特表 2024-536188 抗ＴＮＭＵＣ１ ＧＯＬＤ ＣＡＲ Ｔ細胞用の組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-04

(54)【発明の名称】抗ＴＮＭＵＣ１ ＧＯＬＤ ＣＡＲ Ｔ細胞用の組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/17 20150101AFI20240927BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240927BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240927BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240927BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20240927BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALN20240927BHJP

【ＦＩ】

A61K35/17

C12N15/63 Z

C12N5/10

A61P35/00

A61K48/00

C12N15/12 ZNA

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/24

C12N5/0783

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519420

(86)(22)【出願日】2022-09-21

(85)【翻訳文提出日】2024-05-22

(86)【国際出願番号】 US2022076766

(87)【国際公開番号】W WO2023056194

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】63/249,730

(32)【優先日】2021-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/331,804

(32)【優先日】2022-04-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】519073117

【氏名又は名称】キメラ・バイオエンジニアリング，インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ベンジャミン

(72)【発明者】

【氏名】ゼイナー，ガスティ

(72)【発明者】

【氏名】ガセレズ，アルバート

(72)【発明者】

【氏名】ヘルツィヒ，エイタン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA13

4C084ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB63

4C087NA13

4C087ZB26

(57)【要約】

ペイロードを、ＴｎＭＵＣ１陽性がん細胞に送達するための方法および組成物。抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲおよび導入遺伝子ペイロードは、免疫細胞内へと操作により導入され得るため、導入遺伝子ペイロードは、所望の時間において免疫細胞から発現および送達されることになる。そのような、導入遺伝子ペイロードを含む抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞は、他の分子、例えば、抗がん療法などの他の治療薬の投与と併用され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

膵がん、前立腺がん、またはトリプルネガティブ乳がんを処置するための方法であって、配列番号２のアミノ酸配列を有する抗ＴｎＭＵＣ１キメラ抗原受容体と、ＡＵリッチエレメントであるＲＮＡ分解エレメント（ＲＤＥ）をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＩＬ－１２ペイロードをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む、ＲＤＥに作動可能に連結された導入遺伝子をコードする転写物を作るために転写される異種核酸とを含む初代Ｔ細胞を得るステップ；前記初代Ｔ細胞を、前記膵がん、前記前立腺がん、または前記トリプルネガティブ乳がんと診断された対象に投与するステップ；前記初代Ｔ細胞を、膵がん細胞、前立腺がん細胞、またはトリプルネガティブ乳がん細胞と関連するＴｎＭＵＣ１に曝露するステップであって、前記抗ＴｎＭＵＣ１キメラ抗原受容体による、前記ＴｎＭＵＣ１の結合が前記初代Ｔ細胞を活性化する、ステップ；ならびに前記導入遺伝子を発現させるステップであって、前記導入遺伝子から作られるポリペプチドの量が、前記初代Ｔ細胞の活性化後に増加する、ステップを含む、前記膵がん、前記前立腺がん、または前記トリプルネガティブがんが処置される方法。

【請求項2】

初代Ｔ細胞が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記初代Ｔ細胞が配列番号５を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記初代Ｔ細胞が配列番号１２を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記初代Ｔ細胞が配列番号１３を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記初代Ｔ細胞が配列番号１４を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項7】

方法が、膵がんを処置するためのものであり、かつ前記ＴｎＭＵＣ１が膵がん細胞と関連する、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

方法が、前立腺がんを処置するためのものであり、かつ前記ＴｎＭＵＣ１が前立腺がん細胞と関連する、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

方法が、トリプルネガティブ乳がんを処置するためのものであり、かつ前記ＴｎＭＵＣ１がトリプルネガティブ乳がん細胞と関連する、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、または配列番号１４の核酸配列を含む２シストロン性構築物。

【請求項11】

前記核酸配列が配列番号５である、請求項１０に記載の２シストロン性構築物。

【請求項12】

前記核酸配列が配列番号１２である、請求項１０に記載の２シストロン性構築物。

【請求項13】

前記核酸配列が配列番号１３である、請求項１０に記載の２シストロン性構築物。

【請求項14】

前記核酸配列が配列番号１４である、請求項１０に記載の２シストロン性構築物。

【請求項15】

請求項１０に記載の２シストロン性構築物を含む初代Ｔ細胞。

【請求項16】

前記２シストロン性構築物が、配列番号５の核酸配列を有する、請求項１５に記載の初代Ｔ細胞。

【請求項17】

前記２シストロン性構築物が、配列番号１２の核酸配列を有する、請求項１５に記載の初代Ｔ細胞。

【請求項18】

前記２シストロン性構築物が、配列番号１３の核酸配列を有する、請求項１５に記載の初代Ｔ細胞。

【請求項19】

前記２シストロン性構築物が、配列番号１４の核酸配列を有する、請求項１５に記載の初代Ｔ細胞。

【請求項20】

自家Ｔ細胞である、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の初代Ｔ細胞。

【請求項21】

同種Ｔ細胞である、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の初代Ｔ細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表、表、またはコンピュータプログラムの参照
配列表の正式な写しが、ＷＩＰＯ Ｓｅｑｕｅｎｃｅバージョン２．１．０を用いて作成した、ファイル名「＼ＣＢＩＯ０７８．ｘｍｌ」、作成日２０２２年９月１３日、サイズ１５４キロバイトのｘｍｌファイルとして、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で本明細書と同時に提出される。ＥＦＳ－Ｗｅｂを経由し出願した配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
キメラ抗原受容体は、ＣＡＲにより認識された標的を攻撃するようＴ細胞に指示し得るヒト操作受容体（engineered receptor）である。例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、急性リンパ芽球性白血病および他のＢ細胞関連悪性腫瘍に対する完全奏功の誘導に有効であることが示されており、かつ難治性／再発急性リンパ芽球性白血病の寛解の達成および持続に有効であることが示されている（Maude等、NEJM、371:1507、2014）。しかしながら、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）、Ｂ細胞形成不全、およびオン腫瘍、オフターゲット毒性に関連する危険な副作用が一部の患者で認められている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

現在、ＣＡＲ技術を制御する２つの戦略が存在する。１つ目は、誘導性「キルスイッチ（kill switch）」である。このアプローチでは、アポトーシス経路を開始する１つまたは複数の「自殺」遺伝子がＣＡＲ構築物に組み込まれる（Budde等、PLoS1、2013 doi:10.1371/journal.pone.0082742）。これらの自殺遺伝子の活性化は、脂質透過性タクロリムスアナログであるＡＰ１９０３（リミデュシド（rimiducid）としても知られる）の添加により開始され、このＡＰ１９０３は、アポトーシス誘導性タンパク質が翻訳の際に融合しているヒトタンパク質ＦＫＢＰ１２（Ｆｖ）のホモ二量体化を開始する。理想的なシナリオでは、これらのキルスイッチは、ＣＡＲ技術の長期監視の利点を犠牲にして毒性から守ろうとする。しかしながら、インビボでは、これらの自殺スイッチは、ＡＰ１９０３に応答しないＣＡＲ Ｔ細胞に対する強力な選択圧に逆らう形で動作するため、この目標を実現させないようであり、患者Ｔ細胞への安定な導入遺伝子の挿入と関連する有害な、エラーを起こしやすいレトロウイルスの複製により悪化する状況である。このシナリオでは、非応答性ＣＡＲ Ｔ細胞クローンが増殖し続け、抗原依存性に標的細胞を死滅させるであろう。したがって、キルスイッチ技術は、毒性に対する十分な防衛手段を提供しそうにない。

【0004】

２つ目のＣＡＲ調節アプローチは、いくつかの方法で達成され得る一過性ＣＡＲ発現である。１つのアプローチでは、Ｔ細胞が非血縁ドナーから採取され、ＨＬＡ遺伝子がゲノム編集技術により欠失され、ＣＡＲコード導入遺伝子がこれらの細胞のゲノムに挿入される。養子移入すると、これらのＣＡＲ Ｔ細胞はレシピエントの免疫系により異物として認識され、破壊されるため、この系におけるＣＡＲ曝露は一過性である。別の一過性ＣＡＲ曝露アプローチでは、ＣＡＲコード遺伝子のｍＲＮＡが、採取された患者Ｔ細胞に導入される（Beatty、GL 2014. Cancer Immunology Research 2 (2):112～20頁。doi:10.1158/2326-6066.CIR-13-0170）。ｍＲＮＡは半減期が短く、細胞中で複製されないかまたは安定に維持されないことから、ＣＡＲ発現Ｔ細胞の永続的な変化はなく、したがって、ＣＡＲ発現および活性は短期間となるであろう。しかしながら、キルスイッチアプローチと同様に、これらの一過性ＣＡＲ曝露アプローチは、ＣＡＲの監視の利点を犠牲にする。さらに、これらの一過性の系を用いると、急性毒性の制御が困難な場合がある。

【課題を解決するための手段】

【0005】

発明の概要
一態様では、本記載は、がん細胞を標的にするために合わせて使用される、免疫細胞中におけるＲＮＡ不安定化エレメント（「ＲＤＥ」）の制御下にある様々なペイロードを有する抗ＴｎＭＵＣ１キメラ抗原受容体のための方法、細胞、および核酸を開示する。キメラ抗原受容体は、場合により配列番号３などのシグナル配列を含み得る、配列番号１の配列（配列番号２のアミノ酸配列）を有する抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲであり得る。この抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲを含む構築物は、ＧＣ１６０（配列番号４）、ＧＣ２１３（配列番号５）、ＧＣ２１７（配列番号６）、ＧＣ２１９（配列番号７）、ＧＣ２２３（配列番号８）、ＳＫ０６２（配列番号９）、ＳＫ１４８（配列番号１０）、ＳＫ０７２（配列番号１１）、ＧＣ２５１（配列番号１２）、ＰＤ００７（配列番号１３）、およびＰＤ００９（配列番号１４）を含み得る。ペイロードは、サイトカイン、ＦａｓＬ、抗体、成長因子、ケモカイン、ポリペプチドもしくは多糖を切断する酵素、グランザイム、パーフォリン、またはチェックポイント阻害剤の１つまたは複数であり得る。ペイロードは、ＩＬ－１２、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）、ならびに／または抗ＴＧＦｂ薬剤（例えば、抗ＴＧＦｂ抗体、可溶性ＴＧＦｂＲ、抗ａｖＢ６インテグリン抗体、天然ＴＧＦｂ結合タンパク質、ｄｎＴＧＦＢＲ２、ビグリカン、デコリン）の１つまたは複数であり得る。

【0006】

ＴｎＭＵＣ１は、例えば、卵巣がん、乳がん（例えば、特定のトリプルネガティブ乳がん）、膵がん、結腸直腸がん、結腸がん、前立腺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、多発性骨髄腫、および／またはＴ細胞急性リンパ芽球性白血病を含むいくつかのがん上に見出され得る。ＴｎＭＵＣ１に関して陽性である前記のがんのいずれかが、本明細書に記載される抗ＴｎＭＵＣ１ Ｇｏｌｄ ＣＡＲを用いて処置され得る。一態様では、キメラ抗原受容体の結合ドメインは、Ｔｎ－ＭＵＣ１抗原の、変化したグリコシル化を認識し、かつＴｎグリコシル化ゆえに腫瘍関連抗原になり得る他の抗原における、同様に変化したＴｎグリコシル化も認識できる。そのような、変化したＴｎグリコシル化を有する他の腫瘍関連抗原は、例えば、ＭＵＣ１６（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＷＸＩ７）、ＣＤ４３、ＬＲＰ８（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１４１１４）、ＧＡＬＮＴ１０（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８６ＳＲ１）、ＧＸＹＬＴ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ０ＰＪＺ３）、ＰＯＤＸＬ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ００５９２）、ＴＧＯＬＮ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ４３４９３）、ＣＰＤ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５９７６）、ＬＤＬＲ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１１３０）、ＴＦＲＣ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０２７８６）、ＰＴＰＲＣ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０８５７５）、ＣＤ７（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０９５６４）、ＭＩＣ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１４２０９）、ＭＧＡＴ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２６５７２）、ＣＡＮＸ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２７８２４）、ＧＲＮ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２８７９９）、ＴＮＦＲＳＦ８（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２８９０８）、ＨＣＦＣ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ５１６１０）、ＧＦＲＡ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ５６１５９）、ＮＵＣＢ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ８０３０３）、ＦＢＬＮ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ９８０９５）、ＶＬＤＬＲ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ９８１５５）、ＬＲＰ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０７９５４）、ＭＧＡＴ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１０４６９）、ＧＡＬＮＴ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１０４７１）、ＯＳ９（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１３４３８）、ＤＡＧ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１４１１８）、ＳＥＬＰＬＧ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１４２４２）、ＣＤＯＮ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ４ＫＭＧ０）、ＰＲＲＴ３（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＦＷＥ３）、ＭＩＡ３（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＪＲＡ６）、ＬＡＩＲ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６ＧＴＸ８－２）、ＰＩ１６（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６ＵＸＢ８）、ＳＥＸ６Ｌ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６ＵＸＤ５－３）、ＳＲＣＡＰ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６ＺＲＳ２）、ＧＡＬＮＴ７（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８６ＳＦ２）、ＲＴＮ４ＲＬ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８６ＵＮ３）、ＬＲＰ１１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８６ＶＺ４）、ＡＥＢＰ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＩＵＸ７）、ＬＥＰＲＥＬ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＩＶＬ６）、ＧＡＬＮＴ１２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＩＸＫ２）、ＫＩＡＡ２０１３（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＩＹＳ２）、ＸＸＹＬＴ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＮＢＩ６）、ＴＰ５３Ｉ１３（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＮＢＲ０）、ＣＨＳＴ１４（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＮＣＨ０）、ＳＯＲＬ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９２６７３）、ＳＥＭＡ４Ｄ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９２８５４）、ＤＣＢＬＤ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９６ＰＤ２）、ＳＬＣ２９Ａ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９９８０８）、ＳＭＯ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９９８３５）、ＥＲＰ４４（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＢＳ２６）、ＹＩＰＦ３（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＧＺＭ５）、ＸＹＬＴ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｈ１Ｂ５）、ＭＥＧＦ９（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｈ１Ｕ４）、ＳＬＣ３８Ａ１０（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＨＢＲ０）、ＴＭＥＭ３０Ａ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＶ９６）、ＳＥＬ１Ｌ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＢＶ２）、ＳＡＰ３０ＢＰ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＨＲ５）、ＭＡＮ１Ｂ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＫＭ７）、ＨＥＧ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＬＩ３）、ＭＩＮＰＰ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＮＷ１）、ＣＬＥＣ１１Ａ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ２４０）、ＢＡＣＥ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ５Ｚ０）、ＣＤ９９（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｈ７Ｃ２Ｆ２）、ＮＣＯＲ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ７５３７６）、ＣＴＳＤ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０７３３９）、ＦＡＳ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２５４４５）、ＣＤ２７（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２６８４２）、ＬＲＰＡＰ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３０５３３）、ＢＭＰＲ１Ａ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ３６８９４）、ＦＡＭ３Ａ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ９８１７３）、ＧＮＰＴＡＢ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ３Ｔ９０６）、ＣＡＳＣ４（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６Ｐ４Ｅ１）、ＳＥＺ６Ｌ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６ＵＸＤ５－３）、ＸＸＹＬＴ１２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＮＢＩ６）、ＴＸＮＤＣ５（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＮＢＳ９）、ＥＲＧＩＣ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９６ＲＱ１）、ＣＣＤＣ１３４（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｈ６Ｅ４）、ＳＤＦ２Ｌ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＨＣＮ８）、ＧＰＲ１０８（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＰＲ９）、ＧＮＰＴＧ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＪＪ９）、ＣＣＤＣ６４Ｂ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ１Ａ５Ｄ９）、ＬＩＬＲＡ５（ｕｎｉｐｒｏｔ Ａ６ＮＩ７３）、ＳＰＩＮＴ２（Ｏ４３２９１）、ＧＤＦ１１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ９５３９０）、Ｐ４ＨＡ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１３６７４－２）、ＩＧＬＬ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１５８１４）、ＦＸＹＤ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ５４７１０－２）、ＨＮＲＮＰＵ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ００８３９）、ＰＶＲＬ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５２２３）、ＡＤＲＭ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１６１８６）、ＸＹＬＴ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８６Ｙ３８）、ＰＮＰＬＡ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８Ｎ８Ｗ４）、ＴＴＮ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８ＷＺ４２）、ＩＧＳＦ８（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９６９Ｐ０）、ＬＹ９（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＨＢＧ７）、ＳＬＣ３９Ａ９（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＵＭ３）、Ｂ４ＧＡＬＴ７（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＢＶ７）、ＭＧＡＴ４Ａ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＵＭ２１）、ＴＡＦ４（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｏ００２６８）、ＶＧＦ（ｕｎｉｐｒｏｔ １５２４０）、ＴＡＣＳＴＤ２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０９７５８）、ＨＳＰＡ５（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１１０２１）、ＰＲＪＣＳＨ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１４３１４）、ＬＭＡＮ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４９２５７）、ＴＭＥＤ１０（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４９７５５）、ＮＵＰ１５３（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４９７９０）、ＮＵＣＢ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０２８１８）、ＢＰＴＦ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１２８３０）、ＵＢＡＰ２Ｌ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１４１５７）、ＫＬＨＤＣ１０（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ６ＰＩＤ８）、ＬＲＲＣ８Ｄ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ７Ｌ１Ｗ４）、ＬＹＰＤ６ ＫＩＡＡ２０１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ８６Ｙ７８）、ＺＦＲ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９６ＫＲ１）、ＭＵＣ５Ｂ（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＨＣ８４）、ＣＤＫ１２（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＹＶ４）、ＨＹＯＵ１（ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９Ｙ４Ｌ１）を含む。本明細書に開示される抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲは、これらの他の腫瘍関連抗原も標的にできる。

【0007】

ペイロードは、サイトカイン、抗体、レポーター（例えば、イメージング用）、受容体（例えば、ＣＡＲなど）、または標的部位において所望の効果を有し得る他のポリペプチドであり得る。ペイロードは、細胞の挙動を修飾するために、細胞内または細胞表面上にとどまり得る。ペイロードは、細胞内タンパク質、例えば、キナーゼ、ホスファターゼ、代謝酵素、エピジェネティック修飾酵素、遺伝子編集酵素等であり得る。ペイロードは、遺伝子調節ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ１５５）、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなど、またはＣＲＩＳＰＲシステムと共に使用するガイドＲＮＡであり得る。ペイロードは、核酸（例えば、ベクター、またはヒト人工染色体（ＨＡＣ））であり得る。ペイロードは、ＧＰＣＲ、トランスポータ等の膜結合タンパク質でもあり得る。ペイロードは、標的部位を画像化できるようにするイメージング剤であり得る（標的部位は、ＣＡＲが結合する所望の量の標的抗原を有する）。ペイロードは、チェックポイント阻害剤であり得て、ＣＡＲおよび／または他の結合タンパク質（例えば、Ｔ細胞受容体、抗体または自然免疫受容体）は腫瘍関連抗原を認識することができるため、真核細胞はチェックポイント阻害剤を腫瘍へ優先的に送達する。ペイロードは、例えば、グランザイム、アポトーシス誘導因子、細胞傷害性小分子、または補体を含む細胞傷害性化合物であり得る。ペイロードは、例えば、抗４－１ＢＢアゴニスト抗体（抗ＣＤ１３７抗体）、抗ＩＬ１ｂ抗体（抗炎症性）、抗ＣＤ２９／抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、二重特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥ）、抗ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、可溶性ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ｓｉＲＮＡ、他のアンチセンスＲＮＡ、および／または抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）などの抗体であり得る。ペイロードは、小型ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）、例えば、デコリン、ビグリカン、および／またはルミカンなどを有する融合タンパク質として提示され得る（それらのすべては、融合タンパク質を、標的部位中または標的部位近くの細胞マトリクスに係留し得る）。デコリンおよび／またはビグリカンとの融合は、標的部位中およびその周りにおいてＴＧＦベータを結合することもでき、免疫抑制を低下させ得る。骨髄細胞により引き起こされる免疫抑制または阻害を低下させる骨髄修飾ペイロード（「ＭＭペイロード」）が送達され得て、例えば、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＴＮＦα、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、および／またはＩＬ－１２を含む。送達に関する異なる薬物動態をもたらすＲＤＥを使用して、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ｓｉｄｅ－ＣＡＲおよび／または他の受容体細胞（例えばＴ細胞）により、２つ以上のＭＭペイロードを送達することもできる。例えば、異なるＭＭペイロードは、異なるＲＤＥにより制御され得るため、異なるＭＭペイロードの送達のＣｍａｘは、異なる時間において生じることになる。ペイロードは、例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８）、ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１２）、パーフォリン、グランザイム、および他の免疫ポリペプチドを含む、免疫ポリペプチドであり得る。ペイロードは、例えば、ヒアルロニダーゼ、またはヘパリナーゼを含む、酵素であり得る。ペイロードは、例えば、ＡｐｏＥ（例えば、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３およびＡｐｏＥ４）、ＮＯシンターゼ（例えば、ｉＮＯＳ、ｎＮＯＳ、ｅＮＯＳ）、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＣＣＲ２、および／またはＣＣＲ４を含む、ポリペプチドであり得る。ペイロードは、標的部位近くまたは標的部位中のコラーゲンに結合するように、デコリン、ビグリカン、フィブロモジュリン／ルミカンと融合または会合させてもよい。この戦略は、細胞傷害性ペイロードの、標的細胞（例えば、腫瘍）への局在を維持するために特に有用である。ペイロードは、ウイルスをペイロードとして送達する導入遺伝子であり得る。例えば、ＲＤＥは、複製およびコート／エンベロープタンパク質のためのウイルス遺伝子の発現を制御するマスター制御エレメントを制御し得る。あるいは、Ｒｅｐおよびコート／エンベロープタンパク質は、調節タンパク質により制御される誘導性プロモーターの制御下に置かれ得て、その調節タンパク質はＲＤＥにより制御され得る。さらにあるいは、ウイルスのＲｅｐタンパク質がＲＤＥの制御下に置かれてもよく、および／またはウイルスのコート／エンベロープタンパク質がＲＤＥの制御下に置かれてもよい。他のペイロードと同様に、この複合体ペイロードは、ＣＡＲ Ｔ細胞調節、または細胞において解糖を誘導する他のいずれかの調節を使用し得る。Ｔ細胞中のヘルパー構築物、または他の送達細胞が、ウイルス複製およびウイルスパッケージングに必要な遺伝子をコードしてもよい。

【0008】

ＲＤＥは、複数の導入遺伝子を制御し得るか、または複数のＲＤＥが、複数の導入遺伝子を制御し得る。複数の導入遺伝子は、連続的に、および／またはコンカテマーとして、および／または他の配置で配置されてもよい。複数のＲＤＥが、導入遺伝子を調節するために使用され得て、これらの複数のＲＤＥは、コンカテマーとして編成されてもよく、転写物の領域内に分散されてもよく、または転写物の異なる部分に位置してもよい。複数の導入遺伝子が、ＲＤＥ、またはＲＤＥの組合せにより調節され得る。ＲＤＥは、３’－ＵＴＲ、５’－ＵＴＲおよび／またはイントロン中に局在し得る。ＲＤＥは、例えば、ＡＵ１（ＣＤ４０Ｌ）、ＡＵ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ３（ＣＤ２４７）、ＡＵ４（ＣＴＬＡ４）、ＡＵ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ６（ＩＬ２ＲＡ）、ＡＵ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ８（ＴＲＡＣ）、ＡＵ９（ＣＤ２７４）、ＡＵ１０（Ｍｙｃ）、ＡＵ１１（ＣＤ１９）、ＡＵ１２（ＩＬ４）、ＡＵ１３（ＩＬ５）、ＡＵ１４（ＩＬ６）、ＡＵ１５（ＩＬ９）、ＡＵ１６（ＩＬ１０）、ＡＵ１７（ＩＬ１３）、ＡＵ１８（ＦＯＸＰ３）、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、ＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）、ＡＵ２４（ＣＤ８）、ＡＵ２７（ｂＧＨ）、および／またはＡＵ１０１（インターフェロンガンマまたはＩＦＮｇ）由来のＲＤＥを含み得る。他のＲＤＥが、以下の記載に開示される。ＲＤＥ制御は、導入遺伝子のコドンの一部または全部でのウォブル位（コドンの第３位）のＧＣ含量を増やす、導入遺伝子のコドン最適化と組み合わせることもできる。このコドン最適化は、発現の効率（オンシグナル）を１００倍まで上昇させ得る。そのようなコドン最適化導入遺伝子は、ＲＤＥと連結されて、コドン最適化を伴わない導入遺伝子－ＲＤＥと比べて、ＲＤＥ制御由来の発現の、より大きいダイナミックレンジをもたらすことができる。

【0009】

一態様では、ＲＤＥ制御ペイロードの有無にかかわらず抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞を利用する療法を、他の療法と組み合わせる。他の療法は、例えば、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、小分子薬物、生物学的薬物、抗体、抗体薬物複合体を含むいずれかの治療用分子、または前記の組合せを含み得る。適切な分子を以下に記載する。他の療法が、ＣＡＲ療法（ＲＤＥ制御導入遺伝子の有無にかかわらず）と同時に、ＣＡＲ療法（ＲＤＥ制御導入遺伝子の有無にかかわらず）の投与前に、またはＣＡＲ療法（ＲＤＥ制御導入遺伝子の有無にかかわらず）の投与後に、対象に投与され得る。例えば、対象は、化学療法および／または免疫療法（例えば、抗体薬物複合体）で処置された後に、場合によりＲＤＥ制御ペイロードを含むＣＡＲ Ｔ細胞で処置することができる。ＣＡＲ Ｔ細胞処置は、化学療法および／または免疫療法後の様々な時間において、例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間後に対象に施され得る。化学療法および／または免疫療法（例えば、ＡＤＣ）は、ＣＡＲ Ｔ細胞処置と共に、処置の複数サイクルを循環させることができる。ＣＡＲ Ｔ細胞による処置は、標的Ｘペプチド、または標的Ｘペプチドをロードしたウイルスもしくは細胞によりブーストすることも可能である（標的Ｘは、ＣＡＲが結合する標的である）。

【0010】

一態様では、ＲＤＥ、ＲＤＥの組合せ、および／または修飾ＲＤＥが、例えば、発現量、定常状態濃度、Ｃ_ｍａｘ（得られる遺伝子産物の最大濃度）、Ｔ_ｍａｘ（Ｃ_ｍａｘに達するまでの時間）、ベースライン発現、誘導スピード（加速）、誘導率（速度）、調節倍率（fold regulation）としても知られるダイナミックレンジ（誘導発現／基底発現）、最大ダイナミックレンジ（ＤＲ_ｍａｘ）、ＤＲ_ｍａｘまでの時間、曲線下面積（ＡＵＣ）等を含む、ペイロードの調節に対する所望の動態パラメータを提供するために使用され得る。望ましい調節のレベル、程度、時間、および量を提供する、動態パラメータの所望のセットを有するＲＤＥ構築物が作製され得る。さらに、構築物の動態性能を変更するためにＲＤＥコンカテマーが使用され得る。

【0011】

２つ以上のペイロード間での時間的調節をもたらすために、ＲＤＥの組合せを使用することができる。ＲＤＥは、細胞の活性化（または発現の誘導）後の異なる時間において、最大発現率（および異なる最大発現量）をもたらすように選択され得る。この時間的制御は、第１のペイロードが細胞の状態を変更することを可能にするため、より遅くに発現をもたらすＲＤＥを含む第２のペイロードから作用を受けるように細胞が準備されることになる。この時間的制御は、細胞の活性化後、２つ、３つまたはそれ以上の導入遺伝子の発現の時間を調整するために使用することもできる。導入遺伝子コードポリペプチドが分泌される場合、それらは標的細胞に一時的に作用し得る。例えば、第１のペイロード（早期発現ＲＤＥを含む）は分泌され、標的細胞の状態を変化させるように標的細胞に作用することができる（例えば、受容体の発現を誘導する）。第２のペイロードは、後で発現され（後期発現ＲＤＥの制御下）、変化した状態の標的細胞に作用する（例えば、第２のタンパク質は、誘導された受容体のリガンドであり得る）。

【0012】

一態様では、抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲは、標的部位（例えば、腫瘍細胞または他の疾患組織／細胞）において抗原を認識し、それが細胞を活性化する。ペイロードは、標的部位において第２の抗原を認識する他のＣＡＲであり得て、抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲによる細胞の活性化は、第２のＣＡＲを誘導し、真核細胞が、第２の抗原により標的部位を認識することを可能にする。一態様では、真核細胞は、標的部位において抗原を認識する抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲを有し、これが、細胞の活性化状態を直接または間接的に低下させるポリペプチドをコードする導入遺伝子を（ＲＤＥを通して）活性化する。例えば、導入遺伝子は、健常組織上の抗原を認識する第２のＣＡＲをコードし得るため、第１のＣＡＲが非標的細胞において抗原と反応すると、（標的部位において存在しないか、または低下した量で存在する）健常細胞抗原との、第２のＣＡＲ相互作用により、真核細胞が非活性化されることになる。

【0013】

一部の態様では、抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲを含む細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または他の抗原提示細胞である。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等）は、同種、自家または同系であり得る。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、Ｂ細胞等）は、初代免疫細胞、初代免疫細胞由来、または細胞株由来であり得る。これらの態様では、抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲによる細胞の活性化、または他のやり方で免疫細胞の代謝状態を変化させることが、ＲＤＥを通したペイロードの発現を誘導し得る。ペイロードを制御するＲＤＥは、マイクロＲＮＡ結合部位を有し得て、それらのマイクロＲＮＡ結合部位の１つまたは複数を除去するように操作され得る。ＲＤＥには、Ｈｕタンパク質Ｒ（ＨｕＲ）が結合し得る。理論に拘束されることは望まないが、ＨｕＲは、一部のＲＤＥに結合し、ｍＲＮＡを安定化するように作用して、翻訳の増強をもたらし得ることが予想される。一部のＲＤＥは、真核細胞が活性化されていない（解糖活性が低い）、静止状態である、または休止状態である場合にＲＤＥに結合することができる酵素であるグリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、他のデヒドロゲナーゼ、他の酸化還元酵素、または他の解糖系酵素を通して、真核細胞の解糖状態と結び付いていることがある。ＧＡＰＤＨまたは他の酵素がＲＤＥに結合すると、これは、ＲＤＥを含むＲＮＡの半減期を短縮させ得る。この態様では、真核細胞（例えば、Ｔリンパ球）のＣＡＲ活性化は、ＲＮＡのＧＡＰＤＨ結合を低下させ、ＲＮＡの半減期を延長させる解糖を細胞内で誘導し得て、これが、ＲＮＡ中にコードされ、かつＲＤＥにより制御されるペイロードの発現の上昇をもたらす。理論に拘束されることは望まないが、ＧＡＰＤＨがＲＤＥを空にすることから、ＨｕＲまたは他のＲＤＥ結合タンパク質が、続いて同じＲＤＥ、または以前は接近不可能であったＲＤＥ（ＧＡＰＤＨの存在による立体障害型）のいずれかに結合して、さらにｍＲＮＡを安定化させ、ｍＲＮＡの半減期を延長させ、かつＲＮＡによりコードされて前記ＲＤＥにより制御されるペイロードの発現のさらなる上昇をもたらすことができる。したがって、ＣＡＲ活性化は、ペイロードの発現を誘導し得る。他の態様では、免疫細胞の他の活性化が、ＧＡＰＤＨを解糖に関与させるため、ＲＤＥの制御下でペイロードの発現を誘導することができる。ＧＡＰＤＨが結合するＲＤＥの例には、例えば、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、およびＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）が含まれる。

【0014】

ＲＤＥを含む転写物からの発現は、細胞の代謝状態に応答し得る。例えば、代謝酵素または解糖系酵素がＲＤＥに結合し得て、これが、それらの代謝酵素または解糖系酵素を通して、導入遺伝子の発現を、細胞の活性化状態に結び付ける。いくつかの代謝酵素または解糖系酵素は、転写物中のＲＤＥに結合し、転写物を分解するか、または転写物を分解の標的にする。それらの代謝酵素または解糖系酵素が活性になると、それらの酵素はもはやＲＤＥに結合せず、転写物はより長期間安定であり、転写物はそのより長い期間にわたって翻訳され得る。そのようなＲＤＥの制御下で導入遺伝子を発現する細胞は、所望の時間において細胞の代謝状態を変更できるＣＡＲを発現するようにも操作され得て、所望の時間において導入遺伝子の発現をもたらすことができる。あるいは、真核細胞の代謝状態を変更し、導入遺伝子の発現をもたらすために、他の刺激が使用されてもよい。例えば、細胞の代謝状態は、例えば、小分子（例えば、ＰＭＡ／イオノマイシン）、サイトカイン、リガンドとの、ＴＣＲおよび共刺激ドメインの係合、酸素レベル、細胞ストレス、温度、または光／放射線を含む刺激により、導入遺伝子発現を引き起こす（または発現を阻害する）ように変更されてもよい。

【0015】

一態様では、ＣＡＲ Ｔリンパ球は、移植片対宿主反応を低下させるまたは予防するように修飾されている。これは、Ｔ細胞受容体がＴリンパ球を活性化する能力をノックアウトすることによりなされる。優性ＣＤ３イプシロン鎖変異体がＴリンパ球に導入されると、Ｔ細胞受容体がＴリンパ球を活性化する能力がノックアウトされ得る。１つのそのようなＣＤ３イプシロン変異体は、Ｃ－Ｘ－Ｘ－Ｃモチーフのシステイン残基をセリン残基で置換する二重変異体である（Ｃ１１９ＳおよびＣ１２２Ｓ変異体）。この変異体ＣＤ３イプシロン鎖はＴ細胞受容体からのシグナル伝達を破壊し、Ｔ細胞受容体を通したＴリンパ球のリガンド誘導活性化を阻止する。過剰なＣＤ３イプシロンＣ１１９Ｓ／Ｃ１２２Ｓ変異体をＴリンパ球内で発現させることにより、Ｔリンパ球は、ＣＡＲ Ｔリンパ球のＴリンパ球受容体への、宿主抗原の結合に応じて活性化しないであろう。これは、移植片対宿主反応が低下した、対象における同種ＣＡＲ Ｔリンパ球の使用を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】３つの変数が、ＣＡＲコピー数、標的エピトープコピー数、およびＣＡＲ結合親和性である場合の、最適なＣＡＲ活性の図を示す。

【図2】休止時のＴ細胞の生物発光と比べた、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴＣＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＲＤＥにより制御されるルシフェラーゼを含むＴ細胞からの生物発光に関するグラフを示す。

【図3】休止時のＴ細胞の生物発光と比べた、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＲＤＥであるＧｏｌｄ１、Ｇｏｌｄ２、またはＧｏｌｄ３により制御されるルシフェラーゼを含むＴ細胞からの生物発光に関するグラフを示す。

【図4】休止時のＴ細胞のＩＬ－１２発現と比べた、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＩＬ－１２発現がＲＤＥにより制御されるＴ細胞からのＩＬ－１２発現に関するグラフを示す。

【図5】ジャーカット細胞における、制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。

【図6】初代Ｔ細胞における、制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。

【図7】制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、１、３、６、および８日後の活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ発現を示す。

【図8】制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。

【図9】制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、活性化から１日後、３／４日後、６日後、および８日後に測定されたダイナミックレンジ（活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ）を示す。

【図10】制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、活性化から１日後、３／４日後、６日後、および８日後に測定されたダイナミックレンジ（活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ）を示す。

【図11】制御エレメントとしてＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、グルコースおよびガラクトースの存在下でのルシフェラーゼ発現に対する影響を示す。

【図12】マウスモデルにおける転移性膵癌（ＨＳ７６６Ｔ）に対するＳＫ０７２、ＧＣ２１３、ＧＣ２１６およびＰＢＳの効能を比較する。

【図13】インビトロでのＩＦＮｇのレベルを示す。

【図14】インビトロでＩＬ－１２のレベルを示す。

【図15】インビトロでの細胞傷害性を示す。

【図16】インビトロでの細胞傷害性を示す。

【図17】インビトロでの細胞傷害性を示す。

【図18】マウスモデルにおける転移性膵癌（ＨＳ７６６Ｔ）に対する、ドナー１８０由来のＴ細胞中でのＳＫ０７２、ＧＣ２１３、ＧＣ２１６およびＰＢＳの効能を示す。

【図19】マウスモデルにおける転移性膵癌（ＨＳ７６６Ｔ）に対する、ドナー５８０由来のＴ細胞中でのＳＫ０７２、ＧＣ２１３、ＧＣ２１６およびＰＢＳの効能を示す。

【図20】マウスモデルにおける転移性膵癌（ＨＳ７６６Ｔ）に対する、ドナー５９８由来のＴ細胞中でのＳＫ０７２、ＧＣ２１３、ＧＣ２１６およびＰＢＳの効能を示す。

【図21】マウスにおける膵がんモデルに対するＳＫ０７２、ＳＫ２０１、ＳＫ２０９、ＧＣ２１３、ＧＣ２５１およびＧＣ２１６の効能を示す。

【図22】細胞の活性化後の、Ｇｏｌｄ制御下でのペイロードの発現に対するラパマイシンの阻害効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

発明の詳細な説明
様々な実施形態が記載される前に、本開示の教示は、記載された特定の実施形態に限定されず、そのため、当然のことながら変わり得ることが理解されるべきである。本教示の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定的であるとは意図されないことも理解されるべきである。

【0018】

特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての専門用語および科学用語は、本開示が帰属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料も、本教示の実施または試験において使用され得るが、いくつかの例示的な方法および材料をこれより記載する。

【0019】

本明細書でおよび添付の特許請求の範囲で使用する場合、文脈が特に明確に指示しない限り、単数形「a」、「an」、および「the」は、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。特許請求の範囲は、いずれかの任意選択の要素を排除するように起草され得ることをさらに明記する。そのため、この記述は、請求項要素の列挙に関連した「単に（solely）」、「のみ（only）」等のような排他的用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行詞としての役割を果たすことが意図される。物質の濃度またはレベルに関して与えられる数値限定は、文脈が特に明確に指示しない限り、近似であることが意図される。したがって、濃度が（例えば）１０μｇと示される場合、濃度は少なくともおよそ（approximately）または約（about）１０μｇと理解されることが意図される。

【0020】

本開示を読むと当業者に明らかになるように、本明細書に記載および図示される個々の実施形態の各々は、別々の構成要素および特徴を有し、それらは、本教示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されるか、または組み合わすことができる。列挙されるいずれかの方法は、列挙される、事象の順序、または論理的に可能な他のいずれかの順序で行うことができる。

【0021】

定義
本開示に関して、本明細書の記載において使用する専門用語および科学用語は、特に具体的に定義されない限り、当業者により一般的に理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することが意図される。

【0022】

本明細書で使用する場合、「抗体」は、リガンド結合タンパク質として機能的に定義され、かつ免疫グロブリンの可変領域に由来すると当業者により認識されるアミノ酸配列を含むと構造的に定義されたタンパク質と定義される。抗体は、免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子の断片、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子（異なる動物由来の遺伝情報の組合せにより作製）、または合成免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１つまたは複数のポリペプチドからなり得る。認識されている天然免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子ならびに複数のＤセグメントおよびＪセグメントが含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、それらが次いで、それぞれ、免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを定義する。抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、様々なペプチダーゼでの消化により産生されるいくつかの十分に特徴付けられた断片として、または組換えＤＮＡ技術により作製される様々な断片として存在する。抗体は、多くの異なる種（例えば、ウサギ、ヒツジ、ラクダ、ヒト、もしくは例えばマウスもしくはラットなどのげっ歯類）に由来し得るか、または合成であり得る。抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒューマニア化（humaneered）抗体であり得る。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、多重鎖または一本鎖抗体、断片またはインタクトな免疫グロブリンであり得る。

【0023】

本明細書で使用する場合、「抗体断片」とは、インタクト抗体、またはその組換えバリアントの少なくとも１つの部分と定義され、かつ抗原などの標的に対する、抗体断片の認識および特異的結合を与えるために十分な抗原結合ドメイン、例えば、インタクト抗体の抗原性決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖抗体、ｓｄＡｂなどの単一ドメイン抗体（Ｖ_ＬまたはＶ_Ｈのいずれか）、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片とを含む融合タンパク質と定義され、ただし、軽鎖および重鎖可変領域は、短いフレキシブルポリペプチドリンカーを介して隣接して連結され、かつ一本鎖ポリペプチドとして発現可能であり、ならびにｓｃＦｖは、自身が由来するインタクト抗体の特異性を保持する。指定のない限り、本明細書で使用される場合ｓｃＦｖは、Ｖ_ＬおよびＶ_Ｈ可変領域をいずれかの順序で有し得て、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端に関して、ｓｃＦｖは、Ｖ_Ｌ－リンカー－Ｖ_Ｈを含み得るか、またはＶ_Ｈ－リンカー－Ｖ_Ｌを含み得る。

【0024】

本明細書で使用される場合、「抗原」は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答は、抗体産生、もしくは特定の免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のいずれか、またはその両方ともを含み得る。当業者は、グリコシル化ポリペプチド、リン酸化ポリペプチド、および脂質で修飾されたポリペプチドを含む他の翻訳後修飾ポリペプチドを含む、事実上すべてのタンパク質またはペプチドを含むがこれらに限定されないいずれかの巨大分子が、抗原として機能し得ることを理解するであろう。さらに、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。したがって、当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含むいずれかのＤＮＡが、その用語が本明細書で使用される場合の「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。限定されるものではないが、本発明が、２つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むこと、およびそれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するポリペプチドをコードするように様々な組合せで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によりコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は合成され得る、または生体試料に由来し得る、またはポリペプチド以外の巨大分子であり得ることは容易に明らかである。そのような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞または他の生体成分を含む流体が含まれ得るが、それらに限定されない。

【0025】

本明細書で使用する場合、用語「キメラ抗原受容体」および用語「ＣＡＲ」は交換可能に使用される。本明細書で使用する場合、「ＣＡＲ」は、抗原認識部分および細胞活性化エレメントを含む融合タンパク質と定義される。

【0026】

本明細書で使用する場合、「ＣＡＲ Ｔ細胞」または「ＣＡＲ Ｔリンパ球」は交換可能に使用され、かつ実際の発現レベルに関係なく、ＣＡＲポリペプチドを産生する能力を含有するＴ細胞と定義される。例えば、ＣＡＲを発現することができる細胞は、細胞内でＣＡＲを発現するための核酸配列を含有するＴ細胞である。

【0027】

本明細書で使用する場合、「共刺激エレメント」または「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ポリペプチド」は、共刺激ポリペプチドの細胞内部分であると定義される。共刺激ポリペプチドは、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、および活性化ナチュラルキラー細胞受容体に代表され得る。そのようなポリペプチドの例には、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、ＭｙＤ８８等が含まれる。

【0028】

本明細書で使用する場合、「Ｃ_ｍａｘ」は、細胞がポリペプチドを産生するように刺激または活性化された後に、細胞により産生されるポリペプチドの最大濃度を意味すると定義される。

【0029】

本明細書で使用する場合、「サイトカインＣ_ｍａｘ」は、サイトカインを産生するための刺激または活性化後に、免疫細胞により産生されるサイトカインの最大濃度を意味すると定義される。

【0030】

本明細書で使用する場合、「細胞傷害性ポリペプチドＣ_ｍａｘ」は、細胞傷害性ポリペプチドを産生するための刺激または活性化後に、免疫細胞により産生される細胞傷害性ポリペプチドの最大濃度を意味すると定義される。

【0031】

本明細書で使用する場合、「有効量」または「治療上有効量」は交換可能に使用され、特定の生物学的結果を達成するために有効な、本明細書に記載される化合物、製剤、材料、または組成物の量と定義される。

【0032】

本明細書で使用する場合、「エピトープ」は、免疫応答を誘発することができる、抗原の部分、または抗体に結合する、抗原の部分であると定義される。エピトープは、抗体により認識されるタンパク質配列または部分配列であり得る。

【0033】

本明細書で使用する場合、「発現ベクター」および「発現構築物」は交換可能に使用され、両方とも、細胞内でのタンパク質発現のために設計されたプラスミド、ウイルス、または他の核酸であると定義される。ベクターまたは構築物は、遺伝子を宿主細胞に導入するために使用され、これによりベクターは、細胞内のポリメラーゼと相互作用して、ベクター／構築物にコードされたタンパク質を発現することになる。発現ベクターおよび／または発現構築物は、細胞内で染色体外に存在し得るか、または染色体内に組み込まれて存在し得る。染色体内に組み込まれる場合、発現ベクターまたは発現構築物を含む核酸が、発現ベクターまたは発現構築物となるであろう。

【0034】

本明細書で使用する場合、「細胞外エレメント」は、キメラ抗原受容体の、抗原結合または認識エレメントと定義される。

【0035】

本明細書で使用する場合、「造血細胞」は、造血幹細胞から生じる細胞であると定義される。これには、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、巨核球、赤血球、肥満細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、マクロファージ、血小板、単球、ナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球および形質細胞が含まれるが、それらに限定されない。

【0036】

本明細書で使用する場合、「異種」は、核酸および／またはポリペプチドが宿主細胞に対して同種でないことを意味すると定義される。例えば、構築物が、宿主細胞内で見出されない形で配置されたいくつかの相同配列を含有する、および／または構築物が、宿主細胞内で見出されないいくつかの異種配列を含有する場合、構築物は宿主細胞に対して異種である。

【0037】

本明細書で使用する場合、「細胞内エレメント」は、真核細胞の細胞質膜の細胞質側に存在し、かつシグナルを真核細胞内へと伝達する、キメラ抗原受容体の部分と定義される。「細胞内シグナル伝達エレメント」は、特殊機能を果たすよう真核細胞に指示するエフェクター機能シグナルを伝達する、細胞内エレメントの部分である。

【0038】

本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ不安定化エレメント」または「ＲＤＥ」は交換可能に使用され、両方とも、それにタンパク質が結合し、そのタンパク質結合がＲＮＡの安定性および／または翻訳を変化させる、ＲＮＡ内の核酸配列と定義される。ＲＤＥの例には、クラスＩ ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、クラスＩＩ ＡＲＥ、クラスＩＩＩ ＡＲＥ、Ｕリッチエレメント、ＧＵリッチエレメント、およびステムループ不安定化エレメント（ＳＬＤＥ）が含まれる。理論に拘束されることは望まないが、ＲＤＥは、ＨｕＲのようなＲＮＡ安定化ポリペプチドも結合し得る。

【0039】

本明細書で使用する場合、「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、抗原結合活性において機能を有する免疫グロブリン分子と定義される。ｓｃＦｖ（一本鎖断片可変）フォーマットの抗体は、フレキシブルペプチドリンカーにより連結された、重鎖（Ｖ_Ｈ）および軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域からなる。

【0040】

本明細書で使用する場合、「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、通常は胸腺で発生する造血細胞であると定義される。Ｔリンパ球またはＴ細胞には、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、および粘膜インバリアントＴ細胞が含まれるが、それらに限定されない。

