特表 2024-536217 操作されたＮＫ細胞及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-04

(54)【発明の名称】操作されたＮＫ細胞及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240927BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240927BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240927BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240927BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240927BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

A61K35/17

A61P31/00

A61P35/00

A61P35/04

A61K45/00

A61P43/00 111

A61K39/395 N

A61K39/395 D

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519543

(86)(22)【出願日】2022-09-29

(85)【翻訳文提出日】2024-05-22

(86)【国際出願番号】 US2022077244

(87)【国際公開番号】W WO2023056346

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】63/249,801

(32)【優先日】2021-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510170730

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ セントラル フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001302

【氏名又は名称】弁理士法人北青山インターナショナル

(72)【発明者】

【氏名】コピック，アリシア ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ハサン，エムディー ファクルル

(72)【発明者】

【氏名】クルーム－ペレス，テイラー

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA01

4B065BD25

4B065CA44

4C084AA19

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZB321

4C084ZC411

4C084ZC412

4C084ZC752

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB01

4C085BB44

4C085CC23

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB32

4C087ZC41

(57)【要約】

Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の発現において抑制される、操作されたＮＫ細胞、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）９系を利用するＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片の欠失によって抑制されるＴＩＧＩＴ発現、並びにがん及び感染性疾患を治療するためのそれらの使用が本明細書に開示される。
【選択図】図９

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の発現において抑制される、操作されたＮＫ細胞。

【請求項2】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片の欠失によって抑制される、請求項１に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項3】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）９系をＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡにより前記ＮＫ細胞に導入することを含む方法を使用して抑制され、前記ガイドＲＮＡが、前記ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片を標的とする、請求項１又は２に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項4】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＴＩＧＩＴポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによって抑制される、請求項１に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項5】

前記操作されたＮＫ細胞が、ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有（ＰＶＲＩＧ）、ＣＤ９６、リンパ球活性化３（ＬＡＧ３）、ＴＩＭ－３、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ－１、及びＣＴＬＡ－４からなる群から選択される阻害性受容体の発現において抑制される、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項6】

前記ＮＫ細胞が、初代ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株である、請求項１～５のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項7】

前記ＮＫ細胞が、拡大されたＮＫ細胞又は拡大されていないＮＫ細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項8】

前記拡大されたＮＫ細胞が、インビトロ又はエクスビボでＮＫ細胞拡大組成物に曝露される、請求項７に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項9】

前記ＮＫ細胞拡大組成物が、フィーダー細胞、操作されたＰＭ粒子、又はエクソソームを含む、請求項８に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項10】

前記フィーダー細胞又は操作された粒子が、その外面に結合されたＦｃドメインを含む、請求項９に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項11】

前記ＮＫ細胞拡大組成物が、ＮＫ細胞エフェクター剤を更に含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項12】

前記ＮＫ細胞エフェクター剤が、ＩＬ－２１及び／又は４１ＢＢＬを含む、請求項１１に記載の操作されたＮＫ細胞。

【請求項13】

対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項１～１２のいずれか一項に記載の操作されたＮＫ細胞を投与することを含む、方法。

【請求項14】

前記対象に治療有効量のＴＩＧＩＴ阻害剤を投与することを更に含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ＴＩＧＩＴ阻害剤が、抗ＴＩＧＩＴ抗体である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、Ｆｃ受容体に結合する断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ領域を欠いているか、又は参照対照と比べてＦｃ受容体に対する親和性が低下したＦｃ領域を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

対象に治療有効量のチェックポイント遮断薬を投与することを更に含む、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記チェックポイント遮断薬が、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、又はＣＴＬＡ－４阻害剤を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法であって、前記対象に、治療有効量の操作されたＮＫ細胞を投与することを含み、前記操作されたＮＫ細胞が、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の発現において抑制される、方法。

【請求項21】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片の欠失によって抑制される、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）９系をＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡにより前記ＮＫ細胞に導入することを含む方法を使用して抑制され、前記ガイドＲＮＡが、前記ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片を標的とする、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項23】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＴＩＧＩＴポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによって抑制される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記操作されたＮＫ細胞が、ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有（ＰＶＲＩＧ）、ＣＤ９６、リンパ球活性化３（ＬＡＧ３）、ＴＩＭ－３、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ－１、及びＣＴＬＡ－４からなる群から選択される阻害性受容体の発現において抑制される、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記ＮＫ細胞が、初代ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株である、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記ＮＫ細胞が、拡大されたＮＫ細胞又は拡大されていないＮＫ細胞である、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記拡大されたＮＫ細胞が、インビトロ又はエクスビボでＮＫ細胞拡大組成物に曝露される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記ＮＫ細胞拡大組成物が、フィーダー細胞、操作されたＰＭ粒子、又はエクソソームを含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記フィーダー細胞又は操作された粒子が、その外面に結合されたＦｃドメインを含む、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記ＮＫ細胞拡大組成物が、ＮＫ細胞エフェクター剤を更に含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記ＮＫ細胞エフェクター剤が、ＩＬ－２１及び／又は４１ＢＢＬを含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記対象に治療有効量のＴＩＧＩＴ阻害剤を投与することを更に含む、請求項２０～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記ＴＩＧＩＴ阻害剤が、抗ＴＩＧＩＴ抗体である、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、Ｆｃ受容体に結合する断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）を含む、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ領域を欠いているか、又は参照対照と比べてＦｃ受容体に対する親和性が低下したＦｃ領域を含む、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

対象に治療有効量のチェックポイント遮断薬を投与することを更に含む、請求項２０～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記チェックポイント遮断薬が、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、又はＣＴＬＡ－４阻害剤を含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

ＮＫ細胞を再活性化し、ＮＫ細胞の疲弊を逆行させ、かつ／又はＮＫ細胞機能を増強するためのインビトロ又はエクスビボの方法であって、前記方法が、前記ＮＫ細胞のＩｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の発現を抑制すること、又は前記ＮＫ細胞をＴＩＧＩＴ阻害剤とともにインキュベートすることを含む、方法。

【請求項39】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片の欠失によって抑制される、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）９系をＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡにより前記ＮＫ細胞に導入することを含む方法を使用して抑制され、前記ガイドＲＮＡが、前記ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片を標的とする、請求項３８又は３９に記載の方法。

【請求項41】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＴＩＧＩＴポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによって抑制される、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

前記操作されたＮＫ細胞が、ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有（ＰＶＲＩＧ）、ＣＤ９６、リンパ球活性化３（ＬＡＧ３）、ＴＩＭ－３、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ－１、及びＣＴＬＡ－４からなる群から選択される阻害性受容体の発現において抑制される、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記ＮＫ細胞が、初代ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株である、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記ＮＫ細胞が、拡大されたＮＫ細胞又は拡大されていないＮＫ細胞である、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記拡大されたＮＫ細胞が、インビトロでＮＫ細胞拡大組成物に曝露される、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記ＮＫ細胞拡大組成物が、フィーダー細胞、操作されたＰＭ粒子、又はエクソソームを含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記フィーダー細胞又は操作された粒子が、その外面に結合されたＦｃドメインを含む、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記ＮＫ細胞拡大組成物が、ＮＫ細胞エフェクター剤を更に含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記ＮＫ細胞エフェクター剤が、ＩＬ－２１及び／又は４１ＢＢＬを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記ＮＫ細胞をＴＩＧＩＴ阻害剤とともにインキュベートすることを更に含む、請求項３８～４９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

前記ＴＩＧＩＴ阻害剤が、抗ＴＩＧＩＴ抗体である、請求項３８又は５０に記載の方法。

【請求項52】

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、Ｆｃ受容体に結合する断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ領域を欠いているか、又は参照対照と比べてＦｃ受容体に対する親和性が低下したＦｃ領域を含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項54】

前記ＮＫ細胞をチェックポイント遮断薬とともにインキュベートすることを更に含む、請求項３８～５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記チェックポイント遮断薬が、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、又はＣＴＬＡ－４阻害剤を含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法であって、前記対象に、治療有効量の請求項３８～５５のいずれか一項に記載の方法によって調製されたＮＫ細胞を投与することを含む、方法。

【請求項57】

対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法であって、前記対象に、治療有効量のＮＫ細胞及び治療有効量のＩｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）阻害剤を投与することを含む、方法。

【請求項58】

前記ＮＫ細胞が、初代ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株である、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記ＮＫ細胞が、拡大されたＮＫ細胞である、請求項５７又は５８に記載の方法。

【請求項60】

前記拡大されたＮＫ細胞が、インビトロ又はエクスビボでＮＫ細胞拡大組成物に曝露される、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記ＮＫ細胞拡大組成物が、フィーダー細胞、操作されたＰＭ粒子、又はエクソソームを含む、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

前記フィーダー細胞又は操作された粒子が、その外面に結合されたＦｃドメインを含む、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記ＮＫ細胞拡大組成物が、ＮＫ細胞エフェクター剤を更に含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記ＮＫ細胞エフェクター剤が、ＩＬ－２１及び／又は４１ＢＢＬを含む、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記ＴＩＧＩＴ阻害剤が、抗ＴＩＧＩＴ抗体である、請求項５７～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、Ｆｃ受容体に結合する断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）を含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ領域を欠いているか、又は参照対照と比べてＦｃ受容体に対する親和性が低下したＦｃ領域を含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

対象に治療有効量のチェックポイント遮断薬を投与することを更に含む、請求項５７～６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項69】

前記チェックポイント遮断薬が、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、又はＣＴＬＡ－４阻害剤を含む、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法であって、前記対象に、治療有効量の操作されたＮＫ細胞を投与することを含み、前記操作されたＮＫ細胞が、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の発現において抑制され、前記操作されたＮＫ細胞が、前記投与する工程の前に、インビトロ又はエクスビボでＴＩＧＩＴ阻害剤とともにインキュベートされる、方法。

【請求項71】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片の欠失によって抑制される、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）９系をＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡにより前記ＮＫ細胞に導入することを含む方法を使用して抑制され、前記ガイドＲＮＡが、前記ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片を標的とする、請求項７０又は７１に記載の方法。

【請求項73】

ＴＩＧＩＴの前記発現が、ＴＩＧＩＴポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによって抑制される、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記操作されたＮＫ細胞が、ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有（ＰＶＲＩＧ）、ＣＤ９６、リンパ球活性化３（ＬＡＧ３）、ＴＩＭ－３、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ－１、及びＣＴＬＡ－４からなる群から選択される阻害性受容体の発現において抑制される、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記ＮＫ細胞が、初代ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株である、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記ＮＫ細胞が、拡大されたＮＫ細胞又は拡大されていないＮＫ細胞である、請求項７０～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記拡大されたＮＫ細胞が、インビトロ又はエクスビボでＮＫ細胞拡大組成物に曝露される、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記ＮＫ細胞拡大組成物が、フィーダー細胞、操作されたＰＭ粒子、又はエクソソームを含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項79】

前記フィーダー細胞又は操作された粒子が、その外面に結合されたＦｃドメインを含む、請求項７８に記載の方法。

【請求項80】

前記ＮＫ細胞拡大組成物が、ＮＫ細胞エフェクター剤を更に含む、請求項７７～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記ＮＫ細胞エフェクター剤が、ＩＬ－２１及び／又は４１ＢＢＬを含む、請求項８０に記載の方法。

【請求項82】

前記対象に治療有効量のＴＩＧＩＴ阻害剤を投与することを更に含む、請求項７０～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記ＴＩＧＩＴ阻害剤が、抗ＴＩＧＩＴ抗体である、請求項７０～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体が、Ｆｃ受容体に結合する断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）を含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ領域を欠いているか、又は参照対照と比べてＦｃ受容体に対する親和性が低下したＦｃ領域を含む、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

対象に治療有効量のチェックポイント遮断薬を投与することを更に含む、請求項７０～８５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項87】

前記チェックポイント遮断薬が、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、又はＣＴＬＡ－４阻害剤を含む、請求項８６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年０９月２９日に出願された、米国仮特許出願第６３／２４９，８０１号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

ＮＫ細胞は、一部には、その強固な細胞傷害性、より良好な安全性、及びオフ・ザ・シェルフ（ｏｆｆ－ｔｈｅ－ｓｈｅｌｆ）療法としてのそれらの可能性のために、がんに対する有望な細胞療法として受け入れられてきた。ＮＫ細胞は、先天性免疫系の一部としての第１の応答者であり、がん性細胞を認識し、これを直接的に死滅させる固有の能力を有する。Ｔ細胞とは異なり、ＮＫ細胞は、ＭＨＣ及び抗原に依存しない方法で、がん細胞を死滅させる。ＮＫ細胞は、生殖細胞系列をコードする活性化受容体及びそれらのリガンドと結合する阻害性受容体のセットを発現し、これらの阻害性受容体及び活性化受容体のシグナル伝達のバランスは、ＮＫ細胞活性を制御する。活性化受容体は、悪性及びウイルス感染した細胞において一般的に発現されるそれらのリガンドと結合すると、ＮＫ細胞を活性化するが、阻害性受容体は、ＭＨＣ分子などの健康な細胞上で通常発現するそれらのリガンドと結合すると、ＮＫ細胞機能を防止する。ＮＫ細胞の活性化及び標的細胞の死滅は、これらの活性化シグナル及び阻害性シグナルの微細な調整に依存する。重要なことに、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲ ＣＤ１６活性化受容体を発現し、この受容体は、腫瘍抗原を標的とする抗体のＦｃ領域と結合し、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の方式で、がん細胞を死滅させることができる。がん細胞は、阻害性受容体のリガンドを上方調節し、これらのリガンドと阻害性受容体との結合は、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を防止し、それらの疲弊を促進する。様々ながんでは、阻害性受容体発現の上方調節は、がん細胞に対するより低い細胞傷害性及び炎症誘発性サイトカインＩＦＮγの発現の低下を含む、ＮＫ細胞の疲弊表現型と相関する。

【0003】

ＮＫ細胞は、腫瘍細胞を直接的に死滅させるだけではなく、炎症促進性サイトカイン及びケモカインの分泌によって、適応免疫系の細胞を含む他の免疫細胞を動員し、協調させ、活性化する。近年の研究は、ＮＫ細胞が多くの免疫療法の有効性において重要な役割を果たすことを示している。更に、ＮＫ細胞は、効率的に拡大させ、有効性を損なうことなく生存状態で凍結保存することができ、これは移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）に関連しておらず、オフ・ザ・シェルフ細胞療法として凍結保存されたドナー由来材料の安全な使用の可能性を裏付けている。現在、様々ながん環境において、ＣＡＲ－ＮＫ細胞を含むＮＫ細胞の有効性を評価する臨床試験が多数存在する。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及びＣＴＬＡ－４に対するチェックポイント阻害剤は、いくつかのがんに対する成功を示している。しかしながら、これらの治療から利益を得ることができるのは少数の患者のみである。更に、がんは、多くの場合、これらの療法に対する耐性を発生させ、一部の患者は、免疫関連の副作用を経験する。これらの観察結果は、免疫療法の利益をより多くの患者に拡大し、かつより良い安全性プロファイルを有する新しい阻害チェックポイントへの関心を引き起こした。

【0004】

免疫グロブリン及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）は、ＮＫ及びＴ細胞の両方の主要な阻害性受容体である。ＴＩＧＩＴは、阻害性受容体ＣＤ９６（ＴＡＣＴＩＬＥ）及びＰＶＲＩＧ、並びに活性化受容体ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ－１）と競合し、がん細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）上で一般的に発現されるそれらのリガンドＣＤ１５５（ＰＶＲ）及びＣＤ１１２（Ｎｅｃｔｉｎ－２又はＰＶＲＬ２）と結合するとともに、腫瘍細胞上でほぼ排他的に発現されるＴＩＧＩＴの新規の独自のリガンドであるＰＶＲＬ４（Ｎｅｃｔｉｎ４）と結合する。ＴＩＧＩＴシグナル伝達は、複数の工程で腫瘍免疫サイクルを調節する。これにより、これらの細胞によるＴ細胞増殖、細胞傷害性、及び炎症性サイトカインＩＦＮγの産生を防止する。以前の研究では、ＴＩＧＩＴが、がんにおいてＴ細胞及びＮＫ細胞の両方で上方調節され、多くの場合、それらの疲弊と相関することが報告されている。マウスモデルでは、ＴＩＧＩＴの遮断は、ＮＫ細胞の細胞傷害性を回復させ、ＩＦＮγ及びＴＮＦα発現を増加させ、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を促進した。加えて、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１を併せた遮断は、前臨床マウスモデル及び早期臨床試験において、腫瘍制御及び生存を改善する相乗効果を有していた。Ｂ１６マウスモデルでは、ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴ遮断の治療有効性は、ＮＫ細胞の存在に依存し、ＮＫ細胞の枯渇が、その効果を排除した。いくつかの抗ＴＩＧＩＴ抗体を、単独で、又は他のチェックポイント阻害剤（具体的には抗ＰＤ－１）と組み合わせて、第Ｉ相、第ＩＩ相、及び第ＩＩＩ相の臨床試験で試験している。第ＩＩ相試験は、この併用によるＮＳＣＬＣにおける無増悪生存期間（ＰＦＳ）及び全生存期間（ＯＳ）の増強を示したが、第ＩＩＩ相のＳＫＹＳＣＲＡＰＥＲ－０１は、ＰＦＳの共同主要評価項目を満たしておらず、試験は、ＯＳを評価するのに十分ではなかった。免疫細胞機能のＴＩＧＩＴ調節の現在の理解の大部分は、Ｔ細胞に基づいており、及び／又はマウスモデルに由来するが、ヒトＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴの限定された機構的インビトロ研究のみが存在し、主にＮＫ細胞株に依存する。療法の潜在的な欠点に対処するときに必要とされる機能的及び／又は分子レベルのいずれかでのヒトＮＫ細胞の抗腫瘍機能に対するＴＩＧＩＴ遮断の効果、並びに養子ＮＫ細胞及び抗ＴＩＧＩＴ抗体の併用治療の可能性を評価するためのＴＩＧＩＴ遮断の効果の理解が欠如している。

【発明の概要】

【0005】

いくつかの態様では、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の発現において抑制される、操作されたＮＫ細胞が本明細書に開示される。ＴＩＧＩＴの発現は、ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片の欠失によって抑制され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴの発現は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）９系をＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡによりＮＫ細胞に導入することを含む方法を使用して抑制され、ガイドＲＮＡは、ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片を標的とする。いくつかの態様では、ＴＩＧＩＴの発現は、ＴＩＧＩＴポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによって抑制される。いくつかの態様では、任意の先行する態様のＮＫ細胞が、初代ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株であることが本明細書に開示される。また、ＮＫ細胞が、拡大されたＮＫ細胞又は拡大されていないＮＫ細胞である、任意の先行する態様のＮＫ細胞も本明細書に開示される。いくつかの態様では、ＮＫ細胞は、インビトロ／インビボでＮＫ細胞拡大組成物に曝露され得る（例えば、フィーダー細胞、操作されたＰＭ粒子、又はエクソソーム）。いくつかの態様では、任意の先行する態様のフィーダー細胞又は操作された粒子は、その外面に結合されたＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞拡大組成物は、ＮＫ細胞エフェクター剤（例えば、ＩＬ－２１及び／又は４１ＢＢＬを含む）を更に含む。

【0006】

本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞は、がん又は感染性疾患に対する増強された機能を示す。したがって、対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法であって、対象に、治療有効量の任意の先行する態様の操作されたＮＫ細胞を投与することを含む、方法が本明細書に開示される。同様に、本開示は、対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する際に使用するための、治療有効量の任意の先行する態様の操作されたＮＫ細胞を提供する。いくつかの態様では、操作されたＮＫ細胞は、操作されたＮＫ細胞を対象に投与する前に、ＴＩＧＩＴ阻害剤とともにインキュベートされ得る。いくつかの態様では、本方法は、対象に、治療有効量のＴＩＧＩＴ阻害剤及び／又は治療有効量のチェックポイント遮断薬（例えば、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、又はＣＴＬＡ－４阻害剤）を投与することを更に含む。

【0007】

ＮＫ細胞の疲弊は、がん又はいくつかの感染性疾患を有する対象において生じる。本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞は、増強された機能（例えば、増強された細胞傷害性機能並びに／又はＩＦＮγ、ＴＮＦα、及び／若しくはＣＤ１０７ａの増加した発現を含む）を示す。したがって、ＮＫ細胞を再活性化し、ＮＫ細胞の疲弊を逆行させ、かつ／又はＮＫ細胞機能を増強するための方法であって、当該方法が、ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴの発現を抑制すること、又はＮＫ細胞をＴＩＧＩＴ阻害剤とともにインキュベートすることを含む、方法が本明細書に開示される。

【0008】

また、任意の先行する態様のＮＫ細胞を再活性化し、ＮＫ細胞の疲弊を逆行させ、及び／若しくはＮＫ細胞機能を増強するための方法、並びに／又は任意の先行する態様のがん及び／若しくは転移を治療、減少、阻害、低下、改善、及び／若しくは予防する方法であって、がんが、血液がん、リンパ腫、結腸直腸がん、結腸がん、肺がん、頭頸部がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、腎臓がん、皮膚がん、子宮頸がん、膵臓がん、及び乳がんからなる群から選択される方法である、方法が本明細書に開示される。一態様では、がんは、固形腫瘍を含む。いくつかの態様では、がんは、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄線維症、多発性骨髄腫から選択される。別の態様では、がんは、白血病、リンパ腫、肉腫、がん腫から選択され、骨髄、脳、肺、乳房、膵臓、肝臓、頭頸部、皮膚、生殖管、前立腺、結腸、肝臓、腎臓、腹膜内、骨、関節、又は眼に由来し得る。

【0009】

本明細書に記載される治療方法のうちのいずれもまた、本明細書に開示されるがん又は感染性疾患のうちのいずれかを治療するための、本明細書に開示される組成物のうちのいずれかの医療的使用であるとみなされることを更に理解されたい。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１Ａ～１Ｈは、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断が、ＰＭ２１ ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を増強することを示す。図１Ａは、ｑＲＴ－ＰＣＲによる、ナイーブＮＫ細胞及びＰＭ２１ ＮＫ細胞における阻害性受容体のＲＮＡ発現分析を示す。データは、４つの生体複製物の平均±ＳＤとして示される。図１Ｂは、ナイーブＮＫ細胞及びＰＭ２１ ＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴ発現の頻度を示す（群当たりｎ＝７）。図１Ｃは、アイソタイプ抗体又は抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下でのＡ５４９スフェロイドに対するＮＫ細胞の細胞傷害性の代表的な図を示す。データは、３つの技術的複製物の平均として示される。図１Ｄ～１Ｆは、ＮＫ細胞においてＣＤ１０７ａ（図１Ｄ）、ＩＦＮγ（図１Ｅ）、及びＴＮＦα（図１Ｆ）を発現する細胞の頻度を示す。データを、平均として示す（群当たりｎ＝４）。ＰＭ２１ ＮＫ細胞とＡ５４９スフェロイドとを７日間共培養した後、ＮＫ細胞を、ブレフェルジンＡ及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐの存在下で６時間にわたってＰＶＲ＋Ｋ５６２細胞で再刺激し、それぞれの抗体及びアイソタイプで染色した。刺激されていないＰＭ２１ ＮＫ細胞を除く全ての群を、ＰＶＲ＋Ｋ５６２細胞で刺激した。図１Ｇは、ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴノックアウトの５日後の親ＰＭ２１ ＮＫ細胞（通常のＮＫ細胞）及びＴＩＧＩＴノックアウトＰＭ２１ ＮＫ細胞（ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞）の代表的なＴＩＧＩＴヒストグラムのオーバーラップを示す。図１Ｈは、Ａ５４９スフェロイドの相対的拡大の代表的なグラフを示す。データを、３つの技術的複製物の平均として示す。全てのグラフについて、Ｐ値＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１。

【図2】図２は、ＰＭ２１ ＮＫ細胞が、ＴＩＧＩＴを有意に上方調節することを示す。

【図3】図３は、活性化時にＴＩＧＩＴが上方調節されることを示す。

【図4】図４は、ＴＩＧＩＴが、より高い細胞障害機能を有する活性化された細胞上で発現されることを示す。

【図5】図５は、ＰＶＲ発現が、おそらくＤＮＡＭ－１を介してＮＫ細胞の細胞傷害性を増強することを示す。

【図6】図６は、抗ＴＩＧＩＴが、ＰＭ２１ ＮＫ細胞による３Ｄ Ａ５４９細胞の死滅を改善することを示す。

【図7】図７は、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、３Ｄ Ａ５４９細胞のＰＭ２１ ＮＫ細胞死滅を改善することを示す。

【図8】図８は、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞が、より高い全体的な細胞傷害性を有することを示す。

【図9】図９は、ＴＩＧＩＴノックアウトＮＫ細胞が、フラトリサイドを防止し、ＮＫ細胞数を回復させることができることを示す。

【図10】図１０は、ＮＫ細胞フラトリサイドに対するチラゴルマブの効果を示す。

【図11】図１１は、ＰＭ２１ ＮＫ細胞が、阻害性受容体を有意に上方調節することを示す。

【図12】図１２は、ＰＭ２１ ＮＫ細胞の抗腫瘍活性に対するＴＩＧＩＴ遮断薬の効果を試験するための実験設計を示す概略図を示す。

【図13】図１３Ａ及び１３Ｂは、全てのＲＮＡ－ｓｅｑ遺伝子を用いた遺伝子セット濃縮分析を示す。

【図14】図１４は、差次的に発現された遺伝子を用いた遺伝子セット濃縮分析を示す。

【図15】図１５は、ＴＩＧＩＴの抗体遮断薬が、長期間曝露中のＮＫ細胞のＰＶＲ媒介性疲弊を誘導し、肺がん細胞株スフェロイドに対するＮＫ細胞の抗腫瘍活性を回復させる機構を示す。

【図16】図１６Ａ～１６Ｃは、ＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞は、ＴＩＧＩＴ^－ＮＫ細胞と比較して、ＮＫ細胞受容体の発現が増加していることを示す。ＮＫ細胞を、４名のドナーからのＴ細胞が枯渇したＰＢＭＣからのＰＭ２１粒子で１２日間拡大させた。ＮＫ細胞の活性化受容体及び阻害性受容体の発現をフローサイトメトリーによって決定し、ＴＩＧＩＴ^－又はＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞に対してゲーティングした。ＴＩＧＩＴ^－ＮＫ細胞（黒色）と比較して、ＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞（赤色）上の複数の活性化受容体及び阻害性受容体が上方調節された（図１６Ａ）。活性化受容体ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ１、及びＮＫＧ２Ｄ（図１６Ｂ）、並びに阻害性受容体ＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＮＫＧ２Ａ、ＬＡＧ３、及びＰＤ１（図１６Ｃ）を発現するＮＫ細胞のパーセントを、ＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞（赤色の三角）及びＴＩＧＩＴ^－ＮＫ細胞（黒色の丸）について決定した。データは、ドナー対の線を伴うレーダープロット又は散布図として提示される。統計的有意性を、複数の対応ありｔ検定によって決定した。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊として示すか、又はｐ＜０．０１である場合に＊＊として示す。

【図17】図１７Ａ～１７Ｄは、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、３Ｄ肺腫瘍スフェロイドに対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強したことを示す。ＮＫ細胞を、複数のドナーから得られたＴ細胞が枯渇したＰＢＭＣからのＰＭ２１粒子で１４～１６日間拡大させた。動的生存細胞イメージングによって測定された、単層中のＡ５４９－ＮＬＲ肺がん細胞に対する細胞傷害性は、アイソタイプ対照と比較して、α－ＴＩＧＩＴ抗体の存在下で有意に改善されなかった。１名のドナーからの経時的な代表的な細胞傷害性曲線を、アイソタイプ対照（黒色の丸）で、又はα－ＴＩＧＩＴ存在下（赤色の三角）のいずれかで、０．３：１のＮＫ細胞：Ａ５４９細胞の存在下で示す（図１７Ａ）。ＮＫ細胞の０．３：１における複数のドナーからの２４、４８、及び７２時間における細胞傷害性の概要を示す（Ｎ＝３）（図１７Ａ）。複数のＮＫ細胞：Ａ５４９細胞比で、２４、４８、及び７２時間における１名のドナーについての用量依存性細胞傷害性曲線が示される（図１７Ｂ）。拡大されたＮＫ細胞を、Ａ５４９腫瘍スフェロイドと７日間共培養した。ＮＫ細胞の細胞傷害性を、動的生存細胞イメージングによって決定した。１名のドナーからの代表的な細胞傷害性曲線を、アイソタイプ対照（黒色の丸）又はα－ＴＩＧＩＴ（赤色の三角）が存在する状態で示す（図１７Ｃ）。１：１のＮＫ：Ａ５４９比で７２時間における複数のドナーからのＮＫ細胞の細胞傷害性の概要は、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、細胞傷害性を有意に増加させ（Ｎ＝６ドナー）、正規化されたアイソタイプ対照の場合に各ドナーについて相対的細胞傷害性が増加したことを示す（図１７Ｃ）。共培養の７日後、ＮＫ細胞を分析して、フローサイトメトリーによって阻害性受容体及び活性化受容体の発現を決定した。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、アイソタイプ対照（黒い丸）と比較して、α－ＴＩＧＩＴの存在下でＡ５４９スフェロイドと共培養した場合（赤色の三角）に、主要な阻害性受容体又は活性化受容体の発現を有意に変化させず、発現レベルは、曝露されていないＮＫ細胞（灰色の四角）と同様であった（Ｎ＝３～５ドナー）（図１７Ｄ）。データは、ドナー対の線を伴う散布図として、又は標準偏差を表す誤差バーを伴う平均として提示される。統計的有意性を、複数の対応ありｔ検定によって決定した。用量依存性細胞傷害性曲線について、曲線下面積（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ、ＡＵＣ）を決定し、対応のないｔ検定によって比較した。Ｐ値を、ｐ＞０．０５である場合にｎｓとして、ｐ＜０．０００１である場合に＊＊＊＊として示す。

