特表 2024-536054 タンパク質分解物質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-04

(54)【発明の名称】タンパク質分解物質

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/13 20060101AFI20240927BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240927BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20240927BHJP

【ＦＩ】

C07K1/13 ZNA

C12Q1/02

A61K38/05

A61P43/00 105

C07K19/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024518336

(86)(22)【出願日】2022-09-23

(85)【翻訳文提出日】2024-05-21

(86)【国際出願番号】 GB2022052408

(87)【国際公開番号】W WO2023047121

(87)【国際公開日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】2113656.9

(32)【優先日】2021-09-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500550717

【氏名又は名称】ユニヴァーシティー オブ ダンディー

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100136249

【弁理士】

【氏名又は名称】星野 貴光

(72)【発明者】

【氏名】チウリ アレッシオ

(72)【発明者】

【氏名】ボンド アダム ジョージ

(72)【発明者】

【氏名】クライゴン コナー ジョージ

(72)【発明者】

【氏名】チャン クォク ホ

(72)【発明者】

【氏名】テスタ アンドレア

(72)【発明者】

【氏名】アレッシ ダリオ

(72)【発明者】

【氏名】マッカートニー トーマス

【テーマコード（参考）】

4B063

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA05

4B063QA20

4B063QQ08

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QR55

4B063QS36

4B063QX02

4C084AA02

4C084BA01

4C084BA14

4C084BA32

4C084CA59

4C084NA14

4C084ZB21

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA51

4H045EA50

4H045FA10

(57)【要約】

本発明は、標的タンパク質にコンジュゲートするホール改変変異体ＢＥＴブロモドメインを含む融合タンパク質を形成し、タンパク質分解を開始するための分解化合物を使用することによって標的タンパク質を分解する方法に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（ＩＡ）の分解化合物。

【化1】

（式中、
Ｇは、メチル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル、アミノ、メトキシ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチル、ハロエチル、アミド、イソプロピル、及びメチルチオからなる群から選択される１個又は２個の置換基で置換されてもよい５員ヘテロアレーンであるか、又はＧは、メチル、ハロ、ヒドロキシ及びチオールで置換されてもよい６員アレーン又はヘテロアレーンであり；
Ｒは、Ｃ_1-4アルキル又はＣ_1-4ハロアルキルであり；
Ｒ¹は、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4ハロアルキル、Ｈ及びハロからなる群から選択されるいずれか１つであり；
Ｒ²は、Ｈ、Ｃ_1-3アルキル、Ｃ_1-3ハロアルキル又はハロであり；
Ｒ³は、ハロ、ヒドロキシル、チオール、アミド、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（Ｏ）ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6ハロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ及びＣ_1-6アルキルチオから独立して選択され；
Ｒ⁴及びＲ⁵は、Ｈ及びＣ_1-3アルキルから独立して選択され；
ｎは、０、１、２、３又は４であり；
Ｘはハロであり；
Ｄ’は、反応性基ＤとＤ’－Ｌを形成するためのプロリンカーとの生成物であり、Ｌは、Ｄ’をＢに結合することができる分子であり、Ｂは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができる分子である）

【請求項2】

Ｇが５員ヘテロアレーンである、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ｇがチオフェンである、請求項１に記載の化合物。

【請求項4】

Ｇが、
（ｉ）メチル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル、アミノ、メトキシ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチル、ハロエチル、アミド、イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル及びメチルチオからなる群から選択される１個又は複数個の置換基；又は
（ｉｉ）メチル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル及びアミノからなる群から選択される１個又は複数個の置換基
で置換されている、請求項２又は３に記載の化合物。

【請求項5】

Ｇがメチルで２回置換されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項6】

Ｒ³が、フルオロ、ヒドロキシル、チオール、アミド、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（Ｏ）ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4フルオロアルキル、Ｃ_1-4アルコキシ及びＣ_1-4アルキルチオから独立して選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項7】

Ｘがクロロであり、ｎが０である、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項8】

Ｒ¹が、
（ｉ）Ｃ_1-4アルキル及びＣ_1-4フルオロアルキル；又は
（ｉｉ）メチル又はトリフルオロメチル
からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項9】

Ｒ²がＨである、請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項10】

Ｒがエチルである、請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項11】

Ｄ’が、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）、（ＣＨ₂）_qＮＨ、（ＣＨ₂）_qＳ、（ＣＨ₂）_qＯ、（ＣＨ₂）_q及び１，２，３－トリアゾリレンからなる群から選択されるいずれか１つであり、ｐが０～４の整数であるか又は０であり、ｑが１～４の整数であるか又は１である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の分解化合物。

【請求項12】

Ｄ’がＣ（Ｏ）である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の分解化合物。

【請求項13】

分解化合物が式（ＩＶＡ）のものである、請求項１に記載の分解化合物。

【化2】

【請求項14】

Ｌが式（ＶＩＡ）のものである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の分解化合物。

【化3】

（式中、
波線は結合部位を示し；
Ｘ¹は存在していてもよく、Ｏ（ＣＨ₂）_s、ＮＨ（ＣＨ₂）_s及びＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）_sからなる群から選択されるいずれか１つであり；
Ｘ²は存在していてもよく、Ｏ（ＣＨ₂）_uＣ（Ｏ）、（ＣＨ₂）_uＮＨ、（ＣＨ₂）_uＯ及び（ＣＨ₂）_uＣ（Ｏ）からなる群から選択され；
Ｌ’は、Ｏ（ＣＨ₂）_t、ＣＨ₂、アルキニレン、トリアゾリレン、ピペラジニレン及びピペリジニレンからなる群から選択され；
ｓは０～４の整数であり、ｕは１～４の整数であり、ｔは１～４の整数である）

【請求項15】

Ｘ¹が、Ｏ（ＣＨ₂）₂及びＨＮ（ＣＨ₂）₂からなる群から選択されるいずれか１つであり；Ｘ²がＯＣＨ₂Ｃ（Ｏ）又はＣＨ₂ＮＨであり；Ｌ’がＯ（ＣＨ₂）_tであり、ｔが２又は３である、請求項１４に記載の分解化合物。

【請求項16】

Ｂが、式（ＶＩＩＡ）～（ＸＩＡ）のうちのいずれか１つによって表される構造のうちのいずれか１つである、請求項１～１５のいずれか１項に記載の分解化合物。

【化4】

（式中、Ｒ⁷は、Ｈ又はメチルであり、Ｚは、Ｆ又はＣＮである）

【請求項17】

式（ＸＩＸＡ）～（ＸＸＩＡ）のうちのいずれか１つである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の分解化合物。

【化5】

【請求項18】

標的タンパク質を分解するための、請求項１～１７のいずれか１項に記載の分解化合物の使用。

【請求項19】

標的タンパク質が、１個又は複数個のホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインを含むポリペプチドで内因的にタグ付けされる、請求項１８に記載の使用。

【請求項20】

ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインがＢｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａ又はＢｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ｖブロモドメインであり、タンパク質がＢＥＴタンパク質である、請求項１９に記載の使用。

【請求項21】

細胞内で標的タンパク質を分解する効果を研究する方法であって、
ホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドに融合した標的タンパク質を含む融合タンパク質を内因的に発現させること；
融合タンパク質を、請求項１～１７のいずれか１項に記載の分解化合物に接触させること；及び
標的タンパク質の分解の、細胞に対するあらゆる効果を観察すること
を含む方法。

【請求項22】

標的タンパク質が、ブロモ及び末端外ドメイン（ＢＥＴ）タンパク質、Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３、Ｂｒｄ４及びＢｒｄＴからの１個若しくは複数個のホール改変変異体ブロモドメイン、又はそれらの断片を含むブロモドメインで内因的にタグ付けされる、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

突然変異が、タンパク質に存在する１カ所又は複数カ所のブロモドメイン、又はそれらの断片を含むブロモドメインに存在する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

ホール改変変異体ブロモドメインが、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａ、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ｖ、Ｂｒｄ４_BD1Ｌ９４Ａ、Ｂｒｄ４_BD1Ｌ９４Ｖ、Ｂｒｄ２_BD2Ｌ３８３Ａ、Ｂｒｄ２_BD2Ｌ３８３Ｖ、Ｂｒｄ２_BD1Ｌ１１０Ａ、Ｂｒｄ２_BD1Ｌ１１０Ｖ、Ｂｒｄ３_BD2Ｌ３４４Ａ、Ｂｒｄ３_BD2Ｌ３４４Ｖ、Ｂｒｄ３_BD1Ｌ７０Ａ、Ｂｒｄ３_BD1Ｌ７０Ｖ、ＢｒｄＴ_BD2Ｌ３０６Ａ、ＢｒｄＴ_BD2Ｌ３０６Ｖ、ＢｒｄＴ_BD1Ｌ６３Ａ、又はＢｒｄＴ_BD1Ｌ６３Ｖブロモドメインである、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項25】

ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインがＢｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａ又はＢｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ｖブロモドメインを含む、請求項２２又は２３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的タンパク質にコンジュゲートするホール改変変異体ＢＥＴブロモドメインを含む融合タンパク質を形成し、タンパク質分解を開始するための分解化合物を使用することによって標的タンパク質を分解する方法に関する。ホール改変変異体ＢＥＴブロモドメイン、特に標的タンパク質にタグ付けされた変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインに結合することができる式（Ｉ）の化合物も提供する。さらに、本発明は、式（Ｉ）の化合物に由来するセグメントを含み、ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメイン、リンカー、及びＥ３ユビキチンリガーゼに結合することができるセグメントに結合することができる、式（ＩＡ）の分解化合物に関する。本発明は、タンパク質、特にホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインで内因的にタグ付けされたタンパク質を分解するための式（ＩＡ）の化合物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

標的タンパク質の分解は、化学生物学及び創薬の強力なモダリティとして確立されている。タンパク質分解ターゲティングキメラ（ＰＲＯＴＡＣ）は、Ｅ３ユビキチンリガーゼを目的の標的タンパク質に動員させることによってユビキチンプロテアソームシステムを妨害し、タンパク質のポリユビキチン化、その後のプロテアソーム分解を促進する異種二機能性分子である（Bond, M. J.; Crews, C. M., RSC Chemical Biology 2021, 2 (3), 725-742）。タンパク質を完全に急速に除去する能力は、単一の活性又は相互作用を単にブロックすることとは対照的に、標的タンパク質の生物学的性質、治療可能性を研究し、薬理学的に作用するための魅力的な作用機序を提供する。しかし、ＰＲＯＴＡＣアプローチは、タンパク質標的化に関与する小分子リガンドの利用能によって制限される。良好なリガンドが多くの標的タンパク質に関して利用可能であるが、ヒトプロテオームの大部分はこのような結合リガンドは存在しない（Oprea, T. I. et al., Nat Rev Drug Discov. 2018, 17 (5), 317-332）。したがって、その多くが生物学性質及び疾患において依然として未探索なままである、リガンドと結合させることができない（unligandable）タンパク質に取り組むための新規の方法論を開発することが重要である。

【0003】

結合リガンドを有さないタンパク質に作用させるために、相補的戦略には、「デグロンタグ」とも呼ばれるタグを添加することによって目的のタンパク質をコードする遺伝子を改変することが伴い、これによって、小分子をＥ３リガーゼに結合させ、Ｅ３リガーゼを直接動員させ、標的タンパク質をユビキチン化し、分解するのを可能にする。タグベースのデグロンシステムの例としては、これによって、標的タンパク質が分子接着性オーキシン存在下で（Natsume, T.; Kiyomitsu, T.; Saga, Y.; Kanemaki, M. T., Cell Reports 2016, 15 (1), 210-218.）、又は変異体ＴＩＲ１を選択的に標的とする、バンプを有する（bumped）類似体存在下で（Yesbolatova, A. et al., Nat Comm. 2020, 11 (1), 5701.）植物のカリン ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼＴＩＲ１によって認識されるＡＩＤ／ＩＡＡ１７デグロン配列と融合されている、オーキシン誘発性デグロン（ＡＩＤ）；一端では標的タンパク質に、もう一端ではＥ３リガーゼフォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）に融合したＨａｌｏタグと共有結合を形成するクロロアルカンウォーヘッド（warhead）を有する二機能性分子であるＨａｌｏＰＲＯＴＡＣ（Tovell, H. et al., ACS Chem Biol. 2019, 14 (5), 882-892）；及び一端では標的タンパク質に融合したＦＫＢＰ１２^F36Vタグに、もう一端ではセレブロン（ＣＲＢＮ）又はＶＨＬリガーゼに結合する二機能性分子であるｄＴＡＧ（Nabet, B. et al., Nat. Chem. Biol. 2018, 14 (5), 431-441）がある。これらのアプローチは、細胞内で及びｉｎ ｖｉｖｏで標的タンパク質の分解を誘導するのに成功裏に使用されてきたが、それら全てに不利益及び制限が認められた。例えば、ＡＩＤ法は、漏出しやすい場合があり（オーキシン投薬前でも背景的な標的分解が生じる）、作用するのに高濃度のオーキシンを必要とし、外来植物Ｅ３リガーゼの発現を可能にするための不便な追加の操作も必要とし；全ての制限がオフターゲット効果の可能性につながり得る。ＨａｌｏＰＲＯＴＡＣは、タグ付きタンパク質と共有結合で反応するため、最大限の分解を誘導するためにタグ付きタンパク質の化学量論的改変を必要とし、したがって、非共有結合分解物質の利点である準化学量論の触媒的作用様式が欠けており；結果的にＨａｌｏＰＲＯＴＡＣは、完全な標的分解を達成することができない傾向にあり、高用量でさえＤ_max約８５～９０％でプラトーになる傾向がある。ＣＲＢＮベースのｄＴＡＧは、化学的不安定性及びオフターゲット効果を示す場合があるフタルイミドベースのリガンドを有している（Ishoey, M. et al., ACS Chem Biol. 2018, 13 (3), 553-560）。

【0004】

小分子による古典的阻害と比較すると、ＰＲＯＴＡＣによって、いくつかの潜在的な利点が提供される：（１）下流の結果が全ての場合において同じである（すなわち、細胞内タンパク質レベルで枯渇する）ため、ＰＲＯＴＡＣは、遺伝子的ツール、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、又はクラスター化された規則的に間隔の短い反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）を使用したノックダウンを介して観察されるものと類似した表現型を発揮することが予想される。標的タンパク質が消失すると、生物学的な機能複合体の形成が撹乱されることによって追加の効果を与えることができる。（２）ＰＲＯＴＡＣは、触媒的に作用することができる（すなわち、１個のＰＲＯＴＡＣ分子が複数のＰＯＩ分子と入れ替わることができるように再利用することができる）ため、「準化学両論的に」（すなわち、標的タンパク質の部分的占有率で）作用することができる。この結果として、ＰＲＯＴＡＣは、標的タンパク質単独へのその結合親和性に基づいて予想されるものよりも高い標的タンパク質分解を示すことが多い。（３）ＰＲＯＴＡＣによる標的タンパク質の分解によって、ＰＯＩの耐性突然変異及び／又は上方調節を抑制することができる。

【0005】

ホール改変変異体ブロモドメインで内因的にタンパク質をタグ付けし、その結果、そのようなタンパク質が、ホール改変変異体ブロモドメインに結合することができるセグメントを含む化合物によって分解され得るようにすることが近年報告されている。ＸＹ－０６－００７は、Ｂｒｄ４及びＣＲＢＮベースのリガンドに結合するセグメントの一部として「バンプ」を含む化合物であり、R. P. Nowak et al. in J. Med. Chem., 2021, 64, 15, 11637-11650によって開発されている。ＸＹ－０６－００７は、Ｂｒｄ４^BD1 Ｌ９４Ｖタグを含むタンパク質を分解するために使用される。本発明は、代替のタグベースのデグロンシステムを提供する。

【発明の概要】

【0006】

上述の場合、標的タンパク質の分解に関するＰＲＯＴＡＣアプローチは、標的タンパク質に結合する小分子リガンドの利用能に限定されており、リガンドと結合させることができないタンパク質に取り組むための新規の方法論を開発することが重要である。本発明の発明者らは、ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインでタンパク質を内因的にタグ付けした。得られたタンパク質は、ホール改変変異体ＢＥＴブロモドメインに結合することができるセグメントと、リンカーと、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができるセグメントとを含む分解化合物によって分解され得る。分解化合物は非共有結合で結合し、存在し得る他のタンパク質よりもタグ付きタンパク質に関して選択的である。このようなシステムは、遺伝子操作されたモデルにおける標的タンパク質分解の機能的結果の評価に好適である。
第１の教示において、細胞内で標的タンパク質を分解する効果を研究する方法であって、ホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドに融合した標的タンパク質を含む融合タンパク質を内因的に発現させること；
融合タンパク質を、融合タンパク質のホール改変変異体ブロモドメインに特異的に結合することができるセグメントと、リンカーと、エロンギンＢ、エロンギンＣ及びカリン－２を含み、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有するタンパク質複合体に結合することができるフォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）リガンドとを含む分解化合物に接触させること；及び
標的タンパク質の分解の、細胞に対するあらゆる効果を観察すること
を含む方法が提供される。

【0007】

１つの実施形態において、分解化合物は、本明細書において定義される式１Ａによる化合物又は実施形態、及び本明細書において定義される選択された化合物である。
１つの実施形態において、標的タンパク質は、ブロモ及び末端外ドメイン（ＢＥＴ）タンパク質、Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３、Ｂｒｄ４及びＢｒｄＴからの１個又は複数個のホール改変変異体ブロモドメインで内因的にタグ付けされており（融合タンパク質を生成するために）、突然変異は、タンパク質に存在する１カ所若しくは複数カ所のブロモドメイン、又はそれらの断片を含むブロモドメインに存在し得る。
１つの実施形態において、ホール改変変異体ブロモドメインは、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａ、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ｖ、Ｂｒｄ４_BD1Ｌ９４Ａ、Ｂｒｄ４_BD1Ｌ９４Ｖ、Ｂｒｄ２_BD2Ｌ３８３Ａ、Ｂｒｄ２_BD2Ｌ３８３Ｖ、Ｂｒｄ２_BD1Ｌ１１０Ａ、Ｂｒｄ２_BD1Ｌ１１０Ｖ、Ｂｒｄ３_BD2Ｌ３４４Ａ、Ｂｒｄ３_BD2Ｌ３４４Ｖ、Ｂｒｄ３_BD1Ｌ７０Ａ、Ｂｒｄ３_BD1Ｌ７０Ｖ、ＢｒｄＴ_BD2Ｌ３０６Ａ、ＢｒｄＴ_BD2Ｌ３０６Ｖ、ＢｒｄＴ_BD1Ｌ６３Ａ、又はＢｒｄＴ_BD1Ｌ６３Ｖブロモドメインである。１つの実施形態において、ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインは、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａ又はＢｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ｖブロモドメインである。ナンバリングは、ＵｎｉＰｒｏｔによるものである。

【0008】

Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合すると、ユビキチンが融合タンパク質に動員され、結合し、細胞内でユビキチン－プロテアソーム経路による融合タンパク質の分解が生じることは理解されるであろう。
標的タンパク質は、細胞によって発現されるいずれのタンパク質であってもよい。例示的な標的タンパク質としては、酵素、構造タンパク質、ホルモン、細胞表面受容体、腫瘍関連タンパク質などがある。標的タンパク質は、疾患と関連するタンパク質であってもよく、及び／又は変異体若しくは野生型タンパク質であってもよい。例えば、特定の疾患は、変異体タンパク質の発現と関連する場合があり、本教示は、変異体タンパク質が分解された場合、細胞に何が起こっているかを研究することを可能にする。
細胞は、いずれの好適な真核細胞であってもよい。１つの実施形態において、真核細胞は哺乳動物（例えば、ヒト）細胞である。細胞は、例えば、正常細胞（非疾患）又は疾患細胞であってもよい。疾患細胞は、疾患を呈する対象由来の細胞であってもよい。例えば、対象はがんに罹患していてもよく、細胞はがん細胞であってもよく；対象は肝臓疾患に罹患していてもよく、細胞は対象から得られた肝臓細胞であってもよく；対象は腎臓疾患を有していてもよく、細胞は対象から得られた腎細胞であってもよい。細胞はまた、以前の好適な対象由来の細胞株であってもよい。

【0009】

本明細書において記載する方法は、細胞内で標的タンパク質を分解するあらゆる効果の研究を可能にする。標的タンパク質を分解するあらゆる効果を観察し得るために、比較は、分解化合物が添加されていない対応する細胞で行ってもよいことは理解されるであろう。いずれの分解されたタンパク質も、タンパク質を同定し、定量化するための標準的な方法を使用して、前記細胞中の又はその表面上の非分解又は分解融合タンパク質を測定することによって定量化してもよい。これらの方法には、とりわけ、レポーター、例えば、蛍光又は他のレポーターにリンクされたタンパク質特異的抗体を使用することが含まれ、このような方法としては、多数のものの中でも、免疫測定法（例えば、とりわけＥＬＩＳＡ）及び免疫ブロット、吸光度アッセイ、質量分析法及びプロテオミクス法がある。試料中の特異的タンパク質を定量化するための方法は当技術分野において周知であり、本開示による方法に容易に適合される。分解されたタンパク質及びこのような分解の、細胞機能、例えば、細胞の成長及び／又は増殖（例えば、細胞死）又は細胞の他の特徴（例えば、生物学的、生理学的なもの）に対する影響に関してアッセイすると、細胞の成長及び機能に対する目的のタンパク質の重要性が証明され、例えば、標的タンパク質が、病態又は状態のモジュレーターであるかどうか、したがって前記病態又は状態を処置するための潜在的な標的（薬物を含む生物活性剤）であるかどうかが確立される。医薬標的として標的タンパク質を同定すると、標的タンパク質の潜在的な阻害剤及び／又は作動剤としての活性を示す化合物及び他の生物活性剤を同定するためのアッセイの開発が可能になるであろう。

【0010】

上述の場合、標的タンパク質は、分解化合物と接触する前に、ＢＥＴタンパク質、Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３、Ｂｒｄ４及びＢｒｄＴ内に含まれる１個又は複数個のホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドで内因的にタグ付けされる（融合される）。いくつかの実施形態において、ホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドは、Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３、Ｂｒｄ４又はＢｒｄＴからのものであり、突然変異は、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａ、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ｖ、Ｂｒｄ４_BD1Ｌ９４Ａ、Ｂｒｄ４_BD1Ｌ９４Ｖ、Ｂｒｄ２_BD2Ｌ３８３Ａ、Ｂｒｄ２_BD2Ｌ３８３Ｖ、Ｂｒｄ２_BD1Ｌ１１０Ａ、Ｂｒｄ２_BD1Ｌ１１０Ｖ、Ｂｒｄ３_BD2Ｌ３４４Ａ、Ｂｒｄ３_BD2Ｌ３４４Ｖ、Ｂｒｄ３_BD1Ｌ７０Ａ、Ｂｒｄ３_BD1Ｌ７０Ｖ、ＢｒｄＴ_BD2Ｌ３０６Ａ、ＢｒｄＴ_BD2Ｌ３０６Ｖ、ＢｒｄＴ_BD1Ｌ６３Ａ、又はＢｒｄＴ_BD1Ｌ６３Ｖである。
従来のアミノ酸１文字が本開示全体にわたって使用されており、例えば、Ｌ３８７Ｖは、タンパク質の３８７位のロイシンがバリンに置換されていることを意味することが理解される。

【0011】

細胞は、標的タンパク質をコードする内在性核酸が、ホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドに融合した（又はそれでタグ付けされた）標的タンパク質を含む融合タンパク質を発現するように改変されるような、周知の組換え核酸技術を使用して改変してもよい。標的タンパク質をコードする核酸は、ホール改変変異体ブロモドメインをコードする核酸の５’又は３’インフレーム挿入を有することによって改変してもよい。このように、ホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドは、例えば、標的タンパク質のＮ又はＣ末端に融合してもよい。これを達成する好適な方法としては、相同的組換え（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、及び当技術分野において既知のトランスポゾン介在システム技術を含む）及び当技術分野において既知の非相同末端接合技術がある。
本発明による融合タンパク質は、融合遺伝子の操作によって作成された組換え融合タンパク質である。これは、典型的には、標的タンパク質をコードする配列から終止コドンを除去し、次いで、本明細書において記載する組換え技術によって、ホール改変変異体ブロモドメインタンパク質をコードする配列又はそれらの断片をインフレームで付加することを伴う。次いで、導入されたホール改変変異体ブロモドメイン配列は、単一のタンパク質として、細胞によって標的タンパク質配列とともに発現されることになる。融合タンパク質は、標的とホール改変ブロモドメインタンパク質の両方の全配列、又はどちらか一方の一部のみを含むように操作することができる。２個の実体がタンパク質である場合、タンパク質が独立して折りたたまれ、予想通りにふるまう可能性が高くなるようにするスペーサーペプチドを添加してもよい。

【0012】

したがって、１つの態様において、標的タンパク質を含む融合タンパク質をコードしており、本明細書において定義されるホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドに融合した核酸配列であって、核酸配列が、標的タンパク質をコードし、ホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドをコードする核酸の５’－又は３’－インフレーム挿入を有する核酸配列を含み、これは、発現した場合に本明細書において記載する分解化合物によって結合することができる融合タンパク質をもたらす、核酸配列が提供される。
１つの実施形態において、核酸配列は、細胞内で標的タンパク質をコードする内在性核酸配列を置き換えることを意図する。
上記の態様の核酸配列を含むベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターがさらに提供される。

【0013】

そのゲノムが上記の態様の核酸配列を発現するように改変されている、細胞（体細胞、胚性幹細胞、人工多能性細胞を含む）及び特に非ヒト動物を含む動物がさらに提供される。上述のように、いくつかの実施形態において、本教示の融合タンパク質をコードする核酸配列は、内在性標的タンパク質をコードする核酸を置き換えることができる。このように、標的タンパク質は、本明細書において記載する融合タンパク質の形態で細胞又は動物内でのみ発現することができる。
本明細書において記載する融合タンパク質の開発に加えて、本発明者らは、式（Ｉ）の化合物が、タグ付き融合タンパク質内のホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインに選択的に結合することができることを見出した。さらに、式（ＩＡ）の分解化合物は、タグ付きタンパク質内のホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインに選択的に結合し、その分解を促進することができる。その結果として、式（ＩＡ）の分解化合物は、遺伝子操作されたモデルにおける標的タンパク質分解の機能的結果を評価するのに好適な分解物質である。

【0014】

したがって、別の態様から見ると、本開示は、細胞内で標的タンパク質を分解する効果を研究する方法（例えば、上述の方法）において使用するための式（Ｉ）の化合物を提供する。

【化1】

（式中、
Ｇは、メチル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル、アミノ、メトキシ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチル、ハロエチル、アミド、イソプロピル及びメチルチオからなる群から選択される１個又は２個の置換基で置換されてもよい５員ヘテロアレーンであるか、又はＧは、メチル、ハロ、ヒドロキシ及びチオールで置換されてもよい６員アレーン又はヘテロアレーンであり；
Ｒは、Ｃ_1-4アルキル又はＣ_1-4ハロアルキルであり；
Ｒ¹は、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4ハロアルキル、Ｈ及びハロからなる群から選択されるいずれか１つであり；
Ｒ²は、Ｈ、Ｃ_1-3アルキル、Ｃ_1-3ハロアルキル又はハロであり；
Ｒ³は、ハロ、ヒドロキシル、チオール、アミド、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（Ｏ）ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6ハロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ及びＣ_1-6アルキルチオから独立して選択され；
Ｒ⁴及びＲ⁵は、Ｈ及びＣ_1-3アルキルから独立して選択され；
ｎは、０、１、２、３又は４であり；
Ｄは反応性基であり；
Ｘ はハロである）

【0015】

上述の場合、式（Ｉ）の化合物は、タグ付き融合タンパク質内のホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインに選択的に結合することができる。したがって、さらなる態様から見ると、細胞内で標的タンパク質を分解する効果を研究する方法（例えば、上述の方法）において使用するための式（ＩＡ）の分解化合物が提供される。

【化2】

（式中、Ｇ、Ｒ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ及びｎは、上記で定義されたとおりであり、Ｄ’は、反応性基Ｄ（上記で定義されたとおり）とＤ’－Ｌを形成するためのプロリンカーとの生成物であり、Ｌは、Ｄ’をＢに結合することができる分子であり、Ｂは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができる分子である）

