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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】ピリミジン複素環化合物の結晶形及びその調製方法
(51)【国際特許分類】
C07D 519/00 20060101AFI20240925BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20240925BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240925BHJP
【ＦＩ】
C07D519/00 301
C07D519/00 CSP
A61K31/519
A61P35/00
A61P11/00
A61P1/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024515669
(86)(22)【出願日】2022-09-09
(85)【翻訳文提出日】2024-05-08
(86)【国際出願番号】 CN2022118023
(87)【国際公開番号】W WO2023036282
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】202111062619.1
(32)【優先日】2021-09-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202211034826.0
(32)【優先日】2022-08-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522360286
【氏名又は名称】徳昇済医薬（無錫）有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｄ３ Ｂｉｏ （Ｗｕｘｉ） Ｃｏ．， Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３２４， ８８ ＭｅｉＬｉａｎｇ Ｒｏａｄ， ＭａＳｈａｎ Ｓｔｒｅｅｔ， ＢｉｎＨｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｘｉ， ＪｉａｎｇＳｕ， ２１４０９２， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110000914
【氏名又は名称】弁理士法人ＷｉｓｅＰｌｕｓ
(72)【発明者】
【氏名】徐洋洋
(72)【発明者】
【氏名】孫繼奎
(72)【発明者】
【氏名】伍文韜
(72)【発明者】
【氏名】張楊
(72)【発明者】
【氏名】陳曙輝
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086CB22
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZA66
4C086ZB26
(57)【要約】
ピリミジン複素環化合物の結晶形及びその調製方法。式（ＩＩ）の化合物及びその結晶形の調製方法及び用途が具体的に開示される。
［化１］
【選択図】なし
［化１］
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（ＩＩ）の化合物【化1】
【請求項2】
ｎが０、０．５、１、１．５、２、２．５及び３から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
ｎが２である、請求項２に記載の化合物。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか一項に記載の式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａであって、【化2】
【請求項5】
６．２１８±０．２００°、８．５１４±０．２００°、１２．２９９±０．２００°、１４．６８９±０．２００°、１６．９０３±０．２００°、１８．１２２±０．２００°、１８．９２７±０．２００°、及び２５．５８０±０．２００°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項４に記載の結晶形Ａ。
【請求項6】
６．２１８±０．２００°、８．５１４±０．２００°、１１．６６３±０．２００°、１２．２９９±０．２００°、１４．６８９±０．２００°、１６．９０３±０．２００°、１８．１２２±０．２００°、１８．９２７±０．２００°、１９．３６４±０．２００°、２０．３８６±０．２００°、２１．９１４±０．２００°、及び２５．５８０±０．２００°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項５に記載の結晶形Ａ。
【請求項7】
６．２１８°、８．５１４°、１１．６６３°、１２．２９９°、１４．６８９°、１６．９０３°、１８．１２２°、１８．５５４°、１８．９２７°、１９．３６４°、２０．３８６°、２１．９１４°、２２．６４０°、２３．８６７°、２４．５５３°、２４．８０６°、２５．５８０°、２５．９８８°、２７．１４７°、２７．７１５°、２９．１３５°、及び３１．７９９°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする、請求項６に記載の結晶形Ａ。
【請求項8】
図１に示すＸＲＰＤパターンを有する、請求項７に記載の結晶形Ａ。
【請求項9】
１１５．３７°Ｃ±３°Ｃに吸熱ピークのピーク値を有する示差走査熱量測定曲線を有する、請求項４～８のいずれか一項に記載の結晶形Ａ。
【請求項10】
図２に示すＤＳＣ曲線を有する、請求項９に記載の結晶形Ａ。
【請求項11】
１５０．０°Ｃ±３°Ｃで最大５．３７９％の重量減少を有する熱重量分析曲線を有する、請求項４～８のいずれか一項に記載の結晶形Ａ。
【請求項12】
図３に示すＴＧＡ曲線を有する、請求項１１に記載の結晶形Ａ。
【請求項13】
固形腫瘍を治療するための医薬品の製造における、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項４～１２のいずれか一項に記載の結晶形Ａの使用。
【請求項14】
上記固形腫瘍が肺がん及び直腸がんである、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、
２０２１年９月１０日出願の中国特許出願公開第２０２１１１０６２６１９．１号明細書、
２０２２年８月２６日出願の中国特許出願公開第２０２２１１０３４８２６．０号明細書の優先権を主張する。
２０２１年９月１０日出願の中国特許出願公開第２０２１１１０６２６１９．１号明細書、
２０２２年８月２６日出願の中国特許出願公開第２０２２１１０３４８２６．０号明細書の優先権を主張する。
【0002】
＜技術分野＞
本開示は、ある種のピリミジン複素環化合物の結晶形及びその調製方法に関し、具体的には、式（ＩＩ）で表される化合物及びその結晶形の調製方法及び使用に関する。
本開示は、ある種のピリミジン複素環化合物の結晶形及びその調製方法に関し、具体的には、式（ＩＩ）で表される化合物及びその結晶形の調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0003】
ＲＡＳがん遺伝子変異は、ヒトがんにおける最も一般的な活性化変異であり、ヒト腫瘍の３０％に生じる。ＲＡＳ遺伝子ファミリーには３つのサブタイプ（ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ及びＮＲＡＳ）が含まれ、そのうちＫＲＡＳサブタイプの変異によって、ＲＡＳによるがんの８５％が引き起こされる。ＫＲＡＳ変異は、固形腫瘍、例えば肺腺がん、膵管がん及び結腸直腸がんなどに一般的に見られる。ＫＲＡＳ変異腫瘍では、がん遺伝子変異の８０％がコドン１２に生じ、最も一般的な変異にはｐ．Ｇ１２Ｄ（４１％）、ｐ．Ｇ１２Ｖ（２８％）及びｐ．Ｇ１２Ｃ（１４％）が含まれる。
【0004】
ＫＲＡＳ遺伝子の正式名称は、Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルスがん遺伝子ホモログである。ＫＲＡＳは、細胞増殖のシグナル伝達調節において極めて重要な役割を果たす。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４などの上流細胞表面受容体は、外部シグナルを受信した後、ＲＡＳタンパク質を介して下流にシグナルを伝達する。ＫＲＡＳタンパク質は活性化されていない場合、ＧＤＰ（グアノシン二リン酸）に強く結合する。ＫＲＡＳタンパク質は、ＳＯＳ１などのグアノシン交換因子により活性化された後、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）と結合してキナーゼ活性状態となる。遺伝子変異後、ＫＲＡＳは、成長及び増殖のシグナルを、上流の成長因子受容体シグナルとは無関係の下流経路に独立して伝達し、制御不能な細胞増殖及び腫瘍進行を引き起こし得る。一方、ＫＲＡＳ遺伝子に変異があるか否かも、腫瘍の予後の重要な指標である。
【0005】
ＫＲＡＳは最初に発見されたがん遺伝子であるが、長い間、新薬の開発に繋がらない標的と考えられてきた。２０１９年まで、Ａｍｇｅｎ及びＭｉｒａｔｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、その小分子ＫＲＡＳ阻害剤ＡＭＧ５１０及びＭＲＴＸ８４９の臨床研究結果を連続的に発表し、腫瘍の臨床治療におけるＫＲＡＳ阻害剤の臨床的有効性を初めて確認した。ＡＭＧ５１０及びＭＲＴＸ８４９は両方とも、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異タンパク質のシステイン残基と不可逆的共有結合を形成することによってＫＲＡＳ活性を阻害する不可逆的小分子阻害剤である。
【0006】
ＫＲＡＳは、細胞増殖のシグナル伝達調節において極めて重要な役割を果たす。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＥｒｂＢ３及びＥｒｂＢ４などの上流細胞表面受容体は、外部シグナルを受信した後、ＲＡＳタンパク質を介して下流にシグナルを伝達する。ＫＲＡＳタンパク質は活性化されていない場合、ＧＤＰ（グアノシン二リン酸）に強く結合する。ＫＲＡＳタンパク質は、ＳＯＳ１などのグアノシン交換因子により活性化された後、ＧＴＰ（グアノシン三リン酸）と結合してキナーゼ活性状態となる。ＫＲＡＳはＲＡＳタンパク質の重要なメンバーである。遺伝子変異後、ＫＲＡＳは、成長及び増殖のシグナルを、上流の成長因子受容体シグナルとは無関係の下流経路に独立して伝達し、制御不能な細胞増殖及び腫瘍進行を引き起こし得る。一方、ＫＲＡＳ遺伝子に変異があるか否かも、腫瘍の予後の重要な指標である。
【0007】
統計結果は、肺腺がんの１２～３６％がＫＲＡＳ変異によって引き起こされ、結腸がんの２７～５６％がＫＲＡＳによって引き起こされ、膵臓がんの９０％、子宮内膜がんの２１％、及び肺腺がんの１２～３６％がＫＲＡＳによって引き起こされることを示し、患者集団が巨大であることを示している。ＫＲＡＳ遺伝子変異では、変異の９７％が１２位又は１３位のアミノ酸残基で発生し、Ｇ１２Ｄ変異、Ｇ１２Ｖ変異及びＧ１３Ｄ変異は新薬の開発に繋がりにくく、１２位のグリシンがシステインに置換されるＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｃ）変異は、共有結合阻害剤の開発に良い方向性を示す。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0008】
本開示は、式（ＩＩ）の化合物を提供し、
【化1】
【0009】
式中、ｎは０～３から選択される。
【0010】
本開示のいくつかの実施形態では、ｎは、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、及び３．０から選択される。
【0011】
本開示のいくつかの実施形態では、ｎは、０．５、１、１．５、２、２．５、及び３から選択される。
【0012】
本開示のいくつかの実施形態では、ｎは２である。
【0013】
本開示はまた、式（ＩＩ）の化合物を提供し、
【化2】
【0014】
式中、ｎは０～２から選択される。
【0015】
本開示のいくつかの実施形態では、ｎは、０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９及び２から選択される。
【0016】
本開示のいくつかの実施形態では、ｎは、０．５、１、１．５、及び２から選択される。
【0017】
本開示のいくつかの実施形態では、ｎは２である。
【0018】
本開示はまた、８．５１４±０．２００°、１４．６８９±０．２００°、及び１８．１２２±０．２００°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを提供する。
【0019】
本開示のいくつかの実施形態では、上記結晶形Ａは、６．２１８±０．２００°、８．５１４±０．２００°、１２．２９９±０．２００°、１４．６８９±０．２００°、１６．９０３±０．２００°、１８．１２２±０．２００°、１８．９２７±０．２００°、及び２５．５８０±０．２００°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを有する。
【0020】
