特表 2024-535705 免疫抑制性Ｂ細胞を標的化する抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-02

(54)【発明の名称】免疫抑制性Ｂ細胞を標的化する抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240925BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240925BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240925BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C07K16/28

C12N15/13

C12P21/08

A61P35/00

A61P35/02

A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024511968

(86)(22)【出願日】2022-08-24

(85)【翻訳文提出日】2024-04-17

(86)【国際出願番号】 US2022041400

(87)【国際公開番号】W WO2023028162

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】63/237,065

(32)【優先日】2021-08-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522340657

【氏名又は名称】バイオグラフ ５５，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】プレスタ，レオナルド

(72)【発明者】

【氏名】トゥーメ，ポール

(72)【発明者】

【氏名】ロンバーグ，ニルス

(72)【発明者】

【氏名】ドゥラマド，オマル

【テーマコード（参考）】

4B064

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085DD61

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書には、（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数の突然変異を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、バリアントＦｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比較して減少したエフェクタ機能を示す、複合体結合分子が記載される。また、癌を処置する方法に当該複合体結合分子を使用する方法も記載される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数の突然変異を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、前記バリアントＦｃ領域が、前記野生型Ｆｃ領域と比較して改変されたエフェクタ機能を示す、複合体結合分子。

【請求項2】

前記改変されたエフェクタ機能が、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の減少、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の減少、Ｃ１ｑに対する親和性の減少、およびそれらのあらゆる組合せからなるリストから選択される、請求項１に記載の複合体結合分子。

【請求項3】

前記バリアントＦｃ領域が、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、前記１つまたは複数の突然変異が、ＥＵナンバリングよる（ａ）２９７Ａ、２９７Ｑ、２９７Ｇ、もしくは２９７Ｄ、（ｂ）２７９Ｆ、２７９Ｋ、もしくは２７９Ｌ、（ｃ）２２８Ｐ、（ｄ）２３５Ａ、２３５Ｅ、２３５Ｇ、２３５Ｑ、２３５Ｒ、もしくは２３５Ｓ、（ｅ）２３７Ａ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、もしくは２３７Ｒ、（ｆ）２３４Ａ、２３４Ｖ、もしくは２３４Ｆ、（ｇ）２３３Ｐ、（ｈ）３２８Ａ、（ｉ）３２７Ｑもしくは３２７Ｔ、（ｊ）３２９Ａ、３２９Ｇ、３２９Ｙ、もしくは３２９Ｒ、（ｋ）３３１Ｓ、（ｌ）２３６Ｆもしくは２３６Ｒ、（ｍ）２３８Ａ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、もしくは２３８Ｙ、（ｎ）２４８Ａ、（ｏ）２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｔ、もしくは２５４Ｖ、（ｐ）２５５Ｎ、（ｑ）２５６Ｈ、２５６Ｋ、２５６Ｒ、もしくは２５６Ｖ、（ｒ）２６４Ｓ、（ｓ）２６５Ｈ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６５Ｙ、もしくは２６５Ａ、（ｔ）２６７Ｇ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、もしくは２６７Ｋ、（ｕ）２６８Ｋ、（ｖ）２６９Ｎもしくは２６９Ｑ、（ｗ）２７０Ａ、２７０Ｇ、２７０Ｍ、もしくは２７０Ｎ、（ｘ）２７１Ｔ、（ｙ）２７２Ｎ、（ｚ）２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、もしくは２９２Ｉ、（ａａ）２９３Ｓ、（ｂｂ）３０１Ｗ、（ｃｃ）３０４Ｅ、（ｄｄ）３１１Ｅ、３１１Ｇ、もしくは３１１Ｓ、（ｅｅ）３１６Ｆ、（ｆｆ）３２８Ｖ、（ｇｇ）３３０Ｒ、（ｈｈ）３３９Ｅもしくは３３９Ｌ、（ｉｉ）３４３Ｉもしくは３４３Ｖ、（ｊｊ）３７３Ａ、３７３Ｇ、もしくは３７３Ｓ、（ｋｋ）３７６Ｅ、３７６Ｗ、もしくは３７６Ｙ、（ｌｌ）３８０Ｄ、（ｍｍ）３８２Ｄもしくは３８２Ｐ、（ｎｎ）３８５Ｐ、（ｏｏ）４２４Ｈ、４２４Ｍ、もしくは４２４Ｖ、（ｐｐ）４３４Ｉ、（ｑｑ）４３８Ｇ、（ｒｒ）４３９Ｅ、４３９Ｈ、もしくは４３９Ｑ、（ｓｓ）４４０Ａ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、４４０Ｍ、４４０Ｔ、もしくは４４０Ｖ、（ｔｔ）Ｋ３２２Ａ、（ｕｕ）Ｌ２３５Ｅ、（ｖｖ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、（ｗｗ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ、（ｘｘ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ、（ｙｙ）Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３３１Ｓ、（ｚｚ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａ、（ａａａ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、およびＰ３３１Ｓ、（ｂｂｂ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ、（ｃｃｃ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａ、（ｄｄｄ）Ｇ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒ、（ｅｅｅ）Ｇ２３７Ａ、（ｆｆｆ）Ｆ２４１Ａ、（ｇｇｇ）Ｖ２６４Ａ、（ｈｈｈ）Ｄ２６５Ａ、（ｉｉｉ）Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ａ、（ｊｊｊ）Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇ、（ｋｋｋ）Ｄ２７０Ａ、（ｌｌｌ）Ａ３３０Ｌ、（ｍｍｍ）Ｐ３３１ＡもしくはＰ３３１Ｓ、または（ｎｎｎ）Ｅ２３３Ｐ、（ｏｏｏ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ、あるいは（ｐｐｐ）（ａ）～（ｕｕ）のあらゆる組合せを含む、請求項１～２のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項4】

前記バリアントＦｃ領域が表１から選択される、請求項１～２のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項5】

野生型Ｆｃ領域と比較して前記１つまたは複数の突然変異が、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、またはＰ３３１Ｓのうち１つまたは複数を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項6】

野生型Ｆｃ領域と比較して前記１つまたは複数の突然変異が、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項7】

野生型Ｆｃ領域と比較して前記１つまたは複数の突然変異が、ＥＵナンバリングによるＫ３２２Ａを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項8】

野生型Ｆｃ領域と比較して前記１つまたは複数の突然変異が、ＥＵナンバリングによるＳ３２９ＤおよびＩ３３２Ｅを含むか、またはそれらからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項9】

野生型Ｆｃ領域と比較して前記１つまたは複数の突然変異が、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓを含むか、またはそれらからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項10】

野生型Ｆｃ領域と比較して前記１つまたは複数の突然変異が、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇを含むか、またはそれらからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項11】

野生型Ｆｃ領域と比較して前記１つまたは複数の突然変異が、
Ｎ２９７Ａ／Ｑ／Ｇ、Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、およびＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項12】

前記ＣＤ３８抗原結合成分が、
ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号８１～８５または１５１～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、
前記ＣＤ１９抗原結合成分が、
ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項13】

前記ＣＤ３８抗原結合成分が、配列番号１５１～１５５に明記されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の複合体結合分子。

【請求項14】

前記ＣＤ３８抗原結合成分が、配列番号１５４に明記されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の複合体結合分子。

【請求項15】

前記ＣＤ３８抗原結合成分が、配列番号８１～８５に明記されるアミノ酸配列のうちいずれか１つを含むＨＣＤＲ２アミノ酸配列を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項16】

前記ＣＤ３８抗原結合成分が、配列番号３または５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項17】

前記抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号３または５と同一のアミノ酸配列を含み、前記抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号４と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の複合体結合分子。

【請求項18】

前記ＣＤ１９抗原結合成分が、配列番号１、６、または７に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、抗ＣＤ１９免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項19】

前記抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖可変領域が、配列番号１、６、または７と同一のアミノ酸配列を含み、前記抗ＣＤ１９免疫グロブリン軽鎖可変領域が、配列番号２と同一のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の複合体結合分子。

【請求項20】

抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖可変領域が、免疫グロブリン重鎖定常領域をさらに含み、抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域が、前記抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域のホモ二量体化を支持しないが、非抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域との前記抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域のヘテロ二量体化を促進させる、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項21】

前記抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域が、前記抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域および前記非抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域のヘテロ二量体化が抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖のホモ二量体化と比較して支持されるように、Ｔ３６６Ｗ置換（ＥＵナンバリング）またはＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ置換（ＥＵナンバリング）を含む、請求項２０に記載の複合体結合分子。

【請求項22】

抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖可変領域が、免疫グロブリン重鎖定常領域をさらに含み、抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域が、前記抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域のホモ二量体化を支持しないが、非抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域との第２の重鎖定常領域のヘテロ二量体化を促進させる、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項23】

前記抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域が、前記抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域および前記非抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域のヘテロ二量体化が抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖のホモ二量体化と比較して支持されるように、Ｔ３６６Ｗ置換（ＥＵナンバリング）またはＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ置換（ＥＵナンバリング）を含む、請求項２２に記載の複合体結合分子。

【請求項24】

抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域が、免疫グロブリン軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項25】

前記ＣＤ１９抗原結合成分が、配列番号３０１または３０４に明記される重鎖免疫グロブリン配列および配列番号２１３に明記される軽鎖免疫グロブリン配列を含み、ＣＤ３８結合成分が、配列番号３０２、３０３、３０５～３１０に明記される重鎖免疫グロブリン配列および配列番号２１３に明記される軽鎖免疫グロブリン配列を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項26】

抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖可変領域が、ＫａｂａｔナンバリングによるＡ８４ＳまたはＡ１０８Ｌ置換を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項27】

抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域が、ＫａｂａｔナンバリングによるＷ３２Ｈ置換を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項28】

単一の二特異性結合分子が、前記ＣＤ３８抗原結合成分および前記ＣＤ１９抗原結合成分から形成される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項29】

共通軽鎖二特異性抗体である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項30】

請求項１～２９のいずれか一項に記載の複合体結合分子を含む組成物であって、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤をさらに含む組成物。

【請求項31】

請求項１～３０のいずれか一項に記載の複合体結合分子をコードするポリヌクレオチド配列を含む、核酸または複数の核酸。

【請求項32】

（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数の突然変異を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、前記バリアントＦｃ領域が、前記野生型Ｆｃ領域と比較して減少したエフェクタ機能を示し、前記ＣＤ３８抗原結合成分が、
ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号８１～８５または１５１～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、
前記ＣＤ１９抗原結合成分が、
ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、複合体結合分子。

【請求項33】

（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）表１から選択される１つまたは複数の突然変異を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、前記ＣＤ３８抗原結合成分が、
ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号８１～８５または１５１～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、
前記ＣＤ１９抗原結合成分が、
ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、複合体結合分子。

【請求項34】

（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、および／またはＰ３３１Ｓ突然変異（ＥＵナンバリング）を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、前記ＣＤ３８抗原結合成分が、
ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号８１～８５または１５１～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、
前記ＣＤ１９抗原結合成分が、
ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、複合体結合分子。

【請求項35】

（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）Ｓ３２９ＤおよびＩ３３２Ｅ突然変異（ＥＵナンバリング）を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、前記ＣＤ３８抗原結合成分が、
ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号８１～８５または１５１～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、
前記ＣＤ１９抗原結合成分が、
ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、複合体結合分子。

【請求項36】

前記バリアントＦｃ領域が、非バリアントＦｃ領域を含む抗体と比較して、ＡＤＣＣを少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％以上減少させる、請求項１～３５のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項37】

前記バリアントＦｃ領域が、非バリアントＦｃ領域を含む抗体と比較して、ＣＤＣを少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％以上減少させる、請求項１～３５のいずれか一項に記載の複合体結合分子。

【請求項38】

癌または腫瘍に罹患した個体を処置する方法であって、前記癌または腫瘍に罹患した前記個体に請求項１～３７のいずれか一項に記載の複合体結合分子を投与することによって、前記癌または腫瘍を処置する工程を含む方法。

【請求項39】

前記癌または腫瘍が血液癌である、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

血液癌がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

Ｂ細胞悪性腫瘍がＢ細胞急性リンパ球性白血病である、請求項３８に記載の方法。

【請求項42】

前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、または非ホジキンリンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫）である、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

前記血液癌が血漿悪性腫瘍である、請求項４０に記載の方法。

【請求項44】

前記血漿悪性腫瘍が多発性骨髄腫である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

血液癌がＣＤ１９およびＣＤ３８を発現する、請求項３８～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記癌または腫瘍が固形組織癌である、請求項３８に記載の方法。

【請求項47】

前記固形組織癌が、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、食道癌、皮膚癌、大腸癌、または頭頸部癌を含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌であり、前記肺癌が非小細胞肺癌であり、前記頭頸部癌が頭頸部扁平上皮癌であり、前記腎臓癌が腎細胞癌であり、脳腫瘍が多形性膠芽腫であり、または前記皮膚癌が黒色腫である、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

腫瘍または癌に罹患した個体の腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある腫瘍浸潤性Ｂ細胞を低減させる方法であって、前記腫瘍または癌に罹患した前記個体に請求項１～３７のいずれか一項に記載の複合体結合分子を投与することによって、前記腫瘍中の腫瘍浸潤性Ｂ細胞を低減させる工程を含む、方法。

【請求項50】

腫瘍または癌に罹患した個体の腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある免疫抑制性Ｂ細胞を低減させる方法であって、前記腫瘍または癌に罹患した前記個体に請求項１～３７のいずれか一項に記載の複合体結合分子を投与することによって、前記腫瘍中の免疫抑制性Ｂ細胞を低減させる工程を含む、方法。

【請求項51】

腫瘍または癌に罹患した個体の腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある免疫抑制性Ｂ細胞の機能を阻害する方法であって、前記腫瘍または癌に罹患した前記個体に請求項１～３７のいずれか一項に記載の複合体結合分子を投与することによって、前記腫瘍中の免疫抑制性Ｂ細胞による免疫抑制を低減する工程を含む、方法。

【請求項52】

腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある免疫抑制性Ｂ細胞の機能を阻害する方法であって、前記免疫抑制性Ｂ細胞を請求項１～３７のいずれか一項に記載の複合体結合分子に接触させることによって、前記腫瘍中の前記免疫抑制性Ｂ細胞による免疫抑制を低減させる工程を含む、方法。

【請求項53】

前記免疫抑制性Ｂ細胞の機能が、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－β、またはそれらの組合せの放出を含む、請求項５０～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記腫瘍浸潤性Ｂ細胞または免疫抑制性Ｂ細胞が、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞、ＣＤ３８^＋陽性Ｂ細胞、ＣＤ１９、ＣＤ３８二重陽性Ｂ細胞、またはそれらの組合せを含む、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

請求項１～３７のいずれか一項に記載の複合体結合分子を作製する方法であって、前記複合体結合分子の細胞培養培地への発現、集合、および分泌を可能にするのに十分な条件下で前記細胞培養培地において細胞をインキュベートする工程を含む方法。

【請求項56】

前記細胞培養培地から前記複合体結合分子を単離および精製する工程を含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

癌または腫瘍を処置する方法における、請求項１～３７のいずれか一項に記載の複合体結合分子の使用。

【請求項58】

前記癌または腫瘍が血液癌である、請求項５７に記載の使用。

【請求項59】

前記血液癌がＢ細胞悪性腫瘍である、請求項５８に記載の使用。

【請求項60】

前記Ｂ細胞悪性腫瘍がＢ細胞急性リンパ球性白血病である、請求項５９に記載の使用。

【請求項61】

前記Ｂ細胞悪性腫瘍が、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、または非ホジキンリンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫）である、請求項６０に記載の使用。

【請求項62】

前記血液癌が形質細胞悪性腫瘍である、請求項５８に記載の使用。

【請求項63】

前記形質細胞悪性腫瘍が多発性骨髄腫である、請求項６２に記載の使用。

【請求項64】

前記血液癌がＣＤ１９およびＣＤ３８を発現する、請求項５８～６３のいずれか一項に記載の使用。

【請求項65】

前記癌または腫瘍が固形組織癌である、請求項５７に記載の使用。

【請求項66】

前記固形組織癌が、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、食道癌、皮膚癌、大腸癌、または頭頸部癌を含む、請求項６５に記載の使用。

【請求項67】

前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌であり、前記肺癌が非小細胞肺癌であり、前記頭頸部癌が頭頸部扁平上皮癌であり、前記腎臓癌が腎細胞癌であり、脳腫瘍が多形性膠芽腫であり、または前記皮膚癌が黒色腫である、請求項６６に記載の使用。

【請求項68】

腫瘍または癌に罹患した個体の腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある腫瘍浸潤性Ｂ細胞を低減させる方法における、請求項１～３７のいずれか一項に記載の複合体結合分子の使用。

【請求項69】

腫瘍または癌に罹患した個体の腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある免疫抑制性Ｂ細胞を低減させる方法における、請求項１～３７のいずれか一項に記載の複合体結合分子の使用であって、前記方法が、前記腫瘍または癌に罹患した前記個体に投与する工程を含む、使用。

【請求項70】

腫瘍または癌に罹患した個体の腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある免疫抑制性Ｂ細胞の機能を阻害する方法における、請求項１～３７のいずれか一項に記載の複合体結合分子の使用。

【請求項71】

免疫抑制性Ｂ細胞の機能が、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－β、またはそれらの組合せの放出を含む、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の使用。

【請求項72】

前記腫瘍浸潤性Ｂ細胞または免疫抑制性Ｂ細胞が、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞、ＣＤ３８^＋陽性Ｂ細胞、ＣＤ１９、ＣＤ３８二重陽性Ｂ細胞、またはそれらの組合せを含む、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０２１年８月２５日出願の米国仮特許出願第６３／２３７，０６５号に基づく利益を主張し、当該仮特許出願は、あらゆる目的のためにその全体を参照することによって本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

抗体治療薬は様々な疾患を処置するために首尾よく使用されてきたが、それらの適用は、癌などの複雑な疾患に対する臨床的有効性に関して制限される可能性がある。標的結合親和性および価数を変更するために抗体ベースの治療薬を操作することで、有効性向上の達成および処置アウトカムの改善に向けた候補となる経路が得られる。このため、二特異性または多価抗体が、複雑な疾患の多因子的な性質に結び付けられた課題を解決するための候補となるアプローチを提供する。２つの異なる抗原分子、または同じ抗原の異なるエピトープを結合することにより、二特異性抗体はより大きな機能性をもたらし、多数の疾患の処置のための標的化剤としての多様な用途を与える。

【発明の概要】

【0003】

癌生物学と免疫系との動的な関係性は、臨床アウトカムと関連付けられる要因である。免疫応答は、癌の発症中、腫瘍微環境の調節において意義深い役割を果たす。このため、Ｔ細胞およびＢ細胞などの免疫細胞は、癌の進行または転移のモジュレータおよびエフェクタとして作用する。顕著なことに、免疫抑制細胞は抗腫瘍免疫応答において重要な役割を果たし、このときに免疫抑制は、一般的に腫瘍の成長および浸潤と関連付けられ、負のアウトカムと相関する。Ｂ細胞は免疫応答を正に調節することが公知であるが、免疫抑制性Ｂ細胞の集団は、抗腫瘍免疫応答を抑制して腫瘍成長を促すように機能する。

【0004】

本明細書には、二特異性または多価の標的化分子を有する免疫抑制性Ｂ細胞集団を標的化する、特定の結合分子が提供される。免疫抑制性Ｂ細胞集団の標的化は、（例えば、上皮癌細胞集団の選択的な枯渇とは対照的に）処置アウトカムを改善するために抗腫瘍免疫応答を有効に調節する、癌に対する治療介入用の経路を提示する。本明細書で提供される結合分子は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、および／またはＣＤ２０）ならびに免疫抑制性Ｂ細胞の表面マーカ（例えば、ＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、および／または潜在性ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β ＬＡＰ））に結合する、二特異性抗体を含むことができる。特定の具体的な実施形態では、二特異性抗体は、ＣＤ１９およびＣＤ３８に結合するので、特異的な免疫抑制性Ｂ細胞集団に対する選択性を有する。

【0005】

特定の例では、二特異性または多価の標的化分子は、免疫抑制性Ｂ細胞集団を標的化する（例えば、それにより免疫抑制を低減する）ことで、腫瘍細胞の直接標的化と比較して腫瘍クリアランスを促進させるか、または腫瘍成長を阻害する。このような事例では、腫瘍細胞を直接標的化しない場合、標的細胞における抗体誘導型の細胞死または細胞毒性は望ましくなく、さらに、（例えば、腫瘍細胞ではない）標的細胞における抗体誘導型の細胞死または細胞毒性は、望まれない副作用（例えば、リンパ球減少症）に繋がるおそれがある。

【0006】

本明細書には、（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数の突然変異を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、バリアントＦｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比較して改変されたエフェクタ機能を示す、複合体結合分子が提供される。一部の実施形態では、改変されたエフェクタ機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の減少、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の減少、Ｃ１ｑに対する親和性の減少、およびそれらのあらゆる組合せからなるリストから選択される。一部の実施形態では、改変されたエフェクタ機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の増加、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の減少、Ｃ１ｑに対する親和性の減少、およびそれらのあらゆる組合せからなるリストから選択される。

【0007】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングよる、（ａ）２９７Ａ、２９７Ｑ、２９７Ｇ、もしくは２９７Ｄ、（ｂ）２７９Ｆ、２７９Ｋ、もしくは２７９Ｌ、（ｃ）２２８Ｐ、（ｄ）２３５Ａ、２３５Ｅ、２３５Ｇ、２３５Ｑ、２３５Ｒ、もしくは２３５Ｓ、（ｅ）２３７Ａ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、もしくは２３７Ｒ、（ｆ）２３４Ａ、２３４Ｖ、もしくは２３４Ｆ、（ｇ）２３３Ｐ、（ｈ）３２８Ａ、（ｉ）３２７Ｑもしくは３２７Ｔ、（ｊ）３２９Ａ、３２９Ｇ、３２９Ｙ、もしくは３２９Ｒ、（ｋ）３３１Ｓ、（ｌ）２３６Ｆもしくは２３６Ｒ、（ｍ）２３８Ａ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、もしくは２３８Ｙ、（ｎ）２４８Ａ、（ｏ）２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｔ、もしくは２５４Ｖ、（ｐ）２５５Ｎ、（ｑ）２５６Ｈ、２５６Ｋ、２５６Ｒ、もしくは２５６Ｖ、（ｒ）２６４Ｓ、（ｓ）２６５Ｈ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６５Ｙ、もしくは２６５Ａ、（ｔ）２６７Ｇ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、もしくは２６７Ｋ、（ｕ）２６８Ｋ、（ｖ）２６９Ｎもしくは２６９Ｑ、（ｗ）２７０Ａ、２７０Ｇ、２７０Ｍ、または２７０Ｎ、（ｘ）２７１Ｔ、（ｙ）２７２Ｎ、（ｚ）２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、もしくは２９２Ｉ、（ａａ）２９３Ｓ、（ｂｂ）３０１Ｗ、（ｃｃ）３０４Ｅ、（ｄｄ）３１１Ｅ、３１１Ｇ、もしくは３１１Ｓ、（ｅｅ）３１６Ｆ、（ｆｆ）３２８Ｖ、（ｇｇ）３３０Ｒ、（ｈｈ）３３９Ｅもしくは３３９Ｌ、（ｉｉ）３４３Ｉもしくは３４３Ｖ、（ｊｊ）３７３Ａ、３７３Ｇ、もしくは３７３Ｓ、（ｋｋ）３７６Ｅ、３７６Ｗ、もしくは３７６Ｙ、（ｌｌ）３８０Ｄ、（ｍｍ）３８２Ｄもしくは３８２Ｐ、（ｎｎ）３８５Ｐ、（ｏｏ）４２４Ｈ、４２４Ｍ、もしくは４２４Ｖ、（ｐｐ）４３４Ｉ、（ｑｑ）４３８Ｇ、（ｒｒ）４３９Ｅ、４３９Ｈ、もしくは４３９Ｑ、（ｓｓ）４４０Ａ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、４４０Ｍ、４４０Ｔ、もしくは４４０Ｖ、（ｔｔ）Ｋ３２２Ａ、（ｕｕ）Ｌ２３５Ｅ、（ｖｖ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、（ｗｗ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ、（ｘｘ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ、（ｙｙ）Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３３１Ｓ、（ｚｚ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａ、（ａａａ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、およびＰ３３１Ｓ、（ｂｂｂ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ、（ｃｃｃ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａ、（ｄｄｄ）Ｇ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒ、（ｅｅｅ）Ｇ２３７Ａ、（ｆｆｆ）Ｆ２４１Ａ、（ｇｇｇ）Ｖ２６４Ａ、（ｈｈｈ）Ｄ２６５Ａ、（ｉｉｉ）Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ａ、（ｊｊｊ）Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇ、（ｋｋｋ）Ｄ２７０Ａ、（ｌｌｌ）Ａ３３０Ｌ、（ｍｍｍ）Ｐ３３１ＡもしくはＰ３３１Ｓ、または（ｎｎｎ）Ｅ２３３Ｐ、（ｏｏｏ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ、あるいは（ｐｐｐ）（ａ）～（ｕｕ）のあらゆる組合せを含む。

