特表 2024-535676 治療のための標的化ナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-02

(54)【発明の名称】治療のための標的化ナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 9/51 20060101AFI20240925BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240925BHJP

   A61K 47/32 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20240925BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240925BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20240925BHJP

【ＦＩ】

A61K9/51

A61K45/00

A61K31/7088

A61K31/713

A61K48/00

A61K47/34

A61K47/32

A61K47/36

A61K47/42

A61K47/10

A61P43/00 111

A61K45/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508578

(86)(22)【出願日】2022-09-19

(85)【翻訳文提出日】2024-04-09

(86)【国際出願番号】 US2022043938

(87)【国際公開番号】W WO2023044090

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】63/245,810

(32)【優先日】2021-09-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/299,431

(32)【優先日】2022-01-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】506147560

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ピッツバーグ－オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケーション

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＰＩＴＴＳＢＵＲＧＨ ＯＦ ＴＨＥ ＣＯＭＭＯＮＷＥＡＬＴＨ ＳＹＳＴＥＭ ＯＦ ＨＩＧＨＥＲ ＥＤＵＣＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】110002734

【氏名又は名称】弁理士法人藤本パートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】リ，ソン

(72)【発明者】

【氏名】ホアン，イシアン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，ユアン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA65

4C076AA95

4C076CC29

4C076EE06

4C076EE09

4C076EE13

4C076EE17

4C076EE23

4C076EE30

4C076EE41

4C076FF31

4C076FF68

4C084AA13

4C084AA17

4C084AA18

4C084MA02

4C084MA41

4C084NA05

4C084NA10

4C084NA13

4C084ZC021

4C084ZC022

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA05

4C086NA05

4C086NA10

4C086NA13

4C086ZC02

(57)【要約】

製剤は、カチオン性基を含む複数の両親媒性ポリマーの自己集合から形成されたナノ構造体を含む。各々のナノ構造体は、ナノ構造体への適用剤、又は更にナノ構造体に加えられた適用剤を含む。適用剤は、負電荷を有する標的化薬を含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

カチオン性基を含む複数の両親媒性ポリマーの自己集合から形成されるナノ構造体と、
前記ナノ構造体に加えられた適用剤と、を含み、
前記適用剤が、負電荷を有するＣＤ４４リガンドと親水性高分子化合物とを含む、
製剤。

【請求項2】

前記親水性高分子化合物が、負電荷を有する、請求項１に記載された製剤。

【請求項3】

前記親水性高分子化合物が、負電荷を有する分子と親水性ポリマーとの結合体を含む、請求項２に記載された製剤。

【請求項4】

前記親水性ポリマーに結合した前記負電荷を有する分子は、ＣＤ４４リガンドである、請求項３に記載された製剤。

【請求項5】

各々の前記ナノ構造体が、内側の疎水性ドメインと外側の親水性ドメインとを含む、請求項１に記載された製剤。

【請求項6】

前記ＣＤ４４リガンドは、オステオポンチン、コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はそれらの誘導体である、請求項１に記載された製剤。

【請求項7】

前記ＣＤ４４リガンドは、コンドロイチン硫酸である、請求項６に記載された製剤。

【請求項8】

前記ナノ構造体と一体化された治療用化合物をさらに含む、請求項６に記載された製剤。

【請求項9】

前記治療用化合物は、前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドと前記親水性高分子化合物とが適用される前の前記ナノ構造体に加えられた核酸を含む、請求項８に記載された製剤。

【請求項10】

前記治療用化合物が、疎水性又は親油性の治療用化合物を含む、請求項８に記載された製剤。

【請求項11】

前記治療用化合物は、小分子の治療用化合物である、請求項１０に記載された製剤。

【請求項12】

前記治療用化合物が、１ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１１に記載された製剤。

【請求項13】

前記治療用化合物は、化学療法用化合物である、請求項１２に記載された製剤。

【請求項14】

前記治療用化合物とは異なる第二の治療用化合物をさらに含み、前記第二の治療用化合物は核酸を含む、請求項１０に記載された製剤。

【請求項15】

前記治療用化合物は、小分子の治療用化合物である、請求項１４に記載された製剤。

【請求項16】

前記治療用化合物が、１ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１５に記載された製剤。

【請求項17】

前記治療用化合物は、化学療法用化合物である、請求項１６に記載された製剤。

【請求項18】

前記核酸が、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む、請求項９に記載された製剤。

【請求項19】

前記核酸は、遺伝子又はｓｉＲＮＡである、請求項１８に記載された製剤。

【請求項20】

前記核酸は、ｓｉＲＮＡである、請求項１９に記載された製剤。

【請求項21】

前記カチオン性基が、本質的にカチオン性の基又はｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基を含む、請求項１に記載された製剤。

【請求項22】

前記ｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基は、アミン基であり、前記アミン基は、非環式アミン基、環式アミン基、又は複素環式アミン基である、請求項２１に記載された製剤。

【請求項23】

前記アミン基は、メトホルミン基、モルホリン基、ピペラジン基、ピリジン基、ピロリジン基、ピペリジン、チオモルホリン、チオモルホリンオキシド、チオモルホリンジオキシド、イミダゾール、グアニジン、ビグアニジン、又はクレアチンからなる群より選択される、請求項２２に記載された製剤。

【請求項24】

前記親水性ポリマーは、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類、及びポリペプチドからなる群より選択される、請求項３に記載された製剤。

【請求項25】

前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである、請求項３に記載された製剤。

【請求項26】

前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドの前記親水性高分子化合物に対する比率は、患者の肝臓における前記ナノ構造体の取り込みが、肝臓から離れた腫瘍におけるＣＤ４４と前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドとの相互作用を可能にするのに十分な低レベルに維持されるような比率である、請求項１乃至請求項２５のいずれか一項に記載された製剤。

【請求項27】

前記複数の両親媒性ポリマーの各々が、疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つのカチオン性基を含む第一の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの親水性ポリマーを含む第二の複数のペンダント基と、を含む、請求項１乃至請求項２５のいずれか一項に記載された製剤。

【請求項28】

前記疎水性ポリマー骨格が、ペンダント脂質基をさらに含む、請求項２７に記載された製剤。

【請求項29】

前記疎水性ポリマー骨格は、フリーラジカル重合を介して形成された、請求項２７に記載された製剤。

【請求項30】

前記疎水性ポリマー骨格は、可逆的不活性化ラジカル重合を介して形成された、請求項２９に記載された製剤。

【請求項31】

水性媒体においてカチオン性基を含む複数の両親媒性ポリマーの自己集合を介してナノ構造体を形成することと、
負電荷を有するＣＤ４４リガンド及び親水性高分子化合物を前記ナノ構造体に加えることと、を含む、
組成物の製剤化方法。

【請求項32】

前記親水性高分子化合物が、負電荷を有する、請求項３１に記載された方法。

【請求項33】

前記親水性高分子化合物が、負電荷を有する分子と親水性ポリマーとの結合体を含む、請求項３２に記載された方法。

【請求項34】

前記親水性ポリマーに結合した負電荷を有する分子は、ＣＤ４４リガンドである、請求項３３に記載された方法。

【請求項35】

各々の前記ナノ構造体が、内側の疎水性ドメインと外側の親水性ドメインとを含む、請求項３１に記載された方法。

【請求項36】

前記ＣＤ４４リガンドは、オステオポンチン、コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はそれらの誘導体である、請求項３１に記載された方法。

【請求項37】

前記ＣＤ４４リガンドは、コンドロイチン硫酸である、請求項３６に記載された方法。

【請求項38】

治療用化合物と前記ナノ構造体とを一体化させることをさらに含む、請求項３６に記載された方法。

【請求項39】

前記治療用化合物は、前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドと前記親水性高分子化合物とが加えられる前に前記ナノ構造体へと加えられた核酸を含む、請求項３８に記載された方法。

【請求項40】

前記治療用化合物は、前記複数の両親媒性ポリマーと混合された疎水性又は親油性の化合物である、請求項３８に記載された方法。

【請求項41】

前記治療用化合物は、小分子の治療用化合物である、請求項４０に記載された方法。

【請求項42】

前記治療用化合物が、１ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項４１に記載された方法。

【請求項43】

前記治療化合物は、化学療法用化合物である、請求項４２に記載された方法。

【請求項44】

前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドと前記親水性高分子化合物とを加える前に、核酸を含む第二の治療用化合物を前記ナノ構造体へと加えることをさらに含む、請求項４０に記載された方法。

【請求項45】

前記治療用化合物は、小分子の治療用化合物である、請求項４４に記載された方法。

【請求項46】

前記治療用化合物が、１ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項４５に記載された方法。

【請求項47】

前記治療用化合物は、化学療法用化合物である、請求項４６に記載された方法。

【請求項48】

前記核酸が、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む、請求項３９に記載された方法。

【請求項49】

前記核酸は、遺伝子又はｓｉＲＮＡである、請求項４８に記載された方法。

【請求項50】

前記核酸は、ｓｉＲＮＡである、請求項４８に記載された方法。

【請求項51】

前記カチオン性基が、本質的にカチオン性の基又はｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基を含む、請求項３１に記載された方法。

【請求項52】

前記ｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基は、アミン基であり、前記アミン基は、非環式アミン基、環式アミン基、又は複素環式アミン基である、請求項５１に記載された方法。

【請求項53】

前記アミン基は、メトホルミン基、モルホリン基、ピペラジン基、ピリジン基、ピロリジン基、ピペリジン、チオモルホリン、チオモルホリンオキシド、チオモルホリンジオキシド、イミダゾール、グアニジン、ビグアニジン、又はクレアチンからなる群より選択される、請求項５２に記載された方法。

【請求項54】

前記親水性ポリマーは、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類、及びポリペプチドからなる群より選択される、請求項３３に記載された方法。

【請求項55】

前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである、請求項３３に記載された方法。

【請求項56】

前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドの前記親水性高分子化合物に対する比率は、患者の肝臓における前記ナノ構造体の取り込みが、肝臓から離れた腫瘍におけるＣＤ４４と前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドとの相互作用を可能にするのに十分な低レベルに維持されるような比率である、請求項３１乃至請求項５５のいずれか一項に記載された方法。

【請求項57】

前記複数の両親媒性ポリマーの各々が、疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの前記カチオン性基を含む第一の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの親水性ポリマーを含む第二の複数のペンダント基と、を含む、請求項３１乃至請求項５５のいずれか一項に記載された方法。

【請求項58】

前記疎水性ポリマー骨格が、ペンダント脂質基をさらに含む、請求項５７に記載された方法。

【請求項59】

前記疎水性ポリマー骨格は、フリーラジカル重合を介して形成された、請求項５７に記載された方法。

【請求項60】

前記疎水性ポリマー骨格は、可逆的不活性化ラジカル重合を介して形成された、請求項５９に記載された方法。

【請求項61】

治療用化合物を患者へと送達する方法であって、
カチオン性基を含む複数の両親媒性ポリマーの自己集合から形成されたナノ構造体を含む製剤を投与することを含み、
前記ナノ構造体が、適用剤を含み、
前記適用剤が、負電荷を有するＣＤ４４リガンドと親水性ポリマーとを含み、
前記第一の治療用化合物は、前記製剤と一体化される、方法。

【請求項62】

前記親水性高分子化合物が、負電荷を有する、請求項６１に記載された方法。

【請求項63】

前記親水性高分子化合物が、負電荷を有する分子と親水性ポリマーとの結合体を含む、請求項６２に記載された方法。

【請求項64】

前記親水性ポリマーに結合した前記負電荷を有する分子は、ＣＤ４４リガンドである、請求項６３に記載された方法。

【請求項65】

各々の前記ナノ構造体は、内側の疎水性ドメインと外側の親水性ドメインとを含む、請求項６１に記載された方法。

【請求項66】

前記ＣＤ４４リガンドは、オステオポンチン、コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はそれらの誘導体である、請求項６１に記載された方法。

【請求項67】

前記ＣＤ４４リガンドは、コンドロイチン硫酸である、請求項６１に記載された方法。

【請求項68】

前記治療用化合物は、前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドと前記親水性高分子化合物とが適用される前に前記ナノ構造体へと加えられた核酸を含む、請求項６６に記載された方法。

【請求項69】

前記治療用化合物が、疎水性又は親油性の治療用化合物を含む、請求項６１に記載された方法。

【請求項70】

前記治療化合物は、小分子の治療化合物である、請求項６９に記載された方法。

【請求項71】

前記治療用化合物が、１ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項７０に記載された方法。

【請求項72】

前記治療用化合物は、化学療法用化合物である、請求項７１に記載された方法。

【請求項73】

前記製剤は、前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドと前記親水性高分子化合物とが加えられる前に前記ナノ構造体に加えられた核酸を含む第二の治療化合物をさらに含む、請求項６９に記載された方法。

