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特表2024-536109インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドをコードする腫瘍溶解性ウイルスベクター
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-04
(54)【発明の名称】インターロイキン－７（ＩＬ－７）ポリペプチドをコードする腫瘍溶解性ウイルスベクター
(51)【国際特許分類】
A61K 38/20 20060101AFI20240927BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240927BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20240927BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240927BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240927BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240927BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240927BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240927BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240927BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20240927BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240927BHJP
【ＦＩ】
A61K38/20
A61K35/17
A61K35/761
A61K48/00
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K39/395 V
A61K45/00
A61P37/04
C12N15/861 Z ZNA
C12N15/12
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518987
(86)(22)【出願日】2022-10-04
(85)【翻訳文提出日】2024-04-18
(86)【国際出願番号】 FI2022050662
(87)【国際公開番号】W WO2023057687
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】20216026
(32)【優先日】2021-10-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FI
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524115338
【氏名又は名称】ティルト バイオセラピューティクス オーワイ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】カドリング，タチアナ
(72)【発明者】
【氏名】ヘムミンキ，アクセリ
(72)【発明者】
【氏名】クラブ，ジェームス
(72)【発明者】
【氏名】キシャベイラ，ダフネ
(72)【発明者】
【氏名】ハヴネン，リイカ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C084ZC752
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE03
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BC83
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
4C087ZC75
(57)【要約】
本発明は、導入遺伝子としてインターロイキン７（ＩＬ－７）ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを提供する。本発明はまた、前記腫瘍溶解性ベクターならびに以下：生理学的に許容可能な担体、緩衝液、賦形剤、アジュバント、添加物、消毒剤、防腐剤、充填剤、安定剤および／または増粘剤の少なくとも１つを含む医薬組成物を提供する。本発明の特定の目的は、癌または腫瘍、好ましくは固形腫瘍の処置における使用のための前記腫瘍溶解性ウイルスベクターまたは医薬組成物を提供することである。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
導入遺伝子としてインターロイキン７（ＩＬ－７）ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターであって、前記腫瘍溶解性アデノウイルスベクターのバックボーンが、アデノウイルス血清型３（Ａｄ３）のファイバーノブを有するアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）バックボーンである、腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項2】
インターロイキン７（ＩＬ－７）ポリペプチドまたはその変異体をコードする前記核酸配列が、前記腫瘍溶解性アデノウイルスベクターのＥ３領域内における欠失した核酸配列の場所にある、請求項１に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項3】
前記Ｅ３領域における核酸配列の前記欠失が、ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの欠失である、請求項２に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項4】
前記腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの前記アデノウイルスＥ１配列における２４ｂｐ欠失（Δ２４）を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項5】
Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４バックボーンを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項6】
前記構造Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ－７を有する、請求項５に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項7】
さらなる導入遺伝子をコードする核酸配列を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項8】
前記さらなる導入遺伝子が、サイトカインをコードする、請求項７に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項9】
前記サイトカインが：ＴＮＦアルファ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、補体Ｃ５ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４－１、ＣＣＬ１４－２、ＣＣＬ１４－３、ＣＣＬ１５－１、ＣＣＬ１５－２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３－１、ＣＣＬ２３－２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５－１、ＣＣＬ２５－２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５（＝ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなるリストから選択される、請求項８に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項10】
前記サイトカインが、ＴＮＦアルファまたはＩＬ－１５である、請求項９に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクター。
【請求項11】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターならびに以下：生理学的に許容可能な担体、緩衝液、賦形剤、アジュバント、添加物、消毒剤、防腐剤、充填剤、安定剤および／または増粘剤の少なくとも１つを含む、医薬組成物。
【請求項12】
癌または腫瘍、好ましくは固形腫瘍の処置における使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項13】
請求項１２に記載の癌または腫瘍の処置における使用のための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物であって、前記癌または腫瘍が、鼻咽腔癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌（renal cancer）、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起神経膠腫、神経芽腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、消化管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼癌、頸部癌、腎臓癌（kidney cancer）、ウィルムス腫瘍、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン氏病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌性膵臓癌、グルカゴノーマ、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌（stomach cancer）、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫瘍、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌（mouth cancer）、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃腺癌からなる群より選択される、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物。
【請求項14】
養子細胞治療用組成物と一緒に用いる、請求項１２または１３に記載の癌の処置における使用のための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物。
【請求項15】
免疫チェックポイント阻害剤と一緒に用いる、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の癌または腫瘍の処置における使用のための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物。
【請求項16】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ１に選択的に結合する、請求項１５に記載の癌または腫瘍の処置における使用のための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物。
【請求項17】
ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１に選択的に結合する前記免疫チェックポイント阻害剤が：ＢＭＳ－９３６５５９、ＬＹ３３０００５４、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、エンバフォリマブ、コシベリマブ、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、スパルタリズマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、ＩＮＣＭＧＡ０００１２およびＡＭＰ－５１４からなる群より選択される、請求項１６に記載の癌の処置における使用のための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物。
【請求項18】
放射線療法、モノクローナル抗体、化学療法、小分子阻害剤（small molecular inhibitor）、ホルモン療法または対象への他の抗癌剤もしくは介入と一緒に用いる、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の癌の処置における使用のための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物。
【請求項19】
免疫チェックポイント阻害剤と一緒に用いる、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の癌の処置における使用のための腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成物であって、前記アデノウイルスベクターが、前記構造Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ－７を有しており、前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１に選択的に結合する、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターまたは医薬組成。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生命科学および医学の分野に関する。具体的には、本発明は、ヒトの癌治療に関する。より具体的には、本発明は、インターロイキン－７（ＩＬ－７またはＩＬ７）ポリペプチドをコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性ウイルスベクターに関する。
【背景技術】
【0002】
ＩＬ－７は、免疫細胞の拡大および増殖に関与する主要なサイトカインの１つである。その主な機能は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞の生存ならびにそれらの多様性を維持することである。ＩＬ－７は、Ｔ細胞活性化の負の調節因子の抑制を介するＴ細胞のエフェクター機能を改善することができ、ＩＦＮγ産生を高めることができる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．２００６）。逆に、ＩＬ－７は、いくつかの機構を介する免疫抑制経路を拮抗する。制御性Ｔ細胞の活性化を防止し、エフェクター細胞を抑制するそれらの能力を阻害する（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１２）。さらに、ＩＬ－７は、Ｔ細胞の増殖の阻害を廃止し、それらの消耗を防止する（Ｈｅｎｉｎｇｅｒ ａｔ ａｌ．２０１２）。
【0003】
組換えＩＬ－７は、前臨床実験では期待できる結果を示したが、第Ｉ相臨床試験では、オフターゲット毒性が、用量制限毒性を引き起こした。１６人のうち１人の患者のみが、腫瘍反応を起こしていた（Ｓｐｏｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１０）。
【0004】
従来技術において、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０２１は、ＩＬ－７をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを開示しており、そのベクターのバックボーンは、アデノウイルス血清型５である。このベクターを膠芽腫の処置のために養子細胞療法（ＡＣＴ）と組み合わせて使用した。この処置は、担癌マウスの生存の延長につながった。しかし、著者らは、研究の１つの主要な制限が、マウス由来膠芽腫細胞に感染するのを妨げる、ＩＬ－７がロードされた腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの設計であると述べている。確かに、この研究で使用されたアデノウイルスベクターは、すべての腫瘍細胞で発現しないＣＸＡＲ受容体を通って細胞に入る。
【0005】
Ｎａｋａｏ ｅｔ ａｌ．２０２０は、ＩＬ－７およびＩＬ－１２遺伝子の両方を保持する腫瘍特異的ワクシニアウイルスベクターを開示する。ベクターは、抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ４抗体と組み合わせて使用されて、マウスモデルにおける対側性腫瘍を処置し、腫瘍退縮をもたらす。しかし、著者らは、チェックポイント阻害剤が、ワクシニアウイルスの複製を妨げる可能性があると述べている。
【0006】
長年の開発の末、腫瘍溶解性ウイルスは、現在、癌の治療剤として使用され始めている。ウイルスの有効性に影響を及ぼす作用機序および要因に関する発見があったが、ウイルス療法に対する全体的な反応を決定する経路を同定する必要性が依然としてある。臨床試験において、腫瘍溶解性ウイルスは、好ましい安全性プロファイルおよび有望な有効性を示している。
【0007】
国際公開第２０１４１７０３８９号は、単独または治療的使用のための治療用組成物を一緒に用いる腫瘍溶解性アデノウイルスベクターおよび癌のための治療法に関する。例えば、養子細胞治療用組成物および腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの個別投与が開示される。養子細胞療法（therapiess）は、癌を処置するためだけでなく、感染症および移植片対宿主疾患などの他の疾患を処置するための強力なアプローチである。養子細胞移植は、免疫学的機能性および移植の特性を移植する目的で、エクスビボで増殖した細胞、最も一般的には免疫由来細胞の宿主への受動移入である。国際公開第２０１４１７０３８９号はまた、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターの核酸配列を開示する。
【0008】
国際公開第２０１６１４６８９４号は、二重特異性モノクローナル抗体をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを開示する。
【0009】
欧州特許第３８５８３６９号明細書は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと免疫チェックポイント阻害剤との併用による癌治療に関する。ウイルスは、２つのインターロイキン、ＩＬ－７およびＩＬ－１２をコードし、免疫チェックポイント阻害剤とともに投与されて、抗腫瘍効果をさらに改善する。
【0010】
癌患者にとって、特に大きな転移負荷を有する患者における腫瘍溶解性ウイルス治療を改善する余地が依然としてある。腫瘍溶解性ウイルスの活性に関連する経路のさらなる特性評価は、ウイルス療法の有効性を改善するための潜在的な標的を明らかにする可能性がある。そのため、単独でまたは他の療法と一緒での腫瘍溶解性ウイルスベクターの有効性は、依然として改善される可能性がある。本発明は、特異的ウイルスベクターを利用することにより、例えば養子細胞療法および／または免疫チェックポイント阻害剤を用いる、癌治療剤にとっての効率的なツールおよび方法を提供する。
