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▶ サイバス オイローペ ベスローテン ヴェンノーツハップの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】アサ科細胞の形質転換
(51)【国際特許分類】
A01H 1/00 20060101AFI20240925BHJP
A01H 6/28 20180101ALI20240925BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20240925BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240925BHJP
【ＦＩ】
A01H1/00 Z ZNA
A01H6/28
A01H5/00 A
C12N15/09 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024516739
(86)(22)【出願日】2022-06-13
(85)【翻訳文提出日】2024-05-15
(86)【国際出願番号】 US2022033275
(87)【国際公開番号】W WO2023043511
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】63/245,301
(32)【優先日】2021-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
２．ＳＩＬＷＥＴ
(71)【出願人】
【識別番号】511276161
【氏名又は名称】サイバス オイローペ ベスローテン ヴェンノーツハップ
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】ダ シルヴァ コンセイソン，アレキサンダー
(72)【発明者】
【氏名】カーツ，ブレイディ
(72)【発明者】
【氏名】アップガード，アンダース
(57)【要約】
本開示の例示的な方法は、アサ科種子を水和溶液中に浸すことと、浸されたアサ科種子から胚組織のサブセットを切除して、アサ科分裂組織領域又は胚軸（ＥＡ）を抽出することと、アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露して、アサ科分裂組織領域又はＥＡのアサ科細胞を形質転換させることと、を含む。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
水和溶液中にアサ科種子を浸すことと、前記浸されたアサ科種子から胚組織のサブセットを切除して、アサ科分裂組織領域又は胚軸（ＥＡ）を抽出することと、
前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露して、前記アサ科分裂組織領域又はＥＡのアサ科細胞を形質転換することと、
を含む、方法。
【請求項2】
前記胚組織のサブセットを切除することが、前記浸されたアサ科種子の子葉のいずれも除去することなく、種皮を除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記胚組織のサブセットを切除することが、前記浸されたアサ科種子の種皮と、子葉のうちの１つと、を除去すること、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記胚組織のサブセットを切除することが、種皮を除去することと、前記浸されたアサ科種子の小根を切断することと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記胚組織のサブセットを切除することが、前記浸されたアサ科種子の種皮、子葉の両方、及び葉原基を除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記胚組織のサブセットを切除することが、前記浸されたアサ科種子の種皮、子葉のうちの１つ、及び葉原基を除去することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
チジアズロン（ＴＤＺ）を含む培養培地を使用して、前記形質転換されたアサ科細胞から組織を再生することを更に含み、前記組織が苗条、根、根毛構造及び完全植物のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記組織を再生することが、前記培養培地を使用して前記形質転換されたアサ科細胞からの苗条の形成を誘導することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記培養培地が、約１ミリグラム（ｍｇ）／リットル（Ｌ）～約２０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記形質転換されたアサ科細胞又は前記形質転換されたアサ科細胞から再生された組織を、前記形質転換されたアサ科細胞又は前記形質転換されたアサ科細胞から再生された組織をスクリーニングするための選択剤を使用して、前記異種ヌクレオチド配列の発現についてスクリーニングすることを更に含み、前記選択剤が、カナマイシンＡ（ｋａｎ）、ｇ４１８、スペクチノマイシン及びグリホサートから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを前記異種ヌクレオチド配列に曝露することが、前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを、前記異種ヌクレオチド配列を有する細菌株と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを前記異種ヌクレオチド配列に曝露することが、前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを、前記異種ヌクレオチド配列を有するように形質転換された前記細菌株を含む感染培地に曝露することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記感染培地を除去することと、前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを閾値期間共培養することと、
前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを選択培地中で培養して、形質転換されたアサ科分裂組織領域又はＥＡを選択することと、
を更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記感染培地が、チジアズロン（ＴＤＺ）、メトラクロール、硫酸マグネシウム、Ｔｗｅｅｎ、アセトシリンゴン（ＭＴＡ）、チオール、ＧＡ３、ＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン、ＤＫＷ塩、ＡＢ塩、グルコース、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７、及びそれらの組合せを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記異種ヌクレオチド配列が、プロモータ及び場合によりスクリーニングマーカに作動可能に接続したレアカットエンドヌクレアーゼをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
水和溶液中にアサ科種子を浸すことと、前記浸されたアサ科種子から胚組織のサブセットを切除して、アサ科分裂組織領域又は胚軸（ＥＡ）を抽出することと、
前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露して、前記アサ科分裂組織領域又はＥＡのアサ科細胞を形質転換することと、
チジアズロン（ＴＤＺ）を含む培養培地を使用して、前記形質転換されたアサ科細胞から組織を再生することと、
を含む、方法。
【請求項17】
前記培養培地が、約１ミリグラム（ｍｇ）／リットル（Ｌ）～約２０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む苗条誘導培地を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記アサ科細胞を形質転換することが、前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを、前記異種ヌクレオチド配列を有し、約０．１ミリグラム（ｍｇ）／リットル（Ｌ）～約２ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む細菌株を含む感染培地に曝露することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項19】
前記組織を再生することが、前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを、前記ＴＤＺを含む苗条誘導培地（ＳＩＭ）中で移送し、培養することと、
前記ＳＩＭ中で培養した後、前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを苗条伸長培地（ＳＥＭ）中で移送し、培養することと、
により苗条の形成を誘導することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項20】
前記組織を再生することが、前記異種ヌクレオチド配列への曝露後であり、前記ＳＩＭへの移送前に、約０．１（ｍｇ）／リットル（Ｌ）～約１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む再生培地中で前記アサ科分裂組織領域又はＥＡを移送及び培養することによって回収を行うことを更に含み、前記ＳＩＭが約１ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記組織を再生することが、前記ＴＤＺを含む前記培養培地を使用して、前記形質転換されたアサ科細胞から苗条の形成を誘導することと、前記形成された苗条から根を誘導することと、を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項22】
前記形成された苗条から根を誘導することが、前記形成された苗条を最小高さの苗条についてスクリーニングすることと、
一次根を誘導するために選択された最小高さの苗条を発根させることと、
新たな一次根及び根毛構造の形成を誘導するために、前記誘導された一次根を有する苗条を移送及び発根させることと、
を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
一次根及び根毛構造を有する選択された苗条を土壌に移送することを更に含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
請求項１に記載の方法を使用して産生された形質転換されたアサ科外植片。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
資料の参照による組み込み
電子提出
その全体が参照により組み込まれるのは、コンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表であり、４３３ｋｂのサイズのＡＳＣＩＩテキストファイルであり、本明細書と同時に提出され、以下：「Ｃ１６３３１１６１１１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」の通り識別され、２０２２年６月１３日に作成された。
電子提出
その全体が参照により組み込まれるのは、コンピュータ可読ヌクレオチド／アミノ酸配列表であり、４３３ｋｂのサイズのＡＳＣＩＩテキストファイルであり、本明細書と同時に提出され、以下：「Ｃ１６３３１１６１１１＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」の通り識別され、２０２２年６月１３日に作成された。
【0002】
アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）は、様々な樹木、直立性ハーブ、及び双生ハーブを含む双子葉顕花植物の科である。アサ科植物の例には、大麻植物、例えば工業用麻が含まれる。工業用麻は、０．３％未満のテトラヒドロカンナビノール（ＴＨＣ）を有する大麻植物品種である。工業用麻を栽培して、繊維、穀物、又はカンナビジオール（ＣＢＤ）及びテルペン等の非中毒性医薬化合物を製造することができる。機能的ゲノミクス及び育種を使用して、目的の形質を有する新たなアサ科栽培品種を提供することができる。安定なトランスジェニック系統は、機能的ゲノミクスに有用である。アサ科植物は、形質転換に対して抵抗性であり得る。遺伝的育種及び他の用途のために、アサ科の形質転換及び再生効率を改善する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本開示は、アサ科分裂組織領域又は胚軸（ＥＡ）等のアサ科植物細胞を形質転換し、形質転換された細胞を様々な分化した植物組織、部分植物及び植物全体に再生するための方法及び材料を特徴とする。本明細書に記載される方法は、遺伝子型特異的形質転換及び再生系の系統的設計を含む。更なる実施形態は、遺伝子型特異的形質転換及び再生システムを実施して、目的の１つ又は複数の形質を有するアサ科分裂組織領域又はＥＡに由来するクローン材料から形質転換アサ科植物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示のいくつかの態様は、アサ科種子を水和溶液中に浸すことと、浸されたアサ科種子から胚組織のサブセットを切除して、アサ科分裂組織領域又はＥＡを抽出することと、アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露して、アサ科分裂組織領域又はＥＡのアサ科細胞を形質転換させることと、を含む方法に関する。
【0005】
いくつかの態様は、アサ科種子を水和溶液中に浸すことと、浸されたアサ科種子から胚組織のサブセットを切除して、アサ科分裂組織領域又はＥＡを抽出することと、アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露して、アサ科分裂組織領域又はＥＡのアサ科細胞を形質転換させることと、を含む方法に関する。
【0006】
いくつかの態様では、胚組織のサブセットを切除することは、浸されたアサ科種子の子葉のいずれも除去することなく、種皮を除去することを含む。
【0007】
いくつかの態様では、胚組織のサブセットを切除することは、浸されたアサ科種子の種皮と、子葉のうちの１つと、を除去することを含む。
【0008】
いくつかの態様では、胚組織のサブセットを切除することは、種皮を除去することと、浸されたアサ科種子の小根を切断することとを含む。
【0009】
いくつかの態様では、胚組織のサブセットを切除することは、浸されたアサ科種子の種皮、子葉の両方、及び葉原基を除去することを含む。
【0010】
いくつかの態様では、胚組織のサブセットを切除することは、浸されたアサ科種子の種皮、子葉のうちの１つ、及び葉原基を除去することを含む。
【0011】
いくつかの態様では、方法は、チジアズロン（ＴＤＺ）を含む培養培地を使用して、形質転換されたアサ科細胞から組織を再生することを更に含み、組織は苗条、根、根毛構造及び完全植物のうちの１つ以上を含む。
【0012】
いくつかの態様では、組織を再生することは、培養培地を使用して形質転換されたアサ科細胞からの苗条の形成を誘導することを含む。
【0013】
いくつかの態様では、培養培地は約１ミリグラム（ｍｇ）／リットル（Ｌ）～約２０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む。
【0014】
いくつかの態様では、方法は、形質転換されたアサ科細胞又は形質転換されたアサ科細胞から再生された組織を、形質転換されたアサ科細胞又は形質転換されたアサ科細胞から再生された組織をスクリーニングするための選択剤を使用して、異種ヌクレオチド配列の発現についてスクリーニングすることを更に含み、選択剤は、カナマイシンＡ（ｋａｎ）、ｇ４１８、スペクチノマイシン及びグリホサートから選択される。
【0015】
いくつかの態様では、アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露することは、アサ科分裂組織領域又はＥＡを、異種ヌクレオチド配列を有する細菌株と接触させることを含む。
【0016】
いくつかの態様では、アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露することは、アサ科分裂組織領域又はＥＡを、異種ヌクレオチド配列を有するように形質転換された細菌株を含む感染培地に曝露することを含む。
【0017】
いくつかの態様では、方法は、感染培地を除去することと、アサ科分裂組織領域又はＥＡを閾値期間共培養することと、アサ科分裂組織領域又はＥＡを選択培地中で培養して、形質転換されたアサ科分裂組織領域又はＥＡを選択することと、を更に含む。
【0018】
いくつかの態様では、感染培地は、チジアズロン（ＴＤＺ）、メトラクロール、硫酸マグネシウム、Ｔｗｅｅｎ、アセトシリンゴン（ＭＴＡ）、チオール、ＧＡ３、ＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン、ＤＫＷ塩、ＡＢ塩、グルコース、Ｓｉｌｗｅｔ Ｌ－７７、及びそれらの組合せを含む。
【0019】
いくつかの態様では、異種ヌクレオチド配列が、プロモータ及び場合によりスクリーニングマーカに作動可能に接続したレアカットエンドヌクレアーゼをコードする。
【0020】
いくつかの態様は、水和溶液中にアサ科種子を浸すことと、浸されたアサ科種子から胚組織のサブセットを切除して、アサ科分裂組織領域又はＥＡを抽出することと、アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露して、アサ科分裂組織領域又はＥＡのアサ科細胞を形質転換することと、チジアズロン（ＴＤＺ）を含む培養培地を使用して、形質転換されたアサ科細胞から組織を再生することと、を含む、方法に関する。
【0021】
いくつかの態様では、培養培地は、約１ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む苗条誘導培地を含む。
【0022】
いくつかの態様では、アサ科細胞を形質転換することは、アサ科分裂組織領域又はＥＡを、異種ヌクレオチド配列を有し、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む細菌株を含む感染培地に曝露することを含む。
【0023】
いくつかの態様では、組織を再生することは、アサ科分裂組織領域又はＥＡを、ＴＤＺを含む苗条誘導培地（ＳＩＭ）中で移送し、培養することと、ＳＩＭ中で培養した後、アサ科分裂組織領域又はＥＡを苗条伸長培地（ＳＥＭ）中で移送し、培養することと、により苗条の形成を誘導することを含む。
【0024】
いくつかの態様では、組織を再生することは、異種ヌクレオチド配列への曝露後であり、ＳＩＭへの移送前に、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む再生培地中でアサ科分裂組織領域又はＥＡを移送及び培養することによって回収を行うことを更に含み、ＳＩＭが約１ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む。
【0025】
いくつかの態様では、組織を再生することは、ＴＤＺを含む培養培地を使用して、形質転換されたアサ科細胞から苗条の形成を誘導することと、形成された苗条から根を誘導することと、を含む。
【0026】
いくつかの態様では、形成された苗条から根を誘導することは、形成された苗条を最小高さの苗条についてスクリーニングすることと、一次根を誘導するために選択された最小高さの苗条を発根させることと、新たな一次根及び根毛構造の形成を誘導するために、誘導された一次根を有する苗条を移送及び発根させることと、を含む。
【0027】
いくつかの態様では、方法は、一次根及び根毛構造を有する選択された苗条を土壌に移送することを更に含む。
【0028】
いくつかの態様は、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して産生された形質転換されたアサ科外植片に関する。
【0029】
添付の図面に関連して以下の詳細な説明を考慮すると、様々な例示的な実施形態をより完全に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図1】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な方法を示すフロー図である。
【図2】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な方法を示す別のフロー図である。
【図3】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡの形質転換されたアサ科細胞から形質転換アサ科組織を再生するための例示的スキームを示す図である。
【図4】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡのアサ科細胞に異種配列を送達するための例示的な発現構築物を示す図である。
【図5A】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な発現構築物を示す図である。
【図5B】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な発現構築物を示す図である。
【図5C】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な発現構築物を示す図である。
【図5D】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な発現構築物を示す図である。
【図5E】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な発現構築物を示す図である。
【図5F】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な発現構築物を示す図である。
【図5G】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な発現構築物を示す図である。
【図5H】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な発現構築物を示す図である。
【図5I】本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な発現構築物を示す図である。
【図6A】は本開示と一致する、表１の試料からの例示的な画像を含む図である。
【図6B】は本開示と一致する、表１の試料からの例示的な画像を含む図である。
【図7A】本開示と一致する、細菌株で形質転換された大麻実生外植片の画像である。
【図7B】本開示と一致する、細菌株で形質転換された大麻実生外植片の画像である。
【図10A】本開示と一致する、細菌株で形質転換された大麻の分裂組織領域の画像である。
【図10B】本開示と一致する、細菌株で形質転換された大麻の分裂組織領域の画像である。
【図11】本開示と一致する、細菌株で一時的に形質転換された大麻実生外植片の画像である。
【図12A】本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻実生外植片の画像である。