【0008】

一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、Ｎ２９７Ａ／Ｑ／Ｇ、Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、およびＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａからなる群から選択される。

【0009】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、表１から選択される。一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングによる、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、および／またはＰ３３１Ｓを含む。一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングによる、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓを含む。一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングによるＫ３２２Ａを含む。一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングによるＫ３２２Ａからなる。一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングによるＳ３２９ＤおよびＩ３３２Ｅからなる。

【0010】

一部の実施形態では、ＣＤ３８抗原結合成分は、
ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号８１～８５または１５１～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、
ＣＤ１９抗原結合成分は、
ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む。

【0011】

一部の実施形態では、ＣＤ３８抗原結合成分は、配列番号１５１～１５５に明記されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８抗原結合成分は、配列番号１５４に明記されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８抗原結合成分は、配列番号８１～８５に明記されるアミノ酸配列のうちいずれか１つを含むＨＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号３または５に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号３または５と同一のアミノ酸配列を含み、抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号４と同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１、６、または７に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗ＣＤ１９免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号２に対して少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖可変領域は、配列番号１、６、または７と同一のアミノ酸配列を含み、抗ＣＤ１９免疫グロブリン軽鎖可変領域は、配列番号２と同一のアミノ酸配列を含む。

【0012】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖可変領域は、免疫グロブリン重鎖定常領域をさらに含み、抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域は、抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域のホモ二量体化を支持しないが非抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域との抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域のヘテロ二量体化を促進させる、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域は、抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域および非抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖定常領域のヘテロ二量体化が抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖のホモ二量体化と比較して支持されるように、Ｔ３６６Ｗ置換（ＥＵナンバリング）またはＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ置換（ＥＵナンバリング）を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖可変領域は、免疫グロブリン重鎖定常領域をさらに含み、抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域は、抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域のホモ二量体化を支持しないが非抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域との第２の重鎖定常領域のヘテロ二量体化を促進させる、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域は、抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域および非抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖定常領域のヘテロ二量体化が抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖のホモ二量体化と比較して支持されるように、Ｔ３６６Ｗ置換（ＥＵナンバリング）またはＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ置換（ＥＵナンバリング）を含む。

【0013】

一部の実施形態では、抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域は、免疫グロブリン軽鎖定常領域をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９抗原結合成分は、配列番号３０１または３０４に明記される重鎖免疫グロブリン配列および配列番号２１３に明記される軽鎖免疫グロブリン配列を含み、ＣＤ３８結合成分は、配列番号３０２、３０３、３０５～３１０に明記される重鎖免疫グロブリン配列および配列番号２１３に明記される軽鎖免疫グロブリン配列を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖可変領域は、ＫａｂａｔナンバリングによるＡ８４ＳまたはＡ１０８Ｌ置換を含む。一部の実施形態では、抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域は、ＫａｂａｔナンバリングによるＷ３２Ｈ置換を含む。

【0014】

一部の実施形態では、単一の二特異性結合分子が、ＣＤ３８抗原結合成分およびＣＤ１９抗原結合成分から形成される。一部の実施形態では、複合体結合分子は、共通軽鎖二特異性抗体である。一部の実施形態では、二特異性結合分子は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、または賦形剤を含む組成物の一部である。

【0015】

また本明細書には、（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）野生型Ｆｃ領域と比較して１つまたは複数の突然変異を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、バリアントＦｃ領域が、野生型Ｆｃ領域と比較して改変されたエフェクタ機能を示し、ＣＤ３８抗原結合成分が、
ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号８１～８５または１５１～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、
ＣＤ１９抗原結合成分が、
ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、複合体結合分子が提供される。

【0016】

さらに本明細書には、（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）表１から選択される１つまたは複数の突然変異を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、ＣＤ３８抗原結合成分が、
ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号８１～８５または１５１～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、
ＣＤ１９抗原結合成分が、
ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、複合体結合分子が提供される。

【0017】

（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、および／またはＰ３３１Ｓ突然変異（ＥＵナンバリング）を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、ＣＤ３８抗原結合成分が、
ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号８１～８５または１５１～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、
ＣＤ１９抗原結合成分が、
ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、複合体結合分子が提供される。

【0018】

また、（ｉ）ＣＤ３８に結合するＣＤ３８抗原結合成分と、（ｉｉ）ＣＤ１９に結合するＣＤ１９抗原結合成分と、（ｉｉｉ）３２２Ａ突然変異（ＥＵナンバリング）を含むバリアントＦｃ領域とを含む複合体結合分子であって、ＣＤ３８抗原結合成分が、
ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｂ）配列番号８１～８５または１５１～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、
ＣＤ１９抗原結合成分が、
ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、
ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、
ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、
ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、
ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および
ｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む、複合体結合分子が提供される。
一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、非バリアントＦｃ領域を含む抗体と比較して、ＡＤＣＣを少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％以上減少させる。

【0019】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、非バリアントＦｃ領域を含む抗体と比較して、ＣＤＣを少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％以上減少させる。

【0020】

癌または腫瘍に罹患した個体を処置する方法であって、癌または腫瘍に罹患した個体に本明細書に記載の複合体結合分子を投与することによって、癌または腫瘍を処置する工程を含む方法が提供される。

【0021】

一部の実施形態では、癌または腫瘍は、血液癌である。一部の実施形態では、血液癌はＢ細胞悪性腫瘍である。一部の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、Ｂ細胞急性リンパ球性白血病である。一部の実施形態では、Ｂ細胞悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、または非ホジキンリンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫）である。一部の実施形態では、血液癌は、血漿悪性腫瘍である。一部の実施形態では、血漿悪性腫瘍は、多発性骨髄腫である。一部の実施形態では、血液癌は、ＣＤ１９およびＣＤ３８を発現する。

【0022】

一部の実施形態では、癌または腫瘍は、固形組織癌である。一部の実施形態では、固形組織癌は、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、食道癌、皮膚癌、大腸癌、または頭頸部癌を含む。一部の実施形態では、乳癌はトリプルネガティブ乳癌であり、肺癌は非小細胞肺癌であり、頭頸部癌は頭頸部扁平上皮癌であり、腎臓癌は腎細胞癌であり、脳腫瘍は多形性膠芽腫であり、または皮膚癌は黒色腫である。

【0023】

また、腫瘍または癌に罹患した個体の腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある腫瘍浸潤性Ｂ細胞を低減させる方法であって、腫瘍または癌に罹患した個体に本明細書に記載の複合体結合分子を投与することによって、腫瘍中の腫瘍浸潤性Ｂ細胞を低減させる工程を含む、方法が提供される。

【0024】

腫瘍または癌に罹患した個体の腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある免疫抑制性Ｂ細胞を低減させる方法であって、腫瘍または癌に罹患した個体に本明細書に記載の複合体結合分子を投与することによって、腫瘍中の免疫抑制性Ｂ細胞を低減させる工程を含む、方法が提供される。

【0025】

さらに、腫瘍または癌に罹患した個体の腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある免疫抑制性Ｂ細胞の機能を阻害する方法であって、腫瘍または癌に罹患した個体に本明細書に記載の複合体結合分子を投与することによって、腫瘍中の免疫抑制性Ｂ細胞による免疫抑制を低減させる工程を含む、方法が提供される。また、腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある免疫抑制性Ｂ細胞の機能を阻害する方法であって、免疫抑制性Ｂ細胞を本明細書に記載の複合体結合分子に接触させることによって、腫瘍中の免疫抑制性Ｂ細胞による免疫抑制を低減させる工程を含む、方法が提供される。

【0026】

一部の実施形態では、免疫抑制性Ｂ細胞の機能は、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－β、またはこれらの組合せの放出を含む。一部の実施形態では、腫瘍浸潤性Ｂ細胞または免疫抑制性Ｂ細胞は、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞、ＣＤ３８＋陽性Ｂ細胞、ＣＤ１９・ＣＤ３８二重陽性Ｂ細胞、またはそれらの組合せを含む。

【0027】

また、本明細書に記載の複合体結合分子を作製する方法であって、複合体結合分子の細胞培養培地への発現、集合、および分泌を可能にするのに十分な条件下で細胞培養培地において細胞をインキュベートする工程を含む方法が提供される。一部の実施形態では、本方法は、細胞培養培地から分子を単離かつ精製する工程を含む。

【0028】

参照による援用
本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により援用されることを具体的かつ個々に示された場合と同じ程度まで参照により本明細書に援用される。

【図面の簡単な説明】

【0029】

本発明の新規の特色は、添付の請求項で具体的に明記される。本発明の特色および利点は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を明記する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって、より良く理解されるであろう。

【0030】

【図1】共通軽鎖二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図2】Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図3】Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図4】Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図5】Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図6】Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図7】ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図8】Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図9】Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図10】Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図11】ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧの構造を図示する。

【図12A】Ｄａｕｄｉ細胞に対する抗体の結合データを示す図である。

【図12B】Ｄａｕｄｉ細胞に対する抗体の結合データを示す図である。

【図13A】ＲＥＨ細胞に対する抗体の結合データを示す図である。

【図13B】ＲＥＨ細胞に対する抗体の結合データを示す図である。

【図14A】ＣＤ１９をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する抗体の結合データを示す図である。

【図14B】ＣＤ１９をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する抗体の結合データを示す図である。

【図15A】ＣＤ３８をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する抗体の結合データを示す図である。

【図15B】ＣＤ３８をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する抗体の結合データを示す図である。

【図16A】非トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する抗体の結合データを示す図である。

【図16B】非トランスフェクトＣＨＯ細胞に対する抗体の結合データを示す図である。

【図17A】抗体被験物質に関する、Ｄａｕｄｉ細胞に対する直接的なアポトーシのデータを示す図である。

【図17B】抗体被験物質に関する、Ｄａｕｄｉ細胞に対する直接的なアポトーシのデータを示す図である。

【図18A】抗体被験物質に関する、Ｄａｕｄｉ細胞に対する架橋誘導性アポトーシスのデータを示す図である。

【図18B】抗体被験物質に関する、Ｄａｕｄｉ細胞に対する架橋誘導性アポトーシスのデータを示す図である。

【図19A】抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図19B】抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図19C】抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図20A】抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図20B】抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図20C】抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図21A】被験物質にわたるＣＤＣプロファイルを示す図である。

【図21B】被験物質にわたるＣＤＣプロファイルを示す図である。

【図22】抗体被験物質にわたるＡＤＣＰデータを示す図である。

【図23】抗体被験物質にわたるＲＢＣ結合データを示す図である。

【図24A】抗体被験物質についての赤血球凝集プロファイルを示す図である。

【図24B】抗体被験物質についての赤血球凝集プロファイルを示す図である。

【図25】抗体被験物質にわたる溶血データを示す図である。

【図26A】バリアントを有するものを含め抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図26B】バリアントを有するものを含め抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図26C】バリアントを有するものを含め抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図26D】バリアントを有するものを含め抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図26E】バリアントを有するものを含め抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図26F】バリアントを有するものを含め抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【図26G】バリアントを有するものを含め抗体被験物質にわたるドナー３名のＡＤＣＣデータを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0031】

抗腫瘍免疫応答を抑制する免疫抑制性Ｂ細胞集団は、一般的に、１より多くの細胞表面バイオマーカの存在により定義することができる。そのため、免疫抑制性Ｂ細胞を有効かつ特異的に標的化する治療薬は、腫瘍中で、それに隣接して、もしくはその周囲において、または腫瘍環境内で免疫抑制を防止するため、および／または免疫抑制を除去するために使用することができる。本明細書には、免疫抑制性Ｂ細胞を標的化する複合体結合性分子が提供される。さらに、第１の標的に結合するように構成された第１の結合成分および第２の標的に結合するように構成された第２の結合成分を含む複合体結合分子であって、第１の標的がＢ細胞系列表面マーカを含み、第２の標的が抑制性Ｂ細胞表面マーカを含む、複合体結合分子が提供される。本明細書には、抗腫瘍応答の負の調節または免疫抑制と関連付けられるＢ細胞集団に特異的に結合する多価抗体が開示される。免疫抑制性Ｂ細胞は、細胞表面バイオマーカＣＤ１９およびＣＤ３８を含み得るか、またはそれらにより定義され得る。本明細書で提供される二特異性抗体は、ＣＤ１９およびＣＤ３８の両方を標的化して免疫抑制性Ｂ細胞の機能を阻害することができる。特定の事例では、免疫抑制性Ｂ細胞の機能は、ＩＬ１０、ＩＬ３５、ＴＧＦ－β、もしくはこれらの組合せの放出を含む。ＣＤ１９およびＣＤ３８を標的化する多価または二特異性の抗体はまた、免疫抑制性Ｂ細胞および／または免疫機能障害と関連付けられた腫瘍形成性状態および／または癌を処置するために使用することもできる。

【0032】

「免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、「免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、または「負の免疫調節」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫系機能の低減または抑制を指し、すなわち、免疫抑制は、一般的に免疫系機能が低減されているかまたは存在しない状態を表す。特定の事例では、免疫抑制は一般的に、腫瘍に対する、または腫瘍微環境内、その周囲、もしくはそれに隣接する免疫系機能が低減されているか、または存在しない状態を表す。全体的な免疫応答が抑制され得るか、局所的もしくは特異的な領域内の免疫応答が低減され得るか、または免疫学的に活性なリンパ球の特定の集団が選択的に影響を受け得る。抗原特異的な免疫抑制は、抗原特異的な細胞の特定の集団の欠失もしくは抑制の結果、または抗原特異的な抑制細胞による免疫応答の調節向上の結果であり得る。免疫抑制性Ｂ細胞への言及は、免疫応答に対する負の調節を奏するＢ細胞またはＢ細胞集団を指し、ＣＤ３８など、このような集団と関連付けられる特異的な表面マーカにより同定することができる。特定の事例では、免疫抑制は、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－β、もしくはこれらの組合せの存在または放出により同定することができる。特定の事例では、免疫抑制は、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－β、またはそれらの組合せの存在、またはそれらのＢ細胞による放出により同定することができる。

【0033】

本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、未調節の細胞成長により典型的に特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはそれを記載することができる。癌には、血液腫瘍および／または固形腫瘍も挙げられ得るが、これらに限定されない。癌は、膀胱、血液、骨、脳、乳房、子宮頸部、胸部、結腸、子宮内膜、食道、眼、頭部、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、口、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、直腸、皮膚、胃、精巣、咽頭、および子宮が挙げられるがこれらに限定されない、血液、骨、器官、皮膚組織、および血管系の疾患を指すことができる。具体的な癌としては、白血病（急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ヘアリー細胞白血病、成熟Ｂ細胞腫瘍（小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫（ワルデンシュトレーム巨細胞腫（Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ’ｓ ｇｉａｎｔ ｂａｌｌ）、蛋白血症、もしくは低悪性度リンパ腫）、脾臓辺縁領域リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞白血病、形質細胞腫、インプラント周囲免疫グロブリン沈着、重鎖病、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、胃腸腫瘍（例えば、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ））、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫／白血病、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、およびバーキットのリンパ腫（バーキットリンパ腫）、成熟Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）腫瘍（前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大リンパ球性白血病（Ｔ－ｃｅｌｌ ｌａｒｇｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、浸潤性ＮＫ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、芽球性ＮＫ細胞リンパ腫、菌状息肉症（セザリー症候群）、原発性皮膚変性性大細胞リンパ腫（ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｋｉｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、リンパ腫様丘疹症、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、非特定型末梢Ｔ細胞リンパ腫および変性性大細胞リンパ腫（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ホジキンリンパ腫（結節硬化型、混合細胞型、リンパ球リッチ型、リンパ球枯渇または非低減型、結節性リンパ球型）、骨髄腫（多発性骨髄腫、不活性型骨髄腫（ｉｎｅｒｔ ｍｙｅｌｏｍａ）、くすぶり型骨髄腫））、慢性骨髄増殖性疾患、脊髄形成異常症／骨髄増殖性疾患、骨髄異形成症候群、免疫不全と関連付けられるリンパ増殖性障害、組織球性および樹状細胞性腫瘍、白血球増加症、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、悪性巨細胞腫瘍、骨髄腫骨疾患、骨肉腫、乳癌（ホルモン依存性、非ホルモン依存性）、婦人科癌（小児子宮頸部、子宮内膜、卵管、妊娠性栄養膜疾患、卵巣、腹膜、子宮、膣、および外陰部）、基底細胞癌（ＢＣＣ）、扁平細胞癌（ＳＣＣ）、悪性黒色腫、隆起性（ｐｒｏｔｕｂｅｒｏｕｓ）皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、カポジ肉腫、星細胞腫、有毛細胞性星細胞腫、胚性毛成長神経上皮新形成（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｈａｉｒ ｇｒｏｗｔｈ ｎｅｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ）、乏突起膠腫、上衣腫、多形膠芽腫、混合神経膠腫、乏突起膠細胞・星細胞腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、髄芽腫、網膜芽腫、神経芽腫、胚性組織腫瘍、奇形腫、悪性中皮腫（腹膜中皮腫、心膜中皮腫、胸膜中皮腫）、胃－腸－膵臓または胃腸膵臓神経内分泌腫瘍（ＧＥＰ－ＮＥＴ）、カルチノイド腫瘍、膵臓内分泌腫瘍（ＰＥＴ））、大腸腺癌、大腸癌（ｋｎｏｔ Ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、浸潤性神経内分泌腫瘍、平滑筋肉腫、粘液性腺癌、印環細胞腺癌、肝細胞癌、肝胆道肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｂｉｌｉａｒｙ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ）、肝臓芽細胞腫、血管腫、肝臓腺腫、限局性結節性過形成（結節性再生性過形成、過誤腫）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（扁平細胞肺癌、腺癌、大細胞肺癌）、小細胞肺癌、甲状腺癌、前立腺癌（ホルモン難治性、非アンドロゲン依存性（ｎｏｎ－ａｎｄｒｏｇｅｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｅｘ）、アンドロゲン依存性、ホルモン非感受性）、腎細胞癌および軟組織肉腫（線維肉腫、悪性繊維性組織球腫、皮膚線維肉腫、脂肪肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫、滑膜肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍／神経線維肉腫、骨外性骨肉腫）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0034】

「ＣＤ１９」または「分化クラスタ１９」（Ｂ４、Ｔ細胞表面抗原Ｌｅｕ－１２、およびＣＶＩＤ３としても公知）という用語は、ヒトにおいて遺伝子ＣＤ１９によりコードされるＢ細胞系列表面バイオマーカまたは膜貫通タンパク質を指す。ＣＤ１９は、Ｂリンパ球上でＢ細胞抗原受容体複合体（ＢＣＲ）のための補助受容体として機能して、下流のシグナル伝達経路の活性化のため、および抗原に対するＢ細胞応答を誘導するための閾値を減少させることができる。構造的に、ＣＤ１９アミノ酸配列は、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００個のアミノ酸の配列長にわたり、またはポリペプチドの全長にわたり、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１７８０９８．２→ＮＰ＿００１１７１５６９．１またはＮＭ＿００１７７０．６→ＮＰ＿００１７６１．３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。構造的に、ＣＤ１９核酸配列は、少なくとも３００、５００、７５０、１０００、１２５０、１５００個の核酸の配列長にわたり、またはポリヌクレオチドの全長にわたり、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＧ＿００７２７５．１またはＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ９３０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。配列アライメントは、当該技術分野で公知のあらゆるアライメントアルゴリズム、例えば、デフォルト設定に設定されたＢＬＡＳＴやＡＬＩＧＮを使用して行うことができる。

【0035】

「ＣＤ３８」または「分化クラスタ３８」（ＡＤＰＲＣ１としても公知）という用語は、ヒトにおいて遺伝子ＣＤ３８によりコードされるＢ細胞表面バイオマーカまたは膜貫通タンパク質を指す。ＣＤ３８は、細胞の活性化および増殖に繋がるＢ細胞シグナル伝達において機能することができる。構造的に、ＣＤ３８アミノ酸配列は、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０個のアミノ酸の配列長にわたり、またはポリペプチドの全長にわたり、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１７７５．４→ＮＰ＿００１７６６．２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。構造的に、ＣＤ１９核酸配列は、少なくとも３００、５００、７５０個の核酸の配列長にわたり、またはポリヌクレオチドの全長にわたり、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００４．１２またはＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ９５２の核酸配列に対して少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。配列アライメントは、当該技術分野で公知のあらゆるアライメントアルゴリズム、例えば、デフォルト設定に設定されたＢＬＡＳＴやＡＬＩＧＮを使用して行うことができる。

【0036】

本明細書中の「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、多価または二特異性の抗体およびモノクローナル抗体、例えばインタクトな抗体およびその機能的な（抗原結合）抗体フラグメント、例えばフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆｖフラグメント、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）フラグメント、一本鎖抗体フラグメント、例えば一本鎖可変フラグメント（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）、および単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）フラグメントを含む。本用語は、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体などの遺伝子操作および／またはその他の方法で修飾された形態の免疫グロブリン、多特異性抗体、例えば、二特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖを包含する。別段の定めのない限り、「抗体」という用語は、その機能的抗体フラグメントを包含すると理解されたい。本用語はまた、ＩｇＧ、ならびにそのサブクラスであるＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含めいずれかのクラスまたはサブクラスの抗体を含む、インタクト抗体または全長抗体を包含する。抗体はヒトＩｇＧ１定常領域を含むことができる。抗体はヒトＩｇＧ４定常領域を含むことができる。

【0037】

提供される抗体の中には、多特異性または多価抗体（例えば、二特異性抗体および多反応性抗体）ならびにその抗体フラグメントがある。抗体としては、抗体コンジュゲート、およびキメラ分子など抗体を含む分子が挙げられる。このため、抗体としては、全長およびネイティブな抗体のほか、その結合特異性を保持するそのフラグメントおよび部分、例えばそのあらゆる特異的結合性部分、例えば任意数の免疫グロブリンクラスおよび／またはアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭ）を有するもの、ならびに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、およびｓｃＦｖ（一本鎖または関連する実体）を含むがこれらに限定されない、生物学的に関連する（抗原結合）フラグメントまたはその特異的結合性部分が挙げられるが、これらに限定されない。モノクローナル抗体は、一般に、実質的に均質な抗体の組成物内にあるものであり、このため、モノクローナル抗体組成物内に含まれるあらゆる個々の抗体は、微量で存在する場合のある起こり得る天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体はヒトＩｇＧ１定常領域またはヒトＩｇＧ４定常領域を含むことができる。

