特表 2024-536135 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ挿入の効率を増大させるための阻害剤の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-04

(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ挿入の効率を増大させるための阻害剤の使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240927BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20240927BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240927BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240927BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240927BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N15/867 Z ZNA

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N9/16 Z

C07K14/725

C07K16/28

C07K19/00

C12N5/10

C12N15/11 Z

A61K38/46

A61K48/00

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519281

(86)(22)【出願日】2022-09-29

(85)【翻訳文提出日】2024-04-15

(86)【国際出願番号】 EP2022077122

(87)【国際公開番号】W WO2023052508

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】63/250,945

(32)【優先日】2021-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】391008951

【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ

【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】マレスカ，マルチェッロ

(72)【発明者】

【氏名】スヴィコヴィッチ，サーシャ

(72)【発明者】

【氏名】アクラプ，ニーナ

(72)【発明者】

【氏名】ヴィムベルガー，ザンドラ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA95Y

4B065AA97Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA31

4B065CA44

4C084AA01

4C084AA13

4C084BA44

4C084CA18

4C084CA59

4C084DC22

4C084NA14

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB54

4C087NA14

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA75

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、真核細胞のゲノムに目的のポリヌクレオチドを挿入する方法を提供するものであり、前記方法は、真核細胞へのマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤の添加によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ポリヌクレオチド挿入の効率を改善することを含む。本開示はさらに、目的のポリヌクレオチドを真核細胞のゲノムに挿入するための組成物、及び目的の遺伝子を真核細胞のゲノムに挿入するためのキットを提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

真核細胞のゲノムに目的のポリヌクレオチドを挿入する方法であって、
ａ．前記真核細胞を含む組成物にマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤を添加する工程、
ｂ．前記組成物にＣａｓエフェクタータンパク質を添加する工程、
ｃ．前記組成物に前記目的のポリヌクレオチドを添加する工程
を含み、前記目的のポリヌクレオチドは、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）によって前記ゲノムに挿入される、方法。

【請求項2】

（ａ）は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤を添加することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

（ｄ）ＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドを前記組成物に添加する工程
をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、（ｂ）において、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするＣａｓポリヌクレオチドを添加することによって添加される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

（ｉ）前記目的のポリヌクレオチド、（ｉｉ）（ｄ）の前記ポリヌクレオチド、又は（ｉｉｉ）前記Ｃａｓポリヌクレオチドの１つ以上は、ベクター上にコードされている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

（ｉ）前記目的のポリヌクレオチド、（ｉｉ）工程（ｄ）の前記ポリヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）前記Ｃａｓポリヌクレオチドは、単一ベクター上にコードされている、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記目的のポリヌクレオチドは、ＤＮＡとして添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

工程（ｄ）の前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡとして添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

工程（ｄ）の前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡとして添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＤＮＡとして添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記Ｃａｓポリヌクレオチドは、ＲＮＡとして添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記Ｃａｓポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項５又は６に記載の方法。

【請求項14】

前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質及び（ｄ）の前記ポリヌクレオチドは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で添加される、請求項３に記載の方法。

【請求項16】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質、前記目的のポリヌクレオチド、及び（ｄ）の前記ポリヌクレオチドは、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションによって、又は脂質ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、金ナノ粒子若しくはＤＮＡナノクルーによって、前記細胞に添加される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ベクターは、前記真核細胞をトランスフェクトすることによって前記組成物に添加される、請求項５又は９に記載の方法。

【請求項18】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｆヌクレアーゼである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、逆転写酵素に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮ１Ｓに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ジェミニンデグロンドメインに融合したＣａｓ９、又はＣＴＩＰに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記目的のポリヌクレオチドは、ベクターによって添加される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記目的のポリペプチドは、目的の遺伝子を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記目的のポリペプチドは、長さが１～５０塩基対である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記目的のポリペプチドは、長さが５０～５０００塩基対である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記目的のポリヌクレオチドは、一本鎖である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記目的のポリヌクレオチドは、二本鎖である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記目的のポリヌクレオチドは、一本鎖領域及び二本鎖領域を含むハイブリッドポリヌクレオチドである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記ハイブリッドポリヌクレオチドは、５’末端及び３’末端の二本鎖配列、並びに内部一本鎖配列を含む、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記目的のポリヌクレオチドは、平滑末端を有する二本鎖である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記目的のポリヌクレオチドは、３’オーバーハングを有する二本鎖である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記目的のポリヌクレオチドは、５’オーバーハングを有する二本鎖である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記目的のポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドである、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記目的のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの安定性、活性、分布、又は取り込みを増強する化学修飾を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ＰＯＬＱの阻害剤である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記ＰｏｌＱの阻害剤は、ＰｏｌＱ＿１、ＰｏｌＱ＿２、ＰｏｌＱ＿３、ＰｏｌＱ＿４、ＰｏｌＱ＿５、ＰｏｌＱ＿６、ＰｏｌＱ＿７、又はこれらの組み合わせである、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

前記ＰｏｌＱの阻害剤は、ペプチドである、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記組成物中の前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約１ｍＭである、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記組成物中の前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約１００μＭである、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）の阻害剤である、請求項２～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、Ｍ３８１４、Ｍ９８３１／ＶＸ９８４、Ｎｕ７４４１、Ｎｕ７０２６、ＫＵ００６０６４８、ＡＺＤ７６４８、又はこれらの組み合わせである、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、ＡＺＤ７６４８である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、ペプチドである、請求項４１に記載の方法。

【請求項45】

前記組成物中の前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約１ｍＭである、請求項２～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記組成物中の前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約１００μＭである、請求項２～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質を前記組成物に添加する０分～約４８時間前に前記組成物に添加される、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質を前記組成物に添加する０分～約２４時間前に前記組成物に添加される、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質を前記組成物に添加する０分～約６時間前に前記組成物に添加される、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質の前記組成物への添加から０分～約１時間後に前記組成物に添加される、請求項１～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質を前記組成物に添加する０分～約４８時間前に前記組成物に添加される、請求項２～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質を前記組成物に添加する０分～約２４時間前に前記組成物に添加される、請求項２～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質を前記組成物に添加する０分～約６時間前に前記組成物に添加される、請求項２～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記Ｃａｓエフェクタータンパク質の前記組成物への添加から０分～約１時間後に前記組成物に添加される、請求項２～５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤及び前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物に同時に添加される、請求項２～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤及び前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物に異なる時間に添加される、請求項２～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤、前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤、及び前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、前記組成物に同時に添加される、請求項２～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物中に約１～約３００時間存在する、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物中に約１０～約１００時間存在する、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、少なくとも１回、少なくとも２回、又は少なくとも３回添加される。請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物中に約１～約３００時間存在する、請求項２～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物中に約１０～約１００時間存在する、請求項２～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、少なくとも１回、少なくとも２回、又は少なくとも３回添加される。請求項２～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記真核細胞を含む前記組成物は、細胞培養物である、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記細胞培養物は、インビトロ細胞培養物又はエクスビボ細胞培養物である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記真核細胞は、インビボにある、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記細胞培養物は、細胞抽出物を含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項68】

前記真核細胞は、リンパ球である、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記リンパ球は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記真核細胞は、多能性幹細胞である、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項71】

前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記細胞培養物は、哺乳動物細胞培養物である、請求項６４に記載の方法。

【請求項73】

真核細胞のゲノムに目的のポリヌクレオチドを挿入する方法であって、
ａ．マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤を、前記真核細胞を含む組成物に添加する工程、
ｂ．前記目的のポリヌクレオチドを前記組成物に添加する工程
を含み、
前記ゲノムは、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含み、前記目的のポリヌクレオチドは、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）によって前記ゲノムに挿入される、方法。

【請求項74】

（ａ）は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤を前記組成物に添加することをさらに含む、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

（ｃ）ＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドを前記組成物に添加する工程
をさらに含む、請求項７３又は７４に記載の方法。

【請求項76】

（ｉ）前記目的のポリヌクレオチド及び（ｉｉ）前記（ｃ）のポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされる、請求項７５に記載の方法。

【請求項77】

前記目的のポリヌクレオチドは、ＤＮＡとして添加される、請求項７３～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡとして添加される、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＲＮＡとして添加される、請求項７５～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項７６に記載の方法。

【請求項81】

前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記ベクターは、前記真核細胞をトランスフェクトすることによって前記組成物に添加される、請求項７６に記載の方法。

【請求項83】

前記ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドは誘導性である、請求項７３～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｆヌクレアーゼである、請求項７３～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、逆転写酵素に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮ１Ｓに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ジェミニンデグロンドメインに融合したＣａｓ９、又はＣＴＩＰに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記目的のポリヌクレオチドは、ベクターによって添加される、請求項７３～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記目的のポリペプチドは、目的遺伝子を含む、請求項７３～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記目的のポリペプチドは、長さが１～５０塩基対である、請求項７３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記目的のポリペプチドは、長さが５０～５０００塩基対である、請求項７３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記目的のポリヌクレオチドは、一本鎖である、請求項７３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記目的のポリヌクレオチドは、二本鎖である、請求項７３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記目的のポリヌクレオチドは、一本鎖領域及び二本鎖領域を含むハイブリッドポリヌクレオチドである、請求項７３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記ハイブリッドポリヌクレオチドは、５’末端及び３’末端の二本鎖配列、並びに内部一本鎖配列を含む、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

前記目的のポリヌクレオチドは、平滑末端を有する二本鎖である、請求項７３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記目的のポリヌクレオチドは、３’オーバーハングを有する二本鎖である、請求項７３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記目的のポリヌクレオチドは、５’オーバーハングを有する二本鎖である、請求項７３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記ポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドである、請求項７３～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記目的のポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチドの安定性、活性、分布、又は取り込みを増強する化学修飾を含む、請求項７３～１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ＰＯＬＱの阻害剤である、請求項７３～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記ＰｏｌＱの阻害剤は、ＰｏｌＱ＿１、ＰｏｌＱ＿２、ＰｏｌＱ＿３、ＰｏｌＱ＿４、ＰｏｌＱ＿５、ＰｏｌＱ＿６、ＰｏｌＱ＿７、又はこれらの組み合わせである、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

前記ＰｏｌＱの阻害剤は、ペプチドである、請求項１０２に記載の方法。

【請求項105】

前記組成物中の前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約１ｍＭである、請求項７３～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記組成物中の前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約１００μＭである、請求項７３～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）の阻害剤である、請求項７４～１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、Ｍ３８１４、Ｍ９８３１／ＶＸ９８４、Ｎｕ７４４１、Ｎｕ７０２６、ＫＵ００６０６４８、ＡＺＤ７６４８、又はこれらの組み合わせである、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、ペプチドである、請求項１０７に記載の方法。

【請求項110】

前記ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、ＡＺＤ７６４８である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記組成物中の前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約１ｍＭである、請求項７４～１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項112】

前記組成物中の前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約１００μＭである、請求項７４～１１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項113】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導の０分～約４８時間前に前記組成物に添加される、請求項７３～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導の０分～約２４時間前に前記組成物に添加される、請求項７３～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導の０分～約６時間前に前記組成物に添加される、請求項７３～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導の０分～約２４時間前に前記組成物に添加される、請求項７３～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導の０分～約２４時間前に前記組成物に添加される、請求項７４～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導の０分～約６時間前に前記組成物に添加される、請求項７４～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤及び前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物に同時に添加される、請求項７４～１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤及び前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物に異なる時間に添加される、請求項７４～１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤及び前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導と同時に前記組成物に添加される、請求項７４～１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物中に約１～約３００時間存在する、請求項７３～１２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項123】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物中に約１０～約１００時間存在する、請求項７３～１２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項124】

前記ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、少なくとも１回、少なくとも２回、又は少なくとも３回添加される。請求項７３～１２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項125】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物中に約１～約３００時間存在する、請求項７４～１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、前記組成物中に約１０～約１００時間存在する、請求項７４～１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、少なくとも１回、少なくとも２回、又は少なくとも３回添加される。請求項７４～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項128】

前記真核細胞を含む前記組成物は、細胞培養物である、請求項７３～１２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項129】

前記細胞培養物は、インビトロ細胞培養物又はエクスビボ細胞培養物である、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

前記真核細胞は、インビボにある、請求項７３～１２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項131】

前記細胞培養物は、細胞抽出物を含む、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

前記真核細胞は、リンパ球である、請求項７３～１３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項133】

前記リンパ球は、キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項１３２に記載の方法。

【請求項134】

前記真核細胞は、多能性幹細胞である、請求項７３～１３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項135】

前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞である、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

前記細胞培養物は、哺乳動物細胞培養物である、請求項１３１に記載の方法。

【請求項137】

真核細胞のゲノムにポリヌクレオチドを挿入する方法であって、
ａ．マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤を、前記真核細胞を含む組成物に添加する工程、
ｂ．前記真核細胞に
ｉ．Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするベクター、
ｉｉ．目的のポリヌクレオチドをコードするベクター、
ｉｉｉ．ＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドを含むベクター
をトランスフェクトする工程
を含み、
前記（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のベクターは、同じベクター又は異なるベクター上に存在することができ、前記目的のポリヌクレオチドは、前記目的のポリヌクレオチドは、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）によって前記ゲノムに挿入される、方法。

【請求項138】

非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤を前記真核細胞を含む前記組成物に添加することをさらに含む、請求項１３７に記載の方法。

【請求項139】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１３７又は１３８に記載の方法。

【請求項140】

（ｉ）前記Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び（ｉｉ）前記目的のポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされる、請求項１３７～１３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項141】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び前記（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされる、請求項１３７～１３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項142】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質、前記目的のポリヌクレオチド、及び前記（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドは、単一ベクター上にコードされている、請求項１３７～１３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項143】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質及び前記（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で添加される、請求項１３７又は１３８に記載の方法。

【請求項144】

真核細胞における相同組変え修復（ＨＤＲ）及び一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）の遺伝子挿入効率を増大させる方法であって、前記真核細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入を実施する際に、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤を添加する工程を含む方法。

【請求項145】

非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤を添加することを含む、請求項１４４に記載の方法。

【請求項146】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子挿入である、請求項１４４又は１４５に記載の方法。

【請求項147】

細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入中のマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路組換えを低減する方法であって、Ｃａｓ媒介遺伝子挿入を行う際に、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤を前記細胞に添加することを含む方法。

【請求項148】

細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入中の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）組換えを低減することをさらに含み、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤を前記細胞に添加することを含む、請求項１４７に記載の方法。

【請求項149】

前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子挿入である、請求項１４７又は１４８に記載の方法。

【請求項150】

ａ．Ｃａｓエフェクタータンパク質、又はＣａｓエフェクタータンパク質をコードするベクター；及び
ｂ．マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤
を含む組成物。

【請求項151】

非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤をさらに含む、請求項１５０に記載の組成物。

【請求項152】

少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１５０又は１５１に記載の組成物。

【請求項153】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｆヌクレアーゼである、請求項１５０～１５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項154】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１５３に記載の組成物。

【請求項155】

前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、逆転写酵素に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮ１Ｓに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ジェミニンデグロンドメインに融合したＣａｓ９、又はＣＴＩＰに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１５４に記載の組成物。

【請求項156】

Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項１５０～１５５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項157】

少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含む前記ポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされている、請求項１５０～１５５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項158】

少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含む前記ポリヌクレオチドをコードする前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項１５７に記載の組成物。

【請求項159】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含む前記ポリヌクレオチドは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態である、請求項１５０又は１５１に記載の組成物。

【請求項160】

薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤をさらに含む、請求項１５０～１５９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項161】

ａ．Ｃａｓエフェクタータンパク質、又はＣａｓエフェクタータンパク質をコードするベクター；及び
ｂ．マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤
を含むキット。

【請求項162】

非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤をさらに含む、請求項１６１に記載のキット。

【請求項163】

ｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１６１又は１６２に記載のキット。少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１６１又は１６２に記載のキット。

【請求項164】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｆヌクレアーゼである、請求項１６１～１６３のいずれか一項に記載のキット。

【請求項165】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１６４に記載のキット。

【請求項166】

前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、逆転写酵素に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮ１Ｓに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ジェミニンデグロンドメインに融合したＣａｓ９、又はＣＴＩＰに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１６５に記載のキット。

【請求項167】

Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする前記ベクターは、ウイルスベクターである、請求項１６１～１６６のいずれか一項に記載のキット。

【請求項168】

前記ガイドポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされている、請求項１６１～１６７のいずれか一項に記載のキット。

【請求項169】

前記ガイドポリヌクレオチドは、ウイルスベクターである、請求項１６８に記載のキット。

【請求項170】

前記Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び前記ガイドポリヌクレオチドは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態である、請求項１６１又は１６２に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、真核細胞のゲノムに目的のポリヌクレオチドを挿入する方法を提供するものであり、前記方法は、真核細胞へのマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤の添加によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ポリヌクレオチド挿入の効率を改善することを含む。本開示はさらに、目的のポリヌクレオチドを真核細胞のゲノムに挿入するための組成物、及び目的の遺伝子を真核細胞のゲノムに挿入するためのキットを提供する。

【背景技術】

【0002】

生細胞のゲノムに対し正確に標的とした変更を行うための、費用効率が高く信頼性の高い方法を開発することは、長年の目標であった。ゲノム編集は、特定の障害の原因である遺伝子を排除する（すなわち、遺伝子「ノックアウト」）、或いは、遺伝子「ノックイン」によって遺伝子欠損を補正するか又は生物学的プロセスを増強するための遺伝子の操作又は挿入を行う手段を提供する可能性を有している。ゲノム編集は、遺伝性障害、血液学的障害及び癌の治療を含む多くの障害の治療に、また免疫療法の方法に適用され得る。

【0003】

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＩｓｈｉｎｏにより最初に発見された原核生物免疫システムである（非特許文献１）。原核生物免疫システムは、ウイルス及びプラスミドの核酸を配列特異的に標的化することにより、ウイルス及びプラスミドに対する免疫を提供する。（非特許文献２）も参照されたい。

【0004】

その最初の発見以来、複数のグループが、遺伝子編集を含む遺伝子工学におけるＣＲＩＳＰＲシステムの応用可能性に関して広範な研究を行ってきた（非特許文献３、非特許文献４及び非特許文献５）。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集システムは、広範な生物及び細胞株において首尾よく使用されている。ゲノム編集に加えて、ＣＲＩＳＰＲシステムは、とりわけ遺伝子発現の調節、遺伝子回路の構築、及び機能的ゲノム学を含む、複数の他の用途がある（非特許文献６に概説）。

