特表2024-536283 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ ワイディーバイオラブスカンパニーリミテッドの特許一覧

特表2024-536283鋳型なしＲＮＡ合成用の核酸ポリメラーゼ変異体、キット及びその方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1-1
1-2
1-3
1-4
1-5
2A
2B
3A
3B
4A
4B
5A
5B
6A
6B

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-04

(54)【発明の名称】鋳型なしＲＮＡ合成用の核酸ポリメラーゼ変異体、キット及びその方法

(51)【国際特許分類】

C12N 9/12 20060101AFI20240927BHJP

C12N 15/54 20060101ALN20240927BHJP

【ＦＩ】

C12N9/12 ZNA

C12N15/54

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519868

(86)(22)【出願日】2022-09-29

(85)【翻訳文提出日】2024-03-28

(86)【国際出願番号】 US2022077242

(87)【国際公開番号】W WO2023056344

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】63/249,819

(32)【優先日】2021-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524120011

【氏名又は名称】ワイディーバイオラブスカンパニーリミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＹＤＢｉｏＬａｂｓＣＯ．，ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】４Ｆ．，Ｎｏ．２，Ｓｅｃ．２，ＳｈｅｎｇｙｉＲｄ．，ＺｈｕｂｅｉＣｉｔｙ，ＨｓｉｎｃｈｕＣｏｕｎｔｙ３０２０５８，Ｔａｉｗａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】100120031

【弁理士】

【氏名又は名称】宮嶋学

(74)【代理人】

【識別番号】100120617

【弁理士】

【氏名又は名称】浅野真理

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町洋

(74)【代理人】

【識別番号】100210675

【弁理士】

【氏名又は名称】下山潤

(72)【発明者】

【氏名】チョン－ヤオ、チェン

(72)【発明者】

【氏名】イー－ウェン、チョン

(72)【発明者】

【氏名】ユイ、ティン、フン

(72)【発明者】

【氏名】ウェン－ティン、チェン

(57)【要約】

鋳型なしＲＮＡ合成用の核酸ポリメラーゼ変異体、キット及びその方法を提供することを課題とする。
本発明は、核酸ポリメラーゼ変異体及びそれを含むキットに関するものであり、前記核酸ポリメラーゼ変異体は、耐熱方法でリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）を用いて鋳型なし核酸合成を実施できるため、より理想的な機能及び活性を有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

コンセンサス配列（配列番号１）の７０６～７３０位及び８４３位にそれぞれ対応するＡモチーフ及びＢモチーフと、
前記Ａモチーフ、前記Ｂモチーフ、又はこれらの組み合わせ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換と、
を含むＲＮＡポリメラーゼ変異体であって、
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が低下又は欠失している、ＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項2】

配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼから修飾される、請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項3】

前記野生型ファミリーＢＤＮＡポリメラーゼは、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）、好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ）、バクテリオファージＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９）、バクテリオファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４）又はバチルスファージＰｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９）である、請求項２に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項4】

前記コンセンサス配列（配列番号１）の３４９～３６４位に対応するＥｘｏＩモチーフを含み、前記ＥｘｏＩモチーフ内の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項5】

ｉ．配列番号１の７１５位に対応するアミノ酸Ｌ又はＭは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ或いはＹで置換され、
ｉｉ．配列番号１の７１６位に対応するアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号１の７１７位に対応するアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項6】

配列番号２の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）に由来し、
ｉ．配列番号２の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号２の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号２の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項7】

配列番号２の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）に由来し、
ｉ．配列番号２の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号２の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号２の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され
ｉｖ．配列番号２の４８５位にあるアミノ酸ＡはＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項8】

配列番号３の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）に由来し、
ｉ．配列番号３の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号３の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号３の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項9】

配列番号３の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）に由来し、
ｉ．配列番号３の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号３の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号３の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｖ．配列番号３の４８５位にあるアミノ酸ＡはＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項10】

配列番号４の野生型アミノ酸配列を有する好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）に由来し、
ｉ．配列番号４の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号４の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号４の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項11】

配列番号４の野生型アミノ酸配列を有する好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）に由来し、
ｉ．配列番号４の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号４の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号４の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｖ．配列番号４の４８５位にあるアミノ酸ＡはＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項12】

配列番号５の野生型アミノ酸配列を有するパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）に由来し、
ｉ．配列番号５の４０９位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号５の４１０位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号５の４１１位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項13】

配列番号５の野生型アミノ酸配列を有するパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）に由来し、
ｉ．配列番号５の４０９位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号５の４１０位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号５の４１１位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｖ．配列番号５の４８６位にあるアミノ酸ＡはＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項14】

配列番号６の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）に由来し、
ｉ．配列番号６の４１１位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号６の４１２位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号６の４１３位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項15】

配列番号６の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）に由来し、
ｉ．配列番号６の４１１位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号６の４１２位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号６の４１３位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｖ．配列番号６の４８８位にあるアミノ酸ＡはＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項16】

配列番号７の野生型アミノ酸配列を有するメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）に由来し、
ｉ．配列番号７の４８５位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号７の４８６位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号７の４８７位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項17】

配列番号７の野生型アミノ酸配列を有するメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）に由来し、
ｉ．配列番号７の４８５位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号７の４８６位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号７の４８７位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｖ．配列番号７の５６５位にあるアミノ酸ＡはＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項18】

配列番号８の野生型アミノ酸配列を有するピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）に由来し、
ｉ．配列番号８の４２６位にあるアミノ酸ＭはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号８の４２７位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号８の４２８位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項19】

配列番号８の野生型アミノ酸配列を有するピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）に由来し、
ｉ．配列番号８の４２６位にあるアミノ酸ＭはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号８の４２７位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号８の４２８位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｖ．配列番号８の５０８位にあるアミノ酸ＡはＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項20】

配列番号９の野生型アミノ酸配列を有するスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）に由来し、
ｉ．配列番号８の４２６位にあるアミノ酸ＭはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号９の５１９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号９の５２０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項21】

配列番号９の野生型アミノ酸配列を有するスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）に由来し、
ｉ．配列番号９の５１８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、
ｉｉ．配列番号９の５１９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｉｉ．配列番号９の５２０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、
ｉｖ．配列番号９の６０１位にあるアミノ酸ＡはＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹで置換される、
請求項４に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項22】

天然に存在するヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はそれらの混合物の群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを伸長可能なイニシエーターに付加することによって、鋳型なし方法で核酸を合成する鋳型なし核酸合成活性を示す、請求項１に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項23】

前記伸長可能なイニシエーターは、一本鎖オリゴヌクレオチドイニシエーター、平滑末端（ｂｌｕｎｔ－ｅｎｄ）二本鎖オリゴヌクレオチドイニシエーター又はこれらの混合物を含む、請求項２２に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項24】

前記伸長可能なイニシエーターは、液相中で反応した遊離核酸である、請求項２２に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項25】

前記伸長可能なイニシエーターは、固相担体上に固定されており、前記固相担体としては粒子、ビーズ、スライド、アレイ表面、膜、フローセル、孔、マイクロウェル、ナノウェル、チャンバー、マイクロ流体チャンバー、チャネル又はマイクロ流体チャネルが挙げられる、請求項２２に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項26】

前記少なくとも１つのヌクレオチドは、検出可能な標識と連結される、請求項２２に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項27】

前記少なくとも１つのヌクレオチドは、リボースを含む、請求項２２に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項28】

１０℃～１００℃の反応温度で前記鋳型なし核酸合成活性を示す、請求項２２に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体。

【請求項29】

配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ修飾に由来するＲＮＡポリメラーゼ変異体を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、天然に存在するヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを伸長可能なイニシエーターに付加することで、所望の核酸配列を合成する鋳型なし核酸合成活性を示す、デノボ酵素的核酸合成を実施するためのキット。

【請求項30】

イニシエーターオリゴヌクレオチドを用意するステップ（ａ）と
ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用意するステップ（ｂ）と、
少なくとも１つのヌクレオチドを前記イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端に付加するのに十分な条件下で、前記イニシエーターオリゴヌクレオチド、前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体及び前記少なくとも１つのヌクレオチドを組み合わせてＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するステップ（ｃ）と
を含む鋳型なしＲＮＡオリゴヌクレオチド合成方法であって、
前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、
コンセンサス配列（配列番号１）の７０６～７３０位及び８４３～８５５位にそれぞれ対応するＡモチーフ及びＢモチーフと、
前記Ａモチーフ、前記Ｂモチーフ又はこれらの組み合わせ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換とを含み、
前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が低下又は欠失している、
ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年０９月２９日に出願された米国仮出願番号第ＵＳ６３／２４９，８１９号の優先権を主張し、その全内容は、引用により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、ポリメラーゼ変異体及びそれを含むキットに関し、特に、デノボ酵素的核酸合成（ｄｅｎｏｖｏｅｎｚｙｍａｔｉｃｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）用のポリメラーゼ変異体及びそれを含むキットに関するが、本発はこれらに限定されない。

【背景技術】

【0003】

学術分野であろうと産業分野であろうと、オリゴヌクレオチドの合成はバイオテクノロジー研究の多くの側面にとって極めて重要である。しかし、数十年前に開発された伝統的な化学合成方法には多くの限界があり、特にリボ核酸（以下、ＲＮＡと略称する）デノボ合成（ｄｅｎｏｖｏＲＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に当てはまり、ゲノム工学技術、ＲＮＡベースの診断、治療、配列決定技術、核酸情報保存、さらにはバイオコンピューティングの推進に多大な投資をしてきた人々にとっては、この技術は明らかにまだ手の届かないところにある。ＲＮＡの化学合成は、強力な化学試薬と生体適合性のない有機溶媒を必要とする長い反応ステップに悩まされる。これらの反応条件は、多くの場合、ヌクレオチド塩基の脱プリン化（ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ）、配列全体からの予期せぬ挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）又は欠失、及び望ましくない切断産物をもたらすオリゴヌクレオチドの早期不可逆的なキャッピング（ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｃａｐｐｉｎｇ）を引き起こす。これらの問題により、ＲＮＡ合成の全体的なエラー率が大幅に増加し、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成長が制限され（１２０ヌクレオチド未満）、所望の産物収率を得るまでに長いリードタイムが必要になる。なお、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの化学合成は毒性があり、多大な労力を要する。したがって、現在のＲＮＡオリゴヌクレオチド合成における様々な限界を克服することが重要な課題となっている。

【0004】

酵素ベースのデノボ核酸合成は、数十年前から使用されている有毒な化学的ホスホラミダイトベースの核酸合成に代わる新たな無毒性の方法である。全ての生物は、核酸を効率的に複製するために核酸ポリメラーゼに依存している。核酸複製メカニズムに応じて、ほとんどの核酸ポリメラーゼは合成と成長する核酸鎖へのヌクレオチドの取り込みを誘導するための鋳型を必要とする。核酸合成の鋳型依存性の方法では、ポリメラーゼがプライマーの３’末端にヌクレオチドを付加する前に、ポリメラーゼがプライマー鋳型核酸と結合しなければならない。

