特表 2024-535797 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを処置する組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-02

(54)【発明の名称】顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを処置する組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240925BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240925BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20240925BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240925BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240925BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240925BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C07K16/28

A61K47/68

A61K47/69

A61K39/395 N

A61K31/7088

A61K48/00

A61K31/713

A61P21/04

C12N15/13

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515823

(86)(22)【出願日】2022-09-15

(85)【翻訳文提出日】2024-04-30

(86)【国際出願番号】 US2022043705

(87)【国際公開番号】W WO2023043953

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】63/245,123

(32)【優先日】2021-09-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】518345192

【氏名又は名称】アビディティー バイオサイエンシーズ，インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マレコヴァ，バーボラ

(72)【発明者】

【氏名】バーク，ロブ

(72)【発明者】

【氏名】ダリモント，ベアトリス，ダイアナ

(72)【発明者】

【氏名】サラ カノ，デイビッド

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA65

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB16

4C076BB22

4C076BB25

4C076BB29

4C076BB31

4C076CC09

4C084AA13

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA57

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZA94

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC23

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG04

4C085GG08

4C085GG10

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA38

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA57

4C086MA59

4C086MA60

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA13

4C086NA14

4C086ZA94

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA54

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本明細書には、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を処置するためのポリ核酸分子、医薬組成物、および方法が開示される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリ核酸分子コンジュゲートであって、
ＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子にコンジュゲートされた抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、
前記ポリ核酸分子が、配列番号７２、７６、１２６、または１３１～１３６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含むとともに、２位、６位、１４位、および１６位において２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを含み、
前記ポリ核酸分子が前記ＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介する、
ポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項2】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、非ヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ヒト化抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ科抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む、請求項１に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項3】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１または２に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項4】

前記ポリ核酸分子が約１６～約３０ヌクレオチド長である、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項5】

前記ポリ核酸分子がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＵｆｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｓｕｓｕ、ｕｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｓｕｓｕ、またはｖｐＮｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｓｕｓのうち少なくとも１つの核酸配列を含み、ｖｐＮ＝ビニルホスホネートＶｐＵｑであり、小文字（ｎ）＝２’－Ｏ－Ｍｅ修飾であり、Ｎｆ＝２’－Ｆ修飾であり、ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾である、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項6】

前記ポリ核酸分子がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項7】

前記ポリ核酸分子がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号２、６、５６、または６１～６６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含むとともに、少なくとも２つまたは少なくとも３つの連続する２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項8】

前記ポリ核酸分子がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号２、６、５６、または６１～６６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項9】

前記ポリ核酸分子が、ホスホロチオエート連結またはホスホロジチオエート連結を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項10】

前記ポリ核酸分子が、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシ－２’－フルオロから選択される６つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項11】

前記ポリ核酸分子が、５’－末端ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項12】

５’－末端ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドが、

【化1】

から選択され、
式中、Ｂが複素環塩基部分であり、
Ｒ６が、水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、
Ｊが、前記ポリ核酸分子の隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項13】

前記センス鎖および／または前記アンチセンス鎖が、５’末端または３’末端に、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１０～１２のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項14】

前記抗体またはその抗原結合フラグメント上でシステイン残基またはリシン残基を介して、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを前記ポリ核酸分子に接続するリンカーを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項15】

前記リンカーがＣ_１－Ｃ_６アルキルリンカーである、請求項１４に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項16】

前記リンカーがホモ二機能性リンカーまたはヘテロ二機能性リンカーであり、マレイミド基、ジペプチド部分、安息香酸基、またはその誘導体を含む、請求項１４に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項17】

前記リンカーが切断可能または切断不能リンカーである、請求項１４に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項18】

前記ポリ核酸分子と前記抗体またはその抗原結合フラグメントとの比が、約１：１、２：１、３：１、または４：１である、請求項１～１７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項19】

前記ポリ核酸分子が、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象の筋萎縮症を調節する、請求項１～１８のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項20】

前記ＲＮＡ干渉が、未処置の細胞におけるＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量と比較して、ＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現を少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％以上低下させることを含む、請求項１９に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項21】

前記ＲＮＡ干渉が、細胞における、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む、請求項１９または２０に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項22】

前記ＲＮＡ干渉が、細胞における、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む、請求項１９または２０に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項23】

前記マーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことが、前記マーカ遺伝子の発現を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％以上低下させることである、請求項２２に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項24】

筋ジストロフィーが顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項１９～２３のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。

【請求項25】

請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲートと、
薬学的に許容可能な賦形剤と
を含む医薬組成物。

【請求項26】

ナノ粒子製剤として製剤化される、請求項２５に記載の医薬組成物。

【請求項27】

非経口、経口、鼻腔内、頬側、直腸、経皮、静脈内、皮下、または鞘内の投与用に製剤化される、請求項２４または２６に記載の医薬組成物。

【請求項28】

筋ジストロフィーの処置を必要とする対象の筋ジストロフィーを処置するための方法であって、
請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリ核酸コンジュゲートを提供する工程と、
前記ポリ核酸コンジュゲートを前記対象に投与することで前記筋ジストロフィーを処置する工程であって、前記ポリ核酸コンジュゲートがヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物の量を減少させる、工程とを含む方法。

【請求項29】

前記ポリ核酸コンジュゲートが、前記ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、前記対象の筋ジストロフィーを調節する、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＲＮＡ干渉が、筋ジストロフィーによる影響を受けた細胞における、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＬＥＵＴＸ、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記筋ジストロフィーが顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有すると診断されたかまたはその疑いのある対象を処置するための、請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または請求項２５～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。

【請求項33】

顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有すると診断されたかまたはその疑いのある対象を処置するための薬剤の製造における、請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または請求項２５～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。

【請求項34】

請求項１～２４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または請求項２５～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、キット。

【請求項35】

ＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介するポリ核酸分子であって、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含むポリ核酸分子。

【請求項36】

ＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介する二本鎖ポリ核酸分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含み、前記センス鎖が、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含む、二本鎖ポリ核酸分子。

【請求項37】

ＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介する二本鎖ポリ核酸分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と１、２、または３つ以下のヌクレオチドだけ相違する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含み、前記センス鎖が、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と１、２、または３つ以下のヌクレオチドだけ相違する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖ポリ核酸分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年９月１６日出願の米国仮特許出願第６３／２４５，１２３号に基づく利益を主張し、その全体は参照によって本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

筋萎縮症は、運動を制御する骨格筋や随意筋、心筋、および平滑筋などの筋肉の質量損失、または筋肉の進行性の衰弱および退化である。廃用、飢餓、癌、糖尿病、および腎不全を含む種々の病態生理学状態、またはグルココルチコイドによる処置は、筋萎縮症および強度損失をもたらす。筋萎縮症の表現型の作用は、筋蛋白質合成の阻害、筋蛋白のターンオーバー向上、衛星細胞分化の異常な調節、および筋繊維の種類の異常な転換を含む、種々の分子事象によって誘導される。

【0003】

ＦＳＨＤは、処置が認可されていない、稀な進行性の身体障害性疾患である。ＦＳＨＤは、筋ジストロフィーで最もよく見られる形態の１つであり、両性別に等しく影響を及ぼし、典型的には若者と若年成人層で発症する。ＦＳＨＤは、最初に顔面、肩、腕、および胴体の筋肉に衰弱を生じさせ、下肢および骨盤帯の筋肉の衰弱へと進行する、進行性の骨格筋損失を特徴とする。骨格筋の衰弱は、微笑んだり意思伝達を行ったりすることができなくなり、腕を使っての日常生活動作が困難となり、かつ起き上がりが困難となるおそれのある、顔面筋の進行性損失を含む顕著な身体制限をもたらし、多くの患者が最終的には日常活動において車椅子の使用に頼るようになってしまう。多数のＦＳＨＤ患者では、慢性疼痛、不安、およびうつ病の発症も報告されている。

【0004】

ＦＳＨＤは骨格筋における遺伝子ＤＵＸ４の異常発現によって生じ、ＤＵＸ４タンパク質を不適当に存在させてしまう。ＲＮＡ誘導性遺伝子抑制による遺伝子抑制は、いくつかの管理水準として、転写不活性化、小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）誘導性ｍＲＮＡ分解、およびｓｉＲＮＡ誘導性転写減衰をもたらす。一部の例では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、多数の細胞分裂にわたり長く持続する作用をもたらす。そのためＲＮＡｉは、薬物標的の検証、遺伝子機能の分析、経路分析、および疾患治療に有用である実現可能な方法を表す。

【0005】

参照による援用
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により援用されるように具体的かつ個々に示されるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に援用される。

【発明の概要】

【0006】

本明細書中の一部の態様では、ポリ核酸分子コンジュゲートであって、ＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子にコンジュゲートした抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ポリ核酸分子が、配列番号７２、７６、１２６、または１３１～１３６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも５％、または１００％同一である核酸配列を含み、ポリ核酸分子が２位、６位、１４位、および１６位において２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを含み、ポリ核酸分子がＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介する、ポリ核酸分子コンジュゲートが記載される。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ヒト化抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ科抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態では、ポリ核酸分子は、約１６～約３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、ＵｆｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｓｕｓｕ、ｕｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｓｕｓｕ、またはｖｐＮｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｓｕｓのうち少なくとも１つの核酸配列を含み、ｖｐＮ＝ビニルホスホネートＶｐＵｑであり、小文字（ｎ）＝２’－Ｏ－Ｍｅ修飾であり、Ｎｆ＝２’－Ｆ修飾であり、ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾である。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号２、６、５６、または６１～６６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含み、少なくとも２つまたは少なくとも３つの連続する２’－Ｆ修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号２、６、５６、または６１～６６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含む。一部の実施形態では、ポリ核酸分子は、ホスホロチオエート連結またはホスホロジチオエート連結を含む。一部の実施形態では、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシ－２’－フルオロから選択される６つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリ核酸分子は、５’－末端ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’－末端ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドは、

【0007】

【化1】

から選択され、式中、Ｂは複素環塩基部分であり、Ｒ６は、水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、Ｊは、ポリ核酸分子の隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である。一部の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、５’末端または３’末端に、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリ核酸分子コンジュゲートは、抗体またはその抗原結合フラグメント上でシステイン残基またはリシン残基を介して、抗体またはその抗原結合フラグメントをポリ核酸分子に接続するリンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーはＣ_１－Ｃ_６アルキルリンカーである。一部の実施形態では、リンカーはホモ二機能性リンカーまたはヘテロ二機能性リンカーであり、マレイミド基、ジペプチド部分、安息香酸基、またはその誘導体を含む。一部の実施形態では、リンカーは切断可能または切断不能リンカーである。一部の実施形態では、ポリ核酸分子コンジュゲートは、ポリ核酸分子と抗体またはその抗原結合フラグメントとの比が約１：１、２：１、３：１、または４：１である。一部の実施形態では、ポリ核酸分子は、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象の筋萎縮症を調節する。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉は、未処置の細胞におけるＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写の量と比較して、ＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写の発現を少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％以上低下させることを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉は、細胞における、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉は、細胞における、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む。一部の実施形態では、マーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことは、マーカ遺伝子の発現を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％以上低下させることである。一部の実施形態では、筋ジストロフィーは顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。

【0008】

本明細書中の一部の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物が記載される。一部の実施形態では、医薬組成物はナノ粒子製剤として製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、非経口、経口、鼻腔内、頬側、直腸、経皮、静脈内、皮下、または鞘内の投与用に製剤化される。

【0009】

本明細書中の一部の態様では、筋ジストロフィーの処置を必要とする対象の筋ジストロフィーを処置する方法であって、本明細書に記載されるポリ核酸コンジュゲートを提供する工程と、ポリ核酸コンジュゲートを対象に投与することで筋ジストロフィーを処置する工程であって、ポリ核酸コンジュゲートがヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写の量を減少させる、工程とを含む方法が記載される。一部の実施形態では、ポリ核酸コンジュゲートは、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象の筋ジストロフィーを調節する。一部の実施形態では、ＲＮＡ干渉は、筋ジストロフィーによる影響を受けた細胞における、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＬＥＵＴＸ、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む。一部の実施形態では、筋ジストロフィーは顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。

【0010】

本明細書中の一部の態様では、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有すると診断されたかまたはその疑いのある対象を処置するための、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲートまたは本明細書に記載の医薬組成物の使用が記載される。一部の実施形態では、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有すると診断されたかまたはその疑いのある対象を処置するための薬剤の製造における、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲートまたは本明細書に記載の医薬組成物の使用が記載される。本明細書中の一部の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲートまたは本明細書に記載の医薬組成物を含むキットが記載される。

【0011】

本明細書中の一部の態様では、ＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介するポリ核酸分子であって、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含むポリ核酸分子が記載される。

【0012】

本明細書中の一部の態様では、ＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介する二本鎖ポリ核酸分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含み、センス鎖が、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である核酸配列を含む、二本鎖ポリ核酸分子が記載される。

【0013】

本明細書中の一部の態様では、ＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介する二本鎖ポリ核酸分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と１、２、または３つ以下のヌクレオチドだけ相違する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含み、センス鎖が、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と１、２、または３つ以下のヌクレオチドだけ相違する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、二本鎖ポリ核酸分子が記載される。

【0014】

本明細書中の特定の態様では、筋萎縮症、特に顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と関連付けられる遺伝子を調節するためのポリ核酸分子および医薬組成物が開示される。また本明細書中の一部の態様では、本明細書に開示されるポリ核酸分子またはポリ核酸分子コンジュゲートにより筋萎縮症、特にＦＳＨＤを処置する方法も記載される。

【0015】

本明細書中の特定の態様では、ＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子にコンジュゲートされる抗体またはその抗原結合フラグメントを含むポリ核酸分子コンジュゲートであって、ＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介するポリ核酸分子コンジュゲートが開示される。特定の態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ヒト化抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ科抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む。特定の態様では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0016】

特定の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、それぞれ独立して、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結、または少なくとも１つの逆位脱塩基部分（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ａｂａｓｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）を含む。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ＤＵＸ４の標的配列の少なくとも８つの隣接する塩基にハイブリダイズする。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、約８～約５０ヌクレオチド長、または約１０～約３０ヌクレオチド長である。特定の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１～７０または配列番号１４１～２１０から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。代替的および／または付加的に、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号７１～１４０または配列番号２１１～２８０から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。代替的および／または付加的に、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１４２、１４６、１９６、２０１～２０６、４１２～４２０、または４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号４１２～４２０または配列番号４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンスは、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と同一である。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と同一である。

【0017】

特定の態様では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドを含み、さらに２’修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含むか、あるいはロックド核酸（ＬＮＡ）もしくはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含むか、またはそれらの組合せを含む。特定の態様では、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合を含む。特定の態様では、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシ－２’－フルオロから選択される３つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含む。特定の態様では、ポリ核酸分子は、５’－末端ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドを含む。

【0018】

別の実施形態は、ポリ核酸分子コンジュゲートのポリ核酸分子であって、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然ヌクレオチドが、

【0019】

【化2】

から選択され、式中、Ｂが複素環塩基部分である、ポリ核酸分子を提供する。

【0020】

別の実施形態は、ポリ核酸分子コンジュゲートのポリ核酸分子であって、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然ヌクレオチドが、

【0021】

【化3】

から選択され、
式中、Ｂが複素環塩基部分であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が、独立して水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、Ｊが、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である、ポリ核酸分子を提供する。

【0022】

別の実施形態は、ポリ核酸分子コンジュゲートのポリ核酸分子であって、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然ヌクレオチドが、

【0023】

【化4】

から選択され、
式中、Ｂが複素環塩基部分であり、Ｒ４およびＲ５が、独立して水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、Ｊが、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である、ポリ核酸分子を提供する。

【0024】

別の実施形態は、ポリ核酸分子コンジュゲートのポリ核酸分子であって、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然ヌクレオチドが、

【0025】

【化5】

から選択され、
式中、Ｂが複素環塩基部分であり、Ｒ６が、水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、Ｊが、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である、ポリ核酸分子を提供する。

【0026】

別の実施形態は、ポリ核酸分子コンジュゲートのポリ核酸分子であって、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然ヌクレオチドが、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはエチレン核酸（ＥＮＡ）から選択される、ポリ核酸分子を提供する。

【0027】

別の実施形態は、ポリ核酸分子コンジュゲートのポリ核酸分子であって、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然ヌクレオチドが、

【0028】

【化6】

から選択され、
式中、Ｂが複素環塩基部分であり、Ｊが、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である、ポリ核酸分子を提供する。

【0029】

別の実施形態は、ポリ核酸分子コンジュゲートのポリ核酸分子であって、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然ヌクレオチドが、

【0030】

【化7】

から選択され、式中、Ｂが複素環塩基部分であり、Ｊが、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である、ポリ核酸分子を提供する。

【0031】

別の実施形態は、ポリ核酸分子コンジュゲートのポリ核酸分子であって、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然ヌクレオチドが、

【0032】

【化8】

から選択され、
式中、Ｂが複素環塩基部分であり、Ｒ６が、水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、Ｊが、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である、ポリ核酸分子を提供する。

【0033】

別の実施形態は、ポリ核酸分子コンジュゲートのポリ核酸分子であって、少なくとも１つの５’－ビニルホスホネート修飾された非天然ヌクレオチドが、

【0034】

【化9】

から選択される、ポリ核酸分子を提供する。

【0035】

特定の態様では、２’修飾ヌクレオチドは２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’－末端にある。一部の態様では、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは、プリンヌクレオチドであるか、またはピリジンヌクレオチドである。特定の態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、５’末端に少なくとも２つ、３つ、または４つの連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。

【0036】

特定の態様では、ポリ核酸分子コンサートは、標的細胞結合部分をポリ核酸部分に接続するリンカーを含む。かかる態様では、リンカーはＣ_１－Ｃ_６アルキルリンカーであるか、またはホモ二機能性リンカーもしくはヘテロ二機能性リンカーであり、マレイミド基、ジペプチド部分、安息香酸基、またはその誘導体を含む。代替的および／または付加的に、リンカーは切断可能または切断不能リンカーである。特定の態様では、ポリ核酸部分と標的細胞結合部分との比は、約１：１、２：１、３：１、または４：１である。

【0037】

特定の態様では、ポリ核酸部分は、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象の筋ジストロフィーまたは筋萎縮症の症状を調節する。一部の態様では、ＲＮＡ干渉は、未処置の細胞におけるＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写の量と比較して、ＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写の発現を少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％以上低下させることを含む。代替的および／または付加的に、ＲＮＡ干渉は、細胞における、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸを含むか、またはそれらからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む。一部の態様では、マーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことは、マーカ遺伝子の発現を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％以上低下させることである。一部の態様では、筋ジストロフィーは顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。代替的および／または付加的に、ＲＮＡ干渉は、細胞における、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤを含むか、またはそれらからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む。一部の態様では、マーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことは、マーカ遺伝子の発現を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％以上低下させることである。一部の態様では、筋ジストロフィーは顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。

【0038】

特定の態様では、ポリ核酸分子コンジュゲートは、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ－Ｂの分子を含み、式中、Ａは抗体またはその抗原結合フラグメントであり、Ｂは、ＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子であり、Ｘは、Ａのシステイン残基にコンジュゲートされる結合または非重合体リンカーである。

【0039】

本明細書中の特定の態様では、本明細書に記載されるポリ核酸分子コンジュゲートと薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物が開示される。一部の態様では、医薬組成物はナノ粒子製剤として製剤化される。一部の態様では、医薬組成物は、非経口、経口、鼻腔内、頬側、直腸、経皮、もしくは静脈内、皮下、または鞘内の投与用に製剤化される。

【0040】

ＦＳＨＤの症状は、骨格筋に対する影響を含む。ＦＳＨＤが影響を及ぼす骨格筋には、眼および口の周囲の筋肉、肩の筋肉、上腕の筋肉、下脚の筋肉、腹筋、ならびに臀部の筋肉が挙げられる。一部の例では、ＦＳＨＤの症状は、視力と聴力にも影響を及ぼす。一部の例では、ＦＳＨＤの症状は、心臓または肺の機能にも影響を及ぼす。一部の実例では、ＦＳＨＤの症状として、筋衰弱、筋萎縮症、筋ジストロフィー、疼痛炎症、痙縮、側弯症、脊柱前弯症、低換気、網膜異常、角膜炎への曝露、軽度の聴力損失、およびＥＭＧ異常が挙げられる。本明細書で使用される筋萎縮症という用語は、ＦＳＨＤの広範な筋肉関連の影響を指す。

【0041】

本明細書中の特定の態様では、筋ジストロフィーの処置を必要とする対象の筋ジストロフィーを、本明細書に記載されるポリ核酸コンジュゲートを提供し、当該ポリ核酸コンジュゲートを対象に投与して筋ジストロフィーを処置することによって処置するための方法が開示される。ポリ核酸コンジュゲートは、ヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写の量を低減させる。一部の態様では、ポリ核酸部分は、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象の筋萎縮症を調節する。特定の態様では、ＲＮＡ干渉は、筋ジストロフィーの影響を受けた細胞における、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸを含むか、またはそれらからなる群から選択される、ＤＵＸ４に対するマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む。特定の態様では、ＲＮＡ干渉は、筋ジストロフィーの影響を受けた細胞における、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤを含むか、またはそれらからなる群から選択される、ＤＵＸ４に対するマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む。

【0042】

好ましくは、筋ジストロフィーは顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である。

【0043】

本明細書中の特定の態様では、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有すると診断されたかまたはその疑いのある対象を処置するための、本明細書に記載されるポリ核酸分子コンジュゲートまたは医薬組成物の使用が開示される。また本明細書中の特定の態様では、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有すると診断されたかまたはその疑いのある対象を処置するための薬剤の製造における、本明細書に記載されるポリ核酸分子コンジュゲートまたは医薬組成物の使用が記載される。

【0044】

本明細書中の特定の態様では、本明細書に記載されるポリ核酸分子コンジュゲートまたは医薬組成物を含むキットが開示される。

【図面の簡単な説明】

【0045】

本開示の種々の態様は、とりわけ添付の特許請求の範囲により説明される。本開示の特徴と利点は、本開示の原理が利用される例示的な態様を説明する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって、さらに良く理解されるであろう。

【0046】

【図1】ＦＳＨＤ病状の図表を図示する。

【図2】ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ選択のフローチャート図を示す。

【図3】ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ転写物における選択されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの位置と数を図示する。

【図4A】ＦＳＨＤのマウスモデルの骨格筋におけるＤＵＸ４標的遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏダウンレギュレーションのグラフを示す図である。

【図4B】ＤＵＸ－４ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ筋組織濃度のグラフを示す図である。

【図5A】パッセンジャー鎖またはガイド鎖の５’末端にＣ_６－ＮＨ_２コンジュゲーションハンドル、および３’末端にＣ_６－ＳＨを有する、ｓｉＲＮＡの代表的な構造を図示する。

【図5B】５’末端にＣ_６－ＮＨ_２コンジュゲーションハンドル、および３’末端にＣ_６－Ｓ－ＰＥＧを有する、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造を図示する。

【図5C】５’末端にＣ_６－ＮＨ_２コンジュゲーションハンドル、および３’末端にＣ_６－Ｓ－ＮＥＭを有する、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造を図示する。

【図5D】５’末端にＣ_６－Ｎ－ＳＭＣＣコンジュゲーションハンドル、および３’末端にＣ_６－Ｓ－ＮＥＭを有する、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の代表的な構造を図示する。

【図5E】５’末端にＰＥＧ、および３’末端にＣ_６－ＳＨを有する、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造を図示する。

【図5F】５’末端にＣ_６－Ｓ－ＮＥＭ、および３’末端にＣ_６－ＮＨ_２コンジュゲーションハンドルを有する、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造を図示する。

【図6A】抗体－Ｃｙｓ－ＳＭＣＣ－５’－パッセンジャー鎖（アーキテクチャ１）を図示する。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の５’末端でのマレイミド（ＳＭＣＣ）に対する抗体鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。

【図6B】抗体－Ｃｙｓ－ＳＭＣＣ－３’－パッセンジャー鎖（アーキテクチャ２）を図示する。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の３’末端でのマレイミド（ＳＭＣＣ）に対する抗体鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。

【図6C】抗体－Ｃｙｓ－ｂｉｓＭａｌ－３’－パッセンジャー鎖（ＡＳＣアーキテクチャ３）を図示する。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の３’末端でのビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対する抗体鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。

【図6D】Ｆａｂ－Ｃｙｓ－ｂｉｓＭａｌ－３’－パッセンジャー鎖（ＡＳＣアーキテクチャ４）のモデル構造を図示する。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の３’末端でのビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対するＦａｂ鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。

【図6E】２つの異なるｓｉＲＮＡが１つの抗体分子に付けられた、抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートのモデル構造（ＡＳＣアーキテクチャ５）を図示する。このコンジュゲートは、各ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の３’末端にて、ビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対する低減されたｍＡｂ鎖間システインに、ＳＳＢとＨＰＲＴ ｓｉＲＮＡとの混合物をコンジュゲートすることによって生成された。

【図6F】２つの異なるｓｉＲＮＡが付けられた、抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートのモデル構造（ＡＳＣアーキテクチャ６）を図示する。このコンジュゲートは、各ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の３’末端にて、マレイミド（ＳＭＣＣ）リンカーに対する低減されたｍＡｂ鎖間システインに、ＳＳＢとＨＰＲＴ ｓｉＲＮＡとの混合物をコンジュゲートすることによって生成された。

【図7A】抗体システインコンジュゲーションを介した抗体－Ｃｙｓ－ＳＭＣＣ－ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧコンジュゲートの典型的な合成スキーム（合成スキーム１）を図示する。

【図7B】抗体－Ｃｙｓ－ＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧコンジュゲートの典型的な合成スキーム（合成スキーム２）を図示する。

【図7C】Ｆａｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート生成の典型的な合成スキーム（合成スキーム３）を図示する。

【発明を実施するための形態】

【0047】

ＦＳＨＤは骨格筋における遺伝子ＤＵＸ４の異常発現によって生じ、ＤＵＸ４タンパク質を不適当に存在させてしまう。ＤＵＸ４自体は、他の遺伝子の発現を誘導する転写因子であり、これらの不適当に発現された下流遺伝子が、筋肉の病状をもたらす。通常、ＤＵＸ４駆動型の遺伝子発現は、生殖系列および初期の幹細胞発達に限定される。ＦＳＨＤ患者では、骨格筋中のＤＵＸ４タンパク質は他の遺伝子産物を調節し、その一部は筋肉に対し有毒である。異常なＤＵＸ４駆動型の遺伝子発現の証拠は、ＦＳＨＤの影響を受けた筋組織を健常な筋肉と区別する主な分子シグネチャである。ＦＳＨＤ中での異常なＤＵＸ４発現の結果、筋肉が死滅し、かつ筋肉が脂肪と置き換えられ、その結果、骨格筋虚弱および進行性の身体障害が生じてしまう。データによれば、ＤＵＸ４遺伝子の発現減少、およびその下流の転写プログラムが、それを根本的な原因とするＦＳＨＤの処置のための疾患修飾治療手法を提供できることが示唆されている。

【0048】

ＤＵＸ４遺伝子のサイレンシングまたは抑制を解除することのできる、２つの方法が存在する。ＦＳＨＤ患者の約９５％を含むＦＳＨＤ１では、染色体のサブテロメア領域に反復を有するＤ４Ｚ４として公知の染色体４の長腕の末端付近にある領域においてＤＮＡのアレイを短縮させてしまう突然変異が存在する。Ｄ４Ｚ４領域は異常に短縮、正常な１１～１００の反復に代わり１～１０の間の反復を包含する。この収縮は、Ｄ４Ｚ４領域の低メチル化、およびＤＵＸ４の抑制解除を生じさせる。ＦＳＨＤ２患者は有意なＤ４Ｚ４の反復収縮を有していないが、通常はＤＮＡメチル化を介してＤＵＸ４遺伝子の抑制に寄与するＳＭＣＨＤ１遺伝子として公知の調節遺伝子に突然変異を有している。その抑制がＤ４Ｚ４領域の低メチル化を生じさせるＳＭＣＨＤ１遺伝子の突然変異により損失する場合、ＤＵＸ４は不適当に発現され、疾患状態を誘導する。図１は、ＦＳＨＤ病状の例示的な図表を示す。