【0005】

Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的配列のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流で二本鎖ＤＮＡの切断を生成する。次いで、標的配列を除去するか、又は目的の配列を、細胞の内因性修復経路を使用して標的配列に挿入することができる。内因性ＤＮＡ修復経路としては、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路、及び相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が挙げられる。ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ、及びＨＤＲ経路は二本鎖ＤＮＡ切断を修復するが、そのような二本鎖ＤＮＡ切断の修復は二本鎖切断部位における挿入又は欠失をもたらし得る。ＮＨＥＪにおいて、相同鋳型は、ＤＮＡ中の切断の修復に必要ではない。ＮＨＥＪ修復は、エラープローンであり得るが、エラーは、ＤＮＡ切断が適合性オーバーハングを含む場合に減少する。ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪは、それらのそれぞれに関与するＤＮＡ修復酵素の異なるサブセットにより機序的に区別されるＤＮＡ修復経路である。場合により正確であり、場合によりエラープローンであり得るＮＨＥＪと異なり、ＭＭＥＪは、常にエラープローンであり、修復中の部位に欠失及び挿入の両方をもたらす。ＭＭＥＪ関連欠失は、二本鎖切断の両側におけるマイクロホモロジー（２～１０塩基対）に起因する。対照的に、ＨＤＲは、修復を指示するために相同鋳型を必要とするが、ＨＤＲ修復は、典型的には、高フィデリティ且つ低エラープローンである。したがって、二本鎖ＤＮＡ切断のＨＤＲ駆動修復はＮＨＥＪ又はＭＭＥＪ媒介修復よりも好ましい。しかし、多くの細胞型において、ＨＤＲは細胞周期の全段階でＮＨＥＪの活性によって制限され、ＨＤＲは主に細胞増殖のＳ期で利用される（非特許文献７）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９（１２）：５４２９－５４３３（１９８７）

【非特許文献2】Ｓｏｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６（３）：１８１－１８６（２００８）

【非特許文献3】Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）

【非特許文献4】Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）

【非特許文献5】Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６（２０１３）

【非特許文献6】Ｓａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：３４７－３５５（２０１４）

【非特許文献7】Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ，７：２９０２－２９０６（２００８）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入の効率を増大させる方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は、真核細胞のゲノムに目的のポリヌクレオチドを挿入することを含み、本方法は（ａ）真核細胞を含む組成物にＭＭＥＪ経路の阻害剤を添加する工程、（ｂ）組成物にＣａｓエフェクタータンパク質を添加する工程、及び（ｃ）組成物に目的のポリヌクレオチドを添加する工程を含み、目的のポリヌクレオチドは、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）によって真核細胞のゲノムに挿入される。

【0008】

いくつかの実施形態では、方法の工程（ａ）は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤を添加することをさらに含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、本方法は、（ｄ）ＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドを組成物に添加する工程をさらに含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質及び（ｄ）のポリヌクレオチドは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で添加される。

【0011】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするＣａｓポリヌクレオチドを添加することによって、（ｂ）において添加される。

【0012】

いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチド、工程（ｄ）のポリヌクレオチド、及びＣａｓポリヌクレオチドは単一のベクター上にコードされる。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ＤＮＡとして添加される。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡとして添加される。いくつかの実施形態では、工程（ｄ）のポリヌクレオチドは、ＲＮＡとして添加される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクターポリヌクレオチドは、ＤＮＡとして添加される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリヌクレオチドは、ＲＮＡとして添加される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡとして添加される。

【0013】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。

【0014】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質、目的のポリヌクレオチド、及び（ｄ）のポリヌクレオチドは、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションによって、又は脂質ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、金ナノ粒子若しくはＤＮＡナノクルーによって、真核細胞に添加される。

【0015】

いくつかの実施形態では、ベクターは、真核細胞をトランスフェクトすることによって、真核細胞を含む組成物に添加される。

【0016】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｆヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、逆転写酵素に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮ１Ｓに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ジェミニンデグロンドメインに融合したＣａｓ９、又はＣＴＩＰに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである。

【0017】

いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ベクターによって添加される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルスである。

【0018】

いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、長さが１～５０塩基対である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、長さが１～１０塩基対である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、長さが５０～５０００塩基対である。

【0019】

いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、二本鎖である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、一本鎖領域及び二本鎖領域を含むハイブリッドポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ハイブリッドポリヌクレオチドは、５’末端及び３’末端の二本鎖配列、並びに内部一本鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、平滑末端を有する二本鎖である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、３’オーバーハングを有する二本鎖である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、５’オーバーハングを有する二本鎖である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドである。

【0020】

いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの活性、分布、又は取り込みを増強する化学修飾を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ＰＯＬＱ／ＤＮＡポリメラーゼθの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＯＬＱの阻害剤は、ＰｏｌＱ１、ＰｏｌＱ２、ＰｏｌＱ３、ＰｏｌＱ４、ＰｏｌＱ５、ＰｏｌＱ６ ＰｏｌＱ７、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＰＯＬＱの阻害剤は、ペプチドである。

【0022】

いくつかの実施形態では、真核細胞を含む組成物中のＭＭＥＪ経路の阻害剤は、約０．０１μＭ～約１ｍＭ、約０．１μＭ～約１ｍＭ、約０．１μＭ～約０．５ｍＭ、約０．１μＭ～約１００μＭ、又は約１μＭ～約５０μＭである。

【0023】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、Ｍ３８１４、Ｍ９８３１／ＶＸ９８４、Ｎｕ７４４１、ＫＵ００６０６４８、ＡＺＤ７６４８、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、ＡＺＤ７６４８である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、ペプチドである。

【0024】

いくつかの実施形態では、真核細胞を含む組成物中のＮＨＥＪ経路の阻害剤は、約０．０１μＭ～約１ｍＭ、約０．１μＭ～約１ｍＭ、約０．１μＭ～約０．５ｍＭ、約０．１μＭ～約１００μＭ、又は約１μＭ～約５０μＭである。

【0025】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質が組成物に添加される０分～約４８時間、０分～約２４時間、０分～約１２時間、０分～約６時間、又は０分～約１時間前に、真核細胞を含む組成物に添加される。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質が真核細胞を含む組成物に添加された０分～約１時間後に、真核細胞を含む組成物に添加される。

【0026】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質が組成物に添加される０分～約４８時間、０分～約２４時間、０分～約１２時間、０分～約６時間、又は０分～約１時間前に、真核細胞を含む組成物に添加される。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質が真核細胞を含む組成物に添加された０分～約１時間後に、真核細胞を含む組成物に添加される。

【0027】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤及びＮＨＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物に同時に添加される。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤及びＮＨＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物に異なる時間に添加される。

【0028】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤、ＮＨＥＪ経路の阻害剤、及びＣａｓエフェクタータンパク質は、真核細胞を含む組成物に同時に添加される。

【0029】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物中に、約１～約３００時間、約１０～約１００時間、又は約２０～約８０時間存在する。

【0030】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物に少なくとも１回、少なくとも２回、又は少なくとも３回添加される。

【0031】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物中に、約１～約３００時間、約１０～約１００時間、又は約２０～約８０時間存在する。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物に少なくとも１回、少なくとも２回、又は少なくとも３回添加される。

【0033】

いくつかの実施形態では、真核細胞を含む組成物は、細胞培養物である。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、インビトロ細胞培養物又はエクスビボ細胞培養物である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、インビボにある。

【0034】

いくつかの実施形態では、細胞培養物は、細胞抽出物を含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0037】

いくつかの実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞培養物である。

【0038】

いくつかの実施形態では、本開示は、目的のポリヌクレオチドを、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞のゲノムに挿入することを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入の効率を増大させる方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、真核細胞のゲノムに目的のポリヌクレオチドを挿入する方法であって、（ａ）マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤を、真核細胞を含む組成物に添加する工程、及び（ｂ）目的のポリヌクレオチドを組成物に添加する工程を含み、ゲノムは、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含み、目的のポリヌクレオチドは、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）によってゲノムに挿入される、方法を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドは誘導性である。

【0039】

いくつかの実施形態では、方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤を組成物に添加することをさらに含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）ＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドを組成物に添加する工程をさらに含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、（ｉ）目的のポリヌクレオチド及び（ｉｉ）（ｃ）のポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされる。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ＤＮＡとして添加される。いくつかの実施形態では、（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡとして添加される。いくつかの実施形態では、（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＲＮＡとして添加される。

【0042】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核細胞をトランスフェクトすることによって、真核細胞を含む組成物に添加される。

【0043】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｆヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、逆転写酵素に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮ１Ｓに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ジェミニンデグロンドメインに融合したＣａｓ９、又はＣＴＩＰに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである。

【0044】

いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、ベクターによって添加される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。

【0045】

いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、目的の遺伝子を含む。いくつかの態様では、目的のポリヌクレオチドは、１～５０塩基対長、１～１０塩基対長、又は５０～５０００塩基対長である。

【0046】

いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、一本鎖である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、二本鎖である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、一本鎖領域及び二本鎖領域を含むハイブリッドポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ハイブリッドポリヌクレオチドは、５’末端及び３’末端の二本鎖配列、並びに内部一本鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、平滑末端を有する二本鎖である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、３’オーバーハングを有する二本鎖である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、５’オーバーハングを有する二本鎖である。いくつかの実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、環状ポリヌクレオチドである。

【0047】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの活性、分布、又は取り込みを増強する化学修飾を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ＰＯＬＱ／ＤＮＡポリメラーゼθの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＯＬＱの阻害剤は、ＰｏｌＱ１、ＰｏｌＱ２、ＰｏｌＱ３、ＰｏｌＱ４、ＰｏｌＱ５、ＰｏｌＱ６ ＰｏｌＱ７、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＰＯＬＱの阻害剤は、ペプチドである。

【0049】

いくつかの実施形態では、真核細胞を含む組成物中のＭＭＥＪ経路の阻害剤は、約０．０１μＭ～約１ｍＭ、約０．１μＭ～約１ｍＭ、約０．１μＭ～約０．５ｍＭ、約０．１μＭ～約１００μＭ、又は約１μＭ～約５０μＭである。

【0050】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、Ｍ３８１４、Ｍ９８３１／ＶＸ９８４、Ｎｕ７４４１、ＫＵ００６０６４８、ＡＺＤ７６４８、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、ＡＺＤ７６４８である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、ペプチドである。

【0051】

いくつかの実施形態では、真核細胞を含む組成物中のＮＨＥＪ経路の阻害剤は、約０．０１μＭ～約１ｍＭ、約０．１μＭ～約１ｍＭ、約０．１μＭ～約０．５ｍＭ、約０．１μＭ～約１００μＭ、又は約１μＭ～約５０μＭである。

【0052】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物に、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導の０分～約４８時間、０分～約２４時間、０分～約１２時間、０分～約６時間、又は０分～約１時間前に添加される。

【0053】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物に、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導の０分～約４８時間、０分～約２４時間、０分～約１２時間、０分～約６時間、又は０分～約１時間前に添加される。

【0054】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤及びＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物に同時に添加される。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤及びＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物に異なる時間に添加される。

【0055】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導と同時に、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物に添加される。

【0056】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導と同時に、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物に添加される。

【0057】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤及びＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドの誘導と同時に、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物に添加される。

【0058】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物中に、約１～約３００時間、約１０～約１００時間、又は約２０～約８０時間存在する。

【0059】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物に少なくとも１回、少なくとも２回、又は少なくとも３回添加される。

【0060】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物中に、約１～約３００時間、約１０～約１００時間、又は約２０～約８０時間存在する。

【0061】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物に少なくとも１回、少なくとも２回、又は少なくとも３回添加される。

【0062】

いくつかの実施形態では、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞を含む組成物は、細胞培養物である。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、インビトロ細胞培養物又はエクスビボ細胞培養物である。

【0063】

いくつかの実施形態では、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞は、インビボにある。

【0064】

いくつかの実施形態では、細胞培養物は、細胞抽出物を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞培養物である。

【0065】

いくつかの実施形態では、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、リンパ球は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。

【0066】

いくつかの実施形態では、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む真核細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。

【0067】

いくつかの実施形態では、本開示は、真核細胞のゲノムに目的のポリヌクレオチドを挿入する方法であって、（ａ）マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤を、真核細胞を含む組成物に添加する工程、及び（ｂ）真核細胞を含む組成物に、（ｉ）Ｃａｓエフェクタータンパク質、（ｉｉ）目的のポリヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）ＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドを添加する工程を含み、目的のポリヌクレオチドは、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）によってゲノムに挿入される、方法を提供する。

【0068】

いくつかの実施形態では、方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤を、真核細胞を含む組成物に添加することをさらに含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態で添加される。

【0070】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質及び目的のポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質、目的のポリヌクレオチド、及び（ｉｉｉ）のポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ベクター上に存在する。

【0071】

いくつかの実施形態では、本開示は、真核細胞における相同組変え修復（ＨＤＲ）及び一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）の遺伝子挿入効率を増大させる方法であって、真核細胞においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入を実施する際に、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤を添加することを含む方法に関する。

【0072】

いくつかの実施形態では、方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤を添加することをさらに含む。

【0073】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子挿入である。

【0074】

いくつかの実施形態では、本開示は、細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入中のマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路組換えを低減する方法であって、Ｃａｓ媒介遺伝子挿入を行う際に、ＭＭＥＪ経路の阻害剤を細胞に添加することを含む方法に関する。

【0075】

いくつかの実施形態では、方法は、細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入中の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）組換えを低減することをさらに含み、ＮＨＥＪ経路の阻害剤を細胞に添加することを含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子挿入である。

【0077】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓエフェクタータンパク質、又はＣａｓエフェクタータンパク質をコードするベクターと、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤とを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤をさらに含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドをさらに含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｆヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの態様では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、逆転写酵素に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮ１Ｓに融合したＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ジェミニンデグロンドメインに融合したＣａｓ９、又はＣＴＩＰに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである。

【0080】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするベクターは、ウイルスベクターである。

【0081】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。

【0082】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態である。

【0083】

いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤をさらに含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、本開示は、Ｃａｓエフェクタータンパク質、又はＣａｓエフェクタータンパク質をコードするベクターと、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤とを含むキットに関する。

【0085】

いくつかの実施形態では、キットは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤をさらに含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドをさらに含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、又はＣａｓ１２ｆヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、逆転写酵素に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼ、ＤＮ１Ｓに融合したＣａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、ジェミニンデグロンドメインに融合したＣａｓ９、又はＣＴＩＰに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである。

【0088】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドは、ベクター上にコードされる。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。

【0089】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び少なくとも１つのＲＮＡガイド配列、Ｃａｓ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列又はこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態である。

【図面の簡単な説明】

【0090】

【図1】図１は、小分子阻害剤によるＤＮＡ修復の操作を示す概略図である。この概略図では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集システムの構成要素が、特定の配列で二本鎖切断（ＤＳＢ）を提供する。ＤＳＢは、不正確且つエラープローンなマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって、或いはより正確な相同組換え修復（ＨＤＲ）経路によって修復することができる。

【図2】図２Ａ～２Ｂは、本明細書の実施形態に記載される例示的な方法を示す。図２Ａは、ＰＯＬ Ｑ／ＤＮＡポリメラーゼθ（ＰｏｌＱｉ）及び／又はＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫｉ）の薬理学的阻害剤で細胞を３時間前処理した例を示す。次いで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムを細胞に添加する。６０時間後、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、ディープターゲットシーケンスを行う。次いで、シーケンスの結果を、ＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ修復の頻度を決定するために、理論的インデルメタ解析（Ｒａｔｉｏｎａｌ ＩｎＤｅｌ Ｍｅｔａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＩＭＡ）によって解析する。図２Ｂは、ＲＩＭＡの結果をグラフ表示で示し、ここで、マイクロホモロジーに関連する欠失が、図に示されるバーにより可視化される。

【図3】図３は、代表的なＰＯＬ Ｑ／ＤＮＡポリメラーゼθ阻害剤の化学構造を示す。

【図4】図４は、ＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路の阻害がＤＳＢのＨＤＲ修復の増加をもたらすことを示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８（１μＭ）単独で、及び示されたＰｏｌ Ｑ阻害剤と組み合わせて処理し、続いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子標的化を行った。正確なＤＮＡ修復のパーセンテージによって評価されるように、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤及びＰｏｌ Ｑ阻害剤の添加により、ＭＭＥＪ及びＮＨＥＪによるＤＮＡ修復が減少し、一方、ＨＤＲ媒介ＤＮＡ修復が増加した。

【図5】図５は、実施例１に記載される、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集効率に対するＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路阻害の効果を示す。

【図6】図６は、実施例２に記載される、変異リードによって測定された、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックイン効率に対するＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路阻害の効果を示す。

【図7】図７は、実施例２に記載される、マッピングリードによって測定された、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子ノックイン効率に対するＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路阻害の効果を示す。

【図8】図８は、実施例３に記載される、変異リードにおけるＭＭＥＪに対するＰｏｌ Ｑ阻害の効果を示す。

【図9】図９は、実施例３に記載される、マッピングリードにおけるＭＭＥＪに対するＰｏｌ Ｑ阻害の効果を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８（１μＭ）単独で、及び示されたＰｏｌ Ｑ阻害剤と組み合わせて処理し、続いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子ノックインを行った。Ｐｏｌ Ｑ阻害剤の添加により、マッピングリードにおいてＭＭＥＪの用量依存的減少がもたらされた。

【図10】図１０は、実施例４に記載される、細胞コンフルエンスに対するＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路阻害の効果を示す。

【図11】図１１は、実施例４に記載される、トランスフェクション効率に対するＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路阻害の効果を示す。

【図12】図１２は、ＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路の阻害が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）におけるＤＳＢのＨＤＲ修復の増加をもたらすことを示す。Ｃａｓ９誘導性ｉＰＳＣを、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８（１μＭ）及び／又は示されたＰｏｌ Ｑ阻害剤で処理し、続いてＣａｓ９媒介遺伝子標的化を誘導した。３つの別々の標的部位での正確なＤＮＡ修復のパーセンテージによって評価されるように、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤及びＰｏｌ Ｑ阻害剤の添加により、ＭＭＥＪ及びＮＨＥＪによるＤＮＡ修復が減少し、一方、ＨＤＲ媒介ＤＮＡ修復が増加した。

【図13】図１３は、Ｃａｓ９誘導性ｉＰＳＣにおける一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）媒介ノックイン効率に対するＰｏｌ Ｑ阻害の効果を示す。Ｃａｓ９誘導性ｉＰＳＣを、１μＭのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＺＡＤ７６４８及び／又は示されたＰｏｌ Ｑ阻害剤で処理し、続いて３つの別々の標的部位でＣａｓ９媒介遺伝子ノックインを誘導した。ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤及び／又はＰｏｌ Ｑ阻害剤の添加により、３つの標的部位の全てで、ＳＳＴＲ媒介ノックインが増加した。

【図14】図１４Ａ～１４Ｃは、初代ヒトＴ細胞における遺伝子編集に対するＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路を阻害する効果を示す。ＴＲＡＣを標的とするリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の形態でＣａｓ９をトランスフェクトした初代ヒトＴ細胞に、ノックインによって緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を挿入した。細胞を、１μＭのＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８単独で、及び示されたＰｏｌ Ｑ阻害剤と組み合わせて処理した。（Ａ）細胞生存率に対するＮＨＥＪ及び／又はＭＭＥＪ経路阻害の効果を示す。（Ｂ）細胞数に対するＮＨＥＪ及び／又はＭＭＥＪ経路阻害の効果を示す。（Ｃ）ＧＦＰノックイン効率に対するＮＨＥＪ及び／又はＭＭＥＪ経路阻害の効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0091】