【0016】

理論に束縛されることなく、本発明者らは、式（ＩＡ）と類似の構造を有するが、Ｇがメトキシ置換されたベンゼン環である分子が、Ｅ３リガーゼのフォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）基質認識サブユニットと安定な構造を形成することができないことを見出した。本発明者らは、ベンゼン環のメトキシ置換基がＥ３リガーゼのＶＨＬサブユニットのＨｉｓ１１０と立体的にクラッシュし、ＶＨＬ結合剤を使用した場合に検出可能なタンパク質分解を得ることができないことを見出した。したがって、Ｇのサイズ特性が驚くことに重要である。メトキシ置換ベンゼンをジメチルチオフェンで置き換えた場合、得られる式（ＩＡ）の化合物は非常に有効なタンパク質分解物質である。
上述の場合、式（ＩＡ）の分解化合物は、タグ付き融合タンパク質内のホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインに選択的に結合し、その分解を促進することができる。したがって、さらに別の態様から見ると、目的のタンパク質、例えば、ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインタグを含むタンパク質を分解するための、上述の分解化合物の使用が提供される。

【0017】

詳細な説明
本発明は、標的タンパク質の分解に関するＰＲＯＴＡＣアプローチを使用する。ＰＲＯＴＡＣは、２個の活性ドメインとリンカーとを含む。一方の活性ドメインは、Ｅ３ユビキチンリガーゼと結合することができ、もう一方は、標的タンパク質の分解を意図して標的タンパク質に結合する。一般的に、このアプローチは標的タンパク質に結合する小分子リガンドの利用能に限定される。本発明者らは、式（Ｉ）の化合物がタグ付き融合タンパク質内のホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインに選択的に結合することができることを見出した。式（Ｉ）の化合物は、ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインでタグ付けされ得るいずれのタンパク質にも結合することができる。さらに、式（ＩＡ）の分解化合物は、タグ付き融合タンパク質内のホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインに選択的に結合し、その分解を促進することができる。したがって、式（ＩＡ）の分解化合物は、従来のＰＲＯＴＡＣアプローチによって分解するのが通常困難であるか又は不可能であろう標的タンパク質を分解することができる（例えば、標的タンパク質に結合する小分子リガンドが利用できない場合）。式（ＩＡ）の分解化合物は、遺伝子操作されたモデルにおける標的タンパク質分解の機能的結果を評価するのに好適な分解物質である。

【0018】

以下の考察において、多くの用語が参照されるが、文脈によって逆が示されていない限り、これらは以下の意味を有すると理解されるべきである。化合物、特に本明細書において記載する化合物を定義するために本明細書において使用される命名法は、化学化合物に関するＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＵＰＡＣ）の規則、特に「ＩＵＰＡＣ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ （Ｇｏｌｄ Ｂｏｏｋ）」に従うことを意図する（A. D. Jenkins et al., Pure & Appl. Chem., 68, 2287-2311 (1996)を参照のこと）。誤解を避けるため、ＩＵＰＡＣ規則が本明細書において提供される定義と逆である場合、本明細書における定義が優先される。
「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語又はその変形は、規定された要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を包含するが、その他の要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を排除するものではないことを示唆することは理解されるであろう。

【0019】

「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語又はその変形は、規定された要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を包含し、その他の要素、整数若しくは工程又は要素、整数若しくは工程の群を排除することを示唆することは理解されるであろう。
「アルキル」という用語は、当技術分野において周知であり、いずれかの炭素原子から水素原子を除去することによる、アルカン由来の一価の基を定義し、「アルカン」という用語は、一般式Ｃ_nＨ_2n+2を有する非環式の分岐状又は非分岐状の炭化水素を定義することを意図し、式中、ｎは１以上の整数である。Ｃ_1-4アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソ－ブチル及びｔｅｒｔ－ブチルからなる群から選択されるいずれか１つを指す。
「ハロアルキル」という用語は、少なくとも１つの水素原子が、ハロ原子、例えば、フルオロ、クロロ又はブロモ、典型的には、フルオロで置き換えられたアルキル基を指す。トリフルオロメチルはハロアルキルの例である。

【0020】

「アレーン」という用語は、単環式又は多環式芳香族炭化水素を定義し、「芳香族」は、仮説的な局在構造のものよりも著しく大きい安定性を備えた（非局在化に起因して）環式共役分子実体を定義する。ヒュッケル則は、芳香族特性を評価するために当技術分野において使用されることが多く；（４ｎ＋２）個のπ電子（式中、ｎは負の整数ではない）を含む三方向に（又はときとして二方向に）混成された原子の単環式平面（又はほぼ平面）系は、芳香族特性を示すことになる。規則は一般的にｎ＝０～５に限定される。
「ヘテロアレーン」という用語は、１つ又は複数のヘテロ原子を含む単環式又は多環式芳香族炭化水素を定義する。
「アルコキシ」という用語は、ヒドロキシ基の水素原子を除去することによるアルコール由来の一価の基を定義する。「アルコール」という用語は、１個の水素原子がヒドロキシ基で置き換えられたアルカンを指す。メトキシはＣ１アルコキシ基の例である。
「アルキルチオ」という用語は、チオ基の水素原子を除去することによるアルキルチオール由来の一価の基を定義する。「アルキルチオール」という用語は、１個の水素原子がチオ基で置き換えられたアルカンを指す。メチルチオはＣ１アルキルチオ基の例である。

【0021】

「ハロアルコキシ」という用語は、少なくとも１つの水素原子が、ハロ原子、例えば、フルオロ、クロロ又はブロモ、典型的には、フルオロで置き換えられたアルコキシ基を指す。トリフルオロメトキシはＣ１ハロアルコキシの例である。
「立体異性体」という用語は、同一の分子式及び結合原子の配列を有するが、空間におけるそれらの原子の配置が異なる異性体を指すために本明細書において使用する。
「エナンチオマー」という用語は、互いに鏡像であり、重ね合わせることができない、すなわち移動及び剛体回転変換によって一致させることができない分子実体のペアのうちの一方を定義する。エナンチオマーはキラル分子であり、すなわちその鏡像と区別可能である。
「ラセミ」という用語は、ラセミ体に関するものとして本明細書において使用する。ラセミ体は、エナンチオマーのペアの実質的に等モルの混合物を定義する。
「ジアステレオ異性体」という用語（ジアステレオマーとしても知られる）は、鏡像として関連しない立体異性体を定義する。

【0022】

「溶媒和物」という用語は、溶質、例えば、化合物又は化合物の塩と溶媒とを含む複合体を指すために本明細書において使用する。溶媒が水である場合、溶媒和物は、水和物、例えば、基質１分子あたりに存在する水分子の数に応じて、一水和物、二水和物、三水和物などと呼ばれる場合がある。
「同位体」という用語は、原子核の原子番号は必然的に同じであるが、中性子の数が異なるために質量数が異なる、特定の化学元素の変形物を定義するために本明細書において使用する。
「結合すること（ｂｉｎｄｉｎｇ）」又は「中に収容される（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｉｎｇ ｉｎｔｏ）」という用語は、融合タンパク質のホール改変変異体ブロモドメインと本発明の化合物との相互作用（例えば、ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインの「ホール」によって収容される本発明の化合物の「バンプ」）に関連して本明細書において使用する場合、ホール改変変異体ブロモドメインと化合物との会合を指す。会合は、ホール改変変異体ブロモドメインと化合物との間のいずれの引力相互作用も含む。引力相互作用の例としては、水素結合、ファンデルワールス力、双極子－双極子力、双極子誘起双極子力、イオン－双極子力、イオン誘起双極子力及びイオン結合がある。

【0023】

上述の場合、細胞内で標的タンパク質を分解する効果を研究する方法において使用するための式（Ｉ）の化合物が提供される。

【化3】

（式中、
Ｇは、メチル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル、アミノ、メトキシ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチル、ハロエチル、アミド、イソプロピル及びメチルチオからなる群から選択される１個又は２個の置換基で置換されてもよい５員ヘテロアレーンであるか、又はＧは、メチル、ハロ、ヒドロキシ及びチオールで置換されてもよい６員アレーン又はヘテロアレーンであり；
Ｒは、Ｃ_1-4アルキル又はＣ_1-4ハロアルキルであり；
Ｒ¹は、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4ハロアルキル、Ｈ及びハロからなる群から選択されるいずれか１つであり；
Ｒ²は、Ｈ、Ｃ_1-3アルキル、Ｃ_1-3ハロアルキル又はハロであり；
Ｒ³は、ハロ、ヒドロキシル、チオール、アミド、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（Ｏ）ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6ハロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ及びＣ_1-6アルキルチオから独立して選択され；
Ｒ⁴及びＲ⁵は、Ｈ及びＣ_1-3アルキルから独立して選択され；
ｎは、０、１、２、３又は４であり；
Ｄは反応性基であり；
Ｘはハロである）

【0024】

上述の場合、理論に束縛されることなく、本発明者らは、式（ＩＡ）と類似の構造を有するが、Ｇがメトキシ置換ベンゼン環である場合、分子は、Ｅ３リガーゼのフォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）基質認識サブユニットと安定な構造を形成することができないことを見出した。本発明者らは、ベンゼン環のメトキシ置換基がＥ３リガーゼのＶＨＬサブユニットのＨｉｓ１１０と立体的にクラッシュし、ＶＨＬ結合剤を使用した場合に検出可能なタンパク質分解を得ることができないことを見出した。しかし、メトキシ置換ベンゼンをより小さい基、例えば、ジメチルチオフェンで置き換えた場合、得られる式（ＩＡ）の化合物は非常に有効なタンパク質分解物質である。したがって、化合物（Ｉ）及び（ＩＡ）のＧは、メトキシベンゼンよりも立体的嵩高が低い。

【0025】

したがって、いくつかの実施形態において、Ｇが６員アレーン又はヘテロアレーンである場合、それは置換されていない。好適な６員アレーン及びヘテロアレーンの例としては、ベンゼン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン及びピリダジンがある。いくつかの実施形態において、Ｇの６員アレーン又はヘテロアレーンは、ベンゼン、ピリジン、ピリミジン又はピラジンであり、典型的には、ベンゼンである。
好適な５員ヘテロアレーンの例としては、チオフェン、フラン、ピロール、チアゾール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、イソチアゾール及びイソオキサゾールがある。いくつかの実施形態において、Ｇの５員ヘテロアレーンは、チオフェン、フラン、ピロール及びチアゾール、例えば、チオフェンからなる群から選択されるいずれか１つである。
Ｇが５員ヘテロアレーンである場合、それは、メチル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル、アミノ、メトキシ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチル、ハロエチル、アミド、イソプロピル及びメチルチオからなる群から選択される１個又は２個の置換基で置換されてもよい。ときとして、Ｇの５員環は、メチル、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル（例えば、トリフルオロメチル）及びアミノからなる群から選択される１個又は複数個の置換基で置換されてもよい。多くの場合、Ｇの５員環は、メチル、フルオロ、ヒドロキシ、チオール及びトリフルオロメチルからなる群から選択される１個又は複数個の置換基で置換されてもよい。典型的には、Ｇの５員環はメチルで置換されてもよい。

【0026】

いくつかの実施形態において、Ｇは、置換されてもよい５員ヘテロアレーンであり、典型的には、置換されてもよいチオフェンである。いくつかの実施形態において、Ｇは、１回又は２回置換されたチオフェンである。いくつかの実施形態において、Ｇは、メチルで１回又は２回置換されたチオフェンである。典型的には、Ｇは、メチルで２回置換されたチオフェンである。
上述の場合、Ｘはハロ、例えば、クロロ、フルオロ、ブロモ又はヨードである。いくつかの実施形態において、Ｘはクロロである。
Ｒ³は、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、チオール、アミド、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（Ｏ）ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6ハロアルキル（例えば、Ｃ_1-6フルオロアルキル）、Ｃ_1-6アルコキシ及びＣ_1-6アルキルチオから独立して選択され、Ｒ⁴及びＲ⁵は、Ｈ及びＣ_1-3アルキルから独立して選択される。多くの場合、Ｒ³は、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、チオール、アミド、ＮＨ₂、Ｎ（ＣＨ₃）₂、Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ₃）₂、Ｃ_1-3アルキル、Ｃ_1-3ハロアルキル（例えば、Ｃ_1-3フルオロアルキル）、Ｃ_1-3アルコキシ及びＣ_1-3アルキルチオから独立して選択される。多くの場合、Ｒ³は、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシル、チオール、アミド、ＮＨ₂、Ｎ（ＣＨ₃）₂、Ｃ（Ｏ）ＮＨ₂、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ₃）₂、メチル、トリフルオロメチル、メトキシ及びメチルチオから独立して選択される。典型的には、Ｒ³は、フルオロ、ヒドロキシル、チオール、アミド、ＮＨ₂、及びＮ（ＣＨ₃）₂から独立して選択される。

【0027】

上述の場合、Ｒ³置換基の数ｎは、０、１、２、３又は４である。多くの場合、ｎは、０、１又は２、例えば、０又は１である。いくつかの実施形態において、ｎは０である。
Ｒ¹は、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4ハロアルキル（例えば、Ｃ_1-4フルオロアルキル）、Ｈ及びハロ（例えば、フルオロ）からなる群から選択されるいずれか１つである。多くの場合、Ｒ¹は、Ｃ_1-4アルキル又はＣ_1-4ハロアルキル（例えば、Ｃ_1-4フルオロアルキル）である。いくつかの実施形態において、Ｒ¹は、メチル又はトリフルオロメチルであり、典型的には、メチルである。
Ｒ²は、Ｈ、Ｃ_1-3アルキル、Ｃ_1-3ハロアルキル（例えば、Ｃ_1-3フルオロアルキル）又はハロ（例えば、フルオロ）である。多くの場合、Ｒ²は、Ｈ、メチル、エチル、トリフルオロメチル又はフルオロである。いくつかの実施形態において、Ｒ²は、Ｈ、メチル、トリフルオロメチル又はフルオロである。典型的には、Ｒ²はＨである。

【0028】

上述の場合、Ｒは、Ｃ_1-4アルキル又はＣ_1-4ハロアルキルである。Ｒ基は、ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインの「ホール」によって収容される「バンプ」を提供する。理論に束縛されることなく、本発明者らは、式（Ｉ）及び（ＩＡ）の化合物（水素ではないＲ基を含む）は、ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインの「ホール」に結合すること又は収容されることが可能であるが、非改変Ｂｒｄ４ブロモドメインの結合部位に結合すること又は収容されることはできないことを見出した。したがって、式（Ｉ）及び式（ＩＡ）の化合物は、ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインに選択的に結合すること又は選択的に収容されることができ、一方、Ｒが水素である類似の化合物は選択的ではない。大きなＲ基（例えば、Ｃ_5-8アルキル又はＣ_5-8ハロアルキル）は、大きなホールを含むホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインに結合するか又は収容されるために使用することができることは想定される。
多くの場合、Ｒは、Ｃ_1-3アルキル又はＣ_1-3フルオロアルキルである。典型的には、Ｒは、エチル、プロピル、フルオロエチル及びフルオロプロピルを含む群から選択されるいずれか１つである。いくつかの実施形態において、Ｒはエチルである。
Ｄは反応性基である。「反応性基」という用語は、第２の化合物（典型的には、プロリンカー化合物）と反応して第２の化合物との結合を形成することができるいずれかの基を指す。ただし、Ｄは化合物（Ｉ）とプロリンカー分子とを結合させてリンカーへの結合を形成することができるという条件で、Ｄが正確に何であるかは重要ではなく、式（Ｉ）の化合物は特定のＤ基に限定される必要はない。

【0029】

多くの場合、Ｄは、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）ＯＨ、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）Ｃｌ、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）Ｂｒ、（ＣＨ₂）_qＮＨ₂、（ＣＨ₂）_qＮ（Ｃ_1-3アルキル）Ｈ、（ＣＨ₂）_qＳＨ、（ＣＨ₂）_qＯＨ、（ＣＨ₂）_qＢｒ、（ＣＨ₂）_qＩ、（ＣＨ₂）_qＮ₃及び（ＣＨ₂）_qＣＣＨからなる群から選択されるいずれか１つである；式中、ｐは０～４の整数であり、ｑは１～４の整数である。多くの場合、ｐは、０、１又は２であり、典型的には０である。多くの場合、ｑは１又は２であり、典型的には１である。いくつかの実施形態において、ｐは０であり、ｑは１である。
Ｄは、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）ＯＨ、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）Ｃｌ、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）Ｂｒ、（ＣＨ₂）_qＮＨ₂、（ＣＨ₂）_qＮ（Ｃ_1-3アルキル）Ｈ、（ＣＨ₂）_qＳＨ及び（ＣＨ₂）_qＯＨからなる群から選択されるいずれか１つであることが多い。通常、Ｄは、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）ＯＨ、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）Ｃｌ及び（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）Ｂｒからなる群から選択されるいずれか１つである。いくつかの実施形態において、ＤはＣ（Ｏ）ＯＨである。

【0030】

誤解を避けるため、上記で挙げる官能基と同じ方法で機能する基は、前記官能基の等価の基として含まれる。例えば、ＤがＣ（Ｏ）ＯＨである場合、プロトン化された変形基、例えばＣ（Ｏ）⁺ＨＯＨ（式中、カルボニル基は、酸素原子でプロトン化されている）が含まれる。
Ｇがチオフェンである場合、それは、２位及び３位で又は３位及び４位でジアゼピン環に結合していてもよい。誤解を避けるため、２、３及び４位は、以下で示す通りである。

【化4】

【0031】

Ｇがチオフェンである場合、それは典型的には、２位及び３位でジアゼピン環に結合しており、すなわちいくつかの実施形態において、化合物は式（ＩＩ）のものである。

【化5】

式中、Ｒ⁶は、Ｇの置換基であり（Ｇが５員ヘテロアレーンである場合）、ｍは置換基の数である。誤解を避けるため、Ｇが５員ヘテロアレーンである場合のＧの置換基に関して本明細書において記載する実施形態は、この実施形態のＲ⁶に準用される。例えば、Ｒ⁶は、メチル、ハロ（例えば、フルオロ）、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル（例えば、トリフルオロメチル）及びアミノ、典型的にはメチルからなる群から独立して選択してもよい。

【0032】

いくつかの実施形態において、Ｒ¹はメチルであり、Ｒ²は水素であり、ｎは０であり、Ｇは、２位及び３位でジアゼピンに結合しているチオフェンであり、Ｘはクロロであり、すなわち化合物は式（ＩＩＩ）のものである。

【化6】

【0033】

いくつかの実施形態において、Ｒ¹はメチルであり、Ｒ²は水素であり、ｎは０であり、Ｇは、２位及び３位でジアゼピンに結合しているチオフェンであり、Ｘはクロロであり、ＤはＣ（Ｏ）ＯＨであり、すなわち化合物は式（ＩＩＩａ）のものである。

【化7】

【0034】

典型的には、化合物は、式（ＩＶ）、（ＩＶａ）及び（ＩＶｂ）のうちのいずれか１つである。

【化8】

いくつかの実施形態において、化合物は式（ＩＶ）のものである。
本発明の化合物は、以下のアスタリスクで同定される炭素原子におけるキラリティーによって異なるジアステレオ異性体で存在する。

【化9】

【0035】

全ての立体異性体、並びにエナンチオマー及びラセミ混合物を含むその混合物は発明の範囲内に含まれる。式Ｉの化合物の個々の立体異性体、すなわち、他の立体異性体の５％未満、２％未満又は１％未満（例えば、１％未満）を含む化合物も含まれる。いずれの割合の立体異性体の混合物、例えば、実質的に等量の２種類のエナンチオマーを含むラセミ混合物も本発明の範囲内に含まれる。
ジアステレオ異性体は、従来技術、例えば、クロマトグラフィー又は分別結晶化を使用して分離してもよい。さまざまな立体異性体は、従来技術、例えば分別結晶化又はＨＰＬＣ技術を使用して、化合物のラセミ混合物又は他の混合物を分離することによって単離してもよい。或いは、所望の光学異性体は、ラセミ化又はエピマー化をもたらすことのない条件下で適切な光学的に活性出発材料の反応によって作製してもよい。

【0036】

多くの場合、本発明の化合物はエナンチオマー純粋である。多くの場合、化合物は式（Ｉａ）のものである。

【化10】

【0037】

典型的には、化合物は、式（Ｖ）、（Ｖａ）及び（Ｖｂ）のうちのいずれか１つである。

【化11】

いくつかの実施形態において、化合物は式（Ｖ）のものである。
上述の場合、式（Ｉ）の化合物は、タグ付きタンパク質内のホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインに選択的に結合すること又は収容されることができる。したがって、別の態様から見ると、細胞内で標的タンパク質を分解する効果を研究する方法における使用に使用するための式（ＩＡ）の分解化合物が提供される。

【0038】

【化12】

（式中、Ｇ、Ｒ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ及びｎは上記で定義されたとおりであり、Ｄ’は、反応性基Ｄ（上記で定義されたもの）とＤ’－Ｌを形成するためのプロリンカーとの生成物であり、Ｌは、Ｄ’をＢに結合することができる分子であり、Ｂは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができる分子である）。

【0039】

誤解を避けるため、式（Ｉ）に関して本明細書において記載する実施形態は、式（ＩＡ）に準用される。例えば、分解化合物は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＶ）、（ＩＶａ）、（ＩＶｂ）、（ＩＶｃ）、（Ｉａ）、（Ｖ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）又は（Ｖｃ）のうちのいずれか１つであってもよく、ただし、Ｄ又はＣ（Ｏ）ＯＨは、Ｄ’－Ｌ－Ｂ又はＣ（Ｏ）－Ｌ－Ｂでそれぞれ置き換えられる。
本発明者らは、式（ＩＡ）と類似の構造を有するが、Ｇがメトキシ置換ベンゼン環である分子は、Ｅ３リガーゼのフォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）基質認識サブユニットと安定な構造を形成することができないことを見出した。理論に束縛されるものではないが、ベンゼン環のメトキシ置換基がＥ３リガーゼのＶＨＬサブユニットのＨｉｓ１１０と立体的にクラッシュし、ＶＨＬ結合剤を使用した場合に検出可能なタンパク質分解を得ることができない。したがって、サイズ特性Ｇが驚くことに重要である。メトキシ置換ベンゼンをジメチルチオフェンで置き換えた場合、得られる式（ＩＡ）の化合物は非常に有効なタンパク質分解物質である。
上述の場合、Ｄ’は反応性基Ｄ（上記で定義されたもの）とＤ’－Ｌを形成するためのプロリンカーとの生成物である。プロリンカーは、本明細書においてＤ’と反応してＤ’－Ｌを形成することができる分子として定義され、式中、Ｌは、Ｄ’をＢに結合することができる分子である。ただし、Ｄ’はＬに結合することができるという条件で、Ｄ’が正確に何であるかは重要ではなく、式（ＩＡ）の化合物は特定のＤ’基に限定される必要はない。

【0040】

しかし、いくつかの実施形態において、Ｄ’は、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）、（ＣＨ₂）_qＮＨ、（ＣＨ₂）_qＳ、（ＣＨ₂）_qＯ、（ＣＨ₂）_q及び１，２，３－トリアゾリレンからなる群から選択されるいずれか１つであり、式中、ｐは０～４の整数であり、ｑは１～４の整数である。多くの場合、Ｄ’は、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）、（ＣＨ₂）_qＮＨ、（ＣＨ₂）_qＳ、及び（ＣＨ₂）_qＯ、典型的には、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）からなる群から選択されるいずれか１つである。
多くの場合、ｐは０～２の整数であり、ｑは１又は２である。いくつかの実施形態において、ｐは０であり、ｑは１である。したがって、いくつかの実施形態において、Ｄ’はＣ（Ｏ）である。
上述の場合、ＬはＤ’をＢに結合することができる分子であり、R. I. Troup, C. Fallan and M. G. J. Baud, Explo. Target Anitiumor Ther. 2020, 1, 273-312において記載されているリンカーのうちのいずれか１つであってもよい。いくつかの実施形態において、Ｌは式（ＶＩＡ）のものである。

【0041】

【化13】

（式中、
波線はＤ’及びＢへの結合部位を示し；
Ｘ¹は存在していてもよく、Ｏ（ＣＨ₂）_s、ＮＨ（ＣＨ₂）_s及びＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）_sからなる群から選択されるいずれか１つであり；
Ｘ²は存在していてもよく、Ｏ（ＣＨ₂）_uＣ（Ｏ）、（ＣＨ₂）_uＮＨ、（ＣＨ₂）_uＯ及び（ＣＨ₂）_uＣ（Ｏ）からなる群から選択され；
Ｌ’は、Ｏ（ＣＨ₂）_t、ＣＨ₂、アルキニレン、トリアゾリレン、ピペラジニレン及びピペリジニレンからなる群から選択され；
ｓは０～４の整数であり、ｕは１～４の整数であり、ｔは１～４の整数である）
誤解を避けるため、式（ＶＩＡ）のＸ¹はＤ’に結合しており、Ｘ²はＢに結合している。Ｘ¹が存在しない場合、Ｄ’は（Ｌ’）_rに直接結合し、Ｘ²が存在しない場合、（Ｌ’）_rはＢに直接結合する。いくつかの実施形態において、Ｘ¹及びＸ²は存在する。

【0042】

いくつかの実施形態において、Ｘ¹は、Ｏ（ＣＨ₂）_s及びＨＮ（ＣＨ₂）_sからなる群から選択されるいずれか１つである。多くの場合、ｓは０～２であり、典型的には２である。いくつかの実施形態において、Ｘ¹はＯ（ＣＨ₂）₂である。
Ｌ’は、Ｏ（ＣＨ₂）_t、ＣＨ₂及びアルキニレンからなる群から選択されることが多く、式中、ｔは、１～４の整数である。典型的には、Ｌ’はＯ（ＣＨ₂）_tである。ｔは２又は３であることが多く、したがっていくつかの実施形態において、Ｌ’はＯ（ＣＨ₂）₂又はＯ（ＣＨ₂）₃である。
いくつかの実施形態において、Ｘ²は、Ｏ（ＣＨ₂）_uＣ（Ｏ）又は（ＣＨ₂）_uＮＨである。多くの場合、ｕは１又は２であり、典型的には１である。したがって、いくつかの実施形態において、Ｘ²はＯＣＨ₂Ｃ（Ｏ）又はＣＨ₂ＮＨである。

【0043】

いくつかの実施形態において、分解化合物は、上記の教示のいずれかにより、式中、Ｂは、式（ＶＩＩＡ）～（ＸＶＡ）のうちのいずれか１つによって表される以下の構造から選択される。

【化14】

（式中、Ｒ⁷は、Ｈ又はメチルであり、Ｚは、Ｆ又はＣＮ、例えばＦである）

【0044】

いくつかの実施形態において、Ｂは、式（ＶＩＩＡ）～（ＩＸＡ）のうちのいずれか１つによって表される構造である。いくつかの実施形態においてＢは、式（ＶＩＩＡ）によって表される構造である。構造（ＶＩＩＡ）、（ＶＩＩＩＡ）、（ＩＸＡ）、（ＸＡ）及び（ＸＩＡ）のいくつかの実施形態において、Ｒ⁷はＨである。
いくつかの実施形態において、分解化合物は、式（ＸＩＩＡ）～（ＸＩＶＡ）のうちのいずれか１つである。

【化15】

【0045】

いくつかの実施形態において、分解化合物は、式（ＸＩＩＡ）のものである。
より特定の実施形態において、分解化合物は、式（ＸＶＡ）～（ＸＶＩＩＡ）のうちのいずれか１つである。

【化16】

【0046】

１つの実施形態において、分解化合物は、式（ＸＶＡ）のものである。
本開示の分解化合物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質の分解における特定の使用を見出し得る。したがって、分解化合物は、標的タンパク質を分解する方法であって、融合タンパク質の一部である標的タンパク質を分解するために、一定の期間にわたって分解化合物と好適なホール改変ブロモドメインタグ付き融合タンパク質とを接触させることを含む方法において使用してもよい。
上述の場合、本開示の化合物（水素ではないＲ基を含む）は、ホール改変変異体ブロモドメイン（例えば、変異体Ｂｒｄ４ブロモドメイン）に選択的に結合すること又は収容されることができ、一方、Ｒが水素である類似の化合物は選択的ではない。「選択的に結合する」とは、化合物が、ホール改変変異体ではないブロモドメイン、例えばＢＥＴタンパク質のもの、例えば内在性タンパク質Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３、及びＢｒｄ４よりもより強力に（例えば、より大きな会合定数及びより小さい解離定数を有する）ホール改変変異体ブロモドメイン（例えば、変異体Ｂｒｄ４ブロモドメイン）に結合するか又は収容されることを意味する。有利には、本発明の化合物は、ホール改変変異体ではない野生型ブロモドメイン（例えば、ＢＥＴブロモドメイン）よりもホール改変変異体ブロモドメイン（例えば、変異体Ｂｒｄ４ブロモドメイン）に関してはるかに選択的である。例えば、本発明の分解化合物による、ホール改変変異体ではないブロモドメインを含むタンパク質、例えばＢＥＴブロモドメインを含むタンパク質Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３及びＢｒｄ４の分解は、検出されない場合がある（例えば、ウエスタンブロット法によって分析した場合、ホール改変変異体ではないブロモドメインを含むタンパク質に対応するシグナルにおける減少は認められない場合がある）。

