特表 2024-535781 抗原結合タンパク質およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-02

(54)【発明の名称】抗原結合タンパク質およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/725 20060101AFI20240925BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240925BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240925BHJP

   A61K 47/62 20170101ALI20240925BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240925BHJP

【ＦＩ】

C07K14/725 ZNA

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K38/17

A61K45/00

A61K39/395

A61K48/00

A61P35/00

A61P31/20

A61K35/76

A61K35/17

A61K47/62

C12N5/0783

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515466

(86)(22)【出願日】2022-09-07

(85)【翻訳文提出日】2024-05-01

(86)【国際出願番号】 CN2022117497

(87)【国際公開番号】W WO2023036169

(87)【国際公開日】2023-03-16

(31)【優先権主張番号】202111043194.X

(32)【優先日】2021-09-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524088629

【氏名又は名称】コレジェネ バイオテクノロジー カンパニー リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001210

【氏名又は名称】弁理士法人ＹＫＩ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ジアン ドン

(72)【発明者】

【氏名】ワン ジアンフア

(72)【発明者】

【氏名】シエ シンワン

(72)【発明者】

【氏名】ワン シュエヤン

(72)【発明者】

【氏名】ビ ジンレイ

(72)【発明者】

【氏名】シ ユンチアン

(72)【発明者】

【氏名】ジャイ ジアフイ

(72)【発明者】

【氏名】コン ジンロン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA94X

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC01

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC35

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA23

4C084BA44

4C084CA26

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB331

4C084ZB332

4C085AA13

4C085AA14

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087BC83

4C087CA09

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB33

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA50

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質をコードする核酸、核酸を含むベクター、抗原結合タンパク質、核酸またはベクターを含む細胞、細胞の調製方法が提供される。抗原結合タンパク質を含むコンジュゲートまたは組成物、抗原結合タンパク質または細胞を使用することによって疾患を予防する、および／または処置する方法、ならびに対象における疾患の存在を検出する方法も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＶＩＳＡＧＴＡＬＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記エピトープとＭＨＣ分子との複合体に結合することを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項2】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＳＳＬＧＷＲＧＧＬＹＴＥＡＦ（配列番号８）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記エピトープとＭＨＣ分子との複合体に結合することを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項3】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＶＩＳＡＧＴＡＬＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み；前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＳＳＬＧＷＲＧＧＬＹＴＥＡＦ（配列番号８）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み、
ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記エピトープとＭＨＣ分子との複合体に結合することを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＭＨＣ分子が、ＨＬＡ－Ａ^＊０２型、例えば、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０３型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０５型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０７型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１０型またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：１１型であることを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、および／または前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が、配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含む；ならびに／あるいは前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が、配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するベータ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項7】

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む；ならびに／または前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するベータ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が配列番号４に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、および／または前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が配列番号９に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項9】

請求項８に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、および／または前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項10】

請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が第１のポリペプチドに含まれ、前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が異なる第２のポリペプチドに含まれることを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項11】

請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域および前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が、単一のポリペプチドに含まれることを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
可溶性または膜結合型であることを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
ＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｆｃポリペプチドまたはその抗原結合断片から選択されることを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項14】

請求項１～１３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
ＴＣＲまたはその抗原結合断片であり、ＴＣＲ定常領域またはその断片をさらに含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項15】

請求項１４に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲ定常領域が、ムリン定常領域またはヒト定常領域であることを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項16】

請求項１４または１５に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲ定常領域が、ＴＣＲアルファ鎖定常領域および／またはＴＣＲベータ鎖定常領域を含み；
好ましくは、前記ＴＣＲアルファ鎖定常領域および／または前記ＴＣＲベータ鎖定常領域が、前記ＴＣＲアルファ鎖と前記ＴＣＲベータ鎖との間にジスルフィド結合を形成するように、野生型配列と比較して少なくとも１つのシステイン変異を含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項17】

請求項１６に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖定常領域が、配列番号１４～１９のいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性有するアミノ酸配列を含む、および／または前記ＴＣＲベータ鎖定常領域が、配列番号２１～３０のいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項18】

請求項１７に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲアルファ鎖定常領域が配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、前記ＴＣＲベータ鎖定常領域が配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項19】

請求項１４に記載の抗原結合タンパク質であって、
前記ＴＣＲ定常領域の前記断片が前記ＴＣＲ定常領域の細胞外セグメントであることを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項20】

請求項１４～１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
膜貫通領域および／または細胞質領域をさらに含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項21】

請求項１４に記載の抗原結合タンパク質であって、
配列番号３２～３７から選択されるいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲアルファ鎖；および／または配列番号３８～４７から選択されるいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲベータ鎖を含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項22】

請求項１～２１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
細胞内シグナル伝達領域をさらに含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項23】

請求項１～２２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
他の抗原またはエピトープに結合する１つ以上の抗原結合領域（複数可）をさらに含むことを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項24】

請求項１～２３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質であって、
単離されるか、または精製されることを特徴とする抗原結合タンパク質。

【請求項25】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質をコードすることを特徴とする核酸。

【請求項26】

請求項２５に記載の核酸であって、
配列番号５に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列、および／または配列番号１０に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸。

【請求項27】

請求項２６に記載の核酸であって、
配列番号２０に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列、および／または配列番号３１に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする核酸。

【請求項28】

請求項２５～２７のいずれか１項に記載の核酸を含むことを特徴とするベクター。

【請求項29】

請求項２８に記載のベクターであって、
レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、プラスミド、ＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、トランスポゾンに基づくベクターおよび人工染色体からなる群から選択されることを特徴とするベクター。

【請求項30】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の核酸、または請求項２８もしくは２９に記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。

【請求項31】

請求項３０に記載の細胞であって、
リンパ球（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、単球（例えば、ＰＢＭＣ）および幹細胞からなる群から選択されることを特徴とする細胞。

【請求項32】

請求項３１に記載の細胞であって、
前記幹細胞が、リンパ球系前駆細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であることを特徴とする細胞。

【請求項33】

請求項３１に記載の細胞であって、
Ｔ細胞であることを特徴とする細胞。

【請求項34】

請求項３３に記載の細胞であって、
前記Ｔ細胞が内在性ＴＣＲを発現しないことを特徴とする細胞。

【請求項35】

請求項３０～３４のいずれか１項に記載の細胞を調製する方法であって、
請求項２８または２９に記載のベクターを用いて細胞を形質導入するか、またはトランスフェクトするステップを含むことを特徴とする方法。

【請求項36】

請求項３５に記載の方法であって、
形質導入またはトランスフェクションの前または後に細胞を増やす、および／または活性化するステップをさらに含むことを特徴とする方法。

【請求項37】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、および前記抗原結合タンパク質にコンジュゲートしているかまたはカップルしている活性剤を含むことを特徴とするコンジュゲート。

【請求項38】

請求項３７に記載のコンジュゲートであって、
前記活性剤が、検出可能なマーカー、免疫賦活性分子および治療剤からなる群から選択され；
好ましくは、前記検出可能なマーカーが、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素またはその触媒的に活性な断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、核酸プローブ、造影剤および蛍光性分子、リン光性分子または化学発光分子からなる群から選択され；
好ましくは、前記免疫賦活性分子が、サイトカイン、ケモカイン、血小板因子および補体開始因子からなる群から選択され；
好ましくは、前記治療剤が、免疫調節物質、放射活性化合物、酵素、化学療法薬および毒素からなる群から選択されることを特徴とするコンジュゲート。

【請求項39】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の核酸、請求項２８もしくは２９に記載のベクター、または請求項３０～３４のいずれか１項に記載の細胞を含む組成物であって；
好ましくは、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含むことを特徴とする、
組成物。

【請求項40】

請求項３９に記載の組成物であって、
第２の治療剤をさらに含み、好ましくは前記第２の治療剤が抗体、化学療法薬および小分子薬からなる群から選択されることを特徴とする組成物。

【請求項41】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、前記対象におけるＨＰＶ陽性疾患を処置するか、または予防することを特徴とする方法。

【請求項42】

請求項３０～３４のいずれか１項に記載の細胞の有効量を対象に投与することを含む、前記対象におけるＨＰＶ陽性疾患を処置するか、または予防することを特徴とする方法。

【請求項43】

請求項４２に記載の方法であって、
前記細胞が対象について自家性または同種であることを特徴とする方法。

【請求項44】

請求項４２に記載の方法であって、
（ｉ）対象由来の細胞を含有する試料を単離するステップ；
（ｉｉ）請求項２８または２９に記載のベクターを用いて前記細胞を形質導入するか、またはトランスフェクトするステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において得られた細胞を前記対象に投与するステップ；
を含むことを特徴とする方法。

【請求項45】

請求項４４に記載の方法であって、
ステップ（ｉ）の後でステップ（ｉｉ）の前に前記細胞中の内在性ＴＣＲをノックアウトするステップをさらに含むことを特徴とする方法。

【請求項46】

請求項４１～４５のいずれか１項に記載の方法であって、
前記ＨＰＶ陽性疾患が、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ前悪性腫瘍およびＨＰＶがんからなる群から選択されることを特徴とする方法。

【請求項47】

請求項４６に記載の方法であって、
前記がんが、子宮頸がん、頭頸部がん、中咽頭がん、食道腺癌、肛門がん、肛門管がん、直腸がん、膣がん、外陰部がんおよび陰茎がんからなる群から選択されることを特徴とする方法。

【請求項48】

請求項４１～４７のいずれか１項に記載の方法であって、
第２の治療剤を投与することをさらに含み、好ましくは、前記第２の治療剤が抗体、化学療法薬および小分子薬からなる群から選択されることを特徴とする方法。

【請求項49】

請求項４１～４８のいずれか１項に記載の方法であって、
前記対象が、ＨＬＡ－Ａ^＊０２対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０７、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１０またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：１１対立遺伝子を有することを特徴とする方法。

【請求項50】

（ｉ）対象から得られた試料を、請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の細胞、または請求項３７もしくは３８に記載のコンジュゲートと接触させること；および
（ｉｉ）前記試料中のＨＰＶ抗原の存在を検出することであって、ＨＰＶ抗原の存在がＨＰＶ陽性疾患を示すこと；
を含む、対象におけるＨＰＶ陽性疾患を検出するためであることを特徴とする方法。

【請求項51】

請求項５０に記載の方法であって、
前記ＨＰＶ陽性疾患が、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ前悪性腫瘍およびＨＰＶがんからなる群から選択されることを特徴とする方法。

【請求項52】

請求項５１に記載の方法であって、
前記がんが、子宮頸がん、頭頸部がん、中咽頭がん、食道腺癌、肛門がん、肛門管がん、直腸がん、膣がん、外陰部がんおよび陰茎がんからなる群から選択されることを特徴とする方法。