【0041】

本明細書で使用する場合、「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、外因性核酸が宿主細胞内に移入または導入されるプロセスであると定義される。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクト、形質転換または形質導入されている細胞である。該細胞には、初代対象細胞およびその子孫が含まれる。

【0042】

本明細書で使用する場合、「膜貫通エレメント」は、細胞外エレメントと細胞内エレメントとの間のエレメントと定義される。膜貫通エレメントの一部分は細胞膜内に存在する。

【0043】

抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ
キメラ抗原受容体は、配列番号１の配列を有する抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲであり得る。
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGACCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGCCCTGGAGTGGATGGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAGGAGCATGAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCAAGACCAGCACCTTCTTCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC（配列番号１）
この抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲのアミノ酸配列は、
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGDQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPLTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTFTDHAIHWVRQAPGQALEWMGHFSPGNTDIKYNDKFKGRVTLTVDRSMSTAYMELSSLRSEDTAMYYCKTSTFFFDYWGQGTMVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号２）
である。

【0044】

場合により、この抗ＴｎＭＵＣ１キメラ抗原受容体配列は、例えば、
ＧＣＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＧＣＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＧ（配列番号３）
などのシグナル配列を含む。

【0045】

この抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲを含む構築物は、ＧＣ１６０（配列番号４）、ＧＣ２１３（配列番号５）、ＧＣ２１７（配列番号６）、ＧＣ２１９（配列番号７）、ＧＣ２２３（配列番号８）、ＳＫ０６２（配列番号９）、ＳＫ１４８（配列番号１０）、ＳＫ０７２（配列番号１１）、ＧＣ２５１（配列番号１２）、ＰＤ００７（配列番号１３）、およびＰＤ００９（配列番号１４）を含み得る。
ＧＣ１６０
TCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCTCGAGGTTTAAACGGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAGCGCTAGCGCTACCGGTCGCCAAGATGGCGGCGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGCAGCGGAGAGGGTAGGGGTAGTCTTTTGACGTGTGGGGACGTCGAGGAAAATCCTGGGCCTGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGACCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGCCCTGGAGTGGATGGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAGGAGCATGAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCAAGACCAGCACCTTCTTCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGAAGAGACGTCATAATCAGCCAGCGGCCGCGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAAATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA（配列番号４）
ＧＣ２１３
TCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCTCGAGTAGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATATATTAGATATTGATAATTTTAACAAATGAGTTACTTTCCATTTGGGTACAGTCACAGTTGTCAACAATATTTGGAAGCACCAGGCATGAAATCTCCTGAGATGCTATGTTTTCATCAGGGTCACCTGACACATTCAAGTTCTGTCTGACATGCCATTAAAGCACTGGCTCAGATTGCAGGCATATTTTCAAACCGGCAGTAACTGGATAGTATCACTTCACTTATAAGTGTTCATTGTATCATCAAGTGAAATAAACACACAACCCATGGGATCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGTTGGCCCCTGAGATAAAGCCTTGTAATCACATAGCCTTGCCTAATTAGTCAGAAAACAAAGGATTAAGTGAGACAGTCACAGGATATAGGAATTATAAATAATACATATATTAATAGATATTCATTTTCATTACACAAAAGTTGCTATTATAAATACTTATTTGATTGATGAGTCTAAAAATATATTCCCCATATAAATAATGTTAAATATTAATAAATAGATTTAGATTTAAAATTCAAATATTGCAGGCAGGACAACCACCCGGGTTAACTTGCATTCAAATATGACATTACCCTATCAATTGTAACGGCCCTGATTCTAAAAGCATGCAAAAGTATACACAGCTTTATTTTTGTCTTGTAAAAATCAGGTTCTTCAAGAGAGCTTTTTTGAGGAACCGTTTCAGAATTAAAATTAAGAGCTTGCATCAGCTCATCAATAACGGCAAGCATATTCTGATCAAGGAATATCTGTCGCTTGGGGTCCATCAAAAGTTTTGCGTTCATTGTCTTGAACTCAACCTGGTACATCTTAAGATCTTCATATATAGAAGACAAGCACAGGGCCATCATAAAGCTTGTTTTGCGGCTGGCCAAACAAGATCCATTGGTAATGAAAGAAGTCTCTCTGGAATTGAGACAAGATTCGTTTTTAGTGAGTTCCAGTGGCAGGCATGCCTCCACGGTGGATGTTTTGTCCTTAGTAATATCTTCGTGGTCTATTTCCTCACTTGTGCAAGGGTAAAATTCAAGTGTTTGTCGGGCCTTCTGGAGCATGTTGGAGACAGCCCTAAGCAAGTTTTGAGAGTGGTGAAGACATGGGAACATGCCTGGGTCTGGGGTTGCAACAGGCAAGTTCCGAGAACCGCCCCCACCACCACCTGAGCATGGGACAGATGCCCATTCGCTCCAGCTAGATGAGTAGTATCTGTCTTGGGCTCTGACACTTATGCTTGCGTTCTTTCTGCAAATGACTGTTGCAGACGTTTTATCAGTGAAAACCCGATCTTTCTTTTCCCTTTTTGATTTTCCTTGCACCTGGACACAAAATGTCAAACTAAAGTAAGAGTGCGGAGTTGACCAGGTGTCGGGGTACTCCCAAGAAACTTCAACCTGGCGTGAGTTCTTCAAAGGCTTAAGCTGCAGATTCTTCGGAGGATCGGGCTTGATAATGTCCCGGATAAAAAAGCTGCTCGTGTAATTTTCATACTTCAACTTGTGTACGGCGTCAACCATCACCTCTATTGGCAGGCTCTCCTCTGCTGCGGGGCAAGCGGAGTCTTCCTGGCATTCCACGCTATATTCGTATTCTTTGTTGTCCCCCCGTACCCTCTCCGCAGAAAGCGTAGCAGCACCGCACGTTACACCTTGTGGGTCACTGGAACCCCTACTAGACTTAACAGAAAACGTAAGATCCGTAGAGATTGTTGTCAACCACCAGCAAGTAAAGCGTCCGGAGTAATTTTTTGCTTCACAGCGCAGAAACGTTTTGTTTTTGGGTTCTTTCTGATCCTTAAGGATATCTGTACTCCAAATGCCATCCTCTTTTTTGTGCAGGAGCAGCAGGCTGTGAGAAAGGACCTCGCCTCCCTTATGGCACGTATACTGCCCGGCATCTCCAAACTCTTTTACCTGGATAGTAAGTGTTTTGCCGCTGCCAAGCACCTCTGAGCTTTGGTCCAGGGTCCAGGTTATCCCATCTTCTTCAGGTGTATCGCAGGTGAGGACCACCATCTCGCCCGGTGCGTCGGGATACCAATCCAATTCAACAACATATACGTCTTTCTTAAGTTCCCAAATAGCGACCAATGGTGACGCCAGAAAAACAAGTGAGAACCAAGAGATTACCAGTTGTTGATGGCACATGGTGGGAATTCCTGGAATTCGAGCTTCCATTATATACCCTCTAGAGTCTAGATCTACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCGTTTAAACGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTAGCTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACGCTAGCGCTACCGGTCGCCAAGATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCAATGGATGGTCCGCGTCTACTGCTGTTACTACTTCTGGGTGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAAGAGGCATGCCCCACAGGTCTATACACACATAGCGGTGAATGCTGCAAAGCATGCAACCTGGGCGAAGGTGTGGCCCAACCTTGTGGAGCCAATCAAACCGTTTGTGAGCCATGTCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGATGTTGTTAGCGCGACCGAGCCATGCAAACCGTGTACCGAGTGTGTTGGTCTCCAAAGTATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGTCGCTGTGCCTACGGTTATTACCAGGATGAAACTACTGGTCGCTGTGAAGCGTGCCGCGTGTGTGAGGCGGGCTCAGGCCTCGTGTTCTCCTGTCAGGACAAACAGAACACTGTGTGTGAAGAATGCCCCGACGGTACTTATTCCGACGAGGCCAACCATGTGGACCCGTGTCTGCCCTGCACCGTTTGCGAGGATACCGA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ＧＣ２１７
TCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCTCGAGTAGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATATATTAGATATTGATAATTTTAACAAATGAGTTACTTTCCATTTGGGTACAGTCACAGTTGTCAACAATATTTGGAAGCACCAGGCATGAAATCTCCTGAGATGCTATGTTTTCATCAGGGTCACCTGACACATTCAAGTTCTGTCTGACATGCCATTAAAGCACTGGCTCAGATTGCAGGCATATTTTCAAACCGGCAGTAACTGGATAGTATCACTTCACTTATAAGTGTTCATTGTATCATCAAGTGAAATAAACACACAACCCATGGGATCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGTTGGCCCCTGAGATAAAGCCTTGTAATCACATAGCCTTGCCTAATTAGTCAGAAAACAAAGGATTAAGTGAGACAGTCACAGGATATAGGAATTATAAATAATACATATATTAATAGATATTCATTTTCATTACACAAAAGTTGCTATTATAAATACTTATTTGATTGATGAGTCTAAAAATATATTCCCCATATAAATAATGTTAAATATTAATAAATAGATTTAGATTTAAAATTCAAATATTGCAGGCAGGACAACCACCCGGGTCACACGCGGTAGCAGTAGAAGATGATGATGACGGAGATGGCCACGCCCAGGGGGGGCAGGAGGCTGATGCCGGTCACCTGGAAGATGACCAGCAACAAGTCGGGGTTGCTGGTGTTGTACTCCTCGGAGAAGATGATGTTGTCGTTGCACTCGTCGGAGCTGCAGGAGCACATGAAGAAGGTCTCGCCGGGCTTCTTCTTCTCCTTCATGATGCACTTGGGGGAGGCGGCGTCCTCCAGGATGAAGTCGTGGTAGGGGAGCTTGGGGTCGTGGCACACGGTCTCCAGGGTGATGTTCTCGTCGTTCTTCCTCCACACGGCCACGCAGACCTCCTGGGGCTTCTCGCAGATGGAGGTGATGCTGCAGTTGCTCATGCAGGACTTCTGGTTGTCGCAGGTGGAGAACCTCACGTCGCAGAACTTGCACAGCTGGGGGAACTTGACGGCGCCGTTGTTGTCGGTGACGATCATGTCGTTGTTCACCGACTTCTGCACGTGCGGGGGGATCGTGCTGGCGATCCGCGTCCACAGGACGATGTGCAGCGGCCACAGGCCCCTGAGCAGCCCCCGGCCCATGGTGGGAATTCCTGGAATTCGAGCTTCCATTATATACCCTCTAGAGTCTAGATCTACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCGTTTAAACGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTAGCTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACGCTAGCGCTACCGGTCGCCAAGATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCAATGGATGGTCCGCGTCTACTGCTGTTACTACTTCTGGGTGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAAGAGGCATGCCCCACAGGTCTATACACACATAGCGGTGAATGCTGCAAAGCATGCAACCTGGGCGAAGGTGTGGCCCAACCTTGTGGAGCCAATCAAACCGTTTGTGAGCCATGTCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGATGTTGTTAGCGCGACCGAGCCATGCAAACCGTGTACCGAGTGTGTTGGTCTCCAAAGTATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGTCGCTGTGCCTACGGTTATTACCAGGATGAAACTACTGGTCGCTGTGAAGCGTGCCGCGTGTGTGAGGCGGGCTCAGGCCTCGTGTTCTCCTGTCAGGACAAACAGAACACTGTGTGTGAAGAATGCCCCGACGGTACTTATTCCGACGAGGCCAACCATGTGGACCCGTGTCTGCCCTGCACCGTTTGCGAGGATACCGAGCGCCAGCTACGTGAGTGCACACGTTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAAATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCACCAGAAGGCTCGGACAGCACAGCACCCAGCACTCAGGAACCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTAATAGCCAGCACTGTGGCAGGTGTTGTGACTACAGTGATGGGTAGCTCACAACCCGTTGTTACTCGAGGCACCACCGACAATCTAATTCCTGTCTATTGTTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGTCTTGTTGCATATATAGCCTTCAAGAGGGGCAGCGGAGAGGGTAGGGGTAGTCTTTTGACGTGTGGGGACGTCGAGGAAAATCCTGGGCCTGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGACCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGCCCTGGAGTGGATGGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCCTGACCGT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ＧＣ２１９
TCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCTCGAGTAGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATATATTAGATATTGATAATTTTAACAAATGAGTTACTTTCCATTTGGGTACAGTCACAGTTGTCAACAATATTTGGAAGCACCAGGCATGAAATCTCCTGAGATGCTATGTTTTCATCAGGGTCACCTGACACATTCAAGTTCTGTCTGACATGCCATTAAAGCACTGGCTCAGATTGCAGGCATATTTTCAAACCGGCAGTAACTGGATAGTATCACTTCACTTATAAGTGTTCATTGTATCATCAAGTGAAATAAACACACAACCCATGGGATCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGTTGGCCCCTGAGATAAAGCCTTGTAATCACATAGCCTTGCCTAATTAGTCAGAAAACAAAGGATTAAGTGAGACAGTCACAGGATATAGGAATTATAAATAATACATATATTAATAGATATTCATTTTCATTACACAAAAGTTGCTATTATAAATACTTATTTGATTGATGAGTCTAAAAATATATTCCCCATATAAATAATGTTAAATATTAATAAATAGATTTAGATTTAAAATTCAAATATTGCAGGCAGGACAACCACCCGGGCTAGTCCTCGTTCTGCACGGTGAACATGATGGACCTGTCCCCCAACTCGTCCTCCTTCTTCAAGATGAGCTTGAACAGGTCCCTCTCCTTCTCGCAGGCCAGGAAGTAGCCCTCGTAGGAGGAGGACTCGAACTGCATCTTGTTGTCGTGGCCGGGGACGCTCCTCTGGAAGAAGATGATGTCGCTCTTGGTGTCCTTGATGTTGTCGGGGGGGTTCATCTCCTTGAAGGAGATGATCTTGTTCTCGCAGGAGAGGGTGGAGATCTTCTCGCACTTCACGGAGATGGTCACGGCCTTGCCCCTGGCCCTGCTGTCGCCGTAGGCGCTGATGATGAAGATGGTCCGGGGGGCGTTGTCCCTGCAGTCGGAGTCGGTCATGTCCTCGAACAGGGGCCGGTTGCCCTGGTCGATGAAGAGCACCTGGTCGTTCAAGTTCCTGATGACGGACAACTTGGACTCCAGCTTGCCGAAGTAGTCGGACTCCAGGTTCTCGTCGTCCTCGGCGATGAAGTACAGCGTGTTGTCGATGAACTTCATGGCCACGAAGTTGATGCAGTTGTCCTCCACGGGCTCGGCGGCCATGGTGGGAATTCCTGGAATTCGAGCTTCCATTATATACCCTCTAGAGTCTAGATCTACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCGTTTAAACGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTAGCTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACGCTAGCGCTACCGGTCGCCAAGATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCAATGGATGGTCCGCGTCTACTGCTGTTACTACTTCTGGGTGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAAGAGGCATGCCCCACAGGTCTATACACACATAGCGGTGAATGCTGCAAAGCATGCAACCTGGGCGAAGGTGTGGCCCAACCTTGTGGAGCCAATCAAACCGTTTGTGAGCCATGTCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGATGTTGTTAGCGCGACCGAGCCATGCAAACCGTGTACCGAGTGTGTTGGTCTCCAAAGTATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGTCGCTGTGCCTACGGTTATTACCAGGATGAAACTACTGGTCGCTGTGAAGCGTGCCGCGTGTGTGAGGCGGGCTCAGGCCTCGTGTTCTCCTGTCAGGACAAACAGAACACTGTGTGTGAAGAATGCCCCGACGGTACTTATTCCGACGAGGCCAACCATGTGGACCCGTGTCTGCCCTGCACCGTTTGCGAGGATACCGAGCGCCAGCTACGTGAGTGCACACGTTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAAATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCACCAGAAGGCTCGGACAGCACAGCACCCAGCACTCAGGAACCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTAATAGCCAGCACTGTGGCAGGTGTTGTGACTACAGTGATGGGTAGCTCACAACCCGTTGTTACTCGAGGCACCACCGACAATCTAATTCCTGTCTATTGTTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGTCTTGTTGCATATATAGCCTTCAAGAGGGGCAGCGGAGAGGGTAGGGGTAGTCTTTTGACGTGTGGGGACGTCGAGGAAAATCCTGGGCCTGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGACCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGCCCTGGAGTGGATGGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCCT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ＧＣ２２３
TCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCTCGAGTAGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATATATTAGATATTGATAATTTTAACAAATGAGTTACTTTCCATTTGGGTACAGTCACAGTTGTCAACAATATTTGGAAGCACCAGGCATGAAATCTCCTGAGATGCTATGTTTTCATCAGGGTCACCTGACACATTCAAGTTCTGTCTGACATGCCATTAAAGCACTGGCTCAGATTGCAGGCATATTTTCAAACCGGCAGTAACTGGATAGTATCACTTCACTTATAAGTGTTCATTGTATCATCAAGTGAAATAAACACACAACCCATGGGATCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGTTGGCCCCTGAGATAAAGCCTTGTAATCACATAGCCTTGCCTAATTAGTCAGAAAACAAAGGATTAAGTGAGACAGTCACAGGATATAGGAATTATAAATAATACATATATTAATAGATATTCATTTTCATTACACAAAAGTTGCTATTATAAATACTTATTTGATTGATGAGTCTAAAAATATATTCCCCATATAAATAATGTTAAATATTAATAAATAGATTTAGATTTAAAATTCAAATATTGCAGGCAGGACAACCACCCGGGTCAGGTCAGGGTGGAGATGATGCTCTGGCAGAAGGTGATCCACCTGTTCAGGAACTCCACGATGGTGGCGGTCTCGTCGGCGTACTCGCACATGAAGGTGGTCTCGGAGCCCTTCAGCTCCAGCACGATCACGTTGATGTTGCTGATCAGGTCCCTGGGCCTCAGGTGGAAGTTCTTGCTCTGGGCCAGGTTCAGCACCTCCTCCAGGGGCTTCAGCTCCTCCTCCAGGCACTGCAGGTGCTTCAGCTCGGTGGCCTTCTTGGGCATGTAGAACTTGAAGGTCAGCATCCTGGTCAGCTTGGGGTTCTTGTAGTTGTTGATGCCGTTCAGGATCATCTGCAGGTCCAGCAGCAGGTGCTCCAGCTGCAGCTGGGTCTTCTTGGTGGAGCTGGAGGTGGGGGCGCTGTTGGTCACCAGGGCCAGGCTCAGGGCGATGCAGGACAGCAGCTGCATCCGGTACATGGTGGGAATTCCTGGAATTCGAGCTTCCATTATATACCCTCTAGAGTCTAGATCTACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCGTTTAAACGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTAGCTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACGCTAGCGCTACCGGTCGCCAAGATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCAATGGATGGTCCGCGTCTACTGCTGTTACTACTTCTGGGTGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAAGAGGCATGCCCCACAGGTCTATACACACATAGCGGTGAATGCTGCAAAGCATGCAACCTGGGCGAAGGTGTGGCCCAACCTTGTGGAGCCAATCAAACCGTTTGTGAGCCATGTCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGATGTTGTTAGCGCGACCGAGCCATGCAAACCGTGTACCGAGTGTGTTGGTCTCCAAAGTATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGTCGCTGTGCCTACGGTTATTACCAGGATGAAACTACTGGTCGCTGTGAAGCGTGCCGCGTGTGTGAGGCGGGCTCAGGCCTCGTGTTCTCCTGTCAGGACAAACAGAACACTGTGTGTGAAGAATGCCCCGACGGTACTTATTCCGACGAGGCCAACCATGTGGACCCGTGTCTGCCCTGCACCGTTTGCGAGGATACCGAGCGCCAGCTACGTGAGTGCACACGTTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAAATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCACCAGAAGGCTCGGACAGCACAGCACCCAGCACTCAGGAACCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTAATAGCCAGCACTGTGGCAGGTGTTGTGACTACAGTGATGGGTAGCTCACAACCCGTTGTTACTCGAGGCACCACCGACAATCTAATTCCTGTCTATTGTTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGTCTTGTTGCATATATAGCCTTCAAGAGGGGCAGCGGAGAGGGTAGGGGTAGTCTTTTGACGTGTGGGGACGTCGAGGAAAATCCTGGGCCTGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGACCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGCCCTGGAGTGGATGGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAGGAGCATGAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCAAGACCAGCACCTTCTTCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCAC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ＳＫ０６２
TCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCTCGAGTAGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATATATTAGATATTGATAATTTTAACAAATGAGTTACTTTCCATTTGGGTACAGTCACAGTTGTCAACAATATTTGGAAGCACCAGGCATGAAATCTCCTGAGATGCTATGTTTTCATCAGGGTCACCTGACACATTCAAGTTCTGTCTGACATGCCATTAAAGCACTGGCTCAGATTGCAGGCATATTTTCAAACCGGCAGTAACTGGATAGTATCACTTCACTTATAAGTGTTCATTGTATCATCAAGTGAAATAAACACACAACCCATGGGATCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGTTGGCCCCTGAGATAAAGCCTTGTAATCACATAGCCTTGCCTAATTAGTCAGAAAACAAAGGATTAAGTGAGACAGTCACAGGATATAGGAATTATAAATAATACATATATTAATAGATATTCATTTTCATTACACAAAAGTTGCTATTATAAATACTTATTTGATTGATGAGTCTAAAAATATATTCCCCATATAAATAATGTTAAATATTAATAAATAGATTTAGATTTAAAATTCAAATATTGCAGGCAGGACAACCACCCGGGTCACGCCAGAATGCGTTCGCACAGCCGCCAGCCGGTCACTCCGTTGATGGTTACTCGGAACAGCAGGGAGCCGTCGGGGTTGATCAGGCGCTCGTCGATAATTTTGTTGCCGTTCCACAGGGTCCCTGTTACAGTGATCTTTTTGCCGTCGAACACGGCGATGCCTTCATACGGCCGTCCGAAATAGTCGATCATGTTCGGCGTAACCCCGTCGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACCTTAAAGTGATGATCATCCACAGGGTACACCACCTTAAAAATTTTTTCGATCTGGCCCATTTGGTCGCCGCTCAGACCTTCATACGGGATGATGACATGGATGTCGATCTTCAGCCCATTTTCACCGCTCAGGACAATCCTTTGGATCGGAGTTACGGACACCCCGAGATTCTGAAACAAACTGGACACACCTCCCTGTTCAAGGACTTGGTCCAGGTTGTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCCCCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACTGGGGCAGGGAAGGCAGCAGGCAACACCAGGAGCAGGCCCAGGGAGAAGGCAACTGGACCGAAGGCGCTTGTGGAGAAGGAGTTCATGGTGGGAATTCCTGGAATTCGAGCTTCCATTATATACCCTCTAGAGTCTAGATCTACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCGTTTAAACGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTAGCTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACGCTAGCGCTACCGGTCGCCAAGATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCCATGGACGGGCCGCGCCTGCTGCTGTTGCTGCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAGAGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTCATAGCCAGCACGGTGGCAGGTGTGGTGACCACAGTGATGGGCAGCTCCCAGCCCGTGGTGACCCGAGGCACCACCGACAACCTCATCCCTGTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGTCTTGTGGCCTACATAGCCTTCAAGAGGGGCAGCGGAGAGGGTAGGGGTAGTCTTTTGACGTGTGGGGACGTCGAGGAAAATCCTGGGCCTGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGACCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGCCCTGGAGTGGATGGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTT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ＳＫ０１４８
TCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCTCGAGTAGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATATATTAGATATTGATAATTTTAACAAATGAGTTACTTTCCATTTGGGTACAGTCACAGTTGTCAACAATATTTGGAAGCACCAGGCATGAAATCTCCTGAGATGCTATGTTTTCATCAGGGTCACCTGACACATTCAAGTTCTGTCTGACATGCCATTAAAGCACTGGCTCAGATTGCAGGCATATTTTCAAACCGGCAGTAACTGGATAGTATCACTTCACTTATAAGTGTTCATTGTATCATCAAGTGAAATAAACACACAACCCATGGGATCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGTTGGCCCCTGAGATAAAGCCTTGTAATCACATAGCCTTGCCTAATTAGTCAGAAAACAAAGGATTAAGTGAGACAGTCACAGGATATAGGAATTATAAATAATACATATATTAATAGATATTCATTTTCATTACACAAAAGTTGCTATTATAAATACTTATTTGATTGATGAGTCTAAAAATATATTCCCCATATAAATAATGTTAAATATTAATAAATAGATTTAGATTTAAAATTCAAATATTGCAGGCAGGACAACCACCCGGGTTAACTTGCATTCAAATATGACATTACCCTATCAATTGTAACGGCCCTGATTCTAAAAGCATGCAAAAGTATACACAGCTTTATTTTTGTCTTGTAAAAATCAGGTTCTTCAAGAGAGCTTTTTTGAGGAACCGTTTCAGAATTAAAATTAAGAGCTTGCATCAGCTCATCAATAACGGCAAGCATATTCTGATCAAGGAATATCTGTCGCTTGGGGTCCATCAAAAGTTTTGCGTTCATTGTCTTGAACTCAACCTGGTACATCTTAAGATCTTCATATATAGAAGACAAGCACAGGGCCATCATAAAGCTTGTTTTGCGGCTGGCCAAACAAGATCCATTGGTAATGAAAGAAGTCTCTCTGGAATTGAGACAAGATTCGTTTTTAGTGAGTTCCAGTGGCAGGCATGCCTCCACGGTGGATGTTTTGTCCTTAGTAATATCTTCGTGGTCTATTTCCTCACTTGTGCAAGGGTAAAATTCAAGTGTTTGTCGGGCCTTCTGGAGCATGTTGGAGACAGCCCTAAGCAAGTTTTGAGAGTGGTGAAGACATGGGAACATGCCTGGGTCTGGGGTTGCAACAGGCAAGTTCCGAGAACCGCCCCCACCACCACCTGAGCATGGGACAGATGCCCATTCGCTCCAGCTAGATGAGTAGTATCTGTCTTGGGCTCTGACACTTATGCTTGCGTTCTTTCTGCAAATGACTGTTGCAGACGTTTTATCAGTGAAAACCCGATCTTTCTTTTCCCTTTTTGATTTTCCTTGCACCTGGACACAAAATGTCAAACTAAAGTAAGAGTGCGGAGTTGACCAGGTGTCGGGGTACTCCCAAGAAACTTCAACCTGGCGTGAGTTCTTCAAAGGCTTAAGCTGCAGATTCTTCGGAGGATCGGGCTTGATAATGTCCCGGATAAAAAAGCTGCTCGTGTAATTTTCATACTTCAACTTGTGTACGGCGTCAACCATCACCTCTATTGGCAGGCTCTCCTCTGCTGCGGGGCAAGCGGAGTCTTCCTGGCATTCCACGCTATATTCGTATTCTTTGTTGTCCCCCCGTACCCTCTCCGCAGAAAGCGTAGCAGCACCGCACGTTACACCTTGTGGGTCACTGGAACCCCTACTAGACTTAACAGAAAACGTAAGATCCGTAGAGATTGTTGTCAACCACCAGCAAGTAAAGCGTCCGGAGTAATTTTTTGCTTCACAGCGCAGAAACGTTTTGTTTTTGGGTTCTTTCTGATCCTTAAGGATATCTGTACTCCAAATGCCATCCTCTTTTTTGTGCAGGAGCAGCAGGCTGTGAGAAAGGACCTCGCCTCCCTTATGGCACGTATACTGCCCGGCATCTCCAAACTCTTTTACCTGGATAGTAAGTGTTTTGCCGCTGCCAAGCACCTCTGAGCTTTGGTCCAGGGTCCAGGTTATCCCATCTTCTTCAGGTGTATCGCAGGTGAGGACCACCATCTCGCCCGGTGCGTCGGGATACCAATCCAATTCAACAACATATACGTCTTTCTTAAGTTCCCAAATAGCGACCAATGGTGACGCCAGAAAAACAAGTGAGAACCAAGAGATTACCAGTTGTTGATGGCACATGGTGGGAATTCCTGGAATTCGAGCTTCCATTATATACCCTCTAGAGTCTAGATCTACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCGTTTAAACGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTAGCTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACGCTAGCGCTACCGGTCGCCAAGATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCCATGGACGGGCCGCGCCTGCTGCTGTTGCTGCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGA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ＳＫ０７２
ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCTCGAGTAGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATATATTAGATATTGATAATTTTAACAAATGAGTTACTTTCCATTTGGGTACAGTCACAGTTGTCAACAATATTTGGAAGCACCAGGCATGAAATCTCCTGAGATGCTATGTTTTCATCAGGGTCACCTGACACATTCAAGTTCTGTCTGACATGCCATTAAAGCACTGGCTCAGATTGCAGGCATATTTTCAAACCGGCAGTAACTGGATAGTATCACTTCACTTATAAGTGTTCATTGTATCATCAAGTGAAATAAACACACAACCCATGGGATCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGTTGGCCCCTGAGATAAAGCCTTGTAATCACATAGCCTTGCCTAATTAGTCAGAAAACAAAGGATTAAGTGAGACAGTCACAGGATATAGGAATTATAAATAATACATATATTAATAGATATTCATTTTCATTACACAAAAGTTGCTATTATAAATACTTATTTGATTGATGAGTCTAAAAATATATTCCCCATATAAATAATGTTAAATATTAATAAATAGATTTAGATTTAAAATTCAAATATTGCAGGCAGGACAACCACCCGGGTCACGCCAGAATGCGTTCGCACAGCCGCCAGCCGGTCACTCCGTTGATGGTTACTCGGAACAGCAGGGAGCCGTCGGGGTTGATCAGGCGCTCGTCGATAATTTTGTTGCCGTTCCACAGGGTCCCTGTTACAGTGATCTTTTTGCCGTCGAACACGGCGATGCCTTCATACGGCCGTCCGAAATAGTCGATCATGTTCGGCGTAACCCCGTCGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACCTTAAAGTGATGATCATCCACAGGGTACACCACCTTAAAAATTTTTTCGATCTGGCCCATTTGGTCGCCGCTCAGACCTTCATACGGGATGATGACATGGATGTCGATCTTCAGCCCATTTTCACCGCTCAGGACAATCCTTTGGATCGGAGTTACGGACACCCCGAGATTCTGAAACAAACTGGACACACCTCCCTGTTCAAGGACTTGGTCCAGGTTGTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCCCCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACTGGGGCAGGGAAGGCAGCAGGCAACACCAGGAGCAGGCCCAGGGAGAAGGCAACTGGACCGAAGGCGCTTGTGGAGAAGGAGTTCATGGTGGGAATTCCTGGAATTCGAGCTTCCATTATATACCCTCTAGAGTCTAGATCTACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCGTTTAAACGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTAGCTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACGCTAGCGCTACCGGTCGCCAAGATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCAATGGATGGTCCGCGTCTACTGCTGTTACTACTTCTGGGTGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAAGAGGCATGCCCCACAGGTCTATACACACATAGCGGTGAATGCTGCAAAGCATGCAACCTGGGCGAAGGTGTGGCCCAACCTTGTGGAGCCAATCAAACCGTTTGTGAGCCATGTCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGATGTTGTTAGCGCGACCGAGCCATGCAAACCGTGTACCGAGTGTGTTGGTCTCCAAAGTATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGTCGCTGTGCCTACGGTTATTACCAGGATGAAACTACTGGTCGCTGTGAAGCGTGCCGCGTGTGTGAGGCGGGCTCAGGCCTCGTGTTCTCCTGTCAGGACAAACAGAACACTGTGTGTGAAGAATGCCCCGACGGTACTTATTCCGACGAGGCCAACCATGTGGACCCGTGTCTGCCCTGCACCGTTTGCGAGGATACCGAGCGCCAGCTACGTGAGTGCACACGTTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAAATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCACCAGAAGGCTCGGACAGCACAGCACCCAGCACTCAGGAACCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTAATAGCCAGCACTGTGGCAGGTGTTGTGACTACAGTGATGGGTAGCTCACAACCCGTTGTTACTCGAGGCACCACCGACAATCTAATTCCTGTCTATTGTTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGTCTTGTTGCATATATAGCCTTCAAGAGGGGCAGCGGAGAGGGTAGGGGTAGTCTTTTGACGTGTGGGGACGTCGAGGAAAATCCTGGGCCTGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGAT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GCCAAGCTG（配列番号１１）
ＧＣ２５１
ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCTCGAGTAGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATATATTAGATATTGATAATTTTAACAAATGAGTTACTTTCCATTTGGGTACAGTCACAGTTGTCAACAATATTTGGAAGCACCAGGCATGAAATCTCCTGAGATGCTATGTTTTCATCAGGGTCACCTGACACATTCAAGTTCTGTCTGACATGCCATTAAAGCACTGGCTCAGATTGCAGGCATATTTTCAAACCGGCAGTAACTGGATAGTATCACTTCACTTATAAGTGTTCATTGTATCATCAAGTGAAATAAACACACAACCCATGGGATCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGTTGGCCCCTGAGATAAAGCCTTGTAATCACATAGCCTTGCCTAATTAGTCAGAAAACAAAGGATTAAGTGAGACAGTCACAGGATATAGGAATTATAAATAATACATATATTAATAGATATTCATTTTCATTACACAAAAGTTGCTATTATAAATACTTATTTGATTGATGAGTCTAAAAATATATTCCCCATATAAATAATGTTAAATATTAATAAATAGATTTAGATTTAAAATTCAAATATTGCAGGCAGGACAACCACCCGGGTTAACTTGCATTCAAATATGACATTACCCTATCAATTGTAACGGCCCTGATTCTAAAAGCATGCAAAAGTATACACAGCTTTATTTTTGTCTTGTAAAAATCAGGTTCTTCAAGAGAGCTTTTTTGAGGAACCGTTTCAGAATTAAAATTAAGAGCTTGCATCAGCTCATCAATAACGGCAAGCATATTCTGATCAAGGAATATCTGTCGCTTGGGGTCCATCAAAAGTTTTGCGTTCATTGTCTTGAACTCAACCTGGTACATCTTAAGATCTTCATATATAGAAGACAAGCACAGGGCCATCATAAAGCTTGTTTTGCGGCTGGCCAAACAAGATCCATTGGTAATGAAAGAAGTCTCTCTGGAATTGAGACAAGATTCGTTTTTAGTGAGTTCCAGTGGCAGGCATGCCTCCACGGTGGATGTTTTGTCCTTAGTAATATCTTCGTGGTCTATTTCCTCACTTGTGCAAGGGTAAAATTCAAGTGTTTGTCGGGCCTTCTGGAGCATGTTGGAGACAGCCCTAAGCAAGTTTTGAGAGTGGTGAAGACATGGGAACATGCCTGGGTCTGGGGTTGCAACAGGCAAGTTCCGAGAACCGCCCCCACCACCACCTGAGCATGGGACAGATGCCCATTCGCTCCAGCTAGATGAGTAGTATCTGTCTTGGGCTCTGACACTTATGCTTGCGTTCTTTCTGCAAATGACTGTTGCAGACGTTTTATCAGTGAAAACCCGATCTTTCTTTTCCCTTTTTGATTTTCCTTGCACCTGGACACAAAATGTCAAACTAAAGTAAGAGTGCGGAGTTGACCAGGTGTCGGGGTACTCCCAAGAAACTTCAACCTGGCGTGAGTTCTTCAAAGGCTTAAGCTGCAGATTCTTCGGAGGATCGGGCTTGATAATGTCCCGGATAAAAAAGCTGCTCGTGTAATTTTCATACTTCAACTTGTGTACGGCGTCAACCATCACCTCTATTGGCAGGCTCTCCTCTGCTGCGGGGCAAGCGGAGTCTTCCTGGCATTCCACGCTATATTCGTATTCTTTGTTGTCCCCCCGTACCCTCTCCGCAGAAAGCGTAGCAGCACCGCACGTTACACCTTGTGGGTCACTGGAACCCCTACTAGACTTAACAGAAAACGTAAGATCCGTAGAGATTGTTGTCAACCACCAGCAAGTAAAGCGTCCGGAGTAATTTTTTGCTTCACAGCGCAGAAACGTTTTGTTTTTGGGTTCTTTCTGATCCTTAAGGATATCTGTACTCCAAATGCCATCCTCTTTTTTGTGCAGGAGCAGCAGGCTGTGAGAAAGGACCTCGCCTCCCTTATGGCACGTATACTGCCCGGCATCTCCAAACTCTTTTACCTGGATAGTAAGTGTTTTGCCGCTGCCAAGCACCTCTGAGCTTTGGTCCAGGGTCCAGGTTATCCCATCTTCTTCAGGTGTATCGCAGGTGAGGACCACCATCTCGCCCGGTGCGTCGGGATACCAATCCAATTCAACAACATATACGTCTTTCTTAAGTTCCCAAATAGCGACCAATGGTGACGCCAGAAAAACAAGTGAGAACCAAGAGATTACCAGTTGTTGATGGCACATGGTGGGAATTCGGCTGTCCCAGCACCTCAGCGCAGAGCAAGTGGTGGTCAGGGGAGCGTCTCAAATCCTGCGCAGCCCAACGTCCGGCGCCGCCAAGTGACGCACGAGGTGCTGTGACTCGTGCCAGCCCCCTAATCTGCGGAAGTGGAGTGCGGGGAGTGCGCCGGAAGAGGGGTACGGAAGTGCGCCGGAAGTGGGGTGCGGAGGTGTGCAGCGCGCTGTCAGACTGGCTCGCAGGCGGCGCGGCCGGCGGACCCGTTCGAGACAGCGCGGGCGGCTCGGGTCCCCTGGGGCTCCGCAGCAGGAGGACGCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCAAGATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCCATGGACGGGCCGCGCCTGCTGCTGTTGCTGCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGC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GCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTG（配列番号１２）
ＰＤ００７
GCGATCGCAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTGGCTCCCGATCGTTGCGTTACACACACAATTACTGCTGATCGAGTGTAGCCTTCGAACTCGAGTAGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATATATTAGATATTGATAATTTTAACAAATGAGTTACTTTCCATTTGGGTACAGTCACAGTTGTCAACAATATTTGGAAGCACCAGGCATGAAATCTCCTGAGATGCTATGTTTTCATCAGGGTCACCTGACACATTCAAGTTCTGTCTGACATGCCATTAAAGCACTGGCTCAGATTGCAGGCATATTTTCAAACCGGCAGTAACTGGATAGTATCACTTCACTTATAAGTGTTCATTGTATCATCAAGTGAAATAAACACACAACCCATGGGATCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGTTGGCCCCTGAGATAAAGCCTTGTAATCACATAGCCTTGCCTAATTAGTCAGAAAACAAAGGATTAAGTGAGACAGTCACAGGATATAGGAATTATAAATAATACATATATTAATAGATATTCATTTTCATTACACAAAAGTTGCTATTATAAATACTTATTTGATTGATGAGTCTAAAAATATATTCCCCATATAAATAATGTTAAATATTAATAAATAGATTTAGATTTAAAATTCAAATATTGCAGGCAGGACAACCACCCGGGTTAACTTGCATTCAAATATGACATTACCCTATCAATTGTAACGGCCCTGATTCTAAAAGCATGCAAAAGTATACACAGCTTTATTTTTGTCTTGTAAAAATCAGGTTCTTCAAGAGAGCTTTTTTGAGGAACCGTTTCAGAATTAAAATTAAGAGCTTGCATCAGCTCATCAATAACGGCAAGCATATTCTGATCAAGGAATATCTGTCGCTTGGGGTCCATCAAAAGTTTTGCGTTCATTGTCTTGAACTCAACCTGGTACATCTTAAGATCTTCATATATAGAAGACAAGCACAGGGCCATCATAAAGCTTGTTTTGCGGCTGGCCAAACAAGATCCATTGGTAATGAAAGAAGTCTCTCTGGAATTGAGACAAGATTCGTTTTTAGTGAGTTCCAGTGGCAGGCATGCCTCCACGGTGGATGTTTTGTCCTTAGTAATATCTTCGTGGTCTATTTCCTCACTTGTGCAAGGGTAAAATTCAAGTGTTTGTCGGGCCTTCTGGAGCATGTTGGAGACAGCCCTAAGCAAGTTTTGAGAGTGGTGAAGACATGGGAACATGCCTGGGTCTGGGGTTGCAACAGGCAAGTTCCGAGAACCGCCCCCACCACCACCTGAGCATGGGACAGATGCCCATTCGCTCCAGCTAGATGAGTAGTATCTGTCTTGGGCTCTGACACTTATGCTTGCGTTCTTTCTGCAAATGACTGTTGCAGACGTTTTATCAGTGAAAACCCGATCTTTCTTTTCCCTTTTTGATTTTCCTTGCACCTGGACACAAAATGTCAAACTAAAGTAAGAGTGCGGAGTTGACCAGGTGTCGGGGTACTCCCAAGAAACTTCAACCTGGCGTGAGTTCTTCAAAGGCTTAAGCTGCAGATTCTTCGGAGGATCGGGCTTGATAATGTCCCGGATAAAAAAGCTGCTCGTGTAATTTTCATACTTCAACTTGTGTACGGCGTCAACCATCACCTCTATTGGCAGGCTCTCCTCTGCTGCGGGGCAAGCGGAGTCTTCCTGGCATTCCACGCTATATTCGTATTCTTTGTTGTCCCCCCGTACCCTCTCCGCAGAAAGCGTAGCAGCACCGCACGTTACACCTTGTGGGTCACTGGAACCCCTACTAGACTTAACAGAAAACGTAAGATCCGTAGAGATTGTTGTCAACCACCAGCAAGTAAAGCGTCCGGAGTAATTTTTTGCTTCACAGCGCAGAAACGTTTTGTTTTTGGGTTCTTTCTGATCCTTAAGGATATCTGTACTCCAAATGCCATCCTCTTTTTTGTGCAGGAGCAGCAGGCTGTGAGAAAGGACCTCGCCTCCCTTATGGCACGTATACTGCCCGGCATCTCCAAACTCTTTTACCTGGATAGTAAGTGTTTTGCCGCTGCCAAGCACCTCTGAGCTTTGGTCCAGGGTCCAGGTTATCCCATCTTCTTCAGGTGTATCGCAGGTGAGGACCACCATCTCGCCCGGTGCGTCGGGATACCAATCCAATTCAACAACATATACGTCTTTCTTAAGTTCCCAAATAGCGACCAATGGTGACGCCAGAAAAACAAGTGAGAACCAAGAGATTACCAGTTGTTGATGGCACATGGTGGGAATTCCTGGAATTCGAGCTTCCATTATATACCCTCTAGAGTCTAGATCTACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCGTTTAAACGTAAGTCATTGGTCTTAAAGGTAGCTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGGATCAAGGTTAGGAACAGAGAGACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGTTGGAACAGCAGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCCGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGG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GCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGACCGATTCTAGGTGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAAGGTCGTTTAAAC（配列番号１３）
ＰＤ００９
GCGATCGCAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTGGCTCCCGATCGTTGCGTTACACACACAATTACTGCTGATCGAGTGTAGCCTTCGAACTCGAGTAGTTGTGAACTTACACTTTATTCATATATATTAGATATTGATAATTTTAACAAATGAGTTACTTTCCATTTGGGTACAGTCACAGTTGTCAACAATATTTGGAAGCACCAGGCATGAAATCTCCTGAGATGCTATGTTTTCATCAGGGTCACCTGACACATTCAAGTTCTGTCTGACATGCCATTAAAGCACTGGCTCAGATTGCAGGCATATTTTCAAACCGGCAGTAACTGGATAGTATCACTTCACTTATAAGTGTTCATTGTATCATCAAGTGAAATAAACACACAACCCATGGGATCTTGCTTAGGTTGGCTGCCTAGTTGGCCCCTGAGATAAAGCCTTGTAATCACATAGCCTTGCCTAATTAGTCAGAAAACAAAGGATTAAGTGAGACAGTCACAGGATATAGGAATTATAAATAATACATATATTAATAGATATTCATTTTCATTACACAAAAGTTGCTATTATAAATACTTATTTGATTGATGAGTCTAAAAATATATTCCCCATATAAATAATGTTAAATATTAATAAATAGATTTAGATTTAAAATTCAAATATTGCAGGCAGGACAACCACCCGGGTTAACTTGCATTCAAATATGACATTACCCTATCAATTGTAACGGCCCTGATTCTAAAAGCATGCAAAAGTATACACAGCTTTATTTTTGTCTTGTAAAAATCAGGTTCTTCAAGAGAGCTTTTTTGAGGAACCGTTTCAGAATTAAAATTAAGAGCTTGCATCAGCTCATCAATAACGGCAAGCATATTCTGATCAAGGAATATCTGTCGCTTGGGGTCCATCAAAAGTTTTGCGTTCATTGTCTTGAACTCAACCTGGTACATCTTAAGATCTTCATATATAGAAGACAAGCACAGGGCCATCATAAAGCTTGTTTTGCGGCTGGCCAAACAAGATCCATTGGTAATGAAAGAAGTCTCTCTGGAATTGAGACAAGATTCGTTTTTAGTGAGTTCCAGTGGCAGGCATGCCTCCACGGTGGATGTTTTGTCCTTAGTAATATCTTCGTGGTCTATTTCCTCACTTGTGCAAGGGTAAAATTCAAGTGTTTGTCGGGCCTTCTGGAGCATGTTGGAGACAGCCCTAAGCAAGTTTTGAGAGTGGTGAAGACATGGGAACATGCCTGGGTCTGGGGTTGCAACAGGCAAGTTCCGAGAACCGCCCCCACCACCACCTGAGCATGGGACAGATGCCCATTCGCTCCAGCTAGATGAGTAGTATCTGTCTTGGGCTCTGACACTTATGCTTGCGTTCTTTCTGCAAATGACTGTTGCAGACGTTTTATCAGTGAAAACCCGATCTTTCTTTTCCCTTTTTGATTTTCCTTGCACCTGGACACAAAATGTCAAACTAAAGTAAGAGTGCGGAGTTGACCAGGTGTCGGGGTACTCCCAAGAAACTTCAACCTGGCGTGAGTTCTTCAAAGGCTTAAGCTGCAGATTCTTCGGAGGATCGGGCTTGATAATGTCCCGGATAAAAAAGCTGCTCGTGTAATTTTCATACTTCAACTTGTGTACGGCGTCAACCATCACCTCTATTGGCAGGCTCTCCTCTGCTGCGGGGCAAGCGGAGTCTTCCTGGCATTCCACGCTATATTCGTATTCTTTGTTGTCCCCCCGTACCCTCTCCGCAGAAAGCGTAGCAGCACCGCACGTTACACCTTGTGGGTCACTGGAACCCCTACTAGACTTAACAGAAAACGTAAGATCCGTAGAGATTGTTGTCAACCACCAGCAAGTAAAGCGTCCGGAGTAATTTTTTGCTTCACAGCGCAGAAACGTTTTGTTTTTGGGTTCTTTCTGATCCTTAAGGATATCTGTACTCCAAATGCCATCCTCTTTTTTGTGCAGGAGCAGCAGGCTGTGAGAAAGGACCTCGCCTCCCTTATGGCACGTATACTGCCCGGCATCTCCAAACTCTTTTACCTGGATAGTAAGTGTTTTGCCGCTGCCAAGCACCTCTGAGCTTTGGTCCAGGGTCCAGGTTATCCCATCTTCTTCAGGTGTATCGCAGGTGAGGACCACCATCTCGCCCGGTGCGTCGGGATACCAATCCAATTCAACAACATATACGTCTTTCTTAAGTTCCCAAATAGCGACCAATGGTGACGCCAGAAAAACAAGTGAGAACCAAGAGATTACCAGTTGTTGATGGCACATGGTGGGAATTCGGCTGTCCCAGCACCTCAGCGCAGAGCAAGTGGTGGTCAGGGGAGCGTCTCAAATCCTGCGCAGCCCAACGTCCGGCGCCGCCAAGTGACGCACGAGGTGCTGTGACTCGTGCCAGCCCCCTAATCTGCGGAAGTGGAGTGCGGGGAGTGCGCCGGAAGAGGGGTACGGAAGTGCGCCGGAAGTGGGGTGCGGAGGTGTGCAGCGCGCTGTCAGACTGGCTCGCAGGCGGCGCGGCCGGCGGACCCGTTCGAGACAGCGCGGGCGGCTCGGGTCCCCTGGGGCTCCGCAGCAGGAGGACGCCGCTAGCGCTACCGGTCGCCAAGATGGGGGCAGGTGCCACCGGCCGCGCCATGGACGGGCCGCGCCTGCTGCTGTTGCTGCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCGTGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAGAGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTCATAGCCAGCACGGTGGCAGGTGTGGTGACCACAGTGATGGGCAGCTCCCAGCCCGTGGTGACCCGAGGCACCACCGACAACCTCATCCCTGTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGTCTTGTGGCCTACATAGCCTTCAAGAGGGGCAGCGGAGAGGGTAGGGGTAGTCTTTTGACGTGTGGGGACGTCGAGGAAAATCCTGGGCCTGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGACAGCCTGGCCGTGAGCCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCGACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCAGGGAGAGCGGCGTGCCCGACAGGTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGACTACAGCTACCCCCTGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGACCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACCACGCCATCCACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGCCCTGGAGTGGATGGGCCACTTCAGCCCCGGCAACACCGACATCAAGTACAACGACAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCCTGACCGTGGACAGGAGCATGAGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCATGTACTACTGCAAGACCAGCACCTTCTTCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACCGTGAGCAGCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTGAAGAGACGTCATAATCAGCCAGCGGCCGCGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTCCTGGCCAACGTGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATATCGTTAAGCTGGAGCCTGGGAGCCGGCCTGGCCCTCCGCCCCCCCCACCCCCGCAGCCCACCCCTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGAGTGGCCGACAGTGCCCGTGGAGTTCTCGTGACCTGAGGTGCAGGGCCGGCGCTAGGGACACGTCCGTGCACGTGCCGAGGCCCCCTGTGCAGCTGCAAGGGACAGGCCTAGCCCTGCAGGCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCTCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGACGCTTTTTTGGAGGCCGAGGCTTTTGCAAAGATCGAACAAGAGACAGGACCTGCAGGTTAATTAAATTTAAATCATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCATTTAAATGGCCGGCCTGGCGCGCCGTTTAAACCTAGATATTGATAGTCTGATCGGTCAACGTATAATCGAGTCCTAGCTTTTGCAAACATCTATCAAGAGACAGGATCAGCAGGAGGCTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGC
CGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGACCGATTCTAGGTGCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAAGGTCGTTTAAAC（配列番号１４）
ＧＣ１６０（配列番号４）構築物は、ｍＣｈｅｒｒｙ Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＰＧＫプロモーターをコードするモノシストロン性構築物である。

