知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-04
(54)【発明の名称】グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種の分離方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240927BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024519066
(86)(22)【出願日】2022-09-29
(85)【翻訳文提出日】2024-04-19
(86)【国際出願番号】 US2022045152
(87)【国際公開番号】W WO2023055879
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】63/250,650
(32)【優先日】2021-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500049716
【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ダフ，ロバート・ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】シリンガー，ヘレナ
(72)【発明者】
【氏名】リペンス，ジェニファー
(57)【要約】
本明細書では、分子種の混合物からグアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離する方法であって、混合物のうちの少なくとも１つの分子種がグアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成された四重鎖である方法が提供される。例示的な実施形態では、方法は、（ａ）疎水性リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスに混合物を適用することであって、前記疎水性リガンドがＣ４～Ｃ８アルキル鎖を含み、分子種が疎水性リガンドに結合すること；及び（ｂ）酢酸塩の勾配とアセトニトリルの勾配とを含むがカチオン性イオン対形成剤を含まない移動相をクロマトグラフィーマトリックスに適用して、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を溶出すること；を含む。例示的な態様では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、第１のセットの溶出画分で溶出し、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成された四重鎖は第２のセットの溶出画分で溶出する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
分子種の混合物からグアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離する方法であって、前記混合物のうちの少なくとも１つの分子種が前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成された四重鎖であり、前記方法が、ａ．疎水性リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスに前記混合物を適用することであって、前記疎水性リガンドがＣ４～Ｃ８アルキル鎖を含み、分子種が前記疎水性リガンドに結合すること；
ｂ．酢酸塩の勾配とアセトニトリルの勾配とを含む移動相を前記クロマトグラフィーマトリックスに適用して、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を溶出することであって、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが第１のセットの溶出画分で溶出し、前記四重鎖が第２のセットの溶出画分で溶出すること；
を含む方法。
【請求項2】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖又はアンチセンス鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記混合物が一本鎖分子種及び／又は二本鎖分子種を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記混合物が、アンチセンス一本鎖、センス一本鎖、二重鎖、及び四重鎖からなる群から選択される１つ以上の分子種を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが前記アンチセンス一本鎖である、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記二重鎖が前記アンチセンス一本鎖と前記センス一本鎖とを含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項7】
前記混合物が、アンチセンス一本鎖、センス一本鎖、二重鎖、及び四重鎖の分子種を含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
各分子種が別の分子種とは別の画分で溶出する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記混合物が、アンチセンス一本鎖、センス一本鎖、二重鎖、及び四重鎖を含み、前記二重鎖が第１のセットの溶出画分で溶出し、前記センス鎖が第２のセットの溶出画分で溶出し、前記アンチセンス鎖が第３のセットの溶出画分で溶出し、前記四重鎖が第４のセットの溶出画分で溶出する、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
各分子種のＬＯＱが約０．０３ｍｇ／ｍＬ～約０．０８ｍｇ／ｍＬである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
各分子種のピークの分離の分解能が少なくとも又は約１．０であり、任意選択的には少なくとも又は約１．２である、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
各分子種の前記ピークの分離の分解能が少なくとも又は約２．０であり、任意選択的には少なくとも又は約２．４である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記混合物が、水、酢酸塩源、カリウム源、及び塩化ナトリウムのうちの１つ以上を含む溶液中で調製される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記酢酸塩源が、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記カリウム源がリン酸カリウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
前記溶液が約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの酢酸塩又はカリウムを含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記溶液が、約７５ｍＭ～約１００ｍＭの酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウムを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記溶液がリン酸カリウム及び塩化ナトリウムを含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記混合物が、水中で、任意選択的には精製された脱イオン水中で調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記疎水性リガンドが、Ｃ４アルキル鎖、Ｃ６アルキル鎖、又はＣ８アルキル鎖を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記疎水性リガンドがＣ４アルキル鎖を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記クロマトグラフィーマトリックスが、２．１ｍｍの内径及び／又は約５０ｍｍのカラム長を有するクロマトグラフィーカラム内に収容されている、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記カラム温度が約２０℃～約３５℃である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記カラム温度が約２９℃～約３１℃、任意選択的には約３０℃である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記マトリックスが、１．７のエチレン架橋ハイブリッド（ＢＥＨ）粒子を含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記酢酸塩の勾配が、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの酢酸塩を含む酢酸塩原液を用いて製造される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記酢酸塩原液が、約７０ｍＭ～約８０ｍＭの酢酸塩、任意選択的には約７５ｍＭの酢酸塩を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記酢酸塩原液が、約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの酢酸塩、任意選択的には約１００ｍＭの酢酸塩を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記酢酸塩が、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウムである、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記酢酸塩原液のｐＨが約６．５～約７．０である、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記酢酸塩原液のｐＨが５．０～８．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、又は約７．０である、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記酢酸塩原液が６．７±０．１のｐＨを有する７５ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液である、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記アセトニトリルの勾配がアセトニトリル原液を用いて作られ、前記アセトニトリル原液が１００％のアセトニトリルである、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記移動相が、前記酢酸塩の減少する濃度勾配と、アセトニトリルの増加する濃度勾配とを含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記酢酸塩の勾配が最大濃度で始まり、第１の期間の間に最小濃度まで徐々に減少する、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記第１の期間が約１８分～約１９分である、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記第１の期間が約２２分～約２６分である、請求項３５に記載の方法。
【請求項38】
前記第１の期間の後、前記移動相の前記酢酸塩の濃度が酢酸塩の前記最大濃度まで増加する、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記勾配が酢酸塩の前記最小濃度に到達してから約０．１～約３分後に、酢酸塩の前記最大濃度まで前記酢酸塩が増加する、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
アセトニトリルの前記勾配が最小濃度で始まり、前記第１の期間の間に最大濃度まで徐々に増加する、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記第１の期間の後、前記移動相の前記アセトニトリルの濃度がアセトニトリルの前記最小濃度まで減少する、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
アセトニトリルの前記勾配がアセトニトリルの前記最大濃度に到達してから約０．１～約３分後に、アセトニトリルの前記濃度が前記最小濃度まで減少する、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
以下の条件に従って前記移動相を前記クロマトグラフィーマトリックスに適用することを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法：【表1】
【請求項44】
以下の条件に従って前記移動相を前記クロマトグラフィーマトリックスに適用することを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法：【表2】
【請求項45】
以下の条件に従って前記移動相を前記クロマトグラフィーマトリックスに適用することを含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法：【表3】
【請求項46】
前記移動相がカチオン性イオン対形成剤を含まない、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
総実行時間が少なくとも約２５分であり、４０分未満である、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記総実行時間が３５分未満、任意選択的には３０分以下である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記実行時間が約２６分である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記移動相の流量が約０．５ｍｌ／分～約１ｍｌ／分である、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記移動相の流量が約０．７ｍｌ／分～約０．８ｍｌ／分である、請求項１～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
紫外線検出器を使用して分子種の溶出を監視することを含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
非変性方法である、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記溶出画分を一定期間に別々の容器に回収することをさらに含む、請求項１～５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが約１９～約２３個のヌクレオチドを含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記混合物中の前記グアニンリッチオリゴヌクレオチド及びその１つ以上の前記分子種が、１種以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記１種以上の修飾ヌクレオチドが２’－修飾ヌクレオチドである、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記２’－修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はそれらの組み合わせである、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記混合物中の前記グアニンリッチオリゴヌクレオチド及びその１つ以上の前記分子種が合成ヌクレオチド間結合を含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記合成ヌクレオチド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが配列番号２の配列を含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドが配列番号４による修飾ヌクレオチドの配列を含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項63】
分子種の混合物からグアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離する方法であって、前記混合物の前記分子種が、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成された四重鎖、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチド、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチド及びその相補鎖を含む二重鎖、並びに相補鎖であり、前記方法が、ａ．疎水性リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスに前記混合物を適用することであって、前記疎水性リガンドがＣ４～Ｃ８アルキル鎖を含み、分子種が前記疎水性リガンドに結合すること；
ｂ．酢酸塩の減少する濃度勾配とアセトニトリルの増加する濃度勾配とを含む移動相を前記クロマトグラフィーマトリックスに適用して、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を溶出することであって、前記四重鎖、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチド、前記二重鎖、及び前記相補鎖のそれぞれが前記クロマトグラフィーマトリックスから別個に溶出すること；
を含む方法。
【請求項64】
以下の条件に従って前記移動相を前記クロマトグラフィーマトリックスに適用することを含む、請求項６３に記載の方法：【表4】
【請求項65】
各分子種のピークの分離の分解能が少なくとも又は約２．０であり、任意選択的には少なくとも又は約２．４である、請求項６３又は６４に記載の方法。
【請求項66】
各分子種の前記ピークの前記分離の前記分解能が少なくとも若しくは約３．０、又は少なくとも若しくは約４．０である、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
各分子種のＬＯＱが約０．０３ｍｇ／ｍＬ～約０．０８ｍｇ／ｍＬである、請求項６３～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
請求項１～６７のいずれか一項に従って前記グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離することを含む、グアニンリッチオリゴヌクレオチド原薬又は医薬品を含む試料の純度を決定する方法。
【請求項69】
前記試料が工程内試料である、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記試料がロット試料である、請求項６８に記載の方法。
【請求項71】
グアニンリッチオリゴヌクレオチド原薬又は医薬品の安定性を試験する方法であって、前記グアニンリッチオリゴヌクレオチド原薬又は医薬品を含む試料にストレスを加えること、及び請求項６８に従って前記試料の純度を決定すること、を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０２１年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２５０，６５０号に基づく利益が本出願で主張され、当該仮特許出願の開示は、参照により本明細書に援用される。
米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０２１年９月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２５０，６５０号に基づく利益が本出願で主張され、当該仮特許出願の開示は、参照により本明細書に援用される。
【0002】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出された、コンピュータにより読み込み可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれ、下記のように識別される：２０２２年９月９日作成の「Ａ－２７３５－ＷＯ０１－ＳＥＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ＸＭＬ」という名称の８ＫＢのＸＭＬファイル。
本明細書と同時に提出された、コンピュータにより読み込み可能なヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれ、下記のように識別される：２０２２年９月９日作成の「Ａ－２７３５－ＷＯ０１－ＳＥＣ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ＸＭＬ」という名称の８ＫＢのＸＭＬファイル。
【0003】
本発明は、核酸精製及び分析的検出及びキャラクタリゼーションの分野に関する。特に、本発明は、分子種の混合物からグアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離するための方法であって、混合物のうちの少なくとも１つの分子種がグアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖である方法に関する。この方法により、一本鎖オリゴヌクレオチドだけでなく、二重鎖や四重鎖などの高次構造を含む、混合物中のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの個々の分子種それぞれの分離、検出、及び精製が可能になる。
【背景技術】
【0004】