【請求項74】

前記治療用化合物は、小分子の治療用化合物である、請求項７３に記載された方法。

【請求項75】

前記治療用化合物が、１ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項７４に記載された方法。

【請求項76】

前記治療化合物は、化学療法用化合物である、請求項７５に記載された方法。

【請求項77】

前記核酸が、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む、請求項６８に記載された方法。

【請求項78】

前記核酸は、遺伝子又はｓｉＲＮＡである、請求項７７に記載された方法。

【請求項79】

前記核酸は、ｓｉＲＮＡである、請求項７７に記載された方法。

【請求項80】

カチオン性基を含む複数の両親媒性ポリマーの自己集合から形成されるナノ構造体と、
前記ナノ構造体に加えられた適用剤と、を含み、
前記適用剤が、患者の体内の対象領域を標的とする負電荷を有する標的化剤を含む、
製剤。

【請求項81】

前記負電荷を有する標的化剤は、細胞受容体に対するリガンド、ペプチド、アプタマー、多糖類及び抗体からなる群より選択される、請求項８０に記載された製剤。

【請求項82】

前記負電荷を有する標的化剤は、細胞受容体に対するリガンドである、請求項８０に記載された製剤。

【請求項83】

前記適用剤が、親水性高分子化合物をさらに含む、請求項８０に記載された製剤。

【請求項84】

前記親水性高分子化合物が、負電荷を有する、請求項８３に記載された製剤。

【請求項85】

前記親水性高分子化合物が、負電荷を有する分子と親水性ポリマーとの結合体を含む、請求項８４に記載された製剤。

【請求項86】

前記親水性ポリマーに結合した負電荷を有する分子は、前記標的化剤と同じ化合物である、請求項８５に記載された製剤。

【請求項87】

前記ナノ構造体が、内側の疎水性ドメインと外側の親水性ドメインとを含む、請求項８０に記載された製剤。

【請求項88】

前記ナノ構造体と一体化された治療用化合物をさらに含む、請求項８０に記載された製剤。

【請求項89】

前記治療用化合物が、核酸を含む、請求項８８に記載された製剤。

【請求項90】

前記治療用化合物が、疎水性又は親油性の治療用化合物を含む、請求項８８に記載された製剤。

【請求項91】

前記治療用化合物は、小分子の治療用化合物である、請求項９０に記載された製剤。

【請求項92】

前記治療用化合物が、１ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項９１に記載された製剤。

【請求項93】

前記治療用化合物は、化学療法用化合物である、請求項９２に記載された製剤。

【請求項94】

前記治療用化合物とは異なる第二の治療用化合物をさらに含み、前記第二の治療用化合物が、核酸を含む、請求項９０に記載された製剤。

【請求項95】

前記治療用化合物は、小分子の治療用化合物である、請求項９４に記載された製剤。

【請求項96】

前記治療用化合物が、１ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項９５に記載された製剤。

【請求項97】

前記治療化合物は、化学療法用化合物である、請求項９６に記載された製剤。

【請求項98】

前記核酸が、ＲＮＡ又はＤＮＡを含む、請求項８９に記載された製剤。

【請求項99】

前記核酸は、遺伝子又はｓｉＲＮＡである、請求項９８に記載された製剤。

【請求項100】

前記核酸は、ｓｉＲＮＡである、請求項９９に記載された製剤。

【請求項101】

前記カチオン性基が、本質的にカチオン性の基又はｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基を含む、請求項８０に記載された製剤。

【請求項102】

前記ｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基は、アミン基であり、前記アミン基は、非環式アミン基、環式アミン基、又は複素環式アミン基である、請求項１０１に記載された製剤。

【請求項103】

前記アミン基は、メトホルミン基、モルホリン基、ピペラジン基、ピリジン基、ピロリジン基、ピペリジン、チオモルホリン、チオモルホリンオキシド、チオモルホリンジオキシド、イミダゾール、グアニジン、ビグアニジン、又はクレアチンからなる群より選択される、請求項１０２に記載された製剤。

【請求項104】

前記親水性ポリマーは、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類、及びポリペプチドからなる群より選択される、請求項８５に記載された製剤。

【請求項105】

前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである、請求項８５に記載された製剤。

【請求項106】

前記ナノ構造体に加えられる前記親水性高分子化合物に対する負電荷を有する標的化剤の比率は、前記対象領域以外の一つ以上の領域における前記ナノ構造体の取り込みが、前記対象領域における前記負電荷を有する標的化剤の相互作用を可能にするために十分な低レベルに維持されるような比率である、請求項８３乃至請求項８６のいずれか一項に記載された製剤。

【請求項107】

前記複数の両親媒性ポリマーの各々が、疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの前記カチオン性基を含む第一の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの親水性ポリマーを含む第二の複数のペンダント基と、を含む、請求項８０乃至請求項１０５のいずれか一項に記載された製剤。

【請求項108】

前記疎水性ポリマー骨格が、ペンダント脂質基をさらに含む、請求項１０７に記載された製剤。

【請求項109】

前記疎水性ポリマー骨格は、フリーラジカル重合を介して形成された、請求項１０７に記載された製剤。

【請求項110】

前記疎水性ポリマー骨格は、可逆的不活性化ラジカル重合を介して形成された、請求項１０９に記載された製剤。

【請求項111】

前記標的化剤は、ＣＤ４４リガンドである、請求項８０乃至請求項１０５に記載された製剤。

【請求項112】

前記第二の複数のペンダント基の前記親水性ポリマーは、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類、及びポリペプチドからなる群より選択される、請求項１０７に記載された製剤。

【請求項113】

前記第二の複数のペンダント基の前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである、請求項１０７に記載された製剤。

【請求項114】

前記ナノ構造体へと加えられる前記親水性高分子化合物に対する前記負電荷を有する標的化剤の比率は、前記対象領域以外の一つ以上の領域における前記ナノ構造体の取り込みが、前記対象領域における前記負電荷を有する標的化剤の相互作用を可能にするために十分な低レベルに維持されるような比率である、請求項１０７に記載された製剤。

【請求項115】

前記標的化剤は、ＣＤ４４リガンドである、請求項１１４に記載された製剤。

【請求項116】

水性媒体においてカチオン性基を含む複数の両親媒性ポリマーの自己集合を介してナノ構造体を形成させることと、
負電荷を有する標的化剤を前記ナノ構造体へと加えることにより適用剤を前記ナノ構造体へと加えることを含む、
組成物を製剤化する方法。

【請求項117】

治療用化合物を患者へと送達する方法であって、
カチオン性基を含む複数の両親媒性ポリマーの自己集合から形成されるナノ構造体を含む製剤を投与することを含み、
前記ナノ構造体が、コーティング適用剤を含み、
前記コーティング適用剤が、負電荷を有する標的化剤を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［政府援助］
本発明は、米国国立衛生研究所から授与された助成金番号Ｒ０１ＣＡ２２３７８８及びＣＡ２１９３９９に基づく政府支援を受けてなされた。政府は、本発明について一定の権利を有する。

【0002】

［関連出願との相互参照］
本出願は、２０２１年９月１８日に出願されたシリアル番号第６３／２４５，８１０号の米国仮特許出願と、２０２２年１月１４日に出願されたシリアル番号第６３／２９９，４３１号の米国仮特許出願との利益を主張するものであり、これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

以下の情報は、以下に開示される技術と、そのような技術が典型的に使用され得る環境とを、読者が理解するのを支援するために提供される。本明細書において使用される用語は、本明細書において明確に別段の記載がない限り、特定の狭い解釈に限定されることを意図するものではない。本明細書に記載された参考文献は、技術又はその背景の理解を容易にする場合がある。本明細書において引用される全ての参考文献の開示は、参照により組み込まれる。

【0004】

ナノ粒子／ナノ構造は、例えば、小分子薬物や核酸（ｓｉＲＮＡなど）を含む様々な種類の治療薬を、腫瘍に送達又は共送達するのに有効である。ナノキャリアを介したがん治療薬の送達は、腫瘍血管系は数ナノメートルから数百ナノメートルの柵状脈管で漏出性であり、長時間循環するナノ粒子（nanoparticle：ＮＰ）は受動的標的メカニズムによって腫瘍組織に選択的に集積するという概念に基づいている。さらに、リンパ系が障害される結果、血管外に滲出したＮＰを腫瘍組織から除去することができなくなり、これは透過性及び保持の強化（Enhanced Permeation and Retention：ＥＰＲ）効果として知られる概念である。ＥＰＲは、多くの偽遺伝子腫瘍モデルやヒト異種移植腫瘍モデルで一般的に見られるが、ヒトのがん患者ではより不均一であるようである。したがって、ＥＰＲ以外の、あるいはＥＰＲに加えて、腫瘍を標的とすることができるナノキャリアを開発する必要性が存在する。

【発明の概要】

【0005】

一態様において、製剤は、カチオン性基を有する複数の両親媒性ポリマーの自己集合から形成されるナノ構造体と、前記ナノ構造体に加えられたコーティング、適用剤（application）、又は層と、を含む。前記ナノ構造体は、内側の疎水性ドメインと外側の親水性ドメインとを含むことができる。前記適用剤は、患者の体内の対象領域（例えば、腫瘍）を標的とする負電荷を有する標的化剤を含む。前記標的化剤は、例えば、細胞受容体のためのリガンド、ペプチド、アプタマー、多糖類、及び抗体からなる群から選択され得る。多くの実施形態において、前記標的化剤は、細胞受容体のためのリガンド（例えば、ＣＤ４４リガンド）である。

【0006】

前記適用剤は、親水性高分子化合物をさらに含み得る。前記親水性高分子化合物は、負電荷を有していてもよい。多くの実施形態において、親水性高分子化合物は、負電荷を有する分子又は化合物と、親水性ポリマーと、の結合体（conjugate）を含む。前記親水性ポリマーと結合された前記負電荷を有する分子は、例えば、前記標的化剤と同じ化合物であってもよい。

【0007】

前記製剤は、前記ナノ構造体と一体化された治療用化合物をさらに含むことができる。前記治療用化合物は、例えば、核酸であってもよい。核酸は、電荷－電荷相互作用を介して、その形成後に前記ナノ構造体の前記カチオン性基と一体化するか、又は前記ナノ構造体との結合体を形成することができる。

【0008】

多数の実施形態において、前記治療用化合物は、疎水性又は親油性の治療用化合物である。前記疎水性又は親油性の治療用化合物は、前記ナノ構造体の内側の前記疎水性ドメインと一体化することができる。前記治療用化合物は、例えば、小分子の治療用化合物であってもよい。前記治療用化合物が、例えば、１ｋＤａ未満の分子量を有していてもよい。多くの実施形態において、前記治療用化合物は、化学療法用化合物である。

【0009】

多数の実施形態において、前記製剤は、前記治療用化合物とは異なる第二の治療用化合物をさらに含み、前記第二の治療用化合物は、核酸を含むか又は核酸である。上述したように、前記核酸は、前記ナノ構造体の前記両親媒性ポリマーの前記カチオン性基と一体化していてもよい。

【0010】

前記核酸は、例えば、ＲＮＡ若しくはＤＮＡを含むか、又は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡであってもよい。多数の実施形態において、前記核酸は、遺伝子（gene）又はｓｉＲＮＡである。

【0011】

本明細書で使用される場合、用語「カチオン性基（cationic group）」は、本質的にカチオン性の基又はｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基を指す。多数の実施形態において、前記ｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基は、アミン基であり、ここで前記アミン基は、非環式アミン基、環式アミン基、又は複素環式アミン基である。多数の実施形態において、前記アミン基は、メトホルミン基、モルホリン基、ピペラジン基、ピリジン基、ピロリジン基、ピペリジン、チオモルホリン、チオモルホリンオキシド、チオモルホリンジオキシド、イミダゾール、グアニジン、ビグアニジン、又はクレアチンからなる群より選択される。

【0012】

前記親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類、及びポリペプチドからなる群から選択され得る。多数の実施形態において、前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。

【0013】

前記ナノ構造体に加えられる前記親水性高分子化合物に対する前記負電荷を有する標的化剤の比率は、対象領域以外の一つ以上の領域における前記ナノ構造体の取り込みが、前記対象領域（例えば、腫瘍）における前記負電荷を有する標的化剤の相互作用を可能にするために十分な低レベルに維持されるように決定され得る。

