特表2024-535684Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＵＢＥ３Ａ）のタンパク質標的
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】Ｅ３ユビキチンリガーゼ（ＵＢＥ３Ａ）のタンパク質標的
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240925BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240925BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240925BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240925BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240925BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240925BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240925BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68 ZNA
G01N33/53 D
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
C07K14/47
C12Q1/02
C12N15/113 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509024
(86)(22)【出願日】2022-08-15
(85)【翻訳文提出日】2024-02-15
(86)【国際出願番号】 EP2022072744
(87)【国際公開番号】W WO2023020980
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】21191417.1
(32)【優先日】2021-08-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(74)【代理人】
【識別番号】110001508
【氏名又は名称】弁理士法人 津国
(72)【発明者】
【氏名】ヤーガジア，ラヴィ
(72)【発明者】
【氏名】クレマー，トーマス
(72)【発明者】
【氏名】マイヤー，ソニヤ
(72)【発明者】
【氏名】パンディア，ニクヒル・ヤナーク
(72)【発明者】
【氏名】ティアノヴァ，シュテフカ・グリゴローヴァ
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045BB20
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB01
2G045CB30
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2G045FB06
4B063QA18
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4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA89
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、ＵＢＥ３Ａタンパク質標的、及びｕｂｅ３ａ発現を調節する化合物に対する標的関与のバイオマーカーとしてのその使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組織試料中のＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を測定するための方法であって、ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の前記試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１つのタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、前記対照中の前記少なくとも１つのタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１つのタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を示している、方法。
【請求項2】
組織試料中のＵＢＥ３Ａタンパク質の発現誘導を測定するための請求項１に記載の方法であって、ｄ）ＵＢＥ３Ａ誘導因子で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｅ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の前記試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｆ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１つのタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、前記対照中の前記少なくとも１つのタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１つのタンパク質の減少したタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現誘導を示している、方法。
【請求項3】
ＵＢＥ３Ａ調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を判定するための方法であって、ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の前記試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１つのタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、前記対照中の前記少なくとも１つのタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１つのタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、前記ＵＢＥ３Ａ調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を示している、方法。
【請求項4】
前記組織試料が、血液試料、血漿試料、又はＣＳＦ試料である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記タンパク質発現レベルが、ウェスタンブロッティング、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）又はイムノアッセイを使用して測定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＵＢＥ３Ａ調節因子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ＵＢＥ３Ａ調節因子が、自閉症スペクトラム障害、アンジェルマン症候群、又は１５ｑｄｕｐ症候群の処置のためのＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル誘導因子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ステップｂ）における前記タンパク質が、ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＵＢＬＣＰ１及びＰＳＭＥ３からなる群から選択され、これらのタンパク質の発現レベルが、前記ＵＢＥ３Ａの発現レベルと逆相関する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ステップｂ）における前記タンパク質が、ＡＣＹＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ及びＳＯＤ２からなる群から選択され、これらのタンパク質の発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルの前記発現レベルと直接相関する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＵＢＥ３Ａタンパク質発現調節因子を同定するためのスクリーニング方法であって、ａ）試験化合物で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の前記試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された前記少なくとも１つのタンパク質の前記タンパク質発現レベルを、対照中の前記少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、前記対照中の前記少なくとも１つのタンパク質の前記タンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された前記少なくとも１つのタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現調節因子を示している、スクリーニング方法。
【請求項11】
ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節のためのバイオマーカーとしての、ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択されるタンパク質の使用。
【請求項12】
前記ＵＢＥ３Ａの調節が、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル誘導因子によるものである、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
前記ＵＢＥ３Ａバイオマーカータンパク質のタンパク質発現レベルが、前記ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルと逆相関する、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項14】
前記ＵＢＥ３Ａバイオマーカータンパク質のタンパク質発現レベルが、前記ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルと直接相関する、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項15】
ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を判定するための、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項16】
前記ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項17】
前記ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子が、自閉症スペクトラム障害、アンジェルマン症候群、又は１５ｑｄｕｐ症候群の処置のためのＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル誘導因子である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ユビキチン－タンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）のタンパク質レベルが増加又は減少すると、タンパク質発現レベルが調節される新規バイオマーカー、及び薬物開発におけるその使用を提供する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
アンジェルマン症候群は、重度の知的及び発達障害、睡眠障害、てんかん発作、ぎくしゃくした動き、ＥＥＧ異常、頻繁な笑い又は笑顔、及び深刻な言語障害を特徴とする。アンジェルマン症候群は、ＵＢＥ３Ａ遺伝子、ひいては母性遺伝染色体１５ｑ１１．２上のタンパク質の欠失又は不活性化によって引き起こされる神経遺伝学的障害である。一方、Ｄｕｐ１５ｑ症候群は、染色体１５ｑ１１－１３．１の重複に起因する臨床的に同定可能な症候群である。Ｄｕｐ１５ｑ症候群では、ＵＢＥ３Ａの過剰発現がある。アンジェルマン症候群（ＡＳ）では、Ｅ３ユビキチンリガーゼＵＢＥ３Ａのニューロン喪失が、過剰な重度の神経障害をもたらす。
アンジェルマン症候群は、重度の知的及び発達障害、睡眠障害、てんかん発作、ぎくしゃくした動き、ＥＥＧ異常、頻繁な笑い又は笑顔、及び深刻な言語障害を特徴とする。アンジェルマン症候群は、ＵＢＥ３Ａ遺伝子、ひいては母性遺伝染色体１５ｑ１１．２上のタンパク質の欠失又は不活性化によって引き起こされる神経遺伝学的障害である。一方、Ｄｕｐ１５ｑ症候群は、染色体１５ｑ１１－１３．１の重複に起因する臨床的に同定可能な症候群である。Ｄｕｐ１５ｑ症候群では、ＵＢＥ３Ａの過剰発現がある。アンジェルマン症候群（ＡＳ）では、Ｅ３ユビキチンリガーゼＵＢＥ３Ａのニューロン喪失が、過剰な重度の神経障害をもたらす。
【0003】
ＵＢＥ３Ａのニューロン喪失はＡＳを引き起こすが、下流の分子及び細胞機能障害の知識は不足している。関連するＵＢＥ３Ａ基質の同定は、健康及び疾患におけるＵｂｅ３ａ機能の役割のより良い理解をもたらし、ＵＢＥ３Ａ機能をモニターするための薬物及びバイオマーカーの両方の発見を支援する。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、ユビキチン－タンパク質リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ）のタンパク質レベルが増加又は減少し、さらに一部がＵＢＥ３Ａとタンパク質複合体を形成している場合に、タンパク質発現が調節される新規バイオマーカーに関する。これらには、タンパク質ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３が含まれる。本発明はさらに、アンジェルマン症候群、１５ｑｄｕｐ症候群、及び他の自閉症スペクトラム障害を含む、ＵＢＥ３Ａを標的とする疾患のための医薬処置のための、これらのタンパク質に基づくＵＢＥ３Ａ活性の検出のための医薬バイオマーカー及び方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【0005】
発明の詳細な説明
第１の態様では、本発明は、組織試料中のＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を測定するための方法であって、
ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルを、対照試料中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、対照試料中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を示している、方法を提供する。
第１の態様では、本発明は、組織試料中のＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を測定するための方法であって、
ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルを、対照試料中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、対照試料中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現調節を示している、方法を提供する。
【0006】
第２の態様では、本発明は、組織試料中のＵＢＥ３Ａタンパク質の発現誘導を測定するための方法であって、
ａ）ＵＢＥ３Ａ誘導因子で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルを、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質の減少したタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現誘導を示している、方法に関する。
ａ）ＵＢＥ３Ａ誘導因子で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルを、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質の減少したタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現誘導を示している、方法に関する。
【0007】
さらなる態様では、本発明は、ＵＢＥ３Ａ調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を判定するための方法であって、
ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルを、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａ調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を示している、方法に関する。
ａ）ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルを、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａ調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を示している、方法に関する。
【0008】
さらなるの態様では、本発明は、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現調節因子を同定するためのスクリーニング方法であって、
ａ）試験化合物で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルを、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現調節因子を示している、方法に関する。
ａ）試験化合物で処理された、動物又は細胞培養物の組織試料を提供するステップと、
ｂ）ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の、ステップａ）の試料中のタンパク質発現レベルを測定するステップと、
ｃ）ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルを、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較するステップと
を含み、対照中の少なくとも１つのタンパク質のタンパク質発現レベルと比較した、ステップｂ）で測定された少なくとも１つのタンパク質の調節されたタンパク質発現レベルが、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現調節因子を示している、方法に関する。
【0009】
特定の実施形態では、組織試料は、血液試料、血漿試料、又はＣＳＦ試料である。
【0010】
特定の実施形態では、タンパク質発現レベルは、ウェスタンブロッティング、質量分析（ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）又はイムノアッセイを使用して測定される。
【0011】
特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａ調節因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0012】
特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａ調節因子は、自閉症スペクトラム障害、アンジェルマン症候群、又は１５ｑｄｕｐ症候群の処置のためのＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル誘導因子である。
【0013】
特定の実施形態では、ステップｂ）におけるタンパク質は、ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＵＢＬＣＰ１及びＰＳＭＥ３からなる群から選択され、これらのタンパク質の発現レベルは、ＵＢＥ３Ａの発現レベルと逆相関する。
【0014】
特定の実施形態では、ステップｂ）におけるタンパク質は、ＡＣＹＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ及びＳＯＤ２からなる群から選択され、これらのタンパク質の発現レベルは、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルの前記発現レベルと直接相関する。
【0015】
さらなる態様では、本発明は、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節のためのバイオマーカーとしての、ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＡＣＹＰ１、ＵＢＬＣＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ、ＳＯＤ２及びＰＳＭＥ３からなる群から選択されるタンパク質の使用に関する。
【0016】
本発明の使用の特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａの調節は、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル誘導因子によるものである。
【0017】
本発明の使用の特定の実施形態では、バイオマーカータンパク質は、ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＵＢＬＣＰ１及びＰＳＭＥ３からなる群から選択され、これらのバイオマーカータンパク質のタンパク質発現レベルは、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルと逆相関する。
【0018】
本発明の使用の特定の実施形態では、バイオマーカータンパク質は、ＡＣＹＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ及びＳＯＤ２からなる群から選択され、これらのバイオマーカータンパク質のタンパク質発現レベルは、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベルと直接相関する。
【0019】
本発明の使用の特定の実施形態では、本発明は、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子のＵＢＥ３Ａ標的への関与を判定するための方法を提供する。
【0020】
本発明の使用の特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、特にＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【0021】