【0046】

ＧＣ２１３（配列番号５）構築物は、一方の鎖内にあるＩＦＮｇ ｇｏｌｄエレメントの制御下にＩＬ－１２を発現するＮＦＡＴプロモーター、ならびにＬＮＧＦＲ（５３）Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＭＮＤプロモーターをコードする２シストロン性構築物である。ＧＣ２１３においてＬＮＧＦＲをコードする核酸は、すべてのコドンにおける第３位置のＧＣ含量を５３％へと低下させるように修飾されている。ＬＮＧＦＲのＧＣ含量のこの低下は、ＬＮＧＦＲの発現を低下させ、それは、ＣＡＲの発現も低下させる。

【0047】

ＧＣ２１７（配列番号６）構築物は、一方の鎖内にあるＩＦＮｇ ｇｏｌｄエレメントの制御下に優性阻害ＴＧＦＢＲ２（ＴＧＦベータ受容体２）を発現するＮＦＡＴプロモーター、ならびにＬＮＧＦＲ（全コドンの第３位置に関してＧＣ含量５３％）Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＭＮＤプロモーターである。

【0048】

ＧＣ２１９（配列番号７）構築物は、一方の鎖内にあるＩＦＮｇ ｇｏｌｄエレメントの制御下に変異体ＩＬ１８（ＩＬ－１８結合タンパク質に対するその親和性を低下させるように修飾されたＩＬ１８、例えば配列番号３８）を発現するＮＦＡＴプロモーター、ならびにＬＮＧＦＲ（全コドンの第３位置に関してＧＣ含量５３％）Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＭＮＤプロモーターをコードする２シストロン性構築物である。

【0049】

成熟バリアントＩＬ－１８
YFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED（配列番号１５）
プレプロバリアントＩＬ－１８
MAAEPVEDNCINFVAMKFIDNTLYFIAEDDENLESDYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFKEMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDELGDRSIMFTVQNED（配列番号１６）
ＩＬ－１８バリアントは、配列番号１５において、以下の変化、Ｍ５１Ａ、Ｋ５３Ｇ、Ｑ５６Ｒ、Ｐ５７Ａおよび／またはＭ６０Ｋの１つまたは複数を有する（ナンバリングは、分泌発現およびカスパーゼ－１プロセシング後の成熟活性ＩＬ－１８に対する）。配列番号１６の全長非プロセシング（unprocessed）タンパク質からの代替的なナンバリングは、Ｍ８７Ａ、Ｋ８９Ｇ、Ｑ９２Ｒ、Ｐ９３Ａおよび／またはＭ９６Ｋである。

【0050】

ＧＣ２２３（配列番号８）構築物は、一方の鎖内にあるＩＦＮｇ ｇｏｌｄエレメントの制御下にｅＩＬ－２（ＧＣ３濃縮）を発現するＮＦＡＴプロモーター、ならびにＬＮＧＦＲ（全コドンの第３位置に関してＧＣ含量５３％）Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＭＮＤプロモーターをコードする２シストロン性構築物である。

【0051】

ＳＫ０６２（配列番号９）構築物は、一方の鎖内にあるＩＦＮｇ ｇｏｌｄエレメントの制御下に分泌型ルシフェラーゼを発現するＮＦＡＴプロモーター、ならびにＬＮＧＦＲ（８３）Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＭＮＤプロモーターをコードする２シストロン性構築物である。ＳＫ０６２におけるＬＮＧＦＲは、コドンの第３位置でＧＣ含量８３％を有する。

【0052】

ＳＫ１４８（配列番号１０）構築物は、一方の鎖内にあるＩＦＮｇ ｇｏｌｄエレメントの制御下にＩＬ－１２を発現するＮＦＡＴプロモーター、ならびにＬＮＧＦＲ（８３）Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＭＮＤプロモーターをコードする２シストロン性構築物である。ＳＫ１４８におけるＬＮＧＦＲは、コドンの第３位置でＧＣ含量８３％を有する。

【0053】

ＳＫ０７２（配列番号１１）構築物は、一方の鎖内にあるＩＦＮｇ ｇｏｌｄエレメントの制御下に分泌型ルシフェラーゼを発現するＮＦＡＴプロモーター、ならびにＬＮＧＦＲ（５３）Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＭＮＤプロモーターをコードする２シストロン性構築物である。ＳＫ０６２におけるＬＮＧＦＲは、コドンの第３位置でＧＣ含量５３％を有する。

【0054】

ＧＣ２５１（配列番号１２）構築物は、一方の鎖内にあるＩＦＮｇ ｇｏｌｄエレメントの制御下にＩＬ－１２を発現するｅＩＦ２Ｂ１プロモーター、ならびにＬＮＧＦＲ（８３）Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＧＴＦ２Ｈ３プロモーターをコードする２シストロン性構築物である。ＧＣ２５１においてＬＮＧＦＲをコードする核酸は、すべてのコドンにおける第３位置のＧＣ含量を８３％へと上昇させるように修飾されている。ＬＮＧＦＲのＧＣ含量のこの上昇は、ＬＮＧＦＲの発現を上昇させ、それは、ＣＡＲの発現も上昇させる。

【0055】

ＰＤ００７（配列番号１３）は、一方の鎖内にあるＩＦＮｇ ｇｏｌｄエレメントの制御下にＩＬ－１２を発現するＮＦＡＴプロモーター、ならびにＬＮＧＦＲ（５３）Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＭＮＤプロモーターをコードする２シストロン性構築物である。ＰＤ００７においてＬＮＧＦＲをコードする核酸は、すべてのコドンにおける第３位置のＧＣ含量を５３％へと低下させるように修飾されている。ＬＮＧＦＲのＧＣ含量のこの低下は、ＬＮＧＦＲの発現を低下させ、それは、ＣＡＲの発現も低下させる。

【0056】

ＰＤ００９（配列番号１４）構築物は、一方の鎖内にあるＩＦＮｇ ｇｏｌｄエレメントの制御下にＩＬ－１２を発現するｅＩＦ２Ｂ１プロモーター、ならびにＬＮＧＦＲ（８３）Ｔ２Ａ配列番号３（シグナル配列）および配列番号１（ＣＡＲ）を発現するＧＴＦ２Ｈ３プロモーターをコードする２シストロン性構築物である。ＧＣ２５１においてＬＮＧＦＲをコードする核酸は、すべてのコドンにおける第３位置のＧＣ含量を８３％へと上昇させるように修飾されている。ＬＮＧＦＲのＧＣ含量のこの上昇は、ＬＮＧＦＲの発現を上昇させ、それは、ＣＡＲの発現も上昇させる。

【0057】

一態様では、前記の構築物における両方向性プロモーターは、ＥＩＦ２Ｂ１（真核生物の翻訳開始因子２Ｂサブユニットアルファ）からのプロモーターおよびＧＴＦ２Ｈ３（基本転写因子ＩＩＨサブユニット３）からのプロモーターを有するｓｍｏｌ２両方向性プロモーターにより置換可能である。その構築物では、ＥＩＦ２Ｂ１プロモーターが、ペイロードを転写し、ＧＴＦ２Ｈ３プロモーターが、ＣＡＲ（およびＬＮＧＦＲ）を転写する。ｓｍｏｌ２両方向性プロモーターは、ペイロードのベースライン発現を低下させ、発現のダイナミックレンジを増加させる（非誘導発現から誘導発現への、発現の倍率増加）。

【0058】

ノッチ阻害剤およびモジュレータ
ノッチは、Ｔ細胞における免疫学的チェックポイントであり得る。Ｔ細胞のノッチ関連抑制を修飾するための方法および組成物は、多くの固形腫瘍を処置するために、他のチェックポイント阻害剤および／または他の免疫療法と併用され得る。ノッチシグナルは、状況依存性に、細胞増殖、細胞死、特定の細胞運命の獲得、または分化プログラムの活性化を促進または抑制し得る。

【0059】

Ｔ細胞上のノッチ受容体へのリガンドの結合は、Ｔ細胞の活性化および増殖を阻害することが示されている。ノッチ受容体は、複数部位においてリン酸化され得て、リン酸化は、シグナル伝達において重要であり得る。Ｔ細胞内でのノッチ受容体シグナル伝達は、ナイーブＴ細胞の活性化および増殖を抑制し得る。ＧＳＫ－３βおよびＡＫＴのリン酸化は、ノッチ受容体がリガンドを係合後、迅速動力学により阻害される。ＧＳＫ－３βは、ノッチシグナル伝達の成分であり、そのリン酸化は、ＡＫＴに依存する。ＡＫＴも、Ｔ細胞の活性化、増殖、およびサイトカイン産生に必須である。ＧＳＫ－３β活性のアンタゴニストは、ＧＳＫ－３βのノッチ介在性活性化を阻害するために使用され得る。ＧＳＫ－３βアンタゴニストのいくつかの例は、優性阻害ＧＳＫ－３β変異体（Taelman VF等、2010、Cell 143(7):1136～48頁）、またはＧＳＫ－３β＿Ｓ９Ｄなどの阻害性ホスホセリンミメティクスである。

【0060】

ノッチ受容体活性は、いくつかの異なるクラスの薬剤により阻害され得て、例えば、受容体アンタゴニスト、優性阻害受容体変異体、ＡＤＡＭ１７プロテアーゼ阻害剤、およびガンマセクレターゼ阻害剤を含む。ノッチアンタゴニストには、例えば、可溶性ノッチリガンド、例えば、可溶性高親和性ＤＬＬ４（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているLuca等、2015 Science 347:847～53頁）、可溶性高親和性Ｊａｇｇｅｄ１など、ノッチ受容体に対する抗体（その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているWu等、2010、Nature 464:1052～57頁；Tran等、2013、J. Clin. Invest. 123:1590～1604頁）、およびＭｅｒｃｋ社またはＯｎｃｏｍｅｄ社により作製された、ノッチ受容体に対する抗体が含まれ得る。

【0061】

優性阻害変異体には、例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているZhou等、2017、Proc. Natl Acad Sci 114:12731～36頁に開示されるＰＳＥＮ１（ガンマセクレターゼ複合体の成分）変異体が含まれる。他の優性阻害変異体には、例えば、Zhou等、2017に開示されるＰＳＥＮ１変異体Ｄ２５７Ａ／Ｄ３８５Ａおよび他の変異体、ＡＤＡＭ１７ΔＭＰ（例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているPeng等、2010、Immunology 130:83～91頁）、ＡＤＡＭ１０ΔＭＰ（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているBozkulak等、2009、Molecular and Cellular Biology 29:5679～95頁）が含まれる。

【0062】

ＡＤＡＭ１７プロテアーゼ阻害剤には、例えば、ＴＡＰＩ－２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－２０５８５１）、１－プロピル－１Ｈ－イミダゾール（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４７１９３２）、セカルシフェロール（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４７３２７０）、セコフェノール（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４７３２８８）、（７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１０Ｓ）－ｒｅｌ－７，８，９，１０－テトラヒドロベンゾ［ａ］ピレン－７，８，９，１０－テトロール（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４７４２７４）、Ｂｏｃ－Ｌ－グルタミン酸ガンマ－ベンジルエステル４－オキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４７６５８０）、３－［（４－メチル－１－ピペラジニルイミノ）メチル］リファマイシンＯ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４８７９２２）、ＧＩ ２５４０２３Ｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４９０１１４）、（２Ｚ）－６－クロロ－２－［（２，４－ジメトキシフェニル）イミノ］－Ｎ－（テトラヒドロフラン－２－イルメチル）－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４９１８６５）、｛［４－（２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）－１，３－チアゾール－２－イル］チオ｝酢酸（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４９３５９３）、４－（ジメチルアミノ）－Ｎ－｛１－［３－（２－チエニル）－１Ｈ－ピラゾール－５－イル］ピペリジン－４－イル｝ベンズアミド（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４９５０８１）、２－｛［（２，５－ジエトキシフェニル）アミノ］メチル｝－６－エトキシフェノール（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４９５３１５）、エトゾリン－ｄ３塩酸塩（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４９７４２２）、エリスロロサミン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－４９８３４１）、デスメチルドキシルアミン－ｄ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－５００２８５）、Ｎ－デメチルＮ－アセチルアログリプチン－２，２，２－トリフルオロアセタート（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社カタログ番号ｓｃ－５００４１１）、ＧＩ ２５４０２３Ｘ（Ｔｏｃｒｉｓ社カタログ番号３９９５）、ＴＡＰＩ ０（Ｔｏｃｒｉｓ社カタログ番号５５２３）、ＴＡＰＩ－１（Ｔｏｃｒｉｓ社カタログ番号６１６２）、ＴＡＰＩ－２（Ｔｏｃｒｉｓ社カタログ番号６０１３）、およびＴＭＩ－１（Ｔｏｃｒｉｓ社カタログ番号５９６０）が含まれる。

【0063】

ガンマセクレターゼ阻害剤は、いくつかのクラスおよびサブクラス、つまり、ペプチド等価体（例えば、アスパルチルプロテイナーゼ遷移状態アナログ）および小分子（例えば、アゼピン、スルホンアミド）に分類される。多くのガンマセクレターゼ阻害剤が、市販入手可能であり、例えば、ＤＡＰＴ（ＧＳＩ－ＩＸ）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ２２１５）、ＲＯ４９２９０９７（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ１５７５）、セマガセスタット（ＬＹ４５０１３９）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ１５９４）、ＭＫ－０７５２（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ２６６０）、アバガセスタット（ＢＭＳ－７０８１６３）（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ１２６２）、ＭＤＬ－２８１７０（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ７３９４）、ジベンザゼピン（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ２７１１）、ＬＹ４１１５７５（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ２７１４）、ニロガセスタット（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ８０１８）、Ｌ－６８５，４５８（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ７６７３）、ＦＰＳ－ＺＭ１（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ８１８５）、クレニガセスタット（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ７１６９）、ＣＨＦ－５０７４（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ７３２３）、ＮＧＰ－５５５（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ社カタログ番号Ｓ８６０３）を含む。

【0064】

組換えノッチアンタゴニスト（例えば、抗体もしくは可溶性リガンド）、および／または優性阻害変異体が、ペイロードとして、真核細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞、またはＣＡＲ Ｔ細胞）により送達され得る。ノッチアンタゴニスト（例えば、抗体もしくは可溶性リガンド）および／または優性阻害変異体は、構成的に発現され得るか、または誘導性に発現され得る。誘導性発現には、誘導性プロモーターおよび／または誘導性転写後制御、例えば、ＲＤＥ、ＲＮＡ制御デバイス、またはデグロンなどが含まれ得る。

【0065】

ペイロードは、ＲＤＥの制御下に置かれ得るため、真核細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）が活性化されると発現することになる。いくつかの優性阻害変異体は、ＲＤＥの制御下に置かれ得て、ＣＤ３／ＣＤ２８を用いてＴ細胞を増加させると、Ｔ細胞が、対象への投与前に優性阻害変異体を発現する。

【0066】

抗体または可溶性リガンドペイロードは、構成的に発現され得るか、または誘導性発現下にある場合、発現は、所望の時間において誘導され得る。例えば、発現は、真核細胞（例えば、ＮＫ細胞のＴ細胞）が標的部位（例えば、腫瘍）に達すると、前もって誘導され得る。発現は、真核細胞（例えば、ＮＫ細胞のＴ細胞）が標的部位（例えば、腫瘍）に達するか、または達した後でも誘導され得る。発現が、リガンド誘導性制御下に置かれている場合、リガンドは、所望の時間において真核細胞に添加され得る。

【0067】

小分子ノッチ阻害剤は、対象へと全身的（例えば、経口もしくは注射を介して）または局所的（例えば腫瘍内）に投与され得る。プロテアーゼ阻害剤の多くは、経口投与用に製剤化されており、小分子の公知のＰＫ特性に基づき、標的部位において所望の量の小分子を産生するために、適切な時間に対象に経口服用させ得る。

【0068】

ラパログおよび関連分子
ラパログおよび関連分子は、Ｇｏｌｄ制御下の導入遺伝子の発現をオフにするか、または抑制するために使用され得る。ラパマイシンは、マスターレギュレータｍＴＯＲ（哺乳類ラパマイシン標的タンパク質）を通して作用する免疫抑制剤である。ｍＴＯＲは、栄養素および成長因子から合図を統合し、成長、代謝および寿命を制御するための細胞シグナルの連鎖点（nexus point）として作用する。ｍＴｏｒは、成長（好気的解糖）に対する休止（酸化的リン酸化）のマスターレギュレータである。したがって、細胞の活性化、およびＧｏｌｄ制御下での導入遺伝子の発現後に、導入遺伝子の発現を阻害する（オフにする）ために、ラパログを使用することができる。

【0069】

ｍＴＯＲは、哺乳類ラパマイシン標的複合体１（ｍＴＯＲＣ１）および哺乳類ラパマイシン標的複合体２（ｍＴＯＲＣ２）と呼ばれる、構造的および機能的に異なる２つの複合体を形成する。ｍＴＯＲＣ１は、ｍＴＯＲ、ラプター、ＧβＬおよびデプターからなり、ｍＴＯＲＣ２は、ｍＴＯＲ、リクター、ＧβＬ、ＰＲＲ５、デプターおよびＳＩＮ１からなる。ｍＴＯＲＣ１は、複数の成長因子、酸素およびアミノ酸からのシグナル、ならびにエネルギー供給を統合して、エネルギーが十分である場合は細胞成長（cell growth）を促進し、身体が空腹である場合は異化作用を促進する。ｍＴＯＲＣ１は主に、細胞成長および代謝を調節し、ｍＴＯＲＣ２は主に、細胞増殖および生存を制御する。

【0070】

ｍＴＯＲＣ１は、タンパク質、脂質および細胞小器官の生合成を含む多くの同化プロセスを促進することにより、ならびにオートファジーなどの異化プロセスを限定することにより、細胞成長および増殖を正に調節する。ｍＴＯＲＣ１機能に関する知識の多くは、細菌マクロライドであるラパマイシンの使用に由来する。細胞に侵入すると、ラパマイシンは、１２ｋＤａのＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）に結合し、ｍＴＯＲのＦＫＢＰ１２－ラパマイシン結合ドメイン（ＦＲＢ）と相互作用することにより、ｍＴＯＲＣ１機能を阻害する（GuertinとSabatini、2007により概説）。慢性ラパマイシン処置は、一部の場合、ｍＴＯＲＣ２のアセンブリをブロックすることにより、その活性を阻害し得る（Sarbassov等、2006）。

【0071】

例示的なラパログには、例えば、エベロリムス（Ｅｖｅ、ＲＡＤ－００１）、デフォロリムス（Ｄｅｆ、リダフォロリムス）、ゾタロリムス（Ｚｏｔ）、テムシロリムス（Ｔｅｍ、ＣＣＩ－７７９）、ＷＹＥ－５９２ラパログ、ＩＬＳ－９２０ラパログ、およびシロリムスが含まれる。

【0072】

【化1】

【0073】

Ｇｏｌｄ制御導入遺伝子の発現を低下させるか、またはオフにするために同じく使用され得るｍＴｏｒ阻害剤には、例えば、トリン１、トリン２、ＰＰ３０、ＰＰ２４２、ＯＳＩ－０２７、ＡＺＤ８０５５、ＫＵ－００６３７９４、ＷＹＥ－１２５１３２、ＮＶＰ－ＢＥＺ２３５、ＮＶＰ－ＢＢＤ１３０、ＸＬ７６５、およびウォルトマニンが含まれる。

【0074】

【表1】

【0075】

併用療法
この開示は、他の療法と併用してか、または他の療法と連続した順序で、ＲＤＥの制御下で導入遺伝子を発現するＣＡＲ Ｔリンパ球を提供するための組成物および方法を提供する。他の療法には、例えば、化学療法薬、抗体、および抗体－薬物コンジュゲート、放射線療法、アルキル化剤、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、および／または抗新生物薬が含まれ得る。例えば、他の療法は、ＣＡＲ Ｔリンパ球と同じかまたは異なる特異性を有する抗体薬物コンジュゲートであり得る。

【0076】

抗体、および抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、例えば、ＣＡＲの標的として本明細書に記載される腫瘍関連抗原のいずれかを含む腫瘍関連抗原に結合し得る。ＡＤＣの薬物成分は、例えば、化学療法薬、放射性ヌクレオチド、アルキル化剤、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、および／または抗新生物薬であり得る。ＡＤＣの薬物成分は、本質的に切断可能または切断不可能であり得るリンカーにより抗体に付着させてもよい。

【0077】

アルキル化剤には、例えば、マスタードガス誘導体（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、またはイホスファミド）、エチレンイミン（例えば、チオテパまたはヘキサメチルメラミン）、アルキルスルホン酸塩（例えば、ブスルファン）、ヒドラジンおよびトリアジン（例えば、アルトレタミン、プロカルバジン、ダカルバジン、またはテモゾロミド）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、またはストレプトゾシン）、および金属塩（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、またはオキサリプラチン）が含まれ得る。植物アルカロイドには、例えば、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、またはビノレルビン）、タキサン（例えば、パクリタキセルまたはドセタキセル）、ポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニソピド）、およびカンプトテカン（camptothecan）アナログ（例えば、イリノテカンまたはトポテカン）が含まれ得る。抗腫瘍抗生物質には、例えば、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、またはイダルビシン）、およびクロモマイシン（例えば、ダクチノマイシンまたはプリカマイシン）が含まれ得る。代謝拮抗薬には、例えば、葉酸アンタゴニスト（例えば、メトトレキサート）、ピリミジンアンタゴニスト（例えば、５－フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、カペシタビン、またはゲムシタビン）、プリンアンタゴニスト（例えば、６－メルカプトプリンまたは６－チオグアニン）、およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、またはペントスタチン）が含まれ得る。トポイソメラーゼ阻害剤には、例えば、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカンまたはトポテカン）およびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、またはテニポシド）が含まれ得る。抗新生物薬には、例えば、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤（例えば、ヒドロキシ尿素）、副腎皮質ステロイド阻害剤（例えば、ミトタン）、酵素（例えば、アスパラギナーゼまたはペガスパルガーゼ）、抗微小管剤（例えば、エストラムスチン）、およびレチノイド（例えば、ベキサロテン、イソトレチノイン、またはトレチノイン）が含まれ得る。

【0078】

薬物成分は、アントラサイクリン、カンプトテシン、チューブリン阻害剤、マイタンシノイド、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）、アウリスタチン、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアゼン、葉酸アナログ、タキサン、ＣＯＸ－２阻害剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制薬、ホルモンアンタゴニスト、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗有糸分裂薬、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、アポトーシス促進剤、およびそれらの組合せでもあり得る。

【0079】

使用の特定の薬物は、５－フルオロウラシル、アファチニブ、アプリジン、アザリビン、アナストロゾール、アントラサイクリン、アキシチニブ、ＡＶＬ－１０１、ＡＶＬ－２９１、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブリオスタチン－１、ブスルファン、カリケアマイシン、カンプトテシン、カルボプラチン、１０－ヒドロキシカンプトテシン、カルムスチン、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、ＣＯＸ－２阻害剤、イリノテカン（ＣＰＴ－１１）、ＳＮ－３８、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテカン、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダサチニブ、ディナシクリブ、ドセタキセル、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４、ドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシン（２－ＰＤｏｘ）、２－ＰＤｏｘのプロドラッグ形態（ｐｒｏ－２－ＰＤｏｘ）、シアノモルホリノドキソルビシン、ドキソルビシングルクロニド、エンドスタチン、エピルビシングルクロニド、エルロチニブ、エストラムスチン、エピドフィロトキシン、エルロチニブ、エンチノスタット、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、エトポシドグルクロニド、リン酸エトポシド、エキセメスタン、フィンゴリモド、フロクスウリジン（ＦＵｄＲ）、３’，５’－Ｏ－ジオレオイル－ＦｕｄＲ（ＦＵｄＲ－ｄＯ）、フルダラビン、フルタミド、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、フラボピリドール、フォスタマチニブ、ガネテスピブ、ＧＤＣ－０８３４、ＧＳ－１１０１、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イブルチニブ、イダルビシン、イデラリシブ、イホスファミド、イマチニブ、ラパチニブ、レナリダミド、ロイコボリン、ＬＦＭ－Ａ１３、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトタン、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、モノメチルアウリスタチンＤ（ＭＭＡＤ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、ナベルビン、ネラチニブ、ニロチニブ、ニトロソ尿素、オラパリブ、プリカマイシン、プロカルバジン、パクリタキセル、ＰＣＩ－３２７６５、ペントスタチン、ＰＳＩ－３４１、ラロキシフェン、セムスチン、ＳＮ－３８、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、ＳＵ１１２４８、スニチニブ、タモキシフェン、テモゾロミド、トランス白金、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、ウラシルマスタード、バタラニブ、ビノレルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンカアルカロイド、およびＺＤ１８３９からなる群から選択され得る。好ましくは、薬物はＳＮ－３８である。

【0080】

一態様では、併用療法は、タンパク質コンジュゲートである。タンパク質コンジュゲートは、治療薬、診断薬、またはレポーターであり得るペイロードを運び得る。治療薬、診断薬、またはレポーターの単一分子が存在してもよく、または２つ以上の分子が存在してもよい。治療薬は、化学療法薬、例えば、本明細書に記載されるもののいずれか、例えば、放射性ヌクレオチド、アルキル化剤、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、および／または抗新生物薬などであり得る。コンジュゲートのペイロードは、それらの治療薬、診断薬、および／またはレポーターのうちの任意の１つまたは複数であり得る。タンパク質は、断片、単量体、二量体、または多量体タンパク質であり得る。タンパク質は、抗体、抗体断片または誘導体、一本鎖抗体、酵素、サイトカイン、ケモカイン、受容体、血液因子、ペプチドホルモン、毒素、および／または転写因子であり得る。

【0081】

多くのコンジュゲート化試薬が、ペイロードをタンパク質にコンジュゲートするために使用され得る。そのような試薬は、少なくとも１つの、タンパク質またはペプチドと反応することができる官能基を有し得る。例えば、コンジュゲート化試薬は、タンパク質中に存在する少なくとも１つの求電子体または、特に求核体と反応することができる官能基を含み得て、該官能基は、リンカーを介してペイロードに付着している。コンジュゲートを形成するために、いずれかのタイプの公知のコンジュゲーション反応が使用され得る。例えば、反応は、チオール結合、アミンコンジュゲーション、またはクリック化学の公知の方法を使用して行うことができる。試薬は、マレイミド基、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド基、クリック化学基、例えば、アジドもしくはアルキン基、アミン基、カルボキシル基、カルボニル基、または活性エステル基を有し得る。他の可能なアプローチには、特にコンジュゲーション用のアミノ酸により組換え操作されているタンパク質の使用、例えば、操作されたシステインまたは非天然アミノ酸など、ならびに特異的酵素反応、例えば、トランスグルタミナーゼなどによる酵素コンジュゲーションが含まれる。タンパク質上の反応部位は、本質的に求核性または求電子性のいずれかであり得る。一般的なタンパク質コンジュゲーション部位は、リジンもしくはシステインアミノ酸残基または炭水化物部分である。あるいは、コンジュゲーションは、結合タンパク質に付着しているポリヒスチジンタグにおいて生じ得る。

【0082】

コンジュゲート化試薬は、有利には、タンパク質中の求核体と反応することができ得るため、それらに化学的に結合した状態になり得る。これらの例では、コンジュゲート化試薬は、典型的には、求核体と反応すると失われる少なくとも１つの脱離基を含む。コンジュゲート化試薬は、例えば、２つ以上の脱離基を含み得る。コンジュゲート化試薬は、２つの求核体と反応することができ得る。コンジュゲート化試薬は、少なくとも２つの脱離基を含み得る。２つ以上の脱離基が存在する場合、それらは、同じであっても異なってもよい。あるいは、コンジュゲート化試薬は、２つの脱離基と化学的に同等であって２つの求核体と反応することができる単一基を含有してもよい。求核基には、例えば、イオウ原子およびアミン基が含まれ、タンパク質中の求核基は、例えば、システイン残基、リジン残基、またはヒスチジン残基により提供される。求核基は、タンパク質のシステイン残基に存在するイオウ原子であり得る。そのような構造は、タンパク質中のジスルフィド結合の還元により得られ得る。求核基は、例えば、ポリヒスチジンタグ中に存在するような、タンパク質のヒスチジン残基中のイミダゾール基であり得る。

【0083】

コンジュゲートは、治療薬、診断薬、またはラベリング剤を、コンジュゲート中のタンパク質またはペプチドに連結するリンカーを含有し得る。リンカーの骨格は、一方の端の治療薬、診断薬、またはラベリング剤から、他方の端のタンパク質またはペプチドまで延びる、原子の連続した鎖であり得る。リンカーは、分解可能な基を含有してもよく、すなわち、生理的条件下において破壊される基を含有し、ペイロードが結合しているかまたは結合されるであろうタンパク質からペイロードを分離させてもよい。あるいは、リンカーは、生理的条件下において切断可能でない。リンカーが生理的条件下において破壊される場合、該リンカーは、好ましくは、細胞内条件下において切断可能である。標的が細胞内である場合、好ましくは、リンカーは、細胞外条件に対して実質的に非感受性である（すなわち、十分な用量の治療剤の、細胞内標的への送達が妨害されないことになる）。

【0084】

リンカーが、分解可能な基を有する場合、これは、概して、加水分解性条件に対して感受性であり、例えば、ある特定のｐＨ値（例えば、酸性条件）において分解する基であり得る。加水分解条件／酸性条件は、例えば、エンドソームまたはリソソーム中で見出され得る。酸性条件下で加水分解を受けやすい基の例には、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ－アコニットアミド、オルトエステル、およびケタールが含まれる。分解可能なリンカーは、酸切断可能リンカーまたは還元可能リンカーでもあり得る。還元可能リンカーは、ジスルフィド基を含み得る。リンカーは、酵素的分解を受けやすい基も含み得て、例えば、リンカーは、プロテアーゼ（例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼ）またはペプチダーゼによる切断を受けやすい場合がある。例えば、リンカーは、少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、または少なくとも３つのアミノ酸残基を含むペプチジル基を含有し得る（例えば、Ｐｈｅ－Ｌｅｕ、Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ、Ｖａｌ－Ａｌａ、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ｐｈｅ－Ｌｙｓ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ）。例えば、リンカーは、１から５のアミノ酸、例えば、２から４のアミノ酸を有するアミノ酸鎖を含み得る。酵素切断可能リンカーは、１つまたは複数のリソソーム酵素により切断または分解可能である化学基も含み得る。適切な基には、例えば、バリン－シトルリンジペプチド基、フェニルアラニン－リジンジペプチド基、およびβ－グルクロニド基が含まれる。

【0085】

タンパク質コンジュゲート中のタンパク質が抗体（例えば、全長、断片、および／または一本鎖）である場合、第１のリンカーの一方の端は、抗体に共有結合的に付着し得る。リンカーの抗体反応性末端は、抗体上のシステインチオール基またはリジンアミン基を通して抗体にコンジュゲーションすることができる部位であり得るため、二重結合などのチオール反応性基（マレイミドのような）、またはクロロ、ブロモ、もしくはヨードなどの脱離基、またはＲ－スルファニル基、またはカルボキシル基などのアミン反応性基であり得る。

【0086】

ＣＡＲ療法（例えば、ＧＯＬＤ制御導入遺伝子による）および他の療法は、対象に対して同時に提供してもよく、または一方を他方の前に対象に提供してもよく、またはＣＡＲ療法および他の療法を、交互のサイクルにおいて提供してもよく、またはＣＡＲ療法を他の療法と一緒に、サイクルにおいて提供してもよく、または投与の他の組合せを使用してもよい。ＣＡＲ療法は、抗体コンジュゲート（ＡＤＣ）療法と併用することができ、その場合、ＣＡＲおよびＡＤＣは、同じ抗原に結合するか、または異なる抗原に結合する。ＣＡＲおよびＡＤＣが、同じ抗原に結合する場合、ＣＡＲおよびＡＤＣは、その抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合し得る。ＡＤＣ療法またはＣＡＲ療法の一方を、最初に対象に提供して、その後に他方を、第１の療法による処置期間の後に提供してもよい。ＡＤＣは、単独または他の承認済み療法（例えば、化学療法および／または免疫チェックポイント阻害剤）との併用のいずれかにおいて、対象での腫瘍量を減少させるために、ＣＡＲ療法の投与前に最初に対象に提供することができる。あるいは、ＡＤＣ療法およびＣＡＲ療法は、同時に対象に提供してもよい。あるいは、ＣＡＲ療法を最初に提供し、その後にＡＤＣ療法を提供してもよい。

【0087】

ＲＮＡ不安定化エレメント
ＲＮＡ不安定化エレメント（ＲＤＥ）は、ＲＮＡ分子の安定性もしくはＲＮＡ分子の翻訳動態に影響を与えるか、または維持する核酸である。いくつかのＲＤＥには、ＲＮＡを不安定化（例えば、切断）するかまたは翻訳を妨げるポリペプチドが結合し、ＲＮＡの機能の喪失をもたらす。いくつかのＲＤＥ結合ポリペプチドは、ＲＮＡを安定化し、ＲＮＡの半減期を延長させる。ＲＤＥは、導入遺伝子、例えば、キメラ抗原受容体をコードする導入遺伝子の発現を制御するために使用され得る。ＲＤＥは、導入遺伝子の発現を調節するために、ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、および／またはＳｉｄｅ ＣＡＲと共に使用され得る。ＲＤＥは、ＣＡＲ以外のポリペプチドをコードする導入遺伝子の発現を制御するためにも使用され得る。他の導入遺伝子は、例えば、サイトカイン、抗体、チェックポイント阻害剤、グランザイム、アポトーシス誘導因子、補体、細胞傷害性小分子、他の細胞傷害性化合物、画像化用のポリペプチド、または所望の効果を有し得る他のポリペプチドをコードし得る。ＲＤＥは、導入遺伝子ペイロードの送達を制御し得る。ＲＤＥの例には、例えば、ＡＵリッチエレメント、Ｕリッチエレメント、ＧＵリッチエレメント、および特定のステムループエレメントが含まれる。例示的なＲＤＥは、Kovarik等、Cytokine 89:21～26頁(2017)；Ray等、Nature 499:172～177頁(2013)；Castello等、Cell 149:1393～1406頁(2012)；Vlasova等、Molc. Cell. 29:263～270頁(2008)；Barreau等、Nucl. Acids Res.第33巻、doi:10.1093/nar/gki1012 (2006)；Meisner等、ChemBioChem 5:1432～1447頁(2004)；Guhaniyogi等、Gene 265:11～23頁(2001)に記載されており、それらのすべて、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている。

【0088】

ＲＤＥは、クラスＩ ＡＵリッチエレメント（Ｕリッチコンテキスト（U rich context）での分散ＡＵＵＵＡ（配列番号１７））、クラスＩＩ ＡＵリッチエレメント（重複（ＡＵＵＵＡ）_ｎ）、クラスＩＩＩ ＡＵリッチエレメント（Ｕリッチストレッチ）、ステムループ不安定化エレメント（ＳＬＤＥ）、サイトカイン３’ＵＴＲ（例えば、ＩＮＦ－γ、ＩＬ－２、Ｔ細胞受容体α鎖、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ等）、およびＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡの配列（配列番号１８）であり得る。Khabar, WIREs RNA 2016, doi: 10.1002/wrna.1368 (2016)；Palanisamy等、J. Dent. Res. 91:651～658頁(2012)、その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている。ＲＤＥは、例えば、ＵＵＧＵＵ（配列番号１９）、ＵＧＧＧＧＡＵ（配列番号２０）、またはＧＵＵＵＧ（配列番号２１）の１つまたは複数からなるＧＵリッチエレメントでもあり得る。ＲＤＥは、例えば、ＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号２２）、ＮＮＵＵＮＮＵＵＵ（配列番号２３）、ＵＵＵＡＵＵＵ（配列番号２４）、ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号２５）、ＵＵＡＧＡ（配列番号２６）、またはＡＧＵＵＵ（配列番号２７）の１つまたは複数からなるＵリッチエレメントであり得る。一部の態様では、調節ユニットを作製するために複数のＲＤＥが組み合わされてもよく、例えば、同じ配列を有する複数のＲＤＥが、コンカテマー中に配置されてもよく、またはＲＤＥの一部もしくは全部の間に介在配列がある状態で配置されてもよい。ＲＤＥ配列は、ＲＤＥに対するＲＮＡ結合タンパク質の親和性を上昇または低下させるように修飾され得る。例えば、ＲＤＥに対するグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の親和性を変更するために、ＡＵリッチＲＤＥを変えてもよい。親和性のこの変化は、ＧＡＰＤＨが結合するＲＤＥにより調節される導入遺伝子の発現に関するＧＡＰＤＨ活性化閾値を変更し得る。

【0089】

本開示は、いくつかのＲＤＥにＡＵ＃名称を指定しており、これらのＲＤＥは、ＡＵ＃または、ＲＤＥが由来する遺伝子名により呼ばれ得る。いくつかのＡＵ＃および、ＲＤＥが由来する対応する遺伝子には、例えば、ＡＵ１（ＣＤ４０ＬＧ）、ＡＵ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ３（ＣＤ２４７）、ＡＵ４（ＣＴＬＡ４）、ＡＵ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ６（ＩＬ２ＲＡ）、ＡＵ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ８（ＴＲＡＣ）、ＡＵ９（ＣＤ２７４）、ＡＵ１０（Ｍｙｃ）、ＡＵ１１（ＣＤ１９）、ＡＵ１２（ＩＬ４）、ＡＵ１３（ＩＬ５）、ＡＵ１４（ＩＬ６）、ＡＵ１５（ＩＬ９）、ＡＵ１６（ＩＬ１０）、ＡＵ１７（ＩＬ１３）、ＡＵ１８（ＦＯＸＰ３）、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、ＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）、ＡＵ２４（ＣＤ８）、ＡＵ２７（ｂＧＨ）、およびＡＵ１０１（ＩＦＮｇ）が含まれる。

【0090】

ＲＤＥは、例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＶＥＧ Ｆ、ＰＧＥ_２、ＣＯＸ－２、ＭＭＰ（マトリクスメタロプロテイナーゼ）、ｂＦＧＦ、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆｏｓ、ベータ１－ＡＲ、ＰＴＨ、インターフェロン－ガンマ、ＭｙｏＤ、ｐ２１、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ＰＡＩ－２、ＮＯＳ ＨＡＮＯＳ、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロン－アルファ、ｂｃｌ－２、インターフェロン－ベータ、ｃ－ｊｕｎ、ＧＬＵＴ１、ｐ５３、ミオゲニン、ＮＦ－Ｍ、またはＧＡＰ－４３、リンパ球抗原９６、ＳＵＰＶ３Ｌ１、ＳＦｔＰＡ２、ＢＬＯＣ１Ｓ２、ＯＲ１０Ａ６、ＯＲ８Ｄ１、ＴＲＰＴ１、ＣＩＰ２９、ＥＰ４００、ＰＬＥ２、Ｈ３ＳＴ３Ａ１、ＺＮＦ５７１、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＳＰＡＧ４Ｌ、ＯＲ１０Ａ６、およびＫＩＲ３ＤＬをコードする遺伝子の３’ＵＴＲ由来であり得る。他のＲＤＥは、例えば、ＧＬＭＮ、ＡＭＹ２Ｂ、ＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ２Ａ、ＡＭＹ１Ａ、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３３、ＴＲＩＭ３３、ＣＳＲＰ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ、ＫＣＮＨ１、レティキュロン４、ＭＲＰＬ３０、Ｎａｖ１．２、組織因子経路インヒビター、ＥＥＦ１Ｂ２、ＣＲＹＧＢ、ＡＲＭＣ９、ＲＰＬ１５、ＥＡＦ２、ＭＲＰＳ２２、ＭＲＰＳ２２、ＣＯＰＢ２、ＰＤＣＤ１０、ＲＥ１サイレンシング転写因子、アンフィレギュリン、ＡＰ１ＡＲ、ＴＬＲ３、ＳＫＰ２、ペプチジルグリシンアルファ－アミド化モノオキシゲナーゼ、ＴＮＦＡＩＰ８、インターロイキン９、ＰＣＤＨＡ２、ＰＣＤＨＡ１２、アルデヒドデヒドロゲナーゼ５ファミリーメンバーＡ１、ＫＣＮＱ５、ＣＯＸ７Ａ２、モノカルボン酸トランスポータ１０、ＭＬＬＴ４、ＰＨＦ１０、ＰＴＰＮ１２、ＭＲＮＡ（グアニン－Ｎ７－）－メチルトランスフェラーゼ、ＷＨＳＣ１Ｌ１、毛髪鼻指節骨症候群１型、インターフェロンアルファ－１、ＺＣＣＨＣ６、網膜色素変性症ＧＴＰａｓｅ調節因子、ＭＥＤ１４、ＣＬＣＮ５、ＤＮＡ２Ｌ、ＯＲ５２Ｄ１、ＮＥＬＬ１、ＳＬＣ２２Ａ２５、ＳＬＣ２２Ａ１０、ＴＲＰＣ６、ＣＡＣＮＡ２Ｄ４、ＥＰＳ８、ＣＴ２（遺伝子）、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ４２、ＴＡＯＫ３、ＮＵＰＬ１、エンドセリン受容体Ｂ型、運動ニューロンタンパク質相互作用タンパク質１の生存、ＰＯＬＥ２、肝性リパーゼ、ＴＰＳＧ１、ＴＲＡＰ１、ＲＰＳ１５Ａ、ＨＳ３ＳＴ３Ａ１、ＣＲＯＰ（遺伝子）、アポリポタンパク質Ｈ、ＧＲＢ２、ＣＥＰ７６、ＶＰＳ４Ｂ、インターロイキン２８Ｂ、ＩＺＵＭＯ１、ＦＧＦ２１、ＰＰＰ１Ｒ１５Ａ、ＬＩＮ７Ｂ、ｈｎＲＮＰＬＬ、Ｔｏｘ、およびＣＤＣ４５関連タンパク質由来の３’－ＵＴＲに見出される。