【0014】

多数の実施形態において、前記複数の両親媒性ポリマーの各々は、疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの前記カチオン性基を含む第一の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの親水性ポリマー（すなわち、ペンダント親水性ポリマー）を含む第二の複数のペンダント基とを含む。前記疎水性ポリマー骨格が、例えば、ペンダント脂質基をさらに含み得る。

【0015】

多数の実施形態において、前記疎水性ポリマー骨格は、フリーラジカル重合を介して形成される。前記疎水性ポリマー骨格は、例えば、制御／リビングラジカル重合、又は可逆不活性化ラジカル重合を介して形成され得る。

【0016】

別の態様において、組成物を製剤化する方法は、水性媒体においてカチオン性基を有する複数の両親媒性ポリマーの自己集合を介してナノ構造体を形成することと、負電荷を有する標的化剤を前記ナノ構造体へと加えることによって前記ナノ構造体にコーティング、標的化剤、又は層を付与することと、を含む。

【0017】

別の態様において、患者に治療化合物を送達する方法は、カチオン性基を有する複数の両親媒性ポリマーの自己集合から形成されたナノ構造体を含む製剤を、投与することを含む。各々の前記ナノ構造体は、前記ナノ構造体におけるコーティング、適用剤、又は層を含む。前記適用剤が、負電荷を有する標的化剤を含む。

【0018】

多数の実施形態において、前記標的化剤は、ＣＤ４４リガンドである。その点に関して、一つの態様において、製剤は、カチオン性基を有する複数の両親媒性ポリマーの自己集合から形成されたナノ構造体を含む。前記ナノ構造体は、前記ナノ構造体に加えられた適用剤を含む。前記適用剤は、負電荷を有するＣＤ４４リガンドと親水性高分子化合物とを含む。前記親水性高分子化合物は、負電荷を有していてもよい。多くの実施形態において、前記親水性高分子化合物は、負電荷を有する分子と親水性高分子との結合体である。前記親水性ポリマーと結合する前記負電荷を有する分子は、例えば、ＣＤ４４リガンドであってもよい。多くの実施形態において、前記親水性高分子化合物は、前記コーティング中に存在する親水性ポリマーと前記ＣＤ４４リガンドとの結合体である。

【0019】

前記ナノ構造体は、内側の疎水性ドメインと外側の親水性ドメインとをさらに含み得る。前記ナノ構造体は、例えば、ミセルであってもよい。ここでいう前記ＣＤ４４リガンドは、例えば、オステオポンチン、コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はこのようなリガンドの誘導体（ＣＤ４４リガンドとして活性を維持する）を含むことができる。多くの実施形態において、前記ＣＤ４４リガンドは、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸である。多数の実施形態において、前記ＣＤ４４リガンドは、コンドロイチン硫酸である。

【0020】

前記製剤は、前記ナノ構造体と一体化された治療用化合物をさらに含み得る。前記治療用化合物は、例えば、前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドと前記親水性高分子化合物とが適用される前に前記ナノ構造体に加えられた核酸を含むことができ、これらは、例えば、混合物として適用することができる。前記治療用化合物は、例えば、疎水性又は親油性の治療用化合物を含むことができる。多数の実施形態において、前記疎水性又は親油性治療化合物は、小分子の治療化合物である。前記小分子の治療化合物が、例えば、１ｋＤａ未満の分子量を有することができる。

【0021】

多数の実施形態において、前記治療用化合物（又は第一の治療用化合物）は、疎水性又は親油性の治療用化合物であり、前記製剤が、前記治療用化合物とは異なる第二の治療用化合物をさらに含み、前記第二の治療用化合物が、核酸を含む。上記のように、前記治療用化合物（又は第一の治療用化合物）は、小分子の治療用化合物であってもよい。

【0022】

本明細書における製剤の前記核酸が、例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡを含み得る。多数の実施形態において、前記核酸は、遺伝子又はｓｉＲＮＡである。多数の実施形態において、前記核酸は、ｓｉＲＮＡである。

【0023】

ここでいう前記カチオン性基は、本質的にカチオン性の基又はｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基を含み得る。多数の実施形態において、前記ｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基、前記カチオン性基は、アミン基であり、ここで前記アミン基は、非環式アミン基、環式アミン基、又は複素環式アミン基である。前記アミン基は、例えば、メトホルミン基、モルホリン基、ピペラジン基、ピリジン基、ピロリジン基、ピペリジン、チオモルホリン、チオモルホリンオキシド、チオモルホリンジオキシド、イミダゾール、グアニジン、ビグアニジン、又はクレアチンからなる群より選択され得る。多数の実施形態において、前記アミン基は、ビグアニジンである。

【0024】

前記親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類、及びポリペプチドからなる群から選択され得る。多数の実施形態において、前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。

【0025】

多数の実施形態において、前記親水性高分子化合物に対する前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドの比率は、患者の肝臓における前記ナノ構造体の取り込みが、肝臓から離れた腫瘍におけるＣＤ４４と前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドとの相互作用を可能にするために十分な低レベルに維持されるように、又はそのように決定される。

【0026】

多数の実施形態において、前記複数の両親媒性ポリマーの各々は、疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの前記カチオン性基を含む第一の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの親水性ポリマーを含む第二の複数のペンダント基と、を含む。前記ペンダント親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類、及びポリペプチドからなる群から選択され得る。多くの実施形態において、前記ペンダント親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。前記疎水性ポリマー骨格は、ペンダント脂質基をさらに含み得る。

【0027】

多数の実施形態において、前記疎水性ポリマー骨格は、フリーラジカル重合を介して形成される。前記疎水性ポリマー骨格は、例えば、可逆失活ラジカル重合を介して形成され得る。

【0028】

別の態様において、組成物を製剤化する方法は、水性媒体においてカチオン性基を含む複数の両親媒性ポリマーの自己集合を介してナノ構造体を形成することと、負電荷を有するＣＤ４４リガンドと親水性高分子化合物とを前記ナノ構造へと加えることによって各々の前記ナノ構造体の外側にコーティングを加える又は形成することと、を含む。前記親水性高分子化合物は、負電荷を有していてもよい。多くの実施形態において、前記親水性高分子化合物は、負電荷を有する分子と親水性ポリマーとの結合体を含むか、又は結合体である。前記親水性ポリマーと結合された前記負電荷を有する分子は、例えば、ＣＤ４４リガンドであり得る。多くの実施形態において、前記親水性高分子化合物は、前記コーティング中に存在する親水性ポリマーと前記ＣＤ４４リガンドとの結合体である。

【0029】

上述のように、各々の前記ナノ構造体は、例えば、内側の疎水性ドメインと外側の親水性ドメインとを含むことができる。前記ナノ構造体は、例えば、ミセルであってもよい。本明細書でいう前記ＣＤ４４リガンドは、例えば、オステオポンチン、コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、又はこれらのリガンドの誘導体（ここで、誘導体はＣＤ４４リガンドとしての活性を保持する）を含むことができる。多くの実施形態において、前記ＣＤ４４リガンドは、コンドロイチン硫酸又はヒアルロン酸である。多数の実施形態において、前記ＣＤ４４リガンドは、コンドロイチン硫酸である。

【0030】

前記方法は、治療用化合物を前記ナノ構造体と一体化させることを、さらに含み得る。前記治療用化合物は、例えば、前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドと前記親水性高分子化合物とを適用する前に前記ナノ構造体に加えられた核酸を含み得る。前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドと前記親水性高分子化合物とは、例えば、混合物として適用することができる。前記治療用化合物は、例えば、疎水性若しくは親油性の治療用化合物を含むか、又は、疎水性若しくは親油性の治療用化合物であってもよい。多数の実施形態において、前記疎水性又は親油性の治療化合物は、小分子の治療化合物である。前記小分子の治療化合物が、例えば、１ｋＤａ未満の分子量を有し得る。

【0031】

多数の実施形態において、前記治療用化合物は、疎水性又は親油性の治療用化合物であり、前記製剤は、前記治療用化合物とは異なる第二の治療用化合物をさらに含み、前記第二の治療用化合物は、核酸を含む。上記のように、前記治療用化合物は、小分子の治療用化合物であってもよい。

【0032】

本明細書における製剤の前記核酸は、例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡを含み得る。多数の実施形態において、前記核酸は、遺伝子又はｓｉＲＮＡである。多数の実施形態において、前記核酸は、ｓｉＲＮＡである。

【0033】

ここでいう前記カチオン性基は、本質的にカチオン性の基又はｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基を含み得る。多数の実施形態において、前記ｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基、前記カチオン性基は、アミン基であり、ここで前記アミン基は、非環式アミン基、環式アミン基、又は複素環式アミン基である。前記アミン基は、例えば、メトホルミン基、モルホリン基、ピペラジン基、ピリジン基、ピロリジン基、ピペリジン、チオモルホリン、チオモルホリンオキシド、チオモルホリンジオキシド、イミダゾール、グアニジン、ビグアニジン、又はクレアチンからなる群より選択され得る。多数の実施形態において、アミン基は、ビグアニジンである。

【0034】

前記親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類、及びポリペプチドからなる群から選択され得る。多数の実施形態において、前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。

【0035】

多数の実施形態において、前記親水性高分子化合物に対する前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドの比率は、患者の肝臓における前記ナノ構造体の取り込みが、肝臓から離れた腫瘍におけるＣＤ４４と前記負電荷を有するＣＤ４４リガンドとの相互作用を可能にするために十分な低レベルに維持されるように決定される。

【0036】

多数の実施形態において、前記複数の両親媒性ポリマーの各々は、疎水性ポリマー骨格と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの前記カチオン性基を含む第一の複数のペンダント基と、前記疎水性ポリマー骨格に結合し且つ少なくとも一つの親水性ポリマーを含む第二の複数のペンダント基と、を含む。前記ペンダント親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類、及びポリペプチドからなる群より選択され得る。多くの実施形態において、前記親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。前記疎水性ポリマー骨格は、ペンダント脂質基をさらに含み得る。

【0037】

多数の実施形態において、前記疎水性ポリマー骨格は、フリーラジカル重合を介して形成される。前記疎水性ポリマー骨格は、例えば、可逆不活性化ラジカル重合を介して形成され得る。

【0038】

さらなる態様において、患者に治療化合物を送達する方法は、カチオン性基を含む複数の両親媒性ポリマーの自己集合から形成されたナノ構造体と、各々の前記ナノ構造体の外側におけるコーティングと、を含む製剤を投与することを含む。前記コーティングは、ＣＤ４４リガンドと親水性高分子化合物とを含み、前記治療用化合物は、前記製剤と一体化される。上述のように、前記ナノ構造体は、内側の疎水性ドメインと外側の親水性ドメインとをさらに含み得る。前記ナノ構造体は、例えば、ミセルであってもよい。前記ナノ構造体は、上記及び本明細書の他の箇所に記載されるように、さらに特徴付けられ得る。

【0039】

本発明のデバイス、システム、方法、及び組成物は、その属性と付随する利点とともに、添付の図面と併せてとられる以下の詳細な説明を考慮して、最もよく理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】図１は、同一遺伝子のＣＲＣ（ＣＴ２６）モデルのマウスにおける、ＴＣＦ４ ｓｉＲＮＡと、ＯＸＰを有する５－ＦＵ（ＦｕＯＸＰ）との、プロドラッグ結合体の共導入の代表例を示す図である。Ｎ＝５で、***はＰ＜０．０１で、***はＰ＜０．００１である。

【0041】

【図2A】図２Ａは、例えば、ＣＤ４４リガンドであるコンドロイチン硫酸（chondroitin sulfate：ＣＳ）のような標的化剤を含む核酸（ｓｉＲＮＡ）、および／または、小分子治療薬（ＦｕＯＸＰ）の送達のための、本ナノ担体の代表的なナノ構造またはナノ粒子の形成のための方法論の一実施形態を概略的に示す。

【0042】

【図2B】図２Ｂは、様々な担体／薬物比（ｗ／ｗ）における、ＰＭＡＯＢ／ＦｕＯＸＰ混合ミセルの大きさ、ゼータ電位、薬物担持容量（drug loading content：ＤＬＣ）、及び薬物担持効率（drugloading efficiency：ＤＬＥ）を示す表である。

【0043】

【図2C】図２Ｃは、窒素（Ｎ）／リン酸（Ｐ）比（正電荷を帯びやすいポリマーアミン（Ｎ＝窒素）基と負電荷を帯びやすい核酸リン酸（Ｐ）基との比）が１以上で安定な結合体が形成されたことを示すゲル遅延アッセイを示す。