グアニンリッチ（Ｇ－リッチ）オリゴヌクレオチドによる様々な細胞型の処理は、細胞増殖の阻害、細胞死の誘導、細胞接着の変化、タンパク質凝集の阻害、及び抗ウイルス活性を含む、多様な生物学的効果をもたらすことが報告されている（Ｂａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ８６（３）：１５１－１６４（２００９））。近年、複数の合成Ｇ－リッチオリゴヌクレオチドが様々なヒトの疾患の治療薬として研究されている。
【0005】
Ｇ－リッチオリゴヌクレオチドは、分子間又は分子内で会合して、四本鎖（ｆｏｕｒ－ｓｔｒａｎｄｅｄ又はｑｕａｄｒｕｐｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ、Ｇ４）又は「四重鎖」構造を形成することができる。これらの構造は、４つのグアニンが水素結合の環状パターンを構築するＧ－カルテットの形成によって形成される。 構造的には、四量体集合体は、ａｎｔｉ又はｓｉｎの両方のグリコシド構造をとることができる平面状の集合体からなり、同じ方向のＧ鎖、すなわち平行鎖からのテトラドグアニンは同じグリコシド構造をとる一方で、反対方向のＧ鎖、すなわち逆平行鎖からのものは異なるグリコシド構造をとる。塩基の配向（ａｎｔｉ又はｓｙｎ）は安定性に寄与すると考えられる（Ｈｕｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，３７（７），ｐｐ．１３７５－１３８４（２００８）；Ｂｕｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４（１９），ｐｐ．５４０２－５４１５（２００６）；及びＬａｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，９４（２），ｐｐ．２７７－２８６（２０１２））。
【0006】
グアニン残基の配向の結果として、Ｇ－リッチＤＮＡ四重鎖構造は本質的に非常に不安定である。四重鎖が折りたたまれるためには適切なサイズの一価イオンが必要であることはよく知られた観察結果であるものの、これらの構造が不安定であることは、最初は直感に反する。カチオン、特にＫ＋、及びそれより程度は低いＮａ＋、さらにはＮＨ４
＋は、テトラドグアニンＯ６原子と配位することにより、積み重ねられたＧ－テトラドを安定化する。しかしながら、融解プロファイルからは、四重鎖のトポロジーや構造について何も明らかにならない。ただし、平行トポロジーは通常逆平行トポロジーよりも安定であり、カリウムイオンはナトリウムよりも安定な複合体を生成する（Ｓａｎｎｏｈｅ ａｎｄ Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（１），ｐｐ．１７－２（２０１０）；及びＲａｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｆｏｘ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，４３（４），ｐｐ．２９１－３０１（２００７））。
【0007】
Ｇ－四重鎖の安定性は、静電気力、塩基のスタッキング、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力などの様々なパラメータにより支配される。熱安定性は、溶媒の誘電率が低下するにつれて増加する（Ｓｍｉｒｎｏｖ ａｎｄ Ｓｈａｆｅｒ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，８５（１），ｐｐ．９１－１０１（２００７））。この平衡の熱力学的評価は、より高次の構造の融解プロファイルに基づいており、Ｇ４構造の変性プロセスは、典型的な分光学的手法によって観察される（Ｙａｎｇ，Ｄ． ａｎｄ Ｌｉｎ，Ｃ．ｅｄｓ．，２０１９． Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）。四重鎖は、Ｘ線、ＮＭＲ、ＣＤ、及びＵＶ技術によって調べることもできる。鎖の配向の識別は、２９５ｎｍにおける吸光度によって評価することができる（Ｍｅｒｇｎｙ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３５，７４－７８（１９９８）；Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３（６）：５１５－５３７；Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７（１），ｐｐ．１７－１（２００９）；Ｍａｊｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，８９（４），ｐｐ．３０２－３０９（２００８）；Ｐｅｔｒａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ，５（５），ｐｐ．４６３－４７５（２００５）；Ｄａｒｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（９），ｐｐ．ｅ３９－ｅ３９（２００２））。
【0008】
Ｇ－リッチオリゴヌクレオチドの四重鎖構造は、特異な生物物理学的及び生物学的特性と関連している。四重鎖構造が生体内に存在することを示す証拠が増えてきており、これらの構造がＤＮＡ複製、テロメア維持、及び遺伝子発現などの様々な生理学的機能に関与していることが示唆されている。Ｒｈｏｄｅｓ ａｎｄ Ｌｉｐｐｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４３：８６２７－８６３７，２０１５。
【0009】
これらの構造をより深く理解し、四重鎖構造を形成するＧ－リッチオリゴヌクレオチドの治療有効性を最終的に利用するためには、研究者らはこれらの分子を検出、特性評価、単離、及び精製することができる必要がある。一般に、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを精製したり、関連する不純物から分離したりするためのアプローチの殆どは、高温や高ｐＨ緩衝液を使用することによって、又はカオトロピック剤若しくは有機修飾剤を導入することによって、四重鎖形成などの二次的相互作用を破壊することを目的としている。このような強力に変性させる条件により一本鎖形成が促進される。その後、一本鎖を精製することができるものの、精製した一本鎖から四重鎖を構築する必要がある。分析の観点からは、強力な変性条件は、分析試料中に存在する四重鎖構造、又はより高次構造の他の不純物の正確な定量に影響を及ぼす可能性がある。
【0010】
以上のことを考慮すると、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを、それから形成される四重鎖及び他の不純物から精製又は分離する効率的な方法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Ｂａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｍｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ８６（３）：１５１－１６４（２００９）
【非特許文献2】Ｈｕｐｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，３７（７），ｐｐ．１３７５－１３８４（２００８）
【非特許文献3】Ｂｕｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４（１９），ｐｐ．５４０２－５４１５（２００６）
【非特許文献4】Ｌａｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，９４（２），ｐｐ．２７７－２８６（２０１２）
【非特許文献5】Ｓａｎｎｏｈｅ ａｎｄ Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０（１），ｐｐ．１７－２（２０１０）
【非特許文献6】Ｒａｃｈｗａｌ ａｎｄ Ｆｏｘ，Ｍｅｔｈｏｄｓ，４３（４），ｐｐ．２９１－３０１（２００７）
【非特許文献7】Ｓｍｉｒｎｏｖ ａｎｄ Ｓｈａｆｅｒ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，８５（１），ｐｐ．９１－１０１（２００７）
【非特許文献8】Ｙａｎｇ，Ｄ． ａｎｄ Ｌｉｎ，Ｃ．ｅｄｓ．，２０１９．Ｇ－ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献9】Ｍｅｒｇｎｙ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４３５，７４－７８（１９９８）
【非特許文献10】Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．２００３；１３（６）：５１５－５３７
【非特許文献11】Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７（１），ｐｐ．１７－１（２００９）
【非特許文献12】Ｍａｊｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ：Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，８９（４），ｐｐ．３０２－３０９（２００８）
【非特許文献13】Ｐｅｔｒａｃｃｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ａｎｔｉ－Ｃａｎｃｅｒ Ａｇｅｎｔｓ，５（５），ｐｐ．４６３－４７５（２００５）
【非特許文献14】Ｄａｒｂｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０（９），ｐｐ．ｅ３９－ｅ３９（２００２）
【非特許文献15】Ｒｈｏｄｅｓ ａｎｄ Ｌｉｐｐｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４３：８６２７－８６３７，２０１５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、四重鎖構造を形成する傾向を有するグアニンリッチオリゴヌクレオチドの分離方法に関する。本発明は、Ｃ４～Ｃ８アルキル鎖を含む疎水性リガンドと、酢酸塩の勾配及びアセトニトリルの勾配を含む移動相とを含むクロマトグラフィーマトリックスを採用する本明細書に開示の方法によって、グアニンリッチオリゴヌクレオチドからの四重鎖構造の形成をクロマトグラフィーで分離することができるという発見に一部基づいている。そのような方法は、本明細書で示されるように、グアニンリッチオリゴヌクレオチドと四重鎖との間のみならず、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの他の主要な分子種間の高分解能での分離も可能にする。有利には、本開示の方法は、グアニンリッチオリゴヌクレオチド、その相補鎖、並びにグアニンリッチオリゴヌクレオチド及びその相補鎖を含む四重鎖及び二重鎖の高分解能分離を実現するために使用することができる。
【0013】
本発明者らは、驚くべきことに、移動相からトリエチルアミン（ＴＥＡ）などのカチオン性イオン対形成剤を排除することにより、逆相（すなわち疎水性）である固定相を使用して、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種に対応するピーク間の高い分離能を達成できることを見出した。
【0014】
したがって、本発明は、分子種の混合物からグアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離する方法を提供する。例示的な実施形態では、混合物の少なくとも１つの分子種は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖である。例示的な実施形態では、方法は、（ａ）疎水性リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスに混合物を適用することであって、前記疎水性リガンドがＣ４～Ｃ８アルキル鎖を含み、分子種が疎水性リガンドに結合すること；及び（ｂ）酢酸塩の勾配とアセトニトリルの勾配とを含む移動相をクロマトグラフィーマトリックスに適用して、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を溶出すること；を含む。例示的な態様では、各分子種は、異なる分子種が溶出する時間とは区別できる時間に溶出する。例えば、例示的な場合において、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、四重鎖が溶出する時間とは区別できる時間に溶出する。様々な態様では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは第１のセットの溶出画分で溶出し、四重鎖は第２のセットの溶出画分で溶出する。
【0015】
例示的な態様では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖又はアンチセンス鎖である。例示的な場合において、混合物は一本鎖分子種及び／又は二本鎖分子種を含む。任意選択的には、混合物は、アンチセンス一本鎖、センス一本鎖、二重鎖、及び四重鎖からなる群から選択される１つ以上の分子種を含む。様々な態様では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドはアンチセンス一本鎖である。様々な場合において、二重鎖はアンチセンス一本鎖とセンス一本鎖とを含む。例示的な態様では、混合物は、以下の分子種の全てを含む：アンチセンス一本鎖、センス一本鎖、二重鎖、及び四重鎖。任意選択的には、各分子種は、別の分子種とは別の画分で溶出する。例示的な態様では、二重鎖は第１のセットの溶出画分で溶出し、センス鎖は第２のセットの溶出画分で溶出し、アンチセンス鎖は第３のセットの溶出画分で溶出し、四重鎖は第４のセットの溶出画分で溶出する。様々な態様では、各分子種のピークの分離の分解能（例えば二重鎖のピークとセンス一本鎖のピークとの間の分離の分解能）は、少なくとも若しくは約１．０、任意選択的には少なくとも若しくは約１．１、少なくとも若しくは約１．２、少なくとも若しくは約１．３、又は少なくとも若しくは約１．４である。様々な態様では、各分子種のピークの分離の分解能は、少なくとも若しくは約１．５、任意選択的には少なくとも若しくは約１．６、少なくとも若しくは約１．７、少なくとも若しくは約１．８、又は少なくとも若しくは約１．９である。任意選択的には、各分子種に対応するピークの分離の分解能（例えば二重鎖のピークとセンス一本鎖のピークとの間の分離の分解能）は、少なくとも又は約２．０（例えば少なくとも又は約２．１、少なくとも又は約２．２、少なくとも又は約２．３、少なくとも又は約２．４）である。様々な態様では、分離の分解能は、少なくとも又は約２．４である。例示的な場合において、分解能は少なくとも若しくは約２．５、少なくとも若しくは約３．０、又は少なくとも若しくは約４．０である。任意選択的には、二重鎖のピークとセンス鎖のピークとの間の分離の分解能は、少なくとも４．０である。様々な態様では、シグナル対ノイズ比が１０．０以上である場合、各分子種の定量限界（ＬＯＱ）は約０．０３ｍｇ／ｍＬ～約０．０８ｍｇ／ｍＬである。様々な場合において、シグナル対ノイズ比が１０．０以上である場合、ＬＯＱは約０．０８ｍｇ／ｍｌである。
【0016】
様々な場合において、混合物は、水、酢酸塩源、カリウム源、及び塩化ナトリウムのうちの１つ以上を含む溶液中で調製される。酢酸塩源は、特定の態様では、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸カリウムである。任意選択的には、カリウム源はリン酸カリウムである。様々な態様では、溶液は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの酢酸塩又はカリウムを含む。様々な場合において、溶液は、約７５ｍＭ～約１００ｍＭの酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウムを含む。例示的な態様では、溶液はリン酸カリウム及び塩化ナトリウムを含む。
【0017】
特定の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは、Ｃ４アルキル鎖、Ｃ６アルキル鎖、又はＣ８アルキル鎖を含む疎水性リガンドを含む。任意選択的には、疎水性リガンドはＣ４アルキル鎖を含む。例示的な態様では、クロマトグラフィーマトリックスは、２．１ｍｍの内径及び／又は約５０ｍｍのカラム長を有するクロマトグラフィーカラム内に収容される。例示的な場合において、カラム温度は約２０℃～約３５℃、任意選択的には約３０℃である。様々な場合において、クロマトグラフィーマトリックスはエチレン架橋ハイブリッド（ＢＥＨ）粒子を含む。任意選択的には、ＢＥＨ粒子は、約１．７μｍ又は約３．５μｍの粒径を有する。
【0018】
一部の実施形態では、移動相中の酢酸塩の勾配は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの酢酸塩を含む酢酸塩原液を用いて製造される。任意選択的には、酢酸塩原液は、約７０ｍＭ～約８０ｍＭの酢酸塩、任意選択的には約７５ｍＭの酢酸塩を含む。様々な態様では、酢酸塩原液は、約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの酢酸塩、任意選択的には約１００ｍＭの酢酸塩を含む。様々な場合において、酢酸塩は、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウムである。例示的な態様では、酢酸塩原液のｐＨは、約６．５～約７．０、任意選択的には約６．７、約６．８、約６．９、又は約７．０である。本開示の例示的な態様では、移動相は、酢酸塩の減少勾配とアセトニトリルの増加勾配とを含む。例示的な場合において、酢酸塩の勾配は、最大濃度で始まり、第１の期間の間に最小濃度まで徐々に減少する。任意選択的には、第１の期間は約１８分～約１９分であり、或いは第１の期間は約２２分～約２６分である。様々な態様では、第１の期間の後、移動相は、任意選択的には、勾配が酢酸塩の最小濃度に到達してから約０．１～約３分後に、酢酸塩の最大濃度まで増加する。様々な態様では、アセトニトリルの勾配は最小濃度で始まり、第１の期間の間に最大濃度まで徐々に増加する。任意選択的には、第１の期間の後、移動相はアセトニトリルの最小濃度まで減少する。任意選択的には、移動相は、アセトニトリルの勾配がアセトニトリルの最大濃度に到達してから約０．１～約３分後にアセトニトリルの最小濃度まで減少する。特定の態様では、本開示の方法は、以下の条件に従って移動相をクロマトグラフィーマトリックスに適用することを含む。
【0019】
【表1】
【0020】
代替の又は追加の態様では、方法は、以下の条件に従って移動相をクロマトグラフィーマトリックスに適用することを含む。
【0021】
【表2】
【0022】
代替の又は追加の態様では、方法は、以下の条件に従って移動相をクロマトグラフィーマトリックスに適用することを含む。
【0023】
【表3】
【0024】
例示的な態様では、移動相は、カチオン性イオン対形成剤、例えばＴＥＡを含まない。総実行時間は、様々な場合において、少なくとも約２５分且つ４０分未満、任意選択的には３５分未満、任意選択的には３０分以下である。様々な場合において、実行時間は約２２分～約２６分である。様々な態様では、移動相の流量は約０．５ｍｌ／分～約１．０ｍｌ／分、任意選択的には約０．７ｍｌ／分～約０．８ｍｌ／分である。
【0025】
例示的な態様では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、約１９～約２３個のヌクレオチドを含む。例示的な場合において、混合物中のグアニンリッチオリゴヌクレオチド及びその１つ以上の分子種は、１種以上の修飾ヌクレオチドを含む。任意選択的には、１種以上の修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はそれらの組み合わせなどの２’－修飾ヌクレオチドである。様々な態様では、混合物中のグアニンリッチオリゴヌクレオチド及びその１つ以上の分子種は、ホスホロチオエート結合などの合成ヌクレオチド間結合を含む。
【0026】
本発明は、グアニンリッチオリゴヌクレオチド原薬又は医薬品を含む試料の純度を決定する方法も提供する。例示的な実施形態では、方法は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離する本明細書に開示の方法に従って、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離することを含む。様々な態様では、試料は工程内試料であり、方法は、工程内コントロールアッセイの一部として、又はＧ－リッチオリゴヌクレオチドの製造が実質的な不純物を含まずに確実に行われるようにするためのアッセイとして使用される。様々な場合において、試料はロット試料であり、方法はロットリリースアッセイの一部として使用される。様々な態様では、試料はストレスを受けた試料、又は１回以上のストレスにさらされた試料であり、方法は安定性アッセイである。したがって、本発明は、グアニンリッチオリゴヌクレオチド原薬又は医薬品の安定性を試験する方法であって、グアニンリッチオリゴヌクレオチド原薬又は医薬品を含む試料にストレスを加えること、及び本開示の方法に従って試料の純度を決定することを含む方法を提供する。例示的な場合において、１回以上のストレスの後の試料中の不純物の存在は、１回以上のストレス下でのＧ－リッチオリゴヌクレオチドの不安定性を示す。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】オルパシランの構造を概略的に示す図である。５’から３’への方向に列記される上側の鎖はセンス鎖（配列番号３）であり、３’から５’への方向に列記される下側の鎖はアンチセンス鎖（配列番号４）である。黒色の円は、２’－Ｏ－メチル修飾を有するヌクレオチドを表し、白色の円は、２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）修飾を有するヌクレオチドを表し、灰色の円は、３’－３’結合を介して隣接ヌクレオチドに連結された（すなわち逆位）デオキシアデノシンヌクレオチドを表す。円を連結する灰色の線は、ホスホジエステル結合を表すが、円を連結する黒色の線は、ホスホロチオエート結合を表す。示す構造を有する三価ＧａｌＮＡｃ部分は、Ｒ１によって表されており、ホスホロチオエート結合によってセンス鎖の５’末端に共有結合されている。