【0091】

さらに他のＲＤＥは、例えば、ＳＣＦＤ１、ＭＡＬ２、ＫＨＳＲＰ、ＩＱＣＢ１、ＣＡＭＰ応答性エレメントモジュレータ、ＭＦＡＰ５、ＳＢＦ２、ＦＫＢＰ２、ＰＤＣＤ１０、ＵＢＥ２Ｖ２、ＮＤＵＦＡＢ１、コイルドコイルドメイン含有タンパク質、ＡＬＧ１３、ＴＰＴＥ、エナプチン、チモポエチン、デルタ様１、Ｃ１１ｏｒｆ３０、アクチニンアルファ４、ＴＭＥＭ５９、ＳＰ１１０、ダイサー、ＴＡＲＤＢＰ、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１４、ＺＭＹＭ３、インターロイキン９ Ｉ型、ＯＰＮ１ＳＷ、ＴＨＳＤ１、ＥＲＧＩＣ２、ＣＡＭＫ２Ｂ、ＷＤＲ８、ＦＸＲ１、チミンＤＮＡグリコシラーゼ、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ＯＳＢＰＬ３、Ｒａｎ、ＧＹＰＥ、ＡＫＡＰ４、ＬＯＣ６４２６５８、Ｌ２ＨＧＤＨ、ＡＫＡＰ１、ジンクフィンガータンパク質３３４、ＴＣ２Ｎ、ＦＫＢＰＬ、ＧＲＢ１４、ＣＸｏｒｆ６７、ＣＸｏｒｆ６６、ＣＥＰ７６、ガストリシン、ＣＥＰ７０、ＣＹＰ２６Ａ１、ＮＡＡ３５、アリール炭化水素受容体核内輸送体、ＫＬＣ４、ＧＰＲ１１２、ＬＡＲＰ４、ＮＯＶＡ１、ＵＢＥ２Ｄ３、ＩＴＧＡ６、ＧＰＲ１８、ＭＧＳＴ Ａ型、ＲＥ１サイレンシング転写因子、ＡＳＰＭ、ＺＮＦ４５２、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＡＨＳＡ１、ＴＭＴＣ４、ＶＳＸ１、Ｐ１６、ＭＲＰＬ１９、ＣＣＬ２０、ＴＲＰＴ１、肝性リパーゼ、ＰＤＬＩＭ５、ＣＣＤＣ５３、‘ＣＣＤＣ５５、ＧＡＰＶＤ１、ＨＯＸＢ２、ＫＣＮＱ５、ＢＲＣＣ３、ＧＴＦ２ＩＲＤ１、ＣＤＫ５ＲＡＰ３、転写因子ＩＩ Ｂ、ＺＥＢ１、ＩＲＧＭ、ＳＬＣ３９Ａ６、ＲＨＥＢ、ＰＳＩＰ１、ＲＰＳ６ＫＡ５、ウロキナーゼ受容体、ＧＦＭ１、ＤＮＡＪＣ７、ホスホイノシチド依存性キナーゼ１、ＬＭＯＤ３、ＴＴＣ３５、ＲＲＰ１２、ＡＴＸＮ２、ＡＣＳＭ３、ＳＯＡＴ１、ＦＧＦ８、ＨＮＲＰＨ３、ＣＴＡＧＥ５、ＰＯＬＧ２、ＤＹＲＫ３、ＰＯＬＫ、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤１Ｃ、ＣＤ１３７、カルモジュリン１、ＺＮＦ５７１、ＣＮＯＴ２、ＣＲＹＺＬ１、ＳＭＣ３、ＳＭＣ４、ＳＬＣ３６Ａ１、デコリン、ＨＫＲ１、ＥＲＣ１、Ｓ１００Ａ６、ＲＩＭＳ１、ＴＭＥＭ６７、ミトコンドリアリボソームタンパク質Ｌ４２、ＭＥＣＰ２、ＲＮＦ１１１、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＭＹＬＫ３、ＴＩＮＡＧ、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＲＧＰＤ５、ＵＢＥ２Ｖ１、ＳＡＲ１Ｂ、ＳＬＣ２７Ａ６、ＺＮＦ６３８、ＲＡＢ３３Ａ、ＴＲＩＯＢＰ、ＭＵＣＬ１、ＣＡＤＰＳ２、ＭＣＦ２Ｌ、ＴＢＣＡ、ＳＬＣ１７Ａ３、ＬＥＯ１、ＩＦＮＡ２１、ＲＵＮＸ１Ｔ１、ＰＲＫＤ２、ＡＴＰ１１Ｂ、ＭＯＲＣ２、ＲＢＭ６、ＫＬＲＤ１、ＭＥＤ３１、ＰＰＨＬＮ１、ＨＭＧＢ２、ＤＮＡ修復および組換えタンパク質ＲＡＤ５４様、ＲＢＭ９’、ＡＲＬ１１、ＨｕＤ、ＳＰＥＦ２、ＣＢＬＬ１、ＳＬＣ３８Ａ１、「カスパーゼ１」、Ｓ１００Ｇ、ＣＡ１＿、ＣＥＬＡ１、ＰＴＳ、ＩＴＭ２Ｂ、ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ、ＴＲＰＰ３、ＩＭＰＤＨ２、ＤＰＹＳ、ＣＤＣＡ３、ＥＦＣＡＢ６、ＳＬＩＴ２、ＳＩＰＡ１Ｌ１、ＦＩＰ１Ｌ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＨＳＤ１７Ｂ４、ＨＳＤ１７Ｂ７、ＮＤＵＦＣ１、ＣＲＯＰ、ＣＤ４８、ＡＰＰＢＰ１、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ヒストンデアセチラーゼ２ ＸＩ型、インターロイキン４、毛髪鼻指節骨症候群１型、ＳＥＣ６１Ｇ、ＴＲＩＰ１２、ＰＬＥＫＨＯ１、ＳＥＣ６１Ｂ、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、ＣＰＶＬ、Ｅ２Ｆ７、ＵＴＰ２０、Ｅ２Ｆ５、ＰＡＲＤ３、ＥＸＯＣ７、ＨＥＸＢ、カスパーゼ動員ドメイン含有タンパク質８、ＭＢＤ４、ＰＰＰ４Ｃ、ヘリカーゼ、ホスデューシン、ＳＰＧ１１、ＣＧＧＢＰ１、ＰＳＫＨ１、カテプシンＳ、オレキシン、ＩＭＭＰ２Ｌ、Ｃ２ｏｒｆ２８、ラミニン、ＥＩＦ３Ｓ６、ＬＲＲＣ４１ ＸＩＩ型、カテプシンＣ、ＨＰＳ６、ＡＲＡＦ、ジンクフィンガーおよびＢＴＢドメイン含有タンパク質１６、性ホルモン結合グロブリン、ＦＢＬＮ２、サイトカインシグナル伝達抑制因子１、ＴＭＥＭ１２６Ａ、ＤＯＭ３Ｚ、ＴＳＦＭ＿ＰＯＬＱ様、ＤＹＮＬＴ３、ＣＤＨ９、ＥＡＦ２、ＭＩＰＥＰ、ＮＤＵＦＡ１２、ＨＤＡＣ８、ＭＫＫＳ、ＦＧＧ、ＩＬ３６Ｇ、ＣＤＣＡ７、ＣＲＩＳＰＬＤ２、オルファクトメジン様２ｂ、ＭＲＰＬ３２、ＭＲＰＬ３３、ＡＨＩ１、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＵＴＰ１４Ａ、ＳＳＨ２、ジストニン、コンタクチン６、ＰＰＦＩＢＰ１、ＴＨＯＣ１、ＣＮＯＴ１、ＲＨＣＥ、ＳＬＣ４１Ａ３、ＳＬＣ２Ａ９、ＳＮＡＰ２３、ＲＦＸ３、ＧＮＧ４、ＭＲＰＬ４０、ＬＳＲ、アンジオゲニン、ＴＲＩＰ４、ＶＲＫ１、ＣＯＵＰ－ＴＦＩＩ、ＦＯＸＰ２、ＳＮＸ２、ヌクレオポリン８５、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ２７Ａ、ＳＥＣ６２、カルシウム活性化カリウムチャネルサブユニットアルファ１、ＳＭＡＲＣＥ１、ＲＰＬ１７、ＣＥＰ１０４、ＣＥＰ２９０、ＶＰＳ２９、ＡＮＸＡ４、ジンクフィンガータンパク質７３７、ＤＤＸ５９、ＳＡＰ３０、ＮＥＫ３、エキソソーム成分９、活性化Ｃキナーゼ１の受容体、ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ、ＴＩＮＰ１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＤＩＳＣ１、ＬＲＲＴＭ１、ＰＯＰ１ラミンＢ１、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質、ＣＯＸ６Ｃ、ＴＬＲ１、ＡＲＩＤ２、ＬＡＣＴＢ、ＭＭＳ２２Ｌ、ＵＢＥ２Ｅ３、ＤＡＰ３、ＺＮＦ２３、ＳＫＰ２、ＧＰＲ１１３、ＩＲＦ９、グレリンＯ－アシルトランスフェラーゼ、ＮＥＩＬ３、ＥＥＦ１Ｅ１、ＣＯＸ１７、ＥＳＤ＿、象牙質シアロホスホタンパク質、ＨＤＡＣ９、ＲＦＣ４、ＣＹＬＤ、ＲＰＬＰ０、ＥＩＦ２Ｂ３、ＵＧＴ２Ａ１、ＦＡＢＰ７、ＴＲＩＰ１１、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＩＮＴＳ１２、ＭＹＨ１、ＺＢＴＢ１７、ＭＹＨ４、ＮＬＲＰ２、ＭＥＣＯＭ、ＭＹＨ８、サーモゲニン受容体２、ＩＦＩ１６、ＴＨＹＮ１、ＲＡＢ１７、ＥＴＦＡ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子、Ｆ１３Ｂ、ＲＡＢ６Ａ、ＳＴ８ＳＩＡ１、ＳＡＴＢ２、ＳＡＴＢ１、ＨＭＧ２０Ｂ、ＵＨＲＦ１、ＣＮＯＴ３、プロスタグランジンＥＰ２受容体、ＦＡＭ６５Ｂ、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ、ＫｖＬＱＴ２、ＧＲＩＫ５、ＳＨＯＣ２、コルタクチン、ＦＡＮＣＩ、ＫＩＡＡ１１９９、キヌレニナーゼ、デコイ受容体１、ＮＥＵ３、ＰＨＦ１０、メチルＣｐＧ結合ドメインタンパク質２、ＲＡＢＧＡＰ１、ＣＥＰ５５、ＳＦ３Ｂ１、ＭＳＨ５、ＭＳＨ６、ＣＲＥＢ結合タンパク質、ＬＩＭＳ１、ＳＬＣ５Ａ４、ＣＣＮＢ１ＩＰ１、ＲＮＦ３４、ＳＯＲＢＳ２、ＵＩＭＣ１、ＳＯＸ５、ＹＷＨＡＺ、ＩＣＯＳＬＧ、ＮＯＰ５８、ジンクフィンガータンパク質６７９、ＰＨＫＢ、ＭＥＤ１３、ＡＢＣＢ７、ＣＯＱ９、Ｃ１４ｏｒｆ１０４、ジンクフィンガータンパク質５３０、ＫＬＲＣ２、ＬＳＭ８、ＮＢＲ１、ＰＲＫＣＤ、長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＭＴＳＳ１、ソマトスタチン、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼＬ５、ＷＤＲ７２、ＦＥＲＭＴ３、核内受容体関連－１タンパク質、クエン酸シンターゼ、ＶＰＳ１１、ＫＩＺ、ＺＦＹＶＥ２７、ＢＣＫＤＨＢ、ヒポクレチン、ＣＡＣＮＧ２、ＰＴＣＨ１、カルボニックアンヒドラーゼ４、ヌクレオポリン１０７、ＬＤＬ受容体、ＬＥＫＴＩ、ＦＢＸＯ１１、ＮＤＵＦＢ３、ＦＣＨＯ２、ＣＥＰ７８、ＲＡＰＧＥＦ６、ＰＰＩＬ３、ＮＩＮ、ＲＡＰＧＥＦ２、成長ホルモン１、成長ホルモン２、ＭＮＡＴ１、Ｎａｖ１、ＭＡＰ３Ｋ８、ＳＵＧＴ１、ＬＡＩＲ１、ヒアルロナン媒介運動性受容体、ＭＡＰ３Ｋ２、ＭＰＰ２、ＴＦＢ２Ｍ、ＣＲＢ３、ＭＰＰ５、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＤＬＧＡＰ２、ＩＮＨＢＡ、ＭＡＧＩ２、ＣＩＰ２９、ＳＥＴＤＢ１、チトクロムｂ５、ＴＲＰＶ２、インターロイキン１受容体、ＨＯＸＤ８、ＴＩＭＭ１０、ＡＴＸＮ２Ｌ、ＣＬＣＮ２、ＣＲＥＢ１、ＴＮＩＰ１、ＣＢＬＢ、第Ｖ因子、ＵＳＰ３３、ＳＯＮ、ＲＢＢＰ８、ＳＬＣ２２Ａ１８、ＰＴＰＮ１２、ＡＤＣＹ８、ＭＹＬＫ、ＫＩＦ２３、ＲＥＸＯ２、ＢＳＴ１、ＴＯＰ３Ｂ、ＣＯＰＢ１、ＡＸＩＮ２、ＣＯＰＢ２、ＴＮＲＣ６Ｂ、グアニジノアセタートＮ－メチルトランスフェラーゼ、アシルＣｏＡチオエステラーゼ９、Ｃ４ｏｒｆ２１、ＴＳＨＢ、ＦＲＳ３、ＥＰＢ４１、サイクリンＴ２、ＬＡＩＲ２、ヌクレオポリン４３、ＡＰＬＰ２、ＴＮＦＲＳＦ１９、死亡関連タンパク質６、上皮細胞接着分子、ＣＬＥＣ７Ａ、ゲフィリン、ＣＬＤＮＤ１、ＶＰＳ３７Ａ、ＰＣＤＨＡＣ２、骨形成タンパク質４、ＮＶＬ、ＲＢＭ３３、ＲＮＦ１３９、精子関連抗原５、ＰＬＣＢ１、グリア細胞株由来神経栄養因子、ＰＡＲＰ４、ＰＡＲＰ１、ＭＡＮ２Ａ１、骨形成タンパク質１、ＰＡＸ４、ＢＣＣＩＰ、ＭＭＰ７、デコイ受容体３、ＲＡＭＰ２、ＮＣＡＰＤ３、ＬＲＲＣ３７Ａ、ＲＷＤＤ３、ＵＢＥ２Ａ、ＵＢＥ２Ｃ、ＳＬＣ３Ａ１、ＭＲＰＳ２２、ＣＤＣ１４Ａ、ＩＴＳＮ１、ＰＯＬＥ２、ＭＹＣ誘導性核抗原、ＴＭＬＨＥ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ、ＧＰＲ１７７、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ、ＫＩＡＡ１３３３、ＲＰＰ３８、ＭＹＯ１Ｆ、ファルネソイドＸ受容体、カルデスモン、ＦＢＸＯ４、ＦＢＸＯ５、ＯＰＮ１ＭＷ、ＰＩＧＮ、ＡＲＮＴＬ２、ＢＣＡＳ３、Ｃ６ｏｒｆ５８、ＰＨＴＦ２、ＳＥＣ２３Ａ、ＮＵＦＩＰ２、ＯＡＺ１、オステオプロテゲリン、ＡＮＡＰＣ４、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ２、ＳＰＡＭ１、ＰＳＭＡ６、ＴＡＳ２Ｒ３０、ＲＡＢＥＰ１、ＤＰＭ３、ＳＬＣ６Ａ１５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＡＲＨＧＡＰ２４、カテコール－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、ＥＲＣＣ５、転写開始タンパク質ＳＰＴ３ホモログ、ＯＲ１Ｅ１、ＺＮＲＦ１、ＧＭＥＢ１、ＣＣＴ２ ＧＮＡＱ、ムチン６、ムチン４、ＬＲＰ５、ＰＤＥ９Ａ、Ｃ２ｏｒｆ３、ＥＺＨ２、上皮成長因子受容体、ＴＭＴＣ２、ＰＤＥ４Ａ、ＥＰＨ受容体Ａ４、ＰＰＩＢ、ＤＥＮＮＤ４Ａ、ＡＮＴＸＲ１、ＡＮＴＸＲ２、ヌクレオポリン８８、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＣＯＧ８、ＲＢＭＳ１、ＭＡＰ７、ＨＩＳＴ２Ｈ２ＢＥ、ＡＥＢＰ２、ＤＣＬＲＥ１Ａ、ＲＰＬ２４、ＨＮＲＰＡ２Ｂ１、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２３、ＭＡＰＫＡＰ１、ＮＩＰＢＬ、ＡＴＧ７、ＳＥＲＰＩＮＩ２、ＧＹＬＴＬ１Ｂ、ＡＴＰ５Ｇ２、ＤＩＰ２Ａ、ＡＭＹ２Ａ、ＣＥＰ６３、ＴＤＲＤ７、ＰＩＥＺＯ１、ＣＬＤＮ２０、ＧＲＸＣＲ１、ＰＭＥＬ、ＮＩＦ３Ｌ１、ＭＣＣ＿、ＰＣＮＸ、ＴＭＢＩＭ４、ＤＵＳＰ１２、ＺＭＹＮＤ８、ＧＯＳＲ１、インターフェロンガンマ受容体１、ＬＤＢ３、ＰＯＮ３、Ｃ１Ｄ、ＡＢＣＣ８、ＣＯＱ７、ＣＯＱ６、ＡＭＥＬＹ、ＨＡＶＣＲ１、ＰＩＣＡＬＭ、シェーグレン症候群抗原Ｂ、ＰＬＫ４、ＨＢＢ、ＡＫＴ１、ＰＣＤＨＧＢ７、Ｃ６ｏｒｆ１０、ＵＢＲ１、網膜芽細胞腫様タンパク質１、ＧＲＫ６、ＷＷＣ２、ＧＲＫ４、ＩＮＰＰ４Ｂ、ＳＬＣ３４Ａ１、ＧＯＬＧＡ２、ＭＹＣＢＰ２、ＰＴＰ４Ａ２、ＮＵＣＢ２、ＭＡＧＯＨ、ＲＰＰ４０、アルファ－２Ａアドレナリン作動性受容体、ＳＰＡＧ１１Ｂ、ヌクレオポリン２０５、ＣＯＧ１、運動精子ドメイン含有３、ＫＣＮＭＢ３、運動精子ドメイン含有１、ＫＬＨＬ７、ＫＣＮＮ２、ＴＳＰＡＮ８、ＧＰＲ２１、輸送体タンパク質、ＨＮＲＮＰＬＬ、ＡＢＨＤ５、ＣＡＢ３９Ｌ、アンフィレギュリン、ＧＰＲ１、インターロイキン１８、ＥＩＦ４Ｇ３、インターロイキン１５、ＣＣＤＣ８０、ＣＤ２ＡＰ、ＮＦＳ１、ＧＲＢ２、ＵＬＢＰ２、血管内皮増殖因子Ｃ、ＲＰＳ３、ＴＬＲ８、ＢＣＬ２関連タンパク質Ａ１、ＲＨＯＴ１、コラーゲン、セントロメアタンパク質Ｅ、ＳＴＭＮ２、ＨＥＳＸ１、ＲＰＬ７、カリリン、ＰＣＭＴ１、ＨＬＡ－Ｆ、ＳＵＭＯ２、ＮＯＸ３、ＥＰ４００、ＤＮＭ３、ＥＥＤ、ＮＧＬＹ１、ＮＰＲＬ２、ＰＬＡＣ１、バキュロウイルスＩＡＰリピート含有タンパク質３、Ｃ７ｏｒｆ３１、ＴＵＢＡ１Ｃ、ＨＡＵＳ３、ＩＦＮＡ１０、ＭＹＳＴ４、ＤＣＨＳ１、ＳＩＲＴ４、ＥＦＥＭＰ１、ＡＲＰＣ２、ＭＥＤ３０、ＩＦＴ７４、ＰＡＫ１ＩＰ１、ＤＹＮＣ１ＬＩ２、ＰＯＬＲ２Ｂ、ＰＯＬＲ２Ｈ、ＫＩＦ３Ａ、ＰＲＤＭ１６、ＰＬＳＣＲ５、ＰＥＸ５、副甲状腺ホルモン１受容体、ＣＤＣ２３、ＲＢＰＭＳ、ＭＡＳＴ１、ＮＲＤ１、ＢＡＴ５、ＢＡＴ２、Ｄｏｃｋ１１、ＧＣＳＨ、ＰＯＦ１Ｂ、ＵＳＰ１５、ＰＯＴ１、ＭＵＴＹＨ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＦＡＭ１２２Ｃ、Ａ１ポリペプチド、フラビン含有モノオ
キシゲナーゼ３、ＨＰＧＤ、ＬＧＡＬＳ１３、ＭＴＨＦＤ２Ｌ、生存運動ニューロンドメイン含有１、ＰＳＭＡ３、ＭＲＰＳ３５、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ、ＳＧＣＥ、ＲＥＰＳ１、ＰＰＰ１Ｒ１２Ａ、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ、ＰＡＢＰＣ１、ＭＡＰＫ８、ＰＤＣＤ５、ホスホグルコムターゼ３、ユビキチンＣ、ＧＡＢＰＢ２、ミトコンドリア翻訳放出因子１、ＰＦＤＮ４、ＮＵＢ１、ＳＬＣ１３Ａ３、ＺＦＰ３６Ｌ１、ガレクチン－３、ＣＣ２Ｄ２Ａ、ＧＣＡ、組織因子経路インヒビター、ＵＣＫＬ１、ＩＴＦＧ３、ＳＯＳ１、ＷＷＴＲ１、ＧＰＲ８４、ＨＳＰＡ１４、ＧＪＣ３、ＴＣＦ７Ｌ１、マトリクスメタロペプチダーゼ１２、ＩＳＧ２０、ＬＩＬＲＡ３、血清アルブミン、ホスデューシン様、ＲＰＳ１３、ＵＴＰ６、ＨＰ１ＢＰ３、ＩＬ１２Ａ、ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ２、ＬＡＴＳ１、ＢＭＦ＿、チモシンベータ－４、Ｂ細胞リンカー、ＢＣＬ２Ｌ１１、凝固因子ＸＩＩＩ、ＢＣＬ２Ｌ１２、ＰＲＰＦ１９、ＳＦＲＳ５、インターロイキン２３サブユニットアルファ、ＮＲＡＰ、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１４、Ｃ９ｏｒｆ６４、テスチン、ＶＰＳ１３Ａ、ＤＧＫＤ、ＰＴＰＲＢ、ＡＴＰ５Ｃ１、ＫＣＮＪ１６、ＫＡＲＳ、ＧＴＦ２Ｈ２、ＡＭＢＮ、ＵＳＰ１３、ＡＤＡＭＴＳＬ１、ＴＲＯ＿、ＲＴＦ１、ＡＴＰ６Ｖ１Ｃ２、ＳＳＢＰ１、ＳＮＲＰＮ上流リーディングフレームタンパク質、ＲＰＳ２９、ＳＮＲＰＧ、ＡＢＣＣ１０、ＰＴＰＲＵ、ＡＰＰＬ１、ＴＩＮＦ２、ＴＭＥＭ２２、ＵＮＣ４５Ａ、ＲＰＬ３０、ＰＣＤＨ７、ガラクトサミン－６スルファターゼ、ＵＰＦ３Ａ、ＡＣＴＬ６Ａ、ＡＣＴＬ６Ｂ、ＩＬ３ＲＡ、ＳＤＨＢ、カテプシンＬ２、ＴＡＳ２Ｒ７、カテプシンＬ１、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド、ＲＰＮ２、ＤＹＮＬＬ１、ＫＬＫ１３、ＮＤＵＦＢ３、ＰＲＰＦ８、ＳＰＩＮＴ２、ＡＨＳＡ１、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ、ＤＲＡＰ１、ＲＮＡＳＥ１、オルファクトメジン様２ｂ、ＶＲＫ１、ＩＫＫ２、ＥＲＧＩＣ２、ＴＡＳ２Ｒ１６、ＣＡＭＫ２Ｇ、ＣＡＭＫ２Ｂ、エストロゲン受容体ベータ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＲＰＬ１９、ＮＵＣＢ２、ＫＣＴＤ１３、ユビキノン、Ｈ２ＡＦＹ、ＣＥＰ２９０、ＰＡＢＰＣ１、ＨＬＡ－Ｆ、ＤＨＸ３８、ＫＩＡＡ０９２２、ＭＰＨＯＳＰＨ８、ＤＤＸ５９、ＭＩＢ２＿、ＺＢＰ１、Ｃ１６ｏｒｆ８４、ＵＡＣＡ、Ｃ６ｏｒｆ１４２、ＭＲＰＬ３９、サイクリン依存性キナーゼ７、遠位上流エレメント結合タンパク質１、ＳＧＯＬ１、ＧＴＦ２ＩＲＤ１、ＡＴＧ１０、ダームシジン、ＥＰＳ８Ｌ２、デコリン、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＣＤＣ２０、ＭＹＢ、ＷＮＴ５Ａ、ＲＢＰＪ、ＤＥＦＢ１０３Ａ、ＲＰＳ１５Ａ、ＡＴＰ５Ｈ、ＲＰＳ３、ＦＡＢＰ１、ＳＬＣ４Ａ８、血清アミロイドＰ成分、ＡＬＡＳ１、ＭＡＰＫ１、ＰＤＣＤ５、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＣＨＲＮＡ３、ＡＴＸＮ１０、ＭＮＡＴ１、ＡＬＧ１３、アタキシン３、ＬＲＲＣ３９、ＡＤＨ７、デルタ－サルコグリカン、ＴＡＣＣ１、ＩＦＮＡ４、胸腺間質リンホポエチン、ＬＧＴＮ、ＫＩＡＡ１３３３、ＭＳＨ６、ＭＹＯＴ、ＲＩＰＫ５、ＢＣＬ２Ｌ１１、ＲＰＬ２７、Ｒｎｄ１、血小板因子４、ＨＳＤ１７Ｂ７、ＬＳＭ８、ＣＥＰ６３、ＩＮＴＳ８、ＣＴＮＳ、ＡＳＡＨＬ、ＣＥＬＡ３Ａ、ＳＭＡＲＣＡＬ１、ＨＥＸＢ、ＳＬＣ１６Ａ５、ＭＡＰ３Ｋ１２、ＦＲＭＤ６の３’ＵＴＲ中に見出され得る。

【0092】

さらなるＲＤＥが、長い非コードＲＮＡの３’－ＵＴＲ、またはｍｉＲＮＡをコードする一次転写物中に見出される。例えば、ＴＨＲＩＬ（ｌｉｎｃ １９９２）、ＮＩＫＩＬＡ ｌｎｃＲＮＡ、ＳｅＴ ｌｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡｓ ｕｃ．１９７、ＲＰ１１－１７２Ｅ９．２、ＬＩＮＣ００５９８、ｌｎｃＲＮＡｓ ＬＯＣ１００１２８０９８、ＲＰ１１－１５００１２．３の３’－ＵＴＲ、ならびにｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－ｌｅｔ７ｅ、ｍｉＲ－１８１ｃ、ｍｉＲ－１５５、ｍｉＲ－１２５ｂ、およびｍｉＲ－１６をコードする一次転写物、からのＲＤＥ。

【0093】

ＲＤＥのクラスには、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）などの解糖系酵素が結合するものが含まれる。ＲＤＥのこのグループには、例えば、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、およびＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）が含まれる。

【0094】

ＲＤＥは、例えば、ｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆｏｓ、ｂｅｔａ１－ＡＲ、ＰＴＨ、インターフェロン－ガンマ、ＭｙｏＤ、ｐ２１、サイクリンＡ、サイクリンＢ１、サイクリンＤ１、ＰＡＩ－２、またはＮＯＳ ＨＡＮＯＳをコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じるクラスＩ ＡＵリッチエレメントであり得る。ＲＤＥは、クラスＩＩ ＡＵリッチエレメントでもあり得て、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－アルファ、インターフェロン－アルファ、ＣＯＸ－２、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ｂｃｌ－２、インターフェロン－ベータ、またはＶＥＧ－Ｆをコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じる。ＲＤＥは、例えば、ｃ－ｊｕｎ、ＧＬＵＴ１、ｐ５３、ｈｓｐ７０、ミオゲニン、ＮＦ－Ｍ、またはＧＡＰ－４３をコードする遺伝子の３’ＵＴＲから生じるクラスＩＩＩ ＡＵリッチエレメントであり得る。他のＲＤＥは、Ｔ細胞受容体サブユニット（α、β、γ、またはδ鎖）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ－１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、およびリンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ３）、ならびに他のチェックポイント阻害剤の３’－ＵＴＲから得られ得る。さらに他のＲＤＥが、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているCoppe等、Ann. Rev. Pathol. 5:99～118頁(2010)（例えば、表１を参照）において開示される老化関連分泌表現型遺伝子の３’－ＵＴＲから得られ得る。

【0095】

ＲＤＥには、ある特定のポリペプチドが結合し得て、例えば、ＡＲＥポリ（Ｕ）結合／分解因子（ＡＵＦ－１）、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）、ヒト抗原関連タンパク質（ＨｕＲ）、ブチラート応答因子１（ＢＲＦ－１）、ブチラート応答因子２（ＢＲＦ－２）、Ｔ細胞制限細胞内抗原－１（ＴＩＡ－１）、ＴＩＡ－１関連タンパク質（ＴＩＡＲ）、ＣＵＧトリプレットリピート、ＲＮＡ結合タンパク質１（ＣＵＧＢＰ－１）、ＣＵＧトリプレットリピート、ＲＮＡ結合タンパク質２（ＣＵＧＢＰ－２）、ヒトニューロン特異的ＲＮＡ結合タンパク質（Ｈｅｌ－Ｎ１、Ｈｅｌ－Ｎ２）、ＲＮＡ結合タンパク質ＨｕＡ、ＨｕＢおよびＨｕＣ、ＫＨタイプスプライシング調節タンパク質（ＫＳＲＰ）、３－メチルグルタコニル－ＣｏＡヒドラターゼ（ＡＵＨ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、熱ショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）、熱ショックタンパク質１０（Ｈｓｐ１０）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ａ１（ｈｎＲＮＰ Ａ１）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ａ２（ｈｎＲＮＰ Ａ２）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ａ３（ｈｎＲＮＰ Ａ３）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ｃ（ｈｎＲＮＰ Ｃ）、ヘテロ核リボ核タンパク質Ｌ（ｈｎＲＮＰ Ｌ）、Ｂｃｌ－２ＡＵリッチエレメントＲＮＡ結合タンパク質（ＴＩＮＯ）、ポリ（Ａ）結合タンパク質相互作用タンパク質２（ＰＡＩＰ２）、ＩＲＰ１、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、エノラーゼ、ならびにアルドラーゼが含まれる。ＲＤＥ結合タンパク質は、解糖または炭水化物代謝に関与する酵素でもあり得て、例えば、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、エノラーゼ（ＥＮＯ１もしくはＥＮＯ３）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ１）、ヘキソキナーゼ（ＨＫ－２）、または乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）などである。ＲＤＥ結合タンパク質は、ペントースリン酸シャント路に関与する酵素であり得て、例えば、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）またはトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）が含まれる。さらなる例示的なＲＮＡ結合タンパク質は、Castello等、Molc. Cell 63:696～710頁(2016)；Kovarik等、Cytokine 89:21～26頁(2017)；Ray等、Nature 499:172～177頁(2013)；Castello等、Cell 149:1393～1406頁(2012)；Vlasova等、Molc. Cell. 29:263～270頁(2008)；Barreau等、Nucl. Acids Res.第33巻、doi:10.1093/nar/gki1012 (2006)；Meisner等、ChemBioChem 5:1432～1447頁(2004)；Guhaniyogi等、Gene 265:11～23頁(2001)に記載されており、それらのすべて、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている。

【0096】

ＲＤＥ結合タンパク質は、例えば、ＵＵＡＵＵＵＡＵＵ（配列番号２８）およびＡＵＵＵＡ（配列番号１７）の１つもしくは複数を含むＲＤＥに結合し得るＴＴＰ、または、ＡＵリッチＲＤＥに結合するＫＳＲＰ、または、例えば、ＵＵＧＡ（配列番号２９）、ＡＧＵＵＵ（配列番号２７）、もしくはＧＵＵＵＧ（配列番号２１）の１つもしくは複数を含むＲＤＥに結合するＡｕｆ１、または、例えば、ＵＵＧＵＵ（配列番号１９）の１つもしくは複数を含むＲＤＥに結合するＣＥＬＦ－１、または、例えば、ＵＵＵＡＵＵＵ（配列番号２４）、ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号２５）、もしくはＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号２２）の１つもしくは複数を含むＲＤＥに結合するＨｕＲ、または、例えば、ＵＧＧＧＧＡＵ（配列番号３０）の１つもしくは複数を含むＲＤＥに結合するＥＳＲＰ１もしくはＥＳＲＰ２、または、例えば、ＵＵＵＧＵＵＵ（配列番号２２）の１つもしくは複数を含むＲＤＥに結合するＥＬＡＶ、であり得る。ＲＤＥ結合タンパク質は、解糖に関与する酵素であり得て、例えば、ＡＵＵＵＡ（配列番号１７）エレメントの１つもしくは複数を含むＡＵリッチエレメントに結合するＧＡＰＤＨ、または、例えば、ＣＵＧＣＵＧＣＵＧ（配列番号３１）の１つもしくは複数を含むＲＤＥに結合するＥＮＯ３／ＥＮＯ１、または、例えば、ＡＵＵＧＡ（配列番号３２）の１つもしくは複数を含むＲＤＥに結合するＡＬＤＯＡが含まれる。

【0097】

一態様では、ＲＤＥによる調節をリガンド誘導性にするために、ＲＤＥは、ＲＮＡ制御デバイスと組み合わされ得る。例えば、ＲＤＥは、ＲＮＡ制御デバイスに作動可能に連結され得て、その場合、ＲＮＡ制御デバイスによるリガンド結合が、ＲＤＥを阻害する調節エレメント（例えば、リボザイムまたはリボスイッチ）を活性化する（例えば、リボザイムは、ＲＤＥを切断するため、ＲＤＥ結合タンパク質がもはや結合しなくなる、またはリボスイッチは、二次構造を変更する）。これは、ＲＤＥおよびＲＮＡ制御デバイスを含む転写物を、ＲＤＥからの２種類の制御下に置く。第１に、ＲＤＥは、細胞内の条件により支配されるように、ＲＤＥ結合タンパク質の結合の対象となる転写物を調節することができ、第２に、ＲＤＥ制御は、ＲＮＡ制御デバイスをリガンドで誘導することにより除去することができる。リガンドが添加されると、ＲＮＡ制御デバイスは、ＲＤＥを結合に利用できなくさせ、ＲＤＥ調節が取り除かれる。リガンドが除去されると、転写される新たな転写物は、ＲＤＥの制御下であり得る（ＲＮＡ制御デバイスが活性化されないため）。あるいは、ＲＤＥは、ＲＮＡ制御デバイスに作動可能に連結され得て、この場合、リガンド結合が調節エレメント（例えば、リボザイム）をオフにする。この例では、リガンドの存在がＲＮＡ制御デバイスを阻害し、転写物はＲＤＥにより調節され得る。リガンドが除去されると、ＲＮＡ制御デバイスは、ＲＤＥ結合タンパク質への結合にＲＤＥを利用できなくさせ、転写物のＲＤＥ調節が取り除かれる。ＲＮＡ制御デバイスはまた、ＲＤＥタンパク質がＲＤＥに結合するのを阻害する構造（例えば、ヘリックス）を形成するようにＲＤＥに結合するポリヌクレオチドを切断もし得る。この例では、ＲＮＡ制御デバイスは、阻害性ポリヌクレオチドを切断し得て、すると、その阻害性ポリヌクレオチドは、ＲＤＥに結合しないか、またはＲＤＥへの結合が阻害される。ＲＮＡ制御デバイスによるこの切断は、リガンド結合により刺激され得るか、またはリガンド結合により阻害され得る。

【0098】

異なるＲＤＥは、異なる動態パラメータ、例えば、異なる定常発現レベル、異なるＴ_ｍａｘ（最大発現レベルまでの時間）、異なるＣ_ｍａｘ（最大発現レベル）、異なるダイナミックレンジ（発現／基底発現）、異なるＡＵＣ、誘導の異なる動態（発現率の加速および発現率の速度）、発現量、ベースライン発現、最大ダイナミックレンジ（ＤＲ_ｍａｘ）、ＤＲ_ｍａｘまでの時間、曲線下面積（ＡＵＣ）等を有する。さらに、ＲＤＥのこれらの動態特性は、同じＲＤＥのコンカテマーを作製すること、または異なるＲＤＥを調節ユニットへと組み合わせることにより変更することができる。作動可能に連結されたＲＮＡ制御デバイスの制御下にＲＤＥを置くことも、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、またはＲＤＥ組合せの動態特性を変更し得る。さらに、ＲＤＥを結合するＲＤＥ結合タンパク質の可用性に影響を及ぼす小分子または他の分子も、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組合せの動的応答を変更するために使用され得る。ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組合せの動的応答は、転写物中において競合性ＲＤＥを発現する構築物を使用して変えることができる。１つまたは複数の競合するＲＤＥを含むそのような転写物は、ＲＤＥ結合タンパク質を競合し得るため、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組合せによる、所望の遺伝子の調節を変更する。これらの競合性ＲＤＥ転写物は、ＲＤＥ結合タンパク質に結合して、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組合せへの結合のために利用可能であるＲＤＥ結合タンパク質の量を減少させることができる。したがって、ＲＤＥ、ＲＤＥコンカテマー、および／またはＲＤＥ組合せは、導入遺伝子の発現に所望の動的応答をもたらすように選択する、および／または他の条件（前記で考察）と組み合わすことができる。

【0099】

実施例９の表２は、異なるＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）が発現の異なる動態をもたらしたことを示す。例えば、異なるＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、異なる時点において最大誘導（誘導倍率としても知られる最大ダイナミックレンジ）に達した。ＲＤＥ ＡＵ２およびＡＵ１０１は、１日時点で最大ダイナミックレンジ（ＤＲ_ｍａｘ）に達し、次いで、ダイナミックレンジ（ＤＲ）は減少し、基底発現と比べて低下した発現を示した。ＲＤＥ ＡＵ５およびＡＵ２１は、３／４日時点でＤＲ_ｍａｘを有し、この発現は、８日目まで維持された。ＲＤＥ ＡＵ３、ＡＵ７、ＡＵ１０、ＡＵ２０、およびＡＵ２３は、６日目にＤＲ_ｍａｘを有し、発現は、８日目に低下した。ＲＤＥ ＡＵ１９およびＡＵ２２は、８日目にＤＲ_ｍａｘを有した。ＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、発現量の差異も有し、ＡＵ７の発現をＡＵ１０と比べると約５５００倍の範囲にわたった（表１を参照）。したがって、ＲＤＥ（ＡＵエレメント）は、所望の時点で最大発現率をもたらすように、かつその時点で所望の量のポリペプチドをもたらすように選択することができる。

【0100】

いくつかのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＤＥへの結合後にＲＮＡ分解率を上昇させる。いくつかのＲＮＡ結合タンパク質は、ＲＤＥへの結合後にＲＮＡの分解率を低下させる。２つ以上のＲＮＡ結合タンパク質が、ＲＤＥに結合し得る。いくつかのＲＤＥ調節ユニットでは、２つ以上のＲＮＡ結合タンパク質が、２つ以上のＲＤＥに結合する。１つまたは複数のＲＤＥへの、ＲＮＡ結合タンパク質の１つまたは複数の結合は、ＲＮＡの分解率を上昇させ得る。ＲＮＡ結合タンパク質の１つまたは複数の結合は、ＲＮＡの分解率を低下させ得る。分解を高めるＲＮＡ結合タンパク質は、分解を低めるＲＮＡ結合タンパク質とＲＤＥへの結合を競合し得るため、ＲＮＡの安定性は、２つのＲＮＡ結合タンパク質の相対的結合に依存することになる。他のタンパク質が、ＲＤＥ結合タンパク質に結合して、ＲＤＥを含むＲＮＡに対するＲＮＡ結合タンパク質の効果を調節することができる。ＲＮＡ結合タンパク質へのタンパク質の結合は、ＲＮＡ安定性を上昇または低下させ得る。ＲＮＡは、タンパク質ＨｕＲおよびＴＴＰが結合する複数のＲＤＥを有し得る。ＨｕＲタンパク質は、ＲＮＡを安定化し得て、ＴＴＰタンパク質は、ＲＮＡを不安定化し得る。ＲＮＡは、タンパク質ＫＳＲＰ、ＴＴＰおよび／またはＨｕＲと相互作用する少なくとも１つのＲＤＥを有し得る。ＫＳＲＰは、ＲＮＡを不安定化し得て、かつＲＮＡを安定化し得るＨｕＲタンパク質と結合を競合し得る。ＫＳＲＰタンパク質は、ＲＤＥに結合し得て、ＲＮＡを不安定化し、ＴＴＰタンパク質は、ＫＳＲＰに結合して、ＲＮＡの分解を妨げることができる。異なるタンパク質が、同じ転写物に結合している場合があり、それらは、分解率および安定化率に対して競合効果を有し得る。異なるタンパク質が、同じ転写物に結合している場合があり、それらは、分解率および安定化率に対して協同効果を有し得る。異なるタンパク質が、異なる時間において同じ転写物に結合している場合があり、分解および安定化に対して異なる効果を与え得る。

【0101】

ＲＤＥは、クラスＩＩ ＡＵリッチエレメントであり得て、ＲＮＡ結合タンパク質は、ＧＡＰＤＨであり得る。ＧＡＰＤＨが結合するクラスＩＩ ＡＵリッチエレメントは、ＡＵＵＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡ（配列番号１８）であり得る。クラスＩＩ ＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、導入遺伝子、例えば、ＣＡＲの発現を制御するために使用され得る。クラスＩＩ ＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、Ｔリンパ球において導入遺伝子および／またはＣＡＲの発現を達成するためにも使用され得る。クラスＩＩ ＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球において導入遺伝子および／またはＣＡＲの発現を達成するために使用され得る。クラスＩＩ ＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、ＣＤ４＋Ｔリンパ球において導入遺伝子および／またはＣＡＲの発現を達成するために使用され得る。クラスＩＩ ＡＵリッチエレメントおよびＧＡＤＰＨは、ナチュラルキラー細胞において導入遺伝子および／またはＣＡＲの発現を達成するために使用され得る。

【0102】

ＲＤＥは、マイクロＲＮＡ結合部位を有し得る。ＲＤＥは、これらのマイクロＲＮＡ結合部位の１つまたは複数を除去するように操作されてもよい。マイクロＲＮＡ結合部位の除去は、ＲＤＥを含む構築物からのオン発現を少なくとも５、１０、１５、２０、５０、または１００倍上昇させ得る。マイクロＲＮＡ部位を有するＲＤＥは、ＧＡＰＤＨが結合するＲＤＥであり得る。ＧＡＰＤＨが結合するＲＤＥからのマイクロＲＮＡ部位の除去は、ＧＡＰＤＨ感受性ＲＤＥを含む構築物のオン発現を少なくとも５～１０倍上昇させ得る。ＲＤＥを通したこのＧＡＰＤＨ制御は、ペイロードを標的部位に送達するために使用することができる。ＧＡＰＤＨ制御は、標的部位において優先的に見出される抗原を認識するＣＡＲによる、真核細胞の活性化と結び付けることができる。

【0103】

ＲＤＥは、ＩＬ－２またはＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲであり得て、マイクロＲＮＡ部位の除去は、ＲＤＥを含む導入遺伝子ＲＮＡからの発現率を上昇させる、および／または発現のダイナミックレンジを増加させることができる。ＲＤＥは、ＩＬ－２の３’－ＵＴＲであり得て、除去されるマイクロＲＮＡ部位は、ＭＩＲ－１８６部位であり得て、その欠失は、発現動態を向上させ、発現のダイナミックレンジを約５０倍増加させる。ＲＤＥは、ＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲでもあり得て、除去されるマイクロＲＮＡ部位は、ＭＩＲ－１２５部位であり得る。

【0104】

ＲＤＥによる発現（制御）のダイナミックレンジは、ＲＤＥにより制御される導入遺伝子のコドンの最適化により増加し得る。導入遺伝子におけるコドンのウォブル位のＧＣ含量を増やすことにより、翻訳の効率を、１～２ｌｏｇ（１０～１００倍）上げることができる。翻訳の効率の上昇は、ＲＤＥによる「オン」状態での発現の量が増加していることを意味する。「オフ」状態の発現率が、変化しないか、またはあまり変化しない場合、ＲＤＥによる制御の全体的ダイナミックレンジは増加する。

【0105】

新しいＲＤＥは、例えば、分子育種、および／またはＲＤＥを有することが知られている遺伝子の３’－ＵＴＲへの指向性進化法などの手法を適用することにより、公知のＲＤＥの一部を組合せ的に混合してマッチングすることにより作製された合成ライブラリから得ることができる。例えば、異なるＲＤＥを含む複数の３’－ＵＴＲを、断片化して、合成３’－ＵＴＲへとアセンブリさせ、次いで、それらを、ＲＤＥ活性に関してスクリーニングするか、または選択する。所望の特性を有するＲＤＥは、正および／または負の選択を使用してそのようなライブラリから発見され得る。

【0106】

選択的スプライシング
選択的スプライシングは、細胞内の代謝状態の変化を、プレｍＲＮＡ転写物からの、所望のポリペプチドをコードしてそのポリペプチドへと翻訳されるｍＲＮＡへのスプライシングとリンクさせることができる。例えば、細胞の代謝状態の変化後に、プレｍＲＮＡ転写物は、その細胞内でペイロードを産生するように選択的スプライシングを受けることができる。プレｍＲＮＡ転写物は、選択的スプライシング前は、ナンセンスポリペプチドをコードする転写物へと、または異なるポリペプチド産物をコードするｍＲＮＡへとスプライシングされ得る。

【0107】

ｈｎＲＮＰＬＬ（ヘテロ核リボ核タンパク質Ｌ様）は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびＢ細胞）が活性化されると（代謝状態の変化）作られるＲＮＡ結合ポリペプチドである。ｈｎＲＮＰＬＬは、Ｔ細胞およびＢ細胞を含むリンパ球における活性化誘導選択的スプライシングのマスターレギュレータである。Ｔ細胞において、ｈｎＲＮＰＬＬは、Ｔ細胞の発生および活性化に必須のチロシンホスファターゼであるＣＤ４５を含む、様々な転写物のスプライシングを達成する。

【0108】

ｈｎＲＮＰＬＬは、ＣＡリピートに、同じくＣリッチモチーフ、Ａリッチモチーフ、およびＴリッチモチーフにも結合し、例えば、ＣＡＣＡＣＡ（ＣＡ）_ｎ、ＣＴＴＣＣｔ／ｃ、ＣＡＴｔ／ａ、ＣＡＴＴ、およびＴＴＴＡｔ／ａＡなどが含まれる。ｈｎＲＮＰＬＬ結合部位が、転写物の３’－ＵＴＲ中にある場合、その部位へのｈｎＲＮＰＬＬの結合は、転写物を安定化させ得る。ｈｎＲＮＰＬＬ結合部位が、エクソンの５’側上での約１キロベース以内にある場合、ｈｎＲＮＰＬＬの結合は、スプライシングの際にエクソンの包含を促進する。ｈｎＲＮＰＬＬ結合部位が、エクソンの３’側上での約１キロベース以内にある場合、ｈｎＲＮＰＬＬの結合は、エクソンの除外を促進する。ｈｎＲＮＰＬＬが転写物に結合すると、その転写物のスプライシングパターンを変更させ、新たなｍＲＮＡ転写物および新たな非コード切除産物（切除されたイントロン、またはイントロン＋エクソン）をもたらすことができる。この選択的スプライシングパターンは、これより所望のポリペプチド（例えば、ペイロード）をコードする、選択的スプライシングされたｍＲＮＡを産生し得る、および／または新たな非コード切除産物は、選択的スプライシング時に限り産生されるｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡをコードし得る。

【0109】

ｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシングは、単独またはＲＤＥなどの他の調節シグナルと組み合わせて使用され得る。ｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシングとＲＤＥは協力して、ペイロードが、ＣＡＲ、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、または細胞上で発現する他の受容体に結合するリガンドを有する標的部位に達すると、細胞の活性化（代謝状態の変化）と同時にペイロードの発現を制御し得る。受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）へのリガンドの結合は、細胞を活性化し、ＲＤＥ機構によりペイロードの発現を上昇させ、かつｈｎＲＮＰＬＬ発現に続いて選択的スプライシングをもたらす。ＲＤＥ制御と選択的スプライシングは協力して、所望の量のペイロードまたは他の導入遺伝子を産生する。

