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▶ ノルウェージャン ユニバーシティ オブ サイエンス アンド テクノロジー（エヌティーエヌユー）の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】ジブロックポリマー
(51)【国際特許分類】
C08B 37/04 20060101AFI20240925BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240925BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20240925BHJP
C08G 81/00 20060101ALI20240925BHJP
【ＦＩ】
C08B37/04
A61K47/36
A61K9/51
C08G81/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513129
(86)(22)【出願日】2022-08-26
(85)【翻訳文提出日】2024-04-12
(86)【国際出願番号】 EP2022073797
(87)【国際公開番号】W WO2023025943
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】2112232.0
(32)【優先日】2021-08-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(31)【優先権主張番号】2113143.8
(32)【優先日】2021-09-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】512101187
【氏名又は名称】ノルウェージャン ユニバーシティ オブ サイエンス アンド テクノロジー（エヌティーエヌユー）
(74)【代理人】
【識別番号】110001070
【氏名又は名称】弁理士法人エスエス国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】クリステンセン， ビョルン
(72)【発明者】
【氏名】ソルベルグ， アマリー
【テーマコード（参考）】
4C076
4C090
4J031
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076DD23
4C076DD37
4C076DD41
4C076DD50
4C076DD52
4C076DD62
4C076DD65
4C076EE30
4C076EE41
4C076EE49
4C076FF02
4C076GG06
4C076GG22
4C076GG23
4C090AA02
4C090AA04
4C090AA05
4C090AA09
4C090BA01
4C090BA12
4C090BA19
4C090BA72
4C090BA73
4C090BA97
4C090BB21
4C090BB23
4C090BB32
4C090BB36
4C090BB52
4C090BB53
4C090BB62
4C090CA04
4C090CA06
4C090CA07
4C090CA13
4C090CA14
4C090CA15
4C090CA18
4C090CA19
4C090CA31
4C090CA34
4C090CA35
4C090DA10
4C090DA22
4C090DA23
4C090DA25
4J031AA02
4J031AA20
4J031AA53
4J031AB06
4J031AC09
4J031AD01
4J031AE01
4J031AE10
4J031AF03
(57)【要約】
ジブロックポリマーは、リンカーを介して第２の成分に共有結合された第１の成分を含み、前記第１の成分は、少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含み、かつ重合度ｎを有するオリゴマーであり、ここでｎは少なくとも３であり、前記第２の成分は、３０ｍｏｌ％以下のＬ－グルロン酸残基を有し、かつ重合度ｍを有するポリマーであり、ここで９ｎ＞＝ｍ＞＝ｎ／２である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リンカーを介して第２の成分に共有結合された第１の成分を含むジブロックポリマーであって、前記第１の成分が、少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含み、かつ重合度ｎを有するオリゴマーであり、ここでｎは少なくとも３であり、
前記第２の成分が、３０ｍｏｌ％以下のＬ－グルロン酸残基を有し、かつ重合度ｍを有するポリマーであり、
ここで９ｎ＞＝ｍ＞＝ｎ／２である、ジブロックポリマー。
【請求項2】
リンカーを介して第２の成分に共有結合された第１の成分を含むジブロックポリマーであって、前記第１の成分が、少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含み、かつ重合度ｎを有するオリゴマーであり、ここでｎは少なくとも３であり、
前記第２の成分が、３０ｍｏｌ％以下のＬ－グルロン酸残基を有し、かつ重合度ｍを有するオリゴ糖または多糖であり、
ここで９ｎ＝＞ｍ＝＞ｎ／２であり、かつ、ｎが２０以下であるときにｍが２０以上である、ジブロックポリマー。
【請求項3】
リンカーを介して第２の成分に共有結合された第１の成分を含むジブロックポリマーであって、前記第１の成分が、少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含むオリゴマーであり、
前記第２の成分が、３０ｍｏｌ％以下のＬ－グルロン酸残基を有する第２のポリマーであり、
前記ジブロックポリマーが、少なくとも０．１ｍＭの金属イオン濃度で金属イオンを含む水溶液中で自発的にナノ粒子を形成し、前記金属イオンがたとえばＡｃ、Ｙ、Ｌｕ、Ｃｕ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、もしくはＲａイオン、またはその混合物等、特にＣａ、Ｓｒ、Ｂａ、またはＲａイオンである、ジブロックポリマー。
【請求項4】
前記第２のポリマーが、オリゴ糖もしくは多糖、ポリ（メト）アクリレート、またはポリアルキレングリコール、特にオリゴ糖または多糖である、請求項１～３のいずれかに記載のジブロックポリマー。
【請求項5】
前記第２のポリマーが、デキストランまたはプルランである、請求項１～４のいずれかに記載のジブロックポリマー。
【請求項6】
前記Ｌ－グルロン酸オリゴマーの重合度ｎが７～７０である、請求項１～５のいずれかに記載のジブロックポリマー。
【請求項7】
前記第２のポリマーの重合度が８～１８０である、請求項１～６のいずれかに記載のジブロックポリマー。
【請求項8】
前記リンカーが、アミノ化、還元的アミノ化、またはクリックケミストリーの結果として得られるものである、請求項１～７のいずれかに記載のジブロックポリマー。
【請求項9】
前記リンカーが、トリアゾール、２つのＮＨ－ＮＨ－ＣＯ－官能基、または２つの－Ｎ－Ｏ－ＣＨ2－官能基を含む、請求項１～８のいずれかに記載のジブロックポリマー。
【請求項10】
請求項１～９に記載のジブロックポリマーと、たとえば金属２＋または３＋イオンなどの金属イオンなどの陽イオンとを含むナノ粒子。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載のジブロックポリマーを含むコアシェルナノ粒子であって、前記第１の成分が前記ナノ粒子の前記コアを形成し、前記第２の成分が前記ナノ粒子の前記シェルを形成し、前記ナノ粒子の前記コア内で、金属イオンおよび／または荷電有機化合物がイオン結合している、コアシェルナノ粒子。
【請求項12】
前記金属イオンが、第（ＩＩ）族金属イオンまたは放射性核種である、請求項１０または１１に記載のナノ粒子。
【請求項13】
少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含み、かつ重合度ｎを有し、ここでｎは少なくとも３であって、たとえばペプチドなどの生物活性分子に連結された、オリゴマーを含むポリマーをさらに含む、請求項１０～１２に記載のナノ粒子。
【請求項14】
ナノ粒子を調製するための方法であって、（Ｉ）酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーと反応するように適合された連結基を有する第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含むか、
または、
（Ｉ）酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーおよび第２のポリマーと反応するように適合された連結基と反応させること、
（ＩＩＩ）連結基を有する前記グルロン酸オリゴマーを第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること、
もしくは、
（Ｉ）酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得て、さらに、前記オリゴマーを官能基によって活性化すること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーの前記官能基と反応する官能基を有するように適合された第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること、
を含み、
かつ、その後に、
前記ジブロックポリマーを、たとえば金属イオン、プロトン、または荷電有機化合物などの陽イオンと接触させて、ナノ粒子を形成することを含む、方法。
【請求項15】
前記ナノ粒子が、たとえば金属イオンの溶液などの金属イオンの均質なソースに対する前記ナノ粒子の透析または露出を介して形成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
金属イオンの均質なソースに対する前記ナノ粒子の露出が、好ましくはＧＤＬを用いて、前記ジブロックポリマーおよび陽イオンの水溶液のｐＨを変化させることを伴う、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ナノ粒子が、前のステップで用いられたものとは異なる複数の第２の金属イオンと接触することで、前記複数の第２の金属イオンが前記ナノ粒子中に存在する前記金属イオンを少なくとも部分的に置換する、請求項１４～１６に記載の方法。
【請求項18】
少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含み、かつ重合度ｎを有し、ここでｎは少なくとも３であって、たとえばペプチドなどの生物活性分子に連結されたオリゴマーを含むポリマーの存在下で、前記ジブロックポリマーを、たとえば金属イオン、プロトン、または荷電有機化合物などの陽イオンと接触させて、ナノ粒子を形成することをさらに含む、請求項１５～１７に記載の方法。
【請求項19】
患者に金属イオンもしくは荷電有機化合物を送達するため、または、金属イオンを含有する媒体から前記金属イオンを除去するための、請求項１０～１３に記載のナノ粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、たとえばオリゴ糖もしくは多糖またはポリアルキレングリコールなどの第２のポリマー成分に連結されたオリゴまたはポリグルロン酸成分を含むジブロックポリマーを含むナノ粒子に関する。本発明はさらに、そのジブロックポリマー自体、およびたとえば放射性核種などの金属イオンまたは目的の有機活性剤を患者に送達するためのナノ粒子の使用に関する。代替的に、特定の環境から金属イオンを除去することを可能にするために金属イオンを配位させるためにジブロックポリマーが用いられてもよい。
