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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】バイオインク
(51)【国際特許分類】
A61L 27/20 20060101AFI20240925BHJP
A61L 27/22 20060101ALI20240925BHJP
A61L 27/26 20060101ALI20240925BHJP
A61L 27/16 20060101ALI20240925BHJP
【ＦＩ】
A61L27/20
A61L27/22
A61L27/26
A61L27/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2024516636
(86)(22)【出願日】2022-06-10
(85)【翻訳文提出日】2024-05-13
(86)【国際出願番号】 FI2022050403
(87)【国際公開番号】W WO2023041836
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】20215971
(32)【優先日】2021-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】519096781
【氏名又は名称】タンペレ・ユニバーシティー・ファウンデーション・エスアール
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100225598
【弁理士】
【氏名又は名称】桐島 拓也
(72)【発明者】
【氏名】アンニ モロ
(72)【発明者】
【氏名】オーメン ポディヤン オーメン
【テーマコード（参考）】
4C081
【Ｆターム（参考）】
4C081AB01
4C081AB11
4C081AB31
4C081BA12
4C081BB07
4C081CA052
4C081CA182
4C081CD022
4C081CD042
4C081CD081
4C081CD092
4C081CD112
4C081CD172
(57)【要約】
本発明は、ヒドロゲル前駆体組成物及びヒドロゲル前駆体組成物から得られ得るバイオインク、並びにその調製法及び使用法に関する。より具体的には、本発明は、細胞を含むカテコールがグラフトされ自発的に架橋されるヒドロゲルを含有するバイオインク、並びに３Ｄバイオプリンティングにおけるその使用、及びその調製法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
バイオインク用のヒドロゲル前駆体組成物であってｉ．
ａ．少なくとも１つの第１の反応性官能基並びに
ｂ．少なくとも１つのカテコール基及び／又はフェノール基
にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む、第１の成分と、
ｉｉ．少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第２の成分と、
ｉｉｉ．少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、
を含み、
前記少なくとも１つの第２の反応性官能基が、前記少なくとも１つの第１の反応性官能基と架橋を形成するように構成され、前記少なくとも１つのレオロジー改質剤成分が、１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有するヒアルロン酸を含み、前記少なくとも１つのレオロジー成分が、前記ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の２～５０重量％を構成することを特徴とする、ヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項2】
ｉ．前記少なくとも１つの第１の反応性官能基が、ヒドラジド基、ヒドラジン基、カルボヒドラジド基、アミノオキシ基、アミン基、セミカルバジド基、チオセミカルバジド基及び／又はカルバゼート基から選択され、好ましくは、前記少なくとも１つの第１の反応性官能基がカルボヒドラジド基（－ＣＯＮＨＮＨ２）であり、前記少なくとも１つの第２の反応性官能基がアルデヒド基（－ＣＨＯ）であり、かつ／又はｉｉ．前記少なくとも１つの第１の反応性官能基がセミカルバジド又はアミノオキシであり、前記少なくとも１つの第２の反応性官能基がケトンである、請求項１に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項3】
ｉ．前記少なくとも１つの第１の反応性官能基及び前記少なくとも１つのカテコール基にコンジュゲートされた前記ＨＡ成分を含む第１の成分であって、前記少なくとも１つの第１の反応性基がカルボヒドラジド基（－ＣＯＮＨＮＨ２）である、第１の成分と、ｉｉ．前記少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第２の成分であって、前記少なくとも１つの第２の反応性官能基がアルデヒド基（－ＣＨＯ）である、第２の成分と、
ｉｉｉ．少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と
を含む、請求項１又は２に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項4】
前記ヒドロゲル前駆体組成物の前記レオロジー改質剤成分が、アルギン酸塩、キトサン、ナノセルロース、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、ポリビニルアルコール、細胞外マトリックスタンパク質、アルブミン、又はそれらの混合物をさらに含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項5】
前記ヒドロゲル前駆体組成物の前記レオロジー改質剤成分が、２５０～３００ｋＤａの分子量を有するコラーゲン、好ましくはＩ型をさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項6】
前記ヒドロゲル前駆体組成物の前記レオロジー改質剤成分が、４４０～５３０ｋＤａの分子量を有するヒトフィブロネクチンをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項7】
前記ヒドロゲル前駆体組成物の前記レオロジー改質剤成分が、４００～９００ｋＤａの分子量を有するラミニン、好ましくはヒト又はマウス組換えラミニンをさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項8】
前記少なくとも１つの第１の反応性官能基が、リンカーＬ１を介して前記第１の成分の前記ＨＡ成分にコンジュゲートされ、前記リンカーＬ１が、好ましくは前記ＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシレートヒドロキシ基の置換を介して、前記ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされ、前記リンカーＬ１が、１～１０個の部分から形成され、各部分が、独立して、フェニレン（－Ｃ６Ｈ４－）、オキシム（－Ｃ＝Ｎ－Ｏ－）、イミン（－Ｃ＝Ｎ－Ｃ－）、１～１２の炭素原子を含有するアルキレン（－ＣＨ２－）、エチニジイル（－Ｃ≡Ｃ－）、エチレンジイル（－Ｃ＝Ｃ－）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）、アミド（－ＣＯ－ＮＨ－、－ＣＯ－ＮＲ’－、－ＮＨ－ＣＯ－及びＮＲ’－ＣＯ－）からなる群から選択され、Ｒ’が５未満の炭素原子を含有するアルキル基、カルボニル（－ＣＯ－）、エステル（－ＣＯＯ－及びＯＯＣ－）、ジスルフィド（－ＳＳ－）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ－、－ＳＯ２－ＮＲ’－）、スルホン（－ＳＯ２－）、ホスフェート（－Ｏ－ＰＯ２－Ｏ－）、ジアザ（－Ｎ＝Ｎ－）、ジイミン（－ＮＨＮＨ－）、第２級アミン（－ＮＨＮＨ－）及び第３級アミンである、請求項１～７のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項9】
前記第１の成分が複数の第１の反応性官能基を含み、前記第１の反応性官能基、又は前記第１の反応性官能基にコンジュゲートされた前記リンカーＬ１が、前記第１の成分の前記ＨＡ成分の二糖反復単位の５～２０％、好ましくは９～１５％、より好ましくは１２～１３％にコンジュゲートされる、請求項８に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項10】
前記少なくとも１つの第１の反応性官能基がカルボヒドラジド基であり、前記リンカーＬ１が－ＮＨＮＨ－である、請求項８又は９に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項11】
前記少なくとも１つのフェノール基及び／又はカテコール基が、リンカーＬ２を介して前記第１の成分の前記ＨＡ成分にコンジュゲートされ、前記リンカーＬ２が、好ましくは前記ＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシレートヒドロキシ基の置換を介して、前記ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされ、前記リンカーＬ２が、１～１０個の部分から形成され、各部分が、独立して、フェニレン（－Ｃ６Ｈ４－）、オキシム（－Ｃ＝Ｎ－Ｏ－）、イミン（－Ｃ＝Ｎ－Ｃ－）、１～１２の炭素原子を含有するアルキレン（－ＣＨ２－）、エチニジイル（－Ｃ≡Ｃ－）、エチレンジイル（－Ｃ＝Ｃ－）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）、アミド（－ＣＯ－ＮＨ－、－ＣＯ－ＮＲ’－、－ＮＨ－ＣＯ－及びＮＲ’－ＣＯ－）からなる群から選択され、Ｒ’が５未満の炭素原子を含有するアルキル基、カルボニル（－ＣＯ－）、エステル（－ＣＯＯ－及びＯＯＣ－）、ジスルフィド（－ＳＳ－）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ－、－ＳＯ２－ＮＲ’－）、スルホン（－ＳＯ２－）、ホスフェート（－Ｏ－ＰＯ２－Ｏ－）、ジアザ（－Ｎ＝Ｎ－）、ジイミン（－ＮＨＮＨ－）、第２級アミン（－ＮＨＮＨ－）及び第３級アミンを示し、好ましくは前記リンカーＬ２が－ＮＨ（ＣＨ２）２－である、請求項１～１０のいずれかに記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項12】
前記第１の成分が複数のカテコール基及び／又はフェノール基を含み、前記カテコール基及び／又はフェノール基、あるいは前記カテコール基及び／又はフェノール基にコンジュゲートされた前記リンカーＬ２が、前記第１の成分の前記ＨＡ成分の二糖反復単位の１～２０％、好ましくは２～１０％、より好ましくは３～６％、さらにより好ましくは３．０～３．６％にコンジュゲートされる、請求項１１に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項13】
前記少なくとも１つの第２の反応性官能基が、リンカーＬ３を介して前記第２の成分の前記ＨＡ成分にコンジュゲートされ、前記リンカーＬ３が、好ましくは前記ＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシレートヒドロキシ基の置換によって、前記ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされ、前記リンカーＬ３が、１～１０個の部分から形成され、各部分が、独立して、フェニレン（－Ｃ６Ｈ４－）、オキシム（－Ｃ＝Ｎ－Ｏ－）、イミン（－Ｃ＝Ｎ－Ｃ－）、１～１２の炭素原子を含有するアルキレン（－ＣＨ２－）、エチニジイル（－Ｃ≡Ｃ－）、エチレンジイル（－Ｃ＝Ｃ－）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）、アミド（－ＣＯ－ＮＨ－、－ＣＯ－ＮＲ’－、－ＮＨ－ＣＯ－及びＮＲ’－ＣＯ－）からなる群から選択され、Ｒ’が５未満の炭素原子を含有するアルキル基、カルボニル（－ＣＯ－）、エステル（－ＣＯＯ－及びＯＯＣ－）、ジスルフィド（－ＳＳ－）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ－、－ＳＯ２－ＮＲ’－）、スルホン（－ＳＯ２－）、ホスフェート（－Ｏ－ＰＯ２－Ｏ－）、ジアザ（－Ｎ＝Ｎ－）、ジイミン（－ＮＨＮＨ－）、及び第３級アミンである、請求項１～１２のいずれかに記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項14】
前記第２の成分が複数の第２の反応性官能基、好ましくはアルデヒド基を含み、前記第２の反応性官能基又は前記第２の反応性官能基にコンジュゲートされた前記リンカーＬ３が、前記第２の成分の前記ＨＡ成分の前記二糖反復単位の５～５０％、好ましくは９～１５％、より好ましくは１１～１３％にコンジュゲートされる、請求項１３に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項15】
前記少なくとも１つの第２の反応性官能基がアルデヒド基（－ＣＨＯ）であり、前記リンカーＬ３が－ＮＨＣＨ２－である、請求項１３又は１４に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項16】
前記第１の成分及び前記第２の成分の分子量が１００～１０００ｋＤａである、請求項１～１５のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項17】
前記第１の成分及び前記第２の成分の分子量が１００～３００ｋＤａである、請求項１～１６のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項18】
前記少なくとも１つのレオロジー改質剤成分が、１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量のヒアルロン酸と、
２５０～３００の分子量のコラーゲン、好ましくはＩ型と、
を含み、
前記少なくとも１つのレオロジー成分が、前記ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の２～５０重量％、好ましくは９～４０重量％、より好ましくは１１～２３重量％を構成する、請求項１に記載のヒドロゲル前駆体成分。
【請求項19】
前記少なくとも１つのレオロジー改質剤成分が、好ましくはゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、並びにそれらの断片及び／又は混合物から選択される１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む、請求項１８に記載のヒドロゲル前駆体成分。
【請求項20】
前記少なくとも１つの第１の反応性基がカルボヒドラジドであり、前記少なくとも１つの第２の反応性基がアルデヒドである、請求項１８又は１９に記載のヒドロゲル前駆体成分。
【請求項21】
前記少なくとも１つの第１の反応性基がアルデヒドであり、前記少なくとも１つの第２の反応性基がカルボヒドラジドである、請求項１８又は１９に記載のヒドロゲル前駆体成分。
【請求項22】
前記第１の成分及び前記第２の成分の分子量が１００～１０００ｋＤａである、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項23】
前記第１の成分及び前記第２の成分の分子量が１００～３００ｋＤａである、請求項１８～２１のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物。
【請求項24】
請求項１～２３のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物を、細胞を含む流体と混合することによって得られ得る、バイオインク。
【請求項25】
３Ｄ印刷などの積層造形のための、請求項１～２３のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物又は請求項２４に記載のバイオインクの使用。
【請求項26】
請求項２４に記載のバイオインクを３Ｄ印刷するための方法であってａ）請求項１～２３のいずれか一項に記載のヒドロゲル前駆体組成物を、細胞を含む流体と混合することと、
ｂ）前記流体中で、前記ヒドロゲル前駆体組成物の前記第１の成分と前記ヒドロゲル前駆体組成物の前記第２の成分とを架橋させることと、
ｃ）前記バイオインクの粘度が２００～２０００Ｐａ・ｓである場合に、前記バイオインクを３Ｄ印刷することと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオインク、及びバイオインクを調製し、使用する方法に関する。より具体的には、本発明は、ヒドロゲル前駆体組成物から得られ得る架橋ヒドロゲルと、細胞などの生物起源の材料とを含有するバイオインクに関する。本発明はまた、３Ｄ印刷におけるヒドロゲル又はバイオインクの使用、及びそれを３Ｄ印刷する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
３Ｄバイオプリンティングは、組織及び臓器様構造の生成のための強力な技術であり、人工組織の設計に大きな可能性を提供する。バイオプリンティングは、積層造形の一形態であり、コンピュータに支援されている設計を使用して、３Ｄ生体構造が層ごとに生成される。３Ｄバイオプリンティングは、天然組織の複雑で不規則な形状を模倣する患者特異的構築物又はインプラントへの細胞の正確な空間的配置を可能にする。この新たな技術の可能性にもかかわらず、組織工学及び再生医療におけるそのより広範な使用を制限する技術的課題が依然として存在する。
【0003】
バイオインクは、一般に、生存細胞又は成長因子を含む単一又は複数の成分のマトリックス成分を含有する材料であり、３Ｄバイオプリンターに装填されて天然組織様構築物を製造する。バイオインクが３Ｄバイオプリンティングにおいて良好に機能するために、いくつかの要件が設定されている。バイオインクは、印刷可能であり、印刷後にその３Ｄ形状を保持する必要がある。これらの特性は、構造的安定性、生体適合性及び有効な生物学的性能と組み合わされる必要がある。現在のバイオインクは、単一のバイオインクにおいてこれらの態様の全てを最適化することができていない。
【0004】
バイオインクは、各用途のための特定の要件に応えるために様々な材料から製造され得る。小さなサイズのノズルを通して押し出され、その後、形状安定なゲルを形成する能力を有するヒドロゲル組成物は、生存細胞を組み込むことができる、バイオインクのための適切な基材と見なされる。ヒドロゲル及びバイオインクの開発には進歩があるものの、ヒドロゲル及びバイオインクへの組織接着性成分の組み込みの研究は幾分遅れている。カテコールは、ヒドロゲルの組織接着特性を増加させるために、組織工学用途において研究されており、これまでに、カテコール化学に基づく多くの組織接着性ヒドロゲルが導入されている。しかし、これらのヒドロゲルは、ほとんどが自動酸化、自己重合、又は金属配位重合のいずれかによって形成され、これらの形成経路は、細胞機能を犠牲にする可能性があり、したがって、細胞と生体適合性ではない。さらに、多くのバイオインクは、ヒドロゲル基材の構造的安定性のために光開始剤及び光架橋を必要とし、これは、バイオインクの生物学的機能性に対する重大な制限として作用し得る。
【0005】
クリックケミストリーに基づくヒドロゲルは、反応性試薬を混合した後、成分の自発的な架橋によって形成されるように構成される。こうしたヒドロゲルは、高い細胞生存率で生存細胞を封入できることが示されている。一般に、クリックケミストリー反応は、迅速、自発的、多用途で、極めて選択的であり、２つの分子物質又は成分が組み合わされた場合に高収率の製品を生じ得る。これに関して、ヒアルロン酸（ＨＡ）に基づく架橋ヒドロゲルが研究されており、これらのヒドロゲルの架橋は迅速に起こり、比較的狭いバイオファブリケーションウィンドウを生じる。例えば、Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１９は、３Ｄ印刷に不適切なゲル化速度及び粘度を有するＨＡに基づくヒドラゾン架橋ヒドロゲルを開示している。
【0006】
組織接着特性を有するバイオインク組成物が存在するにもかかわらず、組織接着性成分の自己重合、酸化又は金属配位重合に依存しない、改善された組織接着特性を有する新規のバイオインクが依然として必要とされている。適切な架橋速度、したがって３Ｄ印刷のための最適なバイオファブリケーションウィンドウを提供する新規バイオインク組成物も必要とされている。細胞増殖及び組織分化並びにより特殊化した細胞表現型に向けた成熟を可能にする新規バイオインク組成物も必要とされている。さらに、向上した印刷適性及び構造安定性のために光開始剤及び光架橋を使用しないバイオインクが必要とされている。