【図12B】本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻実生外植片の画像である。
【図12C】本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻実生外植片の画像である。
【図13A】本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻ＥＡの画像である。
【図13B】本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻ＥＡの画像である。
【図14A】本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻実生外植片の画像である。
【図14B】本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻実生外植片の画像である。
【図15A】本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻実生外植片の画像である。
【図15B】本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻実生外植片の画像である。
【図16A】本開示と一致する、異なる培養培地及び光条件を評価した実験のデータ結果の図である。
【図16B】本開示と一致する、異なる培養培地及び光条件を評価した実験のデータ結果の図である。
【図16C】本開示と一致する、異なる培養培地及び光条件を評価した実験のデータ結果の図である。
【図16D】本開示と一致する、異なる培養培地及び光条件を評価した実験のデータ結果の図である。
【図16E】本開示と一致する、異なる培養培地及び光条件を評価した実験のデータ結果の図である。
【図16F】本開示と一致する、異なる培養培地及び光条件を評価した実験のデータ結果の図である。
【図16G】本開示と一致する、異なる培養培地及び光条件を評価した実験のデータ結果の図である。
【図17A】本開示と一致する、異なる培地で外植片の形質転換を評価する実験からの外植片の画像である。
【図17B-17C】本開示と一致する、異なる培地で外植片の形質転換を評価する実験からの外植片の画像である。
【図17D】本開示と一致する、異なる培地で外植片の形質転換を評価する実験からの外植片の画像である。
【図17E】本開示と一致する、異なる培地で外植片の形質転換を評価する実験からの外植片の画像である。
【図17F】本開示と一致する、異なる培地で外植片の形質転換を評価する実験からの外植片の画像である。
【図18A】本開示と一致する、異なるプラスミドベクターを使用して外植片を形質転換した結果を示す図である。
【図18B】本開示と一致する、異なるプラスミドベクターを使用して外植片を形質転換した結果を示す図である。
【図18C】本開示と一致する、異なるプラスミドベクターを使用して外植片を形質転換した結果を示す図である。
【図18D】本開示と一致する、異なるプラスミドベクターを使用して外植片を形質転換した結果を示す図である。
【図18E】本開示と一致する、異なるプラスミドベクターを使用して外植片を形質転換した結果を示す図である。
【図18F】本開示と一致する、異なるプラスミドベクターを使用して外植片を形質転換した結果を示す図である。
【図18G】本開示と一致する、異なるプラスミドベクターを使用して外植片を形質転換した結果を示す図である。
【図18H】本開示と一致する、異なるプラスミドベクターを使用して外植片を形質転換した結果を示す図である。
【図18I】本開示と一致する、異なるプラスミドベクターを使用して外植片を形質転換した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本開示の態様は、アサ科種子から形質転換されたアサ科細胞株、植物及び植物部分、例えば種子部分の分裂組織領域又はアサ科ＥＡを産生するための種々の方法に関する。これらの方法は、アサ科種子からアサ科分裂組織領域又はＥＡを抽出することと、異種ヌクレオチド配列への曝露によってアサ科分裂組織領域又はＥＡの細胞を形質転換することと、を含み得る。曝露は、細胞の形質転換を引き起こすことができ、形質転換された細胞は、植物部分又は植物全体等の形質転換されたアサ科組織を再生するために使用することができる。本開示の植物、植物部分及び植物細胞は、特定のアサ科品種を生産するために使用することができる。いくつかの実施形態では、植物、植物部分及び植物細胞を使用して、特定の形質及び／又は表現型を有する新しい品種又はハイブリッドを開発することができる。本発明は必ずしもそのような用途に限定されないが、本発明の様々な態様は、この文脈を使用した様々な実施形態の説明を通して理解され得る。
【0032】
アサ科植物は様々な目的で使用されている。例えば、アサ科植物の一種である大麻は、成長の早い植物であり、食品、建築又は衣料材料、バイオマス、塗料、紙、及び他の材料源の低コスト源として、並びに医薬品又はレクリエーション目的のために使用することができる。特定の形質及び／又は品種を提供するために、組織培養において遺伝子編集技術を使用して植物を形質転換することができる。しかしながら、組織培養中のアサ科植物細胞は、クローン植物及びインタクト植物を形成し続ける胚形成性細胞を産生するために非応答性又は抵抗性であり得る。本開示の実施形態は、植物部分又は植物全体等の形質転換植物組織を形成するように再生することができる、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科植物細胞を形質転換することに関する。
【0033】
様々な実施形態では、アサ科分裂組織領域又はＥＡは、アサ科種子から調製される。例えば、アサ科種子全体を滅菌し、水和液中に浸すことができ、浸されたアサ科種子から胚組織のサブセットを切除して、アサ科分裂組織領域又はＥＡを抽出することができる。次いで、アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露して、アサ科分裂組織領域又はＥＡのアサ科細胞を形質転換する。異種ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコードすることができ、アサ科細胞に変異を引き起こすことができる。組織は、異種ヌクレオチド配列を発現する形質転換されたアサ科細胞から再生され得る。いくつかの実施形態では、再生組織は、形質転換によって引き起こされる特定の形質を示す植物部分又は完全なアサ科植物を含むことができる。
【0034】
ここで図面を参照すると、図１は、本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な方法を示すフロー図である。方法１００は、異種ヌクレオチド配列を発現するように形質転換されたアサ科細胞から形質転換されたアサ科組織を再生するために使用することができる。
【0035】
１０１において、方法は、アサ科種子を水和溶液に浸すことを含む。いくつかの実施形態では、種子は完全に成熟しており、傷のない種皮を有し、及び／又は細菌、真菌若しくは他の有害生物ベクターを含まない。例えば、水和溶液は、滅菌蒸留水又はｄｄＨ２Ｏ等の水を含むことができる。いくつかの実施形態では、アサ科種子の一定期間、水和溶液への曝露及び／又は回転シェーカーの使用を行うことによって、アサ科種子を浸すことができる。例えば、アサ科種子を滅菌水を入れた５０ｍＬチューブに入れ、１０～２４時間回転振盪機に置くことができる。いくつかの実施形態では、アサ科種子は、とりわけ他の範囲の中でも、１６～２０時間、１０～１４時間、１２～１４時間、１４～１６時間、１６～１８時間、又は１８～２０時間、回転シェーカー上に置くことができる。いくつかの実施形態では、アサ科種子を、滅菌濾紙及び２～３ｍＬの滅菌水を含む１００×２５ｍｍペトリ皿に入れ、密封し、とりわけ他の範囲の中でも、１６～２０時間、１０～１４時間、１２～１４時間、１４～１６時間、１６～１８時間、又は１８～２０時間浸すことができる。
【0036】
いくつかの実施形態では、アサ科種子を浸す前に、方法１００は、アサ科種子を滅菌することを含むことができる。いくつかの実施形態では、アサ科種子は、瘢痕化及び過酸化水素を使用して滅菌することができる。アサ科種子を硫酸等の酸に曝露することによって、瘢痕化をもたらすことができる。いくつかの実施形態では、アサ科種子を１秒～３０秒間酸に曝露することができ、次いで酸を除去し、種子を滅菌水ですすぎ、アサ科種子を過酸化水素又は別の滅菌剤に１～３０分間曝露する。しかしながら、これに限られることはなく、例えば、エタノール、次亜塩素酸塩（ＮａＣｌＯ又はＣａ（ＣｌＯ）２）、塩化ベンザルコニウム、硝酸銀、塩化水銀及び過酸化水素からなる群等の１種又は２種以上の殺菌剤を含む殺菌液を用いてアサ科種子を殺菌することを挙げることができる。滅菌溶液は、０．０１体積％～約９５体積％の範囲内で滅菌剤を含有することができる。アサ科種子は、０．１～約３０分間滅菌溶液に曝露することができる。滅菌溶液は、ポリソルベート（例えば、ＴＷＥＥＮ２０又はＴＷＥＥＮ８０）又は他の非イオン性界面活性剤等の穏やかな洗剤を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、アサ科種子を、約１０％の過酸化水素を含む滅菌溶液で洗浄することができる。アサ科種子を滅菌５０ｍＬコニカルチューブに入れ、滅菌溶液を添加することができる（例えば、５０ｍＬチューブを回転シェーカー上に置くことによって）。溶液に浸漬した後、アサ科種子を数回すすぐことができる。例えば、滅菌したアサ科種子を滅菌蒸留水で３～５回、各すすぎ１～１０分間すすぐことができる。滅菌後、乾燥を防ぐために、層流キャビネット内の密封ペトリ皿内の蒸留水中にアサ科種子を保持することができる。
【0037】
１０３において、方法１００は、アサ科分裂組織領域又はＥＡを抽出するために、浸されたアサ科種子から胚組織のサブセットを切除することを含む。本明細書で使用される場合、「アサ科ＥＡ」は、子葉を含まず、幼芽と小根との間の種子の一部を含む。「分裂組織領域」には、成長が起こり得る植物の区域に見られる未分化細胞（分裂組織細胞）を含む植物組織が含まれる。アサ科ＥＡは、幼芽、小根及び胚軸を含み得る。子葉の付着点と小根との間の胚の部分は、胚軸と呼ばれる。ＥＡは、根が発生する領域である小根で終わる。発芽後、胚は実生に起源を与えることができる。いくつかの実施形態では、分裂組織領域の未分化細胞は、成長が起こり得る植物の区域に見られる植物（分裂組織細胞）に成長及び再生する能力を有することができる。
【0038】
いくつかの実施形態では、胚組織のサブセットを切除することは、浸されたアサ科種子の子葉のいずれも除去することなく、種皮を除去することを含み得る。例えば、滅菌鉗子又は他の切除器具（例えば、メス、ハサミ）を使用して、種皮及び胚組織を除去することができる。いくつかの実施形態では、胚組織のサブセットを切除することは、浸されたアサ科種子の種皮と、子葉のうちの１つと、を除去することを含む。子葉の１つ等の胚組織のサブセットを切除することは、全ての胚組織を切除することと比較して、抽出の時間及びコストを低減することができ、組織を破壊するリスクも低減することができる。いくつかの実施形態では、胚組織のサブセットを切除することは、種皮を除去することと、浸されたアサ科種子の小根を切断することとを含む。いくつかの実施形態では、胚組織のサブセットを切除することは、浸されたアサ科種子の種皮、子葉の両方、及び葉原基を除去することを含む。更なる実施形態では、胚組織のサブセットを切除することは、浸されたアサ科種子の種皮、子葉のうちの１つ、及び葉原基を除去することを含む。上記のように、子葉の１つを除去することは、胚組織の全てを切除することと比較して組織損傷を軽減することができ、それによって形質転換効率を改善し、形質転換に関連する時間及びコストを削減する。様々な実施形態では、滅菌鉗子を使用して種皮を除去し、次いで胚を分裂組織領域又はＥＡ抽出の準備が整う。例えば、鉗子を使用して種子を保持し、メス刃を使用して子葉の一方又は両方を切り落とすことができる。分裂組織への損傷を防止又は緩和するように注意を払うことができる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の子葉を除去した後、メス刃を使用して、分裂組織の損傷を防止又は軽減するように注意しながら、葉原基を除去することができる。
【0039】
１０５において、方法１００は、アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露して、アサ科分裂組織領域又はＥＡのアサ科細胞を形質転換することを含む。異種ヌクレオチド配列は、アサ科細胞によって発現される及び／又はアサ科細胞の形質転換を引き起こすポリペプチドをコードすることができる。例えば、異種配列は、目的の遺伝子をコードすることができる。異種ヌクレオチド配列の発現に応答して、形質転換されたアサ科細胞を使用して、目的の遺伝子に関連する１つ以上の形質を示す組織、植物部分、又は植物全体を再生することができる。
【0040】
いくつかの実施形態では、アサ科細胞は、細菌媒介形質転換を使用して形質転換される。例えば、アサ科分裂組織領域又はＥＡを異種ヌクレオチド配列に曝露することは、アサ科分裂組織領域又はＥＡを、異種ヌクレオチド配列を有する細菌株と接触させることを含む。細菌株は、異種ヌクレオチド配列を有するように形質転換することができる。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に更に記載されるように、アサ科分裂組織領域又はＥＡを形質転換細菌株を含む感染培地に曝露することによってアサ科細胞を形質転換することを含む。
【0041】
細菌株は、目的の遺伝子を発現する等、異種ヌクレオチド配列の発現を誘導するように形質転換された任意の株を含むことができる。細菌株は、リゾビウム株又はアグロバクテリウム株等のリゾビウム株を含むことができる。いくつかの実施形態では、細菌株は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又は以前はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）（Ａ．リゾゲネス）として知られていたリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）株（Ｒ．リゾゲネス）を含む。リゾビウム株には、感染植物に疾患症状を引き起こし、根誘導（Ｒｉ）プラスミド又は腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドに含まれるＴ－ＤＮＡが含まれる。いくつかの実施形態では、Ｔｉ又はＲｉプラスミドを保有する野生型又はディスアームド株を使用することができる。例えば、リゾビア（Ｒｈｉｚｏｂｉａ）株は、Ｔ－ＤＮＡプロセシング、移入及び組み込みを媒介する完全なｖｉｒ遺伝子機能を保持するが、ヘルパーＴｉ又はＲｉプラスミド中の癌遺伝子を除去するという点で除菌することができる。細菌株は、バイナリーベクター中に目的の遺伝子を含有する第２のＴ－ＤＮＡを含む。形質転換中、ヘルパーＴｉプラスミドによってコードされる病原性タンパク質は、細菌から植物へのバイナリーベクター上のＴ－ＤＮＡの移入を助けるためにトランスで作用する。細菌株由来のＴ－ＤＮＡは、植物部分に安定に組み込むことができる。例えば、植物組織のリゾビア感染から生じる組織は、Ｒｉ又はＴｉプラスミドからＴ－ＤＮＡを運び、それらの植物宿主との血管接続を形成する。
【0042】
一般に、細菌株は、異種ヌクレオチド配列を細菌株に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入し、形質転換された細菌株を陽性に形質転換された細胞を選択する条件下で培養することによって感染のために調製される。いくつかの実施形態では、方法１００は、特定の細菌株を選択することを含む。形質転換細胞の産生に有効な細菌株の選択は、感染させる植物種に依存し得、経験的に決定することができる。
【0043】
いくつかの実施形態では、Ｔｉ又はＲｉプラスミドを有するＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）又はＡ．リゾビウム（Ａ．ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の野生型及びディスアームド株を植物への遺伝子導入に使用することができる。例示的な株には、ノパリン型株、ＬＢＡ４４０４等のオクトピン型株、スクシナモピン型株、例えばＥＨＡ１０１又はＥＨＡ１０５、並びにＡ．リゾゲネスアグロピン（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ ａｇｒｏｐｉｎｅ）、マンノピン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）及びククモピン（ｃｕｃｕｍｏｐｉｎｅ）型株（例えば、ＭＳＵ４４０、Ａ１３、１８５５、１１９３、Ａ４、Ｑｕａｌ、Ｋ５９９（ＡＫＡＮＣＰＰＢ２６５９）、及びＣ５８Ｃ１）に由来するＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）が含まれるが、これらに限定されない。場合により、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株は、ＡＧＬ１、ＥＨＡ１０５、ＧＶ３１０１、ＩＣＦ３２０、ＣｒｙＸ、ＬＢＡ４４０４、Ｃ５８、Ａ１３６、Ａ２０８、Ａ３４８、Ａｃｈ５、ＥＨＡ１０１、ＮＴ１ＲＥ、ＮＴ１ＲＥ（ｐＪＫ２７０）、１Ｄ１１０８、１Ｄ１４６０、１Ｄ１６０９、１Ｄ１３２、１Ｄ１４７８及び１Ｄ１４８７からなる群から選択され、Ａ．リゾビウム株はＫ５９９又はＫ５９９に由来する株である。
【0044】
核酸配列は、直接的又は間接的な植物形質転換法によって導入することができる。本開示の実施形態は、アサ科分裂組織領域又はＥＡにＤＮＡ片を注入するための活性化リゾビウム細菌の使用を含む。ＤＮＡ片は、リゾビウム媒介形質転換のためのバイナリープラスミドに導入された発現カセットの一部であり得る。発現カセットは、従来の方法を用いて細菌に導入することができる。
【0045】
細菌媒介植物形質転換は、プラスミドにクローニングされたＤＮＡ断片によるリゾビウム株の活性化を含む。次いで、活性化されたリゾビウム株は、分裂組織領域又はＥＡの個々の植物細胞への形質転換に使用される。いくつかの実施形態では、Ｔ－ＤＮＡは、形質転換及び／又はアサ科分裂組織領域における形質転換体又は細胞内のＥＡの位置を確認するスクリーニングマーカのＤＮＡ配列を含む。例えば、スクリーニングマーカは、選択マーカ又は標識マーカを付与する遺伝子を含み得る。スクリーニングマーカは、目的の遺伝子と同じベクターに埋め込むことができ、又は別個のベクターとして送達することができる。標識マーカは、蛍光顕微鏡法を使用して検出することができる蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ又はｅＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ））等、視覚的、電気的、又は他の方法で検出することができる検出可能な標識を付与することができる。選択マーカは、毒性物質（例えば、選択剤）に対する耐性を付与することができる。植物形質転換のための選択マーカの例には、抗生物質又は除草剤等の毒性物質に対する耐性を付与する選択マーカが含まれる。例えば、選択マーカは、カナマイシン耐性遺伝子、ｇ４１９８耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、又はグリホサート耐性遺伝子を含み得る。標識マーカの例としては、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、Ｒｕｂｙ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。スクリーニングマーカは、特定の組織における遺伝子の発現の空間パターンを定量又は可視化するのに有用であり得、遺伝子発現の調査のために遺伝子又は遺伝子調節配列に融合され得るので、レポーター遺伝子と呼ばれることが多い。例えば、ＧＦＰ変異体である黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）を使用して、リゾビウムが外来ＤＮＡを取り込むことができる植物細胞を示すことができる。
【0046】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、遺伝子編集試薬を含む。遺伝子編集試薬は、レアカットエンドヌクレアーゼ又はその一部（例えば、サブユニット）を含むことができる。レアカットエンドヌクレアーゼは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、又はクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ試薬であり得る。例えば、レアカットエンドヌクレアーゼは、Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：２３－２６，２０１２；Ｂｅｌａｈｊ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９：３９，２０１３；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４３５：１１２２－１１２５，２００５；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０３：１０５０３－１０５０８，２００６；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：６４８－６５１，２００７；Ｓｕｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１０４：１０７２０－１０７２５，２００７；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：６４５－６４８，２００７；Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，１６３：２５６－２７２，２００６；及び国際公開第２０１１／０７２２４６号に記載されるように埋め込まれ、これらはそれぞれ、その教示のためにその全体が本明細書に組み込まれる。
【0047】
いくつかの実施形態では、ベクターは、標的部位に結合し、標的部位で変異を引き起こす第１及び第２のＴＡＬＥＮ及び結合ドメインをコードするＴＡＬＥＮ配列を含むことができる。第１のＴＡＬＥＮは、第１の結合ドメインに関連する第１の標的部位又はその近傍に二本鎖切断を生成することができ、第２のＴＡＬＥＮは、第２の結合ドメインに関連する第２の標的部位又はその近傍に二本鎖切断を生成することができる。いくつかの実施形態では、第１及び第２の結合ドメインは、標的遺伝子と会合することができる。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮ配列を二次導入遺伝子と共に植物組織に共送達して、ウイルス（例えば、毛状根）導入遺伝子と共に二次導入遺伝子の発現を引き起こすことができる。
【0048】
