特表 2024-535920 遺伝子編集のための融合ポリペプチド及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-02

(54)【発明の名称】遺伝子編集のための融合ポリペプチド及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/22 20060101AFI20240925BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240925BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20240925BHJP

   C12N 5/0789 20100101ALI20240925BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240925BHJP

【ＦＩ】

C12N9/22

C07K19/00 ZNA

C12N9/10

C12N15/54

C12N15/55

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/09 100

C12N5/078

C12N5/0789

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519027

(86)(22)【出願日】2022-09-27

(85)【翻訳文提出日】2024-05-21

(86)【国際出願番号】 US2022077080

(87)【国際公開番号】W WO2023049926

(87)【国際公開日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】63/248,968

(32)【優先日】2021-09-27

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519312511

【氏名又は名称】ブイオーアール バイオファーマ インコーポレーテッド

【氏名又は名称原語表記】ＶＯＲ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ ＩＮＣ．

【住所又は居所原語表記】１００ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｐａｒｋ Ｄｒｉｖｅ， Ｓｕｉｔｅ４００，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１４０， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】110003971

【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】パイク，エリザベス

(72)【発明者】

【氏名】ヘーゼルベイカー，デイン

(72)【発明者】

【氏名】チャクラボーティ，ティルタ

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA92X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA60

4H045AA10

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA89

4H045EA20

4H045EA60

4H045FA74

(57)【要約】

ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを含む融合ポリペプチドが本明細書に提供される。また、ゲノム修飾ドメインを更に含む融合ポリペプチドも本明細書で提供され、これは、一部の実施形態では、デアミナーゼなどの塩基エディターである。また、細胞のゲノム中の標的部位配列に向けられた遺伝子編集システムを形成するために融合ポリペプチドをｇＲＮＡと接触させることを含む方法も、本明細書に提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

融合ポリペプチドであって、
ａ)ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン、及び
ｂ)エンドヌクレアーゼドメイン
を含む、前記融合ポリペプチド。

【請求項2】

前記エンドヌクレアーゼドメインが、制限エンドヌクレアーゼの第１のＤＮＡ切断ドメインを含み、ここで前記第１のＤＮＡ切断ドメインが、制限エンドヌクレアーゼの第２のＤＮＡ切断ドメインと二量体を形成することができる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項3】

前記エンドヌクレアーゼドメインが、制限エンドヌクレアーゼの第１のＤＮＡ切断ドメイン及び制限エンドヌクレアーゼの第２のＤＮＡ切断ドメインを含み、ここで前記第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインが、互いに二量体を形成することができる、請求項１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項4】

前記第１のＤＮＡ切断ドメイン及び前記第２のＤＮＡ切断ドメインの前記二量体が、ＤＮＡの一本鎖切断を生じさせることができる、請求項２又は３に記載の融合ポリペプチド。

【請求項5】

前記制限エンドヌクレアーゼが、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ又はその部分である、請求項２～４のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項6】

前記エンドヌクレアーゼドメインが、ＦｏｋＩ又はその一部分を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項7】

前記第１及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインが、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメイン、又はＦｏｋＩに由来するＤＮＡ切断ドメインである、請求項２～６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項8】

前記エンドヌクレアーゼドメインが、ＦｏｋＩの前記ＤＮＡ結合ドメインを含まず、かつ/又は付随するＣｐｆ１ドメインの不在下でＤＮＡと複合体を形成及び/若しくは維持することができない、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項9】

前記第１のＤＮＡ切断ドメイン又は前記第２のＤＮＡ切断ドメインが、対応する野生型配列と比較して１つ以上の修飾を含む、請求項２～８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項10】

前記１つ以上の修飾が、前記エンドヌクレアーゼドメインがＤＮＡの二本鎖切断を生じさせないように、前記エンドヌクレアーゼドメインの活性を変化させる、請求項９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項11】

前記１つ以上の修飾が、前記エンドヌクレアーゼドメインのエンドヌクレアーゼ活性を減少又は除去する、請求項９又は１０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項12】

前記エンドヌクレアーゼドメインが、配列番号１３若しくは１４のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれらのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項13】

前記Ｃｐｆ１ドメインが、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．(ＡｓＣｐｆ１)、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ(ＬｐＣｐｆ１)、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、又は遺伝子操作されたＣｐｆ１からのＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項14】

前記Ｃｐｆ１ドメインが、対応する野生型Ｃｐｆ１アミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸修飾を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項15】

前記１つ以上の修飾が、前記野生型配列と比較して前記Ｃｐｆ１タンパク質に１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項16】

前記Ｃｐｆ１ドメインが、
Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１７４、５４２、５４８、若しくは５５２に対応するアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つ、若しくは各々、及び/又は
配列番号１によって提供されたＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１６９、５２９、５３５、若しくは５３８に対応するアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つ、又は各々に置換を含む、請求項１５に記載の融合ポリペプチド。

【請求項17】

１つ以上の置換が、配列番号４によって提供された前記Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１７４に対応する位置にアルギニン、位置５４２に対応する位置にアルギニン、位置５４８に対応する位置にバリン、及び/又は位置５５２に対応する位置にアルギニンを含む、請求項１６に記載の融合ポリペプチド。

【請求項18】

前記１つ以上の置換が、配列番号１によって提供されたＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１６９に対応する位置にアルギニン、位置５２９に対応する位置にアルギニン、位置５３５に対応する位置にバリン、及び/又は位置５３８に対応する位置にアルギニンを含む、請求項１６又は１７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項19】

ｃ)ゲノム修飾ドメインを更に含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項20】

前記ゲノム修飾ドメインが、塩基エディターを含む、請求項１９に記載の融合ポリペプチド。

【請求項21】

前記塩基エディターが、シトシン塩基エディター(ＣＢＥ)又はアデニン塩基エディター(ＡＢＥ)である、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項22】

前記塩基エディターが、シチジンデアミナーゼ又はアデニンデアミナーゼを含む、請求項２０又は２１に記載の融合ポリペプチド。

【請求項23】

前記塩基エディターが、シチジンデアミナーゼ及びアデニンデアミナーゼの両方を含む、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。

【請求項24】

前記ゲノム修飾ドメインが、エピジェネティック修飾因子を含む、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項25】

前記エピジェネティック修飾因子が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチラーゼ、又はそれらのいずれかの機能的部分若しくは組み合わせを含む、請求項２４に記載の融合ポリペプチド。

【請求項26】

前記ゲノム修飾ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列、又はそのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項27】

前記Ｃｐｆ１ドメインが、前記エンドヌクレアーゼドメインのＮ末端である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項28】

前記エンドヌクレアーゼドメインが、前記Ｃｐｆ１ドメインのＮ末端である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項29】

前記ゲノム修飾ドメインが、前記Ｃｐｆ１ドメインのＮ末端である、請求項１９～２７のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項30】

前記ゲノム修飾ドメインが、前記エンドヌクレアーゼドメインのＮ末端である、請求項１９～２９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項31】

融合物が、Ｎ末端からＣ末端に、前記Ｃｐｆ１ドメイン、前記エンドヌクレアーゼドメイン、及び前記ゲノム修飾ドメインを含む、請求項１９～２７又は３０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項32】

前記融合物が、Ｎ末端からＣ末端に、前記Ｃｐｆ１ドメイン、前記ゲノム修飾ドメイン、及び前記エンドヌクレアーゼドメインを含む、請求項１９～２７又は３０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項33】

前記融合物が、Ｎ末端からＣ末端に、前記エンドヌクレアーゼドメイン、前記Ｃｐｆ１ドメイン、及び前記ゲノム修飾ドメインを含む、請求項１９～２６又は２８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項34】

前記融合物が、Ｎ末端からＣ末端に、前記エンドヌクレアーゼドメイン、前記ゲノム修飾ドメイン、及び前記Ｃｐｆ１ドメインを含む、請求項１９～２６、２８、又は２９のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項35】

前記融合物が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ゲノム修飾ドメイン、前記Ｃｐｆ１ドメイン、及び前記エンドヌクレアーゼドメインを含む、請求項１９～２７、２９、又は３０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項36】

前記融合物が、Ｎ末端からＣ末端に、前記ゲノム修飾ドメイン、前記エンドヌクレアーゼドメイン、及び前記Ｃｐｆ１ドメインを含む、請求項１９～２６、又は２８～３０のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項37】

１つ以上のリンカードメインを更に含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。

【請求項38】

前記リンカーが、ＸＴＥＮリンカーである、請求項３７に記載の融合ポリペプチド。

【請求項39】

請求項１～３８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。

【請求項40】

請求項３９に記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項41】

請求項１～３８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、請求項３９に記載の核酸、又は請求項４０に記載のベクターを含む、細胞。

【請求項42】

システムであって、
請求項１～３８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、及び
細胞のゲノム中の第１の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡ
を含み、
ここで前記融合ポリペプチドが、前記第１のｇＲＮＡとリボ核タンパク質(ＲＮＰ)複合体を形成及び/又は維持することができ、前記ＲＮＰ複合体が、細胞の前記ゲノム中の前記標的配列を結合することができる、前記システム。

【請求項43】

前記細胞の前記ゲノム中の第２の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡを更に含み、ここで前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列が同じではない、請求項４２に記載のシステム。

【請求項44】

第２の融合ポリペプチドであって、
ａ)ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン、及び
ｂ)前記第１のエンドヌクレアーゼドメインと二量体を形成することができる第２のエンドヌクレアーゼドメイン
を含む、第２の融合ポリペプチドを更に含む、請求項４２に記載のシステム。

【請求項45】

リボ核タンパク質(ＲＮＰ)複合体であって、
請求項１～３８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、及び
細胞のゲノム中の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ
を含み、
ここでＲＮＰ複合体が、細胞の前記ゲノム中の前記標的配列を結合することができる、前記リボ核タンパク質複合体。

【請求項46】

方法であって、
ｉ)細胞を、請求項１～３８のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド又は請求項３９に記載の核酸と接触させること、及び
ｉｉ)前記細胞を、細胞のゲノム中の第１の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡと接触させること
を含む、前記方法。

【請求項47】

ｉ)及びｉｉ)が、同時に、又は時間的に近接して起こる、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

ｉｉｉ)前記細胞を、細胞の前記ゲノム中の第２の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ(又はそれをコードする核酸)と接触させることを更に含む、請求項４６又は４７に記載の方法。

【請求項49】

前記細胞を、請求項１～３８のいずれか一項に記載の第２の融合タンパク質又は請求項３９に記載の核酸と接触させることを更に含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

方法であって、
ｉ)細胞を、請求項１～３８のいずれか一項に記載の第１の融合ポリペプチド及び細胞の前記ゲノム中の第１の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡと接触させること、および
ｉｉ)前記細胞を、請求項１～３８のいずれか一項に記載の第２の融合ポリペプチド及び細胞の前記ゲノム中の第２の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡと接触させること
を含み、
ここで前記第１の標的配列と前記第２の標的配列は同じではなく、前記第１の融合ポリペプチドと前記第２の融合ポリペプチドは同じではない、方法。

【請求項51】

前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列が、前記細胞の前記ゲノムの異なる染色体上にある、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列が、前記細胞の前記ゲノム中の同じ染色体上にある、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列が、前記染色体の同じＤＮＡ鎖上にある、請求項５２に記載の方法。

【請求項54】

前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列が、前記染色体の異なるＤＮＡ鎖上にある、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記第１の標的配列及び前記第２の標的配列が、１０～１０，０００ヌクレオチド離れている、請求項４８～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記細胞が、造血細胞である、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記細胞が、造血幹細胞である、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記細胞が、造血前駆細胞である、請求項４６～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項４６～５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記細胞が、リンパ球である、請求項４６～５５又は５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記細胞が、Ｔリンパ球である、請求項４６～５５、５９、又は６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

請求項４６～６１のいずれか一項に記載の方法によって産生された、操作された細胞、又はその子孫。

【請求項63】

請求項６２に記載の遺伝子操作された細胞を含む、細胞集団。

【請求項64】

ヌクレアーゼ活性を欠くキメラポリペプチドであって、
第１のＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列を含む第１の部分、及び
第２のＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列を含む第２の部分
を含み、
ここで前記第１のＣｐｆ１タンパク質及び前記第２のＣｐｆ１タンパク質は、同じではない、前記キメラポリペプチド。

【請求項65】

前記第１のＣｐｆ１タンパク質が、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．(ＡｓＣｐｆ１)、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ(ＬｐＣｐｆ１)、又はＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、又はＩｎｓｃｒｉｐｔａによって提供されたＭＡＤ７(商標)のＣｐｆ１由来である、請求項６４に記載のキメラポリペプチド。

【請求項66】

前記第２のＣｐｆ１タンパク質が、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．(ＡｓＣｐｆ１)、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ(ＬｐＣｐｆ１)、又はＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、又はＩｎｓｃｒｉｐｔａによって提供されたＭＡＤ７(商標)のＣｐｆ１由来である、請求項６４又は６５に記載のキメラポリペプチド。

【請求項67】

前記第１のＣｐｆ１タンパク質が、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１(ＡｓＣｐｆ１)又はその部分を含む、請求項６４～６６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項68】

前記第２のＣｐｆ１タンパク質が、ＭＡＤ７(商標)又はその一部分を含む、請求項６４～６７のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項69】

前記第１のＣｐｆ１タンパク質及び/又は第２のＣｐｆ１タンパク質が、前記第１のＣｐｆ１タンパク質及び/又は第２のＣｐｆ１タンパク質の野生型配列と比較して１つ以上の修飾を含む、請求項６４～６８のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項70】

前記１つ以上の修飾が、前記第１のＣｐｆ１タンパク質の前記野生型配列と比較して、前記第１のＣｐｆ１タンパク質に１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項６９に記載のキメラポリペプチド。

【請求項71】

前記第１のＣｐｆ１タンパク質を含む前記アミノ酸配列が、少なくとも１００アミノ酸長、又は１００～１３００アミノ酸長である、請求項６４～７０のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項72】

前記第２のＣｐｆ１タンパク質を含む前記アミノ酸配列が、少なくとも１００アミノ酸長、又は１００～１３００アミノ酸長である、請求項６４～７１のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項73】

前記キメラポリペプチドが、前記第１の部分と前記第２の部分との間にリンカーを更に含む、請求項６４～７２のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項74】

前記キメラポリペプチドが、少なくとも８００アミノ酸長、又は８００～１５００アミノ酸長である、請求項６４～７３のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項75】

前記第１のＣｐｆ１タンパク質の前記アミノ酸配列が、配列番号１～９のうちのいずれか１つ、又はそれらのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項６４～７４のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項76】

前記第２のＣｐｆ１タンパク質の前記アミノ酸配列が、配列番号１～９のうちのいずれか１つ、又はそれらのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項６４～７５のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【請求項77】

前記キメラポリペプチドが、配列番号２４～３１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列、又はそれらのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項６４～７６のいずれか一項に記載のキメラポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年９月２７日に出願された米国仮出願第６３/２４８，９６８号の米国特許法第１１９条(ｅ)に基づく利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子配列表の参照
電子配列表(Ｖ０２９１７００２３ＷＯ００－ＳＥＱ－ＣＥＷ、サイズ：２２５，２７８バイト、及び作成日：２０２２年９月２６日)の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

背景
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(ＣＲＩＳＰＲ)/Ｃａｓシステムは、細胞における標的遺伝子編集のためのプラットフォームを提供する。使用のためのシステム及び関連ツールの多用途性にもかかわらず、細胞ゲノムへの標的修飾の特異的導入に関し、例えば、疾患又は障害に関連する遺伝子のコード配列の修飾に関しこれらのツールには多くの制限がある。

【発明の概要】

【0004】

概要
本開示は、部分的には、触媒的に不活性である(ヌクレアーゼ活性を欠く)Ｃｐｆ１ドメインと、細胞のゲノム中の標的部位に一本鎖ＤＮＡ切断(すなわち、ニッカーゼ活性)を指示するよう機能する(例えば、ＦｏｋＩなどの制限エンドヌクレアーゼからの)エンドヌクレアーゼドメインとを含む、融合ポリペプチドを対象とする。
したがって、一態様では、本開示は、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインと、エンドヌクレアーゼドメインと、を含む融合ポリペプチドを対象とする。

【0005】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼの第１のＤＮＡ切断ドメインを含み、第１のＤＮＡ切断ドメインは、制限エンドヌクレアーゼの第２のＤＮＡ切断ドメインと二量体を形成することができる。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼの第１のＤＮＡ切断ドメインと、制限エンドヌクレアーゼの第２のＤＮＡ切断ドメインとを含み、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインは、互いに二量体を形成することができる。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインの二量体は、ＤＮＡの一本鎖切断を生じることができる。

【0006】

いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ制限エンドヌクレアーゼ又はその部分である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ又はその一部分を含む。いくつかの実施形態では、第１及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメイン、又はＦｏｋＩに由来するＤＮＡ切断ドメインである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩのＤＮＡ結合ドメインを含まず、かつ/又は付随するＣｐｆ１ドメインの不在下でＤＮＡと複合体を形成及び/若しくは維持することができない。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、対応する野生型配列と比較して１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、エンドヌクレアーゼドメインがＤＮＡの二本鎖切断を生じさせないように、エンドヌクレアーゼドメインの活性を変化させる。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、エンドヌクレアーゼドメインのエンドヌクレアーゼ活性を減少又は除去する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、配列番号１３若しくは１４のうちのいずれかのアミノ酸配列、又はそれらのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．(ＡｓＣｐｆ１)、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ(ＬｐＣｐｆ１)、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、又は操作されたＣｐｆ１由来のＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、対応する野生型Ｃｐｆ１アミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、野生型配列と比較してＣｐｆ１タンパク質に１つ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１７４、５４２、５４８、若しくは５５２に対応するアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つ、若しくは各々に置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号１によって提供されたＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１６９、５２９、５３５、若しくは５３８に対応するアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つ、又は各々に置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、配列番号４によって提供されたＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１７４に対応する位置にアルギニン、位置５４２に対応する位置にアルギニン、位置５４８に対応する位置にバリン、及び/又は位置５５２に対応する位置にアルギニンを含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、１つ以上の置換は、配列番号１によって提供されたＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１６９に対応する位置にアルギニン、位置５２９に対応する位置にアルギニン、位置５３５に対応する位置にバリン、及び/又は位置５３８に対応する位置にアルギニンを含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ｃ)ゲノム修飾ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾ドメインは、塩基エディターを含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、シトシン塩基エディター(ＣＢＥ)又はアデニン塩基エディター(ＡＢＥ)である。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼ又はアデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、塩基エディターは、シチジンデアミナーゼ及びアデニンデアミナーゼの両方を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾ドメインは、エピジェネティック修飾因子を含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾因子は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチラーゼ、又はそれらの任意の機能的部分若しくは組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列、又はそのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、エンドヌクレアーゼドメインのＮ末端である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、Ｃｐｆ１ドメインのＮ末端である。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾ドメインは、Ｃｐｆ１ドメインのＮ末端である。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾ドメインは、エンドヌクレアーゼドメインのＮ末端である。いくつかの実施形態では、融合物は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃｐｆ１ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及びゲノム修飾ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合物は、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃｐｆ１ドメイン、ゲノム修飾ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合物は、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、及びゲノム修飾ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合物は、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、ゲノム修飾ドメイン、及びＣｐｆ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合物は、Ｎ末端からＣ末端に、ゲノム修飾ドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合物は、Ｎ末端からＣ末端に、ゲノム修飾ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及びＣｐｆ１ドメインを含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、１つ以上のリンカードメインを更に含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーである。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を対象とする。

【0012】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸を含む、ベクターを対象とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される融合ポリペプチド、核酸、又はベクターを含む細胞を対象とする。

【0013】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載される融合ポリペプチドと、細胞のゲノム中の第１の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡとを含むシステムを対象とし、融合ポリペプチドは、第１のｇＲＮＡとリボ核タンパク質(ＲＮＰ)複合体を形成及び/又は維持することができ、ＲＮＰ複合体は、細胞のゲノム中の標的配列を結合することができる。いくつかの実施形態では、システムは、細胞のゲノム中の第２の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡを更に含み、第１の標的配列及び第２の標的配列は同じではない。いくつかの実施形態では、システムは、ａ)ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインと、ｂ)第１のエンドヌクレアーゼドメインと二量体を形成することができる第２のエンドヌクレアーゼドメインとを含む、第２の融合ポリペプチドを更に含む。

【0014】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載される融合ポリペプチドと、細胞のゲノム中の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡとを含むリボ核タンパク質(ＲＮＰ)複合体を対象とし、ＲＮＰ複合体は、細胞のゲノム中の標的配列を結合することができる。

【0015】

別の態様では、本開示は、ｉ)細胞を、本明細書に記載の融合ポリペプチド又は核酸と接触させることと、ｉｉ)細胞を、細胞のゲノム中の第１の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡと接触させることとを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、ｉ)及びｉｉ)は、同時に、又は時間的に近接して起こる。いくつかの実施形態では、方法は、ｉｉｉ)細胞を、細胞のゲノム中の第２の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ(又はそれをコードする核酸)と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を、本明細書に記載される第２の融合タンパク質又は核酸と接触させることを更に含む。

【0016】

別の態様では、本開示は、ｉ)細胞を、本明細書に記載される第１の融合ポリペプチド及び細胞のゲノム中の第１の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第１のｇＲＮＡと接触させることと、ｉｉ)細胞を、本明細書に記載される第２の融合ポリペプチド及び細胞のゲノム中の第２の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡと接触させることと、を含む方法であって、第１の標的配列と第２の標的配列は同じではなく、第１の融合ポリペプチドと第２の融合ポリペプチドは同じではない、方法を対象とする。

【0017】

いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、細胞のゲノムの異なる染色体上にある。いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、細胞のゲノム中の同じ染色体上にある。いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、染色体の同じＤＮＡ鎖上にある。いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、染色体の異なるＤＮＡ鎖上にある。いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、１０～１０，０００ヌクレオチド離れている。

【0018】

いくつかの実施形態では、細胞は、造血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、造血前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔリンパ球である。

【0019】

別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法によって産生された、操作された細胞又はその子孫を対象とする。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載される操作された細胞を含む細胞集団を対象とする。

【0020】

別の態様では、本開示は、第１のＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列を含む第１の部分と、第２のＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列を含む第２の部分とを含む、ヌクレアーゼ活性を欠くキメラポリペプチドであって、第１のＣｐｆ１タンパク質及び第２のＣｐｆ１タンパク質は同じではない、キメラポリペプチドを対象とする。いくつかの実施形態では、第１のＣｐｆ１タンパク質は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．若しくはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．(ＡｓＣｐｆ１)、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ(ＬｐＣｐｆ１)、又はＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、又はＩｎｓｃｒｉｐｔａによって提供されたＭＡＤ７(商標)のＣｐｆ１由来である。いくつかの実施形態では、第２のＣｐｆ１タンパク質は、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．若しくはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．(ＡｓＣｐｆ１)、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ(ＬｐＣｐｆ１)、又はＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、又はＩｎｓｃｒｉｐｔａによって提供されたＭＡＤ７(商標)のＣｐｆ１由来である。いくつかの実施形態では、第１のＣｐｆ１タンパク質は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．Ｃｐｆ１(ＡｓＣｐｆ１)又はその部分を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣｐｆ１タンパク質は、ＭＡＤ７(商標)又はその一部分を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、第１のＣｐｆ１タンパク質及び/又は第２のＣｐｆ１タンパク質は、第１のＣｐｆ１タンパク質及び/又は第２のＣｐｆ１タンパク質の野生型配列と比較して１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の修飾は、第１のＣｐｆ１タンパク質の野生型配列と比較して、第１のＣｐｆ１タンパク質に１つ以上のアミノ酸置換を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、第１のＣｐｆ１タンパク質を含むアミノ酸配列は、少なくとも１００アミノ酸長、又は１００～１３００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、第２のＣｐｆ１タンパク質を含むアミノ酸配列は、少なくとも１００アミノ酸長、又は１００～１３００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、第１の部分と第２の部分との間にリンカーを更に含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、少なくとも８００アミノ酸長、又は８００～１５００アミノ酸長である。

【0023】

いくつかの実施形態では、第１のＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１～９のうちのいずれか、又はそれらのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、又は９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１～９のうちのいずれか、又はそれらのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、又は９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号２４～３１のうちのいずれかのアミノ酸配列、又はそれらのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、又は９９％の同一性を有する配列を含む。

【0024】

上記の概要は、本明細書中に開示される技術の実施形態、利点、特徴、及び使用の一部を非限定的な様式で説明することを意図している。本明細書中に開示される技術の他の実施形態、利点、特徴、及び使用は、詳細な説明、図面、実施例、及び特許請求の範囲から明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【0025】

図面の簡単な説明

【図1】強化されたＣｐｆ１ヌクレアーゼ(ｅｎＣｐｆ１、ｅｎＡｓＣｐｆ１－(ＲＶＲ))をコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示す。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。強化されたＣｐｆ１は、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びサイトメガロウイルス(ＣＭＶ)エンハンサー配列の制御下で、Ｅ１７４Ｒ/Ｓ５４２Ｒ/Ｋ５４８Ｖ/Ｎ５５２Ｒ変異を含有するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼ(ｅｎＡｓＣｐｆ１－(ＲＶＲ)と称される)である。

【0026】

【図2】塩基エディターと強化Ｃｐｆ１ヌクレアーゼとの融合物をコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示す。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。塩基エディター－Ｃｐｆ１融合物は、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下で、Ｅ１７４Ｒ/Ｓ５４２Ｒ/Ｋ５４８Ｖ/Ｎ５５２Ｒ変異を含有するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． ＢＶ３Ｌ６由来の強化されたＣｐｆ１ヌクレアーゼのＮ末端に融合された例示的な塩基エディターＡＰＯＢＥＣ－１の融合物である。

【0027】

【図3】ＭＡＤ７(商標)ヌクレアーゼをコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示す。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。ＭＡＤ７(商標)(Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ)をコードする遺伝子は、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下にある。

【0028】

【図4】は、ＭＡＤ７(商標)ヌクレアーゼに基づく強化されたヌクレアーゼをコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示す。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。ＭＡＤ７(商標)ヌクレアーゼに基づく強化されたヌクレアーゼは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下に、変異Ｋ１６９Ｒ、Ｄ５２９Ｆ、Ｋ５３５Ｖ、及びＮ５３８Ｒを含有する。

【0029】

【図5】ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン(ｄＣｐｆ１)及び２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(Ｆｏｋ１ドメインＩ及びＦｏｋ１ドメインＩＩ)を含む融合ポリペプチドをコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示すこのベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。融合ポリペプチドは、ニワトリベータアクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下で、Ｄ９０８Ａ変異を含有するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６由来のヌクレアーゼ－デッド(ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｄｅａｄ)Ｃｐｆ１酵素のＣ末端への２つのＦｏｋ１ヌクレアーゼドメインの融合物である。ＦｏｋＩドメインは、ポリペプチドリンカーで互いに分離され、ＸＴＥＮリンカーでｄＣｐｆ１から分離される。

【0030】

【図6】ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン(ｄＣｐｆ１)及び２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(Ｆｏｋ１ドメインＩ及びＦｏｋ１ドメインＩＩ)を含む融合ポリペプチドをコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示す。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。融合ポリペプチドは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下で、Ｄ９０８Ａ変異を含有するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６由来のヌクレアーゼ－デッドＣｐｆ１酵素のＮ末端への２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの融合物である。Ｆｏｋ１ドメインは、ポリペプチドリンカーで互いに分離され、ＸＴＥＮリンカーでｄＣｐｆ１から分離される。

【0031】

【図7】ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン(ｄＣｐｆ１)及び２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(Ｆｏｋ１ドメイン１及びＦｏｋ１ドメイン)を含む融合ポリペプチドをコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示し、Ｆｏｋ１ドメイン１は、そのヌクレアーゼ活性を無効にするＤ４５０Ａ変異を含有する。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。融合ポリペプチドは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下で、Ｄ９０８Ａ変異を含有するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６由来のヌクレアーゼ－デッドＣｐｆ１酵素のＣ末端への２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの融合物である。Ｆｏｋ１ドメインは、ポリペプチドリンカーで互いに分離され、ＸＴＥＮリンカーでｄＣｐｆ１から分離される。

