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▶ リプリケイト バイオサイエンス，インコーポレイティドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】異種非構造タンパク質を有する改変アルファウイルス
(51)【国際特許分類】
C12N 15/40 20060101AFI20240925BHJP
C12N 15/86 20060101ALI20240925BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240925BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240925BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240925BHJP
A01K 67/0275 20240101ALI20240925BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20240925BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20240925BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240925BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240925BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240925BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240925BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20240925BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240925BHJP
A61K 51/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240925BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240925BHJP
【ＦＩ】
C12N15/40 ZNA
C12N15/86 Z
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12N7/01
A01K67/0275
C07K14/00
C12P21/00 C
A61K35/76
A61K35/12
A61K39/00 H
A61P37/04
A61P35/00
A61P31/00
A61K38/00
A61K45/00
A61K51/00 100
A61P37/02
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513722
(86)(22)【出願日】2022-09-01
(85)【翻訳文提出日】2024-04-25
(86)【国際出願番号】 US2022075853
(87)【国際公開番号】W WO2023034927
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】63/240,297
(32)【優先日】2021-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523031024
【氏名又は名称】リプリケイト バイオサイエンス，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100225598
【弁理士】
【氏名又は名称】桐島 拓也
(72)【発明者】
【氏名】ナサニエル スティーブン ワン
(72)【発明者】
【氏名】シゲキ ジョーセフ ミヤケ－ストーナー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA19
4C084BA03
4C084DC50
4C084MA24
4C084MA41
4C084MA52
4C084MA56
4C084MA59
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB021
4C084ZB031
4C084ZB071
4C084ZB072
4C084ZB091
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB321
4C084ZC032
4C084ZC191
4C084ZC411
4C084ZC712
4C085AA03
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG06
4C085GG08
4C085GG10
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB65
4C087BC83
4C087CA04
4C087CA08
4C087CA12
4C087MA24
4C087MA41
4C087MA56
4C087MA59
4C087MA63
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB02
4C087ZB03
4C087ZB07
4C087ZB26
4C087ZB32
4C087ZC19
4C087ZC41
4H045AA20
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、改変されたウイルスゲノム又はレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を含む核酸分子、それを含有する医薬組成物、及び、所望の生成物を細胞培養物中又は生体内で生成するためのそのような核酸分子及び組成物の使用を含む、分子ウイルス学分野に関する。また、必要とする対象において免疫応答を誘導するための方法、並びに、種々の健康状態を予防及び／又は治療するための方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アルファウイルス種の改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンをコードする核酸構築物であって、前記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの非構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部が、前記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である、核酸構築物。
【請求項2】
前記少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部が、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、もしくはそのいずれかの一部、又は上記のいずれかの組み合わせである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項3】
前記少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部が、同じアルファウイルス種の別の株由来である、請求項１又は請求項２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項4】
前記少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部が、別のアルファウイルス種由来である、請求項１又は請求項２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項5】
前記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンが、１又は複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠失している、請求項１～４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項6】
前記改変されたウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンが、１又は複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列のかなりの部分を欠失している、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項7】
前記改変されたウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンがウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない、請求項１～６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項8】
１又は複数の発現カセットをさらに含み、前記発現カセットのそれぞれが異種核酸配列に機能的に連結しているプロモーターを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項9】
前記発現カセットのうちの少なくとも１つが異種核酸配列に機能的に連結したサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項10】
前記ｓｇプロモーターが２６Ｓサブゲノムプロモーターである、請求項９に記載の核酸構築物。
【請求項11】
１又は複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項12】
前記ＵＴＲのうちの少なくとも１つが異種ＵＴＲである、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項13】
発現カセットの少なくとも１つが目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項14】
前記ＧＯＩが、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助用ポリペプチド、工業用酵素、及びレポーターポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１３に記載の核酸構築物。
【請求項15】
前記ＧＯＩが、抗体、抗原、免疫調節剤、酵素、シグナル伝達タンパク質、及びサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする、請求項１３～１４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項16】
前記ＧＯＩのコード配列が、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルで発現されるように最適化されている、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項17】
前記ＧＯＩのコード配列が、ＲＮＡ安定性が増強されるように最適化されている、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項18】
前記アルファウイルス種が、アウラウイルス（Ａｕｒａ ｖｉｒｕｓ）（ＡＵＲＡＶ）、ババンキウイルス（Ｂａｂａｎｋｉ ｖｉｒｕｓ）（ＢＡＢＶ）、バーマフォレストウイルス（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＢＦＶ）、ベバルウイルス（Ｂｅｂａｒｕ ｖｉｒｕｓ）（ＢＥＢＶ）、バギークリークウイルス（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ ｖｉｒｕｓ）、カイングアウイルス（Ｃａａｉｎｇｕａ ｖｉｒｕｓ）、カバソウウイルス（Ｃａｂａｓｓｏｕ ｖｉｒｕｓ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖｉｒｕｓ）（ＣＨＩＫＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥＶ）、エイラットウイルス（Ｅｉｌａｔ ｖｉｒｕｓ）、エバーグレーズウイルス（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＶＥＶ）、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＶ）、ゲタウイルス（Ｇｅｔａｈ ｖｉｒｕｓ）（ＧＥＴＶ）、ハイランズＪウイルス（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ ｖｉｒｕｓ）（ＨＪＶ）、キジラガッチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ ｖｉｒｕｓ）（ＫＹＺＶ）、マダリアガウイルス（Ｍａｄａｒｉａｇａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＤＶ）、マヤロウイルス（Ｍａｙａｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＹＶ）、ミデルブルグウイルス（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ）（ＭＩＤＶ）、モサオ・ダス・ペドラスウイルス（Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ Ｐｅｄｒａｓ ｖｉｒｕｓ）、ムカンボウイルス（Ｍｕｃａｍｂｏ ｖｉｒｕｓ）（ＭＵＣＶ）、ヌドゥムウイルス（Ｎｄｕｍｕ ｖｉｒｕｓ）（ＮＤＵＶ）、オニョンニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇ ｖｉｒｕｓ）（ＯＮＮＶ）、ピクスナウイルス（Ｐｉｘｕｎａ ｖｉｒｕｓ）（ＰＩＸＶ）、リオネグロウイルス（Ｒｉｏ Ｎｅｇｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＲＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）（ＲＲＶ）、サケ膵臓病ウイルス（Ｓａｌｍｏｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮＶ）、睡眠病ウイルス（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＤＶ）、ミナミゾウアザラシウイルス（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｌｅｐｈａｎｔ ｓｅａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＳＥＳＶ）、タイフォレストウイルス（Ｔａｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＴＦＶ）、トナテウイルス（Ｔｏｎａｔｅ ｖｉｒｕｓ）、トロカラウイルス（Ｔｒｏｃａｒａ ｖｉｒｕｓ）、ウナウイルス（Ｕｎａ ｖｉｒｕｓ）（ＵＮＡＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＷＥＥＶ）、及びワタロアウイルス（Ｗｈａｔａｒｏａ ｖｉｒｕｓ）（ＷＨＡＶ）からなる群から選択される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項19】
前記改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンがシンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮＶ）のものである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項20】
前記改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンがＳＩＮＶのガードウッド（Ｇｉｒｄｗｏｏｄ）株のものである、請求項１９に記載の核酸構築物。
【請求項21】
前記改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部がＳＩＮＶのＡＲ８６株由来である、請求項２０に記載の核酸構築物。
【請求項22】
前記少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部が、ｎｓＰ１、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、もしくはそのいずれかの一部、又は上記のいずれかの組み合わせである、請求項２０～２１のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項23】
前記改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンがＳＩＮＶのＡＲ８６株のものである、請求項１９に記載の核酸構築物。
【請求項24】
前記改変されたＳＩＮＶ－ＡＲ８６ゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部がＳＩＮＶのガードウッド株由来である、請求項２３に記載の核酸構築物。
【請求項25】
前記改変されたＳＩＮＶ－ＡＲ８６ゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部がＳＩＮＶのガードウッド株のｎｓＰ２由来である、請求項２３～２４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項26】
ベクターに組み込まれている、請求項１～２５のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項27】
前記ベクターが自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターである、請求項２６に記載の核酸構築物。
【請求項28】
配列番号１～４からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項29】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、組換え細胞。
【請求項30】
真核細胞である、請求項２９に記載の組換え細胞。
【請求項31】
動物細胞である、請求項３０に記載の組換え細胞。
【請求項32】
前記動物細胞が脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である、請求項３１に記載の組換え細胞。
【請求項33】
前記動物細胞が昆虫細胞である、請求項３１に記載の組換え細胞。
【請求項34】
前記昆虫細胞が蚊細胞である、請求項３３に記載の組換え細胞。
【請求項35】
哺乳類細胞である、請求項３２に記載の組換え細胞。
【請求項36】
ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、ＦＳ４細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ細胞）、ヒトＡ５４９細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒトＣＨＭＥ５細胞、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ヒト喉頭類表皮細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトＨＵＨ－７細胞、ヒトＭＲＣ－５細胞、ヒト筋細胞、ヒト内皮細胞、ヒトアストロサイト、ヒトマクロファージ細胞、ヒトＲＡＷ２６４．７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ９２９細胞、マウス結合組織細胞、マウス筋細胞、及びウサギ腎臓細胞からなる群から選択される、請求項３２に記載の組換え細胞。
【請求項37】
請求項２９～３６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの組換え細胞、及び培地を含む、細胞培養物。
【請求項38】
アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを機能化／操作するための方法であって、（ａ）非機能性のアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを準備すること；
（ｂ）前記非機能性アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの非構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部を、異なるアルファウイルス株由来の対応するｎｓＰ又はその一部の異種コード配列と置き換えることで、改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを作製すること；
（ｃ）前記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの機能性を評価すること；
（ｄ）前記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンがＲＮＡ複製及び／又は発現可能である場合に、前記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを機能的であると見なすこと、
を含む、方法。
【請求項39】
前記異種ｎｓＰ又はその一部が同じアルファウイルス種の別株由来である、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記異種ｎｓＰ又はその一部が別のアルファウイルス種由来である、請求項３８に記載の方法。
【請求項41】
前記異種ｎｓＰ又はその一部がｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、又はそのいずれかの一部である、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンが非機能性であることが、宿主細胞内での自己複製が不充分であることによって判定される、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの機能性の評価が、ＲＮＡ複製の検出、ウイルスタンパク質発現の検出、細胞変性効果（ＣＰＥ）の検出、及び異種導入遺伝子発現の検出からなる群から選択されるアッセイを含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、トランスジェニック動物。
【請求項45】
脊椎動物又は無脊椎動物である、請求項４４に記載のトランスジェニック動物。
【請求項46】
昆虫である、請求項４５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項47】
哺乳動物である、請求項４５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項48】
前記哺乳動物がヒト以外の哺乳動物である、請求項４６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項49】
（ｉ）請求項４４～４８のいずれか一項に記載のトランスジェニック動物を飼育すること、又は、（ｉｉ）請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む組換え細胞の培養を、前記組換え細胞がＧＯＩによってコードされるポリペプチドを産生する条件下で行うことを含む、目的ポリペプチドを生成する方法。
【請求項50】
対象において目的ポリペプチドを生成する方法であって、請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項51】
前記対象が脊椎動物又は無脊椎動物である、請求項４９～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記動物が昆虫である、請求項４９～５１に記載の方法。
【請求項53】
前記対象が哺乳類対象である、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記哺乳類対象がヒト対象である、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
請求項４９～５４のいずれか一項に記載の方法によって生成される、組換えポリペプチド。
【請求項56】
薬剤的に許容できる賦形剤、並びに：（ａ）請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物；
（ｂ）請求項２９～３６のいずれか一項に記載の組換え細胞；及び／又は
（ｃ）請求項５５に記載の組換えポリペプチド、
を含む、医薬組成物。
【請求項57】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物、及び薬剤的に許容できる賦形剤を含む、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項58】
請求項２９～３６のいずれか一項に記載の組換え細胞、及び薬剤的に許容できる賦形剤を含む、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項59】
請求項５５に記載の組換えポリペプチド、及び薬剤的に許容できる賦形剤を含む、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項60】
リポソーム製剤、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤、又はポリマーナノ粒子製剤にされた、請求項５６～５９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項61】
免疫原性組成物である、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項62】
前記免疫原性組成物がワクチンとして製剤化された、請求項６１に記載の医薬組成物。
【請求項63】
対象に対して実質的に非免疫原性である、請求項５６～６０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項64】
アジュバントとして製剤化された、請求項５６～６３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項65】
鼻腔内投与用、経皮投与用、腹腔内投与用、筋内投与用、リンパ節内投与用、腫瘍内投与用、関節内投与用、静脈内投与用、皮下投与用、腟内投与用、及び経口投与用のうちの１又は複数のために製剤化された、請求項５６～６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項66】
必要とする対象において薬力学的効果を誘導するための方法であって、（ａ）請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物；
（ｂ）請求項２９～３６のいずれか一項に記載の組換え細胞；
（ｃ）請求項５５に記載の組換えポリペプチド；及び／又は
（ｄ）請求項５６～６５のいずれか一項に記載の医薬組成物、
を含む組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項67】
前記薬力学的効果が前記対象における免疫応答を誘発することを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項68】
必要とする対象における健康状態を予防及び／又は治療するための方法であって、（ａ）請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物；
（ｂ）請求項２９～３６のいずれか一項に記載の組換え細胞；
（ｃ）請求項５５に記載の組換えポリペプチド；及び／又は
（ｄ）請求項５６～６４のいずれか一項に記載の医薬組成物、
を含む組成物を前記対象に予防目的又は治療目的で投与すること、を含む、方法。
【請求項69】
前記状態が増殖性疾患又は微生物感染症である、請求項６６～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記対象が、増殖性疾患もしくは微生物感染症に伴う状態を有する、又はそれを有する疑いがある、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
投与された前記組成物が前記対象におけるインターフェロン産生の増加をもたらす、請求項６６～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記組成物が、単独療法（単剤療法）として個々に、又は、第１の治療法として少なくとも１つの追加の治療法と組み合わせて、前記対象に投与される、請求項６６～７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
前記少なくとも１つの追加の治療法が、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、及び外科手術からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
薬力学的効果を誘導する、免疫応答を誘発する、健康状態もしくは微生物感染症を予防する、及び／又は、健康状態もしくは微生物感染症を治療するための、キットであって、（ａ）請求項１～２８のいずれか一項に記載の核酸構築物；
（ｂ）請求項２９～３６のいずれか一項に記載の組換え細胞；
（ｃ）請求項５５に記載の組換えポリペプチド；及び／又は
（ｄ）請求項５６～６５のいずれか一項に記載の医薬組成物、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月２日に出願された米国仮特許出願第６３／２４０，２９７号に基づく優先権の利益を主張するものである。上記出願の開示は、図面を含んで、その全体が参照によって本明細書に明示的に援用される。
本出願は、２０２１年９月２日に出願された米国仮特許出願第６３／２４０，２９７号に基づく優先権の利益を主張するものである。上記出願の開示は、図面を含んで、その全体が参照によって本明細書に明示的に援用される。
【0002】
本開示は、分子ウイルス学及び免疫学の分野に関し、特に、改変されたウイルスゲノム及びレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）をコードする核酸分子、それを含有する医薬組成物、並びに、所望の生成物を細胞培養物中又は生体内で生成するためのそのような核酸分子及び組成物の使用に関する。また、必要とする対象において薬力学的効果を誘導する、例えば、必要とする対象における免疫応答を誘発するための方法、並びに、様々な健康状態を予防及び／又は治療するための方法が、提供される。
【0003】
配列表の組み込み
添付の配列表中の材料は、参照によって本願に援用されるものとする。０５８４６２＿５０４００１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ＸＭＬという名称の添付の配列表ＸＭＬファイルは、２０２２年８月２８日に作成されたものであり、９５ＫＢである。
添付の配列表中の材料は、参照によって本願に援用されるものとする。０５８４６２＿５０４００１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ＸＭＬという名称の添付の配列表ＸＭＬファイルは、２０２２年８月２８日に作成されたものであり、９５ＫＢである。
【背景技術】
【0004】
近年、いくつかの異なる動物ウイルス群に対して、相同組換えによる、又はゲノムの直接操作による、遺伝子操作が行われた。ＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスの両方に逆遺伝学システムが利用可能になったことで、組換えウイルスを、例えば、ワクチン、発現ベクター、抗腫瘍薬、遺伝子治療ベクター、及び薬物送達媒体として使用する新たな展望が生まれた。
【0005】
例えば、培養された組換え細胞で異種タンパク質を発現するために、多くのウイルスベース発現ベクターが開発された。例えば、改変ウイルスベクターの、宿主細胞における遺伝子発現への応用が、拡大を続けている。これに関する最近の進展には、マルチサブユニットタンパク質複合体の生産、及び異種タンパク質生産を改善するためのタンパク質修飾酵素の共発現のための手法及びシステムのさらなる開発が含まれる。ウイルス発現ベクター技術に関する他の最近の進歩には、多くの高度なゲノム工学を応用した遺伝子発現の調節、ウイルスベクターの調製、インビボ遺伝子治療応用、ワクチン送達ベクターの作製などがある。
【0006】
したがって、ＲＮＡレプリコンをベースとした発現プラットフォームにおいて目的の産物を発現するための、より効率的な方法及びシステムが、尚も必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、全体として、増殖性疾患及び微生物感染症などの種々の健康状態の予防及び管理で使用するための、組換え核酸構築物及びそれを含む医薬組成物などの、免疫療法薬の開発に関する。特に、以下でより詳細に説明されるように、本開示のいくつかの実施形態は、とりわけ、少なくとも１つの異種の１つの非構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部のコード配列を含む組換えアルファウイルスをコードする核酸構築物を提供する。また、本明細書で開示される核酸構築物を含む組換え細胞、本明細書で開示される核酸構築物を含むトランスジェニック動物、本明細書で開示される核酸構築物を生成するための方法、目的の組換えポリペプチドをエキソビボ又はインビボで生成するための方法、及びそれによって生成された組換えポリペプチド、並びに、上記核酸構築物を含有する医薬組成物、上記組換え細胞を含有する医薬組成物、及び上記組換えポリペプチドを含有する医薬組成物が提供される。また、本開示の核酸構築物、本開示の組換え細胞、本開示の組換えポリペプチド、及び／又は本開示の医薬組成物を投与することを含む、免疫応答を誘導するための方法、並びに、必要とする対象における健康状態を予防及び／又は治療するための方法も、本明細書で提供される。
【0008】
本開示の１つの態様において、アルファウイルス種の改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を含み、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの非構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である、核酸構築物が、本明細書で提供される。
【0009】
本開示の核酸構築物の非限定的な実施形態は、以下の特徴のうちの１又は複数を含むことがある。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、もしくはそのいずれかの一部、又は上記のいずれかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、同じアルファウイルス種の別株由来である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、別のアルファウイルス種由来である。
【0010】
いくつかの実施形態では、改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、１又は複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を含んでいない。いくつかの実施形態では、改変されたウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンは、１又は複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列のかなりの部分を含んでいない。いくつかの実施形態では、改変されたウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含んでいない。
【0011】
いくつかの実施形態では、本開示の改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、それぞれが異種核酸配列に機能的に連結したプロモーターを含む、１又は複数の発現カセットをさらに含む。いくつかの実施形態では、これらの発現カセットの少なくとも１つは、異種核酸配列に機能的に連結したサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、このｓｇプロモーターは２６Ｓサブゲノムプロモーターである。いくつかの実施形態では、本開示の改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンは、１又は複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、これらのＵＴＲの少なくとも１つは異種ＵＴＲである。
【0012】
いくつかの実施形態では、発現カセットの少なくとも１つは、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、上記ＧＯＩは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助用ポリペプチド、工業用酵素、及びレポーターポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、上記ＧＯＩは、抗体、抗原、免疫調節剤、酵素、シグナル伝達タンパク質、及びサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、上記ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルで発現されるように最適化されている。いくつかの実施形態では、上記ＧＯＩのコード配列は、ＲＮＡ安定性が増強されるように最適化されている。
【0013】