【背景技術】
【0002】
アルギン酸は、藻類または細菌の多糖であり、穏やかで有用なゲル化特性を有するために食品、医薬品などに多く使用される。ほとんどのアルギン酸は、たとえばＣａイオンなどの多価カチオンに対する高親和性を有し、その多価カチオンの結合によってヒドロゲル形成がもたらされる。これらの現象は、アルギン酸内にＬ－グルロン酸（Ｇ：ｇｕｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）の配列（ブロック）が存在することに関連し、このＬ－グルロン酸（Ｇ）の配列（ブロック）は、Ｄ－マンヌロン酸（Ｍ：ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）のブロックおよび交互の（．．ＭＧ．．）ブロックと共存する。図１は、アルギン酸内に存在するＬ－グルロン酸残基の構造を示し、かつアルギン酸鎖によるこれらの単位の理論上の分布を示す。
【0003】
Ｇの含有量および分布は、アルギン酸が由来する生物に依存し、それはマンヌロナンＣ５エピメラーゼのファミリーの作用の結果によるものである。
【0004】
アルギン酸自体がブロック多糖と分類されることがあり、３つのブロックタイプの長さおよび分布は、アルギン酸の固有の組成不均一性のために変動する。アルギン酸の多価カチオンによるゲル化特性と、アルギン酸の構造、配列、および鎖長との関係は数十年にわたって広く調査されてきた。
【0005】
どのようにして（ほとんど）純粋なＧブロックを親アルギン酸から単離して分離し得るかは周知である（標準的な方法は、希釈酸による部分加水分解と分画沈殿との組み合わせである：アルギン酸を特定のｐＨで加水分解するときにＧブロックが選択的に沈殿する（ＭおよびＭＧブロックは可溶性である）。それとは対照的に、単離されたＭおよびＧブロックの特性、ならびにそれらを精密に操作されたアルギン酸ベースのブロック多糖に取り込むことは、最低限しか調査されていない。
【0006】
ここで本発明者らは、Ｇブロックが任意の好都合なやり方でたとえばオリゴ糖または多糖などの第２のポリマーに連結されている、精密に操作されたアルギン酸ベースのブロック多糖からナノ粒子を調製し得ることを確定した。必要とされるＧブロックは、高い割合のＧ残基を含有するものである。なぜなら、これらの単位が金属イオンまたは活性剤を配位させて、溶液中でのナノ粒子の自発的な形成を可能にするからである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
１つの態様から見ると、本発明は、リンカーを介して第２の成分に共有結合された第１の成分を含むジブロックポリマーを提供し、
前記第１の成分は、少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含み、かつ重合度ｎを有するオリゴマーであり、ここでｎは少なくとも３であり、
前記第２の成分は、３０ｍｏｌ％以下のＬ－グルロン酸残基を有し、かつ重合度ｍを有するポリマーであり、
ここで９ｎ＝＞ｍ＞＝ｎ／２、たとえば９ｎ＝＞ｍ＝＞ｎなどである。
前記第１の成分は、少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含み、かつ重合度ｎを有するオリゴマーであり、ここでｎは少なくとも３であり、
前記第２の成分は、３０ｍｏｌ％以下のＬ－グルロン酸残基を有し、かつ重合度ｍを有するポリマーであり、
ここで９ｎ＝＞ｍ＞＝ｎ／２、たとえば９ｎ＝＞ｍ＝＞ｎなどである。
【0008】
疑念を回避するために、ｎ／２が整数でないときは、ｎ／２の値が最も近い整数に四捨五入される。
【0009】
別の態様から見ると、本発明は、リンカーを介して第２の成分に共有結合された第１の成分を含むジブロックポリマーを提供し、
前記第１の成分は、少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含み、かつ重合度ｎを有するオリゴマーであり、ここでｎは少なくとも３であり、
前記第２の成分は、３０ｍｏｌ％以下のＬ－グルロン酸残基を有し、かつ重合度ｍを有するオリゴ糖または多糖であり、
ここで９ｎ＝＞ｍ＝＞ｎ／２であり、ｎが２０以下であるときにｍは２０以上である。
前記第１の成分は、少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含み、かつ重合度ｎを有するオリゴマーであり、ここでｎは少なくとも３であり、
前記第２の成分は、３０ｍｏｌ％以下のＬ－グルロン酸残基を有し、かつ重合度ｍを有するオリゴ糖または多糖であり、
ここで９ｎ＝＞ｍ＝＞ｎ／２であり、ｎが２０以下であるときにｍは２０以上である。
【0010】
別の態様から見ると、本発明は、リンカーを介して第２の成分に共有結合された第１の成分を含むジブロックポリマーを提供し、
前記第１の成分は、少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含むオリゴマーであり、
前記第２の成分は、３０ｍｏｌ％以下のＬ－グルロン酸残基を有する第２のポリマーであり、
前記ジブロックポリマーは、少なくとも０．１ｍＭの金属イオン濃度で金属イオンを含む水溶液中で自発的にナノ粒子を形成する。
前記第１の成分は、少なくとも５０ｍｏｌ％のＬ－グルロン酸残基を含むオリゴマーであり、
前記第２の成分は、３０ｍｏｌ％以下のＬ－グルロン酸残基を有する第２のポリマーであり、
前記ジブロックポリマーは、少なくとも０．１ｍＭの金属イオン濃度で金属イオンを含む水溶液中で自発的にナノ粒子を形成する。
【0011】
別の態様から見ると、本発明は、本明細書の前記で定義されたとおりのジブロックポリマーと、たとえば金属２＋もしくは３＋イオンまたはＨ+または荷電有機化合物などの陽イオンとを含むナノ粒子を提供する。
【0012】
別の態様から見ると、本発明は、本明細書の前記で定義されたとおりのジブロックポリマーを含むコアシェルナノ粒子を提供し、前記第１の成分は前記ナノ粒子のコアを形成し、前記第２の成分はシェルを形成し、
ナノ粒子のコア内に、たとえば金属イオンおよび／または荷電有機化合物などの陽イオンがイオン結合している。
ナノ粒子のコア内に、たとえば金属イオンおよび／または荷電有機化合物などの陽イオンがイオン結合している。
【0013】
別の態様から見ると、本発明はナノ粒子の調製のための方法を提供し、この方法は、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーと反応するように適合された連結基を有する第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含むか、
または、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーおよび第２のポリマーと反応するように適合された連結基と反応させること、
（ＩＩＩ）連結基を有する前記グルロン酸オリゴマーを第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること、
あるいは、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得て、前記オリゴマーを官能基によって活性化すること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、グルロン酸オリゴマーの官能基と反応する官能基を有するように適合された第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含み、
かつ、その後に、
前記ジブロックポリマーを、たとえば金属イオン、プロトン、または荷電有機分子などの陽イオンと接触させて、ナノ粒子を形成することを含む。
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーと反応するように適合された連結基を有する第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含むか、
または、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーおよび第２のポリマーと反応するように適合された連結基と反応させること、
（ＩＩＩ）連結基を有する前記グルロン酸オリゴマーを第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること、
あるいは、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得て、前記オリゴマーを官能基によって活性化すること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、グルロン酸オリゴマーの官能基と反応する官能基を有するように適合された第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含み、
かつ、その後に、
前記ジブロックポリマーを、たとえば金属イオン、プロトン、または荷電有機分子などの陽イオンと接触させて、ナノ粒子を形成することを含む。
【0014】
この方法で形成されるジブロックポリマーは、本明細書で前に定義されたとおりのものであることが好ましい。
【0015】
ジブロックポリマーとイオンとの接触が、透析か、またはたとえばｐＨをゆっくりと調整して好適な塩またはイオン錯体からゲル化イオンを放出させることなどによって引き起こされる内部ゲル化によってもたらされることが特に好ましい。
【0016】
別の態様から見ると、本発明は、金属イオンまたは荷電有機化合物を患者に送達するための、本明細書の前記で定義されたとおりのナノ粒子の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】図１は、機能性アルギン酸の生合成、部分的脱重合、および純粋なグルロン酸ブロック（Ｇｎ）の単離、次いで活性化多糖への末端コンジュゲーションを概略的に表す図である。図１は、その後の粒子を形成するためのＣａ＋＋およびＧn－Ｌ－Ｄｅｘmによるダイマー化も示す。これらのダイマーの形成は、次にナノ粒子の形成をもたらす。
【図3】図３は、Ｄｅｘ10－ＰＤＨＡ＝Ｇ3のＮＭＲおよび化学構造を示す図であり、ここでｎは還元Ｎ－オキシドを表す。この図面は、シッフ塩基を有する還元前のコンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｏｎ）を示す。Ｇ3およびＰＤＨＡ－Ｄｅｘ10による平衡反応混合物の1Ｈ－ＮＭＲスペクトルを５００ｍＭ ＡｃＯＨ［ｄ4］ｐＤ４にて得ている。コンジュゲートの（Ｅ）／（Ｚ）－オキシムによる共鳴に注釈を付けている。コンジュゲートされたＧn＝ｂ－Ｄｅｘmの構造が含まれる（＝還元されていないオキシムを示す）。比較のために、精製Ｄｅｘ10－ＰＤＨＡの1Ｈ－ＮＭＲスペクトルが含まれる。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明は、ジブロックポリマーおよびそれらがナノ粒子を形成する能力に関し、このナノ粒子は、たとえば金属イオンもしくはプロトン、またはたとえば医薬品などの荷電有機化合物などの陽イオンを配位させて、たとえば金属イオンまたは荷電有機化合物などの陽イオンを患者に送達することを可能にする。
【0019】
驚くべきことに、たとえばデキストランなどの第２のポリマーをＧ－アルギン酸（＝オリゴグルロン酸＝Ｇブロック）の末端に付着させることによって、たとえばカルシウムイオンなどの陽イオンをジブロックポリマーに接触させたときに、明確に定義された安定性の高いナノ粒子が形成され得る。
【0020】
