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特表2024-535939肝臓指向性カプシドタンパク質及びアルファ－ガラクトシダーゼを含むＡＡＶ粒子並びにファブリー病を治療するためのそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】肝臓指向性カプシドタンパク質及びアルファ－ガラクトシダーゼを含むＡＡＶ粒子並びにファブリー病を治療するためのそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 7/01 20060101AFI20240925BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240925BHJP
C12N 15/56 20060101ALI20240925BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240925BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240925BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240925BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240925BHJP
【ＦＩ】
C12N7/01 ZNA
C12N15/864 100Z
C12N15/56
C12N5/10
A61K35/76
A61K48/00
A61P43/00 105
A61P43/00 111
A61P3/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024537301
(86)(22)【出願日】2022-08-25
(85)【翻訳文提出日】2024-04-05
(86)【国際出願番号】 US2022075474
(87)【国際公開番号】W WO2023028566
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】63/237,122
(32)【優先日】2021-08-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】524071012
【氏名又は名称】ケンブリッジ ファーマシューティカルズ，インコーポレーテッド
(71)【出願人】
【識別番号】521058818
【氏名又は名称】ロジックバイオ セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ジュー，ユンシアン
(72)【発明者】
【氏名】ペチャン，ピーター
(72)【発明者】
【氏名】バンガ，アナンニャ
(72)【発明者】
【氏名】ゴルド ヴィロスラダ，スサナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA95X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA31
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZB211
4C084ZC211
4C084ZC411
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BC83
4C087CA08
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB21
4C087ZC21
4C087ZC41
(57)【要約】
本開示は、ＧＡＬタンパク質を送達するための、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質を含む、単離された、例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含む組成物を提供する。本開示はまた、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質をコードする第１の核酸と、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む第２の核酸とを含む組成物を提供する。本開示はまた、単離された、例えば、組換えＡＡＶ粒子を作製するための方法、及び外因性ＧＡＬタンパク質を対象に送達するための方法、及び／又はＧＡＬ関連疾患若しくは障害、例えば、リソソーム蓄積障害、例えば、ファブリー病を有する対象を治療するための方法を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号４５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質と、α－ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸とを含む、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
【請求項2】
前記カプシドタンパク質をコードする前記核酸が、配列番号４６のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項3】
前記コードされたＧＡＬタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項4】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項5】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子がコドン最適化されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項6】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、配列番号３～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項7】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、シグナル配列を更にコードする、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項8】
前記コードされたシグナル配列が、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項9】
前記コードされたシグナル配列が、配列番号７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項７又は８に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項10】
前記コードされたシグナル配列が、コドン最適化核酸によってコードされる、請求項７又は８に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項11】
前記コドン最適化核酸が、配列番号８～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項12】
前記コードされたシグナル配列が、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項13】
前記コードされたシグナル配列が、配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項７又は１２に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項14】
前記コードされたシグナル配列が、コドン最適化核酸によってコードされる、請求項７又は１２に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項15】
前記コドン最適化核酸が、配列番号１３～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項16】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、５’から３’の順に、（ｉ）配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｉｉ）配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項17】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、５’から３’の順に、（ｉ）配列番号７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｖｉｉｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項18】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、５’から３’の順に、（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質、又は
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質
をコードする、請求項１～１７のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項19】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸に作動可能に連結されたプロモーターを更に含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項20】
前記プロモーターが、組織特異的プロモーター又は遍在性プロモーターを含む、請求項１９に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項21】
前記プロモーターが、（ｉ）Ａ１ＡＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター及び／又はその誘導体ＣＡＧ、ＣＭＶ前初期エンハンサ及び／又はプロモーター、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、血小板由来増殖因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）プロモーター、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ－２）プロモーター、シナプシン（Ｓｙｎ）プロモーター、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、代謝型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）プロモーター、神経フィラメント軽鎖（ＮＦＬ）又は重鎖（ＮＦＨ）プロモーター、β－グロビンミニ遺伝子ｎβ２プロモーター、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）プロモーター、エンケファリン（Ｅｎｋ）及び興奮性アミノ酸輸送体２（ＥＡＡＴ２）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、心血管プロモーター）、肝臓プロモーター、骨格筋プロモーター又はその断片、例えば、切断物若しくは機能的バリアント；及び／又は
（ｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列
を含む、請求項１９又は２０に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項22】
逆位末端配列（ＩＴＲ）配列を更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項23】
前記ＩＴＲ配列が、前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子を含む前記核酸に対して５’に位置する、請求項２２に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項24】
前記ＩＴＲ配列が、前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子を含む前記核酸に対して３’に位置する、請求項２２に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項25】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子を含む前記核酸に対して５’側に位置するＩＴＲ配列及び前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子を含む前記核酸に対して３’側に位置するＩＴＲ配列を含む、請求項２２記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項26】
前記ＩＴＲ配列が、配列番号１７及び／又は１８のヌクレオチド配列、あるいはそれらと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項27】
エンハンサを更に含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項28】
前記エンハンサが、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項29】
イントロン領域を更に含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項30】
前記イントロン領域が、配列番号２１のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項31】
Ｋｏｚａｋ配列を更に含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項32】
前記Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項33】
ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル領域を更に含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項34】
前記ポリＡシグナル領域が、配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項35】
前記ポリＡシグナル領域が、配列番号２４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項36】
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列を更に含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項37】
前記ＷＰＲＥ配列が、配列番号２５のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３６に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項38】
前記ＷＰＲＥ配列が、配列番号２６のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３６に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項39】
５’から３’の順に、５’ＩＴＲ配列、エンハンサ、プロモーター配列、Ｋｏｚａｋ配列、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ポリＡシグナル領域、及び３’ＩＴＲ配列を含む、請求項１～３８のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項40】
５’から３’の順に、５’ＩＴＲ配列、エンハンサ、プロモーター配列、Ｋｏｚａｋ配列、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ配列、ポリＡシグナル領域、及び３’ＩＴＲ配列を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項41】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項42】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項43】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項44】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項45】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項46】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項47】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項48】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項49】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、
（ｉｘ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項50】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、
（ｉｘ）配列番号２４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項51】
５’から３’の順に、（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２６のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、
（ｉｘ）配列番号２４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子。
【請求項52】
配列番号４５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする第１の核酸と、α－グルコシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む第２の核酸とを含む組成物。
【請求項53】
前記カプシドタンパク質をコードする前記第１の核酸が、配列番号４６のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項54】
前記コードされたＧＡＬタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５２又は５３に記載の組成物。
【請求項55】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項56】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子がコドン最適化されている、請求項５２～５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項57】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、配列番号３～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項58】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子がシグナル配列を更にコードする、請求項５２～５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項59】
前記コードされたシグナル配列が、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項60】
前記コードされたシグナル配列が、配列番号７のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項５８又は５９に記載の組成物。
【請求項61】
前記コードされたシグナル配列がコドン最適化核酸によってコードされる、請求項５８又は５９に記載の組成物。
【請求項62】
前記コドン最適化核酸が、配列番号８～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項６１に記載の組成物。
【請求項63】
前記コードされたシグナル配列が、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項64】
前記コードされたシグナル配列が、配列番号１２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項５８又は６３に記載の組成物。
【請求項65】
前記コードされたシグナル配列がコドン最適化核酸によってコードされる、請求項５８又は６３に記載の組成物。
【請求項66】
前記コドン最適化核酸が、配列番号１３～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項６５に記載の組成物。
【請求項67】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、５’から３’の順に、（ｉ）配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｉｉ）配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む、請求項５２～６６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項68】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、５’から３’の順に、（ｉ）配列番号７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む、
を含む、請求項５２～６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項69】
前記ＧＡＬタンパク質をコードする前記導入遺伝子が、５’から３’の順に、（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列、それと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質、又は
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列、それと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質
をコードする、請求項５２～６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項70】
前記ＧＡＬをコードする前記導入遺伝子が、配列番号３～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、α－グルコシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む単離核酸。
【請求項71】
前記導入遺伝子がシグナル配列を更にコードする、請求項７０に記載の核酸。
【請求項72】
前記コードされたシグナル配列が、配列番号８～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項７１に記載の核酸。
【請求項73】
前記コードされたシグナル配列が、配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、請求項７１に記載の核酸。
【請求項74】
請求項７０～７３のいずれか一項に記載の核酸を含む組成物。
【請求項75】
請求項１～５１のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子、又は請求項５２～６９及び７４のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項７０～７３のいずれか一項に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項76】
前記細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は細菌細胞である、請求項７５に記載の細胞。
【請求項77】
単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を作製する方法であって、（ｉ）α－グルコシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む宿主細胞を提供することと、
（ｉｉ）前記導入遺伝子をＡＡＶカプシドタンパク質に封入するのに適した条件下で前記宿主細胞をインキュベートすることであって、前記カプシドタンパク質が、配列番号４５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、ことと、それによって、前記単離されたｒＡＡＶ粒子を作製することと、
を含む、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を作製する方法。
【請求項78】
単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を作製する方法であって、（ｉ）α－グルコシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む第１の核酸を含む宿主細胞を提供することと、
（ｉｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする第２の核酸を前記宿主細胞に導入することであって、前記カプシドタンパク質が、配列番号４５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、ことと、
（ｉｉｉ）前記導入遺伝子を前記ＡＡＶカプシドタンパク質に封入するのに好適な条件下で前記宿主細胞をインキュベートすることと、それによって、前記単離されたｒＡＡＶ粒子を作製することと、
を含む、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を作製する方法。
【請求項79】
前記宿主細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞又は細菌細胞を含む、請求項７６又は７７に記載の方法。
【請求項80】
請求項１～５１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項81】
対象に外因性ＧＡＬタンパク質を送達する方法であって、有効量の請求項７９に記載の医薬組成物又は請求項１～５１のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子を投与し、それにより前記対象に外因性ＧＡＬを送達することを含む、方法。
【請求項82】
前記対象が、ＧＡＬ関連疾患を有するか、有すると診断されているか、又は有する危険性がある、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
前記ＧＡＬ関連疾患がリソソーム蓄積症である、実施形態８１又は８２に記載の方法。
【請求項84】
有効量の請求項８０に記載の医薬組成物又は請求項１～５１のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子を投与し、それにより前記対象の前記ＧＡＬ関連疾患を治療することを含む、ＧＡＬ関連疾患を有するか又はＧＡＬ関連疾患を有すると診断された対象を治療する方法。
【請求項85】
リソソーム蓄積症を有するか又は有すると診断された対象を治療する方法であって、有効量の請求項８０に記載の医薬組成物又は請求項１～５１のいずれか一項に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子を投与し、それにより前記対象の前記リソソーム蓄積症を治療することを含む方法。
【請求項86】
前記ＧＡＬ関連疾患又は前記リソソーム蓄積症がファブリー病である、請求項８２～８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項87】
配列番号３１～４１及び５１～６１のいずれか１つの核酸配列を含むか又はこれからなるＡＡＶウイルスゲノムと、配列番号４５のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質とを含む単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
【請求項88】
配列番号３１～４１及び５１～６１のいずれか１つの核酸配列を含むか又はそれからなる単離された組換えウイルスゲノム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
本出願は、２０２１年８月２５日に出願された米国仮出願第６３／２３７，１２２号に対する優先権を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年８月２５日に出願された米国仮出願第６３／２３７，１２２号に対する優先権を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
リソソーム蓄積障害は、不完全な加水分解酵素による細胞スフィンゴ糖脂質、グリコーゲン、又はムコ多糖類の蓄積によって引き起こされる常染色体劣性疾患の群である。ファブリー病は、酵素アルファ－ガラクトシダーゼ（α－ＧＡＬ）の欠損によって引き起こされるいくつかのリソソーム蓄積障害の１つである。この酵素は、グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ－３又はＧＢ－３としても知られる）及び関連するスフィンゴ糖脂質等の、体内でのスフィンゴ糖脂質の毎日の代謝に必要である。この脂質及び他の類似の脂質の適切な代謝が起こらない場合、ＧＬ－３は身体全体の大部分の細胞に蓄積する。結果として生じる進行性の脂質蓄積は、細胞損傷をもたらす。細胞損傷は、多くの場合比較的若年齢での腎不全、心不全及び脳卒中等の潜在的に生命を脅かす結果を含む広範囲の軽度から重度の症状を引き起こす。
【0003】
一般に、症状が最初に現れるときの人の年齢を反映する２つのタイプのファブリー病が存在する。古典的なタイプでは、症状は小児期又は１０代に現れる。１つの顕著な疾患症状である手及び足の痛みを伴う灼熱感は、２歳という早期に顕著であり得る。症状は時間とともに次第に悪化する。遅発性／非定型タイプでは、３０代以上になるまで症状を示さない。問題の最初の徴候は、腎不全又は心疾患であり得る。
【0004】
ファブリー病の治療は、主に、組換えＧＡＬ（例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）及びＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）（ＴＫＴ，Ｉｎｃ．）として市販されている製品）を用いる酵素補充療法（ＥＲＴ）による。ＥＲＴは、典型的には、対応する野生型タンパク質の精製形態の静脈内、皮下若しくは筋肉内注入、又は持続放出のための生体侵食性固体形態でのタンパク質の移植を含む。ＥＲＴに伴う主な合併症の１つは、注入されたタンパク質の急速な分解による治療有効量のタンパク質の達成及び維持である。結果として、ＥＲＴは、多数の高用量注入を必要とし、結果として、費用がかかり、時間を消費する。加えて、ＥＲＴ療法は、適切に折り畳まれたタンパク質の大規模生成、精製及び貯蔵の困難性、適切にグリコシル化された天然タンパク質の取得、一部の患者における抗タンパク質免疫応答の生成、並びに重要な中枢神経系関与を有する疾患に影響を及ぼすのに十分な量でタンパク質が血液脳関門を通過できないこと等、いくつかの他の警告を有する。
【0005】
したがって、ＧＡＬ関連障害に罹患した患者においてファブリー病を治療し、ＧＡＬ欠損を改善するための新しい療法を開発する長い間の切実な必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【0006】
本開示は、患者のＧＡＬ関連疾患を治療するためのＡＡＶベースの組成物及び方法を提供する。特に、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質又はＬＫ０３カプシドタンパク質を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を利用することによって、標的タンパク質、例えば、ＧＡＬの優れた高度に特異的な肝臓形質導入及び発現が達成され、したがって、本開示のｒＡＡＶ粒子は、ＧＡＬ関連疾患、例えば、ファブリー病を治療するための有望な遺伝子療法候補となる。
【0007】
したがって、一態様では、本開示は、配列番号４５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質と、α－ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸とを含む、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を提供する。
【0008】
いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質をコードする核酸は、配列番号４６のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0009】
いくつかの実施形態では、コードされたＧＡＬタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子はコドン最適化されている。
【0012】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号３～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0013】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、シグナル配列を更にコードする。
【0014】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号７のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0016】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、コドン最適化核酸によってコードされる。
【0017】
いくつかの実施形態では、コドン最適化核酸は、配列番号８～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0020】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、コドン最適化核酸によってコードされる。
【0021】
いくつかの実施形態では、コドン最適化核酸は、配列番号１３～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｉｉ）配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む。
（ｉ）配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｉｉ）配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｖｉｉｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む。
（ｉ）配列番号７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｖｉｉｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質、又は
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質
をコードする。
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質、又は
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質
をコードする。
【0025】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸に作動可能に連結されたプロモーターを更に含む。
【0026】
いくつかの実施形態では、プロモーターは組織特異的プロモーター又は遍在性プロモーターを含む。
【0027】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、
（ｉ）Ａ１ＡＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター及び／又はその誘導体ＣＡＧ、ＣＭＶ前初期エンハンサ及び／又はプロモーター、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、血小板由来増殖因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）プロモーター、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ－２）プロモーター、シナプシン（Ｓｙｎ）プロモーター、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、代謝型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）プロモーター、神経フィラメント軽鎖（ＮＦＬ）又は重鎖（ＮＦＨ）プロモーター、β－グロビンミニ遺伝子ｎβ２プロモーター、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）プロモーター、エンケファリン（Ｅｎｋ）及び興奮性アミノ酸輸送体２（ＥＡＡＴ２）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、心血管プロモーター）、肝臓プロモーター、骨格筋プロモーター又はその断片、例えば、切断物若しくは機能的バリアント；及び／又は
（ｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列
を含む。
（ｉ）Ａ１ＡＴプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター及び／又はその誘導体ＣＡＧ、ＣＭＶ前初期エンハンサ及び／又はプロモーター、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、血小板由来増殖因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）プロモーター、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ－２）プロモーター、シナプシン（Ｓｙｎ）プロモーター、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、代謝型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）プロモーター、神経フィラメント軽鎖（ＮＦＬ）又は重鎖（ＮＦＨ）プロモーター、β－グロビンミニ遺伝子ｎβ２プロモーター、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）プロモーター、エンケファリン（Ｅｎｋ）及び興奮性アミノ酸輸送体２（ＥＡＡＴ２）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、心血管プロモーター）、肝臓プロモーター、骨格筋プロモーター又はその断片、例えば、切断物若しくは機能的バリアント；及び／又は
（ｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列
を含む。
【0028】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子が逆位末端配列（ＩＴＲ）配列を更に含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸に対して５’に配置される。
【0030】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸に対して３’に配置される。
【0031】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸に対して５’に位置するＩＴＲ配列と、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸に対して３’に位置するＩＴＲ配列とを含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、配列番号１７及び／又は１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、エンハンサを更に含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、エンハンサは、配列番号１９のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子がイントロン領域を更に含む。
【0036】
いくつかの実施形態では、イントロン領域は、配列番号２１のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子がＫｏｚａｋ配列を更に含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル領域を更に含む。
【0040】
いくつかの実施形態では、ポリＡシグナル領域は、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、ポリＡシグナル領域は、配列番号２４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0042】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子が、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列を更に含む。
【0043】
いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、配列番号２５のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、配列番号２６のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0044】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、５’ＩＴＲ配列、エンハンサ、プロモーター配列、Ｋｏｚａｋ配列、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ポリＡシグナル領域及び３’ＩＴＲ配列を含む。