【0032】

【図8】ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン(ｄＣｐｆ１)と、２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(Ｆｏｋ１ドメインＩ及びＦｏｋＩドメインＩＩ)とを含む融合ポリペプチドをコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示し、ＦｏｋＩドメインＩＩは、そのヌクレアーゼ活性を無効にするＤ４５０Ａ変異を含有する。Ｆｏｋ１ドメインＩは、野生型Ｄ４５０残基を含有し、機能的ヌクレアーゼ活性を有する。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。融合ポリペプチドは、ニワトリベータアクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下で、Ｄ９０８Ａ変異を含有するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６由来のヌクレアーゼ－デッドＣｐｆ１酵素のＣ末端への２つのＦｏｋ１ヌクレアーゼドメインの融合物である。Ｆｏｋ１ドメインは、ポリペプチドリンカーで互いに分離され、ＸＴＥＮリンカーでｄＣｐｆ１から分離される。

【0033】

【図9】ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン(ｄＣｐｆ１)と、２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(Ｆｏｋ１ドメインＩ及びＦｏｋ１ドメインＩＩ)とを含む融合ポリペプチドをコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示し、ＦｏｋＩドメインＩは、そのヌクレアーゼ活性を無効にするＤ４５０Ａ変異を含有する。Ｆｏｋ１ドメインＩＩは、野生型Ｄ４５０残基を含有し、機能的ヌクレアーゼ活性を有する。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。融合ポリペプチドは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下で、Ｄ９０８Ａ変異を含有するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６(ＡｓＣｐｆ１)由来のヌクレアーゼ－デッドｄＣｐｆ１酵素のＮ末端への２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの融合物である。Ｆｏｋ１ドメインは、ポリペプチドリンカーで互いに分離され、ＸＴＥＮリンカーでｄＣｐｆ１から分離される。

【0034】

【図10】ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン(ｄＣｐｆ１)と、２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(ＦｏｋＩドメインＩ及びＦｏｋＩドメインＩＩ)とを含む融合ポリペプチドをコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示し、ＦｏｋＩドメインＩＩは、そのヌクレアーゼ活性を無効にするＤ４５０Ａ変異を有する。ＦｏｋＩドメインＩは、野生型Ｄ４５０残基を含有し、機能的ヌクレアーゼ活性を有する。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。融合ポリペプチドは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下で、Ｄ９０８Ａ変異を含有するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６(ＡｓＣｐｆ１)由来のヌクレアーゼ－デッド(ｄＣｐｆ１)酵素のＮ末端への２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの融合物である。Ｆｏｋ１ドメインは、ポリペプチドリンカーで互いに分離され、ＸＴＥＮリンカーでｄＣｐｆ１から分離される。

【0035】

【図11】塩基編集ドメイン、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン(ｄＣｐｆ１)と、２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(ＦｏｋＩドメインＩ及びＦｏｋ１ドメインＩＩ)とを含む融合ポリペプチドをコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示し、ＦｏｋＩドメインＩは、そのヌクレアーゼ活性を無効にするＤ４５０Ａ変異を有する。ＦｏｋＩドメインＩＩは、野生型Ｄ４５０残基を含有し、機能的ヌクレアーゼ活性を有する。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。融合ポリペプチドは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下で、２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合されたｄＣｐｆ１のＣ末端を有するＤ９０８Ａ変異を含有するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６(ＡｓＣｐｆ１)由来のヌクレアーゼデッド(ｄＣｐｆ１)酵素のＮ末端への例示的な塩基エディターＡＰＯＢＥＣ－１の融合物である。Ｆｏｋ１ドメインは、ポリペプチドリンカーで互いに分離され、ＸＴＥＮリンカーでｄＣｐｆ１から分離される。

【0036】

【図12】塩基編集ドメインと、ＭＡＤ７(商標)ヌクレアーゼに基づく強化されたヌクレアーゼと、２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン(ＦｏｋＩドメインＩ及びＦｏｋＩドメインＩＩ)とをコードする例示的なプラスミドベクターの概略図を示し、ＦｏｋＩドメインＩは、そのヌクレアーゼ活性を無効にするＤ４５０Ａ変異を有する。ＦｏｋＩドメインＩＩは、野生型Ｄ４５０残基を含有し、機能的ヌクレアーゼ活性を有する。このベクターは、Ｕ６プロモーターの制御下でｇＲＮＡ足場をコードする。融合ポリペプチドは、ニワトリベータ－アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー配列の制御下で、２つのＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合された変異Ｋ１６９Ｒ、Ｄ５２９Ｆ、Ｋ５３５Ｖ、Ｎ５３８Ｒ、及びＤ８７７Ａを含有するＭＡＤ７(商標)に基づく強化された触媒的デッドヌクレアーゼのＮ末端への例示的な塩基エディターＡＰＯＢＥＣ－１の融合物である。Ｆｏｋ１ドメインは、ポリペプチドリンカーで互いに分離され、ＸＴＥＮリンカーでｄＣｐｆ１から分離される。

【0037】

【図13】は、本明細書に記載の例示的な融合ポリペプチドの概略図を示し、ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、塩基エディタードメイン(例えば、ＴａｄＡ２．１)、エンドヌクレアーゼドメイン(例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメイン)、及びヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓドメイン(ｄＣａｓ、例えば、Ｃａｓφ/Ｃａｓ１２ｊ)を含む。

【発明を実施するための形態】

【0038】

本開示の態様は、触媒的に不活性である(ヌクレアーゼ活性を欠く)Ｃｐｆ１ドメインと、細胞のゲノム中の標的部位に一本鎖ＤＮＡ切断(すなわち、ニッカーゼ活性)を指示するよう機能する(例えば、ＦｏｋＩなどの制限エンドヌクレアーゼからの)エンドヌクレアーゼドメインとを含む、融合ポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは更に、塩基エディタードメイン(例えば、デアミナーゼ活性)などのゲノム修飾ドメインを含み、それは、標的部位において、例えばＣ若しくはＡヌクレオチドのシトシン又はアデノシン核酸塩基などの核酸塩基を標的化して脱アミノ化し、細胞ミスマッチ修復機構を介して、ＣからＴヌクレオチドへの核酸塩基の変化、又はＡからＧヌクレオチドへの変化などの修飾をもたらす。

【0039】

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)又はジンクフィンガードメインを使用した所望のゲノム標的部位へのエンドヌクレアーゼの標的化が行われており、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)の場合、遺伝子変異を実行するために利用されている(Ｒａｍｉｒｅｚ，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ(２０１２)４０(１２)：５５６０－６８、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．ＢｉｏＳｙｓｔ．(２０１４)１０：４４６)。しかしながら、このような構築物の生成は、その大きなサイズ(ＴＡＬＥＮＳの場合)のため扱いにくく、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓシステムを使用した遺伝子編集よりも効率が低い可能性がある。

【0040】

正確な遺伝子編集は、例えば、ヌクレアーゼが一本鎖ＤＮＡ切断を生成するようにＣａｓ９のヌクレアーゼドメインのうちの１つが変異されており、主に触媒的に損なわれたＣａｓ９ヌクレアーゼに基づいた塩基エディターを使用して達成されている。しかしながら、このようなゲノム標的化のためのＣａｓ１２ａ/Ｃｐｆ１ヌクレアーゼなどの非Ｃａｓ９ヌクレアーゼの使用は、はるかに制限されている。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、Ｃａｓ９の２つの別個のヌクレアーゼドメインとは対照的に、Ｃａｓ１２ａ/Ｃｐｆ１は、各ＤＮＡ鎖を切断するための別個の活性部位を有さず、Ｃａｓ１２ａ/Ｃｐｆ１のニッカーゼバリアントをより困難なものにしていると考えられる。例えば、Ｒｉｃｈｔｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． (２０２０)３８(７)： ８８３－８９１を参照されたい。

【0041】

融合ポリペプチド
本発明の態様は、ヌクレアーゼ活性を有しないＣｐｆ１/Ｃａｓ１２ａドメインと、エンドヌクレアーゼドメインとを含む融合ポリペプチドを提供し、そのような融合ポリペプチドを使用して標的細胞のゲノムに標的変異を導入するためのシステム及び方法を含む。本明細書で使用される場合の「変異」という用語は、参照配列、例えば、そのような変異を有していない細胞の対応する配列、又は対応する野生型核酸配列と比較して、核酸配列の変化(例えば、挿入、欠失、逆位、又は置換)を指す。

【0042】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して生成される細胞は、参照配列、例えば、そのような変異を有していない細胞の対応する配列、又は対応する野生型核酸配列と比較して、２つ以上(例えば、２、３、４、５、又はそれ以上)の変異を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子(例えば、標的遺伝子)に対する変異は、変異を保有する細胞において、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の喪失をもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子(例えば、標的遺伝子)における変異は、標的遺伝子によってコードされるタンパク質のバリアント形態の発現をもたらす。

【0043】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、遺伝子(例えば、標的遺伝子)に変異をもたらし、その結果、変異を保有する細胞において、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現が喪失する。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、遺伝子(例えば、標的遺伝子)に変異をもたらし、その結果、標的遺伝子によってコードされるタンパク質のバリアント形態が発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子操作された細胞は、例えば、融合ポリペプチドが細胞のゲノム中の標的部位に向けられるのに好適な条件下で(例えば、本明細書の他の箇所に記載されるガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)によって)、及びエンドヌクレアーゼドメインが細胞のＤＮＡ中のホスホジエステル結合を切断するのに好適な条件下で、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかを使用することによって生成される。

【0044】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ペプチドは、細胞のゲノムに「編集」とも呼ばれる標的変化を導入することができるゲノム編集技術を介して遺伝子操作された細胞を生成する。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞は、細胞のゲノム中に複数の編集を含む。

【0045】

本明細書に記載される融合ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を有しないＣｐｆ１/Ｃａｓ１２ａドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを含み、いくつかの実施形態では、ゲノム修飾ドメインを更に含み得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのドメインのうちのいずれかを結合するために、１つ以上のリンカードメインを含む。

【0046】

Ｃｐｆ１ドメイン
一部の態様では、本開示は、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含む融合ポリペプチドを細胞中のゲノム遺伝子座に標的化するためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ塩基のシステムを提供する。本明細書で使用される場合、「Ｃｐｆ１ドメイン」は、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ(Ｃａｓ１２ヌクレアーゼ若しくはＣａｓ１２ａヌクレアーゼとも呼ばれる)若しくはその部分、又はそのバリアントを指す。Ｃｐｆ１は、クラス２ Ｖ－Ａ型Ｃａｓヌクレアーゼに属するとみなされる。例えば、Ｓｔｒｏｈｋｅｎｄｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ(２０１８)７１：１－９を参照されたい。本明細書に記載される融合ポリペプチドで使用するための、Ｃａｓ１２/Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、ｉ)ＰＡＭ部位の遠位で切断されるＩＩ型クラス２ ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓヌクレアーゼに由来するポリペプチド、及びｉｉ)好適なｇＲＮＡと組み合わせて、標的核酸配列(標的配列)と結合することができるポリペプチドを指す。

【0047】

Ｃａｓ９ヌクレアーゼとは対照的に、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の両方ではなく、１つのｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ(ｃｒＲＮＡ)を必要とする標的部位に向けられ、二重ＲｕｖＣ－Ｎｕｃドメイン(ＲｕｖＣエンドヌクレアーゼ及びＮｕｃヌクレアーゼドメイン)を使用して機能するが、一方でＣａｓ９は２つのヌクレアーゼドメイン(ＲｕｖＣ－Ｎｕｃ及びＨＮＨ)を有する。例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．(２０１６)２６(８)：９０１－９１３を参照されたい。

【0048】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ｃｐｆ１酵素の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上を含むＣｐｆ１酵素の一部分である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ｃｐｆ１酵素の１つ以上のドメインである。

【0049】

例示的な、好適なＣｐｆ１ヌクレアーゼの例は、限定されないが、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、ＰａＣａｓ１２ａ、他のＣｐｆ１オルソログ、及びＣａｓ１２ａ誘導体、例えばＭＡＤ７システム(ＭＡＤ７(商標)、Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ，Ｉｎｃ．)、又はＡｌｔ－Ｒ Ｃａｓ１２ａ(Ｃｐｆ１)Ｕｌｔｒａヌクレアーゼ(Ａｌｔ－Ｒ(登録商標)Ｃａｓ１２ａ Ｕｌｔｒａ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．)などを含む。例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．ＬＩＰＳＣＯＭＢ ２０１７． Ｉｎ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ：Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ Ｉｎｃ．、Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．(２０２０)１１７(６０)：１８０５－１８１６、ＰＣＴ公開第２０１６/１６６３４０号、同第２０１７/１５５４０７号、同第２０１８/０８３１２８号、同第２０１６/２０５７１１号、同第２０１７/０３５３８８号、同第２０１７/１８４７６８号、同第２０１９/１１８５１６号、同第２０１７/１８４７６８号、同第２０１８/０９８３８３号、同第２０２０/１４６２９７号、及び同第２０２０/１７２５０２号を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株ＢＶ３Ｌ６などのＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．から得られたＣａｓ１２ａ/Ｃｐｆ１由来である(「ＡｓＣａｓ１２ａ」又は「ＡｓＣｐｆ１」と称される)。

【0050】

本明細書に記載される融合ポリペプチドで使用するためのＣａｓ１２ヌクレアーゼの追加の例としては、限定されないが、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓφ/Ｃａｓ１２ｊ、及びＣａｓ１２ｂが挙げられる。

【0051】

様々なＣａｓ１２/Ｃｐｆ１ヌクレアーゼが、当技術分野で公知であり、様々な供給源から入手され、及び/又は酵素の１つ以上の活性若しくは特異性を調節するように操作/修飾され得る。例えば、Ｃａｓ１２/Ｃｐｆ１ヌクレアーゼのＰＡＭ配列の優先性及び特異性は、改変され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２/Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、１つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作/修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２/Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２/Ｃｐｆ１ヌクレアーゼが操作/修飾なしに認識するＰＡＭ配列とは異なる１つ以上のＰＡＭ配列を認識するように操作/修飾されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２/Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、酵素のオフターゲット活性を低減するように操作/修飾されている。

【0052】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕ ｓ ｓｐ．(ＡｓＣｐｆ１)、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ(ＬｐＣｐｆ１)、若しくはＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ、又は操作されたＣｐｆ１からのＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列であるか、あるいはそれらからのＣｐｆ１タンパク質由来である。いくつかの実施形態では、操作されたＣｐｆ１は、ＭＡＤ７システム(ＭＡＤ７(商標)、Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ，Ｉｎｃ．)である。例示的なＣａｓ１２/Ｃｐｆ１ヌクレアーゼのアミノ酸配列を以下に提供する。

【0053】

ＭＡＤ７(商標)のアミノ酸配列(Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ)(配列番号１)

【化1】

【0054】

残基Ｋ１６９、Ｄ５２９、Ｋ５３５、Ｎ５３８、及びＤ８７７は、太字及び下線で示されている。上記に提供されるＭＡＤ７(商標)配列のバリアント、又は当技術分野で公知のＭＡＤ(商標)の任意の好適な配列(例えば、融合タンパク質との関連で例えば、Ｎ末端メチオニンを含まない上記の配列)も、本開示に包含される。このような配列としては、例えば、残基Ｋ１６９、Ｄ５２９、Ｋ５３５、Ｎ５３８、若しくはＤ８７７にアミノ酸置換、又はこれらの残基の任意の組み合わせに２つ以上の置換を含むＭＡＤ７(商標)配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ＭＡＤ７(商標)配列は、残基Ｋ１６９にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｋ１６９でのアミノ酸置換は、Ｋ１６９Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、ＭＡＤ７(商標)配列は、残基Ｄ５２９にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｄ５２９でのアミノ酸置換は、Ｄ５２９Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、ＭＡＤ７(商標)配列は、残基Ｋ５３５にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｋ５３５でのアミノ酸置換は、Ｋ５３５Ｖ置換である。いくつかの実施形態では、ＭＡＤ７(商標)配列は、残基Ｎ５３８にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｎ５３８でのアミノ酸置換は、Ｎ５３８Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、ＭＡＤ７(商標)配列は、残基Ｄ８７７にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｄ８７７でのアミノ酸置換は、Ｄ８７７Ａ置換である。

【0055】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、例えば、融合タンパク質との関連で)、Ｎ末端メチオニンを欠く配列番号１のアミノ酸配列を含み、本開示にも包含される。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、残基Ｋ１６９、Ｄ５２９、Ｋ５３５、Ｎ５３８、若しくはＤ８７７にアミノ酸置換、又はこれらの残基の任意の組み合わせに２つ以上の置換を含む、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｋ１６９にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｋ１６９でのアミノ酸置換は、Ｋ１６９Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｄ５２９にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｄ５２９でのアミノ酸置換は、Ｄ５２９Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｋ５３５にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｋ５３５でのアミノ酸置換は、Ｋ５３５Ｖ置換である。Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｎ５３８でのアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｎ５３８でのアミノ酸置換は、Ｎ５３８Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、残基Ｄ８７７にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｄ８７７でのアミノ酸置換は、Ｄ８７７Ａ置換である。

【0056】

Ｋ１６９Ｒ、Ｄ５２９Ｒ、Ｋ５３５Ｖ、及びＮ５３８Ｒ変異を含有するＭＡＤ７(商標)(Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ)のアミノ酸配列(配列番号２)

【化2】

【0057】

Ｋ１６９Ｒ、Ｄ５２９Ｒ、Ｋ５３５Ｖ、Ｎ５３８Ｒ、及びＤ８７７Ａ変異を含有するＭＡＤ７(商標)(Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ)のアミノ酸配列(配列番号３)

【化3】

【化4】

【0058】

Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｕ２ＵＭＱ６に対応する、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１の例示的なアミノ酸配列 (配列番号４)

【化5】

【0059】

残基Ｅ１７４、Ｓ５４２、Ｋ５４８、Ｎ５５２、及びＤ９０８は、太字及び下線で示されている。上記に提供されるＣｐｆ１配列のバリアント、又は当技術分野で公知のＣｐｆ１の任意の好適な配列(例えば、融合タンパク質との関連で、Ｎ末端メチオニンを含まない上記配列)も本開示に包含される。このような配列としては、例えば、残基Ｅ１７４、Ｓ５４２、Ｋ５４８、Ｎ５５２、及びＤ９０８にアミノ酸置換、又はこれらの残基の任意の組み合わせに２つ以上の置換を含むＣｐｆ１配列が含まれる。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１配列は、残基Ｅ１７４にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｅ１７４でのアミノ酸置換は、Ｅ１７４Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１配列は、残基Ｓ５４２にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｓ５４２でのアミノ酸置換は、Ｓ５４２Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１配列は、残基Ｋ５４８にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｋ５４８でのアミノ酸置換は、Ｋ５４８Ｖ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１配列は、残基Ｎ５５２にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｎ５５２でのアミノ酸置換は、Ｎ５５２Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１配列は、残基Ｄ９０８にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｄ９０８でのアミノ酸置換は、Ｄ９０８Ａ置換である。

【0060】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、例えば、融合タンパク質との関連で)、Ｎ末端メチオニンを欠く配列番号４のアミノ酸配列を含み、本開示にも包含される。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、残基Ｅ１７４、Ｓ５４２、Ｋ５４８、Ｎ５５２及びＤ９０８にアミノ酸置換、又はこれらの残基の任意の組み合わせに２つ以上の置換を含む、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、残基Ｅ１７４にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｅ１７４でのアミノ酸置換は、Ｅ１７４Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、残基Ｓ５４２にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｓ５４２でのアミノ酸置換は、Ｓ５４２Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、残基Ｋ５４８に置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｋ５４８でのアミノ酸置換は、Ｋ５４８Ｖ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、残基Ｎ５５２にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｎ５５２でのアミノ酸置換は、Ｎ５５２Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含み、残基Ｄ９０８にアミノ置換を含む。いくつかの実施形態では、残基Ｄ９０８でのアミノ酸置換は、Ｄ９０８Ａ置換である。

【0061】

Ｅ１７４Ｒ、Ｓ５４２Ｒ、Ｋ５４８Ｖ、Ｎ５５２Ｒ、及びＤ９０８Ａ変異を含有するＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１の例示的なアミノ酸配列(配列番号５)

【化6】

【0062】

Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ａ０Ａ３５０ＰＳＬ０に対応する、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐｐ．由来のＣｐｆ１の例示的なアミノ酸配列 (配列番号６)。
MAKNFEDFKRLYPLSKTLRFEAKPIGATLDNIVKSGLLEEDEHRAASYVKVKKLIDEYHKVFIDRVLDNGCLPLDDKGDNNSLAEYYESYVSKAQDEDAIKKFKEIQQNLLSIIAKKLTDDKAYANLFGNKLIESYKDKADKTKLIDSDLIQFINTAESTQLVSMSQDEAKELVKEFWGFTTYFEGFFKNRKNMYTPEEKSTGIAYRLINENLPKFIDNMEAFKKAIARPEIQANMEELYSNFSEYLNVESIQEMFLLDYYNMLLTQKQIDVYNAIIGGKTDDEHDVKIKGINEYINLYNQQHKDDKLPKLKALFKQILSDRNAISWLPEEFNSDQEVLNAIKDCYERLAENVLGDKVLKSLLGSLADYSLDGIFIRNDLQLTDISQKMFGNWGVIQNAIMQNIKHVAPARKHKESEEDYEKRIAGIFKKADSFSISYINDCLNEADPNNAYFVENYFATFGAVNTPTMQRENLFALVQNAYTEVAALLHSDYPTVKHLAQDKANVSKIKALLDAIKSLQHFVKPLLGKGDESDKDERFYGELASLWAELDTVTPLYNMIRNYMTRKPYSQKKIKLNFENPQLLGGWDANKEKDYATIILRRNGLYYLAIMDKDSRKLLGKAMPSDGECYEKMVYKFFKDVTTMIPKCSTQLKDVQAYFKVNTDDYVLNSKAFNRPLTITKEVFDLNNVLYGKYKKFQKGYLTATGDNVGYTHAVNVWIKFCMDFLDSYDSTCIYDFSSLKPESYLSLDSFYQDVNLLLYKLSFTDVSASFIDQLVEEGKMYLFQIYNKDFSEYSKGTPNMHTLYWKALFDERNLADVVYKLNGQAEMFYRKKSIENTHPTHPANHPILNKNKDNKKKESLFEYDLIKDRRYTVDKFMFHVPITMNFKSSGSENINQDVKAYLRHADDMHIIGIDRGERHLLYLVVIDLQGNIKEQFSLNEIVNDYNGNTYHTNYHDLLDVREDERLKARQSWQTIENIKELKEGYLSQVIHKITQLMVRYHAIVVLEDLSKGFMRSRQKVEKQVYQKFEKMLIDKLNYLVDKKTDVSTPGGLLNAYQLTCKSDSSQKLGKQSGFLFYIPAWNTSKIDPVTGFVNLLDTHSLNSKEKIKAFFSKFDAIRYNKDKKWFEFNLDYDKFGKKAEDTRTKWTLCTRGMRIDTFRNKEKNSQWDNQEVDLTTEMKSLLEHYYIDIHGNLKDAISTQTDKAFFTGLLHILKLTLQMRNSITGTETDYLVSPVADENGIFYDSRSCGDQLPENADANGAYNIARKGLMLVEQIKDAEDLDNVKFDISNKAWLNFAQQKPYKNG

【0063】

Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ａ０Ｑ７Ｑ２に対応する、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐｐ．由来のＣｐｆ１の例示的なアミノ酸配列(配列番号７)。
MSIYQEFVNKYSLSKTLRFELIPQGKTLENIKARGLILDDEKRAKDYKKAKQIIDKYHQFFIEEILSSVCISEDLLQNYSDVYFKLKKSDDDNLQKDFKSAKDTIKKQISEYIKDSEKFKNLFNQNLIDAKKGQESDLILWLKQSKDNGIELFKANSDITDIDEALEIIKSFKGWTTYFKGFHENRKNVYSSNDIPTSIIYRIVDDNLPKFLENKAKYESLKDKAPEAINYEQIKKDLAEELTFDIDYKTSEVNQRVFSLDEVFEIANFNNYLNQSGITKFNTIIGGKFVNGENTKRKGINEYINLYSQQINDKTLKKYKMSVLFKQILSDTESKSFVIDKLEDDSDVVTTMQSFYEQIAAFKTVEEKSIKETLSLLFDDLKAQKLDLSKIYFKNDKSLTDLSQQVFDDYSVIGTAVLEYITQQIAPKNLDNPSKKEQELIAKKTEKAKYLSLETIKLALEEFNKHRDIDKQCRFEEILANFAAIPMIFDEIAQNKDNLAQISIKYQNQGKKDLLQASAEDDVKAIKDLLDQTNNLLHKLKIFHISQSEDKANILDKDEHFYLVFEECYFELANIVPLYNKIRNYITQKPYSDEKFKLNFENSTLANGWDKNKEPDNTAILFIKDDKYYLGVMNKKNNKIFDDKAIKENKGEGYKKIVYKLLPGANKMLPKVFFSAKSIKFYNPSEDILRIRNHSTHTKNGSPQKGYEKFEFNIEDCRKFIDFYKQSISKHPEWKDFGFRFSDTQRYNSIDEFYREVENQGYKLTFENISESYIDSVVNQGKLYLFQIYNKDFSAYSKGRPNLHTLYWKALFDERNLQDVVYKLNGEAELFYRKQSIPKKITHPAKEAIANKNKDNPKKESVFEYDLIKDKRFTEDKFFFHCPITINFKSSGANKFNDEINLLLKEKANDVHILSIDRGERHLAYYTLVDGKGNIIKQDTFNIIGNDRMKTNYHDKLAAIEKDRDSARKDWKKINNIKEMKEGYLSQVVHEIAKLVIEYNAIVVFEDLNFGFKRGRFKVEKQVYQKLEKMLIEKLNYLVFKDNEFDKTGGVLRAYQLTAPFETFKKMGKQTGIIYYVPAGFTSKICPVTGFVNQLYPKYESVSKSQEFFSKFDKICYNLDKGYFEFSFDYKNFGDKAAKGKWTIASFGSRLINFRNSDKNHNWDTREVYPTKELEKLLKDYSIEYGHGECIKAAICGESDKKFFAKLTSVLNTILQMRNSKTGTELDYLISPVADVNGNFFDSRQAPKNMPQDADANGAYHIGLKGLMLLGRIKNNQEGKKLNLVIKNEEYFEFVQNRNN