それとは対照的に、アルギン酸自体（すなわち、本発明で必要とされるＧブロック濃度を有さないとき）は金属イオン水溶液の存在下でヒドロゲルを形成しやすく、Ｇブロック単独では沈殿を形成する。
【0021】
本発明の主な目標は金属イオンを配位させるナノ粒子であるが、プロトンの配位も可能である。
【0022】
この実施形態において、別の鎖－鎖相互作用が関与する。低ｐＨによって、カルボン酸のプロトン化（－ＣＯＯ－＋ Ｈ＋＝－ＣＯＯＨ）がもたらされる。アルギン酸のｐＫａは約３である。この値より十分に低いとき、アルギン酸はもはや金属を配位させずに沈殿するか、またはいわゆる「酸性ゲル」を形成する。Ｇブロックは通常沈殿する（これはＧブロックが単離され得ることを意味する）。したがって本発明のジブロックは、たとえば３以下などの低ｐＨにてナノ粒子を形成し得る。この形成は可逆的であり、ｐＨ＞ｐＫａのときにナノ粒子は再溶解する。
【0023】
本発明は、Ｌ－グルロン酸オリゴマーである第１のブロック（または第１の成分）と、たとえばオリゴ糖もしくは多糖またはポリアルキレングリコールなどのポリマーである第２のブロック（または第２の成分）との組み合わせを必要とする。理想的には、第２のポリマーは水溶性である。本明細書において、水溶性という用語は、２０℃にて少なくとも１０ｇ／Ｌの水溶解度を有する材料を定義するために用いられる。
【0024】
第２のポリマーは、Ｌ－グルロン酸オリゴマーの末端に、すなわちＬ－グルロン酸オリゴマーの端部の官能性を介して付着されるべきである。加えて、第２のポリマーは末端位置を介してＬ－グルロン酸ブロックに接続されることが好ましい。したがって、ジブロックは「直鎖状」、すなわち両方のブロックが各ブロックそれぞれの末端位置を介して接続されているとみなされ得る。
【0025】
グルロン酸オリゴマー
本発明は、ジブロックポリマーの第１の成分としてグルロン酸オリゴマー（Ｇオリゴマー）を使用することを必要とする。これらのオリゴマーは、アルギン酸から容易に得られる。天然のアルギン酸鎖は十分な濃度のＧ残基を含まないため、天然のアルギン酸をたとえば酸または塩基中で加水分解して、グルロン酸残基の含有量がより高いグルロン酸オリゴマーを生成するべきである。目的のグルロン酸オリゴマーは、Ｌ－グルロン酸オリゴマーである。
本発明は、ジブロックポリマーの第１の成分としてグルロン酸オリゴマー（Ｇオリゴマー）を使用することを必要とする。これらのオリゴマーは、アルギン酸から容易に得られる。天然のアルギン酸鎖は十分な濃度のＧ残基を含まないため、天然のアルギン酸をたとえば酸または塩基中で加水分解して、グルロン酸残基の含有量がより高いグルロン酸オリゴマーを生成するべきである。目的のグルロン酸オリゴマーは、Ｌ－グルロン酸オリゴマーである。
【0026】
グルロン酸オリゴマーを調製するためのアルギン酸は、好ましくはグルロン酸含有量が高いものである。こうしたアルギン酸は公知である。異なる重合度のグルロン酸オリゴマーを生成するために、異なる天然アルギン酸が用いられ得ることがある。
【0027】
天然アルギン酸鎖を分解するための方法として、たとえば硫酸または硝酸などの強酸などを用いた酸加水分解の使用が好ましい。この加水分解方法は、単に天然のアルギン酸を酸または塩基に露出させることによってもたらされ得る。好都合には、この方法は室温にてもたらされ得るが、上昇温度も用いられ得る。反応混合物の撹拌によって、分画が効率的に起こることが確実になる。
【0028】
本発明において用いられるグルロン酸オリゴマーは、３～１００、たとえば５～８０など、特に１０～５０の範囲の重合度を有してもよい。さらに好ましい範囲は１０～４０である。実際には、アルギン酸から非常に長いＧブロックを得ることは困難であるため、ＤＰ３２～５０を有するより短いブロックの使用が好ましい。
【0029】
重合度はＮＭＲを介して決定でき、これはオリゴマー内のすべてのモノマー残基の数を表す。以下に注記するとおり、これらのモノマー残基のすべてがグルロン酸ではないが、その少なくとも５０％はグルロン酸残基である必要がある。
【0030】
重合度は、加水分解ステップの長さ、および加水分解を受ける天然アルギン酸の性質によって制御され得る。より長い加水分解反応はより低い重合度をもたらし、逆も同様である。疑念を回避するために、ＤＰ＝重合度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）＝鎖当たりのモノマー数である。たとえば、ポリマーＧＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＭ、またはＭＧＭＧＭは、ＤＰ＝５（すなわちｎ＝５）を有する。
【0031】
グルロン酸オリゴマーの重合度は一般的に、配位される陽イオンの性質と、第２のコポリマーの性質とに依存して選択される。グルロン酸オリゴマーの重合度が低いときは、ナノ粒子の形成を確実にするために、第２のポリマーがより高い重合度（ＤＰ）を有する傾向がある。一般的に、配位される金属イオンが大きい（例、Ｂａ）ときは、より小さいたとえばＣａなどの金属イオンのときよりも低い重合度が使用されてもよい。
【0032】
代替的に見ると、グルロン酸オリゴマーの重量平均分子量（Ｍｗ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）は１０００～４０，０００の範囲であってもよい。Ｍｗは、ＧＰＣ、光散乱、またはその両方の組み合わせを用いて決定され得る。
【0033】
グルロン酸オリゴマーは、加水分解、（例、リアーゼを用いた）酵素的分解、またはアルカリベータ脱離を含む、当該技術分野で公知の方法によって、アルギン酸から調製されてもよいことが認識されるだろう。当業者は、これらのオリゴマーを形成するための好適な方法を考案し得る。グルロン酸オリゴマーはいくつかの他のモノマー残基を含有してもよいが、グルロン酸オリゴマーのグルロン酸含有量は少なくとも５０ｍｏｌ％、好ましくは少なくとも７０ｍｏｌ％、特に少なくとも８５ｍｏｌ％であることが必須である。その意図するところは、天然アルギン酸よりもかなり高いグルロン酸濃度を含むグルロン酸オリゴマーを調製することである。アルギン酸は分画され、グルロン酸がより低いオリゴマーは除去される。興味深いのは、高Ｇ含有量を有するオリゴマーブロックのみである。高Ｇ含有量は、金属イオン結合選択性を改善する。
【0034】
代替的に見ると、グルロン酸オリゴマーのモノマー残基の５０％以上はＬ－グルロン酸であり、好ましくはモノマー残基の７０％以上、たとえば８５％以上などがＬ－グルロン酸である。したがってＦG値は０．５以上、たとえば０．７以上など、特に０．８５以上である。もちろん、純粋なグルロン酸オリゴマーの使用も可能である（例、９９ｍｏｌ％以上、ＦG０．９９）。存在するグルロン酸オリゴマー中に存在し得る他の残基は、マンヌロン酸を含む。
【0035】
加水分解反応はポリマー鎖の分割をもたらし、形成されるオリゴマーの混合物から目標グルロン酸オリゴマーが分画され得る。
【0036】
本発明のジブロックポリマーを調製するときに、グルロン酸オリゴマーの混合物が使用されてもよいことが認識されるだろう。天然アルギン酸が加水分解されて高Ｇ含有量オリゴマーが単離されるとき、こうした混合物が本発明のジブロックポリマーの第１の成分として用いられてもよいし、さらなる精製を用いて単一のオリゴマーまたはより少数の異なるオリゴマーを含有する混合物が単離されてもよい。当業者は、必要とされるナノ粒子の特性に依存して、グルロン酸オリゴマーの第１の成分の性質を調整し得る。しかし、混合物は、実質的にすべての成分が少なくとも５０ｍｏｌ％のグルロン酸残基を有するオリゴマーを含有することが必要とされる。
【0037】
グルロン酸オリゴマー内の繰り返し単位の数を決定すること、およびグルロン酸オリゴマー内のグルロン酸残基の数を決定することは、たとえばＮＭＲなどの公知の分析技術を用いて達成され得る。ＭＡＬＳ、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ、および粘度測定を用いてポリマーのＭｗを決定することもでき、その情報を用いてポリマー内の繰り返し単位またはモノマーの数を決定することもできる。
【0038】
次いで、任意の好都合な化学的性質を介して、グルロン酸オリゴマーを第２のポリマーと連結する必要がある。アルギン酸の加水分解の性質は、グルロン酸オリゴマーがたとえばアルデヒド官能性などのカルボニル基を含有することを意味する。このカルボニルまたは特定的にアルデヒドの官能性は、グルロン酸オリゴマーを第２のポリマーに接合するときに利用され得る。このカルボニル官能性は、好ましくはグルロン酸オリゴマーの端部に位置する。
【0039】
リンカー
グルロン酸オリゴマーは、リンカーを介して第２のポリマーに接合される。リンカーの性質は重要ではなく、熟練した化学者はグルロン酸オリゴマーを第２のポリマーに接合する多くのやり方を考案し得る。理論上は、このリンカーはジブロックポリマーの２つの成分の連結を可能にする、たとえば－Ｏ－原子などの単純な１原子であり得る。しかし、好ましくは専用の連結分子が用いられる。
グルロン酸オリゴマーは、リンカーを介して第２のポリマーに接合される。リンカーの性質は重要ではなく、熟練した化学者はグルロン酸オリゴマーを第２のポリマーに接合する多くのやり方を考案し得る。理論上は、このリンカーはジブロックポリマーの２つの成分の連結を可能にする、たとえば－Ｏ－原子などの単純な１原子であり得る。しかし、好ましくは専用の連結分子が用いられる。
【0040】
適切な求核剤および求電子剤を作成するために、任意の好適な共有結合化学が反応物の好適な官能化と共に用いられてもよい。クリックケミストリーの使用は、より大きい分子を接合するための特に好ましい方法である。たとえば、アミノオキシ－アジドは、周知のクリックケミストリー反応においてアミノオキシ－ＤＢＣＯと容易に反応する。相補的なクリック基による反応物の官能化によって、反応物の単純な接続が可能になる。したがって、この実施形態におけるリンカーは、Ｌ－グルロン酸オリゴマーと第２のポリマーとの間の原子となる。したがって好ましいリンカーは、（アルキンおよびアジドのクリック反応によって形成された）トリアゾール基を含んでもよい。
【0041】
本発明のリンカーは、好ましくはたとえば二官能性または三官能性などの多官能性である。一実施形態において、二官能性の単一のリンカーが用いられ、すなわちそのリンカーは両方の反応物と反応し得る必要がある。２つの成分の連結は同時にもたらされ得るが、より好都合には最初に一方の成分がリンカーと反応し、その後に他方の成分が官能化された成分と反応する。
【0042】
理想的には、リンカーはＭｗが３００ｇ／ｍｏｌ未満、たとえば５０～２００ｇ／ｍｏｌなどの小分子である。しかし、たとえばポリアルキレンオキシド鎖などのより大きな連結基を用いることも可能である。好ましくは、こうしたポリマーリンカーは２０未満の繰り返し単位を有するだろう。
【0043】
好都合には、連結反応は、グルロン酸オリゴマーおよびもし存在すれば第２のポリマーの末端マスクされたカルボニル／アルデヒド基を利用する。したがって理想的には、連結反応は、たとえばアジド、アルキン、チオール、アルケンなどから選択される官能基による還元的アミノ化、アミノ化、またはクリックケミストリーを伴う反応を含む。ジオキシアミンまたはジヒドラジドの使用が好ましい。
【0044】
したがってリンカーは、第１または第２の成分によってシッフ塩基（オキシムまたはヒドラゾン）を形成してもよい。好都合には、成分の一方は、たとえばＯ，Ｏ’－１，３－プロパンジイルビスヒドロキシルアミン二塩酸塩またはアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ：ａｄｉｐｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｈｙｄｒａｚｉｄｅ）などの、二官能性還元的アミノ化タイプの試薬によって官能化される。次いで、他方の成分が組み合わされて２つのブロックが連結される。詳細は以下の実験セクションに提供されており、熟練した化学者によって容易に適合され得る。