本発明の使用の特定の実施形態では、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子は、自閉症スペクトラム障害、アンジェルマン症候群、又は１５ｑｄｕｐ症候群の処置のためのＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル誘導因子である。
【0022】
定義
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、別段示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然タンパク質を指す。この用語は、「全長」、未処理のタンパク質、及び細胞中での処理から生じるタンパク質の任意の形態、並びに天然タンパク質に由来するペプチドを包含する。この用語はまた、天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又はアレルバリアントを包含する。表２に示すアミノ酸配列は、本発明のバイオマーカータンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、別段示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然タンパク質を指す。この用語は、「全長」、未処理のタンパク質、及び細胞中での処理から生じるタンパク質の任意の形態、並びに天然タンパク質に由来するペプチドを包含する。この用語はまた、天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又はアレルバリアントを包含する。表２に示すアミノ酸配列は、本発明のバイオマーカータンパク質の例示的なアミノ酸配列である。
【0023】
本発明では、ＵＢＥ３Ａタンパク質発現レベル調節因子とは、ＵＢＥ３Ａのタンパク質発現レベルを低下又は増強することができる分子を指す。ＵＢＥ３Ａのタンパク質発現レベルを低下させることができる調節因子をＵＢＥ３Ａ阻害剤と称し、ＵＢＥ３Ａのタンパク質発現レベルを増強することができる調節因子をＵＢＥ３Ａエンハンサーと称する。ＵＢＥ３Ａ調節因子は、ｍＲＮＡ干渉ＲＮＡ分子であり得る。別の実施形態では、ＵＢＥ３Ａ調節因子は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。二本鎖ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びｔＲＮＡを含むが、これらに限定されない、任意の種類のＲＮＡであり得る。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のＲＮＡ及び／又はタンパク質の産生を特異的に阻害するために特に有用である。本発明に適したｄｓＲＮＡ分子の設計及び作出は、特にＷＯ９９／３２６１９、ＷＯ９９／５３０５０、ＷＯ９９／４９０２９、及びＷＯ０１／３４８１５を参照して、当業者の技術の範囲内である。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡと同一の約１９～２３個の連続したヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。「ｓｈＲＮＡ」という用語は、同じＲＮＡ分子上の相補的配列と約５０ヌクレオチド未満が対合し、その配列及び相補的配列が少なくとも約４～１５ヌクレオチドの不対合領域（２つの塩基相補的領域によって生成されるステム構造上で一本鎖ループを形成）によって分離されているｓｉＲＮＡ分子を指す。十分に確立されたｓｉＲＮＡ設計基準がある（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒｅら、２００１を参照されたい）。
【0024】
ＵＢＥ３Ａ調節因子は、標的核酸、特に標的核酸上の連続する配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。一本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）又は相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間デュプレックス構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間のデュプレックス）を形成できることが理解される。ＵＢＥ３Ａ調節因子は、機能的ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現をそれを必要とする患者において確立する遺伝子療法であり得る。
【0025】
「対照試料」という用語は、ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理されていない試料を指す。例えば、対照試料は、ＵＢＥ３Ａ調節因子で処理されていない細胞培養物の試料であるか、又は細胞培養物が、ＵＢＥ３Ａ調節因子でない化合物で処理されている（陰性対照）。
【0026】
ＵＢＥ３Ａマーカータンパク質ＴＫＴ、ＤＺＡＮＫ１、ＵＢＬＣＰ１及びＰＳＭＥ３の発現レベルは、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現レベルと逆相関する、すなわち、低レベルのＵＢＥ３Ａタンパク質レベルは、これらのマーカータンパク質の高発現レベルと相関し、ＵＢＥ３Ａタンパク質レベルの増加は、これらのマーカータンパク質発現レベルの減少と相関する。
【0027】
ＵＢＥ３Ａマーカータンパク質ＡＣＹＰ１、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ及びＳＯＤ２の発現レベルは、ＵＢＥ３Ａタンパク質の発現レベルと直接相関する、すなわち、低レベルのＵＢＥ３Ａタンパク質発現は、これらのマーカータンパク質の低発現レベルと相関し、ＵＢＥ３Ａタンパク質レベルの増加は、これらのマーカータンパク質発現レベルの増加と相関する。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】ＡＳマウスは、出生時にプロテオーム変化を示し、これは、青年期及び成人期に悪化する。図１Ａ：実験設計の概略図。対照マウス及びＡＳマウスをＰ１、Ｐ２１及びＰ５６で屠殺した。対照動物及びＡＳ動物のプール皮質組織を使用して、データ非依存性取得（ＤＩＡ）質量分析のための試料特異的スペクトルライブラリを生成した。個々の試料をＤＩＡモードで実行し、試料特異的ライブラリを使用してデータを分析した。タンパク質発現データを統計学的及び経路濃縮分析に供した。図１Ｂ：Ｐ１対照タンパク質レベルのパーセンテージとしてプロットした、Ｐ１、Ｐ２１及びＰ５６での対照マウス及びＡＳマウスの皮質のＵＢＥ３Ａ生タンパク質強度プロット（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．ｎ＝５～６）。図１Ｃ：年齢（Ｔ１；Ｐ１、Ｐ２１、及びＰ５６）並びに遺伝子型（Ｔ３；対照及びＡＳ）に従って分解した対照マウス及びＡＳマウス皮質の全プロテオームに対して行った部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）。図１Ｄ：ＡＳマウス対対照マウスにおけるＧＯ：細胞成分遺伝子セットを使用した１Ｄアノテーション機能を使用した正規化濃縮スコアを示す経路濃縮プロット。図１Ｅ：ＡＳマウス対対照マウスにおける有意に変化した（ｐ値＜０．０５）タンパク質の時点あたりの平均Ｚスコアヒートマップ。クラスタは、ＵＰＧＭＡ法に基づくユークリッド距離を用いて定義される。
【図2】アミノ－アシルｔＲＮＡシンセターゼ、プロテアソーム及びシナプスにおける経路変化は、発生的に調節されている。図２Ａ：アミノ－アシルｔＲＮＡシンセターゼ多酵素複合体及びアミノ－アシルｔＲＮＡシンセターゼについての時点あたりの平均Ｚスコア化ヒートマップ。クラスタは、ＵＰＧＭＡ法に基づくユークリッド距離を用いて定義される。図２Ｂ：ＡＳ対対照における上方制御されたセット（Ａｉｍｐ１，Ｍａｒｓ）及び下方制御されたセット（Ｙａｒｓ、Ｗａｒｓ）を示すアミノ－アシルｔＲＮＡシンセターゼ経路からの選択されたタンパク質の経時的発現。値はＺスコア化値を表す。エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．図２Ｃ：プロテアソーム複合体についての、それらのサブユニット分類に基づく、時点あたりの平均Ｚスコア化ヒートマップ。クラスタは、ＵＰＧＭＡ法に基づくユークリッド距離を用いて定義される。図２Ｄ：ＡＳ対対照における２０Ｓコアプロテアソームサブユニット（Ｐｓｍａ５、Ｐｓｍｂ１、Ｐｓｍｂ２）、１９Ｓプロテアソーム調節サブユニット（Ｐｓｍｃ３、Ｐｓｍｃ４及びＰｓｍｄ１１）並びにプロテアソーム相互作用タンパク質（Ｕｂｌｃｐ１、Ｕｃｈｌ５及びＵｓｐ１４）からのタンパク質の上方制御されたセットを示す選択されたタンパク質経路の経時的発現。値はＺスコア化値を表す。エラーバー：ｓ．ｅ．ｍ．図２Ｅ：時点Ｐ５６で有意に変化した（ｐ値＜０．０５）シナプスという用語に属するタンパク質についての時点あたりの平均Ｚスコア化ヒートマップ。クラスタは、ＵＰＧＭＡ法に基づくユークリッド距離を用いて定義される。クラスタリングは、ＡＳにおいて上方制御されるタンパク質（赤色クラスタ）とＡＳにおいて下方制御されるタンパク質（青色クラスタ）との間の分割を示す。図２Ｆ：ＡＳで上方制御（Ｆ）されるか又はＡＳで下方制御（Ｇ）されるタンパク質のサンバースト可視化。これらの遺伝子は、ＳｙｎＧＯ ＣＣ（ＳｙｎＧＯ）に対してアノテーションされている。サンバーストプロットの色は、バックグラウンドとしての測定可能なプロテオーム全体（７１２６タンパク質）に対するＵＰ（赤色）又はＤＯＷＮ（青色）セットの濃縮Ｑ値スコアを表す。中心シナプス項から最も遠いエッジに属するタンパク質が標識される。
【図3】成体ＡＳラットは、異なる脳領域にわたってＡＳマウスで観察されるプロテオーム変化を再現する。図３Ａ：実験設計の概略図。対照ラット及びＡＳラットをＰ８４で屠殺した。対照動物及びＡＳ動物の小脳（ＣＢ）、皮質（ＣＸ）及び海馬（ＨＣ）のプール組織を使用して、ＤＤＡ（データ依存性取得）モードで試料特異的スペクトルライブラリを生成した。個々の試料を、データ非依存性取得（ＤＩＡ）質量分析法を用いてさらに分析した。図３Ｂ：ＣＢ対照タンパク質レベルのパーセンテージとしてプロットした、対照ラット及びＡＳラットの小脳（ＣＢ）、皮質（ＣＸ）、及び海馬（ＨＣ）のＵＢＥ３Ａ生タンパク質強度プロット（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。図３Ｃ：脳領域（Ｔ１及びＴ２；小脳、皮質、海馬）及び遺伝子型（Ｔ３；対照及びＡＳ）に従って分離し３Ｄ空間に投影した対照ラット及びＡＳラットの全プロテオームに対して行った部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）。図３Ｄ：ＡＳラットにおいて各脳領域で変化した統計的に有意な（調整ｐ値＜０．０５）タンパク質のベン図。図３Ｅ：小脳において統計学的有意性を通過するタンパク質のヒートマップ。タンパク質は２つのカテゴリーに分類される。小脳の対照と比較してＡＳでは上方又は下方制御されている。図３Ｆ、図３Ｇ及び図３Ｈ：脳領域ごとのｐ値対Ｌｏｇ２倍数変化のボルケーノプロット。各ペアワイズ比較で統計的に有意なタンパク質を強調する（青：ＣＢ、緑：ＨＣ、黄：皮質）。３つ全ての脳領域で有意なタンパク質は黒い星印で示されている。図１Ｅからの目的のタンパク質のサブセットを標識する。図３Ｉ、図３Ｊ及び図３Ｋ：図２Ｆでフィルタリングした、アミノアシルｔ－ＲＮＡシンターゼ経路におけるタンパク質（Ｇ）、プロテアソームサブユニット（Ｈ）及びシナプスタンパク質（Ｉ）についての、マウス皮質とラット皮質との間のＬｏｇ２倍数変化相関プロット。相関係数は、ピアソンの方法を使用して計算される。
【図4】若年及び青年ＡＳマウスの両方におけるＵＢＥ３ａの回復は、タンパク質及び経路の変化を救済する図４Ａ：実験設計の概略図。対照マウス（ＷＴ；ＣｒｅＥＲＴ２＋）、ＡＳマウス（Ｕｂｅ３ａＳｔｏｐ／＋；ＣｒｅＥＲＴ２－）、及びＵｂｅ３ａ回復マウス（Ｕｂｅ３ａＳｔｏｐ／＋；ＣｒｅＥＲＴ２＋）にタモキシフェンをＰ２１又はＰ５６で注射し、Ｐ８４で屠殺した。対照マウスとＡＳマウスの両方の皮質組織をプールして、ＤＤＡ（データ依存性取得）モードで試料特異的スペクトルライブラリを作成した。個々の試料をデータ非依存性取得（ＤＩＡ）モードでさらに分析した。図４Ｂ：Ｐ２１対照タンパク質レベルのパーセンテージとしてプロットした、対照マウス、ＡＳマウス、及びＵＢＥ３Ａ回復マウスのＰ２１及びＰ５６注射群の皮質におけるＵＢＥ３Ａ生タンパク質強度プロット（平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。図４Ｃ：ＵＢＥ３Ａ回復の時点（Ｔ１；Ｐ２１及びＰ５６）及び遺伝子型（Ｔ２；対照、ＡＳ、及び回復）に従って分離した対照マウス及びＡＳマウスの皮質の全プロテオームに対して行った部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）。図４Ｄ：ＡＳマウス対対照マウス（青色）、Ｐ２１でのＵｂｅ３ａ回復ＡＳマウス対対照（赤色）及びＰ５６でのＵＢＥ３Ａ回復ＡＳマウス対対照（青色）におけるＧＯ：細胞成分遺伝子セットを使用した１Ｄアノテーション機能を使用した正規化濃縮スコアを示す経路濃縮プロット。選択された経路は、図１Ｄで観察されるように視覚化される。図４Ｅ：ＡＮＯＶＡを使用した４つの条件のいずれかの間の有意に変化したヒットのヒートマップ（調整ｐ値＜０．０５）。色は、各タンパク質の平均Ｚスコア化タンパク質強度を表す。図４Ｆ：毛細管ウェスタンブロッティングによる、対照マウス（Ｎ＝３）、ＡＳマウス（Ｎ＝４）、及びＰ２１でのＵＢＥ３Ａ回復マウス（Ｎ＝４）の独立した試料セットにおけるＵＢＥ３Ａ標的の直交検証。統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの事後検定を使用して行った。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図5】トランスケトラーゼは、齧歯類及びヒトＡＳ疾患モデルにおいて調節解除されたＵＢＥ３Ａの直接核標的である。図５Ａ：ｈｉＰＳＣ由来ニューロンの対照、対照＋ＵＢＥ３Ａ ＫＤ ＡＳＯ及びＡＳ株におけるＵｂｅ３ａ標的のキャピラリーウエスタンブロット分析。全ての試料についてＮ＝３。統計試験は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの事後検定を使用して行った。（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ ＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。図５Ｂ：対照、対照＋ＵＢＥ３Ａ ＫＤ ＡＳＯ及びＡＳ株のｈｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）及び神経マーカーＭＡＰ２の免疫細胞化学的画像。核をＤＡＰＩで対比染色した。スケールバー：２５μｍ。図５Ｃ：ニューロン（ＭＡＰ２陽性）及び非ニューロン細胞（ＭＡＰ２陰性）における核ＴＫＴシグナルの定量化。２つの独立した実験（ニューロン分化及びＡＳＯ処理において異なるウェルから得られた８つの画像からの個々のデータ点をプロットした。クラスカル・ウォリス検定、続いてＤｕｎｎの事後検定を用いて統計分析を行った。図５Ｄ：成体対照ラット及びＡＳラットの一次感覚皮質におけるトランスケトラーゼ（ＴＫＴ）及びニューロンマーカーＮＥＵＮの免疫組織化学的画像。核をＤＡＰＩで対比染色した。スケールバー：２５μｍ。図５Ｅ：ニューロン（ＮＥＵＮ陽性）及び非ニューロン細胞（ＮＥＵＮ陰性）における核ＴＫＴシグナルの定量化。動物あたり３つの画像からの個々のデータ点をプロットした（対照：Ｎ＝３、ＡＳ：Ｎ＝２匹の動物）。クラスカル・ウォリス検定、続いてＤｕｎｎの事後検定を用いて統計分析を行った。図５Ｆ：ＴＫＴ及びＲＩＮＧ１Ｂについての細菌ユビキチン化アッセイ。図５Ｇ：核を欠くマウス（Ｉｓｏ３ ＫＯ）又は細胞質ゾルＵＢＥ３Ａを欠くマウス（ｉｓｏ２ ＫＯ）におけるＴＫＴのキャピラリーウエスタンブロット分析。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）
【実施例】
【0029】
ＡＳマウスは、出生時にプロテオーム変化を示し、出生後の発達を通して悪化する
データ非依存性取得（ＤＩＡ）質量分析に基づくプロテオミクスは、古典的なデータ依存性取得（ＤＤＡ）と比較して再現性、カバレッジ深度、及びダイナミックレンジが大きいため、標識不含定量的プロテオミクスに最適な方法として浮上した［１７、１８］。本発明者らは、ＤＩＡを選択して、対照マウス及びＡＳマウスからの生後の日Ｐ１、Ｐ２１及びＰ５６におけるマウス皮質発達の過程にわたるプロテオーム変化を定量化した。全ての時点からの対照皮質及びＡＳ皮質のプール試料を生成し、分画し、ＤＤＡモードで測定し、８，２７０のタンパク質（７７，４３９の固有ペプチド）を含む試料特異的スペクトルライブラリを得た。次に、個々の試料をＤＩＡモードで測定し、試料特異的ライブラリを使用してＤＩＡデータを分析して、全ての試料にわたって７，１８７個のタンパク質を定量した。次いで、タンパク質レベルデータを各時点で示差的タンパク質発現プロファイリング分析に供し、経路濃縮分析を実施した（図１Ａ）。各条件における観察されたタンパク質の生物学的変動係数の中央値（％Ｃｏｖ）は、ＤＩＡに関する文献の報告と一致して１１～１５％であった［１７］。
データ非依存性取得（ＤＩＡ）質量分析に基づくプロテオミクスは、古典的なデータ依存性取得（ＤＤＡ）と比較して再現性、カバレッジ深度、及びダイナミックレンジが大きいため、標識不含定量的プロテオミクスに最適な方法として浮上した［１７、１８］。本発明者らは、ＤＩＡを選択して、対照マウス及びＡＳマウスからの生後の日Ｐ１、Ｐ２１及びＰ５６におけるマウス皮質発達の過程にわたるプロテオーム変化を定量化した。全ての時点からの対照皮質及びＡＳ皮質のプール試料を生成し、分画し、ＤＤＡモードで測定し、８，２７０のタンパク質（７７，４３９の固有ペプチド）を含む試料特異的スペクトルライブラリを得た。次に、個々の試料をＤＩＡモードで測定し、試料特異的ライブラリを使用してＤＩＡデータを分析して、全ての試料にわたって７，１８７個のタンパク質を定量した。次いで、タンパク質レベルデータを各時点で示差的タンパク質発現プロファイリング分析に供し、経路濃縮分析を実施した（図１Ａ）。各条件における観察されたタンパク質の生物学的変動係数の中央値（％Ｃｏｖ）は、ＤＩＡに関する文献の報告と一致して１１～１５％であった［１７］。
【0030】
ＵＢＥ３Ａタンパク質は、全ての時点で対照マウスと比較してＡＳにおいて有意に減少した（対照レベルの２０％未満、調整ｐ値＜０．０５）。ＵＢＥ３Ａ発現レベルは、対照及びＡＳの両方においてＰ１からＰ５６に減少し、これは、ニューロンにおける親ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子の完全なサイレンシングが出生後発達中に起こる［１９、２０］という観察結果と一致していた（図１Ｂ）。全てのタンパク質の部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）は、年齢（Ｔ１）及び遺伝子型（Ｔ３）の両方によって試料を分離し、Ｐ２１及びＰ５６はＰ１と有意に異なっていた。Ｔ３に沿った分離は、ＡＳマウスがそれらのプロテオミクスプロファイルに関して対照マウスから徐々に逸れることを明らかにし、成体脳において最大の差があった（Ｐ５６）（図１Ｃ）。
【0031】
ＧＯ：細胞成分（ＧＯ：ＣＣ）を使用した全てのタンパク質の経路濃縮分析は、全ての出生後段階でアミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼ及びプロテアソーム複合体の上方制御を明らかにしたが、シナプスの成熟と一致して、シナプス前後の経路はＰ５６で有意に変化した（図１Ｄ）。次に、本発明者らは、各発達段階で差次的に調節されるタンパク質を同定して、それらの違いを経時的に観察することを目的とした。２８個のタンパク質（図１Ｅ）が、任意の時点において、対照マウスとＡＳマウスとの間で有意に（ｑ値＜０．０５）調節された。これらのタンパク質の階層的クラスタリングにより、ＵＢＥ３Ａ発現に関してタンパク質が共調節及び逆調節される遺伝子型及び発達段階依存的効果が明らかになった。代謝酵素ＴＫＴ（トランスケトラーゼ）のようないくつかのタンパク質はＰ２１及びＰ５６でのみ変化したが、ＭＩＯＳ（ＧＡＴＯＲ２複合体の成分）、微小管タンパク質ＫＩＦ３Ｃ、卵巣腫瘍ドメイン（ＯＴＵ）含有脱ユビキチン化システインプロテアーゼＯＴＵＢ２のようないくつかの他のタンパク質は、全ての時点で調節不全を示す（図１Ｅ、図Ｓ２）。
【0032】
興味深いことに、アミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼ経路に属するタンパク質の存在量（ＱＡＲＳ、ＤＵＳ３Ｌ、ＹＡＲＳ）は、異なる時点でＡＳにおいて増加及び減少の両方であったが、プロテアソームサブユニットＵＢＬＣＰ１、ＵＣＨＬ５、ＰＳＭＥ３は全ての時点で増加し、これらの経路のさらなる調査が必要であった。
【0033】
ＡＳマウスにおけるアミノ－アシルｔＲＮＡシンセターゼ、プロテアソーム及びシナプスにおける発生的に調節された経路変化
次に、本発明者らは、変化した経路内の個々のタンパク質の軌跡を調べた。アミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼ（ＡＲＳ）は、アミノ酸のそれらの同族ｔＲＮＡへのライゲーションに関与する進化的に保存された酵素であり、遊離で、又はＡＲＳ多酵素複合体（ＭＳＣ）の一部としてのいずれかで存在する［２１］。本発明者らは、脳成熟にわたって全てのＡＲＳ及びＭＳＣタンパク質の発現を調べ（図２Ａ）、これにより、クラスＩ ＡＲＳタンパク質、具体的にはＭＳＣに属するＭＡＲＳ、ＱＡＲＳ、ＲＡＲＳ、ＡＩＭＰ１及びＡＩＭＰ２が、ＡＳにおいて増加することが明らかになった。逆に、芳香族アミノ酸負荷に関与するＡＲＳタンパク質、すなわちトリプトファニル－ｔＲＮＡシンセターゼＷＡＲＳ及びチロシル－ｔＲＮＡシンセターゼＹＡＲＳはＡＳにおいて減少した（図２Ａ）。興味深いことに、遺伝子型に関係なく、出生後の脳発達中にこれらのタンパク質の強い減少があり、ＡＳにおいてＰ２１及びＰ５６で疾患の変化が劇的に逸れている（図２Ｂ）。
次に、本発明者らは、変化した経路内の個々のタンパク質の軌跡を調べた。アミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼ（ＡＲＳ）は、アミノ酸のそれらの同族ｔＲＮＡへのライゲーションに関与する進化的に保存された酵素であり、遊離で、又はＡＲＳ多酵素複合体（ＭＳＣ）の一部としてのいずれかで存在する［２１］。本発明者らは、脳成熟にわたって全てのＡＲＳ及びＭＳＣタンパク質の発現を調べ（図２Ａ）、これにより、クラスＩ ＡＲＳタンパク質、具体的にはＭＳＣに属するＭＡＲＳ、ＱＡＲＳ、ＲＡＲＳ、ＡＩＭＰ１及びＡＩＭＰ２が、ＡＳにおいて増加することが明らかになった。逆に、芳香族アミノ酸負荷に関与するＡＲＳタンパク質、すなわちトリプトファニル－ｔＲＮＡシンセターゼＷＡＲＳ及びチロシル－ｔＲＮＡシンセターゼＹＡＲＳはＡＳにおいて減少した（図２Ａ）。興味深いことに、遺伝子型に関係なく、出生後の脳発達中にこれらのタンパク質の強い減少があり、ＡＳにおいてＰ２１及びＰ５６で疾患の変化が劇的に逸れている（図２Ｂ）。
【0034】
プロテアソームの全ての成分に対応するタンパク質は、出生時から成体期まで持続的に変化していた。１１Ｓ及び１９Ｓ調節粒子のサブユニットを含むプロテアソーム機構の個々のタンパク質、２０Ｓコアサブユニット、及びプロテアソーム相互作用タンパク質に続いて、疾患特異的分子軌跡が明らかになった［２２］（図２Ｃ）。本発明者らは、いくつかのプロテアソーム相互作用タンパク質（ＵＣＨＬ５、ＵＢＬＣＰ１、ＵＳＰ１４）並びに１１Ｓ及び１９Ｓ調節サブユニットに属するタンパク質（ＰＳＭＤ１１、ＰＳＭＣ３、ＰＳＭＤ１、ＰＳＭＥ３）の存在量の一貫した増加を観察し、一方で、２０Ｓコアプロテアソームサブユニットの変化は同様の傾向に従ったが比較的軽微であった（図２Ｃ、Ｄ）。したがって、ＵＢＥ３Ａは、発生を通してプロテアソームサブユニット及びアクセサリータンパク質の全体的な増加をもたらし、１１Ｓ及び１９Ｓ調節サブユニット並びにプロテアソーム関連タンパク質のサブセットで最も顕著な変化が見られる。