【0044】

【図2D】図２Ｄは、異なるＮＰ比における、ＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ－コロイドミセルの大きさとゼータ電位（zeta potential）とを示す。

【0045】

【図2E】図２Ｅは、異なるＮＰ／硫酸（Ｓ）比における、ＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ－コロイドミセルの大きさとゼータ電位とを示す。

【0046】

【図2F】図２Ｆは、異なるＮＰ／Ｓ（ＣＳ）／Ｓ（ＣＳ－ＰＥＧ）比における、ＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ－コロイドミセルの大きさとゼータ電位とを示す。

【0047】

【図2G】図２Ｇは、ＰＢＳ中で２週間後と、室温と、マウス血清（mouseserum：ＭＳ）中で２４時間後とでの、ＮＰの大きさの変化の研究を示す。

【0048】

【図2H】図２Ｈは、ＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰに担持されたｓｉＲＮＡが、ＲＮａｓｅ ＩＩＩによる分解から十分に保護されたのに対して、遊離ｓｉＲＮＡがＲＮａｓｅ ＩＩＩで３７℃、１時間処理した後に完全に分解されたことを示すゲル遅延試験を示す。

【0049】

【図3A】図３Ａは、ポリマーＰＭＡＯＢの合成経路の一実施形態を示す。

【0050】

【図3B】図３Ｂは、種々のＮＰ比におけるミセル／ｓｉＲＮＡ複合体（ｗ／ｏ ＦｕＯＸＰ）の大きさ及びゼータ電位の研究を示す。

【0051】

【図3C】図３Ｃは、様々なＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧ比についての、肝臓と腫瘍とにおけるＣｙ５標識ｓｉＲＮＡの組織分布の研究を示す。

【0052】

【図4A】図４Ａは、Ｃｙ５シグナルが腫瘍領域（皮下（subcutaneous：ｓ．ｃ．）ＣＴ２６モデル)に集中したことを示す、腫瘍を有するマウスの全身ＮＩＲイメージングを示す。

【0053】

【図4B】図４Ｂは、心臓、腎臓、脾臓、肺、肝臓、及び腫瘍のｅｘ ｖｉｖｏ画像を示す。

【0054】

【図4C】図４Ｃは、肝臓と腫瘍とにおける、４８時間にわたる定量的蛍光強度を示す。

【0055】

【図4D】図４Ｄは、ＮＰ中のＣｙ５標識ｓｉＲＮＡと、血液中のＣｙ５標識遊離ｓｉＲＮＡとの、経時的な画像を示す。

【0056】

【図4E】図４Ｅは、ヒト結腸癌（ＷｉＤｒ）、ヒト乳癌（ＢＴ－４７４）、マウス膵臓癌（Ｐａｎｃ０２）、及びマウス乳癌（４Ｔ１．２）モデルにおける、心臓、腎臓、脾臓、肺、肝臓、及び腫瘍のＮＩＲ画像を示す。

【0057】

【図4F】図４Ｆは、同所性マウス結腸癌モデルにおける組織分布研究を示す。

【0058】

【図4G】図４Ｇは、ｓｉＲＮＡ ＮＰのｉ．ｖ．投与後２４時間の腫瘍切片におけるＣｙ５ ｓｉＲＮＡの分布を示す図である。

【0059】

【図5A-5C】図５Ａは、野生型（wild-type：ＷＴ）マウスと、ＣＤ４４^－／－マウスとにおける、腫瘍中のＣｙ５標識ｓｉＲＮＡの分布を示す全身ＮＩＲイメージングを示す。

【0060】

図５Ｂは、ＷＴマウスと、ＣＤ４４^－／－マウスとにおける、肝臓及び腫瘍のｅｘ ｖｉｖｏイメージングを示す。

【0061】

図５Ｃは、ＷＴマウスと、ＣＤ４４^－／－マウスとにおける、血清中のＣｙ５標識ｓｉＲＮＡの画像を示す。

【0062】

【図5D】図５Ｄは、野生型（ＷＴ）ＣＤ４４マウスと、ＣＤ４４^－／－マウスとにおける、腫瘍中及び肝臓組織中のＣｙ５シグナルの定量的強度を示す。

【0063】

【図5E】図５Ｅは、野生型（ＷＴ）ＣＤ４４マウスと、ＣＤ４４^－／－マウスとにおける、血液中のＣｙ５シグナルの定量的強度を示す。

【0064】

【図5F】図５Ｆは、ＥＰＲのような受動的標的化機構が有効なままである一方、能動的経内皮輸送機構が阻害されている、ＷＴマウスとゾンビマウスとの全身ＮＩＲイメージングを示す。

【0065】

【図5G】図５Ｇは、野生型（ＷＴ）マウスと、ゾンビマウスとにおける、腫瘍組織及び肝臓組織におけるＣｙ５シグナルの定量的強度を示す図である。

【0066】

【図5H】図５Ｈは、マウスの肝類洞内皮細胞（liversinusoidal endothelial cell：ＬＳＥＣ）と、ヒト臍帯静脈内皮細胞（humanumbilical vein endothelial cell：ＨＵＶＥＣ）とにおける、ＣＳ／ＰＥＧ－ＣＳ比の関数としてのＮＰ取り込みの研究を示す。

【0067】

【図5I】図５Ｉは、本明細書のＮＰによる腫瘍標的化におけるトランスサイトーシスの役割の研究を示す図であり、Ｃｙ５ ｓｉＲＮＡ ＮＰを上部チャンバー内のＨＵＶＥＣに適用した場合、トランスウェルの下部チャンバーにプレーティングされたＣＴ２６において有意なトランスフェクションが認められ、ＣＴ２６細胞のトランスフェクションがエンドサイトーシス阻害剤であるダイナソア（ＮＰ＋Ｉ）によって有意に阻害されたことから、血管ＥＣを介したトランスサイトーシスを媒介する本明細書のＮＰの有効性が示される。

【発明を実施するための形態】

【0068】

本明細書の図に一般的に記載され図示されるような実施形態の構成要素は、記載された代表的な実施形態に加えて、多種多様な異なる構成で配置および設計され得ることが容易に理解されるであろう。したがって、図に例示されるような代表的な実施形態のより詳細な以下の説明は、特許請求されるような実施形態の範囲を限定することを意図するものではなく、単に代表的な実施形態を例示するものである。

【0069】

本明細書全体を通して「一つの実施形態（one embodiment）」若しくは「一実施形態（an embodiment）」（又は同様のもの）への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じて様々な箇所で「一つの実施形態において（in one embodiment）」若しくは「一実施形態において（in anembodiment）」又は同様の表現が現れるが、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すわけではない。

【0070】

さらに、記載された特徴、構造、または特性は、一つ又は複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。以下の説明では、多数の具体的な詳細が、実施形態の徹底的な理解を与えるために提供される。しかし、関連技術の当業者であれば、様々な実施形態は、一つ以上の具体的な詳細がなくても、又は他の方法、構成要素、材料などを用いて実施することができることを認識するであろう。他の例では、よく知られた構造、材料、又は操作は、難読化を避けるために詳細に示されない又は説明されない。

【0071】

本明細書と添付の特許請求の範囲とで使用される場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「治療用化合物（therapeutic compound）」への言及は、当業者に公知の複数のそのような治療用化合物及びその等価物などを含み、「治療用化合物」への言及は、当業者に公知の一つ以上のそのような治療用化合物及びその等価物などへの言及である。本明細書における値の範囲の記載は、単に、範囲内に入る各個別の値を個々に参照する略記法として役立つことを意図している。本明細書において別段の指示がない限り、各別の値および中間範囲は、本明細書において個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書において記載される全ての方法は、本明細書において他に示されない限り、または本文によって明らかに禁忌とされない限り、任意の適切な順序で実施され得る。

【0072】

本明細書で使用する場合、「ポリマー（polymer）」という用語は、より大きな分子を形成するために繰り返し構造で配列された複数の小分子またはモノマーからなる化学化合物を指す。ポリマーは、天然に存在する場合もあれば、合成的に形成される場合もある。ポリマー」という用語には、ホモポリマーとコポリマーとが含まれる。本明細書において「コポリマー（copolymer）」という用語は、二つ以上の異なるモノマーを有する任意のポリマーを含むために使用される。コポリマーは、例えば、交互コポリマー、周期コポリマー、統計コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー等を含み得る。ポリマーの例としては、例えば、ポリアルキレンオキシドが挙げられる。

【0073】

本明細書で使用する場合、「ペンダント（pendant）」という用語は、上記のようなポリマーのような長い分子の骨格鎖に結合した基または部位を指す。ペンダント基は、（１）短鎖若しくは低分子量の基、又は（２）ポリマーのような長鎖若しくは高分子量の基のいずれかである。ペンダント基は、側基と呼ばれることもある。長鎖ペンダント基又は高分子量のペンダント基は、「ペンダント鎖（pendant chain）」又は「側鎖（side chain）」と呼ばれることがある。

【0074】

多数の実施形態において、本明細書のシステム、製剤、方法、及び組成物は、小分子の治療剤若しくは薬剤（例えば、化学療法用治療剤若しくは薬剤）および／または核酸ベースの治療剤若しくは薬剤の送達および／または共送達において使用される。両親媒性ポリマーは、例えば、疎水性ポリマー骨格を有するようにラジカル重合を介して形成され得る。疎水性ポリマー骨格は、例えば、フリーラジカル重合又は可逆的不活性化ラジカル重合又はＲＤＲＰ（以前は制御ラジカル重合またはＣＲＰと呼ばれた）を介して形成され得る。

【0075】

可逆的不活性化ラジカル重合（Reversible-Deactivation RadicalPolymerization：ＲＤＲＰ）手順には、例えば、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、および可逆的付加フラグメンテーション移動（ＲＡＦＴ）、および過去２０年間に発展した他のもの（コバルト媒介移動を含む）が含まれる。ＲＤＲＰは、あらかじめ定義された分子量、組成、アーキテクチャー、狭い／制御された分子量分布を持つラジカル重合性／共重合性モノマーを含むポリマーやコポリマーへのアクセスを提供する。ＲＤＲＰプロセスは、予測される分子量、狭い/設計された分子量分布、高度なα－およびω－鎖末端官能基化など、組成的に均質でよく定義されたポリマーを提供できるため、いくつかの総説やＡＣＳシンポジウムで報告されているように、多くの研究の対象となってきた。例えば、Qiu, J.; Charleux, B.;Matyjaszewski, K., Prog. Polym. Sci. 2001, 26, 2083; Davis, K. A.;Matyjaszewski, K. Adv. Polym. Sci. 2002, 159, 1; Matyjaszewski, K., Ed.Controlled Radical Polymerization; ACS: Washington, D. C., 1998; ACS SymposiumSeries 685. Matyjaszewski, K., Ed.; Controlled/Living Radical Polymerization.Progress in ATRP, NMP, and RAFT; ACS: Washington, D. C., 2000; ACS SymposiumSeries 768; and Matyjaszewski, K., Davis, T. P., Eds. Handbook of RadicalPolymerization; Wiley: Hoboken, 2002の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0076】

疎水性ポリマー骨格は、ラジカル重合性モノマー（ＲＤＲＰだけでなく、従来の重合またはフリーラジカル重合を含む）のラジカル重合を介して形成され得る。このようなモノマーは、重合前にペンダント基を含んでいてもよい。あるいは、このようなペンダント基は、重合後に結合されてもよい。本明細書で使用するための代表的なモノマーとしては、スチレン、アクリル酸、メタクリル酸、アクリロニトリル、ビニルモノマーおよびそれらの誘導体が挙げられる。多数の実施形態において、本明細書の疎水性ポリマーの重合度は、例えば、５００未満である。

【0077】

多数の実施形態において、ポリマーは、疎水性ポリマー骨格に結合され、少なくとも一つのカチオン性基を含む第一の複数のペンダント基と、疎水性ポリマー骨格に結合されて且つ少なくとも一つの親水性ポリマー（上記の通り）を含む第二の複数のペンダント基と、をさらに含む。ペンダント基はまた、少なくとも一つのカチオン性基と少なくとも一つの親水性ポリマーとの両方を含み得る。多数の実施形態において、第一の複数のペンダント基及び第二の複数のペンダント基のうちの少なくとも一つは、連結部分を介して疎水性ポリマー骨格に結合される。