【発明の概要】
【0007】
本出願は、添付の独立請求項において定義される発明、及び以下に開示されるそれらの実施形態に関する。添付の特許請求の範囲は、保護の範囲を定義する。特許請求の範囲によってカバーされない、詳細な説明又は図面に開示される任意の方法、プロセス、製品、又は装置は、特許請求される発明の実施形態ではないが、特許請求される発明を理解するために有用である例として提供される。
【0008】
本明細書では、ヒドロゲル及びバイオインクの調製において利用することができるヒドロゲル前駆体組成物について記載する。ヒドロゲル及びバイオインクは、３Ｄ及び／又は４Ｄ印刷などの積層造形において使用することができる。
【0009】
本発明者らは、驚くべきことに、特定の組成を有する架橋ヒドロゲルが、該ヒドロゲル組成物に１つ以上のレオロジー改質剤が組み込まれた場合に、積層造形及びバイオプリンティングに好適であることを見出し、以下の実施例において示した。
【0010】
第１の態様によれば、
ｉ
ａ．少なくとも１つの第１の反応性官能基並びに
ｂ．少なくとも１つのカテコール基及び／又はフェノール基
にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む、第１の成分と、
ｉｉ 少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第２の成分と、
ｉｉｉ 少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、
を含むヒドロゲル前駆体成分であって、
少なくとも１つの第２の反応性官能基が、少なくとも１つの第１の反応性官能基と架橋を形成するように構成される、ヒドロゲル前駆体組成物が提供される。
ｉ
ａ．少なくとも１つの第１の反応性官能基並びに
ｂ．少なくとも１つのカテコール基及び／又はフェノール基
にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む、第１の成分と、
ｉｉ 少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第２の成分と、
ｉｉｉ 少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、
を含むヒドロゲル前駆体成分であって、
少なくとも１つの第２の反応性官能基が、少なくとも１つの第１の反応性官能基と架橋を形成するように構成される、ヒドロゲル前駆体組成物が提供される。
【0011】
第２の態様によれば、第１の態様のヒドロゲル前駆体組成物を、細胞を含む流体と混合することによって得られ得る、バイオインクが提供される。
【0012】
第３の態様によれば、３Ｄ印刷などの積層造形のための、第１の態様のヒドロゲル前駆体組成物又は第２の態様のバイオインクの使用が提供される。
【0013】
第４の態様によれば、バイオインクを３Ｄ印刷するための方法であって
ａ）第１の態様のヒドロゲル前駆体組成物を、細胞を含む流体と混合することと、
ｂ）この流体中で、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分とヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分とを架橋させることと、
ｃ）バイオインクの粘度が２００～２０００Ｐａ・ｓである場合に、バイオインクを３Ｄ印刷することと、
を含む、方法が提供される。
ａ）第１の態様のヒドロゲル前駆体組成物を、細胞を含む流体と混合することと、
ｂ）この流体中で、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分とヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分とを架橋させることと、
ｃ）バイオインクの粘度が２００～２０００Ｐａ・ｓである場合に、バイオインクを３Ｄ印刷することと、
を含む、方法が提供される。
【0014】
さらなる態様によれば、ｉ）少なくとも１つの第１の反応性官能基、並びに少なくとも１つのカテコール基及び／又はフェノール基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第１の成分と、ｉｉ）少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第２の成分と、ｉｉｉ）１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有する少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、を含むヒドロゲル前駆体組成物であって、少なくとも１つの第２の反応性官能基が、少なくとも１つの第１の反応性官能基と架橋を形成するように構成される、ヒドロゲル前駆体組成物が提供される。さらなる態様によれば、ｉ）少なくとも１つのカルボヒドラジド基（－ＣＯＮＨＮＨ２）及び少なくとも１つのカテコール基にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第１の成分と、ｉｉ）少なくとも１つのアルデヒド基（－ＣＨＯ）にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第２の成分と、ｉｉｉ）１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有する少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、を含むヒドロゲル前駆体組成物が提供される。さらなる態様によれば、ｉ）少なくとも１つのカルボヒドラジド基（－ＣＯＮＨＮＨ２）及び少なくとも１つのドーパミン基（ＤＡ）にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第１の成分と、ｉｉ）少なくとも１つのアルデヒド基（－ＣＨＯ）にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第２の成分と、ｉｉｉ）１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有するＨＡを含む少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、を含むヒドロゲル前駆体組成物が提供される。さらなる態様によれば、ｉ）少なくとも１つのセミカルバジド及び少なくとも１つのカテコール基にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第１の成分と、ｉｉ）少なくとも１つのケトンにコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第２の成分と、ｉｉｉ）１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有する少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、を含むヒドロゲル前駆体組成物が提供される。さらなる態様によれば、ｉ）少なくとも１つのセミカルバジド及び少なくとも１つのカテコール基にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第１の成分と、ｉｉ）少なくとも１つのアルデヒドにコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第２の成分と、ｉｉｉ）１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有する少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、を含むヒドロゲル前駆体組成物が提供される。さらなる態様によれば、ｉ）少なくとも１つのアミノオキシ及び少なくとも１つのカテコール基にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第１の成分と、ｉｉ）少なくとも１つのケトンにコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第２の成分と、ｉｉｉ）１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有する少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、を含むヒドロゲル前駆体組成物が提供される。さらなる態様によれば、ｉ）少なくとも１つのアミノオキシ及び少なくとも１つのカテコール基にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第１の成分と、ｉｉ）少なくとも１つのアルデヒドにコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第２の成分と、ｉｉｉ）１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有する少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、を含むヒドロゲル前駆体組成物が提供される。さらなる態様によれば、第１の態様のヒドロゲル前駆体組成物を流体と混合することによって得られ得るヒドロゲル組成物が提供される。さらなる態様によれば、流体と混合された第１の態様のヒドロゲル前駆体組成物の成分の自発的架橋によって得られ得るヒドロゲル組成物が提供される。さらなる態様によれば、このヒドロゲル前駆体組成物が流体と混合された場合、第１の態様のヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分の自発的ヒドラゾン架橋によって得られ得るヒドロゲル組成物が提供される。さらなる態様によれば、第１の態様のヒドロゲル前駆体組成物を流体と混合することによって得られ得るヒドロゲル組成物であって、積層造形において使用可能であるヒドロゲル組成物が提供される。さらなる態様によれば、ヒドロゲル組成物を３Ｄ印刷するための方法であって、ａ）ヒドロゲル前駆体組成物を流体と混合することと、ｂ）この流体中で、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分とヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分とを架橋させることと、ｃ）ヒドロゲル組成物の粘度が２００～２０００Ｐａ・ｓである場合に、ヒドロゲル組成物を３Ｄ印刷することと、を含む、方法が提供される。
【0015】
一実施形態において、本発明は、印刷可能なヒドロゲル組成物を得るためのヒドロゲル前駆体組成物に関する。一実施形態において、本発明は、３Ｄ印刷用ヒドロゲル組成物に関する。一実施形態において、本発明は、３Ｄバイオプリンティングのためのバイオインク組成物であって、細胞と混合されたヒドロゲル組成物を含むバイオインク組成物に関する。一実施形態において、本発明は、３Ｄ印刷の方法に関する。
【0016】
本発明のヒドロゲル前駆体組成物は、ヒドロゲル組成物の成分間の適切な架橋速度を可能にし、架橋ヒドロゲルが３Ｄ印刷において使用されるための適切な製造期間を可能にする点で有利である。本発明のヒドロゲル前駆体組成物は、モジュールリンカー部分及び反応性官能基のため、並びにレオロジー改質剤成分のコンシステンシーにおけるモジュール性のため、高いモジュール性を有する点で有利である。
【0017】
本発明のヒドロゲル前駆体組成物から得られ得る本発明のヒドロゲル組成物は、印刷適性及び印刷後の形状の保持において改善された性能を有する点で有利である。本発明のヒドロゲル前駆体組成物から得られ得るヒドロゲル組成物は、改善されたずり減粘特性及び粘弾性特性を有し、ヒドロゲルの３Ｄ印刷を可能にする点でさらに有利である。本発明のヒドロゲル前駆体組成物から得られ得る本発明のヒドロゲル組成物は、最適化された架橋速度を有し、ヒドロゲルを３Ｄ印刷において使用することを可能にする点で有利である。本発明のヒドロゲル組成物は、ヒドロゲル組成物の自発的な双直交架橋が制御しやすく、したがってイオン架橋又は光化学的架橋されたヒドロゲルとは異なるために、有利である。
【0018】
本発明のバイオインクは、その中に混合された細胞と高い生体適合性を有し、細胞の増殖を可能にし、より特殊化した細胞表現型及び成熟組織に細胞が分化し成熟する点で有利である。本発明のバイオインクは、移植の際に、印刷された構造が宿主組織に一体化するのを補助する組織接着性成分を含む点で有利である。本発明のバイオインクはまた、改善されたずり減粘特性及び粘弾性特性を有し、架橋速度が最適化され、印刷後の形状が保持されて、バイオインクが３Ｄ印刷において使用されることを可能にする点で有利である。本発明のバイオインクはまた、細胞にとって有害ではないヒドロゲル前駆体組成物成分の架橋反応を通して得られ得るという点で有利である。本発明のバイオインクはまた、ｉｎ ｖｉｖｏで生分解性である成分のみを含む点で有利である。
【0019】
本発明の第１の態様のヒドロゲル前駆体組成物又は第２の態様のバイオインクの使用は、多くの用途における使用を可能にし、使用の多くの改変を可能にする点で有利である。例えば、ヒドロゲル前駆体組成物又はバイオインクは、様々な印刷機器と共に、又は広範囲の３Ｄ印刷／バイオプリンティング技術と共に使用することができる。本発明のヒドロゲル前駆体組成物又はバイオインクの使用は、損傷組織の修復及び再生のためのｉｎ ｓｉｔｕ注入可能物として使用されるように構成される点で有利である。
【0020】
本発明のヒドロゲル組成物の３Ｄ印刷のための方法は、プロセス条件に関して高いモジュール性を有する点で有利である。本発明のヒドロゲル組成物の３Ｄ印刷のための方法は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分と第２の成分との間の架橋の形成が自発的であるように構成されるため、イオン架橋に基づくものでもなく、特定の温度又は光の波長などの特定の架橋誘導因子も必要としない点で有利である。
【0021】
以下に提供される実施例に示されるように、特許請求されるヒドロゲル前駆体組成物、結果として生じる印刷可能なヒドロゲル組成物、及びヒドロゲル前駆体組成物を用いて得られるバイオインクは、３Ｄ印刷において使用される場合、当技術分野において公知の製品と比較して、改善された性能を有する。
【0022】
本発明の例示的かつ非限定的な実施形態は、構造及び操作方法の両方に関して、その追加の目的及び利点と共に、添付の図面に関連して読まれる際、特定の例示的な実施形態の以下の説明から最もよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
いくつかの例示的な実施形態が、添付の図面を参照して説明される。
【図1】例示的な実施形態による例示的なヒドロゲル又はバイオインクの製造の概略図を示す。
【図2】例示的な実施形態によるヒドロゲル組成物のずり減粘挙動を示す、連続流下の粘度Ａ）及び周期的流下の粘度Ｂ）を示す。
【図3】例示的な実施形態による、貯蔵弾性率及び損失弾性率として示されるヒドロゲル組成物の歪み回復を示す。
【図4】例示的な実施形態による、Ａ）いかなるレオロジー改質剤も含まない、Ｂ）本発明記載のレオロジー改質剤成分としてのヒアルロン酸ナトリウム及びヒトＩ型コラーゲンを含む、及びＣ）Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１９の開示に従った、ヒドロゲル前駆体組成物を使用して製造された例示的な３Ｄ印刷されたヒドロゲル格子を示す。スケールバー１０ｍｍ。
【図5】例示的な実施形態による、最終ヒドロゲル組成物体積から、Ａ）２．９２ｍｇ／ｍｌ、Ｂ）８．１６ｍｇ／ｍｌ、及びＣ）１１．６６ｍｇ／ｍｌの架橋成分、すなわち、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分を含むヒドロゲル前駆体組成物を使用して製造された例示的な３Ｄ印刷されたヒドロゲル格子を示す。
【図6】例示的な実施形態による、レオロジー改質剤成分として最終ヒドロゲル組成物体積の、Ａ）０．１８ｍｇ／ｍｌ、Ｂ）０．５６ｍｇ／ｍｌ、及びＣ）１．０９ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンをヒアルロン酸（ＨＡ）と共に含むヒドロゲル前駆体組成物を使用して製造された例示的な３Ｄ印刷されたヒドロゲル格子を示す。
【図7】例示的な実施形態による、レオロジー改質剤成分として最終ヒドロゲル組成物体積のＡ）０．６２５ｍｇ／ｍｌ、Ｂ）１．２５ｍｇ／ｍｌ、及びＣ）３．１２５ｍｇ／ｍｌのＨＡを含むヒドロゲル前駆体組成物を使用して製造された例示的な３Ｄ印刷されたヒドロゲル格子を示す。
【図8】例示的な実施形態による、レオロジー改質剤成分としてＡ）ラミニン、Ｂ）アルブミン、又はＣ）フィブロネクチンをＨＡと共に含むヒドロゲル前駆体組成物を使用して製造される、例示的な３Ｄ印刷されたヒドロゲル格子を示す。
【図10】例示的な実施形態による、Ａ）時間の関数としての例示的な３Ｄ印刷されたヒドロゲル格子の相対フィラメント厚（Ｄ０は０日目の相対フィラメント厚を示し、Ｄ７は７日目の相対フィラメント厚を示す）と、Ｂ）０日目及びＣ）７日後の印刷されたヒドロゲル格子の画像とを示す。
【図11】例示的な実施形態による、Ａ）３Ｄ印刷された線、及びＢ）３Ｄ印刷された構造における細胞生存率を示す、放出された蛍光として測定された、異なる時点での例示的なヒドロゲルにおけるｈＡＳＣ及びｈＡＳＣ由来角膜間質様細胞の細胞生存率、並びにＣ）ｈＡＳＣ及びＤ）ｈＡＳＣ由来角膜間質様細胞における印刷７日後の３Ｄ印刷された線のファロイジン染色を示す。
【図12】レオロジー改質剤として高分子量ＨＡ及びＣｏｌ Ｉを含むバイオインク（基本インク）、Ｃｏｌ Ｉを含まない同じインク、及びレオロジー改質剤として低Ｍｗ ＨＡを含むバイオインクについての１０分間の架橋後の粘度を示す。
【図13】レオロジー改質剤として高分子量ＨＡ及びＣｏｌ Ｉを有するバイオインク（基本インク）、Ｃｏｌ Ｉを含まない同じインク、及びレオロジー改質剤として低Ｍｗ ＨＡを含むバイオインクについての１時間の架橋後の粘度を示す。
【0024】
【図14】Ａ）は、レオロジー改質剤としてのＣｏｌ Ｉと高分子量ＨＡとの組合せが、伸縮性バイオインク及び粘着性材料を生じることを示し、Ｂ）は、Ｃｏｌ Ｉなしでは、同じバイオインクが伸縮性でなく、引っ張っている間に壊れることを示す。
【図15】Ａ）は、レオロジー改質剤としての高分子量ＨＡとＣｏｌ Ｉとの組み合わせが、培養中に印刷された形態を維持し、培養中に皿の底から剥離しない粘着性バイオインクを生じることを示し、Ｂ）は、Ｃｏｌ Ｉなしでは、同じバイオインクが培養中の皿から剥離し、印刷された構造を失うことを示す。
【図16】Ａ）は、高分子量ＨＡの合成が、溶解せず、印刷に使用できない成分を生じることを示し、Ｂ）は、成分が試薬溶液に溶解しないため、合成された高分子量ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨを分析及び特性評価することができないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
動詞「含む（comprise）」、「含有する（contain）」、及び「含まれる（include）」は、本明細書では、記載されていない特徴の存在を排除も要求もしないオープンエンドの表現として使用される。本明細書で使用される場合、用語「含む（comprising）」は、「含まれる（including）」、「含有する（containing）」、及び「包含する（comprehending）」のより広い意味、並びにより狭い表現「からなる（consisting of）」及び「のみからなる（consisting only of）」を含む。添付の従属請求項に記載された特徴は、特に明記しない限り、互いに自由に組み合わせることができる。さらに、「ａ」又は「ａｎ」、すなわち単数形の使用は、本文書全体を通して、複数を除外しないことが理解されるべきである。
【0026】
本明細書で使用される場合、「積層造形」という用語は、コンピュータ誘導されたデジタルモデルに基づく、材料の３Ｄ及び４Ｄ印刷を指す。用語「３Ｄ積層造形」又は「３Ｄ印刷」は、印刷により、物体の表面に材料を単層で塗布すること、又は例えばヒドロゲルの単層コーティングを形成することを指すことができる。用語「３Ｄ積層造形」又は「３Ｄ印刷」はまた、材料を層ごとに印刷して、３次元物体の多層（すなわち、１より多い印刷層）構造を生じることを指すことができる。用語「４Ｄ積層造形」又は「４Ｄ印刷」は、３Ｄ印刷材料が印刷後に異なる形態に変形することが可能な３Ｄ印刷を指すことができる。したがって、用語「３Ｄ印刷」は、用語「４Ｄ印刷」も含む。用語「３Ｄ積層造形」又は「３Ｄ印刷」は、基板などの表面上への印刷、又はＦＲＥＳＨ印刷を含むサポートバスへの印刷を指すこともできる。用語「３Ｄ積層造形」又は「３Ｄ印刷」は、生存細胞などの生物起源の材料を含む材料の印刷も指すことができる。したがって、用語「３Ｄ印刷」は、用語「バイオプリンティング」又は「３Ｄバイオプリンティング」も意味することができる。
