特表 2024-535677 即時血液媒介性炎症反応を減少させるための同種細胞療法を目的とした遺伝子改変細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-02

(54)【発明の名称】即時血液媒介性炎症反応を減少させるための同種細胞療法を目的とした遺伝子改変細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240925BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 17/14 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 38/13 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/675 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/436 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 35/39 20150101ALI20240925BHJP

   A61K 35/407 20150101ALI20240925BHJP

   A61K 47/20 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/727 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/721 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 38/55 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 35/44 20150101ALI20240925BHJP

   A61K 35/55 20150101ALI20240925BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240925BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240925BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20240925BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/57 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 47/55 20170101ALI20240925BHJP

   A61K 31/5355 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/5365 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240925BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20240925BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240925BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240925BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALN20240925BHJP

   C12N 5/0786 20100101ALN20240925BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALN20240925BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALN20240925BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20240925BHJP

   C07K 14/54 20060101ALN20240925BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20240925BHJP

   C12N 1/04 20060101ALN20240925BHJP

   C07K 14/81 20060101ALN20240925BHJP

   A61J 3/00 20060101ALN20240925BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61P3/10 ZNA

A61P35/00

A61P9/00

A61P27/02

A61P5/14

A61P17/00

A61P1/16

A61P35/02

A61P7/00

A61P7/06

A61P37/02

A61P17/14

A61P21/00

A61P25/02

A61P37/08

A61P1/18

A61P27/16

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P13/10

A61P25/00

A61P21/04

A61P1/04

A61P25/16

A61P25/28

A61P25/18

A61P25/24

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K38/13

A61K31/675

A61K31/436

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K35/39

A61K35/407

A61K47/20

A61K31/727

A61K38/05

A61K31/721

A61K31/198

A61K38/55

A61K35/44

A61K35/55

A61K35/12

A61K35/17

A61P13/12

A61K35/30

C12M1/00 A

A61K31/57

A61K47/55

A61K31/5355

A61K31/5365

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N15/09 110

C12N5/0783

C12N5/0781

C12N5/0786

C12N5/0735

C12N5/0775

C12N5/077

C07K14/54

C07K14/705

C12N1/04

C07K14/81

A61J3/00 301

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508655

(86)(22)【出願日】2022-08-11

(85)【翻訳文提出日】2024-04-11

(86)【国際出願番号】 US2022074870

(87)【国際公開番号】W WO2023019225

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】63/232,162

(32)【優先日】2021-08-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/353,527

(32)【優先日】2022-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＹＲＥＸ

(71)【出願人】

【識別番号】522043688

【氏名又は名称】サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】シュレプファー ソニア

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

4C047

4C076

4C084

4C085

4C086

4C087

4C206

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B029AA27

4B029BB11

4B029GA08

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065BB32

4B065BD09

4B065BD12

4B065CA24

4B065CA44

4C047AA11

4C047CC04

4C076CC07

4C076CC42

4C076DD55

4C076EE59

4C084AA19

4C084AA22

4C084AA23

4C084BA14

4C084BA23

4C084BA24

4C084DC32

4C084DC34

4C084NA05

4C084ZA331

4C084ZA361

4C084ZA542

4C084ZA751

4C084ZA891

4C084ZB082

4C084ZB261

4C084ZC061

4C084ZC351

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB17

4C086AA01

4C086AA02

4C086BA17

4C086CB22

4C086DA12

4C086DA35

4C086EA05

4C086EA20

4C086EA27

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA05

4C086NA05

4C086NA06

4C086ZA54

4C086ZB08

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087MA65

4C087MA66

4C087MA67

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA22

4C087ZA33

4C087ZA36

4C087ZA51

4C087ZA55

4C087ZA68

4C087ZA75

4C087ZA81

4C087ZA90

4C087ZA94

4C087ZA96

4C087ZB07

4C087ZB08

4C087ZB13

4C087ZB15

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC06

4C087ZC35

4C087ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206JA58

4C206MA03

4C206MA04

4C206MA05

4C206NA06

4C206ZA54

4C206ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045AA40

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA50

4H045DA56

4H045EA20

(57)【要約】

同種細胞療法に使用するための１つ以上の改変、例えば、遺伝子改変を含有する、操作細胞が提供される。いくつかの実施形態では、操作細胞は、低免疫原性細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ１４２の発現減少を含み、及び／または抗凝固剤と組み合わせて投与される。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる、（ｉｉ）ＣＤ１４２の発現を減少させる、ならびに（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる改変を含む操作細胞であって、（ｉ）の前記発現増加ならびに（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の前記発現減少が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、前記操作細胞。

【請求項2】

（ｉｉｉ）における前記改変のうち１つ以上が、
ａ．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子
ｂ．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または
ｃ．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子
の発現を減少させる、請求項１に記載の操作細胞。

【請求項3】

前記１つ以上の改変が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ及び／またはＮＦＹ－Ｃ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の分子の発現を減少させる、請求項１または請求項２に記載の操作細胞。

【請求項4】

Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ及び／またはＮＦＹ－Ｃ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の分子を発現しない、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項5】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の寛容原性因子を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項6】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項５に記載の操作細胞。

【請求項7】

前記１つ以上の寛容原性因子が、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の寛容原性因子を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項8】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項9】

前記１つ以上の寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項10】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ２４を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項11】

前記１つ以上の寛容原性因子がＰＤＬ１を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項12】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ５５を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項13】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＲ１を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項14】

前記１つ以上の寛容原性因子がＭＡＮＦを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項15】

前記１つ以上の寛容原性因子がＡ２０／ＴＮＦＡＩＰ３を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項16】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項17】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項18】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項19】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項20】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項21】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項22】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項23】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項24】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項25】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項26】

（ｉ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる、ならびに（ｉｉ）ＣＤ１４２の発現を減少させる改変を含む操作細胞であって、（ｉ）の前記発現増加及び（ｉｉ）の前記発現減少が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、前記操作細胞。

【請求項27】

（ｉ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる、（ｉｉ）ＣＤ４６の発現を増加させる、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ５９の発現を増加させる前記改変のうち１つ以上が、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させる１つ以上の改変を含む、請求項２６に記載の操作細胞。

【請求項28】

前記内因性遺伝子が、前記ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、ＣＤ４６、またはＣＤ５９をコードする、請求項２７に記載の操作細胞。

【請求項29】

内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させる前記１つ以上の改変が、前記遺伝子の内因性プロモーターもしくはエンハンサーの１つ以上の改変または異種プロモーターの導入を含む、請求項２７または２８に記載の操作細胞。

【請求項30】

前記異種プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項２９に記載の操作細胞。

【請求項31】

前記操作細胞が、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させる１つ以上の改変をさらに含み、前記１つ以上の補体インヒビターの前記発現増加が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、請求項１～３０のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項32】

発現を増加させる前記改変（複数可）が、表面発現の増加を含み、及び／または発現を減少させる前記改変が、表面発現の減少を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項33】

前記１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させる前記改変が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項３１または請求項３２に記載の操作細胞。

【請求項34】

前記１つ以上の補体インヒビターが、ＣＤ４６及びＣＤ５９であり、任意に前記改変が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項35】

前記１つ以上の補体インヒビターが、ＣＤ４６、ＣＤ５９及びＣＤ５５であり、任意に前記改変が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項36】

ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードする、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項37】

ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：３に記載される配列をコードする、請求項３６に記載の操作細胞。

【請求項38】

ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項39】

ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：５に記載される配列をコードする、請求項３８に記載の操作細胞。

【請求項40】

ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項41】

ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：８に記載される配列をコードする、請求項４０に記載の操作細胞。

【請求項42】

ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが各々、プロモーターに機能的に連結されている、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項43】

ＣＤ４７の発現を増加させる前記改変が、前記ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項５～４２のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項44】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、前記操作細胞の自然免疫死滅を減少させる、請求項４３に記載の操作細胞。

【請求項45】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：１に記載される配列をコードする、請求項４３～４４のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項46】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、プロモーターに機能的に連結されている、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項47】

前記１つ以上の寛容原性因子をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される２つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むマルチシストロン性ベクターを含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項48】

前記ポリヌクレオチドの各々が、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドによって隔てられている、請求項４７に記載の操作細胞。

【請求項49】

前記マルチシストロン性ベクターの各ポリヌクレオチドが、同じプロモーターに機能的に連結されている、請求項４７～４８のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項50】

前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項51】

前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項52】

前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項５０または請求項５１に記載の操作細胞。

【請求項53】

前記マルチシストロン性ベクターが第１導入遺伝子であり、前記操作細胞が、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む別個の導入遺伝子を含む、請求項５０または請求項５１に記載の操作細胞。

【請求項54】

ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項55】

前記操作細胞が、第１導入遺伝子及び第２導入遺伝子を含み、
前記第１及び第２導入遺伝子の各々が、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、
前記第１及び第２導入遺伝子が、モノシストロン性またはマルチシストロン性ベクターである、請求項１～４６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項56】

前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項４２～５５のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項57】

前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、前記ＥＦ１ａプロモーター、前記ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項４２～５６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項58】

ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５ポリペプチドをコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、前記操作細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項３３～５７のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項59】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれる、請求項４３～５８のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項60】

前記組込みが、前記操作細胞の前記ゲノムへの非標的挿入によって、任意にレンチウイルスベクターを使用した前記細胞中への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって行われる、請求項５８または請求項５９に記載の操作細胞。

【請求項61】

前記組込みが、前記細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって行われる、請求項５８または請求項５９に記載の操作細胞。

【請求項62】

前記標的ゲノム座位が、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座、及びＫＤＭ５Ｄ遺伝子座からなる群から選択される、請求項６１に記載の操作細胞。

【請求項63】

前記標的ゲノム座位が、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、ＴＡＰ１遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、またはセーフハーバー座位である、請求項６２に記載の操作細胞。

【請求項64】

前記標的ゲノム座位が、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択される、請求項６３に記載の操作細胞。

【請求項65】

前記セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、請求項６４に記載の操作細胞。

【請求項66】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、第１標的ゲノム座位中に組み込まれ、ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、第２標的ゲノム座位中に組み込まれ、ＣＤ５９をコードする前記ポリヌクレオチドが、第３標的ゲノム座位中に組み込まれる、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項67】

ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、第４標的ゲノム座位中に組み込まれる、請求項６６に記載の操作細胞。

【請求項68】

前記第１、第２、及び第３標的ゲノム座位のうち少なくとも２つが同じ座位である、請求項６６に記載の操作細胞。

【請求項69】

前記第１、第２、第３、及び第４標的ゲノム座位のうち少なくとも２つが同じ座位である、請求項６７または請求項６８に記載の操作細胞。

【請求項70】

前記第１、第２及び第３標的ゲノム座位が同じ座位である、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項71】

前記第１、第２、第３、及び第４標的ゲノム座位が同じ座位である、請求項６６～７０に記載の操作細胞。

【請求項72】

前記第１、第２、及び第３標的ゲノム座位の各々が、異なる座位である、請求項６６または請求項６７に記載の操作細胞。

【請求項73】

前記第１、第２、第３、及び第４標的ゲノム座位が、異なる座位である、請求項６７に記載の操作細胞。

【請求項74】

ＣＤ１４２の発現を減少させる前記改変が、ＣＤ１４２タンパク質発現を減少させる、請求項１～７３のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項75】

前記改変が、ＣＤ１４２遺伝子活性を排除する、請求項７４に記載の操作細胞。

【請求項76】

前記改変が、前記ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、請求項７４または７５に記載の操作細胞。

【請求項77】

前記改変が、前記細胞における全てのＣＤ１４２コード配列の不活性化または破壊を含む、請求項７５～７６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項78】

前記不活性化または破壊が、前記ＣＤ１４２遺伝子内のインデルを含む、請求項７６または請求項７７に記載の操作細胞。

【請求項79】

前記改変が、前記ＣＤ１４２遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または連続ストレッチの欠失である、請求項６１～６５のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項80】

ＣＤ１４２遺伝子がノックアウトされている、請求項７５～７９のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項81】

前記改変がゲノム改変タンパク質によって行われ、任意に前記改変が、ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集によって行われる、請求項７５～８０のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項82】

前記ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または前記ＣＤ１４２遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意に前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される、請求項８１に記載の操作細胞。

【請求項83】

前記ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ＣＤ１４２遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項８２に記載の操作細胞。

【請求項84】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項８３に記載の操作細胞。

【請求項85】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる前記改変が、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる、請求項１～２５及び２７～８４のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項86】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる前記改変が、Ｂ２Ｍの発現減少を含む、請求項１～２５及び２７～８５のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項87】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる前記改変が、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の減少を含む、請求項７４～８６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項88】

前記改変が、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する、請求項８６または請求項８７に記載の操作細胞。

【請求項89】

前記改変が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、請求項８６～８８のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項90】

前記改変が、前記細胞における全てのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む、請求項８６～８９のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項91】

前記不活性化または破壊が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内のインデルを含む、請求項８９または請求項９０に記載の操作細胞。

【請求項92】

前記改変が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または連続ストレッチの欠失である、請求項８６～９１のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項93】

前記Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされている、請求項８６～９２のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項94】

前記改変がゲノム改変タンパク質によって行われ、任意に前記改変が、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、請求項８５～９３のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項95】

前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、または前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せを使用して実施され、任意に前記改変が、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２を使用するヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、請求項９４に記載の操作細胞。

【請求項96】

前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項９５に記載の操作細胞。

【請求項97】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項９６に記載の操作細胞。

【請求項98】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる前記改変が、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる、請求項１～２５、及び２７～９７のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項99】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる前記改変が、ＣＩＩＴＡの発現減少を含む、請求項１～２５及び２７～９８のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項100】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる前記改変が、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の減少を含む、請求項９９に記載の操作細胞。

【請求項101】

前記改変がＣＩＩＴＡを排除する、請求項９９または請求項１００に記載の操作細胞。

【請求項102】

前記改変が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、請求項９９～１０１のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項103】

前記改変が、前記細胞における全てのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む、請求項９９～１０２のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項104】

前記不活性化または破壊が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子内のインデルを含む、請求項１０２または請求項１０３に記載の操作細胞。

【請求項105】

前記インデルが、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または連続ストレッチの欠失である、請求項１０２～１０４のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項106】

ＣＩＩＴＡ遺伝子がノックアウトされている、請求項９９～１０５のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項107】

前記改変が、ゲノム改変タンパク質によって行われる、請求項１～１０６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項108】

前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、または部位特異的ターゲティング要素を介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）による改変である、請求項１０７に記載の操作細胞。

【請求項109】

前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集である、請求項１０７または１０８に記載の操作細胞。

【請求項110】

前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意に前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される、請求項１０９に記載の操作細胞。

【請求項111】

前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される１つ以上のタンパク質によって実施される、請求項１０７または１０８に記載の操作細胞。

【請求項112】

前記改変が、ＮＬＲＣ５、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＣＤ１４２、ＡＢＯ、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＮＬＧＮ４Ｙ及びＲＨＤのうちいずれか１つ以上の発現を減少させる、請求項１～１１１のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項113】

（ｉ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる、（ｉｉ）ＣＤ４６の発現を増加させる、及び（ｉｉｉ）ＣＤ５９の発現を増加させる前記改変のうち１つ以上が、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させる１つ以上の改変を含む、請求項１～１１２のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項114】

前記内因性遺伝子が、前記１つ以上の寛容原性因子、ＣＤ４６、またはＣＤ５９をコードする、請求項１１３に記載の操作細胞。

【請求項115】

前記内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させる前記１つ以上の改変が、前記遺伝子の内因性プロモーターもしくはエンハンサーに対する１つ以上の改変または異種プロモーターの導入を含む、請求項１１３または１１４に記載の操作細胞。

【請求項116】

前記異種プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項１１５に記載の操作細胞。

【請求項117】

ヒト細胞または動物細胞である、請求項１～１１６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項118】

ヒト細胞である、請求項１１７に記載の操作細胞。

【請求項119】

血液にさらされる細胞型、または前記血液にさらされる細胞型に分化できる細胞型である、請求項１～１１８のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項120】

多能性幹細胞またはその子孫に由来する分化細胞である、請求項１～１１９のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項121】

前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１２０に記載の操作細胞。

【請求項122】

ドナー対象から単離された初代細胞である、請求項１１９に記載の操作細胞。

【請求項123】

前記ドナー対象が、健康であるか、または個々のドナーからドナー試料が得られた時点で疾患もしくは状態を有すると疑われていない、請求項１２２に記載の操作細胞。

【請求項124】

島細胞、ベータ島細胞、膵島細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ細胞、内皮細胞、筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞、視細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、及び血液細胞からなる群から選択される、請求項１～１２３のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項125】

内皮細胞である、請求項１～１２４のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項126】

上皮細胞である、請求項１～１２５のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項127】

Ｔ細胞である、請求項１２６に記載の操作細胞。

【請求項128】

ＮＫ細胞である、請求項１２７に記載の操作細胞。

【請求項129】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１２７または請求項１２８に記載の操作細胞。

【請求項130】

幹細胞である、請求項１２４に記載の操作細胞。

【請求項131】

造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項１２４に記載の操作細胞。

【請求項132】

ベータ島細胞である、請求項１２４に記載の操作細胞。

【請求項133】

肝細胞である、請求項１２４に記載の操作細胞。

【請求項134】

多能性幹細胞である、請求項１２４に記載の操作細胞。

【請求項135】

人工多能性幹細胞である、請求項１２４に記載の操作細胞。

【請求項136】

胚性幹細胞である、請求項１２４に記載の操作細胞。

【請求項137】

ＡＢＯ式血液型のＯ型である、請求項１～１３６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項138】

Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である、請求項１～１３７のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項139】

ＡＢＯの機能的Ａアレル及び／またはＡＢＯの機能的Ｂアレルを含む、請求項１～１３６及び１３８のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項140】

Ｒｈ因子陽性（Ｒｈ＋）である、請求項１～１３７及び１３９のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項141】

操作細胞を生成する方法であって、
ａ．前記細胞内の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させるか、または排除すること、
ｂ．前記細胞内のＣＤ１４２の発現を減少させること、ならびに
ｃ．前記細胞内の寛容原性因子の発現を増加させること
を含む、前記方法。

【請求項142】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１４１に記載の方法。

【請求項143】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項１４２に記載の方法。

【請求項144】

前記１つ以上の寛容原性因子が、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の寛容原性因子を含む、請求項１４１～１４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項145】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７を含む、請求項１４３または請求項１４４に記載の方法。

【請求項146】

前記１つ以上の寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅを含む、請求項１４１～１４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項147】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ２４を含む、請求項１４１～１４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項148】

前記１つ以上の寛容原性因子がＰＤＬ１を含む、請求項１４１～１４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項149】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ５５を含む、請求項１４１～１４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項150】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＲ１を含む、請求項１４１～１４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項151】

前記１つ以上の寛容原性因子がＭＡＮＦを含む、請求項１４１～１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項152】

前記１つ以上の寛容原性因子がＡ２０／ＴＮＦＡＩＰ３を含む、請求項１４１～１５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項153】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７を含む、請求項１４１～１５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項154】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、請求項１４１～１５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項155】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、請求項１４１～１５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項156】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、請求項１４１～１５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項157】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、請求項１４１～１５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項158】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、請求項１４１～１５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項159】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１を含む、請求項１４１～１５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項160】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰを含む、請求項１４１～１５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項161】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦを含む、請求項１４１～１６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項162】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦを含む、請求項１４１～１６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項163】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の前記発現を減少させることを含む、請求項１４１～１６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項164】

寛容原性の発現を増加させることが、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることを含む、請求項１４１～１６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項165】

前記内因性遺伝子が、前記寛容原性因子をコードする、請求項１６４に記載の方法。

【請求項166】

前記内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることが、前記遺伝子の内因性プロモーターもしくはエンハンサーを改変すること、または異種プロモーターを導入することを含む、請求項１６４または１６５に記載の方法。

【請求項167】

前記異種プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項１６６に記載の方法。

【請求項168】

低免疫原性細胞を生成する方法であって、
ａ．前記細胞内のＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させること、ならびに
ｂ．前記細胞内のＣＤ１４２の発現を減少させること
を含む、前記方法。

【請求項169】

前記細胞内の、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることをさらに含む、請求項１４１～１６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項170】

ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及び／または１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることが、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることを含む、請求項１６８または１６９に記載の方法。

【請求項171】

前記内因性遺伝子が、前記ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、ＣＤ４６、またはＣＤ５９をコードする、請求項１７０に記載の方法。

【請求項172】

前記内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることが、前記遺伝子の内因性プロモーターもしくはエンハンサーを改変すること、または異種プロモーターを導入することを含む、請求項１７０または請求項１７１に記載の方法。

【請求項173】

前記異種プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項１７２に記載の方法。

【請求項174】

前記発現減少が表面発現の減少を含み、及び／または前記発現増加が表面発現の増加を含み、任意に前記表面発現の減少が、検出可能な表面発現をなんら含まない、請求項１４１～１７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項175】

前記１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを、前記細胞に導入することを含む、請求項１６９～１７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項176】

前記１つ以上の補体インヒビターが、ＣＤ４６及びＣＤ５９であり、任意に前記１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項１６９～１７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項177】

前記１つ以上の補体インヒビターが、ＣＤ４６、ＣＤ５９及びＣＤ５５であり、任意に前記１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項１６９～１７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項178】

ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す、請求項１６９～１７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項179】

ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：３に記載される配列をコードする、請求項１７８に記載の方法。

【請求項180】

ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す、請求項１６９～１７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項181】

ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：５に記載される配列をコードする、１８０に記載の方法。

【請求項182】

ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列をコードし、補体阻害活性を示す、請求項１６９～１８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項183】

ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：８に記載される配列をコードする、請求項１８２に記載の方法。

【請求項184】

ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが各々、プロモーターに機能的に連結されている、請求項１６９～１８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項185】

ＣＤ４７の発現を増加させる前記改変が、前記ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１６９～１８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項186】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列をコードし、前記操作細胞の自然免疫死滅を減少させる、請求項１６９～１８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項187】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：１に記載される配列をコードする、請求項１８６に記載の方法。

【請求項188】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、プロモーターに機能的に連結されている、請求項１６９～１８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項189】

前記１つ以上の寛容原性因子をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される２つ以上の外因性ポリペプチドを含むマルチシストロン性ベクターを、前記細胞に導入することを含む、請求項１６９～１８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項190】

前記ポリヌクレオチドの各々が、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドによって隔てられている、請求項１８９に記載の方法。

【請求項191】

前記２つ以上の外因性ポリヌクレオチドが、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１８９または請求項１９０に記載の方法。

【請求項192】

前記マルチシストロン性ベクターの各ポリヌクレオチドが、同じプロモーターに機能的に連結されている、請求項１８９～１９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項193】

前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１８９～１９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項194】

前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１８９～１９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項195】

前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１９３または請求項１９４に記載の方法。

【請求項196】

前記操作細胞が、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む別個の導入遺伝子を含む、請求項１９３または請求項１９４に記載の方法。

【請求項197】

ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、前記操作細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項１６９～１９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項198】

ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれる、請求項１８５～１９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項199】

前記組込みが、前記操作細胞の前記ゲノムへの非標的挿入によって行われる、請求項１９７または請求項１９８に記載の方法。

【請求項200】

前記組込みが、レンチウイルスベクターを使用した前記細胞中への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって行われる、請求項１９９に記載の方法。

【請求項201】

前記組込みが、前記細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって行われ、任意に前記標的挿入が、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、請求項１９７または請求項１９８に記載の方法。

【請求項202】

前記標的ゲノム座位が、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座、及びＫＤＭ５Ｄ遺伝子座からなる群から選択される、請求項２０１に記載の方法。

【請求項203】

前記標的ゲノム座位が、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、ＴＡＰ１遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、またはセーフハーバー座位である、請求項２０１または請求項２０２に記載の方法。

【請求項204】

前記標的ゲノム座位が、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択される、請求項２０１または請求項２０２に記載の方法。

【請求項205】

前記標的ゲノム座位がセーフハーバー座位である、請求項２０１～２０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項206】

前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または前記標的ゲノム座位を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意に前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される、請求項２０１～２０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項207】

前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記標的ゲノム座位の標的配列に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドを含む相同組換え修復鋳型とを含む、請求項２０６に記載の方法。

【請求項208】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項２０７に記載の方法。

【請求項209】

ＣＤ１４２の発現を減少させることが、ＣＤ１４２タンパク質発現を減少させる、請求項１４１～２０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項210】

ＣＤ１４２の発現を減少させることが、ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる改変を導入することを含む、請求項２０９に記載の方法。

【請求項211】

ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる前記改変が、前記ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、請求項２１０に記載の方法。

【請求項212】

ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる前記改変が、前記細胞における全てのＣＤ１４２コード配列の不活性化または破壊を含む、請求項２１０または請求項２１１に記載の方法。

【請求項213】

前記不活性化または破壊が、前記ＣＤ１４２遺伝子内のインデル、または前記ＣＤ１４２遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失を含む、請求項２１１または請求項２１２に記載の方法。

【請求項214】

前記インデルが、フレームシフト変異である、請求項２１３に記載の方法。

【請求項215】

前記ＣＤ１４２遺伝子がノックアウトされる、請求項２１０～２１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項216】

ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる前記改変が、ゲノム改変タンパク質によって導入され、任意にＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる前記改変が、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって導入される、請求項２１０～２１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項217】

前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、または前記ＣＤ１４２遺伝子を標的とする任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せを使用して実施され、任意に前記改変が、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２を使用するヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、請求項２１６に記載の方法。

【請求項218】

前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ＣＤ１４２遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項２１７に記載の方法。

【請求項219】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項２１８に記載の方法。

【請求項220】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させることが、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変を導入することを含む、請求項１４１～２１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項221】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、Ｂ２Ｍの発現減少を含む、請求項２２０に記載の方法。

【請求項222】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の減少を含む、請求項２２０または２２１に記載の方法。

【請求項223】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を減少させる、請求項２２１または２２２に記載の方法。

【請求項224】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる前記改変が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、請求項２２１～２２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項225】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、前記細胞における全てのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む、請求項２２１～２２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項226】

前記不活性化または破壊が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内のインデル、または前記Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失を含む、請求項２２４または請求項２２５に記載の方法。

【請求項227】

前記インデルが、フレームシフト変異である、請求項２２６に記載の方法。

【請求項228】

前記Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされる、請求項２２１～２２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項229】

１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、ゲノム改変タンパク質によって行われ、任意に１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、請求項２２１～２２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項230】

前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、または前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せを使用して実施され、任意に前記改変が、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２を使用するヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、請求項２２９に記載の方法。

【請求項231】

前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項２３０に記載の方法。

【請求項232】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項２３１に記載の方法。

【請求項233】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させることが、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変を導入することを含む、請求項１４１～２３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項234】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、ＣＩＩＴＡの発現減少を含む、請求項２３３に記載の方法。

【請求項235】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の減少を含む、請求項２３３または２３４に記載の方法。

【請求項236】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性を減少させる、請求項２３３または請求項２３４に記載の方法。

【請求項237】

１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、請求項２３３～２３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項238】

前記改変が、前記細胞における全てのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む、請求項２３３～２３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項239】

前記不活性化または破壊が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子内のインデル、または前記ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失を含む、請求項２３７または請求項２３８に記載の方法。

【請求項240】

前記インデルが、フレームシフト変異である、請求項２３９に記載の方法。

【請求項241】

前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がノックアウトされる、請求項２３４～２４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項242】

前記細胞が、ヒト細胞または動物細胞であり、任意に前記動物細胞が、ブタ（ｐｉｇ）（ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ））細胞、ウシ（ｃｏｗ）（ウシ（ｂｏｖｉｎｅ））細胞、またはヒツジ（ｓｈｅｅｐ）（ヒツジ（ｏｖｉｎｅ））細胞である、請求項１４１～２４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項243】

前記操作細胞がヒト細胞である、請求項１４１～２４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項244】

前記細胞が、血液にさらされる細胞型、または前記血液にさらされる細胞型に分化できる細胞型である、請求項１４１～２４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項245】

前記細胞が、ドナー対象から単離された初代細胞である、請求項１４１～２４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項246】

前記細胞が多能性幹細胞であり、前記操作細胞が、前記多能性幹細胞に由来する分化細胞であり、前記方法が、前記多能性幹細胞を分化させることをさらに含む、請求項１４１～２４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項247】

前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項２４６に記載の方法。

【請求項248】

前記操作細胞が、島細胞、ベータ島細胞、膵島細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ細胞、内皮細胞、筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞、視細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、及び血液細胞からなる群から選択される、請求項１４１～２４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項249】

前記操作細胞がベータ島細胞である、請求項２４８に記載の方法。

【請求項250】

前記操作細胞が肝細胞である、請求項２４８に記載の方法。

【請求項251】

請求項１４１～２５０のいずれか一項に記載の方法に従って作製される、操作細胞。

【請求項252】

前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時にＮＫ細胞媒介性細胞傷害を回避できる、請求項１～１４０及び２５１のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項253】

前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に成熟ＮＫ細胞による細胞溶解から保護される、請求項１～１４０及び２５１～２５２のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項254】

前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に前記細胞に対する免疫応答を誘導しない、請求項１～１４０及び２５１～２５３のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項255】

前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に前記細胞に対する全身性炎症反応を誘導しない、請求項１～１４０及び２５１～２５４のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項256】

前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に前記細胞に対する局所性炎症反応を誘導しない、請求項１～１４０及び２５１～２５５のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項257】

前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に補体経路活性化を誘導しない、請求項１～１４０及び２５１～２５６のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項258】

前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に凝固を誘導しない、請求項１～１４０及び２５１～２５７のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項259】

前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に即時血液媒介性炎症反応を誘導しない、請求項１～１４０及び２５１～２５８のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項260】

前記レシピエント患者への投与時に血液と接触する、請求項２５８～２５９に記載の操作細胞。

【請求項261】

請求項１～１４０及び２５１～２６０のいずれか一項に記載の操作細胞を複数含む、細胞集団。

【請求項262】

前記集団内の細胞の少なくとも約３０％が、前記操作細胞である、請求項２６１に記載の集団。

【請求項263】

前記複数の操作初代細胞が、２以上のドナー対象からプールした細胞に由来する、請求項２６１または２６２に記載の操作細胞集団。

【請求項264】

前記２以上のドナー対象の各々が、健康な対象であるか、または前記ドナー対象から前記ドナー試料が得られた時点で疾患もしくは状態を有すると疑われていない、請求項２６３に記載の操作初代細胞集団。

【請求項265】

前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、前記改変を含む、請求項２６１～２６４のいずれか一項に記載の集団。

【請求項266】

前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２６１～２６５のいずれか一項に記載の集団。

【請求項267】

前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２６１～２６６のいずれか一項に記載の集団。

【請求項268】

前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２６１～２６７のいずれか一項に記載の集団。

【請求項269】

前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２６１～２６８のいずれか一項に記載の集団。

【請求項270】

前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む、請求項２６１～２６９のいずれか一項に記載の集団。

【請求項271】

前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む、請求項２６１～２７０のいずれか一項に記載の集団。

【請求項272】

前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、未変更または非改変の野生型細胞と比較してＣＤ１４２の発現減少を含む、請求項２６１～２７１のいずれか一項に記載の集団。

【請求項273】

前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ１４２遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む、請求項２６１～２７２のいずれか一項に記載の集団。

【請求項274】

請求項２６１～２７３のいずれか一項に記載の集団または請求項１～１４０及び２５１～２６０のいずれか一項に記載の操作細胞を含む、組成物。

【請求項275】

操作ベータ島細胞の集団を含む組成物であって、前記操作ベータ島細胞が、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、前記組成物。

【請求項276】

前記操作ベータ細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、請求項２７５に記載の組成物。

【請求項277】

操作肝細胞の集団を含む組成物であって、前記操作肝細胞が、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、前記組成物。

【請求項278】

前記操作肝細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、請求項２７７に記載の組成物。

【請求項279】

前記導入遺伝子が、マルチシストロン性ベクターであり、前記導入遺伝子が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項２７５～２７８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項280】

前記ベータ島細胞または肝細胞が、マルチシストロン性ベクターをさらに含み、前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２７５～２７８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項281】

前記導入遺伝子（複数可）が、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって標的ゲノム座位に導入される、請求項２７５～２７８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項282】

前記不活性化または破壊が、ゲノム改変タンパク質によって行われ、任意に前記不活性化または破壊が、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、請求項２７５～２８１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項283】

前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、または前記標的ゲノム座位を標的とする任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せを使用して実施され、任意に前記改変が、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２を使用するヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、請求項２８１～２８２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項284】

医薬組成物である、請求項２７５～２８３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項285】

薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項２８４に記載の組成物。

【請求項286】

凍結保護剤を含む無血清凍結保存培地内で製剤化される、請求項２８４～２８５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項287】

前記凍結保護剤がＤＭＳＯであり、前記凍結保存培地が、５％～１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、請求項２８６に記載の組成物。

【請求項288】

前記凍結保護剤が、１０％または約１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、請求項２８６または２８７に記載の組成物。

【請求項289】

滅菌されている、請求項２７５～２８８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項290】

請求項２７５～２８９のいずれか一項に記載の組成物を含む、容器。

【請求項291】

滅菌バッグである、請求項２９０に記載の容器。

【請求項292】

凍結保存適合性バッグである、請求項２９１に記載の滅菌バッグ。

【請求項293】

その必要のある患者の疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法であって、有効量の請求項２６１～２７３のいずれか一項に記載の集団または請求項２７４～２８９のいずれか一項に記載の組成物を、前記患者に投与することを含む、前記方法。

【請求項294】

凝固を減少させる抗凝固剤を前記患者に投与することをさらに含む、請求項２９３に記載の方法。

【請求項295】

その必要のある患者の疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法であって、以下：
（ａ）複数の操作細胞を含む有効量の細胞集団を前記患者に投与することであって、
前記操作細胞が、
（ｉ）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビター（複数可）の発現を増加させる、
（ｉｉ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる、ならびに
（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる
改変を含み、
ここで、（ｉ）及び（ｉｉ）の前記発現増加ならびに（ｉｉｉ）の前記発現減少が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、投与することと、
（ｂ）凝固を減少させる抗凝固剤を前記患者に投与することと
を含む、前記方法。

【請求項296】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、及びＳＥＲＰＩＮＢ９からなる群から選択される、請求項２９５に記載の方法。

【請求項297】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７である、請求項２９６に記載の方法。

【請求項298】

その必要のある患者の疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法であって、以下：
（ａ）複数の操作細胞を含む有効量の細胞集団を前記患者に投与することであって、
前記操作細胞が、
（ｉ）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビター（複数可）の発現を増加させる、ならびに
（ｉｉ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる
改変を含み、
ここで、（ｉ）及び（ｉｉ）の前記発現増加が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、投与すること、ならびに
（ｂ）凝固を減少させる抗凝固剤を前記患者に投与すること
を含む、前記方法。

【請求項299】

前記集団が、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として製剤化される、請求項２９８に記載の方法。

【請求項300】

前記集団及び前記抗凝固剤が、同時にまたは連続して投与される、請求項２９４～２９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項301】

前記抗凝固剤がヘパリンである、請求項２９４～３００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項302】

前記ヘパリンが未分画ヘパリンである、請求項３０１に記載の方法。

【請求項303】

前記ヘパリンが低分子量ヘパリンである、請求項３０１に記載の方法。

【請求項304】

前記ヘパリンが可溶性ヘパリンである、請求項３０１～３０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項305】

前記ヘパリンが、前記患者に前記細胞を投与する前に前記細胞の表面上に固定化される、請求項３０１～３０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項306】

前記抗凝固剤が、メラガトランまたはＬＭＷ－ＤＳである、請求項２９４～３０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項307】

前記抗凝固剤が、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である、請求項２９４～３０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項308】

前記抗凝固剤が、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣである、請求項２９４～３０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項309】

前記状態または疾患が、糖尿病、がん、血管新生障害、眼疾患、甲状腺疾患、皮膚疾患、及び肝疾患からなる群から選択される、請求項２９３～３０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項310】

前記細胞欠損症が糖尿病と関連するか、または前記疾患もしくは状態が糖尿病であり、任意に前記糖尿病がＩ型糖尿病である、請求項２９３～３０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項311】

前記細胞集団が、ベータ島細胞を含む島細胞の集団である、請求項３１０に記載の方法。

【請求項312】

前記島細胞が、島前駆細胞、未成熟島細胞、及び成熟島細胞からなる群から選択される、請求項３１１に記載の方法。

【請求項313】

前記細胞欠損症が、血管状態もしくは疾患と関連するか、または疾患もしくは状態が、血管状態もしくは疾患である、請求項２９３～３０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項314】

前記細胞集団が内皮細胞の集団である、請求項３１３に記載の方法。

【請求項315】

前記細胞欠損症が自己免疫性甲状腺炎と関連するか、または前記疾患もしくは状態が自己免疫性甲状腺炎である、請求項２９３～３０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項316】

前記細胞集団が、甲状腺前駆細胞の集団である、請求項３１５に記載の方法。

【請求項317】

前記細胞欠損症が肝疾患と関連するか、または前記疾患が肝疾患である、請求項２９３～３０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項318】

前記肝疾患が肝硬変を含む、請求項３１７に記載の方法。

【請求項319】

前記細胞集団が、肝細胞または肝前駆細胞の集団である、請求項３１７または３１８に記載の方法。

【請求項320】

前記細胞欠損症が角膜疾患と関連するか、または前記疾患が角膜疾患である、請求項２９３～３０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項321】

前記角膜疾患が、フックスジストロフィーまたは先天性遺伝性内皮ジストロフィーである、請求項３２０に記載の方法。

【請求項322】

前記細胞集団が、角膜内皮前駆細胞または角膜内皮細胞の集団である、請求項３２０または３２１に記載の方法。

【請求項323】

前記細胞欠損症が腎疾患と関連するか、または前記疾患が腎疾患である、請求項２９３～３０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項324】

前記細胞集団が、腎前駆細胞または腎細胞の集団である、請求項３２３に記載の方法。

【請求項325】

前記細胞欠損症ががんと関連するか、または前記疾患ががんである、請求項２９３～３０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項326】

前記がんが、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌からなる群から選択される、請求項３２５に記載の方法。

【請求項327】

前記細胞集団が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の集団である、請求項３２５または３２６に記載の方法。

【請求項328】

前記細胞欠損症が、造血器疾患もしくは障害と関連するか、または前記疾患もしくは状態が、造血器疾患もしくは障害である、請求項２９３～３０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項329】

前記造血器疾患または障害が、骨髄異形成症、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、鎌状赤血球症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、シュワッハマン・ダイアモンド障害、コストマン症候群、慢性肉芽腫症、副腎白質ジストロフィー、白血球接着不全、血友病、サラセミア、ベータ－サラセミア、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄）白血病（ＡＭＬ）、成人リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）など、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖性重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、慢性肉芽腫症、チェディアック・東症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはＡＩＤＳである、請求項３２８に記載の方法。

【請求項330】

前記細胞欠損症が、白血病もしくは骨髄腫と関連するか、または前記疾患もしくは状態が、白血病もしくは骨髄腫である、請求項３２８に記載の方法。

【請求項331】

前記細胞欠損症が、自己免疫疾患もしくは状態と関連するか、または前記疾患もしくは状態が、自己免疫疾患もしくは状態である、請求項２９３～３０９及び３２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項332】

前記自己免疫疾患または状態が、急性散在性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫増殖症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病、バロー同心円硬化症、ベーチェット症候群、バージャー病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん皮膚硬化型全身性強皮症、ドレスラー症候群、円板状エリテマトーデス、湿疹、付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバン症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性肺胞炎、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、炎症性脱髄性多発神経炎、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ルー・ゲーリック病、ルポイド肝炎、エリテマトーデス、Ｍａｊｅｅｄ症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織病、限局性強皮症（ｍｏｒｐｈｅａ）、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経脊髄炎、ニューロミオトニア、眼瘢痕性類天疱瘡、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎（ｏｒｄ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スティル病、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、Ｓｕｓａｃ症候群、Ｓｗｅｅｔ症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、未分化脊椎関節症、血管炎、白斑またはウェゲナー肉芽腫症である、請求項３３１に記載の方法。

【請求項333】

前記細胞集団が、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／またはその誘導体を含む集団である、請求項３２８～３３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項334】

前記細胞欠損症が、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経変性疾患もしくは状態、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、精神神経障害発作、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と関連するか、あるいは前記疾患または状態が、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経変性疾患もしくは状態、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、精神神経障害発作、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項２９３～３０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項335】

前記細胞集団が、神経細胞及び／またはグリア細胞を含む集団である、請求項３３４に記載の方法。

【請求項336】

前記細胞が、投与前に増殖及び凍結保存される、請求項２９３～３３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項337】

前記集団を投与することが、前記集団の静脈内注射、筋肉内注射、血管内注射、または移植を含む、請求項２９３～３３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項338】

前記集団が、腎被膜移植または筋肉内注射を介して移植される、請求項３３７に記載の方法。

【請求項339】

前記集団がドナー対象に由来し、前記ドナーのＨＬＡ型が、前記患者のＨＬＡ型と一致しない、請求項２９３～３３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項340】

前記集団がドナーに由来し、前記ドナーの血液型が、前記患者の血液型と一致せず、前記ドナーの前記血液型が、Ｏ型ではない、請求項２９３～３３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項341】

前記集団がドナーに由来し、前記ドナーの前記血液型が、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陽性であり、前記患者の前記血液型が、Ｒｈ陰性である、請求項２９３～３４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項342】

前記患者の血清が、Ｒｈに対する抗体を含む、請求項２９３～３４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項343】

前記集団がヒト細胞集団であり、前記患者がヒト患者である、請求項２９３～３４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項344】

前記細胞集団が、ＡＢＯの機能的Ａアレル及び／またはＡＢＯの機能的Ｂアレルを含む、請求項２９３～３４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項345】

前記細胞集団がＡＢＯ式Ａ抗原を提示し、前記患者の前記血清が抗Ａ抗体を含む、請求項３４４に記載の方法。

【請求項346】

前記細胞集団がＡＢＯ式Ｂ抗原を提示し、前記患者の前記血清が抗Ｂ抗体を含む、請求項３４４に記載の方法。

【請求項347】

前記細胞集団が、ＡＢＯ式Ａ及びＢ抗原を提示し、前記患者の前記血清が、抗Ａ及び／または抗Ｂ抗体を含む、請求項３４４に記載の方法。

【請求項348】

細胞集団がＲｈ因子を発現し、前記患者の前記血清が抗Ｒｈ抗体を含む、請求項２９３～３４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項349】

前記患者に１つ以上の免疫抑制剤を投与することをさらに含む、請求項２９３～３４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項350】

前記患者が、１つ以上の免疫抑制剤を投与されている、請求項２９３～３４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項351】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、小分子または抗体である、請求項３４９または請求項３５０に記載の方法。

【請求項352】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、コルチコステロイド、プレドニゾン、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、ブレキナル、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスパガリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン（チモシン－α）、及び免疫抑制抗体からなる群から選択される、請求項３４９～３５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項353】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロスポリンを含む、請求項３４９～３５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項354】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、ミコフェノール酸モフェチルを含む、請求項３４９～３５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項355】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、コルチコステロイドを含む、請求項３４９～３５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項356】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロホスファミドを含む、請求項３４９～３５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項357】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、ラパマイシンを含む、請求項３４９～３５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項358】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む、請求項３４９～３５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項359】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、抗胸腺細胞グロブリンを含む、請求項３４９～３５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項360】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、１つ以上の免疫調節剤を含む、請求項３４９～３５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項361】

前記１つ以上の免疫調節剤が、小分子または抗体である、請求項３６０に記載の方法。

【請求項362】

前記抗体が、ＩＬ－２受容体のｐ７５、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８からなる群から選択される受容体またはリガンド、及びそれらのリガンドのいずれかに結合する抗体のうち１つ以上に結合する、請求項３５１または請求項３６１に記載の方法。

【請求項363】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項364】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項365】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間前またはそれよりも前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項366】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項367】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間後、またはそれよりも後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項368】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与と同じ日に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項369】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項370】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項371】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項372】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項373】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間前またはそれよりも前に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項374】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項375】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間後、またはそれよりも後に前記患者に投与されるか、または投与されている、請求項３４９～３６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項376】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の前記改変を含まない免疫原性細胞の免疫拒絶を減少させるために投与される１つ以上の免疫抑制剤の投与量と比較して、少ない投与量で投与される、請求項３４９～３７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項377】

前記操作細胞が、前記操作細胞の死滅を制御できる、請求項２９３～３７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項378】

前記操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチを含む、請求項２９３～３７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項379】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、薬物もしくはプロドラッグの存在下で、または選択的外因性化合物による活性化時に、細胞死の制御を誘導する、請求項３７８に記載の方法。

【請求項380】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記操作細胞のアポトーシスを誘導できる誘導性タンパク質である、請求項３７８または請求項３７９に記載の方法。

【請求項381】

前記操作細胞のアポトーシスを誘導できる前記誘導性タンパク質が、カスパーゼタンパク質である、請求項３８０に記載の方法。

【請求項382】

前記カスパーゼタンパク質がカスパーゼ９である、請求項３８１に記載の方法。

【請求項383】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項３８０または請求項３８１に記載の方法。

【請求項384】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記１つ以上の免疫抑制剤を前記患者に投与した後に細胞死の制御を誘導するように活性化される、請求項３７８～３８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項385】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記１つ以上の免疫抑制剤を前記患者に投与する前に細胞死の制御を誘導するように活性化される、請求項３７８～３８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項386】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記操作細胞を前記患者に投与した後に細胞死の制御を誘導するように活性化される、請求項３７８～３８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項387】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、細胞傷害または他の負の結果が前記患者に生じる場合に細胞死の制御を誘導するように活性化される、請求項３７８～３８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項388】

前記操作細胞集団の操作細胞の枯渇を可能にする薬剤を投与することを含む、請求項２９３～３８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項389】

前記操作細胞の枯渇を可能にする前記薬剤が、前記操作細胞の前記表面上に発現されるタンパク質を認識する抗体である、請求項３８８に記載の方法。

【請求項390】

前記抗体が、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、及びＲＱＲ８を認識する抗体からなる群から選択される、請求項３８９に記載の方法。

【請求項391】

前記抗体が、モガムリズマブ、ＡＦＭ１３、ＭＯＲ２０８、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジニツキシマブ（ｄｉｎｉｔｕｘｉｍａｂ）、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される、請求項３８９または請求項３９０に記載の方法。

【請求項392】

前記操作細胞の前記表面上における前記１つ以上の寛容原性因子を認識する薬剤を投与することを含む、請求項２９３～３９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項393】

前記操作細胞が、前記１つ以上の寛容原性因子を発現するように操作される、請求項３９２に記載の方法。

【請求項394】

前記１つ以上の寛容原性因子が、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の寛容原性因子を含む、請求項２９３～３９３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項395】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７を含む、請求項３９３または３９４に記載の方法。

【請求項396】

前記１つ以上の寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅを含む、請求項２９３～３９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項397】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ２４を含む、請求項２９３～３９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項398】

前記１つ以上の寛容原性因子がＰＤＬ１を含む、請求項２９３～３９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項399】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ５５を含む、請求項２９３～３９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項400】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＲ１を含む、請求項２９３～３９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項401】

前記１つ以上の寛容原性因子がＭＡＮＦを含む、請求項２９３～４００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項402】

前記１つ以上の寛容原性因子がＡ２０／ＴＮＦＡＩＰ３を含む、請求項２９３～４０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項403】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７を含む、請求項２９３～４０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項404】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、請求項２９３～４０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項405】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、請求項２９３～４０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項406】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、請求項２９３～４０５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項407】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、請求項２９３～４０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項408】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、請求項２９３～４０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項409】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１を含む、請求項２９３～４０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項410】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰを含む、請求項２９３～４０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項411】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦを含む、請求項２９３～４１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項412】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦを含む、請求項２９３～４１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項413】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７である、請求項３９３または請求項３９４に記載の方法。

【請求項414】

前記患者に１つ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項２９３～４１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項415】

前記患者が、１つ以上の追加の治療剤を投与されている、請求項２９３～４１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項416】

前記方法の治療有効性をモニターすることをさらに含む、請求項２９３～４１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項417】

前記方法の予防有効性をモニターすることをさらに含む、請求項２９３～４１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項418】

１つ以上の疾患症状の所望の抑制が生じるまで繰り返される、請求項２９３～４１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項419】

自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１～１４０及び２５１～２６０のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項420】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項４１９に記載の操作細胞。

【請求項421】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子または安全スイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、請求項４１９または請求項４２０に記載の操作細胞。

【請求項422】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記１つ以上の寛容原性因子が、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、請求項４１９～４２１のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項423】

前記バイシストロン性カセットが、前記操作細胞の前記ゲノムへの非標的挿入によって、任意にレンチウイルスベクターを使用した前記細胞中への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる、請求項４１９または請求項４２０に記載の操作細胞。

【請求項424】

前記バイシストロン性カセットが、前記細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって組み込まれ、任意に前記標的挿入が、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、請求項４１９または４２０に記載の操作細胞。

【請求項425】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７である、請求項４１９～４２４のいずれか一項に記載の操作細胞。

【請求項426】

前記操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１４１～２５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項427】

前記自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項４２６に記載の方法。

【請求項428】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子または安全スイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、請求項４２６または請求項４２７に記載の方法。

【請求項429】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記１つ以上の寛容原性因子が、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、請求項４２６または請求項４２７に記載の方法。

【請求項430】

前記バイシストロン性カセットが、前記操作細胞の前記ゲノムへの非標的挿入によって組み込まれる、請求項４２８または請求項４２９に記載の方法。

【請求項431】

前記バイシストロン性カセットが、前記操作細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって組み込まれる、請求項４２８または請求項４２９に記載の方法。

【請求項432】

前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７である、請求項４２６～４３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項433】

前記操作細胞集団の操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２７４～２８９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項434】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項４３３に記載の組成物。

【請求項435】

前記自殺遺伝子、及び前記自殺遺伝子または安全スイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞集団の操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、請求項４３３または請求項４３４に記載の組成物。

【請求項436】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記外因性ＣＤ４７が、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、請求項４３３～４３５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項437】

前記バイシストロン性カセットが、前記ゲノムへの非標的挿入によって、任意にレンチウイルスベクターを使用した前記操作細胞集団の操作細胞中への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる、請求項４３５または請求項４３６に記載の組成物。

【請求項438】

前記バイシストロン性カセットが、前記操作細胞集団の操作細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって組み込まれ、任意に前記標的挿入が、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、請求項４３５または請求項４３６に記載の組成物。

【請求項439】

請求項２６１～２７３のいずれか一項に記載の操作細胞集団または請求項４１９～４２５のいずれか一項に記載の操作細胞を複数含む細胞集団と、凝固を減少させる抗凝固剤または細胞コーティングとを含む、組合せ。

【請求項440】

（ａ）複数の操作細胞を含む細胞集団であって、
前記操作細胞が、
（ｉ）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビター（複数可）の発現を増加させる、
（ｉｉ）ＣＤ４７の発現を増加させる、ならびに
（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる
改変を含み、
ここで、（ｉ）及び（ｉｉ）の前記発現増加ならびに（ｉｉｉ）の前記発現減少が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、前記細胞集団と、
（ｂ）抗凝固剤と
を含む、組合せ。

【請求項441】

前記抗凝固剤が、ヘパリン、アンチトロンビンの活性化因子、凝固第ＩＩ因子（ｆＩＩ）の阻害剤、凝固第ＶＩＩ因子（ｆＶＩＩ）の阻害剤、及び凝固第Ｘ因子（ｆＸ）の阻害剤からなる群から選択される、請求項４３９または請求項４４０に記載の組合せ。

【請求項442】

前記抗凝固剤がヘパリンである、請求項４４１に記載の組合せ。

【請求項443】

前記ヘパリンが未分画ヘパリンである、請求項４４２に記載の組合せ。

【請求項444】

前記ヘパリンが低分子量ヘパリンである、請求項４４３に記載の組合せ。

【請求項445】

前記ヘパリンが可溶性ヘパリンである、請求項４４１～４４４のいずれか一項に記載の組合せ。

【請求項446】

前記抗凝固剤が、メラガトランまたはＬＭＷ－ＤＳである、請求項４４１に記載の組合せ。

【請求項447】

前記抗凝固剤が、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である、請求項４４１に記載の組合せ。

【請求項448】

前記抗凝固剤が、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣである、請求項４４１に記載の組合せ。

【請求項449】

前記抗凝固剤が、ＣＤ１４２に対する抗体である、請求項４４１に記載の組合せ。

【請求項450】

請求項４４１～４４８のいずれか一項に記載の組成物を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月１１日出願の米国仮特許出願第６３／２３２，１６２号、及び２０２２年６月１７日出願の米国仮特許出願第６３／３５３，５２７号に対する優先権を主張し、その各々の内容全体が、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子配列表の参照
電子配列表の内容（１８６１５２００５２４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌ、サイズ：４１，５６７バイト、及び作成日：２０２２年８月９日）は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0003】

分野
ある特定の態様では、本開示は、同種細胞療法に使用するための、遺伝子改変などの１つ以上の改変を含有する操作細胞を対象とする。いくつかの実施形態では、操作細胞は、低免疫原性細胞である。

【発明の概要】

【0004】

概要
ドナー同種抗原に対するレシピエントの感作は、細胞療法を含む臨床移植療法が直面している問題である。例えば、移植レシピエントの免疫系が同種物質を拒絶する傾向は、移植療法の潜在的な有効性を大幅に減少させ、そのような治療に関連する、考え得るプラスの効果を低下させる。多数の障害及び状態の治療を目的とした、改善された同種細胞が依然として必要である。したがって、レシピエントの免疫系による検出を回避する同種細胞ベースの療法をもたらすための新規手法、組成物及び方法が依然として必要である。

【0005】

いくつかの態様では、本明細書では、（ｉ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる、（ｉｉ）ＣＤ１４２の発現を減少させる、ならびに（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる改変を含む操作細胞が提供され、（ｉ）の発現増加ならびに（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の発現減少は、改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである。いくつかの実施形態では、（ｉｉｉ）における改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現を減少させる。

【0006】

いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子のうち少なくとも１つが、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子のうち少なくとも１つが、ＰＤ－Ｌ１である。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子のうち少なくとも１つが、ＨＬＡ－Ｅである。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子のうち少なくとも１つが、ＨＬＡ－Ｇである。

【0007】

任意の実施形態のいくつかでは、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＲ１、ＭＡＮＦ、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、及びそれらの任意の組合せ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤ－Ｌ１、ならびにそれらの任意の組合せ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１、ならびにそれらの任意の組合せ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１、ならびにそれらの任意の組合せ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１、ならびにそれらの任意の組合せ、ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰ、ならびにそれらの任意の組合せ、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦ、ならびにそれらの任意の組合せ、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦ、ならびにそれらの任意の組合せ、ならびにＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0008】

任意の実施形態のいくつかでは、改変は、ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を減少させる改変、ＣＤ１４２の発現を減少させる改変、ＣＤ４７ならびに任意にＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現を増加させる改変、ならびにＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させる改変から選択される。

【0009】

任意の実施形態のいくつかでは、改変は、ＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる改変、ＣＤ１４２の発現を減少させる改変、ＴＸＮＩＰの発現を減少させる改変、ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅ、ならびに任意にＡ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦの発現を増加させる改変から選択される。

【0010】

任意の実施形態のいくつかでは、改変は、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる改変、ならびにＣＤ１４２の発現を減少させる改変から選択される。

【0011】

いくつかの実施形態では、改変は、ＭＨＣ Ｉ及び／またはＭＨＣ ＩＩの発現を減少させる改変、ならびにＣＤ４７の発現を増加させる改変から選択される。

【0012】

いくつかの実施形態では、上記改変のいずれかが、提供される操作細胞内において、細胞内での遺伝子の発現を増加または低減させる１つ以上の追加の編集と共に存在する。いくつかの実施形態では、さらなる改変のうちいずれか１つ以上が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＩＲＦ１、ＣＤ１４２、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂの発現を減少させる、例えば、その発現を破壊する、不活性化する、またはノックアウトするなどの改変であり得る。いくつかの実施形態では、さらなる改変のうちいずれか１つ以上が、酸化またはＥＲストレス、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＣＤ１４２、ＡＢＯ、ＣＤ３８、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＮＬＧＮ４Ｙ及び／またはＲＨＤに関与するタンパク質の発現を減少させる改変であり得る。いくつかの実施形態では、酸化またはＥＲストレスに関与するタンパク質としては、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）、イノシトール要求性酵素１α（ＩＲＥ１α）、及びＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）が挙げられる。

【0013】

いくつかの態様では、本明細書では、（ｉ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる、ならびに（ｉｉ）ＣＤ１４２の発現を減少させる改変を含む操作細胞が提供され、（ｉ）の発現増加及び（ｉｉ）の発現減少は、改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させる１つ以上の改変をさらに含み、１つ以上の補体インヒビターの発現増加は、改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである。いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を減少させる改変は、表面発現の減少を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させる改変は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６及びＣＤ５９であり、任意に改変は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６、ＣＤ５９及びＣＤ５５であり、任意に改変は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、本明細書での発現を増加させる改変のいずれかは、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させる１つ以上の改変、例えば、遺伝子の内因性プロモーターもしくはエンハンサーの１つ以上の改変または異種プロモーターの導入などであり得る。いくつかの場合には、異種プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

【0015】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：３に記載される配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：５に記載される配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：８に記載される配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド及び／またはＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドは各々、プロモーターに機能的に連結されている。

【0016】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現を増加させる改変は、ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、操作細胞の自然免疫死滅を減少させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：１に記載される配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0017】

いくつかの実施態様では、操作細胞は、１つ以上の寛容原性因子をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される２つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むマルチシストロン性導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの各々は、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドによって隔てられている。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性導入遺伝子の各ポリヌクレオチドは、同じプロモーターに機能的に連結されている。

【0018】

いくつかの実施形態では、マルチシストロン性導入遺伝子は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性導入遺伝子は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性導入遺伝子は、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性導入遺伝子は第１導入遺伝子であり、操作細胞は、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む別個の導入遺伝子を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、第１導入遺伝子及び第２導入遺伝子を含み、第１及び第２導入遺伝子は各々、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、第１及び第２導入遺伝子は、モノシストロン性またはマルチシストロン性導入遺伝子である。

【0020】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからなる群から選択される。

【0021】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドは、操作細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、操作細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組込みは、操作細胞のゲノムへの非標的挿入によって、任意にレンチウイルスベクターを使用した細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入によって行われる。いくつかの実施形態では、組込みは、細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって行われる。いくつかの実施形態では、標的ゲノム座位は、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座である。いくつかの実施形態では、標的ゲノム座位は、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、第１標的ゲノム座位中に組み込まれ、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドは、第２標的ゲノム座位中に組み込まれ、ＣＤ５９をコードするポリヌクレオチドは、第３標的ゲノム座位中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドは、第４標的ゲノム座位中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３標的ゲノム座位のうち少なくとも２つが同じ座位である。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４標的ゲノム座位のうち少なくとも２つが同じ座位である。いくつかの実施形態では、第１、第２及び第３標的ゲノム座位が同じ座位である。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４標的ゲノム座位が同じ座位である。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３標的ゲノム座位の各々が、異なる座位である。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、及び第４標的ゲノム座位が、異なる座位である。

【0022】

いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２の発現を減少させる改変は、ＣＤ１４２タンパク質発現を減少させる。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２遺伝子活性を排除する。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞における全てのＣＤ１４２コード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、ＣＤ１４２遺伝子内のインデルを含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または連続ストレッチの欠失である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２遺伝子はノックアウトされる。いくつかの実施形態では、改変は、ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集によって行われる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＤ１４２遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意にＣａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せは、ＣＤ１４２遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、任意にＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せは、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。

【0023】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍの発現減少を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の減少を含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞における全てのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、Ｂ２Ｍ遺伝子内のインデルを含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または連続ストレッチの欠失である。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子はノックアウトされる。いくつかの実施形態では、改変は、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＢ２Ｍ遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意にＣａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される。

【0024】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せは、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。

【0025】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡの発現減少を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の減少を含む。いくつかの実施形態では、改変はＣＩＩＴＡを排除する。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞における全てのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、ＣＩＩＴＡ遺伝子内のインデルを含む。いくつかの実施形態では、インデルは、ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または連続ストレッチの欠失である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子はノックアウトされる。

【0026】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒト細胞または動物細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ブタ（ｐｉｇ）（ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ））細胞、ウシ（ｃｏｗ）（ウシ（ｂｏｖｉｎｅ））細胞、またはヒツジ（ｓｈｅｅｐ）（ヒツジ（ｏｖｉｎｅ））細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、血液にさらされる細胞型、または血液にさらされる細胞型に分化できる細胞型である。

【0027】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、多能性幹細胞またはその子孫に由来する分化細胞である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である。

【0028】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ドナー対象から単離された初代細胞である。いくつかの実施形態では、ドナー対象は健康であるか、または個々のドナーからドナー試料が得られた時点で疾患もしくは状態を有すると疑われていない。

【0029】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ベータ島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、及び血液細胞（例えば、形質細胞または血小板）から選択される。いくつかの実施形態では、操作細胞は内皮細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞は上皮細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞はベータ島細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞は多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞は、人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞は胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＢＯ式血液型のＯ型である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＢＯの機能的Ａアレル及び／またはＡＢＯの機能的Ｂアレルを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｒｈ因子陽性（Ｒｈ＋）である。

【0030】

いくつかの態様では、本明細書では、操作細胞を生成する方法が提供され、本方法は、ａ．細胞内の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させるか、または排除すること、ｂ．細胞内のＣＤ１４２の発現を減少させること、ならびにｃ．細胞内の寛容原性因子の発現を増加させることを含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される。

【0032】

いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子のうち少なくとも１つが、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子のうち少なくとも１つが、ＰＤ－Ｌ１である。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子のうち少なくとも１つが、ＨＬＡ－Ｅである。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子のうち少なくとも１つが、ＨＬＡ－Ｇである。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させることを含む。

【0033】

いくつかの態様では、本明細書では、低免疫原性細胞を生成する方法が提供され、本方法は、ａ．細胞内のＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させること、ならびにｂ．細胞内のＣＤ１４２の発現を減少させることを含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、本方法は、本細胞内のＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、発現減少は、表面発現の減少を含み、及び／または発現増加は、表面発現の増加を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることは、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６及びＣＤ５９であり、任意に１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることは、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６、ＣＤ５９及びＣＤ５５であり、任意に１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることは、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：３に記載される配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：５に記載される配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列をコードし、補体阻害活性を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：８に記載される配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドは各々、プロモーターに機能的に連結されている。

【0035】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現を増加させる改変は、ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列をコードし、操作細胞の自然免疫死滅を減少させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、配列番号：１に記載される配列をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0036】

いくつかの実施態様では、本方法は、１つ以上の寛容原性因子をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される２つ以上の外因性ポリペプチドを含むマルチシストロン性導入遺伝子を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの各々は、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドによって隔てられている。いくつかの実施態様では、２つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性導入遺伝子の各ポリヌクレオチドは、同じプロモーターに機能的に連結されている。

【0037】

いくつかの実施形態では、マルチシストロン性導入遺伝子は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性導入遺伝子は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性導入遺伝子は、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む別個の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドは、操作細胞のゲノム中に組み込まれる。

【0038】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、操作細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、組込みは、操作細胞のゲノムへの非標的挿入によって、任意にレンチウイルスベクターを使用した細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入によって行われる。いくつかの実施形態では、組込みは、細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって行われ、任意に標的挿入は、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる。

【0039】

いくつかの実施形態では、標的ゲノム座位は、セーフハーバー座位、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座である。いくつかの実施形態では、標的ゲノム座位は、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、標的ゲノム座位は、セーフハーバー座位である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または標的ゲノム座位を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意にＣａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せは、標的ゲノム座位の標的配列に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む相同組換え修復鋳型とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せは、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。

【0040】

いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２の発現を減少させることは、ＣＤ１４２タンパク質発現を減少させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２の発現を減少させることは、ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる改変は、ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる改変は、細胞における全てのＣＤ１４２コード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、ＣＤ１４２遺伝子内のインデル、またはＣＤ１４２遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失を含む。いくつかの実施形態では、インデルは、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２遺伝子はノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる改変は、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＤ１４２遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意にＣａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せは、ＣＤ１４２遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せは、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。

【0041】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させることは、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍの発現減少を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の減少を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を減少させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変は、細胞における全てのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、Ｂ２Ｍ遺伝子内のインデル、またはＢ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失を含む。いくつかの実施形態では、インデルは、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子はノックアウトされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変は、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＢ２Ｍ遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意にＣａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せは、ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。

【0042】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させることは、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡの発現減少を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の減少を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性を減少させる。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞における全てのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、ＣＩＩＴＡ遺伝子内のインデル、またはＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失を含む。いくつかの実施形態では、インデルは、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子はノックアウトされる。

【0043】

いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞または動物細胞である。いくつかの実施形態では、動物細胞は、ブタ（ｐｉｇ）（ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ））細胞、ウシ（ｃｏｗ）（ウシ（ｂｏｖｉｎｅ））細胞、またはヒツジ（ｓｈｅｅｐ）（ヒツジ（ｏｖｉｎｅ））細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、血液にさらされる細胞型、または血液にさらされる細胞型に分化できる細胞型である。いくつかの実施形態では、細胞は、ドナー対象から単離された初代細胞である。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、多能性幹細胞に由来する分化細胞であり、本方法は、多能性幹細胞を分化させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、ベータ島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、形質細胞または血小板）から選択される。いくつかの実施形態では、操作細胞はベータ島細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞は肝細胞である。

【0044】

本明細書で提供される操作細胞を生成する方法の実施形態のいずれかのいくつかでは、操作細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び自殺遺伝子または安全スイッチと関連する遺伝子は、操作細胞のゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び１つ以上の寛容原性因子は、操作細胞のゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、操作細胞のゲノムへの非標的挿入によって組み込まれる。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、操作細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0045】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載される方法に従って作製される操作細胞が提供される。いくつかの実施形態では、操作細胞、または操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞は、レシピエント患者への投与時にＮＫ細胞媒介性細胞傷害を回避できる。いくつかの実施形態では、操作細胞、または操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞は、レシピエント患者への投与時に成熟ＮＫ細胞による細胞溶解から保護される。いくつかの実施形態では、操作細胞、または操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞は、レシピエント患者への投与時に細胞に対する免疫応答を誘導しない。いくつかの実施形態では、操作細胞、または操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞は、レシピエント患者への投与時に細胞に対する全身性炎症反応を誘導しない。いくつかの実施形態では、操作細胞、または操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞は、レシピエント患者への投与時に細胞に対する局所性炎症反応を誘導しない。

【0046】

いくつかの実施形態では、操作細胞、または操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞は、レシピエント患者への投与時に補体経路活性化を誘導しない。いくつかの実施形態では、操作細胞、または操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞は、レシピエント患者への投与時に凝固を誘導しない。いくつかの実施形態では、操作細胞、または操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞は、レシピエント患者への投与時に即時血液媒介性炎症反応を誘導しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント患者への投与時に血液と接触する。

【0047】

本明細書で提供される操作細胞の実施形態のいずれかのいくつかでは、操作細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される。自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び自殺遺伝子または安全スイッチと関連する遺伝子は、操作細胞のゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び１つ以上の寛容原性因子は、操作細胞のゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、操作細胞のゲノムへの非標的挿入によって、任意にレンチウイルスベクターを使用した細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって組み込まれ、任意に標的挿入は、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0048】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載される複数の操作細胞を含む操作細胞の集団が提供される。

【0049】

いくつかの実施形態では、複数の操作初代細胞は、２以上のドナー対象からプールした細胞に由来する。いくつかの実施形態では、２以上のドナー対象の各々は、健康な対象であるか、またはドナー対象からドナー試料が得られた時点で疾患もしくは状態を有すると疑われていない。

【0050】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が改変を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む。

【0057】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、未変更または非改変の野生型細胞と比較してＣＤ１４２の発現減少を含む。

【0058】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ１４２遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む。

【0059】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載される集団を含む組成物が提供される。

【0060】

いくつかの態様では、本明細書では、操作ベータ島細胞の集団を含む組成物が提供され、操作ベータ島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、操作ベータ細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。

【0062】

いくつかの態様では、本明細書では、操作肝細胞の集団を含む組成物が提供され、操作肝細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、操作肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、マルチシストロン性導入遺伝子であり、導入遺伝子は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、ベータ島細胞または肝細胞は、マルチシストロン性導入遺伝子をさらに含み、マルチシストロン性導入遺伝子は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子（複数可）は、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって標的ゲノム座位に導入される。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または標的ゲノム座位を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意にＣａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される。

【0065】

いくつかの実施形態では、組成物は医薬組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、緩衝溶液、例えば、生理食塩水などである。

【0066】

いくつかの実施形態では、組成物は、凍結保護剤を含む無血清凍結保存培地内で製剤化される。いくつかの実施形態では、凍結保護剤はＤＭＳＯであり、凍結保存培地は、５％～１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、１０％または約１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、組成物は滅菌されている。

【0067】

本明細書に開示される組成物のいずれかのいくつかの実施形態では、操作細胞集団の操作細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子、及び自殺遺伝子または安全スイッチと関連する遺伝子は、操作細胞集団の操作細胞のゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び外因性ＣＤ４７は、操作細胞のゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、ゲノムへの非標的挿入によって、任意にレンチウイルスベクターを使用した操作細胞集団の操作細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる。いくつかの実施形態では、バイシストロン性カセットは、操作細胞集団の操作細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって組み込まれ、任意に標的挿入は、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる。

【0068】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載される組成物のいずれかを含む、容器が提供される。いくつかの実施形態では、容器は滅菌バッグである。いくつかの実施形態では、バッグは、凍結保存適合性バッグである。

【0069】

いくつかの態様では、本明細書では、その必要のある患者の疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法が提供され、本方法は、有効量の本明細書に記載される集団または本明細書に記載される組成物を患者に投与することを含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、本方法は、凝固を減少させる抗凝固剤を患者に投与することをさらに含む。