【0064】

Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ａ０Ａ７Ｃ９Ｈ０Ｚ９に対応する、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐｐからのＣｐｆ１の例示的なアミノ酸配列(配列番号８)。
MNGNRIIVYREFVGVTPVAKTLRNELRPIGHTQEHIIHNGLIQEDELRQEKSTELKNIMDDYYREYIDKSLSGVTDLDFTLLFELMNLVQSSPSKDNKKALEKEQSKMREQICTHMQSDSNYKNIFNAKFLKEILPDFIKNYNQYDAKDKAGKLETLALFNGFSTYFTDFFEKRKNVFTKEAVSTSIAYRIVHENSLTFLANMTSYKKISEKALDEIEVIEKNNQDKMGDWELNQIFNPDFYNMVLIQSGIDFYNEICGVVNAHMNLYCQQTKNNYNLFKMRKLHKQILAYTSTSFEVPKMFEDDMSVYNAVNAFIDETEKGNIIGKLKDIVNKYDELDEKRIYISKDFYETLSCFMSGNWNLITGCVENFYDENIHAKGKSKEEKVKKAVKEDKYKSINDVNDLVEKYIDEKERNEFKNSNAKQYIREISNIITDTETAHLEYDEHISLIESEEKADEMKKRLDMYMNMYHWAKAFIVDEVLDRDEMFYSDIDDIYNILENIVPLYNRVRNYVTQKPYNSKKIKLNFQSPTLANGWSQSKEFDNNAIILIRDNKYYLAIFNAKNKPDKKIIQGNSDKKNDNDYKKMVYNLLPGANKMLPKVFLSKKGIETFKPSDYIISGYNAHKHIKTSENFDISFCRDLIDYFKNSIEKHAEWRKYEFKFSATDSYNDISEFYREVEMQGYRIDWTYISEADINKLDEEGKIYLFQIYNKDFAENSTGKENLHTMYFKNIFSEENLKDIIIKLNGQAELFYRRASVKNPVKHKKDSVLVNKTYKNQLDNGDVVRIPIPDDIYNEIYKMYNGYIKESDLSGAAKEYLDKVEVRTAQKEIVKDYRYTVDKYFIHTPITINYKVAARNNVNDMAVKYIAQNDDIHVIGIDRGERNLIYISVIDSHGNIVKQKSYNILNNYDYKKKLVEKEKTREYARKNWKSIGNIKELKEGYISGVVHEIAMLMVEYNAIIAMEDLNYGFKRGRFKVERQVYQKFESMLINKLNYFASKGKSVDEPGGLLKGYQLTYVPDNIKNLGKQCGVIFYVPAAFTSKIDPSTGFISAFNFKSISTNDSRKQFFMQFDEIRYCAEKDMFSFGFDYNNFDTYNITMGKTQWTVYTNGERLQSEFNNARRTGKTKSINLTETIKLLLEDNEINYADGHDVRIDMEKMDEDKNSEFFAQLLSLYKLTVQMRNSYTEAEEQEKGISYDKIISPVINDEGEFFDSDNYKESDDKECKMPKDADANGAYCIALKGLYEVLKIKSEWTEDGFDRNCLKLPHAEWLDFIQNKRYE

【0065】

Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ａ６Ｌ５Ｔ６５６に対応する、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｅｃｔａｌｅ由来のＣｐｆ１の例示的なアミノ酸配列(配列番号９)。
MNNGTNNFQNFIGISSLQKTLRNALIPTETTQQFIVKNGIIKEDELRGENRQILKDIMDDYYRGFISETLSSIDDIDWTSLFEKMEIQLKNGDNKDTLIKEQAEKRKAIYKKFADDDRFKNMFSAKLISDILEFVIHNNNYSASEKEEKTQVIKLFSRFATSFKDYFKNRANCFSADDISSSSCHRIVNDNAEIFFSNALVYRRIVKNLSNDDINKISGDMKDSLKEMSLDEIYSYEKYGEFITQEGISFYNDICGKVNSFMNLYCQKNKENKNLYKLRKLHKQILCIADTSYEVPYKFESDEEVYQSVNGFLDNISSKHIVERLRKIGDNYNGYNLDKIYIVSRFYESVSQKTYRDWETINTALEIHYNNILPGNGKSKADKVKKAVKNDLQKSITEINELVSNYKLCPDDNIKAETYIHEISHILNNFEAQELKYNPEIHLVESELKASELKNVLDVIMNAFHWCSVFMTEELVDKDNNFYAELEEIYDEIYPVISLYNLVRNYVTQKPYSTKKIKLNFGIPTLADGWSKSKEYSNNAIILMRDNLYYLGIFNAKNKPDKKIIEGNTSENKGDYKKMIYNLLPGPNKMIPKVFLSSKTGVETYKPSAYILEGYKQNKHLKSSKDFDITFCRDLIDYFKNCIAIHPEWKNFGFDFSDTSTYEDISGFYREVELQGYKIDWTYISEKDIDLLQEKGQLYLFQIYNKDFSKKSTGNDNLHTMYLKNLFSEENLKDIVLKLNGEAEIFFRKSSIKNPIIHKKGSILVNRTYEAEEKDQFGNIQIVRKTIPENIYQELYKYFNDKSDKELSDEAAKLKNVVGHHEAATNIVKDYRYTYDKYFLHMPITINFKANKTSFINDRILQYIAKEKDLHVIGIDRGERNLIYVSVIDICGNIVEQKSFNIVNGYDYQIKLKQQEGARQIARKEWKEIGKIKEIKEGYLSLVIHEISKMVIKYNAIIAMEDLSYGFKKGRFKVERQVYQKFETMLINKLNYLVFKDISITENGGLLKGYQLTYIPDKLKNVGHQCGCIFYVPAAYTSKIDPTTGFVNIFKFKDLTVDAKREFIKKFDSIRYDSDKNLFCFTFDYNNFITQNTVMSKSSWSVYTYGVRIKRRFVNGRFSNESDTIDITKDMEKTLEMTDINWRDGHDLRQDIIDYEIVQHIFEIFKLTVQMRNSLSELEDRDYDRLISPVLNENNIFYDSAKAGDALPKDADANGAYCIALKGLYEIKQITENWKEDGKFSRDKLKISNKDWFDFIQNKRYL

【0066】

Ｃｐｆ１酵素の天然に存在するバリアント及び修飾バリアントの両方が、本開示の態様による使用に好適である。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ドメインのヌクレアーゼ活性を低減又は除去するように修飾される。触媒的に不活性なＣａｓヌクレアーゼは、「デッド(ｄｅａｄ)Ｃａｓ１２」「ｄＣａｓ１２」、「デッドＣｐｆ１」、又は「ｄＣｐｆ１」と称され得る。いくつかの実施形態では、不活性Ｃａｓヌクレアーゼは、「デッドＣａｓφ」又は「ｄＣａｓφ」である。ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインを生成するために、変異を含有するＣｐｆ１ドメイン(例えば、野生型Ｃｐｆ１ドメイン)と比較してヌクレアーゼ活性が低減するように、Ｃｐｆ１の１つ以上のアミノ酸の任意の変異(例えば、挿入、欠失、逆位、又は置換)を作製することができる。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、検出可能なヌクレアーゼ活性を有しない。Ｃｐｆ１酵素のヌクレアーゼ活性を低減又は除去する例示的な変異は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ(２０１７)８：２０９５を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１(ＡｓＣｐｆ１)の位置９０８(Ｄ９０８と称される)のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基の変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号４によって提供された、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１(ＡｓＣｐｆ１)の位置９０８(Ｄ９０８と称される)のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基の変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号４によって提供された、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１(ＡｓＣｐｆ１)の位置９０８のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基のアスパラギン酸以外の任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、配列番号４によって提供された、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１(ＡｓＣｐｆ１)の位置９０８のアスパラギン酸残基に対応するアミノ酸残基のアラニン残基への置換を含む(「Ｄ９０８Ａ」と称される)。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性を欠くデッドＣａｓφを生成するために、Ｃａｓφタンパク質は、ＲｕｖＣドメインにＤ３７１Ａ及びＤ３９４Ａを含むように操作される(例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｐａｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．(２０２０)３６９：３３３－３３７を参照されたい。)。

【0067】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)酵素(Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ)に基づく。こうした実施形態では、酵素のヌクレアーゼ活性の低減又は除去をもたらす例示的な変異は、配列番号１によって提供されたＭＡＤ７(商標)の位置８７７のアスパラギン酸残基の、アスパラギン酸以外の任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)酵素(Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ)に基づいており、配列番号１によって提供されたＭＡＤ７(商標)の位置８７７のアスパラギン酸残基の、アラニン残基への置換(Ｄ８７７Ａと称される)を含む。

【0068】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、例えば、ゲノム編集活性の調節、編集効率の調節、及び/又はオフターゲット効果の低減のための１つ以上の変異を含む。例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．(２０１９)３７：２７６－２８２を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、対応する野生型Ｃｐｆ１ヌクレアーゼと比較して１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、対応する野生型Ｃｐｆ１ドメインと比較して、Ｃｐｆ１ドメインに１つ以上の置換を含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、対応する野生型Ｃｐｆ１ドメインと比較して、Ｃｐｆ１ドメインのうちの少なくとも１つ(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上)のアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１７４、５４２、５４８、又は５５２に対応するアミノ酸(Ｅ１７４、Ｓ５４２、Ｋ５４８、及びＮ５５２と称する)のうちの１つ、２つ、３つ、又は各々にアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ由来のＣｐｆ１の位置１７４のグルタミン酸に対応するアミノ酸残基の、グルタミン酸以外の任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ由来のＣｐｆ１の位置１７４のグルタミン酸に対応するアミノ酸残基の、アルギニン残基への置換(Ｅ１７４Ｒ)を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ由来のＣｐｆ１の位置５４２のセリンに対応するアミノ酸残基の、セリン以外の任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ由来のＣｐｆ１の位置５４２のセリンに対応するアミノ酸残基の、アルギニン残基への置換(Ｓ５４２Ｒ)を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ由来のＣｐｆ１の位置５４８のリジンに対応するアミノ酸残基の、リジン以外の任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ由来のＣｐｆ１の位置５４８のリジンに対応するアミノ酸残基の、バリン残基への置換(Ｋ５４８Ｖ)を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ由来のＣｐｆ１の位置５５２のアスパラギンに対応するアミノ酸残基の、アスパラギン以外の任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、これは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ由来のＣｐｆ１の位置５５２のアスパラギンに対応するアミノ酸残基の、アルギニン残基への置換(Ｎ５５２Ｒ)を含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ由来のＣｐｆ１の位置１７４、５４２、５４８、及び５５２の各々に対応するアミノ酸残基の、任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ｅ１７４Ｒ、Ｓ５４２Ｒ、Ｋ５４８Ｖ、及びＮ５５２Ｒの各々に対応する置換変異を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、対応する野生型ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列と比較して、Ｃｐｆ１ドメインの少なくとも１つ(例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上)のアミノ酸の置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１６９、５２９、５３５、又は５３８に対応するアミノ酸(Ｅ１６９、Ｄ５２９、Ｋ５３５、及びＮ５３８と称する)のうちの１つ、２つ、３つ、又は各々にアミノ酸の置換を含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１６９のグルタミン酸に対応するアミノ酸残基の、グルタミン酸以外の任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１６９のグルタミン酸に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換(Ｅ１６９Ｒ)を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置５２９のアスパラギン酸に対応するアミノ酸残基の、アスパラギン酸以外の任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置５２９のアスパラギン酸に対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換(Ｄ５２９Ｒ)を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置５３５のリジンに対応するアミノ酸残基の、リジン以外の任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置５３５のリジンに対応するアミノ酸残基のバリン残基への置換(Ｋ５３５Ｖ)を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置５３８のアスパラギンに対応するアミノ酸残基の、アスパラギン以外の任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置５３８のアスパラギンに対応するアミノ酸残基のアルギニン残基への置換(Ｎ５３８Ｒ)を含む。

【0073】

いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、ＭＡＤ７(商標)Ｃｐｆ１アミノ酸配列の位置１６９、５２９、５３５、又は５３８の各々に対応するアミノ酸残基の、任意の他のアミノ酸残基への置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１ドメインは、Ｋ１６９、Ｄ５２９Ｒ、Ｋ５３５Ｖ、及びＮ５３８Ｒの各々に対応する置換変異を含む。

【0074】

いくつかの実施形態では、第１のＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１～９のうちのいずれか、又はそれらのいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性若しくはそれ以上の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のＣｐｆ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１～９のうちのいずれか、又はそれらのいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性若しくはそれ以上の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、キメラポリペプチドは、配列番号１～９のうちのいずれかのアミノ酸配列、又はそれらのいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性若しくはそれ以上の同一性を有する配列を含む。

【0075】

エンドヌクレアーゼドメイン
本明細書に記載される融合ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインと、エンドヌクレアーゼドメインと、ゲノム修飾ドメインとを含む。本明細書で使用される場合、エンドヌクレアーゼドメインは、２つのヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断することができ、ポリヌクレオチドに一本鎖又は二本鎖の切断をもたらす酵素又はその部分を指す。概して、エンドヌクレアーゼは、配列特異的又は配列非依存的な様式で２つのヌクレオチド間を切断し得る。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、特定のヌクレオチド配列(すなわち、認識部位)の認識後に、２つのヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断する。いくつかの実施形態では、配列特異的な様式で２つのヌクレオチド間で切断するエンドヌクレアーゼは、制限酵素又は制限エンドヌクレアーゼと称され得る。

【0076】

エンドヌクレアーゼは、典型的には、認識部位の構造、認識部位に対する切断の位置、及びエンドヌクレアーゼ活性が任意の酵素補因子の存在を必要とするかどうかなどの要因に基づいて分類される。エンドヌクレアーゼのタイプの例としては、１型エンドヌクレアーゼ、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型エンドヌクレアーゼ、ＩＶ型エンドヌクレアーゼ、及びＶ型エンドヌクレアーゼが挙げられる。

【0077】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼ又はそのドメインを含む。ＩＩ型エンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成し、認識部位の近く(例えば、認識部位の１、２、３、４、又は５ヌクレオチド以内)又は認識部位内の位置で核酸を認識して切断し、その結果ポリヌクレオチドの二本鎖切断が生じる。ＩＩ型エンドヌクレアーゼのサブタイプとしては、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、ＩＩＣ型、ＩＩＥ型、ＩＩＦ型、ＩＩＧ型、ＩＩＨ型、ＩＩＭ型、ＩＩＰ型、ＩＩＳ型、及びＩＩＴ型が挙げられる。例えば、Ｐｉｎｇｏｕｄ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ(２０１４)４２(１２)：７４８９－７５２７を参照されたい。

【0078】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、ＩＩ型エンドヌクレアーゼなどの制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼ又はその一部分を含む。ＩＩＳ型制限酵素は、ＤＮＡ結合ドメインを含むサブユニットと、ＤＮＡ切断ドメインを含むサブユニットとの、２つ以上のサブユニットから構成されることを特徴とする。任意の特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、一般に、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインを介して特定の認識部位と相互作用し、ホモ二量体を形成し、認識部位の近くの２つのヌクレオチド間でホスホジエステル結合を切断すると考えられている。ＩＩＳ型制限酵素の非限定的な例としては、ＦｏｋＩ、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｓＩ－ＨＦ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｌＶＩ、ＢｃｏＤＩ、Ｂｆｉ１、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ－ＨＦｖ２、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ－ｖ２、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ－ｖ２、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｕＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰａｑＣＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、及びＳｆａＮＩが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼ又はその一部分を含む。

【0080】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼ酵素の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上を含む制限エンドヌクレアーゼの一部分である。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ切断ドメイン、二量体形成ドメイン、及び触媒部位などの制限エンドヌクレアーゼの１つ以上のドメインである。

【0081】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第２のＤＮＡ切断ドメインと二量体を形成することができる第１のＤＮＡ切断ドメインを含み、この第２のＤＮＡ切断ドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメインと同じアミノ酸配列、又は第１のＤＮＡ切断ドメインと比較して異なるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドのエンドヌクレアーゼドメインは、第２のＤＮＡ切断ドメインと二量体を形成することができる第１のＤＮＡ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドのエンドヌクレアーゼドメインは、別個のポリペプチド中に存在する第２のＤＮＡ切断ドメインと二量体を形成することができる第１のＤＮＡ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドのエンドヌクレアーゼドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインを含み、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインは、互いに二量体を形成することができる(例えば、同じ融合ポリペプチド内)。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドのエンドヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを含まない。

【0082】

いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインの二量体は、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を生成する。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインの二量体は、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を生成する。こうした一本鎖切断活性は、「ニッカーゼ」と呼ばれる場合がある。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインの二量体は、標的ＤＮＡに二本鎖切断を生成する。

【0083】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ又はその一部分を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩのＤＮＡ結合ドメインを含まない。ＦｏｋＩは、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｋｅａｎｏｋｏｉｔｅｓから単離されたＩＩＳ型制限酵素である。野生型ＦｏｋＩの各単量体は、ＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインを有する。野生型ＦｏｋＩは二量体を形成し、各単量体はＤＮＡの一本鎖を切断し、標的ＤＮＡの二本鎖切断をもたらす。例えば、Ｗａｈ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ(１９９８)９５(１８)：１０５６４－１０５６９を参照されたい。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインの第１のＤＮＡ切断ドメイン及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインであるか、又はＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインに由来する。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩのＤＮＡ結合ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、付随するＣｐｆ１ドメインの不在下でＤＮＡと複合体を形成及び/又は維持することができない。

【0084】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、天然又は野生型エンドヌクレアーゼドメイン配列と比較して遺伝子修飾されている。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、対応する野生型ＤＮＡ切断ドメイン配列と比較して１つ以上の修飾(例えば、変異、置換、欠失、挿入)を含む。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメイン又は第２のＤＮＡ切断ドメインのうちの少なくとも１つがエンドヌクレアーゼ活性を低減又は除去する(例えば、ホスホジエステル結合を切断しない)ように、エンドヌクレアーゼドメイン(又はＤＮＡ切断ドメイン)の活性を調節するための１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメインがエンドヌクレアーゼ活性を低減又は除去する(例えば、ホスホジエステル結合を切断しない)ように、１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、第２のＤＮＡ切断ドメインは、第２のＤＮＡ切断ドメインがエンドヌクレアーゼ活性を低減又は除去する(例えば、ホスホジエステル結合を切断しない)ように、１つ以上の修飾を含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメインがエンドヌクレアーゼ活性を低減又は除去する(例えば、ホスホジエステル結合を切断しない)ように、１つ以上の修飾を含み、第２のＤＮＡ切断ドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインの二量体が標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断を生じないように、野生型又は実質的に野生型のエンドヌクレアーゼ活性(例えば、機能的エンドヌクレアーゼ活性、ホスホジエステラーゼ結合を切断することができる)を含む。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメインがエンドヌクレアーゼ活性を低減又は除去する(例えば、ホスホジエステル結合を切断しない)ように、１つ以上の修飾を含み、第２のＤＮＡ切断ドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインの二量体が標的ＤＮＡにおいて一本鎖切断を生じることができる(例えば、ニッカーゼである)ように、野生型又は実質的に野生型のエンドヌクレアーゼ活性(例えば、機能的エンドヌクレアーゼ活性、ホスホジエステラーゼ結合を切断することができる)を含む。いくつかの実施形態では、第２のＤＮＡ切断ドメインは、第２のＤＮＡ切断ドメインがエンドヌクレアーゼ活性を低減又は除去する(例えば、ホスホジエステル結合を切断しない)ように、１つ以上の修飾を含み、第１のＤＮＡ切断ドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインの二量体が標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断を生じないように、野生型又は実質的に野生型のエンドヌクレアーゼ活性(例えば、機能的エンドヌクレアーゼ活性、ホスホジエステラーゼ結合を切断することができる)を含む。いくつかの実施形態では、第２のＤＮＡ切断ドメインは、第２のＤＮＡ切断ドメインがエンドヌクレアーゼ活性を低減又は除去する(例えば、ホスホジエステル結合を切断しない)ように、１つ以上の修飾を含み、第１のＤＮＡ切断ドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインの二量体が標的ＤＮＡにおいて一本鎖切断を生じることができる(例えば、ニッカーゼである)ように、野生型又は実質的に野生型のエンドヌクレアーゼ活性(例えば、機能的エンドヌクレアーゼ活性、ホスホジエステラーゼ結合を切断することができる)を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメインのエンドヌクレアーゼ活性を低減又は除去する(例えば、ホスホジエステル結合を切断しない)１つ以上の修飾を含む。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメインは、低減又は除去されたエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ切断ドメインをもたらす１つ以上(例えば、１、２、３、４、５、又はそれ以上)の変異を含む。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメインは、低減又は除去されたエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ切断ドメインをもたらす１つ以上(例えば、１、２、３、４、５以上)のアミノ酸の変異を含む。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメインは、低減又は除去されたエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ切断ドメインをもたらすＤＮＡ切断ドメインの触媒部位(活性部位)における１つ以上(例えば、１、２、３、４、５以上)のアミノ酸の変異を含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩ又はその一部分を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩのＤＮＡ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩのＤＮＡ結合ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩからの第１のＤＮＡ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩからの第２のＤＮＡ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＦｏｋＩからの第１のＤＮＡ切断ドメイン及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、例えば、ＦｏｋＩからの野生型ＤＮＡ切断ドメイン(変異を含まない)と比較して、低減された又は除去されたエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ切断ドメインをもたらす、１つ以上(例えば、１、２、３、４、５又はそれ以上)のアミノ酸の変異を含む。ＦｏｋＩ二量体の単量体のエンドヌクレアーゼ活性を損なうＤＮＡ切断ドメインにおける変異は、特定のＤＮＡ鎖にＤＮＡ切断(ニッキング)を誘導し得る。例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Ｓａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．(２００９)３７(７)：２１０５－２１１５を参照されたい。

【0088】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、配列番号１０～１４のアミノ酸配列、又は配列番号１０～１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の同一性を有する配列を含む。 いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、配列番号１０～１４のアミノ酸配列、又は配列番号１０～１４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくはそれ以上の同一性を有する配列を含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、ＦｏｋＩからのＤＮＡ切断ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、配列番号１０～１４のアミノ酸配列を含み、例えば、それぞれ、配列番号１０又は１１と比較して、ＤＮＡ切断ドメインの触媒部位(活性部位)に１つ以上のアミノ酸(例えば、１、２、３、４、５、又はそれ以上)の置換変異を含み、その結果、エンドヌクレアーゼ活性が低減又は除去されたＤＮＡ切断ドメインが生じる。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を含み、配列番号１０のアミノ酸位置番号４５０におけるアスパラギン酸残基(これは、Ｄ４５０とも呼ばれ得る)の置換を含む。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を含み、アミノ酸位置番号４５０におけるアスパラギン酸残基のアラニンへの置換(これは、Ｄ４５０Ａとも呼ばれ得る)を含む。いくつかの実施形態では、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び/又は第２のＤＮＡ切断ドメインは、配列番号１０のアミノ酸位置番号４５０におけるアスパラギン酸残基(これは、Ｄ４５０とも呼ばれ得る)に対応するアミノ酸残基の置換を含む。例示的なＦｏｋＩ及びＦｏｋＩ切断ドメイン配列は、以下の配列番号１０及び１１において、位置４５０のアスパラギン酸残基を下線付き太字で示して提供される。

【0090】

ＦｏｋＩの例示的なアミノ酸配列(配列番号１０)

【化7】

【0091】

ＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインの例示的なアミノ酸配列(配列番号１１)：

【化8】

【0092】

ＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン変異体(Ｄ４５０Ａ)の例示的なアミノ酸配列(配列番号１２)

【化9】

【0093】

ＦｏｋＩニッカーゼ(リンカーによって分離されたＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン変異体(Ｄ４５０Ａ)及びＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン)を含むエンドヌクレアーゼドメインの例示的なアミノ酸配列(配列番号１３)。第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され、ポリペプチドリンカーは斜体で示され、第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは太字で示される。Ｄ４５０Ａ変異は、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインにおいて、二重下線付き太字で示されている。

【化10】

(配列番号１３)

【0094】

ＦｏｋＩニッカーゼ(リンカーによって分離されたＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン及びＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン変異体(Ｄ４５０Ａ))を含むエンドヌクレアーゼドメインの例示的なアミノ酸配列(配列番号１４)。第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され、ポリペプチドリンカーは斜体で示され、第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは太字で示される。Ｄ４５０Ａ変異は、第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインに下線付きの太字で示されている。

【化11】

(配列番号１４)

【0095】

ゲノム修飾ドメイン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及びゲノム修飾ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「ゲノム修飾ドメイン」は、宿主細胞のゲノムに修飾をもたらすことができる酵素又はその部分を指す。エピジェネティック修飾因子(例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンメチラーゼ、又はそれらのいずれかの機能的部分若しくは組み合わせ)、並びに核酸若しくはポリヌクレオチドを修飾する酵素、及び/又はヘリカーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、リガーゼ、転写因子などの核酸若しくはポリヌクレオチドに作用する酵素を含む、ゲノム修飾ドメインの例。

【0096】

いくつかの実施形態では、ゲノム修飾ドメインは、ポリヌクレオチドの核酸塩基を修飾する酵素又はその部分を指し得る、塩基エディターを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾ドメインは、２つ以上の塩基エディタードメイン、又は塩基編集ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾ドメインは、デアミナーゼ酵素又はその部分を含み、これは脱アミノ化反応を触媒することができる。一般に、シトシン又はアデノシンデアミナーゼなどのデアミナーゼは、特定の核酸塩基、例えば、Ｃ又はＡヌクレオチドのシトシン又はアデノシン核酸塩基を標的とし、脱アミノ化する。「塩基編集」方法では、特定の核酸塩基の脱アミノ化により、細胞ミスマッチ修復機構を介して、ＣからＴヌクレオチドへの変化、又はＡからＧヌクレオチドへの変化が生じる。例えば、Ｋｏｍｏｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ(２０１６)５３３：４２０－４２４、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．(２０１８)１９(１２)：７７０－７８８、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．(２０２０)３８：８２４－８４４を参照されたい。

【0097】

塩基エディターは、典型的には、機能ドメイン、例えば、デアミナーゼドメインに融合された触媒的に不活性又は部分的に不活性なＣａｓヌクレアーゼを含む。例えば、Ｅｉｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．(２０１８)４７５(１１)： １９５５－１９６４、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ(２０１８)１９：７７０－７８８を参照されたい。本明細書に記載される融合ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及び塩基編集ドメイン(例えば、デアミナーゼ)であり得るゲノム修飾ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、シチジンデアミナーゼ又はその部分を含む。このような融合ポリペプチドは、シトシン塩基エディター(ＣＢＥ)と称され得る。一般に、シチジンデアミナーゼは、シチジン又はデオキシシチジンのウリジン又はデオキシウリジンへの加水分解を触媒する。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ウラシルへのシトシンの加水分解を触媒する。

【0098】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、アデニンデアミナーゼ又はその部分を含む。こうした融合ポリペプチドは、アデニン塩基エディター(ＡＢＥ)と称され得る。一般に、アデノシンデアミナーゼは、デオキシアデノシン残基におけるアデニンの脱アミノ化を触媒する。いくつかの実施形態では、アデニンデアミナーゼは、アデノシンのイノシンへの変換を触媒する。いくつかの実施形態では、アデニンデアミナーゼは、ｔＲＮＡアデノシンデアミナーゼ(ＴａｄＡ)又はそのバリアント(例えば、ＴａｄＡ２．１などの進化したバリアント)である。

【0099】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、アデニンデアミナーゼ及びシチジンデアミナーゼ、又はそれらの一部を含む。このような融合ポリペプチドは、アデニン及びシトシン塩基エディターと称され得る。

【0100】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、アデニンデアミナーゼ、及びシチジンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、シチジンデアミナーゼ、及びアデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃａｓヌクレアーゼ、アデニンデアミナーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、及びシチジンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃａｓヌクレアーゼ、アデニンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃａｓヌクレアーゼ、シチジンデアミナーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、及びアデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃａｓヌクレアーゼ、シチジンデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、Ｃａｓヌクレアーゼ、アデニンデアミナーゼ、及びシチジンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、Ｃａｓヌクレアーゼ、シチジンデアミナーゼ、及びアデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、アデニンデアミナーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼ、及びシチジンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、アデニンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、及びＣａｓヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、シチジンデアミナーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼ、及びアデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、シチジンデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ、及びＣａｓヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、アデニンデアミナーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、及びシチジンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、アデニンデアミナーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼ、シチジンデアミナーゼ、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、アデニンデアミナーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、Ｃａｓヌクレアーゼ、及びシチジンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、アデニンデアミナーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、シチジンデアミナーゼ、及びＣａｓヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、アデニンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、アデニンデアミナーゼ、シチジンデアミナーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、及びＣａｓヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、シチジンデアミナーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、及びアデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、シチジンデアミナーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼ、アデニンデアミナーゼ、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、シチジンデアミナーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、Ｃａｓヌクレアーゼ、及びアデニンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、シチジンデアミナーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、アデニンデアミナーゼ、及びＣａｓヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、シチジンデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ、エンドヌクレアーゼドメイン、及びＣａｓヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、シチジンデアミナーゼ、アデニンデアミナーゼ、Ｃａｓヌクレアーゼ、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。