本開示は、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入（すなわち、遺伝子「ノックイン」）を改善する方法、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入を改善するための組成物、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介遺伝子挿入を改善するためのキットに関する。一般に、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的ポリヌクレオチド、例えば標的ＤＮＡ配列の部位で、ガイドポリヌクレオチド及びＣａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを含む。天然に存在するＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、細菌性免疫ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム）では、外来性ＤＮＡがＣＲＩＳＰＲアレイに組み込まれ、次いでＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を生成する。ｃｒＲＮＡは、外来性ＤＮＡ部位に相補的なＲＮＡガイド配列領域を含み、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズするが、このＲＮＡもＣＲＩＳＰＲシステムによってコードされている。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ステムループなどの二次構造を形成し、Ｃａｓ９タンパク質に結合することができる。ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、Ｃａｓ９と会合し、このｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が、プロトスペーサー配列を有する外来性ＤＮＡを認識して開裂させることにより、侵入してくるウイルス又はプラスミドに対する免疫が付与される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、さらに、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）；Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３（２０１３）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６（２０１３）；及びＳａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３２：３４７－３５５（２０１４）に記載されている。

【0092】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的ポリヌクレオチドへの挿入を導入するように操作されており、標的挿入としても知られている。典型的には、ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓタンパク質が標的ポリヌクレオチドで二本鎖開裂を生じさせ、目的配列を含む別個のドナー鋳型が、細胞のＤＮＡ修復機構、例えば、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ＨＤＲ）により、この開裂された標的ポリヌクレオチドに挿入されるように設計されている。挿入の効率は、ドナー鋳型、Ｃａｓタンパク質、及びガイドポリヌクレオチドのトランスフェクション比；ドナー鋳型の配列及びサイズ；並びに誘発されるＤＮＡ修復機構の種類を含む、いくつかの要因に依存する。例えば、ＨＤＲは、高い忠実度のＤＮＡ修復を提供するが、挿入頻度が低く、その一方で、ＮＨＥＪは、挿入頻度は高いが、標的ＤＮＡに変異を導入してしまう可能性もある。

【0093】

いくつかの実施形態では、本開示は、改良された標的挿入方法のための組成物、ポリヌクレオチド、及び／又は融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の組成物、ポリヌクレオチド、及び／又は融合タンパク質により、高度に正確な目的配列の挿入が提供される。いくつかの実施形態では、本開示の組成物、ポリヌクレオチド、及び融合タンパク質により、高度に効率的な目的配列の挿入が提供される。

【0094】

本開示において使用される科学技術用語は、本明細書において特に定義しない限り、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で使用され、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同時に使用される場合、語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書で使用される場合、「別の」又は「さらなる」は、少なくとも第２のもの以上を意味し得る。

【0095】

本出願全体にわたり、用語「約」は、値が、その値を決定するために用いられている方法／装置についての誤差の固有の変動又は試験対象間で存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、「約」という用語は、状況に応じておよそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％、又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％未満の変動性を包含することを意味する。

【0096】

特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すものと明示されていない限り、又は代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ、及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

【0097】

本明細書で使用される場合、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに含んでいる、の任意のバリアント又は形態、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに有している、の任意のバリアント又は形態、例えば「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」）、「包含している（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに包含している、の任意のバリアント又は形態、例えば「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、又は「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（並びに含有している、の任意のバリアント又は形態、例えば「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）は、包含的又はオープンエンドであり、追加の引用されない要素又は方法工程を除外するものではない。本明細書で説明される実施形態はいずれも、本開示の任意のタンパク質、組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、方法及び／又はキットに対して実行することができることが企図されている。さらに、本開示の組成物、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞及び／又はキットを使用して、本開示の方法及びタンパク質を得ることができる。

【0098】

用語「例えば」及びその対応する略語「ｅ．ｇ．（イタリック体であるか否かを問わない）」の使用は、引用される特定の用語が、特に明示されていない限り、参照又は引用される特定の例に限定されるものではない本開示の代表的な例及び実施形態であることを意味する。

【0099】

本明細書で使用される場合、「～の間」とは、範囲の両端を含む範囲である。例えば、ｘとｙの間の数値には、数値ｘとｙ、及びｘとｙに含まれるあらゆる数値が明示的に含まれる。

【0100】

「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は、共有結合ヌクレオチドを含むポリマー化合物を意味する。「核酸」という用語には、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれ、その両方が一本鎖又は二本鎖であり得る。ポリヌクレオチドは、天然に存在する核酸塩基（例えば、グアニン、アデニン、シトシン、チミン、及びウラシル）、修飾核酸塩基（例えば、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン）、及び／又は人工核酸塩基（例えば、イソグアニン又はイソシトシン）を含み得る。核酸は、５’末端から３’末端に転写される。いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。ＲＮＡ及びＤＮＡヌクレオチドの両方を含むポリヌクレオチドを生成する方法は、当該技術分野において知られており、例えば、ライゲーション法又はオリゴヌクレオチド合成法が挙げられる。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるようなＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼと複合体を形成することができるポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるタンパク質のいずれか１つ、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。

【0101】

「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合体を指し、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸分子が含まれる。いくつかの実施形態では、「遺伝子」はまた、コード配列の前（すなわち５’）及び後（すなわち３’）の調節配列として機能することができる非コード核酸断片を指す。

【0102】

核酸分子は、温度及び溶液イオン強度の適切な条件下で核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子にアニールし得る場合、別の核酸分子、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はＲＮＡに「ハイブリダイズ可能である」又は「ハイブリダイズされる」。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にその中の第１１章及び表１１．１に例示されている。温度及びイオン強度の条件により、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが決定される。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、潜在的に交差反応又は干渉する他のポリヌクレオチドの存在下で、２つの相補的なポリヌクレオチドの所望のハイブリダイゼーション産物の選択的な形成又は維持をもたらすように選択することができる。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、典型的には、相補的配列が長いほど、より短い相補的配列よりも高温で特異的にハイブリダイズする。通常、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、特定のポリヌクレオチドについて、定義されたイオン強度、化学変性剤の濃度、ｐＨ、及びハイブリダイゼーションパートナーの濃度での熱融点（Ｔ_ｍ）（すなわち、配列の５０％が、実質的に相補的な配列にハイブリダイズする温度）よりも約５℃～約１０℃低い。通常、ヌクレオチド配列は、Ｇ塩基及びＣ塩基のパーセンテージが高いほど、Ｇ塩基及びＣ塩基のパーセンテージがより低いヌクレオチド配列よりもストリンジェントな条件の下で、ハイブリダイズする。一般に、温度を上昇させること、ｐＨを上昇させること、イオン強度を低下させること、及び／又は化学核酸変性剤（例えば、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、及び炭酸エチレン）の濃度を上昇させることによって、ストリンジェンシーを増大させることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ、５００ｍＭ、２００ｍＭ、１００ｍＭ、又は５０ｍＭ未満の塩濃度又はイオン強度；約２０℃、３０℃、４０℃、６０℃、又は８０℃超のハイブリダイゼーション温度；及び約１０％、２０％、３０％、４０％、又は５０％を上回る化学変性剤濃度を含む。多くの要因がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす可能性があるため、任意のパラメータ単独の絶対値よりパラメータの組み合わせがより重要となり得る。

【0103】

用語「相補的」は、互いにハイブリダイズし得るヌクレオチド塩基間の関係を記載するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンは、チミンに相補的であり、シトシンは、グアニンに相補的である。２つの核酸が「相補的」である場合、第１の核酸又はその１つ以上の領域が、第２の核酸又はその１つ以上の領域と水素結合することができることを意味する。相補的な核酸は、各ヌクレオチドで相補性を有する必要はなく、１つ以上のヌクレオチドミスマッチ、すなわち水素結合が生じない点を含んでもよい。例えば、相補的なオリゴヌクレオチドは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のヌクレオチドの水素結合を有し得る。対照的に、オリゴヌクレオチドに関する「完全に相補的」又は「１００％相補的」は、いかなるヌクレオチドミスマッチもない状態で各ヌクレオチドが水素結合していることを意味する。

【0104】

「相同組換え」という用語は、外因性ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）の別の核酸（例えば、ＤＮＡ）分子への挿入、例えば染色体におけるベクター、ポリヌクレオチド断片、又は遺伝子の挿入を指す。いくつかの例では、外因性ポリヌクレオチドは、相同組換えのために特異的な染色体部位を標的化する。特異的相同組換えでは、外因性ポリヌクレオチドは、典型的には、外因性ポリヌクレオチドが染色体に相補的に結合して組み込まれることができるように、染色体の配列と相同な十分に長い領域を含有する。相補性領域がより長く、配列類似性の程度がより大きいと、相同組換えの効率を増大させることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチド又は組成物は、核酸配列に切断、例えば二本鎖切断を生じさせることにより、相同組換えを促進する。

【0105】

「相同組換え修復」又は「ＨＤＲ」という用語は、鋳型核酸配列を使用してＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する機構を指す。ＨＤＲの最も一般的な形態は相同組換えである。ＨＤＲでは、二本鎖切断が、切断部の５’末端ＤＮＡ鎖の切除を含むプロセスによって修復されて、３’オーバーハングを生成し、これが、鎖侵入に必要なタンパク質の基質及びＤＮＡ修復合成のためのプライマーの両方として働く。次いで、侵襲性鎖が相同配列を含む二本鎖ＤＮＡ鋳型配列の一方の鎖を置換し、他方の鎖と対合し、置換ループとして知られるハイブリッドＤＮＡを形成する。次いで、これらの組換え中間体を分離して、ＤＮＡ修復プロセスを完了する。

【0106】

「一本鎖鋳型修復」又は「ＳＳＴＲ」という用語は、鋳型核酸配列を使用してＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する別の機構を指す。ＨＤＲとは対照的に、ＳＳＴＲは、二本鎖ＤＮＡ切断修復のために一本鎖鋳型核酸配列を利用する。

【0107】

「非相同末端結合経路」又は「ＮＨＥＪ経路」という用語は、ＤＮＡ中の二本鎖切断を修復する別の機構を指す。ＮＨＥＪにおいては、Ｋｕ８０／７０ヘテロ二量体が二本鎖切断によって形成される平滑末端を認識して結合し、得られる複合体は、ＤＮＡ－ＰＫの活性を活性化する。ＤＮＡ－ＰＫの活性化により、最終的に二本鎖切断を修復するために、Ａｒｔｅｍｉｓヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼがリクルートされる。ＮＨＥＪは、修復のために相同鋳型配列を必要としないという点で、ＨＤＲ及び相同組換えとは異なる。

【0108】

「マイクロホモロジー媒介末端結合経路」又は「ＭＭＥＪ経路」という用語は、ＤＮＡ中の二本鎖切断を修復するための別の機構を指す。ＭＭＥＪは、二本鎖切断修復に相同鋳型配列が利用されないという点で、ＮＨＥＪと類似している。しかし、ＭＭＥＪは、マイクロホモロジー配列を利用して切断されたＤＮＡ鎖を整列させることによって、他の修復機構と区別される。ＭＭＥＪは、Ｋｕタンパク質又はＤＮＡ－ＰＫに依拠しないが、ＤＮＡポリメラーゼθ（Ｐｏｌ Ｑ）がＭＭＥＪに必要であることが示されている。ＭＭＥＪは、「代替的末端結合」又は「代替的非相同末端結合」又は「Ａｌｔ－ＮＨＥＪ」としても知られている

【0109】

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、目的のポリヌクレオチド、例えばヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドを発現させることができるような方法で調節エレメントに連結されていることを意味する。調節エレメントは、シス調節エレメントであっても、トランス調節エレメントであってもよい。調節エレメントとしては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、インスレーター、サイレンサー、オペレーターなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、プロモーターである。いくつかの実施形態では、目的タンパク質を発現するポリヌクレオチドは、発現ベクター上のプロモーターに作動可能に連結されている。

【0110】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」、「プロモーター配列」、又は「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流のコード配列又は非コード配列の転写の開始に関与するＤＮＡ調節領域又はポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンドを超えた検出可能なレベルで転写を開始するために使用される最小数の塩基又はエレメントを含むように上流に伸長している。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位、及びＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインを含む。真核生物のプロモーターは、典型的には、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。種々のプロモーター、例えば誘導性プロモーターを使用して、本開示の種々のベクターの発現を駆動してもよい。

【0111】

「ベクター」は、宿主細胞中に核酸をクローニングし、且つ／又は移行させる任意の手段である。ベクターは、別のＤＮＡセグメントを付着させて付着セグメントの複製を生じさせることができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわちそれ自体の制御下で複製し得る任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、例えば、非対称分配によって多くの細胞世代後に細胞集団から除去／消去されるエピソーマルベクターである。用語「ベクター」には、インビトロ、エクスビボ又はインビボで細胞中に核酸を導入するためのウイルス及び非ウイルス手段の両方が含まれる。当該技術分野で知られる多数のベクターを使用して核酸を操作し、応答エレメント及びプロモーターを遺伝子に組み込んだりすることができる。ベクターは、１つ以上の調節領域、並びに／又は、核酸導入結果（組織への導入、発現期間など）の選択、測定、及びモニタリングに有用な選択マーカーを含み得る。

【0112】

考えられるベクターとしては、例えば、プラスミド又は改変ウイルス、例として、例えば、バクテリオファージ、例えばラムダ誘導体、又はプラスミド、例えばＰＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体、又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターが挙げられる。例えば、好適なベクターへの応答エレメント及びプロモーターに対応するＤＮＡ断片の挿入は、適切なＤＮＡ断片を相補的な付着端を有する選択されたベクターにライゲートすることによって達成することができる。或いは、ＤＮＡ分子の末端を酵素により改変してもよく、又はポリヌクレオチド（リンカー）をＤＮＡ末端にライゲートすることによって任意の部位を生成してもよい。このようなベクターは、細胞ゲノムにマーカーが組み込まれている細胞の選択を提供する選択マーカー遺伝子を含有するように改変してもよい。このようなマーカーにより、マーカーを組み込み、そのマーカーによりコードされるタンパク質を発現する宿主細胞を同定及び／又は選択することが可能となる。

【0113】

ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞だけでなく、生きている動物対象においても、多種多様な遺伝子送達用途で使用されている。使用可能なウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスベクター、バキュロウイルスベクター、ワクシニアベクター、単純ヘルペスベクター、エプスタイン・バーベクター、アデノウイルスベクター、ジェミニウイルスベクター、及びカリモウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを提供するために、ウイルスベクターが利用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供するために、ウイルスベクターが利用される。

【0114】

ベクターは、トランスフェクション、形質導入、細胞融合、及びリポフェクションを含むがこれらに限定されない知られた方法により、所望の宿主細胞に導入され得る。ベクターは、プロモーターを含む種々の調節エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターの設計は、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９５７－６３（２０１３）により設計された構築物をベースとすることができる。

【0115】

本明細書に提供されるポリヌクレオチド及び／又はベクターを増殖させるために、当該技術分野で知られる方法を使用してもよい。好適な宿主系及び増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを増殖させ、大量に調製することが可能となる。本明細書に記載されるように、使用可能な発現ベクターとしては、以下のベクター又はそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない：ヒト又は動物ウイルス、例えばワクシニアウイルス又はアデノウイルス、昆虫ウイルス、例えばバキュロウイルス、酵母ベクター、バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、並びにプラスミド及びコスミドＤＮＡベクター。

【0116】

用語「プラスミド」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を担持することが多く、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である外部染色体エレメントを指す。このようなエレメントは、多数のポリヌクレオチドが、適切な３’非翻訳配列と共に選択遺伝子を産生させるためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能な独自の構築物に結合されるか、又は組換えられている、任意の源に由来する自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線状、環状又はスーパーコイル状の一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであってよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドを提供するために、プラスミドが利用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供するために、ウイルスベクターが利用される。

【0117】

本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」という用語は、ベクターを含む外因性核酸分子を細胞に導入することを意味する。例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ組成物の構成成分のトランスフェクション法は、当業者に知られている。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞内部の外因性核酸分子を含み、「形質転換された」細胞は、細胞内の外因性核酸分子が細胞の表現型変化を誘導する細胞である。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込むことができ、且つ／又は一時的若しくは長期間にわたり染色体外で細胞により維持させることができる。外因性核酸分子又は断片を発現する宿主細胞又は生物は、本明細書では、「組換え」生物、「形質転換」生物、又は「トランスジェニック」生物と称される。いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のベクターのいずれか、例えばＣａｓポリヌクレオチドを含むベクター、目的のポリヌクレオチドを含むベクター、又はＲＮＡガイド配列、ＣＡＳ結合領域、ＤＮＡ鋳型配列、若しくはこれらの組み合わせを含むポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0118】

「宿主細胞」という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すか、又は、そのような細胞の後代を指すこともある。例えば、変異又は環境の影響により改変が後の世代に発生する場合があるため、そのような後代は、親細胞と同一ではない場合があるが、用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。

【0119】

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、その用語には、コード及び非コードアミノ酸、非天然アミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、改変ペプチド骨格を有するペプチド及びポリペプチド、並びに環状の（ｃｉｒｃｕｌａｒ）／環状の（ｃｙｃｌｉｃ）ペプチド及びポリペプチドが含まれる。

【0120】

タンパク質又はポリペプチドの始点は、「Ｎ末端」（及びアミノ末端、ＮＨ_２末端、Ｎ末端部、又はアミン末端とも称される）として知られており、タンパク質又はポリペプチドの最初のアミノ酸残基の遊離アミン（－ＮＨ_２）基を指す。タンパク質又はポリペプチドの終点は、「Ｃ末端」（及びカルボキシ末端、カルボキシル末端、Ｃ末端部、又はＣＯＯＨ末端とも称される）として知られており、タンパク質又はポリペプチドの最後のアミノ酸残基の遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を指す。

【0121】

「アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）及びアミノ（－ＮＨ_２）基の両方を含有する化合物を指す。「アミノ酸」は、天然及び非天然（すなわち合成）のアミノ酸の両方を指す。３文字及び１文字の略記を有する天然アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ；Ａ）；アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）；アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）；システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）；グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）；ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）；リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）；メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）；プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）；セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）；トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）；トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）；チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）；及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が挙げられる。非天然又は合成アミノ酸としては、上記で提供される天然アミノ酸と異なる側鎖を含み、例えば、フルオロフォア、翻訳後修飾、金属イオンキレート剤、光ケージド部分及び光架橋部分、独自の反応性官能基、並びにＮＭＲ、ＩＲ、及びＸ線結晶プローブが挙げられ得る。例示的な非天然又は合成アミノ酸は、例えば、Ｍｉｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：２０４（２０１３）及びＷａｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｃｈｅｍ ２：１５（２０１４）に提供されている。非天然アミノ酸にはまた、例えば、シトルリン（Ｃｉｔ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、及びピロリジン（Ｐｙｌ）などの、通常はタンパク質又はポリペプチドに組み込まれることのない、天然の化合物も含まれ得る。

