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▶ ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システムの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-04
(54)【発明の名称】ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子療法ベクターおよびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/864 20060101AFI20240927BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240927BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240927BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240927BHJP
【ＦＩ】
C12N15/864 100Z
A61K35/76
A61P25/08
C12N15/12 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024519567
(86)(22)【出願日】2022-09-29
(85)【翻訳文提出日】2024-05-29
(86)【国際出願番号】 US2022077274
(87)【国際公開番号】W WO2023056367
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】63/250,761
(32)【優先日】2021-09-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/364,655
(32)【優先日】2022-05-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508152917
【氏名又は名称】ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＥＸＡＳ ＳＹＳＴＥＭ
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】ベイリー，レイチェル，エム．
【テーマコード（参考）】
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087MA56
4C087NA14
4C087ZA06
4C087ZC51
(57)【要約】
本開示は、神経学的障害、疾患、および状態、例えばてんかん性脳症等を含む、ＳＬＣ１３Ａ５の喪失、誤機能、および／または欠損と関連する疾患および遺伝的障害を処置するための方法および組成物を提供する。本開示の方法および組成物は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子を含むｒＡＡＶベクターおよびＡＡＶウイルスベクターを含む。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
５’から３’の方向に、ａ）配列番号７の配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ）プロモーター配列、
ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列、
ｄ）ポリＡ配列、および
ｅ）配列番号８の配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター。
【請求項2】
前記ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする前記核酸配列が、コドン最適化核酸配列である、請求項１に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項3】
ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする前記コドン最適化核酸配列が、配列番号３で表される核酸配列を含む、請求項１または２に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項4】
前記プロモーター配列が配列番号２１で表される核酸配列を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項5】
前記ポリＡ配列が配列番号３６で表される核酸配列を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項6】
配列番号３８で表される核酸配列を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクター。
【請求項7】
（ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質と、（ｉｉ）請求項１から６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶベクターと
を含むｒＡＡＶウイルスベクター。
【請求項8】
前記ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ９カプシドタンパク質である、請求項７に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
【請求項9】
請求項７または８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加剤を含む医薬組成物。
【請求項10】
ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子が関与する疾患および／または障害を有する対象を処置するための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の請求項７もしくは８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター、または請求項９に記載の医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項11】
ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子が関与する前記疾患および／または障害が乳児てんかん性脳症である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは前記医薬組成物が髄腔内投与される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ｒＡＡＶウイルスベクターまたは前記医薬組成物が大槽内投与される、請求項１０または１１に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年９月３０日出願の米国仮特許出願第６３／２５０，７６１号、および２０２２年５月１３日出願の同第６３／３６４，６５５号の利益を主張し、そのそれぞれは、本明細書において参照により全体として組み込まれている。
本出願は、２０２１年９月３０日出願の米国仮特許出願第６３／２５０，７６１号、および２０２２年５月１３日出願の同第６３／３６４，６５５号の利益を主張し、そのそれぞれは、本明細書において参照により全体として組み込まれている。
【0002】
配列表の参照による組み込み
本出願と関連する配列リストＸＭＬが、ＸＭＬファイルフォーマットで電子的に提供され、そして本明細書により本明細書内に参照として組み込まれる。配列リストＸＭＬを含有するＸＭＬファイルの名称は、「ＴＡＹＳ－０１５＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２６」である。ＸＭファイルは２０２２年９月２０日に作成され、６１，０９５バイトであり、ＵＳＰＴＯ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを経由して電子的に提出される。
本出願と関連する配列リストＸＭＬが、ＸＭＬファイルフォーマットで電子的に提供され、そして本明細書により本明細書内に参照として組み込まれる。配列リストＸＭＬを含有するＸＭＬファイルの名称は、「ＴＡＹＳ－０１５＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２６」である。ＸＭファイルは２０２２年９月２０日に作成され、６１，０９５バイトであり、ＵＳＰＴＯ Ｐａｔｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒを経由して電子的に提出される。
【0003】
本開示は、遺伝子療法の分野、特にＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするトランスジーン配列を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター粒子（ｒＡＡＶウイルスベクターとしても知られている）、その製造、およびトランスジーンを送達して、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の喪失、誤機能、および／または欠損と関連する疾患を含む、疾患または障害を処置または予防するためのその使用と一般的に関連する。
【背景技術】
【0004】
溶質輸送体ファミリー１３メンバー５（ＳＬＣ１３Ａ５）は、クエン酸の細胞内進入を媒介する高親和性ナトリウム依存性クエン酸共輸送体である。ＳＬＣ１３Ａ５は、肝臓、歯、睾丸、および脳内で高度に発現しており、またＳＬＣ１３Ａ５遺伝子内の突然変異は、神経学的異常（Ｙａｎｇら、Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ ２０２０年、Ｖｏｌ．７；１～７頁）と関連する。特に、ＳＬＣ１３Ａ５欠損症は、新生児および小児において常染色体性劣性てんかん性脳症（出生最初期において早くも顕在化し、そして難治性てんかんおよび発達遅延に進行する）を引き起こす（Ｈａｒｄｉｅｓら、ＢＲＡＩＮ ２０１５年：１３８；３２３８～３２５０頁）。今日まで、ＳＬＣ１３Ａ５てんかんの処置は、例えば抗痙攣薬を用いるなど対症的である。ＳＬＣ１３Ａ５てんかんの有効な長期的処置に対する未だ対処されていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
本開示は、５’から３’の方向に、ａ）第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列；ｂ）プロモーター配列；ｃ）ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子；ｄ）ポリＡ配列；およびｅ）第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。
【0006】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含み得る。
【0007】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列であり得る。一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする最適化された核酸配列は、配列番号３で表される核酸配列を含み得る。
【0008】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸配列は、ヒト対象において、野生型または非コドン最適化核酸配列と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％の発現増加を示し得る。
【0009】
一部の態様では、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は配列番号７で表される核酸配列を含み得る。一部の態様では、第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列は配列番号８で表される核酸配列を含み得る。
【0010】
一部の態様では、プロモーター配列は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを伴う）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、ＪｅｔＩプロモーター、Ｈ１プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＥＦ１プロモーター、遍在性ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、Ｕ１ａプロモーター、Ｕ１ｂプロモーター、ＭｅＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、最低限度のＭｅＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、ＥＦｌａプロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ヒトβ－アクチンプロモーター、シナプシン（ｈＳｙｎ）プロモーター配列、ＴＲＥプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ＣａＭＫＩＩａプロモーター、Ｇａｌ１プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、ＧＤＳプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、Ｕｂｉプロモーター、またはα－１－抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーターを含み得る。一部の態様では、プロモーター配列は配列番号２１で表される核酸配列を含み得る。
【0011】
一部の態様では、ポリＡ配列は配列番号３６で表される核酸配列を含む。
【0012】
本開示は、５’から３’の方向に、ａ）配列番号７で表される核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列；ｂ）配列番号２１で表される核酸配列を含むプロモーター配列；ｃ）ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３で表される核酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；ｄ）配列番号３６で表される核酸配列を含むポリＡ；およびｅ）配列番号８で表される核酸配列を含む第２のｒＡＡＶ ＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む、ｒＡＡＶベクターを提供する。
【0013】
本開示は、配列番号３８で表される核酸配列を含むｒＡＡＶベクターを提供する。
【0014】
本開示は、（ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質と、（ｉｉ）本開示のｒＡＡＶベクターとを含むｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質であり得る。一部の態様では、ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶ９カプシドタンパク質であり得る。
【0015】
本開示は、ａ）本開示のｒＡＡＶウイルスベクター；ならびに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加剤を含む医薬組成物を提供する。
【0016】
本開示は、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子が関与する疾患および／または障害を有する対象を処置するための方法であって、少なくとも１つの治療有効量のｒＡＡＶウイルスベクターまたは本開示の医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【0017】
本開示は、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子が関与する疾患および／または障害を処置する際に、それを必要としている対象において使用するための、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物を提供する。
【0018】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子が関与する疾患および／または障害は乳児てんかん性脳症であり得る。
【0019】
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、ベクターゲノム約１０１１～約１０１８個の範囲の用量で対象に投与可能である。
【0020】
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、ベクターゲノム約１０１３～約１０１６個の範囲の用量で対象に投与可能である。
【0021】
一部の態様では、ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、ベクターゲノム約２×１０１１または約８×１０１１個の用量で対象に投与される。
【0022】
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、静脈内、髄腔内、大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ－ｍａｇｎａ）、脳内、脳室内、鼻腔内、気管内、耳内、眼内、または眼周囲、経口、直腸、経粘膜、吸入的、経皮的、非経口的、皮下、皮膚内、筋肉内、大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌｌｙ）、神経内、胸膜内、局所的、リンパ内、大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌｌｙ）、または神経内に投与可能である。
【0023】
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は髄腔内投与可能である。
【0024】
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ－ｍａｇｎａ）投与可能である。
【0025】
別の態様では、５’から３’の方向に、（ａ）配列番号７の配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列；（ｂ）プロモーター配列；（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列；（ｄ）ポリＡ配列；および（ｅ）配列番号８の配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターが本明細書において提供される。
【0026】
一部の実施形態では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列は、コドン最適化核酸配列である。一部の実施形態では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化核酸配列は、配列番号３で表される核酸配列を含む。
【0027】
一部の実施形態では、プロモーター配列は配列番号２１で表される核酸配列を含む。
【0028】
一部の実施形態では、ポリＡ配列は配列番号３６で表される核酸配列を含む。
【0029】
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは配列番号３８で表される核酸配列を含む。
【0030】
別の態様では、（ｉ）ＡＡＶカプシドタンパク質と、（ｉｉ）本明細書に提供されるｒＡＡＶベクターとを含むｒＡＡＶウイルスベクターが本明細書に提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶ９カプシドタンパク質である。
【0031】
別の態様では、本明細書に提供されるｒＡＡＶウイルスベクター、ならびに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または添加剤を含む医薬組成物が本明細書に提供される。
【0032】
別の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子が関与する疾患および／または障害を有する対象を処置するための方法であって、少なくとも１つの治療有効量の本明細書に提供されるｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物を、対象に投与するステップを含む方法が本明細書に提供される。一部の実施形態では、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子が関与する疾患および／または障害は乳児てんかん性脳症である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は髄腔内投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶウイルスベクターまたは医薬組成物は、大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ－ｍａｇｎａ）投与される。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】８週齢のときに、１×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いて静脈内処置されたＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存率を示す図である。
【図2A-2B】ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いて処置されたマウスの体重を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを未処置とするか、または８週齢のときに、尾静脈注射を介して、１×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を投与した。最初の８週間、１週間に３回、次に注射後９か月まで１週間に１回、以後１か月に１回、マウスを秤量した。図２Ａはメスのマウスに関するデータを示し、図２Ｂはオスのマウスに関するデータを示す。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【図3A-3E】投与後８週における血液化学の結果を示す図である。総ビリルビン（図３Ａ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（図３Ｂ）、アルブミン（図３Ｃ）、血中尿素窒素（図３Ｄ）、およびクレアチンキナーゼ（図３Ｅ）のレベルを示す。＊ｐ＜０．０５、スチューデントの独立ｔ検定。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【図4】８週齢のときに、８×１０１１ｖｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の用量を用いて髄腔内的に処置されたＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存率を示す図である。
【図5A-5B】ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いて処置されたマウスの体重を示す図である。８週齢のときに、媒体または８×１０１１ｖｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５のいずれかを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに髄腔内注射した。最初の８週間、１週間に３回、次に注射後６か月まで１週間に１回、その後１か月に１回、マウスを秤量した。図５Ａはメスのマウスから得られたデータを示し、図５Ｂはオスマウスから得られたデータを示す。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【図6A-6E】試験エンドポイントにおける血液化学の結果を示す図である。総ビリルビン（図６Ａ）、アルブミン（図６Ｂ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（図６Ｃ）、血中尿素窒素（図６Ｄ）、およびクレアチンキナーゼ（図６Ｅ）のレベルを示す。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【図7】低用量（２×１０１１ｖｇ）または高用量（８×１０１１ｖｇ）のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いて髄腔内処置されたマウスの生存率を示す図である。
【図8A-8B】ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いて処置されたマウスの体重を示す図である。媒体、または２×１０１１ｖｇ（低用量）もしくは８×１０１１ｖｇ（高用量）のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５のいずれかを、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに髄腔内注射した。最初の８週間、１週間に３回、その後１週間に１回、マウスを秤量した。図８Ａはメスのマウスから得られたデータを示し、図８Ｂはオスのマウスから得られたデータを示す。データを平均±ＳＥＭとして示す。
【図9A-9J】投与後８週目（図９Ａ～図９Ｅ）、および注射後１２か月目（図９Ｆ～図９Ｊ）の、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける血液化学の結果を示す図である。総ビリルビン（図９Ａおよび図９Ｆ）、アルブミン（図９Ｂおよび図９Ｇ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（図９Ｃおよび図９Ｈ）、血中尿素窒素（図９Ｄおよび図９Ｉ）、およびクレアチンキナーゼ（図９Ｅおよび図９Ｊ）を示す。＊＊ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの事後分析。
【図10】媒体、または２×１０１１ｖｇ（低用量（ＬＤ））もしくは８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５のいずれかを用いて、髄腔内（ＩＴ）投与を介して注射した後４週間時点におけるＫＯマウスの血漿クエン酸レベルを、ＷＴコントロール同腹子と比較して図示するグラフを示す図である。媒体処置されたＫＯマウスはＷＴマウスと比較してそれよりも上昇したレベルのクエン酸を有したが、処置を受けたマウスでは用量依存性の様式で有意に低下した。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、一元配置ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙの事後分析。
【図11A-11B】野生型マウスおよびＫＯマウスにおける脳の活動を記録した脳波図（ＥＥＧ）を図示するグラフを示す図である。出生後１０日目（Ｐ１０）のときに、媒体、２×１０１１ｖｇ（低用量（ＬＤ））または８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いながら、髄腔内（ＩＴ）投与を介してマウスを処置した。３月齢（３ｍｏ）のときに、媒体またはＨＤを用いながら、ＩＴまたは大槽内（ＩＣＭ）投与を介してマウスを処置した。図１１Ａは、３月齢のときに評価した、Ｐ１０マウスにおけるスパイク列の数を表す。図１１Ｂは、８月齢のときに評価した３か月処置群におけるスパイク列の数を表す。
