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特表2024-535719アフリカ豚熱ウイルス由来抗原タンパク質を含むアフリカ豚熱の予防用ワクチン
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】アフリカ豚熱ウイルス由来抗原タンパク質を含むアフリカ豚熱の予防用ワクチン
(51)【国際特許分類】
A61K 39/12 20060101AFI20240925BHJP
C12N 15/82 20060101ALI20240925BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240925BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240925BHJP
A61K 39/39 20060101ALI20240925BHJP
A61K 39/295 20060101ALI20240925BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240925BHJP
A23K 50/30 20160101ALI20240925BHJP
A23K 20/147 20160101ALI20240925BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20240925BHJP
C07K 14/01 20060101ALN20240925BHJP
C12N 15/34 20060101ALN20240925BHJP
【ＦＩ】
A61K39/12
C12N15/82
C12N15/13
C12N5/10
A61K39/39
A61K39/295
A61P43/00 121
A23K50/30
A23K20/147
A61P31/20
C07K14/01 ZNA
C12N15/34
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513193
(86)(22)【出願日】2022-08-12
(85)【翻訳文提出日】2024-04-12
(86)【国際出願番号】 KR2022012142
(87)【国際公開番号】W WO2023027402
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】10-2021-0114014
(32)【優先日】2021-08-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0097525
(32)【優先日】2022-08-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519142114
【氏名又は名称】バイオアプリケーションズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001612
【氏名又は名称】弁理士法人きさらぎ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カン、ヒャンジュ
(72)【発明者】
【氏名】チョイ、ボ－ファ
(72)【発明者】
【氏名】ソン、ウン－ジュ
【テーマコード（参考）】
2B005
2B150
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
2B005EA01
2B150AA03
2B150AB10
2B150DC23
4B065AA88X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA45
4C085AA03
4C085AA04
4C085BA51
4C085BB11
4C085CC01
4C085CC21
4C085DD62
4C085EE03
4C085EE06
4C085FF16
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、アフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、および／またはＦ３１７Ｌの塩基配列を含む組換えベクター、前記組換えベクターにより形質転換された形質転換体、および前記形質転換体から分離したアフリカ豚熱ウイルスのＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、および／またはＦ３１７Ｌ抗原タンパク質を有効成分として含むアフリカ豚熱の予防用ワクチン組成物などに関する。
【選択図】図１１
【選択図】図１１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）抗原タンパク質の組み合わせを有効成分として含むアフリカ豚熱の予防用ワクチン組成物であって、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、およびｐ３０タンパク質から成る群から選ばれる１つ以上の組み合わせであり、ただし、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせが前記Ｌｅｃｔｉｎタンパク質および前記ＣＤ２ｖタンパク質を含む場合、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、３つ以上の抗原タンパク質からなることを特徴とするワクチン組成物。
【請求項2】
前記ワクチン組成物は、下記から成る群から選ばれる１つ以上の特徴を満たすことを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物：（ａ）前記Ｌｅｃｔｉｎタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）前記ＣＤ２ｖタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）前記ｐ７２タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）前記ｐ５４タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む；および
（ｅ）前記ｐ３０タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【請求項3】
前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質は、組換えベクターを用いて生産されたものであり、前記組換えベクターは、下記から成る群から選ばれる１つ以上のＡＳＦＶタンパク質コードポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物：（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む、Ｌｅｃｔｉｎコードポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列を含む、ＣＤ２ｖコードポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列を含む、ｐ７２コードポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列を含む、ｐ５４コードポリヌクレオチド；および
（ｅ）配列番号１０で表される塩基配列を含む、ｐ３０コードポリヌクレオチド。
【請求項4】
前記組換えベクターは、下記から成る群から選ばれる１つ以上をさらに含むことを特徴とする請求項３に記載のワクチン組成物：（ａ）配列番号１９のＮＢまたは配列番号２１のＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２７のｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２９のＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｄ）配列番号２３のＭドメインまたは配列番号２５のポリヒスチジンタグ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）をコードするポリヌクレオチド。
【請求項5】
前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質は、前記組換えベクターで形質転換された植物体で生産されたことを特徴とする請求項３に記載のワクチン組成物。
【請求項6】
前記ワクチン組成物は、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のワクチン組成物。
【請求項7】
前記アジュバントは、ミネラルオイル（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）またはエマルシゲン（Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ）系であることを特徴とする請求項６に記載のワクチン組成物。
【請求項8】
請求項１から７のいずれか一項に記載ワクチン組成物を含む、アフリカ豚熱の予防用ワクチンキット。
【請求項9】
ヒトを除いた動物に請求項１に記載のワクチン組成物を投与する段階を含む、アフリカ豚熱の予防方法。
【請求項10】
ＡＳＦＶ（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）抗原タンパク質の組み合わせを有効成分として含むアフリカ豚熱の予防用飼料組成物であって、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、およびｐ３０タンパク質から成る群から選ばれる１つ以上の組み合わせであり、ただし、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせがＬｅｃｔｉｎタンパク質およびＣＤ２ｖタンパク質を含む場合、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、３つ以上の抗原タンパク質からなることを特徴とする飼料組成物。
【請求項11】
配列番号５のアミノ酸配列を含むｐ７２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号７のアミノ酸配列を含むｐ５４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号１１のアミノ酸配列を含むｐ１５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号１３のアミノ酸配列を含むｐ３５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＥ１９９Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または配列番号１７のアミノ酸配列を含むＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、植物体で発現することを特徴とするアフリカ豚熱ウイルスの抗原タンパク質発現用組換えベクター。
【請求項12】
前記組換えベクターは、下記から成る群から選ばれる１つ以上の特徴を満たすことを特徴とする請求項１１に記載の組換えベクター：（ａ）前記ｐ７２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６で表される塩基配列を含む；
（ｂ）前記ｐ５４タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８で表される塩基配列を含む；
（ｃ）前記ｐ１５タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２で表される塩基配列を含む；
（ｄ）前記ｐ３５タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４で表される塩基配列を含む；
（ｅ）前記Ｅ１９９Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６で表される塩基配列を含む；および
ｆ）前記Ｆ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８で表される塩基配列を含む。
【請求項13】
前記組換えベクターは、配列番号１９のＮＢ（ｎｅｗ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドまたは配列番号２１のＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の組換えベクター。
【請求項14】
前記ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチドは、前記ｐ７２タンパク質、ｐ５４タンパク質、ｐ１５タンパク質、ｐ３５タンパク質、Ｅ１９９Ｌタンパク質、またはＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端方向に位置することを特徴とする請求項１３に記載の組換えベクター。
【請求項15】
前記組換えベクターは、配列番号２７のｐＦｃ２（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ）断片をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の組換えベクター。
【請求項16】
前記ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチドは、前記ｐ７２タンパク質、ｐ５４タンパク質、ｐ１５タンパク質、ｐ３５タンパク質、Ｅ１９９Ｌタンパク質、またはＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端方向に位置することを特徴とする請求項１５に記載の組換えベクター。
【請求項17】
前記組換えベクターは、配列番号２９のＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の組換えベクター。
【請求項18】
前記ＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記ｐ７２タンパク質、ｐ５４タンパク質、ｐ１５タンパク質、ｐ３５タンパク質、Ｅ１９９Ｌタンパク質、またはＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端方向に位置することを特徴とする請求項１７に記載の組換えベクター。
【請求項19】
前記組換えベクターは、配列番号１９のＮＢまたは配列番号２１のＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；配列番号２７のｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；および配列番号２９のＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載の組換えベクター。
【請求項20】
前記組換えベクターは、ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；ｐ７２タンパク質、ｐ５４タンパク質、ｐ１５タンパク質、ｐ３５タンパク質、Ｅ１９９Ｌタンパク質、またはＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；および
ＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されたことを特徴とする請求項１９に記載の組換えベクター。
【請求項21】
請求項１１から２０のいずれか一項に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項22】
前記形質転換体は、植物体であることを特徴とする請求項２１に記載の形質転換体。
【請求項23】
アフリカ豚熱の予防のための請求項１に記載のワクチン組成物の用途。
【請求項24】
アフリカ豚熱の予防用ワクチンの製造のための請求項１に記載のワクチン組成物の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）由来抗原タンパク質を有効成分として含むアフリカ豚熱の予防用ワクチンなどに関する。
【0002】
本発明は、２０２１年８月２７日に出願された韓国特許出願第１０－２０２１－０１１４０１４号および２０２２年８月４日に出願された韓国特許出願第１０－２０２２－００９７５２５号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示された全ての内容は本出願に援用される。
【背景技術】
【0003】
アフリカ豚熱（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ，ＡＳＦ）は、アスファウイルス科（Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ）に属するアフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）感染による豚伝染病であり、１９２１年にケニアで最初報告があった後、主にサハラ以南地域で発生報告があり、２００７年以来黒海沿岸のジョージア、アルメニア、アゼルバイジャンなどアフリカ以外の地域でその発生範囲が増え始めた。特に中国は、全世界豚飼育量の約半分を占めるが、２０１８年に初めて発症したＡＳＦにより公式的には約７００万匹、実際の推定では、約２億匹を殺処分して莫大な財産被害を被った 。その後、ＡＳＦ発症を統制してきたが、今年初め、中国北部地域で再びＡＳＦ発症事例が報告された。ベトナムも、今年ＡＳＦが再発し、今年５月まで２０２１年にのみ約３６０００匹、２０１９年からは６００万匹以上の豚を屠殺したが、引き続いて新しい発症事例が全国で報告されている。また、発症事例がなかったマレーシアも、今年２月末に初めてＡＳＦウイルスが検出された。
【0004】
韓国は、２０１９年坡州の豚飼育農家でＡＳＦ発症が最初に報告され、その後、継続して京畿道および江原道一帯で感染事例が報告された。２０２０年９月頃を基準に野生イノシシでアフリカ豚熱を確認した市・郡は、京畿道では坡州市、延川郡、浦川市であり、江原道では鉄原郡、華川郡、春川市、楊口郡、仁済郡、高城郡など９ヶ所に達する。このうち江原道の華川市が２８５件と最も多く、京畿道の延川郡が２８２件、京畿道の坡州市が９８件であった。これによって、ＡＳＦ拡散を防ぐために広域フェンスを設置し、積極的なイノシシ捕獲および防疫を施行し、その結果、２０２０年１０月に江原道の華川養豚農場における感染事例以後しばらくＡＳＦＶ感染が報告されなかったが、最近（２０２１年８月）江原道の豚農場でＡＳＦ発症事例がまた報告された。
【0005】
アフリカ豚熱は、豚に感染した場合、死亡率が１００％に達し、この病気に対するワクチンが開発されておらず、発生直ちに処分しなければならないリスクの高い伝染病であり、これを予防することは非常に重要な課題として残っている。
【0006】
なお、分子生物学と遺伝工学技術のまぶしい発達は、植物分野にも適用され、植物体から有用な生理活性物質を生産する努力が着実に続いている。植物から有用物質を生産することは、生産コストを顕著に減少させることができ、従来の一般的な方法（動物細胞または微生物からタンパク質を合成して分離精製する方法）で発生しうる様々な汚染源（ウイルス、がん遺伝子、腸毒素など）を大幅に減少させることができると共に、商品化段階でも動物細胞や微生物とは異なって、種子としてシードストック（ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋ）管理が可能であるという点から有利なメリットを有している。
【0007】
これより、本発明者らは、アフリカ豚熱の予防用抗原を開発するために鋭意努力した結果、アフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質を植物体で高効率で発現させることができるシステムを開発し、前記抗原タンパク質のうち特定タンパク質の組み合わせが、その他のＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせに比べて、アフリカ豚熱をより効果的に予防することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
アフリカ豚熱ウイルスは、感染細胞の細胞質で複製される巨大二重らせんＤＮＡウイルスである。このウイルスは、豚に死亡率の高い出血熱を引き起こしながらも、病気の兆候なしに媒介体の役割をするような自然宿主豚、イボイノシシ、カワイノシシ、ヒメダニ科に属するヒメダニ属（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ）を持続的に感染させる。このウイルスは、豚に致命的な出血熱を発生させるので、感染前に予防することが非常に重要な伝染病である。
【0009】
本発明は、前述のようなアフリカ豚熱の予防の必要性および従来技術の問題点を解決するためになされたものであって、植物体を用いて効率的な生産が可能であるだけでなく、高い免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を示す組換えアフリカ豚熱ウイルス由来組換え抗原タンパク質、これを含むワクチン組成物などを提供することをその目的とする。
【0010】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が明確に理解できる。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本発明は、アフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）抗原タンパク質の組み合わせを有効成分として含む、アフリカ豚熱の予防用ワクチン組成物であって、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４，およびｐ３０タンパク質から成る群から選ばれる１つ以上の組み合わせであり、
ただし、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせがＬｅｃｔｉｎタンパク質およびＣＤ２ｖタンパク質を含む場合、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、３つ以上の抗原タンパク質からなることを特徴とするワクチン組成物を提供する。
ただし、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせがＬｅｃｔｉｎタンパク質およびＣＤ２ｖタンパク質を含む場合、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、３つ以上の抗原タンパク質からなることを特徴とするワクチン組成物を提供する。
【0012】
本発明のさらに他の具現例において、前記ワクチン組成物は、下記から成る群から選ばれる１つ以上の特徴を満たすことができるが、これらに限らない：
（ａ）前記Ｌｅｃｉｎタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）前記ＣＤ２ｖタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）前記ｐ７２タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）前記ｐ５４タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む；および
（ｅ）前記ｐ３０タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
（ａ）前記Ｌｅｃｉｎタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）前記ＣＤ２ｖタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）前記ｐ７２タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）前記ｐ５４タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含む；および
（ｅ）前記ｐ３０タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【0013】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質は、組換えベクターを用いて生産されたものであり、前記組換えベクターは、下記から成る群から選ばれる１つ以上のＡＳＦＶタンパク質コードポリヌクレオチドを含むこともできるが、これらに限らない：
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む、Ｌｅｃｔｉｎコードポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列を含む、ＣＤ２ｖコードポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列を含む、ｐ７２コードポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列を含む、ｐ５４コードポリヌクレオチド；および
（ｅ）配列番号１０で表される塩基配列を含む、ｐ３０コードポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列を含む、Ｌｅｃｔｉｎコードポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４で表される塩基配列を含む、ＣＤ２ｖコードポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６で表される塩基配列を含む、ｐ７２コードポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号８で表される塩基配列を含む、ｐ５４コードポリヌクレオチド；および
（ｅ）配列番号１０で表される塩基配列を含む、ｐ３０コードポリヌクレオチド。
【0014】
本発明のさらに他の具現例において、前記組換えベクターは、下記から成る群から選ばれる１つ以上をさらに含むこともできるが、これらに限らない：
（ａ）配列番号１９のＮＢまたは配列番号２１のＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２７のｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２９のＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｄ）配列番号２３のＭドメインまたは配列番号２５のポリヒスチジンタグ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）をコードするポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号１９のＮＢまたは配列番号２１のＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２７のｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２９のＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド；および
（ｄ）配列番号２３のＭドメインまたは配列番号２５のポリヒスチジンタグ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）をコードするポリヌクレオチド。
【0015】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質は、前記組換えベクターで形質転換された植物体で生産されたものであってもよいが、これらに限らない。
【0016】
本発明のさらに他の具現例において、前記ワクチン組成物は、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含むこともできるが、これらに限らない。
【0017】
本発明のさらに他の具現例において、前記アジュバントは、ミネラルオイル（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）またはエマルシゲン（Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ）系であってもよいが、これらに限らない。
【0018】
また、本発明は、本発明によるワクチン組成物を含むアフリカ豚熱の予防用ワクチンキットを提供する。
【0019】
また、本発明は、ヒトを除いた動物に本発明による組成物（あるいはＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、およびｐ３０タンパク質から成る群から選ばれる１つ以上のタンパク質の組み合わせ）を投与する段階を含む、アフリカ豚熱の予防、改善、および／または治療方法を提供する。
【0020】
また、本発明は、前記組成物のアフリカ豚熱の予防、改善、および／または治療用途を提供する。
【0021】
また、本発明は、前記組成物のアフリカ豚熱の予防用ワクチンの製造のための用途を提供する。
【0022】
また、本発明は、ＡＳＦＶ（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）抗原タンパク質の組み合わせを有効成分として含むアフリカ豚熱の予防用飼料組成物であって、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、およびｐ３０タンパク質から成る群から選ばれる１つ以上の組み合わせであり、
ただし、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせがＬｅｃｔｉｎタンパク質およびＣＤ２ｖタンパク質を含む場合、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、３つ以上の抗原タンパク質からなることを特徴とする飼料組成物を提供する。
ただし、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせがＬｅｃｔｉｎタンパク質およびＣＤ２ｖタンパク質を含む場合、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、３つ以上の抗原タンパク質からなることを特徴とする飼料組成物を提供する。
【0023】
また、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列を含むｐ７２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号７のアミノ酸配列を含むｐ５４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号１１のアミノ酸配列を含むｐ１５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号１３のアミノ酸配列を含むｐ３５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＥ１９９Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド；または配列番号１７のアミノ酸配列を含むＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、
植物体で発現することを特徴とするアフリカ豚熱ウイルスの抗原タンパク質発現用組換えベクターを提供する。
植物体で発現することを特徴とするアフリカ豚熱ウイルスの抗原タンパク質発現用組換えベクターを提供する。
【0024】
本発明の一具現例において、前記組換えベクターは、下記から成る群から選ばれる１つ以上の特徴を満たすことができるが、これらに限らない：
（ａ）前記ｐ７２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６で表される塩基配列を含む；
（ｂ）前記ｐ５４タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８で表される塩基配列を含む；
（ｃ）前記ｐ１５タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２で表される塩基配列を含む；
（ｄ）前記ｐ３５タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４で表される塩基配列を含む；
（ｅ）前記Ｅ１９９Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６で表される塩基配列を含む；および
（ｆ）前記Ｆ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８で表される塩基配列を含む。
（ａ）前記ｐ７２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６で表される塩基配列を含む；
（ｂ）前記ｐ５４タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８で表される塩基配列を含む；
（ｃ）前記ｐ１５タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２で表される塩基配列を含む；
（ｄ）前記ｐ３５タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４で表される塩基配列を含む；
（ｅ）前記Ｅ１９９Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１６で表される塩基配列を含む；および
（ｆ）前記Ｆ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１８で表される塩基配列を含む。
【0025】
本発明の他の具現例において、配列番号１９のＮＢ（ｎｅｗ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドまたは配列番号２１のＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができるが、これらに限らない。
【0026】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチドは、前記ｐ７２タンパク質、ｐ５４タンパク質、ｐ１５タンパク質、ｐ３５タンパク質、Ｅ１９９Ｌタンパク質、またはＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端方向に位置していてもよいが、これらに限らない。
【0027】
本発明のさらに他の具現例において、前記組換えベクターは、配列番号２７のｐＦｃ２（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ）断片をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよいが、これらに限らない。
【0028】
本発明のさらに他の具現例において、前記ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチドは、前記ｐ７２タンパク質、ｐ５４タンパク質、ｐ１５タンパク質、ｐ３５タンパク質、Ｅ１９９Ｌタンパク質、またはＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端方向に位置していてもよいが、これらに限らない。
【0029】
本発明のさらに他の具現例において、前記組換えベクターは、配列番号２９のＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよいが、これらに限らない。
【0030】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記ｐ７２タンパク質、ｐ５４タンパク質、ｐ１５タンパク質、ｐ３５タンパク質、Ｅ１９９Ｌタンパク質、またはＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端方向に位置していてもよいが、これらに限らない。
【0031】
本発明のさらに他の具現例において、前記組換えベクターは、配列番号１９のＮＢまたは配列番号２１のＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；配列番号２７のｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；および配列番号２９のＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよいが、これらに限らない。
【0032】
本発明のさらに他の具現例において、前記組換えベクターは、ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；ｐ７２タンパク質、ｐ５４タンパク質、ｐ１５タンパク質、ｐ３５タンパク質、Ｅ１９９Ｌタンパク質、またはＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されたものであってもよいが、これらに限らない。
【0033】
また、本発明は、本発明による組換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【0034】
本発明の一具現例において、前記形質転換体は、植物体であってもよいが、これらに限らない。
【0035】
また、本発明は、下記段階を含む組換えアフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質の製造方法を提供する：
（Ｓ１）本発明による組換えベクターを植物体に形質転換させる段階；および
（Ｓ２）前記植物体または培養液から組換え抗原タンパク質を分離および精製する段階。
（Ｓ１）本発明による組換えベクターを植物体に形質転換させる段階；および
（Ｓ２）前記植物体または培養液から組換え抗原タンパク質を分離および精製する段階。
【0036】
本発明の一具現例において、前記ＮＢコードポリヌクレオチドは、配列番号２０で表される塩基配列を含むこともでき；前記ＢｉＰコードポリヌクレオチドは、配列番号２２で表される塩基配列を含むこともでき；前記ｐＦｃ２コードポリヌクレオチドは、配列番号２８で表される塩基配列を含むこともでき；ＨＤＥＬコードポリヌクレオチドは、配列番号３０で表される塩基配列を含むこともできるが、これらに限らない。
【発明の効果】
【0037】
アフリカ豚熱を含むウイルス性病気の予防に用いるためのタンパク質、特に抗原は、タンパク質のフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）、グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）などの問題に起因してバクテリアを用いず、主に動物細胞を用いて生産されている。しかしながら、動物細胞を用いたワクチン生産方法は、大量生産のための設備拡充に大きな費用がかかるため、製造が容易でなく、抗原の価格が高価な場合がほとんどである。また、動物細胞を用いて製造された抗原は、保存が容易でないだけでなく、動物に感染可能なウイルスに汚染される可能性が高いという欠点を有している。しかしながら、本発明は、植物を用いてこのような欠点を補完した。すなわち、植物細胞は、動物細胞とは異なって、動物に感染可能なウイルスに汚染される可能性が非常に低く、耕作面積を確保すると、いつでも大量生産が可能であるだけでなく、植物体を通じて長期保存が可能であるため、安定して安価な抗原の生産が可能である。
【0038】
本発明の組換えアフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質は、植物体においても効果的に発現するだけでなく、高い水溶解性（Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を有しており、分離および精製が容易であり、また、体内で抗原として作用して高い免疫原性を示すので、新規のアフリカ豚熱ウイルスワクチン組成物として使用することができる。特に、本発明者らは、本発明の５種の抗原タンパク質（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０）を含むワクチン組成物が、その他の抗原タンパク質（ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、Ｆ３１７Ｌなど）をさらに含むワクチン組成物に比べて、アフリカ豚熱の予防効果にさらに優れたことをチャレンジ接種実験を通じて確認したところ、本発明による組換えベクターおよびワクチン組成物は、畜産業界などにおいて広く活用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【0039】
【図1】は、本発明の植物体におけるＡＳＦＶのＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ抗原タンパク質の発現のための遺伝子の配列を示す切断地図である。
【図2】は、ＡＳＦＶのＬｅｃｉｎ抗原タンパク質を分離および精製し、電気泳動後にクマシーブルー染色法で確認した結果を示す図である。
【図3】は、ＡＳＦＶのＣＤ２ｖ抗原タンパク質を分離および精製し、電気泳動後にクマシーブルー染色法で確認した結果を示す図である。
【図4a】は、ＡＳＦＶのｐ７２抗原タンパク質の発現を確認するためにウェスタンブロットを行うことで得られたバンド写真である（ＤＴ，Ｄｅｂｒｉｓ Ｔｏｔａｌ（テブリス除去前の総サンプル）；Ｔ，Ｔｏｔａｌ ｅｘｔｒａｃｔ（テブリス除去後の総サンプル）；Ｐ，ｐｅｌｌｅｔ分画；ＦＴ，Ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ分画、以下同一）。
【図4b】は、ＡＳＦＶのｐ７２抗原タンパク質を分離および精製した後、濃縮前後のタンパク質溶液を電気泳動後にクマシーブルー染色法で確認した結果を示す図である（左：濃縮前のｐ７２タンパク質検出結果；右：濃縮後のｐ７２タンパク質検出結果）。
【図5a】は、ＡＳＦＶのｐ５４抗原タンパク質の発現を確認するためにウェスタンブロットを行うことで得られたバンド写真である。
【図5b】は、ＡＳＦＶのｐ５４抗原タンパク質を分離および精製した後、濃縮前後のタンパク質溶液を電気泳動後にクマシーブルー染色法で確認した結果を示す図である（左：濃縮前のｐ５４タンパク質検出結果；右：濃縮後のｐ５４タンパク質検出結果）。
【図6】は、ＡＳＦＶのｐ３０抗原タンパク質を分離および精製し、電気泳動後にクマシーブルー染色法で確認した結果を示す図である。
【図7a】は、ＡＳＦＶのｐ１５抗原タンパク質の発現を確認するためにウェスタンブロットを行うことで得られたバンド写真である。
【図7b】は、ＡＳＦＶのｐ１５抗原タンパク質を分離および精製し、電気泳動後にクマシーブルー染色法で確認した結果を示す図である。
【図8】は、ＡＳＦＶのｐ３５抗原タンパク質を分離および精製し、電気泳動後にクマシーブルー染色法で確認した結果を示す図である。
【図9a】は、ＡＳＦＶのＥ１９９Ｌ抗原タンパク質の発現を確認するためにウェスタンブロットを行うことで得られたバンド写真である。
【図9b】は、ＡＳＦＶのＥ１９９Ｌ抗原タンパク質を分離および精製した後、濃縮前後のタンパク質溶液を電気泳動後にクマシーブルー染色法で確認した結果を示す図である（左：濃縮前のＥ１９９Ｌタンパク質検出結果；右：濃縮後のＥ１９９Ｌタンパク質検出結果）。
【図10a】は、１００ｇまたは１ｋｇのニコチアナ・ベンサミアナ葉から抽出したＡＳＦＶのＦ３１７Ｌ抗原タンパク質の発現を確認するためにウェスタンブロットを行うことで得られたバンド写真である（上方：１００ｇの葉から抽出したＦ３１７Ｌタンパク質検出結果；下方：１ｋｇの葉から抽出したＦ３１７Ｌタンパク質検出結果）。
【図10b】は、１００ｇまたは１ｋｇのニコチアナ・ベンサミアナ葉から抽出したＡＳＦＶのＦ３１７Ｌタンパク質を分離および精製し、電気泳動後にクマシーブルー染色法で確認した結果を示す図である（左：１００ｇの葉から抽出したＦ３１７Ｌタンパク質検出結果；右：１ｋｇの葉から抽出したＦ３１７Ｌタンパク質検出結果）。
【図11】は、豚に本発明による５種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０の組み合わせ）、９種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌの組み合わせ）、またはＰＢＳを処理した後、チャレンジ接種実験を進めて、経時的な豚の体温および生存率を確認した結果である。
【図12】は、豚に本発明による５種の抗原ワクチン、９種の抗原ワクチン、またはＰＢＳを処理した後、チャレンジ接種実験を進めて、経時的な豚の血中ウイルス（Ｖｉｒｅｍｉａ）レベルを測定した結果である。
【図13】は、本発明の一具現例によるＬｅｃｔｉｎ組換えタンパク質発現のための遺伝子配列（上方）およびアミノ酸配列（下方）を示す図である。
【図14】は、本発明の一具現例によるＣＤ２ｖ組換えタンパク質発現のための遺伝子配列（上方）およびアミノ酸配列（下方）を示す図である。
【図15】は、本発明の一具現例によるｐ７２組換えタンパク質発現のための遺伝子配列（上方）およびアミノ酸配列（下方）を示す図である。
【図16】は、本発明の一具現例によるｐ５４組換えタンパク質発現のための遺伝子配列（上方）およびアミノ酸配列（下方）を示す図である。
【図17】は、本発明の一具現例によるｐ３０組換えタンパク質発現のための遺伝子配列（上方）およびアミノ酸配列（下方）を示す図である。
【図18】は、本発明の一具現例によるｐ１５組換えタンパク質発現のための遺伝子配列（上方）およびアミノ酸配列（下方）を示す図である。
【図19】は、本発明の一具現例によるｐ３５組換えタンパク質発現のための遺伝子配列（上方）およびアミノ酸配列（下方）を示す図である。
【図20】は、本発明の一具現例によるＥ１９９Ｌ組換えタンパク質発現のための遺伝子配列（上方）およびアミノ酸配列（下方）を示す図である。
【図21】は、本発明の一具現例によるＦ３１７Ｌ組換えタンパク質発現のための遺伝子配列（上方）およびアミノ酸配列（下方）を示す図である。