【0035】
次に、本発明者らは、ＡＳマウスにおいてＰ５６で選択的に変化したが（ＡＳ対対照、ｑ値＜０．０５）、Ｐ１又はＰ２１では変化しなかったシナプスタンパク質を調べ、これらの基準を満たす６３個のタンパク質を見出した（図２Ｅ）。これらのタンパク質のヒートマップ可視化及び階層的クラスタリングは、双方向ＡＳ遺伝子型効果を明らかにし、タンパク質のセットは、ＡＳ対対照において上方制御（赤色クラスタ、４０タンパク質）及び下方制御（青色クラスタ、２３タンパク質）される。これらの２セットのタンパク質が特定のシナプスサブ区画で濃縮されているかどうかを決定するために、高品質で手動でアノテーションされたシナプスＧＯデータベースであるＳｙｎａｐｓｅＧＯを使用して経路濃縮分析を行った［２３］。４０個のタンパク質の上方制御されたセットについてのＳｙｎＧＯ ＣＣ濃縮分析は、それらがシナプス前及びシナプス後の両方の部位に分布していることを示した。シナプス小胞及びシナプス前活性領域に属するタンパク質（ＳＴＸ１Ａ、ＳＹＰ、ＶＡＭＰ２）、並びにシナプス後密度の不可欠な成分であるタンパク質（ＧＲＩＡ３、ＡＴＰ２Ｂ２、ＬＲＲＣ２）は、有意に濃縮された（ＦＤＲ調整ｐ値＜０．０５）（図２Ｆ、上部；データ表Ｓ３）。ＳｙｎＧＯ分析により、ＡＳで減少したタンパク質もシナプス前とシナプス後の両方の区画に属することが明らかになった。具体的には、シナプス小胞タンパク質（ＳＴＸＢＰ５、ＳＬＣ６Ａ２、ＡＴＰ６Ｖ０Ｃ）及びシナプス後密度タンパク質（ＧＲＫ２、ＫＰＮＡ１、ＰＡＫ１、ＰＴＰＲＦ）は、ＡＳにおいてＰ５６で減少した。
【0036】
したがって、ＡＳマウスにおけるタンパク質変化は動的であり；ＡＲＳ及びプロテアソームサブユニットは誕生から変化しているが、シナプスタンパク質の多くの変化は脳成熟の最終段階にわたって発達する。
【0037】
成体ＡＳラットは、異なる脳領域にわたってＡＳマウスで観察されるプロテオーム変化を再現する。
本発明者らは次に、新たに入手可能なＡＳラットモデルを利用することによって、観察された変化がＡＳラットモデルにおいて種及び脳領域にわたって保存されるかどうかを調査した［２４］。本発明者らは、成体（Ｐ８４）対照及びＡＳラット（図３Ａ）において３つのラット脳領域（ＣＢ：小脳、ＨＣ：海馬、ＣＸ：皮質）のＤＩＡベースのＬＣ－ＭＳ分析を行った。ハイブリッドスペクトルライブラリを、ＤｉｒｅｃｔＤＩＡ測定と組み合わせた全ての試料からの３つ全ての脳領域の分画プール試料に対するＤＤＡ実行から生成して、８，９２８個のタンパク質（１１６，６０３個の固有ペプチド）のライブラリを生成し、全ての試料にわたって７，５２５個のタンパク質を定量することを可能にした。変動係数は、試料タイプあたり約１０％であった。ＵＢＥ３Ａ発現は、ＡＳラットの全ての３つの脳領域で確実に減少した（図３Ｂ）。マウスと同様［２５、２６］。対照ラットの小脳におけるＵＢＥ３Ａレベルは海馬及び皮質と比較して低かったが、ＡＳラット小脳における残留ＵＢＥ３Ａレベルはより高かった（小脳において対照レベルの２７％対海馬及び皮質において対照レベルの１０％未満；図３Ｂ）。その後のＰＬＳ－ＤＡ分析は、遺伝子型（Ｔ３）と脳領域（Ｔ２、Ｔ１）との間の堅固な分離を明らかにした（図３Ｃ）。小脳のプロテオミクスプロファイルは皮質及び海馬とは異なっており、これらは互いにより多くの類似性を共有しており、異なる発生起源及び細胞構造を反映している可能性が高い。
本発明者らは次に、新たに入手可能なＡＳラットモデルを利用することによって、観察された変化がＡＳラットモデルにおいて種及び脳領域にわたって保存されるかどうかを調査した［２４］。本発明者らは、成体（Ｐ８４）対照及びＡＳラット（図３Ａ）において３つのラット脳領域（ＣＢ：小脳、ＨＣ：海馬、ＣＸ：皮質）のＤＩＡベースのＬＣ－ＭＳ分析を行った。ハイブリッドスペクトルライブラリを、ＤｉｒｅｃｔＤＩＡ測定と組み合わせた全ての試料からの３つ全ての脳領域の分画プール試料に対するＤＤＡ実行から生成して、８，９２８個のタンパク質（１１６，６０３個の固有ペプチド）のライブラリを生成し、全ての試料にわたって７，５２５個のタンパク質を定量することを可能にした。変動係数は、試料タイプあたり約１０％であった。ＵＢＥ３Ａ発現は、ＡＳラットの全ての３つの脳領域で確実に減少した（図３Ｂ）。マウスと同様［２５、２６］。対照ラットの小脳におけるＵＢＥ３Ａレベルは海馬及び皮質と比較して低かったが、ＡＳラット小脳における残留ＵＢＥ３Ａレベルはより高かった（小脳において対照レベルの２７％対海馬及び皮質において対照レベルの１０％未満；図３Ｂ）。その後のＰＬＳ－ＤＡ分析は、遺伝子型（Ｔ３）と脳領域（Ｔ２、Ｔ１）との間の堅固な分離を明らかにした（図３Ｃ）。小脳のプロテオミクスプロファイルは皮質及び海馬とは異なっており、これらは互いにより多くの類似性を共有しており、異なる発生起源及び細胞構造を反映している可能性が高い。
【0038】
ＡＳラットの脳において有意に変化したタンパク質を調べると、３４個のタンパク質が３つ全ての脳領域にわたって変化し、海馬及び皮質における変化に大きな重複があることが明らかになった（図３Ｄ）。小脳における有意なヒットを階層的クラスタリングによって可視化し、上方制御されたタンパク質（青色クラスタ）及び下方制御されたタンパク質（緑色クラスタ）のセットを明らかにした（図３Ｅ）。小脳において変化したタンパク質のいくつかは、皮質及び海馬において方向性の傾向を示したが、統計的カットオフを満たさなかった。興味深いことに、いくつかのタンパク質（ＧＳＴＯ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＡＳＮＳ、ＡＧＡＰ１を含む）が、これらの基質の小脳ニューロン特異的調節を示唆するＡＳにおいて小脳において特異的に変化していた。プロテアソームサブユニットに属するタンパク質（ＵＢＬＣＰ１、ＵＣＨＬ５、ＰＳＭＥ３を含む）並びにＡＲＳタンパク質ＹＡＲＳ及びＷＡＲＳは、３つ全ての脳領域において変化した（図３Ｆ、Ｇ、Ｈ、黒い星）。
【0039】
次に、本発明者らは、ＡＳ Ｐ５６マウス及びラットの皮質（図３Ｉ～Ｋ）において、並びにラットの脳領域にわたって、３つの主要経路に対応する変化したタンパク質間の相関を調べた。本発明者らは、各経路を、対照と比較して、Ｐ５６でＡＳマウス皮質において上方制御されるタンパク質（赤色）又は下方制御されるタンパク質（青色）のセットに細分した。ＡＲＳ経路についての倍数変化の相関プロットは、ラットとマウスとの間の有意な相関を明らかにし（Ｒ＝０．６６、ｐ＝４．２９Ｅ－００４）、マウス及びラットの両方においてＡＳで、ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ及びＧＡＲＳは下方制御され、ＭＡＲＳ、ＶＡＲＳ、ＡＩＭＰ１及びＡＩＭＰ２は上方制御された（図３Ｉ）。
【0040】
プロテアソーム複合体タンパク質は、ラット及びマウスの皮質間（図３Ｊ）（Ｒ＝０．４９、Ｐ＝２．１２Ｅ－００４）及び脳領域全体で強い相関を示した。ユビキチン様ドメイン含有ＣＴＤホスファターゼ１；ＵＢＬＣＰ１、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ５；ＵＣＨＬ５及びプロテアソーム活性化因子複合体サブユニット３；ＰＳＭＥ３は、３つ全ての脳領域にわたって成体ラットにおいて一貫して上方制御された（図３Ｊ）。プロテアソーム集合シャペロン３；ＰＳＭＥ３及び２６Ｓプロテアソーム非ＡＴＰアーゼ調節サブユニット１０；ＰＳＭＤ１０は、ＡＳマウス並びにＡＳラット脳領域において、対照と比較してＡＳにおいて一貫して下方制御された。アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ経路の場合と同様に、皮質及び海馬は互いにより類似性を示し、小脳はわずかに逸れた。
【0041】
シナプスタンパク質変化の分析は、種間及びラット脳領域にわたる類似性及び相違性の両方を示した（図３Ｋ）。ＡＳラット皮質はマウス皮質（Ｒ＝０．５３、Ｐ＝４．８６Ｅ－００６）及びラット海馬（Ｒ＝０．５６、Ｐ＝１．５９Ｅ－００６）の両方に類似していたが、ＡＳ小脳では逸れていた（Ｒ＝０．２１、Ｐ＝８．６０Ｅ－００２）。興味深いことに、シナプスタンパク質ＧＡＤ２、ＡＣＨＥ、ＰＬＣＸＤ３及びＧＲＫ２は、全ての脳領域及び種全体でＡＳにおいて下方制御されたが、ＰＳＤ、ＤＬＧ４、ＰＬＣＢ１及びＶＰＳ１１はＡＳにおいて上方制御された。ＭＡＰ１Ａ、ＰＣＬＯ、ＰＴＰＲＦ、ＳＴＸ１Ａなどの他のものは、脳領域又は種特異的な違いを示した。
【0042】
若年及び成体ＡＳマウスにおけるＵＢＥ３Ａ発現の回復は、変化したプロテオーム状態を様々な程度までレスキューする
本発明者らは次に、潜在的なＵＢＥ３Ａ標的、及び経路におけるこれらの変化が、臨床的に関連する治療時点の間に、すなわち若年マウス及び成体マウスにおいて、ＵＢＥ３Ａ回復によってレスキューされ得るかどうかを調査した。ＵＢＥ３Ａ発現を回復させることによって変化した分子プロテオームをレスキューできるかどうかに対処するために、本発明者らは、タモキシフェン誘導性ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子を有するＡＳマウスモデルを利用した［４］。対照（ＷＴ；ＣｒｅＥＲＴ２＋）、ＡＳ（Ｕｂｅ３ａＳｔｏｐ／ｐ＋）。ＵＢＥ３Ａ回復マウス（Ｕｂｅ３ａＳｔｏｐ／ｐ＋；ＣｒｅＥＲＴ２＋）に、若年及び成体の発達段階に対応するＰ２１又はＰ５６のいずれかでタモキシフェンを注射し、Ｐ８４で屠殺して、２つの時点でのレスキューを比較した（図４Ａ）。皮質組織を使用して、対照群とＡＳ群の両方から作成されたプールされたライブラリで分析して、ＤＩＡモードで全ての試料にわたって５３２５個のタンパク質を定量した。
本発明者らは次に、潜在的なＵＢＥ３Ａ標的、及び経路におけるこれらの変化が、臨床的に関連する治療時点の間に、すなわち若年マウス及び成体マウスにおいて、ＵＢＥ３Ａ回復によってレスキューされ得るかどうかを調査した。ＵＢＥ３Ａ発現を回復させることによって変化した分子プロテオームをレスキューできるかどうかに対処するために、本発明者らは、タモキシフェン誘導性ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子を有するＡＳマウスモデルを利用した［４］。対照（ＷＴ；ＣｒｅＥＲＴ２＋）、ＡＳ（Ｕｂｅ３ａＳｔｏｐ／ｐ＋）。ＵＢＥ３Ａ回復マウス（Ｕｂｅ３ａＳｔｏｐ／ｐ＋；ＣｒｅＥＲＴ２＋）に、若年及び成体の発達段階に対応するＰ２１又はＰ５６のいずれかでタモキシフェンを注射し、Ｐ８４で屠殺して、２つの時点でのレスキューを比較した（図４Ａ）。皮質組織を使用して、対照群とＡＳ群の両方から作成されたプールされたライブラリで分析して、ＤＩＡモードで全ての試料にわたって５３２５個のタンパク質を定量した。
【0043】
Ｐ２１及びＰ５６でのＵＢＥ３Ａの回復は、ＬＣ／ＭＳによって測定した場合、それぞれ、対照動物の皮質ＵＢＥ３Ａタンパク質レベルの２０％未満～８１％及び７１％をレスキューすることができた（図４Ｂ）。ＰＬＳ－ＤＡは、回復の時点（Ｔ１）及び遺伝子型（Ｔ２）の両方によって試料を分離し、対照はＡＳマウスとは有意に異なっていた（図４Ｃ）。全体的なプロテオミクスプロファイル分析により、Ｐ２１回復群は対照に戻り、Ｐ５６回復はＡＳプロテオームを部分的にレスキューしたことが明らかになった。これらの結果は、タンパク質恒常性のＡＳ関連変化が、若年の脳におけるＵＢＥ３Ａ回復によってほぼ完全にレスキューされ得、成人ではより少ない程度でしかレスキューされ得ないことを示唆している。
【0044】
次に、本発明者らは、異なる群間のＵＢＥ３Ａ下流標的の軌跡をマッピングするために、示差的に変化したタンパク質の発現及び経路分析を行った。対照とＡＳを比較した、又はＰ２１若しくはＰ５６での回復とＡＳを比較した、ＧＯ：細胞成分（ＧＯ：ＣＣ）分析を使用した全てのタンパク質に対する経路濃縮分析により、Ｐ５６ではなくＰ２１でのアミノアシル－ｔＲＮＡシンセターゼのレスキュー、及び両方の時点でのプロテアソーム複合体及びシナプスタンパク質遺伝子セットの両方のレスキューが明らかになった（図４Ｄ）。
【0045】
４つの試料セットのいずれかの間で有意に変化した上位２７個の個々のタンパク質のヒートマップは、タンパク質の大部分が早期及び後期の両方のレスキューである程度戻り得ることを明らかにする。（調整ｐ値＜０．０５；図４Ｅ）。ＵＢＥ３Ａ発現に関する共調節（マゼンタ）又は逆調節（緑色）の程度に従って階層的クラスタリングを行った。ＡＲＳに属する上位ヒット（ＹＡＲＳ及びＷＡＲＳなど）及びプロテアソームサブユニット又はプロテアソームアクセサリータンパク質（例えば、ＵＢＬＣＰ１、ＵＣＨＬ５、ＰＳＭＥ３）を含むタンパク質の大部分は、Ｐ２１対Ｐ５６で増強されたレスキューを示す；一方、ＦＤＰＳ、Ｃ２ＣＤ４Ｃ、ＦＸＹＤ６、ＴＳＮＡＸ及びＳＴＸ７を含むいくつかのシナプスタンパク質の発現はＰ５６で正規化され、ＵＢＥ３Ａに対するそれらの応答が変動し得ることを示している。
【0046】
トランスケトラーゼは、齧歯類及びヒトにおけるＵＢＥ３Ａの核標的である
上位に同定されたＵＢＥ３Ａ標的のサブセットを直交法で確認するために、対照、ＡＳ及びＰ２１回復マウスの皮質試料の独立したコホートの生化学的分析をキャピラリーウェスタンブロッティングを使用して行った（図４Ｆ）。ＴＫＴ、ＵＣＨＬ５、ＡＣＹＰ１、ＹＡＲＳ、ＤＺＡＮＫ及びＳＯＤ２を含む試験したヒットのいくつかについて、ＡＳマウスと比較して対照において、及びＡＳマウスと比較してＰ２１回復においてタンパク質レベルの有意な変化が検出された。これらの結果は、独立した実験及びタンパク質定量方法にわたって同定された標的の堅牢性を確認する。さらに、対照マウス及びＡＳマウスの皮質組織における上位に同定されたヒットの転写レベルは有意に異ならず、発現レベルの変化が翻訳レベル又は翻訳後であることを示した。
上位に同定されたＵＢＥ３Ａ標的のサブセットを直交法で確認するために、対照、ＡＳ及びＰ２１回復マウスの皮質試料の独立したコホートの生化学的分析をキャピラリーウェスタンブロッティングを使用して行った（図４Ｆ）。ＴＫＴ、ＵＣＨＬ５、ＡＣＹＰ１、ＹＡＲＳ、ＤＺＡＮＫ及びＳＯＤ２を含む試験したヒットのいくつかについて、ＡＳマウスと比較して対照において、及びＡＳマウスと比較してＰ２１回復においてタンパク質レベルの有意な変化が検出された。これらの結果は、独立した実験及びタンパク質定量方法にわたって同定された標的の堅牢性を確認する。さらに、対照マウス及びＡＳマウスの皮質組織における上位に同定されたヒットの転写レベルは有意に異ならず、発現レベルの変化が翻訳レベル又は翻訳後であることを示した。
【0047】
次に、本発明者らは、ＡＳ患者及び対照血液から生成された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するニューロンにおいて、齧歯類における上位のＵＢＥ３Ａ依存的ヒットが変化しているかどうかを調査した［２７］（Ｐａｎｄｙａ ｅｔ ａｌ．，２０２１）。６週間の分化後、この選択されたタンパク質セットの発現をキャピラリーウェスタンブロッティングで分析した。試験した全てのタンパク質は、プロテアソーム（ＵＣＨＬ５、ＰＳＭＤ２、ＵＳＰ１４、ＵＢＬＣＰ１、ＰＳＭＥ３）及びＡＲＳ経路（ＹＡＲＳ、ＷＡＲＳ）に関連する全てのタンパク質を含め、対照と比較してＡＳニューロンにおいて有意な上方制御を示した。さらに、ＵＢＥ３Ａ発現を低下させるためのＵＢＥ３Ａ標的化ＡＳＯによる対照ニューロンの処置（ＵＢＥ３Ａ ＫＤ）は、ほとんどの場合においてより小さい倍数変化ではあったがＡＳ患者ニューロンにおいて見られる変化を模倣した（図５Ａ）。一貫して、ＡＳ患者のニューロン、並びにＡＳマウス及びラットの脳にわたって、ＴＫＴは最大の倍数変化を明らかにした（図５Ａ）。したがって、本発明者らは、ＴＫＴのＵＢＥ３Ａ依存的調節の機構に対処しようと努めた。
【0048】
ペントースリン酸経路における他の酵素とは異なり、ＴＫＴは、特定の癌細胞及び正常組織において実質的な核局在化を有し、核局在化シグナルを含有することが以前に報告されている［２８、２９］。同様に、ＴＫＴは、ほとんどがヒト及びラットのニューロンにおいて核に出現した（図５Ｂ、Ｄ）。ヒトニューロンでは、ＤＡＰＩ及びＭＡＰ２との共標識により、ＴＫＴ発現が非ニューロン細胞と比較してニューロンの核でより高く（ＭＡＰ２＋対ＭＡＰ２－細胞）、ＡＳニューロン及びＵＢＥ３Ａ依存的に増加することが明らかになった（図５Ｂ、Ｃ）。ニューロンｉＰＳＣ由来ＡＳ及びＵＢＥ３Ａ ＫＤ培養物の両方におけるＴＫＴ核強度は、ＴＫＴ発現の有意な上方制御を明らかにした（対照と比較したＭＡＰ２陽性核、＋５９％；図５Ｂ、Ｃ）。ラット皮質では、ニューロン（ＮｅｕＮ陽性）細胞と非ニューロン細胞の両方で発現が低かった。患者ニューロンと一致して、核ＴＫＴシグナルはＡＳ条件で有意に上方制御された（＋９５％；図５Ｄ、Ｅ）。ラットの脳では、非ニューロン細胞のわずかな増加があり、これはＵＢＥ３Ａ遺伝子投与量の減少によるものであり得る（図５Ｅ）。
【0049】
ＴＫＴがＵＢＥ３Ａの直接標的であるかどうかを評価するために、本発明者らは、大腸菌で行われる以前に記載された細胞ユビキチン化アッセイ［１４、３０］を使用した。この目的のために、大腸菌細胞を、ウサギユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、Ｅ２ユビキチンコンジュゲート酵素ＵＢＣＨ５、Ｅ３リガーゼＵＢＥ３Ａ（又は触媒的に不活性なバリアント）、ユビキチン、及びＴＫＴ又はＲＩＮＧ１Ｂをコードするプラスミドで形質転換した。ＲＩＮＧ１Ｂは、ＵＢＥ３Ａの十分に確立された標的であり、このアッセイでは陽性対照として働く［１４、３１］。活性なＵＢＥ３Ａ及びユビキチン化カスケードの全ての成分の存在は、ＲＩＮＧ１Ｂ及びＴＫＴの両方について、より遅い移動バンドの形成をもたらす（図５Ｆ）。これらのより遅い移動バンドは、ユビキチンが存在しない場合又は触媒的に不活性なＵＢＥ３ＡＣ８１７Ｓの存在下では見られない。これらの結果は、ＵＢＥ３ＡがＴＫＴを直接ユビキチン化できることを強く示唆している。
【0050】
ＵＢＥ３Ａは、細胞局在が互いに異なるいくつかのアイソフォームで発現されることが示されている。ヒトでは、Ｎ末端で変化する３つの機能的アイソフォーム［３２、３３］が存在するが、マウスでは、より短い、主に核アイソフォーム（ｍＵＢＥ３Ａ－Ｉｓｏ３）、及びより長い細胞質ゾルアイソフォーム（ｍＵＢＥ３ａ－Ｉｓｏ２）の２つのみが存在する。さらに、核ＵＢＥ３Ａアイソフォームの喪失は、マウスにおいてＡＳ表現型を誘導するのに十分であることが示されている［１３］。ニューロン核におけるＴＫＴのＵＢＥ３Ａ依存的上方制御を考慮して、本発明者らは、その調節がＵＢＥ３Ａアイソフォーム特異的であるかどうかを調べた。ｍＵＢＥ３Ａ－Ｉｓｏ３及びｍＵＢＥ３ａ－Ｉｓｏ２ノックアウトマウス並びにそれらのそれぞれの対照の皮質組織からの溶解物をキャピラリーウェスタンブロッティングで分析した。ｍＵＢＥ３Ａ－Ｉｓｏ３はＵＢＥ３Ａタンパク質の大部分を占めるので、このアイソフォームのノックアウトは総ＵＢＥ３Ａレベルを６０％超低下させた（図５Ｇ）。野生型対照と比較して、ＴＫＴとＵＣＨＬ５（核に局在する既知のＵＢＥ３Ａ標的）の両方のレベルがｍＵＢＥ３Ａ－Ｉｓｏ３ノックアウトマウスの組織で上方制御されたが（それぞれ＋１２．８％及び＋２８．４％）、細胞質アイソフォームｍＵＢＥ３ａ－Ｉｓｏ２のノックアウトは発現レベルに有意に影響しなかった（図５Ｇ）。これは、ＴＫＴタンパク質レベルが核アイソフォームｍＵＢＥ３Ａ－Ｉｓｏ３によって制御されることを示唆している。
【0051】
考察
この研究では、本発明者らは、齧歯類プロテオームのＵＢＥ３Ａ駆動の時間的及び空間的変化を包括的にマッピングした。ＡＳ患者由来ニューロンの以前のプロテオーム分析と合わせて、本発明者らは、種全体の疾患変化を強調する。本発明者らは、ＡＳプロテオームが出生後の発達の過程にわたって悪化すること、及び、より早い時点ではレスキューがより効果的であるが、若年及び若い成人の出生後段階でのＵＢＥ３Ａ回復によって戻り得ることを実証する。さらに、本発明者らは、ＡＳのラット及びヒトモデルでも観察されたマウスのＵＢＥ３Ａ喪失によって影響を受ける３つの主要な細胞経路：プロテアソーム、ＡＲＳ、及びいくつかのシナプス経路を同定した。これらの結果は、基本的な包括的細胞プロセスの調節がＵＢＥ３Ａによって制御され、ＵＢＥ３Ａの変化が異なる発達軌跡を示すことを意味する。
この研究では、本発明者らは、齧歯類プロテオームのＵＢＥ３Ａ駆動の時間的及び空間的変化を包括的にマッピングした。ＡＳ患者由来ニューロンの以前のプロテオーム分析と合わせて、本発明者らは、種全体の疾患変化を強調する。本発明者らは、ＡＳプロテオームが出生後の発達の過程にわたって悪化すること、及び、より早い時点ではレスキューがより効果的であるが、若年及び若い成人の出生後段階でのＵＢＥ３Ａ回復によって戻り得ることを実証する。さらに、本発明者らは、ＡＳのラット及びヒトモデルでも観察されたマウスのＵＢＥ３Ａ喪失によって影響を受ける３つの主要な細胞経路：プロテアソーム、ＡＲＳ、及びいくつかのシナプス経路を同定した。これらの結果は、基本的な包括的細胞プロセスの調節がＵＢＥ３Ａによって制御され、ＵＢＥ３Ａの変化が異なる発達軌跡を示すことを意味する。
【0052】
全ての種及び全ての発達段階にわたってＡＳプロテオームにおいて観察された最も顕著な変化は、プロテアソームサブユニット及びプロテアソームアクセサリータンパク質の上方制御であった。ＵＢＥ３Ａが２６Ｓプロテアソームと直接相互作用し、プロテアソームサブユニットの代謝回転を調節することができることが以前に報告されている［１３、１６、３４、３５］。本発明者らのデータは、タンパク質存在量の変化が１９Ｓ及び１１Ｓ調節サブユニット並びにプロテアソームアクセサリータンパク質に２０Ｓコアよりも大きな程度で影響を及ぼしたことを示す。非ニューロン状況では、ポリユビキチン化受容体ＰＳＭＤ４、デユビキチナーゼＵＣＨＬ５、及び調節サブユニットＰＳＭＣ３を含むいくつかの上位ヒットは、ＵＢＥ３Ａによって直接ユビキチン化される可能性があり、次いで、その基質の結合及びプロセスを含むプロテアソーム機能に悪影響を及ぼす可能性がある［３６］。したがって、ＵＢＥ３Ａの喪失がインビボで同様の方法でプロテアソーム機能に影響を及ぼし、ＡＳプロテオームに対する累積的な影響をもたらすことが考えられる。さらに、アクセサリータンパク質の存在量及び機能の変化は、ニューロンにおける特定の疾患関連基質の認識を妨げることによって疾患表現型に直接寄与し得る。将来の研究は、広範なプロテオーム疾患の変化に対するＵｂｅ３ａプロテアソーム機能障害並びに核と細胞質のＵｂｅ３ａの寄与がどの程度変化するかに対処すべきである。
【0053】