【0045】
好都合には、リンカーは二官能性リンカーであり、そこにはたとえばＣ1-10直鎖アルキレン鎖などのアルキレン鎖によって連結された末端官能基が存在する。目的の官能基は、Ｏ－ＮＨ2または－ＣＯ－ＮＨ－ＮＨ2を含む。より長いリンカーはジブロックポリマーの粘度を変えることがあるため、リンカーの長さは熟練した化学者がジブロックポリマーの特性を変化させるために使用できるさらなるツールである。
【0046】
反応が完了したとき、たとえば安定なアミンを形成するために）シッフ塩基が還元されてもよい。好適な還元剤は、ピコリンボランまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムを含む。こうした種は、オキシムまたはヒドラゾンよりも化学的に安定であってもよい。
【0047】
図２において、グルロン酸とＰＤＨＡまたはＡＤＨとの反応によってオキシムまたはヒドラゾンが形成され、その後還元されてＮ－オキシドまたはヒドラジンになることが記載されている。ヒドラゾンは、等価の形態であるピラノシドを有することが認識されるだろう。たとえばフラノシドなどの等価の環状形態も存在してもよい。
【0048】
理想的には、リンカーはグルロン酸オリゴマーおよび第２のポリマーの末端位置を連結すべきである。
【0049】
当業者は、２つの成分を連結するための好適な化学的性質を容易に考案し得るだろう。一実施形態において、リンカーは５～２０の骨格原子を含有してもよい（すなわち、２つのブロックを連結する鎖の長さが５～２０原子である）。たとえば、Ｏ－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－ＣＨ2－Ｏリンカーは６つの骨格原子を含有する。
【0050】
いくつかの実施形態において、リンカーは、たとえばＰＥＧなどの短鎖ポリアルキレングリコールを含んでもよい。こうした鎖は最大１０の繰り返し単位、たとえば最大５のこうした単位などを有してもよい。
【0051】
第２のポリマー
ジブロックポリマーの第２の成分は、たとえばオリゴ糖もしくは多糖、ポリ（メト）アクリレート、またはポリアルキレングリコールなどのポリマーである。第２の可溶性ポリマーは、グルロン酸オリゴマーとは異なる必要があることが認識されるだろう。したがって、第２のポリマーは３０ｍｏｌ％を超えるグルロン酸残基を含まない。理想的には、第２のポリマーはグルロン酸残基をまったく含まない。第２のポリマーは、好ましくはアルギン酸に由来するものではない。
ジブロックポリマーの第２の成分は、たとえばオリゴ糖もしくは多糖、ポリ（メト）アクリレート、またはポリアルキレングリコールなどのポリマーである。第２の可溶性ポリマーは、グルロン酸オリゴマーとは異なる必要があることが認識されるだろう。したがって、第２のポリマーは３０ｍｏｌ％を超えるグルロン酸残基を含まない。理想的には、第２のポリマーはグルロン酸残基をまったく含まない。第２のポリマーは、好ましくはアルギン酸に由来するものではない。
【0052】
代替的に見ると、第２のポリマーは、Ｇブロックのカチオン配位と相互作用しないものである。
【0053】
第２のポリマーは水溶性ポリマーであることが好ましい。いくつかの不溶性ポリマーも用いられてもよく、特にたとえばＤＰ６～４０の不溶性キチンオリゴマーなどの重合度が低いものが用いられてもよい。
【0054】
第２のポリマーは、Ｇオリゴマーに連結されたときに、たとえば金属イオンなどの陽イオンの存在下でナノ粒子を形成するものである。それらの状況で沈殿を形成する第２のポリマーは、除外される。
【0055】
第２のポリマーは、グルロン酸オリゴマーよりも高い重量平均分子量（Ｍｗ）を有することが好ましい。理想的には、第２のポリマーのＭｗはグルロン酸オリゴマーの少なくとも２倍、たとえば３～８倍高い。しかし、第２のポリマーのＭｗが高過ぎると（例、グルロン酸オリゴマーのＭｗの２０ｘ以上）、目標ナノ粒子よりも沈殿が形成されやすくなる。
【0056】
代替的に見ると、第２のポリマーの重合度は、グルロン酸モノマーの重合度以上であるべきである。したがって、ｎ対ｍの比率が重要であり、ここでｎはグルロン酸のＤＰであり、ｍは第２のポリマーのＤＰである。その比率は理想的には２：１（ｎ：ｍ）～１：９（ｎ：ｍ）、たとえば１：１（ｎ：ｍ）～１：９（ｎ：ｍ）などである。特に好ましい比率は４ｎ＝＞ｍ＞＝ｎである。
【0057】
したがって一般的に、ＧのＤＰが第２のポリマーのＤＰよりもかなり大きいときに沈殿が起こる。両方のオリゴマーが短いとき、たとえば両方のオリゴマーのＤＰが１５未満などであるときに、ＧのＤＰが第２のポリマーのＤＰと等しいとき、ＮＰの形成ではなく沈殿が起こる。したがって、ＧオリゴマーのＤＰがｎ＝３～１５の範囲であるときは、第２のポリマーのＤＰのｍが好ましくは３０～１８０である。
【0058】
たとえば、（Ｃａイオンによって）Ｇ10－リンカー－Ｄｅｘ40はナノ粒子の形成をもたらすのに対して、Ｇ10－リンカー－Ｄｅｘ100は沈殿する。
【0059】
Ｇ40－リンカー－Ｄｅｘ40は、Ｇ40－リンカー－Ｄｅｘ100と同様にナノ粒子を形成する。
【0060】
ｍの値が１８０を超えるとジブロックポリマーが水溶性になる危険性があるため、ｍは好ましくは１８０以下である。
【0061】
沈殿またはナノ粒子をもたらすｍおよびｎの正確な値は、ナノ粒子内に配位される陽イオンの性質に依存して変動することがある。
【0062】
理論によって制限されることは望まないが、第２のポリマーのＤＰの適切なＭｗが、典型的に水性媒体である適切な媒体におけるナノ粒子の自発的な形成を促進すると考えられる。
【0063】
両方のポリマーが少なくとも２０の繰り返し単位を有するときは、水溶性ポリマーのＭｗがグルロン酸オリゴマーよりも少なくてもよい。
【0064】
第２のポリマー内の繰り返し単位の数を決定することは、たとえばＮＭＲなどの周知の分析技術を用いて達成され得る。加えて、ＭＡＬＳ、ＳＥＣ－ＭＡＬＳ、または粘度測定を用いてポリマーのＭｗを決定でき、その情報を用いてポリマー内の繰り返し単位（モノマー）の数を決定することもできる。規定の重合度を有する多くの商業用の多糖が販売されている。
【0065】
実際には、水溶性ポリマーがコアシェルナノ粒子のシェルを形成し、グルロン酸オリゴマーがコアを形成することが考えられ得る。したがって、ナノ粒子はミセルまたはポリマーソームとみなされ得る。
【0066】
好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールまたはオリゴ糖もしくは多糖、特にヒアルロナン、プルラン、β－１，３－グルカン、ヘパリン、グリコサミノグリカン、アミロース、キトサン、またはデキストランである。デキストランは、微生物由来の分岐したポリ－α－Ｄ－グルコシドであり、主にＣ－１→Ｃ－６”のグリコシド結合を有する。デキストラン鎖はさまざまな長さである。
【0067】
水溶性ポリマーは、本明細書で前述されたとおりのリンカーを有するように官能化されてもよく、次いでグルロン酸オリゴマーと水溶性ポリマーとの連結反応がもたらされ得る。
【0068】
第２の成分がポリアルキレングリコールであるとき、それは理想的には少なくとも１０の繰り返し単位を含有する。
【0069】
非常に好ましい実施形態において、グルロン酸オリゴマーは、理想的には還元的アミノ化を介してデキストランに連結され、すなわちリンカーはＮ－オキシドまたはヒドラジンを含む。
【0070】
ジブロックポリマー
したがって、本発明の操作されたジブロックポリマーは、好適なコンジュゲーション法によって連結された２つ以上の異なるブロックを含み、たとえばそれらのブロックからなる。本発明のジブロックポリマーは、直鎖状であってもよい。
したがって、本発明の操作されたジブロックポリマーは、好適なコンジュゲーション法によって連結された２つ以上の異なるブロックを含み、たとえばそれらのブロックからなる。本発明のジブロックポリマーは、直鎖状であってもよい。
【0071】
本発明のジブロックポリマーは、本明細書においてＧn－Ｌ－ｘｘｘと命名でき、ここでＧは重合度ｎを有するグルロン酸オリゴマーである。Ｌはリンカーであり、ｘｘｘはたとえばデキストランなどの第２のポリマーである。特に、ジブロックポリマーはＧn－Ｌ－Ｄｅｘmであり、ここでＤｅｘはデキストランであり、ｍはデキストランの重合度である。
【0072】
ｎの値は、好ましくは８～７０である。ｍの値は、好ましくは３０～１８０、たとえば３０～１５０などである。理想的には、ｍは少なくとも２ｎである。
【0073】
ｎ対ｍの比率も重要である。その比率は理想的には２：１～１：９である。したがって、９ｎ＞ｍ＞ｎ／２であることが好ましい。特に好ましい比率は４ｎ＝＞ｍ＞＝ｎである。
【0074】
ナノ粒子
本発明のジブロックポリマーは、一方のブロックが短距離引力相互作用を生じ得るのに対して他方のブロックが長距離反発相互作用を生じるような、定義された条件下で自己集合する。自己集合は、非常に多様な構造をもたらす自発的プロセスであり、その特徴は出発ブロックポリマーの分子パラメータに依存する。ジブロックポリマーは、好ましくは水に溶解される。金属イオンの添加によって、ナノ粒子が形成される。理論によって制限されることなく、金属イオンの存在は最初にジブロックポリマーのダイマーの形成を可能にすると考えられる。これらのダイマーの形成によって、ナノ粒子の形成がもたらされる。
本発明のジブロックポリマーは、一方のブロックが短距離引力相互作用を生じ得るのに対して他方のブロックが長距離反発相互作用を生じるような、定義された条件下で自己集合する。自己集合は、非常に多様な構造をもたらす自発的プロセスであり、その特徴は出発ブロックポリマーの分子パラメータに依存する。ジブロックポリマーは、好ましくは水に溶解される。金属イオンの添加によって、ナノ粒子が形成される。理論によって制限されることなく、金属イオンの存在は最初にジブロックポリマーのダイマーの形成を可能にすると考えられる。これらのダイマーの形成によって、ナノ粒子の形成がもたらされる。
【0075】
それとは対照的に、２つのオリゴグルロン酸（ｏｌｉｇｏｇｕｒｏｎａｔｅｓ）に基づくジブロックポリマーが用いられるとき、金属イオンの添加はナノ粒子ではなく、固体沈殿物の形成を引き起こす。
【0076】
通常は、ナノ粒子形成を確実にするために、過剰な金属イオンが添加される。溶液中に必要とされる金属イオンの濃度は、金属イオンの性質に依存して変動する。金属イオンの混合物が用いられてもよいことも認識されるだろう。一般的に、溶液中に必要とされる金属（２＋）イオンの濃度は、次の順序に従う。Ｍｇ＞＞Ｍｎ＞Ｃａ＞Ｓｒ＞Ｂａ＞Ｃｕ＞Ｐｂ。いくつかの実施形態において、飽和溶液が用いられてもよい。
【0077】
ジブロックポリマーの水溶液に金属イオンを添加することによって、本発明のナノ粒子の自発的な形成が可能になる。理想的には、金属イオンの添加は透析または内部ゲル化を用いて行われる。
【0078】
内部ゲル化の方法では、最初にたとえばＣａなどの金属イオンが、たとえば金属炭酸塩微小粒子として、またはたとえば金属－ＥＧＴＡもしくは金属－ＥＤＴＡ錯体などの可溶性金属錯体などとして、アルギン酸内に分散される。たとえばＧＤＬなどのｐＨ調整剤を用いて、ソースから金属イオンを放出させるために十分となるようにｐＨをゆっくりと低くして、金属－アルギン酸ゲル化を誘導する。本発明のジブロックの存在下で、この方法は驚くべきことに安定なナノ粒子をもたらす。アルギン酸が用いられるときは、ヒドロゲルが形成される。
【0079】