【図22】は、豚に本発明による５種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０の組み合わせ；「Ｖａｘ ｇｒｐ１」）、９種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌの組み合わせ；「Ｖａｘ ｇｒｐ２」）、またはＰＢＳを投与した後（「ＰＢＳ」）、０、７、１４、２１、２８、および３５日目に抗ｐ３０抗体のレベルを測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0040】
他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書において使用された命名法は、本技術分野において良く知られており、通常使用されるものである。
【0041】
本発明者らは、アフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）の５種の抗原タンパク質Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌの遺伝子を用いて植物体で高い免疫原性を有する前記各ＡＳＦＶ抗原タンパク質を効率的に生産し、分離することができることを確認した。したがって、本発明のアフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質は、安定的かつ効率的な大量生産が可能であるため、安価であり、安定したアフリカ豚熱ウイルスワクチンを提供することができる。また、本発明者らは、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、およびｐ３０を含む５種の抗原タンパク質を含むワクチン組成物は、豚に投与したとき、優れたアフリカ豚熱の予防効果を発揮し、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌなどその他のＡＳＦＶ抗原タンパク質をさらに含むワクチン組成物と比較して、効果がさらに顕著であることを確認した。すなわち、本発明は、従来技術に比べてさらに顕著なアフリカ豚熱の予防効果を達成できる最適な抗原タンパク質の組み合わせ（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、およびｐ３０）を発掘したことに意義がある。
【0042】
これより、本発明は、アフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）タンパク質コードポリヌクレオチドの組み合わせを含むＡＳＦＶ抗原タンパク質発現用組換えベクターを提供することを目的とし、前記ＡＳＦＶタンパク質コードポリヌクレオチドの組み合わせは、下記から成る群から選ばれる１つ以上の組み合わせであることを特徴とする：
配列番号１のアミノ酸配列を含むＬｅｃｔｉｎタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤ２ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号５のアミノ酸配列を含むｐ７２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号７のアミノ酸配列を含むｐ５４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号９のアミノ酸配列を含むｐ３０タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号１１のアミノ酸配列を含むｐ１５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号１３のアミノ酸配列を含むｐ３５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号１５のアミノ酸配列を含むＥ１９９Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
配列番号１のアミノ酸配列を含むＬｅｃｔｉｎタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤ２ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号５のアミノ酸配列を含むｐ７２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号７のアミノ酸配列を含むｐ５４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号９のアミノ酸配列を含むｐ３０タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号１１のアミノ酸配列を含むｐ１５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号１３のアミノ酸配列を含むｐ３５タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号１５のアミノ酸配列を含むＥ１９９Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
配列番号１７のアミノ酸配列を含むＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0043】
より好ましくは、本発明は、アフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）タンパク質コードポリヌクレオチドの組み合わせを含むＡＳＦＶ抗原タンパク質発現用組換えベクターを提供することを目的とし、前記ＡＳＦＶタンパク質コードポリヌクレオチドの組み合わせは、下記から成る群から選ばれる１つ以上の組み合わせであることを特徴とする：
配列番号１のアミノ酸配列を含むＬｅｃｔｉｎタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤ２ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号５のアミノ酸配列を含むｐ７２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号７のアミノ酸配列を含むｐ５４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
配列番号９のアミノ酸配列を含むｐ３０タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
配列番号１のアミノ酸配列を含むＬｅｃｔｉｎタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤ２ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号５のアミノ酸配列を含むｐ７２タンパク質をコードするポリヌクレオチド；
配列番号７のアミノ酸配列を含むｐ５４タンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
配列番号９のアミノ酸配列を含むｐ３０タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【0044】
前記組換えベクター内で前記各ポリヌクレオチドが配列された順序に制限がない。
【0045】
本発明において、「アフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）」は、アスファウイルス科（Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ）、アスファウイルス属（Ａｓｆｉｖｉｒｕｓ）に属する約２００ｎｍのＤＮＡウイルスであり、アフリカ豚熱（Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ，ＡＳＦ）の原因因子である。ＡＳＦＶは、自然宿主豚、イボイノシシ、カワイノシシ、ヒメダニ科に属するＯｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ属を持続的に感染させるが、感染時に致命的な出血熱を発生させる。
【0046】
好ましくは、本発明による組換えベクターは、前記５種のＡＳＦＶタンパク質（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、およびｐ３０）コードポリヌクレオチドを含み、その他のＡＳＦＶタンパク質コードポリヌクレオチドを含まないことを特徴とする。より好ましくは、前記本発明による組換えベクターは、ＡＳＦＶの抗原タンパク質であるｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、またはＦ３１７Ｌをコードするポリヌクレオチドを含まないことを特徴とする。
【0047】
前記Ｌｅｃｔｉｎ抗原タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、最も好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列からなるか、または配列番号２の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ得るが、これらに限定されない。好ましくは、本発明によるＬｅｃｔｉｎタンパク質は、膜貫通領域を含むものであってもよく、または膜貫通領域が除去されたＬｅｃｔｉｎタンパク質であってもよい。
【0048】
具体的には、前記Ｌｅｃｔｉｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２で表される塩基配列からなってもよいが、これらに限定されず、前記塩基配列の変異体が本発明の範囲内に含まれる。本発明の配列番号２で表される塩基配列の核酸分子は、これを構成する核酸分子の作用性等価物、例えば、核酸分子の一部の塩基配列が欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）により修飾されたが、核酸分子と機能的に同じ作用を行うことができる変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む概念である。具体的には、前記Ｌｅｃｔｉｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２で表される塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、２つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。
【0049】
また、前記ＣＤ２ｖ抗原タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を含むか、または配列番号４の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、最も好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列からなるか、または配列番号４の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ得るが、これらに限定されない。すなわち、前記ＣＤ２ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号４で表される塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。好ましくは、本発明によるＣＤ２ｖは、ＣＤ２ｖタンパク質の膜貫通領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ，ＴＭＤ）を含むか、または膜貫通領域が除去されたＣＤ２ｖタンパク質であってもよく、好ましくは、ＣＤ２ｖタンパク質の膜貫通領域からのＮ末端部位であってもよい。
【0050】
また、前記ｐ７２抗原タンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、または配列番号６の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、最も好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列からなるか、または配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ得るが、これらに限定されない。すなわち、前記ｐ７２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号６で表される塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。
【0051】
また、前記ｐ５４抗原タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、または配列番号８の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、最も好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列からなるか、または配列番号８の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ得るが、これらに限定されない。すなわち、前記ｐ５４タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号８で表される塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。好ましくは、本発明によるｐ５４タンパク質は、膜貫通領域が除去されたｐ５４タンパク質（ｐ５４ｄＴＭ）であってもよい。より好ましくは、本発明によるｐ５４タンパク質は、膜貫通領域を含むこともできる。または、前記ｐ５４タンパク質は、膜貫通領域が除去され、これの代わりにリンカー配列が挿入されたものであってもよい。前記リンカー配列は、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒであってもよい。
【0052】
また、前記ｐ３０抗原タンパク質は、配列番号９のアミノ酸配列を含むか、または配列番号１０の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、最も好ましくは、配列番号９のアミノ酸配列からなるか、または配列番号１０の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ得るが、これらに限定されない。すなわち、前記ｐ３０タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１０で表される塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。
【0053】
また、前記ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ抗原タンパク質は、順に、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１７のアミノ酸配列をそれぞれ含むか、または配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１８の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってそれぞれコードされ、最も好ましくは、順に、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１７のアミノ酸配列それぞれからなるか、または配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１８の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってそれぞれコードされ得るが、これらに限定されない。すなわち、前記ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、またはＦ３１７Ｌ抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、順に、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１８で表される塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列をそれぞれ含んでもよい。
【0054】
また、前記Ｅ１９９Ｌは、膜貫通領域を含むものであるか、または膜貫通領域が除外されたものであってもよい。
【0055】
本明細書において、特定の配列番号で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（あるいはペプチド）とは、これを構成するポリペプチド分子の作用性等価物、例えば、ポリペプチド分子の一部のアミノ酸配列が欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）により修飾されたが、ポリペプチド分子と機能的に同じ作用を行うことができる変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）を含む概念である。具体的には、前記特定の配列番号で表されるポリペプチドは、当該配列番号で表されるアミノ酸配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは、８０％以上、より好ましくは、９０％以上、最も好ましくは、９５％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。アミノ酸配列に対する「配列相同性の％」は、２つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域におけるアミノ酸配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。
【0056】
前記Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ抗原タンパク質は、アフリカ豚熱ウイルスの抗原タンパク質であり、宿主の免疫反応機構を調節することができる。
【0057】
本明細書において使用された用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、一般的にリン酸ジエステル結合によって互いに結合した２以上の連結されたヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含むオリゴマーまたはポリマーを示す。ポリヌクレオチドは、また、例えば、ヌクレオチド類似体、またはリン酸ジエステル結合以外の「骨格」結合、例えば、リン酸トリエステル結合、ホスホルアミダート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合（ペプチド核酸）を含むＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖および／または二本鎖ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）だけでなく、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか１つの類似体を含む。
【0058】
本明細書において使用された用語「抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）」とは、体内で免疫反応を起こすすべての物質を総称し、好ましくは、ウイルス、化合物質、細菌、花粉、がん細胞などまたはこれらの一部のペプチドまたはタンパク質であってもよいが、体内で免疫反応を起こすことができる物質であれば、これらに限定されない。
【0059】
本発明の一具体例において、前記組換えベクターは、ＮＢ（ｎｅｗ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）またはＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、豚のｐＦｃ２断片（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）をコードするポリヌクレオチド、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド、Ｍドメインをコードするポリヌクレオチド、および／またはポリヒスチジンタグ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）をコードするポリヌクレオチドなどをさらに含んでもよい。
【0060】
本発明の他の具体例において、前記組換えベクターは、下記特徴のうち１つ以上を満たすことができる：
（ａ）前記ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチドは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端方向に位置する；
（ｂ）前記ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチドは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端方向に位置する；
（ｃ）前記ＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端方向に位置する；または
（ｄ）前記Ｍドメインまたはポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端または３’末端方向に位置する。
（ａ）前記ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチドは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端方向に位置する；
（ｂ）前記ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチドは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端方向に位置する；
（ｃ）前記ＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’末端方向に位置する；または
（ｄ）前記Ｍドメインまたはポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端または３’末端方向に位置する。
【0061】
好ましくは、前記組換えベクターは、前記ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；前記ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；および前記ＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドを全部含んでもよいし、ここで、各遺伝子の連結順序に制限がないが、好ましくは、前記組換えベクターは、ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、および／またはｐ３０タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されていてもよい。