【0101】

本明細書に記載される融合ポリペプチドで使用するためのシチジンデアミナーゼ及び/又はアデノシンデアミナーゼは、当該技術分野で既知の任意の供給源から取得され得る。例えば、いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ及び/若しくはアデノシンデアミナーゼ、又はそれらの部分は、天然デアミナーゼ由来であるか、又は天然デアミナーゼのバリアントである。いくつかの実施形態では、シチジンデアミナーゼ及び/又はアデノシンデアミナーゼ、又はそれらの部分は、天然には発生しない操作された又は合成デアミナーゼである。

【0102】

本明細書に記載される融合ポリペプチドで使用するための好適なゲノム修飾ドメインの追加の例は、限定されないが、次の例示的な塩基エディターに見出すことができる：ＢＥ１、ＢＥ２、ＢＥ３、ＨＦ－ＢＥ３、ＢＥ４、ＢＥ４ｍａｘ、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ、ＢＥ４－Ｇａｍ、ＹＥ１－ＢＥ３、ＥＥ－ＢＥ３、ＹＥ２－ＢＥ３、ＹＥＥ－ＣＥ３、ＶＱＲ－ＢＥ３、ＶＲＥＲ－ＢＥ３、ＳａＢＥ３、ＳａＢＥ４、ＳａＢＥ４－Ｇａｍ、Ｓａ(ＫＫＨ)－ＢＥ３、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ、Ｔａｒｇｅｔ－ＡＩＤ－ＮＧ、ＡＩＤ、ＣＤＡ１、ＡＰＯＢＥＣ－１、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ｘＢＥ３、ｅＡ３Ａ－ＢＥ３、ＢＥ－ＰＬＵＳ、ＴＡＭ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｘ、ＡＢＥ７．９、ＡＢＥ７．１０、ＡＢＥ７．１０＊、ｘＡＢＥ、ＡＢＥＳａ、ＶＱＲ－ＡＢＥ、ＶＲＥＲ－ＡＢＥ、Ｓａ(ＫＫＨ)－ＡＢＥ、及びＣＲＩＳＰＲ－ＳＫＩＰ。塩基エディターの追加の例は、例えば、米国出願公開第２０１８/０３１２８２５Ａ１号、米国出願公開第２０１８/０３１２８２８Ａ１号、及びＰＣＴ公開第２０１８/１６５６２９Ａ１号で見出すことができ、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾は、ＡＰＯＢＥＣ(アポリポタンパク質Ｂ編集複合体触媒サブユニット１、ＡＰＯＢＥＣ－１とも呼ばれる)、ｐｍＣＤＡ１、又は活性化誘導シチジンデアミナーゼ(ＡＩＤ)などのシトシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾は、ＴａｄＡなどのアデニンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤(ＵＧＩ)を含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼは、アデニン塩基エディター(ＡＢＥ)、例えば、ＲＮＡアデニンデアミナーゼＴａｄＡから進化したＡＢＥを含む。

【0103】

いくつかの実施形態では、ゲノム修飾ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列、又はそれらのいずれかと少なくとも８０、８５、９０、９５、若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。

【0104】

ＡＰＯＢＥＣ－１の例示的なアミノ酸配列(配列番号１５)
GSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK

【0105】

リンカードメイン
本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかは、１つ以上のリンカードメインを更に含み得る。リンカードメインは、２つのポリペプチドドメインを結合することができるアミノ酸配列である。概して、リンカードメインは、例えば、ポリペプチドの隣接するドメイン又は機能的領域を結合するために使用されてもよく、結合ドメイン又は領域が独立して機能するような柔軟性(又は剛直性)のレベルを可能にし得る。

【0106】

例示的なリンカードメインは、例えば、Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ(２０１３)Ｏｃｔ．１５ ６５(１０)：１３５７－１３６９に記載されているが、当業者はこの開示によって限定されないであろう。リンカーは、任意の好適なアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、柔軟なリンカーである。柔軟なリンカーは、典型的には、それぞれグリシン(Ｇｌｙ)及びセリン(Ｓｅｒ)又はトレオニン(Ｔｈｒ)などの小さなアミノ酸及び/又は極性アミノ酸を主に含む。これにより、得られる融合ポリペプチドにおける柔軟性及び溶解性が促進される。柔軟なリンカードメインの例としては、グリシンリンカー(例えば、(Ｇｌｙ)_８リンカー)(配列番号５４)、セリンリンカー、グリシン－セリンリンカー(例えば、(Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ)_ｎ(配列番号５５)及び(Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ)_４(配列番号５６)リンカー)、並びにグリシン－セリンリッチリンカー(例えば、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ(配列番号１６)、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ(配列番号１７)、及びＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ(配列番号１８))が挙げられるが、これらに限定されない。

【0107】

いくつかの実施形態では、リンカードメインは、約１～約１００、約３～約２０、約５～約３０、約５～約１８、又は約３～約８アミノ酸長のＧｌｙ/Ｓｅｒリンカーであり、グリシン残基及び/又はセリン残基で連続して構成されている。したがって、Ｇｌｙ/Ｓｅｒリンカーは、グリシン残基及び/又はセリン残基から構成され得る。Ｇｌｙ/Ｓｅｒリンカーは、ＧＧＧＧＳのアミノ酸配列(配列番号１９)を含み、リンカー内に複数の配列番号１９が存在してもよい。任意のリンカー配列は、Ｃｐｆ１ドメインとエンドヌクレアーゼドメインの間、及び/又は第１のＤＮＡ切断ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインの間など、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかの任意の２つのドメイン又は機能領域の間のスペーサーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、領域リンカーは、(［Ｇ］_ｘ［Ｓ］_ｙ)_ｚ(配列番号５７)であり、例えば、式中、ｘが１～１０であり得、７が１～３であり得、ｚが１～５であり得る。いくつかの実施形態では、リンカー領域は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号２０)を含む。いくつかの実施形態では、リンカー領域は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ(配列番号２１)を含む。

【0108】

いくつかの実施形態では、リンカーは、様々な長さの親水性残基からなる非構造化ポリペプチドである、ＸＴＥＮリンカーである。ＸＴＥＮペプチドのアミノ酸配列は、当業者に明らかであり、例えば、米国特許第８，６７３，８６０号に見出すことができ、この特許は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮリンカーは、配列番号２２によって提供される。

【0109】

ＸＴＥＮリンカーのアミノ酸配列(配列番号２２)
SGSETPGTSESATPES

【0110】

例示的なリンカードメインのアミノ酸配列(配列番号２３)
GSGSGSGSITRTTNPRNVVPKIYMSAGSIPLTTHITNSIQPTLWTIGSINGVAPLAKSIKLGIPVTGSAYTDQTTAMVRKKVSVFMGSGSGSGSS

【0111】

いくつかの実施形態では、リンカードメインは、剛直なリンカーである。剛直なリンカーの非限定的な例は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｔａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．(２０１９)１０：４３９に見出すことができる。剛直なリンカーは、プロリン(Ｐｒｏ)残基を含むことが多く、これは二級アミンを含有するため、タンパク質配列の剛直性に寄与する。

【0112】

融合ポリペプチド
本明細書に記載されるドメインは、ドメインの各々がそのそれぞれの機能を実行することができるように、本明細書に記載される融合ポリペプチドにおいて任意の順序(Ｎ末端からＣ末端に)で配置され得る。

【0113】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼドメインのＮ末端に位置するＣｐｆ１ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ切断ドメインと、ＤＮＡ切断ドメインのＮ末端に位置するＣｐｆ１ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメイン、並びに第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインの両方のＮ末端に位置するＣｐｆ１ドメインを含む。

【0114】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、Ｃｐｆ１ドメインのＮ末端に位置するエンドヌクレアーゼドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ切断ドメインと、Ｃｐｆ１ドメインのＮ末端に位置するＤＮＡ切断ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインを含み、第１のＤＮＡ切断ドメイン及び第２のＤＮＡ切断ドメインは両方とも、Ｃｐｆ１ドメインのＮ末端に位置する。

【0115】

本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかは、ゲノム修飾ドメインを更に含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、Ｃｐｆ１ドメインのＮ末端に位置するゲノム修飾ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼドメインのＮ末端に位置するゲノム修飾ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドは、Ｃｐｆ１ドメインとエンドヌクレアーゼドメインの間に位置するゲノム修飾を含んでもよい。

【0116】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃｐｆ１ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及びゲノム修飾ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃｐｆ１ドメイン、ゲノム修飾ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、エンドヌクレアーゼドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、及びゲノム修飾ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、ゲノム修飾ドメイン、及びＣｐｆ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ゲノム修飾ドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ゲノム修飾ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及びＣｐｆ１ドメインを含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及びゲノム修飾ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメイン、ゲノム修飾ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメイン、及びゲノム修飾ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、ゲノム修飾ドメイン、及び配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ゲノム修飾ドメイン、配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ゲノム修飾ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及び配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメインを含む。

【0118】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃｐｆ１ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及び脱アミノ化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、Ｃｐｆ１ドメイン、脱アミノ化ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、及び脱アミノ化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、脱アミノ化ドメイン、及びＣｐｆ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、脱アミノ化ドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、脱アミノ化ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及びＣｐｆ１ドメインを含む。

【0119】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及び脱アミノ化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメイン、脱アミノ化ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメイン、及び脱アミノ化ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、エンドヌクレアーゼドメイン、脱アミノ化ドメイン、及び配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、脱アミノ化ドメイン、配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、脱アミノ化ドメイン、エンドヌクレアーゼドメイン、及び配列番号３又は５のうちのいずれかを含むＣｐｆ１ドメインを含む。

【0120】

本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかは、１つ以上のリンカードメインを更に含み得る。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｃｐｆ１ドメインとエンドヌクレアーゼドメインとの間にリンカードメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｃｐｆ１ドメインとゲノム修飾ドメインとの間にリンカードメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼドメインとゲノム修飾ドメインとの間にリンカードメインを含む。

【0121】

いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第１のＤＮＡ切断ドメインと第２のＤＮＡ切断ドメインとの間にリンカードメインを含む。
本開示の例示的な融合ポリペプチドのアミノ酸配列を以下に提供する。

【0122】

１．構築物Ａ
本明細書に記載される例示的な融合ポリペプチドは、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン、ポリペプチドリンカー、Ｄ４５０Ａ変異を含む第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン、ＸＴＥＮリンカー、及びヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインを含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２４に示される配列を含むアミノ酸配列、又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。以下の配列番号２４では、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され、ポリペプチドリンカーは斜体で示され、Ｄ４５０Ａ変異を含有する第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され(変異は太字で示される)、ＸＴＥＮリンカーは斜体で示され、ヌクレアーゼ活性を欠くＡｓＣｐｆ１は太字で示される。本明細書の配列記述で使用される「ＦｏｋＩＩ」は、第１又は第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインにおける変異の存在又は不在に関係なく、例示的な構築物(ＮからＣ)における第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインを指す。

【0124】

構築物Ａのアミノ酸配列：ＦｏｋＩ(Ｄ４５０)－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(Ｄ４５０Ａ)－ＸＴＥＮリンカー－ＡｓＣｐｆ１(Ａ)(配列番号２４)

【化12】

【0125】

２．構築物Ｂ
本明細書に記載される例示的な融合ポリペプチドは、ＡＰＯＢＥＣ－１塩基エディター、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン、ＸＴＥＮリンカー、Ｄ４５０Ａ変異を含む第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン、ポリペプチドリンカー、及び第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインを含む。

【0126】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２５に示される配列を含むアミノ酸配列、又は配列番号２５に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。以下の配列番号２５では、ＡＰＯＢＥＣ－１塩基エディターは下線で示され、リンカー配列は斜体で示され、ヌクレアーゼ活性を欠くＡｓＣｐｆ１は太字で示され、ＸＴＥＮリンカーは斜体で示され、Ｄ４５０Ａ変異を含有する第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され(変異は太字で示される)、ポリペプチドリンカーは斜体で示され、第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示される。

【0127】

構築物Ｂのアミノ酸配列：ＡＰＯＢＥＣ塩基エディター－ＡｓＣｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)－ＸＴＥＮ－ＦｏｋＩ(Ｄ４５０Ａ)－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(Ｄ４５０)(配列番号２５)

【化13】

【0128】

３．構築物Ｃ
本明細書に記載される例示的な融合ポリペプチドは、ＡＰＯＢＥＣ－１塩基エディター、ヌクレアーゼ活性を欠くＭＡＤ７(商標)塩基のドメイン、ＸＴＥＮリンカー、Ｄ４５０Ａ変異を含む第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン、ポリペプチドリンカー、及び第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２６に示される配列を含むアミノ酸配列、又は配列番号２６に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。以下の配列番号２６では、ＡＰＯＢＥＣ－１塩基エディターは下線で示され、リンカー配列は斜体で示され、ヌクレアーゼ活性を欠くＭａｄ７(商標)塩基のドメインは太字で示され、ＸＴＥＮリンカーは斜体で示され、Ｄ４５０Ａ変異を含有する第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され(変異は太字で示される)、ポリペプチドリンカーは斜体で示され、第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示される。

【0130】

構築物Ｃのアミノ酸配列：ＡＰＯＢＥＣ塩基エディター－Ｍａｄ７(商標)(Ｄ９０８Ａ)－ＸＴＥＮ－ＦｏｋＩ(Ｄ４５０Ａ)－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(Ｄ４５０)(配列番号２６)

【化14】

【0131】

４．構築物Ｅ
本明細書に記載される例示的な融合ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン、ＸＴＥＮリンカー、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン、ポリペプチドリンカー、及び第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインを含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２７に示される配列を含むアミノ酸配列、又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。以下の配列番号２７では、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインは太字で示され、ＸＴＥＮリンカーは斜体で示され、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され、ポリペプチドリンカーは斜体で示され、第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示される。

【0133】

構築物Ｅのアミノ酸配列：Ｃｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)－ＸＴＥＮ－ＦｏｋＩ－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(配列番号２７)

【化15】

【0134】

５．構築物Ｆ
本明細書に記載される例示的な融合ポリペプチドは、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン、ポリペプチドリンカー、及び第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン、ＸＴＥＮリンカー、並びにヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインを含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２８に示される配列を含むアミノ酸配列、又は配列番号２８に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。以下の配列番号２８では、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され、ポリペプチドリンカーは斜体で示され、第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され、ＸＴＥＮリンカーは斜体で示され、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインは太字で示される。

【0136】

構築物Ｆのアミノ酸配列：ＦｏｋＩ－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｃｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)(配列番号２８)

【化16】

【0137】

６．構築物Ｇ
本明細書に記載される例示的な融合ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン、ＸＴＥＮリンカー、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン(Ｄ４５０Ａ)、ポリペプチドリンカー、及び第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインを含む。

【0138】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号２９に示される配列を含むアミノ酸配列、又は配列番号２９に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。以下の配列番号２９では、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインは太字で示され、ＸＴＥＮリンカーは斜体で示され、Ｄ４５０Ａ変異を含有する第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され(変異は太字で示される)、ポリペプチドリンカーは斜体で示され、第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示される。

【0139】

構築物Ｇのアミノ酸配列：Ｃｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)－ＸＴＥＮ－ＦｏｋＩ(Ｄ４５０Ａ)－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(配列番号２９)

【化17】

【化18】

【0140】

７．構築物Ｈ
本明細書に記載される例示的な融合ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメイン、ＸＴＥＮリンカー、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン、ポリペプチドリンカー、及び第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン(Ｄ４５０Ａ)を含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号３０に示される配列を含むアミノ酸配列、又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。以下の配列番号３０では、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインは太字で示され、ＸＴＥＮリンカーは斜線で示され、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され、ポリペプチドリンカーは斜線で示され、Ｄ４５０Ａ変異を含有する第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示される(変異は太字で示される)。

【0142】

構築物Ｈのアミノ酸配列：Ｃｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)－ＸＴＥＮ－ＦｏｋＩ－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(Ｄ４５０Ａ)(配列番号３０)

【化19】

【化20】

【0143】

８．構築物Ｉ
本明細書に記載される例示的な融合ポリペプチドは、第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン(Ｄ４５０Ａ)、ポリペプチドリンカー、第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン、ＸＴＥＮリンカー、及びヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインを含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号３１に示される配列を含むアミノ酸配列、又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。 以下の配列番号３１では、Ｄ４５０Ａ変異を含有する第１のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインは下線で示され(変異は太字で示される)、ポリペプチドリンカーは斜体で示され、第２のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメイン、ＸＴＥＮリンカーは斜体で示され、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインは太字で示される。

【0145】

構築物Ｉのアミノ酸配列：ＦｏｋＩ(Ｄ４５０Ａ)－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｃｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)(配列番号３１)

【化21】

【化22】

【0146】

核酸及びベクター
また、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書の任意のヌクレオチド配列は、コドン最適化されてもよい。特定の理論又は機序に拘束されないが、ヌクレオチド配列をコドン最適化することによって、ｍＲＮＡ転写物の翻訳効率が増加すると考えられている。ヌクレオチド配列のコドン最適化には、天然コドンを、同じアミノ酸をコードするが、細胞内で更に容易に利用効率が高くｔＲＮＡにより翻訳され得る別のコドンに置き換えて、翻訳効率を増加させることが含まれてもよい。ヌクレオチド配列の最適化には、翻訳を妨害するｍＲＮＡ二次構造を減少させ、それによって翻訳効率を増加させることが含まれてもよい。本発明の一実施形態では、コドン最適化されたヌクレオチド配列は、本明細書に記載される核酸配列のいずれか１つを含むか、それからなるか、又はそれから本質的になることができる。

【0147】

本明細書に記載される核酸のうちのいずれかは、組換え体であってよい。本明細書で使用される場合、「組換え体」という用語は、(ｉ)生細胞で複製することができる核酸分子に、天然又は合成の核酸セグメントを結合することによって、生細胞の外側で構築される分子、又は(ｉｉ)上記(ｉ)に記載される分子の複製から生じる分子、を指す。本明細書の目的に対し、複製は、インビトロ複製又はインビボ複製であってもよい。

【0148】

組換え型核酸は、天然ではない配列を有するもの、又は別手段により分離された２つの配列セグメントの人工的な組み合わせにより作製される配列を有するもの、であってもよい。この人工的な組み合わせは多くの場合、化学合成によって行われ、又はより一般的には、単離された核酸セグメントの人工的な操作、例えば、上記のＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．に記載される技術などの遺伝子操作技術によって行われる。核酸は、当技術分野で公知の手順を使用して、化学合成及び/又は酵素ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、上記のＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。例えば、核酸は、天然ヌクレオチド又は様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成されてもよい。修飾ヌクレオチドは、分子の生物学的安定性を高める、又はハイブリダイゼーション時に形成される二重鎖の物理的安定性を高めるよう設計される(例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド)。核酸を生成するために使用され得る改変ヌクレオチドの例としては限定されないが、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルキューオシン、５'－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸(ｖ)、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キューオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－(３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル)ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられる。あるいは本発明の核酸の１つ以上は、例えばＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ(Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ)及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ((Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ)などの企業から購入することができる。

【0149】

また本明細書において、本明細書に記載される核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列、又は本明細書に記載される核酸のうちのいずれかのヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、単離された、又は精製された核酸も提供される。

【0150】

ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。「高ストリンジェント条件」という用語は、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能に強い量で、標的配列(本明細書に記載される核酸のうちのいずれかのヌクレオチド配列)に特異的にハイブリダイズするヌクレオチド配列を指す。高ストリンジェント条件には、正確な相補的配列を有するポリヌクレオチド、又は少数の散在するミスマッチのみを含有するポリヌクレオチドを、ヌクレオチド配列に合致する小さな領域(例えば、３～１０塩基)を偶然に有するランダム配列から、識別する条件が含まれる。そのような小さな相補的領域は、１４～１７個以上の塩基の全長相補鎖よりも簡単に融解するため、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションによって、簡単にそれらを識別することができる。比較的高ストリンジェンシーな条件には、例えば、低塩及び/又は高温の条件、例えば、約０．０２～０．１Ｍ ＮａＣｌ又は同等物によって、約５０～７０℃の温度で提供される条件が含まれる。そのような高ストリンジェンシーな条件は、ヌクレオチド配列と鋳型又は標的配列の間にミスマッチが存在する場合、それが許容されることがほとんどなく、本明細書に記載されるＣＡＲのうちのいずれかの発現の検出に特に好適である。ホルムアミドの量を増やして添加することによって、条件はよりストリンジェントになり得ると一般に認識されている。

【0151】

本開示は、本明細書に記載される核酸のうちのいずれか、例えば配列番号３２～３９のうちのいずれか１つと、少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。

【0152】

本開示の例示的な融合ポリペプチドの核酸配列を以下に提供する。

【0153】

構築物Ａの例示的な核酸配列：ＦｏｋＩ(Ｄ４５０)－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(Ｄ４５０Ａ)－ＸＴＥＮリンカー－ＡｓＣｐｆ１(Ａ)(配列番号３２)
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【0154】

構築物Ｂの例示的な核酸配列：ＡＰＯＢＥＣ塩基エディター－ＡｓＣｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)－ＸＴＥＮ－ＦｏｋＩ(Ｄ４５０Ａ)－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(Ｄ４５０)(配列番号３３)
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【0155】

構築物Ｃの例示的な核酸配列：ＡＰＯＢＥＣ塩基エディター－ＭＡＤ７(商標)(Ｄ９０８Ａ)－ＸＴＥＮ－ＦｏｋＩ(Ｄ４５０Ａ)－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(Ｄ４５０)(配列番号３４)
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【0156】

構築物Ｅの例示的な核酸配列：Ｃｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)－ＸＴＥＮ－ＦｏｋＩ－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(配列番号３５)
atgacacagttcgagggctttaccaacctgtatcaggtgagcaagacactgcggtttgagctgatcccacagggcaagaccctgaagcacatccaggagcagggcttcatcgaggaggacaaggcccgcaatgatcactacaaggagctgaagcccatcatcgatcggatctacaagacctatgccgaccagtgcctgcagctggtgcagctggattgggagaacctgagcgccgccatcgactcctatagaaaggagaaaaccgaggagacaaggaacgccctgatcgaggagcaggccacatatcgcaatgccatccacgactacttcatcggccggacagacaacctgaccgatgccatcaataagagacacgccgagatctacaagggcctgttcaaggccgagctgtttaatggcaaggtgctgaagcagctgggcaccgtgaccacaaccgagcacgagaacgccctgctgcggagcttcgacaagtttacaacctacttctccggcttttatagaaacaggaagaacgtgttcagcgccgaggatatcagcacagccatcccacaccgcatcgtgcaggacaacttccccaagtttaaggagaattgtcacatcttcacacgcctgatcaccgccgtgcccagcctgcgggagcactttgagaacgtgaagaaggccatcggcatcttcgtgagcacctccatcgaggaggtgttttccttccctttttataaccagctgctgacacagacccagatcgacctgtataaccagctgctgggaggaatctctcgggaggcaggcaccgagaagatcaagggcctgaacgaggtgctgaatctggccatccagaagaatgatgagacagcccacatcatcgcctccctgccacacagattcatccccctgtttaagcagatcctgtccgataggaacaccctgtctttcatcctggaggagtttaagagcgacgaggaagtgatccagtccttctgcaagtacaagacactgctgagaaacgagaacgtgctggagacagccgaggccctgtttaacgagctgaacagcatcgacctgacacacatcttcatcagccacaagaagctggagacaatcagcagcgccctgtgcgaccactgggatacactgaggaatgccctgtatgagcggagaatctccgagctgacaggcaagatcaccaagtctgccaaggagaaggtgcagcgcagcctgaagcacgaggatatcaacctgcaggagatcatctctgccgcaggcaaggagctgagcgaggccttcaagcagaaaaccagcgagatcctgtcccacgcacacgccgccctggatcagccactgcctacaaccctgaagaagcaggaggagaaggagatcctgaagtctcagctggacagcctgctgggcctgtaccacctgctggactggtttgccgtggatgagtccaacgaggtggaccccgagttctctgcccggctgaccggcatcaagctggagatggagccttctctgagcttctacaacaaggccagaaattatgccaccaagaagccctactccgtggagaagttcaagctgaactttcagatgcctacactggccagaggctgggacgtgaatgtggagaagaacagaggcgccatcctgtttgtgaagaacggcctgtactatctgggcatcatgccaaagcagaagggcaggtataaggccctgagcttcgagcccacagagaaaaccagcgagggctttgataagatgtactatgactacttccctgatgccgccaagatgatcccaaagtgcagcacccagctgaaggccgtgacagcccactttcagacccacacaacccccatcctgctgtccaacaatttcatcgagcctctggagatcacaaaggagatctacgacctgaacaatcctgagaaggagccaaagaagtttcagacagcctacgccaagaaaaccggcgaccagaagggctacagagaggccctgtgcaagtggatcgacttcacaagggattttctgtccaagtataccaagacaacctctatcgatctgtctagcctgcggccatcctctcagtataaggacctgggcgagtactatgccgagctgaatcccctgctgtaccacatcagcttccagagaatcgccgagaaggagatcatggatgccgtggagacaggcaagctgtacctgttccagatctataacaaggactttgccaagggccaccacggcaagcctaatctgcacacactgtattggaccggcctgttttctccagagaacctggccaagacaagcatcaagctgaatggccaggccgagctgttctaccgccctaagtccaggatgaagaggatggcacaccggctgggagagaagatgctgaacaagaagctgaaggatcagaaaaccccaatccccgacaccctgtaccaggagctgtacgactatgtgaatcacagactgtcccacgacctgtctgatgaggccagggccctgctgcccaacgtgatcaccaaggaggtgtctcacgagatcatcaaggataggcgctttaccagcgacaagttctttttccacgtgcctatcacactgaactatcaggccgccaattccccatctaagttcaaccagagggtgaatgcctacctgaaggagcaccccgagacacctatcatcggcatcgcccggggcgagagaaacctgatctatatcacagtgatcgactccaccggcaagatcctggagcagcggagcctgaacaccatccagcagtttgattaccagaagaagctggacaacagggagaaggagagggtggcagcaaggcaggcctggtctgtggtgggcacaatcaaggatctgaagcagggctatctgagccaggtcatccacgagatcgtggacctgatgatccactaccaggccgtggtggtgctggagaacctgaatttcggctttaagagcaagaggaccggcatcgccgagaaggccgtgtaccagcagttcgagaagatgctgatcgataagctgaattgcctggtgctgaaggactatccagcagagaaagtgggaggcgtgctgaacccataccagctgacagaccagttcacctcctttgccaagatgggcacccagtctggcttcctgttttacgtgcctgccccatatacatctaagatcgatcccctgaccggcttcgtggaccccttcgtgtggaaaaccatcaagaatcacgagagccgcaagcacttcctggagggcttcgactttctgcactacgacgtgaaaaccggcgacttcatcctgcactttaagatgaacagaaatctgtccttccagaggggcctgcccggctttatgcctgcatgggatatcgtgttcgagaagaacgagacacagtttgacgccaagggcacccctttcatcgccggcaagagaatcgtgccagtgatcgagaatcacagattcaccggcagataccgggacctgtatcctgccaacgagctgatcgccctgctggaggagaagggcatcgtgttcagggatggctccaacatcctgccaaagctgctggagaatgacgattctcacgccatcgacaccatggtggccctgatccgcagcgtgctgcagatgcggaactccaatgccgccacaggcgaggactatatcaacagccccgtgcgcgatctgaatggcgtgtgcttcgactcccggtttcagaacccagagtggcccatggacgccgatgccaatggcgcctaccacatcgccctgaagggccagctgctgctgaatcacctgaaggagagcaaggatctgaagctgcagaacggcatctccaatcaggactggctggcctacatccaggagctgcgcaacagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagtcaactggtgaagagcgagctggaagagaagaaaagcgagctcagacataagctgaagtacgttccccacgaatacattgaactgatagaaatcgctagaaacagtacgcaagacagaatactggaaatgaaggtgatggagttcttcatgaaggtttacggctatcgtggcaaacacctcgggggctcccggaagcccgacggggctatctacaccgtgggcagtcccatcgactatggcgtgatcgtggacaccaaagcttatagcggcggatataatctccccatcggccaagccgatgagatgcagaggtatgtggaggagaaccaaacaagaaacaagcatatcaaccccaacgagtggtggaaggtttatcctagctcggtgaccgagtttaagttcctattcgtgtctggccacttcaagggcaactataaggcacagctcactagactgaatcatatcacgaattgcaacggcgccgtgttatccgtggaggagctactgatcggcggagagatgatcaaagccggcaccctgaccctggaagaggtgagaagaaagtttaacaatggcgaaataaatttcggcagcggaagtggaagcggctccatcactagaaccaccaaccctagaaacgtggtgcccaagatctacatgagcgccggcagcatccccctgaccacccacatcaccaactcaattcagcccaccctgtggaccatcggcagcatcaacggcgtggcccccctggccaagagcatcaagctgggcatccccgtgaccggcagcgcctacaccgatcagaccaccgccatggtgagaaagaaggtgagcgtgttcatgggcagcggcagcgggagcggctcatcgcagctggttaagagcgagttagaagaaaaaaagagcgaactgcggcataaactgaagtatgtcccacacgagtacatcgaactgatcgagatcgcgagaaactctacccaagacagaattctggagatgaaagtaatggaatttttcatgaaggtgta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【0157】

