特表 2024-535654 抗ＩＧＳＦ１抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-02

(54)【発明の名称】抗ＩＧＳＦ１抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20240925BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240925BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240925BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240925BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 E

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N1/19

C12N1/21

C12N1/15

C07K16/28

C12P21/02 C

A61K48/00

A61P35/00

A61K39/395 T

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2022574184

(86)(22)【出願日】2021-08-20

(85)【翻訳文提出日】2022-11-29

(86)【国際出願番号】 KR2021011139

(87)【国際公開番号】W WO2023022271

(87)【国際公開日】2023-02-23

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522466625

【氏名又は名称】ウェルマーカー バイオ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＷＥＬＬＭＡＲＫＥＲＢＩＯ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】キム， ソン‐ラック

(72)【発明者】

【氏名】ソン， ヘ‐ジン

(72)【発明者】

【氏名】リー， ミ‐ソ

(72)【発明者】

【氏名】キム， ハ‐ナ

(72)【発明者】

【氏名】リー， ジュン‐ヒョン

(72)【発明者】

【氏名】シン， ウォン‐ファ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4H045AA11

4H045DA75

4H045DA76

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＩＧＳＦ１に特異的に結合する新規な抗体、及びそれを有効成分として含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物に関する。特に、本発明は、ＩＧＳＦ１のＣ末端に結合する抗体を提供する。本発明による抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１に対して高い特異性及び高い結合能を示した。本発明による抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１が過剰発現している肺癌細胞スフェロイドをヒト末梢単核細胞と共培養した場合、スフェロイドへの免疫細胞の浸潤を増加させた。また、本発明による抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１が過剰発現しているヒト肺癌細胞を移植したヒト化マウスにおいて、腫瘍の増殖を阻害し、腫瘍組織におけるサイトカインの発現を増加させた。以上の結果より、抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１の発現が増加している肺癌組織への免疫細胞の浸潤及び免疫反応を増加させることにより、腫瘍の増殖を阻害し得ることが確認された。したがって、抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１が過剰発現している癌を効果的に治療するための抗癌剤として利用し得る。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩＧＳＦ１のＣ末端に特異的に結合する抗ＩＧＳＦ１抗体を有効成分として含む、抗癌剤。

【請求項2】

配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ２及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに
配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５のＬ－ＣＤＲ２及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片。

【請求項3】

前記重鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を有し、前記軽鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項２に記載のＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片。

【請求項4】

配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ２及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。

【請求項5】

配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５のＬ－ＣＤＲ２及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド。

【請求項6】

請求項４又は５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項7】

請求項６に記載のベクターが導入された形質転換細胞。

【請求項8】

ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片を作製する方法であって、
ｉ）請求項７に記載の形質転換細胞を培養するステップ；及び
ｉｉ）ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片を回収するステップを含む、方法。

【請求項9】

請求項２又は３に記載のＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片を有効成分として含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物。

【請求項10】

前記癌が、ＩＧＳＦ１が過剰発現している癌である、請求項９に記載の癌を予防又は治療するための医薬組成物。

【請求項11】

前記癌が、胃癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、骨癌、血液癌、乳癌、メラノーマ、甲状腺癌、副甲状腺癌、骨髄癌、直腸癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、膵臓癌、舌癌、皮膚癌、脳腫瘍、子宮癌、頭頚部癌、胆嚢癌、口腔癌、肛門周囲癌、結腸癌及び中枢神経系腫瘍からなる群から選択されるいずれか１つであることを特徴とする、請求項１０に記載の癌を予防又は治療するための医薬組成物。

【請求項12】

請求項２又は３に記載のＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片を対象に投与することを含む、癌を予防又は治療するための方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＩＧＳＦ１に特異的に結合する新規な抗体、及びそれを有効成分として含む癌を予防又は治療するための医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

癌に関する研究は長い間、深く行われているが、環境汚染及び食習慣の悪化により、癌の発生率は増加の一途をたどっている。世界中で毎年１億人超の癌患者が発生しており、世界保健機関（ＷＨＯ）は、癌を主要な死因の１つに位置付けている。このように、癌は現代社会において死亡率の第１位を占める主要な疾患であり、これまで多くの研究がなされてきたにもかかわらず、画期的な治療は存在しない。

【0003】

癌の治療においては、抗癌剤等の化学療法がある程度有効であるが、癌の多様な病態及び抗癌剤に対する耐性により、多くの研究が必要とされている。ここ数十年の診断及び治療技術の発達により、癌治療率は向上しているが、多くの進行癌の５年生存率は５～５０％の範囲にとどまっている。さらに、いくつかの癌では、種々の研究及び治療が行われているにもかかわらず、過去２０年間の生存率には著しい変化がない。

【0004】

このように、癌は従来の癌治療レジメンでは容易に治療されず、再発及び他部位への転移が起こるため、より本質的な治療法が必要とされている。したがって、癌の悪性化、転移、及び再発の原因と判断される癌細胞に特徴的なバイオマーカーを標的化することによって、癌治療用物質の開発に関心が高まっている。

【0005】

一方、韓国特許出願公開第２０１６－００１４５６４号には、ＩＧＳＦ１（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １）遺伝子をＭＥＴ（間葉上皮転換因子）阻害剤に対する感受性を予測するためのバイオマーカーとして使用し得ることが開示されている。上記文献には、癌患者を治療する前に、バイオマーカーを用いて各患者の感受性を判定することにより、高い治療効果を有する抗癌剤を選択し得ることが開示されている。しかし、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体を抗癌剤として利用し得ることは開示されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明者らは、高い治療効果を有する抗癌剤、特に、ＩＧＳＦ１が過剰発現している癌を効果的に治療するための治療剤を開発することを目的として研究を行った。その結果、本発明者らは、ＩＧＳＦ１のＣ末端に特異的に結合する抗体を開発し、抗体が癌を効果的に予防又は治療することを見出した。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記目的を達成するために、本発明の一態様において、ＩＧＳＦ１のＣ末端に特異的に結合する抗ＩＧＳＦ１抗体を有効成分として含む抗癌剤が提供される。

【0008】

本発明の別の態様において、配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ２及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；並びに配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５のＬ－ＣＤＲ２及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、ＩＧＳＦ１又はその断片に対して特異的な抗体が提供される。

【0009】

本発明の別の態様において、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び発現ベクターが導入された形質転換細胞が提供される。

【0010】

本発明の別の態様において、形質転換細胞を培養すること；及び抗ＩＧＳＦ１抗体又はその断片を回収することを含む、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片を作製する方法が提供される。

【0011】

本発明の別の態様において、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片を有効成分として含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。

【0012】

本発明の別の態様において、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片を対象に投与することを含む、癌を予防又は治療する方法が提供される。

【発明の効果】

【0013】

本発明による抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１に対して高い特異性及び高い結合能を示した。本発明による抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１が過剰発現している肺癌細胞スフェロイドをヒト末梢単核細胞と共培養した場合、スフェロイドへの免疫細胞の浸潤を増加させた。さらに、本発明による抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１が過剰発現しているヒト肺癌細胞を移植したヒト化マウスにおいて、腫瘍の増殖を抑制した。また、前記抗体は、腫瘍組織に存在する細胞傷害性Ｔリンパ球のサイトカイン発現を増加させた。以上の結果より、抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１発現が増加している腫瘍組織への免疫細胞の浸潤及び免疫反応を増加させることにより、腫瘍の増殖を阻害し得ることが確認された。したがって、抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１が過剰発現している癌を効果的に治療するための抗癌剤として利用し得る。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）及び対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）におけるＩＧＳＦ１の発現レベルをウェスタンブロット及びＲＴ－ＰＣＲによって確認することによって得られた結果を示す。

