、
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを製造する方法。

【請求項19】

スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、スクロースシンターゼ、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＭを作製するステップを含み、
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＡからレバウジオシドＭを製造する方法。

【請求項20】

前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１９に記載のレバウジオシドＡからレバウジオシドＭを製造する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、新規な糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）又は前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む微生物、並びに前記微生物を用いたレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

糖摂取による疾病（肥満）の恐れから１日当たりの糖摂取量を低減することを世界保健機関（ＷＨＯ）が勧告しており、先進国を中心に政府主導の下で様々な糖類摂取量を低減するための政策が盛んに議論されている。また、市場においては砂糖及び高果糖を代替する様々な代替甘味料素材に対するニーズが増加しており、代替甘味料素材の開発、製品化が続けられている。

【0003】

代替甘味料は、合成甘味料（Ｓａｃｃｈａｒｉｎ、Ａｓｐａｒｔａｍｅ、Ｓｕｃｒａｌｏｓｅなど）、合成糖アルコール類（Ｍａｌｔｉｔｏｌ，Ｘｙｌｉｔｏｌ）、高甘味料（レバウジオシドＡ，Ｌｉｑｕｏｒｉｃｅ）と変化を続けている。しかし、持続的な合成甘味料の安全性についての懸念から天然甘味料に対する消費者のニーズが大きくなってきているものの、天然甘味料特有の異味・異臭を有する味質の限界により、従来の合成甘味料中心の低カロリー・ゼロカロリー製品を本格的に代替することができていない現状である。

【0004】

これに関して、近年、多くの注目を集めている天然の高甘味料は、ステビアの葉から抽出したステビア甘味料である。ステビア甘味料は、カロリーがなく、血中グルコース及びインスリンレベルに有益な効果をもたらし、人体に副作用がないことが報告されており、代替甘味料としての潜在力を有しているが、苦味が非常に強いという欠点があるので、砂糖低減用途に限界がある。

【0005】

ステビアは、南米パラグアイを原産地とする菊科の多年生植物であり、学名はステビアレバウディアナベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ）である。ステビアの葉には砂糖の２００～３００倍以上の甘味を有する成分が存在するので、その甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる。ステビア抽出物の甘味成分には、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥなどの様々なステビオール配糖体が含まれる。

【0006】

ステビア抽出物の甘味成分のうち、ステビオシド（ＳＴＶ）、レバウジオシドＡ（Ｒｅｂ Ａ）、レバウジオシドＣ（Ｒｅｂ Ｃ）は、ステビアの葉に含有量が比較的多く、高純度で抽出、精製して産業化、製品化されているが、苦味が非常に強いという欠点があるので、砂糖低減用途に限界がある。

【0007】

一方、レバウジオシドＤ（Ｒｅｂ Ｄ）、レバウジオシドＭ（Ｒｅｂ Ｍ）は、ＳＴＶ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣに比べて、苦味が少なく、甘味質に優れ、代替甘味料としての価値が高い。しかし、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭは、ステビアの葉に極めて微量しか存在せず、葉から抽出、精製して製造する方法に高コストを要するという欠点がある。

【0008】

よって、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭの大量生産に必要な新規な酵素及びそれを用いた製造方法に関する研究の必要性が高まっている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】韓国登録特許第１４０４７２８号公報

【特許文献2】国際公開第２０１４／１３３２４８号

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ （１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５］：２４４４

【非特許文献2】Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７

【非特許文献3】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３

【非特許文献4】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４）

【非特許文献5】Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３（１９９０）

【非特許文献6】Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４

【非特許文献7】［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３

【非特許文献8】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２

【非特許文献9】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）

【非特許文献10】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５

【非特許文献11】Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９

【非特許文献12】Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，９．５０－９．５１，１１．７－１１．８

【非特許文献13】“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ” ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