上記のように、例はＴＡＬＥＮに限定されず、とりわけＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（例えば、Ｂｅｌａｈｊ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９：３９，２０１３を参照のこと）を含むことができ、又は遺伝子編集試薬を含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを使用することができる（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との複合体、又はｃｒＲＮＡの３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端との合成融合物（ｓｇＲＮＡ）のいずれか）。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９結合及びＤＮＡ切断を、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する相同配列に向ける。標的ＤＮＡ配列に到達すると、Ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡ標的化配列の３’末端から３ヌクレオチドの位置にＤＮＡ二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、このアプローチ又は他のアプローチ、例えばＺＦＮ及び／又はメガヌクレアーゼを、改変された植物部分を得るためにＴＡＬＥヌクレアーゼに加えて使用することができる。
【0049】
様々な実施形態では、細菌株は、アサ科分裂組織領域又はＥＡ及び関連細胞を感染及び形質転換するために使用される感染培地の一部を形成することができる。感染培地は、形質転換細菌株、基礎塩、糖、及び成長ホルモン及び／又は植物成長調節剤を含み得る。植物成長調節剤は、植物成長を改変する、例えば再生を誘導する化合物を指すか、又は含む。いくつかの実施形態では、植物成長調節剤は、チジアズロン（ＴＤＺ）を含む。例えば、感染培地は、約１ミリグラム（ｍｇ）／リットル（Ｌ）のＴＤＺを含み得る。しかし、実施形態はそのように限定されず、他の成長ホルモン又は調節因子及び／又は他の濃度のＴＤＺ、例えばとりわけメタトポリン、メトラクロール又は硫酸マグネシウムを含み得る。いくつかの実施形態では、感染培地は、硫酸マグネシウム、Ｔｗｅｅｎ、及びアセトシリンゴン（ＭＴＡ）を含む。いくつかの実施形態では、感染培地ＴＤＺ、メトラクロール、硫酸マグネシウム、Ｔｗｅｅｎ、アセトシリンゴン（ＭＴＡ）、チオール（例えば、ＤＴＴ、ＳＴＳ、Ｌ－システイン）、ＧＡ３、ＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン、ＤＫＷ塩、ＡＢ塩、グルコース、及びそれらの組合せ。いくつかの実施形態では、感染培地は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む。いくつかの実施形態では、感染培地は、とりわけ他の範囲の中でも、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１．０ｍｇ／Ｌ、約０．１ｍｇ／Ｌ～約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約２ｍｇ／Ｌ、約１．５ｍｇ／Ｌ～約２ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約１．０ｍｇ／Ｌ、約１．０ｍｇ／Ｌ～約１．５ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む。
【0050】
分裂組織領域又はＥＡを細菌株に露出させることは、分裂組織領域又はＥＡの細胞の細胞内空間に細菌株を導入することを含み得る。例えば、核酸配列を保有する細菌株は、アサ科分裂組織領域又はＥＡを感染培地中の細菌懸濁液に浸すことによって細胞内空間に導入することができる。いくつかの実施形態では、分裂組織領域又はＥＡは、細胞壁をより透過性にする化学処理（例えば、セルラーゼ、ペクチナーゼ又はマセロザイム等の浸軟酵素による処理）を受けることができる。形質転換効率は、ドナー材料を真空浸透、熱ショック及び／又は遠心分離、及び超音波処理に供することによって高めることができる。
【0051】
様々な実施形態では、形質転換は、細菌培養物を調製すること、接種すること、及び共培養することを含み得る。例えば、アサ科分裂組織領域又はＥＡを接種するための目標濃度の感染培地に培養及び懸濁することにより調製することができる。細菌培養物は、筋状プレートから接種することができ、細菌細胞を洗浄し、アサ科分裂組織領域又はＥＡの接種に適した培養培地に再懸濁する。いくつかの実施形態では、細菌は、初期スターター培養物として栄養リッチ液体培地中で約８時間増殖させることができ、スターター培養物を使用して、アグロバクテリウム最小増殖（ＡＢ）培地を含有する振盪フラスコに接種し、約２０～２４時間増殖させることができる。
【0052】
接種に使用される細菌培養物の密度及びアサ科分裂組織領域又はＥＡに対する細菌細胞の比は変化し得る。例えば、過剰増殖を防ぐために、感染培地中の細菌の濃度を変えることができる。細菌密度を最適化することにより、形質転換を促進することができる。細菌密度は、１０，０００，０００～１，０００，０００，０００ｃｆｕ／ｍＬに相当する０．４～０．９のＯＤ６００（ｎｍ）の範囲内で変化させることができる。いくつかの実施形態では、培養物は、少なくとも０．７から１．５の細菌密度まで増殖又は希釈される。
【0053】
酸化ストレス及び／又は細菌の過剰増殖を緩和することによって感染率及び形質転換率を改善するために、感染培地に１つ又は複数の化合物を補充することができる。例えば、感染培地は、有効量のチオール又は関連する硫黄含有化合物等の酸化防止剤を含むことができる。適切なチオール化合物としては、Ｌ－システイン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及びチオ硫酸ナトリウムが挙げられる。感染培地は、上述のように、他の化学物質（例えば、ＴＤＺ、メタトポリン、グリホサート）を含むことができる。感染培地はまた、アセトシリンゴン等のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換効率を高める化合物を含み得る。
【0054】
いくつかの実施形態では、方法１００は、例えば前述のスクリーニングマーカを使用して、形質転換されたアサ科細胞をスクリーニングすることを更に含むことができる。そのような実施形態は、アサ科分裂組織領域、ＥＡ、及び／又は異種ヌクレオチド配列によってコードされる１つ以上のタンパク質を発現する細胞を選択するための選択プロトコルの使用を含む。前述のように、異種ヌクレオチド配列は、場合によりスクリーニングマーカをコードすることができる。スクリーニングマーカは、形質転換されたアサ科分裂組織領域、ＥＡ、及び／又は細胞を同定するため、及び／又は形質転換されたアサ科分裂組織領域、ＥＡ、及び／又は細胞と形質転換されていないアサ科分裂組織領域とを区別するために使用することができる。例えば、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）発現の選択は、他の炭素源の制限を伴う培地へのマンノースの添加を含む。形質転換された細胞及び／又は組織は、様々な方法によって同定することができ、そのいくつかを以下に記載する。
【0055】
上記のように、スクリーニングマーカは、標識マーカ及び／又は選択マーカを含むことができる。標識マーカは、標識の視覚的、電気的、又は他の識別を可能にする。標識マーカの例としては、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ベタライン、及び漂白を引き起こすＰＤＳ編集が挙げられる。通常、発現は自発的に起こる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の発現は、例えば、生物因子又は非生物因子の変化によって誘導される。標識マーカに関連する遺伝子の発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ノーザンブロッティング、ドットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、核ランオン及び／又は核ランオフ、ＲＮａｓｅ保護、又はＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロッティング等の免疫学的及び酵素的方法によって測定することができる。組織を、標識マーカの発現についてアッセイすることができる。蛍光タンパク質マーカの発現は、ＵＶ励起、蛍光顕微鏡法又はフローサイトメトリーによって可視化することができる。形質転換効率を計算し、従来の方法と比較することができる。
【0056】
いくつかの実施形態では、選択マーカを発現するように形質転換されていないアサ科細胞及び／又は組織を中和する（例えば、死滅させる）ために選択剤を使用することができる。例えば、選択マーカは、抗生物質又は除草剤等の毒性物質であり得る選択剤に対する耐性を付与する遺伝子に関連し得る。いくつかの実施形態では、方法１００は、形質転換されたアサ科細胞又は形質転換されたアサ科細胞から再生された組織をスクリーニングするために選択剤を使用することを含む。例えば、選択マーカは、カナマイシン等の抗生物質を含むか又はそれと会合することができ、カナマイシンに対する耐性を提供することができる。十分な量のカナマイシンに曝露された場合、形質転換されていないアサ科分裂組織領域及び／又はＥＡは死滅し、形質転換されたアサ科分裂組織領域及び／又はＥＡは生存することができる。選択剤の例としては、カナマイシンＡ（ｋａｎ）、ｇ４１８、スペクチノマイシン及びグリホサートが挙げられる。
【0057】
方法１００は、図２によって更に図示及び記載されるように、１０１及び１０３におけるアサ科分裂組織領域及び／又はＥＡ調製、１０５におけるアサ科細胞の形質転換、並びに形質転換されたアサ科細胞からの組織の再生を含み得る。調製は、アサ科種子を浸すこと、及びアサ科分裂組織領域又はＥＡを産生するために胚性物質のサブセットを除去することを含み得る。アサ科細胞の形質転換は、細菌培養物の調製、接種及び共培養を含み得る。共培養後、組織を再生することができる。組織を再生することは、感染したアサ科分裂組織領域又はＥＡから苗条形成を誘導すること、苗条を伸長させること、及び苗条を発根させることによって苗条から根形成を誘導することを含み得る。方法１００は、アサ科分裂組織領域又はＥＡが異種ヌクレオチド配列に曝露された後２～１５週間以内に、形質転換されたアサ科植物部分を提供することができる。本開示の材料及び方法は、アサ科のための効率的な形質転換系の開発を可能にする。
【0058】
接種は、約２０～２８℃（℃）、約２３～２８℃、約２４～２６℃又は約２５℃の温度で行うことができる。懸濁液との接触時間は、約１分未満（短時間浸漬）～約３時間の範囲であり得る。接種後、過剰の細菌懸濁液を除去することができ（例えば、滅菌ｄｄＨ２Ｏ中でのブロッティング又はリンスによって）、ＥＡを共培養培地上にプレーティングする。
【0059】
異なる植物組織培養培地を共培養工程に使用することができる。インビトロ条件下でのアサ科分裂組織領域又はＥＡと細菌の共培養は、持続時間、温度、放射照度、並びに／又は培地組成及びｐＨに関して最適化することができる。他の実施形態では、滅菌水で湿らせた滅菌濾紙を共培養工程に使用することができる。いくつかの実施形態では、アサ科分裂組織領域又はＥＡを閾値期間共培養した。例えば、１～４日間の共培養で形質転換を成功させるのに十分であり得るが、形質転換効率を高める必要がある難治性遺伝子型にはより長い期間（例えば、５～７日間）を利用することができる。インキュベーションのための温度は、１８～２５℃、又は２０～２３℃、例えば約２３℃の範囲であり得る。共培養は、光又は光制限条件で行うことができる。照明条件は、植物遺伝子型に最適化することができる。いくつかの実施形態では、共培養は、２～４日間の共培養のために２３±１℃の周囲光で行われる。
【0060】
共培養後、いくつかの実施形態では、形質転換された分裂組織領域及び／又はＥＡを抗生物質溶液ですすぎ、過剰な細菌を除去することができる。抗生物質リンス溶液は、セフォタキシム、チメンチン、又はカルベニシリン等の１つ又は複数の抗生物質からなることができる。抗生物質リンス後、形質転換された分裂組織領域及び／又はＥＡを選択培地（例えば、ＳＩＭ）上にプレートすることができる。選択培地は、基礎塩、及び抗生物質（例えば、カルベニシリン、チカルシリン、クラブラン酸、アンピシリン、スペクチノマイシン及び／又はセフォタキシム）等の細菌増殖を阻害する薬剤を含むことができる。選択培地の例には、基礎塩（例えば、ＤＫＷ）及びビタミン（例えば、Ｂ５ビタミン）、並びに有効量の以下のもの：糖（例えば、スクロース、グルコース、マルトース）、約５．４～６の範囲内のｐＨを維持するための緩衝液（例えば、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ））及び抗生物質（例えば、セフォタキシム及びチカルシリンとクラブラン酸との組合せ（チメンチン）及び／又はスペクチノマイシン）が含まれ得る。いくつかの実施形態では、選択培地は、選択剤を更に含むことができる。例えば、選択マーカがスペクチノマイシン耐性遺伝子であるｓｐＣＮである場合、選択培地は有効量のスペクチノマイシン（例えば、最大１５０ｍｇ／Ｌ）を含み得る。
【0061】
いくつかの実施形態では、汚染を低減又は排除するのを助けるために、変換された分裂組織領域及び／又はＥＡをＣＬ培地等の再生培地に移すことによって回収工程が実行される。ＣＬ培地は、汚染物質を低減又は除去する植物保存混合物（ＰＰＭ）等の殺生物剤を含むことができる。再生培地は、ビタミン、糖、基礎塩、及び／又はＴＤＺ等の植物成長調節剤を更に含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＬ培地は、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬ培地は、約１ｍｇ／ＬのＴＤＺ又は約２ｍｇ／ＬのＴＤＺを含む。いくつかの実施形態では、ＣＬ培地は、とりわけ他の範囲の中でも、約０．１～約９ｍｇ／Ｌ、約０．１～約８ｍｇ／Ｌ、約０．１～約７ｍｇ／Ｌ、約０．１～約６ｍｇ／Ｌ、約０．１～約５ｍｇ／Ｌ、約０．１～約４ｍｇ／Ｌ、約０．１～約３ｍｇ／Ｌ、約０．１～約２．５ｍｇ／Ｌ、約０．１～約２ｍｇ／Ｌ、約０．１～約１．５ｍｇ／Ｌ、約０．１～約１．０ｍｇ／Ｌ、約０．１～約０．５ｍｇ／Ｌ、０．５～約１０ｍｇ／Ｌ、約１～約１０ｍｇ／Ｌ、約１．５～約１０ｍｇ／Ｌ、約２．０～約１０ｍｇ／Ｌ、約２．５～約１０ｍｇ／Ｌ、約２～約８ｍｇ／Ｌ、約２～約６ｍｇ／Ｌ、約２～約４ｍｇ／Ｌ、約２～約３ｍｇ／Ｌ、ＴＺ／Ｌを含む。
【0062】
図２は、本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための別の例示的な方法を示す流れ図である。方法２００は、図１によって説明された工程１０１，１０３，１０５を含み、その詳細は繰り返されない。
【0063】
方法２００は、２０７において、形質転換されたアサ科細胞から組織を再生することを更に含み、組織は、苗条、根、根毛構造及び完全植物のうちの１つ以上を含む。図３によって更に例示されるように、組織を再生することは、形質転換されたアサ科細胞から苗条の形成を誘導することを含み得る。例えば、苗条形成の誘導は、苗条形成を誘導すること及び苗条伸長を誘導することを含み得る。いくつかの実施形態では、組織を再生することは、形質転換されたアサ科細胞から苗条の形成を誘導すること、及び形成された苗条から根を誘導することを含み得る。
【0064】
いくつかの実施形態では、苗条形成を誘導することは、以下に更に示すように、アサ科分裂組織領域又はＥＡを苗条誘導培地（ＳＩＭ）、例えばＳＩＭ＋Ｓ１００（ＴＤＺ２）又は（ＴＤＺ１０）に移して培養することを含み得る。いくつかの実施形態では、アサ科分裂組織領域又はＥＡは、１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含むＳＩＭ上で約２～約６週間、いくつかの実施形態では、約２週間～３週間培養することができる。アサ科分裂組織領域又はＥＡは、根を有する植物を地面に置き、小根がＳＩＭ培地を浸すことができるようにするのと同様に、小根をＳＩＭ培地中に置き、頂端分裂組織を上に置いた状態でＳＩＭ中で配向させることができる。ＳＩＭ培地は、ＴＤＺの植物成長調節剤を含むことができる。やや驚くべきことに、約０．１ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌの濃度のＴＤＺをＳＩＭ培地中で使用することができる。いくつかの実施形態では、ＳＩＭ培地は約２ｍｇ／Ｌ又は約１０ｍｇ／Ｌを含むが、実施形態はそのように限定されない。ＴＤＺは、アサ科分裂組織細胞の頂端優性を破るのに十分な濃度でＳＩＭ中に存在することができ、それによって形質転換効率を高め、より多くのトランスジェニック事象をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳＩＭ培地は、とりわけ他の範囲の中でも、約０．１ｍｇ／Ｌ～約１５ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～約８ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～約６ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～約５ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～約４ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～約３ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～約２ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～約１ｍｇ／Ｌ、０．１ｍｇ／Ｌ～約０．５ｍｇ／Ｌ、約０．５ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約３ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約４ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約６ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約８ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約１５ｍｇ／Ｌ～約２０ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ～約１５ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌ、約２ｍｇ／Ｌ～約５ｍｇ／ＬのＴＤＺを含み得る。
【0065】
ＳＩＭ培地中で培養した後、方法２００は、アサ科分裂組織領域又はＥＡを第１苗条伸長培地（ＳＥＭ）中で転写及び培養することを含み得る。いくつかの実施形態では、第１のＳＥＭに移す前に、メス刃又は他の道具を使用して苗条の小根を切断することができる。第１のＳＥＭで培養した後、いくつかの実施形態では（実施形態はそのように限定されないが）、方法２００は、アサ科分裂組織領域又はＥＡを第２のＳＥＭで移送及び培養することを更に含むことができる。第１のＳＥＭ及び第２のＳＥＭの両方について、アサ科分裂組織領域又はＥＡの小根は、ＳＥＭ内に下方に配向され、頂端分裂組織は上に配置される。第１のＳＥＭ及び第２のＳＥＭは、異なる量のスペクチノマイシン等の異なる量の選択剤を含むことができる。
【0066】
いくつかの実施形態では、根を苗条から誘導することができる。形成された苗条から根を誘導することは、形成された苗条を、高さ１～２インチの苗条等の最小高さの苗条についてスクリーニングすることを含むことができる。最小高さの苗条を選択することができ、方法１００は、選択された苗条を発根させて一次根形成を誘導することと、誘導された一次苗条を有する苗条を移送して発根させて新しい一次苗条及び根毛構造形成を誘導することとを更に含む。様々な実施形態では、選抜した苗条は、発根培地（ＲＭ）中で発根され、新鮮なＲＭ中で継代培養されて、新しい一次根及び根毛構造を誘導する。方法２００は更に、一次根及び根毛構造を有する選択された苗条を土壌に移して、ポリペプチドを発現する部分的又は全体的なアサ科植物、例えば目的の一又は複数のタンパク質を再生することを含み得る。
【0067】
上記の感染培地、共培養培地、選択培地、再生培地（例えば、ＣＬ培地）、ＳＩＭ、第１のＳＥＭ、第２のＳＥＭ、及び／又はＲＭは、一般に、水、基礎塩混合物、糖、並びにビタミン、選択剤、アミノ酸、及び植物ホルモン等の１つ又は複数の他の成分を含む。ＳＩＭ、第１のＳＥＭ、及び第２のＳＥＭの各々は、水及びビタミン等の他の試薬の中でも、糖、基礎塩、成長ホルモン、及び抗生物質を含むことができる。例えば、ＳＩＭ及びＳＥＭは、窒素、リン、カリウム、硫黄、カルシウム、マグネシウム、鉄、ホウ素、モリブデン、マンガン、コバルト、亜鉛、銅、塩素及びヨウ素の栄養源を含むことができる。マクロ元素は、ＮＨ４ＮＯ３、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＫＮＯ３、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及びＫＨ２ＰＯ４として提供することができる。ミクロ元素は、ＫＩ、Ｈ３ＢＯ３、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ、ＺｎＳＯ４、Ｎａ２ＭｏＯ４ ２Ｈ２Ｏ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及びＮａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏとして提供することができる。ニコチン酸、ピリドキシン－ＨＣｌ、チアミン－ＨＣｌ、及びグリシン等の有機サプリメントを含めることができる。一般に、培地のｐＨは、希釈ＫｏＨ及び／又はＨＣｌを用いて５．７±０．５に調整される。固体植物培養培地は、ゲル化剤、例えば、ゲルライト、寒天又はアガロースを更に含むことができる。様々な実施形態では、上記の例示的な実施形態で説明したように、感染培地、再生培地、及び／又はＳＩＭは、ＴＤＺの植物成長調節剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＳＩＭは、感染培地及び／又は再生培地よりも高い濃度のＴＤＺを含み得る。
【0068】
任意の適切な植物培養培地を使用することができる。培地配合物の例としては、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（１９６２）、Ｎ６、Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ（１９６５）、Ｌ３（Ｌｉｎ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ（２００５））、Ｕｃｈｉｍｉｙａ ａｎｄ Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ（１９６２）、Ｇａｍｂｏｒｇ’ｓ ｍｅｄｉａ（１９６８）、Ｄ ｍｅｄｉｕｍ、Ｎｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｎｉｔｓｃｈ（１９６９）、ＤＫＷ、及びＳｃｈｅｎｋ ａｎｄ Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄｔ（１９７２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0069】