【0078】

上述のように、少なくとも一つのカチオン性基は、例えば、本質的にカチオン性の基、又は、本明細書の製剤中および／もしくはｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成する基（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでカチオンを形成するアミン基）を含み得る。アミン基は、非環式アミン基、環式アミン基、又は複素環式アミン基であってよい。少なくとも一つのカチオン性基は、例えば、ビグアニジン基、メトホルミン基、モルホリン基、ピペラジン基、ピロリジン基、ピペリジン基、チオモルホリン、チオモルホリンオキシド、チオモルホリンジオキシド、イミダゾール、グアニジン、又はクレアチンからなる群より選択され得る。多数の実施形態において、少なくとも一つのカチオン性基は、メトホルミン基、モルホリン基、ピペラジン基、又はクレアチンからなる群より選択される。本明細書に記載のカチオン性アミン基は、置換または非置換であってもよい。

【0079】

本明細書のペンダント基は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ条件下（例えば、酸性ｐＨ条件下）で不安定な連結部分を介して疎水性ポリマー骨格に結合され得る。この不安定な結合は、例えば、標的領域における条件（例えば、腫瘍の領域における酸性条件に対して敏感であるか、または酸性条件下で不安定である）に敏感であり得る。酸に不安定な結合としては、例えば、マレイン酸カルボキシジメチル、ヒドラジン、イミン、アセタール、オキシム、シリルエーテル、シス－ソニチル、又は他の酸に不安定な結合若しくは連結が挙げられる。酸性条件に感受性である不安定結合の使用は、例えば、例えば、酸性腫瘍環境において親水性ポリマー／オリゴマーを切断するために使用され得る。他の適切な不安定結合の例としては、ジスルフィド結合、低酸素感受性結合、及びグルコース感受性結合が挙げられる。

【0080】

親水性オリゴマーまたは親水性ポリマーは、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリオキサゾリン、多糖類、及びポリペプチドからなる群から選択され得る。多数の実施形態において、少なくとも一つの親水性ポリマーは、ポリアルキレンオキシドである。ポリアルキレンオキシドは、例えば、ポリエチレングリコールであってもよい。ポリエチレングリコール又は他の親水性ポリマーは、例えば、少なくとも５００Ｄａの分子量を有し得る。多数の実施形態において、ここの他の親水性ポリマーのポリエチレングリコールは、２００Ｄａから１０ｋＤａの範囲、又は、５００Ｄａから５ｋＤａの範囲の分子量を有する。

【0081】

多数の実施形態において、製剤又はナノキャリア製剤は、カチオン性基を含む複数の両親媒性ポリマーの（水性媒体中での）自己集合から形成されるナノ構造体又はナノ粒子を含む。ナノ構造体は、例えば、内側の疎水性ドメインと外側の親水性ドメインとを含むことができる。ナノ構造体は、同様に、ナノ構造体の外側領域または外側領域上にコーティング、適用剤、又は層を含んでもよい。コーティング、適用剤、又は層は、連続的である必要はない。多数の実施形態において、コーティング、適用剤、又は層は、負電荷を有する標的化剤を含む。本明細書中で使用される場合、用語「標的化剤（targeting agent）」は、一般に、腫瘍などの関心領域を積極的に標的化する薬剤を指す。標的化剤の負電荷は、ナノ構造体を形成する両親媒性ポリマーのカチオン性基との電荷－電荷相互作用を介した固定を提供する。標的化を提供することに加えて、このような負電荷を有する薬剤は、ほぼ電荷中性を示すナノ構造／ナノキャリアを達成するために、正電荷の電荷中和／遮蔽を補助する。コーティング、適用剤、又は層は、例えば、電荷－電荷相互作用を介して親水性高分子化合物をカチオン基に固定するための負電荷を含み得る親水性高分子化合物を、さらに含み得る。親水性高分子化合物は、電荷の中和をさらに提供することができ、幾つかの実施形態では、以下でさらに議論されるように、標的化剤に対してある程度の遮蔽を提供することができる。

【0082】

多数の実施形態において、負電荷を有する標的化剤は、細胞レセプター、ペプチド、アプタマー、多糖類、及び抗体のためのリガンドを含むか、またはそれである。負電荷は標的化剤に内在していてもよいし、それに付加されていてもよい（例えば、負電荷分子との結合を介して）。多くの代表的な研究において、標的化剤は負電荷を有するＣＤ４４リガンドである。適用剤（application）は、例えば、負電荷を有するＣＤ４４リガンドと、上記のような親水性高分子化合物と、を含むことができる。好適なＣＤ４４リガンドの例としては、オステオポンチン、コラーゲン、マトリックスメタロプロテアーゼ、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）、ヒアルロン酸（hyaluronic acid：ＨＡ）、又はそのようなリガンドの誘導体（標的化活性を保持する）が挙げられる。上述したように、親水性高分子化合物は負電荷を含んでいてもよい。親水性高分子化合物は、コンドロイチン硫酸やＣＳのような負に荷電した分子を、上記のように親水性ポリマーと結合させることによって形成することができる。例えば、ＣＳ－ＰＥＧ結合体では、ＣＳは、ナノ構造の両親媒性ポリマーの陽イオンに関連する正電荷と電荷－電荷相互作用を介して相互作用する負電荷を提供する。一般に、適切な負電荷を持つ化合物は、ＰＥＧのような親水性ポリマーと共役して、親水性ポリマー共役体をナノ構造に固定することができる。このような化合物は、例えば、別の負電荷を持つＣＤ４４リガンド、生体化合物、合成化合物などである。あるいは、親水性ポリマーの一部を負の電荷を含むように修飾してもよい。多数の実施形態において、親水性高分子化合物は、適用剤中に存在する親水性ポリマーとＣＤ４４リガンドとの結合体である。

【0083】

ここでのナノキャリア製剤は、例えば、疎水性ドメインおよび／またはナノキャリアのカチオン性基と会合または相互作用する治療化合物を送達するために使用することができる。本発明のナノキャリア製剤は、例えば、小分子、疎水性若しくは親油性の治療化合物若しくは薬剤および／または核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、遺伝子、プラスミド等）の送達又は共送達が可能である。カチオン性基を含むポリマーから形成されたナノ構造体又はナノ粒子への核酸の組み込みは、例えば、公開米国特許出願第２０２１／０２３６６４５号に記載されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。両親媒性ポリマー分子のカチオン基と核酸との間の多価の電荷－電荷相互作用は、本明細書のミセルの両親媒性ポリマー分子間に相互作用性の非共有結合性架橋を形成するための単純なアプローチとして機能し得る。

【0084】

ＣＤ４４リガンドでコーティングされた本ナノキャリア製剤は、腫瘍内皮細胞を介したＥＰＲ及びトランスサイトーシスの両方による腫瘍標的化において非常に効果的である。多くの実施形態において、このような負に荷電したリガンドは、ミセルの安定化を補助し得る。このようなナノキャリアは、生物物理学的特性および腫瘍標的化の効率の両方に関して特徴付けられた。

【0085】

さらに、両親媒性間のπ－πスタッキング（例えば、芳香族基の包接を介して）、水素結合などの非共有結合性相互作用が挙げられる。ナノ構造／ミセルを形成する両親媒性ポリマーの基と薬剤のような多数の化合物との間のπ－πおよび疎水性相互作用またはスタッキングおよび他の相互作用は、例えば、米国特許第１０，１７２，７９５号及び同第９，８５５，３４１号、並びに、米国特許公開第２０１８／０２１４５６３号及び同第２０２１／０２３６６４５号に開示されており、これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0086】

多くの研究において、本明細書のナノキャリアは、例えば、ｓｉＲＮＡのような核酸と化学療法薬のような薬物の共送達において非常に効果的であることが実証された。免疫療法は、がん治療において最も急速に発展している戦略のひとつである。特に、ＰＤ－１および／またはＣＴＬＡ－４の阻害剤を用いた免疫チェックポイント阻害（ＩＣＢ）は、臨床においてその治療可能性を明確に示している。しかし、この治療法の恩恵を受ける患者はごく少数である。より多くの癌患者に利益をもたらすために、他の免疫チェックポイントを標的とする新規治療法の開発が急務である。

【0087】

代表的なｓｉＲＮＡ及び代表的な化学療法薬である５－Ｆｕ／シスプラチンの共送達の治療効果と、その基礎となるメカニズムとを、様々な癌モデルにおいて本ナノキャリアを用いて研究した。５－Ｆｕ及びＯＸＰは、大腸癌（colorectal cancer：ＣＲＣ）に対する第一線の治療薬であり、進行性又は転移性のＰＣａを含む様々な病期の膵臓癌（pancreatic cancer：ＰＣａ）患者に対する主要な治療薬であるが、限られた有効性と全身毒性の問題とを伴っている。以前、５－ＦＵ及びシスプラチンの脂質誘導体化プロドラッグ結合体（フプラチン）が、抗腫瘍活性を改善し、正常細胞に対する細胞毒性を低下させることが報告された。臨床においてＯＸＰがシスプラチンより優れていることから、５－Ｆｕ及びＯＸＰのプロドラッグ結合体（ＦｕＯＸＰ）も同様に合成された。ＣＴ２６は、ＦｕＯＸＰだけでなく、５－ＦｕＯＸＰにも中等度まで反応不良な同一遺伝子型のＣＲＣモデルである（データは示さず）。多くの研究で、ＣＴ２６腫瘍のＲＮＡ－ｓｅｑが、ＦｕＯＸＰで５日ごとに３回処理した後に実施され、ＴＣＦ４は有意に誘導された遺伝子の一つであった（データは示さず）。例えば図１は、ＴＣＦ４ ｓｉＲＮＡとＦｕＯＸＰを共導入した代表的な例であり、マウス偽性ＣＲＣ（ＣＴ２６）モデルにおいて腫瘍増殖が有意に抑制された。転写因子４（ＴＣＦ４）は癌タンパク質であり、ＣＲＣの癌化と薬剤耐性に関与している。上述したように、ＣＴ２６腫瘍を有するマウスは、用量１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡと用量５ｍｇ／ｋｇのＦｕＯＸＰとで、５日に１回、様々な治療を３回受けた。ＦｕＯＸＰナノ粒子（ＮＰ）単独は、ＣＴ２６腫瘍の増殖をわずかに阻害した。ＴＣＦ４ ｓｉＲＮＡ ＮＰ単独では、腫瘍の成長を抑制する効果はわずかであった。しかし、両者を組み合わせることにより、抗腫瘍活性が有意に改善した。腫瘍の体積は、２日に１回追跡した。

【0088】

本明細書の多数の実施形態において、代表的なポリ（無水マレイン酸－ａｌｔ－１－オクタデセン又はＰＭＡＯポリマー（ＰＭＡＯＢ－ＣＰ）から形成されるナノキャリアが、ｓｉＲＮＡ及びＦｕＯＸＰの共送達を達成するために開発された（例えば、図２Ａから図２Ｈ参照）。図２Ａは、ＰＭＡＯＢ－ＣＰナノキャリアの開発における主要なコンポーネントとステップを示している。ＰＭＡＯＢは両親媒性ポリマーであり、水溶液中で自己集合してミセルを形成する。脂質モチーフは細胞膜との相互作用を促進し、トランスフェクションを改善することができる。また、疎水性／親油性コアへのＦｕＯＸＰの担持を改善するのにも役立つ。ビグアニジンモチーフは、非常にポジティブな性質の結果、ｓｉＲＮＡとの相互作用を強化するように設計された。ＰＭＡＯＢの合成経路を、図３Ａのスキーム１に示す。ポリ無水マレイン酸－ａｌｔ－１－オクタデセンまたはＰＭＡＯ（化合物１：市販のポリマー）をまずエチレンジアミンと反応させてアミン基を導入した。次に、アミン含有ＰＭＡＯポリマー（化合物２）を、ＰＥＧ_２Ｋ－ＮＨＳとジシアンジアミドとに順次反応させ、それぞれＰＥＧとビグアニドペンダント基とを導入した。ＤＭＳＯ中のＰＭＡＯＢ（化合物３）の核磁気共鳴（^１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、それぞれのＰＭＡＯメチルピーク（１．０ｐｐｍ～１．２ｐｐｍ）と、ＰＥＧメチルピーク（３．２８ｐｐｍ）と、メチレンピーク（３．３ｐｐｍ～３．６ｐｐｍ）とを示した。ＰＥＧ置換は約１０％であり、化合物２の他のすべてのアミン基は、ニンヒドリンアッセイに基づいて、ビグアニド基で誘導体化された。