【図18】図１８Ａ～１８Ｂは、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、複数の長期間の３Ｄ肺腫瘍スフェロイドモデルにおいてＮＫ細胞媒介性の死滅を増強したことを示す。ＮＫ細胞を、複数のドナーから得られたＴ細胞が枯渇したＰＢＭＣからのＰＭ２１粒子で１４～１６日間拡大させた。拡大されたＮＫ細胞を、ＮＣＩ－Ｈ１２９９－ＮＬＲ、ＮＣＩ－Ｈ３５８－ＮＬＲ又はＮＣＩ－１９７５－ＮＬＲ肺腫瘍スフェロイドと７日間共培養した。ＮＫ細胞の細胞傷害性を、動的生存細胞イメージングによって決定した。１名のドナーからの代表的な細胞傷害性曲線を、アイソタイプ対照（黒色の丸）又はα－ＴＩＧＩＴ（赤色の三角）が存在する状態のいずれかで試験した各細胞株について示す（図１８Ａ）。７２時間における複数のドナーからのＮＫ細胞の細胞傷害性の概要は、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、細胞傷害性を有意に増加させ、各ドナーがアイソタイプ対照に対して正規化された場合に、相対的細胞傷害性が増強したことを示す（使用されたＥ：Ｔ比は、ＮＣＩ－Ｈ１２９９について３：１、ＮＣＩ－Ｈ３５８について１：１、及びＮＣＩ－Ｈ１９７５について１：３、Ｎ＝６ドナー）（図１８Ｂ）。データは、ドナー対の線を伴う散布図として、又は標準偏差を表す誤差バーを伴う平均として提示される。統計的有意性を、複数の対応ありｔ検定によって決定した。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊として示し、ｐ＜０．０１である場合に＊＊として示す。

【図19】図１９Ａ～１９Ｃは、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、長期間曝露中のＰＶＲ媒介性ＮＫ細胞の疲弊を防止することを示す。ＮＫ細胞を、Ｔ細胞が枯渇したＰＢＭＣから１４～１６日間かけて拡大させた。拡大されたＮＫ細胞を、α－ＴＩＧＩＴ又はアイソタイプ対照の存在下でＡ５４９スフェロイドと７日間共培養した。共培養の７日後、ＮＫ細胞を、ブレフェルジンＡ及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐの存在下で４～６時間にわたってＰＶＲ発現を伴って、又は伴わずに、Ｋ５６２がん細胞で刺激し、表面ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ及びＴＮＦαのＮＫ細胞発現を、フローサイトメトリーにより分析した。曝露されていない、刺激されていないか、又は刺激されたＰＭ２１－ＮＫ細胞を対照として使用した。加えて、ＮＫ細胞を、Ａ５４９スフェロイドとの共培養の後に選択し、ＲＮＡ抽出及びトランスクリプトーム分析に使用した。実験の概略図を（図１９Ａ）に示す。各ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＣＤ１０７ａ発現について、刺激されていない曝露されていないＮＫ細胞（灰色の四角）、曝露されていない刺激されたＮＫ細胞（黒色の四角）、アイソタイプ存在下（灰色の丸）又は抗ＴＩＧＩＴ抗体存在下（赤色の三角）で腫瘍曝露されたＮＫ細胞を、ＰＶＲ^－Ｋ５６２細胞又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞のいずれかによる再刺激のために示す。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞（Ｎ＝４ドナー）で再チャレンジしたときに、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＣＤ１０７ａ発現を保存した（図１９Ｂ）。ＲＮＡ－ｓｅｑデータのＧＳＥＡ分析は、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及び他の関連する炎症応答遺伝子セットを上方調節したことを示す。概要のグラフは、その－ｌｏｇ_１０（ＦＤＲ）に基づいて、ＴＩＧＩＴ遮断時に上方調節された遺伝子セットを示す（図１９Ｃ）。データは、標準偏差を表す誤差バーを伴う散布図又は棒グラフとして提示される。統計的有意性を、複数の対応のないｔ検定によって決定した。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊、ｐ＜０．０１である場合に＊＊、ｐ＜０．００１である場合に＊＊＊、ｐ＜０．０００１である場合に＊＊＊＊として示す。

【図20】図２０は、Ｋ５６２－ｍｂＩＬ２１－４１ＢＢＬ細胞（ＰＭ２１粒子）に由来する形質膜粒子を利用して、ＮＫ細胞増殖を刺激する、フィーダー細胞を含まない拡大技術が開発されたことを示す。この方法は、２週間で、ＰＭ２１－ＮＫ細胞と呼ばれるＮＫ細胞の平均１，７００倍の拡大をもたらす（１８名のドナーからＮ＝１１３）。

【図21】図２１Ａ～２１Ｂは、０、４８、９６、及び１４４時間後のα－ＴＩＧＩＴ又はアイソタイプ対照の存在下で１０，０００個のＮＫ細胞とともにインキュベートされたＮＬＲを発現するＡ５４９がん細胞スフェロイドの生存細胞イメージング細胞傷害性アッセイからの代表的な画像を示し、抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下でＮＫ細胞の細胞傷害性の増加を示す（図２１Ａ）。１名のドナーからの代表的な生データを、Ａ５４９相対的拡大単独（灰色の四角）又はアイソタイプ対照（黒色の丸）若しくは抗ＴＩＧＩＴ（赤色の三角）を含む０．３：１のＮＫ細胞：Ａ５４９細胞の存在について示す。

【図22】図２２Ａ～２２Ｂは、ＮＫ細胞が、複数のドナーから得られたＴ細胞が枯渇したＰＢＭＣからのＰＭ２１粒子で拡大したことを示す。これらの拡大されたＮＫ細胞を、ブレフェルジンＡ及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐを含むα－ＴＩＧＩＴ又はアイソタイプ対照の存在下で、ＰＶＲ発現を伴いつつ、又は伴わずに、Ｋ５６２がん細胞と４～６時間共培養した。ＩＦＮγ及びＴＮＦα及び表面ＣＤ１０７ａの発現をフローサイトメトリーによって分析した。ＮＫ細胞単独（黒色の丸）と比較して、ＴＩＧＩＴ遮断薬（赤色の三角）は、ＰＶＲ－Ｋ５６２細胞又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞による刺激時に、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、又は表面ＣＤ１０７ａを発現するドナー一致ＮＫ細胞の割合を有意に変化させなかったが、ＴＩＧＩＴ遮断時にＴＮＦαを発現するＮＫ細胞のわずかな有意な増加がみられた（３６％±３％対３２％±２％ ｐ＝０．００８）（Ｎ＝３ドナー）（図２２Ａ）。ＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性に対する短期間ＴＩＧＩＴ遮断薬の効果も決定した。ＰＭ２１－ＮＫ細胞を、抗ＴＩＧＩＴ又はアイソタイプ対照抗体の存在下でＰＶＲ－又はＰＶＲ＋Ｋ５６２細胞と１時間共培養し、ＮＫ細胞の細胞傷害性を、Ｋ５６２細胞のアネキシンＶ染色によって決定した。濃度依存性の細胞傷害性曲線を、複数のＮＫ：Ｋ５６２比を使用して生成し、曲線下面積を決定した。短期間ＴＩＧＩＴ遮断薬は、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＰＶＲ^－又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞のいずれかに対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を有意に改善しなかった（ＰＶＲ－Ｋ５６２細胞に対して、３３５±６％比対３２５±１０％比、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞に対して、３４６±３％比対３４１±１０％比）（図２２Ｂ）。

【図23】図２３は、インビトロ疲弊モデルの分析に使用される生データの代表的なゲーティング戦略及びフローサイトメトリードットプロットを示す。

【図24】図２４は、ＴＩＧＩＴノックアウトＮＫ細胞に関する特定の知見をまとめた概略図を示す。

【図25】図２５Ａ～２５Ｄは、ＴＩＧＩＴが、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞において効率的にノックアウトされ得ることを示す。

【図26】図２６Ａ～２６Ｈは、ＴＩＧＩＴノックアウトがＮＫ細胞表現型を変化させないことを示す。

【図27】図２７Ａ～２７Ｉは、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞が、様々な腫瘍スフェロイドに対して、より細胞傷害性であることを示す。

【図28】図２８Ａ～２８Ｃは、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞が、ＡＤＣＣを介してより良好に死滅させることを示す。

【図29】図２９Ａ～２９Ｃは、ＴＩＧＩＴが、Ａ５４９スフェロイドに４８時間曝露した後の脱顆粒のマーカーであるＣＤ１０７ａ表面発現を増加させることを示す。

【図30】図３０Ａ～３０Ｄは、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞とＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞との間の解糖及びミトコンドリアストレスの比較を示す。

【図31】図３１Ａ～３１Ｂは、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫが、チラゴルマブ誘導性フラトリサイドを防止し、チラゴルマブの存在下でＡ５４９スフェロイドに対する増強された細胞傷害性をもたらすことを示す。

【図32】図３２は、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞が、インビボでの持続性が向上していることを示す。

【図33】図３３Ａ～３３Ｃは、ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴ ＫＯ時の代表的な上方調節及び下方調節された遺伝子セットのヒートマップを示す。

【図34】図３４Ａ～３４Ｄは、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞の代謝分析を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、及び／又は方法が開示及び説明される前に、それらは、別段明記されない限り、特定の合成方法又は特定の組換えバイオテクノロジー方法に限定されないか、又は別段明記されない限り、特定の試薬に限定されず、したがって、もちろん変化し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

【0012】

定義
本出願全体にわたって、様々な刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、それらの全体が、本出願に関係する技術水準をより完全に説明するために参照により本出願に組み込まれる。開示される参考文献はまた、参考文献に依る文章で考察され、それらに含有される材料について、個別にかつ具体的に参照により本明細書に組み込まれる。

【0013】

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ Ｅｄ．１９９４）、Ｔｈｅ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．，１９８８）、Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）、及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段明記されない限り、それらに帰する意味を有する。

【0014】

本開示の要素又はその好ましい実施形態を紹介する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つ以上が存在することを意味することが意図される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることが意図され、列挙されている要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。

【0015】

本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物及び方法が、列挙された要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味することを意図している。組成物及び方法を定義するために使用される場合、「～から本質的になる」は、組み合わせに対する任意の本質的な重要性を有する他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書に定義される要素から本質的になる組成物は、単離及び精製方法から微量汚染物質及び薬学的に許容される担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、保存剤などを除外しない。「～からなる」とは、本発明の組成物を投与するための他の成分の微量要素を超えるもの、及び実質的な方法工程を除外することを意味するものとする。これらの移行語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。

【0016】

本明細書では、範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値から、及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」の使用によって値が近似値として表現される場合、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。範囲の各々の終点は、他の終点と関連して、及び他の終点とは独立して、両方とも重要であることが更に理解されよう。本明細書に開示されるいくつかの値が存在し、各値はまた、値自体に加えて、その特定の値を「約」として本明細書に開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、したがって「約１０」もまた開示される。当業者によって適切に理解されるように、ある値が開示される場合、「その値以下」、「その値以上」及びその値の間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」及び「１０以上」もまた開示される。また、本出願全体にわたって、データは、いくつかの異なる形式で提供され、このデータは、終点及び始点、並びにデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。例えば、特定のデータポイント「１０」及び特定のデータポイント１５が開示される場合、１０と１５との間だけでなく、１０より大きい、１０以上、１０未満、１０以下、及び１０に等しい、１５より大きい、１５以上、１５未満、１５以下、及び１５に等しい値が開示されるとみなされることが理解される。また、２つの特定のユニット間の各ユニットも開示されることが理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。

【0017】

対象への「投与」には、対象に薬剤を導入又は送達する任意の経路が含まれる。投与は、経口、局所、静脈内、皮下、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、筋肉内、関節内、非経口、動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入による、移植リザーバー経由、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、腹腔内、肝臓内、病巣内、及び頭蓋内注射又は注入技術）などを含む、任意の好適な経路によって実施することができる。本明細書で使用される「同時投与」（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ、又はａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）は、化合物が、時間的に同じ時点で投与されるか、又は本質的に互いの直後に投与されることを意味する。後者の場合、２つの化合物は、観察された結果が、時間的に同じ時点で投与された場合に得られる結果と区別できないような十分近い時間に投与される。「全身投与」は、例えば循環系又はリンパ系への入り口を介して、対象の身体の広範囲の領域（例えば、身体の５０％超）に薬剤を導入又は送達する経路を介して、対象に薬剤を導入又は送達することを指す。対照的に、「局所投与」は、投与点の領域又はそれに直接隣接する領域に薬剤を導入又は送達し、治療上有意な量で薬剤を全身的に導入しない経路を介して、対象に薬剤を導入又は送達することを指す。例えば、局所投与される薬剤は、投与点の局所的な近傍で容易に検出可能であるが、対象の身体の遠位部分では検出不能であるか、又は無視できる量で検出可能である。投与には、自己投与及び他者による投与が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物は、非経口、静脈内、腹腔内、若しくは皮下に、又は動脈注入、静脈注入、若しくは人工カテーテル媒介注入を介して投与される。

【0018】

本明細書で使用される場合、「有益な薬剤」及び「活性薬剤」という用語は、有益な生物学的効果を有する化学化合物又は組成物を指すために本明細書で互換的に使用される。有益な生物学的効果としては、治療効果（すなわち、障害又は他の望ましくない生理学的状態の治療）、及び予防効果（すなわち、障害又は他の望ましくない生理学的状態の予防の）両方が挙げられる。これらの用語はまた、本明細書に具体的に言及される有益な薬剤の薬学的に許容される薬理学的に活性な誘導体を包含し、限定されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝産物、異性体、断片、類似体などを含む。「有益な薬剤」又は「治療薬剤」という用語が使用される場合、次いで、又は特定の薬剤が具体的に特定される場合、この用語は、薬剤自体、並びに薬学的に許容される薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、コンジュゲート、活性代謝産物、異性体、断片、類似体などを含むことを理解されたい。

【0019】

「コードする」とは、ヌクレオチドの定義された配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）又はアミノ酸の定義された配列及びそれらから生じる生物学的特性のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び巨大分子の合成のためのテンプレートとして役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、ｍＲＮＡの転写及び翻訳の場合、遺伝子は、タンパク質をコードする。

【0020】

「リンカー」という用語は、ポリペプチドの結合部位及び別のポリペプチドの結合部位を有する少なくとも二価の部分を指す。例えば、ポリペプチドは、そのＮ末端、そのＣ末端、又は側鎖のうちの１つの官能基を介してリンカーに結合し得る。リンカーは、２つのポリペプチドを少なくとも１つの原子によって、いくつかの実施形態では１つより多くの原子によって分離するのに十分である。

【0021】

本明細書で使用される場合、「任意選択的な」又は「任意選択的に」という用語は、その後に説明される事象又は状況が生じても生じなくてもよいことを意味し、この記載には、前述の事象又は状況が生じる場合及び生じない場合が含まれる。

【0022】

「遺伝子」又は「遺伝子配列」という用語は、コード配列又は制御配列、又はその断片を指す。遺伝子は、コード配列及び制御配列、又はそれらの断片の任意の組み合わせを含み得る。したがって、本明細書で言及される「遺伝子」は、天然遺伝子の全部又は一部であり得る。本明細書で言及されるポリヌクレオチド配列は、用語「遺伝子」と互換的に使用され得るか、又は任意のコード配列、非コード配列若しくは制御配列、その断片、及びそれらの組み合わせを含み得る。用語「遺伝子」又は「遺伝子配列」は、例えば、コード配列の上流の制御配列（例えば、リボソーム結合部位）を含む。

【0023】

本明細書で使用される「核酸」という用語は、ヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡ）から構成されるポリマーを意味する。本明細書で使用される「リボ核酸」及び「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチドからなるポリマーを意味する。本明細書で使用される「デオキシリボ核酸」及び「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドからなるポリマーを意味する。（「ポリヌクレオチド」及び「ポリペプチド」とともに使用される。）

【0024】

別途明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの変性バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列といった語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンにおいてイントロンを含有し得る程度にイントロンを含み得る。

【0025】

「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。

【0026】

「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドモノマーからなる一本鎖又は二本鎖ポリマーを指す。

【0027】

「薬学的に許容される」構成要素は、生物学的又は他の望ましくないものではない構成要素、すなわち、著しく望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又はそれが含有される製剤の他の構成要素のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、本発明の薬学的製剤に組み込んで、本明細書に記載のように対象に投与することができる構成要素を指すことができる。ヒトへの投与に関して使用される場合、この用語は、一般に、構成要素が毒性試験及び製造試験の必要な基準を満たしているか、又はそれが、米国食品医薬品局によって調製された不活性成分ガイドに含まれることを意味する。

【0028】

「薬学的に許容される担体」（「担体」と称されることがある）は、一般に安全かつ無毒の薬学的又は治療組成物の調製において有用な担体又は賦形剤を意味し、獣医学的及び／又はヒトの薬学的又は治療的使用が許容される担体を含む。「担体」又は「薬学的に許容される担体」という用語は、限定されないが、リン酸緩衝食塩水、水、エマルジョン（油／水若しくは水／油エマルジョンなど）、及び／又は様々なタイプの湿潤剤を含むことができる。

【0029】

本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤、又は薬学的製剤で使用するために当該技術分野で周知の他の材料を包含する。組成物中で使用するための担体の選択は、組成物の意図される投与経路に依存するであろう。薬学的に許容される担体及びこれらの材料を含有する製剤の調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５に記載される。生理学的に許容される担体の例としては、生理食塩水、グリセロール、ＤＭＳＯ、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、及び他の有機酸を含む緩衝剤などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギニン、アルギニン若しくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール若しくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商標）（ＩＣＩ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪ）などの非イオン界面活性剤が挙げられる。所望の療法的治療のためのそのような用量の投与を提供するために、本明細書に開示される組成物は、担体又は希釈剤を含む組成物の総重量に基づいて、対象化合物のうちの１つ以上の総重量の約０．１重量％～９９重量％を有利に含むことができる。

【0030】

本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、実質的に等しい長さの２つの配列間の同一性の程度の定量的尺度を示す。核酸又はアミノ酸配列に関わらず、２つの配列の同一性パーセントは、２つのアラインメントされた配列間の正確なマッチの数を、より短い配列の長さで割ったものに、１００を乗じたものである。核酸配列の近似アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２－４８９（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ ｓｕｐｐｌ．３：３５３－３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５－６７６３（１９８６）によって正規化されたスコアリングマトリックスを使用することによってアミノ酸配列に適用され得る。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実装態様は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）によって、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおいて提供される。配列間の同一性又は類似性パーセントを計算するのに好適な他のプログラムは、一般に当該技術分野で既知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、既定パラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、以下の既定パラメータを使用して使用され得る：遺伝コード＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予測＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；並び替え＝ハイスコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋのウェブサイトで確認できる。一般に、置換は、保存的アミノ酸置換であり、第１群：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、第２群：セリン、システイン、スレオニン、及びメチオニン、第３群：プロリン、第４群：フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、第５群：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、及びグルタミンのメンバー内の交換に限定される。

【0031】

核酸及びアミノ酸配列同一性を決定するための技術は、当該技術分野で既知である。典型的には、そのような技術は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、及び／又はそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、及びこれらの配列を第２のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列を、この様式で決定及び比較することもできる。一般に、同一性は、それぞれ２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することによって比較され得る。

【0032】

「増加」とは、より多くの量の症状、疾患、組成物、状態、又は活性をもたらす任意の変化を指し得る。増加とは、統計的に有意な量の状態、症状、活性、組成物の任意の個々の、中央値、又は平均の増加であり得る。したがって、増加とは、その増加が統計的に有意である限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％の増加であり得る。

【0033】

「減少」とは、より少ない量の症状、疾患、組成物、状態、又は活性をもたらす任意の変化を指し得る。ある物質はまた、その物質を含む遺伝子産物の遺伝的出力が、その物質を含まない遺伝子産物の出力と比較して少ない場合に、遺伝子の遺伝的出力を減少させると理解される。また、例えば、減少は、症状が以前に観察されたものよりも少ないような、障害の症状の変化であり得る。減少とは、統計的に有意な量の状態、症状、活性、組成物の任意の個々の、中央値、又は平均の減少であり得る。したがって、減少とは、その減少が統計的に有意である限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００％の減少であり得る。

【0034】

「断片」は、他の配列に付着しているか否かにかかわらず、特定の領域又は特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、又は他の選択された改変を含み得るが、ただし、断片の活性は、非改変ペプチド又はタンパク質と比較して著しく変化又は障害されない。これらの改変は、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去又は付加すること、その生物学的寿命を延ばすこと、その分泌特性を変化させることなどのいくつかの追加の特性を提供することができる。いずれにしても、断片は、ＮＫ細胞に対する阻害効果など、生物活性特性を有していなければならない。

【0035】

「阻害する」、「阻害すること」、及び「阻害」とは、活性、応答、状態、疾患、又は他の生物学的パラメータを減少させることを意味する。これには、活性、応答、状態、又は疾患の完全な除去が含まれ得るが、これらに限定されない。これには、例えば、天然又は対照レベルと比較して、活性、応答、状態、又は疾患の１０％低減も含まれ得る。したがって、低減は、天然又は対照レベルと比較して、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、又はその間の任意の量の低減であり得る。

【0036】

発現又は活性の「阻害剤」は、それぞれ、記載される標的タンパク質、例えば、リガンド、アンタゴニスト、及びそれらの相同体及び模倣物の発現又は活性のためのインビトロ及びインビボアッセイを使用して特定される阻害性分子を指すために使用される。阻害剤は、例えば、記載される標的タンパク質、例えば、アンタゴニストの発現を阻害するか、又はそれに結合し、刺激若しくはプロテアーゼ活性を部分的若しくは完全に遮断し、減少させ、防止し、活性化を遅らせ、不活性化し、脱感作するか、又はその活性を下方調節する薬剤である。対照試料（阻害剤で処理されていない）には、１００％の相対的活性値が割り当てられる。記載される標的タンパク質の阻害は、対照と比較した活性値が約８０％、任意選択的に５０％又は２５、１０％、５％又は１％である場合に達成される。

【0037】

本明細書で使用される場合、「Ｎ末端側」又は「アミノ末端」は、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の方向性を指し、Ｎ末端を意味しない場合がある。いくつかの態様では、キメラ又は融合のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質が考察される場合、Ｎ末端側は、キメラ又は融合のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の構成要素のみを指す場合があり、構造全体を指さない場合がある。例えば、Ｆｃドメインが考察され、Ｆｃドメインがそのアミノ末端又は細胞内に面するＮ末端側と融合したものとして説明される場合、本明細書で企図されるのは、単一アンカーが、キメラ又は融合構築物のＮ末端にあり、実際には細胞膜にまたがっているキメラ又は融合のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である。したがって、そのようなキメラでは、膜貫通アンカーは、Ｆｃドメインのアミノ末端側に結合され、Ｆｃドメインの方向性は、細胞に面するＮ末端側を有し、それは、典型的には、細胞膜に広がるカルボキシ末端及び細胞外マトリックスに延びるアミノ末端を有する典型的なＢ細胞上のＦｃドメインに対して反転している。

【0038】

「低減する」又は単語の他の形態、例えば、「低減すること」又は「低減」とは、事象又は特徴（例えば、腫瘍成長）の低下を意味する。これは典型的には、いくつかの標準値又は期待値に関し、換言すれば、それは相対的であるが、標準値又は相対値が参照されることが必ずしも必要ではないことが理解される。例えば、「腫瘍成長を低減する」とは、標準又は対照と比較して、腫瘍の成長速度を低減することを意味する。

【0039】

「予防する」又はその単語の他の形態、例えば「予防すること」又は「予防」とは、特定の事象若しくは特徴を停止すること、特定の事象若しくは特徴の発達若しくは進行を安定化させるか、若しくは遅らせること、又は特定の事象若しくは特徴が発生する可能性を最小限に抑えることを意味する。予防は、典型的には、例えば、低減よりも絶対的であるため、対照との比較を必要としない。本明細書で使用される場合、何かを低減することができるが、予防することができない場合があるが、低減される何かを予防することができる場合もある。同様に、何かを予防することができるが、低減することができない場合があるが、予防される何かを低減することができる場合もある。低減又は予防が使用される場合、特に具体的に指定しない限り、他の単語の使用も明示的に開示されることを理解されたい。

【0040】

「対象」という用語は、投与又は治療の標的である任意の個体を指す。対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物であり得る。一態様では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、又はネコであり得る。対象はまた、モルモット、ラット、ハムスター、ウサギ、マウス、又はモグラであり得る。したがって、対象は、ヒト又は獣医学的患者であり得る。「患者」という用語は、臨床医、例えば、医師の治療下にある対象を指す。

【0041】

「治療的に有効な」という用語は、使用される組成物の量が、疾患又は障害の１つ以上の原因又は症状を軽減するのに十分なものであることを指す。そのような軽減は、低減又は変化を必要とするだけであり、排除である必要はない。

【0042】

「治療」という用語は、疾患、病理学的状態、又は障害を治癒するか、軽減するか、安定化させるか、又は予防する意図を有する患者の医学的管理を指す。この用語は、能動的治療、すなわち、疾患、病的な状態、又は障害の改善に特異的に向けられた治療を含み、原因治療、すなわち、関連する疾患、病的な状態、又は障害の原因の除去に向けられた治療も含む。加えて、この用語は、緩和的治療、すなわち、疾患、病的な状態、又は障害の治癒ではなく、症状の緩和のために設計された治療、予防的治療、すなわち、関連する疾患、病的な状態、又は障害の発症を最小限に抑えるか、又は部分的若しくは完全に阻害することに向けられた治療、及び補助的治療、すなわち、関連する疾患、病的な状態、又は障害の改善に向けられた別の特定の療法を補充するために使用される治療を含む。

【0043】

「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、及びそれらの文法的変形は、本明細書で使用される場合、１つ以上の疾患又は状態の強度又は頻度、疾患又は状態の症状、あるいは疾患又は状態の根本的な原因を、部分的又は完全に予防する、遅延させる、治癒する、快癒する、緩和する、軽減する（ｒｅｌｉｅｖｉｎｇ）、変更する、治療する（ｒｅｍｅｄｙｉｎｇ）、改善する（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）、改善する（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ）、安定化させる、軽減する（ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ）、及び／又は低減することを、意図又は目的とする組成物の投与が含まれる。本発明による治療は、防止的、予防的、姑息的、又は治療的に適用され得る。予防的治療は、発症前（例えば、がんの明らかな徴候の前）、早期発症中（例えば、がんの初期の徴候及び症状時）、又は確立されたがんの発達後に対象に投与される。予防的投与は、疾患又は感染の症状の兆候前の１日（数日）～数年間行われ得る。

【0044】

操作されたＮＫ細胞
いくつかの態様では、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の発現において抑制される、操作されたＮＫ細胞が本明細書に開示される。ＴＩＧＩＴの発現は、例えば、ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片（例えば、ＴＩＧＩＴ遺伝子の１つ以上のエクソン）の欠失によるもの、又はＴＩＧＩＴポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡによるものを含む任意の手段を使用して抑制され得る。

【0045】

「ＴＩＧＩＴ」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＴＩＧＩＴ遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、以下のように、１つ以上の公的に利用可能なデータベースにおいて特定されるものである。ＨＧＮＣ：２６８３８、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：２０１６３３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８１８４７、ＯＭＩＭ（登録商標）：６１２８５９、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ４９５Ａ１。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号１の配列、又は配列番号１と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、若しくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、又は配列番号１の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号１のＴＩＧＩＴポリペプチドは、成熟ＴＩＧＩＴの未成熟形態又は処理前形態を表していてもよく、したがって、配列番号１のＴＩＧＩＴポリペプチドの成熟部分又は処理部分が本明細書に含まれる。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴポリペプチドは、配列番号１０又はその断片に対して少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％）の同一性を含むポリヌクレオチドによってコードされる。

【0046】

いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴの発現は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ）９系をＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡによりＮＫ細胞に導入することを含む方法を使用して抑制され、ガイドＲＮＡは、ＴＩＧＩＴ遺伝子又はその断片を標的とする。

【0047】

一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現又はその活性の指向に関与する転写産物及び他の要素を総称して指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では「ダイレクトリピート」及びｔｒａｃｒＲＮＡプロセシングされた部分ダイレクトリピートを包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では「スペーサー」とも称される）、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写産物を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上の要素は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。ＣＲＩＳＰＲ系は、当該技術分野で既知である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい。