【0110】

ｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシングは、細胞が静止状態である間に発現される遺伝子をオフにするためにも使用され得る。静止状態の細胞が、受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）へのリガンド結合により活性化されると、細胞の代謝状態が変化し、ｈｎＲＮＰＬＬが発現する。細胞が静止状態の間に発現される遺伝子が、ｈｎＲＮＰＬＬ結合部位を有する場合、ｈｎＲＮＰＬＬの結合は、転写物のスプライシングを変更することができるため、ｍＲＮＡはもはや遺伝子産物をコードしなくなる。例えば、細胞（例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞）は、その細胞が静止状態の間に幹細胞性因子（stemness factor）（例えば、Ｔｏｘおよび／またはＴＣＦ７）を発現するように操作され得る。Ｔｏｘおよび／またはＴＣＦ７をコードする核酸は、ｈｎＲＮＰＬＬ結合部位を有するイントロンを含み得るため、ｈｎＲＮＰＬＬの非存在下に、転写物は、Ｔｏｘおよび／またはＴＣＦ７ポリペプチドを作製するようにスプライシングされるが、細胞活性化およびｈｎＲＮＰＬＬの発現と同時に、それらの転写物は、選択的スプライシングを受け、Ｔｏｘおよび／またはＴＣＦ７をコードする転写物をもはや産生しないことになる。

【0111】

ｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシングは、新たな「イントロン」または非コード切除産物ならびに新たなｍＲＮＡも生成する。新たなイントロンは、新たなイントロンにおいてのみ発現される活性ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ等）をコードし得る。これは、さらに他のレベルの制御をｈｎＲＮＰＬＬ選択的スプライシングに加える。なぜなら、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡは、例えば、Ｔｏｘ、ＳＣＦ７、および他の疲弊因子を含む、細胞のエフェクター状態にとって有害である遺伝子を、活性化された細胞中においてオフにし得るからである。このやり方で制御され得るｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡには、例えば、ｍｉＲ１５５、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、およびｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０）が含まれる。

【0112】

キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合／認識エレメント、受容体を細胞膜に固定する膜貫通エレメント、および少なくとも１つの細胞内エレメントを含む融合タンパク質であり得る。これらのＣＡＲエレメントは、当技術分野で公知であり、例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１４０２４２７０１号明細書に記載される。ＣＡＲは、少なくとも１つの細胞外抗原結合エレメント、膜貫通エレメント、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントを含む構築物から発現される組換えポリペプチドであり得る。刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合したゼータ鎖であり得る。細胞質シグナル伝達エレメントはさらに、少なくとも１つの共刺激分子に由来する１つまたは複数の機能的シグナル伝達エレメントを含み得る。共刺激分子は、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７および／またはＣＤ２８から選択され得る。ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメント、膜貫通エレメント、および刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントを含むキメラ融合タンパク質であり得る。ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメント、膜貫通エレメント、ならびに共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントを含むキメラ融合タンパク質を含み得る。ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメント、膜貫通エレメント、ならびに１つまたは複数の共刺激分子に由来する２つの機能的シグナル伝達エレメントおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントを含むキメラ融合タンパク質であり得る。ＣＡＲは、細胞外抗原認識エレメント、膜貫通エレメント、ならびに１つまたは複数の共刺激分子に由来する少なくとも２つの機能的シグナル伝達エレメントおよび刺激分子に由来する機能的シグナル伝達エレメントを含む細胞内シグナル伝達エレメントを含むキメラ融合タンパク質を含み得る。ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末）に任意選択のリーダー配列を含み得る。ＣＡＲはさらに、細胞外抗原認識エレメントのＮ末端にリーダー配列を含み得て、そのリーダー配列は、細胞プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化の間に抗原認識エレメント（例えば、ｓｃＦｖ）から場合により切断される。

【0113】

キメラ抗原受容体－細胞外エレメント
ＣＡＲの作製において有用な例示的細胞外エレメントは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号明細書、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号明細書に記載されており、その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている。

【0114】

細胞外エレメントは、疾患に対して免疫になっている対象の免疫細胞から得られた抗体のレパートリーから得ることができ、例えば、その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号明細書、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号明細書に記載される。

【0115】

細胞外エレメントは、リガンド結合および／またはシグナル伝達と関連する多種多様な細胞外エレメントまたは分泌タンパク質のいずれかから得られ得て、それらのすべて、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号明細書、２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号明細書、米国特許第５，３５９，０４６号明細書、同第５，６８６，２８１号明細書および同第６，１０３，５２１号明細書に記載される。

【0116】

細胞外エレメントは、結合特異性を付与し得る上に異なる結合特異性をもたらすために変更可能であるタンパク質ループを含むタンパク質足場コアの共通の特徴を共有する様々な足場タンパク質ファミリーからも得ることができる。ノッチンは、異なる結合特異性を生み出すために操作され得るペプチドループを有するそのような足場タンパク質の１つである。例えば、ノッチンは、特定のインテグリンペプチドに対して高い親和性を有するように操作され得る。例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているSilverman等、J. Mol. Biol. 385:1064～75頁(2009)およびKimura等、Proteins 77:359～69頁(2009)を参照。いくつかのがんは、ある特定のインテグリンペプチドを過剰発現し、そのようながんは、過剰発現されたインテグリンに対して特異的なノッチンである細胞外エレメントを有するＣＡＲにより標的にされ得る。そのようなインテグリンの１つは、複数の固形腫瘍、例えば、結腸、肺、乳房、頸部、卵巣／卵管、膵臓、および頭頸部に由来するものなどにおいて上方制御されるインテグリンαｖβ６である。例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているWhilding等、Biochem. Soc. Trans. 44:349～355頁(2016)を参照。

【0117】

細胞外エレメントは、傑出したタンパク質分解耐性および熱安定性を与えるジスルフィド結合コアを含有するペプチドのファミリーであるノッチンにも由来し得る。本来、プロテアーゼ阻害剤、抗菌薬、および毒素として機能するノッチンは、ファミリーメンバーの間で多様な配列を有するいくつかのループからなる。結合特異性を上昇させるため、かつ新たな結合特異性を創出するために、ノッチンは、ループ中に配列のさらなる多様性を含むように操作され得る。操作されたノッチンは、所望の特異性で所望の標的（例えば、所望の抗原）に結合するようにされ得る。いくつかのノッチンは、ｎＭ特異性でインテグリンに結合し、ＣＡＲを、ある特定のインテグリン（例えば、αｖβ３／αｖβ５、αｖβ３／αｖβ５／α５β１、またはαｖβ６インテグリン）に向けるために使用され得る。αｖβ６などのインテグリンは、固形腫瘍上で上方制御され得るため、ＣＡＲにとって適切な標的であり得る。そのようなαｖβ６インテグリン特異的ＣＡＲは、αｖβ６インテグリンに対して特異的なノッチンをＣＡＲの細胞外エレメントとして使用して作製され得る。αｖβ６ノッチン－ＣＡＲによる、操作された細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化は、ＣＡＲ細胞活性化と同時にペイロードの発現を引き起こすＲＤＥの制御下にペイロードを固形腫瘍に送達するために使用され得る。

【0118】

一態様では、細胞外ドメインは、ＡＭＬおよびＭＤＳ芽球上に広く見出されるオンコ－シアリル化（onco-sialylated）ＣＤ４３に対して特異的に結合する抗体または他の結合分子であり得る。あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているHazenberg等、European Hematology Associate abstracts, Abst S511頁(2016)を参照。抗体ＡＴ１４－０１３は、オンコ－シアリル化ＣＤ４３上の特定のシアリル化エピトープに結合し、そのエピトープは、正常細胞および組織と関連するＣＤ４３上には見出されない。その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている国際公開第２０１６／２０９０７９号および国際公開第２０１５／０９３９４９号を参照。この抗体または、オンコ－シアリル化ＣＤ４３結合に関してＡＴ１４－０１３と競合する他の結合分子が、抗オンコシアリル化ＣＤ４３ ＣＡＲを作製するために使用される。例えば、ＣＡＲの細胞外ドメインとして用いるために、ＡＴ１４－０１３の重鎖および軽鎖の可変領域を利用して、一本鎖抗体として再フォーマット化することができる。ＣＡＲ上のそのような細胞外ドメインは、ＣＡＲ細胞（例えば、抗オンコシアリル化ＣＤ４３ ＣＡＲ Ｔリンパ球）を、ＡＭＬおよび／またはＭＤＳ細胞に向かわせて、ＣＡＲ細胞による細胞殺滅または修飾のための標的にする。

【0119】

一態様では、細胞外ドメインは、補体Ｈ因子（ＣＦＨ）、例えば、ＣＦＨのＳＣＲ１９エピトープに特異的に結合する抗体または他の結合分子であり得る。ＣＦＨに対して特異的な細胞外ドメインを作製するために使用され得る抗体およびＣＤＲは、例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている米国特許出願第２０１９０３１５８４２号明細書に見出される。ＣＦＨは、例えば、乳がん、肺がん、小細胞肺がん、および非小細胞肺がんを含む、多くの種類の固形腫瘍上で異常発現し得る。

【0120】

ＣＡＲの標的であり得る他の腫瘍関連抗原には、例えば、補体Ｈ因子（例えば、肺がん、乳がん、他の固形腫瘍）、デルタオピオイド受容体（例えば、小細胞肺がん）、ｃ－Ｍｅｔ（例えば、ＮＳＣＬＣ）、ｇｐＮＭＢ（例えば、黒色腫、乳がん、他の固形腫瘍）、ＴＲＡＰ－２（例えば、上皮性腫瘍および他の固形腫瘍）、ＣＥＡＣＡＭ５（例えば、結腸直腸がん）、ＣＤ５６（例えば、ＳＣＬＣ）、ＣＤ２５（例えば、血液がん）、グアニルシクラーゼＣ（例えば、膵がん）、ＣＡＧ（例えば、固形腫瘍）、ＬＩＶ－１（例えば、乳がん）、ＰＴＫ７（例えば、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、および卵巣がん）、ＬＡＭＰ－１（例えば、結腸直腸がん、黒色腫、喉頭がん）、Ｐ－カドヘリン３（例えば、上皮性腫瘍）、ＨＥＲ－３（例えば、乳がん）、ＣＤ１３３（例えば、肝細胞癌、膵がん、結腸直腸がん、胆管癌）、ＧＰＲＣ５Ｄ（例えば、多発性骨髄腫）、ＢＣＭＡ（例えば、多発性骨髄腫）、ＣＤ１３８（例えば、多発性骨髄腫）、Ｉｇカッパ軽鎖（例えば、白血病、リンパ腫、ＮＨＬ、および多発性骨髄腫）、ＣＤ３０（例えば、ＮＨＬ、ＨＤ）、ＩＬ１３Ｒａ２（例えば、膠芽腫）、およびＮＫＧ２Ｄに対するリガンド（例えば、ＡＭＬ、ＭＤＳ、およびＭＭに対する結合ドメインとしてＮＫＧ２Ｄ受容体を使用）が含まれる。

【0121】

ＣＡＲの標的であり得る他の腫瘍関連抗原には、例えば、メソテリン、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、Ｈｅｒ－２、ＭＵＣ１、ＧＰＣ３、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＧＰＣ２、葉酸受容体β、ＩｇＧ Ｆｃ受容体、ＰＳＣＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＰＣＡＭ、ルイスＹ抗原、Ｌ１ＣＡＭ、ＦＯＬＲ、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＥＰＨＡ２、ＰＤ－１、Ｃ－ＭＥＴ、ＲＯＲ１、ＣＬＤＮ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１３３、ＴＳＨＲ、ＣＤ７０、ＥＲＢＢ、ＡＸＬ、細胞死受容体５、ＶＥＧＦＲ－２、ＣＤ１２３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＴＳＨＲ、ＲＯＲ２、ＣＤ１４７、カッパＩＧＧ、ＩＬ－１３、ＭＵＣ１６、ＩＬ－１３Ｒ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＤＬＬ３、ＦＡＰ、ＬＭＰ１、ＴＳＨＲ、ＢＣＭＡ、ＮＥＣＴＩＮ－４、ＭＧ７、ＡＦＰ（アルファ－フェトプロテイン）、ＧＰ１００、Ｂ７－Ｈ３、ネクチン－４、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＲＴ－１、ＨＢＶ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＴＡＡ、ＧＰ１００、チログロブリン、ＥＢＶ、ＨＰＶ Ｅ６、ＰＲＡＭＥ、ＨＥＲＶ－Ｅ、ＷＴ１、ＧＲＡＳ Ｇ１２Ｖ、ｐ５３、ＴＲＡＩＬ、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＨＰＶ－Ｅ７、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄ、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、ＣＤ７、ＳＬＡＭＦ７、ＩＧＧ ＦＣ、ＭＵＣ１、ルイスＹ抗原、ＣＤ１３３、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＮＫＧ２Ｄ、カッパ軽鎖、ＣＤ３４、ＣＬＬ－１、ＴＳＬＰ、ＣＤ１０、ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ４４Ｖ６、ＥＢＶ、ＣＤ５、ＧＰＣ３、ＣＤ５６、インテグリンＢ７、ＣＤ７０、ＭＵＣＬ、ＣＫＩＴ、ＣＬＤＮ１８．２、ＴＲＢＣ１、ＴＡＣ１、ＣＤ５６、およびＣＤ４が含まれる。

【0122】

ＣＡＲの標的であり得るさらに他の腫瘍関連抗原には、例えば、ＣＤ２、ＣＤ１８、ＣＤ２７、ＣＤ３７、ＣＤ７２、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８３、ＣＤ１１７、ＣＤ１７２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＤＲ５、ＨＥＲ２、ＣＳ１、ＩＬ－１ＲＡＰ、ＩＴＧＢ７、ＳＬＣ２Ａ１４、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ６Ａ１１、ＳＬＣ７Ａ３、ＳＬＣ１３Ａ５、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ１２、ＳＬＣ３４Ａ１、ｓｌｃ４５Ａ３、ＳＬＣ４６Ａ２、Ｆｒａ、ＩＬ－１３Ｒａ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ１、ＣＬＤ１８、ＮＡＮＯＧ、ＣＥＡＣＡＭ８、ＴＳＰＡＮ１６、ＧＬＲＢ、ＤＹＲＫ４、ＳＶ２Ｃ、ＳＩＧＬＥＣ８、ＲＢＭＸＬ３、ＨＩＳＴ１ＨＩＴ、ＣＣＲ８、ＣＣＮＢ３、ＡＬＰＰＬ２、ＺＰ２、ＯＴＵＢ２、ＬＩＬＲＡ４、ＧＲＭ２、ＰＧＧ１、ＮＢＩＦ３、ＧＹＰＡ、ＡＬＰＰ、ＳＰＡＴＡ１９、ＦＣＲＬＩ、ＦＣＲＬＡ、ＣＡＣＮＧ３、ＵＰＫ３Ｂ、１２ＵＭＯ４、ＭＵＣ１２、ＨＥＰＡＣＡＭ、ＢＰＩ、ＡＴＰ６Ｖ０Ａ４、ＨＭＭＲ、ＵＰＫ１Ａ、ＡＤＧＲＶ１、ＨＥＲＣ５、Ｃ３ＡＲ１、ＦＡＳＬＧ、ＮＧＢ、ＣＥＬＳＲ３、ＣＤ３Ｇ、ＣＥＡＣＡＭ３、ＴＮＦＲＳＦＢＣ、ＭＳ４ＡＢ、Ｓ１ＰＲ５、ＥＤＮＲＢ、ＳＣＮ３Ａ、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＢ１、ＡＮＯ１、ＫＣＮＤ２、ＨＴＲ４、ＣＡＣＮＢ４、ＨＴＲ４、ＣＮＲ２、２６ＬＲＢ、ＥＸＯＣ１、ＥＮＴＰＰ１、ＩＣＡＭ３、ＡＢＣＧＢ、ＳＣＮ４Ｂ、ＳＰＮ、ＣＤ６８、ＩＴＧＡＬ、ＩＴＧＡＭ、ＳＣＴＲ、ＣＹＹＲ１、ＣＬＣＮ２、ＳＬＡＲＡ３、およびＪＡＧ３が含まれる。

【0123】

細胞内エレメント
細胞内エレメントは、ＣＡＲおよび／またはＲＤＥ－ＣＡＲ（一括して「ＣＡＲＳ」）の細胞外エレメントが抗原に結合する（と相互作用する）と、シグナルを細胞内に伝達することができる分子であり得る。細胞内シグナル伝達エレメントは、概して、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担い得る。用語「エフェクター機能」とは、細胞の特殊機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達エレメント」とは、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊機能を果たすよう細胞に指示する、タンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が利用されてもよいが、多くの場合、細胞内エレメントまたは細胞内シグナル伝達エレメントは、ドメイン全体からなる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの短縮型（truncated）部分が使用されるという点で、そのような短縮型部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り使用され得る。したがって、細胞内シグナル伝達エレメントという用語はまた、エフェクター機能シグナルを伝達するために十分である細胞内シグナル伝達ドメインの任意の短縮型部分を含むことも意図される。ＣＡＲＳに用いる細胞内シグナル伝達エレメントの例には、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始するように呼応して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および共受容体の細胞質配列、ならびにそれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能的能力を有するいずれかの組換え配列が含まれ得る。

【0124】

細胞内エレメント、および細胞内エレメントと共にまたは細胞内エレメントとして有用な、ポリペプチドの組合せは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号明細書、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号明細書に記載されており、その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている。

【0125】

膜貫通エレメントおよびスペーサーエレメント
ＣＡＲおよび／またはＲＤＥ－ＣＡＲは、膜貫通エレメントを含み得る。膜貫通エレメントは、ＣＡＲおよび／またはＲＤＥ－ＣＡＲの細胞外エレメントに付着した状態であり得る。膜貫通エレメントは、膜貫通領域に隣接する１つまたは複数の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通エレメントが由来したタンパク質の細胞外領域と関連する１つもしくは複数のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大で１５まで、のアミノ酸）、および／または膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と関連する１つもしくは複数の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、最大で１５まで、のアミノ酸）を含み得る。膜貫通エレメントは、ＣＡＲおよび／またはＲＤＥ－ＣＡＲにおいて使用される他のエレメントの１つと会合し得る。膜貫通エレメントは、そのようなエレメントが、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通エレメントに結合するのを回避するため、例えば、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、選択され得るかまたはアミノ酸置換により修飾され得る。膜貫通エレメントは、隠れたスプライス部位を除去するように修飾され得る（例えば、ＣＤ８膜貫通ドメインを用いて作製されたＣＡＲＳは、隠れたスプライス部位を除去するように操作され得る）、および／または、ＣＡＲ構築物において、隠れたスプライス部位を有さない膜貫通エレメントが使用され得る。膜貫通エレメントは、細胞表面上の他のＣＡＲおよび／またはＲＤＥ－ＣＡＲとホモ二量体化することができる。膜貫通エレメントのアミノ酸配列は、同じ細胞内に存在する天然結合パートナーの結合エレメントとの相互作用を最小限にするように修飾または置換され得る。

【0126】

本発明において有用な膜貫通エレメントは、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号明細書、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号明細書に記載されており、その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている。

【0127】

受容体
ＣＡＲＳは、受容体として、細胞およびＲＤＥ－導入遺伝子と共に使用することができる。ＣＡＲＳは前記される。ＣＡＲＳに加えて、ＲＤＥの制御下の導入遺伝子が発現されるように細胞内の状態を活性化する、あるいは変化させるために、他の受容体を使用してもよい。化学シグナルを認識して応答する受容体は、ＲＤＥを通した導入遺伝子の発現と連結され得る。例えば、イオンチャネル連結型（イオンチャネル型）受容体、Ｇタンパク質連結型（代謝型）受容体、および酵素連結型受容体が、導入遺伝子の発現と連結され得る。

【0128】

導入遺伝子発現と連結され得る受容体の１つのクラスは、例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体（抗原受容体または免疫グロブリン受容体としても知られる）、および自然免疫受容体などの免疫受容体である。

【0129】

Ｔ細胞受容体は、２つの異なるポリペプチド鎖のヘテロ二量体である。ヒトでは、ほとんどのＴ細胞が、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖からなるＴ細胞受容体を有し、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによりコードされる）Ｔ細胞受容体を有する。リンパ球由来のＴ細胞受容体鎖をコードする核酸を増幅するための手法およびプライマーは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社により市販されているＳＭＡＲＴｅｒ Ｈｕｍａｎ ＴＣＲ ａ／ｂ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｋｉｔ、Boria等、BMC Immunol. 9:50～58頁(2008)；Moonka等、J. Immunol. Methods 169:41～51頁(1994)；Kim等、PLoS ONE 7:e37338 (2012)；Seitz等、Proc. Natl Acad. Sci. 103:12057～62頁(2006)に記載されており、それらのすべて、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている。ＴＣＲレパートリーは、抗原結合ドメインを形成するために、別個の鎖として使用され得る。ＴＣＲレパートリーは、一本鎖抗原結合ドメインに変換されてもよい。一本鎖ＴＣＲは、当技術分野で周知の手法を使用して、ヒトアルファおよびベータ鎖をコードする核酸から作製され得て、例えば、それらのすべて、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている米国特許出願公開第２０１２／０２５２７４２号明細書、Schodin等、Mol. Immunol. 33:819～829頁(1996)；Aggen等、「Engineering Human Single-Chain T Cell Receptors」、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校博士論文(2010)（そのコピーは、ideals.illinois.edu/bitstream/handle/2142/18585/Aggen_David.pdf？sequence=1にある）に記載されるものが含まれる。

【0130】

Ｂ細胞受容体には、膜結合型である免疫グロブリン、シグナル伝達部分、ＣＤ７９、およびＩＴＡＭが含まれる。ヒト抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を増幅するための手法およびプライマーは、当技術分野で周知であり、例えば、それらのすべて、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているＰｒｏＧｅｎ社のＨｕｍａｎ ＩｇＧ ａｎｄ ＩｇＭ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ、カタログ番号Ｆ２０００；Andris-Widhopf等、「Generation of Human Fab Antibody Libraries: PCR Amplification and Assembly of Light and Heavy Chain Coding Sequences」、Cold Spring Harb. Protoc. 2011；Lim等、Nat. Biotechnol. 31:108～117頁(2010)；Sun等、World J. Microbiol. Biotechnol. 28:381～386頁(2012)；Coronella等、Nucl. Acids. Res. 28:e85 (2000)に記載されている。マウス抗体軽鎖および重鎖をコードする核酸を増幅するための手法およびプライマーは、当技術分野で周知であり、例えば、その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている米国特許第８，１４３，００７号明細書；Wang等、BMC Bioinform. 7(Suppl):S9頁(2006)に記載されている。抗体レパートリーは、抗原結合ドメイン中で別個の鎖として使用されてもよく、または一本鎖抗原結合ドメインに変換されてもよい。一本鎖抗体は、当技術分野で周知の手法を使用して、ヒト軽鎖および重鎖をコードする核酸から作製され得て、例えば、その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているPansri等、BMC Biotechnol. 9:6頁(2009)；Peraldi-Roux、Methods Molc. Biol. 907:73～83頁(2012)に記載されるものが含まれる。一本鎖抗体は、当技術分野で周知の手法を使用して、マウス軽鎖および重鎖をコードする核酸から作製され得て、例えば、その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているImai等、Biol. Pharm. Bull. 29:1325～1330頁(2006)；Cheng等、PLoS ONE 6:e27406頁(2011)に記載されるものが含まれる。

【0131】

自然免疫受容体には、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２受容体ファミリー（例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２Ｈ）、２Ｂ４受容体、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫｐ８０受容体、Ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＲＰ１０５）が含まれる。

【0132】

７回膜貫通ドメイン受容体としても知られるＧタンパク質連結型受容体は、Ｇタンパク質を通して、リガンドの受容体結合を細胞応答と連結する受容体のラージファミリーである。これらのＧタンパク質は、α、β、およびγサブユニット（それぞれ、Ｇα、Ｇβ、およびＧγとして知られる）の三量体であり、ＧＴＰに結合していると活性であり、ＧＤＰに結合していると不活性である。受容体は、リガンドを結合すると立体配座変化を受け、Ｇタンパク質をアロステリックに活性化して、結合したＧＤＰに対してＧＴＰを交換する。ＧＴＰ結合後、Ｇタンパク質は受容体から解離して、Ｇα－ＧＴＰ単量体およびＧβγ二量体をもたらす。Ｇタンパク質連結型受容体は、合わせて、例えば、ロドプシン様受容体、セクレチン受容体、代謝型グルタミン酸／フェロモン受容体、真菌交配フェロモン受容体、環状ＡＭＰ受容体、およびフリズルド／スムーズンド（frizzled/smoothened）受容体を含むクラスに分類されている。Ｇタンパク質受容体は、電磁放射線の検出、味覚（味）、嗅覚、神経伝達、免疫系調節、増殖、細胞密度感知等を含む、多種多様な生理学的プロセスにおいて使用される。

【0133】

触媒型受容体としても知られる酵素連結型受容体は、細胞外リガンドの結合が細胞内側での酵素活性をもたらす膜貫通受容体である。酵素連結型受容体は、ポリペプチドの膜貫通部分（またはドメイン）により連結された２つのドメインを有する。２つの末端ドメインは、細胞外リガンド結合ドメイン、および触媒機能を有する細胞内ドメインである。酵素連結型受容体の複数のファミリーがあり、例えば、Ｅｒｂ受容体ファミリー、グリア細胞由来神経栄養因子受容体ファミリー、ナトリウム利尿ペプチド受容体ファミリー、ｔｒｋニューロトロフィン受容体ファミリー、およびｔｏｌｌ様受容体ファミリーが含まれる。

【0134】

リガンド開口型イオンチャネルとしても知られるイオンチャネル連結型受容体は、受容体へのリガンドの結合に応じて、イオン、例えば、Ｎａ^＋、Ｋ^＋、Ｃａ^２＋およびＣｌ^－が、膜を通過できるようにする受容体である。リガンド開口型イオンチャネルの複数のファミリーがあり、例えば、カチオン性ｃｙｓループ受容体、アニオン性ｃｙｓループ受容体、イオンチャネル型グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡ受容体、ＮＭＤＡ受容体）、ＧＡＢＡ受容体、５－ＨＴ受容体、ＡＴＰ開口型チャネル、およびＰＩＰ_２開口型チャネルが含まれる。

【0135】

真核細胞
様々な真核細胞が、真核細胞として使用され得る。真核細胞は、動物細胞であり得る。真核細胞は、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ブタ、ウシ、ネコ、またはイヌなどの哺乳類細胞であり得る。哺乳類細胞は、霊長類の細胞であり得て、サル、チンパンジー、ゴリラ、およびヒトを含むがこれらに限定されない。マウスは、他の哺乳類、特にヒトのモデルとして日常的に機能していることから、哺乳類細胞はマウス細胞であり得る（例えば、Hanna, J.等、Science 318:1920～23頁、2007；Holtzman, D.M.等、J Clin Invest. 103(6):R15～R21頁、1999；Warren, R.S.等、J Clin Invest. 95:1789～1797頁、1995を参照；各刊行物は、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている）。動物細胞には、例えば、線維芽細胞、上皮細胞（例えば、腎臓、乳腺、前立腺、肺）、ケラチン生成細胞、肝細胞、脂肪細胞、内皮細胞、および造血細胞が含まれる。動物細胞は、成体細胞（例えば、最終分化、分裂もしくは非分裂）または胚細胞（例えば、胚盤胞細胞等）または幹細胞であり得る。真核細胞はまた、動物または他の供給源に由来する細胞株でもあり得る。

【0136】

真核細胞は、幹細胞であり得る。様々な幹細胞型が当技術分野で公知であり、真核細胞として使用され得て、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、表皮神経堤幹細胞、乳腺幹細胞、腸幹細胞、間葉系幹細胞、嗅覚成体幹細胞、精巣細胞、および前駆細胞（例えば、神経、血管芽細胞、骨芽細胞、軟骨芽細胞、膵臓、表皮等）を含む。幹細胞は、対象から採取された細胞に由来する幹細胞株であり得る。

【0137】

真核細胞は、ヒトを含む哺乳類の循環系に見出される細胞であり得る。例示的な循環系細胞には、中でも、赤血球、血小板、形質細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球等、およびそれらの前駆細胞が含まれる。これらの細胞は、グループとして、本発明の循環真核細胞であると定義される。真核細胞は、これらの循環真核細胞のいずれかに由来し得る。真核細胞は、初代細胞であり得る、初代細胞または適切な細胞株に由来し得る。真核細胞の供給源は、同種、同系または自家であり得る。導入遺伝子は、これらの循環細胞、または循環細胞に由来する真核細胞のいずれかと共に使用され得る。真核細胞は、Ｔ細胞またはＴ細胞前駆体もしくは前駆細胞であり得る。真核細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞、または前記の細胞の前駆体もしくは前駆細胞であり得る。真核細胞は、ナチュラルキラー細胞、またはナチュラルキラー細胞の前駆体もしくは前駆細胞であり得る。真核細胞は、Ｂ細胞、またはＢ細胞の前駆体もしくは前駆細胞であり得る。真核細胞は、好中球または好中球の前駆体もしくは前駆細胞であり得る。真核細胞は、巨核球、または巨核球の前駆体もしくは前駆細胞であり得る。真核細胞は、マクロファージ、またはマクロファージの前駆体もしくは前駆細胞であり得る。

【0138】

真核細胞は、対象から得られ得る。対象は、いずれかの生命体であり得る。細胞は、対象から得られた細胞に由来し得る。対象の例には、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそれらのトランスジェニック種が含まれる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、いくつかの供給源から得られ得る。当技術分野で利用可能な多くのＴ細胞株も使用され得る。Ｔ細胞は、フィコール分離などの当業者に公知の多くの手法を使用して対象から採取された血液単位から得られ得る。個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスにより得られ得る。アフェレーシス産物は典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。アフェレーシスにより採取された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、その後の処理ステップのために、細胞を適切な緩衝液または培地中に入れることができる。細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄してもよい。代わりの一態様では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、およびマグネシウムを欠いてもよく、またはすべてではないとしても多くの二価カチオンを欠いてもよい。カルシウムの非存在下での初期活性化ステップは、活性化の増強をもたらし得る。

【0139】

負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択される細胞に固有の表面マーカーに対する抗体の組合せにより実現され得る。細胞は、細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負の磁気免疫付着（negative magnetic immunoadherence）もしくはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択により濃縮され得る。例えば、ＣＤ４＋細胞を濃縮するためには、モノクローナル抗体カクテルは典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。典型的にＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を濃縮することが望ましい場合がある。あるいは、特定の態様では、調節性Ｔ細胞は、抗Ｃ２５コンジュゲートビーズまたは他の同様の選択方法により除去される。

【0140】

概して、例えば、その各々は、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載される方法を使用して、Ｔ細胞を、活性化および増加させ得る。

【0141】

ＮＫ細胞は、膜結合ＩＬ－１５および４－１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ）を発現するように遺伝的組換え（genetically modified）されている骨髄細胞株の存在下で増加させてもよい。このようにして修飾された、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子を有さない細胞株は、ＮＫ細胞溶解に対して高度に感受性であり、ＮＫ細胞を活性化する。例えば、Ｋ５６２骨髄細胞は、ヒトＣＤ８αのシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインならびにＧＦＰと融合させたヒトＩＬ－１５成熟ペプチドからなるキメラタンパク質構築物を形質導入され得る。形質導入された細胞は、次いで限界希釈により単一細胞クローニングされ、ＧＦＰ発現および表面ＩＬ－１５が最も高いクローンが選択され得る。このクローンに、次いでヒトＣＤ１３７Ｌを形質導入し、Ｋ５６２－ｍｂ１５－１３７Ｌ細胞株を創出することができる。ＮＫ細胞を優先的に増加させるために、ＮＫ細胞を含有する末梢血単核細胞培養物を、１０ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２の存在下、ＮＫ細胞の集団を活性化および濃縮するために十分な期間、Ｋ５６２－ｍｂ１５－１３７Ｌ細胞株と培養する。この期間は、２～２０日、好ましくは約５日に及び得る。増加させたＮＫ細胞に、次いで抗ＣＤ１９－ＢＢ－ζキメラ受容体を形質導入することができる。

【0142】

Ｔリンパ球におけるＣＤ３イプシロンの修飾
Ｔリンパ球は、移植片対宿主反応を低下させるように修飾され得る。例えば、同種Ｔリンパ球は、移植時に移植片対宿主反応が低下するように修飾され得る。同種Ｔリンパ球は、ＣＡＲ療法において使用可能である、および／または標的部位へのＴリンパ球による送達のための他の導入遺伝子を運び得る。Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体機能への優性効果を有する変異体の導入により修飾され得る。例えば、変異体は、Ｔ細胞受容体をノックアウトすることができるか、またはＴ細胞受容体からのシグナル伝達を破壊することができる。ＣＤ３イプシロン鎖の変異は、Ｔ細胞受容体シグナル伝達に対してそのような優性阻害効果を有し得る。ＣＤ３イプシロンの優性阻害変異体の一例は、ＣＤ３イプシロン中のＣ－Ｘ－Ｘ－ＣモチーフをＳ－Ｘ－Ｘ－Ｓに変更するＣ１１９Ｓ／Ｃ１２２Ｓ二重変異体である。この二重変異体は、活性化Ｔ細胞受容体からのシグナル伝達が欠損するため、Ｔリンパ球（例えば、同種Ｔリンパ球）による宿主抗原の結合はＴリンパ球を活性化せず、移植片対宿主病を軽減する。

【0143】

ＣＤ３イプシロン二重変異体（Ｃ１１９Ｓ／Ｃ１２２Ｓ）は、Ｔリンパ球のＣＤ３イプシロン遺伝子座への組込みによりＴリンパ球に導入され得る、またはこの二重変異体は優性阻害であるため、Ｔリンパ球ゲノムの他の部位に導入され得る、またはＴリンパ球に一過性にトランスフェクト／形質導入され得る。一過性トランスフェクションは、標的部位での、ＣＡＲ（または他の受容体）の結合による活性化の前に、Ｔリンパ球のＴ細胞受容体と会合したＣＤ３イプシロン二重変異体を有するＴリンパ球を産生し得る。Ｔリンパ球が標的に達し、そのＣＡＲと相互作用すると一過性発現が終了する場合、ＣＡＲ Ｔリンパ球は、ＣＡＲ反応により、および同種Ｔ細胞受容体を通した移植片対宿主／腫瘍細胞反応により死滅させることができる。

【0144】

一例では、Ｔリンパ球は宿主（例えば、同種宿主）から得られ、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズにより活性化される。この活性化Ｔリンパ球が、ＣＡＲ（および／または他の所望の導入遺伝子）ならびに二重変異体ＣＤ３イプシロン（Ｃ１１９Ｓ／Ｃ１２２Ｓ）をコードする構築物をトランスフェクトされる。ＣＡＲをトランスフェクト／形質導入したＴリンパ球は、単離され（例えば、ＣＡＲを用いた親和性単離によるか、または活性ＴＣＲを有する活性Ｔリンパ球に対する選択が行われ得る）、対象に投与される。

【0145】

ＣＤ３イプシロンの他の変異は、ポリペプチドのＩＴＡＭ部分の１つまたは複数の欠失をもたらし得る。これらのＩＴＡＭ欠失は、それらのＩＴＡＭ変異体を用いて作製されたＣＡＲＳのシグナル伝達能力を低下させる。ＣＡＲのＣＤ３イプシロンは、１つまたは複数のＩＴＡＭ配列のＩＴＡＭ欠失を有するように操作され得る。ＣＡＲ、およびΔＩＴＡＭを有するこれらのＣＤ３イプシロン遺伝子により操作されたＴ細胞は、ＲＤＥの制御下のペイロードと共に使用され得る。これらのＴ細胞がＣＡＲにより活性化されると、ペイロードが発現する。ΔＩＴＡＭは、ＣＡＲに対する細胞の応答性を低下させ（鈍化（crippled）ＣＡＲ）、Ｔ細胞疲弊を軽減または防止し得る。これにより、Ｔ細胞は導入遺伝子ペイロードをより長期間産生できるようになる。

【0146】

核酸
本明細書に記載される個々のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ＲＤＥ、および他の転写後制御デバイスを少なくとも部分的にコードする核酸もまた本開示に記載される。核酸は、天然、合成またはその組合せであり得る。本発明の核酸は、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。

【0147】

本発明の核酸には、発現ベクター、例えば、プラスミド、またはウイルスベクター、または直鎖状ベクター、または染色体ＤＮＡ内に組み込まれるベクターなども含まれる。発現ベクターは、１つまたは複数の選択された宿主細胞内でのベクターの複製を可能にする核酸配列を含有し得る。そのような配列は、様々な細胞に関して周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に適切である。真核生物宿主細胞、例えば、哺乳類細胞では、発現ベクターは、宿主細胞染色体内に組み込まれ得て、次いで宿主染色体と共に複製し得る。同様に、ベクターは、原核細胞の染色体内に組み込まれ得る。

【0148】

発現ベクターは、概して、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子も含有する。選択マーカーは、本発明の宿主細胞を含む、原核および真核細胞に関して、当技術分野で周知である。概して、選択遺伝子は、選択培地中で増殖する、形質転換させた宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地中で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養素を供給する（例えば、桿菌のＤ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）タンパク質をコードする。例示的な選択スキームは、宿主細胞の増殖を停止する薬物を利用し得る。異種遺伝子での形質転換に成功しているそれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、したがって、選択レジメンを生き延びる。細菌または真核生物（哺乳類を含む）系で用いる他の選択マーカーは、当技術分野で周知である。

【0149】

導入遺伝子（例えば、ＲＤＥ－ＣＡＲおよび／またはＣＡＲ）を哺乳類Ｔ細胞中で発現させることができるプロモーターの一例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、リボソームへのアミノアシルｔＲＮＡの酵素送達を担う、伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳類発現プラスミドにおいて広く使用されており、レンチウイルスベクターにクローニングされた導入遺伝子からのＣＡＲ発現の駆動に有効であることが示されている。例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているMilone等、Mol. Ther. 17(8):1453～1464頁(2009)を参照。プロモーターの他の例は、即時初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、その配列に作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。他の構成的プロモーター配列も使用可能であり、限定されるものではないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＭＮＤプロモーター（骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサを含む修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーター、例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているLi等、J. Neurosci. Methods 第189巻、56～64頁(2010)を参照）、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス即時初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびに限定されるものではないが、例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子－１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーターを含む。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されない。

【0150】

誘導性または抑制性プロモーターも、本開示における使用に企図される。誘導性プロモーターの例には、活性化Ｔ細胞誘導性プロモーターの核因子（ＮＦＡＴ）、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、テトラサイクリンプロモーター、ｃ－ｆｏｓプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス即時初期プロモーターからの発現をテトラサイクリンオペレータの制御下に置くＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社のＴ－ＲＥｘ系、およびＩｎｔｒｅｘｏｎ社のＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。Macian等、Oncogene 20:2476～2489頁(2001)；Karzenowski, D.等、BioTechiques 39:191～196頁(2005)；Dai, X等、Protein Expr. Purif 42:236～245頁(2005)；Palli, S. R.等、Eur. J. Biochem. 270:1308～1515頁(2003)；Dhadialla, T. S.等、Annual Rev. Entomol. 43:545～569頁(1998)；Kumar, M. B.等、J. Biol. Chem. 279:27211～27218頁(2004)；Verhaegent, M.等、Annal. Chem. 74:4378～4385頁(2002)；Katalam, A. K.等、Molecular Therapy 13:S103頁(2006)；およびKarzenowski, D.等、Molecular Therapy 13:S194頁(2006)、米国特許第８，８９５，３０６号明細書、同第８，８２２，７５４号明細書、同第８，７４８，１２５号明細書、同第８，５３６，３５４号明細書、これらのすべては、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている。誘導性プロモーターには、中程度の温熱療法に応答する熱ショックエレメントを含むプロモーターも含まれる。熱ショックエレメントは、例えば、熱ショック遺伝子（例えば、ＨＳＰＢ１）由来のプロモーターなどのプロモーターの上流に位置するコンセンサス配列５’－ｎＧＡＡｎ－３’の多数の逆方向反復からなる。

【0151】

発現ベクターは、典型的には、転写開始の頻度を調節するためのプロモーターエレメント、例えば、エンハンサを有する。典型的に、これらは、開始部位から３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にも同様に機能性エレメントを含有することが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は頻繁に柔軟であるため、エレメントが互いに対して反転または移動している場合にプロモーター機能は保存されることになる。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が低下し始めるまでに、プロモーターエレメント間の間隔を５０ｂｐ離れるまで広げることができる。プロモーターに応じて、個々のエレメントは、協同してか、または独立に機能して転写を活性化し得るようである。

【0152】

発現ベクターは、２シストロン性構築物または多シストロン性構築物であり得る。２つのシストロンは、シストロンの制御領域が２つのシストロン間に位置する状態で反対方向に配向され得る。構築物が３つ以上のシストロンを有する場合、シストロンは２つのグループが転写に関して反対方向に配向される状態で２つのグループに配置され得る。例示的な２シストロン性構築物は、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているAmendola等、Nat. Biotechnol. 23:108～116頁(2005)に記載されている。一方のシストロンに対する制御領域は高い転写活性能力があってよく、他方は使用条件下で低い転写活性を有し得る。一方または両方ともの制御領域が誘導性であり得る。高転写活性制御領域の例には、例えば、ＭＮＤ、ＥＦ１－アルファ、ＰＧＫ１、ＣＭＶ、ユビキチンＣ、ＳＶ４０初期プロモーター、テトラサイクリン応答性エレメントプロモーター、細胞特異的プロモーター、ヒトベータアクチンプロモーター、およびＣＢＧ（ニワトリベータ－グロビン）が含まれ、場合によりＣＭＶ初期エンハンサが含まれる。低転写活性制御領域の例には、例えば、ＴＲＥ３Ｇ（基底発現を低下させる変異を有するテトラサイクリン応答性エレメントプロモーター、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社により市販されている）、Ｔ－ＲＥｘ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社により市販されている）、および最小ＴＡＴＡプロモーター（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているKiran等、Plant Physiol. 142:364～376頁(2006)）、ＨＳＰ６８、および最小ＣＭＶプロモーターが含まれる。誘導性制御領域の例には、例えば、ＮＦＡＴ制御領域（Macian等、Oncogene 20:2476～2489頁(2001)）、および前記される誘導性制御領域が含まれる。

【0153】

２シストロン性構築物は、ＣＡＲ、および標的部位に送達されるべきペイロードである（またはペイロードを作る）ポリペプチドをコードし得る。例示的なペイロードは、前記および以下に記載される。ＣＡＲをコードする核酸は、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または誘導性プロモーターに作動可能に連結され得て、場合により、ＲＮＡ制御デバイス、ＤＥ、ＲＤＥ、または前記の組合せに作動可能に連結され得る。ＣＡＲは、Ｓｉｄｅ－ＣＡＲフォーマットで核酸によりコードされ得る。ポリペプチドをコードする核酸は、強力なプロモーター、弱いプロモーター、および／または誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。ペイロードである（またはペイロードを作る）ポリペプチドをコードする核酸は、ＲＤＥの制御下にあり得る。ＲＤＥは、例えば、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、エノラーゼ（ＥＮＯ１もしくはＥＮＯ３）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ１）、アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）、またはホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ１）などの、例えば、解糖系酵素を通して、細胞の活性化状態に応答するものであり得る。ＲＤＥは、例えば、トランスケトラーゼ（ＴＫＴ）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ２）、スクシニルＣｏＡシンテターゼ（ＳＵＧＬＧ１）、ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬＹ）、またはイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＤＨ１／２）などの他のエネルギー代謝酵素が結合して調節することもできる。宿主細胞は、対象における標的部位でその抗原に結合するＣＡＲを発現し得る。標的部位での抗原のこの結合は、細胞を活性化し、細胞に解糖を亢進させ、（解糖系酵素または他のエネルギー代謝酵素が結合した）ＲＤＥの制御下でポリペプチドをコードする核酸の発現を誘導する。