【0038】

「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義である「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、当該技術分野において公知であり、抗原特異性および／または結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の連続しない配列を指す。一般に、各重鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）、および各軽鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）がある。「フレームワーク領域」および「ＦＲ」は、当該技術分野において、重鎖および軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すと知られている。一般に、各全長重鎖可変領域中に４つのＦＲ（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、およびＦＲ－Ｈ４）、ならびに各全長軽鎖可変領域中に４つのＦＲ（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、およびＦＲ－Ｌ４）がある。所与のＣＤＲまたはＦＲの精密なアミノ酸配列境界は、Ｋａｂａｔら（１９９１）による「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７）によるＪＭＢ ２７３、９２７～９４８頁（「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）；ＭａｃＣａｌｌｕｍらによるＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２～７４５頁（１９９６）、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２、７３２～７４５頁」（「Ｃｏｎｔａｃｔ」ナンバリングスキーム）；Ｌｅｆｒａｎｃ ＭＰらによる「ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ」、Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３ Ｊａｎ；２７（１）：５５～７７頁（「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）；Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ＡおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ Ａによる「Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、２００１ Ｊｕｎ ８；３０９（３）：６５７～７０頁（「Ａｈｏ」ナンバリングスキーム）；ならびにＷｈｉｔｅｌｅｇｇ ＮＲおよびＲｅｅｓ ＡＲによる「ＷＡＭ：ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ＷＥＢ」、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．２０００ Ｄｅｃ；１３（１２）：８１９～２４頁（「ＡｂＭ」ナンバリングスキーム）に記載されるものを含む、多数の周知のスキームのうちいずれかを使用して容易に決定することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、Ａｈｏ、ＡｂＭ、またはそれらの組合せから選択される方法によって定義することができる。

【0039】

所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、同定のために使用されるスキームに応じて変動し得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造アライメントに基づくが、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造情報に基づく。ＫａｂａｔスキームおよびＣｈｏｔｈｉａスキームの両方のナンバリングは、最も共通する抗体領域配列の長さに基づき、挿入文字、例えば、「３０ａ」により挿入が適用され、一部の抗体に欠失が現れる。２つのスキームは、特定の挿入および欠失（「インデル」）を異なる位置に置き、結果として差次的なナンバリングをもたらす。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは複合体結晶構造の分析に基づき、多くの点でＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームに類似している。

【0040】

「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。ネイティブな抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶ_ＨおよびＶ_Ｌ）は全体的に類似した構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）および３つのＣＤＲを含む（例えば、ＫｉｎｄｔらによるＫｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照）。単一のＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からのＶ_ＨまたはＶ_Ｌドメインを使用してそれぞれ相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングするために単離され得る（例えば、ＰｏｒｔｏｌａｎｏらによるＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０～８８７頁（１９９３）；ＣｌａｒｋｓｏｎらによるＮａｔｕｒｅ ３５２：６２４～６２８頁（１９９１）を参照）。

【0041】

提供される抗体の中には、抗体フラグメントがある。「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指すことができる。抗体フラグメントの例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖまたはｓＦｖ）、および抗体フラグメントから形成される多特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、抗体は、ｓｃＦｖなど、可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質消化分解のほか、組換え宿主細胞による産生を含むがこれらに限定されない、様々な技法により作製することができる。一部の実施形態では、抗体は、組換えにより産生されたフラグメント、例えば天然に存在しない構成を含むフラグメント、例えば、合成リンカー、例えばポリペプチドリンカーにより接合された２つ以上の抗体領域もしくは鎖を有するもの、および／または天然に存在するインタクトな抗体の酵素消化によっては産生されないものである。

【0042】

本明細書中、分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、または抗体フラグメントは、文法上の等価物を含む「二特異性」または「二重特異性」として言及され得る。二特異性分子は、少なくとも２つの構造的に別個の標的に特異的に結合する能力を有する。特異的結合は、別個の非同一のアミノ酸配列が挙げられるがそれに限定されない、分子レベルで構造的に別個である２つの別個の結合部分、または、高い親和性（例えば、約１×１０^－６未満のＫＤ）で２つの構造的に別個の標的に特異的に結合することができる単一の結合部分の結果であり得る。「多特異性」として言及される分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、または抗体フラグメントは、少なくとも３つの構造的に別個の標的に特異的に結合する能力を有する分子を指す。文法上の等価物を含む「二特異性抗体」は、標的に特異的に結合可能である抗体の少なくとも１つのフラグメント、例えば、可変領域、重鎖もしくは軽鎖、または抗体分子からの１つもしくは複数の相補性決定領域を保存する、二特異性分子を指す。文法上の等価物を含む「多特異性抗体」は、標的と特異的に結合可能である抗体の少なくとも１つのフラグメント、例えば、可変領域、重鎖もしくは軽鎖、または抗体分子からの相補性決定領域を保存する、多特異性分子を指す。

【0043】

本明細書中、「リンカー」はまた、「リンカー配列」、「スペーサ」、「テザリング配列」、またはそれらの文法上の等価物として言及される。本明細書で言及される「リンカー」は、それら自体が標的結合性、触媒活性を有するか、または天然に発現されて別々のポリペプチドとして集合させられる、２つの別個の分子を接続する。例えば、２つの別個の結合部分または重鎖／軽鎖がペアとなる。分子を共有結合により連結させるために多数の戦略が使用され得る。これらとしては、タンパク質またはタンパク質ドメインのＮ末端とＣ末端とのポリペプチド連結、ジスルフィド結合を介する連結、および化学架橋試薬を介する連結が挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の一態様では、リンカーは、組換え技法またはペプチド合成により生成されるペプチド結合である。リンカーペプチドは、アミノ酸残基であるＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを主に含み得る。リンカーペプチドは、２つの分子が互いに対して相対的に正確なコンホメーションを呈し、その結果、所望の活性を保持するよう、２つの分子を連結するのに十分な長さを有する必要がある。一実施形態では、リンカーは、約１～５０のアミノ酸長または約１～３０のアミノ酸長である。一実施形態では、１～２０のアミノ酸長のリンカーが使用されてもよい。有用なリンカーとして、グリシン－セリンポリマー、例えば（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号２２４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２５）、および（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２６）（ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、および他の柔軟性リンカーが挙げられる。抗体フラグメントまたは一本鎖可変フラグメントを連結するための例示的なリンカーは、ＡＡＥＰＫＳＳ（配列番号２２７）、ＡＡＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２２８）、ＧＧＧＧ（配列番号２２９）、またはＧＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号２３０）を含むことができる。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーが挙げられるがこれらに限定されない、様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとして使用され得る。

【0044】

本開示の「フラグメントベース（Ｆｒａｇｍｅｎｔ－ｂａｓｅｄ）」の二特異性抗体、または「一本鎖可変フラグメント」もしくは「ｓｃＦｖ」を含む二特異性抗体は、２つの結合部分、および２つの結合部分を接続するリンカーを含む、一本鎖抗体またはそのフラグメントを指し得る。リンカーは、ポリペプチドリンカー、またはいずれかの標的化部分の結合を阻害しないような好適で柔軟性の他のリンカーであってもよい。フラグメントベースの二特異性抗体フォーマットとしては、タンデムＶＨＨ抗体、タンデムｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ）が挙げられる。そのようなフラグメントベースの抗体は、所与の標的に対して特異性を有する追加の結合部分、例えば、Ａ_２：Ｂ_１、Ａ_１：Ｂ_２、もしくはＡ_２：Ｂ_２を含むように、あるいは、薬物動態を向上させるか、またはＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、もしくはＣＤＣを促進するためのＦｃ領域のフラグメントを用いてさらに操作することができる。

【0045】

「結合部分」は、列記された標的、抗原、またはエピトープに対する特異的結合を媒介する分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、または抗体フラグメントの部分を指す。例として、抗体の結合部分は、重鎖／軽鎖可変領域ペア、または１つもしくは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでもよい。

【0046】

本明細書で言及される「標的」は、分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、または抗体フラグメントの結合部分と関与する、分子の部分を指す。標的は、アミノ酸配列および／または炭水化物、脂質、もしくは他の化学的実体を含むことができる。「抗原」は、抗体もしくは抗体フラグメント、Ｂ細胞受容体、またはＴ細胞受容体などの適応免疫分子により結合可能である部分を含む標的である。

【0047】

二特異性または多特異性分子の「価数」は、列記される分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、または抗体フラグメントが結合することのできる標的の数を指す。例えば、一価である分子は特異的な標的の１つの分子に結合することができ、二価分子は２つの分子に結合することができ、四価分子は４つの標的に結合することができる。例えば、二特異性で二価の分子は、２つの標的、および２つの構造上異なる標的に結合することのできる分子である。例えば、二特異性で二価の分子は、標的Ａおよび標的Ｂを含む溶液と接触させられると、Ａ_２、Ｂ_２、またはＡ：Ｂに結合し得る。

【0048】

「ヒト化」抗体は、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲアミノ酸残基が非ヒトＣＤＲに由来し、すべてまたは実質的にすべてのＦＲアミノ酸残基がヒトＦＲに由来する抗体である。ヒト化抗体は、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を任意選択で含むことができる。非ヒト抗体の「ヒト化型」は、典型的にはヒトに対する免疫原性を低減させながら親非ヒト抗体の特異性および親和性を保持するために、ヒト化を受けた非ヒト抗体のバリアントを指す。一部の実施形態では、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復または向上させるために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基の由来となる抗体）からの対応する残基で置換される。

【0049】

提供される抗体の中には、ヒト抗体がある。「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞、またはヒト抗体ライブラリを含むヒト抗体レパートリもしくは他のヒト抗体コーディング配列を利用する非ヒト供給源により産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。この用語は、すべてまたは実質的にすべてのＣＤＲが非ヒトであるものなどの非ヒト抗原結合領域を含む非ヒト抗体のヒト化型を除外する。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製されてもよい。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン座位を置き換えるか、または染色体外に存在するか、もしくは動物の染色体に無作為に組み込まれる、ヒト免疫グロブリン座位の全体またはその一部を含有している。このようなトランスジェニック動物において、内因性免疫グロブリン座位は全体的に不活性化されている。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイおよび無細胞ライブラリを含み、ヒトレパートリに由来する抗体コーディング配列を含有する、ヒト抗体ライブラリに由来してもよい。

【0050】

「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」は、本明細書で使用される場合、ＦｃγＲを発現する非特異的な細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を生じさせる細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合と相関することができ、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の増加はＡＤＣＣ活性における増加に繋がる。「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞媒介性ファゴサイトーシスは、本明細書で使用される場合、ＦｃγＲを発現する非特異的な細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞のファゴサイトーシスを生じさせる細胞媒介性反応を指し得る。

【0051】

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、かつ最小の長さに限定されない。提供される抗体および抗体鎖ならびに他のペプチド、例えば、リンカーおよび結合ペプチドを含む、ポリペプチドは、天然および／または非天然アミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含むことができる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、およびリン酸化などを含む。一部の態様では、ポリペプチドは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブまたは天然配列に対して修飾を含有することができる。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発を介するなど故意的なものとすることができるか、または、タンパク質を産生する宿主の突然変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介するなど偶発的なものとすることができる。

【0052】

参照ポリペプチド配列に対する配列同一性パーセント（％）は、配列をアライメントし、必要な場合にはギャップを導入して最大配列同一性パーセントを達成した後の、配列同一性の部分としていかなる保存的置換も考慮しない、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージである。アミノ酸配列同一性パーセントを判定する目的のアライメントは、例えば、公開されているＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどのコンピュータソフトウェアを使用して、公知の様々な方法で達成することができる。比較されている配列の全長にかけて最大のアライメントを達成するのに必要とされるアルゴリズムを含む、配列をアライメントするのに適切なパラメータが判定可能である。しかし、本明細書中の目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作成され、ソースコードは、米国著作権局、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．、２０５５９にユーザドキュメンテーションと共に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ－２プログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．から公開されており、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ－２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルする必要がある。すべての配列比較パラメータがＡＬＩＧＮ－２プログラムにより設定され、変更されない。ＡＬＩＧＮ－２がアミノ酸配列比較に採用される状況では、所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂに対するある特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含んでいる所与のアミノ酸配列Ａとしても表現することができる）は、１００×分数Ｘ／Ｙのように算出され、式中、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ－２によってＡおよびＢのそのプログラムのアライメントにおいて完全一致（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｍａｔｃｈｅｓ）として採点されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％に等しくないことが認識されるであろう。別段の定めのない限り、本明細書で使用されるすべてのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ－２コンピュータプログラムを使用して得られる。

【0053】

本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列バリアントを想定かつ想起することができる。バリアントは、典型的には、１つもしくは複数の置換、欠失、付加、および／または挿入において、本明細書に具体的に開示されるポリペプチドとは相違する。かかるバリアントは天然に存在するものであり得るか、または、例えば、本発明の上記ポリペプチド配列のうち１つもしくは複数を修飾し、本明細書に記載されるようにかつ／もしくは多数の公知の技術のいずれかを使用してポリペプチドの１つもしくは複数の生物学的活性を評価することによって、合成的に生成することができる。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合があり、抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、またはペプチド合成により調製することができる。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、および／または置換を含む。最終構築物が所望の特徴、例えば抗原結合性を有することを前提として、欠失、挿入、および置換のあらゆる組合せを行って最終構築物に到達することができる。１つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体バリアントを提供することができる。置換による突然変異誘発のための関心対象の部位として、ＣＤＲおよびＦＲが挙げられる。アミノ酸置換を関心対象の抗体に導入し、生成物を所望の活性、例えば、抗原結合性の保持／改善、免疫原性の減少、またはＡＤＣＣもしくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。

【0054】

本開示はまた、１つまたは複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体を指す「イムノコンジュゲート」、「抗体コンジュゲート」、または「抗体－薬物コンジュゲート」を提供する。例えばイムノコンジュゲートは、化学療法剤もしくは薬物、成長阻害剤、タンパク質ドメイン、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、もしくはそれらのフラグメント）、または放射活性同位体にコンジュゲートされた抗体など、１つまたは複数の細胞傷害剤を含むことができる。一部の実施形態では、イムノコンジュゲートは、本明細書に開示される複合体結合分子、またはそのフラグメント（例えば、ｓｃＦｖ）を含むことができる。

【0055】

本明細書に記載の抗体は、核酸によりコードすることができる。核酸は、２つ以上のヌクレオチド塩基を含むポリヌクレオチドの一種である。特定の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞に移入するために使用され得るベクターの成分である。本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。ベクターの一種は、ゲノム組込み型ベクター、または「組込み型ベクター」であり、これは宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込むことができる。ベクターの別の種類は、「エピソーム」ベクター、例えば、染色体外複製が可能な核酸である。操作可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能なベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。好適なベクターは、プラスミド、細菌人工染色体、酵母人工染色体、ウイルスベクターなどを含む。発現ベクター中、転写の制御に使用するためのプロモータ、エンハンサ、ポリアデニル化シグナルなどの調節エレメントは、哺乳動物、微小生物、ウイルス、または昆虫遺伝子に由来し得る。通常は複製起点により付与される、宿主中で複製する能力、および形質転換体の認識を促すための選択遺伝子が、追加で組み込まれてもよい。レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどのウイルスに由来するベクターが採用されてもよい。プラスミドベクターは、染色体位置への組込みのために線状化され得る。ベクターは、ゲノム中の定められた位置または制限されたセットの部位への部位特異的組込み（例えば、ＡｔｔＰ－ＡｔｔＢ組換え）を指示する配列を含むことができる。付加的に、ベクターは、転位可能なエレメントに由来する配列を含むことができる。

【0056】

本明細書で使用される場合、参照配列と比較してアミノ酸配列または核酸配列を記載するために本明細書で使用される場合の「相同的」、「相同性」、または「相同性パーセント」という用語は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４～２２６８頁、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３～５８７７頁、１９９３において改訂）により記載される式を使用して決定することができる。かかる式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁、１９９０）のｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムに組み込まれている。配列の相同性パーセントは、本出願の出願日時点のＢＬＡＳＴの最新版を使用して決定することができる。

【0057】

本明細書に記載の抗体をコードする核酸は、好適な細胞を感染、トランスフェクト、形質転換、またはその他の方法で核酸に対してトランスジェニックとすることで、商業的または治療的使用のための抗体の製造を可能にするために使用することができる。大規模の細胞培養から抗体を産生するための標準的な細胞株および方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｌｉらによる「Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．」、Ｍａｂｓ．２０１０ Ｓｅｐ－Ｏｃｔ；２（５）：４６６～４７７頁を参照されたい。特定の実施形態では、細胞は真核細胞である。特定の実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、抗体を産生するのに有用な細胞株であり、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である。特定の実施形態では、抗体をコードする核酸は、抗体を産生するのに有用な細胞のゲノム座位に組み込まれる。特定の実施形態では、本明細書には、抗体を作製する方法であって、抗体をコードする核酸を含む細胞を、当該抗体の産生および分泌を可能とするのに十分なｉｎ ｖｉｔｒｏの条件下で培養する工程を含む、方法が記載される。

【0058】

本明細書で使用される場合、「個体」、「患者」、または「対象」という用語は、記載された組成物および方法がその処置に有用である少なくとも１つの疾患を有すると診断されたか、それに罹患している疑いがあるか、またはそれを発症するリスクがある個体を指す。特定の実施形態では、個体は哺乳動物である。特定の実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマ、アルパカ、またはヤクである。特定の実施形態では、個体はヒトである。

【0059】

本明細書で使用される場合、特有の数を修飾するのに使用される「約」という用語は、その数のプラスまたはマイナス１０％の数を指す。範囲を修飾する「約」という用語は、その最小値のマイナス１０％からその最大値のプラス１０％まで及ぶ範囲を指す。

【0060】

本明細書で使用される場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、レシピエントにおいて有益なまたは所望の結果を得るために使用される医薬的または他の介入レジメンに関して使用される。有益なまたは所望の結果として、治療利益および／または予防利益が挙げられるがこれらに限定されない。治療利益は、症状の、または処置されている根底にある障害の根絶または軽快を指し得る。また、治療利益は、対象が根底にある障害に依然として罹患している場合があるにもかかわらず、対象に改善が観察されるような、根底にある障害と関連付けられる生理学的な症状のうち１つもしくは複数の根絶または軽快とともに達成することができる。予防効果は、疾患もしくは疾病の出現の遅延、予防、もしくは排除、疾患もしくは疾病の症状の発症の遅延もしくは排除、疾患もしくは疾病の進行の緩慢化、停止、もしくは逆転、またはこれらのあらゆる組合せを含む。予防利益のために、特定の疾患を発症するリスクがある対象、または疾患の生理学的な症状のうち１つもしくは複数を報告する対象は、この疾患の診断が行われていなかったとしても、処置を受ける場合がある。当業者であれば、処置の候補となる個体の所与の集団のすべてが処置に応答するか、または等しく応答するわけではないことを認識するであろう。このような個体は処置されたとみなされる。

【0061】

本明細書で使用されるセクションの見出しは、文書編成上の目的のために過ぎず、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。

【0062】

二特異性分子
本明細書には、第１の標的に結合するように構成された第１の結合成分および第２の標的に結合するように構成された第２の結合成分を含む、二特異性結合分子、多価結合分子、または複合体結合分子であって、第１の標的がＢ細胞系列表面マーカを含み、第２の標的が抑制性Ｂ細胞表面マーカを含む、二特異性結合分子、多価結合分子、または複合体結合分子が提供される。免疫抑制性Ｂ細胞またはＢ細胞集団は、Ｂ細胞系列表面バイオマーカおよび抑制性Ｂ細胞表面バイオマーカを含むことができる。Ｂ細胞系列表面マーカは、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５を含むことができる。免疫抑制性Ｂ細胞表面マーカは、ＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－βＬＡＰ）を含むことができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。特定の実施形態では、複合体結合分子はＣＤ３８およびＣＤ１９に結合する。

【0063】

二特異性結合分子、多価結合分子、または複合体結合分子は、少なくとも２つの構造的に別個の標的に特異的に結合する能力を有する。特異的結合は、別個の非同一のアミノ酸配列が挙げられるがそれに限定されない、分子レベルで構造的に別個である２つの別個の結合部分、または、２つの構造的に別個の標的に特異的に結合することができる単一の結合部分の結果であり得る。「多特異性」、「多価」、または「二特異性」として言及される分子、ペプチド、ポリペプチド、抗体、または抗体フラグメントは、少なくとも２つの構造的に別個の標的に特異的に結合する能力を有する分子を指し得る。一部の実施形態では、複合体結合分子の第１または第２の結合成分は、ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、第１または第２の結合成分は、ポリペプチドからなる。一部の実施形態では、複合体結合分子の第１および第２の結合成分は、ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、第１および第２の結合成分は、ポリペプチドからなる。特定の実施形態では、第１または第２の結合成分のポリペプチドは、少なくとも１００個のアミノ酸残基の長さのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１および第２の結合成分のポリペプチドは、少なくとも１００個のアミノ酸残基の長さのアミノ酸配列を含む。

【0064】

二特異性分子は、標的に特異的に結合可能である抗体の少なくとも１つのフラグメント、例えば、可変領域、重鎖もしくは軽鎖、または抗体分子からの１つもしくは複数の相補性決定領域を保存する、二特異性抗体であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載の複合体結合分子は、二特異性抗体および／またはその二重抗原結合フラグメントである。二特異性抗体は、２つの構造的に別個の標的または抗原に結合する能力を有する。一部の実施形態では、二特異性抗体は、第１の標的に結合するように構成された第１の結合成分および第２の標的に結合するように構成された第２の結合成分を含み、第１の標的はＢ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）を含み、第２の標的は抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－βＬＡＰ））を含む。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0065】

免疫抑制性Ｂ細胞または免疫抑制性Ｂ細胞集団は、細胞表面バイオマーカＣＤ１９およびＣＤ３８を含むことができる。さらに本明細書には、ＣＤ１９およびＣＤ３８を標的化する二特異性抗体が開示される。一部の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のうちいずれか１つを含むＶＨ ＣＤＲ１領域を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、または配列番号２５のうちいずれか１つを含むＶＨ ＣＤＲ２領域を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、または配列番号３５のうちいずれか１つを含むＶＨ ＣＤＲ３領域を含む。

【0066】

一部の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号２を含む可変軽鎖（ＶＬ）を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、または配列番号４５のうちいずれか１つを含むＶＬ ＣＤＲ１領域を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５のうちいずれか１つを含むＶＬ ＣＤＲ２領域を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、または配列番号６５のうちいずれか１つを含むＶＬ ＣＤＲ３領域を含む。

【0067】

一部の実施形態では、二特異性抗体は第１の結合成分を含み、第１の結合成分は、配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号４１～４５のうちいずれか１つに明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５１～５５のうちいずれか１つに明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号６１～６５のうちいずれか１つに明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0068】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ１９結合成分を含み、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１１に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２１に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号３１に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号４１に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５１に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号６１に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0069】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ１９結合成分を含み、第１のＣＤ１９結合成分は、配列番号１２に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２２に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号３２に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号４２に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５２に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号６２に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0070】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ１９結合成分を含み、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１５に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２５に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号３５に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号４５に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５５に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号６５に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0071】

一部の実施形態では、ＣＤ１９結合は、イネビリズマブ、タファシタマブ、タプリツモマブ、オベキセリマブ、ブリナツモマブ、コルツキシマブ、デニンツズマブ、もしくはロンカスツキシマブ、ＭＯＲ２０８、ＭＥＤＩ－５５１、ＸｍＡｂ ５８７１、ＭＤＸ－１３４２、またはＡＦＭ１１に対応するか、またはそれらに由来する可変重鎖および軽鎖またはＣＤＲを含む。