ＳＩＭ及びＳＥＭは、選択剤、植物ホルモン及び／又は植物成長調節剤、例えばオーキシン、サイトカニン又はジベレリンを含むことができる。植物ホルモンは、天然に存在する植物ホルモン若しくは植物成長調節剤の遊離形態及びコンジュゲート形態、又はそれらの合成類似体及び前駆体から選択することができる。オーキシンの天然に存在する及び合成類似体には、インドール酢酸（ＩＡＡ）、３－インドール酪酸（ＩＢＡ）、α－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）、４－（２，４－ジクロロフェノキシ）酪酸、２，４，５－トリクロロフェノキシ酢酸（２，４，５－Ｔ）、３－アミノ－２，５－ジクロロ安息香酸（クロランベン）、（４－クロロ－２－メチルフェノキシ）酢酸（ＭＣＰＡ）、４－（４－クロロ－２－メチルフェノキシ）ブタン酸（ＭＣＰＢ）、メコプロップ、ジクロプロップ、キンクロラック、ピクロラム、トリクロピル、クロピラリド、フルオロキシピル、ジカンバ及びそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。２つ以上のオーキシンの任意の組合せが栄養培地中に存在し得る。サイトカイニンの天然及び合成類似体には、カイネチン、ゼアチン、ゼアチンリボシド、ゼアチンリボシドホスフェート、ジヒドロゼアチン、イソペンチルアデニン６－ベンジルアデニン及びそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。２つ又はそれを超えるサイトカイニンの任意の組合せが培地中に存在し得る。
【0070】
有効量のオーキシン、及び場合により有効量のサイトカイニンの存在は、細胞分裂を促進し、再生能を改善し、及び／又はより再生性の高い組織の成長を誘導することができる。形態学的応答を生じさせる外因性オーキシンの効果は、１つ以上の酸化防止剤、アミノ酸、コバルト又はＡｇＮＯ３の添加によって増強され得る。Ｃａｓアミノ酸は、分解することなく高塩条件に耐えることができる、カゼインから加水分解されたアミノ酸の形態の有機窒素源を提供する。グルタミン、アスパラギン、及びメチオニンは、形態形成応答をもたらす生合成経路の調節において複雑な役割を果たす。
【0071】
図３は、本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡの形質転換されたアサ科細胞から形質転換アサ科組織を再生するための例示的スキームを示す図である。スキーム３１０は、図１の方法１００及び／又は図２の方法２００の実施態様を含むことができる。
【0072】
３１５において、アサ科種子３１２を滅菌して、滅菌されたアサ科種子３１４を生成することによって、アサ科分裂組織領域又はＥＡ３２０を調製することができる（３１１）。滅菌は、前述のように、滅菌剤の使用を含むことができる。滅菌されたアサ科種子３１４は、３１７において、アサ科種子３１２を水和溶液に浸すことによって浸すことができる。胚組織のサブセットは、３１９において、アサ科分裂組織領域又はＥＡ３２０を抽出するために、浸されたアサ科種子３１８から切除され得る。
【0073】
アサ科分裂組織領域又はＥＡ３２０は、３２１において、異種ヌクレオチド配列に曝露され得る。いくつかの実施形態では、曝露は、前述のように、アサ科分裂組織領域又はＥＡ３２０を、異種ヌクレオチド配列を有する細菌株を含む感染培地と接触させることによって、アサ科分裂組織領域又はＥＡ３２０を細菌株と接種及び共培養すること、並びに形質転換に十分なインビトロ条件下で共培養することを含む。
【0074】
異種ヌクレオチド配列への曝露は、アサ科分裂組織領域又はＥＡ３２０内のアサ科細胞３２２の形質転換を引き起こし得る。いくつかの実施形態では、アサ科細胞をスクリーニングして、形質転換されたアサ科細胞３２２を同定することができる。形質転換された細胞又は組織は、様々な方法によってスクリーニングすることができる。上記のように、細胞又は組織は、選択培地中の選択剤及び／又は形質転換細胞によって発現されるスクリーニングマーカを使用してスクリーニングすることができる。いくつかの例において、ヌセヌクレオチド配列の移入は、例えば、生物学的又は非生物学的因子の変化によって誘導される。目的の遺伝子の発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ドットブロットハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、核ランオン及び／又は核ランオフ、ＲＮａｓｅ保護、又はＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、及びウェスタンブロッティング等の免疫学的及び酵素的方法によって測定することができる。組織を、標識の発現についてアッセイすることができる。蛍光タンパク質マーカの発現は、ＵＶ励起、蛍光顕微鏡法又はフローサイトメトリーによって可視化することができる。形質転換効率を計算し、従来の方法と比較することができる。しかし、実施形態はそのように限定されず、いくつかの実施形態では、スクリーニングは行われなくてもよい。
【0075】
いくつかの実施形態では、３２３において、形質転換されたアサ科細胞３２２を有するアサ科分裂組織領域又はＥＡを再生培地（例えば、ＣＬ培地）に移し（例えば、）、一定期間、例えば１～５日間培養して、回収工程を行うことができる。再生培地（交換可能に回収培地と呼ばれ得る）は、ＰＰＭ等の殺生物剤を含有する上述のＣＬ培地を含むことができる。いくつかの実施形態では、再生培地は、１つ以上の選択剤及び抗生物質を含む。例えば、再生培地は、形質転換されていない細胞及び／又は組織を中和し、細菌を中和する試薬を含むことができるが、形質転換された細胞及び／又は組織は、異種ヌクレオチド配列によってコードされる選択マーカの発現のために生存することができる。
【0076】
共培養及び回収（任意選択の選択及び／又はスクリーニングを伴う）の後、３２９において、アサ科分裂組織領域又は形質転換されたアサ科細胞３２２を有するＥＡを使用して、組織を再生することができる。例えば、３２３において、形質転換されたアサ科細胞３２２を有するアサ科分裂組織領域又はＥＡを、ある期間、例えば１５～２０日間、苗条形成を誘導する条件下でＳＩＭに移し、ＳＩＭ中で培養することができる。条件は、滅菌、白色光、及び２３℃を含むことができる。ＳＩＭは、前述のように、ＴＤＺ等の他の試薬の中でも細菌株を中和する試薬を含むことができる。これに応答して、苗条形成が誘導され得る。形成された苗条３２４をＳＩＭから取り出すことができ、苗条３２４の小根を切断することができる。３２５において、切断された小根を有する形成された苗条３２４をＳＥＭに移し、３０～５０日間等の期間にわたって、伸長苗条３２６を誘導する条件下で培養することができる。いくつかの実施形態では、形成された苗条３２４は、その期間の１０～１５日ごと、例えば１４日ごとに新鮮なＳＥＭに継代培養することができる。条件は、滅菌、白色光、及び室温を含むことができる。いくつかの実施形態では、切断された小根を有する形成された苗条３２４を、第１の期間、例えば１５～２５日の間、第１のＳＥＭに移して培養し、次いで第２の期間、例えば１５～２５日の間、第２のＳＥＭに移すことができる。第２のＳＥＭでは、いくつかの実施形態では、形成された苗条３２４を継代培養することができる。３２７において、伸長苗条３２６は、最小高さの選択された苗条にスクリーニングすることができ、選択された苗条は、形成された根３２８を誘導するためにＲＭに根付くことができる。いくつかの実施形態では、伸長苗条３２６を発根することは、長さが少なくとも１ｃｍ（及び約１４日間）である少なくとも２つの一次根を発生させる等、閾値長さである一次根が発生するまで苗条を切断し、ＲＭ上の切断苗条を発根することを含むことができる。発根した苗条は、新しい一次根及び根毛構造が形成されるまで、およそ７～１４日ごとに新鮮なＲＭ上で継代培養することができる。発根した苗条３２７は、部分的又は完全なアサ科植物を形成するために土壌中の順化に送ることができる。
【0077】
様々な実施形態では、上記の方法及びスキームを使用して、異種ヌクレオチド配列及び／又はそれによってコードされる遺伝子を発現するように形質転換され、上記請求項のいずれか一項に記載の方法を使用して生産されるアサ科植物又は植物部分を得ることができる。いくつかの実施形態は、上記請求項のいずれかの方法を使用して産生された形質転換されたアサ科外植片に関する。
【0078】
いくつかの実施形態では、細菌媒介法を使用して、アサ科分裂組織領域から形質転換されたアサ科植物組織、又はアサ科種子から得られたＥＡを得ることができる。アサ科分裂組織領域又はＥＡは、限定されないが、目的とするアサ科の任意の株、種又は品種から得ることができる。本発明の方法は、ハイブリッド及びインブレッドを含む任意のアサ科遺伝子型のアサ科分裂組織領域又はＥＡと共に使用することができる。
【0079】
いくつかの実施形態では、生物学的形質転換方法を使用して、アサ科分裂組織領域又はＥＡから形質転換されたアサ科植物組織を得ることができる。例えば、アサ科分裂組織領域又はＥＡは、発現構築物との粒子衝突等による衝突技術によって修飾することができる。いくつかの実施形態では、アサ科分裂組織領域又はＥＡは、ボンバードガン及び／又は発現構築物でコーティングされた粒子を用いたボンバードメントによって発現構築物に曝露され得る。衝撃駆動変換の具体例は、当業者に知られている。
【0080】
図４は、本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡのアサ科細胞に異種配列を送達するための例示的な発現構築物を示す。例示的な発現構築物４４０は、発現カセット４４１及びベクター骨格４４６を含むバイナリーベクターであるか、又はそれを含む。発現カセット４４１は、目的の遺伝子４４５の発現を引き起こす導入遺伝子を含む。発現カセット４４１の導入遺伝子は、目的の遺伝子４４５、プロモータ４４７、左ボーダー４４９、及び右ボーダー４４８を含む。いくつかの実施形態では、左ボーダー４４９及び右ボーダー４４８は、発現カセット４４１から分離することができる。発現構築物４４０及び／又は発現カセット４４１は、シグナル伝達ペプチド等の他の成分の中でも、ＴＡＬＥ配列、スクリーニングマーカ、ターミネータ及び追加の発現カセット等の様々な追加の成分を含むことができる。
【0081】
発現カセット４４１は、外来タンパク質又は農学的形質を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。農業遺伝子には、有害生物又は疾患に対する耐性を付与する遺伝子、除草剤に対する耐性を付与する遺伝子、及び／又は付加価値形質を付与するか又はそれに寄与する遺伝子が含まれる。
【0082】
いくつかの実施形態では、発現構築物４４０を使用して細菌株を形質転換することができる。本明細書で使用される場合、発現構築物は、遺伝子を担持する１つ以上のベクター又はバイナリーベクターを含む核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を指すか又は含む。ベクター又はバイナリーベクターは、「インサート」と呼ばれることもある１つ又は複数の遺伝子又は導入遺伝子と、骨格とを含むＤＮＡ配列を含むか又は指す。ベクター又はバイナリーベクターは、遺伝子又は導入遺伝子と、形質転換植物細胞によって発現される調節配列とを含む発現カセット４４１を含むことができる。形質転換が成功すると、発現カセット４４１は、植物細胞に、目的の１つ以上のタンパク質を発現させ、及び／又は他の方法で標的変異を発現させる。
【0083】
発現カセット４４１は、目的の遺伝子４４５をコードする異種配列、Ｔ－ＤＮＡボーダー配列４４８，４４９、及びプロモータ４４７を含み得る。発現カセットは、典型的には、所望により終結シグナル及び／又は他の調節エレメントに作動可能に連結された、目的の遺伝子４４５をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。例えば、発現カセット４４１は、ＴＡＬＥＮＴ－ＤＮＡを含むことができる。発現カセット４４１はまた、ヌクレオチド配列の適切な翻訳、翻訳後処理、細胞コンパートメント若しくは組織における局在化及び蓄積、又は組織培養培地への分泌に必要な配列を含み得る。一例として、目的の遺伝子４４５は、植物起源のシグナルペプチド（例えば、タバコＰＲ１ａタンパク質又はカルレティキュリン由来のＮ末端シグナルペプチド）又は真核生物分泌ポリペプチドからのシグナルペプチド、例えば哺乳動物シグナルペプチドを含むタンパク質と会合することができ、原形質膜及び細胞壁を通して細胞外培地に効率的に分泌され得る。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子４４５をコードする異種ヌクレオチド配列は、Ｎ末端タグを含む。例えば、膜貫通タンパク質又は膜固定タンパク質の場合、膜貫通ドメイン又は膜固定ドメインをＮ末端分泌シグナル配列で置換することによってＮ末端を修飾する発現構築物４４０を調製することができる。
【0084】
ヌクレオチド配列を含む発現カセット４４１はキメラであり得、これは、その成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。いくつかの実施形態では、発現カセット４４１は、天然に存在するもの、又は完全に細胞外で組み立てられたもの（例えば、組換えクローニング技術によって）であり得る。発現カセット４４１は、内因性配列の上流にプロモータ配列を配置（又は挿入）することによって得ることができ、それにより、挿入されたプロモータ配列によって機能的に連結及び制御されるようになる。
【0085】
いくつかの実施形態では、プロモータ４４７は、誘導性プロモータ、強力なプロモータ、又は組織特異的プロモータを含むことができる。例えば、目的の遺伝子４４５をコードする異種ヌクレオチド配列は、誘導性プロモータ、強力なプロモータ又は組織特異的プロモータに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、プロモータ４４７は構成的プロモータを含むことができる。誘導性プロモータはオンとオフを切り替えることができるが、構成的プロモータは常に活性であり得る。例えば、目的の遺伝子４４５をコードする異種ヌクレオチド配列は、ユビキチンプロモータ（Ｕｂｉ）又は３５Ｓカリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）プロモータに作動可能に接続することができる。
【0086】
プロモータは、典型的には、少なくともコア（基底）プロモータを含むが、少なくとも１つの制御エレメントも含むことができる。そのようなエレメントには、上流活性化領域（ＵＡＲ）、及び任意選択で、合成上流エレメントを含み得る、核酸の転写に影響を及ぼす他のＤＮＡ配列が含まれる。コピーの発現を駆動するプロモータを選択するための因子には、効率、選択性、誘導能、所望の発現レベル、及び細胞又は組織型特異性が含まれる。プロモータ４４７は、アサ科ＥＡにおいて又は特定の条件下で優先的に発現するもの、例えば組織特異的プロモータであり得る。プロモータ４４７は、温度、光又はストレス等の因子によって調節され得る。例えば、誘導性プロモータを使用して、外部刺激（例えば、インデューサへの曝露）に応答して発現を駆動することができる。適切なプロモータには、ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ由来の光誘導性プロモータ、ＭＡＳプロモータ、コメアクチンプロモータ、トウモロコシユビキチンプロモータ、ＰＲ－Ｉプロモータ、ＣＺ１９Ｂ１プロモータ、ミルププロモータ、ＣｅｓＡプロモータ、Ｇａｍａ－ゼインプロモータ、Ｇｌｏｂ－１プロモータ、トウモロコシ１５ｋＤａゼインプロモータ、２２ｋＤａゼインプロモータ、２７ｋＤａゼインプロモータ、δ－ゼインプロモータ、ワックス状プロモータ、収縮した１プロモータ、収縮した２プロモータ、グロブリン１プロモータ、ｐＥＭＵプロモータ、トウモロコシＨ３ヒストンプロモータ、ベータエストラジオールプロモータ、及びデキサメタゾン誘導性プロモータが含まれるが、これらに限定されない。構成的プロモータの非限定的な例としては、とりわけ、３５ＳＣＭＶプロモータ、２×３５Ｓプロモータ、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモータ、ｕｂｉ３等の３５Ｓプロモータが挙げられる。
【0087】
発現を駆動するためのプロモータは、強い転写活性を有し得る。強力なプロモータは、高レベルで、又は約１／１０転写物～約１／１００転写物～約１／１，０００転写物で発現を駆動する。エンハンサをプロモータ領域と組み合わせて使用して、転写レベルを上昇させることができる。目的の遺伝子４４５が植物種に対して内因性である場合、発現カセットは、野生型植物組織における目的の内因性遺伝子の発現レベルと比較して、発現レベルの少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍の増加を達成するのに有効であり得る。
【0088】
目的の遺伝子４４５をコードする異種ヌクレオチド配列は、ヒト及び他の哺乳動物及び／又は脊椎動物、無脊椎動物、植物、海綿、細菌、真菌、藻類及び古細菌を含むがこれらに限定されない様々な生物に由来するＤＮＡ配列を含み得る。異種ヌクレオチド配列は、対応する野生型遺伝子のアミノ酸配列と少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有するタンパク質をコードすることができる。いくつかの場合、異種ヌクレオチド配列は、タンパク質をコードする配列と有意な類似性を有し、機能ドメインを共有する。異種ヌクレオチド配列は、タンパク質をコードする遺伝子と相同、オーソロガス又はパラロガス遺伝子を有する関連生物から得ることができる。保存された又は類似の異種ヌクレオチド配列を同定し、タンパク質をコードする組換え遺伝子を、場合により発現を改善するための様々な改変（例えば、コドン最適化配列）と共に構築する方法は、分子生物学における従来の技術を含む。例えば、重複する相補的な合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅又は設計及び合成をアニールし、一緒に連結して、クローニング、又は別の既にクローニングされた供給源からのサブクローニング、又はライブラリからのクローニングのための制限部位を有する遺伝子を得ることができる。
【0089】
いくつかの実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、野生型アサ科植物に存在する遺伝子の配列、又は遺伝子コード産物の機能を保持することを可能にするパーセント同一性を有する配列、例えば少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み得る。この配列は、生物又は生物部分から得ることができ、又は合成的に作製することができる。配列は、野生型生物において生じる遺伝子と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有することができる。配列は、野生型遺伝子とは異なる遺伝子座に挿入され、野生型遺伝子とは異なるプロモータに作動可能に連結され得る。本開示の細菌媒介方法は、特定の発現構築物に依存しない。植物細胞に導入することができる任意の発現構築物を本方法で使用することができる。核酸配列は、細菌媒介形質転換のためのプラスミドのＴ－ＤＮＡ領域に導入された発現カセットの一部であり得る。Ｔ－ＤＮＡは、バイナリーベクター中に存在することができる。ヌクレオチド配列は、目的のＤＮＡ配列、及び目的のＤＮＡ配列の発現のための調節配列等の他の配列を含み得る。本発明で使用可能なバイナリーベクターは当業者に公知である。バイナリーベクターは、典型的には、細菌における選択を可能にするための抗生物質耐性遺伝子を有する。トランスフェクション効率を高めるために、細菌はｖｉｒＧ遺伝子を保有することができる。ｖｉｒＧは、異種核酸配列と同じプラスミド上に、又はヘルパープラスミド中に存在し得る。
【0090】
本開示の方法は、アサ科植物細胞において機能する発現カセット及び／又は発現構築物を構築することを含み得る。構築は、アサ科植物細胞による導入及び発現に必要な様々な成分の選択を含み得る。例えば、発現カセットは、アサ科植物細胞において機能してＲＮＡ配列の産生を引き起こすプロモータ、（ｂ）所望のポリペプチドをコードするＲＮＡ配列の産生を引き起こす構造ＤＮＡ配列、及び（ｃ）植物細胞において機能してＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を引き起こす３’非翻訳ＤＮＡ配列を含む組換え二本鎖プラスミド又はベクター分子に組み込むことができる。所望の成分を含有するプラスミド又はベクターを調製するための方法は、当技術分野で周知である。
【0091】
いくつかの実施形態では、発現カセットは、記載されるようなスクリーニングマーカ及び関連する調節エレメントをコードする配列、並びに発現された場合に特定の形質を付与する核酸配列も含む。これらの形質導入配列には、農学的に関心のある遺伝子（例えば、昆虫耐性又は有害生物耐性、環境耐性又はストレス耐性、除草剤耐性の遺伝子）、栄養強化等の品質改善のための遺伝子、又は植物生理学、成長、発達、形態若しくは植物産物の任意の望ましい変化が含まれる。
【0092】
いくつかの実施形態では、発現カセットは、アサ科ゲノム内に標的変異を生成するためのヌクレオチド配列を含み得る。例えば、レアカットエンドヌクレアーゼ又はその一部（例えば、サブユニット）をコードする配列は、発現カセットによって導入することができる。本明細書で提供される方法は、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ又はその一部（例えば、サブユニット）の一過性発現を含み得る。レアカットエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン及び切断活性を有する触媒ドメインを含む融合タンパク質であり得る。ＴＡＬＥヌクレアーゼ及びＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインとエンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインとの融合の例である。他の例では、レアカットエンドヌクレアーゼは、野生型又はバリアントホーミングエンドヌクレアーゼ等のメガヌクレアーゼである。
【0093】
いくつかの実施形態では、本開示のアサ科植物を使用して、新しい植物品種を生産することができる。いくつかの実施形態では、植物は、特定の形質及び／又は表現型を有する新規で独特かつ優れた品種又はハイブリッドを開発するために使用される。
【0094】
記載された方法は、トランスジェニック系統を作製するために使用することができる。トランスジェニック系統を別の（形質転換されていない又は形質転換された）系統と交雑させて、新しいトランスジェニックアサ科系統を作製することができる。あるいは、上記の技術を使用して特定のアサ科栽培品種に遺伝子操作された遺伝的形質は、戻し交配技術を使用して別の系統に移すことができる。例えば、戻し交配アプローチを使用して、操作された形質を公的な非エリート集団近交系からエリート集団近交系に、又はそのゲノムに外来遺伝子を含有する近交系からその遺伝子を含有しない近交系に移すことができる。「交差」は、単純なＸとＹの交差、又は逆交差のプロセスを指すことができる。
【0095】
本明細書で提供される方法の実施形態は、導入遺伝子を除去して、新しい非トランスジェニックアサ科植物を提供することを含み得る。例えば、遺伝子技術を使用して、導入遺伝子を欠く導入遺伝子誘導欠失（例えば、レアカットエンドヌクレアーゼを発現する導入遺伝子の発現によって誘導される標的化欠失）を有する形質転換植物の子孫を提供することができる。例示的な実施形態では、子孫植物は、分離によって導入遺伝子についてヘテロ接合性である形質転換されたアサ科植物を自家受粉（自殖）することによって得ることができる。そのようなヘテロ接合植物の自殖は、導入遺伝子が子孫植物集団のサブセットから分離することを提供する。
【0096】