本出願人は、レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する活性を有する酵素を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、従来は機能が開示されていなかったポリペプチド配列が糖転移酵素活性を有することを見出し、前記ポリペプチドがレバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する糖転移酵素活性を有することを確認し、本出願を完成するに至った。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本出願は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を提供することを目的とする。
また、本出願は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを提供することを目的とする。

【0013】

さらに、本出願は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することを目的とする。
さらに、本出願は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）又は前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を提供することを目的とする。

【0014】

さらに、本出願は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下でレバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＤの製造方法を提供することを目的とする。

【0015】

さらに、本出願は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下でレバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップと、前記レバウジオシドＤを糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でグルコースが結合したヌクレオチド二リン酸と反応させてレバウジオシドＭを作製するステップとを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＭの製造方法を提供することを目的とする。

【0016】

さらに、本出願は、スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、スクロースシンターゼ及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを製造する方法を提供することを目的とする。

【0017】

さらに、本出願は、スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、スクロースシンターゼ、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＭを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＡからレバウジオシドＭを製造する方法を提供することを目的とする。

【0018】

さらに、本出願は、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を含むレバウジオシドＤ生産用組成物を提供することを目的とする。
さらに、本出願は、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）と、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）とを含むレバウジオシドＭ生産用組成物を提供することを目的とする。

【0019】

さらに、本出願は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）における、レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する糖転移酵素としての用途を提供することを目的とする。

【発明の効果】

【0020】

本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を用いると、レバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭを生産することができ、副産物をほとんど伴うことなく、高純度及び高収率でレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭを提供することができ、安価な原料を用いるので経済的であり、手順が簡単で時間の消耗が少なく、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭの大量生産に有用である。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）によりレバウジオシドＡがレバウジオシドＤに変換されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。

【図2】糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及びスクロースシンターゼによりステビオシド及びレバウジオシドＡからレバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ及びレバウジオシドＩが生成されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。

【図3】糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）によりレバウジオシドＤがレバウジオシドＭに変換されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。

【発明を実施するための形態】

【0022】

以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。さらに、本明細書全体にわたって多くの論文及び特許文献が参照されており、その引用が示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれており、それにより本出願の属する技術分野の水準及び本出願の内容がより明確に説明される。

【0023】

本出願の一態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を提供する。
本出願における「糖転移酵素（ＵＤＰ（Ｕｒｉｄｉｎｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）－ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＵＧＴ）」とは、グリコシル供与体（ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｄｏｎｏｒ）からグリコシル受容体分子（ｇｌｙｃｏｓｙｌ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に単糖類部分を転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）する活性を有する酵素であって、具体的にはＵＤＰ－糖をグリコシル供与体として用いる酵素を意味する。本出願における前記糖転移酵素は、「ＵＤＰ－糖転移酵素」及び「ＵＧＴ」と混用される。

【0024】

前記糖転移酵素は、糖転移酵素遺伝子を有するベクターで形質転換された組換え大腸菌、バチルス、酵母、コリネバクテリウム又はアグロバクテリウムから生産されたものであるか、前記大腸菌などから生産されてさらに精製されたものであるか、市販されている商品を購入して用いるが、これらに限定されるものではない。また、前記糖転移酵素は当該技術分野において公知であり、前記糖転移酵素のタンパク質及び遺伝子配列は公知のデータベースから得られ、例えばＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどから得られるが、これらに限定されるものではない。

【0025】

本出願においては、レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する酵素活性を有する、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる新規な糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を見出した。

【0026】

具体的には、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0027】

また、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。さらに、そのような相同性又は同一性を有して本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）も本出願に含まれることは言うまでもない。

【0028】

本出願に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはタンパク質」、「特定配列番号で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはタンパク質」又は「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端におけるタンパク質の機能を変更しない配列の付加、自然に発生し得る突然変異、その非表現突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は保存的置換を有するものが挙げられる。