【図2】ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）及び対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）のスフェロイドをヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）と共培養した際にスフェロイドに存在する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を確認することにより得られた結果を示す。

【図3】ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）又は対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）を移植したマウスの腫瘍組織における腫瘍浸潤リンパ球の存在を確認するためにｈＣＤ４５＋細胞の分布度をフローサイトメトリーにより解析して得られた結果を示すグラフである。

【図4】ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）又は対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）を移植したマウスの腫瘍組織におけるＩＧＳＦ１の発現及び腫瘍浸潤リンパ球の存在を免疫組織化学染色法により確認することにより得られた結果を示す。

【図5】ＥＬＩＳＡ法を用いて、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体のＩＧＳＦ１抗原に対する結合親和性を解析することによって得られた結果を示すグラフである。

【図6】ＦＡＣＳ解析を用いて、細胞におけるＷＭ－Ａ１－３３８９抗体のＩＧＳＦ１抗原に対する結合親和性を解析して得られた結果を示すグラフである。

【図7】ＦＡＣＳ解析を用いて、ＩＧＳＦ過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）及び対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）において、細胞に発現するＩＧＳＦ１に対するＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の結合能を解析することにより得られた結果を示すグラフである。

【図8】２つのＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ及びＨＥＫ２９３Ｅ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）及び対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ及びＨＥＫ２９３Ｅ ＭＯＣＫ）においてｓｈＩＧＳＦ１で処理したＩＧＳＦ１ノックダウン（Ｋ／Ｄ）細胞株におけるＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の結合特異性を解析することにより得られた結果を示したグラフである。

【図9】ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）スフェロイドをヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）と共培養した際に、ＩｇＧ又はＷＭ－Ａ１－３３８９抗体による処理後のスフェロイドに存在する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を顕微鏡画像により確認することにより得られた結果を示す。

【図10】ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）及び対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）のスフェロイドをヒト末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）と共培養した際に、ＩｇＧ又はＷＭ－Ａ１－３３８９抗体による処理後のスフェロイドにおけるＨＭＧＢ１及びＨｓｐ９０の発現を示すグラフである。

【図11】ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）を移植したマウスモデルにおいて、ＩｇＧ又はＷＭ－Ａ１－３３８９抗体を投与した群の腫瘍サイズを測定することによって得られた結果を示すグラフである。

【図12】ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）を移植したマウスモデルにおいて、対象によるＩｇＧ又はＷＭ－Ａ１－３３８９抗体が投与されたマウス群の腫瘍サイズを示すグラフである。

【図13】白人の肺癌患者組織におけるＩＧＳＦ１の発現レベルを解析することによって得られた結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明の一態様において、ＩＧＳＦ１のＣ末端に特異的に結合する抗ＩＧＳＦ１抗体を有効成分として含む抗癌剤が提供される。

【0016】

本明細書において使用される、「ＩＧＳＦ１」という用語は、ヒト及び他の哺乳動物種のＸ染色体上に見出されるＩＧＳＦ１遺伝子によってコードされる膜タンパク質である。正常細胞におけるＩＧＳＦ１の機能はよく知られていないが、ＩＧＳＦ１変異は、ＩＧＳＦ１欠損症候群又は中枢性甲状腺機能低下症等の疾患を引き起こすことが知られている。

【0017】

本発明において、ＩＧＳＦ１は、哺乳動物のＩＧＳＦ１であれば限定されることなく含まれてもよいが、好ましくは、ヒトＩＧＳＦ１を指すことができる。さらに、本発明において、ＩＧＳＦ１タンパク質は、ネイティブＩＧＳＦ１タンパク質又はそのバリアントの全てを含むが、これに限定されるものではない。ネイティブＩＧＳＦ１タンパク質は、一般的に、ネイティブＩＧＳＦ１タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指し、ネイティブＩＧＳＦ１タンパク質のアミノ酸配列は、一般的に、天然に存在するＩＧＳＦ１に見出されるアミノ酸配列を指す。ＩＧＳＦ１についての情報は、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから得ることができ、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１６４４３３．１のアミノ酸配列又は配列番号１９のアミノ酸配列を有することができるが、これに限定されるものではない。

【0018】

本明細書において使用される、「抗ＩＧＳＦ１抗体」という用語は、ＩＧＳＦ１に結合することができる抗体を指し、本発明において「ＩＧＳＦ１に特異的な抗体」と互換的に使用することができる。特に、抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１のＣ末端に特異的に結合することができる。抗体の形態は、抗体全体及びその抗体断片の両方を含むことができる。

【0019】

本明細書において使用される、「抗癌剤」という用語は、癌の予防又は治療効果を示す任意の組成物又は医薬を含み得る。

【0020】

本発明において、ＩＧＳＦ１のＣ末端に結合する抗ＩＧＳＦ１抗体は、ＩＧＳＦ１が過剰発現している癌を効果的に死滅させることができる。この場合、癌は、胃癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、骨癌、血液癌、乳癌、メラノーマ、甲状腺癌、副甲状腺癌、骨髄癌、直腸癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、膵臓癌、舌癌、皮膚癌、脳腫瘍、子宮癌、頭頸部癌、胆嚢癌、口腔癌、肛門周囲癌、結腸癌、及び中枢神経系腫瘍からなる群から選択されるいずれか１つでもよいが、ＩＧＳＦ１が過剰発現している癌であれば、これに限定されない。

【0021】

抗ＩＧＳＦ１抗体
本発明の別の態様において、配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ２及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５のＬ－ＣＤＲ２及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むＩＧＳＦ１に対して特異的な抗体又はその断片が提供される。

【0022】

本明細書において使用される、「抗体」という用語は、特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子を指し、抗原を特異的に認識するタンパク質分子を指す。抗体としては、抗体全体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合により連結されたＦｖ（ｓｄＦｖ）、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0023】

免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖は、それぞれ定常領域及び可変領域を含み得る。

【0024】

免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの可変領域と、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。ＣＤＲは主に抗原のエピトープに結合する機能を有する。各鎖のＣＤＲは典型的には、Ｎ末端から出発して、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれ、特定のＣＤＲが存在する鎖によって特定される。本発明のＩＧＳＦ１に特異的な抗体及びその断片は、配列番号１のＨ－ＣＤＲ１、配列番号２のＨ－ＣＤＲ２及び配列番号３のＨ－ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでいてもよい。さらに、本発明のＩＧＳＦ１に特異的な抗体及びその断片は、配列番号４のＬ－ＣＤＲ１、配列番号５のＬ－ＣＤＲ２及び配列番号６のＬ－ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。この場合、重鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列を有していてもよく、軽鎖可変領域は配列番号８のアミノ酸配列を有していてもよい。本明細書において、抗体はＷＭ－Ａ１－３３８９と称することができる。

【0025】

抗体の重鎖可変領域は、配列番号７のアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいても、又はこれらからなっていてもよい。さらに、抗体の軽鎖可変領域は、配列番号８のアミノ酸配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は約１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでいても、又はこれらからなっていてもよい。