【請求項53】

請求項１～２４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質、または請求項３７もしくは３８に記載のコンジュゲートを含むキットであって、
試験される試料中の陽性エピトープの存在を検出するために使用され、前記エピトープがＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）を含むエピトープであることを特徴とするキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗原結合タンパク質、特にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびその使用、特にＨＰＶ陽性疾患の予防、処置または検出における使用に関する。

【0002】

本国際特許出願は、その内容全体をすべての目的のために引用して援用する中国特許出願第２０２１１１０４３１９４．Ｘ号、２０２１年９月７日出願の利益を主張する。

【背景技術】

【0003】

世界での女性の腫瘍の発生頻度において子宮頸がんは、４番目である。世界保健機関（ＷＨＯ）は、子宮頸がんに関して世界で６０４，０００の新規症例および３４２，０００名の死亡があると推定している。中国における子宮頸がんの発生頻度は、子宮頸がんに関して毎年約１０９，０００の新規症例および５９，０００名の死亡を伴って近年上昇している。転移性、進行性子宮頸がんについての５年生存率は、約１０％でしかない。ほとんどすべての子宮頸がんは、高リスク型ＨＰＶの感染を伴っており、その中でＨＰＶ１６が最も一般的な型であり、すべての高リスク型ＨＰＶの６０％を占めている。ＨＰＶ感染は、特に、頭頸部がん、中咽頭がん、食道腺癌、肛門がん、外陰部がん、陰茎がんも生じる場合がある。現在、ＨＰＶ感染および結果として生じる悪性腫瘍についての有効な処置はない。予防ワクチンは、新規ウイルス感染に対しては生物によって生成される特異的中和抗体を誘導するが、既存のＨＰＶ感染は排除できない。まだ臨床試験中である治療ワクチンは、前がん病変の進行をある程度遅らせることができるが、それらが、進行性腫瘍に対して治療的に有効であることは難しい。

【0004】

ＴＣＲ－Ｔは、特異的ＨＬＡ腫瘍抗原ペプチド複合体を特異的に認識するＴＣＲを対応する実験的技術によってクローニングすることに続いて、ＴＣＲ遺伝子コード配列をレンチウイルスなどの遺伝子送達の手段によってこれらのＴ細胞に送達することによって、Ｔ細胞に新たな抗原認識特異性を付与する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＣＲ遺伝子を形質導入され、大量に増やされた患者由来Ｔ細胞は、腫瘍細胞特異的抗原を有効に認識することができる。これらのＴ細胞は、腫瘍細胞を特異的に殺傷し、抗腫瘍活性を発揮するように患者に戻して注入される。ＨＬＡ提示後に、細胞内および細胞外抗原の両方がＴＣＲによって認識され得ることから、ＴＣＲ－Ｔは大部分の腫瘍特異的抗原を標的にすることができ、特に、これらの細胞内腫瘍抗原を認識でき（すべての抗原の約９０％）、このためＴＣＲ－Ｔは、ほとんどすべての腫瘍、特に種々の固形腫瘍の処置において使用される可能性がある。

【0005】

ＨＰＶ１６ウイルスのＥ６およびＥ７タンパク質は、子宮頸がんの発生および進行を駆動する重要な癌遺伝子であり、ほとんどすべてのＨＰＶ１６陽性腫瘍細胞はこれら２つの抗原を安定に発現する。ＨＰＶ関連子宮頸がんは、Ｅ６およびＥ７タンパク質陽性腫瘍細胞が効果的に認識され、殺傷され得る場合は、効果的に処理され得る。以前の研究は、ＨＰＶ１６ウイルスのＥ６およびＥ７抗原がＨＬＡ分子によって効果的に提示され、特異的ＴＣＲによって認識される潜在的抗原性標的になることを見出した。したがって、ＨＰＶ１６、特にＨＰＶ１６ Ｅ７抗原を特異的に標的にするＴＣＲ産生物を開発する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本開示は、ＨＰＶ１６ Ｅ７抗原、特にＨＰＶ１６ Ｅ７１１－１９エピトープまたは、エピトープとＭＨＣ分子との複合体、例えば、ＨＰＶ１６ Ｅ７１１－１９エピトープとＨＬＡ－Ａ＊０２との複合体に特異的に結合する新規抗原結合タンパク質を提供する。本開示の抗原結合タンパク質は、ＴＣＲまたはその抗原結合断片の形態であってよい。本開示の抗原結合タンパク質は、高親和性で標的抗原ペプチドに結合することができ、良好な発現安定性を有し、抗原陽性標的細胞に対するエフェクター細胞の特異的殺効果を媒介することができる。

【課題を解決するための手段】

【0007】

したがって、一態様では本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＶＩＳＡＧＴＡＬＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記エピトープとＭＨＣ分子との複合体に結合する、抗原結合タンパク質を提供する。

【0008】

別の態様では、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＳＳＬＧＷＲＧＧＬＹＴＥＡＦ（配列番号８）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記エピトープとＭＨＣ分子との複合体に結合する、抗原結合タンパク質を提供する。

【0009】

さらに別の態様では、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＶＩＳＡＧＴＡＬＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み；前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＳＳＬＧＷＲＧＧＬＹＴＥＡＦ（配列番号８）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記エピトープとＭＨＣ分子との複合体に結合する、抗原結合タンパク質を提供する。

【0010】

一部の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２型、例えば、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０３型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０５型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０７型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１０型またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：１１型である。

【0011】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、および／またはＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。

【0012】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含む；ならびに／あるいはＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するベータ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含む。

【0013】

別の態様では、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む；ならびに／または前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するベータ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、抗原結合タンパク質を提供する。

【0014】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ならびにＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するベータ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。

【0015】

本開示の抗原結合タンパク質の一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号４に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、および／またはＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号９に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0016】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号４に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、およびＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号９に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0017】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む、および／またはＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含み、およびＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。

【0018】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は第１のポリペプチドに含有され、ＴＣＲβ鎖可変領域は異なる第２のポリペプチドに含有される。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域は、単一のポリペプチドに含有される。

【0019】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は可溶性または膜結合型である。

【0020】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｆｃポリペプチドまたはその抗原結合断片から選択される。

【0021】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＴＣＲまたはその抗原結合断片であり、抗原結合タンパク質はＴＣＲ定常領域またはその断片をさらに含む。

【0022】

一部の実施形態では、ＴＣＲ定常領域は、ムリン（ｍｕｒｉｎｅ）定常領域またはヒト定常領域である。

【0023】

一部の実施形態では、ＴＣＲ定常領域は、ＴＣＲアルファ鎖定常領域および／またはＴＣＲベータ鎖定常領域を含み；好ましくは、前記ＴＣＲアルファ鎖定常領域および／またはＴＣＲベータ鎖定常領域は、前記ＴＣＲアルファ鎖と前記ＴＣＲベータ鎖との間にジスルフィド結合を形成するように、野生型配列と比較して少なくとも１つのシステイン変異を含む。

【0024】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖定常領域は、配列番号１４～１９のいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、および／またはＴＣＲベータ鎖定常領域は、配列番号２１～３０のいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0025】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖定常領域は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、ＴＣＲベータ鎖定常領域は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0026】

一部の実施形態では、ＴＣＲ定常領域の前記断片は前記ＴＣＲ定常領域の細胞外セグメントである。

【0027】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、膜貫通領域および／または細胞質領域をさらに含む。

【0028】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３２～３７から選択されるいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲアルファ鎖；および／または配列番号３８～４７から選択されるいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲベータ鎖を含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３２～３７から選択されるいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲアルファ鎖；および配列番号３８～４７から選択されるいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲベータ鎖を含む。

【0029】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は細胞内シグナル伝達領域をさらに含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、他の抗原またはエピトープに結合する１つ以上の抗原結合領域（複数可）をさらに含む。

【0030】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は単離されるか、または精製される。

【0031】

さらなる態様では、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質をコードする核酸を提供する。

【0032】

一部の実施形態では、核酸は、配列番号５に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列、および／または配列番号１０に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号５に示されるアミノ酸配列および配列番号１０に示されるヌクレオチド配列を含む。

【0033】

一部の実施形態では、核酸は、配列番号２０に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列、および／または配列番号３１に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列および配列番号３１に示されるヌクレオチド配列をさらに含む。

【0034】

別の態様では、本開示は、本開示の核酸を含むベクターを提供する。

【0035】

一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、プラスミド、ＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、トランスポゾンに基づくベクターおよび人工染色体からなる群から選択される。

【0036】

さらに別の態様では、本開示は、本開示による抗原結合タンパク質、核酸またはベクターを含む細胞を提供する。

【0037】

一部の実施形態では、細胞は、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、単球（例えば、ＰＢＭＣ）および幹細胞からなる群から選択される。一部の実施形態では、幹細胞は、リンパ球系前駆細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0038】

一部の実施形態では、細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は内在性ＴＣＲを発現しない。

【0039】

別の態様では、本開示は、本開示のベクターを用いて細胞を形質導入するか、またはトランスフェクトするステップを含む、本開示の細胞を調製する方法を提供する。

【0040】

一部の実施形態では、方法は、形質導入またはトランスフェクトの前または後に細胞を増やす、および／または活性化するステップをさらに含む。

【0041】

別の態様では、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質および前記抗原結合タンパク質にカップルしているかまたはコンジュゲートしている活性剤を含むコンジュゲートを提供する。

【0042】

一部の実施形態では、活性剤は、検出可能なマーカー、免疫賦活性分子および治療剤からなる群から選択され；好ましくは、前記検出可能なマーカーは、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素またはその触媒的に活性な断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、核酸プローブ、造影剤および蛍光性分子、リン光性分子または化学発光分子からなる群から選択され；好ましくは、前記免疫賦活性分子は、サイトカイン、ケモカイン、血小板因子および補体開始因子からなる群から選択され；好ましくは、前記治療剤は、免疫調節物質、放射活性化合物、酵素、化学療法薬および毒素からなる群から選択される。

【0043】

別の態様では、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質、核酸、ベクター、または細胞を含む組成物であって；好ましくは、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む、組成物を提供する。

【0044】

一部の実施形態では、組成物は、第２の治療剤をさらに含み、好ましくは前記第２の治療剤は抗体、化学療法薬および小分子薬からなる群から選択される。

【0045】

さらに別の態様では、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、前記対象におけるＨＰＶ陽性疾患を処置するか、または予防する方法を提供する。

【0046】

別の態様では、本開示は、本開示の細胞の有効量を対象に投与することを含む、対象におけるＨＰＶ陽性状態を処置するか、または予防する方法を提供する。

【0047】

本開示の処置方法の一部の実施形態では、細胞は対象について自家性または同種である。

【0048】

一部の実施形態では、方法は、（ｉ）対象由来の細胞を含有する試料を単離するステップ；（ｉｉ）本開示のベクターを用いて前記細胞を形質導入するか、またはトランスフェクトするステップ；および（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において得られた細胞を前記対象に投与するステップ、のステップを含む。一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｉ）の後でステップ（ｉｉ）の前に細胞中の内在性ＴＣＲをノックアウトするステップをさらに含む。

