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特表2024-535696創薬および消費者向け健康製品開発のための医薬品プラフォーム技術
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】創薬および消費者向け健康製品開発のための医薬品プラフォーム技術
(51)【国際特許分類】
G16C 20/30 20190101AFI20240925BHJP
A61K 9/20 20060101ALI20240925BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240925BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20240925BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20240925BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20240925BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20240925BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240925BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240925BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240925BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240925BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240925BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240925BHJP
A61K 31/05 20060101ALI20240925BHJP
A61K 31/352 20060101ALI20240925BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240925BHJP
【ＦＩ】
G16C20/30
A61K9/20
A61K9/08
A61K9/10
A61K9/107
A61K9/06
A61K9/51
A61P35/00
A61P3/10
A61P9/00
A61P1/16
A61P13/12
A61P11/00
A61P25/00
A61P19/02
A61P29/00
A61P37/02
A61P37/06
A61K31/05
A61K31/352
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024510243
(86)(22)【出願日】2022-08-19
(85)【翻訳文提出日】2024-04-15
(86)【国際出願番号】 IB2022057780
(87)【国際公開番号】W WO2023021472
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】63/234,910
(32)【優先日】2021-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/234,917
(32)【優先日】2021-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＴＨＯＮ
２．ＭＡＴＬＡＢ
３．ＳＩＭＵＬＩＮＫ
(71)【出願人】
【識別番号】524061770
【氏名又は名称】タム，ユン カウ
(71)【出願人】
【識別番号】524061127
【氏名又は名称】シノベダ カナダ インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】タム，ユン カウ
(72)【発明者】
【氏名】ツェン，チン―ユアン
(72)【発明者】
【氏名】ビョルンダール，トレント
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA06
4C076AA11
4C076AA17
4C076AA22
4C076AA36
4C076AA65
4C076BB01
4C076BB02
4C076BB13
4C076BB14
4C076BB15
4C076BB16
4C076CC01
4C076CC09
4C076CC11
4C076CC15
4C076CC16
4C076CC17
4C076CC21
4C076CC27
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA04
4C086MA17
4C086MA22
4C086MA23
4C086MA28
4C086MA35
4C086MA37
4C086MA52
4C086MA57
4C086MA65
4C086MA66
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZA36
4C086ZA59
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZA96
4C086ZB07
4C086ZB08
4C086ZB11
4C086ZB26
4C086ZC35
4C086ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206CA19
4C206MA01
4C206MA02
4C206MA03
4C206MA04
4C206MA37
4C206MA42
4C206MA43
4C206MA48
4C206MA55
4C206MA57
4C206MA72
4C206MA77
4C206MA85
4C206MA86
4C206NA05
4C206NA14
4C206ZA01
4C206ZA36
4C206ZA59
4C206ZA75
4C206ZA81
4C206ZA96
4C206ZB07
4C206ZB08
4C206ZB11
4C206ZB26
4C206ZC35
4C206ZC75
(57)【要約】
一実施形態では、本発明は、活性成分および寄与成分の規定用量を含有する最適化された自然薬品を同定するための方法を記載する。一実施形態では、本発明に開示される方法は、肝細胞癌の治療のためのカンナビノイドを含む組成物を開発する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
疾患を治療するためのハーブまたはハーブ製剤から活性化合物を含む最適な組成物を効率的に同定する方法であって、１）既存のデータベースからハーブまたはハーブの調合物中の化学プロフィールを取得するか、既存のデータベースに記録が見つからない場合は高分解能質量分析を使用して化学プロフィールを作成する工程と、
２）前記疾患に臨床的関連性がある適切なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを特定し、開発する工程と、
３）システム生物学、システム薬理学、バイオインフォマティクス、３つの基準
ａ．疾患の治療における有効性、
ｂ．有効成分の吸収・代謝への影響、および
ｃ．それらの薬物様特性と代謝物
に基づいた機械学習ベースの手法を用いて、１）で得られた化学プロフィールから、主要候補化合物としての潜在的な活性成分を計算により同定する工程と、
４）工程３）で得られた主要候補化合物を、あらかじめ定められた一連の薬力学的基準および薬物動態学的基準ならびに４つの反復手順
ａ．工程２）で開発したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いたペアワイズベースの実験的アプローチに基づく一次候補化合物のペアワイズ相互作用の評価、結果インペアの化合物疾患を相乗的／拮抗的に調節すること、
ｂ．工程４ａ）で得られた結果とクラスタ拡張法を使用して、疾患を治療するための複数の化合物の相乗効果を予測し、特定の濃度比を持つ二次候補化合物のリストを生成すること、
ｃ．工程４ｂ）で得られた二次候補化合物の有効性と副作用をｉｎ ｖｉｔｒｏで検証および試験すること、ならびに
ｄ．工程４ｂ）が検証されるまで工程４ｂ） と４ｃ）を繰り返すこと
に従ってスクリーニングする工程と
５）化合物－化合物相互作用のうち、活性化合物を構成する最適組成物を製剤化し、ここで、組成物は、疾患を治療する際に最小の副作用で最大の有効性を有する。
【請求項2】
化合物－化合物相互作用が対相互作用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
対相互作用が、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルに基づく二次元アレイによって定量化される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
化合物－化合物相互作用が高次相互作用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記高次相互作用が、実験入力で検証されたクラスタ拡張を使用することによって導かれるモデルである、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記薬物様特性が、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成された生理学的薬物動態モデルを使用して推定される、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成された薬物様特性が、以下の１つまたは複数を用いて適切なスケーリングでｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態パラメータを推定するために使用される、請求項６に記載の方法：１）ヒト腸ミクロソーム、
２）３Ｄ腸モデル、
３）模擬胃液または腸液、
４）確立された嫌気的方法、
５）ヒト肝ミクロソーム、
６）Ｓ－９端数、
７）肝細胞、
８）ヒト肝臓の３Ｄモデル、
９）２Ｄ腎モデル、および
１０）３Ｄモデルオルガノイドモデル。
【請求項8】
前記薬物様特性が、既存のアルゴリズム、市販またはオープンソースソフトウェアを使用して推定される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
ハーブまたはハーブの製剤の化学プロフィールが、潜在的活性成分および代謝物の代謝を誘導もしくは阻害するか、または輸送を変化させることができる化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
ハーブまたはハーブ製剤における化学プロフィールが、疾患の治療における潜在的活性成分および代謝物の１つ以上に関連する効果または副作用を増加または減少させることができる化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記組成物が、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて確立された化合物－化合物相互作用の観点から処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記組成物が、容易な送達または効率的な送達のために配合される、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記組成物が、錠剤、溶液、懸濁液、クリーム、エマルション、またはナノカプセル化エマルションとして製剤化される、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記組成物が、経口、舌下、局所、皮下、筋肉内、静脈内、または動脈内投与用に製剤化される、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記疾患が、癌、糖尿病、心血管疾患、肝臓疾患、腎臓疾患、肺疾患、神経変性疾患、関節炎、免疫疾患、自己免疫疾患からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
肝細胞癌を治療するための、ＣＢＤ、ＣＢＣおよびＣＢＮのうちの１つまたは複数を含む最適な組成物。
【請求項17】
前記組成物が、カンナビクロメン（ＣＢＣ）およびカンナビノール（ＣＢＮ）を最適な比率で含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
前記組成物が、ＣＢＣとＣＢＮを１６：１から１６：１～１６：１の範囲の重量比で含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
ＣＢＣ、ＣＢＮおよびＣＢＤを最適な比率で含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項20】
ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮの比が１：１：１～９：３：１の範囲である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項21】
ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮの混合物が、ＨｅｐＧ２細胞に対してソラフェニブと同等以上のＩＣ５０値を有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項22】
肝細胞癌を治療するための１つ以上のナノカプセル化カンナビノイドを含む植物化学組成物。
【請求項23】
前記カンナビノイドが、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）およびカンナビノール（ＣＢＮ）からなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記組成物が、ａ）ナノカプセル化ＣＢＤ、ｂ）ナノカプセル化ＣＢＣ／ＣＢＮ、またはｃ）ナノカプセル化ＣＢＤ／ＣＢＣ／ＣＢＮを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項25】
前記組成物が、非カプセル化形態の用量の半分未満の用量でナノカプセル化ＣＢＤを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項26】
前記組成物が、３２：１～８：１もしくは８：１の範囲、または１：４～１：１６の範囲の重量比でＣＢＤおよびＣＢＣを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項27】
前記組成物が８：１～２：１の範囲の重量比でＣＢＤとＣＢＮを含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項28】
ソラフェニブと比較して同等以上の有効性を示す、請求項１６に記載の組成物。
【請求項29】
組成物の請求項１７、２０または２６を、それを必要とする被験体に投与することにより、肝細胞癌を治療する方法。
【請求項30】
組成物が、血管内または皮下注射により投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記組成物が肝臓癌細胞に選択的に分布され、それにより有効性の最大化および毒性の最小化が可能になる、請求項２９に記載の方法。
【請求項32】
ソラフェニブと比較して同等以上の有効性を示す、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医薬設計方法論を、漢方薬のような薬草処方の活性成分および寄与成分を、私のものと定量化することに関与させるプラットフォーム技術に関する。
【0002】
この出願を通して、種々の引例が参照され、これらの刊行物全体の開示は、本発明が属する技術水準をさらに完全に説明するために、本出願に参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
伝統的漢方医学（ＴＣＭ）を含む伝統的医学は数千年にわたって使用されてきた。これらの伝統的な医薬処方のほとんどは、植物、動物、またはミネラルベースのいずれかの処方で構成されている。これらの公式は、従来のパラダイムを用いて診断された個人に特有の特定の状態を治療するように設計されている。ＴＣＭを展開する目的は、従来の医薬品とは異なり、疾患を治療し、患者を平衡状態に戻すことである。
【0004】
ＴＣＭは世界中で人気を集めている。２０１８年、香港南シナモーニングポストは、ＴＣＭマーケットの規模が全世界で５００億米ドルに近づいたと報じた（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｍｐ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｃｈｉｎａ／ｓｏｃｉｅｔｙ／ａｒｔｉｃｌｅ／２１６６２７８／ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ－ｃｈｉｎｅｓｅ－ｍｅｄｉｃｉｎｅ－ｃｌｏｓｅｓ－ｕｓ５０－ｂｉｌｌｉｏｎ－ｍａｒｋｅｔ－ｌｏｎｇ．））。
【0005】