【図2A】実施例１の試験１に記載されている通り、Ｃ１８疎水性リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスと、ＨＡＡ／アセトニトリル／メタノール（ＭＰ Ａ）及びＨＡＡ／アセトニトリル（ＭＰ Ｂ）を含む移動相とを使用して分離された、アンチセンス、センス、及び二重鎖分子種のピークの例示的なクロマトグラムである。
【図2B】実施例１の試験２に記載されている通り、移動相ＭＰ Ａが９５ｍＭのＨＦＩＰ／８ｍＭのＴＥＡ／２４ｍＭのｔｅｒｔ－ブチルアミンであり、ＭＰ ＢがアセトニトリルであったＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラムからオルパシランの試料を溶出して得られた一連のクロマトグラムである。
【図2C】それぞれ、試験３Ａの表３に記載されている通り、移動相が異なるアルキルアミン及び／又は異なる濃度のＴＥＡ若しくはＨＦＩＰを含むＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラムからオルパシランの試料を溶出して得られた一連の例示的なクロマトグラムである。
【図2D】それぞれ、試験３Ａの表３に記載されている通り、移動相が異なるアルキルアミン及び／又は異なる濃度のＴＥＡ若しくはＨＦＩＰを含むＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラムからオルパシランの試料を溶出して得られた一連の例示的なクロマトグラムである。
【図2E】それぞれ、試験３Ａの表３に記載されている通り、移動相が異なるアルキルアミン及び／又は異なる濃度のＴＥＡ若しくはＨＦＩＰを含むＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラムからオルパシランの試料を溶出して得られた一連の例示的なクロマトグラムである。
【図2F】それぞれ、試験３Ａの表３に記載されている通り、移動相が異なるアルキルアミン及び／又は異なる濃度のＴＥＡ若しくはＨＦＩＰを含むＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラムからオルパシランの試料を溶出して得られた一連の例示的なクロマトグラムである。
【図2G】それぞれ、試験３Ａの表３に記載されている通り、移動相が異なるアルキルアミン及び／又は異なる濃度のＴＥＡ若しくはＨＦＩＰを含むＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラムからオルパシランの試料を溶出して得られた一連の例示的なクロマトグラムである。
【図2H】それぞれ、試験３Ｄ及び３Ｅに記載されている通り、移動相成分及び／又は移動相勾配条件が変更されたＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラムからオルパシランの試料を溶出して得られた一連の例示的なクロマトグラムである。
【図2I】それぞれ、試験３Ｄ及び３Ｅに記載されている通り、移動相成分及び／又は移動相勾配条件が変更されたＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラムからオルパシランの試料を溶出して得られた一連の例示的なクロマトグラムである。
【図2J】試験したカラム温度のそれぞれにおける例示的なクロマトグラムであり、センスと二重鎖のピークを示す。
【図2K】試験したカラム温度のそれぞれにおける例示的なクロマトグラムであり、アンチセンスと四重鎖のピークを示す。
【図2L】より長いカラム長（１００ｍｍ）を有するカラムからオルパシランの試料を溶出して得られた一連のクロマトグラムである。
【図2M】より短いカラム長（５０ｍｍ）を有するカラムからオルパシランの試料を溶出して得られた一連のクロマトグラムである。
【図3】二重鎖濃度の関数としてプロットされた二重鎖ピークのピーク面積％のグラフである。
【図4】オルパシラン試料を水（Ａ１０Ａ－Ｗ）、酢酸アンモニウム（Ａ１０Ａ－Ｎ）、又はＨＦＩＰ／ＴＥＡ（Ａ１０Ａ－Ｈ）中で調製した場合のアンチセンス鎖及び四重鎖のピークを示す一連のクロマトグラムである。
【図5】オルパシラン試料を水中で調製し、加熱した場合（下）、又は加熱しなかった場合（上）のアンチセンス鎖及び四重鎖のピークを示す一対のクロマトグラムである。
【図6】オルパシラン試料を酢酸アンモニウム中で調製して加熱した場合と加熱しない場合のアンチセンス鎖及び四重鎖のピークを示す一対のクロマトグラムである。
【図7】水溶媒を含む加熱試料におけるアンチセンス／四重鎖平衡の例示的なクロマトグラムである。
【図8】濃度の関数としてプロットされた四重鎖ピークのピーク面積％のグラフである。
【図9A】実施例６に記載の第１の方法に従って本開示の例示的な方法を実施した際に得られた重ね書きされたクロマトグラムである。
【図9B】実施例６に記載の第１の方法に従って本開示の例示的な方法を実施した際に得られた並べられたクロマトグラムである。
【図10A】実施例６に記載の第２の方法に従って本開示の例示的な方法を実施した際に得られた重ね書きされたクロマトグラムである。
【図10B】実施例６に記載の第２の方法に従って本開示の例示的な方法を実施した際に得られた並べられたクロマトグラムである。
【図10C】実施例６に記載の第３の方法に従って本開示の例示的な方法を実施した際に得られた重ね書きされたクロマトグラムである。
【図10D】実施例６に記載の第３の方法に従って本開示の例示的な方法を実施した際に得られた並べられたクロマトグラムである。
【図11】二重鎖についての濃度の関数としてプロットされたピーク面積％のグラフである。
【図12】センス鎖についての濃度の関数としてプロットされたピーク面積％のグラフである。
【図13】アンチセンス鎖についての濃度の関数としてプロットされたピーク面積％のグラフである。
【図14】四重鎖についての濃度の関数としてプロットされたピーク面積％のグラフである。
【図15】加熱－冷却処理の影響を試験するために行った試験のスキームである。
【図16A】加熱－冷却処理の前後の、水中で調製されたアンチセンス鎖溶液の重ね書きされたクロマトグラムを示す。
【図16B】加熱－冷却処理の前後の、水中で調製されたアンチセンス鎖溶液の重ね書きされたクロマトグラムを示す。
【図17A】加熱－冷却処理の前後の、７５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中のアンチセンス鎖溶液の重ね書きされたクロマトグラムを示す。
【図17B】加熱－冷却処理の前後の、７５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中のアンチセンス鎖溶液の重ね書きされたクロマトグラムを示す。
【図18】３＋及び４＋の電荷状態の狭い電荷状態分布を提供する提案されたアンチセンス一本鎖に関連するＭＳスペクトルである。
【図19】濃縮されたＧ－四重鎖試料から得られたＭＳスペクトルであり、ＭＳシグナルはより高いｍ／ｚで観察された。
【図20】動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定されたサイズの関数としてプロットされた強度のグラフである。
【図21】ＤＬＳによって測定されたサイズの関数としてプロットされた体積のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0028】
本発明は、分子種の混合物からグアニンリッチオリゴヌクレオチドを分離する方法を提供する。例示的な態様では、混合物の少なくとも１つの分子種は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される四重鎖である。例示的な実施形態では、方法は、（ａ）疎水性リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスに混合物を適用することであって、前記疎水性リガンドがＣ４～Ｃ８アルキル鎖を含み、分子種が疎水性リガンドに結合すること；及び（ｂ）酢酸塩の勾配とアセトニトリルの勾配とを含む移動相をクロマトグラフィーマトリックスに適用して、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を溶出すること；を含み、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは第１のセットの溶出画分で溶出し、四重鎖は第２のセットの溶出画分で溶出する。
【0029】
本発明の方法により分離しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、３個以上の連続するグアニン塩基の少なくとも１つの配列モチーフを含むオリゴヌクレオチドである。他の塩基により分離されるこのような配列モチーフを含有するオリゴヌクレオチド（Ｇ－トラクトとも呼ばれる）は、自然に折りたたまれて四重鎖（Ｇ－四重鎖又は四重体とも呼ばれる）二次構造になることが観察されている。例えば、Ｂｕｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３４：５４０２－５４１５，２００６及びＲｈｏｄｅｓ ａｎｄ Ｌｉｐｐｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．４３：８６２７－８６３７，２０１５を参照。四重鎖は、フーグスティーン水素結合により安定化される環状配置への４個のグアニン塩基の会合から形成される平面状Ｇ－カルテットから組み立てられる四本鎖のヘリックス構造である。Ｇ－カルテットは、四本鎖のヘリックス四重鎖構造を形成させるために互いの上に重なることができる。Ｂｕｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００６及びＲｈｏｄｅｓ ａｎｄ Ｌｉｐｐｓ，２０１５を参照。オリゴヌクレオチド中に存在するＧ－トラクト（すなわち３個以上の連続グアニン塩基の配列モチーフ）の数に依存して、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子内又は分子間フォールディングから四重鎖が形成され得る。例えば、４個以上のＧ－トラクトを含む単一のオリゴヌクレオチドの分子内フォールディングから四重鎖が形成され得る。或いは、少なくとも２個のＧ－トラクトを含む２個のオリゴヌクレオチド又は少なくとも１個のＧ－トラクトを含む４個のオリゴヌクレオチドの分子間フォールディングから四重鎖が形成され得る。Ｂｕｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，２００６及びＲｈｏｄｅｓ ａｎｄ Ｌｉｐｐｓ，２０１５を参照。
【0030】
特定の実施形態では、本発明の方法により分離しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、３個の連続グアニン塩基の少なくとも１つの配列モチーフを有する。他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、４個の連続グアニン塩基の少なくとも１つの配列モチーフを有する。また他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、３個の連続グアニン塩基の単一の配列モチーフを有する。さらに他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、４個の連続グアニン塩基の単一配列モチーフを有する。一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、少なくとも４個の連続グアニン塩基の配列を有する。本発明の方法で使用されるグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、四重鎖を形成するコンセンサス配列、例えばテロメアで見出されるもの又はある一定のプロモーター領域で見られるものなどを含有し得る。例えば、一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドはＴＴＡＧＧＧの配列モチーフ（配列番号５）を含み得る。別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、ＧＧＧＧＣＣの配列モチーフ（配列番号６）を含み得る。別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、（ＧｐＮｑ）ｎの配列モチーフを含み得、ここでＧはグアニン塩基であり、Ｎはいずれかの核酸塩基であり、ｐは少なくとも３であり、ｑは１～７であり、ｎは１～４である。特定の実施形態では、ｐは３又は４である。
【0031】
本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのオリゴマー又はポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又はそれらの組み合わせを含み得る。オリゴヌクレオチドは、数ヌクレオチド長から最大数百ヌクレオチド長、例えば約１０ヌクレオチド長～約３００ヌクレオチド長、約１２ヌクレオチド長～約１００ヌクレオチド長、約１５ヌクレオチド長～約２５０ヌクレオチド長、約２０ヌクレオチド長～約８０ヌクレオチド長、約１５ヌクレオチド長～約３０ヌクレオチド長、約１８ヌクレオチド長～約２６ヌクレオチド長、又は約１９ヌクレオチド長～約２３ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、本発明の方法により精製しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６ヌクレオチド長である。一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは約１９ヌクレオチド長である。別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは約２０ヌクレオチド長である。また別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは約２１ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは約２３ヌクレオチド長である。
【0032】
グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、細胞又は生物から単離される天然のオリゴヌクレオチドであり得る。例えば、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ由来又はゲノムＤＮＡの断片、特にテロメア又はプロモーター領域、であり得るか、又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）由来又はｍＲＮＡの断片、特に５’若しくは３’非翻訳領域であり得る。一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、化学合成法又はインビトロ酵素法により作製される合成オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、前駆ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）、抗ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えばアンタゴミル及びａｎｔｉｍｉＲ）又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ分子又はＲＮＡ干渉剤、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）など、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ模倣物の構成成分鎖の１つであり得る
【0033】
特定の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、疾患又は障害に関連する遺伝子又はＲＮＡ分子を標的とするように設計された治療用オリゴヌクレオチドである。例えば、一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、少なくとも３又は少なくとも４個の連続シトシン塩基を有する標的遺伝子又はｍＲＮＡ配列の領域に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。第１の配列を含むオリゴヌクレオチドが、特定の条件下で第２の配列を含むオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成して二本鎖領域を形成し得る場合、第１の配列は、第２の配列に「相補的」である。「ハイブリッド形成する」又は「ハイブリッド形成」は、典型的には２つのオリゴヌクレオチドにおける相補的塩基間の水素結合（例えばワトソン－クリック、フーグスティーン又は逆フーグスティーン水素結合）を介した、相補的ポリヌクレオチドの対形成を指す。第１の配列を含むオリゴヌクレオチドが、第２の配列を含むオリゴヌクレオチドと、ミスマッチなく、一方又は両方のヌクレオチド配列の全長にわたって塩基対形成する場合、第１の配列は、第２の配列と完全に相補的（１００％相補的）であるとみなされる。
【0034】
別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ又は他のタイプの二本鎖ＲＮＡ干渉剤のアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖は、少なくとも３又は少なくとも４個の連続シトシン塩基を有する標的遺伝子又はｍＲＮＡ配列の領域に相補的な配列を含む。また別の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ又は他のタイプの二本鎖ＲＮＡ干渉剤のセンス鎖であり、このセンス鎖は、少なくとも３又は少なくとも４個の連続グアニン塩基を有する標的遺伝子又はｍＲＮＡ配列の領域と同一である配列を含む。標的配列（例えば標的ｍＲＮＡ）に相補的な配列を有する領域を含む、ｓｉＲＮＡ又は他のタイプの二本鎖ＲＮＡ干渉剤の鎖は、「アンチセンス鎖」と呼ばれる。「センス鎖」は、アンチセンス鎖の領域と相補的な領域を含む鎖を指す。
【0035】
本発明の方法により精製しようとするグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１個以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、ペントース環又はホスフェート基に対する１つ以上の化学修飾を有するヌクレオチドを指す。このような修飾ヌクレオチドとしては、２’糖修飾（２’－Ｏ－メチル、２’－メトキシエチル、２’－フルオロ、デオキシヌクレオチドなど）があるヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、逆ヌクレオチド（３’－３’結合ヌクレオチド）、ホスホロチオエート連結ヌクレオチド、二環式糖修飾があるヌクレオチド（例えばＬＮＡ、ＥＮＡ）、及び塩基類似体（例えばユニバーサル塩基、５－メチルシトシン、シュードウラシルなど）を含むヌクレオチドが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0036】
特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、リボース糖の修飾を有する。当該糖修飾として、ペントース環の２’位及び／又は５’位での修飾、並びに二環式糖修飾が挙げられ得る。２’修飾ヌクレオチドは、ＯＨ以外の置換基を２’位に有するペントース環を有するヌクレオチドを指す。このような２’－修飾としては、２’－Ｈ（例えばデオキシリボヌクレオチド）、２’－Ｏ－アルキル（例えばＯ－Ｃ１～Ｃ１０又はＯ－Ｃ１～Ｃ１０置換アルキル）、２’－Ｏ－アリル（Ｏ－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’－Ｃ－アリル、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル（ＯＣＨ３）、２’－Ｏ－メトキシエチル（Ｏ－（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’－ＯＣＦ３、２’－Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、２’－Ｏ－アミノアルキル、２’－アミノ（例えばＮＨ２）、２’－Ｏ－エチルアミン、及び２’－アジドが挙げられるが、これらに限定されない。ペントース環の５’位での修飾として、５’－メチル（Ｒ又はＳ）；５’－ビニル、及び５’－メトキシが挙げられるが、これらに限定されない。「二環式糖修飾」は、ペントース環の修飾を指し、この場合、架橋が環の２つの原子を接続して、二環式糖構造をもたらす第２の環を形成する。一部の実施形態において、二環式糖修飾は、ペントース環の４’炭素と２’炭素との間の架橋を含む。二環式糖修飾を有する糖部分を含むヌクレオチドは、本明細書中で二環式核酸又はＢＮＡと称される。例示的な二環式糖修飾として下記が挙げられるが、これらに限定されない：α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）二環式核酸（ＢＮＡ）；β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ（ロックド核酸又はＬＮＡとも称されている）；エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ；アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；オキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ；メチル（メチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束エチル又はｃＥｔとも称されている）；メチレン－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ；メチレン－アミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ；メチル炭素環式（４’－ＣＨ２－ＣＨ（ＣＨ３）－２’）ＢＮＡ；プロピレン炭素環式（４’－（ＣＨ２）３－２’）ＢＮＡ；及びメトキシ（エチレンオキシ）（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＭｅ）－Ｏ－２’）ＢＮＡ（拘束ＭＯＥ又はｃＭＯＥとも称されている）。グアニンリッチオリゴヌクレオチドに組み込まれ得るこれら及び他の糖修飾ヌクレオチドは、全てそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されている。