【0047】

有利には、本発明の分解化合物は、標的タンパク質の強力な分解物質である（標的タンパク質がホール改変ブロモドメインタグ付き融合タンパク質の一部である場合）。例えば、本発明の分解化合物は、０．００１～５００ｎＭ、例えば０．０１～４００ｎＭ又は０．１～３００ｎＭのオンターゲット分解効力（半最大分解濃度（ＤＣ₅₀））値を示すことができる。
有利には、本発明の分解化合物は、標的タンパク質の非常に有効な分解物質である（標的タンパク質がホール改変ブロモドメインタグ付き融合タンパク質の一部である場合）。例えば、本発明の分解化合物は、５０～１００％、例えば６５～１００％又は７０～１００％の有効性（最大分解（Ｄ_max））値を示すことができる。
さらに、本発明の分解化合物は、標的タンパク質を分解するために素早く作用することができる（標的タンパク質がホール改変ブロモドメインタグ付き融合タンパク質の一部である場合）。例えば、分解化合物が存在する場合、標的タンパク質の半減期（ｔ_1/2）は、３時間未満、例えば、０．００１～１５０分又は０．０１～１４０分であってもよい。

【0048】

タンパク質の分解分析に好適な方法、例えば、ウエスタンブロット法、並びにＤＣ₅₀、Ｄ_max及びｔ_1/2を計算するための方法は、以下の実験のセクションに記載する。
文書、作用、材料、デバイス、論文などの本明細書におけるいずれの考察も、これらの事項のいずれか又は全てが、本出願の各請求項の優先日以前に存在していたかのように本開示に関連する分野における、先行技術のベースの一部を形成していること又は周知の一般的な知識であったことを認めるものと解釈するべきではない。
多数の変形形態及び／又は改変を、記載されているような発明の範囲から逸脱することなく本明細書において記載する本発明に行ってもよいことは当業者であれば理解されるであろう。したがって、本実施形態は、記載目的のためのものと考えられるべきであり、制限的なものではなく、実施形態において記載するものの範囲に制限されるものではない。当業者であれば、本実施形態は、単独で又は組合せて読み取ってもよく、本明細書において記載する特徴のいずれか１つ又は組合せと合わせてもよいことは理解するべきである。

【0049】

本明細書において挙げる各特許参考文献及び非特許参考文献の主題は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれるものとする。
本発明は、以下の非限定的な条項を参照しながらさらに理解してもよい：
１．細胞内で標的タンパク質を分解する効果を研究する方法であって、
ホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドに融合した標的タンパク質を含む融合タンパク質を内因的に発現させること；
融合タンパク質を、融合タンパク質のホール改変変異体ブロモドメインに特異的に結合することができるセグメントと、リンカーと、エロンギンＢ、エロンギンＣ及びカリン－２を含み、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有するタンパク質複合体に結合することができるフォンヒッペルリンダウ（ＶＨＬ）リガンドとを含む分解化合物に接触させること；及び
標的タンパク質の分解の、細胞に対するあらゆる効果を観察すること
を含む方法。
２．標的タンパク質が、ブロモ及び末端外ドメイン（ＢＥＴ）タンパク質、Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３、Ｂｒｄ４及びＢｒｄＴからの１個若しくは複数個のホール改変変異体ブロモドメイン、又はそれらの断片を含むブロモドメインで内因的にタグ付けされる、第１項に記載の方法。

【0050】

３．突然変異が、タンパク質に存在する１カ所若しくは複数カ所のブロモドメイン、又はそれらの断片を含むブロモドメインに存在する、第２項に記載の方法。
４．ホール改変変異体ブロモドメインが、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａ、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ｖ、Ｂｒｄ４_BD1Ｌ９４Ａ、Ｂｒｄ４_BD1Ｌ９４Ｖ、Ｂｒｄ２_BD2Ｌ３８３Ａ、Ｂｒｄ２_BD2Ｌ３８３Ｖ、Ｂｒｄ２_BD1Ｌ１１０Ａ、Ｂｒｄ２_BD1Ｌ１１０Ｖ、Ｂｒｄ３_BD2Ｌ３４４Ａ、Ｂｒｄ３_BD2Ｌ３４４Ｖ、Ｂｒｄ３_BD1Ｌ７０Ａ、Ｂｒｄ３_BD1Ｌ７０Ｖ、ＢｒｄＴ_BD2Ｌ３０６Ａ、ＢｒｄＴ_BD2Ｌ３０６Ｖ、ＢｒｄＴ_BD1Ｌ６３Ａ、又はＢｒｄＴ_BD1Ｌ６３Ｖブロモドメインである、第２項又は３項に記載の方法。
５．ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインがＢｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａ又はＢｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ｖブロモドメインを含む、第２項又は３項に記載の方法。
６．第１項から５項のいずれか１項に記載の方法において使用するための融合タンパク質をコードする核酸配列であって、融合タンパク質が、本明細書において定義されるホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドに融合した標的タンパク質を含み、核酸配列が、標的タンパク質をコードし、ホール改変変異体ブロモドメインを含むポリペプチドをコードする核酸の５’－又は３’－インフレーム挿入を有する核酸配列を含み、これは、発現した場合に本明細書において記載する分解化合物によって結合することができる融合タンパク質をもたらす、核酸配列。

【0051】

７．第６項に記載の核酸配列を含むベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクター。
８．ゲノムが第６項に記載の核酸配列を発現するように改変されている細胞（体細胞、胚性幹細胞、又は人工多能性細胞を含む）。
９．第８項に記載の細胞を含むか又はそれに由来する非ヒト動物。
１０．細胞内で標的タンパク質を分解する効果を研究する方法において使用するための式（Ｉ）の化合物。

【化17】

（式中、
Ｇは、メチル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル、アミノ、メトキシ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチル、ハロエチル、アミド、イソプロピル、及びメチルチオからなる群から選択される１個又は２個の置換基で置換されてもよい５員ヘテロアレーンであるか、又はＧは、メチル、ハロ、ヒドロキシ及びチオールで置換されてもよい６員アレーン又はヘテロアレーンであり；
Ｒは、Ｃ_1-4アルキル又はＣ_1-4ハロアルキルであり；
Ｒ¹は、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4ハロアルキル、Ｈ及びハロからなる群から選択されるいずれか１つであり；
Ｒ²は、Ｈ、Ｃ_1-3アルキル、Ｃ_1-3ハロアルキル又はハロであり；
Ｒ³は、ハロ、ヒドロキシル、チオール、アミド、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（Ｏ）ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_1-6ハロアルキル、Ｃ_1-6アルコキシ及びＣ_1-6アルキルチオから独立して選択され；
Ｒ⁴及びＲ⁵は、Ｈ及びＣ_1-3アルキルから独立して選択され；
ｎは、０、１、２、３又は４であり；
Ｄは反応性基であり；
Ｘはハロである）

【0052】

１１．方法が、第１項から５項のいずれか１項に記載の方法である、第１０項に記載の使用のための化合物。
１２．Ｇの６員アレーン又はヘテロアレーンが置換されていない、第１０項又は１１項に記載の使用のための化合物。
１３．Ｇの６員アレーン又はヘテロアレーンが、ベンゼン、ピリジン、ピリミジン又はピラジンである、第１０項～１２項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
１４．Ｇの６員アレーンがベンゼンである、第１０項～１２項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
１５．Ｇの５員ヘテロアレーンが、チオフェン、フラン、ピロール及びチアゾールからなる群から選択されるいずれか１つである、第１０項～１４項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。

【0053】

１６．Ｇが５員ヘテロアレーンである、第１０項～１５項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
１７．Ｇがチオフェンである、第１６項に記載の使用のための化合物。
１８．Ｇが、メチル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル、アミノ、メトキシ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチル、ハロエチル、アミド、イソプロピル、ｔｅｒｔ－ブチル及びメチルチオからなる群から選択される１個又は複数個の置換基で置換されている、第１６項又は１７項に記載の使用のための化合物。
１９．Ｇが、メチル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、ハロメチル及びアミノからなる群から選択される１個又は複数個の置換基で置換されている、第１６項又は１７項に記載の使用のための化合物。
２０．Ｇが、メチル、フルオロ、ヒドロキシ、チオール及びフルオロメチルからなる群から選択される１個又は複数個の置換基で置換されている、第１６項又は１７項に記載の使用のための化合物。

【0054】

２１．Ｇがメチルで置換されている、第１６項又は１７項に記載の使用のための化合物。
２２．Ｇが１回又は２回置換されている、第１０項～２１項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
２３．Ｇが２回置換されている、第１０項～２１項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
２４．Ｘがクロロである、第１０項～２３項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
２５．ｎが０である、第１０項～２４項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
２６．Ｒ¹が、Ｃ_1-4アルキル及びＣ_1-4フルオロアルキルからなる群から選択されるいずれか１つである、第１０項～２５項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
２７．Ｒ¹が、メチル又はトリフルオロメチルである、第１０項～２６項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。

【0055】

２８．Ｒ¹がメチルである、第１０項～２７項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
２９．Ｒ²が、Ｈ、メチル、トリフルオロメチル又はフルオロである、第１０項～２８項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
３０．Ｒ²がＨである、第１０項～２９項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
３１．Ｒ³が、フルオロ、ヒドロキシル、チオール、アミド、ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ（Ｏ）ＮＲ⁴Ｒ⁵、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4フルオロアルキル、Ｃ_1-4アルコキシ及びＣ_1-4アルキルチオから独立して選択される、第１０項～３０項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
３２．Ｒが、Ｃ_1-3アルキル又はＣ_1-3フルオロアルキルである、第１０項～３１項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
３３．Ｒが、Ｃ_2-3アルキル又はＣ_2-3フルオロアルキルである、第１０項～３１項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
３４．Ｒがエチルである、第１０項～３１項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。

【0056】

３５．Ｄが、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）ＯＨ、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）Ｃｌ、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）Ｂｒ、（ＣＨ₂）_qＮＨ₂、（ＣＨ₂）_qＮ（Ｃ_1-3アルキル）Ｈ、（ＣＨ₂）_qＳＨ、（ＣＨ₂）_qＯＨ、（ＣＨ₂）_qＢｒ、（ＣＨ₂）_qＩ、（ＣＨ₂）_qＮ₃及び（ＣＨ₂）_qＣＣＨからなる群から選択されるいずれか１つであり；ｐが０～４の整数であり、ｑが１～４の整数である、第１０項～３４項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
３６．ｐが０であり、ｑが１である、第３５項に記載の使用のための化合物。
３７．ＤがＣ（Ｏ）ＯＨである、第１０項～３４項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。
３８．化合物が式（ＩＩ）のものである、第１７項～２３項のいずれか１項に記載の使用のための化合物。

【化18】

（式中、Ｒ⁶はＧの置換基であり、ｍは置換基の数であり、Ｒ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｄ、Ｘ及びｎは、第１０項及び２４項～３７項のいずれか１項に定義されるものである）

【0057】

３９．化合物が式（ＩＩＩ）のものである、第１０項に記載の使用のための化合物。

【化19】

（式中、Ｒ及びＤは、第１０項及び３２項～３７項のいずれか１項に定義されるものである）

【0058】

４０．化合物が式（ＩＶ）のものである、第１０項に記載の使用のための化合物。

【化20】

４１．化合物が式（Ｖ）のものである、第１０項に記載の使用のための化合物。

【化21】

【0059】

４２．細胞内で標的タンパク質を分解する効果を研究する方法において使用するための式（ＩＡ）の分解化合物。

【化22】

（式中、Ｇ、Ｒ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ及びｎは、第１０項及び１２項～３７項のいずれか１項に定義されるものであり、Ｄ’は、反応性基ＤとＤ’－Ｌを形成するためのプロリンカーとの生成物であり、Ｌは、Ｄ’をＢに結合することができる分子であり、Ｂは、Ｅ３ユビキチンリガーゼに結合することができる分子である）

【0060】

４３．方法が、第１から５項のいずれか１項に記載のものである、第４２項に記載の使用のための分解化合物。
４４．Ｄ’が、（ＣＨ₂）_pＣ（Ｏ）、（ＣＨ₂）_qＮＨ、（ＣＨ₂）_qＳ、（ＣＨ₂）_qＯ、（ＣＨ₂）_q及び１，２，３－トリアゾリレンからなる群から選択されるいずれか１つであり、ｐが０～４の整数であり、ｑが１～４の整数である、第４２項又は４３項に記載の使用のための分解化合物。
４５．ｐが０であり、ｑが１である、第４４項に記載の使用のための分解化合物。
４６．Ｄ’がＣ（Ｏ）である、第４２～４５項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。

【0061】

４７．分解化合物が式（ＩＩＡ）のものである、第４２～４６項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。

【化23】

（式中、Ｒ⁶はＧの置換基であり、ｍは置換基の数であり、Ｒ、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｘ及びｎは、第１０項及び１８項～３７項のいずれか１項に定義されるものである）

【0062】

４８．分解化合物が式（ＩＩＩＡ）のものである、第４２～４６項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。

【化24】

（式中、Ｒは、第１０項及び３２項～３４項のいずれか１項に定義されるとおりである）
４９．分解化合物が式（ＩＶＡ）のものである、第４２項又は４３項に記載の使用のための分解化合物。

【化25】

【0063】

５０．分解化合物が式（ＶＡ）のものである、第４２項又は４３項に記載の使用のための分解化合物。

【化26】

【0064】

５１．Ｌが式（ＶＩＡ）のものである、第４２～５０項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。

【化27】

（式中、
波線は結合部位を示し；
Ｘ¹は存在していてもよく、Ｏ（ＣＨ₂）_s、ＮＨ（ＣＨ₂）_s及びＣ（Ｏ）（ＣＨ₂）_sからなる群から選択されるいずれか１つであり；
Ｘ²は存在していてもよく、Ｏ（ＣＨ₂）_uＣ（Ｏ）、（ＣＨ₂）_uＮＨ、（ＣＨ₂）_uＯ及び（ＣＨ₂）_uＣ（Ｏ）からなる群から選択され；
Ｌ’は、Ｏ（ＣＨ₂）_t、ＣＨ₂、アルキニレン、トリアゾリレン、ピペラジニレン及びピペリジニレンからなる群から選択され；
ｓは０～４の整数であり、ｕは１～４の整数であり、ｔは１～４の整数である）

【0065】

５２．Ｘ¹及びＸ²が存在する、第５１項に記載の使用のための分解化合物。
５３．Ｘ¹が、Ｏ（ＣＨ₂）_s及びＨＮ（ＣＨ₂）_sからなる群から選択されるいずれか１つである、第５１項又は５２項に記載の使用のための分解化合物。
５４．ｓが２である、第５１～５３項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。
５５．Ｘ¹がＯ（ＣＨ₂）₂である、第５１～５３項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。
５６．Ｌ’がＯ（ＣＨ₂）_tである、第５１～５５項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。
５７．ｔが、２又は３である、第５１～５６項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。
５８．Ｘ²が、Ｏ（ＣＨ₂）_uＣ（Ｏ）又は（ＣＨ₂）_uＮＨである、第５１～５７項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。
５９．ｕが１である、第５１～５８項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。

【0066】

６０．Ｂが、式（ＶＩＩＡ）～（ＸＩＩＩＡ）のうちのいずれか１つによって表される構造のうちのいずれか１つである、第４２～５９項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。

【化28】

（式中、Ｒ⁷は、Ｈ又はメチルであり、Ｚは、Ｆ又はＣＮである）

【0067】

６１．Ｂが、式（ＶＩＩＡ）～（ＩＸＡ）のうちのいずれか１つによって表される構造である、第６０項に記載の使用のための分解化合物。
６２．Ｂが、式（ＶＩＩＡ）によって表される構造である、第６０項に記載の使用のための分解化合物。
６３．Ｒ⁷がＨである、第６０～６２項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。

【0068】

６４．分解化合物が、式（ＸＩＸＡ）～（ＸＸＩＡ）のうちのいずれか１つである、第４２～６３項のいずれか１項に記載の使用のための分解化合物。

【化29】

【0069】

６５．分解化合物が式（ＸＩＩＡ）のものである、第６４項に記載の使用のための分解化合物。
６６．標的タンパク質を分解するための、第４２項～６５項のいずれか１項に定義される分解化合物の使用。
６７．標的タンパク質が、１個又は複数個のホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインを含むポリペプチドで内因的にタグ付けされる、第６６項に記載の使用。
６８．ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインが、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａ、Ｂｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ｖ、Ｂｒｄ４_BD1Ｌ９４Ａ、Ｂｒｄ４_BD1Ｌ９４Ｖ、Ｂｒｄ２_BD2Ｌ３８３Ａ、Ｂｒｄ２_BD2Ｌ３８３Ｖ、Ｂｒｄ２_BD1Ｌ１１０Ａ、Ｂｒｄ２_BD1Ｌ１１０Ｖ、Ｂｒｄ３_BD2Ｌ３４４Ａ、Ｂｒｄ３_BD2Ｌ３４４Ｖ、Ｂｒｄ３_BD1Ｌ７０Ａ、Ｂｒｄ３_BD1Ｌ７０Ｖ、ＢｒｄＴ_BD2Ｌ３０６Ａ、ＢｒｄＴ_BD2Ｌ３０６Ｖ、ＢｒｄＴ_BD1Ｌ６３Ａ、又はＢｒｄＴ_BD1Ｌ６３Ｖブロモドメインである、第６７項に記載の使用。

【0070】

６９．ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインがＢｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａ又はＢｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ｖブロモドメインである、第６７項に記載の使用。
７０．ホール改変変異体Ｂｒｄ４ブロモドメインがＢｒｄ４_BD2Ｌ３８７Ａブロモドメインである、第６７項に記載の使用。
７１．タンパク質がＢＥＴタンパク質である、第６６項～７０項のいずれか１項に記載の使用。
７２．ＢＥＴタンパク質がＢｒｄ２タンパク質である、第７１項に記載の使用。

【0071】

７３．１つ又は複数のＢｒｄ４ブロモドメインを含むタンパク質であって、それぞれがＬ３８７Ａ突然変異を含む、タンパク質。
７４．タンパク質が第７１項又は７２項に定義されるものである、第７３項に記載のタンパク質。

【0072】

本開示は、例として以下の図面を参照しながらさらに定義することになる。

【図面の簡単な説明】

【0073】

【図1】（Ａ）汎選択的ＢＥＴ分解物質、ＭＺ１及びＡＲＶ－７７１。（Ｂ）汎選択的ＢＥＴ阻害剤、（＋）－ＪＱ１及びＩ－ＢＥＴ７６２（上）。対立遺伝子特異的バンプＢＥＴ阻害剤、ＭＥ、ＥＴ、９－ＭＥ－１及び９－ＥＴ－１（下）。（Ｃ）デグロンシステムとして利用することができる高親和性選択的ペアリングを生成するためのＢＥＴブロモドメインに対する「バンプ及びホール」アプローチのテーラリング。（Ｄ）ブロモタグデグロンアプローチの概念化。

【図2】ヘテロ接合ノックインブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞株の設計及び開発。（Ａ）ＣＲＩＳＰＲ構築物の開発において使用されるノックイン構築物の設計。（Ｂ）ＧＦＰ発現に基づいたＨＥＫ２９３細胞のＦＡＣＳ単一細胞ソート。連続的な単一細胞を、９６ウェルプレートの個々のウェルにソートした。（Ｃ）親ＨＥＫ２９３に対してペアのクローンを発現する拡大ＧＦＰのゲノムＤＮＡを使用したジャンクションＰＣＲ。（Ｄ）ポリクローナルＢｒｄ４ＢＤ２^L387A.抗体の選択性を実証するウエスタンブロット。

【図3】（Ａ）Ｂｒｄ４^BD2（緑色、模式図／表面表示）とＭＺ１（７、棒状物、灰色炭素）とＶＣＢ（ＶＨＬ：青色；エロンギンＣ：ピンク色；エロンギンＢ－淡オレンジ色；模式図／表面表示）との間の三元複合体。Ｌｅｕ３８７（棒状物、緑色）（ＰＤＢコード：５Ｔ３５）は矢印で強調した。Ｂｒｄ４^BD2（淡緑色、模式図画像、５Ｔ３５）と（Ｂ）Ｂｒｄ２^{BD2 L383A}（オレンジ色、模式図画像、４ＱＥＷ）及び（Ｃ）Ｂｒｄ２^{BD2 L383V}（黄色、模式図画像、５Ｏ３Ｃ）とのアラインメントは、ＭＺ１（７、棒状物、灰色炭素）、ＥＴ（４、棒状物、ピンク色炭素）及び９－ＭＥ－１（５、棒状物、青色炭素）とそれぞれ共結晶化されている。Ｂｒｄ４^{BD2 W.T.}Ｌｅｕ３８７（棒状物、淡緑色炭素）及び変異体Ｂｒｄ２^{BD2 L383A}Ａｌａ３８３（棒状物、オレンジ色炭素）及びＢｒｄ２^{BD2 L383V}Ｖａｌ３８３（棒状物、黄色炭素）は強調されている。

【図4】第一世代ＩＢＥＴ－７６２ベースＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣは、ＭＺ１－様三元複合体において提示される立体的クラッシュに起因して、ブロモタグ－Ｂｒｄ２に対して不活性である。（Ａ）ヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞において６時間にわたるＰＲＯＴＡＣ処置を行った後のＢＥＴタンパク質レベルに関するウエスタンブロットデータ。バンドをチューブリンに対して正規化し、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）と比較して各ＰＲＯＴＡＣの順序付けを可能にするＤＣ₅₀値を導出する。（Ｂ）より嵩高い８／９－メトキシフェニル基によってＶＨＬとの潜在的なクラッシュを示すための、ＥＴ（６、８－ＯＭｅ、棒状物、ピンク色炭素、４ＱＥＷ）及び９－ＭＥ－１（７、９－ＯＭｅ、棒状物、青色炭素、５Ｏ３Ｃ）を含む、Ｂｒｄ４^BD2（緑色、表面表示）とＭＺ１（１、棒状物、灰色炭素）とＶＨＬ（青緑色、表面表示）との間の三元複合体のアラインメント（ＰＤＢコード：５Ｔ３５）。Ｈｉｓ１１０は強調されている（棒状物、青緑色炭素）。

【図5】ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞における第二世代Ｂ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣの生物学的評価。ヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞において６時間にわたって１０μＭ～１ｎＭ化合物処置をモニターした、ＢＥＴタンパク質レベルに関するウエスタンブロットデータ。バンドをチューブリン及び陰性対照（シス－ＭＺ１）に対して正規化して、各ＰＲＯＴＡＣの順序付けを可能にするＤＣ₅₀値を導出する。

【図6】ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＧＢ１、ＡＧＢ２及びＡＧＢ３の生物学的評価。（Ａ）ヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞において６時間にわたって１０μＭ～１ｎＭ化合物処置をモニターした、ＢＥＴタンパク質レベルに関するウエスタンブロットデータ。（Ｂ）３６時間にわたってＡＧＢ１及びＡＧＢ２を５００ｎＭで並びにＡＧＢ３を１μＭで処置した際の、ヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞におけるＢｒｄ２レベルの時間経時ウエスタンブロットデータ。（Ｃ及びＤ）ＡＧＢ１がさらなる検証のための最良の選択であることを決定するのを可能にする、化合物に関する（Ｃ）ＤＣ₅₀及び（Ｄ）ｔ_1/2値を計算するためのプロット。（Ａ）及び（Ｂ）からのウエスタンブロットをチューブリンに対して正規化し、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）と比較して各ＰＲＯＴＡＣの順序付けを可能にするｐＤＣ₅₀又はｔ_1/2値を導出した。

【図7】Ｂ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣ二元及び三元複合体結合の蛍光偏光度（ＦＰ）。ＶＨＬ単独に対する４６（Ａ）、４７（Ｂ）及び４８（Ｃ）（黒色実線）、又はＢｒｄ４^{BD2 L387A}とプレインキュベートされた場合のＶＨＬに対するそれぞれもの（色付き破線）に関する二元及び三元複合体形成ＦＰデータ。エラーバー及びＫ_d値は、ＶＨＬに対する二元及び三元結合に関するＮ＝４からの平均（±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）である。二元データと三元データとの間の左へのシフトは正の共同性を示す。共同性（α）は、Ｋ_d ^binary／Ｋ_d ^ternaryの比率として計算される。

【図8】ＡＧＢ１分解活性の細胞機構的特性評価。（Ａ）４６のオンターゲット分解活性は、ＣＲＬ２^VHL、プロテアソーム、及びブロモタグ標的結合の活性に依存することを示すウエスタンブロット。ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞を、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２、ネディレーション阻害剤ＭＬＮ４９２４、ＶＨＬ阻害剤ＶＨ２９８又はブロモタグ阻害剤ＥＴ－ＪＱ１－ＯＭｅ又はＤＭＳＯビヒクルで前処置（１時間）後、２００ｎＭの４６（３時間）で処置した。（Ｂ）ヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞において３時間処置後、２００ｎＭの４６を除去した後のブロモタグ－Ｂｒｄ２の回収を実証するウエスタンブロット。無洗浄及びビヒクル処置に関する対照実験が含まれている。バンドをチューブリンタンパク質レベルに対して正規化し、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）と比較して、ブロモタグ－Ｂｒｄ２の最終タンパク質レベルを定量化する。（Ｃ）ＭＺ１及び非分解物質対照５２及びシス－ＭＺ１と比較した４６の抗増殖に対する効果。スタウロスポリンを細胞毒性に関する陽性対照として使用した。ＭＶ－４－１１、２２Ｒｖ１及びＨＥＫ２９３細胞を異なる濃度の化合物で処置し、２４時間、４８時間及び４８時間後、それぞれにＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ細胞生存率アッセイを行った。ｐＥＣ₅₀値（±Ｓ．Ｅ．Ｍ）は、ＭＶ－４－１１及び２２Ｒｖ１細胞に関してはＮ＝２からの平均であり、ＨＥＫ２９３細胞に関してはＮ＝３からの平均であり、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）から正規化されたデータからのものである。

【図9】血漿安定性及びマウスを用いたＡＧＢ１のＩｎ ｖｉｖｏ薬物動態研究。（Ａ）、１時点あたり２回の独立した反復を伴う、０分の時点に対して正規化された、３７℃のマウス血漿における０、５、１５、３０、４５及び６０分後に残存するＡＧＢ１のパーセンテージ。（Ｂ）雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを静脈内注射（ＩＶ、黒色の点）又は皮下注射（ＳＣ、白色の四角）のいずれかによって、単回５ｍｇ／ｋｇ用量の４６で処置し、４６の血漿濃度を７ケ所の時点で測定した。データは、各時点における３回の独立した反復からの平均（±Ｓ．Ｄ．）である。赤色の破線は、ブロモタグ－Ｂｒｄ２分解に関する４６のＤＣ_{50, 6h}を示す。

【発明を実施するための形態】

【0074】

実験手順
化学物質。
合成。市販の化学物質は、Ａｐｏｌｌｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍ、又はＭａｎｃｈｅｓｔｅｒ Ｏｒｇａｎｉｃｓから購入し、さらに一切精製することなく使用した。全ての反応は無水溶媒を使用して行った。反応は次のいずれかを使用してモニターした：Ａｇｉｌｅｎｔダイオードアレイ検出器及びＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×２．１ｍｍ、粒子サイズ３．５μｍ）を含むＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６１３０四重極ＬＣ／ＭＳに連結されたＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ １２００シリーズ分析ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）。試料は、０．１％ギ酸を含む５％～９５％ＭｅＣＮ：水の勾配、３分、流速０．７ｍＬ／分；又はフォトダイオードアレイ検出器及びＨｙｐｅｒｓｉｌ Ｇｏｌｄカラム（１．９μｍ ５０×２．１ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣ／ＭＳ ２０２０で溶出した。試料は、０．１％ギ酸を含む５％～９５％ＭｅＣＮ：水の勾配、３分、流速０．８ｍＬ／分で溶出した。中間体は、順相ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆディスポーザブルカラム又は逆相ＲｅｄｉＳｅｐ Ｒｆ Ｇｏｌｄ Ｃ１８リユーザブルカラムを備えたＴｅｌｅｄｙｎｅ Ｉｓｃｏ Ｃｏｍｂｉｆｌａｓｈ Ｒｆ又はＲｆ２００ｉを使用したフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。最終化合物は、別途記述がない限り、０．１％ギ酸又はアンモニアを含む水中の５％～９５％アセトニトリル勾配を１０分にわたって流速２５ｍＬ／分で使用した、Ｗａｔｅｒｓ Ｘ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（１００ｍｍ×１９ｍｍ；粒子サイズ５μｍ）を備えたＧｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣシステムを使用したＨＰＬＣで精製した。ＮＭＲを使用した化合物の特性評価は、Ｂｒｕｋｅｒ ５００ Ｕｌｔｒａｓｈｉｅｌｄ又はＢｒｕｋｅｒ Ａｓｃｅｎｄ ４００スペクトロメーターのいずれかで行った。使用したプロトン（¹Ｈ）及び炭素（¹³Ｃ）の基準溶媒は次のとおりである：ｄ１－クロロホルム－ＣＤＣｌ₃（（δＨ＝７．２６ｐｐｍ／δＣ＝７７．１５ｐｐｍ）、ｄ４－ＣＤ₃ＯＤ（δＨ＝３．３１ｐｐｍ／δＣ＝４９．００ｐｐｍ）。シグナルパターンは、シングレット（ｓ）、ダブレット（ｄ）、トリプレット（ｔ）、カルテット（ｑ）、クインテット（ｑｕｉｎｔ．）、マルチプレット（ｍ）、ブロード（ｂｒ．）、又は挙げられる分裂パターンの組合せとして記載する。カップリング定数（Ｊ）はヘルツ（Ｈｚ）で測定する。全ての化合物に関するＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＴｏｐＳｐｉｎ ４．１．１を使用して処理した。高分解マススペクトル（ＨＲＭＳ）データは、ダイオードアレイ検出器及びＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム（５０ｍｍ×２．１、粒子サイズ３．５μｍ）を備えたＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステムに並列に接続したＢｒｕｋｅｒ ＭｉｃｒＯＴＯＦ ＩＩ ｆｏｃｕｓ ＥＳＩ Ｍａｓｓスペクトロメーターで行った。試料は、０．１％ギ酸を含む５％～９５％アセトニトリル：水の勾配、６分、流速０．６ｍＬ／分で溶出した。全ての化合物はＨＰＬＣで９５％を超える純度である。