【0026】

免疫グロブリンの重鎖定常領域（ＣＨ）は、異なるアミノ酸組成及び配列を示し、したがって、異なる種類の抗原性を有する。したがって、免疫グロブリンは、５つのカテゴリーに分類されることができ、免疫グロブリンアイソタイプ、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと称することができる。対応する重鎖は、それぞれ、μ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖、及びε鎖である。さらに、ヒンジ領域のアミノ酸組成、並びに重鎖ジスルフィド結合の数及び位置によって、同じ種類のＩｇが異なるサブタイプに分類され得る。例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分類され得る。軽鎖は、異なる定常領域により、κ鎖又はλ鎖に分類されることができる。５種類のＩｇＧは、それぞれκ鎖又はλ鎖のいずれかを有し得る。

【0027】

本発明のＩＧＳＦ１に特異的な抗体が定常領域を含む場合、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、又はその部分的ハイブリッドに由来する定常領域を含むことができる。

【0028】

本明細書において使用される、「ハイブリッド」という用語は、一本鎖免疫グロブリン重鎖定常領域内に、２つ以上の異なる起源を有する免疫グロブリン重鎖定常領域に対応する配列が存在することを指す。例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる群から選択される１～４個のドメインからなるドメインをハイブリダイズすることが可能である。

【0029】

さらに、本発明のＩＧＳＦ１に特異的な抗体が軽鎖定常領域（ＬＣ）を含む場合、軽鎖定常領域はλ軽鎖又はκ軽鎖に由来するものであってもよい。

【0030】

本明細書において使用される、「抗体の断片」という用語は、抗原結合活性を有するＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、並びにＩＧＳＦ１に結合するＦｖ断片であるｓｃＦｖ断片を指し、本発明に記載の抗体のＣＤＲ領域を含む。Ｆｖ断片は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、定常領域を持たず、全ての抗原結合部位を有する最小の抗体の断片である。

【0031】

抗ＩＧＳＦ１抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明の別の態様において、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドが提供される。抗ＩＧＳＦ１抗体及びその断片は、上述した通りである。この場合、ポリヌクレオチドの重鎖領域は、配列番号９のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、軽鎖領域は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。

【0032】

ポリヌクレオチドが同一のポリペプチドをコードする場合、置換、欠失、挿入又はその組合せにより、１つ又は複数の塩基が変異していてもよい。ポリヌクレオチド配列を化学合成により調製する場合、当技術分野で周知の合成方法、例えば、文献（Ｅｎｇｅｌｓ ａｎｄ Ｕｈｌｍａｎｎ， Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ ＩｎｔＥｄ Ｅｎｇｌ． ３７：７３－１２７， １９８８）に記載の方法を用いてもよく、トリエステル法、ホスファイト法、ホスホラミダイト法及びＨ－ホスフェート法、ＰＣＲ及び他の自動プライマー法、固体支持体上のオリゴヌクレオチドの合成法等が挙げられる。

【0033】

一実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号９又は配列番号１０のヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は少なくとも約１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができる。

【0034】

ポリヌクレオチドは、シグナル配列又はリーダー配列をさらに含んでいてもよい。本明細書で使用される、「シグナル配列」という用語は、標的タンパク質の分泌を指示するシグナルペプチドをコードする核酸を指す。シグナルペプチドは、宿主細胞内で翻訳された後、切断される。詳細には、本発明のシグナル配列は、ＥＲ（小胞体）膜を介したタンパク質の輸送を開始させるアミノ酸配列をコードするヌクレオチドである。

【0035】

シグナル配列は、その特徴について当技術分野で周知である。このようなシグナル配列は、典型的には１６～３０個のアミノ酸残基を含み、このようなアミノ酸残基よりも多い又は少ないアミノ酸残基を含んでいてもよい。従来のシグナルペプチドは、３つの領域、すなわち、塩基性Ｎ末端領域、中央の疎水性領域、及びより極性の高いＣ末端領域から構成されている。中央の疎水性領域は４～１２個の疎水性残基を含み、これにより、未熟なポリペプチドが膜脂質二重層を通過する間、シグナル配列が固定化される。

【0036】

シグナル配列は、開始後、シグナルペプチダーゼとして一般的に知られている細胞内酵素によって、ＥＲの内腔で切断される。この場合、シグナル配列は、ｔＰａ（組織プラスミノーゲン活性化）の分泌シグナル配列、ＨＳＶ ｇＤｓ（単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄのシグナル配列）、ＩｇＧシグナル配列又は成長ホルモンであってもよい。好ましくは、哺乳動物等を含む高等真核細胞で使用される分泌シグナル配列を使用することができる。

【0037】

本発明において有用なシグナル配列としては、抗体１４．１８等の抗体軽鎖シグナル配列（Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９８９．１２５：１９１－２０２）、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列等の抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８０．２８６：６７６－６８３）、及び当技術分野で公知の他のシグナル配列（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８４．１２：５１４５－５１６４参照）等が挙げられる。

【0038】

ポリヌクレオチドをロードしたベクター
本発明の別の態様において、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ポリヌクレオチドの重鎖領域は、配列番号９のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、軽鎖領域は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。さらに、ポリヌクレオチドは、シグナル配列又はリーダー配列をさらに含んでいてもよい。本明細書中において、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体及びその断片、並びにシグナル配列は、上に記載する通りである。

【0039】

この場合、ベクターは、重鎖及び軽鎖のポリヌクレオチドをそれぞれ含む２つのベクターであっても、又は両ポリヌクレオチドを含むバイシストロンベクターであってもよい。

【0040】

本明細書において使用される、「ベクター」という用語は、宿主細胞内に導入され、宿主細胞のゲノムに組み替えられ、ゲノム内に挿入されるものであってもよい。或いは、ベクターは、エピソームとして自発的に複製可能なヌクレオチド配列を含む核酸手段であると理解される。ベクターとしては、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、ミニ染色体、及びそのアナログが挙げられる。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0041】

特に、ベクターとしては、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等、市販の開発されたプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ－ＡＭＰ等）、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来のプラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、ファージＤＮＡ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）、動物ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等）、昆虫ウイルスベクター（バキュロウイルス等）等が挙げられる。ベクターは、宿主細胞によって異なるタンパク質の発現レベル及び修飾等を示すため、目的に最適な宿主細胞を選択して使用することが好ましい。

【0042】

さらに、プラスミドは抗生物質耐性遺伝子等の選択マーカーを含有していてもよく、プラスミドを保持する宿主細胞を選択的な条件下で培養することができる。

【0043】

本明細書において使用される、標的タンパク質の「遺伝子発現」又は「発現」という用語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、及び融合タンパク質生成物又はその断片の分泌を意味すると理解される。有用な発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）又はそのバリアントでもよい。発現ベクターは、哺乳動物細胞における標的遺伝子の連続的な転写を促進するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、及び転写後のＲＮＡの安定性レベルを高めるためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を含むことができる。

【0044】

抗ＩＧＳＦ１抗体を発現する形質転換細胞
本発明の別の態様において、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターが導入された形質転換細胞が提供される。ＩＧＳＦ１に特異的な抗体及びその断片は、上に記載する通りである。

【0045】

本明細書において使用される、「形質転換細胞」という用語は、組換え発現ベクターが導入され得る原核細胞及び真核細胞を指す。形質転換細胞は、宿主細胞にベクターを導入し、これを形質転換することにより構築することができる。また、ベクターに含まれるポリヌクレオチドを発現させることにより、本発明の融合タンパク質を作製することができる。