プロテアソーム経路と同様に、本発明者らは、全ての発達時点にわたってＡＲＳの変化を観察した。ＡＲＳは、アミノ酸をそれらの同族ｔＲＮＡ分子にコンジュゲートしてタンパク質翻訳の重要な初期ステップを提供することによって正しい翻訳を確実にする核コード酵素のファミリーである［２１］。プロテアソームと同様に、ＡＲＳはタンパク質恒常性、この場合は翻訳において中心的な役割を果たすが、プロテアソームのサブユニットとは対照的に、ＵＢＥ３Ａ依存性機構との関連はあまり明らかではない。ヒトタンパク質－タンパク質相互作用データベースを使用した包括的ネットワーク分析により、ＡＩＭＰ１、ＡＩＭＰ２、ＭＡＲＳ及びＱＡＲＳを含むいくつかのＡＲＳがＵＢＥ３Ａインタラクトームの一部として同定されたが、それらのいずれも直接基質として作用することは報告されていない［３７］。これは、ＡＲＳ経路における個々のタンパク質が普遍的に上方制御されないという本発明者らの知見と一致している。タンパク質存在量ＱＡＲＳ及びＡＩＭＰ１タンパク質は上昇したが、ＹＡＲＳ及びＷＡＲＳはＡＳマウスにおいて減少し、これは、直接的及び間接的効果の両方を伴うより複雑なＵＢＥ３Ａ依存性調節機構を示唆している。真核生物の進化の過程で、多細胞生物は、翻訳を超える機能を果たすさらなるＡＲＳタンパク質ドメインを有する［３８］。未知の病因を有する患者における全エクソーム及び全ゲノム配列決定は、ＡＲＳ遺伝子、例えばクラスＩ ＡＲＳタンパク質ＹＡＲＳ及びＷＡＲＳにおける機能喪失突然変異を、神経系機能不全、発達遅延及びてんかんに結び付けた［３９、４０］。触媒ドメイン中の突然変異は、ＡＲＳによるアミノアシル化率又はｔＲＮＡ認識の精度を低下させ、タンパク質合成を妨害し得、それによって関連障害の多くに寄与し得る。さらに、チロシン及びトリプトファンは、正常なシナプス機能に不可欠なセロトニン及びドーパミンの重要な構成要素であり、ＡＳ行動表現型への神経伝達物質不均衡の寄与がＡＳ患者及びＡＳのマウスモデルで報告されている［４１］。触媒機能を妨害しない疾患原因ＡＲＳ突然変異の存在は、非標準的ＡＲＳ機能も病理学的表現型に寄与し得ることを示す。ＡＳにおける個々のＡＲＳタンパク質の存在量の変化は、ＭＳＣ組成及び翻訳非依存的な役割、例えば、ミトコンドリア恒常性、核ｒＲＮＡ合成及びサイトカイン刺激に影響を及ぼすことが考えられる［４２］。翻訳機構又は他のＡＲＳ関連機能がＡＳにおいて妨害されるかどうか、及びこれが疾患表現型にどのように寄与するかを決定するために、将来の研究が必要とされるであろう。
【0054】
プロテアソーム及びｔＲＮＡシンターゼ経路とは対照的に、シナプスヒットは、神経系の完全な成熟と一致する後期発達段階でほとんど変化した。ニューロン機能に関与する多くのＵＢＥ３Ａ下流標的は以前に特徴付けられているが、これらの標的の大部分については、それらが直接的な基質であるかどうかを決定する必要がある。本発明者らのデータセットでは、広範囲のシナプスタンパク質の存在量が増加又は減少し、分子レベルでのシナプスの調節不全が確認された。本発明者らの分析により、ヒットは、シナプス小胞、シナプス前活性領域、及びシナプス後密度の不可欠な成分を含む、シナプス前区画とシナプス後区画の両方に局在し、単一のシナプス区画における変化ではなく、全体的なシナプス摂動を示すことが明らかになった。個々の各成分の存在量の変化が神経機能にどのように影響を及ぼすか、及びＵＢＥ３ａを介して直接、又は結果としてより初期の発達段階で現れるプロテアソーム又はＡＲＳなどの経路を介してクロストークの程度がどの程度であるかは、依然として決定されていない。
【0055】
最近、母体ＵＢＥ３Ａ遺伝子の欠失を有し、ＡＳマウスで以前に観察された行動表現型の多くを再現するＡＳの新規ラットモデルが生成された［２４］。本発明者らの研究は、ＡＳラット脳組織の最初のプロテオーム研究を表し、本発明者らは、ＡＲＳファミリーＹＡＲＳ及びＷＡＲＳのメンバー、プロテアソームサブユニット並びにＵＢＬＣＰ１及びＵＣＨＬ５などのアクセサリータンパク質、並びに本発明者らの全てのＡＳデータセットにわたって一貫した上方制御を示した代謝酵素ＴＫＴを含む、ＡＳマウスにおいて同定された上位ヒットを確認した。ラットＡＳ皮質におけるプロテアソーム、ＡＲＳ及びシナプス経路の変化は、Ｐ５６ ＡＳマウスと強く相関し、ＵＢＥ３Ａ依存性経路の変化が保存されていることを示し、ＡＳにおける広範な基礎疾患機構を指し示している。
【0056】
ラットの個々の脳領域分析により、皮質、海馬、及び小脳（ＡＳ患者において機能障害を示し、長年にわたって研究の主な焦点であった場所）の間の共通性及び領域差が特定された［４３］。認知及び学習障害、運動失調、及び運動協調不全などの潜在的な領域特異的機能障害の根底にある分子機構を調べることは、特に興味深い。興味深いことに、ＡＳマウスとラットとの間の保存されたタンパク質及び経路もまた、異なる脳領域にわたって変化することが確認された。興味深いことに、小脳ＡＳプロテオームは皮質及び海馬から逸れており、これは、齧歯類モデル及びＡＳ患者に見られる運動機能障害及び運動失調に影響を及ぼし得る。小脳ニューロン細胞構造は非常に独特であり、ニューロン、小脳細胞の大部分はＵＢＥ３Ａをほとんど発現せず、したがって、可能性のあるＵＢＥ３Ａタンパク質の変化はプルキンエ細胞又はゴルジ細胞に由来し得る［２６］。ＡＳ小脳特異的タンパク質のいくつかは、排他的に発現されるか、又は他の脳領域と比較して小脳において有意な濃縮を示す。ＤＰＹＳＬ５は、発生中の脳で発現される酵素であり、アクチンとの相互作用を介して神経突起伸長を調節する［４４］。成体小脳では、それはマウスのプルキニエ細胞の樹状突起発達及びシナプス可塑性を調節する［４５］。抗ＣＲＭＰ５抗体は、亜急性小脳性運動失調を有する患者の血清で検出されることが多く［４６］、プロテオミクスプロファイリングは、皮質形成異常及びてんかんを有する患者における有意に増加した発現を明らかにした［４７］。ＢＲＡＦキナーゼ機能獲得突然変異は、発達遅延、知的障害、及び発作を含む、ＡＳに類似する様々な神経学的表現型を呈する噴気顔面皮膚症候群（ＣＦＣ）に関連する。ｉＰＳＣ由来ニューロンでは、ＢＲＡＦ機能獲得は、未熟なニューロン分化及び始原体プールの枯渇をもたらし、これらの培養物で生成されたニューロンは、より高い固有の興奮性を示した［４８］。最後に、アスパラギンシンセターゼＡＳＮＳの機能喪失は小頭症と関連しており、これは始原体の増殖低下によって引き起こされる可能性が最も高い［４９］。ＡＳＮＳは、４つのアミノ酸Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－グルタミン酸、及びＬ－グルタミンを代謝的に接続し、したがって、脳におけるこれらのアミノ酸のバランスの調節不全は、小頭症及び脳機能不全に寄与し得る。
【0057】
ＡＳ患者ではＵＢＥ３Ａ遺伝子座のより大きな欠失が観察されるが、ＵＢＥ３Ａ発現の喪失のみでＡＳを誘導するのに十分であることが示されている。したがって、ＵＢＥ３Ａ発現の復元は、現在臨床試験中の有望な治療戦略である。誘導性母体ＵＢＥ３Ａ対立遺伝子を有する条件的ＡＳマウスモデルでは、ＵＢＥ３Ａ回復後に特定の行動表現型の年齢依存的レスキューが実証された［４，５０］。さらに、しかしながら、成体ＡＳマウスにおけるＵＢＥ３Ａ ＡＴＳ ＡＳＯの単一の脳室内注射は、ほとんどの行動表現型をレスキューすることができなかった［７］。新産仔マウスへのＡＳＯ注射は、多くの行動表現型をレスキューした（Ｍｉｌａｚｚｏ ｉｎ ｐｒｅｓｓ）。齧歯類の行動は、ＵＢＥ３Ａの回復が初期の時点でより効果的であることを示唆しているが、これは必ずしも分子／プロテオームの変化に当てはまるとは限らない。発達の初期段階におけるＵｂｅ３ａニューロン喪失は、成熟ニューロンにおける直接的又は間接的なタンパク質調節から切り分けることが困難な発達上の変化を引き起こし得る。したがって、本発明者らは、ＵＢＥ３Ａを青年期（Ｐ２１）及び成人期（Ｐ５６）に回復させることによって、マウスのＡＳプロテオームがどの程度まで戻り得るかを調べた。驚くべきことに、いずれの段階でのＵＢＥ３Ａ発現の復元もプロテオーム恒常性を有意な程度まで復元させたが、Ｐ２１レスキューはより効率的であった。大部分において、プロテアソーム及びシナプス経路の変化は両方の時点で戻り、これは、ほとんどの電気生理学的パラメータが成体ＵＢＥ３Ａの回復時にも復元され得るという観察結果と一致している［５１］。これらの結果は、タンパク質の疾患軌跡及び関連する経路がＵＢＥ３Ａ依存性であり、出生後に復元され得ることを強調している。興味深いことに、いくつかのタンパク質は、成体レスキューにおいてのみ調節され、完全に成熟したニューロンにおける役割を示唆している。Ｐ５６特異的シナプスヒットには、シナプス可塑性に重要なシグナル伝達タンパク質であるＴＳＮＡＸ［５２］、及びＳＶのシナプス前リサイクルプールを維持するのに役割を果たし得るシナプス小胞（ＳＶ）の成分であるＳＴＸ７［５３］が含まれた。これらの結果は、成人期初期におけるＵＢＥ３Ａ発現の復元がＡＳプロテオームを有意に戻し、潜在的にプロテアソーム及びシナプス機能をレスキューし、ＡＳにおける疾患修飾治療の進歩をさらに促進することができることを実証している。
【0058】
以前の研究では、患者由来のｉＰＳＣニューロン培養物のプロテオーム分析及びＡＳＯを使用したＵＢＥ３Ａ回復後に、ＧＡＧドメイン含有タンパク質ＰＥＧ１０を含む一連のヒト特異的ＵＢＥ３Ａ標的が明らかになった［２７］。さらに、ＰＰＩＤ、ＤＳＴ、及びＵＣＨＬ５を含む、患者ニューロンにおいて同定されたいくつかの上位ヒットもＡＳモデルにおいて変化した。いくつかのさらなるプロテアソーム及びＡＲＳタンパク質がＡＳニューロンにあり、ＵＢＥ３Ａのノックダウンによって表現型模写された。注目すべきことに、齧歯類モデルにわたって最大の変化を示し、直接的なＵＢＥ３Ａ標的として検証されたタンパク質であるＴＫＴもまた、ヒトＡＳニューロンにおいて最も変化した。ＴＫＴは、ＮＡＤＰＨ及びヌクレオチド合成のための構成要素を生成する代謝経路であるペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の律速酵素である。さらに、ＴＫＴは、それを解糖と接続するＰＰＰの非酸化的分岐の一部であり、その可逆的性質のために、ＰＰＰを通る流動を制御することができる。ＴＫＴ機能は補酵素チアミンに依存し、チアミンの欠乏並びにＴＫＴ遺伝子の稀な突然変異は、一連の神経学的機能不全の根底にあるが、ＴＫＴ機能喪失がこれらの表現型をもたらす正確な機構は十分に理解されていない［５４、５５］。興味深いことに、ＰＰＰが細胞質ゾルで起こるにもかかわらず、ヒトニューロン及びラット脳組織の両方におけるＴＫＴ局在化は、主に核であることが見出された［５６］。ＵＢＥ３Ａの核又は細胞質アイソフォームのいずれかの欠失を有するマウスモデルを使用して（参照）、本発明者らは、ＴＫＴが核ＵＢＥ３Ａによって直接調節されることを実証した。核ＵＢＥ３ＡによるＴＫＴの厳密な調節及びＡＳ条件での上方制御は、１）ＵＢＥ３Ａによる調節がその代謝機能及びＰＰＰに直接関連しているのか、又は２）核内のＴＫＴの未知の非標準的機能が存在するのか、及び３）ＴＫＴの過剰が疾患表現型に寄与するかどうかの疑問を提起する。非標準的調節機能は、プロテインキナーゼ及び転写調節因子として作用することができる解糖酵素を含む多くの代謝酵素について記載されており［５７］、また、核ＴＫＴがＴＫＴ酵素活性とは機能的に無関係にＥＧＦＲと相互作用するという報告がある［２８］。ＴＫＴがＡＳ病態生理の役割を有するかどうかを解明するために、将来の研究が必要である。
【0059】
ＡＳ患者由来ニューロンの以前のプロテオミクス分析［２７］と共に、本発明者らの研究は、バイオマーカー及びトランスレーショナル研究を支援するためのプロテオミクスリソースを提供する。ＴＫＴ及び他のタンパク質が疾患のニューロンから分泌されるかどうかを決定し、それを下流のＵＢＥ３Ａバイオマーカーとして検証するために、ＡＳ脳死後試料からの変化したヒトプロテオームを決定し、患者ＣＳＦ試料を分析するための将来の努力が必要とされる。
【0060】
要約すると、本発明者らは、３つの異なるＡＳ齧歯類モデル：１）異なる発達段階にわたるマウス皮質、２）ラット皮質及び他の疾患関連脳領域、及び３）ＵＢＥ３Ａレスキュー後のマウスにわたる１４３回の実行からのプロテオミクスデータセットを提供し；ＵＢＥ３Ａ依存性タンパク質及び経路変化の包括的プロテオミクスアトラスを提供する。
【0061】
材料及び方法
動物
マウスをバリア施設内の個別に換気したケージ（ＩＶＣ；Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔからの１１４５ Ｔケージ）に収容した。全ての動物を、１２時間の明暗サイクルで２２±２℃に保ち、マウス固形飼料（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅからの８０１７２７ＣＲＭ（Ｐ））及び水を自由に与えた。全ての動物実験は、欧州委員会指令（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ）２０１０／６３／ＥＵ（ＣＣＤ承認ＡＶＤ１０１００２０１６７９１）に従って実施した。
動物
マウスをバリア施設内の個別に換気したケージ（ＩＶＣ；Ｔｅｃｈｎｉｐｌａｓｔからの１１４５ Ｔケージ）に収容した。全ての動物を、１２時間の明暗サイクルで２２±２℃に保ち、マウス固形飼料（Ｓｐｅｃｉａｌ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅからの８０１７２７ＣＲＭ（Ｐ））及び水を自由に与えた。全ての動物実験は、欧州委員会指令（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ）２０１０／６３／ＥＵ（ＣＣＤ承認ＡＶＤ１０１００２０１６７９１）に従って実施した。
【0062】
データ非依存性取得（ＤＩＡ）質量分析
ラット及びマウス組織の総タンパク質プロファイリングを、ＢｉｏｇｎｏｓｙｓのＨｙｐｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＨＲＭ（商標））標識なし発見プロテオミクスワークフローを使用してＢｉｏｇｎｏｓｙｓ ＡＧ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行った。全ての溶媒は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製のＨＰＬＣグレードであり、他に明記されていない全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
ラット及びマウス組織の総タンパク質プロファイリングを、ＢｉｏｇｎｏｓｙｓのＨｙｐｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＨＲＭ（商標））標識なし発見プロテオミクスワークフローを使用してＢｉｏｇｎｏｓｙｓ ＡＧ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で行った。全ての溶媒は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製のＨＰＬＣグレードであり、他に明記されていない全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【0063】
試料の調製
Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓの変性緩衝液を用いて組織試料を変性させ、３７℃で６０分間、Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓの還元及びアルキル化溶液を用いて還元及びアルキル化した。その後、ペプチドへの消化を、トリプシン（ｗ／ｗ比１ ５０ Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して３７℃で一晩行った。ＰｒｅＯｍｉｃｓ試料調製キットを使用してサンプルを調製し、乾燥ペプチドとして凍結した。ペプチドを、ＢｉｏｇｎｏｓｙｓのｉＲＴキット較正ペプチドを添加したＬＣ溶媒Ａ（１％アセトニトリル、０．１％ギ酸（ＦＡ））に再懸濁した。ペプチド濃度を、ＵＶ／ＶＩＳ分光計（ＳＰＥＣＴＲＯｓｔａｒ Ｎａｎｏ，ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して決定した。
Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓの変性緩衝液を用いて組織試料を変性させ、３７℃で６０分間、Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓの還元及びアルキル化溶液を用いて還元及びアルキル化した。その後、ペプチドへの消化を、トリプシン（ｗ／ｗ比１ ５０ Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して３７℃で一晩行った。ＰｒｅＯｍｉｃｓ試料調製キットを使用してサンプルを調製し、乾燥ペプチドとして凍結した。ペプチドを、ＢｉｏｇｎｏｓｙｓのｉＲＴキット較正ペプチドを添加したＬＣ溶媒Ａ（１％アセトニトリル、０．１％ギ酸（ＦＡ））に再懸濁した。ペプチド濃度を、ＵＶ／ＶＩＳ分光計（ＳＰＥＣＴＲＯｓｔａｒ Ｎａｎｏ，ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して決定した。
【0064】
ＨＰＲＰ分画
皮質試料（Ｐ１、Ｐ２１、Ｐ５６）：遺伝子型に従ってペプチドをプールした（２つのプール：ＷＴ及びＡＳ）。水酸化アンモニウムを両方のプールにｐＨ値＞１０まで添加した。分画は、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１ｘ１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）でＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ＲＳポンプ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。勾配は２０分で１％から４０％の溶媒Ｂであり、溶媒はＡ：水中２０ｍＭギ酸アンモニウム、Ｂ：アセトニトリルであった。画分を３０秒ごとに採取し、マウス皮質試料については６つの画分プールに、ラット脳試料については８つの画分プールに順次プールした。マウス皮質試料については、溶出液を乾燥させ、１５μｌの溶媒Ａ中で分離し、ＢｉｏｇｎｏｓｙｓのＨＲＭキット較正ペプチドを添加し、ラット試料を１２μＬの溶媒Ａ中で分離し、ＢｉｏｇｎｏｓｙｓのｉＲＴキット較正ペプチドを添加した。
皮質試料（Ｐ１、Ｐ２１、Ｐ５６）：遺伝子型に従ってペプチドをプールした（２つのプール：ＷＴ及びＡＳ）。水酸化アンモニウムを両方のプールにｐＨ値＞１０まで添加した。分画は、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＣＳＨ Ｃ１８ １．７μｍ、２．１ｘ１５０ｍｍカラム（Ｗａｔｅｒｓ）でＤｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ＲＳポンプ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。勾配は２０分で１％から４０％の溶媒Ｂであり、溶媒はＡ：水中２０ｍＭギ酸アンモニウム、Ｂ：アセトニトリルであった。画分を３０秒ごとに採取し、マウス皮質試料については６つの画分プールに、ラット脳試料については８つの画分プールに順次プールした。マウス皮質試料については、溶出液を乾燥させ、１５μｌの溶媒Ａ中で分離し、ＢｉｏｇｎｏｓｙｓのＨＲＭキット較正ペプチドを添加し、ラット試料を１２μＬの溶媒Ａ中で分離し、ＢｉｏｇｎｏｓｙｓのｉＲＴキット較正ペプチドを添加した。
【0065】
マウス皮質試料（Ｕｂｅ３ａ回復）：ペプチドの２つのプールを生成した（ＷＴ；ＣｒｅＥＲＴ＋及びＵｂｅ３ａＳｔｏｐ／ｐ＋；ＣｒｅＥＲＴ－、各６サンプル）。２つのプールを０．２Ｍギ酸アンモニウム（ｐＨ１０）で４倍希釈し、Ｃ１８ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラム（Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ）に適用した。次いで、ペプチドを、０．０５Ｍギ酸アンモニウムを含有し、ｐＨ１０で増加するアセトニトリル濃度（５％、１０％、１５％、２０％、２５％、及び５０％）の緩衝液で溶出した。溶出液を乾燥させ、１５μｌの溶媒Ａ中で分離し、ＢｉｏｇｎｏｓｙｓのＨＲＭキット較正ペプチドを添加した。画分５％及び５０％をプールした。全てのペプチド濃度を、ＵＶ／ＶＩＳ分光計を使用して決定した。
【0066】
スペクトルライブラリ生成のためのショットガンＬＣ ＭＳ／ＭＳ
マウス脳組織のＬＣ ＭＳ／ＭＳ測定のために、標準的なナノエレクトロスプレー源を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ質量分析計に接続されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｅａｓｙ ｎＬＣ １２００ナノ液体クロマトグラフィーシステム上の社内充填Ｃ１８カラム（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＲｅｐｒｏＳｉｌ Ｐｕｒ １．９μｍ粒径、１２０Å孔径７５μｍ内径、５０ｃｍ長さ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）に、画分あたり２μｇのペプチド（又はＵｂｅ３ａ回復を伴う画分５＋５０％の皮質試料については４μｇ）を注入した。ＬＣ溶媒は、Ａ：０．１％ ＦＡを含む１％アセトニトリル水溶液；Ｂ：０．１％ ＦＡを含むアセトニトリル中１５％水であった。ＬＣ勾配は、６０分間で１～５５％の溶媒Ｂ、続いて１０秒間で５５～９０％のＢ、１０分間９０％のＢ、０．１分間で９０％～１％のＢ、及び５分間１％のＢであった。改変されたＴＯＰ１５方法を使用した［５８］
マウス脳組織のＬＣ ＭＳ／ＭＳ測定のために、標準的なナノエレクトロスプレー源を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ質量分析計に接続されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｅａｓｙ ｎＬＣ １２００ナノ液体クロマトグラフィーシステム上の社内充填Ｃ１８カラム（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＲｅｐｒｏＳｉｌ Ｐｕｒ １．９μｍ粒径、１２０Å孔径７５μｍ内径、５０ｃｍ長さ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）に、画分あたり２μｇのペプチド（又はＵｂｅ３ａ回復を伴う画分５＋５０％の皮質試料については４μｇ）を注入した。ＬＣ溶媒は、Ａ：０．１％ ＦＡを含む１％アセトニトリル水溶液；Ｂ：０．１％ ＦＡを含むアセトニトリル中１５％水であった。ＬＣ勾配は、６０分間で１～５５％の溶媒Ｂ、続いて１０秒間で５５～９０％のＢ、１０分間９０％のＢ、０．１分間で９０％～１％のＢ、及び５分間１％のＢであった。改変されたＴＯＰ１５方法を使用した［５８］
【0067】
さらに、Ｂｒｕｄｅｒｅｒら［５９］によるＭＣＰ刊行物からのマウス体性感覚皮質１バレルフィールド及びマウス小脳ライブラリを分析に使用した。
【0068】
ラット脳試料のＤＤＡ ＬＣ ＭＳ／ＭＳ測定のために、Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ（商標）イオン源を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｔｒｉｂｒｉｄ質量分析計に接続したＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＥＡＳＹ－ｎＬＣ（商標）１２００ナノ液体クロマトグラフィーシステム上の社内充填逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ製の１．７μｍの荷電表面ハイブリッドＣ１８粒子を充填した、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ製の内径７５μｍ、長さ６０ｃｍ及び先端１０μｍのＰｉｃｏＦｒｉｔエミッタ）に、画分あたり１μｇのペプチドを注入した。ＬＣ溶媒は、Ａ：０．１％ ＦＡを含む１％アセトニトリル水溶液；Ｂ：０．１％ ＦＡを含むアセトニトリル中２０％水であった。非線形ＬＣ勾配は、９５分間で１～５９％の溶媒Ｂ、続いて１０秒間で５９～９０％のＢ、８分間９０％のＢ、１０秒間で９０％～１％のＢ、及び６０℃で２５０ｎｌ／分の流速で５分間１％のＢであった。Ｈｅｂｅｒｔらによる修正最高速度法（３ ｓサイクル時間）を使用した［６０］。
【0069】
ショットガンＬＣ ＭＳ／ＭＳデータのデータベース検索