好都合には、透析は、たとえばＣａＣｌ2などのＣａイオンの溶液などの金属イオン溶液に対してジブロック溶液が透析されることを伴う。透析の長さは、ジブロックポリマーの分子量および透析膜のポアサイズに依存して変動し得る。より大きいポリマーは、より小さいジブロックポリマーよりも短い透析時間を必要とする傾向がある。
【0080】
ジブロックおよび金属イオン溶液の両方の典型的な溶液は、１～１００ｍＭの濃度であってもよい。たとえば酢酸ナトリウムなどの緩衝液も用いられてもよい。
【0081】
ナノ粒子は、定常状態に到達するまで長期間にわたって形成され得る。その期間は最大２週間であり得る。
【0082】
代替的に、口語的に「内部ゲル化」として知られる方法において、たとえば金属イオンの溶液などの均質な金属イオンソースを供給することによって、ナノ粒子が形成されてもよい。ジブロックポリマーを生理食塩水に溶解した後に、たとえばＣａＥＧＴＡ（エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ－ｂｉｓ（β－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ ｅｔｈｅｒ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－ｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ））などの金属イオン錯体と接触させ得る。たとえばＧＤＬ（グルコノデルタラクトン（ｇｌｕｃｏｎｏｄｅｌｔａ ｌａｃｔｏｎｅ））の導入などによって誘導されるｐＨの低速の変化による、たとえばＣａＥＧＴＡなどからのカルシウムイオンの均質な放出によって、ナノ粒子が形成される。
【0083】
オリゴグルロン酸－Ｌ－デキストランジブロックは、たとえば透析などによるカルシウムイオンの導入によって、明確に定義されたコアシェルミセル様ナノ粒子を形成する。コアシェル粒子は、Ｇベースのコアとデキストランコロナとの間に厳密な相分離を有する。
【0084】
それとは対照的に、遊離オリゴグルロン酸鎖は、同じ条件下で沈殿する。これはおそらく、側方（ｌａｔｅｒａｌ）修飾を伴わない刺激感受性ジブロック多糖の最初の報告である。
【0085】
したがって、アルギン酸、Ｇブロック、およびＧｎ－ｂ－Ｘｍジブロックは、異なる態様でカルシウム塩または希釈酸と反応する。すなわち、アルギン酸は一般的に巨視的ヒドロゲルを形成し、Ｇブロックは溶液中で沈殿するのに対し、Ｇｎ－ｂ－Ｘｍジブロックはコア／シェル構造を有する安定なナノ粒子を形成する。本明細書において、代替的命名Ｇｎ－ｂ－Ｘｍは、Ｇｎ（Ｇブロック）と、リンカーとしてのｂと、第２の成分としてのＸｍとを有するジブロック（ｄｅｂｌｏｃｋ）を定義するために用いられる。
【0086】
配位され得る金属イオンは、好ましくは多価であり、好ましくは三価または特に二価である。第ＩＩ族の金属イオン、特にＣａ、Ｒａ、Ｓｒ、およびＢａイオンの使用が好ましい。その他の目的の金属は、アクチニドおよびランタニド、たとえばイットリウム、テルビウム、ルテチウム、およびアクチニウムなど、またはいくつかの遷移金属、たとえばＣｕおよびＺｒなどを含む。たとえばＣｕ－６４およびＣｕ－６７は、テルビウム１４９／１５２／１５５／１６１と共に興味深い選択肢である。特に、本発明のナノ粒子中に放射性核種が配位され得る。好適な放射性核種は、アクチニウム、トリウム、ラジウム、ルテチウム、ガリウム、テクネチウム、ビスマス、パラジウム、鉛、サマリウム、イリジウム、アスタチン、レニウム、エルビウム、ジルコニウム、およびインジウムのものを含む。
【0087】
特定の放射性核種は、アクチニウム－２２５、トリウム－２２７、ラジウム－２２３／２２４、ルテチウム－１７７、ガリウム－６８、テクネチウム－９９、ビスマス－２１３、ガリウム－６７／６８、サマリウム－１５３、アスタチン－２１１、レニウム－１８６／１８８、エルビウム－１６９、ジルコニウム－８９、パラジウム－１０３、イリジウム－１９２、および鉛－２１２、およびインジウム－１１１を含む。癌を標的とする放射性イオンは特に興味深い。
【0088】
アルギン酸の場合、ＧブロックとＣａ、Ｒａ、Ｓｒ、およびＢａイオンとの強力かつ特異的な相互作用は、たとえばＧブロックにコンジュゲートされたデキストランなどの中性ポリマーブロックによってもたらされる立体（反発）相互作用によって釣り合わされ得る。
【0089】
ナノ粒子は、好ましくは１０～１００ｎｍ、たとえば２０～８０ｎｍなどの直径を有する。
【0090】
したがって、ナノ粒子を用いて、患者に放射性核種またはその他の興味深い金属イオンを投与し得る。ナノ粒子は、放射性核種を貯蔵するために好都合な媒体でもある。本発明のナノ粒子は、たとえば体温および体内ｐＨなどの生理的条件下で安定である。それらのナノ粒子は注入可能である。
【0091】
特定の金属イオンを含むナノ粒子の調製は困難である。たとえば、マグネシウムイオンはジブロックポリマーと自発的に組み合わされてナノ粒子を形成しないため、マグネシウムイオンを用いてナノ粒子を形成することは困難である。しかし、もしマグネシウムを含有するナノ粒子を形成できれば有用であろう。なぜなら、こうしたナノ粒子は、特定の標的に対してより高い親和性を有することがあるからである。
【0092】
ナノ粒子中にすでに存在する金属イオンの置換を介して、マグネシウムイオンをナノ粒子中に導入し得ることが見出されている。したがって、本明細書に記載されるプロトコルに従ってたとえばカルシウムイオンなどを用いてナノ粒子を形成した後に、これらのナノ粒子をたとえばマグネシウムイオン溶液で透析することなどによって、マグネシウムイオン溶液に露出させ得る。さらに、マグネシウムイオン溶液の強度を変動させて、置換される金属イオンの量を変更し得る。溶液中のマグネシウムイオンの濃度を増加させることによって、より多くの金属イオンがナノ粒子から移動させられる。本発明者らの実験では最適濃度が存在することが示唆されており、その濃度を超えると置換の効果が低くなる。当業者は、置換を最大化するために必要な濃度を容易に決定し得る。典型的に、濃度は０．０５～２０ｍＭである。たとえばハライド、硝酸などの対イオンは、金属イオン溶液に対して好適である。本発明者らは、ナノ粒子中の５０～９５％の金属イオンを置換可能であり、よって５０～９５％の置換イオン、たとえばＭｇイオンなどがもたらされることを実証している。
【0093】
ナノ粒子への異なる金属イオンの導入を可能にするために、さまざまな異なる金属イオンの組み合わせに対してこの置換の原理が使用され得ることが認識されるだろう。たとえばナトリウムまたはカリウムイオンなどのアルカリ金属イオンの導入などが考えられるだろう。
【0094】
したがって一実施形態において、本発明の方法がさらに含むステップにおいて、第１の金属イオンを含むナノ粒子が第２の金属イオンの溶液と組み合わされ、たとえばカルシウムイオンを含むナノ粒子がマグネシウムイオンの溶液と組み合わされることなどによって、少なくとも一部分の第１の金属イオンが移動し、それらが第２の金属イオンの一部分によって置換される。
【0095】
さらなる実施形態において、本発明のナノ粒子は、たとえば荷電医薬品など、生物学的目的の荷電有機分子を配位してもよい。グルロン酸コアは典型的に負に荷電しているため、容易に金属イオンを配位する。たとえば正に荷電した有機分子などの荷電有機分子の配位に対しても、同じイオン相互作用が好適であろう。塩の形態の多くの医薬品が荷電しており、したがって本発明のナノ粒子における配位のために好適である。こうした分子が金属イオンの代わりに用いられるか、または金属イオンと同様に用いられてもよい。
【0096】
加えて、荷電種に対する結合の強度は、第１の成分のＧ含有量に依存して調整され得る。より高いＧ含有量は、より強い結合をもたらす傾向がある。したがって、荷電種の生理的放出が重要であるときは、放出を促進するために第１の成分のＧ含有量が低減され得る。
【0097】
さらなる実施形態において、ジブロックポリマーおよびナノ粒子は、たとえば抗体、リガンドなどの生物学的ターゲティング化合物を有するようにさらに機能化されてもよい。この機能化は、ナノ粒子形成の前または後に行われてもよい。これらの生物学的ターゲティング分子自体が興味深い薬物を有してもよい。たとえば、本発明のジブロックポリマーに結合される抗体に放射性核種が配位され得る。
【0098】
一実施形態において、ナノ粒子の形成中にその一部となるジブロックポリマーに、たとえばペプチドなどの生物学的ターゲティング化合物を取り込むことによって、これらの生物学的ターゲティング化合物を含むナノ粒子を形成し得ることが考えられる。代替的には、関連する生物学的ターゲティング部分が、ナノ粒子の形成中にその一部となるＧブロックポリマーと組み合わされてもよい。たとえば、本明細書において定義されるＧブロックおよびペプチドを含むジブロックポリマーが、たとえばＧｎ－ｂ－デキストランを含むものなどの本発明のジブロックポリマーと組み合わされて、ナノ粒子が形成される際にそれに取り込まれ得る。
【0099】
よって、たとえばＧｎ－ｂ－デキストランなどの本発明のジブロックポリマーにＧn－ｂ－ペプチドを加えることによって、ペプチドリガンドを含有するナノ粒子を調製し得る。この方法における比率を用いて、ナノ粒子中の生体分子の濃度を調整し得る。
【0100】
本発明者らは以下においてペプチドを用いてこの概念を例示するが、任意の好適な生体分子が用いられて、Ｇブロックに結合され得る。たとえば、ターゲティングリガンドがグルロン酸オリゴマーと組み合わされ得る。その例は、Ｇブロックを有するアジドへの結合のためにクリックケミストリーリンカーによって活性化され得る葉酸を含む。
【0101】
他の生体分子は、抗体、抗体フラグメント、ナノボディ、アフィボディ、ペプチド（たとえばボンベシン、オクトレオチド、またはＲＧＤなど）、ペプチド模倣薬、アプタマー（核酸）、小分子（たとえばチロシン受容体阻害剤など）、ヒアルロン酸、および受容体または疾患組織を表す細胞中で過剰発現される細胞表面分子を標的とするその他のリガンドを含む。
【0102】
Ｇブロックに結合された生物学的部分を本発明のジブロックポリマーと組み合わせて、存在金属イオンにおいて形成されるナノ粒子の一部として自発的に取り込ませ得ることが考えられる。
【0103】
別の態様から見ると、本発明はナノ粒子の調製のための方法を提供し、この方法は、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーと反応するように適合された連結基を有する第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含むか、
または、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーおよび第２のポリマーと反応するように適合された連結基と反応させること、
（ＩＩＩ）連結基を有する前記グルロン酸オリゴマーを第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること、
もしくは、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得て、前記オリゴマーを官能基によって活性化すること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、グルロン酸オリゴマーの官能基と反応する官能基を有するように適合された第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること、
を含み、
かつ、その後に、
前記ジブロックポリマーを、たとえば金属イオン、プロトン、または荷電有機化合物などの第１の陽イオンと接触させて、ナノ粒子を形成すること、