【図12A-12D】野生型マウスおよびＫＯマウスにおける平均活動度を図示するグラフを示す図である。マウスを、Ｐ１０のときに、媒体、２×１０１１ｖｇ（低用量（ＬＤ））、または８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いながら、髄腔内（ＩＴ）投与を介して処置した。図１２Ａは、媒体を用いて処置されたＷＴマウスおよびＫＯマウスについて、明光サイクル／睡眠期間中の平均活動度を表す。図１２Ｂは、媒体、ＬＤ、またはＨＤを用いて処置されたＫＯマウスについて、明光サイクル／睡眠期間中の平均活動度を表す。図１２Ｃは、媒体を用いて処置されたＷＴマウスおよびＫＯマウスについて、暗光サイクル／覚醒期間中の平均活動度を表す。図１２Ｄは、媒体、ＬＤ、またはＨＤを用いて処置されたＫＯマウスについて、暗光サイクル／覚醒期間中の平均活動度を表す。Ｐ１０：ｎ＝１７～２２匹／群。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図13A-13B】発作感受性をテストするために、ペンチレンテトラゾールを反復注射した後の、ＫＯマウスおよびＷＴマウスにおける生存率（％）を図示するグラフを示す図である。マウスを、媒体、２×１０１１ｖｇ（低用量（ＬＤ））、または８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いながら、髄腔内（ＩＴ）または大槽内（ＩＣＭ）投与を介して処置した。図１３Ａは、Ｐ１０のときに処置され、４月齢のときにテストを受けたマウスを表す。図１３Ｂは、３月齢のときに処置され、９月齢のときにテストを受けたマウスを表す。
【図14A-14B】発作重症度およびペンチレンテトラゾールに対する感受性を図示するグラフを示す図である。マウスを、媒体、２×１０１１ｖｇ（低用量（ＬＤ））、または８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いながら、髄腔内（ＩＴ）または大槽内（ＩＣＭ）投与を介して、Ｐ１０または３月齢のときに処置した。Ｐ１０処置マウス（図１４Ａ）または３月齢処置マウス（図１４Ｂ）を対象に、改訂版Ｒａｃｉｎｅスコアリングスケールを介して発作重症度を測定した。発作までの待機時間を、Ｐ１０処置マウス（図１４Ｃ）および３月齢処置マウス（図１４Ｄ）を対象に評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、２元配置ＡＮＯＶＡ、Ｓｉｄａｋの事後分析。
【図14C-14D】発作重症度およびペンチレンテトラゾールに対する感受性を図示するグラフを示す図である。マウスを、媒体、２×１０１１ｖｇ（低用量（ＬＤ））、または８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いながら、髄腔内（ＩＴ）または大槽内（ＩＣＭ）投与を介して、Ｐ１０または３月齢のときに処置した。Ｐ１０処置マウス（図１４Ａ）または３月齢処置マウス（図１４Ｂ）を対象に、改訂版Ｒａｃｉｎｅスコアリングスケールを介して発作重症度を測定した。発作までの待機時間を、Ｐ１０処置マウス（図１４Ｃ）および３月齢処置マウス（図１４Ｄ）を対象に評価した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、２元配置ＡＮＯＶＡ、Ｓｉｄａｋの事後分析。
【図15A】Ｐ１０処置ノックアウトマウスにおけるベクター生体分布を図示するグラフを示す図である。マウスを、媒体、２×１０１１ｖｇ（低用量（ＬＤ））、または８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いながら、髄腔内（ＩＴ）投与を介して処置した。
【図15B】３月齢処置ノックアウトマウスにおけるベクター生体分布を図示するグラフを示す図である。マウスを、媒体、または８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いながら、髄腔内（ＩＴ）または大槽内（ＩＣＭ）投与を介して処置した。
【図16】Ｐ１０または３月齢処置マウスの脳内でのベクター送達されたＳＬＣ１３Ａ５の発現を図示する一連の画像を示す図である。マウスを、媒体、２×１０１１ｖｇ（低用量（ＬＤ））、または８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いながら、髄腔内（ＩＴ）または大槽内（ＩＣＭ）投与を介して処置した。
【発明を実施するための形態】
【0034】
本開示は、とりわけ、単離されたポリヌクレオチド、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクター、および溶質輸送体ファミリー１３メンバー５（ＳＬＣ１３Ａ５）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子を含むｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。本開示は、これらの単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、およびｒＡＡＶウイルスベクターを製造する方法、ならびにＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の喪失、誤機能不全、および／または欠損に付随する疾患を含む、疾患または障害を処置または防止するためにトランスジーンを送達するためのその使用も提供する。
【0035】
本明細書で使用される用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、この名称に付随し、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）ファミリーのデペンドパルボウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属に属するウイルスのクラスのメンバーを指す。アデノ随伴ウイルスは、細胞中で増殖する一本鎖ＤＮＡウイルスであり、その中である種の機能が共感染するヘルパーウイルスによって提供される。ＡＡＶに関する一般的な情報および総説は、たとえばＣａｒｔｅｒ，１９８９，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，１巻，１６９～２２８頁およびＢｅｒｎｓ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７４３～１７６４頁，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出すことができる。種々の血清型が、遺伝子レベルであっても、構造的および機能的両方に極めて密接に関連していることがよく知られているので、これらの総説に記載された同じ原理が総説の発行日以後に特徴解析されたさらなるＡＡＶの血清型に適用可能であることが、完全に期待される（たとえばＢｌａｃｋｌｏｗｅ，１９８８，Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ編，１６５～１７４頁、およびＲｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３：１～６１頁（１９７４）を参照）。たとえば、全てのＡＡＶ血清型は同種ｒｅｐ遺伝子によって媒介される極めて類似した複製特性を明らかに呈し、全てが、ＡＡＶ２で発現されるもののような３つの関連するカプシドタンパク質を有している。ゲノムの長さに沿った血清型の間の広範な交叉ハイブリダイゼーションおよび「逆転ターミナルリピート配列」（ＩＴＲ）に対応する末端における類似の自己アニール性セグメントの存在を明らかにするヘテロデュプレックス解析によって、関連性の程度がさらに示唆されている。類似した感染性パターンも、各血清型における複製機能が同様の規制制御の下にあることを示唆している。このウイルスの多数の血清型が遺伝子送達に適していることが知られており、全ての既知の血清型が種々の組織型の細胞に感染することができる。連続的に番号付けされた少なくとも１１個のＡＡＶ血清型が当技術で知られている。本明細書で開示した方法において有用な非限定的な例示的血清型には、１１個の血清型、たとえばＡＡＶ２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはバリアント血清型、たとえばＡＡＶ－ＤＪおよびＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂのいずれかが含まれる。ＡＡＶ粒子は、３つの主要なウイルスタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の態様では、ＡＡＶは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、またはＡＡＶｒｈ．１０を指す。
【0036】
例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、全ての血清型（たとえばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶｒｈ７４、およびＡＡＶｒｈ．１０）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）および１つの血清型のゲノムと別の血清型のカプシドとを含むＡＡＶハイブリッド（たとえばＡＡＶ２／５、ＡＡＶ－ＤＪ、およびＡＡＶ－ＤＪ８）が含まれる。例示的なアデノ随伴ウイルスおよび組み換えアデノ随伴ウイルスには、それだけに限らないが、ｒＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ－ＫＰ－１（Ｋｅｒｕｎら．ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ，２０１９；４（２２）：ｅ１３１６１０に詳細に記載）およびＡＡＶ－ＮＰ５９（Ｐａｕｌｋら．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１８；２６（１）：２８９～３０３頁に詳細に記載）が含まれる。
【0037】
ＡＡＶの構造および機能
ＡＡＶは複製欠損性のパルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７ｋｂの長さで、２つの１４５ヌクレオチド逆転ターミナルリピート（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには多数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。たとえば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５～５６４頁（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿ｌ８２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部はそれぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９で提供され、ＡＡＶ－９のゲノムはＧａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１～６３８８頁（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０のゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７～７６頁（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１のゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５～３８３頁（２００４）で提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は米国特許第９，４３４，９２８号で提供されている。米国特許第９，４３４，９２８号は、カプシドタンパク質および自己相補性ゲノムの配列も提供している。一態様では、ＡＡＶゲノムは自己相補性ゲノムである。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド封入／パッケージング、および宿主細胞染色体の一体化を指示するシス作用性配列は、ＡＡＶ ＩＴＲの中に含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置によってｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）差別的スプライシングと一体になった２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、究極的にはウイルスゲノムの複製に関与する多種の酵素特性を有している。
ＡＡＶは複製欠損性のパルボウイルスであり、その一本鎖ＤＮＡゲノムは約４．７ｋｂの長さで、２つの１４５ヌクレオチド逆転ターミナルリピート（ＩＴＲ）を含む。ＡＡＶには多数の血清型が存在する。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は既知である。たとえば、ＡＡＶ－１の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２０７７で提供され、ＡＡＶ－２の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１４０１およびＳｒｉｖａｓｔａｖａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５～５６４頁（１９８３）で提供され、ＡＡＶ－３の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿ｌ８２９で提供され、ＡＡＶ－４の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８２９で提供され、ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６で提供され、ＡＡＶ－６の完全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１８６２で提供され、ＡＡＶ－７およびＡＡＶ－８のゲノムの少なくとも一部はそれぞれＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ７５３２４６およびＡＸ７５３２４９で提供され、ＡＡＶ－９のゲノムはＧａｏら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１～６３８８頁（２００４）で提供され、ＡＡＶ－１０のゲノムはＭｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７～７６頁（２００６）で提供され、ＡＡＶ－１１のゲノムはＶｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５～３８３頁（２００４）で提供されている。ＡＡＶ ｒｈ．７４ゲノムの配列は米国特許第９，４３４，９２８号で提供されている。米国特許第９，４３４，９２８号は、カプシドタンパク質および自己相補性ゲノムの配列も提供している。一態様では、ＡＡＶゲノムは自己相補性ゲノムである。ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、カプシド封入／パッケージング、および宿主細胞染色体の一体化を指示するシス作用性配列は、ＡＡＶ ＩＴＲの中に含まれている。３つのＡＡＶプロモーター（それらの相対的なマップ位置によってｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と命名）は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を推進する。単一のＡＡＶイントロンの（ヌクレオチド２１０７および２２２７における）差別的スプライシングと一体になった２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５およびｐ１９）は、ｒｅｐ遺伝子からの４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、およびｒｅｐ４０）の産生をもたらす。ｒｅｐタンパク質は、究極的にはウイルスゲノムの複製に関与する多種の酵素特性を有している。
【0038】
ｃａｐ遺伝子はｐ４０プロモーターから発現され、３つのカプシドタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする。選択的なスプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位が、この３つの関連するカプシドタンパク質の産生に関与している。より具体的には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３タンパク質のそれぞれがそれから翻訳される単一のｍＲＮＡが転写された後で、このｍＲＮＡは２つの異なる様式でスプライシングされ得る。長いイントロンまたは短いイントロンが切除され、ｍＲＮＡの２つのプール、即ち２．３ｋｂと２．６ｋｂの長さのｍＲＮＡプールの形成がもたらされる。長いイントロンが好ましいことが多く、したがって２．３ｋｂの長さのｍＲＮＡは主要なスプライスバリアントと称され得る。この形態はＶＰ１タンパク質の合成がそれから始まる第１のＡＵＧコドンを欠き、ＶＰ１タンパク質合成の全体のレベルの低下をもたらす。主要なスプライスバリアントに残る第１のＡＵＧコドンは、ＶＰ３タンパク質の開始コドンである。しかし、同じオープンリーディングフレーム中のそのコドンの上流には、最適のＫｏｚａｋ（翻訳開始）コンテクストによって囲まれたＡＣＧ配列（スレオニンをコードする）が存在する。これはＶＰ２タンパク質の合成の低いレベルに寄与する。ＶＰ２タンパク質は実際上、それぞれが参照により本明細書に組み込まれるＢｅｃｅｒｒａ ＳＰら，（１９８５年１２月）．“Ｄｉｒｅｃｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｂ ａｎｄ Ｃ：ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ＡＣＧ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．８２（２３）：７９１９～２３頁；Ｃａｓｓｉｎｏｔｔｉ Ｐら，（１９８８年１１月）．“Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ｃａｐｓｉｄ ｇｅｎｅ：ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ａ ｍｉｎｏｒ ｓｐｌｉｃｅｄ ｍＲＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１６７（１）：１７６～８４頁；Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒ Ｓら，（１９９４年１月）．“Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６８（１）：１７０～６頁；およびＴｒｅｍｐｅ ＪＰ，Ｃａｒｔｅｒ ＢＪ（１９８８年９月）．“Ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｍＲＮＡ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ＶＰ１ ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．６２（９）：３３５６～６３頁に記載されているように、ＶＰ１と同じく、ＶＰ３タンパク質にＮ末端残基が付加されたものである。単一のコンセンサスポリＡ部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に位置している。ＡＡＶのライフサイクルおよび遺伝的特徴は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７～１２９頁（１９９２）に概説されている。
【0039】
それぞれのＶＰ１タンパク質は、ＶＰ１部分、ＶＰ２部分、およびＶＰ３部分を含む。ＶＰ１部分は、ＶＰ１タンパク質に特有のＶＰ１タンパク質のＮ末端部分である。ＶＰ２部分は、ＶＰ２タンパク質のＮ末端部分にも見出される、ＶＰ１タンパク質の中に存在するアミノ酸配列である。ＶＰ３部分とＶＰ３タンパク質は同じ配列を有する。ＶＰ３部分は、ＶＰ１タンパク質とＶＰ２タンパク質に共有されるＶＰ１タンパク質のＣ末端部分である。
【0040】
ＶＰ３タンパク質は、不連続の可変表面領域Ｉ～ＩＸ（ＶＲ－Ｉ～ＩＸ）にさらに分割することができる。可変表面領域（ＶＲ）のそれぞれは、その内容が参照により本明細書に組み込まれるＤｉＭａｔｔａら，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅ ９”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．８６（１２）：６９４７～６９５８頁，２０１２年６月に記載されているように、単独でまたは他のＶＲのそれぞれの特定のアミノ酸配列との組合せで、特有の感染表現型（たとえば低下した抗原性、改善された形質導入および／または他のＡＡＶ血清型と比較した組織特異的向性）を特定の血清型に付与することができる特定のアミノ酸配列を含み得る。
【0041】
ＡＡＶは、たとえば遺伝子療法において外来のＤＮＡを細胞に送達するためのベクターとしてこれを魅力的なものにする固有の特徴を有している。培養における細胞のＡＡＶ感染は細胞変性を起こさず、ヒトおよびその他の動物の天然の感染は症状がなく無症候性である。さらに、ＡＡＶは多くの哺乳動物細胞に感染してｉｎ ｖｉｖｏで多くの異なる組織を標的とすることを可能にする。さらに、ＡＡＶは分裂している細胞および分裂していない細胞にゆっくりと形質導入し、実質的にこれらの細胞の生涯にわたって転写活性の核エピソーム（染色体外エレメント）として持続することができる。ＡＡＶのプロウイルスゲノムはクローニングされたＤＮＡとしてプラスミド中に挿入され、それにより組み換えゲノムの構築が実行可能になる。さらに、ＡＡＶの複製とゲノムのカプシド封入を指示するシグナルがＡＡＶゲノムのＩＴＲの中に含まれているので、ゲノムの内部の約４．３ｋｂの一部または全部（複製および構造のカプシドタンパク質、ｒｅｐ－ｃａｐをコードする）を外来のＤＮＡで置き換えて、ＡＡＶベクターを生成することができる。ｒｅｐおよびｃａｐのタンパク質はトランスで提供され得る。ＡＡＶの別の顕著な特徴は、これが極めて安定で元気なウイルスであることである。これはアデノウイルスを不活化するために用いられる条件（５６～６５℃で数時間）に容易に耐え、ＡＡＶの低温保存の問題を重要でなくしている。ＡＡＶは凍結乾燥することさえできる。最後に、ＡＡＶに感染した細胞は重複感染に抵抗しない。
【0042】
多くの研究が筋肉における長期（１．５年超）の組み換えＡＡＶ媒介タンパク質発現を実証している。Ｃｌａｒｋら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，８：６５９～６６９頁（１９９７）；Ｋｅｓｓｌｅｒら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ．Ａｃａｄ Ｓｃ．ＵＳＡ，９３：１４０８２～１４０８７頁（１９９６）；およびＸｉａｏら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７０：８０９８～８１０８頁（１９９６）を参照されたい。Ｃｈａｏら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２：６１９～６２３頁（２０００）およびＣｈａｏら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，４：２１７～２２２頁（２００１）も参照されたい。さらに、筋肉は高度に血管新生しているので、Ｈｅｒｚｏｇら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：５８０４～５８０９頁（１９９７）およびＭｕｒｐｈｙら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９４：１３９２１～１３９２６頁（１９９７）に記載されているように、組み換えＡＡＶ形質導入によって、筋肉内注射の後の全身循環におけるトランスジーン産生物の出現がもたらされた。さらに、Ｌｅｗｉｓら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，７６：８７６９～８７７５頁（２００２）は、骨格筋筋線維が抗体の正しいグリコシル化、フォールディング、および分泌のために必要な細胞性因子を有していることを実証し、筋肉が分泌されたタンパク質治療剤を安定的に発現することができることを示した。本発明の組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノムは、治療用タンパク質（たとえばＳＬＣ１３Ａ５）をコードする核酸分子および核酸分子の側にある１つまたは複数のＡＡＶ ＩＴＲを含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれからなる。偽型ｒＡＡＶの産生は、たとえばＷＯ２００１０８３６９２に開示されている。その他の型のｒＡＡＶバリアント、たとえばカプシド変異を有するｒＡＡＶも意図されている。たとえばＭａｒｓｉｃら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１１）：１９００～１９０９頁（２０１４）を参照されたい。種々のＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術で既知である。
【0043】
トランスジーン配列を含む単離されたポリヌクレオチド
本開示は、少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本開示は、少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【0044】
一部の態様では、トランスジーン核酸分子は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列またはその少なくとも１つの断片を含み得る。一部の態様では、トランスジーン核酸分子は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドの生物学的等価物をコードする核酸配列を含み得る。
【0045】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列またはその断片を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の少なくとも一部と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一のアミノ酸配列またはその断片を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。一部の実施形態では、断片は、機能的断片、例えば野生型ＳＬＣ１３Ａ５の少なくとも１つの機能を保持する断片である。
【0046】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列は、配列番号２で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0047】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列であってよい。ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（またはその間の任意のパーセンテージ）を超えず同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。本明細書で使用する場合、「ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列」は、ヒトゲノムにおけるＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列を指す。ＳＬＣ１３Ａ５ペプチドをコードする例示的野生型ヒト核酸配列は配列番号４～６で表される。例示的野生型ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドは配列番号２で表される。ＳＬＣ１３Ａ５をコードする例示的コドン最適化配列は配列番号３で表される。