【0027】
本明細書で使用される場合、用語「バイオプリンティング」は、バイオインクなどの印刷される材料が生存細胞などの生物起源の材料を含む、材料の３Ｄ印刷の方法を指す。
【0028】
本明細書で使用される場合、用語「ヒドラゾン架橋」は、生体分子又は生体高分子にグラフトされるアルデヒド基とヒドラジド基との間で架橋反応が起こる、２つの生体適合性生体分子又は生体高分子をコンジュゲートする自発的クリック型反応を意味する。ヒドラゾン結合を含む架橋は、－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－Ｎ＝Ｃ結合を含む。
【0029】
本明細書で使用される場合、用語「バイオファブリケーションウィンドウ」は、本発明によるヒドロゲル又はバイオインクの文脈において、架橋ヒドロゲル又はバイオインクが、積層造形におけるその使用を可能にするコンシステンシーを有する期間を指す。
【0030】
本明細書で使用される場合、用語「アルデヒド基」は、化学式－ＣＨＯを有するアルデヒドを含むか、又はそれからなる官能基を指し、式中、カルボニル中心は、酸素に二重結合し、水素に単結合した炭素である。
【0031】
本明細書で使用される場合、用語「カテコール基」は、ベンゼン核が互いにオルト位に２つのヒドロキシ置換基を有するカテコールを含むか又はカテコールからなる官能基を指す。
【0032】
本明細書で使用される場合、用語「カルボヒドラジド基」は、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）がヒドラジド基（－ＮＨ－ＮＨ２）と隣接している、カルボヒドラジドを含むか又はカルボヒドラジドからなる官能基を指す。
【0033】
本明細書で使用される場合、用語「カルボン酸基」又は「カルボキシル基」は、炭素原子に結合したヒドロキシル基（Ｏ－Ｈ）を有するカルボニル基（Ｃ＝０）からなる。
【0034】
本明細書で使用される場合、用語「細胞外マトリックスタンパク質」は、タンパク質、巨大分子及びミネラル、並びにｉｎ ｖｉｖｏで細胞及び組織を取り囲み、支持し、そして外側から構造を与える他の分子の大きなネットワークにおいて見出される任意のタンパク質を指す。
【0035】
本明細書で使用される場合、用語「レオロジー改質剤」は、組成物に添加された際、粘度、粘弾性、トルク、剪断応力、及び剪断速度などのこの組成物のレオロジー特性を改質することが可能な成分を指す。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「レオロジー改質剤成分」は、ヒドロゲル組成物のレオロジー特性を改善するように構成される成分を意味する。レオロジー改質剤成分は、少なくとも１つのレオロジー改質剤、例えば、２つ又は３つのレオロジー改質剤を含む。レオロジー改質剤成分は、例えば、タンパク質及び／又は多糖類であってもよい、１つ以上のポリマー又は非ポリマー成分を含むことができる。レオロジー改質剤成分は、ヒドロゲル前駆体組成物に添加される場合、少なくとも、生じるヒドロゲル組成物のレオロジー特性（例えば、粘弾性、粘度、トルク、剪断応力及び剪断速度）を改質可能である。必要に応じて、レオロジー改質剤成分はまた、組成物に添加される場合、他の影響（例えば、細胞の生体適合性の増加）を有し得る。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「ヒアルロン酸（ＨＡ）」は、交互のβ－（１→４）及びβ－（１→３）グリコシド結合を介して連結された反復単位としてのＤ－グルクロン酸及びＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン対から構成される二糖類のポリマーを意味する。ヒアルロン酸は、長さが約２５，０００までの二糖反復であってもよい。用語「ヒアルロン酸」は、ヒアルロン酸ナトリウムなどのヒアルロン酸の塩及び／又は溶媒和物も意味し得る。略語ＨＡはヒアルロン酸を意味する。本明細書で使用される場合、用語「ヒアルロン酸（ＨＡ）」は、例えば、ＨＡ成分（下記参照）中のＨＡ、又はレオロジー改質剤成分中のＨＡを指すために使用され得る。
【0038】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＡ成分の二糖反復単位」は、このＤ－グルクロン酸及びＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン対から構成される、ＨＡポリマーの反復二糖単位を指す。本明細書で使用される場合、用語「ヒアルロン酸（ＨＡ）成分」は、ヒアルロン酸（ＨＡ）又はその塩若しくは溶媒和物を含むヒドロゲル前駆体組成物の成分を意味する。一実施形態において、ヒアルロン酸成分は、完全にＨＡからなる。用語「ＨＡ成分」は、ヒアルロン酸成分を意味する。ＨＡ成分は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び／又は第２の成分のＨＡ成分を指すことができる。
【0039】
本明細書で使用される場合、用語「部分」は、分子の構造において機能的又は構造的に同定され得る分子の一部を意味する。部分は、官能基であってもよいし、又は共通の構造的態様を共有する複数の官能基を有する分子の一部を表す。
【0040】
本明細書で使用される場合、用語「流体」は、液体又はガス状物質を指す。ヒドロゲル組成物において、流体は、定義により、水又は水性溶液若しくは懸濁液、例えば、細胞培養培地、緩衝溶液、生理食塩水溶液及び／又はスクロース溶液である。
【0041】
本明細書で使用される場合、用語「成分」は、１つの個々の構成部分を指し、組成物中で使用される場合、それは全ての他の成分と一緒に組成物全体を形成する。成分は、いくつかの異なる化合物を含み得るか、又は全体として１つの特定の化合物若しくは分子からなり得る。
【0042】
本明細書で使用される場合、用語「粘度」は、流体の動的粘度を指し、測定単位Ｐａ・ｓ（パスカル秒）が使用される。
【0043】
本明細書で使用される場合、用語「コンジュゲート」は、２つの部分又は化合物が、互いに直接結合されることによって、又は別の部分若しくは化合物を介して間接的に結合されることによって互いに結合されることを指す。コンジュゲートは、２つ以上の化合物が一緒にコンジュゲートされることによって形成される化合物を指す。
【0044】
本明細書で使用される場合、用語「反応性官能基」は、目的とする実験の設定において化学反応を経ることが意図されるか、又は合理的に予想され得る化合物の官能基又は部分を指す。一実施形態では、反応性官能基は、（やはり官能基又は部分である）特定の反応パートナーが反応性官能基と接触した際、化学反応を経ることが予想される。
【0045】
本明細書で使用される場合、用語「架橋」は、１つのポリマー鎖又は分子を別のものに連結する化学結合又は結合の短い配列を意味する。
【0046】
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分内又は第２の成分内の２つの隣接する部分を接続するモジュール領域を意味する。
【0047】
本明細書で使用される場合、用語「生体適合性」は、生存細胞又は組織と適合性であり、そして細胞の生存性を維持する材料の特性、及び身体又は体液に曝露された場合に、任意の毒性副作用又は免疫学的応答を生じない能力を記載する。
【0048】
本明細書で使用される場合、用語「重量％」は、重量百分率を意味する。混合物中の物質の重量％は、混合物の総重量における物質の重量による割合を意味する。重量％は、試験物質の重量を全混合物の重量で割ることによって計算される。
【0049】
ヒドロゲル前駆体組成物は
ｉ）
ａ）少なくとも１つの第１の反応性官能基並びに
ｂ）少なくとも１つのカテコール基及び／又はフェノール基
にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む、第１の成分と、
ｉｉ）少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第２の成分と、
ｉｉｉ）少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、
を含み、
少なくとも１つの第２の反応性官能基は、少なくとも１つの第１の反応性官能基と架橋を形成するように構成される。
ｉ）
ａ）少なくとも１つの第１の反応性官能基並びに
ｂ）少なくとも１つのカテコール基及び／又はフェノール基
にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む、第１の成分と、
ｉｉ）少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第２の成分と、
ｉｉｉ）少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、
を含み、
少なくとも１つの第２の反応性官能基は、少なくとも１つの第１の反応性官能基と架橋を形成するように構成される。
【0050】
したがって、本開示の目的は、
ｉ．
ａ．少なくとも１つの第１の反応性官能基並びに
ｂ．少なくとも１つのカテコール基及び／又はフェノール基
にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む、第１の成分と、
ｉｉ．少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第２の成分と、
ｉｉｉ．少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、
を含む、ヒドロゲル前駆体組成物であって、
少なくとも１つの第２の反応性官能基が、少なくとも１つの第１の反応性官能基と架橋を形成するように構成され、少なくとも１つのレオロジー改質剤成分が、１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有するヒアルロン酸を含み、少なくとも１つのレオロジー成分が、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の２～５０重量％を構成する、ヒドロゲル前駆体組成物を提供することである。
ｉ．
ａ．少なくとも１つの第１の反応性官能基並びに
ｂ．少なくとも１つのカテコール基及び／又はフェノール基
にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む、第１の成分と、
ｉｉ．少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第２の成分と、
ｉｉｉ．少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、
を含む、ヒドロゲル前駆体組成物であって、
少なくとも１つの第２の反応性官能基が、少なくとも１つの第１の反応性官能基と架橋を形成するように構成され、少なくとも１つのレオロジー改質剤成分が、１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有するヒアルロン酸を含み、少なくとも１つのレオロジー成分が、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の２～５０重量％を構成する、ヒドロゲル前駆体組成物を提供することである。
【0051】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物中、
ｉ）少なくとも１つの第１の反応性官能基は、ヒドラジド、ヒドラジン、カルボヒドラジド、アミノオキシ、アミン、セミカルバジド、チオセミカルバジド及び／又はカルバゼート基から選択され、好ましくは、少なくとも１つの第１の反応性官能基はカルボヒドラジド基（－ＣＯＮＨＮＨ２）であり、少なくとも１つの第２の反応性官能基はアルデヒド基（－ＣＨＯ）であり、並びに／あるいは
ｉｉ）少なくとも１つの第１の反応性官能基はセミカルバジド又はアミノオキシであり、少なくとも１つの第２の反応性官能基はケトンである。
ｉ）少なくとも１つの第１の反応性官能基は、ヒドラジド、ヒドラジン、カルボヒドラジド、アミノオキシ、アミン、セミカルバジド、チオセミカルバジド及び／又はカルバゼート基から選択され、好ましくは、少なくとも１つの第１の反応性官能基はカルボヒドラジド基（－ＣＯＮＨＮＨ２）であり、少なくとも１つの第２の反応性官能基はアルデヒド基（－ＣＨＯ）であり、並びに／あるいは
ｉｉ）少なくとも１つの第１の反応性官能基はセミカルバジド又はアミノオキシであり、少なくとも１つの第２の反応性官能基はケトンである。
【0052】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物は
ｉ）少なくとも１つの第１の反応性官能基及び少なくとも１つのカテコール基にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第１の成分であって、少なくとも１つの第１の反応性基がカルボヒドラジド基（－ＣＯＮＨＮＨ２）である、第１の成分と、
ｉｉ）少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第２の成分であって、少なくとも１つの第２の反応性官能基がアルデヒド基（－ＣＨＯ）である、第２の成分と、
ｉｉｉ）少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、
を含む。
ｉ）少なくとも１つの第１の反応性官能基及び少なくとも１つのカテコール基にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第１の成分であって、少なくとも１つの第１の反応性基がカルボヒドラジド基（－ＣＯＮＨＮＨ２）である、第１の成分と、
ｉｉ）少なくとも１つの第２の反応性官能基にコンジュゲートされたＨＡ成分を含む第２の成分であって、少なくとも１つの第２の反応性官能基がアルデヒド基（－ＣＨＯ）である、第２の成分と、
ｉｉｉ）少なくとも１つのレオロジー改質剤成分と、
を含む。
【0053】
一実施形態では、第１の成分のＨＡ成分は、完全にＨＡポリマーからなる。一実施形態では、第１の成分のＨＡ成分は、１００～１０００ｋＤａ、好ましくは１００～３００ｋＤａの分子量を有するＨＡポリマーからなる。
【0054】
一実施形態では、第２の成分のＨＡ成分は、完全にＨＡポリマーからなる。一実施形態では、第２の成分のＨＡ成分は、１００～１０００ｋＤａ、好ましくは１００～３００ｋＤａの分子量を有するＨＡポリマーからなる。
【0055】
一実施形態では、第１の成分の少なくとも１つの第１の反応性官能基は、－ＣＯＮＨＮＨ２部分からなるカルボヒドラジド基である。
【0056】
一実施形態では、第１の成分は、少なくとも１つのカテコール基又はその誘導体を含む。一実施形態では、第１の成分は、ＨＡ成分にコンジュゲートされたカテコールアミン又はその誘導体を含む。好ましい実施形態では、第１の成分の少なくとも１つのカテコール基は、ＨＡ成分にコンジュゲートされたドーパミン基（ＤＡ）を含むか、又はこうしたドーパミン基からなる。一実施形態では、少なくとも１つのカテコール基を含むヒドロゲル前駆体組成物は、流体がヒドロゲル前駆体組成物に添加されると、非圧潰性ヒドロゲル組成物を生成するように構成される。
【0057】
一実施形態では、第１の成分は、少なくとも１つのフェノール基を含む。一実施形態では、フェノール基を含むヒドロゲル前駆体組成物は、流体がヒドロゲル前駆体組成物に添加されると、非圧潰性ヒドロゲル組成物を生成するように構成される。
【0058】
一実施形態では、第２の成分の少なくとも１つの第２の反応性官能基は、ＨＡ成分にコンジュゲートされた－ＣＨＯ部分からなるアルデヒド基である。一実施形態では、第２の成分の少なくとも１つのアルデヒド基は、ＨＡ成分にコンジュゲートされた－ＣＨＯ部分を含む。
【0059】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分と自発的に架橋可能であるように構成される。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分と自発的にヒドラゾン架橋可能であるように構成される。一実施形態では、ヒドロゲル組成物は、ヒドロゲル前駆体組成物を流体と混合することによって得られ得る。好ましい実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物と混合される流体は液体である。ヒドロゲル前駆体組成物と混合される流体は、例えば、水又は水溶液（例えば、細胞培養培地、緩衝溶液、生理食塩水溶液及び／又はスクロース溶液）であり得る。
【0060】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分の第２の反応性官能基（複数可）は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分の第１の反応性官能基（複数可）と架橋を形成するように構成される。一実施形態では、第２の成分の第２の反応性官能基（複数可）は、ヒドロゲル前駆体組成物が流体と混合された後にのみ、第１の成分の第１の反応性官能基（複数可）と架橋を形成するように構成される。一実施形態では、架橋の形成は、自発的であるように構成され、特定の温度又は光の波長などの誘導因子を必要としない。一実施形態では、架橋の形成は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分を一緒にヒドラゾン架橋するなど、自発的クリック化学反応に基づく。
【0061】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分の反応性官能基は、架橋を形成するように構成されて、非圧潰性ヒドロゲル組成物を形成する。一実施形態では、第２の成分と架橋を形成する第１の成分の少なくとも１つの第１の反応性官能基は、カルボヒドラジド基である。一実施形態では、第２の成分と架橋を形成する第１の成分の少なくとも１つの第１の反応性官能基は、ヒドラジド、ヒドラジン、アミノオキシ、アミン、セミカルバジド、チオセミカルバジド及び／又はカルバゼート基から選択される。
【0062】
一実施形態では、第１の成分の少なくとも１つの第１の反応性官能基は、生じる架橋ヒドロゲル組成物のレオロジー特性に影響を及ぼす。一実施形態では、カルボヒドラジド基などの第１の成分の少なくとも１つの第１の反応性官能基は、第２の成分の反応性官能基と強い架橋を形成するように構成される。
【0063】
一実施形態では、アルデヒド基などの第２の成分の少なくとも１つの第２の反応性官能基は、第１の成分の反応性官能基と強い架橋を形成するように構成される。一実施形態では、第２の成分の少なくとも１つの第２の反応性官能基は、第１の成分のカルボヒドラジド基と、又は第１の成分の別の官能基と反応性である。一実施形態では、第１の成分と架橋を形成する第２の成分の少なくとも１つの第２の反応性官能基は、アルデヒド（－ＣＨＯ）基である。
【0064】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分は、少なくとも１つの共有結合を含む架橋を形成することによってコンジュゲートされるように構成される。ある実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分は、ヒドラゾン（－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－Ｎ＝Ｃ－）、オキシム（－Ｃ＝Ｎ－Ｏ－）、イミン（－Ｃ＝Ｎ－Ｃ－）、セミカルバゾン（－ＮＨ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－Ｎ＝Ｃ－）、チオセミカルバゾン（－ＮＨ－Ｃ（Ｓ）－ＮＨ－Ｎ＝Ｃ－）、又はカルバゾン（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－ＮＨ－Ｎ＝Ｃ－）結合を含む架橋を形成するように構成される。架橋速度及び安定性は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分と第２の成分との間に形成される具体的な架橋に依存して変化する。例えば、ＨＡ成分にコンジュゲートされた－ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ２基を含む第１の成分は、ＨＡ成分にコンジュゲートされた－ＮＨＮＨＣＯ（ＣＨ２）４ＣＯＮＨＮＨ２基を含む第１の成分よりも、第２の成分の反応性官能基アルデヒドと、約１５倍強い架橋を生成する。
【0065】
ヒドロゲル前駆体組成物のそれぞれの成分中のＨＡに対し最低のコンジュゲーション百分率を有する第１の成分及び第２の成分の第１又は第２の反応性官能基（複数可）が、ヒドロゲル中の架橋度を決定する。一実施形態では、第２の反応性官能基としてのアルデヒド基、又は第１の反応性官能基としてのカルボヒドラジド基のいずれかとのＨＡの最低コンジュゲーション百分率が、ヒドロゲル中の架橋度を決定する。しかしながら、ヒドロゲル前駆体組成物が、反応性官能基の１つ、例えばアルデヒド又はカルボヒドラジドを過剰に含む場合、ヒドロゲルマトリックスの安定性は、架橋度に影響を及ぼすことなく増加する。これは、ヒドラゾン架橋プロセスにおいて生成される共有結合の動的性質によるものであり、架橋は繰り返し形成及び破壊され、架橋パートナーは、パートナーの１つが過剰である場合、互いを迅速に見つけることができる。第２の成分中の過剰なアルデヒド基は、ヒドロゲル組成物の組織接着特性を増加させる。
