知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ シェンヤン アイ インダストリー テクノロジー インスティテュート リミテッドの特許一覧
特表2024-535942抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体及びその製造方法と応用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-02
(54)【発明の名称】抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体及びその製造方法と応用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/18 20060101AFI20240925BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240925BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240925BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240925BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240925BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240925BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240925BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240925BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240925BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240925BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240925BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240925BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240925BHJP
G01N 33/536 20060101ALI20240925BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20240925BHJP
【ＦＩ】
C07K16/18 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61P27/02
A61P35/00
G01N33/574 A
G01N33/536 A
G01N33/543 501A
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024539906
(86)(22)【出願日】2022-09-09
(85)【翻訳文提出日】2024-03-13
(86)【国際出願番号】 CN2022118162
(87)【国際公開番号】W WO2023036305
(87)【国際公開日】2023-03-16
(31)【優先権主張番号】202111068177.1
(32)【優先日】2021-09-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524097517
【氏名又は名称】シェンヤン アイ インダストリー テクノロジー インスティテュート リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＹＡＮＧ ＥＹＥ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】リ，シュエジァオ
(72)【発明者】
【氏名】へ，ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】チァン，シュオ
(72)【発明者】
【氏名】ツァオ，ハン
(72)【発明者】
【氏名】フェン，リン
(72)【発明者】
【氏名】リウ，フイ
(72)【発明者】
【氏名】ツァオ，ホンリ
(72)【発明者】
【氏名】へ，シャンドン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA04
4B064DA05
4B064DA13
4B064DA14
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA92Y
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB36
4C085CC23
4H045AA11
4H045DA76
4H045EA28
4H045EA51
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体及びその製造方法と応用を提供する。前記抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、発現量が比較的高く、抗原への結合の特異性及び親和性が比較的良い。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖の可変領域が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖の可変領域が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体。
【請求項2】
重鎖の定常領域がヒトＩｇＧ１であり、軽鎖の定常領域がヒトκ型であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項3】
重鎖のアミノ酸配列が配列番号３で示され、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号４で示されることを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体をコードする核酸。
【請求項5】
重鎖をコードする核酸が、配列番号５で示される核酸配列を有し、軽鎖をコードする核酸が、配列番号６で示される核酸配列を有することを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
【請求項6】
重鎖をコードする核酸が、配列番号７で示される核酸配列を有し、軽鎖をコードする核酸が、配列番号８で示される核酸配列を有することを特徴とする、請求項５に記載の核酸。
【請求項7】
請求項４～６のいずれか１項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項8】
ベクターバックボーンがＰＡＴＸ－ＧＳ２であることを特徴とする、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項9】
請求項８に記載の発現ベクターを形質転換又はトランスフェクションする宿主細胞。
【請求項10】
請求項９に記載の宿主細胞を培養し、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の発現を誘発する工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項11】
組織線維線維化病変及び／又は悪性腫瘍を治療するための薬剤或いは組織線維線維化病変及び／又は悪性腫瘍を診断するための検出試薬の製造における請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の使用。
【請求項12】
前記組織線維化病変が網膜線維化であることを特徴とする、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
組織線維線維化病変及び／又は悪性腫瘍を治療するための薬剤であって、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体を含むことを特徴とする、薬剤。
【請求項14】
組織線維線維化病変及び／又は悪性腫瘍を診断するためのキットであって、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体を含むか、
或いは請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体と化学標識又は生物標識とを形成した結合物を含むか、
或いは請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体と固体媒体又は半固体媒体とをカップリングした複合体を含むことを特徴とする、キット。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【0001】
本出願は、２０２１年０９月１３日に中国特許庁に出願された、出願番号２０２１１１０６８１７７．１、発明の名称「抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体及びその製造方法と応用」である中国特許出願の優先権を主張し、その全内容は援用により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【0002】
本発明は、抗体医薬の技術分野に関し、特に抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体及びその製造方法と応用に関する。
【背景技術】
【0003】
増殖性糖尿病性網膜症（proliferative diabetic retinopathy、PDR）、増殖性硝子体網膜症（proliferative vitreoretinopathy、PVR）及び加齢黄斑変性（age-related macular degeneration、AMD）などの硝子体網膜疾患は、該当する人々の視力低下及び視力喪失の主な原因になっており、世界的な医療難題でもある。従って、硝子体網膜疾患の新たな生物学的マーカーと治療ターゲットを見つけることは、疾患の早期発見、早期診断及び早期治療にとって極めて重要である。
【0004】
ペリオスチン（ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）は、１９９３年にマウス胎児骨芽細胞前駆細胞で発見された細胞接着タンパク質であり、骨芽細胞特異的因子－２（ＯＳＦ－２）と名付けられ、成体マウスの歯周膜と骨膜で特異的に発現されるため、ペリオスチンに改名された。ペリオスチン（ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ）は、ユニークな細胞外マトリックスタンパク質の一種であり、心筋梗塞後のリモデリング、骨髓線維化、歯周組織の再生と修復、皮膚の創傷治癒、腫瘍細胞の転移、腎臓の損傷などの人体の様々な組織や器官の対応する免疫反応に関与し、また慢性アレルギー疾患を誘発する可能性がある。近年、ペリオスチンを標的とした薬剤の研究と生産が注目を集めている。多数の市販薬剤は腫瘍の治療において目覚ましい成果を上げている。
【0005】
ペリオスチンの眼部における主な機能としては、細胞の増殖、分化、遊走及び接着の促進、線維形成の誘発、及び新生血管の促進などが挙げられる。ペリオスチンが様々な硝子体網膜疾患の重要な因子であることが国内外の研究で次々と証明されており、ペリオスチンは硝子体網膜疾患に対する新たな生物学的マーカーとして新たな治療戦略の提供に期待されている。例えば、報告によると、ペリオスチン抗体は、眼科の多くの分野において、加齢黄斑変性や糖尿病性網膜症による眼内新生血管性増殖、黄斑浮腫などの治療に重要な役割を果たすことが証明されているということである。
【0006】
しかしながら、これまでのペリオスチン抗体はすべてマウスモノクローナル抗体であったが、異種タンパク質であるマウス由来の抗体は人体内で使用されると、異種タンパク質に対する免疫拒絶反応が起こし、ヒト抗マウス抗体の産生が誘発され、体内での抗体の半減期が短縮されて抗体の治療効果に悪影響を与える。従って、特異性抗原エピトープに対する高い親和性を維持しながらペリオスチン抗体をヒト化すれば、異種抗体の免疫原性を低下させ、抗原への結合の特異性と親和性を向上させ、より良い治療効果を果たすことが期待される。
【発明の概要】
【0007】
上記事情に鑑みて、本発明が解決しようとする技術的課題は、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体及びその製造方法と応用を提供することである。
【0008】
本発明で提供される抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、重鎖の可変領域が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖の可変領域が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する。
【0009】
本発明で提供される抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、重鎖の定常領域がヒトＩｇＧ１であり、軽鎖の定常領域がヒトκ型である。
【0010】
いくつかの具体的な実施形態において、前記ヒト化抗体は、重鎖のアミノ酸配列が配列番号３で示され、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号４で示される。
【0011】
本発明では、ペリオスチンマウスモノクローナル抗体を使用し、それをヒト化し、真核発現プラスミドをうまく構築し、哺乳動物の細胞ＣＨＯにトランスフェクションして分泌発現を行い、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、ＷＢなどを通じてインビトロで親和性、結合活性などの生物学的機能を評価し、ＣＨＯ細胞が抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体を大規模に発現する研究に理論的基礎を提供した。
【0012】
本発明で提供される抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、上記の重鎖及び軽鎖で構成されたものであり、ヒト化された後、従来技術のキメラ抗体や他のペリオスチンマウスモノクローナル抗体よりも安全で信頼性が高く、機能がより顕著になった。検出の結果、このヒト化抗体はヒトペリオスチンに対して良好な特異性を持っている。ペリオスチン抗体は、眼科の多くの分野において、加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症による眼内新生血管性増殖、黄斑浮腫などの治療に重要な役割を果たすことが証明されたことから、本発明で提供される抗体は、組織線維化病変を治療する可能性を有する。
【0013】