いくつかの実施形態では、本開示の改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、アウラウイルス（Ａｕｒａ ｖｉｒｕｓ）（ＡＵＲＡＶ）、ババンキウイルス（Ｂａｂａｎｋｉ ｖｉｒｕｓ）（ＢＡＢＶ）、バーマフォレストウイルス（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＢＦＶ）、ベバルウイルス（Ｂｅｂａｒｕ ｖｉｒｕｓ）（ＢＥＢＶ）、バギークリークウイルス（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ ｖｉｒｕｓ）、カイングアウイルス（Ｃａａｉｎｇｕａ ｖｉｒｕｓ）、カバソウウイルス（Ｃａｂａｓｓｏｕ ｖｉｒｕｓ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖｉｒｕｓ）（ＣＨＩＫＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥＶ）、エイラットウイルス（Ｅｉｌａｔ ｖｉｒｕｓ）、エバーグレーズウイルス（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＶＥＶ）、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＶ）、ゲタウイルス（Ｇｅｔａｈ ｖｉｒｕｓ）（ＧＥＴＶ）、ハイランズＪウイルス（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ ｖｉｒｕｓ）（ＨＪＶ）、キジラガッチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ ｖｉｒｕｓ）（ＫＹＺＶ）、マダリアガウイルス（Ｍａｄａｒｉａｇａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＤＶ）、マヤロウイルス（Ｍａｙａｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＹＶ）、ミデルブルグウイルス（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ）（ＭＩＤＶ）、モサオ・ダス・ペドラスウイルス（Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ Ｐｅｄｒａｓ ｖｉｒｕｓ）、ムカンボウイルス（Ｍｕｃａｍｂｏ ｖｉｒｕｓ）（ＭＵＣＶ）、ヌドゥムウイルス（Ｎｄｕｍｕ ｖｉｒｕｓ）（ＮＤＵＶ）、オニョンニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇ ｖｉｒｕｓ）（ＯＮＮＶ）、ピクスナウイルス（Ｐｉｘｕｎａ ｖｉｒｕｓ）（ＰＩＸＶ）、リオネグロウイルス（Ｒｉｏ Ｎｅｇｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＲＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）（ＲＲＶ）、サケ膵臓病ウイルス（Ｓａｌｍｏｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮＶ）、睡眠病ウイルス（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＤＶ）、ミナミゾウアザラシウイルス（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｌｅｐｈａｎｔ ｓｅａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＳＥＳＶ）、タイフォレストウイルス（Ｔａｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＴＦＶ）、トナテウイルス（Ｔｏｎａｔｅ ｖｉｒｕｓ）、トロカラウイルス（Ｔｒｏｃａｒａ ｖｉｒｕｓ）、ウナウイルス（Ｕｎａ ｖｉｒｕｓ）（ＵＮＡＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＷＥＥＶ）、及びワタロアウイルス（Ｗｈａｔａｒｏａ ｖｉｒｕｓ）（ＷＨＡＶ）からなる群から選択されるアルファウイルス種のものである。
【0014】
いくつかの実施形態では、本開示の改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮＶ）のものである。いくつかの実施形態では、本開示の改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンは、ＳＩＮＶのガードウッド（Ｇｉｒｄｗｏｏｄ）株のものである。
【0015】
いくつかの実施形態では、改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）の少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ＳＩＮＶのＡＲ８６株由来である。いくつかの実施形態では、改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ＳＩＮＶのガードウッド株由来である。
【0016】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、もしくはそのいずれかの一部、又は上記のいずれかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、ＳＩＮＶのＡＲ８６株のものである。いくつかの実施形態では、改変されたＳＩＮＶ－ＡＲ８６ゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ＳＩＮＶのガードウッド株由来である。いくつかの実施形態では、改変されたＳＩＮＶ－ＡＲ８６ゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ＳＩＮＶのガードウッド株のｎｓＰ２由来である。
【0017】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、ベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態では、このベクターは自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターである。
【0018】
本開示のいくつかの実施形態では、核酸構築物は、配列番号１～４からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
【0019】
１つの態様において、本明細書で開示されているような核酸構築物を含む組換え細胞が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、上記動物細胞は脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、上記動物細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、上記昆虫細胞は蚊細胞である。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、ＦＳ４細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ細胞）、ヒトＡ５４９細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒトＣＨＭＥ５細胞、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ヒト喉頭類表皮細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトＨＵＨ－７細胞、ヒトＭＲＣ－５細胞、ヒト筋細胞、ヒト内皮細胞、ヒトアストロサイト、ヒトマクロファージ細胞、ヒトＲＡＷ２６４．７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ９２９細胞、マウス結合組織細胞、マウス筋細胞、及びウサギ腎臓細胞からなる群から選択される。また、関連する態様において、本明細書で開示されるような少なくとも１つの組換え細胞と、培地とを含む細胞培養物も、提供される。
【0020】
別の態様において、本明細書に記載されているような核酸構築物を含むトランスジェニック動物が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、上記動物は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、上記動物は昆虫である。いくつかの実施形態では、上記動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、上記哺乳動物はヒト以外の哺乳動物である。別の態様において、目的ポリペプチドを生成するための方法であって、（ｉ）本明細書で開示されるようなトランスジェニック動物の飼育；又は、（ｉｉ）本明細書で開示されるような核酸構築物を含む組換え細胞の培養を、上記のトランスジェニック動物又は組換え細胞がＧＯＩによってコードされるポリペプチドを産生する条件下で行うことを含む、方法が、本明細書で提供される。
【0021】
別の態様において、対象において目的ポリペプチドを生成するための方法であって、本明細書で開示されるような核酸構築物を上記対象に投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、上記対象は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、上記対象は昆虫である。いくつかの実施形態では、上記昆虫は蚊である。いくつかの実施形態では、上記対象は哺乳類対象である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類対象はヒト対象である。さらに別の態様においては、本開示の方法によって生成された組換えポリペプチドが、本明細書で提供される。
【0022】
さらに別の態様において、薬剤的に許容できる賦形剤と、ａ）本開示の核酸構築物；ｂ）本開示の組換え細胞；及び／又はｃ）本開示の組換えポリペプチドと、を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。
【0023】
本開示の医薬組成物の非限定的且つ例示的な実施形態は、以下の特徴のうちの１又は複数を含む可能性がある。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような核酸構築物と、薬剤的に許容できる賦形剤と、を含む組成物が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような組換え細胞と、薬剤的に許容できる賦形剤と、を含む組成物が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、上記組成物は、本明細書で開示されるような組換えポリペプチドと、薬剤的に許容できる賦形剤と、を含む。いくつかの実施形態では、リポソーム製剤、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤、又はポリマーナノ粒子製剤にされた組成物が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、上記組成物は免疫原性組成物である。いくつかの実施形態では、上記免疫原性組成物はワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態では、上記免疫原性組成物は対象に対して実質的に非免疫原性である。いくつかの実施形態では、上記医薬組成物はアジュバントとして製剤化される。いくつかの実施形態では、上記医薬組成物は、鼻腔内投与用、リンパ節内投与用、経皮投与用、腹腔内投与用、筋内投与用、腫瘍内投与用、関節内投与用、静脈内投与用、皮下投与用、腟内投与用、眼内投与用、経口投与用、及び直腸内投与用のうちの１又は複数のために製剤化される。
【0024】
別の態様では、アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を機能化／操作するための方法であって、（ａ）非機能性のアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを準備すること；（ｂ）前記非機能性アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの非構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部を、異なるアルファウイルス株由来の対応するｎｓＰ又はその一部の異種コード配列と置き換えることで、改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを作製すること；（ｃ）前記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの機能性を評価すること；並びに、（ｄ）前記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンがＲＮＡ複製及び／又は発現可能である場合に、前記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを機能的であると見なすこと、を含む、方法が、本明細書で提供される。
【0025】
本開示のアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を機能化／操作するための方法の非限定的且つ例示的な実施形態は、以下の特徴のうちの１又は複数を含む可能性がある。いくつかの実施形態では、異種ｎｓＰ又はその一部は、同じアルファウイルス種の別株由来である。いくつかの実施形態では、異種ｎｓＰ又はその一部は、別のアルファウイルス種由来である。いくつかの実施形態では、異種ｎｓＰ又はその一部は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、又はそのいずれかの一部である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンが非機能性であることは、宿主細胞内での自己複製が不充分であることによって判定される。いくつかの実施形態では、改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの機能性の評価は、ＲＮＡ複製の検出、ウイルスタンパク質発現の検出、細胞変性効果（ＣＰＥ）の検出、及び異種導入遺伝子発現の検出からなる群から選択されるアッセイを含む。
【0026】
別の態様において、対象において薬力学的効果を誘導するための方法、特に、必要とする対象における免疫応答を誘発するための方法であって、ａ）本開示の核酸構築物；ｂ）本開示の組換え細胞；ｃ）本開示の組換えポリペプチド；及び／又はｄ）本開示の医薬組成物を含む組成物を上記対象に投与すること、を含む方法が、本明細書で提供される。
【0027】
さらに別の態様において、必要とする対象における健康状態を予防及び／又は治療するための方法であって、ａ）本開示の核酸構築物；ｂ）本開示の組換え細胞；ｃ）本開示の組換えポリペプチド；及び／又はｄ）本開示のいずれか１つの医薬組成物を含む組成物を上記対象に予防目的又は治療目的で投与すること、を含む方法が、本明細書で提供される。
【0028】
本開示の方法の非限定的且つ例示的な実施形態は、以下の特徴のうちの１又は複数を含む可能性がある。いくつかの実施形態では、上記状態は増殖性疾患又は微生物感染症である。いくつかの実施形態では、上記対象は、増殖性疾患もしくは微生物感染症に伴う状態を有する、又はそれを有する疑いがある。いくつかの実施形態では、投与された上記組成物は上記対象におけるインターフェロン産生の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、上記組成物は、単独療法（単剤療法）として個々に、又は、第１の治療法として少なくとも１つの追加の治療法と組み合わせて、上記対象に投与される。いくつかの実施形態では、上記少なくとも１つの追加の治療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、及び外科手術からなる群から選択される。
【0029】
さらに別の態様において、ａ）本開示の核酸構築物；ｂ）本開示の組換え細胞；ｃ）本開示の組換えポリペプチド；及び／又はｄ）本開示の医薬組成物を含む、薬力学的効果を誘導する、免疫応答を誘発する、健康状態もしくは微生物感染症を予防する、及び／又は、健康状態もしくは微生物感染症を治療するための、キットが、本明細書で提供される。
【0030】
本明細書に記載の態様及び実施形態のそれぞれは、実施形態又は態様の文脈から明示的又は明白に排除されていない限り、一緒に使用することが可能である。
【0031】
上記の概要は例示のみを目的としており、なんら限定的であることを意図していない。本明細書に記載の例示的な実施形態及び特徴に加えて、図面及び発明を実施するための形態及び特許請求の範囲からも、本開示のさらなる態様、実施形態、目的、及び特徴は充分に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【0032】
【図1】図１は、本開示のいくつかの実施形態に従ったアルファウイルスゲノム設計の４つの非限定例の模式図である。非構造タンパク質であるｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４が示されている。これらのアルファウイルス設計はそれぞれ、（ｉ）２６Ｓサブゲノムプロモーターの制御下に置かれた異種の目的遺伝子（ＧＯＩ）；並びに、（ｉｉ）ＳＩＮＶのＡＲ８６株由来のネイティブな５’ＵＴＲ配列及び３’ＵＴＲ配列を含有する。ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１において、構造タンパク質のｎｓＰ１、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４はＳＩＮＶのＡＲ８６株由来であり、ｎｓＰ２はＳＩＮＶのガードウッド株由来である。ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド２において、ｎｓＰ４はＡＲ８６株由来であり、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ３はガードウッド株由来である。ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド３において、ｎｓＰ３はＡＲ８６株由来であり、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ４はガードウッド株由来である。ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド４において、ｎｓＰ１はＡＲ８６株由来であり、及びｎｓＰ２、ｎｓＰ３、一方、ｎｓＰ４はガードウッド由来である。
【図2B】図２Ｂは、２６Ｓサブゲノムプロモーターの制御下に置かれた、例示的なＧＯＩ、例えば、インフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ１の赤血球凝集素前駆物質（ＨＡ）（Ｈ５Ｎ１ ＨＡ）、のコード配列を含む、図１に記載されたシンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１ベクターの模式構造である。
【図3B】図３Ｂは、２６Ｓサブゲノムプロモーターの制御下に置かれた、例示的なＧＯＩ、例えば、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ、のコード配列を含む、図１に記載されたシンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド２ベクターの模式構造である。
【図4B】図４Ｂは、２６Ｓサブゲノムプロモーターの制御下に置かれた、例示的なＧＯＩ、例えば、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ、のコード配列を含む、図１に記載されたシンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド3ベクターの模式構造である。
【図5B】図５Ｂは、２６Ｓサブゲノムプロモーターの制御下に置かれた、例示的なＧＯＩ、例えば、Ｈ５Ｎ１ ＨＡ、のコード配列を含む、図１に記載されたシンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド４ベクターの模式構造である。
【図2】図６は、不完全なｎｓＰ配列を、異種アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン由来の対応する機能的なｎｓＰと置き換えることで、非機能的なアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を機能化できることを実証するために行われた実験の結果をグラフでまとめたものである。図６は、本開示のいくつかの実施形態に従った例示的なアルファウイルスゲノム設計物を用いて形質転換されたＢＨＫ－２１細胞の、等高線プロットを示している。これらの実験では、蛍光フローサイトメトリーでｄｓＲＮＡ＋細胞の頻度を定量化するために、これらのアルファウイルスゲノム設計物をＢＨＫ－２１細胞にエレクトロポレーションによってそれぞれ導入し、形質転換の２０時間後、細胞を固定及び透過処理し、ＰＥ結合型抗二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）マウスモノクローナル抗体（Ｊ２、Ｓｃｉｃｏｎｓ）を用いて染色した。これらのアルファウイルスゲノム設計物の、ＲＮＡ複製を行って、ｄｓＲＮＡの生成をもたらす能力が示されている。
【図3】図７は、異種非構造タンパク質遺伝子を含むｓｒＲＮＡベクターからＧＯＩの発現を検出できることを実証するために行われた実験の結果をグラフでまとめたものである。図７は、本開示のいくつかの実施形態に従ったｓｒＲＮＡベクター設計物で形質転換された細胞における、トリインフルエンザＡ Ｈ５Ｎ１のＨＡポリペプチドの相対発現の定量化を示す棒グラフである。これらの実験では、蛍光フローサイトメトリーでＨ５Ｎ１＋細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を定量化するために、これらのアルファウイルスｓｒＲＮＡ設計物をＢＨＫ－２１細胞にエレクトロポレーションによってそれぞれ導入し、形質転換の２０時間後、細胞を固定及び透過処理し、ＡＰＣ結合型抗Ｈ５Ｎ１マウスモノクローナル抗体（２Ｂ７、アブカム社；ＡＰＣ：アロフィコシアニン）を用いて染色した。
【図8A】図８Ａ～図８Ｂは、本開示のいくつかの実施形態にしたがって設計された異種非構造タンパク質遺伝子を含有する改変ｓｒＲＮＡベクターを用いることで、２種の例示的な生物活性タンパク質：（ｉ）インターロイキン－１受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＬ－１ＲＡ）、及び（ｉｉ）インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を発現することができることを実証する実験の結果を模式的にまとめたものである。図８Ａ～図８Ｂは、これらのｓｒＲＮＡで形質転換されたＢＨＫ－２１細胞から分泌されたタンパク質の生理活性の定量化を示す棒グラフである。図８Ａ～図８Ｂに示されているｓｒＲＮＡは、それぞれ２つのタンパク質ＩＬ－１ＲＡ及びＩＬ－１２を２つの異なる構成でコードしている、ＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１ｓｒＲＮＡ（ＲＢＩ３０７、ＲＢＩ３０８）である。また、以下の通りの４つのＶＥＥＶベースｓｒＲＮＡコントロールもこれらの実験に含めた：ＩＬ－１ＲＡ及びＩＬ－１２の両方を２つの構成でコードしているＶＥＥＶ ｓｒＲＮＡ（ＲＢＩ２９９、ＲＢＩ３００）、並びに、コントロール導入遺伝子を含むＶＥＥＶ ｓｒＲＮＡ（ＲＢＩ２９６、ＲＢＩ２９８）。また、それぞれ２つのタンパク質ＩＬ－１ＲＡ及びＩＬ－１２を２つの異なる構成でコードしている、２つのＳＩＮＶガードウッドベースｓｒＲＮＡコントロール（ＲＢＩ３０９、ＲＢＩ３１０）も、これらの実験に含めた。図８Ａは、ｓｒＲＮＡによる形質転換の２４時間後及び４８時間後の細胞培地における、生物活性ＩＬ－１ＲＡの定量化を示している。
【図8B】図８Ａ～図８Ｂは、本開示のいくつかの実施形態にしたがって設計された異種非構造タンパク質遺伝子を含有する改変ｓｒＲＮＡベクターを用いることで、２種の例示的な生物活性タンパク質：（ｉ）インターロイキン－１受容体アンタゴニストタンパク質（ＩＬ－１ＲＡ）、及び（ｉｉ）インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を発現することができることを実証する実験の結果を模式的にまとめたものである。図８Ａ～図８Ｂは、これらのｓｒＲＮＡで形質転換されたＢＨＫ－２１細胞から分泌されたタンパク質の生理活性の定量化を示す棒グラフである。図８Ａ～図８Ｂに示されているｓｒＲＮＡは、それぞれ２つのタンパク質ＩＬ－１ＲＡ及びＩＬ－１２を２つの異なる構成でコードしている、ＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１ｓｒＲＮＡ（ＲＢＩ３０７、ＲＢＩ３０８）である。また、以下の通りの４つのＶＥＥＶベースｓｒＲＮＡコントロールもこれらの実験に含めた：ＩＬ－１ＲＡ及びＩＬ－１２の両方を２つの構成でコードしているＶＥＥＶ ｓｒＲＮＡ（ＲＢＩ２９９、ＲＢＩ３００）、並びに、コントロール導入遺伝子を含むＶＥＥＶ ｓｒＲＮＡ（ＲＢＩ２９６、ＲＢＩ２９８）。また、それぞれ２つのタンパク質ＩＬ－１ＲＡ及びＩＬ－１２を２つの異なる構成でコードしている、２つのＳＩＮＶガードウッドベースｓｒＲＮＡコントロール（ＲＢＩ３０９、ＲＢＩ３１０）も、これらの実験に含めた。図８Ｂは、ｓｒＲＮＡによる形質転換の２４時間後及び４８時間後の細胞培地における、生物活性ＩＬ－１２の定量化を示している。
【図9A】図９Ａ～図９Ｂは、例示的なウイルス抗原をコードするｓｒＲＮＡパネルの、インビボにおける免疫原性を示す棒グラフであり、この例示的なウイルス抗原は狂犬病ウイルスのエンベロープ糖タンパク質Ｇ（ＲＡＢＶ－Ｇ）である。このパネルには、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥ．ＴＣ８３）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖｉｒｕｓ）Ｓ２７株（ＣＨＩＫ．Ｓ２７）及びＤＲＤＥ－０６株（ＣＨＩＫ．ＤＲＤＥ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）ガードウッド株（ＳＩＮ．ＧＷ）及びＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１株（ＳＩＮ．ＡＲ８６）、並びに東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥ．ＦＬ９３）由来のｓｒＲＮＡが含まれた。図９Ａは、２回の免疫化後のＥＬＩＳｐｏｔによって評価された、抗原特異的な脾臓Ｔ細胞応答の定量化を示している。
【図9B】図９Ａ～図９Ｂは、例示的なウイルス抗原をコードするｓｒＲＮＡパネルの、インビボにおける免疫原性を示す棒グラフであり、この例示的なウイルス抗原は狂犬病ウイルスのエンベロープ糖タンパク質Ｇ（ＲＡＢＶ－Ｇ）である。このパネルには、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥ．ＴＣ８３）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖｉｒｕｓ）Ｓ２７株（ＣＨＩＫ．Ｓ２７）及びＤＲＤＥ－０６株（ＣＨＩＫ．ＤＲＤＥ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）ガードウッド株（ＳＩＮ．ＧＷ）及びＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１株（ＳＩＮ．ＡＲ８６）、並びに東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥ．ＦＬ９３）由来のｓｒＲＮＡが含まれた。図９Ｂは、２回の免疫化後の血清から得られた抗狂犬病中和抗体の力価を示している。
【図10A】図１０Ａ～図１０Ｃは、ワクチンとして使用するための、例えば、対象における免疫応答を誘発するための、例示的な腫瘍関連抗原をコードするｓｒＲＮＡパネルの、インビボにおける免疫原性を示す棒グラフである。このパネルには、シンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１（ＳＩＮ．ＡＲ８６）由来のｓｒＲＮＡ、並びに、５種の他のアルファウイルス（ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ．ＴＣ８３）、チクングニアウイルスのＳ２７株（ＣＨＩＫ．Ｓ２７）及びＤＲＤＥ－０６株（ＣＨＩＫ．ＤＲＤＥ）、シンドビスウイルスのガードウッド株（ＳＩＮ．ＧＷ）、並びに東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ．ＦＬ９３））由来のｓｒＲＮＡが含まれた。それぞれのｓｒＲＮＡは、３つのポリペプチドをコードする配列（エストロゲン受容体１（ＥＳＲ１）、ヒト上皮増殖因子２（ＨＥＲ２）、及びヒト上皮増殖因子２（ＨＥＲ３）の配列）を含む。図１０Ａ～図１０Ｃは、２回の免疫化を受けたマウスにおけるＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて測定された、これらの３つの抗原に対する脾臓Ｔ細胞応答を示しており、それぞれの被験抗原間の統計比較を含む。
【図10B】図１０Ａ～図１０Ｃは、ワクチンとして使用するための、例えば、対象における免疫応答を誘発するための、例示的な腫瘍関連抗原をコードするｓｒＲＮＡパネルの、インビボにおける免疫原性を示す棒グラフである。このパネルには、シンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１（ＳＩＮ．ＡＲ８６）由来のｓｒＲＮＡ、並びに、５種の他のアルファウイルス（ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ．ＴＣ８３）、チクングニアウイルスのＳ２７株（ＣＨＩＫ．Ｓ２７）及びＤＲＤＥ－０６株（ＣＨＩＫ．ＤＲＤＥ）、シンドビスウイルスのガードウッド株（ＳＩＮ．ＧＷ）、並びに東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ．ＦＬ９３））由来のｓｒＲＮＡが含まれた。それぞれのｓｒＲＮＡは、３つのポリペプチドをコードする配列（エストロゲン受容体１（ＥＳＲ１）、ヒト上皮増殖因子２（ＨＥＲ２）、及びヒト上皮増殖因子２（ＨＥＲ３）の配列）を含む。図１０Ａ～図１０Ｃは、２回の免疫化を受けたマウスにおけるＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて測定された、これらの３つの抗原に対する脾臓Ｔ細胞応答を示しており、それぞれの被験抗原間の統計比較を含む。
【図10C】図１０Ａ～図１０Ｃは、ワクチンとして使用するための、例えば、対象における免疫応答を誘発するための、例示的な腫瘍関連抗原をコードするｓｒＲＮＡパネルの、インビボにおける免疫原性を示す棒グラフである。このパネルには、シンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１（ＳＩＮ．ＡＲ８６）由来のｓｒＲＮＡ、並びに、５種の他のアルファウイルス（ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ．ＴＣ８３）、チクングニアウイルスのＳ２７株（ＣＨＩＫ．Ｓ２７）及びＤＲＤＥ－０６株（ＣＨＩＫ．ＤＲＤＥ）、シンドビスウイルスのガードウッド株（ＳＩＮ．ＧＷ）、並びに東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ．ＦＬ９３））由来のｓｒＲＮＡが含まれた。それぞれのｓｒＲＮＡは、３つのポリペプチドをコードする配列（エストロゲン受容体１（ＥＳＲ１）、ヒト上皮増殖因子２（ＨＥＲ２）、及びヒト上皮増殖因子２（ＨＥＲ３）の配列）を含む。図１０Ａ～図１０Ｃは、２回の免疫化を受けたマウスにおけるＥＬＩＳｐｏｔ分析を用いて測定された、これらの３つの抗原に対する脾臓Ｔ細胞応答を示しており、それぞれの被験抗原間の統計比較を含む。
【発明を実施するための形態】
【0033】
特に、組換え細胞において、例えばワクチン及び治療用ポリペプチドなどの組換えポリペプチドを発現するのに適した、優れた発現ポテンシャルを有するウイルス発現系が、本明細書で提供される。例えば、本開示のいくつかの実施形態は、アルファウイルス種の改変されたゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）を含有する、例えば発現コンストラクト及び発現ベクターなどの、核酸構築物であって、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの非構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である、核酸構築物に関する。また、本開示のいくつかの実施形態では、目的遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされた目的ポリペプチドをコードする発現カセットを１又は複数含む、ウイルスベースの発現ベクターが提供される。さらに、本明細書で開示される核酸構築物のうちの１又は複数を含むように遺伝子操作された組換え細胞が提供される。そのような組換え細胞から生じた生体材料及び組換え生成物も、本出願の範囲内である。また、必要とする対象において薬力学的効果を誘導する 有用な、例えば、必要とする対象における免疫応答を誘発するための、組成物及び方法、並びに、様々な健康状態を予防及び／又は治療するための方法も、提供される。
【0034】
ＲＮＡウイルス（例えば、アルファウイルス）ベースの自己増幅性のＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ又はレプリコン）は、頑健性のある発現系として用いることができる。例えば、ＳＩＮＶなどのアルファウイルスをウイルス発現ベクターとして使用する利点は、組換え宿主細胞において大量の組換えタンパク質の合成を指示できる点にあるという報告がなされている。利点の中でも特に、治療用単鎖抗体などのポリペプチドは、インビボで高レベルで発現されたならば、最も効果的となり得る。加えて、培養液中（エキソビボ）の細胞から精製された組換え抗体を生成する上で、レプリコンＲＮＡからの高タンパク質発現は、抗体産物の全収率を増加させ得る。さらに、発現されているタンパク質がワクチン抗原であるならば、高レベル発現は、最も頑健性のある免疫応答をインビボで誘導し得る。
【0035】
アルファウイルスは、宿主細胞内での自身の複製に影響を与えるために、自身のＵＴＲ、構造領域、及び非構造領域に含まれるモチーフを利用する。これらの領域は宿主細胞の自然免疫を回避するための機構も含んでいる。しかし、アルファウイルス種の間では、例えば、免疫回避の機構、組織トロピズム、異種指向性の宿主（ｘｅｎｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｓｔ）、並びに疾患の症状及び重症度などにおいて、著しい違いがあることが報告されている。
【0036】
アルファウイルスの非構造領域と構造領域における宿主細胞減弱因子の有無の違いを考慮すると、合成ベクターにおいて目的遺伝子発現の発現を可能にするために構造遺伝子を欠失させると、個々のベクターに対する影響にばらつきがでることとなる。非構造領域に異なる宿主減弱因子を有する合成レプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、発現された目的遺伝子に対する免疫応答の誘導に優劣差がある。非病原性であるシンドビスガードウッド株がＳＴＡＴ１を阻害できないことは、この株を、コードされたタンパク質に対する頑健性のある免疫応答を形成することなく、組換えタンパク質を発現するのに有利なベクターとしている。これらの個々のベクターがもたらす利点は、現在まで全くの未解明であり、予測もされていなかった。
【0037】
以下でより詳細に説明されるように、初期の知見によれば、公開されているアルファウイルスのゲノムデータでは、構造タンパク質をコードする核酸配列を目的遺伝子（ＧＯＩ）と直接置換することで、自己複製ＲＮＡ及び導入遺伝子発現レプリコンを得ることが可能なヌクレオチド配列は必ずしも得られない。特に、公開されているアルファウイルスゲノムの多くは、非機能的であること、例えば、複製すること及び／又は導入遺伝子を発現することができないこと、が判明した。以下の実施例でより詳細に説明されるように、特に、欠陥のあるアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの非構造タンパク質（ｎｓＰ）配列を異なるアルファウイルス株由来の対応するｎｓＰ配列と置換することで、機能的である改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを生成することによって、欠陥のある（例えば、非機能的な）アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を機能化するために有用な新規手順が、本明細書で提供される。
【0038】
十分に理解されていないことであるが、完全長ウイルスと合成レプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、同じ複製能を有していない。特に、公開されている供給源から得られる完全長ウイルスとレプリコンの多くは、機能に欠陥がある。現在、欠陥のあるアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを機能化する（例えば、機能的にする）ための改変アプローチは、株間で分岐した病原性に関連した１又は複数の重要な点変異、例えば、機能的株（例えば、ガードウッド）と非機能的株（例えば、ＡＲ８６）との間で多様性を示す変異、を戻すことである。しかし、この戦略は失敗することが多く、あるいは、解決策が自由裁量に辿り着き、このことは、株間にかなり多くの性質不明の、したがって予測不能な配列分岐があることを示している。したがって、（単に点変異を戻したり、あるいは任意の領域を選択してキメラを作製するのではなく）機能的なアルファウイルス株を識別するための、より迅速で効率的な方法が必要とされている。
【0039】
上記のように、ウイルス複製中、ｎｓＰポリタンパク質複合体のｎｓＰサブユニット（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）のそれぞれは、別々に処理されて個々のタンパク質になる。これらのタンパク質はその後集合してｎｓＰポリタンパク質複合体を形成し、これがゲノム及びサブゲノムの転写機能を実行する。特定の理論に束縛されるものではないが、仮説によれば、それぞれのｎｓＰは、それ自体が、レプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）の機能全体に寄与しているという点で、それなりに生物学的に独立しており、別個のモジュールユニットとして扱われるべきである。以下でより詳細に説明されるように、本開示のいくつかの実施形態は、非機能的アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを機能化する方法であって、ｎｓＰサブユニットのそれぞれを、別個のモジュールユニットとして扱い、別のウイルス（例えば、別の種又は同一種の別の株）由来の対応するモジュールユニットによって置換（交換）することで、新規の特徴を有するキメラウイルスを得ることができる、方法に関する。本開示の方法は、以下の最小セットにおいてｎｓＰを交換する効果の、新たなコンビナトリアル手法による見方を可能にする：（１）インビトロで機能しないレプリコン；及び（２）インビトロで機能しないレプリコン。このアプローチでは、多数の新規構築物を作製する必要なく、任意の所与の株においてどのｎｓＰが問題起こしているかについての情報が、迅速に得られる。したがって、本明細書に記載の新規手順は、現在知られているいずれの方法と比較しても顕著に改善された、迅速な、技術的に実行可能な方法である。
【0040】