中国は国として、ＴＣＭの研究を促進し、前進させるために多くの資源を投資してきた。１３ｔｈ５カ年計画で、中国国務院はＴＣＭの近代化を命じた（ＫＰＭＧ，２０１６，Ｔｈｅ １３ｔｈ５カ年計画－中国の変革と世界経済との統合）。２０１６年初頭、中国政府は、今後１５年間のＴＣＭ開発のための青写真を発表した。ＴＣＭは、現代医学と法的に同等の地位を持つべきであり、そのような規制を受けるべきだと述べた（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｃｏｎｏｍｉｓｔ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｃｈｉｎａ／２１７２７９４５－ｕｎｐｒｏｖｅｎ－ｒｅｍｅｄｉｅｓ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ－ｓｔａｔｅ－ｗｈｙ－ｃｈｉｎａｓ－ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ－ｍｅｄｉｃｉｎｅ－ｂｏｏｍ－ｄａｎｇｅｒｏｕｓ）．）。２０１６年後半には、比較的低コスト（ｈｔｔｐ：／／ｅｎｇｌｉｓｈ．ｇｏｖ．ｃｎ／ａｒｃｈｉｖｅ／ｗｈｉｔｅ＿ｐａｐｅｒ／２０１６／１２／０６／ｃｏｎｔｅｎｔ＿２８１４７５５０９３３３７００．ｈｔｍ）（Ｗａｎｇ，Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．２０２１））のため、ＴＣＭが医療制度の改革に大きな役割を果たすとする「ホワイトペーパー」が発表された。
【0006】
ＴＣＭを含む伝統医学は、２０１９年４月に新たな節目を迎えた。１１ｔｈ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ’ｓ（ＷＨＯ）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ（ＩＣＤ），Ｃｈａｐｔｅｒ ２６には、伝統的な治療
【0007】
ＴＣＭと中国政府の支援の人気にもかかわらず、主流の科学、医学、薬学のコミュニティはＴＣＭの治療価値に非常に懐疑的で批判的であった。この批判は、主として、活性成分の同一性と量、したがって一貫性と質、作用機序の限定された理解、および医薬試験の厳格さを通して受けた臨床的証拠の欠如に関するＴＣＭの複雑さ（Ｇｒａｚｉｏｓｅ，Ｌｉｌａ ｅｔ ａｌ．２０１０）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｍｅｒｉｃａｎ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／ｔｈｅ－ｗｏｒｌｄ－ｈｅａｌｔｈ－ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ－ｇｉｖｅｓ－ｔｈｅ－ｎｏｄ－ｔｏ－ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ－ｃｈｉｎｅｓｅ－ｍｅｄｉｃｉｎｅ－ｂａｄ－ｉｄｅａ／？ｒｅｄｉｒｅｃｔ＝１）．）によるものである。ＴＣＭと現代医学の間の薬理学的、臨床的、質的ギャップは、伝統医学が主流に完全に受け入れられる前に橋渡しされる必要があることは明らかである。この空白はこの分野の研究に対する未充足のニーズを作り出す。
【0008】
ＴＣＭと現代医学の間の知識ギャップに対処するためには、ＴＣＭ公式の構造を理解することが重要である。ＴＣＭの処方は、ジュン（天皇、主成分、その処方にはａが必須）、チェン（天皇の助手、その活性を高めること）、ズオ（活性物質の二次的な症状や毒性を減らすためのファシリテーター）、シ（作用部位への活性の誘導）の４種類の主要な成分から構成されている。
【0009】
中国や世界中で、ＴＣＭ製剤の概念と薬物作用のメカニズムを結びつける原動力があり、現代科学の基礎となっている。データマイニング、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデリングおよび予測、システム生物学、マルチオミクス、遺伝学、バイオインフォマティクス、ネットワーク薬理学および品質マーカーのようないくつかのアプローチが、ＴＣＭ公式を研究するために用いられてきた。活性成分およびその作用機序を同定する上で成功例があるが（Ｊｉａｎｇ，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｌｉａｎｇ，Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｓｈｉ，Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｓｕｎ，Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｚｈａｎｇ，Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｓｕ，Ｊｉａ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｄａｉ ２０１９，Ｚｈａｏ，Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１９）では、個々にまたは組み合わせて作用するこれらの成分の治療価値は、十分に臨床的に試験されていない。
【0010】
ＴＣＭの科学者は、有効成分が適切な薬剤様特性、言い換えれば、適切な薬物動態特性を有し、治療的に活性でなければならないことを認識している。活性のリストを適切な薬剤様特性を有するものに絞り込む試みがなされている。残念ながら、これらの成分の薬物動態学的特性は、通常、動物（Ｗａｎｇ，Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．２０１１）に由来し、これは、ヒトへの適用が限られている可能性がある。試験化合物のヒトの薬物動態特性を迅速かつ正確に予測する方法が望まれる。
【0011】
さらに、これらの試験では活性代謝物とその薬物様特性による寄与はほとんど考慮されていない。ハーブ成分の代謝は、主にマイクロバイオーム、腸細胞および肝臓によって、腸管内腔で頻繁に起こる。有名な例はＰａｎａｘ ｇｉｎｓｅｎｇであり、ジンセノシドはそれ自体活性がなく、化合物Ｋのような大腸代謝物は（Ｈａｓｅｇａｗａ ２００４）である。活性代謝産物に関しては、産生部位はこれらの化合物、特にマイクロビオームによって産生される代謝産物の定量のための複雑さを増す。
【0012】
ＴＣＭ薬理学研究が進歩するにつれて、ＴＣＭ公式の属性を有する医薬品を成功裏に開発するためには、最終製品が体内の様々な問題に対処する複数の要素を含むので、いくつかのハードルを克服しなければならないことが認識されている。
【0013】
バイオインフォマティクス、システムバイオロジー、ネットワーク薬理学、データマイニング、ドッキングを含むｉｎｓｉｌｉｃｏモデリングは、潜在的な活性成分を同定するための優れたツールである。これは、従来の創薬とＴＣＭ研究の両方のための初期段階である。２つの分岐が前者の場合は単一の化合物を探し、後者の場合は化合物群を探し、関連している場合と関連していない場合があるネットワーク内の多数のターゲットに取り組んでいます。
【0014】
これらのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ演習は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のための方向性を提供する。ＴＣＭ研究の主な合併症は、多くの研究と関連するサンプルであり、高スループットの処理がしばしば行われる。特に、マルチオミクスおよびネットワーク薬理学的方法がプロトコルに組み込まれている場合。
【0015】
従来の創薬とＴＣＭ開発のワークフローは類似しているが、複数のハーブを含むＴＣＭ公式の複雑さのために、各ハーブは１０００以上の化合物を容易に含有することができ、異なる戦略が考案されなければならない。
【0016】
ＴＣＭの特性を維持しながら医薬品を開発するために方法論が設計される前に、現代科学の観点からＴＣＭ式設計の「翻訳」が必要であろう。さらに、いくつかの問題が特定され、取り組まれ、方法に含まれなければならない。
【0017】
Ｊｕｎ、天皇は活性成分を示し、Ｃｈｅｎは活性が低く、かつ／または効果を増強する活性と相互作用し得る成分であり、ＺｏｕはＪｕｎの毒性活性の阻害剤である成分であり、Ｓｈｉは活性部位への活性を誘導する成分である。このデザインでは、活性の低い成分が存在する（Ｊｕｎ）。活性のある成分が存在するが、それらは活性の効果を増強する同じ受容体または経路／ネットワークに作用する（Ｃｈｅｎ）。疾患の症状を治療するか、または活性の毒性を阻害する化合物が存在する（Ｚｏｕ）。薬物動態（Ｓｈｉ）のように、作用部位に活性を導くか、体内でその運命を変化させる化合物が存在する。
【0018】
配合物が配合物全体の活性に寄与する場合、成分は活性である必要はない。成分間の相互作用は、活性－活性、活性－不活性、または潜在的に不活性－不活性であり得る。これらの特徴を考慮すると、開発プロセスは、従来の医薬で使用されているものに遠隔的に近いものではない。
【0019】
Ａ．ａｎｎｕａ（Ｗｅａｔｈｅｒｓ，Ｅｌｆａｗａｌ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｗｅａｔｈｅｒｓ，Ｔｏｗｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１４）の成分により活性成分、例えばアルテミシニンの薬物動態特性が改善された。この例は、「Ｓｈｉ」候補の良い例です。従来のスクリーニングプロセスは、活動がなければ構成要素を対象としない。
【0020】
Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１９）は、１分以下の有効成分であるゲニステインが、主成分であるビオチャニンＡの活性を増強することを示した。その代わり、ビオチャニンＡはゲニステインの潜在的な毒性に対抗する一つの抽出物には、Ｊｕｎ、Ｃｈｅｎ、Ｚｏｕが存在する。
【0021】
多成分製品開発では、２つの体の相互作用が分子間の主要な反応であるというのが従来の常識です。高次相互作用は無視できる寄与を持つと仮定した。酵母の最近の出版物は、生物系における高次相互作用が有意な寄与（Ｔｅｋｉｎ，Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．２０１８）を持つことを明確に示した。より高次の相互作用を考慮すると、これらの寄与を解明する負担は重いものとなり、追跡は実用的ではない（図１）。潜在的には、数十億のデータポイントが必要になる可能性があり、複数のターゲットが関与する場合、サンプリング負荷が増加します。高次相互作用を評価するプロセスを単純化する必要があることは明らかである。
【0022】
現代科学を用いてＴＣＭの機構的理解が深まっているが、ＴＣＭ製剤の４つの柱に関係する属性を持つ成分を含む伝統的なＴＣＭ製剤に由来する医薬品がないことは驚くに当たらない。Ｊｕｎ，Ｃｈｅｎ，Ｚｏｕ ａｎｄ Ｓｈｉ．
【0023】
統合的アプローチを用いて、Ｔａｍ＆Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ（２００８）は、薬草に存在するものと同様に、複雑な混合物から活性成分を同定し、定量するための薬学的プラットフォーム技術（ＰＰＴ）の開発に成功した。
【0024】
この技術は、臨床的に試験された植物の寄与成分を同定するために適用されてきた。最も強力な化学物質を探索することを目的とした従来の製薬学的アプローチとは異なり、ＰＰＴを用いる目的は、それらの薬理作用に関与する活性／寄与成分のグループを明らかにすることである。
【0025】
本発明者らは、ＰＰＴを用いて開発された植物性医薬品は、使用歴が長く、かなり頻繁に、裏付けとなる臨床データがあるため、より高い成功の見込みがあると考えた。
【0026】
ＴａｍとＴｕｓｚｙｎｓｋｉの（２００８）のアプローチは、複雑な混合物中の未知物質のランダム化を必要とする。このプロセス全体は、最初から最後まで、何十万ものサンプルを必要とするかもしれない（図１（？））。
【0027】
本発明では、ハーブまたはハーブ処方における活性成分および寄与成分を同定および定量するための簡略化および改良された方法が記載されている。
【発明の概要】
【0028】
一実施形態において、本発明は、医薬プラットフォーム技術（世代ＩＩ）（ＰＰＴ－ＩＩ）を開示し、それは、医薬開発方法論を係合させて、漢方薬のような薬草処方で活性成分および寄与成分をマイニングし、定量する。これらの成分は、ＴＣＭまたは生薬の他の分野のパラダイムの原因であり、これと一致している。
【0029】
一実施形態では、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法がハーブまたはハーブの式をスクリーニングするために使用される。目的は、関心のある化合物の数を迅速に得ることである。
【0030】
一実施形態において、対象化合物は、有効性および適切な薬剤様特性を有する可能性を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングにかけられる。
【0031】
一実施形態において、目的の化合物は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ戦略と共に特定のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルでスクリーニングされる。
【0032】
一実施形態では、化合物の薬物動態学的および薬力学的特性がｉｎ ｖｉｔｒｏで検証される。
【0033】
一実施形態において、対象化合物の比率はリードの宣言の前に最適化される。
【0034】
一実施形態において、システム生物学、システム薬理学、およびバイオインフォマティクスは、植物混合物の臨床反応に関与する成分を同定する確率を高めるために、本発明に組み込まれる。
【0035】
一実施形態において、機械学習に基づくアプローチは、データマイニングおよび分析、ならびに同定された候補の検証に対する前臨床モデルの選択およびそれらの臨床的関連性を支援するために、ＰＰＴ－ＩＩのワークフローに組み込まれる。別の実施形態では、潜在的活性の選択は、作用機序によって裏付けられる。
【0036】
一実施形態において、クラスタ展開法は、寄与成分間の多体相互作用をモデル化するために係合される。
【0037】
一実施形態において、本発明に記載される方法は、肝癌の治療のために大麻から誘導される製品の組成物を開発するために使用される。
【0038】
一実施形態において、大麻誘導組成物は、２～３個の活性部分からなる。別の実施形態では、組成物は、相加的または相乗的に共に作用する。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】相互作用の数（Ｎ）と、複数の身体相互作用を評価するために必要な相互作用の数との関係を示す。
【図2】ＰＰＴ－ＩＩのワークフローを示す。
【図3】ＰＰＴ－ＩＩフローチャートのステップ２（ＰＤ＝薬力学、ＰＫ＝薬物動態、ＭＴＩＩ＝代謝・トランスポーターインデューサーまたはインヒビター、および＊２つ以上の化合物が存在し得るステップ２．１の反復）を示している。
【図4】ＰＰＴ－ＩＩの統合プラットフォームを示す。
【図5】３Ｄ ＨｅｐＧ２スフェロイドの画像を示す。
【図6】経口バイオアベイラビリティ（Ｆｂ）と全身曝露量、血漿中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）の関係 挿入ａ．Ｆｂが９０％以下のカンナビノイド、ｂ．Ｆｂが９０％以上のカンナビノイド
【図7】にカンナビノール（ＣＢＮ）、カンナビジオール（ＣＢＤ）、カンナビクロメン（ＣＢＣ）の化学構造を示す。
【図8A】種々の濃度のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を有するＩＭＤＭ培地におけるＨｅｐＧ２細胞に対するＣＢＤ、ＣＢＣおよびＣＢＮについて得られたＩＣ５０値の比較を示す。
【図8B】広範囲のＦＢＳ濃度のＨｅｐＧ２細胞に対するＣＢＣのＩＣ５０実験の繰り返しを示す。
【図8C】１％、１０％および２０％のＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地で観察されたソラフェニブに関連して報告されたＣＢＤ、ＣＢＣ、およびＣＢＮのＩＣ５０値を示している。
【図9】２０％ ＦＢＳ、１％エタノールを含むＩＭＤＭ培地中のＨｅｐＧ２細胞について得られたＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮの３元比について、観察されたＩＣ５０値の比較を示す。ＣＢＮ比は、他のカンナビノイド成分と比較して１である。
【図10A】ＩＣ５０のＣＢＤ、ＣＢＣ、ＣＢＮ、ｔｈｅｒｅ－ｏｆ、およびソラフェニブの値の比較（２０％ ＦＢＳおよび１％エタノールを含むＩＭＤＭ培地で実施）（ＳＣＩ－９３１：ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ ９：３：１、 ＳＣＩ－４２１：ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ ４：２：１、 ＳＣＩ－１１１：ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ １：１：１）。
【図10B】様々な量のＦＢＳを含む培地中のＨｅｐＧ２細胞に対するＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮの３つの３つの組み合わせのＩＣ５０値の比較。凡例の番号は比率の値に対応します。
【図11A】ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ ９：３：１ ＩＣ５０ ＨｅｐＧ２ スフェロイドを、１％ ＦＢＳのＤＭＥＭ培地で４８時間後に実施したプロット。
【図11B】ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ（９：３：１）の併用で４８時間処理したＨｅｐＧ２スフェロイドの位相差（上）および蛍光（下）顕微鏡像。ＣｙＱｕａｎｔ（商標）を用いて３７℃で１時間培養した後に得られた蛍光画像。
【発明を実施するための形態】
【0040】
本発明は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの方法論のブレンドからなる特別に設計された一連の手順を開示し、植物学的または天然の公式から活性化合物および関連化合物を解読することを可能にする。この方法の独自性は、多成分医薬品または消費者用医薬品の候補を、臨床的に成功する可能性の高い短期間で開発する手段を提供することである。
【0041】