【0046】

形質転換は、種々の方法によって行うことができる。本発明の融合タンパク質を作製し得る限り、特に限定されるものではない。特に、形質転換法、例えば、ＣａＣｌ_２沈殿法、ＣａＣｌ_２沈殿法においてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の還元剤を用いることにより効率が増強したＨａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、プロトプラスト融合法、炭化ケイ素繊維を使用した撹拌法、アグロバクテリウム媒介形質転換法、ＰＥＧ、デキストラン硫酸、リポフェクトアミンを使用した形質転換法、及び乾燥／阻害媒介型形質転換方法等を使用することができる。さらに、感染を手段として使用することにより、ウイルス粒子を用いて細胞に標的目的物を送達することができる。さらに、遺伝子ボンバードメント等によってベクターを宿主細胞内に導入することができる。

【0047】

さらに、形質転換細胞の構築に用いる宿主細胞はまた、本発明の融合タンパク質を作製することができるものであれば、特に限定されない。特に、宿主細胞としては、原核細胞、真核細胞、及び哺乳動物、植物、昆虫、真菌、又は細菌由来の細胞が挙げられるが、これに限定されるものではない。原核細胞の例としては、大腸菌を用いることができる。また、真核細胞の例としては、酵母を用いることができる。さらに、哺乳動物細胞としては、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＳＰ２／０細胞、ヒトリンパ芽球、ＮＳＯ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＰＥＲＣ．６細胞、ＨＥＫ２９３細胞、又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞等を使用できるが、これに限定されるものではない。通常の当業者に哺乳動物宿主細胞として使用可能であることが知られている任意の細胞を使用することができる。

【0048】

上記のように、抗ＩＧＳＦ１抗体及びその断片の治療剤としての、又は他の任意の目的のための特性の最適化のために、宿主細胞が有するグリコシル化関連遺伝子を通常の当業者に公知の方法で操作することによって、融合タンパク質のグリコシル化パターン（例えば、シアル酸、フコシル化、グリコシル化）を調整することができる。

【0049】

抗ＩＧＳＦ１抗体の作製方法
本発明の別の態様において、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片を作製する方法が提供される。この場合、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体及びその断片は、上に記載する通りである。

【0050】

融合タンパク質の作製方法は、ｉ）形質転換細胞を培養すること；及びｉｉ）本発明の抗ＩＧＳＦ１抗体又はその断片を回収することを含んでいてもよい。

【0051】

本明細書において使用される、「培養」という用語は、適切に人工的に制御された環境条件下で微生物を増殖させる方法を指す。

【0052】

形質転換細胞を培養する方法は、当技術分野において周知の方法を用いて実施することができる。特に、培養物は、本発明の融合タンパク質を発現させることにより作製され得るものである限り、特に限定されない。詳細には、培養は、バッチプロセスで行っても、又は連続的に供給バッチプロセス又は反復供給バッチプロセスで行ってもよい。

【0053】

さらに、培養物からの融合タンパク質二量体の回収は、当技術分野で公知の方法によって行うことができる。詳細には、回収方法は、作製された本発明の融合タンパク質を回収し得る限り、特に限定されるものではない。好ましくは、回収方法は、遠心分離、濾過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、及びサイズ排除）等の方法であってもよい。

【0054】

抗ＩＧＳＦ１抗体の使用
本発明の別の態様において、ＩＧＳＦ１抗体又はその断片を有効成分として含む、癌を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。

【0055】

この場合、癌は、ＩＧＳＦ１が過剰発現している癌でもよい。さらに、癌は、胃癌、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、骨癌、血液癌、乳癌、メラノーマ、甲状腺癌、副甲状腺癌、骨髄癌、直腸癌、咽頭癌、喉頭癌、食道癌、膵臓癌、舌癌、皮膚癌、脳腫瘍、子宮癌、頭頸部癌、胆嚢癌、口腔癌、肛門周囲癌、結腸癌、及び中枢神経系腫瘍からなる群から選択されるいずれか１つでもよい。

【0056】

「予防」という用語は、医薬組成物の投与により、癌の発生を阻害する、又は癌の発症を遅延させる任意の作用を指す。「治療」という用語は、医薬組成物の投与により、癌の症状を改善又は有益に変化させる任意の作用を指す。

【0057】

本発明の癌の予防又は治療のための医薬組成物において、抗ＩＧＳＦ１抗体又はその断片は、抗癌活性を示し得る限り、用途、剤型、及び配合目的等に応じて任意の量（有効量）で含まれていてもよい。本明細書において、「有効量」は、抗癌効果を誘導することができる有効成分の量を指す。このような有効量は、通常の当業者の通常の能力の範囲内で実験的に決定することができる。本発明の医薬組成物は、組成物の総重量を基準にして、約０．１重量％～約９０重量％、特に約０．５重量％～約７５重量％、より詳細には約１重量％～約５０重量％の量の抗体を有効成分として含んでいてもよい。

【0058】

本発明の医薬組成物は、従来の方法にしたがって製剤に配合される、従来の非毒性の薬学的に許容できる担体を含んでいてもよい。

【0059】

薬学的に許容できる担体は、患者への送達に適した任意の非毒性物質でもよい。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性固体が担体として含まれ得る。さらに、薬学的に許容できる補助剤（緩衝剤、分散剤）が、医薬組成物に含まれてもよい。

【0060】

本明細書において使用される、「薬学的に許容できる担体」という用語は、生物体を刺激せず、投与される化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤を指す。液剤として製剤化された組成物の薬学的に許容できる担体は、無菌で生体適合性があり、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝生理食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうちの１つ又は複数の成分の混合物を用いることができ、必要に応じて、甘味料、可溶化剤、湿潤剤、乳化剤、等張化剤、吸収剤、酸化防止剤、保存剤、滑沢剤、充填剤、緩衝剤、静菌剤等の他の従来の添加剤を添加することができる。

【0061】

本発明の組成物は、非経口投与（例えば、筋肉内注射、静脈内注射、又は皮下注射）のために種々の製剤で調製することができる。本発明の医薬組成物を非経口製剤として調製する場合、当技術分野で公知の方法にしたがって、適当な担体とともに注射剤、経皮製剤、経鼻吸入剤及び坐剤の形態で製剤化することができる。注射用製剤としては、滅菌水性液剤、非水性液剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び坐剤が挙げられる。非水性溶媒及び懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、オレイン酸エチル等の注射用エステルが挙げられる。坐剤の基剤としては、ウィテプソール（Ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール（Ｍａｃｒｏｇｏｌ）、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）６１、カカオバター、ラウリン、及びグリセロゼラチン等を用いることができる。一方、注射剤とは、可溶化剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、及び保存剤などの従来の添加剤を含有していてもよい。

【0062】

医薬組成物の製剤化は当技術分野で知られており、詳細には、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）］等を参照することができる。この文献は、本明細書の一部と考えられる。

【0063】

本発明の抗体又は組成物は、治療有効量又は医薬有効量で患者に投与することができる。

【0064】

本明細書において使用される、「投与」という用語は、適切な方法によって所定の物質を対象に導入することを意味し、組成物は、標的組織に到達し得る限り、任意の一般的な経路で投与することができる。投与経路としては、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、局所投与、鼻腔内投与、及び直腸内投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0065】

本明細書において、「治療有効量」又は「医薬有効量」は、標的疾患を予防又は治療するために有効な抗体又は組成物の量を指し、医学的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに十分であり、副作用を生じさせない量を意味する。有効量のレベルは、患者の健康状態、疾患の種類及び重症度、薬剤の活性、薬剤に対する感受性、投与方法、投与時間、投与経路及び排出率、治療期間、組合せ及び同時に使用される薬剤を含む要因、医学分野で周知の他の要因に応じて決定することができる。