【0029】

例えば、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及び／又は内部に、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の機能を変更しない配列の付加もしくは欠失、自然に発生し得る突然変異、非表現突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）又は保存的置換を有するものが挙げられる。

【0030】

本出願における「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられ、疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンが挙げられる。また、アミノ酸は、電荷を帯びた（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ ｃｈａｒｇｅｄ）側鎖を有するアミノ酸と、電荷を帯びていない（ｕｎｃｈａｒｇｅｄ）側鎖を有するアミノ酸に分類され、電荷を帯びた側鎖を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられ、電荷を帯びていない側鎖を有するアミノ酸は、さらに非極性（ｎｏｎｐｏｌａｒ）アミノ酸と極性アミノ酸（ｐｏｌａｒ）に分類され、非極性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンが挙げられ、極性アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。通常、保存的置換は、生成されるタンパク質又はポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。

【0031】

また、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含むものであってもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）又は翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）タンパク質の移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。

【0032】

本出願における「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」又は「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。

【0033】

保存されている（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）又は同じ（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下において、一般に配列全体又は一部分とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドンの縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。

【0034】

任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。

【0035】

ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献３などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。

【0036】

本出願の一例として、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）は、レバウジオシドＡをレバウジオシドＭに変換する活性を有するものであってもよい。
本出願における「相当する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」とは、ポリペプチドにおいて列挙される位置のアミノ酸残基であるか、又はポリペプチドにおいて列挙される残基に類似、同一もしくは相当するアミノ酸残基であることを意味する。相当する位置のアミノ酸を確認することは、特定配列を参照する配列の特定アミノ酸を決定することになる。本出願における「相当領域」とは、一般に関連タンパク質又は参照（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）タンパク質における類似又は対応する位置を意味する。

【0037】

例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１とアラインメント（ａｌｉｇｎ）すると、それに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の数、位置を参照してナンバリングすることができる。例えば、本出願における配列アラインメントアルゴリズムは、クエリー配列（「参照配列」ともいう）と比較すると、アミノ酸の位置、又は置換、挿入、欠失などの改変が生じる位置を確認することができる。

【0038】

このようなアラインメントには、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（非特許文献３）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅｍａｎプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，非特許文献２）などを用いることができるが、これらに限定されるものではなく、当該技術分野で公知の配列アラインメントプログラム、ペアワイズ配列（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。

【0039】

本出願の他の態様は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを提供する。
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味し、より具体的には前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。

【0040】

本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであってもよい。本出願の一例として、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４の配列を有するものであってもよく、配列番号４の配列を含むものであってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、配列番号４の配列からなるものであってもよく、配列番号４の配列から実質的に構成されるものであってもよい。

【0041】

本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）により、又は本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号４の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である塩基配列を有するものであるか、前記塩基配列を含むものであるか、又は配列番号４の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満である塩基配列からなるものであるか、前記塩基配列から実質的に構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0042】

また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば本出願のポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１１、１２参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。

【0043】

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。

【0044】

具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検出することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。

【0045】

前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１１）。

【0046】

本出願のさらに他の態様は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。前記ベクターは、前記ポリヌクレオチドを微生物において発現させるための発現ベクターであるが、これに限定されるものではない。

【0047】

本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ産物を含んでもよい。前記発現調節領域には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な微生物に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。

【0048】

本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

【0049】

例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択するためのもの、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。

【0050】

本出願における「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを微生物又は微生物内に導入することにより、微生物内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、微生物内で発現するものであれば、微生物の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、微生物内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で微生物に導入される。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で微生物に導入され、微生物において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0051】

また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。

【0052】

本出願のさらに他の態様は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）又は前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含む微生物を提供する。
本出願の微生物は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチド、又は本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを含むものであってもよい。

【0053】

本出願における「微生物」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするポリペプチド、タンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が行われた微生物である。本出願において、「微生物」、「菌株」、「微生物」は、同じ意味で用いられ、混用される。