【0072】

一部の実施形態では、ＣＤ３８結合成分は、配列番号３を含む可変重鎖（ＶＨ）を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、または配列番号７５のうちいずれか１つを含むＶＨ ＣＤＲ１領域を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、または配列番号８５のうちいずれか１つを含むＶＨ ＣＤＲ２領域を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、または配列番号９５のうちいずれか１つを含むＶＨ ＣＤＲ３領域を含む。

【0073】

一部の実施形態では、ＣＤ３８結合成分は、配列番号４を含む可変軽鎖（ＶＬ）を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０５、または配列番号１０５のうちいずれか１つを含むＶＬ ＣＤＲ１領域を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、または配列番号１１５のうちいずれか１つを含むＶＬ ＣＤＲ２領域を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、または配列番号１２５のうちいずれか１つを含むＶＬ ＣＤＲ３領域を含む。

【0074】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ３８結合成分を含み、ＣＤ３８結合成分は、配列番号７１に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８１に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号９１に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号１０１に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１１に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号１２１に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0075】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ３８結合成分を含み、ＣＤ３８結合成分は、配列番号７２に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８２に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号９２に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号１０２に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１２に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号１２２に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0076】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ３８結合成分を含み、ＣＤ３８結合成分は、配列番号７５に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８５に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号９５に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号１０５に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１５に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号１２５に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0077】

一部の実施形態（例えば、先述の実施形態のうちいずれか）では、ＣＤ３８結合成分のＣＤＲ－Ｈ２はアミノ酸残基Ｐ（Ｘ１）ＬＧ（Ｘ２）Ａ（配列番号１５０）を含み、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸置換を許容しながらＣＤ３８への結合を維持する。特定の実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、ＣＤＲＨ２アミノ酸配列の疎水性を低減させるアミノ酸から選択される。特定の実施形態では、疎水性を低減させるアミノ酸は、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、またはＥを含む。特定の実施形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴである。

【0078】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ３８結合成分およびＣＤ１９結合成分を含み、ＣＤ３８結合成分はＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含み、ＶＨアミノ酸配列は、配列番号３に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含み、ＣＤ１９結合成分はＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含み、ＶＨアミノ酸配列は、配列番号１に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。

【0079】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ３８結合成分およびＣＤ１９結合成分を含み、ＣＤ３８結合成分はＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含み、ＶＨアミノ酸配列は、配列番号３と同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４と同一のアミノ酸配列を含み、ＣＤ１９結合成分はＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含み、ＶＨアミノ酸配列は、配列番号１と同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２と同一のアミノ酸配列を含む。

【0080】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ３８結合成分およびＣＤ１９結合成分を含み、ＣＤ３８結合成分はＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含み、ＶＨアミノ酸配列は、配列番号３、２１５、または２１８～２２３に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４または２２３に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含み、ＣＤ１９結合成分はＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含み、ＶＨアミノ酸配列は、配列番号１、２０１、または２１６～２１７に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、Ａ８４およびＡ１０８において置換を含むＶＨアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、置換はＡ８４ＳおよびＡ１０８Ｌを含む。

【0081】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ３８結合成分およびＣＤ１９結合成分を含み、ＣＤ３８結合成分はＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含み、ＶＨアミノ酸配列は、配列番号３、２１５、または２１８～２２３と同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号４または２２３と同一のアミノ酸配列を含み、ＣＤ１９結合成分はＶＨアミノ酸配列およびＶＬアミノ酸配列を含み、ＶＨアミノ酸配列は、配列番号１、２０１、２１６～２１７と同一のアミノ酸配列を含み、ＶＬは、配列番号２と同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９結合成分は、Ａ８４およびＡ１０８において置換を含むＶＨアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、置換はＡ８４ＳおよびＡ１０８Ｌを含む。

【0082】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ３８結合成分およびＣＤ１９結合成分を含み、ＣＤ３８結合成分は、配列番号７１に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８１に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号９１に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号１０１に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１１に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号１２１に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１１に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２１に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号３１に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号４１に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５１に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号６１に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0083】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ３８結合成分およびＣＤ１９結合成分を含み、ＣＤ３８結合成分は、配列番号７２に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８２に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号９２に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号１０２に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１２に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号１２２に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１２に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２２に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号３２に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号４２に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５２に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号６２に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0084】

一部の実施形態では、二特異性抗体はＣＤ３８結合成分およびＣＤ１９結合成分を含み、ＣＤ３８結合成分は、配列番号７５に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８５に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号９５に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号１０５に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１５に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号１２５に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１５に明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２５に明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号３５に明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列、配列番号４５に明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５５に明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号６５に明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。

【0085】

一部の実施形態では、ＣＤ３８結合成分は、ダラツムマブまたはイサツキシマブに対応するか、またはそれら由来する可変重鎖および軽鎖またはＣＤＲを含む。

【0086】

置換、挿入、または欠失が１つまたは複数のＣＤＲ内で生じる場合があり、このときに置換、挿入、または欠失は、抗原に対する抗体の結合を実質的に低減させない。例えば、結合親和性を実質的に低減させない保存的置換がＣＤＲ中で行われてもよい。かかる改変は、ＣＤＲ「ホットスポット」の外側であってもよい。バリアントＶＨおよびＶＬ配列の一部の実施形態では、各ＣＤＲは改変されていない。アミノ酸配列の挿入および欠失として、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲にあるアミノおよび／またはカルボキシル末端融合のほか、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入および欠失が挙げられる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとして、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴ用）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドに対する、抗体のＮまたはＣ末端の融合が挙げられる。抗体分子の配列内挿入バリアントの例として、軽鎖中の３つのアミノ酸の挿入が挙げられる。末端欠失の例として、軽鎖の末端における７つ以下のアミノ酸の欠失を有する抗体が挙げられる。

【0087】

改変（例えば、置換）は、例えば、抗体の親和性を改善するために、ＣＤＲ中で行われてもよい。かかる改変は、体細胞の成熟の間に高い突然変異率を有するコドンをコードするＣＤＲにおいて行われてもよく（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９～１９６頁（２００８）を参照）、得られたバリアントは結合親和性について試験することができる。親和性成熟（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、ＣＤＲの無作為化、またはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用する）は、抗体の親和性を改善するために使用することができる（例えば、ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍらによるＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１～３７頁（２００１）を参照）。抗原結合に関与するＣＤＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデリングを使用して、特異的に同定されてもよい（例えば、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１～１０８５頁（１９８９）を参照）。ＣＤＲ－Ｈ３およびＣＤＲ－Ｌ３は特に標的化されることが多い。代替的または付加的に、抗体と抗原との間の接触点を同定するために抗原－抗体複合体の結晶構造がある。このような接触残基および隣接する残基は、置換の候補として標的化または排除されてもよい。バリアントは、所望の特性を含有するかどうかを判定するためにスクリーニングされてもよい。

【0088】

抗体は、それらのグリコシル化を増加または減少させるように改変され得る（例えば、１つまたは複数のグリコシル化部位が作出または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによる）。抗体のＦｃ領域に取り付けられた炭水化物が、改変され得る。哺乳動物細胞からのネイティブな抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ連結によって取り付けられた分枝状の二分岐オリゴ糖を含む（例えば、ＷｒｉｇｈｔらによるＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６～３２頁（１９９７）を参照）。オリゴ糖は、種々の炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の基部においてＧｌｃＮＡｃに取り付けられたマンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、フコースとすることができる。抗体中のオリゴ糖の修飾は、例えば、特定の改善された特性を有する抗体バリアントを作出するために行うことができる。抗体グリコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣ機能を有することができる。一部の実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）取り付けられたフコースを欠いた炭水化物構造を有する抗体バリアントが提供される。例えば、かかる抗体中のフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％、または２０％～４０％であり得る。フコースの量は、Ａｓｎ２９７に取り付けられたすべての糖鎖構造の合計に対する、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって判定される（例えば、国際公開第０８／０７７５４６号を参照）。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域中の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング；例えば、ＥｄｅｌｍａｎらによるＰｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９６９ Ｍａｙ；６３（１）：７８～８５頁を参照）に位置するアスパラギン残基を指す。しかし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体中の軽微な配列の変動に起因して、２９７位の約±３アミノ酸だけ上流または下流、すなわち、２９４～３００位の間に位置してもよい。このようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる（例えば、ＯｋａｚａｋｉらによるＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９～１２４９頁（２００４）、およびＹａｍａｎｅ－ＯｈｎｕｋｉらによるＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４頁（２００４）を参照）。細胞株、例えばノックアウト細胞株、およびそれらの使用方法は、脱フコシル化抗体、例えば、タンパク質フコシル化を欠損したＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞およびα－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＴ８）ノックアウトＣＨＯ細胞を産生するために使用することができる（例えば、ＲｉｐｋａらによるＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３～５４５頁（１９８６）；Ｙａｍａｎｅ－ＯｈｎｕｋｉらによるＢｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４頁（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ．らによるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、９４（４）：６８０～６８８頁（２００６）を参照）。他の抗体グリコシル化バリアントも含まれる（例えば、米国特許第６，６０２，６８４号明細書を参照）。

【0089】

一部の実施形態では、本明細書で提供される複合体結合分子は、抗体の標的に対して約１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０１ｎＭ、または０．００１ｎＭ以下（例えば、１０^－８Ｍ以下、例えば、１０^－８Ｍ～１０^－１３Ｍ、例えば、１０^－９Ｍ～１０^－１３Ｍ）の解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。抗体の標的は、ＣＤ１９標的、ＣＤ３８標的、またはＣＤ１９およびＣＤ３８の両方を含む標的とすることができる。Ｋ_Ｄは、あらゆる好適なアッセイにより測定することができる。特定の実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定され得る（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）－３０００またはＯｃｔｅｔを使用）。

【0090】

抗体は、延長した半減期、および新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する改善された結合を有することができる（例えば、米国特許出願第２００５／００１４９３４号明細書を参照）。かかる抗体は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合を改善する１つまたは複数の置換を有するＦｃ領域を含むことができ、Ｆｃ領域残基、すなわちＥＵナンバリングシステムによる２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうち１つまたは複数において置換を有するものを含むことができる（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号明細書を参照）。Ｆｃ領域バリアントの他の例も企図される（例えば、Ｄｕｎｃａｎ＆ＷｉｎｔｅｒによるＮａｔｕｒｅ３２２：７３８～４０頁（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、および国際公開第９４／２９３５１号を参照）。

【0091】

一部の実施形態では、抗体の１つまたは複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作型抗体、例えば、「ｔｈｉｏＭＡｂ」を作出することが望ましい場合がある。一部の実施形態では、置換される残基は、抗体のアクセス可能な部位に存在する。反応性チオール基は、イムノコンジュゲートを作出するために、薬物部分またはリンカー薬物部分などの他の部分へのコンジュゲーションのための部位に配置することができる。一部の実施形態では、次の残基：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、および重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）のうちいずれか１つまたは複数が、システインで置換されてもよい。

【0092】

一部の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、公知および利用可能な追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分として、水溶性ポリマーが挙げられるがこれに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／マレイン酸無水物コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、およびデキストランまたはポリ（ｎビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性に起因して製造上の利点を有し得る。ポリマーはあらゆる分子量であってもよく、分枝状または非分枝状であってもよい。抗体に取り付けられるポリマーの数は変動してもよく、２つ以上のポリマーが取り付けられる場合、それらは同じまたは異なる分子とすることができる。

【0093】

複合体結合分子または二特異性抗体は、これらの分子と関連付けられる結合部分に基づいて異なる可能性があり、展開可能であるとともに本明細書中で想定される、いくつかの異なるフォーマットも存在する。複合体結合分子または二特異性抗体は、抗体フラグメント、実質的にインタクトな抗体、またはこれらの組合せを含むことができる。一部の実施形態では、第１または第２の結合成分は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖ペア、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）_２、単一ドメイン抗体、免疫グロブリン新抗原受容体からの可変領域フラグメント（ＶＮＡＲ）、または重鎖抗体に由来する可変領域（ＶＨＨ）を含む。特定の実施形態では、第１および第２の結合成分は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖ペア、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）_２、単一ドメイン抗体、免疫グロブリン新抗原受容体からの可変領域フラグメント（ＶＮＡＲ）、または重鎖抗体に由来する可変領域（ＶＨＨ）を含む。一部の実施形態では、第１または第２の結合成分は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖ペアを含む。特定の実施形態では、第１および第２の結合成分は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖ペアを含む。一部の実施形態では、第１または第２の結合成分はｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、第１および第２の結合成分はｓｃＦｖを含む。

【0094】

本開示による二特異性抗体は、インタクトな抗体分子または略完全にインタクトな抗体分子を含み、非対称的または対称的であってもよい。

【0095】

非対称的な二特異性抗体は、概して、標的Ａに特異的な抗体からの重鎖／軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）ペアおよび標的Ｂに特異的な抗体からのＨＣ／ＬＣペアを含み、ヘテロ二機能性抗体を作出する。これらなどのヘテロ二機能性抗体は、産生時の分子の非生産的な形成という問題に直面する。ＨＣ／ＬＣ－Ａ：ＨＣ／ＬＣ－Ｂが望ましいが、すべての可能な組合せから通常は熱力学的または統計的に好ましくない。この問題を回避するために複数のスキームが導入されている。一部の事例では、Ａに対する特異性を有する抗体からのＨＣ／ＬＣペアおよびＢに対する特異性を有する抗体からのＨＣ／ＬＣペアは、ＨＣ／ＬＣ－Ａ：ＨＣ／ＬＣ－Ｂを有する抗体の形成の確率を増加させるためにＦＣ領域に対する突然変異をさらに含む。これは、ＨＣ－ＡとＨＣ－Ｂとの間のヘテロ二量体の形成を促進する構造的特色の操作、例えばＨＣ－ＡのＦＣ領域に対する「ノブ」、およびＨＣ－Ｂに対する「ホール」、またはその逆により達成することができる。ＨＣ－Ａ：ＨＣ－Ｂヘテロ二量体を促進するための別のスキームは、ＨＣ－ＢとＨＣ－Ａとの静電相互作用を助長する電荷ペアを含むようにＨＣ－ＡおよびＨＣ－ＢのＦＣ部分中のアミノ酸残基を操作することである。鎖会合の問題に対処するための別のスキームは、ＨＣ／ＬＣペアのうち１つの可変領域を一本鎖結合分子（例えば、Ｖ_ＨＨまたはｓｃＦｖ）と置き換えることである。その結果、分子の半分は古典的なＨＣ／ＬＣペアを含み、他方は、一本鎖結合分子に融合またはその他の方法により接続されたＨＣ定常領域を含む。適切なＨＣ／ＬＣペア形成を促進するためにさらなる修飾を行うことができ、これには、ＡまたはＢのいずれかのＨＣおよびＬＣに対する突然変異を操作して適切なＨＣ／ＬＣペアの形成を助長すること、ＨＣ／ＬＣペアの対応する定常領域の交換を活用するＣｒｏｓｓＭａｂ技術が含まれる。対称的な二特異性抗体は、ヘテロ二機能性分子の形成に依拠しないことによって鎖会合の問題を回避する。このような例として、とりわけ、異なる特異性のスタックされた可変領域を含む二重可変ドメイン分子、古典的な抗体分子の重鎖のｃ末端に融合した異なる特異性のｓｃＦｖを含むＩｇＧ－ｓｃＦｖ分子、ＩｇのＦｃ領域により接続された２つのｓｃＦｖを含む（ｓｃＦＶ）_４－ＦＣ（Ｆｃは二量体化して、二特異性の四価分子を作出する）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、およびｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅが挙げられる。

【0096】

複合体結合分子または二特異性抗体の構造は、複合体結合分子または二特異性抗体の機能性または結合特性を改変するように想起および設計することができる（例えば、「Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ．」、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２０１９ Ａｕｇ；１８（８）：５８５～６０８頁を参照）（例えば、「Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２～２１２頁を参照）。例えば、二特異性抗体は、次のフォーマット：共通軽鎖二特異性ＩｇＧ、Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ、Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ、Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ二特異性ＩｇＧ、Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ、Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ、Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ、Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧ、およびＦａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧのうち１つから選択することができる。

【0097】

共通軽鎖二特異性ＩｇＧ
共通軽鎖二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図１は、共通軽鎖二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を図示する。この構造は、第１および第２のＩｇＧ重鎖を含む。各重鎖は、ＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含む。第１の重鎖は、ＶＨ １０２、ＣＨ１ １０４、ＣＨ２ １０６、およびＣＨ３ １０８を含む。第２の重鎖は、ＶＨ １１２、ＣＨ１ １１４、ＣＨ２ １１６、およびＣＨ３ １１８を含む。共通軽鎖二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン１２０およびＣＬドメイン１２２を含む軽鎖を含む。概して、第１の重鎖は、第１の特異性を有する抗体の重鎖に由来する配列を含み、第２の重鎖は、第２の特異性を有する抗体からの重鎖を含む。第１および第２の重鎖とペアを形成する軽鎖は同一であり、いずれかの特異性、または別々の特異性を有する抗体の軽鎖に由来することができる。重鎖は、共有結合（例えばジスルフィド結合１３０）を介して軽鎖分子に共有結合的に連結され得る。重鎖は、１つまたは複数の共有結合（例えばジスルフィド結合１３４および／または１３６）を介して別の重鎖に連結され得る。共通軽鎖二特異性ＩｇＧ構造は、第１および第２の重鎖の連結を促進しかつ／または第１の重鎖の別の第１の重鎖へのもしくは第２の重鎖の別の第２の重鎖への連結を防止するＣＨ３ドメイン内の突然変異をさらに含む、第１および第２の重鎖分子を含むことができる。突然変異は、２つの第１の重鎖分子または２つの第２の重鎖分子の連結を物理的（例えば立体的妨害、「ノブ」・イントゥ・「ホール」）または生化学的（例えば静電相互作用）に防止することができる。例示的なノブ・イントゥ・ホールの突然変異は、１つの重鎖中のＴ３６６Ｗ（ＥＵナンバリング）、および別の重鎖中のＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ（ＥＵナンバリング）を含むことができる。第１および第２の重鎖分子の連結を促す例示的な変異は、例えば、国際公開第２００９０８９００４号、米国特許第８，６４２，７４５号明細書、米国特許出願公開第２０１４０３２２７５６号明細書、および「Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２～２１２頁に開示されている。共通軽鎖二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子１４０、またはその追加の修飾を含むことができる。

【0098】

共通軽鎖二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β ＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、第１の重鎖は、Ｂ細胞系列表面マーカに結合するように構成され、第２の重鎖は、抑制性Ｂ細胞表面マーカに結合するように構成される。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0099】

一部の実施形態では、第１の重鎖は、ＣＤ１９結合成分を含むＶＨ配列を含み、第２の重鎖は、ＣＤ３８結合成分を含むＶＨ配列を含む。特定の実施形態では、重鎖ＣＤ１９結合成分は、配列番号２０１、配列番号１、配列番号２０１のＡ８４およびＡ１０８のうち１つもしくは両方において突然変異を含むバリアントを含み、重鎖ＣＤ３８結合成分は、配列番号２０２、２１５、２１８～２２１を含む。特定の実施形態では、バリアントは突然変異Ａ８４ＳおよびＡ１０８Ｌを含む。一部の実施形態では、二特異性抗体は共通軽鎖を含む。特定の実施形態では、共通軽鎖配列はＣＤ１９結合成分（例えば配列番号２）を含む。特定の実施形態では、共通軽鎖配列はＣＤ３８結合成分（例えば配列番号４または配列番号２２２）を含む。

【0100】

本明細書に記載されるＢＳ１は、ＣＤ１９に結合するように構成されたＣＤ１９結合成分およびＣＤ３８に結合するように構成されたＣＤ３８結合成分を有する共通軽鎖フォーマットを含み、ＣＤ１９結合成分は抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ＣＤ３８結合成分は抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ＣＤ３８抗体または抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域とペアを形成した抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、ＣＤ１９抗体または抗原結合フラグメントは、抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域とペアを形成した抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖可変領域を含み、ＣＤ３８抗体または抗原結合成分は、ａ）配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ｂ）配列番号８１～８５もしくは１５０～１５５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、ｃ）配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、ｄ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ｅ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および／またはｆ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含み、ＣＤ１９抗原結合成分は、ｇ）配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域１（ＨＣＤＲ１）、ｈ）配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域２（ＨＣＤＲ２）、ｉ）配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域３（ＨＣＤＲ３）、ｊ）配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域１（ＬＣＤＲ１）、ｋ）配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域２（ＬＣＤＲ２）、および／またはｌ）配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域３（ＬＣＤＲ３）を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８抗原結合成分は、配列Ｐ－Ｘ１－Ｌ－Ｇ－Ｘ２－Ａ（配列番号１５６）を含むＨＣＤＲ２アミノ酸配列を含み、Ｘ１およびＸ２は、それぞれＨ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、またはＥからなる群から選択される。特定の実施形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴである。一部の実施形態では、ＣＤ１９重鎖配列はＡ８４Ｓおよび／またはＡ１０８Ｌ置換を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８軽鎖はＷ３２Ｈ置換を含む。

【0101】

Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ
Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図２は、Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を図示する。この構造は、第１の重鎖分子、および一本鎖可変フラグメントを含む修飾された第２のＩｇＧ重鎖分子を含む。第１の重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端までにＶＨ ２０２、ＣＨ１ ２０４、ＣＨ２ ２０６、およびＣＨ３ ２０８を含む。修飾された第２の重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端までに一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）２１０、ＣＨ２ ２１６、およびＣＨ３ ２１８を含む。一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、可変軽鎖ドメインに対応する第１のドメイン２１２またはそのフラグメント、可変重鎖に対応する第２のドメイン２１４またはそのフラグメント、およびリンカーポリペプチド２１５を含むことができる。Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン２２０およびＣＬドメイン２２２を含む軽鎖を含む。第１の重鎖は、共有結合（例えばジスルフィド結合２３０）を介して軽鎖分子に共有結合的に連結され得る。第１の重鎖は、１つまたは複数の共有結合（例えばジスルフィド結合２３４および／または２３６）を介して、修飾された第２の重鎖に連結され得る。Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１および第２の重鎖の連結を促進しかつ／または第１の重鎖の別の第１の重鎖へのもしくは第２の重鎖の別の第２の重鎖への連結を防止するＣＨ３ドメイン内の突然変異をさらに含む、第１および修飾された第２の重鎖分子を含むことができる。突然変異は、２つの第１の重鎖分子または２つの第２の重鎖分子の連結を物理的（例えば立体的妨害）または生化学的（例えば静電相互作用）に防止することができる。第１および第２の重鎖分子の連結を促す例示的な突然変異は、例えば、米国特許出願公開第２０１４０３２２７５６号明細書、および「Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２～２１２頁に開示されている。Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子２４０、またはその追加の修飾を含むことができる。

【0102】

Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５、例えばＣＤ１９、ＣＤ３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－βＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0103】

Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖は、ＣＤ１９結合成分を含むＶＨ配列を含み、第２の重鎖は、ＣＤ３８結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３８一本鎖可変フラグメントを含む重鎖は、配列番号２０５または配列番号２０６を含む。特定の実施形態では、ＶＬ配列はＣＤ１９結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３８結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ３８結合成分、またはそのＣＤ３８結合フラグメントを含む。一部の実施形態では、第１の重鎖は、ＣＤ３８結合成分を含むＶＨ配列を含み、第２の重鎖は、ＣＤ１９結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９一本鎖可変フラグメントを含む重鎖は、配列番号２０３、配列番号２０４、または配列番号２１７を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ１９結合成分、またはそのＣＤ１９結合フラグメントを含む。