【0071】

いくつかの態様では、本明細書では、その必要のある患者の疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法が提供され、本方法は、（ａ）複数の操作細胞を含む有効量の細胞集団を患者に投与することであって、操作細胞が、（ｉ）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビター（複数可）の発現を増加させる、（ｉｉ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる、ならびに（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる改変を含み、（ｉ）及び（ｉｉ）の発現増加ならびに（ｉｉｉ）の発現減少は、改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、投与すること、ならびに（ｂ）凝固を減少させる抗凝固剤を患者に投与することを含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、及びＳＥＲＰＩＮＢ９からなる群から選択される。

【0073】

いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0074】

いくつかの態様では、本明細書では、その必要のある患者の疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法が提供され、本方法は、（ａ）複数の操作細胞を含む有効量の細胞集団を患者に投与することであって、操作細胞が、（ｉ）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビター（複数可）の発現を増加させる、及び（ｉｉ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる改変を含み、（ｉ）及び（ｉｉ）の発現増加は、改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、投与すること、ならびに（ｂ）凝固を減少させる抗凝固剤を患者に投与することを含む。

【0075】

いくつかの実施形態では、集団は、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として製剤化される。

【0076】

いくつかの実施形態では、集団及び抗凝固剤は、同時にまたは連続して投与される。

【0077】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤はヘパリンである。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、未分画ヘパリンである。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、低分子量ヘパリンである。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、可溶性ヘパリンである。

【0078】

いくつかの実施形態では、ヘパリンは、患者に細胞を投与する前に細胞の表面上に固定化される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、メラガトランまたはＬＭＷ－ＤＳである。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣである。

【0079】

いくつかの実施形態では、状態または疾患は、糖尿病、がん、血管新生障害、眼疾患、甲状腺疾患、皮膚疾患、及び肝疾患からなる群から選択される。

【0080】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、糖尿病と関連するか、または細胞療法は、糖尿病の治療を目的とし、任意に糖尿病はＩ型糖尿病である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、ベータ島細胞を含む島細胞の集団である。いくつかの実施形態では、島細胞は、島前駆細胞、未成熟島細胞、及び成熟島細胞からなる群から選択される。

【0081】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、血管状態もしくは疾患と関連するか、または細胞療法は、血管状態もしくは疾患の治療を目的とする。いくつかの実施形態では、細胞集団は、内皮細胞の集団である。

【0082】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、自己免疫性甲状腺炎と関連するか、または細胞療法は、自己免疫性甲状腺炎の治療を目的とする。いくつかの実施形態では、細胞集団は、甲状腺前駆細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、肝疾患と関連するか、または細胞療法は、肝疾患の治療を目的とする。いくつかの実施形態では、肝疾患は肝硬変を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、肝細胞または肝前駆細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、角膜疾患と関連するか、または細胞療法は、角膜疾患の治療を目的とする。いくつかの実施形態では、角膜疾患は、フックスジストロフィーまたは先天性遺伝性内皮ジストロフィーである。

【0083】

いくつかの実施形態では、細胞集団は、角膜内皮前駆細胞または角膜内皮細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、腎疾患と関連するか、または細胞療法は、腎疾患の治療を目的とする。いくつかの実施形態では、細胞集団は、腎前駆細胞または腎細胞の集団である。

【0084】

いくつかの実施形態では、細胞療法は、がんの治療を目的とする。いくつかの実施形態では、がんは、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌からなる群から選択される。

【0085】

いくつかの実施形態では、細胞集団は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団である。いくつかの実施形態では、細胞は、投与前に増殖かつ凍結保存される。いくつかの実施形態では、集団を投与することは、集団の静脈内注射、筋肉内注射、血管内注射、または移植を含む。いくつかの実施形態では、集団は、腎被膜移植または筋肉内注射を介して移植される。いくつかの実施形態では、集団はドナー対象に由来し、ドナーのＨＬＡ型は患者のＨＬＡ型と一致しない。いくつかの実施形態では、集団はドナーに由来し、ドナーの血液型は患者の血液型と一致せず、ドナーの血液型はＯ型ではない。いくつかの実施形態では、集団はドナーに由来し、ドナーの血液型はＲｈ因子（Ｒｈ）陽性であり、患者の血液型はＲｈ陰性である。いくつかの実施形態では、患者の血清は、Ｒｈに対する抗体を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、集団はヒト細胞集団であり、患者はヒト患者である。いくつかの実施形態では、細胞集団は、ＡＢＯの機能的Ａアレル及び／またはＡＢＯの機能的Ｂアレルを含む。いくつかの実施形態では、細胞集団はＡＢＯ式Ａ抗原を提示し、患者の血清は抗Ａ抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団はＡＢＯ式Ｂ抗原を提示し、患者の血清は抗Ｂ抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団はＡＢＯ式Ａ及びＢ抗原を提示し、患者の血清は、抗Ａ及び／または抗Ｂ抗体を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団はＲｈ因子を発現し、患者の血清は抗Ｒｈ抗体を含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の免疫抑制剤を患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、患者は、１つ以上の免疫抑制剤が投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、小分子または抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＬ－２受容体のｐ７５、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８からなる群から選択される受容体またはリガンド、及びそれらのリガンドのいずれかに結合する抗体のうち１つ以上に結合する。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、コルチコステロイド、プレドニゾン、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、ブレキナル、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスパガリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン（チモシン－α）、及び免疫抑制抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、シクロスポリンを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、ミコフェノール酸モフェチルを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、コルチコステロイドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、シクロホスファミドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、ラパマイシンを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、抗胸腺細胞グロブリンを含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、１つ以上の免疫調節剤である。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫調節剤は、小分子または抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩＬ－２受容体のｐ７５、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８からなる群から選択される受容体またはリガンド、及びそれらのリガンドのいずれかに結合する抗体のうち１つ以上に結合する。

【0089】

いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の投与前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間前またはそれよりも前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間後、またはそれよりも後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の初回投与と同じ日に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の投与後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日前に患者に投与されるか、または投与されている。

【0090】

いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間前またはそれよりも前に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間後、またはそれよりも後に患者に投与されるか、または投与されている。いくつかの実施形態では、１つ以上の免疫抑制剤は、操作細胞の改変を含まない免疫原性細胞の免疫拒絶を減少させるために投与される１つ以上の免疫抑制剤の投与量と比較して、少ない投与量で投与される。

【0091】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、操作細胞の死滅を制御できる。いくつかの実施形態では、操作細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチを含む。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、薬物もしくはプロドラッグの存在下で、または選択的外因性化合物による活性化時に、細胞死の制御を誘導する。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、操作細胞のアポトーシスを誘導できる誘導性タンパク質である。いくつかの実施形態では、操作細胞のアポトーシスを誘導できる誘導性タンパク質は、カスパーゼタンパク質である。いくつかの実施形態では、カスパーゼタンパク質はカスパーゼ９である。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、１つ以上の免疫抑制剤を患者に投与した後に細胞死の制御を誘導するように活性化される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、１つ以上の免疫抑制剤を患者に投与する前に細胞死の制御を誘導するように活性化される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、操作細胞を患者に投与した後に細胞死の制御を誘導するように活性化される。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子または自殺スイッチは、細胞傷害または他の負の結果が患者に生じる場合に細胞死の制御を誘導するように活性化される。

【0092】

いくつかの実施形態では、本方法は、操作細胞集団の操作細胞の枯渇を可能にする薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、操作細胞の枯渇を可能にする薬剤は、操作細胞の表面上に発現されるタンパク質を認識する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、及びＲＱＲ８を認識する抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体は、モガムリズマブ、ＡＦＭ１３、ＭＯＲ２０８、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジニツキシマブ（ｄｉｎｉｔｕｘｉｍａｂ）、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、操作細胞の表面上における１つ以上の寛容原性因子を認識する薬剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、１つ以上の寛容原性因子を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0093】

いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の追加の治療剤を患者に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、患者は、１つ以上の追加の治療剤が投与されている。いくつかの実施形態では、本方法は、本方法の治療有効性をモニターすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本方法の予防有効性をモニターすることを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上の疾患症状の所望の抑制が生じるまで繰り返される。

【0094】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載される操作細胞集団、及び凝固を減少させる抗凝固剤または細胞コーティングを含む組合せが提供される。

【0095】

いくつかの態様では、本明細書では組合せが提供され、（ａ）複数の操作細胞を含む細胞集団であって、操作細胞が、（ｉ）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビター（複数可）の発現を増加させる、（ｉｉ）ＣＤ４７の発現を増加させる、ならびに（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる改変を含み、（ｉ）及び（ｉｉ）の発現増加ならびに（ｉｉｉ）の発現減少は、改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、前記細胞集団、ならびに（ｂ）抗凝固剤を含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリン、アンチトロンビンの活性化因子、凝固第ＩＩ因子（ｆＩＩ）の阻害剤、凝固第ＶＩＩ因子（ｆＶＩＩ）の阻害剤、及び凝固第Ｘ因子（ｆＸ）の阻害剤からなる群から選択される。

【0097】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤はヘパリンである。

【0098】

いくつかの実施形態では、ヘパリンは、未分画ヘパリンである。

【0099】

いくつかの実施形態では、ヘパリンは、低分子量ヘパリンである。

【0100】

いくつかの実施形態では、ヘパリンは、可溶性ヘパリンである。

【0101】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、メラガトランまたはＬＭＷ－ＤＳである。

【0102】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である。

【0103】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣである。

【0104】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ＣＤ１４２に対する抗体である。

【0105】

いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載される組合せを含むキットが提供される。

【図面の簡単な説明】

【0106】

【図1A】Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）のフローサイトメトリーによって測定されるようなＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）、ＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）、及びＣＤ４７の発現レベルを示し、細胞がＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの発現を欠き、ＣＤ４７の発現は増加していることを実証している。

【図1B】Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣから分化した内皮細胞（ｈｉＥＣ）のフローサイトメトリーによって測定されるようなＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ－Ｉ）、ＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＩＩ）、及びＣＤ４７の発現レベルを示し、細胞がＨＬＡ－Ｉ及びＨＬＡ－ＩＩの発現を欠き、ＣＤ４７の発現は増加していることを実証している。

【図2】図２Ａは、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣにおけるＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９の表面発現レベルを示す。図２Ｂは、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＥＣにおけるＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９の表面発現レベルを示す。

【図3】図３Ａは、ＡＢＯ不適合補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおける、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣの死滅を示す。図３Ｂは、ＡＢＯ不適合補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおける、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＥＣの死滅を示す。

【図4】図４Ａは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ４６＋＋＋ｈｉＰＳＣクローンの死滅を示す。図４Ｂは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ４６＋＋＋ｈｉＥＣクローンの死滅を示す。

【図5】図５Ａは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ５５＋＋ｈｉＰＳＣクローンの死滅を示す。図５Ｂは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ５５＋＋ｈｉＥＣクローンの死滅を示す。

【図6】図６Ａは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ５９＋＋＋ｈｉＰＳＣクローンの死滅を示す。図６Ｂは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ５９＋＋ｈｉＥＣクローンの死滅を示す。

【図7】図７Ａは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ４６＋＋／ＣＤ５５＋＋ｈｉＰＳＣクローンの死滅を示す。図７Ｂは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ４６＋＋／ＣＤ５５＋＋ｈｉＥＣクローンの死滅を示す。

【図8】図８Ａは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ５５＋＋／ＣＤ５９＋＋＋ｈｉＰＳＣクローンの死滅を示す。図８Ｂは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ５５＋＋／ＣＤ５９＋＋＋ｈｉＥＣクローンの死滅を示す。

【図9】図９Ａは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ４６＋＋／ＣＤ５９＋＋＋ｈｉＰＳＣクローンの生存を示す。図９Ｂは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ４６＋＋／ＣＤ５９＋＋ｈｉＥＣクローンの生存を示す。

【図10】図１０Ａは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ４６＋＋／ＣＤ５５＋／ＣＤ５９＋＋ｈｉＰＳＣクローンの生存を示す。図１０Ｂは、ＡＢＯ不適合ＣＤＣアッセイにおける、代表的なＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ＣＤ４６＋＋／ＣＤ５５＋＋／ＣＤ５９＋＋ｈｉＥＣクローンの生存を示す。

【図11】ＡＢＯ不適合血清の非存在下における、ヒトｉＰＳＣに由来する内皮細胞のＣＤＣアッセイの結果を示す（生存対照）。

【発明を実施するための形態】

【0107】

詳細な説明
本明細書では、同種移植に対する免疫系反応の影響を軽減及び／または回避するための方法及び組成物が提供される。細胞由来及び／または組織移植の免疫拒絶問題を克服するために、本明細書では、任意の移植可能な細胞型の実行可能な供給元となる、操作免疫回避細胞（例えば、操作低免疫原性初代細胞）、またはその集団もしくは医薬組成物が開示される。本明細書に開示される操作細胞は、対象の遺伝子構造、あるいは１つ以上の以前の同種移植、以前の自己キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ拒絶、及び／または導入遺伝子が発現される他の自己もしくは同種療法に対する対象内での任意の既存の応答にかかわらず、レシピエント対象の免疫系による認識の減少を可能にする。操作細胞としては、ベータ島細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、形質細胞または血小板）を挙げてよいが、これらに限定されない。

【0108】

いくつかの態様では、本明細書では、細胞移植療法と関連する即時血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）を減少させるか、または回避するための方法及び組成物が提供される。いくつかの場合には、ＩＢＭＩＲは、レシピエント血液に膵島移植片（例えば、ＣＤ１４２の発現及び／または活性を減少させるためのＣＤ１４２改変を含まない膵島）を曝露した直後に生じる。例えば、臨床的膵島同種移植では、ＩＢＭＩＲは組織喪失の主な原因であり、門脈への注入後に島細胞を血液に曝露することで始まる。移植後１週間以内に膵島の最大６０％が失われると推定されている。最悪の場合、ＩＢＭＩＲは、門脈血栓症、肝梗塞、及び門脈圧亢進症を引き起こす。ＩＢＭＩＲは通常、レシピエント血液に膵島移植片（例えば、ＣＤ１４２の発現及び／または活性を減少させるためのＣＤ１４２改変を含まない膵島）を曝露した直後に生じる。

【0109】

いくつかの実施形態では、本明細書では、操作細胞（例えば、ベータ島細胞、肝細胞、及び他の細胞）が提供され、典型的には、それらが一般的な移植方法、例えば、細胞の静脈内注入または細胞の筋肉内注射などの間に血液と接触する場合にＩＢＭＩＲを開始する細胞型である。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＩＢＭＩＲの開始に寄与する血液凝固経路における膜受容体である、凝固第ＩＩＩ因子、組織因子（ＴＦ）、トロンボプラスチン、血小板組織因子、または第ＩＩＩ因子としても知られるＣＤ１４２の発現を減少させるか、または排除することを含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ１４２の発現減少及び１つ以上の寛容原性因子の発現増加及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子発現の減少を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変（ＣＤ１４２の発現減少または排除を含む）を含む細胞は、移植後に生存、生着、及び機能する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１４２に対する改変を含まない細胞と比較して、生存増強及び／または生着増強及び／または機能長期化を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、静脈内注入、筋肉内注射、または腎被膜移植によって投与される。

【0110】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作細胞は、１つ以上の補体インヒビターの発現増加及び／または過剰発現をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５から選択される。いくつかの実施形態では、操作細胞は、２つ以上を組み合わせた補体インヒビターの発現増加、例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現増加またはＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現増加などを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞は、補体媒介性細胞傷害から保護される。いくつかの実施形態では、操作細胞（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９を過剰発現する）は、ＩＢＭＩＲに付随して生じる補体反応から保護される。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＩＢＭＩＲとは無関係に生じる補体反応から保護される。

【0111】

いくつかの態様では、本明細書では、細胞移植療法と関連する即時血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）を減少させるか、または回避するための方法、組成物、及び組合せが提供される。いくつかの場合には、本明細書の方法は、本明細書に記載される操作細胞の組合せを、抗凝固剤と組み合わせて投与することを含む。いくつかの実施形態では、抗凝固剤と組み合わせて投与される細胞は、ＣＤ１４２の発現減少を含まない。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、急激なＩＢＭＩＲから保護するために細胞移植と同時に投与される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、移植時に投与される（例えば、抗凝固剤は、本明細書に記載される操作細胞集団の投与と同時に静脈内投与されてよい）。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、移植療法の前または後にも投与される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、移植前または移植後、２４～１２時間、１２時間～６時間、６時間～３時間、３時間～１時間、または１時間以内に投与され得る。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、治療と同時に投与される。

【0112】

いくつかの実施形態では、本明細書では、操作細胞（例えば、ベータ島細胞、肝細胞、及び他の細胞）が提供され、典型的には、それらが一般的な移植方法、例えば、細胞の静脈内注入または細胞の筋肉内注射などの間に血液と接触する場合にＩＢＭＩＲを開始する細胞型である。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＩＢＭＩＲの開始に寄与する血液凝固経路における膜受容体である、凝固第ＩＩＩ因子、組織因子（ＴＦ）、トロンボプラスチン、血小板組織因子、または第ＩＩＩ因子としても知られるＣＤ１４２の発現を減少させるか、または排除することを含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ１４２の発現減少及び１つ以上の寛容原性因子の発現増加及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現減少を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変（ＣＤ１４２の発現減少または排除を含む）を含む細胞は、移植後に生存、生着、及び機能する。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１４２に対する改変を含まない細胞と比較して、生存増強及び／または生着増強及び／または機能長期化を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、静脈内注入、筋肉内注射、または腎被膜移植によって投与される。

【0113】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作細胞は、１つ以上の補体インヒビターの発現増加及び／または過剰発現をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５から選択される。いくつかの実施形態では、操作細胞は、２つ以上を組み合わせた補体インヒビターの発現増加、例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現増加またはＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現増加などを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞は、補体媒介性細胞傷害から保護される。いくつかの実施形態では、操作細胞（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の過剰発現）は、ＩＢＭＩＲの結果として生じる補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から保護される。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＩＢＭＩＲとは無関係に生じるＣＤＣから保護される。

【0114】

本明細書で提供される操作細胞は、寛容原性因子の発現を利用し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現（例えば、表面発現）を調節（例えば、減少または排除）もし得る。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びホーミングエンドヌクレアーゼシステム）を利用したゲノム編集技術も、ヒト細胞内で重要な免疫遺伝子の発現を（例えば、重要な免疫遺伝子のゲノムＤＮＡを欠失させることによって）減少させるか、または排除するために使用される。ある特定の実施形態では、ゲノム編集技術または他の遺伝子調節技術が、ヒト細胞内で寛容誘導（寛容）因子（例えば、ＣＤ４７）を挿入するために使用され、したがって、レシピエント対象への生着時に免疫認識を回避し得る操作細胞を作製する。したがって、本明細書で提供される操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に影響を及ぼす１つ以上の遺伝子及び因子の発現調節（例えば、発現減少または排除）、ＣＤ４７などの寛容原性因子の発現調節（例えば、減少または及び発現調節（例えば、過剰発現）を示し、レシピエント対象の免疫系による認識減少を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞は、ＣＤ１４２の発現調節（例えば、発現減少）を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５から選択される１つ以上の補体インヒビターの発現調節（例えば、発現増加）を示す。

【0115】

いくつかの態様では、本明細書で提供される操作細胞は、自然免疫細胞拒絶及び／または適応免疫細胞拒絶の減少を示す（例えば、低免疫原性細胞）。例えば、いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＮＫ細胞媒介性溶解及び／またはマクロファージ貪食に対する感受性の減少を示す。いくつかの実施形態では、操作細胞は、免疫抑制剤をほとんどまたは全く必要とすることなくレシピエント対象に移植される、広く一般に適合性のある細胞または組織（例えば、全般的なドナー細胞または組織）の供給源として有用である。そのような低免疫原性細胞は、移植時に細胞特異的特性及び特徴を保持する。

【0116】

また本明細書では、障害を治療する方法が提供され、本方法は、ＭＨＣ不適合の同種レシピエントの免疫拒絶を回避する操作細胞（例えば、操作初代細胞）を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法のうちいずれか１つから作製される操作細胞は、ＭＨＣ不適合の同種レシピエントに反復投与（例えば、移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）または移植（ｇｒａｆｔｅｄ））される場合に免疫拒絶を回避する。

【0117】

特定の実施形態の実施には、反対の具体的な指示がない限り、当業者の技能範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来の方法を用いることになり、その多くが例証の目的で以下に記載される。そのような技術は文献内で十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙに加えて、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術雑誌の研究論文を参照のこと。

【0118】

本出願で言及される特許文献、科学論文及びデータベースを含む全ての刊行物は、個々の刊行物が参照によって個々に組み込まれる場合と同程度に、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照によって組み込まれる。本明細書に記載される定義が、参照によって本明細書に組み込まれる特許、出願、公開出願及び他の刊行物に記載される定義に反するか、またはさもなければそれと矛盾する場合、本明細書に記載される定義が、参照によって本明細書に組み込まれる定義に優先する。

【0119】

本明細書で使用される節の見出しは、構成目的のためだけにすぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、いくつかの実施形態が、本開示の範囲及び趣旨内で可能であることを認識することになる。以下の説明は本開示を例示し、当然のことながら、本明細書に記載される本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。

【0120】

Ｉ．定義
別段の規定がない限り、本明細書で使用される技術に関する全ての用語、表記ならびに他の専門用語及び科学用語または用語法は、特許請求される主題が関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有することを意図する。いくつかの場合には、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするために、及び／または迅速な参照のために本明細書で定義され、本明細書におけるそのような定義の包含が、必ずしも当該技術分野において一般に理解されるものとの実質的な差を表すと解釈されるべきではない。

【0121】

本明細書で使用される場合の「約」という用語は、量または濃度などの測定可能な値に言及する場合、指定量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味する。添付の特許請求の範囲を含む、本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「または」、及び「その（ｔｈｅ）」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。本明細書に記載される態様及び変化形態は、そのような態様及び変化形態「からなる」及び／または「から本質的になる」実施形態を含むと理解される。

【0122】

本明細書で使用される場合、「及び／または」という用語は、関連する列挙項目のうち１つ以上のあらゆる全ての組合せを含む。

【0123】

本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連する「外因性」という用語は、言及される分子が目的の細胞に導入されることを意味することを意図する。外因性分子、例えば、外因性ポリヌクレオチドなどは、例えば、細胞の遺伝物質に外因性コード核酸を導入することによって、例えば、染色体内への組込み、またはプラスミドもしくは発現ベクターなどの非染色体遺伝物質としての組込みなどによって導入され得る。したがって、本用語は、それがコード核酸の発現に関して使用される場合、発現可能な形態のコード核酸を細胞に導入することを指す。いくつかの場合には、「外因性」分子は、細胞内に通常は存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞内に導入され得る分子、構築物、因子などである。

【0124】

「内因性」という用語は、天然または非改変細胞内に存在する、言及される分子、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子）、またはポリペプチドなどを指す。例えば、本用語は、内因性遺伝子の発現に関連して使用される場合、細胞内に含有されるが、外因的に導入されたものではない内因性核酸によってコードされる遺伝子の発現を指す。「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域に加えて、遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を、そのような調節配列がコード配列及び／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず含む。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位など、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、複製起点、マトリックス結合部位ならびに座位制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。遺伝子の配列は、典型的には細胞内の染色体上の固定された染色体位置または座位に存在する。

【0125】

「座位」という用語は、特定の遺伝子または遺伝子マーカーが位置している染色体上の固定位置を指す。「標的座位」への言及は、遺伝子改変、例えば、外因性ポリヌクレオチドの遺伝子編集または組込みなどを標的とするのが望ましい、所望の遺伝子の特定の座位を指す。

【0126】

遺伝子または「遺伝子発現」に関連する「発現」という用語は、遺伝子内に含有される情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡもしくは任意の他のＲＮＡ型）であり得るか、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、及び編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化、及びグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含む。したがって、発現または遺伝子発現への言及は、タンパク質（もしくはポリペプチド）発現またはｍＲＮＡなどの遺伝子の転写可能な産物の発現を含む。タンパク質発現は、タンパク質の細胞内発現または表面発現を含んでよい。典型的には、遺伝子産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質などの発現は、細胞内で検出可能なレベルである。

【0127】

本明細書で使用される場合、「検出可能な」発現レベルは、当業者に既知の標準的な技術によって検出可能であるレベルを意味し、例えば、ディファレンシャルディスプレイ、ＲＴ（逆転写酵素）結合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ノーザンブロット、及び／またはＲＮａｓｅ保護分析に加えて、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、またはウェスタンブロットなどのタンパク質検出のための免疫親和性ベースの方法を含む。発現レベルの程度は、標準的な特性評価技術によって可視化または測定されるのに十分な大きさでさえあればよい。

【0128】

本明細書で使用される場合、「発現増加」、「発現増強」または「過剰発現」という用語は、特定の遺伝子発現を調節するための改変を含有しない、元の細胞または供給源細胞内での発現、例えば、野生型発現レベル（発現の欠如または測定不可能な発現でもあり得る）に追加される任意の発現形態を意味する。「発現増加」、「発現増強」または「過剰発現」への本明細書での言及は、改変を含有しない細胞、例えば、改変を導入するための操作前の元の供給源細胞、例えば、非改変細胞または野生型細胞などの細胞内レベルと比較した、遺伝子発現の増加及び／またはポリペプチドに言及する限り、ポリペプチドレベルの増加及び／またはポリペプチド活性の増加を意味すると解釈される。発現、ポリペプチドレベルまたはポリペプチド活性の増加は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％もしくは５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または１００％、あるいはさらにそれを超える増加であり得る。いくつかの場合には、発現、ポリペプチドレベルまたはポリペプチド活性の増加は、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍またはそれを超える増加であり得る。

【0129】

「低免疫原性」という用語は、そのような細胞が移植される対象による免疫拒絶を受けにくい細胞を指す。例えば、改変を含有しない同様の細胞、例えば、未変更または非改変の野生型細胞などと比較して、そのような低免疫原性細胞は、そのような細胞が移植される対象による免疫拒絶を、約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％またはそれを超えて受けにくい場合がある。典型的には、低免疫原性細胞は対象に対して同種であり、低免疫原性細胞は、ＭＨＣ不適合同種レシピエントにおける免疫拒絶を回避する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、Ｔ細胞媒介性適応免疫拒絶及び／または自然免疫細胞拒絶から保護される。

【0130】

細胞の低免疫原性は、細胞が適応免疫応答及び自然免疫応答を誘発する能力などの細胞の免疫原性を評価することによって決定され得る。そのような免疫応答は、当業者によって認識されているアッセイを使用して測定され得る。

【0131】

「寛容原性因子」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞が投与、移植、または生着時に宿主またはレシピエント対象の免疫系によって認識される能力を調節するか、またはそれに影響を及ぼす、免疫抑制因子または免疫調節因子を含む。典型的には、寛容原性因子は、操作初代細胞がレシピエントの宿主免疫系によって標的とされない、例えば、拒絶されないなどのように、操作初代細胞に対して免疫寛容を誘導する因子である。したがって、寛容原性因子は免疫低下因子であってよい。寛容原性因子の例としては、免疫細胞阻害性受容体（例えば、ＣＤ４７）、免疫細胞阻害性受容体と結合するタンパク質、チェックポイント阻害剤及び自然免疫または適応免疫の認識を減少させる他の分子が挙げられる。

【0132】

「低減する」、「減少した」、「減少」、及び「低減」という用語は全て、本明細書では一般に、統計的に有意な量による低減を意味するために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「低減する」、「減少した」、「減少」、「低減」は、参照レベルと比較した場合に少なくとも１０％の低減、例えば、参照レベルと比較した場合に少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の低減または最大１００％かつそれを含む低減（すなわち、参照試料と比較した場合に欠如のレベル）、あるいは１０～１００％の間の任意の低減を意味する。

【0133】

「増加した」、「増加する」もしくは「増強する」または「活性化する」という用語は全て、本明細書では一般に、統計学的に有意な量による増加を意味するために使用され、誤解を避けるために、「増加した」、「増加する」もしくは「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較した場合に少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較した場合に少なくとも約２０％、もしくは少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％、もしくは少なくとも約５０％、もしくは少なくとも約６０％、もしくは少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％の増加もしくは最大１００％かつそれを含む増加または１０～１００％の間の任意の増加、あるいは参照レベルと比較した場合に少なくとも約２倍、もしくは少なくとも約３倍、もしくは少なくとも約４倍、もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の増加、または２倍～１０倍以上の任意の増加を意味する。

【0134】

本明細書で使用される場合、「改変」という用語は、細胞内での遺伝子発現に影響を与える、細胞内の任意の変化または変更を指す。いくつかの実施形態では、改変は、細胞内でタンパク質産物をコードする遺伝子またはその調節エレメントを直接変化させる遺伝子改変であり、例えば、遺伝子編集、変異誘発によって、または外因性ポリヌクレオチドもしくは導入遺伝子の遺伝子操作などによって行われる。

【0135】

本明細書で使用される場合、「インデル」は、ゲノム内におけるヌクレオチド塩基の挿入、欠失、またはそれらの組合せから生じる変異を指す。したがって、インデルは、典型的には配列からヌクレオチドを挿入または欠失させる。当業者には理解されることになるように、ゲノム配列のコード領域内におけるインデルは、インデルの長さが３の倍数でない限り、フレームシフト変異をもたらすことになる。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的ポリヌクレオチド配列において任意の長さのインデルを誘導するために使用され得る。

【0136】

いくつかの実施形態では、変更は点変異である。本明細書で使用される場合、「点変異」は、ヌクレオチドの１つを置き換える置換を指す。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的ポリヌクレオチド配列において任意の長さのインデルまたは点変異を誘導するために使用され得る。

【0137】

本明細書で使用される場合、「ノックアウト」は、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨げる方法で、標的ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部を欠失させることを含む。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能ドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン）において標的ポリヌクレオチド配列内にインデルを誘導することにより、標的ポリヌクレオチド配列を変更することによって達成され得る。当業者は、本明細書に記載される詳細に基づいて、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをどのように使用して、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトするかについて容易に理解することになる。

【0138】

いくつかの実施形態では、変更は、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部のノックアウトをもたらす。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用した標的ポリヌクレオチド配列またはその一部のノックアウトは、多様な用途に有用であり得る。例えば、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、研究目的のためにインビトロで実施され得る。エクスビボ目的では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の発現と関連する障害を（例えば、細胞内の変異体アレルをエクスビボでノックアウトし、ノックアウトした変異体アレルを含むそれらの細胞を対象に導入することによって）治療または予防するのに有用であり得る。

【0139】

本明細書における「ノックイン」とは、遺伝子機能を宿主細胞に付加するプロセスを意味する。これにより、ノックインした遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはコードされたタンパク質のレベル増加が引き起こされる。当業者には理解されることになるように、これは、遺伝子の１つ以上の追加コピーを宿主細胞に付加すること、または内因性遺伝子の調節構成要素を変更し、作製されるタンパク質の発現を増加させることを含む、いくつかの方法で達成され得る。これは、プロモーターを改変すること、異なるプロモーターを付加すること、エンハンサーを付加すること、または他の遺伝子発現配列を改変することによって達成されてよい。

【0140】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変更または改変は、標的または選択したポリヌクレオチド配列の発現減少をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変更または改変は、標的または選択したポリペプチド配列の発現減少をもたらす。

【0141】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変更または改変は、標的または選択したポリヌクレオチド配列の発現増加をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される変更または改変は、標的または選択したポリペプチド配列の発現増加をもたらす。

【0142】

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の発現レベルの変化を指す。発現の調節としては、遺伝子活性化及び遺伝子抑制が挙げられ得るが、これらに限定されない。調節はまた、完全なものであってよい（すなわち、遺伝子発現が完全に不活性化されるか、もしくは野生型レベル以上まで活性化される）か、またはそれは部分的であってもよい（遺伝子発現が部分的に減少するか、もしくは野生型レベルのある割合まで部分的に活性化される）。

【0143】

「機能的に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「機能的に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、２つ以上の構成要素（配列要素など）の並置に関して交換可能に使用され、その構成要素は、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうち少なくとも１つが、他の構成要素のうち少なくとも１つに発揮される機能を媒介し得る可能性を許容するように配置される。実例として、プロモーターなどの転写調節配列は、その転写調節配列が１つ以上の転写調節因子の有無に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、コード配列に機能的に連結されている。転写調節配列は通常、コード配列とシスで機能的に連結されるが、それに直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、コード配列に、それらが連続していなくとも、機能的に連結される転写調節配列である。

【0144】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、ペプチド結合によって結合された一連のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基のポリマー）を指すために交換可能に使用されてよく、最小長に限定されない。そのようなポリマーは、天然もしくは非天然アミノ酸残基、またはそれらの組合せを含有してよく、アミノ酸残基のペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、及び多量体を含むが、これらに限定されない。したがって、タンパク質またはポリペプチドとしては、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）及びアミノ酸類似体を含むものが挙げられる。全長ポリペプチドまたはタンパク質、及びその断片は、本定義に包含される。本用語としてはまた、その修飾種、例えば、１つ以上の残基の翻訳後修飾、例えば、メチル化、リン酸化、グリコシル化、シアリル化、またはアセチル化が挙げられる。

【0145】

本開示全体を通して、特許請求される主題の様々な態様が範囲形式で提示される。範囲形式における記載は、便宜上及び簡潔にするためにすぎず、特許請求される主題の範囲に対して柔軟性に欠ける限定として解釈されるべきではないと理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲に加えて、その範囲内の個々の数値が具体的に開示されているとみなされるべきである。例えば、値の範囲が提供される場合、その内容に別段の明確な指示がない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の各介在値、及びその規定範囲内における任意の他の規定値または介在値が本開示内に包含され、規定範囲内の任意の具体的な除外限度に従うと理解される。規定範囲が限界値の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界値の一方または両方を除外する範囲もまた、本開示内に含まれる。いくつかの実施形態では、２つの相対する制限のない範囲が１つの特徴に対して提供され、そのような記載では、それら２つの範囲の組合せが本明細書で提供されると想定される。例えば、いくつかの実施形態では、特徴は約１０単位超であると記載され、かつその特徴が約２０単位未満であると（別の文章内などで）記載されるため、約１０単位～約２０単位の範囲が本明細書に記載される。

【0146】

本明細書で使用される場合、交換可能に使用される用語である「対象」または「個体」は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、「哺乳動物」としては、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜動物、ならびに動物園、スポーツ、またはペットの動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコ、サルなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象または個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または状態を有することが知られているか、または有すると疑われている患者である。

【0147】

本明細書で使用される場合、「治療すること」及び「治療」という用語は、対象が疾患の少なくとも１つの症状の減少または疾患の改善、例えば、有益なまたは所望の臨床結果を有するように、有効量の本明細書に記載される細胞を対象に投与することを含む。本技術の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能または検出不能かにかかわらず、１つ以上の症状の軽減、疾患程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または鈍化、疾患状態の改善または一時的緩和、及び寛解（部分的または完全かにかかわらず）が挙げられるが、これらに限定されない。治療することは、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較した場合に生存期間の延長を指し得る。したがって、当業者は、治療が疾患状態を改善する場合があるが、疾患に対する完全な治癒ではない場合があることを認識する。いくつかの実施形態では、疾患または障害の１つ以上の症状は、疾患の治療時に少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減する。

【0148】

本技術の目的のために、疾患治療の有益なまたは所望の臨床結果としては、検出可能または検出不能かにかかわらず、１つ以上の症状の軽減、疾患程度の減弱、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または鈍化、疾患状態の改善または一時的緩和、及び寛解（部分的または完全かにかかわらず）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0149】

「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に導入できる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を誘導でき、遺伝子配列を標的細胞に導入し得る、任意の核酸構築物を意味する。したがって、本用語は、クローニング、及び発現ビヒクルに加えて、組込みベクターを含む。細胞へのベクターまたは構築物の導入方法は当業者に既知であり、これらとしては、脂質媒介導入（すなわち、中性及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介導入ならびにウイルスベクター媒介導入が挙げられるが、これらに限定されない。

【0150】

ＩＩ．操作細胞及び細胞の操作方法
本明細書では、ＣＤ１４２の発現を制御する改変を含む、操作細胞が提供される。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２の発現を減少させるか、または排除する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２の発現を減少させる改変は、ＣＤ１４２タンパク質発現を減少させる。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２遺伝子活性を排除する。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞における全てのＣＤ１４２コード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、不活性化または破壊は、ＣＤ１４２遺伝子内のインデルを含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または連続ストレッチの欠失である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２遺伝子はノックアウトされる。

【0151】

いくつかの実施形態では、提供される操作細胞はまた、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させる１つ以上の改変を含有する。いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を減少させる改変は、表面発現の減少を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させる改変（複数可）は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６及びＣＤ５９であり、任意に改変は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６、ＣＤ５９及びＣＤ５５であり、任意に改変は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施態様では、操作細胞は、１つ以上の寛容原性因子をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される２つ以上の外因性ポリペプチドを含むマルチシストロン性ベクターを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの各々は、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドによって隔てられている。

【0152】

いくつかの実施形態では、提供される操作細胞はまた、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を制御する、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の改変を含有する。

【0153】

いくつかの実施形態では、提供される操作細胞は、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変も含む。いくつかの実施形態では、寛容原性因子は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ、及びＨ２－Ｍ３、またはそれらの任意の組合せのうち１つ以上である。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＣＤ４７の発現増加であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＰＤ－Ｌ１の発現増加であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＨＬＡ－Ｅの発現増加であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＨＬＡ－Ｇの発現増加であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、Ｈ２－Ｍ３（ＨＬＡ－Ｇ）、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭｆｇｅ８の発現増加であるか、またはそれを含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる１つ以上のゲノム改変及びＣＤ４７の発現を増加させる改変を含む。言い換えれば、操作細胞は、外因性ＣＤ４７タンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現の減少またはサイレンシングを示す。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる１つ以上のゲノム改変及びＣＤ４７の発現を増加させる改変を含む。いくつかの場合では、操作細胞は、外因性ＣＤ４７核酸及びタンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現の減少またはサイレンシングを示す。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させるか、または排除する１つ以上のゲノム改変、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させるか、または排除する１つ以上のゲノム改変、及びＣＤ４７の発現を増加させる改変を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、外因性ＣＤ４７タンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現の減少またはサイレンシングを示し、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の減少または欠如を示す。多くの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ細胞である。

【0155】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術のいずれかが、記載されるような１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたは標的タンパク質の発現を減少させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リコンビナーゼを含む系を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、遺伝子のノックアウトまたはノックダウンに使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、ゲノム領域へのＤＮＡのノックインまたは組込みに使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、一本鎖切断（ＳＳＢ）を媒介する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）に関連するものを含む、二本鎖切断（ＤＳＢ）を媒介する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、ＤＮＡベースの編集またはプライム編集を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、部位特異的ターゲティング要素を介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）を含み得る。

【0156】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術のいずれかが、記載されるような１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたは標的タンパク質の発現を増加させるために使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リコンビナーゼを含む系を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、内因性遺伝子活性を（例えば、遺伝子に機能的に連結されるプロモーターまたはエンハンサーを改変または活性化することによって）増加させるための改変に使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、ゲノム領域へのＤＮＡのノックインまたは組込みに使用され得る（例えば、標的ポリヌクレオチドまたは標的タンパク質をコードする構築物、例えば、操作細胞内での発現増加のために、寛容原性因子、ＣＤ５５、ＣＤ４６、ＣＤ５９のいずれか、または本明細書に記載される他の分子のいずれかをコードする構築物などを導入するために）。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、一本鎖切断（ＳＳＢ）を媒介する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）に関連するものを含む、二本鎖切断（ＤＳＢ）を媒介する。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、ＤＮＡベースの編集またはプライム編集を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、部位特異的ターゲティング要素を介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）を含み得る。

【0157】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、塩基編集と関連する。塩基エディター（ＢＥ）は、典型的にはＣａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ関連」）ドメイン及び核酸塩基修飾ドメイン（例えば、天然または発生したデアミナーゼ、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１（「アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド１」）を含むシチジンデアミナーゼ、ＣＤＡ（「シチジンデアミナーゼ」）、及びＡＩＤ（「活性化誘導シチジンデアミナーゼ」）など）のドメインの融合体である。いくつかの場合には、塩基エディターはまた、得られた単一ヌクレオチド変化の効率及び／または安定性を増加させるために、細胞ＤＮＡ修復プロセスを変更するタンパク質またはドメインを含む場合がある。

【0158】

いくつかの態様では、現在利用可能な塩基エディターとしては、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａに変換するシチジン塩基エディター（例えば、ＢＥ４）及び標的Ａ・ＴをＧ・Ｃに変換するアデニン塩基エディター（例えば、ＡＢＥ７．１０）が挙げられる。いくつかの態様では、Ｃａｓ９標的脱アミノ化が、二本鎖ＤＮＡ切断を導入することなく塩基変化を誘導するように設計された塩基エディター（ＢＥ）システムに関連して最初に実証された。さらに、不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）に融合したラットデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）を使用して、ｓｇＲＮＡのＰＡＭの上流にあるシチジンからチミジンへの変換に成功した。いくつかの態様では、この最初のＢＥシステムは、ｄＣａｓ９を、脱アミノ化シチジンと反対の鎖にニックを入れる、「ニッカーゼ」Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａに変化させることによって最適化された。理論に束縛されるものではないが、これは、ロングパッチ塩基除去修復（ＢＥＲ）を開始すると予想され、脱アミノ化鎖を優先的に使用し、修復を鋳型にしてＵ：Ａ塩基対を生成し、次いでこれをＤＮＡ複製中にＴ：Ａに変換する。

【0159】

いくつかの実施形態では、塩基エディターは、触媒的に不活性な第１ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、塩基編集活性を有するドメイン、及びニッカーゼ活性を有する第２ＤＮＡ結合タンパク質ドメインを含有する核酸塩基エディターであり、ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、単一の融合タンパク質上に発現されるか、または別個に（例えば、別個の発現ベクター上に）発現される。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、塩基編集活性を有するドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）、ならびに２つの核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質ドメイン（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、すなわち、ニッカーゼ活性を含む第１ｎａｐＤＮＡｂｐ及び触媒的に不活性な第２ｎａｐＤＮＡｂｐ（少なくとも２つのｎａｐＤＮＡｂｐがリンカーによって結合している）を含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、ニッカーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）のＤＮＡドメイン（ｎＣａｓ、ｎＣａｓ９）、核酸プログラマブルＤＮＡ結合活性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）の触媒的に不活性なドメイン（ｄＣａｓ、例えば、ｄＣａｓ９）、及びデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質であり、ｄＣａｓはリンカーによってｎＣａｓに結合し、ｄＣａｓは、デアミナーゼドメインにすぐ隣接している。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、アデニン対チミン（ａｄｅｎｉｎｅ－ｔｏ－ｔｈｙｍｉｎｅ）もしくは「ＡＴＢＥ」（またはチミン対アデニン（ｔｈｙｍｉｎｅ－ｔｏ－ａｄｅｎｉｎｅ）もしくは「ＴＡＢＥ」）転換塩基エディターである。例示的な塩基エディター及び塩基エディターシステムとしては、特許公報第ＵＳ２０２２０１２７６２２号、同第ＵＳ２０２１００７９３６６号、同第ＵＳ２０２００２４８１６９号、同第ＵＳ２０２１００９３６６７号、同第ＵＳ２０２１００７１１６３号、同第ＷＯ２０２０１８１２０２号、同第ＷＯ２０２１１５８９２１号、同第ＷＯ２０１９１２６７０９号、同第ＷＯ２０２０１８１１７８号、同第ＷＯ２０２０１８１１９５号、同第ＷＯ２０２０２１４８４２号、同第ＷＯ２０２０１８１１９３号に記載されるようないずれかが挙げられ、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0160】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、標的プライム逆転写（ＴＰＲＴ）または「プライム編集」である。いくつかの実施形態では、プライム編集は、ＤＳＢまたはドナーＤＮＡ鋳型を要することなく、ヒト細胞内で標的挿入、欠失、１２の可能な全ての塩基間変換、及びそれらの組合せを媒介する。

【0161】

プライム編集は、ポリメラーゼと関連して（すなわち、融合タンパク質の形態で、またはさもなければ核酸プログラマブルＤＮＡ結合タンパク質（「ｎａｐＤＮＡｂｐ」）とトランスで提供されて）機能するｎａｐＤＮＡｂｐを使用して、指定したＤＮＡ部位に新たな遺伝情報を直接書き込むゲノム編集方法であり、プライム編集システムは、プライム編集（ＰＥ）ガイドＲＮＡ（「ＰＥｇＲＮＡ」）でプログラムされ、これは標的部位を特定し、ガイドＲＮＡ上で（例えば、ガイドＲＮＡの５’もしくは３’末端で、または内部で）操作された伸長（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）により、置換ＤＮＡ鎖の形態で所望の編集の合成を鋳型とする両方を行う。所望の編集（例えば、単一の核酸塩基置換）を含有する置換鎖は、編集される標的部位の内因性鎖と同じ配列を共有する（ただし、それが所望の編集を含むという点を除く）。ＤＮＡ修復及び／または複製機構を介して、標的部位の内因性鎖は、所望の編集を含有する新たに合成された置換鎖で置き換えられる。いくつかの場合には、プライム編集は、「検索置換（ｓｅａｒｃｈ－ａｎｄ－ｒｅｐｌａｃｅ）」ゲノム編集技術であると考えられてよく、その理由としては、プライムエディターは、編集される所望の標的部位を検索して位置を特定し、対応する標的部位の内因性ＤＮＡ鎖の代わりに同時に配置される、所望の編集を含有する置換鎖をコードするからである。例えば、プライム編集は、二本鎖切断を回避するために、正確なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースのゲノム編集を実施するように適合され得る。いくつかの実施形態では、相同タンパク質は、Ｃａｓタンパク質－逆転写酵素の融合体または関連するシステムであるか、またはそれらをコードし、ガイドＲＮＡにより特定のＤＮＡ配列を標的として、標的部位に一本鎖ニックを生成し、ニックを入れたＤＮＡを、ガイドＲＮＡと共に組み込まれる操作逆転写酵素鋳型の逆転写用プライマーとして使用する。いくつかの実施形態では、プライムエディタータンパク質は、ゲノムＤＮＡの対向鎖上の相補的ＤＮＡフラップの合成を鋳型にする２つのプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）と対になり、その結果、ＰＥ誘導ニック部位間の内因性ＤＮＡ配列が、ｐｅｇＲＮＡコード配列に置き換えられる。

【0162】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、逆転写酵素、または当該技術分野において既知の任意のＤＮＡポリメラーゼであるプライムエディターと関連している。したがって、一態様では、プライムエディターは、ＤＮＡ配列を、標的ＤＮＡ内の相補的プロトスペーサーにアニーリングするスペーサー配列を含有する特殊なガイドＲＮＡ（すなわち、ＰＥｇＲＮＡ）と会合させることによってＤＮＡ配列を標的とするようにプログラムされているＣａｓ９（または同等のｎａｐＤＮＡｂｐ）を含む場合がある。そのような方法としては、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１７１１－４）に、またはＰＣＴ公開第ＷＯ２０２０１９１２４８号、同第ＷＯ２０２１２２６５５８号、もしくは同第ＷＯ２０２２０６７１３０号に開示されるいずれかが挙げられ、その全体が本明細書に組み込まれる。

【0163】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術は、部位特異的ターゲティング要素を介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）である。いくつかの態様では、ＰＡＳＴＥは、ゲノム挿入が、逆転写酵素及びセリンインテグラーゼの両方に融合したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ニッカーゼを介して誘導されるプラットフォームである。Ｉｏａｎｎｉｄｉ ｅｔ ａｌ．（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．１１．０１．４６６７８６）に記載されるように、ＰＡＳＴＥは、二本鎖切断を生成しないが、約３６ｋｂ程度の大きさの配列組込みが可能である。いくつかの実施形態では、セリンインテグラーゼは、当該技術分野において既知のいずれかであり得る。いくつかの実施形態では、セリンインテグラーゼは、ＰＡＳＴＥを多重遺伝子組込みに使用し、少なくとも２つのゲノム座位において少なくとも２つの異なる遺伝子を同時に組み込み得るように、十分な直交性を有する。いくつかの実施形態では、ＰＡＳＴＥは、非分裂細胞における活性及び検出可能なオフターゲットイベントが少ない点で、相同組換え修復または非相同末端結合ベースの組込みの編集効率と同等か、またはそれよりも良好な編集効率を有する。

【0164】

いくつかの実施形態では、記載される操作細胞の集団は、レシピエント対象への投与時に減少したレベルの免疫活性化を誘発するか、または免疫活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象内で減少したレベルの全身性ＴＨ１活性化を誘発するか、または全身性ＴＨ１活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象内で減少したレベルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の免疫活性化を誘発するか、またはＰＢＭＣの免疫活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象への投与時に細胞に対して減少したレベルのドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発するか、またはドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象内で細胞に対して減少したレベルのＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生を誘発するか、またはＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生を誘発しない。いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエント対象への投与時に細胞の減少したレベルの細胞傷害性Ｔ細胞死滅を誘発する。

【0165】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞は、「自殺遺伝子」または「自殺スイッチ」を含む。自殺遺伝子または自殺スイッチは、操作細胞（例えば、操作初代細胞または操作多能性幹細胞から分化した細胞）の死を、例えば、操作細胞が対象に投与された後、それらの細胞が望ましくない様式で増殖及び分裂するような場合などに引き起こし得る、「安全スイッチ」として機能するように組み込まれ得る。「自殺遺伝子」による除去手法は、特定の化合物によって活性化される場合に限り、細胞死滅をもたらすタンパク質をコードする、遺伝子導入ベクター内の自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、非毒性化合物を毒性の高い代謝産物へと選択的に変換する酵素をコードする場合がある。その結果、酵素を発現する細胞を特異的に排除する。いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、トリガーは、ガンシクロビルである。他の実施形態では、自殺遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉシトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子であり、トリガーは、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である（Ｂａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２－１９４３（２０１２）、Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８：７３－８（１９９８）（いずれもその全体が参照によって本明細書に組み込まれる））。

【0166】

他の実施形態では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導できるカスパーゼタンパク質の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、誘導性カスパーゼタンパク質は、ｉＣａｓｐ９である。それは、Ｆ３６Ｖ変異を有するヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）の配列を含み、一連のアミノ酸を介してヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子に連結される。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、低分子二量体化剤のＡＰＩ９０３に高い親和性で結合する。したがって、本発明ではｉＣａｓｐ９の自殺機能は、二量体誘導化合物（ＣＩＤ）の投与によって誘発される。いくつかの実施形態では、ＣＩＤは、低分子薬ＡＰＩ９０３である。二量体化は、アポトーシスの迅速な誘導を引き起こす。（ＷＯ２０１１１４６８６２、Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６５；１８（２０１１）、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３－９２４（２００７）を参照し、その各々全体が参照によって本明細書に組み込まれる。）

【0167】

安全スイッチまたは自殺遺伝子の包含は、レシピエントに細胞傷害または他の負の結果をもたらす場合に細胞死滅の制御を可能にし、それゆえ、寛容原性因子を使用する療法を含む、細胞ベースの療法の安全性が高まる。

【0168】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、例えば、細胞が望ましくない様式で増殖及び分裂するか、または宿主に対して過度の毒性を引き起こす場合に、安全スイッチを含有する操作細胞の死またはアポトーシスを誘導する能力を提供するために、本明細書で提供される操作細胞中に組み込まれ得る（例えば、導入など）。したがって、安全スイッチの使用は、インビボで異常細胞の条件付き排除を可能にし、診療所における細胞療法の適用のための重要なステップであり得る。安全スイッチ及びその使用は、例えば、Ｄｕｚｇｕｎｅ§，Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１９）、Ｄｕｚｇｕｎｅ§（ｅｄｓ），Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８９５（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）（ＨＳＶ－ｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼについて）、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ４４（１１）：１０１３－１０１９（２０１６）（ｉＣａｓｐａｓｅ９について）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １８（５）：１２５５－１２６３（２００１）（ｈｕＥＧＦＲについて）、米国特許出願公開第２０１８０００２３９７号（ＨＥＲ１について）、ならびにＰｈｉｌｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１２４（８）：１２７７－１２８７（２０１４）（ＲＱＲ８について）に記載されている。

【0169】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、制御された様式で、例えば、薬物もしくはプロドラッグの存在下で、または選択的外因性化合物による活性化時に、細胞死を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、ラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、及びＲＱＲ８からなる群から選択される。

【0170】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、薬物またはプロドラッグによって活性化される場合、例えば、非毒性プロドラッグを細胞内で毒性代謝産物に変換することによって、細胞死滅能力を有する生成物をコードする導入遺伝子であってよい。これらの実施形態では、細胞死滅は、操作細胞を薬物またはプロドラッグと接触させることによって活性化される。いくつかの場合には、安全スイッチはＨＳＶ－ｔｋであり、これは、ガンシクロビル（ＧＣＶ）をＧＣＶ三リン酸に変換し、それによってＤＮＡ合成を妨害して分裂細胞を死滅させる。いくつかの場合には、安全スイッチは、ＣｙＤまたはそのバリアントであり、これは、シトシンからウラシルへの加水分解的脱アミノ化を触媒することによって、抗真菌薬の５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を細胞傷害性の５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換する。５－ＦＵは、さらに細胞酵素によって強力な代謝拮抗薬（５－ＦｄＵＭＰ、５－ＦｄＵＴＰ、５－ＦＵＴＰ）に変換される。これらの化合物は、チミジル酸シンターゼならびにＲＮＡ及びＤＮＡの産生を阻害し、細胞死をもたらす。いくつかの場合には、安全スイッチは、ＮＴＲまたはそのバリアントであり、これは、増殖及び非増殖細胞において有毒な反応性Ｎ－ヒドロキシルアミン中間体へのニトロ基の還元を介してプロドラッグＣＢ１９５４に作用し得る。いくつかの場合には、安全スイッチはＰＮＰまたはそのバリアントであり、これは、プロドラッグの６－メチルプリンデオキシリボシドまたはフルダラビンを、増殖及び非増殖細胞の両方にとって有毒な代謝産物に変換し得る。いくつかの場合には、安全スイッチは、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはそのバリアントであり、これは、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）を強力な細胞毒素へと触媒し、それゆえ、細胞死滅を達成し得る。

【0171】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、ｉＣａｓｐ９であってよい。カスパーゼ９は、ミトコンドリアの内因性アポトーシス経路の構成要素であり、これは、生理学的条件下で損傷ミトコンドリアからのシトクロムＣの放出によって活性化される。次いで、活性化カスパーゼ９はカスパーゼ３を活性化し、これはアポトーシスをもたらす末端エフェクター分子を誘導する。ｉＣａｓｐ９は、切断カスパーゼ９（その生理学的二量体化ドメインまたはカスパーゼ活性化ドメインを有しない）を、ペプチドリンカーを介してＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）のＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖに融合させることによって生成されてよい。ｉＣａｓｐ９は、低い二量体非依存的基礎活性を有し、その表現型、機能、または抗原特異性を損なうことなく宿主細胞（例えば、ヒトＴ細胞）中で安定に発現され得る。しかしながら、二量体誘導化合物（ＣＩＤ）、例えば、リミドゥシド（ＡＰ１９０３）、ＡＰ２０１８７、及びラパマイシンなどの存在下で、ｉＣａｓｐ９は、誘導性二量体化を受けて下流のカスパーゼ分子を活性化し得、ｉＣａｓｐ９を発現する細胞のアポトーシスを引き起こす。例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１１／１４６８６２号、Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５；１８（２０１１）、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １３：９１３－９２４（２００７）を参照のこと。特に、ラパマイシン誘導性カスパーゼ９バリアントは、ｒａｐａＣａｓｐ９と呼ばれている。Ｓｔａｖｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｔｈｅｒ．２６（５）：１２６６－１２７６（２０１８）を参照のこと。したがって、ｉＣａｓｐ９は、宿主細胞の死滅制御を達成するための安全スイッチとして使用され得る。

【0172】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、膜発現タンパク質に対する特異的抗体の投与後に細胞枯渇を可能にするそのタンパク質であってよい。このカテゴリーの安全スイッチとしては、例えば、その表面発現のためにＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、またはＲＱＲ８をコードする１つ以上の導入遺伝子が挙げられてよい。これらのタンパク質は、特異的抗体によって標的とされ得る表面エピトープを有してよい。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＣＲ４抗体によって認識され得るＣＣＲ４を含む。好適な抗ＣＣＲ４抗体の非限定的な例としては、モガムリズマブ及びそのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＤ１６または抗ＣＤ３０抗体によって認識され得る、ＣＤ１６またはＣＤ３０を含む。そのような抗ＣＤ１６または抗ＣＤ３０抗体の非限定的な例としては、ＡＦＭ１３及びそのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＤ１９抗体によって認識され得るＣＤ１９を含む。そのような抗ＣＤ１９抗体の非限定的な例としては、ＭＯＲ２０８及びそのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＣＤ２０抗体によって認識され得るＣＤ２０を含む。そのような抗ＣＤ２０抗体の非限定的な例としては、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、及びそのバイオシミラーが挙げられる。したがって、安全スイッチを発現する細胞はＣＤ２０陽性であり、記載されるように抗ＣＤ２０抗体の投与を介して死滅のために標的とされ得る。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＥＧＦＲ抗体によって認識され得るＥＧＦＲを含む。そのような抗ＥＧＦＲ抗体の非限定的な例としては、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びそのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、安全スイッチは、抗ＧＤ２抗体によって認識され得るＧＤ２を含む。そのような抗ＧＤ２抗体の非限定的な例としては、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジニツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ、及びそのバイオシミラーが挙げられる。

【0173】

いくつかの実施形態では、安全スイッチは、操作細胞の表面上における１つ以上の寛容原性因子を認識する外因性投与剤であってよい。いくつかの実施形態では、外因性投与剤は、寛容剤、例えば、抗ＣＤ４７抗体を対象とするか、またはそれに特異的な抗体である。操作細胞上の寛容原性因子を認識及び遮断することによって、外因性投与抗体は、寛容原性因子の免疫阻害機能を遮断する場合があり、それによって、操作細胞に対する免疫系を再感作する。例えば、ＣＤ４７を過剰発現する操作細胞の場合、外因性投与抗ＣＤ４７抗体が対象に投与されてよく、その結果、操作細胞上のＣＤ４７がマスキングされ、操作細胞に対する免疫応答の誘発がもたらされる。

【0174】

いくつかの実施形態では、本方法は、誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを細胞に導入することをさらに含む。

【0175】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、所望の改変のうち１つ以上をすでに含む供給源細胞に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される教示を考慮すると、当業者は、操作細胞の所望の最終形態に到達するためにどのような改変が必要であるか、及び標的構成要素の減少した、または増加したレベル全てが、積極的操作によって達成されているとは限らないのかについて評価する方法を容易に理解することになる。いくつかの実施形態では、操作細胞の改変は、任意の順序であり、必ずしも本明細書で提供される記述言語で列挙される順序でなくともよい。

【0176】

いくつかの実施形態では、本明細書では、操作細胞を生成する方法が提供され、本方法は、（ａ）細胞内の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現を減少させるか、または排除すること、（ｂ）細胞内のＣＤ１４２の発現を減少させること、ならびに（ｃ）細胞内の寛容原性因子の発現を増加させることを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ、及びＨ２－Ｍ３から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、本方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現を減少させるか、または排除することを含む。いくつかの実施形態では、発現を減少または増加させることは、誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を使用して細胞に１つ以上の改変を実施することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本細胞内のＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることをさらに含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、本明細書では、操作細胞を生成する方法が提供され、本方法は、（ａ）細胞内のＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させること、ならびに（ｂ）細胞内のＣＤ１４２の発現を減少させることを含む。いくつかの実施形態では、発現を減少または増加させることは、誘導型ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を使用して細胞に１つ以上の改変を実施することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターを細胞に導入することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、本細胞内のＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることをさらに含む。

【0178】

一度変更されると、本明細書に記載される分子のいずれかの発現の存在が、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイなどの既知の技術を使用してアッセイされ得る。

【0179】

Ａ．標的遺伝子の発現減少
１．標的遺伝子
Ａ．ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子
いくつかの実施形態では、提供される操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかの発現を制御する（例えば、減少させるか、または排除する）、１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたはタンパク質配列（標的遺伝子とも交換可能に称される）の改変（例えば、遺伝子改変）を含む。いくつかの実施形態では、改変または操作される細胞は、１つ以上の改変が予め導入されていない、非改変細胞または非操作細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を制御する（例えば、減少させるか、または排除する）、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を改変するために使用される。ある特定の実施形態では、細胞のゲノムは、細胞の表面上における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現などの、ＨＬＡ発現の促進に必要な、またはそれに関与する構成要素を減少または欠失させるように変更されている。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の構成要素であるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現が細胞中で減少するか、または排除され、それによって１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現（例えば、細胞表面発現）を操作細胞によって減少させるか、または排除する。

【0180】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させることは、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ及び／またはＮＦＹ－Ｃのうち１つ以上の発現を減少させる。

【0181】

いくつかの実施形態では、操作細胞内の１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現を制御する（例えば、減少させるか、または排除する）、操作細胞における記載される改変のいずれも、節ＩＩ．Ｂに記載されるポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ４７などの寛容原性因子）を過剰発現させるための１つ以上の改変と共に組み合わされてよい。

【0182】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子発現の減少は、例えば、以下のうち１つ以上によって達成され得る：（１）多型ＨＬＡアレル（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を直接標的とすること、（２）Ｂ２Ｍの除去によって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子全ての表面輸送が減少することになること、及び／または（３）ＨＬＡ発現に重要なＭＨＣエンハンセオソーム、例えば、ＬＲＣ５、ＲＦＸ－５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＩＲＦｌ、ＮＦ－Ｙ（ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃを含む）、及びＣＩＩＴＡなどの１つ以上の構成要素の欠失。

【0183】

ある特定の実施形態では、ＨＬＡ発現が妨害される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ発現は、個々のＨＬＡを標的とすること（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／またはＨＬＡ－Ｃの発現をノックアウトすること）、ＨＬＡ発現の転写制御因子を標的とすること（例えば、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ及び／またはＩＲＦ－１の発現をノックアウトすること）、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送を遮断すること（例えば、Ｂ２Ｍ及び／またはＴＡＰ１の発現をノックアウトすること）、及び／またはＨＬＡ－Ｒａｚｏｒを用いて標的とすること（例えば、ＷＯ２０１６１８３０４１を参照のこと）によって妨害される。

【0184】

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体は、ヒトＭＨＣと同義である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される操作細胞は、ヒト細胞である。ある特定の態様では、本明細書に開示される操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に対応する１つ以上のヒト白血球抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／またはＨＬＡ－Ｃ）を発現せず、それゆえ、低免疫原性であると特徴付けられる。例えば、ある特定の態様では、本明細書に開示される操作細胞は、任意の幹細胞またはそれから調製される分化した幹細胞を含む細胞が、以下のＭＨＣクラスＩ分子：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃのうち１つ以上を発現しないか、またはその発現減少を示すように改変されている。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃのうち１つ以上が、細胞から「ノックアウト」されてよい。ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子、及び／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子がノックアウトされた細胞は、ノックアウトされた各遺伝子の発現減少または排除を示す場合がある。

【0185】

ある特定の実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、ゲノムＤＮＡの連続ストレッチを標的として欠失させ、それによってＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＮＬＲＣ５からなる群から選択される標的遺伝子の発現を減少させるか、または排除することによって調節される。

【0186】

いくつかの実施形態では、提供される操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子を制御する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の改変を含む。１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる例示的な方法は、以下の節に記載されている。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍ及びＮＬＲＣ５の一方または両方である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する遺伝子編集改変（例えば、インデル）を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集改変（例えば、インデル）を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子に対する遺伝子編集改変（例えば、インデル）を含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍの発現を減少させる改変である。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ発現を減少させる。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現減少は、改変を含まない同じ細胞型の非改変または野生型細胞と比較してのものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、約５％を超えて減少し、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えるいずれかを超えて減少するなどである。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、最大約１００％減少し、例えば、最大約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれ未満のいずれかで減少するなどである。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで減少する。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は排除される（例えば、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの０％発現）。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡ発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する。

【0188】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍタンパク質発現を減少させる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現減少は、改変を含まない同じ細胞型の非改変または野生型細胞と比較してのものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、約５％を超えて減少し、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えるいずれかを超えて減少するなどである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、最大約１００％減少し、例えば、最大約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれ未満のいずれかで減少するなどである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで減少する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は排除される（例えば、Ｂ２Ｍタンパク質の検出可能な発現なし）。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍタンパク質発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する。

【0189】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の片アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ発現を減少させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む不活性化または破壊を含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、改変は、細胞における１つ以上のＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞における全てのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子内のインデルを含む不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失である。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子はノックアウトされる。

【0191】

いくつかの実施形態では、提供される操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を制御する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の改変を含む。１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる例示的な方法は、以下の節に記載されている。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子に対する遺伝子編集改変を含む。

【0192】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡの発現を減少させる改変である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡ発現を減少させる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現減少は、改変を含まない同じ細胞型の非改変または野生型細胞と比較してのものである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は、約５％を超えて減少し、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えるいずれかを超えて減少するなどである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は、最大約１００％減少し、例えば、最大約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれ未満のいずれかで減少するなどである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで減少する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は排除される（例えば、ＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡの０％発現）。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡ発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性を排除する。

【0193】

いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡタンパク質発現を減少させる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現減少は、改変を含まない同じ細胞型の非改変または野生型細胞と比較してのものである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、約５％を超えて減少し、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えるいずれかを超えて減少するなどである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、最大約１００％減少し、例えば、最大約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれ未満のいずれかで減少するなどである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで減少する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は排除される（例えば、ＣＩＩＴＡタンパク質の０％発現）。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性を排除する。

【0194】

いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の片アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ発現を減少させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む不活性化または破壊を含む。

【0195】

いくつかの実施形態では、改変は、細胞における１つ以上のＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞における全てのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子内のインデルを含む不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子はノックアウトされる。

【0196】

いくつかの実施形態では、提供される操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を制御する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の改変を含む。１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる例示的な方法は、以下の節に記載されている。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ及びＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集改変を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集改変を含む。特定の実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集改変を含む。

【0197】

Ｂ．ＣＤ１４２
ある特定の態様では、本明細書に開示される技術は、ＣＤ１４２（組織因子、第ＩＩＩ因子、及びＦ３としても知られる）の発現を調節する（例えば、減少させるか、または排除する）。いくつかの実施形態では、調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して行われる。

【0198】

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ１４２またはＣＤ１４２のバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ１４２のホモログである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ１４２のオルソログである。

【0199】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＣＤ１４２遺伝子を標的とする改変を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＣＤ１４２遺伝子を標的とする改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＣＤ１４２遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列を含む。ＣＤ１４２を標的とするｇＲＮＡ配列を特定する有用な方法は、以下に記載される。

【0200】

ＣＤ１４２遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載される。一実施形態では、ＰＣＲによって得られたＣＤ１４２遺伝子の改変及びＣＤ１４２発現の減少は、ＦＡＣＳ分析によるアッセイであり得る。別の実施形態では、ＣＤ１４２タンパク質発現は、ＣＤ１４２タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、不活性化改変の存在を確認するために使用される。

【0201】

ヒトＣＤ１４２についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０１Ｍ０９４５３０、ＨＧＮＣ番号３５４１、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ２１５２、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＭ＿００１１７８０９６．１、ＮＭ＿００１９９３．４、ＮＰ＿００１１７１５６７．１、及びＮＰ＿００１９８４．１、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ１３７２６などで提供される。

【0202】

２．発現を減少させる方法
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、記載されるような１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現を減少させるように改変される（例えば、遺伝子改変される）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現を減少させる（例えば、排除する）ための１つ以上の改変を用いて操作されている細胞は、本明細書に記載されるような任意の供給源細胞である。いくつかの実施形態では、供給源細胞は、節ＩＩ．Ｃに記載される任意の細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、例えば、ベータ島細胞もしくは肝細胞など、または初代細胞）は、１つ以上の標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるための１つ以上の改変を含む。１つ以上の標的ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、上に記載されるようないずれか、例えば、ＣＤ１４２などに加えて、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＬＲＣ５、ＲＦＸ－ＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸ－ＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ１、及びＴＡＰ１のうち１つ以上が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的ポリヌクレオチドの発現を減少させるための改変は、節ＩＩ．Ｂに記載されるいずれかなどの、所望の導入遺伝子の発現を増加させるための１つ以上の改変と組み合わされる。いくつかの実施形態では、改変は、免疫特権細胞または低免疫原性細胞である操作細胞を作製する。１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの発現を調節すること（例えば、減少させるか、または欠失させること）によって、そのような細胞は、レシピエント対象に移植される場合に免疫活性化の低減を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、投与時にレシピエント対象または患者における低免疫原性とみなされる。

【0203】

標的ポリヌクレオチドの発現を減少させる任意の方法が使用されてよい。いくつかの実施形態では、改変によって、標的ポリヌクレオチドの発現が永久的に排除されるか、または減少する。例えば、いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたは遺伝子は、標的指向性エンドヌクレアーゼの使用などにより、標的ポリヌクレオチドにＤＮＡ切断を導入することによって破壊される。他の実施形態では、改変によって、標的ポリヌクレオチドの発現が一過的に減少する。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子抑制は、遺伝子の発現を選択的に抑制または抑圧するために標的ポリヌクレオチドに相補的な阻害核酸を使用して、例えば、アンチセンス技術を使用して、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、短分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）、及び／またはリボザイムなどによって達成される。

【0204】

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物ゲノム配列である。

【0205】

いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、遺伝子内において典型的には標的様式で、１つ以上の二本鎖切断及び／または１つ以上の一本鎖切断の誘導によって実施される。いくつかの実施形態では、二本鎖または一本鎖切断は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子標的ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼによって作製される。いくつかの実施形態では、標的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子またはその一部の配列を標的とするように特異的に設計されたＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）などから選択される。いくつかの実施形態では、標的ヌクレアーゼは、二本鎖または一本鎖切断を生成し、次いで誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または、いくつかの場合には、正確な相同組換え修復（ＨＤＲ）（その場合は鋳型が使用される）によって修復を受ける。いくつかの実施形態では、標的ヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する。いくつかの実施形態では、切断を生成及び修復するプロセスは、典型的には誤りが多く、ＮＨＥＪ修復からＤＮＡ塩基の挿入及び欠失（インデル）を引き起こす。いくつかの実施形態では、改変は、標的遺伝子のヌクレオチド配列の欠失、挿入または変異を誘導する場合がある。いくつかの場合には、改変はフレームシフト変異を引き起こす場合があり、これは、未成熟終止コドンをもたらし得る。ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集の例では、遺伝子の両アレル上で標的編集が行われ、遺伝子の両アレルの破壊または編集をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子の全アレルが、遺伝子編集によって標的とされる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用などの標的ヌクレアーゼを用いた改変は、遺伝子の完全なノックアウトを引き起こす。