【0066】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、架橋ヒドロゲル前駆体組成物から得られ得るヒドロゲル組成物のレオロジーを改質するように構成される。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、架橋ヒドロゲル前駆体組成物から得られ得るヒドロゲル組成物の、少なくとも粘弾性、粘度、トルク、剪断応力及び剪断速度を改質するように構成される。
【0067】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、多糖、タンパク質、合成ポリマー又はそれらの組み合わせから選択される。
【0068】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、キトサン、ナノセルロース、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、ポリビニルアルコール、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、アルブミン、又はそれらの混合物から選択される。
【0069】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、ゼラチン、Ｉ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、並びにそれらの断片及び／又は混合物から選択される細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質を含む。
【0070】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物中のレオロジー改質剤成分の重量％は、レオロジー改質剤成分の分子量に依存する。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物中のレオロジー改質剤成分の適用重量％は、適用されたレオロジー改質剤成分の分子量の増加と共に実質的に直線的に減少する。レオロジー改質剤成分は、架橋ヒドロゲル前駆体組成物から得られ得るヒドロゲルのレオロジー及び粘度を改質するように構成され、したがって、高分子量レオロジー改質剤成分の濃度が高すぎると、不必要に高い粘度を有するヒドロゲル組成物が生じる。同様に、低すぎる濃度の低分子量レオロジー改質剤成分は、不必要に低い粘度を有するヒドロゲル組成物を生じる。
【0071】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、５０ｋＤａ～１９００ｋＤａ、好ましくは５００ｋＤａ～１９００ｋＤａ、より好ましくは１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有するヒアルロン酸を含む。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物は、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の２～５０重量％、好ましくは５～４０重量％、より好ましくは７～１７重量％のＨＡをレオロジー改質剤として含む。
【0072】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、５０ｋＤａ～１９００ｋＤａ、好ましくは５００ｋＤａ～１９００ｋＤａ、より好ましくは１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有するＨＡからなる。一実施形態では、レオロジー改質剤成分はＨＡからなり、レオロジー改質剤成分の重量％は、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の２～５０重量％、好ましくは５～４０重量％、より好ましくは７～１７重量％である。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有するＨＡからなり、レオロジー改質剤成分の重量％は、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の７～１７重量％である。一実施形態では、レオロジー改質剤成分のＨＡの分子量は、３Ｄ印刷後のヒドロゲル組成物の印刷適性及び形状の保持における改善された性能に基づいて選択される。一実施形態では、１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量を有するＨＡを含むレオロジー改質剤成分は、３Ｄ印刷後のヒドロゲル組成物の印刷性能及び形状の保持に有利である。
【0073】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、２５０～３００ｋＤａの分子量を有するヒトコラーゲン、好ましくはＩ型を含む。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物は、レオロジー改質剤として、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の０．０５～４０重量％、好ましくは２～１５重量％、より好ましくは３～８重量％のコラーゲンを含む。
【0074】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、４４０～５３０ｋＤａの分子量を有するヒトフィブロネクチンを含む。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物は、レオロジー改質剤として、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の２～５０重量％、好ましくは５～３０重量％、より好ましくは７～１２重量％のヒトフィブロネクチンを含む。
【0075】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、４００～９００ｋＤａの分子量を有するラミニン、好ましくはヒト又はマウス組換えラミニンを含む。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物は、レオロジー改質剤として、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の０．２～５０重量％、好ましくは０．２～５重量％、より好ましくは０．２～２．０重量％のラミニンを含む。
【0076】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、６６～６７ｋＤａの分子量を有するヒト又はウシアルブミンを含む。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物は、レオロジー改質剤として、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の０．２～６０重量％、好ましくは３０～６０重量％、より好ましくは５４～５８重量％のアルブミンを含む。
【0077】
一実施形態では、レオロジー改質剤成分は、２つ以上のレオロジー改質剤を含む。一実施形態では、レオロジー改質剤成分は、少なくともＨＡと、アルギン酸塩、キトサン、ナノセルロース、ポリエチレングリコール、ポロキサマー、ポリビニルアルコール、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、アルブミン、又はそれらの混合物から選択される別のレオロジー改質剤とを含む。一実施形態では、レオロジー改質剤成分は、少なくともＨＡと、ＥＣＭタンパク質及び／又はアルブミンから選択される別のレオロジー改質剤とを含む。一実施形態では、レオロジー改質剤成分は、１２００～１９００ｋＤａの分子量を有するＨＡと、ＥＣＭタンパク質及び／又はアルブミンから選択される別のレオロジー改質剤とを含む。一実施形態では、レオロジー改質剤成分は、ヒドロゲル組成物の印刷性能及び形状の保持を改善するように構成されたＨＡと、ヒドロゲル前駆体組成物の生体適合性を改善するように構成された別のレオロジー改質剤としてのＥＣＭタンパク質とを含む。
【0078】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物のレオロジー改質剤成分は、ＨＡとコラーゲン、好ましくはＩ型コラーゲンとの混合物を含む。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物は、レオロジー改質剤成分として、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の２～５０重量％、好ましくは９～４０重量％、より好ましくは１１～２３重量％のＨＡとＩ型コラーゲンとの混合物を含む。
【0079】
例示的な実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物は、レオロジー改質剤成分として、１２００～１９００ｋＤａの分子量を有する１７．６重量％のＨＡを含む。別の例示的な実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物は、レオロジー改質剤成分として、３００ｋＤａの分子量を有する５．４重量％のヒトＩ型コラーゲンと、１２００～１９００ｋＤａの分子量を有する１１．９重量％のＨＡとを含む。
【0080】
一実施形態では、第１の成分の少なくとも１つの第１の反応性官能基及びカテコール基、並びに第２の成分の少なくとも１つの第２の反応性官能基は、それらのそれぞれのＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基に、又はそれらのそれぞれのＨＡ成分の任意の官能基にコンジュゲートされる。一実施形態では、第１の成分の少なくとも１つのカルボヒドラジド基及びカテコール基、並びに第２の成分の少なくとも１つのアルデヒド基は、それらのそれぞれのＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基に、又はそれらのそれぞれのＨＡ成分の任意の官能基にコンジュゲートされる。好ましくは、第１の成分の少なくとも１つのカルボヒドラジド基及びカテコール基、並びに第２の成分の少なくとも１つのアルデヒド基は、ＨＡ成分のグルクロン酸残基のヒドロキシル基（ＯＨ）の置換を介してそれらのそれぞれのＨＡ成分に、又はより好ましくは、それらのそれぞれのＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基にコンジュゲートされる。一実施形態では、第１の成分の少なくとも１つのカルボヒドラジド基及びカテコール基、並びに第２の成分の少なくとも１つのアルデヒド基は、それらのそれぞれのＨＡ成分に直接、又はリンカー成分を介してコンジュゲートされる。
【0081】
一実施形態では、少なくとも１つの第１の反応性官能基は、間にいかなるリンカーも含まず、第１の成分中のＨＡ成分に直接コンジュゲートされる。好ましくは、少なくとも１つの第１の反応性官能基は、ＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基にコンジュゲートされるか、又はＯＨ基の置換を介してＨＡ成分のグルクロン酸残基にコンジュゲートされる。
【0082】
一実施形態では、少なくとも１つの第１の反応性官能基が、リンカーＬ１を介して第１の成分のＨＡ成分にコンジュゲートされるヒドロゲル前駆体組成物であって、このリンカーＬ１が、好ましくはＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシレートヒドロキシ基の置換を介して、ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされる、ヒドロゲル前駆体組成物を開示する。一実施形態では、少なくとも１つの第１の反応性官能基が、リンカーＬ１を介して第１の成分のＨＡ成分にコンジュゲートされる、ヒドロゲル前駆体組成物であって、このリンカーＬ１が、好ましくはＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシレートヒドロキシ基の置換によって、ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされ、リンカーＬ１が、１～１０個の部分から形成され、各部分が、独立して、フェニレン（－Ｃ６Ｈ４－）、オキシム（－Ｃ＝Ｎ－Ｏ－）、イミン（－Ｃ＝Ｎ－Ｃ－）、１～１２の炭素原子を含有するアルキレン（－ＣＨ２－）、エチニジイル（－Ｃ≡Ｃ－）、エチレンジイル（－Ｃ＝Ｃ－）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）、アミド（－ＣＯ－ＮＨ－、－ＣＯ－ＮＲ’－、－ＮＨ－ＣＯ－及びＮＲ’－ＣＯ－）から選択され、Ｒ’が５未満の炭素原子を含有するアルキル基、カルボニル（－ＣＯ－）、エステル（－ＣＯＯ－及びＯＯＣ－）、ジスルフィド（－ＳＳ－）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ－、－ＳＯ２－ＮＲ’－）、スルホン（－ＳＯ２－）、ホスフェート（－Ｏ－ＰＯ２－Ｏ－）、ジアザ（－Ｎ＝Ｎ－）、ジイミン（－ＮＨＮＨ－）、第２級アミン（－ＮＨＮＨ－）及び第３級アミンである、ヒドロゲル前駆体組成物を開示する。
【0083】
一実施形態では、第１の成分が複数の第１の反応性官能基を含み、第１の反応性官能基、又は第１の反応性官能基にコンジュゲートされたリンカーＬ１が、第１の成分のＨＡ成分の二糖反復単位の５～２０％、好ましくは９～１５％、より好ましくは１２～１３％にコンジュゲートされる、ヒドロゲル前駆体組成物を開示する。
【0084】
一実施形態では、少なくとも１つの第１の反応性官能基がカルボヒドラジド基であり、リンカーＬ１が－ＮＨＮＨ－であるヒドロゲル前駆体組成物を開示する。
【0085】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの第１の反応性官能基はカルボヒドラジド基であり、この第一の反応性官能基は第１の成分中のリンカーＬ１を介してＨＡ成分にコンジュゲートされ、リンカーＬ１は、好ましくは、ＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基を介してＨＡ成分にコンジュゲートされる。あるいは、リンカーＬ１は、ＨＡ成分の二糖反復単位に含まれる別の官能基にコンジュゲートされる。
【0086】
一実施形態では、少なくとも１つのカルボヒドラジド基は、式（Ｉ）に記載のリンカーＬ１を介してＨＡのグルクロン酸残基のカルボキシル基にコンジュゲートされる（式中、ｎは好ましくは２５０～２５００であり、より好ましくはｎは２５０～７５０である）。
【化1】
【0087】
一実施形態では、少なくとも１つのカルボヒドラジド基は、グルクロン酸残基の－ＯＨ基の置換によって、リンカーＬ１を介してＨＡ成分のグルクロン酸残基にコンジュゲートされる。一実施形態では、グルクロン酸残基の－ＯＨ基は、アミノ基又はさらなるヒドラジド基などのα－置換基を含むリンカーＬ１で置換される。
【0088】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分のリンカーＬ１は、好ましくは、－ＮＨＮＨ－、及びＮＨＮＨ（ＣＨ２）ｎ－から選択される（式中、ｎは１～１２であり、好ましくはｎは４である）。好ましい実施形態では、リンカーＬ１は－ＮＨＮＨ－であり、リンカーＬ１は、ＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基を介してＨＡ成分にコンジュゲートされる。
【0089】
一実施形態では、第１の成分中にリンカーＬ１として－ＮＨＮＨ－を含むヒドロゲル前駆体組成物は、リンカーＬ１として－ＮＨＮＨ（ＣＨ２）ｎ－（式中、ｎは１～１２である）を有するヒドロゲル前駆体組成物と比較して、より速く架橋を形成するように構成される。一実施形態では、リンカーＬ１として－ＮＨＮＨ－を含むヒドロゲル前駆体組成物は、４個の炭素を含有するリンカー－ＮＨＮＨ（ＣＨ２）４－又はアジピン酸ジヒドラジド系リンカーを有するヒドロゲル前駆体組成物と比較して、印刷可能なヒドロゲル組成物をより速く形成するように構成され、形成されたヒドロゲル組成物はより安定である。一実施形態では、第１の成分中にリンカーＬ１として－ＮＨＮＨ－を含むヒドロゲル前駆体組成物は、リンカーＬ１として－ＮＨＮＨ（ＣＨ２）４を含むヒドロゲル前駆体組成物と比較して、増加した安定性を有する印刷可能なヒドロゲル組成物を形成するように構成される。
【0090】
一実施形態では、第１の成分のリンカーＬ１の構造及び長さは、カルボヒドラジド基とＨＡ成分とのコンジュゲーションのために最適化される。リンカーＬ１の最適な構造及び長さは、カルボヒドラジド基及び第１の成分のＨＡ成分が最適な立体配置を得ることを可能にし、第１の成分の第２の成分への効率的な架橋を可能にする。したがって、第１の成分のリンカーＬ１のモジュール構造及び長さは、より速い反応動力学を有する架橋ヒドロゲル組成物の高い安定性を促進する。
【0091】
一実施形態では、第１の成分は、カルボヒドラジド基である複数の第１の反応性官能基を含み、カルボヒドラジド基又はカルボヒドラジド基にコンジュゲートされたリンカーＬ１は、第１の成分のＨＡ成分の二糖反復単位の５～２０％、好ましくは９～１５％、より好ましくは１２～１３％にコンジュゲートされる。一実施形態では、カルボヒドラジド基（又はリンカーＬ１）と第１の成分のＨＡ成分の二糖反復単位とのこのコンジュゲーション百分率は、ヒドロゲル組成物の印刷適性に有益である。カルボヒドラジド基、又はカルボヒドラジド基にコンジュゲートされたリンカーＬ１が、第１の成分のＨＡ成分の二糖反復単位の２０％超にコンジュゲートされる実施形態では、ヒドロゲルの架橋及び安定性は改善されるが、印刷適性は低下する。
【0092】
一実施形態では、少なくとも１つのフェノール基及び／又はカテコール基は、間にいかなるリンカーも含まず、第１の成分中のＨＡ成分に直接コンジュゲートされる。好ましくは、少なくとも１つのフェノール基及び／又はカテコール基は、ＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基にコンジュゲートされるか、又はＯＨ基の置換を介してＨＡ成分のグルクロン酸残基にコンジュゲートされる。
【0093】
一実施形態では、少なくとも１つのフェノール基及び／又はカテコール基が、リンカーＬ２を介して第１の成分のＨＡ成分にコンジュゲートされ、このリンカーＬ２が、好ましくはＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシレートヒドロキシ基の置換を介して、ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされる、ヒドロゲル前駆体組成物を開示する。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物であって、少なくとも１つのフェノール基及び／又はカテコール基が、リンカーＬ２を介して第１の成分のＨＡ成分にコンジュゲートされ、このリンカーＬ２が、好ましくはＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシレートヒドロキシ基の置換を介して、ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされ、リンカーＬ２が、１～１０個の部分から形成され、各部分が、独立して、フェニレン（－Ｃ６Ｈ４）、オキシム（－Ｃ＝Ｎ－Ｏ－）、イミン（－Ｃ＝Ｎ－Ｃ－）、１～１２の炭素原子を含有するアルキレン（－ＣＨ２－）、エチニジイル（－Ｃ≡Ｃ－）、エチレンジイル（－Ｃ＝Ｃ－）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）、アミド（－ＣＯ－ＮＨ－、－ＣＯ－ＮＲ’－、－ＮＨ－ＣＯ及びＮＲ’－ＣＯ－）からなる群から選択され、Ｒ’が５未満の炭素原子を含有するアルキル基、カルボニル（－ＣＯ－）、エステル（－ＣＯＯ－及びＯＯＣ－）、ジスルフィド（－ＳＳ－）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ－、－ＳＯ２－ＮＲ’－）、スルホン（－ＳＯ２－）、ホスフェート（－Ｏ－ＰＯ２－Ｏ－）、ジアザ（－Ｎ＝Ｎ－）、ジイミン（－ＮＨＮＨ－）、第二級アミン（－ＮＨ－）、及び第三級アミンを示し、好ましくはリンカーＬ２が－ＮＨ（ＣＨ２）２－である、ヒドロゲル前駆体組成物を開示する。
【0094】