【0048】

「ガイドＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」、及び「合成ガイドＲＮＡ」は、互換的に使用され、ガイド配列、ｔｒａｃｒ配列、及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。「ガイド配列」という用語は、標的部位を特定するガイドＲＮＡ内の約２０ｂｐの配列を指し、「ガイド」又は「スペーサー」という用語と互換的に使用され得る。ＴＩＧＩＴポリヌクレオチドを標的とする本明細書に記載のｇＲＮＡは、配列番号１１又はその断片に対して少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％）の同一性の配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号１１に記載の配列を含む。いくつかの例では、ＴＩＧＩＴ ｇＲＮＡは、ＴＩＧＩＴタンパク質ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ４９５Ａ１の細胞外ドメインのアミノ酸残基１１３～１１９（すなわち、配列番号１のアミノ酸残基１１３～１１９）に対応する、厳選されたＴＩＧＩＴ ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１７３７９９のヌクレオチド３７２～３９１（すなわち、配列番号１０のヌクレオチド残基３７２～３９１）を標的とする。

【0049】

本明細書において、「発現」とは、遺伝子、ポリヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドなどの核酸からの転写によるｍＲＮＡの生成、又はｍＲＮＡからの転写によるタンパク質若しくはポリペプチドの生成を意味する。「発現の抑制」は、抑制されていない場合と比較して、転写産物又は翻訳産物の有意な量の減少を指す。

【0050】

本明細書におけるＴＩＧＩＴ発現の抑制は、例えば、ＴＩＧＩＴを抑制しないＮＫ細胞（例えば、初代ＮＫ細胞、ＮＫ細胞株、拡大されていないＮＫ、又は拡大されたＮＫ）における転写産物又は翻訳産物の量と比較して、約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上、約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、又は約９９％以上の量での転写産物又は翻訳産物の有意な量の減少を示す。

【0051】

いくつかの実施形態では、操作されたＮＫ細胞は、阻害性受容体の発現において抑制される。いくつかの実施形態では、阻害剤受容体は、ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有（ＰＶＲＩＧ）、ＣＤ９６、リンパ球活性化３（ＬＡＧ３）、ＴＩＭ－３、ＮＫＧ２Ａ、ＰＤ－１、及びＣＴＬＡ－４からなる群から選択される。

【0052】

ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）（ＣＤ１５５とも称される）は、異なるタイプの腫瘍細胞上で発現され、このリガンドと相互作用した後に反対の機能を発揮するＮＫ細胞上の活性化受容体又は阻害性受容体によって認識されることを理解すべきである。活性化受容体は、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）を含み、阻害性受容体受容体は、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、及びＰＶＲＩＧを含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＮＫ細胞は、ＣＤ９６及びＰＶＲＩＧからなる群から選択される阻害性受容体の発現において更に抑制される。

【0053】

「ポリオウイルス受容体関連免疫グロブリンドメイン含有（ＰＶＲＩＧ）」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＰＶＲＩＧ遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＰＶＲＩＧポリペプチドは、以下のように、１つ以上の公的に利用可能なデータベースにおいて特定されるものである。ＨＧＮＣ：３２１９０、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：７９０３７、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００２１３４１３、ＯＭＩＭ（登録商標）：６１７０１２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ６ＤＫＩ７。いくつかの実施形態では、ＰＶＲＩＧポリペプチドは、配列番号２の配列、又は配列番号２と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、若しくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、又は配列番号２の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号２のＰＶＲＩＧポリペプチドは、成熟ＰＶＲＩＧの未成熟形態又は処理前形態を表していてもよく、したがって、配列番号２のＰＶＲＩＧポリペプチドの成熟部分又は処理部分が本明細書に含まれる。

【0054】

「ＣＤ９６」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＣＤ９６遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ９６ポリペプチドは、以下のように、１つ以上の公的に利用可能なデータベースにおいて特定されるものである。ＨＧＮＣ：１６８９２、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１０２２５、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１５３２８３、ＯＭＩＭ（登録商標）：６０６０３７、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ４０２００。いくつかの実施形態では、ＣＤ９６ポリペプチドは、配列番号３の配列、又は配列番号３と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、若しくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、又は配列番号３の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号３のＣＤ９６ポリペプチドは、成熟ＣＤ９６の未成熟形態又は処理前形態を表していてもよく、したがって、配列番号３のＣＤ９６ポリペプチドの成熟部分又は処理部分が本明細書に含まれる。

【0055】

「ＤＮＡＸアクセサリー分子－１（ＤＮＡＭ－１）」又は「ＣＤ２２６」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＣＤ２２６遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、以下のように、１つ以上の公的に利用可能なデータベースにおいて特定されるものである。ＨＧＮＣ：１６９６１、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１０６６６、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１５０６３７、ＯＭＩＭ（登録商標）：６０５３９７、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ１５７６２。いくつかの実施形態では、ＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、配列番号４の配列、又は配列番号４と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、若しくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、又は配列番号４の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号４のＤＮＡＭ－１ポリペプチドは、成熟ＤＮＡＭ－１の未成熟形態又は処理前形態を表していてもよく、したがって、配列番号４のＤＮＡＭ－１ポリペプチドの成熟部分又は処理部分が本明細書に含まれる。

【0056】

「リンパ球活性化３（ＬＡＧ３）」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＬＡＧ３遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ３ポリペプチドは、以下のように、１つ以上の公的に利用可能なデータベースにおいて特定されるものである。ＨＧＮＣ：６４７６、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３９０２、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ００００００８９６９２、ＯＭＩＭ（登録商標）：１５３３３７、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ１８６２７。いくつかの実施形態では、ＬＡＧ３ポリペプチドは、配列番号５の配列、又は配列番号５と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、若しくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、又は配列番号５の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号５のＬＡＧ３ポリペプチドは、成熟ＬＡＧ３の未成熟形態又は処理前形態を表していてもよく、したがって、配列番号５のＬＡＧ３ポリペプチドの成熟部分又は処理部分が本明細書に含まれる。

【0057】

「ＰＤ－１」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチドは、以下のように、１つ以上の公的に利用可能なデータベースにおいて特定されるものである。ＨＧＮＣ：８７６０ ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：５１３３ Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１８８３８９ ＯＭＩＭ（登録商標）：６００２４４ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ１５１１６。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１ポリペプチドは、配列番号６の配列、又は配列番号６と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、若しくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、又は配列番号６の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号６のＰＤ－１ポリペプチドは、成熟ＰＤ－１の未成熟形態又は処理前形態を表していてもよく、したがって、配列番号６のＰＤ－１ポリペプチドの成熟部分又は処理部分が本明細書に含まれる。

【0058】

「ＣＴＬＡ－４」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＣＴＬＡ４遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４ポリペプチドは、以下のように、１つ以上の公的に利用可能なデータベースにおいて特定されるものである。ＨＧＮＣ：２５０５、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：１４９３、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６３５９９、ＯＭＩＭ（登録商標）：１２３８９０、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ１６４１０。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４ポリペプチドは、配列番号７の配列、又は配列番号７と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、若しくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、又は配列番号７の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号７のＣＴＬＡ－４ポリペプチドは、成熟ＣＴＬＡ－４の未成熟形態又は処理前形態を表していてもよく、したがって、配列番号７のＣＴＬＡ－４ポリペプチドの成熟部分又は処理部分が本明細書に含まれる。

【0059】

「ＴＩＭ－３」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＨＡＶＣＲ２遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ－３ポリペプチドは、以下のように、１つ以上の公的に利用可能なデータベースにおいて特定されるものである。ＨＧＮＣ：１８４３７、ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：８４８６８、Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３５０７７、ＯＭＩＭ（登録商標）：６０６６５２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ８ＴＤＱ０。いくつかの実施形態では、ＴＩＭ－３ポリペプチドは、配列番号８の配列、又は配列番号８と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、若しくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、又は配列番号８の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号８のＴＩＭ－３ポリペプチドは、成熟ＴＩＭ－３の未成熟形態又は処理前形態を表していてもよく、したがって、配列番号８のＴＩＭ－３ポリペプチドの成熟部分又は処理部分が本明細書に含まれる。

【0060】

「ＮＫＧ２Ａ」は、本明細書では、ヒトにおいて、ＫＬＲＣ１遺伝子によってコードされるポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ａポリペプチドは、以下のように、１つ以上の公的に利用可能なデータベースにおいて特定されるものである。ＨＧＮＣ：６３７４ ＮＣＢＩ Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ：３８２１ Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１３４５４５ ＯＭＩＭ（登録商標）：１６１５５５ ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ２６７１５。いくつかの実施形態では、ＮＫＧ２Ａポリペプチドは、配列番号９の配列、又は配列番号９と約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、若しくは約９８％以上の相同性を有するポリペプチド配列、又は配列番号９の一部を含むポリペプチドを含む。配列番号９のＮＫＧ２Ａポリペプチドは、成熟ＮＫＧ２Ａの未成熟形態又は処理前形態を表していてもよく、したがって、配列番号９のＮＫＧ２Ａポリペプチドの成熟部分又は処理部分が本明細書に含まれる。

【0061】

ポリペプチドの発現レベルを増加させる方法は、例えば、細胞に遺伝子を導入し、発現させることを含み、当該技術分野で既知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に移入され得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１２／０７９０００Ａ１を参照されたい。

【0062】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＮＫ細胞は、拡大されたＮＫ細胞又は拡大されていないＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞拡大組成物は、フィーダー細胞、操作されたＰＭ粒子、又はエクソソームを含む。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞又は操作された粒子は、その外面に結合されたＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞拡大組成物は、ＮＫ細胞エフェクター剤を更に含む。

【0063】

（Ｉ）膜結合Ｆｃを含む、操作されたフィーダー細胞、操作された形質膜粒子、及び操作されたエクソソーム
本開示による組成物には、Ｆｃが結合したフィーダー細胞（ＦＣ）を含む組成物、Ｆｃが結合した操作された形質膜（ＰＭ）粒子を含む組成物、及びＦｃが結合した操作されたエクソソームを含む組成物が含まれる。Ｆｃが結合した操作されたＰＭ粒子には、Ｆｃが結合したフィーダー細胞由来のＰＭナノ粒子が含まれる。Ｆｃが結合した操作されたエクソソームには、以下にも更に詳細に記載されるように、Ｆｃが結合したフィーダー細胞由来のエクソソーム又は他の細胞外小胞が含まれた。代替的には、エクソソームは、血小板及び巨核球などの他の供給源に由来し得る。

【0064】

本明細書で使用される場合、「Ｆｃが結合した」という用語は、膜貫通ペプチドを介してフィーダー細胞又は操作された粒子の外面への逆向き（すなわち、細胞内に面するアミノ末端）のＦｃドメインのカップリングを指すと理解される必要がある。これは、本明細書に開示されるＦｃ融合ペプチドを使用して達成され得る。したがって、本開示の一態様は、以下に更に詳細に記載されるように、少なくとも１つのＦｃが結合したフィーダー細胞、すなわち、フィーダー細胞の外面に結合されたＦｃドメインを含むフィーダー細胞を含むフィーダー細胞組成物を提供する。例えば、フィーダー細胞は、フィーダー細胞の外面に結合されたＦｃドメインを発現するように、すなわち、以下に更に記載されるように、Ｆｃ融合ペプチドを発現するように遺伝子改変され得る。本開示の別の態様は、少なくとも１つのＦｃが結合した操作された粒子、すなわち、フィーダー細胞の外面に逆向きで結合したＦｃドメインを含む操作された粒子を含む、フィーダー細胞を含まないＮＫ細胞拡大組成物を提供する。いくつかの態様では、フィーダー細胞は、ヒト化抗体でタグ化され得るリガンドを発現するように操作され得る。

【0065】

フィーダー細胞組成物では、少なくとも１つのＦｃが結合したフィーダー細胞は、任意選択的に、少なくとも１つの細胞ＮＫ細胞エフェクター剤を含む。一例では、Ｆｃが結合したフィーダー細胞は、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１である１つの細胞ＮＫ細胞エフェクターを含む。Ｆｃが結合したフィーダー細胞は、少なくとも２つ以上の異なるＮＫ細胞エフェクター剤を含み得る。

【0066】

フィーダー細胞を含まないＮＫ細胞拡大組成物では、Ｆｃが結合した操作されたＰＭ粒子は、任意選択的に、少なくとも１つの細胞ＮＫ細胞エフェクター剤を含む。一例では、Ｆｃが結合した操作された粒子は、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１である１つの細胞ＮＫ細胞エフェクターを含む。Ｆｃが結合した操作されたＰＭ粒子は、少なくとも２つ以上の異なるＮＫ細胞エフェクター剤を含み得る。

【0067】

少なくとも２つのＮＫ細胞エフェクター剤が存在するフィーダー細胞組成物、又はフィーダー細胞を含まない組成物のいずれかでは、第２のＮＫ細胞エフェクター剤は、例えば、４１ＢＢＬであり得る。フィーダー細胞又は操作されたＰＭ粒子が１つ以上のＮＫ細胞エフェクター剤を含む、フィーダー細胞組成物又はフィーダー細胞を含まないＮＫ細胞拡大組成物のいずれかでは、ＮＫ細胞エフェクター剤は、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＭＩＣＡ、ＵＢＬＰ、２Ｂ４、ＬＦＡ－１、Ｎｏｔｃｈリガンド、ＮＫｐ４６に対するリガンド、又はＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＴＬＲリガンド、及びＮＫＧ２Ｄリガンド、又はサイトカインから選択することができる。例示的なそのような組成物では、少なくとも１つの追加のＮＫ細胞エフェクター剤は、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞エフェクター剤は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から選択され得る。

【0068】

（ａ）Ｆｃが結合したフィーダー細胞
本開示は、上に詳細に記載したＦｃ融合ペプチドを含むフィーダー細胞を提供する。本明細書に開示される方法における使用のための、並びに本明細書に開示されるＰＭ粒子及びエクソソームの作製における使用のためのＮＫ細胞フィーダー細胞は、放射線照射された自己若しくは同種異系の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、又は放射線照射されていない自己若しくは同種異系のＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、７２１．２２１又はＫ５６２細胞、及びＥＢＶ－ＬＣＬ、他の非ＨＬＡ若しくは低ＨＬＡ発現細胞株、又は腫瘍ワクチンとして使用され得る患者由来原発腫瘍のいずれかであり得る。Ｆｃが結合したフィーダー細胞は、当該技術分野で周知の標準的な形質導入又はトランスフェクション技術を使用して、本明細書に記載の任意のＦｃ融合ペプチドでフィーダー細胞をトランスフェクション又は形質導入することによって調製され得る。例えば、本明細書に開示されるＦｃ融合ペプチドのｃＤＮＡベクターを、細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫、又は哺乳動物細胞内での発現を可能にする発現プラスミドにライゲーションすることができる。ｃＤＮＡベクターは、ＦＬＡＧタグ化又はＨＩＳタグ化され得る。好適なトランスフェクション方法としては、核融合（又はエレクトロポレーション）、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマートランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン又はポリエチレンイミン）、ウイルストランスフェクション、ビロソームトランスフェクション、ビリオントランスフェクション、リポソームトランスフェクション、カチオン性リポソームトランスフェクション、イムノリポソームトランスフェクション、非リポソーム脂質トランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、遺伝子銃送達、インパレフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、及び核酸の取り込みを増強した独自の薬剤が挙げられる。トランスフェクション方法は、当該技術分野で周知である（例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００３又は“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１を参照されたい）。代替的には、分子はマイクロインジェクションによって細胞に導入され得る。例えば、分子は、目的の細胞の細胞質又は核に注射され得る。細胞に導入される各分子の量は変化し得るが、当業者は、適切な量を決定するための手段に精通している。

【0069】

様々な分子を同時に又は連続して細胞に導入し得ることが理解されるであろう。例えば、Ｆｃ融合ペプチ及び１つ以上の膜結合ＮＫ細胞エフェクター剤を同時にフィーダー細胞に導入することができる。代替的には、１つは最初に導入され、次いで、他の分子は後で細胞に導入され得る。例えば、Ｆｃ融合ペプチドで一度トランスフェクション又は形質導入されたフィーダー細胞は、ＩＬ－１５及び／若しくはＩＬ－２１及び／若しくは４１ＢＢＬなどの膜結合ＮＫ細胞エフェクター剤で更にトランスフェクションされてもよく、かつ／又はＥＢＶ－ＬＣＬ及び／若しくは他のＮＫ細胞エフェクター剤として感染されてもよい。代替的には、フィーダー細胞は、Ｆｃ融合ペプチド並びにＩＬ－１５及び／又はＩＬ－２１及び／又は４１ＢＢＬなどの膜結合ＮＫ細胞エフェクター剤、及び／又はＥＢＶ－ＬＣＬ及び／又は他のＮＫ細胞エフェクター剤と同時にトランスフェクション又は形質導入されてもよい。代替的には、以前にトランスフェクション又は形質導入され、ＩＬ－１５及び／若しくはＩＬ－２１及び／若しくは４１ＢＢＬなどの膜結合ＮＫ細胞エフェクター剤を発現し、かつ／又はＥＢＶ－ＬＣＬ及び／若しくは他のＮＫ細胞エフェクター剤として感染された、フィーダー細胞は、Ｆｃ融合ペプチドでトランスフェクション又は形質導入されてもよい。また、当該技術分野で既知の化学コンジュゲーション法などの他の手段を使用して、膜結合Ｆｃを達成することができることも理解されるであろう。

【0070】

一般に、細胞は、細胞の成長及び／又は維持に適切な条件下で維持される。好適な細胞培養条件は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００８，１０５：５８０９－５８１４、Ｍｏｅｈｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００７，１０４：３０５５－３０６０、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３５：６４６－６５１、及びＬｏｍｂａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，２５：１２９８－１３０６に記載されている。当業者であれば、細胞の培養方法が当該技術分野で既知であり、細胞型に応じて変化し得、変化するであろうことを理解している。全ての場合において、日常的作業の最適化が使用され、特定の細胞型のための最良の技術を決定し得る。

【0071】

Ｆｃが結合したフィーダー細胞を、ＮＫ細胞を直接的に刺激するために細胞培養において使用することができるか、又はフィーダー細胞に由来するＰＭ粒子又はエクソソームを調製するために使用することができる。

【0072】

（ｂ）Ｆｃが結合したＰＭ粒子
Ｆｃが結合した操作されたＰＭ粒子には、周知の方法を使用してＦｃが結合したＮＫ細胞フィーダー細胞から調製し得る、Ｆｃが結合したＰＭ粒子が含まれる。ＰＭ粒子は、細胞の形質膜から作製された小胞であるか、又は人工的に作製された小胞（すなわち、リポソーム）である。ＰＭ粒子は、脂質二重層、又は単に単一の脂質層を含有し得る。ＰＭ粒子は、単層、多層、又は反転形態で調製され得る。ＰＭ粒子は、既知の形質膜調製プロトコル又は米国特許第９，６２３，０８２号（その全開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものなどのリポソームを調製するためのプロトコルを使用して、本明細書に記載されるＦｃが結合したフィーダー細胞から調製され得る。特定の態様では、本明細書に開示されるＰＭ粒子は、平均直径が約１７０～約３００ｎｍの範囲である。

【0073】

（ｃ）Ｆｃが結合したエクソソーム
本明細書に開示されるＦｃが結合したエクソソームは、周知の方法を使用してＦｃが結合したＮＫ細胞フィーダー細胞から調製され得るエクソソーム分泌細胞から調製することができ、エクソソームは、米国特許出願公開第２０１７／０３３３４７９号（その全開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、エクソソーム分泌細胞の細胞外産物である。エクソソームは、脂質及びタンパク質を含み、特定のエクソソームにおいて見出されるタンパク質の同一性は、それらを産生する細胞に依存する。本明細書に開示されるエクソソームは、本明細書に開示されるＦｃ融合ペプチド（すなわち、Ｆｃ結合している）、及び任意選択的に、エクソソーム膜に存在する１つ以上の刺激ペプチド（ＮＫ細胞エフェクター剤）を含む。エクソソームは、例えば、エクソソームの改善された形成又は放出のために操作された細胞株から産生され得る。そのような細胞株には、セクションＩ（ａ）に上述したＦｃが結合した細胞株が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な細胞株は、Ｆｃが結合したＫ５６２－ｍｂ１５－４１ＢＢＬ及びＦｃが結合したＫ５６２である。特定の態様では、本明細書に開示されるエクソソームは、平均直径が約３０～約１００ｎｍ又は約１６０ｎｍの範囲である。一態様では、エクソソームは、約６０～８０ｎｍの直径の平均をとる。ＰＭ粒子で容易に達成されるよりも小さい粒径を達成するエクソソームを有する能力は、エクソソームが、より小さいサイズが好ましい使用により容易に適応され得ることを意味する。例えば、エクソソームは、生理学的障壁を介した拡散、組織区画を介した生体内分布の増強、又は静脈内注射を必要とする用途において好ましい場合がある。

【0074】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＮＫ細胞拡大組成物は、サイトカイン、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＮＡＭ、アスコルベート、又はそれらの任意の組み合わせなどの少なくとも１つの可溶性培地成分を含む細胞培地溶液と組み合わせられる。

【0075】

いくつかの例では、本明細書で使用されるＮＫ細胞拡大組成物及び本明細書に記載されるＮＫ細胞拡大のための方法は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０２０／０２３７８２２号に記載されるものである。

【0076】

組成物及び方法
また、対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に記載の操作されたＮＫ細胞を投与することを含み、操作されたＮＫ細胞が、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の発現において抑制される、方法が本明細書に開示される。同様に、本開示は、対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する際に使用するための本明細書に開示される治療有効量の操作されたＮＫ細胞であって、操作されたＮＫ細胞が、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）の発現において抑制される、操作されたＮＫ細胞を提供する。

【0077】

また、対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法であって、対象に、治療有効量のＮＫ細胞及び治療有効量のＩｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）阻害剤を投与することを含む、方法が本明細書に開示される。同様に、本開示は、対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する際に使用するための治療有効量のＮＫ細胞及び治療有効量のＴＩＧＩＴ阻害剤を提供する。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、初代ＮＫ細胞又はＮＫ細胞株である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、拡大されたＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、拡大されたＮＫ細胞は、インビトロ又はインビボで、本明細書に開示されるＮＫ細胞拡大組成物に曝露される（例えば、フィーダー細胞、操作されたＰＭ粒子、又はエクソソーム）。いくつかの実施形態では、フィーダー細胞又は操作された粒子は、その外面に結合されたＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞拡大組成物は、ＮＫ細胞エフェクター剤を更に含む。ＮＫ細胞エフェクター剤は、４１ＢＢＬ、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１、ＭＩＣＡ、ＵＢＬＰ、２Ｂ４、ＬＦＡ－１、Ｎｏｔｃｈリガンド、ＮＫｐ４６に対するリガンド、又はＢＣＭ１／ＳＬＡＭＦ２、ＴＬＲリガンド、及びＮＫＧ２Ｄリガンド、及びサイトカインから選択することができる。例示的なそのような組成物では、少なくとも１つのＮＫ細胞エフェクター剤は、ＩＬ－１５又はＩＬ－２１である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞エフェクター剤は、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１８から選択され得る。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞エフェクター剤は、ＩＬ－２１及び／又は４１ＢＢＬを含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象に治療有効量のＴＩＧＩＴ阻害剤を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ阻害剤は、抗ＴＩＧＩＴ抗体（例えば、チラゴルマブ、ビボストリマブ、ドムバナリマブ、ＢＭＳ－９８６２０７、エチギリマブ、ＥＯＳ－４４８、ＣＯＭ９０２、ＡＳＰ８３７４、ＳＥＡ－ＴＧＴ、ＢＧＢ－Ａ１２１７、ＩＢＩ－９３９、又はＭ６２２３）である。

【0079】

多くの抗ＴＩＧＩＴ療法（例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体）が開発中であることを理解すべきである。ＴＩＧＩＴを標的とするＦｃコンピテントな治療抗体は、ＴＩＧＩＴを発現するＮＫ細胞においてＮＫ細胞フラトリサイドを誘導することができる。ＴＩＧＩＴノックアウトＮＫ細胞は、フラトリサイドを防止し、ＮＫ細胞数を回復させることができる。これは、例えば図９に示される概略図によって示される。

【0080】

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、対象に治療有効量のＴＩＧＩＴ阻害剤を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ阻害剤は、抗ＴＩＧＩＴ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６）に結合する断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）を含む。そのようなＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合は、免疫系のエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）の引き金となり得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ領域を欠いているか、又は参照対照と比べてＦｃ受容体（例えば、ＣＤ１６）に対する親和性が低下したＦｃ領域を含む。いくつかの例では、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｆｃ受容体へのＦｃ領域の結合親和性を低下させるＦｃ領域上の１つ以上の変異を含む。

【0081】

「抗体」という用語は、本明細書において広い意味で使用され、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を両方とも含む。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、これらの免疫グロブリン分子の断片又はポリマー、及び免疫グロブリン分子のヒト若しくはヒト化態様、又はそれらの断片も、ＴＩＧＩＴがその受容体との相互作用から阻害されるようにＴＩＧＩＴと相互作用する能力について選択される限り、これらも「抗体」という用語に含まれる。抗体は、本明細書に記載のインビトロアッセイを使用して、又は類似の方法によって、それらの所望な活性について試験することができ、その後に、それらのインビボ治療活性及び／又は予防活性を、既知の臨床試験方法に従って試験する。ヒト免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主要なクラスが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、及びＩｇＧ－４；ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２へと更に分割され得る。当業者は、マウスについての匹敵するクラスを認識するだろう。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる。

【0082】

本明細書で使用される場合、「抗体又はその断片」という用語は、キメラ抗体及びハイブリッド抗体を包含し、二重又は複数抗原又はエピトープ特異性を有し、断片、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ナノボディなどを含み、ハイブリッド断片を含む。したがって、それらの特異的抗原に結合する能力を保持する抗体の断片が提供される。例えば、ＴＩＧＩＴ結合活性を維持する抗体の断片は、「抗体又はその断片」という用語の意味に含まれる。そのような抗体及び断片は、当該技術で既知の技術によって作製することができ、実施例に、また、抗体を産生し、特異性及び活性について抗体をスクリーニングするための一般的な方法に記載される方法に従って、特異性及び活性についてスクリーニングすることができる（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照されたい）。

【0083】

抗体断片及び抗原結合タンパク質（単鎖抗体）のコンジュゲートも、「抗体又はその断片」の意味に含まれる。

【0084】

「断片」は、他の配列に結合しているか否かにかかわらず、特定の領域又は特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、又は他の選択された改変を含み得るが、但し、抗体又は抗体断片の活性は、改変されていない抗体又は抗体断片と比較して著しく変化又は障害されない。これらの改変は、ジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去又は付加すること、その生物学的寿命を延ばすこと、その分泌特性を変化させることなどのいくつかの追加の特性を提供することができる。いずれにしても、抗体又は抗体断片は、その同種抗原に対する特異的結合などの生物活性特性を有していなければならない。抗体又は抗体断片の機能的領域又は活性領域は、タンパク質の特異的領域の変異誘発、その後の発現されたポリペプチドの発現及び試験によって特定され得る。そのような方法は、当業者に容易に明らかであり、抗体又は抗体断片をコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８－３５４，１９９２。）

【0085】

本明細書で使用される場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、ヒト抗体及び／又はヒト化抗体も指すことができる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラット、又はウサギに由来するもの）は、ヒトにおいて通常は抗原性であり、したがって、ヒトに投与される場合、望ましくない免疫応答を生じさせる場合がある。したがって、本法におけるヒト又はヒト化抗体の使用は、ヒトに投与される抗体が望ましくない免疫応答を誘発する機会を少なくするのに役立つ。当業者によって理解されるように、「抗体」という用語に包含される免疫学的結合試薬は、全抗体、二量体、三量体及び多量体抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、組換え及び操作された抗体、及びそれらの断片を含む、全ての抗体及びその抗原結合断片を含むか、又はそれらにまで拡張される。したがって、「抗体」という用語は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用され、この用語は、例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｔ及びＡｂ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、Ｆｄ、直鎖抗体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体断片、ビボディ、トリボディ（ｓｃＦｖ－Ｆａｂ融合物、それぞれ二重特異性又は三重特異性）；ｓｃ－ダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ－ＣＬ融合物）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ）、Ｔ細胞を誘引するためのｓｃＦｖ－ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ－Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性方式）；ＳＩＰ（小さな免疫タンパク質、ある種のミニボディ）；ＳＭＩＰ（「小さなモジュラー免疫医薬」ｓｃＦｖ－Ｆｃ二量体；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「デュアルアフィニティリターゲティング（Ｄｕａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ）」）；小さな抗体模倣物などの抗原結合ドメインを含む抗体断片を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、本方法は、対象に治療有効量のチェックポイント遮断薬を投与することを更に含む。チェックポイント阻害剤としては、限定されないが、ＰＤ－１を遮断する抗体（ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８又はＭＤＸ１１０６）、ＣＴ－０１１、ＭＫ－３４７５）、ＰＤ－Ｌ１（ＭＤＸ－１１０５（ＢＭＳ－９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＰＤ－Ｌ２（ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６））、ＩＤＯ、Ｂ７－Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３（ＢＭＳ－９８６０１６）が挙げられる。いくつかの実施形態では、チェックポイント遮断薬は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、又はＣＴＬＡ－４阻害剤を含む。

