特表 2024-535768 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体を含む医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-02

(54)【発明の名称】抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体を含む医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20240925BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240925BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240925BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240925BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240925BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240925BHJP

【ＦＩ】

A61K39/395 N ZNA

A61P31/00

A61P35/00

A61P43/00 105

A61K9/08

A61K47/12

A61K47/18

A61K47/26

A61K47/34

A61K47/02

C07K16/46

C07K16/28

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515316

(86)(22)【出願日】2022-09-15

(85)【翻訳文提出日】2024-03-08

(86)【国際出願番号】 CN2022118942

(87)【国際公開番号】W WO2023040935

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】202111078172.7

(32)【優先日】2021-09-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

２．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516174219

【氏名又は名称】江蘇恒瑞医薬股▲ふん▼有限公司

(71)【出願人】

【識別番号】520392096

【氏名又は名称】上海盛迪医薬有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＨＥＮＧＤＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１２８８ Ｈａｉｋｅ Ｒｏａｄ， Ｚｈａｎｇｊｉａｎｇ Ｔｏｗｎ， Ｐｕｄｏｎｇ Ｎｅｗ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１２１０， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】楊 健健

(72)【発明者】

【氏名】田 晨敏

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA11

4C076AA96

4C076BB13

4C076BB15

4C076BB16

4C076BB21

4C076CC27

4C076CC32

4C076DD09

4C076DD23D

4C076DD38D

4C076DD41D

4C076DD41Z

4C076DD51Z

4C076EE23

4C076FF14

4C076FF16

4C076FF43

4C076FF61

4C076GG06

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体を含む医薬組成物である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と緩衝剤を含む医薬組成物であって、
前記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、
前記緩衝剤は、ヒスチジン緩衝剤又は酢酸塩緩衝剤であり、
好ましくは、前記ヒスチジン緩衝剤はヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤であり、又は
好ましくは、前記酢酸塩緩衝剤は酢酸－酢酸ナトリウム塩緩衝剤である、
医薬組成物。

【請求項2】

前記医薬組成物のｐＨは５．０～６．５であり、
好ましくは、前記医薬組成物のｐＨは５．５～６．５であり、
より好ましくは、前記医薬組成物のｐＨは６．０±０．２である、
請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は１～１５０ ｍｇ／ｍＬであり、
好ましくは、前記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は１～１００ ｍｇ／ｍＬであり、
より好ましくは、前記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は５０±５ ｍｇ／ｍＬである、
請求項１又は２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記医薬組成物は界面活性剤を含み、
好ましくは、前記界面活性剤はポリソルベート又はポロキサマーであり、
より好ましくは、前記界面活性剤はポリソルベート８０である、
請求項１～３の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記界面活性剤の濃度は０．０５～１．０ ｍｇ／ｍＬであり、
好ましくは、前記界面活性剤の濃度は０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬであり、
より好ましくは、前記界面活性剤の濃度は０．４±０．１ ｍｇ／ｍＬである、
請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記医薬組成物は浸透圧調整剤を含み、
好ましくは、前記浸透圧調整剤は、スクロース、トレハロース、ソルビトール、アルギニン、グリシン及び塩化ナトリウムからなる群から選ばれる１つ又は複数であり、
より好ましくは、前記浸透圧調整剤はスクロースである、
請求項１～５の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記浸透圧調整剤の濃度は７０～１００ ｍｇ／ｍＬであり、
好ましくは、前記浸透圧調整剤の濃度は７０～９０ ｍｇ／ｍＬであり、
より好ましくは、前記浸透圧調整剤の濃度は８０±５ ｍｇ／ｍＬである、
請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記緩衝剤の濃度は５～１００ ｍＭであり、
好ましくは、前記緩衝剤の濃度は１０～３０ ｍＭであり、
より好ましくは、前記緩衝剤の濃度は１０±５ ｍＭである、
請求項１～７の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインは、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、前記免疫グロブリン単一可変ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号３、８０～８４の何れか１つで示される配列中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記免疫グロブリン単一可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義され、そのうち、ＣＤＲ１は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号１１のアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ３は配列番号１５１のアミノ酸配列を含み、
より好ましくは、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む、
請求項１～８の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そのうち、
前記ＶＨはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、そのうち、ＨＣＤＲ１は配列番号１２１のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１２２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ３は配列番号１２３のアミノ酸配列を含む、かつ
前記ＶＬはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、そのうち、ＬＣＤＲ１は配列番号１２４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号１２５のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ３は配列番号１２６のアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＶＨは配列番号１４５のアミノ酸配列を含み、かつ前記ＶＬは配列番号１４９のアミノ酸配列を含み、
より好ましくは、前記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは重鎖と軽鎖を含み、前記重鎖は配列番号１０２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は配列番号１０３のアミノ酸配列を含み、
最も好ましくは、前記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、そのうち、前記第１のポリペプチド鎖は配列番号１０９のアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチド鎖は配列番号１０３のアミノ酸配列を含む、
請求項１～９の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項11】

下記の成分、即ち、
（ａ）１～１００ ｍｇ／ｍＬの前記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、
（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、
（ｃ）７０～９０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、
（ｄ）１０～３０ ｍＭのヒスチジン緩衝剤と、を含み、前記医薬組成物のｐＨが５．５～６．５であり、
好ましくは、前記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）５０～１００ ｍｇ／ｍＬの前記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、
（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、
（ｃ）７５～８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、
（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、前記医薬組成物のｐＨが５．５～６．５であり、
より好ましくは、前記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）５０±５ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体であって、配列番号１０９で示されるアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１０３で示されるアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、
（ｂ）０．４±０．１ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、
（ｃ）８０±５ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、
（ｄ）１０±５ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、前記医薬組成物のｐＨが６．０±０．２である、
請求項１～１０の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

再溶解すると、請求項１～１１の何れか１項に記載の医薬組成物を形成することができる、凍結乾燥製剤。

【請求項13】

請求項１～１１の何れか１項に記載の医薬組成物を凍結乾燥するステップを含む、凍結乾燥製剤を調製する方法。

【請求項14】

請求項１３に記載の方法によって得られる、凍結乾燥製剤。

【請求項15】

静脈注射製剤、皮下注射製剤、腹腔注射製剤又は筋肉注射製剤であり、好ましくは静脈注射製剤である、請求項１～１１の何れか１項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

疾患を治療する方法であって、前記方法は、
治療有効量の請求項１～１１、１５の何れか１項に記載の医薬組成物、請求項１２又は１４に記載の凍結乾燥製剤を、対象に投与することを含み、
好ましくは、前記疾患は増殖性疾患、感染又は敗血症であり、
より好ましくは、前記増殖性疾患は腫瘍であり、
最も好ましくは、前記腫瘍は、肺がん、前立腺がん、乳がん、頭頸部がん、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、肝がん、黒色腫、腎がん、扁平上皮がん及び血液系がんから選ばれる何れか１つである、
方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０２１年０９月１５日に提出された中国特許出願２０２１１１０７８１７２．７の優先権を主張する。

【0002】

本開示は、医薬製剤分野に属し、具体的には、二重特異性抗体を含む医薬組成物、及びその薬剤としての使用に関する。

【背景技術】

【0003】

ここでの記載は、必ずしも従来技術を構成するものではなく、本開示に関連する背景情報のみを提供する。

【0004】

ＰＶＲＩＧは、ＣＤ１１２Ｒとも呼ばれ、細胞表面において発現されるタンパク質であり、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６及びＣＤ２２６などと同じくＢ７／ＣＤ２８スーパーファミリーに属し、免疫系において重要な役割を果たす。

【0005】

ＰＶＲＩＧは、１つの細胞外領域、１つの膜貫通領域、及び１つの細胞内領域を含む。そのリガンドＰＶＲＬ２（ＣＤ１１２とも呼ばれる）がＰＶＲＩＧに結合すると、ＰＶＲＩＧが免疫阻害作用を果たすように、ＰＶＲＩＧ細胞内領域におけるＩＴＩＭドメインを活性化することになる。

【0006】

ＰＶＲＩＧは、主にＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表面において発現される。ＰＶＲＩＧ及びそのリガンドＰＶＲＬ２は、肺がん、乳がん、卵巣がん、腎がん、胃がん、子宮内膜がん、頭頸部がんなどを含む多くの固形腫瘍において高発現される。これらのがんにおけるＰＶＲＩＧの発現は、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１との関連性が高い。ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴと類似し、ＰＶＲＩＧ陽性のＴ細胞もＥｏｍｅｓ陽性及びＴｂｅｔ陰性を示し、ＰＶＲＩＧがＴ細胞の枯渇に関連することが示唆される。従って、ＰＶＲＩＧは、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ以外の新しい免疫チェックポイントを代表し、冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）の役割を果たす可能性がある。体外細胞実験及びマウスモデルから明らかなように、マウスＰＶＲＩＧをノックアウト又は阻害することにより、腫瘍の増殖を効果的に阻害するとともに、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ阻害剤と相乗効果を生じることができる。

【0007】

ＴＩＧＩＴは、様々な腫瘍に浸潤する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びＴｒｅｇを含むリンパ球に高発現される。ＴＩＧＩＴシグナル伝達とその同族リガンドＰＶＲ（ＣＤ１５５とも呼ばれる）の結合は、その細胞質ＩＴＩＭドメインを介してＮＫ細胞の細胞傷害性を直接阻害することが証明された。ＰＶＲは腫瘍においても広く発現され、ＴＩＧＩＴ－ＰＶＲシグナル伝達軸ががんの主要な免疫回避メカニズムであり得ることが示唆される。

【0008】

しかし、現在、臨床に入った抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体薬は、まだ存在していない。従来の技術において、インビボでがん又は腫瘍の増殖を阻害可能な高親和性（ａｖｉｄｉｔｙ）、高選択性、高生物活性の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の製剤は、依然として欠けている。

【発明の概要】

【0009】

本開示は、抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供し、当該組成物は治療活性を有する。さらに、当該組成物は、安定性が良いといった利点を有してもよい。

【0010】

幾つかの実施形態において、本開示は、抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体及び緩衝剤を含む医薬組成物を提供し、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインとを含み、上記緩衝剤はヒスチジン緩衝剤又は酢酸塩緩衝剤である。

【0011】

幾つかの実施形態において、上記緩衝剤は、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤又は酢酸－酢酸ナトリウム塩緩衝剤である。

【0012】

幾つかの具体的な実施形態において、上記緩衝剤は、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤である。

【0013】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記医薬組成物のｐＨは５．０～６．５である。幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは５．５～６．５であり、幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは５．５～６．０であり、幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは約６．０である。本開示において点値に言及する場合、当該点値は、誤差範囲を含むと理解すべきである。この誤差範囲は、実験室環境、作業者による操作、機器、方法学、測定誤差などの要因によるものである。ｐＨを例とすれば、測定値が約６．０である場合、誤差範囲を含んでいると理解すべきである。一例として、工業用ｐＨ計で製剤を測定する場合、「約６．０」は、６．０±０．２を示す。

【0014】

幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは５．０～５．５であり、幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは約５．５である。

【0015】

幾つかの実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４若しくは６．５であり、又はこれらの点値間の任意の範囲である。

【0016】

一般的に、緩衝剤の置換によって得られた医薬組成物は、ｐＨが緩衝剤ｐＨとほぼ一致する。同時に、当業者に公知されているように、医薬製剤化の過程において、ｐＨドリフトが存在する場合があるが、医薬製剤のｐＨのドリフトは一般に小さい（±０．３の範囲内）。幾つかの実施形態において、医薬製剤のｐＨのドリフトは、±０．１の範囲内にある。

【0017】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は１～１５０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は１～１００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は、４０～１００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は、５０～１００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は、４０～６０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は、１００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は、１００±８ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は、５０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は、５０±５ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の濃度は、１ ｍｇ／ｍＬ、１０ ｍｇ／ｍＬ、２０ ｍｇ／ｍＬ、３０ ｍｇ／ｍＬ、４０ ｍｇ／ｍＬ、４５ ｍｇ／ｍＬ、５０ ｍｇ／ｍＬ、５５ ｍｇ／ｍＬ、６０ ｍｇ／ｍＬ、６５ ｍｇ／ｍＬ、７０ ｍｇ／ｍＬ、８０ ｍｇ／ｍＬ、９０ ｍｇ／ｍＬ、１００ ｍｇ／ｍＬ、１１０ ｍｇ／ｍＬ、１２０ ｍｇ／ｍＬ、１３０ ｍｇ／ｍＬ、１４０ ｍｇ／ｍＬ若しくは１５０ ｍｇ／ｍＬであり、又はこれらの点値間の任意の範囲である。

【0018】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記医薬組成物は界面活性剤を含む。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤は非イオン界面活性剤である。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤は、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０）、ポロキサマー、Ｔｒｉｔｏｎ、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ラウリルスルホン酸ナトリウム、オクチルグルコシドナトリウム、ラウリル－スルホベタイン、ミリスチル－スルホベタイン、リノール－スルホベタイン、ステアリン－スルホベタイン、ラウリル－サルコシン、ミリスチル－サルコシン、リノール－サルコシン、ステアリン－サルコシン、リノール－ベタイン、ミリスチル－ベタイン、セチル－ベタイン、ラウラミドプロピル－ベタイン、コカミドプロピル－ベタイン、リノールアミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ベタイン、パルミタミドプロピル－ベタイン、イソステアラミドプロピル－ベタイン、ミリスタミドプロピル－ジメチルアミン、パルミタミドプロピル－ジメチルアミン、イソステアラミドプロピル－ジメチルアミン、メチルココイルナトリウム、メチルオレイルタウリンナトリウム、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレン及びプロピレングリコールの共重合体などから選ばれる。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤はポリソルベート又はポロキサマーである。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０又はポロキサマー１８８である。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤はポリソルベート８０である。

【0019】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記界面活性剤の濃度は０．０５～１．０ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤の濃度は、０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤の濃度は、０．０５ ｍｇ／ｍＬ、０．１ ｍｇ／ｍＬ、０．２ ｍｇ／ｍＬ、０．３ ｍｇ／ｍＬ、０．４ ｍｇ／ｍＬ、０．５ ｍｇ／ｍＬ、０．６ ｍｇ／ｍＬ、０．７ ｍｇ／ｍＬ、０．８ ｍｇ／ｍＬ、０．９ ｍｇ／ｍＬ若しくは１．０ ｍｇ／ｍＬであり、又はこれらの点値間の任意の範囲である。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤の濃度は０．４ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、上記界面活性剤の濃度は０．４±０．１ ｍｇ／ｍＬである。

【0020】

幾つかの実施形態において、上記界面活性剤は０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０である。

【0021】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、それは浸透圧調整剤を含む。幾つかの実施形態において、浸透圧調整剤は、糖（単糖、二糖、三糖、多糖、糖アルコール、還元糖、非還元糖などを含む）、アミノ酸（アルギニン、グリシン、システイン、ヒスチジンなどを含む）又は塩類（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）である。幾つかの実施形態において、上記浸透圧調整剤は糖であり、上記糖は、グルコース、スクロース、トレハロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デキストラン、グリセリン、エリトリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール（ソルビットともいう）、マンニトール、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンニノトリオース、スタキオース、マルトース、ラクツロース、マルツロース、マルチトール、ラクチトールとイソ－マルツロースから選ばれる。幾つかの実施形態において、上記浸透圧調整剤は、スクロース、トレハロース、ソルビトール、アルギニン、グリシン及び塩化ナトリウムからなる群から選ばれる１つ又は複数である。幾つかの実施形態において、上記浸透圧調整剤は非還元二糖であり、幾つかの実施形態において、上記浸透圧調整剤はトレハロース又はスクロースであり、幾つかの実施形態において、上記浸透圧調整剤はスクロースである。

【0022】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、浸透圧調整剤の濃度は７０～１００ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、浸透圧調整剤の濃度は７５～１００ ｍｇ／ｍＬであり、幾つかの実施形態において、浸透圧調整剤の濃度は７５～９０ ｍｇ／ｍＬであり、幾つかの実施形態において、浸透圧調整剤の濃度は７０～９０ ｍｇ／ｍＬであり、幾つかの実施形態において、浸透圧調整剤の濃度は７５～８５ ｍｇ／ｍＬであり、幾つかの実施形態において、浸透圧調整剤の濃度は７５～８０ ｍｇ／ｍＬであり、幾つかの実施形態において、浸透圧調整剤の濃度は８０ ｍｇ／ｍＬであり、幾つかの実施形態において、浸透圧調整剤の濃度は８０±５ ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態において、浸透圧調整剤の濃度の非限定的な実例は、６０ ｍｇ／ｍＬ、６５ ｍｇ／ｍＬ、７０ ｍｇ／ｍＬ、７５ ｍｇ／ｍＬ、８０ ｍｇ／ｍＬ、８５ ｍｇ／ｍＬ、９０ ｍｇ／ｍＬ、９５ ｍｇ／ｍＬ、１００ ｍｇ／ｍＬ、及びこれらの点値間の任意の範囲を含む。

【0023】

幾つかの実施形態において、上記医薬組成物は等張製剤である。幾つかの実施形態において、上記浸透圧調整剤は、上記医薬組成物の浸透圧を２８０～３２０ ｍＯｓｍに制御し、幾つかの実施形態において、浸透圧は約２９０～３００ ｍＯｓｍに制御される。幾つかの実施形態において、浸透圧調整剤は、浸透圧を２８０ ｍＯｓｍ、２９０ ｍＯｓｍ、２９５ ｍＯｓｍ、３００ ｍＯｓｍ、３０５ ｍＯｓｍ、３１０ ｍＯｓｍ、３２０ ｍＯｓｍ、及びこれらの点値間の任意の範囲に制御する。

【0024】

幾つかの実施形態において、上記浸透圧調整剤は８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースである。