【0075】

一般手順Ａ。アジド９（Zengerle, M.; Chan, K.-H.; Ciulli, A., ACS Chem Biol. 2015, 10 (8), 1770-1777に従って合成する）（１ｅｑ．）をＭｅＯＨ（１２５ｍＬ／ｍｍｏｌ）中に溶解した。触媒量の１０ｗｔ．％Ｐｄ／Ｃを添加し、反応物をＨ₂下で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を、ＰＴＦＥシリンジフィルターに通してろ過し、蒸発乾固させて、所望のアミンの定量的収率を得た。得られたアミン（１ｅｑ．）を、ＤＣＭ又はＤＭＦ（２ｍＬ）中の酸（１ｅｑ．）、ＨＡＴＵ（１ｅｑ．）、ＨＯＡｔ（１ｅｑ．）及びＤＩＰＥＡ（３ｅｑ）の溶液に添加し、室温で１８時間撹拌しながら静置した。次いで、これをＨＰＬＣで精製した。

【0076】

一般手順Ｂ。アジド（１ｅｑ．）をＭｅＯＨ（１２５ｍＬ／ｍｍｏｌ）中に溶解した。触媒量の１０ｗｔ．％Ｐｄ／Ｃを添加し、反応物をＨ₂下で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を、ＰＴＦＥシリンジフィルターに通してろ過し、蒸発乾固させて、所望のアミンを定量的収率で得た。得られたアミンを、ＴＨＦ（８Ｌ／ｍｏｌ）中のアルキル化されたＪＱ１酸（１ｅｑ．）、ＣＯＭＵ（１．５ｅｑ．）及びＤＩＰＥＡ（３ｅｑ．）の溶液に添加し、室温で４時間撹拌した。次いで、混合物を真空中で濃縮し、残渣を、水中の０．１％ギ酸中の５％～９５％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用したＨＰＬＣで精製して、２種類のジアステレオマー混合物としてアミドを得た。

【0077】

一般手順Ｃ。アルキル化されたＪＱ１酸（１ｅｑ．）、ＥＤＣ．ＨＣｌ（２ｅｑ．）をＴＨＦ（１５ｍＬ／ｍｍｏｌ）中に溶解し、室温で５分間撹拌した。次いで、ＤＭＡＰ（３ｅｑ）及びアルコール（２ｅｑ．）を添加し、反応物を室温で１６時間撹拌しながら静置した。次いで、混合物を真空中で濃縮し、残渣を、水中の０．１％ギ酸中の５％～９５％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用したＨＰＬＣで精製して、２種類のジアステレオマー混合物としてアミドを得た。
一般手順Ｄ。化合物２９（１２０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５．２ｍＬ）中に溶解し、－７８℃に冷却した。トルエン（８１２μＬ、０．４１ｍｍｏｌ）中の０．５Ｍ ＫＨＭＤＳの溶液を滴加し、反応物を－７８℃で１時間撹拌しながら静置した。次いで、ヨウ化アルキル（０．４１ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を－７８℃で１０分間さらに撹拌してから室温に加温し、１６時間撹拌しながら静置した。次いで、混合物を真空中で濃縮し、水中の０．１％ギ酸中の３０％～７０％ＭｅＣＮの直線勾配を使用したＨＰＬＣで１２分にわたって精製して、アルキル化ＪＱ１－ＯＭｅ誘導体を得た。

【0078】

一般手順Ｅ。（２Ｓ，３Ｓ）ジアステレオマー（１ｅｑ．）及びＮａＯＭｅ（１０ｅｑ．）を、密閉され、Ｎ₂パージされたマイクロ波用バイアル中のＭｅＯＨ（６０Ｌ／ｍｏｌ）中に溶解し、マイクロ波照射下、１２０℃まで４０分間加熱した。反応物を６０℃で撹拌してから数滴のＡｃＯＨで酸性化した。次いで、反応物を室温まで冷却し、真空中で濃縮した。残渣を、水中の０．１％ギ酸中の３０％～７０％ＭｅＣＮの直線勾配を使用したＨＰＬＣで１２分にわたって精製した。
一般手順Ｆ。ＥＴ－ＪＱ１－ＯＨ（４５、Bond, A. G.; Testa, A.; Ciulli, A., Org Biomol Chem. 2020, 18 (38), 7533-7539に従って合成する）（１ｅｑ．）を、Ｎ₂下、ＤＣＭ（９Ｌ／ｍｏｌ）中に溶解した。次いで、塩化チオニル（１５ｅｑ．）を添加し、反応物を室温で３時間撹拌しながら静置し、酸塩化物への変換をＭｅＯＨ中のＬＣＭＳでモニターした（メチルエステル（約４４３）の質量によるモニター）。混合物を蒸発乾固させて、酸塩化物中間体を定量的に得た。アルコール（１ｅｑ．）をＤＣＭ（９Ｌ／ｍｏｌ）中に溶解し、酸塩化物に添加した。これを室温で１６時間撹拌しながら静置した。次いで、混合物を真空中で濃縮し、精製した。

【0079】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２Ｓ）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１７－（６－（４－クロロフェニル）－８－メトキシ－１－メチル－４Ｈ－ベンゾ［ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）－４，１６－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－３，１５－ジアザヘプタデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＭＺＰ－１５）（１４）。一般手順Ａに従って、化合物１４を、ＤＣＭ中の酸１０（Chung, C.-W et al. J Med Chem. 2011, 54 (11), 3827-3838に従って合成する）を使用し、ＨＯＡｔを用いずに得、水中の０．１％ギ酸中の５％～９５％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用したＨＰＬＣで精製して、２種類のジアステレオマー混合物として１４を得た。収率：１６．５ｍｇ（４７％）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 8.70 (s, 1H), 8.63-8.61 (m, 1H), 8.31-8.28 (m, 1H), 8.10-8.03 (m, 1H), 7.52-7.45 (m, 3H), 7.41-7.28 (m, 8H), 7.20-7.16 (m, 1H), 6.86-6.84 (m, 1H), 4.87-4.81 (m, 1H), 4.71-4.63 (m, 2H), 4.57-4.48 (m, 2H), 4.41-4.28 (m, 2H), 4.22-4.06 (m, 3H), 3.78 (s, 3H), 2.57-2.54 (m, 3H), 2.51-2.49 (m, 3H), 2.46-2.35 (m, 1H), 2.27-2.20 (m, 1H), 1.01-0.99 ppm (m, 9H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃): δ = 171.7, 171.5, 171.3, 171.1, 171.04, 171.01, 170.9, 170.7, 166.6, 166.4, 158.3, 156.74, 156.70, 150.6, 150.3, 148.3, 138.7, 138.6, 137.2, 137.1, 137.0, 131.1, 131.0, 130.62, 130.55, 130.4, 130.3, 129.51, 129.47, 129.2, 128.7, 128.6, 128.2, 128.1, 126.2, 124.95, 124.91, 120.3, 118.2, 118.1, 116.0, 71.7, 71.2, 70.9, 70.8, 70.6, 70.5, 70.4, 70.3, 70.22, 70.15, 59.2, 59.1, 57.5, 57.3, 56.9, 56.0, 53.6, 53.5, 43.2, 40.0, 39.9, 38.1, 38.0, 36.9, 36.7, 35.8, 35.6, 26.6, 16.0, 12.11, 12.07; HRMS m/z C₅₀H₆₁ClN₉O₉S [M+H]⁺の計算値998.3996, 実測値998.3996.

【0080】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２Ｓ，１７Ｒ＊）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１７－（（Ｓ＊）－６－（４－クロロフェニル）－８－メトキシ－１－メチル－４Ｈ－ベンゾ［ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）－４，１６－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－３，１５－ジアザノナデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＤＡＴ４８７）（１５）。一般手順Ａに従って、化合物１５を、ＤＭＦ中の酸１１（Runcie, A. C. et al. Chem Sci. 2018, 9 (9), 2452-2468に従って合成する）を使用して得、水中の０．１％アンモニア中の５％～９５％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用したＨＰＬＣで精製して、２種類のジアステレオマー混合物として１５を得た。収率：８．３ｍｇ（２３％）；¹H NMR (400 MHz, MeOD): δ = 8.86 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 7.72-7.67 (m, 1H), 7.56 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.46-7.34 (m, 7H), 6.93-6.91 (m, 1H), 4.79-4.32 (m, 5H), 4.29-4.25 (m, 1H), 4.11-4.02 (m, 2H), 3.90-3.85 (m, 1H), 3.82-3.77 (m, 4H), 3.74-3.40 (m, 13H), 3.30-3.14 (m, 1H), 2.59-2.58 (m, 3H), 2.47-2.46 (m, 3H), 2.27-2.17 (m, 2H), 2.11-2.03 (m, 1H), 1.75-1.63 (m, 1H), 1.07-1.01 ppm (m, 12H); ¹³C NMR (101 MHz, MeOD): δ = 175.9, 174.42, 174.39, 172.1, 171.6, 168.8, 168.7, 159.9, 157.3, 152.8, 152.6, 149.0, 140.3, 140.2, 138.6, 138.14, 138.11, 133.4, 132.1, 131.5, 131.3, 130.3, 129.6, 129.0, 128.9, 127.5, 126.8, 119.2, 116.8, 72.3, 72.2, 71.75, 71.67, 71.5, 71.4, 71.0, 70.5, 70.4, 60.8, 58.5, 58.4, 58.1, 56.4, 49.84, 49.76, 43.8, 43.7, 40.4, 39.0, 37.2, 37.1, 26.99, 26.96, 24.53, 24.46, 15.9, 11.7, 11.6; LCMS m/z C₅₂H₆₆ClN₉O₉S [M+2H]²⁺の計算値513.7, 実測値514.1.

【0081】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２Ｓ，１７Ｒ＊）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１７－（（Ｓ＊）－６－（４－クロロフェニル）－９－メトキシ－１－メチル－４Ｈ－ベンゾ［ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）－４，１６－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－３，１５－ジアザオクタデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＤＡＴ４８８）（１６）。一般手順Ａに従って、化合物１６を、ＤＭＦ中の酸１２（Ｒｕｎｃｉｅ，Ａ．Ｃ．ら、２０１８年（上記を参照のこと）に従って合成する）を使用して得、水中の０．１％アンモニア中の５％～９５％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用したＨＰＬＣで精製して、２種類のジアステレオマー混合物として１６を得た。収率：１３．８ｍｇ（２８％）；¹H NMR (400 MHz, MeOD): δ = 8.87-8.86 (m, 1H), 7.49-7.34 (m, 9H), 7.31-7.29 (m, 1H), 7.16-7.11 (m, 1H), 4.71-4.69 (m, 1H), 4.62-4.56 (m, 1H), 4.55-4.46 (m, 2H), 4.38-4.32 (m, 1H), 4.25-4.21 (m, 1H), 4.09-4.00 (m, 2H), 3.97-3.96 (m, 3H), 3.90-3.72 (m, 3H), 3.71-3.59 (m, 11H), 3.53-3.42 (m, 2H), 2.66-2.64 (m, 3H), 2.47-2.45 (m, 3H), 2.25-2.18 (m, 1H), 2.11-2.04 (m, 1H), 1.36-1.32 (m, 3H), 1.05-1.02 ppm (m, 9H); ¹³C NMR (101 MHz, MeOD): δ = 177.4, 174.39, 174.36, 172.1, 171.7, 171.6, 168.1, 168.0, 163.6, 156.8, 152.9, 152.8, 149.0, 140.3, 140.2, 138.9, 137.9, 135.8, 134.34, 134.32, 133.4, 132.4, 131.5, 130.4, 129.4, 128.9, 122.5, 115.2, 110.6, 72.2, 71.7, 71.6, 71.4, 71.1, 71.0, 70.7, 60.8, 60.7, 58.1, 56.7, 43.9, 43.7, 40.5, 38.9, 37.1, 27.0, 20.0, 16.1, 16.0, 15.9, 11.9; LCMS m/z C₅₁H₆₄ClN₉O₉S [M+2H]²⁺の計算値506.7, 実測値507.1.

【0082】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２Ｓ，１７Ｒ＊）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１７－（（Ｓ＊）－６－（４－クロロフェニル）－９－メトキシ－１－メチル－４Ｈ－ベンゾ［ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）－４，１６－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－３，１５－ジアザノナデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＤＡＴ４８９ １７）。一般手順Ａに従って、化合物１７を、ＤＭＦ中の酸１３（Ｒｕｎｃｉｅ，Ａ．Ｃ．ら、２０１８年に従って合成する（上記を参照のこと））を使用して得、水中の０．１％アンモニア中の５％～９５％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用したＨＰＬＣで精製して、２種類のジアステレオマー混合物として１７を得た。収率：４．８ｍｇ（２０％）；¹H NMR (400 MHz, MeOD): δ = 8.87-8.86 (m, 1H), 7.54-7.50 (m, 2H), 7.46-7.37 (m, 7H), 7.26 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.15-7.12 (m, 1H), 4.74-4.70 (m, 1H), 4.69-4.51 (m, 2H), 4.50-4.46 (m, 1H), 4.42-4.32 (m, 1H), 4.29-4.25 (m, 1H), 4.11-4.02 (m, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.89-3.78 (m, 2H), 3.74-3.39 (m, 13H), 3.29-3.14 (m, 1H), 2.63-2.62 (m, 3H), 2.47-2.46 (m, 3H), 2.28-2.18 (m, 2H), 2.11-2.02 (m, 1H), 1.75-1.62 (m, 1H), 1.06-1.01 ppm (m, 12H); ¹³C NMR (101 MHz, MeOD): δ = 176.0, 174.42, 174.39, 172.1, 171.6, 169.3, 169.2, 163.71, 163.69, 157.27, 157.26, 152.8, 152.6, 149.0, 140.3, 140.2, 139.1, 138.0, 138.0, 136.0, 134.30, 134.28, 133.4, 132.3, 131.5, 130.3, 129.5, 129.02, 128.95, 122.6, 115.1, 110.6, 72.4, 72.2, 71.75, 71.68, 71.50, 71.48, 71.4, 71.09, 71.06, 70.5, 70.4, 60.80, 60.78, 58.4, 58.3, 58.14, 58.10, 56.7, 49.8, 49.7, 43.8, 43.7, 40.4, 39.0, 37.2, 37.1, 27.00, 26.96, 24.5, 24.4, 15.9, 11.9, 11.7, 11.6; LCMS m/z C₅₂H₆₆ClN₉O₉S [M+2H]²⁺の計算値513.7, 実測値514.2.

【0083】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２Ｓ，１７Ｒ＊）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１７－（（Ｓ＊）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－４，１６－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－３，１５－ジアザオクタデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＭＥ－ＭＺ１）（１８）。一般手順Ｂに従って、化合物１８を、アジド９（Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．－Ｗら、２０１１年に従って合成する（上記を参照のこと））及びアルキル化ＪＱ１酸３２を使用して得て、２種類のジアステレオマー混合物として１８を得た。収率：１．６ｍｇ（１９％）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 8.67 (s, 1H), 8.07 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.89 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.46-7.24 (m, 9H), 4.85-4.79 (m, 1H), 4.77-4.63 (m, 1H), 4.63-4.47 (m, 2H), 4.42-4.36 (m, 1H), 4.31-4.23 (m, 2H), 4.18-4.01 (m, 3H), 3.96-3.85 (m, 1H), 3.81-3.36 (m, 16H), 2.65-2.60 (m, 3H), 2.51 (s, 3H), 2.50-2.37 (m, 4H), 2.26-2.11 (m, 1H), 1.73-1.64 (m, 3H), 1.42-1.35 (m, 3H), 1.01-0.94 ppm (m, 9H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃): δ = 175.2, 171.51, 171.49, 171.2, 170.7, 170.5, 163.3, 163.2, 158.2, 155.14, 155.09, 150.4, 149.8, 148.6, 138.6, 138.5, 136.9, 136.8, 136.69, 136.65, 131.9, 131.25, 131.15, 130.8, 130.2, 129.6, 129.5, 128.9, 128.8, 128.2, 128.0, 71.6, 71.4, 70.9, 70.6, 70.5, 70.4, 70.3, 70.25, 70.20, 70.1, 60.5, 60.1, 59.1, 58.9, 57.5, 57.3, 56.8, 56.7, 43.3, 43.2, 42.7, 42.6, 39.9, 36.4, 36.3, 35.9, 35.8, 26.6, 26.5, 16.4, 16.2, 16.1, 14.6, 13.3, 11.91, 11.87; HRMS m/z C₅₀H₆₃ClN₉O₈S₂ [M+H]⁺の計算値1016.3924, 実測値: 1016.3905.

【0084】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２Ｓ，１７Ｒ＊）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１７－（（Ｓ＊）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－４，１６－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－３，１５－ジアザノナデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＥＴ－ＭＺ１）（１９）。一般手順Ｂに従って、化合物１９を、アジド９（Ｃｈｕｎｇ，Ｃ．－Ｗら、２０１１年に従って合成する（上記を参照のこと））及びアルキル化ＪＱ１酸３３を使用して得て、２種類のジアステレオマー混合物として１９を得た。収率：５．３ｍｇ（４７％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 8.68-8.66 (m, 1H), 8.10-8.05 (m, 1H), 7.83-7.79 (m, 1H), 7.69-7.65 (m, 1H), 7.40-7.26 (m, 8H), 7.21-7.16 (m, 2H), 4.87-4.76 (m, 2H), 4.68-4.49 (m, 2H), 4.49-4.36 (m, 1H), 4.28-4.24 (m, 1H), 4.18-4.00 (m, 3H), 3.81-3.74 (m, 1H), 3.74-3.34 (m, 13H), 2.65-2.62 (m, 3H), 2.53-2.51 (m, 3H), 2.49-2.44 (m, 1H), 2.41-2.38 (m, 3H), 2.36-2.30 (m, 1H), 2.25-2.11 (m, 1H), 1.97-1.89 (m, 1H), 1.71-1.59 (m, 4H), 1.03-0.93 ppm (m, 12H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 174.2, 173.9, 171.7, 171.6, 171.2, 170.4, 170.3, 163.8, 163.2, 155.3, 155.1, 150.3, 149.9, 149.8, 148.6, 138.7, 138.6, 136.95, 136.91, 136.8, 136.7, 132.1, 131.94, 131.90, 131.3, 131.1, 131.0, 130.9, 130.8, 130.7, 130.2, 130.1, 129.9, 129.6, 129.5, 129.0, 128.8, 128.3, 127.6, 71.3, 71.2, 71.1, 70.9, 70.8, 70.7, 70.50, 70.47, 70.3, 70.18, 70.15, 59.8, 59.4, 59.2, 58.9, 57.63, 57.59, 56.8, 50.3, 50.1, 43.3, 43.0, 39.9, 39.8, 36.9, 36.4, 35.90, 35.85, 26.6, 23.7, 23.2, 16.21, 16.19, 14.6, 14.5, 13.2, 12.0; HRMS m/z C₅₁H₆₅ClN₉O₈S₂ [M+H]⁺の計算値1030.4081, 実測値: 1030.3943.

【0085】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２Ｓ，１５Ｒ＊）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１５－（（Ｓ＊）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－４，１４－ジオキソ－６，１０－ジオキサ－３，１３－ジアザヘキサデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（（Ｓ）－１－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）フェニル）エチル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＭＥ－ＡＲＶ－７７１）（２０）。一般手順Ｂに従って、化合物２０を、アジド４２（Ｋｌｅｉｎ，Ｖ．ら、ＣｈｅｍＲｘｉｖ ２０２１年に従って合成する）及びアルキル化ＪＱ１酸３２を使用して得て、２種類のジアステレオマー混合物として２０を得た。収率：５．２ｍｇ（３１％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 8.71-8.69 (m, 1H), 7.66-7.61 (m, 1H), 7.57-7.21 (m, 9H), 5.14-4.98 (m, 1H), 4.86-4.80 (m, 1H), 4.65-4.47 (m, 2H), 4.34-4.24 (m, 1H), 4.21-3.77 (m, 4H), 3.75-3.33 (m, 11H), 2.69-2.63 (m, 3H), 2.53-2.50 (m, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.38-2.28 (m, 1H), 2.23-2.10 (m, 1H), 1.92-1.71 (m, 2H), 1.67 (d, J = 3.1 Hz, 3H), 1.48 (d, J = 21.4 Hz, 3H), 1.43-1.35 (m, 3H), 1.10-1.05 ppm (m, 9H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 175.3, 175.0, 171.5, 171.4, 170.8, 170.6, 170.42, 170.38, 164.1, 163.9, 155.0, 154.9, 150.5, 150.22, 150.16, 148.2, 143.9, 143.7, 137.3, 136.4, 136.1, 132.0, 131.8, 131.33, 131.26, 130.6, 130.5, 130.3, 129.6, 129.55, 129.48, 128.92, 128.88, 126.6, 70.4, 70.32, 70.29, 70.2, 69.6, 69.4, 69.2, 67.84, 67.77, 59.9, 59.8, 58.9, 58.8, 57.5, 57.3, 57.1, 57.0, 49.1, 48.9, 42.6, 42.3, 39.7, 39.5, 36.6, 36.5, 35.5, 35.3, 29.53, 29.46, 26.7, 22.4, 22.1, 16.5, 16.3, 16.1, 14.6, 13.3, 11.8, 11.7; HRMS m/z C₅₀H₆₃ClN₉O₇S₂ [M+H]⁺の計算値1000.3975, 実測値: 1000.3975.

【0086】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２Ｓ，１５Ｒ＊）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１５－（（Ｓ＊）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－４，１４－ジオキソ－６，１０－ジオキサ－３，１３－ジアザヘプタデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（（Ｓ）－１－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）フェニル）エチル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＥＴ－ＡＲＶ－７７１）（２１）。一般手順Ｂに従って、化合物２１を、アジド４２（Ｋｌｅｉｎ，Ｖ．ら、２０２１年（上記を参照のこと）に従って合成する）及びアルキル化ＪＱ１酸３３を使用して得て、２種類のジアステレオマー混合物として２１を得た。収率：３．４ｍｇ（２７％）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 8.68 (s, 1H), 7.94-7.90 (m, 1H), 7.71-7.65 (m, 1H), 7.44-7.31 (m, 7H), 7.25-7.22 (m, 1H), 7.17-7.13 (m, 1H), 5.14-4.87 (m, 1H), 4.75-4.58 (m, 1H), 4.53-4.44 (m, 1H), 4.09-3.98 (m, 1H), 3.94-3.87 (m, 2H), 3.80-3.31 (m, 11H), 2.67-2.61 (m, 2H), 2.54-2.49 (m, 3H), 2.41 (s, 2H), 2.37-2.14 (m, 2H), 1.98-1.47 (m, 11H), 1.11-0.94 ppm (m, 12H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃): δ = 174.04, 174.00, 172.3, 171.5, 170.59, 170.55, 170.32, 170.25, 163.6, 163.2, 162.4, 155.3, 155.1, 150.4, 144.0, 143.4, 137.1, 136.9, 136.6, 131.3, 131.2, 131.1, 130.64, 130.59, 130.5, 130.10, 130.07, 130.0, 129.6, 129.4, 128.84, 128.80, 128.7, 126.6, 126.5, 70.4, 70.30, 70.26, 70.2, 69.6, 69.4, 69.1, 68.1, 67.7, 59.6, 59.0, 58.8, 58.6, 57.4, 57.1, 57.0, 50.3, 50.2, 49.1, 48.8, 39.8, 39.4, 36.6, 35.7, 35.6, 29.8, 29.6, 29.5, 26.7, 23.9, 23.4, 22.5, 21.9, 16.2, 14.61, 14.56, 13.3, 12.00, 11.97, 11.91, 11.87; HRMS m/z C₅₁H₆₅ClN₉O₇S₂ [M+H]⁺の計算値1014.4131, 実測値: 1014.4126.

【0087】

（Ｓ）－１３－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－カルボニル）－１４，１４－ジメチル－１１－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル（Ｒ＊）－２－（（Ｓ＊）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）プロパノエート（ＭＥ－ＯＭＺ１）（２２）。一般手順Ｃに従って、化合物２２を、アルキル化ＪＱ１酸３２及びアルコール４１（Ｋｌｅｉｎ，Ｖ．ら、２０２１年（上記を参照のこと）に従って合成する）を使用して得て、２種類のジアステレオマー混合物として２２を得た。収率：１．１ｍｇ（１７％）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 8.69-8.67 (m, 1H), 7.67-7.65 (m, 1H), 7.44-7.28 (m, 10H), 4.78-4.73 (m, 1H), 4.69-4.50 (m, 3H), 4.41-4.24 (m, 3H), 4.13-3.81 (m, 5H), 3.77-3.49 (m, 12H), 2.63 (d, J = 15.9 Hz, 3H), 2.59-2.50 (m, 4H), 2.42 (s, 3H), 1.73-1.66 (m, 3H), 1.58-1.48 (m, 3H), 0.99-0.94 ppm (m, 9H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃): δ = 175.4, 171.6, 170.9, 170.6, 170.5, 163.2, 154.5, 150.4, 149.8, 148.7, 142.1, 140.3, 138.4, 136.9, 136.6, 132.4, 131.7, 131.1, 131.0, 131.0, 130.0, 129.6, 128.9, 128.8, 128.3, 71.30, 71.28, 71.0, 70.93, 70.89, 70.7, 70.6, 70.5, 70.44, 70.36, 69.3, 64.1, 64.0, 61.8, 61.7, 60.2, 60.1, 58.7, 58.6, 57.3, 56.8, 56.7, 43.4, 42.7, 42.6, 36.1, 36.0, 35.2, 26.6, 16.2, 16.1, 15.4, 15.3, 14.60, 14.56, 13.3, 11.9; HRMS m/z C₅₀H₆₂ClN₈O₉S₂ [M+H]⁺の計算値1017.3764, 実測値: 1017.3780.

【0088】

（Ｓ）－１３－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－カルボニル）－１４，１４－ジメチル－１１－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル（Ｒ＊）－２－（（Ｓ＊）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）ブタノエート（ＥＴ－ＯＭＺ１）（２３）。一般手順Ｃに従って、化合物２３を、アルキル化ＪＱ１酸３３及びアルコール４１（Ｋｌｅｉｎ、Ｖ．ら、２０２１年に従って合成する（上記を参照のこと））を使用して得て、２種類のジアステレオマー混合物として２３を得た。収率：０．７ｍｇ（１０％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 8.67 (s, 1H), 7.41-7.23 (m, 10H), 4.77 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.60-4.31 (m, 6H), 4.24 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 4.15-4.11 (m, 1H), 4.05-3.89 (m, 3H), 3.80-3.74 (m, 2H), 3.72-3.52 (m, 10H), 2.65 (s, 3H), 2.60-2.51 (m, 4H), 2.41 (s, 3H), 2.17-2.10 (m, 2H), 1.71-1.64 (m, 4H), 1.05-0.93 ppm (m, 12H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 174.8, 174.1, 171.5, 171.1, 170.5, 163.2, 163.0, 154.6, 150.4, 149.9, 148.7, 141.2, 136.9, 136.7, 132.2, 131.8, 131.0, 130.7, 130.0, 129.7, 128.8, 128.4, 128.3, 71.32, 71.30, 70.98, 70.96, 70.91, 70.85, 70.8, 70.7, 70.6, 70.54, 70.51, 70.3, 69.3, 63.9, 63.8, 59.4, 58.5, 57.3, 56.8, 49.8, 49.7, 43.44, 43.41, 36.0, 35.1, 26.6, 23.4, 16.2, 14.6, 13.3, 11.9, 11.7, 16.1, 15.4, 15.3, 14.60, 14.56, 13.3, 11.9; HRMS m/z C₅₁H₆₄ClN₈O₉S₂ [M+H]⁺の計算値1031.3921, 実測値: 1031.4061.