【0005】

しかし、ほとんどの複製核酸ポリメラーゼとは異なり、Ｘファミリーのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｅｒｍｉｎａｌｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌＴｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｔｄｔ）は、核酸合成中にヌクレオチドを付加するための鋳型に依存しない、独特の中温性酵素（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃｅｎｚｙｍｅ）である。Ｔｄｔでは、ヌクレオチドの合成と成長するイニシエーターＤＮＡ又はプライマーへの取り込みを誘導するため、短いイニシエーターＤＮＡ或いはプライマーのみが必要である。以前の研究により、Ｔｄｔはわずかな区別でデオキシリボヌクレオチド（ｄＮＴＰ）とリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）の両方を組み込むことができることが明らかになった（非特許文献１）。しかし、Ｔｄｔは伸長して最大約４～５個のリボヌクレオチドからなる新たに合成されたＲＮＡ鎖を形成することしかできず、実際には、リボ核酸又はリボ核酸／デオキシリボ核酸混合基質を使用したさらなる合成におけるＴｄｔの取り込み効果は理想的ではないことが分かり、したがってＴｄｔはＲＮＡデノボ合成の反応には適していない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許第１１１３６５６４号明細書

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｂｏｕｌｅ，ＪＢｅｔａｌ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆ biological chemistry（２００１）

【非特許文献2】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，３６００－３６０５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上述の多様な構造と機能の関係により、天然に存在する複製核酸ポリメラーゼは、デノボリボ核酸合成の基質としてリボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）を容易に利用できない。したがって、オーダーメイド・修飾核酸ポリメラーゼは、各種核酸合成への応用にとって必須の前提条件となる。

【0009】

本発明者は、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列において、前記ポリメラーゼに鋳型非依存性（ｔｅｍｐｌａｔｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ）を付与し、リボヌクレオチドに対する前記ポリメラーゼのヌクレオチド基質結合親和性を高める上で重要な役割を果たす新規な位置／領域を発見することで、鋳型なしＲＮＡ合成法のために新しい可能性を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

具体的には、本発明の一態様は、コンセンサス配列（配列番号１）の７０６～７３０位及び８４３位にそれぞれ対応するＡモチーフ及びＢモチーフと、Ａモチーフ、Ｂモチーフ、又はこれらの組み合わせ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換とを含むＲＮＡポリメラーゼ変異体を提供し、前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が低下又は欠失している。

【0011】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６又は１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼから修飾される。

【0012】

本発明の一実施形態によれば、前記野生型ファミリーＢＤＮＡポリメラーゼは、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）、好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ）、バクテリオファージＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９）、バクテリオファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４）又はバチルスファージＰｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９）である。

【0013】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、コンセンサス配列（配列番号１）の３４９～３６４位に対応するＥｘｏＩモチーフを含み、かつ前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体は前記ＥｘｏＩモチーフ内の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。好ましくは、本発明の一実施形態によれば、前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体において、配列番号１の７１５位に対応するアミノ酸Ｌ又はＭは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ或いはＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応するアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号１の７１７位に対応するアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される。

【0014】

本発明の一実施形態によれば、選択されたＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号２の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）に由来し、配列番号２の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、配列番号２の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号２の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される。

【0015】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号２の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）に由来し、配列番号２の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、配列番号２の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号２の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号２の４８５位にあるアミノ酸ＡはＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹで置換される。

【0016】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号３の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）に由来し、配列番号３の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、配列番号３の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号３の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される。

【0017】

【0018】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号４の野生型アミノ酸配列を有する好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）に由来し、配列番号４の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、配列番号４の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号４の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される。

【0019】

【0020】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号５の野生型アミノ酸配列を有するパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）に由来し、配列番号５の４０９位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、配列番号５の４１０位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号５の４１１位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される。

【0021】

【0022】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号６の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）に由来し、配列番号６の４１１位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、配列番号６の４１２位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号６の４１３位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される。

【0023】

【0024】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号７の野生型アミノ酸配列を有するメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）に由来し、配列番号７の４８５位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、配列番号７の４８６位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号７の４８７位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される。

【0025】

【0026】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号８の野生型アミノ酸配列を有するピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）に由来し、配列番号８の４２６位にあるアミノ酸ＭはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、配列番号８の４２７位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号８の４２８位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される。

【0027】

【0028】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号９の野生型アミノ酸配列を有するスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）に由来し、配列番号９の５１８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、配列番号９の５１９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号９の５２０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される。

【0029】

【0030】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、天然に存在するヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はそれらの混合物の群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを伸長可能なイニシエーターに付加することによって、鋳型なし方法で核酸を合成する鋳型なし核酸合成活性を示す。

【0031】

本発明の一実施形態によれば、前記伸長可能なイニシエーターは、一本鎖オリゴヌクレオチドイニシエーター、平滑末端（ｂｌｕｎｔ－ｅｎｄ）二本鎖オリゴヌクレオチドイニシエーター又はこれらの混合物を含む。

【0032】

本発明の一実施形態によれば、前記伸長可能なイニシエーターは、液相中で反応した遊離核酸である。

【0033】

本発明の一実施形態によれば、前記伸長可能なイニシエーターは、固相担体上に固定されており、前記固相担体としては粒子、ビーズ、スライド、アレイ表面、膜、フローセル、孔、マイクロウェル、ナノウェル、チャンバー、マイクロ流体チャンバー、チャネル又はマイクロ流体チャネルが挙げられる。

【0034】

本発明の一実施形態によれば、前記少なくとも１つのヌクレオチドは、検出可能な標識と連結される。

【0035】

本発明の一実施形態によれば、前記少なくとも１つのヌクレオチドは、リボースを含む。

【0036】

本発明の一実施形態によれば、代表的なＲＮＡポリメラーゼ変異体は、１０℃～１００℃の反応温度で前記鋳型なし核酸合成活性を示す。

【0037】

本発明の別の態様は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ修飾に由来するＲＮＡポリメラーゼ変異体を含み、前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、天然に存在するヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを伸長可能なイニシエーターに付加することで、所望の核酸配列を合成する鋳型なし核酸合成活性を示すデノボ酵素的核酸合成を実施するためのキットを提供する。

【0038】

本発明の別の態様は、イニシエーターオリゴヌクレオチドを用意するステップ（ａ）と、ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用意するステップ（ｂ）と、少なくとも１つのヌクレオチドを前記イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端に付加するのに十分な条件下で、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼ変異体及び少なくとも１つのヌクレオチドを組み合わせて前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するステップ（ｃ）とを含む鋳型なしＲＮＡオリゴヌクレオチド合成方法を提供する。特定のＲＮＡポリメラーゼ変異体は、コンセンサス配列（配列番号１）の７０６～７３０位及び８４３～８５５位にそれぞれ対応するＡモチーフ及びＢモチーフと、Ａモチーフ、Ｂモチーフ又はこれらの組み合わせ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換とを含み、かつＲＮＡポリメラーゼ変異体は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が低下又は欠失している。

【発明の効果】

【0039】

したがって、本発明は、核酸鋳型の非存在下での様々な反応温度での核酸合成のため複数種のヌクレオチドの取り込みにおいて改良された性能を示す特定のRNAポリメラーゼ変異体に関する。具体的に言えば、前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体は様々なヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を幅広く利用できる特性により、ＲＮＡデノボ合成法を効率的に実施できる。

【0040】

本発明の上記と他の目的、特徴、利点及び実施形態をより明白かつ理解しやすくするため、図面を以下のように説明する。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1-1】本発明に係る野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）のアミノ酸配列アラインメント及びそのコンセンサス配列を示す図である。

【図1-2】本発明に係る野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）のアミノ酸配列アラインメント及びそのコンセンサス配列を示す図である。

【図1-3】本発明に係る野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）のアミノ酸配列アラインメント及びそのコンセンサス配列を示す図である。

【図1-4】本発明に係る野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）のアミノ酸配列アラインメント及びそのコンセンサス配列を示す図である。

【図1-5】本発明に係る野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）のアミノ酸配列アラインメント及びそのコンセンサス配列を示す図である。

【図2A】本発明の実施例３．１のＲＮＡ合成反応の結果を示す図である。

【図2B】本発明の実施例３．１のＲＮＡ合成反応の結果を示す図である。

【図3A】本発明の実施例３．２のＲＮＡ合成反応の結果を示す図である。

【図3B】本発明の実施例３．２のＲＮＡ合成反応の結果を示す図である。

【図4A】本発明の実施例３．３のＲＮＡ合成反応の結果を示す図である。

【図4B】本発明の実施例３．３のＲＮＡ合成反応の結果を示す図である。

【図5A】本発明の実施例３．４のＲＮＡ合成反応の結果を示す図である。

【図5B】本発明の実施例３．４のＲＮＡ合成反応の結果を示す図である。

【図6A】本発明の実施例３．５のＲＮＡ合成反応の結果を示す図である。

【図6B】本発明の実施例３．５のＲＮＡ合成反応の結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0042】

（配列表に関する記載）
本出願は、電子形式で配列表とともに提出される。前記配列表が入ったテキストファイルの名称はＰ２２２３３８ＴＷ－配列表．ＸＭＬで、２０２２年９月２８日に提出された英語版のＰ２２２３３８ＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ＸＭＬに基づいて作成されるものであり、サイズは３４ｋｂである。この配列表の関連情報は、その全内容が引用により本明細書に組み込まれる。

【0043】

（定義）
本明細書で使用される用語は、本発明の範囲内に広く包含され、各用語を使用する特定の文脈で一般に、関連分野における通常の意味を有する。本明細書では、当業者が本発明の関連する説明を理解できるように、本発明を説明するために使用されるいくつかの用語を以下又は本明細書の他の場所で論じられる。同じ文脈では、同じ用語は同じ範囲と意味を持つ。さらに、同じことを表現する方法が複数あるため、本明細書で論じられている用語は代替の用語や同義語に置き換えられることができ、用語が本明細書で指定又は説明されているかどうかは、特別な意味を持たない。本明細書では、ある用語の同義語が提供されているが、１つ以上の同義語の使用は、他の同義語の使用を除外しない。

【0044】

本明細書で使用される場合、「一つ」、及び「前記」の意味は、文脈が別途明確に示さない限り、複数とも解釈することができる。また、本明細書では、文脈上明らかに別段の指示がない限り、「又は」という用語は「及び／又は」という用語と交換可能に使用することができる。

【0045】

さらに、本明細書において、物又は方法がそれぞれ成分或いはステップを「包括」又は「含む」場合、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、物又は方法は、他の成分或いはステップをさらに含み得るが、排除するものではない。なお、読者の便宜上、明細書にはタイトル又はサブタイトルが使用されることがあるが、本発明の範囲に影響を与えない。