【発明の概要】
【0011】
本発明の目的は、癌処置における腫瘍溶解性アデノウイルスの使用に見られる制限を克服することである。したがって、本発明の目的は、効果がなく、危険で予測できない癌治療の問題を克服するための簡単な方法およびツールを提供することである。本発明の実施形態において、癌治療のための新規のアプローチおよび手段が、このように提供される。本発明の目的は、独立請求項で述べられているものにより特徴づけられている特異的ウイルスベクター、方法および配置により達成される。本発明の特定の実施形態は、従属請求項に開示されている。
【0012】
具体的には、本発明は、導入遺伝子としてインターロイキン７（ＩＬ－７）ポリペプチドをコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを提供する。本発明はまた、前記腫瘍溶解性ベクターならびに以下：生理学的に許容可能な担体、緩衝液、賦形剤、アジュバント、添加物、消毒剤、防腐剤、充填剤、安定剤および／または増粘剤の少なくとも１つを含む医薬組成物を提供する。本発明の特定の目的は、癌または腫瘍、好ましくは固形腫瘍の処置における使用のための前記腫瘍溶解性ウイルスベクターまたは医薬組成物を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】インビトロでのＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７の機能性。（Ａ）Ｅ２Ｆプロモーター；Ｅ１Ａ内の２４塩基対の欠失；Ｅ３領域内で挿入されたヒトＩＬ７導入遺伝子；およびＡｄ５ファイバー内のＡｄ３血清型ノブを含有するキメラ５／３腫瘍溶解性アデノウイルスの図式提示。（Ｂ）上皮腺癌（Ａ５４９）および横紋筋肉腫（ＲＤ）における感染後４日目で１個、１０個、１００個または１０００個のウイルス粒子（ＶＰ）／細胞の添加後の相対的なヒト癌細胞生存率。Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７およびＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４の腫瘍細胞致死能間に大きな差異は観察されず、したがって、ＩＬ７導入遺伝子の存在が、ヒト癌細胞におけるＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７の腫瘍溶解力を低下させないことを示唆した。モックと比較した統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。（Ｃ）ハムスター肺癌（ＨＴ１００）およびハムスター平滑筋肉腫（ＤＤＴ１－ＭＦ２）における感染後５日目または、ハムスター膵臓癌（ＨａｐＴ１）における感染後８日目で１００、１０００、５０００または１００００ＶＰ／細胞の添加後の相対的なハムスター癌細胞生存率。Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７およびＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４の細胞致死能間に大きな差異はなく、したがって、ＩＬ７導入遺伝子の存在が、ハムスター癌細胞におけるＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７の腫瘍溶解力を低下させないことを示唆した。モックと比較した統計的有意性は、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。（Ｄ）ＩＬ７発現を、トランスフェクト癌細胞から分析した。１０００ＶＰ／細胞の感染後（Ａ５４９およびＲＤ）または１００００ＶＰ／細胞の感染後（ＨＴ１００およびＤＤＴ１－ＭＦ２）３日目に回収された細胞上清で、ＩＬ７濃度を測定した。分析により、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７が、多数の癌細胞株においてＩＬ７の発現を誘導することができることが示された。（Ｅ）Ａ５４９細胞株の１０００ＶＰ／細胞の感染後に測定されたＩＬ７の生理活性。上清を濾過し、増殖培地で希釈して、ＩＬ７依存性マウス細胞株２Ｅ８に適用した。組換えマウスＩＬ７（ｒｍＩＬ７）およびマウスＩＬ７（ｒｈＩＬ７）を、２０ｎｇ／ｍｌで対照として使用した。これらのデータは、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７での感染で癌細胞により産生されたＩＬ－７が、機能的であることを示唆する。三連で実行されたインビトロのデータセットおよびすべてのデータを、平均±ＳＥＭと示す
【図2】インビボでのＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７の有効性。（Ａ）ＰＢＳ、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４またはＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７ウイルスで処置された実験群からの３０日目までの腫瘍増殖。腫瘍体積を、０日目に対して正規化した。データを、中央値＋範囲として表す。正規化された腫瘍体積からの統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７での処置により、実験対照（非武装化（unarmed）ウイルス（Ａｄ５／３－Ｄ２４－Ｅ２Ｆ）およびモック）と比べて腫瘍体積の有意な減少が引き起こされ、したがって最良の抗腫瘍効果を与えた。（Ｂ）腫瘍分解物における免疫関連遺伝子発現の変化。全ＲＮＡを、腫瘍組織から単離し、その後、ｃＤＮＡ合成および定量的リアルタイムＰＣＲを行った。ＰＣＲを二連で実行し、データをモックに対して正規化した。データは、平均＋ＳＥＭとして表される。Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７処置を受けた腫瘍は、モック処置動物と比べて免疫関連遺伝子の増加した転写を示し、ＩＬ－７をコードするウイルスが、優れた局所的免疫活性化を誘導することができることを示唆した。
【図3】エクスビボの腫瘍培養での癌患者における溶解能力およびＩＬ７武装化（armed）アデノウイルスの複製（Ａ）卵巣（ＨＵＳＯＶ４およびＯｖＣａＳ）ならびに頭頸部（ＨＵＳＨＮ１１）癌患者からの腫瘍分解物の生存率を、１００ＶＰ/細胞での腫瘍溶解性ウイルスの感染後の異なる日に評価した。細胞生存率データを、非感染モックに対して正規化する。実験を、三連で実行した。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。ほとんどの癌患者試料においてＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７およびＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４の腫瘍細胞致死能間に大きな差異は観察されず、ＩＬ７導入遺伝子の存在が、癌患者の腫瘍培養においてＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７の腫瘍溶解力を低下させないことを示唆した。（Ｂ）卵巣（ＨＵＳＯＶ４およびＯｖＣａＳ）ならびに頭頸部（ＨＵＳＨＮ１１およびＨＵＳＨＮ１０）試料からの定量的リアルタイムＰＣＲを通じたＡｄ５／３複製評価。ウイルスのコピー数を、試料中のゲノムＤＮＡの量に対して正規化し、ヒトβ－アクチンの発現量により決定した。ＰＣＲを、二連で実行した。データから、経時的なＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４およびＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７の間のウイルスＤＮＡレベルの同様のパターンが示され、ＩＬ－７導入遺伝子が、ウイルス複製を妨げないことを示唆した。（Ｃ）サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）アッセイにより測定された、卵巣（ＨＵＳＯＶ４およびＯｖＣａＳ）ならびに頭頸部（ＨＵＳＨＮ１５およびＨＵＳＨＮ１７）試料からの上清におけるＩＬ７タンパク質濃度。実験を、三連で実行した。これにより、ＩＬ－７が、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７で感染させたヒト癌患者の試料で生成されることが示唆される。データはすべて、平均＋ＳＥＭとして表される。
【図4】腫瘍微小環境におけるサイトカインおよびケモカインの評価。腫瘍溶解性アデノウイルスのＭＯＩ１００での感染３日後に卵巣癌試料ＨＵＳＯＶ４、ＨＵＳＯＶ５およびＯｖＣａＳから得られた（Ａ）炎症性サイトカイン、（Ｃ）抗炎症性サイトカインおよび（Ｅ）ケモカインのレベル。プールされた（Ｂ）炎症性および（Ｄ）抗炎症性の変化ならびに（Ｆ）炎症性サイトカインの抗炎症性サイトカインに対する全体比率。炎症性サイトカインおよびケモカインの含有量の増加は、対照と比べて、ヒト癌患者の試料の微小環境を免疫刺激に良好に分極化させる、ＩＬ－７ウイルスの能力を示す。さらに、ＩＬ－７ウイルス処置ウェルでは、抗炎症性サイトカイン含有量における一般的な最小の影響または減少が観察された。データはすべて、モックに対して正規化された。すべての実験を、三連で実行し、得られるデータは、平均＋ＳＥＭとして表される。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１として表される。
【図5】卵巣癌エクスビボ試料（ＨＵＳＯＶ４およびＯｖＣａＳ）における、浸潤ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化ならびに細胞傷害の評価。（Ａ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞集団における、ＣＤ６９＋細胞の頻度。（Ｂ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞での活性化受容体ＣＤ６９の発現量（ＭＦＩ、平均蛍光強度として指定される）。（Ｃ）ＨＵＳＯＶ４試料における、パーフォリンおよびグランザイムＢを発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の頻度。（Ｄ）ＯｖＣａＳ試料における、パーフォリンおよびグランザイムＢを発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の頻度。全体では、データは、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７を用いる患者由来の卵巣のエクスビボ腫瘍培養の処置が、Ｔ細胞亜集団を活性化し、その頻度を高めることを示唆している。すべてのフローサイトメトリー実験を、二連で行い、得られるデータは、平均＋ＳＥＭとして表される。統計的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１として表される。
【図6】Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７（ＴＩＬＴ－５１７）および免疫チェックポイント阻害剤（抗ＰＤ１および抗ＰＤ－Ｌ１）で処理された患者由来の腎細胞癌（ＲＣＣ）試料（ＨＵＳＲｅｎｃａ５）の相対的な癌細胞生存率。（Ａ）１日目、２日目、３日目、４日目、および５日目での、ＨＵＳＲｅｎｃａ５腫瘍細胞の全体的な細胞生存率。ＭＴＳアッセイにより評価された（Ｂ）２日目および（Ｃ）５日目の腫瘍細胞致死の詳細な視点。（Ｂ）および（Ｃ）において、試料は、左から右に：モック、ＴＩＬＴ－５１７、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、ＴＩＬＴ－５１７＋抗ＰＤ－１、ＴＩＬＴ－５１７＋抗ＰＤ－Ｌ１であり；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
インターロイキン７（ＩＬ－７）およびその変異体
本明細書で使用されるように、「ＩＬ－７」または「ＩＬ７」は、天然か組換えかを問わず、野生型ＩＬ－７アイソフォーム１ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸（すなわち遺伝子）を意味する。成熟ヒトＩＬ－７は、１５２のアミノ酸配列として存在する（シグナルペプチドなし、追加の２５のＮ末端アミノ酸からなる）。ヒトＩＬ－７のアミノ酸配列（配列番号１）は、アクセッション番号ＮＰ＿０００８７１．１下、ジェンバンクで見つけられる。その最も広い意味では、用語「ＩＬ－７」または「ＩＬ７」はまた、癌治療に適したＩＬ－７変異体のいずれかを指す場合がある。
本明細書で使用されるように、「ＩＬ－７」または「ＩＬ７」は、天然か組換えかを問わず、野生型ＩＬ－７アイソフォーム１ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸（すなわち遺伝子）を意味する。成熟ヒトＩＬ－７は、１５２のアミノ酸配列として存在する（シグナルペプチドなし、追加の２５のＮ末端アミノ酸からなる）。ヒトＩＬ－７のアミノ酸配列（配列番号１）は、アクセッション番号ＮＰ＿０００８７１．１下、ジェンバンクで見つけられる。その最も広い意味では、用語「ＩＬ－７」または「ＩＬ７」はまた、癌治療に適したＩＬ－７変異体のいずれかを指す場合がある。
【0015】
本明細書で使用されるように、「ＩＬ－７変異体」、「変異体ＩＬ－７」、「ｖＩＬ７」または「ｖＩＬ－７」は、ポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸（すなわち遺伝子）を意味し、ここで、インターロイキン－７ポリペプチドに対する置換などの特定の変化または修飾が行われるかまたは見出されている。用語「ポリペプチド」は、本明細書において、その長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関係なく、アミノ酸残基のいずれかの鎖を指す。変異体ＩＬ－７ポリペプチドはまた、天然のＩＬ－７ポリペプチド鎖の１つもしくは複数の部位または他の残基でのアミノ酸の挿入、欠失、置換および修飾により特徴づけることができる。そのような挿入、欠失、置換および修飾はいずれも、結果的に、好ましくは癌治療のためのＩＬ－７変異体の特性を改善する意図で受容体サブユニットＩＬ－７Ｒまたはその構成成分への修飾された結合を示す、変異体ＩＬ－７となる場合がある。代表的な変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多いアミノ酸の置換を含むことができる。変異体はまた、ＩＬ－７の他の位置（すなわち、変異体の活性または二次構造もしくは三次構造に対して最小限の効果を有する位置）で、保存的修飾および置換を含む場合がある。ＩＬ－７変異体はまた、天然のアイソフォームを含む場合がある（Ｖｕｄａｔｔｕ ｅｔ ａｌ．２００８）。天然のＩＬ－７アイソフォーム前駆体のための配列は、アクセッション番号ＮＰ＿００１１８６８１５．１（アイソフォーム２）、ＮＰ＿００１１８６８１６．１（アイソフォーム３）およびＮＰ＿００１１８６８１７．１（アイソフォーム４）下、ジェンバンクで見つけることができるが、アイソフォーム１の配列と比較して、アイソフォーム２は、７７～１２０位で４４－アミノ酸欠失を有し、アイソフォーム３は、１２１～１３８位で１８－アミノ酸欠失を有し、アイソフォーム４は、７６～１３８位で６２－アミノ酸欠失を有する。
【0016】
代表的な変異体ＩＬ－７ポリペプチドは、配列番号１により表されるポリペプチドがＩＬ－７Ｒを結合する親和性よりも高いまたは低いといった、変更された親和性を有するＩＬ－７Ｒを結合する配列番号１と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を含む。代表的な変異体ＩＬ－７ポリペプチドは、野生型ＩＬ－７と少なくとも約５０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８７％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％同一であり得る。変異体ポリペプチドは、アミノ酸残基の数または含有量における変化を含むことができる。例えば、変異体ＩＬ－７は、野生型ＩＬ－７よりも、より多いまたはより少ないアミノ酸残基の数を有することができる。あるいは、またはさらに、代表的な変異体ポリペプチドは、野生型ＩＬ－７に存在する１つまたは複数のアミノ酸残基の置換を含有することができる。
【0017】
別の実施形態において、ＩＬ－７ポリペプチドはまた、ＩＬ－７ポリペプチドおよび別の異種ポリペプチドを含む融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとして調製され得る。ＩＬ－７および抗体またはその抗原結合部分を含むキメラポリペプチドを生成することができる。キメラタンパク質の抗体または抗原結合成分は、標的化部分として機能することができる。例えば、キメラタンパク質を細胞または標的分子の特定のサブセットに局所化するために使用され得る。
【0018】
本発明は、特に、導入遺伝子として上述のＩＬ－７ポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性ウイルスベクターの設計に向けられる。
【0019】
ウイルスベクター
腫瘍溶解性ウイルスベクターは、癌細胞に選択的に感染し、複製し、破壊することができる、治療的に有用な抗癌ウイルスである。最新の腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍選択性があるように適応されるかまたは設計されるが、癌細胞を自然に好む性質があるレオウイルスおよびムンプスウイルスなどのウイルスがある。多くの遺伝子操作された腫瘍溶解性ウイルスベクターは、腫瘍特異的プロモーター要素を利用して、癌細胞においてのみ自律増殖可能になる。癌細胞により選択的に発現された表面マーカーはまた、ウイルス侵入のための受容体として使用することにより、標的化され得る。アデノウイルス、レオウイルス、麻疹、単純ヘルペスウイルス、ニューキャッスル病ウイルスおよびワクシニアウイルスを含む多数のウイルスは、現在、腫瘍溶解剤として臨床試験されている。
腫瘍溶解性ウイルスベクターは、癌細胞に選択的に感染し、複製し、破壊することができる、治療的に有用な抗癌ウイルスである。最新の腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍選択性があるように適応されるかまたは設計されるが、癌細胞を自然に好む性質があるレオウイルスおよびムンプスウイルスなどのウイルスがある。多くの遺伝子操作された腫瘍溶解性ウイルスベクターは、腫瘍特異的プロモーター要素を利用して、癌細胞においてのみ自律増殖可能になる。癌細胞により選択的に発現された表面マーカーはまた、ウイルス侵入のための受容体として使用することにより、標的化され得る。アデノウイルス、レオウイルス、麻疹、単純ヘルペスウイルス、ニューキャッスル病ウイルスおよびワクシニアウイルスを含む多数のウイルスは、現在、腫瘍溶解剤として臨床試験されている。
【0020】
好ましくは、本発明で使用される腫瘍溶解性ベクターは、ヒトまたは動物を処置するのに適したアデノウイルスベクターである。本明細書で使用されるように、「腫瘍溶解性アデノウイルスベクター」は、正常な細胞に対して腫瘍における選択的複製により癌細胞に感染し、死滅させることができるアデノウイルスベクターを指す。本明細書で使用されるように、表現「アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸バックボーン」は、Ａｄ５のゲノムを指す。同様に、「アデノウイルス血清型３（Ａｄ３）核酸バックボーン」は、Ａｄ３のゲノムを指す。「Ａｄ５／３ベクター」は、Ａｄ５およびＡｄ３ベクターの両方の部分を含むまたはそれを有するキメラベクターを指す。