【0154】

構築物において使用され得る両方向性プロモーターには、例えば、前記のｓｍｏｌ２が含まれる。さらなる両方向性プロモーターには、例えば、ＩＤＨ３プロモーターおよびＳＳＲ４プロモーターを有するＢＤＰ１、ＸＰＣプロモーターおよびＬＳＭ３プロモーターを有するＢＤＰ３、ＸＰＯ５プロモーターおよびＰＯＬＨプロモーターを有するＢＤＰ４、ＤＥＳＩプロモーターおよびＸＲＣＣ６プロモーターを有するＢＤＰ５、ＴＭＥＭ１６７ａプロモーターおよびＸＲＣＣ４プロモーターを有するＢＤＰ６、ＭＢＤ４プロモーターおよびＩＦＴ１２２プロモーターを有するＢＤＰ７、ＰＣＮＡプロモーターおよびＣＤＳ２プロモーターを有するＢＤＰ８、ＣＥＴＮ２プロモーターおよびＤＨＬプロモーターを有するＢＤＰ９、ＳＭＹＤ４プロモーターおよびＲＰＡ１プロモーターを有するＢＤＰ１０、ＰＭＳ２プロモーターおよびＡＩＭＰ２プロモーターを有するＢＤＰ１１、ＭＣＭ７プロモーターおよびＡＰ４Ｍ１プロモーターを有するＢＤＰ１２、ＴＰＲＡ１プロモーターおよびＭＣＭ２プロモーターを有するＢＤＰ１３、ＴＩＭＭ８プロモーターおよびＳＤＨＤプロモーターを有するＢＤＰ１４、ＩＫＺＦ５プロモーターおよびＡＣＡＤＳＡＢプロモーターを有するＢＤＰ１５、ＳＴＹＸＬ１プロモーターおよびＭＤＨ２プロモーターを有するＢＤＰ１６が含まれる。両方向性プロモーターの例は、例えば、ｓｍｏｌ２の例は配列番号３３であり、ＢＤＰ１の例は配列番号３４であり、ＢＤＰ３の例は配列番号３５であり、ＢＤＰ４の例は配列番号３６であり、ＢＤＰ５の例は配列番号３７であり、ＢＤＰ６の例は配列番号３８であり、ＢＤＰ７の例は配列番号３９であり、ＢＤＰ８の例は配列番号４０であり、ＢＤＰ９の例は配列番号４１であり、ＢＤＰ１０の例は配列番号４２であり、ＢＤＰ１１の例は配列番号４３であり、ＢＤＰ１２の例は配列番号４４であり、ＢＤＰ１３の例は配列番号４５であり、ＢＤＰ１４の例は配列番号４６であり、ＢＤＰ１５の例は配列番号４７であり、ＢＤＰ１６の例は配列番号４８である。
GGCTGTCCCAGCACCTCAGCGCAGAGCAAGTGGTGGTCAGGGGAGCGTCTCAAATCCTGCGCAGCCCAACGTCCGGCGCCGCCAAGTGACGCACGAGGTGCTGTGACTCGTGCCAGCCCCCTAATCTGCGGAAGTGGAGTGCGGGGAGTGCGCCGGAAGAGGGGTACGGAAGTGCGCCGGAAGTGGGGTGCGGAGGTGTGCAGCGCGCTGTCAGACTGGCTCGCAGGCGGCGCGGCCGGCGGACCCGTTCGAGACAGCGCGGGCGGCTCGGGTCCCCTGGGGCTCCGCAGCAGGAGGACGCC（配列番号３３）
CGCCTCTTCTCTGCCTAGAGGAAAAGAAAACGAGCTCCCATGAACACGAGGGGCAAACGAGGAAGAGCGACGCGTAAGTGGCAGCGGCAGCCAATCGCGCACCGAACGGCTGGGCCGGCATTGTGACGTCTCTGGCAGCACTGACGTGGCCCCTCCCTGAGCCAGGGGCCCAGCTGGTCGCGGTCCCCCCCTCAACATGGCGGCAGCGGTGCTCTAGGCGCCGGAAGGGGGCGTGAATCGGTGCGACCGCGCGCGTGCGCAGTACCGGGTCCGCGCCTGTCCCCGAAACTTCGCACCCCGTCGAACTCTCGCGAGAGCGGTATCTGCGTGTCGGGACGTGCGGAGGCTCTCACTTTCCGTC（配列番号３４）
CATGTTGCTTGTCTGGGCAAATTCCACTTCGCGAGTGACGCACCCGGCCGCGATGCGCTAGAACGCCGGCCCCGCCCCGAGGCGGTGCGCTTGGCCACGCCCCTTCGTTGGAGGCCTAGTCACGCCCCTAAAGGAAGCTCCACCCCATACCCGTGGCCACTAAAAAACTGCGGGAAGCAGGAAAGAGCACAACAGGTTTCTCTCTATTTCCGGTGTATTGTATCCTCACGTTTCCGGAGATTGACGTTGCTCTTGTGTTCTCGCGAGAGGCGGGAAAGGGCGCAGGGTTTGAAACATG（配列番号３５）
CATGCCTAGCGCCACGCGCCGAGAGCGCACACCACTGCAGTCCCGGGACCACGAGGCACGACAGCTCCCTCGGCGAGACCACCCGTTGGTACCGGGCCGCGGCGGGCGGCGGGGGTGGGAAGCTGGAGGAGGAGCGTTAGCAGCAACTCGCGCTGGGAAGAAGCCGGCGCTGCGCACGCGCCCGGCCCGCCACTGCGCACGCGCCCGCGGAAGTGGCGGCTCCCGTGTGCAGGTTGAGCCTAGGTGGGCGGGGCGGGAGGCGGAAGGGCCGCGGTGCGCAGCCGCGTCAACGGCCCTTCGCAGCGGGCGCGCTGTCAGACCTCA（配列番号３６）
CATTGGGACCCGTGGCGACGGCGGCCACGACGGCCCTCGGGCACCCGGCAGCGGCTTGGACCTTCCCGTACCCGACGGGAGTGCGAAGCGGAGGGAGAGGGGGGGACCGAGCCCGGGCCCGGGCTGAGGGGTGGGGGAGAGGCCGCCCTGCGCTGCTCGCGCCCCCACACCCGCTACCGGCAACGACTACTGTGAGGTGACAGAGAGGGGACAGGGAGGGCCCACACGGAAGAGGGGGCGGGGGCAGGGATGCACTTTTGCGCATGTGCTTACAGTCCTGACGTAGGAAGGGGCGGGGCTTTGCCGAAGGGGGCGGGGCTCTCGCTGATGGGTTGGCTTTCGTCAGGGACATAGGTAGAAGCTGGTTGGGGAGTGTGCGTGCCAGCCTGACGCGATATAGTGCGCACATGCGTGATGACGTAGAGGGCGTTGATTGGGA（配列番号３７）
CATAGCGAGGCCGGCGATGCCGCAGCCACATCACCCTTCCGGGGCTCAGGCGGAAGAGGCTGCATGTCCCGTCTGCCCTTCTCGCCCTCTCCAGCCGTCCGGTTGGGCTTGTCACGGCACCGCCTACCAAGACGGGCGGTTAAGACACTAGGATAGGCTCCTCTCCACCGGAAAAGGCGGGATTTAGATCACGTCCCGCAGGCCGGCGGAAGTAGCTGATACTCTCATTGGTTGCAAAACCTTGATCTGTGAAAGCGGGCGTTTTGGAAGATACCGGAAGTAGAGTCACGGAGAGGTAGGATCCG（配列番号３８）
CATCGAGCAGGGTCCGGCTGCAGCAACGAGCCCAGCGCCGCAACGCCCAGGGTGTGGGGCGGAGTAAGATGTGAAACCTCTTCAGCTCACGGCACCGGGCTGCAACCGAGGTCTGAATGTTGCGAAAGCGCCCCAGACGCCGCCGCTGCTTTCCGGCCGCCCCCTCGGCTACAGCCGCCATTTCCACGCTCCACCAATCAAATCCATTCTCGAGGAAGACGCACCGCCCCCACACGCCCCGACCAATCGCTCGCGCTCTGGTTGCGCTGGCGCCTTAGGGGCTCCAGTGCCACCATTGCTTTTGCTGCTTTTCTGGCTTTCCCTTTCGGACATGCGCGCTCGGAGCAAGGCGCCCTCGCACTCAGCTTACCGCGCATGTACGTTGCCAGGGGTAACGCAGGTAGCCAAAGTGGCTTGTGGAGTGGCGACCGTTAGTGAGGCGGTTGCTGAGACAGACGCTGAGGCGGGTAGGAGGAGCCCGAGCCGTAAGGGAAGCCGTGATG（配列番号３９）
CAGGCTAGAGCCTCCGGGTGGCGCTTCTCGCCCTCAGTAACCGGTTACCTCCAGAACCAGGGCGCCAGCTCCGGCCATCCGCGGTTAAGCGGGAGCTCCCATTGGCTAATCGCACACTGAAACGCACGCCTTTTCCCGCCCCTGACGCTGCCGTCCAATGCGCGCCTCTCGACTCTGCTCCGCCCCGCCCCGCCCCCGTCGCCCTGCCTCCCTGGCGTATTTGCGCCATTGGTGGATATTCCGGACCGTGATGGTGGCGCTGCGCGTGCGCACTCGCTCCGAGCCCTGCTCCCGGGAGAGGGAGCTCTCGGGTCGGGGCTAGGGAAGGCTGACCCCGCTCGGCCCGGGTGAAAGGGCGGTGACGGCACTGGGTGGGGCCGAGCTCCAGGGCTGGCTGCTGGGCTGCTAAGGGAACTGTGAGCCGCTCAGAGCCGCGCGCCTCCCGGGCGGGGCGGGGCCGGCCGTGGGAGTCCGCGCGTGCCCGCGCCGAGCTGCCTGCTCCGGCGGCTTCGCTGCTAGCTCGCGGCGACGTCGGGCCGATTTTCCCAGGATG（配列番号４０）
CATAGCCAAAGGAGTCCGCTGCCGGTTGTTAGGCAACCGACGTGTACACTGACTCGGCGCCGTTCCCACCGCCCCGCGCGCGCAGCCCCGCTCCCCATTGGCCGTCCGCTCGTCGCCGCCTCTCCCTATTGGTGCAGGGCCGAAGAGGGTGGGACTAACCTGGCAAAGCCCCGGCCCAGCGCGGGGAGGGGCACGCTGGCGACAGAGCCCCGTCTTTATTGGGCAAGATCACGCCGTGAGCGCCAATTGGCTGAGTCGTCGCCGAGCTGGGCCAATCCTCTTGGTGGAGGAAGCTCGGCTGATTCTCGGCTCACGCGGGAGGGGAG（配列番号４１）
GTGGGTCACGTGGGCCGCGCCTCGGCCAATGCGGCGGCTGCGTAGCGCCCGGGCCCGCCCCTGAGCCGCGCGCACGTCGGGGGCGGGAGCGGTGCGCGCAACTTC（配列番号４２）
CATGGATGCAACACCCGATCCGCCTCGGGGACTGGGAAAGTTCCCTCCAGGGCTCCCACAGGCGCTCCGCCTCCTGAACTCCCATTGGCTGCTTTCGACGTTGTGCTCCACCCTTTCCGGGCGGGGCGGCAAAAATACTTCCCGTCTCTCCTTTTCGCCTATTGGCTCTGTCAAAGGTCGACTTCGTGACGTCAAAGAGCCTGGGCCAATCAGAGCACACCGGACTGCGTTTTCCCGAACGCCCGCAGCAGGGTCAGAAGGGAGGTGGCCGGTCTCCGTCGTGACCTCTGACGGTTTCTGAGCGTTGGCCTTTGGCACGCGCTACCCCCTTTTGCTTTGGTTCTGCCATG（配列番号４３）
CATCGCTGCCGAGGGCCGTGCGGCCGCGCTTGGCGGGCTCAGAGGTCTTGCTCCTGGGGAAGCTGAGAATCTCCGCGCGGTGGACTGTGGCCGGCCAACCGAAATTGGCGCGAAACGTCGCCCCCCACGTGACCGGCGCCACTGCGTGCGGGCCAATCGGACAAGGCGGCCTTCTTCACCTCCCGCTAGCCGCAAGCCAATCACCGTGCGGGCCTAGAATGAGTGACGGGGAGGCGGTGCGGGCGTCGGAAGGGAATCTCCGGGCGGGGTAGTGCAGGCGCCGGGTTTCCCGCGGTCCGAGCTGGCGCGGGCGGAGGAGAATCGCTCTTAAAGGGCCAGCGCACACGCGTTCTTTTGTTCCGGGGCCGCAGGGCGGGGCAGGCCCGACTTTCGCCGTCTTCTTGTCTACTCTCCAGAACGGCCATG（配列番号４４）
GCACGCGCACAGCGCCGGGCCGCACACCTCCGGGCTCTGGGCGGAGCGCCTCGGGCGTTGTAGGCGGGACCGGACCCTCTGGCCCGCCCCTCCGTGTCCCTTCTGGTCGCCAGTGGACGCCGACGTCATGACGTCGCGTTCCGTAGGGCTCTTCCCGGGCTTTGGTGGGTCACGTGAACCACTTTTCGCGCGAAACCTGGTTGTTGCTGTAGTGGCGGAGAGGATCGTGGTACTGCTATG（配列番号４５）
CATTGTTCGCCTCAGGCTCGCCACCTTCCGACAGCTGTGTTTGCGCATGCGCGACGGGTGTGCACCGCCTCTCGACTTCCGGTTCACCCAGCATTTCCTCTTCCCTGTTTTCTTTCGTCGTCGTGGGTGGGAATTGTCGCCTAAGTGGTTCCGGGTTGGTGGATGACCTTGAGCCCTCAGGAACGAGATG（配列番号４６）
ACCACACCGCCTTGTTAAATGCCGTCGCCGCCGCCGCCGTCTTCGTCACCGTCACAGTCGCCGCCGCCATCTTTGTTGTGTCTCCGACTCCCTTCCCGCCCCCCTGCCTTGCTCAAGTCTCGCGTGAGCAGGATGGAGGGCGAAAGCGAGGAGGGGCCTGTTTGTCTCTCTTGGGGTTCCGTAGGCAGCAGGGGGCAGGGATTAAGGGGGGGTGTGTGCGGGGCGGGTACTGAGTGGGCGGGGCCTTGCTCGGGTAACTCCCAGGGGCTGGCTAGAGACCCAGAGGCGCAGAGCGGAGAGGCCTGCGGCGAGGATG（配列番号４７）
ACCACACCGCCTTGTTAAATGCCGTCGCCGCCGCCGCCGTCTTCGTCACCGTCACAGTCGCCGCCGCCATCTTTGTTGTGTCTCCGACTCCCTTCCCGCCCCCCTGCCTTGCTCAAGTCTCGCGTGAGCAGGATGGAGGGCGAAAGCGAGGAGGGGCCTGTTTGTCTCTCTTGGGGTTCCGTAGGCAGCAGGGGGCAGGGATTAAGGGGGGGTGTGTGCGGGGCGGGTACTGAGTGGGCGGGGCCTTGCTCGGGTAACTCCCAGGGGCTGGCTAGAGACCCAGAGGCGCAGAGCGGAGAGGCCTGCGGCGAGGATG（配列番号４８）
さらなる両方向性プロモーターは、ＩＤＨ３Ｇ、ｅＩＦ２Ｂ１、ＸＰＣ、ＸＰＯ５、ＤＥＳＩ、ＴＭＥＭ１６７ａ、ＭＢＤ４、ＰＣＮＡ、ＣＥＴＮ２、ＳＭＹＤ４、ＰＭＳ２、ＭＣＭ７、ＴＰＲＡ１、ＴＩＭＭ８、ＩＫＺＦ５、およびＳＴＹＸＬ１からのプロモーターの１つと、ＳＳＲ４、ＧＴＦ２Ｈ３、ＬＳＭ３、ＰＯＬＨ、ＸＲＣＣ６、ＸＲＣＣ４、ＩＦＴ１２２、ＣＤＳ２、ＤＨＬ、ＲＰＡ１、ＡＩＭＰ２、ＡＰ４ＭＡ、ＭＣＭ２、ＳＤＨＤ、ＡＣＡＤＳＡＢ、およびＭＤＨ２からのプロモーターの１つとの対合により作製され得る。

【0155】

多シストロン性構築物は、その各々が、導入遺伝子の一部または全部に作動可能に連結された制御領域（場合により誘導性）およびＲＤＥを有する３つ以上のシストロンを有し得る。このカセットは、構築物上で反対方向に転写される２つのグループに編成され得る。２つ以上の導入遺伝子は、同じ制御領域から転写され得て、２つ以上の導入遺伝子は、下流の導入遺伝子に作動可能に連結されたＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列を有し得る。あるいは、２つ以上の導入遺伝子は、blog.addgene.org/plasmids-101-multicistrnic-vectorsに見られるPlasmids 101: Multicistronic Vectorsに記載される２Ａエレメントにより、作動可能に共に連結されている。一般的に使用される２Ａ配列には、例えば、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｔ２Ａ）（配列番号４９）、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（Ｐ２Ａ）（配列番号５０）；ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（Ｅ２Ａ）（配列番号５１）；およびＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（Ｆ２Ａ）（配列番号５２）が含まれ、それらのすべては、場合により、アミノ末端に配列ＧＳＧを含み得る。それにより、複数の導入遺伝子は、ＲＤＥ（または複数のＲＤＥ）を含む３’－ＵＴＲにより調節される単一転写物上に転写され得る。

【0156】

２シストロン性／多シストロン性ベクターは、２つ以上のシストロンの全体的発現を上昇させ得る（別個の構築物上へのシストロンの導入と対比して）。２シストロン性／多シストロン性構築物は、レンチウイルスベクターに由来し得る。２シストロン性／多シストロン性構築物は、ＣＡＲ、および導入遺伝子上にコードされるポリペプチド（例えばペイロード）をコードし得て、２シストロン性構築物は、細胞がＣＡＲにより活性化されると、導入遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現を上昇させ得る。

【0157】

発現構築物の形質導入頻度が上昇するように、発現構築物は、構築物の５’－ＬＴＲ中にあるＲＮＡスプライス部位を除去するように修飾され得る。多くのレンチウイルス形質導入構築物は、５’－ＬＴＲ中に残存スプライス部位を有し、この部位での、導入される核酸を変更するスプライシングイベントを通して、形質導入頻度を低下させ得る。例えば、ｐＣＤＨベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）により代表されるレンチウイルスベクター、レンチウイルスベクターであるｐＬＶＴＨ、ｐＲＲＬＳＩＮ、ｐＷＰＩおよびｐＷＰＸＬ、ならびに他のレンチウイルスベクターは、スプライス受容部位を含む、ＨＩＶ ５’－ＬＴＲの一部分を含有する。ベクターからのこのスプライス部位の除去は、修飾ベクターによる形質導入頻度を上昇させる（非修飾ベクターと比べて）。残存ＨＩＶ ５’－ＬＴＲ断片中にあるスプライス供与部位は、２つのヌクレオチド変化、Ｇ２９０ＣおよびＵ２９１Ａの生成により破壊され得る（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているKeane等、Science 348:917～921頁(2015)による、ＨＩＶスプライス部位のナンバリング）。このスプライス供与部位中の他の変化も、このスプライス部位をノックアウトするために生成され得る。他の形質導入ベクターも、形質導入／トランスフェクション後に所望の配列を破壊し得る残存スプライス部位を含み、それらのスプライス部位の除去は、それらのベクターによる形質導入／トランスフェクション頻度を上昇させることになる。

【0158】

本明細書に記載されるポリペプチドの修飾が望ましい場合がある。当業者は、バリアントポリペプチドを生成するために、所定の核酸構築物中において変更を生成する多くのやり方を認識する。そのような周知の方法には、部位特異的変異導入、変性オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅、核酸を含有する細胞の、変異誘発剤または放射線への曝露、所望のオリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、大きな核酸を生成するためのライゲーションおよび／またはクローニングと併用）、ならびに他の周知の手法が含まれる（例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているGillamおよびSmith、Gene 8:81～97頁、1979；Roberts等、Nature 328:731～734頁、1987を参照）。本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸は、選択された生物体中での核酸の翻訳を増強する、好ましいコドンをもたらすように修飾され得る。

【0159】

ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される他のポリヌクレオチドと実質的に同等であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも含み得る。ポリヌクレオチドは、他のポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらに典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有し得る。核酸は、本明細書に列挙されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、より典型的には少なくとも約９０％、さらに典型的には少なくとも約９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドの相補体も提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、増幅ＤＮＡ、もしくは合成ＤＮＡ）またはＲＮＡであり得る。そのようなポリヌクレオチドを得るための方法およびアルゴリズムは当業者に周知であり、例えば、所望の配列同一性のポリヌクレオチドを日常的に単離することができるハイブリダイゼーション条件を決定する方法が含まれ得る。

【0160】

タンパク質アナログまたはバリアント（すなわち、１つまたは複数のアミノ酸が、野生型ポリペプチドとは異なるように設計された）をコードする核酸は、部位特異的変異導入、またはプライマーが所望の点変異を有するＰＣＲ増幅を使用して産生され得る。適切な変異導入法の詳細な説明については、その各々が、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているSambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y. (1989)および／またはCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubel等編、Green Publishers Inc. and Wiley and Sons、N.Y (1994)を参照。Engels等、Angew Chem Intl Ed. 28:716～34頁、1989（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている）により記載されたものなど、当技術分野で周知の方法を使用する化学合成も、そのような核酸を調製するために使用可能である。

【0161】

バリアントを創出するためのアミノ酸「置換」は、好ましくは、１つのアミノ酸を、類似の構造および／または化学特性を有する他のアミノ酸で置き換えること、すなわち、保存的アミノ酸置換の結果である。アミノ酸置換は、関与する残基の、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の点での類似性に基づき行われ得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ；極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ；正電荷（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれ；ならびに負電荷（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。

【0162】

ＣＡＲＳをコードする導入遺伝子を含む、導入遺伝子をコードする核酸も本明細書に開示される。導入遺伝子をコードする核酸は、従来の方法により、ＲＮＡ制御デバイスの配列と組み合わせて、特定のＣＡＲのアミノ酸配列から容易に調製することができる。アミノ酸配列をコードする塩基配列は、各エレメントのアミノ酸配列に関する前記のＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＩＤまたはＧｅｎＢａｎｋの登録番号から入手可能であり、本発明の核酸は、標準的な分子生物学的および／または化学的手順を使用して調製され得る。例えば、塩基配列に基づき、核酸が合成され得て、本発明の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してｃＤＮＡライブラリから得られるＤＮＡ断片を組み合わせて調製され得る。

【0163】

核酸は、適切なプロモーターの制御下に発現するように、他の核酸と連結され得る。核酸はまた、核酸の効率的な転写を達成するために、プロモーターまたは転写開始部位と協同する他の調節エレメント、例えば、エンハンサ配列、ポリＡ部位、またはターミネータ配列を含む核酸とも連結され得る。本発明の核酸に加えて、核酸の発現を確認するためのマーカーであり得る遺伝子（例えば、薬物耐性遺伝子、レポーター酵素をコードする遺伝子、または蛍光タンパク質をコードする遺伝子）が組み込まれてもよい。

【0164】

核酸がエクスビボで細胞内に導入される場合、本発明の核酸は、前記の賦形剤に加えて、細胞内への核酸の転移を促進する物質、例えば、リポソームまたはカチオン性脂質などの、核酸を導入するための試薬と併用され得る。あるいは、本発明の核酸を運ぶベクターも有用である。特に、適切なベクターにより運ばれる本発明の核酸を含有する、生体への投与に適切な形態での組成物が、インビボ遺伝子療法に適切である。

【0165】

真核細胞内への核酸の導入
導入遺伝子を発現する細胞を産生するためのプロセスは、本明細書に記載される導入遺伝子をコードする核酸を真核細胞内に導入するステップを含む。このステップは、エクスビボで行われ得る。核酸を真核細胞に導入するための例示的な方法は、例えば、２０１６年３月１５日に出願された米国特許出願第１５／０７０，３５２号明細書、および２０１６年１２月５日に出願された米国特許出願第１５／３６９，１３２号明細書に記載されており、その両方とも、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている。

【0166】

ウイルスペイロード
導入遺伝子を標的細胞に送達するためにウイルスが使用され得る。ウイルスは、核酸構築物（例えば、トランスファープラスミド）をペイロードとして運び得るため、標的細胞遺伝子型および／または表現型を（一過性または安定に）修飾するための所望の核酸を標的細胞に送達し得る。これらの形質導入用途の多くでは、ウイルスにより運ばれる核酸は、ウイルスゲノムのすべては含まず、頻繁には、ウイルスゲノムの残りの大部分または全部を含むことなく、核酸構築物をウイルスにパッケージングするのに必要なウイルスゲノムシグナルを含む。例えば、標的細胞の形質導入のためレンチウイルスヘルパープラスミドおよびトランスファープラスミド系は、ａｄｄｇｅｎｅ社から入手可能である。他のヘルパーおよびトランスファープラスミド系は、いくつかの供給源（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｔａｋａｒａ社）から市販入手可能である。

【0167】

ペイロードとして使用される場合、複製およびコートタンパク質のためのウイルス遺伝子の発現のタイミングを、標的部位での受容体によるリガンドの結合に合わせることにより、ウイルスカプシドの合成、ペイロード核酸のパッケージング、およびペイロード核酸を含むウイルスの放出は、標的部位に限定することができる。そのような制御は、細胞が代謝状態の変化（例えば、標的への受容体結合後の解糖の活性化）を経ると発現を誘導するＲＤＥを使用して達成され得る。このＲＤＥ制御は、ウイルス遺伝子の発現用のマスタースイッチ因子の発現を調節し得る。例えば、転写調節因子は、適切なＲＤＥの制御下に置かれ得て、複製、コートタンパク質等のためのウイルス遺伝子は、その転写因子の制御下に置かれ得る。宿主細胞が、標的部位において、適切な受容体（例えば、ＣＡＲ）を通してリガンドに結合すると、それが細胞を活性化し、適切なＲＤＥによる転写因子の発現を誘導し、ウイルス複製タンパク質、コートタンパク質等の発現をもたらす。

【0168】

形質導入は、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびシュードタイプベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどを用いて実現され得る、またはセンダイウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ベクター、およびＨＳＶベクターが使用され得る。ウイルスベクターは、感染細胞内で自己複製しないように複製能力を欠いてもよい。

【0169】

宿主細胞を形質導入するためにレトロウイルスベクターが使用される場合、そのプロセスは、ベクターが保有するＬＴＲ配列およびパッケージングシグナル配列に基づき適切なパッケージング細胞を選択すること、ならびにパッケージング細胞を使用してレトロウイルス粒子を調製すること、により行われ得る。パッケージング細胞の例には、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１０６８６）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－９０７８）、ＧＰ＋Ｅ－８６およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ－１２（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている米国特許第５，２７８，０５６号明細書）、ならびにＰｓｉ－Ｃｒｉｐ（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているProceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、第85巻、6460～6464頁(1988)）が含まれる。レトロウイルス粒子は、高いトランスフェクション効率を有する２９３細胞またはＴ細胞を使用して調製することもできる。レトロウイルスに基づき産生されるレトロウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターのパッケージングに使用され得るパッケージング細胞の多くの種類が、多くの企業から広く市販入手可能である。

【0170】

哺乳類細胞内への遺伝子導入用に、いくつかのウイルスベースの系が開発されている。当技術分野で公知の手法を使用して、選択された遺伝子をベクターに挿入して、ウイルス粒子内にパッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離して、インビボまたはエクスビボのいずれかで、対象の細胞に送達することができる。いくつかのウイルス系が、当技術分野で公知である。アデノウイルスベクターが使用され得る。いくつかのアデノウイルスベクターが、当技術分野で公知であり、使用され得る。さらに、レンチウイルスベクターが使用され得る。

【0171】

医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載される、ＣＡＲＳおよび／または導入遺伝子－ＲＤＥ発現細胞、例えば、複数のＣＡＲＳおよび／または導入遺伝子－ＲＤＥ発現細胞を、１つまたは複数の医薬的もしくは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。そのような組成物は、緩衝液、例えば中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなど；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシンなど；抗酸化物質；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオンなど；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。本発明の組成物は、一態様では、静脈内投与用に製剤化される。

【0172】

医薬組成物は、処置（または予防）されるべき疾患に適切なやり方で投与され得る。適切な投与量は臨床試験により決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因により決定されることになる。

【0173】

適切な、医薬的に許容される賦形剤は当業者に周知である。医薬的に許容される賦形剤の例には、リン酸緩衝食塩水（例えば０．０１Ｍリン酸塩、０．１３８Ｍ ＮａＣｌ、０．００２７Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩などを含有する水溶液、食塩水、グリコールまたはエタノール溶液、および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩など、が含まれる。湿潤剤または乳化剤などのアジュバント、およびｐＨ緩衝剤も使用され得る。Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)（あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）に記載される医薬的に許容される賦形剤が、適切に使用され得る。組成物は、非経口投与、例えば、注射または注入に適切な公知の形態へ製剤化され得る。組成物は、懸濁剤、防腐剤、安定剤および／または分散剤、ならびに貯蔵中の有効期間を延長するための保存剤などの製剤用添加物を含み得る。

【0174】

本明細書に記載される真核細胞を活性成分として含む組成物は、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドが結合する抗原に応じて、例えば、がん（血液がん（白血病）、固形腫瘍（卵巣がん）等）、炎症性疾患／自己免疫疾患（尋常性天疱瘡、エリテマトーデス、関節リウマチ、喘息、湿疹）、肝炎、ならびに原因がインフルエンザおよびＨＩＶなどのウイルス、細菌、または真菌である感染症、例えば、結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、または深在性真菌症などの疾患の処置のために投与され得る。

【0175】

対象組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸注、留置または移植によるものを含む、任意の好都合なやり方で行われ得る。本明細書に記載される組成物は、患者に対して、経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内、鼻腔内、動脈内、腫瘍内、輸入リンパ管内へ、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に投与され得る。一態様では、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射により患者に投与される。一態様では、本発明のＴ細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射により投与される。Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位内に直接注射され得る。投与は、養子移入により行われてもよい。

【0176】

「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示される場合、投与されるべき本発明の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態の個体差を考慮して、医師により決定され得る。本明細書に記載される真核細胞を含む医薬組成物は、１０^４～１０^９細胞／ｋｇ体重、場合によっては１０^５～１０^６細胞／ｋｇ体重（それらの範囲内のすべての整数値を含む）の投与量で投与され得る。真核細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与することもできる。真核細胞は、免疫療法で一般的に知られている注入法を使用して投与することもできる（例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているRosenberg等、New Eng. J. of Med. 319:1676頁、1988を参照）。

【0177】

真核細胞の使用
ＣＡＲＳおよび／または導入遺伝子－ＲＤＥをコードする核酸は、ＣＡＲおよび／または導入遺伝子ポリペプチドを真核細胞内で発現させるために使用され得る。真核細胞は、例えばヒト細胞またはマウス細胞を含む、哺乳類細胞であり得る。真核細胞は、例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、またはマクロファージを含む、例えば、造血細胞でもあり得る。

【0178】

Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋もしくはＣＤ８＋）またはナチュラルキラー細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを用いて操作され得る。エフェクター機能の所望の量は、標的細胞上の標的抗原の公知の量（および／または密度）での、エフェクター機能の最適化量であり得る。エフェクター機能は、標的細胞殺滅、宿主免疫細胞の活性化、サイトカイン分泌、グランザイムの産生、アポトーシス誘導リガンドの産生、免疫系を調節する他のリガンドの産生等であり得る。エフェクター機能は、例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、および／またはＩＬ－１０などのサイトカインの分泌であり得る。エフェクター機能は、標的細胞の殺滅であり得る。標的細胞は、グランザイムにより殺滅され得る。標的細胞は、アポトーシスを経るように誘導され得る。ＣＡＲを含む真核細胞は、アポトーシスおよびグランザイムを通して標的細胞を殺滅し得る。

【0179】

導入遺伝子の発現を制御するためにＲＤＥ調節エレメントが使用され得る。この導入遺伝子発現は、ペイロードを標的部位に送達し得る。それらの導入遺伝子は、ウイルス構築物、またはペイロードがウイルスである場合はウイルスによっても運ばれ得る。導入遺伝子の発現は、真核細胞内で所望の変化を引き起こし得る。ＧＡＰＤＨにより調節されるＲＤＥが、ペイロード送達に使用され得て、真核細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞、または他の抗原提示細胞）は、標的部位に達すると活性化され得る（例えば、ＣＡＲにより）。ＣＡＲを通して真核細胞が標的部位で活性化すると、細胞が解糖を誘導し、ＲＤＥからのＧＡＰＤＨ放出が、ペイロードの発現および送達を可能にした。標的部位は、腫瘍または感染であり得て、導入遺伝子は、サイトカイン、ケモカイン、抗体、チェックポイント阻害剤、グランザイム、アポトーシス誘導因子、補体、細胞傷害性小分子を作るための酵素、ペプチドもしくは糖類を切断する酵素（例えば、バイオフィルムを消化するための）、他の細胞傷害性化合物、または標的部位で所望の効果を有し得る他のポリペプチドをコードし得る。チェックポイント阻害剤には、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ－１）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、およびリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）を含む、免疫チェックポイントにおいて作用する薬剤が含まれる。ペイロードとして使用され得るチェックポイント阻害剤の例には、例えば、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））、ペンブロリズマブ（キートルーダ（登録商標））、セミプリマブ（リブタヨ（登録商標））、アテゾリズマブ（テセントリク（登録商標））、アベルマブ（バベンチオ（登録商標））、デュルバルマブ（イミフィンジ（登録商標））、イピリムマブ（ヤーボイ（登録商標））、リリルマブ、およびＢＭＳ－９８６０１６が含まれる。ニボルマブ、アテゾリズマブおよびペンブロリズマブは、チェックポイントタンパク質ＰＤ－１において作用し、抗腫瘍免疫細胞のアポトーシスを阻害する。いくつかのチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１との間の相互作用を妨げる。イピリムマブは、ＣＴＬＡ４において作用し、ＣＴＬＡ４が腫瘍内で活性化Ｔ細胞を下方制御することを妨げる。リリルマブは、ＫＩＲにおいて作用し、ナチュラルキラー細胞の活性化を促す。ＢＭＳ－９８６０１６は、ＬＡＧ３において作用し、抗原特異的Ｔリンパ球を活性化し、腫瘍細胞の細胞傷害性Ｔ細胞媒介性溶解を増強する。

【0180】

ペイロードは、抗ＩＬ３３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗４１ＢＢ抗体、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＬ－１２、ＣＤ４０Ｌ、および／またはレプチンの１つまたは複数であり得る。ＩＬ－３３受容体は、Ｔ_ｒｅｇ（調節性Ｔ細胞）内で上方制御されており、抗ＩＬ３３抗体は、Ｔ_ｒｅｇの増殖および活性化を低下させる。抗ＬＡＧ３抗体もＴ_ｒｅｇの活性を低下させ得る。抗Ｉｌ３３抗体および抗ＬＡＧ３抗体は、Ｔ_ｒｅｇの活性を低下させるために単独でまたは一緒に使用され得て、それが、ＣＡＲ Ｔ細胞および他の抗がんＴ細胞の抑制を低下させ得る。抗ＴＩＭ－３抗体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＤＣ－１細胞との共局在を可能にする（それは、抗腫瘍応答を改善する）。ＭＡＲＣＯはマクロファージ上で発現し、腫瘍微小環境内では、これはＴ細胞に対して抑制性であり得る。抗ＭＡＲＣＯ抗体は、マクロファージによるこの腫瘍抑制を妨げる。抗ＶＩＳＴＡ抗体は、腫瘍微小環境内の好中球の量を減少させる。腫瘍微小環境内での高い好中球対Ｔ細胞比は、不良な患者転帰と相関する。腫瘍中の好中球を減少させることは、患者転帰および腫瘍細胞殺滅を改善し得る。ＩＬ－１５およびＩｌ－２１はナチュラルキラー細胞の増加を高め、Ｉｌ－１５はＣＤ８＋Ｔ細胞を救助し得て、Ｔ細胞疲弊を防ぎ得る。ＣＤ４０Ｌは、免疫応答におけるＴ細胞のプライミング、共刺激および活性化の点で中心的な役割を果たす。抗ＣＤ３９抗体は、腫瘍微小環境内でのアデノシンレベルを低下させ得る。腫瘍微小環境内での高レベルのアデノシンは、免疫抑制を誘導し得る。抗ＣＤ３９抗体は、この免疫抑制を低下させ得る。抗４１ＢＢ抗体は、Ｔ細胞がアポトーシスを経ることを妨げ得て、かつ腫瘍細胞にＰＤ１の発現を上方制御させることもできる（そのため抗ＰＤ１療法と併用され得る）。

【0181】

サイトカインには、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－β、および／またはＩＬ－１０が含まれ得る。細胞傷害性薬剤には、例えば、グランザイム、アポトーシス誘導因子、補体、または細胞傷害性小分子が含まれ得る。ペイロードは、遺伝子調節ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ１５５）、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなど、またはＣＲＩＳＰＲシステムと共に使用するガイドＲＮＡであり得る。ペイロードは、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、抗ＩＬ３３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＣＤ３９抗体、ＰＧＣ－アルファ、レプチン、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｏｘ４０－４１ＢＢ、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）、ＩＬ－２１、レプチン、ＧＯＴ２、ＮＡＭＰＴ、ＣＤ５６、ＩＬ－２スーパーカイン、抗ＲＥＧＮＡＳＥ－１ペイロード（例えば、ｍｉＲＮＡ）、Ｃ－ｊｕｎ、システイナーゼ酵素、シスチナーゼ酵素、ＰＣＢＰ１（ポリ（ＲＣ）結合タンパク質１）、補体（Ｂ、Ｃ１～Ｃ９、Ｄ、Ｃ５ｂ、Ｃ３ｂ、Ｃ４ｂ、Ｃ２ａの１つまたは複数）、ＢＭＰ－１、抗ＴＧＦｂ剤（例えば、抗ＴＧＦｂ抗体、可溶性ＴＧＦｂＲ、抗ａｖＢ６インテグリン抗体、天然ＴＧＦｂ結合タンパク質、小分子、例えば、ＧＷ７８８３８８、トラニラスト、ロサルタンなど、ＨＭＧ ＣｏＡ還元酵素阻害剤、メシル酸イマチニブ、ＰＰＡＲ－ｇアゴニスト、ロシグリタゾン、ピルフェニドン、ハロフジノン）、ＣＣＬ１９と組み合わせたＩＬ７（例えば、ＩＬ７－ｔ２Ａ－ＣＣＬ１９）、ｄｎＴＮＦＲ２、ｄｎＴＧＦＢＲ２、ＤＣＮ、ＤＫＫ１、ＯＫＴ３、ＮＯＳ２、ＣＣＬ５、抗４－１ＢＢアゴニスト抗体、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ２８アゴニストＡｂ、抗ＣＤ２９／抗ＶＥＧＦ、抗ＣＴＬＡ４ Ａｂ、抗ＩＬ１ｂ Ａｂ、ＢｉＴＥ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２破壊、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、ヒアルロニダーゼ、ＩＬ－１２、ＩＬ１５、ＩＬ１８、ＩＬ２、抗ＣＳＦ１Ｒおよび抗ＩＧＦ１、抗ＩＬ４、ＩＬ４受容体アンタゴニスト、ＩＬ４結合剤（例えば、可溶性ＩＬ４Ｒ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（例えば、分泌型ｅｃｔｏ－ＣＤ４０Ｌ）、膜ＣＤ４０リガンド、ＴＧＦＢＲアンタゴニスト、および／または４－１ＢＢリガンドであり得る。抗ＴＧＦｂペイロードは、多発性骨髄腫に向けられたＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、抗ＧＰＲＣ５Ｄ ＣＡＲ）と組み合わされ得る。ペイロードは、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている米国特許出願公開第２０１９０１８３９３２号明細書に見出されるものも含み得る。標的部位（例えば、非腫瘍標的部位）に送達されるペイロードは、例えば抗炎症性因子などの標的部位を保護する因子、調節性Ｔ細胞を標的部位に誘引する因子、またはサイトカイン、または免疫活性の抑制および低下を引き起こす他の因子であり得る。ペイロードは、ペプチドまたは糖類を切断する酵素、例えば、ヒアルロニダーゼ、ヘパラナーゼ、メタロプロテイナーゼ、および例えば望ましくないバイオフィルムを消化するために使用され得る他のタンパク質分解酵素であり得る。骨髄細胞により引き起こされる免疫抑制または阻害を低下させる骨髄修飾ペイロード（「ＭＭペイロード」）が送達され得て、例えば、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＴＮＦα、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、および／またはＩＬ－１２が含まれる。２つ以上のＭＭペイロードも、送達に関する異なる薬物動態をもたらすＲＤＥを使用して、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、ｓｉｄｅ－ＣＡＲおよび／または他の受容体細胞（例えばＴ細胞）により送達され得る。例えば、異なるＭＭペイロードは、異なるＲＤＥにより制御可能であるため、異なるＭＭペイロードの送達のＣｍａｘは、異なる時間において生じることになる。例えば、骨髄修飾ペイロードは、炎症誘発性および殺腫瘍性である活性化Ｍ１マクロファージを促進し得る。Ｍ１表現型を促進するＭＭペイロードは、ＣＳＦ１Ｒのアンタゴニスト（ＣＳＦ１受容体を遮断して活性化しないアンタゴニスト、およびＣＳＦ１に結合し、そのＣＳＦ１Ｒとの相互作用を防ぐ薬剤）である。ＣＳＦ１Ｒのそのようなアンタゴニストには、例えば、小分子阻害剤、ＰＬＸ３３９７（ペキシダルチニブ、Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ社）、ＰＬＸ７４８６（Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ社）、ＡＲＲＹ－３８２（Ａｒｒａｙ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ社）、ＪＮＪ－４０３４６５２７（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ社）、およびＢＬＺ９４５（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）が含まれる。ＣＳＦ１Ｒのアンタゴニストである例示的な抗体には、例えば、エマクツズマブ（Ｒｏｃｈｅ社）、ＡＭＧ８２０（Ａｍｇｅｎ社）、ＩＭＣ－ＣＳ４（ＬＹ３０２２８５５、Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ社）、およびＭＣＳ１１０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）が含まれる。あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているCannarile等、J. Immunotherp. Cancer 5:53 (2017)。ペイロードは、デコリン、ビグリカン、またはフィブロモジュリン／ルミカンなどの小型ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）とペイロードを融合または会合させることにより、標的細胞（例えば、腫瘍部位）に局在化され得る。デコリン、ビグリカン、またはルミカンは、標的細胞の近くでコラーゲンに結合し得て、この結合が、標的部位においてか、またはその近くにペイロードを局在化させることになる。この戦略は、細胞傷害性ペイロードの、標的細胞（例えば腫瘍）への局在を維持するために特に有用である。デコリンおよびビグリカンはまた、標的部位においてか、またはその近くでＴＧＦ－ベータに結合し、操作されたＴ細胞の抑制を低下させることもでき、そのためこれらは、それ自身、ＴＧＦｂを低下させるためのペイロードとして使用され得る。デコリン、ビグリカン、および／またはルミカンペイロードはさらに、構成的に発現され得るか、またはＲＤＥの制御下で中程度レベルのベースライン発現により発現され得る（細胞活性化時の発現上昇を伴う、低レベルの構成的発現を模倣）。ペイロードは、前記のいずれかの１つまたは複数であり得る。ペイロードは、標的部位を画像化できるようにするイメージング剤であり得る。ペイロードは、直接画像化され得るポリペプチドであってもよく、または基質と相互作用して、画像化され得る産物を作るポリペプチドであってもよい。イメージングポリペプチドには、例えば、チミジンキナーゼ（ＰＥＴ）、ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体、ヨウ化ナトリウムトランスポータ（ＮＩＳ）、デオキシシチジンキナーゼ、ソマトスタチン受容体サブタイプ２、ノルエピネフリントランスポータ（ＮＥＴ）、カンナビノイド受容体、グルコーストランスポータ（Ｇｌｕｔ１）、チロシナーゼ、ヨウ化ナトリウムトランスポータ、ドーパミンＤ２（Ｄ２Ｒ）受容体、修飾ハロアルカンデハロゲナーゼ、チロシナーゼ、β－ガラクトシダーゼ、およびソマトスタチン受容体２が含まれる。これらのレポーターペイロードは、例えば、光学イメージング、超音波イメージング、コンピュータ断層撮影イメージング、光干渉断層撮影イメージング、Ｘ線撮影イメージング、核医学イメージング、陽電子放射断層撮影イメージング、断層撮影イメージング、光音響断層撮影イメージング、Ｘ線イメージング、サーマルイメージング、蛍光透視イメージング、生物発光イメージング、および蛍光イメージングを使用して画像化され得る。これらのイメージング法には、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）または単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）が含まれる。

【0182】

標的細胞を直接殺滅し得る複数の系が、使用のために想定される。これらには、例えば、標的細胞へのウイルス遺伝子または細菌遺伝子の導入が含まれる。このアプローチは、非毒性プロドラッグを毒性のものに変える。広く研究されている系があり、つまり、プロドラッグ５－フルオロシトシン（「５－ＦＣ」）を５－フルオロウラシル（「５－ＦＵ」）に変換する、大腸菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子（「ＣＤ」）；およびガンシクロビル（「ＧＣＶ」）を、がん細胞の酵素によりガンシクロビル三リン酸に変換されるガンシクロビル一リン酸に変換する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（「ＨＳＶ－ｔｋ」）である。腫瘍細胞の直接殺滅において有用なＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ系は、腫瘍細胞へのＨＳＶ－ｔｋのアデノウイルス移入と、その後のガンシクロビルの投与を含む。具体的には、チミジン、ＨＳＶ－ｔｋを肝細胞癌（「ＨＣＣ」）細胞に移入させて、ガンシクロビルに対する感受性を付与するために、組換え複製欠損アデノウイルスが利用される。３つの有用なＨＣＣ細胞株には、例えば、ｌａｃＺレポーター遺伝子を運ぶ組換えアデノウイルス（「Ａｄ－ＣＭＶｌａｃＺ」）により、インビトロで効率的に感染し得るＨｅｐ３Ｂ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、およびＨｅｐＧ２が含まれる。ＨＳＶ－ｔｋ遺伝子を運ぶ組換えアデノウイルス（「ＡｄＣＭＶｔｋ」）で感染させたＨＣＣ細胞内でのＨＳＶ－ｔｋの発現は、ガンシクロビルに対する感受性を用量依存性に誘導する（Qian等、Induction of sensitivity to ganciclovir in human hepatocellular carcinoma cells by adenovirus-mediated gene transfer of herpes simplex virus thymidine kinase, Hepatology, 22:118～123頁(1995)）doi.org/10.1002/hep.1840220119。

【0183】

ペイロードが、遺伝子調節ＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、および／またはマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ１５５）などである場合、調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）は導入遺伝子であり得るか、またはポリペプチドをコードする導入遺伝子のイントロン内に含まれ得る。例えば、Du等、FEBs J. 273:5421～27頁(2006)およびChung等、Nucl Acids Res. 34:e53頁(2006)に記載されるｍｉｒ１５５カセットを、ペイロードとして使用してもよく、またはペイロードとして使用される導入遺伝子のイントロン内へと操作により導入してもよい。ｍｉｒ１５５カセット（または他の調節ＲＮＡ用のカセット）を、イントロンとして導入遺伝子内へと操作により導入してもよく、または導入遺伝子が、場合により追加のヌクレオチドを含むｍｉｒ１５５カセットであってもよい。調節ＲＮＡ導入遺伝子（または調節ＲＮＡをイントロンとして含む導入遺伝子）は、ＲＤＥの制御下に置かれ得る。ＲＤＥは、核内でのＲＮＡプロセシングおよび安定性に影響を与え得る。調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）をコードするか、または調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）イントロンを含む導入遺伝子をコードする導入遺伝子が転写された後、転写物は、核マイクロプロセッサ複合体または他の核成分により核内でプロセシングされて、ヌクレオチドステムループ前駆体調節ＲＮＡ（例えば、プレｍｉｒ１５５）を作ることができる。プレ調節ＲＮＡ（例えば、プレｍｉｒ１５５）ステムループは、核から輸出され、ダイサーによりプロセシングされて短いＲＮＡ二重鎖を形成する。短いＲＮＡ二重鎖に、アルゴノート（Ａｇｏ）が結合してＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれるマルチサブユニット複合体のコアを形成する。調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）をコードする導入遺伝子、または調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）イントロンを含む導入遺伝子にＲＤＥを作動可能に連結することにより、調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）の発現は、ＲＤＥにより調節され得る。真核細胞の活性化（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲによるＴ細胞の活性化）後の発現の、異なるタイミングおよび動態をもたらすために、異なるＲＤＥが、調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）導入遺伝子、または調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）イントロンを含む導入遺伝子に作動可能に連結され得る。細胞の活性化後すぐに発現をもたらすＲＤＥ（例えば、ＡＵ２もしくはＡＵ１０１）、活性化から７２～９６時間後に高い発現をもたらすＲＤＥ（例えば、ＡＵ５もしくはＡＵ２１）、または発現から１９２時間にわたり発現の上昇をもたらすＲＤＥ（例えば、ＡＵ１９もしくはＡＵ２２）が使用され得る。調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）の連続発現をもたらすであろうＲＤＥ、または細胞の活性化後の一定期間の発現と、その後の発現低下をもたらすであろうＲＤＥも選択され得る。協力して連続発現をもたらす、発現の異なる薬物動態プロファイルを生み出すＲＤＥを使用して、細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化後に調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）の連続発現をもたらすために、異なるＲＤＥを含む多重調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）構築物（例えば、導入遺伝子としてのｍｉｒ１５５、またはｍｉｒ１５５イントロンを含む導入遺伝子を含む）が使用され得る（例えば、実施例１１を参照）。あるいは、選ばれたＲＤＥ、またはＲＤＥの組合せ、または異なるＲＤＥを含む調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）の組合せが、調節ＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）の所望の発現プロファイルをもたらすために使用され得る。