【0046】

本明細書で使用される「アミノ酸」とは、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に取り込むことができる任意の単量体ユニットを指す。本明細書で使用される「アミノ酸」という用語には、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン酸（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）又はＤ）、システイン（ＣｙＳ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）といった２０の天然又は遺伝子コードのα－アミノ酸が含まれる。「Ｘ」残基が明確に定義されていない場合、これらのアミノ酸を「任意のアミノ酸」と定義する。

【0047】

「機能的に等価」又は「等価」という用語は、特異性のファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）変異体及び本明細書で提供される誘導ＲＮＡポリメラーゼ変異体のいずれかを記述するために使用される。配列比較又は参照配列分析に基づいて、この誘導ＲＮＡポリメラーゼ変異体が持っている特定のアミノ酸位置の置換或いは突然変異は、その他のＰｏｌＢ若しくはＰｏｌＢ変異体における同等のアミノ酸位置で起こると考えられる置換或いは突然変異であり、こられの等価位置は、酵素内で同じ機能的又は構造的役割を持つ。等価位置は、相同体、保存されたモチーフ（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｍｏｔｉｆ）、ユーザー定義或いは派生したコンセンサス配列に基づいて定義できる。

【0048】

一般に、相同なＰｏｌＢは、類似又は同一のアミノ酸配列及び機能構造を有するため、異なるＰｏｌＢ間の等価のアミノ酸置換変異は、通常、相同なアミノ酸位置で生じる。本明細書で使用される「機能的に等価」又は「等価」という用語は、変異アミノ酸の実際の機能に関係なく、タンパク質配列又は構造アラインメントの観点から所与の突然変異と「相同」又は「位置的に等価」な突然変異も包含する。実際には、異なるポリメラーゼの「機能的に等価」、「相同」、及び/又は「位置的に等価」のアミノ酸残基は、タンパク質配列又は構造アラインメントに基づいて同定できる。したがって、図１は位置参照配列としてコンセンサス配列（配列番号１）を使用し、複数の野生型ＰｏｌＢに対して種間アラインメントを行った結果を示している。

【0049】

例えば、野生型サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）のアミノ酸配列の１４１位にあるアスパラギン酸（Ｄ）をアラニン（Ａ）に置換する（Ｄ１４１Ａと略称する）と、野生型大腸菌ファージＲＢ６９ＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９）のアミノ酸配列の保存された残基１１４位のＤをＡに置換することと機能的に等価と見なされる（Ｄ１１４Ａと略称する）。これらの等価のアミノ酸置換を記述するために位置参照配列が使用される場合、Ｋｏｄ１の１４１位のアミノ酸殘基及びＲＢ６９の１１４位のアミノ酸殘基は機能的に等価な位置であり、両方の機能的に等価な位置はコンセンサス配列（配列番号１）の３５４位に対応する。

【0050】

「保存された」という用語は、異なる供給源からの異なるＰｏｌＢの相同又は等価の位置に同じアミノ酸残基を有するポリメラーゼの断片を意味する。「半保存」という用語は、異なる供給源からの異なるＰｏｌＢの相同又は等価の位置に特性が類似或いは同一のアミノ酸残基を有するポリメラーゼの断片を意味する。

【0051】

「核酸」、「核酸配列」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」及び「核酸断片」という用語は、一本鎖又は二本鎖の形態のリボ核酸（ＲＮＡ）或いはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を指す。ＤＮＡ）配列のソース及び長さは本明細書では限定されず、一般に天然に存在するヌクレオチド或いは人工の化学模倣物を含む。本明細書で使用される「核酸」という用語は、天然又は非天然の「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、「遺伝子」、「相補的ＤＮＡ」（ｃＤＮＡ）及び「メッセンジャーＲＮＡ」を含む用語と互換的に使用され得る。

【0052】

本明細書で使用される場合、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）或いはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ポリマーに対応し得るポリマー若しくはその類似体を指す。これは、ヌクレオチド（ＲＮＡやＤＮＡなど）のポリマー、及び合成型、その修飾（例えば化学的又は生化学的に修飾された）型、及び混合ポリマー（例えばＲＮＡサブユニットとＤＮＡサブユニットの両方を含む）を含む。修飾の例としては、メチル化、類似体での天然ヌクレオチドの１つ以上の置換、無電荷結合のようなヌクレオチド間修飾（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等）、懸垂部分（例えばポリペプチド）、挿入剤（例えばアクリジン、ソラーレン等）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合（例えばアルファアノマー核酸等）が挙げられる。また、水素結合や他の化学的相互作用を通じて指定配列に結合するポリヌクレオチドを模倣する能力を有する合成分子も含まれる。核酸の合成型は他の結合（例えばＮｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１４９７－１５００，１９９１）に記載されるようなペプチド核酸）を含むことができるが、典型的には、ヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して結合する。核酸には、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター（例えば発現ベクター）、発現カセット、裸のＤＮＡ又はＲＮＡポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーがなりえる。又は核酸はそれらを含むことができる。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であることができ、特定の長さに限定されない。他に断りがない限り、特定の核酸配列は、明示された任意の配列に加え、相補的配列を任意に含んでなるか、又はコードする。

【0053】

上述のように、本明細書で使用される「核酸」には、天然に存在するＲＮＡ及びＤＮＡと機能的又は構造的に等価な化合物或いは人工核酸を表す「核酸類似体」も含まれる。核酸類似体は、修飾ヌクレオチドの１つ以上の構成要素（リン酸骨格、ペントース糖、及び核酸塩基）を有する場合がある。ヌクレオチドに対するそのような修飾は、核酸の構造及び幾何学的形状、ならびに核酸ポリメラーゼとの相互作用を変化させる。核酸類似体には、新種の形態の糖骨格を持つように設計されたＸＮＡなどの新興の人工核酸も含まれる。

【0054】

核酸類似体の例としては、４つの標準塩基（ｃａｎｏｎｉｃａｌｂａｓｅ）すべてと塩基対を形成できる、イノシン、３－ニトロピロール、及び５－ニトロインドールなどのユニバーサル塩基、核酸の骨格特性に影響を与える、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのリン酸糖骨格類似体、アミン反応性アミノアリル（ａｍｉｎｅ－ｒｅａｃｔｉｖｅａｍｉｎｏａｌｌｙｌ）ヌクレオチド、チオール含有ヌクレオチド、ビオチン結合ヌクレオチド、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）結合ヌクレオチド、及びシアニン結合ヌクレオチドなどの化学リンカー或いはは蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）結合類似体、２－アミノプリン（２－ａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ，２－ＡＰ）、３－メチルイソキサントプテリン（３－ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｘａｎｔｈｏｐｔｅｒｉｎ，３－ＭＩ）、６－メチルイソキサントプテリン（６－ＭＩ）、４－アミノ－６－メチルイソキサントプテリン（４－ａｍｉｎｏ－６－ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｘａｎｔｈｏｐｔｅｒｉｎ，６－ＭＡＰ）、及び４－ジメチルアミノピリジン（４－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ，ＤＭＡＰ）などの蛍光塩基類似体、蛍光レポーター色素と結合したオリゴヌクレオチド（ＡＬＥＸＡ、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＣＹ３、ＣＹ５、ＶＩＣ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＲＯＸ、ＴｅｘａｓＲｅｄなど）及び／又は蛍光消光剤（ＢＨＱ）などの様々な遺伝的応用のための核酸プローブ、ステムループ構造と二重蛍光団及び消光剤（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ－ａｎｄ－ｑｕｅｎｃｈｅｒ）標識を含む一本鎖核酸プローブであるモレキュラービーコン（ＭＢ）、及び核酸アプタマーが挙げられるが、これらに限定されない。

【0055】

本明細書で使用される「鋳型」という用語は、所望の又は未知の標的ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド或いはポリヌクレオチド模倣物である。場合によっては、用語「標的配列」、「鋳型ポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」、「核酸鋳型」、「配列鋳型」、及びそれらの変形は互換的に使用される。具体的には、「鋳型」という用語は、鋳型依存性又は鋳型指向性の核酸ポリメラーゼの複製を通じてヌクレオチド或いはヌクレオチド類似体から相補的コピーが合成される一本鎖核酸（又は核酸鎖）を指す。従来の定義では、核酸二重らせんに位置する鋳型鎖は「下側」の鎖として描かれ、説明される。同様に、非鋳型鎖は「上側」の鎖として描かれ、説明されることがよくある。「鋳型」鎖は「センス」又は「プラス」鎖とも呼ばれ、非鋳型鎖は「アンチセンス」又は「マイナス」鎖と呼ばれることもある。

【0056】

本明細書で使用される「イニシエーター」という用語は、核酸ポリメラーゼが出発物質として核酸のデノボ（ｄｅｎｏｖｏ）合成を開始する、単一のヌクレオシド、単一のヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド又はこれらの修飾類似体を指す。「イニシエーター」という用語は、異種核酸（ＸＮＡ）或いは３’－ヒドロキシル基を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）を指す場合もある。

【0057】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチドの取り込み」、「類似体の取り込み」、「取り込みヌクレオチド」及び「取り込み類似体」という用語は当業者に知られており、核酸合成のプロセス又は反応を説明するために使用される。したがって、本明細書で使用される「取り込み」という用語は、核酸イニシエーター又はプライマーの３’－ヒドロキシル末端に１つ以上のヌクレオチド、或いは任意の特定の核酸前駆体を付加することを柔軟に指すことが知られている。

【0058】

さらに本明細書で使用される「ヌクレオチド類似体」という用語は、典型的なヌクレオチドの構造模倣物である化学的に修飾されたヌクレオチド或いは人工ヌクレオチドを示すことが当業者に知られている。これらのヌクレオチド類似体は、核酸ポリメラーゼが合成するための基質として機能することができる。ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの１つ以上の変更された構成要素（例えば、リン酸骨格、ペントース糖、核酸塩基）を有する場合があり、これらの変更された構成要素は、ヌクレオチドの構造及び配置を変更するだけでなく、他の核酸塩基及び核酸との相互作用にも影響を与える。例えば、変更された核酸塩基を有するヌクレオチド類似体は、選択のため、ＤＮＡ若しくはＲＮＡに別の塩基対合及び塩基スタッキング特性を与えることができる。さらに、一例として、塩基での修飾により、イノシン、イノシン、メチル－５－デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ－５－デオキシウリジン、ジアミノ－２，６－プリン又はブロモ－５－デオキシウリジン、及びハイブリダイゼーションを可能にする他の任意の類似体などのさまざまなヌクレオシドが生成される可能性がある。他の例示的な実施形態において、これらの修飾は、糖部分のレベル（例えば、類似体によるデオキシリボースの置換）及び／又はリン酸官能基レベル（例えば、ボロン酸塩、アルキルホスホン酸塩（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、或いはホスホロチオエート誘導体）で起こり得る。ヌクレオチド類似体モノマーのリン酸官能基は、一リン酸、二リン酸、三リン酸、四リン酸、五リン酸、及び六リン酸からなる群から選択され得る。