【0045】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、５’ＩＴＲ配列、エンハンサ、プロモーター配列、Ｋｏｚａｋ配列、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ＷＰＲＥ配列、ポリＡシグナル領域及び３’ＩＴＲ配列を含む。
【0046】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0048】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0053】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｉｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0054】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、
（ｉｘ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、
（ｉｘ）配列番号２３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、
（ｉｘ）配列番号２４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、
（ｉｘ）配列番号２４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、単離されたｒＡＡＶ粒子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２６のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、
（ｉｘ）配列番号２４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
（ｉ）配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、
（ｉｉ）配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、
（ｉｉｉ）配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、
（ｉｖ）配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、
（ｖ）配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号２６のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、
（ｉｘ）配列番号２４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び
（ｘ）配列番号１８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域
を含む。
【0057】
一態様では、本発明は、配列番号４５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする第１の核酸と、α－グルコシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む第２の核酸とを含む組成物を提供する。
【0058】
いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質をコードする第１の核酸は、配列番号４６のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、コードされたＧＡＬタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0061】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子はコドン最適化されている。
【0062】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号３～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0063】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、シグナル配列を更にコードする。
【0064】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む。
【0065】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号７のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0066】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、コドン最適化核酸によってコードされる。
【0067】
いくつかの実施形態では、コドン最適化核酸は、配列番号８～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0068】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む。
【0069】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0070】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、コドン最適化核酸によってコードされる。
【0071】
いくつかの実施形態では、コドン最適化核酸は、配列番号１３～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0072】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｉｉ）配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む。
（ｉ）配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｉｉ）配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む。
（ｉ）配列番号７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号８のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｉｉ）配列番号９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｉｖ）配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖ）配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号２のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、
（ｖｉｉ）配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、又は
（ｖｉ）配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列
を含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列、それと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質、又は
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列、それと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質
をコードする。
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列、それと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質、又は
（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列、それと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含むシグナル配列、及び配列番号１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質
をコードする。
【0075】
一態様では、本発明は、ＧＡＬをコードする導入遺伝子が、配列番号３～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む、α－グルコシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む単離核酸を提供する。
【0076】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子はシグナル配列を更にコードする。
【0077】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号８～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0078】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0079】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸を含む組成物を提供する。
【0080】
一態様では、本発明は、本発明の単離されたｒＡＡＶ粒子、又は本発明の組成物、又は本発明の核酸を含む細胞を提供する。
【0081】
いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞、昆虫細胞、又は細菌細胞である。
【0082】
一態様では、本発明は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を作製する方法であって、（ｉ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む宿主細胞を提供することと、（ｉｉ）導入遺伝子をＡＡＶカプシドタンパク質に封入するのに適した条件下で宿主細胞をインキュベートすることであって、カプシドタンパク質が、配列番号４５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、ことと、それによって、単離されたｒＡＡＶ粒子を作製することと、
を含む、方法を提供する。
を含む、方法を提供する。
【0083】
別の態様において、本発明は、単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を作製する方法であって、（ｉ）アルファ－グルコシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む第１の核酸を含む宿主細胞を提供することと、（ｉｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする第２の核酸を宿主細胞に導入することであって、カプシドタンパク質が、配列番号４５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む、ことと、（ｉｉｉ）導入遺伝子をＡＡＶカプシドタンパク質に封入するのに適した条件下で宿主細胞をインキュベートすることと、それによって、単離されたｒＡＡＶ粒子を作製することと、
を含む、方法を提供する。
を含む、方法を提供する。
【0084】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は細菌細胞を含む。
【0085】
一態様では、本発明は、本発明のｒＡＡＶ粒子と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0086】
一態様では、本発明は、有効量の本発明の医薬組成物又は本発明の単離されたｒＡＡＶ粒子を投与し、それにより外因性ＧＡＬを対象に送達することを含む、外因性ＧＡＬタンパク質を対象に送達する方法を提供する。
【0087】
いくつかの実施形態では、対象は、ＧＡＬ関連疾患を有するか、有すると診断されているか、又は有するリスクがある。
【0088】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬ関連疾患はリソソーム蓄積症である。
【0089】
別の態様では、本発明は、有効量の本発明の医薬組成物又は本発明の単離されたｒＡＡＶ粒子を投与し、それにより対象のＧＡＬ関連疾患を治療することを含む、ＧＡＬ関連疾患を有する又はＧＡＬ関連疾患を有すると診断された対象を治療する方法を提供する。
【0090】
一態様では、本発明は、有効量の本発明の医薬組成物又は本発明の単離されたｒＡＡＶ粒子を投与し、それにより対象のリソソーム蓄積症を治療することを含む、リソソーム蓄積症を有する又はリソソーム蓄積症を有すると診断された対象を治療する方法を提供する。
【0091】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬ関連疾患又はリソソーム蓄積症はファブリー病である。
【0092】
一態様では、本発明は、配列番号３１～４１及び５１～６１のいずれか１つの核酸配列を含むか又はこれからなるＡＡＶウイルスゲノムと、配列番号４５のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質とを含む単離された組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を提供する。
【0093】
別の態様では、本発明は、配列番号３１～４１及び５１～６１のいずれか１つの核酸配列を含むか又はそれからなる単離された組換えウイルスゲノムを提供する。
【0094】
本開示の様々な態様又は実施形態の詳細を以下に記載する。本開示の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書において、単数形は、文脈が他のことを明らかに示す場合を除き、複数形も含む。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先する。
【図面の簡単な説明】
【0095】
【図1】ヒトαガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質及びシグナルペプチドをコードする例示的な構築物の概略図を提供する。
【図2】ＡＡＶ－ＧＬＡ構築物の組合せの概略図を示す。ＡｐｏＥ－Ａ１ＡＴ肝臓特異的プロモーター及びｂＧＨポリアデニル化配列の制御下にあるヒトαガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）の天然及びコドン最適化シグナルペプチド及び成熟ペプチドの様々な組合せを有するＡＡＶゲノムが示されている。１～８＝構築物＃１～８；ＩＴＲ＝ＡＡＶ２逆位末端配列；ＡｐｏＥ＝ＡｐｏＥ／Ｃ－１ ＨＣＲ－１エンハンサ；Ａ１ＡＴ＝Ａ１ＡＴプロモーター；ｂｇｉ＝ベータ－グロビンイントロン；ｂＧＨ Ａ＋＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列；ｓｐ＝シグナルペプチド；ｈＧＬＡ＝天然ヒトＧＡＬ；ｃｏＡ－ＧＬＡ＝ｓｐ及びＧＡＬのコドン最適化バージョンＡ；ｃｏＢ－ＧＬＡ＝ｓｐ及びＧＡＬのコドン最適化バージョンＢ；ｃｏＢ－ＣｐＧ－ＧＬＡ＝ｓｐ及びＧＡＬのＣｐＧ低下コドン最適化バージョンＢ；ｓｐ－ＩｇＧ１＝ヒトＩｇＧ１シグナルペプチドの逆翻訳配列；ｃｏＣ－ＩｇＧ１＝ＩｇＧ１シグナルペプチドのコドン最適化バージョンＣ；ｓｐ－ｃｏＣ－ＣｐＧ－ＩｇＧ１＝ＩｇＧ１シグナルペプチドのＣｐＧ低下コドン最適化バージョンＣ。
【図3】プラスミドでトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞からトランスフェクションの７２時間後に回収した上清中のＧＡＬ成熟ペプチド並びに溶解物中の前駆体及び成熟ペプチドのウェスタンブロット可視化を示す。天然ＧＬＡ及びコドン最適化ＧＬＡを発現する構築物＃１～８（具体的には、構築物１Ａ～８Ａ）。
【図4】プラスミドでトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞からトランスフェクションの７２時間後に回収した上清及び溶解物中のＥＬＩＳＡによるＧＡＬ成熟ペプチドの定量を示す。天然ＧＬＡ及びコドン最適化ＧＬＡを発現する構築物＃１～８（具体的には、構築物１Ａ～８Ａ）。
【図5】プラスミドでトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞からトランスフェクションの７２時間後に回収した上清中のＧＡＬタンパク質活性の評価を示す。天然ＧＬＡ及びコドン最適化ＧＬＡを発現する構築物＃１～８（具体的には、構築物１Ａ～８Ａ）。
【図6】は、ファブリー病マウス由来の血漿中のＧＡＬタンパク質活性の評価を示す。活性は、基底時点（０日目）及び注射後（７日目）に採取した試料において評価した。
【図7】例示的なＡＡＶ－ＧＬＡ構築物の組合せを示す。天然及びコドン最適化シグナルペプチド並びにヒトアルファガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）の成熟ペプチドの種々の組合せを有するＡＡＶゲノムが示される。１～１１＝構築物＃１～１１；ＩＴＲ＝ＡＡＶ２逆位末端配列；ｂＧＨポリＡ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列；ｓｐ＝シグナルペプチド；ｈＧＬＡ＝天然ヒトＧＡＬ；ｃｏＡ－ＧＬＡ＝ｓｐ及びＧＡＬのコドン最適化バージョンＡ；ｃｏＢ－ＧＬＡ＝ｓｐ及びＧＡＬのコドン最適化バージョンＢ；ｃｏＢ－ＣｐＧ－ＧＬＡ＝ｓｐ及びＧＡＬのＣｐＧ低下コドン最適化バージョンＢ；ｓｐ－ＩｇＧ１＝ヒトＩｇＧ１シグナルペプチドの逆翻訳配列；ｓｐ－ＩｇＧ１ｃｏ＝ＩｇＧ１シグナルペプチドのコドン最適化バージョンＣ；ｓｐ－ＩｇＧ１ｃｏＣｐＧ＝ＩｇＧ１シグナルペプチドのＣｐＧ低下コドン最適化バージョンＣ；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント；Ｗ３ＳＬ＝内部切断ＷＰＲＥ配列；ＳＶ４０＝ＳＶ４０ポリＡ配列。
【図8】プラスミドでトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞からトランスフェクションの７２時間後に回収した上清中のＧＡＬ成熟ペプチド並びに溶解物中の前駆体及び成熟ペプチドのウェスタンブロット可視化を示す。天然ＧＬＡ及びコドン最適化ＧＬＡを発現する構築物＃１～１１（具体的には、構築物１Ｂ～１１Ｂ）。
【図9】プラスミドでトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞からトランスフェクションの７２時間後に回収した上清中のＧＡＬタンパク質活性の評価を示す。天然ＧＬＡ及びコドン最適化ＧＬＡを発現する構築物＃１～１１（具体的には、構築物１Ｂ～１１Ｂ）。
【図10】３つの異なるＭＯＩ、すなわち、５Ｅ４、１Ｄ５及び２Ｅ５でＡＡＶ／ＤＪにパッケージングされた選択された構築物で形質導入されたＨｅｐＧ２細胞から回収された上清中のＧＡＬ成熟ペプチドのウェスタンブロット可視化を示す。
【図11】３つの異なるＭＯＩ、すなわち、５Ｅ４、１Ｄ５及び２Ｅ５でＡＡＶ／ＤＪにパッケージングされた選択された構築物で形質導入されたＨｅｐＧ２細胞から採取された上清中のＧＡＬタンパク質活性の評価を示す。
【図12】ファブリー病マウス由来の血漿試料におけるＧＡＬタンパク質活性（左）及びｌｙｓｏ－ＧＢ３クリアランス（右）の評価を示す。ファブリー病マウス（１群当たりｎ＝５）に、ＡＡＶ－ＤＪ中のコドン最適化構築物（構築物２、４、６、７、８及び９）を５Ｅ１１ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＧＡＬ活性及びｌｙｓｏ－ＧＢ３レベルを、６週目に採取した試料において評価した。
【図13】血漿ＧＡＬ活性と血漿ｌｙｓｏ－ＧＢ３レベルとの間の相関を示す。
【図14】ファブリー病マウス由来の血漿試料におけるＧＡＬタンパク質活性の評価を示す。ファブリー病マウス（１群当たりｎ＝４）に、ＡＡＶ－ＤＪ中のコドン最適化構築物（構築物６及び９）を１Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＧＡＬ活性レベルを、投与前、並びに１週目、４週目及び６週目に採取した試料において評価した。
【図15】ＰＸＢマウス由来の血漿試料におけるＧＡＬタンパク質活性（左）及びアルブミン（右）レベルの評価を示す。ＰＸＢマウス（１群当たりｎ＝４）に、ＡＡＶ－ＳＬ６５中のコドン最適化構築物（構築物６及び９）を３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。ＧＡＬ活性及びアルブミンレベルを、投与前、２週目、及び４週目に採取した試料において評価した。
【図16】アルブミン対照によって正規化された血漿ＧＡＬタンパク質活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0096】
本開示は、標的タンパク質、例えば、ＧＡＬタンパク質の送達のための、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質又はＬＫ０３カプシドタンパク質を含む単離、例えば、組換えウイルス粒子、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含む組成物、並びに対象において外因性ＧＡＬタンパク質を送達するための方法、及び／又は本開示のＡＡＶ粒子を使用して、ＧＡＬ関連疾患又は障害、例えば、リソソーム蓄積障害、例えば、ファブリー病を有する対象を治療するための方法を提供する。
【0097】
本開示はまた、ＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質をコードする第１の核酸であって、配列番号４５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む第１の核酸と、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む第２の核酸とを含む組成物を提供する。
【0098】
アデノ随伴ウイルスは、一本鎖ＤＮＡウイルスゲノムを特徴とするパルボウイルス科の小さなエンベロープのない正二十面体カプシドウイルスである。パルボウイルス科ウイルスは、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科及び無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科の２つの亜科で構成されている。ＡＡＶは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ及びヒツジ種を含むがこれらに限定されない脊椎動物宿主において複製することができる。パルボウイルス及びパルボウイルス科の他のメンバーは、一般に、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，」Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３ｄ Ｅｄ．１９９６）に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0099】
ＡＡＶは、それらの比較的単純な構造、宿主ゲノムへの組み込みなしに及び複製なしに広範囲の細胞（静止細胞及び分裂細胞を含む）に感染する能力、並びにそれらの比較的良性の免疫原性プロファイルのために生物学的ツールとして有用であることが証明されている。ウイルスのゲノムは、標的細胞、組織又は生物に送達され得る所望の核酸構築物又はペイロード、例えば、導入遺伝子、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＧＡＬタンパク質が負荷されるか又は送達されるように操作された機能的組換えウイルス又はウイルス粒子の構築のための最小限の成分を含有するように改変され得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態では、標的組織は肝組織である。
【0100】
遺伝子治療は、ファブリー病の代替アプローチを提示する。ＡＡＶは、多くの有利な特徴の結果として、遺伝子治療アプローチにおいて一般的に使用されている。理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ粒子を使用して、ＧＡＬタンパク質（例えば、ＧＡＬ及び関連タンパク質）を投与及び／又は送達することができ、非ＡＡＶ療法と比較して、持続的で高濃度を達成し、より持続的な有効性、より少ない用量治療、広範な生体内分布、及び／又はより一貫したレベルのＧＡＬタンパク質を可能にすると考えられる。
【0101】
本明細書に記載の組成物及び方法は、（ｉ）細胞、組織（例えば、肝細胞又は肝組織）におけるＧＡＬ活性の増加、（ｉｉ）肝臓全体にわたる増加した均一な体内分布、及び／又は（ｉｉｉ）肝臓におけるペイロード発現、例えば、ＧＬＡ ｍＲＮＡ発現の上昇を含む、以前の酵素置換アプローチと比較して改善された特徴を提供する。本明細書に記載の組成物及び方法は、リソソーム蓄積症、例えば、ファブリー病等のＧＡＬタンパク質及び／又はＧＡＬ活性の欠如に関連する障害の治療に使用することができる。
【0102】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、以下の用語のそれぞれは、このセクションでそれに関連する意味を有する。
本明細書で使用される場合、以下の用語のそれぞれは、このセクションでそれに関連する意味を有する。
【0103】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１つの要素」は、１つの要素又は１つより多い要素、例えば、複数の要素を意味する。
【0104】
「含む」という用語は、「～を含むがこれに限定されない」という句を意味するために本明細書において使用され、またそれと互換的に使用される。
【0105】
「又は」という用語は、文脈が明らかにそうではないと示さない限り、「及び／又は」という用語を意味するために本明細書において使用され、またそれと互換的に使用される。
【0106】
α－ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）：本明細書で使用される場合、α－ＧＡＬ、ＧＡＬＡ、ガラクトシルガラクトシルグルコシルセラミダーゼ、ゲリビアーゼ、α－Ｄ－ガラクトシダーゼＡ、α－Ｄ－ガラクトシドガラクトヒドロラーゼ１、アガルシダーゼアルファ、α－ｇａｌ Ａ、及びアガルシダーゼとしても知られている「α－ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）」という用語は、糖脂質及び糖タンパク質から末端α－ガラクトシル部分を加水分解するリソソーム酵素を指す。本明細書で使用される場合、「ＧＡＬ」、「ＧＡＬタンパク質」、「ＧＡＬ酵素」、「α－ＧＡＬ」、「α－ＧＡＬ」等の用語は、ＧＬＡ遺伝子のペプチド（アンサンブル遺伝子ＩＤ：ＥＮＳＧ ０００００１０２３９３）、そのホモログ又はバリアント、及びそのオルソログ（非ヒトタンパク質及びそのホモログを含む）を含むタンパク質産物又はタンパク質産物の一部を指す。ＧＡＬタンパク質は、ＧＬＡ遺伝子産物の断片、誘導体、及び改変体を含む。ヒトＧＬＡの例示的なアミノ酸及びヌクレオチド配列を表１に示す。
【0107】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）：本明細書で使用される場合、「アデノ随伴ウイルス」又は「ＡＡＶ」という用語は、ディペンドウイルス属のメンバー又はそのバリアント、例えば、機能的バリアントを指す。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは野生型であるか、又は天然に存在する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは組換えである。
【0108】
ＡＡＶ粒子：本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ粒子」は、ＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶカプシドバリアント、及びポリヌクレオチド、例えば、ウイルスゲノムを含む粒子又はビリオンを指す。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、少なくとも１つのペイロード領域及び少なくとも１つのＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ペイロードをコードする核酸、例えば、ペイロード領域を、細胞、典型的には哺乳動物、例えば、ヒト細胞に送達することができる。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、組換え的に産生され得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、血清型の組合せ（例えば、「シュードタイプ化」ＡＡＶ）を含む、本明細書に記載されるか又は当技術分野で公知の任意の血清型又は様々なゲノム（例えば、一本鎖又は自己相補的）に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、複製欠損及び／又は標的化され得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、所望の標的組織に対する指向性を増強するために、カプシド中に存在する、例えば、挿入されたペプチド、例えば、標的化ペプチドを含み得る。本開示のＡＡＶ粒子への言及は、明示的に記載されていなくても、その医薬組成物も含むことが理解されるべきである。
【0109】
ＡＡＶベクター：本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」又は「ＡＡＶ構築物」という用語は、アデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターを指す。「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶヌクレオチド配列並びに異種ヌクレオチド配列を含むベクターを指す。ＡＡＶベクターは、ウイルスを生成するためにシスで１４５塩基の末端反復のみを必要とする。他の全てのウイルス配列は必須ではなく、トランスで供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大化するように、逆位末端配列（ＩＴＲ）配列のみを保持する。ＩＴＲは野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製及びパッケージングを提供する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって改変されてもよい。
【0110】
投与すること：本明細書で使用される場合、対象に「投与すること」という用語は、対象における所望の位置への組成物の送達のための任意の好適な経路によって、対象に本開示の組成物を分配、送達、又は適用することを含む。代替的に又は組み合わせて、送達は、局所、非経口又は経口経路、脳内注射、筋肉内注射、皮下／皮内注射、静脈内注射、口腔投与、経皮送達、及び直腸、結腸、膣、鼻腔内又は気道経路による投与による。
【0111】
カプシド：本明細書で使用される場合、「カプシド」という用語は、実質的に（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％、＞８０％、＞９０％、＞９５％、＞９９％、又は１００％）タンパク質である、ウイルス粒子、例えば、ＡＡＶ粒子の外部、例えば、タンパク質シェルを指す。いくつかの実施形態では、カプシドは、本明細書に記載されるＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３ポリペプチドを含むＡＡＶカプシドである。ＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質、又は本明細書において「ＡＡＶカプシドバリアント」と称される、バリアント、例えば、野生型若しくは参照カプシドタンパク質由来の構造的及び／若しくは機能的バリアントであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶカプシドバリアントは、ウイルスゲノムを封入する、例えば、カプセル化する能力を有し、かつ／又は細胞、例えば、哺乳動物細胞に侵入することができる。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、本明細書に記載されるｓＬ６５カプシドタンパク質である。
【0112】
コドン最適化：本明細書中で使用される場合、用語「コドン最適化」とは、遺伝子によってコードされるポリペプチド配列が同じままである一方で、変化したコドンがポリペプチド配列の発現のプロセスを改善するような様式で、所定の遺伝子のコドンを変化させるプロセスをいう。例えば、ポリペプチドがヒトタンパク質配列のものであり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される場合、コドン最適化がＤＮＡ配列に対して行われて、ヒトコドンをＥ．ｃｏｌｉ中での発現により有効なコドンに変化させる場合、発現はしばしば改善される。
【0113】
接触させる：本明細書中で使用される場合、用語「接触させること」（すなわち、細胞を薬剤と接触させること）は、薬剤及び細胞を一緒にインビトロでインキュベートすること（例えば、培養中の細胞に薬剤を添加すること）、又は薬剤及び対象の細胞が接触するようにインビボで対象に薬剤を投与することを含むことが意図される。「接触させる」という用語は、対象において天然に生じ得る薬剤への細胞の曝露（すなわち、天然の生理学的プロセスの結果として生じ得る曝露）を含むことを意図しない。
【0114】
ＧＡＬ関連障害：「ＧＡＬ関連障害」、「ＧＡＬ関連疾患」等の用語は、患者細胞におけるＧＡＬタンパク質発現の欠損又は不全をもたらす、ＧＬＡにおける遺伝性、例えば、Ｘ連鎖突然変異等のＧＬＡ遺伝子の欠損を有する疾患又は障害を指す。ＧＡＬ関連障害としては、リソソーム蓄積症、例えば、ファブリー病が挙げられるが、これらに限定されない。
【0115】
ファブリー病：本明細書中で使用される場合、用語「ファブリー病」は、α－ガラクトシダーゼＡ欠損症、Ａｎｄｅｒｓｏｎ－Ｆａｂｒｙ病、びまん性体部被角血管腫、びまん性被角血管腫、及びＧＡＬ欠損症としても公知であり、リソソーム酵素であるα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＡＬ）の活性の非存在又は顕著な欠損に起因するグリコスフィンゴ脂質代謝のまれな遺伝障害をいう。この酵素は、グロボトリアオシルセラミド（ＧＬ－３又はＧＢ－３としても知られる）及び関連するスフィンゴ糖脂質等の、体内でのスフィンゴ糖脂質の毎日の代謝に必要である。この脂質及び他の類似の脂質の適切な代謝が起こらない場合、ＧＬ－３は身体全体の大部分の細胞に蓄積する。結果として生じる進行性の脂質蓄積は、細胞損傷をもたらす。細胞損傷は、多くの場合比較的若年齢での腎不全、心不全及び脳卒中等の潜在的に生命を脅かす結果を含む広範囲の軽度から重度の症状を引き起こす。一般に、症状が最初に現れるときの人の年齢を反映する２つのタイプのファブリー病が存在する。古典的なタイプでは、症状は小児期又は１０代に現れる。１つの顕著な疾患症状である手及び足の痛みを伴う灼熱感は、２歳という早期に顕著であり得る。症状は時間とともに次第に悪化する。遅発性／非定型タイプでは、３０代以上になるまで症状を示さない。問題の最初の徴候は、腎不全又は心疾患であり得る。
【0116】
ヘルパー機能：本明細書で使用される場合、「ヘルパー機能」という用語は、本明細書で使用される場合、ＡＡＶが複製のために依存する機能（すなわち、「ヘルパー機能」）を行うポリペプチドをコードする遺伝子を指す。ヘルパー機能には、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、ｃａｐ発現産物の合成、及びＡＡＶカプシドアセンブリに関与する部分を含むがこれらに限定されないＡＡＶ複製に必要な機能が含まれる。ウイルスベースのアクセサリー機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、及びワクシニアウイルス等の既知のヘルパーウイルスのいずれかに由来し得る。ヘルパー機能としては、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及びＥ４又はヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及びＵＬ２９、並びにヘルペスウイルスポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ヘルパー機能は、アデノウイルスＥ１を含まない。
【0117】
単離：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、天然の状態から改変又は除去された、例えば、天然の状態で関連している成分の少なくとも一部から改変又は除去された物質又は実体を指す。例えば、生きている動物中に天然に存在する核酸又はペプチドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは「単離」されている。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得るか、又は非ネイティブ環境（例えば、宿主細胞）中に存在し得る。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であり得、そして／又はこのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは、組成物の一部であり得、そしてこのようなベクター又は組成物が天然に見出される環境の一部ではないという点でなお単離されている。いくつかの実施形態では、単離された核酸は組換え体であり、例えば、ベクターに組み込まれている。
【0118】
リソソーム蓄積症：本明細書で使用される場合、「リソソーム蓄積症」又は「リソソーム蓄積障害」という用語は、酵素欠損の結果としての身体細胞における様々な毒性物質の異常な蓄積を特徴とする遺伝性代謝疾患を指す。リソソーム蓄積症は、骨格、脳、皮膚、心臓、及び中枢神経系を含む身体の異なる部分に影響を及ぼす。例示的なリソソーム蓄積症としては、ファブリー病、ポンペ病、ゴーシェ病、テイ・サックス病、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サンドホフ病、異染性白質ジストロフィー、ムコリビドーシス、シンドラー病、及びニーマン・ピック病が挙げられるが、これらに限定されない。いずれの場合も、リソソーム蓄積症は、先天性代謝異常症によって引き起こされ、その結果、酵素が欠損又は欠乏し、身体の様々な細胞における物質の不適切な蓄積が引き起こされる。ほとんどのリソソーム蓄積障害は、常染色体劣性様式で遺伝する。
【0119】
突然変異：本明細書で使用される場合、「突然変異」という用語は、変化及び／又は改変を指す。いくつかの実施形態では、突然変異は、タンパク質（ペプチド及びポリペプチドを含む）及び／又は核酸（ポリ核酸を含む）に対する変化及び／又は改変であり得る。いくつかの実施形態は、突然変異は、タンパク質及び／又は核酸配列に対する変化及び／又は改変を含む。このような変化及び／又は改変は、１つ以上のアミノ酸（タンパク質及び／又はペプチドの場合）及び／又はヌクレオチド（核酸及び／又はポリ核酸の場合）の付加、置換及び／又は欠失を含み得る。変異がアミノ酸及び／又はヌクレオチドの付加及び／又は置換を含む実施形態では、そのような付加及び／又は置換は、１つ以上のアミノ酸及び／又はヌクレオチド残基を含んでもよく、修飾アミノ酸及び／又はヌクレオチドを含んでもよい。１つ以上の突然変異は、例えば、核酸配列又はポリペプチド又はタンパク質配列の「変異体」、「誘導体」、又は「バリアント」をもたらし得る。
【0120】
天然に存在する：本明細書中で使用される場合、「天然に存在する」又は「野生型」は、人工的補助又はヒトの手の関与なしに天然に存在することを意味する。「天然に存在する」又は「野生型」は、生体分子、配列、又は実体の天然形態を指し得る。
【0121】
核酸：本明細書中で使用される場合、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」「オリゴヌクレオチド」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含有する）若しくはポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含有する）、又はプリン若しくはピリミジン塩基若しくは修飾プリン若しくはピリミジン塩基のＮグリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチドのいずれかから構成される任意の核酸ポリマーを指す。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」の間に長さの区別は意図されておらず、これらの用語は互換的に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、これらの用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。
【0122】
作動可能に連結された：本明細書中で使用される場合、句「作動可能に連結された」とは、２つ以上の分子、構築物、転写物、実体、部分等の間の機能的接続をいう。
【0123】
粒子：本明細書中で使用される場合、「粒子」は、少なくとも２つの成分（タンパク質カプシド及びカプシド内に封入されたポリヌクレオチド配列）から構成されるウイルスである。
【0124】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」とは、処置を求め得るか若しくは処置を必要とし得る対象、処置を必要とする対象、処置を受けている対象、処置を受ける予定の対象、又は訓練を受けた対象（ケア中）をいう。例えば、認可された）専門家が特定の疾患又は状態のために使用することができる。
【0125】
ペイロード：本明細書で使用される場合、「ペイロード」又は「ペイロード領域」又は「導入遺伝子」は、ウイルスゲノムによってコードされるか若しくはウイルスゲノム内にある１つ以上のポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド領域、又はそのようなポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド領域の発現産物、例えば、導入遺伝子、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。
【0126】
ペイロード構築物：本明細書で使用される場合、「ペイロード構築物」は、逆位末端配列（ＩＴＲ）配列が片側又は両側に隣接しているペイロードをコードするか又は含む１つ以上のポリヌクレオチド領域である。ペイロード構築物は、ウイルスゲノムを産生するためにウイルス産生細胞において複製される鋳型である。
【0127】
ペイロード構築ベクター：本明細書で使用される場合、「ペイロード構築物ベクター」は、ペイロード構築物、並びに細菌細胞における複製及び発現のための調節領域をコードするか又は含むベクターである。ペイロード構築物ベクターはまた、ウイルス複製細胞におけるウイルス発現のための成分を含み得る。
【0128】