また、本発明は前記モノクローナル抗体をコードする核酸を提供する。具体的には、本発明は、前記モノクローナル抗体の重鎖をコードする核酸、前記モノクローナル抗体の軽鎖をコードする核酸、前記モノクローナル抗体の重鎖の可変領域をコードする核酸、及び／又は前記モノクローナル抗体の軽鎖の可変領域をコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態において、前記抗体の重鎖をコードする核酸は、配列番号５で示される核酸配列を有する。前記抗体の軽鎖をコードする核酸は、配列番号６で示される核酸配列を有する。タンパク質の発現を容易にするために、本発明で提供されるコード核酸の５’端にはリンカー配列がさらに含まれる。従って、いくつかの具体的な実施形態において、前記抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の重鎖をコードする核酸は、配列番号７で示される核酸配列を有し、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の軽鎖をコードする核酸は、配列番号８で示される核酸配列を有する。
【0014】
また、本発明は前記モノクローナル抗体をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。本発明において、前記発現ベクターにはベクターバックボーンも含まれる。いくつかの実施形態において、前記ベクターバックボーンはｐＣＤＮＡ３．４である。
【0015】
また、本発明は前記発現ベクターを形質転換又はトランスフェクションする宿主細胞を提供する。本発明において、前記宿主細胞は哺乳動物の細胞である。いくつかの具体的な実施形態において、前記宿主細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞である。
【0016】
本発明による抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の製造方法は、本発明の宿主細胞を培養し、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の発現を誘発する工程を含む。
【0017】
また、本発明は組織線維線維化病変及び／又は悪性腫瘍を治療するための薬剤又は組織線維線維化病変及び／又は悪性腫瘍を診断するための検出試薬の製造における抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態において、前記組織線維化病変は網膜線維化である。
【0018】
本発明は、本発明による抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体を含む薬剤を提供する。
【0019】
また、本発明は抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体を含むか、或いはこの抗体と化学標識又は生物標識とを形成した結合物を含むか、或いは前記抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体と固体媒体又は半固体媒体とをカップリングした複合体を含むキットを提供する。
【0020】
本発明における前記化学標識は、同位体、免疫毒素、及び／又は化学薬品である。前記生物標識は、ビオチン、アビジン、又は酵素標識である。前記酵素標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼであることが好ましい。前記免疫毒素は、アフラトキシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、リシン（rｉｃｉｎ）、アブリン（ａｂｒｉｎ）、ヤドリギレクチン（ｍｉｓｔｌｅｔｏｅ ｌｅｃｔｉｎ）、モデッシン(ｍｏｄｅｃｃｉｎ)、ＰＡＰ、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）又はルフィンであることが好ましい。前記複合体中の固体媒体又は非固体媒体は、コロイド金、ポリスチレンプレート及びビーズならなる群から選択される。このキットは、組織線維線維化病変及び／又は悪性腫瘍の診断に使用できる。前記診断の方法には、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫蛍光技術、免疫組織化学的検出などの免疫学的検出方法が採用される。
【0021】
また、本発明は、本発明による薬剤を投与することにより組織線維線維化病変及び／又は悪性腫瘍を治療する方法を提供する。
【0022】
また、本発明は、本発明による診断試薬を使用して診断するにより組織線維線維化病変及び／又は悪性腫瘍を診断する方法を提供する。
【0023】
本発明は、マウスＭｃＡｂの可変領域における抗原に結合する相補性決定領域のみを保持し、ＣＤＲ移植抗体を調製して得られた抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体を提供する。本発明でスクリーニングにより得られた抗体は、キメラ抗体よりも免疫原性が低く、また実験中の他の抗体と比較すると、発現量がより高く、抗原への結合の特異性及び親和性がより良く、ヒト免疫応答によりよく関与する。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明は、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体及びその製造方法と応用を提供するものであり、当業者であれば、本明細書の内容を参考にして、プロセスパラメータを適切に改良して実施することが可能である。なお、当業者に自明ないかなる類似の置換及び変化は、本発明に含まれるものとみなされることに留意されたい。本発明の方法及び応用について好ましい実施形態を通じて説明してきたが、本発明の技術は、関係者が本発明の内容、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書の方法及び応用に対して修正、変更又は組み合わせを適切に行うことにより実現及び適用し得るものであることは明らかである。
【0026】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。この分野の定義及び用語については、専門家は具体的にＣurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubel）を参照することができる。アミノ酸残基の略語としては、２０種類の一般的に使用されるＬ－アミノ酸の１つを指す当技術分野で使用される標準的な３文字及び／又は１文字コードを採用した。
【0027】
「抗体」とは、抗原に特異的に結合できる１種又は複数種のポリペプチドから構成されるタンバク質を指す。抗体の１つの形態としては、各対が軽鎖と重鎖を有する２対の完全に同じの抗体鎖から構成された四量体であり、この四量体の形態で抗体の基本構造単位を構成する。各対の抗体鎖において、軽鎖と重鎖の可変領域は抗原への結合を共同で担い、定常領域は抗体のエフェクター機能を担う。前記「モノクローナル抗体」とは、単一の分子組成を有する抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
【0028】
抗体の重鎖又は軽鎖の「可変領域」は、この鎖のＮ端成熟領域である。現在知られている抗体のタイプとしては、κ及びλ軽鎖、ならびにα、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、ε及びμ重鎖又はそれらの他のタイプの同等物が挙げられる。全長の免疫グロブリン「軽鎖」（約２５ｋＤａ又は約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２－末端上に約１１０アミノ酸から形成される可変領域、及びＣＯＯＨ－末端上のκ又はλ定常領域を含む。全長の免疫グロブリン「重鎖」（約５０ｋＤａ又は約４４６アミノ酸）は、同様に可変領域（約１１６アミノ酸）、及びγなどの重鎖の定常領域の１つ（約３３０個アミノ酸）を含む。
【0029】
「抗体」としては、任意のアイソタイプの抗体又は免疫グロブリン、或いは抗原への特異的結合を保持する抗体断片があり、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＦｄ断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、並びに抗体の抗原結合部分と非抗体タンバク質を含む融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で提供されるのは、ペリオスチンのヒト化モノクローナル抗体である。培養したハイブリドーマ細胞４５－２－Ｇ３－１－Ｇ７－Ｂ７からトータルＲＮＡを抽出し、オリゴヌクレオチドプライマーで逆転写してｃＤＮＡを合成し、ＩｇＧ縮重プライマーとカッパ特異的プライマーでＶＨとＶＬ断片をそれぞれ増幅し、ゲル電気泳動で結果を観察した（図１）。その後、ＰＣＲ生成物を標準ベクターにサブクローニングし、クローンの選択とＰＣＲ検証を行い（図２）、最後に陽性クローンをシークエンシングする。遺伝子合成法により、抗ペリオスチンマウスモノクローナル抗体の可変領域遺伝子のフレームワーク領域をヒト抗体のフレームワーク領域に置換し、抗体可変領域遺伝子断片をヒト化し、調節配列とヒト抗体定常領域遺伝子を含むベクターに組み換え、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の完全遺伝子と前記遺伝子を含む真核発現ベクターを構築し、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクションする。ＧＳシステムによる加圧スクリーニングにより、ヒト化抗体を持続的かつ安定的に分泌するＣＨＯ－Ｋ１細胞を得る。
【0030】
本発明による抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、重鎖の可変領域のアミノ酸配列が:EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYSFTDYFMNWVRQMPGKGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLQGQVTLSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSS(配列番号1)である。
【0031】
本発明による抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が:DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSASYMHWYQQKPGKAPKNWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIK(配列番号2)である。
【0032】
本発明による抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、重鎖の定常領域のアミノ酸配列が:ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKである。
【0033】
本発明による抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、軽鎖の定常領域のアミノ酸配列が:RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECである。
【0034】
本発明による抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、重鎖のアミノ酸配列が:MKHLWFFLLLVAAPRWVLSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYSFTDYFMNWVRQMPGKGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLQGQVTLSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号3)である。
【0035】
本発明による抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、軽鎖のアミノ酸配列が:MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSASYMHWYQQKPGKAPKNWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(配列番号4)である。
【0036】
抗体の発現と精製を容易にするために、ベクター構築及びタンパク質発現のプロセス中に、重鎖断片及び軽鎖断片のＮ端にそれぞれリンカー断片を付加する。この断片はその後の精製中に除去される。いくつかの実施形態において、前記抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の重鎖のＮ端に付加されるリンカーのアミノ酸配列はＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳであり、前記抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の軽鎖のＮ端に付加されるリンカーのアミノ酸配列はＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧである。
【0037】
抗体は、標識されて検出されることができ、例えば、放射性同位体、検出可能な物質を生成する酵素、蛍光タンバク質、ビオチンなどにより標識されて検出されることができる。また、抗体は、ポリスチレンプレート又はビーズなどを含むがこれらに限定されない固相担体に結合することがある。
【0038】
本発明による薬剤には、少なくとも１つの機能成分が含まれ、さらに薬学的に許容される担体が含まれる。好ましくは、前記薬学的に許容される担体は、水、緩衝水溶液、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）などの等張塩溶液、グルコース、マンニトール、右旋性グルコース、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸マグネシウム、０．３％グリセリン、ヒアルロン酸、エタノール、又はポリアルキレングリコールやトリグリセリドなどのポリプロピレングリコールである。使用される薬学的に許容される担体の種類は、とりわけ、本発明による組成物が経口、経鼻、皮内、皮下、筋肉内又は静脈内投与用に処方されるかどうかに依存する。本発明による組成物は、添加剤として湿潤剤、乳化剤又は緩衝液を含有してもよい。
【0039】
本発明で使用する試験材料はいずれも一般的な市販品であり、市場で購入することができる。以下、本発明を実施例と併せてさらに説明する。
【実施例1】
【0040】
１．抗体ヒト化の設計
（１）ＣＤＲ領域配列の同定
マウスハイブリドーマ細胞（４５－２－Ｇ３－１－Ｇ７－Ｂ７、構築方法については、出願番号：２０２０１０７８８８８５．１、瀋陽何氏眼産業集団有限公司又は瀋陽眼産業技術研究院有限公司からの『抗人ペリオスチンモノクローナルキメラ抗体及び応用』を参照）からすべてのｍＲＮＡを単離し、これをｃＤＮＡを合成するテンプレートとし、ｃＤＮＡから重鎖の可変領域ＤＮＡ断片と軽鎖の可変領域ＤＮＡ断片を分離し、得られたＤＮＡ断片をベクターにクローニングし、シークエンシングした。得られた配列結果は以下の通りであった。