【0025】

幾つかの実施形態において、上記浸透圧調整剤は８０±５ ｍｇ／ｍＬのスクロースである。

【0026】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、上記緩衝剤の濃度は５～１００ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤の濃度は１０～３０ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤の濃度は５～１５ ｍＭである。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤の濃度は、５ ｍＭ、１０ ｍＭ、１５ ｍＭ、２０ ｍＭ、２５ ｍＭ、３０ ｍＭ、４０ ｍＭ、５０ ｍＭ、６０ ｍＭ、７０ ｍＭ、８０ ｍＭ、９０ ｍＭ又は１００ ｍＭ、及びこれらの点値間の任意の範囲である。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤は１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌである。幾つかの実施形態において、上記緩衝剤は１０±５ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌである。

【0027】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、そのＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、上記少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）は３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、そのうち、ＣＤＲ１は、配列番号７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８、３１、３４、３７、４０、４３、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４の何れか１つで示されるアミノ酸配列又はそれに対して３、２、１個若しくはそれ以上のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列から選ばれ、及び／又はＣＤＲ２は、配列番号８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５の何れか１つで示されるアミノ酸配列又はそれに対して３、２、１個若しくはそれ以上のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列から選ばれ、及び／又はＣＤＲ３は、配列番号９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、１５０、１５１の何れか１つで示されるアミノ酸配列又はそれに対して３、２、１個若しくはそれ以上のアミノ酸相違を有するアミノ酸配列から選ばれ、そのうち、配列番号７～２１は、Ｋａｂａｔ番号付け規則に従い、配列番号２２～３６はＣｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従い、配列番号３７～５１はＩＭＧＴ番号付け規則に従い、配列番号５２～６６はＡｂＭ番号付け規則に従う。

【0028】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、そのＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、上記免疫グロブリン単一可変ドメインは配列番号２、７５～７９の何れか１つで示される配列中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、又は配列番号３、８０～８４の何れか１つで示される配列中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、又は配列番号４、８６～９０の何れか１つで示される配列中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、又は配列番号５、９１～９５の何れか１つで示される配列中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、又は配列番号６、９６～１００の何れか１つで示される配列中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む。幾つかの実施形態において、上記免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号３、８０～８４の何れか１つで示される配列中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む。幾つかの実施形態において、上記免疫グロブリン単一可変ドメインは、配列番号８１中のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む。幾つかの実施形態において、上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ又はＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステムによって定義される。幾つかの実施形態において、上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって決定される。幾つかの実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付け規則に従って、ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン（例えば、ＶＨＨ）は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、そのうち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号７、８、９で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号７、８、１５０で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１０、１１、１２で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１０、１１、１５１で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１３、１４、１５で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１６、１７、１８で示され、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１９、２０、２１で示される。幾つかの実施形態において、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け規則に従って、ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン（例えば、ＶＨＨ）は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、そのうち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２２、２３、２４で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２５、２６、２７で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２８、２９、３０で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３１、３２、３３で示され、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３４、３５、３６で示される。幾つかの実施形態において、ＩＭＧＴ番号付け規則に従って、ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン（例えば、ＶＨＨ）は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、そのうち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号３７、３８、３９で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４０、４１、４２で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４３、４４、４５で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４６、４７、４８で示され、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号４９、５０、５１で示される。幾つかの実施形態において、ＡｂＭ番号付け規則に従って、ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン（例えば、ＶＨＨ）は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、そのうち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５２、５３、５４で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５５、５６、５７で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５８、５９、６０で示され、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号６１、６２、６３で示され、又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号６４、６５、６６で示される。

【0029】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、そのＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、上記免疫グロブリン単一可変ドメインはＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３はＫａｂａｔ番号付けシステムによって定義され、そのうち、ＣＤＲ１は配列番号１０のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は配列番号１１のアミノ酸配列を含み、かつＣＤＲ３は配列番号１５１のアミノ酸配列を含む。

【0030】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、そのＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン（例えば、ＶＨＨ）が配列番号２～６、７５～８４、８６～１００の何れか１つで示されるアミノ酸配列を含み、又は配列番号２～６、７５～８４、８６～１００中の少なくとも１つの配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の第１の抗原結合ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の第１の抗原結合ドメインは、配列番号８１に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有する配列のアミノ酸配列を含む。

【0031】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメインが第１の抗体で、ＶＨＨであり、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが第２の抗体であり、幾つかの実施形態において、第２の抗体は重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含み、上記第１の抗体は第２の抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端及び／又はＣ末端に位置する。

【0032】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、１つのＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗体と、２つのＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗体とを含み、上記第２の抗体は２つのＨＣ及び２つのＬＣを含み、第２の抗体の１つのＨＣのＶＨと１つのＬＣのＶＬにより抗原結合部位が形成され、もう１つのＨＣのＶＨともう１つのＬＣのＶＬにより抗原結合部位が形成される。幾つかの実施形態において、一方の第１の抗体は第２の抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端に位置し、他方の第１の抗体は第２の抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端に位置する。幾つかの実施形態において、各第１の抗体はそれぞれ第２の抗体の２つの重鎖又は２つの軽鎖のＮ末端に位置し、或いは、各第１の抗体はそれぞれ第２の抗体の２つの重鎖又は２つの軽鎖のＣ末端に位置する。幾つかの実施形態において、各第１の抗体は、それぞれ第２の抗体の２つの重鎖のＮ末端に位置する。幾つかの実施形態において、各第１の抗体は、それぞれ第２の抗体の２つの重鎖のＣ末端に位置する。幾つかの実施形態において、上記２つの第１の抗体は同じである。幾つかの実施形態において、上記２つの第１の抗体は同じではない。

【0033】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、第２の抗体に１、２、３、４、５、６、７、８個の第１の抗体が連結され、上記第１の抗体は同じ又は異なっており、何れも第２の抗体の重鎖Ｎ末端に連結されてもよく、或いは何れも第２の抗体の重鎖Ｃ末端に連結されてもよく、或いは何れも第２の抗体の軽鎖Ｎ末端に連結されてもよく、或いは何れも第２の抗体の軽鎖Ｃ末端に連結されてもよく、或いは第２の抗体の重鎖Ｎ末端、重鎖Ｃ末端、軽鎖Ｎ末端若しくは軽鎖Ｃ末端又はそれらの任意の組み合わせに連結されてもよい。

【0034】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、第１の抗体は直接的に又はリンカーを介して第２の抗体の重鎖のＮ末端又はＣ末端に連結される。幾つかの実施形態において、上記リンカーは、例えば、（ＧｍＳｎ）ｘ又は（ＧＧＮＧＴ）ｘ又は（ＹＧＮＧＴ）ｘで示されるアミノ酸配列から選ばれ、そのうち、ｍ、ｎはそれぞれ独立的に１～８の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７又は８）から選ばれ、ｘは独立的に１～２０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０）から選ばれる。幾つかの実施形態において、リンカーは、ＧＳ、ＧＡＰ、ＡＳＧＳ（配列番号１５４）、Ｇ_４Ｓ（配列番号１５５）、（Ｇ_４Ｓ）_２（配列番号１５２）、（Ｇ_４Ｓ）_３（配列番号１５６）、（Ｇ_４Ｓ）_４（配列番号１５７）、（Ｇ_４Ｓ）_５（配列番号１５８）、（Ｇ_４Ｓ）_６（配列番号１５９）、ＹＧＮＧＴ（配列番号１６０）、（ＹＧＮＧＴ）_２（配列番号１６１）、（ＹＧＮＧＴ）_３（配列番号１６２）、（ＹＧＮＧＴ）_４（配列番号１６３）、（ＹＧＮＧＴ）_５（配列番号１６４）又は（ＹＧＮＧＴ）_６（配列番号１６５）で示されるアミノ酸配列である。

【0035】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、上記第２の抗体の重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含み、軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。幾つかの実施形態において、第２の抗体は全長抗体である。幾つかの実施形態において、上記第２の抗体の重鎖はＩｇＧアイソタイプであり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４、例えば、ＩｇＧ１アイソタイプであり、及び／又は上記第２の抗体の軽鎖はＫａｐｐａアイソタイプである。

【0036】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、第２の抗体の２つのＨＣは同じＣＤＲを含み、及び／又は第２の抗体の２つのＬＣは同じＣＤＲを含む。幾つかの実施形態において、上記第２の抗体の２つのＨＣは同じＶＨを含み、及び／又は第２の抗体の２つのＬＣは同じＶＬを含む。幾つかの実施形態において、上記第２の抗体の２つのＨＣは同じアミノ酸配列を有し、及び／又は第２の抗体の２つのＬＣは同じアミノ酸配列を有する。

【0037】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は２つの第１の抗体を含み、そのうち、上記２つの第１の抗体は同じ又は異なるアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、２つの第１の抗体は、同じアミノ酸配列を有する。

【0038】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は２つの第１のポリペプチド鎖と２つの第２のポリペプチド鎖を含み、そのうち、各ポリペプチド鎖には、
ａ）第１のポリペプチド鎖はそれぞれ独立的に、第１の抗体となるＶＨＨと、第２の抗体の重鎖（ＨＣ）とを含み、
ｂ）第２のポリペプチド鎖は、それぞれ独立的に第２の抗体の軽鎖（ＬＣ）を含み、
ここで、ＶＨＨは、直接的に又はリンカーを介して第２の抗体のＨＣのＮ末端及び／又はＣ末端に連結される。或いは、ｉ）第１のポリペプチド鎖は、それぞれ独立的に第２の抗体の重鎖（ＨＣ）を含み、かつｉｉ）第２のポリペプチド鎖は、それぞれ独立的に第１の抗体と第２の抗体の軽鎖（ＬＣ）とを含み、ここで、ＶＨＨは、直接的に又はリンカーを介して第２の抗体のＬＣのＮ末端及び／又はＣ末端に連結される。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、２つの同じ第１のポリペプチド鎖と、２つの同じ第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0039】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが任意の抗ＴＩＧＩＴ抗体である。ここで、ＷＯ２００９１２６６８８、ＷＯ２０１４０８９１１３、ＷＯ２０１５００９８５６、ＷＯ２０１５１４３３４３、ＷＯ２０１５１７４４３９、ＷＯ２０１６０２８６５６、ＷＯ２０１６１０６３０２、ＷＯ２０１７０５３７４８、ＷＯ２０１７０３０８２３、ＵＳ２０１６０１７６９６３、ＵＳ２０１３０２５１７２０、ＷＯ２０１９２３２４８４、ＷＯ２０１９０６２８３２におけるＴＩＧＩＴ抗体は、全てここに組み込まれている。例えば、ＴＩＧＩＴ抗体は、ＣＰＡ．９．０８３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＰＡ．９．０８６．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）、ＣＨＡ．９．５４７．７．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）及びＣＨＡ．９．５４７．１３．Ｈ４（Ｓ２４１Ｐ）の何れか１つであってもよい（ＷＯ２０１９２３２４８４参照）。

【0040】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが第２の抗体である。幾つかの実施形態において、ＷＯ２０１９０６２８３２における抗ＴＩＧＩＴ抗体は、第２の抗体として全てここに組み込まれている。幾つかの実施形態において、上記第２の抗体は、重鎖可変領域がそれぞれ配列番号１１５、１１６及び１１７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号１１８、１１９及び１２０で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、又は重鎖可変領域がそれぞれ配列番号１２１、１２２及び１２３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号１２４、１２５及び１２６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、又は重鎖可変領域がそれぞれ配列番号１２７、１２８及び１２９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号１３０、１３１及び１３２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、又は重鎖可変領域がそれぞれ配列番号１３３、１３４及び１３５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号１３６、１３７及び１３８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、又は重鎖可変領域がそれぞれ配列番号１３９、１４０及び１４１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、かつ軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号１４２、１４３及び１４４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。

【0041】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そのうち、上記重鎖可変領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、そのうち、ＨＣＤＲ１は配列番号１２１のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号１２２のアミノ酸配列を含み、かつＨＣＤＲ３は配列番号１２３のアミノ酸配列を含み、また上記軽鎖可変領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、そのうち、ＬＣＤＲ１は配列番号１２４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は配列番号１２５のアミノ酸配列を含み、かつＬＣＤＲ３は配列番号１２６のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４５～１４７の何れか１つで示されるアミノ酸配列のＶＨを含み、又は配列番号１４５～１４７中の少なくとも１つの配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＶＨを含み、及び／又は配列番号１４８～１４９の何れか１つで示されるアミノ酸配列のＶＬを含み、又は配列番号１４８～１４９中の少なくとも１つの配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＶＬを含む。幾つかの実施形態において、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域が配列番号１４５のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１４９のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む。幾つかの実施形態において、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１０２に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＨＣと、配列番号１０３に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列のＬＣとを含む。幾つかの実施形態において、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＣと、配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＬＣとを有する。幾つかの実施形態において、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１４５の重鎖可変領域を含み、かつ配列番号１４９の軽鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態において、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインは、配列番号１０２のアミノ酸配列のＨＣと、配列番号１０３のアミノ酸配列のＬＣとを有する。

【0042】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、上記ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン又は第１の抗体（例えば、ＶＨＨ）は配列番号７、８、９で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、或いは配列番号７、８、１５０で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン又は第２の抗体は、重鎖可変領域がそれぞれ配列番号１２１、１２２、１２３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号１２４、１２５、１２６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む。

【0043】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、上記ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン又は第１の抗体（例えば、ＶＨＨ）は配列番号１０、１１、１２で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、又は配列番号１０、１１、１５１で示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含み、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン又は第２の抗体は、重鎖可変領域がそれぞれ配列番号１２１、１２２、１２３で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域がそれぞれ配列番号１２４、１２５、１２６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３を含む。

【0044】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体では、上記ＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン又は第１の抗体は、配列番号６、７９、８１、９２、９８、９９の１つで示されるアミノ酸配列を含むＶＨＨ、又は配列番号６、７９、８１、９２、９８、９９の１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨＨを有し、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン又は第２の抗体は、配列番号１４５～１４７の何れか１つで示されるアミノ酸配列を含むＶＨ、又は配列番号１４５～１４７の１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１４８～１４９の何れか１つで示されるアミノ酸配列を含むＶＬ、又は配列番号１４８～１４９の１つに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬとを有し、幾つかの実施形態において、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン又は第２の抗体は、配列番号１０２又は配列番号１０２に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＣと、配列番号１０３又は配列番号１０３に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＬＣとを有する。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、そのＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン又は第１の抗体が配列番号８１で示されるＶＨＨを有し、そのＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが配列番号１４５で示されるＶＨと配列番号１４９で示されるＶＬとを有する。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、そのＰＶＲＩＧに特異的に結合する第１の抗原結合ドメイン又は第１の抗体が配列番号８１で示されるＶＨＨを有し、そのＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメインが配列番号１０２で示されるＨＣと配列番号１０３で示されるＬＣとを有する。

【0045】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体はＦｃ領域を含み、幾つかの実施形態において、上記ＴＩＧＩＴに特異的に結合する第２の抗原結合ドメイン又は第２の抗体はＦｃ領域を含む。幾つかの実施形態において、上記ＦｃはＩｇＧアイソタイプＦｃであり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域であり、幾つかの実施形態において、上記Ｆｃは、以下から選ばれる１つ又は複数のアミノ酸変異（変異部位はＥＵインデックスによる）を含む：
ｉ）軽鎖と重鎖の組立が容易になり、或いは抗体の安定性が向上又は低下するように、ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数を変更するもの、
ｉｉ）向上したＡＤＣＣが引き起こされるようにＦｃγＲＩＩＩａとの結合を強める変異、ＦｃγＲＩＩｂとの結合を弱める変異、例えば、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２９９Ｔ、２９７Ｎ又はそれらの任意の組み合わせ、
ｉｉｉ）生物学的半減期を延長するもの、例えば、Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ、４２８Ｌ、４３４Ａ、４３４Ｓ、４２８Ｌ／４３４Ｓ又はそれらの任意の組み合わせ、
ｉｖ）エフェクターリガンドに対する抗体の親和性を変更するとともに、親抗体の抗原結合能を保持するための２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０及び３２２位の１つ又は複数のアミノ酸変異又はそれらの任意の組み合わせ、
ｖ）抗体が改変したＣ１ｑ結合を有し、及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を低減若しくは消去するための３２９、３３１及び３２２位の１つ又は複数のアミノ酸変異又はそれらの任意の組み合わせ、
ｖｉ）抗体の補体固定能力を変更するための２３１～２３９のうちの１つ又は複数のアミノ酸変異又はそれらの任意の組み合わせ、
ｖｉｉ）ＡＤＣＣの能力を向上させ、及び／又はＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を向上させるための２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８又は４３９のうちの１つ又は複数のアミノ酸変異又はそれらの任意の組み合わせ、
ｖｉｉｉ）Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び／又はＫ４４７Ａのアミノ酸変異、並びに
ｉｘ）Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｄ、Ｍ３５８Ｌ及び／又はＴ３６６Ｗのアミノ酸変異。

【0046】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、配列番号１０４で示される第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１０３で示される第２のポリペプチド鎖、配列番号１０５で示される第１のポリペプチド鎖、配列番号１０３で示される第２のポリペプチド鎖、配列番号１０２で示される第１のポリペプチド鎖、配列番号１０６で示される第２のポリペプチド鎖、配列番号１０２で示される第１のポリペプチド鎖、配列番号１０７で示される第２のポリペプチド鎖、又は配列番号１０８～１１２、１１４の何れか１つで示される第１のポリペプチド鎖、配列番号１０３で示される第２のポリペプチド鎖、或いは上記第１のポリペプチド鎖及び／又は第２のポリペプチド鎖に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する変異体を含む。

【0047】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含み、そのうち、上記第１のポリペプチド鎖は配列番号１０９のアミノ酸配列を含み、上記第２のポリペプチド鎖は配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、２つの同じ第１のポリペプチド鎖と、２つの同じ第２のポリペプチド鎖とを含む。

【0048】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、上記何れか１つに記載の二重特異性抗体と競合的に結合する抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体である。