以下でより詳細に説明されるように、本開示のいくつかの実施形態は、１又は複数の異種目的遺伝子（ＧＯＩ）を発現するように操作された異種非構造タンパク質遺伝子を含む自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）ベクターに関する。例えば、１又は複数の異種非構造タンパク質遺伝子を含むｓｒＲＮＡベクター内の構造ポリタンパク質遺伝子を、１又は複数のＧＯＩと置換することが可能であることが分かった。１つの例では、異種非構造タンパク質遺伝子を含むシンドビスｓｒＲＮＡベクター（ＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１）が、構造ポリタンパク質遺伝子を合成ヒトＩＬ－１ＲＡ遺伝子又はＩＬ－１２遺伝子カセットと置換するように操作されて、トランスフェクトＢＨＫ－２１細胞においてＲＮＡ複製及び導入遺伝子発現が可能な自己複製ベクターが生成された（例えば、図８参照）。加えて、以下でより詳細に説明されるように、本明細書に記載されているようないくつかのＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１ベースのｓｒＲＮＡ構築物を、目的の抗原性分子の発現に採用し、インビボにおいて測定可能な薬力学的効果を有するワクチンとして製剤化することができた（例えば、図９及び図１０参照）。さらに、図７Ａ～図７Ｂに記載の実験データは、コード配列が１つのオープンリーディングフレーム内で（例えば、多シストロン性ＯＲＦで）互いに機能的に連結しており、インビボにおける薬力学的効果によって測定される生理活性を有する、複数のタンパク質の発現において、ＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１ベースのｓｒＲＮＡベクターが有用であり得ることを示している（例えば、図１０参照）。まとめると、これらの研究は、治療用途及びワクチン用途における、異種非構造タンパク質遺伝子を有するｓｒＲＮＡベクター及びＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１ベースのｓｒＲＮＡベクターの使用の、さらなる実証を行うものである。
【0041】
定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての述語、記号、及び他の科学用語又は専門用語は、本願が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。場合により、一般に理解される意味を有する用語を、明確さのため、及び／又は、参照のし易さのために、本明細書において定義しているが、そのような定義を本明細書に包含することは、必ずしも、当該技術分野において一般に理解されることと大きな違いがあることを表していると解釈されるべきではない。本明細書において説明又は参照される手法及び手順の多くは、当業者によって、従来の方法論を用いて、充分に理解され、一般的に採用されるものである。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての述語、記号、及び他の科学用語又は専門用語は、本願が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有することが意図される。場合により、一般に理解される意味を有する用語を、明確さのため、及び／又は、参照のし易さのために、本明細書において定義しているが、そのような定義を本明細書に包含することは、必ずしも、当該技術分野において一般に理解されることと大きな違いがあることを表していると解釈されるべきではない。本明細書において説明又は参照される手法及び手順の多くは、当業者によって、従来の方法論を用いて、充分に理解され、一般的に採用されるものである。
【0042】
単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除いて、複数形を包含する。例えば、「細胞」という用語は、１つの細胞、又はその混合物を含む複数の細胞を包含する。「Ａ及び／又はＢ」とは、以下の選択肢の全てを含むように本明細書では使用される：「Ａ」、「Ｂ」、「Ａ又はＢ」、並びに「Ａ及びＢ」。
【0043】
本明細書に記載されている本開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」ことを包含すると理解される。本明細書で使用される場合、「を含む」は、「を包含する」、「を含有する」、又は「を特徴とする」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、追加の、未記載の要素又は方法工程を排除しない。本明細書で使用される場合、「からなる」は、クレームされた組成物又は方法において規定されていない、いかなる要素も、工程も、成分も排除する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる」は、クレームされた組成物又は方法の基本的かつ新規な特徴に重大な影響を与えない材料又は工程を排除しない。本明細書において、特に組成物の成分の記載において、又は方法の工程の記載において、「含む」という用語のいかなる記載も、記載された成分又は工程から本質的になる、又はそれからなる、組成物及び方法を包含すると理解される。
【0044】
「投与」という用語、及びその任意の文法的変形語は、本明細書で使用される場合、限定はされないが、鼻腔内投与、経皮投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、リンパ節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、腟内投与、及び局所投与、又はこれらの組み合わせを含む、投与経路による生物活性を有する組成物又は製剤の送達を指す。上記用語は、医療従事者による投与及び自己投与を包含するが、これらに限定はされない。
【0045】
「細胞」、「細胞培養」、及び「細胞株」という用語は、特定の主題の細胞、細胞培養、又は細胞株を指すだけでなく、培養における移植又は継代の回数に関係なく、そのような細胞、細胞培養、又は細胞株の子孫又は潜在的子孫も指す。全ての子孫が親細胞と全く同一であるわけではないことは、理解されるべきである。これは、変異（例えば、故意又は不注意による変異）又は環境の影響（例えば、メチル化又は他のエピジェネティック修飾）により、後代には、ある特定の変化が生じる可能性があるためであり、このため、子孫は、実際には、親細胞と同一でない可能性があるが、子孫が元の細胞、細胞培養物、又は細胞株のものと同じ機能性を保持する限りは本明細書で使用されるこの用語の範囲内に包含される。
【0046】
本開示の組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物の「有効量」、「治療有効量」、又は「薬剤的有効量」という語は、通常、当該組成物がない場合と比較して、当該組成物が記載された目的を達成する（例えば、投与される目的である効果を達成する、免疫応答を刺激する、疾患を予防もしくは治療する、又は、疾患、障害、感染症、もしくは健康状態の１もしくは複数の症状を低減する）ために充分な量を指す。「有効量」の一例は、疾患の１又は複数の症状の治療、予防、又は低減に寄与するのに充分な量であり、これは「治療有効量」と称されることもある。症状の「低減」とは、当該症状の重症度もしくは頻度の減少、又は、当該症状の消失を意味する。「治療有効量」を含む、組成物の正確な量は、治療の目的に依存し、公知の手法を用いて当業者によって確認可能である（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ （ｖｏｌｓ． １－３， １９９２）； Ｌｌｏｙｄ， Ｔｈｅ Ａｒｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ （１９９９）； Ｐｉｃｋａｒ， Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ （１９９９）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。
【0047】
「核酸構築物」という用語は、異種供給源由来の１又は複数の単離核酸配列を含む、組換え核酸分子を指す。例えば、本開示の核酸構築物は、由来が異なる２以上の核酸配列が集合して１つの核酸分子となった、キメラ核酸分子であり得る。すなわち、代表的な核酸構築物としては、（１）天然では互いに隣接して存在しない制御配列及びコード配列を含む核酸配列（例えば、ヌクレオチド配列の少なくとも１つが、その他のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つに対して異種である）、又は、（２）天然では隣接していない機能的なＲＮＡ分子もしくはタンパク質の一部をコードする配列、又は、（３）天然では隣接していないプロモーターの一部、を含有するあらゆる構築物が挙げられる。代表的な核酸構築物は、１又は複数の核酸配列が機能的に連結された核酸分子を含む、ゲノムインテグレーション又は自律増殖が可能な、プラスミド、コスミド、ウイルス、自己複製ポリヌクレオチド分子、ファージなどの、任意の供給源由来の、あらゆる組換え核酸分子、直鎖状又は環状の、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ核酸分子を含み得る。本開示の構築物は、構築物に含有された目的の核酸配列の発現を指示するために必要なエレメントを含み得る。このようなエレメントは、（目的の核酸配列の転写を指示するために）目的の核酸配列に機能的に連結しているプロモーターなどの調節エレメントを含み得るが、所望により、ポリアデニル化配列も含む。
【0048】
本開示のいくつかの実施形態では、核酸構築物は、ベクター内に組み込まれることがある。「ベクター」という用語は、別の核酸分子を導入又は輸送可能な核酸分子又は配列を指して、本明細書では使用される。すなわち、「ベクター」という用語は、ＤＮＡベースのベクター及びＲＮＡベースのベクターの両方を包含する。「ベクター」という用語は、クローニングベクター及び発現ベクター、並びにウイルスベクター及び組込みベクターを包含する。「発現ベクター」は、調節領域を含み、それにより、インビトロ、エキソビボ、及び／又はインビボでＤＮＡ配列及び断片を発現可能であるベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞における自律増殖を指示する配列を含む場合があり、例えば、プラスミド（ＤＮＡベースのベクター）又は自己複製ＲＮＡベクターなどである。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞ＤＮＡ内への組み込みを可能にするのに充分な配列を含む場合がある。いくつかの実施形態では、ベクターは、インビトロ及び／又はインビボでＲＮＡに転写可能なＤＮＡ配列を含む場合がある。有用なベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド又はＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、バクテリア人工染色体、及びウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、一本鎖ベクター（例えば、ｓｓＤＮＡ又はｓｓＲＮＡ）であることがある。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、二本鎖ベクター（例えば、ｄｓＤＮＡ又はｄｓＲＮＡ）であることがある。いくつかの実施形態では、ベクターは遺伝子送達ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、遺伝子を細胞に導入するための遺伝子送達媒体として使用される。
【0049】
上記構築物の成分に加えて、上記ベクターは、例えば、１もしくは複数の選択マーカー、原核生物の開始点及び真核生物の開始点などの１もしくは複数の複製開始点、少なくとも１つの多重クローニング部位、並びに／又は上記構築物の細胞のゲノム内への安定な組込みを促進するエレメントを含むことがある。２つ以上の構築物が、１つのベクターなどの、１つの核酸分子内に組み込まれることがあり、あるいは、２つ以上の別々のベクターなどの、２つ以上の別々の核酸分子内に含有されることがある。「発現コンストラクト」は、通常、目的ヌクレオチド配列に機能的に連結した制御配列を少なくとも含む。このように、例えば、発現されることとなるヌクレオチド配列と作動可能に連結したプロモーターが、細胞内発現用の発現コンストラクトに含まれて、提供される。本開示の実施に際し、構築物及び細胞を作製及び使用するための組成物及び方法は、当業者に公知である。
【0050】
本開示の組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物の「有効量」、「治療有効量」、又は「薬剤的有効量」という語は、通常、当該組成物がない場合と比較して、当該組成物が記載された目的を達成する（例えば、投与される目的である効果を達成する、免疫応答を刺激する、疾患を予防もしくは治療する、又は、疾患、障害、感染症、もしくは健康状態の１もしくは複数の症状を低減する）ために充分な量を指す。「有効量」の一例は、疾患の１又は複数の症状の治療、予防、又は低減に寄与するのに充分な量であり、これは「治療有効量」と称されることもある。症状の「低減」とは、当該症状の重症度もしくは頻度の減少、又は、当該症状の消失を意味する。「治療有効量」を含む、組成物の正確な量は、治療の目的に依存し、公知の手法を用いて当業者によって確認可能である（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ （ｖｏｌｓ． １－３， １９９２）； Ｌｌｏｙｄ， Ｔｈｅ Ａｒｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ （１９９９）； Ｐｉｃｋａｒ， Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ （１９９９）；及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００３， Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓを参照されたい）。
【0051】
「機能的に連結された」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上のエレメント間の、例えば、ポリペプチド配列間又はポリヌクレオチド配列間の、それらが意図された様式で動作することを可能にする、物理的又は機能的な連結を表す。例えば、「機能的に連結された」という用語は、本明細書に記載の核酸分子又は核酸分子内のコード配列及びプロモーター配列の文脈で使用されている場合、上記コード配列及びプロモーター配列が、インフレームであり、且つ、空間的・距離的に適切に離れていることで、転写因子又はＲＮＡポリメラーゼによる結合のそれぞれが転写に対して影響を与えることが可能であることを意味する。機能的に連結されたエレメントは、隣接し合っていることも、非隣接（例えば、リンカーを介して互いに連結している）であることもあることは理解されよう。ポリペプチド構築物の文脈において、「機能的に連結された」とは、アミノ酸配列間（例えば、異なるセグメント間、部分間、領域間、又はドメイン間）の物理的な連結（例えば、直接的又は間接的な連結）により、当該構築物の記載された活性がもたらされることを指す。本明細書で開示されるポリペプチド又は核酸分子の機能的に連結されたセグメント、部分、領域、及びドメインは、隣接し合っていることも、非隣接（例えば、リンカーを介して互いに連結している）であることもある。
【0052】
「パーセント同一性」という用語は、本明細書で２つ以上の核酸又はタンパク質と関連して使用される場合、２つ以上の配列又は部分配列が、下記の初期パラメーターを使用するＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて測定された場合に、又は、手動のアラインメント及び目視検査によって測定された場合に、同一であること、又は、指定の割合の、同一であるヌクレオチド又はアミノ酸を有すること（比較ウィンドウ又は指定領域に渡って最大一致となるように比較及び整列された場合に、指定の領域に渡って、例えば、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上の配列同一性）を指す。例えば、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴのＮＣＢＩウェブサイトを参照されたい。このような配列は「実質的に同一」であると言われる。この定義は、配列の相補配列のことも指し、あるいはそれに適用され得る。この定義には、欠失及び／又は付加を有する配列、並びに置換を有する配列も含まれる。配列同一性は、公開された手法と、ＧＣＳプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １２：３８７， １９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３， １９９０）などの広く利用可能なコンピュータプログラムを用いて、算出することができる。配列同一性は、その初期パラメーターを使用する、ウィスコンシン大学バイオテクノロジーセンター（１７１０ ユニバーシティ・アヴェニュー、マディソン、ウィスコンシン州 ５３７０５）のジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）の配列解析ソフトウェアパッケージなどの配列解析ソフトウェアを用いて、測定することができる。
【0053】
「一部」という用語は、本明細書で使用される場合、小部分を指すことがある。アミノ酸配列又はタンパク質などの特定の構造に関して、その「一部」という用語は、当該構造の連続的又は非連続的な小部分を指すことがある。例えば、アミノ酸配列の一部は、当該アミノ酸配列の、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、及び少なくとも９０％のアミノ酸を含む。さらに、又はあるい、この一部が非連続的な小部分である場合、この非連続的な小部分は、この構造の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又はそれ以上の一部から構成され、それぞれの一部はこの構造の連続的な要素である。例えば、アミノ酸配列の非連続的な小部分は、このアミノ酸配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、又はそれ以上、例えば４個以下の一部から構成され、それぞれの一部は、このアミノ酸配列の、少なくとも２個、３個、４個、５個の連続的なアミノ酸、少なくとも１０個の連続的なアミノ酸、少なくとも２０個の連続的なアミノ酸、少なくとも３０個の連続的なアミノ酸を含み得る。
【0054】
「薬剤的に許容できる賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、目的化合物を対象に投与するための、薬剤的に許容できる担体、添加剤、又は希釈剤を供する、あらゆる好適な物質を指す。したがって、「薬剤的に許容できる賦形剤」は、薬剤的に許容できる希釈剤と称される物質、薬剤的に許容できる添加剤と称される物質、及び薬剤的に許容できる担体と称される物質を包含し得る。本明細書で使用される場合、「薬剤的に許容できる担体」という用語は、医薬品投与に適合する、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを包含するが、これらに限定はされない。補充的な活性化合物（例えば、抗生物質及び追加の治療薬）が、組成物に組み込まれることもある。
【0055】
「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターを指して使用されている場合、その細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、例えば、実験室的方法によって改変されている、又は実験室的方法の結果であるなど、人の介在を通じて変化させられていること、又は生成されていることを指す。すなわち、例えば、組換えタンパク質及び組換え核酸は、実験室的方法によって生成されたタンパク質及び核酸を包含する。組換えタンパク質は、当該タンパク質のネイティブ型（非組換え型又は野生型）内には存在しないアミノ酸残基を含むことがあり、あるいは、改変された、例えば標識された、アミノ酸残基を含むことがある。この用語は、ペプチド、タンパク質、又は核酸配列に対するあらゆる改変を含み得る。このような改変には以下が含まれる場合がある：１又は複数のアミノ酸、デオキシリボヌクレオチド、又はリボヌクレオチドのあらゆる化学修飾を含む、ペプチド、タンパク質、又は核酸配列のあらゆる化学修飾；ペプチド又はタンパク質の１又は複数のアミノ酸の付加、欠失、及び／又は置換；融合タンパク質、例えば抗体フラグメントを含む融合タンパク質、の作製；並びに、核酸配列内の１又は複数の核酸の付加、欠失、及び／又は置換。「組換え」という用語は、細胞を指して使用されている場合、天然細胞を包含することは意図されていないが、当該細胞が操作／改変されていなければ当該細胞には存在しないであろうポリペプチド又は核酸を、含むか発現するように操作／改変された、細胞は包含する。
【0056】
本明細書で使用される場合、「レプリコンＲＮＡ」又は「ＲＮＡレプリコン」という用語は、許容細胞内で、それ自体の増幅、すなわち自己複製を指示するために必要とされる遺伝情報の全てを含有するＲＮＡを指す。したがって、レプリコンＲＮＡは、「自己増幅ＲＮＡ」（ｓａＲＮＡ）又は「自己複製ＲＮＡ」（ｓｒＲＮＡ）と称される場合もある。それ自体の複製を指示するために、ＲＮＡ分子は、１）ポリメラーゼ、レプリカーゼ、又は、ウイルス性もしくは宿主細胞由来のタンパク質、核酸もしくはリボ核タンパク質と相互作用することで、ＲＮＡ増幅プロセスを触媒し得る他のタンパク質をコードし；且つ、２）サブゲノムレプリコンにコードされたＲＮＡの複製及び転写に必要とされるシス作動性ＲＮＡ配列を含有する。これらの配列は、複製プロセス中に、その自己にコードされたタンパク質、又は非自己にコードされた細胞由来のタンパク質、核酸、もしくはリボ核タンパク質、又はこれらの成分のいずれか同士の複合体に、結合される場合がある。本開示の目的のために、アルファウイルスレプリコンＲＮＡ分子（例えば、ｓｒＲＮＡ又はｓａＲＮＡ分子）は、通常、以下の順の要素を含む：複製のためにシスで必要とされる５’ウイルスＲＮＡ配列、生物学的に活性なアルファウイルス非構造タンパク質（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４）をコードする配列、サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のプロモーター、複製のためにシスで必要とされる３’ウイルス配列、及びポリアデニル化域（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅ ｔｒａｃｔ）（ポリ（Ａ））。さらに、レプリコンＲＮＡ（例えば、ｓｒＲＮＡ又はｓａＲＮＡ分子）という用語は、通常、プラス極性、又は「メッセージ」センスの分子を指し、レプリコンＲＮＡは、いかなる既知の天然アルファウイルスの長さとも異なる長さを有し得る。本開示のいくつかの実施形態では、レプリコンＲＮＡは、構造ウイルスタンパク質の少なくとも１つの配列を含まず；且つ／又は、構造遺伝子をコードする配列が異種配列と置換されることがある。レプリコンＲＮＡが組換えアルファウイルス粒子にパッケージングされることとなる場合、レプリコンＲＮＡは、粒子形成をもたらすアルファウイルス構造タンパク質との相互作用を開始する働きをする１又は複数の配列、いわゆるパッケージングシグナル、を含むことがある。
【0057】
本明細書で使用される場合、「対象」又は「個体」には、ヒト（例えば、ヒト個体）などの動物、及び非ヒト動物が含まれる。いくつかの実施形態では、「対象」又は「個体」は、医師の治療を受けている患者である。すなわち、対象は、目的の健康状態（例えば、がん又は感染症）及び／又は上記健康状態の１もしくは複数の症状を有する、それを有するリスクがある、又はそれを有する疑いがある、ヒト患者又は個体であることがある。対象はまた、診断時以降に、目的の健康状態及び／又は疾患のリスクがあると診断された個体であることもある。「非ヒト動物」という用語には、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類、例えば、げっ歯類、例えば、マウス、非ヒト霊長類、及び、他の哺乳類、例えば、ヒツジ、イヌ、雌ウシ、ニワトリなど、並びに、非哺乳類、例えば、両生類、爬虫類など、が含まれる。
【0058】
値の範囲が提供される場合、本明細書で開示される全ての範囲は、あらゆる全ての可能な部分範囲及びその部分範囲の組み合わせを包含することが、当業者には理解される。列挙されたいずれの範囲も、当該範囲が、少なくとも２分の１、少なくとも３分の１、少なくとも４分の１、少なくとも５分の１、少なくとも１０分の１などに分解されることを、充分に説明し、可能にするものとして、容易に認識できる。非限定例として、本明細書において論じられた各範囲は、下部３分の１、中央３分の１、及び上部３分の１などに容易に分解できる。また、当業者に理解されるように、「最大で」、「少なくとも」、「超」、「未満」などの用語は全て、記載された数字を含み、続いて前述の通りに部分範囲に分解可能な範囲を指す。さらに、当業者には理解されるように、ある範囲は、個々の構成要素をそれぞれ含む。すなわち、例えば、１～３個の物品を有する群は、１個の物品、２個の物品、又は３個の物品を有する群を指す。同様に、１～５個の物品を有する群は、１個の物品、２個の物品、３個の物品、４個の物品、又は５個の物品を有する群を指すなどである。
【0059】
本明細書では、数値の前に「約」という用語が付けられて、ある特定の範囲が示されているが、この用語は、本明細書で使用される場合、およそという通常の意味を有する。「約」という用語は、その用語が先行する正確な数字だけでなく、その用語が先行する数字に近い数字又は近似した数字を、文言上裏付けるために使用される。ある数字が具体的に記載された数字に近いか近似しているかどうかを判断する際、近いか近似している記載されていない数字とは、その数字が提示された文脈において、具体的に記載された数字と実質的に同等である数字とすることができる。近似の程度が文脈から明らかでない場合、「約」は、提供された値の±１０％以内であること、又は提供された値を含む全ての場合において最も近い有効数字に丸められたことを意味する。いくつかの実施形態では、「約」という用語は、指定の値の、±１０％まで、±５％まで、又は±１％まで、を示す。
【0060】
見出し、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、単に、明細書及び特許請求の範囲を読み易くするために提示されたものである。明細書又は特許請求の範囲における見出しの使用は、工程又は要素が、アルファベット順もしくは数字順、又は提示された順序で実行されることを要求するものではない。
【0061】
明確さのために別々の実施形態と関連させて説明されている、本開示のある特定の特徴が、１つの実施形態において組み合わせて提供されることもあることは理解されたい。逆に、簡潔さのために１つの実施形態に関連させて説明されている、本開示の種々の特徴が、別々に、又は任意の好適な部分組合せにおいて、提供されることもある。本開示に係る実施形態の全ての組み合わせは、本開示に具体的に包含され、各々全ての組み合わせが個別にかつ明示的に開示されているかのように、本明細書で開示される。加えて、様々な実施形態及びその要素の全ての部分組合せもまた、本開示に具体的に包含され、そのような部分組合せの各々全てが本明細書で個別にかつ明示的に開示されているかのように、本明細書で開示される。
【0062】
アルファウイルス
アルファウイルスは、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有する、小型のエンベロープＲＮＡウイルスである。アルファウイルス属としては、特に、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮＶ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）（ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥＶ）、及び東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥＶ）が挙げられ、これらは全て近縁種であり、哺乳類、げっ歯類、魚類、鳥類、並びにヒト及びウマなどのより大型の哺乳類といった様々な脊椎動物、並びに、昆虫などの無脊椎動物に感染することができる。特に、シンドビスウイルス及びセムリキ森林ウイルスは広く研究されており、これらのウイルスの生活環、複製様式などはよく特徴付けがなされている。非限定的且つ例示的なアルファウイルス種としては、アウラウイルス（Ａｕｒａ ｖｉｒｕｓ）（ＡＵＲＡＶ）、ババンキウイルス（Ｂａｂａｎｋｉ ｖｉｒｕｓ）（ＢＡＢＶ）、バーマフォレストウイルス（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＢＦＶ）、ベバルウイルス（Ｂｅｂａｒｕ ｖｉｒｕｓ）（ＢＥＢＶ）、バギークリークウイルス（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ ｖｉｒｕｓ）、カイングアウイルス（Ｃａａｉｎｇｕａ ｖｉｒｕｓ）、カバソウウイルス（Ｃａｂａｓｓｏｕ ｖｉｒｕｓ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖｉｒｕｓ）（ＣＨＩＫＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥＶ）、エイラットウイルス（Ｅｉｌａｔ ｖｉｒｕｓ）、エバーグレーズウイルス（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＶＥＶ）、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＶ）、ゲタウイルス（Ｇｅｔａｈ ｖｉｒｕｓ）（ＧＥＴＶ）、ハイランズＪウイルス（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ ｖｉｒｕｓ）（ＨＪＶ）、キジラガッチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ ｖｉｒｕｓ）（ＫＹＺＶ）、マダリアガウイルス（Ｍａｄａｒｉａｇａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＤＶ）、マヤロウイルス（Ｍａｙａｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＹＶ）、ミデルブルグウイルス（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ）（ＭＩＤＶ）、モサオ・ダス・ペドラスウイルス（Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ Ｐｅｄｒａｓ ｖｉｒｕｓ）、ムカンボウイルス（Ｍｕｃａｍｂｏ ｖｉｒｕｓ）（ＭＵＣＶ）、ヌドゥムウイルス（Ｎｄｕｍｕ ｖｉｒｕｓ）（ＮＤＵＶ）、オニョンニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇ ｖｉｒｕｓ）（ＯＮＮＶ）、ピクスナウイルス（Ｐｉｘｕｎａ ｖｉｒｕｓ）（ＰＩＸＶ）、リオネグロウイルス（Ｒｉｏ Ｎｅｇｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＲＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）（ＲＲＶ）、サケ膵臓病ウイルス（Ｓａｌｍｏｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮＶ）、睡眠病ウイルス（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＤＶ）、ミナミゾウアザラシウイルス（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｌｅｐｈａｎｔ ｓｅａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＳＥＳＶ）、タイフォレストウイルス（Ｔａｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＴＦＶ）、トナテウイルス（Ｔｏｎａｔｅ ｖｉｒｕｓ）、トロカラウイルス（Ｔｒｏｃａｒａ ｖｉｒｕｓ）、ウナウイルス（Ｕｎａ ｖｉｒｕｓ）（ＵＮＡＶ）、 ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＷＥＥＶ）、及びワタロアウイルス（Ｗｈａｔａｒｏａ ｖｉｒｕｓ）（ＷＨＡＶ）が挙げられる。
アルファウイルスは、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有する、小型のエンベロープＲＮＡウイルスである。アルファウイルス属としては、特に、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮＶ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）（ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥＶ）、及び東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥＶ）が挙げられ、これらは全て近縁種であり、哺乳類、げっ歯類、魚類、鳥類、並びにヒト及びウマなどのより大型の哺乳類といった様々な脊椎動物、並びに、昆虫などの無脊椎動物に感染することができる。特に、シンドビスウイルス及びセムリキ森林ウイルスは広く研究されており、これらのウイルスの生活環、複製様式などはよく特徴付けがなされている。非限定的且つ例示的なアルファウイルス種としては、アウラウイルス（Ａｕｒａ ｖｉｒｕｓ）（ＡＵＲＡＶ）、ババンキウイルス（Ｂａｂａｎｋｉ ｖｉｒｕｓ）（ＢＡＢＶ）、バーマフォレストウイルス（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＢＦＶ）、ベバルウイルス（Ｂｅｂａｒｕ ｖｉｒｕｓ）（ＢＥＢＶ）、バギークリークウイルス（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ ｖｉｒｕｓ）、カイングアウイルス（Ｃａａｉｎｇｕａ ｖｉｒｕｓ）、カバソウウイルス（Ｃａｂａｓｓｏｕ ｖｉｒｕｓ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖｉｒｕｓ）（ＣＨＩＫＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥＶ）、エイラットウイルス（Ｅｉｌａｔ ｖｉｒｕｓ）、エバーグレーズウイルス（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＶＥＶ）、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＶ）、ゲタウイルス（Ｇｅｔａｈ ｖｉｒｕｓ）（ＧＥＴＶ）、ハイランズＪウイルス（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ ｖｉｒｕｓ）（ＨＪＶ）、キジラガッチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ ｖｉｒｕｓ）（ＫＹＺＶ）、マダリアガウイルス（Ｍａｄａｒｉａｇａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＤＶ）、マヤロウイルス（Ｍａｙａｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＹＶ）、ミデルブルグウイルス（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ）（ＭＩＤＶ）、モサオ・ダス・ペドラスウイルス（Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ Ｐｅｄｒａｓ ｖｉｒｕｓ）、ムカンボウイルス（Ｍｕｃａｍｂｏ ｖｉｒｕｓ）（ＭＵＣＶ）、ヌドゥムウイルス（Ｎｄｕｍｕ ｖｉｒｕｓ）（ＮＤＵＶ）、オニョンニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇ ｖｉｒｕｓ）（ＯＮＮＶ）、ピクスナウイルス（Ｐｉｘｕｎａ ｖｉｒｕｓ）（ＰＩＸＶ）、リオネグロウイルス（Ｒｉｏ Ｎｅｇｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＲＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）（ＲＲＶ）、サケ膵臓病ウイルス（Ｓａｌｍｏｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮＶ）、睡眠病ウイルス（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＤＶ）、ミナミゾウアザラシウイルス（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｌｅｐｈａｎｔ ｓｅａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＳＥＳＶ）、タイフォレストウイルス（Ｔａｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＴＦＶ）、トナテウイルス（Ｔｏｎａｔｅ ｖｉｒｕｓ）、トロカラウイルス（Ｔｒｏｃａｒａ ｖｉｒｕｓ）、ウナウイルス（Ｕｎａ ｖｉｒｕｓ）（ＵＮＡＶ）、 ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＷＥＥＶ）、及びワタロアウイルス（Ｗｈａｔａｒｏａ ｖｉｒｕｓ）（ＷＨＡＶ）が挙げられる。
【0063】
アルファウイルスゲノムは、およそ１２ｋｂ長であり、以下の２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる：非構造タンパク質（ｎｓＰ）をコードする７ｋｂのフレーム及び構造ポリタンパク質をコードする４ｋｂのフレーム。非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ）は切断されることで、宿主細胞の細胞質内でのウイルスｍＲＮＡの転写及び翻訳に必要な４つの異なるタンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４）になる。
【0064】
ｎｓＰ１タンパク質は、新たに合成されたウイルスのゲノムＲＮＡ及びサブゲノムＲＮＡのメチル化及びキャッピングを指示する、グアニン－７－メチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅ）活性及びグアニリルトランスフェラーゼ（ＧＴａｓｅ）活性の両方を有するｍＲＮＡキャッピング酵素である。ｎｓＰ１のＮ末端ドメイン内のＭＴａｓｅモチーフは、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）からＧＴＰ分子のＮ７位（ｍ７Ｇｐｐｐ）へのメチル基の移行を触媒する。次いで、ＧＴａｓｅがそのｍ７Ｇｐｐｐと結合することで、触媒ヒスチジンと共有結合を形成し（ｍ７Ｇｐ－ＧＴａｓｅ）、ＰＰｉを放出する。次いで、ＧＴａｓｅはｍ７Ｇｐ分子を５’－二リン酸ＲＮＡに移すことで、ｍ７ＧｐｐｐＮｐ－ＲＮＡを生成する。得られたキャップ構造は、ウイルスｍＲＮＡの翻訳に必須であり、このｍＲＮＡが細胞の５’エキソヌクレアーゼによって分解されることを防ぐ。このＮ末端ドメインに続くのは、ｎｓＰ１タンパク質が細胞膜に結合することを可能にする特徴である。αヘリックス両親媒性ループ部位及びパルミトイル化部位が存在することで、おそらくはｎｓＰ１と膜の陰イオン性リン脂質との相互作用を介して、ｎｓＰ１タンパク質及びｎｓＰ１含有複製複合体が原形質膜上に係留することが可能となる。