ペプチド：本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、約５０アミノ酸長以下、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０アミノ酸長であるアミノ酸の鎖を指す。
【0129】
薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題や合併症を伴うことなくヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適しており、合理的な利益／リスクの比に見合った化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を指すために本明細書で使用される。
【0130】
薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、本明細書で使用される場合、医薬組成物中に存在し、対象において実質的に非毒性かつ非炎症性である特性を有する活性薬剤（例えば、本明細書に記載されているようなもの）以外の任意の成分を指す。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、活性薬剤を懸濁及び／又は溶解することができるビヒクルである。賦形剤としては、例えば、付着防止剤、抗酸化剤、結合剤、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、染料（着色剤）、皮膚軟化剤、乳化剤、充填剤（希釈剤）、フィルム形成剤又はコーティング、香味料、香料、流動促進剤（流動促進剤）、潤滑剤、保存剤、印刷インク、吸着剤、懸濁化剤又は分散剤、甘味料、及び水和水が挙げられ得る。賦形剤としては、ゼラチンヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム（二塩基性）、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、シェラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン（トウモロコシ）、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＣ、及び／又はキシリトールが挙げられるが、これらに限定されない。
【0131】
医薬組成物：本明細書で使用される場合、「医薬組成物」又は薬学的に許容される組成物」という用語は、ＡＡＶポリヌクレオチド、ＡＡＶゲノム、又はＡＡＶ粒子、及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、溶媒、アジュバント等を含む。
【0132】
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、鎖内で一緒に結合された多数のアミノ酸残基からなる有機ポリマーを指す。単量体タンパク質分子はポリペプチドである。
【0133】
予防する：本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、感染、疾患、障害及び／又は状態の発症を部分的又は完全に遅延させること、特定の感染、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状、特徴、又は臨床症状の発症を部分的又は完全に遅延させること、特定の感染症、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状、特徴、又は発現の発症を部分的又は完全に遅延させること、感染、特定の疾患、障害、及び／若しくは状態からの進行を部分的若しくは完全に遅延させること；並びに／又は感染、疾患、障害、及び／若しくは状態に関連する病理を発症するリスクを減少させることを指す。
【0134】
プロモーター：本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、ポリメラーゼ酵素が結合して転写（ＤＮＡからＲＮＡへ）又は逆転写（ＲＮＡからＤＮＡへ）を開始する核酸部位を指す。
【0135】
調節配列：本明細書で使用される場合、用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサ及び他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するもの、構成的に活性であるもの、誘導性であるもの、及び特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を指令するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。本開示の発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質又はその一部を含むタンパク質又はその一部を産生することができる。
【0136】
血清型：本明細書で使用される場合、「血清型」という用語は、亜種レベルでのＡＡＶの疫学的分類を可能にする表面抗原に基づくＡＡＶのカプシドにおける異なる変異を指す。
【0137】
シグナル配列：本明細書中で使用される場合、句「シグナル配列」は、タンパク質合成の間に小胞体へのタンパク質の輸送又は局在化を指向し得る配列をいう。
【0138】
類似性：本明細書で使用される場合、「類似性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、ポリヌクレオチド分子間（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子間）及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。ポリマー分子の互いに対するパーセント類似性の計算は、パーセント類似性の計算が当該分野で理解されるような保存的置換を考慮に入れることを除いて、パーセント同一性の計算と同じ様式で行われ得る。
【0139】
対象：本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、例えば、実験、診断、予防、及び／又は治療目的のために、本開示による組成物が投与され得る任意の生物を指す。同様に、「対象」又は「罹患体」は、特定の病気又は状態について、治療を求め得る、必要とし得る、受けている、又は受ける予定である、又は訓練を受けた専門家によるケア中である生物を指す。典型的な対象には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及びヒト等の哺乳動物）が含まれる。特定の実施形態では、対象又は患者は、ＧＡＬ関連障害、例えば、リソソーム蓄積障害、例えば、ファブリー病に罹患しやすいか、又は罹患している疑いがあり得る。特定の実施形態では、対象又は患者は、ファブリー病と診断され得る。
【0140】
実質的に：本明細書中で使用される場合、用語「実質的に」は、目的の特徴又は特性の全体又はほぼ全体の範囲又は程度を示す定性的状態をいう。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的現象が、完了に至ること、及び／又は完全に進行すること、又は絶対的な結果を達成若しくは回避することは、あったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捉えるために本明細書で使用される。
【0141】
治療剤：「治療剤」という用語は、対象に投与された場合に、治療、診断、及び／若しくは予防効果を有し、並びに／又は所望の生物学的及び／若しくは薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。
【0142】
治療有効量：本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、感染、疾患、障害、及び／又は状態に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与された場合に、感染、疾患、障害、及び／又は状態を治療し、その症状を改善し、診断し、予防し、かつ／又はその発症を遅延させるのに十分である、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療剤、診断剤、予防剤等）の量を意味する。いくつかの実施形態では、治療有効量は、単回用量で提供される。いくつかの実施形態では、治療有効量は、複数回用量を含む投薬レジメンで投与される。当業者は、いくつかの実施形態では、単位剤形が、そのような投薬レジメンの一部として投与される場合に有効である量を含む場合、単位剤形は、治療有効量の特定の薬剤又は実体を含むと見なされ得ることを理解するであろう。
【0143】
治療する：本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、特定の感染、疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状又は特徴を部分的又は完全に緩和すること、寛解させること、改善すること、軽減すること、逆転させること、その発症を遅延させること、その進行を阻害すること、その重症度を低減すること、及び／又はその発生率を低減することを指す。処置は、疾患、障害、及び／若しくは状態の徴候を示さない対象、並びに／又は疾患、障害、及び／若しくは状態の初期徴候のみを示す対象に、疾患、障害、及び／若しくは状態に関連する病理を発症するリスクを減少させる目的で投与され得る。
【0144】
ベクター：本明細書中で使用される場合、「ベクター」は、異種分子を輸送するか、形質導入するか、又はそうでなければ異種分子のキャリアとして作用する任意の分子又は部分である。本開示のベクターは、組換え産生されてもよく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）親又は参照配列（複数可）に基づいてもよく、かつ／又はそれを含んでもよい。そのような親又は参照ＡＡＶ配列は、ベクターを操作するための元の、第２の、第３の又はその後の配列として役立ち得る。非限定的な例では、そのような親又は参照ＡＡＶ配列は、以下の配列のいずれか１つ以上を含み得る：野生型であり得るか又は野生型から改変され得る配列を有し、その配列がタンパク質、タンパク質ドメイン、又はＧＡＬタンパク質の１つ以上のサブユニット及びそのバリアントの全長又は部分配列をコードし得る、ポリペプチド又はマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列；野生型であり得るか又は野生型から改変され得る配列を有する、ＧＡＬタンパク質及びそのバリアントをコードするポリヌクレオチド；及び野生型配列から改変されていてもされていなくてもよいＧＡＬタンパク質及びそのバリアントをコードする導入遺伝子。
【0145】
ウイルス構築ベクター：本明細書中で使用される場合、「ウイルス構築ベクター」は、Ｒｅｐタンパク質及び／又はＣａｐタンパク質をコードするか又は含む１つ以上のポリヌクレオチド領域を含むベクターである。ウイルス構築物ベクターはまた、ウイルス複製細胞におけるウイルス発現のための成分をコードするか又は含む１つ以上のポリヌクレオチド領域を含み得る。
【0146】
ウイルスゲノム：本明細書で使用される場合、「ウイルスゲノム」又は「ベクターゲノム」は、少なくとも１つの逆位末端配列（ＩＴＲ）及び少なくとも１つのコードされたペイロードを含むポリヌクレオチドである。ウイルスゲノムは、ペイロードの少なくとも１つのコピーをコードする。
【0147】
野生型：本明細書で使用される場合、「野生型」は、生体分子、配列、又は実体の天然型である。
【0148】
本開示の方法の様々な追加の態様は、以下のサブセクションにおいて更に詳細に記載される。
【0149】
ＩＩ．本開示の組成物
本開示は、タンパク質、例えば、ＧＡＬタンパク質の送達のための、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質又はＬＫ０３カプシドタンパク質を含む単離、例えば、組換えウイルス粒子、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含む組成物、及びＧＡＬ関連疾患又は障害、例えば、リソソーム蓄積障害、例えば、ファブリー病を有する対象を治療するための組成物の使用を提供する。
本開示は、タンパク質、例えば、ＧＡＬタンパク質の送達のための、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質又はＬＫ０３カプシドタンパク質を含む単離、例えば、組換えウイルス粒子、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を含む組成物、及びＧＡＬ関連疾患又は障害、例えば、リソソーム蓄積障害、例えば、ファブリー病を有する対象を治療するための組成物の使用を提供する。
【0150】
本開示はまた、ＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質をコードする第１の核酸であって、配列番号４５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも８５％同一のアミノ酸配列を含む第１の核酸と、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む第２の核酸とを含む組成物を提供する。
【0151】
ＡＡＶウイルスは、パルボウイルス科のディペンドウイルス（Dependovirus）属に属し、本明細書で使用される場合、公知の１００を超える血清型のＡＡＶウイルスの任意の血清型を含む。一般に、ＡＡＶウイルスの血清型は、アミノ酸及び核酸のレベルで有意な相同性を有するゲノム配列を有し、同一の一連の遺伝子機能を提供し、物理的及び機能的用語で本質的に等価なビリオンを産生し、実質的に同一の機構を介して複製及び集合する。
【0152】
ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース長であり、ポジティブセンス又はネガティブセンスのいずれかであり得る一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）から構成される。ゲノムは、複製を担うタンパク質（Ｒｅｐ）及びカプシドの構造タンパク質（Ｃａｐ）をコードする２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。オープンリーディングフレームは、ウイルスゲノムの複製起点として働く２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接している。ｒｅｐフレームは、Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）をコードする４つの重複遺伝子からなる。キャップフレームは、３つのカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の重複ヌクレオチド配列を含有する。Ｒｅｐタンパク質は複製及びパッケージングに重要であるが、カプシドタンパク質は組み立てられてＡＡＶ又はＡＡＶカプシドのタンパク質シェルを作成する。Ｃａｒｔｅｒ Ｂ，Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｌａｓｓｉｅ Ｄ，ｅｔ ａｈ，Ｅｄｓ．，「Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，２０００）及びＧａｏ Ｇ，ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８（１２）：６３８１－６３８８を参照されたい。
【0153】
ＡＡＶベクターは、典型的には、細胞において増殖性感染を受けるためにコヘルパーを必要とする。このようなヘルパー機能の非存在下では、ＡＡＶビリオンは本質的に宿主細胞に侵入するが、細胞のゲノムに組み込まれない。
【0154】
ＡＡＶベクターは、いくつかの独特な特徴のため、遺伝子治療薬の送達のために調査されてきた。特徴の非限定的な例としては、（ｉ）分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力、（ｉｉ）ヒト細胞を含む感染性のための広い宿主範囲、（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶは、いかなる疾患とも関連しておらず、感染細胞において複製することが示されていない、（ｉｖ）ベクターに対する細胞媒介性免疫応答の欠如、及び（ｖ）宿主染色体における非組込み性であり、それによって長期の遺伝子変化の可能性を低下させること、が挙げられる。更に、ＡＡＶベクターによる感染は、細胞遺伝子発現のパターンを変化させることに対して最小限の影響しか及ぼさない（Ｓｔｉｌｗｅｌｌ ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２００３，３４，１４８、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0155】
典型的には、ＧＡＬタンパク質送達のためのＡＡＶベクターは、ウイルスゲノム内に機能的なＲｅｐ及びＣａｐタンパク質をコードする配列を欠くために複製欠損である組換えウイルスベクターであり得る。いくつかの場合において、欠損ＡＡＶベクターは、ほとんど又は全てのコード配列を欠き得、そして本質的に１つ又は２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列及びペイロード配列のみを含み得る。
【0156】
特定の実施形態では、単離された、例えば、組換えＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質、例えば、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質、及びＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子はシグナル配列を更にコードする。
【0157】
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は細菌細胞に導入され得る。
【0158】
ＡＡＶベクターは、送達の効率を高めるために改変され得る。本開示のそのような改変ＡＡＶベクターは、効率的にパッケージングすることができ、標的細胞を高頻度かつ最小限の毒性で首尾よく感染させるために使用することができる。
【0159】
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子を使用して、特定の臓器又は組織、例えば、肝臓にＧＡＬタンパク質を送達することができる（例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２０２１／０５０１５８号を参照されたく、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0160】
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶベクター」又は「ＡＡＶ粒子」という用語は、カプシド、及びペイロードを含むウイルスゲノムを含む。本明細書で使用される場合、「ペイロード」又は「ペイロード領域」は、ウイルスゲノム又はその中にコードされる１つ以上のポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド領域、又はそのようなポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド領域の発現産物、例えば、導入遺伝子、ポリペプチド若しくはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＧＡＬタンパク質を指す。
【0161】
本明細書に記載の組成物は、それらの機能に実質的な効果を有さない更なる保存的又は非必須アミノ酸置換を有し得ることが理解される。
【0162】
ＡＡＶ血清型
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ血清型」は、主にＡＡＶカプシドによって定義される。本開示のＡＡＶ粒子は、任意の天然又は組換えＡＡＶ血清型を含み得るか、又はそれに由来し得る。特に、ＡＡＶ粒子は、血清型を利用するか若しくはそれに基づくか、又は肝臓指向性ＡＡＶカプシド、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質、及びそのバリアントのアミノ酸配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ血清型」は、主にＡＡＶカプシドによって定義される。本開示のＡＡＶ粒子は、任意の天然又は組換えＡＡＶ血清型を含み得るか、又はそれに由来し得る。特に、ＡＡＶ粒子は、血清型を利用するか若しくはそれに基づくか、又は肝臓指向性ＡＡＶカプシド、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質、及びそのバリアントのアミノ酸配列を含み得る。
【0163】
ｓＬ６５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子は、肝臓標的化カプシドについていくつかの必須属性を有することが実証された。特に、ｓＬ６５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子は、非ヒト霊長類において優れた肝臓形質導入及び導入遺伝子発現を有する。更に、ｓＬ６５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子は、標的外組織における導入遺伝子発現によって引き起こされる安全性懸念リスクを低減する高い肝臓特異的形質導入を有することが示されている。更に、ｓＬ６５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子は、肝臓全体に広く均一に分布し、細胞内及び分泌タンパク質ベースの遺伝子治療の両方に望ましい。最後に、ｓＬ６５カプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子は、スケーラブルなバイオリアクタにおいて高収率生産を達成することができ、したがって費用対効果の高い製品の製造を可能にする。
【0164】
一態様において、本開示は、カプシドタンパク質及び本明細書に記載のＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子及び核酸を含む単離された、例えば、組換えＡＡＶ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、ｓＬ６５ ＶＰ１カプシドタンパク質又はその機能的バリアントを含む。
【0165】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２０２１／０５０１５８号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される配列、その断片又はバリアント、例えば、ＰＣＴ／ＡＵ２０２１／０５０１５８号のＡＡＶ－Ｃ１１．１１（配列番号１２としても知られる）を含み得る。カプシドタンパク質をコードする核酸は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２０２１／０５０１５８号に記載されるヌクレオチド配列、例えば、ＡＡＶ－Ｃ１１．１１（配列番号３１としても知られる）を含む。
【0166】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４５のアミノ酸配列、その断片又はバリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号４６の核酸配列、その断片又はバリアントによってコードされ得る。
【0167】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子、例えば、本明細書に記載されるＧＡＬタンパク質のベクター化送達のためのＡＡＶ粒子のＡＡＶ血清型は、ｓＬ６５又はそのバリアントである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子、例えば、本明細書に記載される組換えＡＡＶ粒子は、ｓＬ６５カプシドタンパク質を含む。
【0168】
いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質は、配列番号４５のアミノ酸配列又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号４６のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性）を有する）ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４６のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する）配列を含む。
【0169】
いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、ＬＫ０３カプシドタンパク質又はその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、国際特許出願公開第２０１３０２９０３０号（その内容全体を参照により本明細書に組み込む）に記載されている配列、その断片又はバリアント、例えば、国際公開第２０１３０２９０３０号の配列番号３１を含み得る。カプシドタンパク質をコードする核酸は、国際特許出願国際公開第２０１３０２９０３０号に記載されているヌクレオチド配列、例えば、配列番号４を含む。
【0170】
ＡＡＶウイルスゲノム
いくつかの態様では、本開示の組換えＡＡＶ粒子は、ＧＡＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む発現ベクターとして機能する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ＧＡＬタンパク質及びシグナルペプチドをコードし得る。
いくつかの態様では、本開示の組換えＡＡＶ粒子は、ＧＡＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを含む発現ベクターとして機能する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ＧＡＬタンパク質及びシグナルペプチドをコードし得る。
【0171】
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶ粒子例えば、本明細書に記載されるＧＡＬタンパク質のベクター化送達のための組換えＡＡＶ粒子は、ＡＡＶウイルスゲノム、又はウイルスゲノムを含むＡＡＶベクターを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、以下のうちの１つ以上を更に含む：逆位末端配列（ＩＴＲ）領域、エンハンサ（例えば、ＡｐｏＥ／Ｃ１エンハンサ）、プロモーター（例えば、ｈＡ１Ａｔプロモーター）、イントロン領域（例えば、ヒトβ－グロビン短縮型イントロン）、Ｋｏｚａｋ配列、ペイロードをコードする導入遺伝子をコードする核酸（例えば、本明細書に記載されるＧＡＬタンパク質）、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）配列、ポリＡシグナル領域、又はそれらの組合せを含む。
【0172】
ウイルスゲノム成分：逆位末端配列（ＩＴＲ）
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、少なくとも１つの逆位末端配列（ＩＴＲ）領域を含み得る。本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＩＴＲ領域及びペイロード領域を有するウイルスゲノム、すなわち、タンパク質、例えば、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。ＩＴＲ配列は、ペイロード領域に対して５’又は３’のいずれかに位置する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、２つのＩＴＲを有する。これらの２つのＩＴＲは、５’及び３’末端でペイロード領域に隣接する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、複製のための認識部位を含む複製起点として機能する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、相補的であり、対称的に配置され得る配列領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるウイルスゲノムに組み込まれるＩＴＲは、天然に存在するポリヌクレオチド配列又は組換え由来のポリヌクレオチド配列から構成され得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、少なくとも１つの逆位末端配列（ＩＴＲ）領域を含み得る。本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＩＴＲ領域及びペイロード領域を有するウイルスゲノム、すなわち、タンパク質、例えば、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。ＩＴＲ配列は、ペイロード領域に対して５’又は３’のいずれかに位置する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、２つのＩＴＲを有する。これらの２つのＩＴＲは、５’及び３’末端でペイロード領域に隣接する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、複製のための認識部位を含む複製起点として機能する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、相補的であり、対称的に配置され得る配列領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるウイルスゲノムに組み込まれるＩＴＲは、天然に存在するポリヌクレオチド配列又は組換え由来のポリヌクレオチド配列から構成され得る。
【0173】
ＩＴＲは、カプシド又はその誘導体と同じ血清型に由来し得る。ＩＴＲは、カプシドとは異なる血清型のものであってもよい。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、２つ以上のＩＴＲを有する。非限定的な例において、ＡＡＶ粒子は、２つのＩＴＲを含むウイルスゲノムを有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、互いに同じ血清型である。別の実施形態では、ＩＴＲは異なる血清型のものである。非限定的な例としては、カプシドと同じ血清型を有するＩＴＲのうちの０、１つ又は両方が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムの両方のＩＴＲがＡＡＶ２ ＩＴＲである。
【0174】
独立して、各ＩＴＲは、約１００～約１５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、１００～１８０ヌクレオチド長、例えば、約１００～１１５、約１００～１２０、約１００～１３０、約１００～１４０、約１００～１５０、約１００～１６０、約１００～１７０、約１００～１８０、約１１０～１２０、約１１０～１３０、約１１０～１４０、約１１０～１５０、約１１０～１６０、約１１０～１７０、約１１０～１８０、約１２０～１３０、約１２０～１４０、約１２０～１５０、約１２０～１６０、約１２０～１７０、約１２０～１８０、約１３０～１４０、約１３０～１５０、約１３０～１６０、約１３０～１７０、約１３０～１８０、約１４０～１５０、約１４０～１６０、約１４０～１７０、約１４０～１８０、約１５０～１６０、約１５０～１７０、約１５０～１８０、約１６０～１７０、約１６０～１８０又は約１７０～１８０ヌクレオチド長を含む。ＩＴＲ長の非限定的な例は、１２０、１３０、１４０、１４１、１４２、１４５ヌクレオチド長である。
【0175】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、配列番号１７～１８のいずれか１つのヌクレオチド配列、又は前述の配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のヌクレオチド配列を含む。
【0176】
ウイルスゲノム成分：プロモーター及び発現エンハンサ
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、導入遺伝子標的特異性及び発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む。導入遺伝子標的特異性及び発現を増強するためのエレメントの非限定的な例としては、プロモーター、内因性ｍｉＲＮＡ、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、上流エンハンサ（ＵＳＥ）、ＣＭＶエンハンサ、及びイントロンが挙げられる。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、導入遺伝子標的特異性及び発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む。導入遺伝子標的特異性及び発現を増強するためのエレメントの非限定的な例としては、プロモーター、内因性ｍｉＲＮＡ、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列、上流エンハンサ（ＵＳＥ）、ＣＭＶエンハンサ、及びイントロンが挙げられる。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｓｅｔｔｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ Ｅｎｈａｎｃｅ Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５を参照されたく、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0177】
いくつかの実施形態では、標的細胞におけるポリペプチドの発現は、種特異的、誘導性、組織特異的又は細胞周期特異的であるプロモーターを含むがこれらに限定されない特異的プロモーターによって駆動され得る（Ｐａｒｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５－９（１９９７）；その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0178】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、導入遺伝子によってコードされるペイロード（例えば、ＧＡＬタンパク質）の、例えば、標的細胞における発現に十分なプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムのペイロード領域にコードされるポリペプチド（複数可）の発現を駆動する場合、効率的であると見なされる。
【0179】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、標的とされる細胞又は組織において発現を駆動する場合に効率的であると考えられるプロモーターである。
【0180】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、標的組織において一定期間、ＧＡＬタンパク質の発現を駆動する。プロモーターによって駆動される発現は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３週、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月１１ヶ月、１年、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１０年超の期間であり得る。発現は、１～５時間、１～１２時間、１～２日、１～５日、１～２週間、１～３週間、１～４週間、１～２ヶ月、１～４ヶ月、１～６ヶ月、２～６ヶ月、３～６ヶ月、３～９ヶ月、４～８ヶ月、６～１２ヶ月、１～２年、１～５年、２～５年、３～６年、３～８年、４～８年、又は５～１０年であってもよい。
【0181】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ポリペプチド（例えば、ＧＡＬポリペプチド）の発現を、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２１年、２２年、２３年、２４年、２５年、２６年、２７年、２８年、２９年、３０年、３１年、３２年、３３年、３４年、３５年、３６年、３７年、３８年、３９年、４０年、４１年、４２年、４３年、４４年、４５年、４６年、４７年、４８年、４９年、５０年、５５年、６０年、６５年、又は６５年超駆動する。
【0182】
プロモーターは、天然に存在するものであっても天然に存在しないものであってもよい。プロモーターの非限定的な例としては、ウイルスプロモーター、植物プロモーター及び哺乳動物プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、プロモーターはヒトプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態によれば、プロモーターは、合成であり得る。
【0183】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、１つ以上の、例えば、複数の細胞及び／又は組織における発現をもたらすプロモーター、例えば、遍在性プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ほとんどの哺乳動物組織において発現を駆動又は促進するプロモーターとしては、ヒト伸長因子１α－サブユニット（ＥＦ１α）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサ及び／又はプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）及びその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、並びにユビキチンＣ（ＵＢＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。組織特異的発現エレメントは、特定の細胞型（例えば、肝臓特異的プロモーター、ＣＮＳ特異的プロモーター、Ｂ細胞プロモーター、単球プロモーター、白血球プロモーター、マクロファージプロモーター、膵臓腺房細胞プロモーター、内皮細胞プロモーター、肺組織プロモーター、星状細胞プロモーター、又は種々の特異的神経系細胞型プロモーター（これらは、例えば、ニューロン、星状細胞、又は希突起膠細胞に発現を制限するために使用され得る）が挙げられるが、これらに限定されない）に発現を制限するために使用され得る。例示的なプロモーターとしては、ＥＦ－１αプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター及び／又はその誘導体ＣＡＧ、ＣＭＶ前初期エンハンサ及び／又はプロモーター、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、血小板由来増殖因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）プロモーター、細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ－２）プロモーター、シナプシン（Ｓｙｎ）プロモーター、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、代謝型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）プロモーター、神経フィラメント軽鎖（ＮＦＬ）又は重鎖（ＮＦＨ）プロモーター、β－グロビンミニ遺伝子ｎβ２プロモーター、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）プロモーター、エンケファリン（Ｅｎｋ）及び興奮性アミノ酸輸送体２（ＥＡＡＴ２）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、心血管プロモーター（例えば、αＭＨＣ、ｃＴｎＴ、及びＣＭＶ－ＭＬＣ２ｋ）、肝臓プロモーター例えば、ｈＡ１ＡＴ、ＴＢＧ）、骨格筋プロモーター例えば、デスミン、ＭＣＫ、Ｃ５１２）又はその断片例えば、切断物、若しくは機能的バリアントが挙げられるが、これらに限定されない。
【0184】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｉｎ ２０１１，７：６３），Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ ｅｔ ａｌ．（Ｅ．Ｎｅｕｒｏ ２０１５），Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００１，Ｖｏｌ．８，１５３９－１５４６）、及びＨｕｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００９）に記載されているような遍在性プロモーターであり、これらはそれぞれ参照によりその全体が組み込まれる。
【0185】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、肝臓特異的プロモーター、例えば、肝細胞及び／又は組織においてペイロードの発現をもたらすプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、肝臓特異的プロモーターは、ヒトα－１－アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、配列番号２０のヌクレオチド配列、又は前述の配列と実質的に同一である例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【0186】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、１ｋｂ未満であり得る。プロモーターは、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００又は８００を超えるヌクレオチドの長さを有し得る。プロモーターは、２００～３００、２００～４００、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、３００～４００、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、６００～７００、６００～８００、又は７００～８００ヌクレオチドの間の長さを有し得る。
【0187】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ及びＣＢＡ等であるがこれらに限定されない、同じ又は異なる出発プロモーター又は親プロモーターの２つ以上の成分の組合せであってもよい。各成分は、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００又は８００を超えるヌクレオチドの長さを有し得る。各成分は、２００～３００、２００～４００、２００～５００、２００～６００、２００～７００、２００～８００、３００～４００、３００～５００、３００～６００、３００～７００、３００～８００、４００～５００、４００～６００、４００～７００、４００～８００、５００～６００、５００～７００、５００～８００、６００～７００、６００～８００又は７００～８００ヌクレオチドの間の長さを有し得る。