【0104】

Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖は、ＣＤ３８結合成分を含むＶＨ配列を含み、第２の重鎖は、ＣＤ１９結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列を含む。特定の実施形態では、ＶＬ配列はＣＤ３８結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ１９結合成分、またはそのＣＤ１９結合フラグメントを含む。

【0105】

本明細書に記載されるＢＳ２は、ＣＤ１９に結合するように構成されたＣＤ１９結合成分およびＣＤ３８に結合するように構成されたＣＤ３８結合成分を含み、ＣＤ１９結合成分は抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ＣＤ３８結合成分は抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ＣＤ３８抗原結合成分は、抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域とペアを形成した抗ＣＤ３８免疫グロブリン重鎖可変領域を含むＣＤ３８に結合するＦａｂを含み、ＣＤ１９抗原結合成分は、抗ＣＤ３８免疫グロブリン軽鎖可変領域とペアを形成した抗ＣＤ１９免疫グロブリン重鎖可変領域を含むＣＤ１９に結合するｓｃＦｖを含み、ＣＤ３８結合成分は、配列番号７１～７５のうちいずれか１つに明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号８１～８５、または１５０～１５５のうちいずれか１つに明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号９１～９５のうちいずれか１つに明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を含み、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号１０１～１０５のうちいずれか１つに明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１１１～１１５のうちいずれか１つに明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号１２１～１２５のうちいずれか１つに明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含み、ＣＤ１９結合成分は、配列番号１１～１５のうちいずれか１つに明記されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号２１～２５のうちいずれか１つに明記されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号３１～３５のうちいずれか１つに明記されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖を含み、免疫グロブリン軽鎖は、配列番号４１～４５のうちいずれか１つに明記されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号５１～５５のうちいずれか１つに明記されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および／または配列番号６１～６５のうちいずれか１つに明記されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８抗原結合成分は、配列Ｐ－Ｘ１－Ｌ－Ｇ－Ｘ２－Ａ（配列番号１５６）を含むＨＣＤＲ２アミノ酸配列を含み、Ｘ１およびＸ２は、Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａ、Ｒ、Ｋ、Ｄ、またはＥからなる群から選択される。特定の実施形態では、Ｘ１はＨであり、Ｘ２はＴである。一部の実施形態では、ＣＤ１９重鎖配列はＡ８４Ｓおよび／またはＡ１０８Ｌ置換を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８軽鎖はＷ３２Ｈ置換を含む。

【0106】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ
Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する操作された二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図３は、Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を図示する。この構造は、第１の重鎖分子および修飾されたＩｇＧ重鎖分子を含む。第１の重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端までＶＨドメイン３０２、ＣＨ１ドメイン３０４、ＣＨ２ドメイン３０６、ＣＨ３ドメイン３０８、リンカー３１０、第２のＶＨドメイン３１２、および第２のＣＨ１ドメイン３１４を含む。修飾された重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端までＣＨ２ドメイン３１６、およびＣＨ３ドメイン３１８を含む。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン３２０およびＣＬドメイン３２２を含む第１の軽鎖を含む。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン３２４およびＣＬドメイン３２６を含む第２の軽鎖を含む。重鎖は、共有結合（例えばジスルフィド結合３３０）を介して軽鎖分子に共有結合的に連結され得る。第１の重鎖はまた、共有結合（例えばジスルフィド結合３３２）を介して第１、第２の鎖分子に共有結合的に連結され得る。重鎖および軽鎖は、第１の重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインが第１の軽鎖のＶＬドメインおよびＣＬドメインとペアを形成するように連結され得る。第１の重鎖および第２の軽鎖は、第１の重鎖の第２のＶＨドメインおよび第２のＣＨ１ドメインが第２の軽鎖のＶＬドメインおよびＣＬドメインとペアを形成するように連結され得る。第１の重鎖は、１つまたは複数の共有結合（例えばジスルフィド結合３３４および／または３３６）を介して、修飾された第２の重鎖に連結され得る。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１および第２の重鎖の連結を促進しかつ／または第１の重鎖の別の第１の重鎖へのもしくは第２の重鎖の別の第２の重鎖への連結を防止するＣＨ３ドメイン内の突然変異をさらに含む、第１および修飾された第２の重鎖分子を含むことができる。突然変異は、２つの第１の重鎖分子または２つの第２の重鎖分子の連結を物理的（例えば立体的妨害）または生化学的（例えば静電相互作用）に防止することができる。第１および第２の重鎖分子の連結を促す例示的な突然変異は、例えば、米国特許出願公開第２０１４０３２２７５６号明細書、および「Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２～２１２頁に開示されている。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子３４０、またはその追加の修飾を含むことができる。

【0107】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５、例えばＣＤ１９、ＣＤ３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－βＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0108】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば３０２）およびＶＬドメイン（例えば３２０）はＣＤ１９結合成分を含み、第２のＶＨドメイン（例えば３１２）およびＶＬドメイン（例えば３２４）はＣＤ３８結合成分を含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ重鎖は配列番号２０７を含み、Ｆｃ重鎖は配列番号２０８を含む。

【0109】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、第１の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば３０２）およびＶＬドメイン（例えば３２０）はＣＤ３８結合成分を含み、第２のＶＨドメイン（例えば３１２）およびＶＬドメイン（例えば３２４）はＣＤ１９結合成分を含む。

【0110】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ二特異性ＩｇＧ
Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ二特異性ＩｇＧ構造を有する操作された二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図４は、Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を図示する。この構造は２つの第１の重鎖分子を含む。第１の重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端までＶＨドメイン４０２、ＣＨ１ドメイン４０４、ＣＨ２ドメイン４０６、ＣＨ３ドメイン４０８、リンカー４１０、および一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）４１２を含む。一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、可変軽鎖ドメインに対応する第１のドメイン４１４またはそのフラグメント、可変重鎖に対応する第２のドメイン４１６またはそのフラグメント、および第２のリンカーポリペプチド４１５を含むことができる。Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン４２０およびＣＬドメイン４２２を含む第１の軽鎖を含む。重鎖は、共有結合（例えばジスルフィド結合４３０）を介して軽鎖分子に共有結合的に連結され得る。重鎖は、１つまたは複数の共有結合（例えばジスルフィド結合４３４および／または４３６）を介して別の重鎖に連結され得る。Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子４４０またはその追加の修飾を含むことができる。

【0111】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５、例えばＣＤ１９、ＣＤ３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－βＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0112】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば４０２）およびＶＬドメイン（例えば４２０）はＣＤ１９結合成分を含み、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（例えば４１２）配列はＣＤ３８結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３８結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ３８結合成分、またはそのＣＤ３８結合フラグメントを含む。

【0113】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ二特異性ＩｇＧ構造はまた、第１の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば４０２）およびＶＬドメイン（例えば４２０）はＣＤ３８結合成分を含み、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（例えば４１２）配列はＣＤ１９結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ１９結合成分、またはそのＣＤ１９結合フラグメントを含む。一部の実施形態では、Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ重鎖は、配列番号２０９を含む。

【0114】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ
Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する操作された二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図５は、Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を図示する。この構造は、第１の重鎖分子および第２のＩｇＧ重鎖分子を含む。第１の重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端までＶＨドメイン５０２、ＣＨ１ドメイン５０４、ＣＨ２ドメイン５０６、ＣＨ３ドメイン５０８、リンカー５１０、および一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）５１２を含む。一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、可変軽鎖ドメインに対応する第１のドメイン５１４またはそのフラグメント、可変重鎖に対応する第２のドメイン５１６またはそのフラグメント、および第２のリンカーポリペプチド５１５を含むことができる。Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン５２０およびＣＬドメイン５２２を含む第１の軽鎖を含む。Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン５２４およびＣＬドメイン５２６を含む第２の軽鎖を含む。重鎖は、共有結合（例えばジスルフィド結合５３０）を介して軽鎖分子に共有結合的に連結され得る。重鎖は、１つまたは複数の共有結合（例えばジスルフィド結合５３４および／または５３６）を介して別の重鎖に連結され得る。Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１および第２の重鎖の連結を促進しかつ／または第１の重鎖の別の第１の重鎖へのもしくは第２の重鎖の別の第２の重鎖への連結を防止するＣＨ３ドメイン内の突然変異をさらに含む、第１および修飾された第２の重鎖分子を含むことができる。突然変異は、２つの重鎖分子または２つの第２の重鎖分子の連結を物理的（例えば立体的妨害）または生化学的（例えば静電相互作用）に防止することができる。第１および第２の重鎖分子の連結を促す例示的な突然変異は、例えば、米国特許出願公開第２０１４０３２２７５６号明細書、および「Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２～２１２頁に開示されている。Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子５４０、またはその追加の修飾を含むことができる。

【0115】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５、例えばＣＤ１９、ＣＤ３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－βＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0116】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば５０２）およびＶＬドメイン（例えば５２０）はＣＤ１９結合成分を含み、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（例えば５１２）配列はＣＤ３８結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３８結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ３８結合成分、またはそのＣＤ３８結合フラグメントを含む。

【0117】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、第１の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば５０２）およびＶＬドメイン（例えば５２０）はＣＤ３８結合成分を含み、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（例えば５１２）配列はＣＤ１９結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ１９結合成分、またはそのＣＤ１９結合フラグメントを含む。

【0118】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ
Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する操作された二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図６は、Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を図示する。この構造は、第１の重鎖分子および第２のＩｇＧ重鎖分子を含む。第１の重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端までＶＨドメイン６０２、ＣＨ１ドメイン６０４、ＣＨ２ドメイン６０６、ＣＨ３ドメイン６０８、リンカー６１０、第２のＶＨドメイン６１２、および第２のＣＨ１ドメイン６１４を含む。第２の重鎖は、第１の重鎖のものと同様に、それぞれＮ末端からＣ末端までＶＨドメイン６５２、ＣＨ１ドメイン６５４、ＣＨ２ドメイン６５６、およびＣＨ３ドメイン６５８を含む。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン６２０およびＣＬドメイン６２２を含む第１の軽鎖を含む。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン６２４およびＣＬドメイン６２６を含む第２の軽鎖を含む。重鎖は、共有結合（例えばジスルフィド結合６３０）を介して軽鎖分子に共有結合的に連結され得る。第１の重鎖および第１の軽鎖は、第１の重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインが第１の軽鎖のＶＬドメインおよびＣＬドメインとペアを形成するように連結され得る。第１の重鎖および第２の軽鎖は、第１の重鎖の第２のＶＨドメインおよび第２のＣＨ１ドメインが第２の軽鎖のＶＬドメインおよびＣＬドメインとペアを形成するように連結され得る。重鎖は、１つまたは複数の共有結合（例えばジスルフィド結合６３４および／または６３６）を介して別の重鎖に連結され得る。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１および第２の重鎖の連結を促進しかつ／または第１の重鎖の別の第１の重鎖へのもしくは第２の重鎖の別の第２の重鎖への連結を防止するＣＨ３ドメイン内の突然変異をさらに含む、第１および第２の重鎖分子を含むことができる。突然変異は、２つの第１の重鎖分子または２つの第２の重鎖分子の連結を物理的（例えば立体的妨害）または生化学的（例えば静電相互作用）に防止することができる。第１および第２の重鎖分子の連結を促す例示的な突然変異は、例えば、米国特許出願公開第２０１４０３２２７５６号明細書、および「Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２～２１２頁に開示されている。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子またはその追加の修飾を含むことができる。

【0119】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β ＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0120】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば６０２）およびＶＬドメイン（例えば６２０）はＣＤ１９結合成分を含み、第２のＶＨドメイン（例えば６１２）およびＶＬドメイン（例えば６２４）はＣＤ３８結合成分を含む。

【0121】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、第１の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば６０２）およびＶＬドメイン（例えば６２０）はＣＤ３８結合成分を含み、第２のＶＨドメイン（例えば６１２）およびＶＬドメイン（例えば６２４）はＣＤ１９結合成分を含む。

【0122】

ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ
ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する操作された二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図７は、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を図示する。この構造は２つの第１の重鎖分子を含む。第１の重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端まで一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）７１２、リンカー７１０、ＶＨドメイン７０２、ＣＨ１ドメイン７０４、ＣＨ２ドメイン７０６、およびＣＨ３ドメイン７０８を含む。一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、可変軽鎖ドメインに対応する第１のドメイン７１４またはそのフラグメント、可変重鎖に対応する第２のドメイン７１６またはそのフラグメント、および第２のリンカーポリペプチド７１５を含むことができる。ＳｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン７２０およびＣＬドメイン７２２を含む第１の軽鎖を含む。重鎖は、共有結合（例えばジスルフィド結合７３０）を介して軽鎖分子に共有結合的に連結され得る。重鎖は、１つまたは複数の共有結合（例えばジスルフィド結合７３４および／または７３６）を介して別の重鎖に連結され得る。ＳｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子７４０、またはその追加の修飾を含むことができる。

【0123】

ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β ＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0124】

ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば７０２）およびＶＬドメイン（例えば７２０）はＣＤ１９結合成分を含み、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（例えば７１２）配列はＣＤ３８結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３８結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ３８結合成分、またはそのＣＤ３８結合フラグメントを含む。

【0125】

ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、第１の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば７０２）およびＶＬドメイン（例えば７２０）はＣＤ３８結合成分を含み、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（例えば７１２）配列はＣＤ１９結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ１９結合成分、またはそのＣＤ１９結合フラグメントを含む。

【0126】

Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ
Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する操作された二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図８は、Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を図示する。この構造は２つの重鎖分子を含む。重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端まで追加のＶＨドメイン８１２、および追加のＣＨ１ドメイン８１４、リンカー８１０、ＶＨドメイン８０２、ＣＨ１ドメイン８０４、ＣＨ２ドメイン８０６、ならびにＣＨ３ドメイン８０８を含む。Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン８２０およびＣＬドメイン８２２を含む第１の軽鎖を含む。Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン８２４およびＣＬドメイン８２６を含む第２の軽鎖を含む。重鎖分子は、共有結合（例えばジスルフィド結合８３０）を介して軽鎖分子に共有結合的に連結され得る。重鎖および第１の軽鎖は、重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインが第１の軽鎖のＶＬドメインおよびＣＬドメインとペアを形成するように連結され得る。重鎖および第２の軽鎖は、重鎖の追加のＶＨドメインおよび追加のＣＨ１ドメインが第２の軽鎖のＶＬドメインおよびＣＬドメインとペアを形成するように連結され得る。重鎖は、１つまたは複数の共有結合（例えばジスルフィド結合８３４および／または８３６）を介して、修飾された第２の重鎖に連結され得る。Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子８４０、またはその追加の修飾を含むことができる。

【0127】

Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β ＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0128】

Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１のＶＨドメイン（例えば８０２）およびＶＬドメイン（例えば８２０）はＣＤ１９結合成分を含み、第２のＶＨドメイン（例えば８１２）およびＶＬドメイン（例えば８２４）はＣＤ３８結合成分を含む。

【0129】

Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆａｂ－Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、第１の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、ＶＨドメイン（例えば８０２）およびＶＬドメイン（例えば８２０）はＣＤ３８結合成分を含み、第２のＶＨドメイン（例えば８１２）およびＶＬドメイン（例えば８２４）はＣＤ１９結合成分を含む。

【0130】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧ
Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧ構造を有する操作された二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図９は、Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を図示する。この構造は、２つの重鎖分子および２つの軽鎖分子を含む。重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端までＶＨドメイン９０２、ＣＨ１ドメイン９０４、ＣＨ２ドメイン９０６、ＣＨ３ドメイン９０８、リンカー９１０、第２のＶＨドメイン９１２、および第２のＣＨ１ドメイン９１４を含む。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン９２０およびＣＬドメイン９２２を含む第１の軽鎖を含む。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン９２４およびＣＬドメイン９２６を含む第２の軽鎖を含む。重鎖は、共有結合（例えばジスルフィド結合９３０）を介して軽鎖分子に共有結合的に連結され得る。重鎖および第１の軽鎖は、重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインが第１の軽鎖のＶＬドメインおよびＣＬドメインとペアを形成するように連結され得る。重鎖および第２の軽鎖は、重鎖の第２のＶＨドメインおよび第２のＣＨ１ドメインが第２の軽鎖のＶＬドメインおよびＣＬドメインとペアを形成するように連結され得る。重鎖はまた、共有結合（例えばジスルフィド結合９３０および９３６）を介して別の重鎖分子に共有結合的に連結され得る。Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子９４０、またはその追加の修飾を含むことができる。

【0131】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β ＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0132】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１のＶＨドメイン（例えば９０２）およびＶＬドメイン（例えば９２０）はＣＤ１９結合成分を含み、第２のＶＨドメイン（例えば９１２）およびＶＬドメイン（例えば９２４）はＣＤ３８結合成分を含む。

【0133】

Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ：Ｆａｂ－Ｆｃ－Ｆａｂ二特異性ＩｇＧ構造はまた、第１の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、ＶＨドメイン（例えば９０２）およびＶＬドメイン（例えば９２０）はＣＤ３８結合成分を含み、第２のＶＨドメイン（例えば９１２）およびＶＬドメイン（例えば９２４）はＣＤ１９結合成分を含む。

【0134】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ
Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する操作された二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図１０は、Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を実証する。この構造は、第１の重鎖分子および第２のＩｇＧ重鎖分子を含む。第１の重鎖は、それぞれＮ末端からＣ末端までＶＨドメイン１００２、ＣＨ１ドメイン１００４、ＣＨ２ドメイン１００６、ＣＨ３ドメイン１００８、リンカー１０１０、および一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）１０１２を含む。一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、可変軽鎖ドメインに対応する第１のドメイン１０１４またはそのフラグメント、可変重鎖に対応する第２のドメイン１０１６またはそのフラグメント、および第２のリンカーポリペプチド１０１５を含むことができる。第２の重鎖は、第１の重鎖のものと同様に、それぞれＮ末端からＣ末端までＶＨドメイン１００２、ＣＨ１ドメイン１００４、ＣＨ２ドメイン１００４、およびＣＨ３ドメイン１００８を含む。Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、ＶＬドメイン１０２０およびＣＬドメイン１０２２を含む第１の軽鎖を含む。重鎖は、共有結合（例えばジスルフィド結合１０３０）を介して軽鎖分子に共有結合的に連結され得る。重鎖は、１つまたは複数の共有結合（例えばジスルフィド結合１０３４および／または１０３６）を介して別の重鎖に連結され得る。Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１および第２の重鎖の連結を促進しかつ／または第１の重鎖の別の第１の重鎖へのもしくは第２の重鎖の別の第２の重鎖への連結を防止するＣＨ３ドメイン内の突然変異をさらに含む、第１および第２の重鎖分子を含むことができる。突然変異は、２つの第１の重鎖分子または２つの第２の重鎖分子の連結を物理的（例えば立体的妨害）または生化学的（例えば静電相互作用）に防止することができる。第１および第２の重鎖分子の連結を促す例示的な突然変異は、例えば、米国特許出願公開第２０１４０３２２７５６号明細書、および「Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２～２１２頁に開示されている。Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子１０４０またはその追加の修飾を含むことができる。

【0135】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β ＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0136】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば１００２）およびＶＬドメイン（例えば１０２０）はＣＤ１９結合成分を含み、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（例えば１０１２）配列はＣＤ３８結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３８結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ３８結合成分、またはそのＣＤ３８結合フラグメントを含む。

【0137】

Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆａｂ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、第１の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメイン（例えば１００２）およびＶＬドメイン（例えば１０２０）はＣＤ３８結合成分を含み、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）（例えば１０１２）配列はＣＤ１９結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ１９結合成分、またはそのＣＤ１９結合フラグメントを含む。

【0138】

ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ
ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する操作された二特異性抗体を、本発明で使用することができる。図１１は、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体を実証する。この構造は、ｓｃＦｖ、ＶＨ、およびＦｃ領域を含む第１の重鎖分子、ならびにＦｃを含む第２の重鎖分子を含む。ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１および第２の重鎖の連結を促進しかつ／または第１の重鎖の別の第１の重鎖へのもしくは第２の重鎖の別の第２の重鎖への連結を防止するＣＨ３ドメイン内の突然変異をさらに含む、第１および第２の重鎖分子を含むことができる。突然変異は、第１の重鎖分子の第２の重鎖分子への会合を物理的（例えばノブ・イン・ホール構造）または生化学的（例えば静電相互作用）に促進することができる。ＳｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位を作出する第１の重鎖分子と会合した軽鎖分子を含む。第２の抗原結合部位は、第１の重鎖のＮ末端に連結されたｓｃＦｖフラグメントにより提供される。第１および第２の重鎖分子の連結を促す例示的な突然変異は、例えば、米国特許出願公開第２０１４０３２２７５６号明細書、および「Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＭＡｂｓ．２０１７ Ｆｅｂ－Ｍａｒ；９（２）：１８２～２１２頁に開示されている。ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、それに連結された炭水化物分子１１４０、またはその追加の修飾を含むことができる。

【0139】

ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造を有する二特異性抗体は、Ｂ細胞系列表面マーカ（例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５）、および抑制性Ｂ細胞表面マーカ（例えばＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β ＬＡＰ））を標的化することができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９を含む。特定の実施形態では、Ｂ細胞系列表面マーカはＣＤ１９からなる。一部の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８を含む。特定の実施形態では、抑制性Ｂ細胞表面マーカはＣＤ３８からなる。

【0140】

ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造は、第１の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、第１の重鎖ＶＨドメインおよびＶＬドメインはＣＤ１９結合成分を含み、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列はＣＤ３８結合成分を含む。特定の実施形態では、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ３８結合成分、またはそのＣＤ３８結合フラグメントを含む。

【0141】

ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ構造はまた、第１の抗原結合部位がＣＤ３８を標的化し、かつ第２の抗原結合部位がＣＤ１９を標的化するように操作され得る。一部の実施形態では、重鎖ＶＨドメインおよびＶＬドメインはＣＤ３８結合成分を含み、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列はＣＤ１９結合成分を含む。特定の実施形態では、ＣＤ１９結合成分を含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）配列は、抗体重鎖および軽鎖可変配列に対応するＣＤ１９結合成分、またはそのＣＤ１９結合フラグメントを含む。

【0142】

特定の実施形態では、第１の重鎖分子は、配列番号２１２に明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１の重鎖分子は、配列番号２１２に明記されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。

【0143】

特定の実施形態では、第１の軽鎖分子は、配列番号２１３に明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１の軽鎖分子は、配列番号２１３に明記されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。

【0144】

特定の実施形態では、第２の重鎖分子は、配列番号２１４に明記されるアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１の重鎖分子は、配列番号２１４に明記されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。

【0145】

Ｆｃバリアント
一部の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸修飾が、ヒトまたはヒト化抗体のフラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域に導入され、それによってＦｃ領域バリアントを生成する。Ｆｃ領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはそれらのあらゆる組合せを含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を含んでもよい。本明細書で使用される場合、Ｆｃ領域は、ネイティブ配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む。Ｆｃ領域バリアントは、１つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換、付加、または欠失）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）を含んでもよい。

【0146】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、Ｆｃ領域に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾を組み合わせることも有用である。例えば、バリアントＦｃ領域はその中に、例えば本明細書で同定される特定のＦｃ領域位置の、例えば２、３、４、５つの置換を含んでもよい。

【0147】

一部の実施形態では、本明細書に記載の抗体は、ヒトＩｇＧと比較して改変されたエフェクタ機能を有する。一部の実施形態では、改変されたエフェクタ機能は、減少したエフェクタ機能である。一部の実施形態では、改変されたエフェクタ機能は、上昇したエフェクタ機能である。エフェクタ機能は、一般に、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生物学的事象を指す。非限定的なエフェクタ機能としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、およびＢ細胞活性化が挙げられる。場合により、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、Ｆｃ受容体を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ）が標的細胞上で結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を生じさせる細胞媒介反応を指す。場合により、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指し、補体作用経路は、標的と結合した抗体に対するＣ１ｑの結合によって開始される。