【0059】

他のヌクレオチド類似体の例として、除去可能な保護基部分（ｂｌｏｃｋｉｎｇｍｏｏｉｅｔｙ）を有するヌクレオチドも含まれる。除去可能な保護基部分の例としては、３’－Ｏ－保護基部分、塩基保護基部分、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。３’－Ｏ－保護基部分の例としては、O-アジド（Ｏ－Ｎ_３）、Ｏ－アジドメチル、Ｏ－アミン、Ｏ－アリル、Ｏ－フェノキシアセチル、Ｏ－メトキシアセチル、Ｏ－アセチル、Ｏ－（ｐ－トルエン）スルホン酸塩、Ｏ－リン酸塩、Ｏ－硝酸塩、Ｏ－［４－メトキシ］－テトラヒドロチオピラニル、Ｏ－テトラヒドロチオピラニル、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロフラニル、Ｏ－［２－メチル，４－メトキシ］－テトラヒドロピラニル、Ｏ－［５－メチル］－テトラヒドロピラニル、Ｏ－テトラヒドロチオフラニル、Ｏ－２－ニトロベンジル、Ｏ－メチル及びＯ－アシルが挙げられるが、これらに限定されない。塩基保護基部分の例は、可逆的ダイターミネーターであり得る。可逆的ダイターミネーターの例としては、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑの可逆的ダイターミネーター、ＩｌｌｕｍｉｎａＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒＩＩＸの可逆的ダイターミネーター、ＨｅｌｉｃｏｓＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＨｅｌｉｓｃｏｐｅの可逆的ダイターミネーター、及びＬａｓｅｒＧｅｎのＬｉｇｈｔｎｉｎｇＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓの可逆的ダイターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0060】

本明細書で使用される場合、「ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）」とは、全ての生命ドメイン及び多数のＤＮＡウイルスにおいて最も一般的な鋳型依存性核酸ポリメラーゼ又はレプリカーゼを指す。ほとんどの核酸ポリメラーゼと同様に、天然のＰｏｌＢはヌクレオチジルトランスフェラーゼ反応を触媒してプライマー末端の３’－ヒドロキシル（３’－ＯＨ）にヌクレオチドを付加するには、末端に遊離の３’－ヒドロキシル官能基を持つ二本鎖プライマー鋳型、４つ全てのヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ）、及び触媒作用をもたらす二価カチオン（Ｍｇ^２＋又はＭｎ^２＋など）を必要とする。細菌ＰｏｌＩＩや古細菌ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼなどのＰｏｌＢ酵素は、本質的に触媒ポリメラーゼドメイン（ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｄｏｍａｉｎ）と、核酸複製中に成長するプライマー鎖から誤って取り込まれたヌクレオチドを除去するために使用される３’→５’エキソヌクレアーゼドメイン（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃｄｏｍａｉｎ，校正ドメインとも呼ばれる）を含む複製型と修復型ポリメラーゼである。「３'→５'エキソヌクレアーゼドメイン」（Ｅｘｏドメインと略称する）という用語は、プライマー又はポリヌクレオチド鎖の３'末端から核酸分解活性を発揮するポリメラーゼのアミノ酸配列の領域を指す。同様に「触媒ポリメラーゼドメイン」という用語は、プライマー又はポリヌクレオチド鎖の３’末端にヌクレオチドを付加することによって触媒ＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼ活性を発揮するように機能するポリメラーゼのアミノ酸配列の領域も指す。

【0061】

現在知られているＰｏｌＢ触媒ポリメラーゼドメインは、均しくヒトの右手の形状に似ており、主要な機能領域がそれぞれ指、手のひら、及び親指のサブドメインとして特徴付けられている。最も保存されている領域は、手のひらのサブドメインであり、触媒作用に必須の残基が含まれている。異なる生命界及びＤＮＡウイルスに由来する各種ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ間のタンパク質配列アラインメントによりＰｏｌＢポリメラーゼが基本的なエキソヌクレアーゼヌクレアーゼ及びポリメラーゼ機能を果たすため、一般に６つの半保存或いは保存されたモチーフ（Ｉ～ＶＩ）を保持していることが明らかになる。最初の３つの配列モチーフ（ＥｘｏＩ、ＥｘｏＩＩ、ＥｘｏＩＩＩ）は、３’→５’エキソヌクレオシドドメインにあり、他の３つのモチーフ（それぞれＡ、Ｂ及びＣモチーフと呼ばれる）はポリメラーゼドメインにある（１９９９年Ｈｏｐｆｎｅｒらは特許文献２に発表）。本発明のいくつかの実施形態において、いかなる理論にも拘束されることなく、ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼの前記モチーフにいくつかの新規な位置／領域修飾があり、ポリメラーゼがそれにより鋳型なし（すなわち、非鋳型依存性）ＲＮＡポリメラーゼとしてデノボＲＮＡ合成を効果的に触媒できること。後天的に獲得されたデノボＲＮＡ合成活性に基づいて、これらの修飾されたファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型なしＲＮＡポリメラーゼ変異体と呼ばれる。換言すれば、これらのＲＮＡポリメラーゼ変異体は、反応を阻害する条件下で、ｒＡＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰなどのリボヌクレオチドをイニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端に取り込むことができる。

【0062】

本明細書で使用する場合、本発明の文脈における「突然変異体」（ｍｕｔａｎｔ）という用語は、対応する機能的ＤＮＡポリメラーゼと比較して１つ以上のアミノ酸置換を含む、通常は組換え型ポリペプチドを指す。

【0063】

本明細書で使用される場合、本発明の文脈において、「異なる配列に対応する」（例えば、領域、断片、ヌクレオチド又はアミノ酸の位置など）は、ヌクレオチド又はアミノ酸の位置番号に従った番号付けの慣例に基づいており、次に、配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）百分率を最大化する方法で配列を整列させることを意味する。「特定の配列のＸ位に対応する」アミノ酸とは、特定の配列に等価なアミノ酸と整列させる目的のポリペプチド中のアミノ酸を指す。一般に、本明細書に記載されるように、ポリメラーゼの位置に対応するアミノ酸は、アラインメントアルゴリズム（ＢＬＡＳＴなど）及びアミノ酸配列アラインメントを実行するための他のツールを使用して決定できる。所定の「対応する領域」内の全ての位置が同一である必要はないので、対応する領域内の一致しない位置を、「対応する位置」と見做し、或いは定義してもよい。従って、本明細書で使用する場合に、「特定のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸位置Ｘに対応するアミノ酸位置」は、他のＤＮＡポリラーゼ及び構造相同体及びファミリーでの整列に基づく等価な位置を指している。

【0064】

本明細書で使用される「配列番号１のコンセンサス配列」という用語は、異種間ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼの保存或いは半保存されたアミノ酸を含む参照配列を指す。配列番号１のコンセンサス配列は、保存されたアミノ酸を得るため、サーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）、好熱菌属（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）、緑膿菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ）、バクテリオファージ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐｈａｇｅ）ＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９）、バクテリオファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４）及びバチルスファージ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｈａｇｅ）Ｐｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９）といった１６種類の野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼをアラインメントすることによって生成された仮想配列である。これらのＰｏｌＢ配列をアラインメントして、機能的に等価な位置の参照となるアラインメント配列を得する。

【0065】

本発明でいうＥｘｏＩモチーフ、ＥｘｏＩＩモチーフ、ＥｘｏＩＩＩモチーフ、Ａモチーフ、Ｂモチーフ及びＣモチーフの位置は、本発明の配列番号１のコンセンサス配列を用いて本発明者により定義されたものであるため、本発明で定義されるモチーフの位置は文献又は先行技術に記載されているものと完全に同じではないことに留意されたい。

【0066】

（目的）
本発明者は、実験の結果、典型的なヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及びイニシエーターを利用する鋳型なしのポリヌクレオチド合成においてより良好な機能及び活性を有するＰｏｌＢ変異体を発見した。これらのPolB変異体は、鋳型の非存在下で典型的なヌクレオチド或いはヌクレオチド類似体をイニシエーターに効率的に付加して、ランダム又は限定の配列を有するポリヌクレオチドを合成することができる。

【0067】

より具体的に言えば、本発明者は、ＰｏｌＢ変異体が、所望の核酸配列を有するポリヌクレオチドを生成するため、ｒＡＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＣＴＰ及びｒＧＴＰなどの天然リボヌクレオチド（ｒＮＴＰ）の、鋳型の非存在下での一本鎖核酸イニシエーター又は平滑末端（ｂｌｕｎｔｅｎｄ）の二本鎖核酸イニシエーターの３’－ＯＨ末端への付加を効率的に触媒できることを見出した。さらに、本発明のＰｏｌＢ変異体は、一般に、より広範な基質特異性を有し、これは、ＰｏｌＢ変異体が、天然に存在するヌクレオチドだけでなく、様々な修飾ヌクレオチド及び核酸類似体もデノボ核酸合成に利用できることを意味する。したがって、修飾ヌクレオチドは、特定の機能性ポリヌクレオチドを生成するため、イニシエーターに取り込まれるようにさらに設計することができる。よって、本発明のＰｏｌＢ変異体は、所望の配列及び特徴を備えたポリヌクレオチドを合成するために使用される、鋳型なしの酵素触媒核酸合成反応に対して、より広い応用範囲及びより高い実用性を提供する。

【0068】

（ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼのタンパク質配列アラインメント）
図１は、本発明者が用いた１６種類の異なる野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｏｌＢ）のアミノ酸配列アラインメントの結果を示し、アラインメントを通じてコンセンサス配列（配列番号１）が得られた結果を下に示す。アラインメントに用いた１６種類の野生型ＰｏｌＢは、それぞれサーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ，配列番号２）、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１，配列番号３）、好熱菌属（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ，配列番号４）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ，配列番号５）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ，配列番号６）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ，配列番号７）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ，配列番号８）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ，配列番号９）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ，配列番号１０）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ，配列番号１１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ，配列番号１２）、緑膿菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ，配列番号１３）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ，配列番号１４）、バクテリオファージ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｐｈａｇｅ）ＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９，配列番号１５）、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４，配列番号１６）及びバチルスファージＰｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９，配列番号１７）である。