【0089】

ＰＭＡＯＢポリマーは、ＰＢＳ中で容易にミセルを形成し、その大きさは１７３．２ｎｍであった。ＦｕＯＸＰは、２／１という低い担体／薬物比でＰＭＡＯＢミセルに担持することができた。図２Ｂは、さまざまな担体／薬物比（ｗ／ｗ）のＰＭＡＯＢ／ＦｕＯＸＰ混合ミセルの大きさを示している。担体／薬剤比１０／１のＰＭＡＯＢ／ＦｕＯＸＰ混合ミセルを、ｓｉＲＮＡとのさらなる複合化に使用した。

【0090】

薬物を含まないＰＭＡＯＢミセルと、ＦｕＯＸＰを担持したＰＭＡＯＢミセルとの両方が、水溶液中でｓｉＲＮＡと容易に複合体を形成した。ゲル遅延アッセイは、窒素（Ｎ）／リン酸（Ｐ）比が１以上で安定な複合体が形成されることを示した（図２Ｃ）。図２Ｄは、異なるＮＰ比におけるＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ共役ミセルの大きさとゼータ電位とを示している。ＮＰ比を１／１から２．５／１まで増加させると、結合体の大きさは減少し、結合体のゼータ電位は負になった。ＮＰ比を５／１に増加させると、複合体の大きさが増加した。この増加は、この比率で電荷が中性になり、錯体の凝集が起こりやすくなったためと考えられる。ＮＰ比をさらに増加させると、ゼータ電位が徐々に増加し、大きさが減少する錯体が形成された。ＮＰ比１０／１では、得られたＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ／ＰＭＡＯＢ複合体は正電荷を帯び（１７．５ｍＶ）、大きさは１０７．５ｎｍであり、ＦｕＯＸＰを単独で担持したＰＭＡＯＢミセル(１７９．１ｎｍ)よりも小さかった（図２Ｄ）。同様の結果は、ｓｉＲＮＡが薬剤を含まないＰＭＡＯＢミセルと複合体を形成した場合にも示され（図３Ｂ参照）、本明細書のＰＭＡＯＢベースの担体が、ｓｉＲＮＡ単独の送達、又は、ｓｉＲＮＡとＦｕＯＸＰとの共送達に使用できることを示している。

【0091】

肺転移を含む肺血管系への送達の可能性があるにもかかわらず、カチオン性表面を有する担体は、遠隔固形腫瘍への全身送達には適さないことがよく知られている。したがって、代表的な研究では、１０／１のＮＰ比で形成された安定なＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ－コロイドミセルを、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）とＣＳ－ＰＥＧとの結合体の形の代表的な親水性化合物の混合物で、表面コーティング／適用（application）した。ＣＳは、高電荷を持つ分子であり、ＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧは得られたＮＰ（ＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰ）の表面の正電荷を減少させるために用いられた。さらに、血清タンパク質との非特異的相互作用を最小化するために、少量のＰＥＧが含まれた。図２Ｅに示すように、ＣＳの量を増やすと、正電荷が徐々に中和された。ＮＰ／硫酸（Ｓ）比が１０／１／２．２５の場合、得られたＮＰの大きさは１３６．５ｎｍで、わずかにプラスに帯電していた（４．２ｍＶ）。この条件下で、少量のＣＳ－ＰＥＧ（ＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧの比が２．５／０．１から２．２５／０．２５まで）を組み込むと、正電荷の電荷中和／遮蔽がさらに進み、ほぼ電荷が中性になった（図２Ｆ）。ＣＳ－ＰＥＧの量をさらに増やすと、負電荷を有するＮＰが形成された。ＣＳ－ＰＥＧを有するＮＰ（約１２０ｎｍ）は、ＣＳ－ＰＥＧを有さないＮＰ（約１４０ｎｍ）より小さかった（図２Ｆ）。

【0092】

図２Ｇは、ＰＢＳ中、常温で２週間後のＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰの大きさに最小限の変化があったことを示す。大きさの明らかな変化は、ＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰを５０％のマウス血清中で２４時間インキュベートした後にも観察されなかった（図２Ｇ）。図２Ｈは、遊離ｓｉＲＮＡはＲＮａｓｅ ＩＩＩで３７℃、１時間処理すると完全に分解されたことを示している。対照的に、ＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰに担持されたｓｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩによる分解から十分に保護された（図２Ｈ）。これらのデータは、ＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡを担持したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰは、全身投与後に効果的な腫瘍の標的化を達成するのに十分な時間、血中で安定である可能性が高いことを示している。

【0093】

ｓ．ｃ．腫瘍モデル（ＣＴ２６）を、初期の代表的な最適化研究に使用した。Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡと非標識ｓｉＲＮＡの混合物（１：１、ｗ／ｗ）を用いてＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰを調製し、腫瘍における標識ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ分布を尾静脈注射後２４時間で蛍光顕微鏡により調べた。肝臓はＮＰを非選択的に取り込む主要な臓器であるため、肝臓におけるｓｉＲＮＡの取り込みも調べた。図３Ｃは、ＮＰ比１０／１で調製されたが、それぞれ様々な量のＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧでコーティングされた様々なＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰで処理した後のＣｙ５－ｓｉＲＮＡの組織分布を示す。ＮＰ／Ｓ（ＣＳ）比を１／１０／１から１／１０／２．５まで増加させると、腫瘍におけるＣｙ５．５シグナルが徐々に増加し、肝臓におけるシグナルが同時に減少した（図３Ｃ）。ＣＳの量をさらに増やすと、腫瘍のシグナルは減少し、肝臓のシグナルは増加した（図３Ｃ）。次に、ＣＳ－ＰＥＧを組み込むことによって、ＣＳコートＮＰの腫瘍標的化効率をさらに改善できるかどうかが研究された。多くの研究で、ＮＰ／Ｓ（ＣＳ）比を１０／１／２．２５に保ちながら、ＣＳ－ＰＥＧの量を徐々に増加させた。ＣＳ／ＣＳ-ＰＥＧの比を２．２５／０．２から２．２５／０．５に増加させると、腫瘍におけるＣｙ５．５シグナルはさらに増加したが、肝臓におけるシグナルは減少した（図３Ｃ）。ＣＳ－ＰＥＧの量をさらに増やすと、腫瘍のシグナルは減少し、肝臓のシグナルは増加した（図３Ｃ）。その後の研究を、１０／１／２．２５／０．５のＮＰ／Ｓ（ＣＳ）／Ｓ（ＣＳ－ＰＥＧ）比で調製したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰを用いて実施した。

【0094】

図４Ａから図４Ｃは、Ｃｙ５－ｓｉＲＮＡ担持ＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰのｉ．ｖ．注射後の異なる時間におけるＮＩＲ画像を示す。最初に全身イメージングを実施した。その後、腫瘍と主要臓器を採取し、ｅｘ ｖｉｖｏイメージングを行った。蛍光強度も定量した。全身イメージングにより、ＣＹ５シグナルが腫瘍領域に集中していることが示された（図４Ａ）。生体外イメージングのデータ（図４Ｂ）は、全身イメージングの結果と一致していた。腫瘍は最も高いレベルの蛍光シグナルを示した。肝臓も明らかなＮＰの取り込みを示したが、肝臓のＣｙ５シグナルのレベルは腫瘍のそれと比べて有意に低かった。心臓、腎臓、脾臓、肺を含む他の臓器では、シグナルはほとんど見られなかった。図４Ｃは、かなりの量のｓｉＲＮＡシグナルがｉ．ｖ．注射後１２時間で腫瘍で検出されたことを示している。そのレベルは２４時間でピークに達し、その後ゆっくりと減少した（図４Ｃ）。ＮＰは、遊離ｓｉＲＮＡよりも有意に長く血液中に留まった（図４Ｄ）。

【0095】

ｓ．ｃ．ＣＴ２６モデルにおける本明細書のＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰの効果的な腫瘍標的化の実証に続いて、本明細書のナノキャリアが、ヒト結腸癌（ＷｉＤｒ）、ヒト乳癌（ＢＴ－４７４）、マウス膵臓癌（Ｐａｎｃ０２）、及びマウス乳癌（４Ｔ１．２）を含む他のｓ．ｃ．腫瘍モデルにも選択的送達を媒介し得るかどうかを決定するための研究が実施された。図４Ｅは、ｓ．ｃ．ＣＴ２６モデルで見られたのと同様に、Ｃｙ５ ｓｉＲＮＡを担持したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰは、検討した他のすべてのｓ．ｃ.腫瘍モデルにおいて、主に腫瘍組織に集中したことを示している。同様の結果は、同所性のマウス結腸がんモデルでも観察された（図４Ｆ）。図４Ｇは、ｓｉＲＮＡ ＮＰのｉ．ｖ．投与後２４時間の腫瘍切片におけるＣｙ５ ｓｉＲＮＡの分布を示す。Ｃｙ５シグナルの広範な分布が腫瘍組織で観察され、腫瘍細胞と腫瘍ＥＣ（ＣＤ３１^＋細胞）との両方がＮＰを取り込んでいるようである。高倍率では、ＤＡＰＩとＣｙ５の共局在が明瞭に可視化され、ｓｉＲＮＡが細胞内送達後にエンドソームから効果的に放出され、核に到達したことが示された。併せて、これらのデータは、ＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰが様々なタイプの癌に効果的に標的化され得ることを示している。

【0096】

いかなる機構にも限定されないが、ＰＥＧ遮蔽（＞０．５ ＣＳ－ＰＥＧ）の増加に関連した腫瘍取り込みの減少は、ＣＳ媒介能動標的化が全体的な腫瘍標的化において役割を果たしそうであることを示すかもしれない。ＣＳはＣＤ４４の天然リガンドであり、ＣＤ４４は腫瘍細胞と腫瘍内皮細胞（ＥＣ）の両方で過剰発現していることが知られている。ＣＤ４４を介したＥＣの標的化が、ＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰによる効果的な腫瘍の標的化に関与しているかどうかを調べるため、ＣＤ４４^－／－マウスでも同様にＮＩＲイメージングを行い、ＣＤ４４野生型（ＷＴ）マウスでの結果と比較した。ＣＤ４４^－／－マウスはＣ５７ＢＬ／６の遺伝的背景を持ち、ＣＴ２６腫瘍の樹立には適さないため、多くの研究でMC38結腸がんモデルが用いられた。図５Ａに示すように、Ｃｙ５ ｓｉＲＮＡを担持したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰは、ＷＴマウスの腫瘍組織に非常に効果的に集積した。腫瘍におけるそのレベルは、肝臓におけるレベルよりも有意に高かった。しかし、腫瘍組織におけるＣｙ５シグナルは、ＣＤ４４^－／－マウスでは有意に減少した（図５Ｂ及び図５Ｄ）。Ｃｙ５ ｓｉＲＮＡを担持したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰの取り込みも、ＣＤ４４^－／－マウスでは肝臓で減少した。血液中のＣｙ５ ｓｉＲＮＡシグナルはＣＤ４４^－／－マウスで増加した（図５Ｃ及び図５Ｅ）。このような結果は、Ｃｙ５ ｓｉＲＮＡを添加したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰが血中で非常に安定であり、ＣＤ４４を介した腫瘍ＥＣが腫瘍全体の標的化に寄与していることを示している。一方、肝類洞ＥＣ（ＬＳＥＣ）のＣＤ４４もまた、肝臓におけるＣｙ５ ｓｉＲＮＡを担持したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰの取り込みに寄与している可能性がある。

【0097】

Ｃｙ５ ｓｉＲＮＡを担持したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰの腫瘍標的化効率は、腫瘍血管系を含む全身血管系を灌流し、ＮＰの尾静脈注射前に４％パラホルムアルデヒドで固定したゾンビマウスでも評価した。このモデルでは、ＥＲＰのような受動的標的化機構は有効である。図５Ｆから図５Ｇに示すように、腫瘍におけるＣｙ５ ｓｉＲＮＡを担持したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰの蓄積は、ゾンビマウスモデルにおいて有意に減少し、これは、能動的および受動的な標的化機構の両方が、ＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰによる腫瘍全体の標的化に寄与していることを示している。