本開示のいくつかの実施形態では、上記結晶形Ａは、６．２１８±０．２００°、８．５１４±０．２００°、１１．６６３±０．２００°、１２．２９９±０．２００°、１４．６８９±０．２００°、１６．９０３±０．２００°、１８．１２２±０．２００°、１８．９２７±０．２００°、１９．３６４±０．２００°、２０．３８６±０．２００°、２１．９１４±０．２００°、及び２５．５８０±０．２００°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを有する。
【0021】
本開示のいくつかの実施形態では、上記結晶形Ａは、６．２１８±０．２００°、８．５１４±０．２００°、１１．６６３±０．２００°、１２．２９９±０．２００°、１４．６８９±０．２００°、１６．９０３±０．２００°、１８．１２２±０．２００°、１８．９２７±０．２００°、１９．３６４±０．２００°、２０．３８６±０．２００°、２１．９１４±０．２００°、２２．６４０±０．２００°、２５．５８０±０．２００°、２５．９８８±０．２００°、２７．１４７±０．２００°、及び２７．７１５±０．２００°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを有する。
【0022】
本開示のいくつかの実施形態では、上記結晶形Ａは、６．２１８°、８．５１４°、１１．６６３°、１２．２９９°、１４．６８９°、１６．９０３°、１８．１２２°、１８．５５４°、１８．９２７°、１９．３６４°、２０．３８６°、２１．９１４°、２２．６４０°、２３．８６７°、２４．５５３°、２４．８０６°、２５．５８０°、２５．９８８°、２７．１４７°、２７．７１５°、２９．１３５°、及び３１．７９９°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを有する。
【0023】
本開示のいくつかの実施形態では、上記結晶形Ａは、８．５１４±０．２００°及び１４．６８９±０．２００°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有し、任意選択で、６．２１８±０．２００°、及び／又は１１．６６３±０．２００°、及び／又は１２．２９９±０．２００°、及び／又は１６．９０３±０．２００°、及び／又は１８．１２２±０．２００°、及び／又は１８．５５４±０．２００°、及び／又は１８．９２７±０．２００°、及び／又は１９．３６４±０．２００°、及び／又は２０．３８６±０．２００°、及び／又は２１．９１４±０．２００°、及び／又は２２．６４±０．２００°、及び／又は２３．８６７±０．２００°、及び／又は２４．５５３±０．２００°、及び／又は２４．８０６±０．２００°、及び／又は２５．５８±０．２００°、及び／又は２５．９８８±０．２００°、及び／又は２７．１４７±０．２００°、及び／又は２７．７１５±０．２００°、及び／又は２９．１３５±０．２００°、及び／又は３１．７９９±０．２００°の２θ角度にも特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを有する。
【0024】
本開示のいくつかの実施形態では、図１に示すＸＲＰＤパターンを有する上記結晶形Ａが開示される。
【0025】
本開示のいくつかの実施形態において、上記結晶形ＡのＸＲＰＤパターン分解能データを表１に示す。
【表1】
【0026】
本開示のいくつかの実施形態では、上記結晶形Ａの示差走査熱量測定曲線は、１１５．３７℃±３℃に吸熱ピークのピーク値を有する。
【0027】
本開示のいくつかの実施形態において、上記結晶形ＡのＤＳＣ曲線は、図２に示される。
【0028】
本開示のいくつかの実施形態では、上記結晶形Ａの熱重量分析曲線は、１５０．０±３℃で最大５．３７９％の重量減少を有する。
【0029】
本開示のいくつかの実施形態において、上記結晶形ＡのＴＧＡ曲線は、図３に示される。
【0030】
本開示はまた、式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを調製する方法であって、
【化3】
【0031】
（ａ）式（Ｉ）の化合物をエタノールに添加し、透明になるまで混合物を攪拌すること、
【0032】
（ｂ）攪拌しながらゆっくりとその系に水を加え、２０～３０℃で種晶を加えること、
【0033】
（ｃ）２０～３０℃で１５時間攪拌すること、
【0034】
（ｄ）２０～３０℃で反応系に水をゆっくり滴下し、更に１～３時間攪拌すること、
【0035】
（ｅ）濾過し、固体を回収すること
を含む方法を提供する。
を含む方法を提供する。
【0036】
本開示はまた、固形腫瘍を治療するための医薬品の製造における上記化合物及びその結晶形Ａの使用を提供する。
【0037】
本開示のいくつかの実施形態では、上記固形腫瘍は肺がん及び直腸がんである。
【発明の効果】
【0038】
本開示の化合物は、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異ＭＩＡ－ＰＡ－ＣＡ－２細胞株及びＮＣＩ－Ｈ３５８細胞に対して良好な細胞増殖阻害活性を有する。本開示の化合物は、肝ミクロソーム、肝細胞、血漿及び全血における良好な安定性、並びに良好なＰＫ特性及び顕著な抗腫瘍効果を有する。結晶形Ａは安定であり、光及び熱の影響を受けにくく、良好なＰＫ特性を有する。
【0039】
定義及び説明
別段の定めがない限り、本明細書で使用される以下の用語及び語句は、以下の意味を有することを意図している。特定の語句又は用語は、特定の定義がない場合にあいまい又は不明確と見なされるべきではなく、従来の意味で理解されるべきである。商品名が本明細書に現れる場合、それに相当する商品又はその有効成分を指すことを意図している。
別段の定めがない限り、本明細書で使用される以下の用語及び語句は、以下の意味を有することを意図している。特定の語句又は用語は、特定の定義がない場合にあいまい又は不明確と見なされるべきではなく、従来の意味で理解されるべきである。商品名が本明細書に現れる場合、それに相当する商品又はその有効成分を指すことを意図している。
【0040】
本開示の中間体化合物は、当業者に周知の様々な合成方法によって、例えば、以下に列挙する特定の実施形態、以下に列挙する特定の実施形態を他の化学合成方法と組み合わせることによって形成される実施形態、及び当業者に周知の同等の代替方法などによって調製することができる。代替的な実施形態は、本開示の例を含むが、これに限定されない。
【0041】
本開示の特定の実施形態における化学反応は、好適な溶媒中で達成され、その溶媒は、本開示の化学変化並びに必要な試薬及び材料に適していなければならない。本開示の化合物を得るために、当業者は、既存の実施形態に基づいて合成工程又は反応スキームを改変又は選択することが必要な場合がある。
【0042】
以下、実施例により本開示を詳細に説明するが、これらの実施例はいかなる形であれ本開示を限定することを意図しない。
【0043】
本開示で使用されるすべての溶媒は市販されており、更に精製することなく使用することができる。
【0044】
本明細書に開示される化合物の構造は、当業者に周知の従来の方法によって確認することができる。本開示が化合物の絶対配置に関する場合、その絶対配置は、単結晶Ｘ線回折（ＳＸＲＤ）などの当技術分野における従来の技術によって確認することができる。単結晶Ｘ線回折（ＳＸＲＤ）では、育成した単結晶の回折強度データを、φ／ωスキャンの走査モードでＣｕＫα線の光源を備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ８ ｖｅｎｔｕｒｅ回折計を用いて収集し、当該データの収集後、更に直接法（Ｓｈｅｌｘｓ９７）により結晶構造を解析して、絶対配置を確認する。
【0045】
化合物は、当技術分野における一般的な命名原理に従って、又はＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）ソフトウェアによって命名され、市販の化合物は、それらのベンダーのディレクトリ名で命名される。
【0046】
本開示で使用される粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）法
機器モデル：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ２ Ｐｈａｓｅｒ Ｘ線回折計
機器モデル：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ２ Ｐｈａｓｅｒ Ｘ線回折計
【0047】
試験方法：約１０～２０ｍｇのサンプルをＸＲＰＤ検出のために使用した。
【0048】
詳細なＸＲＰＤパラメータは以下の通りであった。
【0049】
光管：Ｃｕ、ｋα（λ＝１．５４１８４Å）。
【0050】
光管の電圧：３０ｋＶ、光管の電流：１０ｍＡ
【0051】
発散スリット：０．６０ｍｍ
【0052】
検出器スリット：５．８２７ｍｍ
【0053】
散乱防止スリット：０ｍｍ
【0054】
走査範囲：３～４０ｄｅｇ
【0055】
ステップサイズ：０．０２ｄｅｇ
【0056】
ステップ長：０．２秒
【0057】
本開示で使用される示差走査熱量測定（ＤＳＣ）法
機器モデル：ＮＥＴＺＳＣＨ ＤＳＣ２１４ ＤＳＣ２１４００Ａ－０９５８－Ｌ
機器モデル：ＮＥＴＺＳＣＨ ＤＳＣ２１４ ＤＳＣ２１４００Ａ－０９５８－Ｌ
【0058】
試験方法：サンプル（約４．０２ｍｇ）を試験のためにＤＳＣアルミニウムポットに入れた。５０ｍＬ／分のＮ２の条件下、１０℃／分の加熱速度で３０℃（室温）から４００℃まで加熱した。
【0059】
本開示で使用される熱重量分析（ＴＧＡ）法
機器モデル：ＴＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＴＧＡ５５００熱重量分析装置
機器モデル：ＴＡ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＴＧＡ５５００熱重量分析装置
【0060】
試験方法：サンプル（２～５ｍｇ）を試験のためにＴＧＡ白金ポットに入れた。２５ｍＬ／分のＮ２の条件下、サンプルを１０℃／分の加熱速度で室温から３５０℃まで、又は２０％の重量減少となるまで加熱した。
【0061】
本開示で使用される単結晶Ｘ線回折法
機器モデル：ｈｅｌｉｏｓ ｍｘ多層モノクロメーターを備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ８ ＶＥＮＴＵＲＥ ＣＭＯＳ Ｐｈｏｔｏｎ ＩＩ回折計
機器モデル：ｈｅｌｉｏｓ ｍｘ多層モノクロメーターを備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ８ ＶＥＮＴＵＲＥ ＣＭＯＳ Ｐｈｏｔｏｎ ＩＩ回折計
【0062】
試験方法：式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａ０．０１３３ｇを室温でアセトニトリル２ｍＬに溶解した。サンプル溶液を４ｍＬの半密封サンプルバイアルに加え、室温でゆっくり蒸発させた。１０日後に無色の塊状結晶が得られた。回折実験の温度はＴ＝１７３（２）Ｋであった。
【0063】
機器パラメータ：
【0064】
ｈｅｌｉｏｓ ｍｘ多層モノクロメーターを備えたＢｒｕｋｅｒ Ｄ８ ＶＥＮＴＵＲＥ ＣＭＯＳ Ｐｈｏｔｏｎ ＩＩ回折計
【0065】
極低温システム：Ｏｘｆｏｒｄ Ｃｒｙｏｓｔｒｅａｍ ８００
Ｃｕ：λ＝１．５４１８４Å、２．５ｋＷ
Ｃｕ：λ＝１．５４１８４Å、２．５ｋＷ
【0066】
結晶から検出器までの距離：ｄ＝４５ｍｍ
【0067】
管電圧：５０ｋＶ
【0068】
管電流：５０ｍＡ
【図面の簡単な説明】
【0069】
【0070】
【0071】
【0072】
【0073】
【0074】
【発明を実施するための形態】
【0075】
本開示の内容をよりよく理解するために、本開示を特定の例と併せて以下に更に説明するが、これらの特定の例は本開示の内容を限定することを意図するものではない。
【0076】
実施例１：式（Ｉ）の化合物の調製
【化4】
【化5】
【0077】
工程１：化合物１－２の合成
５リットルの三口フラスコを用意し、その中で、化合物１－１（２５０ｇ、２．００ｍｏｌ、１当量）、無水炭酸カリウム（６９０．２６ｇ、４．９９ｍｏｌ、２．５当量）及びヨウ化カリウム（３３１．６２ｇ、２．００ｍｏｌ、１当量）をＮ－メチルピロリドン（２．５Ｌ）に加えた。その後、ｐ－メトキシベンジルクロライド（６４１．３６ｇ、４．１０ｍｏｌ、５５７．７１ｍＬ、２．０５当量）を滴下すると、反応溶液は黄色で濁っていた。得られた混合物を窒素下、１２０℃の油浴中で５時間攪拌反応させた。６バッチの反応溶液（２５０×６）を合わせ、２０リットルの水に添加した。その後、１０リットルのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを加え、混合物を攪拌した。分液後、有機相を回収し、水相をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５Ｌ×１）で抽出した。有機相を合わせ、飽和ブライン（１０Ｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物１－２の粗生成物を得た。３リットルの石油エーテルを粗生成物に添加し、混合物を一晩かけてスラリー化した。スラリー系は乳白色で濁っており、ブフナー漏斗で濾過した。濾過ケークを石油エーテル（５００ｍＬ×３）で洗浄して、濾過ケークから化合物１－２を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.23-7.18 (m, 4H), 6.91-6.87(m, 1H), 6.82-6.76 (m, 4H), 6.65 -6.59(m, 2H), 4.20 (s, 4H), 3.79(s, 6H), 2.19 (s, 3H). LCMS: MS m/z = 366.1 [M+H]+.