【0089】

２－（３－（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（（Ｓ）－１－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）フェニル）エチル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）プロポキシ）エチル（Ｒ＊）－２－（（Ｓ＊）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）プロパノエート（ＭＥ－ＯＡＲＶ－７７１）（２４）。一般手順Ｃに従って、化合物２４を、アルキル化ＪＱ１酸３２及びアルコール４４（Ｋｌｅｉｎ、Ｖ．ら、２０２１年（上記を参照のこと）に従って合成する）を使用して得て、２種類のジアステレオマー混合物として２４を得た。収率：１．８ｍｇ（２５％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 8.68-8.66 (m, 1H), 7.51-7.44 (m, 1H), 7.42-7.28 (m, 8H), 7.23-7.16 (m, 1H), 5.52 (br. s, 1H), 5.14-5.06 (m, 1H), 4.81-4.71 (m, 1H), 4.70-4.51 (m, 2H), 4.43-4.31 (m, 2H), 4.27 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.13-4.08 (m, 1H), 4.07-3.81 (m, 4H), 3.75-3.54 (m, 8H), 3.19 (br. s, 1H), 2.66-2.62 (m, 3H), 2.59-2.52 (m, 4H), 2.42 (s, 3H), 2.17-2.08 (m, 1H), 1.96-1.85 (m, 2H), 1.69 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 1.56-1.47 (m, 6H), 1.08-1.05 ppm (m, 9H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 175.4, 174.3, 171.8, 171.5, 170.3, 169.8, 169.7, 169.5, 163.1, 154.5, 150.3, 149.8, 148.7, 136.9, 136.7, 132.2, 131.8, 131.0, 130.7, 130.0, 129.7, 128.9, 128.8, 126.65, 126.60, 73.2, 72.2, 70.5, 70.4, 70.3, 69.3, 69.0, 68.9, 68.0, 67.9, 63.9, 61.9, 60.1, 59.6, 58.8, 58.5, 57.2, 56.8, 56.6, 53.6, 49.1, 49.0, 42.6, 35.6, 35.3, 33.5, 30.0, 26.7, 26.6, 22.4, 22.3, 16.2, 15.3, 14.60, 14.55, 14.3, 13.2, 11.9; HRMS m/z C₅₀H₆₂ClN₈O₈S₂ [M+H]⁺の計算値1001.3815, 実測値: 1001.3967.

【0090】

２－（３－（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（（Ｓ）－１－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）フェニル）エチル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）プロポキシ）エチル（Ｒ＊）－２－（（Ｓ＊）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）ブタノエート（ＥＴ－ＯＡＲＶ－７７１）（２５）。一般手順Ｃに従って、化合物２４を、アルキル化ＪＱ１酸３２及びアルコール４４（Ｋｌｅｉｎ、Ｖ．ら、２０２１年（上記を参照のこと）に従って合成する）を使用して得て、２種類のジアステレオマー混合物として２４を得た。収率：１．７ｍｇ（２４％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 8.66 (s, 1H), 7.47-7.28 (m, 10H), 7.20-7.13 (m, 1H), 5.12-5.04 (m, 1H), 4.81-4.75 (m, 1H), 4.70-4.52 (m, 2H), 4.49-4.31 (m, 2H), 4.28-4.22 (m, 1H), 4.18-4.11 (m, 1H), 4.07-3.94 (m, 2H), 3.91-3.81 (m, 2H), 3.80-3.64 (m, 3H), 3.63-3.54 (m, 5H), 3.07 (s, 1H), 2.67-2.65 (m, 3H), 2.59-2.52 (m, 4H), 2.41 (s, 3H), 2.19-2.05 (m, 2H), 1.96-1.85 (m, 2H), 1.72-1.64 (m, 4H), 1.49-1.46 (m, 3H), 1.07-1.01 ppm (m, 12H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 175.0, 174.9, 171.9, 171.8, 170.42, 170.38, 169.8, 169.7, 163.2, 154.6, 154.5, 150.3, 149.89, 149.85, 148.7, 143.42, 143.36, 136.92, 136.90, 136.71, 136.67, 131.8, 131.0, 130.1, 130.0, 129.7, 128.8, 126.6, 72.2, 70.32, 70.26, 70.2, 69.3, 69.0, 68.9, 68.0, 67.9, 63.8, 62.0, 59.4, 58.45, 58.40, 57.2, 56.8, 56.7, 49.8, 49.7, 49.0, 35.6, 35.4, 35.2, 35.1, 30.1, 26.7, 26.6, 23.43, 23.39, 22.4, 16.2, 14.6, 13.3, 12.0, 11.7; HRMS m/z C₅₁H₆₄ClN₈O₈S₂ [M+H]⁺の計算値1015.3972, 実測値: 1015.4032.

【0091】

メチル２－（５－（４－クロロフェニル）－６，７－ジメチル－２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－チエノ［２，３－ｅ］［１，４］ジアゼピン－３－イル）アセテート（２８）。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ＯＨ（２６）（１．９２ｇ、５．１９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２５ｍＬ）中に溶解した。塩化チオニル（３．７６ｍＬ、５１．９ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を還流しながら２時間静置した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮して、中間体酸塩化物を得た。酸塩化物（２．０１ｇ、５．１９ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１０ｍＬ）中に溶解した。次いで（２－アミノ－４，５－ジメチルチオフェン－３－イル）（４－クロロフェニル）メタノン（２７）（１．３８ｇ、５．１９ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコを加熱還流し、１時間撹拌した。次いで、混合物を室温に冷却してからＴＥＡ（２．８９ｍＬ、２０．７６ｍｍｏｌ）を添加した。フラスコをさらに１６時間加熱還流した。次いで、反応混合物を真空中で濃縮し、１，２－ＤＣＥ（５０ｍＬ）中に再溶解し、ＡｃＯＨ（３．５ｍＬ）で酸性化した。これを８０℃で１時間撹拌しながら静置した。次いで、混合物を蒸発乾固させてからＤＣＭ（５０ｍＬ）中に再溶解し、１．０Ｍ ＨＣｌ溶液（４０ｍＬ）で洗浄した。水性相をＤＣＭ（３×５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＭｇＳＯ₄で乾燥し、ろ過し、真空中で濃縮した。残渣を、ヘプタン中の０％～８０％ＥｔＯＡｃの直線勾配を使用したフラッシュカラムクロマトグラフィー（２４ｇシリカカラム）で精製して２８を得た。収率：１．０６ｇ（５４％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 7.43 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.34 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.26 (dd, J = 6.6, 7.4 Hz, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.44 (dd, J = 7.5, 16.8 Hz, 1H), 3.17 (dd, J = 6.5, 16.8 Hz, 1H), 2.29 (s, 3H), 1.60 ppm (s, 3H); LCMS m/z C₁₈H₁₈ClN₂O₃S [M+H]⁺の計算値377.1, 実測値: 377.0.

【0092】

メチル２－（４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）アセテート（（±）－ＪＱ１－ＯＭｅ）（２９）。化合物２８（３４４ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（７ｍＬ）中に溶解し、－７８℃に冷却してからＴＨＦ（１．３７ｍＬ、１．３７ｍｍｏｌ）中の１．０Ｍ ＫＯ^tＢｕの溶液を添加し、３０分間撹拌した。次いで、ジエチルクロロフォスフェート（１９８μＬ、１．３７ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を－１０℃に加温し、４５分間撹拌した。次いで、アセチルヒドラジン（１３５ｍｇ、１．８２μｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１時間撹拌しながら静置した。次いで、ｎ－ＢｕＯＨ（７．８ｍＬ）を添加してから９０℃に１時間加熱した。反応物を真空中で濃縮し、残渣を、ヘプタン中の３０％～５０％ＥｔＯＡｃの直線勾配を使用したフラッシュカラムクロマトグラフィー（４０ｇシリカカラム）で精製して出発材料を除去し、ＤＣＭ中の２０％ＭｅＯＨをカラムに流した。いくつかの分画を、水中の０．１％ギ酸中の３５％～５５％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用したＨＰＬＣでさらに精製して２９を得た。収率：１７３ｍｇ（４６％）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 7.41 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.62 (dd, J = 6.9, 6.9 Hz, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.70-3.57 (m, 2H), 2.67 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 1.69 ppm (s, 3H); ); LCMS m/z C₂₀H₂₀ClN₄O₂S [M+H]⁺の計算値415.1, 実測値: 415.0.

【0093】

（±）－メチル（Ｒ）－２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）プロパノエート（（±）－（３Ｓ，２Ｒ）－ＭＥ－ＪＱ１－ＯＭｅ）（３０ａ）。一般手順Ｄに従って、化合物３０ａを、アルキル化剤のメチルヨウ化物を使用して得た。収率８．９ｍｇ（７％）；一般手順Ｅに従って、化合物３０ａも３０ｂのエピマー化から得てもよい。単離された収率：１２ｍｇ（３１％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 7.34 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 4.25 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 4.07 (qd, J = 6.9, 10.7 Hz, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.67 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.51 ppm (d, J = 6.9 Hz, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 176.1, 163.2, 154.5, 149.8, 136.9, 136.7, 132.3, 131.1, 130.9, 130.7, 130.0, 128.8, 60.4, 51.9, 42.6, 15.4, 14.6, 13.2, 12.0; LCMS m/z C₂₁H₂₂ClN₄O₂S [M+H]⁺の計算値429.1, 実測値: 429.0.
（±）－メチル（Ｓ）－２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）プロパノエート（（±）－（３Ｓ，２Ｓ）－ＭＥ－ＪＱ１－ＯＭｅ）（３０ｂ）。一般手順Ｄに従って、化合物３０ｂを、アルキル化剤のメチルヨウ化物を使用して得た。収率３５．４ｍｇ（２９％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 7.43 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.31 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 3.88 (qd, J = 7.2, 9.7 Hz, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.64 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 1.70 (s, 3H), 1.62 ppm (d, J = 7.2 Hz, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 176.1, 163.9, 155.5, 149.6, 136.95, 136.90, 132.7, 130.8, 130.4, 129.9, 128.8, 58.5, 52.1, 41.2, 15.4, 14.5, 13.2, 11.9; LCMS m/z C₂₁H₂₂ClN₄O₂S [M+H]⁺の計算値429.1, 実測値: 429.0.

【0094】

（±）－メチル（Ｒ）－２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）ブタノエート（（±）－（３Ｓ，２Ｒ）－ＥＴ－ＪＱ１－ＯＭｅ）（３１ａ）。一般手順Ｄに従って、化合物３１ａを、アルキル化剤のエチルヨウ化物を使用して得た。収率２０ｍｇ（１６％）；一般手順Ｅに従って、化合物３１ａも３１ｂのエピマー化から得てもよい。単離された収率：１１ｍｇ（３７％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 7.35-7.29 (m, 4H), 4.24 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 3.99 (dt, J = 3.7, 10.7 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 2.66 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.23-2.13 (m, 1H), 1.73-1.63 (m, 4H), 1.02 ppm (t, J = 7.4 Hz, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 175.5, 163.2, 154.6, 149.8, 136.9, 136.7, 132.3, 131.0, 130.9, 130.6, 129.9, 128.8, 59.5, 51.6, 49.8, 23.4, 14.6, 13.2, 12.0, 11.7; LCMS m/z C₂₂H₂₄ClN₄O₂S [M+H]⁺の計算値443.1, 実測値: 443.1.

【0095】

（±）－メチル（Ｓ）－２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）ブタノエート（（±）－（３Ｓ，２Ｓ）－ＥＴ－ＪＱ１－ＯＭｅ）（３１ｂ）。一般手順Ｂに従って、化合物３１ｂを、アルキル化剤のエチルヨウ化物を使用して得た。収率２９．２ｍｇ（２３％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 7.42 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 4.31 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 3.83 (dt, J = 3.6, 10.1 Hz, 1H), 3.73 (s, 3H), 2.64 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.37-2.26 (m, 1H), 1.93-1.82 (m, 1H), 1.69 (s, 3H), 1.05 ppm (t, J = 7.5 Hz, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 175.5, 163.9, 155.4, 149.6, 136.95, 136.90, 132.7, 130.8, 130.7, 130.3, 129.9, 128.8, 57.6, 51.9, 47.6, 23.4, 14.5, 13.2, 11.9, 11.2; LCMS m/z C₂₂H₂₄ClN₄O₂S [M+H]⁺の計算値443.1, 実測値: 443.1.

【0096】

（±）－（Ｒ）－２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）プロパン酸（（±）－（３Ｓ，２Ｒ）－ＭＥ－ＪＱ１－ＯＨ）（３２）。化合物３０ａ（８．２ｍｇ、１９μｍｏｌ）をＴＨＦ（４００μＬ）中に溶解した。その後、ＬｉＯＨ（１ｍｇ、３８μｍｏｌ）を水中（１００μＬ）に溶解し、フラスコに添加した。フラスコを３５℃に加熱し、４８時間撹拌した。水（２５μＬ）及び０．６Ｍ ＬｉＯＨ溶液（２５μＬ）を一定間隔（１２時間ごと）で添加して変換を補助した。エステルから酸への変換をＬＣ－ＭＳでモニターした。１００％変換後、溶液を２．０Ｍ ＨＣｌ溶液で中和し、フリーズドライして、酸３２を得た。酸は次の工程のための粗製物として使用し、収率は定量的と考えた。収率：７．９ｍｇ、（定量的）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 7.34 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.31 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 4.25 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 4.07 (m, 1H), 3.83 (s, 3H), 2.67 (s, 3H), 2.42 (s, 3H), 1.69 (s, 3H), 1.51 ppm (d, J = 7.0 Hz, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 175.8, 164.8, 154.6, 150.3, 137.7, 135.7, 132.4, 131.6, 131.4, 130.9, 130.3, 129.0, 59.1, 41.5, 15.6, 14.6, 13.4, 11.8; LCMS m/z C₂₀H₂₀ClN₄O₂S [M+H]⁺の計算値415.1, 実測値: 415.1.

【0097】

（±）－（Ｒ）－２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）ブタン酸（（±）－（３Ｓ，２Ｒ）－ＥＴ－ＪＱ１－ＯＨ）（３３）。化合物３１ａ（３５．２ｍｇ、８０μｍｏｌ）をＴＨＦ（１．２ｍＬ）中に溶解した。その後、ＬｉＯＨ（４．８ｍｇ、２００μｍｏｌ）を水中（３００μＬ）に溶解し、フラスコに添加した。フラスコを４０℃に加熱し、６日間撹拌した。水（５０μＬ）及び０．６５Ｍ ＬｉＯＨ溶液（５０μＬ）を一定間隔（１２時間ごと）で添加して変換を補助した。エステルから酸への変換をＬＣ－ＭＳでモニターした。１００％変換後、溶液を２．０Ｍ ＨＣｌ溶液で中和し、フリーズドライして、酸３３を得た。酸は次の工程のための粗製物として使用し、収率は定量的と考えた。収率：３４．３ｍｇ、（定量的）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 7.41 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.32 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 4.24 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 3.75-3.70 (m, 1H), 2.69 (s, 3H), 2.43 (s, 3H), 2.03-1.95 (m, 2H), 1.71 (s, 3H), 1.10 ppm (t, J = 7.4 Hz, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 175.2, 164.6, 154.9, 150.1, 137.5, 136.1, 132.5, 131.5, 131.2, 130.2, 130.1, 129.0, 58.2, 48.6, 23.8, 14.6, 13.3, 11.9; LCMS m/z C₂₁H₂₂ClN₄O₂S [M+H]⁺の計算値429.1, 実測値: 429.1.

【0098】

（Ｓ）－１３－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－カルボニル）－１４，１４－ジメチル－１１－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル（Ｒ）－２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）ブタノエート（ＡＧＢ１）（４６）。一般手順Ｆに従って、化合物４６を、アルコール４１（Ｋｌｅｉｎ、Ｖ．ら、２０２１年（上記を参照のこと）に従って合成する）を使用して得、水中の０．１％ギ酸中の５％～１００％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用した逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー（１５．５ｇ Ｃ１８金カラム）で精製してＡＧＢ１（４６）を得た。収率：２９ｍｇ（３０％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 8.67 (s, 1H), 7.42 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 7.36-7.28 (m, 9H), 4.74 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.56-4.49 (m, 3H), 4.44-4.30 (m, 3H), 4.23 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 4.06 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 3.98-3.92 (m, 2H), 3.81-3.72 (m, 2H), 3.69-3.59 (m, 10H), 2.65 (s, 3H), 2.53-2.45 (m, 4H), 2.41 (s, 3H), 2.18-2.09 (m, 2H), 1.73-1.62 (m, 4H), 1.01 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 0.95 ppm (s, 9H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 174.8, 171.4, 171.1, 170.5, 163.2, 162.9, 154.5, 150.5, 149.9, 148.5, 138.4, 136.9, 136.6, 132.1, 131.8, 131.1, 131.0, 130.9, 130.7, 130.0, 129.6, 128.8, 128.2, 71.3, 70.9, 70.8, 70.6, 70.5, 70.2, 69.3, 63.8, 59.3, 58.7, 57.2, 56.8, 49.7, 43.3, 36.2, 35.3, 26.5, 23.3, 16.1, 14.5, 13.2, 11.9, 11.7; HRMS m/z C₅₁H₆₄ClN₈O₉S₂ [M+H]⁺の計算値1031.3921, 実測値: 1031.3961.

【0099】

２－（３－（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－４－ヒドロキシ－２－（（（Ｓ）－１－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）フェニル）エチル）カルバモイル）ピロリジン－１－イル）－３，３－ジメチル－１－オキソブタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエトキシ）プロポキシ）エチル（Ｒ）－２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）ブタノエート（ＡＧＢ２）（４７）。一般手順Ｆに従って、化合物４７を、アルコール４４（Ｋｌｅｉｎ、Ｖ．ら、２０２１年（上記を参照のこと）に従って合成する）を使用して得、水中の０．１％ギ酸中の５％～９５％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用したＨＰＬＣで精製してＡＧＢ２（４７）を得た。収率：１．２ｍｇ（１０％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 8.66 (s, 1H), 7.47 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 5.08 (dq, J = 7.2, 7.2 Hz, 1H), 4.78 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.55-4.51 (m, 1H), 4.49-4.43 (m, 1H), 4.35-4.30 (m, 1H), 4.25 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.12 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 4.00-3.93 (m, 2H), 3.87 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 3.80-3.75 (m, 1H), 3.75-3.69 (m, 1H), 3.64-3.58 (m, 5H), 2.65 (s, 3H), 2.58-2.52 (m, 4H), 2.41 (s, 3H), 2.20-2.12 (m, 1H), 2.09 (dd, J = 8.3, 13.6 Hz, 1H), 1.93-1.86 (m, 2H), 1.73-1.63 (m, 4H), 1.47 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.06 (s, 9H), 1.02 ppm (t, J = 7.4 Hz, 3H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 174.9, 171.8, 170.4, 169.8, 163.2, 154.6, 150.3, 149.9, 148.7, 143.4, 136.9, 136.6, 131.02, 130.99, 130.0, 129.7, 128.8, 126.6, 70.3, 70.2, 69.0, 68.9, 68.0, 63.8, 59.4, 58.5, 57.1, 56.8, 49.8, 49.0, 35.6, 35.2, 30.0, 29.8, 26.7, 23.4, 22.4, 16.2, 14.6, 13.3, 11.9, 11.7; HRMS m/z C₅₁H₆₄ClN₈O₈S₂ [M+H]⁺の計算値1015.3972, 実測値: 1015.4197.

【0100】

（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（２Ｓ，１７Ｒ）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１７－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）－４，１６－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－３，１５－ジアザノナデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（ＡＧＢ３）（４８）。アジド９（Ｚｅｎｇｅｒｌｅ，Ｍ、２０１５年（上記を参照のこと）に従って合成する）（３０ｍｇ、４６μｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２ｍＬ）中に溶解した。触媒量の１０ｗｔ．％Ｐｄ／Ｃを添加し、反応物を水素下で３時間撹拌した。次いで、反応混合物を、ＰＴＦＥシリンジフィルターに通してろ過し、蒸発乾固させて、所望のアミンの定量的収率を得た。得られたアミン（７．４ｍｇ、１２μｍｏｌ）をＤＭＦ（９６μＬ）中に溶解し、ＤＭＦ（９６μＬ）中のＥＴ－ＪＱ１－ＯＨ（４５、Ｂｏｎｄ，Ａ．Ｇ．、２０２０年（上記を参照のこと）に従って合成する）（５ｍｇ、１２μｍｏｌ）、ＣＯＭＵ（５．１ｍｇ、１２μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（４．１８μＬ、１２μｍｏｌ）の溶液に添加し、室温で２時間撹拌した。次いで、混合物を真空中で濃縮し、残渣を、水中の０．１％ギ酸中の５％～９５％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用したＨＰＬＣで精製してＡＧＢ３（４８）を得た。収率：２．２ｍｇ（１８％）；¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ = 8.68 (s, 1H), 8.18 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 7.36 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.31-7.24 (m, 5H), 7.17-7.12 (m, 3H), 4.99 (d, J = 4.9 Hz, 1H), 4.85 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 4.80 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 4.51 (br. s, 1H), 4.46 (dd, J = 7.2, 15.8 Hz, 1H), 4.26 (d, J = 10.5 Hz, 1H), 4.19-4.11 (m, 2H), 4.09 (d, J = 15.9 Hz, 1H), 3.83-3.63 (m, 15H), 3.50-3.42 (m, 1H), 2.64 (s, 3H), 2.53 (s, 3H), 2.39 (s, 3H), 2.34-2.27 (m, 1H), 2.16 (dd, J = 7.5, 13.5 Hz, 1H), 1.96-1.89 (m, 1H), 1.64-1.56 (m, 4H), 1.03-0.96 ppm (m, 12H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃): δ = 173.8, 171.7, 171.6, 170.3, 163.9, 155.0, 150.3, 149.9, 148.5, 138.6, 136.9, 136.7, 132.0, 131.9, 131.31, 131.28, 130.9, 130.6, 130.1, 129.4, 129.0, 127.5, 71.3, 71.1, 70.75, 70.69, 70.4, 70.3, 59.8, 59.4, 57.7, 56.7, 50.3, 42.9, 39.8, 36.9, 36.0, 26.6, 23.1, 16.2, 14.6, 13.3, 12.0, 11.9; HRMS m/z C₅₁H₆₅ClN₉O₈S₂ [M+H]⁺の計算値1030.4081, 実測値: 1030.4589.

【0101】

（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（Ｓ）－１７－（ｔｅｒｔ－ブチル）－２，２－ジメチル－１５－オキソ－３，３－ジフェニル－４，７，１０，１３－テトラオキサ－１６－アザ－３－シラオクタデカノ－１８－イル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（５０）。酸３７（Ｋｌｅｉｎ、Ｖ．ら、２０２１年（上記を参照のこと）に従って合成する）（１６１ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ＣＯＭＵ（１５４ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（３３４μＬ、１．９２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．９２ｍＬ）中に溶解し、室温で１０分間撹拌した。アミン４９（Ｚｅｎｇｅｒｌｅ，Ｍ、２０１５年（上記を参照のこと）に従って合成する）（１１２ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で２時間撹拌しながら静置した。次いで、混合物を水中の０．１％ギ酸中の５％～１００％ＭｅＣＮの直線勾配と３分のプラトーとを使用した逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー（２×１５．５ｇ Ｃ１８カラム）で１０分にわたって精製して５０を得た。収率：１０３ｍｇ（５０％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 8.65 (s, 1H), 7.69-7.65 (m, 4H), 7.57 (t, J = 6.1 Hz, 1H), 7.43-7.31 (m, 10H), 7.20 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 5.52 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.71 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 4.60 (dd, J = 7.0, 14.9 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.49-4.43 (m, 1H), 4.29 (dd, J = 5.1, 14.9 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 3.98-3.91 (m, 2H), 3.82-3.77 (m, 3H), 3.70-3.59 (m, 8H), 3.57 (t, J = 5.4 Hz, 2H), 2.50 (s, 3H), 2.34 (d, J = 14.0 Hz, 1H), 2.19-2.10 (m, 1H), 1.04 (s, 9H), 0.93 ppm (s, 9H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): 172.7, 171.9, 169.9, 150.4, 148.7, 137.5, 135.7, 133.8, 131.6, 131.3, 129.7, 128.3, 127.7, 72.6, 71.3, 71.2, 70.9, 70.8, 70.54, 70.51, 63.5, 60.0, 58.7, 56.6, 43.6, 35.2, 35.1, 30.4, 26.9, 26.4, 19.3, 16.1; LCMS m/z C₄₆H₆₃N₄O₈SSi [M+H]⁺の計算値859.4, 実測値: 859.3.

【0102】

（２Ｓ，４Ｓ）－１－（（Ｓ）－２－（ｔｅｒｔ－ブチル）－１４－ヒドロキシ－４－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－３－アザテトラデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｎ－（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）ピロリジン－２－カルボキサミド（５１）。ＴＨＦ（１１．９ｍＬ）中の化合物５０（５１ｍｇ、５９μｍｏｌ）の溶液に、ＴＨＦ（１７８μＬ、１７８μｍｏｌ）中の１．０Ｍ ＴＢＡＦ溶液を添加した。これを６時間撹拌しながら静置した。次いで、混合物を真空中で濃縮し、残渣を水中の０．１％ギ酸中の５％～１００％ＭｅＣＮの直線勾配を１０分にわたって使用して逆相フラッシュカラムクロマトグラフィー（１５．５ｇ Ｃ１８カラム）で精製してアルコール５１を得た。収率：３６．６ｍｇ（定量的）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 8.66 (s, 1H), 8.01 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 7.38-7.32 (m, 4H), 7.29 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.67 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 4.64-4.58 (m, 2H), 4.44 (t, J = 4.3 Hz, 1H), 4.30 (dd, J = 5.1, 15.0 Hz, 1H), 4.04 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 3.97 (d, J = 15.3 Hz, 1H), 3.89 (dd, J = 4.2, 10.9 Hz, 1H), 3.84 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 3.71-3.52 (m, 12H), 3.51-3.44 (m, 1H), 2.50 (s, 3H), 2.26 (d, J = 14.3 Hz, 1H), 2.23-2.15 (m, 1H), 0.96 ppm (s, 9H); 172.8, 171.8, 169.8, 150.4, 148.6, 137.7, 131.7, 131.2, 129.6, 128.2, 72.7, 71.2, 71.1, 70.9, 70.5, 70.35, 70.29, 61.7, 60.1, 58.8, 56.5, 43.6, 35.7, 35.5, 26.4, 16.1; LCMS m/z C₃₀H₄₅N₄O₈S [M+H]⁺の計算値621.3, 実測値: 621.2.

【0103】

（Ｓ）－１３－（（２Ｓ，４Ｓ）－４－ヒドロキシ－２－（（４－（４－メチルチアゾール－５－イル）ベンジル）カルバモイル）ピロリジン－１－カルボニル）－１４，１４－ジメチル－１１－オキソ－３，６，９－トリオキサ－１２－アザペンタデシル（Ｒ）－２－（（Ｓ）－４－（４－クロロフェニル）－２，３，９－トリメチル－６Ｈ－チエノ［３，２－ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３－ａ］［１，４］ジアゼピン－６－イル）ブタノエート（シス－ＡＧＢ１）（５２）。一般手順Ｆに従って、化合物５２を、アルコール５１を使用して得、水中の０．１％ギ酸中の５％～９５％ＭｅＣＮの直線勾配を１２分にわたって使用したＨＰＬＣで精製してシス－ＡＧＢ１（５２）を得た。収率：８．４ｍｇ（５１％）；¹H NMR (500 MHz, CDCl₃): δ = 8.67 (s, 1H), 7.63 (t, J = 5.8 Hz, 1H), 7.38-7.27 (m, 8H), 7.18 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 5.54 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.61 (dd, J = 7.0, 14.9 Hz, 1H), 4.54 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.49-4.33 (m, 3H), 4.30 (dd, J = 5.3, 15.0 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 4.01 (d, J = 15.8 Hz, 1H), 3.99-3.91 (m, 3H), 3.81 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 3.79-3.75 (m, 2H), 3.70-3.62 (m, 8H), 2.65 (s, 3H), 2.51 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.34 (d, J = 14.3 Hz, 1H), 2.21-2.13 (m, 2H), 1.72-1.64 (m, 4H), 1.02 (t, J = 7.5, 3H), 0.95 ppm (s, 9H); ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃): δ = 174.9, 172.9, 171.7, 169.9, 163.2, 154.5, 150.5, 149.9, 148.6, 137.6, 136.8, 136.5, 132.1, 131.6, 131.2, 131.0, 130.9, 130.5, 130.0, 129.7, 128.8, 128.3, 71.3, 71.2, 70.84, 70.81, 70.5, 69.3, 63.8, 60.0, 59.3, 58.7, 56.5, 49.8, 43.6, 35.30, 35.26, 26.4, 23.3, 16.2, 14.6, 13.3, 12.0, 11.7; HRMS m/z C₅₁H₆₄ClN₈O₉S₂ [M+H]⁺の計算値1031.3921, 実測値: 1031.3987.