【0054】

具体的には、前記微生物は、エシェリキア属微生物又はコリネバクテリウム属微生物であり、より具体的には大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）又はコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であるが、これらに限定されるものではない。

【0055】

本出願の微生物は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、本出願のポリヌクレオチド及び本出願のポリヌクレオチドを含むベクターの少なくとも１つを含む菌株であるか、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）もしくは本出願のポリヌクレオチドを発現するように改変された菌株であるか、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）もしくは本出願のポリヌクレオチドを発現する菌株（例えば、組換え菌株）であるか、又は本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）活性を有する菌株（例えば、組換え菌株）であるが、これらに限定されるものではない。

【0056】

本出願の菌株は、レバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭを生産する微生物であってもよい。
本発明における「レバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭを生産する微生物」とは、レバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭを生物体内で生産する原核又は真核微生物菌株を意味する。本発明の目的上、前記微生物は、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を含み、レバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭを生産する微生物であれば、原核細胞と真核細胞のいずれであってもよい。

【0057】

前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を含む、レバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭを生産する微生物は、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードする染色体上の配列を含む微生物、又は／及び前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを導入することにより前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を含む微生物であればいかなるものでもよいが、これらに限定されるものではない。

【0058】

例えば、本出願の菌株は、本出願のポリヌクレオチド、又は本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を発現する細胞又は微生物であり、本出願の目的上、本出願の菌株は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を含み、レバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭを生産する微生物であればいかなるものでもよい。例えば、本出願の菌株は、天然の野生型微生物であってもよく、レバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭを生産する微生物に本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドが導入されることにより糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）が発現し、レバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭ生産能が向上した組換え菌株であってもよい。

【0059】

本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部又は全部の改変は、（ａ）微生物中の染色体導入用ベクターを用いた相同組換え、もしくは遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ｅ．ｇ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を用いたゲノム編集、並びに／又は（ｂ）紫外線や放射線などの光及び／もしくは化学物質処理により誘導することができるが、これらに限定されるものではない。前記遺伝子の一部又は全部の改変方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれる。例えば、標的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に導入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を起こすことにより遺伝子の一部又は全部の欠失が行われる。この導入されるヌクレオチド配列又はベクターは、優性選択マーカーを含むものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0060】

本出願の微生物における糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、ポリヌクレオチド、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭなどについては前述した通りである。
本出願のさらに他の態様は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下でレバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＤの製造方法を提供する。

【0061】

具体的には、本出願のレバウジオシドＤ生産方法は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、本出願のポリヌクレオチド、又は本出願のベクターを含む微生物を培地で培養するステップを含むが、これに限定されるものではない。

【0062】

本出願における「培養」とは、本出願の微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行われる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び／又は流加培養であるが、これらに限定されるものではない。

【0063】

本出願における「培地」とは、本出願の微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給するものである。具体的には、本出願の微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微生物を培養することができる。

【0064】

例えば、コリネバクテリウム属菌株の培養培地は、非特許文献１３に開示されている。
本出願における前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

【0065】

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これら窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

【0066】

前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。

【0067】

また、本出願の微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加することにより、培地のｐＨを調整することができる。さらに、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。

【0068】

本出願の培養は、培養温度を２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。
本出願の培養により生産されたレバウジオシドＤは、培地中に分泌されるか、細胞内に残留する。

【0069】

本出願の一実施例として、前記グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸は、スクロースとヌクレオチド二リン酸をスクロースシンターゼの存在下で反応させて作製したものであるが、これに限定されるものではない。

【0070】

本出願における「スクロースシンターゼ」は、植物体の代謝において可逆的にフルクトースにヌクレオチド二リン酸が結合したグルコースを転移してスクロースを生産する役割を果たし、本発明においては、５～１０のｐＨ範囲でスクロースとヌクレオチド二リン酸を反応させてグルコースが結合したヌクレオチド二リン酸とフルクトースに分離する活性を示す。