【0037】
一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上の、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、二環式核酸（ＢＮＡ）又はそれらの組み合わせを含む。特定の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上の、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド又はそれらの組み合わせを含む。特定の一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。別の特定の一実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。
【0038】
本発明の方法で使用され得るグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合も含み得る。本明細書中で用いられる用語「修飾ヌクレオチド間結合」は、天然の３’－５’ホスホジエステル結合以外のヌクレオチド間結合を指す。一部の実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネート、３’－アルキレンホスホネート）、ホスフィネート、ホスホロアミデート（例えば３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート）、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル及びボラノホスフェートなどのリン含有ヌクレオチド間結合である。一実施形態では、修飾ヌクレオチド間結合は、２’－５’ホスホジエステル結合である。他の実施形態において、修飾ヌクレオチド間結合は、リン非含有ヌクレオチド間結合であるため、修飾ヌクレオシド間結合と称され得る。そのようなリン非含有結合として、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン結合（－Ｏ－Ｓｉ（Ｈ）２－Ｏ－）；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン結合；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル結合；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンメチルイミノ（－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－Ｏ－ＣＨ２－）及びメチレンヒドラジノ結合；スルホネート及びスルホンアミド結合；アミド結合；並びにＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成要素部分が混合された他のものが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、修飾ヌクレオシド間結合は、米国特許第５，５３９，０８２号明細書、米国特許第５，７１４，３３１号明細書、及び米国特許第５，７１９，２６２号明細書に記載されているもの等のペプチド核酸又はＰＮＡを作出するためのペプチドベースの結合（例えばアミノエチルグリシン）である。グアニンリッチオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る他の適切な修飾されたヌクレオチド間及びヌクレオシド間結合は、全てそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６９３，１８７号明細書、米国特許第９，１８１，５５１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０１２２７６１号明細書及びＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９：９３７－９５４，２０１２に記載されている。
【0039】
特定の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれを超えるホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。一部の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチド中のヌクレオチド間結合の全てがホスホロチオエートヌクレオチド間結合である。他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、３’末端、５’末端又は３’及び５’末端の両方で１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。例えば、特定の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、３’末端で約１～約６個又はそれを超える（例えば約１、２、３、４、５、６個又はそれを超える）連続ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、５’末端で約１～約６個又はそれを超える（例えば約１、２、３、４、５、６個又はそれを超える）連続ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【0040】
本発明の方法で使用されるグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の技術を使用して、例えば従来の核酸固相合成を使用して容易に製造することができる。本オリゴヌクレオチドは、標準ヌクレオチド又はヌクレオシド前駆体（例えばホスホラミダイト）を利用する適切な核酸合成装置上で構築され得る。自動核酸合成装置は、いくつかの業者により市販されており、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からのＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置、ＢｉｏＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｇ，ＴＸ）からのＭｅｒＭａｄｅ合成装置及びＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）からのＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ合成装置が挙げられる。２’シリル保護基をリボヌクレオシドの５’位で酸不安定性のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）と一緒に使用して、ホスホラミダイト化学を介してオリゴヌクレオチドを合成し得る。最終脱保護条件は、ＲＮＡ産物を著しく分解しないことが知られている。全ての合成は、任意の自動又は手動合成装置により、大規模、中規模、又は小規模で行うことができる。また、合成は、複数のウェルプレート、カラム、又はスライドガラスにおいて実行することができる。２’－Ｏ－シリル基は、フッ化物イオンへの曝露を介して除去され得、フッ化物イオンとして、フッ化物イオンの何らかの供給源、例えば無機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化セシウム及びフッ化カリウム、又は有機対イオンと対になるフッ化物イオンを含有する塩、例えばフッ化テトラアルキルアンモニウムが挙げられ得る。クラウンエーテル触媒が、脱保護反応において無機フッ化物と組み合わせて利用され得る。好ましいフッ化物イオン供給源として、フッ化テトラブチルアンモニウム又はアミノヒドロフルオリド（例えば、双極性非プロトン溶媒、例えばジメチルホルムアミド中での水性ＨＦの、トリエチルアミンとの組み合わせ）がある。所望の化合物を与えるために、様々な合成段階を代替的な順番又は順序で実施し得る。オリゴヌクレオチドの合成において有用な他の合成化学変換、保護基（例えば、塩基に存在するヒドロキシル、アミノなどのため）及び保護基の手法（保護及び脱保護）は、当技術分野で公知であり、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ ａｎｄ Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９４）；及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９９５）並びにそれらの後続版に記載のものなどを含む。
【0041】
様々な態様では、本発明の方法で使用されるグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、５’－ＵＣＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＡＧＧＧＧＣＵＧ－３’（配列番号２）の配列を含むか、又はそれからなる。いくつかのそのような実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、５’－ｕｓＣｆｓｇＵｆａＵｆａａｃａａＵｆａＡｆｇＧｆｇＧｆｃｓＵｆｓｇ－３’（配列番号４）の配列に従う修飾ヌクレオチドの配列を含むか、又はそれからなり、ここで、ａ、ｇ、ｃ、及びｕは、それぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルシチジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、及びＵｆは、それぞれ２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）アデノシン、２’－フルオログアノシン、２’－フルオロシチジン、及び２’’－フルオロウリジンであり；ｓはホスホロチオエート結合である。様々な場合において、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの相補的オリゴヌクレオチドは、５’－ＣＡＧＣＣＣＣＵＵＡＵＵＧＵＵＡＵＡＣＧＡ－３’（配列番号１）の配列を含むか、又はそれからなる。関連する実施形態では、相補的オリゴヌクレオチドは、５’－ｃｓａｇｃｃｃｃｕＵｆＡｆＵｆｕｇｕａｕａｕａｃｇｓ（ｉｎｖｄＡ）－３’（配列番号３）の配列に従う修飾ヌクレオチドの配列を含むか、又はそれからなり、ここで、ａ、ｇ、ｃ、及びｕは、それぞれ２’－Ｏ－メチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルシチジン、及び２’－Ｏ－メチルウリジンであり；Ａｆ、Ｇｆ、Ｃｆ、及びＵｆは、それぞれ２’－デオキシ－２’－フルオロ（「２’－フルオロ」）アデノシン、２’－フルオログアノシン、２’－フルオロシチジン、及び２’－フルオロウリジンであり；ｉｎｖｄＡは逆位デオキシアデノシン（３’－３’連結ヌクレオチド）であり、ｓはホスホロチオエート結合である。例示的な態様では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖であり、その相補的オリゴヌクレオチドはセンス鎖である。様々な態様では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドとその相補的オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成して二重鎖を形成する。特定の実施形態では、二重鎖は、配列番号３による修飾ヌクレオチドの配列を含むセンス鎖と、配列番号４による修飾ヌクレオチドの配列を含むアンチセンス鎖とを含むオルパシランであり得る。オルパシランの構造は図１に示されており、これは実施例１でさらに説明される。
【0042】
当業者によって理解され得るように、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを合成するさらなる方法は、当業者にとって明らかであろう。例えば、オリゴヌクレオチドは、Ｊｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．５７：１８２１－１８３２，２０１８に記載の方法などで、インビトロ系で酵素を使用して合成され得る。天然のオリゴヌクレオチドは、従来の方法を使用して細胞又は生物から単離され得る。オリゴヌクレオチドのカスタム合成は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）、ＡｘｏＬａｂｓ ＧｍｂＨ（Ｋｕｌｍｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含むいくつかの供給業者からも入手可能である。
【0043】
本発明の方法は、溶液中で１つ以上の不純物又は他の分子種からグアニンリッチオリゴヌクレオチド又は四重鎖構造を精製又は分離するために使用され得る。「精製する」又は「精製」は、標的分子（例えばグアニンリッチオリゴヌクレオチド又は四重鎖）とは異なり、最終組成物又は調製物から望ましくは排除される物質の量を減少させる工程を指す。「不純物」という用語は、標的分子とは異なる構造を有する物質を指し、この用語は、単一の不要な物質又はいくつかの不要な物質の組み合わせを含み得る。不純物は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを作製するための方法で使用される材料又は試薬並びこのオリゴヌクレオチドの断片又は他の不要な誘導体若しくは形態を含み得る。特定の実施形態では、不純物は、標的のグアニンリッチオリゴヌクレオチドより長さが短い１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。これら及び他の実施形態では、不純物は１つ以上の失敗配列を含む。失敗配列は、標的オリゴヌクレオチドの合成中に生じ得、オリゴヌクレオチド鎖へのヌクレオチド単量体の段階的付加中のカップリング反応の失敗から生じ得る。オリゴヌクレオチド合成反応の生成物は、標的オリゴヌクレオチド及び標的オリゴヌクレオチドよりも長さが短い様々な失敗配列（すなわち標的オリゴヌクレオチドの短縮型）を含む様々な長さのオリゴヌクレオチドの不均一な混合物であることが多い。一部の実施形態では、不純物は、１つ以上の工程に関連する不純物を含む。グアニンリッチオリゴヌクレオチドを作製するための合成方法に依存して、このような工程関連不純物としては、ヌクレオチド単量体、保護基、塩、酵素及び内毒素が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【0044】
本明細書で開示の方法の例示的な実施形態では、方法は、分子種の混合物からグアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離する。本明細書で使用される「分子種」という用語は、グアニンリッチオリゴヌクレオチド自体、その相補的オリゴヌクレオチド、及びグアニンリッチオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのコピーを含むあらゆる高次形態を包含し、これには、Ｇ－リッチオリゴヌクレオチドの分子間又は分子内の会合から形成されるグアニンリッチオリゴヌクレオチドの四重鎖が含まれるが、これらに限定されない。様々な態様における「分子種」という用語は、その相補的オリゴヌクレオチド、例えば二重鎖にハイブリッド形成したグアニンリッチオリゴヌクレオチド、及び一本鎖の形態で存在するその相補的オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成していないグアニンリッチオリゴヌクレオチドを包含する。様々な場合において、「分子種」という用語は、その一本鎖形態の相補的オリゴヌクレオチドを包含する。様々な態様では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のセンス鎖又はアンチセンス鎖である。任意選択的には、グアニンリッチオリゴヌクレオチドが分離される混合物は、一本鎖分子種及び／又は二本鎖分子種を含む。様々な態様では、混合物は、アンチセンス一本鎖、センス一本鎖、二重鎖、及び四重鎖からなる群から選択される１つ以上の分子種を含む。例示的な態様では、混合物の少なくとも１つの分子種は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成された四重鎖である。いくつかのそのような実施形態では、四重鎖は４つのグアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成される。グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、様々な態様では、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖である。これら及び他の実施形態では、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、アンチセンスグアニンリッチ鎖と、グアニンリッチアンチセンス鎖に相補的なセンス鎖とを含む。例示的な場合において、混合物は以下の分子種の全てを含む：アンチセンス一本鎖、センス一本鎖、二重鎖、及び四重鎖。いくつかのそのような実施形態では、アンチセンス鎖又はセンス鎖のいずれかがグアニンリッチオリゴヌクレオチドであり、二重鎖はセンス鎖とハイブリッド形成したアンチセンス鎖を含み、四重鎖はグアニンリッチオリゴヌクレオチドである鎖から形成される。
【0045】
様々な実施形態では、方法は、分子種の混合物からグアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種をクロマトグラフィーにより分離する。様々な態様では、方法は、混合物の分子種を分離するためのクロマトグラフィーを含む。例示的な場合において、クロマトグラフィーは分析クロマトグラフィーである。他の例示的な場合において、クロマトグラフィーは分取クロマトグラフィーである。例示的な態様では、混合物の各分子種は、それがマトリックスから溶出する時間によって分離される。様々な場合において、混合物の各分子種は、異なる分子種が溶出する時間とは区別できる時間に溶出する。例えば、例示的な場合において、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、四重鎖が溶出する時間とは区別できる時間に溶出する。例示的な態様では、混合物は以下の分子種の全てを含む：アンチセンス一本鎖、センス一本鎖、二重鎖、及び四重鎖。例示的な場合において、各分子種が固有の時間で溶出するように、二重鎖が第１の時間に溶出し、センス鎖が第２の時間に溶出し、アンチセンス鎖が第３の時間に溶出し、四重鎖が第４の時間に溶出する。任意選択的には、各分子種は、別の分子種とは別の画分で溶出する。例示的な態様では、二重鎖は第１のセットの溶出画分で溶出し、センス鎖は第２のセットの溶出画分で溶出し、アンチセンス鎖は第３のセットの溶出画分で溶出し、四重鎖は第４のセットの溶出画分で溶出する。様々な態様では、分子種は逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって分離される。逆相クロマトグラフィー、例えばＲＰ－ＨＰＬＣは、先行技術において非常に詳細に記載されている。例えば、Ｒｅｖｅｒｓｅｄ Ｐｈａｓｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．ＡＡ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）を参照。様々な場合において、分子種はＲＰ－ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって分離される。例示的な場合において、分子種はクロマトグラフィーによって分離され、その分離は高い分解能を有するものとして特徴付けられる。様々な態様では、各分子種のピークの分離の分解能（例えば二重鎖のピークとセンス一本鎖のピークとの間の分離の分解能）は、少なくとも若しくは約１．０、任意選択的には少なくとも若しくは約１．１、少なくとも若しくは約１．２、少なくとも若しくは約１．３、又は少なくとも若しくは約１．４である。様々な態様では、各分子種のピークの分離の分解能は、少なくとも若しくは約１．５、任意選択的には少なくとも若しくは約１．６、少なくとも若しくは約１．７、少なくとも若しくは約１．８、又は少なくとも若しくは約１．９である。任意選択的には、各分子種に対応するピークの分離の分解能（例えば二重鎖のピークとセンス一本鎖のピークとの間の分離の分解能）は、少なくとも又は約２．０（例えば少なくとも又は約２．１、少なくとも又は約２．２、少なくとも又は約２．３、少なくとも又は約２．４）である。様々な態様では、分離の分解能は、少なくとも又は約２．４である。例示的な場合において、分解能は少なくとも若しくは約２．５、少なくとも若しくは約３．０、又は少なくとも若しくは約４．０である。任意選択的には、二重鎖のピークとセンス鎖のピークとの間の分離の分解能は、少なくとも４．０である。様々な態様では、分離能は米国薬局方（ＵＳＰ）の分離能であり、これは、５０％の高さでピークに接する線を用いて計算されたベースラインピーク幅を使用するＵＳＰ分離能の式（式１）を使用して計算することができる：
Ｒ＝分解能、Ｒｔ＝保持時間、Ｗ１＋Ｗ２＝５０％のピーク高さにおけるピーク幅の合計
［式１］
（”Ｅｍｐｏｗｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ：Ｑｕｉｃｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ”Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．（２００２）から引用）
