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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】ＷＦＤＣ２の発現を調節するアンチセンス化合物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240925BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240925BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240925BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240925BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240925BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20240925BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240925BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240925BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240925BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z
A61P35/00
A61K47/64
A61K47/54
A61K47/26
A61K47/56
A61K31/7088
A61K48/00
C12N5/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024517063
(86)(22)【出願日】2022-09-15
(85)【翻訳文提出日】2024-05-15
(86)【国際出願番号】 KR2022013783
(87)【国際公開番号】W WO2023043220
(87)【国際公開日】2023-03-23
(31)【優先権主張番号】10-2021-0124349
(32)【優先日】2021-09-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0116229
(32)【優先日】2022-09-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524101984
【氏名又は名称】キューマイン・カンパニー・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ヨン・ジュン・キム
(72)【発明者】
【氏名】ジ・ウン・キム
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065CA43
4B065CA44
4C076AA94
4C076AA95
4C076CC27
4C076CC41
4C076DD41
4C076DD66
4C076EE41
4C076EE59
4C076FF31
4C084AA13
4C084NA12
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB26
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA12
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、ＷＦＤＣ２の発現を調節するアンチセンス化合物に関する。本発明によるＷＦＤＣ２の発現を調節するアンチセンス化合物は、多様な癌腫において抗癌効果を示すことができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＷＦＤＣ２（ＷＡＰ Ｆｏｕｒ－Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｏｒｅ Ｄｏｍａｉｎ２）を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列に相補的に結合し、１０個～３０個の連続的に連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物。
【請求項2】
前記ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列は、配列番号１または配列番号２である、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項3】
前記アンチセンス化合物は、１６個～２０個の連続的に連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むものである、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項4】
前記変形されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上の変形されたヌクレオシド間の連結基、変形された糖モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）を含む１つ以上の変形されたヌクレオシドおよび変形された核塩基を含む１つ以上の変形されたヌクレオシドから選択される１つ以上の変形を含むものである、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項5】
前記変形されたヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチル（ｍｅｔｈｙｌ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）、２’－アミノ（ａｍｉｎｏ）、２’－フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ）、２’－アラビノ（ａｒａｂｉｎｏ）－フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ）、２’－Ｏ－ベンジル（ｂｅｎｚｙｌ）又はび２’－Ｏ－メチル（ｍｅｔｈｙｌ）－４－ピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）で置換された糖モイエティからなる群より選択される１つ以上の変形された糖モイエティを含む変形されたヌクレオシドである、請求項４に記載のアンチセンス化合物。
【請求項6】
前記変形されたヌクレオシドは、ロック核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＬＮＡ）、コンストレインドエチルビサイクリック核酸（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ｃＥｔ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－架橋型核酸（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＥＮＡ）およびトリシクロ（ｔｒｉｃｙｃｌｏ）－ＤＮＡからなる群より選択される１つ以上の変形されたヌクレオシドである、請求項４に記載のアンチセンス化合物。
【請求項7】
前記変形されたヌクレオシドは、６員環または非環モイエティを有する糖代用物を含む変形されたヌクレオシドである、請求項４に記載のアンチセンス化合物。
【請求項8】
前記変形されたヌクレオシドは、シュードウリジン（ｐｓｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）、２’－チオウリジン（ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ）、Ｎ６’－メチルアデノシン（ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、５’－メチルシチジン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５’－フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ）－２－デオキシウリジン（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、Ｎ－エチルピペリジン７’－ＥＡＡトリアゾール変形アデニン（Ｎ－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ７’－ＥＡＡ ｔｒｉａｚｏｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｉｎｅ）、Ｎ－エチルピペリジン６’－トリアゾール変形アデニン（Ｎ－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ６’－ｔｒｉａｚｏｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｉｎｅ）、６’－フェニルピロロシトシン（６’－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２’，４’－ジフルオロトルイルリボヌクレオシド（２’，４’－ｄｉｆｌｕｏｒｏｔｏｌｕｙｌｒｉｂｏｎｕｌｅｏｓｉｄｅ）および５’－ニトロインドール（５’－ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ）からなる群より選択される１つ以上の変形された核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）を含む変形されたヌクレオシドである、請求項４に記載のアンチセンス化合物。
【請求項9】
前記変形されたヌクレオシド間の連結基は、ホスホトリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メシルホスホルアミデート（ｍｅｓｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）およびメトキシプロピル－ホスホネート（ｍｅｔｈｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）からなる群より選択される１つ以上の変形されたヌクレオシド間の連結基である、請求項４に記載のアンチセンス化合物。
【請求項10】
前記変形されたオリゴヌクレオチドは、連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、および連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含むものであり、前記ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメントの間に位置し、それぞれのウィングセグメントのヌクレオシドは、変形された糖モイエティまたは糖代用物を含むものである、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項11】
前記変形されたオリゴヌクレオチドは、８個～１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；３個～５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；および
３個～５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、前記ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、それぞれのウィングセグメントのそれぞれのヌクレオシドは、変形された糖モイエティを含むものである、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項12】
前記アンチセンス化合物は、配列番号１または配列番号２と相補的に結合する変形されたオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンス化合物は、配列番号１の塩基配列の開始部位２５から中段部位４６、開始部位２８４から中段部位３０５、開始部位５２０から中段部位５４５、開始部位２２２２から中段部位２３４４、開始部位７３３４から中段部位９３０１、開始部位９５０６から中段部位９５５１、開始部位９７３３から中段部位１０１４３、開始部位１０２７１から中段部位１０３０２、開始部位１０３６０から中段部位１０９０５、開始部位１０９７７から中段部位１１２９２、開始部位１１４４８から中段部位１１５６３および開始部位１１６３３から中段部位１１７７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド塩基配列のうち任意の配列と完全に相補的な８個以上の連続的な隣接核塩基を含む塩基配列を有する変形されたオリゴヌクレオチドを含み、前記変形されたオリゴヌクレオチドは、ＷＦＤＣのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルからなるいずれか１つ以上を減少させるものである、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項13】
前記アンチセンス化合物は、配列番号１または配列番号２と相補的に結合する変形されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号６５、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８９、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４８、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７６、配列番号１９１、配列番号２０５、配列番号２１０、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６４、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号３００、配列番号３１０、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３２０、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３６、配列番号３４３、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２および配列番号３８３からなる群より選択されるいずれか１つのオリゴヌクレオチド塩基配列と完全に一致する８個以上の連続的な隣接核塩基を含む塩基配列を有する変形されたオリゴヌクレオチドを含み、前記変形されたオリゴヌクレオチドは、ＷＦＤＣのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルからなるいずれか１つ以上を減少させるものである、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項14】
前記アンチセンス化合物は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号６５、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８９、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４８、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７６、配列番号１９１、配列番号２０５、配列番号２１０、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６４、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号３００、配列番号３１０、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３２０、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３６、配列番号３４３、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２および配列番号３８３からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列を有する変形されたオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項15】
１つ以上の非－ヌクレオチドモイエティに、請求項１～請求項１４のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物が共有結合した接合体。
【請求項16】
前記非－ヌクレオチドモイエティは、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、重合体、またはこれらの組み合わせを含むものである、請求項１５に記載の接合体。
【請求項17】
請求項１～請求項１４のいずれか１項に記載のアンチセンス化合物、または請求項１５～請求項１６のいずれか１項に記載の接合体を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項18】
前記癌は、胃癌、食道癌、胆管癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、胆嚢癌、大腸癌および膵臓癌からなる群より選択されるものである、請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＷＦＤＣ２の発現を調節するアンチセンス化合物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＷＦＤＣ２は、ヒト精巣上体組織で最初に観察された糖化されたタンパク質であって、卵巣癌を含む多様な癌で過発現することが報告されている。ＷＦＤＣ２遺伝子産物は、安定した４－ジスルフィドコアタンパク質のファミリーメンバーであって、ＷＦＤＣ２タンパク質およびこれを暗号化する遺伝子に関する研究としては、ヒト精巣上体－特異ｃＤＮＡは細胞外タンパク質分解酵素阻害剤と配列相同性を有するタンパク質をエンコードし、卵巣癌腫で過発現した遺伝子の発見のために卵巣ｃＤＮＡアレイの比較混成化を行い、精巣上体タンパク質の分子的特性を分析し、ヒト精巣上体で特異的に発現したｍＲＮＡのクローニングおよび分析などが行われてきており、このような研究により、ＷＦＤＣ２の過発現は前記タンパク質が癌、特に、卵巣癌に対するバイオマーカーとして活用できることを提示している。
【0003】
米国登録特許第７，８１１，７７８号は、胃腸関連癌を診断する方法に関するものであって、前記文献では、酸化性萎縮後、主細胞がＳＰＥＭに転換分化する間に発現が有意に増加し、上方調節された遺伝子の一部がＷＦＤＣ２であることを開示している。
【0004】