【0206】

いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入される。ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼをコードする核酸の形態で細胞に導入されてよい。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成され得る。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞に導入される核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で細胞に導入される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの場合、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）が細胞に導入されてよい。

【0207】

いくつかの実施形態では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して行われる。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変更できる任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、使用され得る。そのようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、様々なＣａｓタンパク質を用い得る（Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００５；１（６）ｅ６０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによる、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の変更を可能にするそのようなＣａｓタンパク質の分子機構は、ＲＮＡ結合タンパク質、エンド及びエキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムである。

【0208】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、細胞内の任意の標的ポリヌクレオチド配列を変更するために使用され得る標的システムを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質及びＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導し、それにハイブリダイズできる１つ以上の、例えば、少なくとも１～２つなどのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））を含む。

【0209】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換または改変を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの場合では、置換及び／または改変は、タンパク質分解を防止もしくは減少させて、及び／または細胞内のポリペプチドの半減期を延長し得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ペプチド結合置換（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素など）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、代替アミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸、ベータ－アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリンなど）を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、部分を含むような改変（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、エンドキャッピングなど）を含み得る。

【0210】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、コアＣａｓタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８及びＣａｓ９が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ２としても知られる）を含む。Ｅ．Ｃｏｌｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、及びＣａｓ５ｅが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＹｐｅｓｔサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ３としても知られる）を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びＣｓｙ４が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮｍｅｎｉサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ４としても知られる）を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｎ１及びＣｓｎ２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＤｖｕｌｇサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ１としても知られる）を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、及びＣａｓ５ｄが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＴｎｅａｐサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ７としても知られる）を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃａｓ５ｔが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、及びＣａｓ５ｈが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡｐｅｒｎサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ５としても知られる）を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、及びＣａｓ５ａが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＭｔｕｂｅサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ６としても知られる）を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、及びＣｓｍ５が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的なＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質としては、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、及びＣｍｒ６が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｌｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７１，２１９－２２５（２０１９）、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６５，４８－５３（２０１９）を参照のこと。

【0211】

いくつかの実施形態では、１つ以上の遺伝子をノックアウト、ノックダウン、または別の方法で改変するように細胞を遺伝子改変する方法は、部位特異的ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムを含むものを使用することを含む。

【0212】

ＺＦＮは、細菌ＦｏｋＩ制限酵素のエンドヌクレアーゼドメインに結合したジンクフィンガー含有転写因子から適応された一連の部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質である。ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインまたはジンクフィンガードメインのうち１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える）を有してよい。例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（２０１１）１８８：７７３－７８２、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１１５６－１１６０を参照のこと。各ジンクフィンガードメインは、１つ以上の亜鉛イオンによって安定化した小タンパク質構造モチーフであり、通常、３～４ｂｐのＤＮＡ配列を認識する。したがって、タンデムドメインは、細胞のゲノム内において特有の伸長したヌクレオチド配列に結合する可能性があり得る。

【0213】

既知の特異性を持つ様々なジンクフィンガーが、約６、９、１２、１５、または１８ｂｐ配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを作製するために組み合わされ得る。ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッドシステム、ならびに哺乳動物細胞を含む、様々な選択及びモジュール組立て技術が、特定の配列を認識するジンクフィンガー（及びそれらの組合せ）を生成するために利用可能である。ジンクフィンガーは、所定の核酸配列と結合するように操作され得る。所定の核酸配列に結合するようにジンクフィンガーを操作するための基準は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｓｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：７０７４－７０８１、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２００８）２４：１８５０－１８５７を参照のこと。

【0214】

ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたは他の二量体ヌクレアーゼドメインを含有するＺＦＮは、二量体として機能する。したがって、非パリンドロームＤＮＡ部位を標的とするために一対のＺＦＮが必要となる。２つの個々のＺＦＮは、それらのヌクレアーゼが適切に離れた状態でＤＮＡの逆鎖と結合しなければならない。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５：１０５７０－１０５７５を参照のこと。ゲノム内の特定の部位を切断するために、一対のＺＦＮは、一方がフォワード鎖上の、及び他方がリバース鎖上の、部位に隣接する２つの配列を認識するように設計される。ＺＦＮが部位の両側に結合すると、ヌクレアーゼドメインが二量体化し、その部位でＤＮＡを切断して５’オーバーハングを有するＤＳＢを生成する。次いで、相同性アームに隣接する所望の変異を含有する修復鋳型を用いて、特定の変異を誘導するためにＨＤＲが利用され得る。修復鋳型は通常、細胞に導入される外因性二本鎖ＤＮＡベクターである。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３－１４８、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：７３１－７３４を参照のこと。

【0215】

ＴＡＬＥＮは、標的遺伝子を編集するために使用され得る人工ヌクレアーゼの別の例である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥリピートと称されるＤＮＡ結合ドメインに由来し、ＴＡＬＥリピートは通常、長いＤＮＡ配列と結合してそれを認識する１０～３０のリピートを有するタンデムアレイを含む。各リピートは、３３～３５アミノ酸長であり、このうち２つの隣接するアミノ酸（反復可変二残基（ｒｅｐｅａｔ－ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｉ－ｒｅｓｉｄｕｅ）またはＲＶＤと称される）が４つのＤＮＡ塩基対のうち１つに特異性を付与する。したがって、標的ＤＮＡ配列内においてリピートと塩基対との間に１対１の対応関係が存在する。

【0216】

ＴＡＬＥＮは、１つ以上のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える）をヌクレアーゼドメイン、例えば、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインに融合することによって人工的に作製される。Ｚｈａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４９－１５３を参照のこと。ＦｏｋＩに対するいくつかの変異が、ＴＡＬＥＮにおけるその使用のために作製されていて、これらは、例えば、切断特異性または活性を改善する。Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１１）３９：ｅ８２、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４３－１４８、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：７３１－７３４、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１）３３３：３０７、Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）８：７４－７９、Ｓｚｃｚｅｐｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００７）２５：７８６－７９３、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１０）２００：９６を参照のこと。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能するため、適切な向き及び間隔で標的ゲノム内の部位に対して特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとの間のアミノ酸残基の数及び２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位間における塩基の数の両方が、高レベルの活性を達成するための重要なパラメータであると思われる。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４３－１４８。

【0217】

操作ＴＡＬＥリピートをヌクレアーゼドメインと組み合わせることによって、任意の所望のＤＮＡ配列に特異的な部位特異的ヌクレアーゼが作製され得る。ＺＦＮと同様に、ゲノム内の所望の標的部位にＤＳＢを生成するためにＴＡＬＥＮが細胞に導入され得、そのため、同様のＨＤＲ媒介経路で遺伝子をノックアウトするか、または変異をノックインするために使用され得る。Ｂｏｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１３５－１３６、Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６：１５０９－１５１２、Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６：３５０１を参照のこと。

【0218】

メガヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼファミリー内の酵素であり、それらは大きなＤＮＡ配列（１４～４０塩基対）を認識して切断するそれらの能力を特徴とする。メガヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性及び／またはＤＮＡ認識に影響を及ぼすそれらの構造モチーフに基づいてファミリーに分類される。最も幅広く、かつ最もよく知られているメガヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのタンパク質であり、それらの名称は保存アミノ酸配列に由来する。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照のこと。一方で、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリーメンバーはＧＩＹ－ＹＩＧモジュールを有し、これは７０～１００残基長であり、４つのインバリアント残基を有する４つまたは５つの保存配列モチーフを含み、そのうち２つは活性に必要である。Ｖａｎ Ｒｏｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（２００２）９：８０６－８１１を参照のこと。Ｈｉｓ－Ｃｙｓファミリーメガヌクレアーゼは、数百のアミノ酸残基を包含する領域にわたる、高度に保存された一連のヒスチジン及びシステインを特徴とする。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照のこと。ＮＨＮファミリーのメンバーは、アスパラギン残基によって囲まれた二対の保存されたヒスチジンを含有するモチーフによって定義される。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照のこと。

【0219】

特定の標的ＤＮＡ配列に対する天然メガヌクレアーゼを同定する可能性は、高い特異性を要するので低いため、変異誘発及びハイスループットスクリーニング方法を含む様々な方法が、特有の配列を認識するメガヌクレアーゼバリアントを作製するために使用されている。例えば、所定の核酸配列に結合するように、変更したＤＮＡ結合特異性を有するメガヌクレアーゼを操作するための戦略が、当該技術分野において既知である。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．（２００２）１０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００３）３１：２９５２－２９６２、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００６）３６１：７４４－７５４、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００２）３０：３８７０－３８７９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００４）３４２：３１－４１、Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（２００６）１２８：２４７７－２４８４、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２００９）２２：２４９－２５６、Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００６）３５５：４４３－４５８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００６）３６３（２）：２８３－２９４を参照のこと。

【0220】

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮのように、メガヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡ内にＤＳＢを作製し得、これは例えば、ＮＨＥＪによって不適切に修復された場合にフレームシフト変異を作製し、細胞内で標的遺伝子の発現の低減をもたらし得る。あるいは、外来ＤＮＡは、メガヌクレアーゼと共に細胞に導入され得る。外来ＤＮＡの配列及び染色体配列に応じて、本プロセスは、標的遺伝子を改変するために使用され得る。Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１１）１１：１１－２７を参照のこと。

【0221】

トランスポザーゼは、トランスポゾンの末端に結合し、切り貼り機構または複製転位機構によってゲノムの別の部分に対してその移動を触媒する酵素である。トランスポサーゼを他のシステム、例えば、ＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓシステムなどと連結させることによって、ゲノムＤＮＡの部位特異的挿入または操作を可能にするための新たな遺伝子編集ツールが開発され得る。トランスポゾンを使用する２つの既知のＤＮＡ組込み方法が存在し、これらは触媒的に不活性なＣａｓエフェクタータンパク質及びＴｎ７様トランスポゾンを使用する。トランスポザーゼ依存的ＤＮＡ組込みは、ゲノム内でＤＳＢを誘発せず、これはより安全かつより特異的なＤＮＡ組込みを保証する可能性がある。

【0222】

ＣＲＩＳＰＲシステムは、獲得免疫の形態を提供する、侵入するファージ及びプラスミドに対する防御に関与するシステムとして原核生物（例えば、細菌及び古細菌）において最初に発見された。現在では、そのシステムは、研究及び臨床用途において普及している遺伝子編集ツールとして適応及び使用されている。

【0223】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは一般に、少なくとも２つの構成要素：１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質を含む。Ｃａｓタンパク質は、標的部位にＤＳＢを導入するヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、２つの主なクラスに分類される：クラス１システムは、核酸を分解するために複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用し、クラス２システムは、同じ目的のために単一の大きなＣａｓタンパク質を使用する。クラス１は、Ｉ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型に分類され、クラス２は、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型に分類される。遺伝子編集用途のために適合された異なるＣａｓタンパク質としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びＭａｄ７が挙げられるが、これらに限定されない。最も広く使用されているＣａｓ９は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質であり、例示として本明細書に記載される。これらのＣａｓタンパク質は、異なる供給源種に由来する場合がある。例えば、Ｃａｓ９は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に由来し得る。

【0224】

本来の微生物ゲノムでは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、宿主ゲノム内のアレイとしてコードされるＣＲＩＳＰＲリピート配列間に侵入ＤＮＡからの配列を組み込む。ＣＲＩＳＰＲリピートアレイからの転写物は、「プロトスペーサー」配列として知られる、侵入ＤＮＡから転写された可変配列に加えて、ＣＲＩＳＰＲリピートの一部を各々保有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）へとプロセシングされる。各ｃｒＲＮＡは、第２トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズし、これらの２つのＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成する。ｃｒＲＮＡのプロトスペーサーコード部分は、相補的標的ＤＮＡ配列を切断するようにＣａｓ９複合体を誘導するが、ただし、それらは「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）として知られる短い配列に隣接していることを条件とする。

【0225】

その発見以降、ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌からヒト細胞を含む真核細胞にわたる、広範囲の細胞及び生物において配列特異的ＤＳＢ及び標的ゲノム編集を誘導するために適合されている。遺伝子編集用途におけるその使用では、人工的に設計された合成ｇＲＮＡが、本来のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体から置き換えられている。例えば、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ、テトラループ、及びｔｒａｃｒＲＮＡで構成される一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。ｃｒＲＮＡは通常、目的の標的ＤＮＡを認識するようにユーザーが設計した相補的領域（スペーサーとも呼ばれ、通常は約２０ヌクレオチド長）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、Ｃａｓヌクレアーゼ結合のための骨格領域を含む。ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、テトラループによって連結され、各々は、互いにハイブリダイズするための短いリピート配列を有し、それゆえ、キメラｓｇＲＮＡを生成する。ｇＲＮＡ中に存在するスペーサーまたは相補的領域配列を単純に変化させることによって、Ｃａｓヌクレアーゼのゲノム標的を変化させ得る。相補的領域は、標準的なＲＮＡ－ＤＮＡ相補的塩基対合規則によって標的ＤＮＡ部位にＣａｓヌクレアーゼを誘導することになる。

【0226】

Ｃａｓヌクレアーゼが機能するためには、ゲノムＤＮＡ内の標的配列のすぐ下流にＰＡＭが存在しなければならない。Ｃａｓタンパク質によるＰＡＭの認識は、隣接ゲノム配列を不安定化し、ｇＲＮＡによる配列の照合を可能にして、一致する配列が存在する場合にｇＲＮＡ－ＤＮＡ対合をもたらすと考えられている。ＰＡＭの特異的配列は、Ｃａｓ遺伝子の種に応じて変動する。例えば、化膿連鎖球菌に由来する最も一般的に使用されているＣａｓ９ヌクレアーゼは、５’－ＮＧＧ－３’、またはあまり効率的ではないが、５’－ＮＡＧ－３’（式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチドであり得る）のＰＡＭ配列を認識する。代替ＰＡＭを有する他のＣａｓヌクレアーゼバリアントもまた特性決定され、ゲノム編集のための使用に成功していて、それを以下の表１ａにまとめている。

【0227】

【表1a】

【0228】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、それらの活性、特異性、認識、及び／または他の特性を変更するための１つ以上の変異を含んでよい。例えば、Ｃａｓヌクレアーゼは、オフターゲット効果を軽減するためにその忠実度を変更する１つ以上の変異を有してよい（例えば、ｅＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＨｙｐａＳｐＣａｓ９、ＨｅＦＳｐＣａｓ９、及びｅｖｏＳｐＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９の高忠実度バリアントである）。別の例では、Ｃａｓヌクレアーゼは、そのＰＡＭ特異性を変更する１つ以上の変異を有してよい。

【0229】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質のうちいずれか１つまたはその機能部分を含む。本明細書で使用される場合、「機能部分」は、少なくとも１つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合化し、標的ポリヌクレオチド配列を切断するその能力を保持するペプチドの部分を指す。いくつかの実施形態では、機能部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、機能的に連結されたＣａｓ９タンパク質機能ドメインの組合せを含む。いくつかの実施形態では、機能部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、機能的に連結されたＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）タンパク質機能ドメインの組合せを含む。いくつかの実施形態では、機能ドメインは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質の機能部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質の機能部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能部分を含む。

【0230】

いくつかの実施形態では、好適なＣａｓタンパク質としては、Ｃａｓ０、Ｃａｓ１２ａ（すなわち、Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｉ、ＣａｓＸ、及びＭａｄ７が挙げられるが、これらに限定されない。

【0231】

いくつかの実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質は、ポリペプチド形態で細胞に導入され得る。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドに複合化または融合され得る。本明細書で使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」及び「細胞透過性ペプチド」は、細胞への分子の取込みを容易にする、ポリペプチドまたはペプチドをそれぞれ指す。細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含有し得る。

【0232】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、荷電タンパク質（例えば、正電荷、負電荷、または全体的に中性の電荷を保有する）に複合化または融合され得る。そのような連結は、共有結合であってよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質が細胞を透過する能力を著しく増加させるために、超正荷電ＧＦＰに融合され得る（Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０；５（８）：７４７－５２）。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞内へのその進入を容易にするためにタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合され得る。例示的なＰＴＤとしては、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、及びペネトラチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、超正荷電ＧＦＰに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａタンパク質は、超正荷電ＧＦＰに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。

【0233】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で、標的ポリヌクレオチド配列を含有する細胞に導入され得る。核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成され得る。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるような改変ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸はｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に記載されるような改変ｍＲＮＡ（例えば、合成改変ｍＲＮＡ）を含む。

【0234】

提供される実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは一般に、２つの構成要素：１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上の、例えば、１～２つなどのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるような改変核酸（例えば、合成改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。

【0235】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ結合のための足場配列及びｃｒＲＮＡと称されるユーザー設計スペーサーまたは相補的部分で構成される短い合成ＲＮＡである。ｃＲＮＡは、改変されるゲノム標的を定義するｃｒＲＮＡ標的指向性配列（本明細書では以後、ｇＲＮＡ標的指向性配列とも呼ばれ、通常は約２０ヌクレオチド長）及びｃｒＲＮＡリピートの領域（例えば、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ、配列番号：１９）で構成される。ｇＲＮＡ中に存在する相補的部分配列（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）を単に変化させることによって、Ｃａｓタンパク質のゲノム標的を変化させ得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合のための足場配列は、そのアンチリピート配列を介してｃｒＲＮＡにハイブリダイズするｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ、配列番号：２０）で構成される。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ間の複合体は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）を動員し、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流で切断する。Ｃａｓタンパク質が機能するためには、ゲノムＤＮＡ内の標的配列のすぐ下流にＰＡＭが存在しなければならない。Ｃａｓタンパク質によるＰＡＭの認識は、隣接ゲノム配列を不安定化し、ｇＲＮＡによる配列の照合を可能にして、一致する配列が存在する場合にｇＲＮＡ－ＤＮＡ対合をもたらすと考えられている。ＰＡＭの特異的配列は、Ｃａｓ遺伝子の種に応じて変動する。例えば、化膿連鎖球菌に由来する最も一般的に使用されているＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＮＧＧのＰＡＭ配列を認識する。代替ＰＡＭを有する他のＣａｓ９バリアント及び他のヌクレアーゼもまた特性決定され、ゲノム編集のための使用に成功している。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的座位のために設計されたｇＲＮＡに相補的な特定のゲノム座位に標的ＤＳＢを作製するために使用され得る。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、キメラ一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．２０１３）であるｇＲＮＡの生成のためにループ配列（例えば、テトラループ、ＧＡＡＡ）と共に連結され得る。ｓｇＲＮＡは、ＤＮＡベースの発現のために、または化学合成によって生成され得る。

【0236】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの相補的部分配列（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）は、目的の標的部位に応じて変動することになる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、表１に記載される遺伝子の配列に特異的な相補的部分を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的とされるゲノム座位は、記載されるような座位のいずれかの４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内に位置している。

【0237】

本明細書に開示される方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導し、それにハイブリダイズできる任意のリボ核酸の使用を企図する。いくつかの実施形態では、リボ核酸のうち少なくとも１つが含む。

【0238】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるような改変核酸（例えば、合成改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。

【0239】

本明細書に開示される方法は、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導し、それにハイブリダイズできる任意のリボ核酸の使用を企図する。いくつかの実施形態では、リボ核酸のうち少なくとも１つが、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸のうち少なくとも１つが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖リボ核酸は、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導し、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸のうち少なくとも１つが、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導し、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸の両方が、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導し、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。当業者には理解されることになるように、本明細書で提供されるリボ核酸は、用いられる特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、及び標的ポリヌクレオチドの配列に応じて様々な異なる標的モチーフにハイブリダイズするように選択され得る。１～２つのリボ核酸はまた、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションを最小限に抑えるように選択され得る。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比較される場合、少なくとも２つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、細胞における全ての他のゲノムヌクレオチド配列と比較される場合、少なくとも１つのミスマッチを含有する標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフにすぐ隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸の各々が、標的モチーフ間に位置する変異体アレルに隣接するＣａｓタンパク質によって認識されるデオキシリボ核酸モチーフにすぐ隣接する標的モチーフにハイブリダイズするように設計される。

【0240】

いくつかの実施形態では、１～２つのリボ核酸の各々が、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導し、それにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。

【0241】

いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列に相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の逆鎖上の配列に相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の逆鎖上の配列に相補的ではなく、及び／またはそれにはハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフに相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１つまたは２つのリボ核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の重複しない標的モチーフに相補的であり、及び／またはそれにハイブリダイズする。

【0242】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸及び少なくとも１～２つのリボ核酸をコードする核酸は、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルス形質導入）を介して細胞に導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２つのリボ核酸と複合化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合化される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されるような改変核酸（例えば、合成改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。

【0243】

本明細書に記載される遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化に有用な、例示的なｇＲＮＡ標的指向性配列が、表１に提供される。本配列は、２０１６年５月９日出願のＷＯ２０１６１８３０４１に見出され得、表、付録、及び配列表を含む本開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0244】

【表1】

【0245】

本明細書に記載される遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化に有用な、追加の例示的なＣａｓ９ガイドＲＮＡ配列が、表１ｃに提供される。

【0246】

【表2A】

【0247】

いくつかの実施形態では、記載されるような遺伝子の発現を減少させるか、または排除するための遺伝子破壊の方法に使用することを目的とした、新規座位及び／またはｇＲＮＡ標的指向性配列の同定は、当業者のレベルの範囲内である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムについて、特定の座位（例えば、表１に記載される、例えば、標的遺伝子内の）に対する既存のｇＲＮＡ標的指向性配列が既知である場合、「インチワーム」手法を使用して、ＰＡＭ配列の座位の両側にあるフランキング領域をスキャンすることによって、導入遺伝子の標的挿入のために追加の座位を同定でき、これは通常、ゲノムにわたって約１００塩基対（ｂｐ）ごとに行われる。ＰＡＭ配列は、使用される特定のＣａｓヌクレアーゼに依存することになり、その理由として、異なるヌクレアーゼは通常、異なる対応するＰＡＭ配列を有するからである。座位の両側におけるフランキング領域は、約５００～４０００ｂｐ長、例えば、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約３０００ｂｐ、約３５００ｂｐ、または約４０００ｂｐ長であり得る。検索範囲内でＰＡＭ配列が同定される場合、遺伝子破壊方法に使用するためのその座位の配列に従って新たなガイドが設計され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例示として記載されているが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ及びトランスポザーゼを使用するものを含む、記載されるような任意の遺伝子編集手法が、新規座位を同定する本方法に使用され得る。

【0248】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）手法を使用して作製される。「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）とは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に通常由来する核酸結合ドメイン及び核酸標的配列を切断するための１つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質を意図する。触媒ドメインは、いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメイン、例えば、Ｉ－ＴｅｖＩ、ＣｏｌＥ７、ＮｕｃＡ及びＦｏｋ－Ｉのような、エンドヌクレアーゼ活性を有するドメインなどである。特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩ及びＩ－ＯｎｕＩまたはその機能的バリアントのような、メガヌクレアーゼに融合され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、単量体ＴＡＬＥヌクレアーゼである。単量体ＴＡＬＥヌクレアーゼは、特異的認識及び切断のために二量体化、例えば、ＷＯ２０１２１３８９２７に記載される、操作ＴＡＬリピートとＩ－ＴｅｖＩの触媒ドメインとの融合体などを必要としないＴＡＬＥヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、細菌種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ由来のタンパク質であり、複数のリピート配列を含み、各リピートが、１２位及び１３位に核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に特異的な二残基（ＲＶＤ）を含む。同様のモジュール式塩基対塩基核酸結合特性（ｍｏｄｕｌａｒ ｂａｓｅ－ｐｅｒ－ｂａｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）（ＭＢＢＢＤ）を有する結合ドメインもまた、異なる細菌種において本出願人によって最近発見された新規モジュールタンパク質に由来し得る。新規モジュールタンパク質は、ＴＡＬリピートよりも高い配列可変性を示すという利点を有する。いくつかの実施形態では、異なるヌクレオチドの認識と関連するＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを認識するためのＮＳ、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ及びＴを認識するためのＹＧ、Ａを認識するためのＴＬ、ＡまたはＧを認識するためのＶＴならびにＡを認識するためのＳＷである。別の実施形態では、重要なアミノ酸１２及び１３は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ及びＧに対するそれらの特異性を調節するために、ならびに特に本特異性を増強するために、他のアミノ酸残基に対して変異され得る。ＴＡＬＥＮキットは市販されている。

【0249】

いくつかの実施形態では、細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用して操作される。「ジンクフィンガー結合タンパク質」は、亜鉛イオンの配位によるタンパク質構造の安定化の結果として、例えば、配列特異的様式でＤＮＡ、ＲＮＡ及び／またはタンパク質と結合するタンパク質またはポリペプチドである。ジンクフィンガー結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される場合が多い。個々のＤＮＡ結合ドメインは、典型的には「フィンガー」と称される。ＺＦＰは、少なくとも１つのフィンガー、典型的には２つのフィンガー、３つのフィンガー、または６つのフィンガーを有する。各フィンガーは、２～４つのＤＮＡの塩基対、典型的には３つまたは４つのＤＮＡの塩基対と結合する。ＺＦＰは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各フィンガーは、典型的にはおよそ３０アミノ酸の亜鉛キレート化ＤＮＡ結合サブドメインを含む。このクラスの単一ジンクフィンガーは、単一ベータターンの２つのシステイン残基と共に亜鉛と配位結合した２つのインバリアントヒスチジン残基を含有するアルファヘリックスからなることが、研究によって実証されている（例えば、Ｂｅｒｇ＆Ｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１０８１－１０８５（１９９６）を参照のこと）。

【0250】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して作製される。そのようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当該技術分野で周知である（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖または二本鎖切断を生成する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、１２～４５塩基対（ｂｐ）長の範囲、通常は１４～４０ｂｐ長の範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼに、ＨＮＨエンドヌクレアーゼに、またはＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼに対応する場合がある。いくつかの実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩバリアントであり得る。

【0251】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞は、メガヌクレアーゼを使用して作製される。メガヌクレアーゼは、定義上、大きな配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ Ｂ．Ｌ．Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１，２９，３７５７－３７７４）。それらは、生細胞において特有の部位を切断し、それによって切断部位の近傍で遺伝子標的化を１０００倍以上増強し得る（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，５０３４－５０４０、Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４，８０９６－８１０６、Ｃｈｏｕｌｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５，１９６８－１９７３、Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，５０５５－５０６０、Ｓａｒｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，１７，２６７－７７、Ｄｏｎｏｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１９９８，１８，４０７０－４０７８、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，９３－１０１、Ｃｏｈｅｎ－Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，１４４４－１４４８）。

【0252】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、ポリペプチドの発現をノックダウンする（例えば、低減させる、排除する、または阻害する）ためにＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用して作製される。有用なＲＮＡｉ法は、合成ＲＮＡｉ分子、短分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ相互作用ＮＲＡ（ｐｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び当業者によって認識される他の一過性ノックダウン法を利用するものを含む。配列特異的ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを含むＲＮＡｉの試薬は、市販されている。例えば、標的ポリヌクレオチド、例えば、上に記載されるいずれか、例えば、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、またはＮＬＲＣ５などは、標的ポリヌクレオチドの標的モチーフに相補的な阻害核酸、例えば、ｓｉＲＮＡなどを細胞に導入することによるＲＮＡ干渉によって細胞内でノックダウンされ得る。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド、例えば、上に記載されるいずれか、例えば、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、またはＮＬＲＣ５などは、ｓｈＲＮＡ発現ウイルスを細胞に形質導入することによって細胞内でノックダウンされ得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉は、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、及びＮＬＲＣ５からなる群から選択される少なくとも１つの発現を減少させるか、または阻害するために用いられる。

【0253】

３．例示的な標的ポリヌクレオチド、及び発現を減少させる方法
Ａ．ＭＨＣクラスＩ分子
ある特定の実施形態では、改変は、副鎖Ｂ２Ｍを標的とすることによって１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子をコードする１つ以上のＭＨＣクラスＩ遺伝子）の発現を減少させるか、または排除する、例えば、ノックアウトなどをする。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して行われる。Ｂ２Ｍの発現を減少させるか、または排除する、例えば、ノックアウトなどをすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送が遮断され、そのような細胞は、レシピエント対象に移植される場合に免疫寛容を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、投与時にレシピエント対象または患者における低免疫原性とみなされる。

【0254】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのホモログである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのオルソログである。

【0255】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現低減または排除は、以下のＭＨＣクラスＩ分子：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－Ｃのうち１つ以上の発現を減少させるか、または排除する。

【0256】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする改変を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む標的ヌクレアーゼシステムを使用することによって行われる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録２または表１５の配列番号：８１２４０～８５６４４からなる群から選択され、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0257】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示される別の寛容原性因子）をコードする外因性核酸または導入遺伝子は、Ｂ２Ｍ遺伝子に挿入される。Ｂ２Ｍ座位での標的挿入を目的とした例示的な導入遺伝子としては、節ＩＩ．Ｂに記載されるようないずれかが挙げられる。

【0258】

Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載される。一実施形態では、ＰＣＲによって得られたＢ２Ｍ遺伝子の改変及びＨＬＡ－Ｉ発現の減少は、フローサイトメトリーによる、例えば、ＦＡＣＳ分析などによるアッセイであり得る。別の実施形態では、Ｂ２Ｍタンパク質発現は、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、不活性化改変の存在を確認するために使用される。

【0259】

いくつかの実施形態では、操作細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現または機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ Ｉ）の減少は、当該技術分野において既知の技術、例えば、ＨＬＡ複合体と結合する標識抗体を使用する、例えば、ヒト主要組織適合性ＨＬＡクラスＩ抗原のアルファ鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ抗体を使用するＦＡＣＳ技術を使用して測定され得る。加えて、細胞は、ＨＬＡ Ｉ複合体が細胞表面上で発現されないことを確認するために試験され得る。これは、上で述べられるような１つ以上のＨＬＡ細胞表面成分に対して抗体を使用するＦＡＣＳ分析によってアッセイされてよい。ＨＬＡ Ｉ（またはＭＨＣクラスＩ）の減少に加えて、本明細書で提供される操作細胞は、マクロファージ食作用及びＮＫ細胞死滅に対して感受性の減少を有する。操作細胞の低免疫原性表現型をアッセイする方法が、以下でさらに記載される。

【0260】

Ｂ．ＭＨＣクラスＩＩ分子
ある特定の態様では、改変は、クラスＩＩトランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）発現を標的とすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の発現を減少させるか、または排除する、例えば、ノックアウトなどをする。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して行われる。ＣＩＩＴＡは、タンパク質のＬＲまたはヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと会合することによって１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写を制御する。ＣＩＩＴＡの発現を減少させるか、または排除する、例えば、ノックアウトなどをすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現が減少し、それによって表面発現も減少する。いくつかの場合には、そのような細胞は、レシピエント対象に移植される場合に免疫寛容を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、投与時にレシピエント対象または患者における低免疫原性とみなされる。

【0261】

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのホモログである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのオルソログである。

【0262】

いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現減少または排除は、以下のＭＨＣクラスＩＩ分子：ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、及びＨＬＡ－ＤＲのうち１つ以上の発現を減少させるか、または排除する。

【0263】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む標的ヌクレアーゼシステムによる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）は、ＷＯ２０１６１８３０４１の付録１または表１２の配列番号：５１８４～３６３５２からなる群から選択され、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0264】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示される別の寛容原性因子）をコードする外因性核酸または導入遺伝子は、ＣＩＩＴＡ遺伝子に挿入される。Ｂ２Ｍ座位での標的挿入を目的とした例示的な導入遺伝子としては、節ＩＩ．Ｂに記載されるようないずれかが挙げられる。

【0265】

ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載される。一実施形態では、ＰＣＲによって得られたＣＩＩＴＡ遺伝子の改変及びＨＬＡ－ＩＩ発現の減少は、フローサイトメトリーによる、例えば、ＦＡＣＳ分析などによるアッセイであり得る。別の実施形態では、ＣＩＩＴＡタンパク質発現は、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、不活性化改変の存在を確認するために使用される。

【0266】

いくつかの実施形態では、操作細胞における１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現または機能（細胞がヒト細胞に由来する場合はＨＬＡ ＩＩ）の減少は、当該技術分野において既知の技術、例えば、タンパク質に対して抗体を使用するウェスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技術、ＲＴ－ＰＣＲ技術などを使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＨＬＡ ＩＩ複合体が細胞表面上で発現されないことを確認するために試験され得る。表面発現を評価する方法は、当該技術分野において既知の方法（例えば、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２１を参照のこと）を含み、一般にヒトＨＬＡクラスＩＩ ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ及び大半のＤＱ抗原に結合する市販の抗体に基づいてウェスタンブロットまたはＦＡＣＳ分析のいずれかを使用して行われる。１つ以上のＨＬＡクラスＩＩ分子（または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子）の減少に加えて、本明細書で提供される操作細胞は、マクロファージ食作用及びＮＫ細胞死滅に対して感受性の減少を有する。操作細胞の低免疫原性表現型をアッセイする方法が、以下でさらに記載される。

【0267】

Ｃ．ＣＤ１４２
ある特定の態様では、改変は、ＣＤ１４２の発現を減少させるか、または排除する、例えば、ノックアウトなどをする。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して行われる。組織因子（Ｆ３）としても知られるＣＤ１４２は、循環因子ＶＩＩまたは第ＶＩＩａ因子と複合体を形成することによって血液凝固を開始する膜結合タンパク質である。ＣＤ１４２（ＴＦ）：ＶＩＩａ複合体は、特異的な限定分解によって第ＩＸ因子または第Ｘ因子を活性化する。ＣＤ１４２（ＴＦ）は、細胞表面集合及び凝固プロテアーゼカスケードの伝播を開始することによって正常な止血において役割を果たす。ＣＤ１４２の発現を減少させるか、または排除する、例えば、ノックアウトなどをすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現が減少し、それによって表面発現も減少する。いくつかの場合には、そのような細胞は、レシピエント対象に移植される場合に免疫寛容を示す。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、投与時にレシピエント対象または患者における低免疫原性とみなされる。

【0268】

いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ１４２のバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ１４２のホモログである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ１４２のオルソログである。

【0269】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ１４２遺伝子を標的とする改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２遺伝子を標的とする改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＣＤ１４２遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む標的ヌクレアーゼシステムによる。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ１４２またはＣＤ１４２のバリアントである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ１４２のホモログである。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＤ１４２のオルソログである。

【0270】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＣＤ１４２遺伝子を標的とする改変を含む。いくつかの実施形態では、レアカットエンドヌクレアーゼによるＣＤ１４２遺伝子を標的とする改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＣＤ１４２遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列を含む。ＣＤ１４２を標的とするｇＲＮＡ配列を特定する有用な方法は、以下に記載される。

【0271】

ＣＤ１４２遺伝子が不活性化されているかどうかを試験するためのアッセイは既知であり、本明細書に記載される。一実施形態では、ＰＣＲによって得られたＣＤ１４２遺伝子の改変及びＣＤ１４２発現の減少は、ＦＡＣＳ分析によるアッセイであり得る。別の実施形態では、ＣＤ１４２タンパク質発現は、ＣＤ１４２タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、不活性化改変の存在を確認するために使用される。

【0272】

ヒトＣＤ１４２についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０１Ｍ０９４５３０、ＨＧＮＣ番号３５４１、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ２１５２、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＭ＿００１１７８０９６．１、ＮＭ＿００１９９３．４、ＮＰ＿００１１７１５６７．１、及びＮＰ＿００１９８４．１、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ１３７２６などで提供される。

【0273】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、もしくはＣＤ４７または本明細書に開示される別の寛容原性因子）をコードする外因性核酸または導入遺伝子は、ＣＤ１４２遺伝子に挿入される。ＣＤ１４２座位での標的挿入を目的とした例示的な導入遺伝子としては、節ＩＩ．Ｂに記載されるようないずれかが挙げられる。

【0274】

いくつかの実施形態では、操作細胞におけるＣＤ１４２の発現または機能の減少は、当該技術分野において既知の技術、例えば、タンパク質に対して抗体を使用するウェスタンブロッティング、ＦＡＣＳ技術、ＲＴ－ＰＣＲ技術などを使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ１４２が細胞表面上で発現されないことを確認するために試験され得る。表面発現を評価する方法は、当該技術分野において既知の方法（例えば、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２１を参照のこと）を含み、一般にヒトＣＤ１４２に結合する市販の抗体に基づいてウェスタンブロットまたはＦＡＣＳ分析のいずれかを使用して行われる。ＣＤ１４２の減少に加えて、本明細書で提供される操作細胞は、ＩＢＭＩＲに対して感受性の減少を有する。操作細胞の低免疫原性表現型をアッセイする方法が、以下でさらに記載される。

【0275】

いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２発現を減少させる改変は、ＣＤ１４２ ｍＲＮＡ発現を減少させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２のｍＲＮＡ発現減少は、改変を含まない同じ細胞型の非改変または野生型細胞と比較してのものである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２のｍＲＮＡ発現は、約５％を超えて減少し、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えるいずれかを超えて減少するなどである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２のｍＲＮＡ発現は、最大約１００％減少し、例えば、最大約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれ未満のいずれかで減少するなどである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２のｍＲＮＡ発現は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで減少する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２のｍＲＮＡ発現は排除される（例えば、ＣＤ１４２ ｍＲＮＡの０％発現）。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２ ｍＲＮＡ発現を減少させる改変は、ＣＤ１４２遺伝子活性を排除する。

【0276】

いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２発現を減少させる改変は、ＣＤ１４２タンパク質発現を減少させる。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２のタンパク質発現減少は、改変を含まない同じ細胞型の非改変または野生型細胞と比較してのものである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２のタンパク質発現は、約５％を超えて減少し、例えば、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれを超えるいずれかを超えて減少するなどである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２のタンパク質発現は、最大約１００％減少し、例えば、最大約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、またはそれ未満のいずれかで減少するなどである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２のタンパク質発現は、約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれかで減少する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２のタンパク質発現は排除される（例えば、ＣＤ１４２タンパク質の０％発現）。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２タンパク質発現を減少させる改変は、ＣＤ１４２遺伝子活性を排除する。

【0277】

いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２発現を減少させる改変は、ＣＤ１４２遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２発現を減少させる改変は、ＣＤ１４２遺伝子の片アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１４２発現を減少させる改変は、ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む不活性化または破壊を含む。

【0278】

いくつかの実施形態では、改変は、細胞における１つ以上のＣＤ１４２コード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、細胞における全てのＣＤ１４２コード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２遺伝子内のインデルを含む不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、改変は、ＣＤ１４２遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失である。

【0279】

ＣＤ１４２を標的とするための例示的なガイド配列は既知であり、例えば、

である。

【0280】

Ｂ．ポリヌクレオチドの過剰発現
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞は、細胞内で所望のポリヌクレオチドを過剰発現するように細胞に１つ以上の改変を導入することなどによって、遺伝子改変または操作される。いくつかの実施形態では、改変または操作される細胞は、１つ以上の改変が予め導入されていない、非改変細胞または非操作細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞は、外因性タンパク質をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」という用語とも交換可能に使用される）を含むように遺伝子改変される。記載されているように、いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエントにおける免疫認識及び寛容に影響を及ぼす寛容（例えば、免疫）因子である、ある特定の遺伝子の発現を増加させるように改変される。いくつかの実施形態では、提供される操作細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞なども、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、外因性ポリヌクレオチドは、上記節Ｉ．Ａに記載される標的ポリヌクレオチド、例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子あるいはＣＤ１４２などの発現を減少させるために、１つ以上の遺伝子改変と共に操作細胞内で発現（例えば、過剰発現）されてよい。いくつかの実施形態では、提供される操作細胞は、レシピエント対象への投与時に免疫応答を誘発または活性化しない。

【0281】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える異なる過剰発現ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える異なる過剰発現ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、過剰発現ポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、操作細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える異なる外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える異なる外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、過剰発現ポリヌクレオチドは、細胞内でエピソームとして発現される外因性ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、過剰発現ポリヌクレオチドは、操作細胞の１つ以上のゲノム座位に挿入または組み込まれる外因性ポリヌクレオチドである。

【0282】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの発現が増加する、すなわち、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ標的指向性ドメイン及び転写活性化因子を含有する融合タンパク質を使用して過剰発現される。トランス活性化因子ドメインを使用して発現を増加させる標的方法は、当業者に既知である。

【0283】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含有し、この１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、非標的挿入方法によって、例えば、レンチウイルスベクターを用いた形質導入などによって細胞のゲノム座位に挿入または組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的挿入方法によって、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用することなどによって細胞のゲノムに挿入または組み込まれる。本明細書に記載される遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含む、任意の好適な方法が、ＨＤＲによって操作細胞のゲノム座位に外因性ポリヌクレオチドを挿入するために使用され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、１つ以上のゲノム座位、例えば、本明細書（例えば、表２）に記載される任意のゲノム座位などに挿入される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、同じゲノム座位に挿入される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、異なるゲノム座位に挿入される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドのうち２つ以上が、同じゲノム座位、例えば、本明細書（例えば、表２）に記載される任意のゲノム座位などに挿入される。いくつかの実施形態では、２つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、異なるゲノム座位、例えば、本明細書（例えば、表２）に記載されるような２つ以上のゲノム座位などに挿入される。

【0284】

例示的なポリヌクレオチドまたは過剰発現、及びこれらを過剰発現する方法は、以下の小節に記載されている。

【0285】

１．補体インヒビター
いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターの発現は、細胞内で増加する。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、１つ以上の膜結合補体インヒビターである。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つは、補体インヒビターをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、またはそれらの任意の組合せである。例えば、いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つは、ＣＤ４６などの１つ以上の補体インヒビターをコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６及びＣＤ５９、またはＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６及びＣＤ５９またはＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現は、細胞またはその集団を、細胞によって発現される細胞表面抗原に対する抗体の存在下を含む、補体依存性細胞傷害から保護する。

【0286】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、またはそれらの任意の組合せなどの１つ以上の補体インヒビターを発現するように改変されている細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６及びＣＤ５９である。いくつかの実施形態では、１つ以上の補体インヒビターは、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５である。いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の補体インヒビターを発現するように細胞ゲノムを変更する方法を提供する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、外因性ＣＤ４６及びＣＤ５９またはＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５などの１つ以上の外因性補体インヒビターを発現する。いくつかの場合では、細胞は、ヒトＣＤ４６ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現する。いくつかの場合では、細胞は、ヒトＣＤ５９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現する。いくつかの場合では、細胞は、ヒトＣＤ５５ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、任意の組合せで２つ以上の補体インヒビターをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＣＤ４６及びＣＤ５９をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５をコードするヌクレオチド配列を含む。

【0287】

Ｄ．ＣＤ４６
いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＤ４６などのＣＤ４６をコードする過剰発現ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＤ４６などのＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６の発現は、参照細胞または非改変細胞がＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ＣＤ４６は、膜結合補体インヒビターである。これは、補体因子Ｉの補因子として作用し、セリンプロテアーゼは、Ｃ３ｂ及びＣ４ｂの切断による補体媒介損傷から自己細胞を保護する。ヒトＣＤ４６についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０１Ｐ２０７７５２、ＨＧＮＣ番号６９５３、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ４１７９、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１５５２９、ならびにＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ番号ＮＭ＿００２３８９．４、ＮＭ＿１５３８２６．３、ＮＭ＿１７２３５０．２、ＮＭ＿１７２３５１．２、ＮＭ＿１７２３５２．２、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＭ＿１７２３５３．２、ＮＭ＿１７２３５９．２、ＮＭ＿１７２３６１．２、ＮＰ＿００２３８０．３、ＮＰ＿７２２５４８．１、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＰ＿７５８８６１．１、ＮＰ＿７５８８６２．１、ＮＰ＿７５８８６３．１、ＮＰ＿７５８８６９．１、及びＮＰ＿７５８８７１．１で提供される。

【0288】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００２３８０．３、ＮＰ＿７２２５４８．１、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＰ＿７５８８６１．１、ＮＰ＿７５８８６２．１、ＮＰ＿７５８８６３．１、ＮＰ＿７５８８６９．１、及びＮＰ＿７５８８７１．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４６ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００２３８０．３、ＮＰ＿７２２５４８．１、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＰ＿７５８８６１．１、ＮＰ＿７５８８６２．１、ＮＰ＿７５８８６３．１、ＮＰ＿７５８８６９．１、及びＮＰ＿７５８８７１．１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ４６ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００２３８９．４、ＮＭ＿１５３８２６．３、ＮＭ＿１７２３５０．２、ＮＭ＿１７２３５１．２、ＮＭ＿１７２３５２．２、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＭ＿１７２３５３．２、ＮＭ＿１７２３５９．２、及びＮＭ＿１７２３６１．２に記載される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４６の過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿００２３８９．４、ＮＭ＿１５３８２６．３、ＮＭ＿１７２３５０．２、ＮＭ＿１７２３５１．２、ＮＭ＿１７２３５２．２、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＭ＿１７２３５３．２、ＮＭ＿１７２３５９．２、ならびにＮＭ＿１７２３６１．２に記載されるようなＣＤ４６の過剰発現ヌクレオチド配列を含む。

【0289】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００２３８０．３、ＮＰ＿７２２５４８．１、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＰ＿７５８８６１．１、ＮＰ＿７５８８６２．１、ＮＰ＿７５８８６３．１、ＮＰ＿７５８８６９．１、及びＮＰ＿７５８８７１．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４６ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００２３８０．３、ＮＰ＿７２２５４８．１、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＰ＿７５８８６１．１、ＮＰ＿７５８８６２．１、ＮＰ＿７５８８６３．１、ＮＰ＿７５８８６９．１、及びＮＰ＿７５８８７１．１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ４６ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００２３８９．４、ＮＭ＿１５３８２６．３、ＮＭ＿１７２３５０．２、ＮＭ＿１７２３５１．２、ＮＭ＿１７２３５２．２、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＭ＿１７２３５３．２、ＮＭ＿１７２３５９．２、及びＮＭ＿１７２３６１．２に記載される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４６の外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿００２３８９．４、ＮＭ＿１５３８２６．３、ＮＭ＿１７２３５０．２、ＮＭ＿１７２３５１．２、ＮＭ＿１７２３５２．２、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＭ＿１７２３５３．２、ＮＭ＿１７２３５９．２、ならびにＮＭ＿１７２３６１．２に記載されるようなＣＤ４６の外因性ヌクレオチド配列を含む。

【0290】

いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿７２２５４８．１、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＰ＿７５８８６１．１、ＮＰ＿７５８８６２．１、ＮＰ＿７５８８６３．１、ＮＰ＿７５８８６９．１、及びＮＰ＿７５８８７１．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有する過剰発現ＣＤ４６ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿７２２５４８．１、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＰ＿７５８８６１．１、ＮＰ＿７５８８６２．１、ＮＰ＿７５８８６３．１、ＮＰ＿７５８８６９．１、及びＮＰ＿７５８８７１．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有する外因性ＣＤ４６ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿７２２５４８．１、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＰ＿７５８８６１．１、ＮＰ＿７５８８６２．１、ＮＰ＿７５８８６３．１、ＮＰ＿７５８８６９．１、及びＮＰ＿７５８８７１．１に記載されるようなアミノ酸配列を有する過剰発現ＣＤ４６ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿７２２５４８．１、ＮＰ＿７５８８６０．１、ＮＰ＿７５８８６１．１、ＮＰ＿７５８８６２．１、ＮＰ＿７５８８６３．１、ＮＰ＿７５８８６９．１、及びＮＰ＿７５８８７１．１に記載されるようなアミノ酸配列を有する外因性ＣＤ４６ポリペプチドを含む。

【0291】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：４に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４６ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：４に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４６ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：４に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ４６ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：４に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ４６ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。

【0292】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：３に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４６ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：３に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ４６ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする配列に機能的に連結されている。

【0293】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４６の全てまたは機能部分は、他の構成要素、例えば、シグナルペプチド、リーダー配列、分泌シグナル、標識（例えば、レポーター遺伝子）、またはそれらの任意の組合せなどに連結され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６のシグナルペプチドをコードする核酸配列は、異種タンパク質からのシグナルペプチドをコードする核酸配列で置き換えられている。異種タンパク質は、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ２８、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、成長ホルモン、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＧＭ－ＣＳＦ受容体（ＧＭ－ＣＳＦＲａ）、または免疫グロブリン（例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＫ）であり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＧ重鎖もしくはＩｇＧカッパ軽鎖など）、サイトカイン（インターロイキン－２（ＩＬ－２）、もしくはＣＤ３３など）、血清アルブミンタンパク質（例えば、ＨＳＡもしくはアルブミン）、ヒトアズロシジンプレタンパク質シグナル配列、ルシフェラーゼ、トリプシノーゲン（例えば、キモトリプシノーゲンもしくはトリプシノーゲン）からのシグナルペプチドまたは細胞によって、もしくは細胞上でタンパク質を効率的に発現できる他のシグナルペプチドである。

【0294】

ある特定の実施形態では、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0295】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４６をコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＣＤ４６をコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＣＤ４６をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＣＤ４６をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＣＤ４６をコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0296】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４６タンパク質発現は、ＣＤ４６タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＣＤ４６ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0297】

Ｅ．ＣＤ５９
いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＤ５９などのＣＤ５９をコードする過剰発現ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＤ５９などのＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９の発現は、参照細胞または非改変細胞がＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ＣＤ５９は、膜結合補体インヒビターである。より具体的には、ＣＤ５９は、補体膜侵襲複合体（ＭＡＣ）活性の阻害剤である。ＣＤ５９は、集合するＭＡＣのＣ８及び／またはＣ９補体に結合して作用し、それによって浸透圧溶解細孔の完全な形成に必要なＣ９の複数コピーの組込みを防止する。ヒトＣＤ５９についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ１１Ｍ０３３７０４、ＨＧＮＣ番号１６８９、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ９６６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１３９８７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＭ＿０００６１１．５、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＭ＿００１１２７２２３．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＭ＿００１１２７２２５．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＭ＿００１１２７２２６．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＭ＿００１１２７２２７．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＭ＿２０３３２９．２、ＮＰ＿９７６０７５．１、ＮＭ＿２０３３３０．２、ＮＰ＿９７６０７６．１、及びＮＭ＿２０３３３１．２で提供される。

【0298】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＰ＿９７６０７５．１、及びＮＰ＿９７６０７６．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５９ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＰ＿９７６０７５．１、及びＮＰ＿９７６０７６．１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ５９ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０００６１１．５、ＮＭ＿００１１２７２２３．１、ＮＭ＿００１１２７２２５．１、ＮＭ＿００１１２７２２６．１、ＮＭ＿００１１２７２２７．１、ＮＭ＿２０３３２９．２、ＮＭ＿２０３３３０．２、及びＮＭ＿２０３３３１．２に記載される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５９の過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０００６１１．５、ＮＭ＿００１１２７２２３．１、ＮＭ＿００１１２７２２５．１、ＮＭ＿００１１２７２２６．１、ＮＭ＿００１１２７２２７．１、ＮＭ＿２０３３２９．２、ＮＭ＿２０３３３０．２、及びＮＭ＿２０３３３１．２に記載されるようなＣＤ５９の過剰発現ヌクレオチド配列を含む。

【0299】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＰ＿９７６０７５．１、及びＮＰ＿９７６０７６．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５９ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＰ＿９７６０７５．１、及びＮＰ＿９７６０７６．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５９ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＰ＿９７６０７５．１、及びＮＰ＿９７６０７６．１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ５９ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＰ＿９７６０７５．１、及びＮＰ＿９７６０７６．１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ５９ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０００６１１．５、ＮＭ＿００１１２７２２３．１、ＮＭ＿００１１２７２２５．１、ＮＭ＿００１１２７２２６．１、ＮＭ＿００１１２７２２７．１、ＮＭ＿２０３３２９．２、ＮＭ＿２０３３３０．２、及びＮＭ＿２０３３３１．２に記載される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５９の過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿０００６１１．５、ＮＭ＿００１１２７２２３．１、ＮＭ＿００１１２７２２５．１、ＮＭ＿００１１２７２２６．１、ＮＭ＿００１１２７２２７．１、ＮＭ＿２０３３２９．２、ＮＭ＿２０３３３０．２、及びＮＭ＿２０３３３１．２に記載される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５９の外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０００６１１．５、ＮＭ＿００１１２７２２３．１、ＮＭ＿００１１２７２２５．１、ＮＭ＿００１１２７２２６．１、ＮＭ＿００１１２７２２７．１、ＮＭ＿２０３３２９．２、ＮＭ＿２０３３３０．２、及びＮＭ＿２０３３３１．２に記載されるようなＣＤ５９の過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０００６１１．５、ＮＭ＿００１１２７２２３．１、ＮＭ＿００１１２７２２５．１、ＮＭ＿００１１２７２２６．１、ＮＭ＿００１１２７２２７．１、ＮＭ＿２０３３２９．２、ＮＭ＿２０３３３０．２、及びＮＭ＿２０３３３１．２に記載されるようなＣＤ５９の外因性ヌクレオチド配列を含む。

【0300】

いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＰ＿９７６０７５．１、及びＮＰ＿９７６０７６．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有する過剰発現ＣＤ５９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＰ＿９７６０７５．１、及びＮＰ＿９７６０７６．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有する外因性ＣＤ５９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＰ＿９７６０７５．１、及びＮＰ＿９７６０７６．１に記載されるようなアミノ酸配列を有する過剰発現ＣＤ５９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００６０２．１、ＮＰ＿００１１２０６９５．１、ＮＰ＿００１１２０６９７．１、ＮＰ＿００１１２０６９８．１、ＮＰ＿００１１２０６９９．１、ＮＰ＿９７６０７４．１、ＮＰ＿９７６０７５．１、及びＮＰ＿９７６０７６．１に記載されるようなアミノ酸配列を有する外因性ＣＤ５９ポリペプチドを含む。

【0301】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：６に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５９ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：６に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５９ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：６に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ５９ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：６に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ５９ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。

【0302】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：５に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５９ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：５に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５９ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ５９ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：５に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ５９ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする配列に機能的に連結されている。

【0303】

いくつかの実施形態では、ＣＤ５９の全てまたは機能部分は、他の構成要素、例えば、シグナルペプチド、リーダー配列、分泌シグナル、標識（例えば、レポーター遺伝子）、またはそれらの任意の組合せなどに連結され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９のシグナルペプチドをコードする核酸配列は、異種タンパク質からのシグナルペプチドをコードする核酸配列で置き換えられている。異種タンパク質は、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ２８、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、成長ホルモン、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＧＭ－ＣＳＦ受容体（ＧＭ－ＣＳＦＲａ）、または免疫グロブリン（例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＫ）であり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＧ重鎖もしくはＩｇＧカッパ軽鎖など）、サイトカイン（インターロイキン－２（ＩＬ－２）、もしくはＣＤ３３など）、血清アルブミンタンパク質（例えば、ＨＳＡもしくはアルブミン）、ヒトアズロシジンプレタンパク質シグナル配列、ルシフェラーゼ、トリプシノーゲン（例えば、キモトリプシノーゲンもしくはトリプシノーゲン）からのシグナルペプチドまたは細胞によって、もしくは細胞上でタンパク質を効率的に発現できる他のシグナルペプチドである。

【0304】

ある特定の実施形態では、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0305】

いくつかの実施形態では、ＣＤ５９をコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＣＤ５９をコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＣＤ５９をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＣＤ５９をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＣＤ５９をコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0306】

いくつかの実施形態では、ＣＤ５９タンパク質発現は、ＣＤ５９タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＣＤ５９ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0307】

Ｆ．ＣＤ５５
いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＤ５５などのＣＤ５５をコードする過剰発現ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＤ５５などのＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５の発現は、参照細胞または非改変細胞がＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ＣＤ５５は、膜結合補体インヒビターである。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５と細胞会合Ｃ４ｂ及びＣ３ｂポリペプチドとの相互作用は、Ｃ２及びＢ因子の酵素的に活性なＣ２ａ及びＢｂへの変換を触媒するそれらの能力を妨げ、それによって補体カスケードの増幅転換酵素であるＣ４ｂ２ａ及びＣ３ｂＢｂの形成を防止する。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５は、Ｃ３及びＣ５転換酵素の形成を不安定化及び防止することによって補体活性化を阻害する。ヒトＣＤ５５（補体崩壊促進因子としても知られる）についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０１Ｐ２０７３２１、ＨＧＮＣ番号２６６５、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ１６０４、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０８１７４、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＭ＿０００５７４．４、ＮＭ＿００１１１４７５２．２、ＮＭ＿００１３００９０３．１、ＮＭ＿００１３００９０４．１、ＮＰ＿０００５６５．１、ＮＰ＿００１１０８２２４．１、ＮＰ＿００１２８７８３２．１、及びＮＰ＿００１２８７８３３．１で提供される。

【0308】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００５６５．１、ＮＰ＿００１１０８２２４．１、ＮＰ＿００１２８７８３２．１、及びＮＰ＿００１２８７８３３．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５５ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００５６５．１、ＮＰ＿００１１０８２２４．１、ＮＰ＿００１２８７８３２．１、及びＮＰ＿００１２８７８３３．１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ５５ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に記載される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５５の過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０００５７４．４、ＮＭ＿００１１１４７５２．２、ＮＭ＿００１３００９０３．１、及びＮＭ＿００１３００９０４．１に記載されるようなＣＤ５５の過剰発現ヌクレオチド配列を含む。

【0309】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００５６５．１、ＮＰ＿００１１０８２２４．１、ＮＰ＿００１２８７８３２．１、及びＮＰ＿００１２８７８３３．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００５６５．１、ＮＰ＿００１１０８２２４．１、ＮＰ＿００１２８７８３２．１、及びＮＰ＿００１２８７８３３．１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に記載される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５５の外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿０００５７４．４、ＮＭ＿００１１１４７５２．２、ＮＭ＿００１３００９０３．１、及びＮＭ＿００１３００９０４．１に記載されるようなＣＤ５５の外因性ヌクレオチド配列を含む。

【0310】

いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００５６５．１、ＮＰ＿００１１０８２２４．１、ＮＰ＿００１２８７８３２．１、及びＮＰ＿００１２８７８３３．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有する過剰発現ＣＤ５５ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００５６５．１、ＮＰ＿００１１０８２２４．１、ＮＰ＿００１２８７８３２．１、及びＮＰ＿００１２８７８３３．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有する外因性ＣＤ５５ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００５６５．１、ＮＰ＿００１１０８２２４．１、ＮＰ＿００１２８７８３２．１、及びＮＰ＿００１２８７８３３．１に記載されるようなアミノ酸配列を有する過剰発現ＣＤ５５ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿０００５６５．１、ＮＰ＿００１１０８２２４．１、ＮＰ＿００１２８７８３２．１、及びＮＰ＿００１２８７８３３．１に記載されるようなアミノ酸配列を有する外因性ＣＤ５５ポリペプチドを含む。

【0311】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：９に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５５ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：９に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：９に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ５５ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：９に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。

【0312】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：８に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５５ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：８に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：８に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ５５ポリペプチドをコードする過剰発現ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、配列番号：８に記載されるようなアミノ酸配列を含むＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする配列に機能的に連結されている。

【0313】

いくつかの実施形態では、ＣＤ５５の全てまたは機能部分は、他の構成要素、例えば、シグナルペプチド、リーダー配列、分泌シグナル、標識（例えば、レポーター遺伝子）、またはそれらの任意の組合せなどに連結され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５のシグナルペプチドをコードする核酸配列は、異種タンパク質からのシグナルペプチドをコードする核酸配列で置き換えられている。異種タンパク質は、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ２８、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、成長ホルモン、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＧＭ－ＣＳＦ受容体（ＧＭ－ＣＳＦＲａ）、または免疫グロブリン（例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＫ）であり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＧ重鎖もしくはＩｇＧカッパ軽鎖など）、サイトカイン（インターロイキン－２（ＩＬ－２）、もしくはＣＤ３３など）、血清アルブミンタンパク質（例えば、ＨＳＡもしくはアルブミン）、ヒトアズロシジンプレタンパク質シグナル配列、ルシフェラーゼ、トリプシノーゲン（例えば、キモトリプシノーゲンもしくはトリプシノーゲン）からのシグナルペプチドまたは細胞によって、もしくは細胞上でタンパク質を効率的に発現できる他のシグナルペプチドである。

【0314】

ある特定の実施形態では、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0315】

いくつかの実施形態では、ＣＤ５５をコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＣＤ５５をコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＣＤ５５をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ５５をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＣＤ５５をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＣＤ５５をコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0316】

いくつかの実施形態では、ＣＤ５５タンパク質発現は、ＣＤ５５タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＣＤ５５ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0317】

Ｇ．補体インヒビターの組合せ
いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から、任意の組合せで選択される２つ以上の補体インヒビターの発現増加を含む。

【0318】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、上に記載されるいずれかなどのＣＤ４６をコードする過剰発現ポリヌクレオチド、及び上に記載されるいずれかなどのＣＤ５９をコードする過剰発現ポリヌクレオチドを含有する。

【0319】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、上に記載されるいずれかなどのＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び上に記載されるいずれかなどのＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。

【0320】

いくつかの実施形態では、操作細胞（ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現を増加させる１つ以上の改変を含む）は、改変を含まない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の内因性発現と比較して）ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現増加を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、改変を有しない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の内因性発現と比較して）、ＣＤ４６及びＣＤ５９発現の１．５倍～２倍、２倍～３倍、３倍～４倍、４倍～５倍、５倍～１０倍、１０倍～１５倍、１５倍～２０倍、２０倍～４０倍、４０倍～６０倍、６０倍～８０倍、８０倍～１００倍、または１００倍～２００倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、改変（複数可）を有しない細胞は、ＣＤ４６及びＣＤ５９の内因性発現を有しないか、またはＣＤ４６及びＣＤ５９の検出可能な発現を有しない。いくつかの実施形態では、改変を欠く細胞と比較して、発現の増加倍率は２００倍よりも大きい。

【0321】

いくつかの実施形態では、操作細胞（ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現を増加させる１つ以上の改変を含む）は、改変を有しない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の内因性発現と比較して）、ＣＤ４６及びＣＤ５９発現の２倍～２００倍、２倍～１００倍、２倍～５０倍、または２倍～２０倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞（ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現を増加させる１つ以上の改変を含む）は、改変を有しない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の内因性発現と比較して）、ＣＤ４６及びＣＤ５９発現の５倍～２００倍、５倍～１００倍、５倍～５０倍、または５倍～２０倍の増加を含む。

【0322】

いくつかの実施形態では、操作細胞（ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現を増加させる１つ以上の改変を含む）は、改変を含まない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の内因性発現と比較して）ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現増加を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、改変を有しない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の内因性発現と比較して）、ＣＤ４６及びＣＤ５９発現の少なくとも２倍もしくは約２倍、少なくとも４倍もしくは約４倍、少なくとも６倍もしくは約６倍、少なくとも１０倍もしくは約１０倍、少なくとも１５倍もしくは約１５倍、少なくとも２０倍もしくは約２０倍、少なくとも３０倍もしくは約３０倍、少なくとも５０倍もしくは約５０倍、少なくとも６０倍もしくは約６０倍、少なくとも７０倍もしくは約７０倍、少なくとも８０倍もしくは約８０倍、少なくとも１００倍もしくは約１００倍、または前述した値のいずれかの間における任意の値の増加を含む。

【0323】

いくつかの実施形態では、操作細胞（ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現を増加させる１つ以上の改変を含む）は、改変を含まない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の内因性発現と比較して）ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現増加を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、改変を有しない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の内因性発現と比較して）、ＣＤ４６及びＣＤ５９発現の２倍もしくは約２倍、４倍もしくは約４倍、６倍もしくは約６倍、１０倍もしくは約１０倍、１５倍もしくは約１５倍、２０倍もしくは約２０倍、３０倍もしくは約３０倍、５０倍もしくは約５０倍、６０倍もしくは約６０倍、７０倍もしくは約７０倍、８０倍もしくは約８０倍、１００倍もしくは約１００倍、または前述した値のいずれかの間における任意の値の増加を含む。

【0324】

いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４６及びＣＤ５９をコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、以下の節ＩＩ．Ｂ．４に記載されるような、モノシストロン性またはマルチシストロン性ベクターである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６及びＣＤ５９は、同じマルチシストロン性ベクターに含まれ、任意にＣＤ４７などの１つ以上の寛容原性因子と組み合わされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６及びＣＤ５９は、異なる導入遺伝子に含まれ、任意にＣＤ４７などの１つ以上の寛容原性因子と組み合わされる。

【0325】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、上に記載されるいずれかなどのＣＤ４６をコードする過剰発現ポリヌクレオチド、上に記載されるいずれかなどのＣＤ５９をコードする過剰発現ポリヌクレオチド、及び上に記載されるいずれかなどのＣＤ５５をコードする過剰発現ポリヌクレオチドを含有する。

【0326】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、上に記載されるいずれかなどのＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、上に記載されるいずれかなどのＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び上に記載されるいずれかなどのＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。

【0327】

いくつかの実施形態では、操作細胞（ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現を増加させる１つ以上の改変を含む）は、改変を含まない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の内因性発現と比較して）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現増加を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、改変を有しない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の内因性発現と比較して）、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５発現の１．５倍～２倍、２倍～３倍、３倍～４倍、４倍～５倍、５倍～１０倍、１０倍～１５倍、１５倍～２０倍、２０倍～４０倍、４０倍～６０倍、６０倍～８０倍、８０倍～１００倍、または１００倍～２００倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、改変（複数可）を有しない細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の内因性発現を有しないか、またはＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の検出可能な発現を有しない。いくつかの実施形態では、改変を欠く細胞と比較して、発現の増加倍率は２００倍よりも大きい。

【0328】

いくつかの実施形態では、操作細胞（ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現を増加させる１つ以上の改変を含む）は、改変を有しない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の内因性発現と比較して）、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５発現の２倍～２００倍、２倍～１００倍、２倍～５０倍、または２倍～２０倍の増加を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞（ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現を増加させる１つ以上の改変を含む）は、改変を有しない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の内因性発現と比較して）、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５発現の５倍～２００倍、５倍～１００倍、５倍～５０倍、または５倍～２０倍の増加を含む。

【0329】

いくつかの実施形態では、操作細胞（ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現を増加させる１つ以上の改変を含む）は、改変を含まない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６及びＣＤ５９の内因性発現と比較して）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現増加を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、改変を有しない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の内因性発現と比較して）、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５発現の少なくとも２倍もしくは約２倍、少なくとも４倍もしくは約４倍、少なくとも６倍もしくは約６倍、少なくとも１０倍もしくは約１０倍、少なくとも１５倍もしくは約１５倍、少なくとも２０倍もしくは約２０倍、少なくとも３０倍もしくは約３０倍、少なくとも５０倍もしくは約５０倍、少なくとも６０倍もしくは約６０倍、少なくとも７０倍もしくは約７０倍、少なくとも８０倍もしくは約８０倍、少なくとも１００倍もしくは約１００倍、または前述した値のいずれかの間における任意の値の増加を含む。

【0330】

いくつかの実施形態では、操作細胞（ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現を増加させる１つ以上の改変を含む）は、改変を含まない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の内因性発現と比較して）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の発現増加を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、改変を有しない細胞と比較して（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５の内因性発現と比較して）、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５発現の２倍もしくは約２倍、４倍もしくは約４倍、６倍もしくは約６倍、１０倍もしくは約１０倍、１５倍もしくは約１５倍、２０倍もしくは約２０倍、３０倍もしくは約３０倍、５０倍もしくは約５０倍、６０倍もしくは約６０倍、７０倍もしくは約７０倍、８０倍もしくは約８０倍、１００倍もしくは約１００倍、または前述した値のいずれかの間における任意の値の増加を含む。

【0331】

いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５をコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、以下の節ＩＩ．Ｂ．４に記載されるような、モノシストロン性またはマルチシストロン性ベクターである。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５は、同じマルチシストロン性ベクターに含まれ、任意にＣＤ４７などの１つ以上の寛容原性因子と組み合わされる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５は、異なる導入遺伝子に含まれ、任意にＣＤ４７などの１つ以上の寛容原性因子と組み合わされる。

【0332】

２．寛容原性因子
いくつかの実施形態では、寛容原性因子の発現は、細胞内で過剰発現されるか、または増加する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、少なくとも１つの寛容原性因子の発現増加、すなわち、過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、寛容原性因子は、免疫系（例えば、自然または適応免疫系）によって操作細胞に対する寛容を促進するか、または寛容の促進もしくは誘導に寄与する任意の因子である。いくつかの実施形態では、寛容原性因子は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ、及びＨ２－Ｍ３である。いくつかの実施形態では、寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥもしくはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００またはＭｆｇｅ８、あるいはそれらの任意の組合せである。いくつかの実施形態では、細胞は、寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つは、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドである。本明細書では、レシピエント対象への投与時に免疫応答を誘発または活性化しない細胞が提供される。上に記載されるように、いくつかの実施形態では、細胞は、レシピエントにおける免疫認識及び寛容に影響を及ぼす遺伝子及び寛容（例えば、免疫）因子の発現を増加させるように改変される。

【0333】

いくつかの実施形態では、本開示は、寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）、例えば、ＣＤ４７などを発現するように改変されている細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）、例えば、ＣＤ４７などを発現するように細胞ゲノムを変更する方法を提供する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、外因性寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）、例えば、外因性ＣＤ４７などを発現する。いくつかの場合では、外因性ポリヌクレオチドの過剰発現または発現増加は、ヒトＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを用いて細胞に導入する（例えば、細胞を形質導入する）ことによって達成される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであってよいか、または非ウイルスベクターであってよい。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含有するように操作され、その場合に外因性ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つは、寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドを含む。任意の実施形態のいくつかでは、寛容原性因子は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ、及びＨ２－Ｍ３である。いくつかの実施形態では、寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥもしくはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００またはＭｆｇｅ８、あるいはそれらの任意の組合せ（例えば、それらの全て）から選択される。例えば、いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つは、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドである。