【0021】
本発明の一実施形態において、アデノウイルスベクターは、ヒトウイルスのベクターである。具体的には、アデノウイルスベクターは、Ａｄ５／３ベクターである。一実施形態においてバックボーンは、Ａｄ３ファイバーノブをさらに含むＡｄ５核酸バックボーンである。換言すると、構築物は、Ａｄ３由来のファイバーノブを有するが、ゲノムの残りの部分またはその残りの大部分は、Ａｄ５由来である（例えば、国際公開第２０１４１７０３８９号を参照されたい）。
【0022】
アデノウイルスベクターは、当技術分野で既知のいずれかの方法、例えば任意のウイルス領域を欠失、挿入、突然変異または修飾することにより改変されている場合がある。ベクターは、複製に関して腫瘍特異的に作られている。例えば、アデノウイルスベクターは、腫瘍特異的プロモーターの挿入（例えばＥ１を駆動するため）、領域の欠失（例えば、「Δ２４」、Ｅ３／ｇｐ１９ｋ、Ｅ３／６．７ｋで使用されるＥ１の定常領域２）および１つまたは複数の導入遺伝子の挿入などの、Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４における改変を含む場合がある。
【0023】
特定の実施形態において、一般的にアデノウイルスベクターの複製を支援することが既知であるＥ１Ｂ １９Ｋ遺伝子は、国際公開第２０２０２４９８７３号に記載されるように、本ベクター内に無効な欠失ｄＥ１Ｂ １９Ｋを有する。
【0024】
腫瘍特異的腫瘍溶解性アデノウイルスの生成のための１つのアプローチは、Ｅ１の定常領域２（ＣＲ２）に影響する、２４塩基対（ｂｐ）の欠失（「Δ２４」または「ｄ２４」）を設計することである。野生型アデノウイルスにおいて、ＣＲ２は、合成（Ｓ）期、すなわちＤＮＡ合成期または複製期の誘導のための細胞性Ｒｂ腫瘍サプレッサー／細胞周期レギュレータタンパク質を結合する役割を担う。ｐＲｂとＥ１Ａとの間の相互作用は、Ｅ１Ａタンパク質保存領域のアミノ酸１２１～１２７を必要とする。ベクターは、Ｈｅｉｓｅ Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ６，１１３４－１１３９）およびＦｕｅｙｏ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９（１）：２－１２）にしたがって、そのベクターのアミノ酸１２２～１２９に対応するヌクレオチドの欠失を含む場合がある。Δ２４を有するウイルスは、Ｇ１－Ｓチェックポイントを克服する能力が低下しており、すべてではないにしても、ほとんどのヒト腫瘍を含む、この相互作用が必要ではない細胞、例えば、Ｒｂ－ｐ１６経路内に欠陥のある腫瘍細胞でのみ効率的に複製することが知られている。本発明の一実施形態において、ベクターは、アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐの欠失（「Δ２４」または「ｄ２４」）を含む。
【0025】
また、Ｅ１Ａ内在性ウイルスプロモーターを、例えば腫瘍特異的プロモーターにより置き換えることも可能である。例えば、Ｅ２Ｆ１（例えばＡｄ５ベースのベクター内）またはｈＴＥＲＴ（例えばＡｄ３ベースのベクター内）プロモーターは、Ｅ１Ａ内在性ウイルスプロモーターの代わりに利用され得る。このベクターは、Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーターを含む場合がある。Ｅ１Ａプロモーターもまた、欠失され得る。
【0026】
Ｅ３領域は、エクスビボのウイルス複製に必須ではないが、Ｅ３タンパク質は、宿主免疫応答の調節において、すなわち、自然免疫応答および適応免疫応答の両方の阻害において、重要な役割がある。本発明の一実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターのＥ３領域における核酸配列の欠失は、ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの欠失である。Ｅ３におけるｇｐ１９ｋ／６．７ｋの欠失は、アデノウイルスＥ３Ａ領域由来の９６５塩基対の欠失を指す。得られるアデノウイルス構築物において、ｇｐ１９ｋおよび６．７ｋ遺伝子は両方とも欠失している（Ｋａｎｅｒｖａ Ａ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １２，８７－９４）。ｇｐ１９ｋ遺伝子産物は、小胞体における主要組織結合性複合体Ｉ（ＭＨＣ１、ヒトのＨＬＡ１として既知）分子を結合し、分離すること、および細胞傷害性Ｔリンパ球により、感染した細胞の認識を妨げることが知られている。多くの腫瘍でＨＬＡ１／ＭＨＣ１が不足しているので、ｇｐ１９ｋの欠失は、ウイルスの腫瘍選択性を高める（ウイルスは、正常細胞からは野生型ウイルスよりも早く除去されるが、腫瘍細胞では差がない）。６．７ｋタンパク質は、細胞表面に発現し、それらは、リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体２を含むＴＮＦ関連アポトーシスのダウンレギュレーションに関与している。
【0027】
本発明の一実施形態において、導入遺伝子、すなわちインターロイキン７（ＩＬ７）をコードする遺伝子は、Ｅ３プロモーター下でｇｐ１９ｋ／６．７ｋ欠失Ｅ３領域に配置される。これは、腫瘍細胞に対する導入遺伝子の発現を制限し、ウイルスの複製およびその後に続くＥ３プロモーターの活性化を可能にする。特定の実施形態において、インターロイキン７をコードする核酸配列は、ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの欠失した核酸配列の場所に挿入される。本発明の別の実施形態において、Ｅ３ ｇｐ１９ｋ／６．７ｋは、ベクター内に維持されるが、１つまたは多くの他のＥ３領域は、欠失している（例えば、Ｅ３ ９ｋＤａ、Ｅ３ １０．２ｋＤａ、Ｅ３ １５．２ｋＤａおよび／またはＥ３ １５．３ｋＤａ）。
【0028】
Ｅ３プロモーターは、当技術分野で既知の任意の外来性（例えば、ＣＭＶまたはＥ２Ｆプロモーター）または内在性プロモーター、具体的には、内在性Ｅ３プロモーターであり得る。Ｅ３プロモーターは、主に複製により活性化されるが、いくらかの発現は、Ｅ１が発現される場合に生じる。Δ２４タイプのウイルスの選択性が、Ｅ１発現後に生じる（Ｅ１がＲｂを結合することができない場合）ので、これらのウイルスは、形質導入された正常細胞でもＥ１を発現する。したがって、腫瘍細胞に対してＥ３プロモーターが媒介する導入遺伝子発現を制限するために、Ｅ１発現も調節することは極めて重要である。
【0029】
本発明の特定の実施形態は、複製が、二重選択性デバイス：定常領域２で突然変異しているアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の前に配置されたＥ２Ｆ（例えばＥ２Ｆ１）腫瘍特異的プロモーターにより網膜芽細胞腫（Ｒｂ）／ｐ１６経路に制限されている腫瘍溶解性アデノウイルスベクター（例えばＡｄ５／Ａｄ３ベクター）を含み、そのため、得られるＥ１Ａタンパク質は、細胞でＲｂを結合することができない。さらに、ファイバーは、５／３キメリズムにより修飾されており、腫瘍細胞への効率的な侵入を可能にする。
【0030】
本発明の特定の実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは：
１）アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐの欠失（Δ２４）；
２）ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの核酸配列の欠失；ならびに
３）ポイント２）で定義された欠失した核酸配列の代わりに、インターロイキン７（ＩＬ７）導入遺伝子をコードする核酸配列
を含む。
１）アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐの欠失（Δ２４）；
２）ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの核酸配列の欠失；ならびに
３）ポイント２）で定義された欠失した核酸配列の代わりに、インターロイキン７（ＩＬ７）導入遺伝子をコードする核酸配列
を含む。
【0031】
以下の実験セクションにおいて、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４バックボーンに基づいて腫瘍溶解性アデノウイルスを構築し、特徴づけ、ＩＬ７でそれを武装化（armed）した。ウイルスは、Ｅ２ＦプロモーターおよびＥ１Ａ定常領域２における２４塩基対の欠失（「Ｄ２４」）を有しており、ｒｂ／ｐ１６経路欠陥細胞においてのみ、その複製を可能にするが、これはすべての癌細胞に共通の特徴の１つである。Ｅ１Ｂ領域は、癌細胞アポトーシス（ｄＥ１Ｂ １９Ｋ）を誘導するために欠失している。さらに、癌細胞に形質導入し、その抗腫瘍効果を強化するその能力を改善するため、ウイルスは、血清型３由来のファイバーノブを特徴とするが、ゲノムの残りは、血清型５に由来する。最も重要なことには、Ａｄ５／３ウイルスは、ヒトでの良好な安全性プロファイルを有する。好ましくは、ＩＬ－７で武装化（armed）された腫瘍溶解性ウイルスは、潜在的なプラットフォームとして、Ｔ細胞併用療法またはチェックポイント阻害剤とともに使用され、現在不治の固形腫瘍を安全で効果的に処置する。特に、Ｔ細胞が機能障害性である腫瘍の種類は、処置されることが好ましい。
【0032】
一実施形態において、本発明は、インターロイキン７（ＩＬ７）導入遺伝子をコードする核酸配列を含む腫瘍溶解性ウイルスベクター、好ましくは腫瘍溶解性アデノウイルスベクターに向けられる。
【0033】
好ましい実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターのバックボーンは、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）または血清型３（Ａｄ３）核酸バックボーンである。
【0034】
より好ましい実施形態において、インターロイキン７（ＩＬ７）導入遺伝子をコードする前記核酸配列は、前記腫瘍溶解性アデノウイルスベクターのＥ３領域で欠失した核酸配列の場所にある。最も好ましくは、Ｅ３領域における核酸配列の欠失は、ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの欠失である。
【0035】
別の好ましい実施形態において、ベクターはまた、前記腫瘍溶解性アデノウイルスベクターのアデノウイルスＥ１配列における２４ｂｐの欠失（Δ２４）を含む。
【0036】
別の好ましい実施形態において、ベクターはまた、Ｅ１Ｂ（ｄＥ１Ｂ １９Ｋ）の無効化欠失を含む。
【0037】
別の好ましい実施形態において、ベクターはまた、Ａｄ５／３ファイバーノブを含む。
【0038】
別の好ましい実施形態において、ベクターは、さらなる導入遺伝子をコードする核酸配列を含む。より好ましくは、さらなる導入遺伝子は、サイトカインをコードする。一実施形態において、サイトカインは：ＴＮＦアルファ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、補体Ｃ５ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４－１、ＣＣＬ１４－２、ＣＣＬ１４－３、ＣＣＬ１５－１、ＣＣＬ１５－２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３－１、ＣＣＬ２３－２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５－１、ＣＣＬ２５－２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５（＝ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなるリストから選択される。
【0039】
より好ましい実施形態において、サイトカインは、ＴＮＦアルファまたはＩＬ－１５である。
【0040】
本発明で使用されるウイルスベクターはまた、上述以外の他の修飾を含む場合がある。追加の成分または修飾はいずれも、場合によっては使用され得るが、本発明に必須ではない。
【0041】
外来性の要素の挿入は、標的細胞におけるベクターの効果を高める場合がある。外来性の組織または腫瘍特異的プロモーターの使用は、組換えベクターにおいて一般的であり、それらもまた、本発明で使用することができる。
【0042】
養子細胞療法
本発明の１つのアプローチは、癌と反応して癌を破壊することができる免疫エフェクター細胞の移動を使用する、癌を有する患者のための処置の開発である。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの単離された免疫エフェクター細胞は、培地中で大量に増殖され、患者に注入される。本発明において、インターロイキン７（ＩＬ７）導入遺伝子をコードする腫瘍溶解性ベクターは、免疫エフェクター細胞の影響を高めるために利用され得る。本明細書で使用されるように、「養子細胞療法の有効性を高めること」は、本発明の腫瘍溶解性ベクターが、養子細胞治療用組成物と一緒に使用される場合、養子細胞治療用組成物単独の治療効果と比較して、対象においてより強い治療効果を引き起こすことができる状況を指す。本発明の特定の実施形態は、対象における癌を処置する方法であり、この方法は、本発明の腫瘍溶解性ベクターの、対象への投与を含み、前記方法は、養子細胞治療用組成物の、対象への投与をさらに含む。養子細胞治療用組成物および本発明のベクターは、別個に投与される。養子細胞治療用組成物およびアデノウイルスベクターの個別投与の前に、骨髄除去または非骨髄除去のプレコンディショニング化学療法および／または放射線照射が行われる場合がある。養子細胞療法の処置は、患者における癌を縮小または除去することを目的とする。
本発明の１つのアプローチは、癌と反応して癌を破壊することができる免疫エフェクター細胞の移動を使用する、癌を有する患者のための処置の開発である。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）などの単離された免疫エフェクター細胞は、培地中で大量に増殖され、患者に注入される。本発明において、インターロイキン７（ＩＬ７）導入遺伝子をコードする腫瘍溶解性ベクターは、免疫エフェクター細胞の影響を高めるために利用され得る。本明細書で使用されるように、「養子細胞療法の有効性を高めること」は、本発明の腫瘍溶解性ベクターが、養子細胞治療用組成物と一緒に使用される場合、養子細胞治療用組成物単独の治療効果と比較して、対象においてより強い治療効果を引き起こすことができる状況を指す。本発明の特定の実施形態は、対象における癌を処置する方法であり、この方法は、本発明の腫瘍溶解性ベクターの、対象への投与を含み、前記方法は、養子細胞治療用組成物の、対象への投与をさらに含む。養子細胞治療用組成物および本発明のベクターは、別個に投与される。養子細胞治療用組成物およびアデノウイルスベクターの個別投与の前に、骨髄除去または非骨髄除去のプレコンディショニング化学療法および／または放射線照射が行われる場合がある。養子細胞療法の処置は、患者における癌を縮小または除去することを目的とする。
【0043】
本発明の特定の実施形態は、アデノウイルスベクターおよび養子細胞治療用組成物、例えば腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）修飾リンパ球またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾リンパ球を用いる療法に関する。Ｔ細胞療法、特にナチュラルキラー（ＮＫ）またはＣＡＲ－ＮＫ細胞療法などの任意の他の養子細胞療法も、本発明において使用される場合がある。確かに、本発明によれば、養子細胞治療用組成物は、例えばＴＩＬ療法における未修飾細胞、または遺伝子組換え細胞を含む場合がある。腫瘍特異的標的へのＴ細胞の遺伝子ターゲティングを達成するための２つの一般的な方法がある。１つは、既知の抗原特異性を有する、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ、げっ歯類において主要な組織結合性複合体として既知）型が一致したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の移動である。もう１つは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの人工受容体を用いる細胞の修飾である。このアプローチは、ＨＬＡに依存しておらず、標的分子に関してより柔軟である。例えば、一本鎖抗体を使用することができ、ＣＡＲは、共刺激ドメインを組み込むこともできる。しかし、ＣＡＲ細胞の標的は、標的細胞の膜上にある必要があるが、ＴＣＲ修飾は、細胞内標的を使用することができる。
【0044】
本明細書で使用されるように、「養子細胞治療用組成物」は、養子細胞移植に適した細胞を含む任意の組成物を指す。本発明の一実施形態において、養子細胞治療用組成物は、ＴＩＬ、ＴＣＲ（すなわち異種Ｔ細胞受容体）修飾リンパ球およびＣＡＲ（すなわちキメラ抗原受容体）修飾リンパ球からなる群より選択される細胞型を含む。本発明の別の実施形態において、養子細胞治療用組成物は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ－細胞、樹状細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、制御性Ｔ細胞および末梢血単核細胞からなる群より選択される細胞型を含む。別の実施形態において、ＴＩＬ、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ－細胞、ガンマ－デルタＴ細胞、制御性Ｔ細胞または末梢血単核細胞は、養子細胞治療用組成物を形成する。本発明の特定の一実施形態において、養子細胞治療用組成物は、Ｔ細胞を含む。本明細書で使用されるように、「腫瘍浸潤リンパ球」またはＴＩＬは、血流から出て、腫瘍に移動した白血球を指す。リンパ球は、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む３つの群に分割され得る。本発明の別の特定の実施形態において、養子細胞治療用組成物は、標的特異的ＣＡＲまたは特別に選択されたＴＣＲで修飾されているＴ細胞を含む。本明細書で使用されるように、「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、ＣＤ４＋細胞傷害性細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞、ガンマ－デルタＴ細胞およびＮＫ Ｔ細胞を含むＣＤ３＋細胞を指す。
【0045】
適切な細胞に加えて、本発明で使用される養子細胞治療用組成物は、薬学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、アジュバント、添加物、消毒剤、充填剤、安定剤および／もしくは増粘剤、ならびに／または対応する製品に通常見られる任意の成分などの任意の他の薬剤を含む場合がある。組成物を配合するための適切な成分および適切な製造方法の選択は、当業者に一般的な知識に属している。
【0046】
養子細胞治療用組成物は、投与に適した固体、半固体または液体の形態などの任意の形態であり得る。製剤は、液剤、乳剤、懸濁剤、錠剤、ペレット剤およびカプセル剤からなる群より選択され得るがこれらに限定されない。組成物は、ある特定の製剤に限定されない；代わりに、組成物は、任意の既知の薬学的に許容される製剤に配合される可能性がある。医薬組成物は、当技術分野で既知の従来のプロセスのいずれかにより生成され得る。
【0047】