【0066】

詳細には、本発明の組成物における抗体の有効量は、患者の年齢、性別、及び体重によって変動し得るものであり、一般的には体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ～約１，０００ｍｇ、又は約５ｍｇ～約２００ｍｇを毎日若しくは隔日に投与しても、又は１日に１～３回に分割してもよい。ただし、投与経路、疾患の重症度、性別、体重、及び年齢等に応じて増減する場合があるため、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。

【0067】

「対象」という用語は、本発明の組成物が適用（処方）され得る対象を指し、ラット、マウス等の哺乳動物、又は家畜であってもよく、ヒトを含む。好ましくは、ヒトであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0068】

本発明の抗体又はそれを含む医薬組成物は、単独の治療剤として、若しくは他の治療剤と組み合わせて投与しても、従来の治療剤と順次又は同時に投与しても、又は１回で若しくは複数回に分けて投与してもよい。この場合、他の治療剤としては、抗癌活性を有することが知られており、抗癌活性の増強及び補強のために安全性が既に確認されている任意の化合物又は天然抽出物をさらに含んでいてもよい。

【0069】

上記の全ての要因を考慮すると、最小限の副作用で、又は副作用なしで最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは通常の当業者であれば容易に判断することが可能であろう。

【0070】

本発明の別の態様において、癌を予防又は治療するための医薬の製造のための、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片の使用が提供され、ここで、抗ＩＧＳＦ１抗体及びその断片、癌、予防及び治療は、上述と同様である。

【0071】

本発明の別の態様において、癌の予防及び治療のためのＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片の使用が提供され、ここで、抗ＩＧＳＦ１抗体及びその断片、癌、予防及び治療は、上述と同様である。

【0072】

本発明の別の態様において、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片を対象に投与することを含む、癌を予防及び治療するための方法が提供され、ここで、抗ＩＧＳＦ１抗体及びその断片、癌、投与、治療及び予防は上述と同様である。

【0073】

対象は、哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトである。さらに、対象は、癌患者又は癌に罹患する可能性が高い対象であってもよい。

【0074】

ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片の投与経路、投与量、投与頻度は、患者の状態及び副作用の有無によって異なり得るため、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片は、種々の方法及び量で対象に投与することができる。最適な投与方法、投与量、及び投与頻度は、通常の当業者であれば適切な範囲で選択することができる。さらに、ＩＧＳＦ１に特異的な抗体又はその断片は、癌に関して治療効果が知られている他の薬剤又は生理活性物質と組み合わせて投与しても、又は他の薬剤との組合せ製剤の形態で製剤化してもよい。

【実施例】

【0075】

以下、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、以下の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

【0076】

実施例１．抗ＩＧＳＦ１抗体の構築
実施例１．ＩＧＳＦ１抗原の発現及び精製
ＩＧＳＦ１の細胞外ドメインのみをＪｕｒｋａｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法により増幅し、Ｎ２９３Ｆベクター（ＹＢｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｃｏ．Ｌｔｄ）を用いてカルボキシ末端（Ｃ末端）においてヒトＦｃ（断片結晶化可能領域）及びＨｉｓタグを融合し、ＩＧＳＦ１タンパク質発現用ベクターを構築した。構築したＩＧＳＦ１発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした後、１ｍＭバルプロ酸（ｖａｌｐｏｒｉｃａｃｉｄ）（バルプロエート）を添加した培地中で６日間培養した。その後、ＩＧＳＦ１細胞外ドメインを、プロテインＡアガロースを用いた一次精製に供し、次いで、ＩＧＳＦ１細胞外ドメインをスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた二次精製に供した後、抗体スクリーニングに使用した。

【0077】

実施例１．２．ＩＧＳＦ１ヒト抗体のスクリーニング
ＩＧＳＦ１抗原のコーティング及びブロッキングの後、調製したヒト抗体ライブラリーファージ（ＹＢｉｏｌｏｇｉｃｓ ＣＯ．，Ｌｔｄ．）を用いてバイオパニング（ＹＢｉｏｌｏｇｉｃｓ ＣＯ．，Ｌｔｄ．）を行い、抗原に特異的に結合したファージのみを溶出させた。２回目、及び３回目のバイオパニングは、１回目のバイオパニングで増幅させたファージを用いて行った。各回のバイオパニングにより得られた陽性ファージ抗体プールについて、ＥＬＩＳＡを行い、抗原についての特異性を確認した。また、３回目で得られたファージプールには、抗ＩＧＳＦ１抗体が濃縮されていることが確認された。各ポリファージＥＬＩＳＡにおいて、３回目のパニングから、結合能の高いモノクローンを数百種類選択し、それらを用いてＥＬＩＳＡ解析によりＩＧＳＦ１に特異的に結合するかどうかを確認し、それによって予備抗体クローンを得た。スクリーニング（ｓｃｒｅｅｎｄｉｎｇ）予備抗体クローンを、ＤＮＡヌクレオチド配列決定に供し、ヌクレオチド配列の異なる９９種類のファージを選択した。選択された９９の陽性ファージクローンが、抗原ＩＧＳＦ１に強く結合するが、他の抗原には結合しないことが確認された。上記の方法により、ＩＧＳＦ１抗原に特異性を示す抗体を、他の様々な抗原を用いてスクリーニングした結果、合計９５種類を選択することができた。

【0078】

実施例１．３．ＩＧＳＦ１抗原に対する特異性の確認
選択した抗体について、ＥＬＩＳＡ法により、ＩＧＳＦ１を含む他の抗原に対する特異性について比較及び解析を行った。ファージクローンが、対照抗原であるｍＦｃ、ｈＲＡＧＥ－Ｆｃ、ＣＤ５８－Ｆｃ、及びＩＴＧＡ６－Ｆｃ等の様々な種類の不特定抗原に結合するかどうかが確認された。こうして得られた抗体をファージからＩｇＧホールベクターに変換し、変換された９５クローンの重鎖配列及び軽鎖配列がファージ抗体の配列と一致することが確認された。得られた抗体のうち、最も最適化された抗体が選択され、これを「ＷＭ－Ａ１－３３８９」と称した。ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体のＣＤＲ配列を下記表１に示す。

【表1】

【0079】

実施例１．４．ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の作製
ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体を作製するために、重鎖（配列番号２１）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２３）をＮ２９３Ｆベクター（ＹＢｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｃｏ， Ｌｔｄ．）にロードした（以下「ＨＣ ＤＮＡ」と称する）。さらに、軽鎖（配列番号２２）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２４）をＮ２９３Ｆベクター（ＹＢｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）にロードした（以下、ＬＣ ＤＮＡと称する）。ベクターを細胞に形質転換した後、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体を取得及び精製した。精製されたタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより同定した。

【表2】

【0080】

実施例２．ＩＧＳＦ１発現と腫瘍浸潤リンパ球の関係の解析
実施例２．１．ＩＧＳＦ１過剰発現細胞株の構築
ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ２９２又はヒト胚性腎細胞株ＨＥＫ２９３Ｅ細胞でＩＧＳＦ１を過剰発現させ、ＩＧＳＦ１が過剰発現している細胞株を構築した（図１）。この場合、ＭＯＣＫは、ＩＧＳＦ１を発現させない対照である。