【0049】

核酸（例えば、ＲＮＡｉ）治療は、選択性および特異性が高い標的化治療である。しかし一部の例では、核酸治療はまた、不十分な細胞内摂取、血液安定性の制限、および非特異的な免疫刺激によって妨げられる。これらの問題に対処するべく、例えば、良好な安定化および／または低い毒性のための新規なリンカー、標的特異性および／または標的送達の増加のための結合部分の最適化、ならびに安定性の増加および／またはオフターゲット効果の減少のための核酸ポリマー修飾など、核酸組成物の種々の修飾が探索されている。

【0050】

一部の態様では、核酸組成物を構成する様々な成分の配置または順序は、さらに細胞内の摂取、安定性、毒性、有効性、および／または非特異的な免疫刺激に影響を与える。例えば、核酸成分が結合部分、ポリマー、およびポリ核酸分子（すなわちポリヌクレオチド）を含む場合、結合部分、ポリマー、および／もしくはポリ核酸分子（すなわちポリヌクレオチド）の順序または配置（例えば、結合部分－ポリ核酸分子－ポリマー、結合部分－ポリマー－ポリ核酸分子、またはポリマー－結合部分－ポリ核酸分子）は、さらに細胞内の摂取、安定性、毒性、有効性、および／または非特異的な免疫刺激に影響を与える。

【0051】

本明細書中の一部の態様では、ここに記述されて、いくつかの態様の中で、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、特にそれに関連付けられる筋ジストロフィーおよび／または筋萎縮症の処置用の、ポリ核酸分子およびポリ核酸分子コンジュゲートが記載される。一部の例では、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲートは、細胞内の摂取、安定性、および／または有効性を向上させる。場合により、ポリ核酸分子コンジュゲートは、ポリ核酸分子にコンジュゲートされる抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。場合により、ＤＵＸ４、好ましくはヒトＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子。場合により、アクセッション番号ＮＭ＿００１３０６０６８を有するヒトＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズする核酸分子。場合により、配列番号４３９を有するヒトＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズする核酸分子。

【0052】

本明細書に記載のさらなる態様は、本明細書に記載のポリ核酸分子またはポリ核酸分子コンジュゲートを対象に投与する工程を含む、ＦＳＨＤを処置する方法を含む。

【0053】

ポリ核酸分子
特定の態様では、ポリ核酸分子は、Ｄｏｕｂｌｅ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ４（ＤＵＸ４）遺伝子の標的配列にハイブリダイズする。一部の例では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ヒトＤＵＸ４遺伝子（ＤＵＸ４）の標的配列にハイブリダイズし、筋細胞中のＤＵＸ４ ｍＲＮＡを減少させる。

【0054】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、配列番号１～７０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、配列番号１４１～２１０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、配列番号７１～１４０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、配列番号２１１～２８０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0055】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、配列番号１４２、１４６、１９６、２０１～２０６、４１２～４２０、または４３０～４３８から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0056】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１～７０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合により、第２のポリヌクレオチドは、配列番号７１～１４０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合により、ポリ核酸分子は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１４１～２１０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合により、第２のポリヌクレオチドは、配列番号２１１～２８０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0057】

一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。場合により、第２のポリヌクレオチドは、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0058】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）およびアンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）を含む。一部の例では、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）は、配列番号１～７０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の例では、アンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）は、配列番号７１～１４０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）およびアンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）を含む。一部の例では、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）は、配列番号１４１～２１０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の例では、アンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）は、配列番号２１１～２８０から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の例では、センス鎖（例えば、パッセンジャー鎖）は、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の例では、アンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖）は、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0059】

一部の例では、センス鎖は、配列番号１、２、３、６、１４、３６、５２、５６、６１、６２、６３、６５、または６６から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の例では、アンチセンス鎖は、配列番号７１、７２、７３、７６、８４、１０６、１２２、１２７、１３１、１３２、１３３、１３５、または１３６から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の例では、ｓｉＲＮＡは、表１１に提示されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。

【0060】

一部の例では、センス鎖は、配列番号１４１、１４２、１４３、１４６、１７６、１９２、１９６、２０１、２０２、２０３、２０５、または２０６から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の例では、アンチセンス鎖は、配列番号２１１、２１２、２１３、２１６、２４６、２６２、２６６、２７１、２７２、２７３、２７５、または２７６から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。一部の例では、ｓｉＲＮＡは、表１２に提示されるセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。

【0061】

一部の例では、センス鎖は、表１４および表１５における配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0062】

一部の例では、アンチセンス鎖は、表１４および表１５における配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。

【0063】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号４１２～４２０または配列番号４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンスは、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と同一である。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と同一である。

【0064】

一部の態様では、配列ポリ核酸分子は、配列番号１４２、１４６、１９６、もしくは２０１～２０６、または配列番号４１２～４２０もしくは４３０～４３８のうちいずれか１つと、３以下のヌクレオチド、２以下のヌクレオチド、または１以下のヌクレオチドだけ相違する、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、または１９の隣接するヌクレオチドを有する。一部の態様では、ポリ核酸分子は一本鎖である。一部の態様では、ポリ核酸分子は二本鎖である。

【0065】

一部の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む。場合により、ポリ核酸分子はＲＮＡを含む。一部の例では、ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、μＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、または異質核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）を含む。一部の例では、ＲＮＡはｓｈＲＮＡを含む。一部の例では、ＲＮＡはｍｉＲＮＡを含む。一部の例では、ＲＮＡはｄｓＲＮＡを含む。一部の例では、ＲＮＡはｔＲＮＡを含む。一部の例では、ＲＮＡはｒＲＮＡを含む。一部の例では、ＲＮＡはｈｎＲＮＡを含む。一部の例では、オリゴヌクレオチドはホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）であり、これらは、ホスホロジチオエート連結によって接続されるモルホリン環の骨格で構築される短い一本鎖オリゴヌクレオチドアナログである。一部の例では、ＲＮＡはｓｉＲＮＡを含む。一部の例では、ポリ核酸分子はｓｉＲＮＡを含む。

【0066】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、約８～約５０ヌクレオチド長である。一部の態様では、ポリ核酸分子は、約１０～約５０ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０～約３０、約１５～約３０、約１８～約２５、約１８～約２４、約１９～約２３、または約２０～約２２ヌクレオチド長である。

【0067】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、約５０ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約４５ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約４０ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約３５ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約３０ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約２５ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約２０ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１９ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１８ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１７ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１６ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１５ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１４ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１３ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１２ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１１ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約８ヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約８～約５０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０～約５０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０～約４５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０～約４０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０～約３５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０～約２５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０～約２０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１５～約２５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１５～約３０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、ポリ核酸分子は、約１２～約３０の間のヌクレオチド長である。

【0068】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、第１のポリヌクレオチドを含む。一部の例では、ポリ核酸分子は、第２のポリヌクレオチドを含む。一部の例、ポリ核酸分子は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、センス鎖またはパッセンジャー鎖である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、アンチセンス鎖またはガイド鎖である。

【0069】

一部の態様では、ポリ核酸分子は第１のポリヌクレオチドである。一部の態様では、第１のポリヌクレオチドは、約８～約５０ヌクレオチド長である。一部の態様では、第１のポリヌクレオチドは、約１０～約５０ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０～約３０、約１５～約３０、約１８～約２５、約１８～約２４、約１９～約２３、または約２０～約２２ヌクレオチド長である。

【0070】

一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約３５ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１９ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１８ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１７ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１４ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１２ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１１ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約８ヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約８～約５０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０～約５０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０～約４５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０～約４０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０～約３５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０～約２５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１０～約２０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５～約２５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１５～約３０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第１のポリヌクレオチドは、約１２～約３０の間のヌクレオチド長である。

【0071】

一部の態様では、ポリ核酸分子は第２のポリヌクレオチドである。一部の態様では、第２のポリヌクレオチドは、約８～約５０ヌクレオチド長である。一部の態様では、第２のポリヌクレオチドは、約１０～約５０ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０～約３０、約１５～約３０、約１８～約２５、約１８～約２４、約１９～約２３、または約２０～約２２ヌクレオチド長である。

【0072】

一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約５０ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約４５ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約４０ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約３５ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１９ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１８ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１７ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１６ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１４ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１３ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１２ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１１ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約８ヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約８～約５０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０～約５０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０～約４５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０～約４０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０～約３５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０～約３０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０～約２５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１０～約２０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５～約２５の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１５～約３０の間のヌクレオチド長である。一部の例では、第２のポリヌクレオチドは、約１２～約３０の間のヌクレオチド長である。

【0073】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドを含む。一部の例では、ポリ核酸分子は、ブラント末端、オーバーハング、またはそれらの組合せをさらに含む。一部の例では、ブラント末端は、５’ブラント末端、３’ブラント末端、またはその両方である。場合により、オーバーハングは、５’オーバーハング、３’オーバーハング、またはその両方である。場合により、オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の非塩基対合ヌクレオチドを含む。場合により、オーバーハングは、１、２、３、４、５、または６つの非塩基対合ヌクレオチドを含む。場合により、オーバーハングは、１、２、３、または４つの非塩基対合ヌクレオチドを含む。場合により、オーバーハングは、１つの非塩基対合ヌクレオチドを含む。場合により、オーバーハングは、２つの非塩基対合ヌクレオチドを含む。場合により、オーバーハングは、３つの非塩基対合ヌクレオチドを含む。場合により、オーバーハングは、４つの非塩基対合ヌクレオチドを含む。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、３’末端にオーバーハングとして２つの非塩基対合ヌクレオチドを含むが、センス鎖にはオーバーハングがない。任意選択で、かかる態様では、非塩基対合ヌクレオチドは、ＴＴ、ｄＴｄＴ、またはＵＵの配列を有する。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス配列に相補的な１つまたは複数のヌクレオチドを５’末端に有する。

【0074】

一部の態様では、ポリ核酸分子の配列は、ＤＵＸ４の標的配列に対して少なくとも４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％相補的である。一部の態様では、ＤＵＸ４の標的配列は、ＤＵＸ４中で約１０～５０塩基対長、約１５～５０塩基対長、１５～４０塩基対長、１５～３０塩基対長、または１５～２５塩基対長の核酸配列であり、その中で標的配列の第１のヌクレオチドは、コード領域中または５’もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）中の、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ転写物におけるいずれかのヌクレオチドにおいて開始する。例えば、標的配列の第１のヌクレオチドは、核酸位置（ｎａｌ、ＤＵＸ ｍＲＮＡの完全長の５’－末端から開始する数、例えば、５’－末端の第１のヌクレオチドはｎａｌ．１である）１、ｎａｌ２、ｎａｌ３、ｎａｌ４、ｎａｌ５、ｎａｌ６、ｎａｌ７、ｎａｌ８、ｎａｌ９、ｎａｌ１０、ｎａｌ１１、ｎａｌ１２、ｎａｌ１３、ｎａｌ１４、ｎａｌ１５、ｎａｌ１５、ｎａｌ１６、ｎａｌ１７、またはＤＵＸ ｍＲＮＡのコーディングもしくは非コーディング部位（５’もしくは３’非翻訳領域）における他のいずれかの核酸位置で開始するように選択することができる。一部の態様では、標的配列の第１のヌクレオチドは、ｎａｌ１０～ｎａｌ１５、ｎａｌ１０～ｎａｌ２０、ｎａｌ５０～ｎａｌ６０、ｎａｌ５５～ｎａｌ６５、ｎａｌ７５～ｎａｌ８５、ｎａｌ９５～ｎａｌ１０５、ｎａｌ１３５～ｎａｌ１４５、ｎａｌ１５５～ｎａｌ１６５、ｎａｌ２２５～ｎａｌ２３５、ｎａｌ２６５～ｎａｌ２７５、ｎａｌ２７５～ｎａｌ２８５、ｎａｌ２８５～ｎａｌ２９５、ｎａｌ３２５～ｎａｌ３３５、ｎａｌ３３５～ｎａｌ３４５、ｎａｌ３８５～ｎａｌ３９５、ｎａｌ５１５～ｎａｌ５２５、ｎａｌ６６５～ｎａｌ６７５、ｎａｌ６７５～ｎａｌ６８５、ｎａｌ６９５～ｎａｌ７０５、ｎａｌ７０５～ｎａｌ７１５、ｎａｌ８７５～ｎａｌ８８５、ｎａｌ８８５～ｎａｌ８９５、ｎａｌ８９５～ｎａｌ９０５、ｎａｌ１０３５～ｎａｌ１０４５、ｎａｌ１０４５～ｎａｌ１０５５、ｎａｌ１１２５～ｎａｌ１１３５、ｎａｌ１１３５～ｎａｌ１１４５、ｎａｌ１１４５～ｎａｌ１１５５、ｎａｌ１１５５～ｎａｌ１１６５、ｎａｌ１１２５～ｎａｌ１１３５、ｎａｌ１１５５～ｎａｌ１１６５、ｎａｌ１２２５～ｎａｌ１２３５、ｎａｌ１２３５～ｎａｌ１２４５、ｎａｌ１２７５～ｎａｌ１２８５、ｎａｌ１２８５～ｎａｌ１２９５、ｎａｌ１３０５～ｎａｌ１３１５、ｎａｌ１１２５～ｎａｌ１１３５、ｎａｌ１１５５～ｎａｌ１１６５、ｎａｌ１２２５～ｎａｌ１２３５、ｎａｌ１２３５～ｎａｌ１２４５、ｎａｌ１２７５～ｎａｌ１２８５、ｎａｌ１２８５～ｎａｌ１２９５、ｎａｌ１３０５～ｎａｌ１３１５、ｎａｌ１３１５～ｎａｌ１３２５、ｎａｌ１３３５～ｎａｌ１３４５、ｎａｌ１３４５～ｎａｌ１３５５、ｎａｌ１５２５～ｎａｌ１５３５、ｎａｌ１５３５～ｎａｌ１５４５、ｎａｌ１６０５～ｎａｌ１６１５、ｎａｌ１６１５－ｃ．１６２５、ｎａｌ１６２５～ｎａｌ１６３５の中、またはそれらの間の位置で開始するように選択することができる。

【0075】

一部の態様では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して少なくとも５０％相補的である。一部の態様では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して少なくとも６０％相補的である。一部の態様では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して少なくとも７０％相補的である。一部の態様では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して少なくとも８０％相補的である。一部の態様では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して少なくとも９０％相補的である。一部の態様では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して少なくとも９５％相補的である。一部の態様では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して少なくとも９９％相補的である。一部の例では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して１００％相補的である。

【0076】

一部の態様では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して５つ以下のミスマッチを有する。一部の態様では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して４つ以下のミスマッチを有する。一部の例では、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して３つ以下のミスマッチを有する。場合により、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して２つ以下のミスマッチを有する。場合により、ポリ核酸分子の配列は、本明細書に記載の標的配列に対して１つ以下のミスマッチを有する。

【0077】

一部の態様では、すべてのポリ核酸分子中のポリ核酸分子の基は、潜在的に、ポリ核酸分子ライブラリを生成するために選択されるＤＵＸ４の標的配列に結合する。特定の態様では、かかる選択プロセスは、あまり望ましくないポリ核酸分子を候補から除外する１つまたは複数の工程によってｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施される。例えば一部の態様では、選択プロセスは、一塩基変異多型（ＳＮＰ）および／または－５未満のＭＥＦを有する、１つまたは複数のポリ核酸分子の除外工程を含む。代替的および／または付加的に、一部の態様では、選択プロセスは、（許容されたヒット（ｈｉｔｓ）だけがＤＵＸ、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴであるような）ヒトトランスクリプトームに０および１つのミスマッチ（ＭＭ）を有する１つまたは複数のポリ核酸分子の除外工程を含む。代替的および／または付加的に、一部の態様では、選択プロセスは、（許容されたヒットだけがＤＵＸ１、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴ偽遺伝子であるような）ヒト遺伝子内領域に０のＭＭを有する１つまたは複数のポリ核酸分子の除外工程を含む。代替的および／または付加的に、一部の態様では、選択プロセスは、ＦＬＥｘＤＵＸ４ ＦＳＨＤマウスモデルに使用されるＤＵＸ４ヒト配列に対するＭＭを有する１つまたは複数のポリ核酸分子の除外工程を含む。代替的および／または付加的に、一部の態様では、選択プロセスは、予測生存度が６０未満である１つまたは複数のポリ核酸分子の除外工程を含む。代替的および／または付加的に、このような選択プロセスは、予測生存度が６０以上である１つまたは複数のポリ核酸分子を繰り越すことを含む。代替的および／または付加的に、一部の態様では、選択プロセスは、既知のｍｉＲＮＡ １～１０００の種領域に対するマッチを有する１つまたは複数のポリ核酸分子の除外工程を含む。代替的および／または付加的に、一部の態様では、選択プロセスは、ＧＣ含有量％が７５以上の１つまたは複数のポリ核酸分子の除外工程を含む。代替的および／または付加的に、一部の態様では、選択プロセスは、２つのＭＭを有する８つ以下の予測オフターゲットヒットの除外工程を含む。一部の態様では、領域２９５～１１３２（ｎａｌ２９５～１１３２）に関しては、２つのＭＭを有する１２以下の予測オフターゲットヒットが許容される。

【0078】

一部の態様では、選択プロセスは、あまり望ましくないポリ核酸分子を候補から除外する１つまたは複数の連続工程によってｉｎ ｓｉｌｉｃｏで実施される。例えば一部の態様では、選択プロセスは、ライブラリを生成するために候補ポリ核酸分子の収集から開始される。このライブラリから、第１の除外工程は、一塩基変異多型（ＳＮＰ）および／または－５未満のＭＥＦを有する、１つまたは複数のポリ核酸分子を除外することを含む。次いで、第２の除外工程は、（許容されたヒットだけがＤＵＸ、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴであるような）ヒトトランスクリプトーム内に０および１つのＭＭを有する１つまたは複数のポリ核酸分子を除外することを含む。次いで、第３の除外工程は、（許容されたヒットだけがＤＵＸ１、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴ偽遺伝子であるような）ヒト遺伝子内領域内に０のＭＭを有する１つまたは複数のポリ核酸分子を除外することを含む。次いで、次の除外工程は、ＦＬＥｘＤＵＸ４ ＦＳＨＤマウスモデルに使用されるＤＵＸ４ヒト配列に対するＭＭを有する１つまたは複数のポリ核酸分子を除外することを含む。次いで、次の工程は、予測生存度が６０以上の１つまたは複数のポリ核酸分子のみを繰り越すことである。次に、除外工程は、既知のｍｉＲＮＡ １～１０００の種領域に対するマッチを有する１つまたは複数のポリ核酸分子を除外することを含む。次いで、除外工程は、ＧＣ含有量％が７５以上の１つまたは複数のポリ核酸分子を除外することで継続する。次いで、最終の選択プロセスは、領域２９５～１１３２を除き、２つのＭＭを有する８つ以下の予測オフターゲットヒットを含み、これにおいては最大１２のヒットが許容される。

【0079】

一部の態様では、本明細書に記載の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子の特異性は、標的配列に対するポリ核酸分子の９５％、９８％、９９％、９９．５％、または１００％の配列相補性である。一部の例では、ハイブリダイゼーションは、高度に厳密なハイブリダイゼーション条件である。

【0080】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、オフターゲット効果が少ない。一部の例では、「オフターゲット」または「オフターゲット効果」は、所与の標的に対して導かれたポリ核酸ポリマーが、別のｍＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、または細胞タンパク質もしくは他の部分との直接的または間接的な相互作用によって意図せぬ効果を生じさせるすべての例を指す。一部の例では、「オフターゲット効果」は、他の転写物とポリ核酸分子のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖との間の部分的な相同性または相補性に起因して、他の転写物が同時に分解される場合に生じる。

【0081】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、天然、合成、もしくは人工のヌクレオチドアナログまたは塩基を含む。場合により、ポリ核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはヌクレオチドアナログの組合せを含む。一部の例では、合成もしくは人工のヌクレオチドアナログまたは塩基は、リボース部分、ホスフェート部分、ヌクレオシド部分、もしくはそれらの組合せのうち１つまたは複数に修飾を含む。

【0082】

一部の態様では、ヌクレオチドアナログまたは人工ヌクレオチド塩基は、リボース部分の２’ヒドロキシル基に修飾を含んだ核酸を含む。一部の例では、修飾はＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮを含み、Ｒはアルキル部分である。典型的なアルキル部分として、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエテール、チオエステル、アミン（第一級、第二級、または第三級）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、および酸素が挙げられるが、これらに限定されない。一部の例では、アルキル部分はさらに修飾を含む。一部の例では、修飾は、アゾ基、ケト基、アルデヒド基、カルボキシル基、ニトロ基、ニトロソ基、ニトリル基、複素環（例えば、イミダゾール、ヒドラジノ、もしくはヒドロキシルアミノ）基、イソシアネートもしくはシアネート基、または硫黄含有基（例えば、スルホキシド、スルホン、硫化物、およびジスルフィド）を含む。一部の例では、アルキル部分はさらにヘテロ置換を含む。一部の例では、複素環基の炭素は、窒素、酸素、または硫黄によって置換される。一部の例では、複素環置換として、モルホリノ、イミダゾール、およびピロリジノが挙げられるが、これらに限定されない。

【0083】

一部の例では、２’ヒドロキシル基の修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾である。場合により、２’－Ｏ－メチル修飾はメチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加えるが、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾はメトキシエチル基をリボース部分の２’ヒドロキシル基に加える。アデノシン分子および２’－Ｏ－メチル修飾およびウリジンの２’－Ｏ－メトキシエチル修飾の典型的な化学構造を、以下に例示する。

【0084】

【化10】

【0085】

一部の例では、２’ヒドロキシル基の修飾は、プロピルリンカーを含む拡張アミン基がアミン基を２’酸素に結合させる２’－Ｏ－アミノプロピル修飾である。一部の例では、この修飾は、糖ごとにアミン基からの１つの正電荷を導入することによってオリゴヌクレオチド分子のホスフェート由来の全体的な負電荷を中和し、それによって、その両性イオンの特性により細胞取込み特性を改善する。２’－Ｏ－アミノプロピルヌクレオシドホスホラミダイトの典型的な化学構造を以下に例示する。

【0086】

【化11】

【0087】

一部の例では、２’ヒドロキシル基における修飾は、２’炭素にて結合された酸素分子がメチレン基によって４’炭素に連結され、これにより２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシ－メチレン－結合二環式のリボヌクレオチドモノマーを形成する、ロックドまたは架橋リボース修飾（例えば、ロックド核酸すなわちＬＮＡ）である。ＬＮＡの化学構造の典型的な表現を以下に例示する。左に示す表現は、ＬＮＡモノマーの化学的接続を強調する。右に示す表現は、ＬＮＡモノマーのフラノース環のロックド３’－ｅｎｄｏ（３Ｅ）立体配座を強調する。

【0088】

【化12】

【0089】

一部の例では、２’ヒドロキシル基における修飾は、例えば、糖の立体配座をＣ３’－ｅｎｄｏ糖パッカリング立体配座（Ｃ３’－ｅｎｄｏ ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）にロックする２’－４’－エチレン－架橋核酸などのエチレン核酸（ＥＮＡ）を含む。ＥＮＡは、さらにＬＮＡを含む修飾核酸の架橋核酸クラスの一部である。ＥＮＡおよび架橋核酸の典型的な化学構造を以下に例示する。

【0090】

【化13】

【0091】

一部の態様では、２’ヒドロキシル基における追加の修飾は、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。

【0092】

一部の態様では、ヌクレオチドアナログは、限定されないが、５－プロピニルウリジン、５－プロピニルシチジン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，－ジメチルアデニン、２－プロピルアデニン、２－プロピルグアニン、２－アミノアデニン、１－メチルイノシン、３－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、および５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ハロシチジン、５－ハロウリジン、４－アセチルシチジン、１－メチルアデノシン、２－メチルアデノシン、３－メチルシチジン、６－メチルウリジン、２－メチルグアノシン、７－メチルグアノシン、２，２－ジメチルグアノシン、５－メチルアミノエチルウリジン、５－メチルオキシウリジン、７－デアザ－アデノシンなどのデアザヌクレオチド、６－アゾウリジン、６－アゾシチジン、６－アゾチミジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－チオウリジンや４－チオウリジンや２－チオシチジンなどの他のチオ塩基、ジヒドロウリジン、シュードウリジン、キューオシン、アーケオシン、ナフチル、および置換ナフチル基、Ｎ６－メチルアデノシンなどのあらゆるＯ－およびＮ－アルキル化プリンおよびピリミジン、５－メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５－オキシ酢酸、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、アミノフェノールまたは２，４，６－トリメトキシベンゼンなどのフェニルおよび修飾フェニル基、Ｇ－クランプヌクレオチドとして作用する修飾シトシン、８－置換アデニンおよびグアニン、５－置換ウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、ならびにアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドといった、修飾塩基を含む。修飾ヌクレオチドはまた、糖部分に対して修飾されるヌクレオチドのほか、リボシルでない糖またはそのアナログを有するヌクレオチドも含む。例えば、場合により糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’－チオリボース、および他の糖、複素環、もしくは炭素環であるか、またはそれらに基づく。ヌクレオチドという用語はまた、ユニバーサル塩基として当該技術分野で公知のものも含む。例として、ユニバーサル塩基には、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、またはネブラリンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0093】

一部の態様では、ヌクレオチドアナログは、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、またはそれらの組合せをさらに含む。モルホリノまたはホスホラミダイトモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）は、その構造が正常な糖およびホスフェート構造から逸脱することによって天然の核酸構造を模倣する、合成分子を含む。一部の例では、５員のリボース環は、４つの炭素、１つの窒素、および１つの酸素を含有する６員のモルホリノ環で置換される。場合により、リボースモノマーは、ホスフェート基の代わりにホスホラミデート基によって結合される。このような場合、骨格の改変により、荷電されたオリゴヌクレオチドによって使用されるものなどの細胞送達剤の補助を必要とすることなく、細胞膜をわたることが可能なモルホリノ中性分子を作る正電荷および負電荷がすべて除去される。

【0094】

【化14】

【0095】

一部の態様では、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は糖骨格環もホスフェート連結も含有しておらず、塩基は、オリゴグリシン様分子によって結合されて適宜間隔を空けられ、そうして骨格電荷が排除される。

【0096】

【化15】

【0097】

一部の態様では、１つまたは複数の修飾は、任意選択でヌクレオチド間連結において生じる。一部の例では、修飾ヌクレオチド間連結として、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、５’－メチルホスホネート、３’－アルキレンホスホネート、ボロントリフルオリデート、３’－５’連結もしくは２’－５’連結のボラノホスフェートエステルおよびセレノホスフェート、ホスホトリエステル、チオのアルキルホスホトリエステル、ホスホン酸水素連結、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスフィネート、ホスホラミデート、３’－アルキルホスホラミデート、アミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミデート、ホスホロピペラジデート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ケトン、スルホン、スルホンアミド、カーボネート、カルバメート、メチレンヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｏｓ）、メチレンジメチルヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｏｓ）、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、チオアミデート、リボアセチル基との連結、アミノエチルグリシン、シリルもしくはシロキサン連結、例えば飽和もしくは不飽和の、置換された、および／またはヘテロ原子を含有する１～１０個の炭素のヘテロ原子を含むかあるいは含まないアルキルまたはシクロアルキル連結、モルホリノ構造を有する連結、アミド、塩基が骨格のアザ窒素に直接的または間接的に結合されるポリアミド、ならびにそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ ＡＳＯ）は、ホスホロチオエート連結を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。典型的なＰＳ ＡＳＯを以下に例示する。

【0098】

【化16】

【0099】

一部の例では、修飾は、メチルホスホネートまたはチオールホスホネート修飾などのメチルまたはチオール修飾である。典型的なチオールホスホネートヌクレオチド（左）およびメチルホスホネートヌクレオチド（右）を以下に例示する。

【0100】

【化17】

【0101】

一部の例では、修飾ヌクレオチドには、

【0102】

【化18】

として例示される２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトが挙げられるが、これらに限定されない。

【0103】

一部の例では、修飾ヌクレオチドとして、

【0104】

【化19】

から選択される５’－ビニルホスホネート修飾の非天然ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されず、式中、Ｂは複素環塩基部分である。

【0105】

一部の例では、修飾ヌクレオチドとして、

【0106】

【化20】

から選択される１つの５’－ビニルホスホネート修飾の非天然ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されず、式中、Ｂは複素環塩基部分であり、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立して水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、Ｊは、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である。

【0107】

一部の例では、修飾ヌクレオチドとして、

【0108】

【化21】

から選択される１つの５’－ビニルホスホネート修飾の非天然ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されず、式中、Ｂは複素環塩基部分であり、Ｒ４およびＲ５は、独立して水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、Ｊは、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である。