一実施形態では、第１の成分が複数のカテコール基及び／又はフェノール基を含み、カテコール基及び／又はフェノール基、あるいはカテコール基及び／又はフェノール基にコンジュゲートされたリンカーＬ２が、第１の成分のＨＡ成分の二糖反復単位の１～２０％、好ましくは２～１０％、より好ましくは３～６％、さらにより好ましくは３．０～３．６％にコンジュゲートされる、ヒドロゲル前駆体組成物を開示する。
【0095】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分は、第１の成分中のリンカーＬ２を介してＨＡ成分にコンジュゲートされる少なくとも１つのカテコール基を含み、リンカーＬ２は、好ましくは、ＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基を介してＨＡ成分にコンジュゲートされる。あるいは、リンカーＬ２は、ＨＡ成分の二糖反復単位に含まれる別の官能基にコンジュゲートされる。
【0096】
一実施形態では、少なくとも１つのカテコール基は、式（ＩＩ）に記載のリンカーＬ２を介してＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基にコンジュゲートされる（式中、ｎは、好ましくは２５０～２５００であり、より好ましくはｎは２５０～７５０である）。
【化2】
【0097】
一実施形態では、少なくとも１つのカテコール基は、グルクロン酸残基の－ＯＨ基の置換によってリンカーＬ２を介してＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基にコンジュゲートされる。一実施形態では、グルクロン酸残基のＯＨ基は、アミノ基などのα－置換基を含むリンカーＬ２で置換されている。
【0098】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分のリンカーＬ２は、最も好ましくは－ＮＨ（ＣＨ２）２－であり、リンカーＬ２は、好ましくはＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基を介してＨＡ成分にコンジュゲートされる。好ましい実施形態において、リンカーＬ２は、－ＮＨ（ＣＨ２）２－である。
【0099】
一実施形態では、第１の成分は複数のカテコール基を含み、カテコール基又はカテコール基にコンジュゲートされたリンカーＬ２は、第１の成分のＨＡ成分の二糖反復単位の１～２０％、好ましくは２～１０％、より好ましくは３～６％、さらにより好ましくは３．０～３．６％にコンジュゲートされる。このリンカーＬ２は、好ましくは、第１の成分のＨＡ成分のグルクロン酸単位のカルボキシル基にコンジュゲートされる。一実施形態では、第１の成分のＨＡ成分の二糖反復単位にコンジュゲートされたカテコール基の百分率は、最終ヒドロゲル組成物の組織接着特性、並びに粘弾性及びずり減粘特性に有利である。
【0100】
一実施形態では、リンカーＬ２としての－ＮＨ（ＣＨ２）２－と、第１の成分にコンジュゲートされたカテコール基とを含むヒドロゲル前駆体組成物は、カテコール基を含まないヒドロゲル前駆体組成物と比較して、印刷可能なヒドロゲル組成物をより速く形成するように構成される。
【0101】
一実施形態では、少なくとも１つのカテコール基は、ドーパミンのアミノ基をＨＡ成分のカルボキシル基と反応させることによってＨＡ成分にコンジュゲートされる。
【0102】
一実施形態では、少なくとも１つの第２の反応性官能基は、間にいかなるリンカーも含まず、第２の成分中のＨＡ成分に直接コンジュゲートされる。好ましくは、少なくとも１つの第２の反応性官能基は、ＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基にコンジュゲートされるか、又はＯＨ基の置換を介してＨＡ成分のグルクロン酸残基にコンジュゲートされる。
【0103】
一実施形態では、少なくとも１つの第２の反応性官能基が、リンカーＬ３を介して第２の成分のＨＡ成分にコンジュゲートされ、このリンカーＬ３が、好ましくはＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシレートヒドロキシ基の置換を介して、ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされる、ヒドロゲル前駆体組成物を開示する。一実施形態では、少なくとも１つの第２の反応性官能基が、リンカーＬ３を介して第２の成分のＨＡ成分にコンジュゲートされ、このリンカーＬ３が、好ましくはＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシレートヒドロキシ基の置換によって、ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされ、リンカーＬ３が、１～１０個の部分から形成され、各部分が、独立して、フェニレン（－Ｃ６Ｈ４－）、オキシム（－Ｃ＝Ｎ－Ｏ－）、イミン（－Ｃ＝Ｎ－Ｃ－）、１～１２の炭素原子を含有するアルキレン（－ＣＨ２－）、エチニジイル（－Ｃ≡Ｃ－）、エチレンジイル（－Ｃ＝Ｃ－）、エーテル（－Ｏ－）、チオエーテル（－Ｓ－）、アミド（－ＣＯ－ＮＨ－、－ＣＯ－ＮＲ’－、－ＮＨ－ＣＯ－及びＮＲ’－ＣＯ－）からなる群から選択され、Ｒ’が５未満の炭素原子を含有するアルキル基、カルボニル（－ＣＯ－）、エステル（－ＣＯＯ－及びＯＯＣ－）、ジスルフィド（－ＳＳ－）、スルホンアミド（－ＳＯ２－ＮＨ－、－ＳＯ２－ＮＲ’－）、スルホン（－ＳＯ２－）、ホスフェート（－Ｏ－ＰＯ２－Ｏ－）、ジアザ（－Ｎ＝Ｎ－）、ジイミン（－ＮＨＮＨ－）、及び第３級アミンである、ヒドロゲル前駆体組成物を開示する。
【0104】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分は、複数の第２の反応性官能基、好ましくはアルデヒド基を含み、第２の反応性官能基又は第２の反応性官能基にコンジュゲートされたリンカーＬ３は、第２の成分のＨＡ成分の二糖反復単位の５～５０％、好ましくは９～１５％、より好ましくは１１～１３％にコンジュゲートされる。
【0105】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の少なくとも１つの第２の反応性官能基はアルデヒド基（－ＣＨＯ）であり、リンカーＬ３は－ＮＨＣＨ２－である。
【0106】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの第２の反応性官能基は、第２の成分中のリンカーＬ３を介してＨＡ成分にコンジュゲートされたアルデヒド基であり、リンカーＬ３は、好ましくは、ＨＡのグルクロン酸残基のカルボキシル基を介してＨＡ成分にコンジュゲートされる。あるいは、リンカーＬ３は、ＨＡ成分の二糖反復単位に含まれる別の官能基にコンジュゲートされる。
【0107】
一実施形態では、少なくとも１つの第２の反応性官能基は、式（ＩＩＩ）に記載のリンカーＬ３を介してＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基にコンジュゲートされるアルデヒド基である（式中、ｎは好ましくは２５０～２５００であり、より好ましくはｎは２５０～７５０である）。
【化3】
【0108】
一実施形態では、少なくとも１つのアルデヒド基は、グルクロン酸残基の－ＯＨ基の置換によってリンカーＬ３を介してＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基にコンジュゲートされる。一実施形態では、グルクロン酸残基の－ＯＨ基は、アミノ基などのα－置換基を含むリンカーＬ３で置換されている。
【0109】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分のリンカーＬ３は、最も好ましくは－ＮＨ（ＣＨ２）ｎ－であり、ｎは１～１２であり、好ましくはｎは２であり、より好ましくはｎは１である。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分のリンカーＬ３は、最も好ましくは－ＮＨＣＨ２－であり、リンカーＬ３は、ＨＡ成分のグルクロン酸残基のカルボキシル基を介してＨＡ成分にコンジュゲートされる。別の実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分のリンカーＬ３は、－ＮＨＮＨ－である。
【0110】
一実施形態では、第２の成分のリンカーＬ３の構造及び長さは、第２の反応性官能基とＨＡ成分とのコンジュゲーションのために最適化される。リンカーＬ３の構造及び長さが最適であれば、アルデヒド基及び第２の成分のＨＡ成分が最適な立体配置を得ることが可能になり、第１の成分の第２の成分への効率的な架橋が可能になる。したがって、第２の成分のリンカーＬ３のモジュール構造及び長さは、架橋ヒドロゲル組成物の高い安定性を促進する。
【0111】
一実施形態では、アルデヒド基は、リンカーＬ３を使用せずに、第２の成分のＨＡ成分の二糖反復単位の５～５０％、好ましくは９～１５％、より好ましくは１１～１３％までの、ＨＡ成分のグルクロン酸残基中のＣ２及びＣ３ヒドロキシルのＮａＩＯ４媒介酸化によって生成される。アミノグリセロール基のグラフト化とそれに続くＮａＩＯ４酸化によるこの様式で生成されるアルデヒド基は、ポリマーの断片化を最小限に抑え、ＨＡの生物活性を保存するため、従来の骨格酸化よりも好ましい。アミノグリセロール基のグラフト化とそれに続くＮａＩＯ４酸化によってアルデヒド基を生成するこのアプローチは、第２の成分のＨＡ成分の二糖反復単位にコンジュゲートされるアルデヒド基の程度に対して、改善された制御を提供する。
【0112】
好ましい実施形態では、カルボヒドラジド基又はカルボヒドラジド基にコンジュゲートされたリンカーＬ１は、ＨＡ成分の二糖反復単位の１２～１３％にコンジュゲートされ、カテコール基又はカテコール基にコンジュゲートされたリンカーＬ２は、第１の成分中のＨＡ成分の二糖反復単位の３．０～３．６％にコンジュゲートされる。好ましい実施形態では、アルデヒド基又はアルデヒド基にコンジュゲートされたリンカーＬ３は、第２の成分のＨＡ成分の二糖反復単位の１１～１３％にコンジュゲートされる。
【0113】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物は、成長因子、抗体、ホルモン、ペプチド、ポリペプチド、ナノ粒子、並びにそれらの断片及び／又は混合物から選択される少なくとも１つの調節シグナル成分も含む。一実施形態では、調節シグナル成分は、ヘパリン、ヘパリン由来ナノ粒子、成長因子封入ナノキャリア、及び／又は成長因子（複数可）を安定化するように適合された成長因子固定化生体材料を含む。一実施形態では、調節シグナル成分は、超常磁性酸化鉄ＮＰ（ＳＰＩＯＮ）であるナノ粒子を含む。一実施形態では、調節シグナル成分は、バイオインク中のニューロン、心筋細胞又は筋芽細胞を利用する場合に伝導特性を付与する金ナノ粒子を含む。ヒドロゲル前駆体組成物の少なくとも１つの調節シグナル成分は、印刷可能なバイオインクを得るために、ヒドロゲル前駆体組成物と混合される細胞タイプに基づいて選択される。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物と混合される少なくとも１つの調節シグナル成分は、ヒドロゲル前駆体組成物中に混合される細胞の分化を誘導又は促進するように構成される。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物と混合された少なくとも１つの調節シグナル成分は、細胞増殖、接着、細胞運命決定を促進し、かつ／又はヒドロゲル前駆体組成物中に混合された細胞のセクレトームに影響を及ぼすように構成される。一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物と混合された少なくとも１つの調節シグナル成分は、ヒドロゲル前駆体組成物中に混合された細胞の組織構造発達を促進するように構成される。
【0114】
好ましい実施形態によれば、したがって、ヒドロゲル前駆体成分の少なくとも１つのレオロジー改質剤成分は
１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量のヒアルロン酸と、
２５０～３００の分子量のコラーゲン、好ましくはＩ型と、
を含み、少なくとも１つのレオロジー成分は、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の２～５０重量％、好ましくは９～４０重量％、より好ましくは１１～２３重量％を構成する。
１２００ｋＤａ～１９００ｋＤａの分子量のヒアルロン酸と、
２５０～３００の分子量のコラーゲン、好ましくはＩ型と、
を含み、少なくとも１つのレオロジー成分は、ヒドロゲル前駆体組成物の総重量の２～５０重量％、好ましくは９～４０重量％、より好ましくは１１～２３重量％を構成する。
【0115】
少なくとも１つのレオロジー改質剤成分はまた、好ましくはゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、並びにそれらの断片及び／又は混合物から選択される１つ以上のさらなる細胞外マトリックスタンパク質を含んでもよい。
【0116】
好ましい実施形態によれば、ヒドロゲル前駆体成分の少なくとも１つの第１の反応性基はカルボヒドラジドであり、少なくとも１つの第２の反応性基はアルデヒドである。
【0117】
別の好ましい実施形態によれば、ヒドロゲル前駆体成分の少なくとも１つの第１の反応性基はアルデヒドであり、少なくとも１つの第２の反応性基はカルボヒドラジドである。
【0118】
好ましい実施形態によれば、第１の成分及び第２の成分の分子量は、１００～１０００ｋＤａ、好ましくは１００～３００ｋＤａである。
【0119】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物を、細胞を含む流体と混合することによって得られ得るバイオインクを提供する。
【0120】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物及び細胞は、その中に混合されている細胞と等張である流体中で混合される。一実施形態では、選択された流体は、その中に細胞が混合されている等張性ヒドロゲル組成物を生成する。好ましい実施形態では、細胞及びヒドロゲル前駆体組成物と混合される流体は、液体である。細胞及びヒドロゲル前駆体組成物と混合される流体は、細胞培養培地などの水溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの生理食塩水溶液、別の緩衝溶液、及び／又はスクロース溶液であってもよい。
【0121】
一実施形態では、細胞は未分化幹細胞及び／又は分化細胞を含む。一実施形態では、細胞はヒト細胞又は哺乳動物細胞を含む。一実施形態では、細胞は、増殖性細胞及び／又は非増殖性細胞を含む。一実施形態では、細胞は、好ましくは同じ種を起源とする、異なる細胞タイプの混合物を含む。一実施形態では、細胞は、ｈＡＳＣ、ｈＡＳＣ由来角膜間質様細胞、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）由来神経細胞（ＮＣ）及び／又はｈＰＳＣ由来角膜内皮細胞を含む。一実施形態では、細胞は、肝細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞及び／又は線維芽細胞を含む。
【0122】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物及び／又はバイオインクは、バイオインク中の細胞生存性を促進する栄養素を含み、栄養素は、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、脂肪酸、脂質、微量元素、抗生物質、ビタミン、無機塩、炭水化物、及び／又は血清から選択される。
【0123】
一実施形態では、３Ｄ印刷などの積層造形のためのヒドロゲル前駆体組成物又はバイオインクの使用を提供する。
【0124】
一実施形態では、バイオインクを３Ｄ印刷するための方法であって、ａ）ヒドロゲル前駆体組成物を、細胞を含む流体と混合することと、ｂ）ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分を、この流体中でヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分と架橋させることと、ｃ）バイオインクの粘度が２００～２０００Ｐａ・ｓである場合に、バイオインクを３Ｄ印刷することと、を含む方法を開示する。
【0125】
一実施形態では、３Ｄ印刷のための方法は、ヒドロゲル前駆体組成物を、細胞を含む流体に混合して、バイオプリント可能なバイオインクを得ることを含む。一実施形態では、ヒドロゲルは、ヒドロゲル前駆体組成物の成分の自発的架橋によって得られ得る。一実施形態では、バイオインクは、ヒドロゲル前駆体組成物が細胞を含む流体中で混合される際に、該組成物の成分の自発的な架橋によって得られ得る。流体と混合されたヒドロゲル前駆体組成物は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分の反応性官能基と第２の成分の反応性官能基との間に架橋を形成するように構成される。生じた架橋ヒドロゲル組成物は、３Ｄ印刷法で印刷可能である。架橋ヒドロゲル組成物及び細胞を含むバイオインクは、３Ｄ印刷法で印刷可能である。
【0126】
一実施形態では、架橋バイオインクが印刷可能である期間は制限され、バイオファブリケーションウィンドウが、ヒドロゲル前駆体組成物の組成によって決定されることで、バイオインクの架橋形成動態が決定される。ヒドロゲル及び／又はバイオインクの架橋は、流体がヒドロゲル前駆体組成物に添加されたときに開始する連続プロセスである。ヒドロゲル及び／又はバイオインクは、適切な量の架橋が形成されるため、印刷可能であり、それによって、ヒドロゲル及び／又はバイオインクに印刷のための最適な粘度及びずり減粘特性を与える。一実施形態では、印刷されたヒドロゲル及び／又はバイオインク構造を、例えば硬化によって安定化させることは、さらなる架橋を促進し、印刷後の印刷されたバイオインク構造の安定性を高める。
【0127】
ヒドロゲル及び／又はバイオインクを得るための例示的なプロセスを図１に示す。例示的なヒドロゲル前駆体組成物は、第１の成分１、ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨ（ヒアルロン酸－ドーパミン－カルボヒドラジド）と、第２の成分２、ＨＡ－Ａｌｄ（ヒアルロン酸－アルデヒド）と、２つのレオロジー改質剤成分であるＩ型コラーゲン及びＨＡを含む第３の成分３と、を含む（工程（Ｉ））。ヒドロゲル前駆体組成物を緩衝液又は細胞培養培地などの流体と混合すると（工程（ＩＩ））、ドーパミン及びコラーゲンとの強い二次相互作用と共に自発的ヒドラゾン架橋反応が起こり、二重ネットワーク構造が形成されることによってヒドロゲル組成物が形成される（工程（ＩＩＩ））。図１にも示されるように、バイオインクは、ヒドロゲル前駆体組成物を、細胞を含む流体と混合することによって得られる。ヒト脂肪細胞組織由来幹細胞（ｈＡＳＣ）及びｈＡＳＣ由来角膜間質様細胞などの哺乳動物細胞は、架橋前にヒドロゲルと混合され、バイオインクの形成を生じる。その結果、生じたヒドロゲル及び／又はバイオインクは、積層造形のためのあらかじめ決定された期間（バイオファブリケーションウィンドウ）に適している。バイオインクは、バイオファブリケーションウィンドウ内で３Ｄバイオプリントすることができ、その結果、生存可能なバイオプリントされた足場が生じる。
【0128】
ヒドロゲル及びヒドロゲルを含むバイオインクは、印刷可能でなければならないが、また十分に安定でなければならない。安定性は、ヒドロゲルの架橋度によって影響され、架橋度は、ヒドロゲルにおいて使用されるヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分の濃度によって部分的に影響される。一実施形態では、ヒドロゲル組成物中のヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分を合わせた濃度は、好ましくは２．５～１５．５ｍｇ／ｍｌである。一実施形態では、バイオインク中のヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分を合わせた濃度は、好ましくは２．５～１５．５ｍｇ／ｍｌである。ヒドロゲルの架橋度は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分の利用可能な反応性官能基によっても影響を受ける。架橋度は、それぞれのＨＡ成分の二糖反復単位に結合した、第１の成分中の第１の反応性官能基、又は第２の成分中の第２の反応性官能基の制限量のいずれかより低い量によって決定される。架橋度は、それぞれ第２の反応性官能基又は第１の反応性官能基と架橋されている第１の反応性官能基又は第２の反応性官能基にコンジュゲートされる第１及び第２のＨＡ成分の二糖反復単位の百分率を指す。バイオインクの架橋度は、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分のリンカーＬ１、Ｌ２及び／又はＬ３の組成によってさらに影響を受ける可能性がある。第１の成分と第２の成分との間に形成されるヒドラゾン架橋の程度は、第１及び第２のＨＡ成分の二糖反復単位の総量の１５％未満でなければならない。ヒドラゾン架橋度が、第１の成分及び第２の成分のＨＡ成分の二糖反復単位を合わせた量の１５％を超える場合、架橋速度が速すぎることでヒドロゲルの印刷適性が制限される。