【0334】

いくつかの実施形態では、寛容原性因子はＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＤ４７などのＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現は、改変によって操作されていない同じ細胞型の類似した細胞、例えば、参照細胞または非改変細胞など、例えば、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドによって操作されていない細胞と比較して、操作細胞内で過剰発現されるか、または増加する。ＣＤ４７は白血球表面抗原であり、インテグリンの細胞接着及び調節に関与する。それは、通常は細胞の表面上で発現され、循環マクロファージが細胞を食べないようにシグナル伝達する。ヒトＣＤ４７についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＮＰ＿００１７６８．１、ＮＰ＿９４２０８８．１、ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２で提供される。

【0335】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、少なくとも１つの寛容原性因子の発現増加、すなわち、過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、寛容原性因子としては、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ、及びＨ２－Ｍ３、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。例えば、いくつかの実施形態では、過剰発現（例えば、外因性）ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つは、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドである。

【0336】

いくつかの実施形態では、本開示は、寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）、例えば、ＣＤ４７などを発現するように改変されている細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）、例えば、ＣＤ４７などを発現するように細胞ゲノムを変更する方法を提供する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、外因性寛容原性因子（例えば、免疫調節ポリペプチド）、例えば、外因性ＣＤ４７などを発現する。いくつかの場合では、細胞は、ヒトＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現する。

【0337】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＤ４７などのＣＤ４７をコードする過剰発現ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＤ４７などのＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現は、参照細胞または非改変細胞がＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ＣＤ４７は白血球表面抗原であり、インテグリンの細胞接着及び調節に関与する。それは、通常は細胞の表面上で発現され、循環マクロファージが細胞を食べないようにシグナル伝達する。ヒトＣＤ４７についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＮＰ＿００１７６８．１、ＮＰ＿９４２０８８．１、ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２で提供される。

【0338】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に記載される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４７の外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に記載されるようなＣＤ４７の外因性ヌクレオチド配列を含む。

【0339】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に記載される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４７の外因性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に記載されるようなＣＤ４７の外因性ヌクレオチド配列を含む。

【0340】

いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有する外因性ＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説される細胞は、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に記載されるようなアミノ酸配列を有する外因性ＣＤ４７ポリペプチドを含む。

【0341】

いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号：１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードする過剰発現ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号：１に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号：１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードする過剰発現ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号：１に記載されるようなアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0342】

いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号：２に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有する過剰発現ＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号：２に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える）を有する外因性ＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号：２に記載されるようなアミノ酸配列を有する過剰発現ＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、配列番号：２に記載されるようなアミノ酸配列を有する外因性ＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ５９ポリペプチドをコードする外因性ヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする配列に機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、以下でさらに記載される方法などの、標的または非標的挿入方法によって細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、標的挿入は、標的座位への相同性依存性挿入によって、例えば、表２に示される遺伝子座のいずれか１つ、例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子、ＴＲＢＣ遺伝子への挿入などによって行われる。いくつかの実施形態では、標的挿入は、相同非依存性挿入によって、例えば、セーフハーバー座位への挿入などによって行われる。いくつかの場合には、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。

【0343】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の全てまたは機能部分は、他の構成要素、例えば、シグナルペプチド、リーダー配列、分泌シグナル、標識（例えば、レポーター遺伝子）、またはそれらの任意の組合せなどに連結され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７のシグナルペプチドをコードする核酸配列は、異種タンパク質からのシグナルペプチドをコードする核酸配列で置き換えられている。異種タンパク質は、例えば、ＣＤ８α、ＣＤ２８、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、成長ホルモン、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＧＭ－ＣＳＦ受容体（ＧＭ－ＣＳＦＲａ）、または免疫グロブリン（例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＫ）であり得る。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＧ重鎖もしくはＩｇＧカッパ軽鎖など）、サイトカイン（インターロイキン－２（ＩＬ－２）、もしくはＣＤ３３など）、血清アルブミンタンパク質（例えば、ＨＳＡもしくはアルブミン）、ヒトアズロシジンプレタンパク質シグナル配列、ルシフェラーゼ、トリプシノーゲン（例えば、キモトリプシノーゲンもしくはトリプシノーゲン）からのシグナルペプチドまたは細胞によって、もしくは細胞上でタンパク質を効率的に発現できる他のシグナルペプチドである。

【0344】

ある特定の実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0345】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0346】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７タンパク質発現は、ＣＤ４７タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＣＤ４７ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0347】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＤ２００などのＣＤ２００をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００の発現は、参照細胞または非改変細胞がＣＤ２００をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ヒトＣＤ２００についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０３Ｐ１１２３３２、ＨＧＮＣ番号７２０３、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ４３４５、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４１２１７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１００４１９６．２、ＮＭ＿００１００４１９６．３、ＮＰ＿００１３０５７５７．１、ＮＭ＿００１３１８８２８．１、ＮＰ＿００５９３５．４、ＮＭ＿００５９４４．６、ＸＰ＿００５２４７５３９．１、及びＸＭ＿００５２４７４８２．２で提供される。ある特定の実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0348】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0349】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２００タンパク質発現は、ＣＤ２００タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＣＤ２００ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0350】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＨＬＡ－ＥなどのＨＬＡ－Ｅをコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅは、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅの発現は、参照細胞または非改変細胞がＨＬＡ－Ｅをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ヒトＨＬＡ－Ｅについての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０６Ｐ０４７２８１、ＨＧＮＣ番号４９６２、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ３１３３、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１３７４７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００５５０７．３及びＮＭ＿００５５１６．５で提供される。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0351】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0352】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅタンパク質発現は、ＨＬＡ－Ｅタンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＨＬＡ－Ｅ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0353】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＨＬＡ－ＧなどのＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇの発現は、参照細胞または非改変細胞がＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ヒトＨＬＡ－Ｇについての有用なゲノム、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０６Ｐ０４７２５６、ＨＧＮＣ番号４９６４、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ３１３５、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１７６９３、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００２１１８．１及びＮＭ＿００２１２７．５で提供される。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0354】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0355】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇタンパク質発現は、ＨＬＡ－Ｇタンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＨＬＡ－Ｇ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0356】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＰＤ－Ｌ１などのＰＤ－Ｌ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１の発現は、参照細胞または非改変細胞がＰＤ－Ｌ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ヒトＰＤ－Ｌ１またはＣＤ２７４についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０９Ｐ００５４５０、ＨＧＮＣ番号１７６３５、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ２９１２６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＱ７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１２５４６３５．１、ＮＭ＿００１２６７７０６．１、ＮＰ＿０５４８６２．１、及びＮＭ＿０１４１４３．３で提供される。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0357】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0358】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0359】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＦａｓＬなどのＦａｓＬをコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＦａｓＬは、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＦａｓＬの発現は、参照細胞または非改変細胞がＦａｓＬをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ヒトＦａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ１７８、ＴＮＦＳＦ６などとして知られる）についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０１Ｐ１７２６２８、ＨＧＮＣ番号１１９３６、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ３５６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４８０２３、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００６３０．１、ＮＭ＿０００６３９．２、ＮＰ＿００１２８９６７５．１、及びＮＭ＿００１３０２７４６．１で提供される。ある特定の実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0360】

いくつかの実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0361】

いくつかの実施形態では、Ｆａｓ－Ｌタンパク質発現は、Ｆａｓ－Ｌタンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性Ｆａｓ－Ｌ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0362】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＣＬ２１などのＣＣＬ２１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１の発現は、参照細胞または非改変細胞がＣＣＬ２１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ヒトＣＣＬ２１についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０９Ｍ０３４７０９、ＨＧＮＣ番号１０６２０、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ６３６６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ００５８５、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００２９８０．１及びＮＭ＿００２９８９．３で提供される。ある特定の実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0363】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0364】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１タンパク質発現は、ＣＣＬ２１タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＣＣＬ２１ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0365】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＣＣＬ２２などのＣＣＬ２２をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２の発現は、参照細胞または非改変細胞がＣＣＬ２２をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ヒトＣＣＬ２２についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ１６Ｐ０５７３５９、ＨＧＮＣ番号１０６２１、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ６３６７、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ００６２６、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００２９８１．２、ＮＭ＿００２９９０．４、ＸＰ＿０１６８７９０２０．１、及びＸＭ＿０１７０２３５３１．１で提供される。ある特定の実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0366】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0367】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２タンパク質発現は、ＣＣＬ２２タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＣＣＬ２２ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0368】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＭｆｇｅ８などのＭｆｇｅ８をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８の発現は、参照細胞または非改変細胞がＭｆｇｅ８をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ヒトＭｆｇｅ８についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ１５Ｍ０８８８９８、ＨＧＮＣ番号７０３６、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ４２４０、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ０８４３１、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１１０８０８６．１、ＮＭ＿００１１１４６１４．２、ＮＰ＿００１２９７２４８．１、ＮＭ＿００１３１０３１９．１、ＮＰ＿００１２９７２４９．１、ＮＭ＿００１３１０３２０．１、ＮＰ＿００１２９７２５０．１、ＮＭ＿００１３１０３２１．１、ＮＰ＿００５９１９．２、及びＮＭ＿００５９２８．３で提供される。ある特定の実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0369】

いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0370】

いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８タンパク質発現は、Ｍｆｇｅ８タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性Ｍｆｇｅ８ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0371】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ヒトＳｅｒｐｉｎＢ９などのＳｅｒｐｉｎＢ９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９は、細胞内で過剰発現される。いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９の発現は、参照細胞または非改変細胞がＳｅｒｐｉｎＢ９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除いて、同様の参照細胞または非改変細胞（任意の他の改変を有することを含む）と比較して操作細胞内で増加する。ヒトＳｅｒｐｉｎＢ９についての有用なゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ識別子ＧＣ０６Ｍ００２８８７、ＨＧＮＣ番号８９５５、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ５２７２、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ５０４５３、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００４１４６．１、ＮＭ＿００４１５５．５、ＸＰ＿００５２４９２４１．１、及びＸＭ＿００５２４９１８４．４で提供される。ある特定の実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能的に連結されている。

【0372】

いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、表２に示される遺伝子座のいずれか１つに挿入される。いくつかの場合には、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１から選択される遺伝子座などのセーフハーバー座位に挿入される。特定の実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、またはＣＤ１４２遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、操作細胞はＴ細胞であり、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座、またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態では、好適な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは本明細書に記載される遺伝子編集システムのいずれか）が、細胞のゲノム座位への、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドの挿入を容易にするために使用される。

【0373】

いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９タンパク質発現は、ＳｅｒｐｉｎＢ９タンパク質に対する抗体でプローブされる細胞溶解物のウェスタンブロットを使用して検出される。別の実施形態では、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）が、外因性ＳｅｒｐｉｎＢ９ ｍＲＮＡの存在を確認するために使用される。

【0374】

３．キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、提供される操作細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するようにさらに改変される。いくつかの実施形態では、提供される細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を制御し、即時血液媒介性炎症反応を制御し、本明細書に記載されるような寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、かつＣＡＲを発現する、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の遺伝子改変を含有する。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍが減少するか、または排除され（例えば、ノックアウトされ）、ＣＩＩＴＡが減少するか、または排除され（例えば、ノックアウトされ）、ＣＤ１４２が減少するか、または排除され、ＣＤ４７が過剰発現され、かつＣＡＲが発現される細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－、ＣＤ１４２^－／－、ＣＤ４７ｔｇ、ＣＡＲ＋である。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＴＲＡＣが減少するか、または排除される（例えば、ノックアウトされる）追加の細胞であってよい。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｂ２^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－、ＣＤ１４２^－／－、ＣＤ４７ｔｇ、ＴＲＡＣ^－／－ＣＡＲ＋である。

【0375】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞または多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣ）から分化したＴ細胞などである。いくつかの実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、例えば、初代ＮＫ細胞または多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣ）から分化したＮＫ細胞などである。

【0376】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲ、及び第４世代ＣＡＲからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン（例えば、１つ、２つまたは３つのシグナル伝達ドメイン）を含む第１世代ＣＡＲであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも２つのシグナル伝達ドメインを含む第２世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む第３世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、第４世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、及びＣＡＲのシグナル伝達成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖまたはＦａｂであるか、またはそれを含む。

【0377】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞のいずれか１つは、ＣＡＲまたは第１世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。

【0378】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞のいずれか１つは、ＣＡＲまたは第２世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第２世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び２つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中にサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及び／またはＣＡＲ Ｔ細胞持続性を増強する。

【0379】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞のいずれか１つは、ＣＡＲまたは第３世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第３世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中にサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及び／またはＣＡＲ Ｔ細胞持続性を増強する。いくつかの実施形態では、第３世代ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの共刺激ドメインは、同じではない。

【0380】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞のいずれか１つは、ＣＡＲまたは第４世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第４世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも２つ、３つ、または４つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化中に下流シグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化中にサイトカイン産生、ＣＡＲ Ｔ細胞増殖、及び／またはＣＡＲ Ｔ細胞持続性を増強する。

【0381】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞（例えば、初代もしくはｉＰＳＣ由来Ｔ細胞または初代もしくはｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞）は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドはゲノム座位に挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１、Ｆ３（ＣＤ１４２としても知られる）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＬＲＰ１（ＣＤ９１としても知られる）、ＨＭＧＢ１、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１、またはＫＤＭ５Ｄ遺伝子座などに挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＰＤ１またはＣＴＬＡ４遺伝子に挿入される。本明細書に記載される遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含む、任意の好適な方法が、低免疫原性細胞のゲノム座位にＣＡＲを挿入するために使用され得る。

【0382】

いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、または第４世代ＣＡＲは、ＣＡＲのシグナル伝達成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＣＡＲのシグナル伝達成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含むＣＡＲを含む標的細胞にとって内因性または外因性である。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、炎症性サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦ、もしくはＩＦＮ－ガンマ、またはその機能的断片をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子またはその機能ドメインもしくは断片であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達成功時にサイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子またはその機能ドメインもしくは断片であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、転写因子またはその機能ドメインもしくは断片は、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）、ＮＦ－ｋＢ、またはその機能ドメインもしくは断片であるか、またはそれを含む。例えば、Ｚｈａｎｇ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５：２２（２０１７）、ＷＯ２０１６１２６６０８、Ｓｈａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｊａｎ ２７，２０１７，３７（１）を参照のこと。

【0383】

当業者は、ＣＡＲならびにＣＡＲの様々な構成要素及び構成に精通している。任意の既知のＣＡＲが、提供される実施形態に関連して用いられ得る。本明細書に記載されるＣＡＲに加えて、様々なＣＡＲ及びそれらをコードするヌクレオチド配列が当該技術分野において既知であり、本明細書に記載されるような細胞の操作に適していることになる。例えば、ＷＯ２０１３０４０５５７、ＷＯ２０１２０７９０００、ＷＯ２０１６０３０４１４、Ｓｍｉｔｈ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７を参照し、その開示が参照によって本明細書に組み込まれる。ＣＡＲの例示的な特徴及び構成要素は、以下の小節に記載されている。

【0384】

Ｈ．抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、抗体またはその抗原結合部分であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖまたはＦａｂであるか、またはそれを含む。

【0385】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、細胞の細胞表面抗原に結合する。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、特定の、または特異的細胞型の特徴を示す（例えば、それによって発現される）。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、２つ以上の細胞型の特徴を示す。

【0386】

いくつかの実施形態では、抗原は、腫瘍細胞上のみで、もしくは選択的に発現される抗原、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患の特徴を示す抗原であってよい。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、腫瘍性細胞の特徴を示す抗原を標的とする。例えば、抗原結合ドメインは、腫瘍性細胞またはがん細胞によって発現される抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、腫瘍関連抗原と結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍性細胞の特徴を示す抗原（例えば、腫瘍性細胞もしくはがん細胞と関連する抗原）または腫瘍関連抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ関連受容体から選択される。

【0387】

いくつかの実施形態では、標的抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３、及びＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８、及びＦＧＦ２１を含む）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、及びＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体ならびにＥｐｈ受容体ファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４、及びＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ－１、ＣＩＣ－２、ＣＩＣ－４、ＣＩＣ－５、ＣＩＣ－７、ＣＩＣ－Ｋａ、ＣＩＣ－Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣトランスポーター、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン－１－リン酸受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、マルチスパン膜貫通タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞アルファ鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ－４Ｒａ、Ｓｃａ－１、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ－１、トランスフェリン受容体、ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ４０、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｆｈ、古典的Ｔｒｅｇ、ＦｏｘＰ３＋、Ｔｒ１、Ｔｈ３、Ｔｒｅｇ１７、Ｔ_ＲＥＧ、ＣＤＣＰ、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２）、ルイス－γ^２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ－１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ－１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、スムーズンド、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、もしくはＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体アルファ（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ－１３Ｒａ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソテリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３αＲ１、Ｌ１－ＣＡＭ、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン－１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体－ベータ（ＰＤＧＦＲ－ベータ）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ（Ｐｒｏｓｔａｓｅ）、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、グロボＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ関連遺伝子タンパク質（ＭＲ１）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、メランＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢ Ｉ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、新生抗原、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ（ＨＬＡ－Ａ、Ｂ、Ｃ）、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢ、もしくはｔｒｋＣ、またはそれらの抗原断片もしくは抗原部分を含むが、これらに限定されない抗原である。

【0388】

いくつかの実施形態では、例示的な標的抗原としては、ＣＤＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ７０、カッパ、ラムダ、及びＢ細胞成熟因子（ＢＣＭＡ）（白血病と関連する）、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＴＡＣＩ、及びＢＣＭＡ（骨髄腫と関連する）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｂ７Ｈ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲａ、ＩＬ－１３Ｒａ、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、及びＲＯＲ１（固形腫瘍と関連する）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0389】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲはＣＤ１９ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＣＤ１９、例えば、ヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＦＭＣ６３モノクローナル抗体（ＦＭＣ６３）に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含み、これはリンカーペプチドによって結合されたＦＭＣ６３の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、「Ｗｈｉｔｌｏｗ」リンカーペプチドである。ＦＭＣ６３及び由来するｓｃＦｖは、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．ｌｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）及びＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１８／２１３３３７Ａ１号に記載されていて、その各々の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0390】

いくつかの実施形態では、ＣＤ１９ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＣＤ１９特異的抗体、例えば、ＳＪ２５Ｃ１（Ｂｅｊｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：２３４６－２３５１（１９９５））、ＨＤ３７（Ｐｅｚｕｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１３８（９）：２７９３－２７９９（１９８７））、４Ｇ７（Ｍｅｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３：３０５－３２０（１９８４））、Ｂ４３（Ｂｅｊｃｅｋ（１９９５））、ＢＬＹ３（Ｂｅｊｃｅｋ（１９９５））、Ｂ４（Ｆｒｅｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，７０：４１８－４２７（１９８７））、Ｂ４ ＨＢ１２ｂ（Ｋａｎｓａｓ＆Ｔｅｄｄｅｒ，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１４７：４０９４－４１０２（１９９１）、Ｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１５１７８－１５１８３（２００５）、Ｈｅｒｂｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３５：２１３－２２２（２０１０））、ＢＵ１２（Ｇａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４８（１０）：２９８３－２９８７（１９９２））、及びＣＬＢ－ＣＤ１９（Ｄｅ Ｒｉｅ Ｃｅｌｌ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１１８：３６８－３８１（１９８９））を含む抗体のうち１つに由来する抗体を含む。

【0391】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２２ ＣＡＲである。ＣＤ２２は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達の阻害性受容体として機能する成熟Ｂ細胞の表面上で主に見出される膜貫通タンパク質である。ＣＤ２２は、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病（例えば、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及びバーキットリンパ腫）の６０～７０％で発現され、Ｂ細胞発生の初期段階の細胞表面上または幹細胞上には存在しない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２２と特異的に結合する細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達、及び／または細胞内共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ｍ９７１モノクローナル抗体（ｍ９７１）に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含み、これはリンカーによって結合されたｍ９７１の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ｍ９７１－Ｌ７に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含み、これは親抗体ｍ９７１と比較して、有意に改善された（約２ｎＭ～５０ｐＭ未満に改善された）ＣＤ２２結合親和性を有するｍ９７１の親和性成熟バリアントである。いくつかの実施形態では、ｍ９７１－Ｌ７に由来するｓｃＦｖ抗体断片は、３ｘＧ４Ｓリンカーによって結合されたｍ９７１－Ｌ７のＶＨ及びＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２２ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、免疫毒素ＨＡ２２またはＢＬ２２を含む。免疫毒素ＢＬ２２及びＨＡ２２は、細菌毒素に融合されたＣＤ２２に特異的なｓｃＦｖを含み、それゆえ、ＣＤ２２を発現するがん細胞の表面に結合し、がん細胞を死滅させ得る治療剤である。ＢＬ２２は、シュードモナス外毒素Ａの３８ｋＤａの切断型に融合された、抗ＣＤ２２抗体であるＲＦＢ４のｄｓＦｖを含む（Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１１：１５４５－５０（２００５））。ＨＡ２２（ＣＡＴ８０１５、モキセツモマブパスードトクス）は、ＢＬ２２の変異した高親和性型である（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（１）：６０７－１７（２００５））。ＣＤ２２に特異的なＨＡ２２及びＢＬ２２の抗原結合ドメインの好適な配列は、例えば、米国特許第７，５４１，０３４号、同第７，３５５，０１２号、及び同第７，９８２，０１１号に開示され、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0392】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ ＣＡＲである。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞系譜の細胞上で発現される腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦＲ）のメンバーであり、最終分化Ｂ細胞または成熟Ｂリンパ球上で最も高く発現する。ＢＣＭＡは、長期的な液性免疫の維持を目的とした形質細胞の生存の媒介に関与する。ＢＣＭＡの発現は、最近では多数のがん、例えば、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、様々な白血病、ならびに膠芽腫などに関連している。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＢＣＭＡと特異的に結合する細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達、及び／または細胞内共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＢＣＭＡ、例えば、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体を含む。ＢＣＭＡを対象とするＣＡＲは、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１６／０１４７８９号、同第ＷＯ２０１６／０１４５６５号、同第ＷＯ２０１３／１５４７６０号、及び同第ＷＯ ２０１５／１２８６５３号に記載されている。ＢＣＭＡ結合抗体はまた、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１５／１６６０７３号及び同第ＷＯ２０１４／０６８０７９号に開示されている。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９（８）：２０４８－２０６０（２０１３）に記載されるようなマウスモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ抗体断片は、マウスモノクローナル抗体のヒト化型である（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３１：２１９１－２１９９（２０１７））。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｅａｌ．１１（１）：１４１（２０１８）に記載されるようなＢＣＭＡの２つのエピトープに結合し得る２本の重鎖の単一可変断片（ＶＨＨ）を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１（１）：２８３（２０２０）に記載されるような完全ヒト重鎖可変ドメイン（ＦＨＶＨ）を含む。

【0393】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、自己免疫障害または炎症性障害の特徴を示す抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、自己免疫障害または炎症性障害と関連する抗原と結合する。いくつかの場合では、抗原は、自己免疫障害または炎症性障害と関連する細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害は、慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症または強皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素症、尋常性天疱瘡、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、血友病Ａ、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎、エバンス症候群、ＩｇＭ介在性ニューロパチー、クリオグロブリン血症、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱瘡、後天性血管性浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発神経炎、及び自己免疫性血小板減少症または好中球減少症または赤芽球癆から選択される一方で、同種免疫疾患の例示的で非限定的な例としては、造血または固形臓器移植、輸血、胎児同種感作を伴う妊娠、新生児同種免疫性血小板減少症、新生児溶血性疾患、酵素またはタンパク質補充療法、血液製剤、及び遺伝子療法で治療される遺伝性または後天性欠損障害の補充によって生じ得るものなどの外来抗原への感作からの同種感作（例えば、Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１５（４）：９３１－４１を参照のこと）または異種感作が挙げられる。同種感作とは、いくつかの場合では、レシピエント対象または妊娠している対象の免疫系が非自己抗原であるとみなす、ＭＨＣ分子（例えば、ヒト白血球抗原）に対する免疫応答（循環抗体など）の発生を指す。いくつかの実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害の特徴を示す抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、またはヒスチジンキナーゼ関連受容体から選択される。

【0394】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ細胞、形質細胞、または形質芽細胞上で発現されるリガンドに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２８、ＴＮＦ、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ、ＺＡＰ－７０、ＬＦＡ－１、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ５またはＣＤ２に結合する。ＵＳ２００３／００７７２４９、ＷＯ２０１７／０５８７５３、ＷＯ２０１７／０５８８５０を参照し、その内容が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲである。

【0395】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、老化細胞の特徴を示す抗原、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、老化細胞と関連する抗原と結合する。いくつかの場合では、抗原は、老化細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、老化細胞の異常蓄積を特徴とする障害、例えば、肝線維症及び肺線維症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病ならびに変形性関節症の治療または予防のために使用されてよい。

【0396】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、感染症の特徴を示す抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、ＡＢＤは、感染症と関連する抗原と結合する。いくつかの場合では、抗原は、感染症の影響を受ける細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、感染症は、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型（ＨＨＶ－８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））、ヒトＴリンパ球向性ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタイン・バーウイルス、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルスから選択される。いくつかの実施形態では、感染症の特徴を示す抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質共役受容体、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン／スレオニンキナーゼ、受容体グアニル酸シクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ関連受容体、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ｇｐ１２０、またはＨＩＶ－１ Ｅｎｖ上のＣＤ４誘導エピトープから選択される。

【0397】

これらの実施形態のいずれにおいても、ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、宿主細胞における発現のためにコドン最適化され得るか、または細胞外結合ドメインの機能を増加させるためにバリアント配列を有し得る。

【0398】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、２つの標的抗原に対して二重特異的である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、異なる標的抗原である。任意のそのような実施形態のいくつかでは、２つの異なる標的抗原は、上に記載される任意の２つの異なる抗原である。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは異なっていて、（ｉ）ＣＤ１９及びＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０及びＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭ及びＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲ及びＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９及びＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴ及びＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲ及びＲＯＲ１からの２つの異なる抗原と結合する。いくつかの実施形態では、２つの異なる抗原結合ドメインの各々がｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、第１ｓｃＦｖの１つの可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）のＣ末端は、ポリペプチドリンカーを介して第２ｓｃＦｖのＮ末端（それぞれＶＬまたはＶＨ）に繋がれる。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と連結させるか、またはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端と連結させる。それらのｓｃＦｖは、天然抗体の重鎖及び軽鎖中に存在する定常領域（Ｆｃ）を欠いている。少なくとも２つの異なる抗原に特異的なｓｃＦｖはタンデムに配置され、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。一実施形態では、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合領域と膜貫通ドメインとの間に連結されてよい。

【0399】

さらなる実施形態では、ＣＡＲの各抗原特異的標的指向性領域は、二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）（または二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））一本鎖可変断片（ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ）を含む。ｄｉ－ｓｃＦＶを含むＣＡＲでは、各抗原に特異的な２つのｓｃＦｖは、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一ペプチド鎖を生成することによって互いに連結され、タンデムｓｃＦｖを生成する。（Ｘｉｏｎｇ，Ｃｈｅｎｇ－Ｙｉ；Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ａ；Ｓｈｉ，Ｘ Ｂ；Ｄｅｎａｒｄｏ，Ｇ Ｌ；Ｄｅｎａｒｄｏ，Ｓ Ｊ（２００６）．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉ－ＭＵＣ－１ ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉ－ｓｃＦｖ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ”．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １９（８）：３５９－３６７、Ｋｕｆｅｒ，Ｐｅｔｅｒ；Ｌｕｔｔｅｒｂｕｓｅ，Ｒａｌｆ；Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐａｔｒｉｃｋ Ａ．（２００４）．“Ａ ｒｅｖｉｖａｌ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４）。少なくとも２つの抗原特異的標的指向性領域を含むＣＡＲは、２つの抗原の各々に特異的な２つのｓｃＦｖを発現することになる。少なくとも２つの異なる抗原に特異的な、得られた抗原特異的標的指向性領域は、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに結合される。一実施形態では、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結されてよい。

【0400】

追加の実施形態では、ＣＡＲの各抗原特異的標的指向性領域は、ダイアボディを含む。ダイアボディでは、２つの可変領域を互いに折り畳むには短すぎるリンカーペプチドを有するｓｃＦｖが作製され、ｓｃＦｖを二量体化する。さらに、より短いリンカー（１つまたは２つのアミノ酸）によって、三量体、いわゆるトリアボディまたはｔｒｉｂｏｄｙが形成される。テトラボディも使用されてよい。

【0401】

いくつかの実施形態では、細胞は、２つ以上のＣＡＲ、例えば、２つの異なるＣＡＲなどを発現するように操作され、その場合に各ＣＡＲは、異なる標的抗原を対象とする抗原結合ドメインを有する。任意のそのような実施形態のいくつかでは、２つの異なる標的抗原は、上に記載される任意の２つの異なる抗原である。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは異なっていて、（ｉ）ＣＤ１９及びＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０及びＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭ及びＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲ及びＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９及びＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴ及びＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲ及びＲＯＲ１からの２つの異なる抗原と結合する。

【0402】

いくつかの実施形態では、２つの異なる操作細胞は、各々が異なるＣＡＲで操作されている、提供される改変を含有して調製される。いくつかの実施形態では、２つの異なるＣＡＲの各々は、異なる標的抗原を対象とする抗原結合ドメインを有する。任意のそのような実施形態のいくつかでは、２つの異なる標的抗原は、上に記載される任意の２つの異なる抗原である。いくつかの実施形態では、細胞外結合ドメインは異なっていて、（ｉ）ＣＤ１９及びＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０及びＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭ及びＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲ及びＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９及びＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴ及びＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲ及びＲＯＲ１からの２つの異なる抗原と結合する。いくつかの実施形態では、第１標的抗原を対象とする第１ＣＡＲを発現する操作細胞（例えば、低免疫原性）の集団及び第２標的抗原を対象とする第２ＣＡＲを発現する操作細胞（例えば、低免疫原性）の集団は、別々に対象に投与される。いくつかの実施形態では、第１及び第２細胞集団は、任意の順序で順次投与される。例えば、第２ＣＡＲを発現する細胞集団は、第１ＣＡＲを発現する細胞集団の投与後に投与される。

【0403】

Ｉ．スペーサー
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上のスペーサーをさらに含み、例えば、スペーサーは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の第１スペーサーである。いくつかの実施形態では、第１スペーサーは、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは改変型の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間の第２スペーサーである。いくつかの実施形態では、第２スペーサーはオリゴペプチドであり、例えば、オリゴペプチドは、グリシン及びセリン残基、例えばこれらに限定されないが、グリシン－セリンダブレットなどを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、２つ以上のスペーサー、例えば、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサー及び膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間のスペーサーを含む。

【0404】

Ｊ．膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ膜貫通ドメインは、少なくともＴ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはその機能的バリアントの膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、少なくともＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、及びＦＧＦＲ２Ｂ、またはその機能的バリアントの膜貫通領域（複数可）を含む。

【0405】

Ｋ．シグナル伝達ドメイン（複数可）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＡＲは、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、ＰＤＣＤ６）、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－アルファ／ＴＮＦ－ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－アルファ、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、Ｉｋａｒｏｓ、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ゼータドメイン、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはその機能的断片のうち１つ以上から選択される１つまたは少なくとも１つのシグナル伝達ドメインを含む。

【0406】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む。

【0407】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインであるシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第２共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも３つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのうち１つ以上から選択される共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲが２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、２つの共刺激ドメインは異なる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲが２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、２つの共刺激ドメインは同じである。

【0408】

他の実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、もしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント、及び（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0409】

いくつかの実施形態では、少なくとも２つのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む。他の実施形態では、少なくとも２つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、もしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント、及び（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0410】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む。他の実施形態では、少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、もしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。さらに他の実施形態では、少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント、及び（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0411】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、もしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。

【0412】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。

【0413】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメイン、もしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアント、及び／または（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。

【0414】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ゼータドメイン、もしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメイン、もしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント、及び（ｉｖ）サイトカインまたは共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0415】

Ｌ．例示的なＣＡＲ
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原（例えば、腫瘍抗原）に結合する細胞外抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体断片、例えば、ｓｃＦｖなど）、スペーサー（例えば、ヒンジドメイン、例えば、本明細書に記載されるようないずれかなどを含有する）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載されるようないずれか）、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、任意の細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載されるような一次シグナル伝達ドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメインなど）を含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞質シグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子（例えば、共刺激ドメイン）の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。そのような構成要素のいずれも、上に記載されるようないずれかであり得る。

【0416】

ＣＡＲの例示的な構成要素の例は、表３に記載されている。提供される態様では、ＣＡＲ内の各構成要素の配列は、表３に列挙される任意の組合せを含み得る。

【0417】

【表3】

【0418】

４．ポリヌクレオチドの発現を増加させる（例えば、過剰発現させる）方法
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの発現増加は、様々な技術のいずれかによって行われてよい。例えば、遺伝子及び因子（タンパク質）の発現を調節する方法としては、ゲノム編集技術、及びＲＮＡまたはタンパク質発現技術などが挙げられる。それらの技術の全てについて、周知の組換え技術が、本明細書に概説されるような組換え核酸を生成するために使用される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの過剰発現または発現増加のために１つ以上の改変を用いて操作されている細胞は、本明細書に記載されるような任意の供給源細胞である。いくつかの実施形態では、供給源細胞は、節ＩＩ．Ｃに記載される任意の細胞である。

【0419】

いくつかの実施形態では、遺伝子の発現は、内因性遺伝子活性を増加させる（例えば、外因性遺伝子の転写を増加させる）ことによって増加する。いくつかの場合には、内因性遺伝子活性は、内因性遺伝子に機能的に連結されているプロモーターまたはエンハンサーの活性を増加させることによって増加する。いくつかの実施形態では、プロモーターまたはエンハンサーの活性を増加させることは、内因性プロモーターまたはエンハンサーの活性を増加させる、内因性プロモーターまたはエンハンサーに対する１つ以上の改変を行うことを含む。いくつかの場合には、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることは、遺伝子の内因性プロモーターを改変することを含む。いくつかの実施形態では、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることは、異種プロモーターを導入することを含む。いくつかの実施形態では、異種プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される。

【0420】

Ｍ．ＤＮＡ結合融合タンパク質
いくつかの実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＣＤ４７、または別の寛容原性因子）の発現は、（１）内因性ＣＤ４７、または他の遺伝子に特異的な部位特異的結合ドメイン及び（２）転写活性化因子を含有する、融合タンパク質またはタンパク質複合体の発現によって増加する。

【0421】

いくつかの実施形態では、調節因子は、部位特異的ＤＮＡ結合核酸分子、例えば、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などで構成される。いくつかの実施形態では、本方法は、部位特異的ＤＮＡ結合標的タンパク質、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはＺＦＰを含有する融合タンパク質（これはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）としても知られる）などによって達成される。

【0422】

いくつかの実施形態では、調節因子は、標的領域の遺伝子に特異的に結合するか、またはハイブリダイズする、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸などを使用する、部位特異的結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、提供されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、改変ヌクレアーゼなどの部位特異的ヌクレアーゼに連結されるか、またはそれと複合化される。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、改変ヌクレアーゼ、例えば、メガヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼなどのＤＮＡ標的指向性タンパク質を含む融合体、例えば、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖回文配列核酸（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムなど、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムなどを使用して達成される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を欠くように改変される。いくつかの実施形態では、改変ヌクレアーゼは、触媒的に死んだｄＣａｓ９である。

【0423】

いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来する場合がある。例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼ、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ及びＩ－ＴｅｖＩＩＩなどの認識配列。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２号、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５－１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３及びＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照のこと。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位と結合するように操作され得る。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６、米国特許公開第２００７／０１１７１２８号を参照のこと。

【0424】

ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ、及びＣＲＩＳＰＲシステム結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域を操作する（１つ以上のアミノ酸を変更する）ことによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」得る。操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用ならびに既存のＺＦＰ及び／またはＴＡＬＥ設計及び結合データの情報を格納するデータベース内の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、及び同第６，５３４，２６１号を参照し、またＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６及びＷＯ０３／０１６４９６ならびに米国公開第２０１１０３０１０７３号も参照のこと。

【0425】

いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、配列特異的様式でＤＮＡに結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはそのドメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化している結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上のジンクフィンガーを介してＤＮＡと配列特異的様式で結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。

【0426】

ＺＦＰには、個々のフィンガーの集合によって生成される、典型的には９～１８ヌクレオチド長の特異的ＤＮＡ配列を標的とする人工ＺＦＰドメインがある。ＺＦＰとしては、単一のフィンガードメインは、およそ３０アミノ酸長であり、単一ベータターンの２つのシステインと亜鉛を介して配位結合した２つのインバリアントヒスチジン残基を含有し、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのフィンガーを有するアルファヘリックスを含有するものが挙げられる。一般に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（－１、２、３及び６）でアミノ酸置換を行うことによって変更されてよい。したがって、いくつかの実施形態では、ＺＦＰまたはＺＦＰ含有分子は天然には存在せず、例えば、好適な標的部位に結合するように操作される。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、及び米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照し、全てのその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0427】

多くの遺伝子特異的操作ジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と提携して、研究者がジンクフィンガーの構築及び検証を完全に省略することを可能にする、ジンクフィンガー構築のためのプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発し、数千ものタンパク質に対する特異的標的ジンクフィンガーを提供する（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７－４０５）。いくつかの実施形態では、市販のジンクフィンガーが使用されるか、またはカスタム設計される。

【0428】

いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、天然に存在するか、または操作された（天然に存在しない）転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、転写活性化因子様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質などを含む。例えば、米国特許公開第２０１１０３０１０７３号を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0429】

いくつかの実施形態では、部位特異的結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。一般に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡもしくは活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムとの関連において「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡプロセシング部分的ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムとの関連において「スペーサー」、もしくは「標的指向性配列」とも称される）、及び／またはＣＲＩＳＰＲ座位からの他の配列及び転写物を含む、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与するか、またはその活性を誘導する転写物及び他のエレメントを総称して指す。

【0430】

一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズして、ＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導するのに十分な、標的ポリヌクレオチド配列との相補性を有するポリヌクレオチド配列を含む標的指向性ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適にアライメントされる場合、約５０％以上、約６０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上、またはそれを超える。いくつかの例では、ｇＲＮＡの標的指向性ドメイン（例えば、標的指向性配列）は、標的核酸上の標的配列に相補的、例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％相補的、例えば、完全に相補的である。

【0431】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書に記載されるようないずれかであってよい。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＤ４７、例えば、配列番号：２００７８４～２３１８８５（ＷＯ２０１６１８３０４１の付録２２、表２９）のいずれか１つに記載されるものなど、ＨＬＡ－Ｅ、例えば、配列番号：１８９８５９～１９３１８３（ＷＯ２０１６１８３０４１の付録１２、表１９）のいずれか１つに記載されるものなど、ＨＬＡ－Ｆ、例えば、配列番号：６８８８０８～６９９７５４（ＷＯ２０１６１８３０４１の付録３８、表４５）のいずれか１つに記載されるものなど、ＨＬＡ－Ｇ、例えば、配列番号：１８８３７２～１８９８５８（ＷＯ２０１６１８３０４１の付録１１、表１８）のいずれか１つに記載されるものなど、またはＰＤ－Ｌ１、例えば、配列番号：１９３１８４～２００７８３（ＷＯ２０１６１８３０４１の付録１４、表２１）のいずれか１つに記載されるものなどの標的部位に相補的な標的指向性配列を有する。

【0432】

いくつかの実施形態では、標的部位は、標的遺伝子の転写開始部位の上流にある。いくつかの実施形態では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位に隣接している。いくつかの実施形態では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位の下流にあるＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接している。

【0433】

いくつかの実施形態では、標的指向性ドメインは、転写開始、１つ以上の転写エンハンサーもしくは活性化因子の結合、及び／またはＲＮＡポリメラーゼを促進するための標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするように構成される。１つ以上のｇＲＮＡが、遺伝子のプロモーター領域を標的とするために使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子の１つ以上の領域が標的とされ得る。ある特定の態様では、標的部位は、遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の両側の６００塩基対以内にある。

【0434】

エクソン配列ならびにプロモーター及び活性化因子を含む調節領域の配列を含む、遺伝子を標的とする配列であるか、またはそれを含むｇＲＮＡ配列（すなわち、ｇＲＮＡ標的指向性配列）を設計または同定することは、当業者のレベルの範囲内である。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集のためのゲノムワイドｇＲＮＡデータベースは公的に利用可能であり、これはヒトゲノムまたはマウスゲノムにおける遺伝子の構成的エクソン内の例示的な一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）標的配列を含有する（例えば、ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ－ｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔｍｌを参照し、またＳａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１：７８３－４、ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／、ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／も参照のこと）。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ配列は、非標的遺伝子へのオフターゲット結合が最小限である標的指向性配列であるか、またはそれを含む。

【0435】

いくつかの実施形態では、調節因子は、機能ドメイン、例えば、転写活性化因子をさらに含む。

【0436】

いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、１つ以上の調節エレメント、例えば、標的遺伝子の１つ以上の転写制御エレメントなどであるか、またはそれを含有し、それによって、上で提供されるような部位特異的ドメインが、そのような遺伝子の発現を誘導するために認識される。いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、標的遺伝子の発現を誘導する。いくつかの場合には、転写活性化因子は、異種トランス活性化ドメインの全てまたは一部であり得るか、またはそれを含有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、転写活性化因子は、単純ヘルペス由来トランス活性化ドメイン、Ｄｎｍｔ３ａメチルトランスフェラーゼドメイン、ｐ６５、ＶＰ１６、及びＶＰ６４から選択される。

【0437】

いくつかの実施形態では、調節因子は、ジンクフィンガー転写因子（ＺＦ－ＴＦ）である。いくつかの実施形態では、調節因子は、ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲ）である。

【0438】

ある特定の実施形態では、調節因子は、転写調節ドメインをさらに含む。一般的なドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子）、サイレンサー、がん遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ、ｍｏｓファミリーメンバーなど）、ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連因子及び修飾因子、ＤＮＡ再構成酵素ならびにそれらの関連因子及び修飾因子、クロマチン関連タンパク質及びそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ及びデアセチラーゼ）、ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチルトランスフェラーゼ、例えば、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌなど）、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼなど）ならびにそれらの関連因子及び修飾因子が挙げられる。例えば、米国公開第２０１３／０２５３０４０号を参照し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0439】

活性化を達成するための好適なドメインとしては、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２－５９６２（１ ９７）を参照のこと）、核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３－３８３（１９９８））、核因子カッパＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ＆Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０－５６１８（１９９８）及びＤｏｙｌｅ＆Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７－２９４２（１９９７））、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３－２８（１９９８））、または人工キメラ機能ドメイン、例えば、ＶＰ６４など（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２３－３３）、ならびにデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８，６４３９－６４４７）が挙げられる。追加の例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐｌ、ＡＰ－２、及びＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔａｌ，ＥＭＢＯＪ．１１，４９６１－４９６８（１９９２））に加えてｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ及びＥＲＦ－２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９－３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２３：２５５－２７５、Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１－１１、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ－Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７－８９、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３－１２、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７－２８３、及びＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９－５０４を参照のこと。追加の例示的な活性化ドメインとしては、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃｌ、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、－６，－１、及び－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ、ならびにＴＲＡＢ１が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１－２９、Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １：８７－９９、Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８－３０９、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０：４１９－４２９、Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４－５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ－Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１－８、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３－４４、及びＨｏｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８－１５，３５３を参照のこと。

【0440】

遺伝子抑制因子を作製するために使用され得る、例示的な抑制ドメインとしては、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＤＮＭＴ３Ｌなど）、Ｒｂ、及びＭｅＣＰ２が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１－４５４、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３－４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７－４５０、及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８－３４２を参照のこと。追加の例示的な抑制ドメインとしては、ＲＯＭ２及びＡｔＨＤ２Ａが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５－３２１、及びＷｕ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９－２７を参照のこと。

【0441】

いくつかの場合では、ドメインは、染色体のエピジェネティック制御に関与する。いくつかの実施形態では、ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、例えば、核に局在するＡ型、例えば、ＭＹＳＴファミリーメンバーのＭＯＺ、Ｙｂｆ２／Ｓａｓ３、ＭＯＦ、及びＴｉｐ６０、ＧＮＡＴファミリーメンバーのＧｃｎ５またはｐＣＡＦ、ｐ３００ファミリーメンバーのＣＢＰ、ｐ３００またはＲｔｔｌ０９などである（Ｂｅｍｄｓｅｎ ａｎｄ Ｄｅｎｕ（２００８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １８（６）：６８２－６８９）。他の場合には、ドメインは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、例えば、クラスＩ（ＨＤＡＣ－１、２、３、及び８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣ ＩＩＡ（ＨＤＡＣ－４、５、７及び９）、ＨＤＡＣ ＩＩＢ（ＨＤＡＣ６及び１０））、クラスＩＶ（ＨＤＡＣ－１１）、クラスＩＩＩ（サーチュイン（ＳＩＲＴ）としても知られる、ＳＩＲＴ１～７）などである（Ｍｏｔｔａｍａｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０（３）：３８９８－３９４ｌを参照のこと）。いくつかの実施形態で使用される別のドメインは、ヒストンホスホリラーゼまたはキナーゼであり、例としては、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＤＮＡ－ＰＫ、Ｂｕｂｌ、ＶｐｒＢＰ、ＩＫＫ－ａ、ＰＫＣｐｉ、Ｄｉｋ／Ｚｉｐ、ＪＡＫ２、ＰＫＣ５、ＷＳＴＦ及びＣＫ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、メチル化ドメインが使用され、Ｅｚｈ２、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲＭＴ２／６、ＣＡＲＭ１、ｓｅｔ７／９、ＭＬＬ、ＡＬＬ－１、Ｓｕｖ３９ｈ、Ｇ９ａ、ＳＥＴＤＢ１、Ｅｚｈ２、Ｓｅｔ２、Ｄｏｔｌ、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲ－Ｓｅｔ７及びＳｕｖ４－２０ｈなどの群から選択されてよい。ｓｕｍｏ化及びビオチン化に関与するドメイン（Ｌｙｓ９、１３、４、１８及び１２）も、いくつかの実施形態で使用されてよい（Ｋｏｕｓａｒｉｄｅｓ（２００７）Ｃｅｌｌ １２８：６９３－７０５の概説を参照のこと）。

【0442】

融合分子は、当業者に周知のクローニング方法及び生化学的複合化方法によって構築される。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメイン及び機能ドメイン（例えば、転写活性化または抑制ドメイン）を含む。融合分子はまた、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原からのシグナルなど）ならびにエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ及びヘマグルチニンなど）も任意に含む。融合タンパク質（及びそれらをコードする核酸）は、融合体の構成要素間で翻訳リーディングフレームが保存されるように設計される。

【0443】

一方では機能ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド構成要素と、他方では非タンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、副溝結合剤、核酸）との融合体は、当業者に既知の生化学的複合化方法によって構築される。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）のカタログを参照のこと。副溝結合剤とポリペプチドとの融合体を作製するための方法及び組成物が記載されている。Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３９３０－３９３５。同様に、ポリペプチド構成要素の機能ドメインと関連するｓｇＲＮＡ核酸構成要素を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦ及びヌクレアーゼもまた、当業者に既知であり、本明細書に詳述される。

【0444】

Ｎ．外因性ポリペプチド
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの発現増加（すなわち、過剰発現）は、過剰発現されるべきポリヌクレオチドをコードする外因性ポリヌクレオチドを細胞に導入することによって媒介される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、組換え核酸である。周知の組換え技術が、本明細書に概説されるような組換え核酸を生成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書の外因性ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドは、コドン最適化核酸配列を含む。

【0445】

ある特定の実施形態では、外因性ポリペプチド、例えば、寛容原性因子またはキメラ抗原受容体などをコードする組換え核酸は、発現構築物における１つ以上の調節性ヌクレオチド配列に機能的に連結されてよい。調節性ヌクレオチド配列は一般に、治療される宿主細胞及びレシピエント対象に適していることになる。多数のタイプの適切な発現ベクター及び好適な調節配列が、様々な宿主細胞に関して当該技術分野において既知である。典型的には、１つ以上の調節性ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダーまたはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ならびにエンハンサーまたは活性化因子配列を挙げてよいが、これらに限定されない。当該技術分野において既知であるような構成的または誘導性プロモーターも企図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーター、または２つ以上のプロモーターのエレメントを組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであってよい。発現構築物は、細胞中においてプラスミドなどのエピソーム上に存在してよいか、または発現構築物は染色体内に挿入されてよい。特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために選択可能マーカー遺伝子を含む。ある特定の実施形態は、少なくとも１つの調節配列に機能的に連結されているバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本明細書で使用するための調節配列は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメントを含む。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、形質転換される宿主細胞の選定、発現が望まれる特定のバリアントポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び／またはベクターによってコードされる任意の他のタンパク質、例えば、抗生物質マーカーなどの発現に関して設計される。

【0446】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、操作細胞における外因性ポリヌクレオチドの発現を目的としたプロモーターに機能的に連結されている。好適な哺乳動物プロモーターの例としては、例えば、以下の遺伝子からのプロモーターが挙げられる：伸長因子１アルファ（ＥＦ１α）プロモーター、ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（ＷＯ９７／１５６６４）、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長末端反復領域、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス長末端反復領域、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーター。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリンまたは熱ショックプロモーター（複数可）である。追加の実施形態では、哺乳動物宿主細胞に使用するためのプロモーターは、ウイルス、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのゲノムから得られ得る。さらなる実施形態では、異種哺乳動物プロモーターが使用される。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、及び熱ショックプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０の初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として簡便に得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３－１２０（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素断片として簡便に得られる（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。前述の参考文献は、その全体が参照によって組み込まれる。

【0447】

いくつかの実施形態では、発現ベクターは、バイシストロン性またはマルチシストロン性発現ベクターである。バイシストロン性またはマルチシストロン性発現ベクターは、（１）オープンリーディングフレームの各々に融合された複数のプロモーター、（２）遺伝子間へのスプライシングシグナルの挿入、（３）遺伝子の発現が単一プロモーターによって誘導されるその遺伝子の融合、及び／または（４）遺伝子間のタンパク質分解切断部位（自己切断ペプチド）の挿入もしくは遺伝子間の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の挿入を含んでよい。

【0448】

いくつかの実施形態では、本明細書における発現ベクターまたは構築物は、マルチシストロン性構築物である。「マルチシストロン性構築物」及び「マルチシストロン性ベクター」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、単一のｍＲＮＡ分子に転写されることになる組換えＤＮＡ構築物を指し、単一のｍＲＮＡ分子は、２つ以上の遺伝子（例えば、２つ以上の導入遺伝子）をコードする。マルチシストロン性構築物は、それが２つの遺伝子をコードする場合にはバイシストロン性構築物と称され、それが３つの遺伝子をコードする場合にはトリシストロン性構築物と称され、それが４つの遺伝子をコードする場合にはクアドロシストロン性構築物と称されるなどである。

【0449】

いくつかの実施形態では、ベクターまたは構築物（例えば、導入遺伝子）に含まれる２つ以上の外因性ポリヌクレオチドは各々、マルチシストロン性分離エレメントによって隔てられている。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性分離エレメントは、ＩＲＥＳまたは切断可能なペプチドもしくはリボソームスキップエレメントをコードする配列である。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性分離エレメントは、ＩＲＥＳ、例えば、脳心筋炎（ＥＭＣＶ）ウイルスのＩＲＥＳなどである。いくつかの実施形態では、マルチシストロン性分離エレメントは、切断可能なペプチド、例えば、２Ａペプチドなどである。例示的な２Ａペプチドとしては、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド、及びＦ２Ａペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドはＴ２Ａである。いくつかの実施形態では、２つ以上の外因性ポリヌクレオチド（例えば、第１外因性ポリヌクレオチド及び第２外因性ポリヌクレオチド）は、プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、第１外因性ポリヌクレオチド及び第２外因性ポリヌクレオチドは各々、プロモーターに機能的に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは同じプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１プロモーターである。

【0450】

いくつかの場合には、外因性ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載される寛容原性因子または補体インヒビターをコードする外因性ポリヌクレオチド）は、切断可能なペプチドまたはリボソームスキップエレメント、例えば、マルチシストロン性ベクターによってコードされる外因性ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のＴ２Ａなどをコードする。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドまたはリボソームスキップエレメントの包含によって、単一の翻訳開始部位からの２つ以上のポリペプチドの発現が可能となる。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドはＴ２Ａである。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号：１１によって記載されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号：１２によって記載されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号：１７によって記載されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号：１８によって記載されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。

【0451】

いくつかの実施形態では、ベクターまたは構築物は、外因性ポリヌクレオチドの１つ以上の転写単位の発現を誘導する単一プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、そのようなベクターまたは構築物は、マルチシストロン性（バイシストロン性またはトリシストロン性、例えば、米国特許第６，０６０，２７３号を参照のこと）であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、転写単位は、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を含有するバイシストロン性単位として操作され得、これは単一プロモーターから転写されるＲＮＡからの遺伝子産物（例えば、ＣＤ４７などの１つ以上の寛容原性因子及び／またはＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５などの１つ以上の補体インヒビター）の共発現を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるベクターまたは構築物はバイシストロン性であり、ベクターまたは構築物が２つの別個のポリペプチドを発現することを可能にする。いくつかの場合には、ベクターまたは構築物によってコードされる２つの別個のポリペプチドは、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－３９、ＦａｓＬ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、Ｍｆｇｅ８、及びＳｅｒｐｉｎｂ９から選択される２つの因子）である。いくつかの場合には、ベクターまたは構築物によってコードされる２つの別個のポリペプチドは、ＣＤ４６及びＣＤ５９である。いくつかの実施形態では、ベクターまたは構築物によってコードされる２つの別個のポリペプチドは、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５から選択される補体インヒビターである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるベクターまたは構築物はトリシストロン性であり、ベクターまたは構築物が３つの別個のポリペプチドを発現することを可能にする。いくつかの場合には、トリシストロン性ベクターまたは構築物の３つの核酸配列は、ＣＤ４７、ＣＤ４６、及びＣＤ５９などの寛容原性因子である。いくつかの場合には、トリシストロン性ベクターまたは構築物の３つの核酸配列は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５である。いくつかの場合には、トリシストロン性ベクターまたは構築物の３つの核酸配列は、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－３９、ＦａｓＬ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、Ｍｆｇｅ８、及びＳｅｒｐｉｎｂ９から選択される３つの寛容原性因子である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるベクターまたは構築物はクアドロシストロン性であり、ベクターまたは構築物が４つの別個のポリペプチドを発現することを可能にする。いくつかの場合には、クアドロシストロン性ベクターまたは構築物の４つの別個のポリペプチドは、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５である。いくつかの場合には、クアドロシストロン性ベクターまたは構築物の４つの別個のポリペプチドは、ＣＤ４７、ＤＵＸ４、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－３９、ＦａｓＬ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、Ｍｆｇｅ８、及びＳｅｒｐｉｎｂ９から選択される４つの寛容原性因子である。

【0452】

いくつかの実施形態では、細胞は１つ以上のベクターまたは構築物を含み、各ベクターまたは構築物は、上に記載されるようなモノシストロン性またはマルチシストロン性構築物であり、モノシストロン性またはマルチシストロン性構築物は、１つ以上の寛容原性因子及び／または補体インヒビターを、任意の組合せまたは順序でコードする。

【0453】

いくつかの実施形態では、単一プロモーターは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に、自己切断ペプチド（例えば、２Ａ配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フーリン）をコードする配列によって互いに隔てられている、２つ、３つ、または４つの遺伝子（例えば、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）及び／またはＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５から選択される１つ以上の補体インヒビターをコードする）を含有するＲＮＡの発現を誘導する。したがって、ＯＲＦは、翻訳中（２Ａの場合）または翻訳後のいずれかで個別のタンパク質にプロセシングされる、単一ポリペプチドをコードする。いくつかの場合には、Ｔ２Ａなどのペプチドは、２ＡエレメントのＣ末端でペプチド結合の合成をリボソームにスキップさせ（リボソームスキッピング）、２Ａ配列の末端と次の下流ペプチドとの間に分離をもたらし得る（例えば、ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒ．２：１３（２００４）及びｄｅＦｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｆｆｉｃ ５：６１６－６２６（２００４）を参照のこと）。多くの２Ａエレメントが、当該技術分野において既知である。本明細書に開示される方法及び核酸に使用され得る２Ａ配列の例としては、米国特許公開第２００７０１１６６９０号に記載されるような、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ、例えば、配列番号：１６）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ、例えば、配列番号：１５）、ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ、例えば、配列番号：１１、１２、１７、または１８）、及びブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ、例えば、配列番号：１３または１４）からの２Ａ配列が挙げられるが、これらに限定されない。

【0454】

ベクターまたは構築物（例えば、導入遺伝子）が、タンパク質をコードする２つ以上の核酸配列、例えば、ＣＤ４６をコードする第１外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする第２外因性ポリヌクレオチド、またはＣＤ４７をコードする第１外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５６をコードする第２外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５９をコードする第３外因性ポリヌクレオチドを含有する場合には、ベクターまたは構築物（例えば、導入遺伝子）は、第１及び第２外因性ポリヌクレオチド配列間にペプチドをコードする核酸配列をさらに含んでよい。いくつかの場合には、第１及び第２外因性ポリヌクレオチド間に位置する核酸配列は、翻訳中または翻訳後に第１及び第２外因性ポリヌクレオチドの翻訳産物を分離するペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ペプチドは、自己切断ペプチドまたはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド（リボソームスキップエレメント）、例えば、Ｔ２Ａペプチドなどを含有する。いくつかの実施形態では、切断可能なペプチドまたはリボソームスキップエレメントの包含によって、単一の翻訳開始部位からの２つ以上のポリペプチドの発現が可能となる。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである自己切断ペプチドである。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号：１１によって記載されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号：１２によって記載されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号：１７によって記載されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ２Ａは、配列番号：１８によって記載されるアミノ酸配列であるか、またはそれを含む。

【0455】

本明細書に記載されるポリヌクレオチドを細胞に導入するプロセスは、任意の好適な技術によって達成され得る。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、フソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入によって細胞に導入される（例えば、レンチウイルス形質導入）か、またはさもなければウイルスベクター上で送達される（例えば、フソゲン媒介送達）。好適な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスポザーゼ媒介送達、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ウイルス形質導入によって細胞に導入される（例えば、レンチウイルス形質導入）か、またはさもなければウイルスベクター上で送達される（例えば、フソゲン媒介送達）。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドをパッケージングするベクターが、パッケージングしたポリヌクレオチドを細胞または細胞集団に送達するために使用されてよい。それらのベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、ウイルスベクター及び粒子を含む、任意の種類のものであってよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子が、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達するために使用され得る。ウイルスベクター技術は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、腫瘍溶解性ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入は、特異的（標的）または非特異的（例えば、非標的）であり得る。いくつかの実施形態では、細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入は、細胞内のゲノムへの組込みまたは挿入をもたらし得る。他の実施形態では、導入された外因性ポリヌクレオチドは、細胞内で非組込み型またはエピソーム型であってよい。当業者は、本明細書に記載される例示的な方法のいずれかを含む、核酸導入遺伝子を細胞に導入する方法に精通し、好適な方法を選択し得る。

【0456】

１）非標的送達
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、様々な非標的方法のいずれかによって細胞（例えば、供給源細胞）に導入される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、宿主細胞のランダムなゲノム座位に挿入される。当業者には既知であるように、例えば、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを含むウイルスベクターは、宿主細胞に遺伝物質を送達し、外来遺伝子または外因性遺伝子を宿主細胞ゲノムにランダムに挿入して遺伝子の安定した発現及び複製を促進するために、一般的に使用される。いくつかの実施形態では、細胞への外因性ポリヌクレオチドの非標的導入は、細胞内での外因性ポリヌクレオチドの安定発現を目的とした条件下にある。いくつかの実施形態では、細胞内での安定発現のために核酸を導入する方法は、組み込まれた細胞が分裂する場合に増殖する可能性があるように、細胞のゲノムに対して核酸の安定した組込みをもたらす任意の方法を含む。

【0457】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、それらが、送達される核酸転写物内に含有される遺伝子の安定した発現を可能にするため、ウイルス形質導入を成功させるための特に有用な手段である。レンチウイルスベクターは、逆転写酵素及びインテグラーゼ、すなわち、送達される核酸転写物内に含有される遺伝子の安定した発現に必要な２つの酵素を発現する。逆転写酵素がＲＮＡ転写物をＤＮＡに変換する一方で、インテグラーゼは、標的細胞のゲノムにＤＮＡを挿入して組み込む。ＤＮＡがゲノムに安定して組み込まれると、これは宿主と共に分裂する。組込みＤＮＡ内に含有される目的の遺伝子は、構成的に発現される場合があるか、またはそれは誘導性の場合がある。宿主細胞ゲノムの一部として、目的の遺伝子は、標的細胞における多くの因子に応じて、活性化または抑制を含む細胞制御を受ける場合がある。

【0458】

レンチウイルスは、ウイルスのレトロウイルス科の下位群であり、宿主ゲノム中に組み込む前にウイルスＲＮＡゲノムのＤＮＡへの逆転写が必要となることから命名される。そのため、レンチウイルスビヒクル／粒子の最も重要な特徴は、それらの遺伝物質を標的／宿主細胞のゲノム中に組み込むことである。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、ビスナ－マエディウイルスならびにヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。

【0459】

典型的には、遺伝子送達ビヒクルを構成するレンチウイルス粒子は、それ自体では複製欠損性である（「自己不活性化」とも称される）。レンチウイルスは、無傷の宿主核膜を介する侵入機構によって分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染できる（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｉｅｃｋｎｏｌ，１９９８，９：４５７－４６３）。組換えレンチウイルスビヒクル／粒子は、ＨＩＶ病原性遺伝子を何倍にも弱毒化することによって生成されていて、例えば、遺伝子Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ及びＴａｔが除去され、ベクターを生物学的に安全にしている。それに対応して、例えば、ＨＩＶ－１／ＨＩＶ－２に由来するレンチウイルスビヒクルは、非分裂細胞中への導入遺伝子の効率的な送達、組込み及び長期発現を媒介し得る。

【0460】

レンチウイルス粒子は、ウイルスパッケージング要素及びベクターゲノムそれ自体を、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの産生細胞中で共発現させることによって生成されてよい。それらの要素は通常、３つの（第２世代レンチウイルス系では）または４つの別個のプラスミド（第３世代レンチウイルス系では）で提供される。産生細胞は、ウイルスのコア（すなわち、構造タンパク質）及び酵素構成要素、ならびにエンベロープタンパク質（複数可）（パッケージングシステムと称される）を含むレンチウイルス構成要素をコードするプラスミド、ならびに標的細胞に移入される外来導入遺伝子を含むゲノムをコードするプラスミド、ビヒクルそれ自体（導入ベクターとも称される）で共トランスフェクトされる。一般に、プラスミドまたはベクターは、産生細胞株に含まれる。プラスミド／ベクターは、トランスフェクション、形質導入または感染を介して産生細胞株中に導入される。トランスフェクション、形質導入または感染の方法は、当業者には周知である。非限定的な例として、パッケージング及び導入構築物は、リン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションによって、一般にネオミオシン（ｎｅｏｍｙｏｃｉｎ）（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタミンシンテターゼまたはアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）などの主要な選択可能マーカーと共に産生細胞株中に導入され、続いて適切な薬物の存在下における選択及びクローンの単離が行われ得る。

【0461】

産生細胞は、外来遺伝子、例えば、外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含有する組換えウイルス粒子を産生する。組換えウイルス粒子は培養培地から回収され、当業者によって使用される標準的な方法によって滴定される。組換えレンチウイルスビヒクルは、標的細胞、例えば、節ＩＩ．Ｃに記載されるいずれかを含む供給源細胞などに感染するために使用され得る。

【0462】

高力価レンチウイルス粒子を産生するために使用され得る細胞としては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、２９３Ｇ細胞、ＳＴＡＲ細胞（Ｒｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００５，１１：４５２－４５９）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及び他のＨＥＫ２９３Ｔベースの産生細胞株（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．＿２０１１，２，２．（３）：３５７～３６９、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１２，１０９９６）：１５５１－１５６０、Ｔｈｒｏｍ ｅｔ ａｌ．．Ｂｌｏｏｄ．２００９，１１３（２１）：５１０４－５１１０）が挙げられてよいが、これらに限定されない。

【0463】

レンチウイルス粒子で提供される追加のエレメントは、５’末端または３’末端のいずれかにあるレトロウイルスＬＴＲ（長端末反復）、レトロウイルス輸送エレメント、任意にレンチウイルス逆応答エレメント（ＲＲＥ）、プロモーターまたはその活性部分、及び座位制御領域（ＬＣＲ）またはその活性部分を含んでよい。他のエレメントとしては、非分裂細胞内で形質導入効率を改善するための中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）配列、導入遺伝子の発現を増強し、力価を増加させるウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が挙げられる。

【0464】

組換えレンチウイルス粒子を生成する方法は、当業者には既知であり、例えば、米国特許第８，８４６，３８５号、同第７，７４５，１７９号、同第７，６２９，１５３号、同第７，５７５，９２４号、同第７，１７９，９０３号、及び同第６，８０８，９０５号を参照のこと。使用されるレンチウイルスベクターは、ｐＬＶＸ、ｐＬｅｎｔｉ、ｐＬｅｎｔｉ６、ｐＬＪＭｌ、ＦＵＧＷ、ｐＷＰＸＬ、ｐＷＰＩ、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ、ｐＬＪＭｌ－ＥＧＦＰ、ｐＵＬＴＲＡ、ｐＩｎｄｕｃｅｒ２Ｑ、ｐＨＩＶ－ＥＧＦＰ、ｐＣＷ５７．１、ｐＴＲＰＥ、ｐＥＬＰＳ、ｐＲＲＬ、及びｐＬｉｏｎＩＩから選択されてよいが、これらに限定されない。任意の既知のレンチウイルスビヒクルも使用されてよい（米国特許第９，２６０，７２５号、同第９，０６８，１９９号、同第９，０２３，６４６号、同第８，９００，８５８号、同第８，７４８，１６９号、同第８，７０９，７９９号、同第８，４２０，１０４号、同第８，３２９，４６２号、同第８，０７６，１０６号、同第６，０１３，５１６号、及び同第５，９９４，１３６号、国際特許公開第ＷＯ２０１２０７９０００号を参照のこと）。

【0465】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞の一過性発現を目的とした条件下で、例えば、外因性ポリヌクレオチドのエピソーム送達をもたらす方法などによって細胞に導入される。

【0466】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターにパッケージングされてよい。そのようなベクターまたはウイルス粒子は、既知の血清型カプシドまたは血清型カプシドの組合せのいずれかを利用するように設計されてよい。血清型カプシドは、同定した任意のＡＡＶ血清型及びそのバリアント、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２及びＡＡＶｒｈ１０からのカプシドを含んでよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ血清型は、米国公開第ＵＳ２００３０１３８７７２号、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，１９（６）：１０７０－１０７８、米国特許第６，１５６，３０３号、同第７，１９８，９５１号、米国特許公開第ＵＳ２０１５／０１５９１７３号及び同第ＵＳ２０１４／０３５９７９９号、ならびに国際特許公開第ＷＯ１９９８／０１１２４４号、同第ＷＯ２００５／０３３３２１号及び同第ＷＯ２０１４／１４４２２号に記載されるような配列であってよいか、またはそれを有してよい。

【0467】

ＡＡＶベクターは、一本鎖ベクターだけでなく、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）も含む。ｓｃＡＡＶベクターは、互いにアニーリングして二本鎖ベクターゲノムを形成するＤＮＡを含有する。第２鎖合成をスキップすることによって、ｓｃＡＡＶは細胞において迅速な発現を可能にする。ｒＡＡＶベクターは、ｓｆ９昆虫細胞内で、またはＨＥＫ２９３細胞などのヒト細胞の浮遊細胞培養物中において、トリプルトランスフェクションなどによる当該技術分野における標準的な方法によって製造されてよい。

【0468】

いくつかの実施形態では、非ウイルスベースの方法が使用されてよい。例えば、いくつかの態様では、ポリヌクレオチドを含むベクターは、針、エレクトロポレーション、ソノポレーション、ハイドロポレーションなどの物理的方法、無機粒子（例えば、リン酸カルシウム、シリカ、金）などの化学的担体及び／または化学的方法による非ウイルス法によって細胞に移入されてよい。いくつかの態様では、合成または天然の生分解性剤は、カチオン性脂質、脂質ナノエマルジョン、ナノ粒子、ペプチドベースのベクター、またはポリマーベースのベクターなどの送達に使用されてよい。

【0469】

２）標的送達
外因性ポリヌクレオチドは、細胞の任意の好適な標的ゲノム座位に挿入され得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、標的座位への標的組込みによって細胞に導入される。いくつかの実施形態では、標的組込みは、相同性依存性または相同性非依存性組換えを伴うプロセスにおいて１つ以上のヌクレアーゼ及び／またはニッカーゼならびにドナー鋳型を使用した遺伝子編集によって達成され得る。

【0470】

多数の遺伝子編集方法、例えば、相同組換え修復（ＨＯＲ）、ホモロジー媒介末端結合（ＨＭＥＪ）、相同性非依存性標的組込み（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）（ＨＩＴＩ）、偏性ライゲーションゲーティング組換え（ｏｂｌｉｇａｔｅ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｇａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＯｂｌｉＧａＲｅ）、または標的染色体への正確な組込み（ＰＩＴＣｈ）を含む方法が、好適な特定のゲノム座位に外因性ポリヌクレオチドを挿入するために使用され得る。

【0471】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の位置（例えば、標的部位）に特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製し、細胞の内因性機構を利用して誘導した切断を修復する。ニッカーゼは、ゲノム内の所望の位置に特異的な一本鎖切断を作製する。非限定的な一例では、２つのニッカーゼが、標的ＤＮＡの逆鎖上に２つの一本鎖切断を作製し、それによって平滑末端または付着末端を生成するために使用され得る。任意の好適なヌクレアーゼが、標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導するために細胞に導入され得、これらとしてはＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、他のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、それらのバリアント、それらの断片、及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼまたはニッカーゼに、内因性ゲノム標的座位、例えば、セーフハーバー座位の、またはその近傍の配列に相同な相同配列（例えば、相同性アーム）に隣接する外因性ポリヌクレオチド配列（導入遺伝子とも呼ばれる）を含有するドナー鋳型が導入される場合、ＤＮＡ損傷修復経路は、細胞内の標的部位に導入遺伝子配列の組込みをもたらし得る。これは、相同性依存性プロセスによって行われ得る。いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、環状二本鎖プラスミドＤＮＡ、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、直鎖二本鎖ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）断片、またはインタクトな姉妹染色分体の相同配列である。ドナー鋳型の形態に応じて、ホモロジー媒介遺伝子挿入及び置換は、特定のＤＮＡ修復経路、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）、合成依存性鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、及びホモロジー媒介末端結合（ＨＭＥＪ）経路などを介して実施され得る。