本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターと養子細胞治療用組成物との組み合わせは、腫瘍溶解性アデノウイルスベクターおよび養子細胞治療用組成物を、別個の組成物としてではなく一緒に使用することを指す。本発明の腫瘍溶解性アデノウイルスベクターおよび養子細胞治療用組成物が、１つの組成物として使用されないことは、当業者には明らかである。確かに、アデノウイルスベクターは、養子細胞を直接修飾するために使用されることはないが、標的腫瘍を修飾するために使用され、そのため、腫瘍は、細胞移植の望ましい影響をより受けやすい。特に、本発明は、養子移植の腫瘍へのリクルートメントを促進し、その活性をそこで高める。本発明の特定の実施形態において、組み合わせの腫瘍溶解性アデノウイルスベクターおよび養子細胞治療用組成物は、同時にまたは連続して、任意の順序で、対象に投与するためのものである。
【0048】
免疫チェックポイント阻害剤
免疫チェックポイントタンパク質は、特定のリガンドと相互作用して、シグナルをＴ細胞に送り、Ｔ細胞機能を阻害する。癌細胞は、それらの表面上でのチェックポイントタンパク質の高レベルの発現を促進することによりこれを利用し、それによって制癌免疫応答を抑制する。
免疫チェックポイントタンパク質は、特定のリガンドと相互作用して、シグナルをＴ細胞に送り、Ｔ細胞機能を阻害する。癌細胞は、それらの表面上でのチェックポイントタンパク質の高レベルの発現を促進することによりこれを利用し、それによって制癌免疫応答を抑制する。
【0049】
本明細書に記載の免疫チェックポイント阻害剤（ＣＰＩまたはＩＣＩとも呼ばれる）は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害することができる任意の化合物である。阻害には、機能の低下および完全遮断が含まれる。特に、免疫チェックポイントタンパク質は、ヒトチェックポイントタンパク質である。したがって、免疫チェックポイント阻害剤は、好ましくはヒト免疫チェックポイントの阻害剤である。
【0050】
免疫チェックポイントタンパク質には、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１（ならびにそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴおよび／またはＩＤＯが含まれるがこれらに限定されない。ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３およびＫＩＲが関与する経路は、ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１依存経路と同様の免疫チェックポイント経路を構成することが当該技術分野で認識されている。免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１（ならびにそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴおよび／またはＩＤＯの阻害剤であり得る。いくらかの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－１の阻害剤である。好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１に選択的に結合する、より好ましくは：ＢＭＳ－９３６５５９、ＬＹ３３０００５４、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、エンバフォリマブ、コシベリマブおよびアベルマブからなる群より選択されるモノクローナル抗体、またはＰＤ－１に選択的に結合する、より好ましくは：ペムブロリズマブ、ニボルマブ、セミプリマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、スパルタリズマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、ＩＮＣＭＧＡ０００１２、ＡＭＰ－５１４からなる群より選択されるモノクローナル抗体である。
【0051】
いくらかの実施形態において、組み合わせの免疫チェックポイント阻害剤は、抗体である。本明細書で使用される用語「抗体」は、例えば標的免疫チェックポイントまたはエピトープを結合することができる（例えば、抗原結合部分を保持することができる）、天然に存在する抗体および改変抗体ならびに完全長抗体またはそれらの機能性フラグメントもしくはそれらの類縁体を包含する。本明細書に記載の方法による使用のための抗体は、ヒト、ヒト化、動物またはキメラを含むがこれらに限定されない任意の起源に由来してもよく、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプが好ましいがどのようなアイソタイプであってもよく、さらにグリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。抗体という用語には、抗体が本明細書に記載の結合特異性を示す限り、二重特異性抗体または多重特異性抗体も含まれる。
【0052】
癌
本発明の組換えベクターは、腫瘍細胞内で自律増殖可能である。本発明の一実施形態において、ベクターは、Ｒｂ－経路、具体的にはＲｂ－ｐ１６経路に欠陥がある細胞内で自律増殖可能である。これらの欠陥のある細胞には、動物およびヒトにおけるすべての腫瘍細胞が含まれる。本明細書で使用されるように、「Ｒｂ－経路における欠陥」は、その経路の任意の遺伝子またはタンパク質における突然変異および／または後成的変化を指す。これらの欠陥のため、腫瘍細胞は、Ｅ２Ｆを過剰発現し、したがって、通常、効果的な複製に必要とされるＥ１Ａ ＣＲ２によるＲｂの結合は不要である。さらなる選択性は、Ｒｂ／ｐ１６経路欠損細胞において見られるように、自由なＥ２Ｆの存在下でのみ活性化するＥ２Ｆプロモーターにより媒介される。自由なＥ２Ｆがないと、Ｅ１Ａの転写は生じず、ウイルスは複製しない。Ｅ２Ｆプロモーターの包含は、Ｅ３プロモーターからの導入遺伝子の発現を可能にすることによって、直接的にも間接的にも毒性を引き起こす可能性があるＥ１Ａが正常組織において発現することを防止するために重要である。
本発明の組換えベクターは、腫瘍細胞内で自律増殖可能である。本発明の一実施形態において、ベクターは、Ｒｂ－経路、具体的にはＲｂ－ｐ１６経路に欠陥がある細胞内で自律増殖可能である。これらの欠陥のある細胞には、動物およびヒトにおけるすべての腫瘍細胞が含まれる。本明細書で使用されるように、「Ｒｂ－経路における欠陥」は、その経路の任意の遺伝子またはタンパク質における突然変異および／または後成的変化を指す。これらの欠陥のため、腫瘍細胞は、Ｅ２Ｆを過剰発現し、したがって、通常、効果的な複製に必要とされるＥ１Ａ ＣＲ２によるＲｂの結合は不要である。さらなる選択性は、Ｒｂ／ｐ１６経路欠損細胞において見られるように、自由なＥ２Ｆの存在下でのみ活性化するＥ２Ｆプロモーターにより媒介される。自由なＥ２Ｆがないと、Ｅ１Ａの転写は生じず、ウイルスは複製しない。Ｅ２Ｆプロモーターの包含は、Ｅ３プロモーターからの導入遺伝子の発現を可能にすることによって、直接的にも間接的にも毒性を引き起こす可能性があるＥ１Ａが正常組織において発現することを防止するために重要である。
【0053】
本発明は、対象における癌を処置するためのアプローチに関する。本発明の一実施形態において、対象は、ヒトまたは哺乳動物、具体的には哺乳動物またはヒト患者、より具体的には癌に罹患したヒトまたは哺乳動物である。
【0054】
このアプローチは、悪性腫瘍および良性腫瘍の両方を含む任意の癌または腫瘍を処置するために使用することができ、原発性腫瘍および転移腫瘍は両方ともそのアプローチの標的であり得る。本発明の一実施形態において、癌は、腫瘍浸潤リンパ球を特徴とする。本発明のツールは、腫瘍浸潤リンパ球を特徴とする転移性固形腫瘍の処置にとって特に魅力的である。別の実施形態において、Ｔ細胞移植片は、腫瘍もしくは組織特異的Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体により修飾されている。
【0055】
本明細書で使用されるように、用語「処置」または「処置すること」は、完全な治癒だけでなく、癌または腫瘍に関連する障害または症状の予防、改善、または軽減も含む目的のために、少なくとも腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを対象、好ましくは哺乳動物またはヒト対象に投与することを指す。治療効果は、患者の症状、血液中の腫瘍マーカー、または例えば腫瘍の大きさもしくは患者の生存長をモニターすることにより評価される場合がある。
【0056】
本発明の別の実施形態において、癌または腫瘍は、鼻咽腔癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌（renal cancer）、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、乏突起神経膠腫、神経芽腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド、消化管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、食道癌、胆嚢癌、頭頸部癌、眼癌、腎臓癌（kidney cancer）、ウィルムス腫瘍、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、ホジキン氏病、非ホジキンリンパ腫、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌性膵臓癌、グルカゴノーマ、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌（stomach cancer）、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫瘍、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌（mouth cancer）、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃腺癌からなる群より選択される。好ましくは、処置される癌または腫瘍は、腎臓癌（renal cancer）、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌および扁平上皮非小細胞肺癌など）、胃癌（gastric cancer）、軟部肉腫、古典的ホジキンリンパ腫、中皮腫、および肝臓癌からなる群より選択される。本発明の好ましい実施形態において、処置される癌または腫瘍は、メソテリンネガティブの癌または腫瘍である。
【0057】
ヒトまたは動物の患者を本発明の治療に適したものとして分類する前、臨床医は、患者を診察する場合がある。正常から逸脱し、腫瘍または癌が明らかになった結果に基づいて、臨床医は、患者のために本発明の処置を提案する場合がある。
【0058】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、少なくとも１種の本発明のウイルスベクターを含む。好ましくは、本発明は、（ａ）腫瘍溶解性ウイルスをそのまま、または（ｂ）養子細胞組成物および／もしくは（ｃ）免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて含有する医薬組成物を提供する。本発明はまた、癌の処置における使用のための前記医薬品組み合わせ剤を提供する。さらに、組成物は、少なくとも２つ、３つまたは４つの異なるベクター含んでいてもよい。ベクターおよび養子細胞組成物または免疫チェックポイント阻害剤に加えて、医薬組成物はまた、他の治療効果のある薬剤や、薬学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、アジュバント、添加物、防腐剤、消毒剤、充填剤、安定剤および／もしくは増粘剤などの任意の他の薬剤、ならびに／または対応する製品に通常見られる任意の成分を含んでいてもよい。組成物を配合するための適切な成分および適切な製造方法の選択は、当業者に一般的な知識に属している。
本発明の医薬組成物は、少なくとも１種の本発明のウイルスベクターを含む。好ましくは、本発明は、（ａ）腫瘍溶解性ウイルスをそのまま、または（ｂ）養子細胞組成物および／もしくは（ｃ）免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて含有する医薬組成物を提供する。本発明はまた、癌の処置における使用のための前記医薬品組み合わせ剤を提供する。さらに、組成物は、少なくとも２つ、３つまたは４つの異なるベクター含んでいてもよい。ベクターおよび養子細胞組成物または免疫チェックポイント阻害剤に加えて、医薬組成物はまた、他の治療効果のある薬剤や、薬学的に許容される担体、緩衝液、賦形剤、アジュバント、添加物、防腐剤、消毒剤、充填剤、安定剤および／もしくは増粘剤などの任意の他の薬剤、ならびに／または対応する製品に通常見られる任意の成分を含んでいてもよい。組成物を配合するための適切な成分および適切な製造方法の選択は、当業者に一般的な知識に属している。
【0059】
医薬組成物は、投与に適した固体、半固体または液体の形態などの任意の形態であり得る。製剤は、液剤、乳剤、懸濁剤、錠剤、ペレット剤およびカプセル剤からなる群より選択され得るがこれらに限定されない。本発明の組成物は、ある特定の製剤に限定されず、代わりに、組成物は、任意の既知の薬学的に許容される製剤に配合される可能性がある。医薬組成物は、当技術分野で既知の従来のプロセスのいずれかにより生成され得る。
【0060】
本発明の医薬品キットは、導入遺伝子としてＩＬ－７をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターおよび１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を含む。導入遺伝子としてＩＬ－７をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、第１の製剤に配合され、前記１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤は、第２の製剤に配合される。あるいは、本発明の医薬品キットは、第１の製剤に導入遺伝子としてＩＬ－７をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターを、第２の製剤に養子細胞組成物を含む。本発明の別の実施形態において第１および第２の製剤は、同時にまたは連続して、任意の順序で、対象に投与するためのものである。別の実施形態において、前記キットは、癌または腫瘍の処置で使用するためのものである。
【0061】
投与
本発明のベクターまたは医薬組成物は、任意の哺乳動物対象に投与され得る。本発明の特定の実施形態において、対象はヒトである。哺乳動物は、ペット、家畜および生産動物（production animal）からなる群より選択され得る。
本発明のベクターまたは医薬組成物は、任意の哺乳動物対象に投与され得る。本発明の特定の実施形態において、対象はヒトである。哺乳動物は、ペット、家畜および生産動物（production animal）からなる群より選択され得る。
【0062】
従来の方法はいずれも、ベクターまたは組成物の対象への投与のために使用される場合がある。投与経路は、組成物の配合または形態、疾患、腫瘍の位置、患者、併存疾患および他の因子に応じて決定される。したがって、組み合わせにおける各治療薬の投与量および投与頻度は、一部が、特定の治療薬、処置される癌の重症度、および患者の特徴に応じて決定される。好ましくは、投薬計画は、副作用の許容可能なレベルと一致した患者に送達される各治療薬の量を最大化する。
【0063】
ベクターの有効量は、少なくとも、処置を必要とする対象、腫瘍型ならびに腫瘍の位置および腫瘍のステージに応じて決定される。用量は、例えば、約１×１０８のウイルス粒子（ＶＰ）から約１×１０１４ＶＰ、具体的には、約５×１０９ＶＰから約１×１０１３ＶＰ、より具体的には、約３×１０９ＶＰから約２×１０１２ＶＰで変更され得る。一実施形態において、ＩＬ－７をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターは、１×１０１０～１×１０１４のウイルス粒子の量で投与される。本発明の別の実施形態において、用量は、約５×１０１０～５×１０１１ＶＰの範囲内である。
【0064】
本発明の一実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスの投与は、腫瘍内、動脈内、静脈内、胸膜内、小胞内、腔内、節内もしくは腹腔内注射、または経口投与を通じて実行される。投与のどのような組み合わせも可能である。アプローチは、局所注射にも関わらず、全身効果を与えることができる。
【0065】
本発明の一実施形態において、（ａ）導入遺伝子としてＩＬ－７をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターおよび（ｂ）１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤の対象への個別投与は、同時にまたは連続して、任意の順序で実行される。これは、（ａ）および（ｂ）が、一緒に服用するための単一用量剤形または同時にもしくは一定の時間差で投与される別個の実体（例えば別の容器内で）で提供される場合があることを意味する。この時間差は、１時間から２週間、好ましくは１２時間から３日間、より好ましくは２４時間または４８時間以内であり得る。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターの初回投与は、免疫チェックポイント阻害剤の初回投与の前に実行される。さらに、免疫チェックポイント阻害剤とは別の投与方法でウイルスを投与することが可能である。この点について、ウイルスまたは免疫チェックポイント阻害剤のいずれかを腫瘍内に投与し、他方を全身にまたは経口で投与することが有利である場合がある。特定の好ましい実施形態において、ウイルスは、腫瘍内に投与され、免疫チェックポイント阻害剤は、静脈内に投与される。別の特定の好ましい実施形態において、ウイルスおよびチェックポイント阻害剤は両方とも、静脈内に投与される。好ましくは、ウイルスおよびチェックポイント阻害剤は、別個の化合物として投与される。２つの薬剤を用いる併用治療も可能である。
【0066】
好ましい実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、約０．２ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。
【0067】
本明細書で使用されるように、「個別投与」または「別個」は、（ａ）導入遺伝子としてＩＬ－７をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスベクターおよび（ｂ）１つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤が、２つの異なる製品であるか、互いに異なる組成物である状況を指す。
【0068】
他の処置または処置の組み合わせはいずれも、本発明の治療に加えて使用される場合がある。特定の実施形態において、本発明の方法または使用は、放射線療法、化学療法、血管新生阻害剤またはアルキル化剤、ヌクレオシド類縁体、細胞骨格修飾剤、細胞分裂抑制剤、モノクローナル抗体、キナーゼ阻害剤もしくは他の抗癌剤などの標的療法の同時または連続的な対象への投与または介入（外科手術を含む）をさらに含む。
【0069】
用語「処置する」または「高める」、ならびにそれらの原型化した単語は、本明細書で使用されるように、必ずしも１００％もしくは完全な処置または向上を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果があると認識する程度は様々である。