【0071】

前記スクロースシンターゼは、コメ、トウモロコシ、コムギ、タケ、シロイヌナズナ、シバ、オオムギ、モロコシ又はジャガイモに由来するスクロースシンターゼであり、コメ、トウモロコシ、コムギ又はオオムギに由来するスクロースシンターゼが好ましく、コメ、特にＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａに由来するスクロースシンターゼがより好ましい。前記スクロースシンターゼは、スクロースシンターゼ遺伝子を有するベクターで形質転換された組換え大腸菌、バチルス、酵母、コリネバクテリウム又はアグロバクテリウムから生産されたものであるか、前記大腸菌などから生産されてさらに精製されたものであるか、当該技術分野で公知のスクロースシンターゼであるか、市販されているものであるが、これらに限定されるものではない。

【0072】

具体的には、本出願のスクロースシンターゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0073】

前記スクロースは、スクロースシンターゼの基質として作用してヌクレオチド二リン酸にグルコースを供給できるものであればいかなるものでもよく、例えば原糖又は砂糖が用いられるが、これらに限定されるものではない。

【0074】

本出願におけるヌクレオチド二リン酸としては、プリンヌクレオチド又はピリミジンヌクレオチドが用いられ、ウリジン二リン酸が好ましいが、これらに限定されるものではない。

【0075】

前記グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）によりレバウジオシドＡと反応してレバウジオシドＤを生成するものであってもよい。

【0076】

本出願の一実施例として、前記レバウジオシドＡは、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でステビオシドと反応させて作製したものであるが、これに限定されるものではない。

【0077】

前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸をステビオシドと反応させてレバウジオシドＡを生成するものであってもよい。
前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ、Ｂａｍｂｕｓａ ｏｌｄｈａｍｉｉ、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｚｅａ ｍａｙｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の糖転移酵素であってもよい。前記糖転移酵素は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ、Ｂａｍｂｕｓａ ｏｌｄｈａｍｉｉ由来の糖転移酵素であることが好ましい。前記糖転移酵素は、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ由来の糖転移酵素であることがより好ましい。前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、糖転移酵素遺伝子を有するベクターで形質転換された組換え大腸菌、バチルス、酵母、コリネバクテリウム又はアグロバクテリウムから生産されたものであるか、前記大腸菌などから生産されてさらに精製されたものであるか、当該技術分野で公知の糖転移酵素であるか、市販されているものであるが、これらに限定されるものではない。

【0078】

具体的には、本出願の糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0079】

前記ステビオシドは、ステビアレバウディアナ熱水もしくはエタノール水溶液抽出物又はそれらの精製物もしくは抽出物からのレバウジオシドＡ生産の副産物であり、ステビオシド含有量がステビオール配糖体の総重量の１０％重量以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上、さらに好ましくは８０重量％以上であるものが用いられるが、これらに限定されるものではない。

【0080】

本出願の一実施例として、前記レバウジオシドＤは、反応式１のように作製したものであるが、これに限定されるものではない。

【0081】

【化1】

【0082】

具体的には、前記製造方法は、同一反応系で連続的に行われるものであってもよい。
本出願における「同一反応系」とは、１つの反応系又は反応システムにおいて反応が連続的に起こることを意味する。

【0083】

本出願の製造方法は、このような反応式１により、ステビオシドの１３－Ｏ－グルコースのＣ－３’位に特異的に１つのグルコースを結合させてレバウジオシドＡを高収率で合成し、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを合成する連続反応システムを提供する。

【0084】

本出願のレバウジオシドＤ生産方法は、本出願の微生物を準備するステップ、前記菌株を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ（任意の順序，ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。

【0085】

本出願のレバウジオシドＤ生産方法は、前述したように培養した培地（培養培地）又は本出願の微生物からレバウジオシドＤを回収するステップをさらに含んでもよい。前記回収するステップは、前記培養するステップの後にさらに含んでもよい。