【0087】

がんは、血液がん、リンパ腫、結腸直腸がん、結腸がん、肺がん、頭頸部がん、卵巣がん、前立腺がん、精巣がん、腎臓がん、皮膚がん、子宮頸がん、膵臓がん、及び乳がんから選択され得るが、これらに限定されない。一態様では、がんが、固形腫瘍を含む。別の態様では、がんが、急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、骨髄線維症、多発性骨髄腫から選択される。別の態様では、がんは、白血病、リンパ腫、肉腫、がん腫から選択され、骨髄、脳、肺、乳房、膵臓、肝臓、頭頸部、皮膚、生殖管、前立腺、結腸、肝臓、腎臓、腹膜内、骨、関節、及び眼に由来し得る。

【0088】

がんの転移及び／又は再発を阻害し、低下させる、及び／又は予防する本開示の方法が、当該技術分野で既知の任意の抗がん剤の投与を含み得ることが本明細書で意図され、任意の抗がん剤としては、限定されないが、アベマシクリブ、アビラテロン酢酸エステル、アビトレキサート（Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ）（メトトレキサート）、アブラキサン（パクリタキセルアルブミン－安定化されたナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ－ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ－Ｔ、アドセトリス（ブレンツキシマブベドチン）、ＡＤＥ、Ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン塩酸塩）、アファチニブ二マレイン酸塩、アフィニトール（エベロリムス）、アキンゼオ（ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩）、アルダラ（イミキモド）、アルデスロイキン、アレセンサ（アレクチニブ）、アレクチニブ、アレムツズマブ、アリムタ（ペメトレキセド二ナトリウム）、アリコパ（コパンリシブ塩酸塩）、注射用アルケラン（メルファラン塩酸塩）、アルケラン錠剤（メルファラン）、アロキシ（パロノセトロン塩酸塩）、アルンブリグ（ブリガチニブ）、アムボクロリン（Ａｍｂｏｃｈｌｏｒｉｎ）（クロラムブシル）、アムボクロリンクロラムブシル）、アミフォスチン、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、アレジア（パミドロン酸二ナトリウム）、アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、アラノン（ネララビン）、三酸化ヒ素、アーゼラ（オファツムマブ）、アスパラギナーゼＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、アテゾリズマブ、アバスチン（ベバシズマブ）、アベルマブ、アキシチニブ、アザシチジン、バベンチオ（アベルマブ）、ＢＥＡＣＯＰＰ、ベセナム（Ｂｅｃｅｎｕｍ）（カルムスチン）、ベレオダック（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベスポンサ（イノツズマブオゾガマイシン）、ベバシズマブ、ベキサロテン、ベクザー（トシツモマブ及びヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ビーリンサイト（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、ボシュリフ（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリガチニブ、ＢｕＭｅｌ、ブスルファン、ブスルフェクス（ブスルファン）、カバジタキセル、カボメティクス（カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩）、カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩、ＣＡＦ、キャンパス（アレムツズマブ）、カンプトサール、（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、カラク（Ｃａｒａｃ）（フルオロウラシル－－局所）、カルボプラチン、カルボプラチン－タキソール、カルフィルゾミブ、カルムブリス（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチンインプラント、カソデックス（ビカルタミド）、ＣＥＭ、セリチニブ、セルビジン（ダウノルビシン塩酸塩）、サーバリックス（組換えＨＰＶ二価ワクチン）、セツキシマブ、ＣＥＶ、クロラムブシル、クロラムブシル－プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラドリビン、クラフェン（シクロホスファミド）、クロファラビン、クロファレックス（Ｃｌｏｆａｒｅｘ）（クロファラビン）、クロラール（クロファラビン）、ＣＭＦ、コビメチニブ、コメトリック（Ｃｏｍｅｔｒｉｑ）（カボザンチニブ－Ｓ－リンゴ酸塩）、コパンリシブ塩酸塩、ＣＯＰＤＡＣ、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ－ＡＢＶ、コスメゲン（ダクチノマイシン）、コテリック（コビメチニブ）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、サイフォス（Ｃｙｆｏｓ）（イホスファミド）、サイラムザ（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビンリポソーム、シトザール（Ｃｙｔｏｓａｒ）－Ｕ（シタラビン）、シトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ）（シクロホスファミド）、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダコゲン（Ｄａｃｏｇｅｎ）（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、ダラザレックス（ダラツムマブ）、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム、デシタビン、デフィブロチドナトリウム、デファイテリオ（デフィブロチドナトリウム）、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デポサイト（ＤｅｐｏＣｙｔ）（シタラビンリポソーム）、デキサメタゾン、デキスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキシル（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ－ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ＤＴＩＣ－Ｄｏｍｅ（ダカルバジン）、デュルバルマブ、エフデックス（フルオロウラシル－－局所）、エリテック（ラスブリカーゼ）、エレンス（Ｅｌｌｅｎｃｅ）（エピルビシン塩酸塩）、エロツズマブ、エロキサチン（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、エメンド（Ｅｍｅｎｄ）（アプレピタント）、エムプリシティ（エロツズマブ）、エナシデニブメシル酸塩、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、アービタックス（セツキシマブ）、エリブリンメシル酸塩、エリベッジ（Ｅｒｉｖｅｄｇｅ）（ビスモデギブ）、エルロチニブ塩酸塩、エルウィナーゼ（Ｅｒｗｉｎａｚｅ）（アスパラギナーゼＥｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、エチオール（Ｅｔｈｙｏｌ）（アミフォスチン）、エトポホス（エトポシドリン酸塩）、エトポシド、エトポシドリン酸塩、エヴァセット（Ｅｖａｃｅｔ）（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エベロリムス、エビスタ、（ラロキシフェン塩酸塩）、エボメラ（Ｅｖｏｍｅｌａ）（メルファラン塩酸塩）、エキセメスタン、５－ＦＵ（フルオロウラシル注射）、５－ＦＵ（フルオロウラシル－－局所）、フェアストン（トレミフェン）、ファリーダック（パノビノスタット）、フェソロデックス（フルベストラント）、ＦＥＣ、フェマーラ（レトロゾール）、フィルグラスチム、フルダラ（フルダラビンリン酸塩）、フルダラビンリン酸塩、フルオロプレックス（フルオロウラシル－－局所）、フルオロウラシル注射、フルオロウラシル－－局所、フルタミド、フォレックス（Ｆｏｌｅｘ）（メトトレキサート）、フォレックスＰＦＳ（メトトレキサート）、フォルフィリ、フォルフィリ－ベバシズマブ、フォルフィリ－セツキシマブ、フォルフィリノックス、フォルフォックス、フォロチン（プララトレキサート）、ＦＵ－ＬＶ、フルベストラント、ガーダシル（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、ガーダシル９（組換えＨＰＶ九価ワクチン）、ガザイバ（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン－シスプラチン、ゲムシタビン－オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ジェムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、ジオトリフ（アファチニブ二マレイン酸塩）、グリーベック（イマチニブメシル酸塩）、ギリアデル（カルムスチンインプラント）、グリアデルウェファー（カルムスチンインプラント）、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、ハラヴェン（エリブリンメシル酸塩）、ヘマンジオル（プロプラノロール塩酸塩）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ＨＰＶ二価ワクチン，組換え体、ＨＰＶ九価ワクチン，組換え体、ＨＰＶ四価ワクチン，組換え体、ハイカムチン（トポテカン塩酸塩）、ハイドレア（ヒドロキシ尿素）、ヒドロキシ尿素、Ｈｙｐｅｒ－ＣＶＡＤ、イブランス（パルボシクリブ）、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ＩＣＥ、アイクルシグ（ポナチニブ塩酸塩）、イダマイシン（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、イドヒファ（Ｉｄｈｉｆａ）（エナシデニブメシル酸塩）、イフェックス（Ｉｆｅｘ）（イホスファミド）、イホスファミド、イフォスファミダム（Ｉｆｏｓｆａｍｉｄｕｍ）（イホスファミド）、ＩＬ－２（アルデスロイキン）、イマチニブメシル酸塩、イムブルビカ（イブルチニブ）、イミフィンジ（デュルバルマブ）、イミキモド、イムリジック（Ｉｍｌｙｇｉｃ）（タリモジェンラヘルパレプベク）、インライタ（アキシチニブ）、イノツズマブオゾガマイシン、インターフェロンアルファ－２ｂ，組換え体、インターロイキン－２（アルデスロイキン）、イントロンＡ（組換えインターフェロンアルファ－２ｂ）、ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ及びトシツモマブ、イピリムマブ、イレッサ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩リポソーム、イストダックス（ロミデプシン）、イキサベピロン、イキサゾミブクエン酸エステル、イクセムプラ（Ｉｘｅｍｐｒａ）（イキサベピロン）、ジャカフィ（Ｊａｋａｆｉ）（ルキソリチニブリン酸塩）、ＪＥＢ、ジェブタナ（カバジタキセル）、カドサイラ（Ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン）、ケオキシフェン（ラロキシフェン塩酸塩）、ケピバンス（パリフェルミン）、キイトルーダ（ペムブロリズマブ）、キスカリ（Ｋｉｓｑａｌｉ）（リボシクリブ）、キムリア（チサゲンレクルユーセル）、カイプロリス（カルフィルゾミブ）、ランレオチド酢酸塩、ラパチニブ二トシル酸塩、ラルツルボ（Ｌａｒｔｒｕｖｏ）（オララツマブ）、レナリドミド、レンバチニブメシル酸塩、レンビマ（レンバチニブメシル酸塩）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、リューケラン（クロラムブシル）、ロイプロリド酢酸塩、ロイスタチン（クラドリビン）、レブラン（アミノレブリン酸）、リンフォリジン（Ｌｉｎｆｏｌｉｚｉｎ）（クロラムブシル）、ＬｉｐｏＤｏｘ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ロムスチン、ロンサーフ（トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩）、ルプロン（Ｌｕｐｒｏｎ）（ロイプロリド酢酸塩）、ルプロンデポー（ロイプロリド酢酸塩）、ルプロンデポー－Ｐｅｄ（ロイプロリド酢酸塩）、リンパルザ（Ｌｙｎｐａｒｚａ）（オラパリブ）、マルキボ（Ｍａｒｑｉｂｏ）（ビンクリスチン硫酸塩リポソーム）、マツラン（Ｍａｔｕｌａｎｅ）（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、酢酸メゲストロール、メキニスト（トラメチニブ）、メルファラン、メルファラン塩酸塩、メルカプトプリン、メスナ、メスネックス（メスナ）、メタゾラストン（テモゾロミド）、メトトレキサート、メトトレキサートＬＰＦ（メトトレキサート）、メチルナルトレキソンブロミド、メキセート（Ｍｅｘａｔｅ）（メトトレキサート）、メキセート－ＡＱ（メトトレキサート）、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン塩酸塩、ミトジトレックス（Ｍｉｔｏｚｙｔｒｅｘ）（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（プレリキサフォル）、ムスタルゲン（メクロレタミン塩酸塩）、ムタマイシン（マイトマイシンＣ）、マイレラン（ブスルファン）、マイロサール（Ｍｙｌｏｓａｒ）（アザシチジン）、マイロターグ（ゲムツズマブオゾガマイシン）、ナノ粒子パクリタキセル（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ナベルビン（ビノレルビン酒石酸塩）、ネシツムマブ、ネララビン、ネオサール（シクロホスファミド）、ネラチニブマレイン酸塩、ネルリンクス（ネラチニブマレイン酸塩）、ネツピタント及びパロノセトロン塩酸塩、ニューラスタ（ペグフィルグラスチム）、ニューポジェン（フィルグラスチム）、ネクサバール（ソラフェニブトシル酸塩）、ニランドロン（ニルタミド）、ニロチニブ、ニルタミド、ニンラーロ（イキサゾミブクエン酸エステル）、ニラパリブトシル酸塩一水和物、ニボルマブ、ノルバデックス（タモキシフェンクエン酸塩）、ヌプレート（Ｎｐｌａｔｅ）（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、オドムゾ（ソニデジブ）、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシンメペスクシナート、オンキャスパー（ペグアスパルガーゼ）、オンダンセトロン塩酸塩、オニバイド（イリノテカン塩酸塩リポソーム）、オンタック（デニロイキンジフチトクス）、オプジーボ（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、オシメルチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パロノセトロン塩酸塩及びネツピタント、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、パラプラット（Ｐａｒａｐｌａｔ）（カルボプラ
チン）、パラプラチン（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ＰＣＶ、ＰＥＢ、ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンアルファ－２ｂ、ＰＥＧ－イントロン（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、パージェタ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、プラチノール（シスプラチン）、プラチノール－ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサフォル、ポマリドミド、ポマリスト（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、ポートラーザ（ネシツムマブ）、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、プロロイキン（アルデスロイキン）、プラリア（デノスマブ）、プロマクタ（エルトロンボパグオラミン）、プロプラノロール塩酸塩、プロベンジ（シプリューセル－Ｔ）、プリネトール（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ）（メルカプトプリン）、プリキサン（メルカプトプリン）、二塩化ラジウム２２３、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ－ＣＨＯＰ、Ｒ－ＣＶＰ、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）二価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンアルファ－２ｂ、レゴラフェニブ、レリストール（メチルナルトレキソンブロミド）、Ｒ－ＥＰＯＣＨ、レブリミド（Ｒｅｖｌｉｍｉｄ）（レナリドミド）、リウマトレックス（メトトレキサート）、リボシクリブ、Ｒ－ＩＣＥ、リツキサン（リツキシマブ）、リツキサンＨｙｃｅｌａ（リツキシマブ及びヒアルロニダーゼヒト）、リツキシマブ、リツキシマブ及びヒアルロニダーゼヒト、ロラピタント塩酸塩、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、ルブラカ（ルカパリブカンシル酸塩）、ルカパリブカンシル酸塩、ルキソリチニブリン酸塩、リダプト（Ｒｙｄａｐｔ）（ミドスタウリン）、スクレロゾール胸膜内エアロゾル（タルク）、シルツキシマブ、シプリューセル－Ｔ、ソマチュリンデポー（ランレオチド酢酸塩）、ソニデジブ、ソラフェニブトシル酸塩、スプリセル（ダサチニブ）、ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｖ、滅菌タルク粉末（タルク）、ステリタルク（タルク）、スチバーガ（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、スーテント（スニチニブリンゴ酸塩）、シラトロン（Ｓｙｌａｔｒｏｎ）（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、シルバント（シルツキシマブ）、シンリボ（オマセタキシンメペスクシナート）、タブロイド（チオグアニン）、ＴＡＣ、タフィンラー（ダブラフェニブ）、タグリッソ（オシメルチニブ）、タルク、タリモジェンラヘルパレプベク、タモキシフェンクエン酸塩、タラビンＰＦＳ（シタラビン）、タルセバ（エルロチニブ塩酸塩）、タルグレチン（ベキサロテン）、タシグナ（ニロチニブ）、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、テセントリク、（アテゾリズマブ）、テモダール（テモゾロミド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、チオグアニン、チオテパ、チサゲンレクルユーセル、トラク（Ｔｏｌａｋ）（フルオロウラシル－－局所）、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、トーリセル（テムシロリムス）、トシツモマブ及びヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ、トテクト（Ｔｏｔｅｃｔ）（デキスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレアンダ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリフルリジン及びチピラシル塩酸塩、トリセノックス（三酸化ヒ素）、タイケルブ（ラパチニブ二トシル酸塩）、ユニツキシン（ジヌツキシマブ）、ウリジントリアセテート、ＶＡＣ、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、バルビ（Ｖａｒｕｂｉ）（ロラピタント塩酸塩）、ベクティビックス（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、ベルバン（Ｖｅｌｂａｎ）（ビンブラスチン硫酸塩）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ベルサール（Ｖｅｌｓａｒ）（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、ベネクレクスタ（ベネトクラクス）、ベネトクラクス、ベージニオ（アベマシクリブ）、ビアデュル（Ｖｉａｄｕｒ）（ロイプロリド酢酸塩）、ビダーザ（アザシチジン）、ビンブラスチン硫酸塩、ビンカサール（Ｖｉｎｃａｓａｒ）ＰＦＳ（ビンクリスチン硫酸塩）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＩＰ、ビスモデギブ、ビストガード（Ｖｉｓｔｏｇａｒｄ）（ウリジントリアセテート）、ボラキサーゼ（Ｖｏｒａｘａｚｅ）（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ヴォトリエント（パゾパニブ塩酸塩）、ヴィキセオス（ダウノルビシン塩酸塩及びシタラビンリポソーム）、ウェルコボリン（Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ）（ロイコボリンカルシウム）、ザーコリ（クリゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、ザイゲバ（デノスマブ）、ゾーフィゴ（二塩化ラジウム２２３）、イクスタンジ（エンザルタミド）、ヤーボイ（イピリムマブ）、ヨンデリス（トラベクテジン）、ザルトラップ（Ｚｉｖ－アフリベルセプト）、ザルキシオ（Ｚａｒｘｉｏ）（フィルグラスチム）、ゼジューラ（ニラパリブトシル酸塩一水和物）、ゼルボラフ（ベムラフェニブ）、ゼヴァリン（イブリツモマブチウキセタン）、ジンカード（デキスラゾキサン塩酸塩）、Ｚｉｖ－アフリベルセプト、ゾフラン（オンダンセトロン塩酸塩）、ゾラデックス（ゴセレリン酢酸塩）、ゾレドロン酸、ゾリンザ（ボリノスタット）、ゾメタ（ゾレドロン酸）、ザイデリグ（イデラリシブ）、ジカディア（セリチニブ）、及び／又はザイティガ（アビラテロン酢酸エステル）が挙げられる。本明細書ではまた、ＰＤ１／ＰＤＬ１遮断阻害剤（例えば、ランブロリズマブ（ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ（ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ＢＭＳ－９３６５５９、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、又はアベルマブなど）である化学療法剤も企図される。がんの転移及び／又は再発を阻害し、低下させ、及び／又は予防するための開示された組成物及び／又は操作されたＮＫ細胞集団の開示された使用が、上に列挙されたこれらの薬剤に限定されないが、それらを含む当該技術分野で既知の任意の抗がん剤の使用を組み合わせて使用することを含み得ることも、本明細書で意図される。

【0089】

いくつかの態様では、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞及びその細胞全ての使用は、ウイルス感染によって引き起こされる感染性疾患を治療するためのものであり、ウイルス感染は、単純ヘルペスウイルス－１、単純ヘルペスウイルス－２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン－バールウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス－６、天然痘ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、麻疹ウイルス、ポリオーマウイルス、ヒトパピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、デングウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、レオウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー熱ウイルス、ウエストナイルウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、シンドビスウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型、ハンタウイルス、風疹ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、又はヒト免疫不全ウイルス２型の感染を含む。

【0090】

代替的には、治療方法又は治療のための使用のうちのいずれかでは、追加の治療剤は、５－置換２－デオキシウリジン類似体、ヌクレオシド類似体、（非ヌクレオシド）ピロホスフェート類似体、ヌクレオシド逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）、及びインテグラーゼ阻害剤、エントリー阻害剤、及び非環状グアノシン類似体、非環状ヌクレオシドホスホネート（ＡＮＰ）類似体、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＮＳ５Ａ及びＮＳ５Ｂ阻害剤、及びインフルエンザウイルス阻害剤、免疫刺激薬、インターフェロン、オリゴヌクレオチド、並びに抗有糸分裂阻害剤から選択されるがこれらに限定されない、抗ウイルス剤であり得る。抗ウイルス剤の非限定的な例としては、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ペンシクロビル、ガンシクロビル、リトナビル、ロピナビル、サキナビルなど、シメチジン、ラニチジン、カプトプリル、メトホルミン、ブプロピオン、フェキソフェナジン、オクスカルバゼピン、レベテラセタム、トラマドール、又はそれらの異性体互変異性体、類似体、多形体、溶媒和物、誘導体、若しくは薬学的に許容される塩のうちのいずれかである。

【0091】

いくつかの態様では、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞及びその細胞全ての使用は、細菌感染によって引き起こされる感染性疾患を治療するためのものであり、細菌感染は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ株ＢＣＧ、ＢＣＧ亜株、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ亜種のパラ結核、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、他のＮｏｃａｒｄｉａ種、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、他のＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ種、Ａｃｅｔｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ、他のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ、他のＳｈｉｇｅｌｌａ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、他のＰａｓｔｅｕｒｅｌｌａ種、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ、他のＢｒｕｃｅｌｌａ種、Ｃｏｗｄｒｉａ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｖｉｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｔｒｅｍａｔｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｈｉｎｚｉｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｔｅｒｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｎｓｏｒｐｉｉ、他のＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ種、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｕｅｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａｎ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ種、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、他のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、他のＨｅｍｏｐｈｉｌｕｓ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、他のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｌｉｔｉｃａ、及び他のＹｅｒｓｉｎｉａ種、並びにＭｙｃｏｐｌａｓｍａ種の感染を含む。

【0092】

いくつかの態様では、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞及びその細胞全ての使用は、真菌感染によって引き起こされる感染性疾患を治療するためのものであり、真菌感染は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍｉｔｉｄｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｉ、又はＡｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔｅの感染を含む。

【0093】

いくつかの態様では、本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞及びその細胞全ての使用は、寄生虫感染によって引き起こされる感染性疾患を治療するためのものであり、寄生虫感染は、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ、Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｅｂｅｒｉ、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｇｒｅｇｏｒｉｉ、Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ、Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ、他のＬｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｌａｔｕｍ、Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｎａｎａ、Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｇｅｌｉ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｏｌｉｇａｒｔｈｒｕｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｌａｔｕｍ、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ；Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ、Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ、Ｄｉｃｒｏｃｏｅｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｕｍ、Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ ｂｕｓｋｉ、Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋｏｇａｗａｉ、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｆｅｌｉｎｅｕｓ、Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ種、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ、他のＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種、Ｔｒｉｃｈｏｂｉｌｈａｒｚｉａ ｒｅｇｅｎｔｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｂｒｉｔｏｖｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｎｅｌｓｏｎｉ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｎａｔｉｖａ、又はＥｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａの感染を含む。

【0094】

代替的には、方法又は使用のうちのいずれかにおいて、追加の治療剤は、ペニシリン、テトラサイクリン、セファロスポリン、リンコマイシン、マクロライド、スルホンアミド、グリコペプチド、アミノグリコシド、及びカルバペネムから選択されるがこれらに限定されない、抗生物質剤であり得る。抗ウイルス剤の非限定的な例としては、アモキシシリン、ドキシサイクリン、セファレキシン、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、メトロニダゾール、アジスロマイシン、スルファメトキサゾール及びトリメトプリム、クラブラナート（ｃｌａｖｕｌａｎａｔｅ）、及びレボフロキサシンである。

【0095】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＮＫ細胞を再活性化し、ＮＫ細胞の疲弊を逆行させ、かつ／又はＮＫ細胞機能を増強するための方法、並びに／あるいは本明細書に開示されるがん、転移、及び／又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法のうちのいずれかで投与されるか、又は使用される操作されたＮＫ細胞は、薬学的に許容される担体及び薬学的に許容される賦形剤において製剤化される。

【0096】

がん、転移性状態、又は感染症のタイミングは、多くの場合予測できないため、がん、転移性状態、又は感染症の治療、予防、低減、及び／又は阻害の開示された方法、又はがん、転移性状態、又は感染症のそのような治療、予防、低減、及び／又は阻害のための開示された組成物又は組み合わせのうちのいずれかの使用は、筋肉疾患を治療、予防、阻害、及び／又は低減するために、がん、転移性状態、又は感染症の発症の前又は後に実施され得ることが理解される必要がある。

【0097】

ＮＫ細胞の疲弊は、がん又は特定の感染性疾患を有する対象において観察される。本明細書に開示される操作されたＮＫ細胞は、増強された機能（例えば、増強された細胞傷害性機能並びに／又はＩＦＮγ、ＴＮＦα、及び／若しくはＣＤ１０７ａの増加した発現を含む）を示す。したがって、ＮＫ細胞を再活性化し、ＮＫ細胞の疲弊を逆行させ、かつ／又はＮＫ細胞機能を増強するための方法であって、当該方法が、ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴの発現を抑制すること、又はＮＫ細胞をＴＩＧＩＴ阻害剤とともにインキュベートすることを含む、方法が本明細書に開示される。開示される方法は、より高い細胞毒性及び／又はＡＤＣＣ機能性を細胞に提供するという付加的な利点を有する。いくつかの例では、操作されたＮＫ細胞は、ＴＩＧＩＴの発現を抑制するようにマニピュレーションされていないＮＫ細胞の細胞傷害性若しくはサイトカインの発現の約２倍、細胞傷害性若しくはサイトカインの発現の少なくとも約５倍、又は細胞傷害性若しくはサイトカインの発現の少なくとも約１０倍を示す。いくつかの実施形態では、マニピュレーションされていないＮＫ細胞は、疲弊したＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、疲弊したＮＫ細胞は、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、及びＴＩＭ３のうちの１つ以上のレベルが増加している。いくつかの実施形態では、疲弊したＮＫ細胞は、Ｋｉ６７、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及び／又はＣＤ１０７ａのレベルが減少している。いくつかの実施形態では、マニピュレーションされていないＮＫ細胞は、対象（例えば、健康な人又はがん患者）に由来する初代ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、拡大されたＮＫ細胞又は拡大されていないＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、拡大されたＮＫ細胞は、インビトロ／インビボでＮＫ細胞拡大組成物に曝露される（例えば、本明細書に開示されるフィーダー細胞、操作されたＰＭ粒子、又はエクソソーム）。マニピュレーションされたＮＫ細胞は、がん又は特定の感染性疾患を有する対象に投与され得る。

【0098】

いくつかの態様では、対象におけるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法であって、１）ＮＫ細胞を得ることと、２）ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴの発現を抑制するか、又はＮＫ細胞とＴＩＧＩＴ阻害剤とを接触させることによって、インビトロ又はエクスビボでＮＫ細胞を再活性化し、ＮＫ細胞の疲弊を逆行させ、かつ／又はＮＫ細胞機能を増強することと、３）治療有効量のＮＫ細胞を対象に投与することと、を含む、方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、工程ａ）のＮＫ細胞は、疲弊したＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、疲弊したＮＫ細胞は、ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、及びＴＩＭ３のうちの１つ以上のレベルが増加している。いくつかの実施形態では、疲弊したＮＫ細胞は、Ｋｉ６７、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及び／又はＣＤ１０７ａのレベルが減少している。いくつかの実施形態では、工程ａ）のＮＫ細胞は、対象（例えば、健康な人又はがん患者）に由来する初代ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＮＫ細胞を再活性化し、ＮＫ細胞の疲弊を逆行させ、かつ／又はＮＫ細胞機能を増強するための方法、並びに／あるいは本明細書に開示されるがん、転移、又は感染性疾患を治療する、減少させる、阻害する、低下させる、改善する、及び／又は予防する方法は、対象にＴＩＧＩＴ阻害剤を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、上述の方法は、対象に治療有効量のチェックポイント遮断薬を投与することを更に含み得る。チェックポイント阻害剤としては、限定されないが、ＰＤ－１を遮断する抗体（ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８又はＭＤＸ１１０６）、ＣＴ－０１１、ＭＫ－３４７５）、ＰＤ－Ｌ１（ＭＤＸ－１１０５（ＢＭＳ－９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＰＤ－Ｌ２（ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６））、ＩＤＯ、Ｂ７－Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３（ＢＭＳ－９８６０１６）が挙げられる。いくつかの実施形態では、チェックポイント遮断薬は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＰＤ－Ｌ２阻害剤、又はＣＴＬＡ－４阻害剤を含む。

【実施例】

【0099】

別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示された本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物及びそれらが引用される資料は、参照により具体的に組み込まれる。

【0100】

当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は単なる日常的な実験を使用して確認することができるであろう。本発明は、特定の実施形態及び実装態様を参照して説明されているが、本発明の範囲又はその発明的概念から逸脱することなく、様々な変更及び追加の変動が行われ得、等価物がその要素に置き換えられ得ることが理解されるであろう。更に、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく、特定の状況又はデバイスを本発明の教示に適合させるために多くの修正が行われ得る。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。本発明は、本明細書に開示される特定の実装態様に限定されず、本発明は、添付の特許請求の範囲内にある全ての実装態様を含むことが意図される。

【0101】

実施例１。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞の抗腫瘍活性を改善する。
この研究では、ＴＩＧＩＴシグナル伝達を、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞の文脈で試験し、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性に対するＴＩＧＩＴ遮断薬の効果を評価した。

【0102】

方法。ＮＫ細胞をサイトカインで一晩かけて活性化するか、又はＰＭ２１粒子によってエクスビボ拡大させた。ｑＲＴ－ＰＣＲ及びフローサイトメトリーにより、ＴＩＧＩＴ発現をＮＫ細胞に対して決定した。細胞傷害性を、３Ｄで培養されたＡ５４９及びＮＣＩ－Ｈ１２９９細胞による動的イメージングベースのアッセイ（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３）によって評価した。異なる時点で、未治療対照に基づいて、細胞傷害性を計算した。２名の複数のドナーからの結果を、個々のドナーについてのアイソタイプを有するＮＫ細胞の細胞傷害性に対して正規化し、抗ＴＩＧＩＴを有するＮＫ細胞の細胞傷害性と比較した。対応のないｔ検定を使用して、統計的有意性を決定した。ＰＶＲを安定して発現するＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞を使用して、Ａ５４９スフェロイドに曝露したＮＫ細胞を再刺激し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及び表面ＣＤ１０７ａを測定した。更に、ＴＩＧＩＴ遮断時のＮＫ細胞の表現型変化を、フローサイトメトリーによって活性化受容体及び阻害性受容体のセットを分析することによって試験した。