【0148】

特定の場合、本明細書に記載の抗体のエフェクタ機能を低下させることが有益である。一部の事例では、Ｆｃ領域における修飾は、（ａ）抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が減少し、（ｂ）補体媒介細胞傷害（ＣＤＣ）が減少し、かつ／または（ｃ）Ｃ１ｑに対する親和性が減少したＦｃバリアントを生成する。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、または４３９位（ＥＵナンバリング）において１つまたは複数のアミノ酸を修飾することによって、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を減少させる、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）を減少させる、補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）を減少させる、および／またはＣ１ｑに対する親和性を減少させるように修飾される。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、表１から選択される。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、表１の突然変異のうち１つまたは複数を含む。

【0149】

【表1-1】

【0150】

【表1-2】

【0151】

関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を精査するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号明細書、および同第５，８２１，３３７号明細書に記載されている。代替的に、非放射アッセイ法を採用してもよい（例えば、ＡＣＴＩ（商標）およびＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）の非放射性細胞毒性アッセイ）。かかるアッセイに有用なエフェクタ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、単球、マクロファージ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。

【0152】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、非バリアントＦｃ領域を含む抗体、すなわち、ＡＤＣＣを減少させる置換がある点を除き同じ配列同一性を有する抗体（ヒトＩｇＧ１など）と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％以上減少したＡＤＣＣを示す。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、非バリアントＦｃ領域を含む抗体、すなわち、ＣＤＣを減少させる置換がある点を除き同じ配列同一性を有する抗体（ヒトＩｇＧ１など）と比較して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％以上減少したＣＤＣを示す。

【0153】

特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、約１０％～約１００％減少したＡＤＣＣを示す。特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約１００％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％減少したＡＤＣＣを示す。特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％減少したＡＤＣＣを示す。特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、最低約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％減少したＡＤＣＣを示す。

【0154】

特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、約１０％～約１００％減少したＣＤＣを示す。特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、約１０％～約２０％、約１０％～約３０％、約１０％～約４０％、約１０％～約５０％、約１０％～約６０％、約１０％～約７０％、約１０％～約８０％、約１０％～約９０％、約１０％～約１００％、約２０％～約３０％、約２０％～約４０％、約２０％～約５０％、約２０％～約６０％、約２０％～約７０％、約２０％～約８０％、約２０％～約９０％、約２０％～約１００％、約３０％～約４０％、約３０％～約５０％、約３０％～約６０％、約３０％～約７０％、約３０％～約８０％、約３０％～約９０％、約３０％～約１００％、約４０％～約５０％、約４０％～約６０％、約４０％～約７０％、約４０％～約８０％、約４０％～約９０％、約４０％～約１００％、約５０％～約６０％、約５０％～約７０％、約５０％～約８０％、約５０％～約９０％、約５０％～約１００％、約６０％～約７０％、約６０％～約８０％、約６０％～約９０％、約６０％～約１００％、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７０％～約１００％、約８０％～約９０％、約８０％～約１００％、または約９０％～約１００％減少したＣＤＣを示す。特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％減少したＣＤＣを示す。特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、最低約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％減少したＣＤＣを示す。

【0155】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、野生型ヒトＩｇＧ１と比較して減少したエフェクタ機能を示す。特定の事例においてＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを減少させる、ＩｇＧ１におけるＦｃ突然変異の非限定的な例として、ＩｇＧ１における２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２６４、２６５、２６７、２６９、２７０、２９７、２９９、３１８、３２０、３２２、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０、および３３１位のうち１つまたは複数での置換が挙げられ、この場合、定常領域のナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔにより示されるＥＵインデックスのナンバリングシステムである。

【0156】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＮ２９７Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＮ２９７Ｑ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＮ２９７Ｄ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＤ２６５Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＳ２２８Ｐ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３５Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３７Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＥ２３３Ｐ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４Ｖ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＫａｂａｔナンバリングシステムによるＣ２３６欠失を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ２３８Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＡ３２７Ｑ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ３２９Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ３２９Ｇ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３５Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４Ｆ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３５Ｇ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３５Ｑ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３５Ｒ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３５Ｓ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３６Ｆ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３６Ｒ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３７Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３７Ｋ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３７Ｎ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３７Ｒ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３８Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３８Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３８Ｇ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３８Ｈ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３８Ｉ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３８Ｖ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３８Ｗ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３８Ｙ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２４８Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５４Ｄ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５４Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５４Ｇ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５４Ｈ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５４Ｉ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５４Ｎ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５４Ｐ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５４Ｑ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５４Ｔ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５４Ｖ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５５Ｎ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５６Ｈ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５６Ｋ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５６Ｒ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２５６Ｖ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６４Ｓ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６５Ｈ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６５Ｋ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６５Ｓ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６５Ｙ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６７Ｇ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６７Ｈ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６７Ｉ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６７Ｋ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６８Ｋ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６９Ｎ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２６９Ｑ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２７０Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２７０Ｇ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２７０Ｍ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２７０Ｎ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２７１Ｔ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２７２Ｎ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２７９Ｆ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２７９Ｋ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２７９Ｌ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２９２Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２９２Ｆ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２９２Ｇ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２９２Ｉ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２９３Ｓ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３０１Ｗ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３０４Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３１１Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３１１Ｇ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３１１Ｓ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３１６Ｆ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３２７Ｔ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３２８Ｖ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３２９Ｙ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３３０Ｒ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域
を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３３９Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３３９Ｌ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３４３Ｉ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３４３Ｖ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３７３Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３７３Ｇ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３７３Ｓ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３７６Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３７６Ｗ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３７６Ｙ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３８０Ｄ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３８２Ｄ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３８２Ｐ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる３８５Ｐ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４２４Ｈ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４２４Ｍ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４２４Ｖ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４３４Ｉ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４３８Ｇ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４３９Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４３９Ｈ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４３９Ｑ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４４０Ａ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４４０Ｄ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４４０Ｅ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４４０Ｆ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４４０Ｍ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４４０Ｔ Ｆｃ領域置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる４４０Ｖ置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。

【0157】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングによるＩｇＧ１ Ｆｃ領域Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、および／またはＰ３３１Ｓを含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＥ２３３Ｐを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３５Ｅを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３３１Ｓを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、およびＰ３３１Ｓを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ（ＩｇＧ１）を含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＧ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＧ２３７Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＦ２４１Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＶ２６４Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＤ２６５Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＤ２６５ＡおよびＮ２９７Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＤ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＤ２７０Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＮ２９７Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＮ２９７Ｇを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＮ２９７Ｄを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＮ２９７Ｑを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ３２９Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ３２９Ｇを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ３２９Ｒを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＡ３３０Ｌを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ３３１Ａを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ３３１Ｓを含むＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域はＩｇＧ２ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＳ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａを含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＩｇＧ２～ＩｇＧ４交差サブクラス（ＩｇＧ２／Ｇ４）Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＩｇＧ２～ＩｇＧ３交差サブクラスＦｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓを含むＩｇＧ２ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＶ２３４Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓを含むＩｇＧ２ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、高マンノースグリコシル化を含むＦｃ領域を含む。

【0158】

一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングによるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓを含むか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、野生型Ｆｃ領域と比して１つまたは複数の突然変異は、Ｎ２９７Ａ／Ｑ／Ｇ、Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ、Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｐ３２９Ｇ、Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ２３８Ｓ／Ｈ２６８Ａ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ、およびＬ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｄ２６５Ａからなる群から選択される。

【0159】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＳ２２８Ｐ置換を含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＡ３３０Ｓ置換を含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。

【0160】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＡ３３０Ｓ置換を含むＩｇＧ２ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによるＰ３３１Ｓ置換を含むＩｇＧ２ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３４Ａ置換を含むＩｇＧ２ Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、ＥＵナンバリングシステムによる２３７Ａ置換を含むＩｇＧ２ Ｆｃ領域を含む。

【0161】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域はＩｇＧ１ Ｆｃ領域を含み、１つまたは複数の突然変異は、ＥＵナンバリングよる、（ａ）２９７Ａ、２９７Ｑ、２９７Ｇ、もしくは２９７Ｄ、（ｂ）２７９Ｆ、２７９Ｋ、もしくは２７９Ｌ、（ｃ）２２８Ｐ、（ｄ）２３５Ａ、２３５Ｅ、２３５Ｇ、２３５Ｑ、２３５Ｒ、もしくは２３５Ｓ、（ｅ）２３７Ａ、２３７Ｅ、２３７Ｋ、２３７Ｎ、もしくは２３７Ｒ、（ｆ）２３４Ａ、２３４Ｖ、もしくは２３４Ｆ、（ｇ）２３３Ｐ、（ｈ）３２８Ａ、（ｉ）３２７Ｑもしくは３２７Ｔ、（ｊ）３２９Ａ、３２９Ｇ、３２９Ｙ、もしくは３２９Ｒ、（ｋ）３３１Ｓ、（ｌ）２３６Ｆもしくは２３６Ｒ、（ｍ）２３８Ａ、２３８Ｅ、２３８Ｇ、２３８Ｈ、２３８Ｉ、２３８Ｖ、２３８Ｗ、もしくは２３８Ｙ、（ｎ）２４８Ａ、（ｏ）２５４Ｄ、２５４Ｅ、２５４Ｇ、２５４Ｈ、２５４Ｉ、２５４Ｎ、２５４Ｐ、２５４Ｑ、２５４Ｔ、もしくは２５４Ｖ、（ｐ）２５５Ｎ、（ｑ）２５６Ｈ、２５６Ｋ、２５６Ｒ、もしくは２５６Ｖ、（ｒ）２６４Ｓ、（ｓ）２６５Ｈ、２６５Ｋ、２６５Ｓ、２６５Ｙ、もしくは２６５Ａ、（ｔ）２６７Ｇ、２６７Ｈ、２６７Ｉ、もしくは２６７Ｋ、（ｕ）２６８Ｋ、（ｖ）２６９Ｎもしくは２６９Ｑ、（ｗ）２７０Ａ、２７０Ｇ、２７０Ｍ、または２７０Ｎ、（ｘ）２７１Ｔ、（ｙ）２７２Ｎ、（ｚ）２９２Ｅ、２９２Ｆ、２９２Ｇ、もしくは２９２Ｉ、（ａａ）２９３Ｓ、（ｂｂ）３０１Ｗ、（ｃｃ）３０４Ｅ、（ｄｄ）３１１Ｅ、３１１Ｇ、もしくは３１１Ｓ、（ｅｅ）３１６Ｆ、（ｆｆ）３２８Ｖ、（ｇｇ）３３０Ｒ、（ｈｈ）３３９Ｅもしくは３３９Ｌ、（ｉｉ）３４３Ｉもしくは３４３Ｖ、（ｊｊ）３７３Ａ、３７３Ｇ、もしくは３７３Ｓ、（ｋｋ）３７６Ｅ、３７６Ｗ、もしくは３７６Ｙ、（ｌｌ）３８０Ｄ、（ｍｍ）３８２Ｄもしくは３８２Ｐ、（ｎｎ）３８５Ｐ、（ｏｏ）４２４Ｈ、４２４Ｍ、もしくは４２４Ｖ、（ｐｐ）４３４Ｉ、（ｑｑ）４３８Ｇ、（ｒｒ）４３９Ｅ、４３９Ｈ、もしくは４３９Ｑ、（ｓｓ）４４０Ａ、４４０Ｄ、４４０Ｅ、４４０Ｆ、４４０Ｍ、４４０Ｔ、もしくは４４０Ｖ、（ｔｔ）Ｋ３２２Ａ、（ｕｕ）Ｌ２３５Ｅ、（ｖｖ）Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ、（ｗｗ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＧ２３７Ａ、（ｘｘ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ、（ｙｙ）Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３３１Ｓ、（ｚｚ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａ、（ａａａ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、およびＰ３３１Ｓ、（ｂｂｂ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ、（ｃｃｃ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ａ、（ｄｄｄ）Ｇ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒ、（ｅｅｅ）Ｇ２３７Ａ、（ｆｆｆ）Ｆ２４１Ａ、（ｇｇｇ）Ｖ２６４Ａ、（ｈｈｈ）Ｄ２６５Ａ、（ｉｉｉ）Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ａ、（ｊｊｊ）Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇ、（ｋｋｋ）Ｄ２７０Ａ、（ｌｌｌ）Ａ３３０Ｌ、（ｍｍｍ）Ｐ３３１ＡもしくはＰ３３１Ｓ、または（ｎｎｎ）Ｅ２３３Ｐ、（ｏｏｏ）Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ、およびＰ３３１Ｓ、あるいは（ｐｐｐ）（ａ）～（ｕｕ）のあらゆる組合せを含む。

【0162】

一部の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、配列番号３１１に明記されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、複合体結合分子において、ＣＤ１９抗原結合成分は、配列番号３０１または３０４に明記される重鎖免疫グロブリン配列を含み、ＣＤ３８結合成分は、配列番号３０２、３０３、３０５～３１０に明記される重鎖免疫グロブリン配列を含む。

【0163】

フレームワーク領域
重鎖および軽鎖のフレームワーク領域内で行われる生殖系列配列に対する突然変異または復帰突然変異は、本明細書に記載されるＣＤ１９およびＣＤ３８結合分子の薬物動態的および薬力学的特性を改善するのに都合の良い可能性がある。特定の事例では、重鎖および／または軽鎖内で行われる生殖系列配列に対する突然変異または復帰突然変異は、ＣＤ１９およびＣＤ３８結合分子（例えば本明細書に記載の二特異性抗体）の安定性を改善する。特定の事例では、重鎖および／または軽鎖内で行われる生殖系列配列に対する突然変異または復帰突然変異は、ＣＤ１９およびＣＤ３８結合分子（例えば本明細書に記載の二特異性抗体）の免疫原性を低減させる。したがって、一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域は、生殖系列配列に戻る１、２、３、４、５、８、または１０個の突然変異または復帰突然変異を含む。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域は、生殖系列配列に戻る１個の突然変異または復帰突然変異から、生殖系列配列に戻る１０個の突然変異または復帰突然変異までを含む。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域は、生殖系列配列に戻る最低１個の突然変異または復帰突然変異を含む。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域は、生殖系列配列に戻る最大１０個の突然変異または復帰突然変異を含む。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域は、生殖系列配列に戻る１個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る２個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る１個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る３個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る１個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る４個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る１個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る５個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る１個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る８個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る１個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る１０個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る２個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る３個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る２個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る４個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る２個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る５個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る２個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る８個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る２個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る１０個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る３個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る４個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る３個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る５個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る３個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る８個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る３個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る１０個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る４個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る５個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る４個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る８個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る４個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る１０個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る５個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る８個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、生殖系列配列に戻る５個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る１０個の突然変異もしくは復帰突然変異まで、または生殖系列配列に戻る８個の突然変異もしくは復帰突然変異から生殖系列配列に戻る１０個の突然変異もしくは復帰突然変異までを含む。一部の実施形態では、重鎖および／または軽鎖のフレームワーク領域は、生殖系列配列に戻る１個の突然変異もしくは復帰突然変異、生殖系列配列に戻る２個の突然変異もしくは復帰突然変異、生殖系列配列に戻る３個の突然変異もしくは復帰突然変異、生殖系列配列に戻る４個の突然変異もしくは復帰突然変異、生殖系列配列に戻る５個の突然変異もしくは復帰突然変異、生殖系列配列に戻る８個の突然変異もしくは復帰突然変異、または生殖系列配列に戻る１０個の突然変異もしくは復帰突然変異を含む。一部の実施形態では、ＣＤ３８結合部分は、配列番号５に明記される重鎖フレームワーク領域を含む。一部の実施形態では、ＣＤ結合部分は、配列番号６または７に明記される重鎖フレームワーク領域を含む。

【0164】

薬学的に許容可能な賦形剤、担体、および希釈剤
本開示の複合体結合分子を含む組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形剤、担体、および希釈剤を含む医薬組成物中に含まれる。特定の実施形態では、本開示の抗体は、滅菌および／または等張溶液中に懸濁されて投与される。特定の実施形態では、溶液は約０．９％のＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、溶液は約５．０％のデキストロースを含む。特定の実施形態では、溶液は、緩衝剤、例えば、アセテート、シトラート、ヒスチジン、スクシネート、ホスフェート、ビカーボネート、およびヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、およびポロキサマー１８８、ポリオール／二糖／多糖、例えば、グルコース、デキストロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、およびデキストラン４０、アミノ酸、例えば、グリシンもしくはアルギニン、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、メチオニン、またはキレート剤、例えば、ＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡのうち、１つまたは複数をさらに含む。

【0165】

抗体の投与のための皮下製剤は、緩衝剤、例えば、アセテート、シトラート、ヒスチジン、スクシネート、ホスフェート、ビカーボネート、およびヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、およびポロキサマー１８８、ポリオール／二糖／多糖、例えば、グルコース、デキストロース、マンノース、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、およびデキストラン４０、アミノ酸、例えば、グリシンもしくはアルギニン、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、メチオニン、またはキレート剤、例えば、ＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡのうち、１つまたは複数を含むことができる。付加的に、例えば約２，０００Ｕ／ｍｌ～約１２，０００Ｕ／ｍｌの濃度のヒアルロニダーゼなど、注射部位における疼痛を緩和する化合物または分子を含めることができる。

【0166】

特定の実施形態では、本開示の複合体結合分子は、凍結乾燥されて輸送／貯蔵され、投与前に再構成される。特定の実施形態では、凍結乾燥された抗体製剤は、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストラン４０、またはそれらの組合せなどの増量剤を含む。凍結乾燥製剤は、ガラスまたは他の好適な非反応性材料で構成されるバイアル中に含有することができる。抗体は、製剤化される場合、再構成されるか否かによらず、特定のｐＨ、一般に７．０未満のｐＨに緩衝化され得る。特定の実施形態では、ｐＨは、４．５～６．５、４．５～６．０、４．５～５．５、４．５～５．０、または５．０～６．０の間とすることができる。

【0167】

また本明細書には、好適な容器にある本明細書に記載の複合体結合分子のうち１つまたは複数と、使用のための指示書、希釈剤、賦形剤、担体、および投与用のデバイスから選択される１つまたは複数の追加の成分とを含む、キットも記載される。

【0168】

特定の実施形態では、本明細書には、癌処置を調製する方法であって、１つまたは複数の薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤と本開示の複合体結合分子とを混合する工程を含む、方法が記載される。特定の実施形態では、本明細書には、貯蔵または輸送のために癌処置を調製する方法であって、１つまたは複数の本開示の抗体を凍結乾燥する工程を含む、方法が記載される。

【0169】

産生と製造
本明細書に記載の複合体結合分子（例えば二特異性抗体）をコードする核酸は、好適な細胞を感染、トランスフェクト、形質転換、またはその他の方法で核酸に対してトランスジェニックとすることで、商業的または治療的使用のための複合体結合分子の産生を可能にするために使用することができる。大規模の細胞培養から抗体を産生するための標準的な細胞株および方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｌｉらによる「Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．」、Ｍａｂｓ．２０１０ Ｓｅｐ－Ｏｃｔ；２（５）：４６６～４７７頁を参照されたい。

【0170】

特定の実施形態では、核酸配列は、本明細書に開示される複合体結合分子または二特異性抗体をコードする。特定の実施形態では、複合体結合分子をコードするポリヌクレオチド配列は、真核性調節配列に操作可能に連結される。一部の実施形態では、細胞は核酸配列を含む。

【0171】

一部の実施形態では、細胞は、本明細書に開示される複合体結合分子をコードする核酸を含む。特定の実施形態では、細胞は原核細胞を含む。特定の実施形態では、原核細胞は大腸菌細胞である。特定の実施形態では、細胞は真核細胞を含む。特定の実施形態では、真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、またはヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞である。

【0172】

特定の実施形態では、本明細書には、複合体結合分子を作製する方法であって、複合体結合分子をコードする核酸を含む細胞を、複合体結合分子の産生および分泌を可能とするのに十分なｉｎ ｖｉｔｒｏ条件下で培養する工程を含む方法が記載される。

【0173】

特定の実施形態では、本明細書には、（ａ）ゲノム位置において組み込まれた本明細書に記載の抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞株と、（ｂ）凍結保護剤とを含むマスターセルバンクが記載される。特定の実施形態では、凍結保護剤はグリセロールを含む。特定の実施形態では、マスターセルバンクは、（ａ）ゲノム位置において組み込まれた複合体結合分子をコードする核酸を含むＣＨＯ細胞株と、（ｂ）凍結保護剤とを含む。特定の実施形態では、凍結保護剤はグリセロールを含む。特定の実施形態では、マスターセルバンクは、液体窒素による凍結に耐えることができる好適なバイアルまたは容器中に包含される。

【0174】

また本明細書には、本明細書に記載の複合体結合分子を作製する方法が記載される。かかる方法は、複合体結合分子をコードする核酸を含む細胞または細胞株を細胞培養培地中、複合体結合分子の発現および分泌を可能とするのに十分な条件下でインキュベートする工程と、さらに細胞培養培地から複合体結合分子を採取する工程とを含む。採取は、生細胞、細胞デブリ、非複合体結合分子タンパク質またはポリペプチド、望ましくない塩、緩衝剤、および培地成分を除去するための１つまたは複数の精製工程をさらに含むことができる。特定の実施形態では、追加の精製工程は、遠心分離、超遠心分離、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、もしくはプロテインＬ精製、および／またはイオン交換クロマトグラフィーを含む。

【0175】

使用方法
免疫調節細胞による免疫応答の抑制は、腫瘍の成長、遊走、および転移を促すことができる。免疫抑制または負の免疫調節は、免疫応答の全体的または部分的な低減をもたらすプロセスまたは経路を含むことができる。免疫抑制は、全身性のもの、または対象もしくは患者の身体の特有の部位（例えば腫瘍微環境）、組織、もしくは領域に局在化されたものとすることができる。Ｂ細胞は主に、病原体の中和を促す抗体の産生を介する正の免疫モジュレータとして公知であるが、特定のＢ細胞集団は、免疫応答を抑制または負に調節するように機能することができる。そのようなＢ細胞集団は、１つより多くの細胞表面バイオマーカの発現により定義することができる。免疫抑制性Ｂ細胞またはＢ細胞集団は、Ｂ細胞系列表面バイオマーカおよび抑制性Ｂ細胞表面バイオマーカを含むことができる。Ｂ細胞系列表面マーカは、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５を含むことができる。Ｂ細胞表面マーカは、ＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、または潜在型ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－βＬＡＰ）を含むことができる。免疫抑制性Ｂ細胞または免疫抑制性Ｂ細胞集団は、サイトカインなどの抗炎症性メディエータの分泌を通じて、Ｔ細胞を含む細胞サブタイプの多様なセットを抑制することにより免疫応答を抑制するように機能することができる。免疫抑制性Ｂ細胞はまた、リンパ様構造を負に調節、および／またはＴ細胞の制御性Ｔ細胞への変換を促すことによって、免疫応答の減弱において機能することができる。このため、本明細書には、免疫抑制性Ｂ細胞集団を標的化して応答を有効に調節するための方法が開示される。