【0086】

前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするレバウジオシドＤを回収（ｃｏｌｌｅｃｔ）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするレバウジオシドＤを回収することができる。

【0087】

また、本出願のレバウジオシドＤ生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願のレバウジオシドＤ生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく連続的又は非連続的に行ってもよく、同時に又は１つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0088】

本出願の方法における糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物などについては前述した通りである。
本出願のさらに他の態様は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下でレバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップと、前記レバウジオシドＤを糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でグルコースが結合したヌクレオチド二リン酸と反応させてレバウジオシドＭを作製するステップとを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＭの製造方法を提供する。

【0089】

本出願の一実施例として、前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるが、これに限定されるものではない。
本出願の一実施例として、前記グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸は、スクロースとヌクレオチド二リン酸をスクロースシンターゼの存在下で反応させて作製したものであるが、これに限定されるものではない。

【0090】

具体的には、本出願のスクロースシンターゼは、配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0091】

本出願の一実施例として、前記レバウジオシドＡは、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でステビオシドと反応させて作製したものであるが、これに限定されるものではない。

【0092】

具体的には、前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0093】

本出願の糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸をレバウジオシドＤと反応させてレバウジオシドＭを生成するものであってもよい。
具体的には、本出願の糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0094】

本出願の一実施例として、前記レバウジオシドＭは、反応式２のように作製したものであるが、これに限定されるものではない。

【0095】

【化2】

【0096】

具体的には、前記製造方法は、同一反応系で連続的に行われるものであってもよい。
本出願の製造方法は、このような反応式２により、ステビオシドからレバウジオシドＡを高収率で合成し、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを合成し、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを合成する連続反応システムを提供する。

【0097】

本出願のレバウジオシドＭ生産方法は、本出願の微生物を準備するステップ、前記菌株を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ（任意の順序，ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。

【0098】

本出願のレバウジオシドＭ生産方法は、前述したように培養した培地（培養培地）又は本出願の微生物からレバウジオシドＭを回収するステップをさらに含んでもよい。前記回収するステップは、前記培養するステップの後にさらに含んでもよい。

【0099】

前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするレバウジオシドＭを回収（ｃｏｌｌｅｃｔ）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするレバウジオシドＭを回収することができる。

【0100】

また、本出願のレバウジオシドＭ生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願のレバウジオシドＭ生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく連続的又は非連続的に行ってもよく、同時に又は１つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0101】

本出願の方法における糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、ポリヌクレオチド、ベクター、微生物などについては前述した通りである。
よって、本出願の製造方法は、ステビオシド、レバウジオシドＡなどの入手が容易で安価な原料を用いて、ステビア抽出物に含まれるステビオシド、レバウジオシドＡなどの苦味成分をおいしさ成分であるレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭに変換することができるので、甘味質が良好なステビア甘味料の生産に有用である。

【0102】

本出願のさらに他の態様は、スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、スクロースシンターゼ及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを製造する方法を提供する。

【0103】

本出願のさらに他の態様は、スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、スクロースシンターゼ、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＭを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、レバウジオシドＡからレバウジオシドＭを製造する方法を提供する。

【0104】

前記スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、スクロースシンターゼ、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、同一反応系、レバウジオシドＭなどについては前述した通りである。

【0105】

具体的には、前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるが、これに限定されるものではない。
本出願のさらに他の態様は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、もしくは本出願のポリヌクレオチドを含む微生物を含むか、それを培養した培地を含むか、又はそれらの２つ以上の組み合わせを含むレバウジオシドＤ生産用組成物を提供する。

【0106】

本出願のさらに他の態様は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）及び糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチド及び前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、もしくは本出願のポリヌクレオチドを含む微生物を含むか、それを培養した培地を含むか、又はそれらの２つ以上の組み合わせを含むレバウジオシドＭ生産用組成物を提供する。