一実施形態において、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法論は、データマイニングおよびデータ分析のためのシステム生物学、システム薬理学およびバイオインフォマティクスを含む。
【0042】
一実施形態では、機械学習に基づくアプローチが、データマイニングの徹底性（図２のステップ１－１）および戦略的スクリーニングの正確性（図３のステップ２－３）を強化するため、疾患ネットワークにおける生物活性の潜在的メカニズムを推定するため、または臨床的に関連する結果を提供するための適切なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを選択するために、手順の異なる領域で使用される（ステップ１－２、図２）。
【0043】
一実施形態において、本発明に記載されたＰＰＴ－ＩＩの研究モジュールの構造は、制御センターによって管理される３つの相互作用ユニット（計算ユニット、図４）を含み、それらは、バイオインフォマティクス、インビトロおよび分析ユニットである。計算ユニットは脳の役割を果たし、バイオインフォマティクスユニットはデータマイニング、データ解析、モデリング、シミュレーションに責任を持ち、潜在的なプロジェクトの実現可能性に関する洞察を提供します。ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび分析ユニットは、実験デザインに関する指示を受け、その代わりに、処理および分析のためのデータを受け取る。また、分析グループはＰＫおよびＰＤ測定用のサンプルをｉｎ ｖｉｔｒｏユニットに供給するため、分析ユニットとｉｎ ｖｉｔｒｏユニットとの間には直接的なコミュニケーションがある。
【0044】
【0045】
一実施形態において、本発明の主な目的は、生薬処方における活性成分および寄与成分の有効性および薬物様特性を記述するための一連の臨床的に関連するパラメータを確立することである。
【0046】
一実施形態において、本発明に記載された方法は、薬草処方の全体的な効果に対する寄与が全くまたは非常に限定されない外来成分を迅速かつ効率的に廃棄するように設計されている（図２および３）。
【0047】
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル、例えば、３Ｄ細胞培養（図５）、オルガノイド、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）、チップ上の細胞（ＣｏＣ）を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで患者の疾患状態を模倣する。
【0048】
一実施形態において、薬効、又は薬力学（ＰＤ）、もしくは吸収（Ａ）、分布（Ｄ）、代謝（Ｍ）、排泄（Ｅ）毒性（Ｔ）、又はハーブ又はハーブ処方における個々の成分のＰＫを推定するために、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが確立される。
【0049】
一実施形態において、既知および未知のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの重要なバイオマーカーは、新しく設計された高スループットシステムを用いて、少数のシグナル伝達経路から選択される。
【0050】
一実施形態において、これらのマーカーは、活性成分および寄与成分の有効性を定量化するために使用される。
【0051】
一実施形態において、個々の成分の吸収は、従来のＣａＣＯ－２またはＭＤＣＫ細胞モデルのいずれかを用いて評価される。あるいは、３Ｄ腸モデル、例えば、オルガン・オン・ア・チップ・モデルを用いて、ハーブ化合物の吸収の程度を推定する。
【0052】
一実施形態において、腸細胞における代謝は、ヒト腸ミクロソームを用いて推定される。あるいは、３Ｄ腸モデル、例えば、オルガン・オン・ア・チップ・モデルを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ腸代謝を推定する。
【0053】
一実施形態において、成分の管腔安定性は、速い状態および摂食状態を模倣して、模擬胃液または腸液で成分をインキュベートすることによって推定される。
【0054】
一実施形態では、確立された嫌気的方法を用いて、成分の糞便代謝を推定する。
【0055】
一実施形態において、成分の肝代謝は、ヒト肝ミクロソーム、Ｓ－９画分、肝細胞またはヒト肝臓の３Ｄモデルのいずれかを用いて評価される。
【0056】
一実施形態において、成分の排泄は、確立されたｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法を用いて推定される。別法として、ＭＤＣＫ細胞の単層のような２Ｄ腎モデル、または３Ｄモデルオルガノイドモデルを用いて、成分の腎排泄を推定する。
【0057】
一実施形態において、成分の分布は、Ｍａｙｕｍｉ，Ｔａｃｈｉｂａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０２０）によって報告されるｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて推定される。分布容積および作用部位での活性物質のプロファイルは、器官への分配のｉｎ ｖｉｔｒｏ測定を組み込むことによって推定される。
【0058】
一実施形態において、可能な活性およびＭＴＩＩの薬物動態パラメータは、本発明において確立されたｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いて推定される。
【0059】
一実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで推定されたＰＤおよびＰＫパラメータは、ヒト生理学的に基づく薬力学および薬物動態（ＰＢＰＫＰＤ）モデルにスケーリングされる。
【0060】
一実施形態において、活性成分および寄与成分の投与量は、パラメータ化されたＰＢＰＫＰＤモデルを用いて、作用部位での最適濃度を達成するために計算される。
【0061】
モデルの予測に基づき、適切な投与経路及び剤型を決定し、作用部位における活性の最適化された時間経過を達成する。
【0062】
一実施形態において、本発明は、疾患を治療するためのハーブまたはハーブ式から活性化合物を含む組成物を効率的に同定する方法を提供し、該方法は以下を含む：
１）既存のデータベースから、データマイニングおよび機械学習アルゴリズムを用いて、または既存のデータベースに記録がない場合に高分解能質量分析法を用いて化学プロファイルを作成することにより、ハーブまたはハーブ式中の化学プロフィールを取得すること、
２）当該疾患に関連する臨床的意義を有する適切なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを特定し、開発すること、
３）システム生物学、システム薬理学、バイオインフォマティクス、機械学習の３つの基準、
ａ．疾患の治療における有効性、
ｂ．有効成分の吸収・代謝への影響
ｃ．それらの薬物様特性と代謝産物
に基づくアプローチからの方法を用いて、ステップ１で得られた化学プロフィールから、潜在的な活性成分を主要候補化合物として計算的に同定すること、
４）ステップ３）で得られた主要候補化合物のリストを、ステップ２で開発したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いたペアワイズベースの実験的アプローチに基づき、予め定められた調節可能な一連の薬力学的および薬物動態学的基準に従い、結果的に二次候補化合物のリストを得ることにより、戦略的にスクリーニングすること、
５）有効性及び副作用の二次候補化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで検証及び試験し、活性化合物のリストを得ること、および
６）化合物－化合物相互作用の観点から活性化合物を含む組成物を調製することであって、該組成物は、該疾患を治療する上で最小の副作用を有する最大の有効性を有する組成物を調製すること。
１）既存のデータベースから、データマイニングおよび機械学習アルゴリズムを用いて、または既存のデータベースに記録がない場合に高分解能質量分析法を用いて化学プロファイルを作成することにより、ハーブまたはハーブ式中の化学プロフィールを取得すること、
２）当該疾患に関連する臨床的意義を有する適切なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを特定し、開発すること、
３）システム生物学、システム薬理学、バイオインフォマティクス、機械学習の３つの基準、
ａ．疾患の治療における有効性、
ｂ．有効成分の吸収・代謝への影響
ｃ．それらの薬物様特性と代謝産物
に基づくアプローチからの方法を用いて、ステップ１で得られた化学プロフィールから、潜在的な活性成分を主要候補化合物として計算的に同定すること、
４）ステップ３）で得られた主要候補化合物のリストを、ステップ２で開発したｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いたペアワイズベースの実験的アプローチに基づき、予め定められた調節可能な一連の薬力学的および薬物動態学的基準に従い、結果的に二次候補化合物のリストを得ることにより、戦略的にスクリーニングすること、
５）有効性及び副作用の二次候補化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで検証及び試験し、活性化合物のリストを得ること、および
６）化合物－化合物相互作用の観点から活性化合物を含む組成物を調製することであって、該組成物は、該疾患を治療する上で最小の副作用を有する最大の有効性を有する組成物を調製すること。
【0063】
一実施形態では、ハーブまたはハーブ処方における化学プロフィールは、ハーブまたはハーブ処方における化学物質のリストを指す。一実施形態では、化学プロフィールは、ハーブまたはハーブ式中の化学物質に代謝されるか、または化学物質から誘導される化学物質を含む。１つの態様において、化学プロフィールは、インビトロまたはインビボで、ある種の化合物の代謝を誘導または阻害し、または輸送を変化させることができる化学物質を含む。
【0064】
一実施形態では、化合物－化合物相互作用は、対相互作用を含む。一実施形態では、ペアワイズ相互作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルに基づく二次元アレイによって定量化される。
【0065】
一実施形態において、化合物－化合物相互作用は、高次相互作用を含む。一実施形態では、高次相互作用は、実験入力で検証されたペアワイズ相互作用からのデータを用いてクラスタ展開を使用することによって予測される。
【0066】
一実施形態において、薬物様特性は、生理学的に基づく薬物動態モデルのための入力として、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｓｉｌｉｃｏパラメータを用いて推定される。
【0067】
一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成された薬物様特性を用いて、以下の１つ以上を用いて適切なスケーリングでｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態パラメータを推定する。
１）ヒト腸ミクロソーム、
２）３Ｄ腸モデル、
３）模擬胃液または腸液、
４）確立された嫌気的方法、
５）ヒト肝ミクロソーム
６）Ｓ－９端数、
７）肝細胞、
８）ヒト肝臓の３Ｄモデル、
９）２Ｄ腎モデル、
１０）３次元オルガノイドモデル、および
１１）オルガン・オン・チップモデル。
１）ヒト腸ミクロソーム、
２）３Ｄ腸モデル、
３）模擬胃液または腸液、
４）確立された嫌気的方法、
５）ヒト肝ミクロソーム
６）Ｓ－９端数、
７）肝細胞、
８）ヒト肝臓の３Ｄモデル、
９）２Ｄ腎モデル、
１０）３次元オルガノイドモデル、および
１１）オルガン・オン・チップモデル。
【0068】
一実施形態では、薬剤様特性は、既存のアルゴリズム、商用またはオープンソースソフトウェアを用いて推定される。
【0069】
一実施形態において、潜在的活性成分および代謝産物の代謝を誘導または阻害し、または輸送を変化させることができるハーブまたはハーブ式化合物の化学プロフィール。
【0070】
一実施形態において、ハーブまたはハーブ処方における化学プロフィールは、疾患を治療する際に、潜在的な活性成分および代謝物の１つ以上に関連する効果または副作用を増加または減少させることができる化合物を含む。
【0071】
一実施形態において、組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて確立された化合物－化合物相互作用の観点から処方される。
【0072】
一実施形態において、組成物は、容易または効率的な送達のために配合される。
【0073】
一実施形態において、組成物は、錠剤、溶液、懸濁液、クリーム、エマルジョン、またはナノカプセル化エマルジョンとして処方される。
【0074】
一実施形態において、組成物は、経口、舌下、局所、皮下、筋肉内、静脈内または動脈内投与用の形態として処方される。
【0075】
一実施形態では、疾患は、癌、心血管、肝臓、腎臓、肺、神経変性、関節炎、免疫、自己免疫疾患、およびＴＣＭの文献に記載されている疾患からなる群から選択される。
【0076】
一実施形態において、ハーブまたはハーブの処方は、大麻またはカンナビノイドであるか、またはそれらを含む。
【0077】
一実施形態では、カンナビノイドは、以下の１つ以上を含むが、これらに限定されない。
１）カンナビクロメン（ＣＢＣ）、
２）カンナビノール（ＣＢＮ）、および
３）カンナビジオール（ＣＢＤ）。
以下の例の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ、分析方法の一連の事象とイノベーションを説明し、パラメータ予測を改善し、データマイニングと処理を強化することです。
１）カンナビクロメン（ＣＢＣ）、
２）カンナビノール（ＣＢＮ）、および
３）カンナビジオール（ＣＢＤ）。
以下の例の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ、分析方法の一連の事象とイノベーションを説明し、パラメータ予測を改善し、データマイニングと処理を強化することです。
【実施例】
【0078】
実施例１
この例の目的は、ハーブ式の特徴を有する多化合物リードを効率的かつ正確に生成するように設計された、計算、インビトロおよび分析プロセスを包含する本発明の統合的アプローチを説明することである（図２および３）。
この例の目的は、ハーブ式の特徴を有する多化合物リードを効率的かつ正確に生成するように設計された、計算、インビトロおよび分析プロセスを包含する本発明の統合的アプローチを説明することである（図２および３）。
【0079】
漢方製剤の開発が決定された後、Ｊｕｎ、Ｃｈｅｎ、Ｚｕｏｏ、Ｓｈｉで重要な役割を果たす生物活性物質と寄与化合物のグループを考案するために、４段階アプローチを採用した。
【0080】
第一段階は、潜在的に活性で寄与する化合物、それらの代謝経路および代謝産物の生成について、ハーブ式の化学プロフィールをスクリーニングするための計算方法論を用いることである。適切なＡＤＭＥまたは薬物様特性を有する代謝物を含む化合物を、さらなる研究のために含める（図２のステップ１）。
【0081】
第１段階に含まれるのは、活性化合物の代謝を予測するためのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法の使用、および生物活性物質の代謝を増強または阻害する不活性化合物である。これらの化合物の潜在的な重要性は、ＡＤＭＥ予測因子のようなソフトウェアを用いて計算されるそれらのＰＫ特性に依存する。
【0082】
第一段階のもう一つの部分は、疾患プロセスを正確に記述するために米国ＦＤＡによって承認された適切で標準化されたｉｎ ｖｉｔｒｏモデルおよびツールを確立することである（図２のステップ１－２）。ｉｎ ｖｉｔｒｏツールは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏスクリーニングの一部として、データベースでは入手できない化合物の活性データを生成するために使用される。
【0083】
第２段階は、１つのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルまたは１つのｉｎ ｖｉｔｒｏモデルシステム、クラスタ拡大法の枠組みに基づく分析およびｉｎ ｓｉｌｉｃｏ方法論の組み合わせを用いて戦略的スクリーニングを実施することである。目標は、個々の化合物の有効性とその潜在的相互作用を定量化することである（ステップ２、図２および３）。
【0084】
第２段階に含まれる、酵素誘導または阻害特性を有するｉｎ－ｓｉｌｉｃｏ探索において同定された潜在的寄与化合物を調製し、ＵＳ ＦＤＡにより承認または試験された標準化されたｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いたさらなるスクリーニングのために、２セットのサンプル、単独および対化合物に分離する（ステップ２－１および２－２、図３）。
【0085】
第２段階に含まれるは、選択した化合物に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤ応答に対する化合物の潜在的相互作用のｉｎ ｓｉｌｉｃｏモデルに基づくクラスタ展開に基づく決定ループの使用である（ステップ２－３、図３）。高次相互作用のｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤ検証がｉｎ－ｓｉｌｉｃｏモデルの予測と一致しない場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤ観察相互作用を用いてｉｎ－ｓｉｌｉｃｏモデルを精製し、ステップ２～４で化合物をスクリーニングする。
【0086】