【数1】
［式１］
（”Ｅｍｐｏｗｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ：Ｑｕｉｃｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｕｉｄｅ”Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．（２００２）から引用）
【0046】
様々な態様では、シグナル対ノイズ比が１０．０以上である場合、各分子種の方法の定量限界（ＬＯＱ）は、約０．０３ｍｇ／ｍＬ～約０．０８ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．０３ｍｇ／ｍＬ、約０．０４ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ、約０．０６ｍｇ／ｍＬ、約０．０７ｍｇ／ｍＬ、約０．０８ｍｇ／ｍＬである。様々な場合において、シグナル対ノイズ比が１０．０以上である場合、ＬＯＱは約０．０８ｍｇ／ｍｌである。
【0047】
グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を含む混合物は、存在が望ましくない１つ以上の不純物又は汚染物質をさらに含み得る。混合物には、オリゴヌクレオチドを製造するための合成方法から生じる混合物が含まれ得る。例えば、一実施形態では、混合物は、自動合成装置から得られる合成反応混合物など、オリゴヌクレオチドを製造するための化学合成法由来の反応混合物である。このような実施形態では、溶液は失敗配列も含み得る。別の実施形態では、混合物はインビトロ酵素合成反応（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））からの混合物である。また別の実施形態では、例えばグアニンリッチオリゴヌクレオチドが細胞又は生物から単離された天然のオリゴヌクレオチドである場合、混合物は細胞溶解液又は生体試料である。さらに別の実施形態では、混合物は、クロマトグラフィー分離からの溶出液など、別の精製操作からの溶液又は混合物である。
【0048】
様々な態様では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を含む混合物は、水、酢酸塩源、カリウム源、及び塩化ナトリウムのうちの１つ以上を含む溶液中で調製される。様々な態様では、酢酸塩源は、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウムである。様々な場合において、カリウム源はリン酸カリウム又は酢酸カリウムである。例示的な態様では、溶液は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭ（例えば約５０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１３０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１２０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１１０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約５０ｍＭ～約９０ｍＭ、約５０ｍＭ～約８０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６０ｍＭ、約６０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約７０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約８０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約９０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１００ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１３０ｍＭ～約１４０ｍＭ）の酢酸塩又はカリウムを含む。いくつかの場合における溶液は、約７５ｍＭ～約１００ｍＭ（例えば約７５ｍＭ～約９５ｍＭ、約７５ｍＭ～約９０ｍＭ、約７５ｍＭ～約８５ｍＭ、約７５ｍＭ～約８０ｍＭ、約８０ｍＭ～約１００ｍＭ、約８５ｍＭ～約１００ｍＭ、約９０ｍＭ～約１００ｍＭ、約９５ｍＭ～約１００ｍＭ）の酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウムを含む。様々な態様では、溶液はリン酸カリウム及び塩化ナトリウムを含む。特定の理論に拘束されるものではないが、溶液中のカリウム、ナトリウム、及び／又はアンモニウムの存在は、四重鎖を安定化させる、及び／又はグアニンリッチオリゴヌクレオチド：：四重鎖の比率を安定化させる（例えばグアニンリッチオリゴヌクレオチド：：四重鎖の平衡を安定化させる）ため、これらの分子種はクロマトグラフィーでよりよく分離されると考えられる。様々な態様では、混合物は、水中で、任意選択的には精製された脱イオン水中で調製される。
【0049】
分子種の混合物を含む溶液が調製された後、それは疎水性リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスに適用される。任意選択的には、クロマトグラフィーマトリックスは、多孔質の不溶性ビーズマトリックスに化学的にグラフトされた疎水性リガンドを含む逆相クロマトグラフィーマトリックスである。様々な場合において、マトリックスは化学的及び機械的に安定である。任意選択的には、マトリックスはシリカ又は合成有機ポリマー（例えばポリスチレン）を含む。様々な態様では、クロマトグラフィーマトリックスは、２．１ｍｍの内径及び／又は約５０ｍｍのカラム長を有するクロマトグラフィーカラム内に収容される。任意選択的には、マトリックスは、疎水性リガンドが結合した１．７のエチレン架橋ハイブリッド（ＢＥＨ）粒子を含む。様々な場合において、各粒子は３００Åの細孔を含む、及び／又は約３．５μｍの粒径を有する。マトリックスの疎水性リガンドは、様々な態様では、Ｃ４アルキル鎖、Ｃ６アルキル鎖、又はＣ８アルキル鎖を含む。特定の態様では、リガンドはＣ４アルキル鎖を含む。適切なクロマトグラフィーマトリックスは市販されており、例えばＷａｔｅｒｓ（商標）ＢＥＨカラム（ＳＫＵ １８６００４４９８；Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）及びＣ４、Ｃ６、又はＣ８アルキル鎖を有する他の同様のカラム、例えばＨｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ（商標）Ｃ４ ＨＰＬＣカラム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、Ｐｏｌａｒ－ＲＰＨＰＬＣカラム（Ｈａｗａｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｘｉ‘ａｎ Ｃｉｔｙ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ＰＲ Ｃｈｉｎａ）、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＲＰ－ｍＡｂカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）が挙げられる。
【0050】
混合物がクロマトグラフィーマトリックスに適用された後、移動相がクロマトグラフィーマトリックスに適用される。例示的な態様では、移動相は酢酸塩の勾配とアセトニトリルの勾配とを含む。様々な場合において、酢酸塩の勾配は、約５０ｍＭ～約１５０ｍＭの酢酸塩、例えば約５０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１３０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１２０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１１０ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約５０ｍＭ～約９０ｍＭ、約５０ｍＭ～約８０ｍＭ、約５０ｍＭ～約７０ｍＭ、約５０ｍＭ～約６０ｍＭ、約６０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約７０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約８０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約９０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１００ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１１０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１２０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約１３０ｍＭ～約１４０ｍＭの酢酸塩を含む酢酸塩原液を用いて製造される。任意選択的には、酢酸塩原液は、約７０ｍＭ～約８０ｍＭの酢酸塩、任意選択的には約７５ｍＭの酢酸塩、又は約９０ｍＭ～約１１０ｍＭの酢酸塩、任意選択的には約１００ｍＭの酢酸塩を含む。様々な態様では、酢酸塩は、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、又は酢酸カリウムである。本明細書では他の対イオンも想定される。特定の実施形態では、酢酸塩は酢酸アンモニウムである。酢酸塩原液のｐＨは、様々な場合において、約６．５～約７．０（例えば６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０）である。例えば、酢酸塩原液のｐＨは約６．７、又は約６．８～約７．０である。様々な場合において、酢酸塩原液は、６．７±０．１のｐＨを有する７５ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液である。例示的な態様では、アセトニトリルの勾配はアセトニトリル原液を用いて製造され、アセトニトリル原液は１００％のアセトニトリルである。例示的な態様では、移動相は、酢酸塩の減少する濃度勾配と、アセトニトリルの増加する濃度勾配とを含む。酢酸塩の勾配は、様々な態様では、最大濃度で始まり、第１の期間の間に最小濃度まで徐々に減少する。例示的な場合において、第１の期間は約１８分～約１９分である。代替の場合において、第１の期間は約２２分～約２６分である。例示的な態様では、第１の期間の後、移動相の酢酸塩の濃度は、酢酸塩の最大濃度まで増加する。様々な場合において、移動相の酢酸塩の濃度は、勾配が酢酸塩の最小濃度に到達してから約０．１～約３分後に、酢酸塩の最大濃度まで増加する。様々な場合において、アセトニトリルの勾配は最小濃度から始まり、第１の期間の間に最大濃度まで徐々に増加する。任意選択的には、第１の期間の後、移動相のアセトニトリルの濃度は、アセトニトリルの最小濃度まで減少する。例えば、移動相のアセトニトリルの濃度は、アセトニトリルの勾配がアセトニトリルの最大濃度に到達してから約０．１～約３分後に、最小濃度まで減少する。様々な場合において、方法は、以下の条件に従って移動相をクロマトグラフィーマトリックスに適用することを含む。
【0051】
【表4】
【0052】
代替の場合において、方法は、以下の条件に従って移動相をクロマトグラフィーマトリックスに適用することを含む。
【0053】
【表5】
【0054】
代替の又は追加の態様では、方法は、以下の条件に従って移動相をクロマトグラフィーマトリックスに適用することを含む。
【0055】
【表6】
【0056】
本発明の方法の一部の実施形態では、移動相は、カチオン性イオン対形成剤を含まない。イオン対形成剤は、イオン相互作用により溶質分子に結合し、溶質分子の疎水性を高め、選択性を変化させると考えられている。高度に負に帯電しているオリゴヌクレオチドについては、逆相クロマトグラフィーによる分離を実現するために移動相にカチオン性イオン対形成剤が含まれることが多く、必要なことさえもある。実施例に記載されているように、本発明の方法は、移動相にカチオン性イオン対形成剤を必要とせず、好ましくは、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種の高分離能分離を実現するためには、これは移動相から除かれる。カチオン性イオン対形成剤は当技術分野で公知であり、トリアルキルアンモニウム種、酢酸ヘキシルアンモニウム（ＨＡＡ）、塩化テトラメチルアンモニウム、塩化テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ｔｅｒｔ－ブチルアミン、プロピルアミン、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ジメチルｎ－ブチルアミン（ＤＭＢＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0057】
様々な態様における移動相は、少なくとも約２５分且つ４０分未満の総実行時間にわたり、クロマトグラフィーマトリックスに適用される。様々な態様では、総実行時間は３５分未満であり、任意選択的には３０分以下である。任意選択的には、総実行時間は約２２分～約２６分である。
【0058】
クロマトグラフィーマトリックスでの分離は、周囲温度で行われ得る。例えば、一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスでの分離は、約２０℃～約３５℃の温度で行われる。他の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスでの分離は約３０℃の温度で行われる。四重鎖二次構造の形成及び安定性、並びにグアニンリッチオリゴヌクレオチドと四重鎖との間の平衡は、温度の影響を受ける場合がある。したがって、一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスでの分離は、約２０℃未満、１５℃未満、又は１０℃未満、例えば約８℃の温度で行われる。
【0059】
移動相がクロマトグラフィーマトリックスに適用され得る際の適切な流量としては、約０．５ｍＬ／分～約１．５ｍＬ／分が挙げられるが、これに限定されない。特定の実施形態では、移動相は、約０．５ｍＬ／分～約１．０ｍＬ／分の流量でクロマトグラフィーマトリックスに適用される。他の実施形態では、移動相は、約０．６ｍＬ／分～約０．９ｍＬ／分の流量でクロマトグラフィーマトリックスに適用される。さらに他の実施形態では、移動相は、約０．７ｍＬ／分～約０．８ｍＬ／分の流量でクロマトグラフィーマトリックスに適用される。一実施形態では、移動相は、約０．７ｍＬ／分又は０．８ｍＬ／分の流量でクロマトグラフィーマトリックスに適用される。当業者は、許容可能な圧力レベルを維持するために、クロマトグラフィーマトリックスの孔径及びカラムのベッドボリュームに応じて、移動相の他の適切な流量を決定することができる。
【0060】
様々な態様では、本方法は、移動相をクロマトグラフィーマトリックスに適用して、混合物中に存在するグアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を溶出することを含む。様々な場合において、少なくともグアニンリッチオリゴヌクレオチドは、四重鎖の溶出する時間とは区別できる時間に溶出する。様々な態様では、混合物の各分子種は、別の分子種が溶出する時間とは区別できる時間に溶出する。様々な場合において、混合物の各分子種は、別の分子種とは別の画分で溶出する。様々な態様では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは第１のセットの溶出画分で溶出し、四重鎖は第２のセットの溶出画分で溶出する。例えば、グアニンリッチオリゴヌクレオチドと、グアニンリッチオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドと、相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成したグアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む二重鎖と、グアニンリッチオリゴヌクレオチドから形成された四重鎖とを混合物が含む実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチド化合物は四重鎖とは別に溶出し、四重鎖は二重鎖及び相補的オリゴヌクレオチドとは別に溶出する。いくつかのそのような実施形態では、二重鎖は第１のセットの溶出画分で溶出し、相補的オリゴヌクレオチドは第２のセットの溶出画分で溶出し、グアニンリッチオリゴヌクレオチドは第３のセットの溶出画分で溶出し、四重鎖は第４のセットの溶出画分で溶出する。様々な態様では、この方法は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの各分子種の高分解能分離を実現する。
【0061】
本開示の様々な態様では、分子種を含む混合物が本明細書に記載の移動相と共にクロマトグラフィーマトリックスを通って移動するのに伴い、溶出画分が回収される。様々な態様では、方法は、溶出画分を一定期間に別々の容器に回収することをさらに含む。様々な態様では、方法は、紫外線検出器を使用して分子種の溶出を監視することを含む。２６０ｎｍ又は２９５ｎｍにおけるＵＶ吸収を使用して、画分中のオリゴヌクレオチド成分を監視することができる。図におけるクロマトグラムにより示されるように、クロマトグラフィーが本発明の方法に従い操作される場合、一本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、四重鎖の前にクロマトグラフィーマトリックスから溶出し、したがって、一本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドについての及び四重鎖についての画分の個別のセットの回収が可能になる。一本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチド及び四重鎖についての画分の濃縮を検証するために、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、イオン対形成逆相液体クロマトグラフィー－質量分析、分析的イオン交換クロマトグラフィー及び／又はネイティブ質量分析によって溶出画分からの試料を分析することができる。
【0062】
本発明の方法の特定の実施形態では、一本鎖グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含む溶出画分又は溶出画分のセットが単離され、任意選択的にさらなる処理のためにプールすることができる。例えば、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含有する溶出画分は、１つ以上のさらなる精製段階、例えばアフィニティー分離（例えば配列特異的な試薬を用いた核酸ハイブリッド形成）、イオン交換クロマトグラフィー段階（例えば異なる固定相を使用）、さらなる逆相クロマトグラフィー、又はサイズ排除クロマトグラフィー（例えば脱塩カラムによる）を受けることができる。これら及び他の実施形態では、グアニンリッチオリゴヌクレオチドを含有する溶出画分は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの構造を修飾するための他の反応を受けることができる。例えば、グアニンリッチオリゴヌクレオチドが治療用分子（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）又は治療用分子の構成成分（例えば二本鎖ＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ）である実施形態では、溶出画分中の精製グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、標的化リガンド、例えば炭水化物含有リガンド、コレステロール、抗体などをオリゴヌクレオチドに共有結合させるための共役反応を受けることができる。他の実施形態では、溶出画分中の精製グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、エキソソーム、リポソーム又は他のタイプの脂質ナノ粒子中にカプセル封入することができ、或いは治療目的での患者への投与のための薬学的に許容可能な賦形剤と共に医薬組成物中に配合することができる。グアニンリッチオリゴヌクレオチドが二本鎖ＲＮＡ干渉剤（例えばｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか）の構成成分である実施形態では、溶出画分中の精製グアニンリッチオリゴヌクレオチドは、グアニンリッチオリゴヌクレオチドをその相補鎖とハイブリッド形成させて、二本鎖ＲＮＡ干渉剤を形成させるためのアニーリング反応を受けることができる。本発明の方法の一部の実施形態では、四重鎖を含む溶出画分又は溶出画分のセットを単離することができ、任意選択的にはさらなる処理のためにプールすることができる。四重鎖は、様々な系で四重鎖構造の機能を試験及び評価するための後続のアッセイ又は分析においてインタクトな構造として使用することができる。
【0063】