【0048】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列、たとえば配列番号１または２で表される配列等は、ドナースプライス部位を含まない可能性がある。一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、約１個、または約２個、または約３個、または約４個、または約５個、または約６個、または約７個、または約８個、または約９個、または約１０個を超えないドナースプライス部位を含んでよい。一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と比較して、少なくとも１個、または少なくとも２個、または少なくとも３個、または少なくとも４個、または少なくとも５個、または少なくとも６個、または少なくとも７個、または少なくとも８個、または少なくとも９個、または少なくとも１０個少ないドナースプライス部位を含む。理論に縛られることは望まないが、曖昧なスプライシングが防止されるので、コドン最適化された核酸配列におけるドナースプライス部位の除去によって、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドの発現を予想外かつ予測外に増加させることができる。さらに、曖昧なスプライシングは様々な対象の間で変動することがあり、ドナースプライス部位を含むＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドの発現レベルは様々な対象の間で予測外に変動することがあることを意味している。
【0049】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列、たとえば配列番号１または２で表される配列等は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列のＧＣ含量と異なるＧＣ含量を有し得る。一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列のＧＣ含量は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする野生型ヒト核酸配列と比較して、核酸配列全体にわたってより均一に分布している。理論に縛られることは望まないが、核酸配列全体にわたってＧＣ含量をより均一に分布させることによって、コドン最適化された核酸配列は転写物の長さにわたってより均一な融解温度（「Ｔｍ」）を呈する。核酸配列の転写および／または翻訳はポリメラーゼおよび／またはリボソームの停滞をあまり伴わずに起こるので、融解温度の均一性は、予期しないことに、ヒト対象におけるコドン最適化された核酸の発現の増大をもたらす。
【0050】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸配列、たとえば配列番号１または２で表される配列等は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする野生型またはコドン最適化されていない核酸配列に対して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも５００％、または少なくとも１０００％増大したヒト対象における発現を呈する。
【0051】
一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドは、タンパク質タグをさらに含み得る。理論に縛られることは望まないが、タンパク質タグを含ませることによって、外因性ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドの検出および／または可視化が可能になる。当業者には認識されるように、タンパク質タグの非限定的な例には、Ｍｙｃタグ、ポリヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ＳＢＰタグ、または当技術で既知の任意の他のタンパク質タグが含まれる。
【0052】
ＡＡＶベクター
一部の態様では、本明細書に記載した少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチドは、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであり得る。
一部の態様では、本明細書に記載した少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含む単離されたポリヌクレオチドは、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターであり得る。
【0053】
本明細書で使用される場合、用語「ベクター」は、元のままのレプリコンを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる核酸であって、それによりベクターが、細胞内に入れられた場合に、たとえばトランスフェクション、感染、または形質転換のプロセスによって複製される、核酸を指す。いったん細胞内に入れば、ベクターは染色体外（エピソーマル）エレメントとして複製され、または宿主細胞の染色体内に統合され得ることが当技術で理解されている。ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、改変されたバキュロウイルス、パポバウイルス、またはその他に改変された天然産生のウイルスから誘導される核酸が含まれ得る。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターには、裸のＤＮＡ、単独もしくはカチオン性ポリマーと組み合わせたカチオン性脂質とのＤＮＡの複合体、アニオン性およびカチオン性のリポソーム、ＤＮＡ－タンパク質複合体、ならびに不均一なポリリジン、定義された長さのオリゴペプチド、およびポリエチレンイミン等のカチオン性ポリマーと縮合し、ある場合にはリポソームに含まれるＤＮＡを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる粒子、ならびにウイルスおよびポリリジン－ＤＮＡを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる三元複合体の使用が含まれる。
【0054】
一般的な組み換え手法に関しては、プロモーターとその中にポリヌクレオチドを作動可能に連結することができるクローニング部位との両方を含むベクターは、当技術で周知である。そのようなベクターはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡを転写することができ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ）およびＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）等の供給元から市販されている。発現および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写を最適化するため、クローニングされたトランスジーンの５’および／または３’の翻訳されない部分を除去、付加、または変化させて、余分で潜在的で不適切な代替の翻訳開始コドンまたは転写もしくは翻訳のレベルにおいて発現に干渉しまたはこれを低減させ得る他の配列を排除することが必要であろう。あるいは、発現を増強するために、コンセンサスリボソーム結合部位を開始コドンの５’のすぐ傍に挿入することができる。
【0055】
本明細書で使用される「ｒＡＡＶベクター」は、１つまたは複数のトランスジーン核酸分子および１つまたは複数のＡＡＶ逆転ターミナルリピート配列（ＩＴＲ）を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるベクターを指す。そのようなＡＡＶベクターは、宿主細胞中に存在する場合に、たとえば宿主細胞のトランスフェクションによってｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子産物の機能を提供する感染性ウイルス粒子の中に、複製しパッケージすることができる。一部の態様では、ＡＡＶベクターは、プロモーター、少なくとも１つのタンパク質もしくはＲＮＡをコードし得る少なくとも１つの核酸、および／または感染性ＡＡＶ粒子の中にパッケージされたフランキングＩＴＲの中のエンハンサーおよび／またはターミネーターを含む。カプシド封入された核酸部分は、ＡＡＶベクターゲノムと称し得る。ｒＡＡＶベクターを含むプラスミドは、製造目的のためのエレメント、たとえば抗生剤耐性遺伝子、複製起点の配列、その他を含んでもよいが、これらはカプシド封入されず、したがってＡＡＶ粒子の一部を形成しない。
【0056】
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのトランスジーン核酸分子を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのＡＡＶ逆転ターミナル（ＩＴＲ）配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのエンハンサー配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも１つのポリＡ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、ＲｅｐＣａｐ配列を含み得る。
【0057】
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。
【0058】
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。
【0059】
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、２つ以上のトランスジーン核酸分子を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも２つのトランスジーン核酸分子を含み得て、それによりｒＡＡＶベクターは第１のトランスジーン核酸分子および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子を含む。一部の態様では、第１および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子は、同じ核酸配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子は、異なる核酸配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のトランスジーン核酸配列は、互いに隣接し得る。
【0060】
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、２つ以上のプロモーター配列を含み得る。一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、少なくとも２つのプロモーター配列を含み得て、それによりｒＡＡＶベクターは第１のプロモーター配列および少なくとも第２のプロモーター配列を含む。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、同じ配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、異なる配列を含み得る。一部の態様では、第１および少なくとも第２のプロモーター配列は、互いに隣接し得る。ｒＡＡＶベクターが第１のトランスジーン核酸分子および少なくとも第２のトランスジーン核酸分子も含む一部の態様では、第１のプロモーターは第１のトランスジーン核酸分子の上流（５’）に位置してよく、少なくとも第２のプロモーターは第１のトランスジーン核酸分子と少なくとも第２のトランスジーン核酸分子との間に位置してよく、それにより少なくとも第２のプロモーターは第１のトランスジーン核酸分子の下流（３’）かつ少なくとも第２のトランスジーン核酸分子の上流（５’）に位置する。
【0061】
先行するｒＡＡＶベクターのいずれも、少なくとも１つのエンハンサーをさらに含み得る。少なくとも１つのエンハンサーは、ｒＡＡＶベクターのいずれの場所に位置してもよい。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、プロモーターのすぐ上流（５’）に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、エンハンサー、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、プロモーターのすぐ下流（３’）に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、エンハンサー、トランスジーン核酸分子、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、少なくとも１つのエンハンサーは、トランスジーン核酸分子のすぐ下流に位置し得る。即ち、ｒＡＡＶベクターは、５’から３’の方向に、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、プロモーター配列、トランスジーン核酸分子、エンハンサー、ポリＡ配列、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。
【0062】
ＡＡＶ ＩＴＲ配列
一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、当技術で既知の任意のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列であってよい。
一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、当技術で既知の任意のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み得る。一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列であってよい。
【0063】
即ち、一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ４ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ６ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ７ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ８ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ９ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ配列、ＡＡＶ１３ ＩＴＲ配列、ＡＡＶｒｈ７４ ＩＴＲ配列、またはＡＡＶｒｈ．１０ ＩＴＲ配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。一部の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、改変された（例えば、突然変異した）ＡＡＶ ＩＴＲ配列である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターは、１つの突然変異したＡＡＶ ＩＴＲおよび１つの野生型ＡＡＶ ＩＴＲを含む。
【0064】
一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲは、配列番号７～１８のうちのいずれか１つで表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0065】
一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲは、配列番号７で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0066】
一部の態様では、ＡＡＶ ＩＴＲは、配列番号８で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0067】
一部の態様では、本明細書に提示されるｒＡＡＶは、第１および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号７で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり、および第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列は、配列番号８で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0068】
プロモーター配列およびエンハンサー
本明細書で使用される用語「プロモーター」および「プロモーター配列」は、遺伝子またはトランスジーン等のコーディング配列の転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である調節配列を意味する。プロモーターは、たとえば構造的、誘起的、抑制的、または組織特異的であってよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子等の制御性のタンパク質および分子が結合し得る遺伝要素を含み得る。非限定的な例示的プロモーターには、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーととともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、シナプシンプロモーター、Ｈ１プロモーター、遍在性ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、小核ＲＮＡ（Ｕ１ａまたはＵ１ｂ）プロモーター、ＭＥＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーターのヒトバリアント、ミニマルＭＥＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、またはＥＦ１プロモーターが含まれる。
本明細書で使用される用語「プロモーター」および「プロモーター配列」は、遺伝子またはトランスジーン等のコーディング配列の転写の開始および速度が制御されるポリヌクレオチド配列の領域である調節配列を意味する。プロモーターは、たとえば構造的、誘起的、抑制的、または組織特異的であってよい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子等の制御性のタンパク質および分子が結合し得る遺伝要素を含み得る。非限定的な例示的プロモーターには、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択でＲＳＶエンハンサーととともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター、β－アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｕ６プロモーター、シナプシンプロモーター、Ｈ１プロモーター、遍在性ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター、小核ＲＮＡ（Ｕ１ａまたはＵ１ｂ）プロモーター、ＭＥＣＰ２プロモーター、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーターのヒトバリアント、ミニマルＭＥＣＰ２プロモーター、ＶＭＤ２プロモーター、ｍＲｈｏプロモーター、またはＥＦ１プロモーターが含まれる。
【0069】
本明細書で提供されるさらなる非限定的な例示的プロモーターには、それだけに限らないが、ＥＦｌａ、Ｕｂｃ、ヒトβ－アクチン、ＣＡＧ、ＴＲＥ、Ａｃ５、ポリヘドリン、ＣａＭＫＩＩａ、Ｇａｌ１、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＡＤＨ１、Ｕｂｉ、およびα－１－アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）が含まれる。ｍＲＮＡ転写の効率を増大または低減させるために、そのようなプロモーターのヌクレオチド配列を改変し得ることは、当技術で既知である。たとえばＧａｏら．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １２：１３５～１４５頁を参照されたい（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写を無効にし、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存性ｍＲＮＡ転写を刺激するために、７ＳＫ、Ｕ６、およびＨ１プロモーターのＴＡＴＡボックスを改変する）。遍在性または組織特異的な発現のために、合成由来のプロモーターを用いてもよい。さらに、そのいくつかを上で言及したウイルス由来プロモーター、たとえばＣＭＶ、ＨＩＶ、アデノウイルス、およびＡＡＶのプロモーターは、本明細書に記載した方法において有用であり得る。一部の態様では、転写効率を増大させるために、プロモーターは少なくとも１つのエンハンサーとともに用いられる。エンハンサーの非限定的な例には、間質性レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）エンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサーが含まれる。
【0070】
一部の態様では、プロモーター配列は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター配列（任意選択でＲＳＶエンハンサーとともに）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ジヒドロフォレートリダクターゼプロモーター配列、ＪｅＴプロモーター配列、強いβ－アクチンプロモーター配列、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、シナプシンプロモーター、Ｈ１プロモーター配列、遍在性ニワトリβ－アクチンハイブリッド（ＣＢｈ）プロモーター配列、小核ＲＮＡ（Ｕ１ａまたはＵ１ｂ）プロモーター配列、ＭＥＣＰ２プロモーター配列、ＭｅＰ４１８プロモーター、ＭｅＰ４２６プロモーター配列、小型の遍在性プロモーター配列（Ｊｅｔ＋Ｉプロモーター配列としても知られている）、ＭＥＣＰ２プロモーター配列、ＶＭＤ２プロモーター配列、ｍＲｈｏプロモーター配列、ＥＦＩプロモーター配列、ＥＦｌａプロモーター配列、Ｕｂｃプロモーター配列、ヒトβ－アクチンプロモーター配列、ＣＡＧプロモーター配列、ＴＲＥプロモーター配列、Ａｃ５プロモーター配列、ポリヘドリンプロモーター配列、ＣａＭＫＩＩａプロモーター配列、Ｇａｌ１プロモーター配列、ＴＥＦ１プロモーター配列、ＧＤＳプロモーター配列、ＡＤＨ１プロモーター配列、Ｕｂｉプロモーター配列、ＭｅＰ４２６プロモーター、またはα－１抗トリプシン（ｈＡＡＴ）プロモーター配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。
【0071】
エンハンサーは、標的配列の発現を増大させる制御エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を提供することができる配列を含むポリヌクレオチドである。たとえば、レトロウイルスの長いターミナルリピートは、プロモーターとエンハンサーの両方の機能を含んでいる。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」または「外因性」または「異種」であり得る。「内因性」エンハンサー／プロモーターは、ゲノム内の所与の遺伝子に天然に連結されたエンハンサー／プロモーターである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターは、遺伝子操作（即ち分子生物学的手法）または合成手法の手段によって遺伝子に並置され、それによりその遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指示される、エンハンサー／プロモーターである。本明細書で提供される方法、組成物、および構築物における使用のための連結されたエンハンサー／プロモーターの非限定的な例には、ＰＤＥプロモータープラスＩＲＢＰエンハンサー、またはＣＭＶエンハンサープラスＵ１ａプロモーターが含まれる。エンハンサーは遠方から、また内因性または異種のプロモーターの位置に対するそれらの配向とは関係なく、作動し得ることが当技術で理解されている。即ち、プロモーターから離れて作動するエンハンサーは、したがってベクター中のその位置またはプロモーターの位置に対するその配向とは関係なく、そのプロモーターに「作動可能に連結」されていることがさらに理解される。
【0072】
本開示を通して使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、遺伝子が空間的に連結されたプロモーターの制御下にある遺伝子（即ちトランスジーン）の発現を指す。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターとそのプロモーターがそれから誘導された遺伝子内でプロモーターが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであってよい。プロモーターと遺伝子との間の距離の変動は、プロモーター機能の損失なしに適応させることができる。
【0073】
一部の態様では、プロモーター配列は、ＭｅＰ４２６プロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。ＭｅＰ４２６プロモーター配列は、配列番号１９で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0074】
一部の態様では、プロモーター配列は、ＪｅＴプロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。ＪｅＴプロモーター配列は、配列番号２０で表される核酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。
【0075】
一部の態様では、プロモーター配列は、Ｊｅｔ＋Ｉプロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。Ｊｅｔ＋Ｉプロモーター配列は、配列番号２１で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0076】
一部の態様では、プロモーター配列は、ＭｅＰ２２９プロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。ＭｅＰ２２９プロモーター配列は、配列番号２２で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0077】
一部の態様では、プロモーター配列は、ハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。ハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター配列は、配列番号２３で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0078】