【0049】

一部の実施形態では、ＨＰＶ陽性疾患は、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ前悪性腫瘍（ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）およびＨＰＶがんからなる群から選択される。好ましくは、がんは、子宮頸がん、頭頸部がん、中咽頭がん、食道腺癌、肛門がん、肛門管がん、直腸がん、膣がん、外陰部がんおよび陰茎がんからなる群から選択される。

【0050】

一部の実施形態では、方法は、第２の治療剤を投与することをさらに含み、好ましくは、前記第２の治療剤は抗体、化学療法薬および小分子薬からなる群から選択される。

【0051】

本開示の処置方法の一部の実施形態では、対象は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０７、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１０またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：１１対立遺伝子を有する。

【0052】

別の態様では、本開示は、（ｉ）対象から得られた試料を本開示の抗原結合タンパク質、細胞またはコンジュゲートと接触させるステップ；および（ｉｉ）前記試料中のＨＰＶ抗原の存在を検出するステップであって、ＨＰＶ抗原の存在がＨＰＶ陽性疾患を示すステップを含む、対象におけるＨＰＶ陽性疾患を検出する（例えば、診断する）方法を提供する。一部の実施形態では、ＨＰＶ陽性疾患は、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ前悪性腫瘍およびＨＰＶがんからなる群から選択される。好ましくは、がんは、子宮頸がん、頭頸部がん、中咽頭がん、食道腺癌、肛門がん、肛門管がん、直腸がん、膣がん、外陰部がんおよび陰茎がんからなる群から選択される。

【0053】

さらに別の態様では、本開示は、本開示による抗原結合タンパク質またはコンジュゲートを含むキットであって、試験される試料中の陽性エピトープの存在を検出するために使用され、前記エピトープがＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）を含むエピトープである、キットを提供する。

【0054】

具体的な一実施形態では、キットは、対象におけるＨＰＶ陽性疾患を検出（例えば、診断）するために使用され、キットは、本開示の抗原結合タンパク質またはコンジュゲートを含む。一部の実施形態では、ＨＰＶ陽性疾患は、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ前悪性腫瘍およびＨＰＶがんからなる群から選択される。好ましくは、がんは、子宮頸がん、頭頸部がん、中咽頭がん、食道腺癌、肛門がん、肛門管がん、直腸がん、膣がん、外陰部がんおよび陰茎がんからなる群から選択される。

【0055】

別の態様では、本開示は、対象においてＨＰＶ陽性疾患を処置するか、または予防するための医薬の調製における本開示の抗原結合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物の使用を提供する。

【0056】

さらに別の態様では、本開示は、対象においてＨＰＶ陽性疾患を処置すること、または予防することにおける使用のための本開示の抗原結合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物を提供する。

【0057】

別の態様では、本開示は、試験される試料中の陽性エピトープの存在を検出する（例えば、診断する）ためのキットの調製における本開示の抗原結合タンパク質またはコンジュゲートの使用であって、前記エピトープがＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）を含むエピトープであり、例えば、対象においてＨＰＶ陽性疾患を検出する（例えば、診断する）ための使用を提供する。

【0058】

さらに別の態様では、本開示は、試験される試料中の陽性エピトープの存在を検出する（例えば、診断する）ことにおける使用のための本開示の抗原結合タンパク質またはコンジュゲートであって、前記エピトープがＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）を含むエピトープであり、例えば、対象においてＨＰＶ陽性疾患を検出する（例えば、診断する）ことにおける使用のための抗原結合タンパク質またはコンジュゲートを提供する。

【0059】

本開示の使用の一部の実施形態では、ＨＰＶ陽性疾患は、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ前悪性腫瘍およびＨＰＶがんからなる群から選択される。好ましくは、がんは、子宮頸がん、頭頸部がん、中咽頭がん、食道腺癌、肛門がん、肛門管がん、直腸がん、膣がん、外陰部がんおよび陰茎がんからなる群から選択される。一部の実施形態では、がんはＨＰＶ１６陽性である。一部の実施形態では、対象はＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０７、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１０またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：１１対立遺伝子を有する。

【図面の簡単な説明】

【0060】

【図1】ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲのスクリーニング工程および初期特徴付けを示す図である。（Ａ）ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲのスクリーニングおよびクローニング；（Ｂ）ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲ（ＣＲＴＥ７Ａ２）は、フローサイトメトリーによって決定されたとおり、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１提示ＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}エピトープを特異的に認識する。

【図2】フローサイトメトリーによって決定された、標的抗原ペプチド（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ）（配列番号１１）に対するＣＲＴＥ７Ａ２の結合親和性を示す図である。ＫＩＴＥ－４３９は対照として使用された。

【図3】フローサイトメトリーによって決定されたＣＲＴＥ７Ａ２およびＫＩＴＥ－４３９ ＴＣＲ－Ｔ細胞の表現型を示す図である。

【図4A】抗原陽性腫瘍細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の特異的殺傷を示す図である。（Ａ）陽性標的細胞および陰性標的細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の殺効果。

【図4B】抗原陽性腫瘍細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の特異的殺傷を示す図である。（Ｂ）抗原陽性腫瘍細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の特異的殺効果。ＫＩＴＥ－４３９ ＴＣＲ－Ｔは対照として使用された。

【図5】ＩＦＮ－γ分泌アッセイによって決定された抗原陽性腫瘍細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の特異的殺効果を示す図である。

【図6】抗原陽性腫瘍細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γの特異的分泌を示す図である。ＫＩＴＥ－４３９ ＴＣＲ－Ｔは対照として使用された。

【図7】ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定された抗原陽性標的細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞のＩＦＮ－γの特異的分泌を示す図である。各群は、少なくとも２回反復された。

【図8】ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の抗原特異的増殖を示す図である。

【図9】Ｈｅｌａ細胞移植腫瘍に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0061】

他に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、本明細書において使用される用語は、ジェーンウエイ ＣＡ Ｊｒ（Ｊａｎｅｗａｙ ＣＡ Ｊｒ）、トラバー Ｐ（Ｔｒａｖｅｒｓ Ｐ）、ウォルポート Ｍ（Ｗａｌｐｏｒｔ Ｍ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＧａｒｌａｎｄＳｃｉｅｎｃｅ（２００１）およびローエンベルガー Ｈ．Ｇ．Ｗ（Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｗ）、ナゲル Ｂ（Ｎａｇｅｌ，Ｂ．）およびケルブル Ｈ．（Ｋｏｌｂｌ，Ｈ．）ｅｄｓ（１９９５），Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ），Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにおいて定義されるとおりである。

【0062】

本明細書において、および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ／ｔｈｅ」が、文脈が明確に他に定義されない限り複数形を含むことは留意されるべきである。したがって、用語「ａ」、「ａｎ」、「１つ以上の」および「少なくとも１つ」は、互換的に使用され得る。同様に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「有する」は、互換的に使用され得る。

【0063】

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」が本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために、用語「～からなる」は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」の好ましい実施形態であると考えられる。群が、少なくともある特定の数の実施形態を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）として下に定義される場合、好ましくはこれらの実施形態だけからなる群を開示するとしても理解される。

【0064】

一態様では、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＶＩＳＡＧＴＡＬＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記エピトープとＭＨＣ分子との複合体に結合する、抗原結合タンパク質を提供する。

【0065】

別の態様では、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＳＳＬＧＷＲＧＧＬＹＴＥＡＦ（配列番号８）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記エピトープとＭＨＣ分子との複合体に結合する、抗原結合タンパク質を提供する。

【0066】

さらに別の態様では、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＶＩＳＡＧＴＡＬＩ（配列番号３）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み；前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が、アミノ酸配列：ＡＳＳＬＧＷＲＧＧＬＹＴＥＡＦ（配列番号８）を有するＣＤＲ３、または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含み、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）のアミノ酸配列を含むエピトープまたは前記エピトープとＭＨＣ分子との複合体に結合する、抗原結合タンパク質を提供する。

【0067】

本明細書において使用される場合、用語「抗原結合タンパク質」は、本明細書において開示される少なくとも１つのＴＣＲアルファ鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ３α）および／または少なくとも１つのＴＣＲベータ鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ３β）を含み、抗原性標的ＨＰＶ Ｅ７に結合することができるタンパク質またはポリペプチドを指す。さらに本明細書において検討されるのは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、アルファ鎖可変領域、ベータ鎖可変領域、アルファ鎖および／もしくはベータ鎖の内の少なくとも１個またはこれらの組合せを、任意選択で本明細書に列挙される他のタンパク質ドメインまたは一部との組合せで含む抗原結合タンパク質である。

【0068】

本明細書において使用される場合、用語「機能性バリアント」は、親ポリペプチドに顕著な配列同一性を有し、親ポリペプチドの生物学的活性を保持しているポリペプチドを指す。機能性バリアントは、親ポリペプチドと同様の程度で、親ポリペプチドと同じ程度で、または親ポリペプチドより高い程度でＨＰＶ１６ Ｅ７抗原に特異的に結合する能力を保持している、本明細書に記載されるポリペプチドまたはタンパク質のバリアントを例えば包含する。機能性バリアントのアミノ酸配列は、例えば、親ポリペプチドのものに少なくとも約５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．２％、９８．４％、９８．６％、９８．８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはさらに高い配列同一性を有し得る。

【0069】

用語「エピトープ」は、結合ドメインによって認識される抗原上の部位、通常、（ポリ）ペプチドを通常指す。用語「結合ドメイン」は、その広義では、「抗原結合部位」、すなわち、抗原性標的上の特定のエピトープに結合する／相互作用する分子を特徴付けるドメインを指す。抗原性標的は、単一のエピトープを含み得るが、抗原の大きさ、コンフォメーションおよび種類に応じて少なくとも２個のエピトープを典型的には含み、抗原性標的は任意の数のエピトープを含み得る。用語「エピトープ」は、リニアエピトープおよびコンフォメーショナルエピトープの両方を典型的には含む。リニアエピトープは、アミノ酸の一次配列に含有される近接エピトープであり、少なくとも２個以上のアミノ酸を典型的には含む。コンフォメーショナルエピトープは、標的抗原、特に標的（ポリ）ペプチドのフォールディングによって並置された非近接アミノ酸によって形成される。

【0070】

本発明の内容では、用語「結合ドメイン」は、特に、ＴＣＲアルファ鎖および／またはベータ鎖の可変領域、特にＴＣＲのＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βを指す。

【0071】

本明細書において使用される場合、用語「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、天然のＴＣＲおよびＴＣＲバリアント、断片および構築物を含む。それにより用語は、ＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖を含むヘテロ二量体および多量体および１本鎖構築物を含み；任意選択で、抗原結合タンパク質が抗原性標的（好ましくは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２とのその複合体）を認識するその能力を保持している限り、他のドメインおよび／または部分を含む。