いくつかの実施形態では、形質転換されたアサ科植物は、少なくとも第１の導入遺伝子を含み、そうでなければドナーアサ科植物の全ての生理学的及び形態学的特徴を発現することができる。他の実施形態では、形質転換されたアサ科植物は、同じ条件下で成長した場合、アサ科植物と比較して１つ以上の遺伝子の発現を変化させ、一方、親株の形質を親株と同程度に発現させるシス遺伝子改変を含む。他の実施形態では、形質転換されたアサ科植物は、ドナーアサ科植物の１つ以上の遺伝子の発現を変化させる１つ以上の標的変異（例えば、欠失）を含む。例えば、形質転換植物は、遺伝子発現の変化の結果として、ドナーのアサ科植物よりも低いレベルのＴＨＣを示すことができる。いくつかの実施形態では、アサ科植物は、単一遺伝子座変換を含む。単一遺伝子座変換は、優性又は劣性対立遺伝子を含み得る。遺伝子座変換は、形質転換されたアサ科植物に形質を付与することができる。
【0097】
アサ科植物は、複数の核酸構築物又は形質転換事象の使用から生じる複合効果を提供する積層形質を含み得る。例えば、２つの転写カセットを単一の形質転換ベクターに含めることによるそのような形質の導入、２つの発現構築物の同時形質転換、１つの構築物を発現する植物組織を第２の遺伝子の発現構築物と一緒に用いた再形質転換、又は伝統的な植物育種法を介してトランスジェニック植物を交雑させることを含む、同じ又は異なる方法によって、上記のような複数の構築物をアサ科植物細胞に導入することができ、得られた産物は両方の特徴を有する植物である。
【0098】
植物部分は、茎、繊維、パルプ、花、種子等を含む、本明細書に記載の方法によって生産された植物から生産又は精製された生成物及び組成物を含むことができる。アサ科植物から生産される製品には、工業用織物、建築材料、食品及び栄養補助食品、石けん、ローション、バーム等のパーソナルケア製品、動物用寝具、塗料、インク、溶媒及び潤滑剤等の工業製品、消費者用織物、動物飼料等が含まれる。場合によっては、アサ科植物及び植物部分は、香味料又は芳香成分として使用することができる抽出物を提供するために、又はアサ科由来の医薬化合物を得るために使用される。
【0099】
本明細書（特許請求の範囲を含む）で使用される様々な用語は、別段の指示がない限り、当技術分野における明白な意味を含む。本明細書で使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、及びそれらの変形は、追加の行為又は構造の可能性を排除しないオープンエンドの移行句、用語、又は単語であることを意図している。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態又は要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の言及を含む。
【0100】
本明細書で提供される様々な範囲は、記載された範囲及び記載された範囲内の任意の値又は部分範囲を含む。更に、値又はパーセンテージを記載するために「約」が利用される場合、これは記載された値又はパーセンテージからの変動（最大＋／－１０％）を含み、言及し、及び／又は包含する。
【0101】
「外植片」とは、ミクロ繁殖による再生能を有する植物部分を指す。外植片は、苗条、根、又は植物全体を再生することができる。
【0102】
「ドナー植物」は外植片の供給源を指す。ドナーアサ科植物は、任意の種類のアサ科植物であり得る。場合によっては、ドナー植物は雌性植物（例えば、雌雄同体ではない）である。いくつかの実施形態では、ドナー植物は、リゾビウム感染に感受性であり、所望の再生応答を示すアサ科遺伝子型である。ドナーアサ科植物は、１つ以上の所望の形質を有するエリートラインに由来し得る。
【0103】
「形質転換」は、ヌクレオチド配列の細胞への移入を指し、「遺伝子形質転換」は、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの細胞への移入及び組み込みを指す。「形質転換体」という用語は、形質転換を受けた細胞、組織又は生物を指す。
【0104】
「発現カセット」は、所望により終結シグナル及び／又は他の調節エレメントに作動可能に連結された、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモータを含む、適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指示することができるＤＮＡ配列を指すことができる。発現カセットはまた、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含み得る。コード領域は、目的のタンパク質をコードすることができるが、センス方向又はアンチセンス方向に、目的の機能性ＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡをコードすることもできる。発現カセットキメラであり得、これは、その成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットは、部分的に内因性成分を使用して組み立てることができる。例えば、発現カセットは、内因性配列の上流にプロモータ配列を配置（又は挿入）することによって得ることができ、挿入されたプロモータ配列によって機能的に連結及び制御されるようになる。
【0105】
本明細書で使用される場合、アサ科はアサ科の植物を指す。例えば、アサ科植物又は植物部分は、アサ属に属する植物又は植物部分を含むことができ、大麻植物又は植物部分と呼ばれることもあり、カンナビス・サティバ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、カンナビス・インディカ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｉｎｄｉｃａ）、及びカンナビス・ルデラリス（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｒｕｄｅｒａｌｉｓ）を含む。しかしながら、実施形態はそのように限定されず、アサ科の植物又は植物部分は、他の植物又は植物部分の中でも、フムルス（例えば、ホップ）、セルチス、アルファナンテ、チャエタクローム、ジロンニエラ、ロザネラ、パラスポニア、プテロセルチス及び／又はトレマの植物又は植物部分を含み得る。「植物」という用語は一般に植物全体を指すが、「植物」が形容詞として使用される場合、植物器官（例えば、葉、茎、根、花）、単細胞（例えば、花粉）、種子、組織培養細胞を含む植物細胞、植物から産生された生成物等の、植物中に存在する、植物から得られる、植物に由来する、又は植物に関連する任意の物質を指す。「アサ科植物部分」という用語は、アサ科の植物全体から得られる１つ以上の植物組織又は器官を指す。アサ科植物部分には、栄養構造（例えば、葉、茎）、根（例えば、毛状根又は非毛状根）、花の器官／構造、種子（胚、胚乳及び種皮を含む）、植物組織（例えば、血管組織、基底組織等）、細胞及びその子孫が含まれる。
【0106】
「アサ科植物細胞」は、プロトプラスト及び細胞壁を含む植物の構造的及び生理学的単位である。植物細胞は、培養中の細胞であり得る。アサ科植物細胞は、単離された単一細胞若しくは細胞の凝集体、例えば脆弱なカルス、又は培養細胞の形態であり得るか、又はより高次の組織単位、例えばアサ科植物組織、植物器官若しくは植物の一部であり得る。アサ科植物細胞は、プロトプラスト、配偶子産生細胞、又は植物全体に再生することができる細胞若しくは細胞の集合であり得る。「アサ科植物組織」とは、植物における分化組織、又は植物から得られる分化組織（「外植片」）、又は未成熟若しくは成熟胚、種子、根、苗条、果実、花粉、及びカルス等の培養中の植物細胞の凝集物の様々な形態に由来する未分化組織を意味する。アサ科種子等の種子中又は種子からの植物組織には、種皮又はテスタ、貯蔵子葉及び胚が含まれる。
【0107】
「分裂組織」又は「分裂組織領域」は、成長が起こり得る植物の区域に見られる未分化細胞（分裂組織細胞）を含む植物組織を指す。分裂組織細胞は、植物の器官を生じさせ、植物の成長を維持する。
【0108】
「品種」又は「栽培品種」という用語は、それらを同じ種の他の植物から分離する特性を共有する植物の集団を指す。１つ又は複数の特有の形質を有するが、品種は、その品種内の個体間の小さな全体的な変動によって更に特徴付けることができる。「純粋な系統」品種は、組織又は細胞培養技術を使用して、数世代の自家受粉及び選択、又は単一の親からの栄養繁殖によって作出することができる。ある変種は、別の系統又は変種に本質的に由来し得る。品種は、（ａ）それが主に初期品種に由来するか、又は主に初期品種に由来する品種に由来するが、初期品種の遺伝子型又は遺伝子型の組合せに由来する特徴の発現を保持している場合、（ｂ）初期品種と区別可能である場合、（ｃ）派生の作用から生じる差異を除いて、最初の品種の遺伝子型又は遺伝子型の組合せから生じる特徴の発現において最初の品種に適合する場合、初期品種に「本質的に由来する」である。本質的に誘導された変種は、天然又は誘導された変異体、体細胞バリアント、初期変種の植物からのバリアント個体、戻し交配又は形質転換の選択によって得ることができる。品種と区別される「系統」は、多くの場合、植物研究等のために非商業的に使用される植物の群を示すことができる。線は、典型的には、関心のある１つ以上の形質については個体間でほとんど変動を示さないが、他の形質については個体間でいくらかの変動があり得る。
【0109】
「形質転換頻度」とは、核酸を導入するために細胞に対して形質転換プロトコルを実行した後に異種ヌクレオチド配列で首尾よく形質転換された植物細胞の割合を指す。「変換効率」の増加は、リソース使用を低減することによって変換プロセスの全体的な効率に影響を与える変換頻度及び品質イベントの増加等の改善を指す。
【0110】
「再生」とは、単一の細胞又は細胞群に由来する新しい組織、器官、胚、植物全体又は植物全体の一部の産生をもたらす形態形成応答を指す。本開示の方法、再生は、分裂組織領域又はＥＡから進行する。「再生能力」は、植物細胞が再生を受ける能力を指す。「再生効率」は、胚形成カルス又は個々の外植片から再生された小植物の数から計算することができる。
【0111】
「目的の遺伝子」又は「目的の形質」という用語は、本明細書に記載の技術を使用して形質転換されたアサ科細胞によって発現される遺伝子又は形質に対応する。
【0112】
様々な実施形態が、基礎となる仮出願である、２０２１年９月１７日に出願され、「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された米国仮出願第６３／２４５，３０１号に従って実施され、この仮出願には利益が主張され、その教示のためにその全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【0113】
実験的実施形態
様々な実験実施形態は、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換することを対象とした。そのような実施形態は、アサ科分裂組織領域及び／又はＥＡを調製すること、アサ科のアサ科細胞を形質転換すること、及び形質転換されたアサ科細胞のために組織を再生することを含む。いくつかの実施形態は、アサ科分裂組織領域及び／又はＥＡからの再現性があり、信頼性があり、単純な形質転換及び再生システムを提供することを対象とした。
様々な実験実施形態は、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換することを対象とした。そのような実施形態は、アサ科分裂組織領域及び／又はＥＡを調製すること、アサ科のアサ科細胞を形質転換すること、及び形質転換されたアサ科細胞のために組織を再生することを含む。いくつかの実施形態は、アサ科分裂組織領域及び／又はＥＡからの再現性があり、信頼性があり、単純な形質転換及び再生システムを提供することを対象とした。
【0114】
図５Ａ～図５Ｉは、本開示と一致する、アサ科分裂組織領域又はＥＡからアサ科細胞を形質転換するための例示的な発現構築物を示す。いくつかの実験的実施形態では、発現構築物を細菌株形質転換（例えば、Ａ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）形質転換）に使用して、右Ｔ－ＤＮＡボーダー配列及び左側Ｔ－ＤＮＡボーダー配列を含み、細菌株がアサ科植物細胞にＤＮＡを送達することを可能にした。発現構築物はプラスミドであり、プラスミドベクターと呼ぶことができる。発現構築物は、標的によって使用されるコドンの偏りに従ってコドン最適化され、ベクターにクローニングされ、プロモータ及びターミネータの制御下にある導入遺伝子をコードするＤＮＡ配列を更に含む。構成的プロモータ及び根特異的プロモータは、組織特異的アプローチのために選択される。
【0115】
図５Ａは、本明細書で「ベタレンベクター」と呼ばれることもある、ベタレインの産生に関連する少なくとも１つの酵素をコードするＤＮＡ配列を含む例示的なプラスミドベクター５５０を示す。プラスミドベクター５５０は、ＦＭＶプロモータによって駆動される酵素ＣＹＰ７６ＡＤ１、ＤＯＤＡ、及びグルコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含み、ＣＹＰ７６ＡＤ１はＤＯＤＡに連結され、ＤＯＤＡは２Ａ自己切断ペプチドＰ２Ａによってグルコシルトランスフェラーゼに連結され、本明細書では「ベタレインカセット」と呼ばれることもある。プラスミドベクター５５０は、植物選択可能マーカカセット及びＬａｃＺカセットを更に含み、これらは、以下に更に記載されるように、プラスミド上で逆向きである。植物選択マーカカセットは、発現されると、形質転換植物細胞の選択のための選択剤（例えば、細菌又は他の毒性物質）、プロモータ及びターミネータに対する耐性を付与する選択マーカをコードする。ＬａｃＺカセットは、ＬａｃＺ遺伝子と、選択マーカとして使用されるＬａｃＺプロモータとをコードする。遺伝子カセットは、左ボーダー（ＬＢ）及び右ボーダー（ＲＢ）Ｔ－ＤＮＡ配列に隣接しており、Ａ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の細菌株、例えば１８Ｒ１２によるアサ科植物細胞への配列全体又は導入遺伝子の移入を可能にする。プラスミド骨格はまた、Ａ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）株内のプラスミドの選択及び維持のためのカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子をコードし、プラスミド上で逆向きである細菌選択マーカカセットを含有する。１８Ｒ１２株を用いてアサ科植物部分を形質転換した。プラスミドベクター５５０の配列を配列番号１で示す。更に同定されたのは、ベタレインカセット（配列番号２）、植物選択マーカカセット（配列番号１０）、ＲＢ（配列番号１５）及びＬＢ（配列番号１６）のＴ－ＤＮＡボーダー、ＬａｃＺカセット（配列番号１７）及び細菌選択マーカカセット（配列番号２０）の配列である。ベタレインカセット（配列番号２）は、ＦＭＶプロモータ（配列番号３）、ＣＹＰ７６ＡＤ１（配列番号４）、Ｐ２Ａ１（配列番号５）、ＤＯＤＡ（配列番号６）、Ｐ２Ａ ２（配列番号７）、グルコシルトランスフェラーゼ（配列番号８）及びｒｂｃＳターミネータ（配列番号９）をコードする。植物選択マーカカセット（配列番号１０）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号１１）、葉緑体移行ペプチド（配列番号１２）、ＳｐｃＮ（配列番号１３）及びＮｏｓターミネータ（配列番号１４）をコードする。ＬａｃＺカセット（配列番号１７）は、ＬａｃＺプロモータ（配列番号１８）及びＬａｃＺ遺伝子（配列番号１９）をコードする。細菌選択マーカカセット（配列番号２０）は、ＫａｎＲプロモータ（配列番号２１）及びＫａｎＲ遺伝子（配列番号２２）をコードする。
【0116】
図５Ｂは、本明細書で「低ＴＨＣＴＡＬＥＮベクター」と呼ばれることもある、低ＴＨＣ導入遺伝子に関連するＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡ配列を含む例示的なプラスミドベクター５６０を示す。プラスミドベクター５６０は、形質転換されたアサ科植物又は植物部分におけるＴＨＣ含有量を減少させる導入遺伝子に関連する左半ＴＡＬＥＮ及び右半ＴＡＬＥＮをコードする遺伝子を含有し、これらは以下、左ＴＡＬＥＮカセット及び右ＴＡＬＥＮカセットと呼ばれる。プラスミドベクター５６０は、形質転換された植物部分を選択するために使用されるＹＦＰをコードするＹＦＰレポーターカセットを含む。プラスミドベクター５６０は、前述のようにプラスミド上で逆向きである植物選択可能マーカカセットを更に含み、その特徴は繰り返されない。プラスミド骨格はまた、Ａ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）株内のプラスミドの選択及び維持のためのＫａｎＲ遺伝子をコードし、プラスミド上で逆向きである細菌選択マーカカセットを含有する。１８Ｒ１２株を用いてアサ科植物部分を形質転換した。プラスミドベクター５６０の配列を配列番号２３で示す。更に同定されたのは、左ＴＡＬＥＮカセット（配列番号２４）、右ＴＡＬＥＮカセット（配列番号３２）、ＹＦＰレポーターカセット（配列番号３６）、植物選択マーカカセット（配列番号３８）及び細菌選択マーカカセット（配列番号２０）の配列である。左ＴＡＬＥＮカセット（配列番号２４）は、Ｎｏｓプロモータ（配列番号２５）、左ＴＡＬエフェクターＮ末端（配列番号２６）、ＣｓＴＨＣＡＳ＿Ｔ２２－Ｌ１結合ドメイン（配列番号２７）、左ＴＡＬエフェクターＣ末端（配列番号２８）、リンカー（配列番号２９）、Ｆｏｋ１（配列番号３０）及びＮｏｓターミネータ（配列番号３１）をコードする。右ＴＡＬＥＮカセット（配列番号３２）は、Ｎｏｓプロモータ（配列番号２５）、右ＴＡＬエフェクターＮ末端（配列番号３３）、ＣｓＴＨＣＡＳ＿Ｔ２２－Ｒ１結合ドメイン（配列番号３４）、右ＴＡＬエフェクターＣ末端（配列番号３５）、リンカー（配列番号２９）、Ｆｏｋ１（配列番号３０）及びＮｏｓターミネータ（配列番号３１）をコードする。ＹＦＰレポーターカセット（配列番号３６）は、ＦＭＶプロモータ（配列番号３）、ＹＦＰ ＣＤＳ（配列番号３７）及びＲｂｃｓ－Ｅ９ターミネータ（配列番号９）をコードする。植物選択マーカカセット（配列番号３８）は、３５Ｓプロモータ（配列番号３９）、ＳＴＬＳ１ｎｐｔＩＩイントロン（配列番号４０）、ＮｐｔＩＩエクソン（配列番号４１）及び３５Ｓターミネータ（配列番号４２）をコードする。細菌選択マーカカセット（配列番号２０）は、ＫａｎＲプロモータ（配列番号２１）及びＫａｎＲ遺伝子（配列番号２２）をコードする。
【0117】
図５Ｃは、低ＴＨＣ導入遺伝子に関連するＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡ配列を含む例示的プラスミドベクター５７０を示し、本明細書では「低ＴＨＣ仕様ＹＦＰベクター」と呼ばれることもある。プラスミドベクター５７０は、形質転換されたアサ科植物又は植物部分におけるＴＨＣ含有量を減少させる導入遺伝子に関連する左半ＴＡＬＥＮ及び右半ＴＡＬＥＮをコードする遺伝子を含有し、これらは以下、左ＴＡＬＥＮカセット及び右ＴＡＬＥＮカセットと呼ばれる。プラスミドベクター５７０は、形質転換された植物部分を選択するために使用されるＹＦＰをコードするＹＦＰレポーターカセットを含む。プラスミドベクター５７０は、前述のようにプラスミド上で逆向きである植物選択可能マーカカセットを更に含み、その特徴は繰り返されない。プラスミド骨格はまた、Ａ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）株内のプラスミドの選択及び維持のためのＫａｎＲ遺伝子をコードし、プラスミド上で逆向きである細菌選択マーカカセットを含有する。１８Ｒ１２株を用いてアサ科植物部分を形質転換した。プラスミドベクター５７０の配列を配列番号４３で示す。更に同定されたのは、左ＴＡＬＥＮカセット（配列番号４４）、右ＴＡＬＥＮカセット（配列番号４８）、ＹＦＰレポーターカセット（配列番号３６）、植物選択マーカカセット（配列番号１０）及び細菌選択マーカカセット（配列番号２０）の配列である。左ＴＡＬＥＮカセット（配列番号４４）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号１１）、左ＴＡＬエフェクターＮ末端（配列番号４５）、ＣｓＴＨＣＡＳ＿Ｔ２２－Ｌ１結合ドメイン（配列番号４６）、左ＴＡＬエフェクターＣ末端（配列番号４７）、リンカー（配列番号２９）、Ｆｏｋ１（配列番号３０）及びＮｏｓターミネータ（配列番号３１）をコードする。右ＴＡＬＥＮカセット（配列番号４８）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号１１）、右ＴＡＬエフェクターＮ末端（配列番号４９）、ＣｓＴＨＣＡＳ＿Ｔ２２－Ｒ１結合ドメイン（配列番号５０）、右ＴＡＬエフェクターＣ末端（配列番号５１）、リンカー（配列番号２９）、Ｆｏｋ１（配列番号３０）及びＮｏｓターミネータ（配列番号３１）をコードする。ＹＦＰレポーターカセット（配列番号３６）は、ＦＭＶプロモータ（配列番号３）、ＹＦＰ ＣＤＳ（配列番号３７）及びＲｂｃｓ－Ｅ９ターミネータ（配列番号９）をコードする。植物選択マーカカセット（配列番号１０）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号１１）、葉緑体移行ペプチド（配列番号１２）、ＳｐｃＮ（配列番号１３）及びＮｏｓターミネータ（配列番号１４）をコードする。細菌選択マーカカセット（配列番号２０）は、ＫａｎＲプロモータ（配列番号２１）及びＫａｎＲ遺伝子（配列番号２２）をコードする。
【0118】