発達の時間経過皮質試料（Ｐ１、Ｐ２１、Ｐ５６）については、質量分析データをＢｉｏｇｎｏｓｙｓの検索エンジンＳｐｅｃｔｒｏＭｉｎｅ（商標）を使用して分析し、Ｕｂｅ３ａ回復を伴う皮質試料については、Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓの検索エンジンＰｕｌｓａｒ（バージョン１．０．１９８４６）を使用した。ペプチド及びタンパク質レベルでの偽発見率を１％に設定した。マウスＵｎｉＰｒｏｔ ｆａｓｔａデータベース（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、２０１９－０７－０１）を検索エンジンに使用し、２回の切断ミス及び可変修飾を可能にした（Ｎ末アセチル化、メチオニン酸化）。
発達の時間経過皮質試料（Ｐ１、Ｐ２１、Ｐ５６）については、質量分析データをＢｉｏｇｎｏｓｙｓの検索エンジンＳｐｅｃｔｒｏＭｉｎｅ（商標）を使用して分析し、Ｕｂｅ３ａ回復を伴う皮質試料については、Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓの検索エンジンＰｕｌｓａｒ（バージョン１．０．１９８４６）を使用した。ペプチド及びタンパク質レベルでの偽発見率を１％に設定した。マウスＵｎｉＰｒｏｔ ｆａｓｔａデータベース（ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、２０１９－０７－０１）を検索エンジンに使用し、２回の切断ミス及び可変修飾を可能にした（Ｎ末アセチル化、メチオニン酸化）。
【0070】
ラット脳組織試料については、Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓの検索エンジンＳｐｅｃｔｒｏＭｉｎｅ（商標）（バージョン１．０．１９０８０８）を使用して質量分析データを分析し、ペプチド及びタンパク質レベルの偽発見率を１％に設定した。ラットＵｎｉＰｒｏｔ／Ｔｒｅｍｂｌ．Ｆａｓｔａデータベース（ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、２０１９－０７－０１）を検索エンジンに使用し、２回の切断ミス及び可変修飾を可能にした（Ｎ末アセチル化、メチオニン酸化）。
【0071】
ＨＲＭ ＩＤ＋質量分析取得
ＬＣ ＭＳ／ＭＳ ＨＲＭ測定のために、標準的なナノエレクトロスプレー源を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計に接続されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅａｓｙ ｎＬＣ １２００ナノ液体クロマトグラフィーシステム上の社内充填Ｃ１８カラム（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＲｅｐｒｏＳｉｌ Ｐｕｒ、１．９μｍ粒径、１２０Å孔径；７５μｍ内径、５０ｃｍ長さ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）に、試料あたり２μｇのペプチドを注入した。ＬＣ溶媒は、Ａ：０．１％ ＦＡを含む１％アセトニトリル水溶液；Ｂ：０．１％ ＦＡを含むアセトニトリル中１５％水であった。非線形ＬＣ勾配は、１２０分間で１～５５％の溶媒Ｂ、続いて１０秒間で５５～９０％のＢ、及び１０分間９０％のＢであった。１回の全範囲サーベイスキャン及び２２個のＤＩＡ窓を用いたＤＩＡ法を使用し、勾配長は１３５分であった。
ＬＣ ＭＳ／ＭＳ ＨＲＭ測定のために、標準的なナノエレクトロスプレー源を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ質量分析計に接続されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅａｓｙ ｎＬＣ １２００ナノ液体クロマトグラフィーシステム上の社内充填Ｃ１８カラム（Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ ＲｅｐｒｏＳｉｌ Ｐｕｒ、１．９μｍ粒径、１２０Å孔径；７５μｍ内径、５０ｃｍ長さ、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）に、試料あたり２μｇのペプチドを注入した。ＬＣ溶媒は、Ａ：０．１％ ＦＡを含む１％アセトニトリル水溶液；Ｂ：０．１％ ＦＡを含むアセトニトリル中１５％水であった。非線形ＬＣ勾配は、１２０分間で１～５５％の溶媒Ｂ、続いて１０秒間で５５～９０％のＢ、及び１０分間９０％のＢであった。１回の全範囲サーベイスキャン及び２２個のＤＩＡ窓を用いたＤＩＡ法を使用し、勾配長は１３５分であった。
【0072】
ＨＲＭデータ分析
ＨＲＭ質量分析データは、Ｓｐｅｃｔｒｏｎａｕｔ Ｐｕｌｓａｒソフトウェア（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ、バージョン１２及び１３．８．１９０９３０）を使用して分析した。ペプチド及びタンパク質レベルの偽発見率を１％に設定し、データを行ベースの抽出を使用してフィルタリングした。このプロジェクトで生成されたアッセイライブラリ（タンパク質在庫）をＭＣＰからのもの（Ｂｒｕｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）と組み合わせて分析に使用した。Ｓｐｅｃｔｒｏｎａｕｔで分析されたＨＲＭ測定値は、局所回帰正規化を使用して正規化された［６１］。
ＨＲＭ質量分析データは、Ｓｐｅｃｔｒｏｎａｕｔ Ｐｕｌｓａｒソフトウェア（Ｂｉｏｇｎｏｓｙｓ、バージョン１２及び１３．８．１９０９３０）を使用して分析した。ペプチド及びタンパク質レベルの偽発見率を１％に設定し、データを行ベースの抽出を使用してフィルタリングした。このプロジェクトで生成されたアッセイライブラリ（タンパク質在庫）をＭＣＰからのもの（Ｂｒｕｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７）と組み合わせて分析に使用した。Ｓｐｅｃｔｒｏｎａｕｔで分析されたＨＲＭ測定値は、局所回帰正規化を使用して正規化された［６１］。
【0073】
ＨＲＭデータ分析
マウス発達時間経過
統計学及びバイオインフォマティクス分析を、Ｒ統計環境［６２］及びＰｅｒｓｅｕｓソフトウェア［６３］で行った。
マウス発達時間経過
統計学及びバイオインフォマティクス分析を、Ｒ統計環境［６２］及びＰｅｒｓｅｕｓソフトウェア［６３］で行った。
【0074】
元のスケールで２０未満のタンパク質強度は、ノイズ閾値を下回ると考えられ、欠損としてマークされた。データをｌｏｇ２変換し、全ての試料にわたって５０％の有効値を含むようにフィルタリングした。ＤＩＡデータが完全であるため、３つのタンパク質のみが除外され、さらなる分析のために合計７，１８４個のタンパク質群が保持された。
【0075】
Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎｅｒ Ｒ Ｐａｃｋａｇｅ［６４］をデフォルト設定で使用して部分最小二乗判別分析（ＰＬＳ－ＤＡ）を実施し、完全に測定した７，０２９個のタンパク質群に基づいた。
【0076】
示差的に発現したタンパク質を同定するために、本発明者らは、順列ベースの偽発見率制御を可能にするｓａｍｒ Ｒパッケージ［６５］を使用し、関連するｑ値を報告した［６６］。１００の順列を有する２クラス独立検定を使用して、各時点におけるＡＳ及びＷＴ遺伝子型を別々に比較した。タンパク質は、５％のｑ値閾値を満たす場合、統計的に有意に差次的に発現されると分類された。
【0077】
経路分析は、１Ｄアノテーション機能を使用してＰｅｒｓｅｕｓソフトウェアで行った。各タンパク質の遺伝子オントロジー（ＧＯ）アノテーションをＵｎｉＰｒｏｔからダウンロードした［６７］。複数の濃縮試験を行ったので、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて多重仮説検定を補正した。完全性のために、３つ全ての比較について経路濃縮スコアをプロットし、有意に調節されたものを明示的にマークする。
【0078】
ラット脳領域
上記と同様の分析戦略をラットデータセットに適用した。簡潔には、２０未満のタンパク質発現値をＮＡに変換した。データをｌｏｇ２変換し、フィルタリングして、全試料の少なくとも５０％において値が測定されたタンパク質群を保持し、７，５２４個のタンパク質群を得た。ＤｉｓｃｒｉＭｉｎｅｒ Ｒパッケージ［６４］を使用して、全ての試料（７，３４６個）にわたる測定でタンパク質を使用してＰＬＳ－ＤＡ分析を行った。示差的に発現されたタンパク質を、各脳領域にわたって別々にＫＯラット試料とＷＴラット試料との間で同定した。２クラス独立検定について同じ関数を使用し、０．０５のｑ値は、タンパク質を統計的に有意に差次的に発現されるとマークすると考えられた。
上記と同様の分析戦略をラットデータセットに適用した。簡潔には、２０未満のタンパク質発現値をＮＡに変換した。データをｌｏｇ２変換し、フィルタリングして、全試料の少なくとも５０％において値が測定されたタンパク質群を保持し、７，５２４個のタンパク質群を得た。ＤｉｓｃｒｉＭｉｎｅｒ Ｒパッケージ［６４］を使用して、全ての試料（７，３４６個）にわたる測定でタンパク質を使用してＰＬＳ－ＤＡ分析を行った。示差的に発現されたタンパク質を、各脳領域にわたって別々にＫＯラット試料とＷＴラット試料との間で同定した。２クラス独立検定について同じ関数を使用し、０．０５のｑ値は、タンパク質を統計的に有意に差次的に発現されるとマークすると考えられた。
【0079】
マウスＵｂｅ３ａの回復
２０未満のタンパク質発現値を検出限界未満とみなし、ＮＡに変換し、データをｌｏｇ２変換した。５，３２５個のタンパク質群は、全試料の少なくとも５０％において測定値を含み、その後の統計分析に使用した。ＤｉｓｃｒｉＭｉｎｅｒ Ｒパッケージ［６４］を使用して、全ての試料（５，３１４個）にわたって測定されたタンパク質に対してＰＬＳ－ＤＡ分析を行った。
２０未満のタンパク質発現値を検出限界未満とみなし、ＮＡに変換し、データをｌｏｇ２変換した。５，３２５個のタンパク質群は、全試料の少なくとも５０％において測定値を含み、その後の統計分析に使用した。ＤｉｓｃｒｉＭｉｎｅｒ Ｒパッケージ［６４］を使用して、全ての試料（５，３１４個）にわたって測定されたタンパク質に対してＰＬＳ－ＤＡ分析を行った。
【0080】
パッケージからの「マルチクラス」に設定された応答タイプを有するｓａｍｒ関数を使用して、ＷＴ、ＫＯ、ｐ２１でのレスキュー及びｐ５６でのレスキューの４つの条件にわたって差次的に発現されたタンパク質群を同定した。どのペアワイズ比較が有意であるかを判定するために、Ｒ統計パッケージ［６２］からのテューキーのＨｏｎｅｓｔｌｙ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ検定を使用し、アルファレベルを５％に設定した。
【0081】
上方又は下方制御された経路を同定するために、Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェアの１Ｄアノテーション試験を使用した。各ペアワイズ比較ＫＯ対ＷＴ、Ｒｅｓｃｕｅ ｐ２１対ＫＯ、及びＲｅｓｃｕｅ ｐ５６対ＫＯについて、タンパク質を最初に、ＧＯアノテーション及びＵｎｉｐｒｏｔデータベースからダウンロードしたキーワードにマッピングした。続いて、濃縮スコアを計算し、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を用いた多重仮説検定補正を適用して、統計学的有意差を同定した。完全性のために、３つ全ての比較について経路濃縮スコアを常にプロットし、有意に調節されたものを明示的にマークした。
【0082】
キャピラリーウエスタンブロット
マウス脳及びｈｉＰＳＣ溶解物における推定上のＵｂｅ３ａ標的のタンパク質発現を、自動キャピラリーウェスタンブロッティング（Ｓａｌｌｙ Ｓｕｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）によって分析した。全ての実験ステップは、製造業者の指示に従って実施した。簡潔には、タンパク質の抽出及び定量の後、０．２５ｍｇ／ｍｌの最終試料濃度をキャピラリーカートリッジ（１２～２３０ｋＤａのＰｅｇｇｙ Ｓｕｅ又はＳａｌｌｙ Ｓｕｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ、＃ＳＭ－Ｓ００１）に充填した。化学発光タンパク質検出を、抗ウサギ及び抗マウス検出モジュール（＃ＤＭ－００１及び＃ＤＭ－００２）を使用して行った。相対タンパク質発現の分析は、Ｃｏｍｐａｓｓ ｆｏｒ ＳＷソフトウェア（バージョン４．１．０、タンパク質単純）を用いて行い、ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの事後検定を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８）を用いてにより統計分析した。
マウス脳及びｈｉＰＳＣ溶解物における推定上のＵｂｅ３ａ標的のタンパク質発現を、自動キャピラリーウェスタンブロッティング（Ｓａｌｌｙ Ｓｕｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ）によって分析した。全ての実験ステップは、製造業者の指示に従って実施した。簡潔には、タンパク質の抽出及び定量の後、０．２５ｍｇ／ｍｌの最終試料濃度をキャピラリーカートリッジ（１２～２３０ｋＤａのＰｅｇｇｙ Ｓｕｅ又はＳａｌｌｙ Ｓｕｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ、＃ＳＭ－Ｓ００１）に充填した。化学発光タンパク質検出を、抗ウサギ及び抗マウス検出モジュール（＃ＤＭ－００１及び＃ＤＭ－００２）を使用して行った。相対タンパク質発現の分析は、Ｃｏｍｐａｓｓ ｆｏｒ ＳＷソフトウェア（バージョン４．１．０、タンパク質単純）を用いて行い、ＡＮＯＶＡ、続いてテューキーの事後検定を用いてＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン８）を用いてにより統計分析した。
【0083】
ｈＩＰＳＣ培養
ＮＰＣ及びニューロンの細胞培養を、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｐａｎｄｙａ ｅｔ ａｌ［２７、６８］に記載されているように行った。
ＩＰＳＣ染色及び画像化
ＮＰＣ及びニューロンの細胞培養を、Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．ａｎｄ Ｐａｎｄｙａ ｅｔ ａｌ［２７、６８］に記載されているように行った。
ＩＰＳＣ染色及び画像化
【0084】
対照及びＡＳ欠失ニューロンをＢＧＡＡ培地中で培養した。培地を処理の１日前に交換した。ｈｉＰＳＣ由来ニューロンを、ニューロン分化中に６週間、ＰＢＳ中の１μＭ ＡＳＯで処理した。処理後、細胞を直ちに固定し、前述のように［２７］、ＴＫＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＨＰＡ０２９４８０；１：２００）、ＵＢＥ３ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳＡＢ１４０４５０８；１：２００）及びＭａｐ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ５３９２；１：５００）及びＤＡＰＩについて染色した。
【0085】
撮像及び撮像データ分析
Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡で画像を取得した。Ｚスタック投影は、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）の「スライスの合計」コマンドを使用して実行された。核ＵＢＥ３Ａ及びＴＫＴ発現の自動定量化を、マスクとしてＤＡＰＩ染色を使用し、各細胞における蛍光の積分密度を測定することによって行った。ニューロン細胞と非ニューロン細胞とを区別するために、各独立した実験におけるＨｕＣ／Ｄ染色の手動閾値処理を行った。２つの独立した分化からの複製物をデータ分析のために組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、続いてＤｕｎｎの事後検定を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（バージョン８）を用いて統計分析を行った。
ＡＳＯ処置
Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５共焦点顕微鏡で画像を取得した。Ｚスタック投影は、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）の「スライスの合計」コマンドを使用して実行された。核ＵＢＥ３Ａ及びＴＫＴ発現の自動定量化を、マスクとしてＤＡＰＩ染色を使用し、各細胞における蛍光の積分密度を測定することによって行った。ニューロン細胞と非ニューロン細胞とを区別するために、各独立した実験におけるＨｕＣ／Ｄ染色の手動閾値処理を行った。２つの独立した分化からの複製物をデータ分析のために組み合わせた。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、続いてＤｕｎｎの事後検定を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（バージョン８）を用いて統計分析を行った。
ＡＳＯ処置
【表1】
【0086】
免疫組織化学
脳組織を４％ ＰＦＡで固定し、凍結切片化のために調製した。ラット脳組織におけるＴｋｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＨＰＡ０２９４８０；１：２００）、Ｕｂｅ３ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳＡＢ１４０４５０８；１：４００）及びＮｅｕＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＡＢ３７７；１／５００）についての免疫組織化学染色を以前に記載されたように行った［１３］。簡潔には、切片を、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び５％正常ウマ血清を含有するＰＢＳにより室温で１時間ブロッキング処理した。一次抗体標識を、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１％正常ウマ血清を含有するＰＢＳ中、室温で一晩行った。一次抗体標識後、切片をＰＢＳで洗浄し、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％正常ウマ血清を含有するＰＢＳ緩衝液中の対応するＡｌｅｘａコンジュゲート二次抗体及びＤＡＰＩと室温で２時間インキュベートした。
脳組織を４％ ＰＦＡで固定し、凍結切片化のために調製した。ラット脳組織におけるＴｋｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＨＰＡ０２９４８０；１：２００）、Ｕｂｅ３ａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳＡＢ１４０４５０８；１：４００）及びＮｅｕＮ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＭＡＢ３７７；１／５００）についての免疫組織化学染色を以前に記載されたように行った［１３］。簡潔には、切片を、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び５％正常ウマ血清を含有するＰＢＳにより室温で１時間ブロッキング処理した。一次抗体標識を、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び１％正常ウマ血清を含有するＰＢＳ中、室温で一晩行った。一次抗体標識後、切片をＰＢＳで洗浄し、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％正常ウマ血清を含有するＰＢＳ緩衝液中の対応するＡｌｅｘａコンジュゲート二次抗体及びＤＡＰＩと室温で２時間インキュベートした。
【0087】
撮像及びデータ分析
Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡で画像を取得した。Ｚスタック投影は、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）の「スライスの合計」コマンドを使用して実行された。核ＵＢＥ３Ａ及びＴＫＴ発現の自動定量化を、マスクとしてＤＡＰＩ染色を使用し、各細胞における蛍光の積分密度を測定することによって行った。ＮｅｕＮ染色の手動閾値処理を行い、ニューロン細胞と非ニューロン細胞を区別するために動物全体で一貫して維持した。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、続いてＤｕｎｎの事後検定を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（バージョン８）を用いて統計分析を行った。
Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡で画像を取得した。Ｚスタック投影は、ＦＩＪＩ（ＩｍａｇｅＪ）の「スライスの合計」コマンドを使用して実行された。核ＵＢＥ３Ａ及びＴＫＴ発現の自動定量化を、マスクとしてＤＡＰＩ染色を使用し、各細胞における蛍光の積分密度を測定することによって行った。ＮｅｕＮ染色の手動閾値処理を行い、ニューロン細胞と非ニューロン細胞を区別するために動物全体で一貫して維持した。Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定、続いてＤｕｎｎの事後検定を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウエア（バージョン８）を用いて統計分析を行った。
【0088】
本発明のバイオマーカータンパク質（ヒトタンパク質を列挙）。
【表2】
【0089】
参考文献
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１１．Ｓｕｎ Ｊ，Ｚｈｕ Ｇ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｓｔａｎｄｌｅｙ Ｓ，Ｊｉ Ａ，Ｔｕｎｕｇｕｎｔｌａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＵＢＥ３Ａ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｍｏｒｙ ｂｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ＳＫ２ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１５；１２：４４９－４６１．
１２．Ｓｕｎ Ｊ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｊｉａ Ｙ，Ｈａｏ Ｘ，Ｌｉｎ ＷＪ，Ｔｒａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＵＢＥ３Ａ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐ１８／ＬＡＭＴＯＲ１ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｍＴＯＲＣ１ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｅｌｉｆｅ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．３７９９３．