また、韓国登録特許第１０－２０５５３０５号は、胃食道境界部腺癌の診断および標的治療のためのマーカーに関するものであって、発現量が増加する多様な遺伝子の一つであるＷＦＤＣ２の発現量がＢＣＣＰ（Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃｏｖａｒｉａｔｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）点数を測定する遺伝子で、胃癌または食道癌を診断するバイオマーカーとして可能性があることを開示している。
【0005】
このように、ＷＦＤＣ２が癌発生時に発現が増加する多様な遺伝子の一つであって、卵巣癌、胃癌などのバイオマーカーとして活用できるという可能性を示す先行文献は存在するが、その発現を抑制または阻害するアンチセンス化合物により癌の治療効果を確認した研究はほとんどなされていないのが現状である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の一態様は、ＷＦＤＣ２（ＷＡＰ Ｆｏｕｒ－Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｏｒｅ Ｄｏｍａｉｎ２）を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列に相補的に結合し、１０個～３０個の連続的に連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物を提供する。
【0007】
本発明の他の態様は、１つ以上の非－ヌクレオチドモイエティに、前記アンチセンス化合物が共有結合した接合体を提供する。
【0008】
本発明のさらに他の態様は、前記アンチセンス化合物、または前記接合体を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の一態様は、ＷＦＤＣ２（ＷＡＰ Ｆｏｕｒ－Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｏｒｅ Ｄｏｍａｉｎ２）を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列に相補的に結合し、１０個～３０個の連続的に連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物を提供する。
【0010】
一具体例によれば、前記ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体の核酸塩基配列は、配列番号１または配列番号２であってもよい。
【0011】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、１６個～２０個の連続的に連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【0012】
一具体例によれば、前記変形されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上の変形されたヌクレオシド間の連結基、変形された糖モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）を含む１つ以上の変形されたヌクレオシドおよび変形された核塩基を含む１つ以上の変形されたヌクレオシドから選択される１つ以上の変形を含むことができる。
【0013】
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、２’－Ｏ－メチル（ｍｅｔｈｙｌ）、２’－Ｏ－メトキシエチル（ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）、２’－アミノ（ａｍｉｎｏ）、２’－フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ）、２’－アラビノ（ａｒａｂｉｎｏ）－フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ）、２’－Ｏ－ベンジル（ｂｅｎｚｙｌ）又は２’－Ｏ－メチル（ｍｅｔｈｙｌ）－４－ピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）で置換された糖モイエティからなる群より選択される１つ以上の変形された糖モイエティを含むことができる。
【0014】
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、ロック核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＬＮＡ）、コンストレインドエチルビサイクリック核酸（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ｃＥｔ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－架橋型核酸（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＥＮＡ）およびトリシクロ（ｔｒｉｃｙｃｌｏ）－ＤＮＡからなる群より選択される１つ以上の変形されたヌクレオシドであってもよい。
【0015】
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、６員環または非環モイエティを有する糖代用物を含む変形されたヌクレオシドであってもよい。
【0016】
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、シュードウリジン（ｐｓｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）、２’－チオウリジン（ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ）、Ｎ６’－メチルアデノシン（ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、５’－メチルシチジン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５’－フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ）－２－デオキシウリジン（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、Ｎ－エチルピペリジン７’－ＥＡＡトリアゾール変形アデニン（Ｎ－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ７’－ＥＡＡ ｔｒｉａｚｏｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｉｎｅ）、Ｎ－エチルピペリジン６’－トリアゾール変形アデニン（Ｎ－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ６’－ｔｒｉａｚｏｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｉｎｅ）、６’－フェニルピロロシトシン（６’－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２’，４’－ジフルオロトルイルリボヌクレオシド（２’，４’－ｄｉｆｌｕｏｒｏｔｏｌｕｙｌｒｉｂｏｎｕｌｅｏｓｉｄｅ）および５’－ニトロインドール（５’－ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ）からなる群より選択される１つ以上の変形された核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）を含む変形されたヌクレオシドであってもよい。
【0017】
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシド間の連結基は、ホスホトリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メシルホスホルアミデート（ｍｅｓｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）およびメトキシプロピル－ホスホネート（ｍｅｔｈｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）からなる群より選択される１つ以上の変形されたヌクレオシド間の連結基であってもよい。
【0018】
一具体例によれば、前記変形されたオリゴヌクレオチドは、連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、および連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含むものであり、前記ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメントの間に位置し、それぞれのウィングセグメントのヌクレオシドは、変形された糖モイエティまたは糖代用物を含むことができる。
【0019】
一具体例によれば、前記変形されたオリゴヌクレオチドは、８個～１０個の連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント；
３個～５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；および
３個～５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、前記ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、それぞれのウィングセグメントのそれぞれのヌクレオシドは、変形された糖モイエティを含むことができる。
３個～５個の連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント；および
３個～５個の連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含み、前記ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントと３’ウィングセグメントとの間に位置し、それぞれのウィングセグメントのそれぞれのヌクレオシドは、変形された糖モイエティを含むことができる。
【0020】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、配列番号１または配列番号２の任意の配列に少なくとも７０％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも９０％以上または完全に相補的な塩基配列を有し、前記アンチセンス化合物は、配列番号１の塩基配列の開始部位２５から中段部位４６、開始部位２８４から中段部位３０５、開始部位５２０から中段部位５４５、開始部位２２２２から中段部位２３４４、開始部位７３３４から中段部位９３０１、開始部位９５０６から中段部位９５５１、開始部位９７３３から中段部位１０１４３、開始部位１０２７１から中段部位１０３０２、開始部位１０３６０から中段部位１０９０５、開始部位１０９７７から中段部位１１２９２、開始部位１１４４８から中段部位１１５６３および開始部位１１６３３から中段部位１１７７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド塩基配列のうち任意の配列と完全に相補的な少なくとも８個以上の連続的な隣接核塩基を含む塩基配列を有する変形されたオリゴヌクレオチドを含み、前記変形されたオリゴヌクレオチドは、ＷＦＤＣのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルからなるいずれか１つ以上を減少させるものであってもよい。
【0021】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、配列番号１または配列番号２と相補的に結合する変形されたオリゴヌクレオチドであって、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号６５、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８９、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４８、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７６、配列番号１９１、配列番号２０５、配列番号２１０、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６４、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号３００、配列番号３１０、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３２０、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３６、配列番号３４３、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２および配列番号３８３からなる群より選択されるいずれか１つのオリゴヌクレオチド塩基配列と完全に一致する少なくとも８個以上の連続的な隣接核塩基を含む塩基配列を有する変形されたオリゴヌクレオチドを含み、前記変形されたオリゴヌクレオチドは、ＷＦＤＣのｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルからなるいずれか１つ以上を減少させるものであってもよい。
【0022】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号６５、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８９、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４８、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７６、配列番号１９１、配列番号２０５、配列番号２１０、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６４、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号３００、配列番号３１０、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３２０、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３６、配列番号３４３、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２および配列番号３８３からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列を有する変形されたオリゴヌクレオチドであってもよい。
【0023】
本発明の他の態様は、１つ以上の非－ヌクレオチドモイエティに、前記アンチセンス化合物が共有結合した接合体を提供する。
【0024】
一具体例によれば、前記非－ヌクレオチドモイエティは、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、重合体、またはこれらの組み合わせを含むものであってもよい。
【0025】
本発明のさらに他の態様は、前記アンチセンス化合物、または前記接合体を有効成分として含む癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0026】
一具体例によれば、前記癌は、胃癌、食道癌、胆管癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頸部癌、脳腫瘍、肺癌、肝臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、胆嚢癌、大腸癌および膵臓癌からなる群より選択されるものであってもよい。
【発明の効果】
【0027】
本発明によるＷＦＤＣ２の発現を調節するアンチセンス化合物は、多様な癌腫において抗癌効果を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】ＳＮＵ６３８細胞株Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルにおいて一具体例によるアンチセンス化合物の皮下投与に対する癌増殖抑制効果（癌細胞サイズ）を示すグラフである。
【図2】ＳＮＵ６３８細胞株Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルにおいて一具体例によるアンチセンス化合物の静脈投与に対する癌増殖抑制効果（癌細胞サイズ）を示すグラフである。
【図3】ＳＮＵ６３８細胞株Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルにおいて一具体例によるアンチセンス化合物の皮下または静脈投与に対する癌増殖抑制効果（癌細胞重量）を示すグラフである。
【図4】ＳＮＵ６３８細胞株Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルにおいて一具体例によるアンチセンス化合物の皮下または静脈投与に対する癌増殖抑制効果を示す写真である。
【図5】ＳＦ２６８細胞株Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルにおいて一具体例によるアンチセンス化合物の静脈投与に対する癌増殖抑制効果（癌細胞サイズ）を示すグラフである。
【図6】ＳＦ２６８細胞株Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルにおいて一具体例によるアンチセンス化合物の静脈投与に対する癌増殖抑制効果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明の一態様は、ＷＦＤＣ２（ＷＡＰ Ｆｏｕｒ－Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｏｒｅ Ｄｏｍａｉｎ２）を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列に相補的に結合し、１０個～３０個の連続的に連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物を提供する。
【0030】
ＷＦＤＣ２（ＷＡＰ Ｆｏｕｒ－Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ Ｃｏｒｅ Ｄｏｍａｉｎ２）
ＷＦＤＣ２遺伝子産物は、ＷＡＰ４－ジスルフィドコアタンパク質のファミリーメンバー（ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ）であって、ＷＦＤＣ２は、ヒト精巣上体組織で最初に観察された分泌および糖化されたタンパク質であり、卵巣癌を含む一部の癌腫で過発現することが知られている。癌細胞におけるＷＦＤＣ２の過発現は、本タンパク質およびその多様なイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）が癌を検出したり、癌の発病の可能性が高い患者を診断するためのバイオマーカーになり得ることを提示する。