当業者により認識される通り、ハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター配列は、ＣＭＶ配列、ニワトリβ－アクチンプロモーター配列、ニワトリβ－アクチンエクソン１配列、ニワトリβ－アクチンイントロン１配列、マウス（ＭＶＭ）イントロン配列のマイニュートウイルス、または任意のこれらの組合せを含み得る。一部の態様では、ハイブリッドニワトリβ－アクチンプロモーター配列は、５’から３’の方向で、ＣＭＶ配列、ニワトリβ－アクチンプロモーター配列、ニワトリβ－アクチンエクソン１配列、ニワトリβ－アクチンイントロン１配列、およびマウス（ＭＶＭ）イントロン配列のマイニュートウイルスを含み得る。
【0079】
一部の態様では、ＣＭＶ配列は、配列番号２８で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。β－アクチンエクソン１配列は、配列番号２９で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。ニワトリβ－アクチンイントロン１配列は、配列番号３０で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。ＭＶＭイントロン配列は、配列番号３１で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0080】
一部の態様では、プロモーター配列は、Ｕ６プロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。Ｕ６プロモーター配列は、配列番号２２４で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0081】
一部の態様では、プロモーター配列は、シナプシンプロモーター配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。シナプシンプロモーター配列は、配列番号２５で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。シナプシンプロモーター配列は、配列番号２６で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0082】
トランスジーン核酸分子
トランスジーン核酸分子は、上の見出し「トランスジーン配列を含む単離されたポリヌクレオチド」の下に記載したトランスジーン核酸分子のいずれかを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
トランスジーン核酸分子は、上の見出し「トランスジーン配列を含む単離されたポリヌクレオチド」の下に記載したトランスジーン核酸分子のいずれかを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【0083】
一部の態様では、ｒＡＡＶベクター中に存在するトランスジーン核酸分子は、同じｒＡＡＶベクター中にも存在するプロモーター配列の転写制御の下にあり得る。
【0084】
ポリＡ配列
一部の態様では、ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、当技術で既知の任意のポリＡ配列を含み得る。ポリＡ配列は、合成ポリＡ配列、または天然に存在するタンパク質に由来するポリＡ配列であり得る。ポリＡ配列の非限定的な例には、それだけに限らないが、ＭＥＣＰ２ポリＡ配列、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリＡ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＰＡ４９ポリＡ配列、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリＡ配列、ｓＮＲＰポリＡ配列、またはＴＫ６５ポリＡ配列が含まれる。
一部の態様では、ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、当技術で既知の任意のポリＡ配列を含み得る。ポリＡ配列は、合成ポリＡ配列、または天然に存在するタンパク質に由来するポリＡ配列であり得る。ポリＡ配列の非限定的な例には、それだけに限らないが、ＭＥＣＰ２ポリＡ配列、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリＡ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＰＡ４９ポリＡ配列、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリＡ配列、ｓＮＲＰポリＡ配列、またはＴＫ６５ポリＡ配列が含まれる。
【0085】
即ち、ポリＡ配列は、ＭｅＣＰ２ポリＡ配列、レチノールデヒドロゲナーゼ１（ＲＤＨ１）ポリＡ配列、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列、ＳＶ４０ポリＡ配列、ＳＰＡ４９ポリＡ配列、ｓＮＲＰ－ＴＫ６５ポリＡ配列、ｓＮＲＰポリＡ配列、またはＴＫ６５ポリＡ配列を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなってよい。
【0086】
一部の態様では、ポリＡ配列は、ＳＶ４０ｐＡ配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。一部の態様では、ＳＶ４０ｐＡ配列は、配列番号３３で表される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0087】
一部の態様では、ポリＡ配列は、ＢＧＨポリＡ配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。一部の態様では、ＢＧＨポリＡ配列は、配列番号３４で表される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。一部の態様では、ＢＧＨポリＡ配列は配列番号３５で表される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0088】
一部の態様では、ポリＡ配列は合成ポリＡ配列である。一部の態様では、合成ポリＡ配列は、配列番号３６で表される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0089】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクターは、Ｋｏｚａｋ配列を含む。一部の態様では、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号３２で表される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0090】
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるｒＡＡＶベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。一部の態様では、ＷＰＲＥ配列は、配列番号３７で表される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0091】
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、配列番号３８で表される配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0092】
一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターは、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９個、または２０個）の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号３８で表される配列からなるか、またはそれを含む。
【0093】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターは、５’から３’の順番で、配列番号７の第１のＡＡＶ２ ＩＴＲ；配列番号２１のＪｅｔ＋Ｉプロモーター；配列番号３のＳＬＣ１３Ａ５をコードするコドン最適化トランスジーン；配列番号３６の合成ポリＡ配列；および配列番号８の第２のＡＡＶ２ ＩＴＲを含む。
【0094】
細菌プラスミド
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｒＡＡＶベクターの増殖を可能にするために細菌プラスミドの中に含ませてよい。即ち、本開示は、本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれかを含む細菌プラスミドを提供する。細菌プラスミドはさらに、複製の起点の配列を含み得る。細菌プラスミドはさらに、抗生剤耐性遺伝子を含み得る。細菌プラスミドは、耐性遺伝子プロモーターをさらに含み得る。細菌プラスミドは、原核生物プロモーターをさらに含み得る。一部の態様では、本開示の細菌プラスミドは、配列番号３９で表される核酸配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｒＡＡＶベクターの増殖を可能にするために細菌プラスミドの中に含ませてよい。即ち、本開示は、本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれかを含む細菌プラスミドを提供する。細菌プラスミドはさらに、複製の起点の配列を含み得る。細菌プラスミドはさらに、抗生剤耐性遺伝子を含み得る。細菌プラスミドは、耐性遺伝子プロモーターをさらに含み得る。細菌プラスミドは、原核生物プロモーターをさらに含み得る。一部の態様では、本開示の細菌プラスミドは、配列番号３９で表される核酸配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（またはその間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0095】
複製の起点の配列
一部の態様では、複製の起点の配列は、当技術で既知の任意の複製の起点の配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。複製の起点の配列は、細菌の複製の起点の配列であってよく、それにより前記細菌の複製の起点の配列を含むｒＡＡＶベクターが当技術で標準的な方法を用いることによって細菌内で産生され、増殖し、維持されることが可能になる。
一部の態様では、複製の起点の配列は、当技術で既知の任意の複製の起点の配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。複製の起点の配列は、細菌の複製の起点の配列であってよく、それにより前記細菌の複製の起点の配列を含むｒＡＡＶベクターが当技術で標準的な方法を用いることによって細菌内で産生され、増殖し、維持されることが可能になる。
【0096】
抗生剤耐性遺伝子
一部の態様では、本開示の細菌プラスミド、ｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターは、抗生剤耐性遺伝子を含み得る。
一部の態様では、本開示の細菌プラスミド、ｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターは、抗生剤耐性遺伝子を含み得る。
【0097】
一部の態様では、抗生剤耐性遺伝子は、当技術で既知の任意の抗生剤耐性遺伝子を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよい。当技術で既知の抗生剤耐性遺伝子の例には、それだけに限らないが、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ポリミキシンＢ耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれる。
【0098】
一部の態様では、抗生物質耐性遺伝子はカナマイシン耐性遺伝子であり得る。一部の態様では、カナマイシン耐性遺伝子は、配列番号４０で表される核酸配列と、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0099】
耐性遺伝子プロモーター
一部の態様では、本開示の細菌プラスミド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターは、耐性遺伝子プロモーターを含み得る。一部の態様では、耐性遺伝子プロモーターは、配列番号４１で表される核酸配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
一部の態様では、本開示の細菌プラスミド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターは、耐性遺伝子プロモーターを含み得る。一部の態様では、耐性遺伝子プロモーターは、配列番号４１で表される核酸配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0100】
ＲｅｐＣａｐ配列
一部の態様では、本開示の細菌プラスミド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターは、ｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびカプシドタンパク質をコードする配列（「ＲｅｐＣａｐ配列」）を含み得る。一部の実施形態では、ＲｅｐＣａｐ配列は、ＡＡＶ９のｒｅｐおよびカプシドタンパク質をコードする核酸を含む。一部の態様では、ＲｅｐＣａｐ配列は、配列番号４２で表される核酸配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
一部の態様では、本開示の細菌プラスミド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターは、ｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびカプシドタンパク質をコードする配列（「ＲｅｐＣａｐ配列」）を含み得る。一部の実施形態では、ＲｅｐＣａｐ配列は、ＡＡＶ９のｒｅｐおよびカプシドタンパク質をコードする核酸を含む。一部の態様では、ＲｅｐＣａｐ配列は、配列番号４２で表される核酸配列のいずれかと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（または、中間の任意のパーセンテージ）同一の核酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【0101】
ＡＡＶウイルスベクター
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞中に送達されるポリヌクレオチドを含む、組み換えで産生されたウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。アルファウイルスベクター、たとえばＳｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス系ベクターおよびＳｉｎｄｂｉｓウイルス系ベクターも、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されている。たとえばＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４～４３９頁およびＹｉｎｇら，（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３～８２７頁を参照されたい。
「ウイルスベクター」は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで宿主細胞中に送達されるポリヌクレオチドを含む、組み換えで産生されたウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アルファウイルスベクター等が含まれる。アルファウイルスベクター、たとえばＳｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔウイルス系ベクターおよびＳｉｎｄｂｉｓウイルス系ベクターも、遺伝子療法および免疫療法における使用のために開発されている。たとえばＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５：４３４～４３９頁およびＹｉｎｇら，（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５（７）：８２３～８２７頁を参照されたい。
【0102】
「ＡＡＶビリオン」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ＡＡＶウイルスベクター」または「ｒＡＡＶウイルスベクター」または「ＡＡＶベクター粒子」または「ＡＡＶ粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質およびカプシド封入されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターからなるウイルス粒子を指す。即ち、ｒＡＡＶウイルスベクターの産生には必然的にｒＡＡＶベクターの産生が含まれ、したがってベクターはｒＡＡＶベクターの中に含まれる。
【0103】
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスカプシド」または「カプシド」は、ウイルス粒子のタンパク質性シェルまたはコートを指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシド封入し、保護し、輸送し、また宿主細胞中に放出するように機能する。カプシドは一般に、タンパク質（「カプシドタンパク質」）のオリゴマー性構造サブユニットからなっている。本明細書で使用される場合、用語「カプシド封入」は、ウイルスカプシド中に封入されることを意味する。ＡＡＶのウイルスカプシドは３つのウイルスカプシドタンパク質、即ちＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物からなっている。ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の混合物は、そのそれぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれるＳｏｎｎｔａｇ Ｆら，（２０１０年６月）“Ａ ｖｉｒａｌ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｆａｃｔｏｒ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ＡＡＶ２ ｃａｐｓｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｌｕｓ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ．１０７（２２）：１０２２０～５頁、およびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＪＥ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ＲＪ（２０００年１２月）．“Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａ ｂｅｔｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒ：ｔｈｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ ｖｉｒｉｏｎｓ”．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２７８（２）：３０１～８頁に記載されているように、１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）または１：１：２０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）の比でＴ＝１の２０面体対称に配置された６０個のモノマーを含む。
【0104】
本開示は、ａ）本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれか、またはその相補体；およびｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。
【0105】
本開示は、ａ）本明細書に記載されるｒＡＡＶベクターのいずれか；およびｂ）ＡＡＶカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶウイルスベクターを提供する。
【0106】
ＡＡＶカプシドタンパク質は、当技術で既知の任意のＡＡＶカプシドタンパク質であってよい。ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質であってよい。
【0107】
代替のｒＡＡＶベクターおよびｒＡＡＶウイルスベクターの実施形態
１．５’から３’の方向に、
ａ．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ．プロモーター配列、
ｃ．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子、
ｄ．ポリＡ配列、および
ｅ．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含むｒＡＡＶベクター。
２．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドが、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のｒＡＡＶベクター。
３．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載のｒＡＡＶベクター。
４．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載のｒＡＡＶベクター。
５．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３～６のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
６．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
７．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号４で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
８．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号５で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号６で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１０．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号７、９、１１～１４、１６および１７のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１１．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号７で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１２．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号８、１０、１５または１８のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１３．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号８で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１４．プロモーター配列が、配列番号１９～２７のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１５．プロモーター配列が、シナプシンプロモーター配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１６．シナプシンプロモーター配列が、配列番号２５で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１７．シナプシンプロモーター配列が、配列番号２６で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１８．プロモーター配列が、ＪｅｔＩプロモーター配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１９．ＪｅｔＩプロモーター配列が配列番号２０で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
２０．ポリＡ配列が配列番号３３～３６のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
２１．ポリＡ配列がＢＧＨポリＡ配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
２２．ＢＧＨポリＡ配列が、配列番号３４で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２３．ＢＧＨポリＡ配列が、配列番号３５で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２４．５’から３’の方向に
ａ．配列番号７の核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ．配列番号２１の核酸配列を含むプロモーター配列、
ｃ．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドが配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ．配列番号３６の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ．配列番号８の核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２５．配列番号３８の核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
２６．
ａ．先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、またはその相補体；および
ｂ．ＡＡＶカプシドタンパク質
を含むｒＡＡＶウイルスベクター。
２７．
ａ．先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター；および
ｂ．ＡＡＶカプシドタンパク質
を含むｒＡＡＶウイルスベクター。
２８．ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