【0065】
ｎｓＰ２タンパク質は多数の酵素活性と機能的役割を有する。Ｎ末端領域は、スーパーファミリー１（ＳＦ１）ヘリカーゼの７つのシグネチャーモチーフを有するヘリカーゼドメインを含有する。このヘリカーゼドメインは、ウイルスＲＮＡのキャッピング反応の最初を担う、ＲＮＡトリホスファターゼとして機能する。このヘリカーゼドメインはまた、ヌクレオチドトリホスファターゼ（ＮＴＰａｓｅ）としても機能し、ＲＮＡヘリカーゼ活性の燃料となる。ｎｓＰ２のＣ末端領域は、パパイン様システインプロテアーゼを含み、ウイルス非構造ポリタンパク質のプロセシングに関与している。上記プロテアーゼは、上記ポリタンパク質内の保存されたモチーフを認識する。このタンパク質分解機能は高度に制御されており、ｎｓＰ２の他のドメインによって調節される。このアルファウイルスｎｓＰ２タンパク質は、感染宿主細胞における転写及び翻訳の遮断、並びに、ウイルス性因子による翻訳機構の制御に寄与するインターフェロン（ＩＦＮ）介在性抗ウイルス反応の阻害に関与する病原性因子としても記述されている。
【0066】
複製複合体においてのアルファウイルスｎｓＰ３タンパク質の明確な役割は、これよりも明らかになっていない。ｎｓＰ３タンパク質には３つのドメインが認識されている：ホスファターゼ活性と核酸結合能を有するＮ末端の大ドメイン、アルファウイルスユニークドメイン（ＡＵＤ）、及びＣ末端の超可変ドメイン。ＳＦＶ ｎｓＰ３のこのドメインの欠失はウイルス病原性の低下をもたらすことが分かっており、ウイルスＲＮＡ転写制御におけるその重要性が示唆されている。
【0067】
ｎｓＰ４ポリメラーゼは、アルファウイルスにおいて最も高度に保存されたタンパク質であり、最も分岐したものでも、他のアルファウイルスｎｓＰ４と比較した場合にアミノ酸配列が５０％超同一である。ｎｓＰ４は、コアとなるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）ドメインをＣ末端に含んでおり、これが単独で、ウイルス複製複合体のＲＮＡ合成特性を担っていることが判明している。このＲｄＲｐは、マイナス鎖ＲＮＡを介したゲノムＲＮＡの複製及び２６ＳサブゲノムＲＮＡの転写に関与している。Ｎ末端ドメインはアルファウイルス特有であり、部分的に構造が乱れていることがある。
【0068】
アルファウイルスゲノムの５’側の３分の２は、ウイルスＲＮＡの転写及び複製に必要ないくつもの非構造タンパク質（ｎＳＰ）をコードしている。これらのタンパク質がＲＮＡから直接翻訳されると、細胞タンパク質と一緒になって、ウイルスゲノム複製及びサブゲノムＲＮＡの転写に必須のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを形成する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）は、１つのポリタンパク質として生成され、ウイルスの複製機構を構成する。このポリタンパク質のプロセシングは高度に制御された様式で起こり、Ｐ２／３接合部位の切断が、ゲノム複製中のＲＮＡ鋳型の使用に影響を及ぼす。この部位は、狭い割れ目の底部に位置しており、容易にアクセスできない。一旦切断されると、ｎｓＰ３は、ｎｓＰ２を取り囲む環構造を生成する。これらの２つのタンパク質は広大な境界面を有する。非細胞変性ウイルス又は温度感受性表現型を生み出すｎｓＰ２における変異は、Ｐ２／Ｐ３境界領域に密集している。ｎｓＰ２非細胞変性変異の位置の反対側のＰ３変異は、Ｐ２／３の効率的な切断を妨げる。これはひいては、ＲＮＡ感染性に影響を及ぼし、ウイルスＲＮＡ生成レベルを変えることがある。
【0069】
上記ゲノムの３’側の３分の１は、ウイルス粒子を形成するために必要とされる全ての構造タンパク質（コアとなるヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、並びにヘテロ二量体として会合するエンベロープタンパク質のＰ６２及びＥ１）の翻訳を行うための鋳型として働くサブゲノムＲＮＡを含む。これらのウイルス膜アンカー型表面糖タンパク質は、受容体認識及び膜融合を介した標的細胞内への侵入に関与する。このサブゲノムＲＮＡは、ｎｓＰ４タンパク質をコードするＲＮＡ配列の３’末端に存在するｐ２６Ｓサブゲノムプロモーターから転写される。タンパク質分解によりＰ６２がＥ２及びＥ３へと成熟することで、ウイルス表面に変化が生じる。Ｅ１とＥ２、そして時にＥ３とが一緒になって、糖タンパク質「スパイク」はＥ１／Ｅ２二量体又はＥ１／Ｅ２／Ｅ３三量体を形成しており、Ｅ２は中心から各頂点に伸び、Ｅ１は頂点間の空間を充填し、Ｅ３は、存在する場合、スパイクの遠位端に位置する。ウイルスがエンドソームの酸性度に曝されると、Ｅ１がＥ２から解離してＥ１ホモ三量体を形成し、これが、細胞膜とウイルス膜を一緒にする融合段階に必要となる。アルファウイルス糖タンパク質Ｅ１はクラスＩＩウイルス融合タンパク質であり、インフルエンザウイルス及びＨＩＶに存在するクラスＩ融合タンパク質とは構造が異なっている。Ｅ２糖タンパク質は、その細胞質ドメインを介してヌクレオカプシドと相互作用する機能を果たし、一方、その外部ドメインは細胞受容体との結合に関与する。大部分のアルファウイルスは周辺タンパク質であるＥ３を失っているが、セムリキウイルスでは、Ｅ３はウイルス表面と結合して残っている。
【0070】
アルファウイルス複製は宿主細胞内の膜表面上で起こることが報告されている。感染サイクルの第１のステップで、ゲノムＲＮＡの５’末端が、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有するポリタンパク質（ｎｓＰ１～４）へと翻訳され、これがゲノムＲＮＡに相補的なマイナス鎖を生成する。第２のステップで、このマイナス鎖が２つのＲＮＡの生産を行うための鋳型として使用され、この２つのＲＮＡとはそれぞれ、（１）翻訳によって他のｎｓＰを生産し、このウイルスのゲノムとして働く、二次ウイルスのゲノムに相当する、プラス鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）ゲノムＲＮＡ；及び、（２）感染性粒子を形成するウイルスの構造タンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡである。プラス鎖ゲノムＲＮＡ／サブゲノムＲＮＡの比は、ポリタンパク質がタンパク質分解による自己切断でｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４になることで制御される。実際には、ウイルスの遺伝子発現は２段階で起こる。第１段階では、プラス鎖ゲノムとマイナス鎖の主要な合成がある。第２段階では、サブゲノムＲＮＡの合成が実質的に独占で行われ、そのため大量の構造タンパク質の生産が起こる。
【0071】
本開示の組成物
以下でより詳細に説明されるように、本開示の１つの態様は、アルファウイルス種の改変されたウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）をコードする核酸構築物 核酸配列、上記核酸構築物を含む組換え細胞、上記核酸構築物を含むトランスジェニック動物、及び本開示の方法によって生成された組換えポリペプチドに関する。
以下でより詳細に説明されるように、本開示の１つの態様は、アルファウイルス種の改変されたウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）をコードする核酸構築物 核酸配列、上記核酸構築物を含む組換え細胞、上記核酸構築物を含むトランスジェニック動物、及び本開示の方法によって生成された組換えポリペプチドに関する。
【0072】
本開示のいくつかの実施形態は、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）であって、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性であり、上記少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部がｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、もしくはそのいずれかの一部、又は上記のいずれかの組み合わせである、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、ｎｓＰ１又はその一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である。いくつかの実施形態では、ｎｓＰ２又はその一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である。いくつかの実施形態では、ｎｓＰ３又はその一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である。いくつかの実施形態では、ｎｓＰ４又はその一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である。いくつかの実施形態では、２つのｎｓＰタンパク質が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である。いくつかの実施形態では、３つのｎｓＰタンパク質が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である。いくつかの実施形態では、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ３、又はそれらの一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である。いくつかの実施形態では、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ４、又はそれらの一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である。いくつかの実施形態では、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４、又はそれらの一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である。
【0073】
Ａ．核酸構築物
以下でより詳細に説明されるように、本開示の１つの態様は、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）などのアルファウイルスの改変されたゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）をコードする核酸配列を含み、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの非構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である、新規の核酸構築物に関する。例えば、少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、もしくはそのいずれかの一部、又は上記のいずれかの組み合わせである。上記のように、非構造ポリペプチドをコードする核酸配列の一部は、当業者による当該配列の手動評価により、又は、ＢＬＡＳＴ（例えば、“Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ”； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０， １９９３を参照されたい）などのアルゴリズムを用いた、コンピュータで自動化された配列比較及び同定により、当該ポリペプチドの推定上の同定を得るために充分な、非構造ポリペプチドをコードする核酸配列を含み得ると、当業者には理解される。したがって、ヌクレオチド配列の一部は、当該配列を含む核酸断片の特異的な同定及び／又は単離を得るのに充分な配列を含む。例えば、核酸配列の一部は、完全長の核酸配列の少なくとも約２０％、例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％を含み得る。
以下でより詳細に説明されるように、本開示の１つの態様は、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）などのアルファウイルスの改変されたゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）をコードする核酸配列を含み、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの非構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部が、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの残部に対して異種性である、新規の核酸構築物に関する。例えば、少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、もしくはそのいずれかの一部、又は上記のいずれかの組み合わせである。上記のように、非構造ポリペプチドをコードする核酸配列の一部は、当業者による当該配列の手動評価により、又は、ＢＬＡＳＴ（例えば、“Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ”； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０， １９９３を参照されたい）などのアルゴリズムを用いた、コンピュータで自動化された配列比較及び同定により、当該ポリペプチドの推定上の同定を得るために充分な、非構造ポリペプチドをコードする核酸配列を含み得ると、当業者には理解される。したがって、ヌクレオチド配列の一部は、当該配列を含む核酸断片の特異的な同定及び／又は単離を得るのに充分な配列を含む。例えば、核酸配列の一部は、完全長の核酸配列の少なくとも約２０％、例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％を含み得る。
【0074】
本開示の組成物及び方法に好適な、非限定的且つ例示的なアルファウイルス種としては、アウラウイルス（Ａｕｒａ ｖｉｒｕｓ）（ＡＵＲＡＶ）、ババンキウイルス（Ｂａｂａｎｋｉ ｖｉｒｕｓ）（ＢＡＢＶ）、バーマフォレストウイルス（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＢＦＶ）、ベバルウイルス（Ｂｅｂａｒｕ ｖｉｒｕｓ）（ＢＥＢＶ）、バギークリークウイルス（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ ｖｉｒｕｓ）、カイングアウイルス（Ｃａａｉｎｇｕａ ｖｉｒｕｓ）、カバソウウイルス（Ｃａｂａｓｓｏｕ ｖｉｒｕｓ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ ｖｉｒｕｓ）（ＣＨＩＫＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥＶ）、エイラットウイルス（Ｅｉｌａｔ ｖｉｒｕｓ）、エバーグレーズウイルス（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ ｖｉｒｕｓ）（ＥＶＥＶ）、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ ｖｉｒｕｓ）（ＦＭＶ）、ゲタウイルス（Ｇｅｔａｈ ｖｉｒｕｓ）（ＧＥＴＶ）、ハイランズＪウイルス（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ ｖｉｒｕｓ）（ＨＪＶ）、キジラガッチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ ｖｉｒｕｓ）（ＫＹＺＶ）、マダリアガウイルス（Ｍａｄａｒｉａｇａ ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＤＶ）、マヤロウイルス（Ｍａｙａｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＭＡＹＶ）、ミデルブルグウイルス（Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ ｖｉｒｕｓ）（ＭＩＤＶ）、モサオ・ダス・ペドラスウイルス（Ｍｏｓｓｏ ｄａｓ Ｐｅｄｒａｓ ｖｉｒｕｓ）、ムカンボウイルス（Ｍｕｃａｍｂｏ ｖｉｒｕｓ）（ＭＵＣＶ）、ヌドゥムウイルス（Ｎｄｕｍｕ ｖｉｒｕｓ）（ＮＤＵＶ）、オニョンニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇ ｖｉｒｕｓ）（ＯＮＮＶ）、ピクスナウイルス（Ｐｉｘｕｎａ ｖｉｒｕｓ）（ＰＩＸＶ）、リオネグロウイルス（Ｒｉｏ Ｎｅｇｒｏ ｖｉｒｕｓ）（ＲＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）（ＲＲＶ）、サケ膵臓病ウイルス（Ｓａｌｍｏｎ ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＰＤＶ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮＶ）、睡眠病ウイルス（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）（ＳＤＶ）、ミナミゾウアザラシウイルス（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｌｅｐｈａｎｔ ｓｅａｌ ｖｉｒｕｓ）（ＳＥＳＶ）、タイフォレストウイルス（Ｔａｉ Ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ）（ＴＦＶ）、トナテウイルス（Ｔｏｎａｔｅ ｖｉｒｕｓ）、トロカラウイルス（Ｔｒｏｃａｒａ ｖｉｒｕｓ）、ウナウイルス（Ｕｎａ ｖｉｒｕｓ）（ＵＮＡＶ）、 ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｅｑｕｉｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＷＥＥＶ）、及びワタロアウイルス（Ｗｈａｔａｒｏａ ｖｉｒｕｓ）（ＷＨＡＶ）が挙げられる。病原性アルファウイルス株及び非病原性アルファウイルス株の両方が好適である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）である。
【0075】
いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）である。本開示の組成物及び方法に好適なＣＨＩＫＶ株の非限定例としては、ＣＨＩＫＶ Ｓ２７、ＣＨＩＫＶ ＬＲ２００６－ＯＰＹ－１、ＣＨＩＫＶ ＹＯ１２３２２３、ＣＨＩＫＶ ＤＲＤＥ、ＣＨＩＫＶ ３７９９７、ＣＨＩＫＶ ９９６５３、ＣＨＩＫＶ Ａｇ４１８５５、及びナーグプル（インド）６５３４９６株が挙げられる。病原性ＣＨＩＫＶ株及び非病原性ＣＨＩＫＶ株の両方が好適である。本開示の組成物及び方法に好適なＣＨＩＫＶ株のさらなる例としては、Ａｆｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１４， ５８：６８８－６９６， Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ ａｎｄ Ｌａｍｂｅｒｔ ＡＳＴＭＨ ２０１６， ９４（４）：８００－８０３ ａｎｄ Ｌａｎｇｓｊｏｅｎ ｅｔ ａｌ． ｍＢｉｏ． ２０１８， ９（２）：ｅ０２４４９－１７に記載されているものが挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨＩＫＶゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、ＣＨＩＫＶ Ｓ２７株由来である。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨＩＫＶゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＣＨＩＫＶ ＤＲＤＥ株由来である。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨＩＫＶゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＣＨＩＫＶ ＤＲＤＥ－０６株由来である。いくつかの実施形態では、改変されたＣＨＩＫＶゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＣＨＩＫＶ ＤＲＤＥ－０７株由来である。
【0076】
いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）である。本開示の組成物及び方法に好適なＥＥＥＶ株の非限定例としては、ＥＥＥＶ ７９２１３８、７８３３７２、ＢｅＡｎ５１２２、ＢｅＡｒ３００８５１、ＢｅＡｒ４３６０８７、Ｃ－４９、ＦＬ９１－４６７９、ＦＬ９３－９３９、ＧＭＬ９０３８３６、ＭＰ－９、ＰＥ６、及びＶ１０５－００２１０が挙げられる。病原性ＥＥＥＶ株及び非病原性ＥＥＥＶ株の両方が好適である。さらなる好適なＥＥＥＶ株としては、Ｖｉｒｕｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅウェブサイト（ＶｉＰＲ；ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝８６８＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｔｏｇａで公開されている）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、改変されたＥＥＥＶゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、ＥＥＥＶ ＦＬ９３－９３９株由来である。
【0077】
いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）である。いくつかの実施形態では、改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、ＳＩＮＶ株のものである。本開示の組成物及び方法に好適なＳＩＮＶ株の非限定例としては、ＳＩＮＶのＡＲ３３９株、ＡＲ８６株、及びガードウッド株が挙げられる。本開示の組成物及び方法に好適なＳＩＮＶ株の例としては、Ｓａｍｍｅｌｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． １９９９， ８０（３）：７３９－７４８， Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ ａｎｄ Ｐｆｅｆｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｏｒｎｅ Ｚｏｏｎｏｔｉｃ Ｄｉｓ． ２０１０， １０（９）：８８９－９０７， Ｓｉｇｅｉ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ． ｏｆ Ｖｉｒｏｌ． ２０１８， １６３：２４６５－２４６９ ａｎｄ Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ２０１９， ９３：ｅ００６２０－１９に記載されているものが挙げられるが、これらに限定はされない。さらなる好適なＳＩＮＶ株としては、Ｖｉｒｕｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅウェブサイト（ＶｉＰＲ；ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝８６８＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｔｏｇａで公開されている）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定はされない。病原性ＳＩＮＶ株及び非病原性ＳＩＮＶ株の両方が好適である。いくつかの実施形態では、改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンは、ＳＩＮＶのガードウッド株のものである。いくつかの実施形態では、改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンは、ＳＩＮＶのＡＲ８６株のものである。いくつかの実施形態では、改変されたＳＩＮＶゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＳＩＮＶのガードウッド株由来である。いくつかの実施形態では、改変されたＳＩＮＶゲノム又はレプリコンＲＮＡは、ＳＩＮＶ ＡＲ８６株由来である。いくつかの実施形態では、改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ＳＩＮＶのＡＲ８６株由来である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、もしくはそのいずれかの一部、又は上記のいずれかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンは、ＳＩＮＶのＡＲ８６株のものである。
【0078】
いくつかの実施形態では、アルファウイルスは、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）である。本開示の組成物及び方法に好適なＷＥＥＶ株の非限定例としては、ＷＥＥＶ カリフォルニア、マクミラン、ＩＭＰ１８１、インペリアル、インペリアル１８１、ＩＭＰＲ４４１、７１Ｖ－１６５８、ＡＧ８０－６４６、ＢＦＳ９３２、ＣＯＡ５９２、ＥＰ－６、Ｅ１４１６、ＢＦＳ１７０３、ＢＦＳ２００５、ＢＳＦ３０６０、ＢＳＦ０９９９７、ＣＨＬＶ５３、ＫＥＲＮ５５４７、８５４５２ＮＭ、モンタナ－６４、Ｓ８－１２２、及びＴＢＴ－２３５が挙げられる。本開示の組成物及び方法に好適なＷＥＥＶ株のさらなる例としては、５６１４、９３Ａ２７、９３Ａ３０、９３Ａ３８、９３Ａ７９、Ｂ６２８（Ｃｌ １５）、ＣＢＡ８７、ＣＮＴＲ３４、ＣＯ９２１３５６、フレミング、レイク４３、ＰＶ０１２３５７Ａ、ＰＶ０２８０８Ａ、ＰＶ７２１０２、Ｒ０２ＰＶ００１８０７Ａ、Ｒ０２ＰＶ００２９５７Ｂ、Ｒ０２ＰＶ００３４２２Ｂ、Ｒ０５ＰＶ００３４２２Ｂ、Ｒ０ＰＶ００３８１４Ａ、及びＲ０ＰＶ００３８４Ａが挙げられる。病原性ＷＥＥＶ株及び非病原性ＷＥＥＶ株の両方が好適である。さらなる好適なＷＥＥＶ株としては、Ｂｅｒｇｒｅｎ ＮＡ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ８８（１６）： ９２６０－９２６７， Ａｕｇ ２０１４、及び、Ｖｉｒｕｓ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｒｅｓｏｕｒｃｅウェブサイト（ＶｉＰＲ；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｖｉｐｒｂｒｃ．ｏｒｇ／ｂｒｃ／ｖｉｐｒ＿ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｐｇ？ｍｅｔｈｏｄ＝ＳｕｂｍｉｔＦｏｒｍ＆ｂｌｏｃｋＩｄ＝５７２４０＆ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝ｔｏｇａで公開されている）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、改変されたＷＥＥＶゲノム又はｓｒＲＮＡは、ＷＥＥＶのインペリアル株由来である。いくつかの実施形態では、改変されたＷＥＥＶゲノム又はｓｒＲＮＡは、ＷＥＥＶのマクミラン株由来である。
【0079】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、同じアルファウイルス種の別株由来である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、別のアルファウイルス種由来である。例えば、いくつかの実施形態では、改変されたＳＩＮＶ－ＡＲ８６ゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）の少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ＳＩＮＶのガードウッド株由来である。いくつかの実施形態では、改変されたＳＩＮＶ－ＡＲ８６ゲノム又はＲＮＡレプリコンの少なくとも１つの異種ｎｓＰ又はその一部は、ＳＩＮＶのガードウッド株のｎｓＰ２由来である。いくつかの実施形態では、構造タンパク質のｎｓＰ１、ｎｓＰ３、及びｎｓＰ４はＳＩＮＶのＡＲ８６株由来であり、ｎｓＰ２はＳＩＮＶのガードウッド株由来である。いくつかの実施形態では、ｎｓＰ４はＡＲ８６株由来であり、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ３はガードウッド株由来である。いくつかの実施形態では、ｎｓＰ３はＡＲ８６株由来であり、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、及びｎｓＰ４はガードウッド株由来である。いくつかの実施形態では、ｎｓＰ１はＡＲ８６株由来であり、及びｎｓＰ２、ｎｓＰ３、一方、ｎｓＰ４はガードウッド株由来である（例えば、図１及び図６を参照）。
【0080】
いくつかの実施形態では、１又は複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列のかなりの部分が除去されている。いくつかの実施形態では、改変されたウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、ウイルス構造タンパク質をコードする配列全体を含まず、例えば、改変されたウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、未改変のウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡの構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンは、１又は複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を含んでいない。いくつかの実施形態では、改変されたウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンは、１又は複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列のかなりの部分を含んでいない。いくつかの実施形態では、改変されたウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含んでいない。ウイルス構造ポリペプチドをコードする核酸配列のかなりの部分は、当業者による当該配列の手動評価により、又は、ＢＬＡＳＴ（例えば、“Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ”； Ａｌｔｓｃｈｕｌ ＳＦ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３－４１０， １９９３を参照されたい）などのアルゴリズムを用いた、コンピュータで自動化された配列比較及び同定により、当該ポリペプチドの推定上の同定を得るために充分な、ウイルス構造ポリペプチドをコードする核酸配列を含み得ると、当業者には理解される。したがって、ヌクレオチド配列のかなりの部分は、当該配列を含む核酸断片の特異的な同定及び／又は単離を得るのに充分な配列を含む。例えば、核酸配列のかなりの部分は、完全長の核酸配列の少なくとも約２０％、例えば、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％を含み得る。上記のように、本開示は、１又は複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を部分的又は完全に含んでいない、核酸分子及び核酸構築物を提供する。
【0081】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）をコードする核酸配列を含み、この改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡの１又は複数の構造タンパク質をコードする核酸配列のかなりの部分が除去されており、例えば、この改変されたアルファウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは、アルファウイルス構造タンパク質であるＣＰ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及び６Ｋのうちの１又は複数のコード配列の少なくとも一部を含んでいない。
【0082】
本開示の核酸構築物の非限定的且つ例示的な実施形態は、以下の特徴のうちの１又は複数を含むことがある。いくつかの実施形態では、未改変のウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）のウイルス構造タンパク質ＣＰ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及び６Ｋのうちの１又は複数をコードする核酸配列の少なくとも一部が除去されている。いくつかの実施形態では、ＣＰをコードする配列の一部又は全体が除去されている。いくつかの実施形態では、Ｅ１をコードする配列の一部又は全体が除去されている。いくつかの実施形態では、Ｅ２をコードする配列の一部又は全体が除去されている。いくつかの実施形態では、Ｅ３をコードする配列の一部又は全体が除去されている。いくつかの実施形態では、６Ｋをコードする配列の一部又は全体が除去されている。いくつかの実施形態では、ＣＰ、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、及び６Ｋの組み合わせをコードする配列の一部又は全体が除去されている。いくつかの実施形態では、ウイルス構造タンパク質をコードする配列全体が除去されており、例えば、改変されたウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡは未改変のウイルスゲノム又はレプリコンＲＮＡの構造タンパク質をコードする核酸配列を含んでいない。
【0083】
非限定的且つ例示的な、本開示の核酸構築物は、配列番号１～４からなる群から選択される核酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むことがある。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号１からなる群から選択される核酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むことがある。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号２からなる群から選択される核酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むことがある。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号３からなる群から選択される核酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むことがある。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号４からなる群から選択される核酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する核酸配列を含むことがある。
【0084】
本開示の核酸構築物（例えば、ベクター構築物又はｓｒＲＮＡ構築物）は、通常、少なくとも約２ｋｂの長さを有する。例えば、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ）は、少なくとも約２ｋｂ、少なくとも約３ｋｂ、少なくとも約４ｋｂ、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約９ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約１１ｋｂ、少なくとも約１２ｋｂの、又は１２ｋｂよりも長い、長さを有することがある。いくつかの実施形態では、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ）は、約４ｋｂ～約２０ｋｂ、約４ｋｂ～約１８ｋｂ、約５ｋｂ～約１６ｋｂ、約６ｋｂ～約１４ｋｂ、約７ｋｂ～約１２ｋｂ、約８ｋｂ～約１６ｋｂ、約９ｋｂ～約１４ｋｂ、約１０ｋｂ～約１８ｋｂ、約１１ｋｂ～約１６ｋｂ、約５ｋｂ～約１８ｋｂ、約６ｋｂ～約２０ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約５ｋｂ～約８ｋｂ、約５ｋｂ～約７ｋｂ、約５ｋｂ～約６ｋｂ、約６ｋｂ～約１２ｋｂ、約６ｋｂ～約１１ｋｂ、約６ｋｂ～約１０ｋｂ、約６ｋｂ～約９ｋｂ、約６ｋｂ～約８ｋｂ、約６ｋｂ～約７ｋｂ、約７ｋｂ～約１１ｋｂ、約７ｋｂ～約１０ｋｂ、約７ｋｂ～約９ｋｂ、約７ｋｂ～約８ｋｂ、約８ｋｂ～約１１ｋｂ、約８ｋｂ～約１０ｋｂ、約８ｋｂ～約９ｋｂ、約９ｋｂ～約１１ｋｂ、約９ｋｂ～約１０ｋｂ、又は約１０ｋｂ～約１１ｋｂの長さを有することがある。いくつかの実施形態では、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ）は、約６ｋｂ～約１４ｋｂの長さを有することがある。いくつかの実施形態では、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ）は、約６ｋｂ～約１６ｋｂの長さを有することがある。
【0085】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、１又は複数の発現カセットをさらに含む。原則として、本明細書で開示される核酸構築物は、通常、いかなる数の発現カセットも含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される核酸構築物は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの発現カセットを含むことがある。当業者には理解されることであるが、「発現カセット」という用語は、コード配列と、インビボ及び／又はエキソビボにおいて細胞内で当該コード配列が適切に転写及び／又は翻訳されることを指示するのに充分な制御情報と、を含有する遺伝物質の構築物を指す。この発現カセットは、所望の宿主細胞を標的化するためにベクターに、及び／又は対象に、挿入されることがある。したがって、いくつかの実施形態では、発現カセットという用語は、「発現コンストラクト」という用語と同義的に用いられることがある。いくつかの実施形態では、「発現カセット」という用語は、例えばプロモーター及び／又は終結シグナルなどの調節エレメントに機能的に連結したタンパク質又は機能性ＲＮＡをコードする遺伝子と、所望により、当該遺伝子の転写又は翻訳に影響を及ぼす他の核酸配列のいずれか又はその組み合わせと、を含む核酸構築物を指す。
【0086】