本明細書に開示の方法の例示的な態様では、方法は非変性方法であるか、又は分子種の混合物中に存在するグアニンリッチオリゴヌクレオチドの四重鎖、二重鎖、又は他の高次構造が変性条件にさらされるような変性ステップを含まない。変性条件には、温度の上昇、ｐＨの上昇、カオトロピック剤への曝露、移動相以外の有機薬剤への曝露、又はこれらの条件のいずれかの組み合わせによる変性が含まれ得る。したがって、例示的な態様では、方法は、クロマトグラフィーマトリックスを加熱することによる変性、又はＧ－カルテットを形成するグアニン塩基間の水素結合相互作用を破壊するのに十分な高温での分離を行うことを含まない。例えば、クロマトグラフィーマトリックスの温度は、約４５℃～約９５℃、約５５℃～約８５℃、又は約６５℃～約７５℃など、４５℃を超える温度には加熱されない。他の実施形態では、移動相は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの四重鎖構造及び他の高次構造を変性させ得る強アルカリ性範囲のｐＨを有さない。例えば、移動相のｐＨは約８．０未満である。特定の実施形態では、本発明の方法で使用される移動相はカオトロピック剤を含まない。カオトロピック剤は、水素結合、ファンデルワールス力及び疎水性相互作用などの非共有結合力が介在する分子内相互作用に影響を及ぼすことにより、水分子間の水素結合ネットワークを破壊し、高分子の構造において秩序を低下させ得る物質である。カオトロピック剤としては、塩化グアニジニウム及び他のグアニジニウム塩、酢酸リチウム又は過塩素酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、ドデシル硫酸ナトリウム、尿素、チオ尿素、及びチオシアン酸塩（例えばチオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸アンモニウム、又はチオシアン酸カリウム）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0064】
本発明の方法は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの実質的に純粋な調製物を提供する。例えば、一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスからの溶出画分中のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。特定の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスからの溶出画分中のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は少なくとも８５％である。他の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスからの溶出画分中のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は少なくとも８８％である。さらに別の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスからの溶出画分中のグアニンリッチオリゴヌクレオチドの純度は少なくとも９０％である。オリゴヌクレオチドを検出及び定量する方法は当業者に公知であり、分析イオン交換法及びイオン対逆相液体クロマトグラフィー－質量分析法、並びに例えば実施例に記載の方法を含み得る。
【0065】
有利には、本開示の方法は、グアニンリッチオリゴヌクレオチド、その相補鎖、グアニンリッチオリゴヌクレオチドとその相補鎖とを含む四重鎖及び二重鎖についての高分解能分離を実現するために使用され得る。そのため、本明細書に開示の方法は、グアニンリッチオリゴヌクレオチド、グアニンリッチオリゴヌクレオチド原薬又は医薬品を含む試料の純度を決定するために有用である。したがって、本発明は、グアニンリッチオリゴヌクレオチド原薬又は医薬品を含む試料の純度を決定する方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離する本明細書に開示の方法に従って、グアニンリッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離することを含む。様々な態様では、試料は工程内試料であり、方法は、工程内コントロールアッセイの一部として、又はＧ－リッチオリゴヌクレオチドの製造が実質的な不純物を含まずに確実に行われるようにするためのアッセイとして使用される。様々な場合において、試料はロット試料であり、方法はロットリリースアッセイの一部として使用される。
【0066】
様々な態様では、試料はストレスを受けた試料、又は１回以上のストレスにさらされた試料であり、方法は安定性アッセイである。したがって、本発明は、グアニンリッチオリゴヌクレオチド原薬又は医薬品の安定性を試験する方法であって、グアニンリッチオリゴヌクレオチド原薬又は医薬品を含む試料にストレスを加えること、及び本開示の方法に従って試料の純度を決定することを含む方法を提供する。例示的な場合において、１回以上のストレスの後の試料中の不純物の存在は、１回以上のストレス下でのＧ－リッチオリゴヌクレオチドの不安定性を示す。例示的な態様では、試料に加えられたストレスは、（Ａ）可視光、紫外（ＵＶ）光、熱、空気／酸素、凍結／解凍サイクル、振盪／撹拌、化学物質及び材料（例えば、金属、金属イオン、カオトロピック塩、洗浄剤、防腐剤、有機溶媒、プラスチック）、分子及び細胞（例えば、免疫細胞）への暴露、又は（Ｂ）ｐＨの変化（例えば、１．０、１．５、又は２．０を超える変化）、圧力、温度、浸透圧、塩濃度、又は（Ｃ）長期保存である。いくつかの態様では、温度の変化は、少なくとも若しくは約１℃、少なくとも若しくは約２℃、少なくとも若しくは約３℃、少なくとも若しくは約４℃、少なくとも若しくは約５℃又はそれを超える変化である。本開示の方法は、いかなる特定の種類のストレスにも限定されない。例示的な態様では、ストレスは、任意選択的には製剤における、例えば２５℃、４０℃、５０℃の高い温度への暴露である。例示的な場合において、このような高温への暴露は、加速ストレスプログラムを模倣する。いくつかの態様では、ストレスは、可視光及び／又は紫外線への暴露、酸化試薬（例えば、過酸化水素）、空気／酸素、凍結／解凍サイクル、振盪、意図した製品貯蔵条件下での製剤としての長期保存であり；弱酸性ｐＨ（例えば、３～４のｐＨ）又は高いｐＨ（例えば、８～９のｐＨ）は、いくつかの精製条件／工程への曝露をシミュレートする。いくつかの態様では、ストレスは、１．０、１．５、２．０又は３．０を超えるｐＨの変化である。例示的な態様では、ストレスは、紫外線への暴露、熱、空気、凍結／解凍サイクル、振盪、長期保存、ｐＨの変化又は温度の変化への暴露であり、任意選択的には、ｐＨの変化は、約１．０超又は約２．０超であり、任意選択的には、温度の変化は、摂氏約２度以上又は摂氏約５度以上である。
【0067】
実行された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示目的のためにのみ提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【0068】
実施例１
この実施例は、Ｇ－リッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離するためのＲＰ－ＨＰＬＣにおける様々なパラメータを評価したいくつかの初期の試験について説明する。
この実施例は、Ｇ－リッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離するためのＲＰ－ＨＰＬＣにおける様々なパラメータを評価したいくつかの初期の試験について説明する。
【0069】
別段の明記がない限り、ＬＰＡ遺伝子から転写されたｍＲＮＡを標的化することによってリポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））の産生を減少させるように設計されたｓｉＲＮＡであるオルパシランを、例示的なオリゴヌクレオチド化合物として使用した。オルパシランのアンチセンス鎖は、その３’末端付近に位置する４つの連続したグアニン塩基の伸長を含むＧ－リッチオリゴヌクレオチドである。このＧ－リッチアンチセンスオリゴヌクレオチドは、センス鎖と対になってｓｉＲＮＡ二重鎖を形成する。４本のアンチセンス鎖は、会合して、各鎖のグアニンヌクレオチドの伸長により単一の四重鎖構造を形成することができる。各鎖は２１ヌクレオチド長であり、化学修飾されたヌクレオチドを含む。Ｎ－アセチルガラクトサミンを含む標的リガンドは、肝臓を選択的に標的化するためにセンス鎖の５’末端に結合されている。オルパシランの構造を図１に示す。
【0070】
クロマトグラフィー分離では、四重鎖が二重鎖と共溶出し、それによって別の分子種の定量化が複雑になる場合がある。センス鎖とアンチセンス鎖の分離も困難な場合がある。そこで、二重鎖及びアンチセンス鎖から四重鎖をクロマトグラフィーにより分離する方法、並びに４つ全ての分子種（例えば四重鎖、二重鎖、アンチセンス鎖、及びセンス鎖）を分離するために、二重鎖とセンス鎖を、及びアンチセンス鎖からセンス鎖をクロマトグラフィーにより分離することを追加的に実現できる方法を特定するために、いくつかの初期試験を行った。
【0071】
試験１
最初の試験では、オルパシランの二重鎖、四重鎖、センス鎖、及びアンチセンス鎖を含む試料を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）のために、カラムを８℃に維持したＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＨＰＨ－Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ×２．７μｍ）に適用した。２０ｍＭの酢酸ヘキシルアンモニウム（ＨＡＡ）＋２％アセトニトリル（ＡＣＮ）＋５％メタノール（移動相Ａ；ＭＰ Ａ）の濃度を下げて２０ｍＭのＨＡＡ＋８２％ＡＣＮ（移動相Ｂ；ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。ＨＡＡはカチオン性イオン対形成剤である。勾配移動相の詳細を表１に示す。
最初の試験では、オルパシランの二重鎖、四重鎖、センス鎖、及びアンチセンス鎖を含む試料を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）のために、カラムを８℃に維持したＡｇｉｌｅｎｔ ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＨＰＨ－Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ×２．７μｍ）に適用した。２０ｍＭの酢酸ヘキシルアンモニウム（ＨＡＡ）＋２％アセトニトリル（ＡＣＮ）＋５％メタノール（移動相Ａ；ＭＰ Ａ）の濃度を下げて２０ｍＭのＨＡＡ＋８２％ＡＣＮ（移動相Ｂ；ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。ＨＡＡはカチオン性イオン対形成剤である。勾配移動相の詳細を表１に示す。
【0072】
【表7】
【0073】
例示的なクロマトグラムを図２Ａに示す。この図に示されているように、アンチセンス鎖とセンス鎖は、ある程度の分解能で二重鎖から分離された。しかしながら、四重鎖のピークが二重鎖のピークと重なっていたため、この方法では四重鎖を分離又は定量することができなかった。
【0074】
試験２
別の試験では、３５℃に維持したＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）を使用して、イオンペアリングＲＰ－ＨＰＬＣ（ＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣ）を行った。オルパシラン二重鎖、オルパシランのセンス鎖、又はオルパシランのアンチセンス鎖のいずれかを含む試料をカラムに適用した後、９５ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）／８ｍＭのトリエチルアミン（ＴＥＡ）／２４ｍＭのｔｅｒｔ－ブチルアミン（移動相Ａ；ＭＰ Ａ）の濃度下げてＡＣＮ（移動相Ｂ；ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。ＴＥＡとｔｅｒｔ－ブチルアミンは、カチオン性イオン対形成剤とみなされる。勾配移動相の詳細を表２に示す。カラム流量を０．５ｍｌ／分に、ＵＶモニターは２６０ｎｍに、カラム温度は３５℃に設定した。
別の試験では、３５℃に維持したＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）を使用して、イオンペアリングＲＰ－ＨＰＬＣ（ＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣ）を行った。オルパシラン二重鎖、オルパシランのセンス鎖、又はオルパシランのアンチセンス鎖のいずれかを含む試料をカラムに適用した後、９５ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）／８ｍＭのトリエチルアミン（ＴＥＡ）／２４ｍＭのｔｅｒｔ－ブチルアミン（移動相Ａ；ＭＰ Ａ）の濃度下げてＡＣＮ（移動相Ｂ；ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。ＴＥＡとｔｅｒｔ－ブチルアミンは、カチオン性イオン対形成剤とみなされる。勾配移動相の詳細を表２に示す。カラム流量を０．５ｍｌ／分に、ＵＶモニターは２６０ｎｍに、カラム温度は３５℃に設定した。
【0075】
【表8】
【0076】
例示的なクロマトグラムを図２Ｂに示す。この図に示されているように、この方法はアンチセンス鎖から四重鎖を分離することに成功した。しかしながら、センス鎖とアンチセンス鎖それぞれの保持時間が同じであるため、これらの種を分離することはできなかった。
【0077】
試験３Ａ～３Ｅ
アンチセンス鎖とセンス鎖の高分解能分離を実現することを目的として、勾配溶出と移動相の成分の影響を分析するためにさらなる試験を行った。特定の理論に拘束されるものではないが、オルパシランのアンチセンス鎖は、アンチセンス一本鎖と四重鎖の２つの分子種間で平衡状態にあり、これら２つの分子種のクロマトグラフィーによる分離の成功は、安定した平衡状態の到達に依存し、ひいてはいくつかある特徴の中でも特に分子種が中に存在する溶液の成分及びイオン強度に依存する。これらの試験の目標の１つは、平衡を安定化させる条件を決定することであった。
アンチセンス鎖とセンス鎖の高分解能分離を実現することを目的として、勾配溶出と移動相の成分の影響を分析するためにさらなる試験を行った。特定の理論に拘束されるものではないが、オルパシランのアンチセンス鎖は、アンチセンス一本鎖と四重鎖の２つの分子種間で平衡状態にあり、これら２つの分子種のクロマトグラフィーによる分離の成功は、安定した平衡状態の到達に依存し、ひいてはいくつかある特徴の中でも特に分子種が中に存在する溶液の成分及びイオン強度に依存する。これらの試験の目標の１つは、平衡を安定化させる条件を決定することであった。
【0078】
試験３Ａ
１つの試験（試験３Ａ）では、試験２の移動相を、ＨＦＩＰと、ＴＥＡと、試験２で使用したｔｅｒｔ－ブチルアミンの代わりの以下のアルキルアミンのうちの１つとを含む移動相に変更した：（ｉ）プロピルアミン、（ｉｉ）ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、又は（ｉｉｉ）ジメチルｎ－ブチルアミン（ＤＭＢＡ）。これらそれぞれのアルキルアミンはＴＥＡと同様にカチオンイオン対形成剤として機能する。移動相の各ＭＰ Ａの詳細を表３に示す。式（ｉｖ）において、ＭＰ Ａは、ＨＦＩＰの濃度を２５ｍＭに下げたことを除いて（ｉｉ）と同じであった。（ｖ）では、移動相は、ｔｅｒｔ－ブチルアミン又は他のアルキルアミンが含まれていないことを除いて試験２のものと同じであった。
１つの試験（試験３Ａ）では、試験２の移動相を、ＨＦＩＰと、ＴＥＡと、試験２で使用したｔｅｒｔ－ブチルアミンの代わりの以下のアルキルアミンのうちの１つとを含む移動相に変更した：（ｉ）プロピルアミン、（ｉｉ）ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、又は（ｉｉｉ）ジメチルｎ－ブチルアミン（ＤＭＢＡ）。これらそれぞれのアルキルアミンはＴＥＡと同様にカチオンイオン対形成剤として機能する。移動相の各ＭＰ Ａの詳細を表３に示す。式（ｉｖ）において、ＭＰ Ａは、ＨＦＩＰの濃度を２５ｍＭに下げたことを除いて（ｉｉ）と同じであった。（ｖ）では、移動相は、ｔｅｒｔ－ブチルアミン又は他のアルキルアミンが含まれていないことを除いて試験２のものと同じであった。
【0079】
各場合において、３５℃に維持したＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）を使用してＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣを行った。オルパシランの二重鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖を含む試料をカラムに適用した後、ＭＰ Ａの濃度を下げてアセトニトリル（ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。各勾配溶出の条件は表２に記載の通りであった。
【0080】
【表9】
【0081】
図２Ｃ～２Ｅ及び２Ｇに示されているように、表３に記載の各移動相は、アンチセンス鎖とセンス鎖の分離を不十分にした。図２Ｆに示されているように、ＤＩＰＥＡの存在下でＨＦＩＰの濃度を下げると、移動相の塩基性が増加し、二重鎖が成分のセンス鎖とアンチセンス鎖に変性した。疎水性の固定相を使用してオリゴヌクレオチドを精製する場合に移動相の必須成分として知られている１種又は２種のカチオン性イオン対形成剤が移動相に含まれており、それらを含めることで試料成分の完全な分離が実現される可能性が高まることが示唆されていることを考慮すると、これらの結果は驚くべきものであった。例えばＲｅｖｅｒｓｅｄ Ｐｈａｓｅ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｅｄ．ＡＡ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９９）を参照。
【0082】
試験３Ｂ
この試験では、移動相中の異なるイオン対形成剤である酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）を、前の試験で使用したものよりもはるかに高い濃度で評価した（例えば試験２及び試験３Ａで使用した８ｍのＭＴＥＡ又はアルキルアミンに対して１００ｍＭのＴＥＡＡ）。ＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣは、４０℃に維持したＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）を使用して行った。オルパシランの二重鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖を含む試料をカラムに適用した後、１００ｍＭのＴＥＡＡ／ＡＣＮ（ｐＨ７）（ＭＰ Ａ）の濃度下げてＡＣＮ（移動相Ｂ；ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。勾配移動相の詳細を表４に示す。カラム流量は０．８ｍｌ／分に設定した。溶出は、ＵＶモニターを使用して２６０ｎｍで監視した。カラム温度は４０℃であった。
この試験では、移動相中の異なるイオン対形成剤である酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）を、前の試験で使用したものよりもはるかに高い濃度で評価した（例えば試験２及び試験３Ａで使用した８ｍのＭＴＥＡ又はアルキルアミンに対して１００ｍＭのＴＥＡＡ）。ＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣは、４０℃に維持したＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）を使用して行った。オルパシランの二重鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖を含む試料をカラムに適用した後、１００ｍＭのＴＥＡＡ／ＡＣＮ（ｐＨ７）（ＭＰ Ａ）の濃度下げてＡＣＮ（移動相Ｂ；ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。勾配移動相の詳細を表４に示す。カラム流量は０．８ｍｌ／分に設定した。溶出は、ＵＶモニターを使用して２６０ｎｍで監視した。カラム温度は４０℃であった。
【0083】
【表10】
【0084】
結果は、四重鎖の分離も一本鎖間の分離もないことを示した。したがって、増加した濃度のカチオン性イオン対形成剤を含む移動相は、分子種の分離を改善しなかった。イオン対形成剤の濃度が増加したことを考慮すると、分解能が改善していないことは驚くべきことであった。
【0085】
試験３Ｃ
試験３Ｃでは、Ｗａｔｅｒ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、２００Å、１．７μｍ）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。アイソクラティック勾配を利用する２つの移動相を使用した。カラム温度は３０℃であった。５％ＡＣＮ＋酢酸アンモニウム（ｐＨ７）を含む０．５ｍｌ／分の流量の移動相を、５％ＡＣＮ＋リン酸ナトリウムを含む０．８ｍｌ／分の流量の移動相と比較した。溶出は、ＵＶモニターを用いて２６０ｎｍで監視した。
試験３Ｃでは、Ｗａｔｅｒ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、２００Å、１．７μｍ）を使用して、サイズ排除クロマトグラフィーを行った。アイソクラティック勾配を利用する２つの移動相を使用した。カラム温度は３０℃であった。５％ＡＣＮ＋酢酸アンモニウム（ｐＨ７）を含む０．５ｍｌ／分の流量の移動相を、５％ＡＣＮ＋リン酸ナトリウムを含む０．８ｍｌ／分の流量の移動相と比較した。溶出は、ＵＶモニターを用いて２６０ｎｍで監視した。
【0086】
５％ＡＣＮ＋酢酸アンモニウム（ｐＨ７）を含む移動相を使用すると、四重鎖は１．４９分に溶出し、アンチセンスは１．８１分に溶出し、センス鎖は１．７６分に溶出し、二重鎖は１．６７分に溶出した。５％ＡＣＮ＋リン酸ナトリウムを含む移動相を使用すると、四重鎖は２．４５分に溶出し、アンチセンスは２．９７分に溶出し、センス鎖は２．８５分に溶出し、二重鎖は２．７６分に溶出した。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して４つの異なる分子種をある程度分離できたものの、カラムからの各分子種の溶出は非常に近い時間に生じた。そうではあるものの、酢酸アンモニウムがアニオン性イオン対形成剤として知られており、アニオン性イオン対形成剤が負に帯電したオリゴヌクレオチドの分離を改善することが期待されていないことを考慮すると、酢酸アンモニウムを含む移動相を使用して試料の４つの分子種が分離されることは驚くべきことであった。
【0087】