５リットルの三口フラスコを用意し、その中で、化合物１－１（２５０ｇ、２．００ｍｏｌ、１当量）、無水炭酸カリウム（６９０．２６ｇ、４．９９ｍｏｌ、２．５当量）及びヨウ化カリウム（３３１．６２ｇ、２．００ｍｏｌ、１当量）をＮ－メチルピロリドン（２．５Ｌ）に加えた。その後、ｐ－メトキシベンジルクロライド（６４１．３６ｇ、４．１０ｍｏｌ、５５７．７１ｍＬ、２．０５当量）を滴下すると、反応溶液は黄色で濁っていた。得られた混合物を窒素下、１２０℃の油浴中で５時間攪拌反応させた。６バッチの反応溶液（２５０×６）を合わせ、２０リットルの水に添加した。その後、１０リットルのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを加え、混合物を攪拌した。分液後、有機相を回収し、水相をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５Ｌ×１）で抽出した。有機相を合わせ、飽和ブライン（１０Ｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、化合物１－２の粗生成物を得た。３リットルの石油エーテルを粗生成物に添加し、混合物を一晩かけてスラリー化した。スラリー系は乳白色で濁っており、ブフナー漏斗で濾過した。濾過ケークを石油エーテル（５００ｍＬ×３）で洗浄して、濾過ケークから化合物１－２を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.23-7.18 (m, 4H), 6.91-6.87(m, 1H), 6.82-6.76 (m, 4H), 6.65 -6.59(m, 2H), 4.20 (s, 4H), 3.79(s, 6H), 2.19 (s, 3H). LCMS: MS m/z = 366.1 [M+H]+.
【0078】
工程２：化合物１－３の合成
【0079】
２，２，６，６－テトラメチルピペリジン（２．４４ｋｇ、１７．２９ｍｏｌ、２．９４Ｌ、４当量）を無水テトラヒドロフラン（１５Ｌ）に加え、混合物を－５～０℃に冷却した。この系を窒素で３回パージし、ｎ－ブチルリチウム（２．５Ｍ、６．９２Ｌ、４当量）を窒素下で滴下した。混合物を－５～０℃で１５分間反応させ、－６０℃まで冷却した。テトラヒドロフラン（１．５Ｌ）に化合物１－２（１．５８ｋｇ、４．３２ｍｏｌ、１当量）を溶解した溶液を滴下した。滴下終了後、混合物を－６５～－６０℃で０．５時間反応させた。次いで、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（３．１６ｋｇ、４３．２４ｍｏｌ、３．３３Ｌ、１０当量）を素早く加え、混合物を－６０℃で１０分間反応させた。反応溶液に２０Ｌの飽和塩化アンモニウムを加え、混合物を５Ｌのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで抽出した。各層を分離させた。有機相を２０Ｌの飽和塩化アンモニウムで洗浄した。次いで、水相を１０Ｌのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルで抽出した。各層を分離させた。有機相を合わせ、飽和ブライン（１２Ｌ×２）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。その後、粗生成物を石油エーテル及びメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（３／１、３Ｌ）で５時間スラリー化した後、濾過した。濾過ケークを回収して化合物１－３を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 10.43 - 10.35 (m, 1H), 7.21-7.18 (m, 5H), 6.92 - 6.81 (m, 5H), 4.25 (s, 4H), 3.80 (s, 6H), 2.23 (s, 3H). LCMS:MS m/z = 394.2[M+H]+.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 10.43 - 10.35 (m, 1H), 7.21-7.18 (m, 5H), 6.92 - 6.81 (m, 5H), 4.25 (s, 4H), 3.80 (s, 6H), 2.23 (s, 3H). LCMS:MS m/z = 394.2[M+H]+.
【0080】
工程３：化合物１－４の合成
【0081】
化合物１－３（１．１７ｋｇ、２．８３ｍｏｌ、純度９５％、１当量）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（５．７Ｌ）に加え、ブロモスクシンイミド（６０３．３５ｇ、３．３９ｍｏｌ、１．２当量）を５℃で数回に分けて加えた。混合物を５～１５℃で１時間反応させた。反応溶液に５．７Ｌの水をゆっくり加えると、固体が析出した。２０分間攪拌した後、１１．４Ｌの水をゆっくり添加した。混合物を更に４０分間攪拌し、濾過した。濾過ケークを水（２Ｌ×２）で洗浄した。粗生成物を石油エーテルとメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルの混合溶媒（１０：１）７．７Ｌで１２時間スラリー化した後、濾過した。濾過ケークを石油エーテルとメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルの混合溶媒（１０：１）５００ｍＬで洗浄した。真空濃縮後、生成物に窒素を１２時間吹き込んで化合物１－４を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 10.39 (s, 1H), 7.17 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.85-6.82 (m, 4H), 4.22 (s, 4H), 3.79 (s, 6H), 2.28 (s, 3H). LCMS:MS m/z = 472.1[M+H]+, 474.1[M+H]+.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 10.39 (s, 1H), 7.17 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.85-6.82 (m, 4H), 4.22 (s, 4H), 3.79 (s, 6H), 2.28 (s, 3H). LCMS:MS m/z = 472.1[M+H]+, 474.1[M+H]+.
【0082】
工程４：化合物１－６の合成
【0083】
化合物１－４（１３０ｇ、２７５．２２ｍｍｏｌ、１当量）、ヨウ化ケトン（１０４．８３ｇ、５５０．４４ｍｍｏｌ、２当量）及び化合物１－５（２６４．３７ｇ、１．３８ｍｏｌ、１７５．０８ｍＬ、５当量）をＤＭＦ（１．３Ｌ）に溶解した。混合物を窒素下、１００℃で４時間攪拌した。反応系を冷却し、濾過し、水（１．３Ｌ）に注ぎ入れて反応をクエンチした。混合物をメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（４００ｍＬ×２）で抽出し、飽和ブライン（３００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した。母液を回収し、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物を石油エーテル及びメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（８／１、３００ｍＬ）でスラリー化して化合物１－６を得た。母液を回収し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／１から５／１）で精製して粗生成物を得た。粗生成物を石油エーテル及びメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（８／１、１００ｍＬ）でスラリー化して化合物１－６を得た。２バッチの固体を混合し、石油エーテルでスラリー化し、濾過した。固体を回収して化合物１－６を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 10.37 (q, J = 4.0 Hz, 1H), 7.18 - 7.11 (m, 4H), 6.89 - 6.82 (m, 4H), 6.73 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.36 (s, 4H), 3.81 (s, 6H), 2.37 - 2.29 (m, 3H). LCMS: MS m/z =484.0[M+Na]+.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 10.37 (q, J = 4.0 Hz, 1H), 7.18 - 7.11 (m, 4H), 6.89 - 6.82 (m, 4H), 6.73 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.36 (s, 4H), 3.81 (s, 6H), 2.37 - 2.29 (m, 3H). LCMS: MS m/z =484.0[M+Na]+.
【0084】
工程５：化合物１－８の合成
【0085】
水素ナトリウム（７０．２１ｇ、１．７６ｍｏｌ、純度６０％、１．８当量）を無水テトラヒドロフラン（４．５Ｌ）に添加し、－５℃に冷却した。混合物を窒素で３回パージし、化合物１－７（２０３．８２ｇ、１．７６ｍｏｌ、１８８．７２ｍＬ、１．８当量）を窒素下で滴下した。－５～０℃で１０分間反応させた後、ｎ－ブチルリチウム（２．５Ｍ、７０２．１４ｍＬ、１．８当量）を滴下した。混合物を窒素下、－５～０℃で更に１０分間反応させ、－１０℃に冷却した。テトラヒドロフラン（４５０ｍＬ）に化合物１－６（４５０ｇ、９７５．１９ｍｍｏｌ、１当量）を溶解した溶液を滴下し、混合物を－１０℃で１０分間反応させた。反応溶液を５Ｌの飽和塩化アンモニウムにゆっくり添加して抽出した。各層を分離させた。有機相を４Ｌの飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。９００ｍＬ×４の石油エーテルを濃縮粗生成物に添加して、振盪しながら洗浄した。石油エーテルの上清を注ぎ出し、粗生成物を真空中で濃縮して化合物１－８を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.18-7.15 (m, 4H), 6.90 - 6.78 (m, 4H), 6.61 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.72 - 5.57 (m, 1H), 4.31 (m, 4H), 3.81(s, 6H), 3.76(s, 3H), 3.56 (s, 2H), 3.50 - 3.38 (m, 1H), 2.98 - 2.93 (m, 1H), 2.38 - 2.26 (m, 3H). LCMS: MS m/z =578.1[M+H]+.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.18-7.15 (m, 4H), 6.90 - 6.78 (m, 4H), 6.61 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.72 - 5.57 (m, 1H), 4.31 (m, 4H), 3.81(s, 6H), 3.76(s, 3H), 3.56 (s, 2H), 3.50 - 3.38 (m, 1H), 2.98 - 2.93 (m, 1H), 2.38 - 2.26 (m, 3H). LCMS: MS m/z =578.1[M+H]+.
【0086】
工程６：化合物１－９の合成
【0087】
化合物１－８（１．１５ｋｇ、１．７７ｍｏｌ、純度８９％、１当量）をジクロロメタン（５．７Ｌ）に加え、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（３３７．８６ｇ、２．８４ｍｏｌ、３７６．６６ｍＬ、１．６当量）を加えた。混合物を２５℃で１時間反応させ、０℃まで冷却した。三フッ化ホウ素ジエチルエーテル（３７７．２７ｇ、２．６６ｍｏｌ、３２８．０６ｍＬ、１．５当量）を０～５℃で滴下し、混合物を１０分間反応させた。ＬＣＭＳによって示されるように、出発物質は消失し、生成物のＭｓシグナルが出現した。反応溶液を１０Ｌの半飽和重炭酸ナトリウム溶液にゆっくり加えて抽出した。各層を分離させた。有機相を５Ｌの飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物を６つの部分に均等に分割し、各部分に０．８３Ｌのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルを添加した。混合物を２０分間攪拌し、固体を析出させた。石油エーテルとメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルの混合溶媒（１：１）０．５Ｌを加え、混合物を夜通しで１６時間スラリー化した。６つの部分を一緒に濾過した。濾過ケークを石油エーテルとメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルの混合溶媒（１：１，８００ｍＬ×２）ですすぎ、回転蒸発させて乾固した。母液をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１００：０－０：１）で精製して化合物１－９を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ =8.43 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.21 - 7.10 (m, 4H), 6.91 - 6.81 (m, 4H), 6.70 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.93 (dd, J = 3.2, 14.8 Hz, 1H), 4.35 (s, 4H), 3.8(s, 3H), 3.81 (s, 6H), 3.38-3.29 (m, 1H), 2.68 (dd, J = 3.6, 16.8 Hz, 1H), 2.39 - 2.24 (m, 3H). LCMS: MS m/z =588.2[M+H]+.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ =8.43 (d, J = 0.8 Hz, 1H), 7.21 - 7.10 (m, 4H), 6.91 - 6.81 (m, 4H), 6.70 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.93 (dd, J = 3.2, 14.8 Hz, 1H), 4.35 (s, 4H), 3.8(s, 3H), 3.81 (s, 6H), 3.38-3.29 (m, 1H), 2.68 (dd, J = 3.6, 16.8 Hz, 1H), 2.39 - 2.24 (m, 3H). LCMS: MS m/z =588.2[M+H]+.