【0109】

一部の例では、修飾ヌクレオチドとして、

【0110】

【化22】

から選択される１つの５’－ビニルホスホネート修飾の非天然ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されず、式中、Ｂは複素環塩基部分であり、Ｒ６は、水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、Ｊは、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である。

【0111】

一部の例では、修飾ヌクレオチドとして、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはエチレン核酸（ＥＮＡ）から選択される、１つの５’－ビニルホスホネート修飾の非天然ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0112】

一部の例では、修飾ヌクレオチドとして、

【0113】

【化23】

から選択される１つの５’－ビニルホスホネート修飾の非天然ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されず、式中、Ｂは複素環塩基部分であり、Ｊは、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である。

【0114】

一部の例では、修飾ヌクレオチドとして、

【0115】

【化24】

から選択される１つの５’－ビニルホスホネート修飾の非天然ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されず、式中、Ｂは複素環塩基部分であり、Ｊは、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である。

【0116】

一部の例では、修飾ヌクレオチドとして、

【0117】

【化25】

から選択される１つの５’－ビニルホスホネート修飾の非天然ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されず、式中、Ｂは複素環塩基部分であり、Ｒ６は、水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、Ｊは、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である。

【0118】

一部の例では、修飾ヌクレオチドとして、

【0119】

【化26】

である１つの５’－ビニルホスホネート修飾の非天然ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0120】

一部の例では、修飾ヌクレオチドとして、

【0121】

【化27】

として例示されるヘキシトール核酸（または１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0122】

一部の態様では、１つまたは複数の修飾は、さらに任意選択で、３’もしくは５’末端にリボース部分、ホスフェート骨格、およびヌクレオシドの修飾、またはヌクレオチドアナログの修飾を含む。例えば、３’末端は、任意選択で３’カチオン性基を含むか、または３’末端において３’－３’連結によりヌクレオシドが逆転される。別の代案では、３’末端は、任意選択でアミノアルキル基、例えば３’Ｃ５－アミノアルキルｄＴとコンジュゲートされる。さらなる代案では、３’末端は、任意選択で脱塩基性部位、例えば脱プリンまたは脱ピリミジン部位とコンジュゲートされる。一部の例では、５’末端は、アミノアルキル基、例えば５’－Ｏ－アルキルアミノ置換基とコンジュゲートされる。場合により、５’末端は、脱塩基性部位、例えば脱プリンまたは脱ピリミジン部位とコンジュゲートされる。

【0123】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログのうち１つまたは複数を含む。一部の例では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログのうち１つまたは複数を含む。一部の態様では、人工ヌクレオチドアナログとして、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾された、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、またはそれらの組合せが挙げられる。一部の例では、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾された、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、またはそれらの組合せから選択される人工ヌクレオチドアナログのうち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上を含む。一部の例では、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドのうち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上を含む。一部の例では、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ヌクレオチドのうち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上を含む。一部の例では、ポリ核酸分子は、チオールホスホネートヌクレオチドのうち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、２０、２５以上を含む。

【0124】

一部の例では、ポリ核酸分子は、約５％～約１００％の修飾、約１０％～約１００％の修飾、約２０％～約１００％の修飾、約３０％～約１００％の修飾、約４０％～約１００％の修飾、約５０％～約１００％の修飾、約６０％～約１００％の修飾、約７０％～約１００％の修飾、約８０％～約１００％の修飾、および約９０％～約１００％の修飾のうち少なくとも１つを含む。

【0125】

場合により、ポリ核酸分子は、約１０％～約９０％の修飾、約２０％～約９０％の修飾、約３０％～約９０％の修飾、約４０％～約９０％の修飾、約５０％～約９０％の修飾、約６０％～約９０％の修飾、約７０％～約９０％の修飾、および約８０％～約１００％の修飾のうち少なくとも１つを含む。

【0126】

場合により、ポリ核酸分子は、約１０％～約８０％の修飾、約２０％～約８０％の修飾、約３０％～約８０％の修飾、約４０％～約８０％の修飾、約５０％～約８０％の修飾、約６０％～約８０％の修飾、および約７０％～約８０％の修飾のうち少なくとも１つを含む。

【0127】

一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０％～約７０％の修飾、約２０％～約７０％の修飾、約３０％～約７０％の修飾、約４０％～約７０％の修飾、約５０％～約７０％の修飾、および約６０％～約７０％の修飾のうち少なくとも１つを含む。

【0128】

一部の例では、ポリ核酸分子は、約１０％～約６０％の修飾、約２０％～約６０％の修飾、約３０％～約６０％の修飾、約４０％～約６０％の修飾、および約５０％～約６０％の修飾のうち少なくとも１つを含む。

【0129】

場合により、ポリ核酸分子は、約１０％～約５０％の修飾、約２０％～約５０％の修飾、約３０％～約５０％の修飾、および約４０％～約５０％の修飾のうち少なくとも１つを含む。

【0130】

場合により、ポリ核酸分子は、約１０％～約４０％の修飾、約２０％～約４０％の修飾、および約３０％～約４０％の修飾のうち少なくとも１つを含む。

【0131】

場合により、ポリ核酸分子は、約１０％～約３０％の修飾、および約２０％～約３０％の修飾のうち少なくとも１つを含む。

【0132】

場合により、ポリ核酸分子は約１０％～約２０％の修飾を含む。

【0133】

場合により、ポリ核酸分子は、約１５％～約９０％、約２０％～約８０％、約３０％～約７０％、または約４０％～約６０％の修飾を含む。

【0134】

さらなる場合に、ポリ核酸分子は、少なくとも約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の修飾を含む。

【0135】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、または約２２以上の修飾を含む。

【0136】

一部の例では、ポリ核酸分子は、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、または約２２以上の修飾ヌクレオチドを含む。

【0137】

一部の例では、ポリ核酸分子の約５～約１００％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約５％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約１０％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約１５％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約２０％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約２５％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約３０％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約３５％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約４０％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約４５％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約５０％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約５５％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約６０％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約６５％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約７０％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約７５％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約８０％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約８５％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約９０％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約９５％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約９６％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約９７％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約９８％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約９９％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の例では、ポリ核酸分子の約１００％は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む。一部の態様では、人工ヌクレオチドアナログとして、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾された、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、またはそれらの組合せが挙げられる。

【0138】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む、約１～約２５の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約２の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約３の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約４の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約５の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約６の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約７の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約８の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約９の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１０の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１１の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１２の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１３の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１４の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１５の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１６の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１７の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１８の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約１９の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約２０の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約２１の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約２２の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約２３の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約２４の修飾を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子は、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログを含む約２５の修飾を含む。

【0139】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、１つのポリヌクレオチドがセンス鎖を含み、別のポリヌクレオチドがポリ核酸分子のアンチセンス鎖を含む、２つの別個のポリヌクレオチドから組み立てられる。他の態様では、センス鎖は、一部の例ではポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーであるリンカー分子を介してアンチセンス鎖に接続される。

【0140】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖内のピリミジンヌクレオチドは２’－Ｏ－メチルピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖内のプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドを含む。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖に存在するピリミジンヌクレオチドは２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドを含み、センス鎖に存在するプリンヌクレオチドは２’－デオキシプリンヌクレオチドを含む。

【0141】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ピリミジンヌクレオチドは、アンチセンス鎖に存在する場合、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは、アンチセンス鎖に存在する場合、２’－Ｏ－メチルプリンヌクレオチドである。

【0142】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ピリミジンヌクレオチドは、アンチセンス鎖に存在する場合、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、プリンヌクレオチドは、アンチセンス鎖に存在する場合、２’－デオキシ－プリンヌクレオチドを含む。

【0143】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖のうち少なくとも１つは、複数（例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上など）の２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有する。一部の態様では、複数の２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドのうち少なくとも２つは、連続するヌクレオチドである。一部の態様では、連続する２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端に位置する。一部の態様では、連続する２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端に位置する。一部の態様では、ポリ核酸分子のセンス鎖は、その５’末端および／もしくは３’末端、またはその両方に少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つの連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。任意選択で、かかる態様では、ポリ核酸分子のセンス鎖は、ポリヌクレオチドの５’末端にある少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つの連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドの３’末端に、またはポリヌクレオチドの３’末端にある少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つの連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドの５’末端に、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つの２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。さらに任意選択で、かかる少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つの２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドは、連続するヌクレオチドである。

【0144】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖およびアンチセンス鎖のうち少なくとも１つは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端に位置する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを有する。一部の態様では、センス鎖およびアンチセンス鎖のうち少なくとも１つは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の３’末端に位置する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを有する。一部の態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端に位置する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは、プリンヌクレオチドである。一部の態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’末端に位置する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドは、ピリジンヌクレオチドである。

【0145】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、５’末端に２つ以上の連続する２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを有する。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、３’末端に２つ以上の連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを有する。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、少なくとも２、３、４、５、６、または７つの連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを有する。

【0146】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｎｓｎｓｎｎｎｎＮｆＮｆＮｆｎｎｎｎｎｎｎｎｓｎｓａ－３’（小文字（ｎ）＝２’－Ｏ－Ｍｅ（メチル）、Ｎｆ＝２’－Ｆ（フルオロ）、ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾）の核酸を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、５’－ＵｆｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｓｕｓｕ－３’（小文字（ｎ）＝２’－Ｏ－Ｍｅ（メチル）、Ｎｆ＝２’－Ｆ（フルオロ）、ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾）の核酸を含む。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、５’－ｎｓｎｓｎｎｎｎＮｆＮｆＮｆｎｎｎｎｎｎｎｎｓｎｓａ－３’（小文字（ｎ）＝２’－Ｏ－Ｍｅ（メチル）、Ｎｆ＝２’－Ｆ（フルオロ）、ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾）の核酸を含み、アンチセンス鎖は、５’－ＵｆｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｓｕｓｕ－３’（小文字（ｎ）＝２’－Ｏ－Ｍｅ（メチル）、Ｎｆ＝２’－Ｆ（フルオロ）、ｓ＝ホスホロチオエート骨格修飾）の核酸を含む。

【0147】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、センス鎖の５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方に末端キャップ部分を含む。他の態様では、末端キャップ部分は、反転デオキシ脱塩基部分である。

【0148】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端にグリセリル修飾を含む。

【0149】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、１つもしくは複数の、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または約１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択でセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に末端キャップ分子を含み、アンチセンス鎖は、約１～約１０以上の、具体的には約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または約１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択でアンチセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に末端キャップ分子を含む。他の態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の、１つまたは複数、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のピリミジンヌクレオチドは、１つまたは複数、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または３’末端、５’末端、もしくは３’末端と５’末端の両方にある末端キャップ分子が、同じまたは異なる鎖に存在する場合、あるいは存在しない場合に、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロで化学修飾される。

【0150】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、約１～約２５の、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または約１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択でセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に末端キャップ分子を含み、アンチセンス鎖は、約１～約２５以上の、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または約１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択でアンチセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に末端キャップ分子を含む。他の態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の、１つまたは複数、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のピリミジンヌクレオチドは、約１～約２５以上の、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または３’末端、５’末端、もしくは３’末端と５’末端の両方にある末端キャップ分子が、同じまたは異なる鎖に存在する場合、あるいは存在しない場合に、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロで化学修飾される。

【0151】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、１つもしくは複数の、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または約１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、ならびに／またはセンス鎖および／もしくはアンチセンス鎖の３’末端、５’末端、もしくは３’末端と５’末端の両方に１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択でセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に末端キャップ分子を含む。一部の態様では、アンチセンス鎖は、約１～約１０以上の、具体的には約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または約１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択でアンチセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に末端キャップ分子を含む。他の態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の、１つまたは複数、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のピリミジンヌクレオチドは、１つまたは複数、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または３’末端、５’末端、もしくは３’末端と５’末端の両方にある末端キャップ分子が、同じまたは異なる鎖に存在する場合、あるいは存在しない場合に、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロで化学修飾される。

【0152】

一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、約１～約２５以上の、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択でセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に末端キャップ分子を含み、アンチセンス鎖は、約１～約２５以上の、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、２’－デオキシ－２’－フルオロ、および／または約１つもしくは複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、ならびに任意選択でアンチセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に末端キャップ分子を含む。他の態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の、１つまたは複数、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のピリミジンヌクレオチドは、約１～約５の、例えば約１、２、３、４、５以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結、および／または３’末端、５’末端、もしくは３’末端と５’末端の両方にある末端キャップ分子が、同じまたは異なる鎖に存在する場合、あるいは存在しない場合に、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチル、および／または２’－デオキシ－２’－フルオロで化学修飾される。

【0153】

一部の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の各鎖において約１～約２５、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を有する、化学修飾された低分子干渉核酸分子である。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’末端にホスフェート骨格修飾を含む。代替的および／または付加的に、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端にホスフェート骨格修飾を含む。一部の例では、ホスフェート骨格修飾は、ホスホロチオエートである。一部の態様では、センス鎖またはアンチセンス鎖は、２つのホスホロチオエート骨格を介して連結される３つの連続するヌクレオシドを有する。

【0154】

別の実施形態では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２’～５’のヌクレオチド間連結を含む。一部の例では、２’～５’のヌクレオチド間連結は、１つまたは両方の配列鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方にある。さらなる例では、２’～５’のヌクレオチド間連結は、１つまたは両方の配列鎖内の他の様々な位置に存在し、例えば、ポリ核酸分子の１つまたは両方の鎖にピリミジンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結を含む、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上が、２’～５’のヌクレオチド間連結を含み、または、ポリ核酸分子の１つまたは両方の鎖にプリンヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間連結を含む、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上が、２’～５’のヌクレオチド間結合を含む。

【0155】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、細胞システムまたは再構築されたｉｎ ｖｉｔｒｏシステムにおいてＲＮＡｉ活性を媒介する、一本鎖のポリ核酸分子であり、本ポリ核酸分子は、標的核酸配列に対する相補性を有する一本鎖のポリヌクレオチドを含み、ポリ核酸に存在する１つまたは複数のピリミジンヌクレオチドは、２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、すべてのピリミジンヌクレオチドが２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドであり、または代替的に複数のピリミジンヌクレオチドが２’－デオキシ－２’－フルオロピリミジンヌクレオチドである）、ポリ核酸に存在するすべてのプリンヌクレオチドは、２’－デオキシプリンヌクレオチド（例えば、すべてのプリンヌクレオチドが２’－デオキシプリンヌクレオチドであり、または代替的に複数のプリンヌクレオチドが２’－デオキシプリンヌクレオチドである）、および、アンチセンス鎖の３’末端、５’末端、または３’末端と５’末端の両方に任意選択で存在する末端のキャップ修飾であり、ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子の３’末端に任意選択で約１～約４（例えば、約１、２、３、または４）の末端２’－デオキシリボヌクレオチドをさらに含み末端ヌクレオチドは、１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４）のホスホロチオエートヌクレオシド間連結をさらに含み、ポリ核酸分子は、任意選択で５’末端ホスフェート基などの末端ホスフェート基をさらに含む。

【0156】

場合により、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログのうち１つまたは複数は、天然のポリ核酸分子と比較して、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または５’－３’エキソヌクレアーゼや３’－５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼといったヌクレアーゼに対して耐性を持つ。一部の例では、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾された、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイト、またはそれらの組合せを含む、人工ヌクレオチドアナログは、例えばＲＮａｓｅ Ｈなどのリボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅなどのデオキシリボヌクレアーゼ、または５’－３’エキソヌクレアーゼや３’－５’エキソヌクレアーゼなどのエキソヌクレアーゼといったヌクレアーゼに対して耐性を持つ。一部の例では、２’－Ｏ－メチル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、２’－デオキシ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、モルホリノは、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼへの耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、メチルホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、チオールホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、ヌクレアーゼ耐性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ、ＤＮａｓｅ、５’－３’エキソヌクレアーゼ、または３’－５’エキソヌクレアーゼへの耐性）を示す。一部の例では、本明細書に記載の５’コンジュゲートは、５’－３’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。一部の例では、本明細書に記載の３’コンジュゲートは、３’－５’エキソヌクレアーゼ切断を阻害する。

【0157】

一部の態様では、本明細書に記載の人工ヌクレオチドアナログのうち１つまたは複数は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、もしくは２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾された、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、または２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含む、人工ヌクレオチドアナログのうち１つまたは複数は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－Ｏ－メチル修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－Ｏ－アミノプロピル修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－デオキシ修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、ＬＮＡ修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、ＥＮＡ修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、ＰＮＡ修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、ＨＮＡ修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、モルホリノ修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、メチルホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、チオールホスホネートヌクレオチド修飾ポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。一部の例では、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含むポリ核酸分子は、等価な天然ポリ核酸分子と比較してｍＲＮＡに対する結合親和性が増加している。場合により、親和性の増加は、低いＫｄ、高い溶融温度（Ｔｍ）、またはそれらの組合せで例示される。

【0158】

一部の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、キラル純粋な（またはステレオ純粋な）ポリ核酸分子、または単一のエナンチオマーを含むポリ核酸分子である。一部の例では、ポリ核酸分子は、Ｌ－ヌクレオチドを含む。一部の例では、ポリ核酸分子は、Ｄ－ヌクレオチドを含む。一部の例では、ポリ核酸分子組成物は、その鏡像エナンチオマーの３０％未満、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％以下を含む。場合により、ポリ核酸分子組成物は、ラセミ混合物の３０％未満、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％以下未満を含む。一部の例では、ポリ核酸分子は、米国特許出願公開第２０１４／１９４６１０号明細書および同第２０１５／２１１００６号明細書ならびに国際公開ＷＯ２０１５１０７４２５に記載されるポリ核酸分子である。

【0159】

一部の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、アプタマーをコンジュゲートする部分を含むようにさらに修飾される。一部の例では、アプタマーをコンジュゲートする部分は、ＤＮＡアプタマーをコンジュゲートする部分である。一部の例では、アプタマーをコンジュゲートする部分はＡｌｐｈａｍｅｒ（Ｃｅｎｔａｕｒｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）であり、特異的な細胞表面標的を認識するアプタマー部分、および循環する抗体に付着するための特異的なエピトープを提示する部分を含む。一部の例では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、米国特許第８，６０４，１８４号明細書、同８，５９１，９１０号明細書、および同７，８５０，９７５号明細書に記載される、アプタマーをコンジュゲートする部分を含むようにさらに修飾される。

【0160】

さらなる態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、その安定性を増加させるように修飾される。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）である。一部の例では、ポリ核酸分子は、その安定性を増加させるように上述の修飾のうち１つまたは複数によって修飾される。場合により、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、もしくは２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾などによって、または、ロックドもしくは架橋リボース立体配座（例えば、ＬＮＡまたはＥＮＡ）によって、２’ヒドロキシル位置で修飾される。場合により、ポリ核酸分子は、２’－Ｏ－メチルおよび／または２’－Ｏ－メトキシエチルリボースによって修飾される。場合により、ポリ核酸分子はまた、その安定性を増加させるために、モルホリノ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、および／または２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホラミダイトを含む。一部の例では、ポリ核酸分子は、キラル純粋（またはステレオ純粋）なポリ核酸分子である。一部の例では、キラル純粋（またはステレオ純粋）なポリ核酸分子は、その安定性を増加させるように修飾される。送達のために安定性を増加させるためのＲＮＡに対する好適な修飾は、当業者に明白であろう。

【0161】

一部の例では、ポリ核酸分子は、自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖のポリヌクレオチド分子であり、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部においてヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。一部の例では、ポリ核酸分子は、２つの別個のポリヌクレオチドから組み立てられ、このとき一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖とセンス鎖は自己相補性であり（例えば、各鎖は、他方の鎖においてヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、例えば、アンチセンス鎖とセンス鎖は、二重鎖または二本鎖の構造を形成し、例えば二本鎖領域は、約１９、２０、２１、２２、２３以上の塩基対である）、アンチセンス鎖は、標的核酸分子またはその一部においてヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。代替的に、ポリ核酸分子は、１つのオリゴヌクレオチドから組み立てられ、このとき、ポリ核酸分子の自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって結合される。

【0162】

場合により、ポリ核酸分子は、自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域を有する二重の、非対称的で二重の、ヘアピン状、または非対称的でヘアピン状の二次構造を含む、ポリヌクレオチドであり、アンチセンス領域は、別個の標的核酸分子またはその一部においてヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。他の場合、ポリ核酸分子は、２つ以上のループ構造、および自己相補性のセンス領域およびアンチセンス領域を含むステムを有する、環状の一本鎖ポリヌクレオチドであり、アンチセンス領域は、標的核酸分子またはその一部においてヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状のポリヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介可能な活性ポリ核酸分子を生成するために、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで処理される。さらなる場合、ポリ核酸分子はまた、標的核酸分子またはその一部においてヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み（例えば、かかるポリ核酸分子は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列のポリ核酸分子内に存在することを必要としない）、一本鎖ポリヌクレオチドは、５’－ホスフェートや５’，３’－ジホスフェートなどの末端ホスフェート基をさらに含む。

【0163】

一部の例では、非対称的なヘアピンは、アンチセンス領域と、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むループ部分と、アンチセンス領域との塩基対に対し十分な相補性のヌクレオチドを有するとともにループとの二重鎖を形成する範囲で、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含むセンス領域とを含む、線形ポリ核酸分子である。例えば、非対称的なヘアピン状のポリ核酸分子は、細胞システムまたはｉｎ ｖｉｔｒｏシステムにおいてＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、約１９～約２２ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域と、約４～約８ヌクレオチドを含むループ領域と、アンチセンス領域に対して相補的な約３～約１８ヌクレオチドを有するセンス領域とを含む。場合により、非対称的なヘアピン状のポリ核酸分子はまた、化学修飾された５’－末端ホスフェート基を含む。さらなる場合、非対称的なヘアピン状のポリ核酸分子のループ領域は、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、またはコンジュゲート分子を含む。

【0164】

一部の態様では、非対称的な二重鎖は、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの別個の鎖を有するポリ核酸分子であり、センス領域は、アンチセンス領域との塩基対に対し十分な相補性のヌクレオチドを有するとともにループとの二重鎖を形成する範囲で、アンチセンス領域よりも少ないヌクレオチドを含む。例えば、非対称的な二重ポリ核酸分子は、細胞システムまたはｉｎ ｖｉｔｒｏシステムにおいてＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、約１９～約２２ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域と、アンチセンス領域に対して相補的な約３～約１８ヌクレオチドを有するセンス領域とを含む。

【0165】

場合により、ユニバーサル塩基は、両者の区別がほとんどない天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれとの塩基対を形成する、ヌクレオチド塩基アナログを指す。ユニバーサル塩基の非限定的な例として、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル、および他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、ならびに３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、および６－ニトロインドールなど当該技術分野で公知のニトロアゾール誘導体が挙げられる。

【0166】

ポリ核酸分子の合成
一部の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、当該技術分野で公知の手順を用いた化学合成および／または酵素ライゲーション反応を使用して構築される。例えばポリ核酸分子は、自然発生のヌクレオチド、または、分子の生物学的安定性を増加させるか、もしくはポリ核酸分子と標的核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成される。典型的な方法として、米国特許第５，１４２，０４７号明細書、同５，１８５，４４４号明細書、同５，８８９，１３６号明細書、同６，００８，４００号明細書、および同６，１１１，０８６号明細書、ＰＣＴ公開ＷＯ２００９０９９９４２、または欧州特許出願公開第１５７９０１５号明細書に記載のものが挙げられる。さらなる典型的な方法として、Ｇｒｉｆｆｅｙらによる「２’－Ｏ－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： ａ ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９（２６）：５１００～５１０９頁（１９９７））；Ｏｂｉｋａらによる「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｕｒｉｄｉｎｅ ａｎｄ －ｃｙｔｉｄｉｎｅ．Ｎｏｖｅｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ａ ｆｉｘｅｄ Ｃ３，－ｅｎｄｏ ｓｕｇａｒ ｐｕｃｋｅｒｉｎｇ．」Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８（５０）：８７３５頁（１９９７）；Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．による「ＥＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．」Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８（２）：１４４～１４９頁（２００６）；およびＡｂｒａｍｏｖａらによる「Ｎｏｖｅｌ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ－ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ： ｎｅｗ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ」，Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８Ｂ：１７２１～１７２６頁（２００９）に記載のものが挙げられる。代替的に、ポリ核酸分子は、ポリ核酸分子がアンチセンスの向きにサブクローニングされている（すなわち、挿入されたポリ核酸分子から転写されたＲＮＡが、関心対象の標的ポリ核酸分子に対するアンチセンスの向きとなる）発現ベクターを用いて、生物学的に生成される。

【0167】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、タンデム合成法によって合成され、このとき両方の鎖は、二重鎖をハイブリダイズしてその精製を許容する別個のフラグメントまたは鎖を与えるように実質的に切断される切断可能リンカーによって分離される、１つの連続するオリゴヌクレオチドフラグメントまたは鎖として合成される。

【0168】

一部の例では、ポリ核酸分子はまた、１つのフラグメントがセンス領域を含み、別のフラグメントが分子のアンチセンス領域を含む、２つの別個の核酸鎖またはフラグメントから組み立てられる。

【0169】

例えば、糖、塩基、およびホスフェート修飾を組み込むためのさらなる修飾方法として、Ｅｃｋｓｔｅｉｎらによる国際公開ＷＯ９２／０７０６５、ＰｅｒｒａｕｌｔらによるＮａｔｕｒｅ，１９９０，３４４，５６５～５６８頁、ＰｉｅｋｅｎらによるＳｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５３，３１４～３１７頁、ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎによるＴｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１９９２，１７，３３４～３３９頁、Ｕｓｍａｎらによる国際公開ＷＯ９３／１５１８７、Ｓｐｒｏａｔによる米国特許第５，３３４，７１１号明細書、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらによる１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２５７０２頁、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらによる国際公開ＷＯ９７／２６２７０、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎらによる米国特許第５，７１６，８２４号明細書、Ｕｓｍａｎらによる米国特許第５，６２７，０５３号明細書、Ｗｏｏｌｆらによる国際公開ＷＯ９８／１３５２６、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらによる１９９８年４月２０日出願の米国仮特許出願第６０／０８２，４０４号明細書、Ｋａｒｐｅｉｓｋｙらによる１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１頁、ＥａｒｎｓｈａｗおよびＧａｉｔによる１９９８， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９～５５頁、ＶｅｒｍａおよびＥｃｋｓｔｅｉｎによる１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９～１３４頁、ならびにＢｕｒｌｉｎａらによる１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９～２０１０頁が挙げられる。これらの刊行物は、触媒の調節なしに糖、塩基、および／またはホスフェート修飾などを核酸分子に導入する位置を判定するための一般的な方法と戦略を記載する。

【0170】

一部の例では、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および／または５’－メチルホスホネートとのポリ核酸分子ヌクレオチド間連結の化学修飾によって安定性は改善するが、修飾が過剰であると、毒性、または活性減少を生じさせることがある。それゆえ、核酸分子を設計する場合、場合により、これらのヌクレオチド間連結の量が最小限に抑えられる。このような場合、これら結合の濃度の低下は、毒性を低下させ、これら分子の有効性を増加させ、特異性を向上させる。

【0171】

ポリ核酸分子コンジュゲート
一部の態様では、ポリ核酸分子（Ｂ）は、関心対象の部位への送達のためにポリペプチド（Ａ）にさらにコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、少なくとも１つのＢにコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、Ａ－Ｂコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢにコンジュゲートされる。一部の態様では、少なくとも１つのＡは、Ｂの５’末端、Ｂの３’末端、Ｂの内部部位、またはそれらのあらゆる組合せにコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、少なくとも２つのＢにコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８以上のＢにコンジュゲートされる。

【0172】

場合により、ポリ核酸分子は、ポリペプチド（Ａ）、および任意選択でポリマー部分（Ｃ）にコンジュゲートされる。一部の態様では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、少なくとも１つのＢの１つの末端にコンジュゲートされ、一方で少なくとも１Ｃは、Ａ－Ｂ－Ｃコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢの反対の末端にコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、少なくとも１つのＢの１つの末端にコンジュゲートされ、一方で少なくとも１つのＣは、少なくとも１つのＢの内部部位にてコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つのポリペプチドＡは、少なくとも１つのＣに直接コンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つのＢは、Ａ－Ｃ－Ｂコンジュゲートを形成するために、少なくとも１つのＣを介して少なくとも１つのポリペプチドＡに間接的にコンジュゲートされる。