【0103】

結果：ＴＩＧＩＴ発現に対するＮＫ細胞拡大／活性化の影響を評価した。トランスクリプトーム分析は、ＴＩＧＩＴが、ｍＲＮＡレベル及びタンパク質レベルの両方で、拡大されたＮＫ細胞又はサイトカイン活性化されたＮＫ細胞のいずれかで上方調節されることを示した。ＮＫ細胞の細胞傷害性に対するＴＩＧＩＴ遮断薬の効果を、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はそれぞれのアイソタイプの存在下で、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞とがん細胞とを共培養することによって試験した。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、４８時間後にＡ５４９（１．３倍、Ｐ＜０．０００１）及びＮＣＩ－Ｈ１２９９（１．２９倍、Ｐ＝０．０００３）スフェロイドに対するエクスビボ拡大されたＮＫ細胞の細胞傷害性を有意に増加させた。疲弊を評価するために、Ａ５４９スフェロイドに７日間曝露されたＮＫ細胞をＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞で再刺激した。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、再刺激されたＮＫ細胞上のＩＦＮγ、ＴＮＦα及び表面ＣＤ１０７ａの発現の増加をもたらすＮＫ細胞の疲弊を防止した（図１Ｄ～１Ｆ）。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞上の阻害性受容体及び活性化受容体の発現の有意な変化を引き起こさなかった。

【0104】

結論：ＴＩＧＩＴは、エクスビボ拡大され、サイトカイン活性化されたＮＫ細胞上で高度に発現する。抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＴＩＧＩＴ遮断は、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞の抗腫瘍活性を有意に改善する。したがって、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞及び抗ＴＩＧＩＴ抗体は、全体的な抗腫瘍活性を改善する有望な併用療法として橋渡しとなる可能性を有する。

【0105】

実施例２。抗腫瘍応答を改善するためのＰＭ２１で拡大されたＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達の観察。
Ｔｒｅｇ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達は、阻害性ＩＬ－１０及びＦｇｌ２発現を増加させ、それらの免疫抑制特性を増強する。以前の研究では、ＴＩＧＩＴが、がんにおいてＮＫ細胞で上方調節され、多くの場合、それらの疲弊と相関することも観察されている。前臨床マウスモデルでは、ＴＩＧＩＴの遮断は、ＮＫ細胞の細胞傷害性を回復させ、ＩＦＮγ及びＴＮＦα発現を増加させ、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を促進した。抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴは、抗腫瘍活性を更に増強し、この効果は、ＮＫ細胞の存在に依存していた。現在、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、前臨床モデル及びヒト治験の両方での結果を示している。前臨床マウスモデルでは、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、単独で、又は抗ＰＤ－１／抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＴＩＭ－３などのチェックポイント阻害剤と組み合わせて、腫瘍成長を防止し、その生存率を増加させる。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈによる第ＩＩ期臨床試験（ＮＣＴ０３５６３７１６）は、ＰＤ－Ｌ１を発現する非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者において、抗ＴＩＧＩＴ単独（１７．２％）と比較して、抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴが、より高い全奏効率（５５．２％）を示すことを調べた。抗ＴＩＧＩＴ抗体の治療有効性は、Ｔ細胞エフェクター機能の回復及びＴｒｅｇ細胞のＡＤＣＣ依存性枯渇を含む複数の機構に依存する。抗ＴＩＧＩＴと他のチェックポイント阻害剤とを組み合わせた複数の前臨床試験及び臨床試験が存在するが、併用療法としての養子ＮＫ細胞及び抗ＴＩＧＩＴの有効性は、まだ調べられていない。

【0106】

ＮＫ細胞は、全末梢血リンパ球の５～１０％のみを構成する先天性免疫系の一成分であり、ＮＫ細胞を遺伝的に改変することは、依然として課題があり、療法として十分なＮＫ細胞を収集することを困難なものにしている。サイトカイン及びフィーダー細胞に基づく拡大方法を含め、ＮＫ細胞を拡大するいくつかの方法が現時点で使用されている。しかしながら、これらの方法には、いくつかの欠点がある。例えば、サイトカインに基づく方法は、ＮＫ細胞を顕著に拡大することができない。更に、フィーダー細胞により拡大されたＮＫ細胞は、残留フィーダー細胞の存在が、がん患者において更なる悪性腫瘍のリスクの可能性を発生させ得るため、拡大後に精製する必要がある。粒子（ＰＭ２１）に基づくＮＫ細胞拡大方法は、更なる精製を必要とすることなく、臨床グレードの細胞傷害性ＮＫ細胞を顕著に拡大させることが発見された。これらのＮＫ細胞は、インビトロ及びインビボの両方で強固な抗腫瘍活性を示す。以前の研究は、ＰＭ２１－ＮＫ細胞が、インビトロ及びインビボの両方でがん細胞上のＰＤ－Ｌ１発現を誘導することを示した。ＰＤ－Ｌ１遮断薬は、インビボで抗腫瘍活性及びＰＭ２１－ＮＫ細胞の持続性を増強し、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長したが、ＰＭ－２１ ＮＫ細胞は、大部分がＰＤ－１陰性であった。これらの知見は、ＰＤ－Ｌ１遮断薬が、直接的及び間接的に、ＰＭ２１－ＮＫ細胞の抗腫瘍応答を増強し得ることを示す。

【0107】

この実施例は、１）ＰＭ２１ ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達の役割を観察し、併用療法としての抗ＴＩＧＩＴ及びＰＭ２１ ＮＫ細胞の可能性を評価し、２）ＰＭ２１ ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達を改変することが、それらの抗腫瘍活性を増強することを示す。本明細書のデータは、ＴＩＧＩＴが、ＮＫ細胞上で高度に発現され、ＴＩＧＩＴの遮断薬が、ＴＩＧＩＴリガンド＋がんスフェロイドに対する細胞傷害性を改善し、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及び表面ＣＤ１０７ａの発現を増加させたことを示す。本明細書のデータはまた、ＰＭ２１ ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴ欠失が、ＴＩＧＩＴリガンド＋がんスフェロイドに対する細胞傷害性を増加させたことも示す。これらのデータは、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断薬が、ＰＭ２１ ＮＫ細胞の疲弊を防止することによって、その抗腫瘍活性を増強することを示す。この実施例は、ＴＩＧＩＴシグナル伝達が、どのようにしてＰＭ２１ ＮＫ細胞の特性を調節するかを示し、抗腫瘍活性を改善するための抑制されたＴＩＧＩＴ発現を有する操作されたＰＭ２１ ＮＫ細胞及び他の併用療法の使用を裏付ける。

【0108】

本明細書の分析は、ＰＭ２１ ＮＫ細胞が、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ－３を含む阻害性受容体を発現し、この中でＴＩＧＩＴが最も上方調節された受容体であることを特定した。本明細書で提供されるデータは、遮断薬又はＴＩＧＩＴ欠失が、ＰＭ２１ ＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及び表面ＣＤ１０７ａの発現を増加させたことを示す。

【0109】

この実施例は、ＰＭ２１ ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達の役割を分析し、ＰＭ２１ ＮＫ細胞のエフェクター機能を改善するための戦略の開発をもたらした。ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達を遮断して、これらのＮＫ細胞の表現型特性、代謝特性、及び機能特性に対するその影響を分析した。ＴＩＧＩＴシグナル伝達がヒトＮＫ細胞をどのように調節するかを理解するために、トランスクリプトーム分析を行った。この実施例は、ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達の機能的結果を決定するだけではなく、改変されたＮＫ細胞、及びがん細胞に対してより良い治療有効性を有する併用免疫療法アプローチを開発するのにも役立った。

【0110】

ＰＭ２１ ＮＫ細胞に対する阻害性受容体の発現を理解するために、ｑＲＴ－ＰＣＲによってＲＮＡ発現を測定し、フローサイトメトリーによってタンパク質発現を測定することによって、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＭ－３、ＣＤ９６、及びＬＡＧ－３を含む阻害性受容体のセットを分析した。これらの研究では、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＭ－３、ＣＤ９６、及びＬＡＧ－３を含む複数の阻害性受容体の有意な上方調節が、ＲＮＡ（図１Ａ、図１１）及びタンパク質レベルの両方で観察された。それらの中で、ＴＩＧＩＴが、ＮＫ細胞において最も上方調節された（図１Ｂ）。しかしながら、ＰＤ－１又はＣＴＬＡ－４の有意なタンパク質発現は観察されなかった（図１１）。この発現分析に基づき、ＮＫ細胞の主要な阻害性受容体であるＴＩＧＩＴを、更なる研究のために選択した。以前の研究は、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断薬が、マウスモデルにおいてＮＫ細胞の抗腫瘍活性を回復させることを示した。ＰＭ２１ ＮＫ細胞の細胞傷害性及び機能特性に対するＴＩＧＩＴ遮断薬の効果を理解するために、ＰＭ２１ ＮＫ細胞をＴＩＧＩＴリガンド＋Ａ５４９ ３Ｄ肺がんスフェロイドと７日間共培養し、次いで、生存イメージングシステムにより分析した。細胞傷害性アッセイに加えて、ＰＭ２１ ＮＫ細胞の機能表現型を更に分析した。これらの実験は、抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＰＭ２１ ＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴの遮断が、Ａ５４９ ３Ｄ肺がん細胞スフェロイドに対するＰＭ２１ ＮＫ細胞の細胞傷害性を有意に増強することを示した（図１Ｃ）。ＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断薬はまた、Ａ５４９細胞スフェロイドに対するＩＦＮγ、ＴＮＦα及び表面ＣＤ１０７ａの発現も増強した（図１Ｄ、１Ｅ、及び１Ｆ）。

【0111】

１）ＰＭ２１ ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達の役割を観察し、併用療法としての抗ＴＩＧＩＴ及びＰＭ２１ ＮＫ細胞を評価する。ＰＭ２１ ＮＫ細胞が、ナイーブ又は拡大されていないＮＫ細胞と比較して、ＴＩＧＩＴを有意に上方調節することが観察された（図１Ｂ及び図２）。ここで、阻害性ＴＩＧＩＴシグナル伝達が、ＰＭ２１ ＮＫ細胞の疲弊を促進し、この受容体の遮断薬が、ＴＩＧＩＴリガンド＋がん細胞に対するＰＭ２１ ＮＫ細胞の抗腫瘍特性を回復させることができることが示される（図１）。この研究のために、ＰＭ２１ ＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴシグナル伝達を遮断して、ＴＩＧＩＴシグナル伝達がＮＫ細胞の疲弊に関与する表現型特性、機能特性、及び代謝特性を調節したことを決定した。更に、トランスクリプトーム分析を行って、ＴＩＧＩＴシグナル伝達によって調節されるシグナル伝達経路を特定した。最後に、抗ＴＩＧＩＴ及びＰＭ２１ ＮＫ細胞の組み合わせを研究し、併用により抗腫瘍活性を改善することができることを決定した。

【0112】

１．１．ＰＭ２１ ＮＫ細胞の細胞傷害性及びエフェクター機能に対するＴＩＧＩＴシグナル伝達の効果を決定する。ＴＩＧＩＴの遮断薬が、Ａ５４９スフェロイドに対するＮＫ細胞の細胞傷害性並びにＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及び表面ＣＤ１０７ａの発現を改善することが観察された（図１Ｄ及び１Ｆ）。ＴＩＧＩＴシグナル伝達は、ＰＭ２１ ＮＫ細胞と他のＴＩＧＩＴリガンド＋がん細胞３Ｄスフェロイドとの７日間の共培養中に抗ＴＩＧＩＴ抗体で更に遮断され、次いで、生存イメージングシステムにより細胞傷害性を分析した（図６及び７）。ＰＭ２１ ＮＫ細胞を、陰性対照としてのアイソタイプ対照抗体の存在下で、がん細胞スフェロイドと共培養した。共培養の後、ＮＫ細胞をＰＶＲ＋Ｋ５６２細胞で再刺激し、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及び表面ＣＤ１０７ａの発現を分析して、それらのエフェクター機能を決定した。共培養されなかったＰＭ２１ ＮＫ細胞を陽性対照として使用した。これらの実験の概略図を図１２に示す。

【0113】

ＰＭ２１で拡大されたＮＫ細胞は、ＴＩＧＩＴ抗体の存在下で、より高度な細胞傷害性を有する。ＰＭ２１ ＮＫ細胞は、他のがんスフェロイドと共培養すると、より少ないＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及び表面ＣＤ１０７ａを発現するが、一方で、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断薬は、それらの発現を回復させることができる（図１Ｄ～１Ｆ）。

【0114】

１．２．トランスクリプトーム分析によって、ＰＭ２１ ＮＫ細胞においてＴＩＧＩＴシグナル伝達を調節する経路及び遺伝子を特定する。阻害性受容体シグナル伝達は、ＮＫ細胞における細胞リプログラミングを促進して、抗腫瘍活性を防止し、疲弊を促進し得る。ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達によって、どの細胞経路及び遺伝子が調節されるかを理解するために、ＰＭ２１ ＮＫ細胞を、抗ＴＩＧＩＴ及びアイソタイプ抗体の存在下でＡ５４９がんスフェロイドと共培養した。がん細胞とのインキュベーションの後、ＮＫ細胞をＣＤ５６陽性選択キットで選択し、ＲＮＡを抽出してＲＮＡ－ｓｅｑを行った。アセンブリ及び正規化の後、有意に差次的に発現された遺伝子を、０．０５未満のカットオフＰ値で分析することができる。調節不全経路、生物学的プロセス、及び機能は、ＫＥＧＧ経路及び遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を行うことによって決定される。

【0115】

加えて、疲弊プロセスに関与する機能的に関連する遺伝子を理解するために、遺伝子セット濃縮分析（ＧＳＥＡ）を行った（図１３Ａ～Ｂ及び１４）。ＲＮＡ－ｓｅｑ発現分析の結果を、ｑＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、及びフローサイトメトリーによって更に検証する。

【0116】

これらの研究では、ＴＩＧＩＴシグナル伝達によって調節される特定の経路及び遺伝子、特に、免疫系、代謝、及びエピジェネティック調節に関連するものは、ＮＫ細胞及びがんスフェロイドの共培養後に調節不全になり得ることが観察された。これらの知見は、ＰＭ２１ ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を改善するために更に利用することができる、疲弊プロセスに関連する重要な洞察を提供する。

【0117】

１．３．ＰＭ２１ ＮＫ細胞の代謝特性に対するＴＩＧＩＴシグナル伝達の効果を調べる。ＴＩＧＩＴシグナル伝達が、ＮＫ細胞代謝を調節するかどうかを理解するために、細胞エネルギー表現型決定を、ミトコンドリア呼吸及び解糖電位を同時に測定することによって行う。ＰＭ２１ ＮＫ細胞は、抗ＴＩＧＩＴ（実験用）及びアイソタイプ対照（陰性対照）抗体の存在下でのＡ５４９がんスフェロイドとの共培養から陽性選択されてもよく、代謝表現型を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ分析機を使用して分析する。

【0118】

ＧＳＥＡ遺伝子濃縮分析を、解糖、ミトコンドリア呼吸、及び決定された調節不全遺伝子によるｍＴＯＲ及びＰＩ３Ｋシグナル伝達を含む代謝に関連する経路に関連する遺伝子について行った（図１３及び１４）。

【0119】

これらの研究は、ＴＩＧＩＴシグナル伝達がＮＫ細胞代謝を制御するかどうかについての貴重な洞察を生み出す。加えて、本研究は、ＴＩＧＩＴシグナル伝達によって調節されるＮＫ細胞の疲弊に関与する代謝経路及び遺伝子を決定する。

【0120】

実施例３。阻害性受容体ＴＩＧＩＴのノックアウトは、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞の抗腫瘍応答を増強する。
ＮＫ細胞は、免疫系の先天性応答及び適応免疫応答のプライミングの両方におけるそれらの役割に起因して、多くの免疫療法の成功に不可欠である重要な免疫細胞集団である。近年、養子細胞療法及び併用免疫オンコロジー療法で使用するための高度に細胞傷害性のＮＫ細胞を生成することに多くの焦点が当てられている。がん細胞及びＮＫ細胞活性化に対する強固な細胞傷害性は、活性化シグナル及び阻害性シグナルの微調整に依存する。ＮＫ細胞阻害性受容体は、多くの場合、刺激され、活性化されると上方調節され、疲弊のマーカーとなり得る。ＮＫ及びＴ細胞の両方における主要な阻害性受容体の１つであるＴＩＧＩＴは、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞において高度に発現される。この研究では、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴのノックアウトが、それらの抗腫瘍活性を増強するかどうかを調べる。

【0121】

ＣＲＩＳＰＲを使用して、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞において標的ＴＩＧＩＴノックアウトアウト（ＫＯ）を作製した。次いで、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞を野生型ＮＫ細胞と比較して、表現型マーカーの任意の変化を決定した。次に、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及び脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａの発現を、がん細胞との共培養後に分析した。最後に、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞の細胞傷害性を、動的生存細胞イメージングアッセイを使用して、複数の異なるがん細胞スフェロイドに対する野生型ＮＫ細胞と比較した。複数のＮＫ細胞：標的細胞比を経時的に分析して、死滅半減期及び最大死滅を決定した。また、データを用量反応曲線に適合させて、細胞傷害性ＥＣ_５０値を決定した。

【0122】

ＴＩＧＩＴ発現を抑制する効果を調べるために、ＰＭ２１ ＮＫ細胞を、ＴＩＧＩＴ特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ ＲＮＰ複合体によってエレクトロポレーションして、ＴＩＧＩＴをノックアウトした。初期のＣＲＩＳＰＲベースのノックアウト効率は、７５％より大きかった（図１Ｇ）。ＰＭ２１ ＮＫ細胞の細胞傷害性に対するＴＩＧＩＴノックアウトの効果を調べるために、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞をＡ５４９スフェロイドと共培養した。抗ＴＩＧＩＴ抗体によるＴＩＧＩＴ遮断と同様に、ＰＭ２１ ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴノックアウトは、Ａ５４９細胞スフェロイドに対する細胞傷害性を増加させた（図１Ｈ）。これらの知見は、ＴＩＧＩＴ発現を抑制することが、ＰＭ２１ ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を改善することを強く示す。

【0123】

１）ＰＭ２１ ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴシグナル伝達を改変して、抗腫瘍活性を増強する。この研究では、ＰＭ２１拡大されたＴＩＧＩＴノックアウトＮＫ（ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ）細胞を開発し、これを拡大させ（図１Ｇ）、がん細胞に対するそれらの抗腫瘍応答を評価した（図１Ｈ及び図８）。これらの実験は、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞が、ＴＩＧＩＴリガンド＋Ａ５４９肺がん細胞スフェロイドに対して、より高い細胞傷害性を示すことを示した（図１Ｈ）。

【0124】

ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞のより良いノックアウト効率、生存率、及び拡大を達成するために、ＣＲＩＳＰＲベースのノックアウト方法を最適化し、確立した。更なる研究のために、複数のＴＩＧＩＴリガンド＋がん細胞スフェロイドに対するＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞の細胞傷害性を決定した。ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞に対する影響を理解するために、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞の機能特性及び表現型特性を、拡大後及びインビトロでのがんスフェロイドとの共培養後のフローサイトメトリーベースのタンパク質発現分析及びＲＮＡ－ｓｅｑベースのトランスクリプトーム分析によって調べた。ＴＩＧＩＴノックアウトがＰＭ２１ ＮＫ細胞代謝に及ぼす影響を決定するために、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞の代謝表現型を調べた。最後に、ＮＫ細胞の持続性及び抗腫瘍活性に対するＴＩＧＩＴノックアウトの効果を、ＮＳＧマウスにおいて決定する。１．１．ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞を開発し、特性決定する。ＴＩＧＩＴノックアウト有効性を最適化するために、ＰＭ２１で拡大されたＮＫ細胞を、複数のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼでエレクトロポレーションした。所望の（＞９０％）ノックアウト有効性を達成した後、本願発明者らの方法に最適なガイドＲＮＡを選択した。オフターゲット効果は、ゲノムワイドシーケンシング（ガイド－ｓｅｑ）法で分析することができる。ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞及び通常のＰＭ２１ ＮＫ細胞（陰性対照）をＴＩＧＩＴリガンド＋がん細胞スフェロイドと共培養し、生存イメージングシステムにより分析して、ＴＩＧＩＴノックアウトがＰＭ２１ ＮＫ細胞の細胞傷害性に及ぼす影響を決定した。細胞傷害性の後、ＮＫ細胞をＰＶＲ＋Ｋ５６２細胞で再刺激して、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞の機能特性を理解するために、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及び表面ＣＤ１０７ａの発現を調べた。

【0125】

この方法は、高いノックアウト有効性（＞９０％）及び高い生存率を有するＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞を生成した。更に、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞は、親ＰＭ２１ ＮＫ細胞と比較して、ＴＩＧＩＴリガンド＋がん細胞に対する通常のＰＭ２１ ＮＫ細胞と比較して、有意に優れた細胞傷害性を有し、より多くのＩＦＮγ、ＴＮＦαを発現することが示された。

【0126】

ＮＫ細胞を、７日目にＴＩＧＩＴ特異的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体（ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞）で、又はＲＮＰを用いずに（ＲＮＰなし対照ＰＭ２１－ＮＫ細胞）でエレクトロポレーションし、ＰＭ２１粒子（ＰＭ２１－ＮＫ細胞）で合計２週間拡大させた。図１２を参照されたい。野生型ＰＭ２１－ＮＫ細胞（ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞）（灰色）及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（赤色）を示す代表的なヒストグラム（図２５Ａ）。ＴＩＧＩＴノックアウト（ＫＯ）効率は、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞と比較して、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞において９０％より大きかった（図２５Ｂ）。代表的な拡大曲線は、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（黒色）及びＲＮＰなし対照ＰＭ２１－ＮＫ細胞（灰色）に匹敵するＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞の有意な拡大を示す（図２５Ｃ）。概要のグラフは、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（平均３，９９９倍）及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（平均７０２．５倍）（Ｎ＝１１ドナー）の拡大を表す（図２５Ｄ）。データは、標準偏差を表す誤差バーを伴う散布図又は棒グラフとして提示される。

【0127】

１．２．ＮＫ細胞の表現型特性、代謝特性、及びトランスクリプトーム特性に対するＴＩＧＩＴ欠失の影響。ＰＭ２１ ＮＫ細胞に対するＴＩＧＩＴノックアウトの全体的な効果を理解するために、ＴＩＧＩＴ ＫＯ及び親ＰＭ２１ ＮＫ細胞の表現型、代謝、及びトランスクリプトームプロファイルを、拡大後及びがんスフェロイドとの共培養後に決定した。ＮＫ細胞を、拡大後及びがんスフェロイドとの共培養後に収集した。表現型特性を研究するために、ＮＫ細胞をＮＫ細胞マーカーに対する抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。代謝特性を調べるために、収集したＮＫ細胞を分析して、Ｓｅａｈｏｒｓｅ分析機を用いて解糖及びミトコンドリア呼吸を決定した。

【0128】

ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞を１２日間かけて拡大させ、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（黒色）及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（赤色）上の活性化受容体及び阻害性受容体の発現をフローサイトメトリーによって決定した。ＴＩＧＩＴノックアウトは、活性化受容体（図２６Ａ）、阻害性受容体（図２６Ｂ）、及びＣＤ９６－ＤＮＡＭ１軸、ＦａｓＬ、及びＴｒａｉｌ（図２６Ｃ）の発現を有意に変化させなかった（Ｎ＝３ドナー、各々複製物の平均）。拡大されたＷＴ及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞をＲＮＡ抽出に使用し、バルクＲＮＡシーケンシングを実施して調節不全遺伝子セットを決定した。遺伝子セット濃縮（ＧＳＥＡ）分析は、ＴＩＧＩＴノックアウトが、ＩＬ２／ＳＴＡＴ５シグナル伝達及びＧ２Ｍチェックポイント関連遺伝子セットを含む複数のホールマーク遺伝子セットを上方調節した（図２６Ｄ）が、Ｐ５３経路を下方調節した（図２６Ｅ）ことを示す。ＩＬ２／ＳＴＡＴ５シグナル伝達（図２６Ｆ）、Ｇ２Ｍチェックポイント（図２６Ｇ）及びＰ５３経路（図２６Ｈ）の濃縮プロット。データは、標準偏差を表す誤差バーを伴う散布図又は棒グラフとして提示される。統計的有意性を、複数の対応のないｔ検定によって決定した。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊、ｐ＜０．０１である場合に＊＊、ｐ＜０．００１である場合に＊＊＊、ｐ＜０．０００１である場合に＊＊＊＊として示す。

【0129】

ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞を、ＩＬ１２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１５（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ１８（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いるか、又は用いずに、ＰＶＲ陰性Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２＿ＰＶＲ^－細胞）又はＰＶＲ陽性Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２＿ＰＶＲ^＋細胞）で２４時間刺激し、ＮＫ細胞を、ｓｅａｈｏｒｓｅシステムを用いた解糖速度及びミトコンドリアストレス試験に使用した。Ｋ５６２＿ＰＶＲ^－及びＫ５６２＿ＰＶＲ^＋細胞刺激は、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（黒色の丸）（Ｎ＝６ドナー）と比較して、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（塗りつぶされた赤色の三角）において、基底及び代償的な解糖速度を両方とも有意に増加させた（図３０Ａ～３０Ｂ）が、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（Ｎ＝４ドナー）では、Ｋ５６２＿ＰＶＲ－細胞のみが、基底酸素消費速度（ＯＣＲ）を増加させた（図３０Ｃ～３０Ｄ）。データは、ドナー対の線を伴う散布図として提示される。統計的有意性を、複数の対応ありｔ検定によって決定した。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊、ｐ＜０．０１である場合に＊＊、ｐ＜０．００１である場合に＊＊＊、ｐ＜０．０００１である場合に＊＊＊＊として示す。

【0130】

収集したＮＫ細胞からＲＮＡを抽出し、これを使用して、全ＲＮＡ ｓｅｑを用いて親及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞のトランスクリプトームプロファイリングを行った。生データを正規化し、０．０５未満のカットオフＰ値を有する遺伝子を有意に差異的に発現させた。

【0131】

ＫＥＧＧ経路分析、ＧＯ分析、及びＧＳＥＡ遺伝子濃縮分析を実施して、ＴＩＧＩＴ調節された経路、生物学的プロセス、及び関連遺伝子セットの機能を決定した。これら全ての実験について、親ＰＭ２１ ＮＫ細胞を対照として使用した。ＲＮＡ－ｓｅｑデータの遺伝子セット濃縮分析は、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞が、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達及び解糖のためのホールマーク遺伝子セットを上方調節することを示し、このことは、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞における成長及び代謝の増加を示している。図３３は、ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴ ＫＯ時の代表的な上方調節及び下方調節された遺伝子セットのヒートマップを示し、図３４Ａ～３４Ｄは、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞の代謝分析を示す。

【0132】

ＴＩＧＩＴノックアウトＮＫ細胞はまた、抗腫瘍活性の阻害に関与する重要な経路及び遺伝子の調節不全を防止し、より活性な表現型を示すことができる。更に、代謝プロファイリングは、ＴＩＧＩＴシグナル伝達がＮＫ細胞代謝を調節したことを決定する。

【0133】

ＣＲＩＳＰＲを使用して、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞においてＴＩＧＩＴを効率的にノックアウトし、発現レベルを５％未満まで減少させた。ＴＩＧＩＴリガンドＰＶＲを発現するＲａｊｉ細胞と共培養した後、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα及びＣＤ１０７αの発現の増加を示した。ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞は、野生型ＮＫ細胞と比較して、改善された死滅を示した。ＴＩＧＩＴ ＫＯ細胞は、６つの異なるがん細胞株の３Ｄスフェロイドモデルで、半分死滅時間及びＥＣ_５０細胞傷害性値を有意に減少させつつ、より迅速により多くの標的細胞を死滅させた。ＮＫ細胞：標的細胞比が低かった場合、ＴＩＧＩＴ ＫＯ細胞でも最大細胞傷害性が更に高かった。

【0134】

１．３ ＮＫ細胞のサイトカイン発現、脱顆粒及び細胞傷害性に対するＴＩＧＩＴ欠失の効果。エクスビボ拡大されたＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴ遺伝子の欠失は、サイトカイン発現、脱顆粒、及び細胞傷害性が増加したＮＫ細胞をもたらした。改善された抗腫瘍活性を有するこれらのＴＩＧＩＴノックアウトＮＫ細胞は、増強された治療有効性の可能性を有する普遍的なエフェクター集団を提供する。