（１）ＣＤＲ領域配列の同定
マウスハイブリドーマ細胞（４５－２－Ｇ３－１－Ｇ７－Ｂ７、構築方法については、出願番号：２０２０１０７８８８８５．１、瀋陽何氏眼産業集団有限公司又は瀋陽眼産業技術研究院有限公司からの『抗人ペリオスチンモノクローナルキメラ抗体及び応用』を参照）からすべてのｍＲＮＡを単離し、これをｃＤＮＡを合成するテンプレートとし、ｃＤＮＡから重鎖の可変領域ＤＮＡ断片と軽鎖の可変領域ＤＮＡ断片を分離し、得られたＤＮＡ断片をベクターにクローニングし、シークエンシングした。得られた配列結果は以下の通りであった。
【0041】
アミノ酸配列：
＞45-2-G3-1-G7-B7-VL1
DIVLTQSPAIMSASPGDKVTMTCSASSSASYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK
＞45-2-G3-1-G7-B7-VL2 及び VL3
QIVLTQSPVIMSASPGDKVTMTCSASSSASYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK
＞45-2-G3-1-G7-B7-VH
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYSFTDYFMNWVKQSHGRSLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKGKATLTVDKSSSTAHMELLSLTSEDSAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTSVTVSS
＞45-2-G3-1-G7-B7-VL1
DIVLTQSPAIMSASPGDKVTMTCSASSSASYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK
＞45-2-G3-1-G7-B7-VL2 及び VL3
QIVLTQSPVIMSASPGDKVTMTCSASSSASYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKLEIK
＞45-2-G3-1-G7-B7-VH
EVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYSFTDYFMNWVKQSHGRSLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKGKATLTVDKSSSTAHMELLSLTSEDSAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTSVTVSS
【0042】
軽鎖の可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、順にＳＳＡＳＹ、ＤＴＳ、ＱＱＷＳＳＮＰＰＴであった。
【0043】
重鎖の可変領域の３つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、順にＧＹＳＦＴＤＹＦ、ＩＮＰＹＳＧＤＴ、ＧＲＳＧＶＳＧＬＤＹであった。
【0044】
（２）配列アライメントとマウス抗体ＣＤＲの移植
ＮＣＢＩが開発したＩｇｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を使用してＩＭＧＴマウス及びヒトＶ遺伝子データベースを検索し、マウス抗体可変領域配列を入力し、配列アライメントにより相同性が一番高いヒト抗体可変領域を決定し、その後マウス抗体のＣＤＲ領域をヒトフレームワーク受容体領域に移植することにより、ＣＤＲ移植を完了した。
ＮＣＢＩが開発したＩｇｂｌａｓｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を使用してＩＭＧＴマウス及びヒトＶ遺伝子データベースを検索し、マウス抗体可変領域配列を入力し、配列アライメントにより相同性が一番高いヒト抗体可変領域を決定し、その後マウス抗体のＣＤＲ領域をヒトフレームワーク受容体領域に移植することにより、ＣＤＲ移植を完了した。
【0045】
２．１８個のヒト化抗体ベクターの構築と発現
（１）遺伝子合成
可変領域配列をヒト定常領域ＤＮＡ配列にリンクし、ヒトｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに挿入してプラスミドマップを得た（図３－１及び図３－２）。ペリオスチン抗体の重鎖及び軽鎖の核酸配列、アミノ酸配列は以下の通りである。
（１）遺伝子合成
可変領域配列をヒト定常領域ＤＮＡ配列にリンクし、ヒトｐｃＤＮＡ３．４発現ベクターに挿入してプラスミドマップを得た（図３－１及び図３－２）。ペリオスチン抗体の重鎖及び軽鎖の核酸配列、アミノ酸配列は以下の通りである。
【0046】
（２）発現ベクターへのサブクローニング
遺伝子合成後、ＣＨＯシステムのコドンを最適化し、発現ベクターＰＡＴＸ１にサブクローニングした。
遺伝子合成後、ＣＨＯシステムのコドンを最適化し、発現ベクターＰＡＴＸ１にサブクローニングした。
【0047】
核酸配列情報には以下が含まれる。
ＤＮＡ配列
＞１２－ＶＨＡ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTTTTCCTGCTGCTGGTGGCCGCCCCCAGGTGGGTTCTGTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATAGCTTTACCGATTATTTCATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCTTGGAGTGGATCGGCAGGATCAACCCTTACTCCGGCGACACCCTGTATAACCAGAGGCTGAAGGGCCGGGCCACCCTGACCGTGGATAAGAGCATCAGCACCGCTTATATGGAGCTGTCCCGGCTGCGGTCCGACGACACCGCTGTGTATTACTGCGGCAGGTCCGGCGTGTCCGGCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞１２－ＶＨＢ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTTTTCCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTCGGTGGGTGCTGTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGACTACTTTATGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAGGATCAACCCCTATAGCGGCGACACCCTGTACAATCAGAAGCTGCAGGGCCGGGTGACCATGACCGTGGACAAGTCCATCAGCACCGCTTACATGGAGCTGTCCCGGCTGCGGAGCGACGATACCGCTGTGTATTACTGCGGCCGGTCCGGCGTGAGCGGCTTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞４５９－ＶＨＡ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTTTTCCTGCTGCTGGTGGCCGCCCCCCGGTGGGTGCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGCTTCCGGCTACAGCTTCACCGATTACTTCATGAACTGGGTGCGGCAGCCCCCTGGCAAGGGCTTGGAGTGGATCGGCAGGATCAACCCTTACAGCGGCGACACCCTGTATAATCAGCGGCTGAAGGGCAGGGTGACCCTGAGCGTGGATAAGAGCAAGAACCAGGCCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCTGCCGATACCGCCGTGTATTATTGTGGCCGGTCCGGCGTGAGCGGCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞４５９－ＶＨＢ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTTTTCCTGCTGCTGGTGGCTGCTCCTCGGTGGGTGCTGAGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGACTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGTCCCTGACCTGCACCGCCAGCGGCTATTCCTTTACCGATTATTTCATGAACTGGATCCGGCAGCCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCGGATCAACCCCTATTCCGGCGATACCCTGTACAACCAGCGGCTGAAGTCCAGGGTGACCCTGAGCGTGGACAAGTCCAAGAACCAGGCTTCCCTGAAGCTGTCCAGCGTGACCGCTGCTGATACCGCTGTGTACTACTGCGGCCGGAGCGGCGTGTCCGGCTTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞４５９－ＶＨＣ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCCCCCAGGTGGGTTCTGAGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGACTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGTCCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCGGCTCCATCACCGATTATTTCATGAACTGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCGGATCAATCCCTATAGCGGCGACACCCTGTACAATCAGCGGCTGAAGAGCAGGGTGACCCTGAGCGTGGATAAGTCCAAGAATCAGGCCAGCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCCGCCGACACCGCTGTGTACTACTGCGGCCGGTCCGGCGTGAGCGGCTTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞５５１－ＶＨＢ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTGCTGCTGGTGGCTGCTCCTAGGTGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGAGAGCCTGAAGATCTCCTGTAAGGCTTCCGGCTACTCCTTCACCGACTACTTTATGAATTGGGTGCGGCAGATGCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAGAATCAATCCTTACAGCGGCGACACCCTGTACAACCAGCGGCTGCAGGGCCAGGTGACCCTGTCCGCTGATAAGAGCATCTCCACCGCCTACCTGCAGCTGTCCTCCCTGAAGGCCTCCGACACCGCCATGTACTACTGTGGCAGGAGCGGCGTGAGCGGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞６２１－ＶＬＡ－７２５ｂｐ
gaattcgccgccaccATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTTATCTCCCTGCTGCTGTGGATCAGCGGCGCCTATGGCGAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGATTTCCAGAGCGTGACCCCTAAGGAGAAGGTGACCATCACCTGCAGCGCCAGCAGCTCCGCCAGCTATATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACCAGTCCCCTAAGCGGTGGATCTATGACACCAGCAAGCTGGCTAGCGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAACTCCCTGGAGGCTGAGGACGCCGCCACCTATTACTGCCAGCAGTGGAGCTCCAACCCCCCTACCTTTGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGcgtacgGTGGCTGCACCTTCTGTGTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTGAAGTCTGGAACCGCATCTGTCGTCTGTCTGCTGAACAACTTTTACCCCAGGGAGGCTAAGGTCCAATGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCTGGTAATAGCCAGGAAAGCGTGACCGAACAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCCTGTCCTCCACACTGACACTGAGCAAAGCCGACTATGAAAAGCACAAAGTGTATGCCTGCGAGGTCACTCATCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACTAAAAGCTTTAATAGGGGGGAGTGCTGAGCGGCCGC
＞３１１－ＶＬＡ－７２５ｂｐ
gaattcgccgccaccATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTTATCAGCCTGCTGCTGTGGATCAGCGGCGCCTACGGCGAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCCACCCTGTCCCTGTCCCCAGGAGAGAGGGCTACCCTGAGCTGCTCCGCCAGCTCCAGCGCCTCCTACATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCCCCTCGGAGATGGATGTACGATACCTCCAAGCTGGCCTCCGGCATCCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGAACCGATTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGCCTGAGGACGCCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCTCCTACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGcgtacgGTGGCTGCACCTTCTGTGTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTGAAGTCTGGAACCGCATCTGTCGTCTGTCTGCTGAACAACTTTTACCCCAGGGAGGCTAAGGTCCAATGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCTGGTAATAGCCAGGAAAGCGTGACCGAACAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCCTGTCCTCCACACTGACACTGAGCAAAGCCGACTATGAAAAGCACAAAGTGTATGCCTGCGAGGTCACTCATCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACTAAAAGCTTTAATAGGGGGGAGTGCTGAGCGGCCGC
＞１３９－ＶＬＡ－７２５ｂｐ
gaattcgccgccaccATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTTATCAGCCTGCTGCTGTGGATCAGCGGCGCTTACGGCGACATCCAGCTGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGCCTCCAGCTCCGCCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAACTGGATCTATGATACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGATGCTGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCCCTACCTTTGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGcgtacgGTGGCTGCACCTTCTGTGTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTGAAGTCTGGAACCGCATCTGTCGTCTGTCTGCTGAACAACTTTTACCCCAGGGAGGCTAAGGTCCAATGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCTGGTAATAGCCAGGAAAGCGTGACCGAACAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCCTGTCCTCCACACTGACACTGAGCAAAGCCGACTATGAAAAGCACAAAGTGTATGCCTGCGAGGTCACTCATCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACTAAAAGCTTTAATAGGGGGGAGTGCTGAGCGGCCGC
＞１２－ＶＨＡ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYFMNWVRQAPGQGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKGRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞１２－ＶＨＢ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYFMNWVRQAPGQGLEWIGRINPYSGDTLYNQKLQGRVTMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞４５９－ＶＨＡ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTASGYSFTDYFMNWVRQPPGKGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKGRVTLSVDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞４５９－ＶＨＢ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTASGYSFTDYFMNWIRQPPGKGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKSRVTLSVDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞４５９－ＶＨＣ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITDYFMNWIRQPPGKGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKSRVTLSVDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK,SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞５５１－ＶＨＢ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYSFTDYFMNWVRQMPGKGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLQGQVTLSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK,SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞６２１－ＶＬＡ
MVLQTQVFISLLLWISGAYGEIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSASYMHWYQQKPDQSPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC,SIP:[1:20],ヒトカッパ定常領域：［１２７：２３３］
＞３１１－ＶＬＡ
MVLQTQVFISLLLWISGAYGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSASYIHWYQQKPGQAPRRWMYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDAAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC,SIP:[1:20],ヒトカッパ定常領域：［１２７：２３３］
＞１３９－ＶＬＡ
MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSASYMHWYQQKPGKAPKNWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC,SIP:[1:20],ヒトカッパ定常領域：［１２７：２３３］
ＤＮＡ配列
＞１２－ＶＨＡ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTTTTCCTGCTGCTGGTGGCCGCCCCCAGGTGGGTTCTGTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTATAGCTTTACCGATTATTTCATGAACTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCTTGGAGTGGATCGGCAGGATCAACCCTTACTCCGGCGACACCCTGTATAACCAGAGGCTGAAGGGCCGGGCCACCCTGACCGTGGATAAGAGCATCAGCACCGCTTATATGGAGCTGTCCCGGCTGCGGTCCGACGACACCGCTGTGTATTACTGCGGCAGGTCCGGCGTGTCCGGCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞１２－ＶＨＢ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTTTTCCTGCTGCTGGTGGCCGCTCCTCGGTGGGTGCTGTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGACTACTTTATGAACTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAGGATCAACCCCTATAGCGGCGACACCCTGTACAATCAGAAGCTGCAGGGCCGGGTGACCATGACCGTGGACAAGTCCATCAGCACCGCTTACATGGAGCTGTCCCGGCTGCGGAGCGACGATACCGCTGTGTATTACTGCGGCCGGTCCGGCGTGAGCGGCTTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞４５９－ＶＨＡ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTTTTCCTGCTGCTGGTGGCCGCCCCCCGGTGGGTGCTGTCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCTGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGCTTCCGGCTACAGCTTCACCGATTACTTCATGAACTGGGTGCGGCAGCCCCCTGGCAAGGGCTTGGAGTGGATCGGCAGGATCAACCCTTACAGCGGCGACACCCTGTATAATCAGCGGCTGAAGGGCAGGGTGACCCTGAGCGTGGATAAGAGCAAGAACCAGGCCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCTGCCGATACCGCCGTGTATTATTGTGGCCGGTCCGGCGTGAGCGGCCTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞４５９－ＶＨＢ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTTTTCCTGCTGCTGGTGGCTGCTCCTCGGTGGGTGCTGAGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGACTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGTCCCTGACCTGCACCGCCAGCGGCTATTCCTTTACCGATTATTTCATGAACTGGATCCGGCAGCCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCGGATCAACCCCTATTCCGGCGATACCCTGTACAACCAGCGGCTGAAGTCCAGGGTGACCCTGAGCGTGGACAAGTCCAAGAACCAGGCTTCCCTGAAGCTGTCCAGCGTGACCGCTGCTGATACCGCTGTGTACTACTGCGGCCGGAGCGGCGTGTCCGGCTTGGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞４５９－ＶＨＣ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTCTTTCTGCTGCTGGTGGCCGCCCCCAGGTGGGTTCTGAGCCAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGACTGGTGAAGCCTAGCGAGACCCTGTCCCTGACCTGCACCGTGTCCGGCGGCTCCATCACCGATTATTTCATGAACTGGATCAGGCAGCCCCCTGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCGGATCAATCCCTATAGCGGCGACACCCTGTACAATCAGCGGCTGAAGAGCAGGGTGACCCTGAGCGTGGATAAGTCCAAGAATCAGGCCAGCCTGAAGCTGTCCTCCGTGACCGCCGCCGACACCGCTGTGTACTACTGCGGCCGGTCCGGCGTGAGCGGCTTGGATTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞５５１－ＶＨＢ－１４２３ｂｐ
gaattcgccgccaccATGAAGCACCTGTGGTTCTTCCTGCTGCTGGTGGCTGCTCCTAGGTGGGTGCTGAGCGAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCGAGAGCCTGAAGATCTCCTGTAAGGCTTCCGGCTACTCCTTCACCGACTACTTTATGAATTGGGTGCGGCAGATGCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCAGAATCAATCCTTACAGCGGCGACACCCTGTACAACCAGCGGCTGCAGGGCCAGGTGACCCTGTCCGCTGATAAGAGCATCTCCACCGCCTACCTGCAGCTGTCCTCCCTGAAGGCCTCCGACACCGCCATGTACTACTGTGGCAGGAGCGGCGTGAGCGGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCgctagcACCAAGGGACCTTCTGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCTTCTAAGTCCACTTCCGGTGGTACAGCAGCTCTGGGTTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCAGAACCAGTGACTGTGTCCTGGAACTCCGGAGCTCTGACTTCTGGAGTGCATACTTTCCCAGCAGTGCTGCAATCTAGCGGACTGTACTCTCTGTCTTCCGTGGTGACTGTGCCTTCTTCTTCCCTGGGGACTCAAACTTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACCCACACCTGTCCACCTTGTCCAGCTCCAGAACTGCTGGGTGGGCCTTCTGTGTTTCTGTTCCCACCTAAGCCAAAGGATACCCTGATGATCTCTAGGACCCCAGAAGTGACCTGTGTGGTCGTCGATGTGTCTCATGAAGACCCTGAAGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGGGTGGAAGTGCATAACGCAAAGACCAAGCCCAGGGAAGAGCAATACAACTCCACCTACAGGGTGGTCTCCGTCCTGACAGTCCTGCATCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAATAAAGCCCTGCCTGCCCCTATCGAGAAAACCATTAGCAAAGCCAAAGGCCAGCCCAGGGAGCCCCAGGTCTATACACTGCCCCCCAGCAGGGAGGAGATGACAAAAAATCAGGTCAGCCTGACATGCCTGGTCAAAGGCTTTTATCCCAGCGACATTGCCGTCGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAATAATTATAAAACAACACCCCCCGTCCTGGACAGCGACGGCAGCTTTTTTCTGTATAGCAAACTGACAGTCGATAAAAGCAGGTGGCAGCAGGGCAATGTCTTTTCCTGCAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACTCAGAAAAGCCTGAGCCTGTCCCCCGGGAAATGAGCGGCCGC