ＷＦＤＣ２遺伝子産物は、ＷＡＰ４－ジスルフィドコアタンパク質のファミリーメンバー（ｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ）であって、ＷＦＤＣ２は、ヒト精巣上体組織で最初に観察された分泌および糖化されたタンパク質であり、卵巣癌を含む一部の癌腫で過発現することが知られている。癌細胞におけるＷＦＤＣ２の過発現は、本タンパク質およびその多様なイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）が癌を検出したり、癌の発病の可能性が高い患者を診断するためのバイオマーカーになり得ることを提示する。
【0031】
アンチセンス化合物
本明細書において、「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）、糖モイエティ（ｓｕｇａｒ ｍｏｉｅｔｙ）およびリン酸グループ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）の結合からなる核酸を構成する単位体分子を意味するものであり、前記ヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、変形されたヌクレオチド、非－天然ヌクレオチド、非－標準ヌクレオチドなどのような核塩基、糖モイエティおよび／またはリン酸グループの非変形または変形をすべて含む概念と解釈できる。
本明細書において、「ヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）、糖モイエティ（ｓｕｇａｒ ｍｏｉｅｔｙ）およびリン酸グループ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）の結合からなる核酸を構成する単位体分子を意味するものであり、前記ヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、変形されたヌクレオチド、非－天然ヌクレオチド、非－標準ヌクレオチドなどのような核塩基、糖モイエティおよび／またはリン酸グループの非変形または変形をすべて含む概念と解釈できる。
【0032】
本明細書において、「ヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）」は、ヌクレオチドにおいてリン酸グループを除いた部分と見なされるグリコシルアミン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｍｉｎｅ）であり、核塩基および糖モイエティで構成された単位体分子を意味し、前記ヌクレオシドは、ヌクレオチドと同じく、核塩基Ｇ／または糖モイエティが変形されたり、変形されていないヌクレオシドをすべて含む概念と解釈できる。
【0033】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＤＮＡ）、またはこれらの類似体の低重合体や重合体を意味するものであり、前記オリゴヌクレオチドは、一般的に生体内に存在する核塩基、糖およびヌクレオシド（骨格）間の共有結合で構成されるオリゴヌクレオチドだけでなく、これと類似して作用するヌクレオチド類似体、変形されたヌクレオチド、非－天然ヌクレオチド、非－標準ヌクレオチドからなる変形または置換されたオリゴヌクレオチドを含む。このような変形または置換されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼの存在下、変形または置換されていないオリゴヌクレオチドより細胞吸収増進、核酸標的親和性増進および安定性増加などの特性を有する。
【0034】
本明細書において、「アンチセンス化合物（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」は、水素結合によって標的核酸配列と混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）できるオリゴヌクレオチドを含むと解釈される。アンチセンス化合物は、標的核酸配列と混成化してその発現を調節するオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド擬似体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、一本鎖ｓｉＲＮＡ（ｓｓ ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ模倣体、リボザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）、外部ガイド配列（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｇｕｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）オリゴヌクレオチドおよびその他のオリゴヌクレオチドを含むが、これに限定されず、前記アンチセンス化合物は、一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドを含む概念と解釈される。
【0035】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、５’から３’方向で記載されている場合、標的化される標的核酸配列の標的部分の逆相補を含む核酸塩基配列を有する。好ましくは、前記アンチセンス化合物は、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列に相補的に結合できる。前記ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体は、前記アンチセンス化合物の標的になる核酸であって、ｍＲＮＡおよびイントロン、エクソンおよび非翻訳領域を含むプレ（ｐｒｅ）－ｍＲＮＡから選択されてもよい。
【0036】
一具体例によれば、前記ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体の塩基配列は、配列番号１または配列番号２であり、配列番号１の塩基配列は、ヒトＷＦＤＣ２ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００００２０．１１(ヌクレオチド４５４６９７５３～４５４８１５３２)の相補物、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列）であり、配列番号２は、ヒトＷＦＤＣ２ ｍＲＮＡ配列（ＲｅｆＳｅｑまたはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００６１０３．４）である。
【0037】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列である配列番号１または配列番号２の任意の配列に少なくとも７０％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも９０％以上または完全に相補的であり、配列番号１または配列番号２の任意の配列に完全に相補的な少なくとも８個以上の隣接した核塩基を含むものであって、１０個～３０個、好ましくは１２個～２５個、さらに好ましくは１４個～２３個、最も好ましくは１６個～２０個の連続的に連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【0038】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列である配列番号１または配列番号２の任意の配列に少なくとも７０％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも９０％以上または完全に相補的な塩基配列を有し、配列番号７～３８６のいずれか１つの核酸塩基配列の一部を含むものであって、１０個～３０個の連続的に連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【0039】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、配列番号１または配列番号２の任意の配列に少なくとも７０％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも９０％以上または完全に相補的な塩基配列を有し、前記アンチセンス化合物は、配列番号１の塩基配列の開始部位２５から中段部位４６、開始部位２８４から中段部位３０５、開始部位５２０から中段部位５４５、開始部位２２２２から中段部位２３４４、開始部位７３３４から中段部位９３０１、開始部位９５０６から中段部位９５５１、開始部位９７３３から中段部位１０１４３、開始部位１０２７１から中段部位１０３０２、開始部位１０３６０から中段部位１０９０５、開始部位１０９７７から中段部位１１２９２、開始部位１１４４８から中段部位１１５６３および開始部位１１６３３から中段部位１１７７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチド塩基配列のうち任意の配列と完全に相補的な少なくとも８個以上の連続的な隣接核塩基を含む塩基配列を有する変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【0040】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列のうち任意の配列に完全に相補的な塩基配列を有するものであって、前記アンチセンス化合物は、配列番号７～３８６のいずれか１つの核酸塩基配列内の任意の配列と完全に相補的な少なくとも８個以上の隣接した核塩基を含み、１０個～３０個の連続的に連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【0041】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、配列番号１または配列番号２の任意の配列に少なくとも７０％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも９０％以上または完全に相補的な塩基配列を有し、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号６５、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８９、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４８、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７６、配列番号１９１、配列番号２０５、配列番号２１０、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６４、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号３００、配列番号３１０、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３２０、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３６、配列番号３４３、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２および配列番号３８３からなる群より選択されるいずれか１つのオリゴヌクレオチド塩基配列と完全に一致する少なくとも８個以上の連続的な隣接核塩基を含む塩基配列を有する変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【0042】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、配列番号７～３８６のいずれか１つの塩基配列からなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【0043】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号６５、配列番号８３、配列番号８６、配列番号８９、配列番号１０９、配列番号１１３、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４８、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６５、配列番号１６９、配列番号１７６、配列番号１９１、配列番号２０５、配列番号２１０、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１８、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４３、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６４、配列番号２８２、配列番号２８４、配列番号２８５、配列番号２８６、配列番号２８７、配列番号２８９、配列番号２９０、配列番号２９１、配列番号２９１、配列番号２９２、配列番号２９３、配列番号２９５、配列番号３００、配列番号３１０、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３２０、配列番号３３０、配列番号３３１、配列番号３３６、配列番号３４３、配列番号３７６、配列番号３７７、配列番号３７８、配列番号３７９、配列番号３８０、配列番号３８１、配列番号３８２および配列番号３８３からなる群より選択されるいずれか１つの塩基配列を有する変形されたオリゴヌクレオチドであってもよい。
【0044】
一具体例によれば、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列に相補的に結合できるアンチセンス化合物の長さは、１０個～３０個の連続的に連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。好ましくは、前記アンチセンス化合物は、１２個～２８個、１５個～２５個、１８個～２４個、１９個～２２個または２０個の長さの連続連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドで構成されてもよいし、好ましくは、前記アンチセンス化合物は、その長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個の長さの連続連結されたヌクレオシドからなる変形されたオリゴヌクレオチドであってもよい。
【0045】
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、一本鎖または二本鎖であってもよい。前記アンチセンス化合物が二本鎖の場合、前記二本鎖は、標的核酸と相補的な領域を有する第１の変形されたオリゴヌクレオチドおよび、前記第１の変形されたオリゴヌクレオチドと相補的な領域を有する第２の変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【0046】
混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）
前記アンチセンス化合物は、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列から１つ以上の標的部位を選択し、前記標的と十分に相補的なオリゴヌクレオチドを選択して、標的部位と十分に特異的に混成化されることにより、ＷＦＤＣ２の発現調節に対する所期の効果を得ることができる。
前記アンチセンス化合物は、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列から１つ以上の標的部位を選択し、前記標的と十分に相補的なオリゴヌクレオチドを選択して、標的部位と十分に特異的に混成化されることにより、ＷＦＤＣ２の発現調節に対する所期の効果を得ることができる。
【0047】
本明細書において、「混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」は、相補的ヌクレオシドやヌクレオチド塩基間のワトソン・クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）または逆フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）水素結合であり得る水素結合を意味する。例えば、アデニンとチミンは、水素結合を形成して対をなす相補的な核酸塩基である。
【0048】
本発明において、「混成化可能な」または「相補的」または「実質的に相補的」の意味は、温度および溶液のイオン強度の適切なインビトロおよび／またはインビボの条件下、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が他の核酸に配列－特異的、逆平行（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ）方式（すなわち、核酸が相補的核酸に特異的に結合）で非－共有的に結合する、すなわちアデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）のペアリング、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）のペアリング、およびグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）のペアリングを形成したり、「アニーリング（ａｎｎｅａｌ）」したり、または「混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」することが可能なヌクレオチドの塩基配列を含むことを意味する。
【0049】
一具体例によれば、前記混成化は、本明細書に開示されたアンチセンス化合物と、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列との間で起こる。混成化の最も通常のメカニズムは、核酸分子の相補的な核酸塩基間の水素結合を伴う。
【0050】
混成化は多様な条件で発生できる。苛酷な条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）は配列に依存し、混成化される核酸分子の性質と組成によって決定される。配列が標的核酸と特異的に混成化できるかを確認する方法は当業界で公知である。
【0051】
相補性（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）
本明細書において、「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」という用語は、２つのヌクレオチド間で精巧に対をなし得る特性をいう。例えば、２つの互いに異なる核酸またはオリゴヌクレオチドの塩基配列が５’から３’方向で記載されている場合、１つの核酸またはオリゴヌクレオチドの一定部分の塩基配列を反対方向に整列した時、残りの１つの核酸またはオリゴヌクレオチドの一定部分と非－共有的に結合する、すなわち、アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）のペアリング、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）のペアリング、およびグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）のペアリングを形成する場合、２つの核酸またはオリゴヌクレオチドは相補的であるという。