【0081】

詳細には、ＩＧＳＦ１をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター（ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．，カタログ番号ＲＣ２０９６２１）を、ヒト肺癌細胞株ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞又はヒト胚性腎細胞株ＨＥＫ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした。その後、Ｇ４１８（ネオマイシン）を含む培地で培養することにより、トランスフェクトされた細胞を選択した。選択したクローンについてＩＧＳＦ１の発現レベルを確認し、最も高いＩＧＳＦ１発現を示すクローンを選択し、実験に使用した。ＭＯＣＫは、ＩＧＳＦ１をコードするポリヌクレオチドがロードされていない空のベクターを指す。

【0082】

実施例２．２．肺癌細胞株スフェロイドにおけるＩＧＳＦ１発現と腫瘍浸潤リンパ球の関係の解析
肺癌におけるＩＧＳＦ１発現と腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の相関関係を細胞レベルで確認するために、ＩＧＳＦ１を過剰発現させた肺癌細胞を用いてスフェロイドにおいて腫瘍浸潤リンパ球を特定した。

【0083】

最初に、肺癌細胞スフェロイドを構築するために、ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ細胞とＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ細胞をそれぞれ２×１０^４細胞／ウェルでＵ字底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、１７４９２５）に播種し、３７℃の炭酸ガスインキュベータ内で７２時間培養した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、１，２００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により上清を除去し、ＰＢＳに再懸濁することにより調製した。１８μｌのＤＭＳＯにＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセイン スクシンイミジルエステル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５５４）を５ｍＭの濃度になるように添加し、ＰＢＳで１ｍＭに希釈した。調製した末梢血単核細胞１×１０^６細胞／ｍｌあたり１ｍＭ ＣＦＳＥ溶液を１μｌ添加し、３７℃の炭酸ガスインキュベータで１０分間染色した。次いで、染色した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む溶液に、ＰＢＳの５倍量のＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有培地を添加した。その後、炭酸ガスインキュベータにて３７℃で、５分間反応を行った。１，２００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離により上清を除去した後、染色した末梢血単核細胞を培地に再懸濁し、実験に用いる末梢血単核細胞を調製した。

【0084】

その後、形成されたスフェロイドを超低接着９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＣＬＳ３４７４）に２ウェルずつ移した後、ＣＦＳＥで染色した末梢血単核細胞を１×１０^５細胞／ウェルに播種し、３７℃の炭酸ガスインキュベータ内で２４時間共培養を行った。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を蛍光顕微鏡で観察した。この場合、ＩＧＳＦ１過剰発現細胞の対照として、ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ細胞を用いた。

【0085】

結果として、ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）スフェロイドでは、対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）と比較して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が減少することが確認された（図２）。

【0086】

実施例２．３．肺癌細胞株を移植したヒト化マウスの腫瘍組織におけるＩＧＳＦ１発現と腫瘍浸潤リンパ球の関係の解析
肺癌におけるＩＧＳＦ１の発現と腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）との相関関係をｉｎ ｖｉｖｏレベルで確認するために、ＩＧＳＦ１が過剰発現しているヒト肺癌細胞を移植したヒト化マウスの腫瘍組織において腫瘍浸潤リンパ球を特定した。

【0087】

詳細には、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植したＮＳＧマウス（ＳＩＤ（ＮＳＧＡ）マウス、Ｆ）に、ＩＧＳＦ１を過剰発現させたヒト肺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ細胞、又は対照であるＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ細胞を１匹あたり５×１０^６個移植し、その後、１７日目にマウスから腫瘍切片を採取した。

【0088】

採取した各腫瘍からヒト末梢血単核細胞分離し、ＦＡＣＳによって解析し、腫瘍組織の免疫組織化学染色により腫瘍組織における腫瘍浸潤リンパ球及びＩＧＳＦ１の発現レベルを確認した。腫瘍に浸潤しているヒト末梢血単核細胞を確認するために、最初に、腫瘍組織をコラゲナーゼＢ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１０８８８１５００１）で処理し、３７℃で２時間以上反応させ、腫瘍組織を解離させた。腫瘍組織が完全に細胞に解離すると、ｌｍｌピペットを用いてピペッティングすることによって、単一細胞に分離させた。

【0089】

分離させた単一細胞を５０ｍｌチューブ（ＳＰＬ、カタログ番号５００５０）に移し、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。その後、１，２００ｒｐｍで３分間遠心分離することによって上清を除去した。残った細胞をＤＮａｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１２８４９３２００１）と３７℃で２０分間反応させた。その後、２０ｍｌのＰＢＳを添加し、１，２００ｒｐｍ、３分間の遠心分離により上清を除去した。残った細胞は０．２５％ トリプシン（Ｔｒｙｓｉｎ）／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号１５４００－０５４）で処理した。細胞をよく混合した後、新しい５０ｍｌチューブにセルストレーナー（ＳＰＬ、カタログ番号９３０７０）を置き、細胞を濾過した。濾過した細胞を含むチューブに２０ｍｌのＰＢＳを添加し、よく混合した。その後、１，２００ｒｐｍ、３分間の遠心分離により上清を除去し、残った細胞にステイン緩衝剤（Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ）（ＢＤ、カタログ番号５５４６５６）１ｍｌを添加し、洗浄した。

【0090】

分離させた細胞の非特異的抗体反応をブロックするため、２μｇのｈｕｍａｎ Ｆｃ ｂｌｏｃｋ（ＢＤ、カタログ番号５６４２１９）を添加し、室温で１０分間反応させた。反応後、抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ、カタログ番号５６４３５７）抗体を添加し、遮光しながら４℃で３０分間反応させた。反応後、ステイン緩衝剤１ｍｌを添加し、洗浄した。その後、１，２００ｒｐｍ、３分間の遠心分離により上清を除去し、細胞を回収した後、２００μｌのステイン緩衝剤を添加し、ＢＤ ＬＳＲフォルテッサ（Ｆｏｒｔｅｓｓａ）（商標）フローサイトメーターで解析した（図３）。

【0091】

また、免疫組織化学染色法により、腫瘍内に発現する腫瘍リンパ球の分布及びＩＧＳＦ１の発現を確認した。詳細には、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を移植したＮＳＧマウス（ＳＩＤ（ＮＳＧＡ）マウス、Ｆ）に、ヒト肺癌細胞株であるＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ細胞、又はＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ細胞を１匹あたり５×１０^６個で移植した。その後、１７日目に、マウスから採取した腫瘍組織の切片を脱パラフィンし、再水和した。

【0092】

その後、標的修復緩衝剤に浸漬し、熱誘導性エピトープ修復のためにマイクロ波で１５分間加熱した。その後、標的修復緩衝剤中に３０分間置いた後、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水－０．０５％ トゥイーン２０（ＴＢＳ－Ｔ）で３回洗浄し、ブロッキング液で６０分間ブロッキングした。一次抗体は抗ＩＧＳＦ１抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ－３９３７８６）であり、１：１００に希釈し、４℃で一晩結合させた。翌日、ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、内因性ペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｃｅｌｌ Ｍａｒｑｕｅ、９２５Ｂ）と室温で５分間反応させた後、二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ、ＰＫ－６１０１ ＰＫ－６１０２）を室温で６０分間結合させた。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、アビジン－ビオチンと６０分間反応させた。最後にＤＡＢ染色（Ｖｅｃｔｏｒ、ＳＫ－４１００）を行った後、脱水処理を経て組織染色を終了し、染色された組織切片を顕微鏡で観察した。