【0098】

代表的なＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰと相互作用する腫瘍ＥＣおよびＬＳＥＣにおけるＣＤ４４のそれぞれの役割をさらに調べるために、単離されたマウスＬＳＥＣおよびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）によるＣｙ５ ｓｉＲＮＡを担持したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰの取り込みを調べた。増殖因子（塩基性線維芽細胞増殖因子、basic fibroblast growth factor：ｂＦＧＦ）非存在下で培養したＨＵＶＥＣは静止状態にあり、ＣＤ４４の発現レベルは低い。一方、ｂＦＧＦ存在下で培養したＨＵＶＥＣは活性化し、ＣＤ４４を高レベルで発現する。図５Ｈに示すように、ＣＳのみ（ＣＳ－ＰＥＧなし）でコーティングしたＮＰは、活性化ＨＵＶＥＣとＬＳＬＥＣとの両方に効果的に取り込まれ、活性化ＨＵＶＥＣにより多くのＮＰが取り込まれた（６９．３％対６１．５％）。また、静止ＨＵＶＥＣは活性化ＨＵＶＥＣと比較して、ＮＰの取り込み量が有意に少ないことも明らかである（図５Ｈ）。同様の結果が、ＷＴ ＬＳＥＣと比較してＣＤ４４^－／－ ＬＳＥＣについても示され、腫瘍ＥＣとＬＳＥＣとの両方によるＣＳコートＮＰの細胞内取り込みにおいて、ＣＤ４４媒介エンドサイトーシスがおそらく役割を果たしていることを示している。

【0099】

ＣＳ－ＰＥＧの取り込みは、活性化ＨＵＶＥＣおよびＬＳＥＣの両方において、ＰＥＧ用量依存的にＮＰの細胞取り込みを減少させた。しかしながら、ＣＳ－ＰＥＧは、活性化ＨＵＶＥＣと比較して、ＬＳＥＣによる取り込みにより多くの影響を明らかに示した。ＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧの比が２．５／０．２５の場合、ＬＳＥＣによる取り込みのレベルは３９．８％に減少したのに対し、活性化ＨＵＶＥＣでは５８．７％のままであった（図５Ｈ）。ＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧの比が２．５／１．０では、両方のタイプの細胞におけるＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰの取り込みレベルは、同等のレベルまで減少した（２４．４％対２６．８％）。

【0100】

ＣＤ４４はトランスサイトーシスを媒介する能力があることが示されている。代表的なＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰによる腫瘍標的化におけるトランスサイトーシスの潜在的役割を探索するために、トランスウェルプレートを用いてＨＵＶＥＣとＣＴ２６細胞との共培養実験を行った。１２時間後のＣｙ５．５^＋ ＣＴ２６細胞のフロー解析から明らかなように、Ｃｙ５．５－ｓｉＲＮＡ ＮＰを上部チャンバーで増殖させたＨＵＶＥＣに適用すると、下部チャンバーで増殖したＣＴ２６細胞が効果的にトランスフェクションされた（図５Ｉ）。トランスフェクションは、エンドサイトーシス阻害剤であるｄｙｎａｓｏｒｅによって有意に阻害され、血管ＥＣを介したトランスサイトーシスを媒介する本ＮＰの有効性を示した。

【0101】

ナノキャリアは、様々なタイプの抗癌剤の送達、特に異なるタイプの治療薬の共送達を強化する可能性を持っている。このナノキャリアは、例えばｓｉＲＮＡと化学治療薬の共導入に適している。腫瘍への両方のタイプの治療薬の送達が強化されることに加えて、この戦略には、化学薬物に曝露される腫瘍細胞にｓｉＲＮＡを選択的に送達するという利点がある。この共導入アプローチの実施形態は、例えば、共導入された化学療法薬によってｉｎ ｓｉｔｕで誘導されるｍＲＮＡに拮抗するのに有効である。核酸（プラスミド及びｓｉＲＮＡ）と疎水性抗がん剤（ＰＴＸ及びＤＯＸ）とを共形成するのに有効な数種の両親媒性ポリマー（ＰＯＥＧ－ｓｔ－Ｐｍｏｒ及びＰＭｅｔ－Ｐ（ｃｄｍＰＥＧ_２Ｋ））が以前に研究された。これらの担体は、肺転移巣を含む肺への送達には非常に有効であるが、カチオン性表面のため、ｓ．ｃ．腫瘍のような遠隔固形腫瘍への選択的な送達には効果が限定的であった。遠隔固形腫瘍へのｓｉＲＮＡと小分子薬剤との共送達を容易にするために、幾つかの新しい特徴を持つ新しいタイプのポリマー（ＰＭＡＯＢがその代表例である）がここでの研究で開発された（図２Ａ）。それに関して、多くの実施形態において、細胞膜との相互作用を促進し、トランスフェクションを改善するために脂質モチーフが導入された。また、代表的な化学療法剤ＦｕＯＸＰの疎水性／親油性コアへの担持を改善するのにも役立つ。多くの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏカチオン性ビグアニジンをポリマーに導入して、ｓｉＲＮＡとの相互作用を強化した。さらに、多くの実施形態において、ＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧ_２Ｋを使用して、ＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡを共担持したＰＭＡＯＢミセルをコーティングし、中性またはわずかに陰イオン性の表面を有するＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰを生成し、ＲＥＳによる「非特異的」取り込みを最小化した。ここでの研究データから、ＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧの量と比率は、効果的な腫瘍の標的化のために容易に決定できる方法で調整可能であることが示された。ＣＳ－ＰＥＧを含まないＮＰは、肝臓による実質的な「非特異的」取り込みの結果として、腫瘍標的化において限定された有効性を示した。代表的な研究例では、ＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧの比を２．５／０．２から２．５／０．５へと増加させると、肝臓への取り込みが減少し、腫瘍への集積が増加した。しかし、ＣＳ－ＰＥＧの量をさらに増やすと、腫瘍の取り込みは減少した。これらのデータは、ＣＤ４４^－／－マウスのデータと合わせて、ＣＤ４４が介在する腫瘍ＥＣの標的化／転移が、腫瘍全体の標的化において重要な役割を果たしていることを強く示している。

【0102】

ＣＤ４４は、腫瘍ＥＣと腫瘍細胞との両方で過剰発現されていることが知られており、トランスサイトーシスを媒介するのに非常に効果的である。ヒアルロン酸（ＨＡ）と、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）とは、細胞外マトリックスに存在する内因性の多糖リガンドである。腫瘍ＥＣのＨＡ又はＣＳを介した標的化の有効性を制限する障壁は、ＬＳＥＣ上のＣＤ４４の発現であり、これらの細胞が豊富であるため、循環中のＮＰのほとんどを除去してしまう。実際、多くの報告されたＨＡとＣＳでコートされたＮＰは、腫瘍内のそれよりも有意に高いレベルで、広範な肝臓への取り込みを示した。腫瘍ECはＬＳＥＣより高いレベルのＣＤ４４を発現しているという事実に基づいて、もしＥＰＲを介して腫瘍細胞にＮＰが到達できた場合、腫瘍ＥＣ又は腫瘍細胞への結合を大きく損なうことなく、例えばＰＥＧを適量取り込むことにより、ＬＳＥＣとの相互作用を最小化できるという仮説が立てられた。過剰量のＰＥＧを用いると、ＣＳでコートしたＮＰと腫瘍ＥＣとの相互作用が阻害され、その結果、ＣＤ４４に依存しないメカニズムを介して、ＮＰが、クッパー細胞や場合によってはＬＳＥＣに取り込まれることになる。仮説に基づいた研究により、代表的なＰＭＡＯＢ－ＣＰベースのナノキャリアが開発され、同所性結腸がんモデルを含む複数の腫瘍モデルにおいて、腫瘍の標的化に高い効果を示した。腫瘍への蓄積レベルは、検討したすべての腫瘍モデルにおいて、肝臓への蓄積レベルよりも有意に高かった。さらに重要なことは、このナノキャリアは、ＥＰＲとトランスサイトーシスとの両方を通じて腫瘍の標的化が可能であり、臨床応用の可能性を提供することである。

【0103】

ＰＭＡＯＢ－ＣＰと他のポリマーベースのＮＰとを介したｓｉＲＮＡの送達は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの標的遺伝子の効果的なノックダウンにつながる。例えば、ｓｉＲＮＡの共送達は、特定のｍＲＮＡの化学療法誘導性アップレギュレーションを有意に減少させる可能性がある。さらに、化学療法化合物／薬剤とｓｉＲＮＡの共導入は、多くのがんモデルにおいて、化学療法薬剤のみを含むＮＰを使用するよりも抗腫瘍活性の有意な改善をもたらす可能性がある。様々なフロー研究により、ＣＤ４５細胞、ＩＦＮγ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞、及びＧｚｍＢ^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の数の増加、Ｍ１／Ｍ２比の増加、並びに、Ｔｒｅｇ細胞の減少が示され、全体的な抗腫瘍活性の増強において、改善された腫瘍免疫微小環境の役割の可能性が高いことが示された。

【0104】

仮説に基づいた研究により、ＬＳＥＣが介在する肝臓への取り込みを最小限に抑えながら、腫瘍ＥＣを効果的に標的化することにより、腫瘍の標的化において非常に効果的なナノキャリアが開発された。核酸治療薬と化学治療薬の腫瘍への送達を強化することに加え、この戦略には、ｓｉＲＮＡのような核酸治療薬を化学薬物に曝露された腫瘍細胞に選択的に送達できるという利点がある。したがって、ここでの共送達アプローチは、例えば、共送された化学療法薬によってｉｎ ｓｉｔｕで誘導されるｍＲＮＡに拮抗するのに特に有効であると考えられる。ｓｉＲＮＡとＦｕＯＸＰの共導入の代表的な研究は、腫瘍微小環境の有意な改善と抗腫瘍活性の増強につながった。様々な免疫学的標的を化学療法と組み合わせて標的とすることは、例えば結腸癌や膵臓癌を含む様々なタイプの癌の治療のための新規で効果的な免疫化学療法を提供する可能性がある。

【0105】

実験方法

【0106】

材料
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）と、トリプシン－ＥＤＴＡ溶液とは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州）から購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と、ペニシリン－ストレプトマイシン溶液とは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（米国ニューヨーク州）から購入した。フローサイトメトリーに使用した抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社やＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社などの信頼できる業者から購入した。

【0107】

細胞および動物
この研究で使用した細胞株はすべてＡＴＣＣ（バージニア州マナサス）から入手した。ＣＴ２６マウスＣＲＣ、ＨＴ２９ヒトＣＲＣＰａｎｃ０２マウスＰＣａ、ＰＡＮＣ－１ヒトＰＣａ、ＷｉＤｒヒトＣＲＣ、ＢＴ－４７４ヒトＢＣａ、及び４Ｔ１．２マウスＢＣａのＳ．Ｃ．モデル、並びにＭＣ３８マウスＣＲＣのＣＲＣ同所モデルは、１０％のＦＢＳと１％のペニシリン／ストレプトマイシンとを添加したＤＭＥＭ培地において、５％のＣＯ_２を含む加湿雰囲気下で、３７℃で培養した。

【0108】

４週鈴から６週齢の雌性のＣ５７ＢＬ／６マウス、ＢＡＬＢ／ｃマウス、及びＢ６．１２９（Ｃｇ）－ＣＤ４４ｔｍ１Ｈｂｇ／Ｊ(ＣＤ４４^－／－)マウスを、ジャクソン研究所から購入した。すべての動物はＡＡＡＬＡＣ（Association for Assessment and Accreditation of Laboratory AnimalCare）のガイドラインに従い、病原体のない条件下で飼育された。マウス関連の実験は、機関内のガイドラインを完全に遵守して実施され、ピッツバーグ大学の動物使用及びケア管理諮問委員会により承認された。

【0109】

ＲＮＡ－ｓｅｑ解析
ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３、約２００ｍｍ^３）に、コントロールとしてＰＢＳを用いたＦｕＯＸＰ ＮＰ処理を、５日に１回、尾静脈注射により３回行った。最後の投与から２４時間後に腫瘍を採取した。サンプルはピッツバーグ大学のＨｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅへと送られ、ＲＮＡ抽出、ライブラリー構築、配列決定が行われた。ＲＮＡ－ｓｅｑデータはＳＴＡＲを用いてマウス参照ゲノムＧＲＣｍ３８にアライメントされた。遺伝子発現レベルが定量され、アラインメントされたリードからＲＳＥＭを用いてカウント発現マトリックスが作成された。百万あたりのカウントをさらなる解析に使用した。

【0110】

ｃＤＮＡは、培養細胞、単離された腫瘍細胞および間質細胞、または腫瘍組織から抽出された精製ＲＮＡから、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、米国メリーランド州）を用いて、製造業者の指示に従って作製した。定量的リアルタイムＰＣＲは、７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍにおいて、ＳＹＢＥ Ｇｒｅｅｎ ｍｉｘを用いて行った。相対的標的ｍＲＮＡレベルは、デルタ・デルタＣｔ法を用いて分析し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。