第２段階に含まれるのは、ステップ２－３または２－４（ステップ２－５、図３）から得られた化合物のハイスループットＭＴＩＩ研究の使用である。
【0087】
第３段階は、生物活性物質および寄与化合物のヒト薬物様特性を推定するためにデザインされたｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを用いることである（図２）。
【0088】
第４段階はこれらの化合物の比率の最適化である。その結果、前臨床試験のリードが生まれる。
【0089】
このワークフローの固有の機能は次のとおりである。
１．シリコでは活性化合物および寄与化合物の可能性が同定されているため、分画は必要ない。
２．活性代謝物の可能性は早期に同定される。ＴＣＭの大部分は経口投与され、天然に存在する化合物の大部分はグリコシド型であるため、実際の活性は脱グリコシル化されたアグリコン型である。アグリコンの数は、通常、対応するグリコシドの数より少ない。
３．特定の化合物を分析に含める場合には、成分の量を考慮する。
４．高次相互作用はしばしば無視される。この相互作用の側面を含めるには、天文学的な数のサンプルが必要である（図１）。ペアワイズＰＤ相互作用研究に基づくクラスタ展開と、機械学習に基づく非線形回帰を含むデータ解析のためのツールを含む方法論を、試験したサンプル数を減らすために用いた。
５．上記４点を取り入れることで、作業負荷が大幅に軽減される。
１．シリコでは活性化合物および寄与化合物の可能性が同定されているため、分画は必要ない。
２．活性代謝物の可能性は早期に同定される。ＴＣＭの大部分は経口投与され、天然に存在する化合物の大部分はグリコシド型であるため、実際の活性は脱グリコシル化されたアグリコン型である。アグリコンの数は、通常、対応するグリコシドの数より少ない。
３．特定の化合物を分析に含める場合には、成分の量を考慮する。
４．高次相互作用はしばしば無視される。この相互作用の側面を含めるには、天文学的な数のサンプルが必要である（図１）。ペアワイズＰＤ相互作用研究に基づくクラスタ展開と、機械学習に基づく非線形回帰を含むデータ解析のためのツールを含む方法論を、試験したサンプル数を減らすために用いた。
５．上記４点を取り入れることで、作業負荷が大幅に軽減される。
【0090】
従来の創薬アプローチと比較して、リード生成の速度が速く、ハーブ製剤の有効性と毒性がほとんど知られているため、リスクは低く、したがって臨床試験での成功の可能性は非常に高まっている。鉛の含有量と投与量が明確になっているため、生薬が直面する品質管理の問題は克服されている。
【0091】
実施例２
この例の目的は、本発明で説明した計算プロセスの概要を示すことである。実施されているプロセスが記述され、開発されるプロセスが公開される。
この例の目的は、本発明で説明した計算プロセスの概要を示すことである。実施されているプロセスが記述され、開発されるプロセスが公開される。
【0092】
いくつかのアルゴリズムとデータベース管理システムが開発され、ＴＣＭデータベース、データマイニングと分析、用量－反応と相互作用の分析、クラスタ拡張に基づく相互作用分析を収容している。
【0093】
ＳＱＬｉｔｅデータベース管理システムが開発され、オープンソースデータベースや自社製の化学薬品、薬草、疾病ネットワークのデータを保存・整理する。Ｇｒａｐｈｉｃ Ｕｓｅｒ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ（ＧＵＩ）は、データベースにアクセスするためにＰｈＰ言語を用いて開発された。化学物質については、米国国立衛生研究所のＰｕｂＣｈｅｍデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／））を使用した。薬草については、２つのＴＣＭデータベースＴＭ－ＭＣ（ｈｔｔｐ：／／ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｋｉｏｍ．ｒｅ．ｋｒ／ｃｏｍｐｏｕｎｄ／ｂｒｏｗｓｅ．ｄｏ）とＥＴＣＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｃｍｉｐ．ｃｎ／ＥＴＣＭ／））を用いた。疾患ネットワークの場合、ＫＥＧＧ：京都遺伝子ゲノム百科事典データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ／））を用いた。
【0094】
ＰｕｂＣｈｅｍデータベース（ＫＥＧＧ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｋｅｇｇ／ｐａｔｈｗａｙ．ｈｔｍｌ）．）を通じて、ＰｕｂＣｈｅｍデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）と興味のある病気のシグナル伝達経路情報）を通して、化学的興味の物理化学的、生物学的、および薬物動態学的情報をマイニングするために、様々なバイオインフォマティックおよびケモインフォマティックパッケージを備えたＰｙｔｈｏｎ言語を用いて、データまた、このアルゴリズムは、基本的な記述統計解析、分配係数および最小線量予測、化学的類似性比較を含むいくつかの解析ツールを用いて作業することができる。
【0095】
用量‐反応および化合物‐化合物相互作用を解析するためのプロトタイプアルゴリズムを設計した。Ｐｙｔｈｏｎ言語を用いて、単一および２つの化合物混合物について細胞の用量－反応回帰を行った。
【0096】
クラスタ展開に基づく相互作用解析の数学的理論を開発した。この理論の妥当性は、検証のための実験データ入力を必要とする。相互作用のこの側面は、創薬に欠けている高次のプロセスを考慮している。
【0097】
内生理学に基づく薬物動態（ＰＢＰＫ）シミュレーションプログラムが確立された。１つ、２つ、および複数コンパートメントモデルをサポートします。コンパートメントモデルプログラムは、ＭａｔｌａｂとＳｉｍｕｌｉｎｋを用いて設計し、ヒトの生理学的条件をエミュレートした。適切なヒト生理学的パラメータを入力することにより、対象化合物の吸収、分布、代謝および排泄プロファイルをヒトで推定することができる。現在のバージョンでは、コマンドラインとシンプルなＧＵＩ操作の両方がサポートされています（ＧＵＩにはＭａｔｌａｂ ２０１４ｂ以降が必要です）。
【0098】
計算ユニットの目標は、インビトロおよび分析データの蓄積、および計算データベースをシームレスに編成し、図２および図３に記載されているように、目的の化合物を効率的にスクリーニングするための統合ワークフローを作成することである。リードの情報、リードの構成要素のＰＤ／ＰＫ特性、および作用機序は、データ提示のテンプレートを形成する。このワークフローはＰＰＴ－ＩＩのバックボーンとなります。
【0099】
統合されたワークフローを達成するためには、いくつかの領域が強化される必要があり、計算スクリーニングと解析プロセスの様々な側面を満たすために新しいアルゴリズムが必要である。
【0100】
データマイニングの範囲において、アルゴリズムは、タンパク質－タンパク質相互作用を評価するためのリアクトームのようなデータベースを含むように拡張される必要がある（タンパク質相互作用を評価するためのｈｔｔｐｓ：／／ｒｅａｃｔｏｍｅ．ｏｒｇ／）、バイオモデル（ネットワークとインビトロ細胞反応を組み合わせて、疾患モデルのより健全な理解を提供するｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｂｉｏｍｏｄｅｌｓ／））、癌における薬物感受性のゲノム学（ＧＤＳＣ）データベース（シグナル伝達と臨床適応のためのｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｘｇｅｎｅ．ｏｒｇ／））、このデータベースは、（Ｓａｋｅｌｌａｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖｏｕｇａｓ ｅｔ ａｌ．２０１９）／＞、亜鉛（リガンド－タンパク質相互作用のためのドッキングアルゴリズムをｈｔｔｐｓ：／／ｚｉｎｃ．ｄｏｃｋｉｎｇ．ｏｒｇ／），する）、および薬剤バンク（化学的、臨床的情報からなる、ＦＤＡ承認医薬品のためのｈｔｔｐｓ：／／ｇｏ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃｏｍ／））を処理するための１１００以上の癌細胞株を利用するので、癌治療におけるインビトロおよびインビボスケーリングを可能にする可能性を有する。この拡大には、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ評価のためのより包括的なＰＫおよびＰＤ情報も含まれる。さらに、著者らは、著者らのデータベースを強化するために、両方のカテゴリーの文献とウェブコンテンツを通してデータを掘り出すために、機械学習に基づく自然言語処理方法の使用を探求する。
【0101】
創薬（Ｔｙｚａｃｋ ａｎｄ Ｋｉｒｃｈｍａｉｒ ２０１９）のための第Ｉ相及び第ＩＩ相代謝を予測するための計算方法及びツールを対象化合物の代謝を予測するために使用する。
【0102】
代謝阻害剤はＴｙｚａｃｋ ａｎｄ Ｋｉｒｃｈｍａｉｒ（２０１９）で発表された方法を用いて同定し、代謝誘導剤はＢａｎｅｒｊｅｅ，Ｄｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０２０）の方法を用いて同定する。
【0103】
遺伝子発現データを用いてヒトにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤ予測の精度を高めるために、発表された機械学習アルゴリズムとＳａｋｅｌｌａｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｖｏｕｇａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１９）とＧｅｅｌｅｈｅｒ，Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．（２０１４）によって利用されたデータベースを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとヒトの間のギャップを埋める。
【0104】
多重化合物組合せからの非線形寄与を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤデータに基づく高次相互作用を適切にモデル化するために、機械学習に基づく非線形回帰法を使用する。
【0105】
既存のＰＢＰＫシミュレーションプログラムの２つの部分を改良した。第１の部分は、体外スケーリングを系統的に改善するためのより優れたｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎ ｖｉｖｏ相関法の導入である。第２部は、消化管における薬物の溶解と吸収をシミュレートするための計算流体力学モデルの開発に焦点を当てている。
【0106】
実施例３
データベースに記載されているｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは化合物の有効性の評価に適しているが、生理学的有効濃度を予測するための有用性は限られている。
データベースに記載されているｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは化合物の有効性の評価に適しているが、生理学的有効濃度を予測するための有用性は限られている。
【0107】
本発明の主な目的の１つは、疾患プロセスを正確に記述するためのｉｎ ｖｉｔｒｏツールを確立することである。３－Ｄ細胞モデルまたはオルガノイド、および患者由来異種移植片（ＰＤｘ）は、人体内の臓器または組織の特徴を有する。疾患状態では、複数の経路が細胞型を越えて影響を受ける。これらは通常、遺伝子、蛋白質、マーカーレベルの変化で発現する。単細胞２－Ｄモデルは、初回スクリーニングには有用であるが、全疾患プロセスに関連する情報を提供しない。例えば、パーキンソン病におけるドパミン作動性ニューロンの変化を測定しても、漏出性の血液脳関門とそのパーキンソン病に対する影響に関する情報は得られない。３－Ｄシステムを用いて定量化された有効性は、患者への投影の精度が高い。このタイプのシステムはまた、複数の化合物の複数の標的に対する効果の評価を可能にし、ＴＣＭ研究に最も適したシステムである。市販のオルガノイドおよび患者由来の異種移植片は、市販されていない場合（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｏｒｎｉｎｇ．ｃｏｍ／ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ／ｅｎ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｓｔｏｒｉｅｓ／ｉｎ－ｔｈｅ－ｆｉｅｌｄ／ｇｌｉｏｍａ－ｓｔｅｍ－ｃｅｌｌｓ－ｅｎａｂｌｅ－ｔｈｅ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ－ｏｆ－３ｄ－ｈｕｍａｎ－ｍｉｎｉ－ｂｒａｉｎ－ｔｏ－ｉｍｐｒｏｖｅ－ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ－ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ｈｔｍｌ）．）を除いて使用する。
【0108】
実施例４
この例の目的は、ペアと高次の相互作用、すなわち多体相互作用を定量化するために必要なサンプル数を最小限にする戦略を開示することである。
この例の目的は、ペアと高次の相互作用、すなわち多体相互作用を定量化するために必要なサンプル数を最小限にする戦略を開示することである。
【0109】
化合物‐化合物相互作用に関して、従来の薬理学的および毒性学的研究は対相互作用のみに焦点を当てている。Ｃｈｏｕ（２００６）は、影響を受けた細胞の割合に対する細胞応答を等しくする一般的な式（式１）
【0110】
【数1】
【0111】
【数2】
【0112】
【数3】
【0113】
【数4】
【0114】
【数5】
【0115】
【数6】
【0116】
【数7】
【0117】
【数8】
【0118】
【数9】
【0119】
【数10】
【0120】
【数11】
アプローチがテストされています。クラスタの拡張。高次相互作用を単一化合物効果と対相互作用の観点から拡張できると仮定した後、理論的枠組みを開発し、実験データを検証に必要とした。
【0121】
実施例５
現在、ヒトを対象とした試験を実施せずに、ヒトにおける肝クリアランスおよび内因性クリアランスを正確に推定する方法はない。本実施例の目的の１つは、３－Ｄ肝モデルから得られたデータおよび既知の基質セットの既存のヒトデータを用いてｉｎ ｖｉｖｏ代謝を推定する新規方法を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物の肝クリアランスをより良く推定する方法を開示することである。ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏ肝クリアランスを推定するために、２つのアプローチが用いられている。
現在、ヒトを対象とした試験を実施せずに、ヒトにおける肝クリアランスおよび内因性クリアランスを正確に推定する方法はない。本実施例の目的の１つは、３－Ｄ肝モデルから得られたデータおよび既知の基質セットの既存のヒトデータを用いてｉｎ ｖｉｖｏ代謝を推定する新規方法を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでの化合物の肝クリアランスをより良く推定する方法を開示することである。ヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏ肝クリアランスを推定するために、２つのアプローチが用いられている。
【0122】
最初のアプローチには以下が含まれます。１．３－Ｄ肝モデルの確立、２．ヒト肝クリアランス値が既知で、抽出比が低（～０．１）、中（～０．５）から高（～１．０）の基質、例えば、アンチピリン、Ｅ＝０．１、ミダゾラム、Ｅ＝０．５、プロプラノロール、Ｅ＝０．９９のカクテルの選択。これらの基板は、モデルの品質管理に使用されます。ｉｎ ｖｉｖｏでの肝抽出比（Ｅ）は、以下の式を用いて計算される。
【0123】
【数12】
【0124】
【数13】
【0125】
分画中の化合物の代謝速度を３－Ｄモデルを用いて測定する。各化合物の固有クリアランス（Ｖｍａｘ／Ｋｍ）を推定する。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ抽出比は、以下の式を用いて推定する。
【0126】
【数14】
【0127】
【数15】
【0128】
【数16】
【0129】
ｉｎ ｖｉｔｒｏからｉｎ ｖｉｖｏまでの
【0130】
【数17】
【0131】
【数18】
【0132】
Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅ値は、式３を用いて推定できる。
【0133】
この例のもう１つの目的は、３－Ｄ肝細胞モデルを結合させて、ハーブ製剤中のＭＴＩＩ化合物を同定することである。
【0134】
米国食品医薬品局の指針に従い（第Ｉ相、第ＩＩ相、および輸送基質のｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｍｅｄｉａ／８２７３４／ｄｏｗｎｌｏａｄ），混合物を評価の対象とする（手順２－５、図３）。これらの基質の消失速度の変化は、潜在的な誘導物質または阻害剤の存在を示すであろう。
【0135】
実施例６
Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａは５５４種以上の化合物からなり、そのうち１１３種はカンナビノイド、１２０種はテルペン（Ｃａｌｖｉ，Ｐｅｎｔｉｍａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１８）、その他はアミド、フラボノイド、フェノール、アルカロイド、脂肪酸などである。これらの成分の量は、菌株によって異なる。特定の成分のために育成される特殊な品種が存在する。
Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａは５５４種以上の化合物からなり、そのうち１１３種はカンナビノイド、１２０種はテルペン（Ｃａｌｖｉ，Ｐｅｎｔｉｍａｌｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１８）、その他はアミド、フラボノイド、フェノール、アルカロイド、脂肪酸などである。これらの成分の量は、菌株によって異なる。特定の成分のために育成される特殊な品種が存在する。
【0136】
２つの主要なカンナビノイドがよく知られている。Ｄ９‐テトラヒドロカンナビノール（Ｄ９‐ＴＨＣ）、精神活性、はレクリエーション消費の主要な構成要素であり、カンナビジオール（ＣＢＤ）非精神活性は、疼痛、神経変性、消化器疾患などの状態に対する多数の医学的価値を有する（Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｓｔｅｌｌａ ２００４，Ｎａｇａｒｋａｔｔｉ，Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｕｒｉｔｓ，Ｂｏｒｃｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．２０１９）。
【0137】
純粋な形式で与えられた場合、ＴＨＣとＣＢＤは大麻のそれほど有効ではない。このエントロレッジ効果により、研究者らは、大麻中の他の成分が活性であるか、主要成分の効果を増強する能力を有するか、または互いに相乗的に作用する（Ｒｕｓｓｏ ２０１８）という結論に達した。
【0138】
構成成分の数が多いため（＞５００）、それらの間の交差反応性の順列は扱いにくく、定量化が不可能になっている。当初の推定では、５００種類の化合物について、数十億の５体（互いに相互作用する５種類の化合物）の相互作用が存在することが示唆されているが、エントロレッジ効果を最初に理解するためには、はるかに多くの研究が必要であり、医療用大麻製品を開発するための優れた方法ではない。
【0139】
この例の目的は、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａの全体的な効果に大きく寄与する可能性のある成分の可能性を調べることである。
【0140】
評価に使用されるパラメータは、ＡＵＣの積であり、大麻に記録された最高の割合である最大曝露指数（ＭＥＩ）である。ＴＨＣおよびＣＢＤのＭＥＩ値は、これら２つの化合物が高度に活性であり、豊富であり、最も研究されているので、参照成分として使用される。
【0141】
表１は、文献（Ｔｕｂａｒｏ，Ｇｉａｎｇａｓｐｅｒｏ ｅｔ ａｌ．２０１０）に報告されている大部分の研究対象のカンナビノイド７種およびテルペン１４種の存在量を要約したものである。２１種類の化合物（表１）は、少なくとも６５％を占め、残りの５００種類に加えた成分は、植物の最大３５％を占める。
【0142】
全身曝露量（血漿中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ血漿中濃度））および存在量（ＭＥＩ）を考慮すると、構成成分の重要性が大きく変化する可能性がある。例えば、ＡＵＣ値でみると、ＣＢＤの全身曝露量はＴＨＣと比較して６倍高いが、存在量を考慮すると、ＴＨＣが豊富な大麻抽出物を与えた場合、ＴＨＣが活性の大きな割合を占める可能性がある（表２）。
【0143】
ＣＢＮはＴＨＣの分解産物であり、大麻花を治癒させるために放置すると芽の蓄積が増加する。
【0144】
表１および表２に挙げた７種類のカンナビノイドのうち、ＴＨＣ、ＣＢＤ、ＴＨＣＶおよびＣＢＧが最も高いＭＥＩ値を示している。１７種のテルペン類の中で、ミルセン、‐カリオフィレン、‐ピネン、‐ピネン、テルピノレン、ｔｒａｎｓ‐オシメン、リモネンは、ＭＥＩ値に関して、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａの全体的な有効性に有意に寄与する可能性があった。
【0145】
【表1】
【0146】
【表2】
【0147】
この事例の結果と整合的に、ＭＥＩ高値のカンナビノイドとテルペンが調査対象（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｌｅａｆｌｙ．ｃｏｍ／ｎｅｗｓ／ｃａｎｎａｂｉｓ－１０１／ｌｉｓｔ－ｍａｊｏｒ－ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ－ｃａｎｎａｂｉｓ－ｅｆｆｅｃｔｓ）．）
【0148】
脳への高曝露は、中枢神経系（ＣＮＳ）作用を発揮する可能性が高い。多少のばらつきはあるものの、同定されたすべてのカンナビノイドは、ＴＨＣおよびＣＢＤ（ＡＤＭＥＴ推定）よりも脳曝露が良好である。
【0149】
この例の結果は、いくつかの重要なポイントを強調しています。１．既知のカンナビノイドおよびテルペンは、大麻の含有量の高い割合を占めている、２．これらのカンナビノイドは広範囲にわたって脳に分布し、中枢神経系（ＣＮＳ）作用が顕著である可能性があることを示している、３．文献で報告されているように、テルペンは、はるかに高い量とＭＥＩ値を有し、カンナビノイドの活性を変化させることができた、および４．少量ではあるが、好ましい薬物様特性を有するカンナビノイドおよび他の成分は、文献で報告されている周知のエントロレージ効果に寄与する可能性がある。
【0150】
実施例７
この例の目的は、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａにおける既知のカンナビノイドの薬物動態特性を評価することである。
この例の目的は、Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａにおける既知のカンナビノイドの薬物動態特性を評価することである。
【0151】
報告された１２５のカンナビノイドの薬物動態特性をＡＤＭＥＴを用いて推定した。結果を図６に示す。
【0152】
経口バイオアベイラビリティは、カンナビノールメチルエーテルの５．４％から（１’Ｓ）－ヒドロキシカンナビノールの１００％の範囲である。ＡＵＣ値は、１ｍｇ用量範囲０．０１～４７９ｎｇ＊ｈｒ／ｍｌ、範囲４８，０００倍で正常化した。
【0153】
全身曝露量では、ＡＵＣ、Δ９－ＴＨＣ、ＣＢＤがそれぞれ９８、６６位であった。両カンナビノイドのバイオアベイラビリティ値は５０％未満であり、ＴＨＣ（１６．７％）およびＣＢＤ（４８．４％）であった（図６、以下ａ）。
【0154】
２５のカンナビノイドの生物学的利用能は９０％以上であり、そのうち２２は酸性である（図６、挿入図ｂ）。これらの化合物は、それらのＡＵＣがＣＢＤのそれより６．６～４２倍高く、Δ９‐ＴＨＣのそれより３２～２０３倍高いことを示した。
【0155】
理論的には、ＡＵＣ値が高いこれら２５種類のカンナビノイドのいくつかは、ＣＢＤよりも最大４０倍有効であるか、Δ９－ＴＨＣより最大２００倍有効である。その結果、これらのカンナビノイドの用量はＣＢＤまたはΔ９－ＴＨＣの用量よりも５～２００倍低かった。これは大麻サチバで最も研究された２つのカンナビノイドであるが、それでも同様に有効である。酸性形態のものと同様に、良好な薬物様特性を有するカンナビノイドは、それらの個々の活性がΔ９－ＴＨＣまたはＣＢＤと同等またはそれ以上であるか、またはこれらの化合物の２つ以上が共に相乗的に作用するならば、より効果的であり得る。
【0156】
薬物動態学的に、Δ９－ＴＨＣおよびＣＢＤはランキングの下半分に属し、より強力なカンナビノイドがまだ同定されていないという明らかな可能性がある。
【0157】
これらのカンナビノイドの薬物動態特性のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ推定は正確ではないかもしれないが、これらの化合物の順位は文献に発表された限られた臨床データと一致している。
【0158】
本発明の主な目的は、ＰＰＴ－ＩＩを使用して、その効果がオーバーシャドウ９－ＴＨＣとＣＢＤの組み合わせ、およびそれらの相互作用をもたらす未発見のカンナビノイドを公開することである。その後の実施例では、カンナビノイドの組成物を、肝癌（ＨＣＣ）の治療のためにＰＰＴ－ＩＩを用いて採掘する。
【0159】
実施例８
この例の目的は、次のとおりである。１．３種類のカンナビノイドからなる処方をＨＣＣの治療に用いるために組み合わせアプローチを用いることの潜在的な利点、２．これらの組合せの分子機構、および３．これらの活性成分の比率の重要性、を検討する。
この例の目的は、次のとおりである。１．３種類のカンナビノイドからなる処方をＨＣＣの治療に用いるために組み合わせアプローチを用いることの潜在的な利点、２．これらの組合せの分子機構、および３．これらの活性成分の比率の重要性、を検討する。
【0160】
概要：肝細胞癌（ＨＣＣ）は悪性疾患であり、患者の予後は不良である。診断された患者の３５％未満が５年生存する。この数は、がんが近くの組織に転移する場合は１２％未満に、他の臓器に転移する場合は２％未満に減少する（Ｋｉｔｉｓｉｎ，Ｐａｃｋｉａｍ ｅｔ ａｌ．２０１１）。現在までのところ、ＨＣＣに対する承認されたフィトカンナビノイド由来の化学療法の選択肢は存在しない。１９７５年に１５歳の少年から分離されたＨｅｐＧ２細胞は、高分化で特徴づけられており、肝細胞癌のモデルとして長く用いられてきた。
【0161】
大麻の医学的使用は、大麻残渣を含む金容器がＳｃｙｔｈｉａｎ墓で出土したとき、紀元前５００年までさかのぼった。現在、大麻は、悪心・嘔吐、食欲不振、疼痛（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ，Ｋｌｅｃｋｎｅｒ ｅｔａｌ．２０１９）を軽減する化学療法の補助薬として米国およびカナダで承認されている。
【0162】
カンナビノイドおよびテルペン、フラボノイドなどの大麻中の他の成分の抗癌特性が報告されている（Ｂｌａｓｃｏ－Ｂｅｎｉｔｏ，Ｓｅｉｊｏ－Ｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．２０１８）。大麻アリーナでは、Ｄ９‐テトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）とカンナビジオール（ＣＢＤ）が数年間癌研究の焦点となってきた。ＣＢＤは中枢神経系（ＣＮＳ）の欠如により「副作用」が多くの関心を集めている。
【0163】
ＣＢＤは、経口バイオアベイラビリティが低く、薬剤様特性（Ｍｅｙｅｒ，Ｌａｎｇｏｓ ｅｔ ａｌ．２０１８）を有することが知られている。その低い溶解度と高い初回通過代謝は、ＣＢＤを経口デリバリーの不適切な候補とする。ＣＢＤの経口バイオアベイラビリティは９～３０％の範囲であり、これは血漿プロフィールの大きな個人間変動を伴う。
【0164】
リポソームを含むナノ粒子は、ＣＢＤの経口バイオアベイラビリティを高めるために使用されてきた。しかし、ＣＢＤを肝臓に特異的に送達するようにデザインされた非経口製剤は入手できない。
【0165】
Ｉｎ ｖｉｖｏ薬物動態データはカンナビクロメン（ＣＢＣ）およびカンナビノール（ＣＢＮ）については入手できない。本発明において、ＣＢＣおよびＣＢＮのヒト薬物動態は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで推定され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで推定される。目標は、最適な投与経路および投与のための所望の投与形態を決定することである。
【0166】
大麻の侵入効果は十分に立証されている。例えば、ＣＢＤの効果は、同量のＣＢＤ（Ｂｌａｓｃｏ－Ｂｅｎｉｔｏ，Ｓｅｉｊｏ－Ｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．２０１８）を含む大麻抽出物と比較すると、あまり効果がない。寄与成分を解読しようとする試みがあるが、文献中のデータはスケッチが多い。大麻の成分も拮抗的に作用することが報告されている。これら２つの相反する力は、未定義の化学プロフィールを有する大麻抽出物を医薬使用に関して疑問視することができる。
【0167】
１つの実施形態において、ＨＣＣの治療においてソラフェニブと少なくとも同等の効力を有する候補の組合せを同定することを目的として、カンナビノイドの組合せの潜在的な相乗的抗癌活性が探索された。
【0168】
一実施形態において、同定された候補間の作用機序が解明される。
【0169】
大麻とその成分に関する数多くの研究が癌細胞増殖に対するそれらの有効性を支持しているが、文献には矛盾が存在する。これらは、実験デザインの相違、および／または異なる癌タイプに特徴的な基礎にある遺伝的および環境的因子に起因する可能性がある。例えば、ＭｃＫａｌｌｉｐ，Ｎａｇａｒｋａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）は様々な乳癌細胞株において純粋なＴＨＣに対する反応性の欠如を示したが、Ｂｌａｓｃｏ－Ｂｅｎｉｔｏ，Ｓｅｉｊｏ－Ｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）は矛盾した結果を報告した。後者の研究では、さらに、ＳＵＭ－１５９細胞と比較してＭＤＡ－ＭＢ－２３１からの改善された反応が観察された。興味深いことに、これらの細胞株はいずれも、過度に攻撃的なトリプルネガティブ（ＥＲ－、ＰＲ－、ＨＥＲ２－）型である。著者らはまた、様々な細胞株反応性に加えて、ＴＨＣ、他のカンナビノイド、フラボノイド、およびテルペンを含む植物抽出物では、試験したすべての細胞株で純粋なＴＨＣ単独と比較して有意な改善が認められた。
【0170】
カンナビノイドの効果は、ＣＢ１、ＣＢ２、ＧＰＲ５５、およびＴＰＲＶ１のような複数のＧ結合蛋白質ヘテロ二量体受容体に対するそれらの可変的結合親和性によって説明でき、複数の下流経路を運び、その結果、可変的な薬物応答性（Ｍｏｒｅｎｏ，Ｃａｖｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１９）をもたらす。ＴＨＣは、ＣＢ２受容体（Ｖａｒａ，Ｓａｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．２０１１）の直接結合を介して、肝細胞癌（ＨＣＣ）、ＨｅｐＧ２細胞のＡＭＰＫ媒介オートファジーを直接増強することが報告されている。これは、グリオーマ細胞（Ｌｏｒｅｎｔｅ，Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１１）において、ＡＬＫ受容体を介してＴＨＣが誘導するオートファジーに加えて起こる。これらの応答が種々の細胞系に特有であるか、あるいは種々の癌細胞型の間に普遍的であるかは、未解決である。さらに、Ｔｏｒｒｅｓ，Ｌｏｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）は、選択的ＡＬＫ阻害剤、ＴＡＥ－６８４の同時治療とＴＨＣに対する相乗反応を示し、相加的または相乗的効果は、収束経路を標的とすることによって増強され得ることを示した。
【0171】
新たな治療標的は、カンナビノイド受容体の一部である多数のＣ共役タンパク質受容体内のヘテロ二量体形成を修飾するアゴニスト化合物またはアンタゴニスト化合物である。これにより、このスーパーファミリーの受容体は、ゲノム（Ｍｏｒｅｎｏ，Ｃａｖｉｃ ｅｔ ａｌ．２０１９）をコードするタンパク質の約４％を構成するため、多くの新しい疾患経路が開かれる。新しい標的は、カンナビノイドおよび／または他の化合物相互作用の機構的な記述を提供する。
【0172】
ＴＨＣはＨｅｐＧ２細胞の末梢ＣＢ２受容体に結合し、アポトーシス促進事象を誘導することが知られているが、ＣＢＤはＴＲＰＶ１、ＰＰＡＲ、ＧＰＲ５５およびＴＲＰＭ８受容体に結合し、活性酸素種（ＲＯＳ）およびセラミドの増加からアポトーシス事象を誘導することができる。比較して、Ｚｈｏｎｇ（２０２０）は、ＣＢＮが、Ｐ２１をダウンレギュレーションすることによって、ＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ－ＡＴＫ経路を介してアポトーシスおよび細胞周期停止を媒介することを報告した。興味深いことに、Ｚｈｏｎｇの研究は、ＣＢＮ処理からのＣＢ２およびＧＰＲ５５受容体のダウンレギュレーションも示した。これは、おそらく、同時治療によるＣＢＤ活性の有効性に直接的な影響を及ぼすであろう。一方、ＣＢＣはＴＰＲＡ１アゴニスト（Ｄｅ Ｐｅｔｒｏｃｅｌｌｉｓ，Ｖｅｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．２００８）であり、細胞内Ｃａ２＋の増加を媒介すると同時にＡＥＡの再取り込みを阻害する。これらの報告は、カンナビノイドが癌の治療のためのオートファジーおよびアポトーシスに影響し得る多数の受容体媒介経路を実証する。これらの様々な受容体選択性と様々な親和性を共役させ、これらの薬物は、所与の細胞株内で相加的、相乗的、または拮抗的に作用する可能性がある。実際、Ｂｌａｓｃｏ－Ｂｅｎｉｔｏ，Ｓｅｉｊｏ－Ｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１８）は、試験したすべての細胞株について、植物薬剤抽出物で純粋なＴＨＣと比較して改善された応答を示した。植物性物質から生じる可能性のある順列および応答の数を考慮すると、テルペンおよびフラボノイド抗酸化剤（Ｔｏｍｋｏ，Ｗｈｙｎｏｔ ｅｔ ａｌ．２０２０）のような潜在的な追加の抗癌剤は言うまでもなく、これらのカンナビノイドの任意の数を任意の組み合わせまたは相対比で含有するカンナビノイド抽出物からの可変応答性を期待することは不合理ではない。いずれにせよ、特徴の不十分な抽出物を用いた治療が予測不可能な反応をもたらすと結論づけることは安全であろう。
【0173】