【0062】
あるいは、前記組換えベクターは、前記ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；前記ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；および前記ＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドを全部含んでもよいし、ここで、各遺伝子の連結順序に制限がないが、好ましくは、前記組換えベクターは、ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、および／またはＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されていてもよい。
【0063】
最も好ましくは、前記組換えベクターは、前記ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；前記ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；前記ＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド；およびＭドメインまたはポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドを全部含んでもよいし、ここで、各遺伝子の連結順序に制限がないが、好ましくは、前記組換えベクターは、ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；Ｍドメインまたはポリヒスチジンタグ；Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、および／またはｐ３０タンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されたり、またはＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、および／またはｐ３０タンパク質をコードするポリヌクレオチド；Ｍドメインまたはポリヒスチジンタグ；ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されていてもよい。
【0064】
あるいは、前記組換えベクターは、前記ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；前記ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；前記ＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド；およびＭドメインまたはポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドを全部含んでもよいし、ここで、各遺伝子の連結順序に制限がないが、好ましくは、前記組換えベクターは、ＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；Ｍドメインまたはポリヒスチジンタグ；Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、および／またはＦ３１７Ｌタンパク質をタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されたり、またはＮＢまたはＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５タンパク質、ｐ３５タンパク質、Ｅ１９９Ｌタンパク質、および／またはＦ３１７Ｌタンパク質をコードするポリヌクレオチド；Ｍドメインまたはポリヒスチジンタグ；ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド；およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されていてもよい。
【0065】
本発明のさらに他の具体例において、前記ポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドは、ＡＳＦＶ抗原タンパク質遺伝子のうちＬｅｃｔｉｎをコードするポリヌクレオチドの５’末端方向および／またはｐ３０をコードするポリヌクレオチドの３’末端方向にのみ位置することを特徴とし、前記Ｍドメインは、ＡＳＦＶ抗原タンパク質遺伝子のうちＣＤ２ｖをコードするポリヌクレオチドの５’末端方向にのみ位置することを特徴とする。さらに他の具体例では、前記ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチドは、ｐ３０をコードするポリヌクレオチドの３’末端方向に位置しないことを特徴とする。
【0066】
前記のような順序によって連結された場合、すなわち、組換えベクターが図１の切断地図に示された発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を含む場合、本発明による組換えベクターは、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０で表される塩基配列を含み、最も好ましくは、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０で表される塩基配列からなるか、または配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０で表される塩基配列とそれぞれ８０％以上、より好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。前記配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０で表される塩基配列は、それぞれ互いに独立したプラスミドベクターに含まれ得、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、および配列番号５０から成る群から選ばれる１種以上の組み合わせが単一のプラスミドベクター内に含まれ得る。
【0067】
本明細書において、「組換えベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）」とは、ベクター内に挿入された異種の核酸によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現できるベクターを指し、好ましくは、目的抗原（本発明では、ＡＳＦＶ抗原であるＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、および／またはＦ３１７Ｌ）を発現することができるように製造されたベクターを意味する。前記「ベクター」は、試験管内、生体外または生体内で宿主細胞に塩基の導入および／または転移のための任意の媒介物を言い、他のＤＮＡ断片が結合し、結合した断片の複製をもたらす複製単位（ｒｅｐｌｉｃｏｎ）であってもよく、「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節によって複製可能な、任意の遺伝単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルスなど）を言う。好ましくは、本発明による組換えベクターは、植物体で発現することを特徴とする。
【0068】
本発明の組換えベクターは、好ましくは、ＲＮＡ重合酵素が結合する転写開始因子であるプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列と転写および翻訳の終結を調節する配列、ターミネーターなどを含んでもよいし、より好ましくは、ポリヒスチジンタグ（最小５個以上のヒスチジン残基で構成されたアミノ酸モチーフ）、小胞体シグナルペプチド（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、小胞体標的化配列と同じ意味）遺伝子、小胞体保留シグナルペプチド（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、クローニングサイト（ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）などをさらに含んでもよいし、より好ましくは、タグであるＦｃ断片以外に追加タグ用遺伝子、形質転換体を選別するための抗生剤耐性遺伝子などの選別用マーカー遺伝子などをさらに含んでもよい。
【0069】
前記タグ用遺伝子としては、代表的にＡｖｉタグ、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎタグ、ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅタグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ（ポリヒスチジンタグ）、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、ＩｇＧ－Ｆｃタグ、ＣＴＢタグ、Ｓｏｆｔａｇ １タグ、Ｓｏｆｔａｇ ３タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグなどが含まれ得る。
【0070】
本明細書において、「Ｆｃ断片（Ｆｃ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、免疫グロブリンがパパイン（ｐａｐａｉｎ）により消化されたとき、重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ；Ｈ ｃｈａｉｎ）部分のみがＳ－Ｓ結合で連結され、抗原結合部位を有しない部分をＦｃ断片と言い、本発明のＦｃ断片は、好ましくは、豚のＦｃ断片であり、より好ましくは、配列番号２８で表される豚のＦｃ断片（ｐＦｃ２）であるが、これらに限定されない。また、本発明のＦｃ断片は、配列番号２８で表される塩基配列の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的には、前記遺伝子は、配列番号２８の塩基配列と９０％以上、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９８％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。
【0071】
前記「クローニングサイト」とは、ベクター内で各遺伝子を連結／区分することを目的で挿入されたものを総称する。好ましくは、前記クローニングサイトは、配列番号２、４、６、８、および１０内で「ｔｃｔａｇａ」で表される配列、「ｇｇａｔｃｃ」で表される配列、「ｃｃｃｇｇｇ」で表される配列、または「ｇａｇｃｔｃ」で表される配列であってもよいが、これらに限らない。
【0072】
前記「小胞体シグナルペプチド（ＥＲ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、タンパク質のＮ末端に位置するシグナルペプチドであり、新しく合成されたタンパク質が小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ、ＥＲ）の内部に入るように誘導する役割をする。本発明による小胞体シグナルペプチドは、当業者において知られた植物小胞体シグナルペプチドであれば、その種類およびアミノ酸配列が制限されないが、好ましくは、ＮＢ（Ｎｅｗ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）から選択することができる。
【0073】
前記「ＮＢ（Ｎｅｗ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子」は、好ましくは、配列番号２０の塩基配列を含む遺伝子であり、最も好ましくは、配列番号２０で表される遺伝子であるが、配列番号２０の塩基配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。また、前記「Ｂｉｐ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子」は、好ましくは、配列番号２２の塩基配列を含む遺伝子であり、最も好ましくは、配列番号２２で表される遺伝子であるが、配列番号２２の塩基配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、より好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。前記ＮＢまたはＢｉＰ遺伝子は、上述したように、発現組換えタンパク質を小胞体に移動させるために使用されるものであり、組換えタンパク質が発現するとき、配列の一部が切られ、一部のアミノ酸のみが残ることもあり、または配列の全部が切られ、シグナルペプチド配列部位が存在しないことがある。
【0074】
前記「小胞体保留シグナルペプチド（ＥＲ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、タンパク質のＣ末端に位置するシグナルペプチドであり、小胞体の内部に存在するタンパク質が分泌経路を介してゴルジ体（Ｇｏｌｇｉ ａｐｐａｒａｔｕｓ）に抜け出た場合、前記タンパク質がさらに小胞体に戻るように（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）する役割をする。本発明による小胞体保留シグナルペプチドは、当業者に知られた植物保留小胞体シグナルペプチドであれば、その種類およびアミノ酸配列が限定されないが、好ましくは、ＫＤＥＬ（Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）配列およびＨＤＥＬ配列から選択することができる。
【0075】
最も好ましくは、前記ＥＲ保留シグナルペプチドのアミノ酸配列は、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ、配列番号２９で表されるアミノ酸）であってもよく、配列番号３０で表される塩基配列でコード化されるものであってもよい。また、本発明の小胞体シグナルペプチドは、配列番号３０の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的には、前記遺伝子は、配列番号３０の塩基配列と９０％以上、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９８％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。前記小胞体シグナルペプチドの結合位置は、植物細胞内で発現または合成を目的とするタンパク質のＣ末端に追加（または連結）されることを特徴とする。
【0076】
前記小胞体シグナルペプチドおよび小胞体保留シグナルペプチドに関する情報は、ＵＳ２０１３０２９５０６５、ＷＯ２００９１５８７１６などの文献を参考にすることができる。
【0077】
前記選別用マーカー遺伝子には、一例として、グリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）またはホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、ハイグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のような抗生剤耐性遺伝子、ａａｄＡ遺伝子などが含まれ得、前記プロモーターには、一例として、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ－１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーター、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター、ＭａｃＴ（ＣａＭＶ ３５Ｓ＋ＭＡＳ；Ｍａｃプロモーターの３’末端ヌクレオチドがＴで置換される）プロモーターなどが含まれ得、前記ターミネーターは、一例として、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、稲アミラーゼＲＡｍｙ１ Ａターミネーター、パセオリンターミネーター、アグロバクテリウムアグロバクテリウムツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネーター、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネーター、シロイヌナズナのＨＳＰ１８．２ターミネーター、シロイヌナズナのＲＤ２９Ｂターミネーターなどが含まれ得るが、前記列挙したものは、例示に過ぎず、これらに限定されない。
【0078】
本発明の他の様態において、本発明は、前記の組換えベクターで形質転換された、形質転換体を提供する。
【0079】
本発明の一具体例において、前記形質転換体は、好ましくは、大腸菌、バシラス、サルモネラ、酵母などのような微生物、昆虫細胞、ヒトを含む動物細胞、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ウマ、ウシなどのような動物、アグロバクテリウムツメファシエンス、植物などであってもよく、より好ましくは、稲、小麦、麦、とうもろこし、豆、ジャガイモ、小豆、エンバク、およびモロコシを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、ハクサイ、ダイコン、唐辛子、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギ、およびニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、木花、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エゴマ、ピーナッツ、およびアブラナを含む特用作物類；およびリンゴの木、梨の木、ナツメ、桃、ブドウ、ミカン、柿、スモモ、アンズ、およびバナナを含む果樹類；およびバラ、カーネーション、菊、ユリ、およびチューリップを含む草花類などであってもよいが、本発明のベクターで形質転換され得る生命体であれば、これらに限定されない。最も好ましくは、前記形質転換体は、ニコチアナ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）植物であってもよい。
【0080】
本明細書において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、注入されたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることを総称し、「形質転換体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、分子遺伝学的方法で外部の遺伝子を注入して製造された生命体であり、好ましくは、本発明の組み換え発現ベクターにより形質転換された生命体であり、前記生命体は、微生物、真核細胞、昆虫、動物、植物など生命がある生物であれば、制限がなく、好ましくは、大腸菌、サルモネラ、バシラス、酵母、動物細胞、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ウマ、ウシ、アクロバクテリウムツメファシエンス、植物などであってもよいが、これらに限定されない。
【0081】
本明細書において、「植物」は、本発明の抗原を含むタンパク質を大量生産できる植物であれば、制限なく使用できるが、より具体的には、タバコ、シロイヌナズナ、とうもろこし、稲、大豆、カノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、アルファルファ、モロコシ、小麦、木花、ピーナッツ、トマト、ジャガイモ、レタスおよび唐辛子から成る群から選ばれるものであってもよく、好ましくは、タバコであってもよい。本発明におけるタバコは、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｅｎｕｓ）植物であり、タンパク質を過発現できるものであれば、特に種類が制限されず、形質転換方法とタンパク質大量生産の目的に合うように適切な品種を選択して本発明を実施することができる。例えば、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ Ｌ．またはＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．ｘａｎｔｈｉなどの品種を用いることができる。
【0082】
前記形質転換体は、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換方法、パーティクルガン衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、超音波処理法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、電気衝撃法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎ ｇｌｙｃｏｌ）媒介形質転換方法などの方法で製造できるが、本発明のベクターを注入できる方法であれば制限がない。
【0083】
本発明のさらに他の様態において、本発明は、本発明による組換えベクターを用いて生産された、アフリカ豚熱ウイルスに対する抗体誘導用組換えタンパク質を提供する。すなわち、本発明は、本発明による組換えベクターを用いて生産された、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ組換え抗原タンパク質を提供する。前記抗原タンパク質は、それぞれ別個の組換えベクター（すなわち、それぞれ別個の核酸分子）から生産されたものであってもよく、２以上の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクター（すなわち、単一核酸分子）から生産されたものであってもよい。特に、すなわち、本発明は、本発明による組換えベクターを用いて生産された、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０組換え抗原タンパク質を提供することを主な目的とする。
【0084】
本発明の一具現例において、前記Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ組換え抗原タンパク質は、水溶性であってもよい。より具体的には、植物体で発現したＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ組換え抗原タンパク質は、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が水溶性分画に溶解しているものであってもよい。
【0085】