【0472】

例えば、ＤＮＡ修復機構は、（ｉ）２つのＳＳＢ（各鎖上にＳＳＢが存在し、それによって一本鎖オーバーハングを誘導する）、または（ｉｉ）両鎖上の同じ切断部位に生じ、それによって平滑末端切断を誘導するＤＳＢ後にヌクレアーゼによって誘導され得る。それらの薬剤のうち１つによる切断時に、ＳＳＢまたはＤＳＢを有する標的座位は、ＤＮＡ損傷修復のための２つの主要な経路、すなわち、（１）誤りがちな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、または（２）高忠実度の相同組換え修復（ＨＤＲ）経路のうち１つを受ける。いくつかの実施形態では、ＳＳＢまたはＤＳＢが存在する細胞に導入されるドナー鋳型（例えば、環状プラスミドＤＮＡまたは線状ＤＮＡ断片、例えば、ｓｓＯＤＮなど）は、ＨＤＲ及び標的座位へのドナー鋳型の組込みをもたらし得る。概して、ドナー鋳型の非存在下では、ＮＨＥＪプロセスは切断ＤＮＡ鎖の末端を再びライゲートし、これは高い頻度で切断部位にヌクレオチドの欠失及び挿入をもたらす。

【0473】

いくつかの実施形態では、細胞への外因性ポリヌクレオチドの部位特異的挿入は、ＨＤＲベースの手法によって達成されてよい。ＨＤＲは、細胞がＤＮＡ中の二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復する機構であり、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びトランスポザーゼを含む、様々な遺伝子編集システムを使用して多くの生物内のゲノムを改変するために利用され得る。

【0474】

いくつかの実施形態では、標的組込みは、標的遺伝子の少なくとも１つの標的部位（複数可）配列を標的とするように特異的に設計された、ＤＮＡ結合標的ヌクレアーゼ及び遺伝子編集ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）など、ならびにＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）システムなどを含む、１つ以上の配列特異的または標的ヌクレアーゼを導入することによって保持される。例示的なＺＦＮ、ＴＡＬＥ、及びＴＡＬＥＮは、例えばＬｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（２２１）：１－７（２０１３）に記載されている。特定の実施形態では、標的部位での、またはその近傍での標的遺伝子破壊が、規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を使用して実施される。Ｓａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ，（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４）：３４７－３５５を参照のこと。

【0475】

節ＩＩ．Ａ．１に記載される遺伝子破壊を目的としたシステムのいずれも使用され得、また外因性ポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子配列を有する適切なドナー鋳型が導入される場合、遺伝子破壊の標的部位での、またはその近傍での外因性ポリヌクレオチドの標的組込みをもたらし得る。特定の実施形態では、遺伝子破壊は、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質を含有するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用して媒介される。例示的なＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡは、上記節ＩＩ．Ａに記載されていて、そのいずれも、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓシステムが特異的である標的座位への外因性ポリヌクレオチドのＨＤＲ媒介組込みに使用され得る。ＨＤＲによる外因性ポリヌクレオチドの切断及び組込みのための特定の標的座位及び標的部位に応じるなどの、適切なＣａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを選択することは当業者のレベルの範囲内である。さらに、標的座位に応じて、当業者は、以下でさらに記載されるものなどの、適切なドナー鋳型を容易に調製し得る。

【0476】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ編集システムは、ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的座位への導入遺伝子の挿入を誘導するために標的座位（例えば、セーフハーバー座位）内に二本鎖切断を作製できる。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、プラスミドベースのＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＲＮＡベースのＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、タンパク質／ＲＮＡ複合体、またはプラスミド／ＲＮＡ複合体、またはタンパク質／プラスミド複合体を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞を生成する方法が提供され、これは導入遺伝子または外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型ならびにＤＮＡヌクレアーゼシステム（例えば、Ｃａｓ９）及び座位特異的ｇＲＮＡを含むＤＮＡヌクレアーゼシステムを供給源細胞（例えば、初代細胞または多能性幹細胞、例えば、ｉＰＳＣ）に導入することを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ｍＲＮＡとして導入される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡとのリボ核タンパク質複合体として導入される。

【0477】

概して、挿入されるドナー鋳型は、目的の外因性ポリヌクレオチド（例えば、寛容原性因子またはＣＡＲ）を含有する少なくとも導入遺伝子カセットを含むことになり、任意にプロモーターも含むことになる。これらの実施態様のいくつかでは、挿入される外因性ポリヌクレオチド及び／またはプロモーターを含有する導入遺伝子カセットは、標的切断部位のすぐ上流及び下流の配列と相同な配列を有する相同性アーム、すなわち、左相同性アーム（ＬＨＡ）及び右相同性アーム（ＲＨＡ）によってドナー鋳型に隣接することになる。典型的には、ドナー鋳型の相同性アームは、標的ゲノム座位がＨＤＲのための鋳型として機能するように特に設計されている。各相同性アームの長さは一般に、導入される挿入物のサイズに依存し、挿入物が大きくなるとより長い相同性アームが必要となる。

【0478】

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型（例えば、組換えドナー修復鋳型）は、（ｉ）外因性ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、例えば、異種プロモーターに機能的に連結されている導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセット、及び（ｉｉ）導入遺伝子カセットに隣接し、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２などのＣａｓヌクレアーゼ）切断部位の両側にある標的座位（例えば、セーフハーバー座位）の部分と相同な２つの相同性アームを含む。ドナー鋳型は、選択可能マーカー、検出可能マーカー、及び／または精製マーカーをさらに含み得る。

【0479】

いくつかの実施形態では、相同性アームは同じ長さである。他の実施形態では、相同性アームは異なる長さである。相同性アームは、少なくとも約１０塩基対（ｂｐ）、例えば、少なくとも約１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４５ｂｐ、５５ｂｐ、６５ｂｐ、７５ｂｐ、８５ｂｐ、９５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、９５０ｂｐ、１０００ｂｐ、１．１キロベース（ｋｂ）、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２．０ｋｂ、２、１ｋｂ、２，２ｋｂ、２，３ｋｂ、２，４ｋｂ、２，５ｋｂ、２，６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３．０ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４．０ｋｂ、またはそれを超える長さであり得る。相同性アームは、約１０ｂｐ～約４ｋｂ、例えば、約１０ｂｐ～約２０ｂｐ、約１０ｂｐ～約５０ｂｐ、約１０ｂｐ～約１００ｂｐ、約１０ｂｐ～約２００ｂｐ、約１０ｂｐ～約５００ｂｐ、約１０ｂｐ～約１ｋｂ、約１０ｂｐ～約２ｋｂ、約１０ｂｐ～約４ｋｂ、約１００ｂｐ～約２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１ｋｂ、約１００ｂｐ～約２ｋｂ、約１００ｂｐ～約４ｋｂ、約５００ｂｐ～約１ｋｂ、約５００ｂｐ～約２ｋｂ、約５００ｂｐ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂ、または約２ｋｂ～約４ｋｂであり得る。

【0480】

いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、発現ベクターにクローニングされ得る。当業者に既知の従来のウイルス及び非ウイルスベースの発現ベクターが使用され得る。

【0481】

いくつかの実施形態では、組込みのために標的とされる標的座位は、座位が外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子の組込みを標的とすることが許容されるか、または望ましいことになる任意の座位であってよい。標的座位の非限定的な例としては、ＣＸＣＲ４遺伝子、アルブミン遺伝子、ＳＨＳ２３１座位、Ｆ３遺伝子（ＣＤ１４２としても知られる）、ＭＩＣＡ遺伝子、ＭＩＣＢ遺伝子、ＬＲＰ１遺伝子（ＣＤ９１としても知られる）、ＨＭＧＢ１遺伝子、ＡＢＯ遺伝子、ＲＨＤ遺伝子、ＦＵＴ１遺伝子、ＫＤＭ５Ｄ遺伝子（ＨＹとしても知られる）、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子、ＴＲＢＣ遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、Ｆ３（すなわち、ＣＤ１４２）遺伝子、ＭＩＣＡ遺伝子、ＭＩＣＢ遺伝子、ＬＲＰ１遺伝子、ＨＭＧＢ１遺伝子、ＡＢＯ遺伝子、ＲＨＤ遺伝子、ＦＵＴ１遺伝子、ＫＤＭ５Ｄ（すなわち、ＨＹ）遺伝子、ＰＤＧＦＲａ遺伝子、ＯＬＩＧ２遺伝子、及び／またはＧＦＡＰ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、例えば、イントロン、エクソン、及び／または遺伝子コード領域（コード配列、もしくは「ＣＤＳ」としても知られる）を含む、標的座位（例えば、セーフハーバー座位）の好適な領域に挿入され得る。いくつかの実施形態では、挿入は、標的ゲノム座位の片アレル内で行われる。いくつかの実施形態では、挿入は、標的ゲノム座位の両アレル内で行われる。これらの実施形態のいずれかでは、標的ゲノム座位に挿入される導入遺伝子の向きは、その座位の遺伝子の方向と同じか、またはその逆のいずれかであり得る。

【0482】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、セーフハーバー遺伝子座のイントロン、エクソン、またはコード配列領域に挿入される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、内因性遺伝子に挿入され、挿入は、内因性遺伝子のサイレンシングまたは発現減少を引き起こす。外因性ポリヌクレオチドの挿入を目的とした例示的なゲノム座位が、表２Ｂに示される。

【0483】

【表2B】

【0484】

いくつかの実施形態では、標的座位は、セーフハーバー座位である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、近傍の、または隣接する内因性遺伝子、調節エレメントなどへの影響を最小限に抑えながら、組込みＤＮＡの安定発現を可能にするゲノム位置である。いくつかの場合には、セーフハーバー遺伝子は、持続可能な遺伝子発現を可能にし、初代細胞及び多能性幹細胞、例えば、その誘導体、及びその分化細胞を含む細胞を含む、様々な細胞型における遺伝子改変を目的とした操作ヌクレアーゼによって標的とされ得る。セーフハーバー座位の非限定的な例としては、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及び／またはＲｏｓａ遺伝子座（例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１座位、ＣＣＲ５座位、及びＣＬＹＢＬ座位からなる群から選択される。いくつかの場合には、ＳＨＳ２３１は、多くの細胞型におけるセーフハーバー座位として標的とされ得る。いくつかの場合には、ある特定の座位は、ある特定の細胞型におけるセーフハーバー座位として機能し得る。例えば、ＰＤＧＦＲａはグリア前駆細胞（ＧＰＣ）のセーフハーバーであり、ＯＬＩＧ２はオリゴデンドロサイトのセーフハーバー座位であり、ＧＦＡＰはアストロサイトのセーフハーバー座位である。特定の操作細胞型に応じて適切なセーフハーバー座位を選択することは、当業者のレベルの範囲内である。いくつかの場合には、２つ以上のセーフハーバー遺伝子が標的とされ、それによって遺伝子改変細胞に２つ以上の導入遺伝子を導入し得る。

【0485】

いくつかの実施形態では、操作細胞を生成する方法が提供され、これは導入遺伝子または外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型、ならびにＤＮＡヌクレアーゼシステム（例えば、Ｃａｓ９）ならびにＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及び／またはＲｏｓａ遺伝子座（例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座）に特異的な相補的部分（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）を含む、座位特異的ｇＲＮＡを含むＤＮＡヌクレアーゼシステムを供給源細胞（例えば、初代細胞または多能性幹細胞、例えば、ｉＰＳＣ）に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的とされるゲノム座位は、記載されるような座位のいずれかの４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内に位置している。

【0486】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入のために本明細書で使用されるｇＲＮＡは、ＡＡＶＳ１中の標的配列を認識する相補的部分（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）を含む。これらの実施態様のいくつかでは、標的配列は、ＡＡＶＳ１のイントロン１に位置している。ＡＡＶＳ１は、染色体１９：５５，０９０，９１８－５５，１１７，６３７リバース鎖に位置し、ＡＡＶＳ１イントロン１（転写物ＥＮＳＧ０００００１２５５０３に基づく）は、染色体１９：５５，１１７，２２２－５５，１１２，７９６リバース鎖に位置する。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体１９：５５，１１７，２２２－５５，１１２，７９６の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体１９：５５，１１５，６７４の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体１９：５５，１１５，６７４において、または染色体１９：５５，１１５，６７４の５、１０、１５、２０、３０、４０もしくは５０ヌクレオチド内の位置において切断部位を生成するように構成されている。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：８６６－８６９（２０１９）に記載される、「ｓｇＡＡＶＳ１－１」としても知られるＧＥＴ００００４６である。このｇＲＮＡは、配列番号：３６（表４に示される）に記載される核酸配列を有する相補的部分（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）を含み、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃとしても知られる）のイントロン１を標的とする。

【0487】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入のために本明細書で使用されるｇＲＮＡは、ＣＬＹＢＬ中の標的配列を認識する相補的部分（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）を含む。これらの実施形態のいくつかでは、標的配列は、ＣＬＹＢＬのイントロン２に位置している。ＣＬＹＢＬは、染色体１３：９９，６０６，６６９－９９，８９７，１３４フォワード鎖に位置し、ＣＬＹＢＬイントロン２（転写物ＥＮＳＴ０００００３７６３５５．７に基づく）は、染色体１３：９９，７７３，０１１－９９，８５８，８６０フォワード鎖に位置する。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体１３：９９，７７３，０１１－９９，８５８，８６０の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体１３：９９，８２２，９８０の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体１３：９９，８２２，９８０において、または染色体１３：９９，８２２，９８０の５、１０、１５、２０、３０、４０もしくは５０ヌクレオチド内の位置において切断部位を生成するように構成されている。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡはＧＥＴ００００４７であり、これは配列番号：３６（表４に示される）に記載される核酸配列を有する相補的部分（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）を含み、ＣＬＹＢＬのイントロン２を標的とする。標的部位は、Ｃｅｒｂｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１０（１）：ｅ０１１６０３２（２０１５）に記載されるように、ＴＡＬＥＮの標的部位に類似している。

【0488】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子のＨＤＲ媒介挿入のために本明細書で使用されるｇＲＮＡは、ＣＣＲ５中の標的配列を認識する相補的部分（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）を含む。これらの実施形態のいくつかでは、標的配列は、ＣＣＲ５のエクソン３に位置している。ＣＣＲ５は、染色体３：４６，３７０，８５４－４６，３７６，２０６フォワード鎖に位置し、ＣＣＲ５エクソン３（転写物ＥＮＳＴ０００００２９２３０３．４に基づく）は、染色体３：４６，３７２，８９２－４６，３７６，２０６フォワード鎖に位置する。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体３：４６，３７２，８９２－４６，３７６，２０６の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体３：４６，３７３，１８０の４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内のゲノム座位を標的とする。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、染色体３：４６，３７３，１８０において、または染色体３：４６，３７３，１８０の５、１０、１５、２０、３０、４０、もしくは５０ヌクレオチド内の位置において切断部位を生成するように構成されている。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５：６４３－６５２（２０１４）に記載される、「ｃｒＣＣＲ５＿Ｄ」としても知られるＧＥＴ００００４８である。このｇＲＮＡは、配列番号：３７（表４に示される）に記載される核酸配列を有する相補的部分を含み、ＣＣＲ５のエクソン３（あるいは、Ｅｎｓｅｍｂｌゲノムデータベースでエクソン２としてアノテーションされる）を標的とする。Ｇｏｍｅｚ－Ｏｓｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．１０（１）：４０４５（２０１９）を参照のこと。

【0489】

表４は、例示的なｇＲＮＡ標的指向性配列を示す。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ標的指向性配列は、表４に記載される相補的部分配列に１つ以上のチミンを含有する場合があり、それらはウラシルで置換されている。ウラシル及びチミンの両方とも、ウラシルに対する「ｕ」及びチミンに対する「ｔ」の代わりに、「ｔ」で表され得ると当業者には理解されることになり、リボ核酸との関連においては、別段の指示がない限り、「ｔ」はウラシルを表すために使用されると理解されることになる。

【0490】

【表4】

【0491】

いくつかの実施形態では、標的座位は、細胞内でノックアウトされることが望まれる座位である。そのような実施形態では、そのような標的座位は、細胞の表現型または機能を調節するためなどの、細胞内でその破壊または排除が望まれる任意の標的座位である。例えば、標的遺伝子の発現を減少させるための、節ＩＩ．Ａに記載される遺伝子改変のいずれも、外因性ポリヌクレオチドの標的組込みを目的とした所望の標的座位であってよく、その場合に標的遺伝子の遺伝子破壊またはノックアウト及び外因性ポリヌクレオチドの標的挿入による過剰発現は、細胞内の同じ標的部位または座位で達成されてよい。例えば、ＨＤＲプロセスは、表１に記載される任意の標的遺伝子の発現を排除するか、または減少させる（例えば、ノックアウトする）ための遺伝子破壊をもたらす一方で、遺伝子破壊の標的部位の、またはその近傍の核酸配列と相同な隣接する相同性アームを有するドナー鋳型を使用することによって、標的遺伝子に外因性ポリヌクレオチドをさらに組み込む（例えば、ノックインする）ために使用されてよい。

【0492】

いくつかの実施形態では、操作細胞を生成する方法が提供され、これは導入遺伝子または外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型、ならびにＤＮＡヌクレアーゼシステム（例えば、Ｃａｓ９）及びＢ２Ｍ座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位に特異的な相補的部分を含む、座位特異的ｇＲＮＡを含むＤＮＡヌクレアーゼシステムを供給源細胞（例えば、初代細胞または多能性幹細胞、例えば、ｉＰＳＣ）に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的とされるゲノム座位は、記載されるような座位のいずれかの４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内、または５００ｂｐ以内に位置している。

【0493】

特定の実施形態では、標的座位はＢ２Ｍである。いくつかの実施形態では、操作細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＢ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む標的ヌクレアーゼシステムを使用することによって行われる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１の付録２または表１５の配列番号：８１２４０～８５６４４からなる群から選択され、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的とされる標的部位に隣接する配列と相同な隣接する相同性アームを有する外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型を導入することによって、ＨＤＲにより破壊したＢ２Ｍ座位中に組み込まれる。

【0494】

特定の実施形態では、標的座位はＣＩＩＴＡである。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む標的ヌクレアーゼシステムによる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６１８３０４１の付録１または表１２の配列番号：５１８４～３６３５２からなる群から選択され、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的とされる標的部位に隣接する配列と相同な隣接する相同性アームを有する外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型を導入することによって、ＨＤＲにより破壊したＣＩＩＴＡ座位中に組み込まれる。

【0495】

いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞であり、内因性ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ座位の発現は、遺伝子編集方法によって細胞内で減少するか、または排除される。例えば、ＨＤＲプロセスは、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子の発現を排除するか、または減少させる（例えば、ノックアウトする）ための遺伝子破壊をもたらす一方で、遺伝子破壊の標的部位の、またはその近傍の核酸配列と相同な隣接する相同性アームを有するドナー鋳型を使用することによって、同じ座位に外因性ポリヌクレオチドをさらに組み込む（例えば、ノックインする）ために使用されてよい。本明細書に記載される遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化に有用な、例示的なｇＲＮＡ配列が、表２Ｃに提供される。本配列は、ＵＳ２０１６０３４８０７３に見出され得、配列表を含む本開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0496】

【表2C】

【0497】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む標的ヌクレアーゼシステムによる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）は、ＵＳ２０１６０３４８０７３の配列番号：５３２～６０９及び９１０２～９７９７からなる群から選択され、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的とされる標的部位に隣接する配列と相同な隣接する相同性アームを有する外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型を導入することによって、ＨＤＲにより破壊したＴＲＡＣ座位中に組み込まれる。

【0498】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びＴＲＢＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列を含む標的ヌクレアーゼシステムによる。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子を特異的に標的とするための少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えば、ｇＲＮＡ標的指向性配列）は、ＵＳ２０１６０３４８０７３の配列番号：６１０～７６５及び９７９８～１０５３２からなる群から選択され、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ｇＲＮＡによって標的とされる標的部位に隣接する配列と相同な隣接する相同性アームを有する外因性ポリヌクレオチド配列を含有するドナー鋳型を導入することによって、ＨＤＲにより破壊したＴＲＢＣ座位中に組み込まれる。

【0499】

いくつかの実施形態では、記載されるようなＨＤＲ媒介組込み手法に使用するための新規座位及び／またはｇＲＮＡ配列の同定は、当業者のレベルの範囲内である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムについて、特定の座位（例えば、表１に記載される、例えば、標的遺伝子内の）に対する既存のｇＲＮＡが既知である場合、「インチワーム」手法を使用して、ＰＡＭ配列の座位の両側にあるフランキング領域をスキャンすることによって、導入遺伝子の標的挿入のために追加の座位を同定でき、これは通常、ゲノムにわたって約１００塩基対（ｂｐ）ごとに行われる。ＰＡＭ配列は、使用される特定のＣａｓヌクレアーゼに依存することになり、その理由として、異なるヌクレアーゼは通常、異なる対応するＰＡＭ配列を有するからである。座位の両側におけるフランキング領域は、約５００～４０００ｂｐ長、例えば、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約３０００ｂｐ、約３５００ｂｐ、または約４０００ｂｐ長であり得る。検索範囲内でＰＡＭ配列が同定される場合、遺伝子破壊方法に使用するためのその座位の配列に従って新たなガイドが設計され得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例示として記載されているが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ及びトランスポザーゼを使用するものを含む、記載されるような任意のＨＤＲ媒介手法が、新規座位を同定する本方法に使用され得る。

【0500】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、外因性ＣＤ４７ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ４７ポリペプチド）をコードし、外因性ポリペプチドは、本明細書に開示されるようなセーフハーバー遺伝子座もしくはセーフハーバー部位または内因性遺伝子のサイレンシングもしくは発現減少を引き起こすゲノム座位に挿入される。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及び／またはＲｏｓａ遺伝子座（例えば、ＲＯＳＡ２６遺伝子座）に挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１またはＣＴＬＡ４遺伝子座に挿入される。

【0501】

Ｃ．細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、そのような幹細胞に由来するか、もしくはそれから産生される分化細胞、造血幹細胞、または初代細胞）、あるいはその集団を提供し、それらは操作（または改変）されていて、本明細書に記載されるような１つ以上の遺伝子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子もしくは１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を制御する１つ以上の遺伝子）の発現が減少もしくは欠失するように細胞のゲノムが改変されているか、または遺伝子もしくはポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ４７などの寛容原性因子をコードするポリヌクレオチド）が過剰発現するか、もしくは発現増加する。いくつかの実施形態では、本出願は、ＣＤ１４２の発現減少または欠失をさらに含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本出願は、１つ以上の補体インヒビターの過剰発現または発現増加を伴う細胞を提供する。

【0502】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドを含む操作細胞は、ベータ島細胞であり、ＣＤ４７ポリペプチドをコードする第１外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、操作ベータ島細胞は、１つ以上の補体インヒビターまたは本明細書に記載される他の寛容原性ポリペプチドをコードする１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベータ島細胞は、節ＩＩ．Ａに記載されるようなＣＤ１４２の発現減少、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現減少及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現減少を含む。いくつかの実施形態では、第１外因性ポリヌクレオチド及び１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドは、同じゲノム座位に挿入される。いくつかの実施形態では、第１外因性ポリヌクレオチド及び１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドは、異なるゲノム座位に挿入される。例示的な実施形態では、操作（例えば、低免疫原性）細胞は、初代ベータ島細胞または操作（例えば、低免疫原性）多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣ）に由来するベータ島細胞である。

【0503】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドを含む操作細胞は肝細胞であり、ＣＤ４７ポリペプチドをコードする第１外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、操作肝細胞は、１つ以上の補体インヒビターまたは本明細書に記載される他の寛容原性ポリペプチドをコードする１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベータ島細胞は、節ＩＩ．Ａに記載されるようなＣＤ１４２の発現減少、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現減少及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現減少を含む。いくつかの実施形態では、第１外因性ポリヌクレオチド及び１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドは、同じゲノム座位に挿入される。いくつかの実施形態では、第１外因性ポリヌクレオチド及び１つ以上の追加の外因性ポリヌクレオチドは、異なるゲノム座位に挿入される。例示的な実施形態では、操作（例えば、低免疫原性）細胞は、初代肝細胞または操作（例えば、低免疫原性）多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣ）に由来する肝細胞である。

【0504】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変されている細胞は、多能性幹細胞であるか、または多能性幹細胞から分化した細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変されている細胞は、初代細胞である。

【0505】

細胞は、脊椎動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞などであってよい。いくつかの実施形態では、細胞は、ブタ（ｐｉｇ）（ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ））細胞、ウシ（ｃｏｗ）（ウシ（ｂｏｖｉｎｅ））細胞、またはヒツジ（ｓｈｅｅｐ）（ヒツジ（ｏｖｉｎｅ））細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はブタ細胞である。細胞はまた、脊椎動物幹細胞、例えば、哺乳動物幹細胞、例えば、ヒト幹細胞またはマウス幹細胞などであってもよい。いくつかの実施形態では、細胞または幹細胞は、改変に適している。いくつかの場合に、細胞もしくは幹細胞、またはそのような幹細胞に由来する細胞は、治療的価値を有するか、または治療的価値を有すると考えられ、結果として、細胞もしくは幹細胞またはそのような幹細胞に由来するか、もしくはそれから分化した細胞は、疾患、障害、欠損症または損傷の治療を必要とする対象の疾患、障害、欠損症または損傷を治療するために使用されてよい。

【0506】

いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞または前駆細胞（例えば、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞もしくは前駆細胞、生殖幹細胞、肺幹細胞もしくは前駆細胞、乳腺幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、万能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、または神経幹細胞もしくは前駆細胞）である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、成体幹細胞（例えば、体性幹細胞または組織特異的幹細胞）である。いくつかの実施形態では、幹細胞または前駆細胞は、分化され得る（例えば、幹細胞は、全能性、多能性、または万能性である）。いくつかの実施形態では、細胞は、胚組織または新生児組織から単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、線維芽細胞、単球前駆体、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆体、内分泌前駆体、肝芽細胞、筋芽細胞、脂肪前駆細胞、前駆細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤血球白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靭帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞、またはナチュラルキラー細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞、赤血球巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、ベータ島細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆体、外分泌前駆体、導管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、または褐色脂肪細胞に操作（例えば、変換または分化）される。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞（例えば、骨格筋、平滑筋、もしくは心筋細胞）、赤血球巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞（例えば、赤血球、白血球、もしくは血小板）、内分泌前駆体、外分泌前駆体、導管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、または白色もしくは褐色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ホルモン分泌細胞（例えば、インスリン、オキシトシン、エンドルフィン、バソプレシン、セロトニン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、グルカゴン、甲状腺ホルモン、ボンベシン、コレシストキニン、テストステロン、エストロゲン、もしくはプロゲステロン、レニン、グレリン、アミリン、または膵ポリペプチドを分泌する細胞）、表皮ケラチノサイト、上皮細胞（例えば、外分泌の分泌上皮細胞、甲状腺上皮細胞、角化上皮細胞、胆嚢上皮細胞、または角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道、もしくは膣の表面上皮細胞）、腎臓細胞、生殖細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、骨細胞（例えば、破骨細胞または骨芽細胞）、軟骨膜細胞（例えば、軟骨芽細胞または軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、軟骨細胞（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｅｌｌ）（例えば、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、線維芽細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、羊膜または胎盤膜から単離された細胞、あるいは漿膜細胞（例えば、体腔の内側を覆う漿膜細胞）である。

【0507】

いくつかの実施形態では、細胞は体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、皮膚または他の臓器、例えば、心臓、脳もしくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸、または胃に由来する。細胞は、ヒトまたは他の哺乳動物（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、ウシ、またはブタの細胞）に由来し得る。

【0508】

いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ベータ島細胞、内皮細胞、上皮細胞、例えば、ＲＰＥなど、甲状腺細胞、皮膚細胞、または肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、操作ｉＰＳＣから分化しているｉＰＳＣ由来細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、初代細胞から改変されている操作細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１４２の発現減少または排除を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の補体インヒビターの過剰発現または発現増加を含む。

【0509】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されているｉＰＳＣ由来Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されている初代Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１４２の発現減少または排除を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の補体インヒビターの過剰発現または発現増加を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、本明細書に記載されるようないずれかを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作され得る。いくつかの実施形態では、操作（例えば、低免疫原性）Ｔ細胞は、本明細書、例えば、節ＩＶに記載されるようないずれかを含む、同種細胞療法を用いて様々な適応症を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では操作（例えば、低免疫原性）Ｔ細胞は、がんを治療するために使用され得る。

【0510】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されているｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されている初代ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１４２の発現減少または排除を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の補体インヒビターの過剰発現または発現増加を含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、本明細書に記載されるようないずれかを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で操作され得る。いくつかの実施形態では、操作（例えば、低免疫原性）ＮＫ細胞は、本明細書、例えば、節ＩＶに記載されるようないずれかを含む、同種細胞療法を用いて様々な適応症を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では操作（例えば、低免疫原性）ＮＫ細胞は、がんを治療するために使用され得る。

【0511】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されているｉＰＳＣ由来ベータ島細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されている初代ベータ島細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１４２の発現減少または排除を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の補体インヒビターの過剰発現または発現増加を含む。いくつかの実施形態では、操作（例えば、低免疫原性）ベータ島細胞は、本明細書、例えば、節ＩＶに記載されるようないずれかを含む、同種細胞療法を用いて様々な適応症を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では操作（例えば、低免疫原性）ベータ島細胞は、糖尿病、例えば、Ｉ型糖尿病などを治療するために使用され得る。

【0512】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されているｉＰＳＣ由来内皮細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されている初代内皮細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１４２の発現減少または排除を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の補体インヒビターの過剰発現または発現増加を含む。いくつかの実施形態では、操作（例えば、低免疫原性）内皮細胞は、本明細書、例えば、節ＩＶに記載されるようないずれかを含む、同種細胞療法を用いて様々な適応症を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では操作（例えば、低免疫原性）内皮細胞は、血管新生または眼疾患を治療するために使用され得る。

【0513】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されているｉＰＳＣ由来上皮細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されている初代上皮細胞である。いくつかの実施形態では、上皮細胞はＲＰＥである。いくつかの実施形態では、上皮細胞は、甲状腺細胞である。いくつかの実施形態では、上皮細胞は、皮膚細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１４２の発現減少または排除を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の補体インヒビターの過剰発現または発現増加を含む。いくつかの実施形態では、操作（例えば、低免疫原性）上皮細胞は、本明細書、例えば、節ＩＶに記載されるようないずれかを含む、同種細胞療法を用いて様々な適応症を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では操作（例えば、低免疫原性）上皮細胞は、甲状腺疾患または皮膚疾患を治療するために使用され得る。

【0514】

いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されているｉＰＳＣ由来肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作されている初代肝細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ１４２の発現減少または排除を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の補体インヒビターの過剰発現または発現増加を含む。いくつかの実施形態では、操作（例えば、低免疫原性）上皮細胞は、本明細書、例えば、節ＩＶに記載されるようないずれかを含む、同種細胞療法を用いて様々な適応症を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では操作（例えば、低免疫原性）肝細胞は、肝疾患を治療するために使用され得る。

【0515】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変される細胞は、健康な対象、例えば、治療される特定の疾患または状態を有することが知られていないか、またはそれを有すると疑われていない対象などに由来する細胞である。例えば、ベータ島細胞が、糖尿病の治療などのためにドナー対象から単離または取得される場合、対象が糖尿病または別の疾患もしくは状態に罹患していることが知られていないか、または罹患していると疑われていない場合、ドナー対象は健康な対象である。

【0516】

５．初代細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作される細胞は、１以上の個々の対象またはドナーから取得または単離された初代細胞に由来する細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上）の異なるドナー対象から得られる、単離初代細胞のプールに由来する。いくつかの実施形態では、複数の異なるドナー対象（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上）から単離または取得される初代細胞は、バッチ内で共にプールされ、提供される方法に従って操作される。

【0517】

いくつかの実施形態では、初代細胞は、レシピエント対象（例えば、細胞を投与される患者）とは異なる１以上のドナー対象からの初代細胞のプールに由来する。初代細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００またはそれを超えるドナー対象から得られ、共にプールされ得る。初代細胞は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上のドナー対象から得られ、共にプールされ得る。いくつかの実施形態では、初代細胞は、１または複数の個体から採取され、いくつかの場合では、初代細胞または初代Ｔ細胞のプールはインビトロで培養される。いくつかの実施形態では、初代細胞または初代Ｔ細胞のプールは、本明細書で提供される方法に従って操作または改変される。

【0518】

いくつかの実施形態では、本方法は、個々のドナー対象から所望の初代細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、ベータ島細胞、肝細胞または本明細書に記載されるような他の初代細胞）型を取得または単離し、細胞をプールして初代細胞型のバッチを得て、本明細書で提供される方法によって細胞を操作することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、所望の初代細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、ベータ島細胞、肝細胞または本明細書に記載されるような他の初代細胞）型を取得または単離し、本明細書で提供される方法によって個々のドナーの各々の細胞を操作し、少なくとも２つの個々の試料の操作（改変）細胞をプールして初代細胞型の操作細胞のバッチを得ることを含む。

【0519】

いくつかの実施形態では、初代細胞は個体から、または２以上の個々のドナーから単離もしくは取得される初代細胞のプールから単離または取得される。初代細胞は、節ＩＩ．Ｃ．３に記載されるいずれかを含む、本明細書に記載される任意の初代細胞型であってよい。いくつかの実施形態では、初代細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ベータ島細胞、内皮細胞、上皮細胞、例えば、ＲＰＥなど、甲状腺細胞、皮膚細胞、または肝細胞から選択される。いくつかの実施形態では、個々のドナーまたは個々のドナーのプールに由来する細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作される。

【0520】

６．人工多能性幹細胞の生成
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作されている細胞は、人工多能性幹細胞であるか、または人工多能性幹細胞に由来するか、もしくはそれらから分化した操作細胞である。マウス及びヒト多能性幹細胞（一般にｉＰＳＣと称され、マウス細胞の場合はｍｉＰＳＣまたはヒト細胞の場合はｈｉＰＳＣと称される）の生成は一般に、当該技術分野において既知である。当業者には理解されることになるように、ｉＰＣＳの生成を目的とした様々な異なる方法が存在する。最初の誘導は、４つの転写因子であるＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４のウイルス導入を使用してマウス胚または成体線維芽細胞から行われた（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６（２００６）を参照し、その全体が、特に本明細書で概説される技術について参照によって本明細書に組み込まれる）。それ以来、多数の方法が開発されてきた（概説については、Ｓｅｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ７（１）：１１６－１２５（２０１５）、及びＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ａｎｄ Ｖｅｒｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１３を参照し、その両方とも、その全体が、特にｈｉＰＳＣの生成方法について参照によって本明細書に明示的に組み込まれる（例えば、後者の参考文献の第３章を参照のこと））。

【0521】

概して、ｉＰＳＣは、エピソーマルベクターを使用して通常は導入される、宿主細胞における１つ以上のリプログラミング因子の一過性発現によって生成される。これらの条件下で、少量の細胞がｉＰＳＣとなるように誘導される（一般に、本ステップの効率は、選択マーカーが使用されないため低い）。細胞が「リプログラミング」されて多能性となると、それらは、エピソーマルベクター（複数可）を喪失し、内因性遺伝子を使用して因子を生成する。

【0522】

また当業者には理解されるように、使用され得る、または使用されるリプログラミング因子の数は変動し得る。通常、より少ないリプログラミング因子が使用される場合、細胞が多能性状態へと形質転換する効率が低下することに加えて、「多能性」、例えば、より少ないリプログラミング因子が、十分に多能性ではないが、より少ない細胞型にのみ分化できる場合がある細胞をもたらす場合がある。

【0523】

いくつかの実施形態では、単一のリプログラミング因子、ＯＣＴ４が使用される。他の実施形態では、２つのリプログラミング因子、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４が使用される。他の実施形態では、３つのリプログラミング因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４及びＳＯＸ２が使用される。他の実施形態では、４つのリプログラミング因子、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ－Ｍｙｃが使用される。他の実施形態では、５つ、６つまたは７つのリプログラミング因子が、ＳＯＫＭＮＬＴ、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、及びＳＶ４０Ｌ Ｔ抗原から選択されて使用され得る。概して、それらのリプログラミング因子遺伝子は、当該技術分野において既知であり、市販されているものなどのエピソーマルベクター上に提供される。

【0524】

いくつかの実施形態では、１つ以上のリプログラミング因子をトランスフェクトするために使用される宿主細胞は、非多能性幹細胞である。概して、当該技術分野において既知であるように、ｉＰＳＣは、本明細書に記載されるようなリプログラミング因子を一過的に発現させることによって、非多能性細胞、例えば、これらに限定されないが、血液細胞、線維芽細胞などから作製される。いくつかの実施形態では、線維芽細胞などの非多能性細胞は、細胞をリプログラミングする前に、１以上の個々の対象またはドナーから取得または単離される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、１以上（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上）の異なるドナー対象から得られる、単離非多能性幹細胞、例えば、線維芽細胞のプールから作製される。いくつかの実施形態では、線維芽細胞などの非多能性細胞は、複数の異なるドナー対象（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上）から単離または取得され、バッチ内で共にプールされてｉＰＳＣとしてリプログラミングされ、提供される方法に従って操作される。

【0525】

いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、レシピエント対象（例えば、細胞を投与される患者）とは異なる１以上のドナー対象に由来する非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）のプールからの細胞に、１つ以上のリプログラミング因子を一過性トランスフェクトすることなどによって得られる。ｉＰＳＣに誘導される非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００またはそれを超えるドナー対象から得られ、共にプールされ得る。非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）は、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、５０以上、または１００以上のドナー対象から得られ、共にプールされ得る。いくつかの実施形態では、非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）が１または複数の個体から採取され、いくつかの場合では、非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）または非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）のプールはインビトロで培養され、ｉＰＳＣの生成を誘導するための１つ以上のリプログラミング因子でトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）または非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）のプールは、本明細書で提供される方法に従って操作または改変される。次いで、いくつかの実施形態では、操作ｉＰＳＣまたは操作ｉＰＳＣのプールは、生物及び組織の任意の細胞への分化を目的とした分化プロセスに供される。

【0526】

操作ｉＰＳＣ細胞が生成されると、それらは、ＷＯ２０１６１８３０４１及びＷＯ２０１８１３２７８３に記載されるように、それらの低免疫原性及び／または多能性の保持についてアッセイされてよい。いくつかの実施形態では、低免疫原性は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１３及び図１５に例示されるような多数の技術を使用してアッセイされる。それらの技術は、同種宿主への移植及び宿主免疫系を回避する低免疫原性多能性細胞の増殖（例えば、奇形腫）に対するモニタリングを含む。いくつかの場合では、低免疫原性多能性細胞誘導体は、ルシフェラーゼを発現するように形質導入され、次いで生物発光イメージングを使用して追跡され得る。同様に、そのような細胞に対する宿主動物のＴ細胞及び／またはＢ細胞応答は、細胞が宿主動物において免疫反応を引き起こさないかを確認するために試験される。Ｔ細胞応答は、Ｅｌｉｓｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲ、またはマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評価され得る。Ｂ細胞応答または抗体応答は、ＦＡＣＳまたはＬｕｍｉｎｅｘを使用して評価される。さらに、または代わりに、細胞は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１４及び１５に一般に示されるように、自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞死滅を回避するそれらの能力についてアッセイされてよい。

【0527】

いくつかの実施形態では、細胞の免疫原性は、Ｔ細胞イムノアッセイ、例えば、当業者によって認識されているＴ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞活性化アッセイ、及びＴ細胞死滅アッセイなどを使用して評価される。いくつかの場合には、Ｔ細胞増殖アッセイは、細胞をインターフェロン－ガンマで前処理し、細胞を標識Ｔ細胞と共に共培養して、事前に選択した期間後にＴ細胞集団（または増殖しているＴ細胞集団）の存在をアッセイすることを含む。いくつかの場合には、Ｔ細胞活性化アッセイは、Ｔ細胞を本明細書で概説される細胞と共に共培養し、Ｔ細胞内のＴ細胞活性化マーカーの発現レベルを決定することを含む。

【0528】

インビボアッセイは、本明細書で概説される細胞の免疫原性を評価するために実施され得る。いくつかの実施形態では、操作または改変ｉＰＳＣの生存及び免疫原性は、同種ヒト化免疫不全マウスモデルを使用して決定される。いくつかの場合では、操作または改変ｉＰＳＣは、同種ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに移植され、細胞拒絶、細胞生存、及び奇形腫形成についてアッセイされる。いくつかの場合では、移植された操作ｉＰＳＣまたはその分化細胞は、マウスモデルにおいて長期生存を示す。

【0529】

細胞の低免疫原性を含む免疫原性を決定するための追加の技術は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に記載され、本方法の図、図の説明、及び記載を含む本開示は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0530】

同様に、多能性の保持が多数の方法で試験される。一実施形態では、多能性は、本明細書で一般的に記載され、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２９に示されるように、ある特定の多能性特異的因子の発現によってアッセイされる。さらに、または代わりに、多能性細胞は、多能性の指標として１つ以上の細胞型に分化される。

【0531】

操作多能性幹細胞（操作ｉＰＳＣ）が生成されると、それらは、ｉＰＳＣの維持について既知であるように、未分化状態で維持され得る。例えば、細胞は、分化を防止し、かつ多能性を維持する培養培地を使用してマトリゲル上で培養され得る。加えて、それらは、多能性を維持するような条件下で培養培地内にあり得る。

【0532】

本明細書に記載される多能性幹細胞のいずれも、生物及び組織の任意の細胞に分化され得る。一態様では、本明細書では、レシピエント対象への後続の移植を目的とした、ｉＰＳＣに由来する異なる細胞型に分化される操作細胞が提供される。分化は、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイされ得る。当業者には理解されることになるように、分化した操作（例えば、低免疫原性）多能性細胞誘導体は、細胞型及びこれらの細胞の最終用途の両方に依存する、当該技術分野において既知の技術を使用して移植され得る。例示的な分化細胞型及びその作製方法が以下に記載される。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、節ＩＩ．Ｃ．３に記載されるいずれかを含む、本明細書に記載される任意の細胞型に分化されてよい。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ベータ島細胞、内皮細胞、上皮細胞、例えば、ＲＰＥなど、甲状腺細胞、皮膚細胞、または肝細胞から選択される細胞型に分化される。いくつかの実施形態では、宿主細胞、例えば、個々のドナーまたは個々のドナーのプールに由来する非多能性細胞（例えば、線維芽細胞）などが、単離または取得されてｉＰＳＣへと生成され、次いでｉＰＳＣが、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有するように操作され、次いで所望の細胞型に分化される。

【0533】

７．細胞型
Ｏ．ベータ島細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変される細胞は、初代ベータ島細胞（膵島細胞または膵ベータ細胞とも称される）である。いくつかの実施形態では、初代ベータ島細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健康なドナー（例えば、疾患または感染を知られていないか、または疑われていない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）などから単離または取得される。当業者には理解されることになるように、個体からベータ島細胞を単離または取得する方法が、既知の技術を使用して達成され得る。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）に対する後続の移植または生着を目的とした、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有する操作初代ベータ島細胞が提供される。

【0534】

いくつかの実施形態では、ベータ島細胞は、対象または個体から得られる（例えば、採取、抽出、除去、または取得される）。いくつかの実施形態では、初代ベータ島細胞は、ベータ島細胞が１以上の対象（例えば、１人以上の健康なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するように、ベータ島細胞のプールから作製される。いくつかの実施形態では、初代ベータ島細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療用細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、ベータ島細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、ベータ島細胞のプールが得られるドナー対象のうち１以上が、患者とは異なる。

【0535】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるような細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有し、ベータ島細胞に分化する、操作ｉＰＳＣに由来するベータ島細胞である。当業者には理解されることになるように、分化方法は、既知の技術を使用する所望の細胞型に依存する。いくつかの実施形態では、様々なベータ島細胞に分化した細胞は、対象（例えば、レシピエント）への後続の移植または生着に使用されてよい。いくつかの実施形態では、島細胞は、本明細書に記載される操作多能性細胞に由来する。多能性幹細胞をベータ島細胞に分化させる有用な方法は、例えば、米国特許第９，６８３，２１５号、米国特許第９，１５７，０６２号、米国特許第８，９２７，２８０号、米国特許公開第２０２１／０２０７０９９号、Ｈｏｇｒｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０２０，３８：４６０－４７０、及びＨｏｇｒｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，”Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，２０２１（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0536】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作多能性細胞は、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植を目的としてベータ様細胞または膵島オルガノイドに分化される。細胞系は、Ｔ１ＤＭに対処するための有望な方法であり、例えば、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１７ Ｏｃｔ；１４（１０）：６１２－６２８（参照によって本明細書に組み込まれる）を参照のこと。さらに、Ｐａｇｌｉｕｃａ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ，２０１４，１５９（２）：４２８－３９）は、ｈｉＰＳＣからのβ細胞分化の成功に関して報告している（その内容全体が、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生について同文献で概説される方法及び試薬について参照によって本明細書に組み込まれる）。さらに、Ｖｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．は、ヒト多能性幹細胞からのヒトβ細胞の産生、続いて宿主による免疫拒絶を回避するためのカプセル化について示している（Ｖｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１６，２２（３）：３０６－１１、その内容全体が、特にヒト多能性幹細胞からの機能的ヒトβ細胞の大規模産生について同文献で概説される方法及び試薬について参照によって本明細書に組み込まれる）。

【0537】

いくつかの実施形態では、インビトロでの分化によって操作多能性細胞の集団から操作島細胞の集団を産生する方法は、（ａ）インスリン様成長因子、トランスフォーミング増殖因子、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＨＨ、ＶＥＧＦ、トランスフォーミング増殖因子－ｂスーパーファミリー、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＧＳＫ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ１型受容体阻害剤、及びレチノイン酸からなる群から選択される１つ以上の因子を含む第１培養培地中で操作ｉＰＳＣの集団を培養し、未成熟島細胞の集団を産生すること、ならびに（ｂ）第１培養培地とは異なる第２培養培地中で未成熟島細胞の集団を培養し、操作島細胞の集団を産生することを含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、またはそのバリアントである。いくつかの場合では、ＧＳＫ阻害剤は、約２ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、またはそのバリアントである。いくつかの場合では、ＡＬＫ阻害剤は、約１ｐＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、第１培養培地及び／または第２培養培地は、動物血清を含まない。

【0538】

分化は、一般にインスリンを含むが、これに限定されないβ細胞関連または特異的マーカーの存在を評価することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイされる。分化はまた、例えば、グルコース代謝の測定などのように、機能的に測定され得、一般にＭｕｒａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ．２０１６ Ｏｃｔ ２６；３（４）：３８５－３９４．ｅ３を参照し、その全体が、特に同文献に概説されるバイオマーカーについて参照によって本明細書に組み込まれる。ベータ細胞が生成されると、それらは、門脈／肝臓、網、胃腸粘膜、骨髄、筋肉、または皮下嚢に（本明細書に記述されるような細胞懸濁液として、またはゲルマトリックス内のいずれかで）移植され得る。

【0539】

本技術に使用する目的を含む、島細胞の追加の記載は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0540】

いくつかの実施形態では、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した操作ベータ島細胞、例えば、初代ベータ島細胞など、または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した内皮細胞の集団が培養下で維持され、いくつかの場合には投与前に増殖させる。ある特定の実施形態では、操作ベータ島細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0541】

例示的な島細胞型としては、島前駆細胞、未成熟島細胞、成熟島細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される膵臓細胞は、糖尿病を治療するために対象に投与される。

【0542】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように操作される島細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ベータ島細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したベータ島細胞などが、インスリンを分泌する。いくつかの実施形態では、島細胞は、内因性島細胞の少なくとも２つの特性、例えば、これらに限定されないが、グルコースに応答したインスリンの分泌、及びベータ細胞マーカーの発現を示す。

【0543】

例示的なベータ細胞マーカーまたはベータ細胞前駆体マーカーとしては、ｃ－ペプチド、Ｐｄｘｌ、グルコース輸送体２（Ｇｌｕｔ２）、ＨＮＦ６、ＶＥＧＦ、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、プロホルモン転換酵素（ＰＣ１／３）、Ｃｄｃｐｌ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｇｎ３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、Ｎｋｘ６．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、Ｐｔｆｌａ、Ｉｓｌｌ、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘｌ７、及びＦｏｘＡ２が挙げられるが、これらに限定されない。

【0544】

いくつかの実施形態では、島細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ベータ島細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したベータ島細胞などが、グルコースの増加に応答してインスリンを産生する。様々な実施形態では、島細胞は、グルコースの増加に応答してインスリンを分泌する。いくつかの実施形態では、細胞は特有の形態、例えば、敷石の細胞形態及び／または約１７ｐｍ～約２５ｐｍの直径などを有する。

【0545】

いくつかの実施形態では、本技術は、操作ベータ島細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ベータ島細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したベータ島細胞などを対象とし、これらは寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、ベータ島細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。ある特定の実施形態では、操作ベータ島細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、ベータ島細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作ベータ島細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、ベータ島細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、ベータ島細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＣＤ１４２遺伝子のうち１つ以上を破壊するゲノム改変を保有する。

【0546】

いくつかの実施形態では、提供される操作ベータ島細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作ベータ島細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ベータ島細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したベータ島細胞などは、患者（例えば、投与時のレシピエント）内で免疫応答を活性化しない。疾患の治療を必要とする対象（例えば、レシピエント）または患者に、本明細書に記載される操作ベータ島細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が提供される。

【0547】

いくつかの実施形態では、細胞投与の数は、免疫原性細胞（例えば、同じか、または類似した細胞型または表現型であるが、操作細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞集団であり、例えば、ＣＤ１４２、ＭＨＣクラスＩ、及び／またはＭＨＣクラスＩＩ発現の内因性レベルを有するが、ＣＤ４７の（例えば、外因性）発現増加を有しない）に必要となる投与量よりも少ない投与量である。いくつかの実施形態では、細胞投与の数は、免疫原性細胞（例えば、同じか、または類似した細胞型または表現型であるが、操作細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞集団であり、例えば、ＣＤ１４２、ＭＨＣクラスＩ、及び／またはＭＨＣクラスＩＩ発現の内因性レベルを有するが、ＣＤ４７の（例えば、外因性）発現増加を有しない）の免疫拒絶を減少させるのに必要となる投与量よりも少ない投与量である。

【0548】

Ｐ．肝細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変されている細胞は、初代肝細胞である。いくつかの実施形態では、初代肝細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健康なドナー（例えば、疾患または感染を知られていないか、または疑われていない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）などから単離または取得される。当業者には理解されることになるように、個体から肝細胞を単離または取得する方法が、既知の技術を使用して達成され得る。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）に対する後続の移植または生着を目的とした、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有する操作初代肝細胞が提供される。いくつかの実施形態では、操作初代肝細胞は、肝細胞機能の喪失または肝硬変に対処する細胞療法として投与され得る。

【0549】

いくつかの実施形態では、初代肝細胞は、対象または個体から得られる（例えば、採取、抽出、除去、または取得される）。いくつかの実施形態では、初代肝細胞は、肝細胞が１以上の対象（例えば、１人以上の健康なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するように、肝細胞のプールから作製される。いくつかの実施形態では、初代肝細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療用細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、肝細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、肝細胞のプールが得られるドナー対象のうち１以上が、患者とは異なる。

【0550】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるような細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有し、肝細胞に分化する、操作ｉＰＳＣから分化した肝細胞である。当業者には理解されることになるように、分化方法は、既知の技術を使用する所望の細胞型に依存する。いくつかの実施形態では、肝細胞に分化した細胞は、対象（例えば、レシピエント）への後続の移植または生着に使用されてよい。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞から分化した操作肝細胞は、肝細胞機能の喪失または肝硬変に対処する細胞療法として投与され得る。

【0551】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変を含有する操作多能性細胞は、肝細胞に分化される。操作多能性細胞を肝細胞に分化させるために使用され得る多数の技術が存在し、例えば、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８、Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１１ ６９８：３０５－３１４、Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１０，５１：２９７－３０５及びＡｓｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ，２０１３，９（４）：４９３－５０４を参照し、その全て全体が、特に分化のための手法及び試薬に関して参照によって本明細書に組み込まれる。分化は、一般にアルブミン、アルファフェトプロテイン、及びフィブリノゲンを含むが、これらに限定されない肝細胞関連及び／または特異的マーカーの存在を評価することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイされ得る。分化はまた、アンモニアの代謝、ＬＤＬ貯蔵及び取込み、ＩＣＧ取込み及び放出、ならびにグリコーゲン貯蔵など、機能的に測定され得る。

【0552】

いくつかの実施形態では、操作肝細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代肝細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した肝細胞などの集団が培養下で維持され、いくつかの場合には投与前に増殖させる。ある特定の実施形態では、肝細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0553】

いくつかの実施形態では、本技術は、操作肝細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代肝細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した肝細胞などを対象とし、これらは寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、肝細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。ある特定の実施形態では、操作肝細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、肝細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作肝細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作肝細胞は、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、肝細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作肝細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のうち１つ以上を破壊するゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、肝細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。

【0554】

いくつかの実施形態では、提供される操作肝細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作肝細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代肝細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した肝細胞などは、患者（例えば、投与時のレシピエント）内で免疫応答を活性化しない。疾患の治療を必要とする対象（例えば、レシピエント）または患者に、本明細書に記載される操作肝細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が提供される。

【0555】

Ｑ．Ｔ細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変されている細胞は、初代Ｔリンパ球（Ｔ細胞とも呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、初代Ｔリンパ球は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健康なドナー（例えば、疾患または感染を知られていないか、または疑われていない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）などから単離または取得される。いくつかの場合では、Ｔ細胞は、１以上の個体に由来する初代Ｔ細胞の集団または下位集団である。当業者には理解されることになるように、個体からＴリンパ球を単離または取得する方法が、既知の技術を使用して達成され得る。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）に対する後続の移植または生着を目的とした、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有する操作初代Ｔリンパ球が提供される。

【0556】

いくつかの実施形態では、初代Ｔ細胞は、対象または個体から得られる（例えば、採取、抽出、除去、または取得される）。いくつかの実施形態では、初代Ｔ細胞は、Ｔ細胞が１以上の対象（例えば、１人以上の健康なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するように、Ｔ細胞のプールから作製される。いくつかの実施形態では、初代Ｔ細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療用細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のプールが得られるドナー対象のうち１以上が、患者とは異なる。

【0557】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるような細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有し、Ｔリンパ球に分化する、操作多能性細胞から分化したＴリンパ球である。当業者には理解されることになるように、分化方法は、既知の技術を使用する所望の細胞型に依存する。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球に分化した細胞は、対象（例えば、レシピエント）への後続の移植または生着に使用されてよい。

【0558】

多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）からＴ細胞を生成する方法は、例えば、Ｉｒｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １２，４３０（２０２１）、Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．１６（４）：３５７－３６６（２０１５）、Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１：９２８－９３３（２０１３）に記載されている。

【0559】

初代Ｔ細胞の非限定的な例としては、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、非制御性Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔ濾胞性ヘルパー（Ｔｆｈ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞、セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞、エフェクターメモリーＴ（Ｔｅｍ）細胞、ＣＤ４５ＲＡを発現するエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ細胞）、組織定住型メモリー（Ｔｒｍ）細胞、バーチャルメモリーＴ細胞、自然メモリーＴ細胞、メモリー幹細胞（Ｔｓｃ）、γδＴ細胞、及び任意の他のＴ細胞サブタイプが挙げられる。いくつかの実施形態では、初代Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、及びそれらの組合せを含む群から選択される。

【0560】

本開示の例示的なＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＲＡ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球、及びそれらの組合せからなる群から選択される。多くの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ４５ＲＡを発現する。いくつかの実施形態では、セントラルＴ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ４５ＲＯを発現する。他の実施形態では、エフェクターメモリーＴ細胞は、ＰＤ－１、ＣＤ２７、ＣＤ２８、及びＣＤ４５ＲＯを発現する。他の実施形態では、エフェクターメモリーＲＡ Ｔ細胞は、ＰＤ－１、ＣＤ５７、及びＣＤ４５ＲＡを発現する。

【0561】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作Ｔ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代Ｔ細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したＴ細胞などは、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を含むが、これに限定されないキメラ抗原受容体を発現するように操作される（例えば、改変される）Ｔ細胞を含む。本明細書に記載されるＣＡＲを含む、任意の好適なＣＡＲがＴ細胞内に含まれ得る。いくつかの実施形態では、操作Ｔ細胞は、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、変異体細胞、及びそれらの組合せのうち少なくとも１つの表面上に発現される目的の抗原またはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現する。他の場合には、操作Ｔ細胞は、細胞が、隣接細胞、組織、または臓器に近接する場合に隣接細胞、組織、または臓器において目的の生物学的効果を調節する少なくとも１つのタンパク質を細胞に発現させる改変を含む。初代Ｔ細胞を含む、Ｔ細胞に対する有用な改変は、ＵＳ２０１６／０３４８０７３及びＷＯ２０２０／０１８６２０に詳細に記載されていて、その開示全体が本明細書に組み込まれる。

【0562】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、ゲノム座位に挿入される。本明細書に記載されるレンチウイルスベースの形質導入方法または遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含む、任意の好適な方法が、ＣＡＲをＴ細胞のゲノム座位に挿入するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１、Ｆ３（ＣＤ１４２としても知られる）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＬＲＰ１（ＣＤ９１としても知られる）、ＨＭＧＢ１、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１、またはＫＤＭ５Ｄ遺伝子座などに挿入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１またはＣＴＬＡ４遺伝子に挿入される。

【0563】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＴ細胞、例えば、操作または改変Ｔ細胞などは、内因性Ｔ細胞受容体の発現減少を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ座位は、本明細書に記載される遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）などによって細胞内で破壊または排除される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたは記載されるような他のポリヌクレオチドなどは、破壊したＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ座位に挿入される。

【0564】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＴ細胞、例えば、操作または改変Ｔ細胞などは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）の発現減少を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４座位は、本明細書に記載される遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）などによって、細胞内で破壊または排除される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたは記載されるような他の外因性ポリヌクレオチドなどは、破壊したＣＴＬＡ－４座位に挿入される。

【0565】

他の実施形態では、本明細書に記載されるＴ細胞、例えば、操作または改変Ｔ細胞などは、プログラム細胞死（ＰＤ１）の発現減少を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ１座位は、本明細書に記載される遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）などによって、細胞内で破壊または排除される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたは記載されるような他の外因性ポリヌクレオチドなどは、破壊したＰＤ１座位に挿入される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＴ細胞、例えば、操作または改変Ｔ細胞などは、ＣＴＬＡ４及びＰＤ１の発現減少を含む。

【0566】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＴ細胞、例えば、操作または改変Ｔ細胞などは、ＰＤ－Ｌ１の発現増強を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１座位は、本明細書に記載される遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）などによって、細胞内で破壊または排除される。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたは記載されるような他の外因性ポリヌクレオチドなどは、破壊したＰＤ－Ｌ１座位に挿入される。

【0567】

いくつかの実施形態では、本技術は、操作Ｔ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代Ｔ細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したＴ細胞などを対象とし、これらは寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、操作Ｔ細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。ある特定の実施形態では、操作Ｔ細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、操作Ｔ細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作Ｔ細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、操作Ｔ細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作Ｔ細胞はまた、ＣＡＲを発現するように操作される。いくつかの実施形態では、操作Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子またはＴＲＢＣ遺伝子におけるゲノム改変（例えば、遺伝子破壊）などによって、ＴＣＲ複合体分子の発現減少を有するか、またはその発現を欠いている。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）及びＣＡＲを過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣ遺伝子のうち１つ以上を破壊するゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、操作Ｔ細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。

【0568】

いくつかの実施形態では、提供される操作Ｔ細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作Ｔ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代Ｔ細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したＴ細胞などは、患者（例えば、投与時のレシピエント）内で免疫応答を活性化しない。疾患の治療を必要とする対象（例えば、レシピエント）または患者に、本明細書に記載される操作Ｔ細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が提供される。

【0569】

本明細書で提供されるＴ細胞は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌を含むが、これらに限定されない好適ながんの治療に有用である。

【0570】

Ｒ．ナチュラルキラー細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変されている細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健康なドナー（例えば、疾患または感染を知られていないか、または疑われていない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）などから単離または取得される。いくつかの場合では、ＮＫ細胞は、１以上の個体に由来するＮＫ細胞の集団または下位集団である。当業者には理解されることになるように、個体からＮＫ細胞を単離または取得する方法が、既知の技術を使用して達成され得る。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）に対する後続の移植または生着を目的とした、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有する操作初代ＮＫ細胞が提供される。例えば、操作Ｔ細胞は、操作ＮＫ細胞を対象に注入することによって、対象（例えば、レシピエント、例えば、患者など）に投与される。

【0571】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるような細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有し、ＮＫ細胞に分化する、操作多能性細胞から分化したＮＫ細胞である。当業者には理解されることになるように、分化方法は、既知の技術を使用する所望の細胞型に依存する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞に分化した細胞は、例えば、分化したＮＫ細胞を対象に注入することなどによって、対象（例えば、レシピエント、例えば、患者など）への後続投与のために使用されてよい。

【0572】

多能性幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）からＮＫ細胞を生成する方法は、例えば、米国特許第１０６２６３７３号、Ｓｈａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ．２０２０；１１：２３４、Ｅｕｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０２１；１２，Ａｒｔｉｃｌｅ ６４０６７２．ｄｏｉ＝１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０２１．６４０６７２に記載されている。

【0573】

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、対象または個体から得られる（例えば、採取、抽出、除去、または取得される）。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞が１以上の対象（例えば、１人以上の健康なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するように、ＮＫ細胞のプールから作製される。いくつかの実施形態では、初代ＮＫ細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、操作ＮＫ細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞のプールが得られるドナー対象のうち１以上が、患者とは異なる。

【0574】

いくつかの実施形態では、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ＮＫ細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したＮＫ細胞を含む、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現し（例えば、ＣＤ５６^ｄｉｍまたはＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}）、ＣＤ３を欠いている（例えば、ＣＤ３^ｎｅｇ）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＮＫ細胞は、ＡＤＣＣを媒介する、低親和性Ｆｃγ受容体ＣＤ１６を発現する場合もある。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞はまた、１つ以上のナチュラルキラー細胞受容体ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｄまたは１つ以上の自然細胞傷害性受容体ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０を発現する。例えば、初代ＮＫ細胞の場合について、特定の場合では、初代細胞は、ＮＫ細胞の出発源、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１４、及び／またはＣＤ１９が陽性である細胞の枯渇によって、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含有する試料などから単離されてよい。例えば、細胞は、それぞれＣＤ３、ＣＤ１４、及び／またはＣＤ１９に対する抗体に結合した免疫磁気ビーズを使用して枯渇に供されてよく、それによってＮＫ細胞の濃縮集団を産生する。他の場合には、初代ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞上の１つ以上のマーカー、例えば、ＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６、及び／またはＮＫＧ２Ｄなどの存在のために細胞を選択することによって、混合集団（例えば、ＰＢＭＣ）である出発源から単離されてよい。

【0575】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような操作前に、ＮＫ細胞、例えば、単離初代ＮＫ細胞などは、１つ以上の増殖または活性化ステップに供されてよい。いくつかの実施形態では、増殖は、フィーダー細胞、例えば、照射されてよいか、または照射されなくともよい抗原提示細胞などと共にＮＫ細胞を培養することによって達成されてよい。増殖ステップにおけるＮＫ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との比は、例えば、１：１、１：１．５、１：２、または１：３などのある特定の数の比であってよい。ある特定の態様では、ＡＰＣは、膜結合ＩＬ－２１（ｍｂｌＬ－２１）を発現するように操作される。特定の態様では、ＡＰＣは、代わりにまたはさらにＩＬ－２１、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２を発現するように操作される。特定の実施形態では、増殖ステップ（複数可）が行われる培地は、１つ以上の組換えサイトカインなどの、増殖を促進するための１つ以上の薬剤を含む。特定の実施形態では、培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、及び／またはＩＬ－２１からの１つ以上の組換えサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような改変を導入することによってＮＫ細胞を操作するステップは、増殖開始の２～１２日後、例えば、２日目もしくは約２日目、３日目もしくは約３日目、４日目もしくは約４日目、５日目もしくは約５日目、６日目もしくは約６日目、７日目もしくは約７日目、８日目もしくは約８日目、９日目もしくは約９日目、１０日目もしくは約１０日目、１１日目もしくは約１１日目、または１２日目もしくは約１２日目などに実施される。

【0576】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作ＮＫ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ＮＫ細胞などは、本明細書に記載されるキメラ抗原受容体を含むが、これに限定されないキメラ抗原受容体を発現するように操作される（例えば、改変される）ＮＫ細胞を含む。本明細書に記載されるＣＡＲを含む、任意の好適なＣＡＲがＮＫ細胞内に含まれ得る。いくつかの実施形態では、操作ＮＫ細胞は、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、変異体細胞、及びそれらの組合せのうち少なくとも１つの表面上に発現される目的の抗原またはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現する。他の場合には、操作ＮＫ細胞は、細胞が、隣接細胞、組織、または臓器に近接する場合に隣接細胞、組織、または臓器において目的の生物学的効果を調節する少なくとも１つのタンパク質を細胞に発現させる改変を含む。

【0577】

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、ゲノム座位に挿入される。本明細書に記載されるレンチウイルスベースの形質導入方法または遺伝子編集方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含む、任意の好適な方法が、ＣＡＲをＮＫ細胞のゲノム座位に挿入するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位、例えばこれらに限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１、Ｆ３（ＣＤ１４２としても知られる）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＬＲＰ１（ＣＤ９１としても知られる）、ＨＭＧＢ１、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１、またはＫＤＭ５Ｄ遺伝子座などに挿入される。

【0578】

いくつかの実施形態では、本技術は、操作ＮＫ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ＮＫ細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したＮＫ細胞などを対象とし、これらは寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、ＣＤ１４２の発現減少を有するか、またはその発現を欠く。いくつかの実施形態では、操作ＮＫ細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５から選択される１つ以上の補体インヒビターを発現する。ある特定の実施形態では、操作ＮＫ細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作ＮＫ細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作ＮＫ細胞はまた、ＣＡＲを発現するように操作される。

【0579】

いくつかの実施形態では、提供される操作ＮＫ細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作ＮＫ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ＮＫ細胞などは、患者（例えば、投与時のレシピエント）内で免疫応答を活性化しない。疾患の治療を必要とする対象（例えば、レシピエント）または患者に、本明細書に記載される操作ＮＫ細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が提供される。

【0580】

本明細書で提供されるＮＫ細胞は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌を含むが、これらに限定されない好適ながんの治療に有用である。

【0581】

Ｓ．内皮細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変されている細胞は、初代内皮細胞である。いくつかの実施形態では、初代内皮細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健康なドナー（例えば、疾患または感染を知られていないか、または疑われていない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）などから単離または取得される。当業者には理解されることになるように、個体から内皮細胞を単離または取得する方法が、既知の技術を使用して達成され得る。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）に対する後続の移植または生着を目的とした、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有する操作初代内皮細胞が提供される。

【0582】

いくつかの実施形態では、初代内皮細胞は、対象または個体から得られる（例えば、採取、抽出、除去、または取得される）。いくつかの実施形態では、初代内皮細胞は、内皮細胞が１以上の対象（例えば、１人以上の健康なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するように、内皮細胞のプールから作製される。いくつかの実施形態では、初代内皮細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療用細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、内皮細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、内皮細胞のプールが得られるドナー対象のうち１以上が、患者とは異なる。

【0583】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるような細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有し、内皮細胞型に分化する、操作ｉＰＳＣから分化した内皮細胞である。当業者には理解されることになるように、分化方法は、既知の技術を使用する所望の細胞型に依存する。いくつかの実施形態では、様々な内皮細胞型に分化した細胞は、対象（例えば、レシピエント）への後続の移植または生着に使用されてよい。

【0584】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作多能性細胞は、末梢動脈疾患に対処するために、新たな血管を形成するための内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）に分化される。内皮細胞に分化させる技術は既知である。例えば、Ｐｒａｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４８を参照のこと（その全体が、特にヒト多能性幹細胞からの内皮細胞の生成を目的とした方法及び試薬に関して、また移植技術に関して参照によって本明細書に組み込まれる）。分化は、一般に内皮細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって当該技術分野において既知であるようにアッセイされ得る。

【0585】

いくつかの実施形態では、インビトロでの分化によって操作多能性細胞の集団から操作内皮細胞の集団を産生する方法は、（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む第１培養培地中で操作ｉＰＳＣ細胞の集団を培養すること、（ｂ）ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む第２培養培地中で操作ｉＰＳＣ細胞の集団を培養し、前駆内皮細胞の集団を産生すること、ならびに（ｃ）ＲＯＣＫ阻害剤及びＡＬＫ阻害剤を含む第３培養培地中で前駆内皮細胞の集団を培養し、本明細書に記載される改変を含有するように操作されている分化した内皮細胞の集団を産生することを含む。

【0586】

いくつかの実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、またはそのバリアントである。いくつかの場合では、ＧＳＫ阻害剤は、約１ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体、またはそのバリアントである。いくつかの場合では、ＲＯＣＫ阻害剤は、約１ｐＭ～約２０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、またはそのバリアントである。いくつかの場合では、ＡＬＫ阻害剤は、約０．５ｐＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。

【0587】

いくつかの実施形態では、第１培養培地は、２ｐＭ～約１０ｐＭのＣＨＩＲ－９９０２１を含む。いくつかの実施形態では、第２培養培地は、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む。他の実施形態では、第２培養培地は、Ｙ－２７６３２及びＳＢ－４３１５４２をさらに含む。様々な実施形態では、第３培養培地は、１０ｐＭのＹ－２７６３２及び１ｐＭのＳＢ－４３１５４２を含む。ある特定の実施形態では、第３培養培地は、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦをさらに含む。特定の場合には、第１培養培地及び／または第２培地は、インスリンを含まない。