【0173】

一部の例では、少なくとも１つのＢおよび／または少なくとも１つのＣ、ならびに任意選択で少なくとも１つのＤは、少なくとも１つのポリペプチドＡにコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つのＢは、末端（例えば、５’末端または３’末端）において少なくとも１つのポリペプチドＡにコンジュゲートされるか、または内部部位を介して少なくとも１つのポリペプチドＡにコンジュゲートされる。場合により、少なくとも１つのＣは、直接的に、または少なくとも１つのＢを介して間接的に、少なくとも１つのポリペプチドＡにコンジュゲートされる。少なくとも１つのＢを介して間接的に行われる場合、少なくとも１つのＣは、Ｂの上の少なくとも１つのポリペプチドＡと同じ末端において、少なくとも１つのポリペプチドＡの反対側の末端において、または独立して内部部位においてコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つの追加のポリペプチドＡは、さらに少なくとも１つのポリペプチドＡ、Ｂ、またはＣにコンジュゲートされる。さらなる例では、少なくとも１つのＤは、任意選択で少なくとも１つのポリペプチドＡ、少なくとも１つのＢ、または少なくとも１つのＣに直接または間接的にコンジュゲートされる。少なくとも１つのポリペプチドＡに直接行われる場合、少なくとも１つのＤも、Ａ－Ｄ－Ｂコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢに任意選択でコンジュゲートされるか、または、Ａ－Ｄ－Ｂ－Ｃコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢおよび少なくとも１つのＣに任意選択でコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つのＤは、Ｄ－Ａ－Ｂ－Ｃコンジュゲートを形成するために、少なくとも１つのポリペプチドＡに直接コンジュゲートされ、少なくとも１つのＢおよび少なくとも１つのＣに間接的にコンジュゲートされる。少なくとも１つのポリペプチドＡに間接的に行われる場合、少なくとも１つのＤも、Ａ－Ｂ－Ｄコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢに任意選択でコンジュゲートされるか、または、Ａ－Ｂ－Ｄ－Ｃコンジュゲートを形成するために少なくとも１つのＢおよび少なくとも１つのＣに任意選択でコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１つの追加のＤは、さらに少なくとも１つのポリペプチドＡ、Ｂ、またはＣにコンジュゲートされる。

【0174】

結合部分
一部の態様では、結合部分Ａはポリペプチドである。一部の例では、ポリペプチドは、抗体またはそのフラグメントである。場合により、フラグメントは抗原結合フラグメントである。一部の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメント、マウス抗体またはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体またはその抗原結合フラグメント、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインを有する結合フラグメント、２つの軽鎖ドメインおよび２つの重鎖ドメインを有する結合フラグメント、２つ以上の軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインを有する結合フラグメント、単価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ_２、Ｆ（ａｂ）’_３フラグメント、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（ｄｓＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、Ｉｇ ＮＡＲ、ラクダ科抗体またはその抗原結合フラグメント、二特異性抗体またはその結合フラグメント、あるいはそれらの化学修飾された誘導体を含む。

【0175】

一部の態様では、結合部分Ａは、二特異性抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の例では、二特異性抗体は、三機能性抗体または二特異性ミニ抗体である。場合により、二特異性抗体は、三機能性抗体である。一部の例では、三機能性抗体は、２つの異なる抗原に対する結合部位を含む全長モノクローナル抗体である。

【0176】

場合により、二特異性抗体は、二特異性ミニ抗体である。一部の例では、二特異性ミニ抗体は、二価Ｆａｂ_２、Ｆ（ａｂ）’_３フラグメント、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、ダイアボディ、ミニボディ、トリアボディ、テトラボディ、または二特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）を含む。一部の態様では、二特異性Ｔ細胞エンゲージャは、２つの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含有する融合タンパク質であり、そこでは２つのｓｃＦｖが２つの異なる抗原のエピトープを標的とする。

【0177】

一部の態様では、結合部分Ａは、二特異性ミニ抗体である。一部の例では、Ａは二特異性Ｆａｂ_２である。一部の例では、Ａは二特異性Ｆ（ａｂ）’_３フラグメントである。場合により、Ａは二特異性ｂｉｓ－ｓｃＦｖである。場合により、Ａは二特異性（ｓｃＦｖ）_２である。一部の態様では、Ａは二特異性ダイアボディである。一部の態様では、Ａは二特異性ミニボディである。一部の態様では、Ａは二特異性トリアボディである。他の態様では、Ａは二特異性テトラボディである。他の態様では、Ａは二特異性Ｔ細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ）である。

【0178】

一部の態様では、結合部分Ａは、三特異性抗体である。一部の例では、三特異性抗体は、Ｆ（ａｂ）’_３フラグメントまたはトリアボディを含む。一部の例では、Ａは、三特異性Ｆ（ａｂ）’_３フラグメントである。場合により、Ａはトリアボディである。一部の態様では、Ａは、Ｄｉｍａｓらによる「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｔｒｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ」，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，１２（９）：３４９０～３５０１頁（２０１５）に記載される三特異性抗体である。

【0179】

一部の態様では、結合部分Ａは、細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の例では、結合部分Ａは、筋細胞上の細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントである。場合により、結合部分Ａは、骨格筋細胞上の細胞表面タンパク質を認識する抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0180】

一部の態様では、典型的な抗体として、抗ミオシン抗体、抗トランスフェリン受容体抗体、および筋特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）を認識する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。一部の例では、抗体は、抗トランスフェリン受容体（抗ＣＤ７１）抗体である。

【0181】

抗体が抗トランスフェリン受容体（抗ＣＤ７１）抗体である一部の態様では、抗トランスフェリン抗体は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に特異的に結合し、好ましくはトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）に特異的に結合し、またはより好ましくはヒトトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）（もしくはヒトＣＤ７１）に特異的に結合する。

【0182】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、可変重鎖（ＶＨ）領域および可変軽鎖（ＶＬ）領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。

【0183】

一部の態様では、抗トランスフェリン受容体抗体のＶＨ領域は、表１から選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３配列を含む。

【0184】

【表1】

【0185】

一部の態様では、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２、２８４、または２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。一部の例では、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。一部の例では、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。一部の例では、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含む。

【0186】

一部の態様では、抗トランスフェリン受容体抗体のＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_３はＮまたはＳから選択され、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合にはＦである。

【0187】

一部の態様では、抗トランスフェリン受容体抗体のＶＬ領域は、表２から選択されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３配列を含む。

【0188】

【表2】

【0189】

一部の例では、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ_３はＮまたはＳから選択される。

【0190】

一部の例では、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択される。

【0191】

一部の例では、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆである。

【0192】

一部の例では、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆである。

【0193】

一部の例では、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0194】

一部の例では、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0195】

一部の例では、ＶＬ領域は、配列番号２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0196】

一部の態様では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_３はＮまたはＳから選択され、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合にはＦである。

【0197】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ_３はＮまたはＳから選択される。

【0198】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択される。

【0199】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆである。

【0200】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆである。

【0201】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0202】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0203】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、ＨＣＤＲ２配列ＥＩＮＰＩＸ_１ＧＲＳＮＹＡＸ_２ＫＦＱＧであって、Ｘ_１がＮまたはＱから選択され、Ｘ_２がＱまたはＥから選択される、ＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0204】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ_３はＮまたはＳから選択される。

【0205】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択される。

【0206】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆである。

【0207】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆである。

【0208】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0209】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0210】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８２を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0211】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ_３はＮまたはＳから選択される。

【0212】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択される。

【0213】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆである。

【0214】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆである。

【0215】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0216】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0217】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８４を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0218】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、ＬＣＤＲ１配列ＲＴＳＥＮＩＹＸ_３ＮＬＡ、配列番号２８７、２８９、または２９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ_３はＮまたはＳから選択される。

【0219】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＸ_４ＴＮＬＡＸ_５、および配列番号２８８または２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含み、Ｘ_４はＡまたはＧから選択され、Ｘ_５はＤまたはＥから選択される。

【0220】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６または２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７、２８９、または２９２を含むＬＣＤＲ２配列、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆである。

【0221】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、ＬＣＤＲ２配列ＡＡＴＮＬＡＸ_５、およびＬＣＤＲ３配列ＱＨＦＷＧＴＰＬＴＸ_６を含み、Ｘ_５はＤまたはＥから選択され、Ｘ_６は存在するかまたは存在せず、存在する場合、Ｆである。

【0222】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８７を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２８８を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0223】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２８６を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２８９を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0224】

一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域は、配列番号２８１を含むＨＣＤＲ１配列、配列番号２８５を含むＨＣＤＲ２配列、および配列番号２８３を含むＨＣＤＲ３配列を含み、ＶＬ領域は、配列番号２９１を含むＬＣＤＲ１配列、配列番号２９２を含むＬＣＤＲ２配列、および配列番号２９０を含むＬＣＤＲ３配列を含む。

【0225】

一部の態様では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＶＨ領域およびＶＬ領域を含み、ＶＨ領域の配列は、配列番号２９３～２９６に対して約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含み、ＶＬ領域の配列は、配列番号２９８～３０１に対して約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む。

【0226】

一部の態様では、ＶＨ領域は、配列番号２９３～２９６から選択される配列（表３）を含み、ＶＬ領域は、配列番号２９８～３０１から選択される配列（表４）を含む。表３および表４中で下線付きの領域は、対応のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３配列を表す。

【0227】

【表3】

【0228】

【表4】

【0229】

一部の態様では、抗トランスフェリン受容体抗体は、表５に例示されるＶＨ領域およびＶＬ領域を含む。

【0230】

【表5】

【0231】

一部の態様では、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧフレームワーク、ＩｇＡフレームワーク、ＩｇＥフレームワーク、またはＩｇＭフレームワークを含む。一部の例では、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧフレームワーク（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）を含む。場合により、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ１フレームワークを含む。場合により、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ２（例えば、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）フレームワークを含む。場合により、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ２ａフレームワークを含む。場合により、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ２ｂフレームワークを含む。場合により、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ３フレームワークを含む。場合により、抗トランスフェリン受容体抗体は、ＩｇＧ４フレームワークを含む。

【0232】

場合により、抗トランスフェリン受容体抗体は、フレームワーク領域、例えば、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジ領域、またはそれらの組合せに１つまたは複数の突然変異を含む。一部の例では、１つまたは複数の突然変異は、抗体を安定させる、かつ／または半減期を増加させることである。一部の例では、１つまたは複数の突然変異は、ＦｃｙＲ、抗体依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、または補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）などのＦｃエフェクタ機能を低減または排除するためにＦｃ受容体相互作用を調節することである。さらなる例では、１つまたは複数の突然変異は、グリコシル化を調節することである。

【0233】

一部の態様では、１つまたは複数の突然変異は、Ｆｃ領域に位置する。一部の例では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、またはそれらの組合せに突然変異を含む。一部の例では、突然変異は、Ｌ２３４およびＬ２３５を含む。一部の例では、突然変異は、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む。場合により、残基位置は、ＩｇＧ１に関連する。

【0234】

一部の例では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、Ｌ３２８、もしくはＰ３２９、またはそれらの組合せに突然変異を含む。一部の例では、突然変異は、残基位置Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９での突然変異と組み合わせてＬ２３４およびＬ２３５を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＫ３２２に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＬ３２８に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、およびＰ３２９に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５およびＮ２９７に突然変異を含む。場合により、残基位置は、ＩｇＧ１に関連する。

【0235】

一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、もしくはＰ３２９Ｇ、またはそれらの組合せを含む。一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、またはＰ３２９Ｇと組み合わせてＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＫ３２２Ｇを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＬ３２８Ｒを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇを含む。場合により、残基位置は、ＩｇＧ１に関連する。

【0236】

一部の例では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３５、Ｌ２３６、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ｋ３２２、Ｌ３２８、もしくはＰ３２９に突然変異を含むか、またはそれら突然変異の組合せを含む。一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５およびＬ２３６に突然変異を含む。一部の例では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｋ３２２、Ｌ３２８、またはＰ３２９での突然変異と組み合わせてＬ２３５およびＬ２３６に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５、Ｌ２３６、およびＫ３２２に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５、Ｌ２３６、およびＬ３２８に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５、Ｌ２３６、およびＰ３２９に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５およびＮ２９７に突然変異を含む。場合により、残基位置は、ＩｇＧ２に関連する。

【0237】

一部の態様では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、もしくはＰ３２９Ｇ、またはそれらの組合せを含む。一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５ＡおよびＬ２３６Ａを含む。一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｋ３２２Ｇ、Ｌ３２８Ｒ、またはＰ３２９Ｇと組み合わせてＬ２３５ＡおよびＬ２３６Ａを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、およびＫ３２２Ｇを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、およびＬ３２８Ｒを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３６Ａ、およびＰ３２９Ｇを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｄ２６５ＡおよびＮ２９７Ｇを含む。場合により、残基位置は、ＩｇＧ２に関連する。

【0238】

一部の態様では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３３、Ｌ２３４、Ｄ２６４、Ｎ２９６、Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８に突然変異を含み、残基は、配列番号３０３の２３３位、２３４位、２６４位、２９６位、３２１位、３２７位、および３２８位に対応する。一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３およびＬ２３４に突然変異を含む。一部の例では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８での突然変異と組み合わせてＬ２３３およびＬ２３４に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３、Ｌ２３４、およびＫ３２１に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３、Ｌ２３４、およびＬ３２７に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３、Ｌ２３４、およびＫ３２１に突然変異を含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３、Ｌ２３４、およびＰ３２８に突然変異を含む。一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｄ２６４およびＮ２９６に突然変異を含む。場合により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４フレームワークにおける残基Ｌ２３３、Ｌ２３４、Ｄ２６４、Ｎ２９６、Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８に対する等価な位置が、企図される。場合によりＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４フレームワークにおける配列番号２３の残基Ｌ２３３、Ｌ２３４、Ｄ２６４、Ｎ２９６、Ｋ３２１、Ｌ３２７、またはＰ３２８に対応する残基に対する突然変異も、企図される。

【0239】

一部の態様では、Ｆｃ領域は、残基位置Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、Ｄ２６４Ａ、Ｎ２９６Ｇ、Ｋ３２１Ｇ、Ｌ３２７Ｒ、またはＰ３２８Ｇを含み、残基は、配列番号３０３の２３３位、２３４位、２６４位、２９６位、３２１位、３２７位、および３２８位に対応する。一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３ＡおよびＬ２３４Ａを含む。一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｋ３２１Ｇ、Ｌ３２７Ｒ、またはＰ３２８Ｇと組み合わせてＬ２３３ＡおよびＬ２３４Ａを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＫ３２１Ｇを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ３２７Ｒを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＫ３２１Ｇを含む。場合により、Ｆｃ領域は、Ｌ２３３Ａ、Ｌ２３４Ａ、およびＰ３２８Ｇを含む。一部の例では、Ｆｃ領域は、Ｄ２６４ＡおよびＮ２９６Ｇに突然変異を含む。

【0240】

一部の態様では、ヒトＩｇＧ定常領域は、例えば、Ｎａｔｓｕｍｅらによる２００８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６８（１０）：３８６３～７２頁、Ｉｄｕｓｏｇｉｅらによる２００１ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６（４）：２５７１～５頁、Ｍｏｏｒｅらによる２０１０ ｍＡｂｓ，２（２）：１８１～１８９頁、Ｌａｚａｒらによる２００６ ＰＮＡＳ，１０３（１１）：４００５～４０１０頁、Ｓｈｉｅｌｄｓらによる２００１ ＪＢＣ，２７６（９）：６５９１～６６０４頁、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎらによる２００７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６７（１８）：８８８２～８８９０頁、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎらによる２００８ Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ．，４８：１５２～１６４頁、Ａｌｅｇｒｅらによる１９９２ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４８：３４６１～３４６８頁、Ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ Ｋａｎｅｋｏ ａｎｄ Ｎｉｗａ，２０１１ Ｂｉｏｄｒｕｇｓ，２５（１）：１～１１頁に記載されるアミノ酸修飾により、抗体依存細胞性細胞毒素（ＡＤＣＣ）および／または補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）を改変するように修飾される。

【0241】

一部の態様では、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む全長抗体である。場合により、重鎖（ＨＣ）は、表６から選択される配列を含む。場合により、軽鎖（ＬＣ）は、表７から選択される配列を含む。下線領域は、対応のＣＤＲを表す。

【0242】

【表6-1】

【0243】

【表6-2】

【0244】

【表6-3】

【0245】

【表6-4】

【0246】

【表6-5】

【0247】

【表6-6】

【0248】

【表7】

【0249】

一部の態様では、本明細書に記載の抗トランスフェリン受容体抗体は、参照の抗トランスフェリン受容体抗体と比較して血清半減期が改善している。一部の例では、改善された血清半減期は、参照の抗トランスフェリン受容体抗体よりも少なくとも３０分、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１４日、３０日以上長い。

【0250】

一部の態様では、結合部分Ａは、ポリ核酸分子（Ｂ）に非特異的にコンジュゲートされる。一部の例では、結合部分Ａは、非部位特異的にリシン残基またはシステイン残基を介してポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。一部の例では、結合部分Ａは、非部位特異的にリシン残基（例えば、結合部分Ａに存在するリシン残基）を介してポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。場合により、結合部分Ａは、非部位特異的にシステイン残基（例えば、結合部分Ａに存在するシステイン残基）を介してポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。

【0251】

一部の態様では、結合部分Ａは、部位特異的にポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。一部の例では、結合部分Ａは、部位特異的な方法によって、リシン残基を通じて、システイン残基を通じて、５’末端にて、３’末端にて、非天然アミノ酸を通じて、または酵素修飾もしくは酵素触媒残基を通じてポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。一部の例では、結合部分Ａは、部位特異的な方法によってリシン残基（例えば、結合部分Ａに存在するリシン残基）を通じてポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。一部の例では、結合部分Ａは、部位特異的な方法によってシステイン残基（例えば、結合部分Ａに存在するシステイン残基）を通じてポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。一部の例では、結合部分Ａは、部位特異的な方法によって５’末端にてポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。一部の例では、結合部分Ａは、部位特異的な方法によって３’末端にてポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。一部の例では、結合部分Ａは、部位特異的な方法によって非天然アミノ酸を通じてポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。一部の例では、結合部分Ａは、部位特異的な方法によって、酵素修飾または酵素触媒残基を通じてポリ核酸分子（Ｂ）にコンジュゲートされる。

【0252】

一部の態様では、１つまたは複数のポリ核酸分子（Ｂ）は、結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６以上のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約１のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約２のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約３のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約４のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約５のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約６のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約７のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約８のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約９のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約１０のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約１１のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約１２のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約１３のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約１４のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約１５のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。一部の例では、約１６のポリ核酸分子が、１つの結合部分Ａにコンジュゲートされる。場合により、１つまたは複数のポリ核酸分子は、同じものである。他の場合、１つまたは複数のポリ核酸分子は、異なるものである。

【0253】

一部の態様では、結合部分Ａにコンジュゲートされたポリ核酸分子（Ｂ）の数は、比を形成する。一部の例では、比は、ＤＡＲ（薬物対抗体）比と称され、本明細書で言及される薬物はポリ核酸分子（Ｂ）である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約２以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約３以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約４以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約５以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約６以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約７以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約８以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約９以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１０以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１１以上である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１２以上である。

【0254】

一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約２である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約３である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約４である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約５である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約６である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約７である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約８である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約９である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１０である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１１である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１２である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１３である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１４である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１５である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、約１６である。

【0255】

一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、１である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、２である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、４である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、６である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、８である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）と結合部分ＡとのＤＡＲ比は、１２である。

【0256】

一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）および結合部分Ａを含むコンジュゲートは、ポリ核酸分子（Ｂ）を含むが結合部分Ａを含まないコンジュゲートと比較して活性が改善されている。一部の例では、改善された活性は、疾患状態の処置または予防における生物学的に関連する機能の向上、例えば、安定性、親和性、結合、機能活性、および有効性の改善をもたらす。一部の例では、疾患状態は、遺伝子の１つまたは複数の突然変異したエクソンの結果である。一部の例では、ポリ核酸分子（Ｂ）および結合部分Ａを含むコンジュゲートは、ポリ核酸分子（Ｂ）を含むが結合部分Ａを含まないコンジュゲートと比較して、１つまたは複数の突然変異したエクソンのエクソンスキッピングの増大をもたらす。一部の例では、エクソンスキッピングは、ポリ核酸分子（Ｂ）および結合部分Ａを含むコンジュゲートにおいて、ポリ核酸分子（Ｂ）を含むが結合部分Ａを含まないコンジュゲートと比較して少なくとももしくは約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９５％より多く増大する。

【0257】

一部の態様では、抗体または抗原結合フラグメントは、当該技術分野で公知の従来技法を用いて、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／もしくは組換えによって、ならびに／または単独もしくは組合せで当該技術分野において公知の他のいずれかの修飾（例えば、グリコシル化やリン酸化などの翻訳後および化学的修飾）によってさらに修飾される。一部の例では、修飾は、Ｆｃ受容体との相互作用を調節するための修飾をさらに含む。一部の例では、１つまたは複数の修飾には、例えば、アミノ酸残基がＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与することを開示する国際公開ＷＯ９７／３４６３１に記載されるものが挙げられる。抗体または抗原結合フラグメントのアミノ酸配列の基礎をなす核酸配列にかかる修飾を導入する方法は、当業者に周知である。

【0258】

一部の例では、抗原結合フラグメントはその誘導体をさらに包含するとともに、少なくとも１つのＣＤＲを含有するポリペプチド配列を含む。

【0259】

一部の例では、本明細書で使用される「一本鎖」という用語は、二特異性の一本鎖構築物の第１および第２のドメインが、好ましくは単一核酸分子によってコード可能な共線形アミノ酸配列の形で共有結合されることを意味する。

【0260】

一部の例では、二特異性の一本鎖抗体構築物は、２つの抗体由来の結合ドメインを含む構築物に関連する。かかる態様では、二特異性の一本鎖抗体構築物は、タンデムｂｉ－ｓｃＦｖまたはダイアボディである。一部の例では、ｓｃＦｖは、リンカーペプチドによって接続されるＶＨドメインおよびＶＬドメインを含有する。一部の実例では、リンカーは、第１のドメインおよび第２のドメインのそれぞれが互いに独立して、それらの特有の結合特異性を保持できるのを確実とするのに十分な、長さおよび配列のものである。

【0261】

一部の態様では、本明細書で使用される結合または相互作用は、少なくとも２つの抗原相互作用部位同士の結合／相互作用を定義する。一部の例では、抗原相互作用部位は、特異的抗原または特異的抗原群との特異的な相互作用の能力を示すポリペプチドのモチーフを定義する。場合により、結合／相互作用はまた、特異的な認識を定義するとも理解される。このような場合、特異的な認識は、抗体またはその抗原結合フラグメントが、標的分子のそれぞれの少なくとも２つのアミノ酸と特異的に相互作用する、かつ／またはそれらに結合することができることを指す。例えば、特異的な認識は、抗体分子の特異性、または標的分子の特異的領域を判別するその能力に関連する。さらなる例では、抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば、抗原の立体配座に対する変化の誘導、抗原のオリゴマー化などに起因して、シグナルの開始をもたらす。さらなる態様では、結合は、「重要なロック原理（ｋｅｙ－ｌｏｃｋ－ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）」の特異性によって例証される。このため一部の例では、抗原相互作用部位および抗原のアミノ酸配列における特異的なモチーフは、それらの一次構造、二次構造、または三次構造の結果、ならびにその構造の二次修飾の結果として互いに結合する。このような場合、抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、同様に抗原に対する部位の単純な結合をもたらす。

【0262】

一部の例では、特異的相互作用はさらに、抗体または抗原結合フラグメントの交差反応性の低減、またはオフターゲット効果の低減を指す。例えば、関心対象のポリペプチド／タンパク質に結合するが、他のポリペプチドのいずれにも結合することも本質的に結合することもない抗体または抗原結合フラグメントは、関心対象のポリペプチド／タンパク質に特異的として考慮される。抗原相互作用部位と特異的抗原との特異的相互作用用の例は、リガンドのその受容体に対する特異性、例えば、抗原決定基（エピトープ）と抗体の抗原性結合部位との相互作用を含む。

【0263】

追加の結合部分
一部の態様では、結合部分は、血漿タンパク質である。一部の例では、血漿タンパク質は、アルブミンを含む。一部の例では、結合部分Ａは、アルブミンである。一部の例では、アルブミンは、本明細書に記載のコンジュゲーション化学のうち１つまたは複数によってポリ核酸分子にコンジュゲートされる。一部の例では、アルブミンは、ネイティブライゲーション化学によってポリ核酸分子にコンジュゲートされる。一部の例では、アルブミンは、リシンコンジュゲーションによってポリ核酸分子にコンジュゲートされる。

【0264】

一部の例では、結合部分は、ステロイドである。典型的なステロイドには、飽和されるか、不飽和だるか、置換を含むか、またはそれらの組合せである、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、炭水化物を含む。一部の例では、ステロイドはコレステロールである。一部の例では、結合部分は、コレステロールである。一部の例では、コレステロールは、本明細書に記載のコンジュゲーション化学のうち１つまたは複数によってポリ核酸分子にコンジュゲートされる。一部の例では、コレステロールは、ネイティブライゲーション化学によってポリ核酸分子にコンジュゲートされる。一部の例では、コレステロールは、リシンコンジュゲーションによってポリ核酸分子にコンジュゲートされる。

【0265】

一部の例では、結合部分は、細胞上で特異的表面マーカに結合するポリ核酸分子アプタマーが挙げられるがこれに限定されない、ポリマーである。本例では、結合部分は、標的遺伝子またはｍＲＮＡにハイブリダイズしないが、その代わりに細胞表面マーカのその特異的なエピトープに対する抗体結合と同様に細胞表面マーカに選択的に結合可能である、ポリ核酸である。

【0266】

場合により、結合部分はペプチドである。場合により、ペプチドは、約１～約３ｋＤａの間を含む。場合により、ペプチドは、約１．２～約２．８ｋＤａの間、約１．５～約２．５ｋＤａの間、または約１．５～２ｋＤａの間を含む。一部の例では、ペプチドは二環式ペプチドである。場合により、二環式ペプチドは、拘束された二環式ペプチドである。一部の例では、結合部分は、二環式ペプチド（例えば、Ｂｉｃｙｃｌｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの二環式（ｂｉｃｙｃｌｅｓ））である。

【0267】

さらなる場合、結合部分は小分子である。一部の例では、小分子は、抗体を補充する小分子である。場合により、抗体を補充する小分子は、標的に結合する末端および抗体に結合する末端を含み、標的に結合する末端は、細胞表面受容体を認識し、それと相互作用することが可能である。例えば一部の例では、グルタメート尿素化合物を含む、標的に結合する末端は、ＰＳＭＡとの相互作用を可能にし、それによって、ＰＳＭＡを発現する細胞との抗体相互作用を向上させる。一部の例では、結合部分は、Ｚｈａｎｇらによる「Ａ ｒｅｍｏｔｅ ａｒｅｎｅ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｏｎ ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１３２（３６）：１２７１１～１２７１６頁（２０１０）、またはＭｃＥｎａｎｅｙらによる「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｅｎｇａｇｉｎｇ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ」，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．７（７）：１１３９～１１５１頁（２０１２）に記載される小分子である。

【0268】

抗体またはその抗原結合フラグメントの産生
一部の態様では、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、抗体および抗原結合フラグメント）は、ポリペプチド（例えば、抗体）の合成に有用であると当該技術分野で公知であるいずれかの方法、具体的には化学合成または組換え発現によって産生され、好ましくは組換え発現技法によって産生される。

【0269】

一部の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは組換えにより発現され、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸は、化学合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒらによる１９９４年の「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２頁」に記載されるもの）から組み立てられ、抗体をコードする配列の複数部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、ならびにその後のライゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅を必要とする。

【0270】

代替的に、抗体をコード化する核酸分子は、配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、または特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングによって、好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、または免疫グロブリンを発現するいずれかの組織もしくは細胞から生成されたｃＤＮＡライブラリ）から任意選択で生成される。

【0271】

一部の例では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリクローナル抗体を生成するためにウサギなどの動物を免疫化することによって、またはより好ましくは、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５～４９７頁）に記載されるか、Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２頁）に記載されるか、もしくはＣｏｌｅら（１９８５ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７～９６頁）に記載されるモノクローナル抗体を生成することによって、任意選択で生成される。代替的に、特異的抗原に結合するＦａｂフラグメントのクローンに対してＦａｂ発現ライブラリをスクリーニングすることによって（例えば、Ｈｕｓｅらによる１９８９年のＳｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５～１２８１頁に記載されるように）、または抗体ライブラリをスクリーニングすることによって（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎらによる１９９１年のＮａｔｕｒｅ ３５２：６２４頁、Ｈａｎｅらによる１９９７年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４９３７頁を参照）、抗体の少なくともＦａｂ部分をコードするクローンが任意選択で得られる。