いくつかの実施形態では、発現カセットの少なくとも１つが、異種核酸配列に機能的に連結したプロモーターを含むことがある。したがって、本明細書で提供されるような核酸構築物は、例えば、異種核酸配列に機能的に連結した調節エレメント（例えば、プロモーター）を含んでいる場合、その異種核酸配列の発現に影響を及ぼす可能性がある発現ベクターなどとして使用されることがある。いくつかの実施形態では、これらの発現カセットの少なくとも１つは、異種核酸配列に機能的に連結したサブゲノム（ｓｇ）プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、このｓｇプロモーターは２６Ｓサブゲノムプロモーターである。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、１又は複数の非翻訳領域（ＵＴＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、これらのＵＴＲの少なくとも１つは異種ＵＴＲである。いくつかの実施形態では、改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）の５’ＵＴＲ配列は、異種５’ＵＴＲ配列であり、例えば、異種供給源由来、例えば、同じアルファウイルス種の異なる株由来又は異なるアルファウイルス種由来であり、例えば、チクングニアウイルス由来のＵＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの３’ＵＴＲ配列は、異種３’ＵＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの５’ＵＴＲ配列及び３’ＵＴＲ配列の両方が、異種ＵＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、これらの異種５’ＵＴＲ配列及び／又は異種３’ＵＴＲ配列は、チクングニアウイルス由来であることがある。いくつかの実施形態では、これらの異種５’ＵＴＲ配列及び／又は異種３’ＵＴＲ配列は、チクングニアＳ２７株由来であることがある。いくつかの実施形態では、これらの異種５’ＵＴＲ配列及び／又は異種３’ＵＴＲ配列は、チクングニアＤＲＤＥ株由来であることがある。
【0087】
いくつかの実施形態では、発現カセットの少なくとも１つは、目的遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、安定性、効力、及び発現（例えば、翻訳効率）などを増加させ、ひいては、バイオ治療薬の生成、送達、及び投与の影響を最大化し得る、所望の特性が得られるように再設計及び／又は最適化される。例えば、いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高い、例えば、参照コード配列よりも２０％高い、３０％高い、４０％高い、５０％高い、６０％高い、７０％高い、８０％高い、９０％高い、又は９５％高い、レベルでの発現が得られるように最適化される。いくつかの実施形態では、この参照コード配列は、野生型の最適化されていない配列である。ヌクレオチド配列の配列最適化に関して、遺伝暗号の縮重は、遺伝子のタンパク質コード配列の少なくとも１つの塩基を、当該遺伝子から生成されるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく、異なる塩基と置換する可能性を生み出す。故に、本開示の核酸構築物は、本明細書で開示されるあらゆるポリヌクレオチド配列から、遺伝暗号の縮重に従った置換によって変化した、いかなる塩基配列も、有する可能性がある。コドン使用頻度を説明している参考文献は、公的に容易に入手可能である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列のバリアントが、様々な理由で、例えば、特定の宿主用に発現を最適化するために、生成されることがある（例えば、アルファウイルスｍＲＮＡにおけるコドン使用頻度を、ヒト、非ヒト霊長類、ハムスター、マウス、又はサルなどの他の生物に好まれるものに変えるなど）。したがって、いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、発現に関する最適化がなされたコドンの使用を通じて、標的宿主細胞において、例えばコドン最適化がなされていないコード配列などの参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルでの発現が得られるように、最適化される。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたＧＯＩ配列は、コドン最適化されていない参照コード配列と比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％の発現レベルの増加をもたらす。いくつかの実施形態では、コドン最適化されたＧＯＩ配列は、コドン最適化されていない参照コード配列と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも５倍の発現レベルの増加をもたらす。
【0088】
いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、ＲＮＡの安定性及び／又は発現が増強されるように最適化される。ＲＮＡの安定性は、通常、ＲＮＡの「半減期」に関連する。「半減期」は、分子の活性、量、又は数の半分を除去するために必要とされる期間に関連する。本開示との関連では、ＲＮＡの半減期は、当該ＲＮＡの安定性を表すものである。ＲＮＡの半減期は、当該ＲＮＡの「発現の持続時間」に影響する場合がある。ＲＮＡ安定性の評価に有用な方法論及び手法がいくつか知られており、ＧＯＩコドン使用頻度が異なるレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）の貯蔵、並びに、レプリコンの効力（例えば、トランスフェクション後の細胞におけるｄｓＲＮＡを検査）及び遺伝子発現に対するその影響の、様々なインシリコ方法論及び／又は経験的ストレス試験が挙げられる。これに関するさらなる情報は、例えば、Ｗａｙｍｅｎｔ－Ｓｔｅｅｌｅ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （２０２１）． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．０８．２２．２６２９３１）で見出すことができる。ＲＮＡ安定性の増強で使用するための原理、戦略、及び方法に関するさらなる情報は、例えば、Ｌｅｐｐｅｋ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ． ｂｉｏＲｘｉｖ． （Ｐｒｅｐｒｉｎｔ）． Ｍａｒ ３０， ２０２１． ｄｏｉ： １０．１１０１／２０２１．０３．２９．４３７５８７で見出すことができる。
【0089】
ＧＯＩによってコードされるポリペプチドは、通常、あらゆるポリペプチドである可能性があり、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助用ポリペプチド、工業用酵素、及びレポーターポリペプチドである可能性がある。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗体、抗原、免疫調節剤、酵素、シグナル伝達タンパク質、及びサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗体、抗原、免疫調節剤、酵素、シグナル伝達タンパク質、又はサイトカインであり得るポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、微生物タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、哺乳類タンパク質、及び任意のこれらの組み合わせをコードすることができる。ＧＯＩの非限定例としては、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、ＩＬ－１０、ＩＬ－１０様、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１８ＢＰ、ＩＬ－１様、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－２０、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６様、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３７、ＩＬ－３８、ＬＩＦ、及びＯＳＭなどのインターロイキン及び相互作用タンパク質が挙げられる。さらなる好適なＧＯＩとして、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ）、ＴＮＦ（例えば、ＣＤ１５４、ＬＴ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＣＤ７０、ＣＤ１５３、ＣＤ１７８、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＡＬＬ－１、ＴＲＡＩＬ、ＴＷＥＡＫ、及びＴＲＡＮＣＥ）、ＴＧＦ－β（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３）、ヘマトポイエチン（例えば、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ、Ｆｌｔ－３Ｌ、ＳＣＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＭＳＰ）、ケモカイン及びその受容体（例えば、ＸＣＬ１、ＸＣＬ２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、及びＣＸ３ＣＬ１）、免疫抑制性遺伝子産物及び関連転写因子（例えば、ＰＥＣＡＭ１、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＯＳ、ＮＦＫＢ１、ＪＵＮ、ＨＩＦ１Ａ、ＰＤ－Ｌ１、ｍＴＯＲ、ＳＴＡＴ５Ｂ、及びＳＴＡＴ４）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【0090】
本開示の組成物及び方法に好適なさらなるＧＯＩとしては、免疫賦活性遺伝子産物（例えば、ＣＤ２７／ＣＤ７０、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、Ｂ７．１、ＢＴＬＡ、ＭＡＶＳ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＲＩＧ－Ｉ、及びＳＴＩＮＧ）、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＧ２、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＡＦＦ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＫ２、ＥＳＲ１、ＧＲＢ２、ＫＲＡＳ、ＭＤＲ１、ＭＲＰ１、ＮＴＲＫ１、ＰＤＣ４、Ｐ－ｇｐ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＲＯＳ１、ＲＳＫ１、ＲＳＫ２、ＳＨＩＰ、及びＳＴＫ１１などの遺伝子の薬剤耐性変異体／バリアントが挙げられるが、これらに限定はされない。また、本開示の組成物及び方法に好適なものとしては、ウイルスタンパク質、特にスパイクタンパク質、ファイバータンパク質、構造タンパク質、及び付着タンパク質をコードする配列も含まれる。
【0091】
いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗体又は抗体バリアント（例えば、単鎖Ｆｖ抗体、二重特異性抗体、ラクダ科抗体、Ｆａｂ抗体、及び重鎖抗体）をコードし得る。いくつかの実施形態では、上記抗体は、がんと関連付けられた、もしくはがんによりアップレギュレートされた表面分子、又は、感染性疾患と関連付けられた表面分子を標的とする。いくつかの実施形態では、上記抗体は、免疫賦活機能を有する、又は免疫抑制機能を有する表面分子を標的とする。
【0092】
いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、例えば、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、イミグルセラーゼ、タリグルセラーゼアルファ、ベラグルセラーゼアルファ、アルグルセラーゼ、セベリパーゼアルファ（ｓｅｂｅｌｉｐａｓｅ ａｌｐｈａ）、ラロニダーゼ、イデュルスルファーゼ、エロスルファーゼアルファ（ｅｌｏｓｕｌｆａｓｅ ａｌｐｈａ）、ガルスルファーゼ、アルグルコシダーゼアルファ（ａｌｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ａｌｆａ）、及びＣＴＦＲなどの、その欠乏や変異が疾患や健康状態と関連している酵素をコードしていることがある。
【0093】
いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗原分子、バイオ治療薬分子、又はこれらのうちいずれかの組み合わせから選択されるポリペプチドをコードしていることがある。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原、ネオアンチゲン、及びこれらのうちのいずれかの組み合わせから選択されるポリペプチドをコードしていることがある。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、エストロゲン受容体、細胞内シグナル伝達物質酵素、及びヒト上皮増殖 受容体から選択されるポリペプチドをコードしていることがある。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、免疫調節薬、血管新生調節薬、細胞外マトリックス調節薬、代謝調節薬、神経調節薬、及びこれらのうちのいずれかの組み合わせから選択されるバイオ治療用ポリペプチドをコードしていることがある。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子から選択されるサイトカインをコードしていることがある。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－２３、ＩＬ－２７、ＩＬ－３５、ＩＦＮγ、及びこれらのうちのいずれかのサブユニットから選択されるインターロイキンをコードしていることがある。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、ＩＬ－１２Ａ、ＩＬ－１２Ｂ、ＩＬ－１ＲＡ、及びこれらのうちのいずれかの組み合わせから選択されるバイオ治療用ポリペプチドをコートしていることがある。
【0094】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、ベクター内に組み込まれている場合がある。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、一本鎖ベクター、例えば、ｓｓＤＮＡベクター又はｓｓＲＮＡベクターである場合がある。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、二本鎖ベクター、例えば、ｄｓＤＮＡベクター又はｄｓＲＮＡベクターであることがある。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、プラスミドであることがある。以下でより詳細に説明されるように、本開示のベクターは、組換えＤＮＡ技術、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、分子クローニングなど、又は化学合成を用いて生成されることがある。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、完全合成ベクター、例えば、完全合成ｓｓＤＮＡベクターであることがある。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、完全合成ｄｓＤＮＡベクターであることがある。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ＰＣＲ反応の産物であることがある。いくつかの実施形態では、本開示のベクターは、ＲＣＡ反応の産物であることがある。いくつかの実施形態では、ベクターは、遺伝子送達ベクターであることがある。いくつかの実施形態では、ベクターは、遺伝子を細胞内に移入するための遺伝子送達媒体として使用されることがある。
【0095】
いくつかの実施形態では、ＧＯＩによってコードされるポリペプチドは、組換えポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、トリインフルエンザＡ Ｈ５Ｎ１の抗原性ＨＡポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、ＥＳＲ１、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３などのオンコロジーに関連したタンパク質、又はその一部をコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、ＩＬ－１ＲＡ又はＩＬ－１２などのサイトカインをコードする。
【0096】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号１～４からなる群から選択される核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、アルファウイルス種の改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号１の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、アルファウイルス種の改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号２の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、アルファウイルス種の改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号３の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、アルファウイルス種の改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物は、配列番号４の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、アルファウイルス種の改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含む。
表１：配列表中の配列の簡潔な説明
表１：配列表中の配列の簡潔な説明
【表1】
【0097】
目的のアルファウイルス種の改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）の配列に対して高度な配列同一性（例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）を有する核酸配列は、アルファウイルス種ゲノム内で特定された配列から、縮重プライマー又は遺伝子特異的プライマーを用いるゲノム配列解析、ハイブリダイゼーション、及び／又はＰＣＲによって、本明細書において特定された配列（例えば、配列番号１～４）又は当該技術分野において公知であるような任意の他のものを使用することによって、識別及び／又は単離することができる。
【0098】
これらの新規核酸構築物を構築し特徴付けするのに用いた分子的な技術及び方法は、本出願の本明細書の実施例でより詳細に説明される。
【0099】
いくつかの実施形態では、上記核酸分子は組換え核酸分子である。上記のように、組換えという用語核酸分子は、ヒトの操作から得られた、又は間接的にであれヒトの操作の結果として生じた、あらゆる核酸分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を意味する。非限定例として、ｃＤＮＡは組換えＤＮＡ分子であり、インビトロポリメラーゼ反応によって生成された、又はリンカーが取り付けられた、又はクローニングベクターもしくは発現ベクターなどのベクターに組み込まれた、あらゆる核酸分子も同様である。非限定例として、組換え核酸分子は、１）例えば、化学的もしくは酵素的な手法を用いて（例えば、化学的な核酸合成の使用によって、もしくは、核酸分子の複製、重合、エキソヌクレアーゼによる消化、ヌクレオチド鎖切断による消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基修飾（例えば、メチル化を含む）、もしくは組換え（相同組換え及び部位特異的組換えを含む）のための酵素の使用によって、インビトロにおいて合成もしくは改変されたものであり；２）天然では結合していない、結合したヌクレオチド配列を含むものであり；３）天然ヌクレオチド配列と比較して１もしくは複数のヌクレオチドを欠くように分子クローニング手法を用いて操作されたものであり；且つ／又は、４）天然ヌクレオチド配列と比較して１又は複数の配列変化又は配列再編成を有するように分子クローニング手法を用いて操作されたものである。
【0100】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニングなど）又は化学合成を用いて生成される。本明細書で開示されるような核酸分子には、天然の核酸分子及びそのホモログが含まれ、天然の対立遺伝子多型、並びに、改変によって本明細書に記載されているような生物活性を発揮する際に所望の特性が得られるように、１又は複数のヌクレオチド残基が挿入、欠失、及び／又は置換された、改変核酸分子が挙げられるが、これらに限定はされない。
【0101】
天然核酸配列のバリアントを含んで、核酸分子は、当業者に公知の多くの方法を用いて生成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９）を参照されたい）。核酸分子の配列は、古典的な変異誘発法及び組換えＤＮＡ法を含むがこれらに限定はされない様々な手法を用いて、由来元である天然配列から改変することができ、例えば、部位特異的変異誘発、核酸分子の化学処理による変異誘導、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択された領域のＰＣＲ増幅及び／又は変異誘発、組換えクローニング、並びに、オリゴヌクレオチド混合物の化学合成と混合物群のライゲーションとによる、核酸分子の混合物の「構築」を含む化学合成、並びに、これらの組み合わせなどであるが、これらに限定はされない。核酸分子ホモログは、当該核酸分子によってコードされるタンパク質もしくはレプリコン（例えば、ｓｒＲＮＡ）の機能のスクリーニングによって、及び／又は、野生型遺伝子もしくはその断片とのハイブリダイゼーションによって、又は、標的もしくは野生型核酸分子もしくは配列に対して相同性を有するプライマーを用いるＰＣＲによって、改変核酸分子の混合物から選別することができる。
【0102】
Ｂ．組換え細胞
以下でより詳細に説明されるように、本開示の１つの態様は、本明細書に記載されているような核酸構築物を含む（例えば、発現する）ように操作された組換え細胞に関する。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ）を宿主細胞に導入することで、上記核酸構築物及び／又はｓｒＲＮＡ構築物を含有する組換え細胞を作製することがある。例えば、本開示の核酸構築物を宿主細胞に導入することで、上記核酸構築物を含有する組換え細胞を作製することがある。したがって、本明細書に記載されているようなアルファウイルス種の改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）をコードする核酸構築物を含有する原核細胞又は真核細胞も、本開示の特徴である。関連の態様において、本明細書で開示されるいくつかの実施形態は、動物細胞などの宿主細胞に、本明細書で提供されるような核酸構築物を導入し、次いで、形質転換細胞をセレクション又はスクリーニングすることを含む、細胞を形質転換する方法に関する。本開示の核酸構築物の細胞への導入は、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、接合伝達、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を介したトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストランを介したトランスフェクション、リポソームを介したトランスフェクション、パーティクルガン技術、ダイレクトマイクロインジェクション、ナノ粒子を介した核酸送達などの、当業者に公知の方法によって、達成することができる。
以下でより詳細に説明されるように、本開示の１つの態様は、本明細書に記載されているような核酸構築物を含む（例えば、発現する）ように操作された組換え細胞に関する。いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ）を宿主細胞に導入することで、上記核酸構築物及び／又はｓｒＲＮＡ構築物を含有する組換え細胞を作製することがある。例えば、本開示の核酸構築物を宿主細胞に導入することで、上記核酸構築物を含有する組換え細胞を作製することがある。したがって、本明細書に記載されているようなアルファウイルス種の改変されたゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）をコードする核酸構築物を含有する原核細胞又は真核細胞も、本開示の特徴である。関連の態様において、本明細書で開示されるいくつかの実施形態は、動物細胞などの宿主細胞に、本明細書で提供されるような核酸構築物を導入し、次いで、形質転換細胞をセレクション又はスクリーニングすることを含む、細胞を形質転換する方法に関する。本開示の核酸構築物の細胞への導入は、例えば、ウイルス感染、トランスフェクション、接合伝達、原形質融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を介したトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストランを介したトランスフェクション、リポソームを介したトランスフェクション、パーティクルガン技術、ダイレクトマイクロインジェクション、ナノ粒子を介した核酸送達などの、当業者に公知の方法によって、達成することができる。
【0103】
１つの態様では、本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の核酸構築物を含む、組換え細胞、例えば、組換え真核細胞、例えば、昆虫細胞又は動物細胞に関する。この核酸構築物は、宿主ゲノム内に安定に組み込まれていることがあり、又は、エピソームとして複製している、すなわち、安定発現もしくは一過性発現を行うためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞内に存在することがある。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、核酸構築物は、エピソームユニットとして、組換え宿主細胞内で維持及び複製される。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、組換え細胞のゲノムに安定に組み込まれる。安定な組み込みは、古典的なランダムなゲノム組換え法を用いて、又は、ガイドＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９もしくはＴＡＬＥＮゲノム編集を使用するなどの、より正確なゲノム編集法によって、達成することができる。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、安定発現又は一過性発現を行うためのミニサークル発現ベクターとして組換え宿主細胞内に存在する。
【0104】
宿主細胞は、未形質転換細胞であることもあれば、少なくとも１つの核酸分子をトランスフェクト済みの細胞であることもある。したがって、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、少なくとも１つの核酸分子で遺伝子改変（例えば、形質導入又は形質転換又はトランスフェクション）されることがある。
【0105】
本明細書に記載されているような目的タンパク質のクローニング又は発現に好適な宿主細胞としては、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、組換え細胞は、大腸菌などの原核細胞、又は、昆虫細胞（例えば、蚊細胞もしくはＳｆ２１細胞）、もしくは哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、もしくはＨｅＬａ細胞）などの真核細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞はインビボの細胞、例えば生体内の組換え細胞、例えば遺伝子導入対象の細胞である。いくつかの実施形態では、上記対象は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、上記対象は昆虫である。いくつかの実施形態では、上記対象は哺乳類対象である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類対象はヒト対象である。いくつかの実施形態では、上記細胞はエキソビボの細胞であり、例えば、処理又は手順にかけるために生体又は生物から個々の細胞として、又は器官もしくは組織の一部として抽出されたものであり、その後、上記生体又は生物に戻される。いくつかの実施形態では、上記細胞はインビトロの細胞であり、例えば、貯蔵所から得られる。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、上記動物細胞は脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は哺乳類細胞である。
【0106】
グリコシル化タンパク質の発現において、好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来するものであり得る。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞が挙げられる。脊椎動物細胞が宿主として使用されることもある。これに関して、懸濁液中で増殖するように適合された哺乳類細胞株が有用であり得る。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、上記動物細胞は脊椎動物細胞又は無脊椎動物細胞である。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、上記動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、上記動物細胞は非ヒト動物細胞である。いくつかの実施形態では、上記細胞は非ヒト霊長類細胞である。有用な哺乳類宿主細胞株のさらなる例としては、ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１細胞（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児由来腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、ＦＳ４細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ細胞）、ヒトＡ５４９細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒトＣＨＭＥ５細胞、ヒトＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞、ヒト喉頭類表皮細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトＨＵＨ－７細胞、ヒトＭＲＣ－５細胞、ヒト筋細胞、ヒト内皮細胞、ヒトアストロサイト、ヒトマクロファージ細胞、ヒトＲＡＷ２６４．７細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウスＬ９２９細胞、マウス結合組織細胞、マウス筋細胞、及びウサギ腎臓細胞を含む。
【0107】
いくつかの実施形態では、組換え細胞は、アフリカミドリザル腎臓細胞（ベロ細胞）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ヒトＡ５４９細胞、ヒト子宮頸部細胞、ヒトＣＨＭＥ５細胞、ヒト喉頭類表皮細胞、ヒト線維芽細胞、ヒトＨＥＫ－２９３細胞、ヒトＨｅＬａ細胞、ヒトＨｅｐＧ２細胞、ヒトＨＵＨ－７細胞、ヒトＭＲＣ－５細胞、ヒト筋細胞、マウス３Ｔ３細胞、マウス結合組織細胞、マウス筋細胞、及びウサギ腎臓細胞からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞はＢＨＫ細胞である。いくつかの実施形態では、上記ＢＨＫ細胞はＢＨＫ－２１細胞である。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞はベロ細胞である。
【0108】
いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は、昆虫細胞、例えば昆虫細胞株の細胞である。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞はＳｆ２１細胞である。さらなる好適な昆虫細胞株としては、昆虫の双翅目、鱗翅目、及び半翅目から樹立された細胞株が挙げられるが、これらに限定はされず、様々な組織供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は、鱗翅目昆虫細胞株の細胞である。過去数十年間で、鱗翅目昆虫細胞株の利用可能性は約５０株／１０年の速度で増加してきた。利用可能な鱗翅目昆虫細胞株に関するさらなる情報は、例えば、参照によって本明細書に援用される、Ｌｙｎｎ Ｄ．Ｅ．， Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２００７；３８８：１１７－３８に見出すことができる。いくつかの実施形態では、上記組換え細胞は、蚊細胞、例えば、ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）（Ａｎ．）、イエカ属（Ｃｕｌｅｘ）（Ｃｘ．）、及びヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）（ヒトスジシマカ）（Ａｅ．）に含まれる蚊種の細胞である。本明細書に記載の組成物及び方法に好適な例示的な蚊細胞株としては、以下の蚊種から得られた細胞株が挙げられる：ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）、アエデス・シュードスキュテラリス（Ａｅｄｅｓ ｐｓｅｕｄｏｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ）、アエデス・トリセリアタス（Ａｅｄｅｓ ｔｒｉｓｅｒｉａｔｕｓ）、アエデス・ベクサンス（Ａｅｄｅｓ ｖｅｘａｎｓ）、ガンビアハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）、ステフェンスハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）、アノフェレス・アルビマヌス（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ａｌｂｉｍａｎｕｓ）、クレクス・クインクエファスキアツス（Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ）、クレクス・タイレリ（Ｃｕｌｅｘ ｔｈｅｉｌｅｒｉ）、コガタアカイエカ（Ｃｕｌｅｘ ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）、カラツイエカ（Ｃｕｌｅｘ ｂｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ）、及びトキソリンキテス・アンボイネンシス（Ｔｏｘｏｒｈｙｎｃｈｉｔｅｓ ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓ）。好適な蚊細胞株としては、ＣＣＬ－１２５、Ａａｇ－２、ＲＭＬ－１２、Ｃ６／２６、Ｃ６／３６、Ｃ７－１０、ＡＰ－６１、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－１、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ－２、ＵＭ－ＡＶＥ１、Ｍｏｓ．５５、Ｓｕａ１Ｂ、４ａ－３Ｂ、Ｍｏｓ．４３、ＭＳＱ４３、及びＬＳＢ－ＡＡ６９５ＢＢが挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、上記蚊細胞は、Ｃ６／２６細胞株の細胞である。
【0109】
Ｃ．細胞培養
別の態様において、少なくとも１つの本明細書で開示されるような組換え細胞と、培地と、を含む細胞培養が、本明細書で提供される。通常、上記培地は、本明細書に記載の細胞を培養するために好適ないかなる培地であってもよい。種々様々な上述の宿主細胞及び種を形質転換する手法が、当該技術分野において公知であり、技術文献及び科学文献に記載されている。したがって、本明細書で開示されるような組換え細胞を少なくとも１つ含む細胞培養も、本願の範囲内である。細胞培養物を作製及び維持するのに適した方法及び系は当該技術分野において公知である。
別の態様において、少なくとも１つの本明細書で開示されるような組換え細胞と、培地と、を含む細胞培養が、本明細書で提供される。通常、上記培地は、本明細書に記載の細胞を培養するために好適ないかなる培地であってもよい。種々様々な上述の宿主細胞及び種を形質転換する手法が、当該技術分野において公知であり、技術文献及び科学文献に記載されている。したがって、本明細書で開示されるような組換え細胞を少なくとも１つ含む細胞培養も、本願の範囲内である。細胞培養物を作製及び維持するのに適した方法及び系は当該技術分野において公知である。
【0110】
Ｄ．トランスジェニック動物
また、別の態様において、本明細書に記載されているような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）を含むトランスジェニック動物が提供される。いくつかの実施形態では、上記トランスジェニック動物は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、上記トランスジェニック動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、上記トランスジェニック哺乳動物は非ヒト哺乳動物である。通常、本開示のトランスジェニック動物は、当該技術分野において公知のいかなる非ヒト動物であってもよい。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト動物は非ヒト霊長類である。本開示の組成物及び方法に好適な他の動物種としては、（ｉ）遺伝子組換えに好適であり、且つ、（ｉｉ）免疫グロブリン遺伝子セグメントを再編成し、抗体応答を生じさせることが可能なものが挙げられる。そのような種の例としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及び雌ウシが挙げられるが、これらに限定はされない。本開示の組成物及び方法に好適な非ヒト動物のさらなる例として、実験動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、モルモットなど）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アヒル、ガチョウ、ニワトリなど）、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、チンパンジー、オランウータン、サルなど）、魚、両生類（例えば、カエル、サンショウウオなど）、爬虫類（例えば、ヘビ、トカゲなど）、及び他の動物（例えば、キツネ、イタチ、ウサギ、ミンク、ビーバー、オコジョ、カワウソ、クロテン、アザラシ、コヨーテ、チンチラ、シカ、ジャコウネズミ、ポッサムなど）が含まれることがあるが、これらに限定はされない。