【0122】

「アミノ酸置換」は、野生型又は天然アミノ酸の、その野生型又は天然アミノ酸とは異なるアミノ酸による、そのアミノ酸残基における、１つ以上の置換を含むポリペプチド又はタンパク質を指す。置換アミノ酸は、合成アミノ酸であっても、天然発生アミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、置換アミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される天然アミノ酸である。いくつかの実施形態では、置換アミノ酸は、非天然又は合成アミノ酸である。置換変異体は、略記方式を用いて記載され得る。例えば、５番目のアミノ酸残基が置換されている置換変異は、「Ｘ５Ｙ」と略記することができ、ここで、「Ｘ」は、置き換えられる野生型又は天然アミノ酸であり、「５」は、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列内のアミノ酸残基の位置であり、「Ｙ」は、置換アミノ酸、又は非野生型若しくは非天然アミノ酸である。

【0123】

「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド又は核酸は、その天然環境から取り出された分子である。「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又は核酸は、希釈剤又は助剤などの賦形剤と配合されてもよく、それでもなお単離されているとみなされることもまた理解される。本明細書で使用される場合、「単離」は、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又は核酸の任意の特定のレベルの純度を必ずしも意味するものではない。

【0124】

用語「組換え体」は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、天然に存在することが知られていない遺伝子材料の新たな組合せを意味するか、又はそれらの新たな組合せから生じることを意味する。組換え分子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用する）遺伝子スプライシング、及び核酸分子、ペプチド又はタンパク質の固相合成を含むがこれらに限定されない、組換え技術の分野で利用可能な技術のいずれかによって産生することができる。

【0125】

「外因性」という用語は、宿主細胞に導入される参照分子又は活性を意味する。この分子は、例えば、宿主の遺伝物質にコード核酸を導入することによって、例えば、宿主の染色体に組み込むことによって、又は非染色体性遺伝物質、例えばプラスミドとして、導入することができる。「外来性」タンパク質は、このタンパク質をコードする「外因性」核酸によって宿主細胞に導入することができる。「内因性」という用語は、宿主細胞内に天然に存在する参照分子又は活性を指す。「内因性」タンパク質は、宿主細胞内に含まれる核酸によって発現される。「異種」という用語は、参照生物／種以外の源に由来する分子又は活性を指し、一方「相同」は、宿主生物／種に由来する分子又は活性を指す。したがって、コード核酸の外因性発現は、異種コード核酸又は相同コード核酸の一方又はその両方を利用することができる。

【0126】

用語「ドメイン」は、ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、タンパク質中の区別される機能的及び／又は構造的単位を意味する。ドメインは、タンパク質の全体的な役割に寄与する特定の機能又は相互作用を担う場合がある。ドメインは、種々の生物学的コンテクストにおいて存在し得る。類似のドメインは、異なる機能を有するタンパク質で見出され得る。或いは、配列同一性が低い（すなわち、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満の配列同一性）ドメインは、同じ機能を有し得る。

【0127】

用語「モチーフ」は、ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、一般的に、タンパク質の機能に重要であり得る、典型的には長さが２０アミノ酸より短い保存アミノ酸残基を指す。特定の配列モチーフは、様々なタンパク質において、特定の細胞内位置に対するタンパク質の結合又は標的化などの一般的な機能を媒介することができる。モチーフの例としては、以下に限定されないが、核局在化シグナル、ミクロボディ標的化モチーフ、分泌を阻止又は促進するモチーフ、並びにタンパク質の認識及び結合を促進するモチーフが挙げられる。モチーフのデータベース及び／又はモチーフ検索ツールは、当該分野で知られており、例えば、ＰＲＯＳＩＴＥ、ＰＦＡＭ、ＰＲＩＮＴＳ、及びＭｉｎｉＭｏｔｉｆ Ｍｉｎｅｒが挙げられる。

【0128】

「改変」タンパク質は、本明細書で使用される場合、タンパク質中に所望の特性を達成するための１つ以上の修飾を含むタンパク質を意味する。例示的な改変としては、以下に限定されないが、挿入、欠失、置換、及び／又は別のドメイン若しくはタンパク質との融合が挙げられる。「融合タンパク質」（「キメラタンパク質」とも称される）は、典型的には、単一のユニットとして転写及び翻訳されるように結合されている、２つの別個の遺伝子によってコードされる、少なくとも２つのドメインを含むタンパク質であり、結合されていることによって、ドメインのそれぞれの機能的特性を有する単一のポリペプチドが生成される。本開示の改変タンパク質には、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、並びにＣａｓタンパク質とＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及び／又はＤＮＡポリメラーゼ結合タンパク質との融合体が含まれる。

【0129】

いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、野生型タンパク質から生成される。本明細書で使用される場合、「野生型」タンパク質又は核酸は、天然の改変されていないタンパク質又は核酸である。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、生物であるストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から単離することができる。野生型は「変異型」と対比することができ、変異型は、タンパク質又は核酸のアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列に１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、改変タンパク質は、野生型タンパク質と実質的に同じ活性、例えば、野生型タンパク質の約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％％超、又は約９９％超の活性を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質のＣａｓヌクレアーゼは、野生型Ｃａｓヌクレアーゼと実質的に同じ活性を有する。

【0130】

いくつかの実施形態では、改変タンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質は、野生型タンパク質と実質的に同じアミノ酸配列、例えば、野生型タンパク質と約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％％超、又は約９９％超の同一性を有し得る。本明細書において使用される場合、用語「配列類似性」又は「類似性％」は、核酸配列間又はアミノ酸配列間の同一性又は対応性の程度を指す。ポリヌクレオチドに関連して、「配列類似性」は、１つ以上のヌクレオチド塩基の変化によって、１つ以上のアミノ酸の置換が生じるが、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の機能的特性に影響しない核酸配列を指す場合がある。「配列類似性」はまた、結果として生じる転写産物の機能的特性に実質的に影響しないポリヌクレオチドの改変、例えば、１つ以上のヌクレオチド塩基の欠失又は挿入を指す場合もある。したがって、本開示は、特定の例示的な配列よりも多くを包含することが理解される。ヌクレオチド塩基の置換を形成する方法は、コードされるポリペプチドの生物活性の保持を判定する方法と同様に知られている。

【0131】

さらに、当業者であれば、本開示に包含される類似のポリヌクレオチドが、ストリンジェントな条件下で本明細書に例示される配列とハイブリダイズする能力によって定義されることも認識する。本開示の類似のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドと、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である。

【0132】

ポリペプチドに関連して、「配列類似性」は、アミノ酸の約４０％超が同一であるか、又はアミノ酸の約６０％超が機能的に同一である２つ以上のポリペプチドを指す。「機能的に同一の」又は「機能的に類似の」アミノ酸は、化学的に類似した側鎖を有する。例えば、アミノ酸は、機能的類似性によって以下のようにグループ分けすることができる：（ｉ）正荷電側鎖：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ；（ｉｉ）負荷電側鎖：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（ｉｉｉ）極性非電荷側鎖：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（ｉｖ）疎水性側鎖：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ；及び（ｖ）その他：Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ。

【0133】

いくつかの実施形態では、本開示の類似のポリペプチドは、約４０％、少なくとも約４０％、約４５％、少なくとも約４５％、約５０％、少なくとも約５０％、約５５％、少なくとも約５５％、約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、本開示の類似のポリペプチドは、約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％機能的に同一であるアミノ酸を有する。

【0134】

配列類似性は、当該分野において知られた方法を使用する配列アライメント、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥ、Ｃｌｕｓｔａｌ（ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＸを含む）、並びにＴ－Ｃｏｆｆｅｅ（例えば、Ｍ－Ｃｏｆｆｅｅ、Ｒ－Ｃｏｆｆｅｅ、及びＥｘｐｒｅｓｓｏなどのバリアントを含む）などによって決定することができる。

【0135】

ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が指定された比較ウィンドウに対してアライメントされる場合に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの同一性パーセントを決定することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列の特定の部分のみをアライメントして、配列同一性を決定する。いくつかの実施形態では、２つ以上の配列の特定のドメインのみをアライメントして、配列類似性を決定する。比較ウィンドウは、配列をアライメントして比較することが可能な、少なくとも１０～１０００個超の残基、少なくとも２０～約１０００個の残基、又は少なくとも５０～５００個の残基のセグメントであり得る。配列同一性を決定するためのアライメント方法はよく知られており、ＢＬＡＳＴなどの公的に利用可能なデータベースを使用して実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）におけるように修正されている）のアルゴリズムを用いて決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴプログラム、例えばＢＬＡＳＴ＋又はＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質の検索は、本開示のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長さ＝３）などのプログラムによって実施することができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５（１７）：３３８９－３４０２（１９９７）に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。

【0136】

いくつかの実施形態では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、本明細書に提供される参照ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド（又は参照ポリペプチド若しくはポリヌクレオチドの断片）と、７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％、又は少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、本明細書に提供される参照ポリペプチド若しくはポリヌクレオチド（又は参照ポリペプチド若しくは核酸分子の断片）と、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。

【0137】

本明細書で使用される場合、「複合体」は、会合した２つ以上のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの群を指す。複合体の形成に関連して、「会合する」又は「会合」という用語は、共有結合せずに、静電相互作用、疎水性／親水性相互作用、及び／又は水素結合相互作用によって互いに結合した分子を指す。互いに共有結合した異なる部分を含む分子は知られている。いくつかの実施形態では、複合体は、複合体の全ての構成成分が共に存在する場合に形成され、すなわち自己集合複合体である。いくつかの実施形態では、複合体は、複合体の異なる構成成分間の化学的相互作用、例えば、水素結合などによって形成される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドは、タンパク質によるポリヌクレオチドの二次構造認識により、本明細書に提供されるタンパク質と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるポリヌクレオチドのＣａｓ結合領域は、本明細書に提供されるＣａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、又は融合タンパク質により認識される二次構造を含む。

【0138】

Ｃａｓタンパク質
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓエフェクタータンパク質」は、本明細書では「Ｃａｓタンパク質」とも称され、Ｃａｓヌクレアーゼ及びＣａｓニッカーゼの両方を包含する。Ｃａｓエフェクタータンパク質は、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの一部である。Ｃａｓエフェクタータンパク質及びポリヌクレオチド（「ガイドポリヌクレオチド」とも称される）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、部位特異的ゲノム改変に利用することができる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓエフェクタータンパク質と、Ｃａｓ結合領域（Ｃａｓタンパク質に結合し且つ／又はＣａｓタンパク質を活性化する）及びガイド配列（標的配列にハイブリダイズする）を含むガイドポリヌクレオチドとを含み、Ｃａｓエフェクタータンパク質とガイドポリヌクレオチドとは、本明細書に記載されるように複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓエフェクタータンパク質と、ガイド配列を含む第１のポリヌクレオチドと、Ｃａｓ結合領域を含む第２のポリヌクレオチドとを含み、第１及び第２のポリヌクレオチドが互いにハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成する。

【0139】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、システム内のＣａｓエフェクタータンパク質に基づいて、Ｉ型～ＶＩ型に分類することができる。例えば、Ｃａｓ９はＩＩ型システムで見られるが、Ｃａｓ１２はＶ型システムで見られるものである。それぞれの型は、さらにサブタイプに分類することができる。例えば、ＩＩ型はサブタイプＩＩ－Ａ、ＩＩ－Ｂ、及びＩＩ－Ｃを含むことができ、Ｖ型はサブタイプＶ－Ａ及びＶ－Ｂを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びＣａｓヌクレアーゼの分類は、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３１１：４７－７５（２０１５）；Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｃｔ ２０１８；３２５－３３６；及びＫｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｂ ３７４：２０１８００８７（２０１８）でさらに説明されている。本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼは、別段の指定がない限り、任意の型又はバリアントを包含することができる。

【0140】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓヌクレアーゼである。一般に、Ｃａｓエフェクターヌクレアーゼは、二本鎖ポリヌクレオチド開裂、例えば、二本鎖ＤＮＡ開裂を生じさせることができる。一般に、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣ及びＨＮＨなどの１つ以上のヌクレアーゼドメインを含むことができ、二本鎖ＤＮＡを開裂させることができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインとを含み、そのそれぞれが二本鎖ＤＮＡの１本の鎖を開裂させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼにより、平滑末端が生成される。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼのＲｕｖＣ及びＨＮＨは、各ＤＮＡ鎖を同じ位置で開裂させ、それによって平滑末端が生成される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼにより、平滑末端が生成される。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼのＲｕｖＣ及びＨＮＨが、異なる位置で各ＤＮＡ鎖を開裂させ（すなわち、「オフセット」で切断し）、それによって付着末端が生成される。本明細書で使用される場合、「付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄｓ）」、「付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｎｄｓ）」、又は「付着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄｓ）」という用語は、不均等な長さの鎖を有する核酸断片を指す。「平滑末端」とは対照的に、付着末端は、二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ）を互い違いに切断することによって生成される。付着末端（ｓｔｉｃｋｙ ｅｎｄ）又は付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ ｅｎｄ）は、不対ヌクレオチドによる突出した一本鎖、すなわち「オーバーハング」、例えば３’又は５’オーバーハングを有する。

【0141】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。例示的なＣａｓ９ヌクレアーゼとしては、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｉｓｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、及びその他多数の細菌由来のＣａｓ９が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる例示的なＣａｓ９ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，７７１，９４５号明細書、同第９，０２３，６４９号明細書、同第１０，０００，７７２号明細書、同第１０，４０７，６９７号明細書、及び米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のものである（ＳｐＣａｓ９）。

【0142】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｇ３ＥＣＲ１（配列番号１）、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｑ９９ＺＷ２（配列番号２）、又はＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｊ７ＲＵＡ５（配列番号３）に開示される配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、配列番号１～３のいずれかに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１～３のいずれかに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされる。

【0143】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＩＩＢ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。一般に、ＩＩＢ型Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書に記載されるように、付着末端を生成することができる。例示的なＩＩＢ型Ｃａｓ９タンパク質としては、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、及びその他多数の細菌由来のＣａｓ９タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるＩＩＢ型Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、国際公開第２０１９／０９９９４３号パンフレットに記載されている。

【0144】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ（以前は「Ｃｐｆ１」又は「Ｃ２ｃ１」として知られている）である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１２ｆヌクレアーゼである。Ｃａｓ１２ｆヌクレアーゼはまた、当該技術分野においてＣａｓ１４としても知られている（Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０１９，１８：６７－８３）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ１４ヌクレアーゼである。Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、一般にＣａｓ９ヌクレアーゼよりも小さく、典型的には付着末端を生成することができる。例示的なＣａｓ１２タンパク質としては、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ラクノスピラ科種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）、及びその他多数の細菌由来のＣａｓ１２タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるＣａｓ１２ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第９，５８０，７０１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３号明細書、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１（２０１５）、及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０：４３６－４３９（２０１８）に記載されている。

【0145】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２ヌクレアーゼは、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ｑ７Ｑ２ 配列番号４）、ＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｕ２ＵＭＱ６（配列番号５）、又はＵｎｉＰｒｏｔ ＩＤ Ｔ０Ｄ７Ａ２（配列番号６）によって開示されている配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、配列番号４～６のいずれかに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号４～６のいずれかのポリペプチドに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ１２は、宿主細胞における発現のためにコドン最適化されたポリヌクレオチドによってコードされる。

【0146】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓニッカーゼである。ニッカーゼは、二本鎖ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）に一本鎖開裂を生じさせるものであり、二本鎖ポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）の両鎖を開裂させるヌクレアーゼとは区別される。本明細書で説明されるように、野生型Ｃａｓヌクレアーゼは、典型的には、２つの触媒ヌクレアーゼドメインであるＲｕｖＣ及びＨＮＨを含み、各ヌクレアーゼドメインが二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の開裂に関与する。したがって、いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼと比較して触媒ドメインにアミノ酸変異を含んでいる。Ｃａｓニッカーゼは、例えば、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ２４：１３２－１４１（２０１３）、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４：１３８０－１３８９（２０１３）、及びＭａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１：８３３－８３８（２０１３）にさらに記載されている。

【0147】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓ１２ａニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、ＩＩ－Ｂ型Ｃａｓニッカーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼに変異をもたらすことによって生成される。例えば、ＳｐＣａｓ９ニッカーゼは、野生型ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼと比較してＤ１０Ａ変異又はＨ８４０Ａ変異を含んでいる。本明細書に記載されるようなアライメント方法を使用して、他のＣａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１２ａ又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓヌクレアーゼ）の対応するアミノ酸残基を決定し、Ｃａｓニッカーゼを生成することができることは、当業者に理解されるであろう。

【0148】

いくつかの実施形態では、本組成物のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、異種タンパク質ドメインに融合されていない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、又は逆転写酵素に融合されていない。

【0149】

いくつかの実施形態では、本開示の組換えＣａｓエフェクタータンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、組換えＣａｓエフェクタータンパク質の他に約又は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。Ｃａｓ融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び任意選択で任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。組換えＣａｓ９タンパク質に融合され得るタンパク質ドメインの例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、及び以下の活性の１つ以上を有するタンパク質ドメイン：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性及び核酸結合活性。エピトープタグの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ－Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグ。レポーター遺伝子の例としては、グルタチオン－５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、自己蛍光タンパク質、例えば青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及びｍＣｈｅｒｒｙが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質は、ＤＮＡ分子と結合するか又は他の細胞分子と結合するタンパク質又はタンパク質のフラグメント、例えば、以下に限定されないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓタグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質と融合する。Ｃａｓエフェクタータンパク質を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインについては、米国特許出願公開第２０１１／００５９５０２号明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、タグ付き組換えＣａｓタンパク質を使用して標的配列の位置を同定する。

【0150】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、異種のタンパク質又はタンパク質ドメインに融合する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、逆転写酵素に融合する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、逆転写酵素に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである。このようなＣａｓ９－逆転写酵素融合体の例は、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ、５７６：１４９－１５７（２０１９）に記載されている。

【0151】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼに融合されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである。

【0152】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ドミナントネガティブ５３ＢＰ１（ＴＰ５３ＢＰ１、腫瘍抑制因子ｐ５３結合タンパク質１としても知られる）に融合されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ドミナントネガティブ５３ＢＰ１タンパク質に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ドミナントネガティブ５３ＢＰ１タンパク質は、ＤＮ１Ｓである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＤＮ１Ｓに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである。

【0153】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ジェミニンデグロンドメインに融合されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ジェミニンデグロンドメインに融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである。このようなタンパク質の例は、Ｇｕｔｓｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１４：１５５５－１５６６（２０１６）に記載されている。

【0154】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＣｔＩＰ（Ｃ末端結合タンパク質１）タンパク質に融合されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＣｔＩＰタンパク質に融合したＣａｓ９ヌクレアーゼである。