２９．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３０．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ２カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３１．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ３カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３２．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ４カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３３．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ５カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３４．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ６カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３５．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ７カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３６．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ８カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３７．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ９カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３８．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１０カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３９．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１１カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
４０．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１２カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
４１．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１３カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
４２．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
４３．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
４４．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
１．５’から３’の方向に、
ａ．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ．プロモーター配列、
ｃ．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子、
ｄ．ポリＡ配列、および
ｅ．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含むｒＡＡＶベクター。
２．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドが、配列番号１または配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載のｒＡＡＶベクター。
３．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドが、配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載のｒＡＡＶベクター。
４．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、実施形態２に記載のｒＡＡＶベクター。
５．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３～６のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
６．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が配列番号３で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
７．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号４で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
８．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号５で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列が、配列番号６で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１０．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号７、９、１１～１４、１６および１７のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１１．第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号７で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１２．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号８、１０、１５または１８のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１３．第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列が、配列番号８で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１４．プロモーター配列が、配列番号１９～２７のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１５．プロモーター配列が、シナプシンプロモーター配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１６．シナプシンプロモーター配列が、配列番号２５で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１７．シナプシンプロモーター配列が、配列番号２６で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１８．プロモーター配列が、ＪｅｔＩプロモーター配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１９．ＪｅｔＩプロモーター配列が配列番号２０で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
２０．ポリＡ配列が配列番号３３～３６のいずれか１つで表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
２１．ポリＡ配列がＢＧＨポリＡ配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
２２．ＢＧＨポリＡ配列が、配列番号３４で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２３．ＢＧＨポリＡ配列が、配列番号３５で表される核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２４．５’から３’の方向に
ａ．配列番号７の核酸配列を含む第１のＡＡＶ ＩＴＲ配列、
ｂ．配列番号２１の核酸配列を含むプロモーター配列、
ｃ．ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドをコードする核酸配列を含むトランスジーン核酸分子であって、前記ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドが配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を含む、トランスジーン核酸分子；
ｄ．配列番号３６の核酸配列を含むポリＡ配列；および
ｅ．配列番号８の核酸配列を含む第２のＡＡＶ ＩＴＲ配列
を含む、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２５．配列番号３８の核酸配列を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載のｒＡＡＶベクター。
２６．
ａ．先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター、またはその相補体；および
ｂ．ＡＡＶカプシドタンパク質
を含むｒＡＡＶウイルスベクター。
２７．
ａ．先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター；および
ｂ．ＡＡＶカプシドタンパク質
を含むｒＡＡＶウイルスベクター。
２８．ＡＡＶカプシドタンパク質が、ＡＡＶ１カプシドタンパク質、ＡＡＶ２カプシドタンパク質、ＡＡＶ４カプシドタンパク質、ＡＡＶ５カプシドタンパク質、ＡＡＶ６カプシドタンパク質、ＡＡＶ７カプシドタンパク質、ＡＡＶ８カプシドタンパク質、ＡＡＶ９カプシドタンパク質、ＡＡＶ１０カプシドタンパク質、ＡＡＶ１１カプシドタンパク質、ＡＡＶ１２カプシドタンパク質、ＡＡＶ１３カプシドタンパク質、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質、またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、先行する実施形態のいずれか一項に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
２９．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３０．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ２カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３１．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ３カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３２．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ４カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３３．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ５カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３４．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ６カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３５．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ７カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３６．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ８カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３７．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ９カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３８．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１０カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
３９．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１１カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
４０．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１２カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
４１．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶ１３カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
４２．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶＰＨＰ．Ｂカプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
４３．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
４４．ＡＡＶカプシドタンパク質がＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、実施形態２８に記載のｒＡＡＶウイルスベクター。
【0108】
組成物および医薬組成物
本開示は、本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれかを含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物は医薬組成物であってよい。したがって、本開示は、本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
本開示は、本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれかを含む組成物を提供する。一部の態様では、組成物は医薬組成物であってよい。したがって、本開示は、本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、および／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれかを含む医薬組成物を提供する。
【0109】
医薬組成物は、本明細書に記載したように、薬理学の技術において既知のまたは開発された任意の方法によって製剤化することができ、その方法には、それだけに限らないが、活性成分（たとえばウイルス粒子または組み換えベクター）を賦形剤および／または添加物および／またはその他の補助的成分と接触させ、産生物を用量単位に分割または包装することが含まれる。本開示のウイルス粒子は、望ましい特徴、たとえば増大した安定性、増大した細胞トランスフェクション、持続したまたは遅延した放出、生体分布もしくは向性、コードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの調節されたまたは増進された翻訳、およびコードされたタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの放出プロファイルを有して製剤化され得る。
【0110】
したがって、医薬組成物は、食塩水、脂質類、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コアシェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞（たとえば対象への移植のための）、ナノ粒子模倣体、またはそれらの組合せをさらに含んでよい。一部の態様では、医薬組成物はナノ粒子として製剤化される。一部の態様では、ナノ粒子は自己アセンブルした核酸ナノ粒子である。
【0111】
本開示による医薬組成物は、単一の単位用量として、および／または複数の単一単位用量として、バルクで調製され、包装され、および／または販売され得る。活性成分の量は一般に、対象に投与される活性成分の投薬量に等しくおよび／またはそのような投薬量の都合の良い割合、たとえばそのような投薬量の半分または３分の１等である。本発明の製剤は、１つまたは複数の賦形剤および／または添加物を、それぞれともにウイルスベクターの安定性を増大し、ウイルスベクターによる細胞のトランスフェクションまたは形質導入を増大し、ウイルスベクターによってコードされたタンパク質の発現を増大し、および／またはウイルスベクターによってコードされたタンパク質の放出プロファイルを変更させる量で含み得る。一部の態様では、医薬組成物は、賦形剤および／または添加物を含む。賦形剤および／または添加物の非限定的な例には、溶媒、分散媒、希釈剤、またはその他の液体ビヒクル、分散または懸濁の助剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、またはそれらの組合せが含まれる。
【0112】
一部の態様では、医薬組成物は凍結保護剤を含む。用語「凍結保護剤」は、凍結中の物質に対する損傷を低減または排除することができる薬剤を指す。凍結保護剤の非限定的な例には、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース、ラフィノース、および／またはマンニトールが含まれる。
【0113】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、標準的な薬学的担体のいずれか、たとえばリン酸塩緩衝食塩溶液、水、およびエマルジョン、たとえば水中油もしくは油中水エマルジョン、ならびに種々の種類の湿潤剤を包含する。組成物は安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ（１９７５）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ）を参照されたい。
【0114】
一部の態様では、本開示の医薬組成物は、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｄ－ソルビトール、またはそれらの任意の組合せを含んでよい。
【0115】
一部の態様では、医薬組成物はＰＢＳを含んでよく、ＰＢＳは約１００ｍＭ～約５００ｍＭ、または約２００ｍＭ～約４００ｍＭ、または約３００ｍＭ～約４００ｍＭの濃度で存在する。一部の態様では、塩化ナトリウムが約３５０ｍＭの濃度で存在してよい。
【0116】
一部の態様では、医薬組成物はＤ－ソルビトールを含んでよく、Ｄ－ソルビトールは約１％～約１０％、または約２．５％～約７．５％の濃度で存在する。一部の態様では、Ｄ－ソルビトールは約５％の濃度で存在してよい。
【0117】
即ち、本開示は、５％の濃度でＤ－ソルビトールを含む３５０ｍＭのリン酸塩緩衝食塩溶液中に本開示のｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターを含む医薬組成物を提供する。
【0118】
本開示の組成物を使用する方法
本開示は、開示した組成物または医薬組成物を用いる、たとえば細胞、組織、器官、動物、または対象に治療有効量の組成物または医薬組成物を投与する、または接触させる、当技術で既知のまたは本明細書に記載した細胞、組織、器官、動物、または対象における疾患または障害の処置のための開示した組成物または医薬組成物の使用を提供する。一態様では、対象は哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。
本開示は、開示した組成物または医薬組成物を用いる、たとえば細胞、組織、器官、動物、または対象に治療有効量の組成物または医薬組成物を投与する、または接触させる、当技術で既知のまたは本明細書に記載した細胞、組織、器官、動物、または対象における疾患または障害の処置のための開示した組成物または医薬組成物の使用を提供する。一態様では、対象は哺乳動物である。好ましくは、対象はヒトである。
【0119】
本開示は、疾患および／または障害を防止または処置する方法であって、治療有効量の、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物のいずれか１つを対象に投与するステップを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる方法を提供する。
【0120】
一部の態様では、疾患および／または障害は、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子が関与する遺伝的障害であり得る。ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子が関与する遺伝的障害は、ＳＬＣ１３Ａ５の喪失、誤機能、および欠損であり得る。ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子が関与する遺伝的障害として、てんかん性脳症、例えば乳児てんかん性脳症等が挙げられるが、但しこれに限定されない。
【0121】
一部の態様では、疾患はＳＬＣ１３Ａ５タンパク質が関与する障害であり得る。ＳＬＣ１３Ａ５タンパク質が関与する遺伝的障害は、ＳＬＣ１３Ａ５の喪失、誤機能、および／または欠損であり得る。
【0122】
一部の態様では、疾患は、対象のゲノム内のＳＬＣ１３Ａ５遺伝子における、その少なくとも１つのコピーの機能喪失により特徴付けられる疾患であり得る。一部の態様では、疾患は、対象のゲノム内のＳＬＣ１３Ａ５遺伝子における、その少なくとも１つのコピーの機能減少により特徴付けられる疾患であり得る。一部の態様では、疾患は、対象のゲノム内のＳＬＣ１３Ａ５遺伝子における、その少なくとも１つのコピー内の少なくとも１つの突然変異における少なくとも１つの突然変異により特徴付けられる疾患であり得る。
【0123】
本明細書に提供される方法における対象では、ＳＬＣ１３Ａ５および／またはＳＬＣ１３Ａ５が欠損している可能性がある。本明細書で使用される場合、「ＳＬＣ１３Ａ５欠損」とは、対象が、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子内に１つまたは複数の突然変異を有し得るか、または機能的ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子を欠いている可能性があることを意味する。本明細書で使用される場合、「ＳＬＣ１３Ａ５欠損」とは、対象が、ＳＬＣ１３Ａ５タンパク質内に１つまたは複数の突然変異を有し得るか、または機能的ＳＬＣ１３Ａ５タンパク質を欠いている可能性があることを意味する。
【0124】
ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子またはＳＬＣ１３Ａ５タンパク質内の突然変異は、当技術分野において公知の任意の種類の突然変異であり得る。変異の非限定的な例には、体細胞変異、単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）、ナンセンス変異、挿入、欠失、重複、フレームシフト変異、反復拡張、短い挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）、長いＩＮＤＥＬ、選択的スプライシング、選択的スプライシングの産物、改変された翻訳の開始、改変された翻訳の開始の産物、プロテオーム切断、プロテオーム切断の産物が含まれる。
【0125】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に基づき処置される対象は、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子内に、ｃ．１０３－１Ｇ＞Ａ、ｃ．１４８Ｔ＞Ｃ、ｃ．２３１＋２Ｔ＞Ｇ、ｃ．３８９Ｇ＞Ａ、ｃ．４２５Ｃ＞Ｔ、ｃ．４７８Ｇ＞Ｔ、ｃ．５１１ｄｅｌＧ、ｃ．６４４Ｃ＞Ｔ、ｃ．６５５Ｇ＞Ａ、ｃ．６８０Ｃ＞Ｔ、ｃ．９９７Ｃ＞Ｔ、ｃ．１０２２Ｇ＞Ａ、ｃ．１２７６－１Ｇ＞Ａ、１４７５Ｔ＞Ｃ、１５１４Ｃ＞Ｔ、イントロンＣＣＤＸ１１０７９．１、エクソン２～４の遺伝子欠損、およびエクソン１～５の遺伝子欠損からなる群から選択される突然変異を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に基づき対象は、ＳＬＣ１３Ａ５タンパク質内に、Ｃ５０Ｒ、Ｇ１３０Ｄ、Ｔ１４２Ｍ、Ｇｌｕ１６０＊、Ｅ１７１Ｓｆｓ＊１６、Ａ２１５Ｖ、Ｇ２１９Ｒ、Ｔ２２７Ｍ、Ｒ３３３＊、Ｔｒｐ３４１＊、Ｌ４９２Ｐ、およびＰ５０５Ｌからなる群から選択される突然変異を有する。
【0126】
一部の実施形態では、遺伝子突然変異はｃ．６５５Ｇ＞Ａである。一部の実施形態では、遺伝子突然変異はｃ．６８０Ｃ＞Ｔである。一部の実施形態では、タンパク質突然変異はＧ２１９Ｒである。一部の実施形態では、タンパク質突然変異はＴ２２７Ｍである。
【0127】
一部の態様では、疾患は、疾患を有さないコントロール対象と比較して、対象におけるＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の発現減少により特徴付けられる疾患であり得る。一部の態様では、発現の低下は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％であってよい。
【0128】
一部の態様では、疾患は、疾患を有さないコントロール対象と比較して、対象におけるＳＬＣ１３Ａ５タンパク質量の減少により特徴付けられる疾患であり得る。一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５タンパク質の量の減少は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％であり得る。
【0129】
一部の態様では、疾患は、疾患を有さないコントロール対象と比較して、対象におけるＳＬＣ１３Ａ５タンパク質の活性減少により特徴付けられる疾患であり得る。一部の態様では、ＳＬＣ１３Ａ５タンパク質の活性減少は、少なくとも約１０％、または少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％であり得る。
【0130】
処置方法は、本明細書に記載される疾患および／または障害の１つまたは複数の症状を緩和することができる。一実施形態では、本明細書に記載した組成物の送達によって、症状が検出可能になる前にＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の変異を有している対象に投与されれば、検出可能な症状の進行を防止しまたは遅延させることができる。したがって、処置は治療的または予防的であり得る。治療は、確立した症状または表現型の阻害または逆転を指す。治療は、症状または表現型の発症の遅延も意味し得る。予防は、既に明白な症状を呈していない対象における症状の進行を阻止または防止することを意味する。明白な症状を呈していない対象は、月齢１８か月、１２か月、または６か月以前に実施される適切な遺伝子検査によって、ＳＬＣ１３Ａ５遺伝子の機能喪失変異を有すると若年期に特定することができる。
【0131】
本開示の方法、組成物、医薬組成物、ｒＡＡＶベクター、またはｒＡＡＶウイルスベクターを用いて処置すべき対象は、本明細書に記載した疾患および／または症状のいずれをも有し得る。
【0132】