また、本発明の他の具体例において、前記Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ組換え抗原タンパク質は、８５％以上の純度で分離、精製されることができる。より具体的には、本発明による組換えベクターを用いて植物体で発現したＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ組換え抗原タンパク質は、通常の分離、精製方法を用いた場合、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％純度のＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ組換え抗原タンパク質を得ることができる。
【0086】
本発明のさらに他の様態において、本発明は、アフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質の組み合わせを有効成分として含むアフリカ豚熱の予防用ワクチン組成物であって、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、および／またはＦ３１７Ｌタンパク質から成る群から選ばれる１つ以上の組み合わせであることを特徴とするワクチン組成物を提供する。好ましくは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、およびｐ３０から成る群から選ばれる１つ以上の組み合わせであってもよい。最も好ましくは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、およびｐ３０からなるものである。また、本発明は、アフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質の組み合わせを有効成分として含むアフリカ豚熱の予防または治療用薬学的組成物であって、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、および／またはＦ３１７Ｌタンパク質から成る群から選ばれる１つ以上の組み合わせであることを特徴とする薬学的組成物を提供する。好ましくは、前記薬学的組成物は、アフリカ豚熱の予防用薬学的組成物である。
【0087】
以下、本発明のワクチン組成物に関する説明は、本発明の薬学的組成物に対しても同一に適用され、反対に、本発明の薬学的組成物に関する説明は、本発明のワクチン組成物に対しても同一に適用される。
【0088】
好ましくは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせがＬｅｃｔｉｎタンパク質およびＣＤ２ｖタンパク質を含む場合、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、３つ以上の抗原タンパク質からなってもよい。すなわち、Ｌｅｃｔｉｎタンパク質およびＣＤ２ｖタンパク質を含む組成物は、前記Ｌｅｃｔｉｎタンパク質および前記ＣＤ２ｖタンパク質の他に、その他のＡＳＦＶ抗原タンパク質（例えば、ｐ７２、ｐ５４、および／またはｐ３０）をさらに含んでもよい。
【0089】
好ましくは、本発明によるワクチン組成物に含まれた前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質は、本発明による組換えベクターを用いて生産されたことを特徴とする。好ましくは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質は、本発明による組換えベクターを用いて植物体で生産されたことを特徴とする。
【0090】
また、本発明によるワクチン組成物は、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、またはｐ３０組換えタンパク質以外のＡＳＦＶ抗原タンパク質をさらに含まないことを特徴とする。好ましくは、前記Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、またはｐ３０組換えタンパク質以外のＡＳＦＶ抗原タンパク質は、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌから成る群から選ばれる１つ以上であってもよい。すなわち、最も好ましい様態において、本発明によるワクチン組成物は、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０組換え抗原タンパク質５種を含むワクチン組成物であり、さらなる抗原（ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、Ｆ３１７Ｌなど）をさらに含むワクチンに比べて、ＡＳＦＶ抗原に対する抗体生成誘導効果、ＡＳＦＶ感染阻害効果、およびアフリカ豚熱の予防効果などがさらに高いことを特徴とする。例えば、前記ワクチン組成物は、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、Ｆ３１７Ｌなどをさらに含むワクチンに比べて、さらに迅速にＡＳＦＶ抗原に対する抗体生成を誘導することができる。
【0091】
また、本発明は、本発明によるワクチン組成物または薬学的組成物をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、アフリカ豚熱の予防または治療方法を提供する。好ましくは、本発明によるアフリカ豚熱の予防または治療方法は、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、またはｐ３０組換えタンパク質以外のＡＳＦＶ抗原タンパク質（例えば、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、および／またはＦ３１７Ｌ）を前記個体に投与しないことを特徴とする。
【0092】
本発明の一具体例において、前記ワクチン組成物は、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）をさらに含んでもよい。好ましくは、前記アジュバントは、ミネラルオイル（ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ）またはエマルシゲン（Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ）系であってもよく、より好ましくは、Ｄｒａｋｅｏｌ ５オイル系アジュバントであってもよく、最も好ましくは、ＳＥＡ１であってもよいが、これらに限らない。
【0093】
本明細書において使用された用語「アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）」とは、ワクチンまたは薬学的に活性を有する成分に添加され、免疫反応を増加させたり影響を与える物質または組成物をいう。代表的に、免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）用キャリアまたは補助物質および／または他の薬学的に活性を有する物質または組成物を通常意味する。典型的に、用語「アジュバント」は、広い概念で解釈されるべきであり、前記アジュバントに統合されたり前記アジュバントとともに投与された抗原の免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を向上させることができる広い範囲の物質または策略（ｓｔｒａｔａｇｅｒｍ）を意味する。また、アジュバントは、これらに限定されず、免疫増強剤（ｉｍｍｕｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）、抗原伝達系またはこれらの組み合わせに分けられる。適切なアジュバントの例として、アルミニウムヒドロキシド、フロイド完全または不完全アジュバント、ＤＥＡＥデキストラン、レバミゾール、ＰＣＧおよびｐｏｌｙ Ｉ：Ｃまたはｐｏｌｙ Ａ：Ｕを含んでもよい。本発明の一実施例では、Ｄｒａｋｅｏｌ ５オイルベースのＳＥＡ１アジュバントを使用した。
【0094】
本明細書において、「ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）」とは、生体に免疫反応を起こす抗原を含有する生物学的な製剤であり、感染症の予防のためにヒトや動物に注射したり経口投与することによって、生体に免疫を生じさせる免疫原をいう。前記動物は、ヒトまたは非ヒト動物であり、前記非ヒト動物は、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ヤギ、ヒツジなどを指すが、これらに限定されない。
【0095】
本明細書において、「溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）」とは、目的タンパク質またはペプチドが人体に投与するのに適した溶媒に溶解することができる程度を意味する。具体的には、特定の温度で与えられた溶媒に対して溶質が飽和した程度を示す。溶解性は、溶質の飽和濃度を決定することによって測定することができ、例えば、溶媒に溶質を過量で添加し、これを撹拌し、ろ過した後、濃度をＵＶ分光器またはＨＰＬＣなどを用いて測定することができるが、これらに限定されるものではなく、高い溶解性は、組換えタンパク質の分離精製に有利であり、組換えタンパク質の凝集が抑制され、組換えタンパク質の生理活性または薬理的な活性を維持するのに利点を有する。
【0096】
本発明のワクチン組成物または薬学的組成物内の前記抗原タンパク質の含有量は、疾患の症状、症状の進行程度、患者の状態などによって適切に調節可能であり、例えば、組成物の全重量を基準にして０．０００１■９９．９重量％、または０．００１■５０重量％であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記含有量比は、溶媒を除去した乾燥量を基準とする値である。
【0097】
本発明によるワクチン組成物または薬学的組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体、賦形剤、および希釈剤をさらに含んでもよい。前記賦形剤は、例えば、希釈剤、結合剤、崩解剤、滑沢剤、吸着剤、保湿剤、フィルムコート物質、および制御放出添加剤から成る群から選択された１つ以上であってもよい。
【0098】
本発明によるワクチン組成物または薬学的組成物は、それぞれ、通常の方法によって散剤、顆粒剤、徐放性顆粒剤、腸溶性顆粒剤、液剤、点眼剤、エリキシル剤、乳剤、懸濁液剤、酒精剤、トローチ剤、芳香水剤、リモナーデ剤、錠剤、徐放性錠剤、腸溶性錠剤、舌下錠、硬質カプセル剤、軟質カプセル剤、徐放性カプセル剤、腸溶性カプセル剤、丸剤、チンキ剤、軟エキス剤、乾燥エキス剤、流動エキス剤、注射剤、カプセル剤、灌流液、硬膏剤、ローション剤、パスタ剤、噴霧剤、吸入剤、パッチ剤、滅菌注射溶液、またはエアロゾルなどの外用剤などの形態に剤形化して使用することができ、前記外用剤は、クリーム、ジェル、パッチ、噴霧剤、軟膏剤、硬膏剤、ローション剤、リニメント剤、パスタ剤またはカタプラズマ剤などの剤形を有していてもよい。
【0099】
本発明によるワクチン組成物または薬学的組成物に含まれ得る担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられる。
【0100】
製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製される。
【0101】
本発明による錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤の添加剤としてコーンスターチ、ジャガイモデンプン、小麦デンプン、乳糖、白糖、ブドウ糖、果糖、Ｄ－マンニトール、沈降炭酸カルシウム、合成ケイ酸アルミニウム、リン酸一水素カルシウム、硫酸カルシウム、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、精製ラノリン、微結晶セルロース、デキストリン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カオリン、ヨウ素、コロイド状シリカゲル、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ＨＰＭＣ１９２８、ＨＰＭＣ２２０８、ＨＰＭＣ２９０６、ＨＰＭＣ２９１０、プロピレングリコール、カゼイン、乳酸カルシウム、プリモジェルなど賦形剤；ゼラチン、アラビアガム、エタノール、寒天粉、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ブドウ糖、精製水、カゼインナトリウム、グリセリン、ステアリン酸、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、微結晶セルロース、デキストリン、ヒドロキシセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシメチルセルロース、精製セラック、デンプン糊、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどの結合剤が使用でき、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、コーンスターチ、寒天粉、メチルセルロース、ベントナイト、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クエン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、無水ケイ酸、Ｌ－ヒドロキシプロピルセルロース、デキストラン、イオン交換樹脂、酢酸ポリビニル、ホルムアルデヒド処理カゼインおよびゼラチン、アルギン酸、アミロース、グアーガム（Ｇｕａｒ ｇｕｍ）、重曹、ポリビニルピロリドン、リン酸カルシウム、ゲル化デンプン、アラビアガム、アミロベクチン、ペクチン、ポリリン酸ナトリウム、エチルセルロース、白糖、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、Ｄ－ソルビトール液、軽質無水ケイ酸など崩解剤；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、水素化植物油（Ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｏｉｌ）、タルク、石松子、カオリン、ワセリン、ステアリン酸ナトリウム、カカオ脂、サリチル酸ナトリウム、サリチル酸マグネシウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００、ＰＥＧ６０００、流動パラフィン、水素添加大豆油（Ｌｕｂｒｉ ｗａｘ）、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸亜鉛、ラウリル硫酸ナトリウム、酸化マグネシウム、マクロゴール（Ｍａｃｒｏｇｏｌ）、合成ケイ酸アルミニウム、無水ケイ酸、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン油、パラフィン油、ポリエチレングリコール脂肪酸エーテル、デンプン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ＤＬ－ロイシン、軽質無水ケイ酸などの滑沢剤が使用できる。
【0102】
本発明による液剤の添加剤としては、水、希塩酸、希硫酸、クエン酸ナトリウム、モノステアリン酸スクロース類、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル類（ツインエステル）、ポリオキシエチレンモノアルキルエテール類、ラノリンエーテル類、ラノリンエステル類、酢酸、塩酸、アンモニア水、炭酸アンモニウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、プロラミン、ポリビニルピロリドン、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが使用できる。
【0103】
本発明によるシロップ剤には、白糖の溶液、他の糖類あるいは甘味剤などが使用でき、必要に応じて芳香剤、着色剤、保存剤、安定剤、懸濁化剤、乳化剤、粘稠剤などが使用できる。
【0104】
本発明による乳剤には、精製水が使用でき、必要に応じて乳化剤、保存剤、安定剤、芳香剤などが使用できる。
【0105】
本発明による懸濁剤には、アカシア、トラガカンタ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶セルロース、アルギン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ＨＰＭＣ１８２８、ＨＰＭＣ２９０６、ＨＰＭＣ２９１０などの懸濁化剤が使用でき、必要に応じて界面活性剤、保存剤、安定剤、着色剤、芳香剤が使用できる。
【0106】
本発明による注射剤には、注射用蒸留水、０．９％塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、デキストロース注射液、デキストロース＋塩化ナトリウム注射液、ピイジー（ＰＥＧ）、乳酸リンゲル注射液、エタノール、プロピレングリコール、非揮発性油－ゴマ油、綿実油、落花生油、ダイズ油、とうもろこし油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、安息香酸ベンゼンのような溶剤；安息香酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ヨウ素、ウレタン、モノエチルアセトアミド、ブタゾリジン、プロピレングリコール、ツイン類、ニコチン酸アミド、ヘキサミン、ジメチルアセトアミドのような溶解補助剤；弱酸およびその塩（酢酸と酢酸ナトリウム）、弱塩基およびその塩（アンモニアおよび酢酸アンモニウム）、有機化合物、タンパク質、アルブミン、ペプトン、ガム類のような緩衝剤；塩化ナトリウムのような等張剤；重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）二酸化炭素ガス、メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３）、窒素ガス（Ｎ２）、エチレンジアミンテトラ酢酸のような安定剤；ソジウムビサルファイト０．１％、ソジウムホルムアルデヒドスルホキシレート、チオウレア、エチレンジアミンテトラ酢酸ジナトリウム、アセトンソジウムビサルファイトのような硫酸化剤；ベンジルアルコール、クロロブタノール、塩酸プロカイン、ブドウ糖、グルコン酸カルシウムのような無痛化剤；ＣＭＣナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ツイン８０、モノステアリン酸アルミニウムのような懸濁化剤を含んでもよい。
【0107】
本発明による坐剤には、カカオ脂、ラノリン、ウィテプソル、ポリエチレングリコール、グリセロゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸とオレイン酸の混合物、スバナル（Ｓｕｂａｎａｌ）、綿実油、落花生油、ヤシ油、カカオバター＋コレステロール、レシチン、ラネットワックス、モノステアリン酸グリセロール、ツインまたはスパン、イムハウゼン（Ｉｍｈａｕｓｅｎ）、モノレン（モノステアリン酸プロピレングリコール）、グリセリン、アデプスソリダス（Ａｄｅｐｓ ｓｏｌｉｄｕｓ）、ブチラムテゴ－Ｇ（Ｂｕｙｔｙｒｕｍ Ｔｅｇｏ－Ｇ）、セベスファーマ１６（Ｃｅｂｅｓ Ｐｈａｒｍａ １６）、ヘキサライドベース９５、コトマー（Ｃｏｔｏｍａｒ）、ヒドロコテＳＰ、Ｓ－７０－ＸＸＡ、Ｓ－７０－ＸＸ７５（Ｓ－７０－ＸＸ９５）、ヒドロコテ（Ｈｙｄｒｏｋｏｔｅ）２５、ヒドロコテ７１１、イドロポスタル（Ｉｄｒｏｐｏｓｔａｌ）、マッサエストラリウム（Ｍａｓｓａ ｅｓｔｒａｒｉｕｍ、Ａ、ＡＳ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｔ）、マッサ－ＭＦ、マスポール、マスポール－１５、ネオスポスタル－Ｎ、パラマウント－Ｂ、スポシロ（ＯＳＩ、ＯＳＩＸ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｌ）、坐剤基剤ＩＶタイプ（ＡＢ、Ｂ、Ａ、ＢＣ、ＢＢＧ、Ｅ、ＢＧＦ、Ｃ、Ｄ、２９９）、スポスタル（Ｎ、Ｅｓ）、ウェコビー（Ｗ、Ｒ、Ｓ、Ｍ、Ｆｓ）、テゲスタートリグリセライド基剤（ＴＧ－９５、ＭＡ、５７）のような基剤が使用できる。
【0108】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記抽出物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用される。
【0109】
経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、頻用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。
【0110】
本発明によるワクチン組成物または薬学的組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明において、「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスクの割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物感受性、投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、同時使用される薬物を含む要素およびその他医学分野によく知られた要素によって決定できる。
【0111】
本発明によるワクチン組成物または薬学的組成物は、個別治療剤として投与したり他の治療剤と併用して投与でき、従来の治療剤とは、順次にまたは同時に投与でき、単一または多重投与できる。上記した要素を全部考慮して副作用なしで最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、本発明の属する技術分野における通常の技術者によって容易に決定できる。
【0112】
本発明のワクチン組成物または薬学的組成物は、個体に多様な経路で投与できる。投与のすべての方式は、予想され得るが、例えば、経口服用、皮下注射、腹腔投与、静脈注射、筋肉注射、脊髄の周囲空間（硬膜内）注射、舌下投与、頬粘膜投与、直腸内挿入、膣内挿入、眼球投与、耳投与、鼻腔投与、吸入、口または鼻を通した噴霧、皮膚投与、経皮投与などにより投与できる。好ましくは、本発明による組成物は、筋肉内投与されることができる。
【0113】
本発明のワクチン組成物または薬学的組成物は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別、体重および疾患の重症度などの様々な関連因子とともに、活性成分である薬物の種類によって決定される。具体的には、本発明による組成物の有効量は、患者の年齢、性別、体重により変わることができ、一般的には、体重１ｋｇ当たり０．００１～１５０ｍｇ、好ましくは、０．０１～１００ｍｇを毎日または隔日投与したり１日に１～３回に分けて投与することができる。しかしながら、投与経路、疾患の重症度、性別、体重、年齢などによって増減することができるので、前記投与量がいかなる方法でも本発明の範囲を限定するものではない。
【0114】
本発明において「個体」とは、疾患の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの哺乳類を意味する。例えば、本明細書において、「個体（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」とは、本発明の組換えアフリカ豚熱抗原タンパク質が投与され得る対象を言い、その対象に制限がない。