本明細書において、「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」という用語は、２つのヌクレオチド間で精巧に対をなし得る特性をいう。例えば、２つの互いに異なる核酸またはオリゴヌクレオチドの塩基配列が５’から３’方向で記載されている場合、１つの核酸またはオリゴヌクレオチドの一定部分の塩基配列を反対方向に整列した時、残りの１つの核酸またはオリゴヌクレオチドの一定部分と非－共有的に結合する、すなわち、アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ）のペアリング、アデニン（Ａ）とウラシル（Ｕ）のペアリング、およびグアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）のペアリングを形成する場合、２つの核酸またはオリゴヌクレオチドは相補的であるという。
【0052】
したがって、「特異的に混成化できる（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ）」と「相補的（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」は、オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で安定した特異結合を発生可能にする相補性または精巧な対形成の十分な程度を示すのに用いられる用語で解釈できる。当業界においてアンチセンス化合物の配列は特異的に混成化される標的核酸の配列と１００％相補的である必要はないことが知られている。
【0053】
前記アンチセンス化合物は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡとの結合が特異的に混成化されて標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常な機能を阻害し、特異的結合が好ましい条件で、すなわち、インビボ分析または治療の場合に生理的条件下、インビトロ分析の場合に分析実施条件下、アンチセンス化合物の非－標的配列との非特異結合を防止するのに十分な程度の相補性があると解釈される。
【0054】
すなわち、前記アンチセンス化合物は、標的核酸と特異的に混成化できれば、アンチセンス化合物と標的核酸との間の非相補的な核酸塩基は容認できる。しかも、アンチセンス化合物は、介在または隣接部分が混成化に関与しないように１つ以上の核酸部分と混成化される（例えば、ループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）。
【0055】
一具体例によれば、本発明のアンチセンス化合物または前記アンチセンス化合物をなしている変形されたオリゴヌクレオチドは、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体（例えば、配列番号１または配列番号２）内の核酸塩基配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％相補的であってもよい。アンチセンス化合物の標的核酸との相補性パーセントは、当業界で知られた通常の方法で決定可能である。例えば、アンチセンス化合物の２０個の核酸塩基のうち１８個が標的領域と相補的なアンチセンス化合物は特異的に混成化可能であり、９０％の相補性を有する。前記例において、残りの非相補的な核酸塩基は、相補的核酸塩基と群をなしたりその内部に配置され、互いにまたは相補的核酸塩基に隣接する必要がない。これによって、標的核酸と完全に相補的な２つの領域の両側面に配置される４つの非相補的核酸塩基を有する１８個の核酸塩基の長さのアンチセンス化合物は、標的核酸と７７．８％の全体相補性を有するので、本発明の範疇に含まれると解釈される。標的核酸領域とのアンチセンス化合物の相補性パーセントは、当業界で知られたＢＬＡＳＴプログラムとＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いて通常決定可能である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３ ４１０；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９ ６５６）。一方、相同性パーセント、配列同一性または相補性は、スミス・ウォーターマンアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２ ４８９）を用いた基本設定を利用するＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）などによって決定可能である。
【0056】
一具体例によれば、本発明のアンチセンス化合物または前記アンチセンス化合物をなしている変形されたオリゴヌクレオチドは、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体（例えば、配列番号１または配列番号２）内の核酸塩基配列に８０％以上相補的であってもよいし、好ましくは９０％以上、最も好ましくは完全に相補的（１００％相補的）であってもよい。本明細書において、「完全に相補的（ｆｕｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」は、アンチセンス化合物の各核酸塩基が標的核酸の対応核酸塩基と精巧な塩基対をなし得ることを意味する。
【0057】
一具体例によれば、非相補的な核酸塩基の位置は、前記アンチセンス化合物の５’末端または３’末端に位置することができる。あるいは、非相補的核酸塩基や核酸塩基は、前記アンチセンス化合物の内部に位置することができる。２以上の非相補的核酸塩基が存在する場合、これらは隣接（すなわち、結合）したり、隣接しなくてもよい。一具体例によれば、前記非相補的核酸塩基は、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）アンチセンスオリゴヌクレオチドのウィング（ｗｉｎｇ）部分に位置することができる。
【0058】
一具体例によれば、本発明のアンチセンス化合物は、ＷＦＤＣ２を暗号化する遺伝子の転写体内の核酸塩基配列部分に相補的なものを含むことができる。本明細書において、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」は、標的核酸の領域や部分内に隣接（すなわち、結合）する所定の核酸塩基数を意味する。前記部分は、アンチセンス化合物の隣接する核酸塩基の一定数を意味したりする。一具体例によれば、アンチセンス化合物は、標的部分の少なくとも８個の核酸塩基部分と相補的であり、少なくとも１２個の核酸塩基部分と相補的であってもよいし、少なくとも１５個の核酸塩基部分と相補的であってもよい。標的部分の少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上やそれら値のうち２つの値で定義される範囲の核酸塩基部分に相補的なアンチセンス化合物も、前記範囲に含まれると解釈される。
【0059】
変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されたオリゴヌクレオチド
本発明の一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができ、前記変形されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上の変形されたヌクレオシド間の連結基、変形された糖モイエティを含む１つ以上の変形されたヌクレオシドおよび変形された核塩基を含む１つ以上の変形されたヌクレオシドから選択される１つ以上の変形を含むことができる。
本発明の一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができ、前記変形されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上の変形されたヌクレオシド間の連結基、変形された糖モイエティを含む１つ以上の変形されたヌクレオシドおよび変形された核塩基を含む１つ以上の変形されたヌクレオシドから選択される１つ以上の変形を含むことができる。
【0060】
糖モイエティ（ｓｕｇａｒ ｍｏｉｅｔｙ）の変形
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、非－ビサイクリック変形糖モイエティおよび／または、ビサイクリックまたはトリサイクリック糖モイエティ、および／または糖代用物または糖擬似体などで変形された糖モイエティを含む変形されたヌクレオシドであってもよい。
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、非－ビサイクリック変形糖モイエティおよび／または、ビサイクリックまたはトリサイクリック糖モイエティ、および／または糖代用物または糖擬似体などで変形された糖モイエティを含む変形されたヌクレオシドであってもよい。
【0061】
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、例えば、２’－Ｏ－メチル（ｍｅｔｈｙｌ）のような２’－Ｏ－アルキル（ａｌｋｙｌ）、例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル（ｍｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ）のような２’－Ｏ－アルコキシアルキル（ａｌｋｏｘｙａｌｋｙｌ）、２’－アミノ（ａｍｉｎｏ）、２’－アリル（ａｌｌｙｌ）、２’－フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ）、２’－アラビノ（ａｒａｂｉｎｏ）－フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ）、例えば、２’－ＯＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨＣＨ３（ＮＭＡ）のような２’－Ｏ－Ｎ－置換アセトアミド、２’－Ｏ－ベンジル（ｂｅｎｚｙｌ）および２’－Ｏ－メチル（ｍｅｔｈｙｌ）－４－ピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）、４’－Ｏ－メチル（ｍｅｔｈｙｌ）、５’－メチル（ｍｅｔｈｙｌ）、５’－ビニル（ｖｉｎｙｌ）および５’－メトキシ（ｍｅｔｈｏｘｙ）からなる群より選択される１つ以上の置換体が導入された糖モイエティを含むものであってもよいが、これに限定しない。
【0062】
本発明の一具体例によるアンチセンス化合物は、選択的に置換または変形された糖モイエティを有する１つ以上の変形されたヌクレオシドを含むことができる。糖モイエティの変形は、前記アンチセンス化合物にヌクレアーゼ安定性、結合親和性やその他の有利な生物学的特性を付与する。前記天然ヌクレオシドの（ペント）フラノシル（（ｐｅｎｔｏ）ｆｕｒａｎｏｓｙｌ）糖環は、置換基の付加（特に、２’位）；ビサイクリック核酸（ＢＮＡ）を形成する２つの他のサイトの環原子の架橋；および４’－位の環酸素に－Ｓ－、－Ｎ（Ｒ）－または－Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）などの原子や基の置換を含む多様な方法で変形できるが、これに限定しない。変形された糖モイエティは、置換糖、特に、２’－Ｆ、２’－ＯＣＨ２（２’－ＯＭｅ）または２’－Ｏ（ＣＨ２）２－ＯＣＨ３（２’－Ｏ－メトキシエチルまたは２’－ＭＯＥ）置換基を有する２’－置換糖；および４’－（ＣＨ２）ｎ－Ｏ－２’（ｎ＝１またはｎ＝２）架橋を有するビサイクリック変形糖（ＢＮＡ）を含むが、これに限定しない。このような変形された糖の製造方法は当業界で公知である。変形された糖モイエティを含むヌクレオシドにおける塩基部分は、標的核酸と混成化するように維持できる。
【0063】
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、２’位において、Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、またはＮ－アルキニル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル；Ｏ－アルキル－Ｏ－アルキル－Ｎ（ジアルキル）；またはＯ－アルキル－カルボキシルアミドのうちの１つを含む（ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは置換もしくは非置換のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルである）。Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯ（ＣＨ２）ｎＮ［（ＣＨ２）ｍＣＨ３］２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（＝Ｏ）－ＮＨＣＨ３およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｍＣＨ３］２が特に好ましい（ここで、ｎとｍは０～約１０である）。その他の好ましい変形されたオリゴヌクレオチドは、２’位にＣ１～Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノまたはポリアルキルアミノ置換基のうちの１つを含むことができる。好ましくは、前記変形は、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られている２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＨｅＩｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６－５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含むことができ、前記変形は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ（すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られている（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基）、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ［すなわち、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られている２’－Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２－Ｎ（ＣＨ３）２基］を含むことができる。
【0064】
さらに他の好ましい変形は、２’－メトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’－アリル（２’－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｏ－アリル（２’－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ＝ＣＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）を含むことができる。２’－変形は、アラビノ（上部）位やリボ（下部）位であってもよい。好ましい２’－アラビノ変形は２’－Ｆであり、ヌクレオシドの他の位置（特に、３’末端ヌクレオシドの糖の３’位または５’末端ヌクレオシドの５’位）も類似して変形可能である。
【0065】
前記ビサイクリックまたはトリサイクリック糖モイエティは、例えば、ロック核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＬＮＡ）、コンストレインドエチルビサイクリック核酸（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ ｂｉｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ｃＥｔ）、２’－Ｏ，４’－Ｃ－エチレン－架橋型核酸（２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｅｔｈｙｌｅｎｅ－ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＥＮＡ）およびトリシクロ（ｔｒｉｃｙｃｌｏ）－ＤＮＡからなる群より選択されてもよいが、これに限定しない。
【0066】
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、６員環または非環モイエティを有する糖代用物を含むことができる。前記糖代用物は、例えば、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ｐｈｏｄｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅ ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｏｌｉｇｏｍｅｒ、ＰＭＯ）のようなモルホリノ環、シクロヘキセニル環、シクロヘキシル環および、例えば、ヘキシトール、アニトール、マンニトール、フルオルヘキシトールのようなテトラヒドロピラニル環からなる群より選択されてもよいが、これに限定しない。本発明によるアンチセンス化合物に導入されるヌクレオシドを変形するのに用いられるその他の多様な二環および三環糖置換環系は当業界で公知である。このような環系は多様な置換過程により活性が増進できる。
【0067】
また、前記糖代用物は、例えば、アンロック核酸（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＵＮＡ）またはペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＰＮＡ）のような非環モイエティであってもよいが、これに限定しない。
ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＰＮＡ）は、核塩基がリン酸結合ではないペプチド結合で連結された核酸類似体の一種で、ホスホジエステル結合がペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ）に代替されており、アデニン、チミン、グアニン、シトシンのような核塩基を有していて、特異的に核酸と混成化反応を起こすことができる。ＰＮＡは、自然界では発見されず、人工的に化学的な方法で合成され、相補的な塩基配列の核酸と混成化反応により二本鎖を形成することができる。また、ＰＮＡは、電気的に中性であるため、化学的に安定しているだけでなく、核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）やタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって分解されず生物学的にも安定しているという特徴を有している。ＰＮＡは、Ｎ－アミノエチルグリシン骨格が最も広く使用されるが、当業界において公知により、変形された骨格を有するＰＮＡも使用可能である（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ＰＮＡ”ｉｎ Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ（Ｅｄ．）“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”２ｎｄ Ｅｄ．Ｐａｇｅ９（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４））。
ペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＰＮＡ）は、核塩基がリン酸結合ではないペプチド結合で連結された核酸類似体の一種で、ホスホジエステル結合がペプチド結合（ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｏｎｄ）に代替されており、アデニン、チミン、グアニン、シトシンのような核塩基を有していて、特異的に核酸と混成化反応を起こすことができる。ＰＮＡは、自然界では発見されず、人工的に化学的な方法で合成され、相補的な塩基配列の核酸と混成化反応により二本鎖を形成することができる。また、ＰＮＡは、電気的に中性であるため、化学的に安定しているだけでなく、核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅａｓｅ）やタンパク質分解酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅ）によって分解されず生物学的にも安定しているという特徴を有している。ＰＮＡは、Ｎ－アミノエチルグリシン骨格が最も広く使用されるが、当業界において公知により、変形された骨格を有するＰＮＡも使用可能である（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ ａｎｄ Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ“Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ＰＮＡ”ｉｎ Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ（Ｅｄ．）“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”２ｎｄ Ｅｄ．Ｐａｇｅ９（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，２００４））。
【0068】
アンロック核酸（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＵＮＡ）は、リボース（ｒｉｂｏｓｅ）のＣ２’－Ｃ３’結合を有しない変形されたヌクレオシドであって、開放鎖構造によって立体的配置が拘束されず、オリゴヌクレオチドの柔軟性を調整することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド内にＵＮＡが含まれる場合、Ｔｍ値を５℃～１０℃程度低下させることができ、オフターゲットを減少させることができることが知られている。
【0069】
核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）の変形
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、シュードウリジン（ｐｓｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）、２’－チオウリジン（ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ）、Ｎ６’－メチルアデノシン（ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、５’－メチルシチジン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５’－フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ）－２－デオキシウリジン（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、Ｎ－エチルピペリジン７’－ＥＡＡトリアゾール変形アデニン（Ｎ－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ７’－ＥＡＡ ｔｒｉａｚｏｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｉｎｅ）、Ｎ－エチルピペリジン６’－トリアゾール変形アデニン（Ｎ－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ６’－ｔｒｉａｚｏｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｉｎｅ）、６’－フェニルピロロシトシン（６’－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２’，４’－ジフルオロトルイルリボヌクレオシド（２’，４’－ｄｉｆｌｕｏｒｏｔｏｌｕｙｌｒｉｂｏｎｕｌｅｏｓｉｄｅ）および５’－ニトロインドール（５’－ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ）からなる群より選択される１つ以上の変形された核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）を含む変形されたヌクレオシドであってもよい。
一具体例によれば、前記変形されたヌクレオシドは、シュードウリジン（ｐｓｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）、２’－チオウリジン（ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ）、Ｎ６’－メチルアデノシン（ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、５’－メチルシチジン（ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５’－フルオロ（ｆｌｕｏｒｏ）－２－デオキシウリジン（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、Ｎ－エチルピペリジン７’－ＥＡＡトリアゾール変形アデニン（Ｎ－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ７’－ＥＡＡ ｔｒｉａｚｏｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｉｎｅ）、Ｎ－エチルピペリジン６’－トリアゾール変形アデニン（Ｎ－ｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ ６’－ｔｒｉａｚｏｌ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｄｅｎｉｎｅ）、６’－フェニルピロロシトシン（６’－ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｒｏｌｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２’，４’－ジフルオロトルイルリボヌクレオシド（２’，４’－ｄｉｆｌｕｏｒｏｔｏｌｕｙｌｒｉｂｏｎｕｌｅｏｓｉｄｅ）および５’－ニトロインドール（５’－ｎｉｔｒｏｉｎｄｏｌｅ）からなる群より選択される１つ以上の変形された核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）を含む変形されたヌクレオシドであってもよい。
【0070】
変形されていない、または自然核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を意味する。
【0071】
前記変形されたヌクレオシドは、核塩基変形または置換も含むことができる。核塩基変形または置換は、構造的に区別される形態であるが、自然発生的または合成変形されていない核塩基と機能的に互いに交換可能である。自然発生核塩基と変形された核塩基は、水素結合に参加できる。このような核塩基変形は、前記アンチセンス化合物にヌクレアーゼ安定性、結合親和性またはその他の有利な生物学的特性を付与する。例えば、５－メチルシトシン置換のような特定の核塩基置換は、０．６－１．２℃まで核酸デュプレックス安定性を高めることが知られていて、標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合親和性を増進するのに特に有用である。
【0072】
例えば、前記変形された核塩基は、５’－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２’－アミノアデニン、アデニンとグアニンの６’－メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンとグアニンの２’－プロピルおよびその他のアルキル誘導体、２’－チオウラシル、２’－チオチミンおよび２’－チオシトシン、５’－ハロウラシルおよびシトシン、５’－プロピニル（－Ｃ≡Ｃ－ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６’－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５’－ウラシル（類似ウラシル）、４’－チオウラシル、８’－ハロ、８’－アミノ、８’－チオール、８’－チオアルキル、８’－ヒドロキシおよびその他の８’－置換されたアデニンおよびグアニン、５’－ハロ（特に、５’－ブロモ）、５’－トリフルオロメチルおよびその他の５’－置換されたウラシルおよびシトシン、７’－メチルグアニンおよび７’－メチルアデニン、２’－Ｆ－アデニン、２’－アミノアデニン、８’－アザグアニンおよび８’－アザアデニン、７’－デアザグアニンおよび７’－デアザアデニンおよび３’－デアザグアニンおよび３－デアザアデニン、フェノキサジンシチジン（ｌＨ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、フェノチアジンシチジン（ＩＨ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾチアジン－２（３Ｈ）－オン）などの三環ピリミジン、９－（２－アミノエトキシ）－Ｈ－ピリミド［５，４－ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン－２（３Ｈ）－オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ－ピリミド［４，５－ｂ］インドール－２－オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ－ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－２－オン）のような置換フェノキサジンシチジンなどのＧ－クランプを含むが、これに限定しない。
【0073】
また、異種環塩基基は、プリンやピリミジン塩基が他の異種環で置換される７’－デアザ－アデニン、７’－デアザグアノシン、２’－アミノピリジンおよび２’－ピリドンなどの異種環塩基基も含むことができる。前記アンチセンス化合物の結合親和性を高めるのに特に有用な核酸塩基は、例えば、５’－置換ピリミジン、６’－アザピリミジンおよび２’－アミノプロピルアデニン、５’－プロピニルウラシルおよび５’－プロピニルシトシンを含み、Ｎ－２、Ｎ－６およびＯ－６置換プリンを含むが、これに限定しない。これとともに、前記変形された核塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、文献［Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０，Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３］、および文献［Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ１５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３］に開示されている核塩基を含む。
【0074】
変形されたヌクレオシド間の連結基
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物において、変形されたヌクレオシド間の連結基は、ホスホトリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メシルホスホルアミデート（ｍｅｓｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）およびメトキシプロピル－ホスホネート（ｍｅｔｈｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）からなる群より選択される１つ以上の変形されたヌクレオシド間の連結基であってもよい。
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物において、変形されたヌクレオシド間の連結基は、ホスホトリエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、メシルホスホルアミデート（ｍｅｓｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）およびメトキシプロピル－ホスホネート（ｍｅｔｈｏｘｙｐｒｏｐｙｌ－ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）からなる群より選択される１つ以上の変形されたヌクレオシド間の連結基であってもよい。
【0075】
当業界において公知のように、ヌクレオシドは、核塩基と糖モイエティとの組み合わせである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖モイエティと共有結合するリン酸基をさらに含む。ペントフラシノル糖を含むヌクレオチドにおいて、リン酸基は、結合糖の２’、３’または５’ヒドロキシ基と結合できる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、互いに隣接するヌクレオシドと共有結合して線状重合体化合物を形成する。順次に、線状重合体構造の各末端も結合して円形構造を形成するが、開放型線状構造が一般的に好ましい。オリゴヌクレオチド構造において、リン酸基は、通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間の骨格を形成し、ＲＮＡとＤＮＡの自然発生的な結合や骨格は３’～５’ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合である。一具体例によるアンチセンス化合物は、自然発生的ヌクレオシド間結合以外に１つ以上の変形されたヌクレオシド間結合を含むことができるが、これは、細胞吸収増進、標的核酸親和性増進、ヌクレアーゼ存在下の安定性増加などの特性によって、自然発生的ヌクレオシド間結合を含むアンチセンス化合物よりよく選択される。
【0076】
本発明において用いられる好ましいアンチセンス化合物の一具体例としては、変形された骨格や非自然的ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドである。前記定義のように、変形された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格にリン原子を含むヌクレオチドと骨格にリン原子を含まないヌクレオチドを含む。これとともに、当業界で援用されるように、本明細書では、ヌクレオシド間の骨格にリン原子を含まない変形されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオチドであると解釈される。
【0077】
一具体例によるアンチセンス化合物においてヌクレオシド間の変形された結合は、リン酸を保有するヌクレオシド間結合だけでなく、リン酸を含まないヌクレオシド間結合を含むことができる。代表的なリン酸含有ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネート、５’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、それらの正常な３’－５’結合、２’－５’結合類似体を有する３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデート、メシルホスホルアミデート、チオノホスホアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホルトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェートを含むホスホアミデートおよび１つ以上のヌクレオチド間結合が３’－３’、５’－５’または２’－２’結合である反対の極性を有する化合物であってもよいが、これに限定しない。また、反対の極性を有するオリゴヌクレオチドは、３’－大部分のヌクレオチド間結合において単一の３’－３’結合、すなわち塩基消失部分であり得る１つの逆転されたヌクレオシド残部（核酸塩基が欠落し、その代わりにヒドロキシ基を有する）を含む。多様な塩、塩混合物遊離酸形態も含まれる。
【0078】
リンを含まない好ましい変形されたオリゴヌクレオチドの骨格は、単鎖アルキルやシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合異種原子とアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合や、１つ以上の単鎖異種原子または異種環ヌクレオシド間結合によって形成される骨格であってもよい。これらは、モルホリン結合（ヌクレオシドの糖部分から一部形成）を有する骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２混合成分要素を有する骨格を含むが、これに限定しない。このようなリン酸含有ヌクレオシド間結合とリン酸非含有ヌクレオシド間結合の製造方法は当業界で公知である。
【0079】
他の具体例において、前記アンチセンス化合物は、５’末端のヒドロキシ基を５’－（Ｅ）－ビニルホスホネート（ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、５’－メチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、（Ｓ）－５’－Ｃ－メチルウィズホスフェート（ｍｅｔｈｙｌ ｗｉｔｈ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）および５’－ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）からなる群より選択される１つで置換することができる。このように変形されたアンチセンス化合物は、ＲＮＡ－誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によくロードされて一本鎖の短い干渉ＲＮＡ（ｓｓ ｓｉＲＮＡ）または二本鎖の短い干渉ＲＮＡ（ｄｓ ｓｉＲＮＡ）として作動することが知られている。