【0107】

本出願の組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0108】

本出願の組成物における糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）、ポリヌクレオチド、ベクター、菌株、培地、Ｌ－バリンなどについては前述した通りである。

【0109】

本出願のさらに他の態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）における、レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する糖転移酵素としての用途を提供する。

【0110】

配列番号１、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤなどについては前述した通りである。

【実施例】

【0111】

以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示する好ましい実施形態にすぎず、本出願がこれらに限定されるものではない。なお、本明細書に記載されていない技術的事項は、本出願の技術分野又は類似技術分野における熟練した技術者が十分に理解し、容易に実施することのできるものである。

【実施例1】

【0112】

新規な糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の設計
実施例１－１．新規な糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の設計
レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭを生産する優れた酵素を開発するために、ステビア及びレバウジオシドＡを糖転移反応の受容体として認識し、ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅを供与体として認識することが知られている２種類の植物由来酵素を選定し、微生物における発現、及びレバウジオシドＡからレバウジオシドＤへの変換活性を調べた。その結果を表１に示す。

【0113】

【表1】

【0114】

表１に示すように、前記２種類の植物由来酵素においては酵素発現量及び変換率が低く、レバウジオシドＤの産業的製造に用いるには効率が悪いので、それを改良すべく、新たな酵素を設計した。

【0115】

具体的には、前記酵素の糖転移反応に用いられる基質の化学的構造と反応メカニズムに基づいて、各タンパク質の三次構造が分類上ＧＴ－Ｂ ｆｏｌｄに属するものと予想された。ＧＴ－Ｂ ｆｏｌｄ構造のタンパク質は、糖受容体を認識するＮ－ｄｏｍａｉｎと、糖供与体を認識するＣ－ｄｏｍａｉｎに明確に区分される特性を有するので、各タンパク質のＮ－ｄｏｍａｉｎとＣ－ｄｏｍａｉｎを混合してｃｈｉｍｅｒａを作製する方法により全１２種の改良酵素を作製し、発現及び活性を評価した。

【0116】

その結果、野生型の酵素に比べて、微生物におけるタンパク質発現が良好であり、その活性が改善された新規な酵素である糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を次の模式図のように作製した。その配列を配列番号１に示す。

【0117】

【表2】

【0118】

実施例１－２．新規な糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の製造及び活性測定
実施例１－１で設計したレバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する新規な酵素及びＷ１、Ｗ２酵素は、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有する組換えプラスミド（ベクター－ｐＥＴ２４ａ）を作製し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローニングして酵素を大量発現させ、その後精製して用いた。

【0119】

組換え菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）培養は、ＬＢ培地５ｍｌを入れた試験管に接種し、６００ｎｍにおける吸光度が２．０になるまで３７℃の培養器にて種菌を培養した。ＬＢ培地５００ｍｌを入れたフラスコに、種菌を培養した培養液を添加し、本培養を行った。また、６００ｎｍにおける吸光度が０．４になったら、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加して酵素の大量発現をそれぞれ誘導した。上記過程において、攪拌速度１８０ｒｐｍ、培養温度３７℃が保持されるように調節し、ＩＰＴＧ添加後は、攪拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度１６℃で培養した。前述したように形質転換した菌株の培養液を６０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、細胞上清のみ酵素液として分離した。酵素の特性を正確に把握するために、Ｎｉ－ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムを用いて精製した。

【0120】

一方、１０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含有する培地（Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎ １０ｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，Ｓｏｙｔｏｎｅ ５ｇ／Ｌ）に、組換えコリネバクテリウムを初期濃度Ｏ．Ｄ．６００＝０．１で接種し、３０℃で２４時間培養して酵素の発現を誘導した。１０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含有する培地（グルコース８０ｇ／Ｌ，ｓｏｙｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １．２ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４ １．４ｇ／Ｌ）を入れた発酵槽に、前述したように得られた培養液をＯ．Ｄ．６００＝０．６で接種し、３０℃で２４時間培養した。