【0272】

一部の態様では、適切な生体活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによって「キメラ抗体」を産生するために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎらによる１９８４年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１～８５５頁、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒらによる１９８４年のＮａｔｕｒｅ ３１２：６０４～６０８頁、Ｔａｋｅｄａらによる１９８５年のＮａｔｕｒｅ ３１４：４５２～４５４頁）が、使用される。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えばヒト化抗体など、様々な部分が様々な動物種に由来する分子である。

【0273】

一部の態様では、一本鎖抗体の産生について記載される技法（米国特許第４，６９４，７７８号明細書、Ｂｉｒｄによる１９８８年のＳｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３～４２頁、Ｈｕｓｔｏｎらによる１９８８年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９～５８８３頁、およびＷａｒｄらによる１９８９年のＮａｔｕｒｅ ３３４：５４４～５４頁）は、一本鎖抗体を産生するのに適している。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ部位の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを連結させることによって形成され、一本鎖ポリペプチドをもたらす。大腸菌中の機能的Ｆｖフラグメントの組立てに関する技法も、任意選択で使用される（Ｓｋｅｒｒａらによる１９８８年のＳｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８～１０４１頁）。

【0274】

一部の態様では、抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクター、または抗体のヌクレオチド配列は、従来技法（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈澱反応）によって宿主細胞に導入され、次いでトランスフェクトされた細胞は、抗体を産生するための従来技法によって培養される。特定の態様では、抗体の発現は、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、または組織特異的プロモータによって調節される。

【0275】

一部の態様では、種々の宿主発現ベクター系が、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するために利用される。このような宿主発現系は、抗体のコード配列を産生した後に精製するビヒクルを表すだけでなく、適切なヌクレオチドコード配列により形質転換またはトランスフェクトされた場合にｉｎ ｓｉｔｕで抗体またはその抗原結合フラグメントを発現する細胞を表す。これらには、抗体またはその抗原結合フラグメントのコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）などの微生物；抗体またはその抗原結合フラグメントのコード配列を含有する組換え酵母菌発現ベクターにより形質転換された酵母菌（例えば、サッカロミケス・ピキア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ））；抗体またはその抗原結合フラグメントのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコ・モザイク・ウイルス（ＴＭＶ））に感染したか、または抗体もしくはその抗原結合フラグメントのコード配列を含有する組換プラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモータ）または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）に由来するプロモータを含有する組換え発現構築物を抱える哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、それらに限定されない。

【0276】

組換えタンパク質の長期にわたる高収量の産生では、安定した発現が好ましい。一部の例では、安定して抗体を発現する細胞株は、任意選択で操作される。宿主細胞は、ウイルスの複製開始点を包含する発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現調節要素（例えば、プロモータ、エンハンサ、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）および選択可能なマーカによって制御されたＤＮＡによって形質転換される。外来性ＤＮＡの導入後、操作された細胞を濃縮培地中で１～２日間成長させた後、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカは、選択に対する耐性を与えて、細胞がプラスミドをその染色体に安定して統合し、クローニングされ細胞株へと拡張される焦点を形成するように成長するのを可能にする。この方法は、抗体またはその抗原結合フラグメントを発現する細胞株を操作するために有利に使用できる。

【0277】

一部の例では、それぞれｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－、またはａｐｒｔ－細胞に採用される、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒらによる１９７７年のＣｅｌｌ １１：２２３頁）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａとＳｚｙｂａｌｓｋｉによる１９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙらによる１９８０年のＣｅｌｌ ２２：８１７頁）の遺伝子を含むがこれらに限定されない、多くの選択システムが使用される。また、代謝拮抗物質耐性（ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）も、次の遺伝子：メトトレキサートに耐性を与えるＤＨＦＲ（Ｗｉｇｌｅｒらによる１９８０年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７頁、Ｏ’Ｈａｒｅらによる１９８１年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７頁）、ミコフェノール酸に耐性を与えるＧＰＴ（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇによる１９８１年のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２頁）、アミノグリコシドＧ－４１８に耐性を与えるｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８～５０５頁、ＷｕとＷｕによる１９９１年のＢｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７～９５頁、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖによる１９９３年のＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３～５９６頁、Ｍｕｌｌｉｇａｎによる１９９３年のＳｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６～９３２頁、およびＭｏｒｇａｎとＡｎｄｅｒｓｏｎによる１９９３年のＡｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１－２１７頁；Ｍａｙ １９９３，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５～２１５頁）、ならびにヒグロマイシンに耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅらによる１９８４年のＧｅｎｅ ３０：１４７頁）に対する選定基準として使用される。使用可能である組換えＤＮＡ技法の分野で一般的に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編、１９９３年のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ、Ｋｒｉｅｇｌｅｒによる１９９０年のＧｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、Ｄｒａｃｏｐｏｌｉら（編）による１９９４年のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ．の第１２章と第１３章、Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎらによる１９８１年のＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１頁）に記載されている。

【0278】

一部の例では、抗体の発現レベルは、ベクター増幅により上昇する（論評に関しては、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎとＨｅｎｔｓｃｈｅｌによる「ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｖｏｌ．３．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカが増幅可能な場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルの上昇により、マーカ遺伝子のコピーの数が増加する。増幅された部位は抗体のヌクレオチド配列に関連付けられるので、抗体の産生も増加することになる（Ｃｒｏｕｓｅらによる１９８３年のＭｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２５７頁）。

【0279】

一部の例では、抗体もしくは抗体コンジュゲートの精製または分析に関する分野で公知のいずれかの方法が、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、具体的にはプロテインＡの後の特異性抗原に対する親和性による、およびサイズカラムクロマトグラフィー（ｓｉｚｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ））、遠心分離、差分溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、またはタンパク質精製に関する他の標準技術によって使用される。典型的なクロマトグラフィー法には、強力陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、および拘束タンパク質液体クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0280】

コンジュゲーション化学
一部の態様では、ポリ核酸分子（Ｂ）は、結合部分にコンジュゲートされる。一部の態様では、ポリ核酸分子Ｂは、式Ａ－Ｘ－Ｂ（Ｘは、ＡとＢをコンジュゲートするリンカーである）で結合部分にコンジュゲートされる。一部の例では、結合部分は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖、炭化水素、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリマーのほか、これら物質のクラスのすべてのアナログまたは誘導体を含む。さらなる結合部分の例にはまた、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびトリアシルグリセロール、脂肪酸、炭化水素（例えば、飽和、不飽和、または置換含有）、酵素基質、ビオチン、ジゴキシゲニン、および多糖類などのステロイドが挙げられる。一部の例では、結合部分は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。一部の例では、ポリ核酸分子はさらに、ポリマー、および任意選択でエンドソーム溶解性部分にコンジュゲートされる。

【0281】

一部の態様では、ポリ核酸分子は、化学ライゲーションプロセスによって結合部分にコンジュゲートされる。一部の例では、ポリ核酸分子は、ネイティブライゲーションによって結合部分にコンジュゲートされる。一部の例では、コンジュゲーションは、Ｄａｗｓｏｎらによる「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９４，２６６，７７６～７７９頁、Ｄａｗｓｏｎらによる「Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｎａｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｈｉｏｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ」，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，４３２５～４３２９頁、Ｈａｃｋｅｎｇらによる「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ｅｘｐａｎｄｅｄ ｓｃｏｐｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｇｈｔｆｏｒｗａｒｄ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９９，９６，１００６８～１００７３頁、またはＷｕらによる「Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｆｒｅｅ ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ」，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００６，４５，４１１６～４１２５頁に記載されるようなものである。いくつかの例では、コンジュゲーションは、米国特許第８，９３６，９１０号に記載されるようなものである。一部の態様では、ポリ核酸分子は、ネイティブライゲーション化学を介して結合部分に部位特異的または非特異的にコンジュゲートされる。

【0282】

一部の例では、ポリ核酸分子は、「トレースレス」カップリング技術（Ｐｈｉｌｏｃｈｅｍ）を利用する部位特異的方法によって結合部分にコンジュゲートされる。一部の例では、「トレースレス」カップリング技術は、アルデヒド基を含有するポリ核酸分子でコンジュゲートされる結合部分上で、Ｎ末端１，２－アミノチオール基にコンジュゲートされる（Ｃａｓｉらによる「Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｏｄｅｌｉｖｅｒｙ」，ＪＡＣＳ １３４（１３）：５８８７～５８９２頁（２０１２）を参照）。

【0283】

一部の例では、ポリ核酸分子は、結合部分に組み込まれた非天然アミノ酸を利用する部位特異的方法によって結合部分にコンジュゲートされる。一部の例では、非天然のアミノ酸は、ｐ－アセチルフェニルアラニン（ｐＡｃＰｈｅ）を含む。一部の例では、ｐＡｃＰｈｅのケト基は、オキシム結合を形成するためにアルコキシ－アミン由来のコンジュゲーション部分に選択的に接合される（Ａｘｕｐらによる「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｕｎｎａｔｕｒａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ」，ＰＮＡＳ １０９（４０）：１６１０１～１６１０６頁（２０１２）を参照）。

【0284】

一部の例では、ポリ核酸分子は、酵素触媒プロセスを利用する部位特異的方法によって結合部分にコンジュゲートされる。一部の例では、部位特異的方法は、ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術（Ｃａｔａｌｅｎｔ，Ｉｎｃ．）を利用する。一部の例では、ＳＭＡＲＴａｇ（商標）技術は、アルデヒドタグの存在下での酸化プロセス、およびその後のヒドラジノ－ピクテ－シュペングラー（ｈｙｄｒａｚｉｎｏ－Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒ；ＨＩＰＳ）ライゲーションによるアルキルヒドラジン官能化ポリ核酸に対するホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）のコンジュゲーションを通じて、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によるシステインからのＦＧｌｙ残基の生成を含む（Ｗｕらによる「Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｔａｇ」，ＰＮＡＳ １０６（９）：３０００～３００５頁（２００９）、Ａｇａｒｗａｌらによる「Ａ Ｐｉｃｔｅｔ－Ｓｐｅｎｇｌｅｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，ＰＮＡＳ １１０（１）：４６～５１頁（２０１３）を参照）。

【0285】

一部の例では、酵素触媒プロセスは、微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を含む。場合により、ポリ核酸分子は、微生物トランスグルタミナーゼ触媒プロセスを利用して結合部分にコンジュゲートされる。一部の例では、ｍＴＧは、認識配列内のグルタミンのアミド側鎖と官能化ポリ核酸分子の第一級アミンとの間の共有結合形成を触媒する。一部の例では、ｍＴＧは、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒｅｎｓｉｓ）から生産される（Ｓｔｒｏｐらによる「Ｌｏｃａｔｉｏｎ ｍａｔｔｅｒｓ：ｓｉｔｅ ｏｆ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０（２）１６１～１６７頁（２０１３）を参照）。

【0286】

一部の例では、ポリ核酸分子は、配列特異的なトランスペプチダーゼを利用する、国際公開ＷＯ２０１４／１４０３１７に記載される方法によって、結合部分にコンジュゲートされる。

【0287】

一部の例では、ポリ核酸分子は、米国特許出願第２０１５／０１０５５３９号明細書および同第２０１５／０１０５５４０号明細書に記載される方法によって、結合部分にコンジュゲートされる。

【0288】

ポリマーコンジュゲーション部分
一部の態様では、ポリマー部分Ｃは、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載の結合部分、またはそれらの組合せにさらにコンジュゲートされる。一部の例では、ポリマー部分Ｃは、式Ａ－Ｘ_１－Ｂ－Ｘ_２－Ｃ（Ｘ_１、Ｘ_２は、それぞれＡとＢ、ＢとＣをコンジュゲートする２つのリンカーである）でポリ核酸分子にコンジュゲートされる。場合により、ポリマー部分Ｃは、結合部分にコンジュゲートされる。他の場合、ポリマー部分Ｃは、ポリ核酸分子－結合部分分子にコンジュゲートされる。さらなる場合、ポリマー部分Ｃは、上述のようにコンジュゲートされる。

【0289】

一部の例では、ポリマー部分Ｃは、分枝状もしくは未分枝状のモノマーの長鎖、および／または２次元もしくは３次元のモノマーの交差結合ネットワークからなる、天然または合成のポリマーである。一部の例では、ポリマー部分Ｃは、多糖類、リグニン、ゴム、またはポリアルキレンオキシド（例えば、ポリエチレングリコール）を含む。一部の例では、少なくとも１つのポリマー部分Ｃは、アルファ－もしくはオメガ－ジヒドロキシポリエチレングリコール、生物分解性のラクトン系ポリマー、例えばポリアクリル酸、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシアノアクリレート、ポリイミド、ポリエチレンテレフタレート（ポリ（エチレンテレフタレート）、ＰＥＴ、ＰＥＴＧ、もしくはＰＥＴＥとしても公知）、ポリテトラメチレングリコール（ＰＴＧ）、またはポリウレタンのほか、それらの混合物を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、混合物は、同じ化合物内にあるほか、ブロック共重合体に関連する異なるポリマーの使用を指す。場合により、ブロック共重合体は、ポリマーの少なくとも１つの部分が別のポリマーのモノマーから構築されるポリマーである。一部の例では、ポリマー部分Ｃは、ポリアルキレンンオキシドを含む。一部の例では、ポリマー部分Ｃは、ＰＥＧを含む。一部の例では、ポリマー部分Ｃは、ポリエチレンイミド（ＰＥＩ）またはヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）を含む。

【0290】

一部の例では、ＣはＰＥＧ部分である。一部の例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の５’末端でコンジュゲートされるが、結合部分はポリ核酸分子の３’末端でコンジュゲートされる。一部の例では、ＰＥＧ部分はポリ核酸分子の３’末端でコンジュゲートされるが、結合部分はポリ核酸分子の５’末端でコンジュゲートされる。一部の例では、ＰＥＧ部分は、ポリ核酸分子の内部部位にコンジュゲートされる。一部の例では、ＰＥＧ部分、結合部分、またはそれらの組合せは、ポリ核酸分子の内部部位にコンジュゲートされる。一部の例では、コンジュゲーションは、直接コンジュゲーションである。一部の例では、コンジュゲーションは、ネイティブライゲーションを介する。

【0291】

一部の態様では、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、多分散系または単分散系化合物である。一部の例では、多分散系材料は、平均重量（重量平均）サイズおよび分散度を特徴とする、異なる分子量の材料の分散分布を含む。一部の例では、単分散系ＰＥＧは、１サイズの分子を含む。一部の態様では、Ｃは、多分散または単分散ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、示された分子量は、ポリアルキレンオキシド、例えばＰＥＧの分子の平均分子量を表す。

【0292】

一部の態様では、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）の分子量は、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａである。

【0293】

一部の態様では、Ｃはポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）であり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａの分子量を有する。一部の態様では、ＣはＰＥＧであり、約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４６００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、１０，０００、１２，０００、２０，０００、３５，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、または１００，０００Ｄａの分子量を有する。一部の例では、Ｃの分子量は、約２００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約３００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約４００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約５００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約６００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約７００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約８００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約９００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１１００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１２００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１３００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１４００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１４５０Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１５００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１６００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１７００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１８００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１９００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２１００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２２００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２３００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２４００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２５００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２６００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２７００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２８００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２９００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約３０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約３２５０Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約３３５０Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約３５００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約３７５０Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約４０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約４２５０Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約４５００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約４６００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約４７５０Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約５０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約５５００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約６０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約６５００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約７０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約７５００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約８０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１０，０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１２，０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約２０，０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約３５，０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約４０，０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約５０，０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約６０，０００Ｄａである。一部の例では、Ｃの分子量は、約１００，０００Ｄａである。

【0294】

一部の態様では、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）は、離散性のエチレンオキシドユニット（例えば、４～約４８のエチレンオキシドユニット）を含む。一部の例では、離散性エチレンオキシドユニットを含むポリアルキレンオキシドは、直鎖である。他の場合、離散性エチレンオキシドユニットを含むポリアルキレンオキシドは、分枝鎖である。

【0295】

一部の実例では、ポリマー部分Ｃは、離散性エチレンオキシドユニットを含むポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）である。場合により、ポリマー部分Ｃは、約４～約４８の間のエチレンオキシドユニットを含む。場合により、ポリマー部分Ｃは、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、または約４８のエチレンオキシドユニットを含む。

【0296】

一部の例では、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４～約４８の間のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、または約４８のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約５のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約６のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約７のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約８のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約９のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１０のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１１のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１２のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１３のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１４のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１５のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１６のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１７のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１８のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約１９のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２０のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２１のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２２のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２３のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２４のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２５のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２６のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２７のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２８のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約２９のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３０のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３１のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３２のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３３のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３４のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３５のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３６のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３７のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３８のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約３９のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４０のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４１のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４２のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４３のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４４のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４５のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４６のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４７のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。場合により、ポリマー部分Ｃは、例えば、約４８のエチレンオキシドユニットを含む離散性ＰＥＧである。

【0297】

場合により、ポリマー部分Ｃは、ｄＰＥＧ（登録商標）（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ）である。

【0298】

一部の態様では、ポリマー部分Ｃは、カチオン性粘液酸系ポリマー（ｃＭＡＰ）を含む。一部の例では、ｃＭＡＰは、少なくとも１つの繰り返しサブユニットの１つまたは複数のサブユニットを含み、サブユニット構造は、式（Ｖ）：

【0299】

【化28】

として表される。

【0300】

式中、ｍは、独立してそれぞれの出現時に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、好ましくは４～６または５であり、ｎは、独立してそれぞれの出現時に、１、２、３、４、または５である。一部の態様では、ｍとｎは、例えば約１０である。

【0301】

一部の例では、ｃＭＡＰは、ＰＥＧ部分にコンジュゲートされて、ｃＭＡＰ－ＰＥＧ共重合体、ｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマー、またはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーを生成する。一部の例では、ＰＥＧ部分は、約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの範囲にある。一部の例では、ＰＥＧ部分は、約５００Ｄａ～約１０００Ｄａ、１０００Ｄａ超～約５０００Ｄａ、５０００Ｄａ超～約１０，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ超～約２５，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ超～約５０，０００Ｄａ、またはこれらの範囲のうち２つ以上のあらゆる組合せの範囲内にある。

【0302】

一部の例では、ポリマー部分Ｃは、ｃＭＡＰ－ＰＥＧ共重合体、ｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマー、またはｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。場合により、ポリマー部分Ｃは、ｃＭＡＰ－ＰＥＧ共重合体である。他の場合、ポリマー部分Ｃは、ｍＰＥＧ－ｃＭＡＰ－ＰＥＧｍトリブロックポリマーである。さらなる場合、ポリマー部分Ｃは、ｃＭＡＰ－ＰＥＧ－ｃＭＡＰトリブロックポリマーである。

【0303】

一部の態様では、ポリマー部分Ｃは、ポリ核酸分子、結合部分、および上述のように任意選択でエンドソーム溶解性部分にコンジュゲートされる。

【0304】

エンドソーム溶解性部分または細胞膜浸透部分
一部の態様は、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｂ－Ｘ_２－Ｃの分子は、追加のコンジュゲーション部分をさらに含む。一部の例では、追加のコンジュゲーション部分は、エンドソーム溶解性部分および／または細胞膜浸透部分である。場合により、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、微小管、ペルオキシソーム、またはその他細胞を含む小胞体など、当該技術分野で公知の細胞区画のうちいずれかから放出可能な化合物といった、細胞区画放出成分（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ ｒｅｌｅａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）である。場合により、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチド、エンドソーム溶解性ポリマー、エンドソーム溶解性脂質、またはエンドソーム溶解性小分子を含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリペプチドを含む。他の場合、エンドソーム溶解性部分は、エンドソーム溶解性ポリマーを含む。場合により、細胞膜浸透部分は、細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）を含む。他の場合、細胞膜浸透部分は、細胞浸透脂質を含む。
他の場合、細胞膜浸透部分は、細胞浸透小分子を含む。

【0305】

エンドソーム溶解性ポリペプチドおよび細胞膜浸透ポリペプチド
一部の態様は、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｂ－Ｘ_２－Ｃの分子は、エンドソーム溶解性ポリペプチドによりさらにコンジュゲートされる。場合により、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ｐＨ依存性の膜活性ペプチドである。場合により、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、両親媒性ポリペプチドである。さらなる場合、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ペプチド模倣体である。一部の例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦ、メリチン、メウシン（ｍｅｕｃｉｎ）、またはそれらの対応の誘導体を含む。一部の例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦまたはその誘導体を含む。他の場合、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、メリチンまたはその誘導体を含む。さらなる場合、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、メウシンまたはその誘導体を含む。

【0306】

一部の例では、ＩＮＦ７は、２４残基ポリペプチドであり、その配列は、ＣＧＩＦＧＥＩＥＥＬＩＥＥＧＬＥＮＬＩＤＷＧＮＡ（配列番号３３１）、またはＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧＷＹＧＣ（配列番号３３２）を含む。一部の例では、ＩＮＦ７またはその誘導体は、次の配列：ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧＳＧＳＣＧ（配列番号３３３）、ＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＤＧ ＷＹＧ－（ＰＥＧ）６－ＮＨ２（配列番号３３４）、またはＧＬＦＥＡＩＥＧＦＩＥＮＧＷＥＧＭＩＷＤＹＧ－ＳＧＳＣ－Ｋ（ＧａｌＮＡｃ）２（配列番号３３５）を含む。

【0307】

場合により、メリチンは、２６残基ポリペプチドであり、その配列は、ＣＬＩＧＡＩＬＫＶＬＡＴＧＬＰＴＬＩＳＷＩＫＮＫＲＫＱ（配列番号３３６）、またはＧＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫＲＫＲＱＱ（配列番号３３７）を含む。一部の例では、メリチンは、米国特許第８，５０１，９３０号明細書に記載されるポリペプチド配列を含む。

【0308】

一部の例では、メウシンは、サソリ・メソブサス・ユーペウス（ｓｃｏｒｐｉｏｎ Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ）の毒液腺に由来する抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）である。一部の例では、メウシンは、配列ＩＦＧＡＩＡＧＬＬＫＮＩＦ－ＮＨ_２（配列番号３３８）のメウシン－１３、および配列ＦＦＧＨＬＦＫＬＡＴＫＩＩＰＳＬＦＱ（配列番号３３９）のメウシン－１８で構成される。

【0309】

一部の例では、エンドソーム溶解性ポリペプチドは、ＩＮＦ７もしくはその誘導体、メリチンもしくはその誘導体、またはメウシンもしくはその誘導体に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性である配列を有するポリペプチドを含む。一部の例では、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦ７もしくはその誘導体、メリチンもしくはその誘導体、またはメウシンもしくはその誘導体を含む。

【0310】

一部の例では、エンドソーム溶解性部分は、ＩＮＦまたはその誘導体である。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３１～３３５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３２～３３５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３１を含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３２～３３５を含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３１からなる。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３２～３３５からなる。

【0311】

一部の例では、エンドソーム溶解性部分は、メリチンまたはその誘導体である。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３６または３３７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３７に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号２８６を含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３７を含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３６からなる。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３７からなる。

【0312】

一部の例では、エンドソーム溶解性部分は、メウシンまたはその誘導体である。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３８または３３９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３８に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３９に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３８を含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３９を含む。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３８からなる。場合により、エンドソーム溶解性部分は、配列番号３３９からなる。一部の例では、エンドソーム溶解性部分は、表８に例示される配列を含む。

【0313】

【表8-1】

【0314】

【表8-2】

【0315】

場合により、エンドソーム溶解性部分は、Ｂｃｌ－２および／またはＢｃｌ－_ＸＬなどのサプレッサ標的の抑圧遺伝子の拮抗によってアポトーシスを誘導するＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。一部の例では、エンドソーム溶解性部分は、Ａｌｂａｒｒａｎらによる「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗｉｔｈ ａ ｐＨ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｃａｒｒｉｅｒ」，Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ７１：２６１～２６５頁（２０１１）に記載されるＢａｋ ＢＨ３ポリペプチドを含む。

【0316】

一部の実例では、エンドソーム溶解性部分は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１６６１５５またはＷＯ２０１５／０６９５８７に記載されるポリペプチド（例えば、細胞浸透ポリペプチド）を含む。

【0317】

エンドソーム溶解性脂質
一部の態様では、エンドソーム溶解性部分は、脂質（例えば、融合脂質）である。一部の態様は、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｂ－Ｘ_２－Ｃの分子は、エンドソーム溶解性脂質（例えば、融合脂質）によりさらにコンジュゲートされる。典型的な融合脂質として、１，２－ジレオイル－ｓｎ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－オール（Ｄｉ－Ｌｉｎ）、Ｎ－メチル（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ－ｋ－ＤＭＡ）、およびＮ－メチル－２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）エタンアミン（ＸＴＣ）が挙げられる。

【0318】

一部の例では、エンドソーム溶解性部分は、国際公開ＷＯ０９／１２６，９３３に記載の脂質（例えば、融合脂質）である。

【0319】

エンドソーム溶解性小分子
一部の態様では、エンドソーム溶解性部分は、小分子である。一部の態様は、式（Ｉ）：Ａ－Ｘ_１－Ｂ－Ｘ_２－Ｃの分子は、エンドソーム溶解性小分子によりさらにコンジュゲートされる。エンドソーム溶解性部分として好適である典型的な小分子として、キニーネ、クロロキン、水酸化クロロキン、アモジアキン（カルノキン（ｃａｒｎｏｑｕｉｎｅｓ））、アモピロキン（ａｍｏｐｙｒｏｑｕｉｎｅｓ）、プリマキン、メフロキン、ニバキン（ｎｉｖａｑｕｉｎｅｓ）、ハロファントリン、キノンイミン、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。一部の例では、キノリンエンドソーム溶解性部分として、７－クロロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン（クロロキン）、７－クロロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン（ヒドロキシクロロキン）、７－フルオロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチル－アミノ）キノリン、４－（４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（４－ジエチル－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－クロロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン（デスメチルクロロキン）、７－フルオロ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、４－（４－ジエチル－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチル－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチル－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－ジエチルアミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－フルオロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、４－（４－エチル－（２－ヒドロキシ－エチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ－）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、ヒドロキシクロロキンホスフェート７－クロロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル－１）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン（（デスメチルヒドロキシクロロキン）７－フルオロ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－ブチルアミノ）キノリン、７－クロロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－フルオロ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、７－ヒドロキシ－４－（１－カルボキシ－４－エチル－（２－ヒドロキシエチル）－アミノ－１－メチルブチルアミノ）キノリン、８－［（４－アミノペンチル）アミノ－６－メトキシジヒドロクロリドキノリン、１－アセチル－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン、８－［（４－アミノペンチル）アミノ］－６－メトキシキノリンジヒドロクロリド、１－ブチリル－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン、３－クロロ－４－（４－ヒドロキシ－アルファ，アルファ’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン、４－［（４－ジエチル－アミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン、３－フルオロ－４－（４－ヒドロキシ－アルファ，アルファ’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン，４－［（４－ジエチルアミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン、４－（４－ヒドロキシ－アルファ，アルファ’－ビス（２－メチル－１－ピロリジニル）－２，５－キシリジノキノリン、４－［（４－ジエチルアミノ）－１－メチルブチル－アミノ］－６－メトキシキノリン、３，４－ジヒドロ－１－（２Ｈ）－キノリンカルボキシアルデヒド、１，１’－ペンタメチレンジキノレイニウムジヨージド、８－キノリノールスルフェート、ならびにそれらのアミノ、アルデヒド、カルボキシル、ヒドロキシル、ハロゲン、ケト、スルフヒドリル、およびビニル誘導体、またはそれらのアナログが挙げられるが、これらに限定されない。一部の例では、エンドソーム溶解性部分は、Ｎａｉｓｂｉｔｔら（１９９７，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒａｐｙ ２８０：８８４～８９３頁）および米国特許第５，７３６，５５７号明細書に記載の小分子である。

【0320】

細胞浸透ポリペプチド（ＣＰＰ）
一部の態様では、細胞浸透ポリペプチドは、５～３０のアミノ酸を有する正に荷電された短いペプチドを含む。一部の態様では、細胞浸透ポリペプチドは、アルギニンまたはリシンリッチなアミノ酸配列を含む。一部の態様では、細胞浸透ポリペプチドは、表９に列挙されるいずれかのポリペプチドまたはそれらの組合せを含む。