【0080】
アンチセンス化合物モチーフ
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、Ｌｘ－Ｄｙ－Ｌｚの形態のキメリック（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）形態を有するもので、Ｌは変形されたヌクレオシドであってもよい。ここで、ＤはＤＮＡであり、ｘおよびｚは１～７の任意の整数であって、同一でも異なっていてもよく、ｙは５～２５の任意の整数である。好ましくは、前記ｘおよびｚは１～５の任意の整数であり、ｙは７～２４の任意の整数であってもよいし、さらに好ましくは、前記ｘおよびｚは３～５の任意の整数であり、ｙは８～２３の任意の整数であってもよい。少なくともＤ領域と最も隣接したＬ領域の糖モイエティは変形されたもので、Ｌ領域とＤ領域との境界が定義される。また、前記すべての領域（Ｌ領域およびＤ領域）において各ヌクレオシド間の連結基は、ホスホジエステルまたは前述の変形されたヌクレオシド間の連結基（例えば、ホスホロチオエート）が１つ以上含まれ、前記ヌクレオシド内の核塩基も、天然核塩基または前述の変形された核塩基を１つ以上含むことができる。
一具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、Ｌｘ－Ｄｙ－Ｌｚの形態のキメリック（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）形態を有するもので、Ｌは変形されたヌクレオシドであってもよい。ここで、ＤはＤＮＡであり、ｘおよびｚは１～７の任意の整数であって、同一でも異なっていてもよく、ｙは５～２５の任意の整数である。好ましくは、前記ｘおよびｚは１～５の任意の整数であり、ｙは７～２４の任意の整数であってもよいし、さらに好ましくは、前記ｘおよびｚは３～５の任意の整数であり、ｙは８～２３の任意の整数であってもよい。少なくともＤ領域と最も隣接したＬ領域の糖モイエティは変形されたもので、Ｌ領域とＤ領域との境界が定義される。また、前記すべての領域（Ｌ領域およびＤ領域）において各ヌクレオシド間の連結基は、ホスホジエステルまたは前述の変形されたヌクレオシド間の連結基（例えば、ホスホロチオエート）が１つ以上含まれ、前記ヌクレオシド内の核塩基も、天然核塩基または前述の変形された核塩基を１つ以上含むことができる。
【0081】
一具体例によれば、前記変形されたオリゴヌクレオチドは、連結されたデオキシヌクレオシドからなるギャップセグメント、連結されたヌクレオシドからなる５’ウィングセグメント、および連結されたヌクレオシドからなる３’ウィングセグメントを含むものであり、前記ギャップセグメントは、５’ウィングセグメントおよび３’ウィングセグメントの間に位置し、それぞれのウィングセグメントのヌクレオシドは、変形された糖モイエティまたは糖代用物を含むことができる。
【0082】
キメラアンチセンス化合物は、典型的にヌクレアーゼ耐分解性増加、細胞吸収増加、標的核酸に対する結合親和性増加および／または阻害活性増加を付与するように変形された少なくとも１つの領域を含むことができる。キメラアンチセンス化合物は、２以上のオリゴヌクレオチドまたは変形されたオリゴヌクレオチドの混成構造に形成される。このような化合物はまた、当業界においてハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）またはギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）と称され、ギャップマー構造の製造については、米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；および第５，７００，９２２号に開示されている。
【0083】
ギャップマーにおいて、ＲＮａｓｅＨ切断を支援する多数のヌクレオチドを有する内部領域は、内部領域のヌクレオシドと化学的に異なる多数のヌクレオシドを有する外部領域との間に位置する。ギャップマーモチーフを有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合、ギャップ（ｇａｐ）セグメント（本明細書のアンチセンス化合物においてＤ領域）は、標的核酸の分割を支援するのに対し、ウィング（ｗｉｎｇ）セグメント（本明細書のアンチセンス化合物においてＬ領域）は、安定性、親和性およびエキソヌクレアーゼ耐性を向上させるための変形されたヌクレオシドを含む変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。必要によっては、前記ギャップセグメントも、変形されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。前記変形されたオリゴヌクレオチドは、１つ以上の変形されたヌクレオシド間の連結基、変形された糖モイエティを含む１つ以上の変形されたヌクレオシドおよび変形された核塩基を含む１つ以上の変形されたヌクレオシドから選択される１つ以上の変形を含むことができ、それぞれの変形については前述した通りである。
【0084】
好ましくは、ギャップマーにおいて異なる各領域は、均一な糖モイエティを含むことができる。また、異なる各領域は、互いに異なる糖モイエティでその境界が区分されるが、各領域内の糖モイエティは、非－変形ヌクレオチドおよび変形ヌクレオチドから自由に選択されるミックスマー（ｍｉｘｍｅｒ）形態になってもよい。本発明の一具体例によれば、このようなウィングセグメント－ギャップセグメント－ウィングセグメントモチーフは、Ｌｘ－Ｄｙ－Ｌｚのような形態で表現される（ここで、ｘは５’ウィングセグメントの長さを示し、ｙはギャップセグメントの長さを示し、ｚは３’ウィングセグメントの長さを示す）。一具体例によるアンチセンス化合物は、ギャップマーモチーフを有することができる。一具体例によるアンチセンス化合物において、ｘ、ｙ、ｚは、例えば、５－１０－５、３－１０－３、１－１２－１、２－１０－３、３－９－４、３－８－３、１－９－２、２－１３－５、４－８－４、４－１２－３、４－１２－４、３－１４－３、２－１６－２、１－１８－１、２－１０－２、１－１０－１または２－８－２を含むが、これに限定しない。他の具体例によれば、前記アンチセンス化合物は、ウィングセグメント－ギャップセグメントまたはギャップセグメント－ウィングセグメント構造、すなわち、前記ｘまたはｚが０の場合、「ウィングマー」（ｗｉｎｇｍｅｒ）モチーフを有することができる。前記ウィングマー構造は、例えば、１０－１０、８－１０、５－１０、８－４、４－１２、１２－４、３－１４、１６－２、１８－１、１０－３、２－１０、１－１０または８－２を含むが、これに限定しない。
【0085】
一具体例において、前記アンチセンス化合物の３’ウィングセグメントの特徴および５’ウィングセグメントの特徴は独立して選択可能である。また、前記具体例において、５’ウィングセグメントのモノマーの数字（前記Ｌｘにおいてｘ）および３’ウィングセグメントのモノマー（前記Ｌｚにおいてｚ）の数字は同一でも異なっていてもよい。また、５’ウィングセグメントの変形（存在すれば）は３’ウィングセグメントの変形（存在すれば）と同一であるか、前記変形（存在すれば）は異なっていてもよく、５’ウィングセグメントのモノメリック連結および３’ウィングセグメントのモノメリック連結は同一でも異なっていてもよい。すなわち、全領域が均一に変形されるべきではなく、前記変形の１つ以上がアンチセンスオリゴヌクレオチド内部の１つ以上のヌクレオチドに導入される。
【0086】
接合体
本発明の一態様は、１つ以上の非－ヌクレオチドモイエティに、前記アンチセンス化合物が共有結合した接合体を提供し、一具体例によれば、前記非－ヌクレオチドモイエティは、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、重合体、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
本発明の一態様は、１つ以上の非－ヌクレオチドモイエティに、前記アンチセンス化合物が共有結合した接合体を提供し、一具体例によれば、前記非－ヌクレオチドモイエティは、タンパク質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、重合体、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【0087】
本明細書において、「接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」は、非－ヌクレオチドモイエティ（接合体モイエティまたは領域Ｃまたは第３領域）に共有連結されたアンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを意味する。このような接合は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞吸収または安定性に影響を及ぼしてアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬理学を改善させることができる。一具体例によれば、前記非－ヌクレオチドモイエティは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞分布、生体利用率、代謝、排泄、透過性、および／または細胞吸収を改善させてアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を変形させるたり向上させることができる。また、前記非－ヌクレオチドモイエティは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを特異的器官、組織または細胞類型に標的化し、それによってその器官、組織または細胞類型においてアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を向上させることができる。これとともに、前記非－ヌクレオチドモイエティは、非－標的細胞類型、組織または器官でのアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性、例えば、オフターゲット活性または非－標的細胞類型、組織または器官での活性を減少させることができる。国際特許公報ＷＯ９３／０７８８３およびＷＯ２０１３／０３３２３０は、好適な非－ヌクレオチドモイエティを開示する。
【0088】
一具体例によれば、前記非－ヌクレオチドモイエティは、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、ビタミンモイエティ、ポリエチレングリコール、チオエーテル、ポリエーテル、コレステロール、コール酸モイエティ、フォレート、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アダマンタン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、蛍光団および染料を含むが、これに限定されない。
【0089】
一具体例によれば、前記非－ヌクレオチドモイエティは、活性薬物物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、ケトプロフェン、カルプロフェン、ジアゼピン、抗菌剤、抗生剤を含むことができる。
【0090】
一具体例によれば、前記非－ヌクレオチドモイエティは、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）をさらに含むことができる。
【0091】
一具体例によれば、前記非－ヌクレオチドモイエティは、前記アンチセンス化合物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に連結される。
【0092】
一具体例によれば、前記非－ヌクレオチドモイエティは、少なくとも１個～３個のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含むことができる。
【0093】
剤形
オリゴヌクレオチドの使用を容易にするために、例えば、分解を最小化したり、伝達および／または吸収を容易にしたり、または剤形においてオリゴヌクレオチドに対して他の有益な性質を提供する剤形を用いてオリゴヌクレオチドを対象体または細胞環境に伝達できる多様な剤形が開発された。
オリゴヌクレオチドの使用を容易にするために、例えば、分解を最小化したり、伝達および／または吸収を容易にしたり、または剤形においてオリゴヌクレオチドに対して他の有益な性質を提供する剤形を用いてオリゴヌクレオチドを対象体または細胞環境に伝達できる多様な剤形が開発された。
【0094】
一具体例において、ＷＦＤＣ２の発現を減少させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的細胞の直面した環境でまたは全身で対象に投与される時、オリゴヌクレオチドの十分な部分が細胞に入ってＷＦＤＣ２の発現を減少させるように好適に剤形化される。一具体例によれば、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、緩衝剤溶液、例えば、リン酸塩緩衝食塩水溶液、リポソーム、ミセル構造体またはカプシドの形態に剤形化される。また、ネイキッド（ｎａｋｅｄ）オリゴヌクレオチドまたはその接合体は、水または水性溶液（例えば、ｐＨが調整された水）または塩基性緩衝水性溶液（例えば、ＰＢＳ）内で剤形化される。
【0095】
一具体例によれば、陽イオン性脂質を有するオリゴヌクレオチドの剤形を用いてオリゴヌクレオチドが細胞に導入されることを容易にできる。例えば、陽イオン性脂質、例えば、リポフェクション、陽イオン性グリセロール誘導体、および多価陽イオン性分子（例えば、ポリリジン）を用いることができ、好適な脂質には、オリゴフェクタミン、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮＣ３８８（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、またはフュージェン（（ＦｕＧｅｎｅ）６（Ｒｏｃｈｅ））が含まれ、これはすべて製造業者のプロトコルによって使用可能である。このような剤形には脂質ナノ粒子を含むことができる。
【0096】
また、前記剤形は、賦形剤を含むことができる。賦形剤は、リポソーム、脂質、脂質複合体、微細球、微細粒子、ナノ球、またはナノ粒子を含むか、またはそれを必要とする対象体の細胞、組織、器官または身体に投与するために異なって剤形化されてもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１３参照）。賦形剤は、組成物に活性成分の改善された安定性、改善された吸収、改善された可溶性および／または治療的増強を付与する。また、賦形剤は、緩衝剤（例えば、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス塩基、または水酸化ナトリウム）またはビヒクル（例えば、緩衝溶液、ワセリン、ジメチルスルホキシド、または鉱油）であってもよい。
【0097】
一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、その保管寿命を延ばすために、凍結乾燥した後、使用する前に溶液に作ることができる。したがって、本発明によるアンチセンス化合物をなしているオリゴヌクレオチドを含む組成物中の賦形剤は、凍結乾燥保護剤（例えば、マンニトール、ラクトース、ポリエチレングリコール、またはポリビニルピロリドン）、または崩壊温度調整剤（例えば、デキストラン、ピコールまたはゼラチン）が使用できる。
【0098】
注射用途に適した薬学的組成物は、滅菌注射溶液または分散液のその場製造のために滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌粉末を含むことができる。静脈内または皮下投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、クレモフォール（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ．ＴＭ．（ＢＡＳＦ）またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。また、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒質であってもよい。様々な場合に、組成物中に等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトール、ソルビトール）および塩化ナトリウムを含むことが好ましい。滅菌性注射溶液は、選択された溶媒中に必要な量のオリゴヌクレオチドを、必要に応じて前記列挙された成分のうちの１つまたはそれらの組み合わせとともに導入させた後に、滅菌濾過させることによって製造される。前記薬学的組成物は、少なくとも約０．１％の治療剤（例えば、ＷＦＤＣ２の発現を減少させるためのアンチセンスオリゴヌクレオチド）またはそれ以上の用量を含むことができるが、活性成分の百分率は、組成物の総重量または体積の約１％～約８０％であることが好ましい。これは、可溶性、生体利用率、生物学的半減期、投与経路、製品保管寿命だけでなく、他の薬理学的考慮事項のような因子が剤形の製造に考慮されるであろう。
【0099】
治療疾患および方法
本発明によるアンチセンス化合物またはこれを含む接合体は、癌の予防または治療用薬学的組成物であって、癌治療剤として使用可能である。「癌（ｃａｎｃｅｒ）」とは、正常なアポトーシスの均衡が崩れる場合、細胞が過剰増殖し、周辺組織に浸潤しうる特徴を有する疾病群を意味する。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本発明による薬学的組成物の投与によって癌に対する症状が好転、改善されたり、有利に変更されるすべての行為を意味する。
本発明によるアンチセンス化合物またはこれを含む接合体は、癌の予防または治療用薬学的組成物であって、癌治療剤として使用可能である。「癌（ｃａｎｃｅｒ）」とは、正常なアポトーシスの均衡が崩れる場合、細胞が過剰増殖し、周辺組織に浸潤しうる特徴を有する疾病群を意味する。「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本発明による薬学的組成物の投与によって癌に対する症状が好転、改善されたり、有利に変更されるすべての行為を意味する。
【0100】
一具体例によれば、前記癌は、胃癌、食道癌、卵巣癌、頭頸部癌、脳腫瘍、甲状腺癌、肺癌、喉頭癌、大腸／直腸癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、膀胱癌、膵臓癌、乳癌、子宮癌、子宮頸癌、前立腺癌、腎臓癌、皮膚癌などの上皮細胞などに由来する癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、骨癌、筋肉癌、脂肪癌、線維細胞癌などの結合組織細胞に由来する肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの造血細胞に由来する血液癌、神経組織に発生する腫瘍からなる群より選択された１種以上であってもよい。好ましくは、前記癌は、固形癌であってもよい。