＞６２１－ＶＬＡ－７２５ｂｐ
gaattcgccgccaccATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTTATCTCCCTGCTGCTGTGGATCAGCGGCGCCTATGGCGAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGATTTCCAGAGCGTGACCCCTAAGGAGAAGGTGACCATCACCTGCAGCGCCAGCAGCTCCGCCAGCTATATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGACCAGTCCCCTAAGCGGTGGATCTATGACACCAGCAAGCTGGCTAGCGGCGTGCCTAGCAGGTTCTCCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAACTCCCTGGAGGCTGAGGACGCCGCCACCTATTACTGCCAGCAGTGGAGCTCCAACCCCCCTACCTTTGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGcgtacgGTGGCTGCACCTTCTGTGTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTGAAGTCTGGAACCGCATCTGTCGTCTGTCTGCTGAACAACTTTTACCCCAGGGAGGCTAAGGTCCAATGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCTGGTAATAGCCAGGAAAGCGTGACCGAACAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCCTGTCCTCCACACTGACACTGAGCAAAGCCGACTATGAAAAGCACAAAGTGTATGCCTGCGAGGTCACTCATCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACTAAAAGCTTTAATAGGGGGGAGTGCTGAGCGGCCGC
＞３１１－ＶＬＡ－７２５ｂｐ
gaattcgccgccaccATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTTATCAGCCTGCTGCTGTGGATCAGCGGCGCCTACGGCGAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGCCACCCTGTCCCTGTCCCCAGGAGAGAGGGCTACCCTGAGCTGCTCCGCCAGCTCCAGCGCCTCCTACATCCACTGGTACCAGCAGAAGCCTGGCCAGGCCCCTCGGAGATGGATGTACGATACCTCCAAGCTGGCCTCCGGCATCCCCGCCAGATTCAGCGGCAGCGGCAGCGGAACCGATTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGGAGCCTGAGGACGCCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCTCCTACCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGcgtacgGTGGCTGCACCTTCTGTGTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTGAAGTCTGGAACCGCATCTGTCGTCTGTCTGCTGAACAACTTTTACCCCAGGGAGGCTAAGGTCCAATGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCTGGTAATAGCCAGGAAAGCGTGACCGAACAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCCTGTCCTCCACACTGACACTGAGCAAAGCCGACTATGAAAAGCACAAAGTGTATGCCTGCGAGGTCACTCATCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACTAAAAGCTTTAATAGGGGGGAGTGCTGAGCGGCCGC
＞１３９－ＶＬＡ－７２５ｂｐ
gaattcgccgccaccATGGTGCTGCAGACCCAGGTGTTTATCAGCCTGCTGCTGTGGATCAGCGGCGCTTACGGCGACATCCAGCTGACCCAGTCCCCCTCCAGCCTGAGCGCTAGCGTGGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCTCCGCCTCCAGCTCCGCCAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAACTGGATCTATGATACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCAGCGGCAGCGGCTCCGGCACCGATTACACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGAGGATGCTGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGTCCTCCAACCCCCCTACCTTTGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGcgtacgGTGGCTGCACCTTCTGTGTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGCTGAAGTCTGGAACCGCATCTGTCGTCTGTCTGCTGAACAACTTTTACCCCAGGGAGGCTAAGGTCCAATGGAAGGTGGACAACGCCCTGCAGTCTGGTAATAGCCAGGAAAGCGTGACCGAACAGGATTCCAAGGACTCCACCTACTCCCTGTCCTCCACACTGACACTGAGCAAAGCCGACTATGAAAAGCACAAAGTGTATGCCTGCGAGGTCACTCATCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACTAAAAGCTTTAATAGGGGGGAGTGCTGAGCGGCCGC
＞１２－ＶＨＡ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYFMNWVRQAPGQGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKGRATLTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞１２－ＶＨＢ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYFMNWVRQAPGQGLEWIGRINPYSGDTLYNQKLQGRVTMTVDKSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞４５９－ＶＨＡ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTASGYSFTDYFMNWVRQPPGKGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKGRVTLSVDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞４５９－ＶＨＢ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTASGYSFTDYFMNWIRQPPGKGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKSRVTLSVDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK;SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞４５９－ＶＨＣ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITDYFMNWIRQPPGKGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLKSRVTLSVDKSKNQASLKLSSVTAADTAVYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK,SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞５５１－ＶＨＢ
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKASGYSFTDYFMNWVRQMPGKGLEWIGRINPYSGDTLYNQRLQGQVTLSADKSISTAYLQLSSLKASDTAMYYCGRSGVSGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK,SIP:[1:19],ヒト IgG1 定常領域:[137:466]
＞６２１－ＶＬＡ
MVLQTQVFISLLLWISGAYGEIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSASYMHWYQQKPDQSPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC,SIP:[1:20],ヒトカッパ定常領域：［１２７：２３３］
＞３１１－ＶＬＡ
MVLQTQVFISLLLWISGAYGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSASYIHWYQQKPGQAPRRWMYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDAAVYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC,SIP:[1:20],ヒトカッパ定常領域：［１２７：２３３］
＞１３９－ＶＬＡ
MVLQTQVFISLLLWISGAYGDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSASYMHWYQQKPGKAPKNWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDAATYYCQQWSSNPPTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC,SIP:[1:20],ヒトカッパ定常領域：［１２７：２３３］
【0048】
（３）瞬時トランスフェクション
エンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡを抽出し、構築したベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞にコトランスフェクションし、生存率が５０％以下になるまで培養した。細胞の一部を採取して培養上清を回収し、抗体をプロテインＧで精製した後にＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに供し、抗原タンパク質でＥＬＩＳＡを実行して抗体の活性を検出した。
エンドトキシンを含まないプラスミドＤＮＡを抽出し、構築したベクターをＣＨＯ－Ｋ１細胞にコトランスフェクションし、生存率が５０％以下になるまで培養した。細胞の一部を採取して培養上清を回収し、抗体をプロテインＧで精製した後にＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに供し、抗原タンパク質でＥＬＩＳＡを実行して抗体の活性を検出した。
【0049】
トランスフェクション方法：
１)トランスフェクション前日に、２７×１０６個の細胞を完全培地に播種して（抗生素及び抗凝集試薬を含まない）、細胞をトランスフェクション当日に対数増殖期になるように培養した。
１)トランスフェクション前日に、２７×１０６個の細胞を完全培地に播種して（抗生素及び抗凝集試薬を含まない）、細胞をトランスフェクション当日に対数増殖期になるように培養した。
【0050】
２)トランスフェクション複合体の準備
ａ ＤＮＡを一部の完全培地に希釈し、穏やかに混合した。
ａ ＤＮＡを一部の完全培地に希釈し、穏やかに混合した。
【0051】
ｂ ＰＥＩトランスフェクション試薬を他の一部の完全培地に希釈し、穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。
【0052】
ｃ 希釈したＤＮＡに希釈したＰＥＩを加えてトランスフェクション混合物の総体積を３ｍｌとし、穏やかに混合し、室温で２０～３０分間インキュベートした。
【0053】
３)トランスフェクション：トランスフェクション混合物３ｍｌを細胞懸濁液２７ｍｌに加え、穏やかに混合し、３７℃、５％ＣＯ２、１３０ｒｐｍ条件下で細胞生存率が５０％以下に低下するまで培養し、サンプルを回収した。
【0054】
トランスフェクションの情報：
【0055】
【表1】
【0056】
（４）精製