【0321】

【表9】

【0322】

リンカー
一部の態様では、本明細書に記載のリンカーは、切断可能リンカーまたは切断不能リンカーである。一部の例では、リンカーは切断可能リンカーである。他の例では、リンカーは切断不能リンカーである。

【0323】

場合により、リンカーは非重合体リンカーである。非重合体リンカーは、重合プロセスによって生成されたモノマーの繰り返しユニットを含有していないリンカーを指す。典型的な非重合体リンカーとして、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル基（例えば、Ｃ_５、Ｃ_４、Ｃ_３、Ｃ_２、またはＣ_１アルキル基）、ホモ二機能性クロスリンカー、ヘテロ二機能性クロスリンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自己犠牲リンカー、マレイミド系リンカー、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。場合により、非重合体リンカーは、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル基（例えば、Ｃ_５、Ｃ_４、Ｃ_３、Ｃ_２、またはＣ_１アルキル基）、ホモ二機能性クロスリンカー、ヘテロ二機能性クロスリンカー、ペプチドリンカー、トレースレスリンカー、自己犠牲リンカー、マレイミド系リンカー、またはそれらの組合せを含む。さらなる場合、非重合体リンカーは、２つより多くの同じ種類のリンカー、例えば、２つより多くのホモ二機能性クロスリンカー、または２つより多くのペプチドリンカーを含まない。さらなる場合、非重合体リンカーは、任意選択で１つまたは複数の反応性官能基を含む。

【0324】

一部の例では、非重合体リンカーは、上述されるポリマーを包含しない。一部の例では、非重合体リンカーは、ポリマー部分Ｃによって包含されるポリマーを包含しない。場合により、非重合体リンカーは、ポリアルキレンオキシド（例えば、ＰＥＧ）を包含しない。場合により、非重合体リンカーは、ＰＥＧを包含しない。

【0325】

一部の例では、リンカーは、ホモ二機能性リンカーを含む。典型的なホモ二機能性リンカーとして、Ｌｏｍａｎｔ試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）ＤＳＰ、３，３’－ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート（ＤＴＳＳＰ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ）、ジスクシンイミジルテトラート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルテトラート（スルホＤＳＴ）、エチレングリコビス（スクシンイミジルスクシネート（ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルグルタラート（ＤＳＧ）、Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）、ジメチル－３，３’－ジチオビスプロピオンイミデ－ト（ＤＴＢＰ）、１，４－ジ－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド）ブタン（ＤＰＤＰＢ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、ハロゲン化アリール含有化合物（ＤＦＤＮＢ）、例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン、１，３－ジフルオロ－４，６－ジニトロベンゼン）、４，４’－ジフルオロ－３，３’－ジニトロフェニルスルホン（ＤＦＤＮＰＳ）、ビス－［β－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ）、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、１，４－ブタンジオールジグリシジルエーテル、アジピン酸ジヒドラジド、カルボヒドラジド、ｏ－トルイジン、３，３’－ジメチルベンジジン、ベンジジン、α，α’－ｐ－ジアミノジフェニル、ジヨード－ｐ－キシレンスルホン酸、Ｎ，Ｎ’－エチレン－ビス（ヨードアセトアミド）、またはＮ，Ｎ’－ヘキサメチレン－ビス（ヨードアセトアミド）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0326】

一部の例では、リンカーは、ヘテロ二機能性リンカーを含む。典型的なヘテロ二機能性リンカーとして、アミン反応性およびスルフヒドリルクロスリンカー、例えばＮ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ｓＰＤＰ）、長鎖Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＬＣ－ｓＰＤＰ）、水溶性長鎖Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（スルホ－ＬＣ－ｓＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルエン（ｓＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル－６－［α－メチル－α－（２－ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ－ＬＣ－ｓＭＰＴ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢｓ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＭＢｓ）、Ｎ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ｓＩＡＢ）、スルホスクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ－ｓＩＡＢ）、スクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（ｓＭＰＢ）、スルホスクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＭＰＢ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢｓ）、Ｎ－（γ－マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ－ＧＭＢ）、スクシンイミジル６－（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＸ）、スクシンイミジル６－［６－（（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサノイル）アミノ］ヘキサノエート（ｓＩＡＸＸ）、スクシンイミジル４－（（（ヨードアセチル）アミノ酸）メチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＩＡＣ）、スクシンイミジル６－（（（（４－ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン－１－カルボニル）アミノ）ヘキサノエート（ｓＩＡＣＸ）、ｐ－ニトロフェニルヨードアセテート（ＮＰＩＡ）、カルボニル反応性およびスルフヒドリル反応性クロスリンカー、例えば、４－（４－Ｎ－マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド（ＭＰＢＨ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシル－ヒドラジド－８（Ｍ_２Ｃ_２Ｈ）、３－（２－ピリジルジチオ）プロビオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、アミン反応性および光反応性クロスリンカー、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（ＮＨ－ＡｓＡ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドサリチル酸（スルホ－ＮＨ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－（４－アジドサリチルアミド）ヘキサノエート（スルホ－ＮＨｓ－ＬＣ－ＡｓＡ）、スルホスクシンイミジル－２－（ρ－アジドサリチルアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡｓＤ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（ＨｓＡＢ）、Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミジル－４－アジドベンゾエート（スルホ－ＨｓＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（ｓＡＮＰＡＨ）、スルホスクシンイミジル－６－（４’－アジド－２’－ニトロフェニルアミノ）ヘキサノエート（スルホ－ｓＡＮＰＡＨ）、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ－ＮＯ）、スルホスクシンイミジル－２－（ｍ－アジド－ｏ－ニトロベンズアミド）－エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＮＤ）、Ｎ－スクシンイミジル－４（４－アジドフェニル）１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＤＰ）、Ｎ－スルホスクシンイミジル（４－アジドフェニル）－１，３’－ジチオプロピオネート（スルホ－ｓＡＤＰ）、スルホスクシンイミジル４－（ρ－アジドフェニル）ブチレート（スルホ－ｓＡＰＢ）、スルホスクシンイミジル２－（７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセトアミド）エチル－１，３’－ジチオプロピオネート（ｓＡＥＤ）、スルホスクシンイミジル７－アジド－４－メチルクマリン－３－アセテート（スルホ－ｓＡＭＣＡ）、ρ－ニトロフェニルジアゾピルベート（ρＮＰＤＰ）、ρ－ニトロフェニル－２－ジアゾ－３，３，３－トリフルオロプロピオネート（ＰＮＰ－ＤＴＰ）、スルフヒドリル反応性および光反応性クロスリンカー、例えば、１－（ρ－アジドサリチルアミド）－４－（ヨードアセトアミド）ブタン（ＡｓＩＢ）、Ｎ－［４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチル］－３’－（２’－ピリジルジチオ）プロピオンアミド（ＡＰＤＰ）、ベンゾフェノン－４－ヨードアセトアミド、ベンゾフェノン－４－マレイミドカルボニル反応性および光反応性クロスリンカー、例えば、ρ－アジドベンゾイルヒドラジド（ＡＢＨ）、カルボキシレート反応性および光反応性クロスリンカー、例えば、４－（ρ－アジドサリチルアミド）ブチルアミン（ＡｓＢＡ）、ならびにアルギニン反応性および光反応性クロスリンカー、例えば、ρ－アジドフェニルグリオキサール（ＡＰＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0327】

一部の例では、リンカーは、反応性官能基を含む。場合により、反応性官能基は、結合部分上に存在する求電子基に反応的な求核基を含む。典型的な求電子基は、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、エノン、ハロゲン化アシル、または酸無水物などのカルボニル基を含む。一部の態様では、反応性官能基はアルデヒドである。典型的な求核基は、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドを含む。

【0328】

一部の例では、リンカーは、マレイミド基を含む。一部の例では、マレイミド基は、マレイミドスペーサとも称される。一部の例では、マレイミド基は、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を形成するカプロン酸をさらに包含する。場合により、リンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）を含む。場合により、リンカーは、マレイミドカプロイル（ｍｃ）である。他の例では、マレイミド基は、上述されるスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ｓＭＣＣ）またはスルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ｓＭＣＣ）などのマレイミドメチル基を含む。

【0329】

一部の態様では、マレイミド基は、自己安定化マレイミドである。一部の例では、自己安定化マレイミドは、マレイミドに隣接する塩基性アミノ基を組み込んでチオスクシンイミド環加水分解の分子内触媒を提供することによって、マレイミドがｒｅｔｒｏ－Ｍｉｃｈａｅｌ反応による脱離反応を受けないようにするために、ジアミノプロピオン酸（ＤＰＲ）を利用する。一部の例では、自己安定化マレイミドは、Ｌｙｏｎらによる「Ｓｅｌｆ－ｈｙｄｒｏｌｙｚｉｎｇ ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ」，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２（１０）：１０５９～１０６２頁（２０１４）に記載されるマレイミド基である。一部の例では、リンカーは、自己安定化マレイミドを含む。一部の例では、リンカーは、自己安定化マレイミドである。

【0330】

一部の例では、リンカーは、ペプチド部分を含む。一部の例では、ペプチド部分は、少なくとも２、３、４、５、または６つより多くのアミノ酸残基を含む。一部の例では、ペプチド部分は、最大２、３、４、５、６、７、または８つのアミノ酸残基を含む。一部の例では、ペプチド部分は、約２、約３、約４、約５、または約６つのアミノ酸残基を含む。一部の例では、ペプチド部分は、（例えば、酵素的または化学的に）切断可能なペプチド部分である。一部の例では、ペプチド部分は、切断不能なペプチド部分である。一部の例では、ペプチド部分は、Ｖａｌ－Ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ（配列番号２９４２２３）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（配列番号２９４２２４）、またはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（配列番号２９４２２５）を含む。一部の例では、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ（バリン－シトルリン）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ（配列番号２９４２２３）、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ｌｙｓ、Ｖａｌ－Ａｒｇ、Ｐｈｅ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｒｇ、Ｌｅｕ－Ｃｉｔ、Ｉｌｅ－Ｃｉｔ、Ｔｒｐ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ａｌａ、Ａｌａ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－Ｌｅｕ（配列番号２９４２２４）、またはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ（配列番号２９４２２５）などのペプチド部分を含む。場合により、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔを含む。場合により、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔである。

【0331】

一部の態様では、リンカーは、安息香酸基またはその誘導体を含む。一部の例では、安息香酸基またはその誘導体は、パラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）を含む。一部の例では、安息香酸基またはその誘導体は、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を含む。

【0332】

一部の態様では、リンカーは、マレイミド基、ペプチド部分、および／もしくは安息香酸基のうち１つまたは複数をあらゆる組合せで含む。一部の態様では、リンカーは、マレイミド基、ペプチド部分、および／または安息香酸基の組合せを含む。一部の例では、マレイミド基は、マレイミドカプロイル（ｍｃ）である。一部の例では、ペプチド基は、ｖａｌ－ｃｉｔである。一部の例では、安息香酸基は、ＰＡＢＡである。一部の例では、リンカーは、ｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ基を含む。場合により、リンカーは、ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。さらなる場合、リンカーは、ｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。

【0333】

一部の態様では、リンカーは、自己犠牲リンカーまたは自己排泄リンカーである。場合により、リンカーは、自己犠牲リンカーである。他の場合、リンカーは、自己排泄リンカー（例えば、環化自己排泄リンカー）である。一部の例では、リンカーは、米国特許第９，０８９，６１４号明細書またはＰＣＴ公開ＷＯ２０１５０３８４２６に記載されるリンカーを含む。

【0334】

一部の例では、リンカーは、樹状型リンカーである。一部の例では、樹木型リンカーは、分枝状の多官能性リンカー部分を含む。一部の例では、樹状型リンカーは、ポリヌクレオチドＢと結合部分Ａとのモル比を増加させるために使用される。一部の例では、樹木型リンカーは、ＰＡＭＡＭデンドリマーを含む。

【0335】

一部の態様では、リンカーは、トレースレスリンカーであるか、または、切断後に結合部分Ａ、ポリヌクレオチドＢ、ポリマーＣ、またはエンドソーム溶解性部分Ｄに対してリンカー部分（例えば、原子基またはリンカー基）を残さないリンカーである。典型的なトレースレスリンカーとして、ゲルマニウムリンカー、ケイ素リンカー、硫黄リンカー、セレンリンカー、窒素リンカー、リンリンカー、ホウ素リンカー、クロムリンカー、またはフェニルヒドラジドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。場合により、リンカーは、Ｈｅｊｅｓｅｎらによる「Ａ ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ａｒｙｌ－ｔｒｉａｚｅｎｅ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ １１（１５）：２４９３～２４９７頁（２０１３）に記載される、トレースレスのアリール－トリアゼンリンカーである。一部の例では、リンカーは、Ｂｌａｎｅｙらによる「Ｔｒａｃｅｌｅｓｓ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：２６０７～２０２４頁（２００２）に記載されるトレースレスリンカーである。一部の例では、リンカーは、米国特許第６，８２１，７８３号明細書に記載されるトレースレスリンカーである。

【0336】

一部の例では、リンカーは、米国特許第６，８８４，８６９号明細書、同第７，４９８，２９８号明細書、同第８，２８８，３５２号明細書、同第８，６０９，１０５号明細書、もしくは同第８，６９７，６８８号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０１２７２３９号明細書、同第２０１３／０２８９１９号明細書、同第２０１４／２８６９７０号明細書、同第２０１３／０３０９２５６号明細書、同第２０１５／０３７３６０号明細書、もしくは同第２０１４／０２９４８５１号明細書、またはＰＣＴ公開ＷＯ２０１５０５７６９９、ＷＯ２０１４０８０２５１、ＷＯ２０１４１９７８５４、ＷＯ２０１４１４５０９０、もしくはＷＯ２０１４１７７０４２に記載されるリンカーである。

【0337】

一部の態様では、Ｘ_１とＸ_２は、それぞれ独立して、結合または非重合体リンカーである。一部の例では、Ｘ_１とＸ_２は、それぞれ独立して、結合である。場合により、Ｘ_１とＸ_２は、それぞれ独立して、非重合体リンカーである。

【0338】

一部の例では、Ｘ_１は、結合または非重合体リンカーである。一部の例では、Ｘ_１は結合である。一部の例では、Ｘ_１は非重合体リンカーである。一部の例では、リンカーはＣ_１－Ｃ_６アルキル基である。場合により、Ｘ_１は、例えばＣ_５、Ｃ_４、Ｃ_３、Ｃ_２、またはＣ_１アルキル基などのＣ_１－Ｃ_６アルキル基である。場合により、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル基は、非置換のＣ_１－Ｃ_６アルキル基である。リンカーの文脈、具体的にはＸ_１の文脈で使用されるように、アルキルは、最大６つの炭素原子を含有する飽和した直鎖または分枝鎖の炭化水素ラジカルを意味する。一部の例では、Ｘ_１は、上述のホモ二機能性リンカーまたはヘテロ二機能性リンカーを含む。場合により、Ｘ_１は、ヘテロ二機能性リンカーを含む。場合により、Ｘ_１は、ｓＭＣＣを含む。他の例では、Ｘ_１は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル基に任意選択でコンジュゲートされたヘテロ二機能性リンカーを含む。他の例では、Ｘ_１は、Ｃ_１－Ｃ_６アルキル基に任意選択でコンジュゲートされたｓＭＣＣを含む。さらなる例では、Ｘ_１は、上述のホモ二機能性リンカーまたはヘテロ二機能性リンカーを含まない。

【0339】

一部の例では、Ｘ_２は、結合または非重合体リンカーである。一部の例では、Ｘ_２は結合である。他の場合、Ｘ_２はリンカーである。さらなる場合、Ｘ_２は非重合体リンカーである。一部の態様では、Ｘ_１はＣ_１－Ｃ_６アルキル基である。一部の例では、Ｘ_２は、上述のホモ二機能性リンカーまたはヘテロ二機能性リンカーを含む。一部の例では、Ｘ_２は、上述のホモ二機能性リンカーである。一部の例では、Ｘ_２は、上述のヘテロ二機能性リンカーである。一部の例では、Ｘ_２は、上述のマレイミドカプロイル（ｍｃ）や自己安定化マレイミド基などのマレイミド基を含む。一部の例では、Ｘ_２は、Ｖａｌ－Ｃｉｔなどのペプチド部分を含む。一部の例では、Ｘ_２は、ＰＡＢＡなどの安息香酸基を含む。さらなる例では、Ｘ_２は、マレイミド基、ペプチド部分、および／または安息香酸基の組合せを含む。さらなる例では、Ｘ_２は、ｍｃ基を含む。さらなる例では、Ｘ_２は、ｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ基を含む。さらなる例では、Ｘ_２は、ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。さらなる例では、Ｘ_２は、ｍｃ－ｖａｌ－ｃｉｔ－ＰＡＢＡ基を含む。

【0340】

使用方法
筋萎縮症は、筋肉質量の損失、ならびに／または筋肉の進行性の衰弱および退化を指す。場合により、筋肉質量の損失、ならびに／または筋肉の進行性の衰弱および退化は、高いタンパク質分解速度、低いタンパク質合成速度、またはその両方の組合せにより生じる。場合により、高い筋蛋白質分解速度は、筋蛋白質の異化作用（すなわち、糖新生の基質としてアミノ酸を使用するための筋蛋白質の崩壊）による。

【0341】

一実施形態では、筋萎縮症は、筋力の相当な損失を指す。筋力の相当な損失とは、対照となる対象の同じ筋組織と比較して、対象の罹患したか、損傷したか、または未使用の筋組織の強度の低下を意味する。一実施形態では、筋力の相当な損害は、対照となる対象の同じ筋組織と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％以上の強度の低下である。別の実施形態では、筋力の相当な損失とは、使用不能期間の前の同対象の同じ筋組織の筋力と比較して、未使用の筋組織の強度の低下を意味する。一実施形態では、筋力の相当な損害は、使用不能期間の前の同対象の同じ筋組織の筋力と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％以上の強度の低下である。

【0342】

別の実施形態では、筋萎縮症は、筋肉質量の相当な損失を指す。筋肉質量の相当な損失とは、対照となる対象の同じ筋組織と比較して、対象の罹患したか、損傷したか、または未使用の筋組織の筋肉量の低下を意味する。一実施形態では、筋肉量の相当な損害は、対照となる対象の同じ筋組織と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％以上の強度の低下である。別の実施形態では、筋肉質量の相当な損失とは、使用不能期間の前の同対象の同じ筋組織の筋肉量と比較して、未使用の筋組織の筋肉量の低下を意味する。一実施形態では、筋組織の相当な損害は、使用不能期間の前の同対象の同じ筋組織の筋肉量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％以上の強度の低下である。筋肉量は、（例えば、筋肉量／断面積（ＣＳＡ）ＭＲＩ方法による）磁気共鳴画像などによって、筋肉の断面積を評価することによって任意選択で測定される。

【0343】

一部の態様では、本明細書には、対象の筋萎縮症を処置する方法であって、本明細書に記載のポリ核酸分子を得る工程と、ヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物の量を低減するために本明細書に記載のポリ核酸分子または本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲートを治療有効量で対象に投与する工程戸を含む、方法が記載される。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号４１２～４２０または配列番号４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンスは、配列番号４１２～４２０または４３０～４３８から選択される配列と同一である。一部の態様では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である。一部の実施形態では、ポリ核酸分子はセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と同一である。

【0344】

一部の例では、筋萎縮症は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）と関連付けられる。ポリ核酸部分は、対象の筋萎縮症を調節するように、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介する。一部の態様では、ＤＵＸ４発現による影響を受ける１つまたは複数のマーカ遺伝子の発現も、ヒトＤＵＸ４の発現低下によって改質または調節される（例えば、低下する）。マーカ遺伝子として、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＬＥＵＴＸ、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤが挙げられるが、これらに限定されない。一部の態様では、１つまたは複数のマーカ遺伝子の発現は、未処置の細胞と比較して少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％低下する。一部の態様では、基または複合体としての１つまたは複数のマーカ遺伝子の発現は、未処置の細胞と比較して少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％低下する。

【0345】

一部の態様では、本明細書には、対象の筋萎縮症を処置する方法であって、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲートを得る工程と、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲートを治療有効量で対象に投与する工程と、対象のヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程とを含む、方法が記載される。一部の例では、筋萎縮症は、ＦＳＨＤと関連付けられる。ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲートは、対象の筋萎縮症を処置するようにヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介し、本明細書に記載のｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲートを治療有効量で対象に投与すること、および対象のヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させることが含まれる。

【0346】

一部の態様では、本明細書には、対象の筋萎縮症を処置する方法であって、本明細書に記載のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲート（ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－コンジュゲートまたはＤＵＸ４－ＡＯＣ）を得る工程と、本明細書に記載のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲートを治療有効量で対象に投与する工程と、対象のヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程とを含む、方法が記載される。一部の例では、筋萎縮症は、ＦＳＨＤと関連付けられる。ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲートは、対象の筋萎縮症を処置するようにヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介し、本明細書に記載のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲートを治療有効量で対象に投与すること、および対象のヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させることが含まれる。

【0347】

一部の態様では、本明細書には、対象のＦＳＨＤを処置する方法であって、本明細書に記載のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲート（ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－コンジュゲートまたはＤＵＸ４－ＡＯＣ）を得る工程と、本明細書に記載のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲートを治療有効量で対象に投与する工程と、対象のヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程とを含む、方法が記載される。一部の例では、ＦＳＨＤは、ＦＳＨＤ １型（ＦＳＨＤ１）である。一部の例では、ＦＳＨＤは、ＦＳＨＤ ２型（ＦＳＨＤ２）である。ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲートは、対象のＦＳＨＤを処置するようにヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介し、本明細書に記載のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲートを治療有効量で対象に投与すること、および対象のヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させることが含まれる。一部の態様では、ＤＵＸ４発現による影響を受ける１つまたは複数のマーカ遺伝子の発現レベルも、ヒトＤＵＸ４の発現レベル低下によって改質または調節される（例えば、低下する）。ＤＵＸ４バイオマーカ遺伝子として、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＬＥＵＴＸ、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤが挙げられるが、これらに限定されない。

【0348】

一部の態様では、本明細書には、ＦＳＨＤ対象の症状を軽減する方法であって、本明細書に記載のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲート（ＤＵＸ４－ｓｉＲＮＡ－コンジュゲートまたはＤＵＸ４－ＡＯＣ）を得る工程と、対象のヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させることによって本明細書に記載のｓｉＲＮＡコンジュゲートを治療有効量で対象に投与する工程とを含む、方法が記載される。一部の例では、ＦＳＨＤは、ＦＳＨＤ １型（ＦＳＨＤ１）である。一部の例では、ＦＳＨＤは、ＦＳＨＤ ２型（ＦＳＨＤ２）である。別の態様では、本明細書には、ＦＳＨＤ患者の症状を軽減する方法であって、本明細書に記載のｓｉＲＮＡコンジュゲートを得る工程と、ヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させるかＤＵＸ４タンパク質のレベルを低下させることによって本明細書に記載のｓｉＲＮＡコンジュゲートを治療有効量でＦＳＨＤ患者に投与する工程とを含む、方法が記載される。

【0349】

一部の例では、ＦＳＨＤの症状は、骨格筋に影響を及ぼす。ＦＳＨＤが影響を及ぼす骨格筋には、眼および口の周囲の筋肉、肩の筋肉、上腕の筋肉、下脚の筋肉、腹筋、ならびに臀部の筋肉が挙げられる。一部の例では、ＦＳＨＤの症状は、視力と聴力にも影響を及ぼす。一部の例では、ＦＳＨＤの症状は、心臓または肺の機能にも影響を及ぼす。一部の実例では、ＦＳＨＤの症状として、筋衰弱、筋萎縮症、筋ジストロフィー、疼痛炎症、痙縮、側弯症、脊柱前弯症、低換気、網膜異常、角膜炎への曝露、軽度の聴力損失、およびＥＭＧ異常が挙げられる。

【0350】

一部の態様では、本明細書には、ＦＳＨＤ患者の骨格筋機能を改善する方法であって、ヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させるかＤＵＸ４タンパク質のレベルを低下させることによって本明細書に記載のｓｉＲＮＡコンジュゲートを治療有効量でＦＳＨＤ患者に投与する工程を含む、方法が記載される。一部の例では、ＦＳＨＤは、ＦＳＨＤ １型（ＦＳＨＤ１）である。一部の例では、ＦＳＨＤ ２型である。一部の態様では、本明細書には、ＦＳＨＤを患う患者の骨格筋機能、視力、張力、心臓機能、または肺機能を改善する方法であって、ヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させるかＤＵＸ４タンパク質のレベルを低下させることによって本明細書に記載のｓｉＲＮＡコンジュゲートを治療有効量でＦＳＨＤ患者に投与する工程を含む、方法が記載される。

【0351】

一部の態様では、本明細書には、対象のＦＳＨＤを処置する方法であって、本明細書に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）抗体コンジュゲートを得る工程と、本明細書に記載のＡＳＯ－抗体コンジュゲートを治療有効量で対象に投与する工程と、対象のヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させる工程とを含む、方法が記載される。一部の例では、ＦＳＨＤは、ＦＳＨＤ １型（ＦＳＨＤ１）である。一部の例では、ＦＳＨＤ ２型である。ＡＳＯ－抗体コンジュゲートは、対象のＦＳＨＤを処置するようにヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉を媒介し、本明細書に記載のＡＳＯ－抗体コンジュゲートを治療有効量で対象に投与すること、および対象のヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物のレベルを低下させることが含まれる。一部の態様では、ＤＵＸ４発現による影響を受ける１つまたは複数のマーカ遺伝子の発現レベルも、ヒトＤＵＸ４の発現レベル低下によって改質または調節される。ＤＵＸ４バイオマーカ遺伝子として、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＬＥＵＴＸ、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤが挙げられるが、これらに限定されない。

【0352】

一部の態様では、本明細書には、対象のＦＳＨＤを処置する方法が記載される。一部の例では、ＦＳＨＤ対象は、ＦＳＨＤ１を患う。他の例では、ＦＳＨＤ対象は、ＦＳＨＤ２を患う。別の実施形態では、ＦＳＨＤ対象は、染色体４の長腕のＤ４Ｚ４領域における遺伝的および後成的な分子変化によって生じる、ＤＵＸ４タンパク質を異常発現する筋細胞を有する。筋細胞における遺伝的な分子変化は、ＦＳＨＤ対象の染色体４の通常１１～１００の繰返しに代わり１～１０の繰返しを含有するＤ４Ｚ４領域部位の縮小をもたらす突然変異である、筋細胞における後成的な分子変化は、ＦＳＨＤ対象の染色体４のＤ４Ｚ４領域の部位の低メチル化をもたらす変化である。一部の例では、筋細胞は、骨格筋細胞である。

【0353】

医薬製剤
一部の態様では、本明細書に記載の医薬製剤は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）、経口、鼻腔内、直腸、または経皮の投与経路を含むがこれらに限定されない、多数の投与経路によって対象に投与される。一部の例では、本明細書に記載の医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内か、鞘内、脳内、脳室内、または頭蓋内）投与のために製剤化される。他の例では、本明細書に記載の医薬組成物は、経口投与のために製剤化される。また他の例では、本明細書に記載の医薬組成物は、鼻腔内投与のために製剤化される。

【0354】

一部の態様では、医薬製剤として、水性液体分散体、自己乳化分散体、固溶体、リポソーム分散体、エアロゾル、固形剤形、散剤、即時放出製剤、制御放出製剤、速溶製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、多重微粒子製剤（例えば、ナノ粒子製剤）、および即時放出・制御放出の混合型製剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0355】

一部の例では、医薬製剤は、多重微粒子製剤を含む。一部の例では、医薬製剤は、ナノ粒子製剤を含む。一部の例では、ナノ粒子は、ｃＭＡＰ、シクロデキストリン、または脂質を含む。場合により、ナノ粒子は、固形の脂質ナノ粒子、重合体ナノ粒子、自己乳化ナノ粒子、リポソーム、マイクロエマルジョン、またはミセル溶液を含む。さらなる典型的なナノ粒子として、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合的に付着した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバ、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、および量子ドットが挙げられるが、これらに限定されない。一部の例では、ナノ粒子は、金属ナノ粒子、例えば、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、ガドリニウム、アルミニウム、ガリウム、インジウム、スズ、タリウム、鉛、ビスマス、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ホウ素、シリコン、リン、ゲルマニウム、ヒ素、アンチモン、およびそれらの組合せ、合金、または酸化物である。