【0101】
本発明による薬学的組成物を用いた治療方法は、対象に組成物の有効量、すなわち、好ましい治療結果を生成できる量を投与することを伴う。治療的に許容可能な量は、疾患を治療できる適切な用量であることが好ましく、これは、対象の大きさ、身体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物中の活性成分、投与時間および経路、全般的な健康、および同時に投与される他の薬物を含めた特定の因子によって左右できる。本発明による組成物の投与は、例えば、経口（例えば、胃供給管、十二指腸供給管、胃瘻形成術または直腸）または非経口（例えば、皮下注射、静脈内注射または注入、動脈内注射または注入、筋肉内注射）、局所（例えば、表皮、吸入、点眼または粘膜）、または標的器官（例えば、対象体の肝）に直接注射によって投与可能である。好ましくは、本発明によるアンチセンス化合物は、静脈内にまたは皮下に投与することができ、０．１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの範囲、または０．５ｍｇ／ｋｇ～５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与可能である。一部の具体例において、治療対象は、ヒトまたは非－ヒト霊長類または他の哺乳類対象体であることが好ましいが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、マウス、ラット、モルモットまたはハムスターが含まれてもよい。
【0102】
併用治療
本発明の一具体例によれば、前記薬学的組成物は、１つ以上の他の薬剤とともに投与可能である。一具体例によれば、前記１つ以上の他の薬剤は、本発明の治療対象と同一の疾患や病態を治療するように設計可能である。あるいは、前記１つ以上の他の薬剤は、１つ以上の本発明の薬学的組成物の望まない効果を治療するように設計されたり、他の治療剤の望まない効果を治療する他の薬剤とともに投与可能である。
本発明の一具体例によれば、前記薬学的組成物は、１つ以上の他の薬剤とともに投与可能である。一具体例によれば、前記１つ以上の他の薬剤は、本発明の治療対象と同一の疾患や病態を治療するように設計可能である。あるいは、前記１つ以上の他の薬剤は、１つ以上の本発明の薬学的組成物の望まない効果を治療するように設計されたり、他の治療剤の望まない効果を治療する他の薬剤とともに投与可能である。
【0103】
一具体例によれば、本発明の薬学的組成物は、１つ以上の他の薬剤と同時に投与されたり、異なる時点で投与されてもよい。これとともに、本発明の薬学的組成物と１つ以上の他の薬剤は、１つの剤形に一緒に製造されたり、別に製造されてもよい。
【0104】
一具体例によれば、本発明の薬学的組成物とともに投与される薬剤は、治療効果を増進して、優れた治療効果、すなわち、シナジー効果をもたらすことができる。言い換えれば、本発明は、アンチセンス化合物および非－アンチセンスメカニズムによって作用する１つ以上の薬剤を含む薬学的組成物を提供することができる。前記薬剤は、化学治療剤であってもよいし、前記化学治療剤は、例えば、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノサイド、ビス－クロロエチルニトロソウレア、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソウレア、窒素マスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、シタラビン、５－アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４－ヒドロキシフェノキシシクロホスホル－アミド、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、５－フルオロデオキシウリジン（５－ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ－１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンまたはジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）であってもよいが、これに限定しない。前記化学治療剤を本発明のアンチセンス化合物とともに用いる場合、これらは個別的に（例えば、５－ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、順次に（例えば、一定期間５－ＦＵおよびオリゴヌクレオチドの使用後、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）、または１つ以上の他の化学治療剤（例えば、５－ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、または５－ＦＵ、放射線治療およびオリゴヌクレオチド）と併用して使用可能である。抗炎剤（非ステロイド抗炎剤およびコルチコステロイドを含むが、これに限定しない）、抗ウイルス剤（リバビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含むが、これに限定しない）も、本発明の組成物に混合できる。
【実施例】
【0105】
以下、１つ以上の具体例を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は１つ以上の具体例を例として説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【0106】
実験方法
１．細胞培養
ヒト由来の胃癌細胞株ＳＮＵ６３８、膠芽腫細胞株ＳＦ２６８を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（＃ＳＨ３００８４．０３ＨＩ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％（ｖ／ｖ）抗生剤（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、＃ＬＳ２０２－０２、Ｗｅｌｇｅｎｅ）溶液が含まれているＲＰＭ１－１６４０（＃Ｓｈ３００２７．０１、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を培地として二酸化炭素濃度５％（ｖ／ｖ）、３７℃の培養器内で培養した。
１．細胞培養
ヒト由来の胃癌細胞株ＳＮＵ６３８、膠芽腫細胞株ＳＦ２６８を１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（＃ＳＨ３００８４．０３ＨＩ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％（ｖ／ｖ）抗生剤（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、＃ＬＳ２０２－０２、Ｗｅｌｇｅｎｅ）溶液が含まれているＲＰＭ１－１６４０（＃Ｓｈ３００２７．０１、Ｈｙｃｌｏｎｅ）を培地として二酸化炭素濃度５％（ｖ／ｖ）、３７℃の培養器内で培養した。
【0107】
膵臓癌上皮性組織に由来するＰＡＮＣ－１細胞株は１０％ＦＢＳ、１％抗生剤（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、＃ＬＳ２０２－０２、Ｗｅｌｇｅｎｅ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地に３７℃の二酸化炭素濃度５％（ｖ／ｖ）の条件で培養した。継代培養は４日ごとに進行させ、形質転換実験に使用される細胞は５～１０回以内の継代培養を経た細胞のみを使用した。
【0108】
２．アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）の作製
本実施例で使用されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ＷＦＤＣ２のｐｒｅ－ｍＲＮＡ（配列番号１）またはｍＲＮＡ（配列番号２）での多様な領域を標的化するようにデザインし、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで注文作製したり、自動化されたＤＮＡ合成器（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ＭｅｒＭａｄｅ１２）または自動化されたペプチド合成器（Ｂｉｏｔａｇｅ ｍｏｄｅｌ Ｓｙｒｏ１）でＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ－ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）固体状支持体に結合しているユニバーザルリンカー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｌｉｎｋｅｒ）に、下記表１のように標準化されたｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｃｙｃｌｅを繰り返し適用して合成した。
本実施例で使用されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、ＷＦＤＣ２のｐｒｅ－ｍＲＮＡ（配列番号１）またはｍＲＮＡ（配列番号２）での多様な領域を標的化するようにデザインし、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで注文作製したり、自動化されたＤＮＡ合成器（ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ＭｅｒＭａｄｅ１２）または自動化されたペプチド合成器（Ｂｉｏｔａｇｅ ｍｏｄｅｌ Ｓｙｒｏ１）でＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ－ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ（ＣＰＧ）固体状支持体に結合しているユニバーザルリンカー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｌｉｎｋｅｒ）に、下記表１のように標準化されたｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｃｙｃｌｅを繰り返し適用して合成した。
【0109】
【表1】
【0110】
ホスホロチオエートリンカーのためには、前記表１のＯｘｉｄａｔｉｏｎ段階の代わりに、３－［（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ－ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ）ａｍｉｎｏ］－３Ｈ－１，２，４－ｄｉｔｈｉａｚｏｌｅ－３－ｔｈｉｏｎｅ（ＤＤＴＴ）の０．１Ｍピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）溶液または０．０５Ｍピリジン－アセトニトリル（Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）１：１の溶液を使用した。
【0111】
オリゴヌクレオチド合成が終結すれば、濃縮されたアンモニア溶液を入れて、６０℃で１２～１８時間反応させて、ＣＰＧＦで切断させ、同時に保護グループ（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）をすべて除去した。以後、ＣＰＧを濾過して除去し、アンモニアを適切に濃縮させた後、残留物をセファデックス（ＳｅｐｈｄｅｘモデルＧ－２５）レジンに濾過して脱塩させ、凍結乾燥してすぐに使用したり、分取高性能液体クロマトグラフィー（ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣ）を用いて精製した後、０．３Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）または酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）溶液から２－３倍の容量の冷却されたエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）に沈殿させて使用した。
【0112】
合成－精製されたオリゴヌクレオチドは分析用高性能液体クロマトグラフィー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＨＰＬＣ）で分析して純度が８０％以上であることを確認し、紫外線－可視光線分光器（ＵＶ－ＶＩＳ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で２６０ｎｍの波長での吸光度を測定して定量した後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦまたはＱ－ＴＯＦ質量分析器によりオリゴヌクレオチドの分子量を確認した後、使用した。
【0113】
３．定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によるＡＳＯを投与した細胞のＷＦＤＣ２ ｍＲＮＡの発現量の分析
形質転換１日前に５～１０回以内の継代培養を経た細胞を９ｃｍ２（６ｗｅｌｌ）の培養皿（＃３００６、ＳＰＬ）に０．２５×１０６ｃｅｌｌだけ細胞を培養した。翌日、９ｃｍ２（６ｗｅｌｌ）の培養皿の面積の約８０％程度細胞が増殖したことを確認した後、形質転換実験を進行させた。形質転換試薬としてはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（＃Ｌ３０００００８、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用した。培養溶液をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（＃Ａ３６３５１０１、Ｇｉｐｃｏ）に入れ替え、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて、製造会社に提供するプロトコルに基づいて０ｎＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）～１００ｎＭのＡＳＯをそれぞれ２４時間処理後、細胞を分析した。
形質転換１日前に５～１０回以内の継代培養を経た細胞を９ｃｍ２（６ｗｅｌｌ）の培養皿（＃３００６、ＳＰＬ）に０．２５×１０６ｃｅｌｌだけ細胞を培養した。翌日、９ｃｍ２（６ｗｅｌｌ）の培養皿の面積の約８０％程度細胞が増殖したことを確認した後、形質転換実験を進行させた。形質転換試薬としてはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（＃Ｌ３０００００８、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用した。培養溶液をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（＃Ａ３６３５１０１、Ｇｉｐｃｏ）に入れ替え、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて、製造会社に提供するプロトコルに基づいて０ｎＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）～１００ｎＭのＡＳＯをそれぞれ２４時間処理後、細胞を分析した。
【0114】
形質転換後、培養皿から培地を除去した後、ＰＢＳ（＃ＭＬ００８－０１、Ｗｅｌｇｅｎｅ）で２回洗浄した。その後、ＴＲＩｚｏｌ（＃１５５９６０１８、Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、製造会社のプロトコルによって細胞からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを鋳型としてＩｍＰｒｏｍ－ＩＩＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（＃Ａ３８００、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造会社のプロトコルによってｃＤＮＡを合成した。以後、合成されたｃＤＮＡと表２のプライマーおよびＴＢ Ｇｒｅｅｎ○Ｒ Ｆａｓｔ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（＃ＲＲ４３０、Ｔａｋａｒａ）を用いて、製造会社のプロトコルによってｑＲＴ－ＰＣＲを進行させた。分析用機械はＳｔｅｐＯｎｅＴＭ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（＃４３７６３５７、Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ｑＲＴ－ＰＣＲの結果に基づいて、０ｎＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）対比、ＡＳＯ処理群のＷＦＤＣ２の発現量をパーセントに換算した。
【0115】
【表2】
【0116】
４．Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）によるＡＳＯを投与した細胞のＷＦＤＣ２タンパク質の発現量の分析
形質転換１日前に５～１０回以内の継代培養を経た細胞を１．９ｃｍ２（２４ｗｅｌｌ）の培養皿（＃３００２４、ＳＰＬ）に５．０×１０４ｃｅｌｌだけ細胞を培養した。翌日、１．９ｃｍ２（２４ｗｅｌｌ）の培養皿の面積の約８０％程度細胞が増殖したことを確認した後、形質転換実験を進行させた。形質転換試薬としてはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（＃Ｌ３０００００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。培養溶液をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（＃Ａ３６３５１０１、Ｇｉｐｃｏ）に入れ替え、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて、製造会社に提供するプロトコルに基づいて０ｎＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）～４００ｎＭのＡＳＯをそれぞれ４８時間処理した。４８時間後、細胞培養液を１．５ｍｌマイクロチューブ（ＭＣＴ－１５０－Ｃ、ＡＸＹＧＥＮ）に収集して、４℃の状態の遠心分離機で２０分間１，０００ｒｐｍの速度で細胞培養液中に含まれている残留物を沈めた後、上層液のみ１．５ｍｌマイクロチューブに収集して－８０℃の超低温冷凍庫にサンプルを保管した。