【0188】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、２つのプロモーターを含む。非限定的な例として、プロモーターは、Ａ１ＡＴプロモーター及びＣＭＶプロモーターである。
【0189】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムはエンハンサエレメントを含む。本明細書において「エンハンサ」とも称されるエンハンサエレメントは、組織特異的エンハンサ、例えば、肝臓特異的エンハンサ、例えば、ヒトアポリポタンパク質Ｅ／Ｃ－Ｉ（ＡｐｏＥ／Ｃ－Ｉ）遺伝子座（又は肝臓制御領域）であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、エンハンサは、配列番号１９のヌクレオチド配列、又は前述の配列と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、エンハンサはＣＭＶエンハンサである。
【0190】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、エンハンサ及び／又はプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサは、ＡｐｏＥ／Ｃ－Ｉエンハンサである。いくつかの実施形態では、プロモーターはＡ１ＡＴプロモーターである。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ＡｐｏＥ／Ｃ－Ｉエンハンサ及びヒトＡ１ＡＴプロモーターを含む。
【0191】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、操作されたプロモーターを含む。別の実施形態では、ウイルスゲノムは、天然に発現されるタンパク質由来のプロモーターを含む。
【0192】
ウイルスゲノム成分：イントロン
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのイントロン又はその断片若しくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのイントロンは、本明細書に記載のＧＡＬタンパク質の発現を増強し得る。イントロンの非限定的な例としては、ヒトβ－グロビンイントロン（例えば、４７６ｂｐｓ長の内部切断型ヒトβ－グロビンイントロン２）、ＭＶＭ（６７～９７ｂｐｓ）、Ｆ．ＩＸ切断型イントロン１（３００ｂｐｓ）、β－グロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター（２５０ｂｐｓ）、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライスアクセプター（５００ｂｐｓ）、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）（１８０ｂｐｓ）、及びハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（２３０ｂｐｓ）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのイントロン又はその断片若しくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのイントロンは、本明細書に記載のＧＡＬタンパク質の発現を増強し得る。イントロンの非限定的な例としては、ヒトβ－グロビンイントロン（例えば、４７６ｂｐｓ長の内部切断型ヒトβ－グロビンイントロン２）、ＭＶＭ（６７～９７ｂｐｓ）、Ｆ．ＩＸ切断型イントロン１（３００ｂｐｓ）、β－グロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター（２５０ｂｐｓ）、アデノウイルススプライスドナー／免疫グロブリンスプライスアクセプター（５００ｂｐｓ）、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）（１８０ｂｐｓ）、及びハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（２３０ｂｐｓ）が挙げられる。
【0193】
いくつかの実施形態では、イントロンは、１００～５００ヌクレオチド長であり得る。イントロンは、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０又は５００ヌクレオチドの長さを有し得る。イントロンは、８０～１００、８０～１２０、８０～１４０、８０～１６０、８０～１８０、８０～２００、８０～２５０、８０～３００、８０～３５０、８０～４００、８０～４５０、８０～５００、２００～３００、２００～４００、２００～５００、３００～４００、３００～５００又は４００～５００ヌクレオチドの長さを有し得る。
【0194】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ヒトβグロビンイントロン又はその断片若しくはバリアントを含み得る。いくつかの実施形態では、イントロンは、１つ以上のヒトβグロビン配列（例えば、その断片／バリアントを含む）を含む。いくつかの実施形態では、プロモーターはヒトＡ１ＡＴプロモーターであり得る。
【0195】
いくつかの実施形態では、イントロンは、配列番号２１のヌクレオチド配列、又は前述の配列のいずれかと実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のヌクレオチド配列を含む。
【0196】
いくつかの実施形態では、コードされたタンパク質は、限定されないが、ＳＶ４０イントロン又はベータグロビンイントロン又は当技術分野で公知の他のもの等の発現ベクター中のイントロンの下流に位置し得る。更に、コードされたＧＡＬタンパク質はまた、発現ベクター中のポリアデニル化配列の上流に位置し得る。いくつかの実施形態では、コードされたタンパク質は、発現ベクター中のイントロンを含むプロモーターから（例えば、イントロンを含むプロモーターに対して３’側）の下流及び／又はポリアデニル化配列（例えば、ポリアデニル化配列に対して５’側）の上流の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３０、４０、５０、６０、若しくは７０を超えるヌクレオチドに位置し得る。いくつかの実施形態では、コードされたＧＡＬタンパク質は、発現ベクター中のイントロン（例えば、イントロンに対して３’）の下流及び／又はポリアデニル化配列（例えば、ポリアデニル化配列に対して５’）の上流の１～５、１～１０、１～１５、１～２０、１～２５、１～３０、５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４５～５０、５０～５５、５５～６０、６０～６５又は６５～７０ヌクレオチド内に位置し得る。いくつかの実施形態では、コードされたタンパク質は、イントロン（Ａ）から下流のヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は２５％超内に位置し得る。例えば、（イントロンに対して３’）及び／又はポリアデニル化配列の上流（例えば、ポリアデニル化配列に対して５’である）。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質は、発現ベクター中のイントロン（例えば、イントロンに対して３’）の下流及び／又はポリアデニル化配列（例えば、ポリアデニル化配列に対して５’）の上流の配列の最初の１～５％、１～１０％、１～１５％、１～２０％、１～２５％、５～１０％、５～１５％、５～２０％、５～２５％、１０～１５％、１０～２０％、１０～２５％、１５～２０％、１５～２５％、又は２０～２５％内に位置し得る。
【0197】
特定の実施形態では、イントロン配列は、エンハンサ配列ではない。いくつかの実施形態では、イントロン配列はプロモーター配列のサブコンポーネントではない。いくつかの実施形態では、イントロン配列はプロモーター配列のサブコンポーネントである。
【0198】
ウイルスゲノム成分：非翻訳領域（ＵＴＲ）
いくつかの実施形態では、遺伝子の野生型非翻訳領域（ＵＴＲ）は転写されるが、翻訳されない。一般に、５’ＵＴＲは転写開始部位で開始し、開始コドンで終了し、３’ＵＴＲは終止コドンの直後に開始し、転写のための終結シグナルまで続く。
いくつかの実施形態では、遺伝子の野生型非翻訳領域（ＵＴＲ）は転写されるが、翻訳されない。一般に、５’ＵＴＲは転写開始部位で開始し、開始コドンで終了し、３’ＵＴＲは終止コドンの直後に開始し、転写のための終結シグナルまで続く。
【0199】
特定の標的器官の豊富に発現される遺伝子に典型的に見られる特徴は、安定性及びタンパク質産生を増強するためにＵＴＲに操作され得る。非限定的な例として、肝臓で通常発現されるｍＲＮＡ由来の５’ＵＴＲ（例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポプロテインＡ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン又は第ＶＩＩＩ因子）を本開示のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムで使用して、肝細胞株又は肝臓での発現を増強することができる。
【0200】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される導入遺伝子（例えば、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子をコードするウイルスゲノム）は、Ｋｏｚａｋ配列を含む。
【0201】
理論に束縛されることを望まないが、野生型５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳開始において役割を果たす特徴を含む。リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することが一般に知られているＫｏｚａｋ配列は、通常、５’ＵＴＲに含まれる。Ｋｏｚａｋ配列はコンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここでＲは開始コドン（ＡＴＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）であり、これに別の「Ｇ」が続く。いくつかの実施形態では、脊椎動物ｍＲＮＡにおける翻訳開始のための有利な状況は、ＧＣＣＡＣＣａｔｇＧ（配列番号４２）（Ｍ．Ｋｏｚａｋ，１９９６，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ７：５６３）である。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号２２のヌクレオチド配列、又は前述の配列と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のヌクレオチド配列を含む。
【0202】
理論に拘束されることを望まないが、野生型３’ＵＴＲは、その中に埋め込まれたアデノシン及びウリジンのストレッチを有することが知られている。これらのＡＵに富むシグネチャーは、高い代謝回転率を有する遺伝子において特に一般的である。それらの配列特徴及び機能的特性に基づいて、ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）は、３つのクラス（その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ，１９９５）：クラスＩ ＡＲＥ、例えば、限定されないが、ｃ－Ｍｙｃ及びＭｙｏＤは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフのいくつかの分散コピーを含む。クラスＩＩ ＡＲＥ（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ及びＴＮＦ－αであるが、これらに限定されない）は、２つ以上の重複するＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。クラスＩＩＩのＡＲＥＳ（例えば、ｃ－Ｊｕｎ及びミオゲニンが挙げられるが、これらに限定されない）は、あまり明確ではない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含まない。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバー、最も顕著にはＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証されている。ＨｕＲは、３つのクラス全てのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲに操作することは、ＨｕＲ結合をもたらし、したがってメッセージの安定化インビボをもたらす。
【0203】
３’ＵＴＲ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去又は修飾を用いて、ポリヌクレオチドの安定性を調節することができる。特定のポリヌクレオチド、例えば、ウイルスゲノムのペイロード領域を操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、ポリヌクレオチドの安定性を低下させ、それによって翻訳を削減し、得られるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを同定し、除去又は変異させて、細胞内安定性を増加させ、したがって、得られるタンパク質の翻訳及び産生を増加させることができる。
【0204】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲは、ポリＡテールの鋳型付加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。
【0205】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号２５のヌクレオチド配列、又は前述の配列と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号２６の内部が切断されたヌクレオチド配列Ｗ３ＳＬ、又は前述の配列と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のヌクレオチド配列を含む。
【0206】
当技術分野で公知の任意の遺伝子由来の任意のＵＴＲをＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに組み込むことができる。これらのＵＴＲ又はその一部は、それらが選択された遺伝子と同じ向きに配置され得るか、又は向き若しくは位置が変更され得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムで使用されるＵＴＲは、当技術分野で公知の１つ以上の他の５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲで逆位、短縮、延長又は作製され得る。本明細書で使用される場合、ＵＴＲに関する「変更された」という用語は、ＵＴＲが参照配列に関して何らかの方法で変更されていることを意味する。例えば、３’又は５’ＵＴＲは、上記で教示されるような向き又は位置の変化によって野生型又は天然のＵＴＲに対して変化し得るか、又は更なるヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換若しくは転位によって変化し得る。
【0207】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、野生型ＵＴＲのバリアントではない少なくとも１つの人工ＵＴＲを含む。
【0208】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴又は特性を共有する転写産物のファミリーから選択されたＵＴＲを含む。
【0209】
ウイルスゲノム成分：ポリアデニル化配列
いくつかの実施形態では、本開示のウイルスゲノムは、少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む。本開示のウイルスゲノムは、ペイロードコード配列の３’末端と３’ＵＴＲの５’末端との間にポリアデニル化配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナル領域は、ペイロードをコードする導入遺伝子、例えば、本明細書に記載のＧＡＬタンパク質を含む核酸に対して３’に配置される。
いくつかの実施形態では、本開示のウイルスゲノムは、少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列を含む。本開示のウイルスゲノムは、ペイロードコード配列の３’末端と３’ＵＴＲの５’末端との間にポリアデニル化配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナル領域は、ペイロードをコードする導入遺伝子、例えば、本明細書に記載のＧＡＬタンパク質を含む核酸に対して３’に配置される。
【0210】
いくつかの実施形態では、ポリＡシグナル領域は約１００～６００ヌクレオチド、例えば、約１００～５００ヌクレオチド、約１００～４００ヌクレオチド、約１００～３００ヌクレオチド、約１００～２００ヌクレオチド、約２００～６００ヌクレオチド、約２００～５００ヌクレオチド、約２００～４００ヌクレオチド、約２００～３００ヌクレオチド、約３００～６００ヌクレオチド、約３００～５００ヌクレオチド、約３００～４００ヌクレオチド、約４００～６００ヌクレオチド、約４００～５００ヌクレオチド又は約５００～６００ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナル領域は、約１００～１５０ヌクレオチド、例えば、約１２７ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナル領域は、約４５０～５００ヌクレオチド、例えば、約４７７ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナル領域は、約５２０～約５６０ヌクレオチド、例えば、約５５２ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡシグナル領域は約１２７ヌクレオチドの長さを含む。
【0211】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号２３のヌクレオチド配列、又は前述の配列と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のヌクレオチド配列を含む。
【0212】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムはＳＶ４０ポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、配列番号２４のヌクレオチド配列、又は前述の配列と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のヌクレオチド配列を含む。
【0213】
ウイルスゲノム成分：フィラー配列
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、１つ以上のフィラー配列を含む。フィラー配列は、野生型配列又は操作された配列であり得る。フィラー配列は、野生型配列のバリアントであってもよい。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、ヒトアルブミンの誘導体である。
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、１つ以上のフィラー配列を含む。フィラー配列は、野生型配列又は操作された配列であり得る。フィラー配列は、野生型配列のバリアントであってもよい。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、ヒトアルブミンの誘導体である。
【0214】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、パッケージングに最適なサイズであるウイルスゲノムの長さを有するために、１つ以上のフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約２．３ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約４．６ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。
【0215】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ウイルスゲノムを含み、独立して又は一緒に、約０．１ｋｂ～３．８ｋｂ、例えば、これらに限定されないが、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ又は３．８ｋｂの長さを有する１つ以上のフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム中の全長フィラー配列は、３．１ｋｂである。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム中の全長フィラー配列は、２．７ｋｂである。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム中の全長フィラー配列は０．８ｋｂである。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム中の全長フィラー配列は０．４ｋｂである。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは０．８ｋｂである。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは０．４ｋｂである。
【0216】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、自己相補的（ｓｃ）ウイルスゲノムを含み、独立して又は一緒に、約０．１ｋｂ～１．５ｋｂ、例えば、これらに限定されないが、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ又は１．５ｋｂの長さを有する１つ以上のフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム中の全長フィラー配列は０．８ｋｂである。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム中の全長フィラー配列は０．４ｋｂである。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは０．８ｋｂである。いくつかの実施形態では、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは０．４ｋｂである。
【0217】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、フィラー配列の任意の部分を含む。ウイルスゲノムは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％のフィラー配列を含み得る。
【0218】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’側に位置する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列はプロモーター配列の５’側に位置する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列はポリアデニル化シグナル配列の３’側に位置する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は３’ＩＴＲ配列の５’側に位置する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は２つのイントロン配列の間に位置する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列はイントロン配列内に位置する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は５’ＩＴＲ配列の３’側に位置し、第２のフィラー配列はポリアデニル化シグナル配列の３’側に位置する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列はプロモーター配列の５’側に位置し、第２のフィラー配列はポリアデニル化シグナル配列の３’側に位置する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’側に位置し、第２のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の５’側に位置する。
【0219】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの１つ以上の領域の間に１つ以上のフィラー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、フィラー領域は、ペイロード領域、逆位末端配列（ＩＴＲ）、プロモーター領域、イントロン領域、エンハンサ領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、及び／又はエクソン領域等であるがこれらに限定されない領域の前に位置し得る。いくつかの実施形態、フィラー領域は、ペイロード領域、逆位末端配列（ＩＴＲ）、プロモーター領域、イントロン領域、エンハンサ領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、及び／又はエクソン領域等であるがこれらに限定されない領域の後に位置し得る。いくつかの実施形態、フィラー領域は、ペイロード領域、逆位末端配列（ＩＴＲ）、プロモーター領域、イントロン領域、エンハンサ領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、及び／又はエクソン領域等であるがこれらに限定されない領域の前後に位置し得る。
【0220】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、５’ＩＴＲの後にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、プロモーター領域の後にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ペイロード領域の後にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、イントロン領域の後にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、エンハンサ領域の後にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列領域の後にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、エクソン領域の後にフィラー配列を含む。
【0221】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、プロモーター領域の前にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ペイロード領域の前にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、イントロン領域の前にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、エンハンサ領域の前にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列領域の前にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、エクソン領域の前にフィラー配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、３’ＩＴＲの前にフィラー配列を含む。
【0222】
いくつかの実施形態では、フィラー配列は、５’ＩＴＲ及びプロモーター領域等であるがこれらに限定されない２つの領域の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、５’ＩＴＲ及びペイロード領域等であるがこれらに限定されない２つの領域の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、５’ＩＴＲ及びイントロン領域等であるがこれらに限定されない２つの領域の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、５’ＩＴＲ及びエンハンサ領域等であるがこれらに限定されない２つの領域の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、５’ＩＴＲ及びポリアデニル化シグナル配列領域等であるがこれらに限定されない２つの領域の間に位置し得る。
【0223】
いくつかの実施形態では、フィラー配列は、２つの領域（例えば、プロモーター領域及びペイロード領域であるが、これらに限定されない）の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、２つの領域（例えば、プロモーター領域及びイントロン領域であるが、これらに限定されない）の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、２つの領域（例えば、プロモーター領域及びエンハンサ領域であるが、これらに限定されない）の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、２つの領域（例えば、プロモーター領域及びポリアデニル化シグナル配列領域であるが、これらに限定されない）の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、２つの領域（例えば、プロモーター領域及びエキソン領域であるが、これらに限定されない）の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、２つの領域（例えば、プロモーター領域及び３’ＩＴＲが挙げられるが、これらに限定されない）の間に位置し得る。
【0224】
いくつかの実施形態では、フィラー配列は、２つの領域（例えば、ペイロード領域及びイントロン領域であるが、これらに限定されない）の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、２つの領域（例えば、ペイロード領域及びエンハンサ領域であるが、これらに限定されない）の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、２つの領域（例えば、ペイロード領域及びポリアデニル化シグナル配列領域であるが、これらに限定されない）の間に位置し得る。いくつかの実施形態では、フィラー配列は、２つの領域（例えば、ペイロード領域及びエキソン領域であるが、これらに限定されない）の間に位置し得る。
【0225】
ウイルスゲノム成分：ペイロード
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶ粒子、例えば、ＧＡＬタンパク質のベクター化送達のためのＡＡＶ粒子は、ペイロードをコードするウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ペイロードをコードする導入遺伝子を含む核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＧＡＬタンパク質を含む。
いくつかの実施形態では、組換えＡＡＶ粒子、例えば、ＧＡＬタンパク質のベクター化送達のためのＡＡＶ粒子は、ペイロードをコードするウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ペイロードをコードする導入遺伝子を含む核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ペイロードは、ＧＡＬタンパク質を含む。
【0226】
いくつかの実施形態では、本明細書中の開示は、遺伝子療法ベクターによって送達されるＧＡＬタンパク質の発現及び／又は活性の改善を可能にする構築物を提供する。
【0227】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子療法ベクターによって送達されるＧＡＬタンパク質の生体分布の改善を可能にする構築物を提供する。
【0228】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子療法ベクターによって送達されるＧＡＬタンパク質の細胞内分布又は輸送の改善を可能にする構築物を提供する。
【0229】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子療法ベクターによって送達されるリソソーム膜へのＧＡＬタンパク質の輸送の改善を可能にする構築物を提供する。
【0230】
いくつかの態様では、本開示は、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質、及びＧＡＬタンパク質又はその機能的断片若しくはバリアントをコードする導入遺伝子を含む核酸を含む単離された組換えＡＡＶ粒子を含む組成物、並びに対象、例えば、ヒト及び／又は疾患、例えば、ＧＡＬ関連疾患、例えばリソソーム蓄積症、例えばファブリー病のモデルにおいて組成物をインビトロ又はインビボ投与又は送達する方法に関する。
【0231】
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つの「ペイロード」をコードする核酸配列を含み得る。本明細書中で使用される場合、「ペイロード」又は「ペイロード領域」とは、ウイルスゲノムによってコードされるか、若しくはウイルスゲノム内にある１つ以上のポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド領域、又はこのようなポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド領域の発現産物、例えば、導入遺伝子、ポリペプチド若しくはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＧＡＬタンパク質又はその断片若しくはバリアントをいう。ペイロードは、ペイロードを保有するＡＡＶビリオンで形質導入又は接触された標的細胞におけるＧＡＬタンパク質の発現（タンパク質産物の補充又は調節性核酸を用いた遺伝子置換による）に有用な、当該分野で公知の任意の核酸を含み得る。
【0232】
本明細書に記載されるようなＡＡＶゲノムにおける使用のためのＧＡＬをコードする導入遺伝子の特定の特徴は、野生型ＧＡＬコード配列及びコドン最適化ＧＡＬコード構築物の使用を含む。
【0233】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は野生型ＧＡＬコード配列であり、野生型ＧＡＬタンパク質又はその機能的バリアントをコードする。いくつかの実施形態では、機能的バリアントは、所望の治療効果を達成するために、その野生型対応物の活性の一部又は全てを保持するバリアントである。例えば、いくつかの実施形態では、機能的バリアントは、障害又は状態、例えば、ＧＬＡ遺伝子産物欠損又はＧＡＬ関連障害、例えば、リソソーム蓄積障害、例えば、ファブリー病を処置するための遺伝子治療において使用されるのに有効である。他に示されない限り、本明細書に記載されるようなＧＡＬタンパク質のバリアント、例えば、本開示の構築物、ベクター、ゲノム、方法、キット、組成物等の文脈においては、機能的バリアントである。いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質は、野生型ＧＡＬタンパク質のアミノ酸１～４２９（例えば、ＧＡＬタンパク質ＮＰ＿０００１６０．１）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質は野生型ＧＡＬタンパク質のアミノ酸３２－４２９を含む。いくつかの実施形態では、コードされたＧＡＬタンパク質は、ヒト、非ヒト霊長類、又は齧歯類等の任意の種に由来してもよいが、これらに限定されない。
【0234】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＧＡＬタンパク質、又はそのバリアントをコードするペイロード領域（又は導入遺伝子）を含む。
【0235】
【表1】
【0236】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、表１に提供されるように、ヒトＧＡＬタンパク質配列又はその断片に対して少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【0237】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質は、カニクイザル、マカ・ファスカシクラリス（Macaca fascicularis）等の非ヒト霊長類の配列をコードするＧＡＬタンパク質に由来する。特定の実施形態は、ＧＡＬタンパク質をカ・ファスカシクラリス（Macaca fascicularis）配列のヒト化バージョンとして提供する。
【0238】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、カニクイザル又はカニ目（ロングテール）カ・ファスカシクラリス（Macaca fascicularis）ＧＡＬタンパク質、又はそのバリアントをコードするペイロード領域を含む。
【0239】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、アカゲザル（Macaca mulatta）ＧＡＬタンパク質又はそのバリアントをコードするペイロード領域を含む。
【0240】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子によってコードされるＧＡＬタンパク質は、上記及び表１に提供されるもののいずれかと５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0241】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質は、上記及び表１に提供されるもののいずれかと５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する核酸配列によってコードされ得る。
【0242】
本明細書に記載されるＧＡＬタンパク質ペイロードは、任意のＧＡＬタンパク質、又はＧＡＬタンパク質の任意の部分若しくは誘導体をコードすることができ、表１に提供されるＧＡＬタンパク質又はタンパク質コード配列に限定されない。
【0243】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質又はその機能的バリアントは、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１と実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）アミノ酸を含む。
【0244】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬをコードする導入遺伝子は、配列番号２のヌクレオチド配列、又は配列番号２と実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）ヌクレオチド配列を含む。
【0245】
いくつかの実施形態では、同じ又は本質的に同じＧＡＬタンパク質アミノ酸配列（例えば、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するもの）をコードするコドン最適化された及び他のバリアントも使用され得る。
【0246】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号３～５に示される配列、又は前述の配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）ヌクレオチド配列等のヒト細胞を含む哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。
【0247】
ペイロード構築物は、コード核酸配列と非コード核酸配列との組合せを含み得る。
【0248】
ウイルスゲノムの任意のセグメント、断片、又は全体及びその中のペイロード領域は、コドン最適化され得る。
【0249】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、１つ以上のペイロードをコードする。非限定的な例として、１つ以上のペイロードをコードするウイルスゲノムを複製し、ウイルス粒子にパッケージングすることができる。１つ以上のペイロードを含むウイルス粒子で形質導入された標的細胞は、単一細胞においてペイロードのそれぞれを発現し得る。
【0250】
いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、コード又は非コードＲＮＡをコードし得る。特定の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクター粒子は、Ｋｏｚａｋ配列、骨格配列、及びイントロン配列からなる群から選択される少なくとも１つのシスエレメントを更に含む。
【0251】
いくつかの実施形態では、ペイロードは、ペプチド又はタンパク質であり得るポリペプチドである。ペイロード構築物によってコードされるタンパク質は、分泌タンパク質、細胞内タンパク質、細胞外タンパク質、及び／又は膜タンパク質を含み得る。コードされたタンパク質は、構造的であっても機能的であってもよい。ウイルスゲノムによってコードされるタンパク質としては、哺乳動物タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ＧＡＬタンパク質又はその断片若しくはバリアントをコードするウイルスゲノムを含む。本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、ヒト疾患、獣医学的適用、並びに種々のインビボ及びインビトロ状況の分野において有用であり得る。
【0252】
いくつかの実施形態では、ペイロードは、細胞の形質転換及び発現を評価するためのマーカータンパク質として機能するポリペプチド、融合タンパク質、所望の生物学的活性を有するポリペプチド、遺伝的欠陥を補完することができる遺伝子産物、ＲＮＡ分子、転写因子、並びに調節及び／又は発現において対象となる他の遺伝子産物を含み得る。いくつかの実施形態では、ペイロードは、所望の効果又は調節機能を提供するヌクレオチド配列（例えば、トランスポゾン、転写因子）を含み得る。
【0253】
コード化されたペイロードは、遺伝子治療産物を含み得る。遺伝子治療産物は、標的細胞において発現される場合、所望の治療効果を提供する、ポリペプチド、ＲＮＡ分子、又は他の遺伝子産物を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、遺伝子治療産物は、非機能性遺伝子又は存在しないか、不十分な量で発現されるか、又は変異している遺伝子の代替物を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子治療製品は、存在しないか、不十分な量で発現されるか、ミスフォールドしているか、速すぎる速度で分解されるか、又は変異している非機能性タンパク質若しくはポリペプチド又はタンパク質若しくはポリペプチドの代替物を含み得る。例えば、遺伝子治療製品は、ＧＡＬ欠損症又はＧＡＬ関連障害を治療するためのＧＡＬタンパク質又はＧＡＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み得る。