【0356】

一部の例では、ナノ粒子は、コアを含むか、またはコア－シェルナノ粒子のようにコアとシェルを含む。

【0357】

一部の例では、ナノ粒子は、（例えば、本明細書に記載のポリ核酸分子または結合部分のうち１つまたは複数との）機能要素の結合のための分子によってさらにコーティングされる。一部の例では、コーティングは、硫酸コンドロイチン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラギーナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤゴム、ゲランガム、キサンタンガム、ヒアルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、キチン（もしくはキトサン）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、チトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノゲン、α－キモトリプシン、ポリリシン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、オバルブミン、またはデキストリンもしくはシクロデキストリンを含む。一部の例では、ナノ粒子は、グラフェンをコーティングされたナノ粒子を含む。

【0358】

場合により、ナノ粒子は、約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、または１００ｎｍ未満のうち少なくとも１つの寸法を有する。

【0359】

一部の態様では、ナノ粒子製剤は、常磁性ナノ粒子、超常磁性ナノ粒子、金属ナノ粒子、フラーレン様材料、無機ナノチューブ、デンドリマー（共有結合的に付着した金属キレートを有するものなど）、ナノファイバ、ナノホーン、ナノオニオン、ナノロッド、ナノロープ、または量子ドットを含む。一部の例では、本明細書に記載のポリ核酸分子または結合部分は、ナノ粒子に直接または間接的にコンジュゲートされる。一部の例では、少なくとも１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００以上の本明細書に記載のポリ核酸分子または結合部分が、ナノ粒子に直接または間接的にコンジュゲートされる。

【0360】

一部の態様では、医薬製剤は、送達ベクター、例えば組換えベクター、すなわち細胞へのポリ核酸分子の送達を含む。一部の例では、組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドである。他の例では、組換えベクターは、ウイルスベクターである。典型的なウイルスベクターとして、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに由来するベクターが挙げられる。一部の例では、ポリ核酸分子を発現可能な組換えベクターは、標的細胞の安定した発現をもたらす。さらなる例では、ポリ核酸分子の一時的な発現をもたらすウイルスベクターが使用される。

【0361】

一部の態様では、医薬製剤は、本明細書に開示される組成物との適合性、および所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択された、担体または担体材料を含む。典型的な担体材料として、例えば、結合剤、懸濁化剤、作用薬、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤などが挙げられる。薬学的に適合性のある担体材料として、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、バクガデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼインナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスホチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸水素二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖ナトリウムステアロイルラクチレート（ｓｕｇａｒｓ ｓｏｄｉｕｍ ｓｔｅａｒｏｙｌ ｌａｃｔｙｌａｔｅ）、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、α化デンプンなどが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）、Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，ペンシルバニア州イーストン，１９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．編，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，ニューヨーク州ニューヨーク，１９８０、およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ第７版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）を参照されたい。

【0362】

一部の例では、医薬製剤は、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および塩酸などの酸を含む、ｐＨ調整剤または緩衝化剤；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリス－ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基；ならびにシトラート／デキストロース、炭酸水素ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝液をさらに含む。このような酸、塩基、および緩衝液は、組成物のｐＨを許容範囲で維持するのに必要な量で含まれる。

【0363】

一部の例では、医薬製剤は、組成物のオスモル濃度を許容範囲とするのに必要な量の１つまたは複数の塩を含む。かかる塩として、ナトリウム、カリウムもしくはアンモニウム陽イオンおよびクロリド、シトラート、アスコルベート、ボレート、ホスフェート、ビカーボネート、スルフェート、チオスルフェート、またはバイサルファイト陰イオンを有するものが挙げられ、好適な塩として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、および硫酸アンモニウムが挙げられる。

【0364】

一部の例では、医薬製剤は、より安定した環境を提供することから、化合物を安定させるために使用される希釈剤をさらに含む。（ｐＨの制御または維持も行う）緩衝液に溶解した塩は、リン酸緩衝生理食塩水を含むがこれらに限定されない当該技術分野における希釈剤として利用される。特定の例では、希釈剤は、圧縮を容易にするか、またはカプセル充填のために均質な混合を行う十分な容積を作り出すために、に組成物の容積を増加させる。かかる化合物として、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの微結晶性セルロース；第二リン酸カルシウム、リン酸カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；Ｄｉ－Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などのα化デンプン、圧縮可能な糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、スクロース系希釈剤、粉糖；第一硫酸カルシウム一水和物（ｍｏｎｏｂａｓｉｃ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ）、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート；加水分解されたシリアル固形物（ｃｅｒｅａｌ ｓｏｌｉｄｓ）、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどが挙げられる。

【0365】

場合により、医薬製剤は、物質の崩壊または分解を容易にするための崩壊薬剤または崩壊剤を含む。「崩壊する」という用語は、胃腸液と接触すると剤形が溶解および分散することの両方を含む。崩壊薬剤の例として、デンプン、例えば、トウモロコシデンプンやジャガイモデンプンなどの天然デンプン、Ｎａｔｉｏｎａｌ １５５１やＡｍｉｊｅｌ（登録商標）などのα化デンプン、またはＰｒｏｍｏｇｅｌ（登録商標）やＥｘｐｌｏｔａｂ（登録商標）などのナトリウムデンプングリコレート、木製品などのセルロース、メチル結晶セルロース、例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０１、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＨ１０５、Ｅｌｃｅｍａ（登録商標）Ｐ１００、Ｅｍｃｏｃｅｌ（登録商標）、Ｖｉｖａｃｅｌ（登録商標）、Ｍｉｎｇ Ｔｉａ（登録商標）、およびＳｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ（登録商標）、メチルセルロース、クロスカルメロース、または架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（Ａｃ－Ｄｉ－Ｓｏｌ（登録商標））、架橋カルボキシメチルセルロース、もしくは架橋クロスカルメロースなどの架橋セルロース、ナトリウムデンプングリコレートなどの架橋デンプン、クロスポビドンなどの架橋ポリマー、架橋ポリビニルピロリドン、アルギン酸などのアルギネートもしくはアルギン酸ナトリウムなどのアルギン酸塩、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）ＨＶ（ケイ酸アルミニウムマグネシウム）などの粘土、寒天、グアーガム、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、もしくはトラガントなどのガム、ナトリウムデンプングリコレート、ベントナイト、天然スポンジ、界面活性剤、陽イオン交換樹脂などの樹脂、柑橘類の果肉、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン配合物中のラウリル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。

【0366】

一部の例では、医薬製剤は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストレート、デキストラン、デンプン、α化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの充填剤を含む。

【0367】

材料の付着もしくは摩擦を防止、低減、または阻害するために、滑沢剤および流動促進剤も任意選択で本明細書に記載の医薬製剤に含まれる。典型的な滑沢剤として、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱油などの炭化水素、または水添大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水添植物油、高級脂肪酸ならびにそのアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、例えば、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ろう、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ－４０００）、またはＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）などのコロイド状シリカ、Ｃａｂ－Ｏ－Ｓｉｌ（登録商標）、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーンオイル、界面活性剤などが挙げられる。

【0368】

可塑剤は、脆くなりすぎないようにマイクロカプセル化材料またはフィルム・コーティングを軟化させるために使用される化合物を含む。好適な可塑剤として、例えば、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３３５０、およびＰＥＧ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、ならびにトリアセチンが挙げられる。可塑剤はまた、分散剤または湿潤剤としても機能する。

【0369】

可溶化剤は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ－メチルピロリドン、Ｎ－ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ－ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁酸塩、ポリエチレングリコール２００～６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。

【0370】

安定剤は、あらゆる抗酸化剤、緩衝液、酸、防腐剤などの化合物を含む。

【0371】

懸濁化剤は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、もしくはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／ビニルアセテート共重合体（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール、例えば、約３００～約６０００、約３３５０～約４０００、もしくは約７０００～約５４００の分子量を有するポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アセテートステアレート、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ガム、例えば、トラガカントガムやアラビアガム、グアーガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、セルロース化合物、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドンなどの化合物を含む。

【0372】

界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート、Ｔｗｅｅｎ６０もしくは８０、トリアセチン、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、ソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリソルベート、ポロクサマー、胆汁酸塩、モノステアリン酸グリセリン、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとの共重合体、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。追加の界面活性剤として、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド、および植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水添ヒマシ油、ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０が挙げられる。時折、界面活性剤は、物理的安定性の向上またはその他の目的のために含まれる。

【0373】

粘度増強剤として、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギネート、アカシア、キトサン、およびそれらの組合せが挙げられる。

【0374】

湿潤剤として、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレアート、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ナトリウムドクセート、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ８０、ビタミンＥ ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物が挙げられる。

【0375】

治療レジメン
一部の態様では、本明細書に記載の医薬組成物は、治療用途のために投与される。一部の態様では、医薬組成物は、１日１回、１日２回、１日３回以上投与される。医薬組成物は、毎日（ｄａｉｌｙ）、毎日（ｅｖｅｒｙ ｄａｙ）、隔日、週５日、週１回、隔週、月２週、月３週、月１回、月２回、月３回、２か月に１回、３か月に１回、４か月に１回、５か月に１回、６か月に１回以上投与される。医薬組成物は、少なくとも１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、１２か月、１８か月、２年、３年以上にわたり投与される。

【0376】

一部の態様では、１つまたは複数の医薬組成物が、同時に、連続して、または間隔を空けて投与される。一部の態様では、１つまたは複数の医薬組成物は、同時に投与される。場合により、１つまたは複数の医薬組成物は、連続して投与される。さらなる場合、１つまたは複数の医薬組成物は、間隔を空けて投与される（例えば、第１の医薬組成物が１日目に投与され、その後に少なくとも１、２、３、４、５日以上の間隔を空けてから、少なくとも第２の医薬組成物が投与される）。

【0377】

一部の態様では、２つ以上の異なる医薬組成物が、共投与される。一部の例では、２つ以上の異なる医薬組成物は、同時に共投与される。場合により、２つ以上の異なる医薬組成物は、投与間の時間にずれが生じることなく連続して共投与される。他の場合、２つ以上の異なる医薬組成物は、投与間に約０．５時間、１時間、２時間、３時間、１２時間、１日、２日、またはそれより多くのずれを伴って連続して共投与される。

【0378】

患者の状態が改善する場合に、医師の裁量に基づき組成物の投与は連続して行われる。代替的に、投与されている組成物の用量は、特定期間にわたり一時的に低減されるか、または一時的に中止される（すなわち、「休薬日」）。一部の例では、休薬日の長さは、ほんの一例として、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、１５日、２０日、２８日、３５日、５０日、７０日、１００日、１２０日、１５０日、１８０日、２００日、２５０日、２８０日、３００日、３２０日、３５０日、または３６５日を含め、２日～１年の間で変動する。休薬日中の用量の低減は、ほんの一例として、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を含め、１０％～１００％である。

【0379】

一旦患者の状態が改善すると、必要に応じて維持用量が投与される。続いて、投与量もしくは投与頻度、またはその両方は、症状に応じて、疾患、障害、または疾病の改善が保持されるレベルにまで低減され得る。

【0380】

一部の態様では、このような量に相当する所与の薬剤の量は、特定の化合物、疾患の重症度、処置を必要とする対象または宿主の同一性（例えば、体重、性別）などの因子に依拠して変動するが、それにもかかわらず、例えば、投与される特定の薬剤、投与経路、処置される疾病、および処置される対象または宿主を含む症例を取り囲む特定の状況に応じて、当該技術分野で公知の方法で慣例的に決定される。一部の例では、所望の用量は、単回用量で、または、同時投与される（すなわち短期間にわたり）かもしくは例えば１日２回、３回、４回以上のサブ用量として適切な間隔で投与される分割用量として、都合良く提供される。

【0381】

個々の処置レジメンに関する変動の数が大きく、これら推奨値からの大幅な偏移は珍しくないことから、先述の範囲は単に示唆的なものである。このような投与量は、使用される化合物の活性、処置対象である疾患または疾病、投与形態、個々の対象の要件、処置される疾患または疾病の重症度、および医療従事者の判断を含むがこれらに限定されない多くの変数に依拠して変更される。

【0382】

一部の態様では、このような治療レジメンの毒性および治療有効性は、ＬＤ５０（個体群の５０％が死に至る用量）およびＥＤ５０（個体群の５０％に治療上有効な用量）の決定を含むがこれらに限定されない、細胞培養または実験動物における標準の医薬手順によって決定される。毒性と治療効果との用量比は治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０との比として表される。高い治療指数を示す化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトに対する使用のための投与量範囲を製剤化するのに使用される。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性が最小限のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、採用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動する。

【0383】

キット／製造品
本明細書中の特定の態様では、本明細書に記載の組成物および方法のうち１つまたは複数とともに使用するための、キットおよび製造品が開示される。かかるキットは、バイアルやチューブなど１つまたは複数の容器を受けるように区画化された運搬体、パッケージ、または容器を備えており、容器のそれぞれは、本明細書に記載の方法に使用されることになる別個の要素のうち１つを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、試験管が挙げられる。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成される。

【0384】

本明細書で提供される製造品は、製造は包装材料を包含する。医薬品パッケージ材料の例として、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、ならびに、選択された製剤、意図した投与形態、および処置に好適なあらゆる包装材料が挙げられるが、これらに限定されない。

【0385】

例えば容器は、本明細書に記載の標的核酸分子を含む。かかるキットは、本明細書に記載の方法における使用に関連する識別表示、ラベル、または指示書を含む。

【0386】

キットは、典型的に内容物を列挙するラベルおよび／または使用説明書、ならびに使用説明書を伴う添付文書を含む。典型的には一組の指示書も含まれる。

【0387】

一実施形態では、ラベルは容器の上にあるか、またはそれに付随する。一実施形態では、ラベルを形成する文字、数字、または他の字が容器自体に付けられるか、成型されるか、またはエッチングされる場合、ラベルは容器の上にある。例えば添付文書として容器を保持するレセプタクルまたは運搬体に存在する場合、ラベルは容器に付随する。一実施形態では、ラベルは、内容物が特定の治療用途のために使用されるものであることを示すために使用される。ラベルはまた、本明細書に記載の方法などにおける内容物の使用に関する指示を示す。

【0388】

特定の態様では、医薬組成物は、本明細書で提供される化合物を含有する１つまたは複数の単位剤形を包含する、パックまたはディスペンサ中で提供される。例えばブリスターパックなどのパックは、金属箔またはプラスチック箔を含有する。一実施形態では、パックまたはディスペンサには、投与の指示書が付随する。一実施形態では、パックまたはディスペンサにはまた、医薬品の製造、使用、または販売を規制する政府機関が規定する形式で容器に取り付けられる通知書も付随し、この通知書は、ヒトまたは動物への投与のための薬物の形態に関する機関の承認を反映している。かかる通知書は、例えば、処方箋に関して米国食品医薬品局が承認するラベル、または承認済みの製品添付文書（ａｐｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｓｅｒｔ）である。一実施形態では、互換性をもつ医薬担体中で製剤化される、本明細書で提供される化合物を含有する組成物も調製され、適切な容器に入れられ、適応症の処置に関するラベルを付けられる。

【0389】

別段の定めのない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、特許請求された主題が属する技術分野の当業者が共通して理解するものと同じ意味を有する。先の一般的な説明および以下の詳細な説明は例示的かつ説明的なものにすぎず、特許請求されたすべての主題を制限するものではないことを理解されたい。本出願では、単数形の使用は、別段の定めのない限り複数形を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に指定されていない限り、複数形を含むことに留意されたい。本出願では、「または（ｏｒ）」の使用は、別段の定めのない限り、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語のほか、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的ではない。

【0390】

本明細書で使用される場合、範囲および量は、「約（ａｂｏｕｔ）」の付く特定の値または範囲として表すことができる。「約」はまた、正確な量も含む。したがって、「約５μＬ」は、「約５μＬ」に加えて「５μＬ」を意味する。概して、「約」という用語は、実験誤差内にあると予想される量を含む。

【0391】

本明細書で使用されるセクションの見出しは、編成のみを目的とするものであり、記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。

【0392】

本明細書で使用される場合、「個体」、「対象」、および「患者」という用語は、あらゆる哺乳動物を意味する。一部の態様では、哺乳動物はヒトである。一部の態様では、哺乳動物はヒト以外である。これらの用語はいずれも、医療従事者（例えば、医師、登録看護師、診療看護師、医療補助者、規則的（ｏｒｄｅｒｌｙ）またはホスピス労働者）の監督（例えば、定期的または断続的）により特徴付けられる状況を必要とすることも、それに制限されることもない。

【0393】

「治療有効量」という用語は、哺乳動物対象に所望の治療効果を提供するのに十分なポリ核酸分子コンジュゲートの量に関する。場合により、この量は、障害もしくは再発性障害を処置する、予防する、その発症を予防する、治癒する、遅延させる、その重症度を低減させる、その少なくとも１つの症状を軽快させる、またはこのような処置のない状態で予想されるものを上回って患者の生存を延ばすための、患者（ヒトなど）への単回または複数回投与である。当然のことながら、治療有効量を提供するのに採用される特定のポリ核酸分子コンジュゲートの投与量レベルは、損傷の種類、対象の年齢、体重、性別、病状、疾病の重症度、投与経路、および採用される特定の阻害剤に依拠して変動する。一部の例では、本明細書に記載されるポリ核酸分子コンジュゲートの治療有効量は、最初に細胞培養物および動物モデルから推計される。例えば、細胞培養方法で判定されたＩＣ_５０値は、任意選択で動物モデルにおける出発点として役立ち、一方で動物モデルに対して判定されたＩＣ_５０値は、ヒトに対する治療有効量を見出すために任意選択で使用される。

【0394】

骨格筋、すなわち随意筋は、概して腱によって硬骨に固定されるとともに、一般的には移動などの骨格動作を達成するために、または姿勢維持に使用される。一部の骨格筋制御は、全体として無意識の反射（例えば、姿勢筋または横隔膜）として維持されるが、骨格筋は意識的な制御に反応する。平滑筋、すなわち不随意筋は、食道、胃、腸、子宮、尿道、および血管などの器官および構造の壁の中に見られる。

【0395】

骨格筋は、２つの広範なタイプであるＩ型（すなわち「緩徐収縮」）とＩＩ型（すなわち「速収縮」）とにさらに分けられる。Ｉ型筋繊維は毛細管が密集しており、ミトコンドリアおよびミオグロビンが豊富であることから、Ｉ型筋組織には特徴的な赤色が与えられる。場合により、Ｉ型筋繊維は、より多くの酸素を運び、脂肪または炭化水素を燃料に使用して好気性活性を維持する。Ｉ型筋繊維は、長期間にわたりほとんど力を必要とすることなく収縮する。ＩＩ型筋繊維は、収縮速度と生成された力の両方において異なる３つの主なサブタイプ（ＩＩａ、ＩＩｘ、およびＩＩｂ）へとさらに細分化される。ＩＩ型筋繊維は、即座に力強く収縮するが非常に急速に披露するため、筋収縮に痛みを伴う前に短く嫌気性の活性の突発しかもたらさない。

【0396】

骨格筋とは異なり、平滑筋は意識制御下にはない。

【0397】

心筋も不随意筋であるが、構造は骨格筋と非常によく類似しており、心臓にのみ見られる。心筋および骨格筋は、高度に規則的に配置された束にまとめられる筋節を含有するという点で横紋状である（ｓｔｒｉａｔｅｄ）。対照的に、平滑筋細胞の筋原繊維は筋節には配置されないことから、横紋状ではない。

【0398】

筋細胞は、筋組織に寄与するあらゆる細胞を包含する。典型的な筋細胞には、筋芽細胞、衛星細胞、筋管、および筋原繊維組織が挙げられる。

【0399】

本明細書で使用される場合、筋力は横断面積（ＣＳＡ）に比例し、筋肉速度は筋繊維長さに比例する。このため、様々な種類の筋肉間で横断面積と筋繊維とを比較することで、筋萎縮症の適応症を得ることが可能である。筋力および筋肉重量を測定する種々の方法が当該技術分野で公知であり、例えば、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓが２０００に発行したＨａｚｅｌ Ｍ．Ｃｌａｒｋｓｏｎによる「Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ：Ｊｏｉｎｔ ｒａｎｇｅ ｏｆ ｍｏｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｎｕａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｓｔｒｅｎｇｔｈ」を参照されたい。筋肉質量を測定するさらなる方法は、コンピュータによる横断断層撮影、および音波検査評価によって、選択された筋組織から断層画像を作成することである。

【0400】

抗体オリゴヌクレオチドコンジュゲート（ＡＯＣ）という用語は、ヌクレオチドにコンジュゲートされた抗体を指す。

【0401】

「ｓｉＲＮＡコンジュゲート」または「ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲート」という用語は、ｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた抗体を指す。

【0402】

「ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－コンジュゲート」または「ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ－抗体コンジュゲート」は、ヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡの標的配列にハイブリダイズするｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた抗体を指す。

【0403】

「ＤＵＸ４－ＡＯＣ」という用語は、ヒトＤＵＸ４ ｍＲＮＡの標的配列にハイブリダイズするｓｉＲＮＡにコンジュゲートされた抗体を指す。

【0404】

実施形態
実施形態１．ポリ核酸分子コンジュゲートであって、ＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子にコンジュゲートした抗体またはその抗原結合フラグメントを含み、ポリ核酸分子がＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介する、ポリ核酸分子コンジュゲート。

【0405】

実施形態２．抗体またはその抗原結合フラグメントが、非ヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ヒト抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ヒト化抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一価Ｆａｂ’、二価Ｆａｂ２、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、ミニボディ、ナノボディ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはラクダ科抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む、実施形態１のポリ核酸分子コンジュゲート。

【0406】

実施形態３．抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗トランスフェリン受容体抗体またはその抗原結合フラグメントである、実施形態１または２のポリ核酸分子コンジュゲート。

【0407】

実施形態４．ポリ核酸分子がセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖および／またはアンチセンス鎖が、それぞれ独立して、少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチド、少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結、または少なくとも１つの逆位脱塩基部分を含む、実施形態１～３のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0408】

実施形態５．ポリヌクレオチドが、ＤＵＸ４の標的配列の少なくとも８つの隣接する塩基にハイブリダイズする、実施形態１～４のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0409】

実施形態６．ポリヌクレオチドが、約８～約５０ヌクレオチド長、または約１０～約３０ヌクレオチド長である、実施形態１～５のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0410】

実施形態７．ポリ核酸分子がセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１～７０または配列番号１４１～２１０から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である、実施形態１～６のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0411】

実施形態８．ポリ核酸分子がセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、配列番号１４２、１４６、１９６、または２０１～２０６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である、実施形態１～７のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0412】

実施形態９．ポリ核酸分子がセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、配列番号７１～１４０または配列番号２１１～２８０から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である、実施形態１～８のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0413】

実施形態１０．ポリ核酸分子がセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖が、配列番号４１２～４２０および配列番号４３０～４３８から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一である、実施形態１～９のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0414】

実施形態１１．ポリ核酸分子が少なくとも１つの２’修飾ヌクレオチドを含み、さらに、２’修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、もしくは２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾ヌクレオチドを含むか、ロックド核酸（ＬＮＡ）もしくはエチレン核酸（ＥＮＡ）を含むか、またはそれらの組合せを含む、実施形態１～１０のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0415】

実施形態１２．少なくとも１つの修飾ヌクレオチド間連結が、ホスホロチオエート連結またはホスホロジチオエート連結を含む、実施形態１～１１のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0416】

実施形態１３．ポリ核酸分子が、２’－Ｏ－メチルおよび２’－デオキシ－２’－フルオロから選択される３つ以上の２’修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１～１２のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0417】

実施形態１４．ポリ核酸分子が、５’－末端ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１～１３のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0418】

実施形態１５．５’－末端ビニルホスホネート修飾ヌクレオチドが、

【0419】

【化29】

から選択され、
式中、Ｂが複素環塩基部分であり、
Ｒ６が、水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシから選択され、
Ｊが、ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチドに連結するヌクレオチド間連結基である、実施形態１～１４のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0420】

実施形態１６．２’修飾ヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドであり、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドが、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の５’－末端にある、実施形態１～１５のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0421】

実施形態１７．２’－Ｏ－メチルがプリンヌクレオチドである、実施形態１６のポリ核酸分子コンジュゲート。

【0422】

実施形態１８．２’－Ｏ－メチルがピリジンヌクレオチドである、実施形態１６のポリ核酸分子コンジュゲート。

【0423】

実施形態１９．センス鎖および／またはアンチセンス鎖が、５’末端に少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つの連続する２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１６～１８のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0424】

実施形態２０．抗体またはその抗原結合フラグメントをポリ核酸分子に接続するリンカーを含む、実施形態１～１９のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0425】

実施形態２１．リンカーがＣ１－Ｃ６アルキルリンカーである、実施形態２０のポリ核酸分子コンジュゲート。

【0426】

実施形態２２．リンカーがホモ二機能性リンカーまたはヘテロ二機能性リンカーであり、マレイミド基、ジペプチド部分、安息香酸基、またはその誘導体を含む、実施形態２０のポリ核酸分子コンジュゲート。

【0427】

実施形態２３．リンカーが切断可能または切断不能リンカーである、実施形態２０のポリ核酸分子コンジュゲート。

【0428】

実施形態２４．ポリ核酸分子と抗体またはその抗原結合フラグメントとの比が、約１：１、２：１、３：１、または４：１である、実施形態１～２３のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0429】

実施形態２５．ポリ核酸分子が、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象の筋萎縮症を調節する、実施形態１～２４のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0430】

実施形態２６．ＲＮＡ干渉が、未処置の細胞におけるＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写物の量と比較して、ＤＵＸ４遺伝子のｍＲＮＡ転写物の発現を少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％以上低下させることを含む、実施形態２５のポリ核酸分子コンジュゲート。

【0431】

実施形態２７．ＲＮＡ干渉が、細胞における、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、およびＬＥＵＴＸからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む、実施形態２５～２６のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0432】

実施形態２８．ＲＮＡ干渉が、細胞における、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む、実施形態２５～２６のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0433】

実施形態２９．マーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことが、マーカ遺伝子の発現を少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％以上低下させることである、実施形態２８のポリ核酸分子コンジュゲート。

【0434】

実施形態３０．筋ジストロフィーが顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、実施形態２５～２９のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0435】

実施形態３１．式（Ｉ）：
Ａ－Ｘ－Ｂ（式Ｉ）
の分子を含み、式中、
Ａが、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、
Ｂが、ＤＵＸ４の標的配列にハイブリダイズするポリ核酸分子であり、
Ｘが、結合または非重合体リンカーであり、
Ｘが、Ａのシステイン残基にコンジュゲートされる、実施形態１～３０のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート。

【0436】

実施形態３２．実施形態１～３１のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲートと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。

【0437】

実施形態３３．ナノ粒子製剤として製剤化される、実施形態３２の医薬組成物。

【0438】

実施形態３４．非経口、経口、鼻腔内、頬側、直腸、経皮、静脈内、皮下、または鞘内の投与用に製剤化される、実施形態３２～３３のいずれか１つの医薬組成物。

【0439】

実施形態３５．筋ジストロフィーの処置を必要とする対象の筋ジストロフィーを処置するための方法であって、実施形態１～３４のいずれか１つのポリ核酸コンジュゲートを提供する工程と、ポリ核酸コンジュゲートを対象に投与することで筋ジストロフィーを処置する工程であって、ポリ核酸コンジュゲートがヒトＤＵＸ４のｍＲＮＡ転写物の量を減少させる、工程とを含む、方法。

【0440】

実施形態３６．ポリ核酸部分が、ヒトＤＵＸ４に対するＲＮＡ干渉を媒介し、対象の筋萎縮症を調節する、実施形態３５の方法。

【0441】

実施形態３７．ＲＮＡ干渉が、筋ジストロフィーによる影響を受けた細胞における、ＭＢＤ３Ｌ２、ＴＲＩＭ４３、ＰＲＡＭＥＦ１、ＺＳＣＡＮ４、ＫＨＤＣ１Ｌ、ＬＥＵＴＸ、ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤからなる群から選択されるマーカ遺伝子の発現に影響を及ぼすことを含む、実施形態３６の方法。

【0442】

実施形態３８．筋ジストロフィーが顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）である、実施形態３５～３７のいずれか１つの方法。

【0443】

実施形態３９．顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有すると診断されたかまたはその疑いのある対象を処置するための、実施形態１～３０のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート、または実施形態３２～３４のいずれか１つの医薬組成物の使用。

【0444】

実施形態４０．顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有すると診断されたかまたはその疑いのある対象を処置するための薬剤の製造における実施形態１～３０のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート、または実施形態３２～３４のいずれか１つの医薬組成物の使用。