【0093】

結果として、ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）を移植したヒト化マウスの腫瘍組織において、ヒト免疫細胞であるｈＣＤ４５＋細胞が対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）と比較して減少していることが確認された（図４）。

【0094】

実施例３．抗ＩＧＳＦ１抗体の結合親和性の解析
実施例３．１．抗ＩＧＳＦ１抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける結合親和性の解析
ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体のＩＧＳＦ１抗原に対する結合親和性を、ＥＬＩＳＡ解析を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。

【0095】

詳細には、１００ｎｇのＩＧＳＦ１で処理して９６ウェルプレートをコートした後、２００μｌの４％スキムミルク（ＰＢＳＴ）を添加し、室温で１時間ブロッキングした。ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体を４％スキムミルク（ＰＢＳＴ）で１２の濃度に１／３に連続希釈し、処理した後、室温で２時間反応させた。反応終了後、ウェルをＰＢＳＴで洗浄し、ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＨＲＰ抗体で処理し、室温で１時間反応させた。その後、ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質を添加して発色の程度を確認した後、４５０ｎｍで吸光度を測定し、結果を比較及び解析した。

【0096】

結果として、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体は、Ｋｄ値が約２．２×１０^－１１であり、これにより、ＩＧＳＦ１抗原に対して高い結合親和性を有することが示された（図５）。

【0097】

実施例３．２．細胞内における抗ＩＧＳＦ１抗体のＩＧＳＦ１に対する結合親和性の解析
ＩＧＳＦ１抗原に対するＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の結合親和性を細胞レベルで確認するために、ＩＧＳＦ１を過剰発現したヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）及び対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）を用いてＩＧＳＦ１に対するＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の結合能を確認した。

【0098】

詳細には、ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ細胞及びＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ細胞の培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄後、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ ２ｍｌで処理し、細胞を分離させた。分離させた細胞を２％ＦＢＳ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む８ｍｌのＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳ緩衝剤と称する）で希釈し、１，２００ｒｐｍ、１分間の遠心分離により上清を除去した。その後、ＦＡＣＳ緩衝剤に１×１０^５細胞／ｍｌになるように細胞を再懸濁した。その後、ＦＡＣＳチューブにそれぞれ１ｍｌずつ分注し、１，２００ｒｐｍ、１分間の遠心分離により上清を除去した。

【0099】

ＦＡＣＳチューブに残ったペレットをボルテックスで遊離させ、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体をＦＡＣＳ緩衝剤２００μｌあたり２０μＭから０μＭまで１／４に希釈して合計１２濃度に添加し、４℃で、３０分間反応させた。反応が終了した後、各チューブに１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝剤を添加し、１，２００ｒｐｍ、１分間の遠心分離によって上清を除去した。このプロセスを合計２回行った。ＦＡＣＳチューブ内に残ったペレットをボルテックスで遊離させ、ＦＡＣＳ緩衝剤２００μｌあたり、５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６２－８４１１）を添加し、４℃で３０分間光を遮断しながら反応させた。反応が終了した後、各チューブに１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝剤を添加し、１，２００ｒｐｍ、１分間の遠心分離により上清を除去した。このプロセスを合計２回行った。

【0100】

最後に、上清を除去した後、残ったペレットを２００μｌのＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁し、ＦＡＣＳにより解析した。ＦＡＣＳ解析については、ＢＤ ＬＳＲフォルテッサ（商標）フローサイトメーターを用いて各細胞における標識されたＦＩＴＣ蛍光値を測定し、その結果をＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析し、シグマプロットプログラムでＥＣ５０値を算出した。この場合、ＩＧＳＦ１過剰発現細胞の対照としてＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ細胞を使用した。

【0101】

結果として、対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）では、ＷＡ－Ａ１－３３８９抗体の濃度に関わらず、結合は確認されなかった。一方、ＩＧＳＦ１が過剰発現しているヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）では、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体のＥＣ５０値は約６９ｎＭであることが確認された（図６）。

【0102】

実施例４．細胞における抗ＩＧＳＦ１抗体のＩＧＳＦ１抗原に対する抗原特異性の解析
ＩＧＳＦ１抗原に対するＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の抗原特異的結合能（標的選択性）を細胞レベルで解析するために、ＩＧＳＦ１が過剰発現されたヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）を用いて細胞内で発現したＩＧＳＦ１に対するＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の結合を確認した。

【0103】

詳細には、ＩＧＳＦ１が過剰発現しているヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）及びその対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）の培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ ２ｍｌで処理し、細胞を分離させた。分離させた細胞を２％ＦＢＳ及び０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳ緩衝剤と称する）８ｍｌで希釈した後、１，２００ｒｐｍ、１分間の遠心分離により上清を除去した。その後、ＦＡＣＳ緩衝剤に１×１０^５細胞／ｍｌになるように細胞を再懸濁した。その後、ＦＡＣＳチューブに各１ｍｌを分注し、１，２００ｒｐｍ、１分間の遠心分離により上清を除去した。

【0104】

ＦＡＣＳチューブに残ったペレットをボルテックスで遊離させ、ＦＡＣＳ緩衝剤２００μｌあたり０．４μｇのヒトＩｇＧアイソタイプ抗体（Ｂｉｏ Ｘ ｃｅｌｌ、ＢＥ０２９７）又はＷＭ－Ａ１－３３８９抗体を添加し、４℃で３０分間反応させた。反応が終了した後、各チューブに１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝剤を添加し、１，２００ｒｐｍ、１分間の遠心分離により上清を除去した。このプロセスを合計２回行った。ＦＡＣＳチューブ内に残った細胞ペレットをボルテックスにより遊離させ、ＦＡＣＳ緩衝剤２００μｌあたり０．４μｇのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６２－８４１１）を添加し、４℃で３０分間遮光しながら反応させた。

【0105】

反応が終了した後、各チューブに１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝剤を添加し、１，２００ｒｐｍ、１分間の遠心分離により上清を除去した。このプロセスを合計２回行った。最後に上清を除去した後、残ったペレットを２００μｌのＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁し、ＦＡＣＳによって解析した。ＦＡＣＳ解析については、ＢＤ ＬＳＲフォルテッサ（商標）フローサイトメーターを用いて各細胞における標識されたＦＩＴＣ蛍光値を測定し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて結果を解析した。この場合、ＩＧＳＦ１過剰発現細胞の対照としてＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ細胞を、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の対照としてヒトＩｇＧアイソタイプを使用した。

【0106】

結果として、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体で処理した群は、ＩｇＧアイソタイプで処理した群と比較して、対照（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ）で約２．６％、及びＩＧＳＦ１過剰発現細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）で約７８．９％の結合能を示した（図７）。

【0107】

次に、ＩＧＳＦ１が過剰発現しているＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ細胞及びＨＥＫ２９３Ｅ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ細胞に、ＩＧＳＦ１をコードするｍＲＮＡに特異的に結合するｓｈＲＮＡ（以下、ｓｈＩＧＳＦ１と称する）をトランスフェクトしてＩＧＳＦ１の発現を低下させ（以下、ＩＧＳＦ１ Ｋ／Ｄ細胞と称する）、細胞内のＩＧＳＦ１抗原に対するＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の結合能を測定した。この場合、トランスフェクション（ＩＧＳＦ１ Ｋ／Ｄ）の対照としてｓｈＩＧＳＦ１を含まないスクランブルＲＮＡ（以下、ｓｃ細胞と称する）を用い、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の対照としてヒトＩｇＧアイソタイプを使用した。ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の抗原特異性は、ｓｃ細胞での結合能に基づいて、ＩＧＳＦ１ Ｋ／Ｄ細胞における結合能と比較した。さらに、ＩＧＳＦ１過剰発現細胞の対照として、ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＭＯＣＫ細胞、ＨＥＫ２９３Ｅ ＭＯＣＫ細胞をそれぞれ使用した。