【0104】

生物学。
細胞培養。ＨＥＫ２９３ヒト胚腎臓付着細胞株（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１５１４０１２２番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）が添加されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｅｂａｄ、ＣＡ、米国）中、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度で培養した。２２ＲＶ１；ヒト前立腺癌腫上皮付着細胞株（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１５１４０１２２番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）が添加されたＲＰＭＩ－１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｅｂａｄ、ＣＡ、米国）中、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度で培養した。ＭＶ－４－１１ヒト急性単球性白血病懸濁液細胞株（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、米国）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１５１４０１２２番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）が添加されたＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ａｒｌｓｅｂａｄ、ＣＡ、米国）中、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度で培養した。

【0105】

ＣＲＩＳＰＲブロモタグ－Ｂｒｄ２ノックイン細胞株の生成。ＨＥＫ２９３細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１５１４０１２２番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）が添加されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｅｂａｄ、ＣＡ、米国）中、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度で維持した。５ｘ１０⁵ ＨＥＫ２９３細胞は、実験開始の２４時間前に、６ウェルプレートの個々のウェルのＤＭＥＭ １ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｅｂａｄ、ＣＡ、米国）中にプレーティングした。細胞存在下で翌日にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ６－ｓｎＲＮＡ ＆ Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ発現カセットを含むｐｘ３３５カスタムベクターと、別のＵ６－ｓｇＲＮＡ及びピューロマイシン発現カセットを保有するｐＢＡＢＥＤベクターと、最後にｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ブロモタグ－Ｂｒｄ２供与体ノックイン配列を含むｐｃＤＮＡ５ベクターとを含む３種類のカスタムベクターと同時にＦｕｇｅｎｅ ＨＤリポフェクタミン（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）を使用してトランスフェクトした。相同的組換えが行われる細胞の相対集団を増加させるため、このトランスフェクションを０．１μＭのＤＮＡリガーゼＩＶ阻害剤ＳＣＲ７存在下で行った。翌日、細胞を洗浄してから０．１μＭ ＳＣＲ７及び２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む新しいＤＭＥＭ培地を適用した。翌日、細胞を洗浄してから０．１μＭ ＳＣＲ７及び２μｇ／ｍＬのピューロマイシンを含む新しいＤＭＥＭ培地を適用するようにこれを繰り返した。翌日、細胞に３回目の洗浄を行い、ＳＣＲ７とピューロマイシンの両方を含んでいない新しい培地を適用して回収した。次いで翌日、ＨＥＫ２９３細胞を引き続き洗浄し、翌日、２．５μｇ／ｍＬピューロマイシン及び０．１μＭ ＳＣＲ７を含む新しいＤＭＥＭを再び適用した。このプロセスをさらに２日間継続した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄してからＤＭＥＭ中でさらに２０日間回収した。その後細胞を調製してＦＡＣＳソートを行った。

【0106】

ＧＦＰ陽性ＣＲＩＳＰＲノックインブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞の蛍光活性化細胞ソート。その後、前段階でＣＲＩＳＰＲリポフェクション及び選択が行われたＨＥＫ２９３細胞を、ｔＴｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（０．０５％）、フェノールレッド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を使用してトリプシン処理した。懸濁液になったら、トリプシン細胞混合物をＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）で中和した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間ペレット化した。その後、生成した細胞ペレットを、１％ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地中に１ｍＬあたり５×１０⁶細胞の濃度で再懸濁した。野生型ＨＥＫ２９３細胞をＧＦＰ発現に関するベースライン対照として使用した。単一細胞クローンをＤｕｎｄｅｅ大学Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ ＦａｃｉｌｉｔｙのＳｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製ＳＨ８００細胞ソーターを使用して蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって生成した。４８８ｎｍレーザーを使用して蛍光を励起させ、光散乱を生成した。前方角度光散乱（ＦＳＣ）及び後方散乱（ＢＳＣ）を４８８±１７ｎｍバンドパスフィルターを使用して検出した。ＦＳＣ領域（Ａ）及びＳＳＣ－Ａの測定値に基づいて細胞とデブリとを区別した。単一細胞をＦＳＣ－Ａ及びＦＳＣ－Ｗｉｄｔｈ（Ｗ）の測定値に基づいてダブレット及びクランプ（clumps）と区別した。ＧＦＰ蛍光を５２５±５０ｎｍバンドパスフィルターを使用して検出し、自己蛍光を６００±６０ｎｍバンドパスフィルターを使用して検出した。ＧＦＰ陽性細胞を、バックグラウンドＧＦＰとＧＦＰを発現しない細胞の対照試料の自己蛍光とを最初に評価することによって同定した。この試料のＧＦＰ及び自己蛍光に関する測定値を使用して、同定されたＧＦＰ陽性細胞を識別するコレクションゲートを設定した。次いでソートされることになる試料を分析し、ＧＦＰ陽性細胞をソートして採取した。

【0107】

単一ＧＦＰ＋ｖｅ細胞を、３枚の９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）の各ウェルにソートし、３枚の９６ウェルプレートは、健常細胞からの５０％ろ過済みプレ調整培地、並びに１０％ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１５１４０１２２番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を含む５０％新しいＤＭＥＭ２００μＬを含んでおり、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度で２週間貯蔵した。２週後、認められる全てのコロニーを拡大させ、その後凍結した。

【0108】

ゲノムＤＮＡ抽出。拡大後の細胞株におけるＢｒｄ２発現をウエスタンブロットによって分析し、その後疑わしい細胞株を回収してゲノム抽出を行った。細胞を、１０ｃｍプレートのウェル中に２×１０⁶の細胞密度でプレーティングした。４８時間後、細胞を、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．０５％）、フェノールレッド（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）を使用してトリプシン処理した。懸濁液になったら、トリプシン細胞混合物をＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）で中和した。細胞を１５００ｒｐｍで５分間ペレット化した。各クローンの残りのペレットに、提供された取扱説明書に従い、ＰＲＯＭＥＧＡのＷｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キットを使用した溶液ベースの抽出アプローチに従ってゲノム抽出を行った。その後、抽出されたＤＮＡを、ナノドロップ分光光度計を使用して分析し、－２０℃で保存してから使用した。

【0109】

ジャンクションＰＣＲ。ジャンクションＰＣＲを、次のプライマー：フォワード、ＡＧＴＣＴＧＴＣＣＡＣＣＣＣＣＴＣＴＡＣ及びリバース、ＡＣＴＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡＣを使用して行った。前の工程から抽出されたゲノムＤＮＡをその後のＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎハイフィデリティポリメラーゼとクローン又はＨＥＫ２９３野生型ゲノムＤＮＡのいずれかの鋳型ＤＮＡ２５０ｎｇとを使用し、３０サイクルのＰＣＲを、９８℃の融解温度、６０℃のアニーリング温度、及び７２℃で２分の伸長工程で実行した。次いで、これらのＰＣＲ産生物を、１×ＤＮＡロード染色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び１×Ｇｅｎｅｒｕｌｅｒ １Ｋｂ ｐｌｕｓ ＤＮＡマーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）中の、１×Ｓｙｂｅｒｓａｆｅ ＤＮＡ染色試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｅｂａｄ、ＣＡ、米国）を含む２％アガロースゲル上、１００ボルトで３０分間続けて実行した。実行したゲルを、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して画像化した。

【0110】

遺伝子型判定。ジャンクションＰＣＲ産生物を含むアガロースゲルを使用し、適切なサイズのバンドを、ＵＶイメージャー及び外科用メスを使用してそのアガロースゲルから採取した。選択されたバンドは、ＨＥＫ２９３野生型Ｂｒｄ２ジャンクション産生物１ｋｂ、ブロモタグ－Ｂｒｄ２クローン野生型Ｂｒｄ２ジャンクション産生物１ｋｂ、及びブロモタグ－Ｂｒｄ２クローンノックインジャンクション産生物２ｋｂに対応していた。その後、切除したバンドを、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）ＤＮＡゲル抽出キット（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用してアガロースから除去した。抽出後、ＰＣＲ産生物を、Ｓｔｒａｔａｃｌｏｎｅ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲクローニングキット（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して平滑末端ベクターにライゲーションし、その後Ｃｒｅリコンビナーゼ発現大腸菌（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にトランスフェクトし、カナマイシン５０μｇ／ｍＬ寒天プレート上にプレーティングした。プレーティングの翌日、認められるコロニーを摘出し、ＬＢ標準製剤を含む５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシン５ｍｌ中で１６時間成長させた。その後一晩、細菌性成長には、Ｍｏｎａｒｃｈ（登録商標）プラスミドミニプレップキット（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用したプラスミドミニプレップ抽出を行った。その後、抽出後に回収したベクター産生物を、ナノドロップ分光光度計を使用して分析した。これらの産生物には、市販のＭ１３－フォワード、Ｍ１３－リバース、及びｅＧＦＰ－Ｃ１－フォワードプライマーを使用し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡアナライザーを使用したシークエンシングを行った。シークエンシングを、Ｄｕｎｄｅｅ大学ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｒｖｉｃｅｓで行った。その後、シークエンシングからの生データをＪａｌｖｉｅｗソフトウェアを使用して分析した。

【0111】

用量－応答分解アッセイ。全ての用量－応答分解アッセイを遺伝子型が検証されたヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞株で行った。ヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞を、滴定実験開始の前日に６個の健常プレートの１ウェルあたり５ｘ１０⁵細胞の密度でプレーティングした。ＰＲＯＴＡＣ化合物を１０ｍＭの濃度でＤＭＳＯ中に溶解し、これらの原液濃度から、ＰＲＯＴＡＣ化合物を１０μＭ～１ｎＭの範囲のＤＭＳＯを使用して希釈して適切な濃度にした。次いで、化合物を１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１５１４０１２２番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）が添加されたＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｅｂａｄ、ＣＡ、米国）２ｍＬに添加し、実験開始時に細胞に添加した。対照化合物、例えば、ＭＺ１、シス－ＭＺ１をＤＭＳＯ中に同様に溶解して適切な濃度にした。全ての滴定実験を合計６時間行ってから回収し、処置を適用したら回収直前まで３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度で維持した。細胞をＰＢＳで２回洗浄してから回収した。

【0112】

時間経時分解アッセイ。ＰＲＯＴＡＣ ＡＧＢ１、ＡＧＢ２、及びＡＧＢ３を使用した時間経時分解アッセイを、遺伝子型が検証されたヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞株で行った。ヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞を時間経過アッセイの開始前日に６個の健常プレートの１ウェルあたり５ｘ１０⁵細胞の密度でプレーティングした。ＰＲＯＴＡＣのＡＧＢ１及びＡＧＢ２をＤＭＳＯで希釈して１ｍＭの濃度にしてからＤＭＥＭ２ｍＬで１：２０００にさらに希釈して、時点ごとに５００ｎＭの濃度にした。ＰＲＯＴＡＣ ＡＧＢ３をＤＭＳＯで希釈して２ｍＭの濃度にしてからＤＭＥＭ２ｍＬで１：２０００にさらに希釈して、１時点あたり１μＭの濃度にした。時点の範囲は０～３６時間の間であった。処置を、時間をずらして適用して全ての時点を同時に回収できるようにした。

【0113】

回収アッセイ。回収アッセイを７２時間にわたって２００ｎＭ ＡＧＢ１を使用して行った。これを遺伝子型が検証されたヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞株で行った。ヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞を、回収アッセイ開始前日に６ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０⁵細胞の密度でプレーティングした。実験当日、細胞をＰＢＳで洗浄してからＤＭＳＯ又はＡＧＢ１ ２００ｎＭのいずれかを含む新しいＤＭＥＭを適用した。処置中、細胞を３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度で維持した。３時間後、回収及びビヒクル対照条件の細胞をＰＢＳで再洗浄してから２００ｎＭ ＡＧＢ１又はＤＭＳＯを含んでいない新しいＤＭＥＭを適用した。陽性対照条件に関しては、これらを残りの処置時間に関して２００ｎＭ ＡＧＢ１とともに放置した。
ポリクローナルＢｒｄ４^{BD2 L387A}抗体の獲得。ポリクローナルＢｒｄ４^{BD2 L387A}抗体を生成するために、ヒツジを、以前に記載されているように精製した（Gadd, M. S. et al., Nat. Chem. Biol. 2017, 13 (5), 514-521；Baud, M. G. J. et al., Science 2014, 346 (6209), 638-641）Ｈｉｓ－Ｂｒｄ４^{BD2 L387A}ドメインタンパク質０．３５ｍｇで免疫化し、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液中で調製した。続いて、２８日間隔でさらに４回の注射を行った。採血を各注射の７日後に行った。抗体を血清からアフィニティー精製し、５０ｍＭ グリシンｐＨ２．５で溶出し、１ＭトリスｐＨ８で中和し、Ｈｉｓ－Ｂｒｄ４^{BD2 L387A}タンパク質を使用してＰＢＳ緩衝液へ透析した。

【0114】

競合アッセイ。ヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞を２ｍＬ ＤＭＥＭ培地中に１ウェルあたり５×１０⁵細胞の密度で６ウェルプレート中にプレーティングした。実験開始時、細胞を、３μＭ ＭＬＮ４９２４、５０μＭ ＭＧ１３２、１０μＭ ＶＨ２９８、１０μＭ ＥＴ－ＪＱ１－ＯＭｅ、又は０．１％ＤＭＳＯのいずれかで処置した。１時間後、２００ｎＭのＡＧＢ１を、事前に化合物で処置した細胞に添加した。３時間後、細胞を回収してウエスタンブロットによるその後の処理を行った。各処置を並行して行って条件ごとに２つの技術的反復を行った。６ウェルプレートを、実験全体にわたって３７℃、５％ＣＯ₂で４時間インキュベートした。

【0115】

ウエスタンブロッティング。全ての細胞を、ＲＩＰＡ溶解、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｍｅｒｃｋ、１１６９７４９８００１）及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｅ１０１４）が添加された抽出緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、８９９０１）を用いて氷上で採取した後、－２０℃で保存してから使用した。総タンパク質量を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（＃２３２２５、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用して決定した。タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２３２２５）を使用して決定した。次いで試料を調製し、ＮｕＰＡＧＥ（商標）４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｍｉｄｉゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＷＧ１４０３Ａ）にロードし、続いて、タンパク質をニトロセルロース膜（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に転写した。膜を１時間ブロックしてから５％Ｍｉｌｋ ＴＢＳＴを使用して一次抗体とインキュベートした。膜を、Ｂｒｄ２（Ａｂｃａｍ、Ａｂ１３９６９０、１：１０００）、Ｂｒｄ３（Ａｂｃａｍ、Ａｂ５０８１８、１：４０００）、Ｂｒｄ４（Ａｂｃａｍ、Ａｂ１２８８７４、１：１０００）又は本発明者らのポリクローナルＢｒｄ４^{BD2 L387A}抗体に関してプローブした。一次抗体と４℃で一晩インキュベートした後、膜を、二次抗体（抗ウサギ、Ａｂｃａｍ ＡＢ２１６７７３、１：５０００又は抗マウス、Ａｂｃａｍ ＡＢ２１６７７４、１：５０００）及びｈＦＡＢＴＭローダミン抗チューブリン抗体（Ｂｉｏｒａｄ、１２００４１６５、１：１００００）と１時間インキュベートし、次いでＢｉｏ－Ｒａｄイメージャー（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で画像化した。全てのウエスタンブロットをＢｉｏ－Ｒａｄ（ＬＩ－ＣＯＲ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製のＩｍａｇｅ Ｌａｂを使用してバンド強度に関して分析した。次いで、これらのブロットから抽出されたデータをプロットし、プリズム（ｖ．８．２．０、ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して分析した。

【0116】

細胞生存率アッセイ。ＭＶ－４－１１細胞を、９６ウェル白色底部プレートの１ウェルあたり２×１０⁴の細胞密度でプレーティングし、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１５１４０１２２番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）が添加された５０μＬのＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ａｒｌｓｅｂａｄ、ＣＡ、米国）中、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度で成長させながら一晩静置した。次いで細胞を、ＤＭＳＯ、ＡＧＢ１、シス－ＡＧＢ１、ＭＺ１、シス－ＭＺ１又はスタウロスポリンを含む２回の化合物処置で添加されたＩＭＤＭ５０μＬで処置した。次いで、これらの細胞を３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度でインキュベートしながら１日静置してから分光光度的分析を行った。２２ＲＶ１細胞を、９６ウェル白色底部プレートの１ウェルあたり２×１０⁴の細胞密度でプレーティングし、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１５１４０１２２番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）が添加されたＲＰＭＩ－１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｅｂａｄ、ＣＡ、米国）１００μＬ中、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度で成長させながら一晩静置した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄してから、ＤＭＳＯ、ＡＧＢ１、シス－ＡＧＢ１、ＭＺ１、シス－ＭＺ１又はスタウロスポリンを含む１回の化合物処置が添加された１００μＬの新しいＲＰＭＩ－１６４０培地で処置した。次いで、これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度でインキュベートしながら２日間静置してから分光光度的分析を行った。ＨＥＫ２９３野生型細胞を、９６ウェル白色底部プレートの１ウェルあたり２×１０⁴の細胞密度でプレーティングし、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ）（１５１４０１２２番、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国）が添加された１００μＬのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｅｂａｄ、ＣＡ、米国）中、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度で成長させながら一晩静置した。次いで、細胞をＰＢＳで２回洗浄してからＤＭＳＯ、ＡＧＢ１、シス－ＡＧＢ１、ＭＺ１、シス－ＭＺ１又はスタウロスポリンを含む１回の化合物処置が添加された１００μＬの新しいＤＭＥＭで処置した。次いで、これらの細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂、及び９５％の湿度でインキュベートしながら２日間静置してから分光光度的分析を行った。全ての細胞株を、０．１％ＤＭＳＯ中の１倍の濃度の化合物で２連で（ＤＭＳＯ対照に関しては３連で）処置した。化合物を連続希釈して７点、１０倍滴定を行った。細胞を５０：１００μＬの化合物で処置して最終濃度を０．１％ＤＭＳＯ中で１０μＭ：１０ｐＭにした。分光分析の時点で細胞をＰｒｏｍｅｇａ ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）２．０細胞生存率アッセイ試薬１００μＬで処置した。プレートにオービタルシェーカーを２分行って溶解を促進し、さらに５分間静置してピーク発光を達成した。次いで発光を、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ ＰＨＥＲＡｓｔａｒ発光プレートリーダーで推奨設定で記録した。この分析から抽出されたデータをＧｒａｐｈｐａｄプリズム（ｖ．８．２．０、ＧｒａｐｈＰａｄ）で分析し、ＤＭＳＯビヒクル対照に対して正規化した。ＥＣ₅₀値をこれらのプロットから導出した。

【0117】

試料処理、ＴＭＴ標識及び画分。ＣＲＩＳＰＲ改変ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞を、処置の２４時間前に１００ｃｍプレート上に５×１０⁶細胞で播種した。細胞をＤＭＳＯ、１μＭ ＡＧＢ１又は１μＭ シス－ＡＧＢ１のいずれかで処置した。処置してから２時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞を１００ｍＭ ＴＥＡＢ、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ １５０μＬ中に溶解した。溶解物を１０秒間超音波処理し、次いで１５，０００ｇで５分間遠心分離し、遠心分離後に上清を採取した。次いで、試料をマイクロ－ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化し；次いで、試料各３００μｇを還元し、アルキル化し、次いで、製造業者（ｐｒｏｔｉｆｉ）によって記載されているＳｔｒａｐ ｍｉｎｉプロトコール（Ｐｒｏｔｉｆｉ）プロトコールを使用していくつか改変しながら消化した。試料を５０ｍＭ ＴＥＡＢ緩衝液中、最初の一晩はトリプシン（１：４０）で、次いでさらに６時間同じ比率（１：４０）で二重消化した。ペプチドを定量的蛍光ペプチドアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。試料（各９０μｇ）を、製造業者の取扱説明書に従ってＴＭＴ１０－ｐｌｅｘ Ｉｓｏｂａｒｉｃ Ｌａｂｅｌ試薬セット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。標識後、試料を標識効率に関して確認し、次いで混合し、脱塩し、３０℃のスピードバキューム中で乾燥した。試料をギ酸アンモニウム（１０ｍＭ、ｐＨ９．５）２００μＬ中に再溶解し、ペプチドを高ｐＨ ＲＰクロマトグラフィーを使用して分画した。Ｗａｔｅｒｓ製のＣ１８カラム（ＸＢｒｉｄｇｅペプチドＢＥＨ、１３０Å、３．５μｍ ２．１×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｉｒｅｌａｎｄ）とガードカラム（ＸＢｒｉｄｇｅ、Ｃ１８、３．５μｍ、２．１×１０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）とをＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＨＰＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で使用した。画分に使用した緩衝液Ａ及びＢは、それぞれ（Ａ）ｍｉｌｌｉＱ水ｐＨ９．５中の１０ｍＭギ酸アンモニウム及び（Ｂ）９０％アセトニトリル中の１０ｍＭギ酸アンモニウム、ｐＨ９．５からなる。分画を、１分間隔でＷＰＳ－３０００ＦＣオートサンプラー（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して採取した。カラム及びガードカラムを２％緩衝液Ｂで０．２ｍｌ／分の一定な流速で２０分間平衡化した。ＴＭＴ標識ペプチド１００μＬをカラム中に注入し、分離勾配を、試料をカラムにロードしてから１分後に開始した。ペプチドを、２％緩衝液Ｂ～２０％緩衝液Ｂ、６分、次いで２０％緩衝液Ｂ～４５％緩衝液Ｂ、５１分、最後に４５％緩衝液Ｂ～１００％緩衝液Ｂ、１分以内の勾配でカラムから溶出した。カラムを１００％緩衝液Ｂで１５分間洗浄した。フラクション採取は注入から１分後に開始し、８０分後に停止した（合計８０分画、各２００μＬ）。溶出ペプチドを酸性化するために、１０％ギ酸３０μＬを８０個の画分バイアルのそれぞれに添加した。合わせる分画の総数は２０個に設定した。

【0118】

ＬＣ－ＭＳ分析。ペプチド分析を、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ＲＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と連結させたＱ－ｅｘａｃｔｉｖｅ－ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量スペクトロメーターで行った。ＬＣ緩衝液は以下のとおり：緩衝液Ａ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中の０．１％ギ酸（ｖ／ｖ））及び緩衝液Ｂ（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中の８０％アセトニトリル及び０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）であった。各試料のアリコート７μＬを、０．１％ＴＦＡで平衡化した捕捉カラム（１００μｍ×２ｃｍ、ＰｅｐＭａｐ ｎａｎｏＶｉｐｅｒ Ｃ１８カラム、５μｍ、１００Å、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に１０μＬ／分でロードした。捕捉カラムを、０．１％ＴＦＡで３分間、同じ流速で洗浄し、次いでＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、分割Ｃ１８カラム（７５μｍ×５０ｃｍ、ＰｅｐＭａｐ ＲＳＬＣ Ｃ１８カラム、２μｍ、１００Å）にインラインで切り替えた。ペプチドを、５％緩衝液Ｂ（分画１～１０に関して、分画１１～２０に関しては７％）～３５％緩衝液Ｂ、１２５分、次いで３５％緩衝液Ｂ～９８％緩衝液Ｂ、２分の直線勾配を用いて３００ｎｌ／分の一定の流速でカラムから溶出した。次いで、カラムを９８％緩衝液Ｂで２０分間洗浄し、５％又は７％緩衝液Ｂで１７分間再平衡化した。カラムは全ての時間で５０℃の一定温度を維持した。Ｑ－ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦはデータ依存性ポジティブイオン化モードで操作した。電源電圧は２．２５Ｋｖに設定し、キャピラリー温度は２５０℃であった。スキャンサイクルは、ＭＳ１スキャン（ｍ／ｚ範囲３３５～１６００、最大イオン注入時間５０ｍ秒、分解能１２００００及び自動利得制御（ＡＧＣ）値３×１０⁶）、続いて所定の選択基準を満たす最も強力なイオンである１５回のシーケンシャル依存型ＭＳ２スキャン（分解６００００）（ＡＧＣ１×１０⁵、最大イオン注入時間２００ｍ秒、アイソレーションウィンドウ０．７ｍ／ｚ、固定初期質量１００ｍ／ｚ、スペクトルデータタイプ：セントロイド、強度閾値５×１０⁴、未割当の除外、単一及び６を超える荷電前駆体、ペプチドマッチ優先、同位体除外、動的除外時間４５秒）からなっていた。ＨＣＤ衝突エネルギーは正規化衝突エネルギーの３２％に設定した。質量精度は試料分析の開始前にチェックした。

【0119】

ペプチド及びタンパク質の同定。全ての分画に関する生データファイルをマージし、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアｖ．１．６．０．１６によってＵｎｉｐｒｏｔ－ｈｕｍａｎ－ｃａｎｃｏｎｉｃａｌデータベースに対して検索してタンパク質を同定し、ＴＭＴレポーターイオンを定量化した。次のＭａｘＱｕａｎｔパラメータを使用した：使用した酵素、トリプシン／Ｐ；失敗した開裂の最大数は２に等しい；前駆体質量許容誤差は１０ｐｐｍに等しい；フラグメント質量許容誤差は２０ｐｐｍに等しい；可変改変、酸化（Ｍ）、アセチル（Ｎ末端）、脱アミド化（ＮＱ）、Ｇｌｎ→ピロＧｌｕ（ＱＮ末端）；固定改変、カルバミドメチル（Ｃ）。データを１％誤検出率を適用し、続いて２個を下回る特有のペプチドを有するタンパク質を除外することによってフィルタリングした。定量化したタンパク質を、３回のＤＭＳＯ反復試料間の絶対倍率変化の差が１．５以上であった場合、フィルタリングした。

【0120】

タンパク質の発現及び精製。ＶＣＢを、以前に記載されているように発現させ、精製した（Gadd, M. S. et al., Nat Chem Biol 2017, 13 (5), 514-521）。簡潔には、Ｎ末端Ｈｉｓ₆タグＶＨＬ（５４～２１３）、エロンギンＣ（１７～１１２）及びエロンギンＢ（１～１０４）を大腸菌において共発現させ、複合体を、ＴＥＶプロテアーゼを使用したＮｉ－親和性クロマトグラフィーを使用して単離してＨｉｓ６タグを除去した。複合体をイオン交換、続いてゲルろ過クロマトグラフィーでさらに精製した。Ｂｒｄ４－ＢＤ２^L387Aを以前に記載されているように発現させ、精製した（Ｇａｄｄ，Ｍ．Ｓ．、２０１７年（上記を参照のこと）；Ｂａｕｄ，Ｍ．Ｇ．Ｊ．、２０１４年（上記を参照のこと））。簡潔には、Ｎ末端Ｈｉｓ₆タグＢｒｄ４－ＢＤ２^L387A（３３３～４６０）を大腸菌において発現させ、ＴＥＶプロテアーゼを使用したＮｉ－親和性クロマトグラフィーで単離してＨｉｓ６タグを除去し、続いてゲルろ過クロマトグラフィーを行った。