【0184】

ｍｉｒ１５５の上方制御は、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞、および免疫学的チャレンジ後のメモリーＴ細胞の形成と関連している。Ｔ細胞（例えば、標的抗原により活性化されるＣＡＲ Ｔ細胞）の活性化の間のｍｉｒ１５５発現の上方制御は、標的細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞応答を強化するであろう。ｍｉｒ１５５を異種ＲＤＥ（例えば、ＧＡＰＤＨに応答するＲＤＥ）の制御下に置くことは、ｍｉｒ１５５の上方制御を、Ｔ細胞の活性化と結び付けるため、ｍｉｒ１５５は、活性化Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋、ＣＡＲ Ｔ細胞）において上方制御されることになる。この上方制御は、活性化Ｔ細胞の増殖を亢進させ得る。上方制御はさらに、Ｔ細胞疲弊および老化を軽減させ得る。上方制御はさらに、Ｔ細胞エフェクター機能を強化して、標的細胞殺滅の増強をもたらし得る。

【0185】

Ｔ細胞のエフェクター機能は、ＴＣＦ７および／もしくはＴｏｘ発現の下方制御、ならびに／またはＩＬ－１５発現の上方制御によっても増強し得る。ＴＣＦ７は、高移動度群（ＨＭＧ）ボックス転写活性化因子のＴ細胞因子／リンパ系エンハンサ結合因子ファミリーのメンバーである。この遺伝子は主にＴ細胞中で発現し、ナチュラルキラー細胞および自然リンパ系細胞発生において重要な役割を果たす。ＨＭＧボックスタンパク質ＴＣＦ７は、自己再生と分化との間の切換えの調節因子であり得る。ＴＣＦ７は、自己再生中のＣＤ３４＋細胞に特有の遺伝子の発現の促進において二重の役割を有し得て、部分的に分化したＣＤ３４－状態で活性化される遺伝子は抑制する。ＴＣＦ７は、ナイーブな未分化状態から、分化したエフェクター細胞状態へと細胞を切り換える転写因子のネットワークを調節し得る。ＴＣＦ７が発現されると、細胞はよりナイーブであまり分化していない自己再生状態をとる。ＴＣＦ７は、ｍｉＲＮＡ、例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、および／またはｍｉＲ－５４１－３ｐなどを使用して下方制御され得る。一例では、これらのｍｉＲＮＡの１つまたは複数は、転写物にｈｎＲＮＰＬＬが結合するとスプライスアウトされる、ペイロードの１つまたは複数のイントロン中にコードされ得て（前記を参照）、ｈｎＲＮＰＬＬを作る活性化細胞中でペイロードが発現されると、これらのｍｉＲＮＡがＴＣＦ７を下方制御するであろう。あるいは、ＴＣＦ７をコードする導入遺伝子が、活性化ＣＡＲ Ｔ細胞のオフスイッチとして使用され得る。エフェクターであるＣＡＲ Ｔ細胞が、標的がん細胞を殺滅した後でＴＣＦ７が発現する場合、これはＣＡＲ Ｔ細胞をナイーブな未分化状態（ＣＡＲ Ｔ細胞のオフ状態）になるように強いるはずである。ＴＣＦ７をコードする導入遺伝子は、誘導性プロモーター（例えば、リガンド誘導性である誘導性プロモーター）の制御下に置かれ得るか、または細胞活性化から８日以上後に発現をもたらすＲＤＥの制御下に置かれ得る（例えば、実施例１１を参照）。ＴＣＦ７の発現は、リガンド（または誘導性プロモーターに対する他の誘導因子）の除去によりオフにすることができる、および／またはＲＤＥ制御が発現をオフにするであろう。それが、ＣＡＲ Ｔ細胞を、他のがん細胞において標的リガンドに結合することにより再活性化され得る状態に戻し得る。

【0186】

胸腺細胞選択関連高移動度群ボックス（ＴＯＸ）タンパク質は、ほぼ同一のＨＭＧ－ボックス配列を共有するタンパク質（ＴＯＸ２、ＴＯＸ３、およびＴＯＸ４）の小さなサブファミリーのメンバーである。ＴＯＸは、Ｔ細胞受容体の強い抗原刺激により誘導され得て、ＴＯＸはＴ_ＥＸ（疲弊Ｔ細胞）の中心的調節因子であり得る。ロバストなＴＯＸ発現は、Ｔ_ＥＸ細胞型の発生への運命決定をもたらし得る。ＴＯＸ疲弊は、慢性抗原刺激の状況において、Ｔ細胞過剰刺激および活性化誘導細胞死を相殺してバランスを保ち得る。エフェクターＴ細胞（例えば、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、低いＴｏｘを有し得るのに対し、より高レベルのＴｏｘは、エフェクター細胞をＴ_ＥＸ細胞になるように強いる。ＴＥＸ細胞は、低下したエフェクター機能を有するが、低レベル感染または少数のがん細胞に対しては依然として有効である。

【0187】

Ｔ細胞のエフェクター機能は、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））をコードするペイロードをＲＤＥの調節下に含めることにより増強し得る。Ｔ細胞の活性化後、ＲＤＥ制御は、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡの発現をもたらすであろう。このｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞内のＴｏｘのレベルを下げ、活性化Ｔ細胞によるＴ_ＥＸ形成を阻害し、標的に対してより活性なエフェクターＴ細胞をもたらすであろう。さらに、ペイロードは、活性化Ｔ細胞を所望の時間にＴ_ＥＸ表現型になるように強いるオンオフスイッチとして使用されるＴｏｘそれ自体であり得る。オフスイッチとして使用される場合、Ｔｏｘ発現は、所望の時間に（例えば、適切なリガンドの添加により）Ｔｏｘを発現するように誘導され得る誘導性プロモーターの制御下にあり得るか、ＴｏｘはＲＮＡ制御デバイスまたはＤＥにより制御され得る（リガンドが発現を誘導し得る）か、またはＴｏｘは、細胞の活性化後、遅い時間間隔で発現をもたらすＲＤＥの制御下に置かれ得る（例えば、実施例１１を参照）。Ｔ細胞の機能的状態およびタイプは、電磁放射線でＴ細胞を処置することにより目的に合わせることができる。ＵＶ領域中の電磁放射線は、Ｔｒｅｇ細胞になるようにＴ細胞を調整することができる。例えば、ＵＶＡ／ＵＶＢの線量は、Ｔｒｅｇの形成を誘導し得る。青色光領域中の電磁放射線は、Ｔ細胞を活性化し得る。

【0188】

例示的なペイロードは、細胞から分泌されるＡｐｏＥ（例えば、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３および／またはＡＰｏＥ４）をコードする導入遺伝子である。ＡｐｏＥは、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）上の受容体（例えば、ＬＲＰ８）に結合し、ＭＤＳＣの生存を低下させることができる。ＭＤＳＣは、特定の疾患状態で増加し得る抑制性自然免疫細胞の不均一な集団である。一部のがん（例えば、黒色腫、肺がん、乳がんおよび卵巣がん）では、ＭＤＳＣレベルは、腫瘍中および患者の血漿中で実質的に上昇し得る。高レベルの循環ＭＤＳＣを有するそのような患者は、チェックポイント遮断にあまり応答することができない。ＭＤＳＣは、これらの患者における免疫抑制を仲介し、血管新生を誘導することができる。ＡｐｏＥ（例えば、ＡｐｏＥ４）のペイロード発現は、腫瘍中のＭＤＳＣ、および血清中を循環するＭＤＳＣの数を減少させて、腫瘍進行および転移性コロニー形成の抑制をもたらすことができる。腫瘍中のＭＤＳＣの減少は、他の免疫細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）が腫瘍細胞をより効率的に殺滅することも可能にする。ＡｐｏＥペイロードは、ＬＲＰ８受容体を発現する骨髄性悪性腫瘍に直接作用することもできる。そのような例では、骨髄性がん細胞へのＡｐｏＥのペイロード送達は、そのがん細胞を抑制および／または殺滅し得る。したがって、ＡｐｏＥは、ＬＲＰ８＋ＡＭＬを含む、ＬＲＰ８＋である骨髄性悪性腫瘍に送達するためのペイロードであり得る。真核細胞（例えば、初代Ｔ細胞）によるＡｐｏＥペイロードの送達は、他の治療剤、例えば、抗がん剤（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞、化学療法薬、放射線、チェックポイント阻害剤、または本明細書に記載される抗がん治療薬のいずれか）などと併用されてもよい。ＭＤＳＣに対するＡｐｏＥ効果は、他の抗がん剤の作用を強化し得る。

【0189】

他の例示的なペイロードは、ＮＯシンターゼ（例えば、ｉＮＯＳ、ｎＮＯＳおよびｅＮＯＳ）をコードする導入遺伝子である。ＮＯシンターゼは、ＧＡＰＤＨに結合することができ、ＧＡＰＤＨを捕捉することができ、細胞が活性化されて解糖が誘導されると、ＲＤＥ（ＧＡＰＤＨが結合した）制御導入遺伝子（もしくは天然遺伝子）を発現できるようにするか、またはＲＤＥ（ＧＡＰＤＨが結合した、例えば、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、およびＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２））制御導入遺伝子（もしくは天然遺伝子）からの発現を上昇させる。ＮＯシンターゼの発現は、ＲＤＥに結合し得るＧＡＰＤＨの量を減少させること、および／またはＧＡＰＤＨがＲＤＥに結合できない時間を長くさせることにより、ＲＤＥ（ＧＡＰＤＨが結合した）制御発現を誘導し得る（ＧＡＰＤＨへの結合により）、および／またはＲＤＥ（ＧＡＰＤＨが結合した）制御発現を強化し得る。細胞活性化に対するＲＤＥ（ＧＡＰＤＨが結合した）応答を高めるためにＮＯシンターゼが使用される場合、ＮＯシンターゼをコードする導入遺伝子は、ＲＤＥの制御下に置かれ得て、その結果、細胞が活性化されると、ＮＯシンターゼをコードする導入遺伝子からの発現が誘導されることになる。ＲＤＥ（ＧＡＰＤＨが結合した）制御遺伝子からの発現を誘導するためにＮＯシンターゼが使用される場合、ＮＯシンターゼは誘導性制御下に置かれ得て（例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている米国特許第９，７７７，０６４号明細書に開示される誘導性プロモーター、ＲＮＡ制御デバイス、または不安定化エレメント）、ＮＯシンターゼ発現の誘導は、ＲＤＥ（ＧＡＰＤＨが結合した）制御遺伝子からの発現を誘導する。

【0190】

例示的なペイロードは、ＨＳＶ－チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）をコードする導入遺伝子である。ＨＳＶ－ＴＫは、アジュバントとして、および／または患者において炎症性応答を誘導するスーパー抗原として使用され得る。そのように使用される場合、細胞は、標的部位でＨＳＶ－ＴＫペイロードを分泌し、炎症性応答を誘導する。ＨＳＶ－ＴＫをコードする導入遺伝子は、操作された細胞（例えば、ＲＤＥ制御ペイロードの有無にかかわらずＣＡＲ Ｔ細胞）を排除するためのキルスイッチとしても使用され得る。キルスイッチとして使用される場合、ＨＳＶ－ＴＫは、後期発現ＲＤＥにより制御されてもよく、そのためＨＳＶ－ＴＫは、ＣＡＲ Ｔ細胞が標的部位で作用した後に発現するか、またはＨＳＶ－ＴＫを発現する導入遺伝子は、リガンド誘導性制御手段により制御されてもよいため、ＨＳＶ－ＴＫタンパク質は、所望の時間に導入されるリガンドに応じて発現することになる。キルスイッチ用途では、ガンシクロビルが細胞に与えられ得て、ＨＳＶ－ＴＫは、ガンシクロビルを、細胞傷害効果により細胞を殺滅するＧＣＶ三リン酸に変換する。ＨＳＶ－ＴＫを発現する導入遺伝子は、ウイルスペイロードに含めることもできるため、ウイルスが標的細胞を感染させると、標的細胞はＨＳＶ－ＴＫを発現することになる。ガンシクロビルが標的細胞に与えられ、標的細胞は、ＨＳＶ－ＴＫを使用して、ガンシクロビルを、標的細胞に毒性であるＧＣＶ三リン酸に変換する。

【0191】

真核細胞は、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドを介して特異的抗原に結合し、ＣＡＲ、ＤＥ－ＣＡＲ、および／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲポリペプチドにシグナルを真核細胞内へと伝達させ得るため、その結果、真核細胞が活性化されて、適切なＲＤＥ－導入遺伝子を発現することができる。ＣＡＲＳを発現する真核細胞の活性化は、真核細胞の種類、およびＣＡＲＳの細胞内エレメントに応じて異なる。真核細胞は、ＣＡＲＳを通した真核細胞の刺激に応じたエフェクター機能に細胞を備えさせるＲＤＥ転写物を発現し得る。

【0192】

ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞は、疾患を処置するための治療剤として使用され得る。治療剤は、ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞を、活性成分として含み得て、適切な賦形剤をさらに含んでもよい。賦形剤の例には、組成物のための医薬的に許容される賦形剤が含まれる。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞が投与される疾患は、疾患が真核細胞、および／またはＲＤＥ－導入遺伝子の産物に対する感受性を示す限り、特に限定されない。

【0193】

処置され得る疾患の例には、がん（血液がん（白血病）、固形腫瘍（卵巣がん）等）、炎症性疾患／自己免疫疾患（喘息、湿疹）、肝炎、ならびに原因がインフルエンザおよびＨＩＶなどのウイルス、細菌、または真菌である感染症、例えば、結核、ＭＲＳＡ、ＶＲＥ、および深在性真菌症、他の免疫介在性疾患、例えばアルツハイマー病またはパーキンソン病のような神経変性疾患、ならびに糖尿病のような代謝疾患が含まれる。受容体（例えば、ＣＡＲ）は、真核細胞を疾患細胞に向けることができ、疾患細胞において受容体がその標的に結合すると、受容体はシグナルを真核細胞内に送り、ＲＤＥ－導入遺伝子の発現をもたらすことができる。ＲＤＥ－導入遺伝子は、疾患細胞の処置または殺滅において有用であるポリペプチドをコードする。がんおよび／または固形腫瘍は、前記されたものなどの腫瘍関連（またはがん関連）抗原に結合する受容体を発現する真核細胞で処置され得る。受容体が腫瘍関連抗原に結合すると、受容体は、ＲＤＥ－導入遺伝子の発現を引き起こすシグナルを、細胞内に送る（例えば、シグナルは、ＲＤＥ－転写物の発現につながるＲＤＥ結合タンパク質をもたらす）。ＲＤＥ－転写物は、真核細胞ががんを治療するように真核細胞を活性化するポリペプチドをコードし得る、および／またはＲＤＥ－転写物は、それ自体ががんを治療するポリペプチド（例えば細胞傷害性ポリペプチド）をコードする。

【0194】

自己免疫疾患（例えば、尋常性天疱瘡、エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病）は、自己免疫疾患に関連する免疫タンパク質に結合する、ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体、および／または他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞で処置され得る。受容体または標的化ポリペプチドは、自己免疫疾患の処置において有用なポリペプチドをコードするＲＤＥ－導入遺伝子の発現を誘発し得る（例えば、ポリペプチドは、自己免疫疾患を引き起こす細胞を調節するか、またはそれらの細胞を殺滅することができる）。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞は、自己免疫疾患に関わる抗体を作る細胞を標的にし得る（例えば、ＲＤＥ－導入遺伝子は、抗体産生細胞を殺滅するか、またはそれらの細胞による抗体の産生を阻害するポリペプチドをコードし得る）。ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、および受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞は、自己免疫疾患に関わるＴリンパ球を標的にし得る（例えば、ＲＤＥ－導入遺伝子は、標的Ｔリンパ球を殺滅するか、またはＴリンパ球の活性を調節するポリペプチドをコードし得る）。

【0195】

ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体、および／または他の受容体または標的化ポリペプチドを発現する真核細胞を活性成分として含む治療剤は、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、動脈内、静脈内、腫瘍内に、または輸入リンパ管内へ、非経口投与により、例えば、注射または注入により投与され得るが、投与経路は限定されない。

【0196】

ＲＤＥ－導入遺伝子またはＲＤＥ転写物、ならびに場合により、ＣＡＲＳ、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、自然免疫受容体および／または他の受容体または標的化ポリペプチドは、攻撃的な抗腫瘍特性を有するＴリンパ球、例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれているPegram等、CD28z CARs and armored CARs、2014、Cancer J. 20(2):127～133頁に記載されるものと共に使用され得る。ＲＤＥ転写物は、Ｔリンパ球における攻撃的な抗腫瘍特性を引き起こすポリペプチドをコードし得る。

【0197】

導入遺伝子は、ＲＤＥにより制御され得て、それらのＲＤＥは、ＲＤＥ中に見出されるマイクロＲＮＡ部位を不活性化するように修飾されてもよい。それらの制御エレメントの使用は、ＲＤＥとグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）との相互作用を通して、導入遺伝子の発現を、宿主細胞の解糖状態における変化に対して感受性にする。ＧＡＰＤＨの解糖活性は、トリオースイソメラーゼの量および／または活性を上げることにより高まり得る。宿主細胞は、組換えトリオースイソメラーゼを過剰発現するように誘導され得て、その過剰発現が、ＧＡＰＤＨの解糖活性を上昇させる。ＲＤＥを含む転写物の発現を低下させるために、解糖阻害剤が添加され得る。そのような解糖阻害剤には、例えば、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、ラパマイシン、２－デオキシグルコース、３－ブロモピルビン酸、ヨードアセタート、フッ化物、オキサマート、プログリタゾン、ジクロロ酢酸、キノン（例えば、クロロキン、ヒドロキシクロロキン等）、または例えば、デヒドロエピアンドロステロンなどの他の代謝阻害剤が含まれる。ＲＤＥ制御転写物からの発現は、ＧＡＰＤＨ（または他のＲＤＥ結合タンパク質）による、ＲＤＥの結合を阻害するＧＡＰＤＨ（または他のＲＤＥ結合タンパク質）阻害剤の添加により上昇し得る。そのようなＧＡＰＤＨ阻害剤には、例えば、ＣＧＰ ３４６６Ｂマレアートまたはヘプテリジン酸（両方ともＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．社により販売されている）、ペンタレノラクトン、または３－ブロモピルビン酸が含まれる。例えば、クロロキンおよびヒドロキシクロロキンなどのキノンは、エンドソームを脱酸してＡＰＣによる抗原プロセシングを損なうことができ、ｔｏｌｌ様受容体からのシグナル伝達を低下させ、Ｔ細胞増殖、Ｔ細胞代謝活性、Ｔ細胞サイトカイン分泌を低下させ、ＩＬ－２産生を妨げ、かつＩＬ－２に対するＴ細胞応答を妨げることができる。

【0198】

免疫細胞中でのＣＡＲ発現を、それらの免疫細胞が標的により、または所望の時間に活性化されるまで低下させるためにＲＤＥが使用され得る。これは、治療効果にとって所望の時間でのＣＡＲの発現をもたらすことができ、ＣＡＲへの、対象の全身曝露を軽減する。全身曝露の軽減は、対象の免疫系が、経時的により少ないＣＡＲを経験することになるため、ＣＡＲに対する免疫応答の発生を軽減および／または阻害し得る。

【0199】

受容体（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ）発現の制御は、免疫療法のＰＫ－ＰＤ軸を調節するために使用され得る。細胞の表面上で発現する受容体の量は、プロモーターの強度、プロモーターの誘導性、２つのシストロンを発現する、異なるプロモーター強度を有する２シストロン性構築物の使用、ＲＤＥ（ＲＤＥの選択は、発現のダイナミックレンジおよびタイミングに影響を与える）、転写物のＧＣ３含量、ＲＮＡ制御デバイス、デグロンおよび／またはＳｉｄｅ－ＣＡＲにより調節され得る。単独でまたは組み合わせて使用されるこれらの制御エレメントは、細胞表面上の受容体の量を変化させ、それが、出力（例えば、ペイロード送達または標的細胞殺滅）をもたらすように細胞を活性化するために必要とされる入力シグナル（例えば、受容体に対するリガンドの量）を変化させる。この制御を使用して、受容体細胞に必要とされる入力シグナルは、所与の標的、身体の区画、副作用の軽減等に関して望みどおりに最適化され得る。ＲＤＥは、受容体（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ）での活性化後の、細胞からの出力のタイミングを変化させるためにも使用され得る。

【0200】

いくつかの神経変性疾患および症候群は、多くの他の非神経疾患および症候群と同じように炎症と関連している。そのような炎症関連疾患は、免疫細胞内での阻害性ＲＤＥ結合タンパク質の可用性を高める小分子（または他の分子）を対象に与えることにより、少なくとも部分的に処置され得る。そのような小分子には、例えば、解糖阻害剤（例えば、フマル酸ジメチル（ＤＭＦ）、ラパマイシン、２－デオキシグルコース、３－ブロモピルビン酸、ヨードアセタート、フッ化物、オキサマート、プログリタゾン、ジクロロ酢酸）、他の代謝阻害剤（例えば、デヒドロエピアンドロステロン）等が含まれる。例えば、解糖阻害剤は、細胞における解糖を低下させ、ＲＤＥに結合する遊離ＧＡＰＤＨ（解糖に関与しない）の量を増加させ得て、それらの転写物の発現を低下させることができる。免疫細胞中のいくつかの炎症性遺伝子産物（例えば、免疫系を活性化する遺伝子産物）は、ＧＡＰＤＨを結合し得るＲＤＥにより調節される。解糖の低下は、ＲＤＥ結合のための遊離ＧＡＰＤＨの量を増加させ、それらの炎症性遺伝子のＲＤＥに結合したＧＡＰＤＨの量を増加させ、それらの炎症性遺伝子の発現を低下させる。炎症性遺伝子には、炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＩＬ－１、ＴＮＦ－α、ＩＮＦ－ｇ、およびＧＭ－ＣＳＦなどが含まれる。これらのサイトカインは、ＧＡＰＤＨを含むＲＤＥ結合タンパク質を結合してその発現を調節することができるＲＤＥを含む３’－ＵＴＲを有する。増加したＧＡＰＤＨは、それらのＲＤＥに結合し、それらの炎症誘発性サイトカインの発現を低下させることができる。炎症誘発性サイトカインの発現の低下は、それらの対象における免疫系の活性を低下させ、炎症を低下させ得る。炎症の低下は、プラスの治療効果を有し、それらの炎症関連神経疾患、ならびに他の炎症関連疾患および症候群の症状を緩和する、および／または基礎疾患の状態を処置することができる。

【0201】

ＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、所望の時点で最大発現をもたらすように、かつその時点で、所望の量のポリペプチドをもたらすように選択することができる。ＲＤＥは、ポリペプチドの所望の曲線下面積をもたらすようにも選択することができる。実施例９の表２に示されるように、異なるＲＤＥ（例えば、ＡＵエレメント）は、異なる時間において最大発現率に達した。同じく表１に示されるように、異なるＲＤＥは、経時的に異なるプロファイルを有する異なる発現量をもたらし、異なるＡＵＣをもたらした。これらのＲＤＥを異なる導入遺伝子と組み合わせて使用することは、細胞の活性化後、異なる導入遺伝子が、互いとの関連でいつ最大発現率に達するかという時間的プログラミングを可能にする。さらに、異なるＲＤＥを使用して、導入遺伝子コードポリペプチドの所望の量、および／または導入遺伝子によってコードされるポリペプチドのＡＵＣもしくは該ポリペプチドへの曝露の所望の量を発現するように、導入遺伝子をプログラミングすることができる。したがって、ＲＤＥは、所望の量の異なる導入遺伝子ポリペプチドを、異なる（または同じ）所望の時間において産生する制御をもたらすために使用され得る。

【0202】

この時間的制御は、細胞内で、異なる導入遺伝子ポリペプチドを産生するための所望のタイミングをもたらすために使用され得る。この時間的制御を使用して、細胞は、細胞の状態を変更する第１の導入遺伝子を発現させて、後で発現される第２の導入遺伝子のポリペプチドにより影響を受ける準備がされているようにするために、プログラミングされ得る。例えば、第１に発現されるポリペプチドは、細胞傷害性ポリペプチド（例えば、グランザイムおよび／またはパーフォリン）を作り、貯蔵するように細胞を誘導し得て、第２に発現されるポリペプチドは、細胞傷害性ポリペプチドの放出に関与し得る。時間的発現の他の例は、変化（例えば、分化または細胞の状態の変化）を経るために、２つ以上の遺伝子産物の時間的発現を必要とする細胞をプログラミングするための使用を含む。ＲＤＥは、この時間的発現を模倣し、細胞がいつその状態を変化させるかまたは分化するか（例えば、幹細胞のプログラム化された分化）を制御できるようにするために使用され得る。幹細胞の一例では、時間的制御および誘導制御は、幹細胞を所望の細胞型に分化させることが望ましい時（および場所）で分化するように幹細胞をプログラミングするために使用され得る。

【0203】

時間的制御は、細胞の外側で、異なる導入遺伝子ポリペプチドを産生する所望のタイミングをもたらすためにも使用され得る。この時間的制御を使用して、細胞は、活性化されて、標的細胞を調節および／または変更する第１の導入遺伝子ポリペプチドを分泌することができるため、標的細胞は、第２の導入遺伝子から後で発現されるポリペプチドから作用を受ける準備がされることになる。例えば、第１のポリペプチドは、標的細胞表面上で受容体（例えば、ＦａｓＲ、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１等）を、または細胞内でポリペプチドを発現するように標的細胞を誘導し得る。第１の導入遺伝子はまた、標的細胞がその状態を変化させることを誘導する因子を分泌するように細胞を誘導し得る（例えば、第１の導入遺伝子は、標的細胞に標的細胞表面上でＯＸ４０を発現させるＣｐＧを分泌するように細胞を誘導し得る）。後で最大発現率に達する第２の導入遺伝子は、誘導された表面受容体に作用するポリペプチドをコードし得る（例えば、ＦａｓＬ、ハーセプチン、リツキシマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、抗ＯＸ４０抗体等）。時間的制御および誘導制御は、第１のポリペプチドが標的細胞を誘導してその状態を変更するため（例えば、分化）、第２のポリペプチド（等、後で最大発現率に達する追加の導入遺伝子ポリペプチド）から標的細胞が作用を受け得ることになるタイミングでポリペプチドを標的細胞に与えることにより、標的細胞の状態または分化を変化させるためにも使用され得る。

【0204】

自己免疫疾患および過活動免疫系を伴う他の疾患状態（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染）は、自己免疫疾患抗原に対して標的化されたΔＩＴＡＭ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置され得る。ΔＩＴＡＭ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＩＬ－４、ＩＬ－１０または他の免疫抑制薬のペイロードを含み得る。ペイロードの有無にかかわらずΔＩＴＡＭ ＣＡＲ Ｔ細胞は、自己免疫疾患を阻害する、および／または免疫系の過剰刺激もしくは慢性的刺激により引き起こされる毒性を低下させることができるＴｒｅｇの形成を誘導し得る。

【0205】

異なる動態パラメータを有するＲＤＥ（Ｇｏｌｄエレメント）（例えば、細胞の活性化後早期の急速な発現と、その後の急速な発現の低下をもたらすＲＤＥ、または細胞活性化後２～３日間にわたり発現を遅らせるＲＤＥ）を使用して処置され得る疾患およびペイロードのいくつかの例には、以下が含まれる：抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ、ならびに抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／または抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つまたは複数のペイロードを使用するＤＬＬ３陽性がん（ＩＤＨ１ｍｕｔグリオーマ、黒色腫、およびＳＣＬＣなど）。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＤＬＬ３ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＤＬＬ３に結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＤＬＬ３ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２、または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つもしくは複数のペイロードを使用するＣＤ１９陽性リンパ腫（例えば、ＮＨＬ）。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＣＤ１９に結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。変異したシアリル化を認識する抗オンコＣＤ４３ ＣＡＲ、ならびに抗ＣＸＣＬ１２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体またはＩＬ－１２のうちの１つまたは複数、ならびに／または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つもしくは複数、のペイロードを使用する、オンコＣＤ４３（シアリル化変異体）を有するＡＭＬ。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗オンコＣＤ４３ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、オンコＣＤ４３に結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗オンコＣＤ４３ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。抗ＰＳＣＡ ＣＡＲ、ならびにヘパリナーゼまたはＩＬ－１２、ならびに／または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つもしくは複数、のペイロードを使用するＰＳＣＡ陽性前立腺がん、膀胱がんまたは膵臓がん。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＰＳＣＡ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＰＳＣＡに結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＰＳＣＡ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。がん精巣抗原、ミスフォールドまたは変異体ＥＧＦＲ（トリプルネガティブ乳がんと関連）、および／または葉酸受容体アルファペプチドを認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２、ならびに／または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つもしくは複数、のペイロードを用いるトリプルネガティブ乳がん。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗がん精巣抗原ＣＡＲ、抗ミスフォールドもしくは変異体ＥＧＦＲ ＣＡＲ、または抗葉酸受容体アルファＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、がん精巣抗原、ミスフォールドもしくは変異体ＥＧＦＲ（トリプルネガティブ乳がんと関連）、および／または葉酸受容体アルファペプチドに結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗がん精巣抗原ＣＡＲ、抗ミスフォールドもしくは変異体ＥＧＦＲ ＣＡＲ、または抗葉酸受容体アルファＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。ＳＥＺ６を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２、ならびに／または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つもしくは複数、のペイロードを用いるＳＥＺ６陽性小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、神経内分泌がん（例えば、甲状腺髄様がん）、大細胞肺がん（ＬＣＬＣ）、および悪性褐色細胞腫。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＳＥＺ６ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＳＥＺ６に結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＳＥＺ６ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。ＲＮＦ４３を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２、ならびに／または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つもしくは複数、のペイロードを用いるＲＮＦ４３陽性結腸直腸がん、結腸がん、および子宮内膜がん。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＲＮＦ４３ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＲＮＦ４３に結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＲＮＦ４３ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。ＴｎＭＵＣ１を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２、ならびに／または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、Ａｐ
ｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つもしくは複数、のペイロードを用いるＴｎＭＵＣ１陽性乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、膵臓がん、卵巣がん、結腸直腸がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、前立腺がん、結腸がん、多発性骨髄腫、および／またはＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＴＡＬＬ）。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＴｎＭＵＣ１に結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。ネクチン４を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２、ならびに／または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つもしくは複数、のペイロードを用いるネクチン４陽性尿路上皮がん、ＮＳＣＬＣ、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、膵臓がん、および他の固形腫瘍。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ネクチン４ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ネクチン４に結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ネクチン４ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。ＥＦＮＡ４を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２、ならびに／または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つもしくは複数、のペイロードを用いるＥＦＮＡ４陽性トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、結腸直腸がん、肝臓がん、肺がん、および他の固形腫瘍。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＥＦＮＡ４ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＥＦＮＡ４に結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＥＦＮＡ４ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。ＧＰＣ３を認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２、ならびに／または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／もしくは抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）のうちの１つもしくは複数、のペイロードを用いるＧＰＣ３陽性肝細胞癌、肺がんおよび他の固形腫瘍。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＧＰＣ３ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＧＰＣ３に結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＧＰＣ３ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。ＣＦＨを認識するＣＡＲ、ならびにＩＬ－１２、ならびに／または抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）、および／もしくは抗ＴＧＦｂ剤（例えば、抗ＴＧＦｂ抗体、可溶性ＴＧＦｂＲ、抗ａｖＢ６インテグリン抗体、天然ＴＧＦｂ結合タンパク質、ｄｎＴＧＦＢＲ２、ビグリカン、デコリン）のうちの１つもしくは複数、のペイロードを用いる補体因子Ｈ（ＣＦＨ）陽性乳がん、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、および他の固形腫瘍。場合により、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＣＦＨ ＣＡＲは、前記の他の療法と併用されるか、または連続投与される。併用療法または連続療法は、抗体が腫瘍関連抗原、例えば、ＣＦＨに結合するＡＤＣであり得る。併用療法は、ＲＤＥ制御ペイロードを含む抗ＣＦＨ ＣＡＲの投与前、同時、または投与後に対象に提供され得る。

【0206】

概して、ＲＤＥ制御導入遺伝子の有無にかかわらず前記のＣＡＲ細胞のいずれかは、他の分子（例えば、他の療法）と組み合わせて使用され得るか、または連続投与され得る。例えば、他の分子は、ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、小分子薬、抗体、抗体－薬物コンジュゲート、生物学的薬物、または前記のいずれかの組合せであり得る。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、本明細書に記載されるものを含む。ＡＤＣは、ＣＡＲと同じ抗原に結合し得るか、または別の抗原に結合し得る。ＡＤＣおよびＣＡＲが、同じ抗原に結合する場合、それらは、その同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープに結合し得る。ＡＤＣおよびＣＡＲ療法（ＲＤＥ制御ペイロードの有無にかかわらず）は、同時に提供され得るか、または、一方を他方の前に対象に投与してもよい。例えば、ＡＤＣおよびＣＡＲは、腫瘍関連抗原を標的にし得て、腫瘍量を減少させるために、まずＡＤＣを対象に投与することができ、次いで、残りのがん細胞を除去するために、ＣＡＲ療法が投与される。

【0207】

Ｇｏｌｄ ＣＡＲＳによる処置
本開示は、本明細書に記載される１つまたは複数の組成物を有するキットに関する。キットには、例えば、受容体（例えば、キメラ抗原受容体もしくはＴ細胞受容体）およびＲＤＥを含む導入遺伝子（ＲＤＥに作動可能に連結された導入遺伝子産物をコードする転写物を産生する）をコードする核酸、ならびに患者への免疫療法の調製および投与に関する、添付文書または他のラベル指示が含まれ得る。本明細書で使用する場合、「添付文書」は、治療用製品の商品包装中に習慣的に含まれる説明書を指し、そのような治療用製品の使用に関する適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌、および／または警告に関する情報を含有する。例示的な核酸には、例えば、ＧＣ２１３（配列番号５）、ＳＫ０７２（配列番号１１）、ＧＣ２５１（配列番号１２）、ＰＤ００７（配列番号１３）、および／またはＰＤ００９（配列番号１４）が含まれる。

【0208】

がんの処置に使用する場合、処置に対する患者の応答は、いくつかの方法、つまり、完全奏効、部分奏効、不変、および疾患進行で定義される。完全奏効では、がんまたは腫瘍のすべてが消失し、疾患の証拠はない。腫瘍マーカー（該当する場合）の発現レベルは、正常範囲内に入り得る。部分奏効では、がんは、百分率で縮小するが、疾患はとどまる。腫瘍マーカー（該当する場合）のレベルは降下（または上昇、腫瘍量の低下の兆候としての腫瘍マーカーに基づく）し得たが、疾患の証拠はとどまる。不変では、がんは増殖も縮小もせず、疾患の量は変わらなかった。腫瘍マーカー（該当する場合）は、著しくは変わらなかった。疾患進行では、がんは増殖し、処置前よりも疾患が増している。腫瘍マーカー試験（該当する場合）は、腫瘍マーカーが増したことを示す。

【0209】

がん処置の効能の他の測定には、全生存期間（すなわち、診断から、または評価される処置の開始から測定して、いずれかの理由による死亡までの時間）、無がん生存（すなわち、完全奏効後の、がんが検出不可能であり続ける期間）、および無増悪生存（すなわち、疾患安定化または部分奏効後の、腫瘍増殖の再開が検出できない期間）の期間が含まれる。

【0210】

腫瘍サイズ（腫瘍量）に関して固形がん処置応答を評価するための２つの標準的方法、ＷＨＯ基準およびＲＥＣＩＳＴ基準がある。これらの方法は、固形腫瘍を測定して、目下の腫瘍を過去の測定と比べるか、または将来の測定による変化を比べて、処置計画における変化を行う。ＷＨＯ法では、固形腫瘍の長軸および短軸を測定し、次いでそれらの２つの測定の積を計算し、複数の固形腫瘍がある場合、すべての積の合計を計算する。ＲＥＣＩＳＴ法では、長軸のみを測定する。複数の固形腫瘍がある場合、すべての長軸測定の合計を計算する。しかしながら、リンパ節に関しては、長軸の代わりに短軸を測定する。

【0211】

本明細書に記載される方法および組成物で患者を処置すると、処置された患者の腫瘍量は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約１００％、またはそれらの値と隣接する任意の範囲だけ減少する。本明細書に記載される方法および組成物で患者を処置すると、処置された患者の１年生存率は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約１００％、またはそれらの値と隣接する任意の範囲だけ上昇する。本明細書に記載される方法および組成物で患者を処置すると、処置された対象の５年生存率は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約９０％、約９５％、約１００％、またはそれらの値と隣接する任意の範囲だけ上昇する。本明細書に記載される方法および組成物で患者を処置すると、患者は、少なくとも６か月、少なくとも７か月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１２か月、少なくとも１４か月、少なくとも１６か月、少なくとも１８か月、少なくとも２０か月、少なくとも２２か月、少なくとも２４か月、少なくとも２７か月、少なくとも３０か月、少なくとも３３か月、少なくとも３６か月、少なくとも４２か月、少なくとも４８か月、少なくとも５４か月、または少なくとも６０か月またはそれ以上の持続的寛解を有する。本明細書に記載される方法および組成物で患者を処置すると、処置された患者の少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％において完全奏効が得られる、および／または処置された患者の少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％において部分奏効が得られる。

【0212】

本明細書に開示される発明は、以下の実験の詳細から理解が深まる。しかしながら、当業者は、考察される具体的な方法および結果が、その後に続く特許請求の範囲においてより十分に記載される本発明を例証するにすぎないことを容易に理解する。特に指示がない限り、開示は、具体的な手順、材料等に限定されず、それ自体、変わり得る。同じく、本明細書で使用する用語は単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定的であるとは意図されないことも理解されるべきである。

【実施例】

【0213】

実施例１ ＲＤＥ－ＣＡＲによるＴ細胞エフェクター活性の制御
あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている国際公開第２０１２／０７９０００号に記載された第三世代抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＩＬ－２をコードする遺伝子の３’－ＵＴＲ（あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＮＣＢＩ参照配列番号：ＮＭ＿０００５８６．３）を使用して、ＲＤＥ Ｃａｒを作製する。ＩＬ－２ ３’－ＵＴＲをコードする核酸を、適切な発現ベクター中の抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット内へと操作により導入する。使用するＩＬ－２、３’－ＵＴＲ配列は：
taattaagtgcttcccacttaaaacatatcaggccttctATTTATTTAaatATTTAaattttatATTTAttgttgaatgtatggtttgctacctattgtaactattattcttaatcttaaaactataaatatggatcttttatgattctttttgtaagccctaggggctctaaaatggtttcacttATTTAtcccaaaatATTTAttattatgttgaatgttaaatatagtatctatgtagattggttagtaaaactATTTAataaatttgataaatataaa（配列番号５３）
であった。

【0214】

抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９ ＣＡＲ構築物を、日常的な方法により、Ｔ細胞（初代ヒトＴ細胞）の異なる集団にトランスフェクトし、適切な抗生物質（または他の選択スキーム）を使用して、Ｔ細胞の安定な集団を選択する。抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９^－／ＣＤ２２^－／ＣＤ３^＋）および抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含むＴ細胞集団（ＣＤ１９^－／ＣＤ２２^－／ＣＤ３^＋）を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとの共インキュベーションによって活性化し、脱ビーズ化後に静止状態へと戻させる。

【0215】

静止抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９^＋／ＣＤ２２^＋／ＣＤ３^－Ｒａｊｉ標的細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＲＤＥ ＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉ標的比で共培養する。解糖活性化因子グルコースを、１．０ｍＭ～１０ｍＭ（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の範囲の濃度で培地に添加する。ＲＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を共に、２４時間増殖させる。培養物を洗浄し、次いで抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色し、その後、ＣＤ２２^＋（Ｒａｊｉ標的細胞）およびＣＤ３^＋細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）をカウントする。これらの測定は、ＲＤＥ－ＣＡＲ発現の異なるレベルでの、ＲＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞の標的細胞殺滅率（例えば、半減期）および増殖率を同定するであろう。

【0216】

活性化された抗ＣＤ１９ ＲＤＥ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９^＋／ＣＤ２２^＋／ＣＤ３^－Ｒａｊｉ標的細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＲＤＥ ＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉ標的比で共培養する。解糖活性化因子グルコースを、１．０ｍＭ～１０ｍＭ（１ｍＭ、２、ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の範囲の濃度で培地に添加する。ＲＤＥ－ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を共に、２４時間増殖させる。培地から試料を採取し、ＩＬ－２に関してＥＬＩＳＡにより試験する。

【0217】

対照として、活性化された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９^＋／ＣＤ２２^＋／ＣＤ３^－Ｒａｊｉ標的細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉ標的比で共培養する。解糖活性化因子グルコースを、１．０ｍＭ～１０ｍＭ（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の範囲の濃度で培地に添加する。ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を共に、２４時間増殖させる。培養物を洗浄し、次いで抗ＣＤ２２および抗ＣＤ３試薬で染色し、その後、ＣＤ２２^＋（Ｒａｊｉ標的細胞）およびＣＤ３^＋細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）をカウントする。

【0218】

対照として、活性化された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＤ１９^＋／ＣＤ２２^＋／ＣＤ３^－Ｒａｊｉ標的細胞と、２：１、５：１、および１０：１のＣＡＲ Ｔ細胞：Ｒａｊｉ標的比で共培養する。解糖活性化因子グルコースを、１．０ｍＭ～１０ｍＭ（１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、７．５ｍＭおよび１０ｍＭ）の範囲の濃度で培地に添加する。ＣＡＲ Ｔ細胞およびＲａｊｉ細胞を共に、４８時間増殖させる。培地から試料を採取し、ＩＬ－２に関してＥＬＩＳＡにより試験する。

【0219】

実施例２ ＲＤＥからのマイクロＲＮＡ結合部位の除去
ＩＬ－２の３’－ＵＴＲ由来のＡＵリッチエレメントは、ｍｉｒ１８１およびｍｉｒ１８６マイクロＲＮＡ結合部位を有する。マイクロＲＮＡ部位の異なる組合せを、ＩＬ－２の３’－ＵＴＲから除去した。ＭＩＲ１８６マイクロＲＮＡ部位をＩＬ－２の３’－ＵＴＲから除去した場合、このＵＴＲを含む構築物からの発現のダイナミックレンジは、５０倍増加した。修飾ＩＬ－２、３’－ＵＴＲは、配列中のＣＴＴをＧＡＡで置き換え、以下に示される（配列中、新たなＧＡＡは下線が付いている）：
taattaagtgcttcccacttaaaacatatcaggccttctATTTATTTAaatATTTAaattttatATTTAttgttgaatgtatggtttgctacctattgtaactattattcttaatcttaaaactataaatatggatcttttatgattGAAtttgtaagccctaggggctctaaaatggtttcacttATTTAtcccaaaatATTTAttattatgttgaatgttaaatatagtatctatgtagattggttagtaaaactATTTAataaatttgataaatataaa（配列番号５４）
ＩＦＮｇの３’ＵＴＲ由来のＡＵリッチエレメントは、ｍｉｒ１２５として特徴付けられるマイクロＲＮＡ結合部位も有する。ＩＦＮｇ ＲＤＥの配列は：
tggttgtcctgcctgcaatatttgaattttaaatctaaatctATTTAttaatATTTAacattATTTAtatggggaatatatttttagactcatcaatcaaataagtATTTAtaatagcaacttttgtgtaatgaaaatgaatatctattaatatatgtattATTTAtaattcctatatcctgtgactgtctcacttaatcctttgttttctgactaattaggcaaggctatgtgattacaaggctttatctcaggggccaactaggcagccaacctaagcaagatcccatgggttgtgtgtttatttcacttgatgatacaatgaacacttataagtgaagtgatactatccagttactgccggtttgaaaatatgcctgcaatctgagccagtgctttaatggcatgtcagacagaacttgaatgtgtcaggtgaccctgatgaaaacatagcatctcaggagatttcatgcctggtgcttccaaatattgttgacaactgtgactgtacccaaatggaaagtaactcatttgttaaaattatcaatatctaatatatatgaataaagtgtaagttcacaacta（配列番号５５）
である。

【0220】

マイクロＲＮＡ部位の異なる組合せをＩＦＮｇの３’ＵＴＲから除去し、発現の上昇について試験した。ｍｉｒ１２５マイクロＲＮＡ部位をＩＦＮ－γの３’－ＵＴＲから除去した場合、このＵＴＲを含む構築物からの発現率は上昇する。

【0221】

ＲＤＥ－ＧＦＰ＋マイクロＲＮＡ部位をトランスフェクトしたＴ細胞におけるＧＦＰの発現を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで２４時間活性化後に、マイクロＲＮＡ部位を除去してあるＲＤＥ－ＧＦＰを含むＴ細胞におけるＧＦＰの発現と比べる。マイクロＲＮＡ部位の除去は、マイクロＲＮＡ部位を含む細胞と比べて、２４時間後、ＧＦＰの発現を２～５倍の間で上昇させた。

【0222】

実施例３ 第２の導入遺伝子を発現させるためのＲＤＥ構築物
あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている国際公開第２０１２／０７９０００号に記載された抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＧＦＰ－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇ由来の３’－ＵＴＲ）インサートを使用して、構築物を作製した。これらの２つのインサート／カセットを、同じレンチウイルス構築物中に配置した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＧＦＰ－ＲＤＥを含むインサートは反対方向に転写され、各々の制御領域は、２つのインサート／カセット間に位置する。ＧＦＰ－ＲＤＥインサートの制御領域はＭｉｎＰであり、ＲＤＥはＩＦＮｇの内因性３’－ＵＴＲであった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤ（前記）であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞に、２シストロン性構築物を形質導入した。

【0223】

形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻させ、次いで、刺激後に以下のように試験した。「刺激なし」設定に関しては、形質導入されたＴ細胞を培地中、単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定および「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」設定に関しては、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ Ｂ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを、形質導入されたＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、フローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞中でのそれらのマーカーおよびＧＦＰ発現を測定した。

【0224】

形質導入されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）と共に培養した場合、１．０％から６．５％の蛍光の増加を示し（約６．５倍）、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴＣＲを活性化する）と共に培養した場合、１．０％から４．４％の蛍光の増加を示した（約４．４倍）。形質転換されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ細胞と共に培養した場合、０．９％から８４．８％への、集団における活性化細胞への変化を示し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共に培養した場合、０．９％から９０．８％への変化を示した。

【0225】

実施例４ 第２の導入遺伝子を発現させるための修飾ＲＤＥ２構築物
実施例１１および１２に記載される抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、ならびにＧＦＰ－ＲＤＥ２．１（ＩＬ－２ ＲＤＥ）インサートを使用して、構築物を作製した。ＲＤＥ２．１を修飾してＭＩＲ１８６マイクロＲＮＡ部位を除去し、ＩＬ－２の３’－ＵＴＲからヌクレオチドを変更して、ＲＤＥ２として用いた。

【0226】

これらの２つのインサート／カセットを、同じレンチウイルス構築物中に配置した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＧＦＰ－ＲＤＥを含むインサートは反対方向に転写され、各々の制御領域は、２つのインサート／カセット間に位置する。ＧＦＰ－ＲＤＥインサートの制御領域は、ＭｉｎＰであった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤ（前記）であった。ＣＤ４＋Ｔ細胞に、２シストロン性構築物を形質導入した。