【0254】
いくつかの実施形態では、ペイロードは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードする。本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、目的のポリペプチドをコードし、翻訳されて、コードされた目的のポリペプチドをインビトロ、インビボ、インサイチュ、又はエクスビボ産生することができる任意のポリヌクレオチドを指す。特定の実施形態は、ＧＡＬ又はそのバリアントをコードするｍＲＮＡを提供する。
【0255】
ｍＲＮＡの成分としては、コード領域、５’－ＵＴＲ（非翻訳領域）、３’－ＵＴＲ、５’－キャップ及びポリＡテールが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、コードされたｍＲＮＡ又はＡＡＶゲノムの任意の部分は、コドン最適化され得る。
【0256】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬ又はそのバリアントをコードするペイロード構築物によってコードされるタンパク質又はポリペプチドは、約５０～約４５００アミノ酸残基長（以下、この文脈において、「長さがＸ個のアミノ酸」は、Ｘ個のアミノ酸残基を指す）である。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質又はポリペプチドは、５０～２０００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質又はポリペプチドは、５０～１０００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質又はポリペプチドは、５０～１５００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質又はポリペプチドは、５０～１０００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質又はポリペプチドは、５０～８００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質又はポリペプチドは、５０～６００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質又はポリペプチドは、５０～４００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質又はポリペプチドは、５０～２００アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、コードされるタンパク質又はポリペプチドは、５０～１００アミノ酸長である。
【0257】
ペイロードをコードするペイロード構築物は、選択マーカーを含み得るか、又はコードし得る。選択マーカーは、選択マーカーを発現してもしなくてもよい細胞集団からの宿主細胞の同定、選択及び／又は精製を可能にする、宿主細胞において発現される遺伝子配列又は遺伝子配列によってコードされるタンパク質若しくはポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、そうでなければ宿主細胞を死滅させるであろう選択プロセス、例えば、抗生物質による処理を生き残るための耐性を提供する。いくつかの実施形態、抗生物質選択マーカーは、ネオマイシン耐性、例えば、ｎｅｏ、ハイグロマイシン耐性、カナマイシン耐性、及び／又はピューロマイシン耐性を含むがこれらに限定されない１つ以上の抗生物質耐性因子を含んでもよい。
【0258】
いくつかの実施形態では、ペイロードをコードするペイロード構築物は、β－ラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はＣＤ４若しくは切断型神経成長因子（ＮＧＦＲ）等の細胞表面マーカーを含む当技術分野で理解されているような任意の他のレポーター遺伝子を含むがこれらに限定されない選択可能なマーカーを含み得る（ＧＦＰについては、国際公開第９６／２３８１０号；Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１７８－１８２（１９９６）；Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ （１９９５）；又はＨｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７３：６６３－６６４（１９９５）；β－ラクタマーゼについては、国際公開第９６／３０５４０号を参照されたい）；その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0259】
いくつかの実施形態では、選択マーカーをコードするペイロード構築物は、蛍光タンパク質を含み得る。本明細書に記載される蛍光タンパク質は、緑色、黄色、及び／又は赤色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＹＦＰ、及び／又はＲＦＰ）を含むがこれらに限定されない任意の蛍光マーカーを含み得る。いくつかの実施形態では、選択可能マーカーをコードするペイロード構築物は、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグを含んでもよい。
【0260】
特定の実施形態では、標的細胞におけるペイロードの発現のための核酸は、ウイルスゲノムに組み込まれ、２つのＩＴＲ配列の間に位置する。
【0261】
ペイロード成分：シグナル配列
いくつかの実施形態では、ペイロード、例えば、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸配列は、シグナル配列（例えば、本明細書におけるシグナル配列領域）をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする導入遺伝子を含む核酸配列は、２つのシグナル配列領域を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする導入遺伝子を含む核酸配列は、３つ以上のシグナル配列領域を含む。
いくつかの実施形態では、ペイロード、例えば、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸配列は、シグナル配列（例えば、本明細書におけるシグナル配列領域）をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする導入遺伝子を含む核酸配列は、２つのシグナル配列領域を含む。いくつかの実施形態では、ペイロードをコードする導入遺伝子を含む核酸配列は、３つ以上のシグナル配列領域を含む。
【0262】
いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して５’に位置する。いくつかの実施形態では、コードされたＧＡＬタンパク質は、Ｎ末端にシグナル配列を含み、シグナル配列は、ＧＡＬタンパク質の細胞プロセシング及び／又は局在化中に場合により切断される。
【0263】
いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ＧＡＬタンパク質、例えばヒトＧＡＬタンパク質の天然シグナル配列である。
【0264】
いくつかの実施形態では、ヒトＧＡＬシグナル配列は、配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号６と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号６と比較して、少なくとも１、２、又は３つであるが、４つ以下の修飾、例えば置換を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0265】
いくつかの実施形態では、ヒトＧＡＬシグナル配列は、配列番号７の核酸配列、又は配列番号７と実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）核酸配列によってコードされ得る。
【0266】
いくつかの実施形態では、ヒトＧＡＬシグナル配列をコードする核酸はコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号８～１０のいずれか１つの核酸配列、又は配列番号８～１０のいずれか１つと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）核酸配列によってコードされ得る。
【0267】
いくつかの実施形態では、シグナル配列は異種シグナル配列である。
【0268】
いくつかの実施形態では、異種シグナル配列は、ヒト又はマウスＩｇＧ１シグナル配列である。
【0269】
いくつかの実施形態では、マウスＩｇＧ１シグナル配列及びヒトＩｇＧ１シグナル配列は、配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１１と実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）アミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号１１と比較して、少なくとも一つ、二つ、又は三つであるが、四つ以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0270】
いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１シグナル配列は、配列番号１２の核酸配列、又は配列番号１２と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列によってコードされ得る。
【0271】
いくつかの実施形態では、マウスＩｇＧ１シグナル配列は、配列番号１２の核酸配列、又は配列番号１２と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列によってコードされ得る。
【0272】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１シグナル配列（例えば、マウス及び／又はヒト配列）をコードする核酸は、コドン最適化されている。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号１３若しくは１４の核酸配列、又は配列番号１３若しくは１４と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％同一）の核酸配列によってコードされ得る。
【0273】
いくつかの実施形態では、異種シグナル配列は、合成ＩｇＧ１シグナル配列である。
【0274】
いくつかの実施形態では、合成ＩｇＧ１シグナル配列は、配列番号１５のアミノ酸配列、又は配列番号１５と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、配列番号１５と比較して、少なくとも一つ、二つ、又は三つであるが、四つ以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含み得る。
【0275】
いくつかの実施形態では、合成ＩｇＧ１シグナル配列は、配列番号１６の核酸配列、又は配列番号１６と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列によってコードされ得る。
【0276】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列、例えば、ヒトＧＡＬシグナルペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のアミノ酸配列を含み、コードされたＧＡＬタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、コードされたＧＡＬタンパク質に対してＮ末端に位置する。いくつかの実施形態では、ヒトＧＡＬシグナルペプチド配列を有するコードされたＧＡＬタンパク質は、配列番号２７のアミノ酸配列、又は配列番号２７と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のアミノ酸配列を含む。
【0277】
いくつかの実施形態では、ヒトＧＡＬシグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列又は配列番号７～１０のいずれか１つと実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又は配列番号２～５のいずれか１つと実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含む。
【0278】
いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７のヌクレオチド配列又は配列番号７と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列又は配列番号２と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含む。
【0279】
いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８のヌクレオチド配列又は配列番号８と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列又は配列番号３と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含む。
【0280】
いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９のヌクレオチド配列又は配列番号９と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列又は配列番号４と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含む。
【0281】
いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０のヌクレオチド配列又は配列番号１０と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列又は配列番号５と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含む。
【0282】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列、例えば、ヒト又はマウスＩｇＧ１シグナルペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列又は配列番号１１と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のアミノ酸配列を含み、コードされたＧＡＬタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、コードされたＧＡＬタンパク質に対してＮ末端に位置する。いくつかの実施形態では、ヒト又はマウスＩｇＧ１シグナルペプチド配列を有するコードされたＧＡＬタンパク質は、配列番号２８のアミノ酸配列、又は配列番号２８と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）のアミノ酸配列を含む。
【0283】
いくつかの実施形態では、ヒト又はマウスＩｇＧ１シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列又は配列番号１２～１４のいずれか１つと実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列又は配列番号２～５のいずれか１つと実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含む。
【0284】
いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２のヌクレオチド配列又は配列番号１２と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列又は配列番号２と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含む。
【0285】
いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３のヌクレオチド配列又は配列番号１３と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列又は配列番号３と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含む。
【0286】
いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３のヌクレオチド配列又は配列番号１３と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列又は配列番号４と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含む。
【0287】
いくつかの実施形態では、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列又は配列番号１４と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列又は配列番号５と実質的に同一（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％同一）の核酸配列を含む。
【0288】
例示的なペイロード：ＧＡＬ
いくつかの実施形態では、本開示の単離された組換えＡＡＶ粒子は、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質、及びＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の単離された組換えＡＡＶ粒子は、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質、及びＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む。
【0289】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号６に対して少なくとも１、２、若しくは３つであるが４つ以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含むシグナル配列；及び配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0290】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0291】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号７のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0292】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0293】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号９のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0294】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１０のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号５のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0295】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号１１に対して少なくとも１、２、若しくは３つであるが４つ以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含むシグナル配列；及び配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0296】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0297】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0298】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0299】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0300】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号５のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0301】
例示的なＡＡＶウイルスゲノム及び粒子
本開示のＡＡＶ粒子は、本明細書に記載されるように、カプシドタンパク質、例えば、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質、及びＡＡＶウイルスゲノム又はベクターを含む。
本開示のＡＡＶ粒子は、本明細書に記載されるように、カプシドタンパク質、例えば、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質、及びＡＡＶウイルスゲノム又はベクターを含む。
【0302】
いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号４５のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又は１００％の配列同一性を有する）を含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号４６のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％を有する）ヌクレオチド配列によってコードされる。
【0303】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、逆位末端配列領域、エンハンサ、プロモーター、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、ＷＰＲＥ配列、ポリＡ領域、又はそれらの組合せを更に含む。
【0304】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、例えば、表２に記載されるような、配列番号３１～４１及び５１～６１のいずれか１つのヌクレオチド配列のヌクレオチド配列、例えば、５’ＩＴＲから３’ＩＴＲのヌクレオチド配列、又は前述の配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含む。
【0305】
【表2】
【0306】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号３１若しくは５１のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３１若しくは５１のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号７のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0307】
いくつかの実施形態では、配列番号３１若しくは５１のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２７のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0308】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号３２若しくは５２のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３２若しくは５２のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0309】
いくつかの実施形態では、配列番号３２若しくは５２のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２７のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0310】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号３３若しくは５３のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３３若しくは５３のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号９のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号４のヌクレオチド配列、又は配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0311】
いくつかの実施形態では、配列番号３３若しくは５３のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２７のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0312】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号３４若しくは５４のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３４若しくは５４のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号１０のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0313】
いくつかの実施形態では、配列番号３４若しくは５４のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２７のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0314】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号３５若しくは５５のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３５若しくは５５のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号１２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号２のヌクレオチド配列、又は配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0315】
いくつかの実施形態では、配列番号３５若しくは５５のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0316】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号３６若しくは５６のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３６若しくは５６のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号１３の塩基配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号３のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0317】
いくつかの実施形態では、配列番号３６若しくは５６のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0318】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号３７若しくは５７のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３７若しくは５７のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号１３の塩基配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号４のヌクレオチド配列、又は配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0319】
いくつかの実施形態では、配列番号３７若しくは５７のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0320】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号３８若しくは５８のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３８若しくは５８のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号１４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0321】
いくつかの実施形態では、配列番号３８若しくは５８のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0322】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号３９若しくは５９のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号３９若しくは５９のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号１４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、配列番号２３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、及び配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0323】
いくつかの実施形態では、配列番号３９若しくは５９のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0324】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号４０若しくは６０のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号４０若しくは６０のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号１４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２５のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ配列、配列番号２４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0325】
いくつかの実施形態では、配列番号４０若しくは６０のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0326】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、配列番号４１若しくは６１のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一の（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、配列番号４１若しくは６１のヌクレオチド配列又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列を含むウイルスゲノムは、５’から３’の順に、配列番号１７のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む５’ＩＴＲ配列領域、配列番号１９のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡｐｏ Ｅ／Ｃ－Ｉエンハンサ、配列番号２０のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＡ１ＡＴプロモーター、配列番号２１のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むイントロン、配列番号２２のヌクレオチド配列又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＫｏｚａｋ配列、配列番号１４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８５％（例えば、少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８、又は９９％）同一のヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列、配列番号２６のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥ切断配列、Ｗ３ＳＬ、配列番号２４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含むポリアデニル化配列、配列番号１８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む３’ＩＴＲ配列領域を含む。
【0327】
いくつかの実施形態では、配列番号４１若しくは６１のヌクレオチド配列、又はそれと実質的に同一のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むウイルスゲノムは、配列番号２８のアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有する）を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0328】
実施形態では、ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載のウイルスゲノムのいずれかの、例えば、表２に記載のヌクレオチド配列、又は前述の配列のいずれかと実質的に同一の（例えば、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を含むＡＡＶウイルスゲノムを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質、例えば、構造タンパク質を更に含む。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、ＶＰ１ポリペプチド、ＶＰ２ポリペプチド及び／又はＶＰ３ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＰ１ポリペプチド、ＶＰ２ポリペプチド及び／又はＶＰ３ポリペプチドは、少なくとも１つのＣａｐ遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質はｓＬ６５カプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、Ｒｅｐタンパク質、例えば、非構造タンパク質を更に含む。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８タンパク質、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２タンパク質、及び／又はＲｅｐ４０タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ７８タンパク質、Ｒｅｐ６８タンパク質、Ｒｅｐ５２タンパク質、及び／又はＲｅｐ４０タンパク質は、少なくとも１つのＲｅｐ遺伝子によってコードされる。
【0329】
本開示は、いくつかの実施形態では、上記で同定されたウイルスゲノムのいずれかを含むベクター、細胞及び／又はＡＡＶ粒子を提供する。
【0330】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは一本鎖ベクター（ｓｓＡＡＶ）である。
【0331】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）である。例えば、米国特許第７，４６５，５８３号を参照されたい。ｓｃＡＡＶベクターは、互いにアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成する両方のＤＮＡ鎖を含有する。第２鎖合成をスキップすることによって、ｓｃＡＡＶは細胞における迅速な発現を可能にする。
【0332】
ＡＡＶベクターを作製及び／又は改変するための方法は、当該技術分野において開示されており、例えば、シュードタイプ化ＡＡＶベクター（国際公開第２０００２８００４号）；ＷＯ２００１２３００１、ＷＯ２００４１１２７２７、国際公開第２００５００５６１０号及び国際公開第２００５０７２３６４号、これらの各々の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0333】
ウイルスカプシド及びウイルスゲノムをコードする核酸
本開示はまた、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸及びＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む組成物を提供し、例えば、２つの核酸は異なるベクター上に位置し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質をコードする第１の核酸を含み、カプシドタンパク質は、配列番号４５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む第１の核酸と、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む第２の核酸とを含む。
本開示はまた、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸及びＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む組成物を提供し、例えば、２つの核酸は異なるベクター上に位置し得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質をコードする第１の核酸を含み、カプシドタンパク質は、配列番号４５のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む第１の核酸と、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む第２の核酸とを含む。
【0334】
いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質をコードする第１の核酸は、配列番号４６のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも８５％同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたＧＡＬタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【0335】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0336】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子はコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む第２の核酸は、配列番号３～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0337】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、シグナル配列を更にコードする。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、ヒトＧＡＬシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号６と比較して、少なくとも１、２、又は３個であるが４個以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0338】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、ＩｇＧ１シグナルペプチド（例えば、マウス及び／又はヒトペプチド）を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１１と比較して少なくとも１、２、若しくは３個であるが４個以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0339】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号６に対して少なくとも１、２、若しくは３つであるが４つ以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含むシグナル配列；及び配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0340】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0341】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号７のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0342】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号８のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0343】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号９のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0344】