【0588】

本明細書で提供される細胞は表面、例えば、多能性細胞の内皮細胞への分化を支援及び／または促進するための合成表面などの上で培養され得る。いくつかの実施形態では、表面は、選択される１つ以上のアクリレートモノマーのホモポリマーまたはコポリマーを含むが、これらに限定されないポリマー材料を含む。アクリレートモノマー及びメタクリレートモノマーの非限定的な例としては、テトラ（エチレングリコール）ジアクリレート、グリセロールジメタクリレート、１，４－ブタンジオールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ジ（エチレングリコール）ジメタクリレート、テトラ（エチエン（ｅｔｈｙｉｅｎｅ）グリコール）ジメタクリレート、１，６－ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、トリメチロールプロパンベンゾエートジアクリレート、トリメチロールプロパンエイホキシレート（ｅｉｈｏｘｙｌａｔｅ）（１ＥＯ／ＱＨ）メチル、トリシクロ［５．２．１．０^２，６］デカンジメタノールジアクリレート、ネオペンチルグリコールエキソキシレート（ｅｘｈｏｘｙｌａｔｅ）ジアクリレート、及びトリメチロールプロパントリアクリレートが挙げられる。アクリレートは、当該技術分野において既知のように合成されるか、またはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、及びＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃ．などの商業的業者から得られる。

【0589】

いくつかの実施形態では、内皮細胞は、ポリマーマトリックス上に播種されてよい。いくつかの場合には、ポリマーマトリックスは生分解性である。好適な生分解性マトリックスは当該技術分野において周知であり、これらとしては、コラーゲン－ＧＡＧ、コラーゲン、フィブリン、ＰＬＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＡ／ＰＧＡコポリマーが挙げられる。追加の生分解性材料としては、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフメレート（ｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ））、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン及び多糖が挙げられる。

【0590】

非生分解性ポリマーも同様に使用されてよい。非生分解性であるが、生体適合性である他のポリマーとしては、ポリピロール、ポリアニブン（ｐｏｌｙａｎｉｂｎｅ）、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生分解性ポリウレタン、ポリウレア、ポリ（エチレンビニルアセテート）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート、及びポリ（エチレンオキシド）が挙げられる。ポリマーマトリックスは、任意の形状で、例えば、粒子、スポンジ、管、球体、ストランド、コイル状ストランド、毛細管網、フィルム、繊維、メッシュ、またはシートとして形成されてよい。ポリマーマトリックスは、天然または合成の細胞外マトリックス材料及び因子を含むように改変され得る。

【0591】

ポリマー材料は、支持体材料の表面上に分散され得る。細胞を培養するのに適した有用な支持体材料としては、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーもしくはコポリマー、それらの任意の組合せ、またはある材料の別の材料上へのコーティングが挙げられる。いくつかの場合では、ガラスとしては、ソーダ石灰ガラス、ｐｙｒｅｘガラス、ｖｙｃｏｒガラス、石英ガラス、ケイ素、またはそれらの誘導体などが挙げられる。

【0592】

いくつかの場合では、プラスチックまたは樹枝状ポリマーを含むポリマーとしては、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（酢酸ビニル－無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンまたはそれらの誘導体などが挙げられる。いくつかの場合では、コポリマーとしては、ポリ（酢酸ビニル－ｃｏ－無水マレイン酸）、ポリ（スチレン－ｃｏ－無水マレイン酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－アクリル酸）またはそれらの誘導体などが挙げられる。

【0593】

本明細書で提供される方法に使用するための内皮細胞及びそれらの分化に関する追加の記載は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0594】

いくつかの実施形態では、操作内皮細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代内皮細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した内皮細胞などの集団が培養下で維持され、いくつかの場合には投与前に増殖させる。ある特定の実施形態では、内皮細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0595】

いくつかの実施形態では、本技術は、操作内皮細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代内皮細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した内皮細胞などを対象とし、これらは寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、内皮細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。ある特定の実施形態では、操作内皮細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、内皮細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作内皮細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子及びＣＤ１４２遺伝子にゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作内皮細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ遺伝子、及びＣＤ１４２のうち１つ以上を破壊するゲノム改変を保有する。

【0596】

いくつかの実施形態では、提供される操作内皮細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作内皮細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代内皮細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した内皮細胞などは、患者（例えば、投与時のレシピエント）内で免疫応答を活性化しない。疾患の治療を必要とする対象（例えば、レシピエント）または患者に、本明細書に記載される操作内皮細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が提供される。

【0597】

いくつかの実施形態では、操作内皮細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代内皮細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した内皮細胞などが、患者、例えば、それを必要とするヒト患者に投与される。操作内皮細胞は、疾患または状態、例えば、これらに限定されないが、心血管疾患、血管疾患、末梢血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、脳卒中、再灌流傷害、虚血肢、神経障害（例えば、末梢神経障害または糖尿病性神経障害）、臓器不全（例えば、肝不全、腎不全など）、糖尿病、関節リウマチ、骨粗鬆症、血管損傷、組織損傷、高血圧、冠動脈疾患に起因する狭心症及び心筋梗塞、腎血管性高血圧、腎動脈狭窄に起因する腎不全、下肢の跛行などに罹患している患者に投与され得る。ある特定の実施形態では、患者は、一過性脳虚血発作または脳卒中に罹患したか、またはそれに罹患していて、これはいくつかの場合には、脳血管疾患に起因する場合がある。いくつかの実施形態では、操作内皮細胞は、例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、及び虚血肢で生じるような組織虚血を治療するため、ならびに損傷した血管を修復するために投与される。いくつかの場合では、細胞は、移植片のバイオエンジニアリングに使用される。

【0598】

例えば、操作内皮細胞は、虚血組織の修復、血管及び心臓弁の形成、人工血管の操作、損傷した血管の修復、ならびに操作組織における血管形成の誘導（例えば、移植前）のために細胞療法に使用され得る。さらに、内皮細胞は、腫瘍を標的として治療するために、薬剤を送達するようにさらに改変され得る。

【0599】

多くの実施形態では、本明細書では、血管細胞または血管新生を必要とする組織の修復または置換の方法が提供される。本方法は、そのような治療を必要とするヒト患者に、そのような組織における血管新生を促進するために、操作内皮細胞、例えば、単離した初代内皮細胞または分化した内皮細胞などを含有する組成物を投与することを含む。血管細胞または血管新生を必要とする組織は、とりわけ、心臓組織、肝臓組織、膵臓組織、腎臓組織、筋組織、神経組織、骨組織であり得、これは損傷を受けた、過剰な細胞死を特徴とする組織、損傷のリスクがある組織、または人工的に操作された組織であり得る。

【0600】

いくつかの実施形態では、心疾患または障害と関連する場合がある血管疾患は、例えば、これらに限定されないが、本明細書に記載されるように得られる最終的な血管内皮細胞及び心内膜内皮細胞などの内皮細胞を投与することによって治療され得る。そのような血管疾患としては、冠動脈疾患、脳血管疾患、大動脈弁狭窄症、大動脈瘤、末梢動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、静脈瘤、血管症、冠灌流が欠如している心臓の梗塞巣、非治癒性創傷、糖尿病性もしくは非糖尿病性潰瘍、または血管の形成を誘導することが望ましい任意の他の疾患もしくは障害が挙げられるが、これらに限定されない。

【0601】

ある特定の実施形態では、内皮細胞は、血管再建手術に使用される人工インプラント（例えば、Ｄａｃｒｏｎ及びＧｏｒｔｅｘなどの合成材料から作製された血管）を改善するために使用される。例えば、人工動脈グラフトは、重要臓器または四肢を灌流する罹患動脈を置換するために使用されることが多い。他の実施形態では、操作内皮細胞は、弁表面の血栓形成性を低下させることによって塞栓形成のリスクを低減させるために、人工心臓弁の表面の被覆に使用される。

【0602】

概説される内皮細胞は、組織及び／または単離細胞を血管に移植するための周知の外科的技術を使用して、患者に移植され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、注射（例えば、心筋内注射、冠動脈内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、経皮注射）、注入、移植、及び埋込みによって患者の心臓組織に導入される。

【0603】

内皮細胞の投与（送達）としては、皮下または非経口、例えば、静脈内、動脈内（例えば、冠動脈内）、筋肉内、腹腔内、心筋内、経心内膜、経心外膜、鼻腔内投与に加えて髄腔内、及び注入技術を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0604】

当業者には理解されることになるように、細胞は、細胞型及びそれらの細胞の最終用途の両方に依存する、当該技術分野において既知の技術を使用して移植される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、患者において静脈内に、または特定の位置での注射によるいずれかで移植される。特定の位置に移植される場合、細胞は、それらが定着する間の分散を防止するためにゲルマトリックス中に懸濁されてよい。

【0605】

例示的な内皮細胞型としては、毛細血管内皮細胞、血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、腎内皮細胞、脳内皮細胞、肝内皮細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0606】

本明細書に概説される内皮細胞、例えば、単離した初代内皮細胞または分化内皮細胞などは、１つ以上の内皮細胞マーカーを発現し得る。そのようなマーカーの非限定的な例としては、ＶＥ－カドヘリン（ＣＤ１４４）、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）（ＣＤ１４３）、ＢＮＨ９／ＢＮＦ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－ｌ）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ－セレクチン）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１４６、エンドカン（ＥＳＭ－ｌ）、Ｅｎｄｏｇｌｙｘ－ｌ、エンドムチン、エオタキシン－３、ＥＰＡＳ１（内皮ＰＡＳドメインタンパク質１）、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、ＦＬＩ－ｌ、Ｆｌｋ－ｌ（ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ－２）、ＦＬＴ－ｌ（ＶＥＧＦＲ－ｌ）、ＧＡＴＡ２、ＧＢＰ－ｌ（グアニル酸結合タンパク質－ｌ）、ＧＲＯ－アルファ、ＨＥＸ、ＩＣＡＭ－２（細胞間接着分子２）、ＬＭ０２、ＬＹＶＥ－ｌ、ＭＲＢ（マジックラウンドアバウト（ｍａｇｉｃ ｒｏｕｎｄａｂｏｕｔ））、ヌクレオリン、ＰＡＬ－Ｅ（病理解剖学的ライデン内皮（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅ ａｎａｔｏｍｉｅ Ｌｅｉｄｅｎ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）、ＲＴＫ、ｓＶＣＡＭ－ｌ、ＴＡＬＩ、ＴＥＭ１（腫瘍内皮マーカー１）、ＴＥＭ５（腫瘍内皮マーカー５）、ＴＥＭ７（腫瘍内皮マーカー７）、トロンボモジュリン（ＴＭ、ＣＤ１４１）、ＶＣＡＭ－ｌ（血管細胞接着分子－１）（ＣＤ１０６）、ＶＥＧＦ、ｖＷＦ（フォンヴィルブランド因子）、ＺＯ－ｌ、内皮細胞選択的接着分子（ＥＳＡＭ）、ＣＤ１０２、ＣＤ９３、ＣＤ１８４、ＣＤ３０４、及びＤＬＬ４が挙げられる。

【0607】

いくつかの実施形態では、内皮細胞は、障害／状態を治療するか、または障害／状態の症状を改善するのに有用な目的のタンパク質、例えば、これらに限定されないが、酵素、ホルモン、受容体、リガンド、または薬物などをコードする外因性遺伝子を発現するようにさらに遺伝子改変される。内皮細胞を遺伝子改変する標準的な方法は、例えば、ＵＳ５，６７４，７２２に記載されている。

【0608】

そのような内皮細胞は、疾患の予防または治療に有用である、ポリペプチドまたはタンパク質の構成的合成及び送達を提供するために使用され得る。このようにして、ポリペプチドは、個体の血流または身体の他の領域（例えば、中枢神経系）に直接分泌される。いくつかの実施形態では、内皮細胞は、インスリン、血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子またはフォンヴィルブランド因子）、アルファ－ｌアンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３）などを分泌するように改変され得る。

【0609】

ある特定の実施形態では、内皮細胞は、埋め込まれたグラフトとの関連においてそれらの性能を改善する方法で改変され得る。非限定的で例示的な例としては、管腔内血栓形成を予防するための血栓溶解剤の分泌または発現、平滑筋肥大に起因する管腔狭窄を予防するための平滑筋増殖の阻害剤の分泌、ならびに内皮細胞増殖を刺激し、グラフト内腔の内皮細胞による裏打ちの範囲または持続期間を改善するための内皮細胞マイトジェンまたは自己分泌因子の発現及び／または分泌が挙げられる。

【0610】

いくつかの実施形態では、操作内皮細胞は、治療レベルの分泌産物を特定の臓器または肢に送達するために利用される。例えば、インビトロで操作した（形質導入した）内皮細胞で裏打ちされた血管インプラントが、特定の臓器または肢に移植され得る。形質導入した内皮細胞の分泌産物は、灌流組織に高濃度で送達され、それによって標的とする解剖学的位置への所望の効果を達成することになる。

【0611】

他の実施形態では、内皮細胞は、血管新生腫瘍において内皮細胞によって発現される場合、血管新生を破壊または阻害する遺伝子を含有するようにさらに遺伝子改変される。いくつかの場合には、内皮細胞はまた、腫瘍治療の完了時に移植された内皮細胞の負の選択を可能にする、本明細書に記載される選択可能な自殺遺伝子のうちいずれか１つを発現するように遺伝子改変され得る。

【0612】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される内皮細胞、例えば、単離した初代内皮細胞または分化した内皮細胞などは、血管損傷、心血管疾患、血管疾患、末梢血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、高血圧、虚血組織損傷、再灌流傷害、虚血肢、脳卒中、神経障害（例えば、末梢神経障害または糖尿病性神経障害）、臓器不全（例えば、肝不全、腎不全など）、糖尿病、関節リウマチ、骨粗鬆症、脳血管疾患、高血圧、冠動脈疾患に起因する狭心症及び心筋梗塞、腎血管性高血圧、腎動脈狭窄に起因する腎不全、下肢の跛行、他の血管状態または疾患からなる群から選択される血管障害を治療するためにレシピエント対象に投与される。

【0613】

Ｔ．上皮細胞
３）網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変されている細胞は、初代網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である。いくつかの実施形態では、初代ＲＰＥ細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健康なドナー（例えば、疾患または感染を知られていないか、または疑われていない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）などから単離または取得される。当業者には理解されることになるように、個体からＲＰＥ細胞を単離または取得する方法が、既知の技術を使用して達成され得る。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）に対する後続の移植または生着を目的とした、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有する操作初代ＲＰＥ細胞が提供される。

【0614】

いくつかの実施形態では、初代ＲＰＥ細胞は、対象または個体から得られる（例えば、採取、抽出、除去、または取得される）。いくつかの実施形態では、初代ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞が１以上の対象（例えば、１人以上の健康なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するように、ＲＰＥ細胞のプールから作製される。いくつかの実施形態では、初代ＲＰＥ細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療用細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞のプールが得られるドナー対象のうち１以上が、患者とは異なる。

【0615】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるような細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有し、ＲＰＥ細胞に分化する、操作ｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞である。当業者には理解されることになるように、分化方法は、既知の技術を使用する所望の細胞型に依存する。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞に分化した細胞は、対象（例えば、レシピエント）への後続の移植または生着に使用されてよい。

【0616】

多能性幹細胞をＲＰＥ細胞に分化させる有用な方法は、例えば、ＵＳ９，４５８，４２８及びＵＳ９，８５０，４６３に記載され、本明細書を含む、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ヒト人工多能性幹細胞からＲＰＥ細胞を産生する追加の方法は、例えば、Ｌａｍｂａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００６，１０３（３４）：１２７６９－１２７７４、Ｍｅｌｌｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１２，３０（４）：６７３－６８６、Ｉｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００９，５（４）：３９６－４０８、Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１２，２２７（２）：４５７－４６６、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ，２０１３，２（５）：３８４－３９３、及びｄａ Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１８，３６：３２８－３３７に見出され得る。

【0617】

ヒト多能性幹細胞は、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４：２：２０５－１８（その全体が、特に分化技術及び試薬について同文献で概説される方法及び試薬に関して参照によって本明細書に組み込まれる）に概説される技術を使用してＲＰＥ細胞に分化されていて、またＭａｎｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１７，３７６：１０３８－１０４６も参照のこと（その内容全体が、ＲＰＥ細胞のシートの生成及び患者への移植を目的とした技術に関して本明細書に組み込まれる）。分化は、一般にＲＰＥ関連及び／または特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって当該技術分野において既知であるようにアッセイされ得る。例えば、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２（２）：２０５－１８を参照のこと（その内容全体が、特に結果の節の第１段落に概説されるマーカーに関して参照によって本明細書に組み込まれる）。

【0618】

いくつかの実施形態では、インビトロでの分化によって操作多能性細胞の集団から操作網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の集団を産生する方法は、（ａ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４／７、ＤＫＫ１、ＩＧＦ１、ノギン、ＢＭＰ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＶＥＧＦＲ阻害剤からなる群から選択される因子のうちいずれか１つを含む第１培養培地中で操作多能性細胞の集団を培養し、前駆ＲＰＥ細胞の集団を産生すること、ならびに（ｂ）第１培養培地とは異なる第２培養培地中で前駆ＲＰＥ細胞の集団を培養し、操作ＲＰＥ細胞の集団を産生することを含む。いくつかの実施形態では、ＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体、またはそのバリアントである。いくつかの場合では、ＡＬＫ阻害剤は、約２ｍＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体、またはそのバリアントである。いくつかの場合では、ＲＯＣＫ阻害剤は、約１ｐＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、第１培養培地及び／または第２培養培地は、動物血清を含まない。

【0619】

分化は、一般にＲＰＥ関連及び／または特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって当該技術分野において既知であるようにアッセイされ得る。例えば、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２（２）：２０５－１８を参照のこと（その内容全体が、特に結果の節に関して参照によって本明細書に組み込まれる）。

【0620】

ＲＰＥ細胞の分化方法及び本技術に使用する方法を含む、ＲＰＥ細胞の追加の記載は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0621】

いくつかの実施形態では、操作ＲＰＥ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ＲＰＥ細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞などの集団が培養下で維持され、いくつかの場合には投与前に増殖させる。ある特定の実施形態では、ＲＰＥ細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0622】

例示的なＲＰＥ細胞型としては、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ＲＰＥ前駆細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞、機能的ＲＰＥ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0623】

いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ＲＰＥ細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞などは、天然ＲＰＥ細胞の遺伝子発現プロファイルと類似した、または実質的に類似した遺伝子発現プロファイルを有する。そのようなＲＰＥ細胞は、平面基質上でコンフルエントな状態まで増殖させた場合に、天然ＲＰＥ細胞の多角形で平面シート状の形態を有する場合がある。

【0624】

いくつかの実施形態では、本技術は、操作ＲＰＥ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ＲＰＥ細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞などを対象とし、これらは寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。ある特定の実施形態では、操作ＲＰＥ細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作ＲＰＥ細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作ＲＰＥ細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、及びＣＤ１４２遺伝子のうち１つ以上を破壊するゲノム改変を保有する。

【0625】

いくつかの実施形態では、提供される操作ＲＰＥ細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作ＲＰＥ細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代ＲＰＥ細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したＲＰＥ細胞などは、患者（例えば、投与時のレシピエント）内で免疫応答を活性化しない。疾患の治療を必要とする対象（例えば、レシピエント）または患者に、本明細書に記載される操作ＲＰＥ細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が提供される。

【0626】

ＲＰＥ細胞は、黄斑変性症に罹患している患者または損傷したＲＰＥ細胞を有する患者に移植され得る。いくつかの実施形態では、患者は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、初期ＡＭＤ、中期ＡＭＤ、後期ＡＭＤ、非血管新生型加齢黄斑変性、ドライ型黄斑変性（ドライ型加齢黄斑変性）、ウェット型黄斑変性（ウェット型加齢黄斑変性）、若年性黄斑変性（ＪＭＤ）（例えば、シュタルガルト病、ベスト病、及び若年性網膜分離症）、レーバー先天性黒内障、または網膜色素変性症を有する。他の実施形態では、患者は網膜剥離に罹患している。

【0627】

治療用途では、開示される方法に従って調製される細胞は、典型的には等張賦形剤を含む医薬組成物の形態で供給され得、ヒト投与のために十分に滅菌されている条件下で調製される。細胞組成物の医薬製剤における一般原則については、“Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，”ｂｙ Ｍｏｒｓｔｙｎ＆Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６、及び“Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ＆Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００を参照のこと。細胞は、分布または臨床用途に適したデバイスまたは容器内に包装され得る。

【0628】

４）甲状腺細胞
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように操作または改変されている細胞は、初代甲状腺細胞である。いくつかの実施形態では、初代甲状腺細胞は、１以上の個々のドナー対象、例えば、１以上の個々の健康なドナー（例えば、疾患または感染を知られていないか、または疑われていない、例えば、その臨床徴候を示していない対象）などから単離または取得される。当業者には理解されることになるように、個体から甲状腺細胞を単離または取得する方法が、既知の技術を使用して達成され得る。本明細書では、対象（例えば、レシピエント）に対する後続の移植または生着を目的とした、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有する操作初代甲状腺細胞が提供される。

【0629】

いくつかの実施形態では、初代甲状腺細胞は、対象または個体から得られる（例えば、採取、抽出、除去、または取得される）。いくつかの実施形態では、初代甲状腺細胞は、甲状腺細胞が１以上の対象（例えば、１人以上の健康なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するように、甲状腺細胞のプールから作製される。いくつかの実施形態では、初代甲状腺細胞のプールは、１～１００、１～５０、１～２０、１～１０、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、ドナー対象は、患者（例えば、治療用細胞が投与されるレシピエント）とは異なる。いくつかの実施形態では、甲状腺細胞のプールは、患者からの細胞を含まない。いくつかの実施形態では、甲状腺細胞のプールが得られるドナー対象のうち１以上が、患者とは異なる。

【0630】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるような細胞は、本明細書に記載される改変（例えば、遺伝子改変）を含有し、甲状腺細胞に分化する、操作ｉＰＳＣから分化した甲状腺細胞である。当業者には理解されることになるように、分化方法は、既知の技術を使用する所望の細胞型に依存する。いくつかの実施形態では、甲状腺細胞に分化した細胞は、対象（例えば、レシピエント）への後続の移植または生着に使用されてよい。

【0631】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される改変を含有する操作多能性細胞は、自己免疫性甲状腺炎に対処するために甲状腺ホルモンを分泌し得る甲状腺前駆細胞及び甲状腺濾胞オルガノイドに分化される。甲状腺細胞を分化させる技術は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｋｕｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１５ Ｎｏｖ ５；１７（５）：５２７－４２を参照のこと（その全体が、特にヒト多能性幹細胞からの甲状腺細胞の生成を目的とした方法及び試薬に関して、また移植技術に関して参照によって本明細書に組み込まれる）。分化は、一般に甲状腺細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能的に測定することによって当該技術分野において既知であるようにアッセイされ得る。

【0632】

いくつかの実施形態では、操作甲状腺細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代甲状腺細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した甲状腺細胞などの集団が培養下で維持され、いくつかの場合には投与前に増殖させる。ある特定の実施形態では、甲状腺細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0633】

いくつかの実施形態では、本技術は、操作甲状腺細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代甲状腺細胞または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した甲状腺細胞などを対象とし、これらは寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、甲状腺細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。ある特定の実施形態では、操作甲状腺細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、甲状腺細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作甲状腺細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子及びＣＤ１４２遺伝子にゲノム改変を保有する。いくつかの実施形態では、操作甲状腺細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子、ならびにＣＤ１４６遺伝子のうち１つ以上を破壊するゲノム改変を保有する。

【0634】

いくつかの実施形態では、提供される操作甲状腺細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作甲状腺細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）から単離した初代甲状腺細胞など、または１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化したベータ島細胞は、患者（例えば、投与時のレシピエント）内で免疫応答を活性化しない。疾患の治療を必要とする対象（例えば、レシピエント）または患者に、本明細書に記載される操作内皮細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が提供される。

【0635】

Ｕ．心臓細胞
本明細書では、対象（例えば、レシピエント）への後続の移植または生着のためにＨＩＰ細胞から分化した心臓細胞型が提供される。当業者には理解されることになるように、分化方法は、既知の技術を使用する所望の細胞型に依存する。例示的な心臓細胞型としては、心筋細胞、結節心筋細胞、伝導心筋細胞、作業心筋細胞、心筋細胞前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｃｅｌｌ）、心筋細胞前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）、心臓幹細胞、心筋細胞、心房心臓幹細胞、心室心臓幹細胞、心外膜細胞、造血細胞、血管内皮細胞、心内膜内皮細胞、心臓弁間質細胞、心臓ペースメーカー細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0636】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される心臓細胞は、小児期心筋症、加齢に伴う心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、特発性心筋症、他の心筋症、心筋虚血再灌流傷害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、末期心疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心臓、動脈炎、心血管疾患、心筋梗塞、心筋虚血、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心外傷、心筋虚血、血管疾患、後天性心疾患、先天性心疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、機能不全伝導系（ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）、機能不全冠動脈（ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｉｅｓ）、肺高血圧症、心不整脈、筋ジストロフィー、筋肉量異常、筋変性、心筋炎、感染性心筋炎、薬物または毒素誘発性筋肉異常、過敏性心筋炎、及び自己免疫性心内膜炎からなる群から選択される心臓障害を治療するために、レシピエント対象に投与される。

【0637】

したがって、本明細書では、心外傷または心疾患もしくは障害の治療及び予防を必要とする対象における、その治療方法及び予防方法が提供される。本明細書に記載される方法は、多数の心疾患またはそれらの症状、例えば、心臓の構造及び／または機能への病理学的損傷をもたらすものなどを治療、改善、予防またはその進行を鈍化するために使用され得る。「心疾患」、「心臓障害」、及び「心外傷」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、弁、内皮、梗塞領域、または心臓の他の構成要素もしくは構造を含む、心臓に関する状態及び／または障害を指す。そのような心疾患または心臓関連疾患としては、とりわけ、心筋梗塞、心不全、心筋症、先天性心臓欠陥、心臓弁疾患もしくは機能不全、心内膜炎、リウマチ熱、僧帽弁逸脱、感染性心内膜炎、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、心肥大、及び／または僧帽弁閉鎖不全が挙げられるが、これらに限定されない。

【0638】

いくつかの実施形態では、心筋細胞前駆体は、成熟（最終段階）心筋細胞を含む子孫を生じさせることができる細胞を含む。心筋細胞前駆細胞は、多くの場合に転写因子のＧＡＴＡ－４、Ｎｋｘ２．５、及びＭＥＦ－２ファミリーから選択される１つ以上のマーカーを使用して同定され得る。いくつかの場合では、心筋細胞は、以下の一覧からの１つ以上のマーカー（時として少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つのマーカー）を発現する未熟心筋細胞または成熟心筋細胞を指す：心筋トロポニンＩ（ｃＴｎｌ）、心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、筋節ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ－４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ－カドヘリン、β２－アドレナリン受容体、ＡＮＦ、転写因子のＭＥＦ－２ファミリー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ－ＭＢ）、ミオグロビン、及び心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）。いくつかの実施形態では、心臓細胞は、自発的な周期的収縮活動を示す。いくつかの場合には、その心臓細胞が、適切なＣａ^２＋濃度及び電解質平衡を伴う好適な組織培養環境で培養される場合、細胞は、培養培地に任意の追加成分を添加する必要なく、細胞の一軸方向に周期的に収縮し、次いで収縮を解除することが観察され得る。いくつかの実施形態では、心臓細胞は、低免疫原性心臓細胞である。

【0639】

いくつかの実施形態では、インビトロでの分化によって低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞の集団から低免疫原性心臓細胞の集団を産生する方法は、（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む培養培地中でＨＩＰ細胞の集団を培養すること、（ｂ）ＷＮＴアンタゴニストを含む培養培地中でＨＩＰ細胞の集団を培養し、前駆心臓細胞の集団を産生すること、及び（ｃ）インスリンを含む培養培地中で前駆心臓細胞の集団を培養し、低免疫心臓細胞の集団を産生することを含む。いくつかの実施形態では、ＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体、またはそのバリアントである。いくつかの場合では、ＧＳＫ阻害剤は、約２ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、ＷＮＴアンタゴニストは、ＩＷＲ１、その誘導体、またはそのバリアントである。いくつかの場合では、ＷＮＴアンタゴニストは、約２ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。

【0640】

いくつかの実施形態では、低免疫原性心臓細胞の集団は、非心臓細胞から単離される。いくつかの実施形態では、低免疫原性心臓細胞の単離集団は、投与前に増殖される。ある特定の実施形態では、低免疫原性心臓細胞の単離集団は、投与前に増殖及び凍結保存される。

【0641】

人工多能性幹細胞または多能性幹細胞を心臓細胞に分化させる他の有用な方法は、例えば、ＵＳ２０１７／０１５２４８５、ＵＳ２０１７／００５８２６３、ＵＳ２０１７／０００２３２５、ＵＳ２０１６／０３６２６６１、ＵＳ２０１６／００６８８１４、ＵＳ９，０６２，２８９、ＵＳ７，８９７，３８９、及びＵＳ７，４５２，７１８に記載される。人工多能性幹細胞または多能性幹細胞から心臓細胞を産生する追加の方法は、例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００６，１５（５）：６３１－９、Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１２，１０：１６－２８、及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１５，ｌ５（２）：３６５－３７５に記載される。

【0642】

様々な実施形態では、低免疫原性心臓細胞は、ＢＭＰ経路阻害剤、ＷＮＴシグナル伝達活性化因子、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤、ＷＮＴアゴニスト、ＷＮＴアンタゴニスト、Ｓｒｃ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＣＫ活性化因子、サイトカイン、成長因子、心臓作用剤（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）、化合物などを含む培養培地中で培養され得る。

【0643】

ＷＮＴシグナル伝達活性化因子としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられるが、これに限定されない。ＰＣＫ活性化因子としては、ＰＭＡが挙げられるが、これに限定されない。ＷＮＴシグナル伝達阻害剤としては、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）、及びＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）、ならびにＸＡＶ９３９から選択される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。Ｓｒｃ阻害剤としては、Ａ４１９２５９が挙げられるが、これに限定されない。ＥＧＦＲ阻害剤としては、ＡＧ１４７８が挙げられるが、これに限定されない。

【0644】

ｉＰＳＣから心臓細胞を生成するための薬剤の非限定的な例としては、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、ＶＥＧＦ、可溶性ｆｒｉｚｚｌｅｄタンパク質、シクロスポリンＡ、アンジオテンシンＩＩ、フェニレフリン、アスコルビン酸、ジメチルスルホキシド、５－アザ－２’－デオキシシチジンなどが挙げられる。

【0645】

本明細書で提供される細胞は表面、例えば、低免疫原性多能性細胞の心臓細胞への分化を支援及び／または促進するための合成表面などの上で培養され得る。いくつかの実施形態では、表面は、選択される１つ以上のアクリレートモノマーのホモポリマーまたはコポリマーを含むが、これらに限定されないポリマー材料を含む。アクリレートモノマー及びメタクリレートモノマーの非限定的な例としては、テトラ（エチレングリコール）ジアクリレート、グリセロールジメタクリレート、１，４－ブタンジオールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ジ（エチレングリコール）ジメタクリレート、テトラ（エチエン（ｅｔｈｙｉｅｎｅ）グリコール）ジメタクリレート、１，６－ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、トリメチロールプロパンベンゾエートジアクリレート、トリメチロールプロパンエイホキシレート（ｅｉｈｏｘｙｌａｔｅ）（１ ＥＯ／ＱＨ）メチル、トリシクロ［５．２．１．０^２，６］デカンジメタノールジアクリレート、ネオペンチルグリコールエキソキシレート（ｅｘｈｏｘｙｌａｔｅ）ジアクリレート、及びトリメチロールプロパントリアクリレートが挙げられる。アクリレートは、当該技術分野において既知のように合成されるか、またはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．、及びＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃ．などの商業的業者から得られる。

【0646】

ポリマー材料は、支持体材料の表面上に分散され得る。細胞を培養するのに適した有用な支持体材料としては、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーもしくはコポリマー、それらの任意の組合せ、またはある材料の別の材料上へのコーティングが挙げられる。いくつかの場合では、ガラスとしては、ソーダ石灰ガラス、ｐｙｒｅｘガラス、ｖｙｃｏｒガラス、石英ガラス、ケイ素、またはそれらの誘導体などが挙げられる。

【0647】

いくつかの場合では、プラスチックまたは樹枝状ポリマーを含むポリマーとしては、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（酢酸ビニル－無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミンまたはそれらの誘導体などが挙げられる。いくつかの場合では、コポリマーとしては、ポリ（酢酸ビニル－ｃｏ－無水マレイン酸）、ポリ（スチレン－ｃｏ－無水マレイン酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－アクリル酸）またはそれらの誘導体などが挙げられる。

【0648】

本明細書に記載されるように調製される心臓細胞の有効性は、治療しない場合に左室壁組織の５５％が瘢痕組織となる、心臓凍結傷害の動物モデルにおいて評価され得る（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４，１９９６、Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９、Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５，１９９９）。治療の成功によって瘢痕の面積が減少し、瘢痕の拡大が制限されて、収縮期圧、拡張期圧、及び最大圧によって決定されるような心機能が改善し得る。心外傷はまた、左前下行枝の遠位部で塞栓コイルを使用してモデル化され得（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：２３９，１９９８）、治療の有効性は組織学及び心機能によって評価され得る。

【0649】

いくつかの実施形態では、操作心臓細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した心臓細胞などの集団が培養下で維持され、いくつかの場合には投与前に増殖させる。ある特定の実施形態では、心臓細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0650】

いくつかの実施形態では、本技術は、操作心臓細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した心臓細胞などを対象とし、これらは寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、心臓細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。ある特定の実施形態では、操作心臓細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、心臓細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作心臓細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、心臓細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作心臓細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子、ならびにＣＤ１４２遺伝子のうち１つ以上を破壊するゲノム改変を保有する。

【0651】

いくつかの実施形態では、提供される操作心臓細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作心臓細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した心臓細胞などは、患者（例えば、投与時のレシピエント）内で免疫応答を活性化しない。疾患の治療を必要とする対象（例えば、レシピエント）または患者に、本明細書に記載される操作心臓細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が提供される。

【0652】

いくつかの実施形態では、投与は、対象の心臓組織内への移植、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、または注入を含む。

【0653】

いくつかの実施形態では、操作心臓細胞を投与される患者はまた、心臓薬も投与される。併用療法での使用に好適な心臓薬の例示的な例としては、成長因子、成長因子をコードするポリヌクレオチド、血管新生剤、カルシウムチャネル遮断薬、降下剤、抗有糸分裂剤、変力剤、抗アテローム発生剤、抗凝固剤、ベータ遮断薬、抗不整脈剤、抗炎症剤、血管拡張薬、血栓溶解剤、強心配糖体、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、原生動物を阻害する薬剤、硝酸塩、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、抗腫瘍剤、ステロイドなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0654】

本明細書で提供される方法による療法の効果は、様々な方法でモニターされ得る。例えば、心電図（ＥＣＧ）またはホルター（ｈｏｌｉｅｒ）モニターが、治療の有効性を決定するために利用され得る。ＥＣＧは、心調律及び電気インパルスの尺度であり、療法が対象の心臓における電気伝導を改善もしくは維持、予防、またはその低下を鈍化しているかどうかを決定するために非常に効果的で非侵襲的方法である。心臓異常、不整脈障害などをモニターするために長時間にわたって装着され得る携帯型ＥＣＧのホルターモニターの使用もまた、療法の有効性を評価するための信頼できる方法である。ＥＣＧまたは核研究は、心室機能の改善を決定するために使用され得る。

【0655】

Ｖ．神経細胞
本明細書では、レシピエント対象への後続の移植または生着に有用である、記載されるような操作多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣ）から分化した異なる神経細胞型が提供される。当業者には理解されることになるように、分化方法は、既知の技術を使用する所望の細胞型に依存する。例示的な神経細胞型としては、脳内皮細胞、ニューロン（例えば、ドーパミン作動性ニューロン）、グリア細胞、グリア前駆細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0656】

いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞の分化は、特定の所望の系譜及び／または目的の細胞型へのそれらの分化を標的とするように、特定の細胞系譜（複数可）を産生することが知られている特定の因子に、細胞を曝露または接触させることによって実施される。いくつかの実施形態では、最終分化細胞は、特化した表現型特性または特徴を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される幹細胞は、神経外胚葉、神経、神経内分泌、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性（５－ＨＴ）、グルタミン酸作動性、ＧＡＢＡ作動性、アドレナリン作動性、ノルアドレナリン作動性、交感神経、副交感神経、交感末梢神経、またはグリア細胞の集団に分化される。いくつかの場合では、グリア細胞集団としては、ミクログリア（例えば、アメボイド型、ラミファイド型、活性化貪食、及び活性化非貪食）細胞集団もしくはマクログリア（中枢神経系細胞：アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞、及び放射状グリア、ならびに末梢神経系細胞：シュワン細胞及び衛星細胞）細胞集団、または先行する細胞のいずれかの前駆体及び前駆細胞が挙げられる。

【0657】

異なる神経細胞型を生成するためのプロトコールは、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１０１４４６９６号、米国特許第９，０５７，０５３号、同第９，３７６，６６４号、及び同第１０，２３３，４２２号に記載されている。低免疫原性多能性細胞を分化させる方法の追加の記載は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に見出され得る。神経障害または状態の動物モデルにおける神経細胞移植の効果を決定する方法が、以下の参考文献に記載されている：脊髄損傷については、Ｃｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８，２２，９４１－９５０、パーキンソン病については、Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４８：５９２－５９６、ＡＬＳについては、Ｉｚｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１８，９（１）：１５２及びＩｚｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＩｎｔｅｃｈＯｐｅｎ，ＤＯＩ：１０．５７７２／ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．７２８６２、てんかんについては、Ｕｐａｄｈｙａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１９，１１６（１）：２８７－２９６。

【0658】

いくつかの実施形態では、操作神経細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した神経細胞などの集団が培養下で維持され、いくつかの場合には投与前に増殖させる。ある特定の実施形態では、神経細胞の集団は、投与前に凍結保存される。

【0659】

いくつかの実施形態では、本技術は、操作神経細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した神経細胞などを対象とし、これらは寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、神経細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。ある特定の実施形態では、操作神経細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、神経細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作神経細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、神経細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。いくつかの実施形態では、操作神経細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、以下の遺伝子：Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子のうち１つ以上を破壊するゲノム改変を保有し、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、神経細胞は、１つ以上の補体インヒビターをさらに発現する。

【0660】

いくつかの実施形態では、提供される操作神経細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作神経細胞、例えば、１以上の個々のドナー（例えば、健康なドナー）に由来するｉＰＳＣから分化した神経細胞などは、患者（例えば、投与時のレシピエント）内で免疫応答を活性化しない。疾患の治療を必要とする対象（例えば、レシピエント）または患者に、本明細書に記載される操作神経細胞の集団を投与することによって疾患を治療する方法が提供される。

【0661】

いくつかの実施形態では、神経細胞は、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、他の神経変性疾患または状態、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、他の精神神経障害を治療するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される神経細胞は、脳卒中を治療または改善するために対象に投与される。いくつかの実施形態では、ニューロン及びグリア細胞は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を有する対象に投与される。

【0662】

１）脳内皮細胞
いくつかの実施形態では、脳内皮細胞（ＥＣ）、その前駆体、及び前駆細胞は、脳ＥＣまたは神経細胞の生成を促進する１つ以上の因子を含む培地中で細胞を培養することによって、表面上で多能性幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞）から分化される。いくつかの場合には、培地は、以下：ＣＨＩＲ－９９０２１、ＶＥＧＦ、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）、及びＹ－２７６３２のうち１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、培地は、神経細胞の生存及び機能性を促進するように設計されたサプリメントを含む。

【0663】

いくつかの実施形態では、脳内皮細胞（ＥＣ）、その前駆体、及び前駆細胞は、非馴化または馴化培地中で細胞を培養することによって、表面上で多能性幹細胞から分化される。いくつかの場合では、培地は、分化を促進または容易にする因子または小分子を含む。いくつかの実施形態では、培地は、ＶＥＧＲ、ＦＧＦ、ＳＤＦ－１、ＣＨＩＲ－９９０２１、Ｙ－２７６３２、ＳＢ４３１５４２、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の因子または小分子を含む。いくつかの実施形態では、分化用の表面は、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む。表面は、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされ得る。細胞は、懸濁液中で分化され、次いで細胞生存を容易にするためにゲルマトリックス形態、例えば、マトリゲル、ゼラチン、またはフィブリン／トロンビン形態などに入れられ得る。いくつかの場合には、分化は、一般に細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、当該技術分野において既知であるようにアッセイされる。

【0664】

いくつかの実施形態では、脳内皮細胞は、ＣＤ３１、ＶＥカドヘリン、及びそれらの組合せからなる群から選択される因子を発現または分泌する。ある特定の実施形態では、脳内皮細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）、ＣＤ１４６、ＣＸＣＲ４、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ－１、ＰＤＧＦ、ＧＬＵＴ－１、ＰＥＣＡＭ－１、ｅＮＯＳ、クローディン－５、オクルディン、ＺＯ－１、ｐ－糖タンパク質、フォンヴィルブランド因子、ＶＥ－カドヘリン、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、インスリン受容体（ＩＮＳＲ）、レプチン受容体（ＬＥＰＲ）、基底細胞接着分子（ＢＣＡＭ）、トランスフェリン受容体（ＴＦＲＣ）、終末糖化産物特異的受容体（ＡＧＥＲ）、レチノール取込み受容体（ＳＴＲＡ６）、大型中性アミノ酸輸送体小サブユニット１（ＳＬＣ７Ａ５）、興奮性アミノ酸輸送体３（ＳＬＣ１Ａ１）、ナトリウム共役中性アミノ酸輸送体５（ＳＬＣ３８Ａ５）、溶質輸送体ファミリー１６メンバー１（ＳＬＣ１６Ａ１）、ＡＴＰ依存性トランスロカーゼ（ＡＢＣＢ１）、ＡＴＰ－ＡＢＣＣ２結合カセット輸送体（ＡＢＣＧ２）、多剤耐性関連タンパク質１（ＡＢＣＣ１）、胆管側多選択性有機アニオン輸送体１（ＡＢＣＣ２）、多剤耐性関連タンパク質４（ＡＢＣＣ４）、及び多剤耐性関連タンパク質５（ＡＢＣＣ５）からなる群から選択される因子のうち１つ以上を発現または分泌する。

【0665】

いくつかの実施形態では、脳ＥＣは、密着結合の高発現、高電気抵抗、低開窓、小血管周囲腔、インスリン及びトランスフェリン受容体の高率発生、ならびに多数のミトコンドリアからなる群から選択される特徴のうち１つ以上を特徴とする。

【0666】

いくつかの実施形態では、脳ＥＣは、正の選択戦略を使用して選択または精製される。いくつかの場合には、脳ＥＣは、内皮細胞マーカー、例えば、これに限定されないが、ＣＤ３１などに対して選別される。言い換えれば、ＣＤ３１陽性脳ＥＣが単離される。いくつかの実施形態では、脳ＥＣは、負の選択戦略を使用して選択または精製される。いくつかの実施形態では、未分化または多能性幹細胞は、ＴＲＡ－１－６０及びＳＳＥＡ－１を含むが、これらに限定されない多能性マーカーを発現する細胞について選択することによって除去される。

【0667】

いくつかの実施形態では、脳内皮細胞は、脳出血の症状または影響を軽減するために投与される。いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンは、パーキンソン病を有する患者に投与される。いくつかの実施形態では、ノルアドレナリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンは、てんかん発作を経験した患者に投与される。いくつかの実施形態では、運動ニューロン、介在ニューロン、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト、及びミクログリアは、脊髄損傷を経験した患者に投与される。

【0668】

２）ドーパミン作動性ニューロン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＨＩＰ細胞は、神経幹細胞、神経前駆細胞、未成熟ドーパミン作動性ニューロン、及び成熟ドーパミン作動性ニューロンを含むドーパミン作動性ニューロンに分化される。

【0669】

いくつかの場合には、「ドーパミン作動性ニューロン」という用語は、ドーパミン合成のための律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現する神経細胞を含む。いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンは、神経伝達物質ドーパミンを分泌し、ドーパミンヒドロキシラーゼをほとんどまたは全く発現しない。ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンは、以下のマーカーのうち１つ以上を発現し得る：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、１－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、小胞モノアミン輸送体２、ドーパミン輸送体、Ｎｕｒｒ－ｌ、及びドーパミン－２受容体（Ｄ２受容体）。ある特定の場合では、「神経幹細胞」という用語は、神経細胞経路に沿って部分的に分化し、例えば、ネスチンを含む１つ以上の神経マーカーを発現する、多能性細胞の集団を含む。神経幹細胞は、ニューロンまたはグリア細胞（例えば、アストロサイト及びオリゴデンドロサイト）に分化されてよい。「神経前駆細胞」という用語は、ＦＯＸＡ２及び低レベルのｂ－チューブリンを発現するが、チロシンヒドロキシラーゼは発現しない培養細胞を含む。そのような神経前駆細胞は、本明細書に記載されるものなどの適切な因子の培養時に、様々な神経サブタイプ、特に様々なドーパミン作動性神経サブタイプに分化する能力を有する。

【0670】

いくつかの実施形態では、ＨＩＰ細胞に由来するＤＡニューロンは、神経変性疾患または状態を治療するために患者、例えば、ヒト患者に投与される。いくつかの場合には、神経変性疾患または状態は、パーキンソン病、ハンチントン病、及び多発性硬化症からなる群から選択される。他の実施形態では、ＤＡニューロンは、精神神経障害、例えば、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、及びうつ病などの１つ以上の症状を治療または改善するために使用される。さらに他の実施形態では、ＤＡニューロンは、ＤＡニューロン障害を有する患者を治療するために使用される。

【0671】

いくつかの実施形態では、ＤＡニューロン、その前駆体、及び前駆細胞は、１つ以上の因子または添加剤を含む培地中で幹細胞を培養することによって、多能性幹細胞から分化される。ＤＡニューロンの分化、成長、増殖、維持、及び／または成熟を促進する有用な因子及び添加剤としては、Ｗｎｔｌ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８ａ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ－ａ）、ＴＧＦ－ｂ、インターロイキン１ベータ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＳＫ－３阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ－９９０２１）、ＴＧＦ－ｂ阻害剤（例えば、ＳＢ－４３１５４２）、Ｂ－２７サプリメント、ドルソモルフィン、パルモルファミン、ノギン、レチノイン酸、ｃＡＭＰ、アスコルビン酸、ニュールツリン、ノックアウト血清代替物、Ｎ－アセチルシステイン、ｃ－ｋｉｔリガンド、それらの改変形態、それらの模倣物、それらの類似体、及びそれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＤＡニューロンは、ＷＮＴ経路、ＮＯＴＣＨ経路、ＳＨＨ経路、ＢＭＰ経路、ＦＧＦ経路などを活性化または阻害する１つ以上の因子の存在下で分化される。分化プロトコール及びその詳細説明は、例えば、ＵＳ９，９６８，６３７、ＵＳ７，６７４，６２０、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８，５０－５６、Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２００２，９９（４），２３４４－２３４９、Ｇｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１６，５（９）：１１３３－４４、及びＣｈｏ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２００８，１０５：３３９２－３３９７で提供され、実施例、方法、図、及び結果の詳細説明を含む、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0672】

いくつかの実施形態では、低免疫原性ドーパミン作動性ニューロンの集団は、非神経細胞から単離される。いくつかの実施形態では、低免疫原性ドーパミン作動性ニューロンの単離集団は、投与前に増殖される。ある特定の実施形態では、低免疫原性ドーパミン作動性ニューロンの単離集団は、投与前に増殖及び凍結保存される。

【0673】

ＤＡの分化を特徴付けてモニターし、ＤＡ表現型を評価するために、任意の数の分子マーカー及び遺伝子マーカーの発現が評価され得る。例えば、遺伝子マーカーの存在は、当業者に既知の様々な方法によって決定され得る。分子マーカーの発現は、定量方法、例えば、これらに限定されないが、ｑＰＣＲベースのアッセイ、イムノアッセイ、免疫細胞化学アッセイ、イムノブロッティングアッセイなどによって決定され得る。ＤＡニューロンに対する例示的なマーカーとしては、ＴＨ、ｂ－チューブリン、ペアードボックスタンパク質（Ｐａｘ６）、インスリン遺伝子エンハンサータンパク質（Ｉｓｌ１）、ネスチン、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、Ｇタンパク質活性型内向き整流性カリウムチャネル２（ＧＩＲＫ２）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ－２）、ＮＵＲＲ１、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＦＯＸ３、ダブルコルチン、及びＬＩＭホメオボックス転写因子ｌ－ベータ（ＬＭＸ１Ｂ）などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＤＡニューロンは、コリン、ＦＯＸＡ２、ＴｕＪ１、ＮＵＲＲ１、及びそれらの任意の組合せから選択されるマーカーのうち１つ以上を発現する。

【0674】

いくつかの実施形態では、ＤＡニューロンは、細胞の電気生理学的活性によって評価される。細胞の電気生理学は、当業者に既知のアッセイを使用することによって評価され得る。例えば、全細胞及び穿孔パッチクランプ法、細胞の電気生理学的活性を検出するためのアッセイ、細胞の活動電位の規模及び持続時間を測定するためのアッセイ、ならびにＤＡ細胞のドーパミン産生を検出するための機能アッセイ。

【0675】

いくつかの実施形態では、ＤＡニューロンの分化は、自発性の律動的活動電位、及び脱分極電流の注入時にスパイク頻度順応を伴う高周波活動電位を特徴とする。他の実施形態では、ＤＡの分化は、ドーパミンの産生を特徴とする。産生されるドーパミンのレベルは、それが最大振幅の半分に達した時点での活動電位の幅（スパイク半値幅）を測定することによって算出される。

【0676】

いくつかの実施形態では、分化したＤＡニューロンは、患者において静脈内に、または特定の位置での注射によるいずれかで移植される。いくつかの実施形態では、分化したＤＡ細胞は、パーキンソン病を招いた変性を有するＤＡニューロンを置換するために、脳の黒質（特に緻密部内に、もしくはそれに隣接する）、腹側被蓋野（ＶＴＡ）、尾状核、被殻、側坐核、視床下核、またはそれらの任意の組合せに移植される。分化したＤＡ細胞は、細胞懸濁液として標的領域に注射され得る。あるいは、分化したＤＡ細胞は、支持体マトリックスまたは足場内に、そのような送達デバイス内に収容される場合に埋め込まれ得る。いくつかの実施形態では、足場は生分解性である。他の実施形態では、足場は生分解性ではない。足場は、天然または合成（人工）材料を含み得る。

【0677】

ＤＡニューロンの送達は、好適なビヒクル、例えば、これらに限定されないが、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルなどを使用することによって達成され得る。他の実施形態では、分化したＤＡニューロンは、等張賦形剤を含む医薬組成物で投与される。医薬組成物は、ヒト投与のために十分に滅菌された条件下で調製される。いくつかの実施形態では、ＨＩＰ細胞から分化したＤＡニューロンは、医薬組成物の形態で供給される。細胞組成物の治療用製剤の一般原則は、Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ＆Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６、及びＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ＆Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００に見出され、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。

【0678】

幹細胞に由来するニューロンの有用な記載及びその作製方法は、例えば、Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２０１２，１：７０３－７１４、Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４８０：５４７－５５１、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，１１（１）：１７１－１８２、Ｌｏｒｅｎｚ Ｓｔｕｄｅｒ，“Ｃｈａｐｔｅｒ ８－Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｂｒｉｎｇｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ－Ｔｈｅ ＮＹＳＴＥＭ Ｔｒｉａｌ”ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，ｖｏｌｕｍｅ ２３０，ｐｇ．１９１－２１２、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１３，８：１６７０－１６７９、Ｕｐａｄｈｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，３８，２Ｄ．７．１－２Ｄ．７．４７、米国公開出願第２０１６０１１５４４８号、ならびにＵＳ８，２５２，５８６、ＵＳ８，２７３，５７０、ＵＳ９，４８７，７５２及びＵＳ１０，０９３，８９７に見出され得、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0679】

ＤＡニューロンに加えて、他の神経細胞、その前駆体、及び前駆細胞は、１つ以上の因子または添加剤を含む培地中で細胞を培養することによって、本明細書に概説されるＨＩＰ細胞から分化され得る。因子及び添加剤の非限定的な例としては、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ２７、塩基性ＦＧＦ、塩基性ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＳＭＡＤ阻害剤、Ｗｎｔアンタゴニスト、ＳＨＨシグナル伝達活性化因子、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＳＭＡＤ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、ノギンＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ３６４９４７、Ａ７７－０１、Ａ－８３－０１、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＧＷ６６０４、ＳＢ－５０５１２４、レルデリムマブ（ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、メテリムマブ、ＧＣ－Ｉ００８、ＡＰ－１２００９、ＡＰ－１１０Ｉ４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ－５０５１２４、Ｅ－６１６４５２（ＲｅｐＳｏｘ ＡＬＫ阻害剤）、ＳＤ－２０８、ＳＭＩ６、ＮＰＣ－３０３４５、Ｋ２６８９４、ＳＢ－２０３５８０、ＳＤ－０９３、アクチビン－Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２－Ｆｃ、ＤＭＨ－１、ドルソモルフィン二塩酸塩及びその誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｗｎｔアンタゴニストは、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ＤＫＫ－２、ＤＫＫ－３、ＤＫＫ－４、ＳＦＲＰ－１、ＳＦＲＰ－２、ＳＦＲＰ－３、ＳＦＲＰ－４、ＳＦＲＰ－５、ＷＩＦ－１、Ｓｏｇｇｙ、ＩＷＰ－２、ＩＷＲ１、ＩＣＧ－００１、ＫＹ０２１１、Ｗｎｔ－０５９、ＬＧＫ９７４、ＩＷＰ－Ｌ６及びその誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達活性化因子は、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）、ＳＡＧ類似体、ＳＨＨ、Ｃ２５－ＳＨＨ、Ｃ２４－ＳＨＨ、パルモルファミン、Ｈｇ－Ａｇ及び／またはその誘導体からなる群から選択される。

【0680】

いくつかの実施形態では、ニューロンは、グルタミン酸イオンチャネル型受容体ＮＭＤＡ型サブユニット１（ＧＲＩＮ１）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ１（ＧＡＤ１）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１－アルファ（ＬＭＸ１Ａ）、フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦＯＸＯ１）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ４（ＦＯＸＯ４）、ＦＯＸＧ１、２’，３’－環状－ヌクレオチド３’－ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、チューブリンベータ鎖３（ＴＵＢ３）、チューブリンベータ鎖３（ＮＥＵＮ）、溶質輸送体ファミリー１メンバー６（ＳＬＣ１Ａ６）、ＳＳＴ、ＰＶ、カルビンジン、ＲＡＸ、ＬＨＸ６、ＬＨＸ８、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ５、ＤＬＸ６、ＳＯＸ６、ＭＡＦＢ、ＮＰＡＳ１、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．２、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１、ＤＬＸ２、ＡＳＣＬ１、ＣｈＡＴ、ＮＧＦＩ－Ｂ、ｃ－ｆｏｓ、ＣＲＦ、ＲＡＸ、ＰＯＭＣ、ヒポクレチン、ＮＡＤＰＨ、ＮＧＦ、Ａｃｈ、ＶＡＣｈＴ、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２ｐ７５、ＣＯＲＩＮ、ＴＵＪ１、ＮＵＲＲ１、及び／またはそれらの任意の組合せからなる群から選択されるマーカーのうち１つ以上を発現する。

【0681】

３）グリア細胞
いくつかの実施形態では、記載される神経細胞としては、多能性幹細胞を治療上有効なグリア細胞などに分化させることによって産生されるグリア細胞、例えば、これらに限定されないが、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞及びシュワン細胞、そのグリア前駆体、ならびにグリア前駆細胞などが挙げられる。低免疫原性多能性幹細胞の分化は、低免疫原性グリア細胞などの低免疫原性神経細胞を産生する。

【0682】

いくつかの実施形態では、グリア細胞、その前駆体、及び前駆細胞は、レチノイン酸、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＣＬ２、ＴＧＦベータ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達活性化因子、ＦＧＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＰＤＧＦＲ－アルファ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、ノギン、ＳＨＨ、ドルソモルフィン、ノギン、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の薬剤を含む培地中で多能性幹細胞を培養することによって生成される。ある特定の場合では、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、またはそれらの組合せである。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニュートロトロフィン（ｎｅｕｔｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）－３（ＮＴ－３）、ＮＴ－４、ＥＧＦ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＦＧＦ８、ＥＧＦＲ、ＯＬＩＧ１、ＯＬＩＧ２、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ＧＡＰ－４３、ＬＮＧＦＲ、ネスチン、ＧＦＡＰ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＩＢＡ－１、ＴＭＥＭ１１９、ＣＤ４５、及びそれらの任意の組合せを発現する。例示的な分化培地は、当業者によって認識されるように、グリア細胞型の生成を容易または可能にする場合がある任意の特定の因子及び／または小分子を含み得る。

【0683】

インビトロ分化プロトコールに従って生成される細胞が、グリア細胞の特性及び特徴を示すかどうかを決定するために、動物モデルに細胞が移植され得る。いくつかの実施形態では、グリア細胞は、免疫不全マウス、例えば、免疫不全シバラーマウスに注射される。グリア細胞はマウスの脳に投与され、事前に選択した時間後に移植細胞が評価される。いくつかの場合では、脳内の移植細胞は、免疫染色及びイメージング法を使用することによって可視化される。いくつかの実施形態では、グリア細胞が既知のグリア細胞バイオマーカーを発現することが決定される。

【0684】

幹細胞からグリア細胞、その前駆体、及び前駆細胞を生成する有用な方法は、例えば、ＵＳ７，５７９，１８８、ＵＳ７，５９５，１９４、ＵＳ８，２６３，４０２、ＵＳ８，２０６，６９９、ＵＳ８，２５２，５８６、ＵＳ９，１９３，９５１、ＵＳ９，８６２，９２５、ＵＳ８，２２７，２４７、ＵＳ９，７０９，５５３、ＵＳ２０１８／０１８７１４８、ＵＳ２０１７／０１９８２５５、ＵＳ２０１７／０１８３６２７、ＵＳ２０１７／０１８２０９７、ＵＳ２０１７／２５３８５６、ＵＳ２０１８／０２３６００４、ＷＯ２０１７／１７２９７６、及びＷＯ２０１８／０９３６８１に見出される。多能性幹細胞を分化させる方法は、例えば、Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４８，５９２－５９６、Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，５４７－５５１、Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，３３７－５０、Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００４，１０１，１２５４３－１２５４８、Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，２７，２７５－２８０、及びＫｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１２，１，７０３－７１４に記載されている。

【0685】

脊髄損傷に対する神経細胞移植の有効性は、例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９９，５：１４１０）及びＫｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：５０によって記載されるような、急性脊髄損傷のラットモデルにおいて評価され得る。例えば、移植の成功によって、２～５週間後の病変中における移植由来細胞の存在、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、及び／またはニューロンへの分化、ならびに病変端部から脊髄に沿った遊走、ならびに歩行、協調、及び体重負荷の改善が示される場合がある。特定の動物モデルは、神経細胞型及び治療される神経疾患または状態に基づいて選択される。

【0686】

神経細胞は、それらが意図される組織部位に生着し、機能不全の領域を再構成または再生することを可能にする様式で投与され得る。例えば、神経細胞は、治療されている疾患によって、中枢神経系の実質部位または髄腔内部位に直接移植され得る。いくつかの実施形態では、脳内皮細胞、ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、上衣細胞、アストロサイト、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト、及びシュワン細胞を含む、本明細書に記載される神経細胞のいずれも、静脈内、脊髄内、脳室内、髄腔内、動脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、筋肉内、腹内、眼内、球後及びそれらの組合せによって患者に注射される。いくつかの実施形態では、細胞は、ボーラス注射または持続注入の形態で注射または沈着される。ある特定の実施形態では、神経細胞は、脳への注射、脳に適切に、及びそれらの組合せによって投与される。注射は、例えば、対象の頭蓋に作製された穿頭孔を介して行われ得る。脳への神経細胞の投与に好適な部位としては、脳室、側脳室、大槽、被殻、基底核、海馬皮質、線条体、脳の尾状領域及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

【0687】

本技術に使用するためのドーパミン作動性ニューロンを含む神経細胞の追加の記載は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見出され、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0688】

Ｗ．造血幹細胞（ＨＳＣ）
いくつかの実施形態では、操作細胞は造血幹細胞である。いくつかの場合には、造血幹細胞は、白血球、赤血球、及び血小板を含む、全ての種類の血液細胞に発達し得る未成熟細胞である。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、末梢血及び骨髄に見られる。いくつかの場合には、造血幹細胞は、末梢血または骨髄から単離される。

【0689】

いくつかの実施形態では、操作ＨＳＣまたは操作ＨＳＣを含む集団は、造血器疾患または障害を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、造血器疾患または障害は、骨髄異形成症、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、鎌状赤血球症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、シュワッハマン・ダイアモンド障害、コストマン症候群、慢性肉芽腫症、副腎白質ジストロフィー、白血球接着不全、血友病、サラセミア、ベータ－サラセミア、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄）白血病（ＡＭＬ）、成人リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖性重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、慢性肉芽腫症、チェディアック・東症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはＡＩＤＳである。

【0690】

いくつかの実施形態では、操作ＨＳＣまたは操作ＨＳＣを含む集団は、白血病もしくは骨髄腫と関連する細胞欠損症を治療するために、または白血病もしくは骨髄腫を治療するために投与される。

【0691】

いくつかの実施形態では、操作ＨＳＣまたは操作ＨＳＣを含む集団は、自己免疫疾患もしくは状態と関連する細胞欠損症を治療するために、または自己免疫疾患もしくは状態を治療するために投与される。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患または状態は、急性散在性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫増殖症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病、バロー同心円硬化症、ベーチェット症候群、バージャー病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん皮膚硬化型全身性強皮症、ドレスラー症候群、円板状エリテマトーデス、湿疹、付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバン症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性肺胞炎、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、炎症性脱髄性多発神経炎、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ルー・ゲーリック病、ルポイド肝炎、エリテマトーデス、Ｍａｊｅｅｄ症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織病、限局性強皮症（ｍｏｒｐｈｅａ）、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経脊髄炎、ニューロミオトニア、眼瘢痕性類天疱瘡、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎（ｏｒｄ ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スティル病、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、Ｓｕｓａｃ症候群、Ｓｗｅｅｔ症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、未分化脊椎関節症、血管炎、白斑またはウェゲナー肉芽腫症である。

【0692】

８．ＡＢＯ式及びＲＨ抗原発現
血液製剤は、人の体内における、全ての赤血球の表面上における抗原の有無によって異なる群に分類され得る（ＡＢＯ血液型）。Ａ、Ｂ、ＡＢ、及びＡｌ抗原は、赤血球の糖タンパク質上におけるオリゴ糖の配列によって決定される。血液型抗原群中の遺伝子は、抗原タンパク質を作製するための指示を提供する。血液型抗原タンパク質は、赤血球の細胞膜内で様々な機能を果たす。これらのタンパク質機能としては、他のタンパク質及び分子の細胞内への輸送及び細胞外への輸送、細胞構造の維持、他の細胞及び分子への結合、ならびに化学反応への関与が挙げられる。

【0693】

Ｒｈ因子（Ｒｈ）血液型は、ＡＢＯ血液型系に次いで２番目に重要な血液型系である。Ｒｈ血液型系は、４９の定義された血液型抗原からなり、そのうち５つの抗原、すなわち、Ｄ、Ｃ、ｃ、Ｅ、及びｅが最も重要である。個体のＲｈ（Ｄ）状態は、通常、ＡＢＯ式の後に陽性または陰性の接尾辞を伴って記載される。「Ｒｈ因子」、「Ｒｈ陽性」、及び「Ｒｈ陰性」という用語は、Ｒｈ（Ｄ）抗原のみを指す。Ｒｈ抗原に対する抗体は、溶血性輸血反応に関与し得、Ｒｈ（Ｄ）及びＲｈ（ｃ）抗原に対する抗体は、胎児及び新生児の溶血性疾患の重大なリスクを与える。ＡＢＯ抗体は、全てのヒトにおいて出生初期に発現する。しかしながら、Ｒｈ－ヒトにおけるＲｈ抗体は、典型的には人が感作される場合に限って発現する。これは、例えば、Ｒｈ＋の子を出産すること、またはＲｈ＋輸血を受けることによって発生し得る。

【0694】

Ａ、Ｂ、Ｈ、及びＲｈ抗原は、血液、組織及び細胞移植のためのドナーとレシピエントとの間における組織適合性の主要な決定因子である。ＡＢＯ遺伝子によってコードされるグリコシルトランスフェラーゼ活性は、細胞の表面上に示される、Ａ、Ｂ、ＡＢ、Ｏ組織血液型抗原の産生に関与する。Ａ型の個体は、ａ（ｌ，３）Ｎ－アセチルガラクトサミン転移酵素活性をもたらす特異性を有するＡＢＯ遺伝子産物をコードし、Ｂ型の個体は、ａ（ｌ，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ活性をもたらす特異性を有するＡＢＯ遺伝子産物をコードする。Ｏ型の個体は、機能的なガラクトシルトランスフェラーゼを全く生成しないため、いずれの修飾も行わない。ＡＢ型の個体は各々の１つのコピーを保有し、両方の種類の修飾を行う。ＡＢＯ遺伝子の酵素産物は、基質としてＨ抗原に作用し、それゆえ、ＡＢＯ活性を欠くＯ型の個体は非修飾Ｈ抗原を提示するため、多くの場合にＯ（Ｈ）型と称される。

【0695】

Ｈ抗原自体は、ＦＵＴＩ遺伝子によってコードされる、ａ（ｌ，２）フコシルトランスフェラーゼ酵素の産物である。極めてまれな個体では、ＦＵＴＩ遺伝子の破壊の結果としてＨ抗原の完全な喪失が存在し、ＡＢＯについてＡまたはＢの組織血液型を生成するための基質が存在しないことになる。これらの個体は、ボンベイ組織血液型であると言われている。Ｒｈ抗原はＲＨＤ遺伝子によってコードされ、Ｒｈ陰性の個体はＲＨＤ遺伝子の欠失または破壊を保有する。

【0696】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞または細胞集団は、ＡＢＯ式Ｏ型Ｒｈ因子陰性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＯ式Ｏ型Ｒｈ因子陰性細胞は、ＡＢＯ式Ｏ型Ｒｈ因子陰性ドナーに由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＢＯ式Ｏ型Ｒｈ因子陰性細胞は、ＡＢＯ式Ａ型、ＡＢＯ式Ｂ型、またはＲｈ因子抗原の提示を欠くように操作される。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ式Ｏ型及び／またはＲｈ陰性細胞は、ＡＢＯ遺伝子の部分的もしくは完全な不活性化（例えば、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異による、もしくはＡＢＯ遺伝子のエクソン６ ２５８ｄｅｌＧ変異の挿入による）を含み、及び／またはＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的もしくは完全に不活性化される。いくつかの実施形態では、ＡＢＯ式Ｏ型Ｒｈ陰性細胞は、ＦＵＴ１遺伝子の部分的もしくは完全な不活性化を含み、及び／またはＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子の有害な変異によって部分的もしくは完全に不活性化される。いくつかの実施形態では、操作ＡＢＯ式Ｏ型及び／またはＲｈ因子陰性細胞は、例えば、Ａ型細胞からＯ型細胞、Ｂ型細胞からＯ型細胞、ＡＢ型細胞からＯ型細胞、Ａ＋型細胞からＯ－型細胞、Ａ－型細胞からＯ－型細胞、ＡＢ＋型細胞からＯ－型細胞、ＡＢ－型細胞からＯ－型細胞、Ｂ＋型細胞からＯ－型細胞、及びＢ－型細胞からＯ－型細胞に改変するために遺伝子編集を使用して生成される。例示的な操作ＡＢＯ式Ｏ型Ｒｈ因子陰性細胞及びその生成方法は、ＷＯ２０２１／１４６２２２に記載され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0697】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現増加を含む、本明細書に提供される細胞もしくは細胞集団は、ＡＢＯ式Ａ型、ＡＢＯ式Ｂ型、もしくはＡＢＯ式ＡＢ型であり、及び／またはＣＤ４６及びＣＤ５９の発現増加を含む、本明細書に提供される細胞もしくは細胞集団は、Ｒｈ因子陽性である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４６及びＣＤ５９の発現増加を含む細胞は、ＣＤＣ反応を誘発することなく、ＡＢＯ及び／またはＲｈ因子不適合レシピエント患者に投与され得る。

【0698】

９．性染色体
ある特定の態様では、性染色体を有する細胞は、ある特定の抗原（例えば、Ｙ抗原）を発現する場合があり、レシピエントは、そのような抗原に対する既存の感受性を有する場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、男性胎児を妊娠している女性は、男性ドナーからの細胞を拒絶する場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、ドナーは男性であり、レシピエントは男性である。いくつかの実施形態では、ドナーは女性であり、レシピエントは女性である。いくつかの実施形態では、操作細胞は、プロトカドヘリンＹ及び／またはニューロリギンＹなどの抗原の発現を減少させる改変を含む。いくつかの実施形態では、プロトカドヘリンＹ（ＰＣＤＨ１１Ｙ、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＧ００００００９９７１５）をコードする遺伝子は、操作細胞内で減少するか、または排除される、例えば、ノックアウトされる。いくつかの実施形態では、ニューロリギンＹ（ＮＬＧＮ４Ｙ、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＧ０００００１６５２４６）をコードする遺伝子は、操作細胞内で減少するか、または排除される、例えば、ノックアウトされる。遺伝子の発現を減少させるか、または排除する任意の方法、例えば、本明細書に記載される任意の方法などが使用され得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＤＨ１１Ｙ及び／またはＮＬＧＮ４Ｙは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどを使用して、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集方法によって操作細胞内で減少するか、または排除される。

【0699】

Ｄ．操作細胞の例示的な実施形態
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、操作ベータ島細胞、肝細胞、または移植中に血液と接触する他の細胞型）及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、及びＭＨＣクラスＩ複合体の１つ以上の分子の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せから選択される１つ以上の外因性補体インヒビターポリペプチドを発現する。