一部の態様では、対象は年齢０．５歳未満、または年齢１歳未満、または年齢１．５歳未満、または年齢２歳未満、または年齢２．５歳未満、または年齢３歳未満、または年齢３．５歳未満、または年齢３．５歳未満、または年齢４歳未満、または年齢４．５歳未満、または年齢５歳未満、または年齢５．５歳未満、または年齢６歳未満、または年齢６．５歳未満、または年齢７歳未満、または年齢７．５歳未満、または年齢８歳未満、または年齢８．５歳未満、または年齢９歳未満、または年齢９．５歳未満、または年齢１０歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢１１歳未満、年齢１２歳未満、年齢１３歳未満、年齢１４歳未満、年齢１５歳未満、年齢２０歳未満、年齢３０歳未満、年齢４０歳未満、年齢５０歳未満、年齢６０歳未満、年齢７０歳未満、年齢８０歳未満、年齢９０歳未満、年齢１００歳未満、年齢１１０歳未満、または年齢１２０歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢０．５歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢４歳未満であってよい。一部の態様では、対象は年齢１０歳未満であってよい。
【0133】
本明細書で開示した処置および防止の方法は、治療または防止のための患者を特定および選択するために適切な診断手法と組み合わせてよい。
【0134】
本開示は、宿主細胞を本明細書で開示したｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか１つと接触させることを含む、宿主細胞中のタンパク質のレベルを増加させる方法を提供し、ｒＡＡＶウイルスベクターは、タンパク質をコードするトランスジーン核酸分子を含む本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのいずれか１つを含む。一部の態様では、タンパク質は治療用タンパク質である。一部の態様では、宿主細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏである。一部の態様では、宿主細胞は対象由来である。一部の態様では、対象は正常な対象におけるタンパク質のレベルおよび／または機能と比較して低下したタンパク質のレベルおよび／または機能をもたらす障害に罹患している。
【0135】
一部の態様では、タンパク質のレベルは、宿主細胞中で約１×１０－７ｎｇ、約３×１０－７ｎｇ、約５×１０－７ｎｇ、約７×１０－７ｎｇ、約９×１０－７ｎｇ、約１×１０－６ｎｇ、約２×１０－６ｎｇ、約３×１０－６ｎｇ、約４×１０－６ｎｇ、約６×１０－６ｎｇ、約７×１０－６ｎｇ、約８×１０－６ｎｇ、約９×１０－６ｎｇ、約１０×１０－６ｎｇ、約１２×１０－６ｎｇ、約１４×１０－６ｎｇ、約１６×１０－６ｎｇ、約１８×１０－６ｎｇ、約２０×１０－６ｎｇ、約２５×１０－６ｎｇ、約３０×１０－６ｎｇ、約３５×１０－６ｎｇ、約４０×１０－６ｎｇ、約４５×１０－６ｎｇ、約５０×１０－６ｎｇ、約５５×１０－６ｎｇ、約６０×１０－６ｎｇ、約６５×１０－６ｎｇ、約７０×１０－６ｎｇ、約７５×１０－６ｎｇ、約８０×１０－６ｎｇ、約８５×１０－６ｎｇ、約９０×１０－６ｎｇ、約９５×１０－６ｎｇ、約１０×１０－５ｎｇ、約２０×１０－５ｎｇ、約３０×１０－５ｎｇ、約４０×１０－５ｎｇ、約５０×１０－５ｎｇ、約６０×１０－５ｎｇ、約７０×１０－５ｎｇ、約８０×１０－５ｎｇ、または約９０×１０－５ｎｇのレベルに増加している。
【0136】
遺伝子（例えば、ＳＬＣ１３Ａ５）またはタンパク質（例えば、ＳＬＣ１３Ａ５）の発現レベルは、当技術分野において公知の、または本明細書に記載される任意の適する方法により決定され得る。タンパク質レベルは、例えば、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、およびフローサイトメトリーにより決定され得る。遺伝子発現は、例えば、定量的ＰＣＲ、遺伝子シークエンシング、およびＲＮＡシークエンシングにより決定され得る。
【0137】
本開示は、細胞を有効量の本明細書で開示したｒＡＡＶウイルスベクターのうちいずれか１つと接触させることを含む、対象における細胞に目的の遺伝子を導入する方法を提供し、ｒＡＡＶウイルスベクターは目的の遺伝子を含む本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのうちいずれか１つを含む。
【0138】
本開示の方法の一部の態様では、対象には、本開示のｒＡＡＶベクターまたはｒＡＡＶウイルスベクターを投与することに加えて、予防的免疫抑制処置レジメンを施行することもできる。一部の態様では、免疫抑制処置レジメンには、少なくとも１つの免疫抑制治療剤を投与することが含まれる。免疫抑制治療剤の非限定的な例には、それだけに限らないが、シロリムス（ラパマイシン）、アセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、ＩＶメチルプレドニソロン、プレドニソン、またはそれらの任意の組合せが含まれる。免疫抑制治療剤は、ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与の日に先立って、ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与と同じ日に、またはｒＡＡＶベクターおよび／もしくはｒＡＡＶウイルスベクターの投与の後の任意の日に、投与してよい。
【0139】
診断または処置の「対象」は、細胞または哺乳動物等の動物、またはヒトである。用語「対象」および「患者」は、本明細書において交換可能に使用される。対象は特定の種に限定されず、限定なしに類人猿、ネズミ、ラット、イヌ、またはウサギ種を含む、診断または処置の対象となる非ヒト動物、および感染または動物のモデルの対象となるもの、ならびにその他の家畜、スポーツ動物、またはペットを含む。一部の態様では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、ヒト小児、例えば５歳未満の小児である。一部の実施形態では、対象は、ヒト新生児、例えば１か月未満、２か月未満、３か月未満、または４か月未満の年齢の新生児である。
【0140】
本明細書で使用される場合、対象における疾患の「処置すること」または「処置」は、（１）疾患を阻止しまたはその進行を阻むこと、または（２）疾患もしくは疾患の症状を改善しまたはその退行を惹起することを指す。当技術で理解されているように、「処置」は、臨床的結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチである。本技術の目的のため、有益なまたは望ましい結果には、検出可能であってもなくても、１つまたは複数の、それだけに限らないが、１つまたは複数の症状の緩和または改善、状態（疾患を含む）の程度の逓減、状態（疾患を含む）の状況の安定化（即ち、悪化しないこと）、状態（疾患を含む）の遅延または遅らせること、状態（疾患を含む）の進行、改善、または軽減、状況および寛解（部分的であっても全面的であっても）が含まれ得る。
【0141】
本明細書で使用される場合、「防止すること」または疾患の「防止」は、疾患に罹患しやすい、または疾患の症状がまだ表れていない対象における発生から症状または疾患を防止することを指す。
【0142】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」とは、所望の効果を達成するのに十分な量を意味することを意図している。治療または予防の用途に関しては、有効量は、問題の状態の種類および重症度、ならびに個別の対象の特徴、たとえば一般的健康状態、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する忍容性に依存することになる。遺伝子治療に関しては、有効量は、対象において欠如している遺伝子の部分的または完全な機能の回復をもたらすために十分な量であってよい。一部の態様では、ｒＡＡＶウイルスベクターの有効量は、ＳＬＣ１３Ａ５ポリペプチドが産生されるような対象における遺伝子の発現をもたらすために十分な量である。一部の態様では、有効量とは、対象における発作の頻度を、本明細書に記載されるｒＡＡＶウイルスベクターを投与されたことがない、またはコントロール処置が施された対象と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％減少させるのに必要とされる量である。当業者であれば、これらのおよびその他の因子に応じて適切な量を決定することができよう。
【0143】
一部の態様では、有効量は、問題の用途の大きさおよび性質に依存することになる。これは標的の対象および使用する方法の性質および感受性に依存することにもなる。当業者であれば、これらのおよびその他の考慮に基づいて有効量を決定することができよう。有効量は、実施形態に応じた組成物の１つまたは複数の投与を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。
【0144】
本明細書で使用される場合、用語「投与する」または「投与」は、ヒトまたは動物等の対象への物質の送達を意味することを意図している。投与は、処置の経過を通して１つの用量で、連続的に、または間欠的に、達成することができる。最も有効な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には既知であり、治療に用いる組成物、治療の目的、ならびに処置される対象の年齢、健康状態、または性別によって変動することになる。単一または多回の投与は、処置する臨床医またはペットおよびその他の動物の場合には処置する獣医によって選択される用量レベルおよびパターンで行なってよい。
【0145】
最も有効な投与の手段および投薬量を決定する方法は当業者には既知であり、治療に用いる組成物、治療の目的、ならびに処置される対象によって変動することになる。単一または多回の投与は、処置する臨床医によって選択される用量レベルおよびパターンで行なってよい。投薬量は投与の経路に影響され得ることが注意される。好適な投薬処方および薬剤を投与する方法は当技術で既知である。そのような好適な投薬量の非限定的な例は、投与あたり１０９ベクターゲノムの低い量から１０１７ベクターゲノムの高い量までであってよい。
【0146】
本明細書に記載した方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえばｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、約１０９～約１０１７の範囲である。一部の態様では、約１０１０～約１０１２、約１０１１～約１０１３、約１０１１～約１０１２、約１０１１～約１０１４、約１０１２～約１０１６、約１０１３～約１０１６、約１０１４～約１０１５、約５×１０１１～約５×１０１２、約１０１１～約１０１８、約１０１３～約１０１６、または約１０１２～約１０１３個のウイルス粒子が対象に投与される。
【0147】
本明細書に記載した方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえばｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、少なくとも約１０１０、または少なくとも約１０１１、または少なくとも約１０１２、または少なくとも約１０１３、または少なくとも約１０１４、または少なくとも約１０１５、または少なくとも約１０１６、または少なくとも約１０１７個のウイルス粒子である。
【0148】
本明細書に記載される方法の一部の態様では、対象に投与されるベクターゲノム（例えば、ｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、約１０９～約１０１７の範囲である。一部の態様では、ベクターゲノム約１０１０～約１０１２、約１０１１～約１０１３、約１０１１～約１０１２、約１０１１～約１０１４、約１０１２～約１０１６、約１０１３～約１０１６、約１０１４～約１０１５、約５×１０１１～約５×１０１２、約１０１１～約１０１８、約１０１３～約１０１６、または約１０１２～約１０１３個が対象に投与される。
【0149】
本明細書に記載される方法の一部の態様では、対象に投与されるベクターゲノム（例えば、ｒＡＡＶウイルスベクター）の数は、少なくとも約１０１０、または少なくとも約１０１１、または少なくとも約１０１２、または少なくとも約１０１３、または少なくとも約１０１４、または少なくとも約１０１５、または少なくとも約１０１６、または少なくとも約１０１７個のベクターゲノムである。一部の態様では、ベクターゲノム２×１０１１または約８×１０１１個が対象に投与される。
【0150】
本明細書に記載した方法の一部の態様では、対象に投与されるウイルス粒子（たとえばｒＡＡＶウイルスベクター）の数は対象の年齢に依存し得る。非限定的な例では、７歳またはそれ以上の年齢の対象には約１０×１０１４個のウイルス粒子を投与してよく、約４歳～約７歳の年齢の対象には約１０×１０１４個のウイルス粒子を投与してよく、約３歳～約４歳の年齢の対象には約９×１０１４個のウイルス粒子を投与してよく、約２歳～約３歳の年齢の対象には約８．２×１０１４個のウイルス粒子を投与してよく、約１歳～約２歳の年齢の対象には約７．３×１０１４個のウイルス粒子を投与してよく、約０．５歳～約１歳の年齢の対象には約４×１０１４個のウイルス粒子を投与してよく、約０．５歳未満の年齢の対象には３×１０１４個のウイルス粒子を投与してよい。
【0151】
一部の態様では、組成物、医薬組成物中のウイルス粒子の量、または患者に投与されるウイルス粒子の量は、ウイルスゲノムを含むと予測されるウイルス粒子のパーセンテージに基づいて計算することができる。
【0152】
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、静脈内、髄腔内（ＩＴ）、大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ－ｍａｇｎａ）（ＩＣＭ）脳内、心室内、鼻内、気管内、耳内、眼内または眼周囲、経口、経直腸、経粘膜、吸入、経皮、非経口、皮下、皮内、筋肉内、脳槽内、神経内、胸膜内、局所、リンパ内、脳槽内で対象に導入してよい。そのような導入は、動脈内、心臓内、脳室下、硬膜外、大脳内、脳室内、網膜下、硝子体内、関節内、腹腔内、子宮内、神経内、またはそれらの任意の組合せであってもよい。一部の態様では、ウイルス粒子は所望の標的組織に、たとえば非限定的な例として、肺、眼、またはＣＮＳに送達される。一部の態様では、ウイルス粒子の送達は全身的である。脳槽内の投与経路には、脳室の脳脊髄液への薬物の直接投与が含まれる。これは、大槽への直接注射または永久的に位置したチューブによって実施し得る。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは髄腔内（ＩＴ）に投与される。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは大槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｒｎａｌ－ｍａｎｇａ）（ＩＣＭ）投与される。
【0153】
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、対象における遺伝子欠損を修復する。一部の態様では、成功裡に処理された細胞、組織、器官、または対象における修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの修復されていない標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとの比は、少なくとも約１．５：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、約１０００：１、約１０，０００：１、約１００，０００：１、または約１，０００，０００：１である。修復された標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量または比は、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、ＰＣＲ、シーケンシング、マススペクトル、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫蛍光、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおける蛍光、次世代シーケンシング、イムノブロット、およびＥＬＩＳＡを含むがそれらに限らない当技術で既知の任意の方法によって決定することができる。
【0154】
本開示のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、または医薬組成物の投与は、処置の経過を通して１つの用量で、連続的に、または間欠的に、達成することができる。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、または医薬組成物は、注射、注入、または移植によって非経口的に投与される。
【0155】
一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、脳および頸椎に増進された向性を示す。一部の態様では、本開示のｒＡＡＶウイルスベクターは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる。
【0156】
一部の実施形態では、対象には、本明細書に提示される組み換えｒＡＡＶの単回用量がその寿命において１回投与される。一部の実施形態では、対象には、本明細書に提示される組み換えｒＡＡＶが反復投与される。このような反復投与は、同一量のｒＡＡＶ粒子を含有し得るか、または異なる量のｒＡＡＶ粒子を含有し得る。一部の実施形態では、対象には、約６か月毎、約９か月毎、約１２か月毎、約１５か月毎、約１８か月毎、約２年毎、約３年毎、約４年毎、約５年毎、約６年毎、約７年毎、約８年毎、約９年毎、または約１０年毎に、ｒＡＡＶが反復投与される。
【0157】
製造方法
本開示のｒＡＡＶウイルスベクターを産生するために種々のアプローチを用い得る。一部の態様では、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドおよび細胞株を用いることによって、パッケージングが達成される。ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、ウイルスベクターの産生を容易にするエレメントおよび配列を含んでいる。別の態様では、ヘルパープラスミドはパッケージング細胞株のゲノムの中に安定に組み込まれ、それによりパッケージング細胞株はヘルパープラスミドによるさらなるトランスフェクションを必要としない。
本開示のｒＡＡＶウイルスベクターを産生するために種々のアプローチを用い得る。一部の態様では、ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドおよび細胞株を用いることによって、パッケージングが達成される。ヘルパーウイルスまたはヘルパープラスミドは、ウイルスベクターの産生を容易にするエレメントおよび配列を含んでいる。別の態様では、ヘルパープラスミドはパッケージング細胞株のゲノムの中に安定に組み込まれ、それによりパッケージング細胞株はヘルパープラスミドによるさらなるトランスフェクションを必要としない。
【0158】
一部の態様では、細胞はパッケージング細胞株またはヘルパー細胞株である。一部の態様では、ヘルパー細胞株は真核細胞、たとえばＨＥＫ２９３細胞または２９３Ｔ細胞である。一部の態様では、ヘルパー細胞は酵母細胞または昆虫細胞である。
【0159】
一部の態様では、細胞はテトラサイクリンアクチベータータンパク質をコードする核酸、およびテトラサイクリンアクチベータータンパク質の発現を制御するプロモーターを含む。一部の態様では、テトラサイクリンアクチベータータンパク質の発現を制御するプロモーターは、構造的プロモーターである。一部の態様では、プロモーターはホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）またはＣＭＶプロモーターである。
【0160】
ヘルパープラスミドはたとえば、複製能のあるＡＡＶを産生せず、複製能のないＡＡＶをパッケージングするためおよび複製能のないＡＡＶをパッケージングすることができるビリオンタンパク質を高いタイターで産生するために必要なトランスオールビリオンタンパク質をコードする複製能のないウイルスゲノムから誘導された少なくとも１つのウイルスヘルパーＤＮＡ配列を含み得る。
【0161】
ＡＡＶをパッケージングするためのヘルパープラスミドは当技術で既知であり、たとえば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００４／０２３５１７４Ａ１号を参照されたい。そこで述べられているように、ＡＡＶヘルパープラスミドはヘルパーウイルスとしてＤＮＡ配列、非限定的な例としてそれぞれの元のプロモーターまたは異種プロモーターによって制御されるＡｄ５遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡを含み得る。ＡＡＶヘルパープラスミドは、所望の標的細胞のトランスフェクションの単純な検出を可能にするために、蛍光タンパク質等のマーカータンパク質の発現のための発現カセットをさらに含んでよい。
【0162】
本開示は、パッケージング細胞株を本明細書で開示したＡＡＶヘルパープラスミドのいずれか１つおよび本明細書で開示したｒＡＡＶベクターのいずれか１つでトランスフェクトすることを含む、ｒＡＡＶウイルスベクターを産生する方法を提供する。一部の態様では、ＡＡＶヘルパープラスミドとｒＡＡＶベクターはパッケージング細胞株に共トランスフェクトされる。一部の態様では、細胞株は哺乳動物細胞株、たとえばヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞株である。本開示は、本明細書で開示したｒＡＡＶベクターおよび／またはｒＡＡＶウイルスベクターのいずれか１つを含む細胞を提供する。
【0163】
本明細書で使用される場合、ウイルスまたはプラスミドに関連する用語「ヘルパー」は、本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれか１つの複製およびパッケージングのために必要なさらなる成分を提供するために用いられるウイルスまたはプラスミドを指す。ヘルパーウイルスによってコードされる成分は、ビリオンのアセンブリー、カプシド封入、ゲノムの複製、および／またはパッケージングのために必要な任意の遺伝子を含み得る。たとえば、ヘルパーウイルスまたはプラスミドは、ウイルスゲノムの複製のための必要な酵素をコードし得る。ＡＡＶ構築物とともに用いるために好適なヘルパーウイルスおよびプラスミドの非限定的な例には、ｐＨＥＬＰ（プラスミド）、アデノウイルス（ウイルス）、またはヘルペスウイルス（ウイルス）が含まれる。一部の態様では、ｐＨＥＬＰプラスミドはｐＨＥＬＰＫプラスミドであってよく、この場合はアンピシリン発現カセットがカナマイシン発現カセットに交換される。
【0164】
本明細書で使用される場合、パッケージング細胞（またはヘルパー細胞）は、ウイルスベクターを産生するために用いられる細胞である。組み換えＡＡＶウイルスベクターの産生には、トランスで提供されるＲｅｐおよびＣａｐタンパク質、ならびにＡＡＶの複製を助けるアデノウイルス由来の遺伝子配列が必要である。一部の態様では、プラスミドを含むパッケージング／ヘルパー細胞が、細胞のゲノムの中に安定に組み込まれる。他の態様では、パッケージング細胞は過渡的にトランスフェクトされ得る。典型的には、パッケージング細胞は真核細胞、たとえば哺乳動物細胞または昆虫細胞である。
【0165】
キット
本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物は、治療、診断、または研究の用途におけるその使用を容易にするために、医薬用または診断用または研究用のキットにアセンブルしてよい。一部の態様では、本開示のキットは、本明細書に記載したように、単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、医薬組成物、宿主細胞、単離された組織のいずれか１つを含む。
本明細書に記載した単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、および／または医薬組成物は、治療、診断、または研究の用途におけるその使用を容易にするために、医薬用または診断用または研究用のキットにアセンブルしてよい。一部の態様では、本開示のキットは、本明細書に記載したように、単離されたポリヌクレオチド、ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶウイルスベクター、組成物、医薬組成物、宿主細胞、単離された組織のいずれか１つを含む。
【0166】
一部の態様では、キットは使用説明書をさらに含む。具体的には、そのようなキットは、本明細書に記載した１つまたは複数の薬剤を、これらの薬剤の意図された用途および正しい使用を記載した説明書とともに含んでよい。一部の態様では、キットは、キットの１つもしくは複数の成分を混合し、および／または試料を単離し混合して対象に適用するための説明書を含んでよい。一部の態様では、キット中の薬剤は医薬製剤中にあり、特定の用途および薬剤の投与の方法に適した投薬量である。研究目的用のキットは、種々の実験を行なうために適切な濃度または量で成分を含み得る。
【0167】
キットは、本明細書に記載した方法の使用を容易にするように設計され、多くの形態を取ることができる。キットの成分のそれぞれは、適用できる場合には、液体形態（たとえば溶液中）または固体形態（たとえば乾燥粉末）で提供され得る。ある特定の例では、組成物のいくつかは、たとえば、キットとともに提供されてもよく提供されなくてもよい好適な溶媒または他の種（たとえば、水または細胞培養培地）によって再構成または他の方法で処理（たとえば活性形に）することができる。一部の態様では、組成物は保存溶液（たとえば凍結保存溶液）中で提供され得る。保存溶液の非限定的な例には、ＤＭＳＯ、パラホルムアルデヒド、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）が含まれる。一部の態様では、保存溶液はある量のメタロプロテアーゼ阻害剤を含む。
【0168】
一部の態様では、キットは、本明細書に記載した成分のいずれか１つまたは複数を、１つまたは複数の容器中に含む。即ち、一部の態様では、キットは、本明細書に記載した薬剤を収容する容器を含み得る。薬剤は液体、ゲル、または固体（粉末）の形態であってもよい。薬剤は無菌的に調製され、シリンジに包装され、冷蔵で出荷され得る。あるいは、保存のために薬剤をバイアルまたはその他の容器中に収容してもよい。第２の容器が無菌的に調製された他の薬剤を有してもよい。あるいは、キットは、事前に混合され、シリンジ、バイアル、チューブ、またはその他の容器中で出荷された活性薬剤を含んでよい。キットは、対象に薬剤を投与するために必要な部品、たとえばシリンジ、局所適用デバイス、またはＩＶニードルチューブおよびバッグの１つもしくは複数または全てを有してよい。
【0169】
さらなる定義
文脈によって他が指示されない限り、本明細書に記載した本発明の種々の特徴は任意の組合せで用いることができることが特に意図されている。さらに、本開示は、一部の態様で、本明細書で説明した任意の特徴または特徴の組合せを除外または削除してよいことも意図している。説明のため、複合体が成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと明細書で述べている場合には、Ａ、Ｂ、もしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せを、単独でまたは任意の組合せで削除または放棄してよいことが特に意図されている。
文脈によって他が指示されない限り、本明細書に記載した本発明の種々の特徴は任意の組合せで用いることができることが特に意図されている。さらに、本開示は、一部の態様で、本明細書で説明した任意の特徴または特徴の組合せを除外または削除してよいことも意図している。説明のため、複合体が成分Ａ、Ｂ、およびＣを含むと明細書で述べている場合には、Ａ、Ｂ、もしくはＣのいずれか、またはそれらの組合せを、単独でまたは任意の組合せで削除または放棄してよいことが特に意図されている。
【0170】