一つの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１０のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0345】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の配列同一性を有するか、又は配列番号１１に対して少なくとも１、２、若しくは３つであるが４つ以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含むシグナル配列；及び配列番号１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＡＬタンパク質をコードする。
【0346】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号２～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0347】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号２のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0348】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0349】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１３のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0350】
一実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、５’から３’の順に、配列番号１４のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むシグナル配列をコードするヌクレオチド配列；及び配列番号５のヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むＧＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0351】
いくつかの実施形態では、第１の核酸及び／又は第２の核酸は、以下：逆位末端配列（ＩＴＲ）領域、プロモーター、エンハンサ、イントロン領域、Ｋｏｚａｋ配列、ＷＰＲＥ配列、ポリＡシグナル領域、又はそれらの組合せの１つ以上を更に含み得る。
【0352】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子を含む第２の核酸は、少なくとも１つのＩＴＲ配列を更に含む。ＩＴＲ配列は、導入遺伝子に対して５’又は３’のいずれかの放出性に位置する。いくつかの実施形態では、導入遺伝子を含む第２の核酸は、２つのＩＴＲを含む。これらの２つのＩＴＲは、５’末端及び３’末端において導入遺伝子に隣接している。
【0353】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子を含む第２の核酸は、プロモーター配列及び／又はエンハンサを更に含む。いくつかの実施形態では、プロモーターは、１つ以上の、例えば、複数の細胞及び／又は組織における発現をもたらす遍在性プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、特定の細胞型に発現を制限するプロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーター及び／又はエンハンサは、本明細書に記載されるように、導入遺伝子の５’に配置される。いくつかの実施形態では、プロモーター及び／又はエンハンサは、本明細書に記載されるように導入遺伝子の５’に配置され、少なくとも１つのＩＴＲ配列はプロモーター及び／又はエンハンサの５’に配置される。
【0354】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子を含む第２の核酸は、少なくとも１つのイントロン又はその断片若しくは誘導体を更に含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのイントロンは、導入遺伝子の発現を増強し得る。いくつかの実施形態では、イントロンは、ベータグロビンイントロン又はその断片若しくはバリアントを含む。
【0355】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子を含む第２の核酸は、Ｋｏｚａｋ配列及び／又はＷＰＲＥ配列を更に含む。いくつかの実施形態では、Ｋｏｚａｋ配列は、本明細書に記載されるように、導入遺伝子に対して５’に配置される。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥ配列は、本明細書に記載されるように、導入遺伝子に対して３’に配置される。
【0356】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子を含む第２の核酸は、少なくとも１つのポリアデニル化（ポリＡ）配列を更に含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、本明細書に記載されるように、導入遺伝子に対して３’に配置される。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、本明細書中に記載されるように、導入遺伝子に対して３’に位置し、少なくとも１つのＩＴＲ配列は、ポリＡ配列に対して３’に位置する。
【0357】
いくつかの実施形態では、第２の核酸は、５’から３’に、ＩＴＲ配列、エンハンサ、プロモーター配列、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、本明細書に記載の任意の導入遺伝子、ポリＡ配列、及び第２のＩＴＲ配列を含む。
【0358】
いくつかの実施形態では、第２の核酸は、５’から３’に、ＩＴＲ配列、エンハンサ、プロモーター配列、イントロン、Ｋｏｚａｋ配列、本明細書に記載の任意の導入遺伝子、ＷＰＲＥ配列、ポリＡ配列、及び第２のＩＴＲ配列を含む。
【0359】
いくつかの実施形態では、第１の核酸及び第２の核酸は、単一のベクターに一緒に含まれ、ベクターは組成物に含まれる。いくつかの実施形態では、第１の核酸及び第２の核酸は異なるベクターに含まれ、両方のベクターは組成物に含まれる。
【0360】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の単離されたｒＡＡＶ粒子を含む１つ以上の細胞（例えば、複数のセル）を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の核酸組成物を含む１つ以上の細胞（例えば、複数のセル）を提供する。
【0361】
本開示は更に、α－グルコシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸、例えば、単離された核酸を提供し、ここで、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号３～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む。本開示はまた、α－グルコシダーゼ（ＧＡＬ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸（例えば、単離された核酸）を含む組成物を提供し、ここで、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、配列番号３～５のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む。
【0362】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子は、シグナル配列を更にコードする。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、ヒトＧＡＬシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号６と比較して、少なくとも１、２、又は３個であるが４個以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号７～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0363】
いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、ヒトＩｇＧ１シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１１と比較して、少なくとも１、２、又は３個であるが４個以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0364】
本開示はまた、シグナル配列をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、ヒトＧＡＬシグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、コードされるシグナル配列は、配列番号６のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列、又は配列番号６と比較して少なくとも１、２、若しくは３であるが４以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号８～１０のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0365】
本開示はまた、シグナル配列をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、ヒトＩｇＧ１シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１１のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１１と比較して、少なくとも１、２、又は３個であるが４個以下の修飾、例えば、置換を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされたシグナル配列は、配列番号１２～１４のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる。
【0366】
本開示は更に、いくつかの実施形態では、配列番号３１～４１及び５１～６１のいずれか１つの核酸配列を含むか又はこれからなる、単離された、例えば、組換えウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号３１の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号３２の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号３３の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号３４の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号３５の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号３６の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号３７の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号３８の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号３９の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号４０の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号４１の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号５１の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号５２の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号５３の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号５４の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号５５の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号５６の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号５７の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号５８の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号５９の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号６０の核酸配列を含むか又はこれからなる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶウイルスゲノム）は、配列番号６１の核酸配列を含むか又はこれからなる。本開示は更に、前述のウイルスゲノムのいずれかを含む組成物を提供する。本開示は更に、前述のウイルスゲノムのいずれかを含む細胞、例えば、細菌、哺乳動物又は昆虫細胞を提供する。
【0367】
ＩＩＩ．ウイルス産生
一般的ウイルス産生プロセス
ＡＡＶ、例えば、ｒＡＡＶを産生するための細胞は、いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３細胞等）及び／又は昆虫細胞（Ｓｆ９細胞等）を含み得る。
一般的ウイルス産生プロセス
ＡＡＶ、例えば、ｒＡＡＶを産生するための細胞は、いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３細胞等）及び／又は昆虫細胞（Ｓｆ９細胞等）を含み得る。
【0368】
様々な実施形態では、ＡＡＶ産生は、標的細胞と接触してペイロード、例えば、ペイロード分子をコードするヌクレオチドを含む組換えウイルス構築物を送達することができるＡＡＶ粒子及びベクターを産生するプロセス及び方法を含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター等のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子等のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子である。
【0369】
いくつかの実施形態では、本開示のウイルスゲノムを含むベクターが本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、本開示のウイルスゲノムを含む細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）、又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）である。
【0370】
いくつかの実施形態では、本開示の組換えＡＡＶ粒子を作製する方法であって、（ｉ）本明細書に記載のウイルスゲノム、例えば、ＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む宿主細胞を提供すること、及びウイルスゲノムをカプシドタンパク質、例えば、本明細書に記載のカプシドタンパク質（例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質又はその機能的バリアント）に封入するのに適した条件下で宿主細胞をインキュベートし、それにより組換えＡＡＶ粒子を作製することを含む方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本方法は、工程（ｉ）の前に、ウイルスゲノムを含む第１の核酸を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、カプシドタンパク質をコードする第２の核酸を含む。いくつかの実施形態では、第２の核酸は、第１の核酸分子の前、第１の核酸分子と同時に、又は第１の核酸分子の後に宿主細胞に導入される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）である。
【0371】
様々な実施形態では、（ａ）ウイルス産生細胞を、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質をコードする１つ以上のウイルス発現構築物、及びペイロード分子をコードする１つ以上のペイロード構築物と接触させることであって、ペイロード構築物は、導入遺伝子、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び調節核酸から選択することができる、ことと、（ｂ）少なくとも１つのＡＡＶ粒子又はベクターが産生されるような条件下でウイルス産生細胞を培養することと、（ｃ）産生流からＡＡＶ粒子又はベクターを単離することと、よってＡＡＶ粒子又はベクターを産生する方法が本明細書で提供される。
【0372】
これらの方法では、ウイルス発現構築物は、少なくとも１つの構造タンパク質及び／又は少なくとも１つの非構造タンパク質をコードし得る。構造タンパク質は、天然又は野生型カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３のいずれか、又はそれらのキメラタンパク質を含み得る。いくつかの実施形態では、ＶＰ１カプシドタンパク質は、ｓＬ６５ ＶＰ１カプシドタンパク質であり得る。非構造タンパク質は、天然又は野生型のＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及び／又はＲｅｐ４０タンパク質のいずれか又はそのキメラタンパク質を含み得る。
【0373】
特定の実施形態では、接触は、一過性トランスフェクション、ウイルス形質導入、及び／又はエレクトロポレーションを介して行われる。
【0374】
特定の実施形態では、ウイルス産生細胞は、哺乳動物細胞及び昆虫細胞から選択される。特定の実施形態では、昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）昆虫細胞を含む。特定の実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｆ９昆虫細胞を含む。特定の実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｆ２１昆虫細胞を含む。
【0375】
本開示のペイロード構築物ベクターは、様々な実施形態では、少なくとも１つの逆位末端配列（ＩＴＲ）を含み得、哺乳動物ＤＮＡを含み得る。
【0376】
本明細書に記載の方法に従って産生されたＡＡＶ粒子及びウイルスベクターも提供される。
【0377】
様々な実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、１つ以上の許容される賦形剤を含む医薬組成物として製剤化されてもよい。
【0378】
特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子又はウイルスベクターは、本明細書に記載の方法によって産生され得る。
【0379】
特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（例えば、昆虫細胞又は哺乳動物細胞）を、少なくとも１つのカプシドタンパク質及び少なくとも１つのペイロード構築物ベクターをコードする少なくとも１つのウイルス発現構築物と接触させることによって産生され得る。ウイルス産生細胞は、一過性トランスフェクション、ウイルス形質導入、及び／又はエレクトロポレーションによって接触させることができる。ペイロード構築物ベクターは、限定されないが、導入遺伝子、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び調節核酸等のペイロード分子をコードするペイロード構築物を含み得る。ウイルス産生細胞は、少なくとも１つのＡＡＶ粒子又はベクターが産生、単離（例えば、温度誘導溶解、機械的溶解及び／又は化学的溶解を使用する）及び／又は精製（例えば、濾過、クロマトグラフィー、及び／又は免疫親和性精製を使用すること）されるような条件下で培養することができる。非限定的な例として、ペイロード構築物ベクターは哺乳動物ＤＮＡを含み得る。
【0380】
特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載の方法を使用して昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９）細胞）中で産生される。非限定的な例として、バキュロウイルス形質導入を含み得るウイルス形質導入を使用して、昆虫細胞を接触させる。
【0381】
特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、本明細書に記載の方法を使用して哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）で産生される。非限定的な例として、マルチプラスミド一過性トランスフェクション（三重プラスミド一過性トランスフェクション等）を含み得るウイルス形質導入を使用して哺乳動物細胞を接触させる。
【0382】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ粒子産生方法は、ウイルス産生細胞において１０１超、１０２超、１０３超、１０４超、又は１０５超のＡＡＶ粒子を産生する。
【0383】
特定の実施形態では、本開示のプロセスは、少なくとも１つのウイルス発現構築物及び少なくとも１つのペイロード構築物を含むウイルス産生系を使用する、ウイルス産生細胞におけるウイルス粒子の産生を含む。少なくとも１つのウイルス発現構築物及び少なくとも１つのペイロード構築物は、ウイルス産生細胞に同時トランスフェクト（例えば、二重トランスフェクション、三重トランスフェクション）することができる。トランスフェクションは、当業者に公知であり、日常的に実施される標準的な分子生物学技術を用いて完了される。ウイルス産生細胞は、ペイロード構築物を複製するＲｅｐタンパク質及び複製されたペイロード構築物を封入するカプシドを形成するように集合するＣａｐタンパク質を含む、ＡＡＶ粒子を産生するために必要なタンパク質及び他の生体材料の発現に必要な細胞機構を提供する。得られたＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞から抽出され、投与のための薬学的調製物に加工される。
【0384】
様々な実施形態では、一旦投与されると、本明細書に開示されるＡＡＶ粒子は、理論に束縛されるものではないが、標的細胞と接触し、例えばエンドソーム内の細胞に侵入し得る。ＡＡＶ粒子例えばは、エンドソームから放出され、続いて標的細胞の核と接触してペイロード構築物を送達し得る。ペイロード構築物、例えば組換えウイルス構築物は、ペイロード構築物によってコードされるペイロード分子が発現され得る標的細胞の核に送達され得る。
【0385】
特定の実施形態では、ウイルス粒子の産生のためのプロセスは、１つ以上のバキュロウイルス（例えば、ウイルス発現構築物及びペイロード構築物ベクターでトランスフェクトされたバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）又はバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ））を含むウイルス産生細胞の種培養物を利用する。特定の実施形態では、種培養物を採取し、一定分量に分割し、凍結し、後の時点で使用して、産生細胞のナイーブ集団の感染を開始することができる。
【0386】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の大規模生産はバイオリアクタを利用する。理論に束縛されるものではないが、バイオリアクタの使用は、質量、温度、混合条件（インペラＲＰＭ又は波動振動）、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度、ガススパージ速度及び体積、ガスオーバーレイ速度及び体積、ｐＨ、生細胞密度（ＶＣＤ）、細胞生存率、細胞直径、及び／又は光学密度（ＯＤ）等、ウイルス産生細胞の増殖及び活性を支援する変数の正確な測定及び／又は制御を可能にし得る。特定の実施形態では、バイオリアクタは、実験的に決定された時点で培養物全体が採取され、ＡＡＶ粒子が精製されるバッチ産生のために使用される。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、培養物の一部がＡＡＶ粒子の精製のために実験的に決定された時点で採取され、バイオリアクタ内の残りの培養物が追加の増殖培地成分でリフレッシュされる連続生産に使用される。
【0387】
様々な実施形態では、ＡＡＶウイルス粒子は、細胞溶解、清澄化、滅菌及び精製を含むプロセスでウイルス産生細胞から抽出することができる。細胞溶解は、ウイルス産生細胞の構造を破壊し、それによってＡＡＶ粒子を放出する任意のプロセスを含む。特定の実施形態では、細胞溶解は、熱衝撃、化学的又は機械的溶解方法を含み得る。清澄化は、溶解された細胞、培地成分及びＡＡＶ粒子の混合物の全体的な精製を含み得る。特定の実施形態では、清澄化には、遠心分離及び／又は濾過（深さ端部、接線流、及び／又は中空糸濾過が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。
【0388】
様々な実施形態では、ウイルス産生の最終結果は、２つの成分：（１）ペイロード構築物（例えば、組換えＡＡＶベクターゲノム構築物）及び（２）ウイルスカプシドを含むＡＡＶ粒子の精製された集合体である。
【0389】
特定の実施形態では、本開示のウイルス産生システム又はプロセスは、ウイルス産生細胞（ＶＰＣ）及びプラスミド構築物を使用してバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を産生する工程を含む。細胞バンク（ＣＢ）からのウイルス産生細胞（ＶＰＣｓ）を解凍及び増殖させて、目標作業体積及びＶＰＣ濃度を提供する。結果として得られるＶＰＣのプールは、Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＶＰＣプールとＰａｙｌｏａｄ ＶＰＣプールとに分割される。１つ以上のＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド構築物（ウイルス発現構築物）をＲｅｐ／Ｃａｐ Ｂａｃｍｉｄポリヌクレオチドにプロセシングし、Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＶＰＣプールにトランスフェクトする。１つ以上のＰａｙｌｏａｄプラスミド構築物（ペイロード構築物）をＰａｙｌｏａｄ Ｂａｃｍｉｄポリヌクレオチドにプロセシングし、Ｐａｙｌｏａｄ ＶＰＣプールにトランスフェクトする。２つのＶＰＣプールをインキュベートして、Ｐ１ Ｒｅｐ／Ｃａｐバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）及びＰ１ペイロードＢＥＶを産生する。２つのＢＥＶプールをプラークのコレクションに拡大し、単一のプラークをクローナルプラーク（ＣＰ）精製（単一プラーク拡大とも呼ばれる）のために選択する。このプロセスは、単一のＣＰ精製工程を含むことができ、又は連続して若しくは他の処理工程のいずれかによって分離された複数のＣＰ精製工程を含むことができる。１つ以上のＣＰ精製工程は、ＣＰ Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＥＶプール及びＣＰ Ｐａｙｌｏａｄ ＢＥＶプールを提供する。次いで、２つのＢＥＶプールを保存し、将来の製造工程に使用することができ、あるいはＲｅｐ／Ｃａｐ ＢＩＩＣプール及びＰａｙｌｏａｄ ＢＩＩＣプールを製造するためにそれらをＶＰＣにトランスフェクトすることができる。
【0390】
特定の実施形態では、本開示のウイルス産生システム又はプロセスは、ウイルス産生細胞（ＶＰＣ）及びバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を使用してＡＡＶ粒子を産生する工程を含む。細胞バンク（ＣＢ）からのウイルス産生細胞（ＶＰＣｓ）を解凍及び増殖させて、目標作業体積及びＶＰＣ濃度を提供する。ウイルス産生細胞の作業体積は、産生バイオリアクタに播種され、ＢＩＩＣ感染の目標ＶＰＣ濃度で２００～２０００ Ｌの作業体積まで更に拡大することができる。次いで、産生バイオリアクタ内のＶＰＣの作業量は、Ｒｅｐ／Ｃａｐ ＢＩＩＣ及びＰａｙｌｏａｄ ＢＩＩＣと、標的ＶＰＣ：ＢＩＩＣ比及び標的ＢＩＩＣ：ＢＩＩＣ比で共インフェクションされる。ＶＣＤ感染もＢＥＶを利用することができる。同時感染されたＶＰＣは、ＡＡＶ粒子及びＶＰＣのバルク収集物を産生するために、産生バイオリアクタ中でインキュベート及び増殖される。
【0391】
ウイルス発現構築物
様々な実施形態では、本開示のウイルス産生系は、ウイルス産生細胞にトランスフェクト／形質導入することができる１つ以上のウイルス発現構築物を含む。特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物又はペイロード構築物は、バキュロウイルスプラスミド又は組換えバキュロウイルスゲノムとしても知られるバクミドであり得る。特定の実施形態では、ウイルス発現は、ウイルス産生細胞における発現のためのタンパク質コードヌクレオチド配列及び少なくとも１つの発現制御配列を含む。特定の実施形態では、ウイルス発現は、ウイルス産生細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたタンパク質コードヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ウイルス発現構築物は、１つ以上のプロモーターの制御下にあるパルボウイルス遺伝子を含む。パルボウイルス遺伝子は、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ６８、又はＲｅｐ７８タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子等の非構造ＡＡＶ複製タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。パルボウイルス遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質をコードするＣａｐ遺伝子等の構造的ＡＡＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＶＰ１タンパク質は、ｓＬ６５ ＶＰ１タンパク質である。
様々な実施形態では、本開示のウイルス産生系は、ウイルス産生細胞にトランスフェクト／形質導入することができる１つ以上のウイルス発現構築物を含む。特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物又はペイロード構築物は、バキュロウイルスプラスミド又は組換えバキュロウイルスゲノムとしても知られるバクミドであり得る。特定の実施形態では、ウイルス発現は、ウイルス産生細胞における発現のためのタンパク質コードヌクレオチド配列及び少なくとも１つの発現制御配列を含む。特定の実施形態では、ウイルス発現は、ウイルス産生細胞における発現のための少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結されたタンパク質コードヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ウイルス発現構築物は、１つ以上のプロモーターの制御下にあるパルボウイルス遺伝子を含む。パルボウイルス遺伝子は、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ６８、又はＲｅｐ７８タンパク質をコードするＲｅｐ遺伝子等の非構造ＡＡＶ複製タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。パルボウイルス遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質をコードするＣａｐ遺伝子等の構造的ＡＡＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＶＰ１タンパク質は、ｓＬ６５ ＶＰ１タンパク質である。
【0392】
本開示のウイルス発現構築物は、核酸による細胞の形質転換、トランスフェクション、又は形質導入を容易にする、生物学的又は化学的な任意の化合物又は製剤を含み得る。例示的な生物学的ウイルス発現構築物には、プラスミド、線状核酸分子、及びバキュロウイルスを含む組換えウイルスが含まれる。例示的な化学ベクターには、脂質複合体が含まれる。ウイルス発現構築物は、本開示に従ってウイルス複製細胞に核酸配列を組み込むために使用される。（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｄａｖｉｄ Ｒ．，Ｌｏｉｓ Ｋ．Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄ Ｖｅｒｎｅ Ａ．Ｌｕｃｋｏｗ．Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４．）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．分子クローニング。ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；ａｎｄ，Ｐｈｉｌｉｐｏｒｔ ａｎｄ Ｓｃｌｕｂｅｒ，ｅｄｓ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）を参照されたく、これらの各々の内容は、ウイルス発現構築物及びその使用に関連して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0393】
特定の実施形態では、ウイルス発現構築物は、非構造ＡＡＶ複製タンパク質、構造ＡＡＶカプシドタンパク質、又はそれらの組合せをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含むＡＡＶ発現構築物である。
【0394】
特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物はプラスミドベクターであり得る。特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物は、バキュロウイルス構築物であり得る。
【0395】
本開示は、ＡＡＶ粒子又はウイルスベクターを産生するために使用されるウイルス発現構築物の数によって限定されない。特定の実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又はそれ以上のウイルス発現構築物を使用して、本開示によるウイルス産生細胞においてＡＡＶ粒子を産生することができる。本開示の特定の実施形態では、ウイルス発現構築物は、昆虫細胞におけるＡＡＶ粒子の産生のために使用され得る。特定の実施形態では、例えば、感染性又は特異性の増加等のウイルス粒子の属性を改善するため、又は産生収率を高めるために、カプシド及び／又はｒｅｐ遺伝子の野生型ＡＡＶ配列に改変を行うことができる。
【0396】
特定の実施形態では、ウイルス発現構築物は、開始コドン領域を含むヌクレオチド配列、例えば、１つ以上の開始コドン領域を含むＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列を含み得る。特定の実施形態では、開始コドン領域は、発現制御配列内にあり得る。開始コドンは、ＡＴＧ又は非ＡＴＧコドン（すなわち、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の開始コドンが非ＡＴＧである準最適な開始コドン）であり得る。
【0397】
特定の実施形態では、ＡＡＶ産生に使用されるウイルス発現構築物は、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の開始コドンが非ＡＴＧ、すなわち準最適な開始コドンであるＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み得、これにより、産生系におけるウイルスカプシドタンパク質の改変された比の発現が可能になり、宿主細胞の感染性が改善される。非限定的な例において、ウイルス構築物ベクターは、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含有し得、ＡＡＶ ＶＰ１カプシドタンパク質の翻訳のための開始コドンは、米国特許第８，１６３，５４３号に記載されるように、ＣＴＧ、ＴＴＧ又はＧＴＧであり、その内容は、ＡＡＶカプシドタンパク質及びその産生に関連してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0398】
特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物は、昆虫細胞における発現のためのパルボウイルスｒｅｐタンパク質をコードするプラスミドベクター又はバキュロウイルス構築物であり得る。特定の実施形態では、単一のコード配列が、Ｒｅｐ７８タンパク質及びＲｅｐ５２タンパク質のために使用され、ここで、Ｒｅｐ７８タンパク質の翻訳のための開始コドンは、ＡＣＧ、ＴＴＧ、ＣＴＧ及びＧＴＧからなる群から選択される、昆虫細胞における発現時に部分的なエキソンスキッピングをもたらす準最適な開始コドンであり、その内容は、例えば、高いベクター収量を促進し得るＲｅｐ５２と比較して、Ｒｅｐ７８のより少ない発現を促進するために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５１２，９８１号に記載される。
【0399】
特定の実施形態では、ＶＰコード領域が、特定のＡＡＶ血清型の１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質をコードする。ＶＰコード領域に対するＡＡＶ血清型は、同じであっても異なっていてもよい。特定の実施形態では、ＶＰコード領域は、コドン最適化され得る。特定の実施形態では、ＶＰコード領域又はヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞のためにコドン最適化され得る。特定の実施形態では、ＶＰコード領域又はヌクレオチド配列は、昆虫細胞のためにコドン最適化され得る。特定の実施形態では、ＶＰコード領域又はヌクレオチド配列は、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のためにコドン最適化され得る。特定の実施形態では、ＶＰコード領域又はヌクレオチド配列は、Ｓｆ９細胞株又はＳｆ２１細胞株に対してコドン最適化され得る。
【0400】
特定の実施形態では、１つ以上のＶＰカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、１００％未満の参照ヌクレオチド配列とのヌクレオチド相同性を有するようにコドン最適化することができる。特定の実施形態では、コドン最適化ＶＰヌクレオチド配列と参照ＶＰヌクレオチド配列との間のヌクレオチド相同性は、１００％未満、９９％未満、９８％未満、９７％未満、９６％未満、９５％未満、９４％未満、９３％未満、９２％未満、９１％未満、９０％未満、８９％未満、８８％未満、８７％未満、８６％未満、８５％未満、８４％未満、８３％未満、８２％未満、８１％未満、８０％未満、７８％未満、７６％未満、７４％未満、７２％未満、７０％未満、６８％未満、６６％未満、６４％未満、６２％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、及び４０％未満である。
【0401】
特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物又はペイロード構築物は、バキュロウイルスプラスミド又は組換えバキュロウイルスゲノムとしても知られるバクミドであり得る。特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物又はペイロード構築物（例えば、バクミド）は、当業者に公知であり実施される標準的な分子生物学技術によって、相同組換え（トランスポゾンドナー／アクセプター系）によってバクミドに組み込まれたポリヌクレオチドを含み得る。
【0402】
特定の実施形態では、バクミドに組み込まれたポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドインサート）は、タンパク質コードヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含み得る。特定の実施形態では、バクミドに組み込まれたポリヌクレオチドは、ｐ１０又はｐｏｌｈ等のプロモーターを含み、構造ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３又はそれらの組合せ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＶＰ１タンパク質は、ｓＬ６５ ＶＰ１カプシドタンパク質である。特定の実施形態では、バクミドに組み込まれたポリヌクレオチドは、ｐ１０又はｐｏｌｈ等のプロモーターを含み、非構造ＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ５２、又はそれらの組合せ）をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含み得る。
【0403】
本開示の方法は、特異的発現制御配列の使用によって限定されない。しかしながら、ＶＰ生成物の特定の化学量論が達成される場合（ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３についてそれぞれ１：１：１０に近い）、また、Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ４０のレベル（ｐ１９ Ｒｅｐとも呼ばれる）がＲｅｐ７８又はＲｅｐ６８のレベル（ｐ５ Ｒｅｐとも呼ばれる）よりも有意に高い場合、産生細胞（昆虫細胞等）におけるＡＡＶの改善された収率が得られ得る。特定の実施形態では、ｐ５／ｐ１９比は、０．６超未満、０．４未満、又は０．３未満であるが、常に少なくとも０．０３である。これらの比は、タンパク質のレベルで測定することができ、又は特異的ｍＲＮＡの相対レベルから関連付けることができる。
【0404】
特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、ウイルス産生細胞（哺乳動物細胞又は昆虫細胞等）で産生され、３つ全てのＶＰタンパク質は、（約）１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）；２：２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）；２：０：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）；１～２：０～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）；１～２：１～２：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）；２～３：０～３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）；２～３：２～３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）；３：３：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）；３～５：０～５：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）；又は３～５：３～５：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の化学的量論近接で発現される。