【0445】

実施形態４１．実施形態１～３１のいずれか１つのポリ核酸分子コンジュゲート、または実施形態３２～３４のいずれか１つの医薬組成物を含む、キット。

【実施例】

【0446】

これらの実施例は例示目的のみのために提供され、本明細書で提供される特許請求の範囲を制限するものではない。

【0447】

実施例１．ヒト全長ＤＵＸ４転写物に対する生物情報ｓｉＲＮＡライブラリの設計
図２は、ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ選択プロセスのフローチャートを示す。ＤＵＸ４、またはＤＵＸ４の所定の領域に結合可能なすべてのｓｉＲＮＡの配列を収集し、ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡのスターティングセットを生成する。ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡのスターティングセットから、第１の除外工程は、一塩基変異多型（ＳＮＰ）および／または－５未満のＭＥＦを有する１つまたは複数のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡを除外することを含む。次いで、第２の除外工程は、（許容されたヒットだけがＤＵＸ、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴであるように）ヒトトランスクリプトーム内に０および１つのＭＭを有するＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡを除外することを含む。次いで、第３の除外工程は、（許容されたヒットだけがＤＵＸ１、ＤＵＸ５、およびＤＢＥＴ偽遺伝子であるように）ヒト遺伝子内領域内に０のミスマッチ（ＭＭ）を有するＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡを除外することを含む。次いで、次の除外工程は、ＦＬＥｘＤＵＸ４ ＦＳＨＤマウスモデルに使用されるＤＵＸ４ヒト配列に対するＭＭを有するＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡを除外することを含む。次いで、次の工程は、予測生存度が６０以上である１つまたは複数のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡのみを繰り越すことである。次に、除外工程は、既知のｍｉＲＮＡの種領域１～１０００に対するマッチを有する１つまたは複数のポリ核酸分子を除外することを含む。次いで、除外工程は、ＧＣ含有量％が７５以上の１～１０００を除外することで継続する。次いで、最終の選択プロセスは、領域２９５～１１３２を除き、２つのＭＭを有する８つ以下の予測オフターゲットヒットを含み、これにおいては最大１２のヒットが許容される。このような一連の選択工程を使用して、１６９４のＤＵＸ ｓｉＲＮＡのスターティングセットから最終的に７０の候補ＤＵＸ ｓｉＲＮＡを選択できた。図３は、ＤＵＸ４ ｍＲＮＡ転写物（ＮＭ＿００１３０６０６８）内のかかる選択されたＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの位置と数を示す。

【0448】

同定されたｓｉＲＮＡ候補は、以下の表１０に示される配列において共通の特徴を共有する。同定されたｓｉＲＮＡは大部分に２’－Ｏ－Ｍｅを有し、３つすべてのＤＵＸ４鋳型では７位、８位、９位においてセンス鎖上に２’－Ｆ修飾のみが位置する。２’－Ｆ修飾を有する２’－Ｏ－Ｍｅ修飾は、ＤＵＸ４鋳型１では１位、２位、６位、１４位、１６位において、ＤＵＸ４鋳型１および２では２位、６位、１４位、１６位においてアンチセンス鎖上に位置する。また、同定されたｓｉＲＮＡは、各鎖の上に４つのホスホロチオエート修飾を含み、５’末端と３’末端のそれぞれの最終的に２つの連結に位置する。同定されたｓｉＲＮＡはさらに、実際の標的ｍＲＮＡ配列（センス鎖の３’末端の最終位置にある「ａ」と連結する）に関係なく、ＤＵＸ４鋳型１ではアンチセンス鎖の５’末端の１位に「Ｕｆ」を含むとともに、ＤＵＸ４鋳型３ではアンチセンス鎖の５’末端の１位に「ｖｐＮ」を含む。同定されたｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖のみの３’末端に「ｕｕ」オーバーハングをさらに含むが、センス鎖の３’末端にオーバーハングはない。同定されたｓｉＲＮＡの最適化は、ビニルホスホネートヌクレオチド、逆位脱塩基部分、またはパッセンジャー鎖もしくはガイド鎖に対するアミンリンカーを含み得る。

【0449】

【表10】

【0450】

表１１、１２、１３、１４、および１５は、ヒトＤＵＸ４の調節のために同定されたｓｉＲＮＡ候補を例示する。

【0451】

【表11-1】

【0452】

【表11-2】

【0453】

【表12-1】

【0454】

【表12-2】

【0455】

【表12-3】

【0456】

【表12-4】

【0457】

【表13】

【0458】

【表14】

【0459】

【表15】

【0460】

実施例２．ｓｉＲＮＡ配列および合成
すべてのｓｉＲＮＡ一本鎖を、固相上、標準のホスホラミダイト化学を用いて完全に組立てて、ＨＰＬＣにより精製した。精製された一本鎖を二重にして、二重鎖ｓｉＲＮＡを得た。ビニルホスホネート修飾ガイド鎖については、５’末端（ＶｐＵｑ）においてビニルホスホネート修飾ヌクレオチド構造を有するガイド鎖を産生した。ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖はすべて、異なるフォーマットのコンジュゲーションハンドルであるＣ_６－ＮＨ_２および／またはＣ_６－ＳＨを含有し、それぞれ鎖の各末端にある。逆位脱塩基リン酸ジエステルまたはホスホロチオエートを介して、コンジュゲーションハンドル（複数可）をｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはｓｉＲＮＡガイド鎖に接続した。図５Ａ～図５Ｆは、ｉｎ ｖｉｖｏ実験で使用されるフォーマットの代表的な構造である。図５Ａは、パッセンジャー鎖またはガイド鎖の５’末端にＣ_６－ＮＨ_２コンジュゲーションハンドル、および３’末端にＣ_６－ＳＨを有する、ｓｉＲＮＡの代表的な構造を図示する。図５Ｂは、５’末端にＣ_６－ＮＨ_２コンジュゲーションハンドル、および３’末端にＣ_６－Ｓ－ＰＥＧを有する、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造を図示する。図５Ｃは、５’末端にＣ_６－ＮＨ_２コンジュゲーションハンドル、および３’末端にＣ_６－Ｓ－ＮＥＭを有する、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造を図示する。図５Ｄは、５’末端にＣ_６－Ｎ－ＳＭＣＣコンジュゲーションハンドル、および３’末端にＣ_６－Ｓ－ＮＥＭを有する、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖の代表的な構造を図示する。図５Ｅは、５’末端にＰＥＧ、および３’末端にＣ_６－ＳＨを有する、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造を図示する。図５Ｆは、５’末端にＣ_６－Ｓ－ＮＥＭ、および３’末端にＣ_６－ＮＨ_２コンジュゲーションハンドルを有する、ｓｉＲＮＡパッセンジャー鎖またはガイド鎖の代表的な構造を図示する。

【0461】

実施例３．コンジュゲートの合成
図６Ａ～図６Ｆ、本明細書に記載のＡ－Ｘ_１－Ｂ－Ｘ_２－Ｙ（式Ｉ）アーキテクチャの典型的な構造を図示する。図６Ａは、抗体－Ｃｙｓ－ＳＭＣＣ－５’－パッセンジャー鎖（アーキテクチャ１）を図示する。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の５’末端でのマレイミド（ＳＭＣＣ）に対する抗体鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。図６Ｂは、抗体－Ｃｙｓ－ＳＭＣＣ－３’－パッセンジャー鎖（アーキテクチャ２）を図示する。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の３’末端でのマレイミド（ＳＭＣＣ）に対する抗体鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。図６Ｃは、抗体－Ｃｙｓ－ｂｉｓＭａｌ－３’－パッセンジャー鎖（ＡＳＣアーキテクチャ３）を図示する。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の３’末端でのビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対する抗体鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。図６Ｄは、Ｆａｂ－Ｃｙｓ－ｂｉｓＭａｌ－３’－パッセンジャー鎖（ＡＳＣアーキテクチャ４）のモデル構造を図示する。このコンジュゲートは、パッセンジャー鎖の３’末端でのビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対するＦａｂ鎖間システインコンジュゲーションによって生成された。図６Ｅは、２つの異なるｓｉＲＮＡが１つの抗体分子に付けられた、抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートのモデル構造（ＡＳＣアーキテクチャ５）を図示する。このコンジュゲートは、各ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の３’末端にて、ビスマレイミド（ｂｉｓＭａｌ）リンカーに対する低減されたｍＡｂ鎖間システインに、ＳＳＢとＨＰＲＴ ｓｉＲＮＡとの混合物をコンジュゲートすることによって生成された。図６Ｆは、２つの異なるｓｉＲＮＡが付けられた、抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートのモデル構造（ＡＳＣアーキテクチャ６）を図示する。このコンジュゲートは、各ｓｉＲＮＡのパッセンジャー鎖の３’末端にて、マレイミド（ＳＭＣＣ）リンカーに対する低減されたｍＡｂ鎖間システインに、ＳＳＢとＨＰＲＴ ｓｉＲＮＡとの混合物をコンジュゲートすることによって生成された。

【0462】

実施例３．１ ＳＭＣＣリンカーを使用した抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成
図７Ａは、抗体システインコンジュゲーションを介した抗体－Ｃｙｓ－ＳＭＣＣ－ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧコンジュゲートの典型的な合成スキーム（合成スキーム１）を図示する。

【0463】

工程１：ＴＣＥＰによる抗体鎖間ジスルフィド還元

【0464】

ホウ砂緩衝液（ｐＨ８）により抗体に緩衝液交換を行い、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、水中の２当量のＴＣＥＰを添加し、室温で２時間回転させた。得られた反応混合物に、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４のＰＢＳにより緩衝液交換を行い、室温で５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ中のＳＭＣＣ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡまたはＳＭＣＣ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡ－Ｃ６－ＮＨＣＯ－ＰＥＧ－ＸｋＤａ（２当量）（Ｘ＝０．５ｋＤａ～１０ｋＤａ）の溶液に添加して、一晩回転させた。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析によって、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡとともに抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートを認めた。

【0465】

工程２：精製

【0466】

粗製の反応混合物を、実施例３．４に記載される陰イオン交換クロマトグラフィー法－１を使用してＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ＞２の抗体－ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧコンジュゲートを含有する画分を分離し、濃縮して、ｐＨ７．４のＰＢＳにより緩衝液交換を行った。

【0467】

工程３：精製されたコンジュゲートの分析

【0468】

単離されたコンジュゲートを、ＳＥＣ、ＳＡＸクロマトグラフィー、およびＳＤＳ－ＰＡＧＥによって特徴解析した。コンジュゲートの純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー法－２または陰イオン交換クロマトグラフィー法－３のいずれかを使用して、分析的ＨＰＬＣによって精査した。両方法は、実施例３．４に記載されている。単離されたＤＡＲ１コンジュゲートは典型的に、分析的ＳＡＸ法では９．０±０．３分で溶出し、純度は９０％を超える。典型的なＤＡＲ＞２のシステインコンジュゲートは、８５％超のＤＡＲ２、および１５％未満のＤＡＲ３を含有する。

【0469】

実施例３．２．ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用した抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成
図７Ｂは、抗体－Ｃｙｓ－ＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧコンジュゲートの典型的な合成スキーム（合成スキーム２）を図示する。

【0470】

工程１：ＴＣＥＰによる抗体還元

【0471】

ホウ砂緩衝液（ｐＨ８）により抗体に緩衝液交換を行い、最大５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、水中の２当量のＴＣＥＰを添加し、室温で２時間回転させた。得られた混合物を、５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４のＰＢＳと交換し、室温で５ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ７．４のＰＢＳ中のＢｉｓＭａｌ－Ｃ６－ｓｉＲＮＡ－Ｃ６－Ｓ－ＮＥＭ（２当量）の溶液に添加して、一晩４℃に維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析によって、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡとともに抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートを認めた。

【0472】

工程２：精製

【0473】

粗製の反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー法－１を使用してＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２の抗体－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを含有する画分を分離し、濃縮して、ｐＨ７．４のＰＢＳにより緩衝液交換を行った。

【0474】

工程３：精製されたコンジュゲートの分析

【0475】

単離されたコンジュゲートを、質量分析法またはＳＤＳ－ＰＡＧＥのいずれかによって特徴解析した。コンジュゲートの純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー法－２または３のいずれかに加え、サイズ排除クロマトグラフィー法－１を使用して、分析的ＨＰＬＣによって精査した。

【0476】

実施例３．３．ｍＡｂからのＦａｂ’生成およびｓｉＲＮＡへのコンジュゲーション
図７Ｃは、Ｆａｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲート生成の典型的な合成スキーム（合成スキーム３）を図示する。

【0477】

工程１：ペプシンによる抗体消化

【0478】

ｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液により抗体に緩衝液交換を行い、最大５ｍｇ／ｍｌの濃度とした。固定化されたペプシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｒｏｄ＃２０３４３）を添加し、３７℃で３時間インキュベートした。３０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルタ、およびｐＨ７．４のＰＢＳを用いて、反応混合物を濾過した。保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を収集し、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することで、Ｆ（ａｂ’）２を単離した。次いで、収集したＦ（ａｂ’）２を１０当量のＴＣＥＰの１０によって還元し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中、室温でＳＭＣＣ－Ｃ_６－ｓｉＲＮＡ－ＰＥＧ５とコンジュゲートさせた。ＳＡＸクロマトグラフィーでの反応混合物の分析により、未反応のＦａｂおよびｓｉＲＮＡ－ＰＥＧとともにＦａｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを認めた。

【0479】

工程２：精製

【0480】

粗製の反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー法－１を使用してＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２のＦａｂ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを含有する画分を分離し、濃縮して、ｐＨ７．４のＰＢＳにより緩衝液交換を行った。

【0481】

工程３：精製されたコンジュゲートの分析

【0482】

単離されたコンジュゲートの特徴解析および純度を、陰イオン交換クロマトグラフィー法－２または３のいずれかに加え、ＳＥＣ法－１を使用して、分析的ＨＰＬＣによって精査した。

【0483】

実施例３．４．精製および分析の方法
陰イオン交換クロマトグラフィー法（ＳＡＸ）－１。
１．カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ×１５ｃｍ、１３ｕｍ
２．溶媒Ａ：２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍｌ／分。
３．勾配：
ａ． ％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ． １００ ０ １．００
ｃ． ６０ ４０ １８．００
ｄ． ４０ ６０ ２．００
ｅ． ４０ ６０ ５．００
ｆ． ０ １００ ２．００
ｇ． １００ ０ ２．００

【0484】

陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）法－２
１．カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃ（商標）ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣ（商標）、４×２５０ｍｍ
２．溶媒Ａ：ｐＨ８で８０％の１０ｍＭ ＴＲＩＳ、２０％エタノール；溶媒Ｂ：ｐＨ８で８０％の１０ｍＭ ＴＲＩＳ、２０％エタノール、１．５Ｍ ＮａＣｌ；流速：０．７５ｍｌ／分。
３．勾配：
ａ． 時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ． ０．０ ９０ １０
ｃ． ３．００ ９０ １０
ｄ． １１．００ ４０ ６０
ｅ． １３．００ ４０ ６０
ｆ． １５．００ ９０ １０
ｇ． ２０．００ ９０ １０

【0485】

陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）法－３
１．カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃ（商標）ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣ（商標）、４×２５０ｍｍ
２．溶媒Ａ：ｐＨ８で８０％の１０ｍＭ ＴＲＩＳ、２０％エタノール；溶媒Ｂ：ｐＨ８で８０％の１０ｍＭ ＴＲＩＳ、２０％エタノール、１．５Ｍ ＮａＣｌ
３．流速：０．７５ｍｌ／分。
４．勾配：
ａ． 時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ． ０．０ ９０ １０
ｃ． ３．００ ９０ １０
ｄ． １１．００ ４０ ６０
ｅ． ２３．００ ４０ ６０
ｆ． ２５．００ ９０ １０
ｇ． ３０．００ ９０ １０

【0486】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法－１
１．カラム：ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＴＳＫｇｅｌＧ３０００ＳＷ ＸＬ、７．８×３００ｍｍ、５μＭ
２．移動相：１５０ｍＭリン酸塩緩衝液
３．流速：１５分間で１．０ｍｌ／分

【0487】

実施例３．５．ビスマレイミド（ＢｉｓＭａｌ）リンカーを使用した抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成
ＴＣＥＰによる抗体還元
１ｍＭ ＤＴＰＡを含む２５ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８）により抗体に緩衝液交換を行い、最大１０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。この溶液に、同じホウ酸緩衝液中の４当量のＴＣＥＰを添加し、３７℃で２時間インキュベートした。得られた反応混合物を、室温でｐＨ６．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液中のＢｉｓＭａｌ－ｓｉＲＮＡ（１．２５当量）の溶液と合わせて、４℃で一晩維持した。分析的ＳＡＸカラムクロマトグラフィーによる反応混合物の分析によって、未反応の抗体およびｓｉＲＮＡとともに抗体ｓｉＲＮＡコンジュゲートを認めた。反応混合物を１０ＥＱのＮ－エチルマレイミド（１０ｍｇ／ｍＬのＤＭＳＯ中）で処理して、残るすべてのシステイン残基をキャッピングした。

【0488】

工程２：精製

【0489】

粗製の反応混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）法－１を使用してＡＫＴＡ Ｐｕｒｅ ＦＰＬＣによって精製した。ＤＡＲ１およびＤＡＲ２の抗体－ｓｉＲＮＡコンジュゲートを含有する画分を単離し、濃縮して、ｐＨ７．４のＰＢＳにより緩衝液交換を行った。

【0490】

陰イオン交換クロマトグラフィー法（ＳＡＸ）－１。

【0491】

カラム：Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫＧｅｌ ＳｕｐｅｒＱ－５ＰＷ、２１．５ｍｍ ＩＤ×１５ｃｍ、１３ｕｍ

【0492】

溶媒Ａ：２０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８．０；溶媒Ｂ：２０ｍＭ ＴＲＩＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０；流速：６．０ｍｌ／分。

【0493】

勾配：
ａ． ％Ａ ％Ｂ カラム体積
ｂ． １００ ０ １
ｃ． ８１ １９ ０．５
ｄ． ５０ ５０ １３
ｅ． ４０ ６０ ０．５
ｆ． ０ １００ ０．５
ｇ． １００ ０ ２

【0494】

陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ）法－２

【0495】

カラム：Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰｒｏＰａｃ（商標）ＳＡＸ－１０、Ｂｉｏ ＬＣ（商標）、４×２５０ｍｍ

【0496】

溶媒Ａ：ｐＨ８で８０％の１０ｍＭ ＴＲＩＳ、２０％エタノール；溶媒Ｂ：ｐＨ８で８０％の１０ｍＭ ＴＲＩＳ、２０％エタノール、１．５Ｍ ＮａＣｌ；流速：０．７５ｍｌ／分。

【0497】

勾配：
ａ． 時間 ％Ａ ％Ｂ
ｂ． ０．０ ９０ １０
ｃ． ３．００ ９０ １０
ｄ． １１．００ ４０ ６０
ｅ． １４．００ ４０ ６０
ｆ． １５．００ ２０ ８０
ｇ． １６．００ ９０ １０
ｈ． ２０．００ ９０ １０

【0498】

実施例４．ＦＳＨＤマウスモデルＡＣＴＡ１－ＭＣＭ：ＦＬＥｘＤＵＸ４に対するＤＵＸ４標的化ＡＯＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性
ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ（ＤＵＸ４．６１ ｎｏｎ－ＶＰ、ＤＵＸ４．６１ ｖｐＵｑ、およびＤＵＸ４．１６１３ ｖｐＵｑ）をマウストランスフェリン受容体（Ｔｆｒｃ）抗体にコンジュゲートして、マウス特異的ＤＵＸ４ ＡＯＣを生成した。ヒトＤＵＸ４遺伝子を発現する、ＦＳＨＤ疾患を有するＡＣＴＡ１－ＭＣＭ：ＦＬＥｘＤＵＸ４マウスモデル：Ｂ６（ｃｇ）－Ｇｔ（ＲＯＳＡ）２６Ｓｏｒｔｍ１．１（ＤＵＸ４^＊）Ｐｌｊ／Ｊ（Ｓｔｏｃｋ＃０２８７１０）と交配されたＳＴＯＣＫ Ｔｇ（ＡＣＴＡ１－ｃｒｅ／Ｅｓｒ１^＊）２Ｋｅｓｒ／Ｊ（Ｓｔｏｃｋ＃０２５７５０）に、ＤＵＸ４ ＡＯＣを静脈内投与した（Ｊｏｎｅｓ Ｔ、Ｊｏｎｅｓ ＰＬによるＡ ｃｒｅ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ＤＵＸ４ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１８ Ｆｅｂ ７；１３（２）：ｅ０１９２６５７）。０日目のマウスの年齢：８～１１週齢（Ｎ＝８または１０の雄と雌の集まり）。ＤＵＸ４ ＡＯＣの単回ＩＶ投与の３週間後に骨格筋を収集した。

【0499】

遺伝子発現をＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。ホモジナイザＦａｓｔＰｒｅｐ－２４（ＭＰＢｉｏ）を使用して、Ｌｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｄ中のＴｒｉｚｏｌにおいて筋組織を均質化し、６，０００ＲＰＭ、４℃で５分間回転させた。製造業者の指示に従いＺｙｍｏ－Ｓｐｉｎ（商標）Ｉ－９６キットを使用して、ＲＮＡを単離した。ＳｉｍｐｌｉＡｍｐ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）およびＴａｑＭａｎプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して２通りに、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６または７のＦｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ｃＤＮＡをｑＰＣＲによって分析した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によってデータを分析した。４つのＤＵＸ４標的遺伝子：ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、ＳＯＲＤの発現レベルを評価した（Ｊｏｎｅｓ ＴＩ、Ｃｈｅｗ ＧＬ、Ｂａｒｒａｚａ－Ｆｌｏｒｅｓ Ｐ、Ｓｃｈｒｅｉｅｒ Ｓ、Ｒａｍｉｒｅｚ Ｍ、Ｗｕｅｂｂｌｅｓ ＲＤ、Ｂｕｒｋｉｎ ＤＪ、Ｂｒａｄｌｅｙ ＲＫ、Ｊｏｎｅｓ ＰＬによるＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｕｎａｂｌｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＤＵＸ４ ｄｅｖｅｌｏｐ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ－ｌｉｋｅ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｒａｎｇｉｎｇ ｉｎ ｓｅｖｅｒｉｔｙ．Ｓｋｅｌｅｔ Ｍｕｓｃｌｅ．２０２０ Ａｐｒ １１；１０（１）：８）。ＤＵＸ４－標的の遺伝子発現を、ＰＰＩＢ参照遺伝子に正規化した。標的ｍＲＮＡのダウンレギュレーションレベルを、２^{－ΔΔＣｔ}法を使用して、ＰＢＳビヒクルで処置された動物と比較して判定した。

【0500】

一般的なプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブの設計のほか、ステム－ループＲＴ－ｑＰＣＲ（ＳＬ－ＲＴ－ｑＰＣＲ）アッセイの方法も、過去に説明されている（Ｃｈｅｎ，２００５，Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ ｂｙ ｓｔｅｍ－ｌｏｏｐ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３，ｅ１７９）。特異的なＳＬ－ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを設計し、ＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡのガイド鎖を定量化した。組織ホモジネートを、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＴＥ緩衝液に入れて希釈し、次いでＳＬ－ＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。試料との比較のために異なる濃度のｓｉＲＮＡを適切なマトリックスにスパイクすることによって、標準曲線を生成した。ｓｉＲＮＡ標準曲線の線形回帰をプリズムおよび勾配において行い、ｙ切片値を使用して組織試料と血漿試料の濃度を外挿した。

【0501】

ＤＵＸ４標的遺伝子の複合物は、４つのＤＵＸ４標的マウス遺伝子（ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤ）の幾何平均であり、データは、ビヒクル（ＰＢＳ）で処置された動物の平均－／＋ＳＥＭ％として表され、Ｎ＝８または１０の雄と雌の集まりである。

【0502】

図４Ａと図４Ｂは、ＦＳＨＤマウスモデルＡＣＴＡ１－ＭＣＭ；ＦＬＥｘＤＵＸ４に対するＤＵＸ４標的化ＡＯＣのｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す。図４Ａでは、ＤＵＸ４ ＡＯＣが、単回ＡＯＣ投与の３週間後の前脛骨筋、腓腹筋、および大腿四頭筋骨格筋に対して複合マウスＤＵＸ４標的遺伝子（ＷＦＤＣ３、ＩＬＶＢＬ、ＳＬＣ１５Ａ２、およびＳＯＲＤ）の用量依存的なダウンレギュレーションを実証することが認められる。さらに、図４Ｂは、ＤＵＸ４ ＡＯＣの単回静脈内投与の３週間後の筋組織におけるＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡｓの用量依存的な濃度上昇を示す。

【0503】

全体的にこれらのデータは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＵＸ４ ＡＯＣのロバストで永続的な活性を実証し、こうしてＦＳＨＤ疾患に対する可能な処置を実証する。

【0504】

実施例５．ＤＵＸ４標的化ＡＯＣによる処置後のＦＳＨＤマウスモデルにおける機能改善
実施例５は、骨格筋中でヒトＤＵＸ４を発現するマウスに対するＤＵＸ４標的化ＡＯＣによる処置後のＦＳＨＤ疾患表現型の抑制におけるＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡの有効性を実証する。６～９週齢のＡＣＴＡ１－ＭＣＭ；ＦＬＥｘＤＵＸ４マウスを処置する。群ごとに１０匹のマウスを、１回または２回のいずれかのタモキシフェン（ＴＭＸ）５ｍｇ／ｋｇの単回ＩＰ注射により処置し、ＦＳＨＤ表現型を誘導する。ＴＭＸ投与後２日以内に、試験ＤＵＸ４ ＡＯＣおよび対照ＡＯＣ物質、またはビヒクルをマウスにＩＶ注射する。投与直後、およびその後週に３回、疼痛の徴候、運動障害、忌避、水分補給についてマウスを観察する。体重を週３回測定する。Ｎｅｕｒｏｓｃｏｒｉｎｇを週３回行う。

【0505】

以下の機能測定を行い、筋肉表現型を精査する：
１．ＡＯＣ処置の１３日後のｉｎ ｖｉｖｏ筋力測定（等尺性筋力－頻度曲線、および強縮からの弛緩時間）
２．ＡＯＣ処置の７、１０、および１４日後のトレッドミル運動
３．ＡＯＣ処置の１５日後にＥＭＧをすべてのマウスに行う

【0506】

機能的エンドポイント測定完了の１日または２日後、マウスを屠殺し、さらなる評価のために以下の組織剖検を収集する：
ａ．腓腹筋
ｉ．左脚筋肉は瞬間冷凍し、－８０℃で保管する。
ｉｉ．右脚筋肉は１０％ＮＢＦ中、室温で固定する。
ｂ．前脛骨筋
ｉ．左脚筋肉は瞬間冷凍し、－８０℃で保管する。
ｉｉ．右脚筋肉は１０％ＮＢＦ中、室温で固定する。
ｃ．大腿四頭筋
ｉ．左脚筋肉は瞬間冷凍し、－８０℃で保管する。
ｉｉ．右脚筋肉は１０％ＮＢＦ中、室温で固定する。
ｄ．半分に切断した横隔膜
ｉ．左半分は瞬間冷凍し、－８０℃で保管する。
ｉｉ．右半分は１０％ＮＢＦ中、室温で固定する。

【0507】

冷凍した組織試料を、ＤＵＸ４依存的な遺伝子発現、および組織中のＤＵＸ４ ｓｉＲＮＡ濃度について分析する。

【0508】

ホルムアルデヒドで固定した組織を包埋のためにトリミングする。各組織から２つの切片を切り取る。
ａ．一方の切片をＳｉｒｉｕｓ Ｒｅｄで染色する。Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄで染色した切片では、線維症の程度を半自動画像分析によって測定する。
ｂ．他方の切片をレチクリンで染色する。レチクリンで染色した切片では、筋繊維のサイズおよび中心核の％を自動画像分析によって測定する。

【0509】

本開示の好ましい態様が本明細書中で示され、かつ記述されてきたが、当業者であれば、このような態様はほんの一例として提供されることが明白であろう。本開示から逸脱することなく、多数の変形、変更、および置換えが当業者により想到されるであろう。本明細書に記載される本開示の態様に代わる種々の代案が本開示の実施に採用されてもよいことを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲とその等価物の範囲内の方法と構造は、特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【配列表】

2024535797000001.xml

【国際調査報告】