【0121】

蛍光偏光結合アッセイ。蛍光偏光（ＦＰ）競合結合アッセイを以前に記載されているように行い（Van Molle et al., Chem. Biol. 2012, 19 (10), 1300-1312；Roy, M. J. et al. ACS Chem Biol. 2019, 14 (3), 361-368）、全ての測定は、４８５及び５２０ｎｍの蛍光励起及び放出波長（λ）をそれぞれを用いたＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳ（ＢＭＧ ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して行った。アッセイを、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３８２０）を使用し３連で実行し、各ウェル溶液は、１５ｎＭ ＶＣＢタンパク質、１０ｎＭ ５，６－カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）－標識ＨＩＦ－１αペプチド（ＦＡＭ－ＤＥＡＬＡＨｙｐＹＩＰＭＤＤＤＦＱＬＲＳＦ、「ＪＣ９」）及び漸減濃度ＰＲＯＴＡＣ（１４点、２倍連続希釈、２０μＭ ＰＲＯＴＡＣから出発）又はＰＲＯＴＡＣ：ブロモドメイン（１４点、２倍連続希釈、２０μＭ ＰＲＯＴＡＣから出発：５０μＭブロモドメインを１０μＭのブロモドメインを含む緩衝液へ）を含んでいた。全ての構成要素を１００ｍＭビス－トリスプロパン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０を使用して原液から溶解して１５μＬの最終アッセイ体積を得た。ＤＭＳＯ必要に応じて添加して、２％ｖ／ｖの最終濃度を確実にした。化合物を含まない（置換えゼロ）ＶＣＢ及びＪＣ９、又はタンパク質非存在下のＪＣ９（最大置換え）を含む対照ウェルも含めて正規化を可能にした。パーセンテージ置換え値を対照を正規化することによって得、Ｌｏｇ［化合物］に対してプロットした。ＩＣ₅₀値をプリズム（ｖ．９．１．０、ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いた非線形回帰分析を使用して各滴定に関して決定した。Ｋ_i値を、以前に記載されているように、Ｋ_dｆｏｒＪＣ９（約１．５～２．５ｎＭ、直接結合から決定した）から逆計算し、ＩＣ₅₀値をフィットさせた（Ｖａｎ Ｍｏｌｌｅ、２０１２年（上記を参照のこと）；Soares, P. et al., J Med Chem. 2018, 61 (2), 599-618）。各ＰＲＯＴＡＣに関する共同性値（α）を比率：α＝二元Ｋ_d（－ブロモドメイン）／三元Ｋ_d（＋ブロモドメイン）を使用して計算した。

【0122】

血漿安定性。血漿安定性研究はＳｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ Ｃｏ．，Ｌｔｄに外部委託して行った。緩衝液の調製：０．０５Ｍリン酸ナトリウム及び０．０７Ｍ ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４の溶液を、脱イオン水中に１４．５０５ｇ／Ｌ Ｎａ₂ＨＰＯ₄．１２Ｈ₂Ｏ、１．４８３ｇ／Ｌ ＮａＨ₂ＰＯ₄．２Ｈ₂Ｏ及び４．０９５ｇ／Ｌ ＮａＣｌを溶解することによって作製し、リン酸でｐＨを調整した。血漿の調製：凍結マウス血漿を３７℃に置いて急速解凍した。解凍した血漿を３，０００ｒｐｍで８分間遠心分離して血栓を除去し、上清をプールして、実験において血漿として使用した。血漿（ｐＨ７．４～８．０）を使用するまで氷上で保存した。ＡＧＢ１（４６）及び参照化合物のプロカインを、スパイク溶液（０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、４％ｖ／ｖ／ＤＭＳＯを含む、０．０５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の０．０２ｍＭ化合物）として調製した。血漿及びスパイク溶液を３７℃で５分間予熱し、次いで予熱したスパイク溶液Ｂ １０μＬを、全ての時点（５、１５、３０、４５、６０分）に関して指定されたウェルに添加した。０分に関しては、内部標準（イミプラミン、グリピジド）を含むアセトニトリル４００μＬを０分プレートのウェルに添加し、次いで血漿９０μＬを添加した。時点（０、５、１５、３０、４５、６０分）に関しては、予熱した血漿９０μＬを添加して計測を開始した。５、１５、３０、４５、６０分で、内部標準（イミプラミン、グリピジド）を含むアセトニトリル４００μＬを対応するプレートのウェルにそれぞれ添加して反応を停止させた。クエンチ後、プレートをバイブレーター（ＩＫＡ、ＭＴＳ２／４）で１０分間（６００ｒｐｍ／分）振とうし、次いで、５５９４ｇで１５分間遠心分離した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ×３Ｒ）。遠心分離したプレートの各ウェルからの上清５０μＬを、超純水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＺＭＱＳ５０Ｆ０１）５０μＬを含む新しい９６ウェル試料プレートに移してＬＣ／ＭＳ分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ－４９（ＡＰＩ６５００＋）、ＵＰＬＣ－ＭＳＭＳ－３２（Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００＋））を行った。データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌで分析した。

【0123】

Ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＫプロファイリング。薬物動態プロファイリングは外部委託し、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＣｈｅｍＰａｒｔｎｅｒ Ｃｏ．、Ｌｔｄ．が請け負い、Ｊｉｈｕｉ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．ＬＴＤから購入した６～８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを研究において使用した。ＡＧＢ１（４６）を、５％ＤＭＳＯ＋５％Ｓｏｌｕｔｏｌ ＨＳ１５＋９０％生理食塩水中に１ｍｇ／ｍＬで製剤化した。ＩＶ注射に関しては、５ｍｇ／ｋｇのＡＧＢ１（４６）を９匹のマウスの尾静脈に投与した。ＳＣ注射に関しては、５ｍｇ／ｋｇのＡＧＢ１（４６）を、９匹のマウスに皮下注射によって投与した。動物を指定された時点（０．０８３、０．２５、０．５、１、２、４及び８時間）で手動で拘束し、およそ血液試料１１０μＬは顔面静脈を介してＫ₂ＥＤＴＡ管に収集した。１時点あたり３匹のマウスを使用し、合計１８匹のマウスを得た。血液試料を氷上に置き、２０００ｇで５分間遠心分離して１５分以内に血漿試料を得た。血漿試料を、分析を行うまでおよそ７０℃で保存した血漿のアリコート３０μＬに、ＭｅＣＮ中の１％ギ酸中の内部標準（ジクロフェナク、４０ｎｇ／ｍＬ）２００μＬを添加した。次いで、混合物を１分間ボルテックスし、次いで５８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清１００μＬを新しいプレートに移した。溶媒０．５μＬを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳに注入した。使用したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ機器はＳＣＩＥＸ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ－４５（Ｔｒｉｐｌｅ Ｑｕａｄ ６５００＋）であった。データをＷｉｎＮｏｎＬｉｎ及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌによって分析した。

【0124】

結果及び考察
ブロモタグの背景及び設計の論理的根拠。ブロモタグを設計するために、本発明者らは、ＰＲＯＴＡＣ ＭＺ１（１、図１Ａ）を動員する強力で選択的なＢＥＴブロモドメイン及びデグロンタグとしてのその標的ＢＥＴブロモドメイン（Ｚｅｎｇｅｒｌｅ，Ｍ、２０１５年（上記を参照のこと））を活用することができるという仮説を立てた。ＭＺ１作用様式の本発明者らの広範な機構的及び構造的特性評価によって、そのＥ３リガーゼＶＨＬが結合しているＭＺ１は、汎選択的ＢＥＴブロモドメインリガンド（＋）－ＪＱ１（３、図１Ｂ）からなるにもかかわらず、Ｂｒｄ４の第２のブロモドメイン（Ｂｒｄ４^BD2）と最も安定で共同的で長寿命の三元複合体を形成することが強調された。この優先的な動員は、生産的ユビキチン化及び内在性Ｂｒｄ４の優先的な分解につながる（Ｇａｄｄ，Ｍ．Ｓ．、２０１７年（上記を参照のこと）；Ｒｏｙ，Ｍ．Ｊ．、２０１９年（上記を参照のこと））。これらの発見は、Ｂｒｄ４^BD2が、リガンド誘発性デグロン技術にとって魅力的なデグロンタグを提供することができることを示唆するが、ＭＺ１の使用によって、全ての内在性ＢＥＴタンパク質の強力な誘発分解からの交絡下流効果を誘導するであろう。

【0125】

この制限を回避するために、本発明者らは、ＢＥＴブロモドメインにおいてキャビティ（又は「ホール」）を生成された本発明者らが以前に記載しているＢＥＴブロモドメインの遺伝子操作されたバリアントを活用し、「バンプ」を有するより嵩高い合成ＢＥＴリガンドによって対立遺伝子選択的結合を可能にした（Ｂａｕｄ，Ｍ．Ｇ．Ｊ．、２０１４年（上記を参照のこと））。このような「バンプ－及び－ホール」アプローチを開発している本発明者らの以前の広範な研究によって、厳密には全てのＢＥＴファミリーメンバーにわたって保存されているリガンド結合部位におけるＬｅｕ残基が同定された。位置特異的突然変異誘発を使用して、このＬｅｕは、ドメイン安定性及びリガンド結合能力を維持するホールを生成するための、より小さなＡｌａ又はＶａｌに突然変異させた。同時に、汎選択的ＢＥＴ阻害剤Ｉ－ＢＥＴ７６２（４、図１Ｂ）は、メチル又はエチル「バンプ」を導入することによって改変されてＭＥ及びＥＴ（それぞれ５及び６、図１Ｂ）を、その後９－ＭＥ－１及び９－ＥＴ－１（それぞれ７及び８、図１Ｂ）を得ており、これらはメトキシがＩ－ＢＥＴ７６２スキャホールドにおける融合されたフェニル環の８’位から９’位にシフトしているという点で異なっている（Ｒｕｎｃｉｅ，Ａ．Ｃ．、２０１８年（上記を参照のこと）；Ｂａｕｄ，Ｍ．Ｇ．Ｊ．、２０１４年（上記を参照のこと））。立体的「バンプ」は、新たに形成されたホール中に収容され、同時に野生型タンパク質とクラッシュし、ＢＥＴブロモドメイン内で絶妙な対立遺伝子選択性が操作できるようになった（Ｒｕｎｃｉｅ，Ａ．Ｃ．、２０１８年（上記を参照のこと）；Ｂａｕｄ，Ｍ．Ｇ．Ｊ．、２０１４年（上記を参照のこと））。したがって本発明者らは、ＭＺ１ ＰＲＯＴＡＣ分解物質の文脈内でこのようなバンプＢＥＴリガンドを使用すると、変異体Ｂｒｄ４^BD2ドメインに融合した標的タンパク質の選択的分解を可能にし、内在性野生型ＢＥＴタンパク質の有害な分解は伴わないことになることを判断した。したがってこのようなカスタムメイドの「バンプ－及び－ホール」－ＰＲＯＴＡＣ（Ｂ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣ）は、ＰＲＯＴＡＣ誘発性デグロンタグ技術の相補的で汎化可能なシステムを提供することになる。

【0126】

ＣＲＩＳＰＲを使用した内在性Ｂｒｄ２に融合したブロモタグを有するノックイン細胞株の開発。ブロモタグプラットフォームを確立し、分解物質構造－活性関係（ＳＡＲ）をサポートして最良の化合物を同定するために、本発明者らは、分解効率だけではなく、本発明者らの分解物質の選択性プロファイルも最良にトリアージすることを可能にすることになる実用的で単純なシステムを模索した。この目的を達成するために、内在性ＢＥＴファミリータンパク質Ｂｒｄ２を、Ｂｒｄ２検出のための十分に確立された抗体の利用能、及びウエスタンブロットにおいて十分に検出されるバンドとしての単一のタンパク質アイソフォームの発現に起因して、モデル標的として選択した（Filippakopoulos, P.; Knapp, S., Nat Rev Drug Discov. 2014, 13 (5), 337-356）。Ｂｒｄ２は内在性ブロモドメインを含み、１及び他のＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣによって分解されるため、本発明者らは、ヘテロ接合ノックイン細胞株は同じ抗体を使用してオンターゲット分解（ブロモタグ付けされた－Ｂｒｄ２）とオフターゲット分解（タグなしＢｒｄ２）の両方を同時にモニターすることを可能にするであろうと判断した。したがって、他のＢＥＴタンパク質Ｂｒｄ３及びＢｒｄ４の潜在的なオフターゲット分解とともに、このシステムはタンパク質分解選択性を最良にモニターすることを可能にすることになる。したがって、本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲノックイン方法論を使用して、内在性Ｂｒｄ２遺伝子遺伝子座のＮ末端にブロモタグを添加することを決定し、したがって、３個のブロモドメイン（内在性Ｂｒｄ２^BD1及びＢｒｄ２^BD2に加えて外在性ブロモタグ）を有するキメラタンパク質を得た。これ以降、本発明者らは、ブロモタグ－Ｂｒｄ２の分解をオンターゲット活性と称し、タグなしＢｒｄ２と内在性Ｂｒｄ３とＢｒｄ４のいずれの分解もオフターゲット活性と称する。

【0127】

ブロモタグ自体は、ＢＥＴファミリータンパク質に関するバンプ及びホール（Ｂ＆Ｈ）戦略を開発するための本発明者らの先行研究に基づいて設計されている（Ｂａｕｄ，Ｍ．Ｇ．Ｊ．、２０１４年（上記を参照のこと））。本発明者らのＭＺ１ベースＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣに関する良好で相補的なデグロンを生成する機会を最大にするために、デグロン「ブロモタグ」構築物としてＢｒｄ４^{BD2 L387A}（ヒトＢｒｄ４の残基３６８～４４０を含む、サイズ約１５ｋＤａ）を使用することを選択した。１及びＶＣＢ（ＶＨＬ：エロンギンＣ：エロンギンＢ）と最も強力で最も共同的な三元複合体を形成し、ＭＺ１による内在性Ｂｒｄ４の生産的ユビキチン化及び即効性の強力な分解を促進するため、特定のブロモドメインＢｒｄ４^BD2が選択された（Ｇａｄｄ，Ｍ．Ｓ．、２０１７年（上記を参照のこと））。さらに、Ｂｒｄ４^BD2での特異的Ｌ３８７Ａ突然変異は、野生型又はＬ－Ｖドメインと比較してアセチル化ヒストン尾部パートナーに関して非常に低い結合親和性を示すため、Ｌ３８７Ｖの代わりに選択されており（Ｒｕｎｃｉｅ，Ａ．Ｃ．、２０１８年（上記を参照のこと））、タグとして使用した場合に望ましくない新しい機能性又はタンパク質－タンパク質相互作用を導入する可能性が低いであろうことを示唆する。

【0128】

プロジェクト着手時、本発明者らは、トランスフェクションの容易性、ＣＲＩＳＰＲ効率の良好なレベル（Tovell, H. et al., ACS Chem Biol. 2019, 14 (5), 882-892）、及び３個全てのＢＥＴタンパク質の発現の高いレベルに起因して、本発明者らのＣＲＩＳＰＲノックイン実験にＨＥＫ２９３細胞を選択してモデルブロモタグ細胞株を確立した。ＨＥＫ２９３細胞は、３個のプラスミド構築物を同時にトランスフェクトされ、２個はｃａｓ９_D10Aを保有し、両方ともＮ末端Ｂｒｄ２特異的ｇＲＮＡを有していた。もう一方のプラスミドは、Ｂｒｄ４^{BD2 L387A}ブロモタグのノックイン配列を保持していた。完全なノックイン構築物には、ｅＧＦＰ蛍光マーカー、Ｐ２Ａスプライス配列、その後Ｂｒｄ４^{BD2 L387A}配列が５’－３’方向に含まれていた（図２Ａ）。トランスフェクション後、細胞には蛍光活性化細胞ソート（ＦＡＣＳ）が行って、ノックイン構築物の良好な組み込みを示すＧＦＰ発現単一細胞を同定した（図２Ｂ）。細胞は、ＧＦＰ発現単一細胞から拡大され、最適なヘテロ接合ノックインクローンが同定され、選択された。その後、ジャンクションＰＣＲを行い、ブロモタグＮ末端のＢｒｄ２への良好なヘテロ接合組み込みを実証した（図２Ｃ）。ＨＥＫ２９３は低三倍体細胞株であるため、本発明者らは、野生型とノックインとでのジャンクションＰＣＲに存在するバンド強度における違いが本発明者らのノックインの単一の対立遺伝子組み込みに起因し、潜在的に２個の野生型非改変対立遺伝子が残っていることを疑っている（図２Ｃ）。このヘテロ接合クローンは、Ｂｒｄ２抗体を使用したウエスタンブロット、及びブロモタグに対する抗体を使用したブロモタグ－Ｂｒｄ２発現の独立した観察によってさらに検証された（図２Ｄ）。この抗体は、抗原として、大腸菌において遺伝子組換えで発現されたＢｒｄ４ＢＤ２^L387Aタンパク質を使用して自社で作製した。次いで、このヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞株は、遺伝子型が同定され、Ｂｒｄ２のＮ末端においてｅＧＦＰ－Ｐ２Ａ－ブロモタグノックインの良好なインフレームノックインを示した。この細胞株は、本明細書においてブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３と称することにする。

【0129】

第一世代Ｉ－ＢＥＴ７６２ベースＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣの開発。バンプ－及び－ホールとＰＲＯＴＡＣ技術の両方を組み合わせるために、本発明者らは、鋳型としてＭＺ１を使用し、そのＢＥＴを標的とするリガンドを、本発明者らが以前に開発したさまざまなバンプ－Ｉ－ＢＥＴ７６２誘導体を置き換え、Ｂ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣの初期シリーズの作製を開始した（Ｒｕｎｃｉｅ，Ａ．Ｃ．、２０１８年（上記を参照のこと）；Ｂａｕｄ，Ｍ．Ｇ．Ｊ．、２０１４年（上記を参照のこと））。最初に本発明者らのＢｒｄ４^BD2１とＶＣＢとの間の三元複合体の結晶構造（図３Ａ）を調査し、Ｂｒｄ２^{BD2 L383A}及びＢｒｄ２^{BD2 L383V}とそれぞれ複合体化されたバンプ－Ｉ－ＢＥＴ化学プローブの共結晶構造６（図３Ｂ）及び７（図３Ｃ）をＢｒｄ４^BD2に重ね合わせた。１及び６の化学構造（図３Ｂ）、及び１及び７の化学構造（図３Ｃ）は非常に類似の結合様式を取り入れており、６及び７において、メチルエステルに近接した炭素はエチル又はメチルバンプをそれぞれ保持しており、１の非バンプブロモドメイン結合部分とうまく整列している。これらの構造的見識とともに、本発明者らは、第一世代Ｉ－ＢＥＴベースＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣの合成を進めた（スキーム１）。

【0130】

本発明者らは最初に、ＶＨ０３２－ＰＥＧ３アジド９（Ｚｅｎｇｅｒｌｅ，Ｍ、２０１５年（上記を参照のこと））を、メタノール中の１０％炭素上パラジウムの懸濁液で、水素ガス下で還元して末端アミンを得、次いでそれをラセミＩ－ＢＥＴ７６２由来の酸１０～１３と、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はジクロロメタン（ＤＣＭ）中の１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を用いた標準的なアミドカップリング条件によって結合させて、バンプ－Ｉ－ＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣ、ＤＡＴ４８７～４８９（１５～１７）及び非バンプ対照、ＭＺＰ－１５（１４）を２種類のジアステレオマー混合物としてそれぞれ得た（スキーム１）。

【0131】

スキーム１．Ｉ－ＢＥＴ７６２ベースＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣ及び非バンプ対照化合物の合成

【化30】

^a反応条件：（ａ）１０％Ｐｄ／Ｃ、Ｈ₂、ＭｅＯＨ、室温、３時間；（ｂ）１０、ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ、室温、１８時間；（ｃ）バンプＩ－ＢＥＴ酸１１、１２又は１３、ＨＡＴＵ、ＨＯＡｔ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、室温、１８時間。＊は分子の指定の立体中心における相対的立体配置を示す。

【0132】

取り掛かったこの初期のライブラリーを用い、本発明者らのヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞を１μＭの化合物１５～１７又は１μＭの対照化合物ＭＺＰ－１５（１４）、ＭＺ１（１）及びシス－ＭＺ１で、有効なＭＺ１誘発性ＢＥＴタンパク質分解を達成するのに十分な時間である６時間にわたって処置することによって、本発明者らのＩ－ＢＥＴベースＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣの活性及び選択性の評価を開始した（図４Ａ）。細胞を回収し、その後の溶解物を、ＢＥＴタンパク質；Ｂｒｄ２、Ｂｒｄ３及びＢｒｄ４に対する抗体を使用したウエスタンブロットによって分析した（図４Ａ）。残念なことに、初期のＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣ化合物はブロモタグ－Ｂｒｄ２の検出可能な分解を誘発しなかった。

【0133】

本発明者らの初期の一連の化合物の不活性に関する潜在的な理由を理解するうえで、３個全てのＢＥＴファミリーメンバーにわたって、１と比較して非バンプ１４の活性が明らかに有意に低いことを興味深く観察していた（図４Ａ）。ジアステレオマー混合物としてのその存在が、エナンチオマー純粋な１と比較して１４の活性が明らかに低いことの一因であり得るが、２種類の化合物の化学構造に注目した。別の面では、化合物１及び１４は、ＢＥＴブロモドメイン結合部分が異なる点を除いて構造的に同一であり：１（ＪＱ１－ベース）は、ジアゼピン環に融合したジメチルチオフェン基を有し、同時に１４（Ｉ－ＢＥＴ７６２－ベース）は、同等の位置において８－ＯＭｅ－フェニル基を有している（図１Ｂ及びスキーム１参照のこと）。したがって、三元結晶構造Ｂｒｄ４^BD2：１：ＶＨＬとバンプＢＥＴリガンドの二元構造との間の本発明者らの構造重ね合わせに乗り出し、異なる基の周囲の構造領域をより詳細に調査した。この分析によって、Ｉ－ＢＥＴ７６２由来リガンドに存在する融合されたフェニル環のメトキシ基は、ＶＨＬに存在するＨｉｓ１１０とクラッシュするであろうことが示された（図４Ｂ）。６の８－ＯＭｅの酸素原子は、Ｈｉｓ１１０側鎖の２個の窒素原子間の炭素原子から約３．０Å離れていることになり、これは、ファンデルワールス相互作用に関する下限値を下回っている。このような構造的クラッシュは、ＭＺ１様ＰＲＯＴＡＣ三元複合体を不安定化することになり、Ｉ－ＢＥＴ７６２ベース化合物の分解活性が低いことを説明すると判断した。この観察から、ＰＲＯＴＡＣのＢＥＴ結合部分における８－ＯＭｅ－フェニル基をジメチル－チオフェン基に置き換えて、所望の三元複合体におけるいずれの潜在的な撹乱も最小化にし、ブロモタグ分解活性を強化するための設計戦略としてＭＺ１の全化学構造とさらにいっそう密接に類似している化合物を開発することを決定するに至った。

【0134】

第２世代ＪＱ１ベースＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣの開発。本発明者らのＩ－ＢＥＴ７６２ベースＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣによって示される制限を克服するために、次に８種類の新規の一連のＪＱ１ベース化合物を設計した（表１）。プロジェクトの開発の頃、本発明者らは、１と構造的に類似しており、またＢＥＴタンパク質を強力に分解する、別のＢＥＴを標的とするＰＲＯＴＡＣ、ＡＲＶ－７７１（２、図１Ａ）を知った（Raina, K. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2016, 113 (26), 7124-7129）。化学的に、２は同じ汎選択的ＢＥＴブロモドメインリガンド、（＋）－ＪＱ１（３、図１Ｂ）からなるが、ＶＨＬ結合親和性を強化することが知られている（Hu, J. et al., J Med Chem. 2019, 62 (3), 1420-1442）、ＶＨＬリガンドＶＨ０３２においてより短くより親油性のリンカー（－ＣＨ₂Ｏ－が欠けている）及び余分なベンジリック（ｂｅｎｚｙｌｉｃ）メチル基を有する点で１とは異なる（Galdeano, C. et al., J Med Chem. 2014, 57 (20), 8657-8663）。化学多様性を最大限にし、したがって強力なブロモタグ分解物質を同定するための本発明者らの機会を最大限にするために、１に基づいて４種類のバンプＰＲＯＴＡＣ化合物を、２に基づいて４種類のＰＲＯＴＡＣ化合物を設計した（Ｒａｉｎａ、Ｋ．、２０１６年（上記を参照のこと））。４種類のセットに関しては、２種類の化合物が、より立体的に保存されたメチルバンプ又はより立体的に要求の高いエチルバンプのいずれかを含むことになる。次いで各メチル又はエチルバンプＢＥＴブロモドメインリガンドは、親化合物に類似するようにアミド結合を介して又はエステル結合を介してリンカーにコンジュゲートすることになる。あまり従来的ではないエステルコンジュゲートの選択に関する本発明者らの推論は、アルキルバンプ基に近接したエステル基を有するバンプＢＥＴリガンドはその親非バンプ類似体と比較して有意により安定であったという本発明者らの以前の観察に基づいていた（Ｒｕｎｃｉｅ，Ａ．Ｃ．、２０１８年（上記を参照のこと））。

【0135】

【表1】

【0136】

本発明者らのバンプ－ＪＱ１リガンドを合成するために、Ｆｉｌｉｐｐａｋｏｐｏｕｌｏｓ、ＰらによってNature 2010, 468, 1067-73に記載されている経路を適応し、Ｂａｕｄ，Ｍ．Ｇ．Ｊ．、２０１４年（上記を参照のこと）及びＲｕｎｃｉｅ，Ａ．Ｃ．、２０１８年（上記を参照のこと）によって記載されている後段階のアルキル化を利用した（スキーム２）。最初に、（±）－Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＭｅ）－ＯＨ（２６）をジクロロメタン（ＤＣＭ）中の塩化チオニルで処置し、酸塩化物に変換してからクロロホルム中のアミノケトン２７と還流して「開環」アミドＦｍｏｃ－保護中間体を形成した。次いで、この「開環された」中間体をトリエチルアミン中で還流してＦｍｏｃ保護基を除去し、遊離アミンが出現し、これが酢酸存在下で閉環してチエノ－１，４－ジアゼピン２８を形成する。ジエチルクロロフォスフェート存在下でカリウムｔｅｒｔ－ブトキシドを用いアミド２８を脱プロトン化し、続いてアセチルヒドラジン処置を行うことによってメチルトリアゾール環が形成され、トリアゾロチエノジアゼピン（±）－ＪＱ１－ＯＭｅ（２９）がラセミ混合物として得られる。

【0137】

メチル又はエチルバンプのいずれかを導入するために、２９を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中、ヘキサメチルジシラザンカリウム（ＫＨＭＤＳ）を用いて－７８℃で脱プロトン化した。次いで、その後のエノレートをメチル又はエチルヨウ化物のいずれかで処置してラセミバンプ－ＪＱ１－ＯＭｅ誘導体３０ａ及び３０ｂ又は３１ａ及び３１ｂをそれぞれジアステレオマー混合物として得、これらはＨＰＬＣ後に容易に分離された。メチル化は、所望の（２Ｓ＊，３Ｒ＊）異性体対不所望の（２Ｓ＊，３Ｓ＊）異性体に関して１：４のジアステレオマー比（ｄ．ｒ．）で進行した。エチル化は、１：１．５のｄ．ｒ．で進行した。不所望の（２Ｓ＊，３Ｓ＊）異性体、３０ｂ及び３１ｂは、マイクロ波照射下、メタノール中のナトリウムメトキシドで処置することによってエピマー化してジアステレオマーのさらなる１：１混合物を得ることができ、これによって、ＨＰＬＣ分離の後、所望の（２Ｓ＊，３Ｒ＊）異性体３０ａ及び３１ａをより多く得られる。

【0138】

さらなる官能基化及びリンカーコンジュゲートを可能にするために、メチルエステル３０ａ及び３０ｂを、ＴＨＦ及び水中の水酸化リチウムを用い、緩和な条件下で加水分解してコンジュゲート可能なカルボン酸３２及び３３をラセミ混合物として得た（スキーム２）。

【0139】

スキーム２．ラセミバンプ－ＪＱ１リガンドの合成^a

【化31】

^a反応条件：（ａ）ｉ）ＳＯＣｌ₂、ＤＣＭ、還流、２時間；ｉｉ）２７、ＣＨＣｌ₃、還流、１時間；ｉｉｉ）ＴＥＡ、還流、１６時間；ｉｖ）ＡｃＯＨ、１，２－ＤＣＥ、８０℃、１時間；（ｂ）ｉ）ＫＯ^tＢｕ、ＴＨＦ、－７８℃～－１０℃、３０分；ｉｉ）（ＥｔＯ）₂Ｐ（Ｏ）Ｃｌ、－７８℃～－１０℃、４５分；ｉｉｉ）ＡｃＮＨＮＨ₂、室温、１時間；ｉｖ）ｎ－ＢｕＯＨ、９０℃、１時間；（ｃ）ｉ）ＫＨＭＤＳ、ＴＨＦ、－７８℃、１時間；ｉｉ）ＭｅＩ／ＥｔＩ、－７８℃～室温、１６時間、ｉｉｉ）ＨＰＬＣ分離；（ｄ）ｉ）ＮａＯＭｅ、ＭｅＯＨ、１２０℃ ｍ．ｗ．、４０分、ｉｉ）ＨＰＬＣ分離；（ｅ）ＬｉＯＨ、ＴＨＦ：Ｈ₂Ｏ ４：１、３０ａ、室温、４８～７２時間、３０ｂ、４５℃、１週間。＊は分子の指定の立体中心における相対的立体配置を示す。