【0072】

天然形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞の表面でいくつかのタンパク質の複合体として存在する。Ｔ細胞受容体は、別々のＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子によって産生され、アルファ鎖およびベータ鎖と呼ばれる２種の（別々の）タンパク質鎖からなる。ＴＣＲの各鎖は、Ｎ末端免疫グロブリン様（Ｉｇ）可変（Ｖ）領域／ドメイン、Ｉｇ定常（Ｃ）領域／ドメイン、鎖を細胞膜にしっかり固定する膜貫通／細胞膜貫通領域、およびＣ末端の短い細胞質側末端を有する。

【0073】

抗原特異性は、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変領域によって付与される。ＴＣＲα鎖およびβ鎖の両方の可変領域は、フレームワーク（ＦＲ）領域に囲まれた３個の高度に可変性の領域または相補性を決定する領域（ＣＤＲ１α／β、ＣＤＲ２α／βおよびＣＤＲ３α／β）を含有する。ＣＤＲ３は、抗原認識および特異性（すなわち、特定の抗原を認識し、相互作用する能力）についての主な決定因子であり、一方ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、抗原ペプチドを提示するＭＨＣ分子と主に相互作用する。

【0074】

天然のＴＣＲは、抗原提示細胞（「ＭＨＣ分子に提示する／示す」）の表面で主要組織適合抗原（ＭＨＣ）分子に結合する抗原ペプチドを認識する。ＭＨＣ分子上に提示される抗原ペプチドは、本明細書において「エピトープとＭＨＣ分子との複合体」、「エピトープ－ＭＨＣ複合体」または「標的抗原ペプチド－ＭＨＣ複合体」とも称される。ＭＨＣ分子の２種の異なるクラス：ＭＨＣ ＩおよびＭＨＣ ＩＩがあり、異なる細胞コンパートメント由来のペプチドを提示する。ＭＨＣクラスＩ分子は、ヒトのすべての有核細胞の表面に発現され、細胞内コンパートメント由来のペプチドまたはタンパク質断片を細胞傷害性Ｔ細胞に提示する。ヒトでは、ＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）としても周知である。ＭＨＣクラスＩ分子の３種の主な種類：ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＢおよびＨＬＡ－Ｃがある。ＴＣＲがその特異的エピトープ－ＭＨＣ複合体に結合すると、Ｔ細胞は活性化され、生物学的なエフェクター機能を発揮する。

【0075】

下にさらに詳細に考察されるとおり、本明細書において提供されるＴＣＲは、ＨＰＶ１６ Ｅ７抗原、特にＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}エピトープまたはエピトープとＭＨＣ分子との複合体、例えば、ＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}エピトープとＨＬＡ－Ａ^＊０２との複合体を有利に（特異的に）認識することができる。

【0076】

本開示の抗原結合タンパク質の一部の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２型、例えば、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０３型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０５型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０７型、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１０型またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：１１型である。

【0077】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、および／またはＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。

【0078】

以前記載されたとおり、ＴＣＲα鎖およびβ鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２が、ＭＨＣ認識に主に関与することは同定されている。ＨＬＡ－Ａ^＊０２拘束性抗原認識に関与することが周知であるＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列の限定的な「プール」がある。抗原結合タンパク質が、添付の実施例において評価されたＴＣＲと同様に、同じにまたはさらに高い程度で抗原性標的（好ましくは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２とのその複合体）を認識するその能力を保持している限り、本発明のＣＤＲ３ドメインが、配列番号１～２および６～７に示されるＣＤＲ１およびＣＤＲ２のいずれか１個と原理的に組み合わされ得ることは予測される。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２ドメインの利用可能な例として、配列番号１に示される配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ１α、配列番号２に示される配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ２α、配列番号６に示される配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ１β、および配列番号７に示される配列を含むかまたはそれからなるＣＤＲ２βが挙げられる。

【0079】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含む；ならびに／あるいはＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するベータ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３または１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換によって形成されるその機能性バリアントを含む。

【0080】

別の態様では、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質であって、前記ＴＣＲアルファ鎖可変領域が配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む；ならびに／または前記ＴＣＲベータ鎖可変領域が配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するベータ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗原結合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号１、配列番号２および配列番号３にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含み；ならびにＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号６、配列番号７および配列番号８にそれぞれ示されるアミノ酸配列を有するベータ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。

【0081】

本開示の抗原結合タンパク質の一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号４に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0082】

本開示の抗原結合タンパク質の一部の実施形態では、ＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号９に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0083】

本明細書において使用される場合、用語「配列同一性」は、２種の（ヌクレオチドまたはアミノ酸）配列がアライメントにおいて同じ残基を同じ位置に有する程度を示し、典型的には百分率で表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全長にわたって決定される。したがって、同一の配列を有する２個の複製物は１００％同一性を有する一方で、あまり高度に保存されておらず、欠失、付加または置換を有する配列は同一性の程度は低い。当業者は、多数のアルゴリズム、例えば、Ｂｌａｓｔ（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）およびＣｌｕｓｔａｌＷが、標準的パラメーターを使用して配列同一性を決定するために使用され得ることを認識するであろう。

【0084】

それにより、配列番号４または９のアミノ酸配列は、例えば「対象配列」または「参照配列」であり得る一方で、ＴＣＲアルファ鎖またはベータ鎖可変領域の異なるアミノ酸配列は、「問い合わせ配列」であり得る。

【0085】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は配列番号４に示されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＴＣＲベータ鎖可変領域は配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。

【0086】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域は第１のポリペプチドに含有され、ＴＣＲβ鎖可変領域は異なる第２のポリペプチドに含有される。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖可変領域およびＴＣＲベータ鎖可変領域は、単一のポリペプチドに含有される。

【0087】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は可溶性または膜結合型である。

【0088】

本発明の抗原結合タンパク質は、可溶性形態で、例えば、可溶性ＴＣＲの形態で提供されてもよい。可溶性ＴＣＲ（ｓＴＣＲ）は、診断ツールとして、および、例えば可溶性ＴＣＲによって認識される抗原性標的を発現しているがん細胞に治療剤またはエフェクター細胞を特異的に標的化するためのベクターまたは「アダプター」として使用され得る。可溶性ＴＣＲは、典型的には、ＴＣＲアルファ鎖および／もしくはベータ鎖またはその可変領域もしくはＣＤＲを含む断片または構築物であり、任意選択でジスルフィド結合によって安定化されるか、または適切なリンカーにより共有結合で連結される。典型的には、可溶性ＴＣＲは例えば、膜貫通領域は含まない。

【0089】

本発明の抗原結合タンパク質は、膜結合型形態、例えば、膜結合型ＴＣＲの形態でも提供され得る。典型的には、膜結合型ＴＣＲは、それを細胞膜にしっかり固定する膜貫通領域を含む。

【0090】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｆｃポリペプチドまたはその抗原結合断片から選択される。

【0091】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＴＣＲまたはその抗原結合断片であり、抗原結合タンパク質はＴＣＲ定常領域またはその断片をさらに含む。

【0092】

本明細書において使用される場合、用語「定常領域」は、ヒト定常領域であってよく、または他の種由来で、「キメラ」ＴＣＲを生じてよい。例えば、ヒトα鎖および／またはβ鎖は、それらのムリン対応物によって置き換えられてよく（「ムリン由来」）、ムリン対応物は、ヒトＴＣＲの表面発現を増強し、ＴＣＲα鎖とβ鎖との優先的対合を支持することによってヒトＴＣＲのＣＤ３共受容体への結合安定性を増強することが見出された。

【0093】

一部の実施形態では、ＴＣＲ定常領域は、ムリン定常領域またはヒト定常領域である。

【0094】

定常領域へのジスルフィド結合の追加は、ＴＣＲα鎖とβ鎖との正しい対合を促進できることが報告された（クバール Ｊ（Ｋｕｂａｌｌ Ｊ）ら、Ｂｌｏｏｄ．２００７ Ｍａｒ １５；１０９（６）：２３３１－８）。したがって、本発明は、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖との間にジスルフィド結合を形成するための１つ以上のシステイン改変の定常領域への追加も予測する。

【0095】

一部の実施形態では、ＴＣＲ定常領域は、ＴＣＲアルファ鎖定常領域および／またはＴＣＲベータ鎖定常領域を含み；好ましくは、前記ＴＣＲアルファ鎖定常領域および／またはＴＣＲベータ鎖定常領域は、前記ＴＣＲアルファ鎖と前記ＴＣＲベータ鎖との間にジスルフィド結合を形成するように、野生型配列と比較して少なくとも１つのシステイン変異を含む。

【0096】

一部の実施形態では、システイン変異は、以下の位置：野生型ヒトＴＣＲアルファ鎖定常領域の４８位、野生型ムリンＴＣＲアルファ鎖定常領域の４８位、野生型ヒトＴＣＲベータ鎖定常領域の５７位および野生型ムリンＴＣＲベータ鎖定常領域の５７位の１つ以上においてである。

【0097】

野生型ＴＣＲ定常領域の配列は、ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）の公開データベースに見出され得る。例えば、ＴＣＲアルファ鎖定常ドメインの配列は、「ＴＲＡＣ^＊０１」であり、ＴＣＲベータ鎖定常ドメインの配列は、「ＴＲＢＣ１^＊０１」または「ＴＲＢＣ２^＊０１」である。

【0098】

システイン変異の位置の記載を容易にするために、本発明において野生型ＴＣＲ定常領域のアミノ酸配列の位置は、ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）の命名法に従って番号付ける。例えば、ＴＣＲアルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）中のアミノ酸がＩＭＧＴにおいて４８の位置番号で指定される場合、本明細書においてＴＣＲアルファ鎖定常領域（ＴＲＡＣ）の４８位のアミノ酸として記載され；ＴＣＲベータ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）中のアミノ酸がＩＭＧＴにおいて５７の位置番号で指定される場合、本明細書においてＴＣＲベータ鎖定常領域（ＴＲＢＣ）の５７位のアミノ酸として記載される；など。本明細書において、可変領域ＴＲＡＶおよびＴＲＢＶのアミノ酸配列の位置番号付けは、ＩＭＧＴに列挙される位置番号付けに基づく。ＴＲＡＶ中のアミノ酸がＩＭＧＴにおいて４６の位置番号で指定される場合、本明細書においてＴＲＡＶの４６位のアミノ酸として記載される；など。他のアミノ酸の配列位置番号付けが本発明において具体的に記載される場合、それらは具体的に記載されるとおり番号付けられる。

【0099】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖定常領域は、定常領域（および／または、膜貫通領域）がアミノ酸配列ＬＬＶＩＶＬＲＩＬを含むようにＬＶＬ変異またはＬＩＶ変異をさらに含む。例えば、ＴＣＲアルファ鎖がヒト定常領域を含む場合、ヒト定常領域は、定常領域（および／または、膜貫通領域）がアミノ酸配列ＬＬＶＩＶＬＲＩＬを含むようにＬＶＬ変異を含み得る。ＴＣＲアルファ鎖がムリン定常領域を含有する場合、ムリン定常領域は、定常領域（および／または、膜貫通領域）がアミノ酸配列ＬＬＶＩＶＬＲＩＬを含むようにＬＩＶ変異を含み得る。