また、別の態様において、本明細書に記載されているような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）を含むトランスジェニック動物が提供される。いくつかの実施形態では、上記トランスジェニック動物は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、上記トランスジェニック動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、上記トランスジェニック哺乳動物は非ヒト哺乳動物である。通常、本開示のトランスジェニック動物は、当該技術分野において公知のいかなる非ヒト動物であってもよい。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト動物は非ヒト霊長類である。本開示の組成物及び方法に好適な他の動物種としては、（ｉ）遺伝子組換えに好適であり、且つ、（ｉｉ）免疫グロブリン遺伝子セグメントを再編成し、抗体応答を生じさせることが可能なものが挙げられる。そのような種の例としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、及び雌ウシが挙げられるが、これらに限定はされない。本開示の組成物及び方法に好適な非ヒト動物のさらなる例として、実験動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、モルモットなど）、家畜（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アヒル、ガチョウ、ニワトリなど）、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、チンパンジー、オランウータン、サルなど）、魚、両生類（例えば、カエル、サンショウウオなど）、爬虫類（例えば、ヘビ、トカゲなど）、及び他の動物（例えば、キツネ、イタチ、ウサギ、ミンク、ビーバー、オコジョ、カワウソ、クロテン、アザラシ、コヨーテ、チンチラ、シカ、ジャコウネズミ、ポッサムなど）が含まれることがあるが、これらに限定はされない。
【0111】
いくつかの実施形態では、上記トランスジェニック動物は昆虫である。いくつかの実施形態では、上記昆虫は蚊である。いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック動物は、キメラトランスジェニック動物である。いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック動物は、１又は複数（例えば、１以上、２以上、３以上、４以上など）の本開示の核酸構築物を含有する生殖細胞及び体細胞を含む、トランスジェニック動物である。いくつかの実施形態では、上記１又は複数の核酸構築物は、上記トランスジェニック動物のゲノムに安定に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック動物のゲノムは、１又は複数の本開示の核酸構築物のコピーを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上のうちのいずれか含むことがある。
【0112】
トランスジェニック非ヒト動物を作製するためのアプローチ及び方法は、当該技術分野において公知である。例示的な方法としては、前核マイクロインジェクション、ＤＮＡマイクロインジェクション、レンチウイルスベクターを介した初期胚へのＤＮＡ移入、精子を介した遺伝子組換え、アデノウイルスを介した動物精子へのＤＮＡ導入（例えば、ブタ）、レトロウイルスベクター（例えば、鳥類）、体細胞核移植（例えば、ヤギ）が挙げられる。トランスジェニック家畜動物の作製における技術の現状は、Ｎｉｅｍａｎｎ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｒｅｖ． Ｓｃｉ． Ｔｅｃｈ． ２４：２８５－２９８で概説されている。いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック非ヒト宿主動物は、外来性核酸を非ヒト動物のゲノムに導入するための当該技術分野において公知の標準方法を用いて作製される。いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック動物は、古典的なランダムゲノム組換え法を用いて、又は、ガイドＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集、もしくはＮｇＡｇｏ（ナトロノバクテリウム・グレゴリー（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒｅｇｏｒｙｉ）のアルゴノート）を用いたＤＮＡ先導型エンドヌクレアーゼゲノム編集、もしくはＴＡＬＥＮゲノム編集（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）などのより正確な手法を用いて、作製されることがある。いくつかの実施形態では、本開示のトランスジェニック動物は、トランスジェニックマイクロインジェクション技術を用いて作製されることがあり、相同組換え技術の使用を必要としないことから、相同組換えを用いるアプローチよりも作製と選別がより簡単であると考えられる。いくつかの実施形態では、上記トランスジェニック動物は、本明細書に記載されているような目的タンパク質を産生する。
【0113】
Ｅ．医薬組成物
本開示の核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチドは、医薬組成物を含む組成物中に組み込まれることがある。このような組成物は、通常、本明細書に記載及び提供された核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチドのうちの１又は複数と、薬剤的に許容できる賦形剤、例えば担体と、を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、免疫疾患又は微生物感染症などの健康状態の予防用、治療用、又は管理用に製剤化される。例えば、本開示の組成物は、薬剤的に許容できる賦形剤又はその混合物を含む、予防用組成物、治療用組成物、又は医薬組成物として製剤化されることがある。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ワクチンとしての用途のために製剤化される。いくつかの実施形態では、本出願の組成物は、アジュバントとしての用途のために製剤化される。
本開示の核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチドは、医薬組成物を含む組成物中に組み込まれることがある。このような組成物は、通常、本明細書に記載及び提供された核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチドのうちの１又は複数と、薬剤的に許容できる賦形剤、例えば担体と、を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、免疫疾患又は微生物感染症などの健康状態の予防用、治療用、又は管理用に製剤化される。例えば、本開示の組成物は、薬剤的に許容できる賦形剤又はその混合物を含む、予防用組成物、治療用組成物、又は医薬組成物として製剤化されることがある。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ワクチンとしての用途のために製剤化される。いくつかの実施形態では、本出願の組成物は、アジュバントとしての用途のために製剤化される。
【0114】
したがって、１つの態様において、薬剤的に許容できる賦形剤と、ａ）本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）；ｂ）本開示の組換え細胞；及び／又はｃ）本開示の組換えポリペプチドと、を含む医薬組成物が、本明細書で提供される。本開示の医薬組成物の非限定的且つ例示的な実施形態は、以下の特徴のうちの１又は複数を含む可能性がある。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）と、薬剤的に許容できる賦形剤と、を含む組成物が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような組換え細胞と、薬剤的に許容できる賦形剤と、を含む組成物が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、上記組成物は、本明細書で開示されるような組換えポリペプチドと、薬剤的に許容できる賦形剤と、を含む。
【0115】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）は、ネイキッド形態で使用されることがあり、あるいは、送達ビヒクルと製剤化されることがある。本開示の組成物及び方法に好適な例示的な送達ビヒクルは、リポソーム（例えば、中性リポソーム又はアニオン性リポソーム）、ミクロスフェア、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ポリプレックス、ポリマーナノ粒子、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）を包含するが、これらに限定はされず、あるいは、送達を促進することができ、及び／又は免疫応答を増強することができる生物活性リガンドとコンジュゲートされる。これらの化合物は、当業者が容易に利用可能であり；例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＲＣＰ Ｎｅｗ Ｅｄ， ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ （１９９０）を参照されたい。リポソームなど以外のアジュバントも使用され、当該技術分野において公知である。アジュバントは、抗原（例えば、核酸構築物、ベクター、ｓｒＲＮＡ分子）を、局所的な沈殿物中に隔離することで、急速な分散から保護する場合があり、あるいは、マクロファージ走化性因子などの免疫系成分を分泌するように宿主を刺激する物質を含有する場合がある。例えば下記のものからの適切な選択は、当業者であれば行うことができる。
【0116】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、以下のうちの１又は複数を含むことがある：生理的緩衝液、リポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）、ポリプレックス、ポリマーナノ粒子、ウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）、ミクロスフェア、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、生物活性リガンドのコンジュゲート、又はそのいずれかの組み合わせ。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、リポソーム製剤とされる。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤とされる。ＬＮＰは、通常、ウイルス粒子よりも免疫原性が低い。多くのヒトがウイルス粒子に対しては既存の免疫を持つが、ＬＮＰに対しては既存の免疫がない。加えて、ＬＮＰに対する適応免疫応答は起こりにくく、このことがＬＮＰの反復投与を可能にする。
【0117】
本明細書に記載の組成物及び方法に好適な脂質は、カチオン性脂質、イオン化可能カチオン性脂質、アニオン性脂質、又は中性脂質であり得る。
【0118】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、１又は複数のイオン化可能脂質を含むことがある。本明細書で使用される場合、「イオン化可能脂質」という用語は、ｐＨが脂質のイオン性基のｐＫａよりも低くなると、カチオン性となる、又はイオン性になる（プロトン化する）が、ｐＨ値が高くなるほどに中性になっていく脂質を指す。ｐＫａを下回るｐＨ値では、この脂質は、負に帯電している核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と結び付くことが可能となる。本明細書で使用される場合、「イオン化可能脂質」という用語は、生理的ｐＨからｐＨが下がると正電荷を呈する脂質、及び生理的ｐＨなどの選択的ｐＨで正味の正電荷を帯びるいくつもの脂質種のうちのいずれかを包含する。ＤＯＴＭＡなどの永続的にカチオン性である脂質は、臨床用途には有毒過ぎることが分かっている。イオン化可能脂質は、他の実施形態における脂質製剤中に存在していることがあり、好ましくは、いくつかの実施形態では約３０～約７０ｍｏｌ％の範囲内で、他の実施形態では約３０ｍｏｌ％で、他の実施形態では約４０ｍｏｌ％で、他の実施形態では約４５ｍｏｌ％で、他の実施形態では約４７．５ｍｏｌ％で、さらに他の実施形態では約５０ｍｏｌ％で、さらに他の実施形態では約６０ｍｏｌ％で、存在している（「ｍｏｌ％」は、特定の成分の総モルに対する割合を意味する）。本段落における「約」という用語は、±５ｍｏｌ％の範囲を示す。ＤＯＤＭＡ、すなわち１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパンはイオン化可能脂質であり、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又は０－（Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ－ヘプタトリアコンタ－６，９，２６，２９－テトラエン－１９－イル）－４－（Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）（「ＭＣ３」）も同様である。
【0119】
本開示の組成物及び方法に好適である例示的なイオン化可能脂質としては、国際公開第２０２０２５２５８９号及び同第２０２１００００４１号、米国特許第８，４５０，２９８号及び同第１０，８４４，０２８号、並びにＬｏｖｅ Ｋ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， Ｆｅｂ． ２， ２０１０ １０７ （５） １８６４－１８６９に記載されているものが挙げられ、これらは全て全体が参照によって本明細書に援用される。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、Ｃ１６－９６、Ｃ１４－１１０、及びＣ１２－２００などの、Ｌｏｖｅ Ｋ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．（２０１０、上記）に記載されている１又は複数の脂質化合物を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＡＬＣ－０３１５、Ｃ１２－２００、ＬＮ１６、ＭＣ３、ＭＤ１、ＳＭ－１０２、及びそのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるイオン化可能カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、Ｃ１２－２００脂質を含む。Ｃ１２－２００脂質の構造は、当該技術分野において公知であり、例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、米国特許第８，４５０，２９８号及び同第１０，８４４，０２８号に記載されている。いくつかの実施形態では、このＣ１２－２００は、コレステロール、Ｃ１４－ＰＥＧ２０００、及びＤＯＰＥと組み合わせられる。いくつかの実施形態では、このＣ１２－２００は、ＤＳＰＣ及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と組み合わせられる。
【0120】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、１又は複数のカチオン性脂質を含む。いくつかの異なるイオン化可能カチオン性脂質が、ＬＮＰで使用するために開発された。好適なカチオン性脂質としては、限定はされないが、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、Ｃ１４－ＰＥＧ２０００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、及び７Ｃ１が挙げられる。ＬＮＰの１種では、ＧａｌＮＡｃ部分が、ＬＮＰの外側に結合して、アシアロ糖タンパク質受容体を介した肝臓内への取り込みのためのリガンドとして作用する。これらのカチオン性脂質のいずれかを、本開示のｓｒＲＮＡ構築物及び核酸構築物を送達するためのＬＮＰ製剤化に使用することができる。
【0121】
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは１又は複数の中性脂質を含む。本開示の組成物及び方法に好適である非限定的な中性脂質としては、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭが挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰは、国際公開第２０２０２５２５８９号及び同第２０２１００００４１号に記載されている、１又は複数のイオン化可能脂質化合物を含む。
【0122】
当該技術分野において公知である、他のいくつもの脂質又は脂質の組み合わせが、ＬＮＰを生成するために使用することができる。ＬＮＰを生成するための使用に好適な脂質の非限定例としては、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、及びＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。カチオン性脂質のさらなる非限定例としては、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、Ｃ１４－ＰＥＧ２０００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、７Ｃ１、及びそのいずれかの組み合わせが挙げられる。中性脂質のさらなる非限定例としては、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭが挙げられる。ＰＥＧ修飾脂質の非限定例としては、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０が挙げられる。
【0123】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達系中の核酸に対する脂質の質量比は、約１００：１～約３：１、約７０：１～１０：１、又は１６：１～４：１である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達系中の核酸に対する脂質の質量比は、約１６：１～４：１である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達系中の核酸に対する脂質の質量比は、約２０：１である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達系中の核酸に対する脂質の質量比は、約８：１である。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０００ｎｍ未満、約５００ｎｍ未満、約２５０ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１５０ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、約７５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、又は約２５ｎｍ未満の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約７０ｎｍ～１００ｎｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約８８ｎｍ～約９２ｎｍ、８２ｎｍ～約８６ｎｍ、又は約８０ｎｍ～約９５ｎｍの範囲の平均直径を有する。
【0124】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、ポリマーナノ粒子製剤とされる。いくつかの実施形態では、上記組成物は、免疫原性組成物であり、例えば、対象における免疫応答を刺激することができる組成物である。いくつかの実施形態では、上記免疫原性組成物はワクチンとして製剤化される。いくつかの実施形態では、上記医薬組成物はアジュバントとして製剤化される。
【0125】
いくつかの実施形態では、上記免疫原性組成物は、対象に対して実質的に非免疫原性であり、例えば、対象における免疫応答を最低限にしか刺激しない組成物である。いくつかの実施形態では、上記非免疫原性又は最低限に免疫原性の組成物は、バイオ治療薬として製剤化される。いくつかの実施形態では、上記医薬組成物は、鼻腔内投与用、経皮投与用、腹腔内投与用、筋内投与用、リンパ節内投与用、腫瘍内投与用、関節内投与用、静脈内投与用、皮下投与用、腟内投与用、眼内投与用、直腸内投与、及び経口投与のうちの１又は複数のために製剤化される。
【0126】
注射剤用途に好適な医薬組成物としては、無菌注射液又は無菌分散液を即時調製するための、無菌水性溶液又は無菌水性分散液、及び無菌散剤が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ社、パーシッパニー、ニュージャージー州）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。これらの場合において、上記組成物は、無菌であるべきであり、且つ、容易な通針性を呈する程度に流動性であるべきである。上記組成物は、製造及び保管の条件下で安定とすることができ、細菌及び真菌などの微生物の混入行為から保護することができる。上記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物、を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、及び、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウムの使用によって、維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど、によって、達成することができる。多くの場合で、上記組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、及び／又は塩化ナトリウム、を含むことが通常となる。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延する薬剤、例えばステアリン酸アルミニウム及びゼラチン、を組成物に含めることによって達成することができる。
【0127】
無菌注射液は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒中に、必要に応じて上記成分の１種又は組み合わせと一緒に、混合した後、濾過滅菌を行うことで、調製できる。通常、分散液は、活性化合物を、基礎となる分散媒及び上記に挙げたものの中から必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に混合することによって、調製される。
【0128】
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物は、エアゾール、スプレー、ミスト、液体、又は粉末などの、吸入用製剤にされる。吸入による投与は、吸入デバイス、例えば、マイクロスプレー、加圧式定量吸入器、又はネブライザー、の使用を通じて、対象（例えば、患者）によって吸入される、乾燥粉末又はエアゾール製剤の形態での投与である場合がある。
【0129】
いくつかの実施形態では、上記組成物は、鼻腔内投与用、経皮投与用、筋内投与用、リンパ節内投与用、腫瘍内投与用、関節内投与用、静脈内投与用、腹腔内投与用、経口投与用、腟内投与用、眼内投与用、直腸内投与用、又は頭蓋内投与用のうちの１又は複数のために製剤化される。いくつかの実施形態では、投与された上記組成物は上記対象におけるインターフェロン産生の増加をもたらす。
【0130】
本開示の方法
以下でより詳細に説明されるように、本開示の１つの態様は、特に、ｎｓＰコード配列の少なくとも一部の置換することによってアルファウイルスを機能化する方法、目的遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされる目的ポリペプチドを生成する方法、必要とする対象における免疫応答を誘発する方法、並びに、必要とする対象における健康状態を予防及び／又は治療する方法に関する。
以下でより詳細に説明されるように、本開示の１つの態様は、特に、ｎｓＰコード配列の少なくとも一部の置換することによってアルファウイルスを機能化する方法、目的遺伝子（ＧＯＩ）によってコードされる目的ポリペプチドを生成する方法、必要とする対象における免疫応答を誘発する方法、並びに、必要とする対象における健康状態を予防及び／又は治療する方法に関する。
【0131】
アルファウイルスを機能化する方法
上記で概要を述べたように、本開示のある態様は、アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を機能化／操作するための方法に関する。上記方法は、（ａ）非機能性のアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを準備すること；（ｂ）上記非機能性アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの非構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部を、異なるアルファウイルス株由来の対応するｎｓＰ又はその一部の異種コード配列と置き換えることで、改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを作製すること；（ｃ）上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの機能性を評価すること；（ｄ）上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンがＲＮＡ複製及び／又は発現可能である場合に、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを機能的であると見なすこと、を含む。
上記で概要を述べたように、本開示のある態様は、アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を機能化／操作するための方法に関する。上記方法は、（ａ）非機能性のアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを準備すること；（ｂ）上記非機能性アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの非構造タンパク質（ｎｓＰ）又はその一部を、異なるアルファウイルス株由来の対応するｎｓＰ又はその一部の異種コード配列と置き換えることで、改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを作製すること；（ｃ）上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの機能性を評価すること；（ｄ）上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンがＲＮＡ複製及び／又は発現可能である場合に、上記改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンを機能的であると見なすこと、を含む。
【0132】
いくつかの実施形態では、異種ｎｓＰ又はその一部は、同じアルファウイルス種の別株由来である。いくつかの実施形態では、異種ｎｓＰ又はその一部は、別のアルファウイルス種由来である。いくつかの実施形態では、異種ｎｓＰ又はその一部は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４、又はそのいずれかの一部である。いくつかの実施形態では、アルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）が非機能性であることは、宿主細胞内での自己複製が不充分であることによって判定される。通常、本開示の改変されたアルファウイルスゲノム又はＲＮＡレプリコンの機能性は、ＲＮＡ複製の検出、ウイルスタンパク質発現の検出、細胞変性効果（ＣＰＥ）の検出、及び異種導入遺伝子発現の検出などの、当該技術分野において公知の１又は複数のアッセイ及び方法論を使用することによって、評価することができる。特に、非機能的なアルファウイルスは、例えば、限定はされないが、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、又はＨＥＫ２９３などの、細胞培養物内又は初代細胞株内で自己複製が不可であるものとして、特定することができる。上記のように、アルファウイルスの非機能性は、寄託されたアルファウイルス配列（例えば、公開データベースから検索された配列）が、合成によって再現された場合に、自己複製するには不充分であることが判明した場合に、決定することができる。
【0133】
目的ポリペプチドを生成する方法
ある態様において、目的ポリペプチドを生成するための方法であって、本明細書で開示されるような核酸構築物を含む組換え細胞の培養を、上記組換え細胞がＧＯＩによってコードされるポリペプチドを産生する条件下で行うことを含む、方法が、本明細書で提供される。別の態様において、対象において目的ポリペプチドを生成するための方法であって、本明細書で開示されるような核酸構築物を上記対象に投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、上記対象は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、上記対象は哺乳類対象である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類対象はヒト対象である。したがって、本明細書で開示される方法によって生成された組換えポリペプチドも、本開示の範囲内である。
ある態様において、目的ポリペプチドを生成するための方法であって、本明細書で開示されるような核酸構築物を含む組換え細胞の培養を、上記組換え細胞がＧＯＩによってコードされるポリペプチドを産生する条件下で行うことを含む、方法が、本明細書で提供される。別の態様において、対象において目的ポリペプチドを生成するための方法であって、本明細書で開示されるような核酸構築物を上記対象に投与することを含む、方法が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、上記対象は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、上記対象は哺乳類対象である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類対象はヒト対象である。したがって、本明細書で開示される方法によって生成された組換えポリペプチドも、本開示の範囲内である。
【0134】
組換えポリペプチドを生成するための本開示の方法の非限定的且つ例示的な実施形態は、以下の特徴のうちの１又は複数を含む可能性がある。いくつかの実施形態では、本開示の組換えポリペプチドを生成するための方法は、生成されたポリペプチドを単離及び／又は精製することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドを生成するための方法は、半減期を延長するために、生成されたポリペプチドを構造的に改変することをさらに含む。いくつかの実施形態では、生成されたポリペプチドのＮ末端は、半減期を延長するために、化学的又は酵素的にさらに改変されることがある。いくつかの実施形態では、生成されたポリペプチドのＣ末端は、半減期を延長するために、化学的及び／又は酵素的に改変される。本明細書に記載の方法に好適な化学的改変及び酵素的改変の非限定例としては、ペグ化、ＸＴＥＮ化、ＰＡＳ化（登録商標）、ＥＬＰ化、及びＨＡＰ化が挙げられる。これらの改変に好適な手法、システム、及び試薬は、当該技術分野において公知である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって生成されるポリペプチドは、半減期を延長するために、ＰＥＧ化、ＸＴＥＮ化、ＰＡＳ化、ＥＬＰ化、及び／又はＨＡＰ化されることがある。いくつかの実施形態では、生成されたポリペプチドは、半減期を延長するために、別のタンパク質又はペプチド（例えば、血清アルブミン、抗体のＦｃドメイン、トランスフェリン、ＧＬＫ、又はＣＴＰペプチド）にコンジュゲートされる。
【0135】
ある実施形態において、目的ポリペプチドを生成する方法は、（ｉ）本開示のトランスジェニック動物を飼育すること、又は（ｉｉ）本開示の核酸構築物を含む組換え細胞の培養を、上記組換え細胞がＧＯＩによってコードされるポリペプチドを産生する条件下で行うことを含む。
【0136】
ある実施形態において、対象において目的ポリペプチドを生成する方法は、本開示の核酸構築物を上記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、上記対象は脊椎動物又は無脊椎動物である。いくつかの実施形態では、上記動物は昆虫である。いくつかの実施形態では、上記対象は哺乳類対象である。いくつかの実施形態では、上記哺乳類対象はヒト対象である。
【0137】
薬力学的効果を誘導する方法、免疫応答を誘発する方法、健康状態を予防する方法、又は健康状態を治療する方法
本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物、のいずれか１つの投与は、増殖性疾患（例えば、がん）、感染性疾患（例えば、急性感染症、慢性感染症、又はウイルス感染症）、希少疾患、及び／又は自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患などの、関係のある健康状態の治療で使用されることがある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、１もしくは複数の関連のある健康状態もしくは疾患を有する、それを有する疑いがある、又はそれを発症するリスクが高い可能性がある、個体を治療する方法で使用するための治療薬に、組み込まれることがある。例示的な健康状態又は疾患としては、がん、免疫疾患、遺伝子治療、遺伝子置換、心血管疾患、加齢性病態、急性感染症、及び慢性感染症を挙げることができるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、上記個体は、医師の治療を受けている患者である。
本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物、のいずれか１つの投与は、増殖性疾患（例えば、がん）、感染性疾患（例えば、急性感染症、慢性感染症、又はウイルス感染症）、希少疾患、及び／又は自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患などの、関係のある健康状態の治療で使用されることがある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、１もしくは複数の関連のある健康状態もしくは疾患を有する、それを有する疑いがある、又はそれを発症するリスクが高い可能性がある、個体を治療する方法で使用するための治療薬に、組み込まれることがある。例示的な健康状態又は疾患としては、がん、免疫疾患、遺伝子治療、遺伝子置換、心血管疾患、加齢性病態、急性感染症、及び慢性感染症を挙げることができるが、これらに限定はされない。いくつかの実施形態では、上記個体は、医師の治療を受けている患者である。
【0138】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、対象において薬力学的効果を誘導するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、必要とする対象における免疫応答を調節する、例えば、誘発又は抑制するのに有用であり得る。したがって、１つの態様では、必要とする対象における免疫応答を誘発するための方法であって、ａ）本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）；ｂ）本開示の組換え細胞；ｃ）本開示の組換えポリペプチド；及び／又はｄ）本開示の医薬組成物、を含む組成物を、上記対象に投与することを含む方法が、本明細書で提供される。
【0139】
本明細書に記載の組成物の薬力学的効果を与える能力の分析は、インビボ及び／又はエキソビボで実行され得る。分析され得る薬力学的効果の例としては以下が挙げられる：免疫原性効果（例えば、インビボにおいて免疫応答を誘発する）、バイオマーカー反応、治療効果、予防効果、所望の効果、望ましくない効果、有害作用、及び疾病モデルにおける効果。いくつかの実施形態では、薬力学的効果の評価は、インビボにおける免疫応答の誘導を評価することを含む。いくつかの実施形態では、薬力学的効果の評価は、免疫応答を増強し、血管新生及び転移を抑制することができる、サイトカイン経路の誘導を評価することを含む。
【0140】
別の態様において、必要とする対象における健康状態を予防及び／又は治療するための方法であって、ａ）本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）；ｂ）本開示の組換え細胞；ｃ）本開示の組換えポリペプチド；及び／又はｄ）本開示のいずれか１つの医薬組成物、を含む組成物を上記対象に予防目的又は治療目的で投与すること、を含む方法が、本明細書で提供される。
【0141】
いくつかの実施形態では、上記健康状態は増殖性疾患又は微生物感染症である。いくつかの実施形態では、上記対象は、増殖性疾患もしくは微生物感染症に伴う状態を有する、又はそれを有する疑いがある。
【0142】