１３．Ａｖａｇｌｉａｎｏ Ｔｒｅｚｚａ Ｒ，Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ，Ｂｏｓｓｕｙｔ ＳＮＶ，Ｚａｍｐｅｔａ ＦＩ，Ｐｕｎｔ ＡＭ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｓｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ＵＢＥ３Ａ ｃａｕｓｅｓ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９．２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９３－０１９－０４２５－０．
１４．Ａｖａｇｌｉａｎｏ Ｔｒｅｚｚａ Ｒ，Ｐｕｎｔ ＡＭ，Ｍｉｅｎｔｊｅｓ Ｅ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｍ，Ｚａｍｐｅｔａ ＦＩ，ｄｅ Ｇｒａａｆ ＩＪ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏ－ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｂｐｈｉｌｉｎ ３Ａ ｂｙ ＵＢＥ３Ａ ｓｅｒｖｅｓ ａ ｎｏｎ－ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２１．２０２１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２１－８２３１９－９．
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２５．Ｗａｎｇ Ｔ，ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ ＧＭ，Ｅｌｇｅｒｓｍａ Ｙ，Ｂｏｒｓｔ ＪＧＧ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｃａｌｙｘ ｏｆ ｈｅｌｄ ｓｙｎａｐｓｅ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｎｃｅｌ．２０１７．００４１８．
２６．Ｂｒｕｉｎｓｍａ ＣＦ，Ｓｃｈｏｎｅｗｉｌｌｅ Ｍ，Ｇａｏ Ｚ，Ａｒｏｎｉｃａ ＥＭＡ，Ｊｕｄｓｏｎ ＭＣ，Ｐｈｉｌｐｏｔ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５．２０１５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７２／ＪＣＩ８３５４１．
２７．Ｐａｎｄｙａ ＮＪ．Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ＧＡＧ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧ１０ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＵＢＥ３Ａ ａｎｄ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．２０２１．２０２１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｘｃｒｍ．２０２１．１００３６０．
２８．Ｑｉｎ Ｚ，Ｘｉａｎｇ Ｃ，Ｚｈｏｎｇ Ｆ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｄｏｎｇ Ｑ，Ｌｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ（ＴＫＴ）ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ａ ｎｏｎ－ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍａｎｎｅｒ．Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１９．２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０４６－０１９－１１３１－１．
２９．Ｌｉ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｌｕ Ｙ，Ｍｅｎｇ Ｓ，Ｑｕａｎ Ｈ，Ｈｏｕ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｆａｒｎｅｓｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＨＤＡＣ３ ｔｏ ＦＸＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４１９－０２０－２２２５－６．
３０．Ｇｅｅｒｔｓ－Ｈａａｇｅｓ Ａ，Ｂｏｓｓｕｙｔ ＳＮＶ，ｄｅｎ Ｂｅｓｔｅｎ Ｉ，Ｂｒｕｇｇｅｎｗｉｒｔｈ Ｈ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇｔ Ｉ，Ｙｎｔｅｍａ ＨＧ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ＵＢＥ３Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｅｉｇｈｔ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｅｌａｙ，ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｗｈｉｃｈ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｍａｔｃｈ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｍｇｇ３．１４８１．
３１．Ｚａａｒｏｏｒ－Ｒｅｇｅｖ Ｄ，Ｄｅ Ｂｉｅ Ｐ，Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ Ｍ，Ｎｏｙ Ｔ，Ｓｈｅｍｅｒ Ｒ，Ｈｅｌｅｄ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｉｎｇ１Ｂ ｂｙ ｓｅｌｆ－ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｒ ｂｙ Ｅ６－ＡＰ ｍａｙ ｈａｖｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０．２０１０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１００３１０８１０７．
３２．Ｚａｍｐｅｔａ ＦＩ，Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ，Ｎｉｇｇｌ Ｅ，Ｌｅｎｄｅｍｅｉｊｅｒ Ｂ，Ｓｍｅｅｎｋ Ｈ，Ｄｅ Ｖｒｉｊ ＦＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＵＢＥ３Ａ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｉｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｂｙ ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄａａ１９４．
３３．Ｓｉｒｏｉｓ ＣＬ，Ｂｌｏｏｍ ＪＥ，Ｆｉｎｋ ＪＪ，Ｇｏｒｋａ Ｄ，Ｋｅｌｌｅｒ Ｓ，Ｇｅｒｍａｉｎ ＮＤ，ｅｔ ａｌ．Ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＵＢＥ３Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄａａ１９１．
３４．Ｙｉ ＪＪ，Ｐａｒａｎｊａｐｅ ＳＲ，Ｗａｌｋｅｒ ＭＰ，Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｒ，Ｗｏｌｔｅｒ ＪＭ，Ｆｒａｇｏｌａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｕｔｉｓｍ－ｌｉｎｋｅｄ ＵＢＥ３Ａ Ｔ４８５Ａ ｍｕｔａｎｔ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１７．２０１７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１７．７８８４４８．
３５．Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｎｏｅｌ Ｇ，Ｇａｌｌｉｇａｎ ＪＴ，Ｓｏｗａ ＭＥ，Ａｒｎｄｔ Ｖ，Ｏｖｅｒｔｏｎ ＴＭ，Ｈａｒｐｅｒ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＵＢＥ３Ａ／Ｅ６ＡＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１２．２０１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ｍｃｂ．００２０１－１２．
３６．Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＡＤ，ＭａｃＦａｄｄｅｎ Ａ，Ｗｕ Ｚ，Ｐｅｎｇ Ｊ，Ｌｉｕ ＣＷ．Ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４．２０１４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９１／ｍｂｃ．Ｅ１３－１０－０５８５．
３７．Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｎｏｅｌ Ｇ，Ｌｕｃｋ Ｋ，Ｋｕｅｈｎｌｅ Ｓ，Ｄｅｓｂｕｌｅｕｘ Ａ，Ｓｚａｊｎｅｒ Ｐ，Ｇａｌｌｉｇａｎ ＪＴ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｔｗｏｒｋ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＵＢＥ３Ａ／Ｅ６ＡＰ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１８．０１．０２１．
３８．Ｇｕｏ Ｍ，Ｙａｎｇ ＸＬ，Ｓｃｈｉｍｍｅｌ Ｐ．Ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｂｅｙｏｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０．
３９．Ｂｏｃｚｏｎａｄｉ Ｖ，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＭＪ，Ｈｏｒｖａｔｈ Ｒ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１８．
４０．Ｏｇｎｊｅｎｏｖｉｅ Ｊ，Ｓｉｍｏｎｏｖｉｅ Ｍ．Ｈｕｍａｎ ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１８．
４１．Ｆａｒｏｏｋ ＭＦ，ＤｅＣｕｙｐｅｒｅ Ｍ，Ｈｙｌａｎｄ Ｋ，Ｔａｋｕｍｉ Ｔ，ＬｅＤｏｕｘ ＭＳ，Ｒｅｉｔｅｒ ＬＴ．Ａｌｔｅｒｅｄ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ，ｄｏｐａｍｉｎｅ ａｎｄ ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｅｒｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ １５ｑ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２．２０１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４３０３０．
４２．Ｓｍｉｒｎｏｖａ Ｅ Ｖ．，Ｌａｋｕｎｉｎａ ＶＡ，Ｔａｒａｓｓｏｖ Ｉ，Ｋｒａｓｈｅｎｉｎｎｉｋｏｖ ＩＡ，Ｋａｍｅｎｓｋｉ ＰＡ．Ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２．
４３．Ｍａｒａｎｇａ Ｃ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ＴＧ，Ｂｅｋｍａｎ Ｅ，ｄａ Ｒｏｃｈａ ＳＴ．Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ ｊｏｕｒｎｅｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ．ＦＥＢＳ Ｊ．２０２０．
４４．Ｇｏｎｇ Ｘ，Ｔａｎ Ｍ，Ｇａｏ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｋ，Ｇｕｏ Ｇ．ＣＲＭＰ－５ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｎ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｒｅｐ．２０１６．２０１６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３８９２／ｍｍｒ．２０１５．４６６２．
４５．Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｎ，Ｍｏｓｉｎｇｅｒ Ｂ，Ｒｏｙ Ａ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｍ，Ｕｇａｊｉｎ Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｆ，ｅｔ ａｌ．ＣＲＭＰ５（Ｃｏｌｌａｐｓｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５）ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｐｕｒｋｉｎｊｅ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１．２０１１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．５３３７－１０．２０１１．
４６．Ｙｕ Ｚ，Ｋｒｙｚｅｒ ＴＪ，Ｇｒｉｅｓｍａｎｎ ＧＥ，Ｋｉｍ ＫＫ，Ｂｅｎａｒｒｏｃｈ ＥＥ，Ｌｅｎｎｏｎ ＶＡ．ＣＲＭＰ－５ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｔｈｙｍｏｍａ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００１．２００１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／１５３１－８２４９（２００１０２０１）４９：２＜１４６：：ＡＩＤ－ＡＮＡ３４＞３．０．ＣＯ；２－Ｅ．
４７．Ｑｉｎ Ｌ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｌｉｕ Ｓ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｙａｎｇ Ｙ，Ｙａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ ｗｉｔｈ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｉＴＲＡＱ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７．２０１７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１７２２１４．
４８．Ｙｅｈ Ｅ，Ｄａｏ ＤＱ，Ｗｕ ＺＹ，Ｋａｎｄａｌａｍ ＳＭ，Ｃａｍａｃｈｏ ＦＭ，Ｔｏｍ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉＰＳＣｓ ｓｈｏｗ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎ ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｍｐ．２０１７．２３８．
４９．Ｓｃｈｌｅｉｎｉｔｚ Ｄ，Ｓｅｉｄｅｌ Ａ，Ｓｔａｓｓａｒｔ Ｒ，Ｋｌａｍｍｔ Ｊ，Ｈｉｒｒｌｉｎｇｅｒ ＰＧ，Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｕ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｇｅｎｅ（ＡＳＮＳ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｇｅｎｅ．２０１８．００２４５．
５０．Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ，Ｚｈａｉ Ｐ，Ｍｉｅｎｔｊｅｓ ＥＪ，Ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ ＧＭ，Ｅｌｇｅｒｓｍａ Ｙ．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｒｅｎａｔａｌ ＵＢＥ３Ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｍｏｌ Ａｕｔｉｓｍ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３２２９－０２０－００３７６－９．
５１．Ｒｏｔａｒｕ ＤＣ，ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ ＧＭ，Ｗａｌｌａａｒｄ Ｉ，Ｅｌｇｅｒｓｍａ Ｙ．Ａｄｕｌｔ Ｕｂｅ３ａ ｇｅｎｅ ｒｅｉｎｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｏｆ ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｌａｙｅｒ ５ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．００８３－１８．２０１８．
５２．Ｐａｒｋ ＡＪ，Ｈａｖｅｋｅｓ Ｒ，Ｆｕ Ｘ，Ｈａｎｓｅｎ Ｒ，Ｔｕｄｏｒ ＪＣ，Ｐｅｉｘｏｔｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌｉｎ／ｔｒａｘ ＲＮａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ．Ｅｌｉｆｅ．２０１７．２０１７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．２７８７２．
５３．Ｓｕｅｄｈｏｆ ＴＣ．Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：Ａｎ Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ Ｃｏｍｅｓ ｏｆ Ａｇｅ．Ｃｅｌｌ．２００６．
５４．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ－Ｋａｕｆｍａｎ Ｋ，Ｈａｒｐｅｒ Ｃ．Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ：ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ－ｒｅｌａｔｅｄ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００９；４１：７１７－７２０．
５５．Ｂｏｙｌｅ Ｌ，Ｗａｍｅｌｉｎｋ ＭＭＣ，Ｓａｌｏｍｏｎｓ ＧＳ，Ｒｏｏｓ Ｂ，Ｐｏｐ Ａ，Ｄａｕｂｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＴＫＴ Ａｒｅ ｔｈｅ Ｃａｕｓｅ ｏｆ ａ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｓｈｏｒｔ Ｓｔａｔｕｒｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｅｌａｙ，ａｎｄ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｈｅａｒｔ Ｄｅｆｅｃｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１６．２０１６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｊｈｇ．２０１６．０３．０３０．
５６．Ｋｒｕｇｅｒ ＮＪ，Ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗｅｎ Ａ．Ｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２００３．
５７．Ｓｎａｅｂｊｏｒｎｓｓｏｎ ＭＴ，Ｓｃｈｕｌｚｅ Ａ．Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１８．
５８．Ｓｃｈｅｌｔｅｍａ ＲＡ，Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ Ｊ－Ｐ，Ｌａｎｇｅ Ｏ，Ｈｏｒｎｂｕｒｇ Ｄ，Ｄｅｎｉｓｏｖ Ｅ，Ｄａｍｏｃ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ，ａ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ｗｉｔｈ ａ Ｐｒｅ－ｆｉｌｔｅｒ，Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ａｎｄ ａｎ Ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ－ｆｉｅｌｄ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ａｎａｌｙｚｅｒ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１４；１３：３６９８－３７０８．
５９．Ｂｒｕｄｅｒｅｒ Ｒ，Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ ＯＭ，Ｇａｎｄｈｉ Ｔ，Ｘｕａｎ Ｙ，Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ Ｊ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ Ｄａｔａ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｄｅｐｔｈ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１７；４１．
６０．Ｈｅｂｅｒｔ ＡＳ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＡＬ，Ｂａｉｌｅｙ ＤＪ，Ｕｌｂｒｉｃｈ Ａ，Ｃｏｕｇｈｌｉｎ ＥＥ，Ｗｅｓｔｐｈａｌｌ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｏｎｅ ｈｏｕｒ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１４．２０１４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１３．０３４７６９．