【0069】

図１に示すように、これらの例示的な野生型ＰｏｌＢは、高度に保存された様々な配列領域を有し、また他の可変領域もある。当業者であれば、本明細書で具体的に同定され論じられる突然変異に加えて、ポリメラーゼ活性を変えることなく、又は実質的に変えることなく、これらの可変領域にも他の突然変異が生じ得ることを理解するであろう。同様に、任意のＰｏｌＢの保存された残基／位置における保存的突然変異は、突然変異した酵素のポリメラーゼ活性を変えることなく、又は実質的に変えることなく行うことができる。他の機能的に関連する酵素又はホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）との比較構造分析に基づく酵素工学は、分子生物学の分野において有用な技術であり、本発明者が酵素の触媒活性に対する特定の突然変異の影響を合理的に予測することを可能にする。本明細書で使用されるアミノ酸配列、構造データセット及び物理的特性に基づいて、当業者は、酵素の重要、固有の特徴を変えることなく、又は実質的に変えることなく、酵素（本発明に含まれるＤＮＡポリメラーゼ）を変異させることができる。

【0070】

なお、本発明は、コンセンサス配列である配列番号１の３４９～３６４位、４５０～４７６位、５９０～６０８位、７０６～７３０位、８４３～８５５位及び９４０～９５６位にそれぞれ対応するモチーフＥｘｏＩ、ＥｘｏＩＩ、ＥｘｏＩＩＩ、Ａ、Ｂ及びＣに焦点を当てる。より具体的には、本発明におけるポリメラーゼ変異体は、前記モチーフ内に対応して存在する１つ以上の残基における置換変異に基づく。

【0071】

（ＲＮＡポリメラーゼ変異体）
上記の内容によれば、本発明で提供されるポリメラーゼ変異体は、ポリメラーゼ変異体を記述するための共通配列（配列番号１）のアミノ酸配列に基づいている。配列番号１のコンセンサス配列を比較すると、該ポリメラーゼ変異体は１つ以上の残基に置換変異を有し、置換変異は該配列と同じ位置又は機能的に等価な位置で起こり得ることが分かる。当業者は、本明細書に記載のポリメラーゼ変異体が天然に存在するものではないことを理解するであろう。したがって、本明細書に記載のポリメラーゼ変異体は、配列番号１のコンセンサス配列に基づいており、個々の野生型ポリメラーゼに応じて１つ以上の残基における置換変異をさらに含む。一実施形態において、置換変異は、配列番号１のコンセンサス配列中のアミノ酸と機能的に等価な位置で生じる。「機能的に等価」とは、ポリメラーゼ変異体が配列番号１のコンセンサス配列におけるアミノ酸位置でアミノ酸置換を有し、前述のアミノ酸置換がコンセンサス配列とポリメラーゼ変異体の両方において同じ機能的又は構造的役割を有することを意味する。

【0072】

一般的に言えば、２つ以上の異なるポリメラーゼにおける機能的に等価な置換変異は、これらのポリメラーゼのアミノ酸配列における相同なアミノ酸位置で生じる。したがって、変異したアミノ酸の特定の機能が既知であるかどうかにかかわらず、該変異が「位置的に等価」又は「相同」である限り、「機能的に等価」として分類することができる。配列アラインメント及び／又は分子モデリングに基づいて、２つ以上の異なるポリメラーゼのアミノ酸配列における機能的に等価及び位置的に等価なアミノ酸残基位置を同定することが可能である。例えば、生命の異なるドメインに由来する１６種類の例示的な野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列アラインメントを使用して、位置的に等価及び／又は機能的に等価な残基を同定することができる。これらのＰｏｌＢ間のタンパク質配列アラインメントの結果を図１に示す。したがって、Ｔｇｏ、Ｋｏｄ１、９°Ｎ、Ｐｆｕ、及びびＶｅｎｔポリメラーゼの例示的な残基１４１、Ｐｉｓポリメラーゼの残基１７１、Ｓｓｏポリメラーゼの残基２３１、及びＭａｃＤＮＡポリメラーゼの残基１９８は、機能的かつ位置的に等価である。同様に、たＴｇｏ、Ｋｏｄ１、９°Ｎ、Ｐｆｕ、及びＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼの例示的な残基１４３、Ｐｉｓポリメラーゼの残基１７３、Ｓｓｏポリメラーゼの残基２３３、及びＭａｃポリメラーゼの残基２００は、機能的かつ位置的に等価である。当業者は、他のポリメラーゼにおける機能的に等価な残基を容易に同定することができる。

【0073】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明のＲＮＡポリメラーゼ変異体は、コンセンサス配列（配列番号１）の７０６～７３０位及び８４３～８５５位にそれぞれ対応するＡモチーフ及びＢモチーフと、Ａモチーフ、Ｂモチーフ又はこれらの組み合わせ内の位置にある少なくとも１つのアミノ酸置換（１つ又は複数のアミノ酸置換、或いはアミノ酸置換の組み合わせ）とを含み、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が低下又は欠失している。前記３’→５’エキソヌクレアーゼ活性欠失は、いかなる手段によっても達成され得る。例えば、ポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼドメインを修飾することによって３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を低下、欠失又は不活化したポリメラーゼを生成することができる。好ましくは、３’→５’エキソ核酸ドメインを修飾する方法は、アミノ酸置換の方法を用いることができる。換言すれば、本発明で提供されるＲＮＡポリメラーゼ変異体は、ＥｘｏＩ、ＥｘｏＩＩ、ＥｘｏＩＩＩ又はこれらの組み合わせにおける少なくとも１つのアミノ酸置換も含み得る。例えば、ＰｏｌＢ変異体は、配列番号１のＥｘｏＩモチーフにおける機能的に等価又は位置等価な３５４位ネイティブＤをＡに置換（Ｄ３５４Ａ）、３５６位のＥをＡに置換（Ｅ３５６Ａ）することで、３’→５’エキソヌクレアーゼ欠失が引き起こされる。

【0074】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼから修飾され、それぞれサーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）（Ｔｇｏ）、サーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）、好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）、ピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｍａ）、ヒトＤＮＡポリメラーゼδのｐ１２５触媒サブユニット（ｈＰＯＬＤ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＤＮＡポリメラーゼδの触媒サブユニット（ＳｃｅＰＯＬＤ）、緑膿菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐａｅ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｅｃｏ）、バクテリオファージＲＢ６９のＤＮＡポリメラーゼ（ＲＢ６９）、バクテリオファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４）又はバチルスファージＰｈｉ２９のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈｉ２９）といった野生型ファミリーＢ型ＤＮＡポリメラーゼに由来する。

【0075】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、コンセンサス配列（配列番号１）の３４９～３６４位に対応するＥｘｏＩモチーフを含み、かつ前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体は前記ＥｘｏＩモチーフ内の位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。好ましくは、配列番号１の７１５位に対応するアミノ酸Ｌ又はＭは、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ或いはＹで置換され、配列番号１の７１６位に対応するアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、配列番号１の７１７位に対応するアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換される。

【0076】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号２の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｇｏ）に由来し、配列番号２の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、好ましくはＹで置換され、配列番号２の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＡで置換され、配列番号２の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＧで置換される。

【0077】

【0078】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号３の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・コダカレンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｄ１）に由来し、配列番号３の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、好ましくはＹで置換され、配列番号３の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＡで置換され、配列番号３の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＧで置換される。

【0079】

【0080】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号４の野生型アミノ酸配列を有する好熱菌属（菌株９°Ｎ－７）のＤＮＡポリメラーゼ（９°Ｎ）に由来し、配列番号４の４０８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、好ましくはＹで置換され、配列番号４の４０９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＡで置換され、配列番号４の４１０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＧで置換される。

【0081】

【0082】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号５の野生型アミノ酸配列を有するパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ）に由来し、配列番号５の４０９位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、好ましくはＹで置換され、配列番号５の４１０位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＡで置換され、配列番号５の４１１位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＧで置換される。

【0083】

【0084】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号６の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）に由来し、配列番号６の４１１位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、好ましくはＹで置換され、配列番号６の４１２位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＡで置換され、配列番号６の４１３位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＧで置換される。

【0085】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号６の野生型アミノ酸配列を有するサーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）に由来し、配列番号６の４１１位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、好ましくはＹで置換され、配列番号６の４１２位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＡで置換され；配列番号６の４１３位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＧで置換され、配列番号６の４８８位にあるアミノ酸ＡはＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹで置換され、好ましくはＥ又はＬで置換される。

【0086】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号７の野生型アミノ酸配列を有するメタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｃ）に由来し、配列番号７の４８５位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、好ましくはＹで置換され、配列番号７の４８６位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＡで置換され、配列番号７の４８７位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＧで置換される。

【0087】

【0088】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号８の野生型アミノ酸配列を有するピロバキュラム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｉｓ）に由来し、配列番号８の４２６位にあるアミノ酸ＭはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、好ましくはＹで置換され、配列番号８の４２７位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＡで置換され、配列番号８の４２８位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＧで置換される。

【0089】

【0090】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、配列番号９の野生型アミノ酸配列を有するスルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｓｏ）に由来し、配列番号９の５１８位にあるアミノ酸ＬはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ又はＹで置換され、好ましくはＹで置換され、配列番号９の５１９位にあるアミノ酸Ｙは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＡで置換され、配列番号９の５２０位にあるアミノ酸Ｐは変化しないままである、或いはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｓ、Ｔ又はＶで置換され、好ましくはＧで置換される。

【0091】

【0092】

いくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、天然に存在するヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はそれらの混合物の群から選択される少なくとも１つのヌクレオチドを伸長可能なイニシエーターに付加することによって、鋳型なし方法で核酸を合成する鋳型なし核酸合成活性を示す。

【0093】

いくつかの実施形態によれば、前記伸長可能なイニシエーターは、一本鎖オリゴヌクレオチドイニシエーター、平滑末端（ｂｌｕｎｔ－ｅｎｄｅｄ）二本鎖オリゴヌクレオチドイニシエーター又はこれらの混合物を含む。いくつかの実施形態によれば、伸長可能なイニシエーターは、液相中で反応する遊離核酸である。

【0094】

いくつかの実施形態によれば、前記伸長可能なイニシエーターは、固相担体上に固定されており、前記固相担体としては粒子、ビーズ、スライド、アレイ表面、膜、フローセル、孔、マイクロウェル、ナノウェル、チャンバー、マイクロ流体チャンバー、チャネル又はマイクロ流体チャネルが挙げられる。

【0095】

いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのヌクレオチドは、リボースを含む。また、前記ヌクレオチドは、蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、酵素、放射性リン酸塩、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ）或いはビオチンなどの検出可能な標識と結合している。

【0096】

本発明のいくつかの実施形態によれば、ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、１０℃～１００℃の範囲の反応温度の反応温度で上述の鋳型なし核酸合成活性を示す。例えば、反応温度は、１０℃～２０℃、２０℃～３０℃、３０℃～４０℃、４０℃～５０℃、５０℃～６０℃、６０℃～７０℃、７０℃～８０℃、８０℃～９０℃、９０℃～９５℃、９５℃～１００℃、又は上限１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃、９５℃、或１００℃及び下限１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃或いは９５℃で限定される範囲内の任意の反応温度である。