他に明示的に示さない限り、全ての特定した態様、実施形態、特徴、および用語は、引用した態様、実施形態、特徴、または用語と、その生物学的等価物の両方を含むことが意図されている。
【0171】
本技術の実施には、他に指示がない限り、当技術の技能の範囲内にある有機化学、薬理学、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組み換えＤＮＡの従来の手法が採用されることになる。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５）），ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編，（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，およびＡｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＲＩ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，（１９８７））を参照されたい。
【0172】
本明細書で使用される場合、用語「含む」は、組成物および方法が引用した要素を含むが、他を排除しないことを意味することを意図している。本明細書で使用される場合、移行句「実質的に～からなる」（および文法的変形）は、引用した材料またはステップ、および引用した実施形態の基礎的かつ新規な特徴に実質的に影響しない材料またはステップを包含すると解釈すべきである。即ち、本明細書で使用される用語「実質的に～からなる」は、「含む」と等価であると解釈するべきではない。「からなる」は、他の成分および本明細書で開示した組成物を投与するための実質的な方法ステップの微量を超える要素を排除することを意味する。これらの移行句のそれぞれによって定義される態様は、本開示の範囲内である。本明細書におけるそれぞれの例において、用語「含む」、「実質的に～からなる」、および「からなる」のいずれも、それらの元の意味を保持したままで他の２つの句によって置き換えることができる。本明細書に記載したいずれの単一の用語、単一の要素、単一の句、用語の群、または要素の群は、特許請求の範囲からそれぞれ具体的に除外され得る。
【0173】
全ての数値指定、たとえば範囲を含むｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて１．０または０．１の増分で、あるいは±１５％、１０％、５％、２％の変動で、（＋）または（－）に変動する近似である。常に明示的に述べてはいないが、全ての数値指定には、用語「約」が先行していることを理解されたい。常に明示的に述べてはいないが、本明細書に記載した試薬は単に例示的なものであり、その等価物が当技術で既知であることも理解されたい。量または濃度その他の測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される用語「約」は、特定した量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、または０．１％でさえもの変動を包含することを意味している。
【0174】
用語「許容される」、「有効な」、または「十分な」は、本明細書で開示した任意の成分、範囲、用量形態、その他の選択を記載するために使用される場合には、前記の成分、範囲、用量形態、その他が開示した目的に適していることを意図している。
【0175】
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、関連する列挙した項目の１つまたは複数のあらゆる可能な組合せ、ならびに選択肢（「または」）で説明される場合には組合せの欠如を指し、包含する。
【0176】
具体的に引用しない限り、用語「宿主細胞」は、たとえば真菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む真核生物宿主細胞を含む。真核生物宿主細胞の非限定的な例には、類人猿、ウシ、ブタ、ネズミ、ラット、鳥類、爬虫類、およびヒト、たとえばＨＥＫ２９３細胞および２９３Ｔ細胞が含まれる。
【0177】
本明細書で使用される用語「単離された」は、実質的に他の材料を含まない分子または生物製剤または細胞材料を指す。
【0178】
本明細書で使用される場合、用語「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」は相互交換可能に使用され、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである任意の長さのヌクレオチドのポリマーの形態を指す。即ち、この用語には、それだけに限らないが、一本鎖、二本鎖、もしくは多数鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基またはその他の天然の、化学的もしくは生化学的に改変された、非天然の、または誘導されたヌクレオチド塩基を含むか、実質的にそれらからなるか、またはそれらからなるポリマーが含まれる。
【0179】
「遺伝子」は、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを指す。「遺伝子産物」あるいは「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写され翻訳された際に生成するアミノ酸配列（たとえばペプチドまたはポリペプチド）を指す。
【0180】
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される２ステップのプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが引き続いてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡから誘導される場合には、発現は真核細胞内におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【0181】
「転写の制御下」は当技術でよく理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与するか、または転写を促進するエレメントに作動可能に連結されていることに依存していることを示す。「作動可能に連結されている」は、ポリヌクレオチドが細胞中において機能することを可能にする様式で配置されていることを意図している。一態様では、プロモーターは下流配列に作動可能に連結されていてよい。
【0182】
用語「コードする」は、それがポリヌクレオチドおよび／または核酸配列に適用される場合には、その塩基配列が、ポリペプチドおよび／またはその断片に翻訳されるＲＮＡ転写物（たとえば、ｍＲＮＡ転写物）の塩基配列と同一であるならば、ポリペプチドを「コードしている」と称されるポリヌクレオチドおよび／または核酸配列を指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コードする配列はそれから推測することができる。
【0183】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は相互交換可能に使用され、その最も広い意味においてアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣体の２つ以上のサブユニットの化合物を指す。サブユニットはペプチド結合で連結されていてよい。別の態様では、サブユニットは他の結合、たとえばエステル、エーテル、その他で連結されていてよい。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるアミノ酸の最大の数には制限はない。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤとＬの両方の光学異性体、アミノ酸アナログ、およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然、または合成のアミノ酸を指す。
【0184】
本明細書で使用される場合、用語「シグナルペプチド」または「シグナルポリペプチド」は、新たに合成された分泌性または膜のポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端に通常存在するアミノ酸配列を意図している。これはポリペプチドを特定の細胞内位置に、たとえば細胞膜を横切って、細胞膜の中に、または核の中に、指向するように作用する。一部の態様では、シグナルペプチドは局在化の後で除去される。シグナルペプチドの例は当技術で公知である。非限定的な例としては、米国特許第８，８５３，３８１号、第５，９５８，７３６号、および第８，７９５，９６５号に記載されたものがある。一部の態様では、シグナルペプチドはＩＤＵＡシグナルペプチドであってよい。
【0185】
用語「等価」または「生物学的等価」は、特定の分子、生物学的材料、または細胞材料に言及する場合には、相互交換可能に使用され、最小の相同性を有しながらそれでも所望の構造または機能性を維持している特定の分子、生物学的材料、または細胞材料を意図している。等価のポリペプチドの非限定的な例には、参照ポリペプチド（たとえば野生型ポリペプチド）と少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、もしくは少なくとも約９９％の同一性を有するポリペプチド、または参照ポリヌクレオチド（たとえば野生型ポリヌクレオチド）と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドでコードされるポリペプチドが含まれる。
【0186】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチドの間、または２つの核酸分子の間の配列類似性を指す。同一性パーセントは、比較の目的でアラインさせたそれぞれの配列において位置を比較することによって決定することができる。比較した配列中のある位置が同じ塩基またはアミノ酸によって占有されている場合には、それらの分子はその位置において同一である。配列の間の同一性の程度は、それらの配列によって共有される一致した位置の数の関数である。「無関係な」または「非相同性」配列は、本開示の配列の１つと４０％未満の同一性、２５％未満の同一性を共有している。アラインメントおよび配列同一性パーセントは、前記核酸またはアミノ酸の配列をＣｌｕｓｔａｌＷ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ－ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能）にインポートし、これを用いることによって、本明細書で提供した核酸またはアミノ酸の配列について決定することができる。たとえば、本明細書で見出したタンパク質配列アラインメントを実施するために用いたＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターは、Ｇｏｎｎｅｔ（タンパク質について）重みマトリックスを用いて生成した。一部の態様では、本明細書で見出した核酸配列を用いて核酸配列アラインメントを実施するために用いたＣｌｕｓｔａｌＷパラメーターは、ＣｌｕｓｔａｌＷ（ＤＮＡについて）重みマトリックスを用いて生成される。
【0187】
本明細書で使用される場合、アミノ酸の改変は、アミノ酸の置換、アミノ酸の欠失、またはアミノ酸の挿入であってよい。アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であってよい。保存的置き換え（保存的変異、保存的置換、または保存的変形とも呼ばれる）は、所与のアミノ酸を同様の生化学的特性（たとえば電荷、疎水性、または大きさ）を有する異なるアミノ酸に変更する、タンパク質中のアミノ酸の置き換えである。本明細書で使用される場合、「保存的変形」は、アミノ酸残基の、別の生物学的に同様の残基による置き換えを指す。保存的変形の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニン等の１つの疎水性残基の別の残基への置換、または１つの荷電したもしくは極性の残基の別の残基への置換、たとえばアルギニンのリジンへの、グルタミン酸のアスパラギン酸への、グルタミンのアスパラギンへの置換、その他が含まれる。保存的置換のその他の説明的な例には、アラニンからセリン、アスパラギンからグルタミンもしくはヒスチジン、アスパラギン酸からグルタミン酸、システインからセリン、グリシンからプロリン、ヒスチジンからアスパラギンもしくはグルタミン、リジンからアルギニン、グルタミン、もしくはグルタミン酸、フェニルアラニンからチロシン、セリンからスレオニン、スレオニンからセリン、トリプトファンからチロシン、チロシンからトリプトファンもしくはフェニルアラニン、その他の変更が含まれる。
【0188】
本明細書で開示したポリヌクレオチドは、遺伝子送達ビヒクルを用いて細胞または組織に送達することができる。本明細書で使用される「遺伝子送達」、「遺伝子移送」、「形質導入」等は、導入のために用いられる方法に関わらず、外因性ポリヌクレオチド（時には「トランスジーン」と称される）の宿主細胞への導入を指す用語である。そのような方法には、種々の公知の手法、たとえばベクター媒介遺伝子移送（たとえばウイルス感染／トランスフェクション、またはその他の種々のタンパク質系もしくは脂質系の遺伝子送達複合体による）、ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする手法（たとえばエレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチドの導入のために用いられる他の種々の手法）が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは、安定的または過渡的に宿主細胞中に維持され得る。安定的な維持には、典型的には導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合する複製の起点を含むか、または宿主細胞のレプリコン、たとえば染色体外レプリコン（たとえばプラスミド）、または核もしくはミトコンドリアの染色体に統合されることが必要である。当技術において既知で本明細書に記載しているように、いくつかのベクターが遺伝子の哺乳動物細胞への移送を媒介することができることが知られている。
【0189】
「プラスミド」は、典型的には染色体ＤＮＡとは離れていて独立にこれを複製することができるＤＮＡ分子である。多くの例で、これは環状で二本鎖である。プラスミドは微生物の集団の中で水平的遺伝子移送のための機構を提供し、典型的には所与の環境状況の下で選択的な利点を提供する。プラスミドは競争的な環境的地位において天然産生の抗生物質に対する耐性を提供する遺伝子を運搬し、あるいは産生されたタンパク質が同様の状況の下で毒素として作用し得る。プラスミドベクターは染色体外環状ＤＮＡ分子として存在することが多い一方、プラスミドベクターはランダムにまたは標的とされた様式で宿主染色体中に安定的に統合されるようにも設計され、そのような統合は環状プラスミドまたは宿主細胞への導入の前に線状化されたプラスミドを用いて達成できることが当技術で知られている。
【0190】
遺伝子操作で用いられる「プラスミド」は「プラスミドベクター」と呼ばれる。そのような使用のために多くのプラスミドが市販されている。複製されるべき遺伝子は、細胞を特定の抗生物質に対して耐性にする遺伝子およびこの位置におけるＤＮＡ断片の挿入を容易にするいくつかの一般に用いられる制限部位を含む短い領域である多重クローニング部位（ＭＣＳまたはポリリンカー）を含むプラスミドのコピーの中に挿入される。プラスミドの別の主要な用途は、大量のタンパク質を作成することである。この場合には、目的の遺伝子を有するプラスミドを含む細菌または真核細胞が研究者によって増殖され、これらは、挿入された遺伝子から大量のタンパク質が産生されるように誘起することができる。
【0191】
遺伝子移送がアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のＤＮＡウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその部分、およびトランスジーンを含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなるポリヌクレオチドを指す。
【0192】
用語「組織」は、生きているもしくは死亡した生命体の組織または生きているもしくは死亡した生命体から誘導されもしくはこれを模倣するように設計された任意の組織を指すために本明細書において使用される。組織は健康であっても、疾患を有していても、および／または遺伝的変異を有していてもよい。生物学的組織は、任意の単一の組織（たとえば相互に連結されていてもよい細胞の集合）または生命体の身体の器官もしくは部分もしくは領域を構成する組織の群を含み得る。組織は、均一な細胞材料を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなってよく、またはたとえば肺組織、骨格組織、および／または筋肉組織を含み得る胸部を含む身体の領域において見出されるようなコンポジット構造であってもよい。例示的な組織には、それだけに限らないが、肝、肺、甲状腺、皮膚、膵、血管、膀胱、腎、脳、胆道系、十二指腸、腹部大動脈、腸骨静脈、心臓、および腸から誘導された組織が含まれ、それらの任意の組合せが含まれ得る。
実施例
実施例
【実施例1】
【0193】
８週齢野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス内に静脈内投与したときのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の安全性を評価する試験
この試験を、配列番号３８を含むＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の毒性を特徴付けるように設計した。初期の試験において、動物（乳児）１匹当たり３．２×１０１２ｖｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５をＩＶ送達すると、処置された動物の６０％において有毒であること、および２．２×１０１５ｖｇ／ｋｇを上回る投与を受けた全ての動物が死亡したことが判明した。毒性の原因は不明である；しかしながら、死亡は、乳児において多数のウイルス粒子が投与されたことに起因したと考えられる。これは、生存するＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５処置マウス（脳内でＳＬＣ１３Ａ５タンパク質の明らかな発現を示した）におい長期毒性が認められないことにより更に裏付けられた。この試験では、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の毒性を更に特徴付けるために、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の標準的なＩＶ用量である１×１０１４ｖｇ／ｋｇを、若年ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス内に送達し、１５か月にわたり当該動物を評価した。ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５は、Ｄエレメントが削除された突然変異体ＡＡＶ２末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、「ＵｓＰ」プロモーター、コドン最適化ヒトＳＬＣ１３Ａ５ＤＮＡコーディング配列、ポリアデニル化シグナル、および野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む自己相補性ＡＡＶゲノムと共にパッケージングされたＡＡＶ９カプシドを含む。
この試験を、配列番号３８を含むＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の毒性を特徴付けるように設計した。初期の試験において、動物（乳児）１匹当たり３．２×１０１２ｖｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５をＩＶ送達すると、処置された動物の６０％において有毒であること、および２．２×１０１５ｖｇ／ｋｇを上回る投与を受けた全ての動物が死亡したことが判明した。毒性の原因は不明である；しかしながら、死亡は、乳児において多数のウイルス粒子が投与されたことに起因したと考えられる。これは、生存するＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５処置マウス（脳内でＳＬＣ１３Ａ５タンパク質の明らかな発現を示した）におい長期毒性が認められないことにより更に裏付けられた。この試験では、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の毒性を更に特徴付けるために、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の標準的なＩＶ用量である１×１０１４ｖｇ／ｋｇを、若年ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス内に送達し、１５か月にわたり当該動物を評価した。ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５は、Ｄエレメントが削除された突然変異体ＡＡＶ２末端逆位反復配列（ＩＴＲ）、「ＵｓＰ」プロモーター、コドン最適化ヒトＳＬＣ１３Ａ５ＤＮＡコーディング配列、ポリアデニル化シグナル、および野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲを含む自己相補性ＡＡＶゲノムと共にパッケージングされたＡＡＶ９カプシドを含む。
【0194】
方法
野生型オスおよびメスＣ５７ＢＬ／６Ｊ同腹子は、７～８週齢において、未処置コントロールとして放置されるか（ｎ＝メス１４、メス７匹、オス７匹）、または１×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の尾静脈注射を受けた（ｎ＝１４、メス７匹、オス７匹）。次に、動物を観察し、そして投与後８週間、１週間に３回秤量した。投与から８週間後に、動物の小さな群について中間分析のために剖検した。投与後１５か月の時点で、残りの動物を組織学的分析のために剖検した。投与後８週間を過ぎたいくつかの時点においても動物を継続して秤量し、そして注射後９か月まで１週間に１回、次にその後は１か月に１回観察した。
野生型オスおよびメスＣ５７ＢＬ／６Ｊ同腹子は、７～８週齢において、未処置コントロールとして放置されるか（ｎ＝メス１４、メス７匹、オス７匹）、または１×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の尾静脈注射を受けた（ｎ＝１４、メス７匹、オス７匹）。次に、動物を観察し、そして投与後８週間、１週間に３回秤量した。投与から８週間後に、動物の小さな群について中間分析のために剖検した。投与後１５か月の時点で、残りの動物を組織学的分析のために剖検した。投与後８週間を過ぎたいくつかの時点においても動物を継続して秤量し、そして注射後９か月まで１週間に１回、次にその後は１か月に１回観察した。
【0195】
処置マウスに、１×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を、尾静脈ＩＶ注射した（表１）。容積はマウスの体重に依存し、またＩＶ注射された動物に対する容積範囲は、メスの場合９８～１１６μＬ（１０４．４１±２．３２μＬ）、およびオスの場合、１１１～１３５μＬ（１２４±２．８５μＬ）であった。
【0196】
【表1】
【0197】
マウスを、臨床兆候、有害事象、および処置後死亡率について、１週間毎にモニタリングした。マウスを、最初の８週間は１週間に３回、次に注射後９か月まで１週間に１回、次にその後１か月に１回秤量した。前回よりも体重が減少した動物については、運動障害および不正咬合について更に観察した。
【0198】
注射後８週間の時点で、血液を、合計８匹のマウス（ｎ＝２／性別／群）から中間分析用に収集した。試験エンドポイント（投与後１５か月）において、残りの２０匹の動物（ｎ＝５／性別／群）から血液を収集した。血液を最終的な心臓採取物として収集した。投与後８週間の血清を、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、アルブミン（ＡＬＢ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含む血液生化学について分析した。これらの生化学変数のレベルは腎臓および肝臓の機能を示唆する。
【0199】
処置後８週間または１５か月の組織病理学的または臨床化学アセスメント用として、最終的な組織サンプルを収集した。
【0200】
中間分析群に対する剖検当日、動物（ｎ＝８）を秤量し、次にアベルチンの過量投与（１．２５％溶液を０．０４ｍＬ／ｇで）により深麻酔した。血液を最終的な心臓採取物として収集した。次に１μｇ／ｍＬのヘパリンを含有する冷却ＰＢＳを用いて、動物を灌流した。組織を迅速に収集、分割し、一方の部分を液体窒素内で急速冷凍し、他方の部分を組織学的分析のために１０％の中和緩衝化ホルマリン（ＮＢＦ）内で滴下固定した。中間群の場合は、下記の組織：脳、肝臓、心臓、および腎臓について分析した。
【0201】
エンドポイント群に対する剖検当日、動物（ｎ＝２０）を秤量し、次に上記のように深麻酔した。血液を最終的な心臓採取物として収集した。動物を、次に１μｇ／ｍＬのヘパリンを含有する冷却ＰＢＳを用いて灌流し、それに後続して、組織収集のために１０％のＮＢＦを用いて潅流した。エンドポイント群の場合、脳、心臓、骨格筋、肝臓、肺、生殖腺、脾臓、腎臓、坐骨神経、頚髄、胸髄、および腰髄を、全ての動物について分析した（収集された場合）。
【0202】
スチューデントの独立ｔ検定を、血液データを分析するのに使用した。因子として処置または注射後の日数を用い、その後Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた反復ＡＮＯＶＡを使用しながら体重データを分析した。全ての比較において、統計的有意性をｐ＜０．０５に設定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ．９．１．０）を使用して分析およびグラフ化した。
【0203】
結果
２回の計画されたエンドポイント（中間分析の場合、投与後８週間、およびエンドポイント分析の場合、投与後１５か月）よりも前の早期死亡は認められなかった（図１）。試験期間全体にわたり、毒性の外的兆候は指摘されなかった。
２回の計画されたエンドポイント（中間分析の場合、投与後８週間、およびエンドポイント分析の場合、投与後１５か月）よりも前の早期死亡は認められなかった（図１）。試験期間全体にわたり、毒性の外的兆候は指摘されなかった。
【0204】
動物の全体的な健康を評価するために、体重をモニタリングした。アセスメントを行ったいずれの時点においても、オスマウス群またはメスマウス群間で体重に有意差は認められず（図２Ａおよび図２Ｂ）、ＩＶ送達された１×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、処置後の１５か月に至るまで良好な忍容性を示したことを実証する。
【0205】
投与後８週間の中間分析群の血清から得られた血液生化学分析より、処置後の有意な変化は認められなかった（図３Ａ～図３Ｅ）。エンドポイント試験群（投与後１５か月）からは１血清サンプルのみが分析可能であった（表２）。
【0206】
【表2】
【0207】
処置関連の全般的な組織異常は剖検期間中に指摘されなかった。試験動物において識別された微視的所見のいずれも、処置関連であるとも、さもなければこれらのマウス内へのベクター投与と関連する副作用を示唆するものともみなされなかった。腎臓内の糸球体症（Ｈｏａｎｅら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２０１６年，４４（５），６８７～７０４頁）、およびリンパ腫（Ｗａｒｄら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２００６年、５７（５－６），３７７～３８１頁）を含む、動物において観察された有害な微視的観察所見のいずれも、このバックグラウンド系統および年齢のマウスにおいて一般的に生じるものである。更に、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５処置マウスと、性別および年齢が一致したそのコントロール同腹子との間のこれらの発生率は類似した（表３および表４）。剖検所見を表５に要約する。