前記ナノ粒子を、たとえば前のステップで用いられたものとは異なる金属イオンなどの第２の陽イオンと接触させて、前記第２の陽イオンが前記ナノ粒子中の前記第１の陽イオンを少なくとも部分的に置換するようにさせることを含む。
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーと反応するように適合された連結基を有する第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含むか、
または、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーおよび第２のポリマーと反応するように適合された連結基と反応させること、
（ＩＩＩ）連結基を有する前記グルロン酸オリゴマーを第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること、
もしくは、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得て、前記オリゴマーを官能基によって活性化すること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、グルロン酸オリゴマーの官能基と反応する官能基を有するように適合された第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること、
を含み、
かつ、その後に、
前記ジブロックポリマーを、たとえば金属イオン、プロトン、または荷電有機化合物などの第１の陽イオンと接触させて、ナノ粒子を形成すること、
前記ナノ粒子を、たとえば前のステップで用いられたものとは異なる金属イオンなどの第２の陽イオンと接触させて、前記第２の陽イオンが前記ナノ粒子中の前記第１の陽イオンを少なくとも部分的に置換するようにさせることを含む。
【0104】
別の態様から見ると、本発明はナノ粒子の調製のための方法を提供し、この方法は、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーと反応するように適合された連結基を有する第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含むか、
または、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーおよび第２のポリマーと反応するように適合された連結基と反応させること、
（ＩＩＩ）連結基を有する前記グルロン酸オリゴマーを第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
もしくは、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得て、前記オリゴマーを官能基によって活性化すること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、グルロン酸オリゴマーの官能基と反応する官能基を有するように適合された第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含み、
かつ、その後に、
前記ジブロックポリマーを、ペプチドに連結されたグルロン酸オリゴマーを含むジブロックポリマーの存在下で、たとえば金属イオン、プロトン、または荷電有機化合物などの陽イオンと接触させて、ナノ粒子を形成することを含む。
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーと反応するように適合された連結基を有する第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含むか、
または、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得ること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、前記グルロン酸オリゴマーおよび第２のポリマーと反応するように適合された連結基と反応させること、
（ＩＩＩ）連結基を有する前記グルロン酸オリゴマーを第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
もしくは、
（Ｉ）たとえば酸または塩基の存在下でアルギン酸を加水分解してグルロン酸オリゴマーを形成することなどによって、グルロン酸オリゴマーを得て、前記オリゴマーを官能基によって活性化すること、
（ＩＩ）前記グルロン酸オリゴマーを、グルロン酸オリゴマーの官能基と反応する官能基を有するように適合された第２のポリマーと反応させて、ジブロックポリマーを形成すること
を含み、
かつ、その後に、
前記ジブロックポリマーを、ペプチドに連結されたグルロン酸オリゴマーを含むジブロックポリマーの存在下で、たとえば金属イオン、プロトン、または荷電有機化合物などの陽イオンと接触させて、ナノ粒子を形成することを含む。
【実施例】
【0105】
テスト方法：
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ
多角度光散乱（ＭＡＬＳ：Ｍｕｌｔｉａｎｇｌｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によるサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）によって、ブロックポリマー（Ｇn－ｂ－ＧnおよびＧn－ｂ－Ｄｅｘm）の分子量および固有粘度を分析した。サンプルを移動相（０．１５Ｍ ＮａＮＯ3および１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、注入の前に濾過した（０．４５μｍ）。同じ手順を用いて標準物質を調製した。アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１２６０ ＩｓｏＰｕｍｐおよび１２６０ ＨｉＰデガッサを用いて、分析中に０．５ｍｌ／分の流れを維持した。アジエル・テクノロジー・バイアルサンプラ（Ａｇｉｅｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｖｉａｌｓａｍｐｌｅｒ）により、サンプル（０．７～１ｍｌ）を注入した（注入体積当たり５０～１００μＬ）。ＴＫＳゲル（Ｇｅｌ）カラム４０００および２５００を直列に接続した。ワイアット・テクノロジー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＤＡＷＮ Ｈｅｌｅｏｓ－ＩＩおよびＶｉｓｃｏＳｔａｒ ＩＩ検出器をＳｈｏｄｅｘ屈折率検出器（ＲＩ－５０１１）と直列に接続した。データの収集および処理のためにＡｓｔｒａ７．３．０ソフトウェアを用いた。
ＳＥＣ－ＭＡＬＳ
多角度光散乱（ＭＡＬＳ：Ｍｕｌｔｉａｎｇｌｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）によるサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ：Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）によって、ブロックポリマー（Ｇn－ｂ－ＧnおよびＧn－ｂ－Ｄｅｘm）の分子量および固有粘度を分析した。サンプルを移動相（０．１５Ｍ ＮａＮＯ3および１０ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、注入の前に濾過した（０．４５μｍ）。同じ手順を用いて標準物質を調製した。アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１２６０ ＩｓｏＰｕｍｐおよび１２６０ ＨｉＰデガッサを用いて、分析中に０．５ｍｌ／分の流れを維持した。アジエル・テクノロジー・バイアルサンプラ（Ａｇｉｅｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｖｉａｌｓａｍｐｌｅｒ）により、サンプル（０．７～１ｍｌ）を注入した（注入体積当たり５０～１００μＬ）。ＴＫＳゲル（Ｇｅｌ）カラム４０００および２５００を直列に接続した。ワイアット・テクノロジー（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＤＡＷＮ Ｈｅｌｅｏｓ－ＩＩおよびＶｉｓｃｏＳｔａｒ ＩＩ検出器をＳｈｏｄｅｘ屈折率検出器（ＲＩ－５０１１）と直列に接続した。データの収集および処理のためにＡｓｔｒａ７．３．０ソフトウェアを用いた。
【0106】
グルロン酸オリゴマーの調製
広範に加水分解された高グルロン酸アルギン酸から、酸沈殿によってさまざまなＤＰnを有するオリゴマーを得ることによって、異なる分子量および重合度を有するグルロン酸オリゴマー（Ｇオリゴマー）を調製した。ＤＰnはＮＭＲによって決定した。
広範に加水分解された高グルロン酸アルギン酸から、酸沈殿によってさまざまなＤＰnを有するオリゴマーを得ることによって、異なる分子量および重合度を有するグルロン酸オリゴマー（Ｇオリゴマー）を調製した。ＤＰnはＮＭＲによって決定した。
【0107】
以下のグルロン酸オリゴマーを調製した。
ＤＰ２１、ＦG０．９０（ここでＤＰnは平均重合度であり、ＦGはグルロン酸であるモノマーの画分、すなわちグルロン酸のｍｏｌ％である）。
ＤＰ４。サンプルのＦGは＞０．９であった。
ＤＰ１０。サンプルのＦGは＞０．９であった。
ＤＰ１１。サンプルのＦGは＞０．９であった。
ＤＰ１２。サンプルのＦGは＞０．９であった。
ＤＰ２１、ＦG０．９０（ここでＤＰnは平均重合度であり、ＦGはグルロン酸であるモノマーの画分、すなわちグルロン酸のｍｏｌ％である）。
ＤＰ４。サンプルのＦGは＞０．９であった。
ＤＰ１０。サンプルのＦGは＞０．９であった。
ＤＰ１１。サンプルのＦGは＞０．９であった。
ＤＰ１２。サンプルのＦGは＞０．９であった。
【0108】
次いで、グルロン酸オリゴマーを活性化してコンジュゲートを形成するか、または活性化したデキストラン成分と組み合わせてジブロックポリマーを形成した。
【0109】
アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、Ｏ，Ｏ’－１，３－プロパンジイルビスヒドロキシルアミン二塩酸塩（ＰＤＨＡ：Ｏ，Ｏ’－１，３－ｐｒｏｐａｎｅｄｉｙｌｂｉｓｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、および２－メチルピリジンボラン錯体（α－ピコリンボラン－ＰＢ）は、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）より購入した。
【0110】
グルロン酸コンジュゲートの調製 － 一般的プロトコル
調製の目的のために、オリゴマーを最終オリゴマー濃度が１０～２０ｍＭとなるようにＮａＡｃ緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ４）に溶解し、反応物に１０当量のＰＤＨＡ／ＡＤＨを加えた。２４ｈ後、室温にてＰＢ（３～２０当量）を反応物に加えた。反応物を撹拌しながら２４～１２０ｈ放置した。その後、反応混合物を（ＤＰｎ＜７のときは１００～５００Ｄａ ＭＷＣＯ、ＤＰｎ≧７のときは３．５ｋＤａ ＭＷＣＯによって）最初に５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析し、次いでＭＱ水に対して透析した。半調製用（ｓｅｍｉ－ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＳＥＣによって過剰なリンカーを除去した後に、サンプルを透析および凍結乾燥した。図２は行われた反応を示す。これらのコンジュゲートは、第２のポリマーと組み合わされ得る。