このことを念頭に置いて、テトラヒドロカンニビノール酸（ＴＨＣＡ）、カンナビジオール酸（ＣＢＤＡ）、カンナビゲロール酸（ＣＢＧＡ）、カンナビクロメン酸（ＣＢＣＡ）およびそれらの脱炭酸誘導体のような純粋なモノカンナビノイド化合物の抗癌剤としての使用を検証する研究および特許が増加している（Ｊａｖｉｄ，Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．２０１８，Ｋｏｌｔａｉ，Ｐｏｕｌｉｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）。これらの報告は、種々の癌細胞株に対するそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ活性を確認したが、それらの相対的に低い有効性（μＭ範囲のＩＣ５０値）と、脱炭酸体に対する不十分な薬物様特性とが、それらの薬物候補を疑わせる。実際、ＭｉｌｌａｒらはＣＢＤ（Ｍｉｌｌａｒ，Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．２０１８）でこれを実証した。
【0174】
最近の開示は、カンナビノイド（Ｓｔｏｔｔ，Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）／の組合せとの相乗的相互作用を報告しているが、これらの研究は、限定された数の規定された比率を有する２つのカンナビノイドのみに主に焦点を当てているか、あるいは、まだいくつかのその（Ｐａｒｏｌａｒｏ，Ｍａｓｓｉ ｅｔ ａｌ．２０１３）を特徴づける多数の成分を含む複雑なトリコーム抽出物を利用しているかのいずれかである。これらの結果から結論を導き出すことは、複雑な混合物中の任意の数の成分が観察された効果に関与している可能性があり、また、交差交通が収束する生物学的経路の間に存在する可能性があることを考えると、問題である。ＣＢＤとＣＢＮは共にＧＰＲ５５受容体と相互作用することが注目される。ＣＢＤはＧＰＲ５５アゴニストである。ＣＢＮは、ＧＲＰ５５発現をダウンレギュレートすることが示されており、その結果、その濃度および親和性と比較して可変的な応答をもたらす可能性がある。一方、ＣＢＤおよびＣＢＣはＴＲＰＶ１およびＴＲＶＡ１アゴニストであり、細胞内カルシウムを増加させ、アポトーシスを促進する。ＣＢＤはまた、異なる経路および受容体にも作用し、そのうちのいくつかは収束性である可能性がある。一方、ＣＢＣおよびＣＢＮは別の経路で作用するようであるため、より直接的な競合的／相加的／相乗的反応が生じる可能性がある。カンナビノイドは３種類しかなく、それぞれの使用量に応じて、どのくらいの数の全体的な反応が観察されるかを容易に知ることができる。経験的な証拠がなければ、全体的な効果がどのようなものか、どのような比率が受容体に過負荷を与え、他の経路への反応をシャントするのかを予測することは困難である。
【0175】
トリコーム内のカンナビノイド比の自然変動は、大麻菌株、生育条件、収穫時間など、さまざまな要因に起因する。従って、肝癌細胞株に対する可変応答は異なる植物抽出物から生じると結論できる。さらに、それらの抗癌効果を予測することは問題となる。予測可能性の程度は、多くの細胞研究において抗癌活性を促進する可能性がある他の内因性植物複合体によってさらに損なわれている。これもまた、様々な細胞研究（Ｔｏｍｋｏ，Ｗｈｙｎｏｔ ｅｔ ａｌ．２０２０）で実証されている。
【0176】
この開示は、癌細胞において、プロオートファジーおよびアポトーシス事象を誘導することが知られている収束性受容体標的および経路を有するカンナビノイドの定義された組み合わせを明らかにする。本発明に記載されたＣＢＤと複数のカンナビノイドの組合せ剤形は、ＨｅｐＧ２細胞に対するソラフェニブに匹敵するＩＣ５０値である。
【0177】
組み合わせ候補開発の概要１つの実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ肝癌モデルにおいて、第一選択の化学療法剤であるソラフェニブに匹敵する効果を有するカンナビノイド、ＣＢＤ、ＣＢＣ／ＣＢＮおよびＣＢＤ／ＣＢＣ／ＣＢＮの３つの組成物。別の実施形態では、ＣＢＣ／ＣＢＮおよびＣＢＤ／ＣＢＣ／ＣＢＮの相乗作用のメカニズムが明らかにされる。
【0178】
この開示は、癌細胞においてプロオートファジーおよびアポトーシス事象を誘導することが知られている多様な受容体標的および経路を有するＣＢＤ、ＣＢＤ／ＣＢＣおよびＣＢＤ／ＣＢＣ／ＣＢＮからなるカンナビノイドの３つの組成物を明らかにする。本発明に記載の３つの組成物は、ＨｅｐＧ２細胞に対してソラフェニブよりも有効である。
【0179】
これらの３つの組成物の効果は、それらがナノカプセル化されたときに強化される。これらのナノ粒子は、有効性および安全性を高めるために、特に肝臓への送達のために設計される。
【0180】
一実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ肝癌モデルにおいて、第一選択の化学療法剤であるソラフェニブよりも有効性を有するカンナビノイド、ＣＢＤ、ＣＢＣ／ＣＢＮおよびＣＢＤ／ＣＢＣ／ＣＢＮの３つの組成物。
【0181】
別の実施形態において、ＣＢＣ／ＣＢＮおよびＣＢＤ／ＣＢＣ／ＣＢＮの相乗作用のメカニズムが明らかにされる。
【0182】
別の実施形態では、最良の有効性および安全性プロファイルを達成／提供するための送達モードが開示される。
【0183】
別の実施形態において、非経口投与のためのＣＢＤ、ＣＢＣ／ＣＢＮおよびＣＢＤ／ＣＢＣ／ＣＢＮのためのナノカプセル化投与形態が明らかにされるであろう。
【0184】
別の実施形態において、組成物のナノカプセル化形態は、それらのそれぞれの非カプセル化組成物よりも有効であることが示される。
【0185】
ナノカプセル化剤形の用量は、カプセル化されていない対応物より少なくとも３倍少なくなる。
【0186】
Ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ Ｆｏｒｍｕｌａｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：の詳細説明本発明においては、ＣＢＤ、ＣＢＣ／ＣＢＮおよびＣＢＤ／ＣＢＣ／ＣＢＮからなる組成物は、肝臓化学療法剤、ソラフェニブに比べてより強力であることが開示されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞モデル、ＨｅｐＧ２、定量法、ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ、遺伝子発現研究、ウェスタンブロット研究、および化合物相互作用のデータ解析を用いて、相互作用の相対的有効性およびメカニズムを評価した。
【0187】
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ：純粋なカンナビノイドをＳｕｐｅｌｃｏ／Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔから得た。カンナビジオール（ＣＢＤ、Ｃ－０４５－１ＭＬ、ロットＦＥ１００７１９１２）、カンナビクロメン（ＣＢＣ、Ｃ－１４３－１ＭＬ、ロットＦＥ０６１５２００５）、カンナビノール（ＣＢＮ、Ｃ－０４６－１ＭＬ、ロットＦＥ０５０５２００８）。陽性対照化合物、レゴラフェニブ（ＴＣＩ、Ｒ１４２－２５ＭＧ、ロット１１－８８９９７－２３０９６）およびソラフェニブ（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ、Ｓ７３９７、ロットＳ７３９７０７）をＦｉｓｈｅｒから入手した。対照化学物質をＤＭＳＯ中で１０ｍＭに再構成し、続いて作業濃度に希釈した。メタノール中の純粋なカンナビノイド（１ｍｇ／ｍｌ）を、評価した最高濃度で直接培地に添加し、次の作業濃度まで段階的に希釈した。
【0188】
セルアッセイ：ＨｅｐＧ２細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ中の凍結保存細胞を解凍し、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを含むフェノールレッドフリーＤＭＥＭ培地中で１０倍に希釈し、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標）およびピルビン酸ナトリウムを添加した。続いて、細胞を２０ｇで１０分間遠心分離した。細胞を同じ培地中に２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で再懸濁した。９６ウェルの細胞培養処理した平底プレートを、７．５×１０３ＨｅｐＧ２細胞で播種し、３７Ｃ、５％ＣＯ２、＞９５％相対湿度で１８時間インキュベートして、細胞接着を可能にし、その後、培地を、１～２０％ＦＢＳおよび種々の試験化合物（５０μｇ／ｍｌ～５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する同様の培地で置換した。試験化合物を含むこの培地は２４時間後に補充した。４８時間後（細胞の２回分裂）、ナトリウム、２－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホナトフェニル）－３－（２－メトキシ－４－ニトロ－５－スルホフェニル）－Ｎ－フェニルテトラゾール－３－ｉｕｍ－５－カルボキシミド酸（ＸＴＴ）（０．３ｍｇ／ｍｌ）を加え、細胞を２時間インキュベートした。フォルマザンの製造は、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ｌｕｘ分光光度計で４５０ｎｍで測定した。非特異的吸収を６６０ｎｍで測定し、４５０ｎｍでの参照測定から減算した。サンプル測定は３回（ｎ＝３）で行った。ブランク減算後、データを平均化し、４点ロジスティック回帰曲線に当てはめて、ＩＣ５０値（Ｒ２＞０．９５）を得た。ブランクサンプルには陰性対照としてエタノールが含まれており、市販のカンナビノイドの溶媒であった。ブランク標準のエタノール濃度は、連続したカンナビノイド系希釈で使用された濃度を反映していた。最初の研究は、ＨｅｐＧ２細胞増殖に対する単一カンナビノイド活性を評価するために実施した。
【0189】
１０カナビノイドアッセイ：第三級カンナビノイド化合物混合物については、ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮの比混合物を、２０％ＦＢＳを添加したＩＭＤＭ培地では３：２：１から１：１までの間で、ＣＢＮ：ＣＢＣ：ＣＢＤの比混合物を、１％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地では９：３：１から１：１：１までの間で、ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮの比混合物を、１％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地では９：３：１から１：１：１までの間で無作為に。カンナビノイドを混合し、連続希釈のために培地中で希釈した。細胞アッセイおよびＸＴＴ実験は、上記のように行った。一次成分に対する理想反応を評価するために、最初の２つの成分比に対してＸＴＴ値をプロットした。
【0190】
Ｓｐｈｅｒｏｉｄ（固形腫瘍）アッセイ：ＨｅｐＧ２細胞を解凍し、Ｇｉｂｃｏ肝細胞維持補充および１％ＦＢＳを補充したＷｉｌｌｉａｍｓＥ培地で再構成した。細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）スフェロイド黒壁、透明丸底、超低付着、９６ウェルマイクロプレートに、１５００細胞／ウェルの密度で播種した。プレートを１０×Ｇで２０分間スピンし、細胞をウェルの中心に集めた。３７℃、５％ＣＯ２で６０時間インキュベートした後、スフェロイドをカンナビノイド混合物ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ ９：３：１で処理し、さらに４８時間インキュベートした。スフェロイドの活力は、ＩｎｖｉｒｏｇｅｎのＣｙＱｕａｎｔ（商標）増殖アッセイ（励起／発光）で測定した。５０８／５２７ｎｍ）６０分後３７℃。
【0191】
質量分析：ＨＰＬＣ－ＤＡＤ／ＭＳ法を用いて、個々のカンナビノイドの濃度と比を確認した。３０分間のインキュベーションの後、試験セットからランダムサンプル（５０μｌ）を採取し、１５０μｌのメタノールでクラッシュさせて培地タンパク質を沈殿させた。サンプルを２１９１０ ＲＣＦで５分間遠心分離し、上清をインサートを用いて２ｍＬガラスバイアルに採取した。 定量データは、１２６０シリーズＨＰＬＣおよびＵＶ検出器に連結したＡｇｉｌｅｎｔ ６４１０トリプル四重極質量分析計を用いて取得した。温度４°Ｃの恒温オートサンプラーを用いて、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ５μｍ ＸＢ－Ｃ１８ １００Å、Ｃ１８ ＳｅｃｕｒｉｔｙＧｕａｒｄ ＵＬＴＲＡ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅを４０°Ｃで装着した２５０ｘ４．６ｍｍカラムに、流量１．００ｍＬ／ｍｉｎ、勾配７２～１００％メタノールを４５分間注入した。移動相Ａは０．０５％酢酸アンモニウムを含む水を含み、移動相Ｂは０．０５％酢酸アンモニウムを含むメタノールからなる。ＵＶ検出は４ｎｍの信号帯域幅で２１５ｎｍで使用した。負イオンモードにおいて、選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）ＬＣ／ＭＳ分析を以下のパラメータで行った。原料ガス温度は３２０℃、流量は１２Ｌ／ｍｉｎ、毛細管電圧は－３．８ｋＶ、滞留時間は２００ｍｓ、フラグメント電圧は１３５Ｖ、ガスネブライザー圧力は３５．０ｐｓｉに設定した。濃度は、ＭＳ検出器については０．０２５～１０μｇ／ｍｌの範囲、ＵＶ検出器については０．５～１５μｇ／ｍｌの範囲で、標準検量線に対するサンプルの面積応答を定量することによって決定した。認証標準物質はすべて、Ｃｅｒｉｌｌｉａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＣＢＤ，Ｃ－０４５、ＣＢＣ，Ｃ－１４３、ＣＢＮ，Ｃ－０４６）から購入した。
【0192】
ｒｔ－ＰＣＲ：標的癌遺伝子経路は、いくつかの癌経路に関与する９１の独特な遺伝子を探索するカスタムＴａｑｍａｎアレイカードを用いて解析する。
【0193】
２００万ＨｅｐＧ２細胞をＩＭＤＭ培地に入れて２０％ＦＢＳおよび１％エタノールをＴ７５フラスコに播種し、３７℃、７．５％ＣＯ２で７０～８０％コンフルエントまでインキュベートした（約７．５ｘ１０５細胞）。培地に個々のカンナビノイド（ＣＢＤ１７μｇ／ｍｌ、ＣＢＣ２３μｇ／ｍｌ、ＣＢＮ２０μｇ／ｍｌ）およびＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ １：１（１７μｇ／ｍｌ）のカンナビノイド混合物を含有する培地を補充し、収穫前に６時間インキュベートした。Ｒａｆ、ＶＥＧＦＲ、およびＰＤＧＦＲ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｄｅｒ ２００７）を介する抗血管新生活性および抗増殖活性を有するキナーゼ阻害剤、ソラフェニブ（１２μｇ／ｍｌ）を陽性対照として含めた。未処理細胞を陰性対照のグリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）として含め、データの正常化に用いた。
【0194】
ＲＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ’ｓ Ｄｙｎａｂｅａｄ ｍＲＮＡ ＤＩＲＥＣＴキットを用いて推奨プロトコルを用いて抽出し、精製ｍＲＮＡ溶液５０Ｌを得た。５０個のＬのＲＴマスターミックスをｍＲＮＡ溶液に混合し、混合物を残して３７℃で６０分間反応させた。逆転写酵素不活性化を９５℃で５分間実施し、得られたｃＤＮＡ試料を使用するまで４℃に維持した。ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅマスターミックス５５マイクロリットルを、１ｇ／１００ｌのｃＤＮＡを含有する等量のｃＤＮＡサンプルに加え、これを各カードリザーバーに装填した。カードをＬｅｇｅｎｄ ＸＦＲ遠心機で１２００ ＲＰＭで３分間２回遠心分離し、４０増幅サイクルの標準設定を用いてＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７ ＰＣＲ装置でｒｔＰＣＲ反応を行った。
【0195】
セル内ウェスタンブロット解析：タンパク質発現は、２０％ＦＢＳおよび１％エタノールを含むＩＭＤＭ培地中のＴｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（項１４２７６１）からの３８４ウェル光学的底部黒色培養プレートに、ｃｙｒｏ凍結保存株から１０００個のＨｅｐＧ２細胞／ウェルを播種することによって評価した。４８時間のリカバリ後、メディアは同じメディア（ＣＢＤ）に置き換えられました。１７μｇ／ｍｌ、ＣＢＣ ２３μｇ／ｍｌ、ＣＢＮ ２０μｇ／ｍｌ、ソラフェニブ １２μｇ／ｍｌ、ＳＣＩ－１１１ １７μｇ／ｍｌ、ＳＣＩ－５２１：１７μｇ／ｍｌ）。６時間処理後、細胞を４％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、０．１％トリトン－ｘ１００で１０分間浸透させ、ブロック緩衝液（３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））中に４℃で一晩放置した。翌日、細胞をＰＢＳでリンスし、一次抗体を含有する２５μｌのＰＢＳ（表１）と共に２５℃で３時間インキュベートした。続いて、一次抗体を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、二次抗体を含むＰＢＳ（ウサギ：２５μｌ）とインキュベートした。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｌｏｔ ２４０９０４２、マウス：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７９０ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ロット２３００９２３）を１：２０００の濃度で投与。Ｄｒａｑ５（１：２０００）を追加し、データを正規化。二次抗体中で１時間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳでリンスし、そして７００および８００ｎｍでの読み取りを、２１μｍの分解能でＬｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ蛍光イメージャー上で取得した。その後、ＥｍｐｉｒｉａＳｔｕｄｉｏ２．１を用いて解析を実施した。抗体あたり合計５サンプルを採取し、統計解析のためにサンプルサイズを３に縮小した。