【0155】

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質は、誘導システムの構成成分を形成し得る。システムの誘導性は、エネルギーの形態を使用する遺伝子編集又は遺伝子発現の時空制御を可能にする。エネルギーの形態としては、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーが挙げられ得るが、これらに限定されない：。誘導システムの非限定的な例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ－Ｏｎ又はＴｅｔ－Ｏｆｆ）、小分子ツーハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）又は光誘導システム（フィトクロム、ＬＯＶドメイン又はクリプトクロム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、配列特異的に転写活性の変化を指向するための光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部である。光の構成成分としては、Ｃａｓエフェクタータンパク質、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）からのもの）及び転写活性化／抑制ドメインが挙げられ得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びそれらの使用方法のさらなる例は、国際特許出願公開の国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット及び同第２０１４／０９３６３５号パンフレット；米国特許第８，８８９，４１８号明細書及び同第８，８９５，３０８号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１４／０１８６９１９号明細書、同第２０１４／０２４２７００号明細書、同第２０１４／０２７３２３４号明細書及び同第２０１４／０３３５６２０号明細書に提供されている。

【0156】

【表1】

【0157】

【表2】

【0158】

【表3】

【0159】

【表4】

【0160】

【表5】

【0161】

ヌクレオチド
ｉ．目的の配列
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、真核細胞のゲノムに挿入される目的配列（ＳＯＩ）を含む外因性ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、目的配列は、目的遺伝子を含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含む外因性ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介相同組換えを介して真核細胞のゲノムに挿入される外因性ポリヌクレオチド鋳型である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、真核細胞のゲノムに挿入される少なくとも１つの目的変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、真核細胞のゲノムに挿入される目的遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、外因性ポリヌクレオチド鋳型として導入することができる。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、一本鎖及び二本鎖領域を含むハイブリッドポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ハイブリッドポリヌクレオチドは、５’末端及び３’末端の二本鎖配列と、内部一本鎖配列を含む（Ｓｈｙ ｅｔ ａｌ， ｂｉｏＲｘｉｖ，２０２１，ｐｒｅｐｒｉｎｔ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ９／２／２０２１）。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、平滑末端を含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、付着末端を含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、標的配列の付着末端に相補的な付着末端を含む。

【0163】

外因性ポリヌクレオチド鋳型は、任意の好適な長さ、例えば約又は少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、１０００，５０００，又は１００００以上のヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、最適にアラインされた場合、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約又は少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００以上のヌクレオチド）と重複する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型と標的配列を含むポリヌクレオチドが最適にアラインされた場合、外因性ポリヌクレオチド鋳型の最近傍ヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１００、１５００、２０００、２５００、５０００、１０，０００以上のヌクレオチド以内に存在する。

【0164】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えばＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、線状一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ片、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸、又はポソームなどの送達ビヒクルと複合体化している核酸などである。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。

【0165】

いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路を使用して標的配列に挿入される。いくつかの実施形態では、内因性ＤＮＡ修復経路は、ＨＤＲである。修復プロセス中、ＳＯＩを含む外因性ポリヌクレオチド鋳型を標的配列に導入することができる。いくつかの実施形態では、上流配列及び下流配列によりフランキングされたＳＯＩを含む外因性ポリヌクレオチド鋳型を細胞中に導入し、上流及び下流配列は、標的配列中の組込みの部位のいずれかの側と配列類似性を共有する。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含む外因性ポリヌクレオチドは、例えば、変異遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、細胞に対して内因性又は外因性である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は、例えばマイクロＲＮＡなどの非コード配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、調節エレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、調節エレメントである。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、耐性カセット、例えば抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、野生型標的配列の変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、フレームシフト変異又はヌクレオチド置換を作出することにより標的配列を破壊又は補正する。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、マーカーを含む。標的配列中へのマーカーの導入は、標的化組込みのスクリーニングを容易にし得る。いくつかの実施形態では、マーカーは、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択マーカーである。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、ＳＯＩを含むベクターとして導入される。

【0166】

外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、標的配列と外因性ポリヌクレオチドとの間の相同組換えを促進するように選択される。上流配列は、組込みのための標的部位の上流の配列（すなわち標的配列）との配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組込みのための標的化部位の下流の配列との配列類似性を共有する核酸配列である。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含む外因性ポリヌクレオチド鋳型は、上流及び下流配列において相同組換えにより標的配列に挿入する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチド鋳型中の上流及び下流配列は、標的化ゲノム配列の上流及び下流配列とそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、上流又は下流配列は、少なくとも約２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は５００の塩基対、且つ最大で約６００、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、又は２０００の塩基対を有する。いくつかの実施形態では、上流又は下流配列は、約２０～２０００の塩基対、又は約５０～１７５０の塩基対、又は約１００～１５００の塩基対、又は約２００～１２５０の塩基対、又は約３００～１０００の塩基対、又は約４００～約７５０の塩基対、又は約５００～６００の塩基対を有する。いくつかの実施形態では、上流又は下流配列は、約５０、約１００、約２５０、約５００、約１００、約１２５０、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、又は約２５００の塩基対を有する。

【0167】

いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、目的遺伝子である。本明細書で使用される場合、「目的遺伝子」という用語は、目的の生体分子（例えば、タンパク質又はＲＮＡ分子）をコードする遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、目的タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、細胞内タンパク質、膜タンパク質、細胞外タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、目的タンパク質は、核タンパク質、転写因子、核膜トランスポーター、細胞内小器官関連タンパク質、膜受容体、触媒タンパク質、酵素、治療用タンパク質、膜タンパク質、膜輸送タンパク質、シグナル伝達タンパク質、免疫学的タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、免疫学的タンパク質は、抗体、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、免疫学的タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、免疫学的タンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、宿主細胞の在来遺伝子のコピーをコードする。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、宿主細胞において欠損している在来遺伝子のコピーをコードする。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、遺伝子に変異を含み、ＳＯＩは、その遺伝子の野生型コピーをコードする。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、野生型遺伝子を含み、ＳＯＩは、目的の突然変異を含む遺伝子のコピーをコードする。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、宿主細胞に天然に存在しない異種遺伝子をコードする。

【0168】

いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、目的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、目的ＲＮＡは、治療用ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、目的ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、目的配列は、目的の調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、目的配列上の調節エレメントが宿主細胞の在来遺伝子を調節することができるように、宿主細胞の標的ポリヌクレオチドに挿入される。調節エレメントは、本明細書に記載されており、例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、オペレーター、応答エレメント、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、インスレーターなどが挙げられる。

【0169】

いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約１ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約５ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約６ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約７ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約８ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約９ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約１５ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約２０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約２５ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約１ヌクレオチド～約１０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約１ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約１ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約１ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、５，６，７，８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含むポリヌクレオチドは、約１０ヌクレオチド長より大きく、約１５ヌクレオチド長より大きく、約２０ヌクレオチド長より大きく、約２５ヌクレオチド長より大きく、約３０ヌクレオチド長より大きく、約３５ヌクレオチド長より大きく、約４０ヌクレオチド長より大きく、約４５ヌクレオチド長より大きく、又は約５０ヌクレオチド長より大きい。

【0170】

いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約３～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約４～約１０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約５～約９００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約６～約８００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約７～約７００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約８～約６００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約９～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約５０～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約６０～約１０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約７０～約９００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約８～約８００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約９０～約７００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１００～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１００～約２５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１０～約９０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１１～約８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１２～約７０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１５～約６０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１０～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１～約１０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１～約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＳＯＩは、約１０ヌクレオチド長より大きく、約１５ヌクレオチド長より大きく、約２０ヌクレオチド長より大きく、約２５ヌクレオチド長より大きく、約３０ヌクレオチド長より大きく、約３５ヌクレオチド長より大きく、約４０ヌクレオチド長より大きく、約４５ヌクレオチド長より大きく、又は約５０ヌクレオチド長より大きい。

【0171】

ｉｉ． Ｃａｓ及びＣａｓ関連ポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のＣａｓエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列、すなわちＣａｓポリヌクレオチドを包含する。

【0172】

いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるポリヌクレオチドは、ガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるポリヌクレオチドは、Ｃａｓ結合領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ鋳型配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるポリヌクレオチドは、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’から３’の順序で、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型配列を含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド、例えば、宿主細胞ゲノム内の標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチドと相補的である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼによって開裂させることが意図される標的ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ＲＮＡを含み、すなわちＲＮＡガイド配列である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、ＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む。ハイブリッドＲＮＡ－ＤＮＡガイド配列は、例えば、Ｒｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ８：１６１０（２０１７）にさらに記載されている。

【0174】

いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１０～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１２～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１５～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、又は約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするのに十分な長さである。

【0175】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼ）に結合し、それによってＣａｓタンパク質と複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ＲＮＡ及びＤＮＡの組み合わせを含む。Ｃａｓタンパク質に結合し、且つ／又はＣａｓタンパク質を活性化するハイブリッドＲＮＡ－ＤＮＡ配列は、例えば、Ｒｕｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ ８：１６１０（２０１７）にさらに記載されている。

【0176】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法、キット、及び組成物に記載される複数のガイドＲＮＡは、同じ方法、キット、又は組成物中に使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上の異なるガイドＲＮＡを同時に使用することができる。

【0177】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、Ｃａｓタンパク質に結合し、Ｃａｓタンパク質を活性化するｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合領域は、ｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズすることができ、組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼに結合することができる。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼを活性化させることができる。いくつかの実施形態では、活性化には、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼの開裂活性を惹起又は増大させることが含まれる。いくつかの実施形態では、活性化には、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼを（例えば、ガイド配列により誘導することで）標的ポリヌクレオチドに結合させることを促進することが含まれる。いくつかの実施形態では、活性化には、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼを標的ポリヌクレオチドに結合するのを促進すること、及びＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼの開裂活性を惹起又は増大させることの組み合わせが含まれる。Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９、Ｃａｓ１２ａ、又はＩＩ－Ｂ型Ｃａｓタンパク質）のＴｒａｃｒＲＮＡ配列は、ＲＮＡｃｅｎｔｒａｌ及びＲｆａｍを含む公的データベースから入手可能であり、さらに、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌ １０（５）：７２６－７３７（２０１３）及びＧａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍ １１：５５１２（２０２０）に記載されている。

【0178】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクター分子と複合体を形成することができるポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの３’末端にＤＮＡ鋳型配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、一本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、目的配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、プライマー結合配列及び目的配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させるための鋳型を含む。いくつかの実施形態では、目的配列は、ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させるための鋳型を含む。いくつかの実施形態では、組成物のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼは、ガイド配列によって標的ポリヌクレオチドに誘導されて標的ポリヌクレオチドを開裂させ、開裂された標的ポリヌクレオチドの一方の鎖が、プライマー結合配列にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして機能する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＳＯＩに相補的なＤＮＡ鎖を合成し、ＳＯＩを含む二本鎖配列を形成することができる。いくつかの実施形態では、ＳＯＩを含む二本鎖配列は、例えば、本明細書に記載されるライゲーション又はＤＮＡ修復経路により、開裂した標的ポリヌクレオチドに挿入される。

【0179】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約５ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約６ヌクレオチド～約１０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約７ヌクレオチド～約７５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約８ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約９ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約１０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約１５ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約２０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約２５ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約３０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、約１０ヌクレオチド長より大きく、約１５ヌクレオチド長より大きく、約２０ヌクレオチド長より大きく、約２５ヌクレオチド長より大きく、約３０ヌクレオチド長より大きく、約３５ヌクレオチド長より大きく、約４０ヌクレオチド長より大きく、約４５ヌクレオチド長より大きく、又は約５０ヌクレオチド長より大きい。

【0180】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、プライマー結合配列を含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約３～約５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約４～約４５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約５～約４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約６～約３５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約７～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約８～約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約１０～約２０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約４～約３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、プライマー結合配列は、開裂した標的ＤＮＡ配列の領域とハイブリダイズするのに十分な長さを有する。

【0181】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、非Ｂ型ＤＮＡ構造体、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分、ＤＮＡリガーゼ動員部分、又はこれらの組み合わせを含む。

【0182】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列を含むポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、脱塩基部位、共有結合リンカー、ゼノ核酸（ＸＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート結合、ＤＮＡ損傷体、ＤＮＡ光産物、修飾デオキシリボヌクレオシド、メチル化ヌクレオチド、又はこれらの組み合わせを含む。

【0183】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによる目的配列の過度な伸長を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼによる目的配列の過度な伸長を低減又は防止することにより、目的配列を含む二本鎖配列の挿入の精度が向上する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、脱プリン塩基／脱ピリミジン塩基部位（ＡＰ部位）としても知られる脱塩基部位を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、共有結合リンカーを含む。いくつかの実施形態では、共有結合リンカーは、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを含む。いくつかの実施形態では、共有結合リンカーは、アミノリンカーを含む。ＴＥＧリンカー及びアミノリンカーは、ポリメラーゼ伸長を阻害することが示されており、例えば、Ｓｔｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ：１０．１１０１／２０１９．１２．２６．８８８７４３（２３ Ｊａｎｕａｒｙ ２０２０）を参照されたい。

【0184】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、本開示のポリヌクレオチドのヌクレアーゼ分解を低減又は防止する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ゼノ核酸（ＸＮＡ）を含む。ＸＮＡは、ＤＮＡのデオキシリボース又はＲＮＡのリボースとは異なる糖基を有する合成ヌクレオチド類似体である。ＸＮＡの例示的な糖基としては、トレオース、シクロヘキセン、グリコール、又はロックドリボースが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＸＮＡは、１，５－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、架橋型核酸（ＢＮＡ）としても公知のロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ＬＮＡは、リボース部分が２’酸素と４’炭素を接続するさらなる架橋によって修飾されている修飾ＲＮＡヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）を含む。ＤＮＡ又はＲＮＡのデオキシリボース骨格又はリボース骨格とは異なり、ＰＮＡポリマーの骨格は、ペプチド結合によって連結されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位を含み、メチレン架橋及びカルボニル基によってプリン塩基及びピリミジン塩基がＰＮＡ骨格に連結されている。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含む。ホスホロチオエート結合は、２つのヌクレオチドを連結するホスフェート基中の酸素の１つの代わりに硫黄原子を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中にＸＮＡ、例えばＬＮＡ若しくはＰＮＡ、又はホスホロチオエート結合が存在することにより、ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ分解に対する安定性が向上する。

【0185】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、本明細書で提供される組成物のポリヌクレオチド）中に修飾ヌクレオチドが存在することにより、ポリヌクレオチドにＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼを動員することには、例えば、ポリヌクレオチド中に修飾ヌクレオチドが存在することによりＤＮＡポリメラーゼがポリヌクレオチドを認識する可能性を増大させること；ＤＮＡポリメラーゼがポリヌクレオチドに結合することを促進すること；及び／又はＤＮＡポリメラーゼを活性化すること、例えば、ＤＮＡポリメラーゼの活性を惹起又は増大させることが含まれる。いくつかの実施形態では、動員されたＤＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載されるように、開裂した標的ポリヌクレオチドの鎖に結合し、ＤＮＡ鋳型配列上の目的配列を伸長する。

【0186】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ＤＮＡ損傷体を含む。本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ損傷体」とは、ＤＮＡ損傷を典型的に示す塩基の変異、塩基の欠失、及び／又は糖の変異を含有するＤＮＡポリヌクレオチドの領域を指す。ＤＮＡ損傷体は、核酸塩基の加水分解、酸化、アルキル化、脱プリン化、脱ピリミジン化、及び／又は脱アミノ化によって生じる可能性のあるものである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷体は、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷体は、８－オキソグアニン、チミン－グリコール、Ｎ７－（２－ヒドロキシエチル）グアニン（７ＨＥＧ）、７－（２－オキソエチル）グアニン、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ損傷体は、８－オキソグアニン、チミン－グリコール、又はこれらの組み合わせを含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ＤＮＡ光産物を含む。ＤＮＡ光産物は、紫外線（ＵＶ）誘発性のＤＮＡ損傷体であり、例えば、Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １５（１１）：２０３２１－２０３３８（２０１４）にさらに記載されている。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ光産物は、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ光産物は、ピリミジン二量体、シクロブタンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン（６－４）ピリミドン光産物（「（６－４）光産物」とも称される）、アデニン－チミンヘテロ二量体、デュワーピリミジノン、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ光産物は、ＣＰＤ、（６－４）光産物、又はこれらの組み合わせを含む。

【0188】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾デオキシリボヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオシドは、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオシドは、ＤＮＡには典型的には存在しない塩基、すなわち、アデニン、シトシン、グアニン、又はチミンを含む。いくつかの実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオシドは、デオキシウリジン、アクロレイン－デオキシグアニン、マロンジアルデヒド－デオキシグアニン、デオキシイノシン、デオキシキサントシン、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、修飾デオキシリボヌクレオシドは、デオキシウリジンを含む。

【0189】

いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、１つ以上のメチル化ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、メチル化ヌクレオチド、例えば、メチル化シトシンは、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、メチル化ヌクレオチドは、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－メチルシトシン、又はこれらの組み合わせを含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、非Ｂ型ＤＮＡ構造体を含む。本明細書で使用される場合、「非Ｂ型ＤＮＡ構造体」とは、標準的な右巻きのＢ型ＤＮＡヘリックスではないＤＮＡの二次構造のコンフォメーションのことである。非Ｂ型ＤＮＡ構造体の非限定的な例としては、グアニン四重鎖、三本鎖ＤＮＡ（Ｈ－ＤＮＡ）、Ｚ－ＤＮＡ、十字形、スリップＤＮＡ鎖、Ａトラクトベンディング、粘着性ＤＮＡが挙げられる。非Ｂ型ＤＮＡ構造体は、例えば、Ｇｕｉｂｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４９（３）：１４９７－１５１６（２０２１）にさらに記載されている。いくつかの実施形態では、非Ｂ型ＤＮＡ構造体は、ＤＮＡポリメラーゼを動員することができる。いくつかの実施形態では、非Ｂ型ＤＮＡ構造体は、ヘアピン、十字形、Ｚ－ＤＮＡ、Ｈ－ＤＮＡ（三本鎖ＤＮＡ）、Ｇ四重鎖ＤＮＡ（四本鎖ＤＮＡ）、スリップＤＮＡ、粘着性ＤＮＡ、又はこれらの組み合わせを含む。

【0191】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鋳型配列は、ＤＮＡポリメラーゼ動員部分を含む。ＤＮＡポリメラーゼの動員は、本明細書に記載されている。ＤＮＡポリメラーゼ動員部分によって動員することができるＤＮＡポリメラーゼの非限定的な例としては、Ｐｏｌ Ｉ（そのクレノウ断片を含む）、Ｐｏｌ ＩＩ、Ｐｏｌ ＩＩＩ、Ｐｏｌ ＩＶ、若しくはＰｏｌ Ｖなどの細菌性ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐｏｌ α、Ｐｏｌ β、Ｐｏｌ λ、Ｐｏｌ γ、Ｐｏｌ σ、Ｐｏｌ μ、Ｐｏｌ δ、Ｐｏｌ ε、Ｐｏｌ η、Ｐｏｌ ι、Ｐｏｌ κ、Ｐｏｌ ζ、Ｐｏｌ θ、ＲＥＶ１、若しくはＲＥＶ３などの真核生物ＤＮＡポリメラーゼ；Ｂｓｔ、Ｔ４、若しくはΦ２９（ファイ２９）ＤＮＡポリメラーゼなどの等温ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔａｑ、Ｐｆｕ、ＫＯＤ、Ｔｔｈ、若しくはＰｗｏ ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ；又はこれらのバリアント若しくは相同体が挙げられる。