【0115】
本発明において「投与」とは、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。
【0116】
本発明において「予防」とは、目的とする疾患の発症を抑制したり遅延させるすべての行為を意味し、「治療」とは、本発明による薬学的組成物の投与により目的とする疾患とそれによる代謝異常症状が好転したり有益に変更されるすべての行為を意味し、「改善」とは、本発明による組成物の投与により目的とする疾患に関連したパラメーター、例えば症状の程度を減少させるすべての行為を意味する。例えば、本明細書において、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」とは、本発明による組換えアフリカ豚熱抗原タンパク質の投与によってアフリカ豚熱を抑制させたり発症を遅延させるすべての行為を意味する。また、本明細書において、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、本発明による組換えアフリカ豚熱抗原タンパク質の投与によってアフリカ豚熱の症状が好転したり有益に変更されるすべての行為を意味する。
【0117】
さらに記述すると、本発明のワクチン組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記レシチン類似乳化剤に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを使用することができ、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得る。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水溶性製剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤制が含まれる。非水溶性製剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用できる。
【0118】
本発明によるワクチン組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投与が好ましい。本願において使用された用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明のワクチン組成物は、また、直腸投与のための坐剤の形態で投与することができる。
【0119】
本発明によるワクチン組成物または薬学的組成物の投与量は、個体の年齢、体重、性別、身体状態などを考慮して選択される。特別な副作用なしに個体に免疫保護反応を誘導するのに必要な量は、免疫原として使用された組換えタンパク質および賦形剤の任意存在によって多様である。
【0120】
好ましくは、本発明によるワクチン組成物２ｍｌ当たりＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、および／またはＦ３１７Ｌは、それぞれ１０μｇ～１ｍｇ、１０～９００μｇ、１０μｇ～８００μｇ、１０μｇ～７００μｇ、１０μｇ～６００μｇ、１０μｇ～５００μｇ、１０μｇ～４００μｇ、１０μｇ～３００μｇ、１０μｇ～２００μｇ、５０μｇ～１５０μｇ、７０μｇ～１３０μｇ、８０μｇ～１２０μｇ、または９０μｇ～１１０μｇが含まれていてもよく、ｐ３０は、１μｇ～１００μｇ、１μｇ～９０μｇ、１μｇ～８０μｇ、１μｇ～７０μｇ、１μｇ～６０μｇ、１μｇ～５０μｇ、１０μｇ～５０μｇ、１５μｇ～４５μｇ、２０μｇ～４０μｇ、または２５μｇ～３５μｇが含まれていてもよいが、これらに限らない。
【0121】
本発明のさらに他の様態において、本発明は、本発明によるワクチン組成物を含む、アフリカ豚熱の予防用ワクチンキットを提供する。前記キットには、本発明のワクチン組成物の他にも、ワクチン投与などのために当業界において一般的に使用されるツール、試薬などが制限なく含まれ得る。また、前記キットには、本発明によるワクチン組成物、組換えベクターなどに関する特徴や情報が記載された説明書が含まれていてもよく、本発明によるワクチン組成物の製造方法が記載された指示書が含まれていてもよい。
【0122】
本発明のさらに他の様態において、本発明は、下記段階を含む組換えＡＳＦＶ抗原タンパク質の製造方法を提供する：
（Ｓ１）本発明による組換えベクターを植物体に形質転換させる段階；および
（Ｓ２）前記植物体または培養液から組換え抗原タンパク質を分離および精製する段階。
（Ｓ１）本発明による組換えベクターを植物体に形質転換させる段階；および
（Ｓ２）前記植物体または培養液から組換え抗原タンパク質を分離および精製する段階。
【0123】
本発明のさらに他の様態において、本発明は、下記段階を含むアフリカ豚熱の予防用ワクチン組成物またはワクチンキットの製造方法を提供する：
（Ｓ１）本発明による組換えベクターを植物体に形質転換させる段階；
（Ｓ２）前記植物体または培養液から組換え抗原タンパク質を分離および精製する段階；および
（Ｓ３）前記分離および精製された組換え抗原タンパク質を用いてワクチン組成物またはワクチンキットを製造する段階。
（Ｓ１）本発明による組換えベクターを植物体に形質転換させる段階；
（Ｓ２）前記植物体または培養液から組換え抗原タンパク質を分離および精製する段階；および
（Ｓ３）前記分離および精製された組換え抗原タンパク質を用いてワクチン組成物またはワクチンキットを製造する段階。
【0124】
前記（Ｓ１）段階の「型質転換」に関する具体的な説明は前述した通りである。前記（Ｓ１）段階の形質転換方法は、具体的な種類が限定されるものではないが、好ましくは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換方法を用いて行われ得る。具体的には、前記（Ｓ１）段階は、本発明による組換えベクターをアグロバクテリア菌株に形質転換させる段階と；前記形質転換されたアグロバクテリア菌株を培養する段階と；前記培養された菌株を植物体に投与（注入あるいは接種）する段階と；を含んでもよい。好ましくは、前記植物体は、タバコであってもよい。
【0125】
前記（Ｓ２）段階の組換え抗原タンパク質を分離および精製する段階は、当業界において一般的に知られているタンパク質分離および精製方法を制限なく適用して行われ得る。好ましくは、前記タンパク質の分離は、形質転換された植物体にタンパク質抽出溶液を添加して行われ得る。また、前記タンパク質の精製は、クロマトグラフィーを行って行われ得る。好ましくは、前記クロマトグラフィーは、親和性クロマトグラフィーであってもよく、この際に使用されるリガンドは、タンパク質Ａ、Ｎｉ－ＩＤＡなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0126】
本発明のさらに他の様態において、本発明は、アフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質の組み合わせを有効成分として含むアフリカ豚熱の予防用飼料組成物を提供し、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、およびｐ３０タンパク質から成る群から選ばれる１つ以上の組み合わせを含むことを特徴とする。好ましくは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせがＬｅｃｔｉｎタンパク質およびＣＤ２ｖタンパク質を含む場合、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質の組み合わせは、３つ以上の抗原タンパク質からなることを特徴とする。
【0127】
好ましくは、本発明による飼料組成物に含まれた前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質は、本発明による組換えベクターを用いて生産されたことを特徴とする。好ましくは、前記ＡＳＦＶ抗原タンパク質は、本発明による組換えベクターを用いて植物体で生産されたことを特徴とする。
【0128】
また、好ましくは、本発明による飼料組成物は、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０組換え抗原タンパク質を全部有効成分として含むことを特徴とし、最も好ましくは、前記飼料組成物は、Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、またはｐ３０組換えタンパク質以外のＡＳＦＶ抗原タンパク質（ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ）をさらに含まないことを特徴とする。
【0129】
前記飼料組成物において「飼料」の具体的な例としては、豚肉、牛肉、鶏肉などの副産物を含んでとうもろこし、米、一般わら、野草、牧草、エンシレージ、乾草、山野草などがあるが、これらに限定されるものではなく、家畜の飼育に使用される飼料であれば、制限がない。このような飼料に本発明によるＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０組換え抗原タンパク質を添加して配合する方法としては、機械的混合、吸着、吸蔵などの方法があるが、これらに限定されるものではない。
【0130】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【0131】
［実施例］
実施例１．アフリカ豚熱ウイルスの抗原を発現する組換えベクターの製造
図１の切断地図に示されたように、植物体でアフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、またはＦ３１７Ｌを発現させることができるように組換え植物発現ベクターを製作した。より詳しくは、アフリカ豚熱ウイルスのＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌタンパク質に対する遺伝子情報を確保し、植物体における発現に最適化された配列でそれぞれＬｅｃｔｉｎタンパク質コード遺伝子（配列番号２）、ＣＤ２ｖタンパク質コード遺伝子（配列番号４）、ｐ７２タンパク質コード遺伝子（配列番号６）、ｐ５４タンパク質コード遺伝子（配列番号８）、ｐ３０タンパク質コード遺伝子（配列番号１０）、ｐ１５タンパク質コード遺伝子（配列番号１２）、ｐ３５タンパク質コード遺伝子（配列番号１４）、Ｅ１９９Ｌタンパク質コード遺伝子（配列番号１６）、およびＦ３１７Ｌタンパク質コード遺伝子（配列番号１８）を合成した。
実施例１．アフリカ豚熱ウイルスの抗原を発現する組換えベクターの製造
図１の切断地図に示されたように、植物体でアフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、またはＦ３１７Ｌを発現させることができるように組換え植物発現ベクターを製作した。より詳しくは、アフリカ豚熱ウイルスのＬｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌタンパク質に対する遺伝子情報を確保し、植物体における発現に最適化された配列でそれぞれＬｅｃｔｉｎタンパク質コード遺伝子（配列番号２）、ＣＤ２ｖタンパク質コード遺伝子（配列番号４）、ｐ７２タンパク質コード遺伝子（配列番号６）、ｐ５４タンパク質コード遺伝子（配列番号８）、ｐ３０タンパク質コード遺伝子（配列番号１０）、ｐ１５タンパク質コード遺伝子（配列番号１２）、ｐ３５タンパク質コード遺伝子（配列番号１４）、Ｅ１９９Ｌタンパク質コード遺伝子（配列番号１６）、およびＦ３１７Ｌタンパク質コード遺伝子（配列番号１８）を合成した。
【0132】
各組換えベクターの具体的な構成は、次の通りである：
Ｌｅｃｔｉｎ抗原タンパク質発現のための組換えベクター
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）遺伝子とＨＳＰターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を挿入し、それらの間にＮＢ（ｎｅｗ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、ポリヒスチジンタグ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）、アフリカ豚熱ウイルスのＬｅｃｔｉｎ抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）、ｐＦｃ２（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ）断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのＬｅｃｔｉｎ抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
Ｌｅｃｔｉｎ抗原タンパク質発現のための組換えベクター
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）遺伝子とＨＳＰターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）を挿入し、それらの間にＮＢ（ｎｅｗ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、ポリヒスチジンタグ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔａｇ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）、アフリカ豚熱ウイルスのＬｅｃｔｉｎ抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）、ｐＦｃ２（ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｃ）断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのＬｅｃｔｉｎ抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
【0133】
ＣＤ２ｖ抗原タンパク質発現のための組換えベクター
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨＳＰターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、Ｍドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号２４）、アフリカ豚熱ウイルスのＣＤ２ｖ抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのＣＤ２ｖ抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨＳＰターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、Ｍドメインをコードするポリヌクレオチド（配列番号２４）、アフリカ豚熱ウイルスのＣＤ２ｖ抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号４）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのＣＤ２ｖ抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
【0134】
ｐ７２抗原タンパク質発現のための組換えベクター
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターの選別マーカーであるハイグロマイシン抵抗性遺伝子をｈｕｍａｎ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ １遺伝子で置換し、Ｍａｃプロモーターの３’末端ヌクレオチドがＴで置換されたＭａｃＴプロモーター遺伝子およびシロイヌナズナＲＤ２９Ｂターミネータを挿入し、それらの間にＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２２）、アフリカ豚熱ウイルスのｐ７２抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのｐ７２抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターの選別マーカーであるハイグロマイシン抵抗性遺伝子をｈｕｍａｎ ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ １遺伝子で置換し、Ｍａｃプロモーターの３’末端ヌクレオチドがＴで置換されたＭａｃＴプロモーター遺伝子およびシロイヌナズナＲＤ２９Ｂターミネータを挿入し、それらの間にＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２２）、アフリカ豚熱ウイルスのｐ７２抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号６）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのｐ７２抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
【0135】
ｐ５４抗原タンパク質発現のための組換えベクター
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨＳＰターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのｐ５４抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのｐ５４抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨＳＰターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのｐ５４抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのｐ５４抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
【0136】
ｐ３０抗原タンパク質発現のための組換えベクター
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨＳＰターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのｐ３０抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０）、ポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのｐ３０抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨＳＰターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのｐ３０抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１０）、ポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのｐ３０抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
【0137】
ｐ１５抗原タンパク質発現のための組換えベクター
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨＳＰターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのｐ１５抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのｐ１５抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨＳＰターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのｐ１５抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１２）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのｐ１５抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
【0138】
Ｐ３５抗原タンパク質発現のための組換えベクター
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨＳＰターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのｐ３５抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのｐ３５抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターにＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨＳＰターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのｐ３５抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１４）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのｐ３５抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
【0139】
Ｅ１９９Ｌ抗原タンパク質発現のための組換えベクター
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターの選別マーカーであるハイグロマイシン抵抗性遺伝子をｔｕｒｎｉｐ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ－ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＶ－ＣＰ）遺伝子で置換し、Ｍａｃプロモーターの３’末端ヌクレオチドがＴで置換されたＭａｃＴプロモーター遺伝子およびシロイヌナズナＲＤ２９Ｂターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのＥ１９９Ｌ抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのＥ１９９Ｌ抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターの選別マーカーであるハイグロマイシン抵抗性遺伝子をｔｕｒｎｉｐ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ－ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＶ－ＣＰ）遺伝子で置換し、Ｍａｃプロモーターの３’末端ヌクレオチドがＴで置換されたＭａｃＴプロモーター遺伝子およびシロイヌナズナＲＤ２９Ｂターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのＥ１９９Ｌ抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１６）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのＥ１９９Ｌ抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