【0088】
工程７：化合物１－１０の合成
【0089】
化合物１－９（７７５ｇ、１．３２ｍｏｌ、１当量）をテトラヒドロフラン（４Ｌ）に加えた。混合物を－６０℃に冷却し、窒素で３回パージした。次いで、トリ－ｓｅｃ－ブチルボロヒドリド（１Ｍ、１．４５Ｌ、１．１当量）を窒素下で滴下した。混合物を－６０℃で１０分間反応させた。反応溶液を３．５Ｌの１Ｍ塩酸溶液にゆっくり加え、２Ｌの水を加えて抽出した。各層を分離させた。水相を２Ｌの酢酸エチルで更に抽出した。有機相を合わせ、１Ｌの酢酸エチルを添加した。混合物を５Ｌの飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗生成物を４つの部分に分割し、各部分に２００ｍＬのメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルをそれぞれ加えた。混合物を１０分間攪拌し、２００ｍＬの石油エーテルをゆっくり添加した。０．５～１時間攪拌した後、固体が析出した。１．６Ｌの石油エーテルを更に数回に分けて添加し、混合物を１２時間スラリー化した。このスラリーを濾過し、濾過ケークを石油エーテルとメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルの混合溶媒（１０：１）３００ｍＬで３回洗浄した。固体を回収して化合物１－１０（１．１５ｋｇ）を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.167-7.14(m, 4H), 6.87-6.83 (m, 4H), 6.63 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.05-5.00 (m, 1H), 4.61-4.58 (m, 1H), 4.42 - 4.24 (m, 5H), 3.85-3.73 (m, 10H), 3.13-3.05 (m, 1H), 2.47 - 2.38 (m, 1H), 2.35-2.31 (m, 3H). LCMS: MS m/z = 590.3.[M+H]+.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.167-7.14(m, 4H), 6.87-6.83 (m, 4H), 6.63 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 5.05-5.00 (m, 1H), 4.61-4.58 (m, 1H), 4.42 - 4.24 (m, 5H), 3.85-3.73 (m, 10H), 3.13-3.05 (m, 1H), 2.47 - 2.38 (m, 1H), 2.35-2.31 (m, 3H). LCMS: MS m/z = 590.3.[M+H]+.
【0090】
工程８：化合物１－１１の合成
【0091】
化合物１－１０（３１０ｇ、５２５．８０ｍｍｏｌ、１当量）をエタノール（１．５５Ｌ）に添加した。次いで、Ｓ－メチルイソチオ尿素硫酸塩（４３９．１１ｇ、１．５８ｍｏｌ、３当量）及び炭酸ナトリウム（１１１．４６ｇ、１．０５ｍｏｌ、２当量）を添加した。混合物を窒素下、４５～５０℃（内部温度）で１６時間反応させた。エタノールの大部分を濃縮により除去した。５００ｍｌの水及び４００ｍｌの酢酸エチルを粗生成物に添加した。混合物を攪拌し、５００ｍｌの１Ｍ塩酸でｐＨ３～４に調整した。オフホワイトの固体を析出させた。６００ｍｌの石油エーテルを更に添加した。攪拌しながら、系内に大量のオフホワイトの固体を析出させた。この系をブフナー漏斗で濾過し、濾過ケークを酢酸エチル（２００ｍＬ×２）で洗浄して濾過ケークを生成物として得た。濾過ケークを２Ｌのジクロロメタンに溶解した。分液後、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して化合物１－１１を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.22 - 7.14 (m, 4H), 6.91 - 6.82 (m, 4H), 6.65 (dd, J = 8.4 Hz 1H), 5.12-5.08 (m, 1H), 4.97-4.91 (m, 1H), 4.67 - 4.57 (m, 1H), 4.45 - 4.22 (m, 4H), 3.88 - 3.74 (m, 6H), 3.43-3.35 (m, 1H), 2.77-2.72 (m, 1H), 2.59 (m, 3H), 2.40-2.31 (m, 3H). LCMS:MS m/z =630.2[M+H]+.
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.22 - 7.14 (m, 4H), 6.91 - 6.82 (m, 4H), 6.65 (dd, J = 8.4 Hz 1H), 5.12-5.08 (m, 1H), 4.97-4.91 (m, 1H), 4.67 - 4.57 (m, 1H), 4.45 - 4.22 (m, 4H), 3.88 - 3.74 (m, 6H), 3.43-3.35 (m, 1H), 2.77-2.72 (m, 1H), 2.59 (m, 3H), 2.40-2.31 (m, 3H). LCMS:MS m/z =630.2[M+H]+.
【0092】
工程９：化合物１－１２Ｂの合成
【0093】
化合物１－１１をＳＦＣ（カラム：ＤＡＩＣＥＬ ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（２５０ｍｍ＊５０ｍｍ、１０μｍ）；移動相：［０．１％ＮＨ３・Ｈ２Ｏ ＥｔＯＨ］；ＥｔＯＨ％：４５％－４５％、６．３分）により分離して、化合物１－１２Ｂ（ピーク時間：１．６６５分）及び化合物１－１２Ａ（ピーク時間：２．４４６分）を得た。
【0094】
工程１０：化合物１－１３の合成
【0095】
化合物１－１２Ｂ（２ｇ、３．１８ｍｍｏｌ、１当量）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（１．２３ｇ、９．５３ｍｍｏｌ、１．６６ｍＬ、３当量）を加えた。混合物を０～１０℃に冷却し、トリフルオロメタンスルホン酸無水物（１．３４ｇ、４．７６ｍｍｏｌ、７８６．１１μＬ、１．５当量）を系にゆっくり添加した。混合物をこの温度で１５分間反応させた。飽和塩化アンモニウム水溶液（１５ｍＬ）を添加した。分液後、水相をジクロロメタン（１５ｍＬ×２）で抽出した。有機相を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／１から０／１）で分離して化合物１－１３を得た。
LCMS m/z =762.2[M+H]+. 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.21 - 7.11 (m, 4H), 6.90 - 6.80 (m, 4H), 6.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.19-5.15 (m, 1H), 5.04 - 4.93 (m, 1H), 4.77-4.72 (m, 1H), 4.41 - 4.19 (m, 4H), 3.80 (s, 6H), 3.62-3.54 (m, 1H), 3.11 - 2.97 (m, 1H), 2.56 (s, 3H), 2.42 - 2.31 (m, 3H). LCMS:MS m/z =762.2[M+H]+.
LCMS m/z =762.2[M+H]+. 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.21 - 7.11 (m, 4H), 6.90 - 6.80 (m, 4H), 6.66 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.19-5.15 (m, 1H), 5.04 - 4.93 (m, 1H), 4.77-4.72 (m, 1H), 4.41 - 4.19 (m, 4H), 3.80 (s, 6H), 3.62-3.54 (m, 1H), 3.11 - 2.97 (m, 1H), 2.56 (s, 3H), 2.42 - 2.31 (m, 3H). LCMS:MS m/z =762.2[M+H]+.
【0096】
工程１１：化合物１－１５の合成
【0097】
化合物１－１３（１４７ｇ、１８６．７４ｍｍｏｌ、純度９６．７６７％、１当量）をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．５Ｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（７２．４０ｇ、５６０．２３ｍｍｏｌ、９７．５８ｍＬ、３当量）を加え、次いで、化合物１－１４（４２．５４ｇ、２１４．７６ｍｍｏｌ、１．１５当量、２ＨＣｌ）も加えた。混合物を５０℃に加熱し、０．５時間攪拌して、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに化合物１－１５が溶解した溶液を得た。反応溶液を次の工程で直接使用した。
【0098】
工程１２：化合物１－１６の合成
【0099】
Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．５Ｌ）に化合物１－１５（１３７．８ｇ、１８７．０２ｍｍｏｌ、１当量）が溶解した溶液を攪拌機に加え、トリエチルアミン（１８．９２ｇ、１８７．０２ｍｍｏｌ、２６．０３ｍＬ、１当量）を添加した。その後、反応溶液に二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（４８．９８ｇ、２２４．４２ｍｍｏｌ、５１．５６ｍＬ、１．２当量）を加え、混合物を１８℃で１０時間攪拌した。混合物を水（１．５Ｌ）に注ぎ入れた後、酢酸エチル（４００ｍＬ×３）及び飽和塩化アンモニウム水溶液（４００ｍＬ×４）を添加した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して化合物１－１６を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.16 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 6.85 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 6.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.22 ( d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.90 - 4.68 (m, 2H), 4.61 (s, 1H), 4.41 - 4.21 (m, 4H), 4.04 (s, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.71 (s, 1H), 3.50 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 3.30 (s, 1H), 3.24 - 3.02 (m, 2H), 2.90 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.78 - 2.58 (m, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.34 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 1.51 (s, 9H). LCMS m/z =837.2[M+H]+.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ = 7.16 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 6.85 (d, J = 8.6 Hz, 4H), 6.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.22 ( d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.90 - 4.68 (m, 2H), 4.61 (s, 1H), 4.41 - 4.21 (m, 4H), 4.04 (s, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.71 (s, 1H), 3.50 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 3.30 (s, 1H), 3.24 - 3.02 (m, 2H), 2.90 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 2.78 - 2.58 (m, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.34 (d, J = 4.0 Hz, 3H), 1.51 (s, 9H). LCMS m/z =837.2[M+H]+.
【0100】
工程１３：化合物１－１７の合成
【0101】
化合物１－１６（２４５ｇ、２７８．１０ｍｍｏｌ、純度９５％、１当量）を無水ジクロロメタン（２５００ｍＬ）に溶解し、０～１０℃に冷却した。その後、ｍ－クロロ過安息香酸（５６．４６ｇ、２７８．１０ｍｍｏｌ、純度８５％、１当量）を数回に分けて添加し、混合物を１０℃で０．５時間攪拌した。更なるｍ－クロロ過安息香酸（８．４７ｇ、４１．７１ｍｍｏｌ、純度８５％、０．１５当量）を添加し、混合物を１０℃で更に０．５時間攪拌した。この反応物を、１０ｇの化合物１－１６のバッチと共に処理した。反応溶液を飽和重炭酸ナトリウム（１５００ｍＬ）、５％チオ硫酸ナトリウム（１５００ｍＬ）（湿潤ヨウ化カリウムデンプン試験紙による試験に合格した後）及び半飽和ブライン（１５００ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：石油エーテル＝１０％－１５％－２０％－３０％）で精製して化合物１－１７を得た。
1HNMR (400 MHz,CDCl3) δ ppm 7.15 (d, J=8.00 Hz, 4 H), 6.85 (d, J=8.80 Hz, 4 H), 6.65 (d, J=8.80 Hz, 1 H), 5.27 (m, 1 H), 4.78 - 4.91 (m, 2 H), 4.61 ( s, 1 H), 4.24 - 4.38 (m, 4 H), 3.90 - 4.18 (m, 2 H), 3.78 - 3.82 (m, 6 H), 3.42 - 3.70 (m, 3 H), 3.33 (br s, 1 H), 3.06 - 3.28 (m, 2 H), 2.90 (s, 3 H), 2.66 (m, 2 H), 2.29 - 2.41 (s, 3 H), 1.51 (s, 9 H). LCMS m/z =853.2[M+H]+.