【0097】

（ポリメラーゼ変異体の生成）
本明細書において、様々な種類の突然変異誘発の技術を任意に使用でき、例えばポリメラーゼを改変して本発明の変異体を生成するか、或いはランダム又は半ランダム突然変異アプローチを使用する。一般に利用可能な突然変異誘発手順は、ポリメラーゼ変異体の作成に使用されることができ、このような突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）手順には、場合により１つ以上の目的の活性についての改変された核酸及びポリペプチドの選択が含まれる。使用できる手順には、部位特異的点突然変異導入、ランダム点突然変異誘発、インビトロ又はインビボでの相同組換え（ＤＮＡシャッフリング（ＤＮＡｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）及びコンビナトリアルオーバーラップＰＣＲ（ｃｏｍｂｉｎａｔｒｏｒｉａｌｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ））、ウラシル含有鋳型を使用した突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異導入、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップ付き二本鎖ＤＮＡを使用した突然変異誘発、点ミスマッチ修復（ｐｏｉｎｔｍｉｓｍａｔｃｈｒｅｐａｉｒ）、修復欠損宿主株を使用した突然変異誘発、制限選択（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）及び制限精製（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ－ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）突然変異誘発、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＰＣＲ、二本鎖切断修復及び当業者に知られている他の多くの方法が含まれるが、これらに限定されない。

【0098】

（鋳型なし核酸合成を実行するためのキット）
本発明の一態様では、本発明の上記RNAポリメラーゼ変異体を含む鋳型なしデノボ酵素の核酸合成反応を行うためのキットも提供する。このＲＮＡポリメラーゼ変異体は、鋳型なし核酸合成活性を示し、少なくとも１つのヌクレオチドを伸長可能なイニシエーターに付加して、所望の核酸配列を生成することによって達成され、ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド、ヌクレオチド類似体及びこれらの混合物からなる群から選択される。

【0099】

場合によっては、上記キットは、ＲＮＡポリメラーゼ変異体及びヌクレオチド溶液液に必要な緩衝液や溶液などの他の試薬も含まれ、組み立てられた又はパッケージ化されたコンポーネントの使用説明書も通常は含まれているが、必ずしも含まれているわけではない。

【0100】

（ＲＮＡポリメラーゼ変異体の使用方法及び用途）
いくつかの実施形態によれば、本発明のＲＮＡポリメラーゼ変異体は、鋳型なし合成方法を用いて天然リボースヌクレオチド（ｒＮＴＰ）（例えばｒＡＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＣＴＰ及びｒＧＴＰ）を一本鎖又は平滑末端二本鎖核酸イニシエーターの３’－ヒドロキシル（３’－ＯＨ）に付加して所望の配列を有するポリヌクレオチドを生成することができる。

【0101】

いくつかの実施形態において、本発明のＲＮＡポリメラーゼ変異体を使用して、天然リボースヌクレオチド（ｒＮＴＰ）（例えばｒＡＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＣＴＰ及びｒＧＴＰ）をクラスター化一本鎖又は平滑末端二本鎖核酸イニシエーターのアレイの３’－ＯＨ末端に付加することができる。前述のように、これらのアレイは固相担体に固定或いはは物理的に閉じ込められ、固相担体から分離することもできる。そして好ましくは、前記固相担体は、ガラスで作られ、シリコンウェーハの形態で実装される。したがって、多重化、並行デノボ核酸合成を実行して、異なる配列を有する多数の様々なポリヌクレオチド又は核酸を合成することができる。

【0102】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＲＮＡポリメラーゼ変異体は、鋳型なし合成方法を使用してヌクレオチド複合体（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，先に定義したヌクレオチド類似体のタイプの１つ）を核酸イニシエーターの３’末端に取り込むことができる。前記ヌクレオチド複合体は、酵素、抗体、化学基（ビオチン、デスチオビオチンなど）或いはヌクレオチドにある塩基、リン酸基若しくは五炭糖上の蛍光団と共有結合する。

【0103】

核酸合成中にＲＮＡポリメラーゼ変異体によって前述のヌクレオチド類似体を核酸に取り込むとともに塩基特異的、部位特異的又は配列特異的な形態で所望の成分（例えば結合した酵素、抗体、或いは化学基）を新しく合成された核酸に付加する。核酸プローブ及び複合体を標識又は生成するために当技術分野で一般的に使用される成分としては、放射性標識ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体、修飾リンカー（例えばビオチン、チオール、アジド若しくはアミンなど）、蛍光団、酵素及び抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0104】

或いは、他の実施形態において、核酸プローブを標識又は生成するため、合成されたヌクレオチドの塩基、リン酸基又は五炭糖上で修飾されたリンカーを介して酵素、抗体、化学基、又は蛍光団と共有結合又は非共有結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）することによって、核酸の合成後の修飾を達成できる。したがって、所望の成分は、特定の塩基に共有結合又は非共有結合することも、新しく合成された核酸の５’末端又は３’末端に結合することもできる。

【0105】

いくつかの実施形態では、リンカー修飾されたヌクレオチド類似体へのＲＮＡポリメラーゼ変異体の取り込みにより、新たに合成されたポリヌクレオチド又は核酸の様々な固体表面への付着、固定化、或いは物理的閉じ込めを促進することができる。他の実施形態において、独自のラベル、タグ、或いは蛍光団を有する新たに合成された配列特異的核酸は、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイム蛍光リガーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＬＣＲ）、リアルタイム蛍光リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）アッセイ、及びリアルタイムの蛍光ループ媒介等温増幅アッセイを含むがこれらに限定されない、様々な核酸ベースの分子検出に使用することができる。

【0106】

本願は、（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを用意するステップと、（ｂ）ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用意するステップと、（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端に少なくとも１つのヌクレオチドを付加／取り組むのに十分な条件下で、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼ変異体及びヌクレオチドを組み合わせて前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するステップとを含むＲＮＡオリゴヌクレオチド用の鋳型なし合成方法をさらに提供する。

【0107】

前記ヌクレオチドがイニシエーターオリゴヌクレオチドに取り込まれると、所望のＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するため、続いて１つ以上の追加のヌクレオチドを付加することができる。したがって、特定の実施形態において、前記方法は、所望のＲＮＡ配列が得られるまで、得られるＲＮＡオリゴヌクレオチド（すなわち、ステップ（ｃ）で形成されたＲＮＡオリゴヌクレオチド）の３’末端に１つ以上の天然ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドを付加するステップをさらに含む。特定の実施形態において、この方法は、（ｄ）所望のＲＮＡ配列が得られるまでステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すステップをさらに含む。

【0108】

いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、１つ以上の追加の酵素の存在下で行われる。特定の実施形態において、ステップ（ｃ）は、２つ以上の異なる酵素の混合物の存在下で行われる。前記酵素の混合物は、２つ以上の異なるＲＮＡポリメラーゼ変異体（例えば、２つまたは３つのＲＮＡポリメラーゼ変異体）を含んでもよい。

【0109】

いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、ＲＮＡポリメラーゼ変異体の使用に加えて、１つ以上の追加の酵素（すなわち、補助酵素）（特異的ホスファターゼなど）も使用する。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）は、ＲＮＡポリメラーゼ変異体の使用に加えて、酵母無機ピロホスファターゼ（ＰＰｉ酵素）も使用する。

【0110】

いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）の反応は、１つ以上の追加の添加剤の存在下で行われる。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）はクラウディング剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇａｇｅｎｔ）を使用する。特定の実施形態において、クラウディング剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はフィコールである。特定の実施形態において、クラウディング剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。いくつかの実施形態において、ステップ（ｃ）はＲＮａｓｅ阻害剤を使用する。特定の実施形態において、ステップ（ｃ）は、非加水分解性ヌクレオチドの存在下で行われる。

【実施例】

【0111】

本節では、以下の実施例を通じて本発明の内容をより詳細に説明するが、これらの実施例は例示に過ぎず、当業者であれば容易に種々の変形及び変更を想到することができる。したがって、以下では本発明の様々な実施例について詳細に説明するが、本発明は本明細書に列挙される様々な実施例に限定されない。

【0112】

（実施例１：ＲＮＡポリメラーゼ変異体の調製）
本明細書に開示される任意のＰｏｌＢ保存領域及び半保存領域における保存／コンセンサスアミノ酸の特性に基づいて、遺伝子合成及び突然変異誘発技術を使用して、例示的なＲＮＡポリメラーゼ変異体を作成した。例えば、当技術分野で周知の部位特異的突然変異誘発法を使用して、例示的な野生型ＰｏｌＢの保存されたＥｘｏＩモチーフ、ＥｘｏＩＩモチーフ、ＥｘｏＩＩＩモチーフ、Ａモチーフ、Ｂモチーフ、及びＣモチーフ領域のアミノ酸残基をそれぞれ変更する。

【0113】

いくつかの実施形態において、前記ＲＮＡポリメラーゼ変異体を取得するための手順は、一般に、ステップ１：野生型ＰｏｌＢ及びその３’→５’エキソヌクレアーゼ欠損型（Ｅｘｏ－）変異体の遺伝子合成、ステップ２：構築を含む３つのステップに分割される。ステップ３：野生型ＰｏｌＢ、Ｅｘｏ変異体、及びＲＮＡポリメラーゼ変異体の発現及び精製。以下により詳細に説明するように、前記手順で使用される技術は当業者には周知である。

【0114】

ステップ１では、野生型イントロンレスＰｏｌＢを発現するために使用されるコドン最適化された遺伝子断片がＧｅｎｏｍｉｃｓＢｉｏＳｃｉ＆Ｔｅｃｈ．Ｃｏ．Ｌｔｄ．（新北市、台湾）により合成された。３'→５'エキソヌクレアーゼ欠損型（Ｅｘｏ^－と呼ばれる）も同じ供給業者から入手された。本明細書で使用される場合、任意のＰｏｌＢ略語の後の上付き文字「Ｅｘｏ－」は、指定された野生型ＰｏｌＢが内在性の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を除去するように修飾されていることを意味する。これは、該PolBが３’→５’エキソヌクレアーゼ欠損型PolBであることを示している。いくつかの好ましい実施形態によれば、Ｅｘｏ^－は、それぞれ、配列番号１のＤ３５４に対応する位置（アラニン残基によって置換される（Ｄ３５４Ａ））及び配列番号１のＥ３５６に対応する位置（アラニン残基によって置換される（Ｅ３５６Ａ））で組み合わせ突然変異を運ぶPolB変異体を意味する。