【0100】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖定常領域は、配列番号１４～１９のいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、および／またはＴＣＲベータ鎖定常領域は、配列番号２１～３０のいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0101】

一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖定常領域は配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含み、ＴＣＲベータ鎖定常領域は配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む。

【0102】

一部の実施形態では、ＴＣＲ定常領域の前記断片はＴＣＲ定常領域の細胞外セグメントである。

【0103】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、アルファ鎖およびベータ鎖を含むＴＣＲである。一部の実施形態では、ＴＣＲアルファ鎖および／またはベータ鎖は、リーダー配列を含み得る。例えば、ＴＣＲアルファ鎖のリーダー配列は、配列番号１２に示されるアミノ酸配列（ＭＩＳＬＲＶＬＬＶＩＬＷＬＱＬＳＷＶＷＳＱ）を有し得る。ＴＣＲベータ鎖のリーダー配列は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列（ＭＧＰＧＬＬＣＷＡＬＬＣＬＬＧＡＧＬＶ）を有し得る。ＴＣＲアルファ鎖のリーダー配列は、配列番号４８において示されるヌクレオチド配列（ＡＴＧＡＴＡＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＴＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＡＧＴＴＡＡＧＣＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＧＣＣＡＡ）によってコードされ得る。ＴＣＲβ鎖のリーダー配列は、配列番号４９において示されるヌクレオチド配列（ＡＴＧＧＧＣＣＣＣＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＣＴＧＧＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＴＡＧＴＧ）によってコードされ得る。

【0104】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、膜貫通領域および／または細胞質領域をさらに含む。

【0105】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３２～３７から選択されるいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲアルファ鎖；および／または配列番号３８～４７から選択されるいずれか１つに少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲベータ鎖を含む。

【0106】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は細胞内シグナル伝達領域をさらに含む。一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、他の抗原またはエピトープに結合する１つ以上の抗原結合領域（複数可）をさらに含む。

【0107】

一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は単離されるか、または精製される。

【0108】

本明細書において使用される場合、用語「単離されるか、または精製される」は、「単離されるか、または精製される」抗原結合タンパク質が、それが産生される環境由来で、治療用または診断用使用を妨げる可能性がある他の混入構成成分を含まないか、または実質的に含まないように「単離されるか、または精製される」抗原結合タンパク質が、それが産生される環境の構成成分から同定された、単離された、および／または回収されたことを意味する。混入構成成分として、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質または非タンパク質溶質が挙げられる。したがって、「単離されるか、または精製される」抗原結合タンパク質は、これらの混入構成成分を除去するか、または実質的に除去する少なくとも１つの精製ステップによって調製され得る。さらに別の態様では、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質をコードする核酸を提供する。

【0109】

一部の実施形態では、核酸は、配列番号５に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列、および／または配列番号１０に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、核酸は、配列番号２０に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列、および／または配列番号３１に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％配列同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含む。

【0110】

別の態様では、本開示は、本開示の核酸を含むベクターを提供する。

【0111】

本明細書において使用される場合、用語「ベクター」は、ベクターとしての核酸分子が、例えば複製および／または発現され得る宿主細胞に（外来性）遺伝子材料を移行するためのビヒクルとして使用される核酸分子である。用語「ベクター」は、これだけに限らないが、プラスミド、ウイルスベクター（レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、牛痘ウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が挙げられる）、ファージ、ファスミド（ｐｈａｓｍｉｄ）、コスミドおよび人工染色体（ＢＡＣおよびＹＡＣが挙げられる）を包含する。ベクター自体は、通常ヌクレオチド配列であり、挿入物（導入遺伝子）およびベクターの「骨格」として作用するさらに大きな配列を含むＤＮＡ配列を通常含む。操作されたベクターは、宿主細胞における自己複製のための起点（ポリヌクレオチドの安定な発現が望ましい場合）、選択マーカーおよび制限酵素切断部位（例えば、ポリクローナル部位、ＭＣＳ）を通常含む。ベクターは、プロモーター、遺伝子マーカー、レポーター遺伝子、標的配列および／またはタンパク質精製タグを追加的に含み得る。当業者に周知のとおり、多数の好適なベクターが当業者に周知であり、多くが市販で入手可能である。好適なベクターの例は、その全体を本願に引用して援用する、Ｊ．サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０１２）に提供されている。

【0112】

一部の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、プラスミドおよびＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、トランスポゾンに基づくベクターおよび人工染色体からなる群から好ましくは選択される。

【0113】

さらに別の態様では、本開示は、本開示による抗原結合タンパク質、核酸またはベクターを含む細胞を提供する。

【0114】

本明細書において使用される場合、用語「細胞」は、本開示の抗原結合タンパク質を発現することができる任意の種類の細胞を指す。細胞は、真核細胞、例えば、植物細胞（植物に発達する潜在力を有しない）、動物細胞、菌類細胞または藻類細胞であってよい、または原核細胞、例えば、細菌細胞または原虫細胞であってよい。細胞は、培養細胞または初代細胞、すなわち、生物、例えばヒトから直接単離された細胞であり得る。細胞は、接着細胞または浮遊細胞、すなわち懸濁液中で増殖する細胞であり得る。好適な宿主細胞は、当技術分野において周知であり、例えば、ＤＨ５α Ｅ． ｃｏｌｉ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、サルＶＥＲＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などが挙げられる。本開示の抗原結合タンパク質を産生する目的のために、細胞は、好ましくは哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞は、ヒト細胞である。

【0115】

一部の実施形態では、細胞は、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、単球（例えば、ＰＢＭＣ）および幹細胞からなる群から選択される。本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」は、本開示の抗原結合タンパク質（特に、ＴＣＲ）を発現するために使用される幹細胞である。例えば、幹細胞は、リンパ球系前駆細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または造血幹細胞（ＨＳＣ）であり得る。一部の実施形態では、幹細胞は、ヒトの胚を破壊することによって得られた胚性幹細胞を含まず、および／または個別の動物に発達およびそれを形成するために使用される全能性幹細胞を含まない。幹細胞が表面にＣＤ３分子を発現しないことから、幹細胞に遺伝子を移行させることは、細胞表面でのＴＣＲの発現を典型的には生じない。しかし、胸腺に移動するリンパ球系前駆細胞に幹細胞が分化する場合、ＣＤ３分子の発現は、胸腺細胞の表面での導入されたＴＣＲ分子の発現を開始する。

【0116】

一部の実施形態では、幹細胞は、リンパ球系前駆細胞または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0117】

一部の実施形態では、細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞などの任意のＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞または培養されたＴ細胞系、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴｌなど由来のＴ細胞、または哺乳動物から得られたＴ細胞であってよい。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、これだけに限らないが、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織もしくは体液が挙げられる多数の供給源から得られ得る。Ｔ細胞は、濃縮または精製されてもよい。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。さらに好ましくは、Ｔ細胞はヒトから単離されたＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意の種類のＴ細胞であってよく、これだけに限らないがＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えばＴｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞およびエフェクターメモリーＴ細胞）、ナイーブＴ細胞などが挙げられる任意の発達段階にあってよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞は内在性ＴＣＲを発現しない。

【0118】

本明細書に記載される抗原結合タンパク質（ＴＣＲなど）を発現するエフェクター細胞がその抗原性標的（好ましくは、ＨＬＡ－Ａ^＊０２に抗原提示細胞によって提示されるＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}エピトープ）に高い親和性で結合することは予測される。用語「親和性」または「結合親和性」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで所与の濃度でリガンドに応答して抗原結合タンパク質を発現する細胞（特に、本明細書に記載されるＴＣＲを発現するＴ細胞）の能力を指し、能力は、抗原結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ）を発現する細胞のｉｎ ｖｉｖｏエフェクター能力と相関すると考えられる。定義により、高い結合親和性を有する抗原結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ）を発現する細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非常に低い用量の抗原に応答する一方で、低い結合活性を有する細胞は、高い親和性を有する抗原結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ）を発現する細胞のものと同様の免疫応答が望ましい場合は、より多い量の抗原が必要である。したがって結合親和性は、抗原結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ）を発現する細胞の活性化閾値の定量的決定因子と考えられ得る。これは、そのような細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでさまざまな量の相同抗原に細胞を曝露することによって測定される。高い親和性を有して抗原結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ）を発現する細胞は、低い用量の抗原に応答する。例えば、抗原陰性ＨＬＡ－^＊０２－発現標的細胞と同時培養される場合に、ＴＣＲ発現細胞が少なくとも約２００ｐｇ／ｍＬ以上（例えば、２００ｐｇ／ｍＬ以上、３００ｐｇ／ｍＬ以上、４００ｐｇ／ｍＬ以上、５００ｐｇ／ｍＬ以上、６００ｐｇ／ｍＬ以上、７００ｐｇ／ｍＬ以上、１０００ｐｇ／ｍＬ以上、５，０００ｐｇ／ｍＬ以上、７，０００ｐｇ／ｍＬ以上、１０，０００ｐｇ／ｍＬ以上または２０，０００ｐｇ／ｍＬ以上）インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）を分泌する場合、ＴＣＲ発現細胞は、その抗原標的に「高」親和性で結合すると一般に考えられる。

【0119】

別の態様では、本開示は、本開示のベクターを用いて細胞を形質導入するか、またはトランスフェクトするステップを含む、本開示の細胞を調製する方法を提供する。

【0120】

本明細書において使用される場合、用語「トランスフェクション」は、核酸分子またはポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に意図的に導入する工程である。一例は、ＲＮＡトランスフェクション、すなわち、ＲＮＡ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）を宿主細胞に導入する工程である。この用語は、真核細胞における非ウイルス性の方法について主に使用される。用語「形質導入」は、核酸分子またはポリヌクレオチドのウイルス媒介移行を記載するために一般に使用される。動物細胞のトランスフェクションは、材料の取込みを可能にするために細胞膜に一過性のポアまたは「穴」を開けることを典型的には含む。トランスフェクションは、リン酸カルシウム、電気穿孔、細胞押出（ｃｅｌｌ ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）、を使用することによって、または細胞膜に融合し、それらの積荷を内側に沈着させるリポソームを産生するように陽イオン性脂質を材料と混合することによって実施され得る。真核宿主細胞をトランスフェクトするための例示的技術として、脂質ビヒクル媒介取込み（ｌｉｐｉｄ ｖｅｓｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ）、熱ショック媒介取込み、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈）、マイクロインジェクションおよび電気穿孔が挙げられる。