図５Ｄは、フィトエンデサチュラーゼ（ＰＤＳ）導入遺伝子と会合したＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡ配列を含む例示的プラスミドベクター５７２を示す。プラスミドベクター５７２は、以下で左ＴＡＬＥインテインカセット及び右ＴＡＬＥインテインカセットと呼ばれる、ＳＳＰ ＤｎａＥインテイン－Ｎに融合したＰＤＳ結合ドメインを有する左半ＴＡＬエフェクター及びＳＳＰインテイン－Ｎに融合したＰＤＳ結合ドメインを有する右半ＴＡＬエフェクターをコードする。プラスミドベクターは、以下でエンドヌクレアーゼカセットと呼ばれる、ＳＳＰ ＤｎａＥインテイン－Ｃに融合したＦｏｋ１エンドヌクレアーゼを更にコードする。プラスミドベクター５７２は、前述のように、プラスミド上で逆向きであるＹＦＰレポーターカセットを含む。プラスミド骨格はまた、ＫａｎＲ遺伝子をコードし、プラスミド上で逆向きである細菌選択マーカカセットを含む。プラスミドベクター５７２の配列を配列番号５２で示す。更に同定されたのは、左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号５７）、右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号６４）、ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）、エンドヌクレアーゼカセット（配列番号６６）、細菌選択マーカカセット（配列番号７４）、右Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７２）、及び左Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７３）の配列である。左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号５７）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＰＤＳ左結合ドメイン（配列番号６０）、特徴１０（配列番号６１）、インテイン－Ｎ（配列番号６２）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。特徴１０は、Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼをコードしない酵母＿１ＮＬＳ＿ＨＡｔａｇ＿Ｎ１５２＿Ｃ４０配列のＣ４０ドメインの一部である。例えば、反復可変二残基（ＲＶＤ）を含む酵母＿１ＮＬＳ＿ＨＡｔａｇ＿Ｎ１５２＿Ｃ４０配列では、Ｆｏｋ１が除去され、インテイン、例えばＧｐ４１－１ｉｎｔ－Ｎ又はＳＳＰ ＤｎａＥインテイン－Ｎで置き換えられる。Ｎ末端は、酵母＿１ＮＬＳ＿ＨＡｔａｇ＿Ｎ１５２＿Ｃ４０のＮ末端ドメインを含む。右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号６４）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＰＤＳ右結合ドメイン（配列番号６５）、特徴１０（配列番号６１）、インテイン－Ｎ（配列番号６２）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。エンドヌクレアーゼカセット（配列番号６６）は、ｐＭｔＥＦ１Ａプロモータ（配列番号６７）、特徴１０（配列番号６８）、インテイン－Ｃ ＣＤＳ（配列番号６９）、Ｆｏｋ１（配列番号７０）、酵母＿１ＮＬＳ＿ＨＡｔａｇ＿Ｎ１５２＿Ｃ４０（配列番号７１）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。酵母＿１ＮＬＳ＿ＨＡｔａｇ＿Ｎ１５２＿Ｃ４０は、核移行シグナル（ＮＬＳ）を含む小さなタンパク質であり、そのタンパク質のＮ末端ドメインとＣ末端ドメインとの間（例えば、Ｎ末端）に、ハーフＴＡＬＥＮが挿入されている。ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）は、ＦＭＶプロモータ（配列番号５４）、ＹＦＰ ＣＤＳ（配列番号５５）及びＲｂｃｓ－Ｅ９ターミネータ（配列番号５６）をコードする。細菌選択マーカカセット（配列番号７４）は、ＫａｎＲプロモータ（配列番号７５）及びＫａｎＲ遺伝子（配列番号７６）をコードする。
【0119】
図５Ｅは、ＰＤＳ導入遺伝子に関連するＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡ配列を含む例示的なプラスミドベクター５７４を示す。プラスミドベクター５７４は、Ｇｐ４１－１インテイン－Ｎに融合したＰＤＳ結合ドメインを有する左半ＴＡＬエフェクター及びＧｐ４１－１インテイン－Ｎに融合したＰＤＳ結合ドメインを有する右半ＴＡＬエフェクターをコードし、これらは以下では左ＴＡＬＥインテインカセット及び右ＴＡＬＥインテインカセットと呼ばれる。プラスミドベクターは、以下でエンドヌクレアーゼカセットと呼ばれる、Ｇｐ４１－１インテイン－Ｃに融合したＦｏｋ１エンドヌクレアーゼを更にコードする。プラスミドベクター５７４は、前述のようにプラスミド上で逆向きであるＹＦＰレポーターカセットを含み、その特徴は繰り返されない。プラスミド骨格はまた、プラスミド上で逆方向にある細菌選択マーカカセットを含有する。プラスミドベクター５７４の配列を配列番号７７で示す。更に同定されたのは、左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号７８）、右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号８１）、ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）、エンドヌクレアーゼカセット（配列番号８２）、細菌選択マーカカセット（配列番号７４）、右Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７２）、及び左Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７３）の配列である。左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号７８）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＰＤＳ左結合ドメイン（配列番号６０）、特徴１０（配列番号７９）、インテイン－Ｎ（配列番号８０）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号８１）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＰＤＳ右結合ドメイン（配列番号６５）、特徴１０（配列番号７９）、インテイン－Ｎ（配列番号８０）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。エンドヌクレアーゼカセット（配列番号８２）は、ｐＭｔＥＦ１Ａプロモータ（配列番号６７）、特徴１０（配列番号８３）、インテイン－Ｃ ＣＤＳ（配列番号８４）、Ｆｏｋ１（配列番号７０）、酵母＿１ＮＬＳ＿ＨＡｔａｇ＿Ｎ１５２＿Ｃ４０（配列番号７１）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）は、ＦＭＶプロモータ（配列番号５４）、ＹＦＰ ＣＤＳ（配列番号５５）及びＲｂｃｓ－Ｅ９ターミネータ（配列番号５６）をコードする。細菌選択マーカカセット（配列番号７４）は、ＫａｎＲプロモータ（配列番号７５）及びＫａｎＲ遺伝子（配列番号７６）をコードする。
【0120】
図５Ｆは、ＴＨＣＡＳ導入遺伝子に関連するＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡ配列を含む例示的なプラスミドベクター５７６を示す。プラスミドベクター５７６は、ＳＳＰ ＤｎａＥインテイン－Ｎに融合されたＴＨＣＡＳ結合ドメインを有する左半ＴＡＬエフェクター及びＳＳＰインテイン－Ｎに融合されたＴＨＣＡＳ結合ドメインを有する右半ＴＡＬエフェクターをコードし、これらは以下では左ＴＡＬＥインテインカセット及び右ＴＡＬＥインテインカセットと呼ばれる。プラスミドベクターは、以下でエンドヌクレアーゼカセットと呼ばれる、ＳＳＰ ＤｎａＥインテイン－Ｃに融合したＦｏｋ１エンドヌクレアーゼを更にコードする。プラスミドベクター５７６は、前述のようにプラスミド上で逆向きであるＹＦＰレポーターカセットを含み、その特徴は繰り返されない。プラスミド骨格はまた、プラスミド上で逆方向にある細菌選択マーカカセットを含有する。プラスミドベクター５７６の配列を配列番号８５で示す。更に同定されたのは、左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号８６）、右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号９０）、ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）、エンドヌクレアーゼカセット（配列番号６６）、細菌選択マーカカセット（配列番号７４）、右Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７２）、及び左Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７３）の配列である。左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号８６）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＴＨＣＡＳ左結合ドメイン（配列番号８７）、特徴１０（配列番号８８）、インテイン－Ｎ（配列番号８９）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号９０）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＴＨＣＡＳ右結合ドメイン（配列番号９１）、特徴１０（配列番号８８）、インテイン－Ｎ（配列番号８９）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。エンドヌクレアーゼカセット（配列番号６６）は、ｐＭｔＥＦ１Ａプロモータ（配列番号６７）、特徴１０（配列番号６８）、インテイン－Ｃ ＣＤＳ（配列番号６９）、Ｆｏｋ１（配列番号７０）、酵母＿１ＮＬＳ＿ＨＡｔａｇ＿Ｎ１５２＿Ｃ４０（配列番号７１）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）は、ＦＭＶプロモータ（配列番号５４）、ＹＦＰ ＣＤＳ（配列番号５５）及びＲｂｃｓ－Ｅ９ターミネータ（配列番号５６）をコードする。細菌選択マーカカセット（配列番号７４）は、ＫａｎＲプロモータ（配列番号７５）及びＫａｎＲ遺伝子（配列番号７６）をコードする。
【0121】
図５Ｇは、ＴＨＣＡＳ導入遺伝子に関連するＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡ配列を含む例示的なプラスミドベクター５７８を示す。プラスミドベクター５７８は、Ｇｐ４１－１インテイン－Ｎに融合したＴＨＣＡＳ結合ドメインを有する左半ＴＡＬエフェクター及びＧｐ４１－１インテイン－Ｎに融合したＴＨＣＡＳ結合ドメインを有する右半ＴＡＬエフェクターをコードし、これらは以下では左ＴＡＬＥインテインカセット及び右ＴＡＬＥインテインカセットと呼ばれる。プラスミドベクターは、以下でエンドヌクレアーゼカセットと呼ばれる、Ｇｐ４１－１インテイン－Ｃに融合したＦｏｋ１エンドヌクレアーゼを更にコードする。プラスミドベクター５７６は、前述のようにプラスミド上で逆向きであるＹＦＰレポーターカセットを含み、その特徴は繰り返されない。プラスミド骨格はまた、プラスミド上で逆方向にある細菌選択マーカカセットを含有する。プラスミドベクター５７６の配列を配列番号９２で示す。更に同定されたのは、左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号９３）、右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号９７）、ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）、エンドヌクレアーゼカセット（配列番号８２）、細菌選択マーカカセット（配列番号７４）、右Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７２）、及び左Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７３）の配列である。左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号９３）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＴＨＣＡＳ左結合ドメイン（配列番号９４）、特徴１０（配列番号９５）、インテイン－Ｎ（配列番号９６）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号９７）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＴＨＣＡＳ右結合ドメイン（配列番号９８）、特徴１０（配列番号９５）、インテイン－Ｎ（配列番号９６）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。エンドヌクレアーゼカセット（配列番号８２）は、ｐＭｔＥＦ１Ａプロモータ（配列番号６７）、特徴１０（配列番号８３）、インテイン－Ｃ ＣＤＳ（配列番号８４）、Ｆｏｋ１（配列番号７０）、酵母＿１ＮＬＳ＿ＨＡｔａｇ＿Ｎ１５２＿Ｃ４０（配列番号７１）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）は、ＦＭＶプロモータ（配列番号５４）、ＹＦＰ ＣＤＳ（配列番号５５）及びＲｂｃｓ－Ｅ９ターミネータ（配列番号５６）をコードする。細菌選択マーカカセット（配列番号７４）は、ＫａｎＲプロモータ（配列番号７５）及びＫａｎＲ遺伝子（配列番号７６）をコードする。
【0122】
図５Ｈは、ＰＤＳ導入遺伝子に関連するＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡ配列を含む例示的なプラスミドベクター５８０を示す。プラスミドベクター５８０は、Ｇｐ４１インテイン－Ｎに融合したＰＤＳ結合ドメインを有する左半ＴＡＬエフェクター及びＧｐ４１－１インテイン－Ｎに融合したＰＤＳ結合ドメインを有する右半ＴＡＬエフェクターをコードし、これらは以下では左ＴＡＬＥインテインカセット及び右ＴＡＬＥインテインカセットと呼ばれる。プラスミドベクターは、以下でエンドヌクレアーゼカセットと呼ばれる、Ｇｐ４１－１インテイン－Ｃに融合したＦｏｋ１エンドヌクレアーゼを更にコードする。プラスミドベクター５８０は、前述のようにプラスミド上で逆向きであるＹＦＰレポーターカセットを含み、その特徴は繰り返されない。プラスミド骨格はまた、プラスミド上で逆方向にある細菌選択マーカカセットを含有する。プラスミドベクター５８０の配列を配列番号９９で示す。更に同定されたのは、左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号１００）、右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号１０４）、ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）、エンドヌクレアーゼカセット（配列番号１０６）、細菌選択マーカカセット（配列番号７４）、右Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７２）、及び左Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７３）の配列である。左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号１００）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＰＤＳ左結合ドメイン（配列番号１０１）、特徴１０（配列番号１０２）、インテイン－Ｎ（配列番号１０３）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号１０４）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＰＤＳ右結合ドメイン（配列番号１０５）、特徴１０（配列番号１０２）、インテイン－Ｎ（配列番号１０３）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。エンドヌクレアーゼカセット（配列番号１０６）は、ｐＭｔＥＦ１Ａプロモータ（配列番号６７）、特徴１０（配列番号１０７）、インテイン－Ｃ ＣＤＳ（配列番号８４）、Ｆｏｋ１（配列番号７０）、酵母＿１ＮＬＳ＿ＨＡｔａｇ＿Ｎ１５２＿Ｃ４０（配列番号７１）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）は、ＦＭＶプロモータ（配列番号５４）、ＹＦＰ ＣＤＳ（配列番号５５）及びＲｂｃｓ－Ｅ９ターミネータ（配列番号５６）をコードする。細菌選択マーカカセット（配列番号７４）は、ＫａｎＲプロモータ（配列番号７５）及びＫａｎＲ遺伝子（配列番号７６）をコードする。
【0123】
図５Ｉは、ＴＨＣＡＳ導入遺伝子に関連するＴＡＬＥＮをコードするＤＮＡ配列を含む例示的なプラスミドベクター５８２を示す。プラスミドベクター５８２は、Ｇｐ４１－１インテイン－Ｎに融合したＴＨＣＡＳ結合ドメインを有する左半ＴＡＬエフェクター及びＧｐ４１－１インテイン－Ｎに融合したＴＨＣＡＳ結合ドメインを有する右半ＴＡＬエフェクターをコードする遺伝子を含み、これらは以下では左ＴＡＬＥインテインカセット及び右ＴＡＬＥインテインカセットと呼ばれる。プラスミドベクターは、以下でエンドヌクレアーゼカセットと呼ばれる、Ｇｐ４１－１インテイン－Ｃに融合したＦｏｋ１エンドヌクレアーゼを更にコードする。プラスミドベクター５８２は、前述のようにプラスミド上で逆向きであるＹＦＰレポーターカセットを含み、その特徴は繰り返されない。プラスミド骨格はまた、プラスミド上で逆方向にある細菌選択マーカカセットを含有する。プラスミドベクター５８２の配列を配列番号１０８で示す。更に同定されたのは、左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号１０９）、右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号１１２）、ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）、エンドヌクレアーゼカセット（配列番号１１４）、細菌選択マーカカセット（配列番号７４）、右Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７２）、及び左Ｔ－ＤＮＡボーダー（配列番号７３）の配列である。左ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号１０９）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＴＨＣＡＳ左結合ドメイン（配列番号１１０）、特徴１０（配列番号１１１）、インテイン－Ｎ（配列番号１０３）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。右ＴＡＬＥインテインカセット（配列番号１１２）は、ＶａＵｂｉ３プロモータ（配列番号５８）、Ｎ末端（配列番号５９）、ＴＨＣＡＳ右結合ドメイン（配列番号１１３）、特徴１０（配列番号１１１）、インテイン－Ｎ（配列番号１０３）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。エンドヌクレアーゼカセット（配列番号１１４）は、ｐＭｔＥＦ１Ａプロモータ（配列番号６７）、特徴１０（配列番号１１５）、インテイン－Ｃ ＣＤＳ（配列番号８４）、Ｆｏｋ１（配列番号７０）、酵母＿１ＮＬＳ＿ＨＡｔａｇ＿Ｎ１５２＿Ｃ４０（配列番号７１）及びＮｏｓターミネータ（配列番号６３）をコードする。ＹＦＰレポーターカセット（配列番号５３）は、ＦＭＶプロモータ（配列番号５４）、ＹＦＰ ＣＤＳ（配列番号５５）及びＲｂｃｓ－Ｅ９ターミネータ（配列番号５６）をコードする。細菌選択マーカカセット（配列番号７４）は、ＫａｎＲプロモータ（配列番号７５）及びＫａｎＲ遺伝子（配列番号７６）をコードする。
【0124】
いくつかの実施形態は、細菌株のスターター培養物を調製すること、及び細菌株を含む細菌培養培地を調製することに関する。細菌株は、Ａ．リゾゲネス細菌株（１８ｒ１２）を含んでいた。Ａ．リゾゲネス株をＡＢ＋Ｋａｎ５０培地上のプレートに画線接種した。単一コロニーを１５ｍＬのＹＥＰ培養物＋７．５ｕＬのＫａｎ５０に接種し、それらは全て５０ｍＬの通気コニカルチューブ内にあった。いくつかの実験では、第２の培養物にバックアップとして別の単一コロニーを接種する。培養物を２８℃のシェーカー（２２０ｒｐｍ）に約８時間斜めに置いた。ＯＤＳＴＡＲＴＥＲは、理想的には０．２～０．４の光学密度（ＯＤ）６００であると測定された。２５０ｍＬフラスコを４９ｍＬの液体ＡＢ最小培養培地、１ｍＬのＹＥＰスターター培養物及び２５ｕＬのＫａｎ５０で調製し、シェーカー（２２０ｒｐｍ）上２８℃で２０時間増殖させた。前述のように、細菌株は、異種ヌクレオチド配列を有するように形質転換することができる。
【0125】
種子を滅菌して浸すことにより、アサ科種子を準備した。以下の工程を換気フード内で実施した：１）約１００個の種を含む５０ｍＬチューブを取り、血清ピペットを使用して１０ｍＬの１２Ｍ硫酸を加えた。２）５０ｍＬチューブを閉じ、１０秒間穏やかに振盪した。３）５０ｍＬチューブを開き、血清ピペットを使用して硫酸を除去した。４）硫酸廃棄物を、４００ｍＬのｄｄＨ２Ｏを含有するガラス廃棄ビーカーにピペットで入れた。５）すすぎ洗浄するために、４５ｍｌの滅菌ｄｄＨ２Ｏを、種を含有する５０ｍＬチューブに加えた。６）５０ｍｌチューブを閉じ、１０秒間穏やかに振盪した。７）血清ピペットを使用して、５０ｍｌチューブからｄｄＨ２Ｏを除去した。８）すすぎ洗浄するために、４５ｍＬの新鮮なｄｄＨ２Ｏを５０ｍＬチューブに添加し、チューブを閉じ、チューブを層流フードに運んだ。ｄｄＨ２Ｏを５０ｍＬチューブから取り出し、４５ｍＬの３０％Ｈ２Ｏ２を加えた。５０ｍｌの管を閉じ、回転シェーカー上に２０ｒｐｍで１０～２０分間置いた。１０～２０分後、５０ｍＬチューブを回転シェーカーから取り出し、層流フードに戻した。血清ピペットを使用して、５０ｍＬチューブからＨ２Ｏ２を除去した。種を含む５０ｍＬチューブにｄｄＨ２Ｏリンスを５回（５回）行った。５回目のｄｄＨ２Ｏリンスの後、滅菌した種を固体ＭＳ培地を含むプレートに注ぎ出し、８ｍＬの２％ｖ／ｖＰＰＭをプレートに直接添加し、７０ｒｐｍに設定したシェーカーに一晩置いた。これは過剰浸漬を回避するために使用され、ＰＰＭは内生菌の汚染を排除する。
【0126】
いくつかの実験実施形態では、細菌株のスターター培養、種子浸漬を１日目に行った。
【0127】
スターター培養物を感染のために調製した。ＯＤ、ボトル、及びスターター培養の３つの５０ｍＬフラスコを５４００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を除去し、１５０ｍＬのＴＤＺ感染培地を添加してペレットを再懸濁した。７５ｕＬの４０ｍｇ／ｍＬアセトシリンゴンを添加して、最終［アセトシリンゴン］＝１００ｕＭとし、感染培地を調製した。０．０２％ｖ／ｖのＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７を感染培地中の再懸濁細菌に添加した。
【0128】
浸された種子を使用して、アサ科分裂組織領域及び／又はＥＡを抽出した。例えば、２０ｍＬのＴＤＺ感染培地を１００×２５ｍｍペトリ皿に添加して感染プレートを形成し、浸された種子を２％ｖ／ｖのＰＰＭを含む固体ＭＳ培地と共にプレート上に残した。十分な数の感染プレートを使用して、プレート当たり約７５個のアサ科分裂組織領域及び／又はＥＡ、並びに浸された種子のプレート当たり１つの感染プレートを提供した。滅菌鉗子を使用して、子葉、一次葉及び種皮を各ＥＡから穏やかに取り出した。種皮、子葉、一次葉を除去したら、ＥＡを、細菌（１８ｒ１２等）を接種する前に、２０ｍＬのＴＤＺ感染培地を含むペトリ皿に入れた。
【0129】
ＴＤＺ感染培地等で培養及び懸濁した細菌株を超音波処理し、浸されたＥＡ及び／又は分裂組織領域を接種する。例えば、ＴＤＺ感染培地を感染プレートからピペットで取り出し、再懸濁した細菌１０ｍＬを添加した。感染プレートをパラフィルムし、一枚ずつ８０秒間超音波処理した。超音波処理後、２０ｍＬの新鮮な細菌を添加した。次いで、プレートを層流フード内で室温にて３０分間インキュベートした。
【0130】
超音波処理及び接種後、分裂組織領域及び／又はＥＡを細菌株と共培養した。例えば、残った細菌を感染プレートからピペッティングした。次いで、分裂組織領域及び／又はＥＡを、本明細書で「共培養プレート」と呼ばれることもある７５０ｕＬの滅菌ｄｄＨ２Ｏで湿らせた滅菌濾紙片を含む新しい１００×１５ｍｍペトリ皿に移した。これにより、過剰な細菌の乾燥が促進された。感染プレート（例えば、７５前後の全体）からのＥＡを屈曲した顎鉗子を使用して山に集め、ＥＡの山を、山のＥＡが依然として一緒に取り付けられた状態で、滅菌ｄｄＨ２Ｏで湿らせた滅菌濾紙を有する調製された共培養プレートに移した。共培養プレートをパラフィルムの層で包み、２３℃、湿度４０％で２４時間の周囲光（０ｕｍｏｌ／ｍ－２／ｓ－２）中で２～４日間インキュベートした。