【0070】
技術の進歩につれて、発明概念が、様々な方法で実行できることは、当業者にとって明らかであろう。本発明およびその実施形態は、上述の例に限定されるものではなく、特許請求の範囲内で変更することができる。
【0071】
実験セクション
材料および方法
細胞株
ヒト癌細胞株Ａ５４９（上皮腺癌）およびＲＤ（横紋筋肉腫）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（マナサス、ＵＳＡ）から購入した。ゴールデンハムスター癌細胞株ＤＤＴ１－ＭＦ２（平滑筋肉腫）は、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｗｏｌｄ博士からご厚意により譲り受けたものであり、ハムスターＨａｐＴ１（膵管腺癌細胞株）は、ライプニッツ研究所（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から取得し、ハムスターＨＴ１００（肺腺癌）は、ジャパン・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソース細胞バンク（大阪、日本）から取得した。細胞株はすべて、推奨条件下で培養した。
材料および方法
細胞株
ヒト癌細胞株Ａ５４９（上皮腺癌）およびＲＤ（横紋筋肉腫）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（マナサス、ＵＳＡ）から購入した。ゴールデンハムスター癌細胞株ＤＤＴ１－ＭＦ２（平滑筋肉腫）は、Ｗｉｌｌｉａｍ Ｗｏｌｄ博士からご厚意により譲り受けたものであり、ハムスターＨａｐＴ１（膵管腺癌細胞株）は、ライプニッツ研究所（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から取得し、ハムスターＨＴ１００（肺腺癌）は、ジャパン・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソース細胞バンク（大阪、日本）から取得した。細胞株はすべて、推奨条件下で培養した。
【0072】
ウイルス構築
Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７ウイルスを、前述の技術（Ｈａｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）により構築した。腫瘍特異的複製は、ウイルス複製に関する腫瘍選択性を決定する２つの修飾：Ｅ２ＦプロモーターおよびＥ１Ａの定常領域における２４塩基対の欠失により達成された。細菌人工染色体（ＢＡＣ）リコンビニアリング戦略を通じて、ｇｐ１９ｋおよび６．７ｋ遺伝子に代わってヒトＩＬ７コード配列をＥ３領域に導入した。得られるウイルスベクター配列を、次世代シーケンシングにより確認した。
Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７ウイルスを、前述の技術（Ｈａｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）により構築した。腫瘍特異的複製は、ウイルス複製に関する腫瘍選択性を決定する２つの修飾：Ｅ２ＦプロモーターおよびＥ１Ａの定常領域における２４塩基対の欠失により達成された。細菌人工染色体（ＢＡＣ）リコンビニアリング戦略を通じて、ｇｐ１９ｋおよび６．７ｋ遺伝子に代わってヒトＩＬ７コード配列をＥ３領域に導入した。得られるウイルスベクター配列を、次世代シーケンシングにより確認した。
【0073】
感染多重度（ＭＯＩ）１でＡ５４９細胞株のトランスフェクションによりウイルス粒子を生成し、続いて塩化セシウムグラジェントにより精製した。Ｌｏｃｋ ａｔ ａｌ．２０１９に記載のプロトコルにしたがってＴＣＩＤ５０アッセイにより、得られるウイルスの感染力および濃度を決定した。
【0074】
細胞生存率アッセイ
ヒト細胞株Ａ５４９およびＲＤを９６ウェルプレート（平底）に１×１０４細胞／ウェルで２４時間、三連で播種し、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４ウイルス（本文中ではバックボーンまたは非武装化（unarmed）バックボーンとも呼ばれる）、またはＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７（本文中ではＩＬ７ウイルス、ＩＬ７武装化（armed）ウイルス、ＩＬ７をコードするウイルスまたはＩＬ７腫瘍溶解性アデノウイルスとも呼ばれる）のいずれかを用いて１、１０、１００もしくは１０００ＶＰ／細胞で感染させた。同様に、ハムスター細胞株ＨＴ１００、ＤＤＴ１－ＭＦ２およびＨａｐＴ１を、１×１０４細胞／ウェルで２４時間、三連で播種し、バックボーンウイルス、もしくはＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７のいずれかを用いて１００、１０００、５０００もしくは１００００ＶＰ／細胞で感染させた。
ヒト細胞株Ａ５４９およびＲＤを９６ウェルプレート（平底）に１×１０４細胞／ウェルで２４時間、三連で播種し、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４ウイルス（本文中ではバックボーンまたは非武装化（unarmed）バックボーンとも呼ばれる）、またはＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ＩＬ７（本文中ではＩＬ７ウイルス、ＩＬ７武装化（armed）ウイルス、ＩＬ７をコードするウイルスまたはＩＬ７腫瘍溶解性アデノウイルスとも呼ばれる）のいずれかを用いて１、１０、１００もしくは１０００ＶＰ／細胞で感染させた。同様に、ハムスター細胞株ＨＴ１００、ＤＤＴ１－ＭＦ２およびＨａｐＴ１を、１×１０４細胞／ウェルで２４時間、三連で播種し、バックボーンウイルス、もしくはＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７のいずれかを用いて１００、１０００、５０００もしくは１００００ＶＰ／細胞で感染させた。
【0075】
４日後（Ａ５４９およびＲＤ）、５日後（ＨＴ１００およびＤＤＴ１－ＭＦ２）または８日後（ＨａｐＴ１）、ウェルを２時間、２０％のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ、ウィスコンシン、ＵＳＡ）とともにインキュベートすることにより、細胞生存率を測定した。Ｆｌｕｏｓｔａｒ ＯＰＴＩＭＡアナライザー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ、オッフェンブルク、ドイツ）を使用して、４９０ｎＭで吸光度を読み取った。データを非感染のモック対照群に対して正規化した。
【0076】
サイトカイン発現および生理活性アッセイ
前述のヒトおよびハムスター細胞株を、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７の１０００ＶＰ／細胞（Ａ５４９およびＲＤ）または１００００ＶＰ／細胞（ＨＴ１００およびＤＤＴ１－ＭＦ２）のいずれかで３日間感染させた。メーカーの説明書にしたがって、ＢＤサイトメトリックビーズアレイヒト可溶性タンパク質マスターバッファーキット（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）をヒトＩＬ７ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）と一緒に使用して細胞上清からヒトＩＬ７を測定した。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターを用いてビーズを検出し、ＦＣＡＰ Ａｒｒａｙソフトウェア（バージョン３．０．１；ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）を用いて結果を分析した。
前述のヒトおよびハムスター細胞株を、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７の１０００ＶＰ／細胞（Ａ５４９およびＲＤ）または１００００ＶＰ／細胞（ＨＴ１００およびＤＤＴ１－ＭＦ２）のいずれかで３日間感染させた。メーカーの説明書にしたがって、ＢＤサイトメトリックビーズアレイヒト可溶性タンパク質マスターバッファーキット（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）をヒトＩＬ７ Ｆｌｅｘ Ｓｅｔ（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）と一緒に使用して細胞上清からヒトＩＬ７を測定した。ＢＤ Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターを用いてビーズを検出し、ＦＣＡＰ Ａｒｒａｙソフトウェア（バージョン３．０．１；ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）を用いて結果を分析した。
【0077】
ウイルスで産生されたヒトＩＬ７に生理活性があったことを確認するため、マウスＩＬ７依存性細胞株２Ｅ８（ＡＴＣＣ、バージニア、ＵＳＡ）を、１０％ＦＢＳ、１％Ｌ－グルタミンおよび１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐが添加されたマッコイ５Ａ培地（サーモフィッシャー、マサチューセッツ、ＵＳＡ）中、２．５×１０５細胞／ｍｌで２４時間、三連で培養した。Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７で感染させたＡ５４９細胞由来の濾過済み上清を、１：１、１：４、１：１６、１：６４および１：２５６の希釈で添加し、５日間インキュベートしてから、上述したように２０％のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔを使用して生存率アッセイを行った。陽性対照として、組換えマウスおよびヒトＩＬ７を２０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。
【0078】
動物実験
Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７の有効性を、アデノウイルス複製について半許容（semi-permissive）のモデルである免疫正常（immunocompetent）ゴールデンハムスターを使用して、インビボでテストした。５週齢のオスシリアンゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）（Ｅｎｖｉｇｏ、インディアナ、ＵＳＡ）の下背部右脇腹に、２×１０６のＨａｐＴ１細胞を皮下移植した。腫瘍が直径５～６ｍｍに到達した後、動物を無作為化し、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４またはＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７のいずれかを用いて１×１０９ＶＰで腫瘍内処置した。対照動物は、ＰＢＳの腫瘍内注射を受けた。腫瘍をデジタルノギスで測定し、腫瘍体積を（長さ×幅２）／２として算出した。６４日目に安楽死させる前に、ハムスターは全１２ラウンドのウイルス処置を受け、その後の分析のためにそれらの腫瘍および臓器を回収した。あるいは、最大許容腫瘍体積（２２．０ｍｍ）に到達し、腫瘍が潰瘍になったときはすぐに、または動物の福祉が損なわれたときはすぐに、動物を安楽死させた。
Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７の有効性を、アデノウイルス複製について半許容（semi-permissive）のモデルである免疫正常（immunocompetent）ゴールデンハムスターを使用して、インビボでテストした。５週齢のオスシリアンゴールデンハムスター（Mesocricetus auratus）（Ｅｎｖｉｇｏ、インディアナ、ＵＳＡ）の下背部右脇腹に、２×１０６のＨａｐＴ１細胞を皮下移植した。腫瘍が直径５～６ｍｍに到達した後、動物を無作為化し、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４またはＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７のいずれかを用いて１×１０９ＶＰで腫瘍内処置した。対照動物は、ＰＢＳの腫瘍内注射を受けた。腫瘍をデジタルノギスで測定し、腫瘍体積を（長さ×幅２）／２として算出した。６４日目に安楽死させる前に、ハムスターは全１２ラウンドのウイルス処置を受け、その後の分析のためにそれらの腫瘍および臓器を回収した。あるいは、最大許容腫瘍体積（２２．０ｍｍ）に到達し、腫瘍が潰瘍になったときはすぐに、または動物の福祉が損なわれたときはすぐに、動物を安楽死させた。
【0079】
遺伝子発現アッセイ
動物腫瘍試料の断片を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（シグマアルドリッチ、ミズーリ、ＵＳＡ）に保存し、さらなる使用まで－２０℃で保管した。メーカーの説明書にしたがってＲＮｅａｓｙ抽出キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用して、試料からのＲＮＡを単離し、Ｑｕｂｉｔ４蛍光光度計（サーモフィッシャー、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を使用してＲＮＡ濃度を測定した。精製済み全ＲＮＡ２５０ｎｇを使用して、メーカーの説明書にしたがってＨｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（サーモフィッシャー、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られるｃＤＮＡを定量的リアルタイムＰＣＲに使用した。以下のプライマーおよびプローブ：グランザイムＢ（フォワードプライマー５’－ＣＡＣＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡ－３’（配列番号２）、リバースプライマー５’－ＴＧＧＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＴＡＧＴＣ－３’（配列番号３）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＧＣ－ＢＢＱ－３’）（配列番号４）、パーフォリン（フォワードプライマー５’－ＴＧＡＧＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＡＡＡＴＣＧ－３’（配列番号５）、リバースプライマー５’－ＴＧＴＣＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＴＴＴＣＧ－３’（配列番号６）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＡＣ－ＢＢＱ－３’）（配列番号７）、ＣＤ２５（フォワードプライマー５’－ＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧ－３’（配列番号８）、リバースプライマー５’－ＧＴＡＴＡＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＴＡＧＣＴＧＣ－３’（配列番号９）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＴＣ－ＢＢＱ－３’）（配列番号１０）、ＣＤ１３７（フォワードプライマー５’－ＡＧＴＧＣＡＴＣＧＡＧＧＧＡＣＴＣＣ－３’（配列番号１１）、リバースプライマー５’－ＣＡＧＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧ－３’（配列番号１２）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＣＴＣＴＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＴＧＣＡＡＴＣＣ－ＢＢＱ－３’）（配列番号１３）、インターフェロンガンマ（フォワードプライマー５’－ＧＡＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＧＣＴＧＧ－３’（配列番号１４）、リバースプライマー５’－ＣＣＴＴＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴ－３’（配列番号１５）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＣＡＴＴＧＡＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＴ－ＢＢＱ－３’）（配列番号１６）、Ｋｉ６７（フォワードプライマー５’－ＧＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＧＴＡＴＧＡＡＡＡＣＧ－３’（配列番号１７）、リバースプライマー５’－ＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴ－３’（配列番号１８）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＡＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧ－ＢＢＱ－３’）（配列番号１９）、ＰＤ１（フォワードプライマー５’－ＧＴＧＴＣＣＴＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＣＣ－３’（配列番号２０）、リバースプライマー５’－ＧＣＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＧＣＴ－３’（配列番号２１）、プローブ５’－ＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡ－ＢＢＱ－３’）（配列番号２２）を使用して、遺伝子発現レベルを測定した。結果を、ハムスターガンマアクチンハウスキーピング遺伝子ｃＤＮＡの含有量に対して、およびモックに対して正規化した（ΔΔＣｔ）。すべてのＰＣＲ反応を二連で実行した。