遠心分離して上清を回収し、それぞれ１８本の１ｍｌのタンパク質Ａ精製カラムに充填し、充填剤をｐＨ７．５のＰＢＳでバランスし、最後にタンパク質Ａ樹脂と培養上清を混合して一晩インキュベートし、インキュベート終了後に精製した。ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液で洗浄し、２０ｍＭ、ｐＨ２．７のクエン酸緩衝液で溶出し、１Ｍ ｐＨ９．０のＴｒｉｓ ＨＣｌ中和緩衝液でＰＨ６．０に中和した。精製完了後、ＩＮ、ＦＴ、洗浄及び溶出のサンプルをそれぞれ２０ｕｌ採取し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実行した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりサンプルを回収して一晩透析した後、サンプルを集めて緩衝液交換と濃縮を行った。最終結果を図４に示す。
遠心分離して上清を回収し、それぞれ１８本の１ｍｌのタンパク質Ａ精製カラムに充填し、充填剤をｐＨ７．５のＰＢＳでバランスし、最後にタンパク質Ａ樹脂と培養上清を混合して一晩インキュベートし、インキュベート終了後に精製した。ｐＨ７．５のＰＢＳ緩衝液で洗浄し、２０ｍＭ、ｐＨ２．７のクエン酸緩衝液で溶出し、１Ｍ ｐＨ９．０のＴｒｉｓ ＨＣｌ中和緩衝液でＰＨ６．０に中和した。精製完了後、ＩＮ、ＦＴ、洗浄及び溶出のサンプルをそれぞれ２０ｕｌ採取し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを実行した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりサンプルを回収して一晩透析した後、サンプルを集めて緩衝液交換と濃縮を行った。最終結果を図４に示す。
【0057】
サンプルの情報
【0058】
【表2】
【0059】
ウェスタンブロットにより特異的結合を検証した。その中、１～１８は１８個のヒト化モノクローナル抗体、１９００９４１４Ｐ １１（ヒト ＩｇＧ１）はペリオスチンキメラ抗体、４５－２－Ｇ３－１－Ｇ７－Ｂ７はペリオスチンマウスモノクローナル抗体であった。結果を下表及び図５に示す。
【0060】
【表3】
【0061】
ヒト化抗体ＥＬＩＳＡの配置
【0062】
【表4】
【0063】
ＥＬＩＳＡ検出結果
【0064】
【表5】
【0065】
３．ヒト化抗体の安定なトランスフェクション株の構築と発現
（１）ベクターの構築
前ステップの瞬時トランスフェクション試験の結果から、１８号抗体５５１－ＶＨＢ／１３９－ＶＬＡの発現量が最も高く、結合能力が要件を満たしていることが分かった。そして、発現量及び抗体結合能力を総合的に考慮したところ、５５１－ＶＨＢと１３９－ＶＬＡをペリオスチンヒト化抗体の重鎖と軽鎖とし、発現ベクターｐＡＴＸ－ＧＳ２にサブクローニングした後、ＣＨＯ細胞に同時トランスフェクションして抗体タンパク質を発現させた。アガロースゲル電気泳動の結果を図６に示す。
（１）ベクターの構築
前ステップの瞬時トランスフェクション試験の結果から、１８号抗体５５１－ＶＨＢ／１３９－ＶＬＡの発現量が最も高く、結合能力が要件を満たしていることが分かった。そして、発現量及び抗体結合能力を総合的に考慮したところ、５５１－ＶＨＢと１３９－ＶＬＡをペリオスチンヒト化抗体の重鎖と軽鎖とし、発現ベクターｐＡＴＸ－ＧＳ２にサブクローニングした後、ＣＨＯ細胞に同時トランスフェクションして抗体タンパク質を発現させた。アガロースゲル電気泳動の結果を図６に示す。
【0066】
（２）ペリオスチンヒト化抗体の発現
目的の断片を二重消化（ＥｃｏＲ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ）してライゲーションし、発現ベクターｐＡＴＸ－ＧＳ２にサブクローニングし、その後ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクションした。ＭＳＸ加圧スクリーニング、ＥＬＩＳＡ限界希釈により安定な細胞株を得た。３７℃、５％二酸化炭素のシェーカー培養器で７日間培養した後、上清を回収し、上清中のヒト化抗体をアガロースゲルプロテインＡ充填剤したアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
目的の断片を二重消化（ＥｃｏＲ Ｉ／Ｎｏｔ Ｉ）してライゲーションし、発現ベクターｐＡＴＸ－ＧＳ２にサブクローニングし、その後ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクションした。ＭＳＸ加圧スクリーニング、ＥＬＩＳＡ限界希釈により安定な細胞株を得た。３７℃、５％二酸化炭素のシェーカー培養器で７日間培養した後、上清を回収し、上清中のヒト化抗体をアガロースゲルプロテインＡ充填剤したアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【0067】
１）プラスミドの線形化
抽出したプラスミドＰＡＴＸ－ＧＳ２－１３９－ＶＬＡ－５５１－ＶＨＢをあらかじめ１０ｕｌバックアップした（線形化が成功したかどうかを検証するため）。その後に、プラスミドに酵素、バッファーを順に加えて混合した。ＥＰチューブをフロートに挿入し、酵素消化のために３７度の水浴に約１～２時間置いた。酵素消化に成功した後、回收を行った。具体的には、消化システムの体積に対する０．７５倍のイソプロパノールを加えて混合し、４℃で３０分間遠心分離した後に上清を捨て、１ｍｌの７０％エタノールを加えて４℃で５分間遠心分離し、ゲルを泳動して濃度を測定した（図７）。
抽出したプラスミドＰＡＴＸ－ＧＳ２－１３９－ＶＬＡ－５５１－ＶＨＢをあらかじめ１０ｕｌバックアップした（線形化が成功したかどうかを検証するため）。その後に、プラスミドに酵素、バッファーを順に加えて混合した。ＥＰチューブをフロートに挿入し、酵素消化のために３７度の水浴に約１～２時間置いた。酵素消化に成功した後、回收を行った。具体的には、消化システムの体積に対する０．７５倍のイソプロパノールを加えて混合し、４℃で３０分間遠心分離した後に上清を捨て、１ｍｌの７０％エタノールを加えて４℃で５分間遠心分離し、ゲルを泳動して濃度を測定した（図７）。
【0068】
酵素消化システム：
【0069】
【表6】
【0070】
２）トランスフェクション
組換え抗体を安定して発現するトランスフェクション細胞プールを得るために、ＣＨＯ－Ｋ１細胞をＰＶＵＩ線形化プラスミドｐＡＴＸ－ＧＳ２－１３９－ＶＬＡ－５５１－ＶＨＢでトランスフェクションし、化学的にトランスフェクションした（ＦｅｃｔｏＣＨＯTM発現システムトランスフェクションキット）。
組換え抗体を安定して発現するトランスフェクション細胞プールを得るために、ＣＨＯ－Ｋ１細胞をＰＶＵＩ線形化プラスミドｐＡＴＸ－ＧＳ２－１３９－ＶＬＡ－５５１－ＶＨＢでトランスフェクションし、化学的にトランスフェクションした（ＦｅｃｔｏＣＨＯTM発現システムトランスフェクションキット）。
【0071】
（３）加圧スクリーニング
４８時間トランスフェクション後、対応する選択圧力スクリーニングをトランスフェクションされた宿主細胞に適用した。ただし、本発明は、ＧＳスクリーニングシステム（glutamine synthetase Gene Expression System）を使用した。細胞を加圧し、細胞を３０ｕｍの濃度のＭＳＸで処理した。具体的には、６ウェルプレート標準バッチ培養法を使用してＭＳＸに対するＣＨＯ－Ｋ１細胞株の自然耐性をそれぞれ測定し、トランスフェクションされていない細胞株ＣＨＯ－Ｋ１に対するＭＳＸの最小死滅濃度を測定したところ、２０ｕＭであった。３０ｕｍの濃度のＭＳＸを加え、耐性のある安定した細胞が出現するまで３～４日ごとに新しいスクリーニング培地を交換した。２～３週間ＭＳＸスクリーニング後、３つの安定細胞プールが生成した。
４８時間トランスフェクション後、対応する選択圧力スクリーニングをトランスフェクションされた宿主細胞に適用した。ただし、本発明は、ＧＳスクリーニングシステム（glutamine synthetase Gene Expression System）を使用した。細胞を加圧し、細胞を３０ｕｍの濃度のＭＳＸで処理した。具体的には、６ウェルプレート標準バッチ培養法を使用してＭＳＸに対するＣＨＯ－Ｋ１細胞株の自然耐性をそれぞれ測定し、トランスフェクションされていない細胞株ＣＨＯ－Ｋ１に対するＭＳＸの最小死滅濃度を測定したところ、２０ｕＭであった。３０ｕｍの濃度のＭＳＸを加え、耐性のある安定した細胞が出現するまで３～４日ごとに新しいスクリーニング培地を交換した。２～３週間ＭＳＸスクリーニング後、３つの安定細胞プールが生成した。
【0072】
１２５ｍｌ振盪フラスコ中で、細胞を標準条件（３７℃、５％ＣＯ２、１３０ｒｐｍ）下で、３０ｍｌの選択的培地中に培養した。細胞が振盪フラスコ中で良好な状態になっている時、３０ｍｌの流加発現試験を行い、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７及びＤ９に培地補充物を添加し、プロセス全体に亘って血糖を監視した。３世代を培養し続け、細胞生存能力が５０％以下に低下するまで培養を終了し、培養液上清を回収し、精製分析を行った。精製結果を図８に示す。図中、「還元」は還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示し、「非還元」は非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示した。
【0073】
サンプルの情報：
【0074】
【表7】
【0075】
（４）限界希釈法によるモノクローナル抗体の単離：安定プール３（Ｓｔａｂｌｅ ｐｏｏｌ ３）ポリクローニング細胞株を選択して限界希釈モノクローナル加圧プレーティングを行い、得られた安定トランスフェクションプールの細胞懸濁液を、各ウェルに平均１個の細胞を播種するように、非常に低密度に希釈した。発現量の高い５－Ｇ４、５－Ｅ６、５－Ｇ６、５－Ｄ７、５－Ｇ９、２－Ｈ３、２－Ｃ７の合計７株のモノクローナル細胞株をＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングしてその後の拡大培養に供した。抗体濃度を１：３倍希釈勾配で順に１、０．３３、０．１１、０．０３７、０．０１２、０．００４、０．００１４ｕｇ／ｍｌとし、ブランク対照を合計８つの勾配とした。
【0076】
モノクローナルを顕微鏡で観察し、ＥＬＳＩＡ法により陽性モノクローナルを検出し、結果を下表に示す。
【0077】
抗体のＥＬＩＳＡ結果：
【0078】
【表8】
【0079】
クローン５－Ｇ４、２－Ｃ７、５－Ｅ６、５－Ｇ９、２－Ｈ３、５－Ｄ７、５－Ｇ６の細胞を、１２５ｍｌの振盪フラスコ中の３０ｍｌの選択的培地中に標準条件（３７℃、５％二酸化炭素、１３０回転／分）下で３世代培養した。細胞が振盪フラスコ中で良好な状態になっている時、３０ｍｌの流加発現試験を行った。Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７及びＤ９に培地補充物を添加した。プロセス全体に亘って血糖を監視した。細胞生存能力が５０％以下に低下するまで培地を回収した。精製結果を図９に示す。
【0080】
サンプル情報：
【0081】
【表9】
【0082】
（５）ヒト化抗ペリオスチン抗体の同定
発現量及びＥＬＩＳＡスクリーニング結果から、３株の安定なトランスフェクションした細胞株５－Ｇ４、５－Ｇ６、５－Ｇ９を選択してＷＢ検出を行い、結合特異性を検証した。
発現量及びＥＬＩＳＡスクリーニング結果から、３株の安定なトランスフェクションした細胞株５－Ｇ４、５－Ｇ６、５－Ｇ９を選択してＷＢ検出を行い、結合特異性を検証した。
【0083】
実験条件：抗原１ｕｇ、一次抗体を１：１０００で希釈、１時間インキュベート、二次抗体を１：１００００で希釈、４５分間インキュベート。結果を図１０に示す。
【0084】
図１０から分かるように、５－Ｇ４、５－Ｇ６、５－Ｇ９の３株の安定なトランスフェクションした株はペリオスチン抗原タンパク質に特異的に結合した。
【0085】
４．抗ペリオスチンヒト化抗体の抗線維化作用に関する研究
４．１ 研究方法
５－Ｇ６安定なトランスフェクション株の抗体を、インビボ及びインビトロで線維芽細胞のクロスウェル遊走試験、遊走細胞数研究をそれぞれ行い、免疫組織化学によりマウスの線維芽細胞の遊走を分析し、ＨＥ及びマッソン染色によりマウス組織の病理学的変化を観察し、線維化面積比率を研究し、蛍光定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりマウス線維化モデルにおけるＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１及びＣｏｌ１ａ２）及びＩＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ３ａ１）ｍＲＮＡの発現をそれぞれ検出した。実験には、ペリオスチン＋対照ＩｇＧを含む馴化培地を対照ＩｇＧ群とし、ペリオスチン＋ヒト化ペリオスチン抗体を含む馴化培地の試験群をＰｏｓｔｎ ｎＡｂ群とした。
４．１ 研究方法
５－Ｇ６安定なトランスフェクション株の抗体を、インビボ及びインビトロで線維芽細胞のクロスウェル遊走試験、遊走細胞数研究をそれぞれ行い、免疫組織化学によりマウスの線維芽細胞の遊走を分析し、ＨＥ及びマッソン染色によりマウス組織の病理学的変化を観察し、線維化面積比率を研究し、蛍光定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりマウス線維化モデルにおけるＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１ａ１及びＣｏｌ１ａ２）及びＩＩＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ３ａ１）ｍＲＮＡの発現をそれぞれ検出した。実験には、ペリオスチン＋対照ＩｇＧを含む馴化培地を対照ＩｇＧ群とし、ペリオスチン＋ヒト化ペリオスチン抗体を含む馴化培地の試験群をＰｏｓｔｎ ｎＡｂ群とした。
【0086】
ウィルコクソンの順位和検定により、線維化面積比率、陽性浸潤線維芽細胞数と線維芽細胞比率、及び遊走線維芽細胞数の中央値を比較した。
【0087】
最後的な統計手法：ＳＰＳＳ統計ソフトを使用して実験データを処理し、分散を使用して群間の分析を行った。すべての統計分析において、有意性はｐ＜０．０５と定義した。
【0088】
４．２ 研究結果
４．２．１ クロスウェル遊走実験（cross hole migration testing）には、ブランク対照群はＰｏｓｔｎ ｎＡｂ群よりも移動線維芽細胞数がはるかに多かった。つまり、Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ群は線維芽細胞の遊走を効果的に阻害できた。この結果はＰｏｓｔｎ ｎＡｂのインビトロでの有効性を示した。
４．２．１ クロスウェル遊走実験（cross hole migration testing）には、ブランク対照群はＰｏｓｔｎ ｎＡｂ群よりも移動線維芽細胞数がはるかに多かった。つまり、Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ群は線維芽細胞の遊走を効果的に阻害できた。この結果はＰｏｓｔｎ ｎＡｂのインビトロでの有効性を示した。
【0089】
４．２．２ １４ｄｐｉの場合、免疫組織学的分析により、ブランク対照群と比較比べると、Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂは浸潤線維芽細胞の数を減少させることが示された。
【0090】