調製の目的のために、オリゴマーを最終オリゴマー濃度が１０～２０ｍＭとなるようにＮａＡｃ緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ４）に溶解し、反応物に１０当量のＰＤＨＡ／ＡＤＨを加えた。２４ｈ後、室温にてＰＢ（３～２０当量）を反応物に加えた。反応物を撹拌しながら２４～１２０ｈ放置した。その後、反応混合物を（ＤＰｎ＜７のときは１００～５００Ｄａ ＭＷＣＯ、ＤＰｎ≧７のときは３．５ｋＤａ ＭＷＣＯによって）最初に５０ｍＭ ＮａＣｌに対して透析し、次いでＭＱ水に対して透析した。半調製用（ｓｅｍｉ－ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）ＳＥＣによって過剰なリンカーを除去した後に、サンプルを透析および凍結乾燥した。図２は行われた反応を示す。これらのコンジュゲートは、第２のポリマーと組み合わされ得る。
【0111】
グルロン酸ジブロックの比較用の調製
グルロン酸を最終濃度２０ｍＭとなるように５００ｍＭのＮａ－Ａｃ緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ４）に溶解した。０．５当量および６～２０当量のＰＢを加えた。ＡＤＨに対して２４ｈ、ＰＤＨＡに対して１２０ｈの反応時間を用いた。反応混合物をＧＦＣ、透析、および凍結乾燥によって精製した。グルロン酸ジブロックは、カルシウムイオンに露出されたときに、沈殿を形成した。
グルロン酸を最終濃度２０ｍＭとなるように５００ｍＭのＮａ－Ａｃ緩衝液（５００ｍＭ、ｐＨ４）に溶解した。０．５当量および６～２０当量のＰＢを加えた。ＡＤＨに対して２４ｈ、ＰＤＨＡに対して１２０ｈの反応時間を用いた。反応混合物をＧＦＣ、透析、および凍結乾燥によって精製した。グルロン酸ジブロックは、カルシウムイオンに露出されたときに、沈殿を形成した。
【0112】
グルロン酸－リンカー－デキストランブロックコポリマーの本発明の調製 － 一般的プロトコル
デキストランを１０当量のＰＤＨＡによって活性化して精製した。グルロン酸（２～３当量）およびデキストラン－ＰＤＨＡをＮａＡｃ緩衝液に溶解し、２４ｈ後にＰＢを加え（３～１０当量）、反応物を磁気撹拌しながら１２０ｈ放置した。その後、反応混合物を透析および凍結乾燥した後に、半調製用ＧＦＣ、透析、および凍結乾燥によって精製した。
デキストランを１０当量のＰＤＨＡによって活性化して精製した。グルロン酸（２～３当量）およびデキストラン－ＰＤＨＡをＮａＡｃ緩衝液に溶解し、２４ｈ後にＰＢを加え（３～１０当量）、反応物を磁気撹拌しながら１２０ｈ放置した。その後、反応混合物を透析および凍結乾燥した後に、半調製用ＧＦＣ、透析、および凍結乾燥によって精製した。
【0113】
Ｇ－リンカー－デキストランの粒子形成
Ｇn－リンカー－Ｄｅｘm（ｎ＝１２およびｍ＝１００）（５～１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌの１０ｍＭ ＮａＣｌに溶解して濾過した（０．２２μｍ）。２４ｈ後に、２０ｍＭ ＣａＣｌ2および１０ｍＭ ＮａＣｌ（１～１．５Ｌ）に対してサンプルを透析した（Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ１００～５００Ｄａ）。
Ｇn－リンカー－Ｄｅｘm（ｎ＝１２およびｍ＝１００）（５～１０ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌの１０ｍＭ ＮａＣｌに溶解して濾過した（０．２２μｍ）。２４ｈ後に、２０ｍＭ ＣａＣｌ2および１０ｍＭ ＮａＣｌ（１～１．５Ｌ）に対してサンプルを透析した（Ｆｌｏａｔ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ１００～５００Ｄａ）。
【0114】
Ｄｅｘm－ｂ－Ｇnブロックコポリマー（ＳＥＣによる精製後）および出発材料（ＧnおよびＤｅｘm－リンカー）のＳＥＣ ＭＡＬＳ分析によるＭｎ、Ｍｗ、およびＤＰnが表１に提示されている。
【0115】
【表1】
【0116】
概念を実証するために、上記と同じプロトコルに従ってさらなるジブロックポリマーを調製して、ＮＭＲを用いて分析した。ＮＭＲの割り当てをより容易にするために、より短鎖のデキストランおよびグルロン酸オリゴマーを用いた。図３は、５００ｍＭ ＡｃＯＨｄ４ ｐＤ４中のＧ3およびＰＤＨＡ－Ｄｅｘ10（１：１）による平衡反応混合物のＤｅｘ10－ＰＤＨＡ－Ｇ3に対するＮＭＲスペクトルである（６００ＭＨｚ）。コンジュゲートの（Ｅ）／（Ｚ）－オキシムによる共鳴に注釈を付けている。コンジュゲートされたＧ3＝ｂ－Ｄｅｘmの構造が含まれる（＝還元されていないオキシムを示す）。比較のために、精製Ｄｅｘ10－ＰＤＨＡの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルが含まれる。
【0117】
結論として、ＤＰ100デキストラン鎖およびＤＰ10デキストラン鎖によって実証されたとおり、オリゴグルロン酸とＰＤＨＡ活性化デキストラン鎖とのコンジュゲーションは、より長鎖およびより短鎖に対して効率的である。
【0118】
溶液中のブロックコポリマーの自己集合
溶液中のＧ40－リンカー－Ｄｅｘ100ジブロックポリマーを、透析によってポリマー溶液に導入されたＣａＣｌ2（２０ｍＭ）と組み合わせた。平衡外の凝集体の形成を最小限にするために、１００～５００Ｄａのカットオフを有する膜を用いた。１０日後に定常状態に到達した。約２５ｎｍの直径を有するナノ粒子の集団は、デキストランブロックによって安定化されたアルギン酸ベースのコアヒドロゲルからなるミセル構造に対応する。コアシェル形態学の仮説は、Ｇ40ブロックが単独では類似の条件下で沈殿するという事実によってサポートされる。したがって、ジブロック構造はＧベースのコアとデキストランコロナとの厳密な相分離を可能にした。
溶液中のＧ40－リンカー－Ｄｅｘ100ジブロックポリマーを、透析によってポリマー溶液に導入されたＣａＣｌ2（２０ｍＭ）と組み合わせた。平衡外の凝集体の形成を最小限にするために、１００～５００Ｄａのカットオフを有する膜を用いた。１０日後に定常状態に到達した。約２５ｎｍの直径を有するナノ粒子の集団は、デキストランブロックによって安定化されたアルギン酸ベースのコアヒドロゲルからなるミセル構造に対応する。コアシェル形態学の仮説は、Ｇ40ブロックが単独では類似の条件下で沈殿するという事実によってサポートされる。したがって、ジブロック構造はＧベースのコアとデキストランコロナとの厳密な相分離を可能にした。
【0119】
溶液中のブロックコポリマーの自己集合
同様にして、Ｇ11－ｂ－Ｄｅｘ100を調製した。Ｇ11－ｂ－Ｄｅｘ100は、類似の条件下で著しく異なる挙動を有した。すなわち、このブロックコポリマーはＣａによって溶液中でより大きいナノ粒子を形成する傾向があった（１０００ｎｍ以上）。熱力学的観点から、これはＧブロックがより短いために、デキストランコロナの形成に関連するエントロピーの損失が、Ｇブロックのゲル化によるエンタルピーの十分な利得によって補償されないことを意味し得る。したがって、自己集合特性を有するように２つのブロックの長さの比率を注意深く考慮する必要がある。
同様にして、Ｇ11－ｂ－Ｄｅｘ100を調製した。Ｇ11－ｂ－Ｄｅｘ100は、類似の条件下で著しく異なる挙動を有した。すなわち、このブロックコポリマーはＣａによって溶液中でより大きいナノ粒子を形成する傾向があった（１０００ｎｍ以上）。熱力学的観点から、これはＧブロックがより短いために、デキストランコロナの形成に関連するエントロピーの損失が、Ｇブロックのゲル化によるエンタルピーの十分な利得によって補償されないことを意味し得る。したがって、自己集合特性を有するように２つのブロックの長さの比率を注意深く考慮する必要がある。
【0120】
さらなるジブロックポリマー
オリゴウロン酸とＰＤＨＡとの反応性が高いことは、ジブロックオリゴ糖または多糖を得るためのＰＤＨＡ活性化オリゴ糖との反応が類似の結果を伴って進行するであろうことを暗示する。このことを、β－１，３－グルカン－ＰＤＨＡ（ＤＰ9）による動力学的調査においてテストした。
オリゴウロン酸とＰＤＨＡとの反応性が高いことは、ジブロックオリゴ糖または多糖を得るためのＰＤＨＡ活性化オリゴ糖との反応が類似の結果を伴って進行するであろうことを暗示する。このことを、β－１，３－グルカン－ＰＤＨＡ（ＤＰ9）による動力学的調査においてテストした。
【0121】
加えて、対称なブロックの調製について、Ｇn－ＰＤＨＡによる反応も調査した。Ｇ3との結合の前に、すべてのコンジュゲート（オキシム）をピコリンボラン（ＰＢ：ｐｉｃｏｌｉｎｅ ｂｏｒａｎｅ）によって完全に還元した。これらのＰＤＨＡ活性化オリゴ糖は、幅広く異なる化学的性質を表す（表３）。デキストランは、α－１，６結合によって鎖の柔軟性が高い中性鎖である。アミロース（α－１，４結合グルカン）およびβ－１，３－グルカンは、どちらも半剛性の中性鎖であり、高次構造を形成する能力を有する。それらは集合的に、ほぼあらゆるタイプのジブロック多糖に向かうこのアプローチの多用途性を示す。
【0122】
最初に、反応物間の１：１のモル比を用いて、オリゴグルロン酸（Ｇn）とのコンジュゲーションを調査した。すべてのＰＤＨＡ活性化オリゴ糖に対する結果を表２ａにまとめている。それ以外の収率は４０～６０％の範囲であった。還元および精製を伴うジブロック多糖の調製を以下にさらに詳述する。
【0123】
【表2A】
【0124】
表２のデータは、さらなるオキシム還元前の反応動力学（一次速度定数）および平衡収率を得るための、反応物間の１：１のモル比を用いた初期実験に関する。
【0125】
その後、本発明者らは、反応物の一方または他方がモル過剰となるモル比を用いて、オリゴグルロン酸（Ｇn）を活性化ブロックにコンジュゲートした。一般的に、反応物のうちの１つがモル過剰で使用されると収率が改善されることが見出される。特に、ジブロックの調製および精製のための方法は、Ｇブロックに対してモル過剰の活性化ブロックを用いてもよい。
【0126】
たとえば、オリゴグルロン酸（７ｍＭ）を３倍モル過剰のＰＤＨＡ－デキストランと反応させて、還元および透析するとき、収率が顕著に改善される。実際に、本発明者らの調査では、本質的に１００％の結合を得るために、３：１または１：３のモル比と、その後の還元ステップとの組み合わせが必要であることが示唆された。（ＰＤＨＡ－デキストランに対して）３当量のオリゴグルロン酸が用いられるとき、ＳＥＣによって未反応オリゴグルロン酸からジブロックを分離できた。（オリゴグルロン酸に対して）３当量のＰＤＨＡ－デキストランによって、最良の結果および最も単純な手順が得られ、ここでジブロックはエタノールで選択的に沈殿させることができ、一方で未反応ＰＤＨＡ－デキストランは溶液中に残り、標準的な方法（蒸発／透析／凍結乾燥）によって再利用された。
【0127】
【表2B】
【0128】
精製
結合の後、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦＣ：ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）または酸による（過剰に添加された）未反応Ｇnの選択的沈殿のいずれかによって、ジブロックを精製し得る。過剰Ｇnの沈殿をさらに促進するために、塩または冷却が用いられ得る。なお、ジブロックが可溶性のままであるような条件が選択されるべきである（短いデキストランを有するジブロックは、より高いＤＰnを有するものに比べてより容易に沈殿する）。