【0700】

いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、及びＢ２Ｍの発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、及びＣＩＩＴＡの発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、及びＮＬＲＣ５の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの１つ以上の分子の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＢ２Ｍ及びＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現減少を示す。本明細書に記載される細胞のいずれも、ＤＵＸ４、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－３９、ＦａｓＬ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、Ｍｆｇｅ８、及びＳｅｒｐｉｎｂ９を含むが、これらに限定されない群から選択される１つ以上の因子の発現増加も示し得る。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せから選択される１つ以上の外因性補体インヒビターポリペプチドを発現する。

【0701】

いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＭＨＣクラスＩ複合体の１つ以上の分子の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＢ２Ｍの発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＣＩＩＴＡの発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＮＬＲＣ５の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの１つ以上の分子の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＢ２Ｍ及びＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現減少を示す。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ＣＤ１４２の発現減少、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現減少を示す。

【0702】

当業者は、遺伝子、タンパク質または分子の発現増加または発現減少などの発現のレベルが、同等の細胞を参照し得るか、またはそれと比較され得ると理解することになる。いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＣＤ４７、または任意の他の寛容原性因子）の発現増加を有する操作細胞（例えば、操作ベータ島細胞または肝細胞）は、非改変細胞と比較してより高いレベルのタンパク質を有する改変細胞（例えば、操作ベータ島細胞または肝細胞）を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、ＣＤ４７、または任意の他の寛容原性因子）の発現増加を有する操作細胞（例えば、操作ベータ島細胞または肝細胞）は、改変を含む細胞（例えば、操作ベータ島細胞または肝細胞）であり、改変を含む細胞は、改変を含まない細胞と比較してより高いレベルのタンパク質を有する（例えば、改変を含まない幹細胞は、他の改変を含む場合がある）。いくつかの実施形態では、タンパク質（例えば、ＣＤ１４２、Ｂ２Ｍ、またはＣＩＩＴＡ）の発現減少を有する操作細胞（例えば、操作ベータ島細胞または肝細胞）は、改変を含む細胞であり、改変を含む細胞は、改変を含まない細胞と比較して、より低いレベルのタンパク質またはＲＮＡを有する（例えば、改変を含まない幹細胞は、他の改変を含む場合がある）。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せから選択される１つ以上の外因性補体インヒビターポリペプチドを発現する。

【0703】

一実施形態では、本明細書では、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現し、ＣＤ１４２の発現減少、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ複合体タンパク質、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ複合体タンパク質、またはＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ複合体タンパク質の任意の組合せの、いずれかの発現減少を有する操作細胞（例えば、操作ベータ島細胞または肝細胞）が提供される。別の実施形態では、細胞は、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現し、減少したレベルのＣＤ１４２、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現し、ＣＤ１４２、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子の改変を有する。いくつかの場合では、改変は、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子を不活性化する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せから選択される１つ以上の外因性補体インヒビターポリペプチドを発現する。

【0704】

いくつかの実施形態では、細胞（例えば、操作ベータ島細胞、肝細胞、または移植中に血液と接触する他の細胞型）及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、及びＭＨＣクラスＩ複合体の１つ以上の分子の発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ならびにＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せから選択される１つ以上の外因性補体インヒビターポリペプチドを発現する。

【0705】

いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加及びＢ２Ｍの発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加及びＣＩＩＴＡの発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加及びＮＬＲＣ５の発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ならびにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの１つ以上の分子の発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ならびにＢ２Ｍ及びＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７の発現増加、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５の１つ以上の分子の発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。本明細書に記載される細胞のいずれも、ＤＵＸ４、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＩＬ－３９、ＦａｓＬ、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、Ｍｆｇｅ８、及びＳｅｒｐｉｎｂ９を含むが、これらに限定されない群から選択される１つ以上の因子の発現増加も示し得る。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せから選択される１つ以上の外因性補体インヒビターポリペプチドを発現する。

【0706】

いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ならびにＭＨＣクラスＩ複合体の１つ以上の分子の発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ならびにＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ならびにＭＨＣクラスＩＩ及びＭＨＣクラスＩＩ複合体の１つ以上の分子の発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ならびにＢ２Ｍの発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ならびにＣＩＩＴＡの発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、細胞及びその集団は、ＣＤ４７ならびにＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの補体インヒビターの発現増加、ならびにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの１つ以上の分子の発現減少を示し、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて投与される。

【0707】

一実施形態では、本明細書では、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ複合体タンパク質、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ複合体タンパク質、またはＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ複合体タンパク質の任意の組合せの、いずれかの発現減少を有する操作細胞（例えば、操作ベータ島細胞または肝細胞）が提供される。別の実施形態では、細胞は、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現し、減少したレベルのＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、外因性ＣＤ４７ポリペプチドを発現し、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子の改変を有する。いくつかの場合では、改変は、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡ遺伝子を不活性化する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、ＣＤ５５、及びそれらの任意の組合せから選択される１つ以上の外因性補体インヒビターポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、抗凝固剤（例えば、ヘパリン、メラガトラン、ＬＭＷ－ＤＳ、Ｎ－アセチルシステイン、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣ）と組み合わせて患者に投与される。

【0708】

Ｅ．低免疫原性表現型に関するアッセイ
いくつかの実施形態では、提供される操作細胞は、患者（例えば、レシピエント対象）に投与される場合、それらが免疫認識及び応答を回避できるように改変される。細胞は、インビトロ及びインビボで免疫細胞による死滅を回避し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、マクロファージ及びＮＫ細胞による死滅を回避する。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞または対象の免疫系によって無視される。言い換えれば、本明細書に記載される方法に従って投与される細胞は、免疫系の免疫細胞によって検出不可能である。いくつかの実施形態では、細胞は覆い隠されるため、免疫拒絶を回避する。

【0709】

本明細書に提供される操作細胞が、免疫認識を回避するかどうかを決定する方法としては、ＩＦＮ－γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、ミクログリア死滅アッセイ、細胞移植動物モデル、サイトカイン放出アッセイ、ＥＬＩＳＡ、生物発光イメージングまたはクロム放出アッセイまたはＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ分析を使用した死滅アッセイ、混合リンパ球反応、免疫蛍光分析などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0710】

いくつかの実施形態では、細胞の免疫原性は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて評価される。ＣＤＣは、補体を含有する血清の存在下で細胞表面上に発現されるＨＬＡ非依存性抗原を標的とするＩｇＧまたはＩｇＭ抗体と共に細胞をインキュベートし、細胞死滅を分析することによってインビトロでアッセイされ得る。いくつかの実施形態では、ＣＤＣは、ＡＢＯ血液型不適合血清と共に細胞をインキュベートすることによってアッセイされ得、細胞はＡ抗原またはＢ抗原を含み、血清は、細胞のＡ抗原及び／またはＢ抗原に対する抗体を含む。

【0711】

いくつかの実施形態では、操作細胞が本明細書に記載されるように改変または生成されると、それらは、その低免疫原性についてアッセイされてよい。様々なアッセイのいずれも、細胞が低免疫原性であるか、または免疫系を回避し得るかどうかを評価するために使用され得る。例示的なアッセイは、ＷＯ２０１６１８３０４１及びＷＯ２０１８１３２７８３に記載されるようないずれかを含む。

【0712】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される操作細胞は、宿主免疫応答を刺激することなく、１週間以上（例えば、細胞及び／またはその子孫の生存期間において、例えば、１週間、２週間、１か月、２か月、３か月、６か月、１年、２年、３年、４年、５年またはそれを超えて）宿主内で生存する。細胞は、それらが宿主内で生存する限り、導入遺伝子の発現を維持し、及び／または標的遺伝子の発現を欠失もしくは減少させる。いくつかの態様では、導入遺伝子がもはや発現されない場合、及び／または標的遺伝子が発現される場合、操作細胞は宿主の免疫系によって除去されてよい。いくつかの実施形態では、操作細胞の持続性または生存は、レシピエントにそれらを投与した後、細胞がインビボで検出されることを可能にするタンパク質（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質、切断型受容体または他の代理マーカーもしくは他の検出可能マーカー）をコードする導入遺伝子をさらに発現することによってモニターされてよい。

【0713】

低免疫原性細胞は、それらが意図される組織部位に生着し、機能不全の領域を再構成または再生することを可能にする様式で投与される。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、移植（例えば、移植の成功）についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の移植は、事前に選択した時間後に評価される。いくつかの実施形態では、移植細胞は、細胞生存についてモニターされる。例えば、細胞生存は、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によってモニターされてよく、細胞は、細胞生存をモニターするためにルシフェラーゼ発現構築物で形質導入される。いくつかの実施形態では、移植細胞は、当該技術分野において既知の免疫染色及びイメージング法によって可視化される。いくつかの実施形態では、移植細胞は、移植の成功を決定するために検出されてよい既知のバイオマーカーを発現する。例えば、フローサイトメトリーが、特定のバイオマーカーの表面発現を決定するために使用されてよい。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、予想されるように（例えば、低免疫原性細胞の移植の成功）、意図される組織部位に移植される。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、必要に応じて意図される組織部位、例えば、細胞欠損の部位などに移植される。いくつかの実施形態では、免疫原性低細胞は、改変を含まない同じ型の細胞と同じ様式で、意図される組織部位に移植される。

【0714】

いくつかの実施形態では、操作細胞（例えば、ＣＤ１４２の発現減少を含む改変を含む操作ベータ島細胞もしくは肝細胞）の集団または組合せを投与すること（例えば、操作細胞集団を抗凝固剤と組み合わせて投与すること）は、移植中に細胞を血液に曝露した結果として生じるＩＢＭＩＲを、細胞が回避または減少させることを可能にすることによって、生存及び移植を改善する。いくつかの実施形態では、ＩＢＭＩＲの減少は、移植中に生じる細胞消失（例えば、移植した膵島または肝細胞の消失）の量を減少させる。

【0715】

いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、機能についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、意図される組織部位にそれらを移植する前に機能についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、意図される組織部位に移植した後、機能についてアッセイされる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の機能は、事前に選択した量の後に評価される。いくつかの実施形態では、移植細胞の機能は、細胞が検出可能な表現型を産生する能力によって評価される。例えば、移植ベータ島細胞の機能は、糖尿病によって失われた糖コントロールの回復に基づいて評価されてよい。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の機能は、予想される通りである（例えば、抗体媒介性拒絶を回避しながらの、低免疫原性細胞の機能の成功）。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の機能は必要とされる通りであり、例えば、抗体媒介性拒絶を回避しながらの、細胞欠損の部位における十分な機能などである。いくつかの実施形態では、操作細胞は、同じ型の非操作細胞と同じ様式で機能する。

【0716】

１０．即時血液媒介性炎症反応
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞は、即時血液媒介性炎症反応を回避する。臨床膵島移植の転帰不良の主な要因は、破壊的な即時血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）の発生であり、これは膵島が門脈内で血液に遭遇する場合に移植組織の喪失を招く（Ｂｅｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４８：１９０７－１９１４、Ｍｏｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｌａｎｃｅｔ ３６０：２０３９－２０４５）。本反応は、一連の他の炎症事象と組み合わされた、膵島の内分泌細胞による組織因子（ＴＦ）発現、例えば、ＭＣＰ－１（Ｐｉｅｍｏｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５１：５５－６５）、ＩＬ－８、及びＭＩＦ（Ｗａｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：４７８２－４７８７、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６（２）：３０５）の発現などによって誘発される。

【0717】

即時血液媒介性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）は、ＣＤ１４２を発現する細胞が血液と接触する場合に生じ得る、非特異的な炎症反応及び血栓反応である。ＩＢＭＩＲは、門脈内でのヒト血液への曝露によって迅速に開始される。これは補体、血小板、及び凝固経路の活性化を特徴とし、次いでそれは好中球の動員をもたらす。ＩＢＭＩＲは、移植膵島または肝細胞の著しい消失を引き起こす。いくつかの実施形態では、本明細書では、細胞の移植または血液への細胞の曝露と関連するＩＢＭＩＲを減少させる組成物（例えば、他の本明細書に記載される改変のうち１つ以上と組み合わせた、ＣＤ１４２の発現減少を含む操作細胞）、組合せ（例えば、本明細書に記載される操作細胞集団のいずれか及び凝固を減少させる抗凝固剤を含む組合せ）、ならびに方法（例えば、本明細書に記載される操作細胞集団のいずれか及び凝固を減少させる抗凝固剤を投与することを含む、患者を治療する方法）が提供される。

【0718】

いくつかの実施形態では、ＩＢＭＩＲはインビトロで、例えば、ＩＢＭＩＲのインビトロチュービングループモデルでアッセイされ得、これは米国特許第７，０４５，５０２号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）で以前に記載されている。

【0719】

いくつかの実施形態では、ＩＢＭＩＲは、インビボで（例えば、哺乳動物またはヒト患者において）移植周期中に血液試料を採取し、トロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）、Ｃ－ペプチド、第ＸＩａ因子－アンチトロンビン（ＦＸＩａ－ＡＴ）、第ＸＩＩａ因子－アンチトロンビン（ＦＸＩＩａ－ＡＴ）、トロンビン－アンチトロンビン（ＴＡＴ）、プラスミン－アルファ２アンチプラスミン（ＰＡＰ）、及び／または補体Ｃ３ａの血漿レベルを評価することによってアッセイされ得る。いくつかの実施形態では、ＩＢＭＩＲは、移植細胞の注入中、及び／または移植後の期間（例えば、移植後最大３時間、５時間、１０時間、もしくは１０時間超）においてＴＡＴ、Ｃ－ペプチド、ＦＸＩａ－ＡＴ、ＦＸＩＩａ－ＡＴ、ＰＡＰ、及び／または補体Ｃ３ａのレベル増加と関連する。いくつかの実施形態では、ＩＢＭＩＲは、遊離循環血小板数をモニターすることによってアッセイされ得、移植中または移植後の血小板数の低減は、ＩＢＭＩＲと（例えば、ＩＢＭＩＲによる血小板消費と）関連する。

【0720】

１１．補体依存性細胞傷害
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞（例えば、ベータ膵島）は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を回避する。いくつかの実施形態では、ＣＤＣは、ＩＢＭＩＲの血栓反応に続発する。いくつかの実施形態では、ＣＤＣは、ＩＢＭＩＲとは無関係に生じる。

【0721】

いくつかの実施形態では、ＣＤＣに対する細胞の感受性は、当業者によって理解される標準的なプロトコールに従ってインビトロで分析され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤＣは、補体系の成分を含む血清（例えば、ヒト血清）を、抗体（例えば、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体）によって結合される標的細胞と混合し、次いで細胞死を決定することによってインビトロで分析され得る。いくつかの実施形態では、ＣＤＣに対する細胞の感受性は、補体系の成分、ならびに細胞のＡＢＯ式Ａ型、ＡＢＯ式Ｂ型、及び／またはＲｈ因子抗原に対する抗体を含む、ＡＢＯ不適合またはＲｈ因子不適合血清の存在下で細胞をインキュベートすることによってインビトロで分析され得る。

【0722】

一般的なＣＤＣアッセイは、標的細胞に放射性化合物を事前に負荷することによって細胞死を決定する。細胞が死滅すると、放射性化合物が細胞から放出される。したがって、細胞死を媒介する抗体の有効性は、放射能レベルによって決定される。放射性ＣＤＣアッセイとは異なり、非放射性ＣＤＣアッセイは、多くの場合に蛍光または発光測定を用いて豊富な細胞成分、例えば、ＧＡＰＤＨなどの放出を決定する。いくつかの実施形態では、ＣＤＣによる細胞死滅は、ラベルフリープラットフォーム、例えば、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）（Ａｇｉｌｅｎｔ）などを使用して分析され得る。

【0723】

ＩＩＩ．操作細胞の集団及び医薬組成物
本明細書では、提供される複数の操作細胞を含有する操作細胞集団が提供される。

【0724】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、本明細書に記載される改変のセットを含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる、及びＣＤ１４２の発現を減少させる改変のセットを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子が、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ、及びＨ２－Ｍ３、またはそれらの任意の組合せのうち１つ以上である。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0725】

いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む。いくつかの実施形態では、集団内の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ１４２遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む。

【0726】

また本明細書では、操作細胞または操作細胞の集団を含む組成物も提供される。いくつかの実施形態では、本組成物は医薬組成物である。

【0727】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントにとって非毒性であり、これらとしては、緩衝液、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸など、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベンなど、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンなど、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなど、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖、二糖、及び他の炭水化物、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡなど、糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなど、塩形成対イオン、例えば、ナトリウムなど、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（ＴＷＥＥＮ（商標））、ポロキサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸着、または浸透を改変、維持または保持するための１つ以上の賦形剤を含有し得る。いくつかの態様では、当業者は、細胞を含有する医薬組成物が、タンパク質を含有する医薬組成物とは異なる場合があると理解する。

【0728】

「医薬製剤」という用語は、調製物の中に含有される活性成分の生物活性の有効化を可能にするような形態であり、製剤が投与されることになる対象にとって許容できないほど有毒である追加成分を全く含有しない調製物を指す。

【0729】

「薬学的に許容される担体」は、対象にとって非毒性である、活性成分以外の医薬製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0730】

いくつかの実施形態における医薬組成物は、疾患または状態を治療または予防するのに効果的な量、例えば、治療有効量または予防有効量などで本明細書に記載されるような操作細胞を含有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、疾患または状態を治療または予防するのに効果的な量、例えば、治療有効量または予防有効量などで本明細書に記載されるような操作細胞を含有する。いくつかの実施形態における治療有効性または予防有効性は、治療される対象の周期的な評価によってモニターされる。数日以上にわたる反復投与の場合、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が生じるまで治療が繰り返される。しかしながら、他の投与レジメンが有用な場合があり、決定され得る。所望の投与量は、組成物の単一ボーラス投与によって、組成物の複数回ボーラス投与によって、または組成物の持続注入投与によって送達され得る。

【0731】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような操作細胞は、標準的な投与技術、製剤、及び／またはデバイスを使用して投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような操作細胞は、標準的な投与技術、製剤、及び／またはデバイスを使用して投与される。組成物の保存及び投与のための製剤及びデバイス、例えば、シリンジ及びバイアルなどが提供される。操作細胞は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む、局所注射によって投与され得る。治療用組成物（例えば、操作細胞を含有する医薬組成物）を投与する場合、それは一般に、単位投与量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化されることになる。

【0732】

製剤は、静脈内、腹腔内、または皮下投与のための製剤を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は非経口投与される。「非経口」という用語は、本明細書で使用される場合、静脈内、筋肉内、皮下、直腸、膣、及び腹腔内投与を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、静脈内、腹腔内、または皮下注射によって末梢性全身送達を使用して対象に投与される。

【0733】

いくつかの実施形態における組成物は、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、または分散液として提供され、これらは、いくつかの態様では選択したｐＨに緩衝化されてよい。液体組成物は投与、特に注射によって幾分か簡便である。液体組成物は担体を含み得、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。滅菌注射用溶液は、好適な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合などをして、細胞を溶媒内に組み込むことによって調製され得る。

【0734】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体としては、医薬投与と適合する全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などが挙げられ得る（Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。そのような担体または希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム及び非水性ビヒクル、例えば、固定油なども使用されてよい。補助活性化合物も、組成物中に組み込まれ得る。医薬担体は、操作細胞に適したもの、例えば、生理食塩水、デキストロース溶液またはヒト血清アルブミンを含む溶液などでなければならない。いくつかの実施形態では、そのような組成物のための薬学的に許容される担体またはビヒクルは、操作細胞が、生細胞の投与を可能にするのに十分な時間にわたって維持され得るか、または生存し続け得る、任意の非毒性水溶液である。例えば、薬学的に許容される担体またはビヒクルは、生理食塩水または緩衝生理食塩水であり得る。

【0735】

いくつかの実施形態では、医薬組成物を含む本組成物は滅菌されている。いくつかの実施形態では、細胞の単離、濃縮、または培養は、エラー、ユーザーの取扱い及び／または汚染を最小限に抑えるために、閉鎖環境または無菌環境内で、例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）及び例えば（ｆｏｒ ｉｎｓｔａｎｃｅ）、無菌培養バッグ内で実施される。いくつかの実施形態では、無菌性は、例えば、滅菌濾過膜に通して濾過することによって容易に達成されてよい。いくつかの実施形態では、培養は、ガス透過性培養容器を使用して実施される。いくつかの実施形態では、培養は、バイオリアクターを使用して実施される。

【0736】

また本明細書では、提供される操作細胞を凍結保存するのに適した組成物も提供される。いくつかの実施形態では、提供される操作細胞は、凍結保存培地内で凍結保存される。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、無血清凍結保存培地である。いくつかの実施形態では、組成物は凍結保護剤を含む。いくつかの実施形態では、凍結保護剤は、ＤＭＳＯ及び／またはｓグリセロールであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、５％または約５％～１０％または約１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、５％または約５％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、６％または約６％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、７％または約７％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、７．５％または約７．５％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、８％または約８％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、９％または約９％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、１０％または約１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、凍結保存培地は、市販の凍結保存溶液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０）を含有する。ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する凍結保存培地である。いくつかの実施形態では、凍結保存のために製剤化される組成物は、低温、例えば、超低温などで保存され、例えば、－４０℃～－１５０℃の温度範囲、例えば、約８０℃±６．０℃などで保存され得る。

【0737】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載される操作細胞、ならびに３１．２５％（ｖ／ｖ）のＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ、３１．２５％（ｖ／ｖ）の５％デキストロース／０．４５％塩化ナトリウム、１０％デキストラン４０（ＬＭＤ）／５％デキストロース、２０％（ｖ／ｖ）の２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、及び７．５％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む薬学的に許容される担体を含む。

【0738】

いくつかの実施形態では、凍結保存される操作細胞は、解凍によって投与のために調製される。いくつかの場合には、操作細胞は、解凍の直後に対象に投与され得る。そのような実施形態では、組成物は、任意のさらなる処理を行うことなくすぐに使用できる。他の場合には、操作細胞は、薬学的に許容される担体との再懸濁、活性化剤もしくは刺激剤とのインキュベーションなどによって、解凍後にさらに処理されるか、または対象への投与前に薬学的に許容される緩衝液中で活性化、洗浄及び再懸濁される。

【0739】

ＩＶ．キット、構成要素、及び製品
いくつかの態様では、本明細書では、本明細書に記載される方法、デバイス、及びシステムのキット、構成要素、及び組成物（消耗品など）が提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書の開示に従って使用説明書を含む。

【0740】

いくつかの実施形態では、本明細書では、本明細書に記載される操作細胞集団、及び凝固を減少させる抗凝固剤または細胞コーティングを含む、キットまたは組合せが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書では、（ａ）複数の操作細胞を含む細胞集団であって、操作細胞が、（ｉ）ＣＤ４７の発現を増加させる、及び（ｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現を減少させる改変を含み、（ｉ）の発現増加及び（ｉｉ）の発現減少が、改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、前記細胞集団、ならびに（ｂ）抗凝固剤を含む、キットまたは組合せが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書では、（ａ）複数の操作細胞を含む細胞集団であって、操作細胞が、（ｉ）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビター（複数可）の発現を増加させる、（ｉｉ）ＣＤ４７の発現を増加させる、ならびに（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現を減少させる改変を含み、（ｉ）及び（ｉｉ）の発現増加ならびに（ｉｉｉ）の発現減少が、改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、前記細胞集団と、（ｂ）抗凝固剤とを含む、キットまたは組合せが提供される。

【0741】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリン、アンチトロンビンの活性化因子、凝固第ＩＩ因子（ｆＩＩ）の阻害剤、凝固第ＶＩＩ因子（ｆＶＩＩ）の阻害剤、及び凝固第Ｘ因子（ｆＸ）の阻害剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤はヘパリンである。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、未分画ヘパリンである。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、低分子量ヘパリンである。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、可溶性ヘパリンである。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、メラガトランまたはＬＭＷ－ＤＳである。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣである。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ＣＤ１４２に対する抗体である。

【0742】

本発明のいくつかの実施形態では、細胞療法を含む、臨床的移植療法に有用な材料を含有する製品が提供される。いくつかの実施形態では、製品は、細胞欠損症、例えば、これらに限定されないが、糖尿病（例えば、Ｉ型糖尿病）、血管状態または疾患、自己免疫性甲状腺炎、肝疾患（例えば、肝硬変）、角膜疾患（例えば、フックスジストロフィーまたは先天性遺伝性内皮ジストロフィー）、腎疾患、ならびにがん（例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌）などの治療に有用な材料を含有する。製品は容器、及び容器上の、または容器と関連するラベルまたは添付文書を含み得る。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなど（例えば、ガラスまたはプラスチック容器）が挙げられる。概して、容器は、同種細胞療法に効果的な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有してよい（例えば、容器は、静注液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能な栓を有するバイアルであってよい）。

【0743】

いくつかの態様では、本明細書で提供されるキットまたは製品は、操作細胞の集団、例えば、本明細書で提供される操作細胞（例えば、操作ベータ島細胞または肝細胞）のいずれかなどを含む。いくつかの実施形態では、キットまたは製品は、操作ベータ島細胞の集団を含む組成物を含み、操作ベータ島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作ベータ細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットまたは製品は、操作肝細胞の集団を含む組成物を含み、操作肝細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、操作肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。

【0744】

ラベルまたは添付文書は、組成物が特定の状態を治療するために使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物を患者に投与するための説明書をさらに含むことになる。いくつかの実施形態では、製品は併用治療を含む。

【0745】

製品及び／またはキットは、添付文書をさらに含んでよい。添付文書は、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用、投与量、投与、禁忌及び／または警告についての情報を含有する、治療用製品の商業用パッケージに通例含まれる説明書を指す。

【0746】

Ｖ．治療の方法
本明細書では、対象における疾患または状態の治療に使用するための、本明細書に記載される操作細胞の集団を含む、提供される細胞組成物に関する組成物及び方法が提供される。本明細書では、本明細書に記載される操作細胞集団を投与することによって患者を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、細胞集団は、医薬組成物、例えば、本明細書に記載されるいずれかなどの投与のために製剤化される。そのような方法及び使用は、例えば、疾患、状態、または障害を有する対象に操作細胞集団、またはそれを含有する組成物を投与することを含む、治療方法及び使用を含む。特定の疾患適応症について、本明細書で提供されるような適切な操作細胞を選択することは、当業者のレベルの範囲内である。いくつかの実施形態では、細胞またはその医薬組成物は、疾患または障害の治療を達成するために有効量で投与される。使用は、そのような方法及び治療における、ならびにそのような治療方法を実施するための医薬の調製における、操作細胞またはその医薬組成物の使用を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、それによって対象の疾患または状態または障害を治療する。

【0747】

本明細書で提供される操作細胞は、例えば、疾患または障害を治療するための細胞療法の候補者を含む、任意の好適な患者に投与され得る。細胞療法の候補者は、本明細書で提供される本操作細胞の治療効果から恩恵を受ける可能性がある、疾患または状態を有する任意の患者を含む。いくつかの実施形態では、患者は、投与される細胞の同種レシピエントである。いくつかの実施形態では、提供される操作細胞は、同種細胞療法での使用に効果的である。本明細書で提供される本操作細胞の治療効果から恩恵を受ける候補者は、疾患または状態の排除、減少または改善を示す。

【0748】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法のいずれかによって産生されるものを含む、本明細書で提供されるような操作細胞は、細胞療法に使用され得る。本明細書に概説される治療用細胞は、障害、例えば、これらに限定されないが、がん、遺伝性障害、慢性感染症、自己免疫障害、神経障害などを治療するのに有用である。

【0749】

いくつかの実施形態では、患者は細胞欠損症を有する。本明細書で使用される場合、「細胞欠損症」は、患者において細胞集団の機能不全または消失を引き起こす任意の疾患または状態を指し、患者は細胞集団を自然に置換または再生できない。例示的な細胞欠損症としては、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、糖尿病、全身性ループス及びエリテマトーデス）、神経変性疾患（例えば、ハンチントン病及びパーキンソン病）、心血管状態及び疾患、血管状態及び疾患、角膜状態及び疾患、肝臓状態及び疾患、甲状腺状態及び疾患、ならびに腎臓状態及び疾患が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、操作細胞を投与される患者は、がんを有する。本明細書で提供される操作細胞によって治療され得る例示的ながんとしては、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、がん患者は、本明細書で提供される操作ＣＡＲ Ｔ細胞の投与によって治療される。

【0750】

いくつかの実施形態では、本明細書では、操作細胞の集団を、それを必要とする患者に投与する方法が提供され、操作細胞が投与中または投与後に血液と接触し、操作細胞が血液と接触する場合に、操作細胞はＩＢＭＩＲを防止または減弱させる改変を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、静脈内、または筋肉内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、操作細胞は寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、ＣＤ１４２の発現減少を有する。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ベータ島細胞または肝細胞である。いくつかの実施形態では、操作細胞は、１つ以上の補体インヒビターの過剰発現をさらに含む。

【0751】

いくつかの実施形態では、本明細書では、操作細胞の集団を、それを必要とする患者に投与する方法が提供され、操作細胞が投与中または投与後に血液と接触し、操作細胞は、寛容原性因子（例えば、ＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原分子）の発現減少を有するか、またはその発現を欠き、本方法は、患者に抗凝固剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５から選択される１つ以上の補体インヒビターの過剰発現をさらに含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６及びＣＤ５９の過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５９の過剰発現を含む。

【0752】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、糖尿病と関連するか、または細胞療法は、糖尿病の治療を目的とし、任意に糖尿病はＩ型糖尿病である。いくつかの実施形態では、操作細胞の集団は、ベータ島細胞を含む島細胞の集団である。いくつかの実施形態では、島細胞は、島前駆細胞、未成熟島細胞、及び成熟島細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本方法は、操作ベータ島細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作ベータ島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、操作ベータ島細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作ベータ島細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、及び（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含み、本方法は、患者に抗凝固剤（例えば、ヘパリン、または節Ｖ．Ｃに記載される抗凝固剤のいずれか）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、操作ベータ細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子は、マルチシストロン性ベクターである導入遺伝子であり、導入遺伝子は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。他の実施形態では、ベータ島細胞は、別個のマルチシストロン性ベクターをさらに含み、マルチシストロン性ベクターは、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0753】

いくつかの実施形態では、細胞欠損症は、肝疾患と関連するか、または細胞療法は、肝疾患の治療を目的とする。いくつかの実施形態では、肝疾患は肝硬変を含む。いくつかの実施形態では、細胞集団は、肝細胞または肝前駆細胞の集団である。いくつかの実施形態では、本方法は、操作肝細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作肝細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、操作肝細胞の集団を含む組成物を患者に投与することを含み、操作肝細胞は、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子及び（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含み、本方法は、患者に抗凝固剤（例えば、ヘパリン、または節Ｖ．Ｃに記載される抗凝固剤のいずれか）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、操作肝細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子は、マルチシストロン性ベクターである導入遺伝子であり、導入遺伝子は、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む。他の実施形態では、肝細胞は、別個のマルチシストロン性ベクターをさらに含み、マルチシストロン性ベクターは、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0754】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作細胞、またはそれを含有する組成物は、以前の移植、例えば、細胞移植、輸血、組織移植、または臓器移植などにおいて存在する１つ以上の抗原から感作された患者の治療に有用である。ある特定の実施形態では、以前の移植は、同種移植であり、患者は、同種移植からの１つ以上の同種抗原に対して感作される。同種移植としては、同種細胞移植、同種輸血、同種組織移植、または同種臓器移植が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、患者は、妊娠しているか、または妊娠したことがある（例えば、妊娠中に同種免疫を有するか、もしくは有したことがある）感作患者である。ある特定の実施形態では、患者は、以前の移植に含まれる１つ以上の抗原から感作され、以前の移植は、改変ヒト細胞、組織または臓器である。いくつかの実施形態では、改変ヒト細胞、組織または臓器は、改変自己ヒト細胞、組織または臓器である。いくつかの実施形態では、以前の移植は、非ヒト細胞、組織または臓器である。例示的な実施形態では、以前の移植は、改変非ヒト細胞、組織、または臓器である。ある特定の実施形態では、以前の移植は、ヒト成分を含むキメラである。ある特定の実施形態では、以前の移植は、ＣＡＲ Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、以前の移植は自己移植であり、患者は、自己移植からの１つ以上の自己抗原に対して感作されている。ある特定の実施形態では、以前の移植は、自己細胞、組織または臓器である。ある特定の実施形態では、感作患者は、アレルギーを有し、１つ以上のアレルゲンに感作されている。例示的な実施形態では、患者は、花粉症、食物アレルギー、昆虫アレルギー、薬物アレルギーまたはアトピー性皮膚炎を有する。

【0755】

いくつかの実施形態では、提供される操作細胞、またはそれを含有する組成物を使用する治療を受けている患者は、以前の治療を受けていた。いくつかの実施形態では、操作細胞、またはそれを含有する組成物は、以前の治療と同じ状態を治療するために使用される。ある特定の実施形態では、操作細胞、またはそれを含有する組成物は、以前の治療とは異なる状態を治療するために使用される。いくつかの実施形態では、患者に投与される操作細胞、またはそれを含有する組成物は、以前の治療によって治療された同じ状態または疾患の治療に対して治療効果の増強を示す。ある特定の実施形態では、投与される操作細胞、またはそれを含有する組成物は、以前の治療と比較した場合、患者における状態または疾患の治療に対してより長期の治療効果を示す。例示的な実施形態では、投与される細胞は、以前の治療と比較した場合、がん細胞に対して効力、有効性及び／または特異性の増強を示す。特定の実施形態では、操作細胞は、がんの治療を目的としたＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0756】

本明細書で提供される方法は、第一選択治療が失敗した後の特定の状態または疾患に対する第二選択治療として使用され得る。いくつかの実施形態では、以前の治療は、治療上有効でない治療である。本明細書で使用される場合、「治療上有効でない」治療は、患者において望ましいとは言えない臨床転帰をもたらす治療を指す。例えば、細胞欠損症の治療に関して、治療上有効でない治療は、患者において欠損細胞を置換するための、所望のレベルの機能細胞及び／または細胞活性を達成しない、及び／または治療持続性を欠いている治療を指してよい。がん治療に関しては、治療上有効でない治療は、所望のレベルの効力、有効性及び／または特異性を達成しない治療を指す。治療有効性は、当該技術分野において既知の任意の好適な技術を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、患者は、以前の治療に対して免疫応答を生じる。いくつかの実施形態では、以前の治療は、患者によって拒絶される細胞、組織または臓器移植である。いくつかの実施形態では、以前の治療は、機械補助による治療を含んだ。いくつかの実施形態では、機械補助による治療は、血液透析または補助人工心臓を含んだ。いくつかの実施形態では、患者は、機械補助による治療に対して免疫応答を生じた。いくつかの実施形態では、以前の治療は、望ましくない様式で治療用細胞が増殖及び分裂する場合、治療用細胞の死を引き起こし得る安全スイッチを含む治療用細胞の集団を含んだ。ある特定の実施形態では、患者は、安全スイッチにより誘導される治療用細胞死の結果として免疫応答を生じる。ある特定の実施形態では、患者は、以前の治療から感作されている。例示的な実施形態では、患者は、本明細書に提供されるような、投与される操作細胞によって感作されない。

【0757】

いくつかの実施形態では、提供される操作細胞、またはそれを含有する組成物は、組織、臓器または部分的臓器移植を提供する前に、それを必要とする患者に投与される。特定の実施形態では、患者は、操作細胞に対して免疫応答を示さない。ある特定の実施形態では、操作細胞は、特定の組織または臓器における細胞欠損症の治療のために患者に投与され、患者はその後、同じ特定の組織または臓器に対する組織移植または臓器移植を受ける。そのような実施形態では、操作細胞治療は、最後の組織または臓器置換へのブリッジ療法として機能する。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、肝臓障害を有し、肝移植を受ける前に、本明細書で提供されるような操作肝細胞治療を受ける。ある特定の実施形態では、操作細胞は、特定の組織または臓器における細胞欠損症の治療のために患者に投与され、患者はその後、異なる組織または臓器に対する組織移植または臓器移植を受ける。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、腎移植を受ける前に、本明細書で提供されるような操作膵ベータ細胞で治療される糖尿病患者である。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞欠損症の治療を目的とする。例示的な実施形態では、組織または臓器移植は、心臓移植、肺移植、腎移植、肝移植、膵移植、腸移植、胃移植、角膜移植、骨髄移植、血管移植、心臓弁移植、または骨移植である。

【0758】

患者を治療する方法は一般に、本明細書で提供されるように、操作細胞、またはそれを含有する組成物を投与することによる。理解されることになるように、細胞及び／または療法のタイミングに関連する、本明細書に記載される複数の実施形態全てについて、細胞の投与は、所望の部位での導入細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって達成される。細胞は、対象内の所望の部位に直接移植され得るか、または代わりに所望の箇所への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得、移植細胞または細胞の構成要素の少なくとも一部が生存し続ける。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞療法によって軽減され得る疾患または障害、例えば、任意の疾患、障害、状態、またはその症状などを治療するために投与される。

【0759】

いくつかの実施形態では、操作細胞の集団、またはそれを含有する組成物は、患者が感作されてから少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも１週間、もしくは少なくとも１か月後またはそれを超えて投与される。いくつかの実施形態では、操作細胞の集団、またはそれを含有する組成物は、患者が感作されてから、または感作の特性もしくは特徴を示してから少なくとも１週間（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、もしくはそれを超えた）後またはそれを超えて投与される。いくつかの実施形態では、操作細胞の集団、またはそれを含有する組成物は、患者が移植（例えば、同種移植）を受けてから、妊娠してから（例えば、妊娠中に同種免疫を有するか、または有したことがある）、あるいは感作されてから、または感作の特性もしくは特徴を示してから少なくとも１か月（例えば、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、もしくはそれを超えた）後またはそれを超えて投与される。

【0760】

いくつかの実施形態では、移植を受けたことがある、妊娠したことがある（例えば、妊娠中に同種免疫を有するか、もしくは有したことがある）、及び／または抗原（例えば、同種抗原）に対して感作されている患者は、本明細書に記載される操作細胞集団の初回用量投与、初回投与後の回復期間、及び記載される操作細胞集団の２回目の用量投与を含む、投薬レジメンを投与される。いくつかの実施形態では、細胞の第１集団及び細胞の第２集団中に存在する細胞型の混成は異なる。ある特定の実施形態では、操作細胞の第１集団及び操作細胞の第２集団中に存在する細胞型の混成は、同じであるか、または実質的に同等である。多くの実施形態では、操作細胞の第１集団及び操作細胞の第２集団は、同じ細胞型を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞の第１集団及び操作細胞の第２集団は、異なる細胞型を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞の第１集団及び操作細胞の第２集団は、同じパーセンテージの細胞型を含む。他の実施形態では、操作細胞の第１集団及び細胞の第２集団は、異なるパーセンテージの細胞型を含む。

【0761】

いくつかの実施形態では、回復期間は、操作細胞の集団またはそれを含有する組成物の初回投与後に開始し、そのような細胞が、患者内でもはや存在しないか、または検出不可能な場合に終了する。いくつかの実施形態では、回復期間の持続期間は、細胞の初回投与から少なくとも１週間（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、もしくはそれを超えた）後またはそれを超える。いくつかの実施形態では、回復期間の持続期間は、細胞の初回投与から少なくとも１か月（例えば、１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１３か月、１４か月、１５か月、１６か月、１７か月、１８か月、１９か月、２０か月、もしくはそれを超えた）後またはそれを超える。

【0762】

いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、対象に投与される場合、低免疫原性である。いくつかの実施形態では、操作細胞は低免疫である。いくつかの実施形態では、操作細胞に対する免疫応答は、免疫原性細胞（例えば、同じか、または類似した細胞型または表現型であるが、操作細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成される免疫応答のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低く減少するか、またはそれよりも低い。いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、患者内の操作細胞に対する免疫応答を誘発しない。

【0763】

いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、患者において低減した、またはより低いレベルの全身性ＴＨ１活性化を誘発する。いくつかの場合では、細胞によって誘発される全身性ＴＨ１活性化のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じか、または類似した細胞型または表現型であるが、操作細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成される全身性ＴＨ１活性化のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い。いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、患者において全身性ＴＨ１活性化を誘発しない。

【0764】

いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、患者において低減した、またはより低いレベルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の免疫活性化を誘発する。いくつかの場合では、細胞によって誘発されるＰＢＭＣの免疫活性化のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じか、または類似した細胞型または表現型であるが、操作細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成されるＰＢＭＣの免疫活性化のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い。いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、患者においてＰＢＭＣの免疫活性化を誘発しない。

【0765】

いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、患者において低減した、またはより低いレベルのドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発する。いくつかの場合では、細胞によって誘発されるドナー特異的ＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じか、または類似した細胞型または表現型であるが、操作細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成されるドナー特異的ＩｇＧ抗体のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い。いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団は、患者においてドナー特異的ＩｇＧ抗体を誘発しない。

【0766】

いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、患者において低減した、またはより低いレベルのＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生を誘発する。いくつかの場合では、細胞によって誘発されるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じか、または類似した細胞型または表現型であるが、操作細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成されるＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い。いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、患者においてＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生を誘発しない。

【0767】

いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、患者において低減した、またはより低いレベルの細胞傷害性Ｔ細胞死滅を誘発する。いくつかの場合では、細胞によって誘発される細胞傷害性Ｔ細胞死滅のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じか、または類似した細胞型または表現型であるが、操作細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞の集団）の投与によって生成される細胞傷害性Ｔ細胞死滅のレベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低い。いくつかの実施形態では、投与される操作細胞集団、またはそれを含有する組成物は、患者において細胞傷害性Ｔ細胞死滅を誘発しない。

【0768】

上で記述されるように、ある特定の実施形態では、同種抗原、例えば、ＭＨＣクラスＩ及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、ヒト白血球抗原）などに対して感作された患者に投与され得る細胞が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、患者は、妊娠しているか、または妊娠したことがあり、例えば、妊娠中に同種免疫を有する（例えば、胎児・新生児溶血性疾患（ＨＤＦＮ）、新生児同種免疫性好中球減少症（ＮＡＮ）または胎児・新生児同種免疫性血小板減少症（ＦＮＡＩＴ））。言い換えれば、患者は、妊娠中に同種免疫と関連する障害または状態、例えば、これらに限定されないが、胎児・新生児溶血性疾患（ＨＤＦＮ）、新生児同種免疫性好中球減少症（ＮＡＮ）、及び胎児・新生児同種免疫性血小板減少症（ＦＮＡＩＴ）などを有するか、または有したことがある。いくつかの実施形態では、患者は、同種移植、例えば、これらに限定されないが、同種細胞移植、同種輸血、同種組織移植、または同種臓器移植などを受けている。いくつかの実施形態では、患者は、同種抗原に対してメモリーＢ細胞を示す。いくつかの実施形態では、患者は、同種抗原に対してメモリーＴ細胞を示す。そのような患者は、同種抗原に対してメモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞の両方を示し得る。

【0769】

記載される細胞の投与時に、患者は、低免疫原性ではない細胞に対する応答と比較して、全身性免疫応答を全く示さないか、または減少したレベルの全身性免疫応答を示す。いくつかの実施形態では、患者は、低免疫原性ではない細胞に対する応答と比較して、適応免疫応答を全く示さないか、または減少したレベルの適応免疫応答を示す。いくつかの実施形態では、患者は、低免疫原性ではない細胞に対する応答と比較して、自然免疫応答を全く示さないか、または減少したレベルの自然免疫応答を示す。いくつかの実施形態では、患者は、低免疫原性ではない細胞に対する応答と比較して、Ｔ細胞応答を全く示さないか、または減少したレベルのＴ細胞応答を示す。いくつかの実施形態では、患者は、低免疫原性ではない細胞に対する応答と比較して、Ｂ細胞応答を全く示さないか、または減少したレベルのＢ細胞応答を示す。

【0770】

Ａ．用量及び投与レジメン
任意の治療有効量の本明細書に記載される細胞は、治療されている適応症に応じて医薬組成物内に含まれ得る。細胞の非限定的な例としては、初代細胞（例えば、初代ベータ島細胞）及び記載されるような操作人工多能性幹細胞から分化した細胞（例えば、ｉＰＳＣから分化したベータ島細胞または肝細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１×１０^２、５×１０^２、１×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、または５×１０^１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大で約１×１０^２、５×１０^２、１×１０^３、５×１０^３、１×１０^４、５×１０^４、１×１０^５、５×１０^５、１×１０^６、５×１０^６、１×１０^７、５×１０^７、１×１０^８、５×１０^８、１×１０^９、５×１０^９、１×１０^１０、または５×１０^１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大で約６．０×１０^８個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、最大で約８．０×１０^８個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも約１×１０^２～５×１０^２、５×１０^２～１×１０^３、１× １０^３～５×１０^３、５×１０^３～１×１０^４、１×１０^４～５×１０^４、５×１０^４～１×１０^５、１×１０^５～５×１０^５、５×１０^５～１×１０^６、１×１０^６～５×１０^６、５×１０^６～１×１０^７、１×１０^７～５×１０^７、５×１０^７～１×１０^８、１×１０^８～５×１０^８、５×１０^８～１×１０^９、１×１０^９～５×１０^９、５×１０^９～１×１０^１０、または１×１０^１０～５×１０^１０個の細胞を含む。例示的な実施形態では、医薬組成物は、約１．０×１０^６～約２．５×１０^８個の細胞を含む。

【0771】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または５００ｍｌの体積を有する。例示的な実施形態では、医薬組成物は、最大で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または５００ｍｌの体積を有する。例示的な実施形態では、医薬組成物は、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または５００ｍｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１～５０ｍｌ、５０～１００ｍｌ、１００～１５０ｍｌ、１５０～２００ｍｌ、２００～２５０ｍｌ、２５０～３００ｍｌ、３００～３５０ｍｌ、３５０～４００ｍｌ、４００～４５０ｍｌ、または４５０～５００ｍｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１～５０ｍｌ、５０～１００ｍｌ、１００～１５０ｍｌ、１５０～２００ｍｌ、２００～２５０ｍｌ、２５０～３００ｍｌ、３００～３５０ｍｌ、３５０～４００ｍｌ、４００～４５０ｍｌ、または４５０～５００ｍｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約１～１０ｍｌ、１０～２０ｍｌ、２０～３０ｍｌ、３０～４０ｍｌ、４０～５０ｍｌ、５０～６０ｍｌ、６０～７０ｍｌ、７０～８０ｍｌ、７０～８０ｍｌ、８０～９０ｍｌ、または９０～１００ｍｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、約５ｍｌ～約８０ｍｌの範囲の体積を有する。例示的な実施形態では、医薬組成物は、約１０ｍｌ～約７０ｍｌの範囲の体積を有する。多くの実施形態では、医薬組成物は、約１０ｍｌ～約５０ｍｌの範囲の体積を有する。

【0772】

特定の量／投与レジメンは、個体の体重、性別、年齢及び健康状態、細胞の製剤化、生化学的性質、生物活性、バイオアベイラビリティ及び副作用、ならびに完全な治療レジメンにおける細胞の数及び同一性に応じて変動することになる。

【0773】

いくつかの実施形態では、ある用量の医薬組成物は、約１０ｍＬ～５０ｍＬの体積で約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個の細胞を含み、医薬組成物は単回用量として投与される。

【0774】

多くの実施形態では、細胞はＴ細胞であり、医薬組成物は、約２．０×１０^６～約２．０×１０^８個の細胞、例えば、これらに限定されないが、初代Ｔ細胞、操作人工多能性幹細胞から分化したＴ細胞などを含む。いくつかの場合には、用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積で約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個の本明細書に記載される初代Ｔ細胞を含む。いくつかの場合には、用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積で約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個の上に記載されている初代Ｔ細胞を含む。様々な場合では、用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積で約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個の、本明細書に記載される操作人工多能性幹細胞から分化したＴ細胞を含む。他の場合には、用量は、初代Ｔ細胞または操作人工多能性幹細胞から分化したＴ細胞を含む、約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個のＴ細胞よりも少ない範囲である。さらに他の場合では、用量は、初代Ｔ細胞及び操作人工多能性幹細胞から分化したＴ細胞を含む、約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個のＴ細胞よりも多い範囲である。

【0775】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、５０ｋｇ以下の対象について、約１．０×１０^５～約１．０×１０^７個の操作細胞（初代細胞または操作人工多能性幹細胞から分化した細胞など）／ｋｇ体重の単回用量として投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、５０ｋｇ以下の対象について、約０．５×１０^５～約１．０×１０^７、約１．０×１０^５～約１．０×１０^７、約１．０×１０^５～約１．０×１０^７、約５．０×１０^５～約１×１０^７、約１．０×１０^６～約１×１０^７、約５．０×１０^６～約１．０×１０^７、約１．０×１０^５～約５．０×１０^６、約１．０×１０^５～約１．０×１０^６、約１．０×１０^５～約５．０×１０^５、約１．０×１０^５～約５．０×１０^６、約２．０×１０^５～約５．０×１０^６、約３．０×１０^５～約５．０×１０^６、約４．０×１０^５～約５．０×１０^６、約５．０×１０^５～約５．０×１０^６、約６．０×１０^５～約５．０×１０^６、約７．０×１０^５～約５．０×１０^６、約８．０×１０^５～約５．０×１０^６、または約９．０×１０^５～約５．０×１０^６個の細胞／ｋｇ体重の単回用量として投与される。いくつかの実施形態では、用量は、５０ｋｇ以下の対象について、約０．２×１０^６～約５．０×１０^６個の細胞／ｋｇ体重である。多くの実施形態では、用量は、５０ｋｇ以下の対象について、約０．２×１０^６～約５．０×１０^６個の細胞／ｋｇ体重よりも少ない範囲である。多くの実施形態では、用量は、５０ｋｇ以下の対象について、約０．２×１０^６～約５．０×１０^６個の細胞／ｋｇ体重よりも多い範囲である。例示的な実施形態では、単回用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積のものである。いくつかの実施形態では、用量は静脈内投与される。

【0776】

例示的な実施形態では、細胞は、５０ｋｇ超の対象について、約１．０×１０^６～約５．０×１０^８個の細胞（初代細胞及び操作人工多能性幹細胞から分化した細胞）の単回用量で投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、５０ｋｇ以下の対象について、約０．５×１０^６～約１．０×１０^９、約１．０×１０^６～約１．０×１０^９、約１．０×１０^６～約１．０×１０^９、約５．０×１０^６～約１．０×１０^９、約１．０×１０^７～約１．０×１０^９、約５．０×１０^７～約１．０×１０^９、約１．０×１０^６～約５．０×１０^７、約１．０×１０^６～約１．０×１０^７、約１．０×１０^６～約５．０×１０^７、約１．０×１０^７～約５．０×１０^８、約２．０×１０^７～約５．０×１０^８、約３．０×１０^７～約５．０×１０^８、約４．０×１０^７～約５．０×１０^８、約５．０×１０^７～約５．０×１０^８、約６．０×１０^７～約５．０×１０^８、約７．０×１０^７～約５．０×１０^８、約８．０×１０^７～約５．０×１０^８、または約９．０×１０^７～約５．０×１０^８個の細胞／ｋｇ体重の単回用量として投与される。多くの実施形態では、細胞は、５０ｋｇ超の対象について、約１．０×１０^７～約２．５×１０^８個の細胞の単回用量で投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、５０ｋｇ超の対象について、約１．０×１０^７～約２．５×１０^８個の細胞よりも少ない範囲の単回用量で投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、５０ｋｇ超の対象について、約１．０×１０^７～約２．５×１０^８個の細胞よりも多い範囲の単回用量で投与される。いくつかの実施形態では、用量は静脈内投与される。例示的な実施形態では、単回用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積のものである。いくつかの実施形態では、用量は静脈内投与される。

【0777】

例示的な実施形態では、用量は、約１～５０ｍｌ／分、１～４０ｍｌ／分、１～３０ｍｌ／分、１～２０ｍｌ／分、１０～２０ｍｌ／分、１０～３０ｍｌ／分、１０～４０ｍｌ／分、１０～５０ｍｌ／分、２０～５０ｍｌ／分、３０～５０ｍｌ／分、４０～５０ｍｌ／分の速度で静脈内投与される。多数の実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与のために１つ以上の輸液バッグ内で保管される。いくつかの実施形態では、用量は、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、７０分、８０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、２４０分、または３００分以下で完全に投与される。

【0778】

いくつかの実施形態では、医薬組成物の単回用量は、単一の輸液バッグ中に存在する。他の実施形態では、医薬組成物の単回用量は、２つ、３つ、４つまたは５つの別個の輸液バッグに分割される。

【0779】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される細胞は、複数回の用量、例えば、２回、３回、４回、５回、６回またはそれを超える回数の用量などで投与される。いくつかの実施形態では、複数回の用量の各用量は、１～２４時間の範囲であけて対象に投与される。いくつかの場合では、後続の用量は、初回用量または先行する用量から約１時間～約２４時間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または約２４時間）後に投与される。いくつかの実施形態では、複数回の用量の各用量は、約１日～２８日間の範囲であけて対象に投与される。いくつかの場合では、後続の用量は、初回用量または先行する用量から約１日～約２８日（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または約２８日）後に投与される。多くの実施形態では、複数回の用量の各用量は、１週間～約６週間の範囲であけて対象に投与される。ある特定の場合では、後続の用量は、初回用量または先行する用量から約１週間～約６週間（例えば、約１、２、３、４、５、または６週間）後に投与される。いくつかの実施形態では、複数回の用量の各用量は、約１か月～約１２か月の範囲であけて対象に投与される。いくつかの場合では、後続の用量は、初回用量または先行する用量から約１か月～約１２か月（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２か月）後に投与される。

【0780】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、（ｉ）本明細書に記載される操作細胞の集団、及び（ｉｉ）抗凝固剤を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、以下の節Ｖ．Ｃに記載される抗凝固剤のいずれかである。

【0781】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、操作細胞集団を投与する時に投与され、ヘパリンは、７０Ｕ／ｋｇレシピエント体重の用量で投与される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、別個の製剤で提供され、操作細胞の集団と同時に投与される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤及び操作細胞集団は、例えば、静脈内投与のために、別個の輸液バッグ中に提供される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤はヘパリンである。いくつかの実施形態では、ヘパリンは全身投与される。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、腸間膜静脈を介して門脈に注入されることによって投与される。いくつかの実施形態では、術後２、３、４、５、６、７、８、９、または１０時間後、患者に１２～３６時間（例えば、約２４時間）にわたってヘパリンを連続的に注入する。いくつかの実施形態では、術後期間中に投与されるヘパリンの投与量は、ヘパリンの初回投与よりも少ない。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、術後に２００～４００Ｕ／ｈの用量（例えば、約３００Ｕ／ｈの用量）のヘパリンで投与される。数時間の内に、ヘパリンは、３００Ｕ／ｈのヘパリン用量で術後２４時間にわたり持続注入によって投与される。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、術後６時間から開始して術後２４時間にわたり、３００Ｕ／ｈのヘパリン用量で連続注入によって投与される。

【0782】

いくつかの実施形態では、対象は、第１時点で第１投与レジメンが投与され、次いでその後、第２時点で第２投与レジメンが投与される。いくつかの実施形態では、第１投与レジメンは、第２投与レジメンと同じである。他の実施形態では、第１投与レジメンは、第２投与レジメンとは異なる。いくつかの場合では、第１投与レジメン及び第２投与レジメンにおける細胞数は同じである。いくつかの場合では、第１投与レジメン及び第２投与レジメンにおける細胞数は異なる。いくつかの場合には、第１投与レジメン及び第２投与レジメンの用量数は同じである。いくつかの場合には、第１投与レジメン及び第２投与レジメンの用量数は異なる。

【0783】

いくつかの実施形態では、細胞は操作Ｔ細胞（例えば、初代Ｔ細胞または操作人工多能性幹細胞から分化したＴ細胞）であり、第１投与レジメンは、第１ＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞を含み、第２投与レジメンは、第１ＣＡＲ及び第２ＣＡＲが異なるように、第２ＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞を含む。例えば、第１ＣＡＲ及び第２ＣＡＲは、異なる標的抗原と結合する。いくつかの場合には、第１ＣＡＲは、抗原と結合するｓｃＦｖを含み、第２ＣＡＲは、異なる抗原と結合するｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、第１投与レジメンは、第１ＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞を含み、第２投与レジメンは、第１ＣＡＲ及び第２ＣＡＲが同じであるように、第２ＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞または初代Ｔ細胞を含む。第１投与レジメンは、第２投与レジメンから少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１～３か月、１～６か月、４～６か月、３～９か月、３～１２か月、またはそれを超える月数をあけて対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、対象は、疾患（例えば、がん）の過程において複数の投与レジメンが投与され、投与レジメンのうち少なくとも２つは、同じ型の本明細書に記載される操作Ｔ細胞を含む。他の実施形態では、複数の投与レジメンのうち少なくとも２つは、異なる型の本明細書に記載される操作Ｔ細胞を含む。

【0784】

Ｂ．免疫抑制剤
いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作細胞集団、またはそれを含有する組成物での初回投与前には患者に投与されない。

【0785】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作細胞の投与を受けた患者に投与されてよい。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作細胞の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与前に患者に投与される。

【0786】

免疫抑制剤及び／または免疫調節剤の非限定的な例としては、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、コルチコステロイド、例えば、プレドニゾンなど、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、ブレキナル、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスパガリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン、チモシン－α及び類似の薬剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、ＩＬ－２受容体のｐ７５に結合する抗体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、またはＣＤ５８、及びそれらのリガンドのいずれかに結合する抗体に結合する抗体からなる免疫抑制抗体の群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の初回投与前または後に患者に投与され、投与は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子発現を有するが、ＣＤ４７の外因性発現を有しない細胞に必要となる投与量よりも少ない投与量である。

【0787】

一実施形態では、そのような免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、可溶性ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１０、Ｂ７分子（例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、それらのバリアント、及びそれらの断片）、ＩＣＯＳ、ならびにＯＸ４０、負のＴ細胞制御因子の阻害剤（ＣＴＬＡ－４に対する抗体など）、ならびに類似の薬剤から選択されてよい。

【0788】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作細胞集団の初回投与前に患者に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の初回投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日前またはそれよりも前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の初回投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間前またはそれよりも前に投与される。

【0789】

特定の実施形態では、免疫抑制及び／または免疫調節剤は、細胞の初回投与後に患者に投与されないか、または細胞の初回投与から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日後、もしくはそれよりも後に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の初回投与から少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間後またはそれよりも後に投与される。

【0790】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作細胞の集団の投与前に患者に投与されない。多くの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作細胞集団の初回及び／または２回目の投与前に患者に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日前またはそれよりも前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の初回及び／または２回目の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間前またはそれよりも前に投与される。特定の実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日後またはそれよりも後に投与される。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の初回及び／または２回目の投与から少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間後またはそれよりも後に投与される。

【0791】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、細胞の投与前または後に患者に投与され、投与は、免疫原性細胞（例えば、同じか、または類似した細胞型または表現型であるが、操作細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞集団であり、例えば、ＣＤ１４２、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子発現の内因性レベルを有するが、ＣＤ４７の（例えば、外因性）発現増加を有しない）に必要となる投与量よりも少ない投与量である。いくつかの実施形態では、細胞投与の数は、免疫原性細胞（例えば、同じか、または類似した細胞型または表現型であるが、操作細胞の改変、例えば、遺伝子改変を含有しない細胞集団であり、例えば、ＣＤ１４２、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子発現の内因性レベルを有するが、ＣＤ４７の（例えば、外因性）発現増加を有しない）の免疫拒絶を減少させるのに必要となる投与量よりも少ない投与量である。

【0792】

Ｃ．抗凝固剤
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、操作細胞集団の投与中、及び／または投与後に患者に投与されない。いくつかの実施形態では、抗凝固剤及び操作細胞集団は、患者に同時に投与される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤及び操作細胞集団は、順次投与される。

【0793】

いくつかの実施形態では、ヘパリンは、操作細胞集団を投与する時に投与され、ヘパリンは、７０Ｕ／ｋｇレシピエント体重の用量で投与される。いくつかの実施形態では、ヘパリンは全身投与される。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、腸間膜静脈を介して門脈に注入されることによって投与される。いくつかの実施形態では、術後２、３、４、５、６、７、８、９、または１０時間後、患者に１２～３６時間（例えば、約２４時間）にわたってヘパリンを連続的に注入する。いくつかの実施形態では、術後期間中に投与されるヘパリンの投与量は、ヘパリンの初回投与よりも少ない。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、術後に２００～４００Ｕ／ｈの用量（例えば、約３００Ｕ／ｈの用量）のヘパリンで投与される。数時間の内に、ヘパリンは、３００Ｕ／ｈのヘパリン用量で術後２４時間にわたり持続注入によって投与される。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、術後６時間から開始して術後２４時間にわたり、３００Ｕ／ｈのヘパリン用量で連続注入によって投与される。

【0794】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ヘパリン、アンチトロンビンの活性化因子、凝固第ＩＩ因子（ｆＩＩ）の阻害剤、凝固第ＶＩＩ因子（ｆＶＩＩ）の阻害剤、及び凝固第Ｘ因子（ｆＸ）の阻害剤からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤はヘパリンである。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、未分画ヘパリンである。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、低分子量ヘパリンである。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、可溶性ヘパリンである。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、メラガトランまたはＬＭＷ－ＤＳである。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣである。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ＣＤ１４２に対する抗体である。

【0795】

いくつかの実施形態では、抗凝固剤は全身投与される。いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、ＩＶ注入によって投与される。

【0796】

例示的な実施形態
１．（ｉ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる、（ｉｉ）ＣＤ１４２の発現を減少させる、ならびに（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる改変を含む操作細胞であって、（ｉ）の前記発現増加ならびに（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の前記発現減少が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、前記操作細胞。

【0797】

２．（ｉｉｉ）における前記改変のうち１つ以上が、
ａ．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子
ｂ．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または
ｃ．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子
の発現を減少させる、実施形態１に記載の操作細胞。

【0798】

３．前記１つ以上の改変が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ及び／またはＮＦＹ－Ｃ、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の分子の発現を減少させる、実施形態１または実施形態２に記載の操作細胞。

【0799】

４．Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ及び／またはＮＦＹ－Ｃ、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の分子を発現しない、実施形態１～３のいずれかに記載の操作細胞。

【0800】

５．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の寛容原性因子を含む、実施形態１～４のいずれかに記載の操作細胞。

【0801】

６．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態５に記載の操作細胞。

【0802】

７．前記１つ以上の寛容原性因子が、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の寛容原性因子を含む、実施形態１～６のいずれかに記載の操作細胞。

【0803】

８．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７を含む、実施形態１～７のいずれかに記載の操作細胞。

【0804】

９．前記１つ以上の寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅを含む、実施形態１～８のいずれかに記載の操作細胞。

【0805】

１０．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ２４を含む、実施形態１～９のいずれかに記載の操作細胞。

【0806】

１１．前記１つ以上の寛容原性因子がＰＤＬ１を含む、実施形態１～１０のいずれかに記載の操作細胞。

【0807】

１２．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ５５を含む、実施形態１～１１のいずれかに記載の操作細胞。

【0808】

１３．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＲ１を含む、実施形態１～１２のいずれかに記載の操作細胞。

【0809】

１４．前記１つ以上の寛容原性因子がＭＡＮＦを含む、実施形態１～１３のいずれかに記載の操作細胞。

【0810】

１５．前記１つ以上の寛容原性因子がＡ２０／ＴＮＦＡＩＰ３を含む、実施形態１～１４のいずれかに記載の操作細胞。

【0811】

１６．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７を含む、実施形態１～１５のいずれかに記載の操作細胞。

【0812】

１７．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、実施形態１～１６のいずれかに記載の操作細胞。

【0813】

１８．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、実施形態１～１７のいずれかに記載の操作細胞。

【0814】

１９．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、実施形態１～１８のいずれかに記載の操作細胞。

【0815】

２０．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、実施形態１～１９のいずれかに記載の操作細胞。

【0816】

２１．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、実施形態１～２０のいずれかに記載の操作細胞。

【0817】

２２．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１を含む、実施形態１～２１のいずれかに記載の操作細胞。

【0818】

２３．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰを含む、実施形態１～２２のいずれかに記載の操作細胞。

【0819】

２４．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦを含む、実施形態１～２３のいずれかに記載の操作細胞。

【0820】

２５．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦを含む、実施形態１～２４のいずれかに記載の操作細胞。

【0821】

２６．（ｉ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる、ならびに（ｉｉ）ＣＤ１４２の発現を減少させる改変を含む操作細胞であって、（ｉ）の前記発現増加及び（ｉｉ）の前記発現減少が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、前記操作細胞。

【0822】

２７．（ｉ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる、（ｉｉ）ＣＤ４６の発現を増加させる、ならびに（ｉｉｉ）ＣＤ５９の発現を増加させる、前記改変のうち１つ以上が、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させる１つ以上の改変を含む、実施形態２６に記載の操作細胞。

【0823】

２８．前記内因性遺伝子が、前記ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、ＣＤ４６、またはＣＤ５９をコードする、実施形態２７に記載の操作細胞。

【0824】

２９．内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させる前記１つ以上の改変が、前記遺伝子の内因性プロモーターもしくはエンハンサーの１つ以上の改変または異種プロモーターの導入を含む、実施形態２７または２８に記載の操作細胞。

【0825】

３０．前記異種プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、実施形態２９に記載の操作細胞。

【0826】

３１．前記操作細胞が、ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させる１つ以上の改変をさらに含み、前記１つ以上の補体インヒビターの前記発現増加が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、実施形態１～３０のいずれかに記載の操作細胞。

【0827】

３２．発現を増加させる前記改変（複数可）が、表面発現の増加を含み、及び／または発現を減少させる前記改変が、表面発現の減少を含む、実施形態１～３１のいずれかに記載の操作細胞。

【0828】

３３．前記１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させる前記改変が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態３１または実施形態３２に記載の操作細胞。

【0829】

３４．前記１つ以上の補体インヒビターが、ＣＤ４６及びＣＤ５９であり、任意に前記改変が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態３１～３３のいずれかに記載の操作細胞。

【0830】

３５．前記１つ以上の補体インヒビターが、ＣＤ４６、ＣＤ５９及びＣＤ５５であり、任意に前記改変が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態３１～３４のいずれかに記載の操作細胞。

【0831】

３６．ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードする、実施形態３３～３５のいずれかに記載の操作細胞。

【0832】

３７．ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：３に記載される配列をコードする、実施形態３６に記載の操作細胞。

【0833】

３８．ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す、実施形態３３～３７のいずれかに記載の操作細胞。

【0834】

３９．ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：５に記載される配列をコードする、実施形態３８に記載の操作細胞。

【0835】

４０．ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す、実施形態３３～３９のいずれかに記載の操作細胞。

【0836】

４１．ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：８に記載される配列をコードする、実施形態４０に記載の操作細胞。

【0837】

４２．ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが各々、プロモーターに機能的に連結されている、実施形態３３～４１のいずれかに記載の操作細胞。

【0838】

４３．ＣＤ４７の発現を増加させる前記改変が、前記ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態５～４２のいずれかに記載の操作細胞。

【0839】

４４．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、前記操作細胞の自然免疫死滅を減少させる、実施形態４３に記載の操作細胞。

【0840】

４５．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：１に記載される配列をコードする、実施形態４３～４４のいずれかに記載の操作細胞。

【0841】

４６．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、プロモーターに機能的に連結されている、実施形態４３～４５のいずれかに記載の操作細胞。

【0842】

４７．前記１つ以上の寛容原性因子をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される２つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むマルチシストロン性ベクターを含む、実施形態１～４６のいずれかに記載の操作細胞。

【0843】

４８．前記ポリヌクレオチドの各々が、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドによって隔てられている、実施形態４７に記載の操作細胞。

【0844】

４９．前記マルチシストロン性ベクターの各ポリヌクレオチドが、同じプロモーターに機能的に連結されている、実施形態４７～４８のいずれかに記載の操作細胞。

【0845】

５０．前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態４７～４９のいずれかに記載の操作細胞。

【0846】

５１．前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態４７～５０のいずれかに記載の操作細胞。

【0847】

５２．前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態５０または実施形態５１に記載の操作細胞。

【0848】

５３．前記マルチシストロン性ベクターが第１導入遺伝子であり、前記操作細胞が、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む別個の導入遺伝子を含む、実施形態５０または実施形態５１に記載の操作細胞。

【0849】

５４．ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む導入遺伝子を含む、実施形態１～５３のいずれかに記載の操作細胞。

【0850】

５５．前記操作細胞が、第１導入遺伝子及び第２導入遺伝子を含み、
前記第１及び第２導入遺伝子の各々が、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、
前記第１及び第２導入遺伝子が、モノシストロン性またはマルチシストロン性ベクターである、実施形態１～４６のいずれかに記載の操作細胞。

【0851】

５６．前記プロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態４２～５５のいずれか１つに記載の操作細胞。

【0852】

５７．前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、前記ＥＦ１ａプロモーター、前記ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、実施形態４２～５６のいずれかに記載の操作細胞。

【0853】

５８．ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５ポリペプチドをコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、前記操作細胞のゲノム中に組み込まれる、実施形態３３～５７のいずれかに記載の操作細胞。

【0854】

５９．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれる、実施形態４３～５８のいずれかに記載の操作細胞。

【0855】

６０．前記組込みが、前記操作細胞の前記ゲノムへの非標的挿入によって、任意にレンチウイルスベクターを使用した前記細胞中への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって行われる、実施形態５８または実施形態５９に記載の操作細胞。

【0856】

６１．前記組込みが、前記細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって行われる、実施形態５８または実施形態５９に記載の操作細胞。

【0857】

６２．前記標的ゲノム座位が、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座、及びＫＤＭ５Ｄ遺伝子座からなる群から選択される、実施形態６１に記載の操作細胞。

【0858】

６３．前記標的ゲノム座位が、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、ＴＡＰ１遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、またはセーフハーバー座位である、実施形態６２に記載の操作細胞。

【0859】

６４．前記標的ゲノム座位が、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択される、実施形態６３に記載の操作細胞。

【0860】

６５．前記セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６、及びＳＨＳ２３１座位からなる群から選択される、実施形態６４に記載の操作細胞。

【0861】

６６．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、第１標的ゲノム座位中に組み込まれ、ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、第２標的ゲノム座位中に組み込まれ、ＣＤ５９をコードする前記ポリヌクレオチドが、第３標的ゲノム座位中に組み込まれる、実施形態６１～６５のいずれかに記載の操作細胞。