４．２．３ ２８ｄｐｉ場合の線維化面積比率において、Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ群のマウスはブランク対照群マウスにより線維化面積が有意に減少した。
【0091】
４．２．４ Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ群マウスにおけるＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンｍＲＮＡ発現量は、ブランク対照群マウスよりも有意に低下した（Ｐ＜０．０５）。
【0092】
研究結論：本研究では抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体を調製した。調製された抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は体内のペリオスチンタンパク質に特異的に結合することができ、それにより体内の線維化作用を効果的に阻害することができた。従って、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、網膜線維化を治療する新たな薬剤となることが期待される。
【0093】
５．ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体のインビトロ活性の実験
５．１ 微小管阻害実験
ＨＵＶＥＣ細胞をインビトロで培養し、５００００個／ウェル（２４時間）で１２ウェルプレートにそれぞれプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した後、１６時間薬剤処理を行い、血管形成実験を行った。実験中、観察して適切な時点で写真を撮影して記録し、実験結果を記録して下表及び図１１を示す。
５．１ 微小管阻害実験
ＨＵＶＥＣ細胞をインビトロで培養し、５００００個／ウェル（２４時間）で１２ウェルプレートにそれぞれプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した後、１６時間薬剤処理を行い、血管形成実験を行った。実験中、観察して適切な時点で写真を撮影して記録し、実験結果を記録して下表及び図１１を示す。
【0094】
【表10】
【0095】
表の結果から、抗体濃度が増加するにつれて微小管の量が減少し、同じ濃度でヒト化モノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体よりも微小管阻害率が高いことが分かった。これから、上記ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、ヒト血管内皮細胞における微小管形成に対するペリオスチンの作用を阻害できることが確認できた。
【0096】
５．２ ＲＰＥ細胞をインビトロで培養し、グループ化し、細胞遊走、細胞浸潤及び細胞スクラッチ実験をそれぞれ行った。
ａ 組換えペリオスチンタンパク質又は抗体を含まないブランク対照群（コントロール）
ｂ ペリオスチンのみを含むペリオスチン群
ｃ ペリオスチン＋対照ＩｇＧを含む対照ＩｇＧ群
ｄ ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂを含むペリオスチン抗体群
Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ：本発明で調製されたペリオスチンヒト化抗体
ａ 組換えペリオスチンタンパク質又は抗体を含まないブランク対照群（コントロール）
ｂ ペリオスチンのみを含むペリオスチン群
ｃ ペリオスチン＋対照ＩｇＧを含む対照ＩｇＧ群
ｄ ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂを含むペリオスチン抗体群
Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ：本発明で調製されたペリオスチンヒト化抗体
【0097】
５．２．１ 細胞遊走実験
トランズウェル検出
（１）細胞を遠心分離した後、培地を捨て、ＰＢＳで１～２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地で再懸濁し、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整した。
トランズウェル検出
（１）細胞を遠心分離した後、培地を捨て、ＰＢＳで１～２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地で再懸濁し、細胞密度を１×１０５個／ｍｌに調整した。
【0098】
（２）細胞懸濁液２００μｌをトランズウェルチャンバーに加え、１０％ＦＢＳを含む培地６００μｌを２４ウェルプレートの下部チャンバーに加え、３７℃で１６～２４時間培養した。
【0099】
（３）トランズウェルチャンバーを取り出し、ウェル中の培地を捨てＰＢＳで２回洗浄した。
【0100】
（４）４％ＰＦＡで１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄した。
【0101】
（５）クリスタルバイオレットで１０分間染色し、ＰＢＳで２回洗浄した。
【0102】
【0103】
実験結果
【0104】
【表11】
【0105】
実験結果、細胞遊走率及び遊走細胞数は、ペリオスチン処理群の方がブランク対照群（コントロール）により有意に増加した（Ｐ＜０．００１）のに対して、ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ処理群の方がブランク対照群より有意に低く（Ｐ＜０．００１）、ペリオスチン＋ＩｇＧ処理群はペリオスチン処理群よりも細胞遊走の程度がわずかに小さかったことが分かった。これから、ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体はペリオスチンによるＲＰＥ細胞の遊走を阻害できることが示された。
【0106】
５．２．２ 細胞浸潤実験
トランズウェルチャンバーをＭａｔｒｉｇｅｌマトリゲルであらかじめ塗布し、一定濃度の細胞懸濁液を加え、下部チャンバーにＦＢＳを含む培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間培養した後、観察し、写真を撮影し（図１４）、遊走細胞数を統計した（図１５）。
トランズウェルチャンバーをＭａｔｒｉｇｅｌマトリゲルであらかじめ塗布し、一定濃度の細胞懸濁液を加え、下部チャンバーにＦＢＳを含む培地を加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間培養した後、観察し、写真を撮影し（図１４）、遊走細胞数を統計した（図１５）。
【0107】
【表12】
【0108】
その結果、細胞遊走率及び浸潤細胞数は、ブランク対照群と比べると、ペリオスチン処理群の方が有意に増加した（Ｐ＜０．０１）のに対し、ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ処理群の方が有意に低下し（Ｐ＜０．０１）、また、ペリオスチン＋ＩｇＧ処理群はペリオスチン処理群よりＲＰＥ細胞遊走の程度がわずかに小さかったことが分かった。この結果は、ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体はペリオスチンを阻害する作用を持っていることが示された。
【0109】
５．２．３ スクラッチ実験
（１）細胞を上記グループ化処理後に１０μｌのピペットチップを使用してウェルプレートに対して垂直に細胞スクラッチを付け、各スクラッチの幅が一定になるようにした。
（１）細胞を上記グループ化処理後に１０μｌのピペットチップを使用してウェルプレートに対して垂直に細胞スクラッチを付け、各スクラッチの幅が一定になるようにした。
【0110】
（２）細胞培地を吸い取り、ＰＢＳでウェルプレートを３回洗浄し、スクラッチにより生じた細胞破片を洗浄し、対応する無血清培地を加えた。
【0111】
（３）培養プレートをインキュベーターに入れて培養し、０時間、６時間、２４時間、４８時間でそれぞれ写真を撮影した。
【0112】
回収した画像データに基づいて実験結果を分析した（図１６～１７）。細胞を上記グループ化処理後に１０μｌのピペットチップを使用してウェルプレートに対して垂直に細胞スクラッチを付け、培養プレートをインキュベーターに入れて培養し、０時間、６時間、２４時間、４８時間でそれぞれ写真を撮影した。このように分析を行って実験結果を得た。
【0113】
【表13】
【0114】
実験結果、４８時間培養後、ペリオスチン処理群はブランク対照群により細胞の相対移動距離が有意に増加した（Ｐ＜０．０１）のに対し、ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ処理群はブランク対照群より有意に低く（Ｐ＜０．００１）、またペリオスチン＋ＩｇＧ処理群はペリオスチン処理群よりＲＰＥ細胞遊走の程度がわずかに小さかったことが分かった。この結果から、ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体はペリオスチンがＲＰＥ細胞を誘発する作用を阻害できることが示された。
【0115】
５．３ ウェスタンブロット検出の結果
ＲＰＥ細胞の異なる群におけるＶＥＧＦＡ、α－ＳＭＡ、Ｃｏｌ Ｉ、Ｃｏｌ ＩＩＩ、フィブロネクチンのタンパク質の発現を検出した。
ＲＰＥ細胞の異なる群におけるＶＥＧＦＡ、α－ＳＭＡ、Ｃｏｌ Ｉ、Ｃｏｌ ＩＩＩ、フィブロネクチンのタンパク質の発現を検出した。
【0116】
ＶＥＧＦＡ（血管内皮増殖因子）Ａは、ＶＥＧＦＡは血管新生反応を誘発し、血管の再生を促進するものである。
【0117】
α－ＳＭＡ（α－平滑筋アクチン）は、血管壁、腸粘膜筋層や固有筋層、及び様々な組織の間質に存在し、筋線維芽細胞及び筋上皮細胞で高度に発現されており、器官線維化の研究で線維化の重症度に応じて増加するということが研究によって示されていた。
【0118】
Ｃｏｌ Ｉ、Ｃｏｌ ＩＩＩ（Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲン）は、皮膚損傷の修復プロセス及び修復品質と密接に関係しているものである。真皮層線維芽細胞の増殖を促進し、主に皮膚、腱、靱帯、血管などの結合組織が存在し、細胞外マトリックスネットワーク構造を形成し、器官を支持して身体を保護する役割を果たしており、細胞の付着や細胞の遊走にも関与している。
【0119】
フィブロネクチンフィブロネクチンは、細胞の接着成長を促進し、細胞の接着、遊走又は腫瘍転移、胚発育、成長及び分化などに影響を与えるものである。
【0120】
【表14】
【0121】
実験結果（図１８～１９）から、ブランク対照群（コントロール）と比較すると、ペリオスチン処理群、ペリオスチン＋ＩｇＧ処理群、ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ処理群はタンパク質発現の差がすべて統計的に有意であり（Ｐ＜０．００１）、また、ブランク対照群（コントロール）と比較すると、ペリオスチン処理群はタンパク質発現量が有意に増加した（Ｐ＜０．００１）のに対し、ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ処理群はＶＥＧＦＡ、α－ＳＭＡ、ＣｏｌＩ 、Ｃｏｌ ＩＩＩ、フィブロネクチンのタンパク質の発現量がすべて有意に低下した（Ｐ＜０．００１）ことが示される。これにより、ペリオスチンモノクローナル抗体は、ＶＥＧＦＡ、α－ＳＭＡ、Ｃｏｌ Ｉ、Ｃｏｌ ＩＩＩ、フィブロネクチンのタンパク質の発現を阻害できることが示された。
【0122】
６． ＨＵＶＥＣ細胞のインビトロでの蛍光定量ＰＣＲ、ＷＢ、ＩＦ検出
ペリオスチンは、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）－局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）－ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ／ＰＫＢ）シグナル伝達経路を介して網膜血管の形成と線維化を促進できるものである。そして、蛍光定量的ＰＣＲ技術、免疫蛍光及びウェスタンブロッティング法によりヒト血管内皮細胞膜上のインテグリン（αｖβ３、αｖβ５）、内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２）、ＦＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴのｍＲＮＡ発現量及びタンパク質発現レベルの差次的変化を測定することにより、ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は硝子体網膜線維化性病変に対する治療作用を有することが確認された。
ペリオスチンは、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）－局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）－ホスホイノシチド３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）－プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ／ＰＫＢ）シグナル伝達経路を介して網膜血管の形成と線維化を促進できるものである。そして、蛍光定量的ＰＣＲ技術、免疫蛍光及びウェスタンブロッティング法によりヒト血管内皮細胞膜上のインテグリン（αｖβ３、αｖβ５）、内皮増殖因子受容体－２（ＶＥＧＦＲ－２、ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２）、ＦＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴのｍＲＮＡ発現量及びタンパク質発現レベルの差次的変化を測定することにより、ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は硝子体網膜線維化性病変に対する治療作用を有することが確認された。
【0123】
ヒトＨＵＶＥＣ細胞をインビトロで培養してグループ分けした。
ａ 組換えペリオスチンタンパク質又は抗体を含有しないブランク対照群（コントロール）：
ｂ ペリオスチンのみを含むペリオスチン群
ｃ ペリオスチン＋対照ＩｇＧを含む対照ＩｇＧ群
ｄ ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂを含むペリオスチン抗体群
Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ：本発明で調製されたペリオスチンヒト化抗体
ａ 組換えペリオスチンタンパク質又は抗体を含有しないブランク対照群（コントロール）：
ｂ ペリオスチンのみを含むペリオスチン群
ｃ ペリオスチン＋対照ＩｇＧを含む対照ＩｇＧ群
ｄ ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂを含むペリオスチン抗体群
Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ：本発明で調製されたペリオスチンヒト化抗体