【0227】

形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻させ、次いで、刺激後に以下のように試験した。「刺激なし」設定に関しては、形質導入されたＴ細胞を培地中、単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定および「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」設定に関しては、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ Ｂ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを、形質導入されたＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、フローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞中でのそれらのマーカーおよびＧＦＰ発現を測定した。

【0228】

形質導入されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ細胞と共に培養した場合、３．９％から１２．１％への、集団における活性化細胞への変化を示し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズと共に培養した場合、３．９％から１１．１％への変化を示した。

【0229】

実施例５ ルシフェラーゼ導入遺伝子を発現させるためのＲＤＥ構築物
あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている国際公開第２０１２／０７９０００号に記載された抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’－ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ１）インサートまたはルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲ（細胞の代謝状態に応じた示差的導入遺伝子翻訳を付与しない３’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ）を使用して、構築物を作製した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ－ＲＤＥ１を含むインサートは反対方向に転写され、各々の制御領域は、２つのインサート／カセット間に位置する。ルシフェラーゼ－ＲＤＥ１インサートおよびルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲの制御領域は、
TAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAG
（ＭｉｎＰ）配列番号５６
GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTAGATCTAGACTCTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGAATTC
（ＮＦＡＴ）配列番号５７
の配列を有する、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのいずれかであった。

【0230】

抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤプロモーターであった。ＣＤ４＋Ｔ細胞に、２シストロン性構築物を形質導入した。

【0231】

形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻させ、次いで、刺激後に以下のように試験した。「刺激なし」設定に関しては、形質導入されたＴ細胞を培地中、単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定および「ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ」設定に関しては、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ Ｂ細胞または抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズを、形質導入されたＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、フローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞中でのそれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定した。

【0232】

図２は、休止時のＴ細胞の生物発光と比べて、形質導入されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）と共に培養した場合、またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴＣＲを活性化する）と共に培養した場合、生物発光が増加したことを示す。ＮＦＡＴプロモーターおよびＩＦＮｇの３’－ＵＴＲ（Ｇｏｌｄ１）を含むＴ細胞は、ＴＣＲ刺激と対比して、ＣＡＲ刺激からより大きなオン－オフ応答を示した。すべての条件下で、Ｇｏｌｄ１を含むＴ細胞は、ＩＦＮｇの３’ＵＴＲ（３’－ＵＴＲ）により制御されないルシフェラーゼを用いた同じ条件（および同じプロモーター）下のＴ細胞よりも少ない量の生物発光を有した。

【0233】

実施例６ ルシフェラーゼを制御するＲＤＥの比較
あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている国際公開第２０１２／０７９０００号に記載された抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’－ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ１）インサート、ルシフェラーゼ－ＲＤＥ２（ＩＬ－２の３’－ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ２）インサート、ルシフェラーゼ－ＲＤＥ３（ｍｉｒ１８６部位を除去するために前記のように修飾された、ＩＬ－２の３’－ＵＴＲ、Ｇｏｌｄ３）またはルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲ（細胞の代謝状態に応じた示差的導入遺伝子翻訳を付与しない３’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ）を使用して、構築物を作製した。図３に示す、これらのインサート／カセットの組合せを、同様のレンチウイルス構築物中に配置した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ－ＲＤＥを含むインサートは反対方向に転写され、各々の制御領域は、２つのインサート／カセット間に位置する。ルシフェラーゼ－ＲＤＥインサートおよびルシフェラーゼ－３’－ＵＴＲの制御領域は、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのいずれかであった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤプロモーターであって、ＣＤ４＋Ｔ細胞に、２シストロン性構築物を形質導入した。

【0234】

形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻させ、次いで、刺激後に以下のように試験した。「刺激なし」設定に関しては、形質導入されたＴ細胞を培地中、単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定に関しては、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ Ｂ細胞を、形質導入されたＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、フローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞中でのそれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定した。

【0235】

図３は、形質導入されたＴ細胞は、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）と共に培養した場合、ＲＤＥ１（Ｇｏｌｄ１）、ＲＤＥ２（Ｇｏｌｄ２）、またはＲＤＥ３（Ｇｏｌｄ３）を含む構築物に関して、休止時のＴ細胞の生物発光と比べて、増加した生物発光を有したことを示す。ＮＦＡＴプロモーターおよびＲＤＥ１を含むＴ細胞は、ＭｉｎＰプロモーターおよび対応するＲＤＥを含むＴ細胞よりも大きなオン－オフ応答を示した。すべての条件下で、ルシフェラーゼを制御するＲＤＥを含むＴ細胞は、ＲＤＥにより制御されないルシフェラーゼカセットを含むＴ細胞よりも少ない量の生物発光を有した。ＭｉｎＰプロモーターと組み合わせた場合、ＲＤＥ１は、ＣＡＲ刺激での生物発光において４．１倍の増加を与え、ＲＤＥ２は、生物発光において１．８倍の増加を与え、ＲＤＥ３は、１．４倍の増加を与えた。ＮＦＡＴプロモーターと組み合わせた場合、ＲＤＥ１は、ＣＡＲ刺激での生物発光において８．５倍の増加を与え、ＲＤＥ２は、生物発光において３．１倍の増加を与え、ＲＤＥ３は、１．３倍の増加を与えた。いずれかのプロモーターにより、ＲＤＥ３構築物は、最も多い量の生物発光を与え、ＲＤＥ１構築物は、最も少ない量の生物発光を与え、ＲＤＥ２構築物は、ＲＤＥ３とＲＤＥ１との間の量の生物発光を与えた。

【0236】

実施例７ ＩＬ－１２を発現するためのＲＤＥ構築物
あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている国際公開第２０１２／０７９０００号に記載された抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＩＬ－１２－ＲＤＥ１（ＩＦＮｇの３’－ＵＴＲ）インサートまたはＩＬ－１２ ３’－ＵＴＲ（細胞の代謝状態に応じた示差的導入遺伝子翻訳を付与しない３’－ＵＴＲ）を使用して、構築物を作製した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびＩＬ－１２－ＲＤＥ１を含むインサートは反対方向に転写され、各々の制御領域は、２つのインサート／カセット間に位置する。ＩＬ－１２－ＲＤＥ１インサートおよびＩＬ－１２ ３’－ＵＴＲの制御領域は、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターのいずれかであった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤプロモーターであった。ＣＤ４＋Ｔ細胞に、２シストロン性構築物を形質導入した。

【0237】

形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻させ、次いで、刺激後に以下のように試験した。「刺激なし」設定に関しては、形質導入されたＴ細胞を培地中、単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定に関しては、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ Ｂ細胞を、形質導入されたＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、フローサイトメトリーに供して、それらのマーカーを測定した。Ｔ細胞中でのＩＬ－１２発現をＥＬＩＳＡにより測定した。

【0238】

図４は、ＭｉｎＰプロモーターまたはＮＦＡＴプロモーターにより制御される構築物を使用して、形質導入されたＴ細胞が、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）と共に培養した場合、休止時のＴ細胞のＩＬ－１２発現と比べて、上昇したＩＬ－１２発現を有したことを示す。ＮＦＡＴプロモーターおよびＲＤＥ１（Ｇｏｌｄ１）を含むＴ細胞は、休止からＣＡＲ刺激へと、ＩＬ－１２発現における１６８倍の変化を示した。ＮＦＡＴプロモーターおよび３’－ＵＴＲ（ＣＡＲ刺激に応答性でない、３’－ＵＴＲ）を含むＴ細胞は、発現における５０倍の変化を示し、ＲＤＥ１（Ｇｏｌｄ１）を含むｍｉｎＰプロモーターは発現における６．３倍の変化を示した。

【0239】

実施例８ ＡＵエレメントおよび定常状態発現
ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された異なるＲＤＥを含む構築物を作製した。使用した異なるＲＤＥは、ＡＵ４（ＣＴＬＡ４）、ＡＵ１３（ＩＬ－５）、ＡＵ１４（ＩＬ－６）、ＡＵ１５（ＩＬ－９）、ＡＵ１６（ＩＬ－１０）、ＡＵ１７（ＩＬ－１３）、およびＡＵ１０１（ＩＦＮｇ）であった。これらのルシフェラーゼ－ＡＵ構築物を初代Ｔ細胞に形質導入した。細胞が休止段階に戻った後、細胞をプレーティングし、偽誘導するか（sham induced）（基底）、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で誘導した（活性化）。活性化から２４時間時点で、各々におけるルシフェラーゼ単位の量を測定した。これらの量を図５の棒グラフにプロットする。

【0240】

この実施例でのＡＵエレメントは、異なる基底発現レベル、異なる誘導発現レベル（２４時間時点）、および異なる誘導倍率レベルを有した。ＡＵ構築物は、異なる基底発現量、異なる誘導発現量、および異なる量の誘導倍率（またはダイナミックレンジ）を示した。

【0241】

実施例９ ＡＵエレメントおよび発現パラメータ
ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された異なるＲＤＥを含む構築物を作製した。使用した異なるＲＤＥは、ＡＵ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ３（ＣＤ２４７）、ＡＵ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ１０（Ｍｙｃ）、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）、ＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）、およびＡＵ１０１（ＩＦＮｇ）であった。これらのルシフェラーゼ－ＡＵ構築物を初代Ｔ細胞に形質導入した。細胞が休止段階に戻った後、細胞をプレーティングし、処理しないか（基底）、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化した（活性化）かのいずれかであった。活性化から２４時間時点で、各々におけるルシフェラーゼ単位の量を測定した。これらの量を図６の棒グラフにプロットする。あるいは、細胞が休止段階に戻った後、細胞を、各時点：１日、３日、６日、および８日での測定のためにクワドルプリケート（quadruplicate）で９６ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、処理しないか、または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化し、１日、３日、６日、および８日時点でルシフェラーゼ活性を測定した。これらの結果を図７の棒グラフにプロットし、下の表１に示す。図８は、棒グラフにプロットした選択されたデータを示す。下の表１の丸括弧の中の数は、１日目のルシフェラーゼ単位で割った、３、６、および８日目のルシフェラーゼ単位である。

【0242】

【表2】

【0243】

図６、図７および表１のＡＵエレメントは、異なる基底発現レベル、異なる誘導発現レベル（２４時間時点）、および異なる誘導倍率レベルを有した。基底発現レベルは、これらのＡＵエレメントに関して約２０００倍の範囲にわたって異なり（ＡＵ７からＡＵ２０）、誘導発現レベルは、約５５００倍の範囲にわたって異なった（ＡＵ７からＡＵ１０）。構築物の基底発現は、ＡＵ７（ＳＬＣ２Ａ１）の１３９０からＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）の２，９２７，０００に及んだ。活性化発現は、ＡＵ７の４９１４（１日目）からＡＵ１０の２７，８００，００００（８日目）に及んだ。図８および表１は、いくつかのＡＵエレメント、例えば、ＡＵ１０１（ＩＦＮｇ）、ＡＵ２（ＣＳＦ２）、ＡＵ５（ＥＤＮ１）、ＡＵ７（ＳＬＣ２Ａ１）、ＡＵ２１（ＣＣＲ７）、およびＡＵ２３（ＣＤＣ４２－ＳＥ２）は、より低いレベルの出力を有したことを示す。いくつかのＡＵエレメント、つまり、ＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９）およびＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ）は、中間の量の出力を有した。そしていくつかのＡＵエレメント、つまり、ＡＵ２０（ＴＭＥＭ－２１９ｓｎｐ）およびＡＵ１０（Ｍｙｃ）は、高い出力を有した。

【0244】

ルシフェラーゼデータは、各ルシフェラーゼ－ＡＵ構築物のダイナミックレンジ（誘導倍率または活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ）についても分析した。各ＡＵ構築物の、１日、３／４日（活性化発現は３日目に測定し、基底発現は４日目に測定した）、６日および８日時点でのダイナミックレンジ（誘導倍率）。このデータを、下の表２に示し、図９および図１０の棒グラフにプロットする。

【0245】

【表3】

【0246】

１日時点で、ダイナミックレンジ（誘導倍率＝活性化／基底）は、約１（ＡＵ２２）から約１７（ＡＵ１０１）に及んだ。３／４日時点で、ダイナミックレンジは、約４．５（ＡＵ２２）から約２７（ＡＵ２１）まで異なった。６日時点で、ダイナミックレンジは、約７（ＡＵ２２）から約２９（ＡＵ２１）まで異なった。８日目、ダイナミックレンジは、約７（ＡＵ２２）から約３０（ＡＵ２１）まで異なった。ＡＵ構築物は、いくつかの関連パターンを示した。ＡＵ２およびＡＵ１０１は、１日目にダイナミックレンジの急速な増加を示し、次いでダイナミックレンジは６日目および８日目に減少した。ＡＵ５およびＡＵ２１は、０日目から３／４日目まで増加するダイナミックレンジを示し、次いでダイナミックレンジは６日目および８日目を通して維持される。ＡＵ３、ＡＵ２０、ＡＵ１０、ＡＵ７およびＡＵ２３は、０日目から６日目まで上昇するダイナミックレンジを示し、次いでダイナミックレンジは８日目に減少した。ＡＵ１９、およびＡＵ２２は、０日目から８日目まで上昇するダイナミックレンジを示した。

【0247】

ＡＵ２１およびＡＵ２３は、加速するダイナミックレンジを示し、これらのＡＵ構築物はさらに、低い基底発現を有した（１日目＝それぞれ、４８６５および２７３６３）。ＡＵ２およびＡＵ１０１は、２４時間から７２時間まで減少するダイナミックレンジを示し、これらのＡＵエレメントも、低い基底発現を有した。ＡＵ５およびＡＵ２０も、１日目から３／４日目まで減少するダイナミックレンジを示し（ＡＵ２およびＡＵ１０１よりも発現は高かったが）、ＡＵ５が低い基底発現を有したのに対し、ＡＵ２０は高い基底発現を有した。ＡＵ１０、ＡＵ１９およびＡＵ２２は、１日目から３／４日目まで一貫したダイナミックレンジを示し、高い基底レベルの発現を有した。ＡＵ３およびＡＵ７も、１日目から３／４日目まで一貫したダイナミックレンジを有し、低い基底発現レベルを有した。

【0248】

上記のデータは、異なるＡＵエレメントが、１～８日目の発現に対して異なる時間的効果を有することを示す。いくつかのＡＵエレメントは、時間範囲の異なる部分にわたって加速するダイナミックレンジを示す。ＡＵエレメントは、異なる総発現量（Ｃ_ｍａｘ）および異なる最大発現までの時間（Ｔ_ｍａｘ）を示す。ＡＵエレメントはまた、異なる最大ダイナミックレンジおよびそれらの最大に達するまでの異なる時間も示す。これらの異なる発現動態は、所望の導入遺伝子に対して、カスタマイズされた基底、Ｃ_ｍａｘ、Ｔ_ｍａｘ、ダイナミックレンジ、および最大ダイナミックレンジまでの時間をもたらすために使用され得る。これらの異なる動態はまた、細胞の活性化後の細胞において、２つの導入遺伝子の時間的に異なる発現をもたらすために使用することもできる。

【0249】

実施例１０ グルコースおよびガラクトースによるＡＵエレメント制御
ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能に連結された異なるＲＤＥを含む構築物を作製した。ＲＤＥは、細胞の解糖状態に応答性のＡＵエレメントであった。ＡＵエレメント－ルシフェラーゼ構築物をＴ細胞に形質導入した。細胞が休止状態に達した後、細胞をウェルに分け、グルコースまたはガラクトースのいずれかを含む培地を供給した。ルシフェラーゼ活性を３日目および５日目に測定した。これらの結果を図１１の棒グラフに示す。結果は、ガラクトースと比べて、グルコースはルシフェラーゼの発現を上昇させ、発現量は３日目から５日目まで増加したことを示す。３日目、グルコース処理した細胞は、ガラクトース処理した細胞よりも１５Ｘ多い、ルシフェラーゼの発現を有し、５日目に、これは２７Ｘ多い発現に増加した。

【0250】

実施例１１ マウスリンパ腫モデルにおける、Ｇｏｌｄを使用するペイロード送達
あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている国際公開第２０１２／０７９０００号に記載された抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ－ＡＵ（ＩＬ－６の３’ＵＴＲ）インサートを使用して、構築物を作製した。これらの構築物を、２シストロン性レンチウイルス構築物中に配置した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼ－ＲＤＥを含むインサートは、２シストロン性ベクター上で反対方向に転写され、各々の制御領域は、２つのインサート／カセット間に位置する。ルシフェラーゼ－ＲＤＥインサートの制御領域はＭｉｎＰプロモーターであった。抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセットの制御領域は、ＭＮＤプロモーターであった。ＣＤ４＋Ｔ細胞に、２シストロン性構築物を形質導入した。

【0251】

第２の構築物は、前記の抗ＣＤ１９ ＣＡＲカセット、およびルシフェラーゼインサート（ＲＤＥエレメントを含まないため、発現は構成的であった）を使用して作製した。両方ともの構築物を、Ｔ細胞の異なる群へと別々に形質導入した。

【0252】

形質導入されたＴ細胞を休止状態に戻させ、次いで、刺激後に以下のように試験した。「刺激なし」設定に関しては、形質導入されたＴ細胞を培地中、単独で２４時間インキュベートした。「Ｒａｊｉ共培養」設定に関しては、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ Ｂ細胞を、形質導入されたＴ細胞と共に２４時間インキュベートした。２４時間時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、フローサイトメトリーに供して、Ｔ細胞中でのそれらのマーカーおよびルシフェラーゼ発現を測定した。これらのインビトロ結果は、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞が、ＣＡＲを通したＴ細胞の活性化後に、ルシフェラーゼを作ることを示した。

【0253】

ルシフェラーゼ－ＲＤＥを含むこれらの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、リンパ腫のマウスモデルにおいても試験した。ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞を、ＮＳＧマウスの脇腹に移植した。腫瘍形成後、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞をマウスに注射し、発光に関してマウスをスキャンした。マウスの撮像は、ＣＤ１９陽性腫瘍により活性化された抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞由来の、腫瘍部位での発光を示した。より多くのＴ細胞が活性化されたため、経時的に発光量も増加した。対照的に、ルシフェラーゼの構成的発現を伴う抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、マウス全体、ならびにマウスの脇腹の腫瘍部位において発光することになる。

【0254】

実施例１２：ペイロードとしてのｍｉＲＮＡ
ＩＬ－１２をコードするペイロード導入遺伝子が、Du等、FEBs Journal 273:5421～5427頁(2006)またはChung等、Nucl Acids Res 34:e53 (2006)において開示されるｍｉｒ１５５カセットをコードする人工イントロンを有するように操作される。ｍｉｒ１５５カセットは、作動可能に連結されたＡＵエレメント、例えば、ＡＵ１０１（ＩＦＮｇ）またはＡＵ１４（ＩＬ－６）などを含むように操作され、導入遺伝子も、ＡＵエレメント、例えば、ＡＵ１０１またはＡＵ１４などを用いて操作される。ｍｉｒ１５５イントロンを含むこの導入遺伝子を、初代Ｔ細胞内へと操作により導入する。実施例１４に記載される抗ＣＤ１９ ＣＡＲも、初代Ｔ細胞内へと操作により導入される。

【0255】

ＩＬ－１２ペイロードを含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、休止状態に戻させ、次いで、刺激後に以下のように試験する。「刺激なし」設定に関しては、形質導入されたＴ細胞を培地中、単独で２４時間インキュベートする。「Ｒａｊｉ共培養」設定に関しては、ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ Ｂ細胞を、形質導入されたＴ細胞と共に２４時間インキュベートする。２４時間時点で、Ｔ細胞を、活性化マーカーであるＣＤ２５およびＣＤ６９に関して染色し、フローサイトメトリーに供して、それらのマーカーを測定する。細胞を、ペイロードＩＬ－１２の発現に関しても試験する。

【0256】

ＩＬ－１２ペイロードを含むこれらの抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、リンパ腫のマウスモデルにおいても試験する。ＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞を、ＮＳＧマウスの脇腹に移植する。腫瘍形成後、ＩＬ－１２ペイロードを含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を、マウスに注射する。投与後４日時点から２日おきに、マウスにおける腫瘍殺滅を、ノギスを使用して測定する。

【0257】

実施例１３ ＩＬ－１２ペイロード送達
実施例１４に記載される抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含む構築物を作製した。ＩＬ－１２とそれに続くＡＵ１０１（ＩＮＦｇからのＲＤＥ）をコードする核酸に作動可能に連結されたＮＦＡＴプロモーターを含む構築物も作製した。構築物から作られるＩＬ－１２転写物は、ＩＬ－１２のコード配列をＡＵ１０１ ＲＤＥに作動可能に連結する。ＩＬ－１２の構成的発現をもたらす第２のＩＬ－１２構築物を作製した。第３の構築物は、ルシフェラーゼをＡＵ１４（ＩＬ－６）の制御下に置いた。

【0258】

構築物を初代Ｔ細胞に形質導入し、次いで、それらを休止状態に戻させた。これは、ＩＬ－１２のペイロード（ＲＤＥ制御もしくは構成的）またはルシフェラーゼのペイロードを含む抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞を生み出した。

【0259】

抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、およびＩＬ－１２ペイロード（ＲＤＥ制御もしくは構成的）またはルシフェラーゼペイロードを含む初代Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋担腫瘍マウスの脇腹において投与した。腫瘍細胞の殺滅を４２日間にわたってモニタリングした。抗ＣＤ１９ ＣＡＲおよびルシフェラーゼペイロードを含むＴ細胞を投与されたマウスは、中程度の量の腫瘍細胞殺滅（約３ｌｏｇ）を示した。ＩＬ－１２ペイロードを投与されたマウスは、多量の腫瘍細胞殺滅（６～７ｌｏｇ）を有した。構成的またはＡＵ１０１制御ＩＬ－１２を投与されたマウスにおけるＩＬ－１２血清レベルの比較は、全身ＩＬ－１２レベルでの１０倍の差異を有しており、ＡＵ１０１制御ペイロードは、構成的ＩＬ－１２ペイロードの１０分の１の量のＩＬ－１２を有した。

【0260】

ＩＬ－１２発現のＲＤＥ制御は、マウスにおける全身ＩＬ－１２レベルを下げたが、ＩＬ－１２の局所的濃縮をもたらし、それが、腫瘍細胞殺滅を改善した。活性化ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺滅した後、それらのＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍部位から、リンパ節および／または脾臓へと遊走し得て、そこで、他のＴ細胞を教育して、メモリーＴ細胞を形成することができる。

【0261】

実施例１４ ＤＬＬ３＋がん細胞へのＣＸＣＬ９および抗ＰＤ１療法の協調的送達
抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを、実施例２０に記載されるように作製する。同じく実施例２０に記載されるように、このＣＡＲ構築物を、Ｔ細胞内へと操作により導入する。

【0262】

抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ Ｔ細胞による送達のために、２つのペイロードカセットを作製する。最初に、早期発現プロファイル（細胞の活性化後の早期最大発現）を有するＲＤＥ、例えば、ＡＵ２（ＣＳＦ－２、１日目に最大誘導倍率）、ＡＵ１０１（ＩＦＮｇ、１日目に最大誘導倍率）、またはＡＵ５（ＥＤＮ１、３／４日目に最大誘導倍率）などに作動可能に連結された分泌ペイロードとしてＣＸＣＬ９をコードする構築物を作製する。次に、後期発現プロファイル（細胞の活性化後の後期最大発現）を有するＲＤＥ、例えば、ＡＵ２２（ＳＥＭ－Ａ４Ｄ、８日目に最大誘導倍率）またはＡＵ１９（ＴＭＥＭ－２１９、８日目に最大誘導倍率）などに作動可能に連結された分泌ペイロードとして抗ＰＤ１抗体（例えば、ペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）））をコードする構築物を作製する。２つのペイロードは、２シストロン性構築物中に配置され得る、同じ構築物上に配置され得る、または、ペイロードを、別個の構築物から発現させることができる。前記の実施例２０に記載されるように、ペイロード構築物を、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ Ｔ細胞内へと操作により導入する。

【0263】

この操作されたＣＡＲ Ｔ細胞を、実施例２０に記載されるようにＮＳＧマウスモデルに投与する。ＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍標的でのＤＬＬ３により活性化され、ＣＸＣＬ９を有するＲＤＥ構築物が、最初にこのペイロードを発現してから、後で抗ＰＤ１抗体ペイロードが発現される。ＣＸＣＬ９構築物のＡＵ２、ＡＵ５、またはＡＵ１０１ ＲＤＥは、がん標的でのＤＬＬ３による、細胞の活性化から約１日後の早期最大発現を有する。ＣＸＣＬ９は、ＤＬＬ３によるＴ細胞の活性化後早期に分泌され得て、ＣＸＣＬ９は、抗ＰＤ１抗体で処置された腫瘍に対するＴ細胞応答を強化し得る。ＣＸＣＬ９の分泌後、抗ＰＤ１は、後で（約８日）最大限分泌され、この抗体の効果は、ＣＸＣＬ９による前処置により増加し得る。

【0264】

ＣＸＣＬ９の早期発現は、抗ＰＤ１抗体からの活性およびがん殺滅を強化する。
実施例１５ 併用療法
例えば、ＳＣ１６．１５またはＳＣ１６．２５として、米国特許出願公開第２０１７０１３７５３３号明細書（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている）に記載されるような抗ＤＬＬ３抗体ドメインを使用して、ＣＡＲ構築物を作製する。この抗ＤＬＬ３抗体ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）にされ、抗ＤＬＬ３ ｓｃＦｖを、ＣＡＲ（例えば、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれている国際公開第２０１２／０７９０００号に記載されたものなど）の膜貫通部分および細胞内部分と組み合わせて、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを作製する。

【0265】

導入遺伝子が転写されると、導入遺伝子に対する転写物が、導入遺伝子をＲＤＥに作動可能に連結することになるように、導入遺伝子を、ＲＤＥを用いて操作することによりペイロード構築物を作製する。ペイロード導入遺伝子は、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＸＣＬ１２抗体、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、ＴＮＦα、および／または抗ＣＤ２８抗体をコードし得る。ＲＤＥは、ＡＵ１０１（ＩＮＦｇ）またはＡＵ１４（ＩＬ－６）であり得る。

【0266】

構築物を初代Ｔ細胞に形質導入し、次いで、それらを休止状態に戻させる。これは、ペイロード：抗ＣＸＣＬ１２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、ＩＬ－１２、抗４－１ＢＢ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、ＢｉＴＥ、ＣＣＬ２、ＨＡＣ、ヘパリナーゼ、ヒアルロニダーゼ、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ７０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＮＦγ、ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒ１５５）、ＣＤ４０リガンド、ＡｐｏＥ３、ＡｐｏＥ４、ＴＮＦα、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４／ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＲ３＋ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＡＣＬＹ、ＣＳＦ１受容体のアンタゴニスト、Ｔｏｘに対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－２６ｂ－５ｐ（ＭＩＲＴ０３０２４８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２３－３ｐ（ＭＩＲＴ０５４６８０））、ＴＣＦ－７に対するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍＩＲ－１９２、ｍＩＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１３３ａ、ｍｉＲ－１３８－５ｐ、ｍｉＲ－３４２－５ｐ、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－５４１－３ｐ）、および／または、抗ＣＤ２８抗体（全長、および一本鎖抗体などの断片を含む）、のうちの１つまたは複数を含む抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ Ｔ細胞を産生した。

【0267】

抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を、例えば、ＳＣ１６．１５またはＳＣ１６．２５として、米国特許出願公開第２０１７０１３７５３３号明細書（あらゆる目的のために参照によりその全体が組み込まれている）に記載されるような抗ＤＬＬ３抗体との間で作製する。この抗ＤＬＬ３抗体ドメインを、適切なフォーマット（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、または全長ＩｇＧ）へと変換し、１つまたは複数の薬物（例えば、エトポシド、イリノテカン、シスプラチン、および／またはカルボプラチン）にコンジュゲートする。

【0268】

ヒト黒色腫、ヒト小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、およびヒトＩＤＨ１ｍｕｔグリオーマのがん異種移植片を確立するために、Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＮＳＧマウスモデルを使用する。がん異種移植片をマウスにおいて確立した後、マウスを、抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ、およびペイロードのうちの１つを含む初代Ｔ細胞、抗ＤＬＬ３ ＡＤＣ、または抗ＤＬＬ３ ＣＡＲおよびペイロードのうちの１つを含む初代Ｔ細胞ならびに抗ＤＬＬ３ ＡＤＣで処置する。次いで、ＡＤＣと、ＤＬＬ３－ＣＡＲ Ｔ細胞の様々なペイロードと、抗ＤＬＬ３ ＡＤＣを加えた、ＤＬＬ３ ＣＡＲ Ｔ細胞の様々なペイロードとの間で、がん異種移植片殺滅を比較する。

【0269】

実施例１６ ノッチ阻害剤はＴ細胞活性化を増強する
抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを、前記のように作製する。この抗ＤＬＬ３ ＣＡＲを、前記のように初代Ｔ細胞内へと配置する。抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＲＤＥの制御下のペイロードも含み得る。

【0270】

抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ Ｔ細胞を、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、および１ｕＭの濃度でのジベンザゼピン（ガンマセクレターゼ阻害剤）の存在下または非存在下、ＳＨＰ７７細胞（ＤＬＬ３発現がん細胞株）と、異なる比（例えば、１：１、１：３、１：１０のＣＡＲ Ｔ細胞対ＳＨＰ７７）で混合する。

【0271】

抗ＤＬＬ３ ＣＡＲ Ｔ細胞を、実施例２０に記載されるＮＳＧマウスモデルにも投与する。その投与も、ジベンザゼピンの投与と共に、または伴わずに行う。

【0272】

実施例１７ 抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲおよびペイロード送達
構築物ＧＣ２１５（分泌ナノルシフェラーゼおよび８３％ ＧＣ３に操作されたＬＮＧＦＲを含む非ＣＡＲベクター）、ＧＣ２１６（分泌ナノルシフェラーゼおよび５３％ ＧＣ３に操作されたＬＮＧＦＲを含む非ＣＡＲベクター）、ＳＫ０６２（配列番号９、ＬＮＧＦＲにおける８３％ ＧＣ３を有する）、およびＳＫ０７２（配列番号１１、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３を有する）抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ、ＳＫ１４８（配列番号１０、ＬＮＧＦＲにおける８３％ ＧＣ３を有する）、およびＧＣ２１３（配列番号５、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３を有する）ＲＤＥ制御下のＩＬ－１２ペイロードを含む抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲを、マウス腫瘍モデルにおいて比較した。これらの構築物を、ドナーＴ細胞に形質導入し、トランスフェクトされたＴ細胞を、１００万または３００万細胞の用量のいずれかでマウスに投与した。Ｔ細胞の投与前に、マウスにＨＳ７６６Ｔ細胞（転移性膵癌細胞株）を接種して、ＴｎＭＵＣ１陽性である腫瘍を増殖させた。ＨＳ７６６Ｔ細胞はさらに、腫瘍細胞のレポーターとしてのルシフェラーゼにより操作された。

【0273】

その試験の結果を図１２に示す。ＧＣ２１３（抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲ＋ＩＬ－１２、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３）およびＳＫ１４８（抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲ＋ＩＬ－１２、ＬＮＧＦＲにおける８３％ ＧＣ３）は、１４日時点で最大量の腫瘍殺滅をもたらした。３００万の、ＧＣ２１３を含むＴ細胞が投与されたマウスのスキャンは、１０匹のマウスのうちの８匹が、試験の６７日時点で無腫瘍であることを示す。

【0274】

実施例１８ 抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞からのサイトカイン分泌
構築物ＧＣ２１５（分泌ナノルシフェラーゼおよび８３％ ＧＣ３に操作されたＬＮＧＦＲを含む非ＣＡＲベクター）、ＧＣ２１６（分泌ナノルシフェラーゼおよび５３％ ＧＣ３に操作されたＬＮＧＦＲを含む非ＣＡＲベクター）、ＳＫ０６２（配列番号９、ＬＮＧＦＲにおける８３％ ＧＣ３を有する）、およびＳＫ０７２（配列番号１１、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３を有する）抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ、ＳＫ１４８（配列番号１０、ＬＮＧＦＲにおける８３％ ＧＣ３を有する）、およびＧＣ２１３（配列番号５、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３を有する）ＲＤＥ制御下のＩＬ－１２ペイロードを含む抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲを、サイトカイン分泌に関するインビトロモデルにおいて比較した。これらの構築物をドナーＴ細胞に形質導入し、トランスフェクトされたＴ細胞を、ＰＬ４５（膵臓腺癌）、ＨＳ７６６Ｔ（転移性膵癌）、またはＭＣＦ７（乳腺癌（breast adenocarcinoma））のうちの１つと混合した。これらの細胞株も、細胞株にルシフェラーゼを付加するＧＣ０８４により修飾した。

【0275】

その試験の結果を、図１３および図１４に示す。図１３は、形質導入されたＴ細胞から、ＴｎＭＵＣ１標的を有する標的がん細胞との相互作用後に分泌されたＩＦＮｇのレベルを示す。図１３は、腫瘍と共培養するとＩＦＮｇ分泌が増加することを示す。図１４では、ＩＬ－１２の分泌は、ＩＬ－１２ペイロードを含む構築物であるＳＫ１４８およびＧＣ２１３においてのみ観察される。８３％ ＧＣ３のＬＮＧＦＲを含む抗ＴｎＭｕｃ１ ＣＡＲ構築物であるＳＫ１４８では、５３％ ＧＣ３ ＬＮＧＦＲを含む抗ＴｎＭｕｃ１ ＣＡＲ構築物であるＧＣ２１３と比べて多くのＩＬ－１２が分泌された。ＩＬ－１２分泌は、腫瘍細胞株のどれとでも、共培養すると上昇する。

【0276】

実施例１９ 異なるがん細胞に対する、抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性
構築物ＧＣ２１５（分泌ナノルシフェラーゼおよび８３％ ＧＣ３に操作されたＬＮＧＦＲを含む非ＣＡＲベクター）、ＧＣ２１６（分泌ナノルシフェラーゼおよび５３％ ＧＣ３に操作されたＬＮＧＦＲを含む非ＣＡＲベクター）、ＳＫ０６２（配列番号９、ＬＮＧＦＲにおける８３％ ＧＣ３を有する）、およびＳＫ０７２（配列番号１１、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３を有する）抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ、ＳＫ１４８（配列番号１０、ＬＮＧＦＲにおける８３％ ＧＣ３を有する）、およびＧＣ２１３（配列番号５、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３を有する）ＲＤＥ制御下のＩＬ－１２ペイロードを含む抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲを、腫瘍細胞株に対する細胞傷害性に関するインビトロモデルにおいて比較した。これらの構築物をドナーＴ細胞に形質導入し、トランスフェクトされたＴ細胞を、ＰＬ４５（膵臓腺癌）、ＨＳ７６６Ｔ（転移性膵癌）、またはＭＣＦ７（乳腺癌）のうちの１つと、異なる、エフェクター細胞対標的細胞比（１：１、３：１および９：１）で混合した。これらの細胞株も、細胞株にルシフェラーゼを付加するＧＣ０８４により修飾した。

【0277】

その試験の結果を、図１５、図１６および図１７に示す。抗ＴＮＭｕｃ１ ＣＡＲを形質導入されたＴ細胞は、腫瘍細胞株の各々に対して、抗ＴｎＭｕｃ１ ＣＡＲを含まない構築物よりも高い細胞傷害性を有する。抗ＴｎＭｕｃ１ ＣＡＲおよびＩＬ－１２ペイロードを含む構築物は、ＨＳ７６６ＴおよびＰＬ４５腫瘍細胞に対して、ＩＬ－１２ペイロードを含まない構築物よりも高い細胞傷害性をもたらした。

【0278】

実施例２０ 異なるドナーからのＴ細胞を使用する、膵がんに対する抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲ Ｔ細胞の効能
構築物ＧＣ２１６（分泌ナノルシフェラーゼおよび５３％ ＧＣ３に操作されたＬＮＧＦＲを含む非ＣＡＲベクター）、ＳＫ０７２（配列番号１１、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３を有する）抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ、およびＧＣ２１３（配列番号５、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３を有する）ＲＤＥ制御下のＩＬ－１２ペイロードを含む抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲを、異なる３ドナー（１８０、５８０および５９８）からのＴ細胞を使用して比較した。

【0279】

これらの構築物を、３つの異なるドナーＴ細胞に形質導入し、トランスフェクトされたＴ細胞をマウスに投与した。Ｔ細胞の投与前に、マウスにＨＳ７６６Ｔ細胞（転移性膵癌細胞株）を接種して、ＴｎＭＵＣ１陽性である腫瘍を増殖させた。ＨＳ７６６Ｔ細胞はさらに、腫瘍細胞のレポーターとしてのルシフェラーゼにより操作された。

【0280】

その試験の結果を、図１８、図１９および図２０に示す。ＧＣ２１３（抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲ＋ＩＬ－１２、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３）は、すべての３ドナー由来のＴ細胞において最大量の腫瘍殺滅をもたらした。

【0281】

実施例２１ 抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲおよびペイロード送達
構築物ＧＣ２１６（分泌ナノルシフェラーゼおよび５３％ ＧＣ３に操作されたＬＮＧＦＲを含む非ＣＡＲベクター）、ＳＫ０７２（配列番号１１、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３を有する）抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ、ＳＫ２０１（抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ、およびＩＦＮｇ Ｇｏｌｄ制御下の分泌Ｎ－ルシフェラーゼペイロードを含むｓｍｏｌ２プロモーター）、ＳＫ２０９（抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ、およびＩＦＮｇ Ｇｏｌｄ制御下の膜結合ＩＬ－１２ペイロードを含むＮＦＡＴ／ＭＮＤプロモーター）、ＧＣ２１３（配列番号５、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３を有する）ＲＤＥ制御下のＩＬ－１２ペイロードを含む抗ＴｎＭＵＣ１ ＣＡＲ、ならびにＧＣ２５１（配列番号１２）を、マウス腫瘍モデルにおいて比較した。これらの構築物を、ドナーＴ細胞に形質導入し、トランスフェクトされたＴ細胞を、１００万または３００万細胞の用量のいずれかでマウスに投与した。Ｔ細胞の投与前に、マウスにＨＳ７６６Ｔ細胞（転移性膵癌細胞株）を接種して、ＴｎＭＵＣ１陽性である腫瘍を増殖させた。ＨＳ７６６Ｔ細胞はさらに、腫瘍細胞のレポーターとしてのルシフェラーゼにより操作された。

【0282】

その試験の結果を図２１に示す。ＧＣ２１３（抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲ＋ＩＬ－１２、ＬＮＧＦＲにおける５３％ ＧＣ３）およびＧＣ２５１（抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲ＋ＩＬ－１２、ＬＮＧＦＲにおける８３％ ＧＣ３）は、１４日時点で最大量の腫瘍殺滅をもたらした。３００万の、ＧＣ２１３を含むＴ細胞が投与されたマウスのスキャンは、１０匹のマウスのうちの８匹が、試験の６７日時点で無腫瘍であることを示す。

【0283】

実施例２２ ラパマイシンは、細胞活性化後のＧｏｌｄ制御下のペイロードの発現を後退させる
前記の方法および材料を使用して、抗ＤＬＬ３－ＣＡＲ、およびＩＦＮｇ Ｇｏｌｄエレメント制御下のナノルシフェラーゼを含む２シストロン性ベクターを作製する。この２シストロン性ベクターを初代Ｔ細胞に形質導入し、形質導入されたＴ細胞を得る。形質導入されたＴ細胞を、ＤＬＬ３抗原を提示するＳＨＰ－７７細胞と混合すると、初代Ｔ細胞が活性化され、ナノルシフェラーゼが発現する。

【0284】

初代Ｔ細胞の活性化に続く、ナノルシフェラーゼの発現を阻害するラパマイシンの能力を試験した。抗ＤＬＬ３ ＣＡＲおよびナノルシフェラーゼをコードする２シストロン性ベクターを形質導入された初代Ｔ細胞を、ＳＨＰ－７７細胞と混合し、次いで、３つの処置計画を使用した。ラパマイシンなし（ＮｏＲｘ）、ＳＨＰ－７７細胞と同時にラパマイシンを添加（同時Ｒｘ）、またはＳＨＰ－７７細胞の添加から２４時間後にラパマイシンを添加した（遅延Ｒｘ）。２４時間ごとに、新しい培地を細胞と混合した。細胞が、より早い時期の培地中でラパマイシンを与えられていた場合、後の培地交換時での培地にラパマイシンを含めた。

【0285】

その結果を図２２に示す。図２２は、ナノルシフェラーゼ活性を、ＮｏＲｘ試料の活性に対して正規化する。ナノルシフェラーゼのレベルを、ＳＨＰ－７７細胞と混合後の２４時間、４８時間、および７２時間の時点で測定した。データは、同時Ｒｘおよび遅延Ｒｘの両方とも、ナノルシフェラーゼの発現を低下させることを示し、ラパマイシンが、ナノルシフェラーゼペイロードのＧｏｌｄ制御発現を後退させ得ることを示す。

【0286】

実施例２３ ＩＬ－１２ペイロードを含む抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲのＩＬ－１２体内分布
ＧＣ２５１（配列番号１２、抗ＴＮＭＵＣ１ ＣＡＲ＋ＩＬ－１２、ＬＮＧＦＲにおける８３％ ＧＣ３）を、ドナーＴ細胞に形質導入し、トランスフェクトされたＴ細胞を、２００万細胞の用量でマウスに投与した。Ｇｏｌｄ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与前に、マウスにＰＣ３細胞（グレードＩＶの前立腺腺癌の骨転移）を接種して、ＴｎＭＵＣ１陽性である腫瘍を増殖させた。ＰＣ３細胞はさらに、腫瘍細胞のレポーターとしてのルシフェラーゼにより操作された。

【0287】

Ｇｏｌｄ ＣＡＲ Ｔ細胞の投与から２日（Ｂ６）、７日（Ｂ５）、１０日（Ｂ４）、１４日（Ｂ３）、２１日（Ｂ２）、および３５日（Ｂ１）の時点で、マウスを殺処分した。腫瘍、血液および脾臓をマウスから採取し、試料を、ＩＬ－１２、ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２ｐ７０、およびＴＮＦａに関して試験した。この用量では、Ｇｏｌｄ ＣＡＲ Ｔ細胞（ＧＣ２５１）は、ＰＣ３腫瘍を、１４～２１日までに完全に退行させた（図２３を参照）。

【0288】

腫瘍試料では、ＩＬ－１２は、７日時点で最大値に達し、次いで、腫瘍が除去されると落下した（図２４）。腫瘍中でのＩＬ－１２レベルは、腫瘍中では、血液または脾臓中よりもはるかに高かった。ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－６、ＩＬ－８およびＩＬ－１２ｐ７０も、腫瘍中では、腫瘍が除去される１０～１４日まで、より高いレベルを有し、血液および脾臓中ではより低いレベルを有した。これらの結果は、ＩＬ－１２のＧｏｌｄ制御が、それらのマウスにおいて、腫瘍が除去されるまで、ＩＬ－１２を腫瘍に送達したことを示す。これらの結果は、ＩＬ－１２ペイロードが腫瘍において、腫瘍が除去されるまで炎症反応を誘導したことも示す。

【0289】

本明細書で考察および引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。開示される発明は、記載される特定の方法、プロトコルおよび材料に限定されず、それらは様々であり得ると理解される。同じく、本明細書で使用する用語は、単に特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、本発明の範囲を限定することは意図しないと理解され、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

【0290】

当業者は、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または確認できる。このような等価物は次の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-05-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0016】

【図1】３つの変数が、ＣＡＲコピー数、標的エピトープコピー数、およびＣＡＲ結合親和性である場合の、最適なＣＡＲ活性の図を示す。

【図2】休止時のＴ細胞の生物発光と比べた、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）またはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（ＴＣＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＲＤＥにより制御されるルシフェラーゼを含むＴ細胞からの生物発光に関するグラフを示す。

【図3】休止時のＴ細胞の生物発光と比べた、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＲＤＥであるＧｏｌｄ１、Ｇｏｌｄ２、またはＧｏｌｄ３により制御されるルシフェラーゼを含むＴ細胞からの生物発光に関するグラフを示す。

【図4】休止時のＴ細胞のＩＬ－１２発現と比べた、Ｒａｊｉ標的細胞（ＣＡＲを活性化する）によるＴ細胞の活性化後の、ＩＬ－１２発現がＲＤＥにより制御されるＴ細胞からのＩＬ－１２発現に関するグラフを示す。

【図5】ジャーカット細胞における、制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。

【図6】初代Ｔ細胞における、制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。

【図7】制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、１、３、６、および８日後の活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ発現を示す。

【図8】制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、基底ルシフェラーゼ発現および活性化ルシフェラーゼ発現を示す。

【図9】制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、活性化から１日後、３／４日後、６日後、および８日後に測定されたダイナミックレンジ（活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ）を示す。

【図10】制御エレメントとして異なるＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、活性化から１日後、３／４日後、６日後、および８日後に測定されたダイナミックレンジ（活性化ルシフェラーゼ／基底ルシフェラーゼ）を示す。

【図11】制御エレメントとしてＲＤＥを利用するルシフェラーゼ構築物に関する、グルコースおよびガラクトースの存在下でのルシフェラーゼ発現に対する影響を示す。

【図12】マウスモデルにおける転移性膵癌（ＨＳ７６６Ｔ）に対するＳＫ０７２、ＧＣ２１３、ＧＣ２１６およびＰＢＳの効能を比較する。

【図13】インビトロでのＩＦＮｇのレベルを示す。

【図14】インビトロでＩＬ－１２のレベルを示す。

【図15】インビトロでの細胞傷害性を示す。

【図16】インビトロでの細胞傷害性を示す。

【図17】インビトロでの細胞傷害性を示す。

【図18】マウスモデルにおける転移性膵癌（ＨＳ７６６Ｔ）に対する、ドナー１８０由来のＴ細胞中でのＳＫ０７２、ＧＣ２１３、ＧＣ２１６およびＰＢＳの効能を示す。

【図19】マウスモデルにおける転移性膵癌（ＨＳ７６６Ｔ）に対する、ドナー５８０由来のＴ細胞中でのＳＫ０７２、ＧＣ２１３、ＧＣ２１６およびＰＢＳの効能を示す。

【図20】マウスモデルにおける転移性膵癌（ＨＳ７６６Ｔ）に対する、ドナー５９８由来のＴ細胞中でのＳＫ０７２、ＧＣ２１３、ＧＣ２１６およびＰＢＳの効能を示す。

【図21】マウスにおける膵がんモデルに対するＳＫ０７２、ＳＫ２０１、ＳＫ２０９、ＧＣ２１３、ＧＣ２５１およびＧＣ２１６の効能を示す。

【図22】細胞の活性化後の、Ｇｏｌｄ制御下でのペイロードの発現に対するラパマイシンの阻害効果を示す。

【図23】 抗ＴｎＭＵＣ１ Ｇｏｌｄ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置されたマウスにおける前立腺がんの退行を示す。

【図24】 ＴｎＭＵＣ１ Ｇｏｌｄ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置されたマウスの腫瘍中、血液中および脾臓中におけるＩＬ－１２レベルを示す。

【国際調査報告】