【0862】

６７．ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、第４標的ゲノム座位中に組み込まれる、実施形態６６に記載の操作細胞。

【0863】

６８．前記第１、第２、及び第３標的ゲノム座位のうち少なくとも２つが同じ座位である、実施形態６６に記載の操作細胞。

【0864】

６９．前記第１、第２、第３、及び第４標的ゲノム座位のうち少なくとも２つが同じ座位である、実施形態６７または実施形態６８に記載の操作細胞。

【0865】

７０．前記第１、第２及び第３標的ゲノム座位が同じ座位である、実施形態６６～６９のいずれかに記載の操作細胞。

【0866】

７１．前記第１、第２、第３、及び第４標的ゲノム座位が同じ座位である、実施形態６６～７０に記載の操作細胞。

【0867】

７２．前記第１、第２、及び第３標的ゲノム座位の各々が、異なる座位である、実施形態６６または実施形態６７に記載の操作細胞。

【0868】

７３．前記第１、第２、第３、及び第４標的ゲノム座位が、異なる座位である、実施形態６７に記載の操作細胞。

【0869】

７４．ＣＤ１４２の発現を減少させる前記改変が、ＣＤ１４２タンパク質発現を減少させる、実施形態１～７３のいずれかに記載の操作細胞。

【0870】

７５．前記改変が、ＣＤ１４２遺伝子活性を排除する、実施形態７４に記載の操作細胞。

【0871】

７６．前記改変が、前記ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、実施形態７４または７５のいずれかに記載の操作細胞。

【0872】

７７．前記改変が、前記細胞における全てのＣＤ１４２コード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態７５～７６のいずれかに記載の操作細胞。

【0873】

７８．前記不活性化または破壊が、前記ＣＤ１４２遺伝子内のインデルを含む、実施形態７６または実施形態７７に記載の操作細胞。

【0874】

７９．前記改変が、前記ＣＤ１４２遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または連続ストレッチの欠失である、実施形態６１～６５のいずれかに記載の操作細胞。

【0875】

８０．ＣＤ１４２遺伝子がノックアウトされている、実施形態７５～７９のいずれかに記載の操作細胞。

【0876】

８１．前記改変がゲノム改変タンパク質によって行われ、任意に前記改変が、ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集によって行われる、実施形態７５～８０のいずれかに記載の操作細胞。

【0877】

８２．前記ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または前記ＣＤ１４２遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意に前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される、実施形態８１に記載の操作細胞。

【0878】

８３．前記ヌクレアーゼ媒介ゲノム編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ＣＤ１４２遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態８２に記載の操作細胞。

【0879】

８４．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態８３に記載の操作細胞。

【0880】

８５．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる前記改変が、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる、実施形態１～２５及び２７～８４のいずれかに記載の操作細胞。

【0881】

８６．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる前記改変が、Ｂ２Ｍの発現減少を含む、実施形態１～２５及び２７～８５のいずれかに記載の操作細胞。

【0882】

８７．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる前記改変が、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の減少を含む、実施形態７４～８６のいずれかに記載の操作細胞。

【0883】

８８．前記改変が、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を排除する、実施形態８６または実施形態８７に記載の操作細胞。

【0884】

８９．前記改変が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、実施形態８６～８８のいずれかに記載の操作細胞。

【0885】

９０．前記改変が、前記細胞における全てのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態８６～８９のいずれかに記載の操作細胞。

【0886】

９１．前記不活性化または破壊が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内のインデルを含む、実施形態８９または実施形態９０に記載の操作細胞。

【0887】

９２．前記改変が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または連続ストレッチの欠失である、実施形態８６～９１のいずれかに記載の操作細胞。

【0888】

９３．前記Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされている、実施形態８６～９２のいずれかに記載の操作細胞。

【0889】

９４．前記改変がゲノム改変タンパク質によって行われ、任意に前記改変が、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、実施形態８５～９３のいずれかに記載の操作細胞。

【0890】

９５．前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、または前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せを使用して実施され、任意に前記改変が、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２を使用するヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、実施形態９４に記載の操作細胞。

【0891】

９６．前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態９５に記載の操作細胞。

【0892】

９７．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態９６に記載の操作細胞。

【0893】

９８．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる前記改変が、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる、実施形態１～２５、及び２７～９７のいずれかに記載の操作細胞。

【0894】

９９．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる前記改変が、ＣＩＩＴＡの発現減少を含む、実施形態１～２５及び２７～９８のいずれかに記載の操作細胞。

【0895】

１００．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる前記改変が、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の減少を含む、実施形態９９のいずれかに記載の操作細胞。

【0896】

１０１．前記改変がＣＩＩＴＡを排除する、実施形態９９または実施形態１００に記載の操作細胞。

【0897】

１０２．前記改変が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、実施形態９９～１０１のいずれかに記載の操作細胞。

【0898】

１０３．前記改変が、前記細胞における全てのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態９９～１０２のいずれかに記載の操作細胞。

【0899】

１０４．前記不活性化または破壊が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子内のインデルを含む、実施形態１０２または実施形態１０３に記載の操作細胞。

【0900】

１０５．前記インデルが、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異または連続ストレッチの欠失である、実施形態１０２～１０４のいずれかに記載の操作細胞。

【0901】

１０６．ＣＩＩＴＡ遺伝子がノックアウトされている、実施形態９９～１０５のいずれかに記載の操作細胞。

【0902】

１０７．前記改変が、ゲノム改変タンパク質によって行われる、実施形態１～１０６のいずれかに記載の操作細胞。

【0903】

１０８．前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、または部位特異的ターゲティング要素を介したプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）による改変である、実施形態１０７に記載の操作細胞。

【0904】

１０９．前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集である、実施形態１０７または１０８に記載の操作細胞。

【0905】

１１０．前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意に前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される、実施形態１０９に記載の操作細胞。

【0906】

１１１．前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される１つ以上のタンパク質によって実施される、実施形態１０７または１０８に記載の操作細胞。

【0907】

１１２．前記改変が、ＮＬＲＣ５、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＣＤ１４２、ＡＢＯ、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＮＬＧＮ４Ｙ及びＲＨＤのうちいずれか１つ以上の発現を減少させる、実施形態１～１１１のいずれか１つに記載の操作細胞。

【0908】

１１３．（ｉ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる、（ｉｉ）ＣＤ４６の発現を増加させる、及び（ｉｉｉ）ＣＤ５９の発現を増加させる前記改変のうち１つ以上が、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させる１つ以上の改変を含む、実施形態１～１１２のいずれか１つに記載の操作細胞。

【0909】

１１４．前記内因性遺伝子が、前記１つ以上の寛容原性因子、ＣＤ４６、またはＣＤ５９をコードする、実施形態１１３に記載の操作細胞。

【0910】

１１５．前記内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させる前記１つ以上の改変が、前記遺伝子の内因性プロモーターもしくはエンハンサーに対する１つ以上の改変または異種プロモーターの導入を含む、実施形態１１３または１１１４に記載の操作細胞。

【0911】

１１６．前記異種プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、実施形態１１５に記載の操作細胞。

【0912】

１１７．ヒト細胞または動物細胞である、実施形態１～１１６のいずれか１つに記載の操作細胞。

【0913】

１１８．ヒト細胞である、実施形態１１７に記載の操作細胞。

【0914】

１１９．血液にさらされる細胞型、または前記血液にさらされる細胞型に分化できる細胞型である、実施形態１～１１８のいずれかに記載の操作細胞。

【0915】

１２０．多能性幹細胞またはその子孫に由来する分化細胞である、実施形態１～１１９のいずれかに記載の操作細胞。

【0916】

１２１．前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態１２０に記載の操作細胞。

【0917】

１２２．ドナー対象から単離された初代細胞である、実施形態１１１９のいずれか１つに記載の操作細胞。

【0918】

１２３．前記ドナー対象が、健康であるか、または個々のドナーからドナー試料が得られた時点で疾患もしくは状態を有すると疑われていない、実施形態１２２に記載の操作細胞。

【0919】

１２４．島細胞、ベータ島細胞、膵島細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ細胞、内皮細胞、筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞、視細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、及び血液細胞からなる群から選択される、実施形態１～１２３のいずれかに記載の操作細胞。

【0920】

１２５．内皮細胞である、実施形態１～１２４のいずれかに記載の操作細胞。

【0921】

１２６．上皮細胞である、実施形態１～１２５のいずれかに記載の操作細胞。

【0922】

１２７．Ｔ細胞である、実施形態１２６に記載の操作細胞。

【0923】

１２８．ＮＫ細胞である、実施形態１２７に記載の操作細胞。

【0924】

１２９．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、実施形態１２７または請求項１２８に記載の操作細胞。

【0925】

１３０．幹細胞である、実施形態１２４に記載の操作細胞。

【0926】

１３１．造血幹細胞（ＨＳＣ）である、実施形態１２４に記載の操作細胞。

【0927】

１３２．ベータ島細胞である、実施形態１２４に記載の操作細胞。

【0928】

１３３．肝細胞である、実施形態１２４に記載の操作細胞。

【0929】

１３４．多能性幹細胞である、実施形態１２４に記載の操作細胞。

【0930】

１３５．人工多能性幹細胞である、実施形態１２４に記載の操作細胞。

【0931】

１３６．胚性幹細胞である、実施形態１２４に記載の操作細胞。

【0932】

１３７．ＡＢＯ式血液型のＯ型である、実施形態１～１３６のいずれかに記載の操作細胞。

【0933】

１３８．Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である、実施形態１～１３７のいずれかに記載の操作細胞。

【0934】

１３９．ＡＢＯの機能的Ａアレル及び／またはＡＢＯの機能的Ｂアレルを含む、実施形態１～１３６及び１３８のいずれかに記載の操作細胞。

【0935】

１４０．Ｒｈ因子陽性（Ｒｈ＋）である、実施形態１～１３７及び１３９のいずれかに記載の操作細胞。

【0936】

１４１．操作細胞を生成する方法であって、
ａ．前記細胞内の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させるか、または排除すること、
ｂ．前記細胞内のＣＤ１４２の発現を減少させること、ならびに
ｃ．前記細胞内の寛容原性因子の発現を増加させること
を含む、前記方法。

【0937】

１４２．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態１４１に記載の方法。

【0938】

１４３．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態１４２に記載の方法。

【0939】

１４４．前記１つ以上の寛容原性因子が、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の寛容原性因子を含む、実施形態１４１～１４３のいずれか１つに記載の方法。

【0940】

１４５．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７を含む、実施形態１４３または実施形態１４４に記載の方法。

【0941】

１４６．前記１つ以上の寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅを含む、実施形態１４１～１４５のいずれか１つに記載の方法。

【0942】

１４７．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ２４を含む、実施形態１４１～１４６のいずれか１つに記載の方法。

【0943】

１４８．前記１つ以上の寛容原性因子がＰＤＬ１を含む、実施形態１４１～１４７のいずれか１つに記載の方法。

【0944】

１４９．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ５５を含む、実施形態１４１～１４８のいずれか１つに記載の方法。

【0945】

１５０．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＲ１を含む、実施形態１４１～１４９のいずれか１つに記載の方法。

【0946】

１５１．前記１つ以上の寛容原性因子がＭＡＮＦを含む、実施形態１４１～１５０のいずれか１つに記載の方法。

【0947】

１５２．前記１つ以上の寛容原性因子がＡ２０／ＴＮＦＡＩＰ３を含む、実施形態１４１～１５１のいずれか１つに記載の方法。

【0948】

１５３．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７を含む、実施形態１４１～１５２のいずれか１つに記載の方法。

【0949】

１５４．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、実施形態１４１～１５３のいずれか１つに記載の方法。

【0950】

１５５．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、実施形態１４１～１５４のいずれか１つに記載の方法。

【0951】

１５６．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、実施形態１４１～１５５のいずれか１つに記載の方法。

【0952】

１５７．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、実施形態１４１～１５６のいずれか１つに記載の方法。

【0953】

１５８．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、実施形態１４１～１５７のいずれか１つに記載の方法。

【0954】

１５９．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１を含む、実施形態１４１～１５８のいずれか１つに記載の方法。

【0955】

１６０．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰを含む、実施形態１４１～１５９のいずれか１つに記載の方法。

【0956】

１６１．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦを含む、実施形態１４１～１６０のいずれか１つに記載の方法。

【0957】

１６２．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦを含む、実施形態１４１～１６１のいずれか１つに記載の方法。

【0958】

１６３．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の前記発現を減少させることを含む、実施形態１４１～１６２のいずれかに記載の方法。

【0959】

１６４．寛容原性の発現を増加させることが、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることを含む、実施形態１４１～１６３のいずれか１つに記載の方法。

【0960】

１６５．前記内因性遺伝子が、前記寛容原性因子をコードする、実施形態１６４に記載の方法。

【0961】

１６６．前記内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることが、前記遺伝子の内因性プロモーターもしくはエンハンサーを改変すること、または異種プロモーターを導入することを含む、実施形態１６４または１６５に記載の方法。

【0962】

１６７．前記異種プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、実施形態１６６に記載の方法。

【0963】

１６８．低免疫原性細胞を生成する方法であって、
ａ．前記細胞内のＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させること、ならびに
ｂ．前記細胞内のＣＤ１４２の発現を減少させること
を含む、前記方法。

【0964】

１６９．前記細胞内のＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることをさらに含む、実施形態１４１～１６８のいずれかに記載の方法。

【0965】

１７０．ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、及び／または１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることが、内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることを含む、実施形態１６８または１６９に記載の方法。

【0966】

１７１．前記内因性遺伝子が、前記ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、ＭＦＧＥ８、ＣＤ４６、またはＣＤ５９をコードする、実施形態１７０に記載の方法。

【0967】

１７２．前記内因性遺伝子の遺伝子活性を増加させることが、前記遺伝子の内因性プロモーターもしくはエンハンサーを改変すること、または異種プロモーターを導入することを含む、実施形態１７０または実施形態１７１に記載の方法。

【0968】

１７３．前記異種プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、実施形態１７２に記載の方法。

【0969】

１７４．前記発現減少が表面発現の減少を含み、及び／または前記発現増加が表面発現の増加を含み、任意に前記表面発現の減少が、検出可能な表面発現をなんら含まない、実施形態１４１～１７３のいずれかに記載の方法。

【0970】

１７５．前記１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを、前記細胞に導入することを含む、実施形態１６９～１７４のいずれかに記載の方法。

【0971】

１７６．前記１つ以上の補体インヒビターが、ＣＤ４６及びＣＤ５９であり、任意に前記１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む、実施形態１６９～１７５のいずれかに記載の方法。

【0972】

１７７．前記１つ以上の補体インヒビターが、ＣＤ４６、ＣＤ５９及びＣＤ５５であり、任意に前記１つ以上の補体インヒビターの発現を増加させることが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む、実施形態１６９～１７６のいずれかに記載の方法。

【0973】

１７８．ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す、実施形態１６９～１７７のいずれかに記載の方法。

【0974】

１７９．ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：３に記載される配列をコードする、実施形態１７８に記載の方法。

【0975】

１８０．ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸の配列をコードし、補体阻害活性を示す、実施形態１６９～１７９のいずれかに記載の方法。

【0976】

１８１．ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：５に記載される配列をコードする、１８０に記載の方法。

【0977】

１８２．ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：８のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列をコードし、補体阻害活性を示す、実施形態１６９～１８１のいずれかに記載の方法。

【0978】

１８３．ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：８に記載される配列をコードする、実施形態１８２に記載の方法。

【0979】

１８４．ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが各々、プロモーターに機能的に連結されている、実施形態１６９～１８３のいずれかに記載の方法。

【0980】

１８５．ＣＤ４７の発現を増加させる前記改変が、前記ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１６９～１８４のいずれかに記載の方法。

【0981】

１８６．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有する配列をコードし、前記操作細胞の自然免疫死滅を減少させる、実施形態１６９～１８５のいずれかに記載の方法。

【0982】

１８７．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、配列番号：１に記載される配列をコードする、実施形態１８６に記載の方法。

【0983】

１８８．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、プロモーターに機能的に連結されている、実施形態１６９～１８７のいずれかに記載の方法。

【0984】

１８９．前記１つ以上の寛容原性因子をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される２つ以上の外因性ポリペプチドを含むマルチシストロン性ベクターを、前記細胞に導入することを含む、実施形態１６９～１８８のいずれかに記載の方法。

【0985】

１９０．前記ポリヌクレオチドの各々が、ＩＲＥＳまたは自己切断ペプチドによって隔てられている、実施形態１８９に記載の方法。

【0986】

１９１．前記２つ以上の外因性ポリヌクレオチドが、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態１８９または実施形態１９０に記載の方法。

【0987】

１９２．前記マルチシストロン性ベクターの各ポリヌクレオチドが、同じプロモーターに機能的に連結されている、実施形態１８９～１９１のいずれかに記載の方法。

【0988】

１９３．前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１８９～１９２のいずれかに記載の方法。

【0989】

１９４．前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチド、及びＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１８９～１９３のいずれかに記載の方法。

【0990】

１９５．前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態１９３または実施形態１９４に記載の方法。

【0991】

１９６．前記操作細胞が、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む別個の導入遺伝子を含む、実施形態１９３または実施形態１９４に記載の方法。

【0992】

１９７．ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、前記操作細胞のゲノム中に組み込まれる、実施形態１６９～１９６のいずれかに記載の方法。

【0993】

１９８．ＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドが、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれる、実施形態１８５～１９７のいずれかに記載の方法。

【0994】

１９９．前記組込みが、前記操作細胞の前記ゲノムへの非標的挿入によって行われる、実施形態１９７または実施形態１９８に記載の方法。

【0995】

２００．前記組込みが、レンチウイルスベクターを使用した前記細胞中への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって行われる、実施形態１９９に記載の方法。

【0996】

２０１．前記組込みが、前記細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって行われ、任意に前記標的挿入が、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、実施形態１９７または実施形態１９８に記載の方法。

【0997】

２０２．前記標的ゲノム座位が、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座、及びＫＤＭ５Ｄ遺伝子座からなる群から選択される、実施形態２０１に記載の方法。

【0998】

２０３．前記標的ゲノム座位が、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、ＴＡＰ１遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、またはセーフハーバー座位である、実施形態２０１または実施形態２０２に記載の方法。

【0999】

２０４．前記標的ゲノム座位が、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択される、実施形態２０１または実施形態２０２に記載の方法。

【1000】

２０５．前記標的ゲノム座位がセーフハーバー座位である、実施形態２０１～２０４のいずれかに記載の方法。

【1001】

２０６．前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、または前記標的ゲノム座位を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、任意に前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される、実施形態２０１～２０５のいずれかに記載の方法。

【1002】

２０７．前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記標的ゲノム座位の標的配列に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、ＣＤ４６をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５９をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、ＣＤ５５をコードする前記外因性ポリヌクレオチド、及び／またはＣＤ４７をコードする前記外因性ポリヌクレオチドを含む相同組換え修復鋳型とを含む、実施形態２０６に記載の方法。

【1003】

２０８．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態２０７に記載の方法。

【1004】

２０９．ＣＤ１４２の発現を減少させることが、ＣＤ１４２タンパク質発現を減少させる、実施形態１４１～２０８のいずれかに記載の方法。

【1005】

２１０．ＣＤ１４２の発現を減少させることが、ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる改変を導入することを含む、実施形態２０９に記載の方法。

【1006】

２１１．ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる前記改変が、前記ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、実施形態２１０に記載の方法。

【1007】

２１２．ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる前記改変が、前記細胞における全てのＣＤ１４２コード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態２１０または実施形態２１１に記載の方法。

【1008】

２１３．前記不活性化または破壊が、前記ＣＤ１４２遺伝子内のインデル、または前記ＣＤ１４２遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失を含む、実施形態２１１または実施形態２１２に記載の方法。

【1009】

２１４．前記インデルが、フレームシフト変異である、実施形態２１３に記載の方法。

【1010】

２１５．前記ＣＤ１４２遺伝子がノックアウトされる、実施形態２１０～２１４のいずれかに記載の方法。

【1011】

２１６．ＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる前記改変が、ゲノム改変タンパク質によって導入され、任意にＣＤ１４２遺伝子活性を減少させる前記改変が、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって導入される、実施形態２１０～２１５のいずれかに記載の方法。

【1012】

２１７．前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、または前記ＣＤ１４２遺伝子を標的とする任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せを使用して実施され、任意に前記改変が、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２を使用するヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、実施形態２１６に記載の方法。

【1013】

２１８．前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ＣＤ１４２遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態２１７に記載の方法。

【1014】

２１９．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態２１８に記載の方法。

【1015】

２２０．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させることが、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変を導入することを含む、実施形態１４１～２１９のいずれかに記載の方法。

【1016】

２２１．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、Ｂ２Ｍの発現減少を含む、実施形態２２０のいずれかに記載の方法。

【1017】

２２２．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の減少を含む、実施形態２２０または２２１のいずれかに記載の方法。

【1018】

２２３．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、Ｂ２Ｍ遺伝子活性を減少させる、実施形態２２１または２２２に記載の方法。

【1019】

２２４．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を減少させる前記改変が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、実施形態２２１～２２３のいずれかに記載の方法。

【1020】

２２５．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、前記細胞における全てのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態２２１～２２３のいずれかに記載の方法。

【1021】

２２６．前記不活性化または破壊が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内のインデル、または前記Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失を含む、実施形態２２４または実施形態２２５に記載の方法。

【1022】

２２７．前記インデルが、フレームシフト変異である、実施形態２２６に記載の方法。

【1023】

２２８．前記Ｂ２Ｍ遺伝子がノックアウトされる、実施形態２２１～２２７のいずれかに記載の方法。

【1024】

２２９．１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、ゲノム改変タンパク質によって行われ、任意に１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、実施形態２２１～２２８のいずれかに記載の方法。

【1025】

２３０．前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、または前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せを使用して実施され、任意に前記改変が、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２を使用するヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、実施形態２２９に記載の方法。

【1026】

２３１．前記ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せによって行われ、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位に相補的な標的指向性ドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態２３０に記載の方法。

【1027】

２３２．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せが、前記ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態２３１に記載の方法。

【1028】

２３３．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させることが、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる改変を導入することを含む、実施形態１４１～２３２のいずれかに記載の方法。

【1029】

２３４．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、ＣＩＩＴＡの発現減少を含む、実施形態２３３に記載の方法。

【1030】

２３５．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の減少を含む、実施形態２３３または２３４に記載の方法。

【1031】

２３６．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、ＣＩＩＴＡ遺伝子活性を減少させる、実施形態２３３または実施形態２３４に記載の方法。

【1032】

２３７．１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子タンパク質の発現を減少させる前記改変が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、実施形態２３３～２３６のいずれかに記載の方法。

【1033】

２３８．前記改変が、前記細胞における全てのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態２３３～２３７のいずれかに記載の方法。

【1034】

２３９．前記不活性化または破壊が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子内のインデル、または前記ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続ストレッチの欠失を含む、実施形態２３７または実施形態２３８に記載の方法。

【1035】

２４０．前記インデルが、フレームシフト変異である、実施形態２３９に記載の方法。

【1036】

２４１．前記ＣＩＩＴＡ遺伝子がノックアウトされる、実施形態２３４～２４０のいずれかに記載の方法。

【1037】

２４２．前記細胞が、ヒト細胞または動物細胞であり、任意に前記動物細胞が、ブタ（ｐｉｇ）（ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ））細胞、ウシ（ｃｏｗ）（ウシ（ｂｏｖｉｎｅ））細胞、またはヒツジ（ｓｈｅｅｐ）（ヒツジ（ｏｖｉｎｅ））細胞である、実施形態１４１～２４１のいずれかに記載の方法。

【1038】

２４３．前記操作細胞がヒト細胞である、実施形態１４１～２４２のいずれかに記載の方法。

【1039】

２４４．前記細胞が、血液にさらされる細胞型、または前記血液にさらされる細胞型に分化できる細胞型である、実施形態１４１～２４３のいずれかに記載の方法。

【1040】

２４５．前記細胞が、ドナー対象から単離された初代細胞である、実施形態１４１～２４４のいずれかに記載の方法。

【1041】

２４６．前記細胞が多能性幹細胞であり、前記操作細胞が、前記多能性幹細胞に由来する分化細胞であり、前記方法が、前記多能性幹細胞を分化させることをさらに含む、実施形態１４１～２４４のいずれかに記載の方法。

【1042】

２４７．前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態２４６に記載の方法。

【1043】

２４８．前記操作細胞が、島細胞、ベータ島細胞、膵島細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ細胞、内皮細胞、筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞、視細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞、幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、及び血液細胞からなる群から選択される、実施形態１４１～２４３のいずれかに記載の方法。

【1044】

２４９．前記操作細胞がベータ島細胞である、実施形態２４８に記載の方法。

【1045】

２５０．前記操作細胞が肝細胞である、実施形態２４８に記載の方法。

【1046】

２５１．実施形態１４１～２５０のいずれかに記載の方法に従って作製される、操作細胞。

【1047】

２５２．前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時にＮＫ細胞媒介性細胞傷害を回避できる、実施形態１～１４０及び２５１のいずれかに記載の操作細胞。

【1048】

２５３．前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に成熟ＮＫ細胞による細胞溶解から保護される、実施形態１～１４０及び２５１～２５２のいずれかに記載の操作細胞。

【1049】

２５４．前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に前記細胞に対する免疫応答を誘導しない、実施形態１～１４０及び２５１～２５３のいずれかに記載の操作細胞。

【1050】

２５５．前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に前記細胞に対する全身性炎症反応を誘導しない、実施形態１～１４０及び２５１～２５４のいずれかに記載の操作細胞。

【1051】

２５６．前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に前記細胞に対する局所性炎症反応を誘導しない、実施形態１～１４０及び２５１～２５５のいずれかに記載の操作細胞。

【1052】

２５７．前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に補体経路活性化を誘導しない、実施形態１～１４０及び２５１～２５６のいずれかに記載の操作細胞。

【1053】

２５８．前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に凝固を誘導しない、実施形態１～１４０及び２５１～２５７のいずれかに記載の操作細胞。

【1054】

２５９．前記操作細胞、または前記操作細胞に由来する子孫もしくは分化細胞が、レシピエント患者への投与時に即時血液媒介性炎症反応を誘導しない、実施形態１～１４０及び２５１～２５８のいずれかに記載の操作細胞。

【1055】

２６０．前記レシピエント患者への投与時に血液と接触する、実施形態２５８～２５９に記載の操作細胞。

【1056】

２６１．実施形態１～１４０及び２５１～２６０のいずれかに記載の操作細胞を複数含む、細胞集団。

【1057】

２６２．前記集団内の細胞の少なくとも約３０％が、前記操作細胞である、実施形態２６１に記載の集団。

【1058】

２６３．前記複数の操作初代細胞が、２以上のドナー対象からプールした細胞に由来する、実施形態２６１または２６２に記載の操作細胞集団。

【1059】

２６４．前記２以上のドナー対象の各々が、健康な対象であるか、または前記ドナー対象から前記ドナー試料が得られた時点で疾患もしくは状態を有すると疑われていない、実施形態２６３に記載の操作初代細胞集団。

【1060】

２６５．前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、前記改変を含む、実施形態２６１～２６４のいずれかに記載の集団。

【1061】

２６６．前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態２６１～２６５のいずれかに記載の集団。

【1062】

２６７．前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態２６１～２６６のいずれかに記載の集団。

【1063】

２６８．前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態２６１～２６７のいずれかに記載の集団。

【1064】

２６９．前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ５５をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態２６１～２６８のいずれかに記載の集団。

【1065】

２７０．前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む、実施形態２６１～２６９のいずれかに記載の集団。

【1066】

２７１．前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む、実施形態２６１～２７０のいずれかに記載の集団。

【1067】

２７２．前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、未変更または非改変の野生型細胞と比較してＣＤ１４２の発現減少を含む、実施形態２６１～２７１のいずれかに記載の集団。

【1068】

２７３．前記集団内の細胞の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％が、ＣＤ１４２遺伝子の両アレルを不活性化する１つ以上の変更を含む、実施形態２６１～２７２のいずれかに記載の集団。

【1069】

２７４．実施形態２６１～２７３のいずれかに記載の集団または実施形態１～１４０及び２５１～２６０のいずれかに記載の操作細胞を含む、組成物。

【1070】

２７５．操作ベータ島細胞の集団を含む組成物であって、前記操作ベータ島細胞が、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、前記組成物。

【1071】

２７６．前記操作ベータ細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、実施形態２７５に記載の組成物。

【1072】

２７７．操作肝細胞の集団を含む組成物であって、前記操作肝細胞が、（ｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、（ｉｉ）ＣＤ１４２遺伝子の両アレルの不活性化または破壊、及び（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、前記組成物。

【1073】

２７８．前記操作肝細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の両アレルの不活性化または破壊を含む、実施形態２７７に記載の組成物。

【1074】

２７９．前記導入遺伝子が、マルチシストロン性ベクターであり、前記導入遺伝子が、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態２７５～２７８のいずれかに記載の組成物。

【1075】

２８０．前記ベータ島細胞または肝細胞が、マルチシストロン性ベクターをさらに含み、前記マルチシストロン性ベクターが、ＣＤ４６をコードする外因性ポリヌクレオチド及びＣＤ５９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態２７５～２７８のいずれかに記載の組成物。

【1076】

２８１．前記導入遺伝子（複数可）が、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって標的ゲノム座位に導入される、実施形態２７５～２７８のいずれかに記載の組成物。

【1077】

２８２．前記不活性化または破壊が、ゲノム改変タンパク質によって行われ、任意に前記不活性化または破壊が、ヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、実施形態２７５～２８１のいずれかに記載の組成物。

【1078】

２８３．前記ゲノム改変タンパク質による前記改変が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、または前記標的ゲノム座位を標的とする任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組合せを使用して実施され、任意に前記改変が、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２を使用するヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、実施形態２８１～２８２のいずれかに記載の組成物。

【1079】

２８４．医薬組成物である、実施形態２７５～２８３のいずれかに記載の組成物。

【1080】

２８５．薬学的に許容される賦形剤を含む、実施形態２８４に記載の組成物。

【1081】

２８６．凍結保護剤を含む無血清凍結保存培地内で製剤化される、実施形態２８４～２８５のいずれかに記載の組成物。

【1082】

２８７．前記凍結保護剤がＤＭＳＯであり、前記凍結保存培地が、５％～１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、実施形態２８６に記載の組成物。

【1083】

２８８．前記凍結保護剤が、１０％または約１０％ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）である、実施形態２８６または２８７に記載の組成物。

【1084】

２８９．滅菌されている、実施形態２７５～２８８のいずれかに記載の組成物。

【1085】

２９０．実施形態２７５～２８９のいずれかに記載の組成物を含む、容器。

【1086】

２９１．滅菌バッグである、実施形態２９０に記載の容器。

【1087】

２９２．凍結保存適合性バッグである、実施形態２９１に記載の滅菌バッグ。

【1088】

２９３．その必要のある患者の疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法であって、有効量の実施形態２６１～２７３のいずれかに記載の集団または実施形態２７４～２８９のいずれかに記載の組成物を、前記患者に投与することを含む、前記方法。

【1089】

２９４．凝固を減少させる抗凝固剤を前記患者に投与することをさらに含む、実施形態２９３に記載の方法。

【1090】

２９５．その必要のある患者の疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法であって、以下：
（ａ）複数の操作細胞を含む有効量の細胞集団を前記患者に投与することであって、
前記操作細胞が、
（ｉ）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビター（複数可）の発現を増加させる、
（ｉｉ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる、ならびに
（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる
改変を含み、
ここで、（ｉ）及び（ｉｉ）の前記発現増加ならびに（ｉｉｉ）の前記発現減少が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、投与すること、ならびに
（ｂ）凝固を減少させる抗凝固剤を前記患者に投与すること
を含む、前記方法。

【1091】

２９６．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃｌインヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、及びＳＥＲＰＩＮＢ９からなる群から選択される、実施形態２９５に記載の方法。

【1092】

２９７．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７である、実施形態２９６に記載の方法。

【1093】

２９８．その必要のある患者の疾患、状態、または細胞欠損症を治療する方法であって、以下：
（ａ）複数の操作細胞を含む有効量の細胞集団を前記患者に投与することであって、
前記操作細胞が、
（ｉ）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビター（複数可）の発現を増加させる、ならびに
（ｉｉ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００、及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる
改変を含み、
ここで、（ｉ）及び（ｉｉ）の前記発現増加が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、投与すること、ならびに
（ｂ）凝固を減少させる抗凝固剤を前記患者に投与すること
を含む、前記方法。

【1094】

２９９．前記集団が、薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物として製剤化される、実施形態２９８に記載の方法。

【1095】

３００．前記集団及び前記抗凝固剤が、同時にまたは連続して投与される、実施形態２９４～２９９のいずれかに記載の方法。

【1096】

３０１．前記抗凝固剤がヘパリンである、実施形態２９４～３００のいずれかに記載の方法。

【1097】

３０２．前記ヘパリンが未分画ヘパリンである、実施形態３０１に記載の方法。

【1098】

３０３．前記ヘパリンが低分子量ヘパリンである、実施形態３０１に記載の方法。

【1099】

３０４．前記ヘパリンが可溶性ヘパリンである、実施形態３０１～３０３のいずれかに記載の方法。

【1100】

３０５．前記ヘパリンが、前記患者に前記細胞を投与する前に前記細胞の表面上に固定化される、実施形態３０１～３０３のいずれかに記載の方法。

【1101】

３０６．前記抗凝固剤が、メラガトランまたはＬＭＷ－ＤＳである、実施形態２９４～３０５のいずれかに記載の方法。

【1102】

３０７．前記抗凝固剤が、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である、実施形態２９４～３０５のいずれかに記載の方法。

【1103】

３０８．前記抗凝固剤が、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣである、実施形態２９４～３０５のいずれかに記載の方法。

【1104】

３０９．前記状態または疾患が、糖尿病、がん、血管新生障害、眼疾患、甲状腺疾患、皮膚疾患、及び肝疾患からなる群から選択される、実施形態２９３～３０８のいずれかに記載の方法。

【1105】

３１０．前記細胞欠損症が糖尿病と関連するか、または前記疾患もしくは状態が糖尿病であり、任意に前記糖尿病がＩ型糖尿病である、実施形態２９３～３０８のいずれか１つに記載の方法。

【1106】

３１１．前記細胞集団が、ベータ島細胞を含む島細胞の集団である、実施形態３１０に記載の方法。

【1107】

３１２．前記島細胞が、島前駆細胞、未成熟島細胞、及び成熟島細胞からなる群から選択される、実施形態３１１に記載の方法。

【1108】

３１３．前記細胞欠損症が、血管状態もしくは疾患と関連するか、または疾患もしくは状態が、血管状態もしくは疾患である、実施形態２９３～３０９のいずれか１つに記載の方法。

【1109】

３１４．前記細胞集団が内皮細胞の集団である、実施形態３１３に記載の方法。

【1110】

３１５．前記細胞欠損症が自己免疫性甲状腺炎と関連するか、または前記疾患もしくは状態が自己免疫性甲状腺炎である、実施形態２９３～３０９のいずれか１つに記載の方法。

【1111】

３１６．前記細胞集団が、甲状腺前駆細胞の集団である、実施形態３１５に記載の方法。

【1112】

３１７．前記細胞欠損症が肝疾患と関連するか、または前記疾患が肝疾患である、実施形態２９３～３０９のいずれか１つに記載の方法。

【1113】

３１８．前記肝疾患が肝硬変を含む、実施形態３１７に記載の方法。

【1114】

３１９．前記細胞集団が、肝細胞または肝前駆細胞の集団である、実施形態３１７または３１８に記載の方法。

【1115】

３２０．前記細胞欠損症が角膜疾患と関連するか、または前記疾患が角膜疾患である、実施形態２９３～３０９のいずれか１つに記載の方法。

【1116】

３２１．前記角膜疾患が、フックスジストロフィーまたは先天性遺伝性内皮ジストロフィーである、実施形態３２０に記載の方法。

【1117】

３２２．前記細胞集団が、角膜内皮前駆細胞または角膜内皮細胞の集団である、実施形態３２０または３２１に記載の方法。

【1118】

３２３．前記細胞欠損症が腎疾患と関連するか、または前記疾患が腎疾患である、実施形態２９３～３０９のいずれか１つに記載の方法。

【1119】

３２４．前記細胞集団が、腎前駆細胞または腎細胞の集団である、実施形態３２３に記載の方法。

【1120】

３２５．前記細胞欠損症ががんと関連するか、または前記疾患ががんである、実施形態２９３～３０９のいずれか１つに記載の方法。

【1121】

３２６．前記がんが、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、膠芽腫、神経芽細胞腫、肺扁平上皮癌、肝細胞癌、及び膀胱癌からなる群から選択される、実施形態３２５に記載の方法。

【1122】

３２７．前記細胞集団が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の集団である、実施形態３２５または３２６に記載の方法。

【1123】

３２８．前記細胞欠損症が、造血器疾患もしくは障害と関連するか、または前記疾患もしくは状態が、造血器疾患もしくは障害である、実施形態２９３～３０９のいずれかに記載の方法。

【1124】

３２９．前記造血器疾患または障害が、骨髄異形成症、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、鎌状赤血球症、ダイアモンド・ブラックファン貧血、シュワッハマン・ダイアモンド障害、コストマン症候群、慢性肉芽腫症、副腎白質ジストロフィー、白血球接着不全、血友病、サラセミア、ベータ－サラセミア、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄）白血病（ＡＭＬ）、成人リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖性重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、慢性肉芽腫症、チェディアック・東症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはＡＩＤＳである、実施形態３２８に記載の方法。

【1125】

３３０．前記細胞欠損症が、白血病もしくは骨髄腫と関連するか、または前記疾患もしくは状態が、白血病もしくは骨髄腫である、実施形態３２８に記載の方法。

【1126】

３３１．前記細胞欠損症が、自己免疫疾患もしくは状態と関連するか、または前記疾患もしくは状態が、自己免疫疾患もしくは状態である、実施形態２９３～３０９及び３２８のいずれかに記載の方法。

【1127】

３３２．前記自己免疫疾患または状態が、急性散在性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫増殖症候群、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、多腺性自己免疫症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病、バロー同心円硬化症、ベーチェット症候群、バージャー病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、頭蓋動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん皮膚硬化型全身性強皮症、ドレスラー症候群、円板状エリテマトーデス、湿疹、付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバン症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性肺胞炎、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、炎症性脱髄性多発神経炎、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、ルー・ゲーリック病、ルポイド肝炎、エリテマトーデス、Ｍａｊｅｅｄ症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織病、限局性強皮症、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経脊髄炎、ニューロミオトニア、眼瘢痕性類天疱瘡、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スティル病、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、Ｓｕｓａｃ症候群、Ｓｗｅｅｔ症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病、未分化脊椎関節症、血管炎、白斑またはウェゲナー肉芽腫症である、実施形態３３１に記載の方法。

【1128】

３３３．前記細胞集団が、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／またはその誘導体を含む集団である、実施形態３２８～３３２のいずれかに記載の方法。

【1129】

３３４．前記細胞欠損症が、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経変性疾患もしくは状態、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、精神神経障害発作、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と関連するか、あるいは前記疾患または状態が、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経変性疾患もしくは状態、注意欠如多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、精神神経障害発作、または筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、実施形態２９３～３０９のいずれかに記載の方法。

【1130】

３３５．前記細胞集団が、神経細胞及び／またはグリア細胞を含む集団である、実施形態３３４に記載の方法。

【1131】

３３６．前記細胞が、投与前に増殖及び凍結保存される、実施形態２９３～３３５のいずれかに記載の方法。

【1132】

３３７．前記集団を投与することが、前記集団の静脈内注射、筋肉内注射、血管内注射、または移植を含む、実施形態２９３～３３６のいずれかに記載の方法。

【1133】

３３８．前記集団が、腎被膜移植または筋肉内注射を介して移植される、実施形態３３７に記載の方法。

【1134】

３３９．前記集団がドナー対象に由来し、前記ドナーのＨＬＡ型が、前記患者のＨＬＡ型と一致しない、実施形態２９３～３３８のいずれかに記載の方法。

【1135】

３４０．前記集団がドナーに由来し、前記ドナーの血液型が、前記患者の血液型と一致せず、前記ドナーの前記血液型が、Ｏ型ではない、実施形態２９３～３３９のいずれかに記載の方法。

【1136】

３４１．前記集団がドナーに由来し、前記ドナーの前記血液型が、Ｒｈ因子（Ｒｈ）陽性であり、前記患者の前記血液型が、Ｒｈ陰性である、実施形態２９３～３４０のいずれかに記載の方法。

【1137】

３４２．前記患者の血清が、Ｒｈに対する抗体を含む、実施形態２９３～３４１のいずれかに記載の方法。

【1138】

３４３．前記集団がヒト細胞集団であり、前記患者がヒト患者である、実施形態２９３～３４２のいずれかに記載の方法。

【1139】

３４４．前記細胞集団が、ＡＢＯの機能的Ａアレル及び／またはＡＢＯの機能的Ｂアレルを含む、実施形態２９３～３４３のいずれかに記載の方法。

【1140】

３４５．前記細胞集団がＡＢＯ式Ａ抗原を提示し、前記患者の前記血清が抗Ａ抗体を含む、実施形態３４４に記載の方法。

【1141】

３４６．前記細胞集団がＡＢＯ式Ｂ抗原を提示し、前記患者の前記血清が抗Ｂ抗体を含む、実施形態３４４に記載の方法。

【1142】

３４７．前記細胞集団が、ＡＢＯ式Ａ及びＢ抗原を提示し、前記患者の前記血清が、抗Ａ及び／または抗Ｂ抗体を含む、実施形態３４４に記載の方法。

【1143】

３４８．細胞集団がＲｈ因子を発現し、前記患者の前記血清が抗Ｒｈ抗体を含む、実施形態２９３～３４７のいずれかに記載の方法。

【1144】

３４９．前記患者に１つ以上の免疫抑制剤を投与することをさらに含む、実施形態２９３～３４８のいずれかに記載の方法。

【1145】

３５０．前記患者が、１つ以上の免疫抑制剤を投与されている、実施形態２９３～３４８のいずれかに記載の方法。

【1146】

３５１．前記１つ以上の免疫抑制剤が、小分子または抗体である、実施形態３４９または実施形態３５０に記載の方法。

【1147】

３５２．前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、コルチコステロイド、プレドニゾン、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア薬、ブレキナル、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスパガリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン（チモシン－α）、及び免疫抑制抗体からなる群から選択される、実施形態３４９～３５１のいずれかに記載の方法。

【1148】

３５３．前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロスポリンを含む、実施形態３４９～３５２のいずれかに記載の方法。

【1149】

３５４．前記１つ以上の免疫抑制剤が、ミコフェノール酸モフェチルを含む、実施形態３４９～３５２のいずれかに記載の方法。

【1150】

３５５．前記１つ以上の免疫抑制剤が、コルチコステロイドを含む、実施形態３４９～３５２のいずれかに記載の方法。

【1151】

３５６．前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロホスファミドを含む、実施形態３４９～３５２のいずれかに記載の方法。

【1152】

３５７．前記１つ以上の免疫抑制剤が、ラパマイシンを含む、実施形態３４９～３５２のいずれかに記載の方法。

【1153】

３５８．前記１つ以上の免疫抑制剤が、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む、実施形態３４９～３５２のいずれかに記載の方法。

【1154】

３５９．前記１つ以上の免疫抑制剤が、抗胸腺細胞グロブリンを含む、実施形態３４９～３５２のいずれかに記載の方法。

【1155】

３６０．前記１つ以上の免疫抑制剤が、１つ以上の免疫調節剤を含む、実施形態３４９～３５２のいずれかに記載の方法。

【1156】

３６１．前記１つ以上の免疫調節剤が、小分子または抗体である、実施形態３６０に記載の方法。

【1157】

３６２．前記抗体が、ＩＬ－２受容体のｐ７５、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－ガンマ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８からなる群から選択される受容体またはリガンド、及びそれらのリガンドのいずれかに結合する抗体のうち１つ以上に結合する、実施形態３５１または実施形態３６１に記載の方法。

【1158】

３６３．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６２のいずれかに記載の方法。

【1159】

３６４．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1160】

３６５．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間前またはそれよりも前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1161】

３６６．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1162】

３６７．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間後、またはそれよりも後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1163】

３６８．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与と同じ日に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1164】

３６９．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の投与後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1165】

３７０．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1166】

３７１．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1167】

３７２．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1168】

３７３．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間前またはそれよりも前に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1169】

３７４．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、または１４日後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1170】

３７５．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の初回投与及び／または２回目の投与の少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間後、またはそれよりも後に前記患者に投与されるか、または投与されている、実施形態３４９～３６３のいずれかに記載の方法。

【1171】

３７６．前記１つ以上の免疫抑制剤が、前記操作細胞の前記改変を含まない免疫原性細胞の免疫拒絶を減少させるために投与される１つ以上の免疫抑制剤の投与量と比較して、少ない投与量で投与される、実施形態３４９～３７５のいずれかに記載の方法。

【1172】

３７７．前記操作細胞が、前記操作細胞の死滅を制御できる、実施形態２９３～３７６のいずれかに記載の方法。

【1173】

３７８．前記操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチを含む、実施形態２９３～３７７のいずれかに記載の方法。

【1174】

３７９．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、薬物もしくはプロドラッグの存在下で、または選択的外因性化合物による活性化時に、細胞死の制御を誘導する、実施形態３７８に記載の方法。

【1175】

３８０．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記操作細胞のアポトーシスを誘導できる誘導性タンパク質である、実施形態３７８または実施形態３７９に記載の方法。

【1176】

３８１．前記操作細胞のアポトーシスを誘導できる前記誘導性タンパク質が、カスパーゼタンパク質である、実施形態３８０に記載の方法。

【1177】

３８２．前記カスパーゼタンパク質がカスパーゼ９である、実施形態３８１に記載の方法。

【1178】

３８３．前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、実施形態３８０または実施形態３８１に記載の方法。

【1179】

３８４．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記１つ以上の免疫抑制剤を前記患者に投与した後に細胞死の制御を誘導するように活性化される、実施形態３７８～３８３のいずれかに記載の方法。

【1180】

３８５．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記１つ以上の免疫抑制剤を前記患者に投与する前に細胞死の制御を誘導するように活性化される、実施形態３７８～３８３のいずれかに記載の方法。

【1181】

３８６．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記操作細胞を前記患者に投与した後に細胞死の制御を誘導するように活性化される、実施形態３７８～３８５のいずれかに記載の方法。

【1182】

３８７．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、細胞傷害または他の負の結果が前記患者に生じる場合に細胞死の制御を誘導するように活性化される、実施形態３７８～３８６のいずれかに記載の方法。

【1183】

３８８．前記操作細胞集団の操作細胞の枯渇を可能にする薬剤を投与することを含む、実施形態２９３～３８７のいずれかに記載の方法。

【1184】

３８９．前記操作細胞の枯渇を可能にする前記薬剤が、前記操作細胞の前記表面上に発現されるタンパク質を認識する抗体である、実施形態３８８に記載の方法。

【1185】

３９０．前記抗体が、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ、及びＲＱＲ８を認識する抗体からなる群から選択される、実施形態３８９に記載の方法。

【1186】

３９１．前記抗体が、モガムリズマブ、ＡＦＭ１３、ＭＯＲ２０８、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジニツキシマブ（ｄｉｎｉｔｕｘｉｍａｂ）、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ、及びそれらのバイオシミラーからなる群から選択される、実施形態３８９または実施形態３９０に記載の方法。

【1187】

３９２．前記操作細胞の前記表面上における前記１つ以上の寛容原性因子を認識する薬剤を投与することを含む、実施形態２９３～３９１のいずれかに記載の方法。

【1188】

３９３．前記操作細胞が、前記１つ以上の寛容原性因子を発現するように操作される、実施形態３９２に記載の方法。

【1189】

３９４．前記１つ以上の寛容原性因子が、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１つ以上の寛容原性因子を含む、実施形態２９３～３９３のいずれか１つに記載の方法。

【1190】

３９５．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７を含む、実施形態３９３または３９４に記載の方法。

【1191】

３９６．前記１つ以上の寛容原性因子がＨＬＡ－Ｅを含む、実施形態２９３～３９５のいずれか１つに記載の方法。

【1192】

３９７．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ２４を含む、実施形態２９３～３９６のいずれか１つに記載の方法。

【1193】

３９８．前記１つ以上の寛容原性因子がＰＤＬ１を含む、実施形態２９３～３９７のいずれか１つに記載の方法。

【1194】

３９９．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ５５を含む、実施形態２９３～３９８のいずれか１つに記載の方法。

【1195】

４００．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＲ１を含む、実施形態２９３～３９９のいずれか１つに記載の方法。

【1196】

４０１．前記１つ以上の寛容原性因子がＭＡＮＦを含む、実施形態２９３～４００のいずれか１つに記載の方法。

【1197】

４０２．前記１つ以上の寛容原性因子がＡ２０／ＴＮＦＡＩＰ３を含む、実施形態２９３～４０１のいずれか１つに記載の方法。

【1198】

４０３．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７を含む、実施形態２９３～４０２のいずれか１つに記載の方法。

【1199】

４０４．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、実施形態２９３～４０３のいずれか１つに記載の方法。

【1200】

４０５．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、及びＰＤＬ１を含む、実施形態２９３～４０４のいずれか１つに記載の方法。

【1201】

４０６．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、実施形態２９３～４０５のいずれか１つに記載の方法。

【1202】

４０７．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、実施形態２９３～４０６のいずれか１つに記載の方法。

【1203】

４０８．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１からなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、及びＣＲ１を含む、実施形態２９３～４０７のいずれか１つに記載の方法。

【1204】

４０９．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＰＤＬ１を含む、実施形態２９３～４０８のいずれか１つに記載の方法。

【1205】

４１０．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＡ２０／ＴＮＦＡＩＰを含む、実施形態２９３～４０９のいずれか１つに記載の方法。

【1206】

４１１．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、及びＭＡＮＦを含む、実施形態２９３～４１０のいずれか１つに記載の方法。

【1207】

４１２．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦからなる群から選択される２つ以上の寛容原性因子を含み、任意に前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤＬ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ、及びＭＡＮＦを含む、実施形態２９３～４１１のいずれか１つに記載の方法。

【1208】

４１３．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７である、実施形態３９３または実施形態３９４に記載の方法。

【1209】

４１４．前記患者に１つ以上の追加の治療剤を投与することをさらに含む、実施形態２９３～４１３のいずれかに記載の方法。

【1210】

４１５．前記患者が、１つ以上の追加の治療剤を投与されている、実施形態２９３～４１４のいずれかに記載の方法。

【1211】

４１６．前記方法の治療有効性をモニターすることをさらに含む、実施形態２９３～４１５のいずれかに記載の方法。

【1212】

４１７．前記方法の予防有効性をモニターすることをさらに含む、実施形態２９３～４１６のいずれかに記載の方法。

【1213】

４１８．１つ以上の疾患症状の所望の抑制が生じるまで繰り返される、実施形態２９３～４１７のいずれかに記載の方法。

【1214】

４１９．自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１～１４０及び２５１～２６０のいずれかに記載の操作細胞。

【1215】

４２０．前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、実施形態４１９に記載の操作細胞。

【1216】

４２１．前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子または安全スイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４１９または実施形態４２０に記載の操作細胞。

【1217】

４２２．前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記１つ以上の寛容原性因子が、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４１９～４２１のいずれかに記載の操作細胞。

【1218】

４２３．前記バイシストロン性カセットが、前記操作細胞の前記ゲノムへの非標的挿入によって、任意にレンチウイルスベクターを使用した前記細胞中への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる、実施形態４１９または実施形態４２０に記載の操作細胞。

【1219】

４２４．前記バイシストロン性カセットが、前記細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって組み込まれ、任意に前記標的挿入が、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、実施形態４１９または４２０に記載の操作細胞。

【1220】

４２５．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７である、実施形態４１９～４２４のいずれかに記載の操作細胞。

【1221】

４２６．前記操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１４１～２５０のいずれかに記載の方法。

【1222】

４２７．前記自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、実施形態４２６に記載の方法。

【1223】

４２８．前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子または安全スイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４２６または実施形態４２７に記載の方法。

【1224】

４２９．前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記１つ以上の寛容原性因子が、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４２６または実施形態４２７のいずれかに記載の方法。

【1225】

４３０．前記バイシストロン性カセットが、前記操作細胞の前記ゲノムへの非標的挿入によって組み込まれる、実施形態４２８または実施形態４２９に記載の方法。

【1226】

４３１．前記バイシストロン性カセットが、前記操作細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって組み込まれる、実施形態４２８または実施形態４２９に記載の方法。

【1227】

４３２．前記１つ以上の寛容原性因子がＣＤ４７である、実施形態４２６～４３１のいずれかに記載の方法。

【1228】

４３３．前記操作細胞集団の操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態２７４～２８９のいずれかに記載の組成物。

【1229】

４３４．前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシン活性化カスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、実施形態４３３に記載の組成物。

【1230】

４３５．前記自殺遺伝子、及び前記自殺遺伝子または安全スイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞集団の操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４３３または実施形態４３４に記載の組成物。

【1231】

４３６．前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記外因性ＣＤ４７が、前記操作細胞の前記ゲノム中に組み込まれているバイシストロン性カセットから発現される、実施形態４３３～４３５のいずれかに記載の組成物。

【1232】

４３７．前記バイシストロン性カセットが、前記ゲノムへの非標的挿入によって、任意にレンチウイルスベクターを使用した前記操作細胞集団の操作細胞中への前記外因性ポリヌクレオチドの導入によって組み込まれる、実施形態４３５または実施形態４３６に記載の組成物。

【1233】

４３８．前記バイシストロン性カセットが、前記操作細胞集団の操作細胞の標的ゲノム座位への標的挿入によって組み込まれ、任意に前記標的挿入が、相同組換え修復を伴うヌクレアーゼ媒介遺伝子編集によって行われる、実施形態４３５または実施形態４３６に記載の組成物。

【1234】

４３９．実施形態２６１～２７３のいずれかに記載の操作細胞集団または実施形態４１９～４２５のいずれかに記載の操作細胞を複数含む細胞集団と、凝固を減少させる抗凝固剤または細胞コーティングとを含む、組合せ。

【1235】

４４０．
（ａ）複数の操作細胞を含む細胞集団であって、
前記操作細胞が、
（ｉ）ＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５からなる群から選択される１つ以上の補体インヒビター（複数可）の発現を増加させる、
（ｉｉ）ＣＤ４７の発現を増加させる、ならびに
（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を減少させる
改変を含み、
ここで、（ｉ）及び（ｉｉ）の前記発現増加ならびに（ｉｉｉ）の前記発現減少が、前記改変を含まない同じ細胞型の細胞と比較してのものである、前記細胞集団と、
（ｂ）抗凝固剤と
を含む、組合せ。

【1236】

４４１．前記抗凝固剤が、ヘパリン、アンチトロンビンの活性化因子、凝固第ＩＩ因子（ｆＩＩ）の阻害剤、凝固第ＶＩＩ因子（ｆＶＩＩ）の阻害剤、及び凝固第Ｘ因子（ｆＸ）の阻害剤からなる群から選択される、実施形態４３９または実施形態４４０に記載の組合せ。

【1237】

４４２．前記抗凝固剤がヘパリンである、実施形態４４１に記載の組合せ。

【1238】

４４３．前記ヘパリンが未分画ヘパリンである、実施形態４４２に記載の組合せ。

【1239】

４４４．前記ヘパリンが低分子量ヘパリンである、実施形態４４３に記載の組合せ。

【1240】

４４５．前記ヘパリンが可溶性ヘパリンである、実施形態４４１～４４４のいずれかに記載の組合せ。

【1241】

４４６．前記抗凝固剤が、メラガトランまたはＬＭＷ－ＤＳである、実施形態４４１に記載の組合せ。

【1242】

４４７．前記抗凝固剤が、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）である、実施形態４４１に記載の組合せ。

【1243】

４４８．前記抗凝固剤が、アルファ－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）及び／または活性化プロテインＣである、実施形態４４１に記載の組合せ。

【1244】

４４９．前記抗凝固剤が、ＣＤ１４２に対する抗体である、実施形態４４１に記載の組合せ。

【1245】

４５０．実施形態４４１～４４８のいずれか１つに記載の組成物を含む、キット。

【実施例】

【1246】

以下の実施例は、例示目的のために含まれているにすぎず、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

【1247】

実施例１ ヒトＡＢＯ不適合媒介ＣＤＣに対する、ヒトＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ細胞におけるＣＤ４６、ＣＤ５５、及び／またはＣＤ５９の過剰発現の効果
本実施例は、過剰発現している膜結合補体インヒビターの、ＣＤＣに対する効果を試験するための研究について記載している。ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９を、ヒトＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）またはＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣから分化した内皮細胞において単独で、または様々な組合せで発現させた。

【1248】

Ａ．方法
Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ低免疫細胞におけるＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９（単独またはその組合せ）の導入遺伝子発現。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}ｈｉＰＳＣを、標準的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して生成した。外因性ＣＤ４７、ならびに１つ以上の外因性膜結合補体インヒビターであるＣＤ４６、ＣＤ５５及びＣＤ５９をコードする導入遺伝子（ｔｇ）を、外因性タンパク質をコードするレンチウイルスベクターを用いた標準的なレンチウイルスベクター形質導入技術を使用して細胞に導入した。

【1249】

改変したｈｉＰＳＣからの内皮細胞の分化。内皮細胞を、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ低免疫細胞から、またはＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６及びＣＤ５９、ＣＤ４６及びＣＤ５５、ＣＤ５５及びＣＤ５９、もしくはＣＤ４６、ＣＤ５５及びＣＤ５９を過剰発現するように追加で操作したｈｉＰＳＣから分化させた。内皮細胞の分化は、Ｄｅｕｓｅ，ｅｔ ａｌ．“Ｈｙｐｏｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｖａｄｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｕｌｌｙ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ”Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．３７，３（２０１９）：２５２－２５８（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように実施した。

【1250】

フローサイトメトリー。操作細胞上のＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及び／またはＣＤ５９の表面発現レベルを、抗体特異的試薬を使用するフローサイトメトリーによって細胞を染色することにより評価した。アイソタイプ抗体を対照として使用した。操作細胞を分析のためにプールしたか、または導入遺伝子の陽性（＋）表面発現（アイソタイプよりも３０～６０倍発現）、導入遺伝子の高（＋＋）表面発現（アイソタイプよりも６１～４００倍発現）もしくは導入遺伝子の超高（＋＋＋）発現（アイソタイプよりも４００倍超）に選別した。

【1251】

ＡＢＯ不適合血清を用いたヒト細胞内でのＣＤＣアッセイ。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣまたはＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ４６及びＣＤ５９、ＣＤ４６及びＣＤ５５、ＣＤ５５及びＣＤ５９、もしくはＣＤ４６、ＣＤ５５及びＣＤ５９を過剰発現するようにも操作したｈｉＥＣを、ＡＢＯ不適合ヒト血清と共にインキュベートし、ＣＤＣを、細胞増殖及び細胞の生存能のラベルフリーモニタリングを提供するために、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）ＭＰプラットフォーム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でインキュベーションの経時的な細胞溶解を測定することによって分析した。インピーダンスの変化を、細胞指数（ＣＩ）として報告した（細胞指数の低減は、細胞の溶解または死滅の増加を示す）。

【1252】

Ｂ．結果
Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ細胞は、ＣＤＣから保護されていない。図１Ａ及び図１Ｂに示す通り、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣ及びｈｉＥＣはそれぞれ、ＨＬＡ－ＩまたはＨＬＡ－ＩＩを発現せず、ＣＤ４７を過剰発現する。図２Ａ及び図２Ｂに示す通り、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣ及びｈｉＥＣもそれぞれ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９補体阻害性受容体の内因性表面発現を示す。補体阻害性受容体の発現にもかかわらず、結果は、細胞がＣＤＣから保護されていなかったことを示した。具体的には、ＡＢＯ不適合血清とのインキュベーションによって、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣ（図３Ａ）及びＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＥＣ（図３Ｂ）の両方とも、迅速な死滅がもたらされた。

【1253】

ＣＤ４６及びＣＤ５９またはＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９の過剰発現は、ＡＢＯ不適合媒介ＣＤＣから細胞を保護する。１つ以上の膜結合補体インヒビターの過剰発現が細胞をＣＤＣから保護することになるかを決定するために、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣまたはＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９のうち１つ以上を過剰発現するように操作したｈｉＥＣを、ＣＤＣに対する耐性について評価した。

【1254】

非形質導入細胞（内因性発現）または形質導入細胞プールもしくは個々のクローンにおけるＣＤ４６、ＣＤ５５、及び／またはＣＤ５９の発現レベルを、以下の表Ｅ１（ｈｉＰＳＣ）及び表Ｅ２（ｈｉＥＣ）に提供する。形質導入細胞プール及びクローンにおける過剰発現は、以下の通りに分類した：＋＝アイソタイプ対照よりも３０～６０倍、＋＋＝アイソタイプ対照よりも６１～４００倍、及び＋＋＋＝アイソタイプ対照よりも４００倍超。個々の補体インヒビター受容体をコードする導入遺伝子を含有するレンチウイルスベクターで形質導入したＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣまたはｈｉＥＣのフローサイトメトリー分析によって、表Ｅ１及び表Ｅ２に示す通り、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９の表面発現の増加が実証された。

【1255】

Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣまたはｈｉＥＣにおけるＣＤ４６、ＣＤ５５、またはＣＤ５９の個々の過剰発現は、個々の補体インヒビター：ＣＤ４６（図４Ａ、ｈｉＰＳＣ、図４Ｂ、ｈｉＥＣ）、ＣＤ５５（図５Ａ、ｈｉＰＳＣ、図５Ｂ、ｈｉＥＣ）、またはＣＤ５９（図６Ａ、ｈｉＰＳＣ、図６Ｂ、ｈｉＥＣ）の超高（＋＋＋）発現を有する代表的なクローンについても、ＣＤＣから細胞を保護しなかった。表Ｅ１及び表Ｅ２に示した他の個々の補体インヒビター発現クローンについての、ＡＢＯ不適合性ＣＤＣアッセイでも同様の結果を得た。ＣＤ４６及びＣＤ５５のＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣ（表Ｅ１）またはＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＥＣ（表Ｅ２）の組合せの過剰発現（高（＋＋）発現でも）は、ＣＤＣに対して若干の保護を提供したが、ｈｉＰＳＣについては図７Ａに、及びｈｉＥＣについては図７Ｂに示した通り、細胞死滅を予防するのに効果的ではなかった。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣ（表Ｅ１）またはＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＥＣ（表Ｅ２）におけるＣＤ５５及びＣＤ５９の組合せの過剰発現（高（＋＋）発現でも）も、ｈｉＰＳＣについては図８Ａに、及びｈｉＥＣについては図８Ｂに示した通り、ＣＤＣに対する保護を一切提供しなかった。

【1256】

対照的に、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣ（表Ｅ１）またはＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＥＣ（表Ｅ２）におけるＣＤ４６及びＣＤ５９の組合せの過剰発現は、代表的なｈｉＰＳＣクローンについては図９Ａに、及び代表的なｈｉＥＣクローンについては図９Ｂに示した通り、実質的にＣＤＣによる細胞死滅を減少させたか、または回避した。さらに、ＣＤ４９及びＣＤ５９の高（＋＋）発現（例えば、表Ｅ１及びＥ２に示したように、アイソタイプ対照よりも１００倍未満）も、ＣＤＣを予防するのに十分であった。

【1257】

Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣ（表Ｅ１）またはＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＥＣ（表Ｅ２）におけるＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９の組合せの過剰発現も、代表的なｈｉＰＳＣクローンについては図１０Ａに、及び代表的なｈｉＥＣクローンについては図１０Ｂに示した通り、実質的にＣＤＣによる細胞死滅を減少させたか、または回避したため、ｈｉＰＳＣまたはｈｉＥＣの生存をもたらした。

【1258】

ｈｉＰＳＣ（ｈｉＥＣ）から単独で（すなわち、ＡＢＯ不適合血清を添加することなく）分化させた内皮細胞についてのＣＤＣアッセイの結果を、図１１に提供する。ＡＢＯ不適合血清の存在下で、ｈｉＥＣ単独（対照）の生存と、ＣＤ４６及びＣＤ５９（図９Ａ～９Ｂ）またはＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９（図１０Ａ～１０Ｂ）を過剰発現するｈｉＰＳＣまたはｈｉＥＣの生存との間に有意差を全く観察せず、これはＣＤ４６及びＣＤ５９またはＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９の過剰発現がＣＤＣを遮断したことを示した。

【1259】

ＣＤＣアッセイの結果を図面内で代表的なクローンについて示しているが、以下の表Ｅ１及び表Ｅ２に示す全てのクローンについても同様の結果を得た。特に、ＣＤ４６、ＣＤ５５、またはＣＤ５９で個々に形質導入したプール及びクローンについて、ならびにＣＤ４６及びＣＤ５５またはＣＤ５５及びＣＤ５９で形質導入したプール及びクローンについては、ＣＤＣ媒介死滅を観察した。対照的に、ＣＤ４６及びＣＤ５９で形質導入したか、またはＣＤ４６、ＣＤ５９、及びＣＤ５５で形質導入したプール及びクローンについては、生存（ＣＤＣ媒介死滅に対する保護）を観察した。

【1260】

まとめると、これらの結果は、膜結合補体インヒビターのＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９を含む、ＣＤＣの阻害剤を内因的に発現する、ｈｉＰＳＣ及び分化細胞（ｈｉＥＣなど）を含む細胞が、自然または適応免疫応答を誘発しないＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ細胞であっても、ＣＤＣから細胞を十分に保護できない可能性があることを実証している。しかしながら、データは、ＣＤ５９と共にＣＤ４６を、またはＣＤ５９及びＣＤ５５と共にＣＤ４６を過剰発現すると、細胞表面上の抗原に結合する抗体（例えば、ＡＢＯ不適合血清中の抗Ａ抗体または抗Ｂ抗体）の存在下であっても、これらの細胞をＣＤＣから保護することを実証している。

【1261】

【表E1】

【1262】

【表E2】

【1263】

実施例２ ヘパリンを有するＢ２Ｍインデル／インデル、ＣＩＩＴＡインデル／インデル、ＣＤ４７ｔｇ、ＣＤ４６ｔｇ、ＣＤ５９ｔｇ ｈｉＰＳＣ由来のベータ島細胞の移植
Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ、ＣＤ４６ｔｇ、ＣＤ５９ｔｇ ｈｉＰＳＣを、実施例１に記載したように生成する。改変したｈｉＰＳＣを、例えば、米国特許公開第２０２１／０２０７０９９号、Ｈｏｇｒｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ｔｏ ｄｉｒｅｃｔ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０２０，３８：４６０－４７０，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０４３０－６、及びＨｏｇｒｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，”Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．，２０２１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５９６－０２１－００５６０－ｙ（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ベータ島細胞の分化に関する確立されたプロトコールに従って、ベータ島細胞（改変した低免疫原性ベータ島細胞）に分化させる。

【1264】

Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ、ＣＤ４６ｔｇ、ＣＤ５９ｔｇ ｈｉＰＳＣから分化させた改変低免疫原性ベータ島細胞を、Ｉ型糖尿病患者に筋肉内注射または門脈内注射によって移植する。患者に、静脈内注射によって１００、５００、または２５００単位／ｋｇでヘパリンを投与する。

【1265】

移植したベータ島細胞の長期的機能を、血糖値をアッセイすることによって分析する。標準的なプロトコールに従って、４時間の絶食後に血糖測定を行う。８０～１２０ｍｇ／ｄＬの血糖値は非糖尿病性に分類し、２００ｍｇ／ｄＬを超える血糖値は糖尿病性に分類する。

【1266】

Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ、ＣＤ４６ｔｇ、ＣＤ５９ｔｇを組み合わせた改変は、移植したｈｉＰＳＣ由来のベータ島細胞の長期生存及び生着を改善し、移植したｈｉＰＳＣ由来のベータ島細胞の（例えば、血糖値によってモニターする場合に）長期機能を改善する。改変低免疫原性ベータ島細胞（Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ、ＣＤ４６ｔｇ、ＣＤ５９ｔｇ）の投与と組み合わせたヘパリンの投与は、移植したｈｉＰＳＣの生存、生着、及び／または機能を改善し得、及び／またはｈｉＰＳＣ由来のベータ島細胞の移植に応答する凝固経路の活性化を減少させ得る（例えば、移植後にトロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）またはＣ－ペプチドのレベルを減少させる）。

【1267】

実施例３ Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ１４２^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣ由来のベータ島細胞の移植
Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ１４２^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣを、実施例１に記載したように生成し、上記実施例２に記載したようにベータ島細胞に分化させる。

【1268】

１型糖尿病患者に、さらにヘパリンを患者に投与しないことを除いて実施例２に記載したように、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ１４２^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ ｈｉＰＳＣから分化した改変低免疫原性ベータ島細胞を移植する。患者を、実施例２に記載したように、移植細胞の生着、長期生存、及び長期的機能についてモニターする。

【1269】

Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ１４２^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇを組み合わせた改変は、移植したｈｉＰＳＣ由来のベータ島細胞の長期生存及び生着を改善し、移植したｈｉＰＳＣ由来のベータ島細胞の（例えば、血糖値によってモニターする場合に）長期機能を改善する。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ１４２^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇは、補体依存性細胞傷害を減少させ、ｈｉＰＳＣ由来のベータ島細胞の移植に応答する凝固経路の活性化を減少させ得る（例えば、移植後にトロンビン－アンチトロンビンＩＩＩ複合体（ＴＡＴ）またはＣ－ペプチドのレベルを減少させる）。したがって、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ１４２^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇ改変ベータ島細胞は、移植後の即時血液媒介性免疫反応（ＩＢＭＩＲ）経路の活性化を回避し得る。

【1270】

本発明は、例えば、本発明の様々な態様を例示するために提供される、特定の開示される実施形態の範囲に限定されることを意図するものではない。記載される組成物及び方法に対する様々な変更が、本明細書の記載及び教示から明らかとなる。そのような変化形態は、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく実施されてよく、本開示の範囲内であることを意図する。

【1271】

配列

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【配列表】

2024535677000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-04-16

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】変更

【補正の内容】

【配列表】

2024535677000001.xml

【国際調査報告】