【0115】

ステップ２では、合成された野生型ＰｏｌＢ遺伝子及びＥｘｏ^－ＰｏｌＢ遺伝子をそれぞれ、隣接ｎＤＥＩ及びＮｏｔｉ制限部位を使用してＰＥＴ２８Ｂベクトルにサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定により組換えプラスミドの配列を確認する。ＰｏｌＢＥｘｏ^－タンパク質骨格上の所望のモチーフ領域でＲＮＡポリメラーゼ変異体を作成するため、部位特異的突然変異誘発を実施した。簡単に言えば、ニューイングランドＢｉｏｌａｂｓ（イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国）社製のＱ５部位特異的突然変異誘発キットを組換えプラスミドとともに使用して、部位特異的突然変異誘発ＰＣＲを実施してアミノ酸置換を導入した。まず生成物を１％アガロースゲルで分析してアンプリコンのサイズを確認し、次に残りのＰＣＲ反応混合物をＤｐｎＩで３７℃にて１時間処理した。混合物を７０℃でさらに１０分間インキュベートして、ＤｐｎＩ機能を不活性化した。次に、Ｑｉａｇｅｎ社製のＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｗｈａｔｍａｎ、マサチューセッツ州、米国）を使用してＤｐｎＩ処理したＰＣＲ反応混合物を精製し、Ｔ４ＰＮＫ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ混合物を使用して精製したＤＮＡ断片を処理し、さらに再環状化されたＰＣＲ増幅したＤＮＡを大腸菌細胞に形質転換した。その後、Ｑｉａｇｅｎ社製プラスミドミニキット（ＱｉａｇｅｎＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＫｉｔ）を使用して、プラスミドＤＮＡを大腸菌細胞から抽出した。続いてＤＮＡ配列決定を行い、所望のモチーフ領域又は特定領域内のポリメラーゼ変異体の突然変異誘発配列を確認した。

【0116】

ステップ３では、特定のポリメラーゼ変異体遺伝子を持つプラスミドＤＮＡを含む大腸菌Ａｃｅｌｌａ細胞を、０．５％グルコース及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を含有した２リットルのＬＢ培地中で３７℃にて増殖させた。細胞密度が６００ナノメートル（ＯＤ_{６００ｎｍ}）での吸光度値約０．６～０．８に達したら、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。細胞を３７℃でさらに４時間増殖させた後、４℃、７，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより回収した。細胞ペレットを、１ｍＭベンズアミジン塩酸塩（ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を含む緩衝液Ａ［５０ｍＭトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５％（ｖ／ｖ）グリセロール］で再懸濁した。細胞溶液を５０ｍｇのリゾチームとともに氷上で１時間インキュベートした後、超音波処理を行って細胞溶解を達成した。４℃、１８，０００ｘｇで２５分間遠心分離することにより、清澄化した細胞溶解液を得た。清澄化された粗細胞抽出物を７０℃で３０分間インキュベートし、その後４℃に冷却した。４℃、１８，０００ｘｇで２５分間遠心分離することにより、より清澄化した熱処理細胞抽出物が得られた。遠心分離後、上清を、ＮａＣｌを含まない緩衝液Ａで希釈し、ＡＥＫＴＡ精製クロマトグラフィーシステム（ＣｙｔｉｖａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州マールボロ、米国）の緩衝液Ａであらかじめ平衡化したＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（ＣｙｔｉｖａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）にロードした。緩衝液Ｂ［５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、５％（ｖ／ｖ）グリセロール］を使用して、１００ｍＭ～１ＭＮａＣｌの直線勾配でタンパク質を溶出した。次いで、カラム画分を１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。所望のタンパク質を含む画分を保存緩衝液［５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、５％（ｖ／ｖ）グリセロール］に対して４℃で一晩プールを透析した。標的タンパク質を含む透析タンパク質画分プールを、Ａｍｉｃｏｎフィルターユニット（分子量カットオフ５０，０００）を使用して濃縮した。濃縮タンパク質プールを等分して、－２０℃で貯蔵した。各変異ポリメラーゼ変異体を、上記と同じ手順で精製した。最終タンパク質濃度の測定を決定するため、ウシ血清アルブミンを標準液として用い、Ｂｉｏ－Ｒａｄタンパク質アッセイ（カリフォルニア州ハーキュリーズ、米国）を用いてＢｒａｄｆｏｒｄ反応（１９７６年にＢｒａｄｆｏｒｄにより提案）を行った。

【0117】

この実施例において、Ａモチーフ及び／又はＢモチーフに存在する機能的或いは位置的置換を含む、以下のアッセイを目的とした選択され(例示的な)Ｅｘｏ^－ＲＮＡポリメラーゼ変異体をまとめて表１にリストする。

【0118】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【0119】

（実施例２：鋳型なしＲＮＡ合成アッセイ）
鋳型なし（又は鋳型非依頼性とも呼ばれる）ＲＮＡ合成方法で本発明のＲＮＡポリメラーゼ変異体を評価した。ＲＮＡポリメラーゼ変異体の活性（天然に存在するリボヌクレオチドの取り込みに関する性能）をさらに確認するため、本明細書では、通常のｒＮＴＰ及び一本鎖ＤＮＡイニシエーター又は平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーターをアッセイに使用した。なお、実施例ＲＮＡポリメラーゼ変異体の耐熱性を評価するため、前記方法の反応温度を５５℃に設定した。

【0120】

この実施例では、以下の合成オリゴヌクレオチドをイニシエーターとして使用して、ＲＮＡポリメラーゼ変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性を測定した。

【0121】

アッセイモードＩのＦＡＭ－４５マー（ｍｅｒ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）イニシエーター：５’－ＣＴＣＧＧＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧＴＣＣＧＴＴＣＡＧＴＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＧ－３’（配列番号１８）配列を有する一本鎖ＤＮＡ。この一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’末端が蛍光フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）色素で標識されている（以下、ＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡという）。

【0122】

アッセイモードＩＩの平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーター：相補的な一本鎖４５マーDNAとアニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）されたＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡで構成される二本鎖ＤＮＡ。

【0123】

前記平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーターは、１００ｍＭＮａＣｌを含む１ｘＴＥ緩衝液［１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭＥＤＴＡ］中にＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡイニシエータープライマーと相補的な４５マーＤＮＡをモル比１：１．５でアニーリングしてすることにより、形成された。ＤＮＡアニーリング反応は、Ｂｉｏ－Ｒａｄサーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で先にサンプル混合物を９８℃に３分間加熱し、次に徐々に（５℃／３０秒）４℃まで冷却ことによって実行された。アニーリング反応後のオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）のないアニーリング生成物は、平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーターとして使用された。

【0124】

鋳型なしＲＮＡ合成反応は、１００ｎＭＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡイニシエーター（アッセイモードＩ）又は平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーター（アッセイモードＩＩ）、０．２５ｍＭ塩化マンガン（ＭｎＣｌ_２）、及び２００ｎＭの実施例のＲＮＡポリメラーゼ変異体を含む反応混合物（１０μｌ）の中で行われた。１００μＭのｒＮＴＰを添加することによって、ＲＮＡデノボ合成反応を開始し、反応を所定の時間進行させ（例えば、アッセイモードＩの場合、２分間、アッセイモードＩＩの場合、１０分間）、その後所定の反応温度（例えば、アッセイモードＩ又はアッセイモードＩＩはどちらも５５℃）で１０μｌの２ｘクエンチング溶液（９５％脱イオンホルムアミド及び２５ｍＭＥＤＴＡ）を加えて反応を停止させた。アッセイモードＩ又はアッセイモードＩＩの反応後、まずサンプル混合物を９５℃で１０分間変性し、８Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素－ＰＡＧＥ）で分析した。その後、ＡｍｅｒｓｈａｍＴｙｐｈｏｏｎレーザースキャナー（ＣｙｔｉｖａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ社製）上でゲルを画像化することで、酵素ＲＮＡデノボ合成反応の生産物を観察できた。

【0125】

上記アッセイに基づいて、各変異体の相対的な鋳型なしＲＮＡ合成活性をスコア化し、記号「＋」の数で表した。各変異体の全体的な活性スコアは４つの異なるレベルに分けられた。１）「＋＋＋」は、基質コントロールのバンド強度及び位置と比較して、イニシエーターがさまざまな長さの新たに合成されたＲＮＡまで完全に伸長されていることを示し、したがって、この変異体は１００％のＲＮＡ合成活性を持っていると考えられる。２）「＋＋」は、基質コントロールのバンド強度及び位置と比較して、イニシエーターの約５０％～１００％がさまざまな長さの新たに合成されたＲＮＡまでに伸長されていることを示し、したがって、この変異体は５０％～１００％のＲＮＡ合成活性を持っていると考えられる。３）「＋」は、基質コントロールのバンド強度及び位置と比較して、イニシエーターの約１０％～５０％がさまざまな長さの新たに合成されたＲＮＡまでに伸長されていることを示し、したがって、この変異体は１０％のＲＮＡ合成活性を持っていると考えられる。４）「＋／－」は、基質コントロールのバンド強度及び位置と比較して、１０％未満のイニシエーターがさまざまな長さの新たに合成されたＲＮＡまでに伸長されていることを示し、したがって、この変異体は１０％未満のＲＮＡ合成活性を持っていると考えられる。活性関連のスコアリングのこの原理は、本願全体にわたって適用され、得られたデータを対応する表に示す。

【0126】

（実施例３：ＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡイニシエーター及び平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーターへのｒＮＴＰの取り込みに対するＲＮＡポリメラーゼ変異体の触媒活性）
ここで、特定のエキソヌクレアーゼ欠損型ＲＮＡポリメラーゼ変異体（例えば、Ｔｇｏ^ｅｘｏ－、Ｋｏｄ１^ｅｘｏ－、９°Ｎ^ｅｘｏ－、Ｐｆｕ^ｅｘｏ－、Ｖｅｎｔ^ｅｘｏ－、Ｍａｃ^ｅｘｏ－及びＳｓｏ^ｅｘｏ－）は、各タンパク質内の異なる保存領域又はモチーフでの１つ以上のアミノ酸置換を含むように修飾された。

【0127】

さらに、本発明者は、予備スクリーニングにおいて、これらのエキソヌクレアーゼ欠損型ＲＮＡポリメラーゼ変異体の保存されたモチーフが本明細書で定義されるコンセンサス配列（配列番号１）のモチーフＡに存在するＬ７１５、Ｙ７１６、及びＰ７１７と機能的かつ位置的に等価であり、前記保存されたモチーフは主にＲＮＡデノボ合成の機能に関連している可能性があることを見出した。より具体的に言えば、前記保存されたモチーフは、鋳型なしＲＮＡ合成活性にとって必須の部位であり得る。なお、コンセンサス配列（配列番号１）と機能的かつ位置的に等価である、モチーフＢにある保守残基Ａ８５４は、鋳型なしＲＮＡ合成活性を増強するための強化可能な部位として機能する（データは示さず）。