【0405】
特定の実施形態では、発現制御領域は、約又は正確に１：０：１０約又は正確に１：１：１０；約又は正確に２：１：１０；約又は正確に２：１：１０；約又は正確に２：２：１０；約又は正確に３：０：１０；約又は正確に３：１：１０；約又は正確に３：２：１０；約又は正確に３：３：１０；約又は正確に４：０：１０；約又は正確に４：１：１０；約又は正確に４：２：１０；約又は正確に４：３：１０；約又は正確に４：４：１０；約又は正確に５：５：１０；約又は正確に１～２：０～２：１０；約又は正確に１～２：１～２：１０；約又は正確に１～３：０～３：１０；約又は正確に１～３：１～３：１０；約又は正確に１～４：０～４：１０；約又は正確に１～４：１～４：１０；約又は正確に１～５：１～５：１０；約又は正確に２～３：０～３：１０；約又は正確に２～３：２～３：１０；約又は正確に２～４：２～４：１０；約又は正確に２～５：２～５：１０；約又は正確に３～４：３～４：１０；約又は正確に３～５：３～５：１０；及び約又は正確に４～５：４～５：１０からなる群から選択されるＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３比を産生するように操作される。
【0406】
本開示の特定の実施形態では、Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ７８は、バキュロウイルス由来多面体プロモーター（ｐｏｌｈ）から転写される。Ｒｅｐ５２又はＲｅｐ７８は、より弱いプロモーターから転写することもでき、例えば、Δｉｅ－１プロモーターであるｉｅ－１プロモーターの欠失変異体は、そのｉｅ－１プロモーターの転写活性の約２０％を有する。Δｉｅ－１プロモーターと実質的に相同なプロモーターを使用してもよい。プロモーターに関して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上の相同性は、実質的に相同なプロモーターであると考えられる。
【0407】
哺乳動物細胞
本明細書に開示される本開示のウイルス産生は、ペイロード分子をコードするヌクレオチドを含むペイロード構築物、例えば、組換えＡＡＶ粒子又はウイルス構築物を送達するために標的細胞と接触するＡＡＶ粒子又はウイルスベクターを産生するためのプロセス及び方法を記載する。ウイルス産生細胞は、原核（例えば、細菌）細胞を含む任意の生物、並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む真核細胞から選択され得る。
本明細書に開示される本開示のウイルス産生は、ペイロード分子をコードするヌクレオチドを含むペイロード構築物、例えば、組換えＡＡＶ粒子又はウイルス構築物を送達するために標的細胞と接触するＡＡＶ粒子又はウイルスベクターを産生するためのプロセス及び方法を記載する。ウイルス産生細胞は、原核（例えば、細菌）細胞を含む任意の生物、並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む真核細胞から選択され得る。
【0408】
特定の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞を含むウイルス産生細胞で産生され得る。ウイルス産生細胞は、哺乳動物由来の、Ａ５４９、ＷＥＨ１、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＢＭＴ１０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ（２９３Ｔ）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞、ＢＨＫ及び初代線維芽細胞、肝細胞、並びに筋芽細胞等の哺乳動物細胞を含み得る。ウイルス産生細胞には、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、及びハムスターを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物種、又は線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞、細胞株形質転換細胞等を含むがこれらに限定されない細胞型に由来する細胞が含まれ得る。
【0409】
組換えＡＡＶ粒子の産生のために一般的に使用されるＡＡＶウイルス産生細胞としては、米国特許第６，１５６，３０３号、同第５，３８７，４８４号、同第５，７４１，６８３号、同第５，６９１，１７６号、同第６，４２８，９８８号及び同第５，６８８，６７６号に記載されるような他の哺乳動物細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許出願第２００２／００８１７２１号、並びに国際特許公開第００／４７７５７号、同第００／２４９１６号、及び同第９６／１７９４７号（これらのそれぞれの内容は、本開示と矛盾しない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、ＡＡＶウイルス産生細胞は、複製欠損ヘルパーウイルス例えば、ＨＥＫ２９３細胞又は他のＥαトランス相補細胞から欠失した機能を提供するトランス相補パッケージング細胞株である。
【0410】
特定の実施形態では、パッケージング細胞株２９３－１０－３（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ－２３６１）は、米国特許第６２８１０１０号（その内容は、２９３－１０－３パッケージング細胞株及びその使用に関連して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＡＡＶ粒子を産生するために使用され得る。
【0411】
本開示の特定の実施形態では、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下でアデノウイルスＥ１ａ及びアデノウイルスＥ１ｂをコードするＥ１欠失アデノウイルスベクターをトランス相補するためのＨｅＬａ細胞株等の細胞株は、米国特許第６３６５３９４号に記載されているようにＡＡＶ粒子産生に使用することができ、その内容は、ＨｅＬａ細胞株及びその使用に記載されるように、ＡＡＶ粒子産生のために使用され得る。
【0412】
特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子は、マルチプラスミド一過性トランスフェクション法（例えば、トリプルプラスミド一過性トランスフェクション）を使用して哺乳動物細胞において産生される。特定の実施形態では、マルチプラスミド一過性トランスフェクション方法は、以下の３つの異なる構築物：（ｉ）ペイロード構築物、（ｉｉ）Ｒｅｐ／Ｃａｐ構築物（パルボウイルスＲｅｐ及びパルボウイルスＣａｐ）、及び（ｉｉｉ）ヘルパー構築物のトランスフェクションを含む。特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子産生の３つの構成要素の三重トランスフェクション法を利用して、形質導入効率、標的組織（向性）評価、及び安定性を含むアッセイのための小ロットのウイルスを産生することができる。特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子産生の３成分のトリプルトランスフェクション法を利用して、臨床用途又は商業用途のための大量の材料を産生することができる。
【0413】
製剤化されるＡＡＶ粒子は、トリプルトランスフェクション若しくはバキュロウイルス媒介ウイルス産生、又は当技術分野で公知の任意の他の方法によって産生され得る。当技術分野で公知の任意の適切な許容セル又はパッケージングセルを使用して、ベクターを作製することができる。特定の実施形態では、複製欠損ヘルパーウイルス、例えば、２９３細胞又は他のＥ１ａトランス相補性細胞から欠失された機能を提供するトランス相補性パッケージング細胞株が使用される。
【0414】
遺伝子カセットは、パルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ｃａｐ遺伝子及びｒｅｐ遺伝子の一部又は全部を含み得る。特定の実施形態では、キャップ及びｒｅｐ機能の一部又は全部は、カプシド及び／又はＲｅｐタンパク質をコードするパッケージングベクターを細胞に導入することによってトランスで提供される。特定の実施形態では、遺伝子カセットはカプシド又はＲｅｐタンパク質をコードしない。あるいは、ｃａｐ及び／又はｒｅｐ遺伝子を発現するように安定に形質転換されたパッケージング細胞株が使用される。
【0415】
組換えＡＡＶウイルス粒子は、特定の実施形態では、米国特許出願公開第２０１６／００３２２５４号に記載されている手順に従って培養上清から産生及び精製され、その内容は、組換えＡＡＶウイルス粒子の産生及び処理に関連してその全体が参照により組み込まれる。産生はまた、２９３Ｔ細胞を使用する方法、トリプルトランスフェクション又は任意の適切な産生方法を含む当技術分野で公知の方法を含み得る。
【0416】
特定の実施形態では、哺乳動物ウイルス産生細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）は、接着／接着状態（例えば、リン酸カルシウムを用いて）又は懸濁状態（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて）であり得る。哺乳動物ウイルス産生細胞に、ＡＡＶの産生に必要なプラスミド（すなわち、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ構築物、アデノウイルスヘルパー構築物、及び／又はＩＴＲ隣接ペイロード構築物）をトランスフェクトする。特定の実施形態では、トランスフェクションプロセスは、任意の培地交換（例えば、接着形態の細胞の培地交換、懸濁形態の細胞の培地交換なし、所望であれば懸濁形態の細胞の培地交換）を含み得る。特定の実施形態では、トランスフェクションプロセスは、ＤＭＥＭ又はＦ１７等のトランスフェクション媒体を含むことができる。特定の実施形態では、トランスフェクション培地は血清を含むことができ、又は無血清（例えば、リン酸カルシウム及び血清と接着状態にある細胞、ＰＥＩ及び血清なしの懸濁状態にある細胞）であり得る。
【0417】
その後、細胞を掻き取ること（接着形態）及び／又はペレット化すること（懸濁形態及び掻き取られた接着形態）によって回収し、レセプタクルに移すことができる。回収工程は、産生された細胞の完全な回収のために必要に応じて繰り返すことができる。次に、細胞溶解は、連続凍結融解サイクル（－８０Ｃ～３７Ｃ）、化学的溶解（洗剤トリトンの添加等）、機械的溶解によって、又は細胞培養物を約０％の生存率に達した後に分解させることによって達成することができる。細胞残屑を遠心分離及び／又は深層濾過によって除去する。試料を、ＤＮＡ ｑＰＣＲ又はｄｄＰＣＲによるＤＮａｓｅ耐性ゲノム滴定によってＡＡＶ粒子について定量する。
【0418】
ＡＡＶ粒子力価は、ゲノムコピー数（１ミリリットル当たりのゲノム粒子）に従って測定される。ゲノム粒子濃度は、以前に報告されたようなベクターＤＮＡのＤＮＡ ｑＰＣＲに基づく（Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１－１０３９；Ｖｅｌｄｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６：２７２－２７８を参照されたい。これらの文献の内容は、粒子濃度の測定に関連して参照によりその全体がそれぞれ組み込まれる）。
【0419】
昆虫細胞
本開示のウイルス産生は、ペイロード分子をコードするヌクレオチドを含むペイロード構築物、例えば組換えウイルス構築物を送達するために標的細胞と接触するＡＡＶ粒子又はウイルスベクターを産生するプロセス及び方法を含む。特定の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子又はウイルスベクターは、昆虫細胞を含むウイルス産生細胞で産生され得る。
本開示のウイルス産生は、ペイロード分子をコードするヌクレオチドを含むペイロード構築物、例えば組換えウイルス構築物を送達するために標的細胞と接触するＡＡＶ粒子又はウイルスベクターを産生するプロセス及び方法を含む。特定の実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子又はウイルスベクターは、昆虫細胞を含むウイルス産生細胞で産生され得る。
【0420】
培養中の昆虫細胞の増殖条件、及び培養中の昆虫細胞における異種産物の産生は、当技術分野で周知である（米国特許第６，２０４，０５９号を参照されたく、その内容は、ウイルス産生における昆虫細胞の増殖及び使用に関するものとしてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【0421】
パルボウイルスの複製を可能にし、培養中に維持することができる任意の昆虫細胞を、本開示に従って使用することができる。組換えＡＡＶ粒子の産生に一般的に使用されるＡＡＶウイルス産生細胞としては、Ｓｆ９細胞株若しくはＳｆ２１細胞株を含むがこれらに限定されないスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞、ショウジョウバエ（Drosophila）細胞株、又はヒトスジシマカ（Aedes albopictus）由来細胞株等の蚊細胞株が挙げられるがこれらに限定されない。異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、ベクター例えば、昆虫細胞適合性ベクター等の核酸をそのような細胞に導入する方法、及びそのような細胞を培養物中で維持する方法と同様に、十分に文書化されている。例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２－８（１９８９）；Ｋａｊｉｇａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：４６４６－５０（１９９１）；Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２－３０（１９９２）；Ｋｉｍｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．２１９：３７－４４（１９９６）；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒ．２７２：３８２－９３（２０００）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第６，２０４，０５９号を参照されたく、これらのそれぞれの内容は、ウイルス産生における昆虫細胞の使用に関連するものとして、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0422】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は、国際公開第２０１５／１９１５０８号（その内容は、本開示と矛盾しない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている方法を使用して作製される。
【0423】
特定の実施形態では、バキュロウイルス系（例えば、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７（１９８８）に記載されているように）と組み合わせた昆虫宿主細胞系を使用してもよい。特定の実施形態では、キメラペプチドを調製するための発現系は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ、Ｔｎ ５Ｂ１－４昆虫細胞／バキュロウイルス系であり、これは、米国特許第６６６０５２１号に記載されているように、高レベルのタンパク質のために使用することができ、その内容は、ウイルス粒子の産生に関して、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0424】
昆虫細胞の増殖、培養、トランスフェクション、感染及び貯蔵は、Ｈｙｃｌｏｎｅ（商標）ＳＦＸ－Ｉｎｓｅｃｔ（商標）Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ＥＳＦ ＡＦ（商標）Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｕｍ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｆ－９００ＩＩ（商標）培地、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｆ－９００ＩＩＩ（商標）培地、又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｇｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉａを含む、当該分野で公知の任意の細胞培養培地、細胞トランスフェクション培地又は貯蔵培地中で行われ得る。本開示の昆虫細胞混合物は、塩、酸、塩基、緩衝剤、界面活性剤（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８／Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８等）、及び他の公知の培養培地要素を含む（がこれらに限定されない）、本開示に記載される製剤添加剤又は要素のいずれかを含むこともできる。製剤添加剤は、徐々に、又は「スパイク」（短時間で大量に組み込む）として組み込むことができる。
【0425】
バキュロウイルス産生系
特定の実施形態では、本開示のプロセスは、ウイルス発現構築物及びペイロード構築物ベクターを使用するバキュロウイルス系におけるＡＡＶ粒子又はウイルスベクターの産生を含むことができる。特定の実施形態では、バキュロウイルス系は、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）及び／又はバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を含む。特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物又はペイロード構築物は、バキュロウイルスプラスミド又は組換えバキュロウイルスゲノムとしても知られるバクミドであり得る。特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物又はペイロード構築物は、当業者に公知であり実施される標準的な分子生物学技術によって、相同組換え（トランスポゾンドナー／アクセプターシステム）によってバクミドに組み込まれるポリヌクレオチドであり得る。別個のウイルス複製細胞集団のトランスフェクションは、バキュロウイルス（ＢＥＶ）の２つ以上の群（例えば、２、３）、ウイルス発現構築物を含むことができる１つ以上の群（発現ＢＥＶ）、及びペイロード構築物を含むことができる１つ以上の群（ペイロードＢＥＶ）を産生する。バキュロウイルスは、ＡＡＶ粒子又はウイルスベクターの産生のためにウイルス産生細胞を感染させるために使用され得る。
特定の実施形態では、本開示のプロセスは、ウイルス発現構築物及びペイロード構築物ベクターを使用するバキュロウイルス系におけるＡＡＶ粒子又はウイルスベクターの産生を含むことができる。特定の実施形態では、バキュロウイルス系は、バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）及び／又はバキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を含む。特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物又はペイロード構築物は、バキュロウイルスプラスミド又は組換えバキュロウイルスゲノムとしても知られるバクミドであり得る。特定の実施形態では、本開示のウイルス発現構築物又はペイロード構築物は、当業者に公知であり実施される標準的な分子生物学技術によって、相同組換え（トランスポゾンドナー／アクセプターシステム）によってバクミドに組み込まれるポリヌクレオチドであり得る。別個のウイルス複製細胞集団のトランスフェクションは、バキュロウイルス（ＢＥＶ）の２つ以上の群（例えば、２、３）、ウイルス発現構築物を含むことができる１つ以上の群（発現ＢＥＶ）、及びペイロード構築物を含むことができる１つ以上の群（ペイロードＢＥＶ）を産生する。バキュロウイルスは、ＡＡＶ粒子又はウイルスベクターの産生のためにウイルス産生細胞を感染させるために使用され得る。
【0426】
特定の実施形態では、このプロセスは、ウイルス発現構築物及びペイロード構築物の両方を含む単一のバキュロウイルス（ＢＥＶ）群を産生するための単一のウイルス複製細胞集団のトランスフェクションを含む。これらのバキュロウイルスは、ＡＡＶ粒子又はウイルスベクターの産生のためにウイルス産生細胞に感染させるために使用され得る。
【0427】
特定の実施形態では、ＢＥＶは、Ｐｒｏｍｅｇａ ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ、ＷＦＩ水、又はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）ＩＩ試薬等のＢａｃｍｉｄトランスフェクション剤を使用して製造される。特定の実施形態では、ＢＥＶは、昆虫細胞等のウイルス産生細胞で産生及び増殖される。
【0428】
特定の実施形態では、本方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を含む１つ以上のＢＥＶを含むウイルス産生細胞の種培養物を利用する。種ＢＩＩＣは、ウイルス発現構築物を含む発現ＢＥＶ、及びペイロード構築物を含むペイロードＢＥＶでトランスフェクト／形質導入／感染されている。特定の実施形態では、種培養物を収穫し、一定分量に分割し、凍結し、その後、産生細胞のナイーブ集団のトランスフェクション／形質導入／感染を開始するために使用することができる。特定の実施形態では、種ＢＩＩＣのバンクは、－８０°Ｃ又はＬＮ２蒸気中で保存される。
【0429】
バキュロウイルスは、バキュロウイルスの機能及び複製に不可欠ないくつかの必須タンパク質、例えば、複製タンパク質、エンベロープタンパク質及びカプシドタンパク質から作製される。したがって、バキュロウイルスゲノムは、必須タンパク質をコードするいくつかの必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む。非限定的な例として、ゲノムは、バキュロウイルス構築物の必須タンパク質をコードする必須遺伝子ヌクレオチド配列を含む必須遺伝子領域を含み得る。必須タンパク質は、ＧＰ６４バキュロウイルスエンベロープタンパク質、ＶＰ３９バキュロウイルスカプシドタンパク質、又はバキュロウイルス構築物のための他の同様の必須タンパク質を含み得る。
【0430】
限定されないが、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９）細胞を含む昆虫細胞においてＡＡＶ粒子を産生するためのバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）は、高力価のウイルスベクター産物を提供する。ウイルス発現構築物及びペイロード構築物をコードする組換えバキュロウイルスは、ウイルスベクター複製細胞の増殖感染を開始させる。一次感染から放出された感染性バキュロウイルス粒子は、培養物中の更なる細胞に二次感染し、初期感染多重度の関数である感染サイクル数で細胞培養集団全体に指数関数的に感染する（ｓｅｅ Ｕｒａｂｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６ Ｆｅｂ；８０（４）：１８７４－８５を参照されたく、その内容は、ＢＥＶ及びウイルス粒子の産生及び使用に関連してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0431】
昆虫細胞系におけるバキュロウイルスを用いたＡＡＶ粒子の産生は、公知のバキュロウイルスの遺伝的及び物理的不安定性に対処し得る。
【0432】
特定の実施形態では、本開示の産生システムは、力価のない感染細胞の保存及びスケールアップシステムを利用することによって、複数回の継代にわたるバキュロウイルスの不安定性に対処する。ウイルス産生細胞の小規模の種培養物を、ＡＡＶ粒子の構造及び／又は非構造成分をコードするウイルス発現構築物でトランスフェクトする。バキュロウイルス感染ウイルス産生細胞を一定分量に採取し、液体窒素中で凍結保存することができ、一定分量は、大規模ウイルス産生細胞培養物の感染のための生存率及び感染力を保持する。Ｗａｓｉｌｋｏ ＤＪ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．２００９ Ｊｕｎ；６５（２）：１２２－３２、その内容は、ＢＥＶ及びウイルス粒子の産生及び使用に関連してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0433】
遺伝的に安定なバキュロウイルスを使用して、無脊椎動物細胞においてＡＡＶ粒子を産生するための成分の１つ以上の供給源を産生することができる。特定の実施形態では、欠陥バキュロウイルス発現ベクターは、昆虫細胞内でエピソーム的に維持され得る。そのような実施形態では、対応するバクミドベクターは、限定されないが、プロモーター、エンハンサ、及び／又は細胞周期調節複製エレメントを含む複製制御エレメントで操作される。
【0434】
特定の実施形態では、バキュロウイルス感染を許容する安定なウイルス産生細胞は、ＡＡＶゲノム全体、Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、別個の転写カセットとしての各Ｒｅｐタンパク質、別個の転写カセットとしての各ＶＰタンパク質、ＡＡＰ（アセンブリ活性化タンパク質）、又は天然若しくは非天然プロモーターを有するバキュロウイルスヘルパー遺伝子の少なくとも１つを含むがこれらに限定されない、ＡＡＶ複製及びベクター産生に必要な要素の少なくとも１つの安定な統合コピーで操作される。
【0435】
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中で産生され得る。
【0436】
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、トリプルトランスフェクションを使用して産生され得る。
【0437】
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞で産生され得る。
【0438】
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、哺乳動物細胞におけるトリプルトランスフェクションによって産生され得る。
【0439】
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、ＨＥＫ２９３細胞におけるトリプルトランスフェクションによって産生され得る。
【0440】
本明細書に記載されるように、肝臓指向性カプシドタンパク質例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質を含み、ＧＡＬタンパク質をコードするＡＡＶ粒子は、ヒトの病気の分野、獣医学的用途、並びに様々なインビボ及びインビトロ環境において有用であり得る。本開示のＡＡＶ粒子は、ＧＡＬ関連疾患及び／又は障害、例えばリソソーム蓄積症、例えばファブリー病の処置、予防、緩和又は改善のための医薬の分野において有用であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、ＧＡＬ関連障害、例えば、リソソーム蓄積症、例えば、ファブリー病の予防及び／又は処置のために使用される。
【0441】
ＩＶ．医薬組成物
本開示は更に、ヒト対象を含む哺乳動物対象におけるＧＡＬ－関連障害及びＧＡＬタンパク質の機能又は発現の欠損に関連する障害を治療する方法であって、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質を含むウイルス粒子、及びＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸、又はその医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
本開示は更に、ヒト対象を含む哺乳動物対象におけるＧＡＬ－関連障害及びＧＡＬタンパク質の機能又は発現の欠損に関連する障害を治療する方法であって、肝臓指向性カプシドタンパク質、例えば、ｓＬ６５カプシドタンパク質を含むウイルス粒子、及びＧＡＬタンパク質をコードする導入遺伝子を含む核酸、又はその医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。
【0442】
本明細書で使用される場合、「組成物」という用語は、ＡＡＶ粒子及び少なくとも１つの賦形剤を含む。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、ＡＡＶ粒子及び１つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。
【0443】
本明細書で提供される医薬組成物、例えば、送達されるＧＡＬタンパク質をコードするペイロードを含むＡＡＶの説明は、主にヒトへの投与に適した医薬組成物を対象としているが、そのような組成物は一般に、任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に適していることが当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に適したものにするためのヒトへの投与に適した医薬組成物の改変は十分に理解されており、当業者の獣医学薬理学者は、もしあれば単なる通常の実験でそのような改変を設計及び／又は実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象には、ヒト及び／又は他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラット等の商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物；及び／又は鳥、例えば、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ及び／又はシチメンチョウ等の商業的に関連する鳥が含まれるが、これらに限定されない。
【0444】
いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者又は対象に投与される。
【0445】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ粒子製剤は、少なくとも１つのペイロードをコードする核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、１、２、３、４、又は５個のペイロードをコードする核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、限定されないが、ヒトタンパク質、獣医学的タンパク質、細菌タンパク質、生物学的タンパク質、抗体、免疫原性タンパク質、治療用ペプチド及びタンパク質、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質タンパク質、細胞内膜骨格タンパク質、細胞結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連するタンパク質、及び／又は非ヒト疾患に関連するタンパク質等のカテゴリーから選択されるタンパク質をコードする核酸を含み得る。いくつかの実施形態では製剤は、タンパク質をコードする少なくとも３つのペイロード構築物を含有する。特定の実施形態は、ペイロードの少なくとも１つがＧＡＬタンパク質又はそのバリアントであることを規定する。
【0446】
本開示による医薬組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び／又は複数の単一単位用量として、調製、包装、及び／又は販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を指す。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の投薬量及び／又はこのような投薬量の都合のよい画分（例えば、このような投薬量の半分又は３分の１）に等しい。
【0447】
本開示の一態様では、本開示のＡＡＶ粒子は、薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物の形態であり得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、本開示の単離されたポリペプチドが安定なままであり、生物学的に利用可能である医薬品の投与に従来使用可能な任意の実質的に無毒性の担体を指す。薬学的に許容され得る担体は、それを処置される哺乳動物への投与に適したものにするのに十分に高い純度及び十分に低い毒性のものでなければならない。更に、活性薬剤の安定性及びバイオアベイラビリティを維持すべきである。薬学的に許容され得る担体は、液体又は固体であり得、所与の組成物の活性剤及び他の成分と組み合わせたときに所望の嵩、稠度等を提供するように、計画された投与様式を念頭に置いて選択される。適切な薬学的に許容される担体としては、生理学的に適合性である任意の及び全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体には、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末も含まれる。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。任意の従来の培地又は薬剤が遺伝子治療ベクターと適合しない場合を除いて、本開示の医薬組成物におけるその使用が企図される。補助活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【0448】
本開示の医薬組成物は、獣医学目的の動物（例えば、家畜（ウシ、ブタ、イヌ、マウス、ラット）及び他の非ヒト哺乳動物対象並びにヒト対象への送達のために製剤化され得る。
【0449】
一実施形態では、本開示の医薬組成物は、注射可能な組成物の形態である。組成物は、注射剤として、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製することができる。製剤は乳化されていてもよい。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、リン酸緩衝生理食塩水等、及びそれらの組合せである。更に、所望であれば、調製物は、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバント、界面活性剤又は免疫賦活剤等の少量の補助物質を含有してもよい。
【0450】
滅菌注射液は、必要に応じて、上に列挙した成分の１つ又は組合せを含む適切な溶媒中に必要量の本開示の組成物を組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒体及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法には、真空乾燥及び凍結乾燥が含まれ、これにより、有効成分及び任意の追加の所望の成分の粉末が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。
【0451】
本明細書に記載の核酸分子の毒性及び治療有効性は、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び／又は動物研究から得られたデータを、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を定式化する際に使用することができる。用量は、典型的には、毒性がほとんど又は全くないＥＤ５０を含む濃度の範囲内にある。投与量は、使用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本開示の方法で使用される任意の化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定することができる。
【0452】
Ｖ．製剤
本明細書に記載のＡＡＶ医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知の又は今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ若しくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、必要及び／又は望ましい場合、製品を所望の単回又は複数回投与単位に分割、成形及び／又は包装する工程を含む。
本明細書に記載のＡＡＶ医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知の又は今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び／又は１つ若しくは複数の他の補助成分と会合させ、次いで、必要及び／又は望ましい場合、製品を所望の単回又は複数回投与単位に分割、成形及び／又は包装する工程を含む。
【0453】
本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／又は任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の同一性、サイズ、及び／又は状態に応じて、更に組成物が投与される経路に応じて変化する。
【0454】
例えば、組成物は、０．１％～９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％～１００％、例えば０．５％～５０％、１～３０％、５～８０％、又は少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【0455】
本開示のＡＡＶ粒子は、（１）安定性を高めるために、（２）細胞トランスフェクション又は形質導入を増加させるために、（３）持続放出又は遅延放出を可能にするために、（４）体内分布を変化させる（例えば、ウイルス粒子を特定の組織又は細胞型に標的化する）ために、（５）コードされたタンパク質の翻訳をインビボで増加させるために、（６）コードされたタンパク質の放出プロファイルをインビボで変化させるために、及び／又は（７）ペイロードの調節可能な発現を可能にするために、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化することができる。
【0456】
本開示の製剤は、生理食塩水、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞（例えば、対象への移植のために）、ナノ粒子模倣物及びそれらの組合せを含み得るが、これらに限定されない。更に、本開示のウイルスベクターは、自己集合型核酸ナノ粒子を使用して製剤化され得る。
【0457】
いくつかの実施形態では、ＧＡＬタンパク質をコードするウイルスベクターは、バリシティ及び／又は重量オスモル濃度を最適化するように製剤化され得る。いくつかの実施形態では、製剤のバリシティ及び／又は重量オスモル濃度は、肝臓における最適な薬物分布を確実にするために最適化され得る。
【0458】
本開示の製剤は、それぞれが一緒になってＡＡＶ粒子の安定性を増加させ、ウイルス粒子による細胞トランスフェクション又は形質導入を増加させ、ウイルス粒子コードタンパク質の発現を増加させ、及び／又はＡＡＶ粒子コードタンパク質の放出プロファイルを変更する量の１つ以上の賦形剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％純粋であり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒト及び獣医学的使用のための使用が承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認され得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は医薬品グレードのものであり得る。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方及び／又は国際薬局方の基準を満たし得る。
【0459】
本明細書で使用される賦形剤には、所望の特定の剤形に適した、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、又は他の液体ビヒクル、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤又は乳化剤、防腐剤等が含まれるが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤及び組成物を調製するための技術は当技術分野で公知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６；その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。従来の賦形剤媒体の使用は、任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的効果を生じさせること、又はそうでなければ医薬組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用すること等によって、物質又はその誘導体と不適合であり得る限りを除いて、本開示の範囲内で企図され得る。
【0460】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ製剤は、不活性成分である少なくとも１つの賦形剤を含み得る。本明細書で使用される場合、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる医薬組成物の活性に寄与しない１つ以上の薬剤を指す。いくつかの実施形態では、本開示の製剤に使用され得る不活性成分の全部、なし、又は一部は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認され得る。
【0461】
本明細書に開示されるＡＡＶ粒子の製剤は、カチオン又はアニオンを含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、限定されないが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋、又はそれらの組合せ等の金属カチオンを含む。いくつかの実施形態では製剤は、金属カチオンと錯体を形成したポリマー又はポリヌクレオチドを含んでもよい（例えば、米国特許第６，２６５，３８９号及び同第６，５５５，５２５号を参照されたく、これらのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【0462】
ＶＩ．本開示の方法
本開示はまた、本開示の組成物の使用方法であって、一般に、本開示のＡＡＶ粒子又はＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
本開示はまた、本開示の組成物の使用方法であって、一般に、本開示のＡＡＶ粒子又はＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0463】