【0135】

エクスビボ拡大されたＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞を未治療のままにし、Ａ５４９スフェロイドと４８時間共培養するか、又はＩＬ１２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１５（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ１８（５０ｎｇ／ｍｌ）で４時間刺激した。Ｇｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ及びブレフェルジンＡを、フローサイトメトリーによるＩＦＮγ、ＴＮＦα及び表面ＣＤ１０７ａの分析及びＮＫ細胞発現の４時間前に添加した。ＴＩＧＩＴノックアウトは、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（塗りつぶされた黒色の丸）と比較して、Ａ５４９スフェロイドに対するＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（塗りつぶされた赤色の三角）上の表面ＣＤ１０７ａ発現を有意に増加させた（図２９Ｃ）が、ＩＦＮγ（図２９Ａ）及びＴＮＦα（図２９Ｂ）は増加しなかった（Ｎ＝４～８ドナー、各々複製物の平均）。データは、ドナー対の線を伴う散布図として提示される。統計的有意性を、複数の対応ありｔ検定によって決定した。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊、ｐ＜０．０１である場合に＊＊、ｐ＜０．００１である場合に＊＊＊、ｐ＜０．０００１である場合に＊＊＊＊として示す。

【0136】

拡大されたＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞を、卵巣ＳＫＯＶ３及び肺Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ３５８、ＮＣＩ－Ｈ１２９９、ＮＣＩ－Ｈ１６５０又はＮＣＩ－Ｈ１２９９がん細胞スフェロイドと７日間共培養した。ＮＫ細胞の細胞傷害性を、動的生存細胞イメージングによって決定した。１つの実験からの代表的な生データは、１００００個のＮＫ細胞（ＮＣＩ－Ｈ３５８）及び３３３３個のＮＫ細胞（ＳＫＯＶ３）を用い、相対的拡大単独（灰色の四角）、又はＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（黒色）若しくはＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（赤色）の存在下に対して、ＮＣＩ－Ｈ３５８及びＳＫＯＶ－３について示される（図２７Ａ及び２７Ｄ）。ＮＫ細胞の細胞傷害性（図２７Ｂ及び２７Ｅ）及びＥＣ_５０（図２７Ｃ及び２７Ｆ）の代表的なプロットも示す。ＮＫ細胞の細胞傷害性の概要のプロットは、ＴＩＧＩＴ ＫＯ－ＰＭ２１ ＮＫ細胞が、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞と比較して、ＥＣ_５０（図２７Ｇ）、ｔ_１／２（図２７Ｈ）及び細胞傷害性最大値（図２７Ｉ）を有意に増加させることを示す（Ｎ＝３ドナー、各々複製物の平均）。データは、ドナー対の線を伴う散布図として、又は標準偏差を表す誤差バーを伴う平均として提示される。統計的有意性を、複数の対応のないｔ検定又は対応ありｔ検定によって決定した。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊、ｐ＜０．０１である場合に＊＊、ｐ＜０．００１である場合に＊＊＊、ｐ＜０．０００１である場合に＊＊＊＊として示す。

【0137】

エクスビボ拡大されたＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞を、セツキシマブを含む場合及び含まない場合で、Ａ５４９細胞（２Ｄ）と４８時間共培養した。ＮＫ細胞の細胞傷害性を、動的生存細胞イメージングによって決定した。代表的なグラフは、Ａ５４９細胞単独（灰色の四角）、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（塗りつぶされた黒色の丸）、セツキシマブを含むＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（黒色の丸）、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（塗りつぶされた赤色の三角）及びセツキシマブを含むＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（赤色の三角）の相対的拡大を示す（図２８Ａ）。代表的な細胞傷害性プロット（図２８Ｂ）は、ＴＩＧＩＴ ＫＯ（赤色）が、ＷＴ ＮＫ細胞（黒色）と比較して、より良くＡ５４９細胞を死滅させ、セツキシマブの添加は、ＷＴ及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞（点線）の両方のＮＫ細胞の細胞傷害性を更に改善したことを示す。複数のＮＫ：Ｔ比でのＡ５４９細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性の概要のプロット及び表は、セツキシマブが、２．４倍の細胞傷害性ＥＣ_５０でＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を更に改善することを示した（Ｎ＝２ドナー、各々複製物の平均）（図２８Ｃ）。

【0138】

図２４の概略図にまとめられているように、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞は、ＷＴ ＮＫ細胞と比較して、ＡＤＣＣを含む増殖及び細胞傷害性を増強している。１）ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞は、ＷＴ ＮＫ細胞と比較して、ＰＶＲ^＋腫瘍細胞による刺激時にＴＮＦα産生を増加させた。２）腫瘍スフェロイド曝露されたＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞は、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞と比較して、脱顆粒が増加している。３）ＲＮＡ－ｓｅｑ分析によって、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞では、ｍＴＯＲシグナル伝達、解糖、及びＩＬ２－ＳＴＡＴ５シグナル伝達の上方調節が観察された。４）ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞をＰＶＲ^＋腫瘍細胞による刺激時と比較して、増強された代謝適合性を観察した。５）ＴＩＧＴ ＫＯは、ＡＤＣＣによって引き起こされるＮＫ細胞フラトリサイドを防止し、Ｆｃコンピテントなα－ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせたときの細胞毒性の減少を防止する。

【0139】

実施例４。ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞のインビボでの持続性及び抗腫瘍活性を調べる。
がん細胞をＮＳＧマウスに腹腔内に播種し、７日間インキュベートする。その後、親及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞を腹腔内に注射する。ＩＬ－２を、ＮＫ細胞を補助するために毎週２回注射する。マウスを経時的に監視して、腫瘍の成長及び生存を調べる。マウスのサブグループを、ＮＫ細胞注射の１４日後に安楽死させる。ＮＫ細胞を収集して、ＮＫ細胞の持続性及び表現型を決定する。加えて、Ｋ５６２＿ＰＶＲ＋細胞で再刺激されたＮＫ細胞、並びにＴＩＧＩＴ ＫＯ及び親ＰＭ２１ ＮＫ細胞のエフェクター機能を分析し、比較した。親ＰＭ２１ ＮＫ細胞をこれらの実験で対照として使用する。

【0140】

ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞は、親ＰＭ２１ ＮＫ細胞と比較して、より優れた持続性を有し、インビボでより強固な抗腫瘍活性を保持する。更に、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞は、親ＰＭ２１ ＮＫ細胞と比較して、腫瘍成長を低下させ、腫瘍を有するマウスの生存率を増加させる。

【0141】

以前の臨床試験では、ＴＩＧＩＴ遮断薬単独では、腫瘍成長及び生存率を有意に低下させることができないことが示された。他の研究は、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、ＮＫ細胞の抗腫瘍免疫を有意に増加させることを示した。しかしながら、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１又は抗ＴＩＭ３と組み合わせた抗ＴＩＧＩＴ抗体は、生存率を有意に改善し、腫瘍成長を更に低下させた。ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞と抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１又は抗ＴＩＭ３との併用療法を利用することができる。

【0142】

実施例５。インビボでのＴＩＧＩＴの遮断薬と組み合わせたＰＭ２１ ＮＫ細胞の治療有効性を評価する。
この実施例は、抗ＴＩＧＩＴの存在下でＰＭ２１ ＮＫ細胞がより良い抗腫瘍活性を示すことができるかどうかを調べ、ＴＩＧＩＴリガンド＋がん細胞をＮＳＧマウスの腹腔内に注射する。抗ＴＩＧＩＴ（実験用）又はアイソタイプ対照（陽性対照）とともにＰＭ２１ ＮＫ細胞を投与して、移植されたマウスを治療する。ＩＬ－２を、ＮＫ細胞を補助するために毎週２回注射する。腫瘍成長及び生存率を経時的に分析する。１４日後にマウスのサブグループを安楽死させ、腹膜洗浄を介してＮＫ細胞を収集する。持続性及び表現型特性を決定するために、回収されたＮＫ細胞を分析する。

【0143】

ＮＫ細胞は、抗ＴＩＧＩＴと組み合わせて、より高い抗腫瘍活性を示すことができ、これにより、腫瘍制御を改善し、したがって、アイソタイプ又は抗ＴＩＧＩＴ単独を注射したマウス群を用いた拡大されたＮＫ細胞と比較して全生存率が向上する。更に、ＴＩＧＩＴ遮断薬は、ＮＫ細胞の持続性を増加させる。

【0144】

インビボ研究では、抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体の両方が、ＰＭ２１ ＮＫ細胞とともに注射される。以前の研究はまた、Ｔｒｅｇ細胞が、ＴＩＧＩＴシグナル伝達において役割を果たし、抗ＴＩＧＩＴ有効性が、Ｔｒｅｇ細胞のＮＫ細胞ベースの欠失に依存することを示した。Ｔｒｅｇ細胞にＰＭ２１ ＮＫ細胞及び抗ＴＩＧＩＴ抗体を注射することができ、Ｔｒｅｇ細胞の存在下で、インビボでＰＭ２１ ＮＫ細胞に対するＴＩＧＩＴシグナル伝達の効果を調べる。

【0145】

実施例６。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、肺がんのモデルにおけるＰＶＲ媒介性疲弊を防止することによって、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞の抗腫瘍活性を改善する。
エクスビボ拡大されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、がんに対するそれらの強固な応答のために、養子免疫療法として関心を集めている。ＮＫ細胞は、その活性を調節する活性化受容体及び阻害性受容体を発現する。阻害性受容体ＴＩＧＩＴは、多くの場合、がんにおいてＮＫ細胞上で上方調節され、ＮＫ細胞活性を阻害し、ＮＫ細胞の疲弊を促進する。ＮＫ細胞機能におけるＴＩＧＩＴの役割に関する理解の大部分は、マウスモデルに由来するが、ヒトＮＫ細胞を使用した機構的インビトロ研究は、限定的である。この研究では、ヒトエクスビボ拡大されたＮＫ細胞の抗腫瘍活性に対するＴＩＧＩＴ遮断薬の効果を評価した。

【0146】

ＴＩＧＩＴ発現は、サイトカイン活性化及びＰＭ２１粒子拡大されたヒトＮＫ細胞（ＰＭ２１－ＮＫ細胞）上で、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びフローサイトメトリーによって決定された。複数の肺がん細胞株の２Ｄ及び３Ｄモデルに対するＮＫ細胞の細胞傷害性を、動的生存イメージングベースのアッセイによって評価した。ＮＫ細胞の疲弊を評価するために、ＰＶＲ^＋又はＰＶＲ^－Ｋ５６２細胞を使用して、Ａ５４９スフェロイド曝露されたＰＭ２１－ＮＫ細胞を再刺激し、ＣＤ１０７ａの表面発現並びにＩＦＮγ及びＴＮＦαの産生を測定した。理論に限定されることを意図するものではないが、ＰＶＲ媒介性疲弊を防止するＴＩＧＩＴ遮断薬の潜在的な機構を図１５に示す。ＲＮＡ－ｓｅｑ分析を、ＴＩＧＩＴ遮断薬を伴って、又は伴わずにＡ５４９スフェロイドと共培養した後に選択されたＰＭ２１－ＮＫ細胞に対して行った。

【0147】

ＴＩＧＩＴは、エクスビボ拡大され、活性化されたヒトＮＫ細胞上で高度に発現する。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、肺がんスフェロイドに対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を有意に改善し、がん細胞スフェロイドへの長期間曝露後にＰＶＲ陽性がん細胞に対するエフェクター機能を回復させる。

【0148】

この実施例では、ＰＭ２１粒子で拡大されたＮＫ細胞（ＰＭ２１－ＮＫ細胞）の抗腫瘍活性に対するＴＩＧＩＴ遮断薬の効果を、肺がんモデルにおいて調査した。エクスビボ拡大及び／又は活性化が、ＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴを上方調節した。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、単層中の肺がん細胞に対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を増加させなかったが、ＴＩＧＩＴ遮断薬は、３Ｄ肺がんスフェロイドに対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を増加させ、腫瘍スフェロイドへの長期間曝露後のＰＶＲ媒介性疲弊を防止した。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、炎症応答関連遺伝子、ＮＦｋＢを介したＴＮＦαシグナル伝達、及びＩＦＮγ応答関連遺伝子セットを含むＮＫ細胞抗腫瘍応答に関連する複数の遺伝子セットを上方調節した。この研究は、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、ＰＶＲによって誘導されるＮＫ細胞機能の減少を防止し、エクスビボ拡大された初代ヒトＮＫ細胞の全体的な抗腫瘍応答を増加させることを示した。

【0149】

方法。
細胞培養。特定されていない健康なドナーからのバフィーコート（白血球源）をＮＫ細胞の供給源として使用し、地元の血液バンク（ＯｎｅＢｌｏｏｄ）から購入した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を密度勾配（Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ溶液、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）によって分離し、更なる使用のために凍結保存した。ＮＫ細胞を、以前に記載されているように（１９、２０、４７）、ＰＭ２１粒子により拡大させた。簡潔に述べると、Ｔ細胞が枯渇したＰＢＭＣ（ＥａｓｙＳｅｐ ＣＤ３陽性選択キット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を、２００μｇ／ｍＬのＰＭ２１粒子で刺激し、ＳＣＧＭ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ ＧｍｂＨ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ ｉｍ Ｂｒｅｉｓｇａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及び１００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）を含むＲＰＭＩ培地中で２～３週間培養した。活性化されたＮＫ細胞について、Ｔ細胞が枯渇したＰＢＭＣを、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）又はＩＬ－１２（１０μｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１５（１００μｇ／ｍｌ）＋ＩＬ－１８（５０μｇ／ｍｌ）で一晩刺激した。がん細胞株Ｋ５６２、Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ３５８、及びＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞（ＡＴＣＣ）、並びにＮＣＩ－Ｈ１２９９（Ｄｒ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｐａｒｋｓ，ＵＣＦからの過大なる寄贈）を、１０％のＦＢＳ、１％の抗生物質／抗真菌薬、及び２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘを含むＲＰＭＩ培地中で維持した。Ａ５４９－ＮＬＲ、ＮＣＩ－Ｈ３５８－ＮＬＲ、ＮＣＩ－Ｈ１９７５－ＮＬＲ、及びＮＣＩ－Ｈ１２９９－ＮＬＲ細胞を、市販のＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、安定した形質導入によって生成した。全ての細胞株を、ピューロマイシン選択を介して陽性選択し、続いて均一な陽性集団を選別した（ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ）。全ての細胞を、空気中に５％（体積／体積）ＣＯ２を補充した３７℃の加湿雰囲気中に維持した。細胞株を、定期的にマイコプラズマについて試験し（Ｅ－Ｍｙｃｏ Ｐｌｕｓ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｂｕｌｌｄｏｇ－Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＮＨ，ＵＳＡ）、Ｈｕｍａｎ ＳＴＲ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＡＴＣＣによってサービス提供される）を介して認証した。

【0150】

安定した細胞株生成。Ｋ５６２－ＧＦＰＬｕｃ細胞を発現するＰＶＲを、ＰＶＲコード遺伝子配列を含有する社内で生成されたレンチウイルス粒子（ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して安定した形質導入によって生成し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて、陽性集団及び陰性集団について選別した。ＰＶＲ^＋及びＰＶＲ^－Ｋ５６２－ＧＦＰＬｕｃ細胞株を、必要になるまで凍結保存した。

【0151】

ｑＲＴ－ＰＣＲ。ＮＫ細胞を、拡大前後に選択し（ＥａｓｙＳｅｐ ＣＤ５６陽性選択キット ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）、全ＲＮＡを単離した（Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット、Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）。ｃＤＮＡを合成し（Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＴＩＧＩＴのための遺伝子発現プライマーセット（ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ｑＲＴ－ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ７ ＰＣＲシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）によって、ＲＮＡ発現レベルを決定した。ＥＩＦ３Ｄ及びＲＰＬ１３Ａを対照遺伝子として使用した。２^－ΔΔＣ _Ｔ方法（４８）を使用して、標的遺伝子の相対的ＲＮＡ発現を決定した。

【0152】

フローサイトメトリー。以下の抗体をフローサイトメトリー分析に使用した。ＣＤ５６－ＰＥ（クローン：５．１Ｈ１１）、ＣＤ５６－ＡＰＣ／Ｆｉｒｅ（商標）７５０（クローン：ＮＣＡＭ）、ＣＤ５６－ＡＦ（登録商標）６４７（クローン：５．１Ｈ１１）、ＣＤ３－ＦＩＴＣ（クローン：ＵＣＨＴ１）、ＴＩＧＩＴ－ＰＥ／Ｃｙ７（クローン：Ａ１５１５３Ｇ）、ＣＤ９６－ＰＥ（クローン：ＮＫ９２．３９）、ＤＮＡＭ－１－ＦＩＴＣ（クローン：ＴＸ２５）、ＰＶＲＩＧ－ＡＰＣ（クローン：Ｗ１６２１６Ｄ）、ＰＶＲ－ＰＥ（クローン：ＳＫＩＬ２）、ＰＶＲＬ２－ＡＰＣ（クローン：ＴＸ３１）、ＰＶＲＬ４－ＡＦ４８８（クローン：３３７５１６）、ＮＫｐ３０－ＰＥ（クローン：Ｐ３０－１５）、ＮＫｐ４６－ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ（商標）５９４（クローン：９Ｅ２）、ＣＤ１６－ＰｅＣｙ５（クローン：３Ｇ８）、ＮＫＧ２Ｄ－ＡＰＣ（クローン：１Ｄ１１）、ＮＫｐ４４－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：Ｐ４４－８）、ＬＡＧ－３－ＦＩＴＣ（クローン：１１Ｃ３Ｃ６５）、ＰＤ－１－ＰＥ－Ｄａｚｚｌｅ（商標）５９４（クローン：ＥＨ１２．２Ｈ７）、ＴＩＭ－３－ＰＥ（クローン：Ｆ３８－２Ｆ２）、ＴＮＦα－ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ（商標）５９４（クローン：ＭＡＢ１１）、ＩＦＮγ－ＰｅｒＣＰ５．５（クローン：Ｂ２７）、ＣＤ１０７ａ－ＰＥ（クローン：Ｈ４Ａ３）、ＣＤ３－ＰｅｒＣＰ－ｅＦ７１０（クローン：ＯＫＴ３）、及びＮＫＧ２Ａ－ＡＰＣ（クローン：Ｚ１９９）。ＮＫ細胞を、プレコンジュゲートタンパク質特異性抗体又は対応するアイソタイプ対照抗体で染色した。全ての試料を、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）又はＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｓ ２０００ Ｆｕｌｌ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｃｙｔｅｋ、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）フローサイトメーターで獲得し、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ、ｖ２．４）又はＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ｖ１０．６．２）で分析した。

【0153】

動的生存細胞イメージング細胞傷害性アッセイ。追跡のために核赤色蛍光タンパク質（ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ、ＮＬＲ）を安定して発現する肺がん細胞株Ａ５４９－ＮＬＲ、ＮＣＩ－Ｈ３５８－ＮＬＲ、ＮＣＩ－Ｈ１９７５－ＮＬＲ及びＮＣＩ－Ｈ１２９９－ＮＬＲを標的細胞として使用した。単層細胞傷害性アッセイについて、ＮＫ細胞を添加する前日に、平底９６ウェルプレートにウェル当たり６，０００個のがん細胞を播種した。スフェロイド細胞傷害性アッセイについて、５，０００個のがん細胞を９６ウェル透明丸底超低付着マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に播種し、１３０×ｇで１０分間遠心分離し、３日間インキュベートした後に、スフェロイドを形成した。がん細胞単層又はスフェロイドを、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦアイソタイプ又は抗ＴＩＧＩＴ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の存在下で、示されるエフェクターの標的に対する（Ｅ：Ｔ）比でＮＫ細胞と共培養した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３ Ｌｉｖｅ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、７日間のスフェロイド実験の間、単層を７２時間撮像した。２Ｄアッセイでは、ウェル当たりの赤色オブジェクト数（ＲＯＣ）、３Ｄアッセイでは、全赤色オブジェクト積分強度（ＲＯＩＩ）（ＲＣＵ×μｍ^２／画像）によって、標的腫瘍細胞の成長を経時的に追跡した。標的細胞単独、又はＴＩＧＩＴ遮断薬を伴うか、又は伴わないＮＫ細胞の存在下での相対的成長を、ＮＫ細胞を最初に添加して正規化されたＲＯＣ（ｎＲＯＣ）又は正規化されたＲＯＩＩ（ｎＲＯＩＩ）を決定したときに、ＲＯＣ又はＲＯＩＩを時間０での値に対して正規化する（ＲＯＣ_ｔ／ＲＯＣ_ｔ＝０又はＲＯＩＩ_ｔ／ＲＯＩＩ_ｔ＝０）ことによって決定した。次いで、以下の式に基づいて細胞傷害性（％）を決定した。

【0154】

アネキシンＶ細胞傷害性アッセイ。組織培養インキュベーター中、ＰＭ２１－ＮＫ細胞を、標的ＰＶＲ＋又はＰＶＲ－Ｋ５６２－ＧＦＰＬｕｃ細胞とともに、示されたエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦアイソタイプ又は抗ＴＩＧＩＴ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の存在下で、３７℃で６０分間共培養した。次いで、細胞を遠心分離し、アネキシン－Ｖ－パシフィックブルー抗体で染色し、４℃で１５分間インキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。細胞傷害性を、エフェクター（ＶＴＣＥ：Ｔ）を有する各ウェルに残存する生存可能な標的細胞（ＧＦＰ＋／アネキシンＶ－）の絶対量に基づいて決定し、「標的単独」対照ウェル（ＶＴＣＴ ｃｔｒｌ）における平均ＶＴＣを参照した。

【0155】

ＩＦＮγ及びＴＮＦα発現、並びに脱顆粒。３０，０００個のＮＫ細胞を、３７℃でブレフェルジンＡ及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（商標）の存在下、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦアイソタイプ又は抗ＴＩＧＩＴ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の存在下でＰＶＲ－又はＰＶＲ＋Ｋ５６２細胞と４～６時間共培養した。試料を、細胞外標的タンパク質特異的抗体（ＣＤ３、ＣＤ５６及びＣＤ１０７ａ）で染色した。次いで、ＮＫ細胞を固定し、透過化し（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＩＣ Ｆｉｘａｔｉｏｎ及び透過化緩衝剤）、細胞内タンパク質標的（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）について染色した。データをフローサイトメトリーによって得て、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアによって分析した。図４を参照されたい。

【0156】

インビトロ疲弊モデル。Ａ５４９－ＮＬＲ細胞（５０００／ウェル）を９６ウェル透明丸底超低付着マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）に播種し、１３０×ｇで１０分間遠心分離し、３～４日間インキュベートして、スフェロイドを形成した。次いで、ＮＫ細胞を、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦアイソタイプ又は抗ＴＩＧＩＴ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）の存在下で添加した。７日間のインキュベーションの後、ＮＫ細胞を、ブレフェルジンＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）及びＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）の存在下でＰＶＲ^－又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２－ＧＦＰＬｕｃ細胞で４～６時間刺激した。試料を採取し、ＣＤ５６、ＣＤ３及びＣＤ１０７ａ抗体で染色し、固定し、透過化し（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＩＣ Ｆｉｘａｔｉｏｎ及び透過化緩衝剤）、ＩＦＮγ及びＴＮＦαについて抗体でプローブ化し、続いて、フローサイトメトリーを使用して分析した。代表的なゲーティング戦略を図２３に示す。

【0157】

ＲＮＡ－ｓｅｑ。ＮＫ細胞を、疲弊モデルに記載されるように設定した。７日間の共インキュベーションの後、ＮＫ細胞を、ＮＫ細胞選択キット（ＥａｓｙＳｅｐ ＣＤ５６^＋選択キット、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で単離し、フローサイトメトリー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｇｈｔｓ ２０００ Ｆｕｌｌ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、Ｃｙｔｅｋ）によって分析して、ＮＫ細胞純度を決定した。ＮＫ細胞から全ＲＮＡを抽出した（Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット、Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ）。ＲＮＡ品質（ＲＩＮ値）をＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎによって決定し、ｐｏｌｙＡ選択、ライブラリー調製、及びＲＮＡシーケンシング（Ｇｅｎｅｗｉｚ，Ｉｎｃ、Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）に使用した。生のＲＮＡ－ｓｅｑデータ（Ｆａｓｔｑ）を、ＦａｓｔＱＣにより品質制御のために分析した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃは、アダプターのトリミングと低品質リードに使用された。ＨＩＳＡＴ２は、ｈｇ３８ヒトゲノムによる遺伝子のマッピングに使用され、Ｓｔｒｉｎｇｔｉｅは、アセンブリ及びリードカウントの定量化に使用された。Ｃｏｍｂａｔ－ｓｅｑを使用して、試料間のバッチ効果を除去した。ＥｄｇｅＲを使用して、遺伝子発現を正規化し、差次的に発現した遺伝子を決定した。ＥｄｇｅＲから得られた個々の遺伝子の倍率変化及びＰ値を掛け算して、ランク付けされた遺伝子リストを作製し、事前ランク付けされた遺伝子セット濃縮（ＧＳＥＡ）分析に使用して、濃縮されたホールマーク遺伝子セットを決定した。

【0158】

統計分析。統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９．３．１によって行った。対応あり又は対応なしの両側スチューデントｔ検定を用いて、ＴＩＧＩＴ発現、細胞傷害性、及び機能アッセイを分析した。全ての実験を、少なくとも３つの生物学的複製物について行った。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊、ｐ＜０．０１である場合に＊＊、ｐ＜０．００１である場合に＊＊＊、ｐ＜０．０００１である場合に＊＊＊＊として示す。

【0159】

結果
ＰＭ２１粒子で拡大されたか、又はサイトカイン活性化されたＮＫ細胞は、ＴＩＧＩＴを高度に発現する。健康なドナーから得られたＮＫ細胞を、ＰＭ２１粒子を使用して拡大させた（１９、２０）。このフィーダー細胞を含まない拡大技術は、Ｋ５６２－ｍｂＩＬ２１－４１ＢＢＬ細胞（ＰＭ２１粒子）に由来する血漿膜粒子を利用して、ＮＫ細胞増殖を刺激し、２週間でＮＫ細胞の平均１，７００倍の拡大をもたらす（１８名のドナーからのＮ＝１１３、図２０）。ＰＭ２１粒子（ＰＭ２１－ＮＫ細胞）を使用して一致したドナーから拡大されたＰＢＭＣ及びＮＫ細胞から単離された休止ＮＫ細胞を、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びフローサイトメトリーによってＴＩＧＩＴ発現について分析した。ＴＩＧＩＴは、休止ＮＫ細胞と比較して、ＰＭ２１－ＮＫ細胞におけるＲＮＡレベルが上方調節された（６±３倍、ｐ＝０．０４）（図２、左パネル）。更に、ＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞の割合は、休止ＮＫ細胞と比較して、ＰＭ２１－ＮＫ細胞において増加し（Ｎ＝８、ｐ＜０．０００１）、発現は、休止ＮＫ細胞において２％～４４％、ＰＭ２１－ＮＫ細胞において３９％～８８％の範囲であった（図２、右パネル）。他のＮＫ細胞活性化方法もＴＩＧＩＴ発現を誘導するかどうかを決定するために、Ｔ細胞が枯渇したＰＢＭＣを、ＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍＬ）又はＩＬ－１２（１０μｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（１００μｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１８（５０μｇ／ｍＬ）の組み合わせのいずれかで一晩刺激し、ＴＩＧＩＴを発現するＮＫ細胞の割合を、休止ＮＫ細胞の割合と比較した。ＴＩＧＩＴ発現は、休止ＮＫ細胞（２１±１３％）と比較して、ＩＬ－２活性化されたＮＫ細胞（６９±３％、ｐ＜０．０００１）及びＩＬ－１２／１５／１８活性化されたＮＫ細胞（６０±１５％、ｐ＝０．０００１）で上方調節され、ＰＭ２１－ＮＫ細胞（６７±１６％）での発現レベルに匹敵するものであった（図３）。まとめると、これらの所見は、ＮＫ細胞が、ＰＭ２１粒子又はサイトカイン活性化を用いて拡大すると、ＲＮＡ及び表面タンパク質レベルの両方でＴＩＧＩＴを上方調節することを示す。

【0160】

ＴＩＧＩＴ陽性ＰＭ２１－ＮＫ細胞は、ＴＩＧＩＴ陰性ＰＭ２１－ＮＫ細胞と比較して、より高いレベルの活性化受容体及び阻害性受容体を発現する。ＴＩＧＩＴの発現が、ＮＫ細胞の表現型及び／又は活性化状態への何らかの変化と関連しているかどうかを決定するために、主要な活性化受容体及び阻害性受容体の発現のレベルを、ＴＩＧＩＴ^＋ＰＭ２１－ＮＫ細胞とＴＩＧＩＴ^－ＰＭ２１－ＮＫ細胞との間で比較した。発現が最大レベルではなく、依然として差次的発現を評価することができるときに、拡大の１４日目前に、細胞上で差を評価した。一般に、活性化受容体及び他の阻害性受容体の発現は、図１６Ａにまとめられ、ＴＩＧＩＴ^－ＰＭ２１－ＮＫ細胞と比較して、ＴＩＧＩＴ^＋ＰＭ２１－ＮＫ細胞上で増加した。活性化受容体ＣＤ１６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＤＮＡＭ－１、及びＮＫＧ２Ｄを発現するＮＫ細胞の割合は、ドナー間で変化したが、ＤＮＡＭ－１を除く全ての活性化受容体について、ドナーが一致した対におけるＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞対ＴＩＧＩＴ^－ＮＫ細胞で増加した（ｐ＝０．０２以下）。ＤＮＡＭ－１は、ＴＩＧＩＴ^－ＮＫ細胞及びＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞の両方の９８％より多くを平均して、全てのＰＭ２１－ＮＫ細胞上で遍在的かつ高度に発現した（図１６Ｂ）。阻害性受容体ＣＤ９６、ＴＩＭ－３、ＮＫＧ２Ａ、及びＬＡＧ－３は、ＰＭ２１－ＮＫ細胞上でも発現され、一方で、ＰＤ－１は、ＰＭ２１－ＮＫ細胞の２％未満で検出された（図１６Ｃ）。ドナーが一致したＴＩＧＩＴ^－ＮＫ細胞と比較して、ＣＤ９６（ｐ＝０．０１）及びＴＩＭ－３（ｐ＝０．００３）を発現したＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞の割合は有意に高かったが、ＮＫＧ２Ａ及びＬＡＧ－３の発現は、ＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞とＴＩＧＩＴ^－ＮＫ細胞との間で有意に差はなかった。これらの所見は、ＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞が、より活性化された細胞亜集団を表し、より高いレベルの重要な活性化受容体及びいくつかの阻害性受容体を発現し、典型的には活性化時に誘導されることを示す。