構築物Ｆの例示的な核酸配列：ＦｏｋＩ－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｃｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)(配列番号３６)
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【0158】

構築物Ｇの例示的な核酸配列：Ｃｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)－ＸＴＥＮ－ＦｏｋＩ(Ｄ４５０Ａ)－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(配列番号３７)
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【0159】

構築物Ｈの例示的な核酸配列：Ｃｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)－ＸＴＥＮ－ＦｏｋＩ－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ(Ｄ４５０Ａ)(配列番号３８)
atgacacagttcgagggctttaccaacctgtatcaggtgagcaagacactgcggtttgagctgatcccacagggcaagaccctgaagcacatccaggagcagggcttcatcgaggaggacaaggcccgcaatgatcactacaaggagctgaagcccatcatcgatcggatctacaagacctatgccgaccagtgcctgcagctggtgcagctggattgggagaacctgagcgccgccatcgactcctatagaaaggagaaaaccgaggagacaaggaacgccctgatcgaggagcaggccacatatcgcaatgccatccacgactacttcatcggccggacagacaacctgaccgatgccatcaataagagacacgccgagatctacaagggcctgttcaaggccgagctgtttaatggcaaggtgctgaagcagctgggcaccgtgaccacaaccgagcacgagaacgccctgctgcggagcttcgacaagtttacaacctacttctccggcttttatagaaacaggaagaacgtgttcagcgccgaggatatcagcacagccatcccacaccgcatcgtgcaggacaacttccccaagtttaaggagaattgtcacatcttcacacgcctgatcaccgccgtgcccagcctgcgggagcactttgagaacgtgaagaaggccatcggcatcttcgtgagcacctccatcgaggaggtgttttccttccctttttataaccagctgctgacacagacccagatcgacctgtataaccagctgctgggaggaatctctcgggaggcaggcaccgagaagatcaagggcctgaacgaggtgctgaatctggccatccagaagaatgatgagacagcccacatcatcgcctccctgccacacagattcatccccctgtttaagcagatcctgtccgataggaacaccctgtctttcatcctggaggagtttaagagcgacgaggaagtgatccagtccttctgcaagtacaagacactgctgagaaacgagaacgtgctggagacagccgaggccctgtttaacgagctgaacagcatcgacctgacacacatcttcatcagccacaagaagctggagacaatcagcagcgccctgtgcgaccactgggatacactgaggaatgccctgtatgagcggagaatctccgagctgacaggcaagatcaccaagtctgccaaggagaaggtgcagcgcagcctgaagcacgaggatatcaacctgcaggagatcatctctgccgcaggcaaggagctgagcgaggccttcaagcagaaaaccagcgagatcctgtcccacgcacacgccgccctggatcagccactgcctacaaccctgaagaagcaggaggagaaggagatcctgaagtctcagctggacagcctgctgggcctgtaccacctgctggactggtttgccgtggatgagtccaacgaggtggaccccgagttctctgcccggctgaccggcatcaagctggagatggagccttctctgagcttctacaacaaggccagaaattatgccaccaagaagccctactccgtggagaagttcaagctgaactttcagatgcctacactggccagaggctgggacgtgaatgtggagaagaacagaggcgccatcctgtttgtgaagaacggcctgtactatctgggcatcatgccaaagcagaagggcaggtataaggccctgagcttcgagcccacagagaaaaccagcgagggctttgataagatgtactatgactacttccctgatgccgccaagatgatcccaaagtgcagcacccagctgaaggccgtgacagcccactttcagacccacacaacccccatcctgctgtccaacaatttcatcgagcctctggagatcacaaaggagatctacgacctgaacaatcctgagaaggagccaaagaagtttcagacagcctacgccaagaaaaccggcgaccagaagggctacagagaggccctgtgcaagtggatcgacttcacaagggattttctgtccaagtataccaagacaacctctatcgatctgtctagcctgcggccatcctctcagtataaggacctgggcgagtactatgccgagctgaatcccctgctgtaccacatcagcttccagagaatcgccgagaaggagatcatggatgccgtggagacaggcaagctgtacctgttccagatctataacaaggactttgccaagggccaccacggcaagcctaatctgcacacactgtattggaccggcctgttttctccagagaacctggccaagacaagcatcaagctgaatggccaggccgagctgttctaccgccctaagtccaggatgaagaggatggcacaccggctgggagagaagatgctgaacaagaagctgaaggatcagaaaaccccaatccccgacaccctgtaccaggagctgtacgactatgtgaatcacagactgtcccacgacctgtctgatgaggccagggccctgctgcccaacgtgatcaccaaggaggtgtctcacgagatcatcaaggataggcgctttaccagcgacaagttctttttccacgtgcctatcacactgaactatcaggccgccaattccccatctaagttcaaccagagggtgaatgcctacctgaaggagcaccccgagacacctatcatcggcatcgcccggggcgagagaaacctgatctatatcacagtgatcgactccaccggcaagatcctggagcagcggagcctgaacaccatccagcagtttgattaccagaagaagctggacaacagggagaaggagagggtggcagcaaggcaggcctggtctgtggtgggcacaatcaaggatctgaagcagggctatctgagccaggtcatccacgagatcgtggacctgatgatccactaccaggccgtggtggtgctggagaacctgaatttcggctttaagagcaagaggaccggcatcgccgagaaggccgtgtaccagcagttcgagaagatgctgatcgataagctgaattgcctggtgctgaaggactatccagcagagaaagtgggaggcgtgctgaacccataccagctgacagaccagttcacctcctttgccaagatgggcacccagtctggcttcctgttttacgtgcctgccccatatacatctaagatcgatcccctgaccggcttcgtggaccccttcgtgtggaaaaccatcaagaatcacgagagccgcaagcacttcctggagggcttcgactttctgcactacgacgtgaaaaccggcgacttcatcctgcactttaagatgaacagaaatctgtccttccagaggggcctgcccggctttatgcctgcatgggatatcgtgttcgagaagaacgagacacagtttgacgccaagggcacccctttcatcgccggcaagagaatcgtgccagtgatcgagaatcacagattcaccggcagataccgggacctgtatcctgccaacgagctgatcgccctgctggaggagaagggcatcgtgttcagggatggctccaacatcctgccaaagctgctggagaatgacgattctcacgccatcgacaccatggtggccctgatccgcagcgtgctgcagatgcggaactccaatgccgccacaggcgaggactatatcaacagccccgtgcgcgatctgaatggcgtgtgcttcgactcccggtttcagaacccagagtggcccatggacgccgatgccaatggcgcctaccacatcgccctgaagggccagctgctgctgaatcacctgaaggagagcaaggatctgaagctgcagaacggcatctccaatcaggactggctggcctacatccaggagctgcgcaacagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagtcaactggtgaagagcgagctggaagagaagaaaagcgagctcagacataagctgaagtacgttccccacgaatacattgaactgatagaaatcgctagaaacagtacgcaagacagaatactggaaatgaaggtgatggagttcttcatgaaggtttacggctatcgtggcaaacacctcgggggctcccggaagcccgacggggctatctacaccgtgggcagtcccatcgactatggcgtgatcgtggacaccaaagcttatagcggcggatataatctccccatcggccaagccgatgagatgcagaggtatgtggaggagaaccaaacaagaaacaagcatatcaaccccaacgagtggtggaaggtttatcctagctcggtgaccgagtttaagttcctattcgtgtctggccacttcaagggcaactataaggcacagctcactagactgaatcatatcacgaattgcaacggcgccgtgttatccgtggaggagctactgatcggcggagagatgatcaaagccggcaccctgaccctggaagaggtgagaagaaagtttaacaatggcgaaataaatttcggcagcggaagtggaagcggctccatcactagaaccaccaaccctagaaacgtggtgcccaagatctacatgagcgccggcagcatccccctgaccacccacatcaccaactcaattcagcccaccctgtggaccatcggcagcatcaacggcgtggcccccctggccaagagcatcaagctgggcatccccgtgaccggcagcgcctacaccgatcagaccaccgccatggtgagaaagaaggtgagcgtgttcatgggcagcggcagcgggagcggctcatcgcagctggttaagagcgagttagaagaaaaaaagagcgaactgcggcataaactgaagtatgtcccacacgagtacatcgaactgatcgagatcgcgagaaactctacccaagacagaattctggagatgaaagtaatggaatttttcatgaaggtgta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【0160】

構築物Ｉの例示的な核酸配列：ＦｏｋＩ(Ｄ４５０Ａ)－ポリペプチドリンカー－ＦｏｋＩＩ－ＸＴＥＮ－Ｃｐｆ１(Ｄ９０８Ａ)(配列番号３９)
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【0161】

核酸は、融合ポリペプチド又はその部分若しくは機能的バリアントのいずれかをコードする、任意の単離された、又は精製されたヌクレオチド配列を含んでもよい。あるいは、ヌクレオチド配列は、配列のうちのいずれかに対して縮重しているか、又は縮重配列の組み合わせであるヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0162】

当該核酸を含むベクターも提供される。本開示において提供される核酸には、タンパク質、ガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)、及び選択カセット(すなわち、アンピシリン耐性カセット及びピューロマイシン耐性カセット)をコードする核酸配列、並びにそれらの発現を制御する核酸配列、すなわちプロモーター、エンハンサー、ポリＡシグナルなどが含まれる。

【0163】

本開示において提供される核酸は、当該核酸を製造するためのシステムにおける当該核酸の複製の促進又は制御することを対象とした特徴を含む。いくつかの実施形態では、細胞を改変するための核酸は、昆虫細胞、酵母細胞、又は細菌細胞において産生される。

【0164】

本明細書に記載の融合ポリタンパク質のいずれかをコードする核酸を、例えば組換え発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。本明細書に記載されるように、「組換え発現ベクター」及び「ベクター」という用語は、相互交換可能に使用され得、遺伝子改変されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド構築物であって、当該構築物がｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、細胞内でｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドが発現されるのに十分な条件下で、当該ベクターが細胞に接触する場合、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの発現が可能となる、構築物を指す。限定されるものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性化合物又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む多数のベクターが当技術分野で既知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミド又はウイルスが含まれる。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移入を促進する非プラスミド及び非ウイルス性化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、以下に限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。

【0165】

いくつかの実施形態では、ベクターは、全体として天然由来のものではない。しかしながら、ベクターの一部は、天然由来のものであり得る。本発明の組換え発現ベクターは、限定されないが、ＤＮＡ及びＲＮＡをはじめとする任意のタイプのヌクレオチドを含んでもよく、それらは一本鎖又は二本鎖であってもよく、合成であっても、又は部分的に天然源から取得されてもよく、そして天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、又は改変ヌクレオチドを含んでもよい。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡベクターである。一部の実施形態では、ベクターは、ＲＮＡベクターである。ベクターは、天然若しくは非天然のヌクレオチド間結合、又は両タイプの結合を含んでもよい。一部の実施形態では、非天然の、若しくは改変されたヌクレオチド又はヌクレオチド間結合は、ベクターの転写又は複製を妨げない。

【0166】

ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであってもよく、ベクターを使用して、任意の好適な宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトしてもよい。好適なベクターとしては、例えばプラスミド及びウイルスなど、増殖及び拡張、又は発現、又はその両方を目的として設計されたものが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ(Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｌｅｎ Ｂｕｒｎｉｅ，ＭＤ)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ)、ｐＥＴシリーズ(Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ)、ｐＧＥＸシリーズ(Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ)、及びｐＥＸシリーズ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ)からなる群から選択されてもよい。バクテリオファージベクターの例えば、ＬＧＴｌＯ、λＧＴ１１、ＬＺａｐＩＩ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)、λＥＭＢＴ４、及びλＮＭＩ１４９を使用してもよい。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩＯ１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＨ２１、及びｐＢＩＮ１９(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ)が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－ＣＩ、ｐＭＡＭ、及びｐＭＡＭｎｅｏ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ)が挙げられる。組換え発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、又はレンチウイルスベクターであってもよい。

【0167】

いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、例えば、上記のＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．に記載される標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製されてもよい。環状又は線状である発現ベクター構築物を調製して、原核宿主細胞又は真核宿主細胞において機能する複製システムを含有させてもよい。複製システムは、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μ プラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどから誘導されてもよい。

【0168】

組換え発現ベクターは、必要に応じて、及びベクターがＤＮＡベースであるか、又はＲＮＡベースであるかどうかを考慮して、ベクターが導入される宿主細胞のタイプ(例えば、細菌、真菌、植物又は動物)に特異的な、例えば転写及び翻訳の開始、並びに終結のコドンなどの調節配列を含んでもよい。組換え型発現ベクターは、クローニングを容易にするための制限酵素部位を含んでもよい。

【0169】

ベクターは、形質転換された宿主細胞又はトランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子を１つ以上含んでもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性などの殺生物剤耐性、栄養要求性宿主における原栄養性を提供するための相補性が挙げられる。本発明の発現ベクターに好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン/Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。

【0170】

いくつかの実施形態では、組換え発現ベクターは、融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結された、又は融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して相補的な、若しくはハイブリダイズするヌクレオチド配列に動作可能に連結された天然型又は非天然型のプロモーターを含んでもよい。例えば、強い、弱い、誘導性などの、プロモーターの選択は、当業者の通常の技術範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組み合わせも、当業者の技術範囲内である。プロモーターは、非ウイルス性プロモーター又はウイルス性プロモーターであってもよく、例えば、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター、ＳＦＦＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、Ｕ６プロモーター、ベータアクチンプロモーター又はマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復に見出されるプロモーターであってもよい。

【0171】

特定のタイプのポリメラーゼに対するプロモーターの選択が望ましい場合がある。当業者によって理解されるように、真核細胞における転写は、典型的には、３つのタイプのＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、及びＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩ、並びにＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩによって行われる。例えば、Ｂｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． (２００２)１６： ２５８３－２５９２を参照されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを含む。

【0172】

ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーター、ユビキチンプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１Ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＵｂｉＣプロモーター、アクチンプロモーター、ジヒドロ葉酸プロモーター、Ｂ２９プロモーター、デスミンプロモーター、エンドグリンプロモーター、ＦＬＴ－１プロモーター、ＧＦＰＡプロモーター、及びＳＹＮ１プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターはＣＭＶプロモーターを含む。

【0173】

ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例としては、Ｈ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、７ＳＫプロモーター、７ＳＫ１プロモーター、７ＳＫ２プロモーター、７ＳＫ３プロモーター、及びＵ３プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは、Ｕ６プロモーターを含む。

【0174】

更に、ベクターは、自殺遺伝子を含むように作製されてもよい。本明細書で使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞に死をもたらす遺伝子を指す。自殺遺伝子は、遺伝子が発現される細胞に対して、例えば薬剤などの剤に対する感受性を与え、細胞が当該剤に接触したとき又は曝露されたときに、細胞に死をもたらす遺伝子であってもよい。自殺遺伝子は当技術分野で公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)チミジンキナーゼ(ＴＫ)遺伝子、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、及びニトロレダクターゼが挙げられる。

【0175】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかをコードする核酸は、別の核酸配列に動作可能に連結される。本明細書で使用される場合、「動作可能に連結された」という用語は、例えば、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結を指し、異種核酸配列の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と動作可能に連結される。例えば、プロモーターが、コード配列(例えば本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかをコードする)の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に動作可能に連結される。一般的に、動作可能に連結されるＤＮＡ配列は連続的であり、２つのタンパク質コード領域を結合することが必要な場合には、同じリーディングフレーム内にある。

【0176】

本明細書に記載されるベクターは、一過性の発現、安定的な発現、又はその両方のために設計されてもよい。あるいは、又は更に、組換え発現ベクターは、構造的発現又は誘導性発現のために作製されてもよい。

【0177】

本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかは、当該ベクターから発現された融合ポリペプチドの発現レベル及び/又は安定性を調節するための１つ以上の追加の調節エレメントを更に含み得る。追加の調節エレメントの例としては、エンハンサー配列、ポリＡ終結配列(例えば、ＢＧＨ、ＳＶ４０由来)、Ｓ/ＭＡＲエレメント、並びに他の転写後及びシス調節エレメントが挙げられる。

【0178】

いくつかの実施形態では、ベクターは、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＰＲＥ)又はウッドチャック肝炎ウイルスなどのシス調節エレメントを含み、これは、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を促進し、３'末端プロセシング及び安定性を強化することによって導入遺伝子発現を増加させる。例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．(２００９)２８(５)： ２３３－２５０を参照されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント(ＷＰＲＥ)を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、肝炎転写後調節エレメント(ＨＰＲＥ)を含む。

【0179】

本明細書に記載されるベクターのうちのいずれかはまた、１つ以上のガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)を含んでもよく、これは、例えば、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかを宿主細胞のゲノム中の標的配列に誘導するように機能し得る。

【0180】

いくつかの例では、本明細書に記載されるベクターは、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかのコード配列に動作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの例では、本明細書に記載されるベクターは、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかのコード配列に動作可能に連結され、１つ以上の追加の調節エレメントに連結されたプロモーターを含む。ベクターの例示的な組成物は、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかのコード配列に動作可能に連結され、１つ以上の追加の調節エレメントに連結されたＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターを含む。一実施例では、ベクターは、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかのコード配列に動作可能に連結され、１つ以上の追加の調節エレメント(例えば、ＨＰＲＥ又はＷＰＲＥ)に連結されたＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターを含む。

【0181】

一部の実施例では、本明細書に記載されるベクターは、ｇＲＮＡをコードする配列に動作可能に連結された第１のプロモーター、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかのコード配列に動作可能に連結され、１つ以上の追加の調節エレメントに連結された第２のプロモーターを含む。ベクターの例示的な組成物は、ｇＲＮＡをコードする配列に動作可能に連結されたＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかのコード配列に動作可能に連結され、１つ以上の追加の調節エレメントに連結されたＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターを含む。一実施例では、ベクターは、ｇＲＮＡをコードする配列に動作可能に連結されたＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかのコード配列に動作可能に連結され、１つ以上の追加の調節エレメント(例えば、ＨＰＲＥ又はＷＰＲＥ)に連結されたＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターを含む。

【0182】

一部の実施例では、本明細書に記載されるベクターは、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかのコード配列に動作可能に連結され、１つ以上の追加の調節エレメントに連結された第１のプロモーターと、ｇＲＮＡをコードする配列に動作可能に連結された第２のプロモーターとを含む。ベクターの例示的な組成物は、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかのコード配列に動作可能に連結され、１つ以上の追加の調節エレメントに連結されたＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターと、ｇＲＮＡをコードする配列に動作可能に連結されたＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターとを含む。一実施例では、ベクターは、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかのコード配列に動作可能に連結され、１つ以上の追加の調節エレメント(例えば、ＨＰＲＥ又はＷＰＲＥ)に連結されたＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターと、ｇＲＮＡをコードする配列に動作可能に連結されたＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターとを含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、ベクターは、配列番号 ４５～５３のうちのいずれか１つによって示される例示的なベクターのうちのいずれかである。本開示はまた、本明細書に記載されるベクターのうちのいずれか、例えば配列番号４５～５３のうちのいずれか１つと、少なくとも約７０％以上、例えば、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一である核酸配列を含むベクターも提供する。

【0184】

融合ポリペプチドの使用方法及びシステム
本開示のいくつかの態様は、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞、例えば、タンパク質の発現若しくは調節の喪失、又はタンパク質のバリアント形態の発現をもたらす修飾など、そのゲノム中に修飾を含む遺伝子操作された細胞を生成するための融合ポリペプチド、システム、リボ核タンパク質(ＲＮＰ)複合体、及び方法を提供する。

【0185】

本開示は、標的ゲノム修飾を対象の細胞に導入するためのシステムを提供する。いくつかの実施形態では、システムは、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかと、融合ポリペプチドを細胞のゲノム中の標的部位(標的配列)に誘導又は標的化する少なくとも１つのガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)とを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかは、ｇＲＮＡとリボ核タンパク質(ＲＮＰ)複合体を形成及び/又は維持することができ、ＲＮＰ複合体は、細胞のゲノム中の標的配列を結合することができる。いくつかの実施形態では、システムは、融合ポリペプチドを、細胞のゲノム中の追加の標的部位(標的配列)に誘導又は標的化する１つ以上の追加のｇＲＮＡを更に含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、システムは、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインと、別個の融合ポリペプチド上に存在する第２のＤＮＡ切断ドメインと二量体を形成することができる第１のＤＮＡ切断ドメインを含むエンドヌクレアーゼドメインとを含む融合ポリペプチドを含む。このような実施形態では、システムは、ヌクレアーゼ活性を欠くＣｐｆ１ドメインと、第２のＤＮＡ切断ドメインを含む第２のエンドヌクレアーゼドメインとを含む第２の融合ポリペプチドを更に含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を第２の融合ポリペプチド、又はそれをコードする核酸と接触させることを更に含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、上記に詳述した第１のステップ及び第２のステップは、同時に、又は時間的に近接して起こる。いくつかの実施形態では、上記に詳述した全てのステップは、実施される場合、同時に、又は時間的に近接して起こる。

【0188】

いくつかの態様では、本開示は、細胞を本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかと接触させることと、細胞を、細胞のゲノム中の第１の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡと接触させることと、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞を、細胞のゲノム中の第２の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第２のものと接触させることを更に含み、第１の標的配列と第２の標的配列は同じではなく、第１の融合ポリペプチドと第２の融合ポリペプチドは同じではない。

【0189】

いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、細胞のゲノムの異なる染色体上にある。いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、細胞のゲノム中の同じ染色体上にある。いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、染色体の同じＤＮＡ鎖上にある。いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、染色体の異なるＤＮＡ鎖上にある。いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、１０～１０，０００ヌクレオチド離れている。いくつかの実施形態では、第１の標的配列及び第２の標的配列は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、又は１０，０００ヌクレオチド離れている。

【0190】

本明細書に記載される融合ポリペプチド及び/又はｇＲＮＡは、任意の好適な様式で細胞に送達され得る。例えば、融合ポリペプチド及びｇＲＮＡを含むＲＮＰを含む、システムの送達のための様々な好適な方法は、細胞中へのＲＮＰのエレクトロポレーション、細胞中への融合ポリペプチド及びｇＲＮＡのうちのいずれかをコードするｍＲＮＡのエレクトロポレーション、様々なタンパク質又は核酸トランスフェクション方法、並びにウイルスベクター、例えば、レトロウイルス(例えば、レンチウイルス)ベクターなどを介したコードＲＮＡ又はＤＮＡの送達などの任意の好適な方法が含まれ得る。任意の好適な送達方法が、本開示によって包含され、本開示は、この点に関して限定されない。

【0191】

いくつかの実施形態では、融合ポリペプチド/ｇＲＮＡ複合体(ＲＮＰ複合体)が、例えば、インビトロで形成され、例えば、細胞内へのＲＮＰ複合体のエレクトロポレーションを介して、細胞がＲＮＰ複合体と接触される。いくつかの実施形態では、細胞は、別々に融合ポリペプチド及びｇＲＮＡと接触され、ＲＮＰ複合体は、細胞内に形成される。いくつかの実施形態では、細胞は、融合ポリペプチドをコードする核酸、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、及び/若しくはｇＲＮＡをコードする核酸と、又は両方と接触される。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドをコードする核酸及び/又はｇＲＮＡをコードする核酸は、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ類似体である。

【0192】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかを、細胞のゲノム中の好適な標的部位に標的化するのに好適なガイドＲＮＡ(ｇＲＮＡ)を提供する。「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、本明細書では同義的に使用され、核酸、典型的には、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼによって結合され、標的核酸、例えば、細胞のゲノム中の標的部位へのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼの特異的標的化又はホーミングを促進するＲＮＡを指す。ｇＲＮＡは、典型的には、少なくとも２つのドメイン：時折、ＲＮＡガイドヌクレアーゼへの結合を媒介する「ｇＲＮＡ足場」又は「ｇＲＮＡ骨格」としても言及される「結合ドメイン」、及び標的部位へのｇＲＮＡ結合ＲＮＡガイドヌクレアーゼの標的化を媒介する「標的化ドメイン」を含む。いくつかのｇＲＮＡは、追加のドメイン、例えば、相補性ドメイン、又はステムループドメインを含む。天然のｇＲＮＡ結合ドメイン及びその操作されたバリアントの構造及び配列は、当業者に周知である。

【0193】

天然に存在するＣｐｆ１ガイドＲＮＡが単一のＲＮＡ分子を含むため、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼなどの、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓヌクレアーゼとともに使用するための好適なｇＲＮＡは、典型的には、単一のＲＮＡ分子を含む。したがって、好適なｇＲＮＡは、本明細書ではシングルガイドＲＮＡ(ｓｇＲＮＡ)と称されることもある、単分子(単一のＲＮＡ分子を有する)、又はモジュラー(１つより多く、典型的には、２つの別個のＲＮＡ分子を含む)であり得る。いくつかの例示的な好適なＣｐｆ１ ｇＲＮＡ足場配列が本明細書で提供され、追加の好適なｇＲＮＡ足場配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。

【0194】

いくつかの実施形態では、例えば、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼが使用されるいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、５'から３'に、
ＣＲＩＳＰＲ/ＣａｓヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ(ｃｒＲＮＡ)配列であって、
近位ドメイン、
第１の相補性ドメイン、
結合ドメイン、及び
第２の相補性ドメイン(第１の相補性ドメインと相補的である)を含むＣＲＩＳＰＲ/ＣａｓヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ(ｃｒＲＮＡ)配列、並びに
標的部位配列に対応する標的化ドメインを含む。

【0195】

いくつかの例示的な好適なＣｐｆ１ ｇＲＮＡ足場配列が本明細書で提供され、追加の好適なｇＲＮＡ足場配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。そのような追加の好適な足場配列には、限定されるものではないが、Ｊｉｎｅｋ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ(２０１２)３３７(６０９６)：８１６－８２１、Ｒａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ(２０１３)８：２２８１－２３０８、ＰＣＴ公開第２０１４/０９３６９４号、及びＰＣＴ公開第２０１３/１７６７７２に引用されているものが挙げられ、これらは参照によりその全体が組み込まれる。