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。例えば、本開示の核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、経口的に、又は吸入によって与えられることがあるが、非経口経路を通じて投与されることの方が多い。非経口投与経路の例としては、例えば、静脈内投与、リンパ節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）投与、皮内投与、皮下投与、経皮（局所）投与、経粘膜的投与、腟内投与、及び直腸内投与が挙げられる。非経口適用に使用される溶液又は懸濁液は以下の成分を含むことがある：注射用蒸留水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの無菌の希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、並びに塩化ナトリウム又はブドウ糖などの張度調整剤。ｐＨは、リン酸一ナトリウム及び／もしくはリン酸二ナトリウム、塩酸、又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調整（例えば、約ｐＨ７．２～７．８、例えば、ｐＨ７．５に）され得る。非経口用調製物は、ガラス製又はプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器、又は反復投与用バイアル内に封入され得る。
【0143】
本開示の、このような主題の核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物の用量、毒性、及び治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対し致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある用量）を求めるための、細胞培養液又は実験動物における標準的な薬学的手法で、求められ得る。毒性効果と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が通常は好適である。有毒な副作用を示す化合物を使用することはできるが、未感染細胞に傷害を与える可能性を最小化し、それによって副作用を低減するために、そのような化合物を患部組織の部位に標的化する送達系を設計することに留意すべきである。
【0144】
例えば、細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータは、ヒトでの使用のための用量範囲を策定する際に使用され得る。このような化合物の用量は、通常、ＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にあり、毒性がほとんどない。用量は、採用された剤形及び使用される投与経路に応じて、この範囲内で変わることがある。本開示の方法で使用されるいずれの化合物においても、最初に、細胞培養アッセイから治療効果のある用量が見積もられ得る。細胞培養で求められるような、ＩＣ５０（例えば、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するように、用量が動物モデルで策定され得る。このような情報を用いることで、ヒトで有用な用量をより正確に求めることができる。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定され得る。
【0145】
本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、１回又は複数回／日～１回又は複数回／週投与されることがあり；１日おきに１回を含む。疾患の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康及び／又は年齢、並びに存在する他の疾患を含むがこれらに限定はされない、ある特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要な用量及びタイミングに影響を与える可能性があることは、当業者には理解される。さらに、本開示の主題の多価ポリペプチド及び多価抗体の治療有効量による対象の治療は、１回の治療を含むことがあり、あるいは、一連の治療を含むことがある。いくつかの実施形態では、上記組成物は、８時間毎に５日間投与され、その後に２～１４日間（例えば９日間）の休薬期間が続き、その後に追加の８時間毎に５日間の投与が続く。核酸構築物及び組換えポリペプチドに関しては、本開示の核酸構築物又は組換えポリペプチドの治療有効量（例えば、有効薬量）は、選択された核酸構築物又は組換えポリペプチドに依存する。例えば、患者の体重１ｋｇ当たりおよそ０．００１～０．１ｍｇの範囲内の１回投与量が、投与されることがある。いくつかの実施形態では、約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇが投与されることがある。いくつかの実施形態では、患者の体重１ｋｇ当たりおよそ０．０３μｇ～３００μｇの範囲内の１回投与量が、投与されることがある。いくつかの実施形態では、患者の体重１ｋｇ当たりおよそ０．３ｍｇ～３ｍｇの範囲内の１回投与量が、投与されることがある。
【0146】
上述したように、治療有効量は、健康状態（例えば疾患又は感染症）を有する対象、それを有する疑いがある対象、又はそのリスクがある対象などの、対象に投与された場合に特定の効果を促進するのに充分な、治療用組成物の量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、疾患もしくは感染症の症状の発症を予防もしくは遅延するため、疾患もしくは感染症の症状の経過を変えるため（例えば、限定はされないが、疾患もしくは感染症の症状の進行を遅くするため）、又は、疾患もしくは感染症の症状を回復に向かわせるために充分な量を含む。いかなる所与の症例においても、適切な「有効量」は、当業者が通例の実験法を用いて決定することができると理解されたい。
【0147】
疾患又は感染症の治療のための本開示の治療用組成物を含む治療の効力は、熟練した臨床医が求めることができる。しかし、疾患又は感染症の徴候又は症状の少なくともいずれか１つ又は全てが改善又は寛解されたならば、治療は有効な治療と見なされる。効力は、入院又は医療行為の必要によって評価されるような、個体が悪化しないこと（例えば、疾患又は感染症の進行が止まるか、少なくとも遅くなること）によっても、測ることができる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、及び／又は本明細書に記載されている。治療は、対象又は動物（いくつかの非限定例はヒト、又は哺乳動物を含む）における疾患又は感染症のあらゆる治療を含み、（１）上記疾患もしくは感染症を阻害すること、例えば、症状の進行を止めること、もしくは遅くすること；又は、（２）上記疾患もしくは感染症を軽減すること、例えば、症状の後退を引き起こすこと；及び、（３）症状の発症を抑制すること、もしくは症状の発症の可能性を低減すること、を含む。
【0148】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、薬剤的に許容できる担体を含む組成物中で、且つ、免疫応答を刺激するのに有効な量で、対象に投与されることがある。通常、対象は、最初の一連の注射（又は、下記の他の経路のうちの１つを介した投与）を通じて免疫化され、その後、最初の一連の投与によって得られた保護を増大するためのブースターが与えられ得る。最初の一連の注射とその後のブースターは、対象における免疫応答を、例えば、当該組成物を投与されていない対象におけるインターフェロン産生と比較して、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％刺激するために必要な用量で、且つ、そのような期間に亘って、投与される。いくつかの実施形態では、投与された上記組成物は上記対象におけるインターフェロン産生の増加をもたらす。本開示の方法のいくつかの実施形態では、上記対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、上記哺乳動物はヒトである。
【0149】
上記のように、注射剤用途に好適な薬剤的に許容できる担体には、無菌水溶液（水溶性の場合）又は無菌分散液、及び無菌注射液又は無菌分散液を即時調製するための無菌散剤が含まれる。これらの場合では、上記組成物は、無菌でなければならず、且つ、容易な通針性を呈する程度に流動性でなければならない。組成物はさらに、製造及び保管の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入行為から保護されなければならない。上記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用によって、分散液の場合で必要な粒径の維持によって、及び、界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど、によって達成され得る。
【0150】
無菌注射液は、必要量の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、及び／又は組換えポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要に応じて上記成分の１種又は組み合わせと一緒に、混合した後、濾過滅菌を行うことで、調製され得る。
【0151】
核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、適切に保護されている場合、上記のように、例えば不活性な希釈剤又は同化可能な食用担体と共に、経口投与され得る。核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物、並びに他の成分はまた、ハードシェルゼラチンカプセル又はソフトシェルゼラチンカプセル内に封入、錠剤に圧縮、又は個体の食事に直接混合され得る。治療目的の経口投与の場合、活性化合物は、賦形剤と混合されて、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用され得る。
【0152】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）及び組換えポリペプチドは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって、細胞又は対象に送達され得る。ＬＮＰは、通常、ウイルス粒子よりも免疫原性が低い。多くのヒトがウイルス粒子に対しては既存の免疫を持つが、ＬＮＰに対しては既存の免疫がない。加えて、ＬＮＰに対する適応免疫応答は起こりにくく、このことがＬＮＰの反復投与を可能にする。
【0153】
上述したように、いくつかの異なるイオン化可能カチオン性脂質が、ＬＮＰで使用するために開発された。これらとしては、特に、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＬＮ１６、及びＭＤ１が挙げられる。例えば、ＬＮＰの１種では、ＧａｌＮＡｃ部分が、ＬＮＰの外側に結合して、アシアロ糖タンパク質受容体を介した肝臓内への取り込みのためのリガンドとして作用する。これらのカチオン性脂質のいずれかが、本開示の核酸構築物及び組換えポリペプチドを肝臓に送達するためのＬＮＰ製剤化に使用され得る。
【0154】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、１０００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、２５０ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、７５ｎｍ未満、５０ｎｍ未満、又は２５ｎｍ未満の直径を有するあらゆる粒子を指す。あるいは、ナノ粒子は、サイズが、１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２５０ｎｍ、２５～２００ｎｍ、２５～１００ｎｍ、３５～７５ｎｍ、又は２５～６０ｎｍの範囲をとり得る。
【0155】
ＬＮＰは、カチオン性脂質、アニオン性脂質、又は中性脂質から調製され得る。融合性リン脂質であるＤＯＰＥや膜成分であるコレステロールなどの中性脂質は、トランスフェクション活性及びナノ粒子安定性を増強するための「ヘルパー脂質」としてＬＮＰに含まれ得る。カチオン性脂質の制限としては、安定性が乏しいこととクリアランスが急速であることにより効力が低いこと、また、炎症反応又は抗炎症反応の生成が挙げられる。ＬＮＰはまた、疎水性脂質、親水性脂質、又は疎水性脂質及び親水性脂質の両方を有し得る。
【0156】
上記のように、ＬＮＰで使用するために開発された、いくつもの脂質又は脂質の組み合わせが、本開示のＬＮＰを生成するために使用され得る。ＬＮＰの生成で使用するのに好適な脂質の非限定例としては、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＤＣ－コレステロール、ＤＯＴＡＰ－コレステロール、ＧＡＰ－ＤＭＯＲＩＥ－ＤＰｙＰＥ、及びＧＬ６７Ａ－ＤＯＰＥ－ＤＭＰＥ－ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ＬＮＰの生成で使用するのに好適なカチオン性脂質の非限定例としては、９８Ｎ１２－５、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（ＫＣ２）、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、ＸＴＣ、ＭＤ１、及び７Ｃ１が挙げられる。ＬＮＰの生成で使用するのに好適な中性脂質の非限定例としては、ＤＰＳＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭが挙げられる。ＬＮＰの生成で使用するのに好適なＰＥＧ修飾脂質の非限定例としては、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＣｅｒＣ１４、及びＰＥＧ－ＣｅｒａＣ２０が挙げられる。
【0157】
いくつかの実施形態では、これらの脂質を、任意の数字のモル比で組み合わせることで、ＬＮＰを生成することがある。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達系中の核酸に対する脂質の質量比は、約１００：１～約３：１、約７０：１～１０：１、又は１６：１～４：１である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達系中の核酸に対する脂質の質量比は、約１６：１～４：１である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達系中の核酸に対する脂質の質量比は、約２０：１である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ送達系中の核酸に対する脂質の質量比は、約８：１である。さらに、ポリヌクレオチドを脂質と幅広いモル比で組み合わせることで、ＬＮＰを生成することがある。
【0158】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、１もしくは複数の関連のある健康状態もしくは疾患を有する、それを有する疑いがある、又はそれを発症するリスクが高い可能性がある、対象を予防又は治療する方法で使用するための治療用組成物に、組み込まれる。例示的な健康状態又は疾患としては、がん、免疫疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、遺伝子治療、遺伝子置換、心血管疾患、加齢性病態、希少疾患、急性感染症、及び慢性感染症を挙げることができるが、これらに限定はされない。
【0159】
いくつかの実施形態では、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、免疫疾患、自己免疫疾患、又は炎症性疾患、例えば、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、腎炎、腹膜炎、乾癬性関節炎、変形性関節症、スチル病、家族性地中海熱（ｆａｍｉｌｉａｒ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｆｅｖｅｒ）、全身性強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、急性肺損傷、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、多発性骨髄腫、糸球体腎炎、腎炎、喘息、アテローム性動脈硬化、白血球接着不全、多発性硬化症、レイノー病、シェーグレン症候群、若年発症糖尿病、ライター症候群、ベーチェット病、免疫複合体性腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパチー、免疫介在性血小板減少症、溶血性貧血、重症筋無力症、ループス腎炎、エリテマトーデス、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、強直性脊椎炎、天疱瘡、グレーブス病、橋本甲状腺炎、小血管炎、オーメン症候群（Ｏｍｅｎ'ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、慢性腎不全、自己免疫性甲状腺疾患、急性伝染性単核症、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス関連疾患、ヒトウイルス感染症、コロナウイルス、他の腸内ウイルス、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、又はアデノウイルスの感染症、細菌性肺炎、創傷、敗血症、脳卒中／脳浮腫、虚血－再灌流障害、並びにＣ型肝炎など、の治療及び／又は予防で有用であり得る。
【0160】
本開示の方法に好適な炎症性 の非限定例としては、喘息、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、慢性大腸炎、脾腫大、及びリウマチ様関節炎などの炎症性疾患が挙げられる。
【0161】
本開示の方法に好適な自己免疫疾患の例としては、リウマチ様関節炎、変形性関節症、スチル病、家族性地中海熱（ｆａｍｉｌｉａｒ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｆｅｖｅｒ）、全身性硬化症、多発性硬化症、強直性脊椎炎、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、糖尿病性網膜症、糖尿病性脈管障害、糖尿病性神経痛、膵島炎、乾癬、円形脱毛症、温式及び冷式自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血、急性炎症性疾患、自己免疫性副腎炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、ランバート・イートン症候群、硬化性苔癬、ライム病、グレーブス病、ベーチェット病、メニエール病、反応性関節炎（ライター症候群）、チャーグ‐ストラウス症候群、コーガン症候群、クレスト症候群、尋常性天疱瘡及び落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、膵炎、腹膜炎、乾癬性関節炎、リウマチ熱、サルコイドーシス、シェールゲンセン症候群（Ｓｊｏｒｇｅｎｓｅｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、強皮症、セリアック病、スティッフマン症候群、高安動脈炎、一過性グルテン不耐症、自己免疫性ブドウ膜炎、白斑、多発性軟骨炎、疱疹状皮膚炎（ＤＨ）又はデューリング病、線維筋痛症、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、自己免疫性肝炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、免疫複合体病、糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、多腺性自己免疫症候群、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、蕁麻疹、自己免疫性不妊症、若年性関節リウマチ、サルコイドーシス、並びに自己免疫性心筋症が挙げられるが、これらに限定はされない。
【0162】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の治療用組成物、例えば、核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物は、微生物感染症（例えば、細菌感染症、ミクロ菌感染症、又はウイルス感染症）を有する、それを有する疑いがある、又はそれを発症するリスクが高い可能性がある、対象を予防又は治療する方法で使用するための治療用組成物に、組み込まれる。本開示の方法に好適な感染症の非限定例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、インフルエンザウイルス、及びエボラウイルスなどのウイルスによる感染症が挙げられる。本開示の方法に好適なさらなる感染症としては、リーシュマニア属、リケッチア属、クラミジア属、コクシエラ属、プラスモジウム属、ブルセラ属、マイコバクテリア属、リステリア属、トキソプラズマ属、及びトリパノソーマ属などの細胞内寄生虫による感染症が挙げられる。いくつかの実施形態では、上記微生物感染症は細菌感染症である。いくつかの実施形態では、上記微生物感染症は真菌感染症である。いくつかの実施形態では、上記微生物感染症はウイルス感染症である。
【0163】
いくつかの実施形態では、上記健康状態は、希少難病医薬法（ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｐａｔｉｅｎｔｓ／ｒａｒｅ－ｄｉｓｅａｓｅｓ－ｆｄａ）によって定義されるような、希少疾患、例えば、合衆国内での発症が２００，０００人未満である疾患もしくは状態、並びに／又は、炎症性障害及び／もしくは自己免疫性障害である。いくつかの実施形態では、上記対象は、炎症性障害及び／もしくは自己免疫障害、並びに／もしくは希少疾患（例えば、家族性地中海熱もしくは成人発症スチル病が挙げられるが、これらに限定はされない）と関連した状態を有する、又はそれを有する疑いがある。
【0164】
さらなる治療法
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、単独療法（単剤療法）として個々に、又は、第１の治療法として少なくとも１つの追加の治療法（例えば、第２の治療法）と組み合わせて、対象に投与される。いくつかの実施形態では、上記第２の治療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、及び外科手術からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上記第２の治療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、又は外科手術からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法及び第２の治療法は、同時に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法は、上記第２の治療法と同時に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法及び第２の治療法は、順次に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法は、上記第２の治療法の前に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法は、上記第２の治療法の後に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法は、上記第２の治療法の前及び／又は後に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法及び第２の治療法は、順番に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法及び第２の治療法は、単一製剤で一緒に施行される。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、単独療法（単剤療法）として個々に、又は、第１の治療法として少なくとも１つの追加の治療法（例えば、第２の治療法）と組み合わせて、対象に投与される。いくつかの実施形態では、上記第２の治療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、標的療法、及び外科手術からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上記第２の治療法は、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、毒素療法、又は外科手術からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法及び第２の治療法は、同時に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法は、上記第２の治療法と同時に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法及び第２の治療法は、順次に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法は、上記第２の治療法の前に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法は、上記第２の治療法の後に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法は、上記第２の治療法の前及び／又は後に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法及び第２の治療法は、順番に施行される。いくつかの実施形態では、上記第１の治療法及び第２の治療法は、単一製剤で一緒に施行される。
【0165】
キット
また、本明細書に記載の方法を実施するための様々なキットも、本明細書で提供される。特に、本開示のいくつかの実施形態は、対象における免疫応答を誘発するためのキットを提供する。いくつかの他の実施形態は、必要とする対象における健康状態の予防のためのキットに関する。いくつかの他の実施形態は、必要とする対象における健康状態を治療する方法のためのキットに関する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供及び記載されたような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物のうちの１又は複数、並びにそれを作製及び使用するための書面での説明書を含むキットが、本明細書で提供される。
また、本明細書に記載の方法を実施するための様々なキットも、本明細書で提供される。特に、本開示のいくつかの実施形態は、対象における免疫応答を誘発するためのキットを提供する。いくつかの他の実施形態は、必要とする対象における健康状態の予防のためのキットに関する。いくつかの他の実施形態は、必要とする対象における健康状態を治療する方法のためのキットに関する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供及び記載されたような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物のうちの１又は複数、並びにそれを作製及び使用するための書面での説明書を含むキットが、本明細書で提供される。
【0166】
いくつかの実施形態では、本開示のキットは、提供された核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物のうちのいずれか１つを対象に投与するのに有用な、１又は複数の手段をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、本開示のキットは、提供された核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物のうちのいずれか１つを対象に投与するために使用される、１又は複数のシリンジ（プレフィルドシリンジを含む）及び／又はカテーテル（プレフィルドシリンジを含む）をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、所望の目的のための、例えば、必要とする対象における状態を診断、予防、又は治療するための、他のキット成分と同時又は順次に投与され得る１又は複数の追加の治療薬を有することがある。
【0167】
前述のキットのいずれかが、１又は複数の追加の試薬をさらに含むことがあり、そのような追加の試薬は以下から選択され得る：希釈用緩衝液、再調製用溶液、洗浄用緩衝液、コントロール試薬、コントロール発現ベクター、ネガティブコントロール、ポジティブコントロール、提供された本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物のインビトロ生成に好適な試薬。
【0168】
いくつかの実施形態では、キットの成分は、別々の容器内にあることがある。いくつかの他の実施形態では、キットの成分は、単一の容器内で組み合わされていることがある。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、キットは、本明細書に提供及び記載されているような核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、組換えポリペプチド、及び／又は医薬組成物のうちの１又は複数を、ある容器内（例えば、無菌のガラス製又はプラスチック製のバイアル内）に含み、さらなる治療薬を別の容器内（例えば、無菌のガラス製又はプラスチック製のバイアル内）に含む。
【0169】
別の実施形態では、キットは、医薬組成物中で、所望により単一の共通容器内で、一緒に製剤化された、１又は複数の追加の治療薬と組み合わされた、１又は複数の本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、及び／又は組換えポリペプチドを含む、本明細書に記載の組成物の組み合わせを含む。
【0170】
キットが対象に非経口投与するための医薬組成物を含む場合、キットは、そのような投与を実行するためのデバイス（例えば、注射デバイス又はカテーテル）を含み得る。例えば、キットは、本開示の核酸構築物（例えば、ベクター又はｓｒＲＮＡ分子）、組換え細胞、及び／又は組換えポリペプチドを１又は複数含有する、１又は複数の皮下用注射針又は前述のような他の注射デバイスを含み得る。
【0171】
いくつかの実施形態では、キットは、キットの構成要素を用いて本明細書で開示される方法を実施するための説明書をさらに含み得る。例えば、キットは、キット内の医薬組成物及び剤形に関する情報を含む添付文書を含み得る。通常、そのような情報は、患者及び医師が、同封された医薬組成物及び剤形を効果的且つ安全に使用する際の助けとなる。例えば、本開示の組み合わせに関する以下の情報が、挿入文書に補足される場合がある：薬物動態学、薬力学、臨床研究、有効性パラメーター、効能及び用法、禁忌、警告、注意事項、有害反応、過量、適切な用法・用量、剤形、適切な貯蔵条件、引用文献、製造業者／販売業者情報、並びに知的財産情報。
【0172】
上記方法を実施するための指示は、通常、好適な記録媒体上に記録される。例えば、指示は、紙又はプラスチックなどの基材上に印刷されることがある。指示は、キット内に添付文書としてや、キット又はその構成要素（例えば、包装又は副包装に関連する）の容器のラベル中などに存在することがある。指示は、適切なコンピュータ可読記憶媒体上、例えばＣＤ－ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ上などに存在する、電子記憶データファイルとして存在することがある。場合によっては、実際の指示がキット内に存在せず、遠隔の供給源から（例えば、インターネットを介して）指示を入手するための手段が提供されることがある。この実施形態の一例は、指示を閲覧することができる、及び／又は、指示をダウンロードすることができる、ウェブアドレスを含むキットである。指示と同様、この、指示を入手するための手段が、適切な基材上に記載されることがある。
【0173】
本開示に記載された全ての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物又は特許出願が参照により援用されると明確且つ個別に示されたかのように、参照により本明細書に援用される。
【0174】
本明細書で引用されたいかなる参考文献も、先行技術を構成するものであることを認めるものではない。参考文献の考察は、その著者が主張することを述べたものであり、出願人は、引用された文献の正確性及び妥当性に異議を唱える権利を有する。科学雑誌の記事、特許文献、教科書を含むいくつもの情報源が本明細書で参照されているが、この参照が、これらの文献のいずれかが当該技術分野における共通一般知識の一部を形成していることを認めるものではないことは、明確に理解されるであろう。
【0175】
本明細書に与えられた一般的な方法の議論は、例示のみを目的とすることが意図されている。他の代替方法及び代替物は、本開示を検討すれば当業者には明らかであり、本出願の精神及び範囲内に含まれるものとする。
【0176】
さらなる実施形態が以下の実施例でさらに詳細に開示されるが、これらは例示として提供されており、本開示又は請求項の範囲を何ら限定する意図はない。
【実施例1】
【0177】
本発明の実施では、特に記載がない限り、当業者に周知である、分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、核酸化学、及び免疫学の従来技術が採用されるものとする。このような手法は、以下のような文献で充分に説明されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ． Ｗ． （２０１２）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （４ｔｈ ｅｄ．）． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ及びＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， ＆ Ｒｕｓｓｅｌ， Ｄ． Ｗ． （２００１）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄ．）． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（まとめて、本明細書では「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と称する）； Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ． （１９８７）． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ （２０１４までの補足を含む）； Ｂｏｌｌａｇ， Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９６）． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ； Ｈｕａｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２００５）． Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｋａｐｌｉｔｔ， Ｍ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ， Ｉ． （１９９７）． Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ： Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ； Ｄｏｙｌｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ； Ｍｕｌｌｉｓ， Ｋ． Ｂ．， Ｆｅｒｒｅ， Ｆ． ＆ Ｇｉｂｂｓ， Ｒ． （１９９４）． ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ． Ｂｏｓｔｏｎ： Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ； Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ， Ｅ． Ａ． （２０１４）． Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．）． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ； Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｓ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （２０００）． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ： Ｗｉｌｅｙ， （ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ２０１４）；及びＭａｋｒｉｄｅｓ， Ｓ． Ｃ． （２００３）． Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ． Ａｍｓｔｅｒｄａｍ， ＮＬ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｂ．Ｖ．（これらの開示は参照によって本明細書に援用される）。
【0178】
さらなる実施形態が以下の実施例でさらに詳細に開示されるが、これらは例示として提供されており、本開示又は請求項の範囲を何ら限定する意図はない。
【0179】
実施例１
基本ベクターＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドの設計及び構築
本実施例は、後に目的遺伝子（例えば、インフルエンザ由来の赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子）の発現に使用された、いくつかの基本アルファウイルスベクター（例えば、異種遺伝子を含まない）を構築するために行われた、実験の結果を記述している。
基本ベクターＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドの設計及び構築
本実施例は、後に目的遺伝子（例えば、インフルエンザ由来の赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子）の発現に使用された、いくつかの基本アルファウイルスベクター（例えば、異種遺伝子を含まない）を構築するために行われた、実験の結果を記述している。
【0180】