【0161】

ＴＩＧＩＴ遮断薬は、３Ｄ肺腫瘍スフェロイドに対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強する。ＰＭ２１－ＮＫ細胞抗腫瘍機能に対するＴＩＧＩＴ遮断薬の効果を入手するために、Ａ５４９肺腫瘍細胞に対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を調べた。この細胞株は、ＰＶＲ及びＰＶＲＬ２を発現するが、ＴＩＧＩＴに結合することができるＰＶＲＬ４を発現しない（表１）。３名のドナーからのＰＭ２１－ＮＫ細胞を、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はアイソタイプ対照の存在下で０．３３：１のＮＫ：Ａ５４９比で２Ｄ Ａ５４９肺がん細胞単層と共培養し、細胞毒性を生存細胞イメージングアッセイで測定した。ＰＭ２１－ＮＫ細胞死滅の有意な増強は、７２時間にわたるＴＩＧＩＴ遮断では生じなかった（アイソタイプ対照対抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下での細胞傷害性は、２４時間で１４±１０％対１５±９％、４８時間で２７±１１％対３１±７％、７２時間で４４±９％対５０±４％であった）（図１７Ａ）。濃度依存性細胞傷害性曲線も、１名のドナーについてこれらの各時点について測定し、ＴＩＧＩＴ遮断薬を伴う場合、又は伴わない場合で、死滅の差は観察されなかった（２４時間で５５９±１８％の比対５２５±２４％の比、４８時間で６８９±１７％の比対６２９±３７％の比、及び７２時間で７５１±１４％の比対６９７±２５％の比）（図１７Ｂ）。
表１：ＴＩＧＩＴリガンドは、いくつかの肺がん細胞株において発現される。肺がん細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ－Ｈ３５８、ＮＣＩ－Ｈ１２９９、及びＮＣＩ－Ｈ１９７５をＴＩＧＩＴリガンド特異的抗体で染色し、アイソタイプ対照と比較して、フローサイトメトリーによってリガンド発現を決定した。データは、２つの異なる継代から平均されたリガンド陽性（％）及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）であるがん細胞のパーセントとして提示される。

【0162】

ＴＩＧＩＴの遮断が、がん環境をよりよく模倣する肺がんスフェロイドへの曝露中のＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性に影響を与えるかどうかを決定するために、ＰＭ２１－ＮＫ細胞をＡ５４９細胞スフェロイドと共培養し、共培養終了時のＮＫ細胞表現型とともに経時的なそれらの死滅を評価した。ＰＭ２１－ＮＫ細胞を、抗ＴＩＧＩＴ又はアイソタイプ対照抗体の存在下で腫瘍スフェロイドに７日間曝露した。いくつかの時点での代表的な画像は、抗ＴＩＧＩＴの存在下でのＡ５４９スフェロイドの殺傷の増加を示し、得られたスフェロイドのより小さいサイズ（図２１Ａ）及び相対的拡大の低下（図２１Ｂ）によって明らかである。経時的な細胞傷害性曲線を決定し、１名のドナーからの代表的な曲線及び複数のドナーからの概要の細胞傷害性データを図１７Ｃに示す。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、ドナー間で平均２０％で、７２時間でＡ５４９スフェロイドに対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強した（ｐ＜０．０００１、１：１のＰＭ２１－ＮＫ細胞：Ａ５４９細胞、Ｎ＝６）（図１７Ｃ）。複数の活性化受容体及び阻害性受容体の発現を、抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下又は不存在下でＡ５４９スフェロイドに曝露した後、３名のドナーからの曝露されていない対照ＰＭ２１－ＮＫ細胞及びＰＭ２１－ＮＫ細胞について評価した。腫瘍曝露単独又はＴＩＧＩＴ遮断薬を伴うものは、アイソタイプ対照又は曝露されていないＮＫ細胞と比較して、阻害性受容体ＴＩＭ－３、ＮＫＧ２Ａ、ＬＡＧ－３、ＰＤ－１又はＣＤ９６を発現するＮＫ細胞の頻度を変化させなかった（図１７Ｄ）。同様に、ＴＩＧＩＴ遮断剤を伴う場合、又は伴わない場合に、腫瘍曝露後の活性化受容体ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６及びＤＮＡＭ－１の発現に差はなかったが、特にアイソタイプ対照では、スフェロイド曝露時にＮＫＧ２Ｄの発現の減少傾向が存在した（図１７Ｄ）。ＴＩＧＩＴ遮断時の肺がんスフェロイドに対するＮＫ細胞の細胞傷害の増強が単一細胞株に制限されていないことを確認するために、抗ＴＩＧＩＴ抗体の試験をＮＣＩ－Ｈ１２９９、ＮＣＩ－Ｈ３５８、及びＮＣＩ－１０７５肺がん細胞株においても行った。これらの細胞株は、ＰＶＲ及びＰＶＲＬ２も高度に発現するが、Ｈ３５８は、試験したＴＩＧＩＴリガンドの中でも、ＰＶＲＬ４も発現する（表１）。これらの細胞株のスフェロイドに対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を、生存細胞イメージングアッセイを使用して決定した。各細胞株は、標的細胞が死滅された異なる速度を有していたが、全ては、ＴＩＧＩＴ遮断時に増強された細胞傷害性を示した（図１８Ａ）。死滅の程度にはドナー依存性の変動があったが、ＴＩＧＩＴ遮断薬は、試験した全ての細胞株に対するドナーが一致した比較において細胞傷害性を増加させ（ＮＣＩ－Ｈ１２９９ ｐ＝０．０２、ＮＣＩ－Ｈ３５８ ｐ＝０．０１、ＮＣＩ－１９７５ ｐ＝０．００５）、Ｈ１２９９の死滅を平均１２％、Ｈ３５８を１８％、及びＨ１９７５を驚異的に８８％増強した（図１８Ｂ）。まとめると、これらの所見は、３Ｄスフェロイドモデルにおいて、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、ＮＫ細胞の表現型の変化なしに、肺がん細胞に対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強することを示す。

【0163】

ＴＩＧＩＴ遮断薬は、がん細胞スフェロイドとの共培養後に、ＰＶＲ陽性がん細胞に対するＰＭ２１－ＮＫ細胞エフェクター機能を保持する。ＮＫ細胞の疲弊は、腫瘍への長期間曝露が、エフェクター機能の減少、表現型の変化、又は死滅の減少を引き起こし得る腫瘍微小環境の文脈で生じ得る。ＮＫ細胞の疲弊につながる機構は十分に定義されていないが、最近の研究では、阻害性受容体シグナル伝達の悪化の役割が示されている。以前の研究では、慢性的な阻害性シグナル伝達が、細胞傷害性免疫細胞の疲弊を促進し、ＴＩＧＩＴが、腫瘍を有するマウスモデル及びがん患者におけるＮＫ細胞の疲弊に関連していることが報告されている。ＴＩＧＩＴ遮断薬が、腫瘍スフェロイドへの曝露時のＰＭ２１－ＮＫ細胞の疲労の徴候を軽減することができるかどうかを決定するために、インビトロ疲弊モデルが開発された。まず、ＰＭ２１－ＮＫ細胞を、抗ＴＩＧＩＴ抗体又はアイソタイプ対照抗体のいずれかの存在下でＡ５４９スフェロイドと７日間共培養した。次いで、ＮＫ細胞をＰＶＲ^－又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞のいずれかで刺激し、エフェクターサイトカインの産生及び脱顆粒を評価した。曝露されていない刺激されていないＰＭ２１－ＮＫ細胞を陰性対照として使用し、一方で、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２又はＰＶＲ^－Ｋ５６２のいずれかで刺激された曝露されていないＰＭ２１－ＮＫ細胞を陽性対照として使用した。インビトロ疲弊モデルの概略図を図１９Ａに示す。

【0164】

曝露されていないＰＭ２１－ＮＫ細胞をＫ５６２細胞で刺激した場合、ＩＦＮγを発現するＮＫ細胞の割合は、ＰＶＲ^－Ｋ５６２細胞で刺激した場合に１％未満から１５±５％（ｐ＝０．０００２）に増加し、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞では１４±７％（ｐ＜０．０００１）に増加した（図１９Ｂ）。Ａ５４９スフェロイド共培養後のＫ５６２細胞による再刺激により、ＩＦＮγを発現するＰＭ２１－ＮＫ細胞の割合が低下し（ＰＶＲ^－で８±５％、ＰＶＲ^＋細胞でｐ＝０．０３及び４±３％、ｐ＝０．０００２）（図１９Ｂ）、ＰＶＲ^＋細胞を使用した場合、減少が大きかった（ｐ＝０．０４）。Ａ５４９スフェロイドとの共培養中のＴＩＧＩＴ遮断は、ＰＶＲ^－細胞による再刺激後のＩＦＮγ発現の腫瘍誘導性減少を軽減せず、これは依然としてＩＦＮγを発現する細胞のわずか９±７％であった。対照的に、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞による再刺激は、ＮＫ細胞におけるＩＦＮγ発現を、アイソタイプ対照での３±２％から抗ＴＩＧＩＴでの７±４％まで増加させたが、有意性には達しなかった（ｐ＝０．１）（図１９Ｂ）。加えて、抗ＴＩＧＩＴ抗体が最初の腫瘍共培養物中に存在した場合、ＰＶＲ^－又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞再刺激の間でＩＦＮγ発現に有意差がなくなり、このことは、初期の差がＴＩＧＩＴ依存性であったことを示している。したがって、腫瘍曝露は、ＩＦＮγ生成能力の８０％近くの損失を引き起こし、この損失の約３０％は、ＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ係合に依存する。

【0165】

ＴＮＦαの生成もまた、腫瘍曝露によって悪影響を受け、その減少の大部分は、ＴＩＧＩＴ／ＰＶＲ軸によって引き起こされた。Ｋ５６２細胞による曝露されていないＰＭ２１－ＮＫ細胞の刺激は、刺激されていない細胞と比較して、ＴＮＦα^＋ＮＫ細胞の頻度の増加をもたらした（ＰＶＲ^－Ｋ５６２細胞刺激時に４±１％対２９±５％、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞ではｐ＜０．０００１及び４％対２８±３％、ｐ＜０．０００１）（図１９Ｂ）。曝露されていない細胞と比較して、アイソタイプ対照又は抗ＴＩＧＩＴ抗体のいずれかの存在下でのＡ５４９腫瘍曝露は、ＰＶＲ^－Ｋ５６２細胞再刺激に応答して誘導されたＴＮＦα^＋ＮＫ細胞の頻度の変化をもたらさなかった（アイソタイプ対照の存在下で２７±６％、抗ＴＩＧＩＴ抗体では３０±８％）（図１９Ｂ）。しかしながら、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞による再刺激は、ＰＶＲ^－Ｋ５６２細胞再刺激と比較して（ＰＶＲ^－細胞での２７±６％対ＰＶＲ^＋細胞での１５±５％、ｐ＝０．００８）、又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞で刺激された曝露されていないＮＫ細胞と比較して（曝露されていない場合に２８±３％対スフェロイド曝露された場合に１５±５％、ｐ＝０．０００１）、アイソタイプ対照抗体との共培養後のＴＮＦα^＋ＮＫ細胞の頻度が低くなった（図１９Ｂ）。スフェロイド共培養中にＴＩＧＩＴを遮断することで、ＴＮＦα^＋ＮＫ細胞の頻度の減少を防止し、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞で再刺激した後、ＮＫ細胞の２８±７％がＴＮＦαを発現し、曝露していない刺激されたＮＫ細胞（２８±３％）及びＰＶＲ^－Ｋ５６２細胞で刺激された曝露されたＮＫ細胞（２７±６％）と同等の頻度であった（図１９Ｂ）。したがって、ＴＩＧＩＴを遮断することで、ＮＫ細胞のＴＮＦα産生能力を完全に回復させた。

【0166】

ＴＩＧＩＴ遮断薬はまた、ＰＶＲ^＋細胞再刺激時の腫瘍共培養後に脱顆粒化するＰＭ２１－ＮＫ細胞の能力の大部分を回復させた。脱顆粒化のマーカーである表面ＣＤ１０７ａの発現は、Ｋ５６２細胞による刺激時に曝露されていないＰＭ２１－ＮＫ細胞において増加し、脱顆粒化ＣＤ１０７ａ^＋ＮＫ細胞の頻度は、ＰＶＲ^－Ｋ５６２細胞により刺激されたときに、刺激されていない場合での６±３％から５３±９％に増加し（ｐ＜０．０００１）、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞刺激後に４４±５％に増加した（ｐ＜０．０００１）（図１９Ｂ）。アイソタイプ対照抗体の存在下での腫瘍共培養は、Ｋ５６２細胞による再刺激時にＣＤ１０７ａ^＋ＮＫ細胞の頻度を減少させ（ＰＶＲ^－では３７±５％、ｐ＝０．００４及び１９±８％ ＰＶＲ^＋、ｐ＜０．０００１）、ＰＶＲ^－細胞と比較して、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞の場合に、減少がより大きい（ｐ＝０．００５）。腫瘍共培養中のＴＩＧＩＴ遮断は、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２で再刺激されたＮＫ細胞のＣＤ１０７ａ発現のみを回復させ、アイソタイプ対照条件と比較して、ＣＤ１０７ａ^＋ＮＫ細胞の頻度の増加をもたらし（ＴＩＧＩＴ遮断の場合に４１％対アイソタイプ対照では１９％、ｐ＜０．０００１）、ＣＤ１０７ａ^＋ＮＫ細胞の頻度は、ＰＶＲ^－Ｋ５６２で再刺激されたＮＫ細胞で観察されたものと同等であり、ＴＩＧＩＴ遮断後も変化しないままであった（ＰＶＲ^＋細胞再刺激での４１％対３９％ ＰＶＲ^－細胞再刺激）。

【0167】

要約すると、腫瘍上のＮＫ細胞の疲弊の証拠が観察され、Ｋ５６２細胞による曝露されていないＮＫ細胞の刺激と比較して、Ｋ５６２細胞による再刺激後に、ＩＦＮγ、ＴＮＦαを産生するＮＫ細胞の頻度の減少、及び脱顆粒がもたらされ、これらの減少は、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞で再刺激されたときに、より大きかった。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、腫瘍曝露されたＰＭ２１－ＮＫ細胞におけるＰＶＲ^＋細胞による再刺激時に、ＩＦＮγ、ＴＮＦαを産生し、ＣＤ１０７ａを脱顆粒化するＮＫ細胞の能力を、ＰＶＲ^－Ｋ５６２細胞による再刺激に匹敵するレベルまで回復させたか、又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞で刺激された曝露されていないＮＫ細胞について観察されたレベルまで回復させた。

【0168】

曝露後のＰＭ２１－ＮＫ細胞のエフェクター機能に対するＴＩＧＩＴ遮断薬の保護効果が転写レベルで生じるかどうかを決定するために、ＮＫ細胞をＡ５４９スフェロイドと７日間共培養した後に選択し、シーケンシング及びトランスクリプトーム分析のためにＲＮＡを抽出した（図１９Ａに示される概略図）。遺伝子セット濃縮分析により、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、ＮＦｋＢを介したＴＮＦαシグナル伝達、炎症応答、ＩＦＮγ応答、及びＩＦＮα応答遺伝子セットを含むホールマーク遺伝子セットを上方調節することが明らかになった（図１９Ｃ）。トランスクリプトーム内のこれらの濃縮は、Ａ５４９共培養後のＴＩＧＩＴ遮断時のＰＭ２１－ＮＫ細胞のより活性化された状態（５７）を示す。まとめると、機能分析及びトランスクリプトーム分析からのこれらの観察は、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、がん細胞スフェロイドへの長期曝露後にＰＶＲ陽性がん細胞に対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の抗腫瘍機能を回復させることを示す。

【0169】

エクスビボ拡大されたＮＫ細胞は、それらの広範な抗腫瘍機能に起因して、有望ながん免疫療法プラットフォームとして出現した。以前の臨床試験は、エクスビボ拡大されたＮＫ細胞及びＣＡＲ－ＮＫ細胞が、ＧＶＨＤの誘導を伴わないがん療法として安全であることを示した。しかしながら、ＮＫ細胞は、腫瘍微小環境におけるがん細胞によってＮＫ細胞の抗腫瘍活性を抑制するために利用可能であり、ＮＫ細胞ベースのがん免疫療法の有効性を制限し得るＴＩＧＩＴなどの複数の阻害性受容体を発現する。したがって、阻害性受容体シグナル伝達を理解し、治療的遮断戦略を開発することは、抗腫瘍応答を更に改善する可能性がある。

【0170】

以前の研究では、ＴＩＧＩＴシグナル伝達が、がん免疫サイクルの複数の工程を調節し、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、前臨床試験で腫瘍成長及び生存率を有意に低下させることが示された。ＴＩＧＩＴ^＋ＮＫ細胞は、いくつかのがんにおいて、より疲弊した表現型を示し、ＴＩＧＩＴの遮断薬は、がん細胞に対するＮＫ細胞の抗腫瘍活性を改善する。ＴＩＧＩＴ遮断薬の効果に関する研究は、これまでのところ前臨床マウスモデルに限定されており、ヒトＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴ遮断薬を特性決定する機構的インビトロ研究は限られている。この研究では、エクスビボ拡大されたＰＭ２１－ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断の効果を特性決定し、ＮＫ細胞の疲弊のための新規のインビトロモデルで試験した。

【0171】

ＴＩＧＩＴは、ＰＭ２１－ＮＫ細胞の表面上で高度に発現されることが発見された。ＰＭ２１－ＮＫ細胞だけでなく、ＩＬ－２又はＩＬ－１２／１５／１８で活性化されたＮＫ細胞も、ＴＩＧＩＴ発現を上方調節する。このことは、ＴＩＧＩＴが、ＮＫ細胞活性化のマーカーであることを示す。以前の研究では、ＩＬ－１５刺激がＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴ発現を増加させるという類似の所見が報告された。表現型分析により、ＴＩＧＩＴ^＋ＰＭ２１－ＮＫ細胞は、ＴＩＧＩＴの発現が拡大によるＮＫ細胞の活性化の結果であることを更に裏付ける、より高いレベルの他の阻害性受容体及び活性化受容体を発現することが明らかになった。驚くべきことに、ＴＩＧＩＴ遮断薬は、短期間アッセイにおいて、ＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性に影響を及ぼさなかった。このことは、短期間には、ＤＮＡＭ－１－ＰＶＲによって引き起こされる活性化が、ＰＭ２１－ＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴ阻害性シグナル伝達を圧倒することを示す。腫瘍環境におけるＴＩＧＩＴの慢性刺激をより良く模倣し、その遮断を評価するために、細胞傷害性アッセイを、腫瘍スフェロイドを使用して実行した。ＴＩＧＩＴ遮断薬は、複数の肺がんスフェロイドに対するＰＭ２１－ＮＫ細胞の細胞傷害性を改善した。このことは、腫瘍スフェロイドへの長期間曝露中に、ＴＩＧＩＴシグナル伝達がＮＫ細胞媒介性死滅を阻害することができることを示す。腫瘍への長期間曝露後のＮＫ細胞のエフェクター機能に対するＴＩＧＩＴシグナル伝達の効果を更に特性決定するために、インビトロ疲弊モデルが開発された。抗ＴＩＧＩＴ又はアイソタイプ対照抗体を用いてＡ５４９腫瘍スフェロイドに７日間曝露した後、ＰＭ２１－ＮＫ細胞を、ＰＶＲ^－又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞のいずれかで再チャレンジして、各エフェクター機能の低下に対するＰＶＲ／ＴＩＧＩＴ軸の寄与を識別した。このモデルから、ＮＫ細胞の疲弊の徴候は、再曝露時の表面ＣＤ１０７ａ発現によって測定されるように、エフェクターサイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦαの発現の減少、並びに脱顆粒の減少によって明らかであり、ＴＩＧＩＴがＮＫ細胞の疲弊の主要であるが唯一の寄与因子ではないことを示す慢性ＴＩＧＩＴ係合の結果とは異なる程度までであった。再刺激時のＴＮＦα発現の減少は、腫瘍曝露されたＮＫ細胞をＰＶＲ^＋細胞で再チャレンジしたときにのみ観察され、その効果は、ＴＩＧＩＴ遮断薬によって完全に緩和された。このことは、このモデルで観察されるＴＮＦα発現の減少が主にＴＩＧＩＴによって引き起こされることを示す。対照的に、腫瘍曝露されたＮＫ細胞におけるＩＦＮγ及びＣＤ１０７ａ発現は、ＰＶＲ^－及びＰＶＲ^＋再刺激の両方に応答して減少した発現を示し、このことは、腫瘍曝露中の更なる機構が、ＩＦＮγ産生及び脱顆粒の欠損につながったことを示している。しかしながら、ＴＩＧＩＴ遮断薬は、ＰＶＲ^－細胞への応答に匹敵するレベルまで、完全に発現レベルを回復させた。注目すべきことに、曝露されていないＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴ遮断は、ＰＶＲ^－又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞のいずれかでの刺激時に、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、又はＣＤ１０７ａの発現に影響を及ぼさなかった（図２２Ａ）。ＰＶＲ^－又はＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞に対する細胞傷害性に対する効果はいずれも観察されなかった（図２２Ｂ）。実際の回復効果は、ＮＫ細胞をＰＶＲ^＋がん細胞で再刺激したときの長期間曝露モデルにおいてのみ見られ、ＴＩＧＩＴ係合に対する感作が、腫瘍スフェロイド曝露の間に生じることを示す。

【0172】

長期間曝露時のエフェクター機能の低下が観察されたが、曝露されていないＰＭ２１－ＮＫ細胞と比較して、ＰＭ２１－ＮＫ細胞は、ＰＶＲ^＋Ｋ５６２細胞による再刺激時に脱顆粒及びＴＮＦαを産生する細胞が５０％少ない状態で、依然としていくつかの細胞傷害性機能を保持していた。要約すると、これにより、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、腫瘍に曝露されたＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴによって引き起こされる疲弊を軽減するための有効なアプローチであり、ＰＶＲ^＋がん細胞に対するエフェクター機能を保持することができることが示された。Ａ５４９スフェロイドへの曝露後のＮＫ細胞のトランスクリプトーム分析により、ＴＩＧＩＴ遮断が、炎症応答及びＴＮＦαシグナル伝達に関与する遺伝子セットを上方調節することを確認し、これらのＮＫ細胞のより活性化された状態が示された。

【0173】

以前の研究は、がん細胞が、ＰＤ－１シグナル伝達遮断に対する耐性を獲得し、Ｔ細胞上のＴＩＧＩＴを上方調節し得ることを示した。この所見は、更なる耐性に関与する代替受容体を見つけるために、ＰＭ２１－ＮＫ細胞のＴＩＧＩＴ遮断後の表現型変化を調べることが重要であることを示す。興味深いことに、長期間スフェロイドモデルでのＴＩＧＩＴ遮断時に、ＰＭ２１－ＮＫ細胞上の活性化受容体及び阻害性受容体の有意な変化はなかった。これらの観察は、ＰＤ－１シグナル伝達とは異なり、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断が、代替の耐性機構を獲得する可能性が低いことを示す。複数のマウスモデルにおける研究は、ＴＩＧＩＴ遮断薬が、ＮＫ及びＴ細胞の両方の疲弊を防止することができることを示した。抗ＴＩＧＩＴ抗体の有効性は、ＮＫ細胞に依存し、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増強した。したがって、養子ＮＫ細胞は、頻繁にＮＫ細胞コンパートメントを欠くがん患者において、がん細胞に対する全体的なＴ細胞免疫応答を高めることによって、抗ＴＩＧＩＴ抗体の有効性を更に改善し得る。

【0174】

要約すると、この研究は、エクスビボ拡大されたヒトＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴ遮断の分子機構への洞察を提供する。抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＰＭ２１－ＮＫ細胞腫瘍免疫及び養子ＰＭ２１－ＮＫ細胞の有効性を有意に改善することができ、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、肺腫瘍などのがんに対する併用療法として使用することができる。

【0175】

実施例７。ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞は、肺がん細胞に対する増強された細胞傷害性を有し、治療用ＴＩＧＩＴ抗体と組み合わせてフラトリサイドに耐性である。
ＴＩＧＩＴ遮断薬は、がん治療への新しいアプローチを有望にしており、現在、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断と組み合わせて後期段階の臨床開発を受けている。前臨床試験は、ＴＩＧＩＴ抗体の抗腫瘍応答におけるＮＫ細胞の関与を示した。更に、マウス研究は、ＴＩＧＩＴを標的とする治療抗体にＡＤＣＣコンピテントＦｃを含めることが、ＴＩＧＩＴ＋Ｔｒｅｇの枯渇及び／又はＦｃγ係合を介した骨髄細胞の活性化を介して起こり得る抗腫瘍応答にとって重要であることを示した。したがって、現在開発中の治療用抗ＴＩＧＩＴ抗体の大部分は、ＡＤＣＣにコンピテントであり、いくつかは更に最適化されたＦｃを有する。チラゴルマブ（Ｆｃコンピテント、Ｒｏｃｈｅ）を用いた初期の臨床試験は、ＴＩＧＩＴが、抗ＰＤ－Ｌ１単独（アテゾリズマブ）と比較して、奏効率及び奏効期間を有意に増加させるが、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞の頻度が高い（＞５０％）腫瘍を有する患者に限ることを示した。初期の結果は非常に有望であったが、チラゴルマブは、ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣにおける第３相試験で失敗した。

【0176】

活性化されたＮＫ細胞の大部分は、活性化時に高レベルのＴＩＧＩＴを発現する。活性化されたＮＫ細胞は、腫瘍に応答し、標的腫瘍上でＰＤ－Ｌ１の誘導をもたらすＩＦＮγを分泌する。したがって、ＴＩＧＩＴ遮断及びＰＤ－Ｌ１の誘導を介した活性化されたＮＫ細胞の存在は、ＰＤ－（Ｌ）１／ＴＩＧＩＴ遮断の組み合わせに対する増強された応答をもたらすはずである。しかし、活性化されたＮＫ細胞上で高度に発現されるＴＩＧＩＴへのＡＤＣＣコンピテント抗体の結合はまた、フラトリサイド及びＮＫ細胞の枯渇を引き起こす場合がある。したがって、養子移植前のＮＫ細胞におけるＴＩＧＩＴのノックアウトは、Ｆｃコンピテント抗ＴＩＧＩＴ治療薬と併用される場合、腫瘍のＮＫ細胞死滅を増加させるだけでなく、ＮＫ細胞のフラトリサイドを防止することができる。

【0177】

ＮＫ細胞フラトリサイドに対するＦｃコンピテントＴＩＧＩＴ抗体の効果を評価する。以前の研究では、抗ＴＩＧＩＴ抗体の有効性は、ＴＩＧＩＴ発現Ｔｒｅｇ細胞のＦｃ依存性の疲弊によるものであることを調べた。ＰＭ２１ ＮＫ細胞は、ＴＩＧＩＴを高度に発現するため、Ｆｃコンピテント抗ＴＩＧＩＴ抗体が、ＰＭ２１ ＮＫ細胞フラトリサイドを誘導するかどうかを試験した。この実験では、ＰＭ２１ ＮＫ細胞及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞を、Ｆｃコンピテント抗ＴＩＧＩＴ抗体（実験用）、Ｆｃコンピテントでない抗ＴＩＧＩＴ抗体、並びにＦｃコンピテント抗ＣＤ３８（陽性対照）とインキュベートして、絶対生存ＮＫ細胞を決定して、フラトリサイド効果を理解した。ＰＭ２１ ＮＫ細胞単独を陰性対照として使用することができる。図９及び１０は、Ｆｃコンピテント（ヒト化）ＴＩＧＩＴ抗体（チラゴルマブ）が、ＰＭ２１ ＮＫ細胞の中程度のフラトリサイドを誘導することができるが、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１ ＮＫ細胞については誘導することができないことを示す。