【0192】

いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの活性、細胞分布、又は細胞取り込みを増強する１つ以上の部分又はコンジュゲートに化学的に架橋することができる。これらの部分又はコンジュゲートとしては、１級又は２級水酸基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を挙げることができる。コンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬理学的特性を増強する基、及びオリゴマーの薬物動態特性を増強する基が挙げられるが、これらに限定されない。好適なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が挙げられるが、これらに限定されない。薬理学的特性を増強する基としては、取り込みを促進する基、分解に対する耐性を高める基、及び／又は標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態特性を増強する基としては、取り込み、分布、代謝又は対象核酸の排泄を改善する基が挙げられる。

【0193】

コンジュゲート部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３－６５５６）などの脂質部分、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えばヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６－３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３－５３８）、脂肪鎖、例えばドデカンジオール若しくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１－１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７－３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９－５４）、リン脂質、例えばジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロール若しくはトリエチル－アンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１－３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７－３７８３）、ポリアミン若しくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９－９７３）、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９－２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３－９３７が挙げられるが、これらに限定されない。

【0194】

コンジュゲートとしては、「タンパク質形質導入ドメイン」又はＰＴＤ（ＣＰＰ－細胞透過性ペプチドとしても知られる）が挙げられ得、これは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、又はベシクル膜を通過することを促進するポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、又は有機若しくは無機化合物を指し得る。別の分子に結合したＰＴＤは、極性小分子から大きな高分子及び／又はナノ粒子にまで及び、分子が、例えば細胞外空間から細胞内空間へ、又は細胞質ゾルから細胞小器官内へと、膜を通過するのを促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、外因性ポリペプチド（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド）のアミノ末端に共有結合される。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、外因性ポリペプチド（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド）のカルボキシル末端に共有結合される。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、核酸（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、部位特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなど）に共有結合される。例示的なＰＴＤとしては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号７を含むＨＩＶ－１ ＴＡＴの残基４７～５７に対応）；細胞への侵入を指示するのに十分な数のアルギニンを含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１０～５０個のアルギニン）；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９（６）：４８９－９６）；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２－１７３７）；トランケート型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ． （２００４）Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８－１２５６）；ポリリシン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０００）ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：１３００３－１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号８）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号９）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号１０）；及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１１）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとしては、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１２）、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１３）；３個のアルギニン残基～５０個のアルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるが、これらに限定されない；例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列としては、以下のいずれかが挙げられるが、これらに限定されない： ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１４）；ＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号１５）；ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ（配列番号１６）；ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ（配列番号１７）；及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲ（配列番号１８）． いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能ＣＰＰ（ＡＣＰＰ）（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ． （２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５－６）：３７１－３８１）である。ＡＣＰＰは、開裂可能なリンカーによって対応するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９又は「Ｅ９」）に連結されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９又は「Ｒ９」）を含み、これは、正味の電荷をほぼゼロに減少させ、それによって、細胞への接着及び取り込みを阻害する。リンカーが開裂されると、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその固有の接着性が局所的に脱マスキングし、これにより、ＡＣＰＰが膜を横断するように「活性化」される。

【0195】

いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、真核細胞中での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ｓｔｉＣａｓ９をコードするポリヌクレオチド配列は、動物細胞中での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ヒト細胞中での発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、植物細胞中での発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化は、組換え又は異種タンパク質発現の収量及び効率を増加させるためにその発現を宿主のｔＲＮＡ存在量にマッチさせるようにコドンを調整することである。コドン最適化法は、当該技術分野における定型作業であり、ソフトウェアプログラム、例えばＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣｏｄｏｎ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎツール、ＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎのＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｔａｂｌｅ分析ツール、ＧＥＮＥＭＡＫＥＲのＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎソフトウェア、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅソフトウェア、ＤＮＡ Ｂｕｉｌｄｅｒソフトウェア、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア、公的に利用可能なＯＰＴＩＭＩＺＥＲソフトウェア、及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅアルゴリズムなどを使用して実施することができる。

【0196】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム
いくつかの実施形態では、本開示は、天然に存在するＣａｓエフェクタータンパク質又は天然に存在しないＣａｓエフェクタータンパク質と、目的の配列をコードするポリヌクレオチドとを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを包含する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、天然に存在するＣａｓエフェクタータンパク質又は天然に存在しないＣａｓエフェクタータンパク質、目的の配列をコードするポリヌクレオチド、及びＣａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるポリヌクレオチドは、ガイド配列、Ｃａｓ結合領域、及びＤＮＡ鋳型領域を含む。

【0197】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、本明細書で提供される組換えＣａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された調節エレメントと、組換えＣａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成し、ガイド配列を含むポリヌクレオチドとを含む。

【0198】

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と結合した調節エレメントは、プロモーターである。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、真核生物プロモーターである。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、調節エレメントは、真核生物調節エレメント、すなわち真核生物プロモーターである。いくつかの実施形態では、真核生物調節エレメントは、哺乳動物プロモーターである。

【0199】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成成分に結合し、それらを標的ＤＮＡ内の特異的位置に標的化するＲＮＡ分子は、本明細書において「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」又は「小分子ガイドＲＮＡ」と称され、本明細書において「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」と称されることもある。ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチドセグメント、すなわち少なくとも１つの「ＤＮＡ結合セグメント」及び少なくとも１つの「ポリペプチド結合セグメント」を含む。「セグメント」とは、分子の一部、セクション又は領域、例えばガイドポリヌクレオチド分子のヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。「セグメント」の定義は、特に具体的に定義されない限り、特定数の合計塩基対に限定されない。

【0200】

いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのＤＮＡ結合セグメント（又は「ＤＮＡ標的化配列」）は、細胞中の標的配列とハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡのＤＮＡ結合セグメントは、標的ＤＮＡ内の特定の配列に対して相補的なポリヌクレオチド配列を含む。

【0201】

いくつかの実施形態では、本開示のガイドポリヌクレオチドは、真核細胞中の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を有する。いくつかの実施形態では、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト又はげっ歯類又はウシの、細胞系又は細胞株である。このような細胞、細胞系又は細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解又はハイブリドーマの細胞系が挙げられる。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞系である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ ＦＵＴ８ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ ＣＨＯＫ１ ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。真核細胞はまた、鳥類細胞、細胞系又は細胞株、例えばＥＢＸ細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６又はＥＢｖｌ３などであり得る。

【0202】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む多能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、本明細書に記載の細胞のいずれかの分化形態である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、培養下の任意の初代細胞に由来する細胞である。

【0203】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞、又は非実質細胞などの肝細胞である。例えば、真核細胞は、付着型代謝試験用ヒト肝細胞、付着型誘導試験用ヒト肝細胞、付着型ヒト肝細胞、懸濁液試験用ヒト肝細胞（１０ドナー及び２０ドナープール肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一及びプールビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ－１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ及びＷｉｓｔａｒ肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（ドメスティックショートヘア肝細胞を含む）、並びにウサギ肝細胞（ニュージーランドホワイト肝細胞を含む）であり得る。

【0204】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。例えば、植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ又はイネなどの作物の細胞であり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は野菜の細胞であり得る。植物細胞は、単子葉若しくは双子葉植物の細胞、又は作物若しくは穀類植物、生産植物、果実若しくは野菜の細胞であり得る。例えば、植物細胞は、樹木、例えば柑橘樹木、例えばオレンジ、グレープフルーツ又はレモン樹木；モモ又はネクタリン樹木；リンゴ又はナシ樹木；堅果樹木、例えばアーモンド又はクルミ又はピスタチオ樹木；ナス属の植物、例えばジャガイモ；ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物、ラクツカ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物、スピナシア属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；カプシカム属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアなどの細胞であり得る。

【0205】

いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約５～約５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約６～約４５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約７～約４０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約８～約３５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約９～約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１０～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１２～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１４～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１６～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約１８～約２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約５～約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約６～約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約７～約１０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、約８～約１０ヌクレオチドである。ガイド配列の長さは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌ（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３１（９）：８２７－８３２（２０１３））、ａｍｐｌｉＣａｎ（Ｌａｂｕｎ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０１８，ｄｏｉ：１０．１１０１／２４９４７４）、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ（Ａｌａｃｈ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１１０１／００５０７４）、ＣＨＯＰＣＨＯＰ（Ｌａｂｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１６，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ３９８）などのガイド配列の設計ツールを用いて、当業者によって決定され得る。

【0206】

いくつかの実施形態では、本開示のガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡは、ポリペプチド結合配列／セグメントを含む。ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、本開示のＣａｓエフェクタータンパク質のポリヌクレオチド結合ドメインと相互作用する。このようなポリペプチド結合セグメント又は配列、例えば米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書、同第２０１４／０２７３０３７号明細書、同第２０１４／０２７３２２６号明細書、同第２０１４／０２９５５５６号明細書、同第２０１４／０２９５５５７号明細書、同第２０１４／０３４９４０５号明細書、同第２０１５／００４５５４６号明細書、同第２０１５／００７１８９８号明細書、同第２０１５／００７１８９９号明細書及び同第２０１５／００７１９０６号明細書に開示されるものは、当業者に知られている。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのポリペプチド結合セグメントは、Ｃａｓ９に結合する。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドのポリペプチド結合セグメントは、本明細書で提供される組換えＣａｓ９タンパク質に結合する。

【0207】

いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも約１０、１５、２０、２５又は３０ヌクレオチドで、且つ最大で約２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約１０～約１５０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約２０～約１２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約３０～約１００ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約４０～約８０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約５０～約６０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約１０～約３５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約１５～約３０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ガイドポリヌクレオチドは、約２０～約２５ヌクレオチドである。

【0208】

ガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡは、単離分子、例えばＲＮＡ分子として標的細胞中に導入することができるか、又はガイドポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用して細胞中に導入される。

【0209】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのガイドポリヌクレオチドは、ダイレクトリピート配列に連結されている。ダイレクトリピート又はＤＲ配列は、非反復配列（スペーサー）の短鎖ストレッチが介在しているＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中の反復配列のアレイである。スペーサー配列は、標的配列上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を標的とする。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の非コード部分（すなわちガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ）が転写される場合、転写産物は、ＤＲ配列において個々のスペーサー配列を含有する短鎖ｃｒＲＮＡに開裂され、それがＣａｓ９ヌクレアーゼをＰＡＭに指向させる。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、核酸によりコードされる。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、ガイドポリヌクレオチドに結合している。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列に結合している。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、二次構造を含む。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、ステムループ構造を含む。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、１０～２０ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、少なくとも１６ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、少なくとも１６ヌクレオチドであり、単一のステムループを含む。いくつかの実施形態では、ＤＲ配列は、ＲＮＡアプタマーを含む。いくつかの実施形態では、ＤＲの二次構造又はステムループは、開裂のためのヌクレアーゼにより認識される。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＩＩＩである。

【0210】

いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含む。「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又はトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡ又はプレＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡとＲＮＡ二本鎖を形成し、次いで、ＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＲＮアーゼＩＩＩにより開裂されて、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを形成する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、Ｃａｓエフェクタータンパク質を活性化させる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む別個のポリヌクレオチドを含む。

【0211】

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド及びガイドポリヌクレオチドは、単一のベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド（又はガイドポリヌクレオチドに転写され得るヌクレオチド）及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一のベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド（又はガイドポリヌクレオチドに転写され得るヌクレオチド）、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びダイレクトリピート配列は、単一のベクター上に存在する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、ヒト発現ベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、植物発現ベクターである。

【0212】

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド及びガイドポリヌクレオチドは、単一の核酸分子である。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一の核酸分子である。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びダイレクトリピート配列は、単一の核酸分子である。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子は、発現ベクターである。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子は、哺乳動物発現ベクターである。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子は、ヒト発現ベクターである。いくつかの実施形態では、単一の核酸分子は、植物発現ベクターである。

【0213】

いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、組換えＣａｓエフェクタータンパク質とガイドポリヌクレオチドとの複合体は、天然に存在しない。

【0214】

細胞
本開示のいくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト又はげっ歯類又はウシの、細胞系又は細胞株である。このような細胞、細胞系又は細胞株の例としては、以下に限定されるものではないが、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及び ＣＯＳ７、ＱＣ１－３、ＨＥＫ－２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解又はハイブリドーマの細胞系が挙げられる。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞系である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ細胞、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ ＦＵＴ８ ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ－Ｋ１ ＳＶ ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ ＣＨＯＫ１ ＳＶ（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。真核細胞はまた、鳥類細胞、細胞系又は細胞株、例えばＥＢＸ細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６又はＥＢｖｌ３などであり得る。

【0215】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む多能性幹細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、本明細書に記載の細胞のいずれかの分化形態である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、培養下の任意の初代細胞に由来する細胞である。

【0216】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞、又は非実質細胞などの肝細胞である。例えば、真核細胞は、付着型代謝試験用ヒト肝細胞、付着型誘導試験用ヒト肝細胞、付着型ヒト肝細胞、懸濁液試験用ヒト肝細胞（１０ドナー及び２０ドナープール肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一及びプールビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ－１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎ及びＷｉｓｔａｒ肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（ドメスティックショートヘア肝細胞を含む）、並びにウサギ肝細胞（ニュージーランドホワイト肝細胞を含む）であり得る。

【0217】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、造血細胞である。いくつかの実施形態では、造血細胞は、骨髄性前駆細胞である。いくつかの実施形態では、造血細胞は、リンパ球前駆細胞である。いくつかの実施形態では、造血細胞は、肥満細胞、巨核球、血小板、好塩基球、好中球、好酸球、樹状細胞、単球、又はマクロファージである。いくつかの実施形態では、造血細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｔリンパ球、又はＢリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球又はＢリンパ球がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0218】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、植物細胞である。例えば、植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ又はイネなどの作物の細胞であり得る。植物細胞は、藻類、樹木又は野菜の細胞であり得る。植物細胞は、単子葉若しくは双子葉植物の細胞、又は作物若しくは穀類植物、生産植物、果実若しくは野菜の細胞であり得る。例えば、植物細胞は、樹木、例えば柑橘樹木、例えばオレンジ、グレープフルーツ又はレモン樹木；モモ又はネクタリン樹木；リンゴ又はナシ樹木；堅果樹木、例えばアーモンド又はクルミ又はピスタチオ樹木；ナス属の植物、例えばジャガイモ；ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物、ラクツカ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物、スピナシア属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；カプシカム属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；綿、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアなどの細胞であり得る。

【0219】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、前述の細胞のいずれかの組織培養物である。いくつかの実施形態では、真核細胞は、前述の細胞のいずれかの組織抽出物の形態である。

【0220】

いくつかの実施形態では、真核細胞は、ゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、真核細胞は、誘導性のゲノムに組み込まれたＣａｓポリヌクレオチドを含む。

【0221】

送達系
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの送達に関する様々な方法が当該技術分野において知られている。好適な送達系としては、Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、目的配列を含むポリヌクレオチド、及び／又はＣａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるポリヌクレオチドのマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクション、又は流体力学的送達が挙げられる。いくつかの実施形態では、送達系は、送達粒子を含む。ナノ粒子、細胞透過性ペプチド、及びＤＮＡナノクルー（ｎａｎｏｃｌｅｗ）を含むこのような送達系の例は、Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２５（１）：１２３４－１２５７（２０１８））に開示されている。

【0222】

いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓエフェクタータンパク質、Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、目的配列をコードするポリヌクレオチド、及び／又はＣａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、送達粒子によって送達される。送達粒子は、粒子を含む生物学的送達系又は配合物である。本明細書に定義される「粒子」とは、約１００ミクロン（μｍ）の最大直径を有する実体である。いくつかの実施形態では、粒子は、約１０μｍの最大直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約２０００ナノメートル（ｎｍ）の最大直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約１０００ｎｍの最大直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約９００ｎｍ、約８００ｎｍ、約７００ｎｍ、約６００ｎｍ、約５００ｎｍ、約４００ｎｍ、約３００ｎｍ、約２００ｎｍ又は約１００ｎｍの最大直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約２５ｎｍ～約２００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、粒子は、約７５ｎｍ～約１００ｎｍの直径を有する。

【0223】

送達粒子は、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない任意の形態で提供され得る：固体、半固体、エマルション又はコロイド粒子。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質ベース系、リポソーム、ミセル、マイクロベシクル、エキソソーム又は遺伝子銃である。いくつかの実施形態では、送達粒子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、組換えＣａｓエフェクタータンパク質と、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができるポリヌクレオチドとを含み、前記ポリヌクレオチドはガイドポリヌクレオチドを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、Ｃａｓエフェクタータンパク質、目的配列を含むポリヌクレオチド、及びＣａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができ、ガイドポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、組換えＣａｓエフェクタータンパク質と、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成し、ガイドポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとを含み、組換えＣａｓエフェクタータンパク質及びポリヌクレオチドは複合体を形成している、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、組換えＣａｓエフェクタータンパク質、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成し、ガイドポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成し、ガイドポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。

【0224】

いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓエフェクタータンパク質とポリヌクレオチドとの複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）であり、前記ＲＮＰは流体力学的送達、ナノ粒子、ベシクル、細胞透過性ペプチド、又はＤＮＡナノクルーによって送達される。

【0225】

いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質、糖、金属又はタンパク質をさらに含む。いくつかの実施形態では、送達粒子は、脂質エンベロープである。脂質エンベロープ又は脂質を含む送達粒子を用いたｍＲＮＡの送達は、例えば、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ８（３）：７７４－７８４（２０１１）に記載されている。いくつかの実施形態では、送達粒子は、糖ベース粒子、例えばＧａｌＮＡｃである。糖ベース粒子は、国際公開第２０１４／１１８２７２号パンフレット及びＮａｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．１３６（４９）：１６９５８－１６９６１（２０１４）に記載されている。

【0226】

いくつかの実施形態では、送達粒子は、ナノ粒子である。本開示に包含されるナノ粒子は、様々な形態で、例えば固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベース固体、ポリマー、ナノ粒子の懸濁液、又はこれらの組み合わせとして提供され得る。金属、誘電体及び半導体ナノ粒子、並びにハイブリッド構造（例えば、コア－シェルナノ粒子）を調製することができる。半導体材料製のナノ粒子はまた、それらが電子エネルギーレベルの量子化が生じるほど十分に小さい場合（典型的には１０ｎｍ未満）、標識量子ドットであり得る。このようなナノスケール粒子は、生物医学用途において薬物担体又はイメージング剤として使用され、本開示における類似の目的に適合させることができる。

【0227】

送達粒子の調製は、米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０３号明細書、同第２０１２／０２５１５６０号明細書及び同第２０１３／０３０２４０１号明細書、並びに米国特許第５，５４３，１５８号明細書、同第５，８５５，９１３号明細書、同第５，８９５，３０９号明細書、同第６，００７，８４５号明細書及び同第８，７０９，８４３号明細書にさらに記載されている。