動物腫瘍試料の断片を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（シグマアルドリッチ、ミズーリ、ＵＳＡ）に保存し、さらなる使用まで－２０℃で保管した。メーカーの説明書にしたがってＲＮｅａｓｙ抽出キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用して、試料からのＲＮＡを単離し、Ｑｕｂｉｔ４蛍光光度計（サーモフィッシャー、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を使用してＲＮＡ濃度を測定した。精製済み全ＲＮＡ２５０ｎｇを使用して、メーカーの説明書にしたがってＨｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｋｉｔ（サーモフィッシャー、マサチューセッツ、ＵＳＡ）を用いてｃＤＮＡを合成した。得られるｃＤＮＡを定量的リアルタイムＰＣＲに使用した。以下のプライマーおよびプローブ：グランザイムＢ（フォワードプライマー５’－ＣＡＣＴＧＴＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡ－３’（配列番号２）、リバースプライマー５’－ＴＧＧＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＧＧＧＡＴＴＡＴＡＧＴＣ－３’（配列番号３）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＣＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＡＴＧＴＴＧＴＧＧＧＣ－ＢＢＱ－３’）（配列番号４）、パーフォリン（フォワードプライマー５’－ＴＧＡＧＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＡＡＡＴＣＧ－３’（配列番号５）、リバースプライマー５’－ＴＧＴＣＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＴＴＴＴＣＧ－３’（配列番号６）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＣＴＧＧＴＡＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＣＡＣ－ＢＢＱ－３’）（配列番号７）、ＣＤ２５（フォワードプライマー５’－ＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧ－３’（配列番号８）、リバースプライマー５’－ＧＴＡＴＡＡＡＴＧＴＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＴＡＧＣＴＧＣ－３’（配列番号９）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＴＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＴＣ－ＢＢＱ－３’）（配列番号１０）、ＣＤ１３７（フォワードプライマー５’－ＡＧＴＧＣＡＴＣＧＡＧＧＧＡＣＴＣＣ－３’（配列番号１１）、リバースプライマー５’－ＣＡＧＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＣＣＴＧＣＴＣＴＧ－３’（配列番号１２）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＣＴＣＴＴＧＡＣＣＣＧＧＣＴＴＧＣＡＡＴＣＣ－ＢＢＱ－３’）（配列番号１３）、インターフェロンガンマ（フォワードプライマー５’－ＧＡＡＣＴＧＧＣＡＡＡＡＧＧＣＴＧＧ－３’（配列番号１４）、リバースプライマー５’－ＣＣＴＴＣＡＡＧＧＣＴＴＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴ－３’（配列番号１５）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＣＡＴＴＧＡＧＡＧＣＣＡＧＡＴＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＴ－ＢＢＱ－３’）（配列番号１６）、Ｋｉ６７（フォワードプライマー５’－ＧＡＣＣＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＧＴＡＴＧＡＡＡＡＣＧ－３’（配列番号１７）、リバースプライマー５’－ＧＴＧＧＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＴ－３’（配列番号１８）、プローブ５’－Ｆａｍ－ＡＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧ－ＢＢＱ－３’）（配列番号１９）、ＰＤ１（フォワードプライマー５’－ＧＴＧＴＣＣＴＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＣＣ－３’（配列番号２０）、リバースプライマー５’－ＧＣＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＧＣＴ－３’（配列番号２１）、プローブ５’－ＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＧＴＣＣＴＡ－ＢＢＱ－３’）（配列番号２２）を使用して、遺伝子発現レベルを測定した。結果を、ハムスターガンマアクチンハウスキーピング遺伝子ｃＤＮＡの含有量に対して、およびモックに対して正規化した（ΔΔＣｔ）。すべてのＰＣＲ反応を二連で実行した。
【0080】
患者試料処理およびエクスビボ腫瘍培養の確立
我々のグループであらかじめ検証済みのプロトコルを使用して、新鮮な単細胞腫瘍分解物を腫瘍から調製した。要約すると、腫瘍を小さい断片に切り刻み、一晩の酵素消化のために、＋３７℃で振盪しながら、１％Ｌ－グルタミン、１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉ型コラゲナーゼ（１７０ｍｇ／Ｌ）、ＩＶ型コラゲナーゼ（１７０ｍｇ／Ｌ）、ＤＮａｓｅ Ｉ（２５ｍｇ／ｍＬ）およびエラスターゼ（２５ｍｇ／ｍＬ）（すべての酵素はワージントン・バイオケミカルから）が添加されたＲＰＭＩ１６４０を含有する５０ｍＬ容ファルコンチューブに入れた。消化後、７０μｍフィルターに通して細胞懸濁液を濾過し、消化されなかった断片および赤血球の除去のために、ＡＣＫ溶解バッファー（シグマアルドリッチ、ミズーリ、ＵＳＡ）で処理した。得られる単細胞懸濁液を使用して、３×１０５個の細胞を三連で９６ウェルプレート（Ｕ底）に播種し、それらをＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４またはＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７のいずれかの１００ＶＰ／細胞で処置することにより、エクスビボ腫瘍培養を確立した；非感染細胞をモック対照として使用した。さらにフローサイトメトリーに使用される細胞を、３日目に９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシドを含有する凍結保存培地に回収し、さらに使用するまで－１４０℃以下で保管した。
我々のグループであらかじめ検証済みのプロトコルを使用して、新鮮な単細胞腫瘍分解物を腫瘍から調製した。要約すると、腫瘍を小さい断片に切り刻み、一晩の酵素消化のために、＋３７℃で振盪しながら、１％Ｌ－グルタミン、１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉ型コラゲナーゼ（１７０ｍｇ／Ｌ）、ＩＶ型コラゲナーゼ（１７０ｍｇ／Ｌ）、ＤＮａｓｅ Ｉ（２５ｍｇ／ｍＬ）およびエラスターゼ（２５ｍｇ／ｍＬ）（すべての酵素はワージントン・バイオケミカルから）が添加されたＲＰＭＩ１６４０を含有する５０ｍＬ容ファルコンチューブに入れた。消化後、７０μｍフィルターに通して細胞懸濁液を濾過し、消化されなかった断片および赤血球の除去のために、ＡＣＫ溶解バッファー（シグマアルドリッチ、ミズーリ、ＵＳＡ）で処理した。得られる単細胞懸濁液を使用して、３×１０５個の細胞を三連で９６ウェルプレート（Ｕ底）に播種し、それらをＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４またはＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７のいずれかの１００ＶＰ／細胞で処置することにより、エクスビボ腫瘍培養を確立した；非感染細胞をモック対照として使用した。さらにフローサイトメトリーに使用される細胞を、３日目に９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および１０％ジメチルスルホキシドを含有する凍結保存培地に回収し、さらに使用するまで－１４０℃以下で保管した。
【0081】
細胞傷害性およびウイルス複製アッセイ
エクスビボ腫瘍培養の細胞生存率を、上述のように測定した。簡潔に言うと、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔを用いて２時間インキュベートすることにより、３日目、５日目および７日目に細胞生存率を測定した。非感染の対照群に対してデータを正規化した。
エクスビボ腫瘍培養の細胞生存率を、上述のように測定した。簡潔に言うと、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔを用いて２時間インキュベートすることにより、３日目、５日目および７日目に細胞生存率を測定した。非感染の対照群に対してデータを正規化した。
【0082】
エクスビボ腫瘍培養におけるウイルス複製を測定するため、ウイルス感染後１日目、２日目および３日目に、リン酸緩衝生理食塩水に細胞を回収し、メーカーの説明書にしたがって、ＱＩＡｍｐ ＤＮＡミニキット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いてＤＮＡを抽出した。フォワードプライマー（５’－ＧＧＡＧＴＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣ－３’）（配列番号２３）、リバースプライマー（５’－ＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＴＣＣＡＴ－３’）（配列番号２４）およびプローブ（Ｆａｍ－ＴＧＧＣＡＴＧＡＣＡＣＴＡＣＧＡＣＣＡＡＣＡＣＧＡＴＣＴ－Ｔａｍ）（配列番号２５）を使用する、Ｅ４領域を標的化する定量的リアルタイムＰＣＲによりウイルスの存在を確認した。既知の濃度のウイルスをコードするプラスミドを使用して生成された標準曲線にしたがって、Ｅ１Ａの定量化を算出した。結果を、ヒトベータ－アクチンハウスキーピング遺伝子ＤＮＡの含有量に対して正規化した。すべてのＰＣＲ反応を二連で実行した。
【0083】
ケモカインおよびサイトカイン分析
感染エクスビボ腫瘍培養由来の上清を、３日目に回収し、Ｃ－Ｃモチーフリガンド２（Ｃｃｌ２）、Ｃ－Ｃモチーフリガンド５（Ｃｃｌ５）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（Ｃｘｃｌ１０）、インターロイキン２（ＩＬ２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）、ＩＦＮｇ、インターフェロン１ベータ（ＩＦＮ１ｂ）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１０（ＩＬ１０）およびトランスフォーミング増殖因子ベータ－１（ＴＧＦ－ｂ１）の存在を、メーカーの説明書にしたがって、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘパネル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）を使用して測定した。
感染エクスビボ腫瘍培養由来の上清を、３日目に回収し、Ｃ－Ｃモチーフリガンド２（Ｃｃｌ２）、Ｃ－Ｃモチーフリガンド５（Ｃｃｌ５）、Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１０（Ｃｘｃｌ１０）、インターロイキン２（ＩＬ２）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）、ＩＦＮｇ、インターフェロン１ベータ（ＩＦＮ１ｂ）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン１０（ＩＬ１０）およびトランスフォーミング増殖因子ベータ－１（ＴＧＦ－ｂ１）の存在を、メーカーの説明書にしたがって、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘパネル（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）を使用して測定した。
【0084】
Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン９（Ｃｘｃｌ９；ＭＩＧとしても既知）および上清中のＩＬ７のレバルを、それぞれヒトＭＩＧおよびＩＬ７ ｆｌｅｘセット（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）を通じて測定した。Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６フローサイトメーターを使用して試料を三連で測定し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘデータ解析ソフトウェアスイート（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）またはＦＣＡＰ Ａｒｒａｙソフトウェアのいずれかを通じて分析した。各検体の濃度を、Ｑｕｂｉｔ４蛍光光度計（サーモフィッシャー、マサチューセッツ、ＵＳＡ）により測定された総タンパク質含有量に対して正規化した。その後、このデータを、非感染の対照群に対して正規化した。
【0085】
フローサイトメトリー
購入したヒトＣＤ３（クローンＳＫ７、蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）、ＣＤ４（クローンＲＰＡ－Ｔ４、蛍光色素Ｖ５００、ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）、ＣＤ８（クローンＲＰＡ－Ｔ８、蛍光色素ＦＩＴＣ、ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）、ＣＤ６９（クローンＦＮ５０、蛍光色素ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）、ＣＤ１２７（クローンＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１、蛍光色素ＰＥ－ＣＦ５９４、ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）、グランザイムＢ（クローンＧＢ１１、蛍光色素ＢＶ４２１、ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）、パーフォリン（Perforine）（クローンＢ－Ｄ４８、蛍光色素ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）、ＣＤ１０７ａ（クローンＨ４Ａ３、蛍光色素ＡＰＣ／Ｃｙａｎｉｎｅ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）に特異的な抗体を使用して、エクスビボ腫瘍培養由来の免疫細胞集団の分析を実行した。メーカーの説明書にしたがってＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓキット（ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇとともに）（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）を使用して細胞内染色を実行した。試料はすべて、Ｆｃブロッキング後に、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ受容体ブロッキング溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）を使用して染色された。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩセルソーター（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）を使用して、試料を二連で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ、ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）を使用して、データ解析を実行した。
購入したヒトＣＤ３（クローンＳＫ７、蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）、ＣＤ４（クローンＲＰＡ－Ｔ４、蛍光色素Ｖ５００、ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）、ＣＤ８（クローンＲＰＡ－Ｔ８、蛍光色素ＦＩＴＣ、ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）、ＣＤ６９（クローンＦＮ５０、蛍光色素ＰＥ／Ｃｙａｎｉｎｅ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）、ＣＤ１２７（クローンＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１、蛍光色素ＰＥ－ＣＦ５９４、ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）、グランザイムＢ（クローンＧＢ１１、蛍光色素ＢＶ４２１、ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）、パーフォリン（Perforine）（クローンＢ－Ｄ４８、蛍光色素ＰｅｒＣＰ／Ｃｙａｎｉｎｅ５．５、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）、ＣＤ１０７ａ（クローンＨ４Ａ３、蛍光色素ＡＰＣ／Ｃｙａｎｉｎｅ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）に特異的な抗体を使用して、エクスビボ腫瘍培養由来の免疫細胞集団の分析を実行した。メーカーの説明書にしたがってＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｐｌｕｓキット（ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇとともに）（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）を使用して細胞内染色を実行した。試料はすべて、Ｆｃブロッキング後に、ヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ受容体ブロッキング溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カリフォルニア、ＵＳＡ）を使用して染色された。ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩセルソーター（ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）を使用して、試料を二連で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ１０（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ、ＢＤバイオサイエンス、ニュージャージー、ＵＳＡ）を使用して、データ解析を実行した。
【0086】
統計解析
データの統計解析およびグラフ表示のために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．８．４．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用した。シャピロ－ウィルク検定を使用して腫瘍進行データの正規性を実行し、等分散性については、ルビーン検定を使用した。これらの検定によれば、データは非正規であり、群間分散は異なっており、そのためノンパラメトリックなフリードマン検定を使用して多群の比較を行い、ダン検定を使用して、一対比較を実行した。対応のないｔ検定を使用して、インビトロ実験における群を比較した。結果は、ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意であるとみなされた。