【0108】

詳細には、ＮＣＩ－Ｈ２９２（ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ、ＭＯＣＫ）及びＨＥＫ２９３Ｅ（ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ、ＭＯＣＫ）細胞株の培地を除去し、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＮＣＩ－Ｈ２９２細胞は０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ ２ｍｌ、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞は０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ２ｍｌでそれぞれ処理して、細胞を分離させた。分離させた細胞を８ｍｌの培養培地で希釈し、８００ｒｐｍ、３分間の遠心分離により上清を除去した。残った細胞をそれぞれ１×１０^５細胞／ｍｌ（ＮＣＩ－Ｈ２９２）及び０．５×１０^５細胞／ｍｌ（ＨＥＫ２９３Ｅ）の濃度に再懸濁した後、６０ｍｍ培養プレートに細胞３ｍｌを添加し、３７℃の細胞インキュベータ内で１日培養した。翌日、ｓｈＩＧＳＦ１のトランスフェクションを行った。１．５ｍｌチューブに２００μｌのｊｅｔ ＰＲＩＭＥ緩衝剤と１０ｎＭのｓｈＩＧＳＦ１を添加及び混合した後、４μｌのｊｅｔ ＰＲＩＭＥ試薬を添加して混合し、室温で１０分間反応させた。その後、前日に調製した細胞の培地を交換し、各細胞にトランスフェクション混合物を２００μｌ添加し、細胞インキュベータ内で２４時間反応させた。２４時間後、新鮮な培養培地に交換し、さらに２４時間培養した。

【0109】

トランスフェクトした細胞については、培地を除去し、上記と同様の方法でＦＡＣＳ解析を行った。

【0110】

結果として、ｓｃ細胞株では、ヒトＩｇＧアイソタイプで処理した群と比較して、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の結合が確認された。さらに、結合能に基づいてＩＧＳＦ１の発現を低下させた場合（ＩＧＳＦ１ Ｋ／Ｄ細胞）、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の結合能が共に低下することが確認された（図８）。

【0111】

実施例５．肺癌細胞スフェロイドにおける抗ＩＧＳＦ１抗体の免疫抗癌効果の解析
ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の免疫抗癌効果を細胞レベルで解析するために、肺癌細胞スフェロイド及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を共培養し、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及び免疫原性細胞の死滅を確認した。

【0112】

肺癌細胞スフェロイドと末梢血単核細胞との共培養は、実施例２．２と同様の方法で行った。

【0113】

共培養した細胞及び上清をチューブに回収し、１，２００ｒｐｍ、２分間の遠心分離によって上清を除去した。細胞ペレットを５００μｌの０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡで処理して単一細胞とした後、２％ＦＢＳと０．０５％ＮａＮ_３とを含むＰＢＳ（以下、ＦＡＣＳ緩衝剤と称する）２ｍｌで希釈し、１２００ｒｐｍ、３分間の遠心分離により上清を除去した。残った細胞ペレットを２００μｌのＦＡＣＳ緩衝剤に再懸濁した後、抗ＨＭＧＢ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、６５１４０８）、抗Ｈｓｐ９０抗体（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＡＤＩ－ＳＰＡ－８３０ＰＥ－Ｄ）を添加し、４℃で３０分間染色を行った。

【0114】

各チューブにＦＡＣＳ緩衝剤１ｍｌを添加し、１，２００ｒｐｍ、２分間の遠心分離により上清を除去した。このプロセスを合計２回繰り返した。その後、ＢＤ ＬＳＲフォルテッサ（商標）フローサイトメーターを用いて解析した。ＦＡＣＳ解析の結果は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて解析した。さらに、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を蛍光顕微鏡で観察した。この場合、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の対照として、ヒトＩｇＧアイソタイプを使用した。

【0115】

結果として、ＩＧＳＦ１過剰発現肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）スフェロイドにおいて、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体で処理した群では対照と比較して腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が増加することが確認された（図９）。さらに、ＩＧＳＦ１過剰発現肺癌細胞スフェロイドにおいて、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体で処理した群では、対照と比較して免疫原性細胞死（ＩＣＤ）も増加することが確認された（図１０）。

【0116】

実施例６．同種移植マウスモデルにおける抗ＩＧＳＦ１抗体の腫瘍増殖抑制有効性の解析
ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の抗癌有効性を動物レベルで確認するために、末梢血単核細胞ヒト化モデル（ＰＢＭＣヒト化モデル）マウスにＩＧＳＦ１を過剰発現させたヒト肺癌細胞（ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ）を移植し、その後、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の腫瘍増殖抑制有効性を評価した。

【0117】

詳細には、６週齢の雌の末梢血単核細胞ヒト化マウス（Ｇｅｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を購入し、１週間馴化した後、ＩＧＳＦ１過剰発現ヒト肺癌細胞ＮＣＩ－Ｈ２９２ ＩＧＳＦ１ Ｏ／Ｅ（５×１０^６細胞／動物）をＰＢＳ及びマトリゲルで希釈し、マウスの右背部に皮下注射（２００μｌ）した。腫瘍サイズが約１２０ｍｍ^３に達すると、ＩｇＧアイソタイプ（対照）又はＷＭ－Ａ１－３３８９抗体をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内投与した。投与は３日に１回、４週間行い、週２回、マウスの腫瘍サイズ及び体重を測定した。投与２２日目にサテライト群マウスから血液及び腫瘍を採取し、ＦＡＣＳ解析に供した。投与が終了した後、実験動物を安楽死させ、腫瘍を摘出し、体重を測定した。ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体の対照として、ヒトＩｇＧアイソタイプを使用した。

【0118】

結果として、ＷＭ－Ａ１－３３８９抗体を投与した群は、対照と比較して高い腫瘍増殖抑制有効性を示し、腫瘍阻害率（ＴＧＩ）約６４．５％を示した（図１１）。さらに、個々の対象においても、腫瘍増殖が阻害されることが確認された（図１２）。

【0119】

実施例７．白人肺癌患者組織におけるＩＧＳＦ１発現の解析
白人肺癌患者組織におけるＩＧＳＦ１の発現を、免疫組織化学染色法により確認した。

【0120】

詳細には、ヒト非小細胞肺癌患者の組織の切片を脱パラフィン及び再水和した後、標的修復緩衝剤に浸漬し、熱誘導性エピトープ修復のためにマイクロ波で１５分間加熱した。その後、さらに３０分間標的修復緩衝剤中で反応させた。その後、０．０５％トゥイーン２０を含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）で３回洗浄し、次いでブロッキング液で６０分間ブロッキングした。一次抗体は抗ＩＧＳＦ１抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ－３９３７８６）であり、１：１００に希釈し、４℃で一晩結合させた。翌日、組織切片をＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、内因性ペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｃｅｌｌ Ｍａｒｑｕｅ、９２５Ｂ）を用いて５分間反応させた。その後、二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ、ＰＫ－６１０１ ＰＫ－６１０２）を室温で６０分間結合させた。その後、ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、アビジン－ビオチンで処理し、６０分間反応させた後、ＤＡＢ染色（Ｖｅｃｔｏｒ、ＳＫ－４１００）を行った。染色された組織切片を顕微鏡で観察した（図１３）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】