逆相（すなわち疎水性）固定相及び酢酸アンモニウム移動相を、さらなる試験のために選択した。
【0088】
試験３Ｄ
試験３Ｄでは、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ＭＰ Ａ）の濃度を下げてＡＣＮ（ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行ったことを除いて、試験２の条件を実行した。勾配移動相の詳細を表２に示す。カラム流量は０．５ｍｌ／分、ＵＶモニターは２６０ｎｍ、カラム温度は３５℃に設定した。
試験３Ｄでは、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ＭＰ Ａ）の濃度を下げてＡＣＮ（ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行ったことを除いて、試験２の条件を実行した。勾配移動相の詳細を表２に示す。カラム流量は０．５ｍｌ／分、ＵＶモニターは２６０ｎｍ、カラム温度は３５℃に設定した。
【0089】
この試験の結果を図２Ｈに示す。この図に示されているように、オルパシランの４つ全ての分子種（二重鎖、センス鎖、アンチセンス鎖、及び四重鎖）は異なる保持時間を有しており、このことは同じ試料中に存在する場合にこの方法で４つ全ての分子種を分離できることを示唆している。したがって、ＲＰ－ＨＰＬＣ Ｃ４カラムの酢酸アンモニウム勾配をさらなる試験のために選択した。
【0090】
試験３Ｅ
この試験では、勾配をわずかに変更し、カラム流量を０．８ｍｌ／分に設定したことを除いて、ＭＰ Ａとして１００ｍＭの酢酸アンモニウムを、ＭＰ ＢとしてＡＣＮを用いて試験３Ｄの条件を実施した。勾配の詳細は、５分で７％から１２％のＭＰ Ｂ→３分で１２％から１４％のＭＰ Ｂ→７分で１４％から３０％のＭＰ Ｂ→３０％のＭＰ Ｂで１分間→２分で３０％から７％のＭＰ Ｂ→７％のＭＰ Ｂで８分間であった。
この試験では、勾配をわずかに変更し、カラム流量を０．８ｍｌ／分に設定したことを除いて、ＭＰ Ａとして１００ｍＭの酢酸アンモニウムを、ＭＰ ＢとしてＡＣＮを用いて試験３Ｄの条件を実施した。勾配の詳細は、５分で７％から１２％のＭＰ Ｂ→３分で１２％から１４％のＭＰ Ｂ→７分で１４％から３０％のＭＰ Ｂ→３０％のＭＰ Ｂで１分間→２分で３０％から７％のＭＰ Ｂ→７％のＭＰ Ｂで８分間であった。
【0091】
この試験の結果を図２Ｉに示す。この図に示されているように、センス鎖とアンチセンス鎖の分離能が向上し、試験３Ｄの結果と一致しており、この方法は、４つ全ての分子種、すなわち二重鎖、センス鎖、アンチセンス鎖、及び四重鎖を分離することができる。
【0092】
試験４
この試験では、オルパシランの異なる分子種の分離に対するＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）のカラム温度の影響を評価した。オルパシランの二重鎖、センス鎖、及び／又はアンチセンス鎖を含む試料をカラムに適用した後、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）（ＭＰ Ａ）の濃度を下げてＡＣＮ（ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。溶離液は２６０ｎｍで監視し、カラム流量は０．８ｍｌ／分であった。勾配移動相の詳細を表４に示す。カラム温度は２５℃、３０℃、３５℃、又は４０℃であった。
この試験では、オルパシランの異なる分子種の分離に対するＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）のカラム温度の影響を評価した。オルパシランの二重鎖、センス鎖、及び／又はアンチセンス鎖を含む試料をカラムに適用した後、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）（ＭＰ Ａ）の濃度を下げてＡＣＮ（ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。溶離液は２６０ｎｍで監視し、カラム流量は０．８ｍｌ／分であった。勾配移動相の詳細を表４に示す。カラム温度は２５℃、３０℃、３５℃、又は４０℃であった。
【0093】
図２Ｊ及び２Ｋは、試験したカラム温度それぞれにおける例示的なクロマトグラムを示す。図２Ｊは、二重鎖（クロマトグラムの最初のピーク）とセンス鎖（クロマトグラムの２番目のピーク）の分離に対する温度の影響を示す。図２Ｋは、アンチセンス鎖（クロマトグラムの最初のピーク）と四重鎖（Ｇ Ｑｕａｄ、クロマトグラムの２番目のピーク）の分離に対する温度の影響を示す。表５は、図２Ｋの各ピークの曲線下の面積を示す。これらの結果に基づいて、最適温度として３０℃のカラム温度を選択した。
【0094】
【表11】
【0095】
勾配をわずかに変えて５０℃で１つの試験を行った。このより高い温度により、単一のセンス鎖とアンチセンス鎖に対応するピークが互いに近づき、これら２つの種の分離が不十分になることが見出された。
【0096】
試験５
試験１では、Ｃ１８リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスを含むカラムを使用した一方で、試験２、３Ａ～３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、及び４では、クロマトグラフィーマトリックスはＣ４マトリックスを含んでいた。オルパシランの異なる分子種の分離に対するクロマトグラフィーマトリックスの疎水性リガンドの影響を評価するために、Ｃ３リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスを使用した。ＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣは、３０℃に維持したＷａｔｅｒｓ Ｃ３カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μｍ）を使用して行った。オルパシランの二重鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖を含む試料をカラムに適用した後、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）（ＭＰ Ａ）の濃度を下げてＡＣＮ（ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。勾配移動相の詳細を表４に示す。
試験１では、Ｃ１８リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスを含むカラムを使用した一方で、試験２、３Ａ～３Ｃ、３Ｄ、３Ｅ、及び４では、クロマトグラフィーマトリックスはＣ４マトリックスを含んでいた。オルパシランの異なる分子種の分離に対するクロマトグラフィーマトリックスの疎水性リガンドの影響を評価するために、Ｃ３リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスを使用した。ＩＰ－ＲＰ－ＨＰＬＣは、３０℃に維持したＷａｔｅｒｓ Ｃ３カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μｍ）を使用して行った。オルパシランの二重鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖を含む試料をカラムに適用した後、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）（ＭＰ Ａ）の濃度を下げてＡＣＮ（ＭＰ Ｂ）の濃度を上げる勾配溶出を行った。勾配移動相の詳細を表４に示す。
【0097】
Ｃ３カラムでは二重鎖が別々のホスホロチオエートジアステレオマーに分解されたため、二重鎖の完全性が失われた。さらに、センス鎖とアンチセンス鎖の保持時間の差はわずか約１分であった。したがって、Ｃ３カラムは分子種の分解能や分離を改善しなかった。
【0098】
試験６
試験２では、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）を使用した。カラム長の影響を評価するために、より長いカラム長（１００ｍｍ）のＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラムを使用した。カラムの他の全ての特徴は試験２のカラムと同じであった。オルパシランの二重鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖（約１ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液を、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、３００Å、３．５μｍ）に注入した。１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）（ＭＰ Ａ）の濃度を下げてＡＣＮの濃度を上げる（ＭＰ Ｂ）、直線的な段階勾配溶出を行った。溶離液は２６０ｎｍで監視し、カラム温度は３０℃であった。カラム流量は０．８ｍｌ／分であった。表４に勾配溶出の移動相の詳細を示す。
試験２では、Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）を使用した。カラム長の影響を評価するために、より長いカラム長（１００ｍｍ）のＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラムを使用した。カラムの他の全ての特徴は試験２のカラムと同じであった。オルパシランの二重鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖（約１ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液を、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１ｍｍ×１００ｍｍ、３００Å、３．５μｍ）に注入した。１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）（ＭＰ Ａ）の濃度を下げてＡＣＮの濃度を上げる（ＭＰ Ｂ）、直線的な段階勾配溶出を行った。溶離液は２６０ｎｍで監視し、カラム温度は３０℃であった。カラム流量は０．８ｍｌ／分であった。表４に勾配溶出の移動相の詳細を示す。
【0099】
例示的な結果を、図２Ｌに示す。この図に示されているように、二重鎖がそのホスホロチオエートジアステレオマーに分離し始めたため、二重鎖の分解能が高すぎた。図２Ｍは、より短いカラム（Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）をほぼ同じ条件下で使用した場合の例示的な結果を示す。ＭＰ Ａは１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）であり、ＭＰ ＢはＡＣＮであった。勾配パラメータを表４に示す。カラム温度は３０℃であり、カラム流量は０．８ｍｌ／分であった。この図に示されているように、二重鎖は約４．６分（中段及び下段）にピークとして溶出し、四重鎖は約１２．９分（上段及び中段）に溶出し、センス鎖は約６．２分（下段）に溶出し、アンチセンス鎖は約１０．７分（上段）に溶出した。二重鎖とセンス鎖の分離（下のパネル）の分解能は改善できる可能性があるものの、図２Ｍは、この方法がオルパシランの４つ全ての分子種を分離できることを示している。
【0100】
実施例２
この実施例は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）と、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）／ＡＣＮ移動相と、表４に示す勾配パラメータとを用いて、上記実施例１の試験７に記載の方法を使用して分離した時の二重鎖の応答についての線形性を示す。
この実施例は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）と、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）／ＡＣＮ移動相と、表４に示す勾配パラメータとを用いて、上記実施例１の試験７に記載の方法を使用して分離した時の二重鎖の応答についての線形性を示す。
【0101】
二重鎖の応答についての線形性は、同一条件下でのオルパシランｓｉＲＮＡ溶液の段階希釈により評価した。二重鎖のＨＰＬＣ標準化曲線は以下の通りに作成した：０．０１ｍｇ／ｍＬ～０．０８７５ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度のオルパシラン二重鎖を含む一連の標準溶液を調製した。これらの濃度を、吸光係数として１９．０９ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍを使用するＵＶ分光法によって決定した。
【0102】
標準化は、既知の濃度の溶液のＨＰＬＣピーク面積を測定することによって行った（５μＬの試料注入）。各試料について、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μｍ）を、１００ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液中で濃度が増加していくＣＨ３ＣＮ（５分で７％から１２％のＭＰ Ｂ、３分で１２％から１４％のＭＰ Ｂ、７分で１４％から３０％のＭＰ Ｂ、３０％で１分間、２分で３０％から７％、そして５分で７％のベースラインに戻る、流量０．８ｍＬ／分）を含む１００ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の直線的な段階勾配系で洗浄した。溶離液は２６０ｎｍで監視し、カラム温度は３０℃であった。
【0103】
これらの条件では、二重鎖は４．７分に溶出した。２６０ｎｍにおける二重鎖のモル吸光係数は１５４３９Ｌ ｃｍ－１ Ｍ－１であった。四重鎖を評価する目的で、長波長のモル吸光係数を評価した。ピーク面積対濃度をプロットしたところ、「Ｒ二乗値」は０．９９９であった。線形性を図３にグラフで示す。
【0104】
この実施例は、０．０１ｍｇ／ｍＬ～０．０８ｍｇ／ｍＬの範囲内で、二重鎖ピークのＵＶ２６０ｎｍにおける応答と二重鎖濃度との間に優れた線形相関を示した。
【0105】
実施例３
この実施例は、アンチセンス鎖：：四重鎖の比に対する溶液調製の影響を説明する。
この実施例は、アンチセンス鎖：：四重鎖の比に対する溶液調製の影響を説明する。
【0106】
オルパシラン試料を調製するための溶液がアンチセンス鎖：：四重鎖の比に及ぼす影響を分析する（アンチセンス鎖と四重鎖との間の平衡についての洞察を可能にする）ことを目的とした試験において、センス鎖（Ａ１０Ｂ）、アンチセンス（鎖（Ａ１０Ａ））、又は二重鎖（Ａ１０Ｃ）を含む溶液を、表６に記載の溶媒中で調製した。溶液を室温で２時間保管し、その後注入用オートサンプラーに５℃で入れた。カラムを、１００ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液中で濃度が増加していくＡＣＮを含む１００ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ７．０）の直線的な段階勾配系で洗浄した。勾配パラメータを表４に示す。流量は０．８ｍＬ／分であった。溶離液は２６０ｎｍで監視し、カラム温度は３０℃であった。
【0107】
【表12】
【0108】
アンチセンス試料の例示的なクロマトグラムを図４に示す。図４の上段のクロマトグラム（Ａ１０Ａ－Ｗ）に示されているように、早く溶出するピークであるアンチセンス鎖の量は、後のピークである四重鎖よりも著しく大きかった（７６．５６％対２１．８７％）。そのため、水は四重鎖構造を支持しないようである。図４の中段と下段のクロマトグラムに示されているように、ＨＦＩＰ／ＴＥＡ（下段のクロマトグラム）又は酢酸アンモニウム（中段のクロマトグラム）中で調製したアンチセンス鎖の２つの試料は、ピーク積分に基づくと、テトラド（四重鎖）構造を支持していた。酢酸アンモニウム中で調製したアンチセンス鎖の試料では、水（２１．８７％）と比較して、四重鎖（７０．３１％）の量が多くなった。ＨＦＩＰ／ＴＥＡで調製したアンチセンス鎖の試料でも、水（２１．８７％）と比較して四重鎖（６３．６６％）の量が多くなったものの、酢酸アンモニウム（７０．３１％）ほどではなかった。
【0109】
四重鎖に対する試料調製の影響を分析するために、別の試験を行った。アンチセンス鎖（Ａ１０Ａ）を含む溶液を、表７に詳述されている通りに、１）水又は２）酢酸アンモニウム（１００ｍＭ）のいずれかの中で調製した。
【0110】
【表13】
【0111】
未希釈溶液の濃度が高いと、吸光度／光路長曲線に曲がりが生じるため、試料を１０倍に希釈した。結果には希釈した濃度を使用した。各溶液１００μＬを含む溶液を６５℃で２０分間加熱し、その後室温まで冷却した。対照は加熱しなかった。溶液を１０倍に希釈し、ＳｏｌｏＶＰＥ分析用のキュベットにロードした。
【0112】
加熱後、アリコートを抜き出し、濃度決定のために１０倍に希釈した：
・ＮＨ４ＯＡｃ中のアンチセンス－ＵＶによる加熱後の濃度（２７．９５ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍ）＝１９．０９３０ｍｇ／ｍＬ（９．５％増加）
・水中のアンチセンス－ＵＶによる加熱後の濃度（２７．９５ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍ）＝２４．８８８８ｍｇ／ｍＬ（６．６４％増加）。
・ＮＨ４ＯＡｃ中のアンチセンス－ＵＶによる加熱後の濃度（２７．９５ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍ）＝１９．０９３０ｍｇ／ｍＬ（９．５％増加）
・水中のアンチセンス－ＵＶによる加熱後の濃度（２７．９５ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍ）＝２４．８８８８ｍｇ／ｍＬ（６．６４％増加）。
【0113】
純度分析は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）／ＡＣＮ移動相を用いて、及びカラム温度を８℃に調整したことを除き表４に示した勾配パラメータを使用して、実施例１の試験６に記載した分離方法を使用して行った。
【0114】
結果を図５、６及び表８に示す。
【0115】
【表14】
【0116】
水を溶解媒体として使用した加熱試料は、酢酸アンモニウムと比較して非常に異なるプロファイルを示した。試料を水中で調製すると、熱により四重鎖が破壊され、平衡がアンチセンス鎖側に移動した。初期の溶出ピークは加熱後に大幅に増加し、これは初期のピークがモノマーのアンチセンス鎖であることを示している。酢酸アンモニウム中で調製した試料でも熱によって四重鎖が破壊されたものの、四重鎖からアンチセンス鎖側への平衡のシフトは大幅に減少し、アンモニウムイオンが四重鎖をある程度安定化していることが示唆された。
【0117】
総合すると、これらの結果は、検出可能なアンチセンスと四重鎖の量は、溶液を調製する溶液によって変化し得ることを示している。いくつかの事例では、アンモニウムイオンやカリウムイオンなど、四重鎖を安定化させるイオンを含む溶液中で試料を調製することが有益であり、その結果、分離中にアンチセンス鎖と四重鎖の比率が変化せず、これらの分子種それぞれの定量がより正確になる。
【0118】
実施例４
この実施例は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）と、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）／ＡＣＮ移動相と、表４に示す勾配パラメータとを用いて、上記実施例１の試験６に記載の方法を使用して分離した時の四重鎖の応答についての線形性を示す。
この実施例は、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）と、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）／ＡＣＮ移動相と、表４に示す勾配パラメータとを用いて、上記実施例１の試験６に記載の方法を使用して分離した時の四重鎖の応答についての線形性を示す。
【0119】
四重鎖についての線形性は、実施例３に記載の水中で加熱したＡ１０試料を使用して評価した。
【0120】
四重鎖のＨＰＬＣ標準化曲線は、本質的に実施例２に記載されている通り、既知の濃度の溶液のＨＰＬＣピーク面積を測定することによって作成した。カラム及び勾配溶出は実施例２に記載の通りであった。溶出液は２６０ｎｍで監視し、カラム温度は８℃であった。
【0121】
水溶媒を含む加熱試料中のアンチセンス／四重鎖平衡の例示的なクロマトグラムを図７に示す。この図に示されているように、これらの条件下では、アンチセンス及び四重鎖は、それぞれ１１．８分及び１３．２分に溶出した。実施例２のカラム温度（３０℃）と比較してカラム温度（８℃）を下げて、アンチセンスとＧ四重鎖の両方のピーク形状を安定化させた。吸光係数が不明なため、Ｇ四重鎖の濃度を決定することはできない。図８のグラフに、アンチセンス鎖及び四重鎖のそれぞれのピーク面積が、試料濃度に対してプロットされている。アンチセンス鎖と四重鎖の両方の「Ｒ二乗値」は１．０であった。
【0122】
実施例５
この実施例は、四重鎖の安定化に対するカリウムの効果を示す。
この実施例は、四重鎖の安定化に対するカリウムの効果を示す。
【0123】
オルパシランアンチセンス鎖を含む試料を、１００ｍＭのカリウムを含む又は含まない溶液中で調製し、次いで熱処理を行った。対照には熱処理を行わなかった。試料をＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）に適用し、１００ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ７）の濃度を下げて（ＭＰ Ａ）ＡＣＮの濃度を上げる（ＭＰ Ｂ）勾配溶出を行った。勾配移動相の詳細を表９に示す。カラム流量は０．８ｍｌ／分に設定した。溶出は、ＵＶモニターを使用して２６０ｎｍで監視した。カラム温度は８℃であった。
【0124】
【表15】
【0125】