【0121】

一部の実施形態では、方法は、形質導入またはトランスフェクトの前または後に細胞を増やす、および／または活性化するステップをさらに含む。

【0122】

別の態様では、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質および前記抗原結合タンパク質にカップルしているかまたはコンジュゲートしている活性剤を含むコンジュゲートを提供する。

【0123】

一部の実施形態では、活性剤は、検出可能なマーカー、免疫賦活性分子および治療剤からなる群から選択される。好ましくは、前記検出可能なマーカーは、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素またはその触媒的に活性な断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、核酸プローブ、造影剤および蛍光発生的分子、リン光分子または化学発光分子からなる群から選択される。好ましくは、前記免疫賦活性分子は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γ）、ケモカイン（例えば、ＩＬ－８）、血小板因子（例えば、血小板第４因子）および補体開始因子からなる群から選択される。好ましくは、前記治療剤は、免疫調節物質、放射活性化合物、酵素、化学療法薬および毒素からなる群から選択される。他の好適な治療剤として、小分子細胞傷害剤、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有し、７００ダルトン未満の分子量を有する化合物が挙げられる。そのような化合物は、細胞傷害効果を有する毒性金属も含有し得る。加えて、これらの小分子細胞傷害剤として、薬物前駆体、すなわち、細胞傷害剤を放出するように生理的条件下で崩壊するか、または変換される化合物も挙げられることは理解されるべきである。そのような薬剤の例として、シスプラチン、メイテニン（ｍａｙｔｅｎｉｎ）誘導体、ラシェルマイシン、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イソサイクリックホスホリルアミン、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリン（ｓｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）ＩＩ、テモゾロミド、トポテカン、トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ）グルクロン酸、アウリスタチンＥ、ビンクリスチンおよびドキソルビシン；ペプチド細胞毒、すなわち、哺乳動物細胞を殺傷する能力を有するタンパク質もしくはその断片；例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌性外毒素Ａ、ＤｎａｓｅおよびＲＮａｓｅ；放射性核種、すなわち、崩壊の際にアルファもしくはベータ粒子またはガンマ線の１つ以上を発する元素の不安定同位体、例えば、ヨウ素－１３１、レニウム－１８６、インジウム－１１１、イットリウム－９０、ビスマス－２１０およびビスマス－２１３、アクチニウム－２２５およびアスタチン－２１３；これらの放射性核種の分子もしくはその多量体への結合を促進するために使用され得るキレート剤；または異種性タンパク質ドメイン、相同性タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌ペプチドが挙げられる。

【0124】

別の態様では、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質、核酸、ベクターまたは細胞を含む組成物を提供し、好ましくは、組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤をさらに含む。

【0125】

用語「組成物」は、ヒトへの投与のために好適な組成物を特に指す。しかし、用語は、非ヒト動物への投与のために好適な組成物も一般に包含する。組成物およびその構成成分（すなわち、活性剤および任意選択で担体または賦形剤）は、好ましくは薬学的に許容される、すなわち、レシピエントにおいていかなる望ましくない局所または全身性の影響も生じることなく、所望の治療効果を引き出すことができる。本発明の薬学的に許容される組成物は、例えば、滅菌されていてよい。具体的には、用語「薬学的に許容される」は、動物における、およびさらに詳細にはヒトにおける使用のために規制当局または他の承認された薬局方による認可を示し得る。

【0126】

用語「賦形剤」として、注入剤、接着剤、崩壊剤、コーティング剤、吸着剤、抗接着剤、流動助剤（ｆｌｏｗ ａｉｄ）、保存剤、抗酸化物質、香味剤、着色剤、甘味剤、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、粘度付与剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、担体、希釈剤、保存剤、乳化剤、安定剤および張力調整剤（ｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）が挙げられる。本発明の組成物を調製するために好適な賦形剤を選択することは当業者に周知である。本発明の組成物における使用のための例示的担体として、生理食塩水、緩衝生理食塩水、グルコースおよび水が挙げられる。典型的には、好適な賦形剤の選択は、特に、使用される活性剤、処置される疾患および組成物の望ましい投薬形態に依存する。

【0127】

用いられる活性剤（例えば、可溶性ＴＣＲ）に依存して、本開示の組成物は、種々の形態、例えば固体、液体、ガス状または凍結乾燥形態に製剤化され得る、特に、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉剤、錠剤、溶液、アエロゾル、顆粒剤、丸剤、懸濁物、乳液、カプセル、シロップ、液剤、エリキシル剤、注入剤、チンキもしくは流エキス剤（ｆｌｕｉｄ ｅｘｔｒａｃｔ）、または所望の投与方法のために特に好適な形態、であってよい。本発明に周知の薬剤生産の工程は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅｄ．ＭａａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２０１２）の第２２版に示されており、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣、粉砕、乳化、被包、包埋または凍結乾燥の従来の工程を含む。例えば、本明細書に記載される宿主細胞または可溶性ＴＣＲを含む組成物は、典型的には液体形態で提供され、薬学的に許容される緩衝剤を好ましくは含む。

【0128】

一部の実施形態では、本開示の組成物は、第２の治療剤をさらに含み、好ましくは前記第２の治療剤は抗体、化学療法薬および小分子薬からなる群から選択される。

【0129】

好ましい第２の治療剤の例として、周知の抗がん薬、例えば、シスプラチン、メイテニン誘導体、ラシェルマイシン、カリケアマイシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イソサイクリックホスホリルアミン、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンＩＩ、テモゾロミド、トポテカン、トリメトレキサートグルクロン酸、アウリスタチンＥ、ビンクリスチンおよびドキソルビシン；およびペプチド細胞毒、例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌性外毒素Ａ、ＤｎａｓｅおよびＲＮａｓｅ；放射性核種、例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０および２１３、アクチニウム２２５ならびにアスタチン２１３；プロドラッグ、例えば、抗体に方向付けられた酵素プロドラッグ；免賦活薬、例えば、ＩＬ－２、ケモカイン、例えば、ＩＬ－８、血小板第４因子；抗体またはその断片、例えば、抗ＣＤ３抗体またはその断片；補体開始因子（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）；異種性タンパク質ドメイン、相同性タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメインおよびウイルス／細菌ペプチドが挙げられる。

【0130】

さらに別の態様では、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、前記対象におけるＨＰＶ陽性疾患を処置するか、または予防する方法を提供する。

【0131】

別の態様では、本開示は、本開示の細胞の有効量を対象に投与することを含む、前記対象におけるＨＰＶ陽性疾患を処置するか、または予防する方法を提供する。

【0132】

本明細書において使用される場合、用語「処置」、「処置する」または「処置すること」は、それを必要とする対象における治療的または予防的処置を含む。用語「治療的または予防的処置」は、臨床的および／もしくは病理学的所見を完全に予防することを意図する予防的処置、または臨床的および／もしくは病理学的所見を改善もしくは軽減することを意図する治療的処置を含む。したがって、用語「処置」は、疾患の改善または予防も含む。

【0133】

本明細書において使用される場合、用語「有効量」は、疾患の処置または予防のために対象に投与された場合に、そのような処置または予防を達成するために十分な治療剤の量を指す。「有効量」は、化合物、疾患およびその重症度ならびに処置される対象の年齢、体重などに応じて変動する場合がある。「治療有効量」は、治療的処置のための有効量を指す。「予防的有効量」は、予防的処置のための有効量を指す。

【0134】

治療有効性および毒性は、細胞培養または実験動物などにおいてＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死性である用量）などの標準的手順によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は、治療指数であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の比として表され得る。大きな治療指数を示す医薬組成物は好ましい。

【0135】

投与される抗原結合タンパク質または細胞の正確な用量は、周知の技術を使用して当業者により決定され得る。好適な用量は、十分な量の本発明の活性剤を提供し、好ましくは治療的に有効である、すなわち、例えば、適正な期間内に対象または動物において治療的または予防的応答を誘発するために十分である。例えば、本発明の抗原結合タンパク質、例えばＴＣＲの用量は、がん抗原に結合するために、または投与の時期から約２時間以上、例えば、１２時間から２４時間以上の期間内（例えば、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、１２カ月、２４カ月など）にがんを検出する、処置する、または予防するために十分であるべきである。一部の実施形態では、期間はさらに長い場合がある。当技術分野において周知であるとおり、治療の目的（疾患の急性の発症の軽減など）、投薬経路、時期および頻度、製剤を投与する時期および頻度、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、疾患状態の重症度、薬物組合せ、応答の感受性および治療への耐性／応答に応じて調整が必要である場合がある。

【0136】

投与される用量を決定するための多数のアッセイが当技術分野において周知である。本発明の目的のために、哺乳動物の群に本開示の抗原結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ）を発現するＴ細胞の所与の用量を投与した後（それぞれ異なる用量のＴ細胞を投与される）に、そのようなＴ細胞によって達成された標的細胞溶解またはＩＦＮ－γ分泌の程度を比較することを含む、アッセイは、哺乳動物に投与される開始用量を決定するために使用され得る。所与の用量の投与後に達成された標的細胞溶解またはＩＦＮ－γ分泌の程度は、当技術分野において周知の方法によって決定され得る。本開示の抗原結合タンパク質または細胞の用量は、本開示の抗原結合タンパク質または細胞の投与に伴う場合がある任意の有害な副作用の存在、性質および程度によっても決定される。典型的には、個々の患者に投与される本開示の抗原結合タンパク質または細胞の用量は、年齢、体重、一般的健康、食事、性別、投与される活性剤、投与の経路および処置される医学的状態の重症度などの種々の要因を考慮して主治医によって決定される。本開示の処置方法の一部の実施形態では、注入あたりで投与される細胞の数は、例えば、細胞約１×１０^６個から約１×１０^１２個以上で変動する場合がある。一部の実施形態では、細胞１×１０^６個未満が投与される場合がある。

【0137】

処置が、本発明の活性剤の治療有効量の単回投与または複数回投与を必要とする場合があることは認識されるべきである。例えば、具体的な組成物の製剤、半減期およびクリアランスに依存して、一部の組成物は、３から４日ごと、毎週もしくは２週間ごとに投与されてよく、または１カ月間で１回投与されてよい。

【0138】

本開示の組成物は、種々の経路による投与のために好適であり得る。典型的には、投与は、非経口的に達成される。非経口的送達方法として、局所的、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、心臓内、静脈内、腹腔内、子宮内、腟内、舌下または、鼻腔内投与が挙げられる。

【0139】

用語「対象」または「個体」または「動物」または「患者」は本明細書において互換的に使用され、処置を必要とする任意の対象、特に哺乳動物対象を指す。一般に、哺乳動物対象として、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛などが挙げられる。しかし、本明細書において提供されるＴＣＲ、核酸、ベクター、宿主細胞および医薬組成物が、ヒト対象、特にＨＬＡ－Ａ^＊０２陽性である、例えばＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０７ ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１０またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：１１陽性であるヒト対象を処置するために使用されることが特に予測されることは容易に理解される。