【0208】
【表3】
【0209】
【表4】
【0210】
【表5】
【0211】
１×１０１４ｖｇ／ｋｇのＡＡＶ９／ＳＬＣ１３Ａ５をＩＶ投与しても、若年ＷＴマウスにおいて安全であり、かつ十分忍容される。試験の生存中の部分または主要組織の顕微鏡検査後のいずれにおいても、処置関連の影響は観察されなかった。
【実施例2】
【0212】
８週齢野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを対象にＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を髄腔内投与したときの安全性を評価するための試験
この試験を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを対象にＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の毒性を特徴付けるように設計した。初期の試験では、１×１０１４ｖｇ／ｋｇのＩＶ用量が、ベクター投与後最長１５か月の時点まで、若年のＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにとって安全であることが判明した。この用量のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５は、テスト品を用いたＩＶ投与後の周辺組織における形質導入にもかかわらず、良好な忍容性を示した。この試験では、８×１０１１ｖｇ／マウスの用量のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を、髄腔内腰椎穿刺（ＩＴ）により、若年のＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに送達した。動物を、次に注射後１５か月までフォローアップし、そして毒性および生体内分布について評価した。
この試験を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを対象にＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の毒性を特徴付けるように設計した。初期の試験では、１×１０１４ｖｇ／ｋｇのＩＶ用量が、ベクター投与後最長１５か月の時点まで、若年のＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにとって安全であることが判明した。この用量のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５は、テスト品を用いたＩＶ投与後の周辺組織における形質導入にもかかわらず、良好な忍容性を示した。この試験では、８×１０１１ｖｇ／マウスの用量のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を、髄腔内腰椎穿刺（ＩＴ）により、若年のＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに送達した。動物を、次に注射後１５か月までフォローアップし、そして毒性および生体内分布について評価した。
【0213】
方法
野生型オスおよびメスＣ５７ＢＬ／６Ｊ同腹子に対して、８週齢のときに、８×１０１１ｖｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５（ｎ＝９、オス５匹、メス４匹）、または媒体（ｎ＝８、オス４匹、メス５匹；３５０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水、５％ソルビトール）のＩＴ注射を施した。動物を１週間に１回観察し、そして投与後８週間につき１週間に３回、次に投与後６か月まで１週間に１回、次に試験のエンドポイントまで１か月に１回秤量した。動物は投与後１５か月まで加齢し、次に組織学分析および生体分布分析のために剖検された。動物は約８週齢まで若年として投与され、そして投与後１５か月、または約１７月齢において剖検された。
野生型オスおよびメスＣ５７ＢＬ／６Ｊ同腹子に対して、８週齢のときに、８×１０１１ｖｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５（ｎ＝９、オス５匹、メス４匹）、または媒体（ｎ＝８、オス４匹、メス５匹；３５０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水、５％ソルビトール）のＩＴ注射を施した。動物を１週間に１回観察し、そして投与後８週間につき１週間に３回、次に投与後６か月まで１週間に１回、次に試験のエンドポイントまで１か月に１回秤量した。動物は投与後１５か月まで加齢し、次に組織学分析および生体分布分析のために剖検された。動物は約８週齢まで若年として投与され、そして投与後１５か月、または約１７月齢において剖検された。
【0214】
注射当日、体重に関する事前の知識を有することなくマウスを各ケージから無作為に選択し、そして媒体または８×１０１１ｖｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５のＩＴ注射を施した（表６）。マウスそれぞれに対して送達された容積は５μＬであった。
【0215】
【表6】
【0216】
マウスを、処置後１週間毎に、臨床兆候、有害事象、および死亡率についてモニタリングした。
【0217】
マウスを、最初の８週間は１週間に３回、次に注射後６か月まで１週間に１回、その後は１か月に１回秤量した。前回から体重が減少した動物を、運動障害および不正咬合について更に観察した。
【0218】
試験エンドポイント（投与後１５か月）において動物を秤量し、次にアベルチンの過量投与（１．２５％溶液を０．０４ｍＬ／ｇで）により深麻酔した。血液を最終的な心臓採取物として収集した。生存期間内の最後に収集した血清を、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、アルブミン（ＡＬＢ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含む血液生化学について分析した。これらの生化学的変数のレベルは腎臓および肝臓の機能を示唆する。
【0219】
最終的な組織サンプルを、処置後の１５か月の組織病理学アセスメントまたは生体分布アセスメント用として収集した。剖検当日、動物を秤量し、次にこれまでに示したように深麻酔した。血液を最終的な心臓採取物として収集した。組織学分析用に意図された動物（媒体ｎ＝４、ベクターｎ＝５）を次に１μｇ／ｍＬのヘパリンを含有する冷却ＰＢＳを用いて灌流し、１０％のＮＢＦを用いた潅流がそれに後続した。脳、心臓、腓腹、肝臓、肺、生殖腺、脾臓、腎臓、坐骨神経、および脊椎を、生体内分布分析用に意図された動物（媒体ｎ＝３、ベクターｎ＝３）から収集した。
【0220】
生体内分布を、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して分析した。
【0221】
スチューデントの独立ｔ検定を、ＣＢＣデータを分析するのに使用した。因子として処置または注射後の日数を用い、その後Ｓｉｄａｋの多重比較検定を用いた反復ＡＮＯＶＡを使用しながら、体重データを分析した。全ての比較において、統計的有意性をｐ＜０．０５に設定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ．９．１．０）を使用して分析およびグラフ化した。
【0222】
結果
注射後約７か月の時点で、ｓｃＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５処置群（ＷＴ２９．４、Ｍ）において１例、および注射後約１１か月の時点で、媒体処置群（ＷＴ２６．１、Ｆ）において１例の早期死亡が認められたが、群間の生存率に有意差は認められなかった（図４）。試験動物の臨床兆候を表に記載する。不正咬合は、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド系統において稀なことではない。不正咬合マウスの場合、その歯を毎週切り取った。
注射後約７か月の時点で、ｓｃＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５処置群（ＷＴ２９．４、Ｍ）において１例、および注射後約１１か月の時点で、媒体処置群（ＷＴ２６．１、Ｆ）において１例の早期死亡が認められたが、群間の生存率に有意差は認められなかった（図４）。試験動物の臨床兆候を表に記載する。不正咬合は、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド系統において稀なことではない。不正咬合マウスの場合、その歯を毎週切り取った。
【0223】
【表7】
【0224】
体重をモニタリングして動物の全体的な健康を評価した。オスマウスまたはメスマウス内の処置群間で体重に有意差は認められず（図５Ａおよび図５Ｂ）、ＩＴ送達された８×１０１１ｖｇの用量は、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、処置後最長１５か月まで十分に忍容されたことを実証する。
【0225】
【0226】
【表8】
【0227】
剖検時の巨視的組織異常を表に記載する。
【0228】
【表9】
【0229】
試験動物において識別された微視的所見からは、このマウス内へのベクター投与に特に関連する副作用は示唆されない。肝細胞癌１を含む、試験動物において指摘された異常な組織病理学は、このバックグラウンド系統および年齢のマウスにおいて一般的に生ずるものである。更に、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５処置マウスと、そのコントロールである性別および年齢一致したが媒体処置同腹子との間のこの発生率は類似した（表）。１つの例外は、腎髄質の尿細管拡張発生率であり、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５マウスにおいてより頻繁に生じた。これはマウスにおいて稀なことではなく、また腎臓内のその他の微視的異常は処置群間で等しい頻度で生じたので、これらの所見は偶発的と考えられる。
【0230】
【表10】
【0231】
８×１０１１ｖｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５をＩＴ投与しても、若年ＷＴマウスにおいて安全であり、かつ十分忍容された。試験の生存中の部分または主要組織の顕微鏡検査後のいずれにおいても、処置関連の影響は観察されなかった。
【実施例3】
【0232】
出生後１０日目の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに髄腔内投与したときのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の安全性を評価するための試験
この試験を、これまでにテストされたものより若年の動物を対象に、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の毒性を特徴付けるように設計した。初期の試験（前出の実施例２に記載されている）では、８×１０１１ｖｇ／マウスのＩＴ用量が、ベクター投与後の最長１２か月まで、若年野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して安全であることが判明した。この試験では、低用量（２×１０１１ｖｇ／マウス）および高用量（８×１０１１ｖｇ／マウス）のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ幼獣を対象に、出生後９～１０日目（Ｐ１０）に髄腔内腰椎穿刺（ＩＴ）により送達した。
この試験を、これまでにテストされたものより若年の動物を対象に、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の毒性を特徴付けるように設計した。初期の試験（前出の実施例２に記載されている）では、８×１０１１ｖｇ／マウスのＩＴ用量が、ベクター投与後の最長１２か月まで、若年野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに対して安全であることが判明した。この試験では、低用量（２×１０１１ｖｇ／マウス）および高用量（８×１０１１ｖｇ／マウス）のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ幼獣を対象に、出生後９～１０日目（Ｐ１０）に髄腔内腰椎穿刺（ＩＴ）により送達した。
【0233】
方法
野生型オスおよびメスＣ５７ＢＬ／６Ｊ同腹子に対して、出生後９または１０日目に、２×１０１１（ｎ＝１２、オス６匹、メス６匹）もしくは８×１０１１ｖｇ（ｎ＝１１、オス５匹、メス６匹）のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５、または媒体（ｎ＝１３、オス６匹、メス７匹；３５０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水、５％ソルビトール）のＩＴ注射を施した。動物を１週間に１回観察し、そして投与後最長１２週間まで、１週間に３回、次に１週間に１回秤量した。動物を注射後最長１２か月まで追跡した。
野生型オスおよびメスＣ５７ＢＬ／６Ｊ同腹子に対して、出生後９または１０日目に、２×１０１１（ｎ＝１２、オス６匹、メス６匹）もしくは８×１０１１ｖｇ（ｎ＝１１、オス５匹、メス６匹）のＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５、または媒体（ｎ＝１３、オス６匹、メス７匹；３５０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水、５％ソルビトール）のＩＴ注射を施した。動物を１週間に１回観察し、そして投与後最長１２週間まで、１週間に３回、次に１週間に１回秤量した。動物を注射後最長１２か月まで追跡した。
【0234】
実験デザイン
注射当日、体重に関する事前の知識を有することなくマウスを各ケージから無作為に選択し、そしてそれに、媒体、または２×１０１１ｖｇもしくは８×１０１１ｖｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５のＩＴ注射を施した（表４）。マウスそれぞれに対して送達された容積は５μＬであった。
注射当日、体重に関する事前の知識を有することなくマウスを各ケージから無作為に選択し、そしてそれに、媒体、または２×１０１１ｖｇもしくは８×１０１１ｖｇのＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５のＩＴ注射を施した（表４）。マウスそれぞれに対して送達された容積は５μＬであった。
【0235】
【表11】
【0236】
マウスを、処置後１週間毎に、臨床兆候、有害事象、および死亡率についてモニタリングした。マウスを、投与後最長１２週間まで１週間に３回、次に注射後１０か月まで１週間に１回、次に投与後１２か月まで１か月に１回秤量した。前回から体重が減少した動物を、運動障害および不正咬合について更に観察した。
【0237】
投与後８週間の中間点血液を、試験対象の全マウスの顔面静脈から収集した。血液を、最終的な心臓採取物として、試験のエンドポイントにおいて収集した。投与後８週間、および試験のエンドポイントにおいて収集した血清を、総ビリルビン（ＴＢＩＬ）、アルブミン（ＡＬＢ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含む血液生化学について分析した。これらの生化学物質のレベルは、腎臓および肝臓の機能を示唆する。
【0238】
Ｔｕｋｅｙの事後分析を伴う一元配置ＡＮＯＶＡを、臨床血液化学データを分析するのに使用した。因子として処置または注射後の日数を用い、その後Ｔｕｋｅｙの多重比較検定を用いた反復ＡＮＯＶＡを使用しながら、体重データを分析した。全ての比較において、統計的有意性をｐ＜０．０５に設定した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ｖ．９．１．０）を使用して分析およびグラフ化した。
【0239】
結果
試験対象の動物について早期死亡は認められなかった（図７）。試験動物の臨床兆候は、残存する眼球において白内障および不正咬合の症例の疑いを有する媒体処置動物１例に限られた。獣医学的協議を行った際に、全てのマウスは正常と確認され、また不正咬合を有さなかった。今日まで、媒体またはＡＡＶ９／ＳＬＣ１３Ａ５処置動物のいずれにおいても、毒性の兆候は認められなかった。
試験対象の動物について早期死亡は認められなかった（図７）。試験動物の臨床兆候は、残存する眼球において白内障および不正咬合の症例の疑いを有する媒体処置動物１例に限られた。獣医学的協議を行った際に、全てのマウスは正常と確認され、また不正咬合を有さなかった。今日まで、媒体またはＡＡＶ９／ＳＬＣ１３Ａ５処置動物のいずれにおいても、毒性の兆候は認められなかった。
【0240】
体重をモニタリングして、動物の全体的な健康を評価した。分析より、オスマウスまたはメスマウス内の処置群間で体重に有意差は認められないことが明らかとなり（図８Ａおよび図８Ｂ）、ＩＴ送達された最大８×１０１１ｖｇの用量は、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ幼獣に送達されたときに、十分に忍容されたことを実証する。
【0241】
ベクター投与後８週間の時点で行った血液生化学の分析より、高用量処置群におけるＴＢＩＬレベルは媒体処置群よりも有意に低いことが明らかとなった（図９Ａ）。高ＴＢＩＬレベルは肝臓の損傷を示唆する一方、低ＴＢＩＬレベルはマイナスの臨床的影響を有するとはみなされない。血清に由来する血液生化学分析では、ＡＬＢ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、またはＣＫレベルにおいて、処置により誘発された有意な変化は認められなかった（図９Ｂ～図９Ｅ）。試験のエンドポイントにおいて行った血液化学の分析から、ＴＢＩＬレベルが高用量処置動物において正常化したことが明らかとなった（図９Ｆ）。投与後１２か月の時点でＡＬＢ、ＡＳＴ、ＢＵＮ、またはＣＫレベルにおいて有意な変化は見出されなかった（図９Ｇ～図９Ｊ）。
【0242】
ＡＡＶ９／ＳＬＣ１３Ａ５を最高８×１０１１ｖｇまでＩＴ投与しても、ＷＴ幼獣において、投与後１２か月まで安全であり、かつ十分忍容される。試験の生存部分において処置関連のマイナスの影響は認められなかったことが判明した。
【実施例4】
【0243】
野生型およびＳｌｃ１３ａ５ノックアウト（ＫＯ）マウスに対するＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５の大槽内または髄腔内投与
この非限定的な実施例では、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５が、野生型およびＳｌｃ１３ａ５ノックアウト（ＫＯ）マウスに対して、約３月齢またはＰ１０において、２×１０１１ｖｇ（低用量（ＬＤ））または８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））の用量で、髄腔内（ＩＴ）または大槽内（ＩＣＭ）送達された。患者と類似して、Ｓｌｃ１３ａ５ＫＯマウスは、血漿クエン酸レベルの増加、ＥＥＧ異常、および発作誘発に対する感受性増加を有した。マウスを体重および生存率についてモニタリングした。血液をベースライン時、次に処置後毎月収集し、そしてマウスにテレメトリーインプラントを施してベースラインＥＥＧおよびＥＭＧ活性を記録した。次にペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）による発作誘発に対する感受性についてマウスをテストし、そして組織を試験のエンドポイントにおいて収集した。
この非限定的な実施例では、ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５が、野生型およびＳｌｃ１３ａ５ノックアウト（ＫＯ）マウスに対して、約３月齢またはＰ１０において、２×１０１１ｖｇ（低用量（ＬＤ））または８×１０１１ｖｇ（高用量（ＨＤ））の用量で、髄腔内（ＩＴ）または大槽内（ＩＣＭ）送達された。患者と類似して、Ｓｌｃ１３ａ５ＫＯマウスは、血漿クエン酸レベルの増加、ＥＥＧ異常、および発作誘発に対する感受性増加を有した。マウスを体重および生存率についてモニタリングした。血液をベースライン時、次に処置後毎月収集し、そしてマウスにテレメトリーインプラントを施してベースラインＥＥＧおよびＥＭＧ活性を記録した。次にペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）による発作誘発に対する感受性についてマウスをテストし、そして組織を試験のエンドポイントにおいて収集した。
【0244】
結果
ｓｃＡＡＶ９／ＳＬＣ１３Ａ５を用いて処置したＳｌｃ１３ａ５ ＫＯマウスは、用量依存性の様式で有意に低下した血漿クエン酸レベルを有した一方、媒体を用いて処置したＳｌｃ１３ａ５ ＫＯマウスは遷延性の高クエン酸レベルを有した（図１０）。ＥＥＧ活性を、Ｐ１０処置群では３月齢、および３ｍｏ処置群では８月齢のときに、無線テレメトリーデバイスを使用して測定した。３月齢のとき、てんかん活性は、媒体処置ＫＯマウスにおいて軽度に上昇し、そしてＰ１０処置ＫＯマウスではＷＴレベルであった（図１１Ａ）。８月齢のとき、ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較してそれより有意に高いてんかん活性を有したが、３月齢のときに投与した場合、ＩＣＭ送達により正常化し、またＩＴ送達を用いた場合その程度はより低いが正常化した（図１１Ｂ）。一般的なホームケージ活動を、Ｐ１０処置マウスを対象に、無線テレメトリーデバイスを使用して６０時間にわたり測定した。明光サイクル／睡眠期間において、ＫＯマウスはＷＴマウスよりも活動的であったが、処置により用量依存性の様式で正常化した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。ＫＯマウスのＫＯマウス暗光／覚醒サイクル活動はＷＴマウスよりも高い傾向を有し、そして処置により用量依存性の様式で減少した（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）。
ｓｃＡＡＶ９／ＳＬＣ１３Ａ５を用いて処置したＳｌｃ１３ａ５ ＫＯマウスは、用量依存性の様式で有意に低下した血漿クエン酸レベルを有した一方、媒体を用いて処置したＳｌｃ１３ａ５ ＫＯマウスは遷延性の高クエン酸レベルを有した（図１０）。ＥＥＧ活性を、Ｐ１０処置群では３月齢、および３ｍｏ処置群では８月齢のときに、無線テレメトリーデバイスを使用して測定した。３月齢のとき、てんかん活性は、媒体処置ＫＯマウスにおいて軽度に上昇し、そしてＰ１０処置ＫＯマウスではＷＴレベルであった（図１１Ａ）。８月齢のとき、ＫＯマウスは、ＷＴマウスと比較してそれより有意に高いてんかん活性を有したが、３月齢のときに投与した場合、ＩＣＭ送達により正常化し、またＩＴ送達を用いた場合その程度はより低いが正常化した（図１１Ｂ）。一般的なホームケージ活動を、Ｐ１０処置マウスを対象に、無線テレメトリーデバイスを使用して６０時間にわたり測定した。明光サイクル／睡眠期間において、ＫＯマウスはＷＴマウスよりも活動的であったが、処置により用量依存性の様式で正常化した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。ＫＯマウスのＫＯマウス暗光／覚醒サイクル活動はＷＴマウスよりも高い傾向を有し、そして処置により用量依存性の様式で減少した（図１２Ｃおよび図１２Ｄ）。
【0245】
ＷＴおよびＫＯマウスに、３０ｍｇ／ｋｇのペンチレンテトラゾール（ＰＴＺ）を、一日おきに最大８回注射した。マウスをＰＴＺ注射後の３０分間観察し、そして改訂版Ｒａｃｉｎｅスケールを使用して発作重症度スコアを割り振った。注射から発作までの待機時間についても測定した。ＡＡＶ９／ｈＳＬＣ１３Ａ５を用いて処置すると、ＫＯマウスを重症誘発型の死亡から保護した。約４月齢のときにテストしたＫＯマウスでは、ＷＴマウスと同一割合（％）のＰＴＺ誘発性の死亡を認めたが、Ｐ１０において処置しても影響を受けなかった（図１３Ａ）。約９月齢のときにテストしたＫＯマウスは、ＷＴと比較して発作起因の死亡が増加したが、処置により救済された（図１３Ｂ）。
【0246】
Ｐ１０群および３月齢群の両群内のＫＯコントロールは、ＷＴマウスと比較してそれよりも増加したＲａｃｉｎｅスコアを有し、より重度の発作が示唆されたが、それはＡＡＶ９／ＳＬＣ１３Ａ５処置により救済された（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。発作までの待機時間は、ＷＴマウスと比較してＫＯ媒体マウスにおいて有意に短縮したが、それは、Ｐ１０および３か月の時点において処置を受けたマウスでは処置により改善した（図１４Ｃおよび図１４Ｄ）。より多くのベネフィットを、Ｐ１０コホートにおいてＬＤを用いることにより、および３ｍｏコホートにおいてはＩＣＭ送達後に実現した。
【0247】
処置ノックアウトマウスにおけるベクターの生体分布を評価した。ベクターの脳内生体分布は、用量、経路、および年齢依存性である。処置ＫＯマウスの肝臓および脳領域から得られたＤＮＡをｑＰＣＲ分析し、Ｐ１０のときにＡＡＶ９／ＳＬＣ１３Ａ５をＩＴ送達すれば、脳および肝臓内で、高度かつ広範囲に及ぶ、用量依存性のベクター分布を実現することを明らかにした（図１５Ａ）。３か月時点でＩＣＭ注射すれば、ＩＴ送達よりも高度かつ広範囲に及ぶ脳形質導入を実現したが、ベクター分布は、経路のいずれかを問わず、Ｐ１０において送達された同一の用量と比較してそれより低かった（図１５Ｂ）。
【0248】
脳内ＳＬＣ１３Ａ５発現は用量および経路依存性である。ＳＬＣ１３Ａ５免疫組織化学（ＩＨＣ）染色により、Ｐ１０のときに注射されたマウスの脳内において用量依存性のＳＬＣ１３Ａ５発現が明らかとなった（図１６上段）。３か月試験では、ＩＣＭ送達は、ＩＴ注射動物と比較して、それより多量かつ広範囲に及ぶベクター発現を引き起した（図１６下段）。挿入図は、原形質膜タンパク質に相当する染色を示す。
【0249】
非ＧＬＰ毒性学試験より、Ｐ１０における処置は注射後最長１年まで十分忍容されることが明らかになった。３～４月齢において評価されたＫＯマウスは、より高齢のＫＯマウスと比較してそれよりも正常な脳活性を有し、また発作に対する感受性も低かった。Ｐ１０のときに処置を行なえば、睡眠サイクル期間中の活動が正常化し、そしてＫＯマウスが発作の発現および重症度から保護された。ｑＰＣＲ分析より、ベクター分布は用量、経路、および年齢依存性であり、ＩＴ ＨＤ Ｐ１０送達が脳および肝臓において最高の分布を実現することが明らかとなった。脳ＩＨＣ分析より、ＳＬＣ１３Ａ５発現は、Ｐ１０注射マウスにおいて用量依存性であり、および３ｍｏ注射マウスにおいては経路依存性であることが明らかとなった。結果は、潜在的安全性、ならびにより若年時にＳＬＣ１３Ａ５ベクターを用い、そしてマウス成獣よりも低ベクター用量を用いて処置することのベネフィットを裏付ける。
【0250】
この実施例において要約される結果より、本開示のｒＡＡＶベクターを含有するＳＬＣ１３Ａ５は、ＳＬＣ１３Ａ５の喪失、誤機能、および／または欠損と関連する疾患および遺伝的障害を処置するためにＩＣＭ投与可能であることが実証される。
【図1】
【図2A-2B】
【図3A-3E】
【図4】
【図5A-5B】
【図6A-6E】
【図7】
【図8A-8B】
【図9A-9J】
【図10】
【図11A-11B】
【図12A-12D】
【図13A-13B】
【図14A-14B】
【図14C-14D】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】