【0121】

酵素反応に用いる原料は、Ｒｅｂ Ａ（デピョン社）であり、水に１、５、１０、２０ｍＭになるように溶解して用いた。微生物において発現した酵素（糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ），Ｗ１，Ｗ２）を用いて、３７度で２４時間反応を行い、その後ＨＰＬＣで分析した。前記原料の水溶液には、ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ社）を２、１０、２０、４０ｍＭ投入した。酵素として精製酵素を用い、酵素濃度０．１ｍｇ／ｍｌで反応を行った。

【0122】

測定結果を表２及び表３に示す。

【0123】

【表3】

【0124】

【表4】

【0125】

表２及び表３に示すように、本出願の新規な糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）において、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤへの変換収率及びタンパク質発現量が改善されることが確認された。

【実施例2】

【0126】

レバウジオシドＡ原料に対する糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の酵素活性の測定
実施例１－２で作製した糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を用いて、レバウジオシドＡ原料に対する糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の酵素活性を測定した。

【0127】

具体的には、酵素反応に用いる原料は、Ｒｅｂ Ａ（デピョン社）であり、水に２ｍＭになるように溶解して用いた。微生物において発現した酵素（配列Ｎｏ０４）を用いて、３７度で１６時間反応を行い、その後ＨＰＬＣで分析した。前記原料の水溶液は、ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ又はＵＤＰ（Ｕｒｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を２ｍＭ含むものである。

【0128】

ＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。
・Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２１０ｎｍ
・Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ
・Ｓａｍｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．：１０μｌ
・Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ＭＧ ＩＩ（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ，２５０×４．６ｍｍ，ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ：５μｍ）
・Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ３０％
測定結果を表４及び図１に示す。

【0129】

【表5】

【0130】

表４及び図１に示すように、本出願の糖転移酵素Ｂにより、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤにほとんど（９８．６％）変換されることが確認された。

【実施例3】

【0131】

ステビオシド原料に対する糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の酵素活性の測定
糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及びスクロースシンターゼは、先行技術文献（特許文献２）の方法により精製して用いた。その配列をそれぞれ配列番号２及び配列番号３に示す。

【0132】

前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）、前記スクロースシンターゼ、及び実施例１－２で作製した糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を用いて、ステビオシド原料に対する糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の酵素活性を測定した。

【0133】

具体的には、酵素反応に用いる原料としては、２ｍＭのステビオシド（ｈａｉｇｅｎ社）、５０ｍＭの砂糖（ＣＪ第一製糖）水溶液を用いた。微生物において発現した前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）、前記スクロースシンターゼ、及び実施例１－２で作製した糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を用いて、３７度で１６時間反応を行い、その後ＨＰＬＣで分析した。前記原料の水溶液は、ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ又はＵＤＰ（Ｕｒｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を２ｍＭ含むものである。

【0134】

測定結果を表５及び図２に示す。

【0135】

【表6】

【0136】

表５及び図２に示すように、ステビオシド及びレバウジオシドＡからレバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ及びレバウジオシドＩにモル濃度で１００％変換されることが確認された。

【実施例4】

【0137】

レバウジオシドＤ原料に対する糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の酵素活性の測定
実施例３の糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）を用いて、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭへの変換率を測定した。

【0138】

具体的には、酵素反応に用いる原料としては、レバウジオシドＤ（ｈａｉｇｅｎ社）を水に１ｍＭになるように溶解して用いた。微生物において発現した前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）を用いて、３７度で１６時間反応を行い、その後ＨＰＬＣで分析した。前記原料の水溶液は、ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ又はＵＤＰ（Ｕｒｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を２ｍＭ含むものである。

【0139】

測定結果を図３に示す。
図３に示すように、本出願の糖転移酵素Ａにより、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭにほとんど変換されることが確認された。

【0140】

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

2024535621000001.app

【国際調査報告】