1HNMR (400 MHz,CDCl3) δ ppm 7.15 (d, J=8.00 Hz, 4 H), 6.85 (d, J=8.80 Hz, 4 H), 6.65 (d, J=8.80 Hz, 1 H), 5.27 (m, 1 H), 4.78 - 4.91 (m, 2 H), 4.61 ( s, 1 H), 4.24 - 4.38 (m, 4 H), 3.90 - 4.18 (m, 2 H), 3.78 - 3.82 (m, 6 H), 3.42 - 3.70 (m, 3 H), 3.33 (br s, 1 H), 3.06 - 3.28 (m, 2 H), 2.90 (s, 3 H), 2.66 (m, 2 H), 2.29 - 2.41 (s, 3 H), 1.51 (s, 9 H). LCMS m/z =853.2[M+H]+.
【0102】
工程１４：化合物１－１９の合成
【0103】
化合物１－１８（１８．２４ｇ、１１４．５９ｍｍｏｌ、１．２当量）を無水テトラヒドロフラン（９００ｍＬ）に溶解し、混合物を－２０℃に冷却した。その後、ナトリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（１１．０１ｇ、１１４．５９ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、混合物を１５分間攪拌した。次いで、無水テトラヒドロフラン（１８０ｍＬ）に化合物１－１７（９０．５ｇ、９５．４９ｍｍｏｌ、純度９０％、１当量）を溶解した溶液を添加し、混合物を更に０．５時間攪拌した。この反応物を５０ｇの化合物１－１８のバッチと共に処理した。反応溶液に１０００ｍＬの飽和塩化アンモニウムを添加して反応をクエンチした。分液後、水相を酢酸エチル（１０００ｍＬ）で抽出した。各層を分離させた。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮し、カラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：石油エーテル＝２０％－５０％－１００％）で精製して、化合物１－１９を白色固体として得た。
LCMS m/z =948.4[M+H]+.
LCMS m/z =948.4[M+H]+.
【0104】
工程１５：化合物１－２０の合成
【0105】
化合物１－１９（９７．００ｇ、９７．２０ｍｍｏｌ、純度９５％、１当量）を２－メチルテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）に溶解し、混合物を０℃に冷却した。その後、反応溶液に塩酸（８Ｍ、６１４．８０ｍＬ、５０．６当量）を滴下し、混合物を２５℃まで加熱して２時間攪拌した。次いで、ｎ－ヘプタン（２００ｍＬ）を添加し、各層を分離させた。水相を回収し、２－メチルテトラヒドロフラン（３００ｍＬ）を加えた。炭酸ナトリウムを用いて混合物のｐＨを８～９に調整し、混合物を透明になるまで攪拌した。分液後、有機相を回収し、水相を２－メチルテトラヒドロフラン（３００ｍＬ×２）で抽出した。有機相を回収し、飽和ブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過した。有機相を回収し、濃縮して粗生成物を得た。粗生成物をジクロロメタン（１０００ｍＬ）に溶解し、温度を１０℃未満に保ちながら、トリフルオロ酢酸（２８３．７３ｇ、２．４９ｍｏｌ、１８４．２４ｍＬ、２５．６当量）をジクロロメタンにゆっくり添加した。混合物を２５℃で３時間攪拌した。反応溶液を５００ｍＬの氷水に注ぎ、混合物を透明になるまで攪拌した。分液後、有機相を水（３００ｍＬ×３）で抽出した。２バッチの水相を合わせ、次いでジクロロメタン（５００ｍＬ×４）で抽出した。有機相を廃棄した。水相を１０℃に冷却し、ここに５００ｍＬの２－メチルテトラヒドロフランを添加した（その結果、発熱した）。次いで、混合物のｐＨを炭酸ナトリウムで９に調整し、２－メチルテトラヒドロフラン（４００ｍＬ×２）を添加して抽出した。有機相を合わせ、水（３００ｍＬ×４）及び飽和ブライン（３００ｍＬ）でそれぞれ洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して、化合物１－２０を灰色固体として得た。
LCMS m/z =608.27[M+H]+.
LCMS m/z =608.27[M+H]+.
【0106】
工程１６：式（Ｉ）の化合物の合成
【0107】
化合物１－２０（５８ｇ、８４．００ｍｍｏｌ、純度８８％、１当量）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２１．７１ｇ、１６８．００ｍｍｏｌ、２９．２６ｍＬ、２当量）及び２－（７－アザベンゾトリアゾール）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３８．３３ｇ、１００．８０ｍｍｏｌ、１．２当量）をＤＭＦ（６００ｍＬ）に溶解した後、混合物を０℃に冷却した。２－フルオロアクリル酸（６．８１ｇ、７５．６０ｍｍｏｌ、０．９当量）を数回に分けて添加し、混合物を０℃で１０分間攪拌した。反応溶液を９００ｍＬの水に注いだ後、酢酸エチル（２００ｍＬ×３）で抽出した。有機相を合わせ、飽和塩化アンモニウム（２００ｍＬ×３）、飽和炭酸ナトリウム（２００ｍＬ×３）及び飽和ブライン（２００ｍＬ）でそれぞれ洗浄し、次いで、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。次いで、混合物をアセトニトリル及び水（１００ｍＬ：１５０ｍＬ）で１６時間スラリー化した。スラリーを濾過して式（Ｉ）の化合物を得た。ＳＦＣ分析法（カラム：Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ ＯＤ－３、５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．、３μｍ；移動相：Ａ（ＣＯ２）、Ｂ（０．０５％ジイソプロピルアミンを含むメタノール）；勾配：Ｂ％＝５から５０％、３分；流速：３．４ｍＬ／分；波長：２２０ｎｍ；圧力：１８００ｐｓｉ、光学純度：９９．２１％、ピーク時間：１．８４０分）。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 6.80 - 6.68 (m, 1H), 5.73 - 5.51 (m, 1H), 5.46 - 5.19 (m, 3H), 5.05 - 4.90 (m, 3H), 4.74 - 4.58 (m, 2H), 4.37 - 4.26 (m, 1H), 4.20 - 4.06 (m, 2H), 4.05 - 3.84 (m, 3H), 3.79 - 3.59 (m, 2H), 3.54 - 3.43 (m, 1H), 3.42 - 3.35 (m, 1H), 3.31 - 3.24 (m, 1H), 3.13 - 2.89 (m, 3H), 2.82 - 2.52 (m, 2H), 2.50 - 2.42 (m, 1H), 2.41 - 2.30 (m, 5H), 2.29 - 2.18 (m, 1H).
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ = 6.80 - 6.68 (m, 1H), 5.73 - 5.51 (m, 1H), 5.46 - 5.19 (m, 3H), 5.05 - 4.90 (m, 3H), 4.74 - 4.58 (m, 2H), 4.37 - 4.26 (m, 1H), 4.20 - 4.06 (m, 2H), 4.05 - 3.84 (m, 3H), 3.79 - 3.59 (m, 2H), 3.54 - 3.43 (m, 1H), 3.42 - 3.35 (m, 1H), 3.31 - 3.24 (m, 1H), 3.13 - 2.89 (m, 3H), 2.82 - 2.52 (m, 2H), 2.50 - 2.42 (m, 1H), 2.41 - 2.30 (m, 5H), 2.29 - 2.18 (m, 1H).
【0108】
実施例２：式（ＩＩＩ）の化合物の単結晶Ｘ線回折分析
０．０１３３ｇの式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを室温で２ｍＬのアセトニトリルに溶解した。サンプル溶液を４ｍＬの半密封サンプルバイアルに加え、室温でゆっくり蒸発させた。１０日後に無色の塊状結晶が得られた。結晶を回収し、単結晶Ｘ線回折計（Ｄ８－ＶＥＮＴＵＲＥ）を用いて回折強度データを収集した。式（ＩＩＩ）の化合物の結晶構造データを表２に、式（ＩＩＩ）の化合物の三次元構造の楕円体図を図６に示す。
【化6】
【表2】
【0109】
実施例３：式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａの調製
方法１：式（Ｉ）の化合物（０．２ｇ）をエタノール（２．４ｍＬ）に添加し、混合物を５０℃に加熱した。溶解後、反応溶液に水（０．４８ｍＬ）をゆっくり加え、混合物を５０℃で７２時間攪拌した。濾過後、固体を回収して、式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを得た。
方法１：式（Ｉ）の化合物（０．２ｇ）をエタノール（２．４ｍＬ）に添加し、混合物を５０℃に加熱した。溶解後、反応溶液に水（０．４８ｍＬ）をゆっくり加え、混合物を５０℃で７２時間攪拌した。濾過後、固体を回収して、式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを得た。
【0110】
方法２：式（Ｉ）の化合物（５．０ｇ）をエタノール（４Ｖ）に添加し、混合物を透明になるまで攪拌した。水（１Ｖ）をゆっくり系に添加し、種晶（０．５ｇ）を２０～３０℃で添加した。混合物をこの温度で１５時間攪拌した。その後、水（３Ｖ）をゆっくり滴下し、混合物を更に１～３時間攪拌した。濾過後、濾過ケークを回収して、式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを得た。
【0111】
実施例４：式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａの固体安定性アッセイ
「原料及び調製物の安定性試験のための指針」（中国薬局方２０１５年版第４部一般原則第９００１章）に従って、式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａの結晶安定性を、高温（６０℃、未封止）、高湿度（室温／相対湿度９２．５％、未封止）及び強光（５０００ｌｘ、未封止）の条件下、並びに長期実験（２５±２℃／６０±５％ＲＨ）及び加速実験（４０±２℃／７５±５％ＲＨ）の条件下で調査した。
「原料及び調製物の安定性試験のための指針」（中国薬局方２０１５年版第４部一般原則第９００１章）に従って、式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａの結晶安定性を、高温（６０℃、未封止）、高湿度（室温／相対湿度９２．５％、未封止）及び強光（５０００ｌｘ、未封止）の条件下、並びに長期実験（２５±２℃／６０±５％ＲＨ）及び加速実験（４０±２℃／７５±５％ＲＨ）の条件下で調査した。
【0112】
約２０ｍｇの式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを秤量し、ガラスサンプルバイアルの底に置いた。サンプルを広げて薄層にした。高温高湿条件下に置いたサンプルについては、バイアル口をアルミニウム箔で封止し、サンプルが周囲空気と完全に接触できるようにアルミニウム箔にいくつかの小さな穴を開けた。強光の条件下に置いたサンプルについては、バイアル口をアルミニウム箔で封止し、アルミニウム箔にいくつかの小さな穴を開けた。各種条件下に置いたサンプルをサンプリングし、それぞれ５日目及び１０日目に試験した（ＸＲＰＤ）。アッセイ結果を０日目の最初のアッセイ結果と比較した。アッセイ結果を以下の表３に示す。
【0113】