【0128】

（実施例３．１：Ｖｅｎｔ変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性）
この実施例において、Ｖｅｎｔ（配列番号６）由来のＲＮＡポリメラーゼ変異体を、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフにおける組み合わせ置換を有する変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性を評価するために例示的に使用した。また、特許文献１は、鋳型依存性ＤＮＡ合成反応（すなわち、ＤＮＡ配列決定）におけるヌクレオチド類似体の取り込みを改善するため、いくつかの古細菌ＤＮＡポリメラーゼの対応する保存モチーフを置換するためのＡＡＩモチーフを開示した。保存されたモチーフＡＡＩは、コンセンサス配列（配列番号１）のＬ７１５、Ｙ７１６、及びＰ７１７と機能的かつ位置的に等価であり、したがって、保存されたモチーフは、野生型ＶｅｎｔのモチーフＡ（配列番号６）Ａモチーフに存在するＬ４１１、Ｙ４１２及びＰ４１３とも機能的かつ位置的に等価である。したがって、鋳型指向性ヌクレオチドの取り込みに対するＡＡＩモチーフの影響を考慮して、ここではＡＡＩモチーフの置換も比較した。なお、この実施例において、コンセンサス配列のＢモチーフに存在するＡ８５４（野生型ＶｅｎｔのＢモチーフに存在するＡ４８８と機能的かつ位置的に等価である）の置換の組み合わせ効果も評価した。

【0129】

この実施例において、Ｖｅｎｔ^Ｅｘｏ－バックボーンから修飾された変異体を上記アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩで評価した。アッセイモードＩの結果を表２．１及び図２Ａに示し、アッセイモードＩＩの結果を表２．２及び図２Ｂに示す。ここで、図中に示される「Ｓ」は基質（ＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡイニシエーター又は平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーター）を表し、ブランクＤＮＡコントロールとして機能する。また、簡潔にするため、図２Ａ及び２Ｂには、代表的なＶｅｎｔ変異体の例示的な結果のみが示されている。

【0130】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【0131】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【0132】

表２．１、表２．２、図２Ａ及び図２Ｂに示すように、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及び／又はＢモチーフ（Ａ４８８Ｌ）に位置するアミノ酸置換を有する変異体は、アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩの両方において、鋳型なし酵素的ＲＮＡ合成の顕著な触媒活性を示した。より具体的に言えば、鋳型なし酵素的ＲＮＡ合成の触媒活性については、好ましい置換の組み合わせはＡモチーフで現れ、例えばＬ４１１Ａ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ（ＡＡＧ）、Ｌ４１１Ｃ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ（ＣＡＧ）、Ｌ４１１Ｆ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ（ＦＡＧ）、Ｌ４１１Ｈ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ（ＨＡＧ）、Ｌ４１１Ｋ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ（ＫＡＧ）、Ｌ４１１Ｍ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ（ＭＡＧ）、Ｌ４１１Ｑ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ（ＱＡＧ）及びＬ４１１Ｙ＋Ｙ４１２Ａ＋Ｐ４１３Ｇ（ＹＡＧ）である。

【0133】

（実施例３．２：Ｐｆｕ変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性）
この実施例において、Ｐｆｕ（配列番号５）に由来するＲＮＡポリメラーゼ変異体を、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフにおける置換組み合わせを有する変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性を評価するために例示的に使用した。

【0134】

具体的に言えば、Ｐｆｕ^Ｅｘｏ－バックボーンから修飾された変異体を上記アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩで評価した。アッセイモードＩの結果を表３．１及び図３Ａに示し、アッセイモードＩＩの結果を表３．２及び図３Ｂに示す。ここで、図中に示される「Ｓ」は基質（ＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡイニシエーター又は平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーター）を表し、ブランクＤＮＡコントロールとして機能する。また、簡潔にするため、この実施例では代表的なＰｆｕ変異体の例示的な結果のみを示す。

【0135】

【表4】

【0136】

【表5】

【0137】

図３Ａ、図３Ｂ、表３．１及び表３．２に示すように、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフに位置するアミノ酸置換を有する変異体（変異体Ｐ０３、Ｐ０４及びＰ０５など）は、アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩの両方において、鋳型なし酵素的ＲＮＡ合成の顕著な触媒活性を示した。また、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフに位置するアミノ酸置換の組み合わせを有する変異体（変異体Ｐ０４及びＰ０５など）は、前記触媒活性をさらに増強した。

【0138】

（実施例３．３：Ｋｏｄ１変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性）
この実施例において、Ｋｏｄ１（配列番号３）に由来するＲＮＡポリメラーゼ変異体を、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフにおける置換組み合わせを有する変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性を評価するために例示的に使用した。

【0139】

具体的に言えば、Ｋｏｄ１^Ｅｘｏ－バックボーンから修飾された変異体を上記アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩで評価した。アッセイモードＩの結果を表４．１及び図４Ａに示し、アッセイモードＩＩの結果を表４．２及び図４Ｂに示す。ここで、図中に示される「Ｓ」は基質（ＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡイニシエーター又は平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーター）を表し、ブランクＤＮＡコントロールとして機能する。また、簡潔にするため、この実施例では代表的なＫｏｄ１変異体の例示的な結果のみを示す。

【0140】

【表6】

【0141】

【表7】

【0142】

図４Ａ、図４Ｂ、表４．１及び表４．２に示すように、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及び／又はＢモチーフに位置するアミノ酸置換を有する変異体（変異体Ｐ０３、Ｐ０４及びＰ０５など）は、アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩの両方において、鋳型なし酵素的ＲＮＡ合成の顕著な触媒活性を示した。また、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフに位置するアミノ酸置換の組み合わせを有する変異体（変異体Ｋ０４及びＫ０５など）は、前記触媒活性をさらに増強した。

【0143】

（実施例３．４：Ｍａｃ変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性）
この実施例において、Ｍａｃ（配列番号７）に由来するＲＮＡポリメラーゼ変異体を、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフにおける置換組み合わせを有する変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性を評価するために例示的に使用した。

【0144】

具体的に言えば、Ｍａｃ^Ｅｘｏ－バックボーンから修飾された変異体を上記アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩで評価した。アッセイモードＩの結果を表５．１及び図５Ａに示し、アッセイモードＩＩの結果を表５．２及び図５Ｂに示す。ここで、図中に示される「Ｓ」は基質（ＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡイニシエーター又は平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーター）を表し、ブランクＤＮＡコントロールとして機能する。また、簡潔にするため、この実施例では代表的なＭａｃ変異体の例示的な結果のみを示す。

【0145】

【表8】

【0146】

【表9】

【0147】

図５Ａ、図５Ｂ、表５．１及び表５．２に示すように、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフに位置するアミノ酸置換を有する変異体（変異体Ｍ０２など）は、アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩの両方において、鋳型なし酵素的ＲＮＡ合成の顕著な触媒活性を示した。また、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフに位置するアミノ酸置換の組み合わせを有する変異体（変異体Ｍ０３など）は、前記触媒活性をさらに増強した。

【0148】

（実施例３．５：Ｔｇｏ変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性）
この実施例において、Ｔｇｏ（配列番号２）に由来するＲＮＡポリメラーゼ変異体を、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフにおける置換組み合わせを有する変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性を評価するために例示的に使用した。

【0149】

具体的に言えば、Ｔｇｏ^Ｅｘｏ－バックボーンから修飾された変異体を上記アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩで評価した。アッセイモードＩの結果を表６．１及び図６Ａに示し、アッセイモードＩＩの結果を表６．２及び図６Ｂに示す。ここで、図中に示される「Ｓ」は基質（ＦＡＭ－４５マーｓｓＤＮＡイニシエーター又は平滑末端二本鎖ＤＮＡイニシエーター）を表し、ブランクＤＮＡコントロールとして機能する。また、簡潔にするため、この実施例では代表的なＴｇｏ変異体の例示的な結果のみを示す。

【0150】

【表10】

【0151】

【表11】

【0152】

図６Ａ、図６Ｂ、表６．１及び表６．２に示すように、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフに位置するアミノ酸置換を有する変異体（変異体Ｔ０１及びＴ０２など）は、アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩの両方において、鋳型なし酵素的ＲＮＡ合成の顕著な触媒活性を示した。

【0153】

（実施例３．６：Ｓｓｏ変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性）
この実施例において、Ｓｓｏ（配列番号９）に由来するＲＮＡポリメラーゼ変異体を、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフにおける置換組み合わせを有する変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性を評価するために例示的に使用した。

【0154】

具体的に言えば、Ｓｓｏ^Ｅｘｏ－バックボーンから修飾された変異体を上記アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩで評価した。アッセイモードＩの結果を表７．１に示し、アッセイモードＩＩの結果を表７．２に示す。また、簡潔にするため、この実施例における尿素－ＰＡＧＥ画像の結果を省略した。

【0155】

【表12】

【0156】

【表13】

【0157】

表７．１及び表７．２に示すように、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及び／又はＢモチーフに位置するアミノ酸置換を有する変異体（変異体Ｓ０３及びＳ０６など）は、アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩの両方において、鋳型なし酵素的ＲＮＡ合成の顕著な触媒活性を示した。

【0158】

（実施例３．７：９°Ｎ変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性）
この実施例において、９°Ｎ（配列番号４）に由来するＲＮＡポリメラーゼ変異体を、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及びＢモチーフにおける置換組み合わせを有する変異体の鋳型なしＲＮＡ合成活性を評価するために例示的に使用した。

【0159】

具体的に言えば、９°Ｎ^Ｅｘｏ－バックボーンから修飾された変異体を上記アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩで評価した。アッセイモードＩの結果を表８．１に示し、アッセイモードＩＩの結果を表８．２に示す。また、簡潔にするため、この実施例における尿素－ＰＡＧＥ画像の結果を省略した。

【0160】

【表14】

【0161】

【表15】

【0162】

表８．１及び表８．２に示すように、ＥｘｏＩモチーフ、Ａモチーフ及び／又はＢモチーフに位置するアミノ酸置換を有する変異体は、アッセイモードＩ及びアッセイモードＩＩの両方において、鋳型なし酵素的ＲＮＡ合成の顕著な触媒活性を示した。

【0163】

要するに、本発明で提供されるＲＮＡポリメラーゼ変異体及びキットは、デノボ酵素的ＲＮＡ合成にｒＮＴＰを効果的かつ効率的に使用するさまざまなシナリオでさらに証明されている。なお、これらのＲＮＡポリメラーゼ変異体は、大気温度から高温条件に至る幅広い反応温度下で、鋳型なしＲＮＡ合成機能を首尾よく発揮することも証明されており、より高い耐熱性を示している。したがって、本開示の範囲内のＲＮＡポリメラーゼ変異体及びキットは、異なる反応条件における鋳型なし酵素的核酸合成の様々な応用の範囲を広げることができる。

【0164】

本発明の具体的実施形態を開示したが、本発明を限定する意図で用いられるものではない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者であれば、本発明の原理及び精神から逸脱することなく、多種多様な変形及び修正を加えることができることを理解することができ、したがって、本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲に限定されるものに基づくべきである。

【図1-1】