【0140】

本開示の処置方法の一部の実施形態では、細胞は対象に自家性または同種である。

【0141】

一部の実施形態では、方法は、以下のステップ：（ｉ）対象由来の細胞を含有する試料を単離するステップ；（ｉｉ）本開示のベクターを用いて前記細胞を形質導入するか、またはトランスフェクトするステップ；および（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において得られた細胞を前記対象に投与するステップ、のステップを含む。一部の実施形態では、方法は、ステップ（ｉ）の後でステップ（ｉｉ）の前に細胞中の内在性ＴＣＲをノックアウトするステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、第２の治療剤を投与することをさらに含む。好ましくは第２の治療剤は、抗体、化学療法薬および小分子薬からなる群から選択される。第２の治療剤の好ましい例は、上に記載されている。

【0142】

本開示の処置方法の一部の実施形態では、ＨＰＶ陽性疾患は、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ前悪性腫瘍およびＨＰＶがんからなる群から選択される。がんは、任意のがんであってよく、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門がん、肛門管がんまたは直腸内肛門がん、眼がん、肝内胆管癌、関節がん、頸部がん、胆嚢がんまたは胸膜がん、鼻がん、鼻腔がんまたは中耳がん、口腔がん、腟がん、外陰部がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、胃腸管カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝がん、肺がん、悪性中皮腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、中咽頭がん、卵巣がん、陰茎がん、膵臓がん、腹膜がん、大網がんおよび腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸内がん、腎臓がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮がん、尿管がんおよび膀胱がんが挙げられる。好ましいがんは、ＨＰＶ１６陽性がんである。ＨＰＶ１６感染に最も一般的に関連するがんとして、子宮頸がん、中咽頭がん、肛門がん、肛門管がん、直腸肛門がん、腟がん、外陰部がんおよび陰茎がんが挙げられるが、本発明の方法は、他の解剖学的領域に存在するものを含んで、任意のＨＰＶ１６陽性がんを処置するために使用され得る。好ましくは、がんは、子宮頸がん、頭頸部がん、中咽頭がん、食道腺癌、肛門がん、肛門管がん、直腸内がん、腟がん、外陰部がんおよび陰茎がんからなる群から選択される。

【0143】

別の態様では、本開示は、対象においてＨＰＶ陽性疾患を検出する（例えば、診断する）方法であって（ｉ）対象から得られた試料を本開示の抗原結合タンパク質、細胞またはコンジュゲートと接触させること；および（ｉｉ）前記試料中のＨＰＶ抗原の存在を検出することであって、ＨＰＶ抗原の存在がＨＰＶ陽性疾患を示すこと、を含む方法を提供する。ＨＰＶ陽性疾患は、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ前悪性腫瘍およびＨＰＶがんからなる群から例えば選択され得る。がんは上に定義されたとおりである。

【0144】

一部の実施形態では、対象から得られる試料は、血液試料、尿試料、組織試料または細胞試料であり得る。一部の実施形態では、方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施される。一部の実施形態では、方法は、（ｉ）対象から得られた試料を本開示のコンジュゲートと接触させることであって、コンジュゲートが検出可能なマーカーを含むこと；および（ｉｉ）検出可能なマーカーを検出することによって試料中のＨＰＶ抗原の存在を検出することを含む。検出可能なマーカーの例として、これだけに限らないが、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素またはその触媒的に活性な断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、核酸プローブ、造影剤および蛍光発生的分子、リン光分子または化学発光分子；好ましくは、酵素またはその触媒的に活性な断片、放射性核種、蛍光発生的分子、リン光分子または化学発光分子が挙げられる。

【0145】

さらに別の態様では、本開示は、本開示による抗原結合タンパク質またはコンジュゲートを含む、試験される試料中の陽性エピトープの存在を検出するためのキットであって、前記エピトープがＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）を含むエピトープである、キットを提供する。

【0146】

一部の実施形態では、キットは、本開示の抗原結合タンパク質またはコンジュゲートを含む、対象におけるＨＰＶ陽性疾患を検出する（例えば、診断する）ためのキットである。ＨＰＶ陽性状態は、例えば、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ前悪性腫瘍およびＨＰＶがんからなる群から選択される。がんは上に定義されたとおりである。

【0147】

一部の実施形態では、コンジュゲートは検出可能なマーカーを含む。検出可能なマーカーの例として、これだけに限らないが、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素またはその触媒的に活性な断片、放射性核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、核酸プローブ、造影剤および蛍光発生的、リン光または化学発光分子；好ましくは、酵素またはその触媒的に活性な断片、放射性核種、蛍光発生的分子、リン光分子または化学発光分子が挙げられる。一部の実施形態では、キットは、キットをどのように使用するかについて説明書をさらに含む。

【0148】

別の態様では、本開示は、対象におけるＨＰＶ陽性疾患の処置または予防のための医薬の調製における抗原結合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または本開示の組成物の使用を提供する。

【0149】

さらに別の態様では、本開示は、対象におけるＨＰＶ陽性疾患の処置または予防における使用のための本開示の抗原結合タンパク質、核酸、ベクター、細胞または組成物を提供する。

【0150】

別の態様では、本開示は、試験される試料中の陽性エピトープの存在を検出するためのキットの調製における本開示の抗原結合タンパク質またはコンジュゲートの使用であって、前記エピトープがＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）を含むエピトープである使用を提供する。

【0151】

一部の実施形態では、本開示は、対象におけるＨＰＶ陽性疾患を検出する（例えば、診断する）ためのキットの調製における本開示の抗原結合タンパク質またはコンジュゲートの使用を提供する。

【0152】

さらに別の態様では、本開示は、試験される試料中の陽性エピトープの存在を検出することにおける使用のための本開示の抗原結合タンパク質またはコンジュゲートであって、前記エピトープがＹＭＬＤＬＱＰＥＴ（配列番号１１）を含むエピトープであり、例えば、対象においてＨＰＶ陽性疾患を検出する（例えば、診断する）ことにおける使用のためである抗原結合タンパク質またはコンジュゲートを提供する。

【0153】

本開示の使用の一部の実施形態では、対象は、ＨＬＡ－Ａ^＊０２対立遺伝子、例えば、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０７、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：１０またはＨＬＡ－Ａ^＊０２：１１対立遺伝子を有する。一部の実施形態では、ＨＰＶ陽性疾患は、ＨＰＶ感染、ＨＰＶ前悪性腫瘍およびＨＰＶがんからなる群から選択される。好ましくは、がんは、子宮頸がん、頭頸部がん、中咽頭がん、食道腺癌、肛門がん、肛門管がん、直腸がん、膣がん、外陰部がんおよび陰茎がんからなる群から好ましくは選択される。

【実施例】

【0154】

本発明は、続く具体的な実施形態によってさらに詳述される。これらの実施例が、本発明を例示することのみを意図し、本発明の範囲を限定することを意図しないことは理解されるべきである。以下の実施例において具体的な条件が示されていない実験方法は、当技術分野における従来の条件、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）およびラッセイ（Ｒｕｓｓｅｉｉ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ） （２００１），ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓに記載されているもの使用して、または製造者によって推奨されているものを使用して実施される。他に述べられない限り、以下の実施例において使用された実験材料および試薬は、市販で入手可能である。

【0155】

＜実施例１：ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＴＣＲについてのスクリーニング＞
患者から倫理承認およびインフォームドコンセントを得た後に、ＨＰＶ１６陽性子宮頸がん（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１）を有する患者由来の術後腫瘍組織を得て、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を培養し、腫瘍組織から増やした。ＴＩＬを適切に増やした後に、ＣＤ８およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１／ＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}四量体で強く染色された陽性細胞を、フローサイトメトリーを使用して選別した。選別したＣＤ８＋／四量体＋細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写し、ＴＣＲα鎖およびβ鎖可変領域（Ｖ領域）遺伝子を得るために増幅させた。得られたＴＣＲα鎖およびβ鎖Ｖ領域遺伝子を、ＴＣＲ定常領域（Ｃ領域）遺伝子を含有するレンチウイルスベクターにさらに構築した。クローニングしたベクターは、完全なＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれ発現できた（図１Ａ）。

【0156】

種々の候補ＴＣＲ対を確立されたＴ細胞レポーター細胞系に導入し、ＴＣＲ対の抗原特異性および親和性を抗原特異的活性化アッセイによって確認した。上記のクローニングおよび確認の計画を使用して、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１によって提示されるＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}エピトープ（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ、配列番号１１）を特異的に認識するＣＲＴＥ７Ａ２と称されるＴＣＲを得た（図１Ｂ）。

【0157】

ＣＲＴＥ７Ａ２の可変領域のアミノ酸配列およびそれらのコード配列を表１および２にそれぞれ示し、α鎖およびβ鎖可変領域のＣＤＲ配列を表３に示す。組換えＴＣＲの定常領域の配列を表４に示す。組換えＴＣＲのα鎖およびβ鎖のアミノ酸配列を表５に示す。

【0158】

【表1】

【0159】

【表2】

【0160】

【表3】

【0161】

【表4】

【0162】

【表5】

【0163】

【表6】

【0164】

【表7】

【0165】

ＣＲＴＥ７Ａ２のα鎖およびβ鎖可変領域をムリン定常領域（配列番号１９（α鎖）および配列番号２６（β鎖））に融合し、続く使用のために、レンチウイルスベクターにβ－Ｔ２Ａ－αの順に直列で構築した。

【0166】

＜実施例２：標的抗原ペプチドに対するＣＲＴＥ７Ａ２の結合親和性＞
標的抗原ペプチド（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴ、配列番号１１）に対するＣＲＴＥ７Ａ２の親和性を確認するために、ＫＩＴＥ－４３９、Ｋｉｔｅ Ｐｈａｒｍａによって開発されたＨＰＶ１６ Ｅ７を標的にするＴＣＲを対照として使用した。ＮＦＡＴ－ＧＦＰレポーター遺伝子を保有するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＧＦＰ、内在性ＴＣＲがノックアウトされている）にレンチウイルスを使用してＣＲＴＥ７Ａ２およびＫＩＴＥ－４３９を導入した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度の標的抗原ペプチドをロードしたＴ２細胞と同時インキュベートし、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるレポーター遺伝子の活性化レベルを測定した。結果は、標的抗原へのＣＲＴＥ７Ａ２結合のＥＣ５０が３．１０^＊１０^－８Ｍであり、標的抗原へのＫＩＴＥ－４３９結合のＥＣ５０が４．８５^＊１０^－８Ｍであって、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞が標的抗原ペプチドに対してＫＩＴＥ－４３９ ＴＣＲ－Ｔ細胞のものより優れた強い反応性を示す（図２）ことを示す。上の結果は、ＣＲＴＥ７Ａ２が標的抗原ペプチドに対して高い結合親和性を有することを示す。