【0129】
一実施形態では、架橋ヒドロゲル組成物及び／又はバイオインクは、ヒドロゲル組成物の粘度が１００～５０００Ｐａ・ｓ、好ましくは２００～２０００Ｐａ・ｓである場合に印刷可能である。一実施形態では、３Ｄ印刷のための方法は、混合物の粘度が１００～５０００Ｐａ・ｓ、好ましくは２００～２０００Ｐａ・ｓに達するまで、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分を架橋させることを含む。一実施形態では、３Ｄ印刷のための方法は、ヒドロゲル組成物の粘度が１００～５０００Ｐａ・ｓ、好ましくは２００～２０００Ｐａ・ｓである場合に、ヒドロゲル組成物を３Ｄ印刷することを含む。
【0130】
一実施形態では、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分は、１～３８℃の温度で架橋するように構成される。一実施形態では、ヒドロゲル架橋温度は、１８～２４℃、好ましくは１９～２２℃の範囲内の室温である。一実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクの架橋に最適な温度は、１～３８℃、好ましくは１８～２４℃である。一実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクの架橋に最適な温度は、１～３８℃、好ましくは１８～２４℃、より好ましくは１９～２２℃である。
【0131】
好ましい実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクの架橋を、ヒドロゲル及び／又はバイオインクの粘度が約２００Ｐａ・ｓに達するまで進行させた後、ヒドロゲル及び／又はバイオインクは印刷に使用され得る。一実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクの架橋は、ヒドロゲル及び／又はバイオインクの粘度が２００Ｐａ・ｓに達するまで、２０℃で最大６０分間、好ましくは４５～６０分間進行する。
【0132】
一実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクが印刷可能である、すなわち、加工され得る期間は、架橋成分、すなわち、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分の使用濃度に依存する。一実施形態では、５．８３ｍｇ／ｍｌの架橋成分を含むヒドロゲル／バイオインクの場合、バイオファブリケーションウィンドウは、少なくとも１５０分、又は好ましくは少なくとも９０分である。一実施形態では、ヒドロゲル／バイオインクを印刷するための印刷圧は、使用印刷ノズルのサイズに依存する。
【0133】
一実施形態では、３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物は、好ましくは、印刷後に十分な安定性を達成するために、印刷後にさらなる架橋を形成することを可能にされる。一実施形態では、３Ｄ印刷されたバイオインクをさらなるプロセシングのために等張液に浸漬する前に、バイオインクは、３Ｄ印刷後に安定化され、さらなる架橋を形成することを可能にされる。一実施形態では、３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物及び／又はバイオインクは、好ましくは、印刷後のヒドロゲルの十分な安定性を達成するため、印刷されたヒドロゲルをさらなるプロセシングのために等張液に浸漬する前に、ある期間硬化される。一実施形態では、３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物及び／又はバイオインクは、１５～６０分間硬化される。
【実施例】
【0134】
実施例１．本発明のヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分の一部としてのドーパミン修飾ヒアルロン酸の合成
１ｍｍｏｌのＨＡ（４００ｍｇ、１当量）を６０ｍＬの脱イオン水に溶解し、次いでそれに１ｍｍｏｌのＨＯＢｔ（１５３ｍｇ、１当量）及び１ｍｍｏｌのドーパミン（１９０ｍｇ、１当量）を添加した。反応溶液のｐＨを１Ｍ ＨＣｌ及び１Ｍ ＮａＯＨで５．５に調整した。次いで、０．２５ｍｍｏｌのＥＤＣ（４８ｍｇ、０．２５当量）を３０分間隔で２バッチで添加した。溶液のｐＨを５．５に６時間維持し、次いで一晩撹拌した。反応混合物を透析バッグに装填し、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する希ＨＣｌ（ｐＨ＝３．５）に対して透析し（４×２Ｌ、２４時間）、続いて希ＨＣｌ中で透析し（ｐＨ３．５、２×２Ｌ、２４時間）、次いで脱イオン水に対して透析した（２×２Ｌ、２４時間）。その後、溶液を凍結乾燥した。ドーパミンは、そのα－アミノ基を介して、ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされるため、リンカーＬ２は、－ＮＨ（ＣＨ２）２－である。ドーパミンコンジュゲーションの程度は、ＮＭＲ分光法（１Ｈ ＮＭＲ、３００ＭＨｚ）によって推定されるように、３．６％（ＨＡの二糖単位に対して）であった。
１ｍｍｏｌのＨＡ（４００ｍｇ、１当量）を６０ｍＬの脱イオン水に溶解し、次いでそれに１ｍｍｏｌのＨＯＢｔ（１５３ｍｇ、１当量）及び１ｍｍｏｌのドーパミン（１９０ｍｇ、１当量）を添加した。反応溶液のｐＨを１Ｍ ＨＣｌ及び１Ｍ ＮａＯＨで５．５に調整した。次いで、０．２５ｍｍｏｌのＥＤＣ（４８ｍｇ、０．２５当量）を３０分間隔で２バッチで添加した。溶液のｐＨを５．５に６時間維持し、次いで一晩撹拌した。反応混合物を透析バッグに装填し、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する希ＨＣｌ（ｐＨ＝３．５）に対して透析し（４×２Ｌ、２４時間）、続いて希ＨＣｌ中で透析し（ｐＨ３．５、２×２Ｌ、２４時間）、次いで脱イオン水に対して透析した（２×２Ｌ、２４時間）。その後、溶液を凍結乾燥した。ドーパミンは、そのα－アミノ基を介して、ＨＡ成分のカルボキシル基にコンジュゲートされるため、リンカーＬ２は、－ＮＨ（ＣＨ２）２－である。ドーパミンコンジュゲーションの程度は、ＮＭＲ分光法（１Ｈ ＮＭＲ、３００ＭＨｚ）によって推定されるように、３．６％（ＨＡの二糖単位に対して）であった。
【0135】
実施例２．本発明のヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分としてのドーパミン及びカルボヒドラジド修飾ヒアルロン酸（ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨ）の合成
第１の反応性基としてのカルボヒドラジド基（－ＣＯＮＨＮＨ２）及びカテコール基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第１の成分を合成した。ドーパミン修飾ヒアルロン酸（ＨＡ－ＤＡ）上へのカルボヒドラジド（ＣＤＨ）のコンジュゲーションを、カルボジイミドカップリング化学によって行った。簡潔に述べると、０．５ｍｍｏｌのＨＡ－ＤＡ（２００ｍｇ、１当量）を１２０ｍＬの脱イオン水に溶解した。その後、０．３７５ｍｍｏｌのカルボジヒドラジド（３４ｍｇ、０．７５当量）及び０．５ｍｍｏｌのＨＯＢｔ（７６．５ｍｇ、１当量）をＨＡ－ＤＡ水溶液に添加した。反応混合物のｐＨを４．７に調整した。最後に、０．１ｍｍｏｌのＥＤＣ・ＨＣｌ（２０ｍｇ、０．２当量）を加え、一晩撹拌した。反応混合物を透析バッグに装填し、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する希ＨＣｌ（ｐＨ＝３．５）に対して透析し（４×２Ｌ、２４時間）、続いて希ＨＣｌ中で透析し（ｐＨ３．５、２×２Ｌ、２４時間）、次いで脱イオン水に対して透析した（２×２Ｌ、２４時間）。その後、混合物を凍結乾燥してＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨを得た。ヒドラジド修飾の程度は、ＴＮＢＳアッセイを使用して決定されるように、１３．２％（ＨＡの二糖反復単位に関して）であることが見出された。カルボジヒドラジド（ＮＨ２ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）はＨＡ－ＤＡのＣＯＯＨ基と反応可能であったため、形成されるリンカーＬ１は－ＮＨＮＨ－である。
第１の反応性基としてのカルボヒドラジド基（－ＣＯＮＨＮＨ２）及びカテコール基にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第１の成分を合成した。ドーパミン修飾ヒアルロン酸（ＨＡ－ＤＡ）上へのカルボヒドラジド（ＣＤＨ）のコンジュゲーションを、カルボジイミドカップリング化学によって行った。簡潔に述べると、０．５ｍｍｏｌのＨＡ－ＤＡ（２００ｍｇ、１当量）を１２０ｍＬの脱イオン水に溶解した。その後、０．３７５ｍｍｏｌのカルボジヒドラジド（３４ｍｇ、０．７５当量）及び０．５ｍｍｏｌのＨＯＢｔ（７６．５ｍｇ、１当量）をＨＡ－ＤＡ水溶液に添加した。反応混合物のｐＨを４．７に調整した。最後に、０．１ｍｍｏｌのＥＤＣ・ＨＣｌ（２０ｍｇ、０．２当量）を加え、一晩撹拌した。反応混合物を透析バッグに装填し、１００ｍＭ ＮａＣｌを含有する希ＨＣｌ（ｐＨ＝３．５）に対して透析し（４×２Ｌ、２４時間）、続いて希ＨＣｌ中で透析し（ｐＨ３．５、２×２Ｌ、２４時間）、次いで脱イオン水に対して透析した（２×２Ｌ、２４時間）。その後、混合物を凍結乾燥してＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨを得た。ヒドラジド修飾の程度は、ＴＮＢＳアッセイを使用して決定されるように、１３．２％（ＨＡの二糖反復単位に関して）であることが見出された。カルボジヒドラジド（ＮＨ２ＮＨＣＯＮＨＮＨ２）はＨＡ－ＤＡのＣＯＯＨ基と反応可能であったため、形成されるリンカーＬ１は－ＮＨＮＨ－である。
【0136】
実施例３．本発明のヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分としてのアルデヒド修飾ヒアルロン酸（ＨＡ－Ａｌｄ）の合成
第２の反応性基としてのアルデヒド基（－ＣＨＯ）にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第２の成分を合成した。表題化合物を、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３に開示されているように合成した。アルデヒド基（－ＣＨＯ）を、この文献に開示されているようにＨＡ成分にコンジュゲートし、形成されるリンカーＬ３は－ＮＨＣＨ２－であった。ＨＡ中のアルデヒド修飾の百分率は、１Ｈ ＮＭＲ分光法によって決定した際、（二糖単位に対して）９％であることが見出された。アルデヒド修飾の程度は、ｔｅｒｔ－ブチルカルバゼートをアルデヒド修飾ＨＡと反応させ、続いてＮａＣＮＢＨ３還元し、ＨＡの２．０ｐｐｍでのＮ－アセチルシグナルに対して１．４ｐｐｍでのｔｅｒｔ－ブチルシグナルを統合することによって推定した。
第２の反応性基としてのアルデヒド基（－ＣＨＯ）にコンジュゲートされたヒアルロン酸（ＨＡ）成分を含む第２の成分を合成した。表題化合物を、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３に開示されているように合成した。アルデヒド基（－ＣＨＯ）を、この文献に開示されているようにＨＡ成分にコンジュゲートし、形成されるリンカーＬ３は－ＮＨＣＨ２－であった。ＨＡ中のアルデヒド修飾の百分率は、１Ｈ ＮＭＲ分光法によって決定した際、（二糖単位に対して）９％であることが見出された。アルデヒド修飾の程度は、ｔｅｒｔ－ブチルカルバゼートをアルデヒド修飾ＨＡと反応させ、続いてＮａＣＮＢＨ３還元し、ＨＡの２．０ｐｐｍでのＮ－アセチルシグナルに対して１．４ｐｐｍでのｔｅｒｔ－ブチルシグナルを統合することによって推定した。
【0137】
実施例４．ヒドロゲル組成物の調製
ヒドロゲル組成物を、ヒドラゾン架橋化学を用いて調製した。合成されたＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨ（ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分）及びＨＡ－Ａｌｄ（ヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分）成分をＵＶで２０分間滅菌し、濃度１０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）で滅菌ＰＢＳに溶解した。１２００～１９００ｋＤａのＭｗを有するヒアルロン酸ナトリウム（Ｐｈａｒｍａ Ｇｒａｄｅ １５０）（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ）を一次レオロジー改質剤成分として使用し、０．４Ｍ ＮａＣｌを含む滅菌５×ＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）の濃度で溶解した。ＯｐｔｉＣｏｌ（商標）ヒトＩ型コラーゲン（３．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｃｅｌｌ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を、生体適合性及び粘弾性を増加させるための二次レオロジー改質剤成分としてヒドロゲル前駆体組成物に導入した。ヒトＩ型コラーゲンを、１０Ｘダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ，Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下、１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でｐＨ７．４に中和した。最終ヒドロゲル組成物中の架橋成分、すなわち、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分の濃度は、５．８３ｍｇ／ｍｌであった。最終ヒドロゲル組成物は、ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨ ２９．２％（ｖ／ｖ）、ＨＡ－Ａｌｄ ２９．２％（ｖ／ｖ）、ＨＡ １２．５％（ｖ／ｖ）、中和ヒトＩ型コラーゲン１８．２％（ｖ／ｖ）及び細胞培養培地１０．９％（ｖ／ｖ）からなった。成分の混合は、２つのシリンジをメス－メスルアーロック（female-female luer lock）で組み合わせたデュアルシリンジシステムを使用して行った。完全に混合した後、混合物を３０ｃｃのＮｏｒｄｓｏｎ ＥＦＤシリンジバレルに入れ、カートリッジピストンを直ちにバレルに入れた。混合物の架橋成分に、室温で４５～６０分間にわたり架橋及び硬化させて、印刷可能なヒドロゲルを形成させた。架橋は、印刷のためにヒドロゲルを使用する前に、ヒドロゲルが最適なコンシステンシー及び粘度を得ることを可能にする。
ヒドロゲル組成物を、ヒドラゾン架橋化学を用いて調製した。合成されたＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨ（ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分）及びＨＡ－Ａｌｄ（ヒドロゲル前駆体組成物の第２の成分）成分をＵＶで２０分間滅菌し、濃度１０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）で滅菌ＰＢＳに溶解した。１２００～１９００ｋＤａのＭｗを有するヒアルロン酸ナトリウム（Ｐｈａｒｍａ Ｇｒａｄｅ １５０）（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ）を一次レオロジー改質剤成分として使用し、０．４Ｍ ＮａＣｌを含む滅菌５×ＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）の濃度で溶解した。ＯｐｔｉＣｏｌ（商標）ヒトＩ型コラーゲン（３．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｃｅｌｌ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を、生体適合性及び粘弾性を増加させるための二次レオロジー改質剤成分としてヒドロゲル前駆体組成物に導入した。ヒトＩ型コラーゲンを、１０Ｘダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ，Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の存在下、１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）でｐＨ７．４に中和した。最終ヒドロゲル組成物中の架橋成分、すなわち、ヒドロゲル前駆体組成物の第１の成分及び第２の成分の濃度は、５．８３ｍｇ／ｍｌであった。最終ヒドロゲル組成物は、ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨ ２９．２％（ｖ／ｖ）、ＨＡ－Ａｌｄ ２９．２％（ｖ／ｖ）、ＨＡ １２．５％（ｖ／ｖ）、中和ヒトＩ型コラーゲン１８．２％（ｖ／ｖ）及び細胞培養培地１０．９％（ｖ／ｖ）からなった。成分の混合は、２つのシリンジをメス－メスルアーロック（female-female luer lock）で組み合わせたデュアルシリンジシステムを使用して行った。完全に混合した後、混合物を３０ｃｃのＮｏｒｄｓｏｎ ＥＦＤシリンジバレルに入れ、カートリッジピストンを直ちにバレルに入れた。混合物の架橋成分に、室温で４５～６０分間にわたり架橋及び硬化させて、印刷可能なヒドロゲルを形成させた。架橋は、印刷のためにヒドロゲルを使用する前に、ヒドロゲルが最適なコンシステンシー及び粘度を得ることを可能にする。
【0138】
実施例５．３Ｄ印刷
実施例４に開示されたヒドロゲルを用いて３Ｄ印刷を行った。Ｅｎｖｉｓｉｏｎｔｅｃ（Ｇｌａｄｂｅｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による３Ｄ－Ｂｉｏｐｌｏｔｔｅｒ（登録商標）Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ Ｓｅｒｉｅｓによる押出ベースの３Ｄ印刷を使用した。プレ架橋期間後、３Ｄ印刷のための９０分のバイオファブリケーションウィンドウが得られた。ヒドロゲル組成物を有するバレルを、３Ｄバイオプリンターの低温プリントヘッドに装填した。０．５０インチの長さ及び１００μｍの内径を有する３２Ｇブラント針を印刷のために使用した。プリントヘッド温度を２０℃に調整し、印刷を室温で行った。．ｓｔｌフォーマットの３ＤモデルをＰｅｒｆａｃｔｏｒｙ ＲＰ Ｓｏｆｔｗａｒｅで作成し、印刷パターンを含む内部パラメータをＶｉｓｕａｌｓ Ｍａｃｈｉｎｅで調整した。８０μｍのスライス間隔を全ての印刷構造に使用し、針の高さを０．０７ｍｍに調整した。細胞を含むヒドロゲル、すなわちバイオインクを用いた３Ｄ印刷のために、１．０バールの印刷圧及び６．０ｍｍ／ｓの印刷速度を使用した。バイオインクに使用された３Ｄ印刷パラメータは、他の点では上に開示されたものと同じであった。
実施例４に開示されたヒドロゲルを用いて３Ｄ印刷を行った。Ｅｎｖｉｓｉｏｎｔｅｃ（Ｇｌａｄｂｅｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による３Ｄ－Ｂｉｏｐｌｏｔｔｅｒ（登録商標）Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ Ｓｅｒｉｅｓによる押出ベースの３Ｄ印刷を使用した。プレ架橋期間後、３Ｄ印刷のための９０分のバイオファブリケーションウィンドウが得られた。ヒドロゲル組成物を有するバレルを、３Ｄバイオプリンターの低温プリントヘッドに装填した。０．５０インチの長さ及び１００μｍの内径を有する３２Ｇブラント針を印刷のために使用した。プリントヘッド温度を２０℃に調整し、印刷を室温で行った。．ｓｔｌフォーマットの３ＤモデルをＰｅｒｆａｃｔｏｒｙ ＲＰ Ｓｏｆｔｗａｒｅで作成し、印刷パターンを含む内部パラメータをＶｉｓｕａｌｓ Ｍａｃｈｉｎｅで調整した。８０μｍのスライス間隔を全ての印刷構造に使用し、針の高さを０．０７ｍｍに調整した。細胞を含むヒドロゲル、すなわちバイオインクを用いた３Ｄ印刷のために、１．０バールの印刷圧及び６．０ｍｍ／ｓの印刷速度を使用した。バイオインクに使用された３Ｄ印刷パラメータは、他の点では上に開示されたものと同じであった。