【0196】

本明細書で提供されるｇＲＮＡは、典型的には、細胞のゲノム中の標的部位に結合する標的化ドメインを含む。標的部位は、典型的には、ＰＡＭ配列と、ＰＡＭ配列と同一の鎖上に、かつそれに直接隣接して、標的ドメインとを含む、二本鎖ＤＮＡ配列である。ｇＲＮＡの標的化ドメインは、典型的には、時として１つ以上のミスマッチを伴う標的ドメインの配列に類似するが、典型的には、ＤＮＡ配列の代わりにＲＮＡを含むという点で標的ドメイン配列に対応する、ＲＮＡ配列を含む。したがって、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、(完全又は部分的相補性で)標的ドメインの配列に相補的である二本鎖標的部位の配列と、したがって、ＰＡＭ配列を含む鎖に相補的である鎖と塩基対合する。ｇＲＮＡの標的化ドメインは、典型的には、ＰＡＭ配列を含まないことが理解されるであろう。ＰＡＭの場所は、採用されるヌクレアーゼに応じて、標的ドメイン配列の５'又は３'であり得ることが更に理解されるであろう。例えば、ＰＡＭは、典型的には、Ｃａｓ９ヌクレアーゼについては標的ドメイン配列の３'、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼについては標的ドメイン配列の５'である。ＰＡＭの場所及び標的部位に結合するｇＲＮＡの機構の例証については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｖａｎｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９；６：６の図１を参照されたい。ＲＮＡ誘導性ヌクレアーゼを標的部位に標的化するｇＲＮＡの機構の追加の例証及び説明については、両方とも参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｕ Ｙ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ(２０１４)(ｄｏｉ：１０．１０３８/ｎｂｔ．２８０８)、及びＳｔｅｒｎｂｅｒｇ ＳＨ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ(２０１４)(ｄｏｉ：１０．１０３８/ｎａｔｕｒｅｌ３０１１)を参照されたい。

【0197】

標的化ドメインは、標的ドメインの配列に対応するヌクレオチド配列、すなわち、ＰＡＭ配列に直接隣接するＤＮＡ配列(例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼについてはＰＡＭ配列の５'、又はＣａｓ１２ａヌクレアーゼについてはＰＡＭ配列の３')を含み得る。標的化ドメイン配列は、典型的には、１７～３０個のヌクレオチドを含み、標的ドメイン配列に完全に一致する(すなわち、いかなるミスマッチヌクレオチドも伴わない)か、又は１つ以上であるが典型的には４つ以下のミスマッチを含み得る。標的化ドメインは、ＲＮＡ分子、ｇＲＮＡの一部であるため、典型的にはリボヌクレオチドを含むが、ＤＮＡ標的化ドメインは、デオキシリボヌクレオチドを含むであろう。

【0198】

典型的なＣａｓ１２ａ ｇＲＮＡの構造は、例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ(２０１５)１６３(３)：７５９－７７１の図１に見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２２ヌクレオチドの標的ドメイン及びＴＴＮ ＰＡＭ配列を含むＣａｓ１２ａ標的部位、並びに標的ドメインに完全に一致する(したがって、標的ドメイン及びＰＡＭを含む鎖に相補的なＤＮＡ鎖と完全な相補性で塩基対合する)標的化ドメインを含むｇＲＮＡの例示的な例証が、以下に提供される。

【化23】

【0199】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ配列は、５'－Ｔ－Ｔ－Ｔ－Ｖ－３'である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ａ ＰＡＭ配列は、５'－Ｔ－Ｔ－Ｖ－３'である。

【0200】

理論によって拘束されることを所望しないが、少なくともいくつかの実施形態では、標的化ドメインの長さ及び標的配列との相補性は、標的核酸とのｇＲＮＡ/Ｃａｓ分子複合体の相互作用の特異性に寄与すると考えられる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡの標的化ドメインは、長さが５～５０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１５～２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１８～２２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１９～２１個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１６個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１７個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１８個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが１９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２１個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２２個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２３個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２４個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、長さが２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、ミスマッチを伴わずに、本明細書で提供される標的ドメイン配列又はその一部に完全に対応する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡの標的化ドメインは、本明細書で提供される標的ドメイン配列に対して１つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、標的ドメイン配列に対して２つのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、標的ドメインは、標的ドメイン配列に対して３つのミスマッチを含む。

【0201】

いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、例えば、参照によりその全体で組み込まれる、ＰＣＴ公開第２０１５/１５７０７０号に記載されるように、コアドメインと、二次標的化ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、コアドメインは、標的化ドメインの３'末端から約８～約１３個のヌクレオチド(例えば、標的化ドメインの最も３'の８～１３個のヌクレオチド)を含む。いくつかの実施形態では、二次ドメインは、コアドメインに対して５'に位置付けられる。いくつかの実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン配列又はその一部に完全に対応する。他の実施形態では、コアドメインは、標的ドメイン配列の対応するヌクレオチドとミスマッチである、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。

【0202】

上述のドメインの配列及び配置は、その中のページ８８～１１２を含む、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第２０１５/１５７０７０号により詳細に記載されている。

【0203】

結合ドメインは、単分子ｇＲＮＡの第１の相補性ドメインを第２の相補性ドメインに結合する役割を果たし得る。結合ドメインは、第１の相補性ドメイン及び第２の相補性ドメインを共有結合的又は非共有結合的に結合することができる。いくつかの実施形態では、結合は、共有結合である。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、第１の相補性ドメインと第２の相補性ドメインとの間に介在する共有結合であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、１個以上の、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、結合ドメインは、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開第２０１８/１２６１７６号に開示される、少なくとも１つの非ヌクレオチド結合を含む。

【0204】

いくつかの実施形態では、標的化ドメインの第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインと少なくとも部分的に相補的であり、一実施形態では、少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するために第２の相補性ドメインに対して十分な相補性を有する。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性ドメインとの相補性を欠く配列、例えば、二本鎖領域からループアウトする配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、長さが５～２７個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、第１の相補性領域よりも長い。一実施形態では、相補性ドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、第２の相補性ドメインは、５'から３'の方向に、５'サブドメイン、中央サブドメイン、及び３'サブドメインである、３つのサブドメインを含む。いくつかの実施形態では、５'サブドメインは、長さが３～２５個、例えば、４～２２個、４～１８個、又は４～１０個、又は３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、中央サブドメインは、長さが１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ、例えば、３つのヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３'サブドメインは、長さが４～９個、例えば、４、５、６、７、８又は９個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、第１の相補性ドメインの５'サブドメイン及び３'サブドメインは、それぞれ、第２の相補性ドメインの３'サブドメイン及び５'サブドメインと相補的、例えば、完全に相補的である。

【0205】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学的に修飾された１つ以上のヌクレオチドを含み得る。ｇＲＮＡの化学修飾は、以前に記載されており、好適な化学修飾には、ｇＲＮＡ機能のために有益であり、所与のｇＲＮＡの任意の望ましくない特性、例えば、オフターゲット効果を計測可能なほど増加させない、任意の修飾が含まれる。好適な化学修飾としては、例えば、ｇＲＮＡがエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼ触媒活性の影響をあまり受けなくするものが挙げられ、限定されるものではないが、ホスホロチオエート骨格修飾、２'－Ｏ－Ｍｅ修飾(例えば、３'及び５'末端の一方又は両方における)、２'Ｆ修飾、二環式ヌクレオチド－ｃＥｔによるリボース糖の置き換え、３'チオＰＡＣＥ(ＭＳＰ)修飾、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。追加の好適なｇＲＮＡ修飾が、本開示に基づいて当業者に明らかとなり、そのような好適なｇＲＮＡ修飾には、限定されるものではないが、例えば、各々が参照によりその全体で本明細書に組み込まれる、Ｒａｈｄａｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ(２０１５)１１２(５１)Ｅ７１１０－Ｅ７１１７及びＨｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．(２０１５)；３３(９)：９８５－９８９において記載されるものを含む。

【0206】

例えば、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、１つ以上の２'－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２'－Ｏ－メチルヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５'末端に、２'－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２'－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３'末端に、２'－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２'－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５'及び３'末端の両方に、２'－Ｏ修飾ヌクレオチド、例えば、２'－Ｏ－メチルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチドが、２'－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、及び３'末端からの第３のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第４のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第４のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル修飾される。いくつかの実施形態では、２'－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのリン酸塩結合を含む。いくつかの実施形態では、２'－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、２'－Ｏ－メチルヌクレオチドは、隣接するヌクレオチドへのチオＰＡＣＥ結合を含む。

【0207】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、１つ以上の２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾ヌクレオチド、例えば、２'－Ｏ－メチル３'ホスホロチオエートヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５'末端に、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾、例えば、２'－Ｏ－メチル３'ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３'末端に、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾、例えば、２'－Ｏ－メチル３'ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５'及び３'末端に、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾、例えば、２'－Ｏ－メチル３'ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル３'ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル３'ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル３'ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第４のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル３'ホスホロチオエート修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第４のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル３'ホスホロチオエート修飾される。

【0208】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、１つ以上の２'－Ｏ修飾及び３'－リン修飾、例えば、２'－Ｏ－メチル３'チオＰＡＣＥヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５'末端に、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾、例えば、２'－Ｏ－メチル３'チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの３'末端に、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾、例えば、２'－Ｏ－メチル３'チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡの５'及び３'末端に、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾、例えば、２'－Ｏ－メチル３'チオＰＡＣＥヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられ、１つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル３'チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル３'チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル３'チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第４のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル３'チオＰＡＣＥ修飾される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾されていない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチドは、化学的に修飾された糖を有していない。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、２'－Ｏ修飾及び３'リン修飾され、例えば、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第４のヌクレオチドで、２'－Ｏ－メチル３'チオＰＡＣＥ修飾される。

【0209】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、化学的に修飾された骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非架橋酸素原子は、硫黄原子に置き換えられている。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第４のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第二のヌクレオチド、５'末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第四のヌクレオチドは各々、ホスホロチオエート結合を含む。

【0210】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるｇＲＮＡは、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１つ以上の非架橋酸素原子が硫黄原子に置き換えられ、１つ以上の非架橋酸素原子が酢酸基に置き換えられている、骨格を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第４のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第二のヌクレオチド、５'末端からの第三のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第二のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第三のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第四のヌクレオチドは各々、チオＰＡＣＥ結合を含む。

【0211】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、１つ以上の２'－Ｏ－メチル－３'－ホスホロチオエートヌクレオチド、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、又は６個の２'－Ｏ－メチル－３'－ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、３つの末端位置のうちの１つ以上及び５'末端に、並びに/又は３つの末端位置のうちの１つ以上に及び３'末端に、修飾ヌクレオチド(例えば、２'－Ｏ－メチル－３'－ホスホロチオエートヌクレオチド)を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの５'末端におけるヌクレオチド、ｇＲＮＡの５'末端からの第２のヌクレオチド、５'末端からの第３のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第２のヌクレオチド、ｇＲＮＡの３'末端からの第３のヌクレオチド、及びｇＲＮＡの３'末端からの第４のヌクレオチドは各々、２'－Ｏ－メチル－３'－ホスホロチオエートヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、参照によりそれらの全体が組み込まれる、ＰＣＴ公開第２０１７/２１４４６０号、同２０１６/０８９４３３号、及び同２０１６/１６４３５６号に記載されるように、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。

【0212】

本明細書で提供されるｇＲＮＡは、好適な任意の様式において細胞に送達され得る。例えば、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかに結合されたｇＲＮＡを含むＲＮＰを含む、ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓシステムの送達のための様々な好適な方法が記載されており、例示的な、好適な方法は、限定されないが、細胞中へのＲＮＰのエレクトロポレーション、細胞中への本明細書に記載される融合ポリペプチド及びｇＲＮＡのうちのいずれかをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡのエレクトロポレーション、様々なタンパク質又は核酸トランスフェクション方法、並びにウイルスベクター、例えば、レトロウイルス(例えば、レンチウイルス)ベクターなどを介したコードＲＮＡ又はＤＮＡの送達を含む。任意の好適な送達方法が、本開示によって包含され、本開示は、この点に関して限定されない。

【0213】

細胞
本明細書に提供される融合ポリペプチド、方法、及び戦略は、本明細書に記載される融合ポリペプチド及び方法を使用して遺伝子操作することができる任意の細胞又は細胞型に適用され得る。当業者は、しかし、そのような例の提供は、一部の特定の実施形態を例証する目的のためであり、追加の適切な細胞及び細胞型は、本開示に基づいて当業者に明らかであろうが、この点おいて限定されない。

【0214】

いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、又は植物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、例えば非ヒト霊長類細胞、齧歯類(例えば、マウス若しくはラット)細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、又は家畜動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞又はマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト対象(例えば、健康なヒト対象又は疾患を有するヒト対象)などの対象から取得され得る。

【0215】

いくつかの実施形態では、細胞は、造血細胞、例えば、造血幹細胞(ＨＳＣ)又は造血前駆細胞(ＨＰＣ)である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、造血幹細胞又は前駆細胞である。造血幹細胞(ＨＳＣ)は、典型的には、骨髄系前駆細胞及びリンパ系前駆細胞の両方を生じさせることができ、それら前駆細胞はそれぞれ、更に骨髄系細胞(例えば、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、樹状細胞、赤血球、血小板など)及びリンパ系細胞(例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞)を生じさせる。ＨＳＣは、ＨＳＣの同定及び/又は単離に使用され得る、１つ以上の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ３４(例えば、ＣＤ３４＋)の発現、並びに細胞系統への関与に関連する細胞表面マーカーの不在によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＨＳＣは、末梢血ＨＳＣである。造血幹細胞などの細胞を取得する方法は、例えば、その全体で参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願第ＰＣＴ/ＵＳ２０１６/０５７３３９号に記載されている。

【0216】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される細胞は、免疫エフェクター細胞である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、アルファ/ベータＴリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は、ガンマ/デルタＴリンパ球である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ(ＮＫＴ細胞)である。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞である。

【0217】

いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞(ＥＳＣ)、人工多能性幹細胞(ｉＰＳＣ)、間葉系幹細胞、又は組織特異的幹細胞からなる群から選択される。

【0218】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、ゲノム修飾を１つのみ含み、例えば、タンパク質、例えば、標的部位配列によってコードされるか、若しくは調節されるタンパク質、又はタンパク質のバリアント形態の発現の喪失をもたらす、１つのゲノム修飾を含む。本明細書で提供される遺伝子編集方法は、標的遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子においてゲノム修飾をもたらし得ることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、所与の遺伝子座の両方の対立遺伝子におけるゲノム修飾を含む、遺伝子操作された細胞が好ましい。

【0219】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞は、２つ以上のゲノム修飾を含む。例えば、遺伝子操作された細胞の集団は、複数の異なる変異を含み得る。

【0220】

当業者にとって明らかであるように、本明細書に記載される融合ポリペプチド及び方法を使用して、例えば、タンパク質コード配列、非タンパク質コード配列、染色体配列、及び染色体外配列を含む、細胞中の任意の遺伝子座位を修飾することができる。したがって、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、対応するＣＲＩＳＰＲ/ＣａｓヌクレアーゼのＰＡＭ配列に隣接する標的部位配列などの任意の遺伝子座位(すなわち、標的部位配列)を標的とするように設計され得る。

【0221】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合ポリペプチドとともに使用するためのｇＲＮＡの標的化ドメインは、０型、１型、又は２型細胞表面タンパク質などの細胞表面タンパク質を標的とする。いくつかの実施形態では、標的化ドメインは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ２３、ＣＤ３３、ＣＤ３８、Ｃ型レクチン様分子－１
(ＣＬＬ－１)、ＣＳ１、ＥＭＲ２、ＩＬ－５、Ｌ１－ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１３８、ＣＤ１３３、ＣＤ７０、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ１３、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＤ１１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３/ＴＣＲ、ＣＤ７９/ＢＣＲ、及び/又はＣＤ２６を標的とする。

【0222】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の融合ポリペプチドとともに使用するためのｇＲＮＡの標的化ドメインは、腫瘍性若しくは悪性の疾患又は障害、例えば、限定されないが、ＣＤ２０、ＣＤ２２(非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ))、ＣＤ５２(Ｂ細胞ＣＬＬ)、ＣＤ３３(急性骨髄性白血病(ＡＭＬ))、ＣＤ１０(ｇｐ１００)(一般的な(プレＢ)急性リンパ性白血病及び悪性黒色腫)、ＣＤ３/Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)(Ｔ細胞リンパ腫及び白血病)、ＣＤ７９/Ｂ細胞受容体(ＢＣＲ)(Ｂ細胞リンパ腫及び白血病)、ＣＤ２６(上皮及びリンパ系悪性腫瘍)、ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、及びＨＬＡ－ＤＱ(リンパ系悪性腫瘍)、ＲＣＡＳ１(婦人科がん、胆管腺がん、及び膵臓の管腺がん)、並びに前立腺特異的膜抗原などの特定の種類のがんに関連する細胞表面タンパク質を標的とする。

【0223】

細胞表面タンパク質の追加の非限定的な例としては、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１/ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、ＣＤ３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、ＣＤ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、ＣＤ３６３、ＣＤ３６４、ＣＤ３６５、ＣＤ３６６、ＣＤ３６７、ＣＤ３６８、ＣＤ３６９、ＣＤ３７０、又はＣＤ３７１が含まれる。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈｕｍａｎ ＣＤ Ｍａｒｋｅｒ Ｃｈａｒｔ：ｂｄｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ/ｃｏｎｔｅｎｔ/ｄａｍ/ｂｄｂ/ｃａｍｐａｉｇｎｓ/ｒｅａｇｅｎｔ－ｅｄｕｃａｔｉｏｎ/ＢＤ＿Ｒｅａｇｅｎｔｓ＿ＣＤＭａｒｋｅｒＨｕｍａｎ＿Ｐｏｓｔｅｒ．ｐｄｆ(その全体が参照により組み込まれる)からの系統特異的細胞表面抗原の例も参照されたい。

【0224】

投与を必要とする対象への投与の方法
本開示のいくつかの態様は、投与することを必要とする対象に、本明細書に記載される組成物、例えば、本明細書に記載される融合ポリペプチド及び方法を使用して遺伝子操作された細胞、細胞の集団若しくはその子孫、又はそれを含む医薬組成物を投与することを含む、方法を提供する。細胞、細胞の集団、又はその子孫は、野生型細胞と比較して１つ以上の修飾(例えば、遺伝子修飾)を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、又はその子孫は、同じ型の野生型細胞と比較して、第１の遺伝子に対する修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、又はその子孫は、同じ型の野生型細胞と比較して、第２の遺伝子に対する修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、又はその子孫は、疾患又は障害に関連する細胞(例えば、がん細胞)などの疾患細胞と比較して１つ以上の修飾(例えば、遺伝子修飾)を含み得る。修飾された遺伝子は、本明細書に記載される例示的な遺伝子又はタンパク質のうちのいずれかなど、本明細書に記載される方法によって標的化可能な任意の遺伝子座に対応し得る。

【0225】

いくつかの実施形態では、方法は、修飾遺伝子の野生型コピーによってコードされる産物を標的とする治療有効量の少なくとも１つの薬剤を対象に投与することを更に伴う。理論に束縛されることを望むものではないが、修飾遺伝子の野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤を、修飾遺伝子を含む細胞、細胞集団、又はその子孫と組み合わせて投与することによって、細胞、細胞集団、若しくはその子孫を標的としない、又はより低い程度で標的とする一方で、薬剤で対象内の細胞(例えば、疾患細胞、例えば、がん細胞)を標的とすることが可能である。例えば、そのような方法は、対象における標的細胞集団を選択的に切除又は殺傷させると同時に、薬剤に対して脆弱でない新しい細胞を対象に補充するために組み合わせて使用され得る。更なる例として、そのような方法は、細胞、細胞集団、又はその子孫(例えば、ＣＡＲ－Ｔ療法)の一部として薬剤を投与することができ、したがって、細胞のフラトリサイド(ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ)を回避又は減少させるであろう。いくつかの実施形態では、修飾遺伝子の野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、細胞、集団、若しくはその子孫、又は薬学的組成物の投与と同時に、あるいは時間的に近接して生じる。いくつかの実施形態では、修飾遺伝子の野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、細胞、集団、若しくはその子孫、又は薬学的組成物の投与後に生じる。いくつかの実施形態では、修飾遺伝子の野生型コピーによってコードされる産物を標的とする少なくとも１つの薬剤の投与は、細胞、集団、若しくはその子孫、又は薬学的組成物の投与前に生じる。いくつかの実施形態では、細胞、細胞集団、又はその子孫が、同じ型の野生型細胞と比較して、第１の遺伝子及び第２の遺伝子に対する修飾を含む場合、方法は、第１の遺伝子及び第２の遺伝子の産物(例えば、第１の遺伝子及び第２の遺伝子の野生型コピー)を標的とする１つ以上(例えば、２つの薬剤)を投与することを含み得る。

【0226】

投与を必要とする対象は、いくつかの実施形態では、第１の遺伝子及び/若しくは第２の遺伝子の産物を標的とする免疫療法を受けているか、又は受けようとしている対象である。投与を必要とする対象は、いくつかの実施形態では、がん(例えば、がん幹細胞の存在に関連するがん、造血器悪性腫瘍、第１及び/又は第２の遺伝子の産物の発現を特徴とするがんなどの悪性腫瘍を有するか、又はそれを有すると診断されている対象である。いくつかの実施形態では、そのような悪性腫瘍を有する対象は、第１の遺伝子及び/又は第２の遺伝子の産物を標的とする免疫療法剤などの薬剤の投与の候補であり得るが、有害なオンターゲット、疾患外効果のリスクが、対象にとって予期又は観察される利益を上回り得る。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に記載される遺伝子操作された細胞の投与は、本明細書に提供される遺伝子操作された細胞が薬剤によって効率的に標的とされないため、有害なオンターゲット、疾患外効果(ｏｆｆ－ｄｉｓｅａｓｅ)の改善をもたらす。

【0227】

いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、血液悪性腫瘍、又は血液のがんである。いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、リンパ性の悪性腫瘍又は骨髄性の悪性腫瘍である。

【0228】

いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、自己免疫疾患又は障害である。自己免疫障害の例としては、関節リウマチ、多発性硬化症、白血病、移植片対宿主病、ループス、及び乾癬が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、悪性腫瘍は、移植片対宿主病である。

【0229】

また、本開示の範囲内には、再発性又は難治性血液悪性腫瘍などの再発性及び/又は難治性とみなされる悪性腫瘍がある。投与を必要とする対象は、いくつかの実施形態では、第１の遺伝子及び/又は第２の遺伝子の産物を標的とする免疫エフェクター細胞療法、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法を受けているか、又は受けるであろう対象であり、免疫エフェクター細胞は、産物を標的とするＣＡＲを発現し、免疫エフェクター細胞の少なくともサブセットは、それらの細胞表面上でも産物を発現する。本明細書で使用される場合、「フラトリサイド」は、自己殺傷を指す。例えば、細胞の集団の細胞は、同じ集団の細胞を殺傷する、又はその殺傷を誘導する。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞治療の細胞は、免疫エフェクター細胞治療の他の細胞を殺傷する、又はその殺傷を誘導する。

【0230】

そのような実施形態では、フラトリサイドは、所望の臨床転帰、例えば、対象内で産物を発現する悪性細胞のアブレーションが達成できる前に、免疫エフェクター細胞の一部分又は全集団をアブレーションする。いくつかのそのような実施形態では、本明細書で提供される、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を使用して、例えば、産物を発現しない、又はＣＡＲにより認識される産物のバリアントを発現しない免疫エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞治療の基礎を形成する免疫エフェクター細胞として、そのようなフラトリサイド及び治療転帰に対する関連する負の影響を回避し得る。そのような実施形態では、本明細書で提供される、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞、例えば、産物を発現しない、又はＣＡＲにより認識される産物のバリアントを発現しない免疫エフェクター細胞はまた、薬剤(例えば、産物を標的とするＣＡＲ)も発現するように更に修飾され得る。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、例えば、Ｔリンパ球、例えば、アルファ/ベータＴリンパ球、ガンマ/デルタＴリンパ球、又はナチュラルキラーＴ細胞などであってもよい。いくつかの実施形態では、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞であり得る。

【0231】

いくつかの実施形態では、それらのゲノムに修飾を含む、本明細書に記載される有効数の遺伝子操作された細胞は、それを必要とする対象、例えば、第１の遺伝子及び/若しくは第２の遺伝子の産物を標的とする療法を受けているか、又は受けるであろう対象に投与され、その療法は、例えば、産物を発現する対象における健康な細胞に向けた細胞傷害性の形態で、有害なオンターゲット、疾患外効果に関連するか、又は関連するリスクがある。いくつかの実施形態では、有効数のそのような遺伝子操作された細胞は、第１の遺伝子又は第２の遺伝子によってコードされる産物を標的とする薬剤と組み合わせて対象に投与され得る。

【0232】

遺伝子修飾細胞、及び第１の遺伝子又は第２の遺伝子によってコードされる産物を標的とする薬剤(例えば、免疫療法剤)を組み合わせて投与する場合、細胞及び薬剤は、同じ時間に投与され得るか、又は異なる時間に、例えば、時間的に近接して投与され得ることが理解される。

【0233】

例えば、いくつかの実施形態では、組み合わせての投与には、同じ治療過程での投与、例えば、産物を標的とする薬剤で対象を治療する過程での投与が含まれ(例えば、免疫療法)、対象は、有効な数の遺伝子操作された細胞が同時に、同時発生的に、又は連続的に、例えば、薬剤による治療前、治療中、治療後に、並びに/又は相互に、及び細胞、細胞集団、若しくはその子孫に関して任意の順序で投与され得る。更に、細胞及び薬剤は、混合されてもよく、又は別々の容量若しくは剤形において混合されてもよい。

【0234】

いくつかの実施形態では、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤は、免疫療法剤である。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤は、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物と結合する抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤は、第２の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物に結合する抗原結合断片を含む。

【0235】

いくつかの実施形態では、薬剤は、第１の遺伝子又はその野生型コピーによって産生される産物と結合することができる抗原結合断片(例えば、単鎖抗体)を含む、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞である。いくつかの実施形態では、薬剤は、第２の遺伝子又はその野生型コピーによって産生される産物と結合することができる抗原結合断片(例えば、単鎖抗体)を含む、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞である。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞(例えば、ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞)又はＮＫ細胞であり得る。

【0236】

キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、刺激分子に由来するものを含む、組換えポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの共刺激分子、例えば４－１ＢＢ(すなわち、ＣＤ１３７)、ＣＤ２７、及び/又はＣＤ２８、又はそれらの分子の断片に由来する１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインを更に含む。ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインは、第１の遺伝子若しくはその野生型コピーによってコードされる産物、第２の遺伝子若しくはその野生型コピーによってコードされる産物、又はその両方と結合する抗体断片を含み得る。抗体断片は、１つ以上のＣＤＲ、可変領域(又はその一部)、定常領域(又はその一部)、又は前述のうちのいずれかの組み合わせを含むことができる。

【0237】

キメラ抗原受容体(ＣＡＲ)は、典型的には、ヒンジ領域(例えば、ＣＤ８又はＣＤ２８由来)、膜貫通ドメイン(例えば、ＣＤ８又はＣＤ２８由来)、１つ以上の共刺激ドメイン(例えば、ＣＤ２８又は４－１ＢＢ)、及びシグナル伝達ドメイン(例えば、ＣＤ３ｚｅｔａ)を含み得る、例えば、ＣＡＲフレームワークに融合された抗体断片を含む、抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲドメイン及び構成要素の例示的な配列は、例えば、ＰＣＴ公開第２０１９/１７８３８２号、及び以下の表１に提供される。

【0238】

表１：キメラ受容体の例示的な構成要素

【表1】

【0239】

いくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に投与される、本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、又は免疫エフェクター細胞(例えば、ＣＡＲ発現細胞)の数は、１０^６～１０^１１個の範囲内である。しかし、この例示的な範囲を下回る又は上回る量も、本開示の範囲内である。例えば、いくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、又は免疫エフェクター細胞(例えば、ＣＡＲ発現細胞)の数は、約１０^６、約１０^７、約１０^８、約１０^９、約１０^１０、又は約１０^１１個である。いくつかの実施形態では、投与を必要とする対象に投与される本明細書で提供される遺伝子操作された細胞、例えば、ＨＳＣ、ＨＰＣ、又は免疫エフェクター細胞(例えば、ＣＡＲ発現細胞)の数は、１０^６～１０^９個の範囲内、１０^６～１０^８個の範囲内、１０^７～１０^９個の範囲内、１０^７～１０^１０個の範囲内、１０^８～１０^１０個の範囲内、又は１０^９～１０^１１個の範囲内である。