【0176】

免疫抑制性Ｂ細胞またはＢ細胞集団の標的化は、腫瘍または腫瘍形成性細胞に対する免疫活性化または免疫応答の正の調節をもたらすことができる。本明細書には、癌または腫瘍に罹患した個体を処置する方法であって、癌または腫瘍に罹患した個体に本明細書に開示される複合体結合分子を投与する工程を含む方法が提供される。また本明細書には、腫瘍または癌に罹患した個体の腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある免疫抑制性Ｂ細胞を低減させる方法であって、腫瘍または癌に罹患した個体に本明細書に開示される複合体結合分子を投与することによって、腫瘍中にあるか、それに隣接するか、またはその周囲にある免疫抑制性Ｂ細胞を低減させる工程を含む、方法が提供される。さらに、対象中の免疫抑制性Ｂ細胞を複合体結合分子と接触させる方法であって、複合体結合分子を対象に投与する工程を含む方法が開示される。特定の実施形態では、対象は腫瘍または癌を有する。

【0177】

腫瘍もしくは癌の種類、サブタイプ、または形態は、処置の戦略および方法における重要な因子であり得る。一部の実施形態では、癌または腫瘍は、血液癌である。一部の実施形態では、癌または腫瘍は、固形組織癌である。一部の実施形態では、癌は、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、腎臓癌、胃癌、食道癌、皮膚癌、大腸癌、または頭頸部癌を含む。

【0178】

免疫抑制性Ｂ細胞は抗腫瘍免疫応答を抑制することができる。一部の実施形態では、腫瘍または癌は、Ｂ細胞系列表面バイオマーカおよび抑制性Ｂ細胞表面バイオマーカを含むＢ細胞を含む。Ｂ細胞系列表面マーカは、ＣＤ１９、ＣＤ１３８、ＩｇＡ、またはＣＤ４５を含むことができる。Ｂ細胞表面マーカは、ＩｇＤ、ＣＤ１、ＣＤ５、ＣＤ２１、ＣＤ２４、ＣＤ３８、ＨＭ１３、ＳＬＡＭＦ７、ＡＱＰ３、またはＴＧＦＢを含むことができる。一部の実施形態では、Ｂ細胞表面マーカはＣＤ１９（例えばＣＤ１９＋）およびＣＤ３８（例えばＣＤ３８＋）を含む。一部の実施形態では、腫瘍浸潤性Ｂ細胞または免疫抑制性Ｂ細胞は、ＣＤ１９＋、ＣＤ３８＋のＢ細胞を含む。

【0179】

特定の実施形態では、本明細書には癌または腫瘍の処置に有用な二特異性抗体が開示される。処置は、処置されている状態の改善または軽快を試みる方法を指す。癌に関して、処置としては、腫瘍体積の低減、腫瘍体積の成長の低減、無増悪生存期間の増加、または全体的な平均余命の増加が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、処置は、処置されている癌の寛解に影響する。特定の実施形態では、処置は、以前に処置された癌もしくは腫瘍の再発または進行を防止することが意図される予防用量または維持用量としての使用を包含する。すべての個体が施された処置に対して等しくまたは確実に応答するわけではないことが当業者により理解されるが、それにもかかわらずこれらの個体は処置されると考慮される。

【0180】

特定の実施形態では、癌または腫瘍は、固形の癌または腫瘍である。特定の実施形態では、癌または腫瘍は、血液の癌または腫瘍である。特定の実施形態では、癌または腫瘍は、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭部、頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、および肝臓の腫瘍を含む。特定の実施形態では、本発明の抗体により処置できる腫瘍は、腺腫、腺癌、血管肉腫、星細胞腫、上皮癌、胚芽腫、神経膠芽腫、神経膠腫、血管腫内皮腫、血管腫、血腫、肝芽細胞腫、白血病、リンパ腫、髄芽細胞腫、黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、および／または奇形腫を含む。特定の実施形態では、腫瘍／癌は、末端黒子型黒色腫、光線性角化症、腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星細胞腫瘍、バルトリン腺癌、 基底細胞癌、気管支腺癌、毛細血管カルチノイド（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｉｄ）、癌腫、癌肉腫、胆管癌、軟骨肉腫、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、上衣肉腫（ｅｐｅｎｄｙｍａｌ ｓａｒｃｏｍａ）、ユーイング肉腫（Ｓｗｉｎｇ’ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、限局性結節性過形成、ガストリノーマ（ｇａｓｔｒｏｎｏｍａ）、生殖系列腫瘍、膠芽腫、グルカゴノーマ、血管芽腫、血管内皮腫、血管腫、肝臓腺腫、肝臓腺腫症、肝細胞癌、インスリナイト（ｉｎｓｕｌｉｎｉｔｅ）、上皮内異常増殖、上皮内扁平細胞異常増殖、浸潤性扁平細胞癌、大細胞癌、脂肪肉腫、肺癌、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、平滑筋肉腫、黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫、神経鞘腫瘍、髄芽腫、髄上皮腫、中皮腫、粘膜上皮癌、骨髄性白血病、神経芽腫、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、骨肉腫、卵巣癌、乳頭状漿液性腺癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、前立腺癌、肺芽細胞腫、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌腫、扁平細胞癌、小細胞癌、軟組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平癌、扁平細胞癌、未分化癌、ぶどう膜黒色腫、疣状癌、膣／外陰部癌、ＶＩＰオーマ（ＶＩＰｐｏｍａ）、およびウィルムス腫瘍の群から選択される。特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数の抗体で処置される腫瘍／癌は、脳腫瘍、頭頸部癌、大腸癌、急性骨髄性白血病、プレＢ細胞急性リンパ芽球性白血病、膀胱癌、星細胞種、好ましくはグレードＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶの星細胞種、膠芽腫、多形膠芽腫、小細胞癌、および非小細胞癌、好ましくは、非小細胞肺癌、肺腺癌、転移性黒色腫、アンドロゲン非依存性転移性腺癌、アンドロゲン依存性転移性腺癌、前立腺癌、および乳癌、好ましくは乳腺管癌、および／または乳癌を含む。特定の実施形態では、本開示の抗体で処置される癌は、膠芽腫を含む。特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数の抗体で処置される癌は、膵臓癌を含む。特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数の抗体で処置される癌は、卵巣癌を含む。特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数の抗体で処置される癌は、肺癌を含む。特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数の抗体で処置される癌は、前立腺癌を含む。特定の実施形態では、本開示の１つまたは複数の抗体で処置される癌は、結腸癌を含む。特定の実施形態では、処置される癌は、膠芽腫、膵臓癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、または肺癌を含む。特定の実施形態では、癌は、他の処置に対して難治性である。特定の実施形態では、処置される癌は、再発性である。特定の実施形態では、癌は、再発性／難治性の膠芽腫、膵臓癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、または肺癌を含む。

【0181】

特定の実施形態では、本明細書中の複合体結合分子で処置される癌および／または腫瘍は、成熟Ｂ細胞新生物：慢性リンパ球性白血病、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症、結節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫、または原発性中枢神経系リンパ腫である。

【0182】

特定の実施形態では、本明細書中の複合体結合分子で処置される癌および／または腫瘍は、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫、Ｔ細胞ＡＬＬ、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、急性骨髄芽球性白血病、急性単球性白血病などのＴ細胞新生物である。

【0183】

特定の実施形態では、抗体は、例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、腫瘍内、または脳内など、抗体を含有する医薬組成物の投与に好適なあらゆる経路によって、その抗体を必要とする対象に投与することができる。特定の実施形態では、抗体は静脈内投与される。特定の実施形態では、抗体は皮下投与される。特定の実施形態では、抗体は腫瘍内投与される。特定の実施形態では、抗体は、好適な投与スケジュール、例えば、毎週、週２回、毎月、月２回、２週間に１回、３週間に１回、または月１回などで投与される。特定の実施形態では、抗体は、３週間に１回投与される。抗体は、あらゆる治療有効量で投与することができる。特定の実施形態では、治療上許容可能な量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの間である。特定の実施形態では、治療上許容可能な量は、約１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇの間である。特定の実施形態では、治療上許容可能な量は、約５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの間である。治療有効量には、処置される疾患または苦痛と関連付けられる１つまたは複数の症状を軽快させるのに十分な量が挙げられる。

【実施例】

【0184】

以下の実施例は、実例的な目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定することは意図されない。

【0185】

実施例１：Ｏｃｔｅｔ結合データ
バイオレイヤー干渉法を使用して、親抗体および二特異性抗体の結合親和性を判定した。Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６上、２５℃で、０．１％のＢＳＡ、１ＸＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ－２０、０．０５％のＮａＮ３からなるアッセイ緩衝液を使用して、結合実験を行った。抗体を抗ｈＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅバイオセンサに３００秒間かけてロードした。リガンドをロードしたセンサを、会合（ＣＤ１９では２００秒、ＣＤ３８では１５０秒）、続いて解離（ＣＤ１９では６００秒、ＣＤ３８では４００秒）のために抗原の段階希釈液（３００ｎＭで開始：ＣＤ１９では２倍段階希釈液、ＣＤ３８では３倍段階希釈液）に浸漬した。一価（１：１）結合モデルを使用して速度定数を算出した。

【0186】

親被験物質は以下を含んでいた：

【0187】

８５１Ａ＝抗ＣＤ１９ ３Ｃ１０

【0188】

８５１Ｂ＝抗ＣＤ１９ ３Ｃ１０重鎖＆抗ＣＤ３８ ００３軽鎖

【0189】

８５１Ｃ＝抗ＣＤ３８ ００３重鎖＆抗ＣＤ１９ ３Ｃ１０軽鎖

【0190】

８５１Ｄ＝抗ＣＤ３８ ００３

【0191】

８５１Ｅ＝抗ＣＤ１９ ３Ｃ１０（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）２

【0192】

８５１Ｆ＝抗ＣＤ３８ ００３（ｓｃＦｖ－Ｆｃ）２

【0193】

抗ＣＤ１９ ３Ｃ１０ ＶＨおよびＶＬを有する２つの親抗体（８５１Ａ／８５１Ｅ）は、同様のＫＤでＣＤ１９に結合した。抗ＣＤ３８ ＶＬでの抗ＣＤ１９ ３Ｃ１０ ＶＬの置換（８５１Ｂ）は、ＣＤ１９に対する結合の、約５倍の低減をもたらした。予想されたように、抗ＣＤ３８ ００３ ＶＨおよびＶＬを有する親抗体（８５１Ｄ／８５１Ｆ）は、ＣＤ１９に結合しなかった。

【0194】

表２は、結合データを示す。抗ＣＤ３８ ００３ ＶＨおよびＶＬを有する２つの親抗体（ｐａｓｒｅｎｔａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（８５１Ｄ／８５１Ｆ）は、同様のＫＤでＣＤ３８に結合した。抗ＣＤ１９ ＶＬでの抗ＣＤ３８ ００３ ＶＬの置換（８５１Ｃ）は、ＣＤ３８に対する結合の、大幅な低減をもたらした。予想されたように、抗ＣＤ１９ ＶＨおよびＶＬを有する親抗体（８５１Ａ／８５１Ｅ）はＣＤ３８に結合せず、８５１ＢもＣＤ３８に結合しなかった。このデータは、抗ＣＤ３８ ００３ ＶＬのみが抗ＣＤ１９ ３Ｃ１０ ＶＨに対する共通軽鎖として機能できることを示している。

【0195】

【表2】

【0196】

二特異性抗体（フォーマット）被験物質は以下を含んでいた：

【0197】

ＢＳ１＝１：１：２の比の００３ＨＣ：３Ｃ１０ＨＣ：００３ＬＣ（共通軽鎖）

【0198】

ＢＳ１ｂ＝２：１：２の比の００３ＨＣ：３Ｃ１０ＨＣ：００３ＬＣ（共通軽鎖）

【0199】

ＢＳ２＝１：１：１の比の００３Ｋｎｏｂ：３Ｃ１０ｓｃＦｖＨｏｌｅ：００３ＬＣ（Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ１）

【0200】

ＢＳ２ｂ＝４：１：４の比の００３Ｋｎｏｂ：３Ｃ１０ｓｃＦｖＨｏｌｅ：００３ＬＣ（Ｆａｂ－Ｆｃ：ｓｃＦｖ－Ｆｃ二特異性ＩｇＧ１）

【0201】

ＢＳ３＝１：１：１の比の３Ｃ１０ｓｃＦｖ－００３Ｆａｂ－ＦｃＫｎｏｂ：ＦｃＨｏｌｅ：００３ＬＣ）（ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－Ｆｃ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ１）

【0202】

ＢＳ４＝１：１：１の比の００３Ｆａｂ－ＦｃＫｎｏｂ－３Ｃ１０ｓｃＦｖ：ＦｃＨｏｌｅ（Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ１）

【0203】

ＢＳ４ｂ＝４：１：４の比の００３Ｆａｂ－ＦｃＫｎｏｂ－３Ｃ１０ｓｃＦｖ：ＦｃＨｏｌｅ（Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ：Ｆｃ二特異性ＩｇＧ１）

【0204】

ＣＭ１＝１：１：２の比の３Ｃ１０Ｈｏｌｅ：ＶＺＶＫｎｏｂ：００３ＬＣ抗ＣＤ１９対照抗体

【0205】

ＣＭ１ｂ＝１：３：３の比の３Ｃ１０Ｈｏｌｅ：ＶＺＶＫｎｏｂ：００３ＬＣ

【0206】

ＣＭ２＝１：１：２の比の００３Ｋｎｏｂ：ＶＺＶＨｏｌｅ：００３ＬＣ抗ＣＤ３８対照抗体

【0207】

ＣＭ２ｂ＝３：１：３の比の００３Ｋｎｏｂ：ＶＺＶＨｏｌｅ：００３ＬＣ

【0208】

表３は、単一抗原のフォーマットにおける二特異性被験物質に関する結合データを示す。二特異性抗体ＢＳ１／ＢＳ２／ＢＳ４は、親抗体の４倍以内のＫＤで両標的抗原に結合した（灰色の陰影で示す）。ＢＳ３はＣＤ１９にのみ結合し、ＣＤ３８には結合せず、抗ＣＤ３８ Ｆａｂ結合部位が抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ Ｎ末端融合物により遮断されたか、または抗ＣＤ３８には結合に遊離ＶＨ Ｎ末端が必要とされることのいずれかが示唆される。１アームの対照抗体（ＣＭ１、ＣＭ２）は、それらの意図した標的抗原にのみ結合した。

【0209】

【表3】

【0210】

２抗原フォーマットでは、抗体を抗ｈＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅバイオセンサに３００秒間かけてロードした。リガンドをロードしたセンサを、５００ｎＭの第１の抗原で５００秒間、続いて３００ｎＭの第２の抗原で２４０秒間飽和させた。一価（１：１）結合モデルを使用して速度定数を算出した。表５は、二特異性抗体ＢＳ１／ＢＳ２／ＢＳ４が、親抗体（８５１Ｂ、８５１Ｄ、および８５１Ｅ）の２倍以内のｋａ（１／Ｍｓ）で両標的抗原に同時に結合できたことを示す。１抗原フォーマットの場合と同様に、ＢＳ３はＣＤ１９にのみ結合し、ＣＤ３８に結合しなかった。

【0211】

【表4-1】

【0212】

【表4-2】

【0213】

ＣＤ１９および／またはＣＤ３８に対する結合能についてバリアントをさらに試験した。結合実験をＯｃｔｅｔ Ｒｅｄ上、２５℃で行った。抗体を抗ｈＩｇＧ Ｆｃ Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）バイオセンサに３００秒間かけてロードした。リガンドをロードしたセンサを、会合のためにＣＤ１９で２４０秒間およびＣＤ３８で１５０秒間、続いて解離のためにＣＤ１９で６００秒間およびＣＤ３８で１３０秒間、抗原（ＣＤ１９およびＣＤ３８）の２倍段階希釈液（３００ｎＭで開始）に浸漬した。一価（１：１）結合モデルを使用して速度定数を算出した。表５は、抗ＣＤ３８ ＣＤＲＨ２バリアントの結合を示す。表６は、ＣＤ３８軽鎖Ｗ３２Ｈバリアントの結合を示す。表８は、ＣＤ１９重鎖フレームワーク突然変異体Ａ８４Ｓ Ａ１０８Ｌの結合を示す。

【0214】

【表5】

【0215】

【表6】

【0216】

【表7】

【0217】

実施例２：細胞結合試験
細胞結合試験のプロトコル：５つの細胞株（ＨＥＫ２９３－ＣＤ１９、ＨＥＫ２９３－ＣＤ３８、ＨＥＫ２９３－ＣＤ１９／ＣＤ３８、Ｄａｕｄｉ、およびＲＥＨ）を、無処置の対照に加えて、１３３ｎＭ、続いて３倍系列希釈（計７点）の被験物質により、三通りにインキュベートした。ＨＥＫ２９３細胞株を一過的にトランスフェクトした。

【0218】

Ｄａｕｄｉ、Ｒａｊｉ、およびＲＥＨ細胞株上でのＣＤ１９およびＣＤ３８の細胞表面発現を評価する試験を行った。ＰＥにコンジュゲートされた市販で入手可能な抗体を用いて細胞を三通りに染色し、洗浄し、フローサイトメトリーによって取得した。細胞表面上での分子発現を定量化するべく、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＱｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｋｉｔ（カタログ＃８１５－Ａ）を使用して、分子数／細胞値に対してＭＦＩを補間するための標準曲線を生成した（表８）。

【0219】

【表8】

【0220】

図１２Ａは、親抗体（８５１Ａ、８５１Ｂ、８５１Ｄ）ならびに２つの対照二特異性抗体（それぞれ、ＣＤ１９またはＣＤ３８に対する１つのアーム、および水痘帯状疱疹ウイルスに対する他のアームを有する）のＤａｕｄｉ細胞に対する結合を示している。Ｄａｕｄｉ細胞は表面上に約１００万コピーのＣＤ３８を有するがＣＤ１９を約２００，０００コピーしか有していないことを考慮すると、図１２Ａは、抗ＣＤ３８ ８５１Ｄおよび３８Ｋ－ＶＺＶＨの結合は効率的であるが、抗ＣＤ１９ ８５１Ａ、８５１Ｂ、１９Ｈ－ＶＺＶＫの結合は中等度に過ぎないことを示している。２つのＣＤ３８結合Ｆａｂを有する８５１Ｄは、ＣＤ３８に対して１つの結合Ｆａｂしか有していない３８Ｋ－ＶＺＶＨよりも約５倍良好に結合することに留意されたい。

【0221】

図１２Ｂは、二特異性抗体ＢＳ１、ＢＳ２、およびＢＳ４のＤａｕｄｉ細胞に対する結合を示している。ＣＤ３８およびＣＤ１９の両方に結合する二特異性抗体のアビディティは、ＣＤ３８にのみ結合する３８Ｋ－ＶＺＶＨに対するそれらの結合を比較することによって明らかとなる。

【0222】

図１３Ａは、親抗体（８５１Ａ、８５１Ｂ、８５１Ｄ）ならびに２つの対照二特異性抗体（それぞれ、ＣＤ１９またはＣＤ３８に対する１つのアーム、および水痘帯状疱疹ウイルスに対する他のアームを有する）のＲＥＨ細胞に対する結合を示している。ＲＥＨ細胞は表面上に約３００，０００コピーのＣＤ３８有するがＣＤ１９を約５０，０００コピーしか有していないことを考慮すると、図１３Ａは、抗ＣＤ３８ ８５１Ｄおよび３８Ｋ－ＶＺＶＨの結合は効率的であるが、抗ＣＤ１９ ８５１Ａ、８５１Ｂ、１９Ｈ－ＶＺＶＫの結合は中等度に過ぎないことを示している。ＭＦＩの規模は、ＲＥＨ細胞上でのＣＤ３８およびＣＤ１９の両方の発現レベルが低いので、Ｄａｕｄｉ細胞と比較して大幅に少ない（図２Ａ、図２Ｂ）。２つのＣＤ３８結合Ｆａｂを有する８５１Ｄは、ＣＤ３８に対して１つの結合Ｆａｂしか有していない３８Ｋ－ＶＺＶＨよりも約５倍良好に結合することに留意されたい。

【0223】

図１３Ｂは、二特異性抗体ＢＳ１、ＢＳ２、およびＢＳ４の、ＲＥＨ細胞に対する結合を示す。ＣＤ３８およびＣＤ１９の両方に結合する二特異性抗体のアビディティは、ＣＤ３８にのみ結合する３８Ｋ－ＶＺＶＨに対するそれらの結合を比較することによって明らかとなる。

【0224】

図１４Ａは、親抗体（８５１Ａ、８５１Ｂ、８５１Ｄ）および２つの対照二特異性抗体（３８Ｋ－ＶＺＶＨ、１９Ｈ－ＶＺＶＫ）の、ＣＤ１９をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する結合を示す。予想されたように、２つの抗ＣＤ３８抗体はこれらの細胞に結合しない。２つのＣＤ１９結合Ｆａｂを有する８５１Ａおよび８５１Ｂは、ＣＤ１９に対する１つの結合Ｆａｂしか有していない１９Ｈ－ＶＺＶＫよりも有意に良好に結合することに留意されたい。

【0225】

図１４Ｂは、二特異性抗体ＢＳ１、ＢＳ２、およびＢＳ４の、ＣＤ１９をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する結合を示す。ＢＳ２およびＢＳ＄はＢＳ１よりもわずかに良好に結合する。ＢＳ１は抗ＣＤ３８軽鎖を有するので、ＢＳ２およびＢＳ４はＢＳ１よりも約１０倍良好にＣＤ１９に結合する（Ｏｃｔｅｔデータの表を参照）。

【0226】

図１５Ａは、親抗体（８５１Ａ、８５１Ｂ、８５１Ｄ）および２つの対照二特異性抗体（３８Ｋ－ＶＺＶＨ、１９Ｈ－ＶＺＶＫ）の、ＣＤ３８をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する結合を示す。予想されたように、３つの抗ＣＤ１９抗体はこれらの細胞に結合しない。２つのＣＤ３８結合Ｆａｂを有する８５１Ｄは、ＣＤ３８に対して１つの結合Ｆａｂしか有していない３８Ｋ－ＶＺＶＨよりも良好に結合することに留意されたい。

【0227】

図１５Ｂは、二特異性抗体ＢＳ１、ＢＳ２、およびＢＳ４の、ＣＤ３８をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞に対する結合を示す。

【0228】

細胞結合試験のプロトコル－非特異的バックグラウンド結合：ＣＨＯ－ＳおよびＥｘｐｉ２９３Ｔ細胞株に対する、３つの親モノクローナル抗体（抗ＣＤ１９クローン８５１Ａおよび８５１Ｂ、ならびに抗ＣＤ３８クローン８５１Ｄ）、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照、ならびにダラツムマブの結合を評価する試験を行った。２つの細胞株を死細胞標識試薬（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ）で染色し、次いで無処置の対照のほか、無処置、無二次対照に加えて、１，２５０ｎＭの最高濃度、続いて５倍系列希釈（計４点）の被験物質で三通りにインキュベートした。

【0229】

図１６Ａは、親抗体（８５１Ａ、８５１Ｂ、８５１Ｄ）の、非トランスフェクトＣＨＯ－Ｓ細胞に対する結合を示す。２５０ｎＭで開始して３つの親抗体すべてにおいて非特異的結合を認め、抗ＣＤ３８ ８５１Ｄでより顕著であった。

【0230】

図１６Ｂは、親抗体（８５１Ａ、８５１Ｂ、８５１Ｄ）の、非トランスフェクトＥｘｐｉ２９３Ｔ細胞に対する結合を示す。２５０ｎＭで開始して３つの親抗体すべてにおいて非特異的結合を認め、抗ＣＤ３８ ８５１Ｄでより顕著であった。