【0131】
他の実験では、共培養培地を使用した。例えば、単一の分裂組織領域及び／又はＥＡは、一度に１つの分裂組織領域及び／又はＥＡを静かにピックアップし、各共培養プレートに１つずつ広げて約１０個のＥＡをめっきすることによって、その上に共培養培地を有する共培養プレートに移された。共培養プレートをパラフィルムの層で包み、２３℃、湿度４０％で１６／８時間の周囲光（３０μｍｏｌ／ｍ－２／ｓ－１）中で２～４日間インキュベートした。
【0132】
いくつかの実験的実施形態では、感染培地の調製、アサ科分裂組織領域及び／又はＥＡの抽出、超音波処理及び接種、並びに共培養は、２日目に行われたか、又は少なくとも開始された。
【0133】
共培養後、以下に開示されるＣＬ培地等の汚染を低減又は排除するのを助けるための回収工程として、分裂組織領域及び／又はＥＡをアサ科液体（ＣＬ）培地に移した。例えば、分裂組織領域及び／又はＥＡを１００×２５ｍｍペトリ皿中のＣＬ培地に移し、パラフィルムで密封した。いくつかの実験では、プレート当たり約５０～１００個のＥＡを、Ｃｏｎｖｉｒｏｎインキュベータ中、２３℃、湿度４０％で、５０～１００ｕｍｏｌ／ｍ－２／ｓ－１の１６／８時間光で３日間プレーティングした。
【0134】
回収工程の後、２～１０ｍｇ／Ｌの範囲のＴＤＺを含有するＳＩＭに、分裂組織領域及び／又はＥＡを移す。ＥＡは、小根を下方に向けて配向され、及び／又は分裂組織領域は、ＳＩＭ及び頂端分裂組織を上方に向けて配向された。いくつかの実施形態では、ＥＡを固体ＳＩＭに浸漬した。第２の滅菌１００×２５ｍｍプレートの底部を蓋として使用し、マイクロポアテープで密封した。いくつかの実施形態では、ＥＡを、プレート当たり１０個のＥＡを、１００μｍｏｌ／ｍ２／秒の白色蛍光下、室温２３＋／－１℃で１８日間培養した。
【0135】
苗条誘導後、１回目の苗条伸長を行った。例えば、分裂組織領域及び／又はＥＡを、ＳＥＭＩ＋Ｓ１００培地等の第１のＳＥＭに移した。小根を切断し、ＥＡを、小根を第１のＳＥＭ培地に下げ、頂端分裂組織を上にして配向させた。第２の滅菌１００×２５ｍｍプレートの底部を蓋として使用し、マイクロポアテープで密封した。いくつかの実施形態では、ＥＡを、２３＋／－１℃で１００μｍｏｌ／ｍ２／秒白色蛍光下、プレート当たり５個のＥＡを２１日間培養した。
【0136】
１回目の苗条伸長後、２回目の苗条伸長を行った。例えば、次いで、分裂組織領域及び／又はＥＡを、ＳＥＭＩ＋Ｓ１５０培地等の第２のＳＥＭに移した。ＥＡを、第２のＳＥＭ培地中に小根を下げ、頂端分裂組織を上にして配向させた。第２の滅菌１００×２５ｍｍプレートの底部を蓋として使用し、マイクロポアテープで密封した。いくつかの実施形態では、ＥＡを、２３＋／－１℃で１００μｍｏｌ／ｍ２／秒白色蛍光下、プレート当たり５個のＥＡを２１日間培養した。
【0137】
２回目の苗条伸長後、伸長した苗条が発根した。ポジティブルッキング苗条（好ましくは高さ２インチ、非漂白葉を有する最低１インチの高さの苗条）を切断し、苗条が少なくとも１ｃｍの長さである少なくとも２つの一次根を発達させるまで、約１４日間、ＬＥＤ下のフィタットレイでアサ科ＲＭ ＤＫＷ＋０．５ＩＢＡ培地に発根させた。新しい一次根及び根毛構造が発達するまで、及び土壌中の順化に送る前に、苗条をおよそ７～１４日ごとに新鮮なＲＭ上で継代培養した。
【0138】
ＡＢ塩（２０Ｘ）を作製するために、以下のプロトコル及び容量を使用した：
７００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ；２０ｇのＮＨ４Ｃｌ；６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；３ｇのＫＣｌ；０．２ｇのＣａＣｌ２；５０ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；ＫＯＨでｐＨを７．０に調整し、溶液を１０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。
７００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ；２０ｇのＮＨ４Ｃｌ；６ｇのＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；３ｇのＫＣｌ；０．２ｇのＣａＣｌ２；５０ｍｇのＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ；ＫＯＨでｐＨを７．０に調整し、溶液を１０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。
【0139】
ＡＢ緩衝液（２０Ｘ）を作成するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
７００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ；６０ｇのＫ２ＨＰＯ４；２０ｇのＮａＨ２ＰＯ４；溶液を１０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。
７００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ；６０ｇのＫ２ＨＰＯ４；２０ｇのＮａＨ２ＰＯ４；溶液を１０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。
【0140】
ＡＢ最小寒天培地（固体）を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
７００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ；５ｇのスクロース；１５ｇの分子等級寒天；溶液を９００ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。５０ｍＬの２０×ＡＢ塩；及び５０ｍＬの２０×ＡＢ緩衝液。
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブ処理した。ＡＢ＋Ｋａｎ５０培地を作製するために、５０ｍｇ／ＬのカナマイシンをＡＢ培地に添加した。
７００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ；５ｇのスクロース；１５ｇの分子等級寒天；溶液を９００ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。５０ｍＬの２０×ＡＢ塩；及び５０ｍＬの２０×ＡＢ緩衝液。
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブ処理した。ＡＢ＋Ｋａｎ５０培地を作製するために、５０ｍｇ／ＬのカナマイシンをＡＢ培地に添加した。
【0141】
ＡＢ最小培地（液体）を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
７００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ；５ｇのスクロース；溶液を９００ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。５０ｍＬの２０×ＡＢ塩；及び５０ｍＬの２０×ＡＢ緩衝液。
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブ処理し、５５℃に冷却し、１００×１５ｍｍプレートに注いだ。
７００ｍＬのｄｄＨ２Ｏ；５ｇのスクロース；溶液を９００ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。５０ｍＬの２０×ＡＢ塩；及び５０ｍＬの２０×ＡＢ緩衝液。
培地を液体サイクルで２５分間オートクレーブ処理し、５５℃に冷却し、１００×１５ｍｍプレートに注いだ。
【0142】
ＹＥＰ培地（液体）を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；１０ｇのバクトペプトン；５ｇの酵母エキス；５ｇのＮａＣｌ；溶液を１０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。培地を濾過滅菌した。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；１０ｇのバクトペプトン；５ｇの酵母エキス；５ｇのＮａＣｌ；溶液を１０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。培地を濾過滅菌した。
【0143】
ＴＤＺ感染培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；１．３０５ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；２５ｍＬの２０×ＡＢ塩；２５ｍＬの２０×ＡＢ緩衝液；１ｇの硝酸カリウム；２０ｇのグルコース；５ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；０．１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）［１０００Ｘ］；溶液をｄｄＨ２Ｏの１０００ｍＬ体積にした。ＫＯＨ／ＨＣｌの滴定によりｐＨを５．４に調整した。１．０ｍＬ［１ｍｇ／ｍＬ］のＴＤＺ（Ｔ８１１８）。
培地を濾過滅菌し、使用日にチオールを添加した。添加したチオールは、２．０ｍＬのジチオスレイトール［７７ｍｇ／ｍｌ］、４．９６ｍＬのチオ硫酸ナトリウム・５Ｈ２Ｏ［５０ｍｇ／ｍｌ］、及び８ｍＬのＬ－システイン［５０ｍｇ／ｍｌ］を含んでいた。いくつかの実施形態では、０．０２％ｖ／ｖのＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７を使用日に添加した。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；１．３０５ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；２５ｍＬの２０×ＡＢ塩；２５ｍＬの２０×ＡＢ緩衝液；１ｇの硝酸カリウム；２０ｇのグルコース；５ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；０．１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）［１０００Ｘ］；溶液をｄｄＨ２Ｏの１０００ｍＬ体積にした。ＫＯＨ／ＨＣｌの滴定によりｐＨを５．４に調整した。１．０ｍＬ［１ｍｇ／ｍＬ］のＴＤＺ（Ｔ８１１８）。
培地を濾過滅菌し、使用日にチオールを添加した。添加したチオールは、２．０ｍＬのジチオスレイトール［７７ｍｇ／ｍｌ］、４．９６ｍＬのチオ硫酸ナトリウム・５Ｈ２Ｏ［５０ｍｇ／ｍｌ］、及び８ｍＬのＬ－システイン［５０ｍｇ／ｍｌ］を含んでいた。いくつかの実施形態では、０．０２％ｖ／ｖのＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７を使用日に添加した。
【0144】
ＣＬ培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＰＰＭ；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）［１０００ｘ］；溶液を１６８．９ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨ滴定によりｐＨを５．７に調整した。
培地を濾過滅菌し、以下をオートクレーブ後に添加した：２ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１９）［１ｍｇ／ｍＬ］；２．０ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２．０ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．０ｍＬのチメンチン（Ｔ１０４）［３００ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）［２５０ｍｇ／ｍｌ］及び２ｍＬのカルベンシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍＬ］。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＰＰＭ；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）［１０００ｘ］；溶液を１６８．９ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨ滴定によりｐＨを５．７に調整した。
培地を濾過滅菌し、以下をオートクレーブ後に添加した：２ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１９）［１ｍｇ／ｍＬ］；２．０ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２．０ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．０ｍＬのチメンチン（Ｔ１０４）［３００ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）［２５０ｍｇ／ｍｌ］及び２ｍＬのカルベンシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍＬ］。
【0145】
共培養培地（例えば、ｃｏ－ｃｕｌｔ Ｇ ＤＫＷ）を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；２０ｇのグルコース；５．２２ｇのＧ ＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；溶液を１８３．７５ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．８に調整した。６ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：０．１２５ｍＬのＩＡＡ（Ｉ３６４）［１ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのｔｒａｎｓ－Ｚｅａｔｉｎ Ｒｉｂｏｓｉｄｅ（Ｚ８９９）［１ｍｇ／ｍｌ］、及び２ｍＬのアセトシリンゴン（Ａ１１０４）［２０ｍｇ／ｍｌ＝１００ｍＭ］。本明細書で使用される場合、ＤＫＷ中のＧはｇｅｌｚａｎ（例えば、固化剤）を指し、ＤＫＷは塩の一種である。しかし、様々な実験において、共培養は、滅菌ｄｄＨ２Ｏで湿らせた滅菌濾紙片を使用し、共培養培地を使用せずに実施した。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；２０ｇのグルコース；５．２２ｇのＧ ＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；溶液を１８３．７５ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．８に調整した。６ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：０．１２５ｍＬのＩＡＡ（Ｉ３６４）［１ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのｔｒａｎｓ－Ｚｅａｔｉｎ Ｒｉｂｏｓｉｄｅ（Ｚ８９９）［１ｍｇ／ｍｌ］、及び２ｍＬのアセトシリンゴン（Ａ１１０４）［２０ｍｇ／ｍｌ＝１００ｍＭ］。本明細書で使用される場合、ＤＫＷ中のＧはｇｅｌｚａｎ（例えば、固化剤）を指し、ＤＫＷは塩の一種である。しかし、様々な実験において、共培養は、滅菌ｄｄＨ２Ｏで湿らせた滅菌濾紙片を使用し、共培養培地を使用せずに実施した。
【0146】
ＳＩＭ＋Ｓ１０（ＴＤＺ２）培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）［１０００ｘ］；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１６３．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：２ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び０．２ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）［１０００ｘ］；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１６３．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：２ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び０．２ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
【0147】
ＳＩＭ＋Ｓ１０（ＴＤＺ１０）培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５５．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：１０ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び０．２ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５５．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：１０ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び０．２ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
【0148】
ＳＩＭ＋Ｓ５０（ＴＤＺ２）培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１６３．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：２ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び１ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１６３．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：２ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び１ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
【0149】
ＳＩＭ＋Ｓ５０（ＴＤＺ１０）培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５５．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：１０ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び１ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍＬ］。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５５．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：１０ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び１ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍＬ］。
【0150】
ＳＩＭ＋Ｓ１００（ＴＤＺ２）培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１６３．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：２ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び２ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１６３．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：２ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び２ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
【0151】
ＳＩＭ＋Ｓ１００（ＴＤＺ１０）培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５５．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：１０ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び２ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５５．５３２ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：１０ｍＬのＴＤＺ（Ｔ８１１８）［１ｍｇ／ｍＬ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び２ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
【0152】
ＳＥＭ Ｉ＋Ｓ５０培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５４．５９４ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：０．０３８５ｍＬのジベレリン酸（Ｇ３６２）［１３ｍｇ／ｍｌ］、０．１ｍＬのＩＡＡ（Ｉ３６４）［１ｍｇ／ｍｌ］、１０ｍＬのＬ－アスコルビン酸［１０ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び１ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５４．５９４ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：０．０３８５ｍＬのジベレリン酸（Ｇ３６２）［１３ｍｇ／ｍｌ］、０．１ｍＬのＩＡＡ（Ｉ３６４）［１ｍｇ／ｍｌ］、１０ｍＬのＬ－アスコルビン酸［１０ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び１ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
【0153】
ＳＥＭ Ｉ＋Ｓ１００培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５４．５９４ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：０．０３８５ｍＬのジベレリン酸（Ｇ３６２）［１３ｍｇ／ｍｌ］、０．１ｍＬのＩＡＡ（Ｉ３６４）［１ｍｇ／ｍｌ］、１０ｍＬのＬ－アスコルビン酸［１０ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び２ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５４．５９４ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：０．０３８５ｍＬのジベレリン酸（Ｇ３６２）［１３ｍｇ／ｍｌ］、０．１ｍＬのＩＡＡ（Ｉ３６４）［１ｍｇ／ｍｌ］、１０ｍＬのＬ－アスコルビン酸［１０ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び２ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