【0049】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、そのうち、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、下記特徴の中の少なくとも１つを有する：
（ａ）ヒトＰＶＲＩＧに結合するＫＤ値が１×１０^－７ Ｍ未満であること、
（ｂ）ＰＶＲＩＧとそのリガンド（例えば、ＰＶＲＬ２）の相互作用を遮断すること、
（ｃ）Ｔ細胞に対する樹状細胞の阻害作用を解除し、Ｔ細胞を活性化すること、
（ｄ）ＮＫ細胞に対する腫瘍細胞の阻害作用を解除すること、
（ｅ）腫瘍の増殖を阻害すること。

【0050】

幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体のＫＤ値は、１×１０^－７ Ｍ未満、１×１０^－８ Ｍ未満、１×１０^－９ Ｍ未満、１×１０^－１０ Ｍ未満であってもよい。幾つかの実施形態において、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、腫瘍の増殖を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％阻害することができる。

【0051】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）１～１００ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、
（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、
（ｃ）７５～９０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、
（ｄ）１０～３０ ｍＭのヒスチジン緩衝剤と、を含み、医薬組成物のｐＨが５．５～６．０である。

【0052】

幾つかの実施形態において、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）５０～１００ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、
（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、
（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨが５．５～６．０であり、
幾つかの実施形態において、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体であって、配列番号１０９のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１０３のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨが６．０である。

【0053】

幾つかの実施形態において、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）５０～１００ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、
（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、
（ｃ）８０±５ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、
（ｄ）１０±５ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨが５．５～６．０である。

【0054】

幾つかの実施形態において、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）１～１００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０～９０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０～３０ ｍＭのヒスチジン緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨが５．５～６．５である。

【0055】

幾つかの実施形態において、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）５０～１００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７５～８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨが５．５～６．５である。

【0056】

幾つかの実施形態において、上記医薬組成物は下記の成分、即ち、
（ａ）５０±５ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体であって、配列番号１０９のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１０３のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、
（ｂ）０．４±０．１ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、
（ｃ）８０±５ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、
（ｄ）１０±５ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨが６．０±０．２である。

【0057】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）４０～６０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、
（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、
（ｃ）７５～８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、
（ｄ）１０～３０ ｍＭのヒスチジン緩衝剤と、を含み、医薬組成物のｐＨが５．５～６．０である。

【0058】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７５～８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０～３０ ｍＭの酢酸塩緩衝剤と、を含み、医薬組成物のｐＨが５．０～５．５である。

【0059】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム塩緩衝剤と、を含み、ｐＨが５．０である。

【0060】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム塩緩衝剤と、を含み、ｐＨが５．５である。

【0061】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０±５ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、
（ｂ）０．４±０．１ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、
（ｃ）７５～８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、
（ｄ）１０～３０ ｍＭの酢酸塩緩衝剤と、を含み、医薬組成物のｐＨが５．０～５．５である。

【0062】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０±５ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、
（ｂ）０．４±０．１ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、
（ｃ）８０±５ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、
（ｄ）１０±５ ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム塩緩衝剤と、を含み、ｐＨが５．５±０．２である。

【0063】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０±５ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４±０．１ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０±５ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０±５ ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム塩緩衝剤と、を含み、ｐＨが５．５である。

【0064】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、ｐＨが５．５である。

【0065】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、ｐＨが６．０である。

【0066】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、ｐＨが６．５である。

【0067】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）１００ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、ｐＨが６．０である。

【0068】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．２ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、ｐＨが６．５である。

【0069】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、ｐＨが６．５である。

【0070】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、ｐＨが６．５である。

【0071】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポロキサマー１８８と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、ｐＨが６．５である。

【0072】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、ｐＨが５．５である。

【0073】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（例えば、１７０８－３０Ｈ２）と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０と、（ｃ）７５ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、ｐＨが５．５である。

【0074】

幾つかの実施形態において、上記の医薬組成物であって、上記医薬組成物は液体製剤である。幾つかの実施形態において、上記液体製剤の溶媒は水である。

【0075】

本開示は、再溶解された後、上記何れか１つに記載の医薬組成物を形成することができることを特徴とする凍結乾燥製剤をさらに提供する。

【0076】

本開示は、上記何れか１つに記載の医薬組成物の凍結乾燥形態の製剤である凍結乾燥製剤をさらに提供する。

【0077】

本開示は、上記何れか１つに記載の医薬組成物を凍結乾燥するステップを含む、凍結乾燥製剤を調製する方法をさらに提供する。幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の凍結乾燥は、順に予備凍結、一次乾燥及び二次乾燥のステップを含む。

【0078】

本開示は、上記何れか１つに記載の医薬組成物を凍結乾燥することにより得られる凍結乾燥製剤をさらに提供する。

【0079】

本開示は、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤を再溶解して調製することにより得られることを特徴とする再溶解溶液をさらに提供する。

【0080】

本開示は、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤の再溶解形態の製剤である再溶解溶液をさらに提供する。

【0081】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の再溶解溶液であって、その成分及び含有量は、上記医薬組成物の成分及び含有量と同じである。

【0082】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の再溶解溶液であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）１～１５０ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、（ｂ）０．０５～１．０ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０～１００ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）５～１００ ｍＭのヒスチジン緩衝剤と、を含み、医薬組成物のｐＨが５．０～６．５である。

【0083】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の再溶解溶液であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）１～１００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７０～９０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０～３０ ｍＭのヒスチジン緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨが５．５～６．５である。

【0084】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の再溶解溶液であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）５０～１００ ｍｇ／ｍＬの上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７５～８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨが５．５～６．５である。

【0085】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の再溶解溶液であって、それは下記の成分、即ち、
（ａ）１～１００ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）７５～９０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０～３０ ｍＭのヒスチジン緩衝剤と、を含み、医薬組成物のｐＨが５．５～６．０である。

【0086】

幾つかの実施形態において、上記再溶解溶液は下記の成分、即ち、
（ａ）５０～１００ ｍｇ／ｍＬの上記何れか１つに記載の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、（ｂ）０．２～０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨが５．５～６．０である。

【0087】

幾つかの実施形態において、上記再溶解溶液は下記の成分、即ち、
（ａ）５０ ｍｇ／ｍＬの抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体であって、配列番号１０９のアミノ酸配列の第１のポリペプチド鎖、及び配列番号１０３のアミノ酸配列の第２のポリペプチド鎖を含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体と、（ｂ）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０と、（ｃ）８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースと、（ｄ）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤と、を含み、上記医薬組成物のｐＨが６．０である。

【0088】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物又は再溶解溶液であって、それは、静脈注射製剤、皮下注射製剤、腹腔注射製剤又は筋肉注射製剤であり、幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物又は再溶解溶液であって、それは静脈注射製剤である。

【0089】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物又は再溶解溶液であって、それは、静脈注射、皮下注射、腹腔注射又は筋肉注射に適用される。

【0090】

幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の医薬組成物又は再溶解溶液又は凍結乾燥製剤であって、それは、静脈注射、皮下注射、腹腔注射又は筋肉注射の薬剤の調製に用いられる。

【0091】

本開示は少なくとも１つの容器を含むキットをさらに提供し、各容器は、上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、又は上記何れか１つに記載の再溶解溶液を独立的に含む。

【0092】

幾つかの実施形態において、本開示は、対象の病状を診断・治療・緩和する方法であって、有効量の上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットを、上記対象に投与することを含む方法をさらに提供する。

【0093】

幾つかの実施形態において、本開示は、対象の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する方法であって、有効量の上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットを、上記対象に投与することを含む方法をさらに提供し、ここで、上記対象の上記ＣＴＬのサブグループは活性化される。

【0094】

幾つかの実施形態において、本開示は、対象のＮＫ細胞を活性化する方法であって、有効量の上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットを、上記対象に投与することを含む方法をさらに提供し、ここで、上記対象の上記ＮＫ細胞のサブグループは活性化される。

【0095】

幾つかの実施形態において、本開示は、対象のγδＴ細胞を活性化する方法であって、有効量の上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットを、上記対象に投与することを含む方法をさらに提供し、ここで、上記対象の上記γδＴ細胞のサブグループは活性化される。

【0096】

幾つかの実施形態において、本開示は、対象のＴｈ１細胞を活性化する方法であって、有効量の上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットを、上記対象に投与することを含む方法をさらに提供し、ここで、上記対象の上記Ｔｈ１細胞のサブグループは活性化される。

【0097】

幾つかの実施形態において、本開示は、対象のインビボでの制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）中の少なくとも１種の細胞数及び／又は活性を活性化、減少又は消去する方法であって、有効量の上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットを、上記対象に投与することを含む方法をさらに提供する。

【0098】

幾つかの実施形態において、本開示は、対象のインビボでのインターフェロン－γの産生及び／又は炎症促進性サイトカインの分泌を増加する方法であって、有効量の上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットを、上記対象に投与することを含む方法をさらに提供する。

【0099】

幾つかの実施形態において、本開示は、対象のインビボでのＰＶＲＩＧとＰＶＬＲ２の相互作用を阻害する方法であって、有効量の上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットを、上記対象に投与することを含む方法をさらに提供する。

【0100】

幾つかの実施形態において、本開示は、疾患を治療する薬剤の調製における上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットの使用をさらに提供する。

【0101】

幾つかの実施形態において、本開示は、疾患を治療する方法であって、治療有効量の上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットを、対象に投与することを含む方法をさらに提供する。

【0102】

幾つかの実施形態において、本開示は、疾患を治療するための上記何れか１つに記載の医薬組成物、上記何れか１つに記載の凍結乾燥製剤、上記何れか１つに記載の再溶解溶液又は上記何れか１つに記載のキットをさらに提供する。

【0103】

幾つかの具体的な実施形態において、上記何れか１つに記載の疾患は、増殖性疾患（例えば、腫瘍）である。幾つかの具体的な実施形態において、上記腫瘍は、前立腺がん、肝がん（ＨＣＣ）、結腸直腸がん（結腸がん、直腸がん）、卵巣がん、子宮内膜がん、乳がん（例えば、三重陰性乳がん）、膵臓がん、胃（ｓｔｏｍａｃｈ／ｇａｓｔｒｉｃ）がん、子宮頸がん、頭頸部がん、甲状腺がん、精巣がん、尿路上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、黒色腫、非黒色腫皮膚がん（扁平上皮がん及び基底細胞がん）、神経膠腫、腎がん（ＲＣＣ）、リンパ腫（ＮＨＬ又はＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、精巣胚細胞腫瘍、中皮腫、食道がん（「食管がん」とも呼ばれる）、メルケル細胞がん（Ｍｅｒｋｅｌ Ｃｅｌｌｓ ｃａｎｃｅｒ）、高ＭＳＩがん、ＫＲＡＳ変異腫瘍、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又はそれらの組み合わせから選ばれる。幾つかの具体的な実施形態において、上記疾患は、ＰＶＲＩＧ及び／又はＴＩＧＩＴの異常発現に関連する疾患であってもよい。幾つかの具体的な実施形態において、上記腫瘍は、三重陰性乳がん、胃がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん、高ＭＳＩがん、ＫＲＡＳ変異腫瘍、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又はそれらの組み合わせから選ばれる。幾つかの具体的な実施形態において、上記腫瘍は、三重陰性乳がん、胃がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん）、メルケル細胞がん及び高ＭＳＩがん又はそれらの組み合わせから選ばれる。幾つかの具体的な実施形態において、上記疾患の患者は、ＰＶＲＩＧ及び／又はＴＩＧＩＴに関連する病態を有する。幾つかの具体的な形態において、対象の病態は、ＰＶＲＩＧを発現するか又は発現しないがんを含み、また、非転移性又は非浸潤性及び浸潤性又は転移性がんをさらに含み、ここで、免疫細胞、間質細胞又は病変の発生した細胞のＰＶＲＩＧ発現は、抗腫瘍応答と抗浸潤性免疫応答を阻害する。幾つかの具体的な形態において、上記疾患は血管新生腫瘍である。幾つかの実施形態において、上記腫瘍は、肺がん、前立腺がん、乳がん、頭頸部がん、食道がん、胃がん、結腸直腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、肝がん、黒色腫、腎がん、扁平上皮がん、血液系がん又は制御不能な細胞増殖により特徴づけられる任意の他の疾患又は病状から選ばれる。

【0104】

幾つかの実施形態において、上記疾患は感染又は敗血症である。幾つかの具体的な形態において、上記感染は、ウィルス特異的Ｔ細胞応答の異なる程度の機能障害を特徴とする病原体感染であり、例えばＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶである。幾つかの具体的な形態において、上記敗血症は、重症敗血症、敗血性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、菌血症、セプシス、毒血症及び敗血性症候群から選ばれる。

【図面の簡単な説明】

【0105】

【図1】抗ＰＶＲＩＧ抗体のＰＶＲＩＧレポーター遺伝子細胞における活性検査結果である。

【図2】ＮＫ細胞殺傷実験においてＮＫ細胞を活性化する抗ＰＶＲＩＧ抗体の活性検出結果である。

【図3】ＭＬＲ実験においてＴ細胞を活性化する抗ＰＶＲＩＧ抗体の活性検出結果である。

【図4】図４Ａ～４Ｂは、ヒト化された抗ＰＶＲＩＧ抗体のＰＶＲＩＧレポーター遺伝子細胞における活性検出結果である。

【図5】図５Ａ～５Ｂは、ＮＫ細胞殺傷実験においてＮＫ細胞を活性化するヒト化された抗ＰＶＲＩＧ抗体の活性検出結果である。

【図6】図６Ａ～６Ｅは、ヒト化された抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の、ヒトＰＶＲＩＧ組換えタンパク質、ヒトＰＶＲＩＧ過剰発現細胞、カニクイザルＰＶＲＩＧ組換えタンパク質、カニクイザルＰＶＲＩＧ過剰発現細胞への結合活性、及びヒトＰＶＲＩＧとヒトＰＶＲＬ２の結合への遮断活性の検出結果をそれぞれ示す。

【図7】図７Ａ～７Ｅは、ヒト化された抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の、ヒトＴＩＧＩＴ組換えタンパク質、ヒトＴＩＧＩＴ過剰発現細胞、カニクイザルＴＩＧＩＴ組換えタンパク質、カニクイザルＴＩＧＩＴ過剰発現細胞への結合活性、及びヒトＴＩＧＩＴとヒトＰＶＲの結合への遮断活性の検出結果をそれぞれ示す。

【図8】ＭＬＲ実験においてＴ細胞を活性化するヒト化された抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の活性検出結果である。

【図9】図９Ａ～９Ｂは、ヒト黒色腫Ａ３７５にヒトＰＢＭＣを混合したマウス皮下移植腫瘍モデルにおける、マウスの体重及び腫瘍体積に対する抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の影響をそれぞれ示す。

【図10】図１０Ａ～１０Ｂは、ヒト黒色腫Ａ３７５にヒトＰＢＭＣを混合したマウス皮下移植腫瘍モデルにおける、マウスの体重及び腫瘍体積に対する抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の影響をそれぞれ示す。

【発明を実施するための形態】

【0106】

用語
本開示がさらに容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を具体的に定義する。本明細書で特に明確な定義のない限り、本明細書に使用される他の技術・科学用語の全ては、当業者に一般的に理解されている意味を持っている。

【0107】

本開示に用いられるアミノ酸の３文字コード及び１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ，２４３，ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。

【0108】

「ＰＶＲＩＧ」又は「ＰＶＲＩＧタンパク質」又は「ＰＶＲＩＧポリペプチド」は、本明細書に記載の既知又は野生型ＰＶＲＩＧ、及び任意の天然に産生したスプライス変異体、アミノ酸変異体又はアイソフォーム、特にＰＶＲＩＧの可溶性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）断片を含む（が、これらに限定されない）任意のこのようなタンパク質又はその変異体、結合体若しくは断片を任意選択的に含んでもよい。ここで、ＥＣＤの定義は、特許ＷＯ２０１６１３４３３３に記載された通りである。完全なヒトＰＶＲＩＧ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＨ７３８６１．１で見出すことができる。

【0109】

「ＴＩＧＩＴ」又は「ＴＩＧＩＴタンパク質」又は「ＴＩＧＩＴポリペプチド」は、本明細書に記載の既知又は野生型ＴＩＧＩＴ、及び任意の天然に産生したスプライス変異体、アミノ酸変異体又はアイソフォームを含む（が、これらに限定されない）任意のこのようなタンパク質又はその変異体、結合体若しくは断片を任意選択的に含んでもよい。完全なＴＩＧＩＴ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＩ０１２８９．１で見出すことができる。

【0110】

「ＰＶＲＩＧに結合する」とは、ＰＶＲＩＧ又はそのエピトープと相互作用できることを意味し、上記ＰＶＲＩＧ又はそのエピトープは、ヒト由来であってもよい。

【0111】

「ＴＩＧＩＴに結合する」とは、ＴＩＧＩＴ又はそのエピトープと相互作用できることを意味し、上記ＴＩＧＩＴ又はそのエピトープは、ヒト由来であってもよい。

【0112】

「抗原結合部位」とは、抗原における連続的又は非連続的な、本開示の抗体により認識される３次元空間部位である。

【0113】

「抗体」又は「免疫グロブリン」は、最も広義に使用され、かつ種々の抗体構造をカバーし、従来の抗体（２つの重鎖と２つの軽鎖が鎖間ジスルフィド結合によって連結されてなるテトラペプチド鎖構造抗体）、及び抗原結合活性を有するＦａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２、線形抗体、単鎖抗体、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、ペプチド抗体ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ、ドメイン抗体（重鎖（ＶＨ）抗体、軽鎖（ＶＬ）抗体）及び多重特異性抗体（二重特異性抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙとｔｅｔｒａｂｏｄｙ、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ）を含むが、これらに限定されない。