式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを医薬品用二重層低密度ポリエチレン袋に入れた。各医薬品用低密度ポリエチレン袋をひもできつく縛った後、単層アルミニウム箔袋に入れた。次いで、単層アルミニウム箔袋をヒートシールした。最後に、サンプルをプラスチックバケツ中に保管し、一定の温度及び湿度のチャンバ中で保管した。安定性アッセイで使用した包装は、材料貯蔵包装をシミュレートした。材料を赤色光下で安定性サンプルとして１．５ｇ／包装に分割した。各サンプルを同じ方法で包装し、安定性サンプルのラベルで標識した。各種条件下に置いたサンプルをサンプリングし、３ヶ月目及び６ヶ月目に試験した（ＸＲＰＤ）。アッセイ結果を０日目の最初のアッセイ結果と比較した。アッセイ結果を以下の表３に示す。
【表3】
【0114】
光制御＊１：光制御サンプルを同時に配置する必要があった。光制御サンプルをスクリューキャップで封止し、次いでスズ箔で完全に包んだ。
【0115】
結論：式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａは、高温、高湿度、強光、並びに長期実験及び加速実験の条件下で良好な安定性を有する。
【0116】
生物学的アッセイデータ：
アッセイ例１：ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異ＭＩＡ－ＰＡ－ＣＡ－２細胞の増殖に対する化合物の阻害効果のアッセイ
１．１ アッセイの目的
アッセイ例１：ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異ＭＩＡ－ＰＡ－ＣＡ－２細胞の増殖に対する化合物の阻害効果のアッセイ
１．１ アッセイの目的
【0117】
化合物を、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異ＭＩＡ－ＰＡ－ＣＡ－２細胞の増殖阻害のＩＣ５０についてアッセイした。
【0118】
１．２ 試薬
【0119】
このアッセイで使用した主な試薬は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７３）を含んでいた。
【0120】
１．３ 機器
【0121】
このアッセイで使用した主な機器は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ多機能マイクロプレートリーダーであった。
【0122】
１．４ アッセイの方法
１）接着細胞をトリプシンで消化して細胞懸濁液を形成し、その後の使用のために細胞懸濁液を計数した。
２）遠心管に適量の細胞を加え、細胞培養培地を加えて必要な容量とし、次いで、細胞を９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェル（１００μＬの培養培地）の最終密度で播種した。
３）２４時間インキュベートした後、化合物をＤＭＳＯを用いて１０ｍＭに処方し、ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）で９点に３倍段階希釈し、１０μＬを各ウェルに二連で加えた。１ウェルあたり１０μＬのＤＰＢＳをアッセイ対照ウェル（Ｃｏｎ）に加えた。
４）同日に、化合物を含まない別の細胞培養プレートに５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを加え、ＥｎＶｉｓｉｏｎで蛍光値を読み取った。この値を０日目の値として記録した。
５）化合物で処理した細胞を７２時間インキュベーションした後、プレートを取り出し、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを細胞プレートに加えた。蛍光値をＥｎＶｉｓｉｏｎで読み取った。
６）データ解析：各ウェル中の細胞の阻害率を以下の式に従って計算した。
＊ＦＤａｙ０は、化合物処理なしの元の細胞数アッセイウェルの読み取り値であった。
ＦＣｏｎは、７２時間のインキュベーション後のＣｏｎ群の蛍光読み取り値であった。
ＦＣｐｄは、７２時間のインキュベーション後の各化合物の蛍光読み取り値であった。
７）Ｌｏｇ（アゴニスト）対応答：化合物の阻害率データ（阻害率％）に対する可変勾配非線形フィット分析を実施して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって以下の式を使用して化合物のＩＣ５０値を得た。
１）接着細胞をトリプシンで消化して細胞懸濁液を形成し、その後の使用のために細胞懸濁液を計数した。
２）遠心管に適量の細胞を加え、細胞培養培地を加えて必要な容量とし、次いで、細胞を９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェル（１００μＬの培養培地）の最終密度で播種した。
３）２４時間インキュベートした後、化合物をＤＭＳＯを用いて１０ｍＭに処方し、ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）で９点に３倍段階希釈し、１０μＬを各ウェルに二連で加えた。１ウェルあたり１０μＬのＤＰＢＳをアッセイ対照ウェル（Ｃｏｎ）に加えた。
４）同日に、化合物を含まない別の細胞培養プレートに５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを加え、ＥｎＶｉｓｉｏｎで蛍光値を読み取った。この値を０日目の値として記録した。
５）化合物で処理した細胞を７２時間インキュベーションした後、プレートを取り出し、５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏを細胞プレートに加えた。蛍光値をＥｎＶｉｓｉｏｎで読み取った。
６）データ解析：各ウェル中の細胞の阻害率を以下の式に従って計算した。
【数1】
ＦＣｏｎは、７２時間のインキュベーション後のＣｏｎ群の蛍光読み取り値であった。
ＦＣｐｄは、７２時間のインキュベーション後の各化合物の蛍光読み取り値であった。
７）Ｌｏｇ（アゴニスト）対応答：化合物の阻害率データ（阻害率％）に対する可変勾配非線形フィット分析を実施して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって以下の式を使用して化合物のＩＣ５０値を得た。
【数2】
【0123】
１．５ アッセイの結果
【表4】
【0124】
アッセイ結果は、式（Ｉ）の化合物が、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異ＭＩＡ－ＰＡ－ＣＡ－２細胞株の細胞増殖に対して良好な阻害活性を有することを示した。
【0125】
アッセイ例２：ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異Ｈ３５８細胞の増殖に対する化合物の阻害効果のアッセイ
２．１ アッセイの目的
２．１ アッセイの目的
【0126】
化合物を、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異Ｈ３５８細胞の増殖阻害のＩＣ５０についてアッセイした。
【0127】
２．２ 試薬
【0128】
このアッセイで使用した主な試薬には、ＲＰＭＩ－１６４０培地、Ｖｉｃｅｎｔｅから購入したペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質、Ｂｉｏｓｅｒａから購入したウシ胎児血清、Ｐｒｏｍｅｇａから購入したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（細胞生存率化学発光検出試薬）試薬、及び中国科学院のセルバンクから購入したＮＣＩ－Ｈ３５８細胞株が含まれていた。
【0129】
２．３ 機器
【0130】
このアッセイで使用した主な機器は、Ｎｉｖｏマルチラベルアナライザ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）であった。
【0131】
２．４ アッセイの方法：
１）ＮＣＩ－Ｈ３５８細胞を白色９６ウェルプレートに接種したが、各ウェルは８０μＬの細胞懸濁液及び４０００個のＮＣＩ－Ｈ３５８細胞を含んでいた。細胞プレートを炭酸ガスインキュベータ内で一晩インキュベートした。
２）アッセイ対象の化合物をマルチチャネルピペットで５倍段階希釈して、９つの濃度、すなわち２ｍＭ～５．１２ｎＭを得た。アッセイを二連で行った。７８μＬの培地を中間プレートに加えた後、２μＬの段階希釈した化合物を対応する位置に従って中間プレートの各ウェルに移した。ウェルを混合した後、２０μＬ／ウェルを細胞プレートに移した。細胞プレートに移した化合物の濃度は、１０μＭ～０．０２５６ｎＭの範囲であった。細胞プレートを炭酸ガスインキュベータ内で５日間インキュベートした。別の細胞プレートを用意し、化合物添加当日の細胞プレートのシグナル値を最大値（下記式におけるＭａｘ値）として読み取って、データ解析に利用した。細胞プレートの各ウェルに２５μＬの細胞生存率化学発光検出試薬を加え、プレートを室温で１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化させた。プレートを読み取るためにマルチラベルアナライザを使用した。
３）細胞プレートの各ウェルに２５μＬの細胞生存率化学発光検出試薬を加え、プレートを室温で１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化させた。プレートを読み取るためにマルチラベルアナライザを使用した。
１）ＮＣＩ－Ｈ３５８細胞を白色９６ウェルプレートに接種したが、各ウェルは８０μＬの細胞懸濁液及び４０００個のＮＣＩ－Ｈ３５８細胞を含んでいた。細胞プレートを炭酸ガスインキュベータ内で一晩インキュベートした。
２）アッセイ対象の化合物をマルチチャネルピペットで５倍段階希釈して、９つの濃度、すなわち２ｍＭ～５．１２ｎＭを得た。アッセイを二連で行った。７８μＬの培地を中間プレートに加えた後、２μＬの段階希釈した化合物を対応する位置に従って中間プレートの各ウェルに移した。ウェルを混合した後、２０μＬ／ウェルを細胞プレートに移した。細胞プレートに移した化合物の濃度は、１０μＭ～０．０２５６ｎＭの範囲であった。細胞プレートを炭酸ガスインキュベータ内で５日間インキュベートした。別の細胞プレートを用意し、化合物添加当日の細胞プレートのシグナル値を最大値（下記式におけるＭａｘ値）として読み取って、データ解析に利用した。細胞プレートの各ウェルに２５μＬの細胞生存率化学発光検出試薬を加え、プレートを室温で１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化させた。プレートを読み取るためにマルチラベルアナライザを使用した。
３）細胞プレートの各ウェルに２５μＬの細胞生存率化学発光検出試薬を加え、プレートを室温で１０分間インキュベートして、発光シグナルを安定化させた。プレートを読み取るためにマルチラベルアナライザを使用した。
【0132】
データ解析：
【0133】
式（Ｓａｍｐｌｅ－Ｍｉｎ）／（Ｍａｘ－Ｍｉｎ）＊１００％を使用して生データを阻害率に変換し、４つのパラメータ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにおける「ｌｏｇ（阻害剤）対応答－－可変勾配」モード）によるカーブフィッティングによってＩＣ５０値を得ることができる。ＮＣＩ－Ｈ３５８細胞増殖に対する本開示の化合物の阻害活性を表５に示した。
【表5】
【0134】
結論：式（Ｉ）の化合物は、ＮＣＩ－Ｈ３５８細胞の増殖に対して良好な阻害活性を示す。
【0135】
アッセイ例３：肝細胞の代謝安定性
アッセイの目的：ＣＤ－１マウス、ＳＤラット、ビーグル犬、カニクイザル及びヒトの肝細胞におけるアッセイ化合物の代謝安定性をそれぞれアッセイした。
アッセイの目的：ＣＤ－１マウス、ＳＤラット、ビーグル犬、カニクイザル及びヒトの肝細胞におけるアッセイ化合物の代謝安定性をそれぞれアッセイした。
【0136】