形質転換１日前に５～１０回以内の継代培養を経た細胞を１．９ｃｍ２（２４ｗｅｌｌ）の培養皿（＃３００２４、ＳＰＬ）に５．０×１０４ｃｅｌｌだけ細胞を培養した。翌日、１．９ｃｍ２（２４ｗｅｌｌ）の培養皿の面積の約８０％程度細胞が増殖したことを確認した後、形質転換実験を進行させた。形質転換試薬としてはｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（＃Ｌ３０００００８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。培養溶液をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（＃Ａ３６３５１０１、Ｇｉｐｃｏ）に入れ替え、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を用いて、製造会社に提供するプロトコルに基づいて０ｎＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）～４００ｎＭのＡＳＯをそれぞれ４８時間処理した。４８時間後、細胞培養液を１．５ｍｌマイクロチューブ（ＭＣＴ－１５０－Ｃ、ＡＸＹＧＥＮ）に収集して、４℃の状態の遠心分離機で２０分間１，０００ｒｐｍの速度で細胞培養液中に含まれている残留物を沈めた後、上層液のみ１．５ｍｌマイクロチューブに収集して－８０℃の超低温冷凍庫にサンプルを保管した。
【0117】
ＷＦＤＣ２に対するＤｕｏｓｅｔ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（ＤＹ６２７４－０５、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いて、製造会社に提供する次のようなプロトコルによってＷＦＤＣ２の濃度を測定した。Ｈｕｍａｎ ＷＦＤＣ２ ｃａｐｔｕｒｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（＃８４４３４７、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）をＰＢＳで希釈させた後、９６ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｔｅ（＃ＤＹ９９０、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）に分注して、常温で３０分間反応させた後、４℃の冷蔵庫に１日間保管した。以後、９６ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｔｅにＲｅａｇｅｎｔ ｄｉｌｕｅｎｔ（＃ＤＹ９９５、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）で２倍希釈された前記細胞培養液１００μｌまたはＷＦＤＣ２組換えタンパク質標準溶液１００μｌを分注して、常温で２時間反応させた。そして、それぞれの９６ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｔｅにＲｅａｇｅｎｔ ｄｉｌｕｅｎｔで希釈したビオチン化されたＨｕｍａｎ ＷＦＤＣ２ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ（＃８４４３４８、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）を分注して、常温で２時間反応させた後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ溶液（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ、＃８９３９７５、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）１００μｌを分注後、常温で２０分間反応させた。以後、それぞれの９６ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏ－ｐｌａｔｅにＴｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ溶液（Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、＃ＤＹ９９９、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）１００μｌを分注して７分間反応させた後、２Ｎ濃度の硫酸溶液５０μｌを分注して反応を抑制させ、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを用いて４５０ｎｍの波長での吸光度を測定した。各試料内のＷＦＤＣ２の濃度は、知られた濃度のＷＦＤＣ２組換えタンパク質標準溶液の吸光度から作った標準曲線に測定された各試料の吸光度を代入して計算した。陰性対照群に比べてＷＦＤＣ２生成抑制率を次の式のように計算した。
【0118】
【数1】
【0119】
５．ＳＮＵ６３８ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルを用いたＡＳＯの癌増殖抑制効果の確認
前記実施例で述べた細胞培養条件で育ったＳＮＵ６３８細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（＃３５４２３０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）／ＰＢＳ（＃ＭＬ００８－０１、Ｗｅｌｇｅｎｅ）１：１溶液に浮遊させた後、呼吸麻酔させた８週齢Ｍａｌｅ ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｓｃｉｄ／ＮＣｒＫｏａｔ）に３×１０６ｃｅｌｌだけ注入した。以後、癌細胞定着、増殖のために、注入後３週間モニタリングした。癌細胞移植３週後、尾静脈注射（ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）経路（ＩＶ群）と皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）経路（ＳＣ群）を通して７．５ｍｐｋ、３０ｍｐｋ濃度の化合物３を週２回４週間注射（計８回）した。ＩＶ７．５ｍｐｋ群、ＩＶ３０ｍｐｋ群、ＳＣ７．５ｍｐｋ群、ＳＣ３０ｍｐｋ群のＮ数は各８匹であり、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）は５匹であった。２８日間バーニアキャリパーを用いて癌細胞のサイズ（ｍｍ３）を測定して、ＡＳＯによる癌増殖抑制効果を確認した。
前記実施例で述べた細胞培養条件で育ったＳＮＵ６３８細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（＃３５４２３０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）／ＰＢＳ（＃ＭＬ００８－０１、Ｗｅｌｇｅｎｅ）１：１溶液に浮遊させた後、呼吸麻酔させた８週齢Ｍａｌｅ ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｓｃｉｄ／ＮＣｒＫｏａｔ）に３×１０６ｃｅｌｌだけ注入した。以後、癌細胞定着、増殖のために、注入後３週間モニタリングした。癌細胞移植３週後、尾静脈注射（ｔａｉｌ ｖｅｉｎ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）経路（ＩＶ群）と皮下注射（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）経路（ＳＣ群）を通して７．５ｍｐｋ、３０ｍｐｋ濃度の化合物３を週２回４週間注射（計８回）した。ＩＶ７．５ｍｐｋ群、ＩＶ３０ｍｐｋ群、ＳＣ７．５ｍｐｋ群、ＳＣ３０ｍｐｋ群のＮ数は各８匹であり、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）は５匹であった。２８日間バーニアキャリパーを用いて癌細胞のサイズ（ｍｍ３）を測定して、ＡＳＯによる癌増殖抑制効果を確認した。
【0120】
６．ＳＦ２６８ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルを用いたＡＳＯの癌増殖抑制効果の確認
前記実施例で述べた細胞培養条件で育ったＳＦ２６８細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（＃３５４２３０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）／ＰＢＳ（＃ＭＬ００８－０１、Ｗｅｌｇｅｎｅ）１：１溶液に浮遊させた後、呼吸麻酔させた８週齢Ｍａｌｅ ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｓｃｉｄ／ＮＣｒＫｏａｔ）に５×１０６ｃｅｌｌだけ注入した。以後、癌細胞定着、増殖のために、注入後３週間モニタリングした。癌細胞移植３週後、尾静脈注射経路（ＩＶ群）を通して２０ｍｐｋの化合物３を週３回４週間注射（計１２回）した。ＩＶ２０ｍｐｋ群のＮ数は８匹であり、対照群は４匹であった。２４日間バーニアキャリパーを用いて癌細胞のサイズ（ｍｍ３）を測定して、ＡＳＯによる癌増殖抑制効果を確認した。
前記実施例で述べた細胞培養条件で育ったＳＦ２６８細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（＃３５４２３０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）／ＰＢＳ（＃ＭＬ００８－０１、Ｗｅｌｇｅｎｅ）１：１溶液に浮遊させた後、呼吸麻酔させた８週齢Ｍａｌｅ ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃｓｓｃｉｄ／ＮＣｒＫｏａｔ）に５×１０６ｃｅｌｌだけ注入した。以後、癌細胞定着、増殖のために、注入後３週間モニタリングした。癌細胞移植３週後、尾静脈注射経路（ＩＶ群）を通して２０ｍｐｋの化合物３を週３回４週間注射（計１２回）した。ＩＶ２０ｍｐｋ群のＮ数は８匹であり、対照群は４匹であった。２４日間バーニアキャリパーを用いて癌細胞のサイズ（ｍｍ３）を測定して、ＡＳＯによる癌増殖抑制効果を確認した。
【0121】
７．統計的分析
すべての統計的分析はＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ９．０．０により行われ、有意性の検証はＴｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｔｅｓｔで進行させ、統計的有意性を示す値は＊、＊＊、＊＊＊で記載した。＊はＰ≦０．０５、＊＊はＰ≦０．０１、＊＊＊はＰ≦０．００１を示す。
すべての統計的分析はＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍ９．０．０により行われ、有意性の検証はＴｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｔｅｓｔで進行させ、統計的有意性を示す値は＊、＊＊、＊＊＊で記載した。＊はＰ≦０．０５、＊＊はＰ≦０．０１、＊＊＊はＰ≦０．００１を示す。
【0122】
実験結果
１．ＡＳＯの製造結果
前記実験方法のアンチセンスオリゴヌクレオチドの作製方法により、５’および３’ウィングは５個の連続的な２’－ＭＯＥで変形されたヌクレオシドであり、ギャップは８個～１０個の連続的な天然ＤＮＡヌクレオシドで構成され、ヌクレオシド間の連結基はすべてホスホロチオエートで変形された５－８－５または５－１０－５ＭＯＥギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチド、または５’および３’ウィングは３個の連続的な２’－ＬＮＡで変形されたヌクレオシドであり、ギャップは１０個の連続的な天然ＤＮＡヌクレオシドで構成され、ヌクレオシド間の連結基はすべてホスホロチオエートで変形された３－１０－３ＬＮＡギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを含めて計３８０種を合成し、ＷＦＤＣ２のｐｒｅ－ｍＲＮＡ（配列番号１）またはｍＲＮＡ（配列番号２）の開始部位および中段部位を含む塩基配列およびギャップマーモチーフを下記表３に示した。
１．ＡＳＯの製造結果
前記実験方法のアンチセンスオリゴヌクレオチドの作製方法により、５’および３’ウィングは５個の連続的な２’－ＭＯＥで変形されたヌクレオシドであり、ギャップは８個～１０個の連続的な天然ＤＮＡヌクレオシドで構成され、ヌクレオシド間の連結基はすべてホスホロチオエートで変形された５－８－５または５－１０－５ＭＯＥギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチド、または５’および３’ウィングは３個の連続的な２’－ＬＮＡで変形されたヌクレオシドであり、ギャップは１０個の連続的な天然ＤＮＡヌクレオシドで構成され、ヌクレオシド間の連結基はすべてホスホロチオエートで変形された３－１０－３ＬＮＡギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを含めて計３８０種を合成し、ＷＦＤＣ２のｐｒｅ－ｍＲＮＡ（配列番号１）またはｍＲＮＡ（配列番号２）の開始部位および中段部位を含む塩基配列およびギャップマーモチーフを下記表３に示した。
【0123】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【表3-7】
【表3-8】
【表3-9】
【表3-10】
【0124】
２．ｍＲＮＡレベルで及ぼすＡＳＯの効果の確認
ヒト由来の膠芽腫細胞株ＳＦ２６８において前記製造されたＡＳＯがＷＦＤＣ２ ｍＲＮＡの発現を減少させるか否かを確認した。０ｎＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）対比、１００ｎＭのＡＳＯ処理によりＷＦＤＣ２の発現量をパーセントに換算した結果を表４に示した。
ヒト由来の膠芽腫細胞株ＳＦ２６８において前記製造されたＡＳＯがＷＦＤＣ２ ｍＲＮＡの発現を減少させるか否かを確認した。０ｎＭ（ｃｏｎｔｒｏｌ）対比、１００ｎＭのＡＳＯ処理によりＷＦＤＣ２の発現量をパーセントに換算した結果を表４に示した。
【0125】
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【表4-5】
【0126】
また、ＳＮＵ６３８およびＳＦ２６８細胞株において濃度依存的にｍＲＮＡの生成抑制効果を示した化合物は表５および表６に示した。
【0127】
【表5】
【0128】
【表6】
【0129】
３．タンパク質レベルで及ぼすＡＳＯの効果の確認
ヒト由来の胃癌細胞株ＳＮＵ６３８および膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１において前記製造されたＡＳＯがＷＦＤＣ２タンパク質の発現を減少させるか否かをＥＬＩＳＡにより確認した。
ヒト由来の胃癌細胞株ＳＮＵ６３８および膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１において前記製造されたＡＳＯがＷＦＤＣ２タンパク質の発現を減少させるか否かをＥＬＩＳＡにより確認した。
【0130】
胃癌細胞株ＳＮＵ６３８および膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１に対するＡＳＯのＷＦＤＣ２タンパク質発現の減少程度をＥＬＩＳＡにより確認した結果、表７および表８に示すように、化合物２、化合物３、化合物３２、化合物４３、化合物５９、化合物８０、化合物１０３、化合物１１３、化合物１１４、化合物１１５、化合物１１６、化合物１１７、化合物１２５、化合物１３０、化合物１３６、化合物１４２、化合物１４８、化合物１４９、化合物１５１、化合物１５９、化合物１６３、化合物１９９、化合物２０４、化合物２０８、化合物２０９、化合物２２３、化合物２３２、化合物２３３、化合物２３４、化合物２３７、化合物２３９、化合物２４４、化合物２４５、化合物２４６、化合物２４７、化合物２４８、化合物２４９、化合物２７９、化合物２８５、化合物２８６、化合物２９４、化合物３０４、化合物３０７、化合物３０８、化合物３１０、化合物３１１、化合物３１４、化合物３２４、化合物３２５、化合物３３０、化合物３３７、化合物３７０、化合物３７３、化合物３７４、化合物３７５、化合物３７６、および化合物３７７がＳＮＵ６３８細胞株およびＰＡＮＣ１細胞株でそれぞれ発現を著しく減少させることを確認した。
【0131】
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【表7-4】
【表7-5】
【表7-6】
【表7-7】
【表7-8】
【表7-9】
【表7-10】
【0132】
【表8-1】
【表8-2】
【表8-3】
【表8-4】
【表8-5】
【表8-6】
【表8-7】
【表8-8】
【表8-9】
【0133】
また、表９および表１０に示すように、化合物１、化合物３、化合物５７、化合物５８、化合物７６、化合物７７、化合物７９、化合物８０、化合物８８、化合物１１３、化合物１１４、化合物１１５、化合物１１６、化合物１１７、化合物１２５、化合物１３６がＳＮＵ６３８細胞株において、化合物２、化合物１４、化合物２４、化合物３０、化合物３２、化合物３６、化合物３７、化合物４０、化合物４１、化合物４２、および化合物４３がＰＡＮＣ１細胞株において濃度依存的にＷＦＤＣ２の発現を減少させることを確認した。
【0134】
【表9-1】
【表9-2】
【0135】
【表10】
【0136】
４．ＷＦＤＣ２の発現阻害による癌増殖抑制効果
胃癌細胞株ＳＮＵ６３８ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルに化合物３を投与した結果、投与経路に関係なく濃度依存的に統計的有意性を有する癌増殖抑制効果を確認することができ、特に、長期間投与することによってその効果がさらに大きくなることを確認することができた（図１～図４）。
胃癌細胞株ＳＮＵ６３８ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルに化合物３を投与した結果、投与経路に関係なく濃度依存的に統計的有意性を有する癌増殖抑制効果を確認することができ、特に、長期間投与することによってその効果がさらに大きくなることを確認することができた（図１～図４）。
【0137】
また、膠芽腫細胞株ＳＦ６３８ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔマウスモデルに化合物３を尾静脈注射で投与した結果、２０ｍｐｋ濃度で統計的有意性を有する癌増殖抑制効果を確認することができ、特に、長期間投与することによってその効果がさらに大きくなることを確認することができた（図５および図６）。
【0138】
以上、本発明についてその好ましい実施例を中心に説明した。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は本発明が本発明の本質的な特性を逸脱しない範囲で変形された形態で実現できることを理解するであろう。そのため、開示された実施例は限定的な観点ではなく説明的な観点で考慮されなければならない。本発明の範囲は上述した説明ではなく特許請求の範囲に示されており、それと同等範囲内にあるすべての差異は本発明に含まれていると解釈されなければならない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】