【0240】

いくつかの実施形態では、第１の遺伝子又はその野生型コピーによってコードされる産物を標的とする薬剤は、抗体－薬物複合体(ＡＤＣ)である。ＡＤＣは、毒素又は薬物分子に複合体化された抗体又はその抗原結合断片を含む分子であってもよい。対応する抗原との抗体又はその断片の結合は、細胞表面上に抗原を提示する細胞(例えば、標的細胞)への毒素又は薬物分子の送達を可能にし、それによって、標的細胞の死をもたらす。

【0241】

抗体－薬物複合体中での使用のために適合性のある毒素又は薬物は、当技術分野において公知であり、当技術分野の当業者には明らかであろう。例えば、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．(２０１５)３５(４)：ｅ００２２５、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ(２０１７)１６：３１５－３３７、Ｍａｒｉｎ－Ａｃｅｖｅｄｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ． Ｏｎｃｏｌ．(２０１８)１１：８、Ｅｌｇｕｎｄｉ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ(２０１７)１２２：２－１９を参照されたい。

【0242】

一部の実施形態では、抗体－薬物複合体は、抗体及び薬物分子を付着させるリンカー(例、ペプチドリンカー、例えば切断可能なリンカーなど)を更に含み得る。

【0243】

抗体－薬物複合体のための適切な毒素又は薬物の例は、限定されないが、ブレンツキシマブベドチン、グレンバツムマブベドチン/ＣＤＸ－０１１、デパツキズマブマフォドチン/ＡＢＴ－４１４、ＰＳＭＡ ＡＤＣ、ポラツズマブベドチン/ＲＧ７５９６/ＤＣＤＳ４５０１Ａ、デニンツズマブマホドチン/ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＡＧＳ－１６Ｃ３Ｆ、ＣＤＸ－０１４、ＲＧ７８４１/ＤＬＹＥ５９５３Ａ、ＲＧ７８８２/ＤＭＵＣ４０６Ａ、ＲＧ７９８６/ＤＣＤＳ０７８０Ａ、ＳＧＮ－ＬＩＶ１Ａ、エンフォルツマブベドチン/ＡＳＧ－２２ＭＥ、ＡＧ－１５ＭＥ、ＡＧＳ６７Ｅ、テリソツズマブベドチン/ＡＢＢＶ－３９９、ＡＢＢＶ－２２１、ＡＢＢＶ－０８５、ＧＳＫ－２８５７９１６、ティソツマブベドチン/ＨｕＭａｘ－ＴＦ－ＡＤＣ、ＨｕＭａｘ－Ａｘｌ－ＡＤＣ、ピナツズマブベドチン/ＲＧ７５９３/ＤＣＤＴ２９８０Ｓ、リファツズマブベドチン/ＲＧ７５９９/ＤＮＩＢ０６００Ａ、インデュサツマブベドチン/ＭＬＮ－０２６４/ＴＡＫ－２６４、バンドルツズマブベドチン/ＲＧ７４５０/ＤＳＴＰ３０８６Ｓ、ソフィツズマブベドチン/ＲＧ７４５８/ＤＭＵＣ５７５４Ａ、ＲＧ７６００/ＤＭＯＴ４０３９Ａ、ＲＧ７３３６/ＤＥＤＮ６５２６Ａ、ＭＥ１５４７、ＰＦ－０６２６３５０７/ＡＤＣ ５Ｔ４、トラスツズマブエムタンシン/Ｔ－ＤＭ１、ミルベツキシマブソラフタンシン/ＩＭＧＮ８５３、コルツキシマブラヴタンシン/ＳＡＲ３４１９、ナラツキシマブエムタンシン/ＩＭＧＮ５２９、インダツキシマブラヴタンシン/ＢＴ－０６２、アネツマブラヴタンシン/ＢＡＹ ９４－９３４３、ＳＡＲ４０８７０１、ＳＡＲ４２８９２６、ＡＭＧ ２２４、ＰＣＡ０６２、ＨＫＴ２８８、ＬＹ３０７６２２６、ＳＡＲ５６６６５８、ロルボツズマブメルタンシン/ＩＭＧＮ９０１、カンツズマブメルタンシン/ＳＢ－４０８０７５、カンツズマブラヴタンシン/ＩＭＧＮ２４２、ラプリツキシマブエムタンシン/ＩＭＧＮ２８９、ＩＭＧＮ３８８、ビバツズマブメルタンシン、ＡＶＥ９６３３、ＢＩＩＢ０１５、ＭＬＮ２７０４、ＡＭＧ １７２、ＡＭＧ ５９５、ＬＯＰ ６２８、バダツキシマブタリリン/ＳＧＮ－ＣＤ３３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ７０Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ｂ、ＳＧＮ－ＣＤ１２３Ａ、ＳＧＮ－ＣＤ３５２Ａ、ロバルピツズマブテシリン/ＳＣ１６ＬＤ６．５、ＳＣ－００２、ＳＣ－００３、ＡＤＣＴ－３０１/ＨｕＭａｘ－ＴＡＣ－ＰＢＤ、ＡＤＣＴ－４０２、ＭＥＤＩ３７２６/ＡＤＣ－４０１、ＩＭＧＮ７７９、ＩＭＧＮ６３２、ゲムツズマブオゾガマイシン、イノツズマブオゾガマイシン/ＣＭＣ－５４４、ＰＦ－０６６４７２６３、ＣＭＤ－１９３、ＣＭＢ－４０１、トラスツズマブデュオカルマジン/ＳＹＤ９８５、ＢＭＳ－９３６５６１/ＭＤＸ－１２０３、サシツズマブゴビテカン/ＩＭＭＵ－１３２、ラベツズマブゴビテカン/ＩＭＭＵ－１３０、ＤＳ－８２０１ａ、Ｕ３－１４０２、ミラツズマブドキソルビシン/ＩＭＭＵ－１１０/ｈＬＬ１－ＤＯＸ、ＢＭＳ－９８６１４８、ＲＣ４８－ＡＤＣ/ヘルツズマブ－ｖｃ－ＭＭＡＥ、ＰＦ－０６６４７０２０、ＰＦ－０６６５０８０８、ＰＦ－０６６６４１７８/ＲＮ９２７Ｃ、ルパルツマブアマドチン/ＢＡＹ１１２９９８０、アプルツマブイクサドチン/ＢＡＹ１１８７９８２、ＡＲＸ７８８、ＡＧＳ６２Ｐ１、ＸＭＴ－１５２２、ＡｂＧｎ－１０７、ＭＥＤＩ４２７６、ＤＳＴＡ４６３７Ｓ/ＲＧ７８６１中に含まれる毒素及び薬物を含む。抗ＣＤ３０抗体薬物複合体は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ａｍ． Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ Ｓｙｓｔ． Ｐｈａｒｍ． (２０１３)７０(７)： ５８９－９７、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ(２０１９)１１(６)： １１４９－１１６１である。

【0244】

いくつかの実施形態では、細胞表面タンパク質(例えば、細胞表面系統特異的細胞表面タンパク質)のエピトープへの抗体－薬物複合体の結合は、抗体－薬物複合体の内部移行を誘導し、薬物(又は毒素)は、細胞内に放出され得る。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープとの抗体－薬物複合体の結合は、毒素又は薬物の内部移行を誘導し、それによって、毒素又は薬物が、系統特異的タンパク質を発現する細胞(標的細胞)を殺傷することが可能になる。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的タンパク質のエピトープとの抗体－薬物複合体の結合は、毒素又は薬剤の内部化を誘発し、それによって、毒素又は薬剤は、系統特異的タンパク質(標的細胞)を発現する細胞の活性が調節され得る。本明細書に記載される抗体－薬物複合体で使用される毒素又は薬物の種類は、いかなる特定の種類にも限定されない。

【0245】

本開示の態様はまた、キット、例えば、遺伝子操作された細胞を産生するための試薬を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかと、細胞のゲノム中の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチド及びｇＲＮＡは、１細胞又は複数の細胞のゲノム中の標的ドメインと結合するのに好適な条件下で、リボ核タンパク質(ＲＮＰ)複合体を形成する。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかと、細胞のゲノム中の第２の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、第２のｇＲＮＡ及び融合ポリペプチドは、１細胞又は複数の細胞のゲノム中の第２の標的ドメインと結合するのに好適な条件下で、リボ核タンパク質(ＲＮＰ)複合体を形成する。

【0246】

いくつかの実施形態では、キットは、１細胞又は複数の細胞をｇＲＮＡ及び本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかと接触させる方法に関する説明書を含む。いくつかの実施形態では、説明書は、細胞又は複数の細胞をｇＲＮＡと接触させる前に、細胞又は複数の細胞を融合ポリペプチドと接触させることを提示する。いくつかの実施形態では、説明書は、細胞又は複数の細胞を融合ポリペプチドと接触させる前に、細胞又は複数の細胞をｇＲＮＡと接触させることを提示する。

【0247】

いくつかの実施形態では、キットは、１細胞又は複数の細胞を含む。いくつかの実施形態では、キットは、１細胞又は複数の細胞を含まない(例えば、説明書に列挙された１細胞又は複数の細胞は、他の手段によって取得される)。

【0248】

配列
例示的なベクター配列の核酸配列を以下に提供する。
構築物Ａ－(配列番号４５)
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【0249】

構築物Ｂ－(配列番号４６)
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【0250】

構築物Ｃ(配列番号４７)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttttagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtgccaccatgggcagctcagagactggcccagtggctgtggaccccacattgagacggcggatcgagccccatgagtttgaggtattcttcgatccgagagagctccgcaaggagacctgcctgctttacgaaattaattgggggggccggcactccatttggcgacatacatcacagaacactaacaagcacgtcgaagtcaacttcatcgagaagttcacgacagaaagatatttctgtccgaacacaaggtgcagcattacctggtttctcagctggagcccatgcggcgaatgtagtagggccatcactgaattcctgtcaaggtatccccacgtcactctgtttatttacatcgcaaggctgtaccaccacgctgacccccgcaatcgacaaggcctgcgggatttgatctcttcaggtgtgactatccaaattatgactgagcaggagtcaggatactgctggagaaactttgtgaattatagcccgagtaatgaagcccactggcctaggtatccccatctgtgggtacgactgtacgttcttgaactgtactgcatcatactgggcctgcctccttgtctcaacattctgagaaggaagcagccacagctgacattctttaccatcgctcttcagtcttgtcattaccagcgactgcccccacacattctctgggccaccgggttgaaatctggtggttcttctggtggttctagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagttccggagggagtagcggcgggtctaataacggaactaataacttccaaaacttcatcgggatcagttccttgcagaaaactctccggaatgctctcatcccaactgagactactcagcagttcattgttaagaatggaatcataaaagaggacgagcttaggggggaaaataggcaaatcctcaaggatatcatggatgactattataggggctttatatccgagacactgagcagcattgatgatatagactggacctctcttttcgaaaagatggaaatacaacttaaaaatggagataacaaggacaccctgataaaggaacagaccgaatataggaaggcaattcataaaaagtttgctaacgatgataggtttaaaaacatgttctcagcaaaactcatttcagatatactgcccgaattcgttatccacaacaacaactactccgctagcgaaaaagaggaaaagacccaagtcataaagctgttctctcgattcgcgacgagttttaaagattatttccgaaatcgcgcaaactgtttctcagctgatgatatcagcagctcatcctgtcatcggatcgttaacgataatgctgaaatcttcttctccaatgcacttgtttataggcgcattgttaaatctctctcaaacgatgatatcaataagatttccggcgatatgaaggacagtcttaaggagatgagcctcgaagagatatactcatacgagaaatatggcgaatttatcacccaggaagggatttccttctataatgacatttgcggcaaagtcaattccttcatgaacctgtattgccaaaaaaataaagaaaacaagaacctctataagctgcaaaagttgcataagcaaatactttgtatcgcggatacaagctatgaagttccctacaagttcgagagtgatgaggaggtgtatcaatctgtcaatggtttccttgataatatttcttctaagcatattgttgaacgactccgaaagataggagacaactataatggatacaatttggataaaatctacatcgtgtctaaattttacgagagtgtgtcacaaaaaacatatagagactgggagacaattaataccgccctggagatacattacaacaatatacttcccgggaacgggaagtctaaggcagacaaggtgaagaaagccgtgaagaacgacttgcaaaagtcaattaccgaaatcaatgagcttgtttcaaactataaactttgttcagatgacaatattaaagccgaaacctatattcatgaaatctctcatattctgaataactttgaggcgcaagaactgaaatataacccagaaatacacctcgttgagtccgaactgaaagcaagcgaactgaaaaatgttttggacgtgataatgaacgcttttcattggtgctcagtctttatgacagaggagcttgttgacaaggataacaatttctatgcggaactggaagagatttacgacgaaatctatccggtcatatccctgtataacctggttcgcaactatgtcacgcaaaaaccatacagcacgaagaagattaaactgaactttggtattccgacgctggcccgcggatggtcaaaatctgttgaatactcacgaaatgccataatcctgatgcgagataacctctactaccttggaatctttaatgctaaaaataaacccgataaaaaaattatcgaagggaacacgagtgaaaacaaaggtgattataaaaaaatgatatataatctgcttccaggaccaaataagatgatacccaaagttttcctttcttcaaagaccggcgtcgagacatataaaccatccgcgtacatacttgaaggctacaaacaaaataaacatatcaaatcatctaaggattttgacattacgttctgtcatgatttgattgactatttcaaaaattgcatagccattcatccagagtggaaaaactttgggtttgacttctctgataccagtacatatgaagacataagtggattttaccgagaagtagagctccaaggttataaaatagactggacctatatatctgaaaaggatatagaccttttgcaagagaagggacagctttatcttttccaaatctacaacaaagacttcagtaagaaaagtaccgggaatgacaatcttcataccatgtatctgaagaacctgttctccgaagaaaatctgaaggacatagtcctgaagcttaatggcgaagcggaaatttttttccgaaagagctctattaagaaccccataatacataagaagggaagcattctcgttaatcgaacgtatgaggccgaagagaaagatcaatttgggaatatccaaatcgttcgaaagaacataccagaaaatatttaccaagaattgtacaaatattttaacgataaaagcgacaaagaactgtctgatgaagctgctaagctgaaaaacgtcgtcggccatcatgaggccgcgacgaatatagtcaaggattaccgatatacatacgataagtatttcctgcatatgcccatcactatcaactttaaggcaaataagactggattcattaatgacagaatactgcaatacatagctaaagaaaaagatttgcatgttattggcattgccaggggtgagcgcaatcttatctatgtaagcgtcattgatacttgcgggaatatcgtagagcagaagtcatttaatattgtaaatgggtacgattaccaaatcaagttgaagcagcaagagggagcacgacagattgcccgcaaggagtggaaagagatcggaaagataaaggagatcaaggaggggtatttgtcccttgttatacacgaaatttccaagatggtaatcaagtacaacgctataattgctatggaggatctctcctatggatttaaaaagggaagatttaaagtcgagcggcaggtatatcagaaatttgaaacaatgcttattaata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【0251】

構築物Ｄ．(配列番号４８)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttttagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtgccaccatgaataacggaactaataacttccaaaacttcatcgggatcagttccttgcagaaaactctccggaatgctctcatcccaactgagactactcagcagttcattgttaagaatggaatcataaaagaggacgagcttaggggggaaaataggcaaatcctcaaggatatcatggatgactattataggggctttatatccgagacactgagcagcattgatgatatagactggacctctcttttcgaaaagatggaaatacaacttaaaaatggagataacaaggacaccctgataaaggaacagaccgaatataggaaggcaattcataaaaagtttgctaacgatgataggtttaaaaacatgttctcagcaaaactcatttcagatatactgcccgaattcgttatccacaacaacaactactccgctagcgaaaaagaggaaaagacccaagtcataaagctgttctctcgattcgcgacgagttttaaagattatttccgaaatcgcgcaaactgtttctcagctgatgatatcagcagctcatcctgtcatcggatcgttaacgataatgctgaaatcttcttctccaatgcacttgtttataggcgcattgttaaatctctctcaaacgatgatatcaataagatttccggcgatatgaaggacagtcttaaggagatgagcctcgaagagatatactcatacgagaaatatggcgaatttatcacccaggaagggatttccttctataatgacatttgcggcaaagtcaattccttcatgaacctgtattgccaaaaaaataaagaaaacaagaacctctataagctgcaaaagttgcataagcaaatactttgtatcgcggatacaagctatgaagttccctacaagttcgagagtgatgaggaggtgtatcaatctgtcaatggtttccttgataatatttcttctaagcatattgttgaacgactccgaaagataggagacaactataatggatacaatttggataaaatctacatcgtgtctaaattttacgagagtgtgtcacaaaaaacatatagagactgggagacaattaataccgccctggagatacattacaacaatatacttcccgggaacgggaagtctaaggcagacaaggtgaagaaagccgtgaagaacgacttgcaaaagtcaattaccgaaatcaatgagcttgtttcaaactataaactttgttcagatgacaatattaaagccgaaacctatattcatgaaatctctcatattctgaataactttgaggcgcaagaactgaaatataacccagaaatacacctcgttgagtccgaactgaaagcaagcgaactgaaaaatgttttggacgtgataatgaacgcttttcattggtgctcagtctttatgacagaggagcttgttgacaaggataacaatttctatgcggaactggaagagatttacgacgaaatctatccggtcatatccctgtataacctggttcgcaactatgtcacgcaaaaaccatacagcacgaagaagattaaactgaactttggtattccgacgctggcccgcggatggtcaaaatctgttgaatactcacgaaatgccataatcctgatgcgagataacctctactaccttggaatctttaatgctaaaaataaacccgataaaaaaattatcgaagggaacacgagtgaaaacaaaggtgattataaaaaaatgatatataatctgcttccaggaccaaataagatgatacccaaagttttcctttcttcaaagaccggcgtcgagacatataaaccatccgcgtacatacttgaaggctacaaacaaaataaacatatcaaatcatctaaggattttgacattacgttctgtcatgatttgattgactatttcaaaaattgcatagccattcatccagagtggaaaaactttgggtttgacttctctgataccagtacatatgaagacataagtggattttaccgagaagtagagctccaaggttataaaatagactggacctatatatctgaaaaggatatagaccttttgcaagagaagggacagctttatcttttccaaatctacaacaaagacttcagtaagaaaagtaccgggaatgacaatcttcataccatgtatctgaagaacctgttctccgaagaaaatctgaaggacatagtcctgaagcttaatggcgaagcggaaatttttttccgaaagagctctattaagaaccccataatacataagaagggaagcattctcgttaatcgaacgtatgaggccgaagagaaagatcaatttgggaatatccaaatcgttcgaaagaacataccagaaaatatttaccaagaattgtacaaatattttaacgataaaagcgacaaagaactgtctgatgaagctgctaagctgaaaaacgtcgtcggccatcatgaggccgcgacgaatatagtcaaggattaccgatatacatacgataagtatttcctgcatatgcccatcactatcaactttaaggcaaataagactggattcattaatgacagaatactgcaatacatagctaaagaaaaagatttgcatgttattggcattgacaggggtgagcgcaatcttatctatgtaagcgtcattgatacttgcgggaatatcgtagagcagaagtcatttaatattgtaaatgggtacgattaccaaatcaagttgaagcagcaagagggagcacgacagattgcccgcaaggagtggaaagagatcggaaagataaaggagatcaaggaggggtatttgtcccttgttatacacgaaatttccaagatggtaatcaagtacaacgctataattgctatggaggatctctcctatggatttaaaaagggaagatttaaagtcgagcggcaggtatatcagaaatttgaaacaatgcttattaataaacttaattatctcgttttcaaagacattagtatcaccgaaaacggtgggctgttgaagggctatcaacttacgtacataccagataagcttaagaatgtgggtcaccaatgcggatgcatattctacgtgcccgcagcttatacaagcaaaatcgacccaacaacgggtttcgtaaacatatttaagttcaaggatctcaccgtggatgccaagcgagagttcataaaaaaatttgactcaatcagatatgactcagaaaagaatcttttttgttttaccttcgactacaataatttcattacacaaaatacggttatgagcaagtcatcctggtccgtatatacgtatggagtgcgcataaagcggagattcgttaacgggcgattttctaatgagtccgatacaatcgatataacaaaggatatggaaaaaactctggaaatgactgatataaattggagggacggtcatgacctcaggcaagacattatcgattatgagatcgtgcaacatatttttgagatctttcggttgactgtccaaatgaggaactctctgtctgaattggaagatagggactacgatcgcctgataagccccgtgttgaacgagaataacatattctacgattccgcgaaagccggggatgcgctccctaaggacgccgatgcaaatggggcctattgtattgctttgaaagggctgtacgaaatcaaacagatcaccgaaaactggaaagaagacgggaagtttagtcgggataaactgaagatatccaaca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【0252】

構築物Ｅ(配列番号４９)
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【0253】

構築物Ｆ(配列番号５０)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttttagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtgccaccatgcaactggtgaagagcgagctggaagagaagaaaagcgagctcagacataagctgaagtacgttccccacgaatacattgaactgatagaaatcgctagaaacagtacgcaagacagaatactggaaatgaaggtgatggagttcttcatgaaggtttacggctatcgtggcaaacacctcgggggctcccggaagcccgacggggctatctacaccgtgggcagtcccatcgactatggcgtgatcgtggacaccaaagcttatagcggcggatataatctccccatcggccaagccgatgagatgcagaggtatgtggaggagaaccaaacaagaaacaagcatatcaaccccaacgagtggtggaaggtttatcctagctcggtgaccgagtttaagttcctattcgtgtctggccacttcaagggcaactataaggcacagctcactagactgaatcatatcacgaattgcaacggcgccgtgttatccgtggaggagctactgatcggcggagagatgatcaaagccggcaccctgaccctggaagaggtgagaagaaagtttaacaatggcgaaataaatttcggcagcggaagtggaagcggctccatcactagaaccaccaaccctagaaacgtggtgcccaagatctacatgagcgccggcagcatccccctgaccacccacatcaccaactcaattcagcccaccctgtggaccatcggcagcatcaacggcgtggcccccctggccaagagcatcaagctgggcatccccgtgaccggcagcgcctacaccgatcagaccaccgccatggtgagaaagaaggtgagcgtgttcatgggcagcggcagcgggagcggctcatcgcagctggttaagagcgagttagaagaaaaaaagagcgaactgcggcataaactgaagtatgtcccacacgagtacatcgaactgatcgagatcgcgagaaactctacccaagacagaattctggagatgaaagtaatggaatttttcatgaaggtgtatggatatagagggaagcacctgggtggcagcagaaaacccgacggcgccatctacactgtggggagccccatagactatggtgtgatcgtggataccaaggcgtatagcggcggttacaatctgcccattgggcaagcggacgagatgcaaagatatgtggaagagaatcagacgaggaacaagcacattaaccctaatgagtggtggaaggtctaccctagctccgttaccgagttcaagttcctgtttgtgagcgggcattttaagggcaactacaaggcacagctgacccgcctgaaccacataacaaactgcaacggtgccgtgctgagcgtagaagagttgctaatcggcggcgagatgatcaaggccggcacgctaaccctcgaagaggtgcgcagaaagttcaataacggcgaaatcaatttcagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagtacacagttcgagggctttaccaacctgtatcaggtgagcaagacactgcggtttgagctgatcccacagggcaagaccctgaagcacatccaggagcagggcttcatcgaggaggacaaggcccgcaatgatcactacaaggagctgaagcccatcatcgatcggatctacaagacctatgccgaccagtgcctgcagctggtgcagctggattgggagaacctgagcgccgccatcgactcctatagaaaggagaaaaccgaggagacaaggaacgccctgatcgaggagcaggccacatatcgcaatgccatccacgactacttcatcggccggacagacaacctgaccgatgccatcaataagagacacgccgagatctacaagggcctgttcaaggccgagctgtttaatggcaaggtgctgaagcagctgggcaccgtgaccacaaccgagcacgagaacgccctgctgcggagcttcgacaagtttacaacctacttctccggcttttatagaaacaggaagaacgtgttcagcgccgaggatatcagcacagccatcccacaccgcatcgtgcaggacaacttccccaagtttaaggagaattgtcacatcttcacacgcctgatcaccgccgtgcccagcctgcgggagcactttgagaacgtgaagaaggccatcggcatcttcgtgagcacctccatcgaggaggtgttttccttccctttttataaccagctgctgacacagacccagatcgacctgtataaccagctgctgggaggaatctctcgggaggcaggcaccgagaagatcaagggcctgaacgaggtgctgaatctggccatccagaagaatgatgagacagcccacatcatcgcctccctgccacacagattcatccccctgtttaagcagatcctgtccgataggaacaccctgtctttcatcctggaggagtttaagagcgacgaggaagtgatccagtccttctgcaagtacaagacactgctgagaaacgagaacgtgctggagacagccgaggccctgtttaacgagctgaacagcatcgacctgacacacatcttcatcagccacaagaagctggagacaatcagcagcgccctgtgcgaccactgggatacactgaggaatgccctgtatgagcggagaatctccgagctgacaggcaagatcaccaagtctgccaaggagaaggtgcagcgcagcctgaagcacgaggatatcaacctgcaggagatcatctctgccgcaggcaaggagctgagcgaggccttcaagcagaaaaccagcgagatcctgtcccacgcacacgccgccctggatcagccactgcctacaaccctgaagaagcaggaggagaaggagatcctgaagtctcagctggacagcctgctgggcctgtaccacctgctggactggtttgccgtggatgagtccaacgaggtggaccccgagttctctgcccggctgaccggcatcaagctggagatggagccttctctgagcttctacaacaaggccagaaattatgccaccaagaagccctactccgtggagaagttcaagctgaactttcagatgcctacactggccagaggctgggacgtgaatgtggagaagaacagaggcgccatcctgtttgtgaagaacggcctgtactatctgggcatcatgccaaagcagaagggcaggtataaggccctgagcttcgagcccacagagaaaaccagcgagggctttgataagatgtactatgactacttccctgatgccgccaagatgatcccaaagtgcagcacccagctgaaggccgtgacagcccactttcagacccacacaacccccatcctgctgtccaacaatttcatcgagcctctggagatcacaaaggagatctacgacctgaacaatcctgagaaggagccaaagaagtttcagacagcctacgccaagaaaaccggcgaccagaagggctacagagaggccctgtgcaagtggatcgacttcacaagggattttctgtccaagtataccaagacaacctctatcgatctgtctagcctgcggccatcctctcagtataaggacctgggcgagtactatgccgagctgaatcccctgctgtaccacatcagcttccagagaatcgccgagaaggagatcatggatgccgtggagacaggcaagctgtacctgttccagatctataaca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【0254】