【0167】

＜実施例３：ＣＲＴＥ７Ａ２の細胞膜発現安定性＞
ＰＢＭＣを等量のＫＩＴＥ－４３９およびＣＲＴＥ７Ａ２レンチウイルスを用いて形質導入し（ＭＯＩ２０）、次いで９日目まで増やし、培養した。良好なＴＣＲ形質導入をヒトＣＤ３－ＦＩＴＣ抗体を使用して確認した。ＴＣＲ－Ｔの発現率を抗マウスＴＣＲβ－ＡＰＣ抗体を使用する染色によって検出し；ＣＤ４／ＣＤ８の比をヒトＣＤ４－ＡＰＣおよびＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７抗体を使用する染色によって測定した。フローサイトメトリーの結果は、両方のＴＣＲの形質導入後の各細胞のＣＤ４／ＣＤ８比およびＴＣＲ陽性比が、同じ形質導入および培養条件下で実質的に同じであることを示す（図３）。ＣＲＴＥ７Ａ２の発現強度は、ＫＩＴＥ－４３９のものより顕著に良好で、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲがさらに良い細胞膜発現安定性を有することを示し、ＣＲＴＥ７Ａ２がさらに良い抗原反応性および抗腫瘍活性を潜在的に有することを示唆している。

【0168】

＜実施例４：抗原陽性腫瘍細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の特異的殺活性＞
ＣＲＴＥ７Ａ２またはＫＩＴＥ－４３９ ＴＣＲを発現するＴ細胞をエフェクター細胞として使用し、ＴＣＲを用いて形質導入していない、並行して増やし、培養したＰＢＭＣをエフェクター細胞についての対照として使用した。１０^－６ＭのＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}ポリペプチドをロードしたＴ２細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性）、Ｃａｓｋｉ細胞（ＨＰＶ１６ Ｅ７陽性、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性）およびＨｅｌａ－Ｅ７－０２０１細胞（ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１を過発現）をＨＬＡ抗原ペプチドマッチ陽性標的細胞として使用した。ＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}ポリペプチドをロードしていないＴ２細胞、Ａ３７５細胞（ＨＰＶ１６ Ｅ７陰性、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性）およびＡ５４９細胞（ＨＰＶ１６ Ｅ７陰性、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陰性）をＨＬＡ抗原ペプチド非マッチ陰性標的細胞として使用した。すべての標的細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子を安定に発現した。エフェクター細胞をそれぞれ９：１、３：１および１：１のエフェクター細胞の標的細胞に対する比（Ｅ：Ｔ）でさまざまな標的細胞と１６時間インキュベートし、生存している標的細胞を検出するためにルシフェラーゼ基質を加えた。殺傷された標的細胞の割合を残った標的細胞に基づいて算出した。

【0169】

結果は、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞が陽性標的細胞に対して顕著な殺効果を有し、陰性標的細胞に殺効果を有さず（図４Ａ）、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞がＨＬＡ抗原ペプチドマッチ標的細胞を特異的に殺傷する能力を有することを示す。ＫＩＴＥ－４３９の結果との比較は、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞が標的細胞に対してＫＩＴＥ－４３９よりも顕著に優れた殺活性を示す（図４Ｂ）ことを示す。これらの結果は、抗原陽性腫瘍細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の顕著にさらに効率的で特異的な殺効果を示す。

【0170】

＜実施例５：抗原陽性標的細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の特異的応答＞
ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲを発現するＴ細胞をエフェクター細胞として使用し、ＴＣＲを用いて形質導入していない、並行して増やし、培養したＰＢＭＣをエフェクター細胞についての対照として使用した。１０^－６ＭのＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}ポリペプチドをロードしたＴ２細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性）、Ｃａｓｋｉ細胞（ＨＰＶ１６ Ｅ７陽性、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性）およびＨｅｌａ－Ｅ７－０２０１細胞（ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１を過発現）をＨＬＡ抗原ペプチドマッチ陽性標的細胞として使用した。ＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}ポリペプチドをロードしていないＴ２細胞、Ａ３７５細胞（ＨＰＶ１６ Ｅ７陰性、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性）およびＡ５４９細胞（ＨＰＶ１６ Ｅ７陰性、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陰性）をＨＬＡ抗原ペプチド非マッチ陰性標的細胞として使用した。ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の数は１０^５個であった。ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞を種々の標的細胞と１：１のＥ：Ｔ比で２４時間インキュベートし、上清中のＩＦＮ－γの分泌をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号８８－７３１６－７６）を使用して検出した。結果は図５に示すとおりである。

【0171】

結果は、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞がＨＬＡ抗原ペプチドマッチ陽性標的細胞に対してＩＦＮ－γ分泌を生じ、ＨＬＡ抗原ペプチド非マッチ陰性標的細胞に対してはＩＦＮ－γ分泌を生じないことを示し、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の良好に特異的な殺効果を示している。

【0172】

ＣＲＴＥ７Ａ２またはＫＩＴＥ－４３９を発現するＴＣＲ－Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。１０^－６ＭのＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}ポリペプチドをロードしたＴ２細胞（ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性）、Ｃａｓｋｉ細胞（ＨＰＶ１６ Ｅ７陽性、ＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性）およびＨｅｌａ－Ｅ７－０２０１細胞（ＨＰＶ１６ Ｅ７およびＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１を過発現）をＨＬＡ抗原ペプチドマッチ陽性標的細胞として使用した。ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の数は１０^５個であった。ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞を種々の標的細胞と９：１、３：１および１：１のＥ：Ｔ比でそれぞれ２４時間インキュベートし、上清中のＩＦＮ－γの分泌を検出した。結果は図６に示すとおりである。結果は、ＫＩＴＥ－４３９ ＴＣＲ－Ｔ細胞と同様に、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞が抗原陽性標的細胞の刺激下で高レベルのＩＦＮ－γを分泌することができることを示す。

【0173】

＜実施例６：抗原陽性標的細胞に対するＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞による特異的ＩＦＮ－γ分泌＞
１０^５個のＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞を、細胞によって分泌されたＩＦＮ－γを捕捉することができるＥＬＩＳｐｏｔ検出ウエルＡ、Ｂ、ＣおよびＤに加えた。異なるウエルに：（Ａ）陽性対照として２５ｎｇ／ｍｌ ＰＨＡ（Ｔ細胞サイトカイニン）；（Ｂ）自己対照としてＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞；（Ｃ）陰性対照としてＣＲＴＥ７Ａ２の培養のための培養培地；および（Ｄ）実験ウエルとして１０ｎＭ ＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}ポリペプチドをロードしたＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１陽性Ｔ２細胞、を加えた。ＥＬＩＳｐｏｔ染色を１６～２４時間のインキュベーション後に実施した、結果は図７に示すとおりである。
結果は、ウエルＡ中のＣＲＴＥ７Ａ２はＰＨＡ刺激に茶色の陽性応答を示し；ウエルＢおよびＣは陰性対照として作用して、明らかな茶色のスポットを示さず；ならびにウエルＤ中のＣＲＴＥ７Ａ２は１０ｎＭ ＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}ポリペプチドの刺激下で明らかな茶色のスポットを示すことを示す。これは、ＣＲＴＥ７Ａ２がＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１－陽性Ｔ２細胞によって提示されたＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}ポリペプチドの刺激下で特異的ＩＦＮ－γ分泌を産生することを示している。

【0174】

＜実施例７：ＣＲＴＥ７Ａ２は、抗原特異的Ｔ細胞増殖を効率的に媒介する＞
ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞およびＴＣＲを用いて形質導入されていないＰＢＭＣをＩＬ－２不含有、リンパ球血清不含有培地Ｘ ＶＩＶＯ－１５（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＢＥ０２－０６０Ｆ）において２４時間それぞれ静置し、次いで、ＣＦＳＥ（Ｃ３４５５４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色および標識し、１０ｎＭまたは１ｎＭ ＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}ポリペプチドをロードしたＴ２細胞と５日間同時培養した。次いで、混合細胞をマウスＴＣＲβ－ＡＰＣおよびヒトＣＤ８α－ＰＥ Ｃｙ７について染色した。ＣＤ８およびマウスＴＣＲβ陽性細胞を細胞増殖の分析のために選択した。無関係のポリペプチドをロードしたＴ２細胞をポリペプチドについての対照として使用し、ＴＣＲを用いて形質導入していないＰＢＭＣを陰性対照として使用した。結果は、図８に示すとおりである。

【0175】

結果は、ＨＰＶ１６ Ｅ７_{１１－１９}ポリペプチドがＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の増殖を特異的に刺激することができることを示し、これは、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の抗原特異的活性化をさらに確認する。

【0176】

＜実施例８：ＣＲＴＥ７Ａ２のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性＞
子宮頸がん細胞系Ｈｅｌａ－Ｅ７－Ａ０２０１を使用してＢ２ＭノックアウトＮＤＧ免疫不全マウスにおいて腫瘍形成モデル（ＣＤＸモデル）を確立し、５×１０^６個および１０^７個のＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の尾静脈再注入、および対照として１０^７個のＰＢＭＣの再注入が続いた。皮下移植したＨｅｌａ腫瘍の増殖をモニターした、結果は図９Ａに示すとおりである。結果は、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞が用量依存性腫瘍阻害活性を有することを実証する。５×１０^６個および１０^７個のＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞は、腫瘍細胞の増殖を顕著に阻害でき、１０^７個の細胞は、５×１０^６個の細胞のものよりも良い腫瘍阻害効果を有する。ルシフェラーゼライブイメージングシステムを使用して、ＴＣＲ－Ｔ細胞再注入後２１日間モニターした皮下移植Ｈｅｌａ腫瘍の増殖は、５×１０^６個および１０^７個のＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞の再注入が腫瘍細胞の増殖を顕著に阻害でき、１０^７個の細胞は、５×１０^６細胞のものよりも良い腫瘍阻害効果を有することを示す（図９Ｂ）。

【0177】

これらの結果は、ＣＲＴＥ７Ａ２ ＴＣＲ－Ｔ細胞が顕著なｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を有することを示唆する。

【0178】

本出願は、さまざまな公開特許、公開特許出願、学術論文および他の出版物を参照し、そのすべてを本願に引用して援用する。援用した参考文献のいずれかと本明細書の間に矛盾がある場合、明細書が優先される。加えて、先行技術の範囲内にある本発明の任意の具体的な実施形態は、任意の１つ以上の特許請求の範囲から明確に除外され得る。その実施形態は当業者に周知であると考えられることから、除外が本出願に明確に記載されていない場合でもそれらは除外され得る。本発明の任意の具体的な実施形態は、それが先行技術の存在と関連するかどうかにかかわらず、いかなる理由でもすべての請求項から除外され得る。

【0179】

本発明は、その具体的な実施形態を参照して記載されたが、さまざまな変更が行われてよく、等価物が本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく置き換えられ得ることは、当業者に理解されるべきである。加えて、多数の変形が、本発明の目的、精神および範囲のために好適な特定の例、材料、組成物、方法、方法のステップを作製するために行われ得る。そのようなすべての変形は、特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】