【0154】
ＳＥＭ Ｉ＋Ｓ１５０培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５４．５９４ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：０．０３８５ｍＬのジベレリン酸（Ｇ３６２）［１３ｍｇ／ｍｌ］、０．１ｍＬのＩＡＡ（Ｉ３６４）［１ｍｇ／ｍｌ］、１０ｍＬのＬ－アスコルビン酸［１０ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び３ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｇのＭＥＳ（Ｍ８２５）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；８ｍＬの鉄キレート（Ｆ３１８）；溶液を１５４．５９４ｍＬのｄｄＨ２Ｏの体積にした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．７に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）。
培地をＭｅｄｉａＣｌａｖｅを用いてＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、オートクレーブ後に以下を添加した：０．０３８５ｍＬのジベレリン酸（Ｇ３６２）［１３ｍｇ／ｍｌ］、０．１ｍＬのＩＡＡ（Ｉ３６４）［１ｍｇ／ｍｌ］、１０ｍＬのＬ－アスコルビン酸［１０ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのアスパラギン（Ａ１０７）［２５ｍｇ／ｍｌ］、２ｍＬのグルタミン（Ｇ２２９）［２５ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのカルベニシリン（Ｃ３４６）［２５０ｍｇ／ｍｌ］、１．２ｍＬのセフォタキシム（Ｃ３８０）及び３ｍＬのスペクチノマイシン（Ｓ４０１４）［５０ｍｇ／ｍｌ］。
【0155】
アサ科ＲＭ ＤＫＷ＋０．５ＩＢＡ培地を作製するために、以下のプロトコル及び体積を使用して１Ｌの培地を形成した：
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；５ｍＬの植物保存混合物；溶液を体積１７４．６３ｍＬのｄｄＨ２Ｏにした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．８に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）
培地を、ＭｅｄｉａＣｌａｖｅを含むＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、０．５ｍＬのＩＢＡ［１ｍｇ／１ｍＬ］を添加した。
８００ｍＬのｄｄＨ－２Ｏ；３０ｇのスクロース（Ｓ３９１）；５．２２ｇのＤＫＷ基礎塩（Ｄ１９０）；１ｍＬのＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミン（Ｇ２１９）；５ｍＬの植物保存混合物；溶液を体積１７４．６３ｍＬのｄｄＨ２Ｏにした。ＫＯＨの滴定によりｐＨを５．８に調整した。７ｇの寒天、植物ＴＣ（Ａ２９６）
培地を、ＭｅｄｉａＣｌａｖｅを含むＡＧＡＲサイクルでオートクレーブし、０．５ｍＬのＩＢＡ［１ｍｇ／１ｍＬ］を添加した。
【0156】
感染培地（例えば、ＥＡ ＴＤＺ感染培地）、共培養培地、再生培地（例えば、ＣＬ培地、）、ＳＩＭ（例えば、ＳＩＭ＋Ｓ１０（ＴＤＺ２）培地、ＳＩＭ＋Ｓ１０（ＴＤＺ１０）培地、ＳＩＭ＋Ｓ５０（ＴＤＺ２）培地、ＳＩＭ＋Ｓ５０（ＴＤＺ１０）培地、ＳＩＭ＋Ｓ１００（ＴＤＺ２）培地、及びＳＩＭ＋Ｓ１００（ＴＤＺ１０）培地）、ＳＥＭ（例えば、ＳＥＭＩ＋Ｓ５０培地、ＳＥＭＩ＋Ｓ１００培地、及びＳＥＭＩ＋Ｓ１５０培地）、及びＲＭ ＤＫＷは、一般に、水、基礎塩混合物、糖、並びにビタミン、選択剤、アミノ酸、及び植物ホルモン等の１つ又は複数の他の成分を含む。ＳＩＭ及びＳＥＭは、窒素、リン、カリウム、硫黄、カルシウム、マグネシウム、鉄、ホウ素、モリブデン、マンガン、コバルト、亜鉛、銅、塩素及びヨウ素の栄養源を含むことができる。いくつかの実験実施形態では、以下を表１に従って実施した：
そのような実験実施形態では、大麻ＥＡを図５Ｃに示すようにプラスミドベクター５７０で形質転換した。大麻ＥＡを、アサ科形質転換プロトコルを使用し、バイナリーベクターを含有する細菌を使用して形質転換した。バイナリーベクターは、スペクチノマイシン選択マーカ、ＹＦＰ視覚選択マーカ、及びＴＨＣＡＳ遺伝子の一部をノックアウトするように設計されたＴＡＬＥＮ対を含む異なる要素を含む。２１％及び３１％の編集頻度を有する大麻ＥＡをＳＩＭ＋Ｓ１０（ＴＤＺ１０）に３週間プレーティングした。
【表1】
【0157】
図６Ａ～６Ｂは、本開示と一致する、表１の試料からの例示的な画像を含む。図６Ａ～図６Ｂからの画像は、試料２からのＩｌｌｕｍｉｎａ位置合わせ画像である。垂直黄色点線内の白色領域は、標的ＴＨＣＡＳ領域の編集の成功を示す。図６Ｂは、ＴＨＣＡＳ領域のノックアウト編集を表すリードを示す、図６Ａの拡大版である。
【0158】
図７Ａ～図７Ｂは、本開示と一致する、細菌株で形質転換された大麻実生外植片の画像である。いくつかの実験では、図５Ｂに示すように、形質転換中に子葉が無傷の大麻実生外植片をプラスミドベクター５６０で形質転換した。このような実験では、アサ科形質転換プロトコルを使用し、バイナリーベクターを含有する細菌を使用して、子葉が無傷の大麻実生を形質転換した。バイナリーベクターは、カナマイシン選択マーカ、ＹＦＰ視覚選択マーカ、及びＴＨＣＡＳ遺伝子の一部をノックアウトするように設計されたＴＡＬＥＮ対を含む異なる要素を含む。図７Ａの画像によって示されるように、ＹＦＰは外植片の幹の形質転換外植片に見られ、導入遺伝子が大麻ゲノムに安定的に組み込まれていることを示している。図７Ｂの画像によって示されるように、ＹＦＰ蛍光は外植片の根領域にも見ることができる。
【0159】
図８は、本開示と一致する、図７Ａ～７Ｂに示す細菌で形質転換された大麻実生外植片から再生された植物の画像である。植物を組織サンプリングし、ＰＣＲを用いて分析した。ＰＣＲデータは、植物が形質転換法によって送達された導入遺伝子を含むことを示す。
【0160】
【0161】
図１０Ａ～図１０Ｂは、本開示と一致する、細菌株で形質転換された大麻の分裂組織領域の画像である。いくつかの実施形態では、大麻外植片を、図５Ａに示すようにプラスミドベクター５５０で形質転換した。実験では、分裂組織領域を含む又は分裂組織領域として実施される大麻外植片を、上記の形質転換プロトコルを使用し、バイナリーベクターを含むアグロバクテリウム株を使用して形質転換した。バイナリーベクターは、スペクチノマイシン選択マーカ及びベタライン視覚選択マーカを含む異なる要素を含んでいた。大麻外植片は非常に効率的な形質転換を示し、外植片全体がベタライン色を発現する。更に、大麻外植片に由来する外植片は、導入遺伝子が再生組織に首尾よく組み込まれたことを証明する。ベタラインは、元の外植片における高レベルのベタライン発現に加えて、分裂組織、葉柄及び葉組織において発現されるものとして示されている。図１０Ａは、形質転換された大麻外植片の画像であり、ベタレインの発現を示し、Ｔ－ＤＮＡベクターの組み込みを示す。より詳細には、図１０Ａの画像は、分裂組織領域の変換を示す。図１０Ｂは、外植片から再生された植物を示し、これは、分裂組織、葉柄及び葉組織におけるベタレイン発現を示す。元の外植片は、Ｔ－ＤＮＡベクターの非常に効率的な組み込みを示す。更に、この外植片に由来する再生植物は、分裂組織、葉柄及び葉組織においてベタレイン発現を示す。
【0162】
図１１は、本開示と一致する、細菌株で一時的に形質転換された大麻実生の画像である。いくつかの実験では、プラスミドベクター５５０で形質転換された実生の一過性発現を行った。そのような実施形態では、大麻実生を、上記の形質転換プロトコルを使用し、バイナリーベクターを含有するアグロバクテリウム株を使用して形質転換した。バイナリーベクターは、スペクチノマイシン選択マーカ及びベタライン視覚選択マーカを含む異なる要素を含んでいた。実生は効率的な形質転換を示し、いくつかの外植片は形質転換の４５分後にベタレイン色を一過性に発現した。図１１の画像は、形質転換４５分後のベタライン色の一過性発現を示す大麻実生を示す。丸で囲んだ外植片は一過性にベタレインを発現しているが、残りは発現していない。
【0163】
図１２Ａ～図１２Ｃは、本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻実生外植片の画像である。いくつかの実施形態では、大麻実生外植片をプラスミドベクター５５０で安定に形質転換した。実生は効率的な形質転換を示し、例示的な外植片は対照と比較してＲＵＢＹベクターの安定した形質転換を示した。図１２Ａは、ＲＵＢＹベクターで形質転換されていない対照外植片の画像を示す。１２Ｂ及び１２Ｃは、安定に形質転換された大麻実生外植片を示す。図１２Ｂ～図１２Ｃに示すように、ベタライン発現は外植片で見ることができる。
【0164】
図１３Ａ～図１３Ｂは、本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻ＥＡの画像である。いくつかの実施形態では、大麻ＥＡをプラスミドベクター５５０で形質転換した。ＥＡは、野生型ＥＡ対照におけるベタレイン発現なしと比較して、導入遺伝子の安定した発現を示した。図１３Ａは、ＲＵＢＹベクターで形質転換されていない対照外植片の画像を示す。図１３Ｂは、安定に形質転換された大麻実生外植片を示す。図１３Ｂによって示されるように、ベタライン発現は外植片において見られ得る。形質転換された大麻ＥＡは、外植片全体にわたってベタレインの安定した発現を示す。
【0165】
図１４Ａ～図１４Ｂは、本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻実生外植片の画像である。いくつかの実施形態では、大麻実生外植片をプラスミドベクター５５０で形質転換した。苗の外植片を薄くスライスし、顕微鏡を使用して画像化した。切片は、ベタレインを発現している細胞を示す。図１４Ａ～図１４Ｂは、導入遺伝子で安定に形質転換された大麻実生の断面を示す。
【0166】
図１５Ａ～図１５Ｂは、本開示と一致する、細菌株で安定に形質転換された大麻実生外植片の画像である。いくつかの実施形態では、大麻実生外植片を、図５Ｂに示すようにプラスミドベクター５６０で形質転換した。実生外植片を、上記のように、バイナリーベクターを含むアグロバクテリウムを使用して形質転換プロトコルで安定に形質転換した。バイナリーベクターは、カナマイシン選択マーカ及びＹＦＰレポーター（例えば、視覚的選択マーカ）を含む様々な要素を含んでいた。高レベルのＹＦＰ蛍光は、形質転換の７日後に分裂組織領域で同定された。図１５Ａは、白色光下でプラスミドベクター５６０で形質転換された大麻外植片の画像である。図１５Ｂは、ＹＦＰ蛍光光の下に置かれた図１５Ａの大麻外植片の画像である。外植片は、ベクターの大麻ゲノムへの組み込みに起因して、分裂組織領域で安定したＹＦＰ蛍光を示す。
【0167】
様々な実験は、異なる培養培地及び異なるＴＤＺ濃度を有するＳＩＭ等の培養培地の異なる濃度の成分を試験することを対象とした。大麻は難分解性であり、いくつかの実験では、得られた外植片は形質転換苗条を示さなかった。様々な実験に基づいて、大麻植物は強い頂端優性を有し、頂端優性を破ると形質転換効率が高まり、より多くのトランスジェニック事象が生じると考えられている。やや驚くべきことに、約２ｍｇ／Ｌ～約１０ｍｇ／Ｌの濃度のＴＤＺをＳＩＭに使用して、頂端優位性を破り、分裂組織大麻細胞の苗条を増加させた。いくつかの実験は、大麻ＥＡ上で異なる光条件で異なるＳＩＭを試験することを対象とした。例えば、種子を滅菌し、浸し、ＥＡを抽出した。いくつかの実験では、ＥＡは形質転換されず、４０から５０個のＥＡが各異なるＳＩＭで再生された。更なる実験では、ＥＡのサブセットをＴＤＺ等の植物成長調節剤を含まないＳＩＭにプレーティングし、残りのＥＡを１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含むＳＩＭにプレーティングし、各サブセットの異なる群を異なる光条件に曝露した。表２及び表３は、例示的な培地及び光条件を要約する。
表３のＢ、Ｇ、Ｒ値は、光の強度と共に、青色、緑色、及び赤色の光の値を含む。
【表2】
【表3】
【0168】
【0169】
図１６Ａは、異なるＳＩＭ上で培養した大麻ＥＡから再生した大麻外植片の画像１６８０、１６８１、１６８３、１６８４である。図示されていないが、ＩＡＡ、アデニンヘミ硫酸及びグルコースは、有意な正の影響を及ぼさなかった。画像１６８０、１６８１、１６８３、１６８４は、それぞれ１ｍｇ／ＬのＴＤＺ、２．５ｍｇ／ＬのＴＤＺ、５ｍｇ／ＬのＴＤＺ、及び１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含むＳＩＭで再生された得られた外植片を示す。約３週間後、１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含むＳＩＭ上の外植片は、最大の苗条成長を示した。約６週間後、１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含むＳＩＭ上の外植片は、ストレスの徴候、例えば、クロロシス、カルス形成、成長阻害を示した。したがって、大麻ＥＡを、１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含むＳＩＭ上で約２～約６週間、いくつかの実施形態では、約２週間～３週間培養することができる。
【0170】
図１６Ｂは、図１６Ａによって前述されたように異なるＳＩＭにおいて再生された外植片及び結果として生じる分裂組織の数を示すグラフである。示されるように、１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを有するＳＩＭは、複数の分裂組織を有する外植片をほとんど有していた。５ｍｇ／ＬのＴＤＺを含むＳＩＭは、多数の分裂組織を有する外植片をほとんど有していた。
【0171】
図１６Ｃは、１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含有するＳＩＭ上で再生された、得られた外植片の画像である。
【0172】
例は、図１６Ｂ～図１６Ｃに示されるＴＤＺ及び／又はＴＤＺ濃度を含有する培地に限定されない。いくつかの実験では、追加のＴＤＺ濃度を試験し、ＳＩＭ中の成分の異なる組合せを試験した。表４及び表５は、２週目及び６週目に試験された異なるＳＩＭ及び得られた分裂組織を示す。
【表4】
【表5】
【0173】
図１６Ｄは、１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含有し、植物成長調節剤を含まないＳＩＭ上での大麻ＥＡの結果として生じる成長の画像である。特に、画像は、上記の表３に記載の明Ｉ条件下での成長を示す。植物成長調節剤を含まない培地は、特に明Ｉ及び明ＩＩ条件下で、及び著しく長い苗条を有する明ＩＩＩ条件下で、良好な根成長を有した。
【0174】
図１６Ｅは、植物成長調節剤なし及び１０ｍｇ／ＬのＴＤＺありの異なる光条件下（例えば、光Ｉ、光ＩＩ、及び光ＩＩＩの条件）でのＳＩＭにおける大麻ＥＡの結果として生じる成長の画像を示す。
【0175】
図１６Ｆ及び図１６Ｇは、植物成長調節剤なし（図１６Ｆ）及び１０ｍｇ／Ｌ ＴＤＺあり（図１６Ｇ）の培養物における外植片当たりの分裂組織の数に対する異なる光条件の結果を示すグラフである。示されるように、明条件のみは苗条数に有意な影響を及ぼさなかったが、ＴＤＺの使用は影響を及ぼした。例えば、１０ｍｇ／ＬのＴＤＺの約半分は複数の分裂組織を有し、軽質ＩＩ条件は３＋の分裂組織を有する４０％の外植片をもたらし、軽質ＩＩ条件は３＋の分裂組織を有する２４％の外植片をもたらし、軽質Ｉ条件は３＋の分裂組織を有する１２％の外植片をもたらした。
【0176】
様々な実験は、上述のプロトコルを使用して大麻ＥＡを形質転換することを対象とし、感染、ＣＬ、及びＴＤＺを含有するＳＩＭ培地の使用を含む。例えば、５０～７５個のＥＡを２０ｍＬのＴＤＺ感染培地＋チオール／感染プレート中で単離した。単離が完了した後、ＴＤＺ感染培地＋チオールを除去した。約０．８のＯＤ６００を有する１８ｒ１２をＹＥＰ／ＡＢ培養培地で増殖させた。１８ｒ１２をＴＤＺ感染培地＋チオール＋１００ｕＭアセトシリンゴン（ＡＳ）＋０．０２％ｖ／ｖＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７に再懸濁した。１０ｍＬの再懸濁した１８ｒ１２を８０秒間超音波処理したところ、超音波処理はほとんど又は全くＹＦＰ又は他の形質転換体発現をもたらさなかった。他の例には、２０～６０秒の超音波処理が含まれた。次いで、２０ｍＬの新鮮な再懸濁した１８ｒ１２を、既に感染プレート内にある１０ｍＬに添加し、３０分から１時間接種した。再懸濁した１８ｒ１２の３０ｍＬを感染プレートから取り出した。感染プレートから５０～７５個のＥＡを採取し、１００×１５ｍｍペトリ皿中の７５０μＬのｄｄＨ２Ｏで湿らせた滅菌紙に取り付けて共培養プレートを形成することによって、５日間の共培養を行った。共培養プレートをパラフィルムし、２４時間の周囲光、０μｍｏｌ／ｍ－２／ｓ－１、４０％ＲＨ、２３℃を含む条件でインキュベータに入れた。次いで、ＥＡを２０ｍｌのＣＬ培地（０．１％ＰＰＭ、ＴＤＺ）を含む１００×２４ｍｍペトリ皿に回収し、パラフィルムし、コンビロンに３日間入れ、その間に１回滅菌したｄｄＨ２Ｏリンスを用いて毎日継代培養した。ＣＬ培地を除去し、ＥＡを１×滅菌ｄｄＨ２Ｏですすぎ、ＳＩＭ＋Ｓ１０（ＴＤＺ２）固体培地中に約３週間置いた。以下の表６及び７は、大麻ＥＡを形質転換するために使用される異なる培養培地及び条件を記載する。様々な実験において、得られた形質転換外植片を、形質転換頻度を同定するためにＰＣＲを使用して試験した。０．５から２．５の間のコピー数値を有する形質転換培養物を同定し、そのような培養物から、合計４７個のＴ０のうち７個のトランスジェニックＴ０が観察され、１４．８９％の形質転換効率が得られた。
【表6】
【表7】
【0177】
図１７Ａ～図１７Ｆは、本開示と一致する、異なる培地で外植片の形質転換を評価する実験からの外植片の画像である。図１７Ａは、ＣｓＥＡ ＴＤＺ＋０．０２％ｖ／ｖＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７、ＧｍＥＡ ＴＤＺ＋０．０２％ｖ／ｖＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７（これは、塩組成がジベレリン酸を更に含むＣｓＥＡ ＴＤＺ＋０．０２％ｖ／ｖＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７と同じである）、ＭＴＡ＋ＴＤＺ、及びＭＴＡを含む異なる感染培地から得られた外植片の画像を示す。図１７Ａによって示されるように、異なる感染培地処理は、異なるＹＦＰ発現をもたらした。より詳細には、ＣｓＥＡ ＴＤＺ及びＧｍＥＡ ＴＤＺは、ＭＴＡ＋ＴＤＺとＭＴＡとの間で行われた。
【0178】
図１７Ｂ～図１７Ｃは、ＧｍＥＡ ＴＤＺ＋０．０２％ｖ／ｖＳｉｌｗｅｔ Ｌ－７７（図１７Ｂ）及びＭＴＡ感染培地（図１７Ｃ）を使用して形質転換した場合に得られた外植片を示す。示されるように、葉原基は形質転換されず、非トランスジェニック一次苗条を生じさせる。
【0179】
図１７Ｄ～図１７Ｅは、１８ｒ１２プラスミドベクター５７０による感染の４週間後に、回収され、ＣＬ（例えば、２ｍｇ／Ｌ ＴＤＺ）及びＳＩＭ（２ｍｇ／Ｌ ＴＤＺ）を使用して再生されたときに画像化された、得られた安定に形質転換された外植片の画像である。
【0180】
図１７Ｆは、１８ｒ１２－プラスミドベクター５７０による感染の５週間後に画像化され、回収され、ＣＬ（例えば、２ｍｇ／Ｌ ＴＤＺ）及びＳＩＭ（２ｍｇ／Ｌ ＴＤＺ）を使用して再生された、得られた安定に形質転換された外植片の画像である。
【0181】
更なる実験実施形態では、大麻ＥＡを、図５Ｄ～図５Ｉによって示されるように、プラスミドベクター５７２、５７６、５７８、５８０、５８２プラスミドベクターで形質転換した。大麻ＥＡを、上記のアサ科形質転換プロトコルを使用し、それぞれのバイナリーベクターを含有する細菌を使用して形質転換し、感染培地、ＣＬ（ＰＰＭ及びＴＤＺ２を含む）及びＳＩＭ（ＴＤＺ１０）の使用を含む上記実験実施形態の工程を使用して再生した。様々な実施形態では、編集効率を異なるプラスミドベクター間で比較した。異なるプラスミドベクターは、ＰＤＳ遺伝子を標的とする第１のセット（例えば、図５Ｄのプラスミドベクター１０，５７２、図５Ｅの５７４、図５Ｈの５８０）及びＴＨＣＡＳ遺伝子を標的とする第２のセット（例えば、図５Ｆのプラスミドベクター１１、５７６、図５Ｇの５７８、図５Ｉの５８２）を含んでいた。第１のセット及び第２のセットの各々の中で、それぞれのベクターは、インテイン（例えば、本明細書に示されていないプラスミドベクター１０及びプラスミドベクター１１）、ＳＳＰ ＤｎａＥ及びネイティブエクテイン（例えば、図５Ｄの５７２、図５Ｆの５７６）のインテイン、ＧＰ４１－１及び非ネイティブエクテイン（例えば、図５Ｅの５７４、図５Ｇの５７８）のインテイン、並びにＧＰ４１－１及びネイティブエクテイン（例えば、図５Ｈの５８０、図５Ｉの５８２）のインテインを含まなかった。
【0182】
図１８Ａ～図１８Ｉは、本開示と一致する、異なるプラスミドベクターを使用して外植片を形質転換した結果を示す図である。図１８Ａは、第１のセット及び第２のセットの異なるプラスミドベクターの編集効率を比較するグラフであり、インテインなし（例えば、プラスミドベクター１０及びプラスミドベクター１１、ＳＳＰ ＤｎａＥ及びネイティブエクテインのインテイン（例えば、図５Ｄの場合は５７２、図５Ｆの場合は５７４）、ＧＰ４１－１及び非ネイティブエクテインのインテイン（例えば、図５Ｅの５７４、図５Ｇの５７８、並びにＧＰ４１－１及びネイティブエクテインのインテイン（例えば、図５Ｈの５８０、図５Ｉの５８２）の編集効率を示す。図１８Ｂ～図１８Ｃは、図１８Ａによって示されるように、第１のセット及び第２のセットの異なるプラスミドベクターのパーセント編集事象を比較するグラフである。
【0183】
【0184】
様々な実験実施形態は、様々な培地を使用してアサ科のＥＡを形質転換することを対象とした。いくつかの実験において、感染培地、ＣＬ培地及びＳＩＭ培地はＴＤＺを含有した。やや驚くべきことに、ＳＩＭ培地は時に２又は１０ｍｇ／ＬのＴＤＺを含有し、形質転換細胞を有する再生されたアサ科外植片をもたらした。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図5H】
【図5I】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図16G】
【図17A】
【図17B-17C】
【図17D】
【図17E】
【図17F】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図18E】
【図18F】
【図18G】
【図18H】
【図18I】
【配列表】
【国際調査報告】