構築物Ｇ(配列番号５１)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttttagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtgccaccatgacacagttcgagggctttaccaacctgtatcaggtgagcaagacactgcggtttgagctgatcccacagggcaagaccctgaagcacatccaggagcagggcttcatcgaggaggacaaggcccgcaatgatcactacaaggagctgaagcccatcatcgatcggatctacaagacctatgccgaccagtgcctgcagctggtgcagctggattgggagaacctgagcgccgccatcgactcctatagaaaggagaaaaccgaggagacaaggaacgccctgatcgaggagcaggccacatatcgcaatgccatccacgactacttcatcggccggacagacaacctgaccgatgccatcaataagagacacgccgagatctacaagggcctgttcaaggccgagctgtttaatggcaaggtgctgaagcagctgggcaccgtgaccacaaccgagcacgagaacgccctgctgcggagcttcgacaagtttacaacctacttctccggcttttatagaaacaggaagaacgtgttcagcgccgaggatatcagcacagccatcccacaccgcatcgtgcaggacaacttccccaagtttaaggagaattgtcacatcttcacacgcctgatcaccgccgtgcccagcctgcgggagcactttgagaacgtgaagaaggccatcggcatcttcgtgagcacctccatcgaggaggtgttttccttccctttttataaccagctgctgacacagacccagatcgacctgtataaccagctgctgggaggaatctctcgggaggcaggcaccgagaagatcaagggcctgaacgaggtgctgaatctggccatccagaagaatgatgagacagcccacatcatcgcctccctgccacacagattcatccccctgtttaagcagatcctgtccgataggaacaccctgtctttcatcctggaggagtttaagagcgacgaggaagtgatccagtccttctgcaagtacaagacactgctgagaaacgagaacgtgctggagacagccgaggccctgtttaacgagctgaacagcatcgacctgacacacatcttcatcagccacaagaagctggagacaatcagcagcgccctgtgcgaccactgggatacactgaggaatgccctgtatgagcggagaatctccgagctgacaggcaagatcaccaagtctgccaaggagaaggtgcagcgcagcctgaagcacgaggatatcaacctgcaggagatcatctctgccgcaggcaaggagctgagcgaggccttcaagcagaaaaccagcgagatcctgtcccacgcacacgccgccctggatcagccactgcctacaaccctgaagaagcaggaggagaaggagatcctgaagtctcagctggacagcctgctgggcctgtaccacctgctggactggtttgccgtggatgagtccaacgaggtggaccccgagttctctgcccggctgaccggcatcaagctggagatggagccttctctgagcttctacaacaaggccagaaattatgccaccaagaagccctactccgtggagaagttcaagctgaactttcagatgcctacactggccagaggctgggacgtgaatgtggagaagaacagaggcgccatcctgtttgtgaagaacggcctgtactatctgggcatcatgccaaagcagaagggcaggtataaggccctgagcttcgagcccacagagaaaaccagcgagggctttgataagatgtactatgactacttccctgatgccgccaagatgatcccaaagtgcagcacccagctgaaggccgtgacagcccactttcagacccacacaacccccatcctgctgtccaacaatttcatcgagcctctggagatcacaaaggagatctacgacctgaacaatcctgagaaggagccaaagaagtttcagacagcctacgccaagaaaaccggcgaccagaagggctacagagaggccctgtgcaagtggatcgacttcacaagggattttctgtccaagtataccaagacaacctctatcgatctgtctagcctgcggccatcctctcagtataaggacctgggcgagtactatgccgagctgaatcccctgctgtaccacatcagcttccagagaatcgccgagaaggagatcatggatgccgtggagacaggcaagctgtacctgttccagatctataacaaggactttgccaagggccaccacggcaagcctaatctgcacacactgtattggaccggcctgttttctccagagaacctggccaagacaagcatcaagctgaatggccaggccgagctgttctaccgccctaagtccaggatgaagaggatggcacaccggctgggagagaagatgctgaacaagaagctgaaggatcagaaaaccccaatccccgacaccctgtaccaggagctgtacgactatgtgaatcacagactgtcccacgacctgtctgatgaggccagggccctgctgcccaacgtgatcaccaaggaggtgtctcacgagatcatcaaggataggcgctttaccagcgacaagttctttttccacgtgcctatcacactgaactatcaggccgccaattccccatctaagttcaaccagagggtgaatgcctacctgaaggagcaccccgagacacctatcatcggcatcgcccggggcgagagaaacctgatctatatcacagtgatcgactccaccggcaagatcctggagcagcggagcctgaacaccatccagcagtttgattaccagaagaagctggacaacagggagaaggagagggtggcagcaaggcaggcctggtctgtggtgggcacaatcaaggatctgaagcagggctatctgagccaggtcatccacgagatcgtggacctgatgatccactaccaggccgtggtggtgctggagaacctgaatttcggctttaagagcaagaggaccggcatcgccgagaaggccgtgtaccagcagttcgagaagatgctgatcgataagctgaattgcctggtgctgaaggactatccagcagagaaagtgggaggcgtgctgaacccataccagctgacagaccagttcacctcctttgccaagatgggcacccagtctggcttcctgttttacgtgcctgccccatatacatctaagatcgatcccctgaccggcttcgtggaccccttcgtgtggaaaaccatcaagaatcacgagagccgcaagcacttcctggagggcttcgactttctgcactacgacgtgaaaaccggcgacttcatcctgcactttaagatgaacagaaatctgtccttccagaggggcctgcccggctttatgcctgcatgggatatcgtgttcgagaagaacgagacacagtttgacgccaagggcacccctttcatcgccggcaagagaatcgtgccagtgatcgagaatcacagattcaccggcagataccgggacctgtatcctgccaacgagctgatcgccctgctggaggagaagggcatcgtgttcagggatggctccaacatcctgccaaagctgctggagaatgacgattctcacgccatcgacaccatggtggccctgatccgcagcgtgctgcagatgcggaactccaatgccgccacaggcgaggactatatcaacagccccgtgcgcgatctgaatggcgtgtgcttcgact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【0255】

構築物Ｈ(配列番号５２)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttttagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtgccaccatgacacagttcgagggctttaccaacctgtatcaggtgagcaagacactgcggtttgagctgatcccacagggcaagaccctgaagcacatccaggagcagggcttcatcgaggaggacaaggcccgcaatgatcactacaaggagctgaagcccatcatcgatcggatctacaagacctatgccgaccagtgcctgcagctggtgcagctggattgggagaacctgagcgccgccatcgactcctatagaaaggagaaaaccgaggagacaaggaacgccctgatcgaggagcaggccacatatcgcaatgccatccacgactacttcatcggccggacagacaacctgaccgatgccatcaataagagacacgccgagatctacaagggcctgttcaaggccgagctgtttaatggcaaggtgctgaagcagctgggcaccgtgaccacaaccgagcacgagaacgccctgctgcggagcttcgacaagtttacaacctacttctccggcttttatagaaacaggaagaacgtgttcagcgccgaggatatcagcacagccatcccacaccgcatcgtgcaggacaacttccccaagtttaaggagaattgtcacatcttcacacgcctgatcaccgccgtgcccagcctgcgggagcactttgagaacgtgaagaaggccatcggcatcttcgtgagcacctccatcgaggaggtgttttccttccctttttataaccagctgctgacacagacccagatcgacctgtataaccagctgctgggaggaatctctcgggaggcaggcaccgagaagatcaagggcctgaacgaggtgctgaatctggccatccagaagaatgatgagacagcccacatcatcgcctccctgccacacagattcatccccctgtttaagcagatcctgtccgataggaacaccctgtctttcatcctggaggagtttaagagcgacgaggaagtgatccagtccttctgcaagtacaagacactgctgagaaacgagaacgtgctggagacagccgaggccctgtttaacgagctgaacagcatcgacctgacacacatcttcatcagccacaagaagctggagacaatcagcagcgccctgtgcgaccactgggatacactgaggaatgccctgtatgagcggagaatctccgagctgacaggcaagatcaccaagtctgccaaggagaaggtgcagcgcagcctgaagcacgaggatatcaacctgcaggagatcatctctgccgcaggcaaggagctgagcgaggccttcaagcagaaaaccagcgagatcctgtcccacgcacacgccgccctggatcagccactgcctacaaccctgaagaagcaggaggagaaggagatcctgaagtctcagctggacagcctgctgggcctgtaccacctgctggactggtttgccgtggatgagtccaacgaggtggaccccgagttctctgcccggctgaccggcatcaagctggagatggagccttctctgagcttctacaacaaggccagaaattatgccaccaagaagccctactccgtggagaagttcaagctgaactttcagatgcctacactggccagaggctgggacgtgaatgtggagaagaacagaggcgccatcctgtttgtgaagaacggcctgtactatctgggcatcatgccaaagcagaagggcaggtataaggccctgagcttcgagcccacagagaaaaccagcgagggctttgataagatgtactatgactacttccctgatgccgccaagatgatcccaaagtgcagcacccagctgaaggccgtgacagcccactttcagacccacacaacccccatcctgctgtccaacaatttcatcgagcctctggagatcacaaaggagatctacgacctgaacaatcctgagaaggagccaaagaagtttcagacagcctacgccaagaaaaccggcgaccagaagggctacagagaggccctgtgcaagtggatcgacttcacaagggattttctgtccaagtataccaagacaacctctatcgatctgtctagcctgcggccatcctctcagtataaggacctgggcgagtactatgccgagctgaatcccctgctgtaccacatcagcttccagagaatcgccgagaaggagatcatggatgccgtggagacaggcaagctgtacctgttccagatctataacaaggactttgccaagggccaccacggcaagcctaatctgcacacactgtattggaccggcctgttttctccagagaacctggccaagacaagcatcaagctgaatggccaggccgagctgttctaccgccctaagtccaggatgaagaggatggcacaccggctgggagagaagatgctgaacaagaagctgaaggatcagaaaaccccaatccccgacaccctgtaccaggagctgtacgactatgtgaatcacagactgtcccacgacctgtctgatgaggccagggccctgctgcccaacgtgatcaccaaggaggtgtctcacgagatcatcaaggataggcgctttaccagcgacaagttctttttccacgtgcctatcacactgaactatcaggccgccaattccccatctaagttcaaccagagggtgaatgcctacctgaaggagcaccccgagacacctatcatcggcatcgcccggggcgagagaaacctgatctatatcacagtgatcgactccaccggcaagatcctggagcagcggagcctgaacaccatccagcagtttgattaccagaagaagctggacaacagggagaaggagagggtggcagcaaggcaggcctggtctgtggtgggcacaatcaaggatctgaagcagggctatctgagccaggtcatccacgagatcgtggacctgatgatccactaccaggccgtggtggtgctggagaacctgaatttcggctttaagagcaagaggaccggcatcgccgagaaggccgtgtaccagcagttcgagaagatgctgatcgataagctgaattgcctggtgctgaaggactatccagcagagaaagtgggaggcgtgctgaacccataccagctgacagaccagttcacctcctttgccaagatgggcacccagtctggcttcctgttttacgtgcctgccccatatacatctaagatcgatcccctgaccggcttcgtggaccccttcgtgtggaaaaccatcaagaatcacgagagccgcaagcacttcctggagggcttcgactttctgcactacgacgtgaaaaccggcgacttcatcctgcactttaagatgaacagaaatctgtccttccagaggggcctgcccggctttatgcctgcatgggatatcgtgttcgagaagaacgagacacagtttgacgccaagggcacccctttcatcgccggcaagagaatcgtgccagtgatcgagaatcacagattcaccggcagataccgggacctgtatcctgccaacgagctgatcgccctgctggaggagaagggcatcgtgttcagggatggctccaacatcctgccaaagctgctggagaatgacgattctcacgccatcgacaccatggtggccctgatccgcagcgtgctgcagatgcggaactccaatgccgccacaggcgaggactatatcaacagccccgtgcgcgatctgaatggcgtgtgcttcgact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【0256】

構築物Ｉ(配列番号５３)
gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgtttttagcgcgtgcgccaattctgcagacaaatggctctagaggtacccgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattgtgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagctgagcaagaggtaagggtttaagggatggttggttggtggggtattaatgtttaattacctggagcacctgcctgaaatcactttttttcaggttggaccggtgccaccatgcaactggtgaagagcgagctggaagagaagaaaagcgagctcagacataagctgaagtacgttccccacgaatacattgaactgatagaaatcgctagaaacagtacgcaagacagaatactggaaatgaaggtgatggagttcttcatgaaggtttacggctatcgtggcaaacacctcgggggctcccggaagcccgccggggctatctacaccgtgggcagtcccatcgactatggcgtgatcgtggacaccaaagcttatagcggcggatataatctccccatcggccaagccgatgagatgcagaggtatgtggaggagaaccaaacaagaaacaagcatatcaaccccaacgagtggtggaaggtttatcctagctcggtgaccgagtttaagttcctattcgtgtctggccacttcaagggcaactataaggcacagctcactagactgaatcatatcacgaattgcaacggcgccgtgttatccgtggaggagctactgatcggcggagagatgatcaaagccggcaccctgaccctggaagaggtgagaagaaagtttaacaatggcgaaataaatttcggcagcggaagtggaagcggctccatcactagaaccaccaaccctagaaacgtggtgcccaagatctacatgagcgccggcagcatccccctgaccacccacatcaccaactcaattcagcccaccctgtggaccatcggcagcatcaacggcgtggcccccctggccaagagcatcaagctgggcatccccgtgaccggcagcgcctacaccgatcagaccaccgccatggtgagaaagaaggtgagcgtgttcatgggcagcggcagcgggagcggctcatcgcagctggttaagagcgagttagaagaaaaaaagagcgaactgcggcataaactgaagtatgtcccacacgagtacatcgaactgatcgagatcgcgagaaactctacccaagacagaattctggagatgaaagtaatggaatttttcatgaaggtgtatggatatagagggaagcacctgggtggcagcagaaaacccgacggcgccatctacactgtggggagccccatagactatggtgtgatcgtggataccaaggcgtatagcggcggttacaatctgcccattgggcaagcggacgagatgcaaagatatgtggaagagaatcagacgaggaacaagcacattaaccctaatgagtggtggaaggtctaccctagctccgttaccgagttcaagttcctgtttgtgagcgggcattttaagggcaactacaaggcacagctgacccgcctgaaccacataacaaactgcaacggtgccgtgctgagcgtagaagagttgctaatcggcggcgagatgatcaaggccggcacgctaaccctcgaagaggtgcgcagaaagttcaataacggcgaaatcaatttcagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagtacacagttcgagggctttaccaacctgtatcaggtgagcaagacactgcggtttgagctgatcccacagggcaagaccctgaagcacatccaggagcagggcttcatcgaggaggacaaggcccgcaatgatcactacaaggagctgaagcccatcatcgatcggatctacaagacctatgccgaccagtgcctgcagctggtgcagctggattgggagaacctgagcgccgccatcgactcctatagaaaggagaaaaccgaggagacaaggaacgccctgatcgaggagcaggccacatatcgcaatgccatccacgactacttcatcggccggacagacaacctgaccgatgccatcaataagagacacgccgagatctacaagggcctgttcaaggccgagctgtttaatggcaaggtgctgaagcagctgggcaccgtgaccacaaccgagcacgagaacgccctgctgcggagcttcgacaagtttacaacctacttctccggcttttatagaaacaggaagaacgtgttcagcgccgaggatatcagcacagccatcccacaccgcatcgtgcaggacaacttccccaagtttaaggagaattgtcacatcttcacacgcctgatcaccgccgtgcccagcctgcgggagcactttgagaacgtgaagaaggccatcggcatcttcgtgagcacctccatcgaggaggtgttttccttccctttttataaccagctgctgacacagacccagatcgacctgtataaccagctgctgggaggaatctctcgggaggcaggcaccgagaagatcaagggcctgaacgaggtgctgaatctggccatccagaagaatgatgagacagcccacatcatcgcctccctgccacacagattcatccccctgtttaagcagatcctgtccgataggaacaccctgtctttcatcctggaggagtttaagagcgacgaggaagtgatccagtccttctgcaagtacaagacactgctgagaaacgagaacgtgctggagacagccgaggccctgtttaacgagctgaacagcatcgacctgacacacatcttcatcagccacaagaagctggagacaatcagcagcgccctgtgcgaccactgggatacactgaggaatgccctgtatgagcggagaatctccgagctgacaggcaagatcaccaagtctgccaaggagaaggtgcagcgcagcctgaagcacgaggatatcaacctgcaggagatcatctctgccgcaggcaaggagctgagcgaggccttcaagcagaaaaccagcgagatcctgtcccacgcacacgccgccctggatcagccactgcctacaaccctgaagaagcaggaggagaaggagatcctgaagtctcagctggacagcctgctgggcctgtaccacctgctggactggtttgccgtggatgagtccaacgaggtggaccccgagttctctgcccggctgaccggcatcaagctggagatggagccttctctgagcttctacaacaaggccagaaattatgccaccaagaagccctactccgtggagaagttcaagctgaactttcagatgcctacactggccagaggctgggacgtgaatgtggagaagaacagaggcgccatcctgtttgtgaagaacggcctgtactatctgggcatcatgccaaagcagaagggcaggtataaggccctgagcttcgagcccacagagaaaaccagcgagggctttgataagatgtactatgactacttccctgatgccgccaagatgatcccaaagtgcagcacccagctgaaggccgtgacagcccactttcagacccacacaacccccatcctgctgtccaacaatttcatcgagcctctggagatcacaaaggagatctacgacctgaacaatcctgagaaggagccaaagaagtttcagacagcctacgccaagaaaaccggcgaccagaagggctacagagaggccctgtgcaagtggatcgacttcacaagggattttctgtccaagtataccaagacaacctctatcgatctgtctagcctgcggccatcctctcagtataaggacctgggcgagtactatgccgagctgaatcccctgctgtaccacatcagcttccagagaatcgccgagaaggagatcatggatgccgtggagacaggcaagctgtacctgttccagatctataaca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【0257】

本明細書に開示される技術の実施形態、利点、特徴、及び使用のうちのいくつかが、以下の例からより完全に理解されるであろう。例は、本開示の利益のうちのいくつかを例証し、かつ特定の実施形態を説明することを意図しているが、本開示の全範囲を例示することを意図しておらず、したがって、本開示の範囲を限定しない。

【0258】

例
例１．塩基編集融合ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを使用した遺伝子操作された造血細胞の生成
本例は、融合ポリペプチドの生成、及び遺伝子操作された造血細胞などの遺伝子操作された細胞の生成におけるそれらの使用を示す。Ｃａｓ１２ａ/Ｃｐｆ１ ｇＲＮＡは、目的の標的配列に向けられたｇＲＮＡ標的ドメインを使用して合成される。

【0259】

末梢血単核細胞を、造血幹細胞の動員後のアフェレーシスによって、健康なドナー対象から収集する。あるいは、動員末梢血(ｍＰＢ)に由来する凍結ＣＤ３４＋ＨＳＣは、例えば、Ｈｅｍａｃａｒｅ又はＦｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒから購入され、製造業者の指示に従って解凍される。約１×１０^６個のＨＳＣを解凍し、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＣＣ１１０カクテル(ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)を補充したＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ培地中で２４～４８時間培養した後、ＲＮＰでエレクトロポレーションする。

【0260】

ドナー又は購入したＣＤ３４＋細胞は、目的の標的化配列を標的とする融合ポリペプチド及びｇＲＮＡでエレクトロポレーションされる。ＨＳＣをエレクトロポレーションするために、１．５×１０^５個の細胞をペレット化し、２０μＬのＬｏｎｚａ Ｐ３溶液中に再懸濁し、融合ペプチド及びｇＲＮＡを含む１０μＬのＲＮＰと混合する。ＣＤ３４＋ＨＳＣが、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２及びＨｕｍａｎ Ｐ３ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(ＶＰＡ－１００２、Ｌｏｎｚａ)を使用して、エレクトロポレーションされる。

【0261】

編集した細胞を、４８時間未満培養する。採取後、細胞を洗浄し、最終製剤に再懸濁し、凍結保存する。

【0262】

編集されたＨＳＣの代表的な試料(例えば、時点アリコートの細胞の一部分又は全て)を、標的特異的抗体を使用した染色によって、生存率、標的配列における編集効率、及び/又は例示的な標的領域遺伝子の発現、又はその不在について評価し、フローサイトメトリーによって分析する。編集されたＨＳＣ集団はまた、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄細胞などの特定の細胞型への発生及び分化について評価され得る。

【0263】

ゲノムＤＮＡ解析
全てのゲノム解析では、ＤＮＡを細胞から採取し、標的領域に隣接するプライマーで増幅し、精製し、対立遺伝子修飾頻度を、当技術分野で知られている適切な方法を使用して解析した。解析を、模擬トランスフェクト試料の参照配列を使用して実行した。

【0264】

フローサイトメトリー分析
ｇＲＮＡ編集細胞はまた、例えば、フローサイトメトリー分析(ＦＡＣＳ)により、標的遺伝子によってコードされるタンパク質の表面発現について評価されてもよい。生存しているＣＤ３４＋ＨＳＣは、標的特異性抗体を使用して標的遺伝子タンパク質について染色され、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター(Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ)でのフローサイトメトリーによって分析される。

【0265】

編集された細胞の生存率
エクスビボ編集の０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、及び/又は４８時間後(例えば、エクスビボ編集の４、２４、及び４８時間後)に、生存細胞、編集された細胞、及び対照細胞の割合を、フローサイトメトリー及び７ＡＡＤ生存率色素を使用して定量化する。本明細書に記載される例示的なｇＲＮＡ又はｓｇＲＮＡを使用して編集された細胞は、生存能力があり、エレクトロポレーション及び遺伝子編集後に長時間生存能力し続け得る。これは、対照の模擬編集細胞で観察されるものに類似する。

【0266】

例２：インビトロでの遺伝子編集の評価
培養細胞における標的ＤＮＡ修飾をもたらす本明細書に記載される融合ポリペプチドの能力を評価するために、本明細書に記載される融合ポリペプチドのうちのいずれかなどの 融合ポリペプチド(例えば、図１～１２によって示されるか、又は配列番号２４～３１のうちのいずれかによって提供されるものなど及び所望の遺伝子座を標的とするｇＲＮＡを、健康な対象又は患者集団を含む目的の対象から供給される細胞株又は細胞などの適切な培養細胞集団に導入する。いくつかの実験では、図１～１２に示されるプラスミドなどの、融合タンパク質及びｇＲＮＡをコードする発現プラスミドが生成され、融合ポリペプチドを産生するために使用される。

【0267】

融合ポリペプチドは、ｇＲＮＡとインキュベートされてリボ核タンパク質(ＲＮＰ)複合体を形成し、次いで宿主細胞をトランスフェクトするために使用できる。

【0268】

十分な時間後、すなわち、エレクトロポレーションの４８、７２、又は１２０時間後、ゲノムＤＮＡは、編集された細胞及び対照(非編集)細胞から抽出される。標的配列のサンガー配列決定、全ゲノム配列決定などの配列決定は、ゲノム修飾の効率を評価し、任意のオフターゲット編集を決定するために実行され得る。

【0269】

例３：編集された細胞を用いて対象を治療する
急性骨髄性白血病に対する本明細書に記載される方法、細胞、及び薬剤を使用した治療レジメンの例を以下に提供する。
１)造血細胞移植(ＨＣＴ)を受ける候補となるＡＭＬを有する患者を特定する；
２)標準的な方法及び技術を使用して、一致するＨＬＡハプロタイプを有するＨＣＴドナーを特定する；
３)ドナーから骨髄を抽出する；
４)ドナー骨髄細胞をエクスビボで遺伝子操作する。簡潔に述べると、ｇＲＮＡと、本明細書に記載される融合ペプチドのうちのいずれかを使用して、系統特異的細胞表面抗原の標的修飾(欠失、置換)に導入する。細胞は、分化する能力、及び患者に生着し、移植片対腫瘍(ＧＶＴ)効果を媒介する能力を決定するため特徴について評価され得る。

【0270】

任意のステップ５～７：
いくつかの実施形態では、以下に提供されるステップ５～７は、本明細書に記載される例示的な治療方法で(１回又は複数回)実施され得る：
５)化学療法剤(例えば、エトポシド、シクロホスファミド)の注入及び/又は放射線照射などの標準的な技術を使用して、ＡＭＬ患者を前処置する；
６)操作されたドナー骨髄をＡＭＬ患者に投与し、生着を成功させる；
７)キメラ受容体(例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞)又は抗体－薬物複合体を発現する免疫細胞などの細胞傷害性薬剤でフォローアップし、細胞傷害性薬剤が結合するエピトープは、修飾されたエピトープと同じであり、操作された細胞にはもはや存在しない。したがって、標的療法は、エピトープが存在しない骨髄移植片を同時に除去することなく、抗原を特異的に標的とする必要がある。

【0271】

任意のステップ８～１０：
いくつかの実施形態では、ステップ８～１０は、本明細書に記載される例示的な治療方法で(１回又は複数回)実施され得る：
８)キメラ受容体を発現する免疫細胞(例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞)又は抗原のエピトープを標的とする抗体－薬物複合体などの細胞傷害性薬剤の投与。この標的療法は、がん細胞及び患者の非がん細胞の両方を除去することが期待される。
９)化学療法剤の注入などの標準的な技法を使用して、ＡＭＬ患者を前処置する；
１０)操作されたドナー骨髄をＡＭＬ患者に投与し、生着を成功させる。

【0272】

ステップ８～１０は、標的タンパク質を発現する患者のがん細胞及び正常細胞の除去をもたらし、同時に標的療法に耐性のあるドナー細胞を正常細胞集団に補充する。

【0273】

参考文献
例えば、発明の背景、概要、詳細な説明、例、及び/又は参考文献のセクションにおける、本明細書に記述される全ての刊行物、特許、特許出願、公表、及びデータ塩基エントリー(例えば、配列データベースエントリー)は、個々の刊行物、特許、特許出願、公表、及びデータベースエントリーが、参照により具体的に及び個別に本明細書に組み込まれるかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本明細書の任意の定義を含む本出願が優先されるであろう。

【0274】

均等物及び範囲
当業者は、本明細書に記載される実施形態の多くの均等物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。本開示の範囲は、上記の説明に限定されることを意図しておらず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。

【0275】

「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、１つ、又は１つより多くを意味し得る。群の２つ以上のメンバーの間に「又は」を含む、請求項又は明細書は、反対の指示がない限り、又は文脈から明らかでない限り、群のメンバーのうちの１つ、１つより多く、又は全てが存在する場合に満たされるとみなされる。２つ以上の群のメンバーの間に「又は」を含む群の開示は、群の正確に１つのメンバーが存在する実施形態、群の１つより多くのメンバーが存在する実施形態、及び群のメンバーの全てが存在する実施形態を提供する。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書では個別には詳述されていないが、これらの実施形態の各々は、本明細書で提供され、具体的に主張又は否定され得ることが理解されるであろう。

【0276】

本発明は、請求項のうちの１つ以上、又は明細書の１つ以上の関連部分からの１つ以上の制限、要素、節、又は説明用語が、別の請求項に導入される、全ての変形例、組み合わせ、及び順列を包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に依存する請求項は、同じ基本請求項に依存する任意の他の請求項において見出される限定のうちの１つ以上を含むように改変され得る。更に、請求項が組成物を列挙する場合、別段の指示がない限り、又は矛盾若しくは不一致が生じることが当業者に明白ではない限り、本明細書に開示される作製若しくは使用方法のうちのいずれかによる、又は存在する場合、当技術分野で公知の方法による、組成物を作製若しくは使用する方法が含まれることを理解されたい。

【0277】

要素が、例えば、マーカッシュ群形式でリストとして提示される場合、要素の全ての可能な部分群も開示されており、任意の要素又は要素の部分群が群から削除され得ることを理解されたい。また、「含む」という用語は、開放的であることを意図し、追加の要素又はステップの包含を可能にすることにも留意されたい。一般的に、実施形態、製品、又は方法が、特定の要素、特徴、又はステップを含むと言及される場合、そのような要素、特徴、若しくはステップからなる、又はそれらから本質的になる実施形態、製品、又は方法も同様に提供されることが理解されるべきである。簡潔にするために、これらの実施形態は、本明細書では個別には詳述されていないが、これらの実施形態の各々は、本明細書で提供され、具体的に主張又は否定され得ることが理解されるであろう。

【0278】

範囲が与えられる場合、終点が含まれる。更に、別段の指示がない限り、又は文脈及び/若しくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈が明確に別段に指示しない限り、一部の実施形態では、範囲の下限の単位の１/１０まで、記載された範囲内の任意の特定の値を想定し得ることを理解されたい。簡潔にするために、各範囲の値は、本明細書には個別に詳述されていないが、これらの値の各々は、本明細書に提供され、具体的に主張され又は否認され得ることが理解されよう。また、別段で指示されない限り、又は文脈及び/若しくは当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、所与の範囲内の任意の部分範囲を想定することができ、部分範囲の終点は範囲の下限の単位の１/１０と同程度の精度で表されることも理解されたい。

【0279】

加えて、本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外され得ることを理解されたい。範囲が与えられる場合、その範囲内の任意の値は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明示的に除外され得る。本明細書に記載される組成物及び/又は方法の任意の実施形態、要素、特徴、用途、又は態様を、いずれか１つ以上の請求項から除外することができる。簡潔にするために、１つ以上の要素、特徴、目的、又は態様が除外される実施形態の全ては、本明細書に明示的に記載されていない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】