データの統計解析およびグラフ表示のために、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ．８．４．２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用した。シャピロ－ウィルク検定を使用して腫瘍進行データの正規性を実行し、等分散性については、ルビーン検定を使用した。これらの検定によれば、データは非正規であり、群間分散は異なっており、そのためノンパラメトリックなフリードマン検定を使用して多群の比較を行い、ダン検定を使用して、一対比較を実行した。対応のないｔ検定を使用して、インビトロ実験における群を比較した。結果は、ｐ＜０．０５の場合、統計的に有意であるとみなされた。
【0087】
実施例１．ヒトＩＬ７で武装化（armed）された腫瘍溶解性アデノウイルスは、導入遺伝子を癌細胞に送達し、多数の癌細胞株の生存率を低下させることができる
これまで、我々は、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４ウイルスが、いくつかの癌細胞株に浸透し、複製する能力を示していた（Ｈａｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）。ヒトＩＬ７をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスは、ファイバーノブを血清型３から運ぶアデノウイルス血清型５と同じバックボーンを利用し、Ｅ１Ａ遺伝子の定常領域２における２４－ｂｐの欠失（ｄ２４）およびＥ１Ａ領域の上流での腫瘍特異的Ｅ２Ｆプロモーターの挿入を有する。ヒトＩＬ７遺伝子は、部分的に欠失したＥ３遺伝子領域に導入され、導入遺伝子発現をウイルス複製に関連づけた（図１Ａ）。
これまで、我々は、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４ウイルスが、いくつかの癌細胞株に浸透し、複製する能力を示していた（Ｈａｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）。ヒトＩＬ７をコードする腫瘍溶解性アデノウイルスは、ファイバーノブを血清型３から運ぶアデノウイルス血清型５と同じバックボーンを利用し、Ｅ１Ａ遺伝子の定常領域２における２４－ｂｐの欠失（ｄ２４）およびＥ１Ａ領域の上流での腫瘍特異的Ｅ２Ｆプロモーターの挿入を有する。ヒトＩＬ７遺伝子は、部分的に欠失したＥ３遺伝子領域に導入され、導入遺伝子発現をウイルス複製に関連づけた（図１Ａ）。
【0088】
Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７が癌細胞に感染して溶解する能力を、いくつかのヒトおよびハムスター細胞株を使用してインビトロで評価した。ヒト肺および横紋筋肉腫の癌細胞株（それぞれＡ５４９およびＲＤ）、ならびにハムスター平滑筋肉腫、肺および膵臓癌の細胞株（それぞれＤＤＴ１－ＭＦ２、ＨＴ１００およびＨａｐＴ１）を、様々な濃度のＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７で感染させた;非感染細胞および前述の（Ｈａｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）非武装化（unarmed）Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４ウイルスで感染させた細胞を対照として使用した。したがって、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７ウイルスの溶解効果は、非武装化（unarmed）ウイルスに匹敵していた（図１Ｂおよび図１Ｃ）。これらの結果は、ＩＬ７導入遺伝子の存在が、ウイルス腫瘍溶解性の特徴に影響しないことを示す。
【0089】
ウイルスが癌細胞で導入遺伝子発現量を誘導する能力を評価するため、後者をＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７で感染させ、ＩＬ７タンパク質量の存在について上清を分析した。興味深いことに、ヒト細胞株は、より高いＩＬ７の濃度を示し、Ａ５４９により産生された１７．５ｐｇ／ｍｌが最大量であった（図１Ｄ）。ハムスター細胞株ＨＴ１００は、最も低いタンパク質量（０．４ｐｇ／ｍｌ）であったが、ＤＤＴ１－ＭＦ２およびＲＤ細胞株は、同等の生産性であった（図１Ｄ）。
【0090】
次に、ウイルスにより産生されたヒトＩＬ７の生理活性を評価した。これを行うため、ＩＬ７依存性マウス細胞株２Ｅ８を、Ａ５４９上清のいくつかの希釈とインキュベートし、その後、ＭＴＳ細胞増殖測定を行った。対照群と比較して１：４希釈でより良好な結果として、用量依存的な細胞増殖が観察された（図１Ｅ）。
【0091】
全体では、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７が、癌細胞を死滅させ、生理活性のあるＩＬ７の発現を後者で誘導することができることが確認された。
【0092】
実施例２．ＩＬ７腫瘍溶解性アデノウイルスは、膵臓癌のハムスターモデルにおいて腫瘍退縮を促進する
インビボでのＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７の有効性を、免疫正常（immunocompetent）ゴールデンハムスター、アデノウイルス複製に対して半許容（semi-permissive）の前臨床モデルでテストした。膵臓癌細胞株ＨａｐＴ１を皮下移植して、異所性腫瘍形成およびその後の腫瘍内ウイルス注入を可能にした。処置開始の３０日後、モック対照群のハムスターは、ウイルス処置動物と比較した場合、腫瘍が有意に大きかった。バックボーンおよびＩＬ７コーディングウイルス処置群は両方とも、腫瘍体積の減少の傾向を示したが、ＩＬ７コーディングウイルス処置動物は、モックおよびＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４処置動物よりも有意に小さい腫瘍が見られた（それぞれｐ値が０．００１３および０．０１５５）（図２Ａ）。
インビボでのＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７の有効性を、免疫正常（immunocompetent）ゴールデンハムスター、アデノウイルス複製に対して半許容（semi-permissive）の前臨床モデルでテストした。膵臓癌細胞株ＨａｐＴ１を皮下移植して、異所性腫瘍形成およびその後の腫瘍内ウイルス注入を可能にした。処置開始の３０日後、モック対照群のハムスターは、ウイルス処置動物と比較した場合、腫瘍が有意に大きかった。バックボーンおよびＩＬ７コーディングウイルス処置群は両方とも、腫瘍体積の減少の傾向を示したが、ＩＬ７コーディングウイルス処置動物は、モックおよびＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４処置動物よりも有意に小さい腫瘍が見られた（それぞれｐ値が０．００１３および０．０１５５）（図２Ａ）。
【0093】
ＩＬ７武装化（armed）アデノウイルスの免疫学的作用機序の良好な理解をさらに詳細に得るために、６４日目に動物から回収した腫瘍内のいくつかの免疫関連遺伝子の発現量を測定した。含まれているウイルス処置群の両方で、標準的なＴ細胞活性化マーカーであるＣＤ２５、ＣＤ１３７、Ｋｉ６７およびＰＤ１のかなりのアップレギュレーションが観察された（図２Ｂ）。ＩＦＮｇおよびパーフォリンの発現量はまた、ウイルス群で実質的に高く、腫瘍微小環境で免疫細胞の細胞傷害性を高めることを潜在的に示唆した。Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４処置群は、ほとんどの分析されたサイトカインの量がより高いことを示した。全群にわたり、グランザイムＢの量では、大きな差異は観察されなかった（図２Ｂ）。
【0094】
結論として、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７ウイルス処置により効果的なインビボ腫瘍退縮がもたらされ、主要な免疫刺激因子の活性化を可能にすることが示された。
【0095】
実施例３．ＩＬ７で武装化（armed）された腫瘍溶解性アデノウイルスは、患者由来のエクスビボ腫瘍モデルに感染し、複製する。
ＩＬ７で武装化（armed）された腫瘍溶解性アデノウイルスの作用機序をさらに調べるため、より臨床的に関連性が高いエクスビボ腫瘍モデルに移行した。予想通り、細胞生存率試験は、卵巣癌（ＨＵＳＯＶ４およびＯｖＣａＳ）の場合、バックボーンおよびＩＬ－７をコードするウイルスの両方について匹敵する溶解能力を示した：インキュベーションの３日後、生存率は、７０～８０％まで低下し、７日目まで低下し続けた（図３Ａ）。生存率の低下はまた、バックボーンおよびＩＬ７をコードするウイルスでのウイルス感染後７日目に、頭頸部試料（ＨＵＳＨＮ１１）で観察された（図３Ａ）。
ＩＬ７で武装化（armed）された腫瘍溶解性アデノウイルスの作用機序をさらに調べるため、より臨床的に関連性が高いエクスビボ腫瘍モデルに移行した。予想通り、細胞生存率試験は、卵巣癌（ＨＵＳＯＶ４およびＯｖＣａＳ）の場合、バックボーンおよびＩＬ－７をコードするウイルスの両方について匹敵する溶解能力を示した：インキュベーションの３日後、生存率は、７０～８０％まで低下し、７日目まで低下し続けた（図３Ａ）。生存率の低下はまた、バックボーンおよびＩＬ７をコードするウイルスでのウイルス感染後７日目に、頭頸部試料（ＨＵＳＨＮ１１）で観察された（図３Ａ）。
【0096】
次に、アデノウイルスＥ４遺伝子を標的化する定量的リアルタイムＰＣＲを通じてエクスビボ腫瘍試料でのウイルスコピー数を評価した。全体では、ウイルスの量は、テストされた全試料にわたってバックボーンおよびＩＬ－７をコードするウイルスでは同程度であり、全体的にウイルスのゲノムコピーが経時的に増加する傾向があった（図３Ｂ）。しかし、試料癌種間でウイルスコピー総数において明らかな差異があった。ＯｖＣａＳおよびＨＵＳＨＮ１０試料は、ウイルスＤＮＡ量が最も高かったが、ＨＵＳＨＮ１１では、１００倍低かった。ＨＵＳＯＶ４は、中程度のウイルスコピー数を示した（図３Ｂ）。
【0097】
最後に、上清中のヒトＩＬ７濃度を測定した。テストされた全試料において、１日目から３日目にＩＬ７濃度の増加が見られたが、予想通り、タンパク質の量は、試料間で異なっていた。ＨＵＳＯＶ４およびＨＨＵＳＨＮ１５試料は、ＩＬ７の量がより高く、それぞれ全ＩＬ７タンパク質の０．６５ｐｇ／ｕｇおよび０．５７ｐｇ／ｕｇに達するが、ＯｖＣａＳおよびＨＵＳＨＮ１７試料におけるＩＬ７濃度は、３倍低かった（図３Ｃ）。
【0098】
全体では、このデータは、試料間で差異があるにも関わらず、ＩＬ７腫瘍溶解性アデノウイルスが患者由来の腫瘍分解物に感染し、複製し、癌細胞を溶解する能力を示す。
【0099】
実施例４．ＩＬ７で武装化（armed）された腫瘍溶解性アデノウイルスは、局所腫瘍微小環境を免疫促進に変換する
感染した患者由来のエクスビボ卵巣癌試料の免疫状態を評価するために、主要な免疫シグナル伝達分子－ケモカインおよびサイトカインの濃度を測定した。最初に、炎症性サイトカイン：ＩＬ２、ＴＮＦａ、ＩＦＮｇおよびＩＬ１ｂの量を比較した。テストされた全試料は、ＩＬ７をコードするウイルス群で感染させた場合、非感染の細胞およびバックボーンウイルス群と比較して、ＩＦＮｇの有意な増加を示した。ＩＬ７をコードするウイルスで感染させた場合、ＯｖＣａＳおよびＨＵＳＯＶ５試料はまた、ＩＬ２のより高い発現を示したが、ＨＵＳＯＶ４は、異なる実験群間で顕著なサイトカイン変化を示さなかった。さらに、ＯｖＣａＳ試料は、任意の他の処置群よりもＩＬ７をコードするウイルス群でＴＮＦａの顕著に高い濃度が見られた。興味深いことに、テストされた全試料でＩＬ１ｂの量において変化は観察されなかった（図４Ａ）。全体では、ＯｖＣａＳおよびＨＵＳＯＶ５でプールされた炎症性サイトカインの量は、他の群と比較してＩＬ７ウイルス処置群で顕著に高かった（図４Ｂ）。
感染した患者由来のエクスビボ卵巣癌試料の免疫状態を評価するために、主要な免疫シグナル伝達分子－ケモカインおよびサイトカインの濃度を測定した。最初に、炎症性サイトカイン：ＩＬ２、ＴＮＦａ、ＩＦＮｇおよびＩＬ１ｂの量を比較した。テストされた全試料は、ＩＬ７をコードするウイルス群で感染させた場合、非感染の細胞およびバックボーンウイルス群と比較して、ＩＦＮｇの有意な増加を示した。ＩＬ７をコードするウイルスで感染させた場合、ＯｖＣａＳおよびＨＵＳＯＶ５試料はまた、ＩＬ２のより高い発現を示したが、ＨＵＳＯＶ４は、異なる実験群間で顕著なサイトカイン変化を示さなかった。さらに、ＯｖＣａＳ試料は、任意の他の処置群よりもＩＬ７をコードするウイルス群でＴＮＦａの顕著に高い濃度が見られた。興味深いことに、テストされた全試料でＩＬ１ｂの量において変化は観察されなかった（図４Ａ）。全体では、ＯｖＣａＳおよびＨＵＳＯＶ５でプールされた炎症性サイトカインの量は、他の群と比較してＩＬ７ウイルス処置群で顕著に高かった（図４Ｂ）。
【0100】
次に、抗炎症性サイトカイン：ＩＬ４、ＩＬ６、ＩＬ１０およびＴＧＦｂの量を測定した。全体では、サイトカイン量の有意な増加は、非感染の細胞と比較してウイルス処置群で観察されなかった（図４Ｃ）。ＨＵＳＯＶ４は、ＩＬ４、ＩＬ６およびＩＬ１０濃度における顕著な減少を示したが、ＯｖＣａＳおよびＨＵＳＯＶ５は、ＩＬ７をコードするウイルスでの感染でＴＧＦｂの量が低下した。プールされた抗炎症性サイトカインの量は、ＩＬ７をコードするウイルスで感染させた培養において３つの試料のうち２つ（ＯｖＣａＳおよびＨＵＳＯＶ５）で減少した。減少は、ＯｖＣａＳ試料においてバックボーンウイルスとＩＬ７をコードするウイルスとの間で統計的に有意であった（図４Ｄ）。
【0101】
最後に、エクスビボ感染試料におけるケモカイン：Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ５、Ｃｘｃｌ９、Ｃｘｃｌ１０の量を測定した。特に、ウイルス処置試料は、Ｃｃｌ５およびＣｘｃｌ１０産生で顕著な増加を示し、ＩＬ７をコードするウイルスは、バックボーンよりも有意に高い産生をもたらした（図４Ｅ）。ＨＵＳＯＶ４試料は、群間でケモカイン濃度における任意の他の変化を示さなかったが、ＯｖＣａＳ試料は、ＩＬ７をコードするウイルスで処置した場合、Ｃｃｌ２およびＣｘｃｌ９のアップレギュレーションを示した。ＨＵＳＯＶ５試料は、ＩＬ７をコードするウイルスでの感染でＣｃｌ５、Ｃｘｃｌ９およびＣｘｃｌ１０の顕著なアップレギュレーションを示した。
【0102】
重要なことに、ＩＬ－７をコードするウイルスは、テストされたほとんどの卵巣癌患者試料で、抗炎症性のものよりも炎症性サイトカインの最も高い蔓延を誘導した（図４Ｆ）。全体では、これらのデータは、腫瘍微小環境を炎症誘発性に変換するためにＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７がシグナル伝達分子の産生を誘導する能力を示し、これは、Ｔ細胞の腫瘍への動員に特に有用である。
【0103】
実施例５．ＩＬ７で武装化（armed）された腫瘍溶解性アデノウイルスは、浸潤ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する
腫瘍浸潤リンパ球に対するＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７の影響を評価するため、フローサイトメトリーを通じて別個に、腫瘍溶解性アデノウイルスで処置したＨＵＳＯＶ４およびＯｖＣａＳエクスビボ腫瘍培養からのＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞に対する活性化および細胞傷害性のマーカーの発現量を最初に検証した。ＩＬ７をコードするウイルスでの感染で、ＨＵＳＯＶ４培養は、他の群と比較してＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ６９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の量における有意な増加を示した（図５Ａ）が、ＣＤ８＋細胞はまた、それらの表面上でＣＤ６９＋受容体の発現が高かった（図５Ｂ）。ＩＬ７をコードするウイルスで感染させたＯｖＣａＳ培養で同様のシナリオが観察され、非感染の培養と比較してＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増加が観察されたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞では有意な変化は検出されなかった（図５Ａ）。
腫瘍浸潤リンパ球に対するＡｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７の影響を評価するため、フローサイトメトリーを通じて別個に、腫瘍溶解性アデノウイルスで処置したＨＵＳＯＶ４およびＯｖＣａＳエクスビボ腫瘍培養からのＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞に対する活性化および細胞傷害性のマーカーの発現量を最初に検証した。ＩＬ７をコードするウイルスでの感染で、ＨＵＳＯＶ４培養は、他の群と比較してＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ６９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の量における有意な増加を示した（図５Ａ）が、ＣＤ８＋細胞はまた、それらの表面上でＣＤ６９＋受容体の発現が高かった（図５Ｂ）。ＩＬ７をコードするウイルスで感染させたＯｖＣａＳ培養で同様のシナリオが観察され、非感染の培養と比較してＣＤ６９＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増加が観察されたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞では有意な変化は検出されなかった（図５Ａ）。
【0104】
さらに、２つの強力な細胞溶解剤であるパーフォリン（Ｐｅｒｆ）およびグランザイムＢ（ＧｒｚｍＢ）を発現する細胞傷害性Ｔ細胞の数における変化を評価した。ＩＬ７をコードするウイルスで処置されたＨＵＳＯＶ４培養において、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方でＧｒｚｍＢ＋Ｔ細胞の顕著な増加が観察された（図５Ｃ）が、ＯｖＣａＳ試料ではＧｒｚｍＢ＋細胞において変化は検出されなかった（図５Ｄ）。しかし、同じ試料では、ＩＬ７群においてＣＤ８＋Ｐｅｒｆ＋細胞の増加が検出され（図５Ｄ）、ＩＬ７をコードするウイルスで処置されたＨＵＳＯＶ４におけるＣＤ４＋Ｐｅｒｆ＋およびＣＤ８＋Ｐｅｒｆ＋集団両方の頻度の増加が観察された。
【0105】
全体では、我々のデータは、Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７が、浸潤リンパ球を活性化し、細胞傷害性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の割合を高めることができることを示す。
【0106】
実施例６．ヒト免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ－１および／またはＰＤＬ－１）と組み合わせたＩＬ７で武装化（armed）された腫瘍溶解性アデノウイルス
ウイルス構築物および免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）