【0114】

本開示に使用される「抗体」という用語は、全長抗体、その単一の鎖、及びその抗原結合活性を有する任意の部分（即ち、抗原結合断片）、ドメイン又は断片、並びにその単一の鎖と、抗原結合活性を有する任意の部分、ドメイン又は断片とを含む多重特異性抗体（抗原結合ドメイン又は断片、例えば、ＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメインを含むが、これらに限定されない）をカバーしようとする。従来の抗体又は免疫グロブリンは、通常、２つの同じ重鎖及び２つの同じ軽鎖が鎖間ジスルフィド結合によって連結されてなるテトラペプチド鎖構造である。重鎖定常領域のアミノ酸組成及び配列順序によって、免疫グロブリンは、５種類に分けられ、又はＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥという免疫グロブリンのアイソタイプと呼ばれてもよく、その対応する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同一種類のＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成及び重鎖ジスルフィド結合の数と位置の違いによって、さらに異なるサブクラスに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けることができる。軽鎖は、定常領域の違いによって、κ鎖又はλ鎖に分けられる。５種類のＩｇのそれぞれは、何れもκ（ｋａｐｐａ）鎖又はλ（ｌａｍｂｄａ）鎖を有してもよい。幾つかの実施形態において、本開示の抗体は、ＰＶＲＩＧ及び／又はＴＩＧＩＴに特異的に結合する。

【0115】

本開示の「抗原結合断片」は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）２つのドメインが結合して抗原結合部位を形成することを可能にする、ペプチドリンカーによってそのうちのＶＨドメインとＶＬドメインを連結した単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：５８７９－５８８３）２４２で、援用により本明細書に完全に組み込まれている）、（ｉｖ）遺伝子融合によって構築された多価又は多重特異性断片である「二機能性抗体」又は「三機能性抗体」（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２６：４６１－４７９、ＷＯ９４／１３８０４、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ ９０：６４４４－６４４８で、全て援用により本明細書に完全に組み込まれている）、（ｖ）齧歯動物（例えば、ＷＯ００／２９００４に開示されたもの）、ナースシャークなどの他の種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメイン及びラクダ科Ｖ－ＨＨ ｄＡｂを含む「ドメイン抗体」又は「ｄＡｂ」（「免疫グロブリン単一可変ドメイン」と呼ばれる場合がある）、（ｖｉ）ＳＭＩＰ（小分子免疫薬）、ラクダ抗体、ナノボディ及びＩｇＮＡＲ、（ｖｉｉ）上記（ｉ）～（ｖｉ）のヒト化抗体を含むが、これらに限定されない。

【0116】

特に明記されていない場合、本開示の抗体は、通常、Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用する。ＫａｂａｔにおけるＥＵ番号は、一般的に定常ドメイン及び／又はＦｃドメインにも使用される。

【0117】

「二重特異性抗体」という用語は、２つの異なる抗原又は同じ抗原の２つの異なる抗原エピトープに特異的に結合可能な抗体を指す。従来技術には、種々の構造の二重特異性抗体が開示されている。ＩｇＧ分子の完全性によって、ＩｇＧ様二重特異性抗体と抗体断片型二重特異性抗体に分けることができる。抗原結合領域の数によって、２価、３価、４価又はそれ以上の二重特異性抗体に分けることができる。構造が左右対称であるか否かによって、対称構造の二重特異性抗体と非対称構造の二重特異性抗体に分けることができる。ここで、抗体断片に基づく二重特異性抗体、例えば、Ｆｃ断片を欠くＦａｂ断片は、２つ又は複数のＦａｂ断片を１つの分子内で結合することにより、低い免疫原性を有し、分子量が小さく、高い腫瘍組織透過性を有する二重特異性抗体を形成する。当該タイプの典型的な抗体構造は、例えば、Ｆ（ａｂ）２、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ、（ｓｃＦｖ）２－Ｆａｂなどの二重特異性抗体、ＩｇＧ様二重特異性抗体（例えば、Ｆｃ断片を有する）である。このような抗体は、分子量が比較的大きく、Ｆｃ断片が抗体の後期精製に寄与し、かつその溶解性、安定性を向上させる。Ｆｃ部分は、また、受容体ＦｃＲｎに結合して、抗体の血清半減期を増加させることが可能である。例えば、典型的な二重特異性抗体の構造モデルは、例えば、ＶＨＨ－ＩｇＧ、ＫｉＨ、ＣｒｏｓｓＭＡｂ、Ｔｒｉｏｍａｂ ｑｕａｄｒｏｍａ、ＦｃΔＡｄｐ、ＡＲＴ－Ｉｇ、ＢｉＭＡｂ、Ｂｉｃｌｏｎｉｃｓ、ＢＥＡＴ、ＤｕｏＢｏｄｙ、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ、ＸｍＡｂ、２：１ ＴＣＢｓ、１Ｆａｂ－ＩｇＧ ＴＤＢ、ＦｙｎｏｍＡｂ、ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ／ＤＡＦ、ｓｃＦｖ－Ｆａｂ－ＩｇＧ、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ＬＰ－ＤＡＲＴ、ＣＯＤＶ－Ｆａｂ－ＴＬ、ＨＬＥ－ＢｉＴＥ、Ｆ（ａｂ）２－ＣｒｏｓｓＭＡｂ、ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）２、Ｂｓ４Ａｂ、ＤＶＤ－Ｉｇ、Ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ－ＤＡＲＴ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）４－Ｆｃ、ＣＯＤＶ－Ｉｇ、ｍＡｂ２、Ｆ（ａｂ）４－ＣｒｏｓｓＭＡｂなどの二重特異性抗体である（Ａｒａｎ Ｆ． Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｖｏｌｕｍｅ １８，ｐａｇｅｓ５８５－６０８（２０１９）、Ｃｈｅｎ Ｓ１ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ． ２０１９ Ｆｅｂ １１、２０１９：４５１６０４１を参照）。

【0118】

本開示に係る抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、異種、同種異系、同系又はその修飾された形態であってもよく、そのうち、モノクローナル抗体は、特に複数の実施例に適用される。一般的に、本開示に係る抗体は組換え抗体である。本明細書に使用される「組換え」は、例えば細胞又は核酸、タンパク質又はベクターなどの製品を広義に指し、上記細胞、核酸、タンパク質又はベクターが既にヘテロ核酸又はタンパク質を導入したり、天然の核酸又はタンパク質を改変したりすることで修飾され、或いは上記細胞がこのように修飾された細胞に由来することを表す。例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）細胞形態に存在しない遺伝子を発現し、或いは元々異常に発現され、低発現されるか又は完全に発現されていない天然遺伝子を発現する。

【0119】

「モノクローナル抗体」は、単一のＢ細胞クローンによって産生され、特定の抗原エピトープと相互作用することができる抗体分子集団を指す。一方、「ポリクローナル抗体」は、複数のＢ細胞クローンによって産生され、特定の抗原と相互作用することができる抗体分子集団を指す。モノクローナル抗体は、典型的に、それと相互作用する特定の抗原に対して単一の結合親和性を示す。

【0120】

本明細書において、抗原は、より広義に定義され、かつ一般的に、抗体によって特異的に認識される標的分子を含むことを意図する。従って、抗体を産生するための免疫化プロセス、又は抗体のライブラリースクリーニングに使用される分子又は模倣体を含む。

【0121】

「相同性」又は「同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド間の配列の類似性を指す。２つの比較される配列における位置が何れも同じ塩基又はアミノ酸残基に占められる場合、２つのＤＮＡ分子の１つの位置がアデニンに占められると、上記分子は当該位置で相同である。２つの配列間の同一性百分率は、２つの配列の共有するマッチング又は相同位置数を比較される位置数で割って１００％をかける関数である。例えば、配列が最適にアラインメントされる場合、２つの配列における１０個の位置のうち６個がマッチングするか又は相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一般的に、２つの配列をアラインメントして最大の相同性百分率が得られる場合に比較する。

【0122】

ポリペプチド又はタンパク質の「ドメイン」は、タンパク質の他の部分から独立してその三次構造を維持できる折り畳みタンパク質構造を指す。一般的に、ドメインは、タンパク質の単一の機能特性を担い、かつ多くの場合に、タンパク質の他の部分及び／又はドメインの機能を失うことなく、付加され、除去され、又は他のタンパク質に移されてもよい。

【0123】

「免疫グロブリンドメイン」は、抗体鎖の球形領域を指すか、又は基本的にこのような球形領域で構成されたポリペプチドを指す。幾つかの実施形態において、「抗原結合ドメイン」の非限定的な実例は、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、全長抗体などを含む。

【0124】

「免疫グロブリン可変ドメイン」は、基本的に、「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」、「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」から構成される免疫グロブリンドメインを指す。従って、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造又は配列は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４と示されてもよい。免疫グロブリン可変ドメインは、抗原結合部位を有するため、抗原に対する特異性が付与される。

【0125】

「抗体フレームワーク（ＦＲ）」とは、可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のステントとして使用される可変ドメインの一部を指す。

【0126】

ＣＤＲについての確定又は定義は、抗体の構造を解明し、及び／又は抗体－リガンド複合物の構造を解明することにより、ＣＤＲについての確実な描写又は結合部位の残基についての同定を達成することができる。これは、当業者に知られている種々の技術の何れか１つ、例えば、Ｘ線結晶学により実現することができる。種々の分析方法は、ＣＤＲの同定に使用することができ、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム、ＡｂＭ番号付けシステム、ＩＭＧＴ番号付けシステム、接触定義、立体配座定義を含むが、これらに限定されない。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、抗体における残基に番号を付けるための基準であり、一般的にＣＤＲ領域の同定に使用される（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ，２０００，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１４－８を参照）。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムと類似するが、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムは、ある構造ループ領域の位置を考慮に入れた。（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１－１７、及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７－８３を参照）。ＡｂＭ番号付けシステムは、抗体構造をモデリングしたＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ製のコンピュータプログラム統合スイートを使用する（例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８６：９２６８－９２７２、「ＡｂＭＴＭ，Ａ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ ＭｏｄｅｌｉｎｇＶａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄを参照）。ＡｂＭ番号付けシステムは、知識データベース及びａｂ ｉｎｉｔｉｏ法の組み合わせを用いて、基本配列から抗体の三次構造をモデリングする（Ｓａｍｕｄｒａｌａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．，３：１９４－１９８における「Ａｂ Ｉｎｉｔｉｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」に記載されたものを参照）。接触定義は、利用できる複雑な結晶構造の分析に基づくものである（例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：７３２－４５を参照）。立体配座の定義において、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー（ｅｎｔｈａｌｐｙ）的寄与をする残基として同定することができる（例えば、Ｍａｋａｂｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８３：１１５６－１１６６を参照）。なお、他のＣＤＲの境界の定義は、上記の方法の１つに厳密に従わない場合があるが、特定の残基又は残基群が抗原結合に顕著に影響しないという予測又は実験の結果によって、それらは短縮又は延長可能であるとはいえ、依然としてＫａｂａｔ ＣＤＲの少なくとも一部と重複する。本明細書に使用されるように、ＣＤＲは、当分野で知られている任意の方法（方法の組み合わせを含む）により定義されたＣＤＲを指すことができる。本明細書に使用される方法は、これらの方法の何れか１つにより定義されたＣＤＲを用いることができる。ＣＤＲを１つよりも多く含む任意の所定の実施例においては、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、伸長、ＡｂＭ、ＩＭＧＴ、接触及び／又は立体配座定義の何れか１つによりＣＤＲを定義することができる。

【0127】

「免疫グロブリン単一可変ドメイン」は、通常、他の可変ドメインと相互作用しない場合（例えば、通常の４本鎖抗体中のＶＨとＶＬドメインの間に必要なＶＨ／ＶＬ相互作用がない場合）に機能的抗原結合部位を形成することができる免疫グロブリン可変ドメイン（重鎖ドメイン又は軽鎖ドメインであってもよく、ＶＨ、ＶＨＨ又はＶＬドメインを含む）を指すために使用される。「免疫グロブリン単一可変ドメイン」の実例は、ナノボディ（ＶＨＨ、例えば、ヒト化ＶＨＨ及び／又はラクダ化ヒトＶＨなどのラクダ化ＶＨを含む）、ＩｇＮＡＲ、ドメイン、ＶＨドメインとしての又はＶＨドメインに由来する（単一ドメイン）抗体（例えば、ｄＡｂｓ^ＴＭ）及びＶＬドメインとしての又はＶＬドメインに由来する（単一ドメイン）抗体（例えばｄＡｂｓ^ＴＭ）を含む。重鎖可変ドメイン（例えば、ＶＨ又はＶＨＨドメイン）に基づく及び／又は由来する免疫グロブリン単一可変ドメインは、通常好ましい。免疫グロブリン単一可変ドメインの一具体的な実例としては、下記のように定義される「ＶＨＨドメイン」（又は、「ＶＨＨ」と略称）である。

【0128】

「ＶＨＨドメイン」は、重鎖単一ドメイン抗体、ＶＨＨ、ＶＨＨ抗体断片、ＶＨＨ抗体、ナノボディとも呼ばれ、「重鎖抗体」（即ち、「軽鎖を欠く抗体」）と呼ばれる抗原結合免疫グロブリンの可変ドメインである（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ，Ａｔａｒｈｏｕｃｈ Ｔ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｇ，Ｈａｍｅｒｓ Ｃ，Ｓｏｎｇａ ＥＢ，Ｂｅｎｄａｈｍａｎ Ｎ，Ｈａｍｅｒｓ Ｒ．：“Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ”、Ｎａｔｕｒｅ３６３，４４６－４４８（１９９３））。「ＶＨＨドメイン」という用語は、上記可変ドメインを通常のテトラペプチド鎖構造抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本開示において「ＶＨドメイン」と呼ばれる）及び軽鎖可変ドメイン（本開示において「ＶＬドメイン」と呼ばれる）と区別するために使用される。ＶＨＨドメインは、他の抗原結合ドメインを必要とすることなく、エピトープに特異的に結合する（通常のテトラペプチド鎖構造抗体におけるＶＨ又はＶＬドメインとは異なり、この場合、エピトープは、ＶＬドメインとＶＨドメインの両方によって認識される）。ＶＨＨドメインは、単一免疫グロブリンドメインで形成された小さくて安定的な抗原認識ユニットである。「重鎖単一ドメイン抗体」、「ＶＨＨドメイン」、「ＶＨＨ」、「ＶＨＨドメイン」、「ＶＨＨ抗体断片」、「ＶＨＨ抗体」（「Ｎａｎｏｂｏｄｙ」はＡｂｌｙｎｘ Ｎ．Ｖ．社、Ｇｈｅｎｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍの商標である）という用語は、互換的に使用されてもよい。「ＶＨＨドメイン」は、ラクダ科動物により産生された天然抗体を含むが、これに限定されず、ラクダ科動物により抗体を産生した後にヒト化したものであってもよく、ファージディスプレイ技術によりスクリーニングしたものであってもよい。

【0129】

ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインについて当分野で知られているように、各ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の総数は、異なる可能性があり、かつＫａｂａｔ番号で示されるアミノ酸残基の総数に対応しない可能性がある（即ち、Ｋａｂａｔ番号に基づく１つ又は複数の位置は、実際の配列において占められていない可能性があり、又は実際の配列にＫａｂａｔ番号の許容する数よりも多いアミノ酸残基を含む可能性がある）。これは、一般的に、Ｋａｂａｔに基づく番号は、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際の番号に対応するか又は対応しない可能性があることを意味する。ＶＨＨに適用可能な他の番号付けシステム又は番号付け規則は、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭを含む。

【0130】

ＶＨＨドメインにおけるアミノ酸残基の総数は、通常１１０～１２０の範囲であり、１１２～１１５の間にある場合が多い。しかし、小さい配列及び長い配列も本開示に記載の目的に適合することができると留意すべきである。

【0131】

ＶＨＨドメイン（単独又は大きいポリペプチドの一部として）は、通常のＶＨ及びＶＬドメイン、ｓｃＦｖ又は通常の抗体断片（例えば、Ｆａｂ－又はＦ（ａｂ’）２－断片）を使用する場合よりも優れた顕著な利点を多く提供する：
－単一ドメインによって高親和性及び高選択性で抗原に結合するだけでよく、２つの単独のドメインが存在する必要がなく、当該２つのドメインが適切な空間立体配座及び配置で存在することを確保する必要もない（例えば、ｓｃＦｖは、一般的に特に設計されたリンカーを使用する必要がある）こと、
－ＶＨＨドメインは、単一の遺伝子によって発現可能であり、かつ翻訳後に折り畳みや修飾をする必要がないこと、
－ＶＨＨドメインは、多価及び多特異的フォーマットに改変することができること、
－ＶＨＨドメインは、可溶性が高くて凝集傾向がないこと、
－ＶＨＨドメインは、熱、ｐＨ、プロテアーゼ及び変性剤に対して高度に安定的であるため、調製、貯蔵又は輸送中に、冷凍機器への依存を低減し、コストや時間の節約及び環境を達成することができること、
－ＶＨＨドメインは、調製しやすく、比較的安く、さらには生産に必要な規模でも同様であること、
－ＶＨＨドメインは、通常のテトラペプチド鎖構造抗体及びその抗原結合断片と比べ、比較的小さい（約１５ ｋＤａ又は大きさが通常のＩｇＧの１／１０）ため、通常のテトラペプチド鎖構造抗体及びその抗原結合断片と比べ、高い組織浸透性を示し、かつ高用量で投与することができること、及び
－ＶＨＨドメインは、所謂キャビティ結合特性（特に、通常のＶＨドメインと比べ、その延長されたＣＤＲ３ループのため）を示すことができるので、通常のテトラペプチド鎖構造抗体及びその抗原結合断片が到達できない標的及びエピトープに到達することができること。

【0132】

特定の抗原又はエピトープに結合するＶＨＨを得る方法は、この前にＲ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４０（２０００）１８５－１９５、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８７（２０１２）１３７１３－１３７２１、Ｄｅｆｆａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８（１２），ｐｐ．２６４５－２６５２，１７ Ｊｕｎｅ，２００９及びＷＯ９４／０４６７８という文献に開示された。

【0133】

「Ｆｃ変異体」又は「変異体Ｆｃ」は、Ｆｃドメインにアミノ酸修飾が含まれるタンパク質を指す。本開示のＦｃ変異体は、それを構成するアミノ酸修飾に基づいて定義される。従って、例えば、Ｓ２２８Ｐ又は２２８Ｐは、親Ｆｃポリペプチドに対して２２８位にプロリン置換を有するＦｃ変異体であり、ここで、番号はＥＵインデックスに基づくものである。ＷＴアミノ酸は明示されなくてもよく、この場合、上記変異体は２２８Ｐと呼ばれる。