【0178】

図３１Ａに示されるように、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞を、非Ｆｃコンピテント抗ＴＩＧＩＴ及びＦｃコンピテント抗ＴＩＧＩＴ抗体（チラゴルマブ）と２４時間共培養した。ＮＫ細胞をＤｉｏｃ６及びＤｒａｑ７で染色して、生存可能なＮＫ細胞をカウントした。チラゴルマブは、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞に対して有意なフラトリサイドを誘導したが、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞に対しては誘導しなかった（Ｎ＝３ドナー、各々３つの複製物）。データは、標準偏差を表す誤差バーを伴う散布図又は棒グラフとして提示される。統計的有意性を、複数の対応のないｔ検定によって決定した。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊、ｐ＜０．０１である場合に＊＊、ｐ＜０．００１である場合に＊＊＊、ｐ＜０．０００１である場合に＊＊＊＊として示す。図３１Ｂ）拡大されたＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞及びＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞（３３３３ＮＫ細胞／ウェル）を、非Ｆｃコンピテント抗ＴＩＧＩＴ抗体又はＦｃコンピテント抗ＴＩＧＩＴ抗体（チラゴルマブ）を伴い、又は伴わずに、Ａ５４９スフェロイドと７日間共培養した。ＮＫ細胞の細胞傷害性を、動的生存細胞イメージングによって決定した。概要のプロットは、ＷＴ ＰＭ２１－ＮＫ細胞が、非Ｆｃコンピテント抗ＴＩＧＩＴ抗体（塗りつぶされた青色の四角）と比較して、Ｆｃコンピテント抗ＴＩＧＩＴ抗体（塗りつぶされた赤色の三角）の存在下で、Ａ５４９スフェロイドに対する有意に低い細胞傷害性を示し、非Ｆｃ及びＦｃコンピテント抗ＴＩＧＩＴ抗体の存在下で、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＰＭ２１－ＮＫ細胞に有意な変化はなかったことを示す（Ｎ＝３ドナー、各々３つの複製物）。データは、標準偏差を表す誤差バーを伴う散布図又は棒グラフとして提示される。統計的有意性を、複数の対応のないｔ検定によって決定した。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊、ｐ＜０．０１である場合に＊＊、ｐ＜０．００１である場合に＊＊＊、ｐ＜０．０００１である場合に＊＊＊＊として示す。

【0179】

ＴＩＧＩＧ ＫＯ ＮＫ細胞が改善されたインビボ持続性を示したかどうかを試験するために、１×１０^６個の肺がん細胞株ＮＣＩ－Ｈ３５８－ＧＦＰ－ｌｕｃ又はＮＣＩ－Ｈ１２９９－ＧＦＰ－ｌｕｃを、ＮＳＧ（ＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ－２Ｒγヌル）メスマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）の腔に注射し、３日間播種させた。次いで、マウスを、１名のドナーからのＷＴ又はＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞で治療し、ＩＬ－２（２５，０００Ｕ、３回／週）とともにｉ．ｐ．注射した。ＮＫ細胞注射の１２日後にマウスを安楽死させた。腹部洗浄を、ｈＣＤ４５^＋細胞上でゲーティングするフローサイトメトリーによって分析した。ｈＣＤ４５^＋集団において、ｈＮＫ（ＣＤ３^－、ＣＤ５６^＋）の割合を決定した。Ｈ３５８又はＨ１２９９のいずれかの肺腫瘍細胞を注射したマウスからのＷＴ ＮＫ細胞（黒色の丸）と比較して、ＴＩＧＩＴ ＫＯ ＮＫ細胞（赤色の三角）で治療されたマウスからより多くのＮＫ細胞を回収し、Ｈ３５８を有するマウスは、統計的有意性に達した（図３２）。統計的有意性を、対応のないｔ検定によって決定した。Ｐ値を、ｐ＜０．０５である場合に＊として示す。

【0180】

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１１．Ｍａｎｉｅｒｉ ＮＡ，Ｃｈｉａｎｇ ＥＹ，Ｇｒｏｇａｎ ＪＬ．ＴＩＧＩＴ：Ａ Ｋｅｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｃｙｃｌｅ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１７ Ｊａｎ １；３８（１）：２０－８．ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｉｔ．２０１６．１０．００２から利用可能
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１３．Ｚｈａｎｇ Ｑ，Ｂｉ Ｊ，Ｚｈｅｎｇ Ｘ，Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｗｕ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＴＩＧＩＴ ｐｒｅｖｅｎｔｓ ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｌｉｃｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１８；１９（７）：７２３－３２．
１４．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ａｂｒｅｕ Ｄ，Ｊｏｈｎｓｏｎ ＭＬ，Ｈｕｓｓｅｉｎ ＭＡ，Ｃｏｂｏ Ｍ，Ｐａｔｅｌ ＡＪ，Ｓｅｃｅｎ ＮＭ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｉｍａｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄ，ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ－ＴＩＧＩＴ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ（ｔｉｒａ）ｐｌｕｓ ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ（ａｔｅｚｏ）ｖｅｒｓｕｓ ｐｌａｃｅｂｏ ｐｌｕｓ ａｔｅｚｏ ａｓ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ（１Ｌ）ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＰＤ－Ｌ１－ｓｅｌｅｃｔｅｄ ＮＳＣＬＣ（ＣＩＴＹＳＣＡＰＥ）．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０２０ Ｍａｙ ２０；３８（１５＿ｓｕｐｐｌ）：９５０３．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１２００／ＪＣＯ．２０２０．３８．１５＿ｓｕｐｐｌ．９５０３
１５．Ｙａｎｇ Ｆ，Ｚｈａｏ Ｌ，Ｗｅｉ Ｚ，Ｙａｎｇ Ｙ，Ｌｉｕ Ｊ，Ｌｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ａ Ｃｒｏｓｓ－Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＴＩＧＩＴ－Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ Ｃｏｎｆｅｒｓ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２０；２０５（８）：２１５６－６８．
１６．Ｐｒｅｉｌｌｏｎ Ｊ，Ｃｕｅｎｄｅ Ｊ，Ｒａｂｏｌｌｉ Ｖ，Ｇａｒｎｅｒｏ Ｌ，Ｍｅｒｃｉｅｒ Ｍ，Ｗａｌｄ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔ－ｃｅｌｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｅｇｓ，ａｎｄ ｄｉｒｅｃｔ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ－ｔｉｇｉｔ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０２１；２０（１）：１２１－３１．
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１８．Ｄａｈｅｒ Ｍ，Ｒｅｚｖａｎｉ Ｋ．Ｏｕｔｌｏｏｋ ｆｏｒ ｎｅｗ ｃａｒ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｃａｒ ｎｋ ｃｅｌｌｓ：Ｗｈａｔ ｌｉｅｓ ｂｅｙｏｎｄ ｃａｒ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０２１；１１（１）：４５－５８．
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２０．Ｌａｎｉｅｒ ＬＬ．Ｕｐ ｏｎ ｔｈｅ ｔｉｇｈｔｒｏｐｅ：Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；９（５）：４９５－５０２．
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２２．Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｃｏｒｒｅａ Ｂ，Ｖａｌｈｏｎｄｏ Ｉ，Ｈａｓｓｏｕｎｅｈ Ｆ，Ｌｏｐｅｚ－Ｓｅｊａｓ Ｎ，Ｐｅｒａ Ａ，Ｂｅｒｇｕａ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．ＤＮＡＭ－１ ａｎｄ ｔｈｅ ＴＩＧＩＴ／ＰＶＲＩＧ／ＴＡＣＴＩＬＥ ａｘｉｓ：Ｎｏｖｅｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｖｏｌ．１１，Ｃａｎｃｅｒｓ．２０１９．ｐ．１－１５．
２３．Ｓｅｌｖａｎ ＳＲ，Ｄｏｗｌｉｎｇ ＪＰ．“ａｄｈｅｒｅｎｔ”ｖｅｒｓｕｓ Ｏｔｈｅｒ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ，Ｐｏｔｅｎｔ，ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１５；２０１５（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ）．
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２５．Ｏｙｅｒ ＪＬ，Ｇｉｔｔｏ ＳＢ，Ａｌｔｏｍａｒｅ ＤＡ，Ｃｏｐｉｋ ＡＪ．ＰＤ－Ｌ１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１８；７（１１）：１－１１．
２６．Ｈａｎ ＪＨ，Ｃａｉ Ｍ，Ｇｒｅｉｎ Ｊ，Ｐｅｒｅｒａ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｂｉｇｌｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ＴＩＧＩＴ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｗｉｔｈ ＦｃγＲ Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０２０；１１（Ｏｃｔｏｂｅｒ）：１－１４．
２７．Ｄｏｌｇｉｎ Ｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ ｓｅｅｋ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｒｕｇ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＴＩＧＩＴ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２０；３８（９）：１００７－９．
２８．Ｗｕ Ｊ，Ｍｉｓｈｒａ ＨＫ，Ｗａｌｃｈｅｃｋ Ｂ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ＡＤＡＭ１７ ａｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｏｆ ＣＤ１６Ａ ｉｎ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．２０１９；１０５（６）：１２９７－３０３．
２９．Ｂｒｕｈｎｓ Ｐ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（２４）：５６４０－９．
３０．Ｗａｌｃｈｅｃｋ Ｂ，ＷｕＪ．ｉＮＫ－ＣＤ６４／１６Ａ ｃｅｌｌｓ：ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ＡＤＣＣ？Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ［Ｉｎｔｅｒｎｅｔ］．２０１９；１９（１２）：１２２９－３２．

【0181】

配列
配列番号１（ＴＩＧＩＴのポリペプチド配列）
ＭＲＷＣＬＬＬＩＷＡＱＧＬＲＱＡＰＬＡＳＧＭＭＴＧＴＩＥＴＴＧＮＩＳＡＥＫＧＧＳＩＩＬＱＣＨＬＳＳＴＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨＩＳＰＳＦＫＤＲＶＡＰＧＰＧＬＧＬＴＬＱＳＬＴＶＮＤＴＧＥＹＦＣＩＹＨＴＹＰＤＧＴＹＴＧＲＩＦＬＥＶＬＥＳＳＶＡＥＨＧＡＲＦＱＩＰＬＬＧＡＭＡＡＴＬＶＶＩＣＴＡＶＩＶＶＶＡＬＴＲＫＫＫＡＬＲＩＨＳＶＥＧＤＬＲＲＫＳＡＧＱＥＥＷＳＰＳＡＰＳＰＰＧＳＣＶＱＡＥＡＡＰＡＧＬＣＧＥＱＲＧＥＤＣＡＥＬＨＤＹＦＮＶＬＳＹＲＳＬＧＮＣＳＦＦＴＥＴＧ
配列番号２（ＰＶＲＩＧのポリペプチド配列）
ＭＲＴＥＡＱＶＰＡＬＱＰＰＥＰＧＬＥＧＡＭＧＨＲＴＬＶＬＰＷＶＬＬＴＬＣＶＴＡＧＴＰＥＶＷＶＱＶＲＭＥＡＴＥＬＳＳＦＴＩＲＣＧＦＬＧＳＧＳＩＳＬＶＴＶＳＷＧＧＰＮＧＡＧＧＴＴＬＡＶＬＨＰＥＲＧＩＲＱＷＡＰＡＲＱＡＲＷＥＴＱＳＳＩＳＬＩＬＥＧＳＧＡＳＳＰＣＡＮＴＴＦＣＣＫＦＡＳＦＰＥＧＳＷＥＡＣＧＳＬＰＰＳＳＤＰＧＬＳＡＰＰＴＰＡＰＩＬＲＡＤＬＡＧＩＬＧＶＳＧＶＬＬＦＧＣＶＹＬＬＨＬＬＲＲＨＫＨＲＰＡＰＲＬＱＰＳＲＴＳＰＱＡＰＲＡＲＡＷＡＰＳＱＡＳＱＡＡＬＨＶＰＹＡＴＩＮＴＳＣＲＰＡＴＬＤＴＡＨＰＨＧＧＰＳＷＷＡＳＬＰＴＨＡＡＨＲＰＱＧＰＡＡＷＡＳＴＰＩＰＡＲＧＳＦＶＳＶＥＮＧＬＹＡＱＡＧＥＲＰＰＨＴＧＰＧＬＴＬＦＰＤＰＲＧＰＲＡＭＥＧＰＬＧＶＲ
配列番号３（ＣＤ９６のポリペプチド配列）
ＭＥＫＫＷＫＹＣＡＶＹＹＩＩＱＩＨＦＶＫＧＶＷＥＫＴＶＮＴＥＥＮＶＹＡＴＬＧＳＤＶＮＬＴＣＱＴＱＴＶＧＦＦＶＱＭＱＷＳＫＶＴＮＫＩＤＬＩＡＶＹＨＰＱＹＧＦＹＣＡＹＧＲＰＣＥＳＬＶＴＦＴＥＴＰＥＮＧＳＫＷＴＬＨＬＲＮＭＳＣＳＶＳＧＲＹＥＣＭＬＶＬＹＰＥＧＩＱＴＫＩＹＮＬＬＩＱＴＨＶＴＡＤＥＷＮＳＮＨＴＩＥＩＥＩＮＱＴＬＥＩＰＣＦＱＮＳＳＳＫＩＳＳＥＦＴＹＡＷＳＶＥＮＳＳＴＤＳＷＶＬＬＳＫＧＩＫＥＤＮＧＴＱＥＴＬＩＳＱＮＨＬＩＳＮＳＴＬＬＫＤＲＶＫＬＧＴＤＹＲＬＨＬＳＰＶＱＩＦＤＤＧＲＫＦＳＣＨＩＲＶＧＰＮＫＩＬＲＳＳＴＴＶＫＶＦＡＫＰＥＩＰＶＩＶＥＮＮＳＴＤＶＬＶＥＲＲＦＴＣＬＬＫＮＶＦＰＫＡＮＩＴＷＦＩＤＧＳＦＬＨＤＥＫＥＧＩＹＩＴＮＥＥＲＫＧＫＤＧＦＬＥＬＫＳＶＬＴＲＶＨＳＮＫＰＡＱＳＤＮＬＴＩＷＣＭＡＬＳＰＶＰＧＮＫＶＷＮＩＳＳＥＫＩＴＦＬＬＧＳＥＩＳＳＴＤＰＰＬＳＶＴＥＳＴＬＤＴＱＰＳＰＡＳＳＶＳＰＡＲＹＰＡＴＳＳＶＴＬＶＤＶＳＡＬＲＰＮＴＴＰＱＰＳＮＳＳＭＴＴＲＧＦＮＹＰＷＴＳＳＧＴＤＴＫＫＳＶＳＲＩＰＳＥＴＹＳＳＳＰＳＧＡＧＳＴＬＨＤＮＶＦＴＳＴＡＲＡＦＳＥＶＰＴＴＡＮＧＳＴＫＴＮＨＶＨＩＴＧＩＶＶＮＫＰＫＤＧＭＳＷＰＶＩＶＡＡＬＬＦＣＣＭＩＬＦＧＬＧＶＲＫＷＣＱＹＱＫＥＩＭＥＲＰＰＰＦＫＰＰＰＰＰＩＫＹＴＣＩＱＥＰＮＥＳＤＬＰＹＨＥＭＥＴＬ
配列番号４（ＤＮＡＭ－１のポリペプチド配列）
ＭＤＹＰＴＬＬＬＡＬＬＨＶＹＲＡＬＣＥＥＶＬＷＨＴＳＶＰＦＡＥＮＭＳＬＥＣＶＹＰＳＭＧＩＬＴＱＶＥＷＦＫＩＧＴＱＱＤＳＩＡＩＦＳＰＴＨＧＭＶＩＲＫＰＹＡＥＲＶＹＦＬＮＳＴＭＡＳＮＮＭＴＬＦＦＲＮＡＳＥＤＤＶＧＹＹＳＣＳＬＹＴＹＰＱＧＴＷＱＫＶＩＱＶＶＱＳＤＳＦＥＡＡＶＰＳＮＳＨＩＶＳＥＰＧＫＮＶＴＬＴＣＱＰＱＭＴＷＰＶＱＡＶＲＷＥＫＩＱＰＲＱＩＤＬＬＴＹＣＮＬＶＨＧＲＮＦＴＳＫＦＰＲＱＩＶＳＮＣＳＨＧＲＷＳＶＩＶＩＰＤＶＴＶＳＤＳＧＬＹＲＣＹＬＱＡＳＡＧＥＮＥＴＦＶＭＲＬＴＶＡＥＧＫＴＤＮＱＹＴＬＦＶＡＧＧＴＶＬＬＬＬＦＶＩＳＩＴＴＩＩＶＩＦＬＮＲＲＲＲＲＥＲＲＤＬＦＴＥＳＷＤＴＱＫＡＰＮＮＹＲＳＰＩＳＴＳＱＰＴＮＱＳＭＤＤＴＲＥＤＩＹＶＮＹＰＴＦＳＲＲＰＫＴＲＶ
配列番号５（ＬＡＧ３のポリペプチド配列）
ＭＷＥＡＱＦＬＧＬＬＦＬＱＰＬＷＶＡＰＶＫＰＬＱＰＧＡＥＶＰＶＶＷＡＱＥＧＡＰＡＱＬＰＣＳＰＴＩＰＬＱＤＬＳＬＬＲＲＡＧＶＴＷＱＨＱＰＤＳＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳＷＧＰＲＰＲＲＹＴＶＬＳＶＧＰＧＧＬＲＳＧＲＬＰＬＱＰＲＶＱＬＤＥＲＧＲＱＲＧＤＦＳＬＷＬＲＰＡＲＲＡＤＡＧＥＹＲＡＡＶＨＬＲＤＲＡＬＳＣＲＬＲＬＲＬＧＱＡＳＭＴＡＳＰＰＧＳＬＲＡＳＤＷＶＩＬＮＣＳＦＳＲＰＤＲＰＡＳＶＨＷＦＲＮＲＧＱＧＲＶＰＶＲＥＳＰＨＨＨＬＡＥＳＦＬＦＬＰＱＶＳＰＭＤＳＧＰＷＧＣＩＬＴＹＲＤＧＦＮＶＳＩＭＹＮＬＴＶＬＧＬＥＰＰＴＰＬＴＶＹＡＧＡＧＳＲＶＧＬＰＣＲＬＰＡＧＶＧＴＲＳＦＬＴＡＫＷＴＰＰＧＧＧＰＤＬＬＶＴＧＤＮＧＤＦＴＬＲＬＥＤＶＳＱＡＱＡＧＴＹＴＣＨＩＨＬＱＥＱＱＬＮＡＴＶＴＬＡＩＩＴＶＴＰＫＳＦＧＳＰＧＳＬＧＫＬＬＣＥＶＴＰＶＳＧＱＥＲＦＶＷＳＳＬＤＴＰＳＱＲＳＦＳＧＰＷＬＥＡＱＥＡＱＬＬＳＱＰＷＱＣＱＬＹＱＧＥＲＬＬＧＡＡＶＹＦＴＥＬＳＳＰＧＡＱＲＳＧＲＡＰＧＡＬＰＡＧＨＬＬＬＦＬＩＬＧＶＬＳＬＬＬＬＶＴＧＡＦＧＦＨＬＷＲＲＱＷＲＰＲＲＦＳＡＬＥＱＧＩＨＰＰＱＡＱＳＫＩＥＥＬＥＱＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＰＥＱ
配列番号６（ＰＤ－１のポリペプチド配列）
ＭＱＩＰＱＡＰＷＰＶＶＷＡＶＬＱＬＧＷＲＰＧＷＦＬＤＳＰＤＲＰＷＮＰＰＴＦＳＰＡＬＬＶＶＴＥＧＤＮＡＴＦＴＣＳＦＳＮＴＳＥＳＦＶＬＮＷＹＲＭＳＰＳＮＱＴＤＫＬＡＡＦＰＥＤＲＳＱＰＧＱＤＣＲＦＲＶＴＱＬＰＮＧＲＤＦＨＭＳＶＶＲＡＲＲＮＤＳＧＴＹＬＣＧＡＩＳＬＡＰＫＡＱＩＫＥＳＬＲＡＥＬＲＶＴＥＲＲＡＥＶＰＴＡＨＰＳＰＳＰＲＰＡＧＱＦＱＴＬＶＶＧＶＶＧＧＬＬＧＳＬＶＬＬＶＷＶＬＡＶＩＣＳＲＡＡＲＧＴＩＧＡＲＲＴＧＱＰＬＫＥＤＰＳＡＶＰＶＦＳＶＤＹＧＥＬＤＦＱＷＲＥＫＴＰＥＰＰＶＰＣＶＰＥＱＴＥＹＡＴＩＶＦＰＳＧＭＧＴＳＳＰＡＲＲＧＳＡＤＧＰＲＳＡＱＰＬＲＰＥＤＧＨＣＳＷＰＬ
配列番号７（ＣＴＬＡ－４のポリペプチド配列）
ＭＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＬＮＬＡＴＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＬＬＦＩＰＶＦＣＫＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥＰＣＰＤＳＤＦＬＬＷＩＬＡＡＶＳＳＧＬＦＦＹＳＦＬＬＴＡＶＳＬＳＫＭＬＫＫＲＳＰＬＴＴＧＶＹＶＫＭＰＰＴＥＰＥＣＥＫＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ
配列番号８（ＴＩＭ－３のポリペプチド配列）
ＭＦＳＨＬＰＦＤＣＶＬＬＬＬＬＬＬＬＴＲＳＳＥＶＥＹＲＡＥＶＧＱＮＡＹＬＰＣＦＹＴＰＡＡＰＧＮＬＶＰＶＣＷＧＫＧＡＣＰＶＦＥＣＧＮＶＶＬＲＴＤＥＲＤＶＮＹＷＴＳＲＹＷＬＮＧＤＦＲＫＧＤＶＳＬＴＩＥＮＶＴＬＡＤＳＧＩＹＣＣＲＩＱＩＰＧＩＭＮＤＥＫＦＮＬＫＬＶＩＫＰＡＫＶＴＰＡＰＴＲＱＲＤＦＴＡＡＦＰＲＭＬＴＴＲＧＨＧＰＡＥＴＱＴＬＧＳＬＰＤＩＮＬＴＱＩＳＴＬＡＮＥＬＲＤＳＲＬＡＮＤＬＲＤＳＧＡＴＩＲＩＧＩＹＩＧＡＧＩＣＡＧＬＡＬＡＬＩＦＧＡＬＩＦＫＷＹＳＨＳＫＥＫＩＱＮＬＳＬＩＳＬＡＮＬＰＰＳＧＬＡＮＡＶＡＥＧＩＲＳＥＥＮＩＹＴＩＥＥＮＶＹＥＶＥＥＰＮＥＹＹＣＹＶＳＳＲＱＱＰＳＱＰＬＧＣＲＦＡＭＰ
配列番号９（ＮＫＧ２Ａのポリペプチド配列）
ＭＤＮＱＧＶＩＹＳＤＬＮＬＰＰＮＰＫＲＱＱＲＫＰＫＧＮＫＮＳＩＬＡＴＥＱＥＩＴＹＡＥＬＮＬＱＫＡＳＱＤＦＱＧＮＤＫＴＹＨＣＫＤＬＰＳＡＰＥＫＬＩＶＧＩＬＧＩＩＣＬＩＬＭＡＳＶＶＴＩＶＶＩＰＳＴＬＩＱＲＨＮＮＳＳＬＮＴＲＴＱＫＡＲＨＣＧＨＣＰＥＥＷＩＴＹＳＮＳＣＹＹＩＧＫＥＲＲＴＷＥＥＳＬＬＡＣＴＳＫＮＳＳＬＬＳＩＤＮＥＥＥＭＫＦＬＳＩＩＳＰＳＳＷＩＧＶＦＲＮＳＳＨＨＰＷＶＴＭＮＧＬＡＦＫＨＥＩＫＤＳＤＮＡＥＬＮＣＡＶＬＱＶＮＲＬＫＳＡＱＣＧＳＳＩＩＹＨＣＫＨＫＬ
配列番号１０（ＴＩＧＩＴのポリヌクレオチド配列、参照配列ＮＭ＿１７３７９９）
ＡＣＡＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＴＡＧＧＣＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＡＡＧＣＡＴＧＣＧＣＴＧＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣＧＣＣＴＣＡＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＣＡＣＡＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡＣＧＧＧＧＡＡＣＡＴＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＡＴＣＡＴＣＴＴＡＣＡＡＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＡＣＡＡＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＣＡＴＴＴＧＴＡＡＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＧＧＧＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＧＧＡＴＣＧＡＧＴＧＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＣＣＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＣＡＣＣＣＴＣＣＡＧＴＣＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＡＴＡＣＡＧＧＧＧＡＧＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＴＣＴＡＴＣＡＣＡＣＣＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＴＡＣＡＣＴＧＧＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＴＡＧＡＡＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧＡＧＣＡＣＧＧＴＧＣＣＡＧＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＴＴＧＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＣＧＡＣＧＣＴＧＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＴＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＣＧＴＴＧＡＣＴＡＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＧＡＡＴＣＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＴＣＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＣＴＧＴＧＣＣＧＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＴＧＴＣＣＴＧＡＧＴＴＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＴＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＡＣＡＧＡＧＡＣＴＧＧＴＴＡＧＣＡＡＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＡＴＴＡＴＡＧＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＣＴＧＴＡＣＴＣＴＣＣＡＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＴＴＧＡＧＴＧＡＡＴＡＡＡＴＧＴＣＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＣＴＴＴＴＣＧＴＴＣＴＡＴＴＣＣＡＴＴＴＴＧＣＡＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣＴＡＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＣＧＴＧＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＡＴＡＡＡＴＧＣＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＴＧＡＣＣＴＧＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＴＧＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＡＴＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＧＡＣＡＣＡＴＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＡＣＡＡＧＧＴＴＴＴＧＴＧＧＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＣＡＴＧＡＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＡＣＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＧＴＡＡＣＴＴＴＣＡＣＴＣＡＴＴＣＡＡＡＧＧＣＡＧＧＴＴＡＴＡＡＧＴＡＡＧＴＣＣＴＧＧＴＡＧＣＡＧＣＣＴＣＴＡＴＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＧＡＧＡＧＴＧＡＣＴＡＡＡＴＣＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＣＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＡＣＡＧＴＴＡＡＡＴＧＧＧＧＡＧＡＣＡＡＴＧＴＴＧＴＣＡＴＧＡＡＡＡＧＧＴＡＴＴＡＴＡＧＴＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＴＡＣＡＣＡＧＧＣＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＡＧＡＣＧＡＣＡＧＴＴＴＧＧＧＧＴＧＡＧＧＴＡＧＴＴＧＧＣＡＴＡＧＧＣＴＴＡＴＣＴＧＴＧＡＴＧＡＡＧＴＧＧＣＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＧＡＴＧＴＴＧＡＧＧＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＴＴＴＴＧＴＣＴＡＧＧＧＡＡＣＴＴＧＴＡＧＧＡＡＡＴＴＣＴＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＴＣＣＣＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＡＧＴＣＡＧＣＡＡＡＣＴＴＣＡＧＡＴＴＴＴＡＴＴＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＣＡＴＴＴＣＡＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＣＡＴＴＡＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＴＡＣＡＧＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＧＣＣＧＴＧＴＧＴＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＣＧＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＡＣＡＧＧＧＡＧＣＣＡＡＧＴＣＧＴＡＧＣＡＴＴＴＧＧＧＣＣＴＴＧＡＴＣＴＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＡＴＡＣＡＣＴＣＴＴＧＡＧＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＧＴＴＴＣＣＣＡＣＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＧＧＡＣＴＣＴＴＣＣＴＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＧＧＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＣＣＴＴＣＡＡＡＣＴＡＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡＣＣＣＴＴＴＴＡＴＴＣＡＣＴＣＣＣＴＧＡＣＧＡＣＴＴＴＧＴＧＣＴＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＡＡＣＴＧＡＡＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＴＴＡＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＧＡＴＣＴＴＡＧＡＡＧＡＣＴＴＴＴＡＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＧＡＧＣＧＧＧＧＡＧＧＴＴＧＧＡＴＴＴＡＣＴＧＧＴＧＡＣＴＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＧＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＴＧＴＧ
配列番号１１（ＴＩＧＩＴを標的とするｇＲＮＡの配列）
ＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＡＣＧＴＡＣＡＣＴ

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図17-4】

【図17-5】

【図17-6】

【図18-1】

【図18-2】

【図18-3】

【図18-4】

【図19-1】

【図19-2】

【図19-3】

【図19-4】

【図19-5】

【図19-6】

【図19-7】

【図19-8】

【図19-9】

【図20】

【図21-1】

【図21-2】

【図22-1】

【図22-2】

【図22-3】

【図23-1】

【図23-2】

【図23-3】

【図23-4】

【図23-5】

【図23-6】

【図23-7】

【図23-8】

【図23-9】

【図23-10】

【図24】

【図25-1】

【図25-2】

【図26-1】

【図26-2】

【図26-3】

【図26-4】

【図26-5】

【図27-1】

【図27-2】

【図27-3】

【図27-4】

【図27-5】

【図28-1】

【図28-2】

【図28-3】

【図29-1】

【図29-2】

【図30-1】

【図30-2】

【図30-3】

【図31-1】

【図31-2】

【図32】

【図33-1】

【図33-2】

【図33-3】

【図34-1】

【図34-2】

【図34-3】

【図34-4】

【配列表】

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【国際調査報告】