アッセイの手順：いくつかの９６ウェルサンプル析出プレートを用意し、それぞれＴ０基板、Ｔ１５基板、Ｔ３０基板、Ｔ６０基板、Ｔ９０基板、Ｔ１２０基板、Ｔ０－ＭＣ基板、Ｔ１２０－ＭＣ基板及びブランク基板と命名した。回収培地及びインキュベーション培地を予め取り出し、予熱のために３７℃の水浴に入れた。凍結保存した肝細胞を液体窒素タンクから取り出し、直ちに３７℃の水浴に浸した（約９０秒）。凍結保存した肝細胞を解凍してほぐした後、回収培地４０ｍＬを入れた遠心管に注ぎ、管を静かに逆さにして回収培地に細胞を再懸濁させた。細胞を室温で５分間１００×ｇで遠心分離し、上清を取り除いた。肝細胞を適当な体積のインキュベーション培地に再懸濁し、トリパンブルー染色法によって細胞生存率を計算した。１９８μＬの肝細胞懸濁液（０．５１×１０６細胞／ｍＬ）を予熱したインキュベーションプレートに加えた。培養培地対照群については、１９８μＬの肝細胞非含有インキュベーション培地をＴ０－ＭＣ及びＴ１２０－ＭＣインキュベーションプレートに加えた。すべてのインキュベーションプレートを３７℃のインキュベータ内で１０分間プレインキュベートした。次いで、アッセイサンプル及び対照化合物の作業溶液２μＬをそれぞれ添加し、混合物をよく混合した。インキュベーションプレートを直ちにインキュベータ内のシェーカーに入れ、タイマーをスタートさせると同時に反応を開始した。各化合物の各時点について、２つの複製サンプルを調製した。インキュベーション条件は、３７℃、飽和湿度、及び５％ＣＯ２であった。アッセイ系において、アッセイサンプルの最終濃度は１μＭ、対照サンプルの最終濃度は３μＭ、肝細胞の最終濃度は０．５×１０６細胞／ｍＬ、全有機溶媒の最終濃度は０．９６％であり、そのうちＤＭＳＯの最終濃度は０．１％であった。対応する時点のインキュベーションの終了時に、インキュベーションプレートを取り出し、化合物及び対照化合物と細胞との混合物２５μＬを、１２５μＬの停止溶液（アセトニトリル中２００ｎｇ／ｍＬのトルブタミド及びラベタロール）を含むサンプルプレートに加えた。ブランクサンプルプレートについては、２５μＬの肝細胞非含有インキュベーション培地を直接加えた。密封後、すべてのサンプルプレートをシェーカーにて６００ｒｐｍで１０分間振盪し、次いで３２２０×ｇで２０分間遠心分離した。アッセイサンプル及び対照サンプルの上清を超純水で１：３の比で希釈した。すべてのサンプルをよく混合し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【0137】
アッセイ結果：アッセイ結果を表６に示す。
【表6】
【0138】
結論：様々な種の肝細胞における代謝アッセイは、式（Ｉ）の化合物が良好な代謝安定性を有することを示した。
【0139】
アッセイ例４：肝ミクロソームにおけるインビトロ安定性アッセイ
アッセイの目的：ＣＤ－１マウス、ＳＤラット、ビーグル犬、カニクイザル及びヒトの肝ミクロソームにおけるアッセイ化合物の代謝安定性をそれぞれアッセイした。
アッセイの目的：ＣＤ－１マウス、ＳＤラット、ビーグル犬、カニクイザル及びヒトの肝ミクロソームにおけるアッセイ化合物の代謝安定性をそれぞれアッセイした。
【0140】
アッセイの手順：２つの９６ウェルインキュベーションプレートを用意し、それぞれＴ６０インキュベーションプレート及びＮＣＦ６０インキュベーションプレートと命名した。４４５μＬのミクロソーム作業溶液（０．５６ｍｇ／ｍＬの肝ミクロソームタンパク質濃度）をＴ６０インキュベーションプレート及びＮＣＦ６０インキュベーションプレートにそれぞれ加え、次いで、上記インキュベーションプレートを３７℃の水浴中で約１０分間プレインキュベートした。
【0141】
プレインキュベーション後、アッセイサンプル又は対照化合物の作業溶液５μＬをＴ６０インキュベーションプレート及びＮＣＦ６０インキュベーションプレートにそれぞれ加え、混合物を十分に混合した。５０μＬのリン酸カリウム緩衝液をＮＣＦ６０インキュベーションプレートの各ウェルに加えて反応を開始した。１８０μＬの停止溶液（アセトニトリル中２００ｎｇ／ｍＬのトルブタミド及び２００ｎｇ／ｍＬのラベタロール）及び６ｕＬのＮＡＤＰＨ再生系作業溶液をＴ０停止プレートに加え、５４μＬのサンプルをＴ６０インキュベーションプレートからＴ０停止プレートに移した（Ｔ０サンプルの生成）。４４μＬのＮＡＤＰＨ再生系作業溶液をＴ６０インキュベーションプレートの各ウェルに加えることによって、反応を開始した。５４μＬのミクロソーム作業溶液、６ｕＬのＮＡＤＰＨ再生系作業溶液及び１８０μＬの停止溶液のみをブランクプレートに加えた。したがって、アッセイ化合物又は対照化合物のサンプルでは、化合物、テストステロン、ジクロフェナク及びプロパフェノンの最終反応濃度は１μＭであり、肝ミクロソームの濃度は０．５ｍｇ／ｍＬであり、反応系内のＤＭＳＯ及びアセトニトリルの最終反応濃度はそれぞれ０．０１％（ｖ／ｖ）及び０．９９％（ｖ／ｖ）であった。適当な時間（例えば、５、１５、３０、４５及び６０分）のインキュベーション後、１８０μＬの停止溶液（アセトニトリル中２００ｎｇ／ｍＬのトルブタミド及び２００ｎｇ／ｍＬのラベタロール）を各停止プレートのサンプルウェルにそれぞれ加えた。６０μＬのサンプルをＴ６０インキュベーションプレートから取り出して、反応を停止させた。すべてのサンプルプレートを十分に振盪し、次いで３２２０×ｇで２０分間遠心分離した。その後、各ウェルから８０μＬの上清を取り出し、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析のために２４０μＬの純水で希釈した。すべてのサンプルを注入し、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析によって分析した。
【0142】
アッセイ結果：アッセイ結果を表７に示す。
【表7】
【0143】
結論：肝ミクロソームにおける代謝安定性のアッセイは、式（Ｉ）の化合物が良好な代謝安定性を有することを示した。
【0144】
アッセイ例５：血漿中の安定性アッセイ
アッセイの目的：ＣＤ－１マウス及びヒトの血漿中のアッセイ化合物の安定性をそれぞれアッセイした。
アッセイの目的：ＣＤ－１マウス及びヒトの血漿中のアッセイ化合物の安定性をそれぞれアッセイした。
【0145】
アッセイの手順：凍結保存血漿を１０～２０分間解凍した。血漿を完全に解凍した後、遠心分離機に入れ、３２２０×ｇで５分間遠心分離して、血漿中のあらゆる懸濁物及び沈殿物を除去した。９６ウェルインキュベーションプレートを用意し、それぞれＴ０、Ｔ１０、Ｔ３０、Ｔ６０、Ｔ１２０と命名した。マウス、ラット、イヌ、サル及びヒトのブランク血漿９８μＬを対応するインキュベーションプレートに加え、次いで、化合物又は対照化合物の作業溶液２μＬを対応するプレートに二連で加えた。すべてのサンプルを３７℃の水浴中でインキュベートした。化合物及び対照化合物のビサコジル、マレイン酸エナラプリル、プロカイン及びプロバンチンの最終インキュベーション濃度は２μＭであり、最終有機相含有量は２．０％であった。各時点のインキュベーションの終了時に、対応するインキュベーションプレートを取り出し、アセトニトリル中２００ｎｇ／ｍＬのトルブタミド及びラベタロールの溶液４００μＬを各対応するサンプルウェルに加えてタンパク質を沈殿させた。すべてのサンプルプレートを密封し、十分に振盪し、次いで３２２０×ｇで２０分間遠心分離した。５０μＬの上清を取り出し、１００μＬの超純水で希釈した。すべてのサンプルをよく混合し、次いでＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。
【0146】
アッセイ結果：アッセイ結果を表８に示す。
【表8】
【0147】
結論：式（Ｉ）の化合物は、ヒト及びマウスの血漿中で良好な安定性を有する。
【0148】
アッセイ例６：全血中の安定性アッセイ
アッセイの目的：ＣＤ－１マウス、ＳＤラット、ビーグル犬及びカニクイザルの全血中のアッセイ化合物の安定性をそれぞれアッセイした。
アッセイの目的：ＣＤ－１マウス、ＳＤラット、ビーグル犬及びカニクイザルの全血中のアッセイ化合物の安定性をそれぞれアッセイした。
【0149】
アッセイの手順：アッセイの当日又はアッセイの前日に、抗凝固剤ＥＤＴＡ－Ｋ２を用いて、ＣＤ－１マウス、ＳＤラット、ビーグル犬及びカニクイザルから新鮮な全血を採取した。アッセイ開始前に、全血をＰＢＳと１：１（ｖ：ｖ）で混合し、混合物を３７℃の水浴中で１０～２０分間予熱した。９６ウェルインキュベーションプレートを用意し、それぞれＴ０、Ｔ３０、Ｔ６０、Ｔ２４０と命名した。Ｔ０、Ｔ３０、Ｔ６０及びＴ２４０インキュベーションプレートを含む対応するインキュベーションプレートにおいて、化合物又は対照化合物の作業溶液２μＬを、マウス、ラット、イヌ、サル及びヒトのブランク全血９８μＬと二連で混合した。すべてのサンプルを３７℃の水浴中でインキュベートした。化合物の最終インキュベーション濃度は５μＭであり、対照化合物の最終インキュベーション濃度は２μＭであった。各時点のインキュベーションの終了時に、対応するインキュベーションプレートを取り出し、１００μＬの超純水を対応するサンプルウェルに直ちに加え、十分に混合した。アセトニトリル中２００ｎｇ／ｍＬのトルブタミド及びラベタロールの溶液８００μＬを添加してタンパク質を沈殿させた。サンプルプレートを密封し、十分に振盪し、次いで３２２０×ｇで２０分間遠心分離した。上清１５０μＬを取り出し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。
【0150】
アッセイ結果：アッセイ結果を表９に示す。
【表9】
【0151】
結論：様々な種の全血中の安定性アッセイは、式（Ｉ）の化合物が全血中で良好な安定性を有することを示した。
【0152】
アッセイ例７：タンパク質結合率のアッセイ
アッセイの目的：ＣＤ－１マウス、ＳＤラット、ビーグル犬、カニクイザル及びヒトの血漿中のアッセイ化合物のタンパク質結合率を平衡透析によって求めた。
アッセイの目的：ＣＤ－１マウス、ＳＤラット、ビーグル犬、カニクイザル及びヒトの血漿中のアッセイ化合物のタンパク質結合率を平衡透析によって求めた。
【0153】
アッセイの手順：上記５種の血漿を用いて化合物濃度が２μＭの血漿サンプルを調製し、９６ウェル平衡透析装置に入れ、３７±１℃のリン酸緩衝液で４時間透析した。このアッセイでは、対照化合物としてワーファリンを使用した。血漿及び透析緩衝液中のアッセイ化合物の濃度をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって求めた。
【0154】
アッセイ結果：アッセイ結果を表１０に示す。
【表10】
【0155】
結論：様々な種の血漿結合率に関するアッセイは、式（Ｉ）の化合物が血漿中で高いタンパク質未結合率を有することを示した。
【0156】
アッセイ例８：インビボでの薬物動態に関するアッセイ
１）ＳＤラットにおける経口投与及び静脈内注射によるアッセイ化合物の薬物動態に関するアッセイ
１）ＳＤラットにおける経口投与及び静脈内注射によるアッセイ化合物の薬物動態に関するアッセイ
【0157】
アッセイ化合物を５％ジメチルスルホキシド／９５％（１０％ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン）溶液と混合した。混合物をボルテックスし超音波処理して１ｍｇ／ｍＬの透明溶液を調製し、これを後で使用するために微多孔膜を通して濾過した。７～１０週齢の雄性ＳＤラットを選択し、候補化合物溶液を静脈内又は経口投与した。全血を一定期間採取し、調製して血漿を得た。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって薬物濃度を分析し、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、米国）によって薬物動態パラメータを計算した。アッセイの結果を表１１に示す。
【表11】
【0158】
注釈：Ｖｄｓｓ，ｕは、未結合血漿タンパク質下の見かけの分布容積である（Ｖｄｓｓ，ｕ＝Ｖｄｓｓ／ＰＰＢ（未結合％））；Ｃｍａｘ，ｕ及びＡＵＣ０－ｌａｓｔ，ｕは、未結合血漿タンパク質下での対応する値である（Ｃｍａｘ，ｕ＝Ｃｍａｘ×ＰＰＢ（未結合％）；ＡＵＣ０－ｌａｓｔ，ｕ＝ＡＵＣ０－ｌａｓｔ×ＰＰＢ（未結合％））。
【0159】
結論：ＰＫアッセイは、式（Ｉ）の化合物がラットにおいて高い未結合血漿曝露量及び良好な経口バイオアベイラビリティを有することを示した。