【0134】

「ヒト化」の例としては、ラクダ科に由来するＶＨＨドメインを、ヒトの通常のテトラペプチド鎖構造抗体のＶＨドメインにおける対応する位置に存在する１つ又は複数のアミノ酸残基で、元のＶＨＨ配列のアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸残基を置換することで、「ヒト化」を実現することができることを含む。本開示において「配列最適化」とも呼ばれ、「配列最適化」は、ヒト化以外に、潜在的な翻訳後の修飾部位の除去などの、ＶＨＨの改善された特性を与える１つ又は複数の変異によって配列に加えられた他の修飾を含んでもよい。ヒト化ＶＨＨドメインは、１つ又は複数の完全ヒトフレームワーク領域配列を含んでもよく、かつ幾つかの具体的な実施形態において、ＩＧＨＶ３のヒトフレームワーク領域配列を含んでもよい。「ヒト化」のさらなる例は、マウスのＣＤＲ配列をヒトの抗体の可変領域フレームワーク、即ち、異なるタイプのヒト生殖細胞系列抗体のフレームワーク配列に移植して産生した抗体を含む。キメラ抗体が大量の異種タンパク質成分を持っていることにより誘導された強い抗体可変抗体反応を克服することができる。ヒト化方法としては、例えば、タンパク質表面アミノ酸のヒト化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）及びＣＤＲを他の「ステント」（ヒトステント又は非免疫グロブリンステントを含むが、これらに限定されない）に「移植」する抗体ヒト化ユニバーサルフレームワーク移植法（ＣＤＲ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｔｏ ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）である。上記ＣＤＲ移植に適するステント及び技術は、当分野で既知のものである。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベースにおいて、及びＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．、１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎにおいて見出すことができる。本開示のヒト化抗体は、さらにファージで提示される、ＣＤＲに対して親和性成熟を行ったヒト化抗体も含む。また、免疫原性の低下に伴う活性の低下を回避するために、上記ヒト抗体可変領域フレームワーク配列に対して最も少ない逆変異又は復帰変異を行うことにより、活性を保つことができる。

【0135】

「親和性成熟」の抗体は、１つ又は複数のＣＤＲにおいて１つ又は複数の変化を有し、上記変化により、抗原への親和性がそれぞれの親抗体と比べて増加する。親和性成熟の抗体は、例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９－７８３又はＢａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９１：３８０９－３８１３．、Ｓｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ １６９：１４７－１５５、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４－２００４、Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０－９、及びＨａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２６（３）：８８９８９６、ＫＳ Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＲＥ Ｈａｗｋｉｎｓ，「Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ」，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９６に記載された当分野で既知の方法によって調製することができる。

【0136】

通常、本開示の抗体は、Ｂｉａｃｏｒｅ又はＫｉｎＥｘＡ又はＦｏｒｔｉｂｉｏアッセイにおいて測定された、好ましくは１０^－７～１０^－１０モル／リットル（Ｍ）、より好ましくは１０^－８～１０^－１０モル／リットル、さらに好ましくは１０^－９～１０^－１０又はそれ以下の解離定数（ＫＤ）、及び／又は少なくとも１０^－７ Ｍ、好ましくは少なくとも１０^－８ Ｍ、より好ましくは少なくとも１０^－９ Ｍ、さらに好ましくは少なくとも１０^－１０ Ｍの会合定数（ＫＡ）で結合しようとする抗原（即ち、ＰＶＲＩＧ）に結合する。１０^－４ Ｍよりも大きい任意のＫＤ値は、一般的に非特異的結合を示すと見なされる。抗体の抗原又はエピトープへの特異的結合は、例えば、本開示に記載の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、Ｓｃａｔｃｈａｒｄアッセイ及び／又は競合結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイを含む既知の任意の適切な方法によって測定することができる。

【0137】

「エピトープ」又は互換的に使用可能な「抗原決定基」は、抗体が結合する抗原上の任意の部分を指す。抗原決定基は、通常、例えば、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的活性表面基を含み、かつ、通常、特定の３次元構造特性及び特定の電荷特性を有する。例えば、エピトープは、通常、独特な空間立体配座で少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５個の連続又は非連続のアミノ酸を含み、「線状」エピトープ又は「立体配座」エピトープであってもよい。線状エピトープにおいて、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）の間における全ての相互作用部位は、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状で存在する。立体配座エピトープにおいて、相互作用する位置は、互いに離れたアミノ酸残基にある。当分野でよく知られている多くのエピトープマッピング技術により所定の抗原のエピトープを同定することができる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６６巻，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６），ＵＳ４７０８８７１）。当業者に知られている通常の技術により、同じエピトープに対する結合で抗体を競合的にスクリーニングすることができる。例えば、競合及び交差競合研究を行うことにより、抗原への結合について互いに競合するか又は交差競合する抗体を得ることができる（ハイスループットスクリーニング方法は、例えばＷＯ０３／４８７３１を参照する）。従って、当業者に知られている通常の技術により、ＰＶＲＩＧ上の同じエピトープに本開示の抗体分子と競合的に結合する抗体及びその抗原結合断片を得ることができる。

【0138】

「特異的結合」、「選択的結合」は、抗体と所定の抗原上のエピトープへの結合を指す。通常、組換えヒトＰＶＲＩＧ、ＴＩＧＩＴ又はそのエピトープを分析物として使用するとともに抗体をリガンドとして使用し、機器において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって測定する場合、抗体は、約１０^－７ Ｍ未満又はそれ以下の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）で所定の抗原又はそのエピトープに結合し、かつ所定の抗原又はそのエピトープへの結合親和性が、所定の抗原（又はそのエピトープ）又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡなど）への結合親和性の少なくとも２倍である。「抗原を認識する抗体」は、本明細書において「特異的に結合する抗体」と互換的に使用されてもよい。

【0139】

「結合親和性」は、本明細書において２つの分子（例えば、抗体又はその一部及び抗原）の間の非共有相互作用の強度の目安として使用され、一価相互作用（固有活性）を説明するために使用される。２つの分子間の結合親和性は、解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定することで定量化することができる。例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）方法（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して複合物の形成及び解離の動態を測定することでＫ_Ｄを決定することができる。一価複合物の結合及び解離に対応する速度定数は、それぞれ結合速度定数ｋａ（又はｋｏｎ）及び解離速度定数ｋｄ（又はｋｏｆｆ）と呼ばれる。Ｋ_Ｄは、Ｋ_Ｄ＝ｋｄ／ｋａという方程式によりｋａ及びｋｄに関連する。解離定数の値は、公知の方法によって直接決定することができる（Ｃａｃｅｃｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｂｙｔｅ ９：３４０－３６２、Ｗｏｎｇ＆Ｌｏｈｍａｎ，１９９３，ＰＮＡＳ ９０：５４２８－５４３２を参照）。標的抗原に対する抗体の結合能力を評価する他の標準的なアッセイは、当分野で知られているものであり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡとフローサイトメトリー分析、及び本明細書の他の箇所に挙げられた他のアッセイを含む。これと類似し、相互作用の特異性は、標的相互作用（例えば、抗体と抗原の間の特異的相互作用）のＫ_Ｄ値と非標的相互作用（例えば、ＰＶＲＩＧに結合しない既知の対照抗体）のＫ_Ｄ値を決定して比較することで評価することができる。幾つかの実施形態において、本開示の抗ＰＶＲＩＧ抗体のその標的に結合可能な親和性は、ＰＶＲＩＧではない他の分子に結合する親和性よりも少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍又は１０，０００倍大きいが、ここでの定義は限定的なものではない。

【0140】

「保存的修飾」は、アミノ酸及びヌクレオチド配列に適用される。特定のヌクレオチド配列について、保存的修飾は、同じ又は基本的に同じアミノ酸配列をコードするような核酸の相互置換を指し、或いはヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合、基本的に同じヌクレオチド配列を指す。アミノ酸配列について、保存的修飾は、タンパク質の生物学的活性を変えずにアミノ酸配列を頻繁に変更することができるように、類似の特徴（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、主鎖の立体配座及び剛性など）を有する他のアミノ酸でタンパク質におけるアミノ酸を置換することを指す。当業者に知られているように、一般的に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換によって、基本的に生物学的活性を変えることはない（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，２２４ページ，（４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照）。

【0141】

「アミノ酸変異」は、最終構築体が補強された安定性、向上した活性などの所望の特性を有するように、最終構築体を実現するために、アミノ酸の置換、欠失、挿入、修飾及びそれらの任意の組み合わせを含む。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端での欠失及び挿入を含む。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、抗ＰＶＲＩＧ抗体の結合特性を変えるために、非保存的アミノ酸を置換し、即ち、１つのアミノ酸を異なる構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置換することができる。好ましいアミノ酸置換は、親水性アミノ酸で疎水性アミノ酸を置換することを含む。アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸又は２０種の標準的なアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）による置換を含む。アミノ酸変異は、部位特異的変異導入、ＰＣＲ、遺伝子合成、化学修飾などの方法を含むこの分野で公知の遺伝学的又は化学的方法により生成することができる。アミノ酸変異は、抗体のＣＤＲ領域、ＦＲ領域又はＦｃ領域で発生することができる。

【0142】

本開示の工学的な抗体又は抗原結合断片は、通常の方法により調製・精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列は、クローニングして発現ベクターに組換えることができる。組換えた免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定的にトランスフェクションすることができる。哺乳動物類の発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存的なＮ末端において、抗体のグリコシル化を引き起こすことになる。ヒト抗原に特異的に結合する抗体を発現することにより、安定的なクローンが得られる。陽性のクローンは、バイオリアクターの無血清培地において培養を拡大することで、抗体を産生する。抗体が分泌された培養液は、通常の技術により精製して収集することができる。抗体は、通常の方法によりろ過濃縮することができる。可溶性の混合物及び多量体は、分子ふるい、イオン交換などの通常の方法により除去されてもよい。得られた生成物は、直ちに－７０℃などで冷凍し、又は凍結乾燥しなければならない。

【0143】

「任意選択的」又は「任意選択的に」とは、その後に説明される事象又は状況が生じてもよいが、生じなくてもよいことを意味し、この説明は、当該事象又は状況が生じる場合と生じない場合を含む。例えば、「任意選択的に１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしも存在しなくてもよいことを意味する。

【0144】

「医薬組成物」は、１種又は複数種の本明細書に記載の抗体（例えば、抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体）又はその生理学的／薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグと、他の化学成分とを含む混合物を指し、ここで、他の成分の例は、例えば、生理学的／薬学的に許容されるベクター及び賦形剤である。医薬組成物は、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与してさらに生物活性を発揮するためのものである。

【0145】

「薬学的に許容されるベクター」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と組み合わせる場合に、当該成分が生物学的活性を保つことを許容するとともに、対象の免疫系と反応しない任意の材料を含む。例としては、任意の標準的な薬剤ベクター、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、及び種々の湿潤剤などを含むが、これらに限定されない。幾つかの実施例において、非経口投与に用いられる希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は生理（０．９％）食塩水である。このようなベクターを含む組成物は、周知の通常方法により調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０、及びＲ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００を参照）。

【0146】

「緩衝剤」は、その酸－塩基共役成分の作用によりｐＨの変化を調節する緩衝剤を指す。ｐＨを適当な範囲に制御する緩衝剤の例は、酢酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン、シュウ酸塩、乳酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グリシルグリシン及び他の有機酸緩衝剤を含む。

【0147】

「ヒスチジン緩衝剤」は、ヒスチジンを含む緩衝剤である。ヒスチジン緩衝剤の実例は、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン、ヒスチジン－酢酸ヒスチジン、ヒスチジン－リン酸ヒスチジン、ヒスチジン－硫酸ヒスチジンなどの緩衝剤を含み、好ましくはヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤である。ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝剤は、ヒスチジン及び塩酸から調製され、又はヒスチジン及び塩酸ヒスチジンから調製されてもよい。

【0148】

「酢酸塩緩衝剤」は、酢酸イオンを含む緩衝剤である。酢酸塩緩衝剤の実例は、酢酸－酢酸ナトリウム塩、ヒスチジン－酢酸ヒスチジン、酢酸－酢酸カリウム、酢酸－酢酸カルシウム、酢酸－酢酸マグネシウムなどを含む。好ましい酢酸塩緩衝剤は、酢酸－酢酸ナトリウム塩である。

【0149】

「クエン酸塩緩衝剤」は、クエン酸イオンを含む緩衝剤である。クエン酸塩緩衝剤の実例は、クエン酸－クエン酸ナトリウム、クエン酸－クエン酸カリウム、クエン酸－クエン酸カルシウム、クエン酸－クエン酸マグネシウムなどを含む。好ましいクエン酸塩緩衝剤は、クエン酸－クエン酸ナトリウムである。

【0150】

「コハク酸塩緩衝剤」は、コハク酸イオンを含む緩衝剤である。コハク酸塩緩衝剤の実例は、コハク酸－コハク酸ナトリウム塩、コハク酸－コハク酸カリウム、コハク酸－コハク酸カルシウム塩などを含む。好ましいコハク酸塩緩衝剤は、コハク酸－コハク酸ナトリウム塩である。例示的に、上記コハク酸－コハク酸ナトリウムは、コハク酸及び水酸化ナトリウムにより調製され、又はコハク酸及びコハク酸ナトリウム塩により調製されてもよい。

【0151】

「リン酸塩緩衝剤」は、リン酸イオンを含む緩衝剤である。リン酸塩緩衝剤の実例は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム－クエン酸などを含む。好ましいリン酸塩緩衝剤は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウムである。

【0152】

「凍結乾燥製剤」は、液体若しくは溶液形態の医薬組成物又は液体若しくは溶液製剤に対して凍結乾燥ステップを行った後に得られた製剤又は医薬組成物を示す。

【0153】

本開示に記載の医薬組成物は、安定的な効果を達成することができ、即ち、その中の抗体（例えば、抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体）が貯蔵後に基本的にその物理的安定性及び／又は化学的安定性及び／又は生物学的活性を保持している医薬組成物である。好ましくは、医薬組成物は、貯蔵後にその物理的と化学的安定性、及びその生物学的活性を基本的に保持している。貯蔵期間は、一般的に医薬組成物の所定の保存期間に基づいて選択される。現在、タンパク質の安定性を測定する分析技術が複数種あり、所定の温度で、所定の期間貯蔵した後の安定性を測定することができる。

【0154】

安定した製剤は、冷蔵温度（２～８℃）で少なくとも３ヶ月、好ましくは６ヶ月、より好ましくは１年間、さらに好ましくは２年間も保存した場合に統計的に有意な変化が認められない製剤を含む。

【0155】

また、安定した液体製剤は、２５℃を含む温度で１ヶ月、３ヶ月又は６ヶ月を含む期間保存した後、所望の特徴を示している液体製剤も含む。安定性の典型的な例としては、ＳＥＣ－ＨＰＬＣにより、凝集又は分解を発生した抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体が通常、約１０％を超えず、好ましくは約５％を超えないことが測定される。視覚的分析によると、製剤は、淡黄色でほぼ無色透明な液体又は無色透明な液体であり、或いは清澄からやや乳白色である。上記製剤の濃度、ｐＨ及び重量モル浸透圧濃度は、±１０％を超えない変化を有する。通常、約１０％を超えず、好ましくは約５％を超えない減少が認められる。通常、約１０％を超えず、好ましくは約５％を超えない凝集が形成される。

【0156】

幾つかの実施形態において、本開示の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体製剤は、４０℃の高温条件下で１ヶ月間放置し、ＳＥＣモノマー％が９５％以上（例えば、９５％よりも大きく、９６％よりも大きく、９７％よりも大きく、９８％よりも大きく又は９９％よりも大きい）であり、及び／又はＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）％が９５％以上（例えば、９５％よりも大きく、９６％よりも大きく、９７％よりも大きく、９８％よりも大きく又は９９％よりも大きい）である。

【0157】

色及び／又は清澄度を目視で検査したところ、又はＵＶ光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）及び動的光散乱（ＤＬＳ）により測定したところ、抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体が顕著な凝集の増加、沈殿及び／又は変性を示さない場合、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、医薬製剤において「その物理的安定性を保持している」とする。タンパク質の立体配座の変化は、蛍光分光法（タンパク質の三次構造を確定するもの）により、及びＦＴＩＲ分光法（タンパク質の二次構造を確定するもの）により評価することができる。

【0158】

抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体が顕著な化学的変化を示さない場合、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、医薬製剤において「その化学的安定性を保持している」とする。化学的安定性は、化学的に形態が変化されたタンパク質を検出・定量することにより、評価することができる。タンパク質の化学構造を常に変化させる分解過程は、加水分解又は切断（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー及びＣＥ－ＳＤＳなどの方法により評価される）、酸化（例えば、質量分析法又はＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ／ＭＳと合わせるペプチドマッピング法などの方法により評価される）、脱アミド作用（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、ペプチドマッピング法、イソアスパラギン酸の測定などの方法により評価される）及び異性化（イソアスパラギン酸の含有量の測定、ペプチドマッピング法などにより評価される）を含む。

【0159】

抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、所定の時間での生物活性が医薬製剤の調製時に示される生物活性の所定範囲にある場合、上記抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、医薬製剤において「その生物活性を保持している」とする。

【0160】

「投与」、「与える」及び「処理」は、動物、ヒト、実験の対象、細胞、組織、器官又は生物流体に適用される場合に、外因性薬剤、治療剤、診断薬又は組成物の、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官又は生物流体との接触を意味する。「投与」、「与える」及び「処理」は例えば、治療、薬物動態、診断、研究及び実験方法を意味してもよい。細胞の処理は、試薬の細胞との接触、及び試薬の流体との接触を含み、そのうち、上記流体は細胞と接触する。「投与」、「与える」及び「処理」はまた、試薬、診断、組成物により、又は別種の細胞を通じて、体外及びインビトロで例えば細胞を処理することを意味する。「処理」はヒト、獣医学又は研究対象に適用される場合に、治療的処理、予防又は予防的措置、研究及び診断的使用を意味する。