図２Ａに記載されたシンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１ベクターを、以下の通りに構築した。基本ＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１ベクターは、ＳＩＮＶ構造遺伝子のコード配列の代わりにユニークな制限酵素切断部位（ＳｐｅＩ、５’－Ａ’ＣＴＡＧ，Ｔ－３’）を有するＡＲ－８６参照配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ３８３０５）からの４つの約４ｋｂ部分（ツイスト・バイオサイエンス社）として新規合成した（ここで、５’Ａは、構造ポリタンパク質遺伝子のヌクレオチド９３に続くＰ２Ａ配列の次のヌクレオチドであり、３’Ｔは構造ポリタンパク質の終止コドンＴＧＡの場所と一致する）。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’；配列番号１２）をＳＩＮＶゲノム配列の上流に含め、下流には、ポリＡ配列、続いて、ユニークな制限酵素部位（ＳａｐＩ、５’－ＧＣＴＣＴＴＣ（Ｎ）１’（Ｎ）３，－３’）、続いて、Ｔ７転写終結配列（５’－ＡＡＣＣＣＣＴＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’；配列番号１３）、続いて、ユニークな制限酵素切断部位（ＮｏｔＩ、５’－ＧＣ’ＧＧＣＣ，ＧＣ－３’）を含めた。これらの部分は、５ピースのＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）反応（例えば、直線化されたｐＹＬ骨格と、４つの合成断片）で結合された。得られたベクターでは、ＡＲ８６ ｎｓＰ２遺伝子が、ガードウッドｎｓＰ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＦ４５９６８３）と置き換えられており、最終的なＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１ベースベクター（配列番号１）が得られた。
【0181】
図３Ａに記載されたシンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド２ベクターを、以下の通りに構築した。基本ＳＩＮＶガードウッドベクターは、ＳＩＮＶ構造遺伝子のコード配列の代わりにユニークな制限酵素切断部位（ＳｐｅＩ、５’－Ａ’ＣＴＡＧ，Ｔ－３’）を有するガードウッド株参照配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ＭＦ４５９６８３）からの４つの約４ｋｂ部分（ツイスト・バイオサイエンス社、サーモフィッシャー社ＧｅｎｅＡｒｔ）として新規合成した（ここで、５’Ａは、構造ポリタンパク質遺伝子のヌクレオチド９３に続くＰ２Ａ配列の次のヌクレオチドであり、３’Ｔは構造ポリタンパク質の終止コドンＴＧＡの場所と一致する）。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’；配列番号１２）をＳＩＮＶゲノム配列の上流に含め、下流には、ポリＡ配列、続いて、ユニークな制限酵素部位（ＳａｐＩ、５’－ＧＣＴＣＴＴＣ（Ｎ）１’（Ｎ）３，－３’）、続いて、Ｔ７転写終結配列（５’－ＡＡＣＣＣＣＴＣＴＣＴＡＡＡＣＧＧＡＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴ－３’；配列番号１３）、続いて、ユニークな制限酵素切断部位（ＮｏｔＩ、５’－ＧＣ’ＧＧＣＣ，ＧＣ－３’）を含めた。これらの部分は、５ピースのＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）反応（例えば、直線化されたｐＹＬ骨格と、４つの合成断片）で結合された。得られたベクターでは、ガードウッドｎｓＰ４遺伝子が、ＡＲ８６ ｎｓＰ４遺伝子と置き換えられており、最終的なＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド２ベースベクター（配列番号２）が得られた。
【0182】
図４Ａに記載されたシンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド３ベクターを、以下の通りに構築した。シンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド２基本ベクターと同様に、代わりにガードウッドｎｓＰ３遺伝子をＡＲ８６ ｎｓＰ３遺伝子と置換することで、シンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド３基本ベクターを構築した（配列番号３）。
【0183】
図５Ａに記載されたシンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド４ベクターを、以下の通りに構築した。シンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド２基本ベクターと同様に、代わりにガードウッドｎｓＰ１遺伝子をＡＲ８６ ｎｓＰ１遺伝子と置換することで、シンドビスＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド４基本ベクターを構築した（配列番号４）。
【0184】
実施例２
目的遺伝子の発現のための改変アルファウイルスベクターの構築
図２Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂ、及び図５Ｂのアルファウイルスベクターは、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ消化による、それぞれ図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、及び図５Ａの空の基本ベクターの直線化によって構築した。インフルエンザ由来の赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ＃ＡＹ６５１３３４）に、コンピュータで、ヒト発現用にコドンのリファクタリングを行い、合成（ＩＤＴ）した。ＰＣＲ産物上の基本ベクターに３０ｂｐのフランキング相同性末端を付加する以下のプライマーを使用して、この合成産物を増幅した。
目的遺伝子の発現のための改変アルファウイルスベクターの構築
図２Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂ、及び図５Ｂのアルファウイルスベクターは、ＳｐｅＩエンドヌクレアーゼ消化による、それぞれ図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ、及び図５Ａの空の基本ベクターの直線化によって構築した。インフルエンザ由来の赤血球凝集素（ＨＡ）遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ＃ＡＹ６５１３３４）に、コンピュータで、ヒト発現用にコドンのリファクタリングを行い、合成（ＩＤＴ）した。ＰＣＲ産物上の基本ベクターに３０ｂｐのフランキング相同性末端を付加する以下のプライマーを使用して、この合成産物を増幅した。
【0185】
フォワードプライマー：
【0186】
（５’－ＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＴＣＴＴＴＴＴＧ－３’；配列番号１０）。
【0187】
リバースプライマー：
【0188】
（５’－ＧＣＴＧＧＴＣＧＧＧＴＣＡＴＴＧＧＧＧＣＧＴＡＧＣＧＧＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＴＧＣＡＴＴＧＴＡＡＣＧ－３’；配列番号１１）。
【0189】
消化産物（すなわち、直線化ベクター）及びＰＣＲ産物を二断片Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）反応で結合し、２６Ｓサブゲノムプロモーターの制御下に置かれたＨ５Ｎ１ ＨＡコード配列をそれぞれ含有する最終ベクターを得た（ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１～４については、それぞれ配列番号５～８）。
【0190】
実施例３
欠陥のあるアルファウイルスゲノム及びＲＮＡレプリコンの機能性を改善する
本実施例は、欠陥のあるｎｓＰ配列を機能的アルファウイルス由来の対応するｎｓＰ配列と置換することによって、欠陥のある（非機能的な）ＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を、機能化する（例えば、機能するようにする）ことが可能であることを明らかにするために行なわれた実験の結果を記述している。
欠陥のあるアルファウイルスゲノム及びＲＮＡレプリコンの機能性を改善する
本実施例は、欠陥のあるｎｓＰ配列を機能的アルファウイルス由来の対応するｎｓＰ配列と置換することによって、欠陥のある（非機能的な）ＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を、機能化する（例えば、機能するようにする）ことが可能であることを明らかにするために行なわれた実験の結果を記述している。
【0191】
インビトロ転写：酵素消化によって直線化されたプラスミド鋳型ＤＮＡを使用するインビトロ転写により、自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）を作製した。これらの実施例では、ＤＮＡは、Ｔ７ターミネーターの下流を切断するＮｏｔＩで直線化するか、又は、ポリ（Ａ）の終わりで切断するＳａｐＩで切断した。バクテリオファージＴ７ポリメラーゼを使用してインビトロ転写を行い、５’ＡＲＣＡキャップ（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標） Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ、ＮＥＢ社）を用いるか、又は、キャッピングを行わない転写（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ＮＥＢ社）後に５’キャップ１（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ， ｍＲＮＡ Ｃａｐ ２´－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＮＥＢ社）を付加した。フェノール／クロロホルム抽出、ＬｉＣｌ沈殿、又はカラム精製（Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標） ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ、ＮＥＢ社）を使用して、ｓｒＲＮＡを精製した。ｓｒＲＮＡ濃度を２６０ｎｍにおける吸光度によって測定した（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）。
【0192】
複製：ｓｒＲＮＡで、ＢＨＫ－２１細胞又はベロ細胞の、エレクトロポレーションによる形質転換を行った（例えば、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）、ロンザ社）。形質転換の１７～２０時間後に、細胞を固定・透過処理（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｏｘｐ３ ／ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ、インビトロジェン社）し、ＰＥ結合型抗二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）マウスモノクローナル抗体（Ｊ２、Ｓｃｉｃｏｎｓ）を使用して染色して、ｄｓＲＮＡ＋細胞の頻度及び個々の細胞におけるｄｓＲＮＡの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を蛍光フローサイトメトリーで定量化した。
【0193】
非機能的なＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、ｓｒＲＮＡをトランスフェクトされた細胞を染色後にシグナルを示さず（Ｘで印を付けた、ＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）を参照）、トランスフェクトされた機能的なＲＮＡレプリコン（例えば、自己複製ＲＮＡ）は、ＲＮＡ複製を示すものであり、２６Ｓ ＲＮＡ転写とその後の導入遺伝子発現に必要な、検出可能なｄｓＲＮＡを生産する（シンボル「
」で印を付けたＲＮＡレプリコンを参照）（図６）。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本明細書に記載されているような、機能的な、自己複製するｓｒＲＮＡは、薬物動態学的効果を誘導するための実用的なベクターとして見なす使用することができると考えられる。
【数1】
【0194】
実施例４
インビトロにおける改変アルファウイルスベクターの評価
上記の実施例１及び実施例２に記述された改変アルファウイルスベクター構築物の発現レベルを評価し、その挙動（例えば、複製及びタンパク質発現）における差異を調べるために行われた、インビトロ実験の結果を記述している。
インビトロにおける改変アルファウイルスベクターの評価
上記の実施例１及び実施例２に記述された改変アルファウイルスベクター構築物の発現レベルを評価し、その挙動（例えば、複製及びタンパク質発現）における差異を調べるために行われた、インビトロ実験の結果を記述している。
【0195】
これらの実験では、図２Ｂ、図３Ｂ、図４Ｂ、及び図５Ｂに示された改変アルファウイルス設計の機能性を、以下のアッセイを用いて評価した。これらの実験では、インフルエンザＡウイルスＨ５Ｎ１の赤血球凝集素前駆物質（ＨＡ）（Ｈ５Ｎ１ ＨＡ）をコードする改変アルファウイルスｓｒＲＮＡベクター（異種であるＡＲ８６のｎｓＰ１、又はｎｓＰ２、又はｎｓＰ３、又はｎｓＰ４を有するＳＩＮＶガードウッド）も、以下のアッセイを利用して評価した。
【0196】
インビトロ転写：酵素消化によって直線化されたプラスミド鋳型ＤＮＡを使用するインビトロ転写により、自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ を作製した。これらの実施例では、ＤＮＡは、Ｔ７ターミネーターの下流を切断するＮｏｔＩで直線化するか、又は、ポリ（Ａ）の終わりで切断するＳａｐＩで切断した。バクテリオファージＴ７ポリメラーゼを使用してインビトロ転写を行い、５’ＡＲＣＡキャップ（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標） Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ、ＮＥＢ社）を用いるか、又は、キャッピングを行わない転写（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ＮＥＢ社）後に５’キャップ１（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ， ｍＲＮＡ Ｃａｐ ２´－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＮＥＢ社）を付加した。フェノール／クロロホルム抽出、ＬｉＣｌ沈殿、又はカラム精製（Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標） ＲＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ、ＮＥＢ社）を使用して、ｓｒＲＮＡを精製した。ＲＮＡ濃度を２６０ｎｍにおける吸光度によって測定した（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）。
【0197】
複製：ｓｒＲＮＡで、ＢＨＫ－２１細胞又はベロ細胞の、エレクトロポレーションによる形質転換を行った（例えば、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）、ロンザ社）。形質転換の１７～２０時間後に、細胞を固定・透過処理（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｏｘｐ３ ／ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ、インビトロジェン社）し、ＰＥ結合型抗ｄｓＲＮＡマウスモノクローナル抗体（Ｊ２、Ｓｃｉｃｏｎｓ）を使用して染色して、ｄｓＲＮＡ＋細胞の頻度及び個々の細胞におけるｄｓＲＮＡの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を蛍光フローサイトメトリーで定量化した。
【0198】
タンパク質発現
ＲＮＡで、ＢＨＫ－２１細胞又はベロ細胞の、エレクトロポレーションによる形質転換を行った（例えば、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）、ロンザ社）。形質転換の１７～２０時間後に、細胞を固定・透過処理（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｏｘｐ３ ／ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ、インビトロジェン社）し、ＡＰＣ結合型抗ＨＡマウスモノクローナル抗体（２Ｂ７、アブカム社；ＡＰＣ：アロフィコシアニン）を使用して染色して、ＨＡタンパク質＋細胞の頻度及び個々の細胞におけるＨＡタンパク質の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を蛍光フローサイトメトリーで定量化した（図７）。
ＲＮＡで、ＢＨＫ－２１細胞又はベロ細胞の、エレクトロポレーションによる形質転換を行った（例えば、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）、ロンザ社）。形質転換の１７～２０時間後に、細胞を固定・透過処理（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）Ｆｏｘｐ３ ／ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ、インビトロジェン社）し、ＡＰＣ結合型抗ＨＡマウスモノクローナル抗体（２Ｂ７、アブカム社；ＡＰＣ：アロフィコシアニン）を使用して染色して、ＨＡタンパク質＋細胞の頻度及び個々の細胞におけるＨＡタンパク質の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を蛍光フローサイトメトリーで定量化した（図７）。
【0199】
さらなる実験
ＢＨＫ－２１細胞又はベロ細胞を漸増曲線（ｔｉｔｒａｔｅｄ ｃｕｒｖｅ）の組換えＩＦＮで前処理してから、ＲＮＡのエレクトロポレーションを行い、各ベクターの複製及びタンパク質発現に対する影響を、上記アッセイを用いて測定する。
ＢＨＫ－２１細胞又はベロ細胞を漸増曲線（ｔｉｔｒａｔｅｄ ｃｕｒｖｅ）の組換えＩＦＮで前処理してから、ＲＮＡのエレクトロポレーションを行い、各ベクターの複製及びタンパク質発現に対する影響を、上記アッセイを用いて測定する。
【0200】
非機能的なｓｒＲＮＡベクターは、ＧＯＩ発現を検出するためのｓｒＲＮＡトランスフェクト細胞染色後にシグナルを示さず、機能的なｓｒＲＮＡベクターは検出可能なＧＯＩ発現を生じる。この実験では、ＡＰＣ結合型抗ＨＡマウスモノクローナル抗体を使用して陽性に染色された細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によってＧＯＩ発現を定量化する。図７は、ＲＮＡ複製を示した（図６）基本ｓｒＲＮＡベクターは、ＧＯＩ挿入後も発現を示したことを示している。これらの機能的な、ＧＯＩを発現するｓｒＲＮＡは、薬物動態的効果を誘導する（例えば、宿主における免疫応答を誘発する）ための実用的なベクターとして使用することができる。
【0201】
実施例５
インビボにおける改変アルファウイルスベクターの評価
本実施例は、上記の実施例１及び実施例２における改変アルファウイルスベクター構築物（例えば、未製剤化ベクター及びＬＮＰ製剤化ベクターの両方）によるワクチン接種後の、免疫応答における差異を評価するために行われた、インビボ実験の結果を記述している。
インビボにおける改変アルファウイルスベクターの評価
本実施例は、上記の実施例１及び実施例２における改変アルファウイルスベクター構築物（例えば、未製剤化ベクター及びＬＮＰ製剤化ベクターの両方）によるワクチン接種後の、免疫応答における差異を評価するために行われた、インビボ実験の結果を記述している。
【0202】
【0203】
マウス及び注射
雌のＣ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスを、チャールス・リバー・ラボラトリーズ社又はジャクソン・ラボラトリーズ社から購入する。投与当日、０．１～１０μｇの物質を、両方の四頭筋に分割して筋肉内注射する。ベクターは、生理食塩水中で未製剤化の状態で、又はＬＮＰ製剤の状態で、投与する。動物を、体重及び他の一般的な観察事項について、試験期間を通じてモニターする。免疫原性試験では、０日目及び２１日目に動物に投与を行う。３５日目に脾臓を摘出し、０日目、１４日目、及び３５日目に血清を単離した。タンパク質発現試験では、０日目に動物に投与し、１日目、３日目、及び７日目に生物発光を評価する。ルシフェラーゼ活性のインビボイメージングを、表示の時点において、ＩＶＩＳシステムを使用して行う。
雌のＣ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスを、チャールス・リバー・ラボラトリーズ社又はジャクソン・ラボラトリーズ社から購入する。投与当日、０．１～１０μｇの物質を、両方の四頭筋に分割して筋肉内注射する。ベクターは、生理食塩水中で未製剤化の状態で、又はＬＮＰ製剤の状態で、投与する。動物を、体重及び他の一般的な観察事項について、試験期間を通じてモニターする。免疫原性試験では、０日目及び２１日目に動物に投与を行う。３５日目に脾臓を摘出し、０日目、１４日目、及び３５日目に血清を単離した。タンパク質発現試験では、０日目に動物に投与し、１日目、３日目、及び７日目に生物発光を評価する。ルシフェラーゼ活性のインビボイメージングを、表示の時点において、ＩＶＩＳシステムを使用して行う。
【0204】
ＬＮＰ製剤
レプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）を、マイクロ流体ミキサーを用いて脂質ナノ粒子製剤にして、粒径の分析、動的光散乱を用いた多分散性の分析、及び封入効率の分析を行う。ＬＮＰ粒子を配合する際に用いられた脂質のモル比は、３０％のＣ１２－２００、４６．５％のコレステロール、２．５％のＰＥＧ－２Ｋ、及び１６％のＤＯＰＥである。
レプリコンＲＮＡ（例えば、自己複製ＲＮＡ）を、マイクロ流体ミキサーを用いて脂質ナノ粒子製剤にして、粒径の分析、動的光散乱を用いた多分散性の分析、及び封入効率の分析を行う。ＬＮＰ粒子を配合する際に用いられた脂質のモル比は、３０％のＣ１２－２００、４６．５％のコレステロール、２．５％のＰＥＧ－２Ｋ、及び１６％のＤＯＰＥである。
【0205】
ＥＬＩＳｐｏｔ
インフルエンザ特異的なＴ細胞応答の規模を測定するため、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ（ＨＲＰ）（マブテック社（ＭａｂＴｅｃｈ））を使用して、製造業者の取扱説明書に従って、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ分析を行う。簡潔には、脾細胞を単離し、ＨＡに対するＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのいずれかを提示するペプチド、ポジティブコントロールとしてのＰＭＡ／イオノマイシン、又は偽刺激としてのＤＭＳＯを含有する培地で５×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁する。
インフルエンザ特異的なＴ細胞応答の規模を測定するため、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ（ＨＲＰ）（マブテック社（ＭａｂＴｅｃｈ））を使用して、製造業者の取扱説明書に従って、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ分析を行う。簡潔には、脾細胞を単離し、ＨＡに対するＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのいずれかを提示するペプチド、ポジティブコントロールとしてのＰＭＡ／イオノマイシン、又は偽刺激としてのＤＭＳＯを含有する培地で５×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁する。
【0206】
細胞内サイトカイン染色
ＥＬＩＳｐｏｔで概要を述べた方法に従って脾臓を摘出し、１×１０６個の細胞を、２００μＬ／ウェルの総体積で細胞含有培地に加える。各ウェルには、ＨＡに対するＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのいずれかを提示するペプチド、ポジティブコントロールとしてのＰＭＡ／イオノマイシン、又は偽刺激としてのＤＭＳＯを含有させる。１時間後、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）タンパク質輸送阻害剤（ＢＤバイオサイエンス社）を各ウェルに添加する。細胞をさらに５時間インキュベートする。インキュベーション後、標準方法を用いて、細胞表面のＣＤ８＋（５３－６．７）、ＣＤ４＋（ＧＫ１．５）、Ｂ２２０（Ｂ２３８１２８）、Ｇｒ－１（ＲＢ６－８Ｃ５）、ＣＤ１６／３２（Ｍ９３）を染色する。表面染色後、細胞を固定し、標準方法に従って、ＩＦＮγ（ＲＰＡ－Ｔ８）、ＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４）、及びＴＮＦ（ＭＰ６－ＸＴ２２）の細胞内タンパク質染色を行う。その後、細胞をフローサイトメーター分析にかけ、得られたＦＣＳファイルをＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．４．１を用いて解析した。
ＥＬＩＳｐｏｔで概要を述べた方法に従って脾臓を摘出し、１×１０６個の細胞を、２００μＬ／ウェルの総体積で細胞含有培地に加える。各ウェルには、ＨＡに対するＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープのいずれかを提示するペプチド、ポジティブコントロールとしてのＰＭＡ／イオノマイシン、又は偽刺激としてのＤＭＳＯを含有させる。１時間後、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）タンパク質輸送阻害剤（ＢＤバイオサイエンス社）を各ウェルに添加する。細胞をさらに５時間インキュベートする。インキュベーション後、標準方法を用いて、細胞表面のＣＤ８＋（５３－６．７）、ＣＤ４＋（ＧＫ１．５）、Ｂ２２０（Ｂ２３８１２８）、Ｇｒ－１（ＲＢ６－８Ｃ５）、ＣＤ１６／３２（Ｍ９３）を染色する。表面染色後、細胞を固定し、標準方法に従って、ＩＦＮγ（ＲＰＡ－Ｔ８）、ＩＬ－２（ＪＥＳ６－５Ｈ４）、及びＴＮＦ（ＭＰ６－ＸＴ２２）の細胞内タンパク質染色を行う。その後、細胞をフローサイトメーター分析にかけ、得られたＦＣＳファイルをＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．４．１を用いて解析した。
【0207】
抗体
総ＨＡ特異的ＩｇＧを測定するための抗体応答を、アルファ・ダイアグノスティック・インターナショナル社（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）製のＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の取扱説明書に従って、測定する。
総ＨＡ特異的ＩｇＧを測定するための抗体応答を、アルファ・ダイアグノスティック・インターナショナル社（Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）製のＥＬＩＳＡキットを使用して、製造業者の取扱説明書に従って、測定する。
【0208】
実施例６
異種非構造タンパク質遺伝子を含む改変ｓｒＲＮＡベクターのインビトロ評価
本実施例は、異種非構造タンパク質を含む合成自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）の発現レベルを評価するため、及び、その挙動（例えば、複製及びタンパク質発現）における差異を調べるために行われた、インビトロ実験の結果を記述している。
異種非構造タンパク質遺伝子を含む改変ｓｒＲＮＡベクターのインビトロ評価
本実施例は、異種非構造タンパク質を含む合成自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）の発現レベルを評価するため、及び、その挙動（例えば、複製及びタンパク質発現）における差異を調べるために行われた、インビトロ実験の結果を記述している。
【0209】
これらの実験では、無関係な導入遺伝子を含むコントロールのＶＥＥＶ ｓｒＲＮＡ（ＲＢＩ２９６、ＲＢＩ２９８）、２種類の構成でＩＬ－１ＲＡ及びＩＬ－１２の両方をコードするＶＥＥＶ ｓｒＲＮＡ（ＲＢＩ２９９、ＲＢＩ３００）、２種類の構成でＩＬ－１ＲＡ及びＩＬ－１２の両方をコードするＳＩＮＶ ＡＲ８６－ガードウッドハイブリッド１ ｓｒＲＮＡ（ＲＢＩ３０７、ＲＢＩ３０８）、並びに、２種類の構成でＩＬ－１ＲＡ及びＩＬ－１２の両方をコードするＳＩＮＶガードウッドｓｒＲＮＡ（ＲＢＩ３０９、ＲＢＩ３１０）を含む、ＳＩＮＶのガードウッド株由来及びＡＲ８６株由来の合成ｓｒＲＮＡを設計し、その後評価した。
【0210】
インビトロ転写：ＳａｐＩで直線化されたプラスミド鋳型からの、バクテリオファージＴ７ポリメラーゼを用いた、キャッピングを行わない転写（ｕｎｃａｐｐｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）による、インビトロ転写（ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標） Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ、ＮＥＢ社）の後、５’キャップ１の付加（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｃａｐｐｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ， ｍＲＮＡ Ｃａｐ ２´－Ｏ－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＮＥＢ社）を行うことにより、ｓｒＲＮＡを調製した。次に、ｓｒＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿で精製した。ｓｒＲＮＡ濃度を２６０ｎｍにおける吸光度によって測定した（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）。
【0211】
タンパク質発現：ｓｒＲＮＡで、ＢＨＫ－２１細胞の、エレクトロポレーションによる形質転換を行った（４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）、ロンザ社）。形質転換後２４時間及び４８時間の時点で、細胞から培養上清を回収した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ＩＬ－１Ｒ細胞（インビボジェン社（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ））を、一連の濃度の組換えＩＬ－１ＲＡ（ペプロテック社（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））又は培養上清と共にプレインキュベートすることによる生理活性アッセイで、ＩＬ－１ＲＡの分泌を評価した。組換えＩＬ－１Ｂ（インビボジェン社）を細胞に添加し、一晩インキュベート後、ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ（商標）（インビボジェン社）を使用してＳＥＡＰレポーターを定量化した（図８Ａ）。
【0212】
一連の濃度の組換えＩＬ－１２（ペプロテック社）又は培養上清を、ＤＭＥＭ中のＩＬ－１２ Ｂｉｏａｓｓａｙ細胞（プロメガ社）上で一晩インキュベートした後、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ（プロメガ社）を使用してルシフェラーゼレポーターを定量化することによる生理活性アッセイで、ＩＬ－１２の分泌を評価した（図８Ｂ）。
【0213】
実施例８
異種非構造タンパク質遺伝子を含む改変ｓｒＲＮＡベクターのインビボ評価
本実施例は、未製剤化ベクター及びＬＮＰ製剤化ベクターの両方としての、異種非構造タンパク質を含む自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）によるワクチン接種後の、免疫応答における差異を評価するために行われた、インビボ実験の結果を記述している。
異種非構造タンパク質遺伝子を含む改変ｓｒＲＮＡベクターのインビボ評価
本実施例は、未製剤化ベクター及びＬＮＰ製剤化ベクターの両方としての、異種非構造タンパク質を含む自己複製ＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）によるワクチン接種後の、免疫応答における差異を評価するために行われた、インビボ実験の結果を記述している。
【0214】
これらの実験では、ＳＩＮＶガードウッド－ＡＲ８６ハイブリッド１由来の合成ｓｒＲＮＡ構築物を設計し、その後評価した。
【0215】
マウス及び注射
雌のＣ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスを、チャールス・リバー・ラボラトリーズ社又はジャクソン・ラボラトリーズ社から購入した。投与当日、０．１～１０μｇの物質を、両方の四頭筋に分割して筋肉内注射した。ベクターは、生理食塩水中で未製剤化の状態で、又はＬＮＰ製剤の状態で、投与した。動物を、体重及び他の一般的な観察事項について、試験期間を通じてモニターした。免疫原性試験では、０日目及び２１日目に動物に投与を行った。１４日目及び／又は３５日目に脾臓を摘出し、１４日目及び／又は３５日目に血清を単離した。
雌のＣ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスを、チャールス・リバー・ラボラトリーズ社又はジャクソン・ラボラトリーズ社から購入した。投与当日、０．１～１０μｇの物質を、両方の四頭筋に分割して筋肉内注射した。ベクターは、生理食塩水中で未製剤化の状態で、又はＬＮＰ製剤の状態で、投与した。動物を、体重及び他の一般的な観察事項について、試験期間を通じてモニターした。免疫原性試験では、０日目及び２１日目に動物に投与を行った。１４日目及び／又は３５日目に脾臓を摘出し、１４日目及び／又は３５日目に血清を単離した。
【0216】
ＬＮＰ製剤
いくつかの試験において、ｓｒＲＮＡを、マイクロ流体ミキサーを用いて脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤にして、粒径の分析、動的光散乱を用いた多分散性の分析、及び封入効率の分析を行った。ＬＮＰは、イオン化可能脂質、コレステロール、ＰＥＧ－２Ｋ、及びＤＯＰＥから構成されるものである。
いくつかの試験において、ｓｒＲＮＡを、マイクロ流体ミキサーを用いて脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤にして、粒径の分析、動的光散乱を用いた多分散性の分析、及び封入効率の分析を行った。ＬＮＰは、イオン化可能脂質、コレステロール、ＰＥＧ－２Ｋ、及びＤＯＰＥから構成されるものである。
【0217】
ＥＬＩＳｐｏｔ
抗原特異的なＴ細胞応答の規模を測定するため、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ（ＨＲＰ）（マブテック社（ＭａｂＴｅｃｈ））を使用して、製造業者の取扱説明書に従って、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ分析を行った。簡潔には、脾細胞を単離し、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ、ＥＳＲ１、ＨＥＲ２、もしくはＨＥＲ３に対応するペプチドプールのいずれかを提示するペプチド、ポジティブコントロールとしてのＰＭＡ／イオノマイシン、又は偽刺激としてのＤＭＳＯを含有する培地で２～５×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。
抗原特異的なＴ細胞応答の規模を測定するため、Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ ＰＬＵＳ Ｋｉｔ（ＨＲＰ）（マブテック社（ＭａｂＴｅｃｈ））を使用して、製造業者の取扱説明書に従って、ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔ分析を行った。簡潔には、脾細胞を単離し、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ、ＥＳＲ１、ＨＥＲ２、もしくはＨＥＲ３に対応するペプチドプールのいずれかを提示するペプチド、ポジティブコントロールとしてのＰＭＡ／イオノマイシン、又は偽刺激としてのＤＭＳＯを含有する培地で２～５×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁した。
【0218】
抗体
迅速蛍光フォーカス抑制試験を用いて、狂犬病ウイルスに対する中和抗体応答を測定する。簡潔には、血清希釈物を基準量の生狂犬病ウイルスと混合し、インキュベートする。中和性抗狂犬病抗体が存在する場合、これらの抗体は上記ウイルスを中和する。次に、培養細胞を添加し、血清／ウイルス／細胞を一緒にインキュベートする。被覆されていない（すなわち、抗体によって中和されていない）狂犬病ウイルスは細胞に感染し、これは顕微鏡法で可視化することができる。スライド上で確認されたウイルス感染細胞のパーセントから、エンドポイント力価の算出を行う。
迅速蛍光フォーカス抑制試験を用いて、狂犬病ウイルスに対する中和抗体応答を測定する。簡潔には、血清希釈物を基準量の生狂犬病ウイルスと混合し、インキュベートする。中和性抗狂犬病抗体が存在する場合、これらの抗体は上記ウイルスを中和する。次に、培養細胞を添加し、血清／ウイルス／細胞を一緒にインキュベートする。被覆されていない（すなわち、抗体によって中和されていない）狂犬病ウイルスは細胞に感染し、これは顕微鏡法で可視化することができる。スライド上で確認されたウイルス感染細胞のパーセントから、エンドポイント力価の算出を行う。
【0219】
ウイルス抗原、狂犬病ウイルス糖タンパク質ＧをコードするｓｒＲＮＡのインビボにおける免疫原性の評価を、２回の免疫化後にＥＬＩＳｐｏｔによる抗原特異的脾臓Ｔ細胞応答（図９Ａ）及び血清から得られた抗狂犬病中和抗体の力価（図９Ｂ）を評価することで、行った。生理食塩水コントロールと比較して、ｓｒＲＮＡで免疫化された群は全て、頑健性のあるＴ細胞応答を示したが（図９Ａ）、ｓｒＲＮＡワクチン間で反応差が確認された。同様に、ｓｒＲＮＡで免疫化された群は全て、感染防御レベルの（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）中和抗体価を示し、ｓｒＲＮＡワクチン間でいくらかのばらつきがあった（図９Ｂ）。感染性疾患抗原に加えて、がん抗原に対するｓｒＲＮＡベースのワクチンの免疫原性を評価した（図１０）。それぞれのｓｒＲＮＡワクチンは、ＥＳＲ１、ＨＥＲ２、及びＨＥＲ３由来の配列を共コードしていた。２回の免疫化を受けたマウスにおいて、ＥＬＩＳｐｏｔ分析を使用して、これらの３つの抗原に対する脾臓Ｔ細胞応答を測定した。３つ全ての標的に対し、頑健性のあるＴ細胞応答が観察されたが、反応のパターンはｓｒＲＮＡベクター間で異なっていた（図１０）。
【0220】
本開示の特定の代替案を開示してきたが、添付の特許請求の範囲の真の精神及び範囲内で、様々な変更及び組み合わせが可能であり、想定されることを理解されたい。したがって、本明細書で提示された要旨及び開示に厳密に限定する意図はない。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【配列表】
【国際調査報告】