６１．Ｃａｌｌｉｓｔｅｒ ＳＪ，Ｂａｒｒｙ ＲＣ，Ａｄｋｉｎｓ ＪＮ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＥＴ，Ｑｉａｎ ＷＪ，Ｗｅｂｂ－Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＢＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂｉａｓｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００６．２００６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｐｒ０５０３００ｌ．
６２．Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ．Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０１４）．Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ Ｆｏｕｎｄ Ｓｔａｔ Ｃｏｍｐｕｔ Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ ＵＲＬ Ｈｔｔｐ／／ＷｗｗＲ－ＰｒｏｊｅｃｔＯｒｇ／．２０１４．２０１４．
６３．Ｔｙａｎｏｖａ Ｓ，Ｔｅｍｕ Ｔ，Ｓｉｎｉｔｃｙｎ Ｐ，Ｃａｒｌｓｏｎ Ａ，Ｈｅｉｎ ＭＹ，Ｇｅｉｇｅｒ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｅｒｓｅｕｓ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ（ｐｒｏｔｅ）ｏｍｉｃｓ ｄａｔａ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１６．
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６６．Ｓｔｏｒｅｙ ＪＤ．Ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅｓ．Ｊ Ｒ Ｓｔａｔ Ｓｏｃ Ｓｅｒ Ｂ Ｓｔａｔ Ｍｅｔｈｏｄｏｌ．２００２．２００２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／１４６７－９８６８．００３４６．
６７．Ｂａｔｅｍａｎ Ａ．ＵｎｉＰｒｏｔ：Ａ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｈｕｂ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１９．２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｙ１０４９．
６８．Ｃｏｓｔａ Ｖ，Ａｉｇｎｅｒ Ｓ，Ｖｕｋｃｅｖｉｃ Ｍ，Ｓａｕｔｅｒ Ｅ，Ｂｅｈｒ Ｋ，Ｅｂｅｌｉｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＭＴＯＲＣ１ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｃｏｒｒｅｃｔｓ Ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｔｕｂｅｒｏｕｓ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１６；１５：８６－９５．
１．Ｂｕｉｔｉｎｇ Ｋ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｃ，Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ Ｂ．Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ａ ｒａｒｅ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１６；１２：５８４－５９３．
２．Ｍａｂｂ ＡＭ，Ｊｕｄｓｏｎ ＭＣ，Ｚｙｌｋａ ＭＪ，Ｐｈｉｌｐｏｔ ＢＤ．Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１；３４：２９３－３０３．
３．Ｒｏｔａｒｕ ＤＣ，Ｍｉｅｎｔｊｅｓ ＥＪ，Ｅｌｇｅｒｓｍａ Ｙ．Ａｎｇｅｌｍａｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ｆｒｏｍ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．２０２０．
４．Ｓｉｌｖａ－ｓａｎｔｏｓ Ｓ，Ｗｏｅｒｄｅｎ ＧＭ Ｖａｎ，Ｂｒｕｉｎｓｍａ ＣＦ，Ｍｉｅｎｔｊｅｓ Ｅ．Ｕｂｅ３ａ ｒｅｉｎｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｎｄｏｗｓ ｉｎ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｄｅｌ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５：２０６９－２０７６．
５．Ｇｕ Ｂ，Ｃａｒｓｔｅｎｓ ＫＥ，Ｊｕｄｓｏｎ ＭＣ，Ｄａｌｔｏｎ ＫＡ，Ｒｏｕｇｉｅ Ｍ，Ｃｌａｒｋ ＥＰ，ｅｔ ａｌ．Ｕｂｅ３ａ ｒｅｉｎｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｅｐｉｌｅｐｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｄｅｌ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１９．２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７２／ＪＣＩ１２０８１６．
６．Ｈｕａｎｇ ＨＳ，Ａｌｌｅｎ ＪＡ，Ｍａｂｂ ＡＭ，Ｋｉｎｇ ＩＦ，Ｍｉｒｉｙａｌａ Ｊ，Ｔａｙｌｏｒ－Ｂｌａｋｅ Ｂ，ｅｔ ａｌ．Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｕｎｓｉｌｅｎｃｅ ｔｈｅ ｄｏｒｍａｎｔ ａｌｌｅｌｅ ｏｆ Ｕｂｅ３ａ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２．２０１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１０７２６．
７．Ｍｅｎｇ Ｌ，Ｗａｒｄ ＡＪ，Ｃｈｕｎ Ｓ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ＣＦ，Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ，Ｒｉｇｏ Ｆ．Ｔｏｗａｒｄｓ ａ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ｌｏｎｇ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１４；５１８：４０９－４１２．
８．Ｍｅｎｇ Ｌ，Ｐｅｒｓｏｎ ＲＥ，Ｈｕａｎｇ Ｗ，Ｚｈｕ ＰＪ，Ｃｏｓｔａ－Ｍａｔｔｉｏｌｉ Ｍ，Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ．Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｂｅ３ａ－ＡＴＳ Ｕｎｓｉｌｅｎｃｅｓ Ｐａｔｅｒｎａｌ Ｕｂｅ３ａ ａｎｄ Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｎｇｅｌｍａｎ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ．ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔ．２０１３；９．
９．Ｅｌｇｅｒｓｍａ Ｙ，Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ．ＵＢＥ３Ａ ｒｅｉｎｓｔａｔｅｍｅｎｔ ａｓ ａ ｄｉｓｅａｓｅ－ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｄｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．２０２１．
１０．Ｅｇａｗａ Ｋ，Ｋｉｔａｇａｗａ Ｋ，Ｉｎｏｕｅ Ｋ，Ｔａｋａｙａｍａ Ｍ，Ｔａｋａｙａｍａ Ｃ，Ｓａｉｔｏｈ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｏｎｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｇｒａｎｕｌｅ ｃｅｌｌｓ ｃａｕｓｅｓ ｍｏｔｏｒ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１２．２０１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００４６５５．
１１．Ｓｕｎ Ｊ，Ｚｈｕ Ｇ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｓｔａｎｄｌｅｙ Ｓ，Ｊｉ Ａ，Ｔｕｎｕｇｕｎｔｌａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＵＢＥ３Ａ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ Ｍｅｍｏｒｙ ｂｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ＳＫ２ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１５；１２：４４９－４６１．
１２．Ｓｕｎ Ｊ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｊｉａ Ｙ，Ｈａｏ Ｘ，Ｌｉｎ ＷＪ，Ｔｒａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．ＵＢＥ３Ａ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐ１８／ＬＡＭＴＯＲ１ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｍＴＯＲＣ１ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｅｌｉｆｅ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．３７９９３．
１３．Ａｖａｇｌｉａｎｏ Ｔｒｅｚｚａ Ｒ，Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ，Ｂｏｓｓｕｙｔ ＳＮＶ，Ｚａｍｐｅｔａ ＦＩ，Ｐｕｎｔ ＡＭ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｓｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ＵＢＥ３Ａ ｃａｕｓｅｓ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１９．２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９３－０１９－０４２５－０．
１４．Ａｖａｇｌｉａｎｏ Ｔｒｅｚｚａ Ｒ，Ｐｕｎｔ ＡＭ，Ｍｉｅｎｔｊｅｓ Ｅ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ Ｍ，Ｚａｍｐｅｔａ ＦＩ，ｄｅ Ｇｒａａｆ ＩＪ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏ－ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｂｐｈｉｌｉｎ ３Ａ ｂｙ ＵＢＥ３Ａ ｓｅｒｖｅｓ ａ ｎｏｎ－ｄｅｇｒａｄａｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２１．２０２１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５９８－０２１－８２３１９－９．
１５．Ｂｏｓｓｕｙｔ ＳＮＶ，Ｐｕｎｔ ＡＭ，ｄｅ Ｇｒａａｆ ＩＪ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｕｒｇ Ｊ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＭＧ，Ｈｅｕｓｓｌｅｒ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｌｏｓｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ＵＢＥ３Ａ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｔｈｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｃａｕｓｅ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ＵＢＥ３Ａ ｍｉｓｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０２１．２０２１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄａｂ０５０．
１６．Ｔｏｍａｉｅ Ｖ，Ｂａｎｋｓ Ｌ．Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ＵＢＥ３Ａ／Ｅ６ＡＰ ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．２０１５．２０１５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｃｄｄｉｓ．２０１４．５７２．
１７．Ｋｏｏｐｍａｎｓ Ｆ，Ｐａｎｄｙａ ＮＪ，Ｆｒａｎｋｅ ＳＫ，Ｐｈｉｌｌｉｐｐｅｎｓ ＩＨＣＭＨ，Ｐａｌｉｕｋｈｏｖｉｃｈ Ｉ，Ｌｉ ＫＷ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ ｏｆ Ｒｏｄｅｎｔｓ ａｎｄ Ｐｒｉｍａｔｅｓ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｎｍｏｌ．２０１８．００３６４．
１８．Ｌｕｄｗｉｇ Ｃ，Ｇｉｌｌｅｔ Ｌ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｇ，Ａｍｏｎ Ｓ，Ｃｏｌｌｉｎｓ ＢＣ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ Ｒ．Ｄａｔａ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄ ＳＷＡＴＨ－ＭＳ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ａ ｔｕｔｏｒｉａｌ．Ｍｏｌ Ｓｙｓｔ Ｂｉｏｌ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５２５２／ｍｓｂ．２０１７８１２６．
１９．Ｊｕｄｓｏｎ ＭＣ，Ｓｏｓａ－Ｐａｇａｎ ＪＯ，Ｄｅｌ Ｃｉｄ ＷＡ，Ｈａｎ ＪＥ，Ｐｈｉｌｐｏｔ ＢＤ．Ａｌｌｅｌｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｕｂｅ３ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｂｒａｉｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐｏｓｔｎａｔａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ．２０１４．２０１４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｃｎｅ．２３５０７．
２０．Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ，Ｈａｋｏｎｅｎ Ｊ，Ｂｅｒｎａｂｅ Ｋｌｅｉｊｎ Ｍ，Ｓｉｌｖａ－Ｓａｎｔｏｓ Ｓ，Ｊｕｄｓｏｎ ＭＣ，Ｐｈｉｌｐｏｔ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｌａｙｅｄ ｌｏｓｓ ｏｆ ＵＢＥ３Ａ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｍｏｌ Ａｕｔｉｓｍ．２０１９．２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３２２９－０１９－０２７７－１．
２１．Ｋｗｏｎ ＮＨ，Ｆｏｘ ＰＬ，Ｋｉｍ Ｓ．Ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１９．
２２．Ｔａｎａｋａ Ｋ．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ：Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｊａｐａｎ Ａｃａｄ Ｓｅｒ Ｂ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．２００９．
２３．Ｋｏｏｐｍａｎｓ Ｆ，ｖａｎ Ｎｉｅｒｏｐ Ｐ，Ａｎｄｒｅｓ－Ａｌｏｎｓｏ Ｍ，Ｂｙｒｎｅｓ Ａ，Ｃｉｊｓｏｕｗ Ｔ，Ｃｏｂａ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．ＳｙｎＧＯ：Ａｎ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ，Ｅｘｐｅｒｔ－Ｃｕｒａｔｅｄ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ Ｂａｓｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎａｐｓｅ．Ｎｅｕｒｏｎ．２０１９．２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｎｅｕｒｏｎ．２０１９．０５．００２．
２４．Ｂｅｒｇ ＥＬ，Ｐｒｉｄｅ ＭＣ，Ｐｅｔｋｏｖａ ＳＰ，Ｌｅｅ ＲＤ，Ｃｏｐｐｉｎｇ ＮＡ，Ｓｈｅｎ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｉｎ ａ ｆｕｌｌ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｓｅ Ｅ３Ａ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｔｒａｎｓｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１３９８－０２０－０７２０－２．
２５．Ｗａｎｇ Ｔ，ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ ＧＭ，Ｅｌｇｅｒｓｍａ Ｙ，Ｂｏｒｓｔ ＪＧＧ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ｃａｌｙｘ ｏｆ ｈｅｌｄ ｓｙｎａｐｓｅ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｆｒｏｎｔ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｎｃｅｌ．２０１７．００４１８．
２６．Ｂｒｕｉｎｓｍａ ＣＦ，Ｓｃｈｏｎｅｗｉｌｌｅ Ｍ，Ｇａｏ Ｚ，Ａｒｏｎｉｃａ ＥＭＡ，Ｊｕｄｓｏｎ ＭＣ，Ｐｈｉｌｐｏｔ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｄｅｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５．２０１５．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１７２／ＪＣＩ８３５４１．
２７．Ｐａｎｄｙａ ＮＪ．Ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ＧＡＧ ｄｏｍａｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＥＧ１０ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＵＢＥ３Ａ ａｎｄ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｍｅｄ．２０２１．２０２１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｘｃｒｍ．２０２１．１００３６０．
２８．Ｑｉｎ Ｚ，Ｘｉａｎｇ Ｃ，Ｚｈｏｎｇ Ｆ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｄｏｎｇ Ｑ，Ｌｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ（ＴＫＴ）ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ａ ｎｏｎ－ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍａｎｎｅｒ．Ｊ Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１９．２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３０４６－０１９－１１３１－１．
２９．Ｌｉ Ｍ，Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｌｕ Ｙ，Ｍｅｎｇ Ｓ，Ｑｕａｎ Ｈ，Ｈｏｕ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｆａｒｎｅｓｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＨＤＡＣ３ ｔｏ ＦＸＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４１９－０２０－２２２５－６．
３０．Ｇｅｅｒｔｓ－Ｈａａｇｅｓ Ａ，Ｂｏｓｓｕｙｔ ＳＮＶ，ｄｅｎ Ｂｅｓｔｅｎ Ｉ，Ｂｒｕｇｇｅｎｗｉｒｔｈ Ｈ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇｔ Ｉ，Ｙｎｔｅｍａ ＨＧ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ＵＢＥ３Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｉｎ ｅｉｇｈｔ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｗｉｔｈ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｄｅｌａｙ，ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ａ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｗｈｉｃｈ ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｍａｔｃｈ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｍｅｄ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｍｇｇ３．１４８１．