【0111】

ＰＭＡＯＢの合成スキーム
ＰＭＡＯ（化合物１）は、３０，０００から５０，０００の平均Ｍｎで販売されており、ポリマー１分子あたり約１００から約１４０の繰り返し単位を持つポリマーとなる。Ｍｎは、繰り返し単位の分子量である。化合物１の誘導体を合成するために、反応物のモル比の計算は、分子量３５０ｇ／ｍｏｌの繰り返しモノマー単位Ａに基づいて行った。７グラムの化合物１（繰り返し単位２０ｍｍｏｌ）を、マグネットバーを備えた２５０ｍＬのガラス瓶に加え、窒素雰囲気下に置いた。ポリマーを、乾燥脱気させた１５０ｍＬのＤＭＳＯに溶解した。次いで、５０ｍＬの乾燥脱気ＤＭＳＯ溶液中の６．６７ｍＬのエチレンジアミン（１００ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。溶液を窒素下１６０℃で４８時間撹拌した。反応後、溶液を室温まで冷却した。１Ｌの塩酸溶液（２ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＳＯ溶液に加え、沈殿をろ過し、水で３回洗浄し、５０℃で真空乾燥した（化合物２）。収量は定量的である。３９２ｍｇの化合物２（繰り返し単位１ｍｍｏｌ）と、２００ｍｇのＰＥＧ_２Ｋ－ＮＨＳ（０．１ｍｍｏｌ）とを、マグネットバーを備えた５０ｍＬ瓶に加え、固体を、１０ｍＬの乾燥ＤＭＳＯと１ｍＬのＴＥＡ（トリエチルアミン）とに溶解させた。溶液を室温で４８時間撹拌した。反応後、溶液を透析バッグ（ＭＷＣＯ １２，０００～１４，０００）に移し、水中で２４時間透析した。反応後、溶液を透析バッグ（ＭＷＣＯ １２，０００～１４，０００）に移し、水中で２４時間透析した。透析後、溶液をＰ５ろ紙でろ過し、ろ液を凍結乾燥にかけた（ＰＥＧ誘導体）。収率は約１０～２０％である。１００ｍｇのＰＥＧ誘導体と、８４０ｍｇのジシアンジアミド（１０ｍｍｏｌ）とを、マグネットバーを備えた５０ｍＬボトルに加えた。固体を、１０ｍＬのｔｅｒｔ－ＢｕＯＨに溶解した。その後、溶液をリフレクションし、１２時間撹拌した。反応後、溶液を透析バッグ（ＭＷＣＯ １２，０００～１４，０００）に移し、水中で２４時間透析した。透析後、溶液を凍結乾燥にかけた（化合物３：ＰＭＡＯＢ）。収率は定量的である。

【0112】

ＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ－コロイド化ＰＭＡＯＢ ＮＰの調製
フィルム水和法を用いて、ＦｕＯＸＰ担持ＰＭＡＯＢ ＮＰを調製した。簡単に述べると、ＰＭＡＯＢポリマーと、ＦｕＯＸＰとを、ジクロロメタン中で１０：１（ｗ／ｗ）の比率で混合した。溶媒を蒸発させた後、ナノ水を加えてフィルムを水和させ、ＦｕＯＸＰ／ＰＭＡＯＢ ＮＰを得た。次に、ナノ水で希釈したｓｉＲＮＡをＦｕＯＸＰ担持ミセルと混合し、ＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ／ＰＭＡＯＢ複合体を形成させる。その後、様々な比率のＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧとインキュベートすることで、ＣＳ／ＣＳ－ＰＥＧで装飾されたＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ共担持ＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰが形成された。ｓｉＲＮＡとＰＭＡＯＢポリマーの複合化は、ゲル遅延アッセイによって確認される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、ＦｕＯＸＰの担持容量（ＤＬＣ）と薬物担持効率（ＤＬＥ）とを測定した。粒子径と、ゼータ電位とは、動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬物放出試験は、公表されたプロトコールに従って透析法で実施した。透析液中に放出されたＦｕＯＸＰをＨＰＬＣで測定した。ＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ共担持ＮＰのコロイド安定性は、大きさの変化と表面電荷の変化とを追跡することにより、ＰＢＳ（５０％マウス血清の有無）中で調べた。ＲＮａｓｅへの曝露後のｓｉＲＮＡの完全性を、電気泳動により調べた。

【0113】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物放出
ｓｉＲＮＡ複合体の有無にかかわらず、ＦｕＯＸＰを担持したＰＭＡＯＢ－ＣＰからのＦｕＯＸＰの放出を、透析法を用いて調べた。簡単に述べると、１ｍｇのＦｕＯＸＰと１０ｍｇのＰＭＡＯＢ－ＣＰとを含む２ｍＬのＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ／ＰＭＡＯＢ－ＣＰおよびＦｕＯＸＰ／ＰＭＡＯＢ－ＣＰミセルを透析バッグ（ＭＷＣＯ ３．５ｋＤａ）に入れ、０．５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含む４０ｍＬの０．１ＭのＰＢＳ溶液に浸した。実験は、３７℃、１００ｒｐｍのインキュベーションシェーカーで行った。一定の時間間隔で、透析バッグ内の溶液１０μＬと、透析バッグ外の培地１ｍＬとを抜き取り、同量の新しい透析溶液を補充した。ＦｕＯＸＰの濃度は、ＨＰＬＣで調べた。対照として、遊離のＦｕＯＸＰを加えた。

【0114】

全身の近赤外（near-infrared：ＮＩＲ）蛍光イメージング及び生体外イメージング
５匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、それぞれ５×１０^５個のＣＴ２６細胞を右脇腹に接種した。腫瘍が約３００ｍｍ^３に成長した時点で、マウスにＣｙ５．５－ｓｉＲＮＡを１ｍｇ／ｋｇの濃度で担持したＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰを静脈内投与した。１２時間、２４時間、３６時間、４８時間の時点で、マウスをＩＶＩＳ２００システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、米国）により、励起波長６７８ｎｍ、発光波長６９４ｎｍで６０秒の露光時間で画像化した。腫瘍と、各種の臓器とは、既報のプロトコールに従って、ｅｘ ｖｉｖｏイメージング用に摘出した。血液を、５分、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、４８時間、及び７２時間の時点で採取し、血清サンプルを調製してＩＶＩＳ２００システムで画像化した。

【0115】

ＮＰの腫瘍分布の顕微鏡的研究。ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の生体内分布研究のために、MC38腫瘍を有するマウス（約３００ｍｍ^３）に、Ｃｙ５．５－ｓｉＲＮＡを担持したＮＰを、静脈内（intravenously：ｉ．ｖ．）注射した。注入後２４時間で、マウスを犠牲にした。腫瘍凍結切片を作製し、ヘキスト染色し、蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０、日本）で観察した。血管はＦＩＴＣ－抗ＣＤ３１抗体で染色した。

【0116】

ゾンビの固定およびナノ粒子の循環。ゾンビマウスアッセイは、以前に公表されたプロトコールに従って実施した。マウスを、ＴＥＭ溶液（1×ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドおよび０．５％グルタルアルデヒド）を用いた経心臓灌流を用いて２０分間固定した。その後、Ｃｙ５．５－ｓｉＲＮＡ搭載ＰＭＡＯＢ－ＣＰ ＮＰを１ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ濃度で添加し、循環させた。ナノ粒子の濃度は、対照動物の血液1.8ｍＬを想定した濃度と同じであった。これらの各ナノ粒子溶液を、循環中に圧力を変化させる蠕動ポンプを用いて、生理学的に適切な流速（６ｍｌ ｍｉｎ^－１）で４時間、固定マウスに循環させた。その後、ＩＶＩＳ２００システムによりマウスを画像化し、Ｃｙ５．５を検出した。

【0117】

細胞への取り込み
マウスの肝類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）を、ＷＴのＣ５７ＢＬ／６マウスと、Ｂ６．１２９（Ｃｇ）－ＣＤ４４ｔｍ１Ｈｂｇ／Ｊ（ＣＤ４４^－／－）マウスとの両方から、以前に公表されたプロトコールに従って単離した。灌流したマウスの肝臓を切り出し、細胞を放出させるためにすり潰した。細胞懸濁液を異なる速度で数回遠心し、懸濁ペレットをパーコール勾配において担持させた。非実質細胞（ＮＰＣ）は、２５％と５０％とのパーコールの二つの密度クッションの界面から集め、クッパー細胞は選択的接着により除去した。ＬＳＥＣは、コラーゲンコート細胞培養プラスチックディッシュに播種して採取した。ＷＴマウスとＣＤ４４^－／－マウスとのＬＳＥＣ及び成長因子（ｂＦＧＦ）を添加又は無添加で処理したサブコンフルエントＨＵＶＥＣを、様々なＰＥＧ－ＣＳ比のＣｙ５．５－ｓｉＲＮＡ担持ＰＭＡＯＢ-ＣＰ ＮＰとインキュベートした。細胞の取り込みは、４時間後にフローサイトメトリーにより調べた。

【0118】

ＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ－コロイドＮＰの治療効果調査
皮下ＣＴ２６腫瘍保有マウスにおいて。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５．Ｊａｘ）に、１００μｌの血清中に５×１０^５個のＣＴ２６細胞を皮下注射した。腫瘍体積が約５０ｍｍ^３に達した時点で、マウスにＤＰＢＳ（ＣＴ）、ｓｉＣＴ ＮＰ、ｓｉＲＮＡ ＮＰ、ＦｕＯＸＰ ＮＰ、ＦｕＯＸＰ／ｓｉＣＴ ＮＰ、又はＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ ＮＰを５日の間隔で３回静脈内投与した。腫瘍の体積と、体重とを、特定の日にモニターした。

【0119】

皮下Ｐａｎｃ０２腫瘍保有マウスにおいて、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５、Ｊａｘ）に、１００μｌの無血清ＤＰＢＳ中５×１０^５個のＰａｎｃ０２細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍体積が約７０ｍｍ^３に達した時点で、マウスにＤＰＢＳ（ＣＴ）、ｓｉＣＴ ＮＰ、ｓｉＲＮＡ ＮＰ、ＦｕＯＸＰ ＮＰ、ＦｕＯＸＰ／ｓｉＣＴ ＮＰ、又はＦｕＯＸＰ／ｓｉＲＮＡ ＮＰを、５日の間隔で３回静脈内投与した。腫瘍の体積と、体重とを、特定の日にモニターした。

【0120】

腫瘍浸潤免疫細胞
ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスに、対照としてＤＰＢＤＳを尾静脈注射で５日に１回、３回投与した。腫瘍と、脾臓とは、最後の処置の２４時間後に採取した。腫瘍浸潤免疫細胞を単離し、単細胞懸濁液を調製し、フローサイトメトリー分析のために、アネキシンＶ、ＣＤ４５、ＣＤ８（ＩＦＮ－γ^＋／－及びグランザイムＢ^＋／－）、ＣＤ４（ＩＦＮ－γ^＋／－及びグランザイムＢ^＋／－）、ＦｏｘＰ３、並びにマクロファージ（Ｆ４／８０及びＣＤ２０６）を染色した。

【0121】

毒性
全身毒性の指標として、治療後のマウスの体重を追跡した。ｉｎ ｖｉｖｏ治療試験終了後、血液サンプルを採取し、製造業者のプロトコールに従って、ＡＬＴ／ＳＧＰＴ又はＡＳＴ／ＳＧＰＴ液体ＵＶアッセイキットによりＡＬＴ及びＡＳＴを測定した。血清サイトカインレベル（ＴＮＦ－α及びＩＬ－６）はマウスサイトカインアッセイキットを用いて測定した。腫瘍および心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓などの主要臓器を摘出し、１０％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した後、パラフィンに包埋した。パラフィン包埋されたサンプルは、ＨＭ３２５ロータリーマイクロトームを用いて、４μｍでスライスした。次いで、組織スライスを、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｓｔａｒ ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（米国ペンシルベニア州）下での病理組織学的検査のために、ヘマトキシリン・エオジン染色に供した。

【0122】

統計分析
すべての値は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として示した。統計解析は、二群間の比較には両側スチューデントのｔ検定、複数群間の比較には一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。結果は、ｐ＜０．０５の場合に統計的に有意であるとみなされた。

【0123】

前述の説明及び添付の図面は、現時点における多数の代表的な実施形態を示す。様々な変更、追加および代替設計は、もちろん、前述の説明よりも、むしろ、以下の特許請求の範囲により示される本明細書の範囲から逸脱することなく、前述の教示に照らして当業者に明らかになるであろう。特許請求の範囲の意味及び同等性の範囲内に入るすべての変更および変形は、その範囲内に包含される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図5A-5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【国際調査報告】