【0140】

次に、リンカー３６及び３７をＶＨ０３２－アミン３４に、リンカー３８及び３９をメチル化ＶＨ０３２－アミン３５に、ＤＭＦ中のＨＡＴＵ及びＤＩＰＥＡを用い、標準的なアミドカップリング条件によって結合させて、アミド９、４０、４２、及び４３を得た（スキーム３）。シリルエーテル４０及び４３を、ＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムフッ化物（ＴＢＡＦ）の溶液を使用して開裂して、末端アルコール４１及び４４をエステルコンジュゲートに好適な前駆体としてそれぞれ得た。

【0141】

スキーム３．リンカーのＶＨＬリガンドへのコンジュゲート^a

【化32】

^a反応条件：（ａ）ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、室温、２時間；（ｂ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、室温、６時間。

【0142】

その後、アジド９及び４２をメタノール中の１０％炭素上パラジウムの懸濁液を用い、水素ガス下で還元して末端アミンを得てから、ＴＨＦ中の（１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）ジメチルアミノ－モルホリノ－カルベニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）及びＤＩＰＥＡを使用してラセミバンプ－ＪＱ１酸３２及び３３に結合させて、アミドＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣ１８～２１をジアステレオマー混合物として得た（スキーム４）。

【0143】

最後に、アルコール４１及び４４を、ＴＨＦ中のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）及び４－（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）を用い、バンプ－ＪＱ１酸３２及び３３と結合させてエステルＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣ２２～２５を２種類のジアステレオマー混合物として得た（スキーム４）。各アミド及びエステルの場合において形成されたジアステレオマーはＨＰＬＣで分離できず、ジアステレオマー混合物のまま、ブロモタグ－Ｂｒｄ２分解及び野生型ＢＥＴタンパク質に対する選択性に関してスクリーニングするための予備的なｉｎ ｃｅｌｌｕｌｏ評価に進んだ。

【0144】

スキーム４．２種類のジアステレオマー混合物としてのＪＱ１ベースＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣの合成^a

【化33】

^a反応条件：（ａ）１０％Ｐｄ／Ｃ、Ｈ₂、ＭｅＯＨ、室温、３時間；（ｂ）バンプＪＱ１－酸（３２又は３３）、ＣＯＭＵ、ＤＩＰＥＡ、ＴＨＦ、室温、４時間；（ｃ）バンプＪＱ１－酸（３２又は３３）、ＥＤＣ．ＨＣｌ、ＤＭＡＰ、ＴＨＦ、室温、１６時間．＊分子の指定の立体中心における相対的立体配置を示す。
次に１ｎＭ～１０μＭの範囲の濃度で、本発明者らのヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ノックインＨＥＫ２９３細胞株において、８種類全てのＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣ（１８～２５）の細胞活性を評価した（図５）。際立っていることに、全ての化合物が、ブロモタグ－Ｂｒｄ２アイソフォームの分解に対して明白な効果を示し、ブロモタグ－Ｂｒｄ２タンパク質の観察可能で多くの場合に完全な枯渇を達成した。これによって化合物のオンターゲット分解効力（ＤＣ₅₀）及びＳＡＲを構築するための有効性（Ｄ_max）の定量分析が可能になり、両方の独立した抗体を使用した検出によって定量化が行われ、これらによって全ての場合において極めて十分に比較が行われた（表２）。

【0145】

最良の化合物は１９、２３及び２５であることが判明し、これらは全てエチルバンプを有していた。これらは、ブロモタグ－Ｂｒｄ２アイソフォームの強力な分解と完全な分解の両方を示し、ＤＣ₅₀値は２５０～３６０ｎＭ、１３～－８０ｎＭ、及び１３～１６ｎＭであり、Ｄ_maxは７５％を超えた。重要なことには、１μＭの２５で観察されたＢｒｄ３のわずかなオフターゲット分解を除いて、タグなしＢｒｄ２又は他の内在性ＢＥＴタンパク質の観察可能なオフターゲット分解を観察することができず（図５）、これらの化合物が高度に選択的なブロモタグ分解を上手く可能にすることが示唆される。興味深いことに、１～１０μＭの高濃度で使用した際（図５）、ＰＲＯＴＡＣ：標的とＰＲＯＴＡＣ：Ｅ３リガーゼとの間の二成分相互作用が生産的三元複合体形成を打ち消す二機能性ＰＲＯＴＡＣ分解物質で周知の現象であるエステル２３及び２５はフック効果の強力な発現を示した。対照的に、アミド１９ではフック効果は観察されなかった。最後のエチル－バンプ化合物２１は、最も完全ではなく（Ｄ_max＜７０％）最も弱い分解活性を示し（ＤＣ₅₀約１μＭ）、１０μＭでの強力なフック効果に起因して非常に狭い分解域も示した。

【0146】

全てのメチルバンプ化合物１８、２０、２２及び２４も強力なオンターゲット分解活性を示し、それらのエチルバンプカウンターパートよりも平均で２倍強力であり、それぞれ１００～１６０ｎＭの間、３２０～４００ｎＭの間、２０～８０ｎＭの間、及び５～１０ｎＭの間のＤＣ₅₀であった。しかし、本発明者らは、全てのメチルバンプ化合物が不所望のオフターゲット分解も誘発し、したがって低い選択性を示すことが観察された。これらの結果は、メチル基が、野生型ＢＥＴタンパク質の保存されたＬｅｕ残基との立体的クラッシュを十分に提供しておらず、オフターゲット分解を阻止するのに十分ではなく、より大きなエチルバンプよりもさらにいっそう耐容性を示すことを示唆する。内在性ＢＥＴタンパク質に対する選択性は、良好なブロモタグシステムに関して厳密に必要とされる基準であるため、本発明者らは、この段階で全てのメチルバンプ化合物の開発を中断することを決定した。

【0147】

全てのエステル（２２～２５）は、それらの個別のアミドカウンターパート（１８～２１）よりもＤＣ₅₀において２倍及び１２６倍強力であることが示されたのは興味深い（表２）。近年、本発明者らは、アミドからエステルへの置換が、親油性及び細胞透過性を増加させ、同時に顕著な細胞内安定性を維持することに起因して、ＰＲＯＴＡＣ分解活性を増加させるための単純な戦略を提供できることを示している（Ｋｌｅｉｎ、Ｖ．ら、２０２１年（上記を参照のこと））。この傾向は、全てのエステル（２２～２５）が細胞活性を示し、それらのアミドカウンターパートと比較して高濃度でより強力なＤＣ₅₀及び顕著なフック効果を示したため、この化合物セットにおいて十分に反映されている。

【0148】

【表2】

総合すると、このスクリーニングからの結果によって、最も選択的なブロモタグ－Ｂｒｄ２分解物質として３種類の化合物、ＥＴ－ＭＺ１（１９）、ＥＴ－ＯＭＺ１（２３）及びＥＴ－ＯＡＲＶ－７７１（２５）が同定され、強力なオンターゲット活性に関する基準が満たされ、同時にオフターゲットＢＥＴ分解がほぼ回避された。したがって本発明者らは、これらの３種類の化合物をパイプラインに進めた。

【0149】

単一の立体異性体としてのＥＴ－ＯＭＺ１、ＥＴ－ＯＡＲＶ－７７１及びＥＴ－ＭＺ１の合成。本発明者らは、本発明者らの第二世代Ｂ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣは有望な結果を示しているが、ジアステレオマー混合物として全て合成されていることを実現し、それは活性種だけではなく、化合物の明らかに弱い活性及び狭い選択性治療域につながることが予想されることになる不活性な又は活性の低い種も含むであろうことを意味する。生物学的な活性異性体（ユートマー）の真の分解プロファイル得るために、次にエナンチオマー純粋な単一のジアステレオマーとして本発明者らの現在のところ最良の分解物質を合成することを試みた。エナンチオマー純粋なＰＲＯＴＡＣを達成するために、本発明者らは、ＢＥＴリガンドをバンプするための新規の立体選択的な合成を開発しており、これは本発明者らがＢｏｎｄ，Ａ．Ｇ．、２０２０年（上記を参照のこと）で近年開示している。簡単に述べると、本発明者らの新規な立体選択的な経路は、ＢＥＴ－リガンドスキャホールドの合成においてはるかに早くアルキルバンプを組み込むことを可能にした。これを達成するために、二重保護されたアスパルテート誘導体のリチウムヘキサメチルジシラザン（ＬＨＭＤＳ）が介在するジアステレオ選択的アルキル化を最適化し、これを、立体化学を完全に保持し、９９％を超えるｅｅで最終バンプ－ＪＱ１－酸類似体に導いた（Ｂｏｎｄ，Ａ．Ｇ．、２０２０年（上記を参照のこと）。したがって、プロジェクトにおけるこの段階で、本発明者らは、エナンチオマー純粋なＥＴ－ＪＱ１－ＯＨ（４５）を使用して新規のＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣ、ＡＧＢ１（４６）、ＡＧＢ２（４７）及びＡＧＢ３（４８）を作製することを決定した（スキーム５）。

【0150】

エステル４６及び４７に関しては、酸４５を、ＤＣＭ中の塩化チオニルを用いて酸塩化物中間体に定量的に変換し、その後アルコール４１及び４４と反応させて単一の立体異性体として最終化合物４６及び４７を得た。アミド４８に関しては、アジド９をメタノール中の１０％炭素上パラジウムの懸濁液を用い、水素ガス下で最初に還元して中間体アミンを得、これをＤＭＦ中のＣＯＭＵ及びＤＩＰＥＡを使用して４５とただちに結合させて単一の立体異性体として４８を得た。

【0151】

スキーム５．エナンチオマー純粋なＡＧＢ１、ＡＧＢ２及びＡＧＢ３の合成^a

【化34】

^a反応条件：（ａ）ｉ）ＳＯＣｌ₂、ＤＣＭ、室温、３時間；ｉｉ）４１又は４４、ＤＣＭ、室温、１６時間；（ｂ）１０％Ｐｄ／Ｃ、Ｈ₂、ＭｅＯＨ、室温、３時間；（ｃ）４５、ＣＯＭＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、室温、２時間。

【0152】

次に以前に記載した本発明者らのブロモタグ－Ｂｒｄ２ノックイン細胞株を使用して４６～４８の細胞活性を評価した（図６Ａ及びＣ、表３）。この段階で本発明者らは、より正確なＤＣ₅₀及びＤ_max値を得る目的で、１０μＭ～１ｎＭの濃度範囲の広範な８点にわたってタンパク質分解を定量化することを決定した。各化合物は、内在性ＢＥＴタンパク質に対して、ブロモタグ－Ｂｒｄ２の強力で高度に選択的でほぼ完全な（Ｄｍａｘ＞９２％）分解を示した。エステル４６（ＤＣ₅₀１３～１５ｎＭ）と４７（ＤＣ₅₀１～３ｎＭ）の両方が、アミド４８（ＤＣ₅₀２１０～２９０ｎＭ）より強力なオンターゲット分解活性を示し、１７分の１を下回るＤＣ₅₀及び８１分の１を下回るＤＣ₅₀にそれぞれ対応していた（図６Ａ及びＣ、表３）。予測通り、エナンチオマー純粋な化合物は、ジアステレオマー混合物のまま試験した場合よりも平均で５倍強力であることが見い出され、より一層完全なオンターゲット分解を示した（２３、２５及び１９それぞれ、図５、表２を参照のこと）。エステルによって示される効力における大きな差は、１μＭを超える濃度での明白なフック効果によって例示される。関連する非バンプＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣにおけるアミドからエステルへの置換に関する本発明者らの近年の研究から、観察された効力における増加は、４８におけるアミドから４６におけるエステルへの切り替えによる親油性の増加の結果として細胞透過性における増加におそらく起因する（Ｋｌｅｉｎ、Ｖ．ら、２０２１年（上記を参照のこと））。

【0153】

【表3】

【0154】

本発明者らのＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣがブロモタグ－Ｂｒｄ２を完全に枯渇することができるスピードを評価するために、次にヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞を５００ｎＭの４６又は４７、又は１μＭの４８で処置し、３６時間にわたってブロモタグ－Ｂｒｄ２タンパク質レベルを測定することによって時間依存的分解アッセイを実行した（図６Ｂ及びＤ、表３）。化合物４６は高速で最も完全な分解物質であり、６時間以内にブロモタグ－Ｂｒｄ２を完全に分解し、わずか４０分のタンパク質半減期（ｔ_1/2）を得ることができることが証明された。化合物４８はわずかに遅い分解物質であり、１１３分のタンパク質ｔ_1/2を誘発し、この実験においてタンパク質の最大約８０％しか分解することができなかった（図６Ｄ）。すなわち、４８は４６の２倍の処置濃度で使用されているにもかかわらず、エステルバンプＰＲＯＴＡＣのより強力でより速くより十分な活性を明らかに実証している。もう一方のエステル化合物４７は、４６と類似しているほぼ完全な標的分解を示したが、４６と比較した場合ほど速くはなく（ｔ_1/2＝１４２分）、わずかではあるが１００～１，０００ｎＭでＢｒｄ３のオフターゲット分解を残し（図６）、４７の優先順位の低下につながった。総合すると、細胞データは、４６単一の立体異性体として評価された３種類のうち最良の分解物質であることを示唆する。

【0155】

本発明者らの３種類のＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣの作用様式をより理解するために、次に遺伝子組換え精製Ｂｒｄ４^{BD2 L387A}ブロモドメインタンパク質とＶＨＬとの間で三元複合体を形成する各化合物の能力を調査しようとした。したがって、すでに発表されている競合蛍光偏光度（ＦＰ）アッセイ（Ｒｏｙ，Ｍ．Ｊ．、２０１９年（上記を参照のこと）を用い、化合物単独を滴定することによって（二元結合に関して）又はＢｒｄ４^{BD2 L387A}タンパク質とプレインキュベートした化合物を滴定することによって（三元複合体結合の場合）、ＶＨＬに結合した蛍光標識ＨＩＦ－１αペプチドプローブを置き換えた。その後、三元複合体形成の共同性（α）を計算することができる（α＝Ｋ_d ^binary／Ｋ_d ^ternary）（図７）。三元複合体は、α＞１又はα＜１である場合、それぞれ正又は負の共同性を有し、α＝１である場合、共同的ではないと言われている。ＰＲＯＴＡＣ４６、４７及び４８は等効力の三元結合親和性（それぞれＫ_d＝１１ｎＭ、１２ｎＭ及び９ｎＭ）を有し、ＭＺ１ベースの４６及び４８が最も共同的な三元複合体（それぞれα＝１１．１及び１０．９）を与えた。ＡＲＶ－７７１ベースの４７は、そのＶＨＬに対する二元親和性が２～３倍高いこと（α＝３．６、図７Ｂ）に起因して最も共同的ではない三元複合体を形成した（４６及び４８に関するそれぞれＫ_d＝１２５ｎＭ及び１０２ｎＭと比較して、４７に関してはＫ_d＝４５ｎＭ）。三元複合体共同性及び安定性におけるこの減少は、観察された分解の低速度に起因する可能性があり、ＢＥＴ ＰＲＯＴＡＣで以前に認められたもの（Ｒｏｙ，Ｍ．Ｊ．、２０１９年（上記を参照のこと）と一致する。
この全ての生物学的データを総合して、本発明者らの最良のＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣとして４６を選択し、これをさらなる生物学的評価に進めることを決定した。

【0156】

ＡＧＢ１のさらなる生物学的及び機構的特性評価。本発明者らのブロモタグシステムにとって最良で強力で選択的な分解化合物としてＡＧＢ１（４６）が確立されると、次にこの化合物クラスに関して予想されるその作用機序をさらに特徴付けしようとした。４６のオンターゲット分解活性はそのＰＲＯＴＡＣ作用様式に起因して機構的に予想通りであることを実証するために、薬理学的競合実験を行った（図８Ａ）。ＶＨＬ及びプロテアソームの依存性を実証するために、カリン２のネディレーションを阻害するＮＡＥ１阻害剤ＭＬＮ４９２４とＶＨＬ阻害剤ＶＨ２９８とプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２とで前処置した。さらに、ブロモタグ－Ｂｒｄ２に対するオンターゲット活性がブロモタグの動員に起因することを実証するために、Ｂｒｄ４^{BD2 L387A}バリアントに高親和性（Ｋ_d＝６５ｎＭ）で結合するが野生型ドメインに対する検出可能な結合は示されていないＥＴ－ＪＱ１－ＯＭｅ（Ｂｏｎｄ，Ａ．Ｇ．、２０２０年（上記を参照のこと）で前処置した。この実験において、本発明者らのヘテロ接合ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞を異なる阻害剤に個別に１時間の短い時間にわたって曝露してからその後の処置を２００ｎＭ ４６で行って、処置をさらに３時間継続して、阻害剤細胞毒性に起因する潜在的な交絡効果を最小限にした。予想通り、４６によるオンターゲット分解活性はＭＬＮ４９２４又はＶＨ２９８で前処置した際に完全に無効になり、ＣＲＬ２^VHL活性に対する依存性を実証した（図８Ａ）。この実験におけるＭＬＮ４９２４及びＶＨ２９８の細胞活性は、ＭＬＮ４９２４処置の際のＨＩＦ－１αの大幅な蓄積及びＣｕｌ２のネディレーションのブロックを観察することによって確認された。オンターゲット分解活性はＭＧ１３２での前処置の際にブロックされたため、プロテアソーム依存性であることが示された、類似の結果は、ＥＴ－ＪＱ１－ＯＭｅでの前処置からも認められ（図８Ａ）、オンターゲット分解がブロモタグを用いた標的結合によって絶妙にドライブされ、内在性Ｂｒｄ２タンパク質の野生型ブロモドメインの潜在的に偶発的なより弱い動員の貢献はないことが確認された。

【0157】

次にウォッシュアウト実験を使用して４６のオンターゲット分解活性の持続をモニターしようとした。ブロモタグ－Ｂｒｄ２ ＨＥＫ２９３細胞を２００ｎＭ４６で３時間処置し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回すすぎ、ＰＲＯＴＡＣを含んでいない新しい培地を補充した。３時間後完全に枯渇した後、ブロモタグ－Ｂｒｄ２のタンパク質レベルはウォッシュアウト後２４時間で回復を示した（図８Ｂ）。この効果は、ウォッシュアウトなしで最大７２時間にわたる完全で恒久的なオンターゲット分解とは全く対照的であった。この結果は、本発明者らのブロモタグシステムの可逆的性質を裏付けるものである。注目すべきことに、Ｂｒｄ２発現は回収してから２４時間後に減少し始め、場合によりＢｒｄ２タンパク質レベルの長期的な調節を反映する。

【0158】

細胞生物学的調査に好適な化学プローブとして本発明者らの分解物質４６を認定するために、生物学的効果及び応答を混乱させ、所望のオンターゲット薬理作用をマスクし得る潜在的な細胞毒性を評価することが重要と考えた。この目的を達成するために、プローブ基準として、化合物が細胞において使用されることになる濃度よりもおよそ最大１０倍高い濃度でいずれの細胞毒性も示さないことを選択した。４６の顕著な選択性及びオフターゲットＢＥＴ分解活性の欠如は、化合物が細胞傷害性ではないはずだと本発明者らに確信を与えたが、親ＨＥＫ２９３細胞、並びによりＢＥＴ感受性のＭＶ－４－１１及び２２ＲＶ１細胞株においてこの試験を行うことを決定した。いずれの潜在的な非分解性オフターゲット結合活性も割り引くのに好適な制御を可能にするために、トランスヒドロキシプロリン基の代わりにシスヒドロキシプロリンを有する化合物であるシス－ＡＧＢ１（５２）合成してＶＨＬへの結合を無効にしており（スキーム６）、これは陰性非分解対照化合物を得るための十分に確立された戦略である（Ｚｅｎｇｅｒｌｅ，Ｍ、２０１５年（上記を参照のこと））。細胞生存率をモニターするために、ＨＥＫ２９３、ＭＶ－４－１１及び２２ＲＶ１細胞を９６ウェルプレートフォーマット中にプレーティングし、ビヒクル対照（ＤＭＳＯ）４６、その非分解対照（５２）、及びそれらの非バンプ対照化合物ＭＺ１及びシス－ＭＺ１、並びに陽性対照の細胞傷害性薬剤スタウロスポリンで用量依存的様式で最大約１０μＭで処置した。次いで、生存可能な細胞の代用物として細胞ＡＴＰレベルを、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｒｅ Ｇｌｏ（登録商標）２．０発光試薬を使用して測定した（図８Ｃ）。安心なことに、４６は予想通り、３個全ての細胞株において、使用される１～１０μＭの高濃度まで細胞毒性の欠如を示した。４６による内在性ＢＥＴタンパク質のオフターゲット分解の顕著な不足は、それを高ＢＥＴ感受性ＭＶ－４－１１細胞においてＭＺ１（約２０ｎＭのＥＣ₅₀）と比較することによって完全に証明される。このデータを総合することによって、細胞調査用に機構的に完全で真のブロモタグ分解物質として４６が認定される。

【0159】

スキーム６．陰性対照シス－ＡＧＢ１（５２）の合成^a

【化35】

^a反応条件：（ａ）３７、ＣＯＭＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、室温、２時間；（ｂ）ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、室温、６時間；（ｃ）ｉ）４５、ＳＯＣｌ_2、ＤＣＭ、室温、３時間；ｉｉ）５１、ＤＣＭ、室温、１６時間。

【0160】

次にマウス血漿において３７℃でインキュベートし、１時間にわたっていくつかの時点で残りの４６のレベルを測定することによって、４６の血漿安定性を評価した。化合物４６は、実験全体にわたって優れた血漿安定性を示し、４６のレベルの大幅な変化は伴っていなかった。最後に、ｉｎ ｖｉｖｏ研究に適切かどうか４６をさらに認定するために、次にマウスにおけるその薬物動態（ＰＫ）プロファイルを評価している（図９、表４及び５）。４６は、静脈内（ＩＶ）５ｍｇ／ｋｇ注射（表４）と皮下（ＳＣ）５ｍｇ／ｋｇ注射（表５）の両方でマウスにおいて良好なＰＫプロファイルを有することが示された。４６は、親化合物ＭＺ１（１）で認められるものに相当するＰＫプロファイルを有し、クリアランス率（ＣＬ）が４７．２ｍＬ／分／ｋｇと比較的低く、半減期（Ｔ_1/2）はＩＶ及びＳＣにおいてそれぞれ１．４９時間及び１．６５時間と良好である（１に関しては１．０５時間及び２．９５時間と比較）（表４及び５）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ－ ｏｐｎＭｅ． ｈｔｔｐｓ：／／ｏｐｎｍｅ．ｃｏｍ／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ／ｂｅｔ－ｍｚ－１ （ａｃｃｅｓｓｅｄ ２４／０８／２０２１）。著しいことに、４６は、ＩＶ注射５ｍｇ／ｋｇを約４時間及びＳＣ注射５ｍｇ／ｋｇを８時間を超えて投薬した場合に、そのブロモタグ－Ｂｒｄ２ＤＣ_50、6hの１５ｎＭ未満を上回る血漿濃度を維持するでき（図９）、遺伝子操作されたマウスモデルにおいてブロモタグ付き標的タンパク質分解の機能的結果をｉｎ ｖｉｖｏ研究評価するのに好適である。

【0161】

【表4】

【表5】

【0162】

さまざまな標的タンパク質の分解。本発明者らは、さまざまな標的タンパク質の分解に対して記載されたプロセスの一般的な適用可能性を実証するために上述の技術を用いた。記載したように、５種類の追加のタンパク質の内在性遺伝子座にブロモタグのＣＲＩＳＰＲノックインを行った。結果を以下の表６に示しており、表では、ブロモタグのＣＲＩＳＰＲノックインが、ブロモタグデグロンシステムによって標的とすることができるタンパク質の広範な範囲を実証していることを認めることができる。表６の標的タンパク質は全て異なり、異なる細胞の役割及び機能、細胞内発現、及び細胞内での異なる代謝回転速度を全てが有することは既知である。

【0163】

【表6】

【0164】

上記の表において認められるように、タグ付けが成功した全ての場合において、細胞において本発明者らのＰＲＯＴＡＣ化合物ＡＧＢ１を使用して本発明者らのブロモタグコンジュゲートの分解を誘導することができた。これらの結果はまた、本発明者らのタグがＮ末端遺伝子座とＣ末端遺伝子座の両方においてブロモタグの分解を誘導できることを示す。また、本発明者らのブロモタグ－タンパク質コンジュゲートの分解に、１００ｎＭ～１ｎＭの処置治療域の範囲内で総標的タンパク質の９５％を超える減少をもたらし得ることを実証している。これらの試験が行われた標的に関して、本発明者らは、ＡＧＢ１が１３～４０分の間の半減期分解を生じることができることを示している。

【0165】

そのブロモタグ標的タンパク質に関するＡＧＢ１のプロテオーム全体の細胞選択性を評価するために、マルチプレックスタンデムマスタグ（ＴＭＴ）標識質量分析法プロテオミクス実験を行って、定量的で不偏の様式でタンパク質レベルをモニターした。ブロモタグ－ＢＲＤ２ ＣＲＩＳＰＲノックインＨＥＫ２９３細胞をＤＭＳＯ、１μＭ ＡＧＢ１、又は１μＭシス－ＡＧＢ１で２時間で３連で処置した。定量化された６，６２１種類を超えるタンパク質のうち、ＢＲＤ２が、ＳＩＭ１によって最も有意に分解されることが認められ、同時にＢＲＤ３、ＢＲＤ４又は実際にその他の内在性タンパク質に関しては枯渇を検出することはできなかった。ＢＲＤ２タンパク質存在量における大幅な変化は、シス－ＡＧＢ１で処置した細胞において観察されなかった。同じ選択性パターンが第２のブロモタグ付き標的ＣＲＩＳＰＲノックイン細胞株で観察された。総合すると、データは、ブロモタグに関する絶妙な選択性を伴ない、検出可能なオフターゲット効果のない分解物質としてのＡＧＢ１を裏付けている。

【0166】

結論及び将来の展望
慎重な構造ガイド設計を通して、本発明者らの新規の誘発性デグロンシステムであるブロモタグのために、本発明者らの超高速で高選択的で強力なＢ＆Ｈ－ＰＲＯＴＡＣ分解物質としてＡＧＢ１（４６）を開発した。本発明者らは、ＡＧＢ１（４６）がＶＨＬとブロモタグ（Ｂｒｄ４^{BD2 L387A}）との間に強力で共同的な三元複合体を形成するだけではなく、低いナノモル濃度効力、並びに野生型ＢＥＴタンパク質及びプロテオーム全体に対する絶妙な選択性でブロモタグ付き標的タンパク質を完全に分解することを示している。また、ＡＧＢ１（４６）は、いくつかのがん関連細胞株において細胞傷害性を示さないことを示し、オフターゲット内在性ＢＥＴタンパク質に対するその優れた選択性をさらに示している。ＡＧＢ１（４６）は優れた血漿安定性及び許容される薬物動態も示しており、マウスモデルにおけるその後のｉｎ ｖｉｖｏ研究に好適である。したがって本発明者らは、生体をブローブするのに有用なツールとしてＡＧＢ１（４６）及び本発明者らの新規のブロモタグシステムを認定する。本発明者らは、ブロモタグがまた、一度に１種類を超えるタンパク質を同時に枯渇させるための直交性システムとして、他の誘発性デグロン、例えば、ｄＴＡＧ、ＡＩＤ又はＨａｌｏＰＲＯＴＡＣとともに並行して使用することができることを想定する。

【0167】

背景技術の項に記載した、Ｂｒｄ４及びＣＲＢＮベースのリガンドに結合するセグメントの一部として「バンプ」を含む化合物であるＸＹ－０６－００７は、Ｒ．Ｐ．Ｎｏｗａｋら（２０２１年、上記を参照のこと）によって開発されている。本発明者らのデータは、ＡＧＢ１とＶＨＬ及び本発明者らのブロモタグとによって形成されるＭＺ１様の高度に共同的で安定な三元複合体が、ＸＹ－０６－００７よりもＡＧＢ１で有意であるその迅速で十分なタグ付き標的タンパク質分解を強調していることを示唆する。ＸＹ－０６－００７及びＡＧＢ１は、化学（それぞれＪＱ１ベースではなくＩ－ＢＥＴ７６２、エチルバンプではなくメチルバンプ）と生物学（それぞれＶＨＬベースではなくＣＲＢＮベース、Ｂｒｄ４^BD2Ｌ３８７Ａタグの代わりにＢｒｄ４^BD1Ｌ９４Ｖタグ）の両方で大幅に異なる。したがって、本明細書において記載する方法及びＮｏｗａｋらの方法は、ブロモドメインタグタンパク質の分解を誘導するための２種類の方法を提供し、これらは、標的タンパク質の迅速で高度な選択的分解の効果及び暗示を研究するために利用可能な、増え続ける誘発性デグロン技術群に加わる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B-1】

【図2B-2】

【図2B-3】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【配列表】

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【国際調査報告】