四重鎖のピーク面積がカリウム存在下でのアンチセンス鎖のピーク面積と比較して増加することから、四重鎖が熱処理を受けた場合であっても、カリウムは、アンチセンス鎖と四重鎖との間の平衡を四重鎖側に動かし、四重鎖を安定化させるようである。カリウムがない状態では、四重鎖に対応するピークの大幅な減少とアンチセンス鎖に対応するピークのピーク面積の増加によって証明されるように、熱処理により四重鎖が破壊され、構造はアンチセンス一本鎖に戻る。カリウムがなくても、四重鎖はこの方法で検出できる程度に十分に安定である。移動相中のアンモニウムイオンは四重鎖を安定化するように作用すると考えられる。
【0126】
この実施例は、四重鎖構造を安定化し、分離中にアンチセンス鎖と四重鎖の比率が変化することを防ぐために、試料調製においてカリウムを使用することを支持する。
【0127】
実施例６
この実施例は、Ｇ－リッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離する例示的な方法を示す。
この実施例は、Ｇ－リッチオリゴヌクレオチドの分子種を分離する例示的な方法を示す。
【0128】
第１の方法では、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、３００Å、３．５μＭ）を使用してＲＰ－ＨＰＬＣを行った。カラム温度は３０℃であった。オルパシラン二重鎖、アンチセンス鎖、センス鎖、又はＧ－四重鎖（オルパシランアンチセンス鎖から形成）を含む試料を脱イオン水中で調製した。具体的には、ポリプロピレン製バイアルの中に、１ｍＬの脱イオン水で溶解した凍結乾燥粉末から二重鎖試料溶液を約７０ｍｇ調製した。センス鎖とアンチセンス鎖の両方の試料溶液を、水中約３０ｍｇ／ｍＬで得た。これを脱イオン水で約４．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。アンチセンス鎖を３：５の比率で様々なカチオンと室温で最大１週間インキュベートすることによって得た濃縮Ｇ－四重鎖溶液（面積＞９６％）を、アセトニトリルとＮａＢｒ（最終濃度６２５ｍＭ）緩衝液とを含むリン酸ナトリウム中で約３．５ｍｇ／ｍＬで得た。これは、さらに希釈することなく直接分析した。
【0129】
これらの調製されたオルパシラン試料をオートサンプラーに注入した後、１００ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６．８）の濃度を下げて（ＭＰ Ａ）ＡＣＮの濃度を上げる（ＭＰ Ｂ）、勾配溶出を行った。勾配移動相の詳細は上の表９に記載されている。カラム流量は０．８ｍｌ／分に設定した。溶出は、ＵＶモニターを使用して２６０ｎｍ／４ｎｍのバンド幅で監視した。総実行時間は２６分であった。
【0130】
図９Ａ及び９Ｂは、それぞれ分子種のクロマトグラムを重ね書きした図及び並べた図として示している。これらの図に示されているように、この方法では４つ全ての分子種を検出することができる。ただし、二重鎖ピークとセンス鎖ピークとの間の分解能（ＵＳＰ分解能≦１．２）は改善の余地があるであろう。
【0131】
二重鎖ピークとセンス鎖ピークの分解能を改善するために、第１の方法と同様に同じＣ４カラムを使用する第２のＲＰ－ＨＰＬＣ方法を行った。第２の方法（「方法２」）は、第２の方法の移動相が、表１０に示される異なる勾配パラメータに従って、減少する濃度の７５ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６．８）（ＭＰ Ａ）と増加する濃度のＡＣＮ（ＭＰ Ｂ）を含むことを除いて、第１の方法と同じであった。流量も０．７ｍｌ／分に下げた。総実行時間は３０分であった。オートサンプラーの温度は１５℃であった。
【0132】
【表16】
【0133】
図１０Ａ及び１０Ｂは、それぞれ分子種のクロマトグラムを重ね書きした図及び並べた図として示している。これらの図に示されているように、二重鎖とセンス鎖のピークは互いに十分に分離されていた（ＵＳＰ分解能≧２．４）。また、この方法により、センス鎖のピークとアンチセンス鎖のピークとの間の分離、及びアンチセンス鎖のピークと四重鎖のピークとの間の分離も改善された。
【0134】
潜在的なキャリーオーバーの問題を回避するために、第１及び第２の方法と同様に同じＣ４カラムを使用する第３のＲＰ－ＨＰＬＣ方法を行った。第３の方法（「方法３」）は、四重鎖の溶出が完了した後に追加のカラムフラッシング段階を追加したことを除き、Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ、３００Å、３．５μｍ）を使用する第２の方法と同じであった。追加のフラッシング段階は２２．１分から２４分まで行った。移動相勾配パラメータの詳細を表１１に示す。また、酢酸塩勾配については、７５ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液である原液（ｐＨ６．７±０．１）を使用した。流量は０．７ｍｌ／分±０．２ｍｌ／分であり、総実行時間は３０分であった。オートサンプラーの温度は１５℃±１℃であった。カラム温度は３０℃±１℃であった。溶出は、２６０ｎｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣシステムについては４ｎｍのバンド幅、又はＷａｔｅｒｓ ＵＰＬＣシステムについては４．８ｎｍのバンド幅）でＵＶによって監視した。
【0135】
【表17】
【0136】
結果を図１０Ｃ及び１０Ｄに示す。この方法で示されているように、方法３の詳細は、方法２で観察された分子種のピークの溶出プロファイルを変化させなかった。これは、カラムフラッシング段階前の勾配ステップが同じままであったことから予想された。４つ全ての分子種が、クロマトグラフィーによって高分解能で分離された。
【0137】
実施例７
この実施例は、異なる試料希釈剤を評価するための試験について説明する。
この実施例は、異なる試料希釈剤を評価するための試験について説明する。
【0138】
試料溶液を、３つの異なる試料希釈剤である（１）脱イオン水、（２）ｐＨ６．８の７５ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液、及び（３）医薬品製剤緩衝液（ｐＨ６．８の水中に４０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのリン酸カリウム）の中で調製した。次いで、上の実施例６に記載の方法２を使用して試料を分離した。全ての結果を比較し、方法の線形性と様々な試料希釈剤による影響を評価した。
【0139】
最初に、各分子種（アンチセンス鎖、センス鎖、二重鎖、四重鎖）の名目濃度（１００％レベル）を、そのメインピークの高さが約１．０ＡＵ（吸光度単位）になる濃度で決定した。次に、一連の希釈の後、ピークのシグナル対ノイズ（ｓ／ｎ）の値が１０．０を超える最低濃度を各メインピークの定量限界（ＬＯＱ）レベルとして決定した。各分子種の方法の線形性を評価するために、ＬＯＱから名目濃度の１２０％までを網羅する試料濃度範囲を選択した。
【0140】
図１１は、３つの異なる希釈剤中で調製した、ＬＯＱから名目濃度の１５０％までを網羅するその濃度に対する二重鎖のピーク面積の線形性の応答を示している。水と製剤緩衝液（ＦＢ）の両方に含まれる二重鎖試料は差を示さず、それぞれ０．９９９８と０．９９９４のＲ２値で同様に高度に線形的な応答を与えた。７５ｍＭの酢酸アンモニウム中の二重鎖試料も、０．９９８８のＲ２値で高度に線形的な応答を示した。二重鎖の名目濃度は１９．５ｍｇ／ｍＬであり、ＬＯＱレベルは０．０４ｍｇ／ｍＬ（名目濃度の０．２０％）であると決定された。試料の試験と方法の適格性評価も、下げた名目濃度（１５ｍｇ／ｍＬ）の二重鎖を使用することによって首尾よく完了した。この例では、二重鎖ピーク面積対その濃度のＲ２が０．９９９３である非常に高い線形的な応答が得られた。ＬＯＱレベルは０．０８ｍｇ／ｍＬであり、シグナル対ノイズ比は２６～２８であった。
【0141】
約３０ｍｇ／ｍＬのセンス鎖及びアンチセンス鎖の原液を使用して、これらの一本鎖及びＧ－四重鎖の線形性を評価するための一連の希釈試料溶液を調製した。これらの原液の正確な濃度測定は、２６０ｎｍにおけるこれらの吸光度係数である２１．７４ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍ（センス）及び２７．９３ｍＬ／ｍｇ＊ｃｍ（アンチセンス）を使用して、Ｓｏｌｏ ＶＰＥにより行った。測定された原液の濃度は、センス鎖については２７．６３ｍｇ／ｍＬ、アンチセンス鎖については３２．７８ｍｇ／ｍＬであった。センス鎖、アンチセンス鎖、及びＧ－四重鎖については、ＬＯＱから名目濃度の１２０％までを網羅する濃度範囲を選択した。センス鎖、アンチセンス鎖、及び四重鎖について、それぞれ図１２、図１３、及び図１４に示されているように、ピーク面積対濃度のＲ２値が０．９９を超える高い線形的な応答を全て示した。
【0142】
センス鎖の名目濃度は６．９ｍｇ／ｍＬであり、ＬＯＱは０．００９ｍｇ／ｍＬ（名目値の０．１３％）であると決定された。全てのアンチセンス鎖試料には約１９％（面積％）のＧ－四重鎖も含まれていたため、アンチセンスとＧ－四重鎖の線形性評価は同じ試料で同時に行った。アンチセンス鎖の名目濃度及びＬＯＱは、それぞれ１３．３ｍｇ／ｍＬ及び０．００５ｍｇ／ｍＬ（名目値の０．０３８％）であった。また、Ｇ－四重鎖の名目濃度及びＬＯＱは、それぞれ３．０ｍｇ／ｍＬ及び０．０３ｍｇ／ｍＬ（名目の１％）であった。
【0143】
各分子種について、これらの条件下で実行した場合、試験した試料希釈剤の間で有意差は存在しなかった。水及びＤＰ製剤緩衝液中の試料は、線形性評価において全く同じ応答を示した。これらの結果は、例えばアンチセンスと四重鎖との間の平衡を四重鎖側にすることが望ましくない場合に、試料希釈剤として脱イオン水（抵抗率≧１８Ωｃｍ）を使用することを支持している。
【0144】
実施例８
この実施例は、アンチセンス及び四重鎖に対する加熱－冷却処理の影響を説明する。
この実施例は、アンチセンス及び四重鎖に対する加熱－冷却処理の影響を説明する。
【0145】
オルパシランアンチセンス鎖（８．２ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液は、２つの異なる希釈剤である脱イオン水とｐＨ６．８の７５ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液のうちの１つでアンチセンス原液を希釈することによって調製した。希釈したアンチセンス鎖溶液を６５℃で２０分間熱に暴露した。熱処理後、各溶液を氷上又は室温（ＲＴ）で冷却した。図１５に試料調製手順を示す。
【0146】
溶液を実施例６に記載の方法２によって分析し、希釈剤及び加熱－冷却処理の影響を評価した。特に、各試料のアンチセンスピークとＧ－四重鎖ピークの面積％を測定した。
【0147】
図１６Ａ及び１６Ｂは、加熱－冷却処理の前後の、水中で調製されたアンチセンス鎖溶液の重ね書きしたクロマトグラムを示す。加熱－冷却処理後のアンチセンスピークの面積％は、加熱処理なしの試料と比較して、８２．０％から９９．２％へと劇的に増加した。アンチセンス鎖含有量のこの増加（１７．２％の増加）は、四重鎖の面積％の減少（１７．３％の減少）と相関している。２つの異なる冷却プロセス（氷対室温）の間に差は観察されなかった。
【0148】
図１７Ａ及び１７Ｂは、加熱－冷却処理の前後の、７５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中のアンチセンス鎖溶液の重ね書きしたクロマトグラムを示す。興味深いことに、アンチセンスピーク及びＧ－四重鎖ピークの面積％に有意な変化は観察されなかった（例えば加熱処理前と加熱処理後、氷冷と室温での冷却）。アンチセンスピークとＧ－四重鎖ピークの面積％は、全ての溶液でそれぞれ約８２％と約１８％で同じままであった。この結果は、ＮＨ４ＯＡｃ緩衝液中のアンモニウムカチオンが、水中で加熱した試料と比較して、加熱／冷却プロセス中にＧ－四重鎖を強く安定化させる効果を有することを明確に示している。熱により破壊されたＧ－四重鎖は、水中で平衡をアンチセンス鎖（モノマー）側にシフトさせた。しかし、この熱により破壊され弱まったＧ－四重鎖構造は、酢酸アンモニウム試料希釈剤中のアンモニウムカチオンによって迅速に安定化されるようであり、最終的には酢酸アンモニウム緩衝液の最終溶液におけるＧ－四重鎖含有量に大きな変化はみられなかった。
【0149】
この実施例は、Ｇ－リッチオリゴヌクレオチドと四重鎖との間の平衡を安定化させるために酢酸アンモニウム中でＧ－リッチオリゴヌクレオチドの試料を調製することを支持する。
【0150】
実施例９
この実施例は、ＨＰＬＣ中のアンチセンス：：四重鎖の平衡に対する移動相緩衝液のカチオンの影響を示す。
この実施例は、ＨＰＬＣ中のアンチセンス：：四重鎖の平衡に対する移動相緩衝液のカチオンの影響を示す。
【0151】
実施例８では、試料希釈剤としての酢酸アンモニウムのＧ－四重鎖安定化効果が明確に示された。この実施例では、アンチセンス：：四重鎖平衡に対する酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）と酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）の影響を評価した。
【0152】
名目濃度４．５ｍｇ／ｍＬ又は１３．３ｍｇ／ｍＬのオルパシランアンチセンス鎖を含む溶液を、脱イオン水、ｐＨ６．８の７５ｍＭのＮａＯＡｃ水溶液、又はｐＨ６．８の７５ｍＭのＫＯＡｃ水溶液の３つの異なる希釈剤のうちの１つでアンチセンス原液を希釈することによって調製した。移動相Ａ溶液がｐＨ６．８の７５ｍＭのＮａＯＡＣ水溶液又はｐＨ６．８の７５ｍＭのＫＯＡｃ水溶液を含むこと以外は実施例６に記載の方法２と同様の方法によって各溶液を分析した。アンチセンスピークとＧ－四重鎖ピークのそれぞれの面積％を測定した。
【0153】
結果を表１２に示す。
【0154】
【表18】
【0155】
４．５ｍｇ／ｍＬのアンチセンス濃度では、異なる希釈剤間でアンチセンスピークの面積％が減少傾向にあり、それに対応して四重鎖ピークの面積％が増加傾向にあり、ＫＯＡｃは最も低いアンチセンスピークの面積％と最も高い四重鎖ピークの面積％を示した。さらに、ＫＯＡｃ移動相は、ＮａＯＡｃ移動相よりも高い四重鎖含有量と低いアンチセンス含有量を示した。より高いアンチセンス濃度（１３．３ｍｇ．ｍＬ）の試料では、同様にアンチセンス含有量の減少と同時に四重鎖含有量の増加が観察され、アンチセンス含有量の減少と四重鎖含有量の増加の両方においてより大きな変化があった。これらの結果は、アンチセンス－四重鎖平衡が、４．５ｍｇ／ｍＬの場合よりもアンチセンス濃度が高い場合（１３．３ｍｇ／ｍＬ）に四重鎖形成が有利になるようにさらにシフトしたことを示した。予想通り、ＫＯＡｃは３つの異なる試料希釈剤の中で最も高い安定化効果を示し、ＫＯＡｃ移動相はＮａＯＡｃよりも四重鎖構造に有利である。
【0156】
実施例１０
この実施例は、他の分析技術によるＧ四重鎖のキャラクタリゼーションを説明する。
この実施例は、他の分析技術によるＧ四重鎖のキャラクタリゼーションを説明する。
【0157】
Ｇ－四重鎖構造には、鎖間に非共有結合的に保持されたカチオン（ＮＨ４
＋、Ｎａ＋、又はＫ＋）を有する４つのＧ－リッチアンチセンス鎖モノマーが組み込まれている。Ｋａｚａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ．Ｖｏｌ １６３４：４６１６３３（２０２０）で同じ種について観察されたように、この構造の形成により約７０２０Ｄａ（アンチセンスモノマー）から約２８１００Ｄａ（Ｇ－四重鎖）まで質量が増加することになるであろう。先の実施例に記載したＲＰ－ＨＰＬＣ方法を使用してＧ－四重鎖構造が検出されたことをさらに証明するために、液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）及び動的光散乱法（ＤＬＳ）を含むいくつかの分析技術を使用した。これらの分析試験の結果を以下で説明する。
【0158】
ＬＣ－ＭＳ：アンチセンス鎖とＧ－四重鎖試料の両方についてＬＣ－ＭＳ分析を行った。Ｇ－四重鎖試料は、アンチセンス鎖をＮａＢｒと１週間インキュベートすることによって得た。データは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＱＥｘａｃｔｉｖｅ ＨＦＸ質量分析計と接続したＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＬＣを使用して収集した。２つの種のベースライン分離は、寸法がわずかに異なる同じＣ４固定相を有するカラムで得た。提案されたアンチセンス一本鎖に関連するＭＳスペクトルからは、３＋と４＋の電荷状態の狭い分布が得られた（図１８）。主な提案された一本鎖ピークで観察される複数のピークは、配列内のホスホロチオエート結合の存在によって導入されるキラリティーの相違から生じるホスホロチオエートジアステレオマーによるものである可能性が最も高い。アンチセンス試料では、一本鎖又はＧ－四重鎖に対応する提案されたＧ－四重鎖ピークについて明確なＭＳシグナルは観察されなかった。
【0159】
しかしながら、濃縮されたＧ四重鎖試料からＭＳスペクトルを得た場合、ＭＳシグナルはより高いｍ／ｚで観察された（図１９）。これらのＭＳシグナルは、様々なカチオン（水、Ｎａ＋、及びＮＨ４
＋）が高度に付加されているものの、より大きな構造に対応しており、一本鎖シグナルは観察されなかった。さらに、一本鎖アンチセンスシグナルが存在すべきｍ／ｚでは、ＭＳシグナルは観察されなかった。この観察は、四重鎖を示す結合三次相互作用に一本鎖が関与しているという仮説を裏付ける。
【0160】
この試料について得られた質量精度データは、アンチセンス鎖試料の分離についての実施例６に記載のＲＰ－ＨＰＬＣ方法のクロマトグラムに存在する第２のピークが実際にＧ－四重鎖であるという仮説を裏付ける。興味深いことに、一本鎖試料では、この高次構造に対応するＵＶピークが全イオンクロマトグラム（ＴＩＣ）でＭＳシグナルを生じない。Ｇ－四重鎖に対応するＭＳシグナルを観察するためには、Ｇ－四重鎖が濃縮された試料が必要であった。
【0161】
動的光散乱（ＤＬＳ）：アンチセンス一本鎖とＧ－四重鎖試料の両方に存在する粒度分布を調べるために、ＤＬＳ分析を行った。アンチセンス一本鎖試料の分析からは、＞２ｎｍと１１～１２ｎｍの２つの粒度分布が示された（図２０）。対照的に、高次構造を優先的に選択するためにカチオンを用いて調製された提案されたＧ－四重鎖試料には、約１１ｎｍの単一の粒度分布しか含まれていなかった。アンチセンス一本鎖試料中、より大きいサイズの粒子が若干存在することは、実施例６に記載のＲＰ－ＨＰＬＣ方法を用いたアンチセンス鎖試料の分析中に観察された低レベルの第２のピークの観察と一致する。さらに、提案されたＧ－四重鎖試料では、非常に低レベルの一本鎖ピークを観察することができるが、ＤＬＳによってはより小さな粒子が観察されないことから、これは明らかに最小限であり、アンチセンス鎖の大部分が高次構造（すなわち四重鎖）に関与していることを示唆している。
【0162】
体積による粒度分布を見ると、図２１で見られるように、一本鎖試料の大部分が主に＞２ｎｍのサイズであることは依然として明らかである。
【0163】
【表19】
【0164】
本明細書に引用される刊行物、特許出願及び特許を含むすべての参考文献は、あたかも各参考文献が参照により組み込まれ、本明細書のその全体が記載されることを個々に且つ具体的に示すかのごとく、同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【0165】
本開示の説明に関する（とりわけ下記の特許請求の範囲に関する）「１つの（ａ）」、及び「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という用語、並びに類似の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別段の指定がない限り、指定の構成要素を含むが他の要素を排除しない（すなわち、「含むが限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する）、非限定的な用語として解釈されるべきである。
【0166】
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で別段の指示がない限り、単にその範囲及び各端点にある別個の値の各々を個々に指す簡略法の役割を果たすものに過ぎず、別個の値及び端点の各々は、それが個々に本明細書で列挙されていたかのように本明細書に組み込まれる。
【0167】
本明細書に記載される方法は全て、本明細書で別段の指示がない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、あらゆる適切な順序で実施し得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的な言語（例えば、「等」）の使用は、本開示をより明らかにすることが意図されているに過ぎず、別途特許請求されない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる言語も、任意の特許請求されていない要素を、本開示を実施するのに必要不可欠なものとして示すものと解釈されるべきではない。
【0168】
本明細書では、本開示の好ましい実施形態が説明されており、例えば、本開示を実行するための本発明者らにとって公知の最良の形態が説明されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の説明を読むことで当業者に明らかになり得る。発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを予想し、発明者らは、本明細書中で具体的に説明されている形態以外で本開示が実施されることを意図する。したがって、本開示は、適用される法により認められるとおり、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての変更形態及び均等物を含む。さらに、上記の要素の任意の組み合わせは、別途本明細書で指示されない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形形態で本開示に包含される。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図2G】
【図2H】
【図2I】
【図2J】
【図2K】
【図2L】
【図2M】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【配列表】
【国際調査報告】