結合の後、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＦＣ：ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）または酸による（過剰に添加された）未反応Ｇnの選択的沈殿のいずれかによって、ジブロックを精製し得る。過剰Ｇnの沈殿をさらに促進するために、塩または冷却が用いられ得る。なお、ジブロックが可溶性のままであるような条件が選択されるべきである（短いデキストランを有するジブロックは、より高いＤＰnを有するものに比べてより容易に沈殿する）。
【0129】
過剰なＰＤＨＡ－デキストランによって結合が行われるとき、ＮａＣｌを最終濃度０．２Ｍとなるように加えた後に、エタノールを４０％（最終濃度ｖ／ｖ）となるように加えることによって、形成された純粋なジブロックを選択的に沈殿させ得る。上清は過剰（未反応）ＰＤＨＡ－デキストランを含有し、これは透析による脱塩または８０％エタノールによる沈殿の後に再利用され得る）。したがって、第２の成分を過剰に使用することは、収率および精製の両方の点で好都合である。
【0130】
透析または内部ゲル化によるナノ粒子（ＮＰ）の調製：
さらなる実施形態において、透析または（ＣａＥＧＴＡまたはＣａＣＯ3／ＧＤＬによる）内部ゲル化によって、ナノ粒子を調製し得る。これら２つの方法は、わずかに異なる粒子サイズをもたらし、加えて異なる集合の動力学を有する。
さらなる実施形態において、透析または（ＣａＥＧＴＡまたはＣａＣＯ3／ＧＤＬによる）内部ゲル化によって、ナノ粒子を調製し得る。これら２つの方法は、わずかに異なる粒子サイズをもたらし、加えて異なる集合の動力学を有する。
【0131】
これらの例に対して、上述と同様の原理を用いて、Ｇ２４－リンカー－Ｄｅｘ３６ジブロックポリマーを調製した。
【0132】
内部ゲル化によるＮＰの調製：
２２℃にて１０ｍｇのＧ24－ＰＤＨＡ－Ｄｅｘ36を１ｍｌの１５ｍＭ ＮａＣｌに溶解し、１２ｈ振とうした。０．３ｍｌの１００ｍＭ ＣａＥＧＴＡを添加し、溶液を濾過した（０．２２μｍ）。０．０１６６ｇのＧＤＬをＭＱ水に溶解し、濾過して直ちにジブロックの溶液に加えた。溶液を２２℃にて１２ｈ放置した。後方散乱検出（１７３°）を伴うＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（マルバーン・インスツルメンツ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ＵＫ）（２５℃、λ＝６３２．８）を用いた動的光散乱（ＤＬＳ：ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（散乱強度（キロカウント毎秒（ｋｉｌｏ ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｓｅｃｏｎｄ）、ｋｃｐｓ）および強度分布）によって、一定の時間間隔で（１～２ｈごとに）ナノ粒子の形成をモニタした。
２２℃にて１０ｍｇのＧ24－ＰＤＨＡ－Ｄｅｘ36を１ｍｌの１５ｍＭ ＮａＣｌに溶解し、１２ｈ振とうした。０．３ｍｌの１００ｍＭ ＣａＥＧＴＡを添加し、溶液を濾過した（０．２２μｍ）。０．０１６６ｇのＧＤＬをＭＱ水に溶解し、濾過して直ちにジブロックの溶液に加えた。溶液を２２℃にて１２ｈ放置した。後方散乱検出（１７３°）を伴うＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（マルバーン・インスツルメンツ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ＵＫ）（２５℃、λ＝６３２．８）を用いた動的光散乱（ＤＬＳ：ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（散乱強度（キロカウント毎秒（ｋｉｌｏ ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｓｅｃｏｎｄ）、ｋｃｐｓ）および強度分布）によって、一定の時間間隔で（１～２ｈごとに）ナノ粒子の形成をモニタした。
【0133】
透析によるＮＰの調製：
２２℃にて１０ｍｇのＧ24－ＰＤＨＡ－Ｄｅｘ36を１ｍｌの１０ｍＭ ＮａＣｌに溶解し、１２ｈ振とうした。溶液を濾過し（０．２２μｍ）、透析袋に移した。１Ｌの２０ｍＭ ＣａＣｌ2および１０ｍＭ ＮａＣｌに対する透析を、ＭＷＣＯ≧３．５ｋＤａに対して２０ｈ、０．５ｋＤａ＜ＭＷＣＯ≦１．０ｋＤａに対して１４日間、ＭＷＣＯ≦０．５ｋＤａに対して１４日間続けた。後方散乱検出（１７３°）を伴うＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（マルバーン・インスツルメンツ、ＵＫ）（２５℃、λ＝６３２．８）を用いた動的光散乱（ＤＬＳ）（散乱強度（キロカウント毎秒、ｋｃｐｓ）および強度分布）によって、ナノ粒子の形成をモニタした。
２２℃にて１０ｍｇのＧ24－ＰＤＨＡ－Ｄｅｘ36を１ｍｌの１０ｍＭ ＮａＣｌに溶解し、１２ｈ振とうした。溶液を濾過し（０．２２μｍ）、透析袋に移した。１Ｌの２０ｍＭ ＣａＣｌ2および１０ｍＭ ＮａＣｌに対する透析を、ＭＷＣＯ≧３．５ｋＤａに対して２０ｈ、０．５ｋＤａ＜ＭＷＣＯ≦１．０ｋＤａに対して１４日間、ＭＷＣＯ≦０．５ｋＤａに対して１４日間続けた。後方散乱検出（１７３°）を伴うＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（マルバーン・インスツルメンツ、ＵＫ）（２５℃、λ＝６３２．８）を用いた動的光散乱（ＤＬＳ）（散乱強度（キロカウント毎秒、ｋｃｐｓ）および強度分布）によって、ナノ粒子の形成をモニタした。
【0134】
【化1】
【0135】
安定性
動的光散乱（ＤＬＳ）によって、異なる溶媒条件のセットに対するナノ粒子の安定性を実証した。ナノ粒子は、ＧＤＬ／ＥＧＴＡの除去、（水に対する透析による）過剰なイオン、および生理的食塩の条件下（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．２ｍＭ ＣａＣｌ2）で安定であることを示した。粒子は凍結乾燥可能であった（再懸濁の際には熱処理（４０Ｃ、３０分）のみ必要である）。結果が図６に提示される。
動的光散乱（ＤＬＳ）によって、異なる溶媒条件のセットに対するナノ粒子の安定性を実証した。ナノ粒子は、ＧＤＬ／ＥＧＴＡの除去、（水に対する透析による）過剰なイオン、および生理的食塩の条件下（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．２ｍＭ ＣａＣｌ2）で安定であることを示した。粒子は凍結乾燥可能であった（再懸濁の際には熱処理（４０Ｃ、３０分）のみ必要である）。結果が図６に提示される。
【0136】
酸性化を用いて、Ｇ２４－ｂ－Ｄｅｘ３６のナノ粒子を調製した。任意の残留純Ｇｎは低ｐＨにて沈殿したのに対し、ジブロックポリマーは溶液中に残ってナノ粒子に対応するサイズを保持した。図７は、これを１．０９までのさまざまなｐＨ値に対する数の分布として提示されたＤＬＳ（動的光散乱）分析によって示す。
【0137】
Ｍｇ2+溶液中のナノ粒子の安定性
Ｇ40－ｂ－Ｄｅｘ50ジブロック（４ｍｇ／ｍｌ、Ｖ＝１．０ｍｌ）を２０ｍＭ ＣａＣｌ2および１０ｍＭ ＮａＣｌに対して２４ｈ透析した（ｆｌｏａｔ－Ａ－ｌｙｚｅｒ３．５～５．０ｋＤａ）。次いでそれを水に対して透析した（２４ｈ）。この方法は、このタイプのジブロックによるＮＰおよびいくつかの凝集体をもたらした。
Ｇ40－ｂ－Ｄｅｘ50ジブロック（４ｍｇ／ｍｌ、Ｖ＝１．０ｍｌ）を２０ｍＭ ＣａＣｌ2および１０ｍＭ ＮａＣｌに対して２４ｈ透析した（ｆｌｏａｔ－Ａ－ｌｙｚｅｒ３．５～５．０ｋＤａ）。次いでそれを水に対して透析した（２４ｈ）。この方法は、このタイプのジブロックによるＮＰおよびいくつかの凝集体をもたらした。
【0138】
その後、サンプルを次のように段階的に増加する濃度のＭｇＣｌ2を含有する溶液（２０ｍｌ）に対して２０～２４ｈ透析した：０．０１４ｍＭ、０．１４ｍＭ、１．４ｍＭ、１４ｍＭ、１４０ｍＭ、および１０００ｍＭ。ＤＬＳによって、粒子サイズ分布の変化をモニタした。ＩＣＰ－ＭＳによって透析物中のＣａ2+およびＭｇ2+イオンの量を決定し、そこから結合されたＣａ2+（ＸCa）およびＭｇ2+（ＸMg）の画分を算出した。
【0139】
【表3】
【0140】
この結果は、結合Ｃａ2+がＭｇ2+イオンによって徐々に置換されるときに、ナノ粒子（ｎａｎ）はインタクトなままであり、サイズが縮小する傾向があることを示す。サンプル４（１４ｍＭ Ｍｇ2+、ＸCa＝０．７７）に対して、最小の粒子および最も狭いサイズ分布が得られた。それより高いＭｇ2+濃度は、粒子の膨張をもたらした。したがって、適切な濃度のＭｇ2+塩に対する透析によって、粒子崩壊を伴わずに強力に結合したＣａ2+イオンの一部を除去することができる。
【0141】
ジブロックポリマー
遊離Ｇ１２をＤＰｎ１００を有する精製ＰＤＨＡ－デキストランと反応させることによって、Ｇ12－ＰＤＨＡ－Ｄｅｘ100ジブロックを調製した。ここではＰＤＨＡ－デキストランの定量的な置換を得るために、３当量のＧ１２を選択した。ＳＥＣによって、残留（未反応）Ｇ１２が選択的に除去された（図５ａ）。ジブロックに対するＳＥＣ－ＭＡＬＬＳデータは、遊離ブロックと比較して溶出プロファイルの明確なシフトを示した（図５ｂ）。
遊離Ｇ１２をＤＰｎ１００を有する精製ＰＤＨＡ－デキストランと反応させることによって、Ｇ12－ＰＤＨＡ－Ｄｅｘ100ジブロックを調製した。ここではＰＤＨＡ－デキストランの定量的な置換を得るために、３当量のＧ１２を選択した。ＳＥＣによって、残留（未反応）Ｇ１２が選択的に除去された（図５ａ）。ジブロックに対するＳＥＣ－ＭＡＬＬＳデータは、遊離ブロックと比較して溶出プロファイルの明確なシフトを示した（図５ｂ）。
【0142】
ペプチドリガンドを含有するナノ粒子
ＤＰn＝２２を有する多分散Ｇブロックを、還元的アミノ化によって末端アジド基を含有するアミノオキシ（ａｍｉｎｏｘｙ）－ＰＥＧ5に結合した。Ｇn－アミノオキシ－ＰＥＧ－Ｎ3をさらに、Ｃｕフリーのクリックケミストリーを用いてシクロオクチン（ＤＢＣＯ）置換ＧＲＧＤＳＰペプチドと反応させて、Ｇn－アミノオキシ－ＰＥＧ－ペプチドを形成した。
ＤＰn＝２２を有する多分散Ｇブロックを、還元的アミノ化によって末端アジド基を含有するアミノオキシ（ａｍｉｎｏｘｙ）－ＰＥＧ5に結合した。Ｇn－アミノオキシ－ＰＥＧ－Ｎ3をさらに、Ｃｕフリーのクリックケミストリーを用いてシクロオクチン（ＤＢＣＯ）置換ＧＲＧＤＳＰペプチドと反応させて、Ｇn－アミノオキシ－ＰＥＧ－ペプチドを形成した。
【0143】
ＳＥＣ－ＭＡＬＬＳによって、Ｇ25－アミノオキシ－ＰＥＧ－ペプチドのモル質量７．９ｋＤａを決定した。この調製は、ソルバーグ（Ｓｏｌｂｅｒｇ）ら（２０２２）のカーボハイドレート・ポリマーズ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．）２７８、１１８８４０に記載されている。
【0144】
ＧＤＬ／ＣａＧＥＧＴＡ法（２０ｍＭ ＣａＥＧＴＡ、３．１当量のＧＤＬ）によって、１０％（ｗ／ｗ）のＧ22－アミノオキシ（ａｍｉｎｏｘｙ）－ＰＥＧ－ペプチドおよび９０％（ｗ／ｗ）のＧ40－ｂ－Ｄｅｘ50を含有するナノ粒子を調製した。合計ジブロック濃度は４ｍｇ／ｍｌであった。
【0145】
この混合物は、ごくわずかに高い流体力学値を伴って、Ｇn－アミノオキシ－ＰＥＧ－ペプチドを有さない組成物と同様にナノ粒子を形成した。遊離鎖を沈殿させる０．５ｍＭ ＢａＣｌ2の添加後のＤＬＳによって、（ナノ粒子に取り込まれなかった）遊離鎖は検出できなかった。よって、通常のＧn－ｂ－ＤｅｘmジブロックにＧn－アミノオキシ（ａｍｉｎｏｘｙ）－ＰＥＧ－ペプチドを加えることによって、ペプチドリガンドを含有するナノ粒子を調製し得る。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】