【0140】
Ｆ３１７Ｌ抗原タンパク質発現のための組換えベクター
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターの選別マーカーであるハイグロマイシン抵抗性遺伝子をｔｕｒｎｉｐ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ－ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＶ－ＣＰ）遺伝子で置換し、Ｍａｃプロモーターの３’末端ヌクレオチドがＴで置換されたＭａｃＴプロモーター遺伝子およびシロイヌナズナＲＤ２９Ｂターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのＦ３１７Ｌ抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのＦ３１７Ｌ抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターの選別マーカーであるハイグロマイシン抵抗性遺伝子をｔｕｒｎｉｐ ｃｒｉｎｋｌｅ ｖｉｒｕｓ－ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＣＶ－ＣＰ）遺伝子で置換し、Ｍａｃプロモーターの３’末端ヌクレオチドがＴで置換されたＭａｃＴプロモーター遺伝子およびシロイヌナズナＲＤ２９Ｂターミネータを挿入し、それらの間にＮＢシグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号２０）、アフリカ豚熱ウイルスのＦ３１７Ｌ抗原組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１８）、ｐＦｃ２断片をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８）、およびＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３０）を順に連結し、アフリカ豚熱ウイルスのＦ３１７Ｌ抗原タンパク質の植物発現ベクターを製作した。
【0141】
実施例２．組換えＡＳＦウイルス抗原タンパク質の発現の確認
２－１．植物発現ベクターの一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
前記実施例１で準備したアフリカ豚熱抗原タンパク質（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ）の植物発現組換えベクターそれぞれをアグロバクテリアＬＢＡ４４０４菌株に電気衝撃法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒａｔｉｏｎ）を用いて形質転換させた。形質転換されたアグロバクテリアを５ｍＬのＹＥＰ液体培地（酵母抽出物１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）で２８℃の条件で１６時間振とう培養した後、１次培養液１ｍＬを５０ｍＬの新しいＹＥＰ培地に接種し、２８℃の条件で６時間振とう培養した。このように培養されたアグロバクテリアは、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、４℃、５分）して収集した後、６００ｎｍの波長で吸光度（Ｏ．Ｄ）の値が１．０となるようにインフィルトレーション（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）バッファー［１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭアセトシリンゴン］に懸濁させた。アグロバクテリア懸濁液は、注射針を除去した注射器を用いてニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉の裏面に注入する方法でアグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。
２－１．植物発現ベクターの一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
前記実施例１で準備したアフリカ豚熱抗原タンパク質（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ７２、ｐ５４、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ）の植物発現組換えベクターそれぞれをアグロバクテリアＬＢＡ４４０４菌株に電気衝撃法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒａｔｉｏｎ）を用いて形質転換させた。形質転換されたアグロバクテリアを５ｍＬのＹＥＰ液体培地（酵母抽出物１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）で２８℃の条件で１６時間振とう培養した後、１次培養液１ｍＬを５０ｍＬの新しいＹＥＰ培地に接種し、２８℃の条件で６時間振とう培養した。このように培養されたアグロバクテリアは、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、４℃、５分）して収集した後、６００ｎｍの波長で吸光度（Ｏ．Ｄ）の値が１．０となるようにインフィルトレーション（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）バッファー［１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭアセトシリンゴン］に懸濁させた。アグロバクテリア懸濁液は、注射針を除去した注射器を用いてニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉の裏面に注入する方法でアグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。
【0142】
２－２．ＡＳＦウイルスの抗原タンパク質の分離および精製
前記実施例２－１で準備したニコチアナ・ベンサミアナ葉から組換えタンパク質を分離および精製するために、各組換えタンパク質を発現するニコチアナ・ベンサミアナ葉にタンパク質抽出溶液を添加し、ブレンダーで組織を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し、タンパク質抽出液を回収した。前記抽出液からそれぞれのＡＳＦウイルス抗原タンパク質を分離精製するために、タンパク質Ａ－セファロースレジン（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｒｅｓｉｎ）が充填されたカラムで親和性クロマトグラフィーを実施した。前記カラムにタンパク質Ａレジンを充填した後、洗浄液で平衡化させた。回収したタンパク質抽出液をカラムに適用し、平衡化させた後、洗浄液を流してレジンを洗浄し、溶出溶液でそれぞれの組換えタンパク質を溶出させた。組換え抗原タンパク質が含まれた溶出溶液は、中和溶液を加えて適切なｐＨで中和した後、３０ｋＤａカットオフのフィルターを用いてバッファー交換および濃縮を行った。分離精製された組換え抗原タンパク質は、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）後、クマシー染色法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いて濃度を確認した。
前記実施例２－１で準備したニコチアナ・ベンサミアナ葉から組換えタンパク質を分離および精製するために、各組換えタンパク質を発現するニコチアナ・ベンサミアナ葉にタンパク質抽出溶液を添加し、ブレンダーで組織を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し、タンパク質抽出液を回収した。前記抽出液からそれぞれのＡＳＦウイルス抗原タンパク質を分離精製するために、タンパク質Ａ－セファロースレジン（ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｒｅｓｉｎ）が充填されたカラムで親和性クロマトグラフィーを実施した。前記カラムにタンパク質Ａレジンを充填した後、洗浄液で平衡化させた。回収したタンパク質抽出液をカラムに適用し、平衡化させた後、洗浄液を流してレジンを洗浄し、溶出溶液でそれぞれの組換えタンパク質を溶出させた。組換え抗原タンパク質が含まれた溶出溶液は、中和溶液を加えて適切なｐＨで中和した後、３０ｋＤａカットオフのフィルターを用いてバッファー交換および濃縮を行った。分離精製された組換え抗原タンパク質は、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）後、クマシー染色法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）を用いて濃度を確認した。
【0143】
ｐ３０タンパク質の場合、次の過程を通じて分離、精製した：ｐ３０を発現するニコチアナ・ベンサミアナ葉にタンパク質抽出溶液を添加し、ブレンダーで組織を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し、タンパク質抽出液を回収した。前記抽出液からｐ３０を分離精製するために、Ｎｉ－ＩＤＡレジンが充填されたカラムで親和性クロマトグラフィーを実施した。まず、前記カラムにＮｉ－ＩＤＡレジンを充填した後、洗浄液で平衡化させた。回収したタンパク質抽出液をカラムに適用し、平衡化させた後、洗浄液を流してレジンを洗浄し、溶出溶液でｐ３０タンパク質を溶出させた。ｐ３０タンパク質が含まれた溶出溶液は、１０ｋＤａカットオフのフィルターを用いてバッファー交換および濃縮を行った。分離精製されたｐ３０タンパク質は、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）後、クマシー染色法を用いて濃度を確認した。
【0144】
その結果、図２～図１０ｂに示されたように、本発明のアフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質は、いずれも、本来のタンパク質と比較して、大きな変異や修飾なく良好に精製されたことを確認した。このような結果は、タンパク質を植物で発現させる場合、糖構造が変異し、生産効率が低下する問題点が発見されていないことを検証したものであり、本発明によるアフリカ豚熱ウイルス組換え抗原タンパク質が植物で良好に生産されることを確認したものである。
【0145】
組換え抗原タンパク質別分離、精製条件および結果は、次の通りである：
【0146】
Ｌｅｃｔｉｎ抗原タンパク質（分子量：４０６５１．８２；図２）
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇ、タンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約８０ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで３０分間バインディング（ｂｉｎｄｉｎｇ）後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）／洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ（－Ｗ）、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１．５％ＰＶＰＰ（－Ｗ）
－溶出液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５で中和）
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、約１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１．０２μｇ／μＬ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：５４ｍｇ／ｋｇ
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇ、タンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約８０ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで３０分間バインディング（ｂｉｎｄｉｎｇ）後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液（ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）／洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ（－Ｗ）、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１．５％ＰＶＰＰ（－Ｗ）
－溶出液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５で中和）
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、約１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１．０２μｇ／μＬ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：５４ｍｇ／ｋｇ
【0147】
ＣＤ２ｖ抗原タンパク質（分子量：５５２１４．７０；図３）
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇ、タンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液／洗浄液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ（－Ｗ）、１．５％ＰＶＰＰ（－Ｗ）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５で中和）
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５となるまで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加する。
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１．２μｇ／μＬ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：６８．６７ｍｇ／ｋｇ
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇ、タンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液／洗浄液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ（－Ｗ）、１．５％ＰＶＰＰ（－Ｗ）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５で中和）
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５となるまで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加する。
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１．２μｇ／μＬ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：６８．６７ｍｇ／ｋｇ
【0148】
ｐ７２抗原タンパク質（分子量：１００４０５．７７（ただし、７個のｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅによって１４ｋＤａ増加）；図４ａおよび図４ｂ）
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇ、タンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液／洗浄液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ（－Ｗ）、１．５％ＰＶＰＰ（－Ｗ）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：１．５ Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５で中和）
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５になるまで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加する。
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：０．５７μｇ／μＬ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：７．０６ｍｇ／ｋｇ
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇ、タンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液／洗浄液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ（－Ｗ）、１．５％ＰＶＰＰ（－Ｗ）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：１．５ Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５で中和）
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５になるまで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加する。
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：０．５７μｇ／μＬ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：７．０６ｍｇ／ｋｇ
【0149】
ｐ５４抗原タンパク質（分子量：４３９５６．０９（ただし、１個のｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅによって２ｋＤａ増加）；図５ａおよび図５ｂ）
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉０．１ｋｇ、タンパク質抽出液０．２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１０ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで７０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ、１．５％ＰＶＰＰ、０．５ｘ ＰＩ
－洗浄液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ
－最終バッファー：１Ｎ ＮａＯＨ（ｐＨ７．４となるまで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加する）
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１ｍｇ／ｍｌ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：７１ｍｇ／ｋｇ
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉０．１ｋｇ、タンパク質抽出液０．２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１０ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで７０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ、１．５％ＰＶＰＰ、０．５ｘ ＰＩ
－洗浄液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ
－最終バッファー：１Ｎ ＮａＯＨ（ｐＨ７．４となるまで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加する）
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１ｍｇ／ｍｌ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：７１ｍｇ／ｋｇ
【0150】
ｐ３０抗原タンパク質（分子量：２２９９３．９５；図６）
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇ、タンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、１００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ３、１０ｍＭ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、１．５％ＰＶＰＰ
－洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（Ｗ１、２）、１００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（Ｗ３）、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｗ１）
－溶出液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：０．３μｇ／μＬ（ｖｏｌｕｍｅ：９３ｍｌ）
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：２７．９ｍｇ／ｋｇ
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇ、タンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５０ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ、１００ｍＭ Ｎａ２ＳＯ３、１０ｍＭ Ａｓｃｏｒｂｉｃ Ａｃｉｄ、１．５％ＰＶＰＰ
－洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（Ｗ１、２）、１００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ（Ｗ３）、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｗ１）
－溶出液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：０．３μｇ／μＬ（ｖｏｌｕｍｅ：９３ｍｌ）
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：２７．９ｍｇ／ｋｇ
【0151】
ｐ１５抗原タンパク質（分子量：４４１１４．３４；図７ａおよび図７ｂ）
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１．５ｋｇ、タンパク質抽出液１Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液／洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ（－Ｗ）、１．５％ＰＶＰＰ（－Ｗ）、１ｍＭ ＰＭＳＦ
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：０．５Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ７．５で中和）
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５となるまで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加する。
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：０．５ｍｇ／ｍｌ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：９８．６ｍｇ／ｋｇ
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１．５ｋｇ、タンパク質抽出液１Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液／洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ（－Ｗ）、１．５％ＰＶＰＰ（－Ｗ）、１ｍＭ ＰＭＳＦ
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：０．５Ｍ ＮａＯＨ（ｐＨ７．５で中和）
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５となるまで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加する。
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：０．５ｍｇ／ｍｌ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：９８．６ｍｇ／ｋｇ
【0152】
ｐ３５抗原タンパク質（分子量：６１３２３．４２；図８）
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉０．５ｋｇ、タンパク質抽出液１Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液／洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ（－Ｗ）、１５ｇ ＰＶＰＰ（－Ｗ）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：１ Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５で中和）
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５となるまで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加する。
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：０．５３μｇ／μＬ（ｖｏｌｕｍｅ：約１１０ｍＬ）
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１１６．６ｍｇ／ｋｇ
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉０．５ｋｇ、タンパク質抽出液１Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液／洗浄液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ（－Ｗ）、１５ｇ ＰＶＰＰ（－Ｗ）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：１ Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５で中和）
－最終バッファー：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５となるまで１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加する。
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：０．５３μｇ／μＬ（ｖｏｌｕｍｅ：約１１０ｍＬ）
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１１６．６ｍｇ／ｋｇ
【0153】
Ｅ１９９Ｌ抗原タンパク質（分子量：４６４８５．２０（ただし、２個のｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅによって４ｋＤａ増加）；図９ａおよび図９ｂ）
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇ、タンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ、１．５％ＰＶＰＰ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（ＤＭＳＯ）
－洗浄液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：０．２Ｎ ＮａＯＨ（ｐＨ７．５で中和）
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１ｍｇ／ｍｌ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：７０．３ｍｇ／ｋｇ
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇ、タンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１００ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ、１．５％ＰＶＰＰ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（ＤＭＳＯ）
－洗浄液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．２）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：０．２Ｎ ＮａＯＨ（ｐＨ７．５で中和）
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１ｍｇ／ｍｌ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：７０．３ｍｇ／ｋｇ
【0154】
Ｆ３１７Ｌ抗原タンパク質（分子量：６２７７７．７３（ただし、３個のｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅによって６ｋＤａ増加）；図１０ａおよび図１０ｂ）
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１００ｇおよびタンパク質抽出液２００ｍＬ；またはニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇおよびタンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１０ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ、１．５％ＰＶＰＰ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（ＤＭＳＯ）
－洗浄液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：０．２Ｎ ＮａＯＨ（ｐＨ７．５で中和）
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１ｍｇ／ｍｌ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１４ｍｇ／ｋｇ
（１）タンパク質抽出条件：ニコチアナ・ベンサミアナ葉１００ｇおよびタンパク質抽出液２００ｍＬ；またはニコチアナ・ベンサミアナ葉１ｋｇおよびタンパク質抽出液２Ｌ
（２）タンパク質分離精製：約１０ｍＬのタンパク質Ａレジンが充填されたカラムで６０分間バインディング後、２０分間レジンダウン（ｒｅｓｉｎ ｄｏｗｎ）
－抽出液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１００ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｓｕｌｆｉｔｅ、１．５％ＰＶＰＰ、１ｍＭ ＰＭＳＦ（ＤＭＳＯ）
－洗浄液：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（－Ｗ２）
－溶出液：５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ（ｐＨ３．０）、１５４ｍＭ ＮａＣｌ
－中和バッファー：０．２Ｎ ＮａＯＨ（ｐＨ７．５で中和）
（３）最終タンパク質濃度（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１ｍｇ／ｍｌ
（４）最終収率（Ｎａｎｏｄｒｏｐ基準）：１４ｍｇ／ｋｇ
【0155】
実施例３．５種の抗原または９種の抗原ワクチンによるＡＳＦウイルス防護効果の確認
前記実施例２で分離および精製されたＡＳＦウイルス抗原タンパク質の投与によるＡＳＦウイルス感染予防効果および前記ワクチンの安定性を確認するために、下記表１に記載したように、合計１８匹の豚を６匹ずつ３グループに分けて防護能試験を行った。具体的には、動物モデルを５種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０の組み合わせ）処理グループ（Ｇ１）、および９種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌの組み合わせ）処理グループ（Ｇ２）、ＰＢＳ処理対照群グループ（Ｇ３）に分けた。ｐ３０を除いたＡＳＦＶ抗原タンパク質は、ワクチンにそれぞれ１００μｇずつ含まれ、ｐ３０は、３０μｇが含まれるようにし、１回接種当たり豚１匹に２ｍＬのワクチンを投与した。
前記実施例２で分離および精製されたＡＳＦウイルス抗原タンパク質の投与によるＡＳＦウイルス感染予防効果および前記ワクチンの安定性を確認するために、下記表１に記載したように、合計１８匹の豚を６匹ずつ３グループに分けて防護能試験を行った。具体的には、動物モデルを５種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０の組み合わせ）処理グループ（Ｇ１）、および９種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌの組み合わせ）処理グループ（Ｇ２）、ＰＢＳ処理対照群グループ（Ｇ３）に分けた。ｐ３０を除いたＡＳＦＶ抗原タンパク質は、ワクチンにそれぞれ１００μｇずつ含まれ、ｐ３０は、３０μｇが含まれるようにし、１回接種当たり豚１匹に２ｍＬのワクチンを投与した。
【0156】
【表1】
【0157】
防護能試験スケジュールは、表２に示した。組換えタンパク質抗原カクテルをＳＥＡ１アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合してワクチンを製造し、３週間の間隔で２回筋肉注射を施行し、２次注射後に２週間が経過したとき、各グループ別の２匹にアフリカ豚熱ウイルス（野生型ＡＳＦウイルス）を筋肉注射を通じてチャレンジ接種した。グループ別の残りの４匹は、アフリカ豚熱ウイルスを筋肉接種済みの豚と同じ飼育室で管理し、チャレンジ接種済みの豚から放出されるウイルスと接触させて、水平感染（ｈｏｒｉｚｏｎａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を誘導した（Ｓｅｎｔｉｎｅｌ）。チャレンジ接種後、毎日症状を観察し、感染症状（４１．１℃以上の高温）が現れた豚は、試験終了時点前に早期安楽死させ、血清を採取した。具体的には、頚静脈（ｊｕｇｕｌａｒ ｖｅｉｎ）または前大静脈（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｖｅｎａ ｃａｖａ）から３～５ｍＬの血清を収得し（１８～２０Ｇ、１ １／２ニードルを使用）、肺、肝、脾臓、腎臓、リンパ節、および膵臓などの感染した組織を分離した。
【0158】
【表2】
【0159】
チャレンジ接種による豚の体温変化および生存率の結果を図１１に示した。アフリカ豚熱ウイルスを直接チャレンジ接種した各群別の２匹は、いずれも、チャレンジ接種１週間となる時点の前後に死亡した。しかしながら、５種の抗原ワクチンを投与したグループ（Ｇ１）の非チャレンジ接種豚は、いずれも、４０．５℃未満の体温を示し、２週間全部生存した。一方、９種の抗原ワクチンを投与したグループ（Ｇ２）の非チャレンジ接種豚３匹は、高熱に起因して全部１１日ぶりに死亡し、対照群（Ｇ３）の非チャレンジ接種豚３匹のうち１匹は、症状がなく生存したが、１匹は、高熱に起因して１３日目に 死亡し、残りの１匹は、１１日目から高熱があったが、実験期間に設定した２週間は生存した。
【0160】
このような結果は、本発明による５種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０の組み合わせ）が、優れた豚熱ウイルス予防効果があることを示し、特に従来ＡＳＦウイルスワクチン抗原として使用されてきたｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ抗原タンパク質をさらに組み合わせることは（すなわち、９種の抗原ワクチン）、かえってワクチンの機能を阻害し、アフリカ豚熱の予防効果を低下させることを示唆する。
【0161】
実施例４．５種の抗原または９種の抗原ワクチン投与後、チャレンジ接種による血中ウイルス（Ｖｉｒｅｍｉａ）レベルの確認
引き続いて、実施例３のチャレンジ接種試験を行った豚の血中ウイルス（Ｖｉｒｅｍｉａ；「ウイルス血症」とも呼ばれる）レベルを測定し、本発明によるワクチンのアフリカ豚熱ウイルス予防効果を確認した。
引き続いて、実施例３のチャレンジ接種試験を行った豚の血中ウイルス（Ｖｉｒｅｍｉａ；「ウイルス血症」とも呼ばれる）レベルを測定し、本発明によるワクチンのアフリカ豚熱ウイルス予防効果を確認した。
【0162】
具体的には、血中ウイルスレベルを測定するために、チャレンジ接種後０、３、７、１０、および１４日が経過した時点に各豚から血清を抽出し、ＡＳＦウイルス特異的プライマーおよびプローブを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行った後、試料別Ｃｔ値を比較した。実験に使用したＡＳＦウイルス特異的プライマー配列は、下記の通りである：
【0163】
【表3】
【0164】
その結果、図１２に示されたように、５種の抗原ワクチンを投与した豚（Ｇ１）のうちＡＳＦウイルスを接触接種（ｃｏｎｔａｃｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）した豚は、接種後７日が経過するまで血中ＡＳＦウイルスレベルが非常に低いため、検出されず（ＵＤ）、接種後１０日となったとき、一部の豚でウイルスが検出されたが、非常に低いレベルであり、１４日目には検出されなかった。一方、９種の抗原ワクチンを投与した豚（Ｇ２）のうちＡＳＦウイルスを接触接種した豚は、接種後７日が経過したときからＡＳＦウイルスが検出され、１０日が経過したときには、血中ウイルスレベルが増加し、同じ時点の対照群グループに比べて、血中ウイルスレベルがさらに高くなったことが示されたところ、ワクチンを全く投与しないものに比べて、ウイルス予防効果がかえってさらに低下することを確認することができた。また、上述したように、９種の抗原ワクチンを投与した豚は、チャレンジ接種後１１日が経過したとき、熱症状が悪化し、事前に安楽死させた。
【0165】
前記結果は、本発明による５種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０の組み合わせ）が、ＡＳＦウイルスの感染および増殖を抑制し、優れた豚熱の予防効果を達成することができることを証明するものであり、特に従来ＡＳＦウイルスワクチン抗原に使用されてきたｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ抗原タンパク質をさらに組み合わせることは（すなわち、９種の抗原ワクチン）、かえってワクチンの効果を阻害し、ウイルスの感染および体内増殖を全く予防できないことを示す。
【0166】
実施例５．５種の抗原または９種の抗原ワクチン投与後、抗ＡＳＦＶ抗体のレベルの確認
次に、血清内抗ＡＳＦＶ抗体のレベルを確認するために、ワクチン抗原がコートされたプレートを用いてワクチン接種後に経時的な抗ｐ３０抗体の生成程度をすべての個体でモニタリングした（ワクチン接種後０、７、１４、２１、２８、および３５日目に実施する）。５種の抗原ワクチンを投与されたグループは、ワクチン接種後２１日目から抗ｐ３０抗体のレベルが検出され、ワクチン接種後２８日および３５日目には、ワクチンが投与されたすべての個体において高いレベルの抗ｐ３０抗体が検出され、９種の抗原ワクチンを投与されたグループより平均的に高い抗体反応が確認された（図２２）。
次に、血清内抗ＡＳＦＶ抗体のレベルを確認するために、ワクチン抗原がコートされたプレートを用いてワクチン接種後に経時的な抗ｐ３０抗体の生成程度をすべての個体でモニタリングした（ワクチン接種後０、７、１４、２１、２８、および３５日目に実施する）。５種の抗原ワクチンを投与されたグループは、ワクチン接種後２１日目から抗ｐ３０抗体のレベルが検出され、ワクチン接種後２８日および３５日目には、ワクチンが投与されたすべての個体において高いレベルの抗ｐ３０抗体が検出され、９種の抗原ワクチンを投与されたグループより平均的に高い抗体反応が確認された（図２２）。
【0167】
前記結果は、本願発明による５種および９種の抗原ワクチンがいずれも豚熱ウイルス抗原に対する抗体生成を誘導することができるが、特に５種の抗原ワクチンは、９種の抗原ワクチンに比べて、さらに高いレベルの抗体生成をさらに迅速に誘導できることを示す。
【0168】
以上説明したように、本発明者らは、植物体で発現させるためのアフリカ豚熱ウイルス特異タンパク質を発現するベクターを製作し、前記組換えタンパク質が組み合わせられたＡＳＦウイルスワクチンを豚に投与したとき、副作用なくＡＳＦウイルスに対する抗体の生成を安定的に誘導されることを確認した。特に、５種の抗原（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０）が組み合わせられた５種のワクチンを投与された豚は、ウイルスに露出した後にも、体重が安定的に増加し、ＡＳＦＶウイルス血症（ｖｉｒｅｍｉａ）や発熱が観察されず、１００％の生存率を示したところ、前記５種の抗原ワクチンが、ＡＳＦウイルスの感染および体内増殖を効果的に抑制し、アフリカ豚熱を抑制することができることを確認した。特に、前記５種の抗原ワクチンの抗体生成誘導効果は、９種の抗原ワクチン（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、ｐ３０、ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、およびＦ３１７Ｌ）に比べて優れていることが確認されたところ、これは、抗原タンパク質Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０の組み合わせが、従来のワクチンに比べて、優れたアフリカ豚熱の予防効果を達成することができることを意味する。したがって、本発明による５種の抗原ワクチンは、新規のアフリカ豚熱ウイルスワクチン組成物において多様に活用できることが期待される。
【0169】
上述した本発明の説明は例示のためのもので、本発明が属する技術分野において通常の知識を有した者は、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更しなくても他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できる。したがって、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的ではないものと理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【0170】
本発明の組換えアフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質は、植物体でも効果的に発現するだけでなく、高い水溶解性（Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を有していて、分離および精製が容易であり、また、体内で抗原として作用して、高い免疫原性を示すので、新規のアフリカ豚熱ウイルスワクチン組成物として使用できる。特に、本発明者らは、本発明の抗原タンパク質５種（Ｌｅｃｔｉｎ、ＣＤ２ｖ、ｐ５４、ｐ７２、およびｐ３０）を含むワクチン組成物が、その他の抗原タンパク質（ｐ１５、ｐ３５、Ｅ１９９Ｌ、Ｆ３１７Ｌなど）をさらに含むワクチン組成物に比べて、アフリカ豚熱の予防効果にさらに優れていることをチャレンジ接種実験を通じて確認したところ、本発明による組換えベクターおよびワクチン組成物は、畜産業界などにおいて広く活用されることが期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図5a】
【図5b】
【図6】
【図7a】
【図7b】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図10a】
【図10b】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】