一態様では、本開示は、外因性ＧＡＬタンパク質を対象に送達する方法を提供する。この方法は一般に、有効量のＡＡＶウイルス粒子又は本開示のＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を投与し、それによって外因性ＧＡＬを対象に送達することを含む。
【0464】
本開示は更に、リソソーム蓄積症（例えば、ファブリー病）を有する又は有すると診断された対象を治療する方法を提供する。方法は、有効量のＡＡＶウイルス粒子又は本開示のＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を投与し、それにより対象のリソソーム蓄積症を治療することを含む。
【0465】
本開示はまた、ＧＡＬ関連疾患（例えば、ファブリー病）を有するか又は有すると診断された対象を治療する方法を提供する。方法は、有効量のＡＡＶウイルス粒子又は本開示のＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を投与し、それにより対象のＧＡＬ関連疾患を治療することを含む。
【0466】
本開示はまた、ファブリー病を有するか又は有すると診断された対象を治療する方法を提供する。方法は、有効量のＡＡＶウイルス粒子又は本開示のＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を投与し、それにより対象のファブリー病を治療することを含む。
【0467】
いくつかの実施形態では、本開示のＡＡＶ粒子は、ＧＡＬタンパク質又はそのバリアントを含む治療用産物である機能性ペイロードの送達を通して、それを必要とする対象における遺伝子産物のレベル又は機能を調節することができる。機能的ペイロードは、それを必要とする対象における遺伝子産物（例えば、タンパク質の非存在又は欠損）の異常なレベル及び／又は機能に起因する症状を軽減又は軽減し得る。
【0468】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子の送達は、対象のＧＡＬのレベルによって測定される場合、ＧＡＬ関連障害、例えばリソソーム蓄積症、例えばファブリー病の進行を停止又は遅延させることができる。ＧＡＬのレベルは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、血液中のＧＡＬのレベルを測定することによって測定することができる。ファブリー病の男性は、通常、酵素アッセイ試験によって診断することができる。古典的ファブリー病を有する男性は、本質的にＧＡＬ酵素を有しない（正常の１％未満）。非古典的ファブリー遺伝子変異を有する雄は、いくらかの酵素を有するが、依然として非常に低い。対照的に、雌はほぼ正常なレベルの酵素を有し得るので、酵素アッセイは診断に十分ではなく、したがってＤＮＡ配列分析を行わなければならない。
【0469】
特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子の送達は、例えば、特に手及び足のしびれ、刺痛、灼熱感又は他の異常な感覚（先端感覚異常）、疼痛発作／発作、発熱、身体の痛み又は不快感、激しい身体活動に対する不耐性、頻繁な及び／又は慢性疲労、高温及び低温不耐性、発汗の減少又は欠如、下肢、足首及び足の腫れ（浮腫）、角膜又は水晶体混濁（角膜及び時には眼のレンズの線条又は渦巻状の不透明な又は白いパターン（渦巻き状角膜及びファブリー病白内障）、小さな、時にはクラスター化した、わずかに隆起した赤色又は赤紫色の皮膚病変（被角血管腫）、胃腸の問題、例えば、頻繁な軽度から重度の下痢及び／又は便秘、鼓腸、胃痛又は腸痛及び痙攣、早期満腹、食物不耐性、及び体重増加困難、しばしば喘鳴によって証明される閉塞性又は収縮性肺疾患、慢性咳、息切れ又は努力呼吸（呼吸困難）、再発性気管支炎及び疲労（しばしば閉塞性肺疾患と診断される）、耳鳴り（耳鳴症）、並びに進行性又は突然の難聴、脱力感、意識もうろう感、めまい、めまい症（回転性めまい）及び神経学的損傷及び他の脳血管疾患の影響による頭痛、多くの他のファブリー病症状、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、脳卒中、腎機能障害及びしばしば糖尿病を伴わない腎不全、タンパク質尿及び微量アルブミン尿、腎臓透析及び移植、不整脈等の心臓合併症（心房細動を含む心拍数又は律動の異常）を引き起こす又は悪化させる末梢神経障害（末梢神経系の損傷）；左室肥大（ＬＶＨ）、並びに心臓弁の機能不全、心臓発作及び心不全を含むＧＡＬ関連障害（例えば、ファブリー病）の１つ以上の症状を改善し得る。これらの症状のいずれかの改善は、当技術分野で公知の標準的な方法及び技術に従って容易に評価することができる。ファブリー病の処置の有効性を決定するために、上に列挙していない他の症状もモニターすることができる。
【0470】
特定の実施形態では、処置を必要とする対象は、古典的なファブリー病型を有する対象である。他の実施形態では、治療を必要とする対象は、遅発性又は非定型ファブリー病型を有する対象である。特定の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ粒子又は本開示のＡＡＶ粒子を含む医薬組成物を投与することによって、必要とする前述の対象のいずれかにおいて、骨格筋、心筋及び／又は肝臓等におけるスフィンゴ糖脂質蓄積を減少させる方法を提供する。
【0471】
一般に、目的の細胞のウイルス感染のための方法は当技術分野で公知である。ウイルスは、目的の細胞と接触して配置され得るか、あるいは、ＧＡＬ関連障害、例えば、リソソーム蓄積症、例えば、ファブリー病に罹患している対象に注射され得る。
【0472】
本開示の組成物を治療目的で対象に導入する際の指針は、当技術分野で公知であり、米国特許第５，６３１，２３６号、第５，６８８，７７３号、第５，６９１，１７７号、第５，６７０，４８８号、第５，５２９，７７４号、第５，６０１，８１８号、及びＰＣＴ公開番号国際公開第９５／０６４８６号（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）において得ることができる。
【0473】
本開示のＡＡＶ粒子は、治療上有効な転帰をもたらす任意の経路によって投与され得る。これらには、経腸（腸内）、胃腸管、硬膜外（硬膜内に）、経口（口を介して）、経皮、硬膜外、脳内（大脳内）、脳室内（脳室に）、頭蓋内（頭蓋骨内）、皮膚皮内（皮膚への適用）、皮内（皮膚自体に）、皮下（皮膚下）、経鼻投与（鼻を介して）、静脈内（静脈に）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈内に）、筋肉内（筋肉に）、心臓内（心臓に）、骨内注入（骨髄に）、実質内（の物質に）、髄腔内（脊髄管内）、腹腔内（腹膜内への注入又は注射）、小胞内注入、硝子体内、（眼を介して）、空洞内（病変腔内）腔内（陰茎の基部内）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のための無傷の皮膚を介した拡散）、経粘膜（粘膜を介した拡散）、経膣、吹送（鼻吸引）、舌下、口唇下、浣腸、点眼剤（結膜上）、点耳、耳介（耳内又は耳経由）、頬側（頬に向けられる）、結膜、皮膚、歯科（１つ以上の歯に向けられる）、電気浸透、頸管内、内腔内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内、羊膜内、関節内、胆管内、気管内、嚢内、軟骨内（軟骨内に）、尾内（馬尾内）、大槽内（小脳延髄腔内）、角膜内（角膜内）、歯質内、冠動脈内（冠動脈内）、海綿体内（陰茎の海綿体の拡張可能な空間内）、椎間板内（椎間板に）、管内（腺管内）、十二指腸内（十二指腸に）、硬膜内（硬膜内又は硬膜下）、表皮内（表皮に）、食道内（食道に）、胃内（胃に）、歯肉内（歯肉に）、回腸内（小腸遠位部内）、病巣内（限局性病変内又はそれに直接導入）、管腔内（管腔管内）、リンパ管内（リンパ内）、髄内（骨の骨髄腔内）、髄膜内（髄膜に）、眼内（眼に）、卵巣内（卵巣に）、心膜内（心膜に）、胸膜内（胸膜に）、前立腺内（前立腺に）、肺内（肺又はその気管支内）、鼻腔内（鼻又は眼窩周囲洞内）、脊髄内（脊柱内）、滑膜内（関節の滑膜腔内）、腱内（腱に）、精巣内（精巣に）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルでの髄腔液内）、胸部内（胸郭内）、管状内（器官の細管内）、腫瘍内（腫瘍に）、鼓膜内（耳介内）、血管内（（１つ以上の）血管内）、脳室内（脳室に）、イオン導入（可溶性塩のイオンが身体の組織内に移動する電流による）、洗浄（開口創傷又は体腔を入浴又は洗浄するため）、喉頭（喉頭の直上）、経鼻胃部（鼻及び胃の中）、閉塞包帯法（局所経路投与であって、その後、その領域を閉塞する包帯によって覆われる局所経路投与）、眼（外眼）、中咽頭（口及び咽頭に直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所的又は全身的効果のために経口的又は経鼻的に吸入することによる気道内）、球後（橋の後ろ又は眼球の後ろ）、軟組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、軟膜下、局所的、経胎盤（胎盤を通る又は横切る）、経気管（気管の壁を通る）、経鼓室（鼓室を横切る又は通る）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、尾ブロック、診断、神経ブロック、胆汁灌流、心臓灌流、光フェレーシス又は脊髄が挙げられるがこれらに限定されない。
【0474】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子は全身送達によって送達され得る。いくつかの実施形態では、全身送達は血管内投与によるものであり得る。いくつかの実施形態では、全身送達は静脈内（ＩＶ）投与によるものであり得る。
【0475】
障害の処置及び／又は予防のための本開示の方法の適用は、障害を治癒させ、障害に関連する少なくとも１つの症状を長期若しくは短期のいずれかで、又は単に対象に対する一時的な有益な効果を減少させることができる。
【0476】
したがって、本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」及び「処置すること」という用語は、ＧＡＬ関連疾患、例えば、リソソーム蓄積症（例えば、ファブリー病）に罹患しているか、又はそのような状態若しくはそのような状態の少なくとも１つの症状を治癒、治癒、緩和、緩和、変更、矯正、改善若しくは影響する目的でそのような状態にかかりやすい対象への、本明細書に記載される組成物の適用又は投与を含む。本明細書で使用される場合、状態の再発が減少、減速、遅延又は予防される場合、状態はまた「治療される」。
【0477】
「予防的」又は「治療的」治療という用語は、対象組成物の１つ以上の対象への投与を指す。望ましくない状態（例えば、宿主動物の疾患又は他の望ましくない状態）の臨床症状発現前に投与される場合、治療は予防的であり、すなわち、宿主を望ましくない状態の発症から保護するが、望ましくない状態の症状発現後に投与される場合、治療は治療的である（すなわち、それは、そこからの既存の望ましくない状態又は副作用を減少、改善又は維持することを意図している）。
【0478】
本明細書で使用される「治療有効量」は、ＧＡＬ関連疾患、例えば、リソソーム蓄積症（例えば、ファブリー病）を治療するために患者に投与された場合、（例えば、既存の疾患又は疾患の１つ以上の症状を減少、改善又は維持することによって）疾患の治療を行うのに十分な本開示の組成物の量を含むことを意図する。「治療有効量」は、組成物、組成物がどのように投与されるか、疾患及びその重症度並びに病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的構成、疾患発現によって媒介される病理学的過程の病期、もしあれば先行する又は付随する治療の種類、及び治療される患者の他の個々の特徴に応じて異なり得る。
【0479】
本明細書で使用される「予防有効量」は、例えば、ＧＡＬ関連疾患、例えば、リソソーム蓄積症（例えば、ファブリー病）の症状をまだ経験していないか又は示していないが、疾患にかかりやすい可能性がある対象に投与された場合、疾患又は疾患の１つ若しくは複数の症状を予防又は改善するのに十分な組成物の量を含むことを意図している。疾患を改善することには、疾患の経過を遅らせること、又は後に発症する疾患の重症度を低下させることが含まれる。「予防有効量」は、組成物、組成物がどのように投与されるか、疾患のリスクの程度、並びに治療される患者の病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝的構成、先行する又は付随する治療の種類、存在する場合、及び他の個々の特徴に応じて異なり得る。
【0480】
「治療有効量」又は「予防有効量」はまた、任意の治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で何らかの所望の局所的又は全身的効果を生じる組成物の量を含む。本開示の方法で使用される組成物は、そのような治療に適用可能な合理的な利益／リスク比をもたらすのに十分な量で投与され得る。
【0481】
本明細書に記載される組成物は、所望の効果を達成するために必要に応じて投与され得、限定されないが、対象の状態の重症度、年齢及び病歴並びに組成物の性質、例えば、遺伝子の同一性又は影響を受けた生化学的経路を含む様々な因子に依存する。
【0482】
本開示の医薬組成物は、単回用量で投与されてもよく、又は本開示の特定の実施形態では、治療効果を達成するために複数回用量（例えば、２回、３回、４回又はそれ以上の投与）が使用されてもよい。複数回投与が使用される場合、本明細書に記載されるもの等の分割投与レジメンが使用され得る。本明細書で使用される場合、「分割用量」は、単一単位用量又は総１日用量を２つ以上の用量、例えば、単一単位用量の２回以上の投与に分割することである。本明細書で使用される場合、「単回単位用量」は、１回用量／１回／単一経路／単一接触点、すなわち単回投与事象で投与される任意の治療用組成物の用量である。いくつかの実施形態では、単一単位用量は、個別剤形（例えば、錠剤、カプセル、パッチ、充填シリンジ、バイアル等）として提供される。本明細書で使用される場合、「１日の総用量」は、２４時間以内に与えられる又は処方される量である。それは、単回単位用量として投与され得る。ウイルス粒子は、緩衝液のみで、又は本明細書に記載の製剤で製剤化され得る。
【0483】
治療的又は予防的レジメンは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４週間の期間をカバーし得るか、又は対象に慢性的に投与され得る。
【0484】
一般に、本開示の核酸分子及び／又はベクターは、所望の効果を誘発する、例えば、ＧＡＬ発現及び／又は活性を増加させるための治療有効量で提供される。投与されるウイルス粒子の量は、治療の数及び量の両方に応じて、対象の臨床状態、年齢、以前の治療、一般的な健康状態及び／又は年齢、存在する他の疾患、及び障害の重症度等の要因にも依存する。投与するのに必要な有効成分の正確な量は、遺伝子治療医の判断に依存し、個々の患者に固有である。更に、本開示の治療有効量の核酸分子及び／又はベクターによる対象の治療は、単一の治療を含むことができ、又は好ましくは、一連の治療を含むことができる。治療に使用される有効投与量は、特定の治療の経過にわたって増加又は減少し得ることも理解されよう。投与量の変化は、本明細書に記載の診断アッセイの結果から生じ得る。医薬組成物は、投与説明書と共に容器、パック、又はディスペンサーに含めることができる。
【0485】
いくつかの実施形態では、本開示のウイルス粒子（又は本開示の医薬組成物）の治療有効量又は予防有効量は、約１×１０５、約１．５×１０５、約２×１０５、約２．５×１０５、約３×１０５、約３．５×１０５、約４×１０５、約４．５×１０５、約５×１０５、約５．５×１０５、約６×１０５、約６．５×１０５、約７×１０５、約７．５×１０５、約８×１０５、約８．５×１０５、約９×１０５、約９．５×１０５、約１×１０６、約１．５×１０６、約２×１０６、約２．５×１０６、約３×１０６、約３．５×１０６、約４×１０６、約４．５×１０６、約５×１０６、約５．５×１０６、約６×１０６、約６．５×１０６、約７×１０６、約７．５×１０６、約８×１０６、約８．５×１０、約９×１０６、約９．５×１０６、約１×１０７、約１．５×１０７、約２×１０７、約２．５×１０７、約３×１０７、約３．５×１０７、約４×１０７、約４．５×１０７、約５×１０７、約５．５×１０７、約６×１０７、約６．５×１０７、約７×１０７、約７．５×１０７、約８×１０７、約８．５×１０７、約９×１０７、約９．５×１０７、約１×１０８、約１．５×１０８、約２×１０８、約２．５×１０８、約３×１０８、約３．５×１０８、約４×１０８、約４．５×１０８、約５×１０８、約５．５×１０８、約６×１０８、約６．５×１０８、約７×１０８、約７．５×１０８、約８×１０８、約８．５×１０８、約９×１０８、約９．５×１０８、約１×１０９、約１．５×１０９、約２×１０９、約２．５×１０９８、約３×１０９、約３．５×１０９、約４×１０９、約４．５×１０９、約５×１０９、約５．５×１０９、約６×１０９、約６．５×１０９、約７×１０９、約７．５×１０９、約８×１０９、約８．５×１０９、約９×１０９、約９．５×１０９、約１×１０１０、約１．５×１０１０、約２×１０１０、約２．５×１０１０、約３×１０１０、約３．５×１０１０、約４×１０１０、約４．５×１０１０、約５×１０１０、約５．５×１０１０、約６×１０１０、約６．５×１０１０、約７×１０１０、約７．５×１０１０、約８×１０１０、約８．５×１０１０、約９×１０１０、約９．５×１０１０、約１×１０１１、約１．５×１０１１、約２×１０１１、約２．５×１０１１、約３×１０１１、約３．５×１０１１、約４×１０１１、約４．５×１０１１、約５×１０１１、約５．５×１０１１、約６×１０１１、約６．５×１０１１、約７×１０１１、約７．５×１０１１、約８×１０１１、約８．５×１０１１、約９×１０１１、約９．５×１０１１、約１×１０１２、約１．５×１０１２、約２×１０１２、約２．５×１０１２、約３×１０１２、約３．５×１０１２、約４×１０１２、約４．５×１０１２、約５×１０１２、約５．５×１０１２、約６×１０１２、約６．５×１０１２、約７×１０１２、約７．５×１０１２、約８×１０１２、約８．５×１０１２、約９×１０１２、約９．５×１０１２、約１×１０１３、約１．５×１０１３、約２×１０３４、約２．５×１０１３、約３×１０１３、約３．５×１０１３、約４×１０１３、約４．５×１０１３、約５×１０１３、約５．５×１０１３、約６×１０１３、約６．５×１０１３、約７×１０１３、約７．５×１０１３、約８×１０１３、約８．５×１０１３、約９×１０１３、約９．５×１０１３、約１×１０１４、約１．５×１０１４、約２×１０１４、約２．５×１０１４、約３×１０１４、約３．５×１０１４、約４×１０１４、約４．５×１０１４、約５×１０１４、約５．５×１０１４、約６×１０１４、約６．５×１０１４、約７×１０１４、約７．５×１０１４、約８×１０１４、約８．５×１０１４、約９×１０１４、約９．５×１０１４、約１×１０１５ウイルス粒子（ｖｐ）の範囲の力価である。
【0486】
いくつかの実施形態では、本開示のウイルス粒子（又は本開示の医薬組成物）の治療有効量又は予防有効量は、約１×１０５、約１．５×１０５、約２×１０５、約２．５×１０５、約３×１０５、約３．５×１０５、約４×１０５、約４．５×１０５、約５×１０５、約５．５×１０５、約６×１０５、約６．５×１０５、約７×１０５、約７．５×１０５、約８×１０５、約８．５×１０５、約９×１０５、約９．５×１０５、約１×１０６、約１．５×１０６、約２×１０６、約２．５×１０６、約３×１０６、約３．５×１０６、約４×１０６、約４．５×１０６、約５×１０６、約５．５×１０６、約６×１０６、約６．５×１０６、約７×１０６、約７．５×１０６、約８×１０６、約８．５×１０、約９×１０６、約９．５×１０６、約１×１０７、約１．５×１０７、約２×１０７、約２．５×１０７、約３×１０７、約３．５×１０７、約４×１０７、約４．５×１０７、約５×１０７、約５．５×１０７、約６×１０７、約６．５×１０７、約７×１０７、約７．５×１０７、約８×１０７、約８．５×１０７、約９×１０７、約９．５×１０７、約１×１０８、約１．５×１０８、約２×１０８、約２．５×１０８、約３×１０８、約３．５×１０８、約４×１０８、約４．５×１０８、約５×１０８、約５．５×１０８、約６×１０８、約６．５×１０８、約７×１０８、約７．５×１０８、約８×１０８、約８．５×１０８、約９×１０８、約９．５×１０８、約１×１０９、約１．５×１０９、約２×１０９、約２．５×１０９８、約３×１０９、約３．５×１０９、約４×１０９、約４．５×１０９、約５×１０９、約５．５×１０９、約６×１０９、約６．５×１０９、約７×１０９、約７．５×１０９、約８×１０９、約８．５×１０９、約９×１０９、約９．５×１０９、約１×１０１０、約１．５×１０１０、約２×１０１０、約２．５×１０１０、約３×１０１０、約３．５×１０１０、約４×１０１０、約４．５×１０１０、約５×１０１０、約５．５×１０１０、約６×１０１０、約６．５×１０１０、約７×１０１０、約７．５×１０１０、約８×１０１０、約８．５×１０１０、約９×１０１０、約９．５×１０１０、約１×１０１１、約１．５×１０１１、約２×１０１１、約２．５×１０１１、約３×１０１１、約３．５×１０１１、約４×１０１１、約４．５×１０１１、約５×１０１１、約５．５×１０１１、約６×１０１１、約６．５×１０１１、約７×１０１１、約７．５×１０１１、約８×１０１１、約８．５×１０１１、約９×１０１１、約９．５×１０１１、約１×１０１２、約１．５×１０１２、約２×１０１２、約２．５×１０１２、約３×１０１２、約３．５×１０１２、約４×１０１２、約４．５×１０１２、約５×１０１２、約５．５×１０１２、約６×１０１２、約６．５×１０１２、約７×１０１２、約７．５×１０１２、約８×１０１２、約８．５×１０１２、約９×１０１２、約９．５×１０１２、約１×１０１３、約１．５×１０１３、約２×１０３４、約２．５×１０１３、約３×１０１３、約３．５×１０１３、約４×１０１３、約４．５×１０１３、約５×１０１３、約５．５×１０１３、約６×１０１３、約６．５×１０１３、約７×１０１３、約７．５×１０１３、約８×１０１３、約８．５×１０１３、約９×１０１３、約９．５×１０１３、約１×１０１４、約１．５×１０１４、約２×１０１４、約２．５×１０１４、約３×１０１４、約３．５×１０１４、約４×１０１４、約４．５×１０１４、約５×１０１４、約５．５×１０１４、約６×１０１４、約６．５×１０１４、約７×１０１４、約７．５×１０１４、約８×１０１４、約８．５×１０１４、約９×１０１４、約９．５×１０１４、約１×１０１５、約１．５×１０１５、約２×１０１５、約２．５×１０１５、約３×１０１５、約３．５×１０１５、約４×１０１５、約４．５×１０１５、約５×１０１５、約５．５×１０１５、約６×１０１５、約６．５×１０１５、約７×１０１５、約７．５×１０１５、約８×１０１５、約８．５×１０１５、約９×１０１５、約９．５×１０１５、又は約１×１０１６ｖｇの範囲の「ウイルスゲノム」（「ｖｇ」）とも呼ばれるゲノムコピー（「ＧＣ」）である。
【0487】
当技術分野で公知の任意の方法を使用して、本開示のウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定することができる。ＡＡＶ ＧＣ数滴定を行うための１つの方法は以下の通りである：精製ＡＡＶウイルス粒子試料を最初にＤＮａｓｅで処理して、カプセル化されていないＡＡＶゲノムＤＮＡ又は混入プラスミドＤＮＡを産生プロセスから除去する。次いで、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理して、カプシドからゲノムを放出させる。次いで、放出されたゲノムを、ウイルスゲノムの特異的領域を標的とするプライマー／プローブセットを使用してリアルタイムＰＣＲ又はｄｄＰＣＲによって定量する。
【0488】
本開示の特定の実施形態では、本開示の組成物は、追加の治療剤又は治療と組み合わせて投与される。組成物及び更なる治療薬は、同じ組成物中で組み合わせて投与することができ、又は更なる治療薬は、別個の組成物の一部として、又は本明細書に記載の別の方法によって投与することができる。
【0489】
治療薬は、米国食品医薬品局によって承認されてもよいし、臨床試験中又は前臨床研究段階であってもよい。治療剤は、当技術分野で公知の任意の治療様式を利用することができ、非限定的な例としては、遺伝子サイレンシング又は干渉（すなわち、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ）、遺伝子編集（すなわち、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、及び遺伝子、タンパク質又は酵素の置換が挙げられる。
【0490】
本開示の方法における使用に適した追加の治療剤又は処置の例としては、ＧＡＬ関連疾患、例えば、ファブリー病を処置することが公知の剤又は処置が挙げられる。一実施形態では、追加の治療剤又は治療は酵素補充療法である。それは、例えば、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｉｎｃ．）及びＲｅｐｌａｇａｌ（登録商標）（ＴＫＴ，Ｉｎｃ．）として市販されている製品を用いた組換えヒトＧＡＬの静脈内投与を含む。他の実施形態では、本開示の方法での使用に適した追加の治療薬又は治療は、経口シャペロン療法、例えば、Ｇａｌａｆｏｌｄ （登録商標）（又はミガラスタット）を含む。
【0491】
ＶＩＩ．キット
本開示はまた、本開示の方法を簡便に及び／又は効果的に実施するための様々なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の複数の処置を実施すること、及び／又は複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量及び／又は数の成分を含む。
本開示はまた、本開示の方法を簡便に及び／又は効果的に実施するための様々なキットを提供する。典型的には、キットは、使用者が対象の複数の処置を実施すること、及び／又は複数の実験を実施することを可能にするのに十分な量及び／又は数の成分を含む。
【0492】
本開示のベクター、構築物又はＧＡＬタンパク質のいずれも、キットに含まれ得る。いくつかの実施形態では、キットは、本開示の化合物及び／又は組成物を作製及び／又は合成するための試薬及び／又は説明書を更に含み得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、１つ以上の緩衝液を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示のキットは、タンパク質又は核酸アレイ又はライブラリを作製するための成分を含み得、したがって、例えば、固体支持体を含み得る。
【0493】
いくつかの実施形態では、キット構成要素は、水性媒体又は凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る。キットの容器手段は、一般に、成分が配置され、適切に等分され得る少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ又は他の容器手段を含む。２つ以上のキット構成要素がある場合（標識試薬及びラベルが一緒に包装され得る）、キットはまた、一般に、追加の構成要素が別々に配置され得る第２、第３又は他の追加の容器を含み得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、滅菌された薬学的に許容され得る緩衝液及び／又は他の希釈剤を収容するための第２の容器手段を含み得る。いくつかの実施形態では、成分の様々な組合せが１つ以上のバイアルに含まれてもよい。本開示のキットはまた、典型的には、本開示の化合物及び／又は組成物、例えば、タンパク質、核酸、及び商業的販売のために厳重に閉じ込められた任意の他の試薬容器を収容するための手段を含み得る。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出又はブロー成形プラスチック容器を含むことができる。
【0494】
いくつかの実施形態では、キット構成要素は、１つ及び／又は複数の液体溶液で提供される。いくつかの実施形態では、液体溶液は水溶液であり、滅菌水溶液が特に使用される。いくつかの実施形態では、キット構成要素は、乾燥粉末として提供され得る。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合、そのような粉末は、適切な体積の溶媒の添加によって再構成され得る。いくつかの実施形態では、溶媒が別の容器手段にも提供され得ることが想定される。いくつかの実施形態では、標識染料は乾燥粉末として提供される。いくつかの実施形態では、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００マイクログラム、又は少なくとも若しくは多くともそれらの量の乾燥色素が、本開示のキットにおいて提供されることが企図される。そのような実施形態では、次いで、色素をＤＭＳＯ等の任意の適切な溶媒に再懸濁してもよい。
【0495】
いくつかの実施形態では、キットは、キット成分を使用するための説明書、並びにキットに含まれない任意の他の試薬の使用を含み得る。命令は、実装され得る変形を含み得る。
【0496】
本開示は、以下の非限定的な例によって更に説明される。
【実施例】
【0497】
実施例１．ベクターの設計及び合成
ヒトＧＡＬタンパク質をコードする種々のＡＡＶウイルスゲノムを作製した。コードされたＧＡＬタンパク質は、ヒトＧＡＬタンパク質のアミノ酸３２～４２９（配列番号４７）に対応する配列番号１のアミノ酸配列を有し、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされた。ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列もコドン最適化した（配列番号３～５）。
ヒトＧＡＬタンパク質をコードする種々のＡＡＶウイルスゲノムを作製した。コードされたＧＡＬタンパク質は、ヒトＧＡＬタンパク質のアミノ酸３２～４２９（配列番号４７）に対応する配列番号１のアミノ酸配列を有し、配列番号２のヌクレオチド配列によりコードされた。ＧＡＬタンパク質をコードする核酸配列もコドン最適化した（配列番号３～５）。
【0498】
ＧＡＬタンパク質をコードするウイルスゲノムを、シグナルペプチドを更にコードするように設計した。いくつかのウイルスゲノムは、ヒトＧＡＬタンパク質のアミノ酸１～３１（配列番号４７）に対応する配列番号６のアミノ酸配列を有する天然のＧＡＬシグナルペプチドを含むように設計された。天然ＧＡＬシグナルペプチドは、配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされた。ＧＡＬシグナルペプチドをコードする核酸配列もコドン最適化された（配列番号８～１０）。
【0499】
あるいは、配列番号１１のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１シグナル配列をウイルスゲノムに組み込んだ。ヒトＩｇＧ１シグナルペプチドは、配列番号１２のヌクレオチド配列によってコードされた。ＩｇＧ１シグナルペプチドをコードする核酸配列もコドン最適化された（配列番号１３及び１４）。
【0500】
図１は、シグナルペプチドを有するＧＡＬタンパク質をコードする例示的な構築物の概略図を提供する。
【0501】
実施例２．インビトロ発現構築物の評価
種々のＡＡＶ－ＧＬＡ構築物の組合せを、α－ＧＡＬ成熟ペプチドのインビトロ産生について評価した。
種々のＡＡＶ－ＧＬＡ構築物の組合せを、α－ＧＡＬ成熟ペプチドのインビトロ産生について評価した。
【0502】
ＨｅｐＧ２細胞を、構築物１～８を含むプラスミドでトランスフェクトした（図２）。実施例２及び３（並びにその中で参照される図）における構築物１～８は、それぞれ、本明細書に記載される構築物１Ａ～８Ａ、又は配列番号３１～３８を指す（表６参照）。細胞をトランスフェクションの７２時間後に回収し、処理して、溶解物及び上清の両方におけるα－ＧＡＬレベルを測定した。α－ＧＡＬペプチドレベルのウェスタンブロット可視化及びＥＬＩＳＡ定量化は、特定の構築物が、溶解物及び上清の両方においてより高いα－ＧＡＬ発現を示し、構築物２及び構築物８が、ＥＬＩＳＡによって検出されるように、上清において少なくとも７５０ｎｇ／ｍｌを生じたことを実証した（参照、図３、図４及び表３）。β－アクチン標準もローディング対照として含めた。α－ＧＡＬタンパク質の活性を各構築物について評価し、構築物２及び構築物８は、上清中で少なくとも１５ｎｍｏｌ／時間＊ｍｌを示した（図５及び表４を参照されたい）。
【0503】
【表3】
【0504】
【表4】
【0505】
本実施例は、とりわけ、本開示の構築物が成熟した機能的ＧＡＬをインビトロで産生し得ることを実証する。いくつかの実施形態では、ＧＡＬのレベル及び／又は活性は、参照構築物と比較して改善され得る。
【0506】
実施例３．インビボ発現構築物の評価
種々のＡＡＶ－ＧＬＡ構築物の組合せを、α－ＧＡＬ成熟ペプチドのインビボ産生及び活性について評価した。
種々のＡＡＶ－ＧＬＡ構築物の組合せを、α－ＧＡＬ成熟ペプチドのインビボ産生及び活性について評価した。
【0507】
構築物１（図２）をＡＡＶ－ＤＪにパッケージングし、静脈内（ＩＶ）投与を介して１４週齢のファブリー病マウス（ｎ＝３）に送達した。実施例３における構築物１は、本明細書に記載される構築物１Ａ、又は配列番号３１を指す（表６参照）。組成物を５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で眼窩静脈に投与した。血漿中試料を０日目及び注射後７日目に採取し、ＧＡＬ活性を評価した（図６）。
【0508】
本実施例は、とりわけ、本開示の構築物が成熟した機能的ＧＡＬをインビボで産生することを実証する。いくつかの実施形態では、ＧＡＬのレベル及び／又は活性は、参照構築物と比較して改善され得る。
【0509】
図２に示される構築物を、プロモーター下でＡＡＶ ＩＴＲ内にパッケージングし、発現について試験した。これらの構築物をまた、細胞におけるＧＬＡ酵素活性について試験した。
【0510】
ウイルスゲノムを含むＡＡＶ粒子が生成される。これらの組換えＡＡＶ粒子は、配列番号４５のアミノ酸配列を有する肝臓指向性カプシドタンパク質ｓＬ６５を含む。カプシドタンパク質は、配列番号４６のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる。
【0511】
実施例４．インビトロ発現構築物の評価
ＡＡＶ－ＧＬＡ構築物の組合せを、α－ＧＡＬ成熟ペプチドのインビトロ産生について評価した。ＨｅｐＧ２細胞を、構築物１－１１を含むプラスミドでトランスフェクトした（図７）。実施例４及び５における構築物１～１１、並びにその中で参照される図は、それぞれ、構築物１Ｂ～１１Ｂ、又は配列番号５１～６１を指す（表６を参照されたい）。構築物１Ｂ～１１Ｂは、構築物１Ｂ～１１Ｂが３’ＩＴＲのすぐ５’側のフィラー配列中に（「ｇｔ」の）２塩基対付加、及び５’ＩＴＲの外側及びそのすぐ３’側のフィラー配列中に６塩基対欠失を含む点で、構築物１Ａ～１１Ａとは異なる。
ＡＡＶ－ＧＬＡ構築物の組合せを、α－ＧＡＬ成熟ペプチドのインビトロ産生について評価した。ＨｅｐＧ２細胞を、構築物１－１１を含むプラスミドでトランスフェクトした（図７）。実施例４及び５における構築物１～１１、並びにその中で参照される図は、それぞれ、構築物１Ｂ～１１Ｂ、又は配列番号５１～６１を指す（表６を参照されたい）。構築物１Ｂ～１１Ｂは、構築物１Ｂ～１１Ｂが３’ＩＴＲのすぐ５’側のフィラー配列中に（「ｇｔ」の）２塩基対付加、及び５’ＩＴＲの外側及びそのすぐ３’側のフィラー配列中に６塩基対欠失を含む点で、構築物１Ａ～１１Ａとは異なる。
【0512】
簡単に説明すると、細胞を１２ウェルプレートの細胞培養培地（ＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ、２ｍｌ／ウェル）に播種した。プラスミド及び脂質複合体を製造業者の指示に従って調製した。２μｇのＤＮＡとＯｐｔｉ－ＭＥＭを混合して総体積を９２μｌとし、６μｌのＦｕｇｅｎｅ ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、直ちに５秒間ボルテックスした。ＤＮＡ／脂質複合体を室温で１５分間インキュベートし、次いで３７℃で４８～７２時間インキュベートするために細胞に添加した。
【0513】
α－ＧＡＬペプチドレベルのウェスタンブロット可視化は、特定の構築物が溶解物及び上清の両方においてより高いα－ＧＡＬ発現を示すことを実証した（図８）。β－アクチン標準もローディング対照として含めた。α－ＧＡＬタンパク質の活性も各構築物について評価し、構築物２、４、５、６、７、８、９、１０及び１１は、上清中に少なくとも７０ｎｍｏｌ／ｈｒ＊ｍｌを示した（図９及び表５）。
【0514】
【表5】
【0515】
ＨｅｐＧ２細胞はまた、Ｒｅｆ２Ｋと共にＡＡＶ／ＤＪにパッケージングされた選択構築物（すなわち、構築物２、４、６、７、８及び９）で形質導入された。簡単に説明すると、０日目に、細胞を１２ウェルプレートに５００，０００細胞播種し、１日目に、３つの異なる感染多重度（ＭＯＩ）、すなわち、５Ｅ４、１Ｅ５及び２Ｅ５でＡＡＶ／ＤＪにパッケージングされた構築物で形質導入した。形質導入の７２時間後に細胞を回収し、上清試料を収集した。α－ＧＡＬペプチドレベルのウェスタンブロット可視化は、１Ｅ５のＭＯＩでの形質導入がＧＡＬのより良好な発現をもたらし、構築物６、８及び９等の特定の構築物が上清中でより高いα－ＧＡＬ発現を示したことを実証した（図１０）。α－ＧＡＬタンパク質の活性もまた、各構築物について評価した。ウェスタンブロットの結果と一致して、１Ｅ５のＭＯＩでの形質導入は、特に構築物６、８及び９について、より高いＧＡＬ活性レベルをもたらした（図１１）。
【0516】
実施例５．ＡＡＶ－ＤＪにおけるインビボ発現構築物の評価
ＡＡＶ－ＧＬＡ構築物の組合せを、α－ＧＡＬ成熟ペプチドのインビボ産生及び活性について評価した。実施例５における構築物１～１１、及びその中で参照される図は、それぞれ、構築物１Ｂ～１１Ｂ、又は配列番号５１～６１を指す（表６を参照されたい）。
ＡＡＶ－ＧＬＡ構築物の組合せを、α－ＧＡＬ成熟ペプチドのインビボ産生及び活性について評価した。実施例５における構築物１～１１、及びその中で参照される図は、それぞれ、構築物１Ｂ～１１Ｂ、又は配列番号５１～６１を指す（表６を参照されたい）。
【0517】
簡潔に述べると、ファブリー病マウス（Ｂ６；１２９－Ｇｌａｔｍ１Ｋｕｌ／Ｊ；ＪＡＸ ００３５３５）（１群当たりｎ＝５）に、ＡＡＶ－ＤＪ中のコドン最適化構築物を投与し、６週間モニターした。製剤緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８）中の組成物を５Ｅ１１ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。動物を６週後に屠殺した。α－ＧＡＬ活性を血漿中で測定し、ｌｙｓｏ－ＧＢ３蓄積のクリアランスも評価した（図１２）。図１２に示されるように、構築物６、８及び９を受けたマウスは、α－ＧＡＬ活性の有意な増加、並びにｌｙｓｏ－ＧＢ３レベルの有意な減少を有した。α－ＧＡＬレベルとｌｙｓｏ－ＧＢ３レベルとの間の相関を図１３に示す。
【0518】
ＡＡＶ－ＤＪにおける構築物６及び９を、上記のように、１Ｅ１３ｖｇ／ｋｇのより高い用量で、ファブリー病マウス（１群当たりｎ＝４）において更に試験した。血漿試料を投与前、並びに１週目、４週目及び６週目に採取し、α－ＧＡＬ活性を測定した。図１４に示すように、構築物９を受けたマウスは、最高レベルのα－ＧＡＬ活性を有していた。
【0519】
本実施例は、とりわけ、本開示の構築物が成熟した機能的ＧＡＬをインビボで産生し、ＧＡＬのレベル及び／又は活性が、本開示の構築物を受けたマウスにおいて有意に改善されたことを実証する。
【0520】
実施例６．ＳＬ６５カプシドを含有するＡＡＶ粒子にパッケージングされたインビボ発現構築物の評価
選択された発現構築物を、肝臓指向性カプシドタンパク質ＳＬ６５を含むＡＡＶ粒子における評価のために選択した。肝臓指向性カプシドタンパク質ｓＬ６５は、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。カプシドタンパク質は、配列番号４６のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる。α－ＧＡＬ成熟ペプチドの産生及び活性をインビボで評価した。
選択された発現構築物を、肝臓指向性カプシドタンパク質ＳＬ６５を含むＡＡＶ粒子における評価のために選択した。肝臓指向性カプシドタンパク質ｓＬ６５は、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。カプシドタンパク質は、配列番号４６のヌクレオチド配列を有する核酸によってコードされる。α－ＧＡＬ成熟ペプチドの産生及び活性をインビボで評価した。
【0521】
簡潔には、構築物６及び９を、肝臓指向性カプシドタンパク質ＳＬ６５を含むＡＡＶ粒子にパッケージングし、ＩＶ投与を介してＰＸＢマウス（１群当たりｎ＝４）に送達した。実施例６における構築物６及び９、並びにその中で参照される図は、それぞれ、構築物６Ｂ～９Ｂ、又は配列番号５６及び５９を指す（表６を参照されたい）。組成物を３Ｅ１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。血漿試料を投与前、並びに２週目及び４週目に採取した。動物を４週後に屠殺した。α－ＧＡＬ活性を血漿中で測定し、ヒトアルブミン（ＡＬＢ）のレベルを対照として評価した（図１５）。図１５に示されるように、投与前と比較して、構築物６又は９のいずれかを受けたマウスは、α－ＧＡＬ活性のレベルの有意な増加を有したが、ＡＬＢレベルについては有意な変化は観察されなかった。図１６は、ＡＬＢレベルによって正規化された補正α－ＧＡＬ活性レベルを示す。具体的には、ＳＬ６５カプシドを有するＡＡＶ粒子中にパッケージングされた構築物９の投与の２週間後のマウスにおいて、α－ＧＡＬ活性のレベルの１７倍の増加が観察された。
【0522】
本実施例は、とりわけ、本開示の構築物が成熟した機能的ＧＡＬをインビボで産生し、ＧＡＬのレベル及び／又は活性が、本開示の構築物を受けたマウスにおいて有意に改善されたことを実証する。
【0523】
等価物及び範囲
当業者は、本明細書に記載の特定の実施形態及び方法に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
当業者は、本明細書に記載の特定の実施形態及び方法に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【0524】
【表6-1】
【0525】
【表6-2】
【0526】
【表6-3】
【0527】
【表6-4】
【0528】
【表6-5】
【0529】
【表6-6】
【0530】
【表6-7】
【0531】
【表6-8】
【0532】
【表6-9】
【0533】
【表6-10】
【0534】
【表6-11】
【0535】
【表6-12】
【0536】
【表6-13】
【0537】
【表6-14】
【0538】
【表6-15】
【0539】
【表6-16】
【0540】
【表6-17】
【0541】
【表6-18】
【0542】
【表6-19】
【0543】
【表6-20】
【0544】
【表6-21】
【0545】
【表6-22】
【0546】
【表6-23】
【0547】
【表6-24】
【0548】
【表6-25】
【0549】
【表6-26】
【0550】
【表6-27】
【0551】
【表6-28】
【0552】
【表6-29】
【0553】
【表6-30】
【0554】
【表6-31】
【0555】
【表6-32】
【0556】
【表6-33】
【0557】
【表6-34】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】