【0139】
実施例６．ヒドロゲル組成物の粘度及びずり減粘
実施例４に封入されたヒドロゲル組成物の注入性及びずり減粘特性を測定した。連続流下（０．０１～１０ｓ－１）及び周期流下の両方で、ヒドロゲルの粘度及び流動特性を測定した。周期流に関して使用された剪断速度は、ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＤＨＲ－ＩＩレオメーターにおいて、１２ｍｍステンレス鋼平行板形状を使用して、各サイクルについて６０秒の保持時間を有する７サイクルまで、０．０１及び１０ｓ－１であった。図２は、Ａ）連続流及びＢ）周期流の下でのヒドロゲル組成物の粘度をＰａ・ｓとして開示しており、ヒドロゲル組成物が優れた注入性及びずり減粘特性を有することを開示する。実施例４の架橋ヒドロゲルの歪み回復をさらに評価するために、その貯蔵弾性率及び損失弾性率を測定した。測定は、低（１％歪み）振動歪み条件と高（５０％歪み）振動歪み条件とを交互に繰り返す流動下、２５℃及び１Ｈｚの振動周波数で、各工程において６０秒の保持期間を有する７サイクルについて、直径１２ｍｍのステンレス鋼平行板形状を使用して行った。図３におけるヒドロゲル組成物の貯蔵弾性率（Ｐａ）及び損失弾性率（Ｐａ）を開示する結果は、ヒドロゲル組成物が歪み下でずり減粘性であることを示す。
実施例４に封入されたヒドロゲル組成物の注入性及びずり減粘特性を測定した。連続流下（０．０１～１０ｓ－１）及び周期流下の両方で、ヒドロゲルの粘度及び流動特性を測定した。周期流に関して使用された剪断速度は、ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＤＨＲ－ＩＩレオメーターにおいて、１２ｍｍステンレス鋼平行板形状を使用して、各サイクルについて６０秒の保持時間を有する７サイクルまで、０．０１及び１０ｓ－１であった。図２は、Ａ）連続流及びＢ）周期流の下でのヒドロゲル組成物の粘度をＰａ・ｓとして開示しており、ヒドロゲル組成物が優れた注入性及びずり減粘特性を有することを開示する。実施例４の架橋ヒドロゲルの歪み回復をさらに評価するために、その貯蔵弾性率及び損失弾性率を測定した。測定は、低（１％歪み）振動歪み条件と高（５０％歪み）振動歪み条件とを交互に繰り返す流動下、２５℃及び１Ｈｚの振動周波数で、各工程において６０秒の保持期間を有する７サイクルについて、直径１２ｍｍのステンレス鋼平行板形状を使用して行った。図３におけるヒドロゲル組成物の貯蔵弾性率（Ｐａ）及び損失弾性率（Ｐａ）を開示する結果は、ヒドロゲル組成物が歪み下でずり減粘性であることを示す。
【0140】
実施例７．レオロジー改質剤成分を含むヒドロゲル組成物及びレオロジー改質剤成分を含まないヒドロゲル組成物を使用した、３Ｄ印刷
レオロジー改質剤を含むヒドロゲル組成物及びレオロジー改質剤を含まないヒドロゲル組成物を３Ｄ印刷に関して試験した。実施例４に開示された組成物を、レオロジー改質剤を含むヒドロゲルとして、この実験で使用した。実施例４に開示されたヒドロゲルに対応するヒドロゲルを、いかなるレオロジー改質剤もなしで調製した。どちらのヒドロゲルも、５．８３ｍｇ／ｍｌの架橋成分を含んでいた。６つの層を有し、ストランド間の距離が２．５ｍｍである格子構造を印刷した。印刷された構造の写真を、印刷直後に撮った。ヒドロゲルを印刷前に室温で１時間架橋させ、その後、３２Ｇノズルを通して印刷した。どちらのヒドロゲルについても、１．０バール及び６．０ｍｍ／ｓの印刷パラメータを使用した。
レオロジー改質剤を含むヒドロゲル組成物及びレオロジー改質剤を含まないヒドロゲル組成物を３Ｄ印刷に関して試験した。実施例４に開示された組成物を、レオロジー改質剤を含むヒドロゲルとして、この実験で使用した。実施例４に開示されたヒドロゲルに対応するヒドロゲルを、いかなるレオロジー改質剤もなしで調製した。どちらのヒドロゲルも、５．８３ｍｇ／ｍｌの架橋成分を含んでいた。６つの層を有し、ストランド間の距離が２．５ｍｍである格子構造を印刷した。印刷された構造の写真を、印刷直後に撮った。ヒドロゲルを印刷前に室温で１時間架橋させ、その後、３２Ｇノズルを通して印刷した。どちらのヒドロゲルについても、１．０バール及び６．０ｍｍ／ｓの印刷パラメータを使用した。
【0141】
これらのヒドロゲル組成物の印刷適性を、Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１９によって以前に開示されたように調製されたヒドロゲル組成物とさらに比較した。材料のゲル化が他の２つのヒドロゲル組成物と比較して非常に迅速であったため、Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１９によって開示されたヒドロゲル組成物は、架橋成分を混合した直後に印刷された。２層及び線間距離２．５ｍｍを有する格子構造を使用した。２７Ｇのより大きなノズルを使用し、ヒドロゲル材料がノズルを通って流れるために、１．５～２．０バールのより高い圧力が必要であった。
【0142】
いかなるレオロジー改質剤成分も含まない３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物を示す画像を図４Ａに示し、レオロジー改質剤としてヒアルロン酸及びヒトＩ型コラーゲンを含む３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物を示す画像を図４Ｂに示し、Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１９の３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物を示す画像を図４Ｃに示す。これらの結果は、例示的なレオロジー改質剤を含むヒドロゲルが、良好な印刷品質を有するヒドロゲルを形成することを示す。これらの結果はまた、レオロジー改質剤を含まないヒドロゲルは、印刷可能なフィラメントを形成せず、特定の構造にパターン化することができず、こうしたものとして３Ｄ印刷に使用することができないことを示す。さらに、Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ ｅｔ ａｌ ２０１９によって開示されたヒドロゲル組成物は、図４Ｃに示されるヒドロゲル組成物のように、連続フィラメントとして印刷されるのではなく、塊を形成し、不均一に印刷された。これは、より高濃度の架橋成分を含み、レオロジー改質剤を含まない、Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１９に記載されているヒドロゲル組成物が、３Ｄ印刷に適していないことを示す。
【0143】
実施例８．異なる濃度の架橋成分を含むヒドロゲル組成物を使用した３Ｄ印刷
ヒドロゲル組成物中の異なる濃度の架橋成分を、ヒドロゲルの印刷適性に対する影響を観察するために研究した。実施例４と同じヒドロゲル前駆体組成物の成分を使用した。２．９２ｍｇ／ｍｌ、８．１６及び１１．６６ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度を有するヒドロゲルを調製し、研究した。２つの層及び１．００ｍｍの線距離を有する２０×２０ｍｍの格子構造を、２．９２ｍｇ／ｍｌ及び８．１６ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度のヒドロゲルで印刷し、線距離２．５０ｍｍを有する１５ｍｍ×１５ｍｍの格子を、１１．６６ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度のヒドロゲルに使用した。２．９２ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度のヒドロゲルを、３４Ｇノズルを使用して、０．２バールの圧力及び１８ｍｍ／ｓの速度で印刷した。８．１６ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度のヒドロゲルに関しては、１．６バールの圧力及び５ｍｍ／ｓの速度の印刷パラメータで３２Ｇノズルを使用した。１．３バール及び６ｍｍ／ｓで２７Ｇノズルを使用して、１１．６６ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度のヒドロゲルを印刷した。架橋時間は、最初の２つの濃度については１時間であり、後者については３０分であった。図５は、２．９２ｍｇ／ｍｌ（図５Ａ）、８．１６ｍｇ／ｍｌ（図５Ｂ）、及び１１．６６ｍｇ／ｍｌ（図５Ｃ）の架橋成分を含むヒドロゲルの代表的な画像を示す。良好なフィラメント形成及び微調整されたパターニングを伴う成功した印刷が、３つ全てのヒドロゲル組成物で見られ、研究された濃度の架橋成分を伴うヒドロゲル組成物が、３Ｄ印刷への使用に好適であることが示された。
ヒドロゲル組成物中の異なる濃度の架橋成分を、ヒドロゲルの印刷適性に対する影響を観察するために研究した。実施例４と同じヒドロゲル前駆体組成物の成分を使用した。２．９２ｍｇ／ｍｌ、８．１６及び１１．６６ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度を有するヒドロゲルを調製し、研究した。２つの層及び１．００ｍｍの線距離を有する２０×２０ｍｍの格子構造を、２．９２ｍｇ／ｍｌ及び８．１６ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度のヒドロゲルで印刷し、線距離２．５０ｍｍを有する１５ｍｍ×１５ｍｍの格子を、１１．６６ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度のヒドロゲルに使用した。２．９２ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度のヒドロゲルを、３４Ｇノズルを使用して、０．２バールの圧力及び１８ｍｍ／ｓの速度で印刷した。８．１６ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度のヒドロゲルに関しては、１．６バールの圧力及び５ｍｍ／ｓの速度の印刷パラメータで３２Ｇノズルを使用した。１．３バール及び６ｍｍ／ｓで２７Ｇノズルを使用して、１１．６６ｍｇ／ｍｌの架橋成分濃度のヒドロゲルを印刷した。架橋時間は、最初の２つの濃度については１時間であり、後者については３０分であった。図５は、２．９２ｍｇ／ｍｌ（図５Ａ）、８．１６ｍｇ／ｍｌ（図５Ｂ）、及び１１．６６ｍｇ／ｍｌ（図５Ｃ）の架橋成分を含むヒドロゲルの代表的な画像を示す。良好なフィラメント形成及び微調整されたパターニングを伴う成功した印刷が、３つ全てのヒドロゲル組成物で見られ、研究された濃度の架橋成分を伴うヒドロゲル組成物が、３Ｄ印刷への使用に好適であることが示された。
【0144】
実施例９．レオロジー改質剤として異なる濃度のＩ型コラーゲンを含むヒドロゲル組成物を使用した３Ｄ印刷
ヒドロゲルの印刷適性に対する、レオロジー改質剤成分としてのＨＡとコラーゲン濃度との複合的影響を評価した。第２のレオロジー改質剤成分として、改変された濃度のＩ型コラーゲンを含む実施例４に開示されるようなヒドロゲル組成物を試験のために使用した。実施例４に開示した組成物と同じ濃度のＨＡをレオロジー改質剤として含む３つのヒドロゲル組成物を調製した。３つのヒドロゲル組成物は全て、５．８３ｍｇ／ｍｌの架橋成分も含んでいた。ヒドロゲル中の試験した中和ヒトＩ型コラーゲン成分濃度は、０．１８ｍｇ／ｍｌ、０．５６ｍｇ／ｍｌ及び１．０９ｍｇ／ｍｌであった。全ての調べたヒドロゲル組成物に関して、０．９バール及び６．００ｍｍ／ｓの印刷パラメータを使用し、全ての試料を、１．０ｍｍの線距離を有する２層及び２０ｍｍ×２０ｍｍの格子構造に印刷した。３２Ｇノズルを印刷に使用した。二次レオロジー改質剤成分として３つの異なる濃度のヒトＩ型コラーゲンを含む３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物を示す例示的な画像を図６に示す。図６は、１ｍｇ／ｍｌ（図６Ａ）、３．１ｍｇ／ｍｌ（図６Ｂ）、及び６．０ｍｇ／ｍｌ（図６Ｃ）のヒトＩ型コラーゲン濃度を有するヒドロゲルの代表的な画像を提示する。コラーゲン濃度の増加と共に、ヒドロゲル組成物において、架橋の増加及び形状忠実度の改善が観察された。
ヒドロゲルの印刷適性に対する、レオロジー改質剤成分としてのＨＡとコラーゲン濃度との複合的影響を評価した。第２のレオロジー改質剤成分として、改変された濃度のＩ型コラーゲンを含む実施例４に開示されるようなヒドロゲル組成物を試験のために使用した。実施例４に開示した組成物と同じ濃度のＨＡをレオロジー改質剤として含む３つのヒドロゲル組成物を調製した。３つのヒドロゲル組成物は全て、５．８３ｍｇ／ｍｌの架橋成分も含んでいた。ヒドロゲル中の試験した中和ヒトＩ型コラーゲン成分濃度は、０．１８ｍｇ／ｍｌ、０．５６ｍｇ／ｍｌ及び１．０９ｍｇ／ｍｌであった。全ての調べたヒドロゲル組成物に関して、０．９バール及び６．００ｍｍ／ｓの印刷パラメータを使用し、全ての試料を、１．０ｍｍの線距離を有する２層及び２０ｍｍ×２０ｍｍの格子構造に印刷した。３２Ｇノズルを印刷に使用した。二次レオロジー改質剤成分として３つの異なる濃度のヒトＩ型コラーゲンを含む３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物を示す例示的な画像を図６に示す。図６は、１ｍｇ／ｍｌ（図６Ａ）、３．１ｍｇ／ｍｌ（図６Ｂ）、及び６．０ｍｇ／ｍｌ（図６Ｃ）のヒトＩ型コラーゲン濃度を有するヒドロゲルの代表的な画像を提示する。コラーゲン濃度の増加と共に、ヒドロゲル組成物において、架橋の増加及び形状忠実度の改善が観察された。
【0145】
実施例１０．レオロジー改質剤成分として異なる濃度のＨＡを含むヒドロゲル組成物を使用した３Ｄ印刷
実施例４に含まれるヒドロゲル架橋成分比及び試薬を使用した。レオロジー改質剤成分として異なる濃度のＨＡを有するヒドロゲルを調製し、それらの印刷適性を調べた。これらのヒドロゲルにはレオロジー改質剤としてＩ型コラーゲンを添加しなかった。ヒドロゲル中の０．６２５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ及び３．１２５ｍｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度を試験した。ヒドロゲルを、１．３バール、８ｍｍ／ｓを使用して印刷し、２．５０ｍｍのストランド距離を有する６つの層状格子を３Ｄ印刷した。
実施例４に含まれるヒドロゲル架橋成分比及び試薬を使用した。レオロジー改質剤成分として異なる濃度のＨＡを有するヒドロゲルを調製し、それらの印刷適性を調べた。これらのヒドロゲルにはレオロジー改質剤としてＩ型コラーゲンを添加しなかった。ヒドロゲル中の０．６２５ｍｇ／ｍｌ、１．２５ｍｇ／ｍｌ及び３．１２５ｍｇ／ｍｌの最終ＨＡ濃度を試験した。ヒドロゲルを、１．３バール、８ｍｍ／ｓを使用して印刷し、２．５０ｍｍのストランド距離を有する６つの層状格子を３Ｄ印刷した。
【0146】
図７に示す結果は、ＨＡの濃度が、ヒドロゲルの印刷品質及び形状忠実度に明らかな影響を及ぼすことを示す。ヒドロゲル中の０．６２５ｍｇ／ｍｌのＨＡの濃度（図７Ａ）は、最適ではなく、多層ヒドロゲルがその形状を保持するには低すぎるようである。３．１２５ｍｇ／ｍｌ（図７Ｃ）のＨＡ濃度を有するヒドロゲルは、他の試験された濃度と比較してより硬いが、多層３Ｄ構造をプリントする間にフィラメントが広がり、したがって、この濃度は最適ではない。レオロジー改質剤として１．２５ｍｇ／ｍｌ（図７Ｂ）のＨＡを含むヒドロゲルは、試験された濃度のうち最良の印刷適性及び形状忠実度品質を示した。
【0147】
実施例１１．様々なレオロジー改質剤を含むヒドロゲル組成物を使用した３Ｄ印刷
ヒドロゲル組成物中のレオロジー改質剤成分のいくつかの異なる組み合わせを調べ、それらの印刷適性を試験した。実施例４のヒドロゲル組成物を、ヒトＩ型コラーゲン成分を他のタンパク質で置き換える改変を伴って使用した。ヒドロゲル中で０．８ｍｇ／ｍｌの最終濃度を有するＰＢＳ中のヒトフィブロネクチンを研究した。さらに、ヒドロゲル中の最終濃度が０．０２ｍｇ／ｍｌであるヒト組換えラミニン５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）、及びヒドロゲル中の最終濃度が９．１ｍｇ／ｍｌであるヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を調べた。成分を混合した後、ヒドロゲルを室温で１時間架橋させた。全ての調製されたヒドロゲルを、３２Ｇ針を用いて０．９バール及び６．０ｍｍ／ｓで印刷した。
ヒドロゲル組成物中のレオロジー改質剤成分のいくつかの異なる組み合わせを調べ、それらの印刷適性を試験した。実施例４のヒドロゲル組成物を、ヒトＩ型コラーゲン成分を他のタンパク質で置き換える改変を伴って使用した。ヒドロゲル中で０．８ｍｇ／ｍｌの最終濃度を有するＰＢＳ中のヒトフィブロネクチンを研究した。さらに、ヒドロゲル中の最終濃度が０．０２ｍｇ／ｍｌであるヒト組換えラミニン５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ）、及びヒドロゲル中の最終濃度が９．１ｍｇ／ｍｌであるヒトアルブミン（Ｓｉｇｍａ）を調べた。成分を混合した後、ヒドロゲルを室温で１時間架橋させた。全ての調製されたヒドロゲルを、３２Ｇ針を用いて０．９バール及び６．０ｍｍ／ｓで印刷した。
【0148】
図８は、フィブロネクチン及びＨＡ（図８Ａ）、ラミニン及びＨＡ（図８Ｂ）、並びにアルブミン及びＨＡ（図８Ｃ）をレオロジー改質剤成分として示された濃度で有するヒドロゲル前駆体組成物を使用して生成された代表的なヒドロゲル格子を提示する。ラミニン及びアルブミンを含むヒドロゲル組成物は、迅速な架橋、及びレオロジー改質剤としてヒトＩ型コラーゲンを含むヒドロゲルと非常に類似した挙動を示した。フィブロネクチンを含むヒドロゲルは印刷可能であったが、ラミニン及びアルブミンを含む他の２つの調べたヒドロゲル組成物と比較して、フィラメント広がりの増加及び印刷適性の低下を示した。これらの結果は、ヒドロゲル前駆体組成物において使用することができ、ヒドロゲルにおいて良好な架橋及びずり減粘特性を生じるレオロジー改質剤のいくつかの潜在的な組み合わせが存在することを示す。
【0149】
実施例１２．３Ｄヒドロゲル円柱構造における３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物の形状忠実度の観察
３Ｄ印刷されたヒドロゲルの形状忠実度を観察するために、実施例４のヒドロゲル組成物を使用した。
３Ｄ印刷されたヒドロゲルの形状忠実度を観察するために、実施例４のヒドロゲル組成物を使用した。
【0150】
１５ｍｍの直径及び１ｍｍの高さを有する３Ｄ円柱を印刷した。使用した線距離は４００μｍであり、交互層は９０°の角度であった。図９には、印刷直後の、１００μｍ印刷ノズルを使用した、１２個の印刷層を有する、印刷された３Ｄ構造の２つの例示的な斜視図Ａ及びＢが示される。これらの結果は、ヒドロゲル組成物が３Ｄ円柱形状で印刷された際、層ごとに良好に印刷され、良好な形状忠実度を有することを示す。
【0151】
実施例１３．３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物の形状忠実度の、時間の関数としての観察
ヒドロゲル組成物の形状忠実度をさらに調べるために、ヒドロゲルのフィラメント厚を時間の関数として測定した。この実験でも、実施例４のヒドロゲル組成物を使用した。ヒドロゲルを、１５ｍｍ×１５ｍｍの寸法を有する６層の十字パターンを有する格子状に３Ｄ印刷した。印刷された線の間に２．５０ｍｍの距離を使用し、交互層は９０°の角度であった。印刷直後及び＋３７℃のＰＢＳに７日間浸漬した後に、試料を画像化した。印刷されたヒドロゲルフィラメントの厚さを、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて定量化した。結果は、試料が採取された時点のフィラメント厚の、印刷直後のフィラメント厚に対する比として計算された、相対フィラメント厚として提示される。図１０Ａには、時間の関数として、３Ｄ印刷されたヒドロゲルの計算された相対フィラメント厚が示されており、Ｄ０は０日目の相対フィラメント厚を示し、Ｄ７は７日目の相対フィラメント厚を示す。０日目（Ｄ０）及び７日目の印刷された格子の対応する画像を、それぞれ図１０Ｂ及び図１０Ｃに示す。これらの結果は、ヒドロゲルの形状忠実度が、観察された期間にわたって有意に変化しないことを立証する。印刷されたヒドロゲル格子の全ての孔（３６／３６）は、０日目（図１０Ｂ）から７日目（図１０Ｃ）までの７日間の観察期間中、開いたままであった。７日間の培養期間中に、相対フィラメント厚の増加はわずか１２％であることが観察された。