【0124】
ヒトペリオスチンタンパク質及び抗体をまず１時間インキュベートし、次に細胞に添加して再度２４時間処理した後、下記の検出を行った。対照ＩｇＧの作業濃度は、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の濃度と同じであった。
【0125】
６．１ 蛍光定量的ＰＣＲ測定
血管内皮細胞膜上のαｖβ３、αｖβ５インテグリン，ＶＥＧＦＲ－２、ＦＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴのｍＲＮＡ発現量を検出した。
血管内皮細胞膜上のαｖβ３、αｖβ５インテグリン，ＶＥＧＦＲ－２、ＦＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴのｍＲＮＡ発現量を検出した。
【0126】
図２０から、ブランク対照群と比較すると、ペリオスチン処理群はαｖβ３、αｖβ５、ＶＥＧＦＲ－２、ＦＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴ遺伝子の発現が増加し、ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ処理群は遺伝子発現量が低下し、特にＶＥＧＦＲ－２のｍＲＮＡ発現量がブランク対照群より有意に低かった（Ｐ＜０．００１）ことが分かった。これにより、ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体はＶＥＧＦＲ－２、ＦＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴのｍＲＮＡ遺伝子の発現を阻害できることが示された。
【0127】
６．２ ウェスタンブロットによるＨＵＶＥＣ細胞におけるαｖβ３、αｖβ５、ＶＥＧＦＲ－２、ＦＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴタンパク質の発現の検出
正常培養したＨＵＶＥＣ細胞を１０６個／ディッシュ（６ｃｍディッシュ）でプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した。細胞を一晩接着させた後、グループ分けて処理した。ＢＣＡキットで総タンパク質含有量を検出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動後にメンブレンに転写し、ブロッキング液でブロッキングし、洗浄後に一次抗体を加えて４℃で一晩冷蔵し、メンブレンを洗浄し、二次抗体をを加えて室温でシェーカーで１時間インキュベートし、発色させた。各群のグレー値と同じ条件下での内部基準グレー値との割合を、各タンパク質の相対発現量として算出した。
正常培養したＨＵＶＥＣ細胞を１０６個／ディッシュ（６ｃｍディッシュ）でプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した。細胞を一晩接着させた後、グループ分けて処理した。ＢＣＡキットで総タンパク質含有量を検出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動後にメンブレンに転写し、ブロッキング液でブロッキングし、洗浄後に一次抗体を加えて４℃で一晩冷蔵し、メンブレンを洗浄し、二次抗体をを加えて室温でシェーカーで１時間インキュベートし、発色させた。各群のグレー値と同じ条件下での内部基準グレー値との割合を、各タンパク質の相対発現量として算出した。
【0128】
異なる群のＨＵＶＥＣ細胞における各タンパク質の発現及びグレー分析を図２１～２２に示す。実験結果から、ブランク対照群と比較すると、ペリオスチン処理群はαｖβ３、αｖβ５、ＶＥＧＦＲ－２、ＦＡＫ、ＰＩ３Ｋ、ｐ－ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｐ－ＡＫＴタンパク質の発現が増加したのに対し、ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ処理群はタンパク質発現量が低下し、ペリオスチン処理群よりも低かったことが示された。これにより、ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体はペリオスチンの作用を阻害できることが示された。
【0129】
６．３ ＩＦによるＨＵＶＥＣ細胞におけるαｖβ３、αｖβ５、ＶＥＧＦＲ－２、ＦＡＫタンパク質の発現の検出
培養プレート中で、細胞が付着したスライドをＰＢＳに浸し、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で室温で２０分間透過処理し、一次抗体を加えて湿潤ボックスを入れて４℃で一晩インキュベートし、蛍光二次抗体を加え、湿潤ボックスで２０～３７℃で１時間インキュベートし、ＤＡＰＩ核対比染色を滴下し、スライドを密閉して蛍光顕微鏡で観察した（図２３～２６）。
培養プレート中で、細胞が付着したスライドをＰＢＳに浸し、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で室温で２０分間透過処理し、一次抗体を加えて湿潤ボックスを入れて４℃で一晩インキュベートし、蛍光二次抗体を加え、湿潤ボックスで２０～３７℃で１時間インキュベートし、ＤＡＰＩ核対比染色を滴下し、スライドを密閉して蛍光顕微鏡で観察した（図２３～２６）。
【0130】
蛍光顕微鏡で観察した結果：ペリオスチンタンパク質はＨＵＶＥＣ細胞の細胞質で発現された。αｖβ３、αｖβ５、ＶＥＧＦＲ－２、ＦＡＫタンパク質のブランク対照群は、細胞の細胞質が弱い蛍光を示した。ペリオスチン処理群は、細胞の細胞質が強い蛍光を示した。ペリオスチン＋Ｐｏｓｔｎ ｎＡｂ処理群は、ペリオスチン処理群より細胞の蛍光シグナルが有意に弱く、かつ、ブランク対照群と比較すると有意差が見られなかった。これらの結果により、ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、インテグリン－ＦＡＫ－ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ／ＰＫＢシグナル伝達経路を遮断してペリオスチンの作用を遮断することにより、網膜線維化を阻害することができたことが示された。
【0131】
以上の記載は本発明の好適な実施形態に過ぎない。当業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、若干の改善や修正を行い得る。これらの改善及び修正は本発明の保護範囲に含まれたものとみなされることに留意する必要がある。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-03-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重鎖の可変領域が配列番号１で示されるアミノ酸配列を有し、軽鎖の可変領域が配列番号２で示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体。
【請求項2】
重鎖の定常領域がヒトＩｇＧ１であり、軽鎖の定常領域がヒトκ型であることを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項3】
重鎖のアミノ酸配列が配列番号３で示され、軽鎖のアミノ酸配列が配列番号４で示されることを特徴とする、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体をコードする核酸。
【請求項5】
重鎖をコードする核酸が、配列番号５で示される核酸配列を有し、軽鎖をコードする核酸が、配列番号６で示される核酸配列を有することを特徴とする、請求項４に記載の核酸。
【請求項6】
重鎖をコードする核酸が、配列番号７で示される核酸配列を有し、軽鎖をコードする核酸が、配列番号８で示される核酸配列を有することを特徴とする、請求項５に記載の核酸。
【請求項7】
請求項４～６のいずれか１項に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項8】
ベクターバックボーンがＰＡＴＸ－ＧＳ２であることを特徴とする、請求項７に記載の発現ベクター。
【請求項9】
請求項８に記載の発現ベクターを形質転換又はトランスフェクションする宿主細胞。
【請求項10】
請求項９に記載の宿主細胞を培養し、抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の発現を誘発する工程を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の製造方法。
【請求項11】
組織線維化病変及び／又は悪性腫瘍を治療するための薬剤であって、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体を含むことを特徴とする、薬剤。
【請求項12】
組織線維化病変及び／又は悪性腫瘍を診断するためのキットであって、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体を含むか、
或いは請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体と化学標識又は生物標識とを形成した結合物を含むか、
或いは請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体と固体媒体又は半固体媒体とをカップリングした複合体を含むことを特徴とする、キット。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0017】
また、本発明は組織線維化病変及び／又は悪性腫瘍を治療するための薬剤又は組織線維化病変及び／又は悪性腫瘍を診断するための検出試薬の製造における抗ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体の使用を提供する。いくつかの実施形態において、前記組織線維化病変は網膜線維化である。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0020】
本発明における前記化学標識は、同位体、免疫毒素、及び／又は化学薬品である。前記生物標識は、ビオチン、アビジン、又は酵素標識である。前記酵素標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼであることが好ましい。前記免疫毒素は、アフラトキシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素、リシン（rｉｃｉｎ）、アブリン（ａｂｒｉｎ）、ヤドリギレクチン（ｍｉｓｔｌｅｔｏｅ ｌｅｃｔｉｎ）、モデッシン(ｍｏｄｅｃｃｉｎ)、ＰＡＰ、サポリン（ｓａｐｏｒｉｎ）、ゲロニン（Ｇｅｌｏｎｉｎ）又はルフィンであることが好ましい。前記複合体中の固体媒体又は非固体媒体は、コロイド金、ポリスチレンプレート及びビーズならなる群から選択される。このキットは、組織線維化病変及び／又は悪性腫瘍の診断に使用できる。前記診断の方法には、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫蛍光技術、免疫組織化学的検出などの免疫学的検出方法が採用される。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0021】
また、本発明は、本発明による薬剤を投与することにより組織線維化病変及び／又は悪性腫瘍を治療する方法を提供する。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0022】
また、本発明は、本発明による診断試薬を使用して診断するにより組織線維化病変及び／又は悪性腫瘍を診断する方法を提供する。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0024】
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0072】
１２５ｍｌ振盪フラスコ中で、細胞を標準条件（３７℃、５％ＣＯ２、１３０ｒｐｍ）下で、３０ｍｌの選択的培地中に培養した。細胞が振盪フラスコ中で良好な状態になっている時、３０ｍｌの流加発現試験を行い、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７及びＤ９に培地補充物を添加し、プロセス全体に亘ってぶどう糖を監視した。３世代を培養し続け、細胞生存能力が５０％以下に低下するまで培養を終了し、培養液上清を回収し、精製分析を行った。精製結果を図８に示す。図中、「還元」は還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示し、「非還元」は非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示した。
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0079】
クローン５－Ｇ４、２－Ｃ７、５－Ｅ６、５－Ｇ９、２－Ｈ３、５－Ｄ７、５－Ｇ６の細胞を、１２５ｍｌの振盪フラスコ中の３０ｍｌの選択的培地中に標準条件（３７℃、５％二酸化炭素、１３０回転／分）下で３世代培養した。細胞が振盪フラスコ中で良好な状態になっている時、３０ｍｌの流加発現試験を行った。Ｄ３、Ｄ５、Ｄ７及びＤ９に培地補充物を添加した。プロセス全体に亘ってぶどう糖を監視した。細胞生存能力が５０％以下に低下するまで培地を回収した。精製結果を図９に示す。
【手続補正9】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0093】
５．ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体のインビトロ活性の実験
５．１ 血管形成阻害実験
ＨＵＶＥＣ細胞をインビトロで培養し、５００００個／ウェル（２４時間）で１２ウェルプレートにそれぞれプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した後、１６時間薬剤処理を行い、血管形成実験を行った。実験中、観察して適切な時点で写真を撮影して記録し、実験結果を記録して下表及び図１１を示す。
５．１ 血管形成阻害実験
ＨＵＶＥＣ細胞をインビトロで培養し、５００００個／ウェル（２４時間）で１２ウェルプレートにそれぞれプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃で一晩培養した後、１６時間薬剤処理を行い、血管形成実験を行った。実験中、観察して適切な時点で写真を撮影して記録し、実験結果を記録して下表及び図１１を示す。
【手続補正10】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0095】
表の結果から、抗体濃度が増加するにつれて血管の量が減少し、同じ濃度でヒト化モノクローナル抗体はマウスモノクローナル抗体よりも血管形成阻害率が高いことが分かった。これから、上記ペリオスチンヒト化モノクローナル抗体は、ヒト血管内皮細胞における血管形成に対するペリオスチンの作用を阻害できることが確認できた。
【国際調査報告】