【0228】

いくつかの実施形態では、ベシクルは、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。「ベシクル」は、脂質二重層により封入される流体を有する細胞内の小型構造体である。いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ベシクルにより送達される。いくつかの実施形態では、ベシクルは、組換えＣａｓエフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ベシクルは、Ｃａｓエフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドを含み、Ｃａｓエフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体を形成している。いくつかの実施形態では、ベシクルは、Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができ、ガイドポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。いくつかの実施形態では、ベシクルは、Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができ、ガイドポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。

【0229】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質、及びＣａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができ、ガイドポリヌクレオチドを含むベシクルは、エキソソーム又はリポソームである。いくつかの実施形態では、ベシクルは、エキソソームである。いくつかの実施形態では、エキソソームを使用して本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを送達する。エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送し、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達し得る内因性ナノベシクル（すなわち約３０～約１００ｎｍの直径を有する）である。外因性生物材料を標的器官に送達するための改変エキソソームは、例えば、Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：３４１（２０１１）、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７：２１１２－２１１６（２０１２）、及びＷａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０（１７）：ｅ１３０（２０１２）によって説明されている。

【0230】

いくつかの実施形態では、リポソームを使用して本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを送達する。リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を有する球状ベシクル構造体であり、栄養及び医薬物の投与用ビヒクルとして使用することができる。リポソームは、リン脂質、特にホスファチジルコリンから構成されることが多いが、他の脂質、例えば卵ホスファチジルエタノールアミンからも構成される。リポソームの型としては、限定されるものではないが、マルチラメラベシクル、スモールユニラメラベシクル、ラージユニラメラベシクル及び渦巻き型ベシクルが挙げられる。例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９（２０１１）を参照されたい。生物材料、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ構成成分を送達するためのリポソームは、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（８）：１００２－１００７（２００５）、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４４１：１１１－１１４（２００６）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １９：７７５－７８０（２０１２）によって説明されている。

【0231】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質がＣａｓエフェクタータンパク質に融合した細胞透過性ペプチドを使用して送達することができる。

【0232】

いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓエフェクタータンパク質及びポリヌクレオチドは、ＤＮＡナノクルーの形態で送達することができる。ＤＮＡナノクルーは、Ｃａｓエフェクタータンパク質などのペイロードを装填することができるＤＮＡを含む球状構造体である（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．，１３６：１４７２２－１４７２５）。ＤＮＡナノクルーは、Ｃａｓ９編集システムの送達のためにインビトロで使用されている（Ｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２５（１）：１２３４－１２５７）。

【0233】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ウイルスベクターにより送達される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、組換えＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、Ｃａｓエフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドを含み、Ｃａｓエフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドは、複合体を形成している。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができ、ガイドポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｃａｓエフェクタータンパク質と複合体を形成することができ、ガイドポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのベクターである。ウイルスベクターの例は、本明細書で提供される。

【0234】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、及び／又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のベクターは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムのエレメントを含むウイルスベクターとして使用することができる。本開示のいくつかの実施形態では、Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ウイルスベクターにより形質導入された細胞により細胞内で発現される。

【0235】

いくつかの実施形態では、本開示のＣａｓタンパク質及び方法は、エクスビボ遺伝子編集、例えばＣＡＲ－Ｔ型療法において使用される。これらの実施形態は、ヒトドナーからの細胞の修飾を含み得る。これらの例では、ウイルスベクターを使用することもできるが、Ｃａｓ９タンパク質を（インビトロ転写ガイドＲＮＡ及びドナーＤＮＡと共に）培養細胞中に直接トランスフェクトする追加の選択肢も存在する。

【0236】

マイクロホモロジー末端結合（ＭＭＥＪ）経路の阻害剤
本明細書で使用される場合、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ＭＭＥＪ経路の任意の成分の活性及び／又はレベルを阻害、拮抗、遮断、又は低下させる任意の化合物、分子、又は実体である。ＭＭＥＪ阻害剤は、ＭＭＥＪ経路の任意の成分の活性及び／又はレベルを阻害、拮抗、遮断、又は低下させる抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、可溶性タンパク質、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、又は小分子化合物であり得る。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ阻害剤は、ＦＥＮ１（フラップエンドヌクレアーゼ１）、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＭＲＥＩＩ、ＮＢＳ１（Ｎｉｂｒｉｎ、ＮＢＮ）、ＸＲＣＣ１（Ｘ線修復交差補完タンパク質１）、ＰＡＲＰ１（ポリ［ＡＤＰ－リボース］ポリメラーゼ１）、又はＰｏｌＱ（ＤＮＡポリメラーゼθ）の活性及び／又はレベルを阻害、拮抗、遮断、又は低下させる。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ノボビオシンである。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、ＰｏｌＱ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰｏｌＱ阻害剤は、ＡＲＴ５５８（Ｚａｔｒｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１２（１）：３６３６（２０２１））である。いくつかの実施形態では、ＰｏｌＱ阻害剤は、図３に示すように、ＰｏｌＱ１（国際公開第２０２００３０９２５号パンフレットに記載）、ＰｏｌＱ２、ＰｏｌＱ３、ＰｏｌＱ４、ＰｏｌＱ５（全て、国際公開第２０２１０２８６４３号パンフレットに記載）、ＰｏｌＱ６、ＰｏｌＱ７（国際公開第２０２０２４３５４９号パンフレットに記載）、又はこれらの組み合わせから選択される。

【0237】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、約０．０１μＭ～約１ｍＭの濃度で、真核細胞を含む組成物に添加される。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約０．７５ｍＭ、約０．０１μＭ～約０．５ｍＭ、約０．０１μＭ～約０．２５ｍＭ、約０．０１μＭ～約０．１ｍＭ、約０．０１μＭ～約７５μＭ、約０．０１μＭ～約５０μＭ、約０．０１μＭ～約２５μＭ、約０．０１～約２５μＭ、約０．０１～約２０μＭ、約０．０１μＭ～約１５μＭ、約０．０１μＭ～約１０μＭ、又は約０．０１μＭ～約１μＭである。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約１ｍＭ、約１μＭ～約１ｍＭ、約１０μＭ～約１ｍＭ、約１５μＭ～約１Ｍ、約２０μＭ～約１Ｍ、約２５μＭ～約１ｍＭ、約５０μＭ～約１ｍＭ、約７５μＭ～約１ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．２５ｍＭ～約１ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１ｍＭ、又は約０．７５ｍＭ～約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約１ｍＭ、０．１μＭ～約０．７５ｍＭ、約０．１μＭ～約０．５ｍＭ、約０．１μＭ～約０．２５ｍＭ、約０．１μＭ～約０．１ｍＭ、約０．１μＭ～約７５μＭ、約０．１μＭ～約５０μＭ、約０．１μＭ～約２５μＭ、約０．１μＭ～約２０μＭ、約０．１μＭ～約１５μＭ、約０．１μＭ～約１０μＭ、又は約０．１μＭ～約１μＭである。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約１５μＭ、約１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約２５μＭ、約１μＭ～約５０μＭ、約１μＭ～約０．１ｍＭ、約１μＭ～約０．２５ｍＭ、約１μＭ～約０．５ｍＭ、約１μＭ～約０．７５ｍＭ、又は約１μＭ～約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約１００μＭ、約０．１μＭ～約９０μＭ、約０．２μＭ～約８０μＭ、約０．３μＭ～約７０μＭ、約０．４μＭ～約６０μＭ、約０．５μＭ～約５０μＭ、約１μＭ～約５０μＭ、約２μＭ～約４５μＭ、約３μＭ～約４０μＭ、約４μＭ～約３５μＭ、約５μＭ～約３０μＭ、約６μＭ～約２５μＭ、約７μＭ～約２０μＭ、又は約８μＭ～約１５μＭである。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約０．１μＭ、約０．０１～約１μＭ、約０．０５μＭ～約０．１μＭ、約０．５μＭ～約１μＭ、約０．５μＭ～約５μＭ、約０．５μＭ～約１０μＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約０．１μＭ～約５μＭ、約０．１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約５μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約１５μＭ、約１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約２５μＭ、約１μＭ～約５０μＭ、約５μＭ～約１０μＭ、約５μＭ～約１５μＭ、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約５ｍＭ～約２５ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００μＭである。

【0238】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約１μＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約０．１μＭ～約０．５μＭ、約０．１μＭ～約１００μＭ、又は約１μＭ～約５０μＭである。

【0239】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約９６時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約７２時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約４８時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約３６時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約２４時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約１８時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約１２時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約６時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約３時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約２時間前に、エフェクタータンパク質を添加する約０分～約１時間前に、又はＣａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約３０分前に、真核細胞を含む組成物に添加される。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００時間前に、真核細胞を含む組成物に添加される。

【0240】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加すると同時に、真核細胞を含む組成物に添加される。

【0241】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約３０分後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約１時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約３時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約６時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約１２時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約１８時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約２４時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約３６時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約４８時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約７２時間後に、又はＣａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約９６時間後に、真核細胞を含む組成物に添加される。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００時間後に、真核細胞を含む組成物に添加される。

【0242】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物中に、約１～約３００時間、約１０～約２００時間、約１０～約１００時間、約２０～約８０時間、約３０～約７０時間、約４０～約時間存在する。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物中に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、又は３００時間存在する。

【0243】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回以上添加される。

【0244】

非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路の阻害剤
本明細書で使用される場合、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、ＮＨＥＪ経路の任意の成分の活性及び／又はレベルを阻害、拮抗、遮断、又は低下させる任意の化合物、分子、又は実体である。ＮＨＥＪ阻害剤は、ＮＨＥＪ経路の任意の成分の活性及び／又はレベルを阻害、拮抗、遮断、又は低下させる抗体若しくはその抗原結合断片、ペプチド、可溶性タンパク質、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、又は小分子化合物であり得る。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路は、Ｋｕ７０、Ｋｕ８０、ＤＮＡリガーゼＩＶ、ＸＬＦ（非相同末端結合因子１；ＸＲＣＣ４様因子）、又はＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）の活性及び／又はレベルを阻害、拮抗、遮断、又は低下させる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫの阻害剤は、Ｍ３８１４、Ｍ９８３１／ＶＸ９８４、Ｎｕ７４４１、ＫＵ００６０６４８、ＡＺＤ７６４８、Ｎｕ５４５５、バニリン、ウォルトマンニン、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤は、ＡＺＤ７６４８である。

【0245】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、約０．０１μＭ～約１ｍＭの濃度で、真核細胞を含む組成物に添加される。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約０．７５ｍＭ、約０．０１μＭ～約０．５ｍＭ、約０．０１μＭ～約０．２５ｍＭ、約０．０１μＭ～約０．１ｍＭ、約０．０１μＭ～約７５μＭ、約０．０１μＭ～約５０μＭ、約０．０１μＭ～約２５μＭ、約０．０１～約２５μＭ、約０．０１～約２０μＭ、約０．０１μＭ～約１５μＭ、約０．０１μＭ～約１０μＭ、又は約０．０１μＭ～約１μＭである。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約１ｍＭ、約１μＭ～約１ｍＭ、約１０μＭ～約１ｍＭ、約１５μＭ～約１Ｍ、約２０μＭ～約１Ｍ、約２５μＭ～約１ｍＭ、約５０μＭ～約１ｍＭ、約７５μＭ～約１ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１ｍＭ、約０．２５ｍＭ～約１ｍＭ、約０．５ｍＭ～約１ｍＭ、又は約０．７５ｍＭ～約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．１μＭ～約１ｍＭ、０．１μＭ～約０．７５ｍＭ、約０．１μＭ～約０．５ｍＭ、約０．１μＭ～約０．２５ｍＭ、約０．１μＭ～約０．１ｍＭ、約０．１μＭ～約７５μＭ、約０．１μＭ～約５０μＭ、約０．１μＭ～約２５μＭ、約０．１μＭ～約２０μＭ、約０．１μＭ～約１５μＭ、約０．１μＭ～約１０μＭ、又は約０．１μＭ～約１μＭである。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約１５μＭ、約１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約２５μＭ、約１μＭ～約５０μＭ、約１μＭ～約０．１ｍＭ、約１μＭ～約０．２５ｍＭ、約１μＭ～約０．５ｍＭ、約１μＭ～約０．７５ｍＭ、又は約１μＭ～約１ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約１００μＭ、約０．１μＭ～約９０μＭ、約０．２μＭ～約８０μＭ、約０．３μＭ～約７０μＭ、約０．４μＭ～約６０μＭ、約０．５μＭ～約５０μＭ、約１μＭ～約５０μＭ、約２μＭ～約４５μＭ、約３μＭ～約４０μＭ、約４μＭ～約３５μＭ、約５μＭ～約３０μＭ、約６μＭ～約２５μＭ、約７μＭ～約２０μＭ、又は約８μＭ～約１５μＭである。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約０．１μＭ、約０．０１～約１μＭ、約０．０５μＭ～約０．１μＭ、約０．５μＭ～約１μＭ、約０．５μＭ～約５μＭ、約０．５μＭ～約１０μＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約０．１μＭ～約５μＭ、約０．１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約５μＭ、約１μＭ～約１０μＭ、約１μＭ～約１５μＭ、約１μＭ～約２０μＭ、約１μＭ～約２５μＭ、約１μＭ～約５０μＭ、約５μＭ～約１０μＭ、約５μＭ～約１５μＭ、約５ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約５ｍＭ～約２５ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００μＭである。

【0246】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤の濃度は、約０．０１μＭ～約１μＭ、約０．１μＭ～約１μＭ、約０．１μＭ～約０．５μＭ、約０．１μＭ～約１００μＭ、又は約１μＭ～約５０μＭである。

【0247】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約９６時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約７２時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約４８時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約３６時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約２４時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約１８時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約１２時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約６時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約３時間前に、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約２時間前に、エフェクタータンパク質を添加する約０分～約１時間前に、又はＣａｓエフェクタータンパク質を添加する約０分～約３０分前に、真核細胞を含む組成物に添加される。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加する約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００時間前に、真核細胞を含む組成物に添加される。

【0248】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質を添加すると同時に、真核細胞を含む組成物に添加される。

【0249】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約３０分後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約１時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約３時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約６時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約１２時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約１８時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約２４時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約３６時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約４８時間後に、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約７２時間後に、又はＣａｓエフェクタータンパク質の添加から約０分～約９６時間後に、真核細胞を含む組成物に添加される。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質の添加から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００時間後に、真核細胞を含む組成物に添加される。

【0250】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物中に、約１～約３００時間、約１０～約２００時間、約１０～約１００時間、約２０～約８０時間、約３０～約７０時間、約４０～約時間存在する。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物中に、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、又は３００時間存在する。

【0251】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回以上添加される。

【0252】

いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は，ＭＭＥＪ経路の阻害剤が真核細胞を含む組成物に添加される前、ＭＭＥＪ経路の阻害剤が組成物に添加された後に、真核細胞を含む組成物に添加される。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪ経路の阻害剤及びＭＭＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物に同時に添加される。

【0253】

いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤及びＮＨＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物に、Ｃａｓエフェクタータンパク質が添加される前に添加される。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤及びＮＨＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物へ、Ｃａｓエフェクタータンパク質が添加された後に添加される。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤及びＮＨＥＪ経路の阻害剤は、真核細胞を含む組成物へ、Ｃａｓエフェクタータンパク質が添加されると同時に添加される。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質が添加される前に、真核細胞を含む組成物に添加され、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質が添加された後に添加される。いくつかの実施形態では、ＭＭＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質が添加された後に、真核細胞を含む組成物に添加され、ＮＨＥＪ経路の阻害剤は、Ｃａｓエフェクタータンパク質が添加される前に添加される。

【0254】

本明細書に引用される全ての参考文献、例えば、特許、特許出願、論文、教科書など、及びこれらに引用される参考文献は、それらが既に引用されていない限り、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0255】

実施例１－二本鎖切断修復経路に対するＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ阻害剤の効果。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘導ＤＮＡ二本鎖切断修復経路に対するＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路の阻害剤の効果を、図２Ａに概略的に示すプロセスを用いて調べた。簡潔に記載すると、一本鎖オリゴヌクレオチドドナー（ｓｓＤＮＡ）と共にＳｐＣａｓ９をコードするプラスミド及びＣＤ３４を標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をトランスフェクトする２０時間前に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種した。トランスフェクトの３時間前に、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）阻害剤ＡＺＤ７６４８（ＮＨＥＪ阻害剤）（最終濃度１μＭ）の単独と図４に示す濃度の６種の異なるＰｏｌ Ｑ阻害剤（ＭＭＥＪ阻害剤）との組み合わせで、細胞を処理した。使用したＰｏｌ Ｑ阻害剤は、ＰｏｌＱ＿２、ＰｏｌＱ＿３、ＰｏｌＱ＿４、ＰｏｌＱ＿５、ＰｏｌＱ＿６又はＰｏｌＱ＿７である。トランスフェクションの６０時間後、ゲノムＤＮＡを回収し、ディープターゲットアンプリコンシーケンスを用いて配列を決定した。配列決定データの遺伝的バリアントをバイオインフォマティクスワークフローを用いて決定し、ＭＭＥＪ、ＮＨＥＪ、及びＨＤＲ経路によるＤＮＡ二本鎖切断修復のパーセンテージを、理論的インデルメタ解析（ＲＩＭＡ）を用いて決定した。例えば、Ｔａｈｅｒｉ－Ｇｈａｆａｒｏｋｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０１８，４６（１６）：８４１７－８４３４を参照されたい。ＲＩＭＡの結果を図２Ｂに示すようにプロットし、マイクロホモロジーに関連する欠失を、図に示すバーに従って可視化する。

【0256】

これらの実験の結果を図４に示す。ＭＭＥＪ又はＮＨＥＪ阻害剤で処理されていないトランスフェクト細胞（ＤＭＳＯ処理対照）では、二本鎖切断の約２０％がＨＤＲ経路によって修復され、ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ経路は二本鎖切断修復の約４０％を担っていた。対照的に、ＮＨＥＪ阻害剤（ＡＺＤ７６４８）単独又はＭＭＥＪ阻害剤（Ｐｏｌ Ｑ ２－７）との組み合わせで処理したトランスフェクト細胞は、ＨＤＲ経路による二本鎖切断修復の顕著な増加を示し、ＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路による修復は減少した。トランスフェクト細胞をＮＨＥＪ阻害剤及びＭＭＥＪ阻害剤の両方で処理すると、大部分の二本鎖切断がＨＤＲ経路を介して修復され、いくつかの例では、二本鎖切断修復のほぼ全てがＨＤＲ経路を介したものであった。

【0257】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集効率に対する様々な阻害剤の効果を実証するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８（１μＭ）の単独と、示したＰｏｌ Ｑ阻害剤との組み合わせで処理した後、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングを行った。図５に示すように、これらの実験で使用したＮＨＥＪ阻害剤とほとんどの濃度のＭＭＥＪ阻害剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介編集効率に影響を及ぼさなかった。これらの研究は、ＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ－遺伝子ターゲティングと組み合わせたＮＨＥＪ及び／又はＭＭＥＪ経路の阻害が、より正確なＨＤＲ経路によるＤＮＡ二本鎖切断修復をもたらし、よりエラープローンなＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路の寄与を最小限にすることを示している。