ヒドロゲル組成物の形状忠実度をさらに調べるために、ヒドロゲルのフィラメント厚を時間の関数として測定した。この実験でも、実施例４のヒドロゲル組成物を使用した。ヒドロゲルを、１５ｍｍ×１５ｍｍの寸法を有する６層の十字パターンを有する格子状に３Ｄ印刷した。印刷された線の間に２．５０ｍｍの距離を使用し、交互層は９０°の角度であった。印刷直後及び＋３７℃のＰＢＳに７日間浸漬した後に、試料を画像化した。印刷されたヒドロゲルフィラメントの厚さを、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて定量化した。結果は、試料が採取された時点のフィラメント厚の、印刷直後のフィラメント厚に対する比として計算された、相対フィラメント厚として提示される。図１０Ａには、時間の関数として、３Ｄ印刷されたヒドロゲルの計算された相対フィラメント厚が示されており、Ｄ０は０日目の相対フィラメント厚を示し、Ｄ７は７日目の相対フィラメント厚を示す。０日目（Ｄ０）及び７日目の印刷された格子の対応する画像を、それぞれ図１０Ｂ及び図１０Ｃに示す。これらの結果は、ヒドロゲルの形状忠実度が、観察された期間にわたって有意に変化しないことを立証する。印刷されたヒドロゲル格子の全ての孔（３６／３６）は、０日目（図１０Ｂ）から７日目（図１０Ｃ）までの７日間の観察期間中、開いたままであった。７日間の培養期間中に、相対フィラメント厚の増加はわずか１２％であることが観察された。
【0152】
実施例１４．細胞及び細胞培養
ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）を、当該技術分野において開示されているように、皮下脂肪組織試料から機械的及び酵素的に単離した。その後、ｈＡＳＣを、５％ヒト血清（ＡＢ型男性、ＢｉｏＷｅｓｔ，Ｎｕａｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ由来、ＨＩＶ試験済み）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２を含有する培地中で培養した。ヒトＡＳＣを、ＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用して集密時に継代し、継代４～５でバイオプリンティングに使用した。バイオプリンティングのために、ｈＡＳＣをＴｒｙｐＬＥ（商標）の酵素作用により剥離させ、遠心分離し、計数のために培養培地に再懸濁した。その後、ｈＡＳＣを遠心分離し、上清を除去し、細胞を培養培地に再懸濁し、１．１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度でヒドロゲル前駆体組成物と混合して、バイオプリンティングに使用される印刷可能なバイオインクを得た。
ヒト脂肪由来幹細胞（ｈＡＳＣ）を、当該技術分野において開示されているように、皮下脂肪組織試料から機械的及び酵素的に単離した。その後、ｈＡＳＣを、５％ヒト血清（ＡＢ型男性、ＢｉｏＷｅｓｔ，Ｎｕａｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ由来、ＨＩＶ試験済み）、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２を含有する培地中で培養した。ヒトＡＳＣを、ＴｒｙｐＬＥ（商標）を使用して集密時に継代し、継代４～５でバイオプリンティングに使用した。バイオプリンティングのために、ｈＡＳＣをＴｒｙｐＬＥ（商標）の酵素作用により剥離させ、遠心分離し、計数のために培養培地に再懸濁した。その後、ｈＡＳＣを遠心分離し、上清を除去し、細胞を培養培地に再懸濁し、１．１×１０６細胞／ｍｌの細胞密度でヒドロゲル前駆体組成物と混合して、バイオプリンティングに使用される印刷可能なバイオインクを得た。
【0153】
別の実験設定では、ｈＡＳＣを、バイオプリンティングに使用する前に、７日間培養して角膜間質様細胞に分化させた。分化のため、ｈＡＳＣを、１０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、０．１ｍＭアスコルビン酸－２－リン酸及び１μＭレチノイン酸を添加した、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（商標））、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地中、７０００細胞／ｃｍ２の細胞密度でＴ７５細胞培養フラスコ上にプレーティングした。印刷のため、ｈＡＳＣについて記載したように、あらかじめ分化させた細胞を調製した。
【0154】
実施例１５．３Ｄ印刷されたヒドロゲル組成物の生体適合性
実施例４において開示されるヒドロゲル組成物の生体適合性を、３Ｄ印刷された線及び円柱由来のｈＡＳＣ及びｈＡＳＣ由来角膜間質様細胞を用いて評価した。ヒドロゲル組成物を調製し、ｈＡＳＣ又はｈＡＳＣ由来角膜間質様細胞のいずれかと混合して、２つの異なるバイオインクを得た。バイオインクは、平行線の２層で３Ｄ印刷された。印刷領域の寸法は２０ｍｍ×２０ｍｍであり、線間距離は１．００ｍｍであった。１５ｍｍの直径及び８００μｍの高さを有する３Ｄ円柱もまた、３Ｄ印刷した。使用した線間距離は４００μｍであった。交互層は９０°の角度であった。３Ｄ印刷後、印刷された線及び円柱をさらに架橋させ、＋３７℃、５％ＣＯ２で２０分間安定化させた後、細胞培養培地又は滅菌ＰＢＳ中に浸漬した。より高い３Ｄ円柱試料の印刷のため、印刷されたヒドロゲルを培地又は滅菌ＰＢＳ中に浸漬する前に、１時間の安定化期間を使用した。
実施例４において開示されるヒドロゲル組成物の生体適合性を、３Ｄ印刷された線及び円柱由来のｈＡＳＣ及びｈＡＳＣ由来角膜間質様細胞を用いて評価した。ヒドロゲル組成物を調製し、ｈＡＳＣ又はｈＡＳＣ由来角膜間質様細胞のいずれかと混合して、２つの異なるバイオインクを得た。バイオインクは、平行線の２層で３Ｄ印刷された。印刷領域の寸法は２０ｍｍ×２０ｍｍであり、線間距離は１．００ｍｍであった。１５ｍｍの直径及び８００μｍの高さを有する３Ｄ円柱もまた、３Ｄ印刷した。使用した線間距離は４００μｍであった。交互層は９０°の角度であった。３Ｄ印刷後、印刷された線及び円柱をさらに架橋させ、＋３７℃、５％ＣＯ２で２０分間安定化させた後、細胞培養培地又は滅菌ＰＢＳ中に浸漬した。より高い３Ｄ円柱試料の印刷のため、印刷されたヒドロゲルを培地又は滅菌ＰＢＳ中に浸漬する前に、１時間の安定化期間を使用した。
【0155】
印刷後の細胞生存率を、印刷の１、３及び７日後にＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）細胞生存性試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて決定した。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）分析のため、両方の細胞タイプ由来の各時点の３つの試料をＤＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ）で１回洗浄し、細胞培養培地中で１：１０（ｖ／ｖ）に希釈したＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）試薬を試料に添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）培地の１００μＬアリコットを９６ウェルプレート上の各試料から３つ組で収集し、それらの蛍光を、Ｖｉｋｔｏｒ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用して、それぞれ５４４ｎｍ及び５９０ｎｍの励起及び発光波長で測定した。
【0156】
培地試料に関する蛍光値を図１１に示す。Ｄ０は０日目の蛍光、Ｄ３は３日目の蛍光、Ｄ７は７日目の蛍光を示す。図１１Ａは、３Ｄ印刷された二重層バイオインク線における蛍光を示し、図１１Ｂは、この細胞タイプを有する３Ｄ印刷された非中空３Ｄ円柱における蛍光を示す。これらの結果は、印刷可能なバイオインクを生じる細胞と共に使用されるヒドロゲルが、複数の細胞タイプと生体適合性であり、印刷後の細胞生存性を支持することが可能であることを示す。経時的な蛍光の増加は、印刷可能なバイオインクを生じる細胞と共に使用されるヒドロゲルが、印刷後に複数の細胞タイプで細胞増殖を促進することも可能であることを示す。印刷された細胞タイプ両方の細胞形態を、Ｄ７後の細胞のアクチンフィラメントのＩＦ染色で評価した。簡潔に述べると、印刷された線を４％ＰＦＡで３０分間固定し、洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００で室温で１５分間透過処理し、その後、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングした。ファロイジン（Ｓｉｇｍａ）を５％ＢＳＡ－ＰＢＳ溶液中に１：１００の比で希釈し、室温で１時間インキュベートした。試料をＰＢＳで３回洗浄し、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ ５１蛍光顕微鏡で免疫蛍光画像を撮影した。ｈＡＳＣ及びｈＡＳＣ由来角膜間質様細胞のＩＦ画像を、それぞれ図１１Ｃ及びＤに示す（スケールバー５００μｍ）。どちらの細胞タイプも細長い細胞形態を有し、バイオインクにおける良好な生体適合性並びに細胞及び組織成熟を示した。
【0157】
実施例１６．ヒドロゲル特性に対するレオロジー改質剤のＭｗの影響の観察
実施例４に開示されたヒドロゲル組成物のためのレオロジー改質剤の組成及びＭｗの影響を評価した。実施例４に開示されたレオロジー成分として高Ｍｗ ＨＡ（Ｍｗ＝１２００～１９００ｋＤａ）及びヒトＩ型コラーゲンを有するヒドロゲル組成物を対照（基本バイオインク）として使用した。ヒトＩ型コラーゲンを含まない実施例４に開示されるものと類似のヒドロゲル組成物（コラーゲンを含まないバイオインク）も調べた。最後に、実施例４に開示されたヒドロゲルのレオロジー成分を、低Ｍｗ ＨＡ（Ｍｗ １００～３００ｋＤａ）で置き換えた。これらのヒドロゲル組成物の注入性及びずり減粘特性を、室温で１０分及び１時間の架橋後に、ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＤＨＲ－ＩＩレオメーターを用いて連続流下（０．０１～１０ｓ－１）で決定した。基本バイオインク組成物は、架橋の１０分後（図１２）及び１時間後（図１３）に最も高い粘度を示した。基本バイオインクの粘度は、コラーゲンを含まない類似のヒドロゲル組成物と比較して高かった。低Ｍｗ ＨＡを有するヒドロゲル組成物は、どちらの時点でも最も低い粘度値を示した。これらの結果は、レオロジー改質剤として使用されるＨＡのＭｗが、開発されたヒドロゲルの粘度及び印刷適性に有意な影響を及ぼすことを示す。さらに、レオロジー改質剤として高Ｍｗ ＨＡ及びヒトＩ型コラーゲンの両方を使用する複合的影響は、ヒドロゲル組成物の印刷適性に有益である。
実施例４に開示されたヒドロゲル組成物のためのレオロジー改質剤の組成及びＭｗの影響を評価した。実施例４に開示されたレオロジー成分として高Ｍｗ ＨＡ（Ｍｗ＝１２００～１９００ｋＤａ）及びヒトＩ型コラーゲンを有するヒドロゲル組成物を対照（基本バイオインク）として使用した。ヒトＩ型コラーゲンを含まない実施例４に開示されるものと類似のヒドロゲル組成物（コラーゲンを含まないバイオインク）も調べた。最後に、実施例４に開示されたヒドロゲルのレオロジー成分を、低Ｍｗ ＨＡ（Ｍｗ １００～３００ｋＤａ）で置き換えた。これらのヒドロゲル組成物の注入性及びずり減粘特性を、室温で１０分及び１時間の架橋後に、ＴＡ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＤＨＲ－ＩＩレオメーターを用いて連続流下（０．０１～１０ｓ－１）で決定した。基本バイオインク組成物は、架橋の１０分後（図１２）及び１時間後（図１３）に最も高い粘度を示した。基本バイオインクの粘度は、コラーゲンを含まない類似のヒドロゲル組成物と比較して高かった。低Ｍｗ ＨＡを有するヒドロゲル組成物は、どちらの時点でも最も低い粘度値を示した。これらの結果は、レオロジー改質剤として使用されるＨＡのＭｗが、開発されたヒドロゲルの粘度及び印刷適性に有意な影響を及ぼすことを示す。さらに、レオロジー改質剤として高Ｍｗ ＨＡ及びヒトＩ型コラーゲンの両方を使用する複合的影響は、ヒドロゲル組成物の印刷適性に有益である。
【0158】
実施例１７．ヒドロゲル特性に対するヒトＩ型コラーゲンの影響
実施例４に開示されたヒドロゲル組成物に対するヒトＩ型コラーゲンの影響を評価した。このために、実施例４に開示されたヒドロゲル組成物を、ヒトＩ型コラーゲン成分を含まない類似のヒドロゲル組成物と比較した。どちらのヒドロゲルも室温で１時間架橋させた。次いで、ヒドロゲルをシリンジからわずかに押し出し、そしてヒドロゲルを引っ張ることによって、弾性及びフィラメント形成を評価した。ヒトＩ型コラーゲンを含むヒドロゲル組成物は、優れたフィラメント形成及び弾性を示した（図１４Ａ）。コラーゲンを含むヒドロゲルは、長い繊維へと引き伸ばされた。コラーゲンを含むヒドロゲルは粘着性であり、複数回引き伸ばした後も基材から剥離しなかった。Ｉ型コラーゲンを含まないヒドロゲルは、繊維を形成することができず、乏しい弾性を示した（図１４Ｂ）。両方のヒドロゲルを、実施例１５に含まれるような平行線の２つの層に３Ｄバイオプリントした。印刷された線を細胞培養培地に入れ、基材への接着及び形状忠実度について調べた。コラーゲンＩを含むヒドロゲル組成物は、印刷基材に付着したままであり、印刷された線の形態を維持した（図１５Ａ）。対照的に、Ｉ型コラーゲンを含まないヒドロゲル組成物は、細胞培養培地中で印刷基材から剥離し、印刷された組織化線パターンを失った（図１５Ｂ）。これらの結果は、ヒトＩ型コラーゲンと高Ｍｗ ＨＡとの組み合わせが、優れた印刷適性、弾性、粘着性及びフィラメント形成を有する独特のヒドロゲル組成物を生じることを示す。
実施例４に開示されたヒドロゲル組成物に対するヒトＩ型コラーゲンの影響を評価した。このために、実施例４に開示されたヒドロゲル組成物を、ヒトＩ型コラーゲン成分を含まない類似のヒドロゲル組成物と比較した。どちらのヒドロゲルも室温で１時間架橋させた。次いで、ヒドロゲルをシリンジからわずかに押し出し、そしてヒドロゲルを引っ張ることによって、弾性及びフィラメント形成を評価した。ヒトＩ型コラーゲンを含むヒドロゲル組成物は、優れたフィラメント形成及び弾性を示した（図１４Ａ）。コラーゲンを含むヒドロゲルは、長い繊維へと引き伸ばされた。コラーゲンを含むヒドロゲルは粘着性であり、複数回引き伸ばした後も基材から剥離しなかった。Ｉ型コラーゲンを含まないヒドロゲルは、繊維を形成することができず、乏しい弾性を示した（図１４Ｂ）。両方のヒドロゲルを、実施例１５に含まれるような平行線の２つの層に３Ｄバイオプリントした。印刷された線を細胞培養培地に入れ、基材への接着及び形状忠実度について調べた。コラーゲンＩを含むヒドロゲル組成物は、印刷基材に付着したままであり、印刷された線の形態を維持した（図１５Ａ）。対照的に、Ｉ型コラーゲンを含まないヒドロゲル組成物は、細胞培養培地中で印刷基材から剥離し、印刷された組織化線パターンを失った（図１５Ｂ）。これらの結果は、ヒトＩ型コラーゲンと高Ｍｗ ＨＡとの組み合わせが、優れた印刷適性、弾性、粘着性及びフィラメント形成を有する独特のヒドロゲル組成物を生じることを示す。
【0159】
実施例１８．ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨ合成及びヒドロゲル組成物に対するＭｗの影響
ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨは、高Ｍｗ ＨＡ（Ｍｗ＝１２００～１９００ｋＤａ）を使用する改変を伴って、実施例２に記載されるように合成された。合成されたＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨを、実施例４に含まれるヒドロゲル組成物を調製するために調べた。このために、ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨを１ｘＰＢＳに溶解した。溶液を、連続的に振盪しながら＋３７℃で５時間インキュベートした。ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨは、１０ｍｇ／ｍｌの濃度までは１×ＰＢＳに溶解しなかった（図１６Ａ）。調製されたＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨ成分の合成度を決定するために、ＴＮＢＳアッセイを使用した。合成された成分は試薬溶媒中に溶解せず（図１６Ｂ）、ＴＮＢＳアッセイによる定量化を行うことができなかった。これらの結果は、高Ｍｗ ＨＡが、ヒドロゲル組成物を調製するためのＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨの合成に適していないことを示す。
ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨは、高Ｍｗ ＨＡ（Ｍｗ＝１２００～１９００ｋＤａ）を使用する改変を伴って、実施例２に記載されるように合成された。合成されたＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨを、実施例４に含まれるヒドロゲル組成物を調製するために調べた。このために、ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨを１ｘＰＢＳに溶解した。溶液を、連続的に振盪しながら＋３７℃で５時間インキュベートした。ＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨは、１０ｍｇ／ｍｌの濃度までは１×ＰＢＳに溶解しなかった（図１６Ａ）。調製されたＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨ成分の合成度を決定するために、ＴＮＢＳアッセイを使用した。合成された成分は試薬溶媒中に溶解せず（図１６Ｂ）、ＴＮＢＳアッセイによる定量化を行うことができなかった。これらの結果は、高Ｍｗ ＨＡが、ヒドロゲル組成物を調製するためのＨＡ－ＤＡ－ＣＤＨの合成に適していないことを示す。
【0160】
前述の説明は、特定の実装形態及び実施形態の非限定的な例として、本発明を実施するために本発明者らによって現在企図されている最良の形態の完全かつ有益な説明を提供している。しかし、本発明は、上述した実施形態の詳細に限定されるものではなく、本発明の特徴から逸脱することなく、同等の手段を使用する他の実施形態において、又は実施形態の異なる組み合わせにおいて実施され得ることは、当業者には明らかである。
【0161】
さらに、先に開示された例示的な実施形態の特徴のいくつかは、他の特徴の対応する使用を伴わず、有利に使用され得る。したがって、実施形態や態様の任意の適切な組み合わせを行ってもよい。本明細書に開示される態様又は実施形態の任意の組み合わせはまた、態様又は実施形態に開示される少なくとも１つの非本質的な特徴を伴わずに行われ得る。
【0162】
異なる非拘束的な例示的態様及び実施形態が、上記に説明されている。前述の実施形態は、単に、異なる実装において利用され得る選択された態様又は工程を説明するために使用される。いくつかの実施形態は、特定の例示的な態様のみに関して提示され得る。対応する実施形態は、他の例示的な態様にも適用され得ることを理解されたい。添付の特許請求の範囲は、保護の範囲を定義する。説明又は図面に開示され、特許請求の範囲によってカバーされない任意の方法、プロセス、使用、製品又は装置は、特許請求される発明の実施形態として理解されるべきではないが、特許請求される発明を理解するために有用である例として提供される。
【0163】
参考文献
Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４，７，２４２７－２４３２，公開日：２０１３年５月３０日、ｈｔｔｐｓ： ／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｍ４００６１２ｈ
Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１９，２２５，公開日２０１９年９月２３日、ｈｔｔｐｓ： ／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１９．１１９５１６
Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１３，１４，７，２４２７－２４３２，公開日：２０１３年５月３０日、ｈｔｔｐｓ： ／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ｂｍ４００６１２ｈ
Ｋｏｉｖｕｓａｌｏ Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１９，２２５，公開日２０１９年９月２３日、ｈｔｔｐｓ： ／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２０１９．１１９５１６
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】