【0161】

「治療」は、例えば、本開示の何れか１つの医薬組成物を含む、内用又は外用治療剤を対象に与えることを意味し、上記対象は、１種又は複数種の疾患症状を有するが、上記治療剤は、これらの症状に対して治療効果を有することが知られている。通常、治療される対象又は集団には、１種又は複数種の疾患症状を効果的に緩和する量で治療剤を与えることにより、これらの症状の解消を誘導し、又は臨床的に測定可能な任意の程度まで進行しないようにこれらの症状を阻害する。任意の具体的な疾患症状を効果的に緩和する治療剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、対象の疾患状態、年齢と体重、及び薬剤の対象に必要な治療効果を発生させる能力などの複数の要因によって、変化することができる。当該症状の重症度又は進行状況の評価に医者又は他のプロのヘルスケアプロバイダによく用いられる任意の臨床的検出方法により、疾患症状が低減されたか否かを評価することができる。本開示の実施形態（例えば、治療方法又はキット）は、それぞれの対象における目標疾患症状の緩和において無効であり得るが、この分野で知られている任意の統計学的検定方法、例えば、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、カイ二乗検定、Ｍａｎｎ及びＷｈｉｔｎｅｙによるＵ検定、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定（Ｈ検定）、Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ検定及びＷｉｌｃｏｘｏｎ検定により、統計的に有意な数の対象において目標疾患症状を軽減するはずであることが確認された。

【0162】

「有効量」は、医学病状の症状の改善又は予防に十分な量を含む。有効量は、さらに、診断の許容又は促進に十分な量を指す。対象に使用される有効量は、治療される病状、対象の全体的健康状態、投与の方法と経路及び用量、並びに副作用の重症度といった要因によって変化することができる。有効量は、顕著な副作用又は毒性作用が回避される最大用量又は投与計画であってもよい。本開示の対象は、動物又はヒト対象であってもよい。

【0163】

本開示に係る医薬組成物は、非経口投与、肺内投与及び鼻内投与を含む任意の適切な手段により投与することができ、かつ局所治療が必要な場合、病巣内に投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内又は皮下投与を含む。投与は、任意の適切な経路により、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。本明細書では、様々な投与スケジュールが考慮されており、単回投与又は複数の時点での複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本開示の医薬組成物は、静脈内で投与される。

【0164】

本開示の医薬組成物は、良好な医療行為に適合するように調製、投薬及び投与される。この背景で考えられる要因は、治療される具体的な病状、治療される具体的な哺乳動物、個体対象の臨床状況、病状の起因、試薬の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医療従事者に知られている他の要因を含む。任意選択的に、医薬組成物は、上記病状の予防又は治療に使用される１種以上の他の試薬と合わせて調製されてもよい。このような他の試薬の有効量は、医薬組成物に存在する抗原結合分子の量、病状又は治療のタイプ及び他の要因に依存する。本明細書の記載と同じ用量及び投与経路で使用され、又は本明細書に記載の用量の約１％～約９９％で使用され、又は任意の用量で使用され、かつ経験的／臨床的に適切と確認された任意の経路で使用されてもよい。

【0165】

上記の明細書には、本開示の１種又は複数種の実施形態の詳細が提出されている。本開示は、本明細書の記載と類似する又は同じである任意の方法と材料により実施又は試験することができるが、以下、好ましい方法及び材料を説明する。明細書及び特許請求の範囲により、本開示の他の特徴、目的及び利点は明らかになる。明細書及び特許請求の範囲において、文脈で特に明記のない限り、単数形は複数の指示対象のことを含む。特に定義のない限り、本明細書に用いられる技術・科学用語の全ては、当業者により理解されている一般的な意味を持っている。明細書に援用される特許及び出版物は、全て援用により組み込まれている。下記の実施例は、本開示の好ましい実施形態をさらに全面的に説明するために提出される。これらの実施例は、何れかの方式で、本開示の範囲を限定するものと理解すべきではなく、本開示の範囲は、特許請求の範囲により限定される。

【0166】

以下、実施例と合わせてさらに説明するが、これらの実施例は、範囲を限定するものではない。実施例又は試験例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に通常の条件、又は原料や商品メーカーにより推奨された条件に従う。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング、実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー研究所、及び現代分子生物学方法、Ａｕｓｕｂｅｌら著、Ｇｒｅｅｎｅ出版協会、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹが参照される。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販される通常の試薬である。

【0167】

実施例－抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の調製及び検出
ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８０４７０（出願日：２０２１．３．１３、優先権特許出願番号：ＣＮ２０２０１０１７４８３５．４）は、援用により全体として本明細書に組み込まれている。

【0168】

実施例１． ＰＶＲＩＧタンパク質配列及び調製
ｈｉｓタグ付きのヒトＰＶＲＩＧ（ｈ－ＰＶＲＩＧ－ｈｉｓ）組換えタンパク質、マウスＩｇＧ２ａのＦｃタグ付きのヒトＰＶＲＩＧ（ｈ－ＰＶＲＩＧ－ｍＩｇＧ２ａ Ｆｃ）組換えタンパク質、ヒトＩｇＧ１のＦｃタグ付きのマウスＰＶＲＩＧ（ｍ－ＰＶＲＩＧ－ｈＩｇＧ１ Ｆｃ）は、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入された精製後の市販のタンパク質試薬であり、その配列は表１に示されている。

【0169】

【表1】

ｈｉｓタグ付きのカニクイザルＰＶＲＩＧ（ｃｙｎｏ－ＰＶＲＩＧ－ｈｉｓ）組換えタンパク質配列は、以下の通りである：
ＴＰＥＶＷＶＱＶＱＭＥＡＴＥＬＳＳＦＴＶＨＣＧＦＬＧＰＧＳＩＳＬＶＴＶＳＷＧＧＰＤＧＡＧＧＴＫＬＡＶＬＨＰＥＬＧＴＲＱＷＡＰＡＲＱＡＲＷＥＴＱＳＳＩＳＬＡＬＥＤＳＧＡＳＳＰＦＡＮＴＴＦＣＣＫＦＡＳＦＰＥＧＳＷＥＳＣＧＳＬＰＰＳＳＤＰＧＬＳＡＰＰＴＰＶＰＩＬＲＡＤＨＨＨＨＨＨ（配列番号１）
ＨＥＫ２９３細胞において通常の方法によって一過性トランスフェクションして組換えタンパク質を発現し、上清を収集するとともにＮｉ－ＮＴＡによって精製した。検出したところ、ｃｙｎｏ－ＰＶＲＩＧ－ｈｉｓを得た。

【0170】

実施例２． 抗ヒトＰＶＲＩＧ単一ドメイン抗体の産生
抗ヒトＰＶＲＩＧモノクローナル単一ドメイン抗体は、ラクダを免疫化することによって産生された。免疫抗原は、ｈｉｓタグ付きのヒトＰＶＲＩＧ組換えタンパク質（ｈ－ＰＶＲＩＧ－ｈｉｓ）である。フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｌｏｔ Ｎｏ．：Ｆ５８８１／Ｆ５５０６）で乳化し、最初に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）ＣＦＡを使用し、残りの追加免疫化には、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を使用した。免疫化注射時間は、０、１４、２８、４２日目である。５６日目に採血して血液検出を行い、ＥＬＩＳＡ方法によってラクダ血清を検出し、ラクダ血清における抗体価を決定した。

【0171】

２００ ｍＬのラクダ末梢血を採取し、その中のＰＢＭＣを単離し、Ｔｒｉｚｏｌで細胞におけるＲＮＡを抽出し、そしてｃＤＮＡに逆転写した。ＰＣＲ方法によって単一ドメイン抗体可変領域の遺伝子を増幅し、ファージベクターにクローニングすることにより、抗ヒトＰＶＲＩＧ単一ドメイン抗体のファージライブラリーを構築した。

【0172】

ファージライブラリーをＢＳＡで希釈してブロッキングし、磁気ビーズＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ－２８０、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートし、ネガティブセレクションしてインキュベーションしたファージを収集した。ビオチンで標識したｈｉｓタグ付きのヒトＰＶＲＩＧでＤｙｎａｂｅａｄｓを被覆してブロッキングし、ネガティブセレクション後に収集されたファージ懸濁液を上記Ｄｙｎａｂｅａｄｓとともにインキュベートし、トリプシンでファージを溶離した。スクリーニングを３ラウンド行い、３ラウンド目にスクリーニングされた４００個のクローンを選んでシークエンシングし、そのうち５つの単一ドメイン抗体の重鎖配列は表２に、異なる番号付け規則のＣＤＲは表３に示す通りである。

【0173】

【表2】

【0174】

【表3-1】

【表3-2】

【0175】

実施例３． 全長抗ＰＶＲＩＧ抗体の調製
実施例２の５つの抗体の重鎖可変領域をヒトＩｇＧ４重鎖Ｆｃ領域に連結し、全長抗ＰＶＲＩＧ抗体を構築した。ここで、重鎖Ｆｃ領域はヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域を含み、かつＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７Ａ変異（Ｅｕ命名システム）を有する。ＷＯ２０１６１３４３３３Ａ１に示される抗ＰＶＲＩＧ抗体ＣＰＡ．７．０２１は、抗体ファージライブラリーからスクリーニングされ、そのサブタイプはＩｇＧ１であり、ヒトＰＶＲＩＧに好適に結合することができるが、カニクイザルＰＶＲＩＧには結合しない。ＣＰＡ．７．０２１の重鎖及び軽鎖可変領域を、それぞれヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７Ａ変異を有する）及びヒトＫａｐｐａ軽鎖定常領域に連結し、陽性抗体Ｔａｂ５を構築した。

【0176】

５つの抗体及び陽性抗体の全長配列は、表４に示す通りである。

【0177】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【0178】

上記配列をコードする遺伝子配列を合成し、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化した後、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ酵素切断部位を介してｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｖ７９０－２０）に挿入した。発現ベクター及びトランスフェクション試薬ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ． Ｃａｔ． Ｎｏ． ２３９６６）を１：２の割合でＨＥＫ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃａｔ． Ｎｏ． １１６２５０１９）にトランスフェクションするとともに、ＣＯ_２のインキュベーターに置いて４～５日間インキュベートした。発現された抗体を遠心分離によって回収した後、通常の方法によって抗体を精製し、検出したところ、目的抗体を得た。

【0179】

実施例４． 抗ＰＶＲＩＧ抗体とＰＶＲＩＧ組換えタンパク質の結合実験
ＥＬＩＳＡ実験は、抗ＰＶＲＩＧ抗体の結合特性を検出するために使用された。ｈｉｓタグ付きのＰＶＲＩＧ組換えタンパク質で直接被覆し、抗体を加えた後、二次抗体（ＨＲＰとカップリングした抗一次抗体Ｆｃの抗体）及びＨＲＰ基質ＴＭＢを加えることで抗体の抗原への結合活性を検出した。

【0180】

ヒト、カニクイザル又はマウスのＰＶＲＩＧタンパク質で９６ウェルマイクロプレートを、１ μｇ／ｍＬの濃度で１ウェルあたり１００ μＬ被覆し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄液で３回洗浄し、１ウェルあたり２５０ μＬであった。十分に洗浄するために、洗浄するたびに１０秒間振とうした。３００ μＬ／ウェルのブロッキング液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０＋１％のＢＳＡ）を加えて室温で１時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄し、１ウェルあたり２５０ μＬであった。十分に洗浄するために、洗浄するたびに１０秒間振とうした。各ウェルに、希釈液で希釈した測定待ちの抗ＰＶＲＩＧ抗体１００ μＬを加えた。３７℃で１時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄し、１ウェルあたり２５０ μＬであった。各ウェルに、ＨＲＰで標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａ８６６７）１００ μＬを加えた。３７℃で１時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄し、１ウェルあたり２５０ μＬであった。各ウェルに１００ μＬのＴＭＢを加え、暗所で１５分間反応させた。５０ μＬ／ウェルで０．１６ Ｍの硫酸を加えた。Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｆｃプレートリーダーによって４５０ ｎｍにおけるＯＤ値を読み取り、抗ＰＶＲＩＧ抗体のＰＶＲＩＧへの結合ＥＣ_５０値を算出した。何れの抗体も、ヒト又はカニクイザルのＰＶＲＩＧ組換えタンパク質に対して強い結合能力を有するが、マウスＰＶＲＩＧ組換えタンパク質とは結合しなかった。

【0181】

【表5】

【0182】

実施例５． 抗ＰＶＲＩＧ抗体のＰＶＲＩＧを発現した細胞への結合実験
フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）により抗ＰＶＲＩＧ抗体の結合特性を検出した。ヒト又はカニクイザルのＰＶＲＩＧを過剰発現する細胞株を構築し、抗体を加えた後、二次抗体を加えることで抗体の抗原への結合活性を検出した。

【0183】

ヒト又はカニクイザルのＰＶＲＩＧ遺伝子配列を有する発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞においてトランスフェクションするとともに、抗生物質スクリーニング及び無限希釈法により過剰発現して安定的にトランスフェクションされたモノクローナル細胞株を得た。９６ウェルプレートにおいて各ウェルに２×１０^５個の過剰発現細胞を接種した。３００ ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、１００ μＬの測定待ちの抗体を加え、４℃で１時間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、２００ μＬの洗浄液（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）で３回洗浄し、１：５００で希釈した、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ－１１０１３）１００ μＬを加え、４℃で１時間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、２００ μＬの洗浄液（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ）で３回洗浄した。１００ μＬのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ又はＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ＿ＩＩ）により検出した。何れの抗体も、細胞表面に発現されたヒト又はカニクイザルのＰＶＲＩＧに対して強い結合能力を有し、陽性抗体Ｔａｂ５よりも明らかに優れたが、Ｔａｂ５はさらに、カニクイザルのＰＶＲＩＧに完全に結合しなかった。

【0184】

【表6】

（注：Ｎ．Ａ．は、ｎｏｔ ａｖａｉｌａｂｌｅで、結合が高過ぎて、低濃度条件でも抗体が解離せず、フィッティングして正確なＥＣ_５０を得ることができないことを示す。）

【0185】

実施例６． 抗ＰＶＲＩＧ抗体のＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２の結合への遮断実験
この実験において、体外遮断実験により、スクリーニングされた抗ＰＶＲＩＧ抗体のヒトＰＶＲＩＧとそのリガンドであるヒトＰＶＲＬ２との結合への遮断能力を検出した。具体的な方法としては、マウスＩｇＧ２ａ Ｆｃタグ付きのヒトＰＶＲＩＧ組換えタンパク質（ｈ－ＰＶＲＩＧ－ｍＩｇＧ２ａ Ｆｃ）を９６ウェルマイクロプレートに被覆し、抗ＰＶＲＩＧ抗体を加えて十分に結合してエピトープを占めた後、ｈｉｓタグ付きのＰＶＲＬ２（ＰＶ２－Ｈ５２Ｅ２、ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）を加え、ｈｉｓタグを検出することにより、ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２の結合量を算出し、抗ＰＶＲＩＧ抗体のＰＶＲＩＧ活性部位への遮断のＩＣ_５０値を算出した。

【0186】

ｈ－ＰＶＲＩＧ－ｍＩｇＧ２ａ Ｆｃタンパク質で９６ウェルマイクロプレートを１ μｇ／ｍＬの濃度で１ウェルあたり１００ μＬ被覆し、４℃で一晩インキュベートした。洗浄液で３回洗浄し、１ウェルあたり２５０ μＬであった。十分に洗浄するために、洗浄するたびに１０秒間振とうした。３００ μＬ／ウェルでブロッキング液を加えて室温で１時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄し、１ウェルあたり２５０ μＬであった。十分に洗浄するために、洗浄するたびに１０秒間振とうした。各ウェルに５０ μＬの希釈した測定待ちの抗ＰＶＲＩＧ抗体及び５０ μＬのｈｉｓタグ付きのリガンドＰＶＲＬ２を加え、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄し、１ウェルあたり２５０ μＬであった。各ウェルに、１：２０００倍で希釈した、ＨＲＰで標識した抗ｈｉｓタグ付きの二次抗体（Ｇｅｎｓｃｒｐｉｔ）１００ μＬを加えた。３７℃で１時間インキュベートした。洗浄液で３回洗浄し、１ウェルあたり２５０ μＬであった。各ウェルに１００ μＬのＴＭＢを加え、暗所で１５分間反応させた。５０ μＬ／ウェルで０．１６ Ｍの硫酸を加えた。Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｆｃプレートリーダーによって４５０ ｎｍにおけるＯＤ値を読み取り、ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２の結合への抗ＰＶＲＩＧ抗体の遮断のＩＣ_５０値を算出した。

【0187】

結果から明らかなように、何れの検出抗体も、ヒトＰＶＲＩＧとヒトＰＶＲＬ２の結合を強く阻害することができる。

【0188】

【表7】

【0189】

実施例７． 抗ＰＶＲＩＧ抗体のＰＶＲＩＧへの親和性測定
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａバイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、＃１８－５０１０）を２００ μＬのＫＢ緩衝剤（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０２％のｔｗｅｅｎ－２０、０．１％のＢＳＡ）に６０秒間浸漬し、湿潤処理を行った。その後、ＫＢ緩衝剤で抗ＰＶＲＩＧ抗体を１０ μｇ／ｍＬに希釈し、センサーを２００ μＬの当該溶液に入れ、読み取り値が１．２ ｎｍになるまで停止した。センサーをＫＢ緩衝剤に１００秒間浸漬することにより、過剰な抗体を溶離した。ｈｉｓタグ付きのヒトＰＶＲＩＧをＫＢ緩衝剤により２倍の勾配で６４～４ ｎＭの間に希釈した。センサーを当該溶液に入れて３００秒間結合させた。センサーをＫＢ緩衝剤に入れて６００秒間解離した。動的１：１結合方法によりフィッティングしたところ、抗ＰＶＲＩＧ抗体のヒトＰＶＲＩＧへの親和性は表８に示す通りである。