【0258】

実施例２－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ノックイン効率に対するＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ阻害剤の効果。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介ノックイン効率に対するＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ阻害剤の効果を、変異リード及びマッピングリードの両方で決定した。簡潔に記載すると、実施例１に記載のプロトコルに従って、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養し、トランスフェクトし、次いで、ＮＨＥＪ阻害剤（ＡＺＤ７６４８）の単独とＭＭＥＪ阻害剤（Ｐｏｌ Ｑ１～７）との組み合わせで処理し、続いて、ゲノムＤＮＡを単離し、その後、変異リード及びマッピングリードの両方でノックイン効率を分析した。ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ経路の阻害は、変異（図６）及びマッピング（図７）リードの両方を評価した場合、ＤＭＳＯで処理した対照と比較してノックイン事象が約３倍増加した。ＭＭＥＪ経路の阻害をＮＨＥＪ経路の阻害と組み合わせたことにより、総細胞集団でノックイン効率が最大４．５倍、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集細胞で最大５．９倍増加した。

【0259】

実施例３－変異リード及びマッピングリードに対するＭＭＥＪ阻害の効果。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養し、トランスフェクトし、ＤＮＡ－ＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８（１μＭ）の単独と示したＰｏｌ Ｑ阻害剤との組み合わせで処理し、続いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介遺伝子ノックインを行った。変異リード及びマッピングリードに対するＭＭＥＪ経路阻害の効果を評価した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集細胞のＭＭＥＪ阻害剤による処理により、ＭＭＥＪ変異リード（図８）及びＭＭＥＪマッピングリード（図９）が用量依存的に減少した。

【0260】

実施例４－ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ経路の阻害は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓトランスフェクト細胞における細胞コンフルエンス及びトランスフェクション効率に影響しない。
実施例１に記載のように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養し、トランスフェクトし、ＮＨＥＪ阻害剤及びＭＭＥＪ阻害剤で処理した。ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ阻害剤で処理したトランスフェクト細胞において、細胞コンフルエンス及びトランスフェクション効率を評価した。図１０に示すように、トランスフェクト細胞を最終濃度１ｍＭのＮＨＥＪ阻害剤（ＡＺＤ７６４８）により処理しても、細胞コンフルエンスに有意な影響を及ぼすことはなかった。トランスフェクト細胞を、示したＰｏｌ Ｑ阻害剤と組み合わせてＮＨＥＪ阻害剤で処理しても、ＰｏｌＱ＿１、ＰｏｌＱ＿５、及びＰｏｌＱ＿７の最高濃度を除いて、細胞コンフルエンスに影響を及ぼさなかった。同様に、図１１に示すように、トランスフェクトする前に１μＭのＮＨＥＪ阻害剤（ＡＺＤ７６４８）で細胞を処理しても、トランスフェクション効率に有意な影響はなかった。そのトランスフェクト細胞を、トランスフェクトする前に、示したＰｏｌ Ｑ阻害剤と組み合わせてＮＨＥＪ阻害剤で処理しても、ＰｏｌＱ＿１及びＰｏｌＱ＿７の最高濃度を除いてトランスフェクション効率に影響はなかった。

【0261】

実施例５－人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）における二本鎖切断修復経路に対するＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ阻害剤の効果。
ｉＰＳＣにおけるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ誘導ＤＮＡ二本鎖切断修復経路に対するＮＨＥＪ及び／又はＭＭＥＪ経路阻害の効果を調べた。簡潔に記載すると、誘導性Ｃａｓ９遺伝子を含むｉＰＳＣを９６ウェルプレートに播種し、２０時間後、３つの別々の標的部位のうちの１つを標的とするガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をコードするプラスミドを、一本鎖オリゴヌクレオチドドナー（ｓｓＤＮＡ）と共にトランスフェクトし、続いてＣａｓ９発現を誘導した。トランスフェクション及びＣａｓ９発現誘導の３時間前に、ｉＰＳＣを、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ－ＰＫ）阻害剤ＡＺＤ７６４８（最終濃度１μＭ）の単独と、３μＭのＰｏｌＱ２又はＰｏｌＱ６との組み合わせで処理した。トランスフェクションの６０時間後、ＨＤＲ、ＮＨＥＪ、及びＭＭＥＪ経路による二本鎖切断修復のパーセンテージを、実施例１で説明したように決定した。

【0262】

これらの実験の結果を図１２に示す。ＭＭＥＪ又はＮＨＥＪ阻害剤で処理されていないトランスフェクト細胞（ＤＭＳＯ処理対照）では、二本鎖切断のＨＤＲ経路による修復は１０％未満である、ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ経路は二本鎖切断修復の約７０％を担っていた。対照的に、ＮＨＥＪ阻害剤（ＡＺＤ７６４８）単独又はＭＭＥＪ阻害剤（Ｐｏｌ Ｑ ２又はＰｏｌ Ｑ ６）との組み合わせで処理したトランスフェクト細胞は、ＨＤＲ経路による二本鎖切断修復の顕著な増加を示し、ＭＭＥＪ及びＮＨＥＪ経路による修復は減少した。ＮＨＥＪ阻害剤及びＭＭＥＪ阻害剤との組み合わせ処理により、ＨＤＲ媒介修復はさらに大きく増加し、それに対応してＮＨＥＪ媒介修復及びＭＭＥＪ媒介修復は減少した。

【0263】

実施例６－ｉＰＳＣにおける一本鎖鋳型修復（ＳＳＴＲ）遺伝子挿入に対するＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ阻害剤の効果。
ｉＰＳＣにおけるＳＳＴＲ経路によって媒介される遺伝子ノックイン効率に対するＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ経路阻害の効果を調べた。簡潔に記載すると、実施例５に記載のように、Ｃａｓ９誘導性ｉＰＳＣを培養し、ｓｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡポリヌクレオチドをトランスフェクトした。図１３に示すように、ＮＨＥＪ又はＭＭＥＪ阻害剤で処理されていないトランスフェクト細胞（ＤＭＳＯ処理対照）では、３つの別々の標的部位での遺伝子ノックインマッピングリードにおけるＳＳＴＲ経路の寄与は、５％未満であった。ＮＨＥＪ阻害剤ＡＺＤ７６４８の添加により、３つ全ての標的部位でＳＳＴＲ媒介遺伝子ノックインが増加した。同様に、ＭＭＥＪ阻害剤ＰｏｌＱ２又はＰｏｌＱ６の添加によっても、３つ全ての標的部位でＳＳＴＲ媒介遺伝子ノックインが増加した。ＮＨＥＪ阻害剤とＭＭＥＪ阻害剤を組み合わせて添加した場合には、３つ全ての標的部位でＳＳＴＲ媒介遺伝子ノックインが大きく増加した。

【0264】

実施例７－初代ヒトＴ細胞における遺伝子挿入に対するＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ阻害剤の効果。
ヒト初代Ｔ細胞における遺伝子挿入に対するＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ経路阻害の効果を調べた。簡潔に記載すると、ヒトＴ細胞を、ＮＨＥＪ阻害剤ＡＺＤ７６４８（１μＭ）を単独で、又はＭＭＥＪ阻害剤ＰｏｌＱ２若しくはＰｏｌＱ６（３μＭ）と組み合わせて処理した。３時間後、細胞を、Ｃａｓ９及びＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）、及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトした。トランスフェクションの６０時間後、実施例１に記載のように、ＧＦＰノックイン効率を測定した。

【0265】

これらの実験の結果を図１４Ａ～Ｃに示す。初代Ｔ細胞のトランスフェクションとＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ阻害剤による処理は、細胞生存率に影響を及ぼさず（図１４Ａ）、細胞数に中程度の減少をもたらした（図１４Ｂ）。ＮＨＥＪ阻害剤でもＭＭＥＪ阻害剤でも処理されなかったトランスフェクト初代ヒトＴ細胞は、約５％のＧＦＰノックイン効率を示した。しかし、ＮＨＥＪ阻害剤による処理では、単独でもＭＭＥＪ阻害剤との組み合わせでも、ＧＦＰノックイン効率は有意に増加した（図１４Ｃ）。ノックイン効率は、特に、ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ経路の組み合わせ阻害によって大きく増強された。

【0266】

実施例８－正確な遺伝子編集結果に対する種々のＤＮＡＰＫ阻害剤の効果
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、培地を含み、以下の条件を含む９６ウェルプレートに播種した： ａ）ＤＭＳＯ ｂ）０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、１０μＭのＤＮＡＰＫ阻害剤ＴＬＲ１（ＩＳＡＣ： （４－フルオロ－３－（７－モルホリノキナゾリン－４－イル）フェニル）（３－メチラジン－２－イル）メタノール ｓｕｒｅｃｈｅｍｂｌ： ＳＣＨＥＭＢＬ１６２３５４８６） ｃ）０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、１０μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＴＬＲ２（ＩＳＡＣ： ５－メチル－２－（（７－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）アミノ）－８－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン ；ＭｅｄＣｈｅｍ ＥＬＮ： ＥＬＮＣ０２５３０５１４４） ｄ）０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、１０μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤 Ｍ９８３１／ＶＸ－９８４ ｅ）０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、１０μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤 ＡＺＤ７６４８。細胞をトランスフェクションの１２時間前に付着させた。一本鎖オリゴヌクレオチドドナー（ｓｓＤＮＡ）の存在下、ＳｐＣａｓ９－ＥＧＦＰをコードするＤＮＡプラスミド及びＣＤ３４（ｇＩＮＳ）を標的とするｓｇＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの７０時間後、細胞コンフルエンス及びＥＧＦＰに基づくトランスフェクション効率をＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３を用いて決定した。ゲノムＤＮＡを抽出し、編集結果を、バイオインフォマティクス解析を用い、ディープターゲットアンプリコンシーケンスにより解析した。

【0267】

以下の表２のデータに示されるように、試験した全てのＤＮＡＰＫ阻害剤は、提供された一本鎖オリゴヌクレオチドドナーの正確なノックイン頻度を増加させ、ＮＨＥＪからの不正確なＤＮＡ修復事象を減少させ、それは濃度依存的であり、同様の効率を有した。

【0268】

【表6】

【0269】

実施例９－様々な標的部位での正確な遺伝子編集結果に対するＰｏｌＱ阻害剤のＰｏｌＱ２及びＰｏｌＱ６の効果
ＰｏｌＱ２及びＰｏｌＱ６が異なるゲノム遺伝子座での正確な遺伝子編集を増加させるかどうかを評価するために、以下の実験において特定した条件を使用して、阻害剤を種々のｓｇＲＮＡで試験した。

【0270】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種し、２０時間付着させた。トランスフェクションの２時間前に、細胞を以下の条件を含む阻害剤処理に供した： ａ）ＤＭＳＯ対照 ｂ）１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８ ｃ）３μＭ ＰｏｌＱ阻害剤（ＰｏｌＱ２）と組み合わせた１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８ ｄ）３μＭ ＰｏｌＱ阻害剤（ＰｏｌＱ６）と組み合わせた１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８。一本鎖オリゴヌクレオチドドナー（ｓｓＤＮＡ）の存在下、ＳｐＣａｓ９－ＥＧＦＰをコードするＤＮＡプラスミド、並びにＣＤ３４（ｇＭＥＪ、ｇＩＮＳ）及びＳＴＡＴ１（ｇＤｅｌ）を標的とするｓｇＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの７０時間後、細胞コンフルエンス及びＥＧＦＰに基づくトランスフェクション効率をＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３を用いて決定した。ゲノムＤＮＡを抽出し、編集結果を、バイオインフォマティクス解析を用い、ディープターゲットアンプリコンシーケンスにより解析した。

【0271】

以下の表３に示すように、両ＰｏｌＱ阻害剤、ＰｏｌＱ２及びＰｏｌＱ６は、ＤＮＡＰＫ阻害細胞において、試験した全ての標的部位で、提供された一本鎖オリゴヌクレオチドドナーの正確なノックイン頻度を増加させる。さらに、試験した阻害剤の組み合わせは、不正確なＤＮＡ修復事象を減少させる。

【0272】

【表7】

【0273】

実施例１０－正確な遺伝子編集結果に対するＰｏｌＱ阻害剤ＡＲＴ５５８の効果
正確な遺伝子編集に対するＰｏｌＱ阻害剤ＡＲＴ５５８の効力を試験するために、この阻害剤を、以下の実験で特定した条件を使用して滴定した。

【0274】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種し、２０時間付着させた。トランスフェクションの２時間前に、細胞を以下の条件を含む阻害剤処理に供した： ａ）１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８ ｂ）０．１、０．３、１、３ １０μＭ ＰｏｌＱ阻害剤（ＡＲＴ５５８）と組み合わせた１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８。一本鎖オリゴヌクレオチドドナー（ｓｓＤＮＡ）の存在下、ＳｐＣａｓ９－ＥＧＦＰをコードするＤＮＡプラスミド、及びＣＤ３４（ｇＭＥＪ）を標的とするｓｇＲＮＡで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの７０時間後、細胞コンフルエンス及びＥＧＦＰに基づくトランスフェクション効率をＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３を用いて決定した。ゲノムＤＮＡを抽出し、編集結果を、Ｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ２バイオインフォマティクス解析を用い、ディープターゲットアンプリコンシーケンスにより解析した。以下の表４に示すように、ＡＲＴ５５８は、提供された一本鎖オリゴヌクレオチドドナーの正確なノックイン頻度を濃度依存的に増加させ、阻害剤濃度の増加とともに不正確なＤＮＡ修復事象を減少させる。

【0275】

【表8】

【0276】

実施例１１－２つの機能的酵素ドメインを標的とするＰｏｌＱ阻害剤による組み合わせ処理
ＤＮＡ二本鎖切断時にゲノムの完全性を維持するために、細胞は、切断されたＤＮＡ末端を修復するための異なる機構を発達させた。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え（ＨＲ）に加えて、細胞は、エラープローンなマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）ＤＮＡ修復経路を進化させた。ＤＮＡポリメラーゼシータ（ＰｏｌＱ）は、ＭＭＥＪ修復を媒介する重要な酵素である。ＰｏｌＱマルチドメイン酵素は、Ｎ末端ヘリカーゼ様機能、非構造中心ドメイン、及びＣ末端ポリメラーゼドメインを含む。両方の機能的タンパク質単位はＰｏｌＱ媒介ＤＮＡ修復に関与し、ドメイン特異的阻害剤を用いて阻害することができる。この実験は、両方の機能的ＰｏｌＱドメインの同時阻害が個々のドメインの標的化と比較して、遺伝子編集結果に対する効果を増強するかどうかという問題に対処するものである。

【0277】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種し、２０時間付着させた。トランスフェクションの２時間前に、細胞を以下の条件を含む阻害剤処理に供した： ａ）ＤＭＳＯ対照、ｂ）１μＭ及び２μＭのポリメラーゼドメイン標的化ＰｏｌＱ阻害剤（ＰｏｌＱ２）と組み合わせた１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８、ｃ）１μＭ及び２μＭのヘリカーゼドメイン標的化ＰｏｌＱ阻害剤（ＰｏｌＱ６）と組み合わせた１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８、さらにｄ）０．５μＭ ポリメラーゼ－及びヘリカーゼドメイン標的化ＰｏｌＱ阻害剤（ＰｏｌＱ２及びＰｏｌＱ６）、並びに１μＭ ポリメラーゼ－及びヘリカーゼドメイン標的化ＰｏｌＱ阻害剤（ＰｏｌＱ２及びＰｏｌＱ６）と組み合わせた、１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８。一本鎖オリゴヌクレオチドドナー（ｓｓＤＮＡ）と共に、ＳｐＣａｓ９－ＥＧＦＰをコードするＤＮＡプラスミド及びＣＤ３４を標的とするｓｇＲＮＡ（ｇＭＥＪ）で細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの７０時間後、細胞コンフルエンス及びＥＧＦＰに基づくトランスフェクション効率をＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３を用いて決定した。ゲノムＤＮＡを抽出し、編集結果を、ＫＩバイオインフォマティクス解析のためのＲＩＭＡを用い、ディープターゲットアンプリコンシーケンスにより解析した。

【0278】

表５に示すデータによって示すように、両方の機能的ＰｏｌＱドメインを標的とする組み合わせＰｏｌＱ阻害剤による処理は、同じ濃度で１つの機能的酵素ドメインのみを標的とする個々のＰｏｌＱ阻害剤と比較した場合、標的とされたノックインの大幅な増加、及びそれに付随した不正確なＤＮＡ修復産物の大幅な減少を示す。

【0279】

【表9】

【0280】

実施例１２－ＤＮＡＰＫ及びＰｏｌＱ阻害剤の存在下でのオフターゲット編集の評価
オフターゲット編集において確立されたＨＥＫ３及びＨＥＫ４のオンターゲット部位及びオフターゲット部位に対するＤＮＡＰＫ／ＰｏｌＱ阻害剤組み合わせの効果を試験するために、以下の実験において分析した。

【0281】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種し、２０時間付着させた。トランスフェクションの２時間前に、細胞を以下の条件を含む阻害剤処理に供した： ａ）ＤＭＳＯ対照、ｂ）１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８ ｃ）３μＭ ポリメラーゼドメイン標的化ＰｏｌＱ阻害剤（ＰｏｌＱ２）と組み合わせた１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８、及びｄ）３μＭ ヘリカーゼドメイン標的化ＰｏｌＱ阻害剤（ＰｏｌＱ６）と組み合わせた１μＭ ＤＮＡＰＫ阻害剤ＡＺＤ７６４８。一本鎖オリゴヌクレオチドドナー（ｓｓＤＮＡ）の非存在下及び存在下にて、ＳｐＣａｓ９－ＥＧＦＰをコードするＤＮＡプラスミドと、確立されたＨＥＫ３及びＨＥＫ４オフターゲット部位を標的とするｓｇＲＮＡとで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの７０時間後、細胞コンフルエンス及びＥＧＦＰに基づくトランスフェクション効率をＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３を用いて決定した。ゲノムＤＮＡを抽出し、編集結果を、Ｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ２バイオインフォマティクス解析を用い、ディープターゲットアンプリコンシーケンスにより解析した。

【0282】

以下の表６に示すように、ＤＮＡＰＫ阻害剤を用いたオン－及びオフ－標的編集の減少、その効果は、ＤＮＡＰＫ阻害剤をＰｏｌＱ阻害剤と組み合わせた場合により一層顕著である。一本鎖オリゴヌクレオチドドナーが存在した場合、ＤＮＡドナー試料なしと比較して、オン－及びオフ－標的編集が約２０％低減する。ＤＮＡＰＫ及びＰｏｌＱ阻害剤の存在下でのオンターゲット編集の減少は、一本鎖オリゴヌクレオチドドナーの存在下で部分的に回復するが、オフターゲットは減少する。

【0283】

【表10】

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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【国際調査報告】