この概念実証研究で使用されたウイルスは、ＴＩＬＴ－５１７（Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７）である。Ｅ２Ｆプロモーター上の修飾、およびＥ１Ａの定常領域における２４塩基対の欠失ならびに導入遺伝子としてヒトインターロイキン－７タンパク質を組み込む細菌人工染色体リコンビニアリング技術によりウイルスを調製した。ヒト抗ＰＤ－Ｌ１ Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）（アテゾリズマブ、ロシュ；本文中では抗ＰＤ－Ｌ１と呼ばれる）およびヒト抗ＰＤ－１ ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ、メルク；本文中では抗ＰＤ－１と呼ばれる）などのＩＣＩを、単独および／またはＴＩＬＴ－５１７と組み合わせたいずれかの研究で使用した。
ウイルス構築物および免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）
この概念実証研究で使用されたウイルスは、ＴＩＬＴ－５１７（Ａｄ５／３－Ｅ２Ｆ－ｄ２４－ｈＩＬ７）である。Ｅ２Ｆプロモーター上の修飾、およびＥ１Ａの定常領域における２４塩基対の欠失ならびに導入遺伝子としてヒトインターロイキン－７タンパク質を組み込む細菌人工染色体リコンビニアリング技術によりウイルスを調製した。ヒト抗ＰＤ－Ｌ１ Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）（アテゾリズマブ、ロシュ；本文中では抗ＰＤ－Ｌ１と呼ばれる）およびヒト抗ＰＤ－１ ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ、メルク；本文中では抗ＰＤ－１と呼ばれる）などのＩＣＩを、単独および／またはＴＩＬＴ－５１７と組み合わせたいずれかの研究で使用した。
【0107】
患者試料処理およびエクスビボ腫瘍培養
腎細胞癌（ＲＣＣ）を有する患者由来の腫瘍試料を、ヘルシンキ大学病院（ＨＵＳ）から取得した。要約すると、腫瘍を小さい断片に切り刻み、一晩の酵素消化のために、＋３７℃で振盪しながら、１％Ｌ－グルタミン、１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉ型コラゲナーゼ（１７０ｍｇ／Ｌ）、ＩＶ型コラゲナーゼ（１７０ｍｇ／Ｌ）、ＤＮａｓｅ Ｉ（２５ｍｇ／ｍＬ）およびエラスターゼ（２５ｍｇ／ｍＬ）（すべての酵素はワージントン・バイオケミカルから）が添加されたＲＰＭＩ１６４０を含有する５０ｍＬ容ファルコンチューブに入れた。消化後、７０μｍフィルターに通して細胞懸濁液を濾過し、消化されなかった断片および赤血球の除去のために、ＡＣＫ溶解バッファー（シグマアルドリッチ、ミズーリ、ＵＳＡ）で処理した。すべてのこのプロセスにより、異種単細胞懸濁液がもたらされ、後者は、細胞生存率アッセイで使用するためのエクスビボ腫瘍培養、この場合は、ＨＵＳＲｅｎｃａ５を確立するために使用された。
腎細胞癌（ＲＣＣ）を有する患者由来の腫瘍試料を、ヘルシンキ大学病院（ＨＵＳ）から取得した。要約すると、腫瘍を小さい断片に切り刻み、一晩の酵素消化のために、＋３７℃で振盪しながら、１％Ｌ－グルタミン、１％Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、Ｉ型コラゲナーゼ（１７０ｍｇ／Ｌ）、ＩＶ型コラゲナーゼ（１７０ｍｇ／Ｌ）、ＤＮａｓｅ Ｉ（２５ｍｇ／ｍＬ）およびエラスターゼ（２５ｍｇ／ｍＬ）（すべての酵素はワージントン・バイオケミカルから）が添加されたＲＰＭＩ１６４０を含有する５０ｍＬ容ファルコンチューブに入れた。消化後、７０μｍフィルターに通して細胞懸濁液を濾過し、消化されなかった断片および赤血球の除去のために、ＡＣＫ溶解バッファー（シグマアルドリッチ、ミズーリ、ＵＳＡ）で処理した。すべてのこのプロセスにより、異種単細胞懸濁液がもたらされ、後者は、細胞生存率アッセイで使用するためのエクスビボ腫瘍培養、この場合は、ＨＵＳＲｅｎｃａ５を確立するために使用された。
【0108】
細胞生存率アッセイ
ＭＴＳアッセイを使用して、感染した腫瘍細胞の細胞生存率を評価した。２０，０００個の生存可能な患者の腫瘍細胞を９６ウェルプレート（Ｕ底）に三連で播種した。翌日、ＴＩＬＴ－５１７、抗ＰＤ－１、抗ＰＤＬ－１、ＴＩＬＴ－５１７＋抗ＰＤ－１またはＴＩＬＴ－５１７＋抗ＰＤ－Ｌ１のいずれかで腫瘍を処置した。非感染の細胞をモック対照として使用した。ウイルスを１００ＶＰ／細胞の濃度で感染させた。使用された両方のＩＣＩの濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌであった。処置後の１日後、２日後、３日後、４日後、および５日後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ、ウィスコンシン、ＵＳＡ）との２時間のインキュベーションにより細胞生存率を評価した。Ｈｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅプレートリーダー（Ｈｉｄｅｘ、トゥルク、フィンランド）を使用して、４９０ｎｍで吸光度を読み取った。データを非感染のモック対照群に対して正規化した。
ＭＴＳアッセイを使用して、感染した腫瘍細胞の細胞生存率を評価した。２０，０００個の生存可能な患者の腫瘍細胞を９６ウェルプレート（Ｕ底）に三連で播種した。翌日、ＴＩＬＴ－５１７、抗ＰＤ－１、抗ＰＤＬ－１、ＴＩＬＴ－５１７＋抗ＰＤ－１またはＴＩＬＴ－５１７＋抗ＰＤ－Ｌ１のいずれかで腫瘍を処置した。非感染の細胞をモック対照として使用した。ウイルスを１００ＶＰ／細胞の濃度で感染させた。使用された両方のＩＣＩの濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌであった。処置後の１日後、２日後、３日後、４日後、および５日後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（プロメガ、ウィスコンシン、ＵＳＡ）との２時間のインキュベーションにより細胞生存率を評価した。Ｈｉｄｅｘ Ｓｅｎｓｅプレートリーダー（Ｈｉｄｅｘ、トゥルク、フィンランド）を使用して、４９０ｎｍで吸光度を読み取った。データを非感染のモック対照群に対して正規化した。
【0109】
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ９．２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を、データの統計解析およびグラフ表示のために使用した。群間で対応のないｔ検定を使用することにより統計的検定を行い、ｐ＜０．０５の場合、有意性があるとみなされた。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ９．２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を、データの統計解析およびグラフ表示のために使用した。群間で対応のないｔ検定を使用することにより統計的検定を行い、ｐ＜０．０５の場合、有意性があるとみなされた。
【0110】
結果
図６Ａの結果から、ＴＩＬＴ－５１７およびそのＩＣＩとの組み合わせを使用すると、ＲＣＣ試料において抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１いずれかの単独の使用と比較して、より効果的に機能することが示される。ＩＣＩが、ＲＣＣの標準治療として使用される一般的な免疫療法であることを認めることが重要である。しかし、図６Ａで観察することができるように、抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１の処置が、腫瘍培養の相対的な細胞生存率をわずか約９０％まで低下させるが、ＴＩＬＴ－５１７関与群は、４０％未満に達しても、日を追うごとに腫瘍の相対的な細胞生存率を低下させ続ける。
図６Ａの結果から、ＴＩＬＴ－５１７およびそのＩＣＩとの組み合わせを使用すると、ＲＣＣ試料において抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１いずれかの単独の使用と比較して、より効果的に機能することが示される。ＩＣＩが、ＲＣＣの標準治療として使用される一般的な免疫療法であることを認めることが重要である。しかし、図６Ａで観察することができるように、抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１の処置が、腫瘍培養の相対的な細胞生存率をわずか約９０％まで低下させるが、ＴＩＬＴ－５１７関与群は、４０％未満に達しても、日を追うごとに腫瘍の相対的な細胞生存率を低下させ続ける。
【0111】
注目すべきは、２日目に、ＴＩＬＴ－５１７＋抗ＰＤ－１およびＴＩＬＴ－５１７＋抗ＰＤ－Ｌ１の併用群により媒介された腫瘍死滅は、モックと比較して統計的に有意である（図６Ｂ）。重要なことに、ＴＩＬＴ－５１７、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１の単独療法と比較して培養の試料細胞生存率を低下させることで２０％を超える改善を示すので、この併用群は、有望な戦略であることを示した（図６Ｂ）。５日目までに、この併用群は、抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１単独のいずれかと比較して、統計的に有意に高い腫瘍細胞死滅を示した（図６Ｃ）。併用処置群によるより良好な腫瘍死滅の背景にある１つの可能な機構は、高い免疫細胞活性化による。
【0112】
全体では、ＴＩＬＴ－５１７＋抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＰＤ－１の迅速で効果的な反応は、いずれかの療法単独と比較して、臨床実施に向けた有望なアプローチを示唆する。
【0113】
参考文献
引用した非特許文献：
Havunen R, Siurala M, Sorsa S, Gronberg-Vaha-Koskela S, Behr M, Tahtinen S, Santos JM, Karell P, Rusanen J, Nettelbeck DM, et al.: Oncolytic Adenoviruses Armed with Tumor Necrosis Factor Alpha and Interleukin-2 Enable Successful Adoptive Cell Therapy. Mol Ther Oncolytics 2017, 4:77-86.
Heninger AK, Theil A, Wilhelm C, Petzold C, Huebel N, Kretschmer K, Bonifacio E, Monti P: IL-7 abrogates suppressive activity of human CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells and allows expansion of alloreactive and autoreactive T cells. J Immunol 2012, 189:5649-5658.
Huang J, Zheng M, Zhang Z, Tang X, Chen Y, Peng A, Peng X, Tong A, Zhou L: Interleukin-7-loaded oncolytic adenovirus improves CAR-T cell therapy for glioblastoma. Cancer Immunology, Immunotherapy 2021, 70:2453-2465.
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Rosenberg SA, Sportes C, Ahmadzadeh M, Fry TJ, Ngo LT, Schwarz SL, Stetler-Stevenson M, Morton KE, Mavroukakis SA, Morre M, et al.: IL-7 administration to humans leads to expansion of CD8+ and CD4+ cells but a relative decrease of CD4+ T-regulatory cells. Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md. : 1997) 2006, 29:313-319.
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Vudattu, N., Magalhaes, I., Hoehn, H., Pan D., and Maeurer M.J. (2009). Expression analysis and functional activity of interleukin-7 splice variants. Genes Immun 10, 132-140.
White, E., Sabbatini, P., Debbas, M., Wold, W.S.M., Kusher, D.I., and Gooding, L. (1992). The 19-kilodalton adenovirus E1B transforming protein inhibits programmed cell death and prevents cytolysis by tumor necrosis factor alpha. Mol. Cell. Biol. 1992; 12: 2570-2580.
引用した非特許文献：
Havunen R, Siurala M, Sorsa S, Gronberg-Vaha-Koskela S, Behr M, Tahtinen S, Santos JM, Karell P, Rusanen J, Nettelbeck DM, et al.: Oncolytic Adenoviruses Armed with Tumor Necrosis Factor Alpha and Interleukin-2 Enable Successful Adoptive Cell Therapy. Mol Ther Oncolytics 2017, 4:77-86.
Heninger AK, Theil A, Wilhelm C, Petzold C, Huebel N, Kretschmer K, Bonifacio E, Monti P: IL-7 abrogates suppressive activity of human CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells and allows expansion of alloreactive and autoreactive T cells. J Immunol 2012, 189:5649-5658.
Huang J, Zheng M, Zhang Z, Tang X, Chen Y, Peng A, Peng X, Tong A, Zhou L: Interleukin-7-loaded oncolytic adenovirus improves CAR-T cell therapy for glioblastoma. Cancer Immunology, Immunotherapy 2021, 70:2453-2465.
Lock, M., et al., Measuring the Infectious Titer of Recombinant Adenovirus Using Tissue Culture Infection Dose 50% (TCID(50)) End-Point Dilution and Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR). Cold Spring Harb Protoc, 2019. 2019(8).
Nakao S, Arai Y, Tasaki M, Yamashita M, Murakami R, Kawase T, Amino N, Nakatake M, Kurosaki H, Mori M, et al.: Intratumoral expression of IL-7 and IL-12 using an oncolytic virus increases systemic sensitivity to immune checkpoint blockade. Science Translational Medicine 2020, 12:eaax7992.
Pellegrini M, Calzascia T, Elford AR, Shahinian A, Lin AE, Dissanayake D, Dhanji S, Nguyen LT, Gronski MA, Morre M, et al.: Adjuvant IL-7 antagonizes multiple cellular and molecular inhibitory networks to enhance immunotherapies. Nat Med 2009, 15:528-536.
Rosenberg SA, Sportes C, Ahmadzadeh M, Fry TJ, Ngo LT, Schwarz SL, Stetler-Stevenson M, Morton KE, Mavroukakis SA, Morre M, et al.: IL-7 administration to humans leads to expansion of CD8+ and CD4+ cells but a relative decrease of CD4+ T-regulatory cells. Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md. : 1997) 2006, 29:313-319.
Sportes C, Babb RR, Krumlauf MC, Hakim FT, Steinberg SM, Chow CK, Brown MR, Fleisher TA, Noel P, Maric I, et al.: Phase I study of recombinant human interleukin-7 administration in subjects with refractory malignancy. Clin Cancer Res 2010, 16:727-735.
Vudattu, N., Magalhaes, I., Hoehn, H., Pan D., and Maeurer M.J. (2009). Expression analysis and functional activity of interleukin-7 splice variants. Genes Immun 10, 132-140.
White, E., Sabbatini, P., Debbas, M., Wold, W.S.M., Kusher, D.I., and Gooding, L. (1992). The 19-kilodalton adenovirus E1B transforming protein inhibits programmed cell death and prevents cytolysis by tumor necrosis factor alpha. Mol. Cell. Biol. 1992; 12: 2570-2580.
【0114】
引用した特許公開：
国際公開第２０１４１７０３８９号
国際公開第２０１６１４６８９４号
国際公開第２０２０２４９８７３号
欧州特許第３８５８３６９号明細書
国際公開第２０１４１７０３８９号
国際公開第２０１６１４６８９４号
国際公開第２０２０２４９８７３号
欧州特許第３８５８３６９号明細書
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】