【0196】
【表3】
【0197】
データ収集：その後の実験は、この開示において、ＨｅｐＧ２細胞、すなわちＣＢＤ、ＣＢＣ、およびＣＢＮに対して最低のＩＣ５０値を示した３つの非精神活性カンナビノイドに焦点を当てたことを明らかにした。様々な培地におけるこれらのカンナビノイドのさらなる研究により、培地中のＦＢＳ濃度と観察されたＩＣ５０値との間の相関が確認された（図８Ａ）。ソラフェニブ、ＣＢＤおよびＣＢＮは、ＩＣ５０値の平準化を示し、これにより、１２．５％ＦＢＳ後のＩＣ５０値の平坦化が示されるが、ＣＢＣは、さらに４５％ＦＢＳまで測定された線形相関を示す（図８Ｂ）。この観察により、本発明者らは、１％、１０％および２０％のＦＢＳにおけるソラフェニブに対する個々のカンナビノイドのＩＣ５０値を検討することになった。これらのデータを図８Ｃに示す。見たように、様々なＩＣ５０値が得られたにもかかわらず、ソラフェニブに対するカンナビノイドＩＣ５０値は、ＣＢＤでは～１．２５、ＣＢＮでは～１．５、ＣＢＣでは～２．０のままである。この方法は、ソラフェニブがベンチマーク基準として使用される限り、様々な実験条件にわたって一貫したデータの比較を可能にする。複数の実験条件を探索し、文献に報告されている標準溶媒系から毒性を明らかにした（データは示していない）。このように、２０％ＦＢＳおよび１％エタノールを含むＩＭＤＭ培地は、本開示の残りの部分に使用されたＨｅｐＧ２細胞のデータの明確な解釈を可能にする非毒性系であることが見出された。
【0198】
Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ：純粋なカンナビノイドの結果を所与として、本発明者らは、３つのカンナビノイド対、ＣＢＤ－ＣＢＣ、ＣＢＤ－ＣＢＮ、ＣＢＣ－ＣＢＮを用いて、３成分相互作用マトリックスの効果を推定するために、一定範囲の比を有する同様の生物学的研究を実施した。得られたＩＣ５０の対応するトリプルレシオ濃度の値を図９に示す。ＣＢＤ：ＣＢＣの濃度比が２：１を超え、ＣＢＤ：ＣＢＮが２０％ＦＢＳのＩＭＤＭ培地で２：１と４：１の間にあるとき、最適効果が観察された。
【0199】
３項インタラクション：カンナビノイド、ＣＢＤ、ＣＢＣ、およびＣＢＮの潜在的な相乗的相互作用を評価するために、実施例８に見られるＸＴＴ結果のバリデーションを実施した。図９に示されたプロットから観察された潜在的な相乗作用の範囲に基づいて、３つのカンナビノイドの様々な組み合わせが三元分析（ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ ９：３：１、４：２：１、および１：１：１：１）のために選択された。ＩＣ５０値は、本明細書に記載されたＸＴＴアッセイを用いて得られ、値は、各サンプルに使用されたカンナビノイドの組み合わせの総濃度にそれぞれ報告される。本試験の結果を図１０Ａおよび１０Ｂに示す。４：２：１のＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ比は、２０％のＦＢＳを含む培地において、ソラフェニブに匹敵するＩＣ５０値を生成したが、この比は、ＦＢＳ濃度が１％に減少するにつれて、９：３：１にシフトした（図１０Ｂ）。この変化は、ＣＢＣの血漿蛋白結合の減少に起因すると仮定され、ＩＣ５０値の同時減少をもたらした（図８Ａ）。実際、最適なＩＣ５０は、１％ＦＢＳのＣＢＤ：ＣＢＣとＣＢＣ：ＣＢＮの相対３：１比が、２０％ＦＢＳの２：１までの増加比を必要とする場合に見られ、これは、おそらく同様のＣＢＣの遊離薬物濃度を提供する。この一連の結果から、配合剤候補は個々の化合物よりも優れており、ソラフェニブよりも有効であるという証拠が得られる。その結果、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルの選択、試験方法および試験化合物が評価される条件が最も重要であることも示された。これは、配合剤候補がスクリーニングされている場合に特に当てはまる。
【0200】
相互作用のメカニズム：本研究の目的は、本開示で探求したカンナビノイド類の作用機序およびＨｅｐＧ２細胞の増殖に対するこれらの化合物の最適有効比を理解することであるｉｎ ｖｉｔｒｏ。
【0201】
がん遺伝子経路の評価は、多数のがん関連経路に関連する８６の遺伝子を探索するカスタムデザインのＴａｑＭａｎアレイカードを用いて実施された。これらの経路には、最上位のＧ結合タンパク質受容体（ＣＢ１、ＣＢ２、ＧＰＲ５５、ＴＲＰＶ１など）およびアポトーシス、オートファジー、細胞周期停止に関連する下流のタンパク質および酵素が含まれ、この開示で前述したカンナビノイドによって攪乱される経路も含まれる。これらのデータを表４に示す。カンナビノイドを陰性対照と比較した結果は、過去の文献報告と一致していた。実際、この開示は、ＣＢＤがいくつかのＭＡＰキナーゼおよびＰＩ３Ｋ経路遺伝子の変化を介してｍＴｏｒ経路に影響することを確認した。また、ＣＢＮはＰＩ３Ｋ／ＡＴＫ経路を介してｍＴＯＲを変化させ、ＣＢＣはアポトーシスに関連するＣＡＭＫ１およびＥＬＫ１遺伝子を誘導する可能性が高いことが確認された。しかしながら、我々の包括的な分析は、遺伝子発現のより広範な関与を明らかにする。ＴＧＦシグナル伝達、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｊａｋ－ＳＴＡＴ、ＨｉｐｐｏおよびＮｏｔｃｈを含むいくつかの他の経路は、報告されていない摂動を受けている。興味深いことに、ＨｅｄｇｅｈｏｇはＣＢＤの影響を受けないが、Ｊａｋ－ＳＴＡＴおよびＮｏｔｃｈはＣＢＣの影響のみを受ける。ＴＧＦシグナル伝達とＰＩＫ３Ｒ５は、ＣＢＮの影響を大きく受けるようである。これらのユニークな標的は、組合せ処方から観察された相加効果を説明する可能性がある。実際、ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ比は１：１：１であり、各々の個々のカンナビノイドの初期濃度の１／３しか保持していないにもかかわらず、最良の全ＩＣ５０を提示しておらず、実際、最強の遺伝子折畳み変化（ＭＡＰ３Ｋ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＯ、ＣＣＮＥ１、およびＢＣＬ２）のいくつかを示す。これらの効果は、本研究では同定されていない上流の相互作用が存在し、最終的には混合物が個々のカンナビノイド単独よりも相乗作用をもたらすことを示唆している。個々の経路に加えて、特定の細胞過程に関連する遺伝子も探索された。予想されたように、細胞周期停止およびアポトーシスに関与する遺伝子は、試験した３つのカンナビノイドすべてで変化した。しかし、血管新生（ＶＥＧＦＡおよびＣＵＬ２）および細胞接着（ＧＳＫ３、ＤＶＬＤ２、およびカテニンＢ）に関与する遺伝子も変化した。これらのプロセスは転移にとって重要であり、単純な２Ｄ細胞アッセイから評価することはできず、ＸＴＴアッセイから測定したＩＣ５０値に影響しない。
【0202】
前述の遺伝子に加えて、本発明者らは、研究されたＨｅｐＧ２細胞系においてＣＢ１遺伝子もＣＢ２遺伝子も発現されないことに留意した。むしろ、ＰＰＡＲＧ、ＥＲＢＢ２およびＭＥＴタンパク質は変化を示す。カンナビノイドがこれらの受容体に直接結合するのか、その発現に影響を及ぼすのかは不明である。ＰＰＡＲＧは、Ｇ共役蛋白質受容体の発現／活性に関連する転写因子であり、潜在的カンナビノイド受容体（ＧＲＰ５５およびＧＲＰ１１９）に影響する可能性がある。ＭＥＴは肝細胞増殖因子としても知られており、肝細胞増殖に直接関連している。
【0203】
【表4-1】
【0204】
【表4-2】
【0205】
遺伝的解析：ＰＣＲ観察を検証するために、候補遺伝子をタンパク質発現について表４から選択した。これらの遺伝子を表４に示す。観察された遺伝子発現変化は、必ずしも、リサイクル／スカベンジャー経路、遺伝子と蛋白質発現との間のラグタイム、および遊技におけるホメオスタシス機構の複雑なネットワークによる蛋白質発現と相関しないことが一般的である。いずれにせよ、すべての標的遺伝子の蛋白質発現は、スクリーニングした薬剤候補の少なくとも１つについてのＰＣＲ結果を検証した。これらの折り畳み変化を表５に示す。最も顕著なのは、アポトーシス関連蛋白ｐ５３およびｃ－ＭＹＣについて観察される普遍的な変化である。また、細胞接着蛋白質も調べた全ての候補により影響され、血管新生関連蛋白質はＣＢＤとカンナビノイドの組合せにより影響された。ＭＡＰＫ／ＰＩ３Ｋ／ＡＴＫ蛋白質も、以前の文献所見を確認するカンナビノイドの影響を受けた。興味深いことに、試験した配合剤は、ＸＴＴ実験において、カンナビノイドの個々の用量の減少にもかかわらず、同等のＩＣ５０値を示しただけでなく、それらの個々の成分の対応物と比較して、同様またはより有意な遺伝子および蛋白質発現変化を示した。例えば、ＳＣＩ－５２１は、個々のカンナビノイドＣＢＤ、ＣＢＣ、およびＣＢＮのわずか６２．５％、２５％、および１２．５％を含有するだけであるが、２０％ＦＢＳを含有するＩＭＤＭ培地において、ＣＢＤおよびソラフェニブ単独のＩＣ５０と同様のＩＣを産生する。この組み合わせは、リン酸化ＰＴＥＮ蛋白質においてもＣＢＤ単独と同様の減少をもたらした（表５）。また、ＣＢＤ単独と比較してＶＥＧＡ発現が多く、ＣＵＬ２が減少したが、これはサンプル採取時の所与の時間枠（６時間）ではＣＢＤでは観察されなかった。これらのデータは、加法的／相乗的効果の提供における個々のカンナビノイドの協同効果を示唆する。それぞれのカンナビノイドの３３％しかないＳＣＩ－１１１では、同様の結果が観察されている。この製剤は、ＸＴＴでは、１％または２０％のＦＢＳのいずれの結果も理想的なＩＣ５０を示さなかったが、個々のカンナビノイドと比較して、ｐ５３についてより有意な蛋白質変化をもたらした。１０Ｂに示されたデータに基づいて、この比率はＦＢＳが５０％に近づくと最適な結果を提示すると仮定することができる。
【0206】
【表5-1】
【0207】
【表5-2】
【0208】
３Ｄ ＨｅｐＧ２ Ｓｔｕｄｙ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ固形腫瘍モデルＨｅｐＧ２細胞に対するカンナビノイド混合物の有効性を、スフェロイド型で評価した。カンナビノイド混合物（ＳＣＩ－９３１）：ＣＢＤ：ＣＢＣ：ＣＢＮ９：３：１）は、１％ＦＢＳのＤＭＥＭ培地において、ＩＣ５０値２．９５μｇ／ｍｌ（図１１Ａおよび１１Ｂ）で活性を示した。
【0209】
実施例９
本試験の目的は、投与方法および最適な送達方法を決定することを目的として、三成分系における３つのカンナビノイドの薬物様特性を推定することである。ＡＤＭＥＴ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（登録商標）とＰｏｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔｈｅｉｌ（２００２）の組み合わせを用いて、ＣＢＤ，ＣＢＣ，ＣＢＮの薬剤様特性を評価した。自社独自の薬物動態モデルを用いて、血漿および臓器プロファイルをシミュレートした。
本試験の目的は、投与方法および最適な送達方法を決定することを目的として、三成分系における３つのカンナビノイドの薬物様特性を推定することである。ＡＤＭＥＴ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（登録商標）とＰｏｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔｈｅｉｌ（２００２）の組み合わせを用いて、ＣＢＤ，ＣＢＣ，ＣＢＮの薬剤様特性を評価した。自社独自の薬物動態モデルを用いて、血漿および臓器プロファイルをシミュレートした。
【0210】
【表6-1】
【0211】
【表6-2】
【0212】
表６は、ＣＢＤ、ＣＢＣおよびＣＢＮの薬剤様特性のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ推定値の要約である。ＣＢＤの他に、ヒトにおけるＣＢＣとＣＢＮに関する薬物動態データが不足している。ここで推定したＣＢＤの全身クリアランス値は、文献（Ｍｅｙｅｒ，Ｌａｎｇｏｓ ｅｔ ａｌ．２０１８）で報告されている値と一致し、このデータセットがより高いレベルで使用できることを定性的に裏付けている。
【0213】
ＣＢＤ、ＣＢＣおよびＣＢＮは溶解度が極めて低く、腸および肝臓の初回通過代謝が高く、経口投与の候補としては不十分である。これら３種のカンナビノイドは主に肝臓で除去され、高ＣｌＴＢが肝血流量（１．５Ｌ／ｍｉｎ）に近い値を示した。
【0214】
初回通過代謝の高い薬物は、個体間変動が大きく、＞１０倍の変動はまれではない。被験者内のばらつきも問題である。化学療法剤の効果は非特異性が高く、したがって毒性が強いため、これらの薬物濃度の変動は癌治療に関しては問題である。用量漸増は実用的ではない。さらに、本発明に開示されているような、相乗効果を引き出すために濃度比が極めて重要である複数の成分の公式に関しては、薬物動態プロフィールにおける個々の変動は、治療の成功に脅威を与える可能性がある。
【0215】
血管経路を介して候補を投与することにより、被験者間および被験者内の変動を回避することができる。ＣＢＤのＡＵＣ値は静脈内注射（Ｍｅｙｅｒ，Ｌａｎｇｏｓ ｅｔ ａｌ．２０１８）後約２倍に変化した。この変動は、本開示で測定された相乗比率範囲内である。
【0216】
デリバリーの管理を改善し、有効性を最大限に高め、毒性を最小限に抑えるために、候補を血管内に注入することができる。表７は、定常状態の血中および肝臓レベルを達成するための推定注入速度を示しており、これはそれぞれのＩＣ５０値に相当する。
【0217】
【表7】
【0218】
過去数十年間で薬物動態パラメータのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ予測は改善されているが、まだ改善の余地がある。すなわち、予測値が臨床値の５倍以上ずれることは珍しくない。
【0219】
臨床濃度の予測法はまだ開発されていない。一般的なアプローチはまだ利用できない。本開示では、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏデータの両方を有する陽性対照のものを用いて、本明細書に記載される式の生理学的有効濃度を導出する。
【0220】
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ推定に基づく併用薬剤候補のナノカプセル化は、候補の有効性を高め、毒性を低下させる可能性がある。
【0221】
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Ｗｅａｔｈｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｍ．Ａ．Ｅｌｆａｗａｌ，Ｍ．Ｊ．Ｔｏｗｌｅｒ，Ｇ．Ｋ．Ａｃｑｕａａｈ－Ｍｅｎｓａｈ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｒｉｃｈ（２０１４）．“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｏｒａｌ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ ｄｒｉｅｄ ｌｅａｖｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｓ．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄｉ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ．”Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ １５３（３）：７３２－７３６．
Ｗｅａｔｈｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｍ．Ｔｏｗｌｅｒ，Ａ．Ｈａｓｓａｎａｌｉ，Ｐ．Ｌｕｔｇｅｎ ａｎｄ Ｐ．Ｏ．Ｅｎｇｅｕ（２０１４）．“Ｄｒｉｅｄ－ｌｅａｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｍａｌａｒｉａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ？”Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３（４）：３９－５５．
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Ｚｈｏｎｇ，Ｎ．（２０２０）．Ｃａｎｎａｂｉｎｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｆｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ａｐｏｔｏｓｉｓ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍ．Ｓｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｔｈｂｒｉｄｇｅ．
Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｐ．，Ｍ．Ｄｕｎｋｅｌ，Ｅ．Ｋｅｍｍｌｅｒ ａｎｄ Ｒ．Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ（２０２０）．“ＳｕｐｅｒＣＹＰｓＰｒｅｄ－ａ ｗｅｂ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４８（Ｗ１）：Ｗ５８０－Ｗ５８５．
Ｂｌａｓｃｏ－Ｂｅｎｉｔｏ，Ｓ．，Ｍ．Ｓｅｉｊｏ－Ｖｉｌａ，Ｍ．Ｃａｒｏ－Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ，Ｉ．Ｔｕｎｄｉｄｏｒ，Ｃ．Ａｎｄｒａｄａｓ，Ｅ．Ｇａｒｃｉａ－Ｔａｂｏａｄａ，Ｊ．Ｗａｄｅ，Ｓ．Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｇｕｚｍａｎ，Ｅ．Ｐｅｒｅｚ－Ｇｏｍｅｚ，Ｍ．Ｇｏｒｄｏｎ ａｎｄ Ｃ．Ｓａｎｃｈｅｚ（２０１８）．”Ａｐｐｒａｉｓｉｎｇ ｔｈｅ “ｅｎｔｏｕｒａｇｅ ｅｆｆｅｃｔ”：Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｕｒｅ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄ ｖｅｒｓｕｓ ａ ｂｏｔａｎｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．”Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７：２８５－２９３．
Ｃａｌｖｉ，Ｌ．，Ｄ．Ｐｅｎｔｉｍａｌｌｉ，Ｓ．Ｐａｎｓｅｒｉ，Ｌ．Ｇｉｕｐｐｏｎｉ，Ｆ．Ｇｅｌｍｉｎｉ，Ｇ．Ｂｅｒｅｔｔａ，Ｄ．Ｖｉｔａｌｉ，Ｍ．Ｂｒｕｎｏ，Ｅ．Ｚｉｌｉｏ，Ｒ．Ｐａｖｌｏｖｉｃ ａｎｄ Ａ．Ｇｉｏｒｇｉ（２０１８）．“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｄｉｃａｌ Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ Ｌ．ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｍａｃｅｒａｔｅｄ ｏｉｌｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＨＳ－ＳＰＭＥ ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｏ ＧＣ－ＭＳ ａｎｄ ＬＣ－ＨＲＭＳ（ｑ－ｅｘａｃｔｉｖｅ ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｒ））ａｐｐｒｏａｃｈ．”Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ １５０：２０８－２１９．
Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｃ．（２００６）．“Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ，ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｉｎ ｄｒｕｇ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｓｔｕｄｉｅｓ．”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖ ５８（３）：６２１－６８１．
Ｄａｅｍｅｎ，Ｔ．，Ｍ．Ｖｅｌｉｎｏｖａ，Ｊ．Ｒｅｇｔｓ，Ｍ．ｄｅ Ｊａｇｅｒ，Ｒ．Ｋａｌｉｃｈａｒａｎ，Ｊ．Ｄｏｎｇａ，Ｊ．Ｊ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｎｔ ａｎｄ Ｇ．Ｌ．Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆ（１９９７）．“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．”Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６（２）：４１６－４２３．
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Ｄｅ Ｐｅｔｒｏｃｅｌｌｉｓ，Ｌ．，Ｖ．Ｖｅｌｌａｎｉ，Ａ．Ｓｃｈｉａｎｏ－Ｍｏｒｉｅｌｌｏ，Ｐ．Ｍａｒｉｎｉ，Ｐ．Ｃ．Ｍａｇｈｅｒｉｎｉ，Ｐ．Ｏｒｌａｎｄｏ ａｎｄ Ｖ．Ｄｉ Ｍａｒｚｏ（２００８）．“Ｐｌａｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ ａｎｋｙｒｉｎ ｔｙｐｅ－１ ａｎｄ ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ ｔｙｐｅ－８．”Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３２５（３）：１００７－１０１５．
Ｇｅｅｌｅｈｅｒ，Ｐ．，Ｎ．Ｊ．Ｃｏｘ ａｎｄ Ｒ．Ｓ．Ｈｕａｎｇ（２０１４）．“Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｃａｎ ｂｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇｂａｓｅｌｉｎｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ａｎｄｉｎ ｖｉｔｒｏｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．”Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １５（Ｒ４７）：１－１２．
Ｇｒａｚｉｏｓｅ，Ｒ．，Ｍ．Ａ．Ｌｉｌａ ａｎｄ Ｉ．Ｒａｓｋｉｎ（２０１０）．“Ｍｅｒｇｉｎｇ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｗｉｔｈ ｍｏｄｅｒｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｔｏ ｆｉｎｄ ｎｏｖｅｌ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄｓ．”Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ ７（１）：２－１２．
Ｈａｓｅｇａｗａ，Ｈ．（２００４）．“Ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｓｔｅｒｉｏｕｓ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｇ：ｂａｓｉｃ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ：ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ：ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ．゛ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ９５（２）：１５３－１５７．
Ｊａｖｉｄ，Ｆ．Ａ．，Ｍ．Ｄｕｎｃａｎ ａｎｄ Ｃ．Ｓｔｏｔｔ（２０１８）．Ｕｓｅ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｏｖａｒｉａｎ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．ＵＳＰＴＯ．
Ｊｉａｎｇ，Ｍ．，Ｃ．Ｚｈａｎｇ，Ｇ．Ｚｈｅｎｇ，Ｈ．Ｇｕｏ，Ｌ．Ｌｉ，Ｊ．Ｙａｎｇ，Ｃ．Ｌｕ，Ｗ．Ｊｉａ ａｎｄ Ａ．Ｌｕ（２０１２）．“Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｚｈｅｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｅｖｉｄｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ａ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．”Ｅｖｉｄ Ｂａｓｅｄ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ａｌｔｅｒｎａｔ Ｍｅｄ ２０１２：４０９５６８．
Ｋｉｔｉｓｉｎ，Ｋ．，Ｖ．Ｐａｃｋｉａｍ，Ｊ．Ｓｔｅｅｌ，Ａ．Ｈｕｍａｒ，Ｔ．Ｃ．Ｇａｍｂｌｉｎ，Ｄ．Ａ．Ｇｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｍａｒｓｈ ａｎｄ Ａ．Ｔｓｕｎｇ（２０１１）．“Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｏｕｔｃｏｍｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｔ ａ ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｅｎｔｒｅ．”ＨＰＢ（Ｏｘｆｏｒｄ）１３（１０）：７１２－７２２．
Ｋｌｅｃｋｎｅｒ，Ａ．Ｓ．，Ｉ．Ｒ．Ｋｌｅｃｋｎｅｒ，Ｃ．Ｓ．Ｋａｍｅｎ，Ｍ．Ａ．Ｔｅｊａｎｉ，Ｍ．Ｃ．Ｊａｎｅｌｓｉｎｓ，Ｇ．Ｒ．Ｍｏｒｒｏｗ ａｎｄ Ｌ．Ｊ．Ｐｅｐｐｏｎｅ（２０１９）．“Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｎａｂｉｓ ｉｎ ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ ｃａｒｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．”Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｍｅｄ Ｏｎｃｏｌ １１：１７５８８３５９１９８６６３６２．
Ｋｏｌｔａｉ，Ｈ．，Ｐ．Ｐｏｕｌｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｎａｍｄａｒ（２０１９）．“Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｃａｎｎａｂｉｓ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｔｏ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｒｕｇｓ．”Ｅｕｒ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ １３２：１１８－１２０．
Ｌｉ，Ｗ．Ｊ．，Ｙ．Ｗ．Ｌｉａｎ，Ｑ．Ｓ．Ｇｕａｎ，Ｎ．Ｌｉ，Ｗ．Ｊ．Ｌｉａｎｇ，Ｗ．Ｘ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｂ．Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｈ．Ｌｕｏ（２０１８）．“Ｌｉｖｅｒ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｃｕｒｃｕｍｏｌ ｕｓｉｎｇ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ－ｓｔｅａｒａｔｅ．”Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ Ｍｅｄ １６（２）：９２５－９３０．
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Ｔａｍ，Ｙ．Ｋ．ａｎｄ Ｊ．Ａ．Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ（２００８）．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｐ．Ｃ．Ｔｒｅａｔｙ．
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Ｔｏｒｒｅｓ，Ｓ．，Ｍ．Ｌｏｒｅｎｔｅ，Ｆ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｆｏｒｎｅｓ，Ｓ．Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｔｉｅｄｒａ，Ｍ．Ｓａｌａｚａｒ，Ｅ．Ｇａｒｃｉａ－Ｔａｂｏａｄａ，Ｊ．Ｂａｒｃｉａ，Ｍ．Ｇｕｚｍａｎ ａｎｄ Ｇ．Ｖｅｌａｓｃｏ（２０１１）．“Ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ａｇａｉｎｓｔ ｇｌｉｏｍａ．”Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０（１）：９０－１０３．
Ｔｕｂａｒｏ，Ａ．，Ａ．Ｇｉａｎｇａｓｐｅｒｏ，Ｓ．Ｓｏｓａ，Ｒ．Ｎｅｇｒｉ，Ｇ．Ｇｒａｓｓｉ，Ｓ．Ｃａｓａｎｏ，Ｒ．Ｄｅｌｌａ Ｌｏｇｇｉａ ａｎｄ Ｇ．Ａｐｐｅｎｄｉｎｏ（２０１０）．“Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃａｎｎａｂｉｎｏｉｄｓ ａｎｄ ｃａｎｎａｂｉｖａｒｉｎｓ．”Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ ８１（７）：８１６－８１９．
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Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．，Ｈ．Ｚｈｏｕ，Ｙ．Ｆ．Ｗａｎｇ，Ｂ．Ｓ．Ｓａｎｇ ａｎｄ Ｌ．Ｌｉｕ（２０２１）．”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｏｌｉｃｉｅｓ ａｎｄ Ｍｅａｓｕｒｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ．”Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｓ １６３：１０５１８７．
Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｈ．Ｓｕｎ，Ａ．Ｚｈａｎｇ，Ｇ．Ｊｉａｏ，Ｗ．Ｓｕｎ ａｎｄ Ｙ．Ｙｕａｎ（２０１１）．“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ａｂｓｏｒｂｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｐｌａｓｍａ ａｆｔｅｒ ｏｒａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｆｏｒｍｕｌａ Ｙｉｎ－Ｃｈｅｎ－Ｈａｏ－Ｔａｎｇ ｂｙ ｕｌｔｒａ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ／ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ．”Ａｎａｌｙｓｔ １３６（２３）：５０６８－５０７６．
Ｗｅａｔｈｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｍ．Ａ．Ｅｌｆａｗａｌ，Ｍ．Ｊ．Ｔｏｗｌｅｒ，Ｇ．Ｋ．Ａｃｑｕａａｈ－Ｍｅｎｓａｈ ａｎｄ Ｓ．Ｍ．Ｒｉｃｈ（２０１４）．“Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂｙ ｏｒａｌ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ ｄｒｉｅｄ ｌｅａｖｅｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｖｓ．Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｃｈａｂａｕｄｉ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｍｉｃｅ．”Ｊ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ １５３（３）：７３２－７３６．
Ｗｅａｔｈｅｒｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｍ．Ｔｏｗｌｅｒ，Ａ．Ｈａｓｓａｎａｌｉ，Ｐ．Ｌｕｔｇｅｎ ａｎｄ Ｐ．Ｏ．Ｅｎｇｅｕ（２０１４）．“Ｄｒｉｅｄ－ｌｅａｆ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｍａｌａｒｉａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｏｕｎｔｒｉｅｓ？”Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ３（４）：３９－５５．
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Ｚｈｏｎｇ，Ｎ．（２０２０）．Ｃａｎｎａｂｉｎｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｒｏｆｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ａｐｏｔｏｓｉｓ ｉｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ，ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍ．Ｓｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｅｔｈｂｒｉｄｇｅ．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【国際調査報告】