【0231】

実施例３：直接的および架橋によるアポトーシス
直接的なアポトーシスの評価のために、細胞を被験物質で処理し、３７℃／５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。架橋誘導性アポトーシスの評価のために、細胞を氷上で３０分間被験物質によりインキュベートした後、５μｇ／ｍＬのウサギ抗ヒトＦｃガンマ特異的Ｆ（ａｂ’）_２を添加した。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖで染色し、次いで死細胞標識試薬（ヨウ化プロピジウム；ＰＩ）を含有するＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ緩衝液に再懸濁した後に、フローサイトメトリー取得を行った。早期アポトーシス細胞をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／ＰＩ－単一細胞として定義し、後期アポトーシス／壊死細胞をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／ＰＩ＋単一細胞として定義した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／ＰＩ－およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／ＰＩ－の和を、アポトーシス／壊死細胞の合計として定義した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／ＰＩ－細胞またはＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ＋／ＰＩ＋のパーセンテージをプロットし、様々なアポトーシス条件を比較した。

【0232】

直接的なアポトーシスの評価のために、未処置対照に加えて、被験物質を３３ｎＭの最終最高濃度、続いて７点の５倍系列希釈でそれぞれ三通りに試験した。架橋誘導性アポトーシスのために、ダラツムマブおよびＩｇＧ１アイソタイプ対照に加えて、個々の被験物質（ＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ４、８５１Ａ、８５１Ｂ、および８５１Ｄ）ならびに被験物質の組合せ（８５１Ａと８５１Ｄ、８５１Ｂと８５１Ｄ、３８Ｋ－ＶＺＶＨと１９Ｈ－ＶＺＶＫ）を、未処置対照に加えて、３３ｎＭの最終最高濃度、続いて７点の５倍系列希釈でそれぞれ三通りに試験した。Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ染色の陽性対照として、細胞を５ｍＭのスタウロスポリンで処理した。

【0233】

図１７Ａは、親抗体（８５１Ａ、８５１Ｂ、８５１Ｄ）、２つの対照二特異性抗体（３８Ｋ－ＶＺＶＨ、１９Ｈ－ＶＺＶＫ）、ダラツムマブおよびＩｇＧ１アイソタイプ対照に関する、Ｄａｕｄｉ細胞での直接的なアポトーシスを示す。ダラツムマブは最高レベルのアポトーシスを呈した。両方の抗ＣＤ１９親（８５１Ａ、８５１Ｂ）は、ダラツムマブと比較して低レベルのアポトーシスを呈した。２つの二特異性対照および抗ＣＤ３８親抗体８５１Ｄは、認識可能である直接的なアポトーシスを示さなかった。

【0234】

図１７Ｂは、二特異性抗体ＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ４、ダラツムマブ、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照に関する、Ｄａｕｄｉ細胞での直接的なアポトーシスを示す。ＢＳ１およびＢＳ２のフォーマットは、ダラツムマブと比較して大幅に高いレベルの直接的なアポトーシスを示した。二特異性フォーマットＢＳ４は、親抗ＣＤ１９ ８５１Ａ／８５１Ｂ抗体と同等のレベルの直接的なアポトーシスを示し（図１７Ａと比較）、これは、ＢＳ４フォーマットがアポトーシスを開始するためにＣＤ１９およびＣＤ３８を近接させることができないことに起因し得る。

【0235】

図１８Ａは、親抗体（８５１Ａ、８５１Ｂ、８５１Ｄ）、親抗体の２つの組合せ（８５１Ａ＋８５１Ｄ、８５１Ｂ＋８５１Ｄ）、ダラツムマブ、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照に関する、Ｄａｕｄｉ細胞での架橋誘導性アポトーシスを示す。架橋は、ダラツムマブ駆動性アポトーシスのレベルを上昇させた。架橋は、直接的なアポトーシスを示さなかった抗ＣＤ３８ ８５１Ｄにおいてアポトーシスのレベルを大幅に上昇させた。抗ＣＤ１９親抗体８５１Ａおよび８５１Ｂを架橋した場合のアポトーシスのレベルの上昇は、おそらくＤａｕｄｉ細胞でのＣＤ１９がＣＤ３８と比較して低いことにより、ＣＤ３８抗体では少なかった（表９を参照）。抗ＣＤ１９ ８５１Ａまたは８５１Ｂと抗ＣＤ３８ ８５１Ｄとの組合せの架橋では、８５１Ｄ単独と比較してアポトーシスのレベルは上昇しなかった。

【0236】

図１８Ｂは、二特異性抗体ＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ４、（３８Ｋ－ＶＺＶＨ＋１９Ｈ－ＶＺＶＫ）、ダラツムマブ、およびＩｇＧ１アイソタイプ対照に関する、Ｄａｕｄｉ細胞での架橋誘導性アポトーシスを示す。架橋された場合、ＢＳ１およびＢＳ２のフォーマットは、ダラツムマブと同等のレベルのアポトーシスを示した。顕著なことに、二特異性フォーマットＢＳ４は、ＢＳ１、ＢＳ２、およびダラツムマブと同等のレベルの架橋誘導性アポトーシスを示し、架橋のない場合、ＢＳ４はアポトーシスを示さなかった（図６Ｂを参照）。２つの対照抗体、３８Ｋ－ＶＺＶＨと１９Ｈ－ＶＺＶＫとの組合せは、有意なアポトーシスを呈したが二特異性フォーマットのいずれよりも低く、単一の抗体中に抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３８結合部位を含めることは、独立した抗体に含めるよりも有利であることが認められる。

【0237】

実施例４：細胞傷害性
Ｄａｕｄｉ標的細胞を被験物質の用量応答で処理し、３７℃／５％ＣＯ２で１５分間インキュベートした。０ｎＭの対照に加えて、被験物質を１３３ｎＭの最終最高濃度、続いて７点の５倍系列希釈で試験した。ダラツムマブおよびＩｇＧ１アイソタイプ対照を、陽性および陰性対照として使用した。

【0238】

予備処理した標的細胞をｎ＝３のドナーからのヒトＰＢＭＣと共培養した（Ｅ：Ｔ ２５：１）。ＰＢＭＣは、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２で一晩「プライミング」してあった。ＰＢＭＣをＶｉａＦｌｕｏｒ ４０５（ＶＦ４０５）で標識した。試料を３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、細胞傷害性についてのフローサイトメトリー分析を行った。細胞傷害性分析のために、細胞をヨウ化プロピジウム（Ｐ．Ｉ．）で染色し、ハイスループットのフローサイトメトリーにより分析した。ＶＦ４０５－集団内のＰ．Ｉ．＋細胞のパーセンテージを、標的細胞の細胞傷害性の指標として分析した。

【0239】

図１９Ａ、図１９Ｂ、および図１９Ｃは、ドナー３名についての抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す。ドナー３名すべてにおいて、結果は類似していた。３つの二特異性フォーマットＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ４、およびダラツムマブは、同様のレベルのＡＤＣＣを呈した。おそらく標的Ｄａｕｄｉ細胞でのＣＤ１９のレベルが低いことにより、抗ＣＤ１９二特異性対照１９Ｈ－ＶＺＶＫはＡＤＣＣを誘導せず、ＩｇＧ１対照抗体と同等であった（表９を参照）。対照的に、おそらくＤａｕｄｉ細胞でのＣＤ３８のレベルがＣＤ１９と比較してはるかにより高いことにより、抗ＣＤ３８二特異性対照３８Ｋ－ＶＺＶＨは、二特異物（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃｓ）およびダラツムマブと同等のＡＤＣＣを呈した。

【0240】

図２０Ａ、図２０Ｂ、および図２０Ｃは、ドナー３名についてのＡＤＣＣを示す。ドナー３名すべてにおいて、結果は類似していた。３つの二特異性フォーマットＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ４は、同様のレベルのＡＤＣＣを呈した。ＢＳ１、ＢＳ２、ＢＳ４の脱フコシル化バージョンは、フコシル化バージョンと比較して約１０倍のＡＤＣＣの増加を示した。

【0241】

補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイも行った。標的細胞を、次の被験物質：ＢＳ１、ＢＳ２、３８Ｋ－ＶＺＶＨ、１９Ｈ－ＶＺＶＨ、３８Ｋ－ＶＺＶＨ／１９Ｈ－ＶＺＶＨの組合せのほか、対照となるダラザレックス、抗ＣＤ２０、ＷＴ ＩｇＧ１タファシタマブ（Ｔａｆａｓｉｔｉｍａｂ）、およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照の用量応答により処理した。無処理対照に加えて、すべてを１３３ｎＭの最高濃度、続いて計７点の５倍系列希釈で試験した。３７℃、５％ＣＯ２で１５分間のインキュベーション後、２５％の最終濃度で処理された細胞に補体を添加した。次いで細胞を３７℃、５％ＣＯ２でさらに２時間、補体でインキュベートした。補体でのインキュベーション後、細胞を洗浄し、５μｇ／ｍＬの死細胞標識試薬、ヨウ化プロピジウム（Ｐ．Ｉ．）とともに再懸濁し、ハイスループットのフローサイトメトリーにより取得した。

【0242】

図２１Ａおよび図２１Ｂは、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイの結果を示す。陽性技術的対照である抗ＣＤ２０は、堅牢な用量依存性のＣＤＣ活性を誘導した。３８Ｋ－ＶＺＶＨおよび１９Ｈ－ＶＺＶＨ（単独または組合せのいずれか）、抗ＣＤ１９タファシタマブ（ｗｔ ＩｇＧ１）、ならびにヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照は、いかなるＣＤＣ活性も誘導しなかった。ダラザレックス、ＢＳ１、およびＢＳ２はすべてＣＤＣ活性を示した（但し、文献から予想されるように、抗ＣＤ２０と同じ規模ではなかった）。ダラザレックスの最大細胞傷害性は、ＢＳ１およびＢＳ２の両方のものよりも高かった。

【0243】

被験物質の用量応答で処理され、３７℃、５％ＣＯ２で１５分間インキュベートされたｐＨｒｏｄｏ Ｇｒｅｅｎ ＡＭ（ｐＨＧ）標識Ｒａｊｉ細胞により、抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）をさらにアッセイした。ｐＨＧはｐＨ感受性色素であり、中性ｐＨでは弱い蛍光性に過ぎないが、マクロファージの成熟ファゴソームにおいては低ｐＨで高度に蛍光性である。抗ＣＤ２０抗体およびＩｇＧ１アイソタイプ対照を用いたｐＨＧ標識Ｒａｊｉ標的細胞を陽性対照および陰性対照として使用し、１３３ｎＭの最高濃度、７点の５倍系列希釈、および０ｎＭの対照を用いた。予備処理された標的細胞をｎ＝３のドナーからのヒトマクロファージ（単球からｉｎ ｖｉｔｒｏで分化）と共培養した（Ｅ：Ｔ １：２）。マクロファージをＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識した。試料を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、ファゴサイトーシスについてのフローサイトメトリー分析を行った。ｐＨＧｈｉ／ＣＴＶ＋細胞のパーセンテージを標的細胞ファゴサイトーシスの指標として分析した。パーセンテージをＸＹチャート上、被験物質濃度の対数に対してプロットし、ＥＣ５０を算出した４パラメータ非線形回帰曲線に対してデータをフィッティングした。

【0244】

図２２は、標的としてＲａｊｉ細胞およびドナーマクロファージを使用した抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）アッセイの結果を示す。陽性対照である抗ＣＤ２０は、４時間後にドナー３名すべてにおいて用量依存性ファゴサイトーシスを実証した（５～１０％の間の最大ファゴサイトーシス）。陰性対照であるＩｇＧ１アイソタイプ対照は、４時間後にドナー３名すべてにおいて用量依存性ファゴサイトーシスを実証しなかった。ダラザレックスは、４時間後にドナー３名すべてにおいて用量依存性ファゴサイトーシスを実証した（４～１０％の間の最大ファゴサイトーシス）。ＢＳ－１、ＢＳ－２、脱フコシル化ＢＳ－１、および脱フコシル化ＢＳ－２は、わずかな用量依存性ファゴサイトーシスを示し、脱フコシル化フォーマットはＡＤＣＰの増加をもたらした。

【0245】

実施例５：ＲＢＣとの相互作用
ｎ＝３のカニクイザルおよびｎ＝３のヒトドナーからの赤血球細胞に対する被験物質の結合を評価するべく、フローサイトメトリーベースの赤血球細胞（ＲＢＣ）結合試験を行った。全血を１Ｘ ＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳで２０倍に希釈した後に、被験物質で処理した。０ｎＭの対照に加えて、二特異物（ＢＳ１、ＢＳ２）、親モノクローナル（８５１Ａ、８５１Ｄ）、および対照（抗ＣＤ３８ダラザレックス、組換え抗ＣＤ１９タファシタマブ、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７にコンジュゲートされた抗ＣＤ４７）を、１３３ｎＭの最高最終濃度、続いて計７点の５倍系列希釈で三通りに試験した。単一アーム対照（３８Ｋ－ＶＺＶＨ、１９Ｈ－ＶＺＶＫ）を組合せで、ともに１３３ｎＭの最高濃度および同じ用量応答により試験した。

【0246】

一次抗体による氷上で３０分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、５ｕｇ／ｍＬの二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で標識されたヤギ抗ヒトＦｃγ Ｆ（ａｂ’）２）で染色して、赤血球細胞上の被験物質の結合を検出した。抗ＣＤ４７－Ａ６４７染色細胞では二次抗体は使用しなかった。二次抗体による氷上でのさらに３０分間のインキュベーション後、染色された細胞を洗浄し、希釈し、ハイスループットのフローサイトメトリーにより取得した。単一細胞集団のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）を算出した。ＡＦ６４７のＭＦＩをＸＹチャート上にプロットし、濃度の対数に対してＭＦＩをグラフ化し、ＥＣ５０を算出した非線形回帰曲線にデータをフィッティングした。

【0247】

図２３は、ＡＦ６４７コンジュゲート抗ＣＤ４７がヒトドナー３名すべての赤血球細胞による用量応答結合曲線を示したことを示す。ダラザレックスも同様に、ドナー３名すべてでの結合において用量依存性の増加を示したが、最大ＭＦＩは抗ＣＤ４７よりも低い桁数であった。抗ＣＤ３８ ８５１Ｄはダラザレックスに次いで高い最大ＭＦＩを示し、続いてＢＳ１、ＢＳ２、３８Ｋ－ＶＺＶＨ＆１９Ｈ－ＶＺＶＫの組合せ、および抗ＣＤ１９タファシタマブの順であった。最後に、抗ＣＤ１９ ８５１ＡおよびＩｇＧ１アイソタイプは、最高濃度においてのみＭＦＩのわずかな増加を示すに過ぎなかった。

【0248】

計３匹の健常（ｎ＝３）カニクイザル（Ｃｙｎｏ）ドナーおよび３名の健常（ｎ＝３）ヒトドナーからの赤血球細胞に対し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ赤血球凝集アッセイを行った。全血を試験当日に獲得し、凝固を検査した。次いで血液をＰＢＳで洗浄し、１：５０に希釈して、「全血基質」を得た。全血基質を９６ウェル丸底プレートに播種し、０ｎＭの対照に加えて、１３３ｎＭの最高最終濃度、続いて６点の５倍系列希釈のＰＢＳ中、被験物質（ＢＳ１、ＢＳ２、３８Ｋ－ＶＺＶＨ＋１９Ｈ－ＶＺＶＫ、８５１Ａ、および８５１Ｄ）、対照（野生型ＩｇＧ１を有するタファシタマブ）、ダラザレックス、およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照）、または陽性技術的対照（ＩＧＭ－５５．５）を用いて三通りに処理した。３７℃、５％ＣＯ２で１時間のインキュベーション後、プレートを撮影して赤血球凝集のレベルを確認した。参照として写真を使用して、各ウェルを０～５の特有の赤血球凝集スケールで採点した。各スコアの特異的徴候は、個々のドナーに対してある程度相対的である。

【0249】

図２４Ａは、ヒトドナー３に対する赤血球凝集アッセイの結果を示す。陽性対照である抗ＣＤ４７は、０．０４～１．１ｎＭの間で開始して、ヒトドナー３名すべてにおいて赤血球凝集を誘導した。ＢＳ１、ＢＳ２、３８Ｋ－ＶＺＶＨ＋１９Ｈ－ＶＺＶＫ、ダラザレックス、タファシタマブ、およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照はすべて、ドナー３名すべてにおいていずれの濃度でも赤血球凝集の誘導を示さなかった。モノクローナル抗体８５１Ａ（抗ＣＤ１９）および８５１Ｄ（抗ＣＤ３８）はともに、それぞれ０．２または１．１ｎＭで開始して、ドナー３名すべてにおいて赤血球凝集を誘導し、応答は技術的対照（抗ＣＤ４７）と規模が類似していた。親モノクローナル抗体とは対照的に、ＢＳ１およびＢＳ２は、いずれの濃度でも赤血球凝集の誘導を何も示さなかった。

【0250】

図２４Ｂは、カニクイザルドナー３に対する赤血球凝集アッセイの結果を示す。陽性対照であるＩＧＭ－５５．５（抗ｌｉｔｔｌｅ ｉ抗原ＩｇＭ抗体）は、０．０４または０．２ｎＭで開始して、カニクイザルドナー３匹すべてにおいて赤血球凝集を誘導した。ＢＳ１、ＢＳ２、３８Ｋ－ＶＺＶＨ＋１９Ｈ－ＶＺＶＫ、ダラザレックス、タファシタマブ、およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照はすべて、ドナー３名すべてにおいていずれの濃度でも赤血球凝集の誘導を示さなかった。モノクローナル抗体８５１Ａ（抗ＣＤ１９）および８５１Ｄ（抗ＣＤ３８）はともに、それぞれ１．１ｎＭで開始して、ドナー３匹すべてにおいて赤血球凝集を誘導した。親モノクローナル抗体とは対照的に、ＢＳ１およびＢＳ２は、いずれの濃度でも赤血球凝集の誘導を全く示さなかった。

【0251】

３匹（ｎ＝３）の健常カニクイザル（ｃｙｎｏ）および３名（ｎ＝３）の健常ヒトドナーからの赤血球細胞に対する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ溶血アッセイも行った。全血を試験当日に獲得し、凝固を検査した。血液をＰＢＳで洗浄し、１：１０に希釈して、「全血基質」を得た。全血基質をＰＢＳ中の被験物質および対照で処理した。０ｎＭの対照に加えて、二特異物（ＢＳ１、ＢＳ２）、親モノクローナル（８５１Ａ、８５１Ｄ）、および対照（抗ＣＤ３８ダラザレックス、組換え抗ＣＤ１９タファシタマブ、ＩｇＧ１アイソタイプ対照）を、１３３ｎＭの最高最終濃度、続いて計７点の５倍系列希釈で三通りに試験した。単一アーム対照（３８Ｋ－ＶＺＶＨ、１９Ｈ－ＶＺＶＫ）を組合せで、ともに１３３ｎＭの最高濃度および同じ用量応答により試験した。サポニンを０．１％の最高濃度、計７点の３倍系列希釈で試験した。３７℃、５％ＣＯ２で１時間のインキュベーション後、プレートを遠心分離し、上清を収集した。プレートリーダによって５４０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）について上清を分析した。陽性対照であるサポニンは、すべての種およびドナーにおいて、０．００１％で開始して０．１０％まで、用量依存的な溶血を誘導した。どの被験物質も、いずれの試験対象濃度でも溶血を誘導しなかった。

【0252】

図２５は、被験物質がすべて、いずれの試験対象濃度でも溶血を誘導しなかったことを示す。陽性対照であるサポニンは、すべての種およびドナーにおいて、０．００１％で開始して０．１０％まで、用量依存的な溶血を誘導した。

【0253】

実施例６：ＦＣＲバリアントはＣＤ３８およびＣＤ１９結合二重特異性抗体においてＡＤＣＣを低下させる
健常なヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離したＢ細胞を、被験物質の用量応答により処理し、１５分間インキュベートした。ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ標的細胞も同様に、リツキサン、ダラザレックス、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照の用量応答により処理し、３７℃、５％ＣＯ２で１５分間インキュベートした。０ｎＭ対照に加えて、Ｎ＝５の被験物質およびｎ＝３の対照（リツキサン、ダラザレックス、およびヒトＩｇＧ１アイソタイプ）を、１３３ｎＭの最高最終濃度、続いて７点の５倍系列希釈で試験した。

【0254】

予備処理した標的細胞をｎ＝３のドナーからのヒトＰＢＭＣと共培養した（Ｅ：Ｔ ２５：１）。ＰＢＭＣを１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２で一晩プライミングした。ＰＢＭＣをＶｉａＦｌｕｏｒ ４０５で標識した。試料を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。被験物質には、ＢＳ１、脱フコシル化ＢＳ１、Ｆｃバリアント（「死Ｆｃ」、例えば、配列番号３０１および３０２）を有するＢＳ１、ならびに対照リツキサン、ダラザレックス、およびヒトＩｇＧ１アイソタイプを含めた。ＢＳ１は既に良好な低いＡＤＣＣプロファイルを示していたので、それぞれの場合にバリアントＦｃ（死Ｆｃ）がさらに低下および／または減少したという点で興味深いものであった。

【0255】

細胞傷害性分析のために、細胞をヨウ化プロピジウム（Ｐ．Ｉ．）で染色し、ハイスループットのフローサイトメトリーにより分析した。ＶＦ４０５－集団内のＰ．Ｉ．＋細胞のパーセンテージを、標的細胞の細胞傷害性の指標として分析した。図２６Ａは、ドナー３からのＰＢＭＣを使用したＲａｊｉおよびＤａｕｄｉ対照標的細胞上でのＡＤＣＣのレベルを示す。図２６Ｂは、ドナー１からのＰＢＭＣを使用したドナー１からの標的Ｂ細胞上でのＡＤＣＣのレベルを示す。図２６Ｃは、ドナー１からのＰＢＭＣを使用したドナー３からの標的Ｂ細胞上でのＡＤＣＣのレベルを示す。図２６Ｄは、ドナー２からのＰＢＭＣを使用したドナー１からの標的Ｂ細胞上でのＡＤＣＣのレベルを示す。図２６Ｅは、ドナー２からのＰＢＭＣを使用したドナー３からの標的Ｂ細胞上でのＡＤＣＣのレベルを示す。図２６Ｆは、ドナー３からのＰＢＭＣを使用したドナー１からの標的Ｂ細胞上でのＡＤＣＣのレベルを示す。図２６Ｇは、ドナー３からのＰＢＭＣを使用したドナー３からの標的Ｂ細胞上でのＡＤＣＣのレベルを示す。ＢＳ１は良好なＡＤＣＣプロファイル（例えば、低ＡＤＣＣ）を実証したので、ＢＳ１のＡＤＣＣがバリアントＦｃ（例えば、突然変異Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２Ｅを含む「死」Ｆｃ）を使用してさらに減少され得ることは予想外であった。このようなさらなる減少は、免疫学的有害事象の可能性をさらに低下させることによって、治療的処置において有利となり得る。このことは特に、望ましくない細胞非腫瘍細胞（すなわち、ＣＤ１９×ＣＤ３８抑制性Ｂ細胞）が特異的に標的化され得る可能な作用機序において当てはまる。

【0256】

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、記載してきたが、このような実施形態は例示のためにのみ提供されていることは当業者に明白であろう。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に想起されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替案が本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義すること、かつ、これら特許請求の範囲内にある方法および構造、ならびにそれらの等価物は特許請求の範囲によりカバーされることが意図される。

【0257】

【表9-1】

【0258】

【表9-2】

【0259】

【表9-3】

【0260】

【表9-4】

【0261】

【表9-5】

【0262】

【表9-6】

【0263】

【表9-7】

【0264】

【表9-8】

【0265】

【表9-9】

【0266】

【表9-10】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図26D】

【図26E】

【図26F】

【図26G】

【配列表】

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【国際調査報告】