【0160】
２）ＳＤラットにおける経口投与による式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａの薬物動態に関するアッセイ
【0161】
１０９．７２ｍｇのアッセイ化合物を精秤し、ガラスバイアルに加えた。７７４ｕＬの０．５％メチルセルロース（４００粘度）水溶液を添加し、混合物を５分間攪拌した。１０ｍＬの０．５％メチルセルロース（４００粘度）水溶液を添加し、混合物を５分間攪拌して均一で不透明な懸濁液を得た。７～１０週齢の雄性ＳＤラットを選択し、候補化合物溶液を経口投与した。全血を一定期間採取し、調製して血漿を得た。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって薬物濃度を分析し、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、米国）によって薬物動態パラメータを計算した。アッセイの結果を表１２に示す。
【表12】
【0162】
結論：ＰＫアッセイは、式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａがラットにおいて高い曝露量を有することを示した。
【0163】
３）ＣＤマウスにおける経口投与及び静脈内注射によるアッセイ化合物の薬物動態に関するアッセイ
【0164】
アッセイ化合物を５％ジメチルスルホキシド／９５％（１０％ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン）溶液と混合した。混合物をボルテックスし超音波処理して１ｍｇ／ｍＬの透明溶液を調製し、これを後で使用するために微多孔膜を通して濾過した。７～１０週齢の雄性ＣＤマウスを選択し、候補化合物溶液を静脈内又は経口投与した。全血を一定期間採取し、調製して血漿を得た。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって薬物濃度を分析し、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、米国）によって薬物動態パラメータを計算した。アッセイの結果を表１３に示す。
【表13】
【0165】
注釈：Ｖｄｓｓ，ｕは、未結合血漿タンパク質下の見かけの分布容積である（Ｖｄｓｓ，ｕ＝Ｖｄｓｓ／ＰＰＢ（未結合％））；Ｃｍａｘ，ｕ及びＡＵＣ０－ｌａｓｔ，ｕは、未結合血漿タンパク質下での対応する値である（Ｃｍａｘ，ｕ＝Ｃｍａｘ×ＰＰＢ（未結合％）；ＡＵＣ０－ｌａｓｔ，ｕ＝ＡＵＣ０－ｌａｓｔ×ＰＰＢ（未結合％））。
【0166】
結論：ＰＫアッセイは、式（Ｉ）の化合物がマウスにおいて高い未結合血漿曝露量及び良好な経口バイオアベイラビリティを有することを示した。
【0167】
４）ビーグル犬における経口投与によるアッセイ化合物の薬物動態に関するアッセイ
【0168】
６８０．３９７ｍｇのアッセイ化合物粉末を精秤し、５０ｍＬの０．５％メチルセルロース（４００粘度）水溶液を添加した。混合物を１０分間攪拌し、１０分間超音波処理した。５０ｍＬの０．５％メチルセルロース（４００粘度）水溶液を加え、ホモジナイザーを用いて１０分間ホモジナイズした。１１ｍＬの０．５％メチルセルロース（４００粘度）水溶液を添加した。混合物を５分間超音波処理し、１０分間攪拌した。３５８μＬの０．５％メチルセルロース（４００粘度）水溶液を添加し、２分間攪拌した。６月齢を超える雄性ビーグル犬を選択し、候補化合物溶液を経口投与した。全血を一定期間採取し、調製して血漿を得た。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって薬物濃度を分析し、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、米国）によって薬物動態パラメータを計算した。アッセイの結果を表１４に示す。全血を一定期間採取し、調製して血漿を得た。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法によって薬物濃度を分析し、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、米国）によって薬物動態パラメータを計算した。アッセイの結果を表１４に示す。
【表14】
【0169】
結論：ＰＫアッセイは、式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａがイヌにおいて高い曝露量を有することを示した。
【0170】
アッセイ例９：インビボでの薬力学に関するアッセイ
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるヒト膵臓がんＭｉａ ＰａＣａ－２細胞の皮下移植腫瘍モデルにおけるインビボでの薬力学に関するアッセイ
Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるヒト膵臓がんＭｉａ ＰａＣａ－２細胞の皮下移植腫瘍モデルにおけるインビボでの薬力学に関するアッセイ
【0171】
１．細胞培養及び腫瘍組織調製
【0172】
細胞培養：ヒト膵臓がんＭｉａ ＰａＣａ－２細胞（ＡＴＣＣ－ＣＲＬ－１４２０）を、３７℃、５％炭酸ガスインキュベータにおいて１０％ウシ胎児血清及び２．５％ウマ血清を含むＤＭＥＭ培地中、インビトロで単層培養した。細胞をトリプシン－ＥＤＴＡによる通常の消化によって週に２回継代した。細胞飽和度が８０％～９０％に達し、細胞数が要件を満たしたときに、細胞を回収し、計数し、適当な量のＰＢＳに再懸濁した。マトリゲルを１：１の比で添加して、２５×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を有する細胞懸濁液を得た。
【0173】
細胞接種：０．２ｍＬ（５×１０６細胞／マウス）のＭｉａ ＰａＣａ－２細胞（＋マトリゲル、体積で１：１）を各マウスの右背部に皮下接種した。平均腫瘍体積が１９０ｍｍ３に達したときに、マウスを腫瘍体積に基づいて各群に無作為化し、表１５のプロトコルに従って投与を開始した。
【表15】
【0174】
注釈：ＰＯは経口投与を示し、ＱＤは１日１回を示す。
【0175】
２．腫瘍測定及びアッセイインジケータ
【0176】
腫瘍直径をノギスで週に２回測定した。腫瘍体積の計算式は、Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａ及びｂは、それぞれ腫瘍の長径及び短径を表す）とした。
【0177】
化合物の抗腫瘍効果を、ＴＧＩ（％）又は相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）によって評価した。相対腫瘍増殖率Ｔ／Ｃ（％）＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（ＴＲＴＶ：処置群におけるＲＴＶ；ＣＲＴＶ：陰性対照群におけるＲＴＶ）。腫瘍測定結果より相対腫瘍体積（ＲＴＶ）を計算し、計算式はＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０（式中、Ｖ０は群ごとに投与時（すなわち、Ｄ０）に測定した平均腫瘍体積であり、Ｖｔは所定の測定時における平均腫瘍体積である）とした。ＴＲＴＶ及びＣＲＴＶについては、同日のデータを使用した。
【0178】
ＴＧＩ（％）は腫瘍増殖阻害率を反映するものであった。ＴＧＩ（％）＝［（１－（処置群の投与終了時の平均腫瘍体積－処置群の投与開始時の平均腫瘍体積））／（ビヒクル対照群の処置終了時の平均腫瘍体積－ビヒクル対照群の処置開始時の平均腫瘍体積）］×１００％。
【0179】
３．アッセイの結果
【0180】
【0181】
投与２２日目の結果を表１６に示す。
【表16】
【0182】
結論：式（Ｉ）の化合物は、顕著な腫瘍阻害効果を有する。また、各用量群のマウスの体重は安定しており、明らかな不耐性はない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-08
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（ＩＩ）の化合物【化1】
【請求項2】
ｎが０．１、０．５、１、１．５及び２から選択されるか、あるいは
ｎが２である、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａであって、【化2】
８．５１４±０．２００°、１４．６８９±０．２００°、及び１８．１２２±０．２００°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とする結晶形Ａ。
【請求項4】
６．２１８±０．２００°、８．５１４±０．２００°、１２．２９９±０．２００°、１４．６８９±０．２００°、１６．９０３±０．２００°、１８．１２２±０．２００°、１８．９２７±０．２００°、及び２５．５８０±０．２００°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とするか、あるいは
６．２１８±０．２００°、８．５１４±０．２００°、１１．６６３±０．２００°、１２．２９９±０．２００°、１４．６８９±０．２００°、１６．９０３±０．２００°、１８．１２２±０．２００°、１８．９２７±０．２００°、１９．３６４±０．２００°、２０．３８６±０．２００°、２１．９１４±０．２００°、及び２５．５８０±０．２００°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とするか、あるいは
６．２１８°、８．５１４°、１１．６６３°、１２．２９９°、１４．６８９°、１６．９０３°、１８．１２２°、１８．５５４°、１８．９２７°、１９．３６４°、２０．３８６°、２１．９１４°、２２．６４０°、２３．８６７°、２４．５５３°、２４．８０６°、２５．５８０°、２５．９８８°、２７．１４７°、２７．７１５°、２９．１３５°、及び３１．７９９°の２θ角度に特徴的な回折ピークを有する粉末Ｘ線回折パターンを特徴とするか、あるいは
図１に示すＸＲＰＤパターンを有する、請求項３に記載の結晶形Ａ。
【請求項5】
１１５．３７°Ｃ±３°Ｃに吸熱ピークのピーク値を有する示差走査熱量測定曲線を有するか、あるいは
図２に示すＤＳＣ曲線を有する、請求項３に記載の結晶形Ａ。
【請求項6】
１５０．０°Ｃ±３°Ｃで最大５．３７９％の重量減少を有する熱重量分析曲線を有するか、あるいは
図３に示すＴＧＡ曲線を有する、請求項３に記載の結晶形Ａ。
【請求項7】
１５０．０°Ｃ±３°Ｃで最大５．３７９％の重量減少を有する熱重量分析曲線を有するか、あるいは
図３に示すＴＧＡ曲線を有する、請求項５に記載の結晶形Ａ。
【請求項8】
ｎが２である、請求項３に記載の結晶形Ａ。
【請求項9】
請求項３に記載の式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを調製する方法であって、
（ａ）式（Ｉ）の化合物をエタノールに添加し、透明になるまで混合物を攪拌すること、
【化3】
（ｃ）２０～３０℃で１５時間攪拌すること、
（ｄ）２０～３０℃で反応系に水をゆっくり滴下し、更に１～３時間攪拌すること、
（ｅ）濾過し、固体を回収すること
を含む方法。
【請求項10】
請求項１～２のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項３～８のいずれか一項に記載の結晶形Ａ、又は請求項９に記載の方法に従って調製した式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを含む医薬品。
【請求項11】
疾患を治療するための医薬組成物であって、
請求項１～２のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項３～８のいずれか一項に記載の結晶形Ａ、又は請求項９に記載の方法に従って調製した式（ＩＩ）の化合物の結晶形Ａを含み、
上記疾患が固形腫瘍であるか、あるいは
上記疾患が肺がん及び直腸がんから選択される、医薬組成物。
【国際調査報告】