３１．Ｚａａｒｏｏｒ－Ｒｅｇｅｖ Ｄ，Ｄｅ Ｂｉｅ Ｐ，Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ Ｍ，Ｎｏｙ Ｔ，Ｓｈｅｍｅｒ Ｒ，Ｈｅｌｅｄ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｉｎｇ１Ｂ ｂｙ ｓｅｌｆ－ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ ｏｒ ｂｙ Ｅ６－ＡＰ ｍａｙ ｈａｖｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１０．２０１０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７３／ｐｎａｓ．１００３１０８１０７．
３２．Ｚａｍｐｅｔａ ＦＩ，Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ，Ｎｉｇｇｌ Ｅ，Ｌｅｎｄｅｍｅｉｊｅｒ Ｂ，Ｓｍｅｅｎｋ Ｈ，Ｄｅ Ｖｒｉｊ ＦＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＵＢＥ３Ａ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｉｃｅ ｉｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ ｂｙ ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄａａ１９４．
３３．Ｓｉｒｏｉｓ ＣＬ，Ｂｌｏｏｍ ＪＥ，Ｆｉｎｋ ＪＪ，Ｇｏｒｋａ Ｄ，Ｋｅｌｌｅｒ Ｓ，Ｇｅｒｍａｉｎ ＮＤ，ｅｔ ａｌ．Ａｂｕｎｄａｎｃｅ ａｎｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＵＢＥ３Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍｓ．Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄａａ１９１．
３４．Ｙｉ ＪＪ，Ｐａｒａｎｊａｐｅ ＳＲ，Ｗａｌｋｅｒ ＭＰ，Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ Ｒ，Ｗｏｌｔｅｒ ＪＭ，Ｆｒａｇｏｌａ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｕｔｉｓｍ－ｌｉｎｋｅｄ ＵＢＥ３Ａ Ｔ４８５Ａ ｍｕｔａｎｔ Ｅ３ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｌｉｇａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｈｅ Ｗｎｔ／β－ｃａｔｅｎｉｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１７．２０１７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１７．７８８４４８．
３５．Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｎｏｅｌ Ｇ，Ｇａｌｌｉｇａｎ ＪＴ，Ｓｏｗａ ＭＥ，Ａｒｎｄｔ Ｖ，Ｏｖｅｒｔｏｎ ＴＭ，Ｈａｒｐｅｒ ＪＷ，ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ＵＢＥ３Ａ／Ｅ６ＡＰ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１２．２０１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１２８／ｍｃｂ．００２０１－１２．
３６．Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＡＤ，ＭａｃＦａｄｄｅｎ Ａ，Ｗｕ Ｚ，Ｐｅｎｇ Ｊ，Ｌｉｕ ＣＷ．Ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１４．２０１４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９１／ｍｂｃ．Ｅ１３－１０－０５８５．
３７．Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｎｏｅｌ Ｇ，Ｌｕｃｋ Ｋ，Ｋｕｅｈｎｌｅ Ｓ，Ｄｅｓｂｕｌｅｕｘ Ａ，Ｓｚａｊｎｅｒ Ｐ，Ｇａｌｌｉｇａｎ ＪＴ，ｅｔ ａｌ．Ｎｅｔｗｏｒｋ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＵＢＥ３Ａ／Ｅ６ＡＰ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２０１８．０１．０２１．
３８．Ｇｕｏ Ｍ，Ｙａｎｇ ＸＬ，Ｓｃｈｉｍｍｅｌ Ｐ．Ｎｅｗ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｂｅｙｏｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１０．
３９．Ｂｏｃｚｏｎａｄｉ Ｖ，Ｊｅｎｎｉｎｇｓ ＭＪ，Ｈｏｒｖａｔｈ Ｒ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｉｎ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１８．
４０．Ｏｇｎｊｅｎｏｖｉｅ Ｊ，Ｓｉｍｏｎｏｖｉｅ Ｍ．Ｈｕｍａｎ ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ ｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１８．
４１．Ｆａｒｏｏｋ ＭＦ，ＤｅＣｕｙｐｅｒｅ Ｍ，Ｈｙｌａｎｄ Ｋ，Ｔａｋｕｍｉ Ｔ，ＬｅＤｏｕｘ ＭＳ，Ｒｅｉｔｅｒ ＬＴ．Ａｌｔｅｒｅｄ ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ，ｄｏｐａｍｉｎｅ ａｎｄ ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｈｅｒｉｎｅ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ １５ｑ ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１２．２０１２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４３０３０．
４２．Ｓｍｉｒｎｏｖａ Ｅ Ｖ．，Ｌａｋｕｎｉｎａ ＶＡ，Ｔａｒａｓｓｏｖ Ｉ，Ｋｒａｓｈｅｎｉｎｎｉｋｏｖ ＩＡ，Ｋａｍｅｎｓｋｉ ＰＡ．Ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２．
４３．Ｍａｒａｎｇａ Ｃ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ ＴＧ，Ｂｅｋｍａｎ Ｅ，ｄａ Ｒｏｃｈａ ＳＴ．Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ ｊｏｕｒｎｅｙ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ．ＦＥＢＳ Ｊ．２０２０．
４４．Ｇｏｎｇ Ｘ，Ｔａｎ Ｍ，Ｇａｏ Ｙ，Ｃｈｅｎ Ｋ，Ｇｕｏ Ｇ．ＣＲＭＰ－５ ｉｎｔｅｒａｃｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｔｉｎ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ Ｒｅｐ．２０１６．２０１６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３８９２／ｍｍｒ．２０１５．４６６２．
４５．Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｎ，Ｍｏｓｉｎｇｅｒ Ｂ，Ｒｏｙ Ａ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｍ，Ｕｇａｊｉｎ Ｋ，Ｎａｋａｍｕｒａ Ｆ，ｅｔ ａｌ．ＣＲＭＰ５（Ｃｏｌｌａｐｓｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｅｄｉａｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ５）ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｐｕｒｋｉｎｊｅ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１１．２０１１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．５３３７－１０．２０１１．
４６．Ｙｕ Ｚ，Ｋｒｙｚｅｒ ＴＪ，Ｇｒｉｅｓｍａｎｎ ＧＥ，Ｋｉｍ ＫＫ，Ｂｅｎａｒｒｏｃｈ ＥＥ，Ｌｅｎｎｏｎ ＶＡ．ＣＲＭＰ－５ ｎｅｕｒｏｎａｌ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｔｈｙｍｏｍａ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．２００１．２００１．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／１５３１－８２４９（２００１０２０１）４９：２＜１４６：：ＡＩＤ－ＡＮＡ３４＞３．０．ＣＯ；２－Ｅ．
４７．Ｑｉｎ Ｌ，Ｌｉｕ Ｘ，Ｌｉｕ Ｓ，Ｌｉｕ Ｙ，Ｙａｎｇ Ｙ，Ｙａｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｄｙｓｐｌａｓｉａ ｗｉｔｈ ｅｐｉｌｅｐｓｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｉＴＲＡＱ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１７．２０１７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１７２２１４．
４８．Ｙｅｈ Ｅ，Ｄａｏ ＤＱ，Ｗｕ ＺＹ，Ｋａｎｄａｌａｍ ＳＭ，Ｃａｍａｃｈｏ ＦＭ，Ｔｏｍ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉＰＳＣｓ ｓｈｏｗ ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｎｅｕｒａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎ ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｍｐ．２０１７．２３８．
４９．Ｓｃｈｌｅｉｎｉｔｚ Ｄ，Ｓｅｉｄｅｌ Ａ，Ｓｔａｓｓａｒｔ Ｒ，Ｋｌａｍｍｔ Ｊ，Ｈｉｒｒｌｉｎｇｅｒ ＰＧ，Ｗｉｎｋｌｅｒ Ｕ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ｇｅｎｅ（ＡＳＮＳ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｃｅｐｈａｌｙ．Ｆｒｏｎｔ Ｇｅｎｅｔ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｇｅｎｅ．２０１８．００２４５．
５０．Ｓｏｎｚｏｇｎｉ Ｍ，Ｚｈａｉ Ｐ，Ｍｉｅｎｔｊｅｓ ＥＪ，Ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ ＧＭ，Ｅｌｇｅｒｓｍａ Ｙ．Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｒｅｎａｔａｌ ＵＢＥ３Ａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｍｏｌ Ａｕｔｉｓｍ．２０２０．２０２０．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓ１３２２９－０２０－００３７６－９．
５１．Ｒｏｔａｒｕ ＤＣ，ｖａｎ Ｗｏｅｒｄｅｎ ＧＭ，Ｗａｌｌａａｒｄ Ｉ，Ｅｌｇｅｒｓｍａ Ｙ．Ａｄｕｌｔ Ｕｂｅ３ａ ｇｅｎｅ ｒｅｉｎｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｒｅｓｔｏｒｅｓ ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｏｆ ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｌａｙｅｒ ５ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８．２０１８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１５２３／ＪＮＥＵＲＯＳＣＩ．００８３－１８．２０１８．
５２．Ｐａｒｋ ＡＪ，Ｈａｖｅｋｅｓ Ｒ，Ｆｕ Ｘ，Ｈａｎｓｅｎ Ｒ，Ｔｕｄｏｒ ＪＣ，Ｐｅｉｘｏｔｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅａｒｎｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｌｉｎ／ｔｒａｘ ＲＮａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓ ａｃｔｉｖｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｍｅｍｏｒｙ．Ｅｌｉｆｅ．２０１７．２０１７．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．２７８７２．
５３．Ｓｕｅｄｈｏｆ ＴＣ．Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：Ａｎ Ｏｒｇａｎｅｌｌｅ Ｃｏｍｅｓ ｏｆ Ａｇｅ．Ｃｅｌｌ．２００６．
５４．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ－Ｋａｕｆｍａｎ Ｋ，Ｈａｒｐｅｒ Ｃ．Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ：ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｌｃｏｈｏｌ－ｒｅｌａｔｅｄ ｂｒａｉｎ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００９；４１：７１７－７２０．
５５．Ｂｏｙｌｅ Ｌ，Ｗａｍｅｌｉｎｋ ＭＭＣ，Ｓａｌｏｍｏｎｓ ＧＳ，Ｒｏｏｓ Ｂ，Ｐｏｐ Ａ，Ｄａｕｂｅｒ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＴＫＴ Ａｒｅ ｔｈｅ Ｃａｕｓｅ ｏｆ ａ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｓｈｏｒｔ Ｓｔａｔｕｒｅ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｅｌａｙ，ａｎｄ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ｈｅａｒｔ Ｄｅｆｅｃｔｓ．Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１６．２０１６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｊｈｇ．２０１６．０３．０３０．
５６．Ｋｒｕｇｅｒ ＮＪ，Ｖｏｎ Ｓｃｈａｅｗｅｎ Ａ．Ｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｅｎｔｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌ．２００３．
５７．Ｓｎａｅｂｊｏｒｎｓｓｏｎ ＭＴ，Ｓｃｈｕｌｚｅ Ａ．Ｎｏｎ－ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｃｒｏｓｓ－ｔａｌｋ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｌｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２０１８．
５８．Ｓｃｈｅｌｔｅｍａ ＲＡ，Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ Ｊ－Ｐ，Ｌａｎｇｅ Ｏ，Ｈｏｒｎｂｕｒｇ Ｄ，Ｄｅｎｉｓｏｖ Ｅ，Ｄａｍｏｃ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ，ａ Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ｗｉｔｈ ａ Ｐｒｅ－ｆｉｌｔｅｒ，Ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ａｎｄ ａｎ Ｕｌｔｒａ－ｈｉｇｈ－ｆｉｅｌｄ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ａｎａｌｙｚｅｒ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１４；１３：３６９８－３７０８．
５９．Ｂｒｕｄｅｒｅｒ Ｒ，Ｂｅｒｎｈａｒｄｔ ＯＭ，Ｇａｎｄｈｉ Ｔ，Ｘｕａｎ Ｙ，Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ Ｊ，Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎ Ｄａｔａ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｄｅｐｔｈ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１７；４１．
６０．Ｈｅｂｅｒｔ ＡＳ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＡＬ，Ｂａｉｌｅｙ ＤＪ，Ｕｌｂｒｉｃｈ Ａ，Ｃｏｕｇｈｌｉｎ ＥＥ，Ｗｅｓｔｐｈａｌｌ ＭＳ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｏｎｅ ｈｏｕｒ ｙｅａｓｔ ｐｒｏｔｅｏｍｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１４．２０１４．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１３．０３４７６９．
６１．Ｃａｌｌｉｓｔｅｒ ＳＪ，Ｂａｒｒｙ ＲＣ，Ａｄｋｉｎｓ ＪＮ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＥＴ，Ｑｉａｎ ＷＪ，Ｗｅｂｂ－Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＢＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｂｉａｓｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００６．２００６．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｐｒ０５０３００ｌ．
６２．Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ．Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０１４）．Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｒ Ｆｏｕｎｄ Ｓｔａｔ Ｃｏｍｐｕｔ Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ ＵＲＬ Ｈｔｔｐ／／ＷｗｗＲ－ＰｒｏｊｅｃｔＯｒｇ／．２０１４．２０１４．
６３．Ｔｙａｎｏｖａ Ｓ，Ｔｅｍｕ Ｔ，Ｓｉｎｉｔｃｙｎ Ｐ，Ｃａｒｌｓｏｎ Ａ，Ｈｅｉｎ ＭＹ，Ｇｅｉｇｅｒ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｐｅｒｓｅｕｓ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ（ｐｒｏｔｅ）ｏｍｉｃｓ ｄａｔａ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１６．
６４．Ｇａｓｔｏｎ Ａ，Ｓａｎｃｈｅｚ ＭＧ．ＤｉｓｃｒｉＭｉｎｅｒ：Ｔｏｏｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｄｅ ｆｏｒ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒ Ｐａｃｋａｇ Ｖｅｒｓｉｏｎ ０１－２９．２０１３．２０１３．
６５．Ｒｅｄｅｉ ＧＰ．ＳＡＭ（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）．Ｅｎｃｙｃｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００８．
６６．Ｓｔｏｒｅｙ ＪＤ．Ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅｓ．Ｊ Ｒ Ｓｔａｔ Ｓｏｃ Ｓｅｒ Ｂ Ｓｔａｔ Ｍｅｔｈｏｄｏｌ．２００２．２００２．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１１１／１４６７－９８６８．００３４６．
６７．Ｂａｔｅｍａｎ Ａ．ＵｎｉＰｒｏｔ：Ａ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ ｈｕｂ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１９．２０１９．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｙ１０４９．
６８．Ｃｏｓｔａ Ｖ，Ａｉｇｎｅｒ Ｓ，Ｖｕｋｃｅｖｉｃ Ｍ，Ｓａｕｔｅｒ Ｅ，Ｂｅｈｒ Ｋ，Ｅｂｅｌｉｎｇ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＭＴＯＲＣ１ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ Ｃｏｒｒｅｃｔｓ Ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｔｕｂｅｒｏｕｓ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１６；１５：８６－９５．
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I-K】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【配列表】
【国際調査報告】