【0190】

結果から明らかなように、何れの検出抗体も、ヒトＰＶＲＩＧへの高親和性を有する。

【0191】

【表8】

【0192】

実施例８． 抗ＰＶＲＩＧ抗体レポーター遺伝子細胞の活性実験
まず、ｐｌｖｘ－ＯＳ８（Ｇ４１８耐性）プラスミドを構築し、２９３Ｆ細胞をトランスフェクションし、Ｇ４１８でスクリーニングし、フローサイトメーターによってクローン細胞ＯＳ８の発現を検出するとともに、ＯＳ８によるＪｕｒｋａｔ細胞の活性化を検出し、中等度に活性化されたクローンを選択して、２９３Ｆ－ＯＳ８細胞株を得て、ｐｌｖｘ－ＰＶＲＬ２プラスミドを構築し、それを用いて２９３Ｆ－ＯＳ８細胞に感染し、フローサイトメーターによってＰＶＲＬ２の発現量が最も高いクローンをスクリーニングして、２９３Ｆ－ＯＳ８－ＰＶＲＬ２細胞株を得た。

【0193】

次に、ｐｌｖｘ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性）を構築し、レンチウィルスにパッケージングし、Ｊｕｒｋａｔ Ｅ６．１細胞に感染し、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎを加えて耐性を有するクローンをスクリーニングし、ＯＫＴ３でクローンを刺激し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅシグナルが中等度のクローンをスクリーニングして、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞系を得て、ｐｌｖｘ－ＰＶＲＩＧ（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性）ベクターを構築し、レンチウィルスにパッケージングし、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞に感染し、フローサイトメーターによってＰＶＲＩＧの発現量が最も高いクローンをスクリーニングして、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ－ＰＶＲＩＧ細胞株を得た。

【0194】

１Ｅ４個のＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ－ＰＶＲＩＧ細胞及び測定待ちの抗体を３７℃で２０分間インキュベートした。１Ｅ５個の２９３Ｆ－ＯＳ８－ＰＶＲＬ２細胞を加え、３７℃で５時間インキュベートした。遠心分離によって上清を除去し、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ緩衝剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１３０）を加えて細胞を溶解し、蛍光値を検出した。ＥＣ_５０値を算出して抗ＰＶＲＩＧ抗体の体外細胞活性を評価した。実験の結果は図１及び表９に示す通りである。

【0195】

結果から明らかなように、何れの検出抗体も、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを活性化する能力が強く、活性が陽性抗体の３．７～１８．５倍であり、これらの抗体は、ＰＶＲＩＧに結合するとともに、ＰＶＲＬ２とＰＶＲＩＧの結合を遮断することができることが証明された。

【0196】

【表9】

【0197】

実施例９． 抗ＰＶＲＩＧ抗体のＮＫ細胞殺傷実験
ＰＶＲＩＧは、ＮＫ細胞において発現されるが、ＰＶＲＬ２は、多くの腫瘍細胞（Ｋ５６２細胞を含む）において発現される。抗ＰＶＲＩＧ抗体は、ＰＶＲＬ２とＰＶＲＩＧの結合を遮断することで、腫瘍細胞によるＮＫ細胞への阻害作用を解除することができる。

【0198】

培養されたＮＫ９２細胞系（ヒト悪性非ホジキンリンパ腫患者のＮＫ細胞）を洗浄液（ＲＰＭＩ １６４０、５％のＦＢＳ、１０ ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２を含む）で２回洗浄するとともに、２×１０^６個／ｍＬの密度に再懸濁した。９６ウェルプレートの各ウェルに５０ μＬ（合計１×１０^５個）のＮＫ９２細胞を加えた。２０ ｎＭ又は１００ ｎＭの測定待ちの抗体５０ μＬを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄液で２回洗浄し、２×１０^５個／ｍＬの密度に再懸濁した。５０ μＬ（合計１×１０^４個）のヒト慢性骨髄性白血病Ｋ５６２細胞を加えて、ＮＫ９２細胞とＫ５６２細胞の個数の割合を１０：１にした。３７℃で４時間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ－Ｇｌｏ細胞傷害性系（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ９２９２）を用いて殺傷活性を測定した。まず、５０ μＬのＡＡＦ－Ｇｌｏ試薬を加え、室温で１５分間インキュベートし、ＮＫ９２細胞に殺傷されたＫ５６２細胞の蛍光を測定した。さらに５０ μＬの溶解液を加え、室温で１５分間インキュベートし、ウェルにおける全ての細胞を溶解し、全ての細胞の蛍光を測定した。それぞれ培養液のみを含む試料（対照群１）、ＮＫ９２細胞のみを含む試料（対照群２）、Ｋ５６２細胞のみを含む１５０ μＬの試料（対照群３）という３つの対照群を準備し、同様の操作を行った。

【0199】

下記式に基づき、殺傷活性を算出した：
殺傷活性（％）＝｛［（Ｒ－ＢＧ）－（Ｔ－ＢＧ）－（Ｅ－ＢＧ）］／［（ＴＬ－ＢＧＬ）－（Ｔ－ＢＧ）］｝×１００
そのうち、Ｒは、ＡＡＦ－Ｇｌｏを加えた後の蛍光値であり、ＢＧは、対照群１のＡＡＦ－Ｇｌｏを加えた後の蛍光値であり、Ｅは、対照群２のＡＡＦ－Ｇｌｏを加えた後の蛍光値であり、Ｔは、対照群３のＡＡＦ－Ｇｌｏを加えた後の蛍光値であり、ＴＬは、対照群３の溶解液を加えた後の蛍光値であり、ＢＧＬは、対照群１の溶解液を加えた後の蛍光値である。

【0200】

実験の結果は図２及び表１０に示す通りで、何れの検出された抗ＰＶＲＩＧ抗体も、明らかにＮＫ９２細胞を活性化し、Ｋ５６２細胞を殺傷することができることが示された。

【0201】

【表10】

【0202】

実施例１０． 抗ＰＶＲＩＧ抗体の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）実験
ＰＶＲＩＧは、Ｔ細胞において発現されるが、ＰＶＲＬ２は、樹状細胞（ＤＣ細胞）において発現される。抗ＰＶＲＩＧ抗体は、ＰＶＲＬ２とＰＶＲＩＧの結合を遮断することで、樹状細胞によるＴ細胞への阻害作用を解除し、Ｔ細胞を活性化することができる。

【0203】

混合リンパ球反応とは、２つの無関係な個体で、機能が正常なリンパ球が体外で混合培養される場合、主要組織適合抗原が異なるため、相手のＴ細胞を増殖するように刺激することができることを指す。１つ目の個体由来の末梢血からＰＢＭＣを単離し、細胞を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ １６４０培地で培養し、５０ ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００－０３－１００ＵＧ）及び５０ ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－０４－１００ＵＧ）の最終濃度でサイトカインを加え、２～３日ごとにサイトカインを含む新鮮な培地を加え、６日間培養した後、１ μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｌ２８８０－２５ＭＧ）を加えて２４時間インキュベートし、分化成熟で得られたＤＣ細胞を収集した。２つ目の個体由来の末梢血からＰＢＭＣを単離し、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞単離試薬キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、１７９５２）を用いてその中からＣＤ３^＋Ｔ細胞を単離した。各ウェルに１×１０^５個のＣＤ３^＋Ｔ細胞及び２×１０^４個のＤＣ細胞が加えられるように、ＣＤ３^＋Ｔ細胞及びＤＣ細胞の密度を調整した。測定待ちの抗体を加え、３７℃で１２０時間インキュベートし、上清を取り、上清中のＩＦＮγ含有量をＥＬＩＳＡ試薬キット（Ｒ＆Ｄ、ＤＹ２０２）で検出した。実験の結果は図３及び表１１に示す通りである。

【0204】

結果から明らかなように、対照抗体ＩｇＧ４と比べ、何れの検出された抗ＰＶＲＩＧ抗体も、明らかにＴ細胞を活性化してＩＦＮγを分泌させることができる。かつ、低用量（例えば４ ｎＭ、２０ ｎＭ）の場合、本開示の抗体は、陽性対照Ｔａｂ５よりも効果が優れている。

【0205】

【表11】

【0206】

実施例１１． 抗ＰＶＲＩＧ抗体のヒト化改変
得られたラクダ単一ドメイン抗体２０、抗体３０、抗体３８、抗体３９及び抗体１５１のＶＨの典型的な構造に基づき、重鎖可変領域配列を抗体ＧｅｒｍＬｉｎｅデータベースと比べ、相同性の高いヒト生殖細胞系列テンプレートを得た。ラクダ単一ドメイン抗体のフレームワーク領域をヒト生殖細胞系列テンプレートの重鎖フレームワーク領域で置換し、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる）を保持し、さらにヒトＩｇＧのＦｃ領域（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７Ａ変異を有するＩｇＧ４ Ｆｃ）と組み換えた。ラクダ単一ドメイン抗体の３次元構造に基づき、埋め込まれた残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基、及び可変領域の立体配座に重要な影響を与える残基を復帰変異させるとともに、ＣＤＲ領域の化学的に不安定なアミノ酸残基を最適化し、一連のヒト化単一ドメイン抗体を産生した。各単一ドメイン抗体のヒト生殖細胞系列テンプレート及びヒト化抗体重鎖可変領域配列は、表１２～１６に示す通りである。

【0207】

【表12】

表１２によれば、抗体２０Ｈ１－２０Ｈ５は、ＴＤＣＭＧ（配列番号７）で示されるＣＤＲ１、ＨＩＤＳＤＧＩＰＲＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号８）で示されるＣＤＲ２及びＧＦＫＦＤＥＤＹＣＡＰＮＤ（配列番号１５０）で示されるＣＤＲ３を含む。

【0208】

【表13】

表１３によれば、抗体３０Ｈ１－３０Ｈ５は、ＧＤＣＭＧ（配列番号１０）で示されるＣＤＲ１、ＴＩＤＮＡＧＲＩＫＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１１）で示されるＣＤＲ２、ＧＷＴＦＧＧＱＣＳＰＡＤ（配列番号１５１）で示されるＣＤＲ３を含む。

【0209】

【表14】

【0210】

【表15】

【0211】

【表16】

上記ヒト化抗体重鎖可変領域をヒトＩｇＧ４重鎖Ｆｃ領域に連結して、全長抗ＰＶＲＩＧ抗体を構築した。ここで、重鎖Ｆｃ領域はヒンジ（ｈｉｎｇｅ）領域を含み、かつＳ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ４４７Ａ変異を有する。

【0212】

＞ヒトＩｇＧ４重鎖Ｆｃ領域（Ｓ２２８Ｐ／Ｆ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ／Ｋ４４７Ａ）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＡ（配列番号１０１）
＞ヒトＩｇＧ４重鎖Ｆｃ領域（Ｓ２２８Ｐ／Ｋ４４７Ａ）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１５３）
通常の方法によって抗体の発現及び精製を行い、検出したところ、目的抗体を得た。

【0213】

実施例１２． ヒト化抗ＰＶＲＩＧ抗体のＰＶＲＩＧを発現した細胞への結合実験
実施例５の方法によって、フローサイトメーターによってヒト化抗ＰＶＲＩＧ抗体のヒト又はカニクイザルのＰＶＲＩＧへの結合を検出した。実験の結果は表１７に示す通りである。

【0214】

【表17】

（注：Ｎ．Ｔ．は、ｎｏｔ ｔｅｓｔｅｄで、未試験である。）

【0215】

実施例１３． ヒト化抗ＰＶＲＩＧ抗体のＰＶＲＩＧへの親和性測定
実施例７の方法によって、ヒト化抗ＰＶＲＩＧ抗体のヒトＰＶＲＩＧへの親和性を検出した。結果は表１８に示す通りである。表に挙げられた何れの抗体も、ヒトＰＶＲＩＧへの高親和性を有する。

【0216】

【表18】

【0217】

実施例１４． ヒト化抗ＰＶＲＩＧ抗体のレポーター遺伝子細胞における活性実験
実施例８の方法によって、ヒト化抗ＰＶＲＩＧ抗体のレポーター遺伝子細胞における活性を検出した。実験の結果は図４Ａ～図４Ｂ及び表１９に示す通りである。表に挙げられた抗体は、何れもＪｕｒｋａｔ細胞を活性化する能力を有する。

【0218】

【表19】

【0219】

実施例１５． ヒト化抗ＰＶＲＩＧ抗体によるＮＫ細胞の殺傷能力の活性化実験
実施例９の方法によって、ヒト化抗ＰＶＲＩＧ抗体のＮＫ細胞への活性化能力を検出した。実験の結果は図５Ａ～図５Ｂ及び表２０～表２１に示す通りである。結果から明らかなように、本開示のヒト化抗ＰＶＲＩＧ抗体は、何れもＮＫ細胞を活性化する明らかな能力を有し、ＮＫ細胞の標的細胞Ｋ５６２への殺傷を促進した。

【0220】

【表20】

【0221】

【表21】

【0222】

実施例１６． 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の調製
異なる構造の抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の抗体機能への影響を調べるために、抗ＰＶＲＩＧ単一ドメイン抗体１５１をＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１５２）リンカーで抗ＴＩＧＩＴ抗体１７０８の重鎖又は軽鎖のＮ末端又はＣ末端に連結した。１７０８－１５１－１、１７０８－１５１－２、１７０８－１５１－３、１７０８－１５１－４と命名され、それぞれ１５１に対応して１７０８の重鎖のＮ末端、重鎖のＣ末端、軽鎖のＮ末端及び軽鎖のＣ末端に連結された４つの抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体を形成した。抗ＴＩＧＩＴ抗体１７０８は、ヒトＩｇＧ４サブタイプを採用し、かつＳ２２８Ｐ（Ｅｕ命名システム）の変異を有する。抗ＴＩＧＩＴ抗体１７０８及びそれと１５１で形成された二重特異性抗体の配列は、下記の表２２に示す通りである。抗ＴＩＧＩＴ抗体の配列情報は表２３～２４に示す通りである。ＷＯ２０１９０６２８３２Ａ１におけるＴＩＧＩＴ抗体は、全てここに組み込まれている。

【0223】

【表22-1】

【表22-2】

【表22-3】

【表22-4】

【0224】

【表23-1】

【表23-2】

【0225】

【表24】

【0226】

通常の方法によって抗体の一過性トランスフェクション、発現及び精製を行い、同定したところ、本開示の全長抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体を得た。二重特異性抗体の発現量及び純度は、表２５に示す通りである。ナノボディを一般的なモノクローナル抗体にカップリングし、重鎖と軽鎖のＮ末端でもＣ末端でも、良好な発現量及び純度を示した。

【0227】

【表25】

【0228】

実施例１７． 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体のＰＶＲＩＧとＴＩＧＩＴへの結合及び対応するリガンドへの遮断実験
１． 異なる配置の二重特異性抗体のヒトＰＶＲＩＧへの結合及びリガンドＰＶＲＬ２への遮断
実施例４、実施例５及び実施例６の方法によって実験を行い、結果は表２６に示す通りである。結果から明らかなように、異なる配置の二重特異性抗体は、ヒトＰＶＲＩＧ組換えタンパク質とヒトＰＶＲＩＧ過剰発現細胞への結合、及びＰＶＲＬ２とＰＶＲＩＧの結合への遮断は、基本的に一致しており、差がない。

【0229】

【表26】

【0230】

２． 異なる配置の二重特異性抗体のヒトＴＩＧＩＴへの結合及びリガンドＰＶＲへの遮断
実施例４、実施例５及び実施例６の方法（対応する受容体及びリガンドをヒトＴＩＧＩＴ及びヒトＰＶＲに置換）によって、実験を行い、結果は表２７に示す通りである。結果から明らかなように、異なる配置の二重特異性抗体と抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ヒトＴＩＧＩＴ組換えタンパク質及びヒトＴＩＧＩＴ過剰発現細胞への結合、及びＴＩＧＩＴとそのリガンドＰＶＲとの結合への遮断が、基本的に一致しており、差がない。抗ＰＶＲＩＧ抗体１５１の連結方式は、抗ＴＩＧＩＴ抗体とＴＩＧＩＴとの結合に基本的に影響しない。

【0231】

【表27】

表２６～２７のデータをまとめると、抗ＰＶＲＩＧ抗体は、抗ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖、軽鎖のＮ末端又はＣ末端の何れに連結されても、ＰＶＲＩＧ及びＴＩＧＩＴへの結合及びリガンドへの遮断を保持し、かつ良好な発現量、純度を示した。

【0232】

実施例１８． ヒト化抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の調製
異なるヒト化抗ＰＶＲＩＧ抗体（２０Ｈ５、３０Ｈ２、３９Ｈ２、１５１Ｈ７、１５１Ｈ８）を抗ＴＩＧＩＴ抗体１７０８の重鎖のＮ末端に連結し、即ち、１７０８－１５１－１と類似する二重特異性抗体構造を用いて二重抗体を構築し、配列は表２８に示す通りである。

【0233】

【表28-1】

【表28-2】

【表28-3】

【表28-4】

通常の方法によって抗体の一過性トランスフェクション、発現及び精製を行い、同定したところ、標的二重抗体を得た。

【0234】

実施例１９． ヒト化抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体のＰＶＲＩＧとＴＩＧＩＴへの結合及び対応するリガンドへの遮断
実施例４、５、６の方法によって、ヒト化抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体のヒトとカニクイザルＰＶＲＩＧへの結合、ヒトＰＶＲＩＧのリガンドへの遮断を検出した。結果は、表２９及び図６Ａ～６Ｅに示す通りである。結果から明らかなように、各ヒト化二重特異性抗体は、何れもヒトＰＶＲＩＧに結合し、ＰＶＲＩＧとＰＶＲＬ２の結合を遮断することができる。１７０８－１５１Ｈ８は、カニクイザルＰＶＲＩＧへの結合が弱い。

【0235】

【表29】

【0236】

実施例４、５、６と類似し、ヒト化抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体のヒト及びカニクイザルのＴＩＧＩＴへの結合、ヒトＴＩＧＩＴとリガンドの結合への遮断を検出し、ここで、ＰＶＲＩＧタンパク質をＴＩＧＩＴに置換するとともに、ＰＶＲＬ２をＰＶＲに置換した。結果は、表３０及び図７Ａ～図７Ｅに示す通りである。結果から明らかなように、各二重抗体は、何れもヒト及びカニクイザルのＴＩＧＩＴに結合し、ＴＩＧＩＴとＰＶＲの結合を遮断することができる。

【0237】

【表30】

【0238】

Ｂｉａｃｏｒｅによってヒト化二重特異性抗体とヒトＰＶＲＩＧ、カニクイザルＰＶＲＩＧ及びヒトＴＩＧＩＴへの親和性を検出した。ヒト化二重特異性抗体をＢｉａｃｏｒｅ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００、ＧＥ）のＰｒｏｔｅｉｎ Ａバイオセンサーチップ（ＧＥ ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、２９１２７５５７）に捕捉した後、チップ表面において一連の濃度勾配でのヒトＰＶＲＩＧ抗原（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍ、ＰＶＧ－Ｈ５２Ｈ４）、カニクイザルＰＶＲＩＧ抗原（配列番号１）又はヒトＴＩＧＩＴ抗原（ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍ、ＴＩＴ－Ｈ５２Ｈ３）を流した。Ｂｉａｃｏｒｅ機器（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００、ＧＥ）によって反応シグナルをリアルタイムに検出して結合及び解離曲線を得た。実験で得られたデータは、ソフトウェアＢｉａｃｏｒｅＸ１００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ２．０ ＧＥを用いて（１：１）Ｂｉｎｄｉｎｇモデルでフィッティングし、親和性数値を得て、表３１に示されている。

【0239】

【表31】

【0240】

実施例２０． ヒト化抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）実験
実施例１０の方法によって、ヒト化抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体のＴ細胞への活性化能力を検出した。実験の結果は、図８及び表３２に示す通りである。結果から明らかなように、ヒト化抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体１７０８－１５１Ｈ８は、Ｔ細胞を活性化する明らかな能力を有し、Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌を促進する。重要なことに、二重特異性抗体の活性は、抗ＰＶＲＩＧ抗体１５１Ｈ８を単独で使用する場合、抗ＴＩＧＩＴ抗体１７０８を単独で使用する場合よりも強い。

【0241】

【表32】

【0242】

実施例２１． ヒト黒色腫Ａ３７５にヒトＰＢＭＣを混合したマウス皮下移植腫瘍モデルにおける抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の抗腫瘍作用の評価
二重特異性抗体サブタイプの動物薬効における作用をさらに調べるために、上記ＩｇＧ４サブタイプの二重特異性抗体以外、対応するＩｇＧ１サブタイプの抗体を合成し、動物薬効試験に使用した。当該実験で使用された、以上に説明されていない他の抗体配列は表３３に示す通りである。

【0243】

【表33-1】

【表33-2】

【0244】

４～８週齢、体重約１８～２２ ｇの雌ＮＣＧマウスを、江蘇集萃薬康生物科技有限公司から購入した。全てのＮＣＧマウスは、ＳＰＦグレードの動物飼育室のＩＶＣ恒温恒圧システムの条件で培養された。

【0245】

１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ培養液においてＡ３７５細胞を培養した。指数増殖期のＡ３７５細胞を収集し、ＨＢＳＳにより、ＮＣＧマウスの皮下腫瘍接種のために適切な濃度に再懸濁した。共培養に使用されたＡ３７５細胞をＭｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃで２時間処理した後、ＰＢＳで３回洗浄する必要がある。正常なヒト末梢血を採取し、密度勾配遠心分離法によってヒトＰＢＭＣを単離し、カウントした。その後、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＩＬ２及び１０％のＦＢＳを含む）でＰＢＭＣを３×１０^６個／ｍＬの濃度に再懸濁し、Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ Ｃで処理したＡ３７５細胞と共培養した。６日間共培養した後、ＰＢＭＣを収集すると同時に、消化したばかりのＡ３７５細胞を収集した。各マウスに、５×１０^５個のＰＢＭＣ、４×１０^６個のＡ３７５細胞を接種し、接種体積が０．２ ｍＬ／匹（５０％のＭａｔｒｉｇｅｌを含む）であり、雌ＮＣＧマウスの右側皮下に接種した。マウスの体重に基づいてランダムに群分けして投与し、詳細な投与方法、投与量及び投与経路を表３４に示し、群分けして投与する当日を０日目とした。抗ＰＶＲＩＧ抗体及び抗ＴＩＧＩＴ抗体の分子量が異なるため、当該投与量は、抗ＰＶＲＩＧ抗体と抗ＴＩＧＩＴ抗体が同様の初期モル濃度を有することを確保した。

【0246】

【表34】

（注：Ｎ：使用された動物数、ｉ．ｐ．：腹腔内注射、Ｑ２Ｄ：２日に１回、投与体積：担腫瘍マウスの体重に応じて投与体積を調整した（０．１ ｍＬ／１０ ｇ）。）

【0247】

投与開始後、マウスに対して体重及び腫瘍体積を週に２回測定した。実験の結果は、それぞれ表３５～３６及び図９Ａ～図９Ｂに示されている。

【0248】

【表35】

【0249】

【表36】

（注：対照群（ｈＩｇＧ１）と比べて、×Ｐ＜０．０５、××ＰＰ＜０．０１、×××Ｐ＜０．００１であれば、有意差があると考えられる。）

【0250】

実験終了時（投与後の２６日目）、対照群と比べ、抗ＰＶＲＩＧ抗体１５１単剤群は、有意差がなかった。抗ＴＩＧＩＴ抗体１７０８－ＩｇＧ１単剤群、抗ＰＶＲＩＧ抗体１５１と抗ＴＩＧＩＴ抗体１７０８－ＩｇＧ１の併用群、１７０８－１５１－ＩｇＧ１の二重抗体群は、腫瘍体積が減少した。その一方、１７０８－１５１－ＩｇＧ４の二重抗体群は、腫瘍の増殖を完全に阻害することさえでき、他の群とは有意差があった（図９Ｂ参照）。

【0251】

マウスの体重に基づいてランダムに群分けして投与し、詳細な投与方法、投与量及び投与経路を表３７に示し、群分けして投与する当日を０日目とした。

【0252】

【表37】

（注：Ｎ：使用された動物数、ｉ．ｐ．：腹腔内注射、Ｑ２Ｄ：２日に１回、投与体積：担腫瘍マウスの体重に応じて投与体積を調整した（０．１ ｍＬ／１０ ｇ）。）

【0253】

投与開始後、マウスに対して体重及び腫瘍体積を週に２回測定した。実験の結果は、それぞれ表３８～３９及び図１０Ａ～図１０Ｂに示されている。

【0254】

【表38】

【0255】

【表39】

（注：対照群（ｈＩｇＧ１）と比べて、×Ｐ＜０．０５、××ＰＰ＜０．０１、×××Ｐ＜０．００１であれば、有意差があると考えられる。）

【0256】

実験終了時（投与後の２８日目）、対照群と比べ、１７０８－３０Ｈ２ ＩｇＧ４と１７０８－１５１Ｈ７ ＩｇＧ４の二重抗体群は、何れも低用量で腫瘍の増殖を効果的に阻害することができ、対照群とは有意差があった（図１０Ａ及び図１０Ｂ参照）。

【0257】

調製例－抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体製剤
製剤の調製と検出中に使用された機器、抗体及び方法は、以下の通りである：
１．ＳＥＣサイズ排除クロマトグラフィー：
ゲル細孔の孔径の大きさと高分子試料分子のコイル寸法との間の相関関係に基づいて溶質を単離する分析方法である。
ＳＥＣ％（ＳＥＣモノマーの含有量百分率）＝Ａモノマー／Ａ全×１００％（Ａモノマーは試料中のメインピークモノマーのピーク面積であり、Ａ全は全てのピーク面積の和である）。
ＳＥＣ測定用機器：アジレントＨＰＬＣ１２６０、カラム：ｗａｔｅｒｓ、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ２００Å ＳＥＣ（７．８×３００ ｍｍ ３．５ μｍ）。

【0258】

２．ＮＲ－ＣＥ（ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）ともいう）キャピラリーゲル電気泳動：
ゲルをキャピラリーに支持媒体として移動して行われる電気泳動であり、かつ一定の電圧で試料の分子量の大きさによって単離する方法である。
非還元ＣＥの純度百分率＝Ａメインピーク／Ａ全×１００％（Ａメインピークは、試料中のメインピークのピーク面積であり、Ａ全は全てのピーク面積の和である。）ＣＥ測定用機器：Ｂｅｃｋｍａｎキャピラリー電気泳動装置 型番ｐｌｕｓ８００。

【0259】

３．ｉＣＩＥＦイメージングキャピラリー等電点電気泳動：
タンパク質の等電点ｐＩの違いによって単離する技術である。
ｉＣＩＥＦ中性ピークの含有量百分率＝中性ピーク面積／総面積×１００％（総面積は、酸性ピーク、中性ピーク及び塩基性ピーク面積の和である）。
ｉＣＩＥＦ測定用機器：ｓｉｍｐｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、型番ｍｕａｒｉｃｅ。

【0260】

４．浸透圧の測定：
凝固点法により浸透圧を測定し、凝固点降下値が溶液のモル濃度に正比例することを基にして、高感度測温素子を使用し、溶液の凝固点を測定し、電気量で浸透圧に変換した。
浸透圧測定用機器：ルーザーＬｏｓｅｒ、型番ＯＭ８１５。

【0261】

５．タンパク質濃度の測定：
以下の調製例に採用された抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体は、１７０８－３０Ｈ２である。二重特異性抗体の濃度は、タンパク質濃度計を用いた。
タンパク質濃度の測定機器：紫外可視分光光度計、型番：Ｎａｎｏ Ｄｒｏｐ ｏｎｅＣ、光路１ ｍｍ。

【0262】

調製例１． 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体製剤緩衝系及びｐＨ値のスクリーニング
以下の緩衝化系を用いて、約５０ ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有する抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体（１７０８－３０Ｈ２）製剤を調製し、ここで、緩衝系は以下の通りである：
１）１０ ｍＭの酢酸－酢酸ナトリウム塩（ＡＡと略す）、ｐＨ５．０
２）１０ ｍＭのＡＡ、ｐＨ５．５
３）１０ ｍＭのコハク酸－コハク酸ナトリウム塩（ＳＡと略す）、ｐＨ６．０
４）１０ ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン（Ｈｉｓ－ＨＣｌと略す）、ｐＨ５．５
５）１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．０
６）１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．５
７）１０ ｍＭのリン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム塩（ＰＢと略す）、ｐＨ８．０
８）１０ ｍＭのトロメタモール－塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌと略す）、ｐＨ８．０
９）１０ ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５、
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。製剤試料を４０℃の高温条件下で強制分解し、外観、ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）及びｉＣＩＥＦを評価指標として製剤の安定性を考査した。

【0263】

実験の結果は表４０に示されている。結果から明らかなように、製剤試料を４０℃の高温条件下で１ヶ月間放置した後：
－外観では、ＳＡ緩衝系群の製剤は、大量の粒子が現れ、他の緩衝系群製剤よりも劣り、
－純度では、緩衝系ｐＨ≧８．０の製剤試料は、ＳＥＣモノマー及びＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）が比較的多く低減され、低減範囲がそれぞれ３．３％～５．６％及び７．１％～１４．９％である。また、緩衝系のｐＨ＝５．０又はｐＨ≧８．０の製剤試料は、そのｉＣＩＥＦ中性ピークの純度の低減が３０％を超えた。

【0264】

【表40】

注：Ｍは月、４０℃Ｍ１は４０℃で１ヶ月間恒温放置することを示す

【0265】

調製例２． 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体製剤のタンパク質濃度のスクリーニング
１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０緩衝系を用いて、タンパク質濃度がそれぞれ低濃度５０ ｍｇ／ｍＬ及び高濃度１００ ｍｇ／ｍＬである製剤を調製した。調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。試料を４０℃の高温条件下で強制分解し、ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）及びｉＣＩＥＦを評価指標として製剤の安定性を考査した。

【0266】

実験の結果を表４１に示し、実験の結果から明らかなように、製剤試料を４０℃の高温条件下で１ヶ月間放置した後、異なる濃度の製剤群の純度では、高タンパク質濃度の製剤は、ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）及びｉＣＩＥＦ値が比較的やや低かった。

【0267】

【表41】

【0268】

調製例３． 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体製剤における界面活性剤の種類及び濃度のスクリーニング
１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．５の緩衝系を用いて、５０ ｍｇ／ｍＬの抗体、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、及び異なる濃度の界面活性剤を含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ抗体（１７０８－３０Ｈ２）製剤を調製し、具体的な界面活性剤の種類及び濃度は以下の通りである：
１）０．２ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
２）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
３）０．６ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
４）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０、
５）０．４ ｍｇ／ｍＬのポロキサマー１８８、
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。試料を４０℃の高温条件下で強制分解し、外観、ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）及びｉＣＩＥＦを評価指標として製剤の安定性を考査した。

【0269】

実験の結果は、表４２に示されている。実験の結果から明らかなように、各実験群の製剤は何れも良好な安定性を有する。

【0270】

【表42】

【0271】

調製例４． 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体製剤の糖濃度のスクリーニング
１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ５．５の緩衝系を用いて、５０ ｍｇ／ｍＬの抗体、０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０及び異なる濃度のスクロースを含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ抗体（１７０８－３０Ｈ２）製剤を調製し、具体的なスクロース濃度は以下の通りである：
１）７５ ｍｇ／ｍＬのスクロース、
２）８０ ｍｇ／ｍＬスクロース、
調製済みの製剤の浸透圧を測定した。

【0272】

実験の結果は表４３に示されている。結果から明らかなように、スクロース濃度が７５～８０ ｍｇ／ｍＬである場合、浸透圧が何れも等張範囲内（２８０～３２０ ｍＯｓｍ）である。

【0273】

【表43】

【0274】

調製例５． 異なる緩衝系における抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体の安定性実験
下記の緩衝系を用いて、５０ ｍｇ／ｍＬの抗体、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ抗体（１７０８－３０Ｈ２）製剤を調製し、ここで、緩衝系は以下の通りである：
１）１０ ｍＭのＡＡ ｐＨ５．５
２）１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ５．５
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。試料を４０℃の高温条件下で強制分解し、外観、ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）及びｉＣＩＥＦを評価指標として製剤の安定性を考査した。

【0275】

実験の結果を表４４に示し、結果から明らかなように、製剤試料を４０℃の高温条件下で１ヶ月間放置した後、Ｈｉｓ－ＨＣｌ及びＡＡを緩衝系とする製剤は、外観、ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）に有意差がなかったが、ｉＣＩＥＦ値では、Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝系群の中性ピークの純度がＡＡよりも高いことを示した。

【0276】

【表44】

【0277】

調製例６． 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体製剤の異なるｐＨでの安定性
下記の緩衝系を用いて、５０ ｍｇ／ｍＬの抗体、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロース、０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０を含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ抗体製剤（１７０８－３０Ｈ２）を調製し、緩衝系は以下の通りである：
１）１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ５．５
２）１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０
３）１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．５
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。試料を４０℃の高温条件下で強制分解し、外観、ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）及びｉＣＩＥＦを評価指標として製剤の安定性を考査した。

【0278】

実験の結果は、表４５に示されている。実験の結果から明らかなように、Ｈｉｓ－ＨＣｌ緩衝剤のｐＨが５．５～６．５の間にある場合、各群の製剤は何れも良好な安定性を有する。

【0279】

【表45】

【0280】

調製例７． 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体製剤の安定性実験
１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０の緩衝化系を用いて、５０ ｍｇ／ｍＬの抗体、０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースを含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ抗体（１７０８－３０Ｈ２）製剤を調製した。調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。試料を２５℃及び２～８℃の条件下で６ヶ月間放置し、外観、ＳＥＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）及びｉＣＩＥＦを評価指標として製剤の安定性を考査した。

【0281】

実験の結果は、表４６に示されている。結果から明らかなように、好ましい製剤は良好な安定性を有する。

【0282】

【表46】

【0283】

調製例８． 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体製剤のｐＨドリフト実験
１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０の緩衝系を用いて、５０ ｍｇ／ｍＬの抗体、０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロースを含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ抗体（１７０８－３０Ｈ２）製剤をそれぞれ３バッチ調製した。３バッチの製剤完成品のｐＨ値を測定し、緩衝液のｐＨと比べてｐＨドリフト様子を考査した。

【0284】

実験の結果は、表４７に示されている。結果から明らかなように、製剤のｐＨドリフトは、統計的に有意な変化がなかった。

【0285】

【表47】

【0286】

調製例９． 抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ二重特異性抗体製剤における異なる界面活性剤の安定性実験
１０ ｍＭのＨｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ６．０の緩衝系を用いて、５０ ｍｇ／ｍＬの抗体、８０ ｍｇ／ｍＬのスクロース及び異なる種類の界面活性を含む抗ＰＶＲＩＧ／ＴＩＧＩＴ抗体（１７０８－３０Ｈ２）製剤を調製し、具体的な界面活性剤の種類及び濃度は以下の通りである：
１）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、
２）０．４ ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０、
３）０．４ ｍｇ／ｍＬのポロキサマー１８８、
調製済みの製剤を滅菌ろ過し、容器に充填し、プラグを入れて、蓋をした。試料を２～８℃の条件下で１２ヶ月間放置し、外観、ＳＥＣ及びｉＣＩＥＦを評価指標として製剤の安定性を考査した。

【0287】

実験の結果は、表４８に示されている。結果から明らかなように、上記製剤は良好な安定性を有する。

【0288】

【表